ES2213506T3 - Metodo de producir derivados de hidroxialquil-almidon. - Google Patents
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Abstract
Un método de producir un derivado de hidroxialquil-almidón, teniendo dicho hidroxialquil-almidón una estructura de acuerdo con la fórmula (I) **FORMULA** que comprende hacer reaccionar -hidroxialquil-almidón de fórmula (I) en su extremo reductor opcionalmente oxidado o- un derivado de hidroxialquil-almidón obtenible haciendo reaccionar hidroxialquil-almidón de fórmula (I) en su extremo reductor opcionalmente oxidado con un compuesto (D), comprendiendo dicho compuesto (D) - al menos un grupo funcional Z1 capaz de ser hecho reaccionar con el extremo reductor opcionalmente oxidado de hidroxialquil-almidón, y - al menos un grupo funcional W, con un compuesto (L) que comprende - al menos un grupo funcional Z1 capaz de ser hecho reaccionar con dicho hidroxialquil-almidón, o al menos un grupo funcional Z2 capaz de ser hecho reaccionar con el grupo funcional W contenido en dicho derivado de hidroxialquil-almidón, y - al menos un grupo funcional X capaz de ser hecho reaccionar con un grupo funcional Y de un compuesto adicional (M), en donde dicho grupo funcional Y se selecciona del grupo que consiste en un grupo aldehido, un grupo ceto, un grupo hemiacetal, un grupo acetal y un grupo tio.
Description
Método para producir derivados de
hidroxialquil-almidón.
La presente invención se refiere a derivados de
hidroxialquil-almidón, particularmente a derivados
de hidroxialquil-almidón obtenibles por un
procedimiento en el cual el hidroxialquil-almidón se
hace reaccionar con un grupo amino primario o secundario de un
compuesto reticulante o con dos compuestos reticulantes, en donde el
derivado de hidroxialquil-almidón resultante tiene
al menos un grupo funcional X que es capaz de ser hecho reaccionar
con un grupo funcional Y de un compuesto adicional y, en donde este
grupo Y es un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo hemiacetal o
un grupo acetal. De acuerdo con una realización especialmente
preferida, la presente invención se refiere a derivados de
hidroxialquil-almidón obtenibles por un
procedimiento de acuerdo con el cual el
hidroxialquil-almidón se hace reaccionar con un
grupo amino primario o secundario de un compuesto reticulante,
siendo el producto de reacción resultante hecho reaccionar
opcionalmente además con un segundo compuesto reticulante, en donde
el derivado de hidroxialquil-almidón resultante
tiene al menos un grupo funcional X que es capaz de ser hecho
reaccionar con un grupo funcional Y de un compuesto adicional y en
donde este grupo Y es un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo
hemiacetal o un grupo acetal, y el producto de reacción resultante
se hace reaccionar con un polipéptido, preferiblemente con un
polipéptido, tal como AT III, IFN-beta o
eritropoyetina y especial y preferiblemente con eritropoyetina, que
comprende al menos uno de estos grupos funcionales Y. Un
hidroxialquil-almidón que es especialmente preferido
es el hidroxietil-almidón. De acuerdo con la
presente invención, el hidroxialquil-almidón y
preferiblemente el hidroxietil-almidón se hace
reaccionar con el compuesto enlazador en su extremo reductor que
está opcionalmente oxidado antes de dicha reacción.
El hidroxietil-almidón
(abreviadamente en lo sucesivo HES por la expresión inglesa
hydroxyethyl starch) es un derivado de amilopectina que se
presenta en la naturaleza y es degradado por la
alfa-amilasa en el cuerpo. El HES es un derivado
sustituido del carbohidrato polímero amilopectina, que está presente
en el almidón de maíz a una concentración de hasta 95% en peso. El
HES exhibe sus propiedades biológicas ventajosas y se usa como un
agente para reemplazar el volumen de sangre y en terapia de
hemodilución en estudios clínicos (Sommermeyer et al., 1987,
Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; y
Weidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res.,
41, 494-498).
La amilopectina consiste en restos de glucosa,
en donde en la cadena principal están presentes enlaces
alfa-1,4-glucosídicos y en los
sitios de ramificación se encuentras enlaces
alfa-1,6-glucosídicos. Las
propiedades físico-químicas de esta molécula están
principalmente determinadas por el tipo de enlaces glucosídicos.
Debido al enlace
alfa-1,4-glucosídico provisto de
muesca, se producen estructuras helicoidales con aproximadamente
seis monómeros de glucosa por vuelta. Las propiedades
físico-químicas, así como las propiedades biológicas
del polímero pueden ser modificadas por sustitución. La
introducción de un grupo hidroxietilo puede conseguirse por
hidroxietilación alcalina. Adaptando las condiciones de reacción es
posible explotar la diferente reactividad del grupo hidroxi
respectivo en el monómero de glucosa no sustituido con respecto a
una hidroxietilación. Debido a este hecho los expertos en la
técnica son capaces de influir en el modelo de sustitución en una
extensión limitada.
Algunos modos de producir un derivado de
hidroxietil-almidón están descritos en la
técnica.
El documento DE 2616086 describe la conjugación
de hemoglobina con hidroxietil-almidón en donde, en
una primera etapa, un agente reticulante, por ejemplo, bromociano,
se une a hidroxietil-almidón y subsiguientemente la
hemoglobina se enlaza al producto intermedio.
Un campo importante en el que se usa HES es la
estabilización de polipéptidos que se aplica, por ejemplo, al
sistema circulatorio con el fin de obtener un efecto fisiológico
particular. Un ejemplo específico de estos polipéptidos es la
eritropoyetina, un glucoproteína ácida de aproximadamente 34.000 kD
que es esencial en regular el nivel de glóbulos rojos en la
circulación.
Un problema muy conocido con la aplicación de
polipéptidos y enzimas es que estas proteínas frecuentemente
exhiben una estabilidad insatisfactoria. Especialmente la
eritropoyetina tiene una semi-vida en plasma
relativamente corta (Spivak and Hogans, 1989, Blood 73, 90;
McMahon et al., 1990, Blood 76, 1718). Esto significa
que los niveles terapéuticos en plasma se pierden rápidamente y
deben realizarse repetidas administraciones intravenosas. Además, en
ciertas circunstancias se observa una respuesta inmune contra los
péptidos.
Generalmente se acepta que se puede mejorar la
estabilidad de los polipéptidos y que la respuesta inmune contra
estos polipéptidos se reduce cuando los polipéptidos están acoplados
a moléculas polímeras. El documento WO 94/28024 describe que los
polipéptidos fisiológicamente activos modificados con
polietilenglicol (PEG) exhiben inmunogenicidad y antigenicidad
reducidas y circulan en el torrente sanguíneo considerablemente más
tiempo que las proteínas no conjugadas, es decir, tienen una mayor
(sic) tasa de eliminación. Sin embargo, los conjugados
PEG-fármacos exhiben diversos inconvenientes, por
ejemplo, no exhiben una estructura natural que pueda ser reconocida
por elementos de la vía de degradación en vivo. Por tanto,
aparte de los PEG-conjugados, se han producido
otros conjugados y polimerizados de proteínas. Una pluralidad de
métodos para la reticulación de diferentes proteínas y
macromoléculas, tales como polimerasa han sido descritos en la
literatura científica (véase, por ejemplo, Wong, Chemistry of
Protein Conjugation and Cross-linking, 1993,
GRGS, Inc.).
\newpage
En resumen, sigue existiendo la necesidad de más
polipéptidos mejorados con mejor estabilidad y/o bioactividad. Esto
se aplica especialmente a la eritropoyetina, en donde las isoformas
con un alto grado de ácidos siálicos y por tanto con alta actividad
tienen que ser purificadas de isoformas con un bajo grado de ácidos
siálicos (véase el documento EP 0428267 B1). Por consiguiente,
sería altamente ventajoso que estuvieran disponibles métodos de
producción que proporcionen polipéptidos altamente activos sin
requerir una exhaustiva purificación. Desafortunadamente, la
producción de polipéptidos en células de bacterias o insectos es
frecuentemente difícil, debido a que los polipéptidos
frecuentemente no se producen en una conformación natural con el
plegamiento adecuado, y carecen de la adecuada glucosilación.
El documento WO 02/08079 A2 describe compuestos
que comprenden un conjugado de un agente activo y un
hidroxialquil-almidón, en donde el agente activo y
el hidroxialquil-almidón están enlazados
directamente o mediante un compuesto enlazador. En lo que se
refiere al enlace directo, la reacción del activo agente y el
hidroxialquil-almidón se lleva a cabo en un medio
acuoso que comprende al menos 10% en peso de agua. En dicho
documento no se dan ejemplos que estén dirigidos a un derivado de
hidroxialquil-almidón que esté enlazado a un grupo
carbonilo contenido en el reactivo activo, ni a un grupo aldehído o
ceto, ni a un grupo acetal ni a un grupo hemiacetal.
En consecuencia, es un objeto de la presente
invención proporcionar derivados de
hidroxialquil-almidón que sean capaces de formar un
enlace químico con un compuesto adicional, por ejemplo un
polipéptido, que comprende, como grupo funcional, un grupo tio o un
grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo hemiacetal o un grupo
acetal. Preferiblemente, el grupo aldehído, el grupo ceto, el grupo
hemiacetal o el grupo acetal están contenidos en un resto de
carbohidrato del compuesto adicional.
Por tanto, la presente invención se refiere a un
método de producir un derivado hidroxialquil-almidón
que comprende el hidroxialquil-almidón, un
compuesto (L), opcionalmente un compuesto (D), y el compuesto
adicional (M), teniendo dicho hidroxialquil-almidón
una estructura de acuerdo con la fórmula (I):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
comprendiendo el método hacer
reaccionar:
- -
- hidroxialquil-almidón de fórmula (I) en su extremo reductor opcionalmente oxidado o
- -
- un derivado de hidroxialquil-almidón, obtenible haciendo reaccionar el hidroxialquil-almidón de fórmula (I) en su extremo reductor opcionalmente oxidado con un compuesto (D), comprendiendo dicho compuesto (D):
- -
- al menos un grupo funcional Z_{1} capaz de ser hecho reaccionar con el extremo reductor opcionalmente oxidado del hidroxialquil-almidón, y
- -
- al menos un grupo funcional W,
\vskip1.000000\baselineskip
con un compuesto (L) que comprende:
- -
- al menos un grupo funcional Z_{1} capaz de ser hecho reaccionar con dicho hidroxialquil-almidón, o al menos un grupo funcional Z_{2} capaz de ser hecho reaccionar con grupo funcional W contenido en dicho derivado de hidroxialquil-almidón, y
- -
- al menos un grupo funcional X capaz de ser hecho reaccionar con un grupo funcional Y de un compuesto adicional (M),
en donde dicho grupo funcional Y se selecciona
del grupo que consiste en un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo
hemiacetal y un grupo acetal,
\newpage
en donde el grupo funcional Z_{1} se
selecciona del grupo que consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es
metilo.
En el contexto de la presente invención, la
expresión "hidroxialquil-almidón"
(abreviadamente en lo sucesivo HAS por la expresión inglesa
hydroxyalkyl starch) se refiere a un
derivado de almidón que ha sido sustituido con al menos un grupo
hidroxialquilo. Por tanto, la expresión
hidroxialquil-almidón tal y como se usa en la
presente invención no está limitada a compuestos en donde el resto
de carbohidrato terminal comprende grupos hidroxialquilo R_{1},
R_{2}, y/o R_{3}, tales como los representados, para abreviar,
en la fórmula (I), sino que también se refiere a compuestos en los
cuales al menos un grupo hidroxi presente en cualquier lugar, bien
sea en el resto carbohidrato terminal y/o en la parte restante de la
molécula de almidón, HAS', esta sustituido con un grupo
hidroxialquilo R_{1}, R_{2} ó R_{3}.
En este contexto, el grupo alquilo puede ser un
grupo alquilo lineal o ramificado que puede estar adecuadamente
sustituido. Preferiblemente, el grupo hidroxialquilo contiene 1 a 10
átomos de carbono, más preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono,
más preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono, e incluso más
preferiblemente 2-4 átomos de carbono.
"Hidroxialquil-almidón" por tanto comprende
preferiblemente hidroxietil-almidón,
hidroxipropil-almidón e
hidroxibutil-almidón, en donde son particularmente
preferidos hidroxietil-almidón e
hidroxipropil-almidón.
El hidroxialquil-almidón que
comprende dos o más grupos hidroxialquilo diferentes también está
comprendido en la presente invención.
El al menos un grupo hidroxialquilo contenido en
HAS puede contener dos o más grupos hidroxi. De acuerdo con una
realización preferida, el al menos un grupo hidroxialquilo contenido
en HAS contiene un grupo hidroxi.
La expresión
"hidroxialquil-almidón" también incluye
derivados, en donde el grupo alquilo está mono- o
poli-sustituido. En este contexto, se prefiere que
el grupo alquilo esté sustituido con un halógeno, especialmente
flúor, o con un grupo arilo, siempre que el HAS permanezca soluble
en agua. Además, el grupo hidroxi terminal del grupo hidroxialquilo
puede estar esterificado o eterificado.
Además, en lugar de alquilo, también pueden
usarse grupos alqueno sustituidos o no sustituidos lineales o
ramificados.
El hidroxialquil-almidón es un
derivado de tipo éter de almidón. Además de dichos derivados de tipo
éter, también se pueden usar otros derivados de almidón en el
contexto de la presente invención. Por ejemplo, son útiles
derivados que comprenden grupos hidroxi esterificados. Estos
derivados pueden ser, por ejemplo, derivados de ácidos mono- o
di-carboxílicos no sustituidos con
2-12 átomos de carbono o de sus derivados
sustituidos. Especialmente útiles son los derivados de ácidos
monocarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de
carbono, especialmente derivados de ácido acético. En este
contexto, se prefieren acetil-almidón,
butil-almidón y propil-almidón.
Además, se prefieren derivados de ácidos
dicarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de
carbono.
En el caso de derivados de ácidos
dicarboxílicos, es útil que en el segundo grupo carboxi del ácido
dicarboxílico esté también esterificado. Además, también son
adecuados en el contexto de la presente invención los derivados de
ésteres monoalquílicos de ácidos dicarboxílicos.
Para los ácidos mono- o
di-carboxílicos sustituidos, los grupos de
sustitución pueden ser preferiblemente los mismos que se han
mencionado antes para los residuos de alquilo sustituido.
Los métodos para la esterificación de almidón
son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo. Klemm D. et al,
Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2, 1998,
Whiley-VCH, Weinheim, New York, especialmente el
capítulo 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN
3-527-29489-9).
El hidroxietil-almidón
(abreviadamente en lo sucesivo HES por la expresión inglesa
hydroxyethylyl starch) es el más
preferido para todas las realizaciones de la presente invención.
Por lo tanto, la presente invención también se
refiere a un método como se ha descrito antes en donde el
hidroxialquil-almidón es
hidroxietil-almidón.
El HES está caracterizado principalmente por la
distribución de pesos moleculares y el grado de sustitución. Hay dos
posibilidades de describir el grado de sustitución:
- 1.
- El grado de sustitución (abreviadamente en lo sucesivo DS, por la expresión inglesa degree of substitution) puede ser descrito relativamente a la porción de los monómeros de glucosa sustituidos con respecto a todos los restos de glucosa.
- 2.
- El grado de sustitución puede ser descrito como la "sustitución molar" (abreviadamente en lo sucesivo MS, por la expresión inglesa molar substitution), en donde se describen el número de grupos hidroxietilo por resto de glucosa.
Las soluciones de HES están presentes como
composiciones polidispersas, en donde cada molécula difiere de la
otra con respecto al grado de polimerización, el número y modelo de
sitios de ramificación, y el modelo de sustitución. El HES es por
tanto una mezcla de compuestos con diferente peso molecular.
Consecuentemente, una solución particular de HES se determina por
el peso molecular medio con la ayuda de medios estadísticos. En
este contexto, M_{n} se calcula como la media aritmética
dependiendo del número de moléculas. Alternativamente, M_{w}, la
media ponderal, representa una unidad que depende de la masa del
HES.
En el contexto de la presente invención, el
hidroxietil-almidón puede tener un peso molecular
medio (media ponderal) de 1 a 300 kDa, en donde un peso molecular
medio de 5 a 100 kDa es más preferido. El
hidroxietil-almidón puede exhibir además un grado
de sustitución molar de 0,1 a 0,8 y una relación entre sustitución
C_{2}:C_{6} en el intervalo de 2 a 20 con respecto a los grupos
hidroxietilo.
En lo que respecta a los residuos R_{1},
R_{2} y R_{3} de acuerdo con la fórmula (I) no hay limitaciones
específicas dado que el compuesto (I) permanece capaz de ser hecho
reaccionar con un compuesto (D) o un compuesto (L). De acuerdo con
una realización preferida, R_{1}, R_{2} y R_{3} son
independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo
hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo
que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. El hidrógeno y los grupos
hidroxialquilo que tienen de 1 a 6 átomos de carbono son los
preferidos. El grupo alquilo, arilo, aralquilo y/o alcarilo puede
ser lineal o ramificado y adecuadamente sustituido.
Por lo tanto, la presente invención también se
refiere a un método como se ha descrito anteriormente, en donde
A_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente hidrógeno o un
grupo hidroxialquilo lineal o ramificado de 1 a 6 átomos de
carbono.
carbono.
Por tanto, R_{1}, R_{2} y R_{3} pueden ser
hidroxihexilo, hidroxipentilo, hidroxibutilo, hidroxipropilo, tal
como 1-hidroxipropilo,
2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo,
1-hidroxiisopropilo,
2-hidroxiisopropilo, hidroxietilo, tal como
1-hidroxietilo, 2-hidroxietilo, o
hidroximetilo. El hidrógeno y los grupos hidroxietilo son los
preferidos, siendo el hidrógeno y el grupo
2-hidroxietilo especialmente preferidos.
Por lo tanto, la presente invención también se
refiere a un método como se ha descrito anteriormente, en donde
R_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente hidrógeno o un
grupo 2-hidroxietilo.
De acuerdo con la presente invención el
compuesto (D) o el compuesto (L) se hace reaccionar con el extremo
reductor del hidroxialquil-almidón por la reacción
del grupo funcional Z_{1} con el extremo reductor, en donde el
grupo Z_{1} está contenido en el compuesto (D) o el compuesto
(L).
De acuerdo con una primera realización de la
presente invención, el compuesto (D) o el compuesto (L) se hacen
reaccionar con el extremo reductor del
hidroxialquil-almidón y en donde el extremo reductor
se oxida antes de la reacción.
Esta oxidación del extremo reductor conduce a
hidroxialquil-almidón el cual el grupo carbohidrato
terminal comprende un grupo lactona, o en el cual el grupo
carbohidrato terminal, dependiendo de las condiciones de reacción
química y/o los agentes oxidantes, tiene una estructura no cíclica
que comprende un grupo carboxi.
\newpage
De acuerdo con una realización de la presente
invención, el hidroxialquil-almidón que se oxida en
su extremo reductor está presente como una mezcla de un compuesto
que comprende el grupo lactona y un compuesto que comprende el
grupo carboxi. En la mezcla, los compuestos respectivos pueden estar
presentes en cualquier relación concebible.
Por tanto, la presente invención también se
refiere a un método como se ha descrito anteriormente, en donde el
extremo reductor del hidroxialquil-almidón se oxida
antes de la reacción con el compuesto (D) o el compuesto (L),
teniendo por tanto dicho hidroxialquil-almidón una
estructura de acuerdo con la fórmula (IIa)
\vskip1.000000\baselineskip
y/o de acuerdo con la fórmula
(IIb)
\vskip1.000000\baselineskip
La oxidación del extremo reductor del
hidroxialquil-almidón puede llevarse a cabo de
acuerdo con cada método o combinación de métodos que den como
resultado los compuestos que tienen las estructuras (IIa) y/o (IIb)
antes mencionadas.
Aunque la oxidación puede llevarse a cabo de
acuerdo con todos los métodos adecuados que den como resultado el
extremo reductor oxidado del hidroxialquil-almidón,
se lleva a cabo preferiblemente usando una solución alcalina de yodo
como se describe, por ejemplo, en el documento 19628705 A1.
Por lo tanto, la presente invención también se
refiere a un método como se ha mencionado anteriormente, en donde el
extremo reductor se oxida por una solución alcalina de yodo.
De acuerdo con una segunda realización preferida
de la presente invención, el compuesto (D) o el compuesto (L) se
hacen reaccionar con el extremo reductor del
hidroxialquil-almidón y donde el extremo reductor no
está oxidado antes de la reacción.
Por tanto, la presente invención también se
refiere a un método como se ha mencionado anteriormente, en donde
el extremo reductor del hidroxialquil-almidón no
está oxidado antes de la reacción con el compuesto (D) o el
compuesto (L), teniendo por tanto dicho
hidroxialquil-almidón una estructura de acuerdo con
la fórmula (I)
La formación de un enlace químico entre el
compuesto (L) y el hidroxialquil-almidón o el
compuesto (D) y el hidroxialquil-almidón se consigue
por reacción del grupo funcional Z_{1} con el extremo reductor
opcionalmente oxidado del hidroxialquil-almidón.
De acuerdo con la presente invención, el grupo
funcional Z_{1} se selecciona del grupo que consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es
metilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Es un objeto de la presente invención
proporcionar un derivado de hidroxialquil-almidón
que comprende un grupo funcional X que es capaz de reaccionar con
el grupo funcional Y de un compuesto adicional (M) para dar como
producto de reacción un derivado de
hidroxialquil-almidón que comprende el
hidroxialquil-almidón, el compuesto (L),
opcionalmente el compuesto (D), y el compuesto adicional (M).
Como para el grupo funcional X, no hay
restricciones específicas, siempre que pueda formarse un enlace
químico con el grupo funcional Y que está contenido en el compuesto
adicional (M).
Si el grupo funcional Y se selecciona del grupo
que consiste en un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo
hemiacetal, y un grupo acetal, el grupo funcional X, preferiblemente
comprende la estructura química -NH-.
Por lo tanto, la presente invención también se
refiere a un método como se ha descrito anteriormente, en donde el
grupo funcional Y se selecciona del grupo que consiste en un grupo
aldehído, un grupo ceto, un grupo hemiacetal y un grupo acetal, y el
grupo funcional X comprende la estructura -NH-.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención, el grupo funcional X es un grupo que tiene la
estructura R'-NH- donde R' es hidrógeno o un residuo
de alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo,
alcarilo o cicloalquiloarilo, donde el residuo de cicloalquilo,
arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo
puede estar enlazado directamente al grupo NH o, de acuerdo con otra
realización, puede estar enlazado por un puente de oxígeno al grupo
NH. Los residuos de alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo;
arilcicloalquilo, alcarilo, o cicloalquilarilo pueden estar
adecuadamente sustituidos. Como sustituyentes preferidos, pueden
mencionarse los halógenos, tales como F, Cl ó Br. Los residuos R'
especialmente preferidos son grupos hidrógeno, alquilo y alcoxi, e
incluso más preferidos son hidrógeno y grupos alquilo y alcoxi no
sustituidos.
Entre los grupos alquilo y alcoxi, los grupos
con 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 átomos de C son los preferidos. Más preferidos
son los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, metoxi, etoxi,
propoxi e isopropoxi. Especialmente preferidos son metilo, etilo,
metoxi, etoxi, y se da particular preferencia a metilo o metoxi.
Por tanto, la presente invención también se
refiere a un método tal como se ha descrito anteriormente en donde
R' es hidrógeno o un grupo metilo o metoxi.
De acuerdo con otra realización preferida de la
presente invención, el grupo funcional X tiene la estructura
R'-NH-R''- donde R'' preferiblemente
comprende la unidad estructural -NH- y/o la unidad estructural
-(C=G)- donde G es O ó S, y/o la unidad estructural -SO_{2}-. De
acuerdo con más realizaciones preferidas, el grupo funcional R'' se
selecciona del grupo que consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
y
donde, si G está presente dos
veces, es independientemente O ó
S.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, la presente invención también se
refiere a un método como se ha mencionado anteriormente, en donde el
grupo funcional X se selecciona del grupo que consiste en:
H_{2}N-
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y. si está
presente dos veces, independientemente O ó S y R' es
metilo.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización de la presente
invención, el hidroxialquil-almidón se hace
reaccionar con un compuesto (D) y el producto de reacción
resultante se hace reaccionar además con el compuesto (L), en donde
el enlace químico entre el compuesto (L) y el producto de reacción
se forma por reacción de grupo funcional Z_{2} contenido en el
compuesto (L) y siendo el grupo funcional W contenido en el
compuesto (D) parte del producto de reacción.
Respecto a los grupos funcionales Z_{2} y W,
generalmente no hay restricciones, siempre que se forme el enlace
químico deseado.
Como posibles grupos funcionales W ó Z_{2}, se
han de mencionar entre otros los siguientes grupos funcionales:
- -
- dobles enlaces -C=C- o triples enlaces -C\equivC- o enlaces aromáticos -C-C-;
- -
- el grupo tio o los grupos hidroxi;
- -
- hidrazida de ácido alquilsulfónico, hidrazida de ácido arilsulfónico;
- -
- 1,2-dioles;
- -
- 1,2-aminoalcoholes;
- -
- -el grupo amino -NH_{2} o derivados de los grupos amino que comprende la unidad estructural -NH-, tales como grupos aminoalquilo, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo, o grupos alcarilamino;
- -
- el grupo hidroxilamino -O-NH_{2}, o derivados del grupo hidroxilamino que comprende la unidad estructural -O-NH-, tal como grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxilaralquilamino o grupos hidroxilalcarilamino;
- -
- grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino o grupos alcariloxiamino, comprende cada uno la unidad estructural-NH-O-;
- -
- residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C(=G)-M, en donde G es O ó S, y M es, por ejemplo,
- -
- -OH ó -SH;
- -
- un grupo alcoxi, un grupo ariloxi, un grupo aralquiloxi, o un grupo alcariloxi;
- -
- un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio, o un grupo alcariltio;
- -
- un grupo alquilcarboniloxi, un grupo arilcarboniloxi, un grupo aralquilcarboniloxi, un grupo alcarilcarboniloxi; ésteres activados, tales como ésteres de hidroxilaminas que tienen una estructura de imida, tal como N-hidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural O-N donde N es parte de un compuesto de heteroarilo o, con G = O y Q ausentes, tal como compuestos de ariloxi con un residuo de arilo sustituido, tal como pentafluorofenilo, para-nitrofenilo o triclorofenilo;
\vskip1.000000\baselineskip
en donde Q está ausente o es NH o un
heteroátomo, tal como S ó O;
- -
- -NH-NH_{2}, ó -NH-NH-;
- -
- -NO_{2};
- -
- el grupo nitrilo;
- -
- grupos carbonilo, tales como el grupo aldehído o el grupo ceto;
- -
- el grupo carboxi;
- -
- el grupo -N=C=O o el grupo -N=C=S;
- -
- grupos haluro de vinilo, tal como el grupo yoduro de vinilo o bromuro de vinilo o tri-flato;
- -
- -C=C-H;
- -
- -(C=NH_{2}Cl)-O-alquilo;
- -
- -(C=O)-CH_{2}-Hal en donde Hal es Cl, Br ó I;
- -
- -CH=CH-SO_{2}-;
- -
- un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-;
- -
- el grupo
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
- -
- el grupo
en donde Z_{2} y W,
respectivamente, es un grupo capaz de formar un enlace químico con
uno de los grupos antes
mencionados.
De acuerdo con realizaciones preferidas de la
presente invención, Z_{2} o W, son grupos de la lista de grupos
dada anteriormente.
De acuerdo con una primera realización
especialmente preferida de la presente invención Z_{2} o W es un
grupo tio. En este caso particular, el grupo funcional W se
selecciona preferiblemente del grupo que consiste en:
en donde Hal es Cl, Br ó I,
preferiblemente Br ó
I.
Por tanto, la presente invención también se
refiere a un método como se ha descrito anteriormente, en donde el
grupo funcional W o el grupo funcional Z_{2} es -SH y el grupo
funcional Z_{2} o el grupo funcional W se seleccionan del grupo
que consiste en:
en donde Hal es Cl, Br ó
I.
De acuerdo con una segunda realización
especialmente preferida de la presente invención, Z_{2} o W se
selecciona del grupo que consiste en un éster activado, como se ha
descrito anteriormente, o un grupo carboxi que se transforma
opcionalmente en un éster activado. En este caso particular, el
grupo funcional W o Z_{2}, respectivamente, comprende la
estructura química -NH-.
Por lo tanto, la presente invención también se
refiere a un método como se ha descrito anteriormente en donde
Z_{2} o W se selecciona del grupo que consiste en un éster
activado, como se ha descrito antes, o un grupo carboxi que se
transforma opcionalmente en un éster activado, y el grupo funcional
W o Z_{2}, respectivamente, contiene la estructura química
-NH-.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención, el grupo funcional W o Z_{2} que comprende la
estructura -NH- es un grupo que tiene la estructura
R'-NH- donde R' es hidrógeno o un residuo de
alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo
o cicloalquilarilo, en donde el residuo de cicloalquilo, arilo,
aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo puede estar
enlazado directamente al grupo NH o de acuerdo con otra
realización, puede estar enlazado por un puente de oxígeno al grupo
NH. Los residuos de alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo,
arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo pueden estar
adecuadamente sustituidos. Como sustituyentes preferidos, pueden
mencionarse halógenos, tales como F, Cl ó Br. Los residuos
especialmente preferidos residuos R' son hidrógeno grupos alquilo y
alcoxi, e incluso más preferidos son hidrógeno y grupos alquilo y
alcoxi no sustituidos.
Entre los grupos alquilo y alcoxi, los grupos
con 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 átomos de C son los preferidos. Los grupos
más preferidos son metilo, etilo, propilo, isopropilo, metoxi,
etoxi, propoxi e isopropoxi. Son especialmente preferidos metilo,
etilo, metoxi, etoxi y se da preferencia particular a metilo o
metoxi.
Por lo tanto, la presente invención también se
refiere a un método como se ha descrito anteriormente en donde W o
Z_{2} se selecciona del grupo que consiste en un éster activado,
como se ha descrito antes, o un grupo carboxi que se transforma
opcionalmente en un éster activado, y el grupo funcional W o
Z_{2}, respectivamente, es R'-NH- en donde R' es
hidrógeno o un grupo metilo o metoxi.
