KR101154343B1 - 히드록시알킬 스타치 및 ｇ-ｃｓｆ의 컨쥬게이트 - Google Patents

히드록시알킬 스타치 및 ｇ-ｃｓｆ의 컨쥬게이트 Download PDF

Info

Publication number
KR101154343B1
KR101154343B1 KR1020067002747A KR20067002747A KR101154343B1 KR 101154343 B1 KR101154343 B1 KR 101154343B1 KR 1020067002747 A KR1020067002747 A KR 1020067002747A KR 20067002747 A KR20067002747 A KR 20067002747A KR 101154343 B1 KR101154343 B1 KR 101154343B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
group
groups
polymer
delete delete
protein
Prior art date
Application number
KR1020067002747A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20060037431A (ko
Inventor
볼프람 아이흐너
헬무트 크놀러
카타리나 루테베크
노베르트 잔더
로날드 프랑크
클라우스 좀머마이어
하랄드 에스. 콘라트
에크하르트 그라벤호르스트
Original Assignee
프레제니우스 카비 도이치란트 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2003/008829 external-priority patent/WO2004024776A1/en
Application filed by 프레제니우스 카비 도이치란트 게엠베하 filed Critical 프레제니우스 카비 도이치란트 게엠베하
Publication of KR20060037431A publication Critical patent/KR20060037431A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101154343B1 publication Critical patent/KR101154343B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 히드록시알킬 스타치 또는 히드록시알킬 스타치의 유도체와 단백질 간에 공유결합에 의해 형성되는 히드록시알킬 스타치 및 과립구 콜로니 자극 인자 단백질(G-CSF)의 컨쥬게이트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 컨쥬게이트의 제조방법 및 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
히드록시알킬 스타치, G-CSF, 컨쥬게이트

Description

히드록시알킬 스타치 및 Ｇ-ＣＳＦ의 컨쥬게이트{CONJUGATES OF HYDROXYALKYL STARCH AND G-CSF}
본 발명은 히드록시알킬 스타치 또는 히드록시알킬 스타치의 유도체와 단백질 간에 공유결합에 의해 형성되는 히드록시알킬 스타치 및 과립구 콜로니(colony) 자극 인자 단백질(G-CSF)의 컨쥬게이트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 컨쥬게이트의 제조방법 및 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
단백질이 폴리머성 분자에 커플링되면 단백질의 안정성은 향상 되어지고 단백질에 대한 면역 반응은 감소될 수 있다는 것이 일반적으로 받아들여진다. 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 변형된 생리학적 활성 단백질은 감소된 면역원성 및 항원성을 나타내고, 컨쥬게이션되지 않은 단백질보다 혈류내에서 상당히 오랫동안 순환한다(즉, 감소된 클리언스 레이트(clearance rate)가진다)는 것이 WO 94/28024에 개시되어 있다.
G-CSF는 두개의 인트라체인 디설파이드 결합에의해 안정화되고 하나의 O-결합된 탄수화물 부위를 함유한 21 kDa 글리코프로테인이다. 성숙된 G-CSF는 174 아미노산을 가진다. 동물 체내에서, G-CSF는 골수 간질 세포, 대식세포 및 섬유모세포에서 합성된다. 주기능은 중성구 및 그의 선구체 세포에 대한 성장 및 분화 인 자이다. 그러나, G-CSF는 성숙된 중성구를 활성화시킨다고 당업계에 알려져 있다. 추가로, 다양한 다른 혈액 형성 전구세포 성장/분활을 자극하며(추가적 혈액형성 성장 인자와 함께 상승작용으로) 내피세포의 증식 및 이동을 자극한다. 임상학적으로, G-CSF를 중성구 레벨 중 결핍(재생불량빈혈, 척수형성이상증, AIDS, 또는 화학요법에 의해 유발되는)치료에 대해 투여한다.
WO 02/09766는 생체적합한 폴리머 유도체와 생물학적 활성 단백질의 컨쥬게이션으로 생성된 다른 것들 중, 생체적합한 단백질 폴리머 화합물을 개시하고 있다. 사용된 생체적합한 폴리머는 높은 반응성의 분쇄 폴리머이고 그 결과 컨쥬게이트는 폴리머 유도체와 단백질 간의 긴 연결자를 포함한다. 생체적합한 폴리머로서, 화학식 (P-OCH2CO-NH-CHR-CO-)n-L-Qk-A의 폴리머가 개시되어 있으며, 여기에서 P 및 Q 는 폴리머성 잔기이며, k는 1 또는 0이고 P 및 Q는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리트리메틸렌 글리콜, 폴리락트산 및 그의 유도체, 폴리아크릴산 및 그의 유도체, 폴리아미노산, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리(L-리신), 폴리알킬렌 옥시드, 폴리아크릴 아미드 및 덱스트란 또는 다당류와 같은 수용성 폴리머가 언급되어 있다. 단백질로서 알파, 베타 및 감마 인터페론, 혈액인자, 인터루킨과 같은 시토킨, G-CSF, GM-CSF 등이 언급되어 있다. WO 02/09766의 실시예에서는 모노-, 디- 및 트리-폴리에틸렌글리콜 유도체가 인터페론 및 표피 성장 인자, 및 인간 성장 호르몬에 배타적으로 커플된 것만이 개시되어 있다.
WO 94/01483에는 생물학적 불반응성 폴리머 또는 폴리머 유도체와 약제학적으로 순순한,합성된 친수성 폴리머를 화학적 결합의 특정 유형을 통해 공유결합적으로 결합하여 형성된 생체적합성 폴리머 컨쥬게이트를 개시되어 있다. 천연적으로 발생된 폴리머 및 그의 유도체로서 히알루론산과 같은 다당류, 콘드로이틴 설페이트 A, B 및 C과 같은 프로테오글리칸, 키틴, 헤파린, 헤파린 설페이트, 사이클로덱스트란, 히드로옥시에틸 셀룰로스, 셀룰로스 에테르 및 스타치(starch)와 같은 덱스트란, 트리글리세리드 및 포스포리피드와 같은 리피드가 개시되어 있다. 합성된 폴리머로서, 다른 것들 중 폴리에틸렌 및 그의 유도체는 약 100 내지 약 100,000의 평균 분자량을 가진다고 개시되어 있다. 폴리머 및 폴리머 유도체에 결합된 단백질로서, 시토킨 및 성장 인자가 개시되어 있으며, 인터페론, 종양 괴사 인자, 인터루킨, 콜로니 자극 인자, 골원성 인자 추출, 표피 성장 인자, 형성 성장 인자, 혈소판 유도 성장 인자, 산성 섬유모세포 성장인자와 같은 성장 인자 및 기타 등이 개시되어 있다. WO 94/01483의 모든 실시예에서, 폴리에틸렌 글리콜 유도체가 폴리머로서 사용되었다.
WO 96/11953에는 N-말단 화학적으로 변형된 단백질 화합물 및 그의 생산 방법이 개시되어있다. 구체적으로, 수용성 폴리머를 G-CSF의 N 말단에 커플링시키는 G-CSF 조성물이 개시되어있다. WO 96/11953의 본문에, 수용성 폴리머와 N-말단 커플된 교감 인터페론이 개시되어있다. 한편 다양한 수(물) 폴리머가 WO 96/11953(예를 들어, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜, 카복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥소란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 무수 코폴리머, 폴리아미노산(호모폴리머 또는 랜덤 코폴리머 중 어느 하나), 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 코폴리머 또는 폴리프로필렌화된 폴리올)이 개시되어 있으나, PEG화된 G-CSF 또는 교감 IFN 조성물만이 WO 96/11953의 실시예에 개시되어 있다.
US 6,555,660 B2에는 G-CSF 활성을 나타내고, 적어도 하나의 구체화되고 도입된 및/또는 제거된 아미노산 잔기에서 인간 G-CSF의 아미노산 서열이 차이가 있는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 컨쥬게이트가 개시되어 있으며, 여기에서 컨쥬게이트는 비 폴리펩티드 부위에 대한 접착 그룹을 포함하고 추가로 폴리펩티드의 접착 그룹에 부착된 적어도 하나의 비 폴리펩티드 부위를 포함한다. 상기 폴리 펩티드부위는 폴리에틸렌 글리콜 또는 올리고당과 같은 폴리머 일수 있다. PEG는 덱스트란과 같은 다당류와 비교하여 교차 결합할 수 있는 반응성 그룹을 거의 가지고 있지 않기 때문에, US 6,555,660 B2에서 PEG는 매우 가장 바람직한 폴리머 분자로 명백하고 분명하게 언급되어 있다.
WO 97/30148은 2개 이상의 폴리펩티드 분자와 커플된 폴리머성 담체 분자를 함유한 감소된 알레르기항원성이 있는 폴리펩티드 컨쥬게이트에 관한것이다. 이 컨쥬게이트는 개인 캐어(care) 시장에서 사용되는 조성물의 바람직한 부분이다. 상기 컨쥬게이트는 폴리머성 담체 분자를 활성화시키고, 활성화된 폴리머성 담체 분자를 2 이상의 폴리펩티드 분자와 반응시키고, 컨쥬게이트상에 잔류 활성 그룹을 블로킹시켜서 생산된다. 폴리머성 담체 분자로서, 다양한 것이 WO 97/30148에 개시되어 있고, 여기에는 폴리올, 폴리아민, 폴리카르복실산 및 적어도 두개의 다른 부착 그룹을 함유하는 헤테로폴리머와 같은 천연 또는 합성 호모폴리머처럼 다른 그룹의 화합물 포함되어 있다. 예를 들어, 스타(star) PEG, 분지된 PEG, 폴리비닐 알코올, 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리-D,L-아미노산을 포함한것이 제시되어 있다. 카르복실메틸 덱스트란과 같은 덱스트란, 히드록시에틸 셀룰로스 또는 히드록시프로필 셀룰로스와 같은 셀룰로스, 키토산의 가수분해물, 히드록시에틸 스타치 또는 히드록시프로필 스타치와 같은 스타치, 글리코젠, 아가로스, 구아검, 이눌린, 풀루란, 잔탄검, 카라기닌, 펙틴, 알긴산 등이 개시되어 있다. 폴리펩티드로서, 일부 효소만이 명백하게 개시되어 있을 뿐이다.
Baldwin, J. E. 등., Tetrahedron, vol. 27 (1981), pp. 1723-1726 에는 덱스트란 및 히드록시에틸 스타치의 화학적 변형으로 헤모글로빈과 반응하여 용해성 폴리머-결합 헤모글로빈이 되게 하는 알데히드 치환된 폴리머를 제공하는 것이 개시되어 있다. 이들은 산소에 결합하는 능력을 보여주고 있으나, 심장 관류 실험은 폴리머-결합 헤모글로빈이 혈액 치환체로서 사용에 적합하지 않다는 것을 명백하게 지시하고 있다.
WO 99/49897는 헤모글로빈의 아미노 그룹과 덱스트란 또는 히드록시에틸 스타치와 같은 다당류와 반응시켜서 형성된 헤모글로빈의 컨쥬게이트를 개시하고 있다. 다당류의 아이오데이트으로서, 산화의 당 고리-오프닝에 의해 형성된 알데히드 그룹이 사용된다. 바람직한 환원제로서, 보란 디메틸아민이 개시되어 있다. 게다가, WO 99/49897에는 헤모글로빈으로 제한되어 있다.
WO 03/074087은 단백질을 스타치-유도된 변형된 다당류에 커플링시키는 방법에 관한 것이다. 단백질 및 다당류, 히드록시알킬 스타치간의 결합 작용은 말단 알데히드 그룹 또는 히드록시 알킬 스타치 분자의 상기 말단 알데히드 그룹의 화학적 변형으로 초래된 아이오데이트 및 단백질 아이오데이트간에 형성되는 공유 결합이다. 단백질의 반응 그룹으로서, 아미노 그룹, 티오 그룹 및 카복시 그룹이 개시되어있으나, 단백질의 알데히드 그룹은 언급되어 있지 않다. 추가로 다른 결합의 매우 다양한 가능이 다른 기능그룹, 이론적으로 알맞은 다른 결합 분자 및 다른 화학적 과정을 포함하는 많은 리스트 형태에 주어지는 반면에, 실시예는 단지 두 개의 대안책을 기술할 뿐이다: 첫번째로 산화된 히드록시에틸 스타치를 사용하고 에틸디메틸아미노프로필 카르보디이미드(EDC) 활성을 사용하여 단백질에 직접 커플링하거나 비-산화된 히드록시에틸 스타치를 사용하여 각각 아민에 연속적으로 환원된 시프 염기를 형성하는 단백질에 직접 커플링시킨다. 그래서, WO 03/074087의 실시예는 단백질의 티오 그룹이나 카복시 그룹을 통해 커플링된 단일의 컨쥬게이트 및 히드록시에틸 스타치, 단백질 및 하나 이상의 결합 분자를 포함한 컨쥬게이트를 개시한 적이 없다. 추가로 G-CSF 분자를 실시예에 사용한 것이 없다.
그러므로, 선행 기술에서 아직 개시되지 않은 히드록시알킬 스타치, 바람직하게는 히드록시에틸 스타치 및 G-CSF의 컨쥬게이트를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이 컨쥬게이트를 제조하는 방법을 제공하는 것이 다.
그러므로, 본 발명은 단백질 및 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하는 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 폴리머는 히드록시알킬 스타치(HAS)이고 단백질은 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)이며, 상기 방법은 폴리머 또는 그의 유도체의 적어도 하나의 작용 그룹 A를 단백질의 적어도 하나의 작용 그룹 Z와 반응시켜 공유결합을 형성하는 것을 포함하며, 여기에서 Z는 아미노 그룹, 티올 그룹, 알데히드 그룹 및 케토 그룹으로부터 선택되며,
- 여기에서, Z가 알데히드 그룹 또는 케토 그룹인 경우에, A 는 Z와 상기 결합을 형성하는 아미노 그룹을 포함하거나,
- 여기에서, Z 가 아미노 그룹일 경우에, A는 반응성 카복시 그룹 및 알데히드 그룹, 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
-- 여기에서, A 가 알데히드 그룹, 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹인 경우, 상기 방법은
---하나의 작용 그룹은 폴리머와 반응하고, 적어도 하나의 다른 작용 그룹은 알데히드 그룹, 케토 그룹 또는 헤미아세탈이거나, 추가로 화학적으로 변형되어 알데히드 그룹, 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 제공하는 기능그룹을 가진 적어도 이작용성 화합물과 폴리머를 반응시키거나,
--- 폴리머를 산화시켜 적어도 하나의, 특히 적어도 두개의 알데히드 그룹을 제공시켜 A를 폴리머에 도입하여 폴리머 유도체를 제공하는 것을 추가로 포함하며,
-- 여기에서, A가 반응성 카복시 그룹인 경우, 상기 방법은
--- 그것의 환원 말단에서 폴리머를 선택적으로 산화시키고 생성된 카복시 그룹을 활성시키거나,
--- 그것의 비-산화된 환원 말단에서 폴리머를 카보닉 디에스테르와 반응시킴에 의해 A를 폴리머에 도입시켜 폴리머 유도체를 제공하는 것을 추가로 포함하거나,
- 여기에서 Z가 티올 그룹인 경우, A는 Z와 상기 결합을 형성하는 말레이미도 그룹 또는 할로겐아세틸 그룹을 포함한다.
따라서 본 발명은 상기에서 기술한 방법에 의해 획득될 수 있는 컨쥬게이트에 관한 것이다.
G-CSF는 화학적 합성 과정에 의해 생산될 수 있거나, 인간[예를 들어, Burgess, A. W. 등. 1977, 인간 골수 세포에 의해 형성된 혈액 콜로니의 매체 조건화된 인간 태반의 자극, Blood 49 (1977), 573-583; Shah, R. G. 등. 1977, 인간 단핵세포 및 식물 적혈구응집소-자극 림프구에 의해 생산된 콜로니-자극 활성의 특성화, Blood 50 (1977), 811 참고] 또는 다른 포유류 소스로 일 수 있으며, 인간 태반, 인간 혈액 또는 인간 소변과 같이 자연스럽게 발생하는 소스로부터 정제하여 획득되어 질 수 있다. 추가로, 많은 상피 암종, 급성 골수병 백혈병 세포 및 다양한 종양 세포 라인(방광 암종, 속질모세포종)이 이 인자를 발현시킬 수 있다.
추가로, 발현 G-CSF은 G-CSF 변이체를 또한 포함할 수 있으며, 여기에서 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 1 내지 25, 바람직하게는 1 내지 10, 더 바람직하게는 1 내지 5, 가장 바람직하게는 1 또는 2)은 G-CSF 활성을 나타내는 다른 아미노산으로 변화될 수 있다[예를 들어, Riedhaar-Olson, J. F. 등 1996, 인간 과립구 콜로니-자극 인자의 활성에 결정적인 잔기 규명, Biochemistry 35: 9034-9041 1996; 미국 특허. Nos. 5,581,476; 5,214,132; 5,362,853; 4,904,584 참고]. G-CSF 활성의 측정은 당업계에 개시되어 있다[시험관내에서 G-CSF 활성 측정과 관련하여, 예를 들어. Shirafuji, N. 등 1989, 타겟으로서 쥐의 골수모세포성 NFS-60 세포와 감염 및 혈액 장애가 있는 환자 및 보통의 건강한 사람으로부터 세라(sera) 내의 그것의 수준을 측정을 이용하여 인간 과립구 콜로니-자극 인자(hG-CSF)에 대한 새로운 바이오에세이, Exp. Hematol. 1989, 17, 116-119; 생체내에서 G-CSF 활성 측정과 관련하여, 예를 들어 Tanaka, H. 등 1991, 쥐에서 폴리에틸렌 글리콜에 컨쥬게이트된 재조합형의 인간 과립구 콜로니-자극 인자의 약물동력학, Cancer Research 51, 3710-3714, 1991 참고].
G-CSF의 활성 측정에 대한 테스트한 추가의 공개문헌으로 미국 특허 제6,555,660호; Nohynek, G. J. 등 1997, 호중성백혈구감소증성 및 비호중성 백혈구감소증성 CD 쥐 중에 글리코실화된 및 비글리코실화된 재조합형 인간 과립구 콜로니-자극 인자의 효능 비교, Cancer Chemother Pharmacol (1997) 39; 259-266 가 있다.
바람직하게는 G-CSF를 재조합하여 생산한다. 이것은 DNA 합성에 의해 또는 게놈 또는 cDNA 클로닝에 의해 획득된 원핵 또는 진핵 호스트의 외인 DNA 시퀀스를 포함한다. 적당한 원핵 호스트는 E. coL1.와 같은 다양한 박테리아를 포함한다. 적당한 진핵 호스트에는 S. cerevisiae와 같은 이스트 및 중국 햄스터 난소 세포 및 원숭이 세포와 같은 포유류 세포를 포함한다.
단백질의 재조합형 생산은 당업계에 공지되어있다. 일반적으로, 이것은 알맞은 발현 벡터가 있는 호스트 세포의 트렌스펙션(transfection), 단백질 생산을 가능하게 하는 조건하에서 호스트 세포의 배양 및 호스트 세포로부터 단백질의 정제를 포함한다. 상세한 정보로, 예를 들어, Souza, L. M. 등. 1986, 재조합형의 인간 과립구 콜로니-자극 인자; 정상 및 백혈병 골수 세포에 대한 효과, Science 1986 232: 61-65,1986 ; Nagata, S. 등.1986, 인간 과립구 콜로니-자극 인자에 대한 cDNA의 분자 클로닝 및 발현, Nature 319: 415-418,1986 ; Komatsu, Y. 등. 1987, 인간의 대식세포로부터의 과립구 콜로니-자극 인자 cDNA의 클로닝 및 Escherichia coli 중의 그것의 발현, Jpn J Cancer Res.198778 (11):1179-1181을 참고하라.
바람직한 구체예에서, G-CSF는 인간 성숙 G-CSF의 아미노산 시퀀스를 가지고[예를 들어, Nagata, S. et.al.1986, 인간 과립구 콜로니-자극 인자에 대한 cDNA의 분자 클로닝 및 발현, Nature 319: 415-418,1986 참조], 그것의 아미노산 말단에 메티오닌을 추가로 포함할 수 있고, 그때 175 아미노산인 단백질이 된다. 추가로, 메티오닌 대신에, G-CSF는 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 G-CSF 및 본 발명에 따른 컨쥬게이트는 하나의 탄화수소 측쇄가 Thr 133 위치에 0-결합 글리코실화를 통해 G-CSF에 붙어 있는 것을 포함한다(즉, G-CSF가 글리코실화된다)[V. Gervais 등., Eur. J. Biochem. 1997,247,386-395 참고]. 탄화수소 측쇄의 구조는 NeuNAc(알파2-3)Gal(beta1-3)[NeuNAc(알파2-6)]GalNAc 및 (알파2-3)Gal(beta1-3)GalNAc(NeuNAc = N-아세틸네우람산, GalNAc = N-아세틸갈락토스아민)이다.
본래의 폴리펩티드와 비교되는 적어도 하나의 추가된 탄화수소 쇄를 도입한 G-CSF의 변형 및 다른 폴리펩티드가 제시되고 있다(미국 특허 제5,218,092호). 적용된 호스트에 의존하여, G-CSF 발현 생산물은 포유류 또는 다른 진핵 탄화수소와 글리코실화될 수 있다. 결과적으로, 탄화수소 측쇄는 포유류, 특히 인간, 곤충 또는 이스트 세포 내에서 생합성 동안 G-CSF에 부착될 수 있다.
재조합형의 인간 G-CSF (rhG-CSF)는 일반적으로 다양한 형태의 백혈구감소증에 사용된다. 그래서, 상업적으로 제조된 rhG-CSF가 필그라스팀(filgrastim(Gran? 및 Neupogen?), 레노그라스팀(Neutrogin? 및 Granocyte?) 및 나르토그라스팀 (Neu-up?)이라는 이름으로 판매된다. Gran? 및 Neupogen?는 비-글리코실화된것이고 재조합형의 E. coL1 세포로 생산되었다. Neutrogin? 및 Granocyte?는 글리코실화되고 재조합형의 CHO 세포로 생산되었고, Neu-up?은 재조합형의 E. coL1 세포에서 생산된 손상되지 않은 rhG-CSF의 N-말단 지역에 치환된 5개 아미노산으로 비-글리코실화된 것이다.
글리코실화된 단백질로서, Granocyte?과 같은 글리코실화된 G-CSF가 적용될 수 있다. 비 글리코실화된 G-CSF로서, Neupogen?와 같이 비-글리코실화된 G-CSF가 본 발명에 따른 컨쥬게이션 및 방법에 적용될 수 있다.
추가로, 위치-1에서, G-CSF는 메티오닌 아미노산 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 본문에서, 용어 "히드록시알킬 스타치(HAS)"는 적어도 하나의 히드록시알킬 그룹에 의해 치환된 스타치 유도체를 의미한다. 본 발명에서 바람직한 히드록시알킬 스타치는 화학식(I)의 구성을 가진다.
Figure 112006009433098-pct00001
여기에서 스타치 분자의 환원된 말단은 비-산화된 형태로 보여지고, 말단 당류 단위는 아세탈 형태로 보여지나, 예를 들어 용매에 따라 알데히드 형태와 평형상태를 이룰 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 히드록시알킬 스타치는 말단 탄화수소 부분이 화학식(I)에서 간략하게 묘사된 히드록시알킬 그룹 R1, R2, 및/또는 R3를 포함하는 화합물에 제한되지 않으며, 말단 탄화수소 부위 및/또는 스타치 분자의 남아 있는 부분중 어느 곳이든지 적어도 하나의 히드록시 그룹이 존재하는 화합물을 의미하며, HAS' 는 히드록시알킬 그룹 R1, R2, 또는 R3에 의해 치환된 것이다.
두 개 이상의 다른 히드록시알킬 그룹을 포함하는 히드록시알킬 스타치 또한 가능하다.
HAS 중에 포함되는 적어도 하나의 히드록시알킬 그룹은 두개 이상의 히드록시 그룹을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, HAS 중에 포함된 적어도 하나의 히드록시 그룹은 하나의 히드록시 그룹이다.
표현 "히드록시알킬 스타치"는 또한 알킬그룹이 모노- 또는 다 치환된 유도체이다. 본 명세서에서, 알킬그룹은 할로겐, 특히 플루오린 또는 아릴 그룹으로 치환된 것이 바람직하다. 추가로, 히드록시알킬 그룹의 히드록시 그룹은 에스테르화되거나 에테르화될 수 있다.
추가로 알킬대신에, 직쇄 또는 분쇄의 치환되거나 치환되지 않은 알켄 그룹이 사용될 수 있다.
히드록시알킬 스타치는 스타치의 에테르 유도체이다. 상기 에테르 유도체에 추가하여, 다른 스타치 유도체가 본 발명의 명세서에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 유도체는 에스테르화된 히드록시 그룹을 포함한 것이 유용하다. 이 유도체들은 예를 들어, 탄소 원자수 2 내지 12인 비치환된 모노- 또는 디카르복실산의 유도체이거나 그의 치환된 유도체일 수 있다. 특히 2 내지 6개의 탄소 원자를 가진 비치환된 모노카르복실산의 유도체가 유용하고, 더 바람직하게는 아세트산의 유도체이다. 본 명세서에서, 아세틸 스타치, 부틸 스타치 및 프로필 스타치가 바람직하다.
게다가, 2 내지 6개의 탄소 원자를 가진 비치환된 디카르복실산이 바람직하다.
디카르복실산 유도체의 경우, 디카르복실산의 제 2 카복시 그룹이 또한 에스테르화 될 수 있다. 추가로, 디카르보실산의 모노 알킬 에스테르 유도체는 본 발명의 본문에서 또한 적합할 수 있다.
치환된 모노-또는 디카르복실산에서, 치환된 그룹은 바람직하게는 치환된 알킬 잔기에 대해 상기에서 언급한 것과 동일하다.
스타치의 에스테르화에 대한 기술은 당업계에 공지되어 있다[예를 들어, Klemm D. 등, Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, New York, 특히 chapter 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9 참고].
본 발명의 바람직한 구체예에서, 화학식(I)에 따른 히드록시알킬 스타치가 적용된다. 화학식(I)에서, HAS'으로 표시된 간단하게 묘사된 당류 및 잔기는 함께 바람직한 히드록시알킬 스타치 분자를 나타낸다. HAS'를 포함하는 다른 당류 링 구조는 간단하게 묘사된 당류 고리와 같거나 다를 수 있다.
화학식 (I)에 따른 잔기 R1, R2, 및 R3에 관하여, 특별한 제한은 없다. 바람직한 구체예에서, R1, R2, 및 R3는 독립적으로 수소 또는 각각 알킬 잔기에서 2 내지 10개의 탄소 원자를 가진 히드록시알킬 그룹, 히드록시아릴 그룹, 히드록시아르알킬 그룹 또는 히드록시알크아릴 그룹이다. 수소 및 2 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 히이드록시 알킬 그룹이 바람직하다. 더 바람직하게는 2 내지 6개의 탄소 원자, 더 바람직하게는 2 내지 4개의 탄소 원자, 및 가장 바람직하게는 2 내지 4개의 탄소 원자를 가진 히드록시알킬 그룹이다. 그러므로 "히드록시알킬 스타치"는 히드록시에틸 스타치, 히드록시프로필 스타치 및 히드록시부틸 스타치를 포함하며, 여기에서 히드록시에틸 스타치 및 히드록시프로필 스타치가 더 바람직하며, 히드록시에틸 스타치가 가장 바람직하다.
알킬, 아릴, 아르알킬 및/또는 알크아릴 그룹은 직쇄이거나 분쇄 및 적당히치환된 것일 수 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 R1, R2, 및 R3가 독립적으로 수소이거나 1 내지 6개의 탄소 원자가 있는 직쇄 또는 분쇄의 히드록시알킬 그룹인 상기 기술된 방법에 관한 것이다.
그래서, R1, R2, 및 R3는 바람직하게는 히드록시 헥실, 히드록시펜틸, 히드록시부틸, 2-히드록시프로필, 3-히드록시프로필, 2-히드록시이소프로필과 같은 히드록시프로필, 2-히드록시에틸과 같은 히드록시에틸일 수 있으며, 수소 및 2-히드록시에틸 그룹일 때 특히 바람직하다.
그러므로, 본 발명은 또한 R1, R2, 및 R3가 독립적으로 수소 또는 2-히드록시에틸 그룹이고, 하나의 구체예에서, 적어도 하나의 잔기 R1, R2, 및 R3가 2-히드록시에틸 그룹인 상기 기술된 것과 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
히드록시에틸 스타치(HES)는 본 발명의 모든 구체예에서 가장 바람직하다.
그러므로 본 발명은 폴리머가 히드록시에틸 스타치이고 그 폴리머 유도체가 히드록시에틸 스타치 유도체인, 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관련된 것이다.
히드록시에틸 스타치(HES)는 천연적으로 발생하는 아밀로펙틴의 유도체이고, 체내의 알파-아밀라아제에의해 분해된다. HES는 탄화수소 폴리머 아밀로펙틴의 치환된 유도체이고, 이것은 95 중량% 까지의 농도로 콘 스타지에 존재한다. HES는 유리한 생물학적 성질을 나타내며 혈관 비중 대체제(replacement agent) 및 임상중 혈액희석 치료로 사용된다[Sommermeyer 등., 1987, Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278; and Weidler 등. , 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res. , 41,494-498].
아밀로펙틴은 글루코스 부분을 구성하고, 여기에서 주 쇄 중 알파-1,4-글루코시드 결합이 존재하고 분쇄된 위치에서 알파-1,6-글루코시드 결합이 형성된다. 이 분자의 물리적-화학적 성질은 글리코시드 결합의 유형에 따라 주로 결정된다. 닉(nick)된 알파-1,4-글루코시드 결합 때문에, 턴(turn)당 6개 글루코스-모노머가량이 있는 헬리카 구조가 생성된다. 폴리머의 생화학적 성질 및 물리-화학적 성질은 치환에 의해 변형될 수 있다. 히드록시에틸 그룹의 도입은 알카라인 히드록시에틸화를 통해 성취될 수 있다. 반응 조건의 적용하여, 히드록시에틸화와 관련하여 비치환된 글루코스 단량체 중 각각의 히드록시 그룹의 다른 반응성 개척이 가능하다. 이러한 사실로 인하여, 당업자는 제한된 범위내에서 치환 패턴에 영향을 줄 수 있다.
HES는 주로 분자량 분포 및 치환의 정도에 의해 특징되어진다. 치환도를 기술하는 두 가지 것이 있다.
1. 정도는 모든 글루코스 부분과 관련하여 치환된 글루코스 단량체의 상대적인 분율을 기술할 수 있다.
2. 치환도는 몰 치환으로 기술될 수 있으며, 이는 기술된 글루코스 부위당 히드록시에틸 그룹의 수로 기술된다.
본 발명의 명세서에서, 치환도는 DS로 표시되며, 상기 기술한 바와 같이 몰 치환에 관한 것이다.
HES 용액은 다분산 조성물로서 존재하며, 여기에서 각 분자는 폴리머화된 정도, 분지된 부위의 수 및 패턴 및 치환 패턴과 관련하여 다른 것과 다르다. HES는 그러므로 다른 분자량을 가진 화합물의 혼합물이다. 결과적으로, 특정 HES 용액은 통계적 수단을 이용하여 평균 분자량에의해 결정된다. 본 명세서에서, Mn은 분자 수에 의존하는 산술 평균으로 계산된다. 다르게, Mw(또는 MW), 중량 평균은 HES의 질량에 의존하는 단위를 나타낸다.
본 발명의 명세서에서, 히드록시에틸 스타치는 바람직하게 1 내지 300 kD의 평균 분자량(중량 평균)을 가진다. 히드록시에틸 스타치는 추가로 바람직한 몰 치환도 0.1 내지 0.8을 나타낼 수 있고, 히드록시에틸 그룹과 관련하여 2 내지 20범위에서 C2 :C6 치환 간의 바람직한 비율을 나타낼 수 있다.
본 발명의 명세서에서 사용된 용어"평균 분자량"은 Sommermeyer 등. , 1987, Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278; and Weidler 등.,1991, Arzneim. -Forschung/Drug Res. , 41,494-498 에 따라 결정된 중량이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 이용된 히드록시에틸 스타치의 평균 분자량은 1 내지 300 kD, 더 바람직하게는 2 내지 200 kD, 더 바람직하게는 4 내지 130 kD, 더 바람직하게는 4 내지 70 kD 이다.
약 130 kD의 평균 분자량을 갖는 HES에 대한 예로 Fresenius의 Voluven?이 있다. Voluven?은 인공 콜로이드이며, 적용되는, 예를 들어, 용적 대체에 대해, 히포보라에미아(hypovolaemia)의 치료 및 예방에 대한 치료적 지시에 사용된다. Voluven?의 특징은 130,000 +/-20,000 D의 평균 분자량, 0.4의 몰 치환 및 C2: C6 약 9: 1의 비율을 가진다.
그러므로, 본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같이 히드록시알킬 스타치가 4 내지 70 kD의 평균 분자량을 가지는 히드록시에틸 스타치인 방법 및 컨쥬게이트에 관련된 것이다.
바람직한 평균분자량의 범위는 예를 들어, 4 내지 70 kD 또는 10 내지 70 kD 또는 12 내지 70 kD 또는 18 내지 70 kD 또는 50 내지 70 kD 또는 4 내지 50 kD 또는 10 내지 50 kD 또는 12 내지 50 kD 또는 18 내지 50 kD 또는 4 내지 18 kD 또는 10 내지 18 kD 또는 12 내지 18 kD 또는 4 내지 12 kD 또는 10 내지 12 kD 또는 4 내지 10 kD이 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따라, 적용된 히드록시에틸 스타치의 평균분자량은 약 10 kD, 또는 9 내지 10 kD 또는 10 내지 11 kD 또는 9 내지 11 kD, 또는 약 12 kD, 또는 11 내지 12 kD 또는 12 내지 13 kD 또는 11 내지 13 kD 또는 약 18 kD, 또는 17 내지 18 kD 또는 18 내지 19 kD 또는 17 내지 19 kD 또는 약 50 kD, 또는 49 내지 50 kD 또는 50 내지 51 kD 또는 49 내지 51 kD과 같은 4 kD 이상 및 70 kD이하이다.
치환도(DS)와 관련하여, DS 는 적어도 0.1, 더 바람직하게는 적어도 0.2, 및 더 바람직하게는 적어도 0.4이다. 바람직한 DS의 범위는 0.1 내지 0.8, 더 바람직하게는 0.2 내지 0.8, 더 바람직하게는 0.3 내지 0.8 및 더 바람직하게는 0.4 내지 0.8, 더욱 더 바람직하게는 0.1 내지 0.7, 매우 바람직하게는 0.2 내지 0.7, 더 바람직하게는 0.3 내지 0.7 및 더 바람직하게는 0.4 및 0.7이다. 특히 바람직한 DS 값은 예를 들어, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8, 더 바람직하게는 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8, 더 바람직하게는 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8 이고, 더욱더 바람직하게는 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8 이고, 예를 들어, 0.4 및 0.7이 가장 바람직하다.
히드록시알킬 스타치(바람직하게는 히드록시에틸 스타치)의 분자량 및 치환정도 DS의 특히 바람직한 조합은 예를 들어, 10 kD 및 0.4 또는 lO kD 및 0.7 또는 12 kD 및 0.4 또는 12 kD 및 0.7 또는 18 kD 및 0.4 또는 18 kD 및 0.7 또는 50 kD 및 0.4 또는 50 kD 및 0.7이다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예에서, 히드록시에틸 스타치(여기에서 기술된 컨쥬게이트에 포함된 것 및 적용된 것으로서)는 약 20 kD 내지 약 130 kD을 가지고(즉, 약 40 kD, 약 50 kD, 약 60 kD, 약 70 kD, 약 80 kD, 약 90 kD, 약 100 kD, 약 110 kD, 약 120 kD, 약 130 kD), 바람직하게는 약 30 kD 내지 약 100 kD, 더 바람직하게는 약 40 내지 약 70 kD의 평균 분자량 및 0.4 내지 0.8, 더 바람직하게는 0.5 내지 0.8의 치환도를 가진다.