De acuerdo con otra realización preferida de la
presente invención, el grupo funcional W o Z_{2} tiene la
estructura R'-NH-R''- donde R''
comprende preferiblemente la unidad estructural -NH- y/o la unidad
estructural -(C=G)-, en donde G es O ó S, y/o la unidad estructural
-SO_{2}-. De acuerdo con más realizaciones preferidas, el grupo
funcional R'' se selecciona del grupo que consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
y
donde, si G está presente dos
veces, es independientemente O ó
S.
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, la presente invención también se
refiere a un método como se ha mencionado anteriormente, en donde el
grupo funcional W o Z_{2} se selecciona del grupo que consiste
en:
H_{2}N-
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es
metilo.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con todavía otro aspecto de la
presente invención, el al menos un grupo funcional X, Z_{2} y/o W
puede ser un grupo que no es capaz de reaccionar directamente con un
compuesto adicional dado, pero que pueda estar químicamente
modificado para ser capaz de reaccionar de modo deseado.
Como un ejemplo de un grupo funcional para ser
modificado antes de la reacción con un compuesto adicional, puede
mencionarse un 1,2-amino-alcohol o
un 1,2-diol que se modifica, por ejemplo, por
oxidación para formar un grupo aldehído o un grupo ceto.
Otro ejemplo para un grupo funcional que ha de
ser modificado antes de la reacción con un compuesto adicional es un
grupo -NH_{2} que se modifica por la reacción con, por ejemplo, un
compuesto de acuerdo con la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
para dar una estructura de la
fórmula
siguiente:
que es, por ejemplo, reactiva con
un grupo
tio.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro ejemplo para un grupo funcional que ha de
ser modificado antes de la reacción con un compuesto adicional es un
grupo -NH_{2} que se modifica por la reacción con, por ejemplo, un
compuesto de acuerdo con la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
para dar una estructura de la
fórmula
siguiente:
que, por ejemplo, es reactiva con
un grupo
tio.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro ejemplo más para un grupo funcional que ha
de ser modificado antes de la reacción con un compuesto adicional es
un grupo amino que se hace reaccionar con anhídrido bromoacético o
yodoacetato de N-succinimidilo.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención, un compuesto (L) tiene la estructura
Z_{1}-L'-X o
Z_{2}-L'-X, siendo L' un residuo
orgánico que separa los grupos funcionales y que está opcionalmente
ausente dependiendo la estructura de sí o no un compuesto (D) se
hace reaccionar con el hidroxialquil-almidón.
De acuerdo con una primera realización
preferida, no está implicado un compuesto (D) e Y se selecciona del
grupo que consiste en un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo
hemiacetal y un grupo acetal.
\newpage
En este caso particular, se prefieren, entre
otros, como compuesto (L) que tienen la estructura
Z_{1}-L'-X, en donde L' está
ausente, los siguientes compuestos:
H_{2}N-NH_{2}
o
Si, en este caso particular, L' no está ausente,
L' puede ser un grupo alquilo lineal o ramificado o cicloalquilo o
arilo o aralquilo o arilcicloalquilo o alcarilo o cicloalquilarilo,
en donde L' puede comprender al menos un heteroátomo, tal como N,
O, S, y en donde L' puede estar adecuadamente sustituido. El tamaño
del grupo L' puede adaptarse a las necesidades específicas.
Generalmente, el grupo separador L' tiene generalmente de 1 a 60,
preferiblemente de 1 a 40, más preferiblemente de 1 a 20, más
preferiblemente de 1 a 10, más preferiblemente de 1 a 6 y especial
y preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono. Si están presentes
heteroátomos, el grupo separador comprende generalmente de 1 a 20,
preferiblemente de 1 a 8 y especialmente preferiblemente de 1 a 4
heteroátomos. De acuerdo con realizaciones particularmente
preferidas de la presente invención, el grupo separador L'
comprende 1 a 4 átomos de oxígeno. El grupo separador L' puede
comprender una cadena de alquilo opcionalmente ramificada o un
grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tiene, por ejemplo, de 5 a 7
átomos de carbono, o ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo, en
donde la parte de alquilo puede ser un grupo alquilo lineal y/o
cíclico. De acuerdo con una realización incluso más preferida, el
grupo separador es una cadena de alquilo de 1 a 20, preferiblemente
de 1 a 8, más preferiblemente de 1 a 6, más preferiblemente de 1 a 4
y especial y preferiblemente de 2 a 4 átomos de carbono. En el caso
de que estén presentes heteroátomos, es particularmente preferida
una cadena que comprende 1 a 4 átomos de oxígeno.
Como para este caso particular, en donde Y se
selecciona del grupo que consiste en un grupo aldehído, un grupo
ceto, un grupo hemiacetal y un grupo acetal, entre otros, son
preferidos como compuesto (L) que tiene la estructura
Z_{1}-L'-X donde L' no está
ausente, los compuestos siguientes:
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una segunda realización
preferida, está implicado un compuesto (D).
De acuerdo con una realización preferida
adicional de la presente invención, un compuesto (D) tiene la
estructura Z_{1}-D'-W, siendo D'
un residuo orgánico que separa los grupos funcionales y que está
opcionalmente ausente.
En este caso particular, se prefieren, entre
otros, como compuesto (D) que tienen la estructura
Z_{1}-D'-W, en donde D' está
ausente, los compuestos siguientes:
H_{2}N-NH_{2}
o
Si, en este caso particular, D' no está ausente,
D' puede ser un grupo alquilo lineal o ramificado o cicloalquilo o
arilo o aralquilo o arilcicloalquilo o alcarilo o cicloalquilarilo,
en donde D' puede comprender al menos un heteroátomo, tal como N,
O, S, y en donde D' puede estar adecuadamente sustituido. El tamaño
del grupo D' puede adaptarse a las necesidades específicas.
Generalmente, el grupo separador D' tiene de 1 a 60, preferiblemente
de 1 a 40, más preferiblemente de 1 a 20, más preferiblemente de 1
a 10, más preferiblemente de 1 a 6 y especialmente preferiblemente
de 1 a 4 átomos de carbono. Si están presentes heteroátomos, el
grupo separador comprende generalmente de 1 a 20, preferiblemente
de 1 a 8 y especial y preferiblemente de 1 a 4 heteroátomos. De
acuerdo con realizaciones particularmente preferidas de la presente
invención, el grupo separador D' comprende 1 a 4 átomos de oxígeno.
El grupo separador D' puede comprender una cadena de alquilo
opcionalmente ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo
que tiene, por ejemplo, de 5 a 7 átomos de carbono, o ser un grupo
aralquilo, un grupo alcarilo donde la parte de alquilo puede ser un
grupo alquilo lineal y/o cíclico. De acuerdo con una realización
incluso más preferida, el grupo separador es una cadena de alquilo
de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 8, más preferiblemente de 1 a 6,
más preferiblemente de 1 a 4 y especial y preferiblemente de 2 a 4
átomos de carbono. En el caso de que estén presentes heteroátomos,
es particularmente preferida una cadena que comprende 1 a 4 átomos
de oxígeno.
Como para este caso particular, los compuestos
(D) preferidos que tienen la estructura
Z_{1}-D'-W en donde D' no está
ausente son:
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Dependiendo de la naturaleza del grupo funcional
W contenido en el compuesto (D) y el grupo funcional Y, pueden
usarse compuestos específicos (L) de acuerdo con necesidades
específicas.
Si, por ejemplo, el grupo funcional Y se
selecciona del grupo que consiste en un grupo aldehído, un grupo
ceto, un grupo hemiacetal y un grupo acetal, y el grupo funcional W
es un grupo tio, se prefieren, entre otros, los siguientes tipos de
compuestos (L):
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 1 que se encuentra al final de la
presente descripción, se presentan en una lista algunos ejemplos
preferidos de compuestos (L) de acuerdo con los tipos dados en la
lista anterior.
Los grupos separadores L' y/o D' pueden estar
adecuadamente sustituidos. Los sustituyentes preferidos son, por
ejemplo, halógenos, tales como F, Cl, Br ó I.
Los grupos separadores L' y/o D' pueden
comprender uno o más sitios de escisión, tales como:
-S-S-
que permiten una fácil escisión de
un compuesto resultante en un sitio
predeterminado.
Los ejemplos especialmente preferidos de
compuestos (L) que pueden estar enlazados al
hidroxialquil-almidón, en donde el derivado de
hidroxialquil-almidón resultante comprende el grupo
funcional X capaz de ser hecho reaccionar con un grupo funcional Y
contenido en un compuesto adicional (M) y en donde dicho grupo
funcional Y se selecciona del grupo que consiste en un grupo
aldehído, un grupo ceto, un grupo hemiacetal, un grupo acetal,
son:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
siendo los compuestos
(L):
los particularmente
preferidos.
De acuerdo con una primera realización preferida
de la presente invención, un compuesto (D) o un compuesto (L) se
hace reaccionar con el extremo reductor del
hidroxialquil-almidón que no está oxidado.
Dependiendo de las condiciones de reacción, tal
como el disolvente o mezcla de disolventes usada, la temperatura,
presión o pH de la mezcla de reacción, el producto de la reacción de
un compuesto (D) o un compuesto (L) se hace reaccionar con el
extremo reductor del hidroxialquil-almidón que no
está oxidado puede tener diferentes constituciones.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención, esta reacción se lleva a cabo en un sistema
acuoso.
La expresión "sistema acuoso" tal como se
usa en el contexto de la presente invención se refiere a un
disolvente o una mezcla de disolventes que comprende agua en el
intervalo de al menos 10% en peso, preferiblemente al menos 50% en
peso, más preferiblemente al menos 80% en peso, incluso más
preferiblemente al menos 90% en peso o hasta 100% en peso, basado
en el peso de los disolventes empleados. Como disolventes
adicionales, pueden mencionarse disolventes, tales como DMSO, DMF,
etanol o metanol.
De acuerdo con una segunda realización preferida
de la presente invención, un compuesto (D) o un compuesto (L) se
hacen reaccionar con el extremo reductor del
hidroxialquil-almidón que está oxidado.
En este caso, se usan disolventes
preferiblemente polares y apróticos que también pueden contener una
cierta cantidad de agua, tal como hasta 10% en peso. Los
disolventes apróticos preferidos son, entre otros, DMSO ó DMF. Un
ejemplo de un intervalo de temperatura de reacción preferido es
desde la temperatura ambiente 20 a 65ºC, y los tiempos de reacción
están generalmente en el intervalo de 1 minuto a varias horas y
hasta varios días, dependiendo de la naturaleza química del grupo
funcional que se hace reaccionar con el extremo reductor oxidado del
hidroxialquil-almidón y las otras condiciones de
reacción.
En lo que respecta a las reacciones del
hidroxialquil-almidón con el compuesto (D) y/o el
compuesto (L), así como con el compuesto (M), todas las secuencias
posibles están comprendidas en la presente invención.
Una realización preferida de la presente
invención se refiere a un método como se ha descrito antes, en donde
el hidroxialquil-almidón se hace reaccionar con un
compuesto (L) por la reacción del grupo funcional Z_{1} con el
extremo reductor del hidroxialquil-almidón
opcionalmente oxidado y el producto de reacción resultante se hace
reaccionar con un compuesto adicional (M) por la reacción del grupo
funcional X contenido en el compuesto (L) con el grupo funcional Y
contenido en el compuesto (M).
Otra realización de la presente invención se
refiere a un método como se ha descrito antes, en donde el
hidroxialquil-almidón se hace reaccionar con un
compuesto (L) por la reacción del grupo funcional Z_{1} con el
extremo reductor del hidroxialquil-almidón
opcionalmente oxidado, en donde el compuesto (L), antes de la
reacción con el hidroxialquil-almidón, se hace
reaccionar con un compuesto adicional (M) por la reacción de grupo
funcional X contenido en el compuesto (L) con el grupo funcional Y
contenido en el compuesto (M).
Incluso otra realización de la presente
invención se refiere a un método como se ha descrito antes, en donde
el hidroxialquil-almidón se hace reaccionar con un
compuesto (D) por la reacción del grupo funcional Z_{1} contenido
en el compuesto (D), con el extremo reductor del
hidroxialquil-almidón opcionalmente oxidado para
dar un primer derivado del hidroxialquil-almidón, y
en donde el primer derivado del
hidroxialquil-almidón se hace reaccionar con un
compuesto (L) por la reacción de grupo funcional Z_{2} contenido
en el compuesto (L) con el grupo funcional W contenido en el
compuesto (D) para dar un segundo derivado del
hidroxialquil-almidón.
Otra realización más de la presente invención
se refiere a al método antes citado, en donde el segundo derivado
del hidroxialquil-almidón se hace reaccionar con un
compuesto adicional (M) por la reacción de grupo funcional X
contenido en el compuesto (L) con el grupo funcional Y contenido en
el compuesto (M).
Incluso todavía otra realización de la presente
invención se refiere a un método como se ha descrito antes, en
donde el hidroxialquil-almidón se hace reaccionar
con un compuesto (D) por la reacción de grupo funcional Z_{1}
contenido en el compuesto (D) con el extremo reductor del
hidroxialquil-almidón opcionalmente oxidado para
dar un primer derivado del hidroxialquil-almidón, y
en donde el primer derivado del
hidroxialquil-almidón se hace reaccionar, por la
reacción del grupo funcional W, contenido en el compuesto (D), y el
grupo funcional Z_{2}, contenido en el compuesto (L), con el
compuesto (L), en donde el compuesto (L), antes de la reacción con
el primer derivado del hidroxialquil-almidón, se
hace reaccionar con un compuesto adicional (M) por la reacción de
grupo funcional X contenido en el compuesto (L) con el grupo
funcional Y contenido en el compuesto (M).
En lo que respecta a las condiciones de reacción
de cada una de las etapas de reacción antes descritas, todos los
parámetros, tales como temperatura, presión, pH, o disolvente o
mezcla de disolventes pueden adaptarse a las necesidades
específicas y la naturaleza química de los compuestos que han de
hacerse reaccionar.
De acuerdo con una realización especialmente
preferida de la presente invención, se usa agua como disolvente,
bien sea sola o en combinación con al menos otro disolvente. Como al
menos otro disolvente puede mencionarse DMSO, DMF, metanol y
etanol. Los disolventes preferidos distintos del agua son DMSO, DMF,
metanol y etanol. En esta realización, el
hidroxilalquil-almidón se hace reaccionar
preferiblemente por el extremo reductor no oxidado.
Si el hidroxialquil-almidón se
hace reaccionar con el compuesto (D) o el compuesto (L) en un medio
acuoso y el compuesto (D) o el compuesto (L) es una hidroxilamina o
una hidrazida, la temperatura de la reacción está preferiblemente
en el intervalo de 5 a 45ºC, más preferiblemente en el intervalo de
10 a 30ºC y especial y preferiblemente en el intervalo de 15 a
25ºC.
Si el hidroxialquil-almidón se
hace reaccionar con el compuesto (D) o el compuesto (L) en un medio
acuoso y la reacción es una aminación reductora, la temperatura
está preferiblemente en el intervalo de hasta 100ºC, más
preferiblemente en el intervalo de 70 a 90ºC y especial y
preferiblemente en el intervalo de 75 a 85ºC.
Durante el curso de la reacción la temperatura
puede variar, preferiblemente en los intervalos dados anteriormente
o mantenerse esencialmente constante.
El tiempo de reacción para la reacción del
hidroxialquil-almidón con el compuesto (D) o el
compuesto (L) puede adaptarse a las necesidades y está generalmente
en el intervalo 1 hora a 7 días.
En el caso de que el compuesto (D) o el
compuesto (L) sea una hidroxilamina o una hidrazida, el tiempo de
reacción está preferiblemente en el intervalo de 1 hora a 3 días y
más preferiblemente de 2 horas a 48 horas.
En el caso de que la reacción del
hidroxialquil-almidón con el compuesto (D) o el
compuesto (L) sea una aminación reductora, el tiempo de reacción
está preferiblemente en el intervalo de 2 horas a 7 días.
El valor del pH para la reacción de
hidroxialquil-almidón con el compuesto (D) o el
compuesto (L) puede adaptarse a las necesidades específicas, tal
como la naturaleza química de los reaccionantes.
En el caso de que el compuesto (D) o el
compuesto (L) sean una hidroxilamina o una hidrazida, el valor del
pH está preferiblemente en el intervalo de 4,5 a 6,5.
En el caso de que la reacción del
hidroxialquil-almidón con el compuesto (D) o el
compuesto (L) sea una aminación reductora, el valor del pH está
preferiblemente en el intervalo de 8 a 12.
El valor del pH adecuado de la mezcla de
reacción puede ajustarse, para cada etapa de reacción, añadiendo al
menos un tampón adecuado. Entre los tampones preferidos se pueden
mencionar el tampón de acetato sódico o los tampones de fosfato o
borato.
Si es necesario, el al menos un grupo funcional
X puede estar protegido con al menos un grupo protector adecuado
antes de la reacción del hidroxialquil-almidón con
el compuesto (L) o antes de la reacción del compuesto (D) con el
compuesto (L) o antes de la reacción del compuesto (L) con el
producto de reacción del hidroxialquil-almidón con
el compuesto (D). A este respecto, son posibles todos los grupos
protectores concebibles que impidan que el compuesto protegido (L)
reaccione por al menos un grupo funcional X. Por tanto, el grupo
protector puede elegirse dependiendo de la naturaleza química del
grupo funcional X que ha de protegerse, de, por ejemplo, el
disolvente en el que se lleva a cabo la reacción o el pH de la
mezcla de reacción. Los grupos protectores preferidos son, entre
otros, el grupo benciloxicarbonilo, el grupo terc.butoxicarbonilo,
el grupo metoxifenilo, el grupo 2,4-dimetoxifenilo,
los grupos triarilmetilo, el grupo tritilo, el grupo
monometoxitritilo, el grupo dimetoxitritilo, el grupo
monometiltritilo, el grupo dimetiltritilo, el grupo trifluoracetilo,
compuestos de ftalimino, compuestos de
2-(trialquilosilil)etoxicarbonilo, Fmoc, el grupo
terc.butilo, o grupos trialquilsililo.
Si están presentes dos o más diferentes grupos
funcionales X en el compuesto (L), al menos un grupo puede estar
protegido, mientras que al menos otro grupo puede dejarse sin
proteger.
Después de la reacción del compuesto (L), el al
menos un grupo protector puede dejarse en el producto de reacción o
eliminarse por métodos adecuados, tal como métodos convencionales
conocidos por los expertos en la técnica. Si dos diferentes grupos
funcionales X están protegidos por grupos protectores adecuados, es
posible eliminar al menos un grupo protector de modo que al menos
un grupo funcional X esté disponible para la reacción posterior con
al menos un compuesto adicional (M), y deje al menos el otro grupo
funcional protegido hasta que el producto de reacción que comprende
el compuesto (L) se haga reaccionar con el compuesto adicional (M).
Posteriormente, puede eliminarse el grupo protector del grupo
funcional todavía protegido para dejar disponible el grupo funcional
restante X para la reacción con todavía un compuesto adicional
(M).
El uso de al menos un grupo protector puede ser
importante para impedir la reacción que da como resultado un
derivado del hidroxialquil-almidón que comprende un
compuesto (L) o el compuesto (D) que se han hecho reaccionar con
dos o más moléculas de hidroxialquil-almidón, es
decir, un compuesto (L) ó (D) sustituido con múltiple HAS. Sin
embargo, el mismo resultado puede conseguirse haciendo reaccionar el
hidroxialquil-almidón con un exceso de compuesto
(L) ó (D). Si en el proceso de la presente invención se usa una
cantidad en exceso del compuesto (L) o (D), la relación molar de
compuesto (L) ó (D) a hidroxialquil-almidón está
preferiblemente en el intervalo de 2 a 100.
Una vez que se forma el producto de reacción de
la etapa de reacción respectiva, que se ha descrito antes, puede
aislarse de la mezcla de reacción por al menos un método adecuado.
Si es necesario, el producto de reacción puede ser precipitado antes
del aislamiento por al menos un método adecuado.
Si el producto de reacción se precipita
primeramente, es posible, por ejemplo, poner en contacto la mezcla
de reacción con al menos un disolvente o mezcla de disolventes
distinto del disolvente o mezcla de disolventes presente en la
mezcla de reacción a temperaturas adecuadas. De acuerdo con una
realización particularmente preferida de la presente invención
cuando se usa un sistema acuoso como disolvente, la mezcla de
reacción se pone en contacto con una mezcla de etanol y acetona,
preferiblemente una mezcla 1:1, que indica volúmenes iguales de
dichos compuestos, a una temperatura, preferiblemente en el
intervalo de -20 a +50ºC y especialmente preferiblemente en el
intervalo de 0 a 25ºC.
El aislamiento del producto de reacción puede
llevarse a cabo por un proceso adecuado que puede comprender una o
más etapas. De acuerdo con una realización preferida de la presente
invención, el producto de reacción se separa primeramente de la
mezcla de reacción con, por ejemplo, la mezcla
etanol-acetona, por un método adecuado, tal como
centrifugación o filtración. En una segunda etapa, el producto de
reacción separado puede someterse a un tratamiento adicional, tal
como un tratamiento posterior como diálisis, filtración centrífuga
o filtración a presión, cromatografía de cambio iónico,
cromatografía de líquidos de alta resolución (abreviadamente en lo
sucesivo HPLC por la expresión inglesa High Performance Liquid
Chromatography), cromatografía de líquidos a presión media
(abreviadamente en lo sucesivo MPLC por la expresión inglesa
Medium Pressure Liquid Chromatography), filtración por gel
y/o liofilización. De acuerdo con una realización aún más preferida,
el producto de reacción separado se dializa primeramente,
preferiblemente frente a agua, y luego se liofiliza hasta que el
contenido de disolvente del producto de reacción sea suficientemente
bajo de acuerdo con las especificaciones deseadas del producto. La
liofilización puede llevarse a cabo a una temperatura de 20 a 35ºC,
preferiblemente de 25 a 30ºC.
De acuerdo con realizaciones preferidas de la
presente invención, el derivado del
hidroxialquil-almidón que comprende el
hidroxialquil-almidón y el compuesto (L) o que
comprende el hidroxialquil-almidón, el compuesto
(D) y el compuesto (L) se hace reaccionar más con el compuesto (M)
que comprende al menos un grupo funcional Y.
Generalmente, no hay limitaciones respecto al
compuesto (M). Preferiblemente, se usa un polipéptido como compuesto
(M) en el contexto de la presente invención. Sin embargo, también
son posibles otros compuestos (M), bien sean polímeros u oligómeros
o compuestos monomoleculares o mezclas de dos o más de ellos.
El término "polipéptido" tal como se usa en
el contexto de la presente invención se refiere a un compuesto que
comprende al menos 2 aminoácidos que están enlazados por un enlace
peptídico, es decir, un enlace con estructura
-(C=O)-NH-. El polipéptido puede ser compuesto
natural o un polipéptido que no existe en la naturaleza,
comprendiendo este último naturalmente aminoácidos naturales y/o al
menos un aminoácido no natural. La cadena principal del
polipéptido, puede estar además sustituida con al menos un
sustituyente adecuado, que tiene por tanto al menos una cadena
lateral. El al menos un grupo funcional Y puede ser parte de la
cadenas principal del polipéptido o de al menos un sustituyente de
la cadena principal en donde son posibles realizaciones que
comprenden al menos un grupo funcional que es parte de la cadena
principal del polipéptido y al menos un grupo funcional que es
parte de al menos un sustituyente de la cadena principal del
polipéptido.
En lo que respecta al polipéptido no existen
restricciones, dado que el polipéptido comprende al menos un grupo
funcional Y. Dicho grupo funcional Y puede estar enlazado
directamente a la cadena principal del polipéptido o ser parte de
una cadena lateral de la cadena principal. Bien sea la cadena
lateral o bien el grupo funcional Y o ambos puede ser parte de un
polipéptido natural o puede estar introducido en un polipéptido
natural o en un polipéptido que, al menos parcialmente, no existe
en la naturaleza, antes de la reacción con el grupo funcional X.
Además, el polipéptido puede ser, al menos
parcialmente, de cualquier fuente humana o animal. En una
realización preferida, el polipéptido es de origen humano.
El polipéptido puede ser una citoquina,
especialmente eritropoyetina, una antitrombina (AT), tal como AT
III, una interleuquina, especialmente
interleuquina-2, interferón-beta
(IFN-beta), IFN-alfa, factor
estimulante de colonias de granulocitos (abreviadamente en lo
sucesivo G-CSF por la expresión inglesa
Granulocyte Colony Stimulating Factor), factor estimulantes
de colonias (CSF), interleuquina-6
(IL-6) y anticuerpos terapéuticos.
De acuerdo con una realización preferida, el
polipéptido es una antitrombina (AT), preferiblemente AT III (Levy
JH, Weisinger A, Ziomek CA, Echelard Y, Recombinant Antithrombin:
Production and Role in Cardiovascular Disorder, Seminars in
Thrombosis and Hemostasis 27, 4, (2001) 405-416;
Edmunds T, Van Patten SM, Pollock J, Hanson E, Bernasconi R,
Higgins E, Manavalan P, Ziomek C, Meade H, McPherson J, Cole ES,
Transgenically Produced Human Antithrombin: Structural and
Functional Comparison to Human Plasma-Derived
Antithrombin, Blood 91, 12 (1998) 4661-4671,
Minnema MC, Chang ACK, Jansen PM, Lubbers YTP, Pratt BM, Whittaker
BG, Taylor FB, Hack CE, Friedman B, Recombinant human
antithrombin III improves survival and attenuates inflammatory
responses in baboons lethally challenged with Escherichia coli,
Blood 95, 4, (2000) 1117-1123; Van Patten SM,
Hanson EH, Bernasconi R, Zhang K, Manavaln P, Cole ES, McPherson
JM, Edmunds T, Oxidation of Metionine Residues in Antithrombin,
J. Biol. Chemistry 274, 15, (1999)
10268-10276).
De acuerdo con otra realización preferida, el
polipéptido es IFN-beta humano, en particular
IFN-beta 1a (véase, Avonex®, REBIF®) y
IFN-beta 1b (cf. BETASERON®).
Un polipéptido más preferido es factor
estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF)
humano. Véase, por ejemplo, Nagata et al., The chromosomal gene
structure and two mRNAs for human granulocyte
colony-stimulating factor, EMBO J. 5:
575-581, 1986; Souza et al., Recombinant human
granulocyte colony-stimulating factor: Effects on
normal and leukemic myeloid cells, Science 232 (1986)
61-65; y Herman et al., Characterization,
formulation, and stability of Neupogen® (Filgrastim), a recombinant
human granulocyte-colony stimulating factor, in:
Formulation, characterization, and stability of protein drugs,
Rodney Pearlman and Y. John Wang, eds., Plenum Pres, New York, 1996,
303-328.
Si se usa una mezcla de al menos dos
polipéptidos diferentes, los al menos dos polipéptidos pueden
diferir, por ejemplo, en el peso molecular, el número y/o secuencia
de aminoácidos, el número y/o naturaleza química de los
sustituyentes o el número de cadenas polipeptídicas enlazadas por
enlaces químicos adecuados, tal como puentes disulfuro.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención, el producto de reacción del
hidroxialquil-almidón y el compuesto (L) o el
producto de reacción del hidroxialquil-almidón y el
compuesto (D) que se hace reaccionar adicionalmente con el
compuesto (L) se aísla, preferiblemente de acuerdo con al menos uno
de los procesos anteriormente mencionado, y luego se hace
reaccionar con un polipéptido que tiene al menos un grupo funcional
Y. De acuerdo con una realización preferida de la presente
invención, el grupo funcional Y está contenido en un resto de
carbohidrato del polipéptido.
En el contexto de la presente invención, la
expresión "resto de carbohidrato" se refiere a hidroxialdehídos
o hidroxicetonas, así como a sus modificaciones químicas (véase
Römpp Chemielexicon, Thieme Verlag Stuttgart, Alemania, 9th
edición 1990, Volume 9, pp. 2281-2285 y la
literatura científica citada en dicho documento). Además también se
refiere a derivados de restos de carbohidratos naturales como
glucosa, galactosa, manosa, ácido siálico y similares. La expresión
también incluye restos de carbohidrato naturales químicamente
oxidados. La estructura del resto de carbohidrato oxidado puede ser
cíclica o lineal.
El resto de carbohidrato puede estar enlazado
directamente a la cadena principal del polipéptido. Preferiblemente,
el resto de carbohidrato es parte de una cadena lateral de
carbohidrato. Más preferiblemente, el resto de carbohidrato es el
resto terminal de la cadena lateral de carbohidrato.
En incluso una realización más preferida, el
resto de carbohidrato es un residuo de galactosa de la cadena
lateral del carbohidrato, preferiblemente el residuo terminal de
galactosa de la cadena lateral de carbohidrato. Este residuo de
galactosa puede ser hecho disponible por la reacción con el grupo
funcional X contenido en el producto de reacción del
hidroxialquil-almidón y el compuesto (L) o el
producto de reacción del hidroxialquil-almidón y el
compuesto (D) que se hace reaccionar adicionalmente con el compuesto
(L), por eliminación de los ácidos siálicos terminales, seguido por
oxidación, como se describe más adelante.
En una realización aún más preferida, el
producto de reacción del hidroxialquil-almidón y el
compuesto (L) o el producto de reacción del
hidroxialquil-almidón y el compuesto (D) que se hace
reaccionar adicionalmente con el compuesto (L) está enlazado a un
residuo de ácido siálico de las cadenas laterales del carbohidrato,
preferiblemente el residuo de ácido siálico terminal de la cadena
lateral de carbohidrato.
La oxidación de los restos de carbohidrato
terminal puede realizarse bien sea químicamente o
enzimáticamente.
Los métodos para la oxidación química de los
restos de carbohidrato de los polipéptidos son conocidos en la
técnica e incluyen el tratamiento con peryodato (Chamow et
al., 1992, J. Biol. Chem., 267,
15916-15922).
La oxidación química, en principio, es posible
para oxidar cualquier resto de carbohidrato, que esté terminalmente
posicionado o no. Sin embargo, eligiendo condiciones suaves
(peryodato 1 mM, 0ºC en contraste con condiciones fuertes:
peryodato 10 mM, 1 hora a temperatura ambiente), es posible oxidar
preferiblemente el ácido siálico terminal de una cadena lateral de
carbohidrato.
Alternativamente, el resto de carbohidrato puede
ser oxidado enzimáticamente. Las enzimas para la oxidación de los
restos de carbohidrato individuales son conocidas en la técnica, por
ejemplo, en el caso de galactosa la enzima es la
galactosa-oxidasa. Si se pretende oxidar restos de
galactosa terminales, será finalmente necesario eliminar los ácidos
siálicos terminales (parcial o completamente) si el polipéptido ha
sido producido en células capaces de unir ácidos siálicos a cadenas
de carbohidrato, por ejemplo, en células de mamíferos o en células
que han sido modificadas genéticamente para ser capaces de unir
ácidos siálicos a cadenas de carbohidrato. Los métodos químicos o
enzimáticos para la eliminación de ácidos siálicos son conocidos en
la técnica (Chaplin and Kennedy (eds.), 1996, Carbohydrate
Analysis: A practical Approach, especialmente el Chapter
5, Montreuill, Glycoproteins, pp. 175-177;
IRL Press, Practical Approach Series (ISBN
0-947946-44-3)).
Como polipéptido especialmente preferido se usa,
eritropoyetina (EPO).
Por lo tanto, la presente invención también se
refiere a un método como se ha descrito antes, en donde el
polipéptido es eritropoyetina.
La EPO puede ser humana (véase, por ejemplo.
Inoue, Wada, Takeuchi, 1994; An improved method for the
purification of human erythropoietin with high in vivo
activity from the urine of anemic patients, Biol. Pharm. Bull.
17(2), 180-4; Miyake, Kung, Goldwaser, 1977,
Purification of human erythropoietin, J. Biol. Chem.,
252(15), 5558-64) o de otra fuente de
mamífero y puede obtenerse por purificación de fuentes naturales
como riñón humano, hígado embriónico humano o animal,
preferiblemente riñón de mono. Además, la expresión
"eritropoyetina" o "EPO" abarca también una variante de
EPO, en donde uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1 a 25,
preferiblemente 1 a 10, más preferido 1 a 5, los más preferido 1 ó
2) han sido cambiados por otro aminoácido y que exhibe actividad
eritropoyética (véase por ejemplo, el documento EP 640619 B1). La
medida de la actividad eritropoyética se describe en la técnica
(para medición de la actividad in vitro véase por ejemplo,
Fibi et al., 1991, Blood, 77, pp. 1203 y siguientes;
Kitamura et al, 1989, J. Cell Phys., 140,
323-334; para medición de actividad de EPO in
vivo véase Ph. Eur. 2001, 911-917; Ph.
Eur. 2000, 1316 Erythropoietini solutio concentrata,
780-785; European Pharmacopoeia (1996/2000);
European Pharmacopoeia, 1996, Erythropoietin concentrated
solution, Pharmaeuropa., 8, 371-377; Fibi,
Hermentin, Pauly, Lauffer, Zettimeisi., 1995, N- and
O-glycosylation muteins of recombinant human
erythropoietin secreted from BHK-21 cells,
Blood, 85(5), 1229-36; (EPO y formas
modificadas de EPO se inyectaron en ratones del National Medical
Research Institute (NMRI) hembras (cantidades iguales de
proteína 50 ng/ratón) se tomaron muestras de sangre en los días 1,
2 y 3 y en el día 4 se determinaron los reticulocitos). Otras
publicaciones donde se encuentran ensayos para la medición de la
actividad de EPO son Barbone, Aparicio, Anderson, Natarajan,
Ritchie, 1994, Reticulocytes measurements as a bioassay for
erythropoietin, J. Pharm. Biomed. Anal., 12(4),
515-22; Bowen, Culligan, Beguin, Kendall, Villis,
1994, Estimation of effective and total erythropoiesis in
myelodysplasia using serum transferrin receptor and erythropoietin
concentrations, with automated reticulocyte parameters,
Leukemi, 8(1), 151-5; Delorme, Lorenzini,
Giffin, Martin, Jacobsen, Boone, Elliott, 1992, Role of
glycosylation on the secretion and biological activity of
erythropoietin, Biochemistry, 31(41),
9871-6; Higuchi, Oheda, Kuboniwa, Tomonoh,
Shimonaca, Ochi, 1992; Role of sugar chains in the expression of
the biological activity of human erythropoietin, J. Biol.
Chem., 267(11), 7703-9; Yamaguchi, Akai,
Kawanishi, Ueda, Masuda, Sasaki, 1991, Effects of site directed
removal of N-glycosylation sites in human
erythropoietin on its production and biological properties, J.
Biol. Chem., 266(30), 20434-9; Takeuchi,
Inoue, Strickland, Kubota, Wada, Shimizu, Hoshi, Kozutsumi,
Takasaki, Cobata, 1989, Relationship between sugar chain
structure and biological activity of recombinant human
erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 85(20), 7819-22; Kurtz,
Eckardt, 1989, Assay methods for eryhtropoietin, Nephron.,
51(1), 11-4 (German); Zucali, Sulkowski,
1985, Purification of human urinary erythropoietin on
controlled-pore glass and silicic acid, Exp.
Hematol., 13(3), 833-7; Krystal, 1983,
Physical and biological characterization of erythroblast
enhancing factor (EEF), a late acting erythropoietic
stimulator in serum distinct from erythropoietin, Exp. Hematol.,
11(1), 18-31.
Preferiblemente, la EPO se produce
recombinantemente. Esto incluye la producción en células
eucarióticas o procarióticas, preferiblemente células de mamíferos,
insectos, levaduras, bacterias o en cualquier otro tipo de célula
que sea conveniente para la producción recombinante de EPO. Además,
la EPO puede ser expresada en animales transgénicos (por ejemplo,
en los fluidos corporales como la leche, la sangre, etc.), en huevos
de aves transgénicas, especialmente aves de corral, preferiblemente
pollos o en plantas transgénicas.
La producción recombinante de un polipéptido es
conocida en la técnica. En general, esto incluye la transfección de
células hospedantes con un vector de expresión apropiado, el cultivo
de las células hospedantes en condiciones que facilitan la
producción del polipéptido y la purificación del polipéptido a
partir de las células hospedantes. Para información detallada véase
por ejemplo, Krystal, Pankratz, Farber, Smart, 1986, Purification
of human erythropoietin to homogeneity by a rapid
five-step procedure, Blood, 67(1),
71-9; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989,
High-level expression and purification of a
recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus
vector, Blood, 74(2), 652-7; documentos
EP 640619 B1 y EP 668351 B1.
En una realización preferida, la EPO tiene la
secuencia de aminoácidos de la EPO humana (véase el documento EP
148605 B2).
La EPO puede comprender una o más cadenas
laterales de carbohidrato, preferiblemente 1 a 12, más
preferiblemente 1 a 9, incluso más preferiblemente 1 a 6 y
particularmente 1 a 4, especial y preferiblemente 4 cadenas
laterales de carbohidrato, unidas a la EPO por N- y/o
O-glicosilación, es decir, la EPO está glicosilada.
Usualmente, cuando se produce EPO en células eucarióticas, el
polipéptido se glicosila después de la traducción. Consecuentemente,
las cadenas laterales de carbohidrato pueden haber sido unidas a la
EPO durante las biosíntesis en células de mamíferos, especialmente
humanas, de insectos o de levadura. La estructura y propiedades de
la EPO glucosilada han sido estudiadas extensivamente (véase EP
428267 B1; EP 640619 B1; Rush, Derby, Smith, Merry, Rogers, Rohde,
Catta, 1995, Microheterogeneity of erythropoetin carbohydrate
structure, Anal. Chem., 67(8), 1442-52;
Takeuchi, Kobata, 1991, Structures and functional roles of the
sugar chains of human erythropoietins, Glycobiology,
1(4), 337-46 (Review).
Por consiguiente, el derivado del
hidroxialquil-almidón de acuerdo con la presente
invención puede comprender al menos 1, preferiblemente 1 a 12, más
preferiblemente 1 a 9, incluso más preferiblemente 1 a 6 y
particular y preferiblemente 1 a 4 moléculas de HAS por molécula de
EPO. El número de moléculas de HAS por molécula de EPO puede
determinarse por análisis composicional cuantitativo usando
cromatografía de gases-espectrometría de masas
(abreviadamente en lo sucesivo GC-MS por la
expresión inglesa Gas Chromathography - Mass Spectrometry)
después de la hidrólisis del producto y derivatización de los
monosacáridos resultantes (véase Chaplin and Kennedy (eds.), 1986,
Carbohydrate Analysis: A Practical Approach, IRL Press,
Practical Approach Series (ISBN
0-947946-44-3),
especialmente el Chapter 1, Monosaccharides, pp.
1-36; Chapter 2, Oligosaccharides, pp.
37-53, Chapter 3, Neutral Polysaccharides, pp.
55-96).
De acuerdo con una realización especialmente
preferida de la presente invención, el resto de carbohidrato resto
unido a la EPO, es parte de una cadena lateral de carbohidrato. Más
preferiblemente, el resto de carbohidrato es el resto terminal de
la cadena lateral de carbohidrato. En una realización incluso más
preferida, el resto de carbohidrato es un residuo de galactosa de
la cadena lateral de carbohidrato, preferiblemente el residuo de
galactosa terminal de la cadena lateral del carbohidrato. Este
residuo de galactosa puede ser hecho disponible para reacción con
el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) por
eliminación de ácidos siálicos terminales, seguido por oxidación,
como se describe más adelante. En otra realización preferida, el
producto de reacción del compuesto (I) y (II) se enlaza a un residuo
de ácido siálico de las cadenas laterales del carbohidrato,
preferiblemente el residuo de ácido siálico terminal de la cadena
lateral de carbohidrato. El ácido siálico se oxida como se describe
más adelante.
Particular y preferiblemente este residuo de
galactosa se hace disponible para reacción con el producto de
reacción del hidroxialquil-almidón y el compuesto
(L) o el producto de reacción del
hidroxialquil-almidón y el compuesto (D) que se
hace reaccionar además con el compuesto (L) por el grupo funcional X
por eliminación del ácido siálico terminal seguido por
oxidación.
Más preferiblemente, este residuo de galactosa
se hace disponible para reacción con el producto de reacción del
hidroxialquil-almidón y el compuesto (L) o el
producto de reacción del hidroxialquil-almidón y el
compuesto (D) que se hace reaccionar adicionalmente con el
compuesto (L) por el grupo funcional X por oxidación en donde no se
elimina el ácido siálico terminal.
En lo que respecta a las condiciones de reacción
del producto de reacción del hidroxialquil-almidón y
el compuesto (L), opcionalmente con el compuesto (D), con el
compuesto adicional (M), no existen limitaciones específicas, y las
condiciones de reacción pueden ajustarse a las necesidades
específicas. De acuerdo con una realización especialmente preferida
de la presente invención, se usa agua como disolvente, bien sola
bien en combinación con al menos otro disolvente. Como al menos
otros disolventes se pueden mencionar DMSO, DMF, metanol o etanol.
Los disolventes distintos de agua son metanol y etanol. De acuerdo
con otra realización preferida se usa como disolvente DMSO o DMF o
metanol o etanol o una mezcla de dos o más de ellos.
Si, por ejemplo, el
hidroxialquil-almidón se hace reaccionar con el
compuesto (L) en un sistema acuoso, como es el caso, por ejemplo,
cuando el hidroxietil-almidón se hace reaccionar con
una hidroxiamina, tal como
O-[2-(2-aminooxietoxi)etil]-hidroxilamina,
por reacción del extremo reductor no oxidado del almidón, y el
producto de la reacción se hace reaccionar adicionalmente con un
polipéptido, preferiblemente la eritropoyetina, por un grupo
aldehído, ceto, acetal o hemiacetal, la temperatura de reacción
está preferiblemente en el intervalo de 4 a 37ºC, más
preferiblemente de 10 a 30ºC y especial y preferiblemente de 15 a
25ºC.
El aislamiento del producto de reacción que
comprende el compuesto adicional (M), preferiblemente el polipéptido
y especialmente preferiblemente eritropoyetina, puede realizarse
usando métodos conocidos para la purificación de EPO natural y
recombinante (por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño
molecular, cromatografía de cambio iónico, cromatografía de
líquidos de alta resolución en fase inversa (abreviadamente en lo
sucesivo RP-HPLC por la expresión inglesa
Reverse Phase -High Performance Liquid Chromatography),
cromatografía con hidroxiapatito, cromatografía de interacción
hidrófoba o sus combinaciones). El aislamiento del producto de
reacción puede llevarse a cabo por un proceso adecuado que puede
comprender una o más etapas. De acuerdo con una realización
preferida de la presente invención, el producto de reacción se
separa primeramente de la mezcla de reacción con, por ejemplo, la
mezcla etanol-acetona, por un método adecuado, tal
como centrifugación o filtración. En una segunda etapa, el producto
de reacción separado puede someterse a un tratamiento adicional,
tal como un tratamiento posterior como diálisis, centrifugación,
filtración o filtración a presión, cromatografía de cambio iónico,
tal como, por ejemplo, por una columna que contiene
Q-Sepharose, HPLC, MPLC, filtración por gel y/o
liofilización. De acuerdo con una realización preferida, el producto
de reacción separado se dializa primeramente, preferiblemente
frente a agua, y luego se liofiliza hasta que el contenido de
disolvente del producto de reacción se suficientemente bajo de
acuerdo con las especificaciones deseadas del producto. La
liofilización puede ser llevada a cabo a una temperatura de 20 a
35ºC, preferiblemente de 25 a 30ºC. De acuerdo con otra realización
preferida, la mezcla de reacción que comprende el producto de
reacción se aplica a una columna que contiene
Q-Sepharose para dar un eluato que se concentra, por
ejemplo, por filtración centrífuga.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar derivados de hidroxialquil-almidón que
se producen por uno o más de los métodos antes mencionados.
Por tanto, la presente invención se refiere a un
derivado de hidroxialquil-almidón que comprende el
hidroxialquil-almidón, un compuesto (L),
opcionalmente un compuesto (D), y un compuesto adicional (M),
obtenible por un método de producir un derivado de
hidroxialquil-almidón, teniendo dicho
hidroxialquil-almidón una estructura de acuerdo con
la fórmula (I):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
que comprende hacer
reaccionar:
- -
- hidroxialquil-almidón de fórmula (I) en su extremo reductor opcionalmente oxidado o
- -
- un derivado de hidroxialquil-almidón, obtenible haciendo reaccionar el hidroxialquil-almidón de fórmula (I) en su extremo reductor opcionalmente oxidado con un compuesto (D), comprendiendo dicho compuesto (D):
- -
- al menos un grupo funcional Z_{1} capaz de ser hecho reaccionar con el extremo reductor opcionalmente oxidado del hidroxialquil-almidón, y
- -
- al menos un grupo funcional W,
\vskip1.000000\baselineskip
con un compuesto (L) que comprende:
- -
- al menos un grupo funcional Z_{1} capaz de ser hecho reaccionar con dicho hidroxialquil-almidón, o al menos un grupo funcional Z_{2} capaz de ser hecho reaccionar con el grupo funcional W contenido en dicho derivado de hidroxialquil-almidón, y
- -
- al menos un grupo funcional X capaz de ser hecho reaccionar con un grupo funcional Y de un compuesto adicional (M),
en donde dicho grupo funcional Y se selecciona
del grupo que consiste en un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo
hemiacetal y un grupo acetal, en donde el grupo funcional Z_{1} se
selecciona del grupo que consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es
metilo.
De acuerdo con una realización preferida, la
presente invención se refiere a un derivado del
hidroxialquil-almidón como se ha descrito
anteriormente, en donde R_{1}, R_{2} y R_{3} son
independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o
ramificado.
De acuerdo con una realización incluso más
preferida, la presente invención se refiere a un derivado del
hidroxialquil-almidón como se ha descrito antes, en
donde R_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente hidrógeno o
un grupo 2-hidroxietilo.
De acuerdo con otra realización preferida, la
presente invención se refiere a un derivado del
hidroxialquil-almidón como se ha descrito en donde
el hidroxialquil-almidón es
hidroxietil-almidón.
De acuerdo con otra realización preferida, la
presente invención se refiere a un derivado del
hidroxialquil-almidón como se ha descrito antes en
donde el grupo funcional Y se selecciona del grupo que consiste en
un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo hemiacetal y un grupo
acetal, y el grupo funcional X comprende la estructura -NH-.
De acuerdo con una realización especialmente
preferida, la presente invención se refiere a un derivado del
hidroxialquil-almidón como se ha descrito antes, en
donde X se selecciona del grupo que consiste en:
H_{2}N-
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es
metilo.
De acuerdo con otra realización preferida, la
presente invención se refiere a un derivado del
hidroxialquil-almidón como se ha descrito antes, en
donde el grupo funcional W o el grupo funcional Z_{2} es -SH y el
grupo funcional Z_{2} o el grupo funcional W se selecciona del
grupo que consiste en:
en donde Hal es Cl, Br ó
I.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con otra realización preferida, la
presente invención se refiere a un derivado del
hidroxialquil-almidón como se ha descrito antes, en
donde el grupo funcional W o el grupo funcional Z_{2} se
selecciona del grupo que consiste en un éster activado, como se ha
descrito antes, o un grupo carboxi que está opcionalmente
transformado en un éster activado y el grupo funcional Z_{2} o el
grupo funcional W se selecciona del grupo que consiste en:
H_{2}N-
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es
metilo.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización especialmente
preferida, la presente invención se refiere a un derivado del
hidroxialquil-almidón como se ha descrito antes, en
donde el extremo reductor del hidroxialquil-almidón
no está oxidado antes de la reacción con el compuesto (D) o el
compuesto (L), teniendo por tanto dicho
hidroxialquil-almidón una estructura de acuerdo con
la fórmula (I)
De acuerdo con otra realización especialmente
preferida, la presente invención se refiere a un derivado del
hidroxialquil-almidón como se ha descrito antes, en
donde el extremo reductor del hidroxialquil-almidón
se oxida antes de la reacción con el compuesto (D) o el compuesto
(L), teniendo por tanto dicho hidroxialquil-almidón
una estructura de acuerdo con la fórmula (IIa)
\vskip1.000000\baselineskip
y/o de acuerdo con la fórmula
(IIb)
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con otra realización preferida, la
presente invención se refiere a un derivado del
hidroxialquil-almidón como se ha descrito antes, en
donde el extremo reductor se oxida por una solución alcalina de
yodo.
De acuerdo con otra realización preferida, la
presente invención se refiere a un derivado del
hidroxialquil-almidón como se ha descrito antes, en
donde el hidroxialquil-almidón se hace reaccionar
con un compuesto (L) por la reacción de grupo funcional Z_{1} con
el extremo reductor opcionalmente oxidado del
hidroxialquil-almidón y el producto resultante de
la reacción se hace reaccionar con un compuesto adicional (M) por la
reacción del grupo funcional X contenido en el compuesto (L) con el
grupo funcional Y contenido en el compuesto (M).
De acuerdo con todavía otra realización
preferida, la presente invención se refiere a un derivado del
hidroxialquil-almidón como se ha descrito antes, en
donde el hidroxialquil-almidón se hace reaccionar
con un compuesto (L) por la reacción del grupo funcional Z_{1}
con el extremo reductor opcionalmente oxidado del
hidroxialquil-almidón, en donde el compuesto (L),
antes de la reacción con el hidroxialquil-almidón,
se hace reaccionar con un compuesto adicional (M) por la reacción
de grupo funcional X contenido en el compuesto (L) con el grupo
funcional Y contenido en el compuesto (M).
De acuerdo con todavía otra realización más
preferida, la presente invención se refiere a un derivado del
hidroxialquil-almidón como se ha descrito antes, en
donde el hidroxialquil-almidón se hace reaccionar
con un compuesto (D) por la reacción del grupo funcional Z_{1}
contenido en el compuesto (D), con el extremo reductor
opcionalmente oxidado del hidroxialquil-almidón para
dar un primer derivado del hidroxialquil-almidón, y
donde el primer derivado del hidroxialquil-almidón
se hace reaccionar con un compuesto (L) por la reacción de grupo
funcional Z_{2} contenido en el compuesto (L) con el grupo
funcional W contenido en el compuesto (D) para dar un segundo
derivado del hidroxialquil-almidón.
De acuerdo con una realización especialmente
preferida, la presente invención se refiere al derivado del
hidroxialquil-almidón antes mencionado, en donde el
segundo derivado del hidroxialquil-almidón se hace
reaccionar con un compuesto adicional (M) por la reacción del grupo
funcional X contenido en el compuesto (L) con el grupo funcional Y
contenido en el compuesto (M).
De acuerdo con otra realización más preferida,
la presente invención se refiere a un derivado del
hidroxialquil-almidón como se ha descrito antes, en
donde el hidroxialquil-almidón se hace reaccionar
con un compuesto (D) por la reacción del grupo funcional Z_{1}
contenido en el compuesto (D) con el extremo reductor del
hidroxialquil-almidón opcionalmente oxidado para
dar un primer derivado del hidroxialquil-almidón, y
donde el primer derivado del hidroxialquil-almidón
se hace reaccionar, por la reacción del grupo funcional W, contenido
en el compuesto (D), y el grupo funcional Z_{2}, contenido en el
compuesto (L), con el compuesto (L), en donde el compuesto (L),
antes de la reacción con el primer derivado del
hidroxialquil-almidón, se hace reaccionar con un
compuesto adicional (M) por la reacción de grupo funcional X
contenido en el compuesto (L) con el grupo funcional Y contenido en
el compuesto (M).
De acuerdo con una realización especialmente
preferida, la presente invención se refiere a un derivado del
hidroxialquil-almidón como se ha descrito antes, en
donde el al menos un compuesto adicional (M) es un polipéptido.
De acuerdo con una realización particularmente
preferida, la presente invención se refiere a un derivado del
hidroxialquil-almidón como se ha descrito antes, en
donde el polipéptido es eritropoyetina.
El derivado del
hidroxialquil-almidón que en lo sucesivo se denomina
conjugado HAS-EPO y que se forma por reacción del
hidroxialquil-almidón con el compuesto (L) y
opcionalmente el compuesto (D) y eritropoyetina, tiene la ventaja
de que exhibe una estabilidad biológica mejorada cuando se compara
con la eritropoyetina antes de la conjugación. Además, exhibe una
actividad biológica superior a la del patrón de la preparación
biológica de referencia (en lo sucesivo abreviadamente patrón de
BRP-EPO por la expresión inglesa Biological
Reference Preparation-EPO). Esto se debe principalmente al hecho
de que este derivado del hidroxialquil-almidón es
menos reconocido o incluso no es reconocido por los sistemas de
eliminación del hígado y el riñón y por lo tanto persiste en el
sistema circulatorio durante un mayor periodo de tiempo. Además,
puesto que el HAS está unido a un sitio específico, se minimiza el
riesgo de destrucción de la actividad biológica in vivo de la
EPO por conjugación de HAS con EPO.
El conjugado HAS-EPO de la
invención puede exhibir esencialmente la misma actividad biológica
in vitro que la EPO recombinante natural puesto que la
actividad biológica in vitro solo mide la afinidad de unión
al receptor de EPO. Los métodos para determinar la actividad
biológica in vitro son conocidos en la técnica.
Además, el HAS-EPO exhibe su
mayor actividad in vivo que la EPO usada como material de
partida para la conjugación (EPO no conjugada). Los métodos para
determinar la actividad biológica in vivo son conocidos en la
técnica.
El conjugado HAS-EPO puede
exhibir una actividad in vivo de 110% a 500%, preferiblemente
de 300% a 400%, o preferiblemente de 110% a 300%, más
preferiblemente 110% a 200%, más preferiblemente de 110% a 180% o
110% a 150%, lo más preferiblemente 110% a 140%, si la actividad
in vivo de EPO no conjugada se establece como 100%.
Comparada con la EPO altamente sialilada de
Amgen (véase el documento EP 428267 B1), el conjugado
HAS-EPO exhibe preferiblemente al menos 50%, más
preferiblemente al menos 70%, incluso más preferiblemente al menos
85% o al menos 95%, al menos 150%, al menos 200% o al menos 300% de
la actividad in vivo de la EPO altamente sialilada, si la
actividad in vivo de la EPO altamente sialilada se establece
como 100%. Más preferiblemente, exhibe al menos 95% de actividad
in vivo de la EPO altamente sialilada.
La alta actividad biológica in vivo del
conjugado HAS-EPO de la invención resulta
principalmente del hecho de que el conjugado
HAS-EPO permanece más tiempo en la circulación que
la EPO no conjugada debido a que es menos reconocida por los
sistemas de eliminación del hígado y debido a que la eliminación
(aclaramiento) renal es reducida debido a su alto peso molecular.
Los métodos para la determinación de la semi-vida
in vivo de la EPO en la circulación son conocidos en la
técnica (Sytcowski, Lunn, Davis, Feldman, Siekman, 1998, Human
erythropoietina dimers with markedly enhanced in vivo activity,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(3),
1184-8).
En consecuencia es una gran ventaja de la
presente invención que se proporcione un conjugado
HAS-EPO que puede ser administrado menos
frecuentemente que las preparaciones de EPO comercialmente
disponibles en la actualidad. Aunque las preparaciones estándares
de EPO han de ser administradas al menos dos veces cada 3 días, el
conjugado HAS-EPO de la invención se administra
preferiblemente dos veces a la semana, más preferiblemente una vez a
la semana.
Además, el método de la invención tiene la
ventaja de que puede producirse un derivado de EPO eficaz a costes
reducidos, puesto que el método no comprende etapas de purificación
extensivas y que requieran mucho tiempo que dan como resultado un
bajo rendimiento final, por ejemplo no es necesario purificar las
formas de EPO sub-sialiladas que se sabe que
exhiben baja o ninguna actividad biológica in vivo.
Especialmente el Ejemplo 8.11 (d) demuestra que un conjugado
HAS-EPO producido con pocas etapas de modificación
exhibe el triple de actividad que el patrón BRP-EPO.
Es otro objeto de la presente invención proporcionar una composición
farmacéutica que comprende, en una cantidad terapéuticamente eficaz,
el conjugado HAS-EPO de la presente invención.
Además, la presente invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende, en una cantidad
terapéuticamente eficaz, el conjugado
HAS-polipéptido, preferiblemente el conjugado
HAS-EPO, más preferiblemente el conjugado
HES-EPO de la presente invención. En una realización
preferida, la composición farmacéutica comprende además al menos un
diluyente, adyuvante y/o vehículo farmacéuticamente aceptable útil
en la terapia con eritropoyetina.
\newpage
Por tanto, la presente invención también se
refiere a una composición farmacéutica que comprende, en una
cantidad terapéuticamente eficaz, un derivado de
hidroxialquil-almidón que comprende el
hidroxialquil-almidón, un compuesto (L),
opcionalmente un compuesto (D), y un compuesto adicional (M),
obtenible por un método de producir un derivado de
hidroxialquil-almidón, teniendo dicho
hidroxialquil-almidón una estructura de acuerdo con
la fórmula (I):
que comprende hacer
reaccionar:
- -
- hidroxialquil-almidón de fórmula (I) en su extremo reductor opcionalmente oxidado o
- -
- un derivado de hidroxialquil-almidón, obtenible haciendo reaccionar el hidroxialquil-almidón de fórmula (I) en su extremo reductor opcionalmente oxidado con un compuesto (D), comprendiendo dicho compuesto (D):
- -
- al menos un grupo funcional Z_{1} capaz de ser hecho reaccionar con el extremo reductor opcionalmente oxidado del hidroxialquil-almidón, y
- -
- al menos un grupo funcional W,
\vskip1.000000\baselineskip
con un compuesto (L) que comprende:
- -
- al menos un grupo funcional Z_{1} capaz de ser hecho reaccionar con dicho hidroxialquil-almidón, o al menos un grupo funcional Z_{2} capaz de ser hecho reaccionar con grupo funcional W contenido en dicho derivado de hidroxialquil-almidón, y
- -
- al menos un grupo funcional X capaz de ser hecho reaccionar con un grupo funcional Y de un compuesto adicional (M),
en donde dicho grupo funcional Y se selecciona
del grupo que consiste en un grupo aldehído, un grupo ceto, un
grupo hemiacetal y un grupo acetal, en donde el grupo funcional
Z_{1} se selecciona del grupo que consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es
metilo,
comprendiendo además dicho método de producir un
derivado del hidroxialquil-almidón hacer reaccionar
el producto de reacción que comprende
hidroxialquil-almidón, compuesto (L) y opcionalmente
compuesto (D) con el compuesto adicional (M) en donde el al menos un
compuesto adicional (M) es un polipéptido.
Además, la presenteinvención se refiere al uso
de un derivado de hidroxialquil-almidón como el
descrito para la preparación de un medicamento para el tratamiento
de trastornos anémicos o trastornos por disfunción hematopoyética o
enfermedades relacionadas con dicha función.
De acuerdo con una realización preferida, la
presente invención se refiere a una composición farmacéutica como
se ha descrito antes, en donde el polipéptido es una antitrombina
(AT), preferiblemente AT 111 (Levy JH, Weisinger A, Ziomek CA,
Echelard Y, Recombinant Antithrombin: Production and Role in
Cardiovascular Disorder, Seminars in Thrombosis and Hemostasis
27, 4, (2001) 405-416; Edmunds T, Van Patten SM,
Pollock J, Hanson E, Bernasconi R, Higgins E, Manavalan P, Ziomek
C, Meade H, McPherson J, Cole ES, Transgenically Produced Human
Antithrombin: Structural and Functional Comparison to Human
Plasma-Derived Antithrombin, Blood 91, 12
(1998) 4661-4671, Minnema MC, Chang ACK, Jansen PM,
LubbersYTP, Pratt BM, Whittaker BG, Taylor FB, Hack CE, Friedman B,
Recombinant human antithrombin III improves survival and
attenuates inflammatory responses in baboons lethally challenged
with Escherichia coli, Blood 95, 4, (2000)
1117-1123; Van Patten SM, Hanson EH, Bernasconi R,
Zhang K, Manavaln P, Cole ES, McPherson JM, Edmunds T, Oxidation
of Metionine Residues in Antithrombin, J. Biol. Chemistry 274,
15, (1999) 10268-10276).
De acuerdo con otras realizaciones preferidas,
la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas en
donde el polipéptido es G-CSF o
IFN-beta.
De acuerdo con una realización especialmente
preferida, la presente invención se refiere a una composición
farmacéutica como se ha descrito antes, en donde el polipéptido es
eritropoyetina.