본 발명에서, 약 30kD는 즉, 26, 27, 28, 29, 31, 32, 33 또는 34 kD의 평균 분자량을 포함하는 스타치를 또한 포함하는 25 kD 내지 34 kD의 평균 분자량을 의미한다.
본 발명에서, 약 40kD는 즉, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 43 또는 44 kD의 평균 분자량을 포함하는 스타치를 또한 포함하는 35 kD 내지 44 kD의 평균 분자량을 의미한다.
본 발명에서, 약 50kD는 즉, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 53 또는 54 kD의 평균 분자량을 포함하는 스타치를 또한 포함하는 45 kD 내지 54 kD의 평균 분자량을 의미한다.
본 발명에서, 약 60kD는 즉, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63 또는 64 kD의 평균 분자량을 포함하는 스타치를 또한 포함하는 55 kD 내지 64 kD의 평균 분자량을 의미한다.
본 발명에서, 약 70kD는 즉, 66, 67, 68, 69, 71, 72, 73 또는 74 kD의 평균 분자량을 포함하는 스타치를 또한 포함하는 65 kD 내지 74 kD의 평균 분자량을 의미한다.
본 발명에서, 약 80kD는 즉, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83 또는 84 kD의 평균 분자량을 포함하는 스타치를 또한 포함하는 75 kD 내지 84 kD의 평균 분자량을 의미한다.
본 발명에서, 약 90kD는 즉, 86, 87, 88, 89, 91, 92, 93 또는 94 kD의 평균 분자량을 포함하는 스타치를 또한 포함하는 85 kD 내지 94 kD의 평균 분자량을 의미한다.
본 발명에서, 약 100kD는 즉, 96, 97, 98, 99, 101, 102, 103 또는 104 kD의 평균 분자량을 포함하는 스타치를 또한 포함하는 95 kD 내지 104 kD의 평균 분자량을 의미한다.
본 발명에서, 약 110kD는 즉, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113 또는 114 kD의 평균 분자량을 포함하는 스타치를 또한 포함하는 105 kD 내지 114 kD의 평균 분자량을 의미한다.
본 발명에서, 약 120kD는 즉, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123 또는 124 kD의 평균 분자량을 포함하는 스타치를 또한 포함하는 115 kD 내지 124 kD의 평균 분자량을 의미한다.
본 발명에서, 약 130kD는 즉, 126, 127, 128, 129, 131, 132, 133 또는 134 kD의 평균 분자량을 포함하는 스타치를 또한 포함하는 125 kD 내지 134 kD의 평균 분자량을 의미한다.
따라서, 상기에서 기술된 구체예에는 평균분자량이 약 30 kD 이고 치환도가 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8, 바람직하게는 0.6, 0.7 또는 0.8인 히드록시에틸 스타치(및 히드록시에틸 스타치를 포함하고 있는 여기에서 서술된 컨쥬게이트 및 히드록시에틸 스타치를 적용하고 있는 여기에서 기술된 방법)을 포함한다.
따라서, 상기에서 기술된 구체예에는 평균분자량이 약 40 kD 이고 치환도가 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8, 바람직하게는 0.6, 0.7 또는 0.8인 히드록시에틸 스타치(및 히드록시에틸 스타치를 포함하고 있는 여기에서 서술된 컨쥬게이트 및 히드록시에틸 스타치를 적용하고 있는 여기에서 기술된 방법)을 포함한다.
따라서, 상기에서 기술된 구체예에는 평균분자량이 약 50 kD 이고 치환도가 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8, 바람직하게는 0.6, 0.7 또는 0.8인 히드록시에틸 스타치(및 히드록시에틸 스타치를 포함하고 있는 여기에서 서술된 컨쥬게이트 및 히드록시에틸 스타치를 적용하고 있는 여기에서 기술된 방법)을 포함한다.
따라서, 상기에서 기술된 구체예에는 평균분자량이 약 60 kD 이고 치환도가 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8, 바람직하게는 0.6, 0.7 또는 0.8인 히드록시에틸 스타치(및 히드록시에틸 스타치를 포함하고 있는 여기에서 서술된 컨쥬게이트 및 히드록시에틸 스타치를 적용하고 있는 여기에서 기술된 방법)을 포함한다.
따라서, 상기에서 기술된 구체예에는 평균분자량이 약 70 kD 이고 치환도가 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8, 바람직하게는 0.6, 0.7 또는 0.8인 히드록시에틸 스타치(및 히드록시에틸 스타치를 포함하고 있는 여기에서 서술된 컨쥬게이트 및 히드록시에틸 스타치를 적용하고 있는 여기에서 기술된 방법)을 포함한다.
따라서, 상기에서 기술된 구체예에는 평균분자량이 약 80 kD 이고 치환도가 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8, 바람직하게는 0.6, 0.7 또는 0.8인 히드록시에틸 스타치(및 히드록시에틸 스타치를 포함하고 있는 여기에서 서술된 컨쥬게이트 및 히드록시에틸 스타치를 적용하고 있는 여기에서 기술된 방법)을 포함한다.
따라서, 상기에서 기술된 구체예에는 평균분자량이 약 90 kD 이고 치환도가 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8, 바람직하게는 0.6, 0.7 또는 0.8인 히드록시에틸 스타치(및 히드록시에틸 스타치를 포함하고 있는 여기에서 서술된 컨쥬게이트 및 히드록시에틸 스타치를 적용하고 있는 여기에서 기술된 방법)을 포함한다.
따라서, 상기에서 기술된 구체예에는 평균분자량이 약 100 kD 이고 치환도가 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8, 바람직하게는 0.6, 0.7 또는 0.8인 히드록시에틸 스타치(및 히드록시에틸 스타치를 포함하고 있는 여기에서 서술된 컨쥬게이트 및 히드록시에틸 스타치를 적용하고 있는 여기에서 기술된 방법)을 포함한다.
따라서, 상기에서 기술된 구체예에는 평균분자량이 약 110 kD 이고 치환도가 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8, 바람직하게는 0.6, 0.7 또는 0.8인 히드록시에틸 스타치(및 히드록시에틸 스타치를 포함하고 있는 여기에서 서술된 컨쥬게이트 및 히드록시에틸 스타치를 적용하고 있는 여기에서 기술된 방법)을 포함한다.
따라서, 상기에서 기술된 구체예에는 평균분자량이 약 120 kD 이고 치환도가 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8, 바람직하게는 0.6, 0.7 또는 0.8인 히드록시에틸 스타치(및 히드록시에틸 스타치를 포함하고 있는 여기에서 서술된 컨쥬게이트 및 히드록시에틸 스타치를 적용하고 있는 여기에서 기술된 방법)을 포함한다.
따라서, 상기에서 기술된 구체예에는 평균분자량이 약 130 kD 이고 치환도가 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8, 바람직하게는 0.6, 0.7 또는 0.8인 히드록시에틸 스타치(및 히드록시에틸 스타치를 포함하고 있는 여기에서 서술된 컨쥬게이트 및 히드록시에틸 스타치를 적용하고 있는 여기에서 기술된 방법)을 포함한다.
평균 분자량이 약 130 kD인 HES의 예는 치환도가 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 또는 0.8과 같은 0.2 내지 0.8, 바람직하게는 0.4, 0.5, 0.6, 또는 0.7과 같은 0.4 내지 0.7인 HES이다.
C2 :C6 치환 비율과 관련하여, 상기 치환은 바람직하게는 2 내지 20, 더 바람직하게는 2 내지 15 및 가장 바람직하게는 3 내지 12이다.
본 발명의 추가의 구체예에 따라서, 히드록시에틸 스타치의 혼합물은 또한 다른 평균분자량 및/또는 다른 치환도 및/또는 다른 C2:C6 치환 비율을 가진 것을 이용할 수 있다. 그러므로 히드록시에틸 스타치의 혼합물은 다른 평균분자량 및 다른 치환도 및 다른 C2:C6 치환 비율을 가진 것을 적용하거나, 다른 평균분자량 및 다른 치환도 및 같거나 유사한 C2:C6 치환 비율을 가진 것을 적용하거나, 다른 평균분자량 및 같거나 유사한 치환도 및 다른 C2:C6 치환의 비율을 가진 것을 적용하거나, 같은 또는 유사한 평균분자량 및 다른 치환도 및 다른 C2:C6 치환의 비율을 가진 것을 적용하거나, 다른 평균분자량 및 같거나 유사한 치환도 및 같거나 유사한 C2:C6 치환의 비율을 가진 것을 적용하거나, 같은 또는 유사한 평균분자량 및 다른 치환도 및 같거나 유사한 C2:C6 치환의 비율을 가진 것을 적용하거나, 같은 또는 유사한 평균분자량 및 같거나 유사한 치환도 및 다른 C2:C6 치환의 비율을 가진 것을 적용하거나, 대략 같은 평균분자량 및 대략 같은 치환도 및 대략 같은 C2:C6 치환의 비율을 가진 것을 적용할 수 있다.
본 발명에 따라 다른 컨쥬게이트 및/또는 다른 방법에서, 다른 히드록시 스타치, 바람직하게는 다른 히드록시에틸 스타치 및/또는 다른 히드록시알킬 스타치 혼합물, 바람직하게는 다른 히드록시에틸 스타치 혼합물이 적용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 단백질의 작용 그룹 Z는 알데히드 그룹 또는 케토 그룹이다. 그러므로, 본 발명은 단백질의 작용 그룹 Z이 알데히드 그룹 또는 케토 그룹인 상기 묘사된 대로의 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
단백질 내의 알데히드 또는 케토 그룹의 위치는 일반적으로 제한되지 않지만, 본 발명의 발마직한 하나의 구체예에 따른 알데히드 또는 케토 그룹은 단백질의 탄화수소 측쇄에 위치한다. 그러므로 본 명세서의 이 구체예에서, 글리코실화된 단백질이 적용된다.
글리코실화된 단백질로서, Granocyte?와 같은 글리코실화된 G-CSF가 적용될수 있다.
본 발명의 명세서에서, 용어 "탄화수소 측쇄"는 히드록시알데히드 또는 히드록시케톤 및 그의 화학적 변형체(Rompp Chemielexikon, Thieme Verlag Stuttgart, Germany, 9th edition 1990, Volume 9, pages 2281-2285 및 여기에서 인용된 참고 문헌 참고)를 의미한다. 추가로, 갈락토스, N-아세틸네우람산 및 N-아세틸갈락토스아민 등과 같은 천연적으로 발생하는 탄화수소 부위의 유도체를 의미한다. N-글루코실화된것이 적용된 G-CSF의 돌연변이의 경우, 탄화수소 부위는 만노스이다.
더 바람직한 구체예에서, 알데히드 그룹 또는 케토 그룹은 탄화수소 측쇄의 갈락토스 잔기의 일부분이다. 이 갈락토스 잔기는 이하에서 기술된 대로 말단 시알산을 제거한 후, 산화시켜 폴리머 또는 폴리머 유도체에 포함된 작용 그룹 A와 반응할 수 있게 제조될 수 있다.
추가의 바람직한 구체예에서, 작용 그룹 A를 포함하는 폴리머 또는 폴리머 유도체는 탄화수소 측쇄의 시알산 잔기, 바람직하게는 탄화수소 측쇄의 말단 시알 산 잔기에 결합된다.
말단 탄화수소 부위의 산화는 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다.
폴리펩티드의 탄화수소 부위의 화학적 산화 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 과요오드산염의 처리를 포함한다(Chamow 등., 1992, J. Biol. Chem. , 267, 15916-15922).
화학적 산화에 의해, 말단에 위치되거나 말단에 위치되지 않은 어떤 탄화수소 부위를 산화시키는 것이 원칙적으로 가능하다. 그러나, 온화한 반응 조건을 선택하여, 탄화수소 측쇄의 말단 시알산을 산화시켜 알데히드 그룹 또는 케토 그룹을 제공하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 온화한 반응 조건은 과요오드산염 농도가 바람직하게는 1 내지 50 mM, 더 바람직하게는 1 내지 25 mM 및 가장 바람직하게는 약 1 mM과 같은 1 내지 10 mM 인 적당한 수성 과요오드산염 용액과 단백질을 바람직하게는 0 내지 40℃ 및 더 바람직하게는 약 0℃와 같은 0 내지 21℃인 반응 온도에서, 바람직하게는 5 분 내지 5 시간, 더 바람직하게는 10 분 내지 2 시간 및 가장 바람직하게는 약 1시간과 같은 10분 내지 1 시간의 반응 시간으로 반응시키는 것을 의미한다. 바람직한 과요오드산염 : 단백질의 몰 비율은 1: 200 내지 1:1이고 더 바람직하게는약 15: 1와 같은 1: 50 내지 1: 5이다.
그러므로, 본 발명은 또한 단백질 및 폴리머 또는 폴리머 유도체의 반응전에, 글리코실화된 단백질을 과요오드산염 용액과 반응시켜 산화된 탄화수소 측쇄에 위치한 알데히드 그룹 또는 케토 그룹이 있는 단백질을 제공하는 상기에서 묘사된 바의 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
또다르게, 탄화수소 측쇄는 효소적으로 산화될 수 있다. 각 탄화수소 측쇄의 산화에 대한 효소는 당업계에 공지되었으며, 예를 들어, 갈락토스의 경우, 효소는 갈락토스 산화효소이다. 만약, 말단 갈락토스 부위를 산화시키려는 의도이고, , 만약 폴리펩티드가 탄화수소 쇄에 시알산을 부착할 수 있는 세포내에서 생산되었다면(예를 들어, 포유류 세포 또는 탄화수소 쇄에 시알산을 부착할 수 있게 유전적으로 변형된 세포 내에서 생산된 경우), 결과적으로 말단 시알산의 제거가 필요하다(부분적으로 또는 완전히). 시알산의 제거에 대한 화학적 또는 효소적 방법은 당업계에 공지되어 있다[Chaplin 및 Kennedy (eds.), 1996, Carbohydrate Analysis: a practical approach, 특히 Chapter 5 Montreuill, Glycoproteins, pages 175-177; IRL Press Practical approach series (ISBN 0- 947946-44-3)].
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 알데히드 그룹 또는 케토 그룹은 단백질의 N 말단에 위치할 수 있고, 알맞은 산화에 용이하다. 아미노산을 포함한 히드록시 그룹이 트레오닌 또는 세린처럼 단백질의 N 말단에 위치하는 경우에 있어서, 상기 N-말단 아미노산의 산화는 상기 케토 그룹 또는 알데히드 그룹에서 수행된다. 트레오닌은 G-CSF에서 유래된 인간의 N-말단 아미노산이다. 추가적 N-말단 세린 또는 트레오닌은 분자 생물학적 방법에 의해 활성화되는 것과 같은 G-CSF를 나타내는 어떤 단백질로부터라도 도입될 수 있다. 이 단백질 또는 인간 아미노산 시퀀스를 발현하는 단백질은 박테리아, 포유류, 곤충, 이스트 세포와 같은 진핵 세포 또는 원핵 세포에서의 발현에 의해 생산될 수 있으며, 이들은 글리코실화되거나 되지 않은 것일 수 있다. 적당한 N-말단 아미노산의 화학적 산화 방법으로서, 생각할 수 있는 방법이 적용될 수 있으며, 이에는 바람직한 과요오드산염을 포함한 산화를 포함한다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 온화한 반응 조건은 과요오드산염 농도가 바람직하게는 1 내지 50 mM, 더 바람직하게는 1 내지 25 mM 및 가장 바람직하게는 약 1 mM과 같은 1 내지 10 mM 인 적당한 수성 과요오드산염 용액과 단백질을 바람직하게는 0 내지 40℃ 및 더 바람직하게는 약 0℃와 같은 0 내지 21℃인 반응 온도에서, 바람직하게는 5 분 내지 5 시간, 더 바람직하게는 10 분 내지 2 시간 및 가장 바람직하게는 약 1시간과 같은 10분 내지 1 시간의 반응 시간으로 반응시키는 것을 의미한다. 바람직한 과요오드산염 : 단백질의 몰 비율은 1: 200 내지 1:1이고 더 바람직하게는약 15: 1와 같은 1: 50 내지 1: 5이다.
그러므로, 본 발명은 또한 알데히드 그룹 또는 케토 그룹이 단백질의 탄화수소 측쇄 및/또는 단백질의 N-말단 그룹에 위치하는 상기에서 묘사된 바의 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
번역 후로 글리코실화된 것을 가진 진핵 세포에서 생산된 단백질의 올리고당 패턴은 인간에서 유래된 단백질로 특정되지 않는다. 추가로, 많은 글리코실화된 단백질은 갈락토스 잔기와 같은 추가의 탄화수소 부위를 마스킹(masking)하는 바람직한 수의 말단 시알산 잔기를 가지지 않는다. 갈락토스 잔기와 같은 이런 추가의 탄화수소 부위는 그러나, 만약 마스킹되지 않았다면, 약으로서 단백질의 사용 가능과 관련하여 단백질의 더 짧은 플라즈마 반감기와 같은 불이익을 초래할 수 있다. 예를 들어 이하에서 개시된 것과 같은 옥심 결합을 통해, 단백질의 탄화수소 측쇄의 탄화수소 부위에 직접 또는 하나 또는 두개의 결합 화합물과 같은 적어도 하나의 결합 화합물을 통해 공유결합으로 결합된 히드록시알킬 스타치 폴리머, 바람직하게는 히드록시에틸 스타치 폴리머에 의해 형성된 단백질 컨쥬게이트를 제공하여, 적어도 상기 언급된 불이익을 극복할 수 있다는 것을 본 발명자들은 발견하였다. 그래서, 히드록시알킬 스타치 폴리머 또는 그의 유도체, 바람직하게는 히드록시에틸 스타치 폴리머 또는 그의 유도체를 적어도 하나의 글리코실화된 단백질의 탄화수소 측쇄에 커플시켜, 탄화수소 측쇄에 위치한 적당한 말단 탄화수소 잔기가 결여된 것을 보상할 수 있다고 이해된다. 본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 기술된 대로 산화된 탄화수소 부위와 커플링된 히드록시알킬 스타치 폴리머 또는 그의 유도체, 바람직하게는 히드록시에틸 스타치 폴리머 또는 그의 유도체는 상기 불이익을 보상할 뿐만 아니라 각각 천연적으로 발생하는 단백질보다 바람직한 용도면에 있어서, 더 나은 특성을 가진 단백질 컨쥬게이트를 제공한다. 그러므로, 본 발명에 따른 각각의 컨쥬게이트는 보상적이고, 심지어 단백질상에서 시너지 효과도 가진다. 인간 단백질과 동일하거나 인간 단백질인 단백질은 천연적으로 발생하는 탄화수소 부위에서 시알산 잔기와 같은 원하는 수의 적당히 마스킹된 말단 탄화수소 잔기를 가지지 않는다. 상기 기술된 대로 산화된 탄화수소 부위와 커플링된 히드록시알킬 스타치 폴리머 또는 그의 유도체, 바람직하게는 히드록시에틸 스타치 폴리머 또는 그의 유도체는 인공적으로 합성된 단백질의 불이익을 극복하고 보상할 뿐만 아니라 천연적으로 발생한 단백질의 특성을 향상시킨다. 단백질의 산화된 탄화수소 부위 중 알데히드 그룹 또는 케토 그룹과 커플링되는 히드록시알킬 스타치 폴리머 또는 그의 유도체, 바람직하게는 히드록시에틸 스타치 폴리머 또는 그의 유도체의 작용 그룹에 대해, 참고문헌은 작용 그룹 A를 이하에서 개시된 바로 제조한다. 이 일반적인 개념은 글리코실화된 G-CSF에 적용가능하며, 말단의 탄화수소 잔기의 부족이 있는 모든 글리코실화된 것에 원칙적으로 적용될 수 있다. 에리스로포이에틴(EPO), 인터페론 베타 1a (IFN 베타 1a), ATIII, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 알파1-항트립신(A1AT), htPA, 또는 GM-CSF 등이 언급될 수 있다.
그러므로, 본 발명 또한 적어도 하나의 케토 또는 알데히드 그룹이 있는 단백질의 적어도 하나의 산화된 탄화수소 부위에 대해 상기 스타치 또는 그의 유도체와 공유적으로 커플링시켜, 자연적으로 발생하거나 번역 후에 부착된 단백질의 탄화수소 부위 중 말단 탄화수소 잔기, 바람직하게는 시알산 잔기의 결여를 보상하기 위한 히드록시알킬 스타치, 바람직하게는 히드록시에틸 스타치 또는 그의 유도체의 용도에 관련된 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 적어도 하나의 케토 또는 알데히드 그룹이 있는 단백질의 적어도 하나의 산화된 탄화수소 부위에 대해 히드록시알킬 스타치, 바람직하게는 히드록시에틸 스타치 또는 그의 유도체와 공유적으로 커플링시켜, 바람직하게는 옥심 결합을 통해, 자연적으로 발생하거나 번역 후에 부착된 단백질의 탄화수소 부위 중 말단 탄화수소 잔기, 바람직하게는 시알산 잔기의 결여를 보상하기 위한 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 또한 적어도 하나의 케토 또는 알데히드 그룹이 있는 단백질의 적어도 하나의 산화된 탄화수소 부위에 대해 히드록시알킬 스타치, 바람직하게는 히드록시에틸 스타치 또는 그의 유도체와 공유적으로 커플링시켜 형성된 컨쥬게이트에 관련된 것이며, 상기 단백질은 천연 소스에서 분리되거나 포유류, 곤충 또는 이스트 세포와 같은 진핵 세포에서 발현되어 생산되며, 컨쥬게이트는 원하는 용도, 바람직하게는 의약 용도 면에서, 각각 비변형된 단백질과 동일하거나 더 나은 특성을 가진다.
단백질의 작용 그룹 Z가 알데히드 그룹 또는 케토 그룹인 경우, 폴리머 또는 그의 유도체의 작용 그룹 A는 구조 -NH-에 따른 아미노 그룹을 포함한다.
그러므로, 본 발명은 임의로 산화되고 환원된 폴리머 말단과 반응할 수 있는 작용 그룹 A가 구조 -NH-에 따른 아미노산을 포함하는 상기 서술대로의 방법 및 컨쥬게이트에 관련된 것이다.
본 발명의 하나의 바람직한 구체예에 따르면, 이 작용 그룹 A는 구조 R'-NH-를 가지는 그룹이고, 여기에서 R'은 수소 또는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴시클로알킬, 알크아릴 또는 시클로알킬아릴 잔기이며, 이 때, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴시클로알킬, 알크아릴 또는 시클로알킬아릴 잔기는 NH 그룹과 직접 결합될 수 있거나, 다른 구체예에 따르면, NH 그룹에 산소 결합으로 결합될 수 있다. 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬,아릴시클로알킬, 알크아릴, 또는 시클로알킬아릴 잔기가 적절히 치환될 수 있다. 바람직한 치환기로서, F, Cl 또는 Br과 같은 할로겐이 언급될 수 있다. 특히 바람직한 잔기 R'은 수소, 알킬 및 알콕시 그룹이고, 수소, 및 비치환된 알킬 및 알콕시 그룹이 보다 더욱 바람직하다.
알킬 및 알콕시 그룹 가운데, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 C 원자를 가진 그룹이 바람직하다. 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 및 이소프로폭시 그룹이 더욱 바람직하다. 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시가 특히 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 메틸 또는 메톡시이다.
따라서, 본 발명은 또한 R'이 수소, 또는 메틸 또는 메톡시 그룹인 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따라, 작용 그룹 A는 구조 R'-NH-R"를 가지고, 여기에서 R"은 바람직하게는 구조 단위 -NH 및/또는 구조단위 -(C=G)-를 포함하며, 이 때 G는 O 또는 S, 및/또는 구조단위 -SO2-이다. 더욱 바람직한 구체예에 따라, 작용 그룹 R"는 하기 그룹으로부터 선택된다.
Figure 112006009433098-pct00002
상기 식에서, G는 2가지로 존재하며, 독립적으로 O 또는 S이다.
따라서, 아미노 그룹 -NH2을 포함하는 바람직한 작용 그룹 A는 예를 들어, 하기 구조이다.
Figure 112006009433098-pct00003
상기 식에서 G는 O 또는 S이고, 만일 2가지로 존재하면, 독립적으로 O 또는 S이며, R'은 메틸이다.
아미노 그룹을 포함하는 특히 바람직한 작용 그룹 A는 특히 바람직한 아미노옥시 그룹,
Figure 112006009433098-pct00004
H2N-O-, 및 하기 히드라지도 그룹이다.
Figure 112006009433098-pct00005
상기 식에서, G는 바람직하게는 0이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법에 관한 것으로, 여기에서 단백질의 작용 그룹 Z는 알데히드 그룹 또는 케토 그룹이고, 작용 그룹 A는 아미노옥시 그룹 또는 히드라지도 그룹이다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따라, A는 아미노옥시 그룹이다.
그래서, 본 발명은 또한 상기 기재된 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 단백질의 작용 그룹 Z는 알데히드 그룹 또는 케토 그룹이고, 작용 그룹 A는 아미노옥시 그룹 또는 히드라지도 그룹이다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따라, A는 아미노옥시 그룹이다.
폴리머 또는 폴리머 유도체의 아미노옥시 그룹을 단백질의 알데히드 그룹 또는 케토 그룹과 반응시킬 때, 옥심 결합이 형성된다.
따라서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같이 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 단백질 및 폴리머 또는 폴리머 유도체 간의 공유 결합은 단백질의 작용 그룹 Z및 폴리머 또는 폴리머 유도체의 작용 그룹 A의 반응에 의해 형성되는 옥심 결합이고, 상기 작용 그룹 Z는 알데히드 그룹 또는 케토 그룹이며, 상기 작용 그룹 A는 아미노옥시 그룹이다.
폴리머 또는 폴리머 유도체의 히드라지도 그룹을 단백질의 알데히드 그룹 또는 케토 그룹과 반응시킬 때, 히드라존 결합이 형성된다.
따라서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같이 또한 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 단백질 및 폴리머 또는 폴리머 유도체 간의 공유 결합은 단백질의 작용 그룹 Z 및 폴리머 또는 폴리머 유도체의 작용 그룹 A의 반응에 의해 형성된 히드라존 결합이고, 이 때 상기 작용 그룹 Z는 알데히드 그룹 또는 케토 그룹이며, 상기 작용 그룹 A는 히드라지도 그룹이다.
작용 그룹 A를 폴리머에 도입하기 위해서, 폴리머 유도체가 작용 그룹 A를 포함하도록 하는데 특이적 제한이 존재하지 않는다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 작용 그룹 A가 적어도 이작용성 화합물로 폴리머를 반응시켜 폴리머에 도입되는데, 여기에서 하나의 작용 그룹은 폴리머의 적어도 하나의 작용 그룹과 반응할 수 있고, 적어도 이작용성 화합물의 적어도 하나의 다른 작용 그룹은 작용 그룹 A가 되거나 화학적으로 변형되어 작용 그룹 A를 형성한다.
더욱 추가적 바람직한 구체예에 따라, 폴리머가 그것의 임의로 산화된 환원 말단에서 적어도 이작용성 화합물과 반응한다.
폴리머가 그것의 비-산화된 환원 말단과 반응하는 경우, 폴리머는 바람직하게는 하기 구조를 갖는다.
Figure 112006009433098-pct00006
상기 화학식 (I)에서, 비-산화된 환원 말단의 알데히드 형태가 포함된다.
폴리머가 그것의 산화된 환원 말단과 반응하는 경우, 폴리머는 바람직하게는 화학식(IIa) 및/또는 화학식(IIb)에 따른 하기 구조를 가진다.
Figure 112006009433098-pct00007
Figure 112006009433098-pct00008
폴리머, 바람직하게는 히드록시에틸 스타치의 환원 말단의 산화가 상기 언급된 구조 (IIa) 및/또는 (IIb)를 가지는 화합물을 제조하는 각 방법 또는 방법의 결합에 따라 수행될 수 있다.
산화가 모든 적절한 방법 또는 히드록시알킬 스타치의 산화된 환원 말단을 제공하는 방법에 따라 수행될 수 있지만, 바람직하게는 예를 들어, 본원의 참고문헌으로 개시되어 있는 DE 196 28 705 Al (실시예 A, 컬럼 9, 6 내지 24면)에 기재된 바와 같은 알칼리성 요오드 용액을 사용하여 수행된다.
폴리머의 임의로 산화된 환원 말단과 반응할 수 있는 적어도 이작용성 화합물의 작용 그룹으로서, 각 작용 그룹은 히드록시알킬 스타치의 임의로 산화된 환원 말단과 화학적 결합을 형성하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 이 작용 그룹은 화학 구조 -NH-를 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 적어도 이작용성 화합물의 작용 그룹, 즉 폴리머의 임의로 산화된 환원 말단과 결합할 수 있는 상기 작용 그룹은 구조 -NH-를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 적어도 이작용성 화합물의 이 작용 그룹은 구조 R'-NH-를 가지는 그룹으로, 여기에서 R'은 수소 또는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴시클로알킬, 알크아릴 또는 시클로알킬아릴 잔기이고, 이 때 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴시클로알킬, 알크아릴 또는 시클로알킬아릴 잔기는 NH 그룹에 직접 결합하거나, 다른 구체예에 따라, NH 그룹에 산소 결합으로 결합될 수 있다. 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴시클로알킬, 알크아릴, 또는 시클로알킬아릴 잔기는 적절하게 치환될 수 있다. 바람직한 치환기로서, F, Cl 또는 Br과 같은 할로겐이 언급될 수 있다. 특히 바람직한 잔기 R'은 수소, 알킬 및 알콕시 그룹이고, 보다 더 바람직하게는 수소 및 비치환된 알킬 및 알콕시 그룹이다.
알킬 및 알콕시 그룹 중에, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 C 원자를 가진 그룹이 바람직하다. 더 바람직하게는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 및 이소프로폭시 그룹이다. 특히 바람직하게는 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시이고, 메틸 또는 메톡시가 더욱 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 언급된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 R'은 수소 또는 메틸 또는 메톡시 그룹이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따라, 적어도 이작용성 화합물의 작용 그룹이 구조 R'-NH-R"-을 가지고, 여기에서 R"은 바람직하게는 구조 단위 -NH- 및/또는 구조단위 -(C=G)-를 가지며, 이 때 G는 O 또는 S, 및/또는 구조 단위 -S02-이다. 더욱 바람직한 구체예에 따라, 작용 그룹 R"는 하기 그룹으로부터 선택된다.
Figure 112006009433098-pct00009
상기 식에서 G는 2가지로 존재하며, 이는 독립적으로 O 또는 S이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 적어도 이작용성 화합물의 작용 그룹, 즉 폴리머의 임의로 산화된 환원 말단과 반응할 수 있는 상기 작용 그룹은 하기 그룹으로부터 선택된다.
Figure 112006009433098-pct00010
상기 식에서, G는 O 또는 S이고, 만일 2가지로 존재하면, 독립적으로 O 또는 S이며, R'은 메틸이다.
본 발명의 보다 더욱 바람직한 구체예에 따라, 적어도 이작용성 화합물의 작용 그룹, 즉 폴리머의 임의로 산화된 환원 말단과 반응할 수 있고 아미노 그룹을 포함하는 상기 작용 그룹은 하기 아미노옥시 그룹:
Figure 112006009433098-pct00011
또는 하기 히드라지도 그룹:
Figure 112006009433098-pct00012
이고, 특히 H2N-O-가 바람직하며, 상기 식에서 G는 바람직하게는 0이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 단백질의 작용 그룹 Z는 알데히드 그룹 또는 케토 그룹이고, 적어도 이작용성 화합물의 작용 그룹, 즉 폴리머의 임의로 산화된 환원 말단과 반응할 수 있는 상기 작용 그룹은 아미노옥시 그룹 또는 히드라지도 그룹이며, 바람직하게는 아미노옥시 그룹이다.
그래서, 본 발명은 또한 상기 기재된 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 단백질의 작용 그룹 Z는 알데히드 그룹 또는 케토 그룹이고, 적어도 이작용성 화합물의 작용 그룹, 폴리머의 임의로 산화된 환원 말단과 반응할 수 있는 상기 작용 그룹은 아미노옥시 그룹 또는 히드라지도 그룹이며, 바람직하게는 아미노옥시 그룹이다
본 발명의 추가적 바람직한 구체예에 따라, 적어도 이작용성 화합물은 비-산화된 환원 말단에서 폴리머와 반응한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따라, 폴리머의 임의로 산화된 환원 말단과 반응하는 적어도 이작용성 화합물은 작용 그룹 A를 포함한다.
적어도 이작용성 화합물은 우선 폴리머와 반응하여 폴리머 유도체를 제조하고, 그 후에 작용 그룹 A를 통하여 단백질과 반응한다. 또한 적어도 이작용성 화합물은 우선 작용 그룹 A를 통하여 단백질과 반응하여 단백질 유도체를 제조하고, 그 후에 단백질 유도체에 포함된 적어도 이작용성 화합물의 작용 그룹 잔기의 적어도 하나를 통하여 폴리머와 반응할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 적어도 이작용성 화합물은 우선 폴리머와 반응한다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 상기 방법은 A를 포함하는 폴리머 유도체 및 Z를 포함하는 단백질이 반응하기 전에, 폴리머가 비-산화된 환원 말단에서 폴리머의 비-산화된 환원 말단과 반응할 수 있는 작용 그룹 및 그룹 A를 포함하는 적어도 이작용성 결합 화합물과 반응하는 것을 추가로 포함한다.
폴리머와 반응하는 적어도 이작용성 결합 화합물의 작용 그룹 및 단백질의 작용 그룹 Z와 반응하는 적어도 이작용성 결합 화합물의 작용 그룹 A는 임의의 적절한 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 스페이서는 임의로 적절히 치환된 선형, 측쇄 및/또는 사이클릭 탄화수소 잔기 등일 수 있다. 일반적으로 탄화수소 잔기는 60까지, 바람직하게는 40까지, 더 바람직하게는 20까지, 더 바람직하게는 10까지, 더 바람직하게는 6까지, 및 특히 바람직하게는 4까지의 탄소 원자수를 가진다. 헤테로 원자가 존재하면, 각각의 그룹은 통상 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 8, 더 바람직하게는 1 내지 6, 더 바람직하게는 1 내지 4 및 특히 바람직하게는 1 내지 2 헤테로 원자를 포함한다. 헤테로 원자로, O가 바람직하다. 탄화수소 잔기는 예를 들어, 탄소 원자수 5 내지 7인 임의로 측쇄 알킬 쇄 또는 아릴 그룹 또는 시클로알킬 그룹을 포함하거나, 아르알킬 그룹, 알크아릴 그룹일 수 있고, 여기에서 알킬 부분은 직쇄 및/또는 사이클릭 알킬 그룹일 수 있다. 본 발명의 보다 더욱 바람직한 구체예에 따라, 작용 그룹은 탄소 원자수 4인 직쇄 탄화수소 쇄로 분리된다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따라, 작용 그룹은 탄소 원자수 4인 탄소 원자 및 적어도 하나의, 바람직하게는 하나의 헤테로 원자, 특히 바람직하게는 산소 원자를 가지는 직쇄 탄화수소 쇄로 분리된다.
추가적 바람직한 구체예에 따라, 적어도 이작용성 결합 화합물은 동종 이작용성(homobifunctional) 결합 화합물이다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 관한 것으로, 여기에서 적어도 이작용성 결합 화합물은 동종 이작용성 화합물이다.