De acuerdo con una realización preferida, la
presente invención se refiere a una composición farmacéutica como
se ha descrito antes, en donde el grupo funcional Y se selecciona
del grupo que consiste en un grupo aldehído, un grupo ceto, un
grupo acetal y un grupo acetal, y el compuesto (L) es un compuesto
de la fórmula general Z_{1}-L'-X,
en donde el grupo funcional Z_{1} se selecciona del grupo que
consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es metilo, y en
donde el grupo funcional X se selecciona del grupo que consiste
en:
H_{2}N-
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es metilo, y
donde L' es una cadena orgánica que puentea Z_{1} y X o donde L'
está
ausente.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con otra realización, la presente
invención se refiere a una composición farmacéutica como se ha
descrito antes, en donde el grupo funcional Y es -SH, el compuesto
(D) es un compuesto de la fórmula general
Z_{1}-D'-W, y el compuesto (L) es
un compuesto de la fórmula general
Z_{2}-L'-X, en donde el grupo
funcional Z_{1} se selecciona del grupo que consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es metilo, en
donde el grupo funcional X se selecciona del grupo que consiste
en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde Hal es Cl, Br o I, en
donde el grupo funcional W o el grupo funcional Z_{2} es -SH y el
grupo funcional Z_{2} o el grupo funcional W se selecciona del
grupo que consiste
en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde Hal es Cl, Br o I, o donde
el grupo funcional W o el grupo funcional Z_{2} se selecciona del
grupo que consiste en un éster activado, como se ha descrito antes,
o un grupo carboxi que está opcionalmente transformado en un éster
activado y el grupo funcional Z_{2} o el grupo funcional W se
selecciona del grupo que consiste
en:
\vskip1.000000\baselineskip
H_{2}N-
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es metilo, y en
donde D' es una cadena orgánica que puentea Z_{1} y W o en donde
D' está ausente y en donde L' es una cadena orgánica que puentea
Z_{2} y X o donde L' está
ausente.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con todavía otra realización, la
presente invención se refiere a una composición farmacéutica como
se ha descrito antes, en donde el grupo funcional Y se selecciona
del grupo que consiste en un grupo aldehído, un grupo ceto, un
grupo acetal y un grupo acetal, el compuesto (D) es un compuesto de
la fórmula general Z_{1}-D'-W, y
el compuesto (L) es un compuesto de la fórmula general
Z_{2}-L'-X, en donde el grupo
funcional Z_{1} se selecciona del grupo que consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es metilo, en
donde el grupo funcional X se selecciona del grupo que consiste
en:
H_{2}N-
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es metilo, el
grupo funcional W o el grupo funcional Z_{2} es -SH y el grupo
funcional Z_{2} o el grupo funcional W se selecciona del grupo que
consiste
en:
en donde Hal es Cl, Br o I, o en
donde el grupo funcional W o el grupo funcional Z_{2} se
selecciona del grupo que consiste en un éster activado, como se ha
descrito antes, o un grupo carboxi que está transformado
opcionalmente en un éster activado y el grupo funcional Z_{2} o el
grupo funcional W se selecciona del grupo que consiste
en
H_{2}N-
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S, y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es metilo, y en
donde D' es una cadena orgánica que puentea Z1 y W o en donde D'
está ausente y en donde L' es una cadena orgánica que puntea Z_{2}
y X o donde L' está
ausente.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización particularmente
preferida, la presente invención se refiere a una composición
farmacéutica como se ha descrito antes en donde el
hidroxietil-almidón se hace reaccionar en un medio
acuoso con un compuesto de acuerdo con la fórmula siguiente:
y el producto de reacción se hace
reaccionar con
eritropoyetina.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización incluso más
preferida, la presente invención se refiere a la composición
farmacéutica antes mencionada, en donde la eritropoyetina está
oxidada con peryodato de sodio antes de la reacción.
De acuerdo con otra realización preferida, la
presente invención se refiere a la composición farmacéutica como se
ha descrito antes, en donde la eritropoyetina está parcialmente
desialilada y subsiguientemente oxidada con peryodato de sodio antes
de la reacción.
De acuerdo con otra realización preferida de la
presente invención, están excluidas las composiciones farmacéuticas
que comprenden un derivado del hidroxialquil-almidón
que se producen sobre la base de una tioEPO completamente reducida
de acuerdo con el Ejemplo 6.
La composición farmacéutica antes mencionada es
especialmente adecuada para el tratamiento de trastornos anémicos o
trastornos con disfunción hematopoyética o enfermedades relacionadas
con dicha función.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" como
se usa en la presente descripción se refiere a la cantidad que
proporciona el efecto terapéutico para un estado y régimen de
administración dados. La administración de isoformas de
eritropoyetina es preferiblemente por rutas parenterales. La ruta
específica elegida dependerá del estado que se trate. La
administración de isoformas de eritropoyetina se realiza
preferiblemente como parte de una formulación que contiene un
vehículo adecuado, tal como seroalbúmina humana, un diluyente
adecuado, tal como una solución salina tamponada, y/o un adyuvante
adecuado. La dosis requerida será en cantidades suficientes para
elevar el hematocrito de pacientes y variará dependiendo de la
gravedad del estado que se trate, el método de administración usado
y otros aspectos similares
El objeto del tratamiento con la composición
farmacéutica de la invención es preferiblemente un aumento en el
valor de la hemoglobina de más de 6,8 mmol/l en la sangre. Para
esto, la composición farmacéutica puede ser administrada en un modo
en el que el valor de hemoglobina aumenta entre 0,6 mmol/l y 1,6
mmol/l por semana. Si el valor de la hemoglobina excede de 8,7
mmol/l, la terapia debe ser preferiblemente interrumpida hasta que
el valor de la hemoglobina sea inferior a 8,1 mmol/l.
La composición de la invención se usa
preferiblemente en una formulación adecuada para inyección
subcutánea o intravenosa o parenteral. Para esto, los excipientes y
vehículos adecuados son por ejemplo, dihidrógenofosfato sódico,
hidrógenofosfato disódico, clorato sódico, polisorbato 80,
seroalbúmina humana (abreviadamente en lo sucesivo HSA por la
expresión inglesa human serum albumina) y agua para
inyección. La composición puede administrarse tres veces por
semana, preferiblemente dos veces por semana, más preferiblemente
una vez por semana, y más preferiblemente cada dos semanas.
Preferiblemente, la composición farmacéutica se
administra en una cantidad de 0,01-10 \mug/kg de
peso corporal del paciente, más preferiblemente 0,1 a 5 \mug/kg,
0,1 a 1 \mug/kg o 0,2-0,9 \mug/kg, más
preferiblemente 0,3-0,7 \mug/kg, y más
preferiblemente 0,4-0,6 \mug/kg de peso
corporal.
En general, se administran preferiblemente por
dosis de 10 \mug y 20 \mug, preferiblemente entre 15 \mug y
100 \mug.
La invención se refiere además a un
HAS-polipéptido de acuerdo con la presente invención
para uso en un método para tratamiento del cuerpo humano o animal.
La invención se refiere además al uso de un conjugado
HES-EPO de la presente invención para la preparación
de un medicamento para el tratamiento de trastornos anémicos o
trastornos con disfunción hematopoyética o enfermedades relacionadas
con dicha función.
En el caso de que el compuesto (L) usado de
acuerdo con la presente invención comprenda uno o más centros
quirales, el compuesto (II) puede estar presente en la conformación
R o en la conformación S o como compuesto racémico con respecto a
cada centro quiral.
\global\parskip0.970000\baselineskip
En el caso de que el compuesto (D) usado
opcionalmente en la presente invención comprenda uno o más centros
quirales, el compuesto (D) puede estar presente en la conformación R
o en la conformación S o como compuesto racémico con respecto a cada
centro quiral.
La invención se ilustra además por los
siguientes Ejemplos, Tablas y Figuras que de ningún modo se pretende
que restrinjan el alcance de la presente invención.
Figura
1
La Figura 1 muestra un análisis por
electroforesis en gel de policacrilamida con dodecilsulfato sódico
(en lo sucesivo abreviadamente SDS-PAGE por la
expresión inglesa Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel
Electrophoresis) del conjugado HES-EPO,
producido de acuerdo con el Ejemplo 5.1.
- Pista A:
- Marcador de proteínas Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, Alemania); pesos moleculares (en kD) del marcador de proteínas desde la parte superior hasta el fondo: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 y 17.
- Pista B:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 5.1.
- Pista C:
- Material de partida de EPO.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
La Figura 2 muestra un análisis por
SDS-PAGE del conjugado HES-EPO,
producido de acuerdo con el Ejemplo 5.3.
- Pista A:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 5.3.
- Pista B:
- Material de partida de EPO.
- Pista C:
- Marcador de proteínas Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, Alemania); pesos moleculares (en kD) del marcador de proteínas desde la parte superior hasta el fondo: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4, y 17.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
3
La Figura 3 muestra un análisis por
SDS-PAGE del conjugado HES-EPO,
producido de acuerdo con los Ejemplos 5.4 y 5.5.
- Pista A:
- Marcador de proteínas Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, Alemania); pesos moleculares (en kD) del marcador de proteínas desde la parte superior hasta el fondo: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4, y 17.
- Pista B:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 5.4.
- Pista C:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 5.5.
- Pista D:
- Material de partida de EPO.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
4
La Figura 4 muestra un análisis por
SDS-PAGE del conjugado HES-EPO,
producido de acuerdo con los Ejemplos 7.1 y 7.4.
- Pista A:
- Marcador de proteínas Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Carlsruhe, Alemania); pesos moleculares (en kD) del marcador de proteínas desde la parte superior hasta el fondo: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 y 17.
- Pista B:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 7.4.
- Pista C:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 7.1.
- Pista D:
- Material de partida de EPO.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Figura
5
La Figura 5 muestra un análisis por
SDS-PAGE del conjugado HES-EPO,
producido de acuerdo con los Ejemplos 7.2, 7.3, 7.5 y 7.6.
- Pista A:
- Marcador de proteínas Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, Alemania); pesos moleculares (en kD) del marcador de proteínas desde la parte superior hasta el fondo: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 y 17,
- Pista B:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 7.6, basado en el Ejemplo 1.3b).
- Pista C:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 7.5, basado en el Ejemplo 1.1b).
- Pista D:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 7.6, basado en el Ejemplo 1.3a).
- Pista E:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 7.5, basado en el Ejemplo 1.1a).
- Pista F:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 7.2.
- Pista G:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 7.3.
- Pista K:
- Material de partida de EPO.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
6
La Figura 6 muestra un análisis por
SDS-PAGE del conjugado HES-EPO,
producido de acuerdo con los Ejemplos 7.7, 7.8, 7.9, 7.10, 7.11 y
7.12.
- Pista A:
- Marcador de proteínas Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, Alemania); pesos moleculares (en kD) del marcador de proteínas desde la parte superior hasta el fondo: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 y 17.
- Pista B:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 7.11.
- Pista C:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 7.10.
- Pista D:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 7.7.
- Pista E:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 7.8.
- Pista F:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 7.12.
- Pista G:
- Material de partida de EPO.
- Pista K:
- Producto en bruto después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 7.9.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
7
Análisis por SDS-PAGE de
EPO-GT-1 sometida a tratamiento con
ácido débil durante 5 minutos = pista 2; 10 minutos = pista 3; 60
minutos = pista 4 y EPO no tratada = pista 1; se muestra el cambio
de movilidad de la EPO después de la eliminación de
N-glicanos (+ tratamiento con
péptido-N-glicosidasa
(abreviadamente PNGASA).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
8
Modelo de cromatografía de cambio iónico de alta
resolución con detección amperómetrica pulsada (abreviadamente en lo
sucesivo HPAEC-PAD por la expresión inglesa
High-Performance Anion-Exchange
Chromatography with Pulsed Amperometric Detection) de
oligosacáridos aislados de EPO no tratada y de EPO incubada durante
5 minutos, 10 minutos y 60 minutos en condiciones de hidrólisis
ácida suave. Los números romanos I-V indican la
posición de elución I= estructura diantenaria desialilada, II =
estructuras triantenarias trisialiladas (dos isómeros), III =
estructura tetraantenaria tetrasialilada + 2 repeticiones de
N-acetil-lactosamina, IV =
estructura tetraantenaria tetrasialilada + 1 repetición de
N-acetil-lactosamina; V = estructura
tetraantenaria tetrasialilada + sin repetición de
N-acetil-lactosamina. El área de
elución de las estructuras de oligosacáridos sin y con ácido
1-4 siálico está indicada entre
paréntesis.
paréntesis.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
9
HPAEC-PAD de oligosacáridos
N-enlazados después de la desialilación; se muestra
la posición de elución del ácido
N-acetilneuramínico; los números 1-9
indican la posición de elución de los oligosacáridos estándares: 1 =
diantenaria; 2 = triantenaria (isómero 2-4), 3 =
triantenaria (isómero 2-6); 4 = tetraantenaria; 5 =
triantenaria más 1 repetición; 6 = tetraantenaria más 1 repetición;
7 = triantenaria más 2 repeticiones; 8 = tetraantenaria más 2
repeticiones y 9 = tetraantenaria más 3 repeticiones.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
10
Análisis por SDS-PAGE de EPO con
tratada suavemente y no tratada que se sometieron a oxidación con
peryodato de los de residuos ácido siálico. 1 = oxidada con
peryodato sin tratamiento con ácido; 2 = oxidada con peryodato y 5
minutos de tratamiento con ácido; 3 = oxidada con peryodato y 10
minutos de tratamiento con ácido; 4 = oxidad con peryodato sin
tratamiento con ácido; 5 = patrón de BRP EPO sin oxidación con
peryodato y sin tratamiento con ácido.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
11
Modelo de HPAEC-PAD de los
oligosacáridos naturales aislados de la EPO no tratada EPO y de la
EPO incubada durante 5 minutos y 10 minutos en condiciones de
hidrólisis ácida suave y subsiguiente tratamiento con peryodato. El
área de elución de las de estructura de los oligosacáridos sin y con
ácido 1-4 siálico está indicada por los
paréntesis
1-5.
1-5.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
12
Análisis de SDS-PAGE del tiempo
transcurrido de modificación con HES de
EPO-GT-1-A: partes
alícuotas de 20 \mug de
EPO-GT-1-A se
hicieron reaccionar con el derivado X de HES modificado con
hidroxilamina durante 30 minutos, 2, 4 y 17 horas. Pista 1 = tiempo
de reacción 30 minutos; pista 2 = tiempo de reacción 2 horas; pista
3 = tiempo de reacción 4 horas; pista 4 = tiempo de reacción 17
horas; pista 5 =
EPO-GT-1-A sin
modificación de HES. La figura de la izquierda muestra el cambio en
la movilidad de
EPO-GT-1-A con
tiempos de incubación crecientes en presencia del derivado de HES
modificado con hidroxilamina (caudal: 1
ml.min-^{1}) X: Pista 1 = tiempo de reacción 30
minutos; pista 2 = tiempo de reacción 2 horas; pista 3 = tiempo de
reacción 4 horas; pista 4 = tiempo de reacción 17 horas; pista 5 =
EPO-GT-1-A con
modificación de HES. La figura de la derecha muestra el análisis de
las mismas muestras después de su tratamiento con
N-glicosidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
13
Análisis por SDS-PAGE de
fracciones en Q-Sepharose de conjugados
HES-EPO. Cada 1% del flujo pasante y 1% de la
fracción que se eluye a altas concentraciones de sal se concentraron
en un concentrador Speed Vac y se cargaron sobre los geles en
tampón de muestra. La proteína EPO se tiñó con azul Coomasie. A =
muestra 1; B = muestra II; C = muestra III; K =
EPO-GT-1 de control; A1, B1, Cl y K1
indicaron la fracción de flujo pasante; A2, B2, C2 y K2 indicaron la
fracción eluida con alta concentración de sal.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
14a
Análisis por SDS-PAGE de la
muestra A2 de EPO modificada con HES (véase la Figura 13), la
muestra de EPO de control K2 y la preparación de EPO
EPO-GT-1-A EPO se
digirieron en presencia de N-glucosidasa para
eliminar los oligosacáridos N-enlazados. Todas las
muestras de EPO mostraron el cambio de movilidad hacia las formas de
bajo peso molecular que carecen de O-glicano o
carecen de él. Se observa una relación inferior de la banda de
proteína O-glicosilada y no glicosilada para la
muestra A2 de EPO modificada con HES después de la
N-glicosilación y se detectó una banda de proteína
difusa alrededor de 30 KDa, que representa presumiblemente la
modificación con HES en el ácido siálico del residuo de
O-glicano (véase la flecha marcada con un
asterisco).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
14b
Análisis por SDS-PAGE después de
la hidrólisis suave de la muestra A2 de EPO modificada con HES
(véase la Figura 13), muestra EPO de control de K2 y
EPO-GT-1A que no se trataron o
digirieron en presencia de N-glicosidasa para
eliminar los oligosacáridos para eliminar los
N-enlazados (véase la Figura 14a). Tanto la forma de
alto peso molecular de A2 antes del tratamiento con
N-glicosidasa como la forma A después del
tratamiento con N-glicosidasa (véanse paréntesis con
y sin flecha) desaparecieron por tratamiento de las muestras con
ácido. El patrón de BRP-EPO que se sometió al
análisis para comparación no se sometió al tratamiento con
ácido.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
15
Análisis por HPAEC-PAD de
material oligosacárido N-enlazado liberado la
muestra A modificada con HES, de
EPO-GT-1-A y de una
muestra de EPO de control incubada con HES no modificado (K). Los
números romanos I-V indican la posición de elución
de I = estructura diantenaria disialilada, II = estructuras
triantenarias trisialiladas (dos isómeros), III = estructura
tetraantenaria tetrasialilada + 2 repeticiones de
N-acetil-lactosamina, IV =
estructura tetraantenaria tetrasialilada + 1 repetición de
N-acetil-lactosamina, V = estructura
tetraantenaria tetrasialilada + sin repetición de
N-acetil-lactosamina; los paréntesis
indican el área de elución de N-glicanos di-, tri- y
tetrasialilados como se informa en las leyendas de las Figuras 8 y
11.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
16
Análisis por HPAEC-PAD de
material oligosacárido N-enlazado liberado de la
muestra A modificada por HES, de
EPO-GT-1A y de una muestra de EPO
control (K) incubada con HES no modificado. Se muestran los tiempos
de retención de una mezcla de oligosacáridos estándares: los números
1-9 indican la posición de elución de oligosacáridos
estándares: 1 = diantenaria; 2 = triantenaria (isómero
2-4); 3 = triantenaria (isómero
2-6); 4 = tetraantenaria; 5 = triantenaria más 1
repetición; 6 = tetraantenaria más 1 repetición; 7 = triantenaria
más 2 repeticiones; y 9 = tetraantenaria más 3 repeticiones.
\vskip1.000000\baselineskip
Figuras 17 a
23
Las Figuras 17 a 23 representan espectros de
masas de tiempo de vuelo con ionización por láser asistida por
matriz (abreviadamente en lo sucesivo MALDI-TOF por
la expresión inglesa Matrix-assisted
laser-desorption ionization-time
of flight) de aislados de
N-glicanos liberados enzimáticamente y desialilados
químicamente de preparaciones de EPO modificada con HES y EPO de
control. Las principales señales m/z 1809,7, 2174,8, 2539,9,
2905,0 y 3270,1 ([M+Na]^{+}) corresponden a estructuras de
N-glicano de tipo complejo di- a tetraantenarias con
ninguna, una o dos repeticiones de
N-acetil-lactosamina acompañadas por
señales débiles debidas a la pérdida de fucosa o galactosa que son
debidas a las condiciones ácidas de la hidrólisis empleadas para la
desialilación de muestras para análisis por espectrometría de masas
(MS).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
17
Espectro MALDI-TOP:
oligosacáridos desialidados de EPO A2 modificada con HES.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
18
Espectro MALDI-TOP:
oligosacáridos desialidados de EPO GT-1A.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
19
Espectro MALDI-TOP:
oligosacáridos desialidados de EPO K2,
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
20
Espectro MALDI-TOP:
oligosacáridos desialidados de EPO GT-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
21
Espectro MALDI-TOP:
oligosacáridos desialidados de EPO GT-1 sometida a
hidrólisis ácida durante 5 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
22
Espectro MALDI-TOP:
oligosacáridos desialidados de EPO GT-1 sometida a
hidrólisis ácida durante 10 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
23
Espectro MALDI-TOP:
oligosacáridos desialidados de EPO GT-1 sometida a
hidrólisis ácida durante 60 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
24
La Figura 24 muestra un análisis por
SDS-PAGE de dos conjugados de
HES-EPO.
- mw*:
- marcador.
- Pista 1:
- HES-EPO producido de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 8: la EPO esta conjugada al hidrazido-HES 12 KD L.
- Pista 2:
- HES-EPO producido de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 9: la EPO está conjugada al hidroxil-amino-HES 12 KD L.
- C:
- control (EPO no conjugada); la banda superior representa el dímero de EPO.
* abreviatura de molecular weight = peso
molecular.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
25
La Figura 25 demuestra que el HES está conjugado
con un resto de carbohidrato de una cadena lateral de carbohidrato
mostrando una digestión las formas de EPO modificadas con HAS con
N-glicosidasa polipeptídica.
- Pista 1:
- HES-EPO producido de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 8 después de la digestión con N-glicosidasa.
- Pista 2:
- HES-EPO producido de acuerdo con el protocolo del ejemplo 9 después de la digestión con N-glicosidasa.
- Pista 3:
- Patrón de BRP-EPO.
- Pista 4:
- Patrón de BRP-BRP después de la digestión con N-glicosidasa.
- mw:
- marcador (Patrones de gama baja de SDS-PAGE de Bio-Rad, Nº de catálogo 161-0305, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.1
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- A una solución de 200 mg de hidroxietil-almidón (HES 18/0,4 (MW = 18.000 D, DS=0,4)) en 5 ml de agua se añadieron 0,83 mmol de 1,3-diamino-2-hidroxipropano (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania) y 50 mg de cianoborohidruro sódico (NaCNBH_{3}). La mezcla resultante se incubó a 80ºC durante 17 horas. La mezcla de reacción se añadió a 160 ml de una mezcla de acetona y etanol 1:1 (v/v). El precipitado se recogió por centrifugación y se dializó durante 4 días frente a agua (tubo de diálisis SnakeSkin, límite de exclusión 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania), y se liofilizó.
- b)
- También fue posible la incubación de la mezcla resultante de añadir 0,83 mmol de 1,3-diamino-2-hidroxipropano y 50 mg de cianoborohidruro sódico (NaCNBH_{3}) a la solución de 200 mg de hidroxietil-almidón y dicha incubación se llevó a cabo 25ºC durante 3 días.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.2
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- A una solución de 200 mg de hidroxietil-almidón (HES 18/0,4 (MW = 18.000 D, DS=0,4)) en 5 ml de agua, se añadieron 0,83 mmol de 1,2-dihidroxi-3-aminopropano (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania) y 50 mg de cianoborohidruro sodio (NaCNBH_{3}). La mezcla resultante se incubó a 80ºC durante 17 horas. La mezcla de reacción se añadió a 160 ml de una mezcla fría de acetona y etanol 1:1 (v/v). El precipitado se recogió por centrifugación y se dializó durante 4 días frente a agua (tubo de diálisis SnakeSkin, límite de exclusión 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania), y se liofilizó.
- b)
- También fue posible la incubación de la mezcla resultante de añadir 0,83 mmol de 1,3-diamino-3-hidroxipropano y 50 mg de cianoborohidruro sódico (NaCNBH_{3}) a la solución de 200 mg de hidroxietil-almidón y dicha incubación se llevó a cabo 25ºC durante 3 días.
La reacción de
1,2-dihidroxi-3-aminopropano
con HES se confirmó indirectamente por cuantificación del
formaldehído, resultante de la escisión oxidante del
1,2-diol en el producto de reacción por peryodato
como se describe por G. Avigad, Anal. Biochem. 134 (1983)
449-504.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.3
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- A una solución de 200 mg de hidroxietil-almidón (HES 18/0,4 (MW = 18.000 D, DS=0,4)) en 5 ml agua se añadieron 0,83 mmol de 1,4-diaminobutano (SigmaAldrich, Taufkirchen, Alemania) y 50 mg de cianoborohidruro sódico (NaCNBH_{3}). La mezcla resultante se incubó a 80ºC durante 17 horas. La mezcla de reacción se añadió a 160 ml de una mezcla fría de acetona y etanol 1:1 (v/v). El precipitado se recogió por centrifugación y dializó durante 4 días frente a agua (tubo de diálisis SnakeSkin, límite de exclusión 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania), y se liofilizó.
- b)
- También fue posible la incubación de la mezcla resultante de añadir 0,83 mmol de 1,4-diaminobutano y 50 mg de cianoborohidruro sódico (NaCNBH_{3}) a la solución de 200 mg dehidroxietil-almidón y se llevó a cabo a 25ºC durante 3 días.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.4
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- A una solución de 200 mg de hidroxietil-almidón (HES 18/0,4 (MW = 18.000 D, DS=0,4)) en 5 ml agua, se añadieron 0,83 mmol de 1-mercapto-2-aminoetano (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania) y 50 mg de cianoborohidruro sódico (NaCNBH_{3}). La mezcla resultante se incubó a 80ºC durante 17 horas. La mezcla de reacción se añadió a 160 ml de una mezcla fría de acetona y etanol 1:1 (v/v). El precipitado se recogió por centrifugación y se dializó durante 4 días frente a agua (tubo de diálisis SnakeSkin, límite de exclusión 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania), y se liofilizó.
- b)
- También fue posible la incubación de la mezcla resultante de añadir 0,83 mmol de 1-mercapto-2-aminoetano y 50 mg de cianoborohidruro sódico (NaCNBH_{3}) a la solución de 200 mg de hidroxietil-almidón y se llevó a cabo a 25ºC durante 3 días.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2.1
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 0,96 g de HES 18/0,4 (MW = 18.000
D, DS=0,4) en 8 ml de tampón de acetato sódico acuoso 0,1 M, pH
5,2, y se añadieron 8 mmol de carbohidrazida (Sigma Aldrich,
Taufkirchen, Alemania). Después de agitar durante 18 horas a 25ºC,
la mezcla de reacción se añadió a 160 mL de una mezcla fría de
acetona y etanol 1:1 (v/v). El producto precipitado se recogió por
centrifugación, se re-disolvió en 40 ml agua, y se
dializó durante 3 días frente a agua (tubo de diálisis
SnakeSkin, límite de exclusión 3,5 KD, Perbio Science
Deutschland GmbH, Bonn, Alemania), y se liofilizó.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2.2
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 0,96 g de HES18/0,4 (MW = 18.000
D, DS=0,4) en 8 ml de tampón de acetato sódico acuoso 0,1 M, pH
5,2, y se añadieron 8 mmol de dihidrazida adípica (Lancaster
Synthesis, Frankfurt/Main, Alemania). Después de agitar durante 18
horas a 25ºC, la mezcla de reacción se añadió a 160 mL de una mezcla
fría de acetona y etanol 1:1 (v/v). El producto precipitado se
recogió por centrifugación, se re-disolvió en 40 ml
agua, y se dializó durante 3 días frente a agua (tubo de diálisis
SnakeSkin, límite de exclusión 3,5 KD, Perbio Science
Deutschland GmbH, Bonn, Alemania), y se liofilizó.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2.3
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 0,96 g de HES18/0,4 (MW = 18.000
D, DS=0,4) en 8 ml de tampón de acetato sódico acuoso 0,1 M, pH
5,2, y se añadieron 8 mmol de
1,4-fenilen-bis-3-tiosemicarbazida
(Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, Alemania). Después de agitar
durante 18 horas a 25ºC, se añadieron 8 ml agua a la mezcla de
reacción, y la suspensión se centrifugó durante 15 minutos a 4.500
rpm. El líquido sobrenadante transparente se decantó y
subsiguientemente se añadió a 160 ml de una mezcla fría de acetona y
etanol 1:1 (v/v). El producto precipitado se recogió por
centrifugación, se re-disolvió en 40 ml agua, y se
centrifugó durante 15 minutos a 4.500 rpm. El líquido transparente
sobrenadante se dializó durante 3 días frente a agua (tubo de
diálisis SnakeSkin, límite de exclusión 3,5 KD, Perbio
Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania), y se liofilizó.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizó
O-[2-(2-aminooxietoxi)etil]hidroxilamina
como se describe en Boturyn et al. Tetrahedron 53 (1997) pp.
5485-5492 en 2 etapas a partir de materiales
comercialmente disponibles.
Se disolvieron 0,96 g de HES18/0,4 (MW = 18.000
D, DS=0,4) en 8 ml de tampón de acetato sódico acuoso 0,1 M, pH
5,2, y se añadieron 8 mmol de
O-[2-(2-aminooxi-etoxi)etil]hidroxilamina.
Después de agitar durante 18 horas a 25ºC, la mezcla de reacción se
añadió a 160 ml de una mezcla fría de acetona y etanol 1:1 (v/v). El
producto precipitado se recogió por centrifugación, se
re-disolvió en 40 ml agua, y se dializó durante 3
días frente a agua (tubo de diálisis SnakeSkin, límite de
exclusión 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania),
y se liofilizó.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 0,12 mmol de
oxo-HES 10/0,4 (MW = 10.000 D, DS=0,4, preparado de
acuerdo con el documento DE 19628705 A1) en 3 ml de
dimetilsulfóxido (DMSO) absoluto y se añadieron gota a gota bajo una
atmósfera de nitrógeno a una mezcla de 15 mmol de carbohidrazida
(Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania) en 15 ml de DMSO. Después de
agitar durante 88 horas a 65ºC, la mezcla de reacción se añadió a
160 ml de una mezcla fría de acetona y etanol 1:1 (v/v). El
precipitado se recogió por centrifugación y se dializó durante 4
días frente a agua (tubo de diálisis SnakeSkin, límite de
exclusión 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y
se liofilizó.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 0,12 mmol de
oxo-HES 10/0,4 (MW =10.000 D, DS=0,4, preparado de
acuerdo con el documento DE 19628705 A1) en 3 ml de
dimetilsulfóxido (DMSO) absoluto y se añadieron gota a gota bajo una
atmósfera de nitrógeno a una mezcla de 15 mmol de
1,4-fenilen-bis-3-tiosemicarbazida
(Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, Alemania) en 15 ml de DMSO.