그래서, 결합 화합물의 상기 언급된 바람직한 작용 그룹에 관하여, 상기 동종 이작용성 결합 화합물은 바람직하게는 두개의 아미노옥시 그룹 H2N-O- 또는 두개의 아미노옥시 그룹 R'-O-NH- 또는 두개의 히드라지도 그룹 H2N-NH-(C=G)- 중 하나를 포함하고, 여기에서 상기 아미노옥시 그룹 H2N-O- 및 히드라지도 그룹 H2N-NH- (C=O)-이 바람직하며, 아미노옥시 그룹 H2N-O-이 특히 바람직하다.
두개의 히드라지도 그룹 H2N-NH-(C=O)-을 포함하는 모든 생각할 수 있는 동종 이작용성 화합물 가운데, 히드라지드가 바람직하고, 여기에서 두개의 히드라지도 그룹이 60까지, 바람직하게는 40까지, 더 바람직하게는 20까지, 더 바람직하게는 10까지, 더 바람직하게는 6까지, 및 특히 바람직하게는 4까지의 탄소 원자를 가지는 탄화수소 잔기로 분리된다. 더 바람직하게는, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수 1, 2, 3, 또는 4와 같이 탄소 원자수가 1 내지 4이다. 가장 바람직하게는, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수가 4이다. 따라서, 하기 화학식에 따른 동종 이작용성 화합물이 바람직하다:
Figure 112006009433098-pct00013
본 발명의 보다 더욱 바람직한 구체예에 따라, 이작용성 결합 화합물은 하기의 카보히드라지드이다:
Figure 112006009433098-pct00014
상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 적어도 이작용성 결합 화합물이 동종 이작용성 화합물이고, 두개의 아미노옥시 그룹을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 적어도 이작용성 결합 화합물은 동종 이작용성 화합물이고 두개의 아미노옥시 그룹 H2N-O-을 포함한다.
상기 기재된 바와 같이, 폴리머는 바람직하게는 이작용성 결합 화합물과 반응하기 전에 산화되지 않는 환원 말단에서 반응한다. 따라서, 폴리머와 함께 두개의 아미노옥시 그룹 H2N-O-을 포함하는 바람직한 동종 이작용성 화합물의 반응은 옥심 결합을 포함하는 폴리머 유도체를 형성한다.
따라서, 단백질의 작용 그룹 Z는 폴리머 유도체의 아미노옥시 그룹과 반응하는 알데히드 또는 케토 그룹이기 때문에, 본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같이 컨쥬게이트에 관한 것으로, 상기 컨쥬게이트는 폴리머 및 단백질을 포함하고, 각각은 옥심 또는 사이클릭 아미날(aminal) 결합에 의해 결합 화합물에 공유 결합한다.
두개의 아미노옥시 그룹 H2N-O-을 포함하는 모든 생각할 수 있는 동종 이작용성 화합물 가운데, 이작용성 화합물은 두개의 아미노옥시 그룹이 탄소 원자수 1 내지 60, 바람직하게는 1 내지 40, 더 바람직하게는 1 내지 20, 더 바람직하게는 1 내지 10, 더 바람직하게는 1 내지 6 및 특히 바람직하게는 1 내지 4인 탄화수소 잔기에 의해 분리되는 경우, 바람직하다. 더 바람직하게는, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수 1, 2, 3, 또는 4와 같이 탄소 원자수가 1 내지 4이다. 가장 바람직하게는, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수가 4이다. 보다 더 바람직하게는, 탄화수소 잔기는 적어도 하나의 헤테로 원자, 더 바람직하게는 하나의 헤테로 원자, 및 가장 바람직하게는 하나의 산소 원자를 가진다. 하기 화학식에 따른 화합물 0-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]히드록실 아민이 특히 바람직하다.
Figure 112006009433098-pct00015
따라서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같이 컨쥬게이트에 관한 것으로, 상기 컨쥬게이트는 하기 화학식:
Figure 112006009433098-pct00016
에 따른 구조를 가지며, 상기 식에서, HAS'는 바람직하게는 HES'이다. 특히 바람직한 히드록시에틸 스타치는, 예를 들어, 약 10 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 10 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 12 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 12 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 18 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 18 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 50 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 50 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치이다.
특히 상기 결합 화합물이 두개의 아미노옥시 그룹 H2N-O-를 포함하는 동종 이작용성 결합 화합물인 경우, 비-산화된 환원 말단에서 폴리머의 결합 화합물과의 반응은 바람직하게는 수성 시스템에서 수행된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "수성 시스템"은 적어도 10 중량% 범위의 물을 포함하는 용매 또는 용매의 혼합물을 언급한다. 바람직하게는 용매의 중량에 기초하여 적어도 50 중량%, 더 바람직하게는 적어도 80 중량%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90 중량% 또는 100 중량%까지, 포함된다. 바람직한 반응 매질은 물이다.
다른 구체예에 따라, 적어도 하나의 다른 용매는 HAS, 바람직하게는 HES가 가용성일 때 사용될 수 있다. 이들 용매의 예는 예를 들어, DMF, 디메틸아세트아미드 또는 DMSO이다.
반응 동안 적용되는 온도에 관한 한, 원하는 폴리머 유도체를 제공하는 반응을 일으킨다면 특정 제한이 존재하지 않는다.
폴리머가 두개의 아미노옥시 그룹 H2N-O-, 바람직하게는 0-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]히드록실 아민을 포함하는 동종 이작용성 결합 화합물과 반응하는 경우, 온도는 바람직하게는 0 내지 45 ℃ 범위, 더 바람직하게는 4 내지 30 ℃ 범위 및 특히 바람직하게는 15 내지 25 ℃ 범위이다.
폴리머와 두개의 아미노옥시 그룹 H2N-O-, 바람직하게는 0-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]히드록실 아민을 포함하는 동종 이작용성 결합 화합물과의 반응에서 반응 시간은, 특수한 필요에 적합할 수 있고, 일반적으로 1 시간 내지 7 일 범위, 바람직하게는 1 시간 내지 3 일 범위 및 더 바람직하게는 2 시간 내지 48 시간 범위이다.
폴리머의 두개의 아미노옥시 그룹 H2N-O-, 바람직하게는 0-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]히드록실 아민을 포함하는 동종 이작용성 결합 화합물과의 반응에 대한 pH 값은 반응물의 화학적 특성과 같은 특수한 필요에 적합할 수 있다. pH 값은 바람직하게는 4.5 내지 9.5, 더 바람직하게는 4.5 내지 6.5 범위이다.
상기 언급된 반응 상태의 특정 예는 예를 들어 약 25 ℃의 반응 온도 및 약 5.5의 pH이다.
반응 혼합물의 적절한 pH 값은 적어도 하나의 적절한 버퍼를 첨가하여 조절될 수 있다. 바람직한 버퍼 중에, 소듐 아세테이트 버퍼, 포스페이트 또는 보레이트 버퍼가 언급될 수 있다.
폴리머 및 거기에 결합하는 이작용성 결합 화합물을 포함하는 폴리머 유도체가 일단 형성되면, 그것은 적어도 하나의 적절한 방법에 의해 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 필요하다면, 폴리머 유도체는 적어도 하나의 적절한 방법에 의해 분리되기 전에 침전될 수 있다.
폴리머 유도체가 우선 침전되면, 예를 들어, 반응 혼합물이 적절한 온도에서 반응 혼합물에 존재하는 용매 또는 용매 혼합물 이외의 적어도 하나의 용매 또는 용매 혼합물과 접촉할 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따라, 수성 매질, 바람직하게는 물이 용매로서 사용되면, 반응 혼합물은 바람직하게는 -20 내지 +50 ℃ 범위, 특히 바람직하게는 -20 내지 25 ℃ 범위의 온도에서, 2-프로판올과 접촉시킨다.
폴리머 유도체의 분리는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있는 적절한 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 폴리머 유도체는 첫째로 원심분리 또는 여과와 같은 적절한 방법에 의해 반응 혼합물 또는 예를 들어, 수성 2-프로판올 혼합물을 가진 반응 혼합물의 혼합물에서 분리된다. 두번째 단계에서, 분리된 폴리머 유도체에 투석, 원심여과 또는 가압여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, HPLC, MPLC, 겔 여과 및/또는 냉동건조와 같은 후-처리 같이 추가적 처치를 가할 수 있다. 보다 더욱 바람직한 구체예에 따라, 분리된 폴리머 유도체는 첫째로 투석되고, 바람직하게는 물에 저항하며, 그 후, 생성물의 원하는 사항에 따라 반응 생성물의 용매 함량이 충분히 낮을 때까지 냉동건조시킨다. 냉동건조는 20 내지 35 ℃, 바람직하게는 20 내지 30 ℃의 온도에서 수행된다.
그래서 분리된 폴리머 유도체는 단백질의 작용 그룹 Z로, 작용 그룹 A를 통하여 추가적으로 반응하고, 여기에서 Z는 알데히드 그룹 또는 케토 그룹이다. A가 아미노옥시 그룹 H2N-O-이어서 폴리머 유도체 및 단백질 간에 옥심 결합을 형성하는 특히 바람직한 경우에서, 반응은 바람직하게는 수성 매질, 바람직하게는 물 중에서, 0 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 4 내지 25 ℃ 및 특히 바람직하게는 15 내지 25 ℃의 바람직한 온도에서 수행된다. 반응 매질의 pH 값은 바람직하게는 4 내지 10, 더 바람직하게는 5 내지 9 및 특히 바람직하게는 5 내지 7 범위이다. 반응 시간은 바람직하게는 1 내지 72 시간, 더 바람직하게는 1 내지 48 시간 및 특히 바람직하게는 4 내지 24 시간 범위이다.
컨쥬게이트에 투석, 원심여과 또는 가압여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, HPLC, MPLC, 겔 여과 및/또는 냉동건조와 같은 후-처리 같이 추가적 처치를 가할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 따라, 단백질의 작용 그룹 Z는 아미노 그룹이다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 단백질의 작용 그룹 Z는 아미노 그룹이다.
본 발명의 추가적 바람직한 구체예에 따라, 아미노 그룹인 작용 그룹 Z와 반응된는 작용 그룹 A는 반응성 카복시 그룹이다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 작용 그룹 Z는 아미노 그룹이고, 폴리머 또는 폴리머 유도체의 작용 그룹 A는 반응성 카복시 그룹이다.
본 발명의 첫번째 바람직한 구체예에 따라, 반응성 카복시 그룹은 그의 환원 말단에서 폴리머를 선택적으로 산화시켜 폴리머에 도입된다.
따라서, 반응성 카복시 그룹가 도입되는 폴리머는 바람직하게는 하기 화학식(IIa) 및/또는 화학식 (IIb)에 따른 구조를 가진다.
Figure 112006009433098-pct00017
Figure 112006009433098-pct00018
하기 화학식(I)에 따른 폴리머의 환원 말단, 바람직하게는 히드록시에틸 스타치의 산화는 상기 언급된 구조 (IIa) 및/또는 (IIb)를 가지는 화합물을 형성하는 각 방법 또는 방법의 결합에 따라 수행될 수 있다.
Figure 112006009433098-pct00019
비록 산화가 모든 적절한 방법 또는 히드록시알킬 스타치의 산화된 환원 말단을 제공하는 방법에 따라 수행될 수 있지만, 바람직하게는 예를 들어, 본원의 참고문헌으로 통합되어 개시된 DE 19628 705 Al (실시예 A, 컬럼 9, 6 내지 24면)에 기재된 알칼리성 요오드 용액을 사용하여 수행된다.
반응성 카복시 그룹을 그의 환원 말단에서 선택적으로 산화된 폴리머로 도입하는 것은 모든 생각할 수 있는 방법에 의해 수행될 수 있다.
산화된 폴리머는 알칼리 금속 염, 바람직하게는 소듐 및/또는 포타슘 염과 같은 염으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 방법에 따라, 환원 말단에서 선택적으로 산화되는 폴리머는 산화된 환원 말단에서 적어도 하나의 알코올, 바람직하게는 적어도 하나의 산성 알코올과 반응한다. 보다 추가적으로 25 ℃에서, 6 내지 12, 더 바람직하게는 7 내지 11 범위의 pKA 값을 갖는 산성 알콜이 바람직하다. 산성 알코올의 분자량은 바람직하게는 80 내지 500 g/몰, 더 바람직하게는 90 내지 300g/몰 및 특히 바람직하게는 100 내지 200 g/몰이다.
적절한 산성 알코올은 산성 프로톤을 가지는 모든 알코올 H-O-RA이고, 바람직하게는 하기 화학식:
Figure 112006009433098-pct00020
에 따라, 더 바람직하게는 하기 화학식:
Figure 112006009433098-pct00021
에 따라 산화된 폴리머와 반응하여 각각의 반응성 폴리머 에스테르를 제조할 수 있다.
바람직한 알코올은 N-히드록시 숙신이미드 또는 설포-N-히드록시 숙신이미드와 같은 N-히드록시 숙신이미드, p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀과 같은 트리클로로페놀, 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀과 같은 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀과 같은 적절히 치환된 페놀, 또는 히드록시 벤조트리아졸과 같은 히드록시아졸이다.
특히 바람직하게는 N-히드록시 숙신이미드로, N-히드록시 숙신이미드 및 설포-N-히드록시 숙신이미드가 특히 바람직하다. 모든 알코올이 단독 또는 그의 둘 이상의 적절한 결합으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 내용에서, 또한 예를 들어 카르본산의 디에스테르를 가하여, 각각의 알코올을 방출하는 화합물을 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 환원 말단에서 선택적으로 산화된 폴리머는 산화된 폴리머를 산성 알코올과, 바람직하게는 N-히드록시 숙신이미드 및/또는 설포-N-히드록시 숙신이미드와 반응시켜 활성화시킨다.
본발명의 또한 추가적 바람직한 구체예에 따라, 환원 말단에서 선택적으로 산화된 폴리머는 산화된 환원 말단에서 적어도 하나의 카보닉 디에스테르 RB-O- (C=O)-O-RC와 반응하고, 여기에서 RB 및 RC는 같거나 다를 수 있다. 바람직하게는, 이 방법은 하기 화학식에 따른 반응성 폴리머를 제공한다.
Figure 112006009433098-pct00022
상기 식에서, HAS'는 바람직하게는 HES'이다.
적절한 카보닉 디에스테르 화합물로, 알코올 성분이 독립적으로 N-히드록시 숙신이미드 또는 설포-N-히드록시 숙신이미드와 같은 N-히드록시 숙신이미드, p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀과 같은 트리클로로페놀, 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀과 같은 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀과 같은 적절히 치환된 페놀, 또는 히드록시 벤조트리아졸과 같은 히드록시아졸인 화합물이 사용될 수 있다. 특히 바람직하게는 N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트 및 설포-N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트이고, N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트가 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 환원 말단에서 선택적으로 산화된 폴리머는 산화된 폴리머를 N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트와 반응시켜 활성화된다.
산성 알코올은 산성 알코올 : 폴리머의 몰비가 바람직하게는 5 : 1 내지 50 : 1, 더 바람직하게는 8 : 1 내지 20 : 1이고, 바람직한 반응 온도가 2 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 10 내지 30 ℃ 및 특히 바람직하게는 15 내지 25 ℃일 때, 산화된 폴리머 또는 산화된 폴리머의 염과 반응시킨다. 반응 시간은 바람직하게는 1 내지 10 시간, 더 바람직하게는 2 내지 5 시간, 더 바람직하게는 2 내지 4 시간 및 특히 2 내지 3 시간 범위이다.
카보닉 디에스테르 화합물은 디에스테르 화합물: 폴리머의 몰비가 바람직하게는 1 : 1 내지 3: 1, 더 바람직하게는 1 : 1 내지 1.5 : 1일 때, 산화된 폴리머 또는 산화된 폴리머의 염과 반응한다. 반응 시간은 바람직하게는 0.1 내지 12 시간, 더 바람직하게는 0.2 내지 6 시간, 더 바람직하게는 0.5 내지 2 시간 및 특히 0.75 내지 1.25 시간이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 산화된 폴리머의 산성 알코올 및/또는 카보닉 디에스테르과의 반응은 적어도 하나의 비양자성 용매에서, 특히 바람직하게는 0.5 중량 퍼센트 이하, 바람직하게는 0.1 중량 퍼센트 이하의 물 함량을 가지는 무수 비양자성 용매에서 수행된다.
그들 중에 적절한 용매는 디메틸 설폭시드 (DMSO), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아미드 (DMA), 디메틸 포름아미드 (DMF) 및 그의 둘 이상의 혼합물이다. 반응 온도는 바람직하게는 2 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 10 내지 30 ℃이다.
산화된 폴리머을 적어도 하나의 산성 알코올과 반응시키기 위해, 적어도 하나의 추가적 활성화제가 사용된다.
적절한 활성화제는 카보닐디이미다졸, 디이소프로필 카르보디이미드 (DIC), 디시클로헥실 카르보디이미드 (DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC)와 같은 카르보디이미드이고, 디시클로헥실 카르보디이미드 (DCC) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC)가 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 환원 말단에서 산화된 폴리머는 추가적 활성화제의 존재 하에서 산성 알코올과 반응하여 반응성 폴리머 에스테르를 제공한다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따라, 산화된 폴리머의 카보닉 디에스테르 및/또는 산성 알코올과의 반응은 저염기 활성에서 수행되며, 여기에서 저염기 활성은 반응 혼합물에 대한 물의 부피비가 10 : 1이 되도록 반응 혼합물을 물에 가하여 측정할 수 있다. 첨가에 앞서, 버퍼를 필수적으로 포함하지 않는 물은 25℃에서 pH 값이 7이다. 반응 혼합물의 추가 후 및 pH 값의 측정에 따라, 반응 혼합물의 바람직하게는 9.0 이하, 더 바람직하게는 8.0 이하 및 특히 바람직하게는 7.5 이하의 값을 갖는 염기 활성이 얻어진다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 산화된 폴리머는 EDC를 가지고 물이 없는 건조 DMA 중에서 N-히드록시 숙신이미드와 반응하여, 하기 화학식에 따른 폴리머 N-히드록시 숙신이미드 에스테르를 선택적으로 제공한다.
Figure 112006009433098-pct00023
상기 식에서 더 바람직하게는 HAS'는 HES'이다.
놀랍게도, 이 반응은 HES의 OH 그룹을 가진 EDC의 반응으로부터 부산물을 생성하지 않고, EDC에 의해 형성된 O-아실 이소우레아 및 각각의 N-아실 우레아에 대한 산화된 폴리머의 재배열 반응이 놀랍게도 억제된다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따라, 산화된 폴리머는 무수 DMF 중에서, 활성화제 없이, N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트와 반응하여 하기 화학식에 따른 폴리머 N-히드록시 숙신이미드 에스테르를 선택적으로 제공한다.
Figure 112006009433098-pct00024
상기 식에서, 더 바람직하게는 HAS'는 HES'이다.
상기 기재된 바와 같이 반응성 폴리머는 단백질의 적어도 하나의 아미노 그룹과 바람직하게는 추가적으로 반응하여 아미드 결합을 형성한다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 반응성 폴리머는 단백질의 하나의 아미노 그룹과 반응한다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식에 따른 구조를 가진 컨쥬게이트에 관한 것이다.
Figure 112006009433098-pct00025
상기 식에서, 아미드 결합의 N 원자는 더 바람직하게는 HAS'가 HES'인 단백질의 아미노 그룹으로 유래하고, 히드록시에틸 스타치는 약 10 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 10 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 12 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 12 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 18 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 18 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 50 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 50 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치이다.
반응성 폴리머의 단백질과의 반응은 반응성 폴리머 제조의 반응 혼합물을, 즉, 반응성 폴리머 중량에 대해 적어도 10, 더 바람직하게는 적어도 30 및 보다 더 바람직하게는 적어도 50 중량 퍼센트를 포함하는 반응성 폴리머의 분리 없이, 단백질의 수용액과 결합하여 수행할 수 있다. 단백질의 바람직한 수용액은 5.0 내지 9.0, 더 바람직하게는 6.0 내지 9.0 및 특히 바람직하게는 7.5 내지 8.5의 바람직한 pH에서, 단백질 중량에 대해 0.05 내지 10, 더 바람직하게는 0.5 내지 5 및 특히 바람직하게는 0.5 내지 2 중량 퍼센트를 포함한다.
본 발명에 따라, 또한 무수 에탄올, 이소프로판올 및/또는 아세톤과 같은 적어도 하나의 적절한 침전제로 적어도 하나, 바람직하게는 다수 침전시켜 반응성 폴리머를 정제하여 반응성 폴리머 중량에 대해 적어도 10, 더 바람직하게는 적어도 30 및 보다 더 바람직하게는 적어도 50 중량 퍼센트를 포함하는 고체를 제공할 수 있다.
정제된 반응성 폴리머는 단백질의 수용액에 첨가될 수 있다. 또한 단백질의 수용액에 정제된 반응성 폴리머의 용액을 첨가하는 것도 가능하다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 아미드 결합을 형성하기 위한 반응성 폴리머의 단백질과의 반응은 2 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 5 내지 35 ℃ 및 특히 10 내지 30 ℃의 온도에서; 7.0 내지 9.0, 바람직하게는 7.5 내지 9.0 및 특히 바람직하게는 7.5 내지 8.5의 바람직한 pH에서; 0.1 내지 12 시간, 더 바람직하게는 0,5 내지 5 시간, 더 바람직하게는 0,5 내지 3 시간, 보다 더 바람직하게는 0,5 내지 72 시간 및 특히 바람직하게는 0,5 내지 1 시간의 바람직한 반응 시간에서; 반응성 폴리머 에스테르: 단백질의 몰비가 바람직하게는 1 : 1 내지 70 : 1, 더 바람직하게는 5 : 1 내지 50 : 1 및 특히 바람직하게는 10 : 1 내지 50 : 1일 때 수행된다.
본 발명의 다른 구체예에 따라, 환원 말단에서 선택적으로 산화된 폴리머는 산화된 환원 말단에서 카보닐 디이미다졸 또는 카보닐 디벤즈이미다졸과 같은 아졸라이드와 반응시켜, 반응성 카복시 그룹을 가지는 폴리머를 제공한다. 카보닐디이미다졸의 경우, 하기 화학식에 따른 반응성 폴리머 유도체가 생성된다.
Figure 112006009433098-pct00026
상기 식에서, HAS'는 바람직하게는 HES'이다. 폴리머의 아졸라이드와의 반응으로부터 생성된 상기 이미다졸라이드는 바람직하게는 단백질의 아미노 그룹과 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있다. 또한 존재한다면, 단백질의 히드록시 그룹과 반응하여 에스테르 결합, 또는 단백질의 티오 그룹과 반응하여 티오에스테르 결합, 또는 단백질의 카복시 그룹과 반응하여 -(C=O)-O-(C=O)-결합을 형성하는 반응이 가능하다.
본 발명의 다른 구체예에 따라, 폴리머의 선택적인 산화된 환원 말단의, 상기 언급된 화합물 중 하나, 바람직하게는 적어도 하나의 산성 알코올 및/또는 적어도 하나의 카보닉 디에스테르 화합물과의 반응으로부터 생성된 반응성 카복시 그룹 A를 가지는 폴리머는 적어도 하나의 링커 화합물을 통하여 단백질의 작용 그룹 Z에 결합할 수 있다. 링커 화합물이 사용되는 경우, 상기 화합물은 폴리머 유도체의 작용 그룹 A와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용 그룹 F1, 및 단백질의 작용 그룹 Z와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용 그룹 F2, 또는 단백질의 작용 그룹 Z에 화학적으로 변형될 수 있는 작용 그룹 F2를 가지는 적어도 이작용성 화합물이다. 화학적 변형은 예를 들어, 작용 그룹 F2의 추가적 링커 화합물의 작용 그룹 F3와의 반응 또는 적절한 작용 그룹 F2의 산화 또는 환원일 수 있다. 적어도 하나의 링커 화합물이 사용되는 경우, 반응은 단백질의 아미노 그룹에 제한되는 것은 아니나, 링커 화합물의 작용 그룹 또는 링커 화합물의 화학적 특성에 따라, 카복시 그룹, 반응성 카복시 그룹, 알데히드 그룹, 케토 그룹, 티오 그룹, 아미노 그룹 또는 히드록시 그룹과 같은 단백질의 각각의 적절한 작용 그룹과 결합을 형성할 수 있다. 두개의 링커 화합물이 사용되는 경우, 첫번째 링커 화합물은 아미노 그룹, 티오 그룹, 히드록시 그룹, 또는 카복시 그룹과 같은 폴리머의 반응성 카복시 그룹과 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용 그룹 F1을 가진 것을 사용한다. 또한, 첫번째 링커 화합물 두번째 링커 화합물의 적어도 하나의 작용 그룹 F3와 반응할 수 있는 적어도 하나의 다른 작용 그룹 F2를 가진다. 작용 그룹 F2으로, 하기 작용 그룹이 언급된다:
- C-C-이중 결합 또는 C-C-삼중 결합 또는 방향족 C-C-결합;
- 티올 그룹 또는 히드록시 그룹;
- 알킬 설폰산 히드라지드, 아릴 설폰산 히드라지드;
- 1,2-디올;
- 1,2-아미노알코올;
- 1,2 아미노-티오알코올;
- 아지드;
- 아미노 그룹 -NH2 또는 아미노알킬 그룹, 아미노아릴 그룹, 아미노아르알킬 그룹, 또는 알크아릴아미노그룹과 같은 구조 단위 -NH-를 포함하는 아미노 그룹의 유도체;
- 히드록실아미노 그룹 -O-NH2, 또는 히드록실알킬아미노 그룹, 히드록실아릴아미노 그룹, 히드록실아르알킬아미노 그룹, 또는 히드록살알크아릴아미노 그룹과 같은 구조 단위 -O-NH-를 포함하는 히드록실아미노 그룹의 유도체;
- 각각 구조단위 -NH-O-을 포함하는 알콕시아미노 그룹, 아릴옥시아미노 그룹, 아르알킬옥시아미노 그룹, 또는 알크아릴옥시아미노 그룹;
- 카보닐 그룹, -Q-C(=G)-M을 가지는 잔기,
(여기에서 G는 O 또는 S이고, M은 예로서,
-- -OH 또는 -SH;
-- 알콕시 그룹, 아릴옥시 그룹, 아르알킬옥시 그룹, 또는 알크아릴옥시 그룹;
-- 알킬티오 그룹, 아릴티오 그룹, 아르알킬티오 그룹, 또는 알크아릴티오 그룹;
-- 알킬카보닐옥시 그룹, 아릴카보닐옥시 그룹, 아르알킬카보닐옥시 그룹, 알크아릴카보닐옥시 그룹;
-- G = O이고 Q는 존재하지 않는 경우, 예를 들면, 펜타플루오로페닐, 파라니트로페닐 또는 트리클로로페닐과 같은 치환된 아릴 잔기를 갖는 아릴옥시 화합물이거나, N이 헤테로아릴 화합물의 일부인 구조 단위 O-N을 갖거나, N-히드록시숙신이미드와 같은 이미드 구조를 갖는 히드록실아민의 에스테르와 같은 활성화된 에스테르이다);
Q가 존재하지 않거나 NH 또는 헤테로원자, 예로서 S 또는 O인 경우;
- -NH-NH2, 또는 -NH-NH-;
- -N02;
- 니트릴 그룹;
- 알데히드 그룹 또는 케토 그룹과 같은 카보닐 그룹;
- 카복시 그룹;
- -N=C=O 그룹 또는 -N=C=S 그룹;
- 비닐 아이오다이드 또는 비닐 브로마이드 그룹 또는 트리플레이트와 같은 비닐 할라이드 그룹;
- -C≡C-H ;
- -(C=NH2Cl)-O알킬;
- 그룹 -(C=O)-CH2-Hal(여기에서 Hal은 Cl, Br, 또는 I이다);
- -CH=CH-S02-;
- 구조-S-S-을 포함하는 디설파이드 그룹;
- 그룹
Figure 112009038347086-pct00027
;
- 그룹
Figure 112006009433098-pct00028
상기 식에서, F3는 상기 언급된 그룹 중 하나와 화학 결합을 형성할 수 있는 그룹이고, 바람직하게는 상기 언급된 그룹으로부터 선택된다. 더욱이, 두번째 링커 화합물은 단백질의 작용 그룹 Z과 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용 그룹, 예를 들어, 아미노 그룹, 티오 그룹, 카복시 그룹, 반응성 카복시 그룹, 알데히드 그룹, 케토 그룹, 또는 히드록시 그룹을 가진다. 하나의 결합 화합물이 폴리머 및 단백질과 공유 결합하는 경우, 폴리머는 결합 화합물과 반응할 수 있고 생성된 폴리머 유도체는 단백질과 반응하거나, 또는 단백질은 결합 화합물과 반응할 수 있고 생성된 단백질 유도체는 폴리머와 반응한다. 두개의 결합 화합물 L1 및 L2가 사용되는 경우, 폴리머는 L1과 반응하고, 생성된 폴리머 유도체는 L2와 반응하며, 생성된 폴리머 유도체는 단백질과 반응하거나; 또는 단백질은 L2와 반응하고, 생성된 단백질 유도체는 Ll과 반응하며, 생성된 단백질 유도체는 폴리머와 반응할 수 있다. 또한, 폴리머가 L1과 반응하고 단백질이 L2 와 반응하며 폴리머 유도체가 단백질 유도체과 반응할 수 있다. 추가로, Ll이 L2와 반응하고, 생성된 화합물이 폴리머와 반응하며 생성된 폴리머 유도체가 단백질과 반응할 수 있다. 추가로, L1이 L2와 반응하고, 생성된 화합물이 단백질과 반응하며 생성된 단백질 유도체가 폴리머와 반응할 수 있다.
반응성 카복시 그룹의 폴리머로의 도입과 관련된 본 발명의 두번째 바람직한 구체예에 따라, 폴리머의 적어도 하나의 히드록시 그룹을 카보닉 디에스테르와 반응시켜 반응성 카복시 그룹을 환원 말단이 산화되지 않은 폴리머에 도입시킨다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 A는 반응성 카복시 그룹이고, 이 때, 폴리머의 적어도 하나의 히드록시 그룹을 적어도 하나의 카보닉 디에스테르 카보닉 디에스테르 RB-O-(C=O)-O-RC (여기에서, RB 및 RC는 같거나 다르다)와 반응시켜, A를 환원 말단이 산화되지 않은 폴리머에 도입시킨다.
본 발명의 다른 구체예에 따라, 환원 말단이 산화되지 않은 폴리머를 적어도 하나의 히드록시 그룹에서 카보닐디이미다졸, 카보닐-디-(1,2,4-트리아졸) 또는 카보닐 디벤크이미다졸과 같은 아졸라이드과 반응시켜 반응성 카복시 그룹을 가지는 폴리머를 제공한다.
적절한 카보닉 디에스테르 화합물로써, 알코올 성분이 독립적으로 N-히드록시 숙신이미드 또는 설포-N-히드록시 숙신이미드와 같은 N-히드록시 숙신이미드, p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀과 같은 트리클로로페놀, 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀과 같은 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀과 같은 적절히 치환된 페놀, 또는 히드록시 벤조트리아졸과 같은 히드록시아졸인 화합물이 사용될 수 있다.
대칭성 카보닉 디에스테르 화합물이 특히 바람직하고, RB 및 RC는 동일하다. 카보닉 디에스테르의 알코올 성분은 바람직하게는 N-히드록시 숙신이미드, 설포네이트 N-히드록시 숙신이미드, N-히드록시 벤조트리아졸, 및 니트로- 및 할로겐-치환된 페놀로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 니트로페놀, 디니트로페놀, 트리클로로페놀, 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 및 펜타플루오로페놀 등이 바람직하다. 특히 바람직하게는 N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트 및 설포-N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트이고, N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트가 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 히드록시알킬 스타치 유도체 및 동일한 것, 바람직하게는 히드록시에틸 스타치 유도체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 여기에서 적어도 하나의 히드록시 그룹, 바람직하게는 상기 스타치의 적어도 두개의 히드록시 그룹이 카보닉 디에스테르 화합물과 반응하여 각각의 반응성 에스테르를 형성한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 환원 말단이 산화되지 않은 폴리머의 적어도 하나의 카보닉 디에스테르 화합물과의 반응은 2 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 10 내지 30 ℃ 및 특히 15 내지 25 ℃의 온도에서, 0.5 내지 5 시간, 더 바람직하게는 1 내지 3 시간, 및 특히 바람직하게는 2 내지 3 시간의 바람직한 반응 시간 동안 수행된다.
카보닉 디에스테르 및/또는 아졸라이드의 몰비, 바람직하게는 카보닉 디에스테르 화합물 : 폴리머는 비-반응 폴리머에 존재하는 히드록시 그룹의 수에 대한 카보닉 디에스테르 화합물과 반응하는 히드록시 그룹의 수에 관한 폴리머의 치환도에 의존한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 카보닉 디에스테르 화합물 : 안하이드로글루코스 단위의 몰비는 1 : 2 내지 1 : 1000, 더 바람직하게는 1 : 3 내지 1 : 100 및 특히 바람직하게는 1 : 10 내지 1 : 50의 범위로, 0.5 내지 0.001, 바람직하게는 0.33 내지 0.01 및 특히 바람직하게는 0.1 내지 0.02 범위의 치환도를 제공한다. 치환도는 UV 분광기를 통하여 측정된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 환원 말단이 산화되지 않은 폴리머의 카보닉 디에스테르와의 반응은 적어도 하나의 비양자성 용매, 특히 바람직하게는 0.5 중량 퍼센트 이하, 바람직하게는 0.1 중량 퍼센트 이하의 물 함량을 가지는 무수 비양자성 용매에서 수행된다. 다른 것들 중, 다른 적절한 용매는 디메틸 설폭시드 (DMSO), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아미드 (DMA), 디메틸 포름아미드 (DMF) 및 그의 둘 이상의 혼합물이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서, 반응성 에스테르 그룹 A를 제공하기 위한 환원 말단이 산화되지 않은 폴리머의 적어도 하나의 히드록시 그룹의 카보닉 디에스테르와의 반응은 무수 비양자성 극성 용매에서 수행되고, 이 때, 상기 용매는 바람직하게는 디메틸 아세트아미드, 디메틸 포름아미드 또는 그의 혼합물이다.
적어도 하나의 아미드 결합, 바람직하게는 적어도 두개의 아미드 결합을 형성하기 위한, 적어도 하나의 반응성 에스테르 그룹, 바람직하게는 적어도 두개의 반응성 에스테르 그룹을 포함하는 반응성 폴리머의 단백질과의 반응은 반응성 폴리머 중량에 대해 적어도 5, 더 바람직하게는 적어도 10 및 보다 더 바람직하게는 적어도 15 중량 퍼센트를 포함하고, 단백질의 수성액과 함께, 반응성 폴리머의 분리 없이 반응성 폴리머 제조의 반응 혼합물을 결합시켜 수행될 수 있다. 단백질의 바람직한 수용액은 7.0 내지 9, 더 바람직하게는 7.5 내지 9 및 특히 바람직하게는 7.5 내지 8.5의 바람직한 pH에서, 단백질 중량에 대해 0.05 내지 10, 더 바람직하게는 0.5 내지 5 및 특히 바람직하게는 05 내지 2 중량 퍼센트를 포함한다.
본 발명에 따라, 또한 무수 에탄올, 이소프로판올 및/또는 아세톤과 같은 적어도 하나의 적절한 침전제로 적어도 하나, 바람직하게는 다수 침전시켜 반응성 폴리머를 정제하여 반응성 폴리머 중량에 대해 적어도 20, 더 바람직하게는 적어도 50 및 보다 더 바람직하게는 적어도 80 중량 퍼센트를 포함하는 고체를 제공할 수 있다.