Después de agitar durante 88 horas a 65ºC, la mezcla de reacción se
añadió a 160 mL de una mezcla fría de acetona y etanol 1:1 (v/v).
El precipitado se recogió por centrifugación y se dializó durante 4
días frente a agua (Tubo de diálisis SnakeSkin, límite de
exclusión 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y
se liofilizó.
\newpage
Ejemplo
3.3
H_{2}N-NH_{2}
Se disolvieron 1,44 g (0,12 mmol) de
oxo-HES 10/0,4 (MW = 10.000 D, DS=0,4, preparado de
acuerdo con el documento DE 19628705 A1) en 3 ml de
dimetilsulfóxido (DMSO) absoluto y se añadieron gota a gota bajo una
atmósfera de nitrógeno a una mezcla de 0,47 ml (15 mmol) de
hidrazina en 15 ml de DMSO. Después de agitar durante 19 horas a
40ºC, la mezcla de reacción se añadió a 160 ml de una mezcla fría de
etanol y acetona 1:1 (v/v). El producto precipitado se recogió por
centrifugación, se re-disolvió en 40 ml de agua y se
dializó durante 2 días frente a una solución de trietilamina al
0,5% (v/v) en agua y durante 2 días frente a agua (tubo de diálisis
SnakeSkin, límite de exclusión 3,5 KD, Perbio Science
Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y se liofilizó.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3.4
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizó
O-[2-(2-aminooxietoxi)etil]hidroxilamina
como se ha descrito por Boturyn et al en 2 etapas a partir de
materiales comercialmente disponibles (Boturyn, Boudali, Constant,
Defrancq, Lhomme, 1997, Tetrahedron, 53, 5485).
Se disolvieron 1,44 g (0,12 mmol) de
oxo-HES 10/0,4 (MW = 10.000 D, DS=0,4, preparado de
acuerdo con el documento DE 19628705 A1) en 3 ml de
dimetilsulfóxido (DMSO) absoluto y se añadieron gota a gota bajo una
atmósfera de nitrógeno a una mezcla de 2,04 g (15 mmol) de
O-[2-(2-aminooxietoxi)etil]hidroxilamina
en 15 ml DMSO. Después de agitar durante 48 horas a 65ºC la mezcla
de reacción se añadió a 160 ml de una mezcla fría de etanol y
acetona 1:1 (v/v). El producto precipitado se recogió por
centrifugación, se re-disolvió en 40 ml de agua y
se dializó durante 4 días frente a agua (tubo de diálisis
SnakeSkin, límite de exclusión 3,5 KD, Perbio Science
Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y se liofilizó.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3.5
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 1,74 g (15 mmol) de dihidrazida
adípica (Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, Alemania) en 20 ml
dimetilsulfóxido (DMSO) absoluto a 65ºC y se añadieron gota a gota
bajo una atmósfera de nitrógeno 1,44 g (0,12 mmol) de
oxo-HES 10/0,4 (MW = 10.000 D, DS=0,4, preparado de
acuerdo con el documento DE 19628705 A1), disuelto en 3 ml DMSO
absoluto. Después de agitar durante 68 horas a 60ºC la mezcla de
reacción se añadió a 200 ml de agua. La solución que contenía el
producto de reacción se dializó durante 2 días frente a trietilamina
al 0,5% (v/v) en solución de agua y durante 2 días frente a agua
(tubo de diálisis SnakeSkin, límite de exclusión 3,5 KD,
Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y se liofilizó.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3.6
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 1,44 g (0,12 mmol) de
oxo-HES 10/0,4 (MW = 10.000 D, DS=0,4, preparado de
acuerdo con el documento DE 19628705 A1) en 3 ml de
dimetilsulfóxido (DMSO) seco y se añadieron gota a gota bajo una
atmósfera de nitrógeno a una mezcla de 1,51 ml (15 mmol) de
1,4-diaminobutano (Sigma Aldrich, Taufkirchen,
Alemania) en 15 ml de DMSO. Después de agitar durante 19 horas a
40ºC la mezcla de reacción se añadió a 160 ml de una mezcla fría de
etanol y acetona 1:1 (v/v). El precipitado de
amino-HES 10KD/0,4 se recogió por centrifugación, se
re-disolvió en 40 ml de agua y se dializó durante 4
días frente a agua (tubo de diálisis SnakeSkin, límite de
exclusión 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y
se liofilizó.
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjo eritropoyetina oxidada como se
describe en el Ejemplo 8. Como eritropoyetina oxidada, se usó la
EPO-GT-1-A como se
describe en el Ejemplo 8.11(c)
(EPO-GT-1 sin hidrólisis ácida,
tratada con oxidación suave con peryodato).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5.1
EPO oxidada (1,055 \mug/\mul) en 20 mM de
tampón de PBS se ajustó a pH 5,3 con tampón de acetato sódico 5 M,
pH 5,2. A 19 \mul de la solución de EPO, se añadieron 18 \mul de
una solución del derivado de HES como se produjo de acuerdo con el
Ejemplo 2.1 (MW 18 kD; 18,7 \mug/\mul en tampón de acetato
sódico 0,1 M, pH 5,2), y la mezcla se incubó durante 16 horas a
25ºC. Después de la liofilización, el producto en bruto se analizó
por SDS-PAGE con tampón NuPAGE
Bis-Tris al 10% geles/MOPS (Invitrogen, Carlsbad,
CA, EE.UU.) como se describe en las instrucciones dadas por
Invitrogen. El gel se tiñó durante la noche con el reactivo de
tinción Roti-Blue Coomasie (Roth,
Karlsruhe,
Alemania).
Alemania).
El resultado experimental se muestra en la
Figura 1, Una conjugación satisfactoria viene indicada por la
migración de la banda de proteína a pesos moleculares mayores. El
mayor ancho de banda se debe a la distribución de pesos moleculares
de los derivados de HES usados y al número de derivados de HES
unidos a la proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5.2
EPO oxidada (1,055 \mug/\mul) en tampón de
PBS 20 mM se ajustó a pH 5,3 con tampón de acetato sódico 5 M, pH
5,2. A 19 \mul de la solución de EPO, se añadieron 18 \mul de
una solución del derivado de HES como se produjo de acuerdo con el
ejemplo 2,3 (MW 18 kD; 18,7 \mug/\mul en tampón de acetato
sódico 0,1 M, pH 5,2), y la mezcla se incubó durante 16 horas a
25ºC. Después de liofilización, el producto en bruto se analizó por
SDS-PAGE con tampón NuPAGE Bis-Tris
al 10% geles/MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) como se
describe en las instrucciones dadas por Invitrogen.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5.3
EPO oxidada (1,055 \mug/\mul) en tampón de
PBS 20 mM se ajustó a pH 5,3 con tampón de acetato sódico 5 M, pH
5,2. A 19 \mul de la solución de EPO se añadieron 18 \mul de una
solución del derivado de HES como se produjo de acuerdo con el
Ejemplo 2.4 (MW 18 kD; 18,7 \mug/\mul en tampón de acetato
sódico 0,1 M, pH 5,2), y la mezcla se incubó durante 16 horas a
25ºC. Después de liofilización, el producto en bruto se analizó por
SDS-PAGE con tampón NuPAGE Bis-Tris
al 10% geles/MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) como se
describe en las instrucciones dadas por Invitrogen. El gel se tiñó
con el reactivo de tinción Roth-Blue
Coomassie (Roth, Karlsruhe, Alemania) durante la noche.
El resultado experimental se muestra en la
Figura 2. Una conjugación satisfactoria viene indicada por la
migración de la banda proteínica a pesos moleculares superiores. El
mayor ancho de banda se debe a la distribución de pesos moleculares
de los derivados de HES usados y al número de HES unidos a la
proteína.
\newpage
Ejemplo
5.4
EPO oxidada (1,055 \mug/\mul) en tampón de
PBS 20 mM se ajustó a pH 5,3 con tampón de acetato sódico 5 M, pH
5,2. A 19 \mul de la solución se EPO se añadieron 18 \mul de una
solución del derivado de HES como se produjo de acuerdo con el
Ejemplo 3,1 (MW 10 kD; 18,7 \mug/\mul en tampón de acetato
sódico 0,1 M, pH 5,2), y la mezcla se incubó durante 16 horas a
25ºC. Después de liofilización, el producto en bruto se analizó por
SDS-PAGE con tampón NuPAGE Bis-Tris
al 10% geles/MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) como se
describe en las instrucciones dadas por Invitrogen. El gel se tiñó
con el reactivo de tinción Roth-Blue
Coomassie (Roth, Karlsruhe, Alemania) durante la noche
El resultado experimental se muestra en la
Figura 3. Una conjugación satisfactoria viene indicada por la
migración de la banda proteínica a pesos moleculares superiores. El
mayor ancho de banda se debe a la distribución de pesos moleculares
de los derivados de HES usados y al número de HES unidos a la
proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5.5
EPO oxidada (1,055 \mug/\mul) en tampón de
PBS 20 mM se ajustó a pH 5,3 con tampón de acetato sódico 5 M, pH
5,2. A 19 \mul de la solución de EPO se añadieron 18 \mul de una
solución del derivado de HES como se produjo de acuerdo con el
Ejemplo 3.1 (MW 18 kD; 18,7 \mug/\mul en tampón de acetato
sódico 0,1 M, pH 5,2), y la mezcla se incubó durante 16 horas a
25ºC. Después de liofilización, el producto en bruto se analizó por
SDS-PAGE con tampón NuPAGE Bis-Tris
al 10% geles/MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) como se
describe en las instrucciones dadas por Invitrogen. El gel se tiñó
con el reactivo de tinción Roth-Blue
Coomassie (Roth, Karlsruhe, Alemania) durante la noche.
El resultado experimental se muestra en la
Figura 3. Una conjugación satisfactoria viene indicada por la
migración de la banda proteínica a pesos moleculares superiores. El
mayor ancho de banda se debe a la distribución de pesos moleculares
de los derivados de HES usados y al número de HES unidos a la
proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
241,5 \mug de eritropoyetina
(EPO-GT-1, véase el Ejemplo 8) en
500 \mul de un tampón de borato sódico 0,1 M, EDTA 5 mM, DTT 10
mM (Lancaster, Morcambe, Reino Unido), pH 8,3, se incubaron durante
1 hora a 37ºC. El DTT se separó por filtración centrífuga con un
concentrador VIVASPIN de 0,5 ml, 10 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover,
Alemania) a 13.000 rpm, y después de lavar 3 veces con el tampón de
borato y dos veces con tampón de fosfato (0,1 M, NaCl 9,15 M, EDTA
50 mM, pH 7,2). El gel se tiñó con el reactivo de tinción
Roth-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe,
Alemania) durante la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
En cada uno de los siguientes ejemplos se usó
como compuesto reticulante éster de
N-(alfa-maleimidoacetoxi)succinimida
(AMAS).
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Ejemplo
7.1
A 50 nmol del derivado de HES, producido de
acuerdo con el Ejemplo 2.1 y disuelto en 200 \mul de una tampón
de fosfato sódico 0,1 M (0,1 M, NaCl 9,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) se
añadieron 10 \mul de una solución de 2,5 \mumol de AMAS (Sigma
Aldrich, Taufkirchen, Alemania) en DMSO. La solución transparente se
incubó durante 80 minutos a 25ºC y 20 minutos a 40ºC. El AMAS
restante se retiró por filtración centrífuga con un concentrador
VIVASPIN de 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Alemania) a
13.000 rpm, lavando 4 veces durante 30 minutos con el tampón de
fosfato.
A la solución residual se añadieron 15 \mug de
tioEPO producida de acuerdo con el Ejemplo 5 (1 \mug/\mul en
tampón de fosfato), y la mezcla se incubó durante 16 horas a 25ºC.
Después de liofilización, el producto bruto se analizó por
SDS-PAGE con tampón NuPAGE Bis-Tris
al 10% geles/MOPS (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) como se describe
en las instrucciones dados por Invitrogen. El gel se tiñó con el
reactivo de tinción Roth-Blue Coomassie
(Roth, Karlsruhe, Alemania) durante la noche.
El resultado experimental se muestra en la
Figura 4. Una conjugación satisfactoria viene indicada por la
migración de la banda proteínica a pesos moleculares superiores. El
mayor ancho de banda se debe a la distribución de pesos moleculares
de los derivados de HES usados y al número de HES unidos a la
proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7.2
A 50 nmol del derivado de HES, producido de
acuerdo con el Ejemplo 2.2 y disuelto en 200 \mul de un tampón de
fosfato sódico 0,1 M (0,1 M, NaCl 9,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) se
añadieron 10 \mul de una solución de 2,5 \mumol de AMAS (Sigma
Aldrich, Taufkirchen, Alemania) en DMSO. La solución transparente se
incubó durante 80 minutos a 25ºC y 20 minutos a 40ºC. El AMAS
restante se retiró por filtración centrífuga con un concentrador
VIVASPIN de 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Alemania) a
13.000 rpm, lavando 4 veces durante 30 minutos con tampón de
fosfato.
A la solución residual se añadieron 15 \mug de
TioEPO, producida de acuerdo con el Ejemplo 5 (1 \mug/\mul en
tampón de fosfato), y la mezcla se incubó durante 16 horas a 25ºC.
Después de liofilización, el producto en bruto se analizó por
SDS-PAGE con tampón NuPAGE Bis-Tris
al 10% geles/MOPS (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) como se describe
en las instrucciones dadas por Invitrogen. El gel se tiñó con el
reactivo de tinción Roth-Blue Coomassie
(Roth, Karlsruhe, Alemania) durante la noche.
El resultado experimental se muestra en la
Figura 5. Una conjugación satisfactoria viene indicada por la
migración de la banda proteínica a pesos moleculares superiores. El
mayor ancho de banda se debe a la distribución de pesos moleculares
de los derivados de HES usados y al número de HES unidos a la
proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7.3
A 50 nmol del derivado de HES, producido de
acuerdo con el Ejemplo 2.3 y disuelto en 200 \mul de un tampón de
fosfato sódico 0,1 M (0,1 M, NaCl 9,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) se
añadieron 10 \mul de una solución de 2,5 \mumol de AMAS (Sigma
Aldrich, Taufkirchen, Alemania) en DMSO. La solución transparente se
incubó durante 80 minutos a 25ºC y 20 minutos a 40ºC. El AMAS
restante se separó por filtración centrífuga con un concentrador
VIVASPIN de 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Alemania) a
13.000 rpm, lavando 4 veces durante 30 minutos con tampón de
fosfato.
A la solución residual se añadieron 15 \mug de
tioEPO, producida de acuerdo con el Ejemplo 5 (1 \mug/\mul en
tampón de fosfato), y la mezcla se incubó durante 16 horas a 25ºC.
Después de liofilización, el producto en bruto se analizó por
SDS-PAGE con tampón NuPAGE Bis-Tris
al 10% geles/MOPS (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) como se describe
en las instrucciones dadas por Invitrogen. El gel se tiñó con el
reactivo de tinción Roth-Blue Coomassie
(Roth, Karlsruhe, Alemania) durante la noche.
El resultado experimental se muestra en la
Figura 5. Una conjugación satisfactoria viene indicada por la
migración de la banda proteínica a pesos moleculares superiores. El
mayor ancho de banda se debe a la distribución de pesos moleculares
de los derivados de HES usados y al número de HES unidos a la
proteína.
\newpage
Ejemplo
7.4
A 50 nmol del derivado de HES, producido de
acuerdo con el Ejemplo 2.4 y disuelto en 200 \mul de un tampón de
fosfato sódico 0,1 M (0,1 M, NaCl 9,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) se
añadieron 10 \mul de una solución de 2,5 \mumol de AMAS (Sigma
Aldrich, Taufkirchen, Alemania) en DMSO. La solución transparente se
incubó durante 80 minutos a 25ºC y 20 minutos a 40ºC. El AMAS
restante se separó por filtración centrífuga con un concentrador
VIVASPIN de 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Alemania) a
13.000 rpm, lavando 4 veces durante 30 minutos con tampón de
fosfato.
A la solución residual se añadieron 15 \mug de
tioEPO, producida de acuerdo con el Ejemplo 5 (1 \mug/\mul en
tampón de fosfato), y la mezcla se incubó durante 16 horas a 25ºC.
Después de liofilización, el producto en bruto se analizó por
SDS-PAGE con tampón NuPAGE Bis-Tris
al 10% geles/MOPS (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) como se describe
en las instrucciones dadas por Invitrogen. El gel se tiñó con el
reactivo de tinción Roth-Blue Coomassie
(Roth, Karlsruhe, Alemania) durante la noche.
El resultado experimental se muestra en la
Figura 4. Una conjugación satisfactoria viene indicada por la
migración de la banda proteínica a pesos moleculares superiores. El
mayor ancho de banda se debe a la distribución de pesos moleculares
de los derivados de HES usados y al número de HES unidos a la
proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7.5
A 50 nmol del derivado de HES, producido de
acuerdo con el Ejemplo 1.1, en condiciones de incubación de 80ºC y
17 horas, así como de 25ºC y 3 días, y disuelto en 200 \mul de un
tampón de fosfato sódico 0,1 M (0,1 M, NaCl 9,15 M, EDTA 50 mM, pH
7,2) se añadieron 10 \mul de una solución de 2,5 \mumol de AMAS
(Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania) en DMSO. La solución
transparente se incubó durante 80 minutos a 25ºC y 20 minutos a
40ºC. El AMAS restante se separó por filtración centrífuga con un
concentrador VIVASPIN de 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover,
Alemania) a 13.000 rpm, lavando 4 veces durante 30 minutos con
tampón de fosfato.
A la solución residual se añadieron 15 \mug de
tioEPO como se produjo de acuerdo con el Ejemplo 5 (1 \mug/\mul
en tampón de fosfato), y la mezcla se incubó durante 16 horas a
25ºC. Después de liofilización, el producto en bruto se analizó por
SDS-PAGE con tampón NuPAGE Bis-Tris
al 10% geles/MOPS (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) como se describe
en las instrucciones dadas por Invitrogen. El gel se tiñó con el
reactivo de tinción Roth-Blue Coomassie
(Roth, Karlsruhe, Alemania) durante la noche.
El resultado experimental se muestra en la
Figura 5. Una conjugación satisfactoria viene indicada por la
migración de la banda proteínica a pesos moleculares superiores. El
mayor ancho de banda se debe a la distribución de pesos moleculares
de los derivados de HES usados y al número de HES unidos a la
proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7.6
A 50 nmol del derivado de HES, producido de
acuerdo con el Ejemplo 1.3, en condiciones de incubación de 80ºC y
17 horas, así como de 25ºC y 3 días, y disuelto en 200 \mul de un
tampón de fosfato sódico 0,1 M (0,1 M, NaCl 9,15 M, EDTA 50 mM, pH
7,2) se añadieron 10 \mul de una solución de 2,5 \mumol de AMAS
(Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania) en DMSO. La solución
transparente se incubó durante 80 minutos a 25ºC y 20 minutos a
40ºC. El AMAS restante se separó por filtración centrífuga con un
concentrador VIVASPIN de 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover,
Alemania) a 13.000 rpm, lavando 4 veces durante 30 minutos con
tampón de fosfato.
A la solución residual se añadieron 15 \mug de
tioEPO como se produjo de acuerdo con el ejemplo 5 (1 \mug/\mul
en tampón de fosfato), y la mezcla se incubó durante 16 horas a
25ºC. Después de liofilización, el producto en bruto se analizó por
SDS-PAGE con tampón NuPAGE Bis-Tris
al 10% geles/MOPS (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) como se describe
en las instrucciones dadas por Invitrogen. El gel se tiñó con el
reactivo de tinción Roth-Blue Coomassie
(Roth, Karlsruhe, Alemania) durante la noche.
El resultado experimental se muestra en la
Figura 5. Una conjugación satisfactoria viene indicada por la
migración de la banda proteínica a pesos moleculares superiores. El
mayor ancho de banda se debe a la distribución de pesos moleculares
de los derivados de HES usados y al número de HES unidos a la
proteína.
\newpage
Ejemplo
7.7
A 50 nmol del derivado de HES, producido de
acuerdo con el Ejemplo 3.1, y disuelto en 200 \mul de un tampón
de fosfato sódico 0,1 M (0,1 M, NaCl 9,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) se
añadieron 10 \mul de una solución de 2,5 \mumol de AMAS (Sigma
Aldrich, Taufkirchen, Alemania) en DMSO. La solución transparente se
incubó durante 80 minutos a 25ºC y 20 minutos a 40ºC. El AMAS
restante se separó por filtración centrífuga con un concentrador
VIVASPIN de 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Alemania) a
13.000 rpm, lavando 4 veces durante 30 minutos con tampón de
fosfato.
A la solución residual se añadieron 15 \mug de
TioEPO (1 \mug/\mul en tampón de fosfato), y la mezcla se
incubó durante 16 horas a 25ºC. Después de liofilización, el
producto en bruto se analizó por SDS-PAGE con
tampón NuPAGE Bis-Tris al 10% geles/MOPS
(Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) como se describe en las instrucciones
dadas por Invitrogen. El gel se tiñó con el reactivo de tinción
Roth-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe,
Alemania) durante la noche.
El resultado experimental se muestra en la
Figura 6. Una conjugación satisfactoria viene indicada por la
migración de la banda proteínica a pesos moleculares superiores. El
mayor ancho de banda se debe a la distribución de pesos moleculares
de los derivados de HES usados y al número de HES unidos a la
proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7.8
A 50 nmol del derivado de HES, producido de
acuerdo con el Ejemplo 3.2, y disuelto en 200 \mul de un tampón
de fosfato sódico 0,1 M (0,1 M, NaCl 9,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) se
añadieron 10 \mul de una solución de 2,5 \mumol de AMAS (Sigma
Aldrich, Taufkirchen, Alemania) en DMSO y la solución transparente
se incubó durante 80 minutos a 25ºC y 20 minutos a 40ºC. El AMAS
restante se separó por filtración centrífuga con un concentrador
VIVASPIN de 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Alemania) a
13.000 rpm, lavando 4 veces durante 30 minutos con tampón de
fosfato.
A la solución residual se añadieron 15 \mug de
tioEPO (1 \mug/\mul en tampón de fosfato), y la mezcla se
incubó durante 16 horas a 25ºC. Después de liofilización, el
producto en bruto se analizó por SDS-PAGE con
tampón NuPAGE Bis-Tris al 10% geles/MOPS
(Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) como se describe en las instrucciones
dadas por Invitrogen. El gel se tiñó con el reactivo de tinción
Roth-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe,
Alemania) durante la noche.
El resultado experimental se muestra en la
Figura 6. Una conjugación satisfactoria viene indicada por la
migración de la banda proteínica a pesos moleculares superiores. El
mayor ancho de banda se debe a la distribución de pesos moleculares
de los derivados de HES usados y al número de HES unidos a la
proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7.9
A 50 nmol del derivado de HES, producido de
acuerdo con el Ejemplo 3.3 y disuelto en 200 \mul de un tampón de
fosfato sódico 0,1 M (0,1 M, NaCl 9,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) se
añadieron 10 \mul de una solución de 2,5 \mumol de AMAS (Sigma
Aldrich, Taufkirchen, Alemania) en DMSO. La solución transparente se
incubó durante 80 minutos a 25ºC y 20 minutos a 40ºC. El AMAS
restante se separó por filtración centrífuga con un concentrador
VIVASPIN de 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Alemania) a
13.000 rpm, lavando 4 veces durante 30 minutos con tampón de
fosfato.
A la solución residual se añadieron 15 \mug de
tioEPO (1 \mug/\mul en tampón de fosfato), y la mezcla se
incubó durante 16 horas a 25ºC. Después de liofilización, el
producto en bruto se analizó por SDS-PAGE con
tampón NuPAGE Bis-Tris al 10% geles/MOPS
(Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) como se describe en las instrucciones
dadas por Invitrogen. El gel se tiñó con el reactivo de tinción
Roth-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe,
Alemania) durante la noche.
El resultado experimental se muestra en la
Figura 6. Una conjugación satisfactoria viene indicada por la
migración de la banda proteínica a pesos moleculares superiores. El
mayor ancho de banda se debe a la distribución de pesos moleculares
de los derivados de HES usados y al número de HES unidos a la
proteína.
\newpage
Ejemplo
7.10
A 50 nmol del derivado de HES, producido de
acuerdo con el Ejemplo 3.4 y disuelto en 200 \mul de un tampón de
fosfato sódico 0,1 M (0,1 M, NaCl 9,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) se
añadieron 10 \mul de una solución de 2,5 \mumol de AMAS (Sigma
Aldrich, Taufkirchen, Alemania) en DMSO y la solución transparente
se incubó durante 80 minutos a 25ºC y 20 minutos a 40ºC. El AMAS
restante se separó por filtración centrífuga con un concentrador
VIVASPIN de 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Alemania) a
13.000 rpm, lavando 4 veces durante 30 minutos con tampón de
fosfato.
A la solución residual se añadieron 15 \mug de
tioEPO (1 g/\mul en tampón de fosfato), y la mezcla se incubó
durante 16 horas a 25ºC. Después de liofilización, el producto en
bruto se analizó por SDS-PAGE con tampón NuPAGE
Bis-Tris al 10% geles/MOPS (Invitrogen, Carlsbad,
EE.UU.) como se describe en las instrucciones dadas por Invitrogen.
El gel se tiñó con el reactivo de tinción
Roth-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe,
Alemania) durante la noche.
El resultado experimental se muestra en la
Figura 6. Una conjugación satisfactoria viene indicada por la
migración de la banda proteínica a pesos moleculares superiores. El
mayor ancho de banda se debe a la distribución de pesos moleculares
de los derivados de HES usados y al número de HES unidos a la
proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7.11
A 50 nmol del derivado de HES, producido de
acuerdo con el Ejemplo 3.5 y disuelto en 200 \mul de un tampón de
fosfato sódico 0,1 M (0,1 M, NaCl 9,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) se
añadieron 10 \mul de una solución de 2,5 \mumol de AMAS (Sigma
Aldrich, Taufkirchen, Alemania) en DMSO y la solución transparente
se incubó durante 80 minutos a 25ºC y 20 minutos a 40ºC. El AMAS
restante se separó por filtración centrífuga con un concentrador
VIVASPIN de 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Alemania) a
13.000 rpm, lavando 4 veces durante 30 minutos con tampón de
fosfato.
A la solución residual se añadieron 15 \mug de
tioEPO (1 \mug/\mul en tampón de fosfato), y la mezcla se
incubó durante 16 horas a 25ºC. Después de liofilización, el
producto en bruto se analizó por SDS-PAGE con
tampón NuPAGE Bis-Tris al 10% geles/MOPS
(Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) como se describe en las instrucciones
dadas por Invitrogen. El gel se tiñó con el reactivo de tinción
Roth-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe,
Alemania) durante la noche.
El resultado experimental se muestra en la
Figura 6. Una conjugación satisfactoria viene indicada por la
migración de la banda proteínica a pesos moleculares superiores. El
mayor ancho de banda se debe a la distribución de pesos moleculares
de los derivados de HES usados y al número de HES unidos a la
proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7.12
A 50 nmol del derivado de HES, producido de
acuerdo con el Ejemplo 3.6 y disuelto en 200 \mul de un tampón de
fosfato sódico 0,1 M (0,1 M, NaCl 9,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) se
añadieron 10 \mul de una solución de 2,5 \mumol de AMAS (Sigma
Aldrich, Taufkirchen, Alemania) en DMSO y la solución transparente
se incubó durante 80 minutos a 25ºC y 20 minutos a 40ºC. El AMAS
restante se separó por filtración centrífuga con un concentrador
VIVASPIN de 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Alemania) a
13.000 rpm, lavando 4 veces durante 30 minutos con tampón de
fosfato.
A la solución residual se añadieron 15 \mug de
TioEPO como se produjo de acuerdo con el Ejemplo 5 (1 \mug/\mul
en tampón de fosfato), y la mezcla se incubó durante 16 horas a
25ºC. Después de liofilización, el producto en bruto se analizó por
SDS-PAGE con tampón NuPAGE Bis-Tris
al 10% geles/MOPS (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) como se describe
en las instrucciones dadas por Invitrogen. El gel se tiñó con el
reactivo de tinción Roth-Blue Coomassie
(Roth, Karlsruhe, Alemania) durante la noche.
El resultado experimental se muestra en la
Figura 6. Una conjugación satisfactoria viene indicada por la
migración de la banda proteínica a pesos moleculares superiores. El
mayor ancho de banda se debe a la distribución de pesos moleculares
de los derivados de HES usados y al número de HES unidos a la
proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron conjugados de
HES-EPO acoplando derivados de HES (peso molecular
medio 18.000 Dalton; grado de sustitución con hidroxietilo 0,4) a
los residuos de ácido siálico parcialmente oxidados (peryodato
suave) en las cadenas de oligosacárido de la EPO humana
recombinante. Basándose en el análisis estructural de los
carbohidratos las modificaciones introducidas no afectaron a la
integridad estructural del núcleo de las cadenas de oligosacárido
puesto el análisis por MALDITTOF-MS de los glicanos
modificados con HES tratados en condiciones ácidas suaves revelaron
cadenas de tipo N-acetil-lactosamina
intactas y neutras que eran indistinguibles de las observadas en el
producto EPO no modificado. Los resultados obtenidos indican que al
menos 3 residuos de HES modificados están unidos por molécula de
EPO en el caso de la preparación de EPO que se sometió a
modificación sin eliminación previa parcial de ácido siálico. Una
variante de EPO que carece de aproximadamente 50% de los residuos
de ácido siálico de la proteína anterior mostró una movilidad de
peso molecular alto aparente similar en SDS-PAGE
(60-110 KDa vs 40 KDa para el patrón BRP EPO). La
EPO modificada con HES es estable en condiciones de cromatografía de
cambio iónico a temperatura ambiente a pH 3-10.
El bioensayo con EPO en el sistema de ratón
normocitémico indica que la EPO modificada con HES tiene una
actividad específica 2,5-3,0 (UI/mg) veces superior
en este ensayo, cuando se compara con el patrón BRP EPO
internacional basado en la determinación de proteínas usando el
valor de la absorción UV de la Farmacopea Europea y un método de
determinación de la proteína EPO por RP-HPLC
calibrada frente a la preparación patrón de BRP EPO.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8.1
Se incubaron muestras con 25 unidades (de
acuerdo con la especificación del fabricante, Roche Diagnostics,
Alemania) de PNGasa F recombinante durante una noche a 37ºC. La
digestión completa se monitorizó respecto al cambio de la movilidad
específica de la proteína en SDS-PAGE. Los
N-glicanos liberados se separaron del polipéptido
por adición de 3 volúmenes de etanol frío al 100% e incubación a
-20ºC durante al menos 2 horas (Schroeter S et al., 1999).
La proteína precipitada se separó por centrifugación durante 10
minutos a 4ºC a 13.000 rpm. El sedimento se sometió a dos lavados
adicionales con 500 \mul de etanol al 75% enfriado con hielo. Los
oligosacáridos de los líquidos sobrenadantes reunidos se secaron en
una centrífuga de vacío (concentrador Speed Vac de Savant
Instruments Inc., EE.UU.). Las muestras de glicano se desalificaron
usando cartuchos Hipercarb (de 25 mg o 100 mg de HiperCarb) como
sigue antes de su uso: las columnas se lavaron con 3 x 500 \mul
de acetonitrilo al 80% (v/v) en TFA al 0,1% seguido por lavados con
3 x 500 \muI de agua. Las muestras se diluyeron con agua hasta un
volumen final de 300 \mul - 600 \mul antes de ser cargadas en el
cartucho que luego fue exhaustivamente lavado con agua. Los
oligosacáridos se eluyeron con 1,2 ml (cartuchos de 25 mg; 1,8 ml
en el caso de cartuchos de 100 mg) acetonitrilo al 25% en agua que
contenía ácido trifluoroacético al 0,1% (v/v). Los oligosacáridos
eluidos se neutralizaron con NH_{4}OH 2 M y se secaron en un
concentrador Speed Vac. En algunos casos la desalificación
de los oligosacáridos liberados por la N-glucosidasa
se realizó por adsorción
de la mezcla de digestión de muestras < 100 \mug de la(glico)proteína total en cartuchos Hipercarb de 100 mg.
de la mezcla de digestión de muestras < 100 \mug de la(glico)proteína total en cartuchos Hipercarb de 100 mg.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un instrumento de tiempo de vuelo
(TOF/TOF) Bruker ULTRAFLEX: se analizaron oligosacáridos
desialilados naturales usando ácido
2,5-dihidroxibenzoico como materia absorbente de UV
en el modo de ion positivo, así como en el modo de ion negativo
usando el reflectrón en ambos casos. Para los análisis por
espectrometría de masas (MS-MS), se seleccionaron
los iones precursores sometidos a disociación inducida por láser
(abreviadamente en lo sucesivo LID por la expresión inglesa
laser induced dissociation) y los iones fragmentarios
resultantes se separaron por la segunda etapa de TOF (LIFT) del
instrumento. Las soluciones de muestra de 1 \mul y una
concentración aproximada de 1-10
pmol\cdot\mul-^{1} se mezclaron con cantidades
iguales de la respectiva matriz. Esta mezcla se depositó como una
mancha sobre una placa de acero inoxidable y se secó a temperatura
ambiente antes del análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8.2
Se expresó EPO en células recombinantes de
ovario de hámster chino (abreviadamente CHO por la expresión inglesa
Chinese hamster ovary) como se describe (en Mueller PP et
al., 1999, Dorner AJ et al., 1984) y las preparaciones
se caracterizaron de acuerdo con los métodos descritos en Eur. Phar.
(Ph. Eur. 4, Monography 01/2002:1316: Erythropoietin
concentrated solution). El producto final tenía un contenido de
ácido siálico de 12 nmol (+/- 1,5 nMol) por nmol de proteína. Las
estructuras de oligosacáridos N-enlazados se
determinaron por HPAEC-PAD y por
MALDI/TOF-MS como se describe (por Nimtz et
al., 1999, Grabenhorst, 1999). Las preparaciones de EPO que se
obtuvieron contenían oligosacáridos di-, tri- y
tetra-sialilados (2-12%,
15-28% y 60-80%, respectivamente,
sulfatados y las cadenas pentasialiladas estaban presentes en
pequeñas cantidades). Las características de glucosilación global de
las preparaciones de EPO fueron similares a las del patrón de BRP
EPO internacional.
El modelo de enfoque isoeléctrico de la EPO
recombinante fue comparable al de la preparación del patrón de BRP
EPO internacional mostrado las isoformas correspondientes. El 25% de
la proteína EPO carecía de O-glicosilación en la
Ser_{126} de la cadena polipeptídica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8.3
La proteína EPO GT-1 (2,84
mg/ml) se calentó a 80ºC en tampón de fosfato de Na 20 mM, pH 7,0, y
luego se añadieron 100 \mul de H_{2}SO_{4} 1 N por cada ml de
la solución de EPO; la incubación se continuó durante 5 minutos, 10
minutos y 60 minutos, respectivamente, proporcionando preparaciones
de EPO de diferentes grados de desialilación. La determinación
cuantitativa de oligosacáridos con 0-4 ácidos
siálicos se realizó después de la liberación de los oligosacáridos
con la polipéptido-N-glucosidasa y
el aislamiento de las cadenas N-enlazadas se realizó
por desalificación usando cartuchos Hipercarb (de 25 mg, HiperSep
Hipercarb; ThermoHipersil-Keystone, Reino Unido).
Las preparaciones de EPO se neutralizaron por adición de NaOH 1 N y
se congelaron en N_{2} líquido y se conservaron a -20ºC hasta su
uso posterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8.4
A 10 mg de EPO no tratada o tratada en
condiciones ácidas suaves disuelta en 3,5 ml tampón de fosfato de Na
20 mM, pH 7,0 se añadieron 1,5 ml de tampón de acetato de Na 0,1 M,
pH 5,5 y la mezcla enfrió a 0ºC en un baño de hielo; se añadieron
500 \mul de peryodato de Na 10 mM y la mezcla de reacción se
mantuvo en la oscuridad durante 60 minutos a 0ºC. Luego se
añadieron 10 \mul de glicerol y la incubación se continuó durante
10 minutos más en la oscuridad. Las formas de EPO parcialmente
oxidadas se separaron de los reactivos por desalificación usando
concentradores VIVASPIN (10.000 MWCO, PES Vivascience AG, Hannover,
Alemania) de acuerdo con la recomendación del fabricante a 3000 rpm
en una centrífuga de laboratorio equipada con un rotor de ángulo
fijo. Después de congelar en nitrógeno líquido las preparaciones de
EPO se conservaron en un volumen final de 4 ml a -20ºC.
Partes alícuotas de 100 \mug de la de
preparación EPO se sometieron a tratamiento con
N-glucosidasa y se aislaron los oligosacáridos
usando cartuchos Hypercarb como se ha descrito. Los oligosacáridos
se desialilaron por tratamiento en condiciones ácidas suaves y se
analizaron por HPAEC-PAD y sus tiempos de retención
se compararon con los de oligosacáridos patrones auténticos como se
describe (por Nimtz et al., 1990 y 1993).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8.5
Se incubaron 5 mg de
EPO-GT-1 en 5 ml de tampón Tris/HCI
0,1 M pH 8,1 en presencia de ditioeritreitol (DTI) 30 mM a 37ºC
durante 60 minutos; la separación del DTT se consiguió usando un
concentrador Vivaspin a 4ºC, con 4 ciclos de cambio de tampón. La
preparación de EPO reducida final se conservó en nitrógeno líquido y
se conservó a -20ºC en tampón de acetato de Na a pH 5,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8.6
La determinación cuantitativa de la proteína EPO
se realizó midiendo la absorción UV a 280 nm de acuerdo con la Eur.
Pharm. (European Pharmacopeia 4, Monography 01/2002: 1316:
Erythropoietin concentrated solution) en una cubeta con un
longitud de trayectoria de 1 cm. Además, la EPO se cuantificó
aplicando un método de RP-HPLC usando una columna
RP-C4 (Vydac Protein C4, Nº de Cat. 214TP5410, Grace
Vydac, Ca, EE.UU.); el método de HPLC se calibró usando el patrón
de referencia de eritropoyetina BRP 1 (European Pharmacopeia,
Conseil de l'Europe B.P. 907-F67029, Strasbourg
Cedex 1).
\newpage
Ejemplo
8.7
Se incubaron 4,485 mg de EPO completamente
desialidada en tampón de fosfato de Na 20 mM, pH 6,8 en presencia
de 16 \mul de catalasa (6214 unidades/200 ml) y 80 \mul de
galactosa-oxidasa (2250 unidades/ml de Dactylium
dendroides (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania); la incubación a
37ºC se realizó durante una noche; se añadieron 2 veces 20 \mul
de galactosa-oxidasa, después de 4 horas, y después
de 8 horas, desde el comienzo de la incubación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8.8
La purificación de muestras de EPO (la
eliminación de derivados de HES sin reaccionar) se llevó a cabo a
temperatura ambiente. Las mezclas de incubación de EPO
(aproximadamente 5 mg de proteína EPO) se diluyeron a 1:10 con
tampón A (N-morfolina-ácido propanosulfónico 20 mM
[MOPS/NaOH] en H_{2}O bidestilada, pH 8,0) y se aplicaron a una
columna que contenía 3 ml Q-Sepharose HP (Pharmacia
Code Nº 17-1014-03, lote Nº 220211)
equilibrada con 10 volúmenes de columna (abreviadamente en los
sucesivo CV por la expresión inglesa column volumes) de
tampón A usando un caudal de 0,5 ml/minutos. La columna se lavó con
6-8 CV de tampón A (caudal = 0,8 ml/min) y la
elución se realizó usando tampón B (morfolina-ácido etanosulfónico
20 mM [MOPS/NaOH), NaCl 0,5 M en H_{2}O bidestilada, pH 6,5) a un
caudal de 0,5 ml/minutos. La EPO se detectó por absorción UV a 280
nm y se eluyó con aproximadamente 6 ml. La columna se regeneró
usando 3 CV de tampón C (MES 20 mM, NaCl 1,5 M en H_{2}O ajustado
a pH 6,5) y se re-equilibró usando 10 CV de tampón A
(caudal = 0,7 ml/min).
El cambio de tampón de los eluatos de EPO
obtenidos de la etapa de Q-Sepharose se realizó
usando concentradores VIVASPIN y solución salina tamponada con
fosfato (abreviadamente en lo sucesivo PBS por la expresión inglesa
phosphate buffer saline) con cada 3 ciclos de centrifugación
por muestra; las muestras se ajustaron a 2 ml con PBS y se
conservaron a -20ºC.
Solamente <25% de las formas de EPO
parcialmente diasililadas y subsiguientemente oxidadas con peryodato
en condiciones suaves que fueron sometidas a la modificación con
HES se obtuvieron a partir de eluato de Q-Sepharose,
puesto que, en las condiciones empleadas, las formas básicas de EPO
no se unen a la Q-Sepharose se encontraron en el
flujo pasante junto con los derivados de HES que no habían
reaccionado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8.9
Los oligosacáridos naturales purificados y
desialidados se analizaron por cromatografía de cambio aniónico a
alto pH (abreviadamente en lo sucesivo HPAE por la expresión
High-pH Anion-Exchange)
usando un sistema Dionex BioLC (Dionex, EE.UU.) equipado con una
column CarboPac PA1 (0,4 x 25 cm) en combinación con un detector
amperométrico pulsado (abreviadamente PAD por la expresión inglesa
Pulsed Amperometric Detector) (Schroter et al., 1999;
Nimtz et al., 1999). Los potenciales de detector (E) y las
duraciones de impulsos (T) fueron: E1: +50 mV, T1: 480 ms; E2: +500
mV, T2: 120 ms; E3: -500 mV, T3: 60 ms, y el intervalo de salida
500-1500 nA. Los oligosacáridos se inyectaron luego
en la columna CarboPac PA1 que fue equilibrada con disolvente A al
100%. Para los oligosacáridos desialilados la elución (caudal: 1
ml\cdotmin-^{1}) se realizó a un gradiente
lineal (0-20%) de disolvente B durante de un periodo
de 40 minutos seguido por un aumento lineal de disolvente B al
20-100% durante 5 minutos. El disolvente A fue NaOH
0,2 M en H_{2}O bidestilada, el disolvente B consistía en NaOAc
0,6 M en disolvente A. Para los oligosacáridos naturales la columna
se equilibró con disolvente C al 100% (NaOH 0,1 M en H_{2}O
bidestilada) y la elución (caudal: 1
ml\cdotmin-^{1}) se realizó aplicando un
gradiente lineal (0-35%) de disolvente D durante un
periodo de 48 minutos seguido por un aumento lineal de disolvente D
al 35-100% durante 10 minutos. El disolvente D
consistía en NaAc 0,6 M en disolvente C.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8.10
Los monosacáridos se analizaron como los
metil-glicósidos correspondientes después de
metanolisis, N-reacetilación y trimetilsililación
por GC/MS [Chaplin, M.F. (1982) A rapid and sensitive method for
the analysis of carbohydrate. Anal. Biochem. 123,
336-341]. Los análisis se realizaron en un
espectrómetro de masas con trampa de iones Finnigan GCQ (Finnigan
MAT Corp., San Jose, CA) funcionando en el modo de iones positivos,
equipado con una columna capilar DB5 de 30 m. El programa de
temperaturas fue: isoterma de 2 minutos a 80ºC, luego 10 grados
\hbox{min- ^{1} a 300ºC.}
Los monosacáridos se identificaron por su tiempo
de retención y modelo de fragmentación característico. Para la
cuantificación se usaron los resultados no corregidos de la
integración de los picos electrónicos. Los monosacáridos que
proporcionan más de un pico debido a la anomericidad y/o presencia
de formas furanoides y piranoides se cuantificaron sumando todos
los picos principales. Como compuesto patrón interno se usó 0,5
\mug de mio-inositol.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8.11
Ejemplo
8.11(a)
Las preparaciones de
EPO-GT-1 sometidas a tratamiento con
ácido en condiciones suaves durante 5, 10 ó 60 minutos se
analizaron por SDS-PAGE antes y después de la
liberación de los oligosacáridos N-enlazados por
incubación con N-glicosidasa como se muestra en la
Figura 7. Los oligosacáridos N-enlazados se
sometieron a cartografía de oligosacáridos por
HPAEC-PAD (Figura 8). La
EPO-GT-1 no tratada contenía >90%
de oligosacáridos N-enlazados con 3 ó 4 residuos de
ácido siálico, mientras que después de 5 minutos de incubación en
presencia de ácido débil <40% de las cadenas de carbohidratos
tenían 3 ó 4 residuos de ácido siálico. La HPAEC-PAD
de los N-glicanos desialilados reveló que la
relación de oligosacáridos neutros que se detectaron para la
EPO-GT-1 no tratada permanecía
estable en las preparaciones sometidas a tratamiento con ácido
durante 5, 10 ó 60 minutos. La técnica MALDI/TOF-MS
aplicada a los glicanos desialilados reveló que <90% de la fucosa
próxima estaba presente después del tratamiento de la proteína con
ácido débil.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8.11(b)
En la Figura 10 se comparan las movilidades en
SDS-PAGE de las formas de EPO tratadas con peryodato
débil que previamente fueron sometidas a un tratamiento con durante
ácido durante 5 a 10 minutos o no fueron tratadas. Las condiciones
usadas para la oxidación con peryodato de ácidos siálicos no cambió
el modelo de la SDS-PAGE de las de preparaciones
EPO (compárese con la Figura 7). La oxidación de los ácidos siálicos
dio como resultado en el análisis por HPAEC-PAD un
cambio de oligosacáridos a tiempos de elución anteriores (compárense
las Figuras 8 y 11).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8.11(c)
Se añadieron 400 \mug del derivado X de HES
modificado con hidroxilamina a 20 \mug de
EPO-GT-1-A (EPO
oxidada con peryodato en condiciones suaves, no hidrolizado con
ácido antes de la oxidación con peryodato en condiciones suaves) en
20 \muL de tampón de NaOAc 0,5 M, pH 5,5 y la reacción se detuvo
después de 30 minutos, 2, 4, y 17 horas, respectivamente,
congelando las muestras en nitrógeno líquido. Las muestras
subsiguientes se conservaron a -20ºC hasta un posterior
análisis.
Se añadió el tampón de muestra de
SDS-PAGE y las muestras se calentaron a 90ºC y se
aplicaron sobre geles de SDS. Como se muestra en la Figura 12, los
tiempos de incubación crecientes dieron como resultado una mayor
incubación cambio a pesos moleculares superiores de proteína.
Después 17 horas de incubación en presencia del derivado X de HES
modificado con hidroxilamina se detectó una banda de proteína difusa
teñida con azul Coomasie que migraba a una zona entre 60 y 11 KDa,
basada en la posición de los patrones de pesos moleculares (véase
la parte izquierda de la Figura 12). Por tratamiento con
des-N-glicosidasa la mayor parte de
la proteína se desplazó hacia la posición de la EPO
N-glucosilada (véase la Figura 12, gel de la parte
derecha; la flecha A indica la posición de migración de la
N-glucosidasa, la flecha B indica la posición de
migración de la EPO N-glucosilada; la banda difusa
de proteína visible en la región entre los patrones de pesos
moleculares 28 KDa y 36 KDa representa presumiblemente las formas
de EPO que están modificadas por HES y el sitio
O-glicosilación de la molécula. En vista de la
especificidad de la N-glicosidasa los inventores
llegaron a la conclusión de esto este resulta de que la
modificación con HES ocurre en los residuos de ácido siálico
oxidados con peryodato de los glicanos de la proteína EPO.
Los conjugados I de HES-EPO (que
se originan de la EPO-GT-1 después
de oxidación con peryodato en condiciones suaves, es decir, de
EPO-GT-1-A), II (que
resultan de EPO-GT-1 sometida a
hidrólisis ácida durante 5 minutos y oxidación con peryodato en
condiciones suaves), III (que resultan de EPO-GT1
sometida a hidrólisis ácida de 10 minutos y oxidación con peryodato
débil) se sintetizaron como se ha descrito antes. Se incluyó una
incubación de control (K) que contenía
EPO-GT-1 no modificada en las mismas
condiciones de tampón a las cuales se añadió una cantidad
equivalente de HES no modificado. Las mezclas de incubación se
sometieron a más purificación para el análisis bioquímico
subsiguiente de los derivados de HES-EPO.
La incubación de los conjugados I, II y III de
HES-EPO así como la incubación de control K se
sometieron a una etapa de purificación en
Q-Sepharose como se describe en el apartado
"Materiales y Métodos" (Ejemplo 8.8) con el fin de eliminar el
exceso de reactivo HES que no ha reaccionado que se espera en flujo
pasante de la columna de cambio iónico. Debido a las altas
cantidades de las formas de EPO básicas contenidas en las muestras
II y III previamente tratadas con ácido los inventores esperaron
cantidades considerables de producto EPO modificado de estas
incubaciones en el flujo pasante. Como se muestra en la Figura 13,
casi la totalidad del material de EPO de las muestras I fue
retenido por la columna de Q-Sepharose, mientras que
solo aproximadamente 20-30% de las muestras III y
II se recuperó en la fracción que se eluye con alta concentración de
sal. La totalidad del material proteínico de las incubaciones con
el derivado X de HES, tanto en el flujo pasante como en las
fracciones que se eluyen con alta concentración de sal, tenían un
peso molecular aparente superior en SDS-PAGE cuando
se comparan con la EPO de control.
Con el fin de caracterizar con más detalle la
EPO modificada con HES las muestras A y K (véase la Figura 11) se
compararon con la forma
EPO-GT-1-A oxidada
con peryodato. Las muestras se sometieron a tratamiento con
N-glicosidasa y como se representa en las Figuras
14a y 14b la liberación de los N-glicanos dio como
resultado dos bandas de bajo peso molecular en la posición de las
formas de EPO O-glicosiladas y no glicosilada de la
preparación patrón de EPO. En el caso de la muestra A se detectó una
banda más que migraba en la posición del patrón de peso molecular =
28 KD lo que sugiere la modificación con HES en el
O-glicano de esta variante de EPO (compárense el
Ejemplo 8.11 (c)(aa)). Esta banda (y también la forma intensamente
modificada con HES de la EPO N-glicosilada de alto
peso molecular, véanse las Figuras 14a y 14b) desaparecía después de
someter las muestras a hidrólisis suave lo cual está de acuerdo con
el punto de vista de que la modificación con HES se consiguió en
los residuos de ácido siálico oxidados con peryodato de la
eritropoyetina.
Partes alícuotas de las mezclas de incubación de
la N-glicosidasa se hidrolizaron usando condiciones
que permiten la eliminación completa de los residuos de ácidos
siálicos (y también el derivado de HES enlazado a ácido siálico) de
los oligosacáridos; después de neutralización, las mezclas se
absorbieron luego sobre pequeñas columnas Hypercarb para su
desalificación. Las columnas se lavaron exhaustivamente con agua
seguido por elución de los oligosacáridos neutros unidos con
acetonitrilo al 40% en H_{2}O que contenía ácido trifluoroacético
al 0,1%. Los oligosacáridos resultantes se sometieron a análisis por
MALDl/TOF-MS. Los espectros de las fracciones de
oligosacáridos desialilados de la muestra A,
EPO-GT-1-A y la
muestra K mostraron masas idénticas para el complejo de tipo
oligosacáridos a m/z = 1810 Da (diantenaria), 2175 =
triantenaria, 2540 = tetraantenaria y 2906 = tetraantenaria y más 1
repetición de N-acetil-lactosamina y
3271 = tetraantenaria más repeticiones de 2
N-acetil-lactosamina; se detectaron
señales pequeñas que corresponden a la falta de fucosa (-146) y
galactosa (menos 162) que son atribuibles a las condiciones ácidas
aplicadas para la eliminación de ácido siálico (véase el MALDI/TOF
de las Figuras 17, 18 y 19).
En un experimento paralelo la mezcla de
digestión con la N-glicosidasa se absorbió sobre un
cartucho de ml RP-C (sin hidrólisis ácida previa de
oligosacáridos) y la elución se realizó con acetonitrilo al 5% en
agua que contenía TFA al 0,1%; en estas condiciones la proteína EPO
se retuvo completamente en el material de RP y los oligosacáridos
se arrastraron de la columna por lavado con acetonitrilo al 5% en
H_{2}O que contenía TFA al 0,1%. La proteína EPO
des-N-glicosilada se eluyó con acetonitrilo
al 70% en H_{2}O que contenía TFA al 0,1%. Las fracciones de
oligosacáridos de la etapa RP-C18 de la muestra A,
EPO GT-1-A tratada con
N-glicosidasa, y la muestra K se neutralizaron y
sometieron a desalificación usando cartuchos Hypercarb como se ha
descrito antes. Los oligosacáridos aislados se sometieron a
cartografía por HPAEC-PAD antes (véanse las
Figuras 15) y después a tratamiento con ácido en condiciones suaves
que permitieron la eliminación cuantitativa de ácidos siálicos de
glicanos (véanse las Figuras 16).
El perfil de HPAEG-PAD para el
material natural obtenido de la muestra A modificada con HES
mostró solamente señales despreciables para los oligosacáridos
mientras que los oligosacáridos derivados de
EPO-GT-1-A exhibían
el mismo perfil de glicanos que el mostrado en la Figura 11 (muestra
denominada EPO-GT-1 después de
tratamiento con peryodato en condiciones suaves). El perfil de
elución de oligosacáridos obtenido de la muestra de EPO de control
(K) proporcionó el modelo esperado (compásese el perfil en la Figura
8). Para comparación se incluye el perfil de oligosacárido natural
del patrón de BRP-EPO Internacional y como patrón de
referencia.
Después de la hidrólisis ácida suave, todas las
preparaciones de oligosacáridos mostraron un perfil de elución
idéntico de la estructuras de oligosacáridos neutras (véanse las
Figuras 16) con la esperada composición cualitativa y cuantitativa
de las cadenas de carbohidratos de tipo complejo di-, tri- y
tetraantenarias como se ha descrito en el apartado "métodos"
para la preparación de EPO que se usó como material de partida para
el presente estudio. Este resultado demuestra que la modificación
con HES de la muestra de EPO da como resultado un enlace covalente
del derivado de HES que se desprende de la proteína por
N-glicosidasa y es lábil frente a los ácidos puesto
que se separa de los N-glicanos usando condiciones
de tratamiento con ácido en condiciones suaves conocidas para
desialilar carbohidratos (véanse las Figuras 14a+b).
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de confirmar más la modificación con
HES de EPO en los N-glicanos de la molécula,
muestras de EPO se digirieron con N-glicosidasa y
la proteína EPO se absorbió en cartuchos RP-C18,
mientras que el material oligosacárido se arrastró por lavado como
se ha descrito antes. Como se muestra en la Tabla 2, la glucosa y
los derivados de glucosa hidroxietilados se detectaron solamente en
la proteína EPO que se sometió a la modificación con HES en los
residuos de cisteína y en las fracciones de oligosacáridos de la
muestra de EPO A2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8.11(d)
El bioensayo de EPO en el sistema de ratón
normocitémico indica que se realizó de acuerdo con los métodos
descritos en la Farmacopea Europea; el laboratorio que realizó el
ensayo con la EPO usó la preparación del patrón de referencia BRP
EPO Internacional. Para la preparación de EPO A2 modificada con HES
se determinó un valor medio para la actividad específica de
294.600 unidades por mg de proteína EPO lo que indica una actividad
específica 3 veces mayor cuando se compara con la preparación del
patrón de referencia BRP EPO internacional incluido en las muestras
enviadas para los análisis de actividad.
Los resultados del estudio se recogen en la
Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Nimtz M, Noll G, Paques EP,
Conradt HS. Carbohydrate structures of a human tissue
plasminogen activator expressed en recombinant Chinese hamster ovary
cells. FEBS Lett. 1990 Oct. 1;
271(1-2):14-8.
Dorner AJ, Wasley LC,
Kaufman RJ. Increased synthesis of secreted proteins
induces expression of glucose regulated proteins en
butyrate-treated Chinese hamster ovary cells. J.
Biol. Chem. 1989 Dec 5; 264
(34):20602-7.
Mueller PP, Schlenke P;
Nimtz M, Conradt HS, Hauser H. Recombinant
glycoprotein quality in proliferation-controlled
BHK-21 cells. Biotechnol Bioeng. 1999 Dec
5; 65(5):529-36.
Nimtz M, Martin W, Wray V,
Kloppel KD, Augustin J, Conradt HS.
Structures of sialylated oligosaccharides of human erythropoietin
expressed in recobminant BHK-21 cells. Eur. J.
Biochem. 1993 Apr. 1;
213(1):39-56.
Hermentin P, Witzel R,
Vliegenthart JF, Kamerling JP, Nimtz M,
Conradt HS. A strategy for the mapping of
N-glycans by high-pH
anion-exchange chromatography with pulsed
amperometric detection. Anal Biochem. 1992 Jun;
203(2): 281-9.
Schroter S, Derr P, Conradt
HS, Nimtz M, Hale G, Kirchhoff C. Male
specific modification of human CD52, J. Biol. Chem. 1999
Oct. 15;274(42):29862-73.
\vskip1.000000\baselineskip
La EPO recombinante se produjo en células CHO
como sigue:
Un plásmido que aloja cDNA de EPO humana se
clonó en el vector de expresión eucariota (pCR3 y se denominó a
continuación pCREPO). La mutagénesis dirigida al sitio se realizó
usando métodos estándares como se ha descrito por
(Graben-horst, Nimtz, Costa et al., 1998,
In vivo specificity of human alpha
1,3/4-fucosyltransferases III-VII
in the biosynthesis of Lewis(x) and sialyl Lewis(x)
motifs on complex-type N-glycans -
Coexpression studies from BHK-21 cells together
with human beta-trace protein, J. Biol. Chem.,
273(47), 30985-30994).
Se generaron células CHO que expresan
establemente EPO humana o sus variantes de aminoácidos (por ejemplo,
Cys-29\rightarrowSer/Ala, o
Cys-33\rightarrowSer/Ala ,
Ser-126\rightarrowAla) con el método de
precipitación de fosfato de calcio y se seleccionaron con sulfato
G418 como se ha descrito (Grabenhorst et al.). Tres días
después de la transfección, las células se subcultivaron1:5 y se
seleccionaron en DMEM que contenía suero de bobino fetal
(abreviadamente en lo sucesivo FBS por la expresión inglesa Fetal
bovine serum) al 10% y 1,5 g/litro de sulfato G418.
Usando este método de selección, usualmente
sobrevivieron 100-500 clones y se propagaron en un
medio de selección durante un periodo de tiempo adicional de
2-3 semanas. Los líquidos sobrenadantes del cultivo
de células de las monocapas de crecimiento confluente se analizaron
en cuanto a los niveles de expresión de EPO por análisis de
transferencia Western y por análisis de transferencia Western +
enfoque isoeléctrico.
La EPO se produjo a partir de subclones estables
en matraces giratorios para centrífuga o en 21 reactores de
perfusión. Se aislaron diferentes glicoformas de EPO con diferentes
cantidades de NeuAc (por ejemplo, 2-8,
4-10, 8-12 residuos de NeuAc) de
acuerdo con protocolos publicados que usan combinaciones de diversos
procedimientos cromatográficos como se describe a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Grabenhorst, Conradt, 1999. The cytoplasmic,
transmembrane, and stem regions de glycosyltransferases specify
their in vivo funcional sublocalization and stability
in-the Golgi. J. Biol. Chem., 274(51),
36107-16; Grabenhorst,
Schlenke, Pohl, Nimtz, Conradt, 1999, Genetic engineering of recombinant glycoproteins and the glycosylation pathway in mammalian host cells, Glycoconj J., 16(2), 81-97; Mueller, Schlenke, Nimtz, Conradt, Hauser, 1999, Recombinant glycoprotein product quality in proliferation-controlled BHK-21 cells. Biotechnology and Bioengineering, 65(5), 529-536; Schlenke, Grabenhorst, Nimtz, Conradt, 1999. Construction and characterization of stably transfected BHK-21 cells with human-type sialylation characteristic. Cytotechnology, 30(1-3), 17-25.
Schlenke, Pohl, Nimtz, Conradt, 1999, Genetic engineering of recombinant glycoproteins and the glycosylation pathway in mammalian host cells, Glycoconj J., 16(2), 81-97; Mueller, Schlenke, Nimtz, Conradt, Hauser, 1999, Recombinant glycoprotein product quality in proliferation-controlled BHK-21 cells. Biotechnology and Bioengineering, 65(5), 529-536; Schlenke, Grabenhorst, Nimtz, Conradt, 1999. Construction and characterization of stably transfected BHK-21 cells with human-type sialylation characteristic. Cytotechnology, 30(1-3), 17-25.