정제된 반응성 폴리머는 단백질의 수용액에 가해질 수 있다. 또한, 정제된 반응성 폴리머의 용액을 단백질의 수용액에 가하는 것도 가능하다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 적어도 하나의, 바람직하게는 적어도 두개의 아미드 결합을 형성하기 위한 반응성 폴리머의 단백질과의 반응은 2 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 5 내지 35 ℃ 및 특히 10 내지 30 ℃의 온도에서; 7.5 내지 9.5, 바람직하게는 7.5 내지 9 및 특히 바람직하게는 7.5 내지 8.5의 바람직한 pH에서; 0.5 내지 5 시간, 더 바람직하게는 0.5 내지 3 시간, 및 특히 바람직하게는 0.5 내지 1 시간의 바람직한 반응 시간에서; 반응성 폴리머 에스테르: 단백질의 몰비가 바람직하게는 1 : 1 내지 70 : 1, 더 바람직하게는 5 : 1 내지 50 : 1 및 특히 바람직하게는 10 : 1 내지 50 : 1일 때 수행된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 올리고- 또는 멀티단백질-치환된 폴리머가 수득되고, 여기에서 단백질 분자는 아미드 결합을 통하여 폴리머에 결합된다.
본 발명에서 사용되는 단백질 분자 (PDS)의 치환도는 HAS, 바람직하게는 HES에 포함된 모든 글루코스 부분에 대해 단백질에 결합된 글루코스 부분의 부분을 언급한다.
PDS는 0.001 내지 1, 바람직하게는 0.005 내지 0.5, 더 바람직하게는 0.005 내지 0.2 범위이다.
본 발명의 다른 구체예에 따라, 폴리머의 적어도 하나의 히드록시 그룹의 상기 언급된 화합물 중 하나, 바람직하게는 적어도 하나의 카보닉 디에스테르 화합물과의 반응으로부터 생성된 반응성 카복시 그룹 A를 가지는 폴리머는 적어도 하나의 링커 화합물을 통하여 단백질의 작용 그룹 Z에 결합할 수 있다. 링커 화합물이 사용되는 경우, 상기 화합물은 폴리머 유도체의 작용 그룹 A와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용 그룹 F1, 및 단백질의 작용 그룹 Z와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용 그룹 F2, 또는 단백질의 작용 그룹 Z에 화학적으로 변형될 수 있는 작용 그룹 F2를 가지는 적어도 이작용성 화합물이다. 화학적 변형은 예를 들어, 작용 그룹 F2의 추가적 링커 화합물의 작용 그룹 F3와의 반응 또는 적절한 작용 그룹 F2의 산화 또는 환원일 수 있다. 적어도 하나의 링커 화합물이 사용되는 경우, 반응은 단백질의 아미노 그룹에 제한되는 것은 아니나, 링커 화합물의 작용 그룹 또는 링커 화합물의 화학적 특성에 따라, 카복시 그룹, 반응성 카복시 그룹, 알데히드 그룹, 케토 그룹, 티오 그룹, 아미노 그룹 또는 히드록시 그룹과 같은 단백질의 각각의 적절한 작용 그룹과 결합을 형성할 수 있다. 두개의 링커 화합물이 사용되는 경우, 첫번째 링커 화합물은 아미노 그룹, 티오 그룹, 히드록시 그룹, 또는 카복시 그룹과 같은 폴리머의 반응성 카복시 그룹과 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용 그룹 F1을 가진 것을 사용한다. 또한, 첫번째 링커 화합물 두번째 링커 화합물의 적어도 하나의 작용 그룹 F3와 반응할 수 있는 적어도 하나의 다른 작용 그룹 F2를 가진다. 작용 그룹 F2으로, 하기 작용 그룹이 언급된다:
- C-C-이중 결합 또는 C-C-삼중 결합 또는 방향족 C-C-결합;
- 티올 그룹 또는 히드록시 그룹;
- 알킬 설폰산 히드라지드, 아릴 설폰산 히드라지드;
- 1,2-디올;
- 1,2-아미노알코올;
- 1,2 아미노-티오알코올;
- 아지드;
- 아미노 그룹 -NH2 또는 아미노알킬 그룹, 아미노아릴 그룹, 아미노아르알킬 그룹, 또는 알크아릴아미노그룹과 같은 구조 단위 -NH-를 포함하는 아미노 그룹의 유도체;
- 히드록실아미노 그룹 -O-NH2, 또는 히드록실알킬아미노 그룹, 히드록실아릴아미노 그룹, 히드록실아르알킬아미노 그룹, 또는 히드록살알크아릴아미노 그룹과 같은 구조 단위 -O-NH-를 포함하는 히드록실아미노 그룹의 유도체;
- 각각 구조단위 -NH-O-을 포함하는 알콕시아미노 그룹, 아릴옥시아미노 그룹, 아르알킬옥시아미노 그룹, 또는 알크아릴옥시아미노 그룹;
- 카보닐 그룹, -Q-C(=G)-M을 가지는 잔기,
(여기에서 G는 O 또는 S이고, M은 예로서,
-- -OH 또는 -SH;
-- 알콕시 그룹, 아릴옥시 그룹, 아르알킬옥시 그룹, 또는 알크아릴옥시 그룹;
-- 알킬티오 그룹, 아릴티오 그룹, 아르알킬티오 그룹, 또는 알크아릴티오 그룹;
-- 알킬카보닐옥시 그룹, 아릴카보닐옥시 그룹, 아르알킬카보닐옥시 그룹, 알크아릴카보닐옥시 그룹;
-- G = O이고 Q는 존재하지 않는 경우, 예를 들면, 펜타플루오로페닐, 파라니트로페닐 또는 트리클로로페닐과 같은 치환된 아릴 잔기를 갖는 아릴옥시 화합물이거나, N이 헤테로아릴 화합물의 일부인 구조 단위 O-N을 갖거나, N-히드록시숙신이미드와 같은 이미드 구조를 갖는 히드록실아민의 에스테르와 같은 활성화된 에스테르이다);
Q가 존재하지 않거나 NH 또는 헤테로원자, 예로서 S 또는 O인 경우;
- -NH-NH2, 또는 -NH-NH-;
- -N02;
- 니트릴 그룹;
- 알데히드 그룹 또는 케토 그룹과 같은 카보닐 그룹;
- 카복시 그룹;
- -N=C=O 그룹 또는 -N=C=S 그룹;
- 비닐 아이오다이드 또는 비닐 브로마이드 그룹 또는 트리플레이트와 같은 비닐 할라이드 그룹;
- -C≡C-H ;
- -(C=NH2Cl)-O알킬;
- 그룹 -(C=O)-CH2-Hal(여기에서 Hal은 Cl, Br, 또는 I이다);
- -CH=CH-S02-;
- 구조-S-S-을 포함하는 디설파이드 그룹;
- 그룹
Figure 112009038347086-pct00029
;
- 그룹
Figure 112006009433098-pct00030
상기 식에서, F3는 상기 언급된 그룹 중 하나와 화학 결합을 형성할 수 있는 그룹이고, 바람직하게는 상기 언급된 그룹으로부터 선택된다. 더욱이, 두번째 링커 화합물은 단백질의 작용 그룹 Z과 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용 그룹, 예를 들어, 아미노 그룹, 티오 그룹, 카복시 그룹, 반응성 카복시 그룹, 알데히드 그룹, 케토 그룹, 또는 히드록시 그룹을 가진다. 하나의 결합 화합물이 폴리머 및 단백질과 공유 결합하는 경우, 폴리머는 결합 화합물과 반응할 수 있고 생성된 폴리머 유도체는 단백질과 반응하거나, 또는 단백질은 결합 화합물과 반응할 수 있고 생성된 단백질 유도체는 폴리머와 반응한다. 두개의 결합 화합물 L1 및 L2가 사용되는 경우, 폴리머는 L1과 반응하고, 생성된 폴리머 유도체는 L2와 반응하며, 생성된 폴리머 유도체는 단백질과 반응하거나; 또는 단백질은 L2와 반응하고, 생성된 단백질 유도체는 Ll과 반응하며, 생성된 단백질 유도체는 폴리머와 반응할 수 있다. 또한, 폴리머가 L1과 반응하고 단백질이 L2 와 반응하며 폴리머 유도체가 단백질 유도체과 반응할 수 있다. 추가로, Ll이 L2와 반응하고, 생성된 화합물이 폴리머와 반응하며 생성된 폴리머 유도체가 단백질과 반응할 수 있다. 추가로, L1이 L2와 반응하고, 생성된 화합물이 단백질과 반응하며 생성된 단백질 유도체가 폴리머와 반응할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따라, 단백질의 작용 그룹 Z는 아미노 그룹이고, 폴리머 또는 그의 유도체의 작용 그룹 A는 알데히드 그룹, 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹이다. 특히 바람직한 구체예에 따라, 작용 그룹 Z 및 작용 그룹 A는 환원성 아미노화 반응을 통하여 반응한다.
폴리머 또는 폴리머 유도체가 적어도 하나의 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 통하여 단백질의 적어도 하나의 아미노 그룹에 공유 결합하는 본 발명에 따른 환원성 아미노화 반응은 바람직하게는 0 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 0 내지 25 ℃ 및 특히 바람직하게는 4 내지 21 ℃의 온도에서 수행된다. 반응 시간은 바람직하게는 0.5 내지 72 시간, 더 바람직하게는 2 내지 48 시간 및 특히 바람직하게는 4 내지 7 시간의 범위이다. 반응 용매로써, 수성 매질이 바람직하다.
그래서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 환원성 아미노화는 4 내지 21 ℃의 온도에서 수행된다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 환원성 아미노화는 수성 매질 중에서 수행된다.
그래서, 본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 환원성 아미노화는 4 내지 21 ℃ 온도에서 수성 매질 중에서 수행된다.
본 명세서에 사용된 용어 "수성 매질"은 함유된 용매의 중량에 대해 적어도 10 중량%, 더 바람직하게는 적어도 20 중량%, 더 바람직하게는 적어도 30 중량%, 더 바람직하게는 적어도 40 중량%, 더 바람직하게는 적어도 50 중량%, 더 바람직하게는 적어도 60 중량%, 더 바람직하게는 적어도 70 중량%, 더 바람직하게는 적어도 80 중량%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90 중량% 또는 100 중량%까지 범위의 물을 포함하는 용매 또는 용매의 혼합물과 관련된다. 바람직한 반응 매질은 물이다.
반응 매질의 pH 값은 일반적으로 4 내지 9 또는 4 내지 8 또는 4 내지 7.3의 범위이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 환원성 아미노화 반응이 수행되는 pH는 7.3 미만, 더 바람직하게는 7 보다 작거나 동일한, 및 가장 바람직하게는 7 미만, 즉, 산성 범위이다. 따라서, 바람직한 범위는 3 내지 7, 더 바람직하게는 3.5 내지 6.5, 보다 더 바람직하게는 4 내지 6, 보다 더 바람직하게는 4.5 내지 5.5 및 특히 바람직하게는 약 5.0, 즉, 4.6 또는 4.7 또는 4.8 또는 4.9 또는 5.0. 또는 5.1 또는 5.2 또는 5.3 또는 5.4이다. 바람직한 범위는 3 내지 6.9 또는 3 내지 6.5 또는 3 내지 6 또는 3 내지 5.5 또는 3 내지 5 또는 3 내지 4.5 또는 3 내지 4 또는 3 내지 3.5 또는 3.5 내지 6.9 또는 3.5 내지 6.5 또는 3.5 내지 6 또는 3.5 내지 5.5 또는 3.5 내지 5 또는 3.5 내지 4.5 또는 3.5 내지 4 또는 4 내지 6.9 또는 4 내지 6.5 또는 4 내지 6 또는 4 내지 5.5 또는 4 내지 5 또는 4 내지 4.5 또는 4.5 내지 6.9 또는 4.5 내지 6.5 또는 4.5 내지 6 또는 4.5 내지 5.5 또는 4.5 내지 5 또는 5 내지 6.9 또는 5 내지 6.5 또는 5 내지 6 또는 5 내지 5.5 또는 5.5 내지 6.9 또는 5.5 내지 6.5 또는 5.5 내지 6 또는 6 내지 6.9 또는 6 내지 6.5 또는 6.5 내지 6.9 등이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 환원성 아미노화는 7 이하의 pH, 더 바람직하게는 6 이하의 pH에서 수행된다.
그래서, 본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 환원성 아미노화는 4 내지 21 ℃의 온도, 7 이하, 바람직하게는 6 이하의 pH에서 수행된다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 환원성 아미노화는 수성 매질 중에서 7 이하, 바람직하게는 6 이하의 pH에서 수행된다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 환원성 아미노화는 4 내지 21 ℃ 온도에서, 수성 매질 중에서 7 이하, 바람직하게는 6 이하의 pH에서 수행된다.
반응에 사용되는 폴리머 유도체 : 단백질의 몰비는 바람직하게는 200 : 1 내지 5 : 1, 더 바람직하게는 100 : 1 내지 10 : 1 및 특히 바람직하게는 75: 1 내지 20: 1 범위이다.
특히 상기 주어진 바람직한 pH 범위에서, 특히 7 이하 및 4 보다 크거나 동일한 pH에서, 폴리머 유도체가 단백질의 N 말단에 위치한 아미노 그룹과 지배적으로 반응하는 것이 가능하다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 본 명세서에 사용된 용어 "지배적으로(predominantly)"는 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85 %의 유효한 N-말단 아미노 그룹이 환원성 아미노화를 통해 반응하는 구체예와 관련된다. 또한 적어도 90 % 또는 적어도 95 % 또는 적어도 96 % 또는 적어도 97 % 또는 적어도 98 % 또는 적어도 99 %의 유효한 N-말단 아미노 그룹이 반응할 수 있다. N-말단 아미노 그룹 이외의 아미노 그룹에 커플링하는 것이 완전히 배제될 수는 없지만, 7 이하, 바람직하게는 6 이하의 pH에서, 본 발명에 따른 환원성 아미노화를 통한 커플링은 N-말단 아미노 그룹에서 필수적 선택적으로 발생한다고 믿어진다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 단백질은 N-말단 아미노 그룹 및 적어도 하나의 추가적 아미노 그룹을 포함하고, 상기 컨쥬게이트는 N-말단 아미노 그룹에 지배적으로 커플링된 폴리머를 포함한다.
특히 바람직한 구체예에 따라, 본 발명은 알데히드 또는 케토 또는 헤미아세탈 기능성 히드록시알킬 스타치 또는 알데히드 또는 케토 또는 헤미아세탈 기능성 히드록시알킬 스타치 유도체를 단백질의 N-말단 아미노 그룹에 지배적으로 결합시키는 방법에 관한 것으로, 여기에서 상기 방법은 7 이하, 바람직하게는 6 이하의 pH에서, 상기 히드록시알킬 스타치 또는 그의 유도체를 환원성 아미노화 반응시키는 것을 포함하고, 상기 환원성 아미노화 반응은 바람직하게는 수성 매질 중에서 수행된다.
본 발명에 따라, 알데히드 기능성 히드록시알킬 스타치 또는 알데히드 기능성 히드록시알킬 스타치 유도체가 바람직하다.
보다 추가적인 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 알데히드 또는 케토 또는 헤미아세탈 기능성 히드록시에틸 스타치 또는 알데히드 또는 케토 또는 헤미아세탈 기능성 히드록시에틸 스타치 유도체를 단백질의 N-말단 아미노 그룹에 선택적으로 결합시키는 방법에 관한 것으로, 여기에서 상기 방법은 7 이하, 바람직하게는 6 이하의 pH에서, 상기 히드록시알킬 스타치 또는 그의 유도체를 환원성 아미노화 반응시키는 것을 포함하고, 상기 환원성 아미노화 반응은 바람직하게는 수성 매질 중에서 수행되며, 상기 히드록시에틸 스타치는 바람직하게는 약 10 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 10 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 12 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 12 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 18 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 18 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 50 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 50 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치인 것이 사용된다.
알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹 간의 폴리머 유도체 및 단백질, 및 아미노 그룹의 반응은 환원성 아미노화이고, 여기에서 시프(Schiff) 염기가 제공된다. 반응 후에, 이 염기는 적어도 하나의 환원제에 의해 환원되어 폴리머 유도체 및 단백질 간의 안정한 결합을 형성한다. 또한 적어도 하나의 환원제의 존재 하에서 반응을 수행하는 것이 가능하다.
바람직한 구체예에 따르면, 환원성 아미노화 반응은 적어도 하나의 환원제의 존재 하에 수행된다.
바람직한 환원제는 소듐 보로하이드리드; 소듐 시아노보로하이드리드; 4-(디메틸아민)피리딘 보란 복합체, N-에틸디이소프로필아민 보란 복합체, N-에틸몰포린 보란 복합체, N-메틸몰포린 보란 복합체, N-페닐몰포린 보란 복합체, 루티딘 보란 복합체, 트리에틸아민 보란 복합체, 또는 트리메틸아민 보란 복합체과 같은 유기 보란 복합 화합물이다. 특히 바람직하게는 소듐 시아노보로하이드리드이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 환원성 아미노화는 NaCNBH3의 존재 하에서 수행된다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 환원성 아미노화는 수성 매질 중에서, 7 이하, 바람직하게는 6 이하 pH에서, 환원제 바람직하게는 NaCNBH3의 존재 하에 수행된다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 환원성 아미노화는 4 내지 21 ℃의 온도에서, 수성 매질 중에서, 7 이하, 바람직하게는 6 이하의 pH에서, 환원제 바람직하게는 NaCNBH3의 존재 하에 수행된다.
반응에 사용되는 폴리머 유도체: 단백질의 몰비는 바람직하게는 200: 1 내지 10: 1, 더 바람직하게는 100: 1 내지 10: 1 및 특히 바람직하게는 75: 1 내지 20: 1이다.
따라서, 본 발명은 또한 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 수성 매질 중에 알데히드 그룹을 포함하는 폴리머 또는 폴리머 유도체를 상기 환원제, 바람직하게는 NaCNBH3의 존재 하에, 단백질의 아미노 그룹과 반응시키는 것을 포함한다.
본 발명의 첫번째 바람직한 구체예에 따르면, 개환 산화 반응에 의해 폴리머가 폴리머에 도입되는 적어도 두개의 알데히드 그룹을 포함함에 따라, 폴리머는 바람직하게는 하기 화학식에 따른 적어도 하나의 구조를 포함한다.
Figure 112006009433098-pct00031
본 발명의 구체예에 따라, 폴리머의 적어도 하나의 단당류 환을 산화시킬 수 있는 각 산화제 또는 산화제의 결합이 사용되어 적어도 하나의, 바람직하게는 적어도 두개의 알데히드 그룹을 가지는 개방 단당류 환을 제공한다. 이 반응은 산화된 폴리머의 단당류 환을 도시한 하기 반응식에 의해 도시되어 두개의 알데히드 그룹을 가지는 개방 환을 제공한다:
Figure 112006009433098-pct00032
적절한 산화제는 알칼리성 금속 퍼아이오데이트 또는 그의 둘 이상의 혼합물과 같은 퍼아이오데이트이며, 바람직하게는 소듐 퍼아이오데이트 및 포타슘 퍼아이오데이트이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 폴리머가 퍼아이오데이트를 사용하여 개환 산화 반응되어 적어도 하나의, 바람직하게는 적어도 두개의 알데히드 그룹을 가지는 폴리머 유도체를 형성한다.
이 산화 반응에서, 폴리머는 산화된 또는 비-산화 중 하나의 형태로, 그의 환원 말단으로 사용되고, 이 때 비-산화된 형태가 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 폴리머는 비-산화된 형태로 그의 환원 말단으로 사용된다.
반응 온도는 0 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 0 내지 25 ℃ 및 특히 바람직하게는 0 내지 5 ℃의 범위가 바람직하다. 반응 시간은 1 분 내지 5 시간 및 특히 바람직하게는 10 분 내지 4 시간의 범위가 바람직하다. 산화의 원하는 정도에 따라, 즉, 산화 반응으로부터 제공되는 알데히드 그룹의 수에 따라, 퍼아이오데이트: 폴리머의 몰비가 적절하게 선택될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 개환 산화 반응은 0 내지 5 ℃의 온도에서 수행된다.
폴리머의 퍼아이오데이트와의 산화 반응은 바람직하게는 수성 매질, 가장 바람직하게는 물 중에서 수행된다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 개환 산화 반응은 수성 매질 중에서 수행된다. 반응 혼합물의 적절한 pH 값은 적어도 하나의 적절한 버퍼를 가하여 조절할 수 있다. 바람직한 버퍼 중에, 소듐 아세테이트버퍼, 포스페이트 또는 보레이트 버퍼가 언급될 수 있다.
상기 개환 산화 반응되는 히드록시에틸 스타치는 바람직하게는 약 10 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 10 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 12 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 12 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 18 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 18 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 50 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 50 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치이다.
생성된 폴리머 유도체는 적어도 하나의 적절한 방법에 의해 반응 혼합물로부터 정제될 수 있다. 필요하다면, 폴리머 유도체는 적어도 하나의 적절한 방법에 의해 분리하기 전에 침전시킬 수 있다.
만일 폴리머 유도체가 먼저 침전된다면, 예를 들어, 반응 혼합물이 적절한 온도에서 반응 혼합물 중에 존재하는 용매 또는 용매 혼합물 이외의 적어도 하나의 용매 또는 용매 혼합물과 접촉할 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 수성 매질, 바람직하게는 물이 용매로 사용되는 경우, 반응 혼합물은 바람직하게는 -20 내지 +50 ℃ 및 특히 바람직하게는 -20 내지 25 ℃ 범위의 온도에서, 2-프로판올 또는 아세톤 및 에탄올의 혼합물, 바람직하게는 상기 화합물의 동일한 부피를 가리키는 1: 1 혼합물 (v/v)과 접촉시킨다.
폴리머 유도체의 분리는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있는 적절한 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 폴리머 유도체는 첫째로 원심분리 또는 여과와 같은 적절한 방법에 의해, 예를 들어, 수성 2-프로판올 혼합물을 가진 반응 혼합물 또는 반응 혼합물의 혼합물로부터 분리된다. 두번째 단계에서, 분리된 폴리머 유도체에 투석, 원심여과 또는 가압여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, HPLC, MPLC, 겔 여과 및/또는 냉동건조와 같은 후-처리 같이 추가적 처치를 가할 수 있다. 보다 더욱 바람직한 구체예에 따라, 분리된 폴리머 유도체는 첫째로 투석되고, 바람직하게는 물에 저항하며, 그 후, 생성물의 원하는 사항에 따라 반응 생성물의 용매 함량이 충분히 낮을 때까지 냉동건조시킨다. 냉동건조는 20 내지 35 ℃, 바람직하게는 20 내지 30 ℃의 온도에서 수행된다.
바람직한 구체예에 따라, 산화 반응으로부터 생성된 산화된 폴리머는 예를 들어, 원하지 않는 저분자량 염 및 폴리머 성분을 제거하여, 또한 산화된 폴리머의 분자량 범위를 조절하는 수단을 제공하기 위해, 초여과 및/또는 투석과 같은 적어도 하나의 적절한 방법을 사용하여 정제된다.
산화된 폴리머는 단백질과의 반응에 직접 사용되거나, 또는 예를 들어 냉동건조에 의해, 첫번째 단계에서 적절히 제거되고, 두번째 단계에서, 단백질에 대한 컨쥬게이션을 위해 물에서 재용출시킬 수 있다. 환원성 아미노화에 의한, 단백질의 적어도 하나의 아미노 그룹과 폴리머의 적어도 하나의 알데히드 그룹과의 커플링에 대하여, pH 또는 온도와 같은 환원성 아미노화 반응의 특이적 반응 파라미터에 관한 상기 상세한 기재가 참고가 된다.
두번째 바람직한 구체예에 따라, 폴리머는 폴리머와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용 그룹 M; 및 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹이고, 환원성 아미노화에 의해 단백질의 아미노 그룹과 반응하는 적어도 하나의 작용 그룹 Q를 포함하는 적어도 이작용성 화합물과 반응한다.
산화된 폴리머는 단백질과의 반응에 직접 사용되거나, 또는 예를 들어 냉동건조에 의해, 첫번째 단계에서 적절히 제거되고, 두번째 단계에서, 단백질에 대한 컨쥬게이션을 위해 물에서 재용출시킬 수 있다. 환원성 아미노화에 의한, 단백질의 적어도 하나의 아미노 그룹과 폴리머의 적어도 하나의 알데히드 그룹과의 커플링에 대하여, pH 또는 온도와 같은 환원성 아미노화 반응의 특이적 반응 파라미터에 관한 상기 상세한 기재가 참고가 된다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따라, 환원성 아미노화는 바람직하게는 약 4 ℃와 같은 0 내지 5 ℃의 온도, 약 5.0와 같은 약 4.5 내지 5.5의 pH에서, 및 약 24 시간과 같은 약 20 내지 30 시간의 반응 시간 동안 수행된다.
두번째 바람직한 구체예에 따라, 폴리머는 폴리머와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용 그룹 M; 및 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹이고, 환원성 아미노화에 의해 단백질의 아미노 그룹과 반응하는 적어도 하나의 작용 그룹 Q를 포함하는 적어도 이작용성 화합물과 반응한다.
알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹과 구별하여, 적어도 하나의 카복시 그룹 또는 적어도 하나의 반응성 카복시 그룹, 바람직하게는 하나의 카복시 그룹 또는 하나의 반응성 카복시 그룹을 가지는 화합물을 사용하는 것이 바람직하다. 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹 및 카복시 그룹 또는 반응성 카복시 그룹은 임의의 적절한 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 스페이서는 임의로 치환된, 선형, 측쇄 및/또는 사이클릭 탄화수소 잔기 등일 수 있다. 일반적으로 탄화수소 잔기는 탄소 원자수가 1 내지 60, 바람직하게는 1 내지 40, 더 바람직하게는 1 내지 20, 더 바람직하게는 2 내지 10, 더 바람직하게는 2 내지 6 및 특히 바람직하게는 2 내지 4이다. 헤테로 원자가 존재한다면, 각 그룹은 통상 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 8 및 특히 바람직하게는 1 내지 4 헤테로 원자를 포함한다. 탄화수소 잔기는 예를 들어, 탄소 원자수 5 내지 7인 임의로 측쇄 알킬 쇄 또는 아릴 그룹 또는 시클로알킬 그룹을 포함하거나, 또는 알킬 부분이 직쇄 및/또는 사이클릭 알킬 그룹일 수 있는 아르알킬 그룹, 알크아릴 그룹일 수 있다. 보다 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수 5 내지 7 및 바람직하게는 탄소 원자수 6인 아릴 잔기이다. 가장 바람직하게는, 탄화수소 잔기는 벤젠 잔기이다. 본원의 바람직한 구체예에 따라, 카복시 그룹 및 알데히드 그룹은 벤젠 환의 1,4-위치, 1,3-위치 또는 1,2-위치에 위치할 수 있으며, 1,4-위치가 바람직하다.
반응성 카복시 그룹으로서, 반응성 에스테르, 이소티오시아네이트 또는 이소시아네이트가 언급될 수 있다. 바람직한 반응성 에스테르는 N-히드록시 숙신이미드 또는 설포-N-히드록시 숙신이미드와 같은 N-히드록시 숙신이미드, p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀과 같은 트리클로로페놀, 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀과 같은 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀과 같은 적절히 치환된 페놀, 또는 히드록시 벤조트리아졸과 같은 히드록시아졸로부터 유도된다. 특히 바람직하게는 N-히드록시 숙신이미드로, N-히드록시 숙신이미드 및 설포-N-히드록시 숙신이미드가 특히 바람직하다. 모든 알코올이 단독 또는 그의 둘 이상의 적절한 결합으로서 사용될 수 있다. 반응성 에스테르로써, 펜타플루오로페닐 에스테르 및 N-히드록시 숙신이미드 에스테르가 특히 바람직하다.
그래서, 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 폴리머는 포르밀벤조산과 반응한다.
다른 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 폴리머는 포르밀벤조산 펜타플루오로페닐 에스테르와 반응한다.
또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 폴리머는 포르밀벤조산 N-히드록시숙신이미드 에스테르와 반응한다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 폴리머는 4-(4-포르밀-3,5-디메톡시페녹시)부티르산과 반응한다.
바람직하게는 카복시 그룹 또는 반응성 카복시 그룹인 M; 및 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹인 Q를 포함하는 화합물과 반응하는 히드록시에틸 스타치는 가장 바람직하게는 약 10 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치이다. 약 10 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 12 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 12 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 18 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 18 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 50 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 50 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치도 가능하다. 특히 바람직하게는, 히드록시알킬 스타치 및 보다 더 바람직하게는 히드록시에틸 스타치가 산화된 형태로 그의 환원 말단으로 사용된다.
알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 가지는 생성된 폴리머 유도체는 그 후에 환원성 아미노화를 통하여 단백질의 아미노 그룹과 반응한다. 환원성 아미노화에 의한 단백질의 적어도 하나의 아미노 그룹과 폴리머의 적어도 하나의 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹과의 커플링에 대하여, pH 또는 온도와 같은 환원성 아미노화 반응의 특이적 반응 파라미터에 관한 상기 상세한 기재가 참고가 된다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따라, 단백질의 아미노 그룹과의 반응은 바람직하게는 0 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 0 내지 25 ℃ 및 특히 바람직하게는 4 내지 21 ℃의 온도에서 수행된다. 반응 시간은 바람직하게는 30 분 내지 72 시간, 더 바람직하게는 2 내지 48 시간 및 특히 바람직하게는 4 시간 내지 17 시간의 범위이다. 반응 용매로써, 수성 매질이 바람직하다. 반응 매질의 pH 값은 바람직하게는 4 내지 9, 더 바람직하게는 4 내지 8 및 특히 바람직하게는 4.5 내지 5.5 범위이다.
세번째 바람직한 구체예에 따르면, 폴리머는 임의로 산화된 환원 말단에서, 아미노 그룹 M 및 작용 그룹 Q를 포함하는 적어도 이작용성 화합물과 반응하고, 여기에서 상기 아미노 그룹 M은 폴리머의 임의로 산화된 환원 말단과 반응하며, 작용 그룹 Q는 화학적으로 변형되어 환원성 아미노화에 의해 단백질의 아미노 그룹과 반응하는 알데히드 기능성 폴리머 유도체를 제공한다.
작용 그룹 Q, 즉 하기 작용 그룹 등이 언급된다:
- C-C-이중 결합 또는 C-C-삼중 결합 또는 방향족 C-C-결합;
- 티올 그룹 또는 히드록시 그룹;
- 알킬 설폰산 히드라지드, 아릴 설폰산 히드라지드;
- 1,2-디올;
- 1,2-아미노알코올;
- 1,2 아미노-티오알코올;
- 아지드;
- 아미노 그룹 -NH2 또는 아미노알킬 그룹, 아미노아릴 그룹, 아미노아르알킬 그룹, 또는 알크아릴아미노그룹과 같은 구조 단위 -NH-를 포함하는 아미노 그룹의 유도체;
- 히드록실아미노 그룹 -O-NH2, 또는 히드록실알킬아미노 그룹, 히드록실아릴아미노 그룹, 히드록실아르알킬아미노 그룹, 또는 히드록살알크아릴아미노 그룹과 같은 구조 단위 -O-NH-를 포함하는 히드록실아미노 그룹의 유도체;
- 각각 구조단위 -NH-O-을 포함하는 알콕시아미노 그룹, 아릴옥시아미노 그룹, 아르알킬옥시아미노 그룹, 또는 알크아릴옥시아미노 그룹;
- 카보닐 그룹, -Q-C(=G)-M을 가지는 잔기,
(여기에서 G는 O 또는 S이고, M은 예로서,
-- -OH 또는 -SH;
-- 알콕시 그룹, 아릴옥시 그룹, 아르알킬옥시 그룹, 또는 알크아릴옥시 그룹;
-- 알킬티오 그룹, 아릴티오 그룹, 아르알킬티오 그룹, 또는 알크아릴티오 그룹;
-- 알킬카보닐옥시 그룹, 아릴카보닐옥시 그룹, 아르알킬카보닐옥시 그룹, 알크아릴카보닐옥시 그룹;
-- G = O이고 Q는 존재하지 않는 경우, 예를 들면, 펜타플루오로페닐, 파라니트로페닐 또는 트리클로로페닐과 같은 치환된 아릴 잔기를 갖는 아릴옥시 화합물이거나, N이 헤테로아릴 화합물의 일부인 구조 단위 O-N을 갖거나, N-히드록시숙신이미드와 같은 이미드 구조를 갖는 히드록실아민의 에스테르와 같은 활성화된 에스테르이다);
Q가 존재하지 않거나 NH 또는 헤테로원자, 예로서 S 또는 O인 경우;
- -NH-NH2, 또는 -NH-NH-;
- -N02;
- 니트릴 그룹;
- 알데히드 그룹 또는 케토 그룹과 같은 카보닐 그룹;
- 카복시 그룹;
- -N=C=O 그룹 또는 -N=C=S 그룹;
- 비닐 아이오다이드 또는 비닐 브로마이드 그룹 또는 트리플레이트와 같은 비닐 할라이드 그룹;
- -C≡C-H ;
- -(C=NH2Cl)-O알킬;
- 그룹 -(C=O)-CH2-Hal(여기에서 Hal은 Cl, Br, 또는 I이다);
- -CH=CH-S02-;
- 구조 -S-S-을 포함하는 디설파이드 그룹;
- 그룹
Figure 112009038347086-pct00033
;
- 그룹
Figure 112006009433098-pct00034
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 용어, "작용 그룹 Q"는 화학 구조 -NH-를 포함하는 작용 그룹 Q에 관한 것이다
본 발명의 하나의 바람직한 구체예에 따라, 작용 그룹 M은 구조 R'-NH-를 가지는 그룹이고, 여기에서 R'은 수소 또는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴시클로알킬, 알크아릴 또는 시클로알킬아릴 잔기이며, 이 때, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴시클로알킬, 알크아릴 또는 시클로알킬아릴 잔기는 다른 구체예에 따라 NH 그룹에 직접 결합하거나, NH 그룹에 산소 결합에 의해 결합될 수 있다. 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴시클로알킬, 알크아릴, 또는 시클로알킬아릴 잔기는 적절하게 치환될 수 있다. 바람직한 치환기로써, F, Cl 또는 Br과 같은 할로겐이 언급될 수 있다. 특히 바람직한 잔기 R'은 수소, 알킬 및 알콕시 그룹이고, 보다 더 바람직하게는 수소 및 비치환된 알킬 및 알콕시 그룹이다.
알킬 및 알콕시 그룹 가운데, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 C 원자를 가진 그룹이 바람직하다. 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 및 이소프로폭시 그룹이 더욱 바람직하다. 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시가 특히 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 메틸 또는 메톡시이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따라, 작용 그룹 M은 구조 R'-NH-R"를 가지고, 여기에서 R"은 바람직하게는 구조 단위 -NH 및/또는 구조단위 -(C=G)-를 포함하며, 이 때 G는 O 또는 S, 및/또는 구조단위 -SO2-이다. 작용 그룹 R"의 특이적 예는 하기와 같다.
Figure 112006009433098-pct00035
상기 식에서, G는 2가지로 존재하며, 독립적으로 O 또는 S이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 언급된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 작용 그룹 M은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
Figure 112006009433098-pct00036
상기 식에서 G는 O 또는 S이고, 만일 2가지로 존재하면, 독립적으로 O 또는 S이며, R'은 메틸이다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따라, 작용 그룹 M은 아미노 그룹 -NH2이다.
용어 "아미노 그룹 Q"는 화학 구조 -NH-를 포함하는 작용 그룹 Q와 관련된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 작용 그룹 Q는 구조 R'-NH-를 포함하는 그룹으로, 여기에서 R'는 수소 또는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴시클로알킬, 알크아릴 또는 시클로알킬아릴 잔기이고, 이 때, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴시클로알킬, 알크아릴 또는 시클로알킬아릴 잔기는 다른 구체예에 따라 NH 그룹에 직접 결합하거나, NH 그룹에 산소 결합에 의해 결합될 수 있다. 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴시클로알킬, 알크아릴, 또는 시클로알킬아릴 잔기는 적절하게 치환될 수 있다. 바람직한 치환기로써, F, Cl 또는 Br과 같은 할로겐이 언급될 수 있다. 특히 바람직한 잔기 R'은 수소, 알킬 및 알콕시 그룹이고, 보다 더 바람직하게는 수소 및 비치환된 알킬 및 알콕시 그룹이다.
알킬 및 알콕시 그룹 가운데, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 C 원자를 가진 그룹이 바람직하다. 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 및 이소프로폭시 그룹이 더욱 바람직하다. 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시가 특히 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 메틸 또는 메톡시이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따라, 작용 그룹 Q는 구조 R'-NH-R"를 가지고, 여기에서 R"은 바람직하게는 구조 단위 -NH 및/또는 구조단위 -(C=G)-를 포함하며, 이 때 G는 O 또는 S, 및/또는 구조단위 -SO2-이다. 보다 바람직한 구체예에 따라, 작용 그룹 R"은 하기 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
Figure 112006009433098-pct00037
상기 식에서, G는 2가지로 존재하며, 독립적으로 O 또는 S이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 언급된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 작용 그룹 Q는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
Figure 112006009433098-pct00038
상기 식에서 G는 O 또는 S이고, 만일 2가지로 존재하면, 독립적으로 O 또는 S이며, R'은 메틸이다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따라, 작용 그룹 Q는 아미노 그룹 -NH2이다.
본 발명의 보다 추가적인 바람직한 구체예에 따르면, M 및 Q 모두는 아미노 그룹 -NH-을 포함한다. 특히 바람직한 구체예에 따라, M 및 Q 모두는 아미노 그룹 -NH2이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, M 및 Q를 포함하는 화합물은 동종 이작용성 화합물이고, 더 바람직하게는 작용 그룹 M 및 Q로써, 가장 바람직하게는 아미노 그룹-NH2, 또는 다른 구체예에 따라, 히드록실아미노그룹 -O-NH2 또는 하기 그룹을 포함하는 동종 이작용성 화합물이다.
Figure 112006009433098-pct00039
상기 식에서, G는 바람직하게는 0이다. M 및 Q를 포함하는 이들 화합물의 특이적 예는 하기와 같다.
Figure 112006009433098-pct00040
M이 바람직하게는 아미노 그룹 -NH- 및 더 바람직하게는 아미노그룹 -NH2이고, 더 바람직하게는 M 및 Q 모두가 아미노 그룹 -NH-를 포함하고, 특히 바람직하게는 M 및 Q 모두가 아미노 그룹-NH2을 포함하는, M을 포함하는 화합물과 반응하는 히드록시에틸 스타치는 바람직하게는 약 10 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 10 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치이다. 또한 약 12 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 12 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 18 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 18 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 50 kD의 평균 분자량 및 약 0.4의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치, 또는 약 50 kD의 평균 분자량 및 약 0.7의 DS를 가지는 히드록시에틸 스타치가 가능하다.
M 및 Q 모두가 아미노그룹 -NH2인 경우, M 및 Q는 임의의 적절한 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 스페이서는 임의로 치환된, 선형, 측쇄 및/또는 사이클릭 탄화수소 잔기 등일 수 있다. 일반적으로 탄화수소 잔기는 탄소 원자수가 1 내지 60, 바람직하게는 1 내지 40, 더 바람직하게는 1 내지 20, 더 바람직하게는 2 내지 10, 더 바람직하게는 2 내지 6, 및 특히 바람직하게는 2 내지 4이다. 헤테로 원자가 존재하면, 각각의 그룹은 통상 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 8, 특히 바람직하게는 1 내지 4 헤테로 원자를 포함한다. 탄화수소 잔기는 예를 들어, 탄소 원자수 5 내지 7인 임의로 측쇄 알킬 쇄 또는 아릴 그룹 또는 시클로알킬 그룹을 포함하거나, 아르알킬 그룹, 알크아릴 그룹일 수 있고, 여기에서 알킬 부분은 직쇄 및/또는 사이클릭 알킬 그룹일 수 있다. 본 발명의 보다 더욱 바람직한 구체예에 따라, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수 1 내지 20, 바람직하게는 2 내지 10, 더 바람직하게는 2 내지 6, 및 특히 바람직하게는 2 내지 4인 알킬 쇄이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 폴리머는 1,4-디아미노부탄, 1,3-디아미노프로판 또는 1,2-디아미노에탄과 반응하여 폴리머 유도체를 제공한다.
M 및 Q를 포함하는 적어도 이작용성 화합물의 폴리머와의 반응은 바람직하게는 온도가 0 내지 100 ℃, 더 바람직하게는 4 내지 80 ℃ 및 특히 바람직하게는 20 내지 80 ℃이고; 반응 시간이 바람직하게는 4 시간 내지 7 일, 더 바람직하게는 10 시간 내지 5 일 및 특히 바람직하게는 17 내지 4 시간 범위일 때, 수행된다. 적어도 이작용성 화합물: 폴리머의 몰비는 바람직하게는 10 내지 200, 특히 50 내지 100 범위이다.
적어도 이작용성 화합물과 폴리머와의 반응 용매로서, 적어도 하나의 비양자성 용매, 특히 바람직하게는 0.5 중량 퍼센트 이하, 바람직하게는 0.1 중량 퍼센트 이하의 물 함량을 가지는 무수 비양자성 용매가 바람직하다. 적절한 용매는 디메틸 설폭시드 (DMSO), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아미드 (DMA), 디메틸 포름아미드 (DMF) 및 그의 둘 이상의 혼합물이다.
적어도 이작용성 화합물과 폴리머와의 반응 용매로서, 또한 수성 매질이 사용될 수 있다.
바람직한 구체예에 따르면, 폴리머 및 적어도 이작용성 화합물을 포함하는 폴리머 유도체는 자유 작용 그룹 Q에서 기능적으로 변형되어 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 포함하는 폴리머 유도체를 제공한다. 이 구체예에 따라, 폴리머 유도체를 작용 그룹 Q와 반응할 수 있는 작용 그룹 및 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 포함하는 적어도 하나의 적어도 이작용성 화합물과 반응시키는 것이 바람직하다.
적어도 이작용성 화합물로써, 각 화합물은 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹 및 폴리머 유도체의 작용 그룹 Q와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용 그룹을 가지는 것이 적절하다. 적어도 하나의 작용 그룹은 Q와 동일한 작용 그룹 풀로부터 선택되고, Q과 반응할 수 있는 것이 선택된다. Q가 아미노 그룹 -NH2인 바람직한 경우에 있어서, 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹과 구별하여, 적어도 하나의 카복시 그룹 또는 적어도 하나의 반응성 카복시 그룹, 바람직하게는 하나의 카복시 그룹 또는 하나의 반응성 카복시 그룹을 가지는 화합물을 사용하는 것이 바람직하다. 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹 및 카복시 그룹 또는 반응성 카복시 그룹은 임의의 적절한 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 스페이서는 임의로 치환된, 선형, 측쇄 및/또는 사이클릭 탄화수소 잔기 등일 수 있다. 일반적으로 탄화수소 잔기는 탄소 원자수가 1 내지 60, 바람직하게는 1 내지 40, 더 바람직하게는 1 내지 20, 더 바람직하게는 2 내지 10, 더 바람직하게는 2 내지 6 및 특히 바람직하게는 2 내지 4이다. 헤테로 원자가 존재한다면, 각 그룹은 통상 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 8 및 특히 바람직하게는 1 내지 4 헤테로 원자를 포함한다. 탄화수소 잔기는 예를 들어, 탄소 원자수 5 내지 7인 임의로 측쇄 알킬 쇄 또는 아릴 그룹 또는 시클로알킬 그룹을 포함하거나, 또는 알킬 부분이 직쇄 및/또는 사이클릭 알킬 그룹일 수 있는 아르알킬 그룹, 알크아릴 그룹일 수 있다. 보다 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수 5 내지 7 및 바람직하게는 탄소 원자수 6인 아릴 잔기이다. 가장 바람직하게는, 탄화수소 잔기는 벤젠 잔기이다. 본원의 바람직한 구체예에 따라, 카복시 그룹 및 알데히드 그룹은 벤젠 환의 1,4-위치, 1,3-위치 또는 1,2-위치에 위치할 수 있으며, 1,4-위치가 바람직하다.
반응성 카복시 그룹으로서, 반응성 에스테르, 이소티오시아네이트 또는 이소시아네이트가 언급될 수 있다. 바람직한 반응성 에스테르는 N-히드록시 숙신이미드 또는 설포-N-히드록시 숙신이미드와 같은 N-히드록시 숙신이미드, p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀과 같은 트리클로로페놀, 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀과 같은 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀과 같은 적절히 치환된 페놀, 또는 히드록시 벤조트리아졸과 같은 히드록시아졸로부터 유도된다. 특히 바람직하게는 N-히드록시 숙신이미드로, N-히드록시 숙신이미드 및 설포-N-히드록시 숙신이미드가 특히 바람직하다. 모든 알코올이 단독 또는 그의 둘 이상의 적절한 결합으로서 사용될 수 있다. 반응성 에스테르로써, 펜타플루오로페닐 에스테르 및 N-히드록시 숙신이미드 에스테르가 특히 바람직하다.
그래서, 바람직한 구체예에 따라, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 아미노 그룹 -NH2인 Q를 포함하는 폴리머 유도체는 포르밀벤조산과 추가로 반응한다.
다른 구체예에 다라, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 아미노 그룹인 Q를 포함하는 폴리머 유도체는 포르밀벤조산 펜타플루오로페닐 에스테르와 추가로 반응한다.
또 다른 구체예에 따라, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 아미노 그룹인 Q를 포함하는 폴리머 유도체는 포르밀벤조산 N-히드록시숙신이미드 에스테르와 추가로 반응한다.
또 다른 구체예에 따라, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 아미노 그룹인 Q를 포함하는 폴리머 유도체는 4-(4-포르밀-3,5-디메톡시페녹시)부티르산과 추가로 반응한다.
아미노 그룹 및 예를 들어, 포르밀벤조산을 포함하는 폴리머 유도체의 반응 용매로써, 적어도 하나의 비양자성 용매, 특히 바람직하게는 0.5 중량 퍼센트 이하, 바람직하게는 0.1 중량 퍼센트 이하의 물 함량을 가지는 무수 비양자성 용매가 바람직하다. 적절한 용매는 디메틸 설폭시드 (DMSO), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아미드 (DMA), 디메틸 포름아미드 (DMF) 및 그의 둘 이상의 혼합물이다.
상기 반응은 바람직하게는 0 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 0 내지 25 ℃ 및 특히 바람직하게는 15 내지 25 ℃ 온도에서, 바람직하게는 0.5 내지 24 시간 및 특히 바람직하게는 1 내지 17 시간의 반응 시간 동안 수행된다.
바람직한 구체예에 따르면, 상기 반응은 활성화제의 존재 하에서 수행된다. 적절한 활성화제는 디이소프로필 카르보디이미드 (DIC), 디시클로헥실 카르보디이미드 (DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC)와 같은 카르보디이미드이고, 디이소프로필 카르보디이미드 (DIC)가 특히 바람직하다.
생성된 폴리머 유도체는 적어도 하나의 적절한 방법에 의해 반응 혼합물로부터 정제될 수 있다. 필요하다면, 폴리머 유도체는 적어도 하나의 적절한 방법에 의해 분리하기 전에 침전시킬 수 있다.
만일 폴리머 유도체가 먼저 침전된다면, 예를 들어, 반응 혼합물이 적절한 온도에서 반응 혼합물 중에 존재하는 용매 또는 용매 혼합물 이외의 적어도 하나의 용매 또는 용매 혼합물과 접촉할 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 수성 매질, 바람직하게는 물이 용매로 사용되는 경우, 반응 혼합물은 바람직하게는 -20 내지 +50 ℃ 및 특히 바람직하게는 -20 내지 25 ℃ 범위의 온도에서, 2-프로판올 또는 아세톤 및 에탄올의 혼합물, 바람직하게는 상기 화합물의 동일한 부피를 가리키는 1: 1 혼합물 (v/v)과 접촉시킨다.
폴리머 유도체의 분리는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있는 적절한 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 폴리머 유도체는 첫째로 원심분리 또는 여과와 같은 적절한 방법에 의해, 예를 들어, 수성 2-프로판올 혼합물을 가진 반응 혼합물 또는 반응 혼합물의 혼합물로부터 분리된다. 두번째 단계에서, 분리된 폴리머 유도체에 투석, 원심여과 또는 가압여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, HPLC, MPLC, 겔 여과 및/또는 냉동건조와 같은 후-처리 같이 추가적 처치를 가할 수 있다. 보다 더욱 바람직한 구체예에 따라, 분리된 폴리머 유도체는 첫째로 투석되고, 바람직하게는 물에 저항하며, 그 후, 생성물의 원하는 사항에 따라 반응 생성물의 용매 함량이 충분히 낮을 때까지 냉동건조시킨다. 냉동건조는 20 내지 35 ℃, 바람직하게는 20 내지 30 ℃의 온도에서 수행된다.
알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 가지는 생성된 폴리머 유도체는 그 후, 환원성 아미노화를 통하여 단백질 아미노 그룹과 반응한다. 환원성 아미노화에 의한, 단백질의 적어도 하나의 아미노 그룹과 폴리머의 적어도 하나의 알데히드 그룹과의 커플링에 대하여, pH 또는 온도와 같은 환원성 아미노화 반응의 특이적 반응 파라미터에 관한 상기 상세한 기재가 참고가 된다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따라, 환원성 아미노화는 1 내지 8 ℃와 같은 0 내지 10 ℃ 또는 약 4 ℃와 같은 2 내지 6 ℃의 온도, 및 약 5.0과 같은 약 4.5 내지 5.5의 pH에서 수행된다. 반응 시간은 12 내지 19 시간과 같은 약 10 내지 20 시간, 또는 약 17 시간과 같은 14 내지 18 시간, 또는 약 24 시간과 같은 약 20 내지 30 시간이다.
그래서, 상기 언급된 바람직한 구체예에 따라, 폴리머가 그것의 산화된 환원 말단을 통하여 반응하는 경우, 본 발명은 또한 하기 화학식에 따른 컨쥬게이트에 관한 것이다.
Figure 112006009433098-pct00041
상기 기재된 바와 같이, 특히 바람직한 구체예에 따라, 폴리머는 히드록시에틸 스타치, 즉, HAS'는 HES'이고, n = 2, 3, 또는 4이며, 가장 바람직하게는 4이다. 따라서, 폴리머가 그의 산화된 환원 말단을 통하여 반응하는 경우, 본 발명은 또한 하기 화학식에 따른 컨쥬게이트에 관한 것이다.
Figure 112006009433098-pct00042
다른 바람직한 구체예에 따라, 본 발명은 또한 폴리머가 그의 산화된 환원 말단을 통하여 반응하는 경우, 본 발명은 또한 하기 화학식에 따른 컨쥬게이트에 관한 것이다.
Figure 112006009433098-pct00043
상기 식에서, n = 2, 3, 또는 4이고, R4는 독립적으로 수소 또는 메톡시 그룹이며, R4가 수소인 경우 m = 0이고, R4가 메톡시인 경우 m = 1이며, HAS는 바람직하게는 HES'이다.
상기 각 화학식에서, 단백질에 부착된 질소는 단백질의 아미노 그룹으로부터 유도되고, 이 때 폴리머 유도체는 알데히드 그룹을 통하여 결합된다.
작용 그룹 M 및 Q가 아미노 그룹 -NH2를 포함함에 따라 상기 언급된 구체예에 관하여, M은 아미노그룹 -NH2이고, Q는 베타 히드록시 아미노 그룹 -CH(OH)-CH2-NH2을 포함하며, 바람직하게는 베타 히드록시 아미노 그룹일 수 있다
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 두개의 아미노 그룹 M 및 Q를 포함하는 화합물의 아미노 그룹 Q는 베타 히드록시 아미노 그룹 -CH(OH)-CH2-NH2이다.
이 경우에, M 및 Q는 임의의 적절한 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 스페이서는 임의로 치환된, 선형, 측쇄 및/또는 사이클릭 탄화수소 잔기 등일 수 있다. 일반적으로 탄화수소 잔기는 탄소 원자수가 1 내지 60, 바람직하게는 1 내지 40, 더 바람직하게는 1 내지 20, 더 바람직하게는 2 내지 10, 더 바람직하게는 1 내지 6 및 특히 바람직하게는 1 내지 2이다. 헤테로 원자가 존재한다면, 각 그룹은 통상 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 8 및 특히 바람직하게는 1 내지 4 헤테로 원자를 포함한다. 탄화수소 잔기는 예를 들어, 탄소 원자수 5 내지 7인 임의로 측쇄 알킬 쇄 또는 아릴 그룹 또는 시클로알킬 그룹을 포함하거나, 또는 알킬 부분이 직쇄 및/또는 사이클릭 알킬 그룹일 수 있는 아르알킬 그룹, 알크아릴 그룹일 수 있다. 보다 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 더 바람직하게는 1 내지 6, 더 바람직하게는 1 내지 4, 및 특히 바람직하게는 1 내지 2인 알킬 쇄이다. 보다 더 바람직하게는, M 및 Q는 메틸렌 그룹에 의해 분리된다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 폴리머는 1,3-디아미노-2-히드록시프로판과 반응한다.
폴리머가 그의 산화된 환원 말단을 통하여 반응하는 경우, 하기 화학식에 따른 폴리머 유도체가 제공된다.
Figure 112006009433098-pct00044
상기 식에서, 바람직하게 HAS'는 HES'이다.
M 및 Q, 특히 바람직하게는 1,3-디아미노-2-히드록시프로판을 포함하는 적어도 이작용성(bifunctional) 화합물과 폴리머와의 반응은 바람직하게는 40 내지 120 ℃, 보다 바람직하게는 40 내지 90 ℃, 가장 바람직하게는 60 내지 80 ℃의 온도에서 수행된다. 반응 시간은 바람직하게는 17 내지 168 시간, 보다 바람직하게는 17 내지 96 시간, 가장 바람직하게는 48 내지 96 시간이다. 적어도 이작용성 화합물:폴리머의 몰비는 바람직하게는 200:1 내지 10:1이고, 특히 50:1 내지 100:1이다.
적어도 이작용성 화합물과 폴리머의 반응 용매로서, 적어도 하나의 비양성자성 용매, 바람직하게는 물 함량이 0.5 중량% 이하, 바람직하게는 0.1 중량% 이하인 무수 비양성자성 용매가 바람직하다. 안정한 용매는 특히 디메틸 설폭시드 (DMSO), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아미드 (DMA), 디메틸 포름아미드 (DMF) 및 그의 둘 이상의 혼합물이다.
폴리머 유도체의 베타 히드록시 아미노 그룹 Q는 일반적으로 Q와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용 그룹을 포함하고 추가적으로 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹인 적어도 하나의 작용 그룹 또는 변형되어 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 제공할 수 있는 작용 그룹을 포함하는 적어도 이작용성 화합물과 반응할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 베타 히드록시 아미노 그룹은 화학적 산화에 의해 직접 변형되어 알데히드 그룹을 제공한다.
이 산화는 베타 히드록시 아미노 그룹을 알데히드 그룹으로 전환시킬 수 있는 모든 적합한 산화제를 이용하여 수행될 수 있다. 바람직한 산화제는 알칼리 금속 과요오드산과 같은 과요오드산이다. 특히 바람직한 것은 소듐 과요오드산이고, 바람직하게는 수용액으로서 사용된다. 이 용액은 바람직하게는 1 내지 50 mM, 보다 바람직하게는 1 내지 25 mM, 가장 바람직하게는 1 내지 10 mM의 요도드산 농도를 가진다. 산화는 0 내지 40 ℃, 바람직하게는 0 내지 25 ℃, 특히 바람직하게는 4 내지 20 ℃의 온도에서 수행된다..
얻은 폴리머 유도체는 적어도 하나의 적합한 방법에 의해 반응 혼합물로부터 정제될 수 있다. 필요하다면, 폴리머 유도체는 적어도 하나의 적합한 방법에 의해 분리되기 전에 침전될 수 있다.
먼저 폴리머 유도체가 침전되면, 예를 들어 반응 혼합물을 적합한 온도에서 반응 혼합물에 존재하는 용매 또는 용매 혼합물과 다른 적어도 하나의 용매 또는 용매 혼합물과 접촉시키는 것이 가능하다. 수성 매질 바람직하게는 물이 용매로서 사용되는 본 발명에 특히 바람직한 구체예에서, 반응 혼합물은 바람직하게는 -20 내지 +50 ℃, 특히 바람직하게는 -20 내지 25 ℃의 온도에서 2-프로판올 또는 아세톤 및 에탄올의 혼합물과 접촉된다..
폴리머 유도체의 분리는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있는 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 폴리머 유도체는 먼저 반응 혼합물 또는 반응 혼합물과 예를 들어 수성 2-프로판올 혼합물의 혼합물로부터 원심분리 또는 여과와 같은 적합한 방법에 의해 분리된다. 두번째 단계에서, 분리된 폴리머 유도체는 투석, 원심분리 여과 또는 압력 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, HPLC, MPLC, 겔 여과 및/또는 동결건조와 같은 후-처리에 의해 추가로 처리될 수 있다. 보다 바람직한 구체예에서, 분리된 폴리머 유도체는 먼저 (바람직하게는 물로) 투석된 후, 반응 생성물의 용매 함량이 생성물의 바람직한 설명에 따라 충분히 낮아질 때 까지 동결건조된다. 동결건조는 20 내지 35 ℃, 바람직하게는 20 내지 30 ℃의 온도에서 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 과요오드산을 이용하여 베타 히드록시 아미노 그룹 Q의 산화가 수행되는 상기 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
그러므로, 본 발명은 또한 폴리머가 산화된 환원 말단을 가지는 경우에 베타 히드록시 아미노 그룹을 가지는 폴리머 유도체, 바람직하게 하기 화학식의 화합물을 바람직하게는 과요오드산으로 알데히드 그룹을 가지는 폴리머 유도체, 특히 바람직하게는 하기 화학식의 화합물로 산화시켜 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 관한 것이다:
Figure 112006009433098-pct00045
Figure 112006009433098-pct00046
상기 식에서, 바람직하게 HAS'는 HES'이다.
그 후, 형성된 알데히드 그룹 A를 가지는 폴리머 유도체를 단백질과 반응시킨다. 따라서, 본 발명은 또한 폴리머가 산화된 환원 말단을 가지는 경우에 베타 히드록시 아미노 그룹을 가지는 폴리머 유도체, 바람직하게는 하기 화학식의 화합물을 단백질의 아미노 그룹과 반응시키는 것을 포함하는 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 관한 것이다:
Figure 112006009433098-pct00047
상기 식에서, 바람직하게 HAS'는 HES'이다.
얻은 알데히드 그룹을 가지는 폴리머 유도체를 그 후 환원성 아미노화에 의해 단백질의 아미노 그룹과 반응시킨다. 환원성 아미노화에 의한 단백질의 적어도 하나의 아미노 그룹 및 폴리머의 적어도 하나의 알데히드 그룹의 커플링에 관한 참고 내용이 위의 상세한 설명에 기재되어 있다.
따라서, 상기 바람직한 구체예에 따르면 폴리머가 산화된 환원 말단을 가지는 경우, 본 발명은 또한 하기 화학식의 컨쥬게이트에 관한 것이다
Figure 112006009433098-pct00048
상기 식에서, 바람직하게 HAS'는 HES'이다. 상기 식에서, 단백질에 결합한 질소는 알데히드 그룹을 통해 폴리머 유도체에 연결된 단백질의 아미노 그룹으로부터 유래된다.
본 발명의 추가적인 구체예에서, 폴리머는 먼저 적합한 화합물과 반응하여 적어도 하나의 반응성 카복시 그룹을 포함하는 제1 폴리머 유도체를 제공한다. 상기 제1 폴리머 유도체는 그 후 추가적으로 적어도 하나의 작용 그룹이 폴리머 유도체의 적어도 하나의 반응성 카복시 그룹과 반응하고, 적어도 하나의 다른 작용 그룹이 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹, 또는 화학적으로 변형되어 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 제공하는 작용 그룹인 적어도 이작용성 화합물과 반응하고, 얻은 상기 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 포함하는 폴리머 유도체는 상술한 환원성 아미노화를 통해서 단백질의 적어도 하나의 아미노 그룹과 반응한다. 각 화합물 사이의 반응 순서는 또한 변경될 수 있다.
상기 추가적 구체예의 제1 변형에 따라, 적어도 하나의 반응성 카복시 그룹을 포함하는 폴리머는 그의 환원 말단을 선택적으로 환원시키고, 그 후 하기 화학식의 락톤 및/또는 하기 화학식의 카복실산 또는 알칼리 금속염, 바람직하게는 소듐 및/또는 포타슘염과 같은 상기 카복실산의 적합한 염이고, 산화된 폴리머를 적합한 화합물과 반응시켜 적어도 하나의 반응성 카복실산을 포함하는 폴리머를 제공한다:
Figure 112006009433098-pct00049
Figure 112006009433098-pct00050
상기 식에서, 바람직하게 HAS'는 HES'이다.
폴리머, 바람직하게는 히드록시에틸 스타치의 산화는 상기 구조 (IIa) 및/또는 (IIb)를 가지는 화합물을 야기하는 각 방법 또는 조합된 방법에 따라 수행될 수 있다.
산화가 히드록시 알킬 스타치의 산화된 환원 말단을 야기하는 모든 적합한 방법(들)에 따라 수행될 수 있지만, 예를 들어 DE 196 28 705 A1에 기재된 알칼리 요오드 용액을 이용하여 수행하는 것이 바람직하고, 상기 문헌의 내용(실시예 A, 컬럼 9, 6~24줄)은 참고로서 여기에 편입되어 있다.
그의 환원 말단이 선택적으로 산화된 폴리머에 반응성 카복시 그룹을 도입하는 것은 생각할 수 있는 모든 방법 및 적합한 모든 화합물에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 특별한 방법에 따라, 그의 환원 말단이 선택적으로 산화된 폴리머는 산화된 환원 말단에서 적어도 하나의 알코올, 바람직하게는 25 ℃에서 6 내지 12, 또는 7 내지 11 범위의 pKA 값을 가지는 산성 알코올과 같은 적어도 하나의 산성 알코올과 반응한다. 산성 알코올의 분자량은 90 내지 300 g/몰 또는, 100 내지 200 g/몰과 같이 80 내지 500g/몰의 범위일 수 있다.
안정한 산성 알코올은 산성 양성자를 가지는 모든 알코올 H-O-RA이고 산화된 폴리머와 반응하여 각각의 반응성 폴리머 에스테르, 바람직하게는 하기 식의 반응성 폴리머 에스테르,
Figure 112006009433098-pct00051
보다 바람직하게는 하기 식의 반응성 폴리머 에스테르를 제공할 수 있다.
Figure 112006009433098-pct00052
바람직한 알코올은 N-히드록시 숙신이미드 또는 설포-N-히드록시 숙신이미드와 같은 N-히드록시 숙신이미드류, p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀과 같은 트리클로로페놀, 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀과 같은 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀과 같은 적절히 치환된 페놀류, 또는 히드록시 벤조트리아졸과 같은 히드록시아졸류이다. 특히 바람직한 것은 N-히드록시 숙신이미드류이고, N-히드록시숙신이미드 및 설포-N-히드록시숙신이미드가 특히 바람직하다. 모든 알코올은 단독으로 사용되거나 그의 둘 이상의 적합한 조합으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 명세서에서, 예를 들어 탄산 디에스테르의 첨가와 같이 각각의 알코올을 방출하는 화합물을 사용하는 것도 또한 가능하다.
그러므로, 본 발명은 또한 산화된 폴리머와 산성 알코올, 바람직하게는 N-히드록시 숙신이미드 및/또는 설포-N-히드록시 숙신이미드와 반응시킴으로써 그의 환원 말단이 선택적으로 산화된 폴리머를 활성화시키는 상기 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 그의 환원 말단이 선택적으로 산화된 폴리머는 산화된 환원 말단에서 RB 및 RC가 같거나 다를 수 있는 적어도 하나의 카보닉 디에스테르 RB-O-(C=O)-O-RC와 반응한다. 바람직하게, 이 방법은 하기 식의 반응성 폴리머를 제공한다:
Figure 112006009433098-pct00053
상기 식에서, 바람직하게 HAS'는 HES'이다.
적합한 카보닉 디에스테르 화합물로서, 그의 알코올 성분이 독립적으로 N-히드록시 숙신이미드 또는 설포-N-히드록시 숙신이미드와 같은 N-히드록시 숙신이미드류, p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀과 같은 트리클로로페놀, 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀과 같은 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀과 같은 적절히 치환된 페놀류, 또는 히드록시 벤조트리아졸과 같은 히드록시아졸류인 화합물이 사용될 수 있다. 특히, 바람직한 것은 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트 및 설포-N,N'-디숙신이미딜 카보네이트이고, 보다 바람직한 것은 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트이다.
그러므로, 본 발명은 또한 산화된 폴리머를 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트와 반응시킴으로써 그의 환원 말단이 선택적으로 산화된 폴리머를 활성화시키는 상기 방법에 관한 것이다.
산성 알코올은 산화된 폴리머 또는 산화된 폴리머의 염과 바람직하게는 5:1 내지 50:1, 보다 바람직하게는 8:1 내지 20:1의 산성 알코올:폴리머의 몰비로, 바람직하게는 2 내지 40 ℃, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ℃, 가장 바람직하게는 15 내지 25 ℃의 반응 온도에서 반응한다. 반응시간은 바람직하게는 1 내지 10 시간, 보다 바람직하게는 2 내지 5 시간, 보다 바람직하게는 2 내지 4 시간이고, 특히 2 내지 3 시간의 범위이다.
카보닉 디에스테르 화합물은 산화된 폴리머 또는 산화된 폴리머의 염과 일반적으로 디에스테르 화합물:폴리머의 몰비 1:1 내지 1.5:1과 같이 1:1 내지 3:1로 반응한다. 반응시간은 일반적으로 0.2 내지 6 시간, 또는 0.5 내지 2 시간 또는 0.75 내지 1.25 시간과 같이 0.1 내지 12 시간이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 산화된 폴리머와 산성 알코올 및/또는 카보닉 디에스테르의 반응은 물 함량이 0.5 중량% 이하, 바람직하게는 0.1 중량% 이하인 무수 비양성자성 용매와 같은 적어도 하나의 비양성자성 용매 내에서 수행된다. 안정한 용매는 특히 디메틸 설폭시드 (DMSO), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아미드 (DMA), 디메틸 포름아미드 (DMF) 및 그의 둘 이상의 혼합물이다. 반응 온도는 바람직하게는 2 내지 40 ℃, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ℃의 범위이다.
산화된 폴리머와 적어도 하나의 산성 알코올의 반응을 위해, 추가적으로 적어도 하나의 활성화제가 사용된다.
적합한 활성화제는 특히 카보닐디이미다졸, 디이소프로필 카보디이미드 (DIC), 디시클로헥실 카보이미드 (DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보이미드 (EDC)와 같은 카보이미드류이고, 보다 바람직한 것은 디시클로헥실 카보이미드 (DCC) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보이미드 (EDC)이다.
그러므로, 본 발명은 또한 그의 환원 말단이 산화된 폴리머를 추가적인 활성화제의 존재하에 산성 알코올과 반응시켜 반응성 폴리머 에스테르를 제공하는 상기 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, 산화된 폴리머와 카보닉 디에스테르 및/또는 산성 알코올의 반응은 물 대 반응 혼합물의 부피비가 10:1이 되도록 물에 반응 혼합물에 첨가함으로써 결정될 수 있는 낮은 염기 활성에서 수행된다. 첨가 전, 본질적으로 완충액을 포함하지 않는 물은 25 ℃에서 pH 값이 7이다. 반응 혼합물을 첨가하고 pH를 측정함으로써 반응 혼합물의 염기 활성을 얻으며, 바람직하게는 9.0 이하, 보다 바람직하게는 8.0 이하, 가장 바람직하게는 7.5 이하의 값을 가진다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 산화된 폴리머는 EDC, 또는 물의 부재하에 드라이 DMA 내에서 N-히드록시 숙신이미드와 반응하여 하기 식의 폴리머 N-히드록시 숙신이미드 에스테르를 선택적으로 제공하고, 보다 바람직하게는 HAS'가 HES'이다.
Figure 112006009433098-pct00054
놀랍게도, 이 반응은 EDC와 HES의 OH 그룹의 반응으로부터 야기되는 부산물을 제공하지 않고, EDC 및 산화된 폴리머에 의해 형성된 O-아실 이소우레아의 개별 N-아실 우레아로의 자리옮김(rearrangement)을 현저히 억제한다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 산화된 폴리머는 물 및 활성화제의 부재하에 드라이 DMF 내에서 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트와 반응하여 선택적으로 하기 화학식의 폴리머 N-히드록시 숙신이미드 에스테르를 제공하고, 보다 바람직하게 HAS'는 HES'이다.
Figure 112006009433098-pct00055
본 발명의 다른 구체예에서, 그의 환원 말단이 선택적으로 산화된 폴리머는 산화된 환원 말단에서 카보닐디이미다졸 또는 카보닐디벤지이미다졸과 같은 아졸리드와 반응하여 반응성 카복시 그룹을 가지는 폴리머를 제공한다. 카보닐디이미다졸의 경우에, 하기 화학식의 반응성 이미다졸리드 폴리머 유도체가 형성되고, 바람직하게 HAS'는 HES'이다.
Figure 112006009433098-pct00056
폴리머에 적어도 하나의 반응성 카복시 그룹을 도입하는 것과 관련된 본 발명의 추가적인 별도의 2번째 구체예에서, 폴리머 중 적어도 하나의 히드록시 그룹과 카보닉 디에세테르를 반응시킴으로써 반응성 카복시 그룹이 환원 말단이 산화되지 않은 폴리머에 도입된다.
그러므로, 본 발명은 또한 폴리머 중의 적어도 하나의 히드록시 그룹과 RB 및 RC가 같거나 다를 수 있는 적어도 하나의 카보닉 디에스테르 RB-O-(C=O)-O-RC를 반응시킴으로써 환원 말단이 산화되지 않은 폴리머에 반응성 카복시 그룹을 도입하는 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 환원 말단이 산화되지 않은 폴리머는 적어도 하나의 히드록시 그룹에서 카보닐디이미다졸, 카보닐-디-(1,2,4-트리아졸) 또는 카보닐 디벤즈이미다졸과 같은 아졸리드와 반응하여 반응성 카복시 그룹을 가지는 폴리머를 제공한다.
적합한 카보닉 디에스테르 화합물로서, 그의 알코올 성분이 독립적으로 N-히드록시 숙신이미드 또는 설포-N-히드록시 숙신이미드와 같은 N-히드록시 숙신이미드류, p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀과 같은 트리클로로페놀, 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀과 같은 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀과 같은 적절히 치환된 페놀류, 또는 히드록시 벤조트리아졸과 같은 히드록시아졸류인 화합물이 사용될 수 있다.
특히 바람직한 것은 대칭 카보닉 디에스테르 화합물, 따라서 RB 및 RC가 같은 화합물이다. 카보닉 디에스테르의 알코올 성분은 바람직하게는 N-히드록시 숙신이미드, 설폰화된 N-히드록시 숙신이미드, N-히드록시 벤조트리아졸, 및 니트로- 및 할로겐-치환된 페놀로 구성된 그룹에서 선택된다. 특히, 니트로페놀, 디니트로페놀, 트리클로로페놀, 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 및 펜타플루오로페놀이 바람직하다. 특히 바람직한 것은 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트 및 설포-N,N'-디숙신이미딜 카보네이트이고, 보다 바람직한 것은 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트이다.