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjo EPO recombinante humana a partir de
las líneas de células de insectos SF9 y SF 21 después de la
infección de las células con el vector de baculovirus recombinante
que contiene el cDNA de EPO bajo el control del promotor de
polihedrina como se describe en la bibliografía científica.
Las células crecidas en un medio de cultivo
exento de suero se infectaron a una densidad de células de
2x10^{6} o X10^{7} células por mL y se determinaron los títulos
de EPO cada día en los líquidos sobrenadantes de cultivo. La EPO se
purificó por cromatografía en Sepharose Blue, cromatografía
de cambio iónico en Q-Sepharose y finalmente en
RP-HPLC sobre la fase C_{4}.
La pureza del producto se comprobó por
SDS-PAGE y secuenciación N-terminal.
El análisis estructural detallado de los carbohidratos (N- y
O-glicosilación) se realizó de acuerdo con métodos
publicados.
\vskip1.000000\baselineskip
Grabenhorst, Hofer, Nimtz, Jager, Conradt, 1993,
Biosynthesis and secretion of human interleukin 2 glycoprotein
variants from baculovirus-infected Sf21 cells.
Characterization of polypeptides and
post-translational modifications. Eur, J.
Biochem., 215(1), 189-97; Quelle,
Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989, High-level
expression and purification of a recombinant human erythropoietin
produced using a baculovirus vector. Blood. 74(2),
652-7.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 0,144 g (0,012 mmol) de
oxo-HES12KD (Patente Alemana de Fresenius DE
19628705 A1) en 0,3 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) absoluto y se
añadieron gota a gota bajo una atmósfera de nitrógeno a una mezcla
de 34 mg (0,15 mmol) de EMCH (Perbio Science, Deutschland GmbH,
Bonn, Alemania) en 1,5 mL de DMSO. Después de agitar durante 19
horas a 60ºC la mezcla de reacción se añadió a 16 mL de una mezcla
de etanol y acetona 1:1. El precipitado se recogió por
centrifugación, se re-disolvió en 3 mL de DMSO y de
nuevo se precipitó como se ha descrito. La HES12KD B reactiva con
SH se obtuvo por centrifugación y secado a vacío. La reacción de
conjugación con tioEPO se describe en el Ejemplo 11, 2.2.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta reacción pueden usarse todos los agentes
reticulantes que presenten una función hidrazida y una función
maleimida, separadas por un espaciador. Otros ejemplos de moléculas
de dicho grupo, disponible de Perbio Science, Deutschland GmbH,
Bonn, Alemania, se muestran en la Tabla 1; marcados con una
"A". Además, también se puede usar otro grupo de agentes
reticulantes que exhiben una función disulfuro activada en lugar de
una función maleimida.
\vskip1.000000\baselineskip
Una muestra de 1 mg de HES12KD se disolvió en 3
mL de bicarbonato amónico saturado. Luego se añadió bicarbonato
amónico adicional para mantener la saturación de la solución durante
la incubación de 120 horas a 30ºC. La amino-HES12KD
C se desalificó por liofilización directa de la mezcla de
reacción.
^{1}Manger, Wong, Rademacher, Dwek, 1992,
Biochemistry. 31, 10733-10740; Manger,
Rademacher, Dwek, 1992. Biochemistry, 31,
10724-10732.
\vskip1.000000\baselineskip
Una muestra de 1 mg de Amino-HES
12KD C se disolvió en 1 mL de bicarbonato sódico 1 M y se enfrió en
hielo. A esto se añadió un cristal de anhídrido de ácido
cloroacético sólido (~5 mg), y la mezcla de reacción se dejó
calentar hasta la temperatura ambiente. El pH se monitorizó y se
añadió más base si el pH caía por debajo de 7,0. Después de dos
horas a la temperatura ambiente se añadió una segunda parte alícuota
de base y anhídrido. Después de seis horas el producto
cloroacetamida-HES D1 (X = Cl) se desalificó por
paso sobre un lecho mixto de resinas de cambio iónico Amberlite
MB-3(H)(OH).
\vskip1.000000\baselineskip
El anhídrido bromoacético se preparó como se
describe por Thomas^{3}. Una muestra de 1 mg de
amino-HES 12KD C se disolvió en 0,1 mL de DMF
anhidra y se enfrió en hielo y se añadieron 5 mg de anhídrido
bromoacético. La mezcla de reacción se llevó lentamente a la
temperatura ambiente y la solución se agitó durante 3 horas. La
mezcla de reacción se añadió a 1 mL de una mezcla de etanol y
acetona 1:1 a -20ºC. El precipitado se recogió por centrifugación,
se re-disolvió en 0,1 mL de DMF y se precipitó de
nuevo como se ha descrito. La bromoacetamida-HES D2
(X = Br) se obtuvo por centrifugación y secado a vacío. La reacción
de conjugación con tioEPO se describe en el Ejemplo 11, 1.2.
^{2}Black, Miss, Tul, Withers, 1993.
Carbohidr. Res., 250, 195.
^{3} Thomas, 1977, Methods Enzimol.,
46, 362.
\vskip1.000000\baselineskip
y todas las etapas se realizaron en
la
oscuridad.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la acilación de los grupos amino, pueden
usarse otras formas activadas de ácidos halohídricos, por
ejemplo:
- -
- -bromuros o -cloruros
- -
- -ésteres, por ejemplo éster de N-hidroxisuccinimida, ésteres con fenoles sustituidos (p-nitrofenol, pentafluorofenilo, triclorofenilo).
Además pueden usarse todos los agentes
reticulantes que tiene un grupo amino reactivo y una función acetilo
halogenada, separados por un espaciador. Un ejemplo de ello es
SBAP. Esta molécula y otras están disponibles en Perbio Science
Deutschland GmbH, Bonn, Alemania. Están marcadas en la Tabla 1 con
una "D". Para el uso como agentes reticulantes para la
ligación de amino-HES con tioEPO sin aislamiento de
los derivados de
halógeno-acetamida-HES, véase las
observaciones en el ejemplo 11, 1.2.
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- Reacción de 1,4-diaminobutano con oxo-HES 12KD para obtener amino-HES 12KD E^{4}.
- Se disolvieron 1,44 g (0,12 mmol) de oxo-HES 12KD en 3 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) seco y se añadieron gota agota bajo una atmósfera de nitrógeno a una mezcla de 1,51 mL (15 mmol) de 1,4-diaminobutano en 15 mL de DMSO. Después de agitar durante 19 horas a 40ºC la mezcla de reacción se añadió a 160 mL de una mezcla 1:1de etanol y acetona. El precipitado amino-HES 12KD E se recogió por centrifugación, se re-disolvió en 40 mL de agua y se dializó durante 4 días frente a agua (tubo de diálisis SnakeSkin, límite de exclusión 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y se liofilizó.
- ^{4}S. Frie, Diplomarbeit, Fachhochschule Hamburg, 1998.
- b)
- La cloroacetamida-HES12KD F1 se preparó como se ha descrito para la cloroacetamida-HES12KD D1 en 1.3 anteriormente.
- c)
- La bromoacetamida-HES12KD F2 (X = Br) se preparó como se ha descrito para la bromoacetamida-HES12KD D2 en 1.3 anteriormente. La reacción de conjugación con tioEPO se describe en el Ejemplo 11, 1.2.
- d)
- El derivado yodado correspondiente F3 (X =1) no se aisló antes de su reacción con tioEPO. El experimento se describe en el Ejemplo 11, 1.1.
\vskip1.000000\baselineskip
Véase 1,2 anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 1,44 g (0,12 mmol) de
oxo-HES12KD en 3 mL de dimetilsulfóxido (DMSO)
absoluto y se añadieron gota a gota bajo una atmósfera de nitrógeno
a una mezcla de 0,47 mL (15 mmol) de hidrazina en 15 mL de DMSO.
Después de agitar durante 19 horas a 40ºC la mezcla de reacción se
añadió a 160 mL de una mezcla de etanol y acetona 1:1. El producto
precipitado J se recogió por centrifugación, se redisolvió en 40 mL
de agua y se dializó durante 2 días frente a trietilamina al 0,5%
(v/v) en solución acusa y durante 2 días frente a agua (tubo de
diálisis SnakeSkin, límite de exclusión 3,5 KD, Perbio
Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y se liofilizó. La
reacción de conjugación con glico-EPO oxidada se
describe en el Ejemplo 12, 2.2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 1,74 g (15 mmol) de dihidrazida
adípica en 20 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) absoluto a 65ºC y se
añadieron gota a gota bajo una atmosfera de nitrógeno 1,44 g (0,12
mmol) de oxo-HES12KD, disuelto en 3 mL de DMSO
absoluto. Después de agitar durante 68 horas a 60ºC la mezcla de
reacción se añadió a 200 mL de agua. La solución que contenía L se
dializó durante 2 días frente a trietilamina al 0,5% (v/v) en
solución acuosa y durante 2 días frente a agua (tubo de diálisis
SnakeSkin, límite de exclusión 3,5 KD, Perbio Science
Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y se liofilizó. La reacción de
conjugación con glico-EPO oxidada se describe en el
Ejemplo 12, 2.2.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, pueden usarse otros derivados en donde 2
grupos hidrazida están separados por un espaciador.
\vskip1.000000\baselineskip
La amoniolisis de D o F se realizó separadamente
disolviendo una muestra de 1 mg de cada halógenoacetamida en 0,1 mL
de carbonato amónico saturado. Luego se añadió más carbonato amónico
sólido para mantener la saturación de la solución durante la
incubación de 120 horas a 30ºC. La mezcla de reacción se añadió a 1
mL de una mezcla 1:1 de etanol y acetona a -20ºC. El precipitado se
recogió por centrifugación, se re-disolvió en 0,05
mL de agua y de nuevo se precipitó como se ha descrito. El producto
amino-HES H o I se obtuvo por centrifugación y
secado a vacío. La reacción de conjugación con
glico-EPO oxidada se describe en el Ejemplo 12,
4.1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La
O-[2-(2-aminooxietoxi)etil]hidroxilamina
se sintetizó como se ha descrito por Boturyn et al en 2
etapas a partir de materiales comercialmente disponibles^{5}. Se
disolvieron 1,44 g (0,12 mmol) de oxo-HES 12KD en 3
mL de dimetilsulfóxido absoluto (DMSO) y se añadieron gota a gota
bajo una atmósfera de nitrógeno una mezcla de 2,04 g (15 mmol) de
Q-[2-(2-aminooxietoxi)etil]hidroxilamina
en 15 mL de DMSO. Después de agitar durante 48 horas a 65ºC la
mezcla de reacción se añadió a 160 mL de una mezcla etanol y acetona
1:1. El producto precipitado K se recogió por centrifugación, se
re-disolvió en 40 mL de agua y se dializó durante 4
días frente a agua (tubo de diálisis SnakeSkin, límite de
exclusión 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania)
y se liofilizó. La reacción de conjugación con
glico-EPO oxidada se describe en el Ejemplo 12,
3.1.
^{5}Boturyn, Boudali, Constant, Defrancq,
Lhomme, 11997. Tetrahedron, 53, 5485.
\vskip1.000000\baselineskip
Además podrían usarse derivados en donde los dos
grupos hidroxilamina están separados por un espaciador.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 1,44 g (0,12 mmol) de
oxo-HES12KD en 3 mL de dimetilsulfóxido (DMSO)
absoluto y se añadieron gotas a gota bajo una atmósfera de
nitrógeno a una mezcla de 1,16 g (15 mmol) de cisteamina en 15 mL de
DMSO. Después de agitar durante 24 horas a 40ºC la mezcla de
reacción se añadió a 160 mL de una mezcla de etanol y acetona 1:1.
El producto precipitado M se recogió por centrifugación, se
re-disolvió en 40 mL de agua y se dializó durante 2
días frente a trietilamina al 0,5% (v/v) en solución acuosa y
durante 2 días frente a agua (tubo de diálisis SnakeSkin,
límite de exclusión 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn,
Alemania) y se liofilizó. La reacción de conjugación con
glico-EPO oxidada se describe en el Ejemplo 12,
2.1.
\vskip1.000000\baselineskip
Podrían usarse derivados en donde el grupo amino
y la función tio están separados por un espaciador. Además, el
grupo amino de los derivados podría estar reemplazado por una
hidrazina, una hidrazida o una hidroxilamina. La función tio podría
estar protegida en la forma de un disulfuro o un derivado de
tritilo. Sin embargo, en este caso, debe realizarse una etapa de
desprotección antes de la conjugación, que liberaría un componente
que es análogo a M.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 1,44 g (0,12 mmol) de
amino-HES12KD E, H o I en 3 mL de dimetilsulfóxido
(DMSO) absoluto y se añadieron gota a gota bajo una atmósfera de
nitrógeno a una mezcla de 139 mg (0,6 mmol) de SATA en 5 mL de
DMSO. Después de agitar durante 24 horas a temperatura ambiente la
mezcla de reacción se añadió a 160 mL de una mezcla de etanol y
acetona 1:1. El producto precipitado N se recogió por
centrifugación, se re-disolvió en 40 mL de agua y
se dializó durante 2 días frente a agua (tubo de diálisis
SnakeSkin, límite de exclusión 3,5 KD, Perbio Science
Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y se liofilizó.
La desprotección se realizó en un tampón de
fosfato sódico 50 mM, que contenía EDTA 25 mM e hidroxilamina 0,5
M, pH 7,5 durante 2 horas a temperatura ambiente y el producto O se
purificó por diálisis frente a un tampón de acetato sódico 0,1 M
pH 5,5, que contenía EDTA 1 mM. La reacción de desprotección se
realizó inmediatamente antes de la reacción de conjugación que se
describe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en el Ejemplo 12,
2.1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 1,44 g (0,12 mmol) de
amino-HES12KD E, H o I en 3 mL de dimetilsulfóxido
(DMSO) absoluto y se añadieron gota a gota bajo una atmósfera de
nitrógeno a una mezcla de 187 mg (0,6 mmol) de SPDP en 5 mL DMSO.
Después de agitar durante 24 horas a temperatura ambiente la mezcla
de reacción se añadió a 160 mL de una mezcla de etanol y acetona
1:1. El producto precipitado P se recogió por centrifugación, se
re-disolvió en 40 mL de agua y se dializó durante 2
días frente a agua (tubo de diálisis SnakeSkin, límite de
exclusión 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y
se liofilizó.
La desprotección se realizó en una solución de
12 mg de ditiotreitol (DTT) por 0,5 mL de tampón de acetato sódico
100 mM, que contenía cloruro sódico 100 mM a pH 4,5 durante 30
minutos a temperatura ambiente y el producto Q se purificó por
diálisis frene a un tampón de acetato sódico 0,1 M, pH 5,5, que
contenía, EDTA 1 mM. La reacción de desprotección se realizó
inmediatamente antes de la reacción de conjugación que se describe
en el Ejemplo 12, 2.1.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la conversión de los grupos amino en grupos
tiol, sea en forma libre o sea en forma protegida, están
disponibles diversos reactivos. Después de la modificación, los
productos podían ser aislados. Alternativamente, como se acepta
para el uso de los agentes reticulantes, pueden ser usados
directamente para la reacción de conjugación, preferiblemente
después de una etapa de purificación. Para el aislamiento y
conservación de los derivados de tio-HES, puede ser
útil la síntesis de derivados de tio-HES en una
forma protegida. Para esto podrían usarse todos los que son
análogos a SATA, que tengan una función éster y una función tioéster
activas separadas por cualquier espaciador. Siendo SATP un miembro
más de este grupo, se encuentra en la Tabla 1, marcado con una
"H". Los derivados que son análogos a SPDP podrían tener una
función éster y una función disulfuro activas separadas por
cualquier espaciador. Otros miembros de estos grupos se encuentran
en la Tabla 1, marcados con una "F". Otros derivados análogos
podrían tener una función éster y una función tiol activas,
protegidas con un derivado de tritilo, separado por cualquier
espaciador.
\vskip1.000000\baselineskip
Conjugación de tioEPO con
amino-HES12KD (E, H o I) con un agente reticulante
que contiene un éster de NHS activo y un grupo yodoacetamida, por
ejemplo, SIA.^{6}
^{6}Cumber, Forrester, Foxwell, Ros, Thorpe,
1985, Methods Enzymol., 112, 207.
\vskip1.000000\baselineskip
- A.
- Tampón de borato. La composición fue borato sódico 50 mM, pH 8,3, EDTA 5 mM.
- B.
- Solución salina tamponada con fosfato (PBS),: fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4.
- C.
- AminoHES 12KD E, H o I. Preparado a 1 mg/mL en tampón de borato.
- D.
- Solución madre de agente reticulante: 14 mg de SIA se disolvieron en 1 mL de DMSO.
- E.
- Columnas de desalificación de dextrano D-SaIt^{TM}, volumen de lecho 2 x 5mL (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania).
- F.
- Reactivo de ensayo para proteínas Coomasie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania).
- G.
- Solución de tioEPO: 5 mg/mL de TioEPO 1 en tampón de borato.
- H.
- Microconcentrador: Microcon YM-3 (Amicon, Milipore GmbH, Eschbom, Alemania).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 100 \muL de solución de SIA a 400
\muL de la solución de aminoHES12KD E y se dejó que reaccionara
con agitación durante 0,5 horas a temperatura ambiente. El agente
reticulante en exceso se separó centrifugando la muestra a 14000 x
g durante 60 minutos usando un microconcentrador. Después de
centrifugar la muestra se llevó a su volumen original en tampón de
borato y este procedimiento se repitió dos veces más. La solución
residual se añadió a 1 mL de solución de tioEPO y la mezcla de
reacción se incubó durante 16 horas a temperatura ambiente. La
reactividad de la yodoacetamida en exceso se desactivó al final del
periodo de incubación por la adición de cisteína hasta una
concentración final de 10 mM. La mezcla de reacción se aplicó a una
columna de desalificación equilibrada con tampón de PBS y el
contenido de proteína de las fracciones se monitorizó con un
reactivo de ensayo para proteínas Coomasie. Se reunieron todas las
fracciones que contenían el conjugado de proteínas y el conjugado se
obtuvo por liofilización después de diálisis frente a agua durante
la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta reacción, podían usarse todos los
agentes reticulantes, que tengan una función succinimida o
sulfosuccinimida y una función yodoacetamida separadas por un
espaciador. Otros ejemplos se encuentran en la Tabla 1. Están
marcados con una "C" y están disponibles en Perbio Science
Deutschland GmbH, Bonn, Alemania.
\vskip1.000000\baselineskip
Conjugación de tioEPO 1 con
HES12KD-bromoacetamida reactivo con SH D2, F2 o
yodoacetamida D3.^{7}
^{7}de Velasco, Merkus, Anderton, Verheul,
Lizzio, Van der Zee, van Eden, Hoffmann, Verhoef, Snippe, 1995,
Infect. Immun., 63, 961.
\vskip1.000000\baselineskip
- A.
- Tampón de fosfato. La composición fue fosfato sódico 100 mM, pH 6,1, EDTA 5 mM.
- B.
- Solución salina tamponada con fosfato (PBS): fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4.
- C.
- HES12KD-bromoacetamida D2 reactivo con SH. Preparada a10 mg/mL en tampón de fosfato.
- D.
- Columnas de desalificación con dextrano D-SaIt^{TM}, volumen de lecho 2 x 5 mL, Perbio ScienceDeutschland GmbH, Bonn, Alemania).
- E.
- Reactivo de ensayo para proteínas Coomasie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania).
- F.
- Solución de tioEPO: 5 mg/mL de tioEPO 1 en tampón de fosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
Se reunieron 1 mL de solución de
HES12KD-bromoacetamida reactiva con SH D2 y 1 mL de
solución de tioEPO y la mezcla de reacción se incubó durante 48
horas a temperatura ambiente. La reactividad del exceso de
bromoacetamida se desactivó al final del periodo de incubación por
la adición de cisteína hasta una concentración final de 10 mM. La
mezcla de reacción se aplicó a una columna de desalificación,
equilibrada con tampón de PBS. El contenido de proteína de las
fracciones se monitorizó con un reactivo de ensayo para proteínas
Coomasie y todas las fracciones que contenían el conjugado de
proteína se reunieron y el conjugado se obtuvo por liofilización
después de diálisis frente a agua durante una noche.
\vskip1.000000\baselineskip
En lugar del aislamiento de
HES12KD-bromoacetamida D2 reactivo con SH, el amino
HES12KD (E, H, I) pudo ser enlazado con un agente reticulante por
una función succinimida y una función bromoacetamida (véase 1.1
antes). La SBAP es un miembro de este grupo agentes reticulantes y
se encuentra en la Tabla 1, marcado con una "D".
\vskip1.000000\baselineskip
Conjugación de tioEPO con
maleimido-HES12KD B.
\vskip1.000000\baselineskip
- A.
- Maleimido-HES 12KD B: 10 mg/mL en tampón de acetato sódico 0,1 M, pH 5,5.
- B.
- Solución de tioEPO: 5 mg/mL de tioEPO en tampón de fosfato/NaCl.
- C.
- Fosfato/NaCl: fosfato sódico 0,1 M, NaCl 50 mM, pH 7,0.
- D.
- Columna de filtración por gel: por ejemplo, Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm).
- E.
- Reactivo para ensayos de proteínas Coomasie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania).
- F.
- Solución salina tamponada con fosfato (PBS): fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4.
\newpage
Se reunieron 1 mL de solución HES12KD reactivo
con SH B y 1 mL de solución de tioEPO 1 y la mezcla de reacción se
incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. La reactividad de las
maleimidas en exceso se desactivó al final del periodo de
incubación por la adición de cisteína hasta una concentración final
de 10 mM. La mezcla de reacción se aplicó a una columna cargada con
Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm) equilibrada con tampón
de PBS y se recogieron fracciones de 1 mL. El contenido de proteína
de las fracciones se monitorizó con un reactivo de ensayo para
proteínas Coomasie. Se reunieron todas las fracciones que contenían
el conjugado de proteína y el conjugado se obtuvo por liofilización
después de diálisis frente a agua durante una noche.
\vskip1.000000\baselineskip
Conjugación de tioEPO con aminoHES12KD (E, H, I)
con agente reticulante que comprenden un éster de NHS activo y un
grupo maleimida, por ejemplo, SMCC.
\vskip1.000000\baselineskip
- A.
- Microconcentrador: Microcon YM-10 (Amicon, Millipore GmbH, Eschbom, Alemania).
- B.
- Solución salina tamponada con fosfato (PBS): fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4.
- C.
- AminoHES 12KD E, H o I. Preparado a 10 mg/mL en tampón de PBS.
- D.
- Solución de SMCC: 1 mg de SMCC se disolvieron en 50 \mul de DMSO.
- E.
- Columnas de desalificación con dextrano D-Salt^{TM}, volumen de lecho 2 x 5 mL (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania).
- F.
- Reactivo para ensayos de proteínas Coomasie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania).
- F.
- Solución de tioEPO 1: 5 mg/mL de tioEPO 1 en tampón de PBS.
\vskip1.000000\baselineskip
A 50 \muL de solución de SMCC se añadieron 400
\muL de solución del aminoHES 12KD E y la mezcla de reacción se
dejo reaccionar con agitación durante 80 minutos a temperatura
ambiente y durante 10 minutos a 46ºC. El agente reticulante en
exceso se separó por centrifugación de la mezcla de reacción a
través de un microconcentrador a 14000 x g durante 60 minutos. El
volumen se llevó hasta 450 \muL con tampón de PBS y el proceso se
repitió dos veces más. Después de la última centrifugación, la
solución residual se llevó hasta 450 \muL con PBS y se añadió a 1
mL de solución de tioEPO y la mezcla de reacción se incubó durante
16 horas a temperatura ambiente. La reactividad de la maleimida en
exceso se desactivó al final del periodo de incubación por adición
de cisteína hasta una concentración final de 10 mM. La mezcla de
reacción se aplicó a una columna de desalificación equilibrada con
tampón de PBS. El contenido de proteína de las fracciones se
monitorizó con un reactivo de ensayos para proteínas Coomasie, se
reunieron todas las fracciones que contenían el conjugado de
proteína y el conjugado se obtuvo por liofilización después de
diálisis frente a agua durante una noche.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta reacción podrían usarse todos los
agentes reticulantes que tienen una función succinimida o
sulfosuccinimida y una función maleimida, separadas por un
espaciador. Otros ejemplos para este grupo de moléculas, disponibles
de Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania, se encuentra en
la Tabla 1, marcados con una "E". Hay otro grupo de agentes
reticulantes, que en lugar de una función maleimida tiene una
función disulfuro activada. Estos agentes reticulantes también
podrían usarse para la conjugación. Sin embargo, el enlace disulfuro
del conjugado es escindible en condiciones reductoras. Los miembros
de este grupo están marcados en la Tabla 1 con una "F". Un
tercer grupo de agentes reticulantes se usa en lugar de maleimida
una función vinilsulfona como grupo reactivo con SH. Un miembro de
este grupo "SVSB" está marcado en la Tabla 1 con una
"G".
\vskip1.000000\baselineskip
- A.
- Solución de glico-EPO: 10 mg/mL de glico-EPO en tampón de acetato.
- B.
- Solución de meta-peryodato sódico: tampón de meta-peryodato sódico 10 mM o 100 mM en tampón de acetato, preparado recientemente. Manténgase en la oscuridad. Usando estas soluciones, la concentración final de peryodato sódico en la mezcla de oxidación es 1 mM o 10 mM, respectivamente.
- C.
- Tampón de acetato: Tampón de acetato sódico 0,1 M, pH 5,5.
- D.
- Glicerol.
- E.
- Microconcentrador: Microcon YM-3 (Amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Alemania).
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las etapas se realizaron en la
oscuridad.
A 1 mL de solución fría de
glico-EPO se añadieron 0,1 mL de solución fría de
meta-peryodato sódico y la reacción de oxidación se
dejo transcurrir durante 1 hora en la oscuridad. Si la
glico-EPO que ha ser oxidada contenía residuos de
ácido siálico, entonces las condiciones de oxidación serían
peryodato sódico 1 mM y 0ºC. De otro modo, se usó peryodato sódico
10 mM a temperatura ambiente. Para detener la oxidación se añadió
glicerol hasta una concentración final de 15 mM y se incubó durante
5 minutos a 0ºC. Los reactivos en exceso y los
sub-productos se separaron por centrifugación del
producto a 14000 x g durante 60 minutos usando un microconcentrador.
Después de centrifugar, la muestra se llevó hasta su volumen
original en el tampón usado en la siguiente etapa de modificación,
por ejemplo, en el tampón de acetato. Este proceso se repitió dos
veces más.
\vskip1.000000\baselineskip
La oxidación enzimática de EPO se describe en
otro lugar (Chamow et al., 1992, J. Biol. Chem.,
267,15916-15922).
\vskip1.000000\baselineskip
Conjugación de glico-EPO oxidada
con tioHES12KD M, O o Q con un agente reticulante que contiene un
grupo funcional hidrazida y un grupo funcional maleimida por
ejemplo, M_{2}C_{2}H (Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn,
Alemania).
\vskip1.000000\baselineskip
- A.
- Solución madre de M_{2}C_{2}H: 10 mg/mL de M_{2}C_{2}H en DMSO, recientemente preparada.
- B.
- Solución de glico-EPO oxidada del ejemplo 6.1.1: 5 mg/mL de glico EPO en tampón de acetato.
- C.
- Tio-HES 12KD M, O o Q: 10 mg/mL en tampón de fosfato/NaCl.
- D.
- Tampón de acetato: tampón de acetato sódico 0,1 M, pH 5,5.
- E.
- Fosfato/NaCl: fosfato sódico 0,1 M, NaCl 50 mM, pH 7,0.
- F.
- Microconcentrador: Microcon YM-3 (Amicon, Milipore GmbH, Eschbom, Alemania).
- G.
- Columna de filtración por gel: por ejemplo, Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm).
- H.
- Reactivo de ensayo para proteínas Coomasie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania).
- I.
- Solución salina tamponada con fosfato (PBS): fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4.
\vskip1.000000\baselineskip
La solución madre de M_{2}C_{2}H se añadió a
1 mL de glico-EPO oxidada hasta una concentración
final de 1 mM y se dejó reaccionar con agitación durante 2 horas a
temperatura ambiente. El agente reticulante en exceso se separó
centrifugando la muestra a 14000 x g durante 60 minutos usando un
microconcentrador. Después de centrifugar la muestra se llevó hasta
su volumen original en tampón de fosfato/NaCl y este proceso se
repitió dos veces más. A la glico-EPO modificada
con M_{2}C_{2}H se añadió 1 mL de solución de
tio-HES 12KD M, O o Q y la mezcla de reacción se
incubó durante 16 horas a temperatura ambiente. La reactividad de
las maleimidas en exceso se desactivó al final del periodo de
incubación por la adición de cisteína. La mezcla de reacción se
aplicó a una columna Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm)
equilibrada con PBS y se recogieron fracciones de 1 mL. El
contenido de proteína de las fracciones se monitorizó con un
reactivo de ensayos para proteínas Coomasie, se reunieron todas las
fracciones que contenían el conjugado de proteína y el conjugado se
obtuvo por liofilización después de diálisis frente a agua durante
una noche.
\vskip1.000000\baselineskip
Notas sobre el
método
El aducto de hidrazona es ligeramente menos
estable en los extremos del pH. Para aplicaciones que puedan
implicar tratamientos a bajo pH, los inventores redujeron la
hidrazona por tratamiento con cianoborohidruro sódico 30 mM en
tampón de PBS a una hidrazina. Para la mayoría de las aplicaciones
esta etapa neutra fue innecesaria.
\vskip1.000000\baselineskip
Conjugación directa de glico-EPO
oxidada con hidrazido-HES12KD L.
\vskip1.000000\baselineskip
- A.
- Solución de glico-EPO oxidada del Ejemplo 6.1.1: 5 mg/mL de glico-EPO en tampón de acetato.
- B.
- Hidrazido-HES 18KD L o J: 10 mg/mL en tampón de acetato.
- C.
- Tampón de acetato: tampón de acetato sódico 0,1 M, pH 5,5.
- D.
- Columna de filtración por gel: por ejemplo, Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm).
- E.
- Reactivo de ensayo para proteínas Coomasie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania).
- F.
- Solución salina tamponada con fosfato (PBS): fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4.