그러므로, 본 발명은 또한 스타치 중의 적어도 하나의 히드록시 그룹, 바람직하게는 적어도 2개의 히드록시 그룹이 카보닉 디에스테르 화합물과 반응하여 개개의 반응성 에스테르를 제공하는 히드록시알킬 스타치 유도체, 바람직하게는 히드록시에틸 스타치 유도체에 관한 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, 환원 말단이 산화되지 않은 폴리머와 적어도 하나의 카보닉 디에스테르 화합물과의 반응은 2 내지 40 ℃, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ℃ 및 가장 바람직하게는 15 내지 25 ℃의 온도에서 수행된다. 바람직한 반응시간은 0.5 내지 5 시간, 보다 바람직하게는 1 내지 3 시간, 가장 바람직하게는 2 내지 3 시간이다.
카보닉 디에스테르 화합물:폴리머의 몰비는 비-반응 폴리머 내에 존재하는 히드록시 그룹의 수에 대해 상대적인 카보닉 디에스테르 화합물과 반응하는 히드록시 그룹의 수와 관련된 폴리머의 치환도에 의존한다.
본 발명의 한 구체예에서, 카보닉 디에스테르 화합물:폴리머의 안하이드로글루코오스 유니트의 몰비는 1:2 내지 1:1000, 보다 바람직하게는 1:3 내지 1:100, 가장 바람직하게는 1:10 내지 1:50의 범위 내에 있고, 0.5 내지 0.001, 바람직하게는 0.33 내지 0.01 및 가장 바람직하게는 0.1 내지 0.02의 범위 내의 치환도를 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 환원 말단이 산화되지 않은 폴리머와 카보닉 디에스테르의 반응은 적어도 하나의 비양성자성 용매, 특히 바람직하게는 0.5 중량% 이하, 바람직하게는 0.1 중량% 이하의 물 함량을 가지는 무수 비양성자성 용매 내에서 수행된다. 적합한 용매는 특히 디메틸 설폭시드 (DMSO), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아미드 (DMA), 디메틸 포름아미드 (DMF) 및 그의 둘 이상의 혼합물이다.
그러므로, 본 발명은 또한 환원 말단이 산화되지 않은 폴리머의 적어도 하나의 히드록시 그룹과 카보닉 디에스테르를 반응시켜 반응성 카복시 그룹을 제공하는 것이 무수 비양성자성 극성 용매, 바람직하게는 디메틸 아세트아미드, 디메틸 포름아미드 또는 그의 혼합물인 용매 중에서 수행되는 상기 방법에 관한 것이다.
적어도 하나의 반응성 카복시 그룹, 바람직하게는 상술한 바와 같이 폴리머와 산성 알코올, 카보네이트 및/또는 아졸리드의 반응으로부터 얻어진 적어도 하나의 반응성 카복시 그룹을 포함하는 반응성 폴리머 유도체는 적어도 하나의 작용 그룹 F1이 폴리머 유도체의 적어도 하나의 반응성 카복시 그룹과 반응하는 추가적인 적어도 이작용성 화합물과 추가로 반응한다. 추가적인 화합물의 적어도 하나의 작용 그룹 F1은 폴리머 중의 적어도 하나의 카복시 그룹과의 반응이 가능한 이상 특별히 제한은 없다. 바람직한 작용 그룹 F1은, 예를 들어, 아미노 그룹 또는 히드록시 그룹 또는 티오 그룹 또는 카복시 그룹이다.
추가적인 적어도 이작용성 화합물은 알데히드 그룹 또는 화학적으로 변형되어 알데히드 그룹을 제공할 수 있는 적어도 하나의 다른 작용 그룹 F2를 포함한다. 화학적 변형은 예를 들어 작용 그룹 F2와 작용 그룹 F3 추가적인 링커 화합물과의 반응 또는 적합한 작용 그룹 F2의 산화 또는 환원일 수 있다.
F2가 추가적 화합물인 작용 그룹 F3와 반응하는 경우, 작용 그룹 F2는 특히 다음의 그룹으로부터 선택될 수 있다:
-C-C-이중 결합 또는 C-C-삼중 결합 또는 방향족 C-C-결합;
-티오 그룹 또는 히드록시 그룹;
-알킬 설폰산 히드라지드, 아릴 설폰산 히드라지드;
-1,2-디올;
-1,2-아미노알코올;
-1,2 아미노-티오알코올;
-아지드;
-아미노그룹 -NH2 또는 구조 단위 -NH-를 포함하는 아미노그룹 유도체, 예로서, 아미노알킬 그룹, 아미노아릴 그룹, 아미노아르알킬 그룹, 또는 알크아릴아미노그룹;
-히드록실아미노 그룹 -O-NH2, 또는 구조 단위 -0-NH-를 포함하는 히드록실아미노 그룹 유도체, 예로서, 히드록실알킬아미노 그룹, 히드록실아릴아미노 그룹, 히드록실아르알킬아미노 그룹, 또는 하이드록살알크아릴아미노 그룹;
-각각 구조 단위 -NH-O-를 포함하는 알콕시아미노 그룹, 아릴옥시아미노 그룹, 아르알킬옥시아미노 그룹, 또는알크아릴옥시아미노 그룹;
-카보닐 그룹, -Q-C(=G)-M을 갖는 잔기
(여기에서, G는 O 또는 S이고, M은 예로서,
-- -OH 또는 -SH;
-- 알콕시 그룹, 아릴옥시 그룹, 아르알킬옥시 그룹, 또는 알크아릴옥시 그룹;
-- 알킬티오 그룹, 아릴티오 그룹, 아르알킬티오 그룹, 또는 알크아릴티오 그룹;
-- 알킬카보닐옥시 그룹, 아릴카보닐옥시 그룹, 아르알킬카보닐옥시 그룹, 알크아릴카보닐옥시 그룹;
-- G = O이고 Q는 존재하지 않는 경우, 예를 들면, 펜타플루오로페닐, 파라니트로페닐 또는 트리클로로페닐과 같은 치환된 아릴 잔기를 갖는 아릴옥시 화합물이거나, N이 헤테로아릴 화합물의 일부인 구조 단위 O-N을 갖거나, N-히드록시숙신이미드와 같은 이미드 구조를 갖는 히드록실아민의 에스테르와 같은 활성화된 에스테르이다);
Q가 존재하지 않거나 NH 또는 헤테로원자, 예로서 S 또는 O인 경우;
- -NH-NH2, 또는 -NH-NH-;
- -NO2;
- 니트릴 그룹;
- 카보닐 그룹, 예로서, 알데히드 그룹 또는 케토 그룹;
- 카복시 그룹;
- -N=C=O 그룹 또는 -N=C=S 그룹;
- 비닐 할라이드 그룹, 예로서 비닐 아이오다이드 또는 비닐 브로마이드 그룹 또는 트리플레이트;
- -C=C-H;
- -(C=NH2Cl)-O알킬
- 그룹 -(C=O)-CH2-Hal(여기에서, Hal은 Cl, Br, 또는 I이다);
- -CH=CH-SO2-;
- 구조 -S-S-를 갖는 디설파이드 그룹;
- 그룹
Figure 112006009433098-pct00057
;
- 그룹
Figure 112006009433098-pct00058
이고,
여기에서, F3는 상기 그룹 중 하나와 화학적 연결(linkage)를 형성할 수 있는 그룹이고, 바람직하게는 상기 그룹으로부터 선택된다. 또한, 두번째 링커 화합물은 바람직하게 환원성 아미노화를 통해서 단백질의 아미노 그룹과 반응할 수 있는 적어도 하나의 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 가진다.
작용 그룹 F1 및 폴리머와 반응하는 적어도 이작용성 연결(linking) 화합물의 알데히드 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹, 및/또는 폴리머와 반응하는 적어도 이작용성 연결 화합물의 작용 그룹 F1 및 F2, 및/또는 작용 그룹 F3 및 추가적인 적어도 이작용성 연결 화합물의 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹은 어떤 적합한 스페이서(spacer)에 의해 독립적으로 분리될 수 있다. 특히, 스페이서는 임의로 치환되는, 직쇄, 측쇄 및/또는 사이클릭, 지방족 및/또는 방향족 탄화수소 잔기이다. 일반적으로, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수가 60 이하, 바람직하게는 40 이하, 보다 바람직하게는 20 이하, 보다 바람직하게는 10 이하이다. 헤테로원자가 존재하면 분리 그룹(separating group)은 일반적으로 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 8, 보다 바람직하게는 1 내지 6, 보다 바람직하게는 1 내지 4, 특히 바람직하게는 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로원자로는 O가 바람직하다. 탄화수소 잔기는 임의로 예를 들어 탄소 원자수 5 내지 7인 측쇄 알킬 사슬 또는 아릴 그룹 또는 사이클로알킬 그룹이거나, 알킬 부분이 직쇄 및/또는 사이클릭 알킬 그룹인 아르알킬 그룹, 알크아릴 그룹일 수 있다.
작용 그룹 F1 및 F2을 가진 화합물의 예는 예를 들어 탄소 원자수 2 내지 20인 임의로 치환된 디아미노알칸이고, 특히 바람직하게는 1,2-디아미노에탄, 1,3-디아미노프로판, 및 1,4-디아미노부탄이다. 작용 그룹 F3 및 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 가진 화합물의 바람직한 예는 예를 들어 포르밀벤조산, 4-포르밀벤조산 펜타플루오르페닐 에스테르, 4-포르밀벤조산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 및 4-(4-포르밀-3,5-디메톡시페녹시)부티르산이다.
그러므로, 본 발명은 또한 폴리머, 바람직하게는 히드록시에틸 스타치를 그의 임의로 산화된 환원 말단에서 산성 알코올, 카보닉 디에스테르 및 아졸리드로 구성된 그룹에서 선택된 화합물과 반응시켜, 적어도 하나의 반응성 카복시 그룹을 함유하는 폴리머 유도체를 제공하고, 상기 폴리머 유도체를 적어도 하나의 적어도 이작용성 화합물과 반응시켜 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹 또는 화학적으로 변형되어 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 제공할 수 있는 작용 그룹을 포함하는 폴리머 유도체를 제공하며, 임의로 상기 작용 그룹을 화학적으로 변형시켜 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 함유하는 폴리머 유도체를 제공하고, 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 함유하는 상기 폴리머 유도체를 환원성 아미노화를 통해 단백질의 아미노 그룹과 반응시키는 것을 포함하는 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 폴리머를 그의 임의로 산화된 환원 말단에서 산성 알코올, 카보닉 디에스테르 및 아졸리드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물과 반응시켜 적어도 하나의 반응성 카복시 그룹을 포함하는 폴리머 유도체를 수득하고, 폴리머 유도체를 적어도 하나의 적어도 이작용성 화합물과 반응시켜 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는헤미아세탈 그룹, 또는 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 제공하기 위하여 화학적으로 변형될 수 있는 작용 그룹을 포함하는 폴리머 유도체를 수득하고, 임의로 작용 그룹을 화학적으로 변형시켜 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 포함하는 폴리머 유도체를 수득하고, 알데히드 그룹 또는 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 포함하는 폴리머 유도체를 환원 아민화에 의해 단백질의 아미노 그룹과 반응시키는 것을 포함하는, 컨쥬게이트를 생산하는 방법에 의해 수득될 수 있는, 폴리머, 바람직하게 히드록시에틸 스타치, 및 서로 공유결합된 단백질을 포함하는 컨쥬게이트에 관한 것이다.
작용 그룹 F1 및 알데히드 그룹으로 산화되는 작용 그룹 F2를 갖는 화합물의 특정 일례로 F1로서 아미노 그룹 및 F2로서 베타 히드록시 아미노 그룹을 포함하는 화합물을 포함한다. 특히 바람직한 예로 1,3-디아미노-2-히드록시프로판이다. 베타 히드록시 아미노 그룹을 알데히드 그룹으로 전환시킬 수 있는 모든 적절한 산화제를 사용하여 산화 반응이 수행될 수 있다. 바람직한 산화제는 퍼아이오데이트, 예로서, 알칼리 금속 퍼아이오데이트이다. 특히 바람직하게 수용액으로서 사용할 수 있는 소듐 페리오테이트가 바람직하다. 이 용액의 바람직한 아이오데이트 농도는 1 내지 50 mM, 더욱 바람직하게 1 내지 25 mM 및 특히 바람직하게 1 내지 10 mM이다. 0 내지 40℃, 바람직하게 0 내지 25℃ 및 특히 바람직하게 4 내지 20℃의 온도에서 산화를 수행한다.
적어도 적절한 하나의 방법에 의해 반응 혼합물로부터 생성된 폴리머 유도체를 정제할 수 있다. 필요한 경우, 적어도 적절한 하나의 방법에 의해 분리하기 전에 폴리머 유도체를 침전시킬 수 있다.
폴리머 유도체가 먼저 침전되는 경우, 예를 들면, 적절한 온도에서 반응 혼합물을 반응 혼합물에 존재하는 용매 또는 용매 혼합물이외의 적어도 하나의 용매 또는 용매 혼합물과 접촉시킬 수 있다. 수성 매질, 바람직하게 물을 용매로서 사용하는 특히 바람직한 본 발명의 일면에 따라 바람직하게 -20℃ 내지 +50℃ 범위, 바람직하게 -20 내지 25℃ 범위의 온도에서 반응 혼합물을 2-프로판올과 접촉시키거나 아세톤 및 에탄올 혼합물, 바람직하게 동량의 화합물을 언급하는 1: 1 혼합물(v/v)과 접촉시킨다.
하나 이상의 단계를 포함할 수 있는 적절한 과정에 의해 폴리머 유도체 분리를 수행할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일면에 따라, 적절한 방법, 예로서 원심분리 또는 여과에 의해 반응 혼합물, 반응 혼합물의 혼합물, 예로서, 수성 2-프로판올 혼합물로부터 폴리머 유도체를 1차로 분리한다. 제 2단계에서, 분리된 폴리머 유도체를 투석, 원심분리 여과 또는 가압 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, HPLC, MPLC, 겔 여과 및/또는 동결건조과 같은 후처리로 추가로 처리할 수 있다. 더욱더 바람직한 일면에 따라, 분리된 폴리머 유도체를 먼저 바람직하게 물에 대하여 투석시킨 후 산물에 대한 바람직한 설명에 따라 반응 산물의 용매 함량이 충분히 낮아질 때까지 동결건조시킨다. 동결건조는 20 내지 35℃, 바람직하게, 20 내지 30℃의 온도에서 수행될 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 일면에 따라, 폴리머 또는 폴리머 유도체의 작용 그룹 A와 반응하는 단백질의 작용 그룹 Z는 티올 그룹이다.
티올 그룹은 그 자체로서 단백질에 존재할 수 있다. 또한, 적절한 방법에 따라 단백질내로 티올 그룹으로 도입할 수 있다. 다른 것중, 화학 방법을 언급할 수 있다. 디설파이드 브릿지가 단백질내 존재하는 경우, -S-S-구조를 환원시켜 티올 그룹을 얻을 수 있다. 아미노 그룹을 통해 폴리펩티드를 적어도 2개의 상이한 작용 그룹(여기에서, 이중 하나는 아미노 그룹과 반응할 수 있고, 나머지 하나는 SH 그룹 또는 SH 그룹의 전구체, 예로서, N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트, N-숙신이미딜-S-아세틸티오프로피오네이트 또는 N-숙신이미딜-3-(피리딜디티오)프로피오네이트이다)을 갖는 화합물과의 반응에 의해 폴리펩티드에 존재하는 아미노 그룹을 SH 그룹으로 형질전환시킬 수 있다. 추가의 시스테인을 단백질로 도입하고, 아미노산을 시스템으로 교환하거나 시스테인을 단백질로부터 제거하여 단백질중 또다른 시스테인을 무력화시켜 디설파이드 브릿지를 형성하므로써 단백질을 돌연변이화시켜 SH 그룹ㄹ을 도입시킬 수 있다. 가장 바람직하게, 폴리머는 단백질의 유리 시스테인, 특히 바람직하게 Cys 17 또는 Cys 18(여기에서, Cys 17은 예로서, Granocyte?에 존재하고, Cys 18은 예로서, Neupogen?에 존재한다)에 결합한다.
제 1면에 따라, 단백질의 작용 그룹 Z는 티올 그룹이고, 폴리머의 작용 그룹 A는 할로겐아세틸 그룹이고, 여기에서, A는 그의 임의로 산화된 환원 말단에의 폴리머를 각각 아미노 그룹을 포함하는 적어도 2개의 작용 그룹을 갖는 적어도 이작용성 화합물과 반응시켜 아미노 그룹을 포함하는 적어도 하나의 작용 그룹을 갖는 폴리머 유도체를 제공하고, 폴리머 유도체를 모노할로겐-치환된 아세트산 및/또는 반응성 모노할로겐-치환된 아세트산 유도체와 반응시켜 도입된다.
각각 아미노 그룹을 포함하는 적어도 2개의 작용 그룹을 갖는 적어도 이작용성 화합물과 관련하여, 그의 임의로 산화된 환원 말단에의 폴리머와 반응하여 모노할로겐-치환된 아세트산 및/또는 반응성 모노할로겐-치환된 아세트산 유도체와 반응할 수 있는 아미노 그룹을 포함하는 폴리머 유도체를 형성하는 모든 화합물을 고려할 수 있다.
바람직한 일면에 따라, 폴리머의 임의로 산화된 환원 말단과 반응할 수 있는, 적어도 이작용성 화합물중 하나의 작용 그룹을 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
Figure 112006009433098-pct00059
(상기 식에서, G는 O 또는 S이고, 2회 존재하는 경우, 독립적으로 O 또는 S이고, R'은 메틸이다).
본 발명의 특히 바람직한 일면에 따라, 임의로 산화된 환원 말단과 반응할 수 있는, 적어도 이작용성 화합물중 작용 그룹은 아미노 그룹 -NH2이다. 추가의 바람직한 일면에 따라, 이 작용 그룹, 가장 바람직하게, 아미노 그룹은 폴리머의 환원 말단과 반응한다.
본 발명의 바람직한 일면에 따라, 모노할로겐-치환된 아세트산 및/또는 반응성 모노할로겐-치환된 아세트산 유도체와 반응하는, 적어도 이작용성 화합물중 작용 그룹은 아미노 그룹 -NH2이다.
바람직하게, 임의로 산화된 환원 말단의 폴리머, 바람직하게 임의로 산화된 환원 말단과 반응하는 적어도 작용성 화합물의 아미노 그룹 -NH2 및 모노할로겐-치환된 아세트산 및/또는 반응성 모노할로겐-치환된 아세트산 유도체 둘 모두인 작용 그룹은 적절한 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 다른 것중 스페이서는 임의로 치환된, 선형, 분지형 및/또는 사이클릭 탄화수소 잔기일 수 있다. 적절한 치환체는 알킬, 아릴, 아르알킬, 알크아릴, 할로겐, 카보닐, 아실, 카복시, 카복시에스테르, 히드록시, 티오, 알콕시 및/또는 알킬티오 그룹이다. 일반적으로 탄화수소 잔기는 탄소 원자수가 1 내지 60개, 바람직하게 1 내지 40개, 더욱 바람직하게 1 내지 20개, 더욱 바람직하게 2 내지 10개, 더욱 바람직하게 2 내지 6 및 특히 바람직하게 2 내지 4개이다. 헤테로원자가 존재하는 경우, 분리 그룹은 일반적으로 1 내지 20개, 바람직하게 1 내지 8개 및 특히 바람직하게 1 내지 4개의 헤테로원자를 갖는다. 탄화수소 잔기는 예로서 탄소 원자수 5 내지 7인 임의의 분지형 알킬쇄 또는 아릴 그룹 또는 사이클로알킬 그룹을 포함할 수 있거나, 알킬 부분이 선형 및/또는 사이클릭 알킬 그룹일 수 있는 아르알킬 그룹, 알크아릴 그룹일 수 있다. 더욱더 바람직한 일면에 따라, 탄화수소잔기는 탄소 원자수 1 내지 20개, 바람직하게 2 내지 10개, 및 특히 바람직하게 2 내지 8인 알킬 쇄이다. 따라서, 바람직한 저어도 이작용성 화합물은 이작용성 아미노 화합물, 특히 바람직하게 1,8-디아미노 옥탄, 1,7-디아미노 헵탄, 1, 6-디아미노 헥산, 1,5-디아미노 펜탄, 1,4-디아미노 부탄, 1,3-디아미노 프로판, 및 1,2-디아미노 에탄이다. 추가의 바람직한 일면에 따라, 적어도 이작용성 화합물은 하기 식:
H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2(여기에서, m은 정수이고, 바람직하게 m은 1,2, 3, 또는 4이다)의 디아미노폴리에틸렌글리콜, 바람직하게 디아미노폴레에틸렌글리콜이다.
따라서, 본 발명은 또한 폴리머를 그의 산화된 환원 말단에서 1,8-디아미노옥탄, 1,7-디아미노헵탄, 1,6-디아미노헥산, 1,5-디아미노펜탄, 1,4-디아미노부탄, 1,3-디아미노프로판, 및 1,2-디아미노에탄과 반응시켜 하기 식:
Figure 112006009433098-pct00060
(여기에서, n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8이다)의 폴리머 유도체를 형성하는 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이며, 상기 폴리머는 HES인 것인 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 폴리머를 그의 산화된 환원 말단에서 H2N-(CH2-CH2)m-CH2-NH2(여기에서, m은 1, 2, 3, 또는 4이다)과 반응시켜 하기 식:
Figure 112006009433098-pct00061
(여기에서, m은 1, 2, 3, 또는 4이다)의 폴리머 유도체를 형성하는 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이며, 상기 폴리머는 HES인 것인 특히 바람직하다.
폴리머, 바람직하게 히드록시에틸 스타치의 환원 말단의 산화는 각 방법 방법의 조합에 따라 수행하여 화학식(IIa) 및/또는 (IIb)의 화합물을 수득할 수 있다:
Figure 112006009433098-pct00062
Figure 112006009433098-pct00063
히드록시알킬 스타치의 산화된 환원 말단을 형성하는 모든 적절한 방법 또는 방법들에 따라 산화를 수행할 수 있지만, 예로서 DE 196 28 705 A1(각 내용은 본 명세서에서 참고 문헌으로서 인용된다)에 기술된 바와 같은 알칼리성 요오딘 용액을 사용하여 바람직하게 수행된다.
적어도 이작용성 화합물과 폴리머 반응으로부터 형성된 폴리머 유도체는 추가로 모노할로겐-치환된 아세트산및/또는 반응성 모노할로겐-치환된 아세트산 유도체와 반응시킨다.
모노할로겐-치환된 아세트산 또는 반응성 산으로서, Cl-치환된, Br-치환된 및 I-치환된 아세트산이 바람직하고, 아세트산 클로라이드가 특히 바람직하다.
할로겐-치환된 산을 그 자체로서 사용하는 경우, 활성제의 존재하에 산을 폴리머 유도체와 반응시키는 것이 바람직하다. 적절한 활성제는 카보디이미드 예로서, 디이소프로필 카보디이미드(DIC), 디사이클로헥실 카보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC)이고 디사이클로헥실 카보디이미드 (DCC) 및 1-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC)이 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 폴리머, 바람직하게 HES를 디아미노 화합물, 바람직하게 디아미노알칸을 2 내지 8개의 탄소 원자 또는 H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2(여기에서, m = 1, 2, 3, 또는 4이다)와 반응시키고 생성된 폴리머 유도체를 활성제, 바람직하게 EDC의 존재하에 Br-치환된 및 I-치환된 아세트산과 반응시키는, 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 하기 식의 폴리머 유도체
Figure 112006009433098-pct00064
(여기에서, X =Cl, Br 또는 I이고, n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8이다)에 관한 것이며, 상기 폴리머는 HES인 것인 특히 바람직하거나,
하기 식의 폴리머 유도체
Figure 112006009433098-pct00065
(여기에서, X =Cl, Br 또는 I이고, m =1, 2,3, 또는 4이다)에 관한 것이며, 상기 폴리머는 HES인 것인 특히 바람직하다.
폴리머 유도체와 할로겐-치환된 아세트산의 반응은 바람직하게 수성 시스템바람직하게 물중, 3.5 내지 5.5의 바람직한 pH, 4.0 내지 5.0의 더욱 바람직한 pH 및 4.5 내지 5.0의 특히 바람직한 pH에서, 4 내지 30℃의 바람직한 반응 온도, 더욱 바람직하게 15 내지 25 및 특히 바람직하게 20 내지 25℃의 반응 온도에서; 1 내지 8 시간의 바람직한 반응 시간, 더욱 바람직하게 2 내지 6시간 특히 3 내지 5 시간의 반응 시간동안 수행한다.
단백질과의 반응을 위해 폴리머를 포함하는 폴리머 유도체, 적어도 이작용성 화합물 및 할로겐-치환된 아세트산을 포함하는 반응 혼합물을 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일면에 따라, 폴리머 유도체를 바람직하게 한외여과, 연속하여 침전, 임의 세척 및 진공에서의 건조에 의해 반응 혼합물로부터 분리시킨다.
단백질과 폴리머 유도체의 반응은 바람직하게 수성 시스템에서 수행된다.
단백질과 폴리머 유도체의 반응은 바람직하게 6.5 내지 8.5, 더욱 바람직하게 7.0 내지 8.5 및 특히 바람직하게 7.5 내지 8.5의 pH: 및 바람직하게 4 내지 30℃, 더욱 바람직하게 15 내지 25 및 특히 바람직하게 20 내지 25℃의 반응 온도에서; 바람직하게 0.5 내지 8 시간, 더욱 바람직하게 1 내지 6 시간 및 특히 2 내지 5 시간의 반응 시간동안 수행된다.
단백질의 티올 그룹과 폴리머 유도체의 반응으로 폴리머 유도체 및 단백질 사이의 티오에테르 결합을 형성한다.
따라서, 본 발명은 또한 폴리머, 바람직하게 HES를 디아미노 화합물, 바람직하게 디아미노알칸을 2 내지 8개의 탄소 원자 또는 H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2(여기에서, m = 1, 2, 3, 또는 4이다)와 반응시키고 생성된 폴리머 유도체를 활성제, 바람직하게 EDC의 존재하에 Br-치환된 및 I-치환된 아세트산과 반응시키고 생성된 폴리머 유도체를 단백질의 티올 그룹과 반응시켜 폴리머 유도체 및 단백질 사이의 티오에테르 결합을 포함하는 컨쥬게이트를 형성하는 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 하기 식에 따른 컨쥬게이트
삭제
Figure 112006009433098-pct00066
(여기에서, n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8이다)에 관한 것이며, 상기 폴리머는 HES인 것인 특히 바람직하거나,
하기 식에 따른 컨쥬게이트
Figure 112006009433098-pct00067
(여기에서, m =1, 2, 3, 또는 4이다)에 관한 것이며, 상기 폴리머는 HES인 것인 특히 바람직하다. 히드록시에틸 스타치는 바람직하게 평균 분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량이 약 12kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량이 약 18kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량이 약 18kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량이 약 50kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록스에틸 스타치이다.
제 2면에 따라 단백질의 작용 그룹 Z는 티올 그룹이고 폴리머의 작용 그룹 A은 말레이미도 그룹을 포함한다.
이 일면에 따라, 컨쥬게이트를 생산하는 수개의 가능성이 존재하다. 일반적으로 폴리머를 그의 산화된 환원 말단에서 적어도 하나의 적어도 이작용성 화합물과 반응시키되, 이 적어도 이작용성 화합물은 폴리머의 임의로 산화된 환원 말단과 반응할 수 있는 하나의 작용 그룹, 및 말레이미도 그룹 또는 화학적으로 변형된 적어도 하나의 작용 그룹을 포함하여 말레이미도 그룹을 포함하는 폴리머 유도체를 형성한다. 바람직한 일면에 따라 말레이미도 그룹을 포함하는 폴리머 유도체를 형성하기 위하여 작용 그룹은 화학적으로 변형된다.
따라서, 본 발명은 임의로 산화된 환원 말단에서 폴리머를 임의로 산화된 환원 말단과 반응할 수 있는 작용 그룹 U를 포함하는 적어도 이작용성 화합물과 반응시키되, 적어도 이작용성 화합물은 추가로 화학적으로 변형될 수 있는 작용 그룹 W를 포함하여 말레이미도 그룹을 형성하고, 추가로 작용 그룹 W를 화학적으로 변형시켜 말레이미도 그룹을 형성하는 것을 포함하는, 말레이미도 그룹을 포함하는 폴리머 유도체를 단백질의 티올 그룹과 반응시킴으로써, 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
작용 그룹 U와 관련하여, 폴리머의 임의로 산화된 환원 말단과 반응할 수 있는 각 작용 그룹을 고려할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일면에 따라, 작용 그룹 U는 화학 구조 -NH-를 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한 작용 그룹 U는 화학 구조 -NH-를 포함하는 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 일면에 따라 작용 그룹 U는 구조식 R'-NH-(여기에서, R'은 수소 또는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알크아릴 또는 사이클로알킬아릴 잔기이고, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬,아릴사이클로알킬, 알크아릴 또는 사이클로알킬아릴 잔기는 NH 그룹에 직접 결합할 수 있거나, 또다른 일면에 따라 NH 그룹에 산소 브릿지에 의해 결합할 수 있다)를 갖는 그룹이다. 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알크아릴, 또는 사이클로알킬아릴 잔기는 적절하게 치환될 수 있다. 바람직한 치환체로서, 할로겐, F, Cl 또는 Br이 언급될 수 있다. 특히 바람직한 잔기 R'은 수소, 알킬 및 알콕시 그룹이고, 더욱더 바람직하게는 수소 및 비치환된 알킬 및 알콕시 그룹이다.
알킬 및 알콕시 그룹중 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 C 원자를 갖는 그룹이 바람직하다. 더 바람직하게는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 및 이소프로폭시 그룹이다. 특히 바람직하게는 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시이고 특히 바람직하게는 메틸 또는 메톡시이다.
따라서, 본 발명은 또한 R'이 수소 또는 메틸 또는 메톡시 그룹이 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 바람직한 일면에 따라, 그룹 U는 구조식 R'-NH-R"-(여기에서, R"은 바람직하게 구조 단위 -NH-및/또는 구조 단위 -(C=G)-(여기에서, G는 O 또는 S이다) 및/또는 구조 단위 -S02-를 포함한다)를 갖는다.
더욱 바람직한 일면에 따라 작용 그룹 R"은
하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
Figure 112006009433098-pct00068
(상기 식에서, G가 2회 존재하는 경우, 독립적으로 0 또는 S이다).
따라서, 본 발명은 또한 작용 그룹 U는 하기로 이루어진 그룹으로 선택되는, 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006009433098-pct00069
(여기에서, G는 0 또는 S이고, 2회 존재하는 경우, 독립적으로 0 또는 S이고, R'은 메틸이다).
본 발명의 더욱더 바람직한 일면에 따라, U는 아미노그룹 -NH2을 포함한다.
본 발명의 일면에 따라, 적어도 이작용성 화합물의 작용 그룹 W는 W를 포함하는 폴리머 유도체를 W와 반응할 수 있는 작용 그룹을 포함하고 추가로 말레이미도 그룹을 포함하는 추가의 적어도 이작용성 화합물과 반응시켜 화학적으로 변형된다.
작용 그룹 W 및 W와 반응할 수 있는 추가의 적어도 이작용성 화합물의 작용 그룹과 관련하여 하기 작용 그룹은 다음중에서 언급된다:
-C-C-이중 결합 또는 C-C-삼중 결합 또는 방향족 C-C-결합;
-티오 그룹 또는 히드록시 그룹;
-알킬 설폰산 히드라지드, 아릴 설폰산 히드라지드;
-1,2-디올;
-1,2-아미노알코올;
-1,2 아미노-티오알코올;
-아지드;
-아미노그룹 -NH2 또는 구조 단위 -NH-를 포함하는 아미노그룹 유도체, 예로서, 아미노알킬 그룹, 아미노아릴 그룹, 아미노아르알킬 그룹, 또는 알크아릴아미노그룹;
-히드록실아미노 그룹 -O-NH2, 또는 구조 단위 -0-NH-를 포함하는 히드록실아미노 그룹 유도체, 예로서, 히드록실알킬아미노 그룹, 히드록실아릴아미노 그룹, 히드록실아르알킬아미노 그룹, 또는 하이드록살알크아릴아미노 그룹;
-각각 구조 단위 -NH-O-를 포함하는 알콕시아미노 그룹, 아릴옥시아미노 그룹, 아르알킬옥시아미노 그룹, 또는알크아릴옥시아미노 그룹;
-카보닐 그룹, -Q-C(=G)-M을 갖는 잔기
(여기에서, G는 O 또는 S이고, M은 예로서,
-- -OH 또는 -SH;
-- 알콕시 그룹, 아릴옥시 그룹, 아르알킬옥시 그룹, 또는 알크아릴옥시 그룹;
-- 알킬티오 그룹, 아릴티오 그룹, 아르알킬티오 그룹, 또는 알크아릴티오 그룹;
-- 알킬카보닐옥시 그룹, 아릴카보닐옥시 그룹, 아르알킬카보닐옥시 그룹, 알크아릴카보닐옥시 그룹;
-- G = O이고 Q는 존재하지 않는 경우, 예를 들면, 펜타플루오로페닐, 파라니트로페닐 또는 트리클로로페닐과 같은 치환된 아릴 잔기를 갖는 아릴옥시 화합물이거나, N이 헤테로아릴 화합물의 일부인 구조 단위 O-N을 갖거나, N-히드록시숙신이미드와 같은 이미드 구조를 갖는 히드록실아민의 에스테르와 같은 활성화된 에스테르이다);
Q가 존재하지 않거나 NH 또는 헤테로원자, 예로서 S 또는 O인 경우;
- -NH-NH2, 또는 -NH-NH-;
- -NO2;
- 니트릴 그룹;
- 카보닐 그룹, 예로서, 알데히드 그룹 또는 케토 그룹;
- 카복시 그룹;
- -N=C=O 그룹 또는 -N=C=S 그룹;
- 비닐 할라이드 그룹, 예로서 비닐 아이오다이드 또는 비닐 브로마이드 그룹 또는 트리플레이트;
- -C=C-H;
- -(C=NH2Cl)-O알킬
- 그룹 -(C=O)-CH2-Hal(여기에서, Hal은 Cl, Br, 또는 I이다);
- -CH=CH-SO2-;
- 구조 -S-S-를 갖는 디설파이드 그룹;
- 그룹
Figure 112006009433098-pct00070
;
- 그룹
Figure 112006009433098-pct00071
이고,
여기에서, W 및 추가의 적어도 이작용성 화합물의 작용 그룹은 각각 상기 언급한 그룹중 하나와 화학 결합을 형성할 수 있는 그룹이다.
본 발명의 더욱더 바람직한 일면에 따라 W는 아미노그룹 -NH2를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일면에 따라, W 및 다른 작용 그룹 둘 모두는 상기 그룹 리스트로부터의 그룹이다.
본 발명의 일면에 따라, 이들 작용 그룹중 하나는 티오 그룹이다. 특정 일례에서, 다른 작용 그룹은 바람직하게 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
Figure 112006009433098-pct00072
(상기 식에서, Hal은 Cl, Br, 또는 I, 바람직하게 Br 또는 I이다).
본 발명의 특히 바람직한 일면에 따라, 이들 작용 그룹중 하나는 반응성 에스테르로 임의적으로 형질변환되는 카복시 그룹, 또는 예를 들면, 펜타플루오로페닐, 파라니트로페닐 또는 트리클로로페닐과 같은 치환된 아릴 잔기를 갖는 아릴옥시 화합물이거나, N이 헤테로아릴 화합물의 일부인 구조 단위 O-N을 갖거나, N-히드록시숙신이미드와 같은 이미드 구조를 갖는 히드록실아민의 에스테르와 같은 반응성 에스테르로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 일례에서, 다른 작용 그룹은 화학 구조 -NH-를 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 일면에 따라, W는 구조식 -NH-를 포함하고 추가의 적어도 이작용성 화합물은 반응성 에스테르 및 말레이미도 그룹를 포함한다.