\vskip1.000000\baselineskip
Se reunieron 1 mL de solución de
hidrazido-HES 12KD L y 1 mL de solución de
glico-EPO oxidada y la mezcla de reacción se dejó
reaccionar con agitación durante 16 horas a temperatura ambiente. La
mezcla de reacción se aplicó a una columna Sephadex®
G-200 (1,5 x 45 cm) equilibrada con PBS y se
recogieron fracciones de 1 mL. El contenido de proteína de las
fracciones se monitorizó con un reactivo de ensayos para proteínas
Coomasie, se reunieron todas las fracciones que contenían el
conjugado de proteína y el conjugado se obtuvo por liofilización
después de diálisis frente a agua durante una noche. El resultado de
la conjugación se muestra en la Figura 24, El cambio de peso
molecular observado demuestra que la conjugación fue satisfactoria.
Los resultados dan cuentan de la heterogeneidad de HES. La Figura
25 demuestra que HES está conjugado con un resto de la cadena
lateral de un carbohidrato.
\vskip1.000000\baselineskip
Notas sobre el
método
El aducto de hidrazona es ligeramente menos
estable en los extremos del pH. Para aplicaciones que puedan
implicar tratamientos a bajo pH, los inventores redujeron la
hidrazona por tratamiento con cianoborohidruro sódico 30 mM en
tampón de PBS a una hidrazina. Para la mayoría de las aplicaciones
esta etapa neutra fue innecesaria.
\vskip1.000000\baselineskip
Conjugación de glico-EPO oxidada
con hidroxilamino-HES12KD K.
^{8}Rose, 1994, Am. Chem. Soc., 116,
30.
\vskip1.000000\baselineskip
- A.
- Solución de glico-EPO oxidada del Ejemplo 6.1.1: 5 mg/mL de glico-EPO en tampón de acetato.
- B.
- Hidroxilamino-HES12KD K: 10 mg/mL en tampón de acetato.
- C.
- Tampón de acetato: tampón de acetato sódico 0,1 M, pH 5,5.
- D.
- Columna de filtración por gel: por ejemplo, Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm).
- E.
- Reactivo de ensayo para proteínas Coomasie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania).
- F.
- Solución salina tamponada con fosfato (PBS): fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4.
\vskip1.000000\baselineskip
Se reunieron 1 mL de solución de
hidroxilamino-HES12KD K y 1 mL de solución de
glico-EPO oxidada y la mezcla de reacción se dejó
reaccionar con agitación durante 16 horas a temperatura ambiente. La
mezcla de reacción se aplicó a una columna Sephadex®
G-200 (1,5 x 45 cm) equilibrada con PBS y se
recogieron fracciones de 1 mL. El contenido de proteína de las
fracciones se monitorizó con un reactivo de ensayos para proteínas
Coomasie, se reunieron todas las fracciones que contenían el
conjugado de proteína y el conjugado se obtuvo por liofilización
después de diálisis frente a agua durante una noche. El resultado de
la conjugación se muestra en la Figura 24. El cambio molecular
observado en la pista 2 demuestra que la conjugación fue
satisfactoria. Los resultados dan cuentan de la heterogeneidad de
HES. La Figura 25 demuestra que HES está conjugado con un resto de
la cadena lateral de un carbohidrato.
\vskip1.000000\baselineskip
EPO recombinante o formas de EPO parcialmente
desialiladas (generadas por hidrólisis ácida limitada en condiciones
suaves) se incubaron con galactosa-oxidasa en
presencia de catalasa a 37ºC en 30 min - 4 horas a 37ºC en tampón
de fosfato 0,05 M. pH 7,0. El progreso de la reacción se monitorizó
por separación de partes alícuotas de 50 \mug de de la EPO y
tratamiento subsiguiente de la proteína con
polipéptido-N-glicanasa.
Los oligosacáridos N-enlazados
liberados (monitorizados por detección por SDS-PAGE
de la polipéptido-N-glicanasa) se
sometieron a cartografía por HPAEC-PAD como se ha
descrito (Grabenhorst et al., 1999, Nimtz et al.,
1993/1994; Schlenke et al., 1999) antes y después de la
eliminación de los ácidos siálicos. La cuantificación de los de
residuos galactosa oxidada en oligosacáridos individuales de EPO se
realizó por el cambio típico observado en HPAEC-PAD
y también se verificó por análisis de MALDI/TOF MS de las mezclas de
oligosacáridos.
\vskip1.000000\baselineskip
La separación de las formas de EPO modificadas
de las formas de EPO que no han reaccionado y las moléculas
precursoras de HAS se llevaron a cabo por filtración por gel usando,
por ejemplo, Ultrogel AcA 44/54 o medios de filtración similares.
Alternativamente, el HAS que no ha reaccionado se separó por
aislamiento por inmunoafinidad de EPO en una columna de 4 mL que
contenía un anticuerpo monoclonal acoplado a Affigel (BioRad) y
subsiguiente separación de la EPO no modificada por filtración por
gel (por ejemplo, usando una matriz que permite la separación de
proteínas globulares de una masa molecular relativa entre 20 kDa y
200 kDa).
Las EPO modificadas con HAS se identificaron por
análisis por SDS-PAGE (usando geles de acrilamida al
12,5 o 10%) a través de la detección de su peso molecular superior
comparado con el de la EPO no modificada por tinción de geles con
azul brillante Coomasie. Los polipéptidos de EPO modificados con HAS
de peso molecular superior también se identificaron por análisis de
transferencia Western de muestras que usan un anticuerpo policlonal
producido contra EPO humana recombinante.
La modificación en los
N-glicanos de las formas de EPO se demostró por su
eliminación satisfactoria de la proteína EPO con
polipéptido-N-glicanasa
(N-glicosidasa recombinante de Roche, Alemania que
emplea 25 unidades/mg de proteína EPO a 37ºC durante 16 horas); el
análisis por SDS-PAGE dio como resultado un cambio
típico de la proteína EPO hasta una posición de migración de la EPO
no modificada tratada con la N-glicosidasa de
aproximadamente 20 KDa.
La modificación de la EPO
O-glicano, tratada con
galactosa-oxidasa y desialilada sencilla en Ser126
se demostró por migración en SDS-PAGE del producto
des-N-glicosilado por detección de
su posición de migración comparado con la EPO
des-N-glicosilada que no había
reaccionado. Si se requiere, la EPO modificada se fraccionó por
RP-HPLC en una fase C8 antes del análisis por
SDS-PAGE. La modificación de con HAS
O-glicano de EPO también se analizó por
\beta-eliminación del O-glicano y
detección de la forma de EPO
des-O-glicosilada en transferencias
Western que usan un anticuerpo policlonal producido contra la EPO
humana recombinante.
\vskip1.000000\baselineskip
Las formas de EPO fueron determinadas
cuantitativamente por mediciones de UV como se describe en Ph. Eur.
(2000, Erythropoietini solutio concentrata, 1316,
780-785) y se compararon con el patrón BRP EPO
internacional de referencia EPO. Alternativamente, las
concentraciones de EPO se determinaron por un ensayo de
RP-HPLC que usa una columna RP-C4 y
absorción a 254 nm, empleando para la calibración 20, 40, 80 y 120
\mug de la preparación de referencia el patrón BRP EPO.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó en cuanto a su actividad EPO
modificada con HES purificada usando el ensayo de bioactividad de
eritropoyetina como se describe por Krystal [Krystal, 1984, Exp.
Heamatol., 11, 649-660].
Se indujo anemia en ratones NMRI por tratamiento
con hidrocloruro de fenilhidrazina y se recogieron células del bazo
y se usaron como se ha descrito en [Fibi et al., 1991,
Blood, 77, pp. 1203 y siguientes]. Las diluciones de EPO se
incubaron con 3x10^{5} células/pocillo en placas de
microtitulación de 96-pocillos. Después de 24 horas
a 37ºC en una atmósfera humidificada (CO_{2} al 5%), las células
se marcaron durante 4 horas con 1 \mu Ci de
^{3}H-timidina por pocillo. La radiactividad
incorporada se determinó por recuento por escintilación de líquidos.
El patrón de EPO de referencia (patrón BRP) se usó para
comparación.
Alternativamente, la bioactividad de EPO se
midió por un ensayo in vitro que usa la línea celular
TF-1 sensible a EPO (Kitamura et. al., [J. Cell,
Phys., 140, 323-334]. Las células que crecieron
exponencialmente se liberaron por lavado de los factores de
crecimiento y se incubaron en presencia de diluciones seriadas de
la EPO durante otras 48 horas. La proliferación de las células se
determinó usando el ensayo de reducción con MTT como se describe por
Mosmann [Mosman, 1983, J. Immunol. Methods, 65,
55-63].
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Las determinaciones de la actividad in
vivo se realizaron en ratones normocitémicos midiendo el aumento
de reticulocitos después de 4 días tras haber recibido los animales
la dosis prevista de EPO o las formas de EPO modificadas. Los
ensayos se realizaron usando el patrón BRP EPO que se calibró contra
el patrón de EPO de la WHO (Organización Mundial de la Salud) en el
ensayo con ratones normocitémicos. Las muestras de EPO se diluyeron
en solución salina tamponada con fosfato que contenía 1 mg/ml de
seroalbúmina bovina (Sigma).
0,5 ml de la solución de ensayo de EPO en
solución salina tamponada de Dulbecco (correspondiente a una
equivalente de proteína EPO de 100, 80, 40 o 20 UI/ml del patrón
BRP EPO) se infectaron subcutáneamente por animal. Se tomaron
muestras de sangre 4 días después de la inyección y los
reticulocitos se tiñeron con naranja de acridina; La cuantificación
de los reticulocitos se realizó por citometría de flujo contando un
total de 30.000 células de sangre 5 horas después de haber extraído
la muestra de sangre (véase Ph. Eur, 2000, Erythropoietini
solutio concentrata, 1316, pp. 780-785) y la
European Pharmacopoeia (1996/2000, Apéndice de 2002).
Se inyectaron intravenosamente conejos con
cantidades especificadas de formas de EPO no modificadas o
modificadas con HAS. Las muestras de sangre se obtuvieron en los
tiempos especificados, y se preparó suero. Los niveles de
eritropoyetina en suero se determinaron por el bioensayo in
vitro o por un ensayo comercial ELISA específico para EPO.
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En ratones: Cada animal recibió subcutáneamente
300 UI de EPO/kg. Siete días después del
post-tratamiento se determine el hematocrito de
cada animal. Se observó un aumento sustancial en el hematocrito en
todos los animales tratados con la EPO modificada, que era un
resultado esperado en vista de la semi-vida
relativamente corta de la EPO no tratada. El cambio medio en el
hematocrito del grupo tratado con la EPO modificada fue
significativamente diferente del que tenía el grupo de EPO no
tratada y el del grupo de control.
En conejos: Los conejos se trataron con una sola
dosis de EPO no modificada o modificada con HAS correspondiente a
200 o hasta 800 ng/kg de peso corporal. Después de 2, 6, 16, 24 y 48
horas las muestras de sangre se analizaron usando un ensayo ELISA
comercial específico para EPO para la determinación de
concentraciones en plasma. Se determinaron las concentraciones
medias en plasma de EPO y se calcularon por un ensayo ELISA los
valores de las semi-vidas medias iniciales (fase
\alpha) y las semi-vidas medias terminales (fase
\beta) como se ha descrito: (Zettimissi et al., 1989, J.
Biol. Chem., 264, 21153-21159).
\vskip1.000000\baselineskip
Sytcowski, Lunn, Risinger, and Davis, 1999,
An Erythropoietin Fusion Protein Comprised of Identical
Repetitioning Domains Exhibits Enhanced Biological Properties, J.
Biol. Chem., 274, 24773-24778.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recuperó IL-2 (interleuquina
2) modificada por filtración por gel en una columna Ultrogel AcA 54.
Partes alícuotas de la fracción correspondiente se filtró en
condiciones estériles y se determino la bioactividad de la
IL-2 usando la línea celular CTLL-2
de IL2 dependiente de múridos [Gillis, Ferm, On, and Smith, 1978,
J. Immunol., 120, 2027-2032]. La actividad
estaba relacionada con la preparación patrón de referencia
internacional de IL-2.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Claims (48)
1. Un método para producir un derivado de
hidroxialquil-almidón, comprendiendo dicho
hidroxialquil-almidón, un compuesto (L),
opcionalmente un compuesto (D) y un compuesto (M) adicional,
teniendo dicho hidroxialquil-almidón una estructura
de acuerdo con la fórmula (I):
comprendiendo el método hacer
reaccionar:
- -
- hidroxialquil-almidón de fórmula (I) en su extremo reductor opcionalmente oxidado o
- -
- un derivado de hidroxialquil-almidón obtenible haciendo reaccionar hidroxialquil-almidón de fórmula (I) en su extremo reductor opcionalmente oxidado con un compuesto (D), comprendiendo dicho compuesto (D)
- -
- al menos un grupo funcional Z_{1} capaz de hacerse reaccionar con el extremo reductor opcionalmente oxidado del hidroxialquil-almidón, y
- -
- al menos un grupo funcional W,
\vskip1.000000\baselineskip
con un compuesto (L) que comprende:
- -
- al menos un grupo funcional Z_{1} capaz hacerse reaccionar con dicho hidroxialquil-almidón, o al menos un grupo funcional Z_{2} capaz de hacerse reaccionar con el grupo funcional W contenido en dicho derivado de hidroxialquil-almidón, y
- -
- al menos un grupo funcional X capaz de hacerse reaccionar con un grupo funcional Y de un compuesto adicional (M),
en donde dicho grupo funcional Y se selecciona
del grupo que consiste en un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo
hemiacetal y un grupo acetal,
en donde el grupo funcional Z_{1} se
selecciona del grupo que consiste en:
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es
metilo.
2. Un método según la reivindicación 1, en donde
R_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente hidrógeno o un
grupo hidroxialquilo lineal o ramificado.
3. Un método según la reivindicación 2, en donde
R_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente hidrógeno o un
grupo 2-hidroxietilo.
4. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde el
hidroxialquil-almidón es
hidroxietil-almidón.
5. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde el grupo funcional Y se selecciona
del grupo que consiste en un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo
hemiacetal y un grupo acetal, y el grupo funcional X comprende la
estructura -NH-.
6. Un método según la reivindicación 5, en donde
X se selecciona del grupo que consiste en
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H_{2}N-
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en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es
metilo.
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7. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde el grupo funcional W o el grupo
funcional Z_{2} es -SH y el grupo funcional Z_{2} o el grupo
funcional W se selecciona del grupo que consiste en
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde Hal es Cl, Br o
I.
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8. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde el grupo funcional W o el grupo
funcional Z_{2} se selecciona del grupo que consiste en un éster
activado o un grupo carboxi que está opcionalmente transformado en
un éster activado y el grupo funcional Z_{2} o el grupo funcional
W se selecciona del grupo que consiste en:
\newpage
H_{2}N-
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es
metilo.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en donde el extremo reductor del
hidroxialquil-almidón no está oxidado antes de la
reacción con el compuesto (D) o el compuesto (L), teniendo por tanto
dicho hidroxialquil-almidón una estructura de
acuerdo con la fórmula (I)
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\vskip1.000000\baselineskip
10. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en donde el extremo reductor del
hidroxialquil-almidón no está oxidado antes de la
reacción con el compuesto (D) o el compuesto (L), teniendo por tanto
dicho hidroxialquil-almidón una estructura de
acuerdo con la fórmula (IIa)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
y/o de acuerdo con la fórmula
(IIb)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
11. Un método según la reivindicación 10, en
donde el extremo reductor se oxida mediante una solución alcalina de
yodo.
12. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 y 9 a 11, en donde el
hidroxialquil-almidón se hace reaccionar con un
compuesto (L) vía la reacción de grupo funcional Z_{1} con el
extremo reductor opcionalmente oxidado del
hidroxialquil-almidón y el producto de reacción
resultante se hace reaccionar con un compuesto adicional (M) por la
reacción del grupo funcional X contenido en el compuesto (L) con el
grupo funcional Y contenido en el compuesto (M).
13. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 y 9 a 11, en donde el
hidroxialquil-almidón se hace reaccionar con un
compuesto (L) por la reacción de grupo funcional Z_{1} con el
extremo reductor opcionalmente oxidado del
hidroxialquil-almidón, en donde el compuesto (L),
ante de la reacción con el hidroxialquil-almidón, se
hace reaccionar con un compuesto adicional (M) por la reacción del
grupo funcional X contenido en el compuesto (L) con el grupo
funcional Y contenido en el compuesto (M).
14. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en donde el
hidroxialquil-almidón se hace reaccionar con un
compuesto (D) por la reacción del grupo funcional Z_{1} contenido
en el compuesto (D), con el extremo reductor opcionalmente oxidado
del hidroxialquil-almidón obteniéndose un primer
derivado de hidroxialquil-almidón, y en donde el
primer derivado de hidroxialquil-almidón se hace
reaccionar con un compuesto (L) por la reacción del grupo funcional
Z_{2} contenido en el compuesto (L) con el grupo funcional W
contenido en el compuesto (D) obteniéndose un segundo derivado de
hidroxialquil-almidón, en donde el segundo derivado
de hidroxialquil-almidón se hace reaccionar con un
compuesto adicional (M) por la reacción del grupo funcional X
contenido en el compuesto (L) con el grupo funcional Y contenido en
el compuesto (M).
15. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en donde el
hidroxialquil-almidón se hace reaccionar con un
compuesto (D) por la reacción del grupo funcional Z_{1} contenido
en el compuesto (D) con el extremo reductor opcionalmente oxidado
del hidroxialquil-almidón obteniéndose un primer
derivado de hidroxialquil-almidón, y en donde el
primer derivado de hidroxialquil-almidón se hace
reaccionar, por la reacción del grupo funcional W, contenido en el
compuesto (D), y el grupo funcional Z_{2}, contenido en el
compuesto (L), con el compuesto (L), en donde el compuesto (L),
antes de la reacción con el primer derivado de
hidroxialquil-almidón, se hace reaccionar con un
compuesto adicional (M) por la reacción del grupo funcional X
contenido en el compuesto (L) con el grupo funcional Y contenido en
el compuesto (M).
16. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en donde el al menos un compuesto adicional
(M) es un polipéptido.
17. Un método según la reivindicación 16, en
donde el polipéptido es eritropoyetina.
18. Un derivado de
hidroxialquil-almidón que comprende el
hidroxialquil-almidón, un compuesto (L),
opcionalmente un compuesto (D) y un compuesto adicional (M),
obtenible por el método de acuerdo con la reivindicación 1.
19. Un derivado de
hidroxialquil-almidón según la reivindicación 18, en
donde R_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente hidrógeno o
un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado.
20. Un derivado de
hidroxialquil-almidón según la reivindicación 19, en
donde R_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente hidrógeno o
un grupo 2-hidroxietilo.
21. Un derivado de
hidroxialquil-almidón según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 20, en donde el
hidroxialquil-almidón es
hidroxietil-almidón.
22. Un derivado de
hidroxialquil-almidón según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 21, en donde el grupo funcional Y se
selecciona del grupo que consiste en un grupo aldehído, un grupo
ceto, un grupo hemiacetal y un grupo acetal, y el grupo funcional X
comprende la estructura -NH-.
23. Un derivado de
hidroxialquil-almidón según la reivindicación 22, en
donde X se selecciona del grupo que consiste en:
H_{2}N-
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es
metilo.
\vskip1.000000\baselineskip
24. Un derivado de
hidroxialquil-almidón según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 23, en donde el grupo funcional W o el grupo
funcional Z_{2} es -SH y el grupo funcional Z_{2} o el grupo
funcional W se selecciona del grupo que consiste en
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde Hal es Cl, Br o
I.
\vskip1.000000\baselineskip
25. Un derivado de
hidroxialquil-almidón según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 23, en donde el grupo funcional W o el grupo
funcional Z_{2} se selecciona del grupo que consiste en un éster
activado o un grupo carboxi que está opcionalmente transformado en
un éster activado y el grupo funcional Z_{2} o el grupo funcional
W se selecciona del grupo que consiste en
H_{2}N-
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es
metilo.
26. Un derivado de
hidroxialquil-almidón según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 25, en donde el extremo reductor del
hidroxialquil-almidón no se oxida antes de la
reacción con un compuesto (D) o un compuesto (L), teniendo por tanto
dicho hidroxialquil-almidón una estructura de
acuerdo con la fórmula (I)
27. Un derivado de
hidroxialquil-almidón según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 25, en donde el extremo reductor del
hidroxialquil-almidón se oxida antes de la reacción
con un compuesto (D) o un compuesto (L), teniendo por tanto dicho
hidroxialquil-almidón una estructura de acuerdo con
la fórmula (IIa)
y/o de acuerdo con la fórmula
(IIb)
28. Un derivado de
hidroxialquil-almidón según la reivindicación 27, en
donde el extremo reductor se oxida con una solución alcalina de
yodo.
29. Un derivado de
hidroxialquil-almidón según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 23 y 26 a 28, en donde el
hidroxialquil-almidón se hace reaccionar con un
compuesto (L) por la reacción de grupo funcional Z_{1} con el
extremo reductor opcionalmente oxidado del
hidroxialquil-almidón y el producto de reacción
resultante se hace reaccionar con un compuesto adicional (M) por la
reacción del grupo funcional X contenido en el compuesto (L) con el
grupo funcional Y contenido en el compuesto (M).
30. Un derivado de
hidroxialquil-almidón según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 23 y 26 a 28, en donde el
hidroxialquil-almidón se hace reaccionar con un
compuesto (L) por la reacción del grupo funcional Z_{1} con el
extremo reductor opcionalmente oxidado del
hidroxialquil-almidón, en donde el compuesto (L),
antes de la reacción con hidroxialquil-almidón, se
hace reaccionar con un compuesto adicional (M) por la reacción del
grupo funcional X contenido en el compuesto (L) con el grupo
funcional Y contenido en el compuesto (M).
31. Un derivado de
hidroxialquil-almidón según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 28, en donde el
hidroxialquil-almidón se hace reaccionar con un
compuesto (D) por la reacción del grupo funcional Z_{1} contenido
en el compuesto (D), con el extremo reductor opcionalmente oxidado
del hidroxialquil-almidón obteniéndose un primer
derivado del hidroxialquil-almidón, y en donde el
primer derivado de hidroxialquil-almidón se hace
reaccionar con un compuesto (L) por la reacción de grupo funcional
Z_{2} contenido en el compuesto (L) con el grupo funcional W
contenido en el compuesto (D) obteniéndose un segundo derivado del
hidroxialquil-almidón, en donde el segundo derivado
de hidroxialquil-almidón se hace reaccionar con un
compuesto adicional (M) por la reacción de grupo funcional X
contenido en el compuesto (L) con el grupo funcional Y contenido en
el compuesto (M).
32. Un derivado de
hidroxialquil-almidón según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 28, en donde el
hidroxialquil-almidón se hace reaccionar con un
compuesto (D) vía la reacción de grupo funcional Z_{1} contenido
en el compuesto (D) con el extremo reductor opcionalmente oxidado
del hidroxialquil-almidón obteniéndose un primer
derivado de hidroxialquil-almidón, y en donde el
primer derivado de hidroxialquil-almidón se hace
reaccionar, por la reacción del grupo funcional W, contenido en el
compuesto (D), y el grupo funcional Z_{2}, contenido en el
compuesto (L), con el compuesto (L), en donde el compuesto (L),
antes de la reacción con el primer derivado de
hidroxialquil-almidón, se hace reaccionar con un
compuesto adicional (M) por la reacción de grupo funcional X
contenido en el compuesto (L) con el grupo funcional Y contenido en
el compuesto (M).
33. Un derivado de
hidroxialquil-almidón según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 32, en donde el al menos dicho compuesto
adicional (M) es un polipéptido.
34. Un derivado de
hidroxialquil-almidón según la reivindicación 33, en
donde el polipéptido es eritropoyetina.
35. Una composición farmacéutica que comprende
en una cantidad terapéuticamente eficaz, un derivado de
hidroxialquil-almidón, que comprende el
hidroxialquil-almidón, un compuesto (L),
opcionalmente un compuesto (D) y un compuesto adicional (M)
obtenible por un método de acuerdo con la reivindicación 1,
comprendiendo además dicho método para producir un derivado de
hidroxialquil-almidón hacer reaccionar el producto
de reacción que comprende el hidroxialquil-almidón,
el compuesto (L) y opcionalmente el compuesto (D) con un compuesto
adicional (M), en donde al menos dicho compuesto adicional es un
polipéptido.
36. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 35, en donde el polipéptido es AT III.
37. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 36, en donde el polipéptido es eritropoyetina.
38. Una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, en donde el grupo
funcional Y se selecciona del grupo que consiste en un grupo
aldehído, un grupo ceto, un grupo hemiacetal, y un grupo acetal, y
el compuesto (L) es un compuesto de fórmula general
Z_{1}-L'-X en donde el grupo
funcional Z_{1} se selecciona del grupo que consiste en
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R es alquilo,
cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o
cicloalquilarilo, y en donde el grupo funcional X se selecciona del
grupo que consiste
en
H_{2}N-
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es metilo, y en
donde L' es una cadena orgánica que une como puente Z_{1} y X o en
donde L' está
ausente.
39. Una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, en donde el grupo
funcional Y se selecciona del grupo que consiste en un grupo
aldehído, un grupo ceto, un grupo hemiacetal, y un grupo acetal, el
compuesto (D) es un compuesto de fórmula general
Z_{1}-D'-W y el compuesto (L) es
un compuesto de la fórmula general
Z_{2}-L'-X, en donde el
grupofuncional Z_{1} se selecciona del grupo que consiste
en
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R es metilo, en
donde el grupo funcional X se selecciona del grupo que consiste
en:
H_{2}N-
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es metilo, en
donde el grupo funcional W o el grupo funcional Z_{2} es -SH y el
grupo funcional Z_{2} o el grupo funcional W se selecciona del
grupo que consiste
en
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde Hal es Cl, Br o I, o en
donde el grupo funcional W o el grupo funcional Z_{2} se
selecciona del grupo que consiste en un éster activado o un grupo
carboxi que está opcionalmente transformado en un éster activado y
el grupo funcional Z_{2} o el grupo funcional W se selecciona del
grupo que consiste
en:
H_{2}N-
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde G es O ó S y, si está
presente dos veces, independientemente O ó S, y R' es metilo, y en
donde D' es una cadena orgánica que une como puente Z_{1} y W o en
donde D' está ausente y en donde L' es una cadena orgánica que une
como puente Z_{2} y X o en donde L' está
ausente.
\vskip1.000000\baselineskip
40. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 35, que comprende un derivado de
hidroxialquil-almidón, en donde el
hidroxietil-almidón se hace reaccionar en un medio
acuoso con un compuesto de acuerdo con la fórmula siguiente
y el producto de reacción se hace
reaccionar con
eritropoyetina.
\vskip1.000000\baselineskip
41. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 40, en donde la eritropoyetina está oxidada con
peryodato sódico antes de la reacción.
42. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 41, en donde la eritropoyetina está parcialmente
desialilada y se oxida subsiguientemente con peryodato sódico antes
de la reacción.
43. Un método para producir un derivado de
hidroxialquil-almidón, teniendo dicho
hidroxialquil-almidón una estructura de acuerdo con
la fórmula (I)
en donde R_{1}, R_{2} y R_{3}
son independientemente hidrógeno o un grupo
2-hidroxietilo, que comprende hacer reaccionar el
hidroxialquil-almidón en su extremo reductor
opcionalmente oxidado con un compuesto de acuerdo con la fórmula
siguiente:
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o un compuesto de la fórmula
siguiente:
y hacer reaccionar el producto de
reacción con un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo hemiacetal o
un grupo acetal de un resto terminal de la cadena lateral de
carbohidrato de eritropoyetina, que se oxida con peryodato sódico
antes de la reacción o se desialila y subsiguientemente se oxida con
peryodato sódico antes de la
reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
44. Un método según la reivindicación 43, en
donde el hidroxialquil-almidón se hace reaccionar en
su extremo reductor, que no está oxidado, con un compuesto de
acuerdo con la fórmula siguiente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en un medio
acuoso.
\vskip1.000000\baselineskip
45. Un derivado de
hidroxialquil-almidón obtenible por un método para
producir un derivado de hidroxialquil-almidón,
teniendo dicho hidroxialquil-almidón una estructura
de acuerdo con la fórmula (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R_{1}, R_{2} y R_{3}
son independientemente hidrógeno o un grupo
2-hidroxietilo, que comprende hacer reaccionar
hidroxialquil-almidón en su extremo reductor
opcionalmente oxidado con un compuesto de acuerdo con la fórmula
siguiente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o un compuesto de acuerdo con la
fórmula
siguiente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y hacer reaccionar el producto de
reacción con un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo hemiacetal o
un grupo acetal de un resto terminal de la cadena lateral de
carbohidrato de eritropoyetina, que se oxida con peryodato sódico
antes de la reacción o se desialila y subsiguientemente se oxida con
peryodato sódico antes de la
reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
46. Un derivado de
hidroxialquil-almidón según la reivindicación 45, en
donde el hidroxialquil-almidón se hace reaccionar en
su extremo reductor, que no está oxidado, con un compuesto de
acuerdo con la fórmula siguiente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en un medio
acuoso.
\newpage
47. Una composición farmacéutica que comprende,
en una cantidad terapéuticamente eficaz, un derivado de
hidroxialquil-almidón obtenible por un método para
producir un derivado de hidroxialquil-almidón,
teniendo dicho hidroxialquil-almidón una estructura
de acuerdo con la fórmula (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R_{1}, R_{2} y R_{3}
son independientemente hidrógeno o un grupo
2-hidroxietilo, que comprende hacer reaccionar
hidroxialquil-almidón en su extremo reductor
opcionalmente oxidado con un compuesto de acuerdo con la fórmula
siguiente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o un compuesto de acuerdo con la
fórmula
siguiente
\vskip1.000000\baselineskip
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y hacer reaccionar el producto de
reacción con un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo hemiacetal o
un grupo acetal de un resto terminal de la cadena lateral de
carbohidrato de eritropoyetina, que se oxida con peryodato sódico
antes de la reacción o se desialila parcialmente y se oxida
subsiguientemente con peryodato sódico antes de la
reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
48. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 47, en donde el hidroxialquil-almidón
se hace reaccionar en su extremo reductor, que no está oxidado, con
un compuesto de acuerdo con la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en un medio
acuoso.
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