구조식 -NH-를 포함하는 작용 그룹 W와 관련하여, 상기 기술된 바와 같은 작용 그룹을 참조할 수 있고, W는 U와 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일면에 따라, U 및 W는 동일하다. 더욱 바람직하게, U 및 W는 둘 모두 아미노 그룹을 포함한다. 특히 바람직하게, U 및 W 둘 모두는 아미노 그룹 -NH2이다.
본 발명의 일면에 따라, 폴리머는 수성 매질중 그의 비-산화된 환원 말단에서 U 및 W를 포함하는 적어도 이작용성 화합물과 반응할 수 있다. U 및 W가 아미노 그룹인 바람직한 일면에 따라, 산화된 형태로, 적어도 하나의 양자성 용매, 특히 바람직하게 물 함량이 0.5중량% 이하, 더욱 바람직하게 0.1중량% 이하인 무수 양자성 용매중에서 환원 말단을 포함하는 폴리머를 사용하여 반응을 수행한다. 적절한 용매는 디메틸 설폭시드(DMSO), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아미드(DMA), 디메틸 포름아미드 (DMF) 및 2개 이상의 혼합물중에서 수행한다.
특히, U 및 W가 아미노그룹 -NH2인 경우, U 및 W는 적절한 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 이중 스페이서는 임의로 치환된 선형, 분지형 및/또는 사이클릭 탄화수소 잔기일 수 있다. 적절한 치환체는 알킬, 아릴, 아르알킬, 알크아릴, 할로겐, 카보닐, 아실, 카복시, 카복시에스테르, 히드록시, 티오, 알콕시 및/또는알킬티오 그룹이다. 일반적으로 탄화수소 잔기는 탄소 원자수가 1 내지 60개, 바람직하게 1 내지 40개, 더욱 바람직하게 1 내지 20개, 더욱 바람직하게 2 내지 10개, 더욱 바람직하게 2 내지 6개 및 특히 바람직하게 2 내지 4개이다. 헤테로원자가 존재하는 경우, 분리 그룹은 일반적으로 1 내지 20개, 바람직하게 1 내지 8개 및 특히 바람직하게 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함한다. 탄화수소 잔기는 예로서, 탄소 원자수 5 내지 7개인 임의의 분지형 알킬쇄 또는 아릴 그룹 또는 사이클로알킬 그룹을 포함할 수 있거나, 아르알킬 그룹, 알크아릴 그룹(여기에서, 알킬 그룹부는 선형일 수 있다), 및/또는 사이클릭 알킬 그룹을 포함할 수 있다. 더욱더 바람직한 일면에서, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수 1 내지 20개, 바람직하게 2 내지 10개, 더욱 바람직하게 2 내지 6개, 및 특히 바람직하게 2 내지 4개인 알킬 쇄이다.
따라서, 본 발명은 또한 그의 산화된 환원 말단을 갖는 폴리머를 1,4-디아미노부탄, 1,3-디아미노프로판 또는 1,2-디아미노에탄와 반응시켜 하기 화학식에 따른 폴리머 유도체를 형성하는, 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이며, 상기 폴리머는 HES인 것인 특히 바람직하다:
Figure 112006009433098-pct00073
(상기 식에서, n = 2, 3, 또는 4이다).
상기 언급된 바람직한 구체예에 따라, 아미노 그룹을 함유하는 폴리머 유도체를 반응성 에스테르 그룹 및 말레이미도 그룹을 함유하는 적어도 이작용성 화합물과 추가로 반응시킨다. 반응성 에스테르 그룹 및 말레이미도 그룹은 적합한 스페이서로 분리될 수 있다. 이 스페이서에 대해서는 작용기 U 및 W 간의 스페이서를 참조할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 반응성 에스테르 그룹 및 말레이미도 그룹은 탄소원자수 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 8, 더 바람직하게는 1 내지 6, 보다 더 바람직하게는 1 내지 4, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 2 및 특히 바람직하게는 1의 탄화수소 사슬로 분리된다. 다른 바람직한 구체예에 따라, 반응성 에스테르는 숙신이미드 에스테르이고, 특히 바람직한 구체예에 따라, 말레이미도 그룹 및 반응성 에스테르 그룹을 함유하는 적어도 이작용성 화합물은 N-(알파-말레이미도아세톡시)숙신이미드 에스테르이다.
따라서, 본 발명은 또한 하기 화학식의 폴리머 유도체에 관한 것이다:
Figure 112006009433098-pct00074
상기 식에서,
n = 2, 3 또는 4이고,
폴리머는 바람직하게는 HES이다.
말레이미도 그룹을 함유하는 폴리머 유도체를 단백질의 티올 그룹과 추가로 반응시켜 티오에테르 그룹을 통해 단백질에 결합된 폴리머 유도체 함유 컨쥬게이트를 제공한다.
따라서, 본 발명은 또한 하기 화학식의 폴리머 유도체 함유 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006009433098-pct00075
상기 식에서,
n = 2, 3 또는 4, 바람직하게는 4이고
폴리머는 바람직하게는 HES이며,
S 원자는 단백질의 Cys17 또는 Cys18로부터 유도된다. 히드록시에틸 스타치는 바람직하게는 평균 분자량 약 10 kD이고 DS 약 0.4인 히드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량 약 10 kD이고 DS 약 0.7인 히드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량 약 12 kD이고 DS 약 0.4인 히드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량 약 12 kD이고 DS 약 0.7인 히드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량 약 18 kD이고 DS 약 0.4인 히드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량 약 18 kD이고 DS 약 0.7인 히드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량 약 50 kD이고 DS 약 0.4인 히드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량 약 50 kD이고 DS 약 0.7인 히드록스에틸 스타치이다.
말레이미도 그룹을 함유하는 폴리머 유도체와 단백질의 티올 그룹의 반응은 바람직하게는 완충 수성 시스템에서 5.5 내지 8.5, 더 바람직하게는 6 내지 8 및 특히 바람직하게는 6.5 내지 7.5의 바람직한 pH, 0 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 0 내지 25 ℃ 및 특히 바람직하게는 4 내지 21 ℃의 바람직한 반응 온도에서 0.5 내지 24 시간, 더 바람직하게는 1 내지 20 시간 및 특히 2 내지 17 시간의 바람직한 반응 시간동안 수행된다. 반응 혼합물의 적합한 pH 값은 적어도 하나의 적합한 버퍼를 첨가하여 조정할 수 있다. 바람직한 버퍼로, 0 내지 8 M, 보다 바람직하게는 2 내지 8 M 및 특히 바람직하게는 4 내지 8 M의 바람직한 농도로 우레아를 함유하고/하거나 0 내지 1% (w/v), 보다 바람직하게는 0.4 내지 1% (w/v) 및 특히 바람직하게는 0.8 내지 1% (w/v)의 바람직한 농도로 SDS를 함유하는 소듐 아세테이트 버퍼, 포스페이트 또는 보레이트 버퍼가 언급될 수 있다.
컨쥬게이트는 투석, 원심 여과 또는 압력 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, HPLC, MPLC, 겔 여과 및/또는 동결건조 등의 후처리와 같은 처리로 추가로 처리될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 상술된 방법으로 수득될 수 있는 컨쥬게이트에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 폴리머의 적어도 하나의 히드록시 그룹을 카보닉 디에스테르와 반응시켜 A가 반응성 카복시 그룹이고, A는 환원 말단이 산화되지 않은 폴리머내로 도입되었으며 하나의 폴리머 분자 및 아미드 결합을 통해 폴리머에 결합된 적어도 하나, 특히 1 내지 10개의 단백질 분자를 함유하는 상술된 방법으로 수득될 수 있는 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명 또한 단백질 및 폴리머 또는 그의 유도체를 함유하는 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서, 폴리머는 히드록시알킬 스타치 (HAS)이고 단백질은 하기 화학식의 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)이다:
Figure 112006009433098-pct00076
상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 탄소 원자수가 1 내지 10인 히드록시알킬 그룹, 히드록시아릴 그룹, 히드록시아르알킬 그룹 또는 히드록시알크아릴 그룹, 바람직하게는 수소 또는 히드록시알킬 그룹, 더 바람직하게는 수소 또는 히드록시에틸 그룹이고,
G는 O 및 S로 구성된 그룹 중에서 선택되고, 바람직하게는 0이며,
L은 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하는 임의로 적절히 치환된 선형, 측쇄 및/또는 사이클릭 탄화수소 잔기, 바람직하게는 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬 잔기(2 내지 60개의 탄소 원자를 가진다)이다.
상기 화학식에 사용된 약어 "단백질"은 N=C 이중 결합에서 옥심 결합의 일부인 탄수화물 부위의 탄소 원자 없이 반응에 사용되는 G-CSF 분자를 의미한다.
본 발명은 또한 상술된 컨쥬게이트에 관한 것으로, -L-은 -(CH2)n-이고, n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 더 바람직하게는 2, 3, 4 및 특히 바람직하게는 4이다.
본 발명 또한 단백질 및 폴리머 또는 그의 유도체를 함유하는 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 폴리머는 히드록시알킬 스타치 (HAS)이고 단백질은 하기 화학식의 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)이다:
Figure 112006009433098-pct00077
상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 탄소 원자수가 1 내지 10인 히드록시알킬 그룹, 히드록시아릴 그룹, 히드록시아르알킬 그룹 또는 히드록시알크아릴 그룹, 바람직하게는 수소 또는 히드록시알킬 그룹, 더 바람직하게는 수소 또는 히드록시에틸 그룹이고,
G는 O 및 S로 구성된 그룹 중에서 선택되고, 바람직하게는 O이다.
상기 화학식에 사용된 약어 "단백질"은 N=C 이중 결합에서 옥심 결합의 일부인 탄수화물 부위의 탄소 원자 없이 반응에 사용되는 G-CSF 분자를 의미한다.
본 발명은 또한 단백질 및 폴리머 또는 그의 유도체를 함유하는 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 폴리머는 히드록시알킬 스타치 (HAS)이고 단백질은 하기 화학식의 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)이다:
Figure 112006009433098-pct00078
상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 탄소 원자수가 1 내지 10인 히드록시알킬 그룹, 히드록시아릴 그룹, 히드록시아르알킬 그룹 또는 히드록시알크아릴 그룹, 바람직하게는 수소 또는 히드록시알킬 그룹, 더 바람직하게는 수소 또는 히드록시에틸 그룹이고,
L은 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하는 임의로 적절히 치환된 선형, 측쇄 및/또는 사이클릭 탄화수소 잔기, 바람직하게는 탄소 원자수가 2 내지 60인 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬 잔기이다.
상기 화학식에 사용된 약어 "단백질"은 N=C 이중 결합에서 옥심 결합의 일부인 탄수화물 부위의 탄소 원자 없이 반응에 사용되는 G-CSF 분자를 의미한다.
상기 두 구조는 가교화 화합물이 옥심 결합을 통해 HAS의 환원 말단에 결합되고, HAS의 말단 사카라이드 단위는 개방 형태로 존재하는 구조 및 가교화 화합물이 옥시아미노 그룹을 통해 HAS의 환원 말단에 결합되고, HAS의 말단 사카라이드 단위는 사이클릭 형태로 존재하는 각각의 사이클릭 아민 형태를 가지는 구조를 나타낸다.
본 발명은 또한 상술된 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서, -L-은 -[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-의 구조를 가진다:
상기 식에서,
Ra, Rb, Rc, Rd는 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 바람직하게는 수소이고,
G는 O 및 S로 구성된 그룹 중에서 선택되고, 바람직하게는 O이고,
m은 1, 2, 3 또는 4이고, 여기에서, m 그룹의 C RaRb에서 잔기 Ra 및 Rb는 동일하거나 상이할 수 있고,
n은 0 내지 20, 바람직하게는 0 내지 10, 더 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 가장 바람직하게는 1 또는 2이고,
o는 0 내지 20, 바람직하게는 0 내지 10, 보다 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 가장 바람직하게는 1 또는 2이고, o 그룹의 C RcRd에서 잔기 Rc 및 Rd는 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명은 또한 상술된 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서, Ra, Rb, Rc, Rd는 수소이고, m은 2이고, n은 1이고, o는 2이다.
본 발명은 또한 단백질 및 폴리머 또는 그의 유도체를 함유하는 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서, 폴리머는 히드록시알킬 스타치 (HAS)이고 단백질은 하기 화학식 구조의 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)이다:
Figure 112006009433098-pct00079
상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 탄소 원자수가 1 내지 10인 히드록시알킬 그룹, 히드록시아릴 그룹, 히드록시아르알킬 그룹 또는 히드록시알크아릴 그룹, 바람직하게는 수소 또는 히드록시알킬 그룹, 더 바람직하게는 수소 또는 히드록시에틸 그룹이다.
상기 화학식에 사용된 약어 "단백질"은 아미드 결합의 일부인 아미노 그룹의 질소 원자 없이 반응에 사용되는 G-CSF 분자를 의미한다.
본 발명은 또한 단백질 및 폴리머 또는 그의 유도체를 함유하는 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 폴리머는 히드록시알킬 스타치 (HAS)이고 단백질은 하기 화학식의 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)이다:
Figure 112006009433098-pct00080
상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 탄소 원자수가 1 내지 10인 히드록시알킬 그룹, 히드록시아릴 그룹, 히드록시아르알킬 그룹 또는 히드록시알크아릴 그룹, 바람직하게는 수소 또는 히드록시알킬 그룹, 더 바람직하게는 수소 또는 히드록시에틸 그룹이고,
결합 -0-(C=0)-는 카복시 그룹 또는 반응성 카복시 그룹과 HAS 분자의 히드록시 그룹의 반응으로 형성된다.
상기 화학식에 사용된 약어 "단백질"은 아미드 결합의 일부인 아미노 그룹의 질소 원자 없이 반응에 사용되는 G-CSF 분자를 의미한다.
본 발명은 또한 단백질 및 폴리머 또는 그의 유도체를 함유하는 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 폴리머는 히드록시알킬 스타치 (HAS)이고 단백질은 하기 화학식의 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)이다:
Figure 112006009433098-pct00081
상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 탄소 원자수가 1 내지 10인 히드록시알킬 그룹, 히드록시아릴 그룹, 히드록시아르알킬 그룹 또는 히드록시알크아릴 그룹, 바람직하게는 수소 또는 히드록시알킬 그룹, 더 바람직하게는 수소 또는 히드록시에틸 그룹이고,
L은 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 탄소 원자수 1 내지 60, 바람직하게는 1 내지 40, 더 바람직하게는 1 내지 20, 보다 더 바람직하게는 1 내지 10, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 6, 보다 더욱 더 바람직하게는 1 내지 2 및 특히 바람직하게는 1의 임의로 치환된 선형, 측쇄 및/또는 사이클릭 탄화수소 잔기이고, L은 특히 CH2이다.
상기 화학식에 사용된 약어 "단백질"은 아미노메틸 결합의 일부인 아미노 그룹의 질소 원자 없이 반응에 사용되는 G-CSF 분자를 의미한다.
본 발명은 또한 단백질 및 폴리머 또는 그의 유도체를 함유하는 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 폴리머는 히드록시알킬 스타치 (HAS)이고 단백질은 하기 화학식의 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)이다:
Figure 112006009433098-pct00082
상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 탄소 원자수가 1 내지 10인 히드록시알킬 그룹, 히드록시아릴 그룹, 히드록시아르알킬 그룹 또는 히드록시알크아릴 그룹, 바람직하게는 수소 또는 히드록시알킬 그룹, 더 바람직하게는 수소 또는 히드록시에틸 그룹이고,
L1 및 L2는 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고 알킬, 아릴, 아르알킬 헤테로알킬, 및/또는 헤테로아르알킬 부위를 포함하는 탄소 원자수 1 내지 60, 바람직하게는 1 내지 40, 더 바람직하게는 1 내지 20, 보다 더 바람직하게는 1 내지 10의 임의로 치환된 선형, 측쇄 및/또는 사이클릭 탄화수소 잔기이고,
D는 결합, 바람직하게는 L1에 결합된 적합한 작용기 F2 및 L2에 결합된 적합한 작용기 F3에 의해 형성된 공유 결합이다.
상기 화학식에 사용된 약어 "단백질"은 아미노메틸 결합의 일부인 아미노 그룹의 질소 원자 없이 반응에 사용되는 G-CSF 분자를 의미한다.
본 발명은 또한 상술된 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 L1은 -(CH2)n-이고, n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 더 바람직하게는 2, 3, 4 및 특히 바람직하게는 4이다.
본 발명은 또한 상술된 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 L2는 임의로 적절히 치환된 아릴 부위, 바람직하게는 6개의 탄소 원자를 가지는 아릴 부위를 포함하고, L2는 특히 바람직하게는 C6H4이거나, 또는 L2는 -(CH2)n-이고, n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 더 바람직하게는 2, 3, 4이다.
본 발명은 또한 상술된 컨쥬게이트에 관한 것으로, 다음 그룹 중에서 선택된다:
- C-C- 이중 결합 또는 C-C- 삼중 결합 또는 방향족 C-C-결합;
- 티오 그룹 또는 히드록시 그룹;
- 알킬 설폰산 히드라지드, 아릴 설폰산 히드라지드;
- 1,2-디올;
- 1,2 아미노-티오알코올;
- 아지드;
- 1,2-아미노알코올;
- 아미노 그룹 -NH2 또는 아미노알킬 그룹, 아미노아릴 그룹, 아미노아르알킬 그룹, 또는 알크아릴아미노그룹과 같은 구조 단위 -NH-를 포함하는 아미노 그룹의 유도체
- 히드록실아미노 그룹 -0-NH2, 또는 히드록실알킬아미노 그룹, 히드록실아릴아미노 그룹, 히드록실아르알킬아미노 그룹, 또는 하이드록살알크아릴아미노 그룹과 같은 구조 단위 -O-NH-를 포함하는 히드록실아미노 그룹의 유도체;
- 각각 구조단위 -NH-O-를 포함하는 알콕시아미노 그룹, 아릴옥시아미노 그룹, 아르알킬옥시아미노 그룹, 또는 알크아릴옥시아미노 그룹;
- 카보닐 그룹을 가지는 잔기, -Q-C(=G)-M, 여기에서, G는 O 또는 S, M은 예를 들어
-- -OH 또는 -SH;
-- 알콕시 그룹, 아릴옥시 그룹, 아르알킬옥시 그룹, 또는 알크아릴옥시 그룹;
-- 알킬티오 그룹, 아릴티오 그룹, 아르알킬티오 그룹, 또는 알크아릴티오 그룹;
-- 알킬카보닐옥시 그룹, 아릴카보닐옥시 그룹, 아르알킬카보닐옥시 그룹, 알크아릴카보닐옥시 그룹;
-- 활성화 에스테르, 예로서 N-히드록시숙신이미드와 같은 이미드 구조, 또는 펜타플루오로페닐, 파라니트로페닐 또는 트리클로로페닐과 같이 치환된 아릴 잔기를 가지는 아릴옥시 화합물과 같은 구조 단위 O-N(여기에서, N은 헤테로아릴 화합물의 일부이거나, G = O이고, Q는 존재하지 않은)을 가지는 히드록실아민의 에스테르; 여기에서, Q는 존재하지 않거나 또는 NH 또는 헤테로원자, 예로서 S 또는 O;
- -NH-NH2, 또는 -NH-NH-;
- -NO2;
- 니트릴 그룹;
- 카보닐 그룹, 예를 들어 알데히드그룹 또는 케토그룹;
- 카복시 그룹;
- -N=C=O 그룹 또는 -N=C=S 그룹;
- 비닐 할라이드 그룹, 예를 들어 비닐 아이오다이드 또는 비닐 브로마이드 그룹 또는 트리플레이트;
- -C≡C-H;
- -(C=NH2Cl)-O알킬
- 그룹 -(C=O)-CH2-Hal(여기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I);
- -CH=CH-S02-;
- 구조 -S-S-를 가지는 디설파이드 그룹;
- 그룹
Figure 112006009433098-pct00083
- 그룹
Figure 112006009433098-pct00084
상기에서, F3는 F2와 함께 화학 결합을 형성할 수 있는 작용기이고, 바람직하게는 상기 언급된 그룹 중에서 선택되고, F2는 바람직하게는 -NH- 부위를 포함하며, 보다 바람직하게는 아미노 그룹을 포함하고, F3는 바람직하게는 -(C=G)- 부위, 보다 바람직하게는 -(C=O)-, -(C=G)-G- 부위, 보다 더 바람직하게는 -(C=O)-G-, 및 특히 바람직하게는 -(C=O)-O를 포함하고, D는 특히 바람직하게는 아미드 결합이다.
본 발명은 또한 단백질 및 폴리머 또는 그의 유도체를 함유하는 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 폴리머는 히드록시알킬 스타치 (HAS)이고 단백질은 하기 화학식의 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)이다:
Figure 112006009433098-pct00085
상기 식에서,
부위 -CH2-N2-의 탄소 원자는 개환 산화 반응에 의해 폴리머에 도입되는 알데히드 그룹으로부터 유도되고,
HAS"는 개환 산화에 의한 알데히드 그룹없이 히드록시알킬 스타치 분자와 관련되며 단백질의 아미노 그룹과 반응하며, 질소 원자는 단백질의 아미노 그룹으로부터 유도된다.
상기 화학식에 사용된 약어 "단백질"은 아미드 결합의 일부인 아미노 그룹의 질소 원자 없이 반응에 사용되는 G-CSF 분자를 의미한다.
본 발명은 또한 단백질 및 폴리머 또는 그의 유도체를 함유하는 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 폴리머는 히드록시알킬 스타치 (HAS)이고 단백질은 하기 화학식의 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)이다:
Figure 112006009433098-pct00086
상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 탄소 원자수가 1 내지 10인 히드록시알킬 그룹, 히드록시아릴 그룹, 히드록시아르알킬 그룹 또는 히드록시알크아릴 그룹, 바람직하게는 수소 또는 히드록시알킬 그룹, 더 바람직하게는 수소 또는 히드록시에틸 그룹이고,
L은 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로알킬 및/또는 헤테로아르알킬 부위를 함유하는 탄소 원자수 2 내지 60, 바람직하게는 2 내지 40, 더 바람직하게는 2 내지 20, 보다 더 바람직하게는 2 내지 10의 임의로 치환된 선형, 측쇄 및/또는 사이클릭 탄화수소 잔기이고,
황 원자는 단백질의 시스테인 잔기 또는 디설파이드 그룹으로부터 유도된다.
본 발명은 또한 상술된 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서, -L-은 -[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-의 구조를 가진다:
상기 식에서,
Ra, Rb, Rc, Rd는 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 바람직하게는 수소이고,
G는 O 및 S로 구성된 그룹 중에서 선택되고, 바람직하게는 O이고,
m은 1, 2, 3 또는 4, 가장 바람직하게는 2이고, 여기에서, m 그룹의 C RaRb에서 잔기 Ra 및 Rb는 동일하거나 상이할 수 있고,
n은 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 더 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4이고,
o는 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 보다 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 보다 더 바람직하게는 1 또는 2이고, 가장 바람직하게는 1이고, 여기에서, o 그룹의 C RcRd에서 잔기 Rc 및 Rd는 동일하거나 상이할 수 있거나,
n은 0이고,
o는 2 내지 20, 바람직하게는 2 내지 10, 보다 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고, o 그룹의 C RcRd에서 잔기 Rc 및 Rd는 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명은 또한 단백질 및 폴리머 또는 그의 유도체를 함유하는 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서, 폴리머는 히드록시알킬 스타치 (HAS)이고 단백질은 하기 화학식 구조의 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)이다:
Figure 112006009433098-pct00087
상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 탄소 원자수가 1 내지 10인 히드록시알킬 그룹, 히드록시아릴 그룹, 히드록시아르알킬 그룹 또는 히드록시알크아릴 그룹, 바람직하게는 수소 또는 히드록시알킬 그룹, 더 바람직하게는 수소 또는 히드록시에틸 그룹이고,
L은 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로알킬 및/또는 헤테로아르알킬 부위를 함유하는 탄소 원자수 2 내지 60, 바람직하게는 2 내지 40, 더 바람직하게는 2 내지 20, 보다 더 바람직하게는 2 내지 10의 임의로 치환된 선형, 측쇄 및/또는 사이클릭 탄화수소 잔기이고,
황 원자는 단백질의 시스테인 잔기 또는 디설파이드 그룹으로부터 유도된다.
본 발명은 또한 상술된 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서, -L-은 -[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-의 구조를 가진다:
상기 식에서,
Ra, Rb, Rc, Rd는 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 바람직하게는 수소이고,
G는 O 및 S로 구성된 그룹 중에서 선택되고, 바람직하게는 O이고,
m은 1, 2, 3 또는 4, 가장 바람직하게는 2이고, 여기에서, m 그룹의 C RaRb에서 잔기 Ra 및 Rb는 동일하거나 상이할 수 있고,
n은 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 더 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4이고,
o는 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 보다 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 보다 더 바람직하게는 1 또는 2이고, o 그룹의 C RcRd에서 잔기 Rc 및 Rd는 동일하거나 상이할 수 있거나,
n은 0이고,
o는 2 내지 20, 바람직하게는 2 내지 10, 보다 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고, o 그룹의 C RcRd에서 잔기 Rc 및 Rd는 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명은 또한 상술된 임의의 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서, 히드록시알킬 스타치는 히드록시에틸 스타치이다.
본 발명은 또한 상술된 임의의 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서, 히드록시알킬 스타치는 2 내지 200 kD, 바람직하게는 4 내지 130 kD, 더 바람직하게는 4 내지 70 kD의 분자량을 가진다.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 또한 인간 또는 동물 체내 치료방법에 사용하기 위한 상술된 방법으로 수득될 수 있는 상술된 컨쥬게이트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상술된 방법으로 수득될 수 있는 치료적 유효량의 상술된 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 시용된 용어 "치료적 유효량"은 주어진 조건 및 투여 요법에 치료 효과를 제공하는 양을 의미한다. 투여는 바람직하게는 경로에 의한다. 선택된 특정 경로는 치료 증상에 따라 달라질 것이다. 투여는 바람직하게는 폴리소르베이트와 같은 적합한 담체, 물과 같은 적합한 희석제 및/또는 소르비톨과 같은 적합한 보조제를 함유하는 제제의 일부로 행해진다. 필요한 투여량은 치료 증상의 중증도, 개별 환자의 반응, 사용된 투여방법 등에 따라 달라질 것이다.
따라서, 바람직한 구체예로, 약제학적 조성물은 특히 G-CSF 치료에 사용하기에 적합한 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 및/또는 희석제를 추가로 포함한다.
약제학적 조성물은 바람직하게는 조혈 또는 면역 기능 저하를 특징으로 하는 질환 또는 그와 관련된 질환을 치료하는데 사용된다.
따라서, 본 발명은 또한 조혈 또는 면역 기능 저하를 특징으로 하는 질환 치료용 약제를 제조하기 위한 상술된 컨쥬게이트 또는 상술된 방법으로 수득할 수 있는 컨쥬게이트를 포함하는 상술된 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
바람직한 구체예에 따라, 조혈 또는 면역 기능 저하를 특징으로 하는 질환은 화학요법, 방사선 치료, 감염성 질환, 중증 만성 호중성 백혈구 감소증 또는 백혈병에 기인한다. 따라서, 본 발명은 또한 조혈 또는 면역 기능 저하를 특징으로 하는 질환으로서 화학요법, 방사선 치료, 감염성 질환, 중증 만성 호중성 백혈구 감소증 또는 백혈병에 기인한 질병 치료용 약제를 제조하기 위한 상술된 컨쥬게이트 또는 상술된 방법으로 수득할 수 있는 컨쥬게이트를 포함하는 상술된 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물의 치료 대상은 바람직하게는 i.v. 또는 s.c. 경로로 투여된다. 이를 위해, 약제학적 조성물은 멸균액으로 투여될 수 있다.
도 1a
도 1a는 실시예 2.1(a)에 따라 제조된 HES-G-CSF 컨쥬게이트, Neupogen?의 SDS page 분석 결과를 나타낸다. 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) 및 Consort E143 전원(CONSORTnv, Turnout, B)이 사용되었다. 12% Bis-Tris 겔이 MOPS SDS 실험 버퍼와 함께 환원 조건(둘 다 Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)에서 제조자 지시에 따라 사용되었다.
레인 A: 단백질 마커 SeeBlue?Plus2(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). 상단에서 하단까지의 분자량 마커: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
레인 B: 실시예 2.1(a)에 개시된 바와 같이 HES와 G-CSF(Neupogen?)의 컨쥬게이트후 조 생성물.
레인 C: G-CSF 출발물질.
도 1b
도 1b는 실시예 2.1(a)에 따라 제조된 HES-G-CSF 컨쥬게이트,Granocyte?의 SDS page 분석 결과를 나타낸다. 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) 및 Consort E143 전원(CONSORTnv, Turnout, B)이 사용되었다. 12% Bis-Tris 겔이 MOPS SDS 실험 버퍼와 함께 환원 조건(둘 다 Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)에서 제조자 지시에 따라 사용되었다.
레인 A: 단백질 마커 SeeBlue?Plus2(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). 상단에서 하단까지의 분자량 마커: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
레인 B: 실시예 2.1(a)에 기재된 바와 같은 G-CSF(Granocyte?)와 HES의 컨쥬게이션 후의 조 생성물.
레인 C: G-CSF 출발물질.
도 2
도 2는, 실시예 2.1(b)에 따라 생성된, HES-G-CSF 컨쥬게이트의 SDS 페이지 분석을 보여주며, 슈트라트만 바이오텍 AG, 함부르크, 독일(Strathmann Biotec AG, Hamburg, D)의 G-CSF가 사용되었다. 겔 전기영동에는, XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) 및 Consort E143 파워 서플라이 (CONSORTnv,Turnhout, B)가 사용되었다. 제조사의 안내에 따라, 12% 비스-트리스 겔(Bis-Tris gel)과 함께 MOPS SDS 런닝 버퍼(양자 모두 Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)가 환원 조건에서 사용되었다.
레인 A: 단백질 마커 SeeBlue?Plus2(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). 상위로부터 하위까지의 분자량 마커: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
레인 B: pH 5.0의 0.1M NaOAc 버퍼 중에서의 HES10/0.4와 G-CSF의 컨쥬게이션 후의 조 생성물.
레인 C: pH 5.0의 0.1M NaOAc 버퍼 중에서의 HES10/0.7과 G-CSF의 컨쥬게이션 후의 조 생성물.
레인 D: pH 5.0의 0.1M NaOAc 버퍼 중에서의 HES50/0.4와 G-CSF의 컨쥬게이션 후의 조 생성물.
레인 E: pH 5.0의 0.1M NaOAc 버퍼 중에서의 HES50/0.7과 G-CSF의 컨쥬게이션 후의 조 생성물.
레인 F: G-CSF 출발물질.
도 3
도 3은, 실시예 2.2에 따라 생성된, HES-G-CSF 컨쥬게이트의 SDS 페이지 분석을 보여주며, 슈트라트만 바이오텍 AG, 함부르크, 독일(Strathmann Biotec AG, Hamburg, D)의 G-CSF가 사용되었다. 겔 전기영동에는, XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) 및 Consort E143 파워 서플라이(CONSORTnv,Turnhout, B)가 사용되었다. 제조사의 안내에 따라, 12% 비스-트리스 겔(Bis-Tris gel)과 함께 MOPS SDS 런닝 버퍼(양자 모두 Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)가 환원 조건에서 사용되었다.
레인 A: 단백질 마커 SeeBlue?Plus2(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). 상위로부터 하위까지의 분자량 마커: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
레인 B: pH 5.0의 0.1M NaOAc 버퍼 중에서의 산화된 HES10/0.7과 G-CSF의 컨쥬게이션 후의 조 생성물.
레인 C: pH 5.0의 0.1M NaOAc 버퍼 중에서의 산화된 HES50/0.4와 G-CSF의 컨쥬게이션 후의 조 생성물.
레인 D: pH 5.0의 0.1M NaOAc 버퍼 중에서의 산화된 HES50/0.7과 G-CSF의 컨쥬게이션 후의 조 생성물.
레인 E: G-CSF 출발물질.
도 4
도 4는, 실시예 2.3에 따라 생성된, HES-G-CSF 컨쥬게이트의 SDS 페이지 분석을 보여주며, G-CSF는 Neupogen? 또는 Granocyte?이다. 겔 전기영동에는, XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) 및 Consort E143 파워 서플라이(CONSORTnv,Turnhout, B)가 사용되었다. 제조사의 안내에 따라, 12% 비스 -트리스 겔(Bis-Tris gel)과 함께 MOPS SDS 런닝 버퍼(양자 모두 Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)가 환원 조건에서 사용되었다.
레인 A: 단백질 마커 SeeBlue?Plus2(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). 상위로부터 하위까지의 분자량 마커: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
레인 B: 실시예 2.3에 따른 조 생성물(i-N).
레인 C: 실시예 2.3에 따른 조 생성물(ii-N).
레인 D: 실시예 2.3에 따른 조 생성물(iii-N).
레인 E: 실시예 2.3에 따른 조 생성물(iv-N).
레인 F: 실시예 2.3에 따른 조 생성물(i-G).
레인 G: 실시예 2.3에 따른 조 생성물(ii-G).
레인 H: 실시예 2.3에 따른 조 생성물(iii-G).
레인 I: 실시예 2.3에 따른 조 생성물(iv-G).
레인 J: Neupogen?.
도 5
도 5는, 실시예 2.4에 따라 생성된, HES-G-CSF 컨쥬게이트의 SDS 페이지 분석을 보여주며, 슈트라트만 바이오텍 AG, 함부르크, 독일(Strathmann Biotec AG, Hamburg, D)의 G-CSF가 사용되었다. 겔 전기영동에는, XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) 및 Consort E143 파워 서플라이 (CONSORTnv,Turnhout, B)가 사용되었다. 제조사의 안내에 따라, 12% 비스-트리스 겔(Bis-Tris gel)과 함께 MOPS SDS 런닝 버퍼(양자 모두 Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)가 환원 조건에서 사용되었다.
레인 A: 단백질 마커 SeeBlue?Plus2(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). 상위로부터 하위까지의 분자량 마커: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
레인 B: 실시예 2.4에 따른 조 생성물(vi).
레인 C: 실시예 2.4에 따른 조 생성물(v).
레인 D: G-CSF 출발물질.
레인 E: 단백질 마커 SeeBlue?Plus2(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). 상위로부터 하위까지의 분자량 마커: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
레인 F: 실시예 2.4에 따른 조 생성물(ix).
레인 G: 실시예 2.4에 따른 조 생성물(viii).
레인 H: 실시예 2.4에 따른 조 생성물(vii).
레인 I: G-CSF 출발물질.
도 6
도 6은, 실시예 2.5에 따라 생성된, HES-G-CSF 컨쥬게이트의 SDS 페이지 분석을 보여주며, 슈트라트만 바이오텍 AG, 함부르크, 독일(Strathmann Biotec AG, Hamburg, D)의 G-CSF가 사용되었다. 겔 전기영동에는, XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) 및 Consort E143 파워 서플라이(CONSORTnv,Turnhout, B)가 사용되었다. 제조사의 안내에 따라, 12% 비스-트리스 겔(Bis-Tris gel)과 함께 MOPS SDS 런닝 버퍼(양자 모두 Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)가 환원 조건에서 사용되었다.
레인 A: 단백질 마커 SeeBlue?Plus2(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). 상위로부터 하위까지의 분자량 마커: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
레인 B: 실시예 2.5에 따른 조 생성물.
레인 C: G-CSF 출발물질.
도 7
도 7은, 실시예 3에 따라 생성된, HES-G-CSF 컨쥬게이트의 SDS 페이지 분석을 보여주며, G-CSF는 Neupogen? 또는 Granocyte?이다. 겔 전기영동에는, XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) 및 Consort E143 파워 서플라이(CONSORTnv,Turnhout, B)가 사용되었다. 제조사의 안내에 따라, 12% 비스-트리스 겔(Bis-Tris gel)과 함께 MOPS SDS 런닝 버퍼(양자 모두 Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)가 환원 조건에서 사용되었다.
레인 A: 단백질 마커 SeeBlue?Plus2(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). 상위로부터 하위까지의 분자량 마커: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
레인 B: 실시예 3에 따른 조 생성물(x).
레인 C: 실시예 3에 따른 조 생성물(xi).
레인 D: 실시예 3에 따른 조 생성물(xii).
레인 E: 실시예 3에 따른 조 생성물(xiii).
레인 F: 실시예 3에 따른 조 생성물(xiv).
레인 G: 실시예 3에 따른 조 생성물(xv).
도 8
도 8은 실시예 6의 생체외(in vitro) 결과를 보여준다.
도표에서, x축은 pg/ml의 농도를 나타내고, y축은 셀 수/100,000을 나타낸다. 도표에서, 약어들은 다음을 나타낸다:
G-CSF/A32 실시예 2.5에 따라 제조된 G-CSF 컨쥬게이트
G-CSF/A33 실시예 2.5의 컨쥬게이트에 사용된 G-CSF 출발물질
G-CSF/A57 비-변형된 Neulasta?
G-CSF/A58 비-변형된 Neupogen?
G-CSF/A60 실시예 4.2에 따라 제조된 G-CSF 컨쥬게이트
도 9
도 9는, 실시예 4.1에 따른 조 컨쥬게이션 반응 생성물에 대한 HPGPC 크로마 토그램을 보여준다. HPGPC 분석에서 사용된 매개변수들은 다음과 같다:
컬럼: Superose 12 HR 10/30 300x10mm I.D.(Pharmacia)
용출액(Eluent): 27.38mM Na2HP04; 12.62mM NaH2P04; 0.2M NaCl; 탈미네랄수 1L 중의 0.005% NaN3
유량(Flux): 0.24ml/h
검출기 1: MALLS 디텍터
검출기 2: UV(280nm)
검출기 3: RI(굴절율(Refractive Index) 디텍터)
A는 검출기 1로부터의 결과를 나타내고, B는 검출기 2로부터의 결과를 나타낸다.
도 10
도 10은, 실시예 4.1에 따른 컨쥬게이션 반응 생성물에 대한 HPGPC 크로마토그램을 보여주며, 여기에서, 용매는 물론 미반응된 옥소-HES 및 유리 N-히드록시숙신이미드와 같은 반응 부산물에 관한 혼합물의 함량은 냉각 원심분리 중의 10 kD 한외여과막을 사용하여 다운그레이드되었다.
HPGPC 분석에서 사용된 매개변수들은 다음과 같다:
컬럼: Superose 12 HR 10/30 300x10mm I.D.(Pharmacia)
용출액(Eluent): 27.38mM Na2HP04; 12.62mM NaH2P04; 0.2M NaCl; 탈미네랄수 1L 중의 0.005% NaN3
유량(Flux): 0.24ml/h
검출기 1: MALLS 디텍터
검출기 2: UV(280nm)
검출기 3: RI(굴절율(Refractive Index) 디텍터)
A는 검출기 1로부터의 결과를 나타내고, B는 검출기 2로부터의 결과를 나타낸다.
도 11
HPGPC 분석에서 사용된 매개변수들은 다음과 같다:
컬럼: Superose 12 HR 10/30 300x10mm I.D.(Pharmacia)
용출액(Eluent): 27.38mM Na2HP04; 12.62mM NaH2P04; 0.2M NaCl; 탈미네랄수 1L 중의 0.005% NaN3
유량(Flux): 0.24ml/h
검출기 1: MALLS 디텍터
검출기 2: UV(280nm)
검출기 3: RI(굴절율(Refractive Index) 디텍터)
A는 검출기 1로부터의 결과를 나타내고, B는 검출기 2로부터의 결과를 나타낸다.
도 12
HPGPC 분석에서 사용된 매개변수들은 다음과 같다:
컬럼: Superose 12 HR 10/30 300x10mm I.D.(Pharmacia)
용출액(Eluent): 27.38mM Na2HP04; 12.62mM NaH2P04; 0.2M NaCl; 탈미네랄수 1L 중의 0.005% NaN3
유량(Flux): 0.24ml/h
검출기 1: MALLS 디텍터
검출기 2: UV(280nm)
검출기 3: RI(굴절율(Refractive Index) 디텍터)
A는 검출기 1로부터의 결과를 나타내고, B는 검출기 2로부터의 결과를 나타낸다.
도 13
도 13은, DEAE-Sepharose CL-6B 상에서의 크로마토그래피 후의 HES-변형된 G-CSF(A32)의 용출액(eluate)과 통과유량(flow-through)의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 표시된 분율의 1.5%가 한외여과에 의해 탈염되었고, SpeedVac 중에서 건조되었으며, 12.5% 폴리아크릴아미드 겔 상에 적용되었다.
도 14
도 14는 G-CSF 출발물질(시료 A33)의 MALDI/TOF 스펙트럼을 보여준다.
도 15
도 15는 HES-변형된 G-CSF(시료 A32)의 MALDI/TOF 스펙트럼을 보여준다.
도 16
도 16은 HES-변형된 G-CSF(시료 A60)의 MALDI/TOF 스펙트럼을 보여준다.
도 17
도 17은 실시예 7.2(b)의 반응 혼합물의 겔 전기영동을 보여준다.
겔 전기영동에는, XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) 및 Consort E143 파워 서플라이(CONSORTnv,Turnhout, B)가 사용되었다. 제조사의 안내에 따라, 12% 비스-트리스 겔(Bis-Tris gel)과 함께 MOPS SDS 런닝 버퍼(양자 모두 Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)가 환원 조건에서 사용되었다. 제조사의 안내에 따라, 겔은 Roti-Blue(Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D)로 스테이닝되었다.
레인 A: 단백질 마커 Roti-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D). 상위로부터 하위까지의 분자량 마커: 200 KD, 119 KD, 66 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14.3 KD.
레인 B: 실시예 7.1(d)에서 제조된 HES 유도체와 hG-CSF의 컨쥬게이션 후의 조 생성물.
레인 C: 실시예 7.1(b)에서 제조된 HES 유도체와 hG-CSF의 컨쥬게이션 후의 조 생성물.
레인 D: 실시예 7.1(j)에서 제조된 HES 유도체와 hG-CSF의 컨쥬게이션 후의 조 생성물.
레인 E: 반응 컨트롤: HES 50/07
도 18
도 18은 실시예 7.2(d)의 반응 혼합물의 겔 전기영동을 보여준다. 겔 전기영동에는, XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) 및 Consort E143 파워 서플라이(CONSORTnv,Turnhout, B)가 사용되었다. 제조사의 안내에 따라, 12% 비스-트리스 겔(Bis-Tris gel)과 함께 MOPS SDS 런닝 버퍼(양자 모두 Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)가 환원 조건에서 사용되었다. 제조사의 안내에 따라, 겔은 Roti-Blue(Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D)로 스테이닝되었다.
레인 A: 단백질 마커 Roti-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D). 상위로부터 하위까지의 분자량 마커: 200 KD, 119 KD, 66 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14.3 KD.
레인 B: 실시예 7.2(c)에 기재된 바와 같은 버퍼 교환 후의 hG-CSF.
레인 C: 실시예 7.1(f)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 hG-CSF의 컨쥬게이션 후의 조 생성물.
레인 D: 실시예 7.1(h)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 hG-CSF의 컨쥬게이션 후의 조 생성물.
도 19
도 19는, 실시예 7.3에 따른 컨쥬게이션 반응 생성물에 대한 HPGPC 크로마토그램을 보여준다(MALLS 디텍터: 상부 차트; UV 디텍터: 하부 차트). HPGPC 분석에서 사용된 매개변수들은 다음과 같다:
컬럼: Superose 12 HR 10/30 300x10mm I.D.(Pharmacia)
용출액(Eluent): 27.38mM Na2HP04; 12.62mM NaH2P04; 0.2M NaCl; 탈미네랄수 1L 중의 0.005% NaN3
유량(Flux): 0.24ml/h
검출기 1: MALLS 디텍터
검출기 2: UV(280nm)
검출기 3: RI(굴절율(Refractive Index) 디텍터)
도 20
도 20은 실시예 7.4의 유사분열성 검사(mitogenecity assay) 결과를 보여준 다. Y 축은 NFS-60-셀의 수/ml를 나타내고, X 축은 pg/ml 단위의 농도를 나타낸다.
도 21
도 21은 실시예 7.5의 생체내(in vivo) 검사 결과를 보여준다.
실시예 1: 알데히드 기능화된 히드록시에틸 스타치의 합성
실시예 1.1(a): 환원 말단에서 선택적으로 산화된 히드록시에틸 스타치의 퍼아이오데이트 산화 및 0℃에서의 배양에 의한 합성
100mg의 옥소-HES10/0.4(MW=10kD, DS=0.4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D에 의해 제조; DE 196 28 705 Al에 의거)를 pH 7.2의 20mM 소듐 포스페이트 버퍼 5ml 중에 용해하고 0℃로 냉각시켰다. 21.4mg의 소듐 퍼아이오데이트(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)를 동일 버퍼 5ml 중에 용해하고 0℃로 냉각시켰다. 두 용액을 혼합하고, 0℃에서 10분간 배양한 후, 0.73ml의 글리세롤을 가하고, 반응 혼합물을 21℃에서 10분간 배양하였다. 반응 혼합물을 물에 대하여 24시간 동안 투석(SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)하였고, 동결건조하였다.
실시예 1.1(b): 환원 말단에서 선택적으로 산화된 히드록시에틸 스타치의 퍼아이오데이트 산화 및 21℃에서의 배양에 의한 합성
100mg의 옥소-HES10/0.4(MW=10kD, DS=0.4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D에 의해 제조; DE 196 28 705 Al에 의거)를 pH 7.2의 20mM 소듐 포스페이트 버퍼 5ml 중에 용해하고, 21.4mg의 소듐 퍼아이오데이트(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)를 동일 버퍼 5ml 중에 용해하였다. 두 용액을 혼합하고, 21℃에서 10분간 배양한 후, 0.73ml의 글리세롤을 가하고, 반응 혼합물을 21℃에서 10분간 배양하였다. 반응 혼합물을 물에 대하여 24시간 동안 투석(SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)하였고, 동결건조하였다.
실시예 1.2(a): 비-산화된 환원 말단을 갖는 히드록시에틸 스타치의 퍼아이오데이트 산화 및 0℃에서의 배양에 의한, 알데히드 기능화된 히드록시에틸 스타치의 합성
100mg의 옥소-HES10/0.4(MW=10kD, DS=0.4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)를 pH 7.2의 20mM 소듐 포스페이트 버퍼 5ml 중에 용해하고 0℃로 냉각시켰다. 21.4mg의 소듐 퍼아이오데이트(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)를 동일 버퍼 5ml 중에 용해하고 0℃로 냉각시켰다. 두 용액을 혼합하고, 0℃에서 10분간 배양한 후, 0.73ml의 글리세롤을 가하고, 반응 혼합물을 21℃에서 10분간 배양하였다. 반응 혼합물을 물에 대하여 24시간 동 안 투석(SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)하였고, 동결건조하였다.
실시예 1.2(b): 비-산화된 환원 말단을 갖는 히드록시에틸 스타치의 퍼아이오데이트 산화 및 21℃에서의 배양에 의한, 알데히드 기능화된 히드록시에틸 스타치의 합성
100mg의 옥소-HES10/0.4(MW=10kD, DS=0.4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)를 pH 7.2의 20mM 소듐 포스페이트 버퍼 5ml 중에 용해하고, 21.4mg의 소듐 퍼아이오데이트(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)를 동일 버퍼 5ml 중에 용해하였다. 두 용액을 혼합하고, 21℃에서 10분간 배양한 후, 0.73ml의 글리세롤을 가하고, 반응 혼합물을 21℃에서 10분간 배양하였다. 반응 혼합물을 물에 대하여 24시간 동안 투석(SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)하였고, 동결건조하였다.
실시예 1.3: 아미노 기능화된 히드록시에틸 스타치와 포르밀벤조산으로부터의 , 알데히드 기능화된 히드록시에틸 스타치의 합성
옥소-HES10/0.4(MW=10kD, DS=0.4)는, DE 196 28 705 Al에 의거하여 Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D에 의해 제조되었다.
5.1g(0.51mmol)의 옥소-HES10/0.4를 무수 디메틸설폭사이드(DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) 15ml 중에 용해하고, 무수 디메틸설폭사이드 10ml 중의 5.1ml(51mmol) 1,4-디아미노부탄 용액에 질소 하에서 적가하고, 40℃에서 19시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 80ml 에탄올과 80ml 아세톤의 혼합물에 가하였다. 결과 침전물을 원심분리로 분리하고, 20ml 에탄올과 20ml 아세톤의 혼합물로 세척하고, 80ml 물에 재용해시켰다. 그 용액을 물에 대하여 4일 동안 투석(SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)하였고, 이어서 동결건조하였다. 67% 수율(3.4g)의 아미노-HES10/0.4를 얻었다.
150mg의 4-포르밀벤조산과 230mg의 1-히드록시-1H-벤조트리아졸(양자 모두 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)을 10ml의 N,N-디메틸포름아미드(Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL)에 용해하고, 204㎕의 N,N'-디이소프로필카보디이미드를 가하였다. 21℃에서 30분간 배양한 후, 1g의 아미노-HES10/0.4를 가하였다. 22℃에서 19시간 동안 흔든 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙-냉 1:1 혼합물(v/v) 84ml에 가하였다. 침전된 생성물을 4℃에서 원심분리하여 수거하고, 50ml 물에 재용해시키고, 물에 대하여 2일 동안 투석(SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)하고, 동결건조하였다.
실시예 1.4: 히드록시에틸 스타치와 포르밀벤조산으로부터의 , 알데히드 기능화된 히드록시에틸 스타치의 합성
옥소-HES10/0.7(MW=10kD, DS=0.7)은, DE 196 28 705 Al에 의거하여 Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D에 의해 제조되었다.
83mg의 4-포르밀벤조산과 180mg의 1-히드록시-1H-벤조트리아졸(양자 모두 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)을 5ml의 N,N-디메틸포름아미드(DMF, Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL)에 용해하고, 78㎕의 N,N'-디이소프로필카보디이미드를 가하였다. 21℃에서 30분간 배양한 후, 0.5g의 옥소-HES10/0.7을 가하였다. 22℃에서 19시간 동안 흔든 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙-냉 1:1 혼합물(v/v) 37.5ml에 가하였다. 침전된 생성물을 4℃에서 원심분리하여 수거하고, 2.5ml의 물 및 2.5ml의 DMF에 재용해시키고, 전술한 바와 같이 다시 침전시켰다. 반응 생성물을 전술한 바와 같은 원심분리에 의해 수거하고, 10ml의 물에 재용해시키고, 물에 대하여 2일 동안 투석(SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)하고, 동결건조하였다.
실시예 1.5: 히드록시에틸 스타치와 포르밀벤조산으로부터의 , 알데히드 기능화된 히드록시에틸 스타치의 합성
HES10/0.7(MW=10kD, DS=0.7)은 Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D에 의해 제조되었다.
50mg의 4-포르밀벤조산과 108mg의 1-히드록시-1H-벤조트리아졸(양자 모두 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)을 3ml의 N,N-디메틸포름아 미드(Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL)에 용해하고, 47㎕의 N,N'-디이소프로필카보디이미드를 가하였다. 21℃에서 30분간 배양한 후, 0.3g의 HES10/0.7을 가하였다. 22℃에서 19시간 동안 흔든 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙-냉 1:1 혼합물(v/v) 23ml에 가하였다. 침전된 생성물을 4℃에서 원심분리하여 수거하고, 1.5ml의 물 및 1.5ml의 DMF에 재용해시키고, 전술한 바와 같이 다시 침전시켰다. 반응 생성물을 전술한 바와 같은 원심분리에 의해 수거하고, 10ml의 물에 재용해시키고, 물에 대하여 2일 동안 투석(SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)하고, 동결건조하였다.
실시예 1.6: 아미노 기능화된 히드록시에틸 스타치와 포르밀벤조산 펜타플루오로페닐 에스테르로부터의, 알데히드 기능화된 히드록시에틸 스타치의 합성
옥소-HES10/0.7(MW=10kD, DS=0.7)은, DE 196 28 705 Al에 의거하여 Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D에 의해 제조되었다.
6.0g(0.6mmol)의 옥소-HES10/0.7을 무수 디메틸설폭사이드(DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) 20ml 중에 용해하고, 무수 디메틸설폭사이드 11ml 중의 6ml(60mmol) 1,4-디아미노부탄 용액에 질소 하에서 적가하고, 40℃에서 19시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 80ml 에탄올과 80ml 아세톤의 혼합물에 가하였다. 결과 침전물을 원심분리로 분리하고, 20ml 에탄올과 20ml 아세톤의 혼합물로 세척하고, 80ml 물에 재용해시켰다. 그 용액을 물에 대하여 4일 동안 투석(SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)하였고, 이어서 동결건조하였다. 52% 수율(3.15g)의 아미노-HES10/0.7을 얻었다.
4-포르밀벤조산 펜타플루오로페닐 에스테르는 J. S. Lindsey at al. , Tetrahedron 50 (1994) pp. 8941-68, 특히 p. 8956에 기재된 바와 같이 합성되었다. 50mg의 아미노-HES10/0.7을 0.5ml의 N,N-디메틸포름아미드(Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL)에 용해하고, 15.3mg의 4-포르밀벤조산 펜타플루오로페닐 에스테르를 가하였다. 22℃에서 22시간 동안 흔든 후, 반응 혼합물을 빙-냉 2-프로판올 3.5ml에 가하였다. 침전된 생성물을 4℃에서 원심분리하여 수거하고, 빙-냉 2-프로판올 4ml로 세척하고, 50ml의 물에 재용해시키고, 물에 대하여 2일 동안 투석(SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)하고, 동결건조하였다.
실시예 1.7: 히드록시에틸 스타치와 포르밀벤조산 펜타플루오로페닐 에스테르로부터의, 알데히드 기능화된 히드록시에틸 스타치의 합성
옥소-HES10/0.7(MW=10kD, DS=0.7)은, DE 196 28 705 Al에 의거하여 Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D에 의해 제조되었다.
4-포르밀벤조산 펜타플루오로페닐 에스테르는 J. S. Lindsey at al. , Tetrahedron 50 (1994) pp. 8941-68, 특히 p. 8956에 기재된 바와 같이 합성되었다. 200mg의 옥소-HES10/0.7을 2ml의 N,N-디메틸포름아미드(Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL)에 용해하고, 61.2mg의 4-포르밀벤조산 펜타플루오로페닐 에스테르를 가하였다. 22℃에서 22시간 동안 흔든 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙-냉 1:1 혼합물(v/v) 15ml에 가하였다. 침전된 생성물을 4℃에서 원심분리하여 수거하고, 1.4ml의 물 및 0.7ml의 DMF에 재용해시키고, 전술한 바와 같이 다시 침전시켰다. 반응 생성물을 전술한 바와 같은 원심분리에 의해 수거하고, 10ml의 물에 재용해시키고, 물에 대하여 2일 동안 투석(SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)하고, 동결건조하였다.
실시예 1.8: 아미노 기능화된 히드록시에틸 스타치와 4-(4- 포르밀 -3,5- 디메톡시페녹시 )부티르산으로부터의, 알데히드 기능화된 히드록시에틸 스타치의 합성
옥소-HES10/0.4(MW=10kD, DS=0.4)는, DE 196 28 705 Al에 의거하여 Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D에 의해 제조되었다.
5.1g(0.51mmol)의 옥소-HES10/0.4를 무수 디메틸설폭사이드(DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) 15ml 중에 용해하고, 무수 디메틸설폭사이드 10ml 중의 5.1ml(51mmol) 1,4-디아미노부탄 용액에 질소 하에서 적가하고, 40℃에서 19시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 80ml 에탄올과 80ml 아세톤의 혼합물에 가하였다. 결과 침전물을 원심분리로 분리하고, 20ml 에탄올과 20ml 아세톤의 혼합물로 세척하고, 80ml 물에 재용해시켰다. 그 용액을 물에 대하여 4일 동안 투석(SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)하였고, 이어서 동결건조하였다. 67% 수율(3.4g)의 아미노-HES10/0.4를 얻었다.
80.5mg의 4-(4-포르밀-3,5-디메톡시페녹시)부티르산(Calbiochem-Novabiochem, Laufelfingen, CH)과 61mg의 1-히드록시-1H-벤조트리아졸(Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)을 3ml의 N,N-디메틸포름아미드(Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL)에 용해하고, 45.4㎕의 N,N'-디이소프로필카보디이미드를 가하였다. 21℃에서 30분간 배양한 후, 0.3g의 아미노-HES10/0.4를 가하였다. 22℃에서 22시간 동안 흔든 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙-냉 1:1 혼합물(v/v) 23ml에 가하였다. 침전된 생성물을 4℃에서 원심분리하여 수거하고, 2ml의 물 및 1ml의 DMF에 재용해시키고, 전술한 바와 같이 다시 침전시켰다. 반응 생성물을 전술한 바와 같은 원심분리에 의해 수거하고, 10ml의 물에 재용해시키고, 물에 대하여 1일 동안 투석(SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)하고, 동결건조하였다.
실시예 2: 환원성 아미노화에 의한 G-CSF 컨쥬게이트의 합성
실시예 2.1(a): pH=7.4에서 비-산화된 환원 말단을 갖는 히드록시에틸 스타치와의 환원성 아미노화에 의한 G-CSF 컨쥬게이트의 합성 (비교예)
실시예 2.1에서는, HES-G-CSF 컨쥬게이트의 제조를 위하여 WO 03/074087호의 합성방법(실시예 12, 22~23면)을 사용하고자 하였다.
pH 7.4의 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼 중의 G-CSF(Amgen, Munchen, D의 Neupogen?, 또는 Aventis Pharma AG, Zurich, CH의 Granocyte?, 각각, 3mg/ml) 수용액 3.33㎕에, 동일 버퍼 중의 HES10/0.4(MW=10kD, DS=0.4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D, 79mg/ml) 용액 3.33㎕를 가하였다. 이 혼합물에, 동일 버퍼 중의 소듐 시아노보로하이드라이드 60mM 용액 3.33㎕를 가하고, 결과 혼합물을 22℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이어서, 새로이 제조된 소듐 시아노보로하이드라이드 60mM 용액 3.33㎕를 추가로 가하였다. 30시간의 배양시간 동안, 새로이 제조된 소듐 시아노보로하이드라이드 60mM 용액을 3.33㎕씩 총 5회 가하였다. 반응 혼합물을 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 아무런 반응도 관찰되지 않았다.
실시예 2.1(b): pH 5.0 내지 9.2에서 비-산화된 환원 말단을 갖는 히드록시에틸 스타치와의 환원성 아미노화에 의한 G-CSF 컨쥬게이트의 합성 (비교예)
주어진 버퍼 중의 G-CSF(Strathmann Biotec AG, Hamburg, D의 G-CSF, 3mg/ml) 수용액 3.33㎕에, 동일 버퍼 중의 HES(300mg/ml) 용액 3.33㎕를 가하였다. 이 혼합물을 4℃로 냉각하고, 동일 버퍼 중의 소듐 시아노보로하이드라이드 60mM 용액 3.33㎕를 가하고, 결과 혼합물을 4℃에서 20시간 동안 배양하였다.
다음과 같은 HES 조제 및 버퍼가 사용되었다:
a) 버퍼: pH 5.0의 0.1M 소듐 아세테이트 버퍼
- HES10/0.4(MW=10kD, DS=0.4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
- HES10/0.7(MW=10kD, DS=0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
- HES50/0.4(MW=50kD, DS=0.4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
- HES50/0.7(MW=50kD, DS=0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
b) 버퍼: pH 7.2의 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼
- HES10/0.7(MW=10kD, DS=0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
c) 버퍼: pH 8.3의 0.1M 소듐 보레이트 버퍼
- HES10/0.7(MW=10kD, DS=0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
d) 버퍼: pH 9.2의 0.2M 포타슘 보레이트 버퍼
- HES10/0.7(MW=10kD, DS=0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
각각의 반응 혼합물을 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 컨쥬게이션은 관찰되지 않거나, 무시할 수 있는 정도였다(반응 b) 내지d)에 대한 겔 스캔은 나타내지 않았다).
실시예 2.2: pH 5.0 내지 9.2에서 산화된 환원 말단을 갖는 히드록시에틸 스타치와의 환원성 아미노화에 의한 G-CSF 컨쥬게이트의 합성 (비교예)
주어진 버퍼 중의 G-CSF(Strathmann Biotec AG, Hamburg, D의 G-CSF, 3mg/ml) 수용액 3.33㎕에, 동일 버퍼 중의 옥소-HES(300mg/ml) 용액 3.33㎕를 가하였다. 이 혼합물을 4℃로 냉각하고, 동일 버퍼 중의 소듐 시아노보로하이드라이드 60mM 용액 3.33㎕를 가하고, 혼합물을 4℃에서 17시간 동안 배양하였다.
다음과 같은 HES 조제 및 버퍼가 사용되었다:
a) 버퍼: pH 5.0의 0.1M 소듐 아세테이트 버퍼
- 옥소-HES10/0.7(MW=10kD, DS=0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
- 옥소-HES50/0.4(MW=50kD, DS=0.4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
- 옥소-HES50/0.7(MW=50kD, DS=0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
b) 버퍼: pH 7.2의 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼
- HES10/0.7(MW=10kD, DS=0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
c) 버퍼: pH 8.3의 0.1M 소듐 보레이트 버퍼
- HES10/0.7(MW=10kD, DS=0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
d) 버퍼: pH 9.2의 0.2M 포타슘 보레이트 버퍼
- HES10/0.7(MW=10kD, DS=0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
각각의 반응 혼합물을 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 컨쥬게이션은 관찰되지 않거나, 무시할 수 있는 정도였다(반응 b) 내지d)에 대한 겔 스캔은 나타내지 않았다).
HES10/0.4(MW=10kD, DS=0.4)의 산화는, DE 196 28 705 Al에 의거하여 Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D에 의해 제조되었다.
실시예 2.3 : 퍼아이오데이트 산화에 의해 합성된 알데히드 작용기화된 히드록시에틸 스타치에 의한 환원성 아미노화를 통한 G-CSF 컨쥬게이트의 합성
0.1 M 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.0) 중의 G-CSF(Granocyteⓡ from Aventis Pharma AG, Zurich, CH, and Neupogenⓡ from Amgen, Munchen, D, 각각 3 mg/mL) 수용액 3.33㎕에 동일 완충액중의 알데히도-HES (79 mg/mL) 용액 3.33 ㎕를 가하였다. 혼합물에 동일 완충액 중의 60 mM 소듐 시아노보로하이드리드 용액 3.33 ㎕를 가하고 21 ℃에서 25 시간동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 겔 전기영동으로 분석하였다.
하기 알데히드 작용기화된 HES 컨쥬게이트를 사용하였다.
(i-N) 상기 실시예 1.1(a)에 따라 Neupogenⓡ 을 사용하여 제조된 것;
(ii-N) 상기 실시예 1.1(b)에 따라 Neupogenⓡ 을 사용하여 제조된 것;
(iii-N) 상기 실시예 1.2(a)에 따라 Neupogenⓡ 을 사용하여 제조된 것;
(iv-N) 상기 실시예 1.2(b)에 따라 Neupogenⓡ 을 사용하여 제조된 것;
(i-G) 상기 실시예 1.1(a)에 따라 Granocyteⓡ 을 사용하여 제조된 것;
(ii-G) 상기 실시예 1.1(b)에 따라 Granocyteⓡ 을 사용하여 제조된 것;
(iii-G) 상기 실시예 1.2(a)에 따라 Granocyteⓡ 을 사용하여 제조된 것;
(iv-G) 상기 실시예 1.2(b)에 따라 Granocyteⓡ 을 사용하여 제조된 것.
실시예 2.4 : 포밀-카복실산에 히드록시에틸 스타치를 컨쥬게이션하여 합성된 알데히드 작용기화된 히드록시에틸 스타치에 의한 환원성 아미노화를 통한 G-CSF-컨쥬게이트의 합성
0.1M 소듐 아세테이트 완충액 (pH 5.0) 중의 G-CSF(G-CSF from Strathmann Biotec AG, Hamburg, D, 3 mg/ml) 수용액 3.33 ㎕에 동일 완충액 중의 알데히도-HES (118.5 mg/mL) 수용액 3.33 ㎕를 가하고 4 ℃로 냉각시켰다. 혼합물에 동일 완충액 중의 60 mM 소듐 시아노보로하이드리드 용액 3.33 ㎕를 4 ℃에서 가하고 4 ℃에서 17 시간동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 겔 전기영동으로 분석하였 다.
하기 알데히드 작용기화된 HES 컨쥬게이트를 사용하였다.
(v) 상기 실시예 1.4에 따라 제조된 것;
(vi) 상기 실시예 1.5에 따라 제조된 것;
(vii) 상기 실시예 1.6에 따라 제조된 것;
(viii) 상기 실시예 1.7에 따라 제조된 것;
(ix) 상기 실시예 1.8에 따라 제조된 것.
실시예 2.5 : 포밀-카복실산에 히드록시에틸 스타치를 컨쥬게이션하여 합성된 알데히드 작용기화된 히드록시에틸 스타치에 의한 환원성 아미노화를 통한 G-CSF-컨쥬게이트의 합성
0.1M 소듐 아세테이트 완충액 (pH 5.0) 중의 G-CSF(G-CSF from Strathmann Biotec AG, Hamburg, D,, 2.27 mg/ml) 수용액 2.5 ㎖에 상기 실시예 1.3에 따라 제조된 알데히도-HES10/0.4 136 ㎎을 가하고, 용액을 0 ℃로 냉각시켰다. 혼합물에 동일 완충액 중의 빙 냉각된 40 mM 소듐 시아노보로하이드리드 용액 2.5 ㎖를 가하고 4 ℃에서 17 시간동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 겔 전기영동으로 분석하였다.
실시예 3: SH 알킬화에 의한 G- CSF 컨쥬게이트의 합성
옥소-HES10/0.7 (MW = 10 kD, DS = 0.7)을 DE 196 28 705 Al에 따라 독일 로스바흐-로드하임의 수프라몰 파렌테랄 콜로이드 게엠베하 (Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)가 제조하였다.
무수 디메틸 설폭시드 (DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) 20 ml에 옥소-HES 10/0.7 6.0 g (0.6 mmol)을 녹이고, 이를 질소 대기하에 무수 디메틸 설폭시드 11 ml 중의 1,4-디아미노부탄 6 ml (60 mmol) 용액에 적가한 다음 40 ℃에서 19 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에탄올 80 ml 및 아세톤 80 ml의 혼합물에 가하였다. 생성된 침전을 원심분리하고 에탄올 20 ml 및 아세톤 20 ml의 혼합물로 세척하고 물 80 ml에 다시 녹였다. 용액을 물에 대하여 4일간 투석하고 (SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), 동결건조시켰다. 아미노-HES10/0.7의 수율은 52% (3.15 g)이었다.
소듐 포스페이트 완충액 (0.1 M, 0.15 M NaCI, 50 mM EDTA, pH 7.2) 100 ㎕에 녹인 아미노-HES10/0.7 132 ㎍에 무수 DMSO 중의 17.5 mg/ml N-알파(말레이미도아세톡시)숙신이미드 에스테르 (AMAS) 용액 10 ㎕ (둘다 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)를 가하고, 맑은 용액을 25 ℃에서 80분간 인큐베이션한 후 40 ℃에서 20분간 인큐베이션하였다. 과잉 AMAS를 VIVASPIN 0.5 ml 농축기 및 5KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D)를 사용하여 13,000 rpm으로 원심 여과하여 제거하고, 포스페이트 완충액 450 ㎕를 사용하여 30분간 2회 세척한 다음, 완충액 B 450 ㎕로 1회 세척하였다. 잔류 용액에 G-CSF(Neupogenⓡ from Amgen, Munchen, D 및 Granocyteⓡfrom Aventis Pharma AG, Zurich, CH, 각각 포스페이트 완충액 중의 3 ㎍/㎕)를 가하고, 혼합물을 25 ℃에서 16 시간동안 인큐베이션하였다. 반응혼합물을 진공하에 농축시킨 후 겔 전기영동으로 분석하였다.
하기 방법을 사용하였다:
(x) 완충액 B로 소듐 포스페이트 완충액 (0.1 M, 0.15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.2)를 사용한 G-CSF (Granocyteⓡ).
(xi) 완충액 B로 소듐 포스페이트 완충액 (0.1 M, 0.15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.2)를 사용한 G-CSF (Neupogenⓡ).
(xii) 완충액 B로 소듐 포스페이트 완충액 (0.1 M, 0.15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.2) 및 8 M 우레아, 1% SDS, pH 7.4의 1:1 (v/v) 혼합물을 사용한 G-CSF (Granocyteⓡ).
(xiii) 완충액 B로 소듐 포스페이트 완충액 (0.1 M, 0.15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.2) 및 8 M 우레아, 1% SDS, pH 7.4의 1:1 (v/v) 혼합물을 사용한 G-CSF (Neupogenⓡ).
(xiv) 완충액 B로 8 M 우레아, 1% SDS, pH 7.4를 사용한 G-CSF (Granocyteⓡ).
(xv) 완충액 B로 8 M 우레아, 1% SDS, pH 7.4를 사용한 G-CSF(Neupogenⓡ).
실시예 4 : 반응성 에스테르 그룹을 갖는 히드록시에틸 스타치와 G- CSF 의 반응에 의한 G- CSF 컨쥬게이트의 합성
실시예 4.1 :
옥소-HES10/0.4 (MW = 10,559 D, DS = 0.4)을 DE 196 28 705 Al에 따라 독일 로스바흐-로드하임의 수프라몰 파렌테랄 콜로이드 게엠베하 (Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)가 제조하였다. 옥소-HES의 산화 정도는 95% 이었다.
옥소-HES10/0.4 66 mg을 무수 DMF 0.5 ml에 녹였다. 이 용액에 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트 3.4 ㎎을 가하고, 혼합물을 실온에서 2 시간동안 교반하였다. 생성된 용액의 반응성 HES 농도는 13 중량% 이었다.
농도가 ml 당 G-CSF 약 0.5 mg인 G-CSF (Strathmann Biotec AG, Hamburg, D) 용액을 냉각된 원심분리기를 사용하여 10 kD 컷오프에서 초원심분리하여 10 mg/ml의 농도로 농축시켰다.
상기 농축된 G-CSF 용액 0.5 ml에 소듐 바이카보네이트 용액 180 ㎕를 가하였다. 단백질 용액에 반응성 HES 용액 3 분획 (각각 100 ㎕)을 약 30분이 경과하기까지 적가하여 반응을 종료시켰다. 이에 따라 반응성 HES:G-CSF 의 전체적인 몰비는 20:1이 되었다. 0.1 N HCl을 사용하여 혼합물의 pH를 4.0 으로 조정하였다.
HPGPC 분석 (High-Performance Gel Permeation Chromatography)에 의한 수율은 약 70 % 이었다. 결과는 도 9에 나타내었다.
혼합물을 pH 4.0, 4 ℃에서 4일간 보관할 수 있으며, HPGPC 분석에 따라 안정한 상태를 유지하는 것으로, 즉, 변화하지 않는 것으로 확인되었다.
미반응 옥소-HES, 자유(free) N-히드록시숙신이미드, 용매와 같은 혼합물 내의 반응 부산물들의 함량을 줄이기 위하여 냉각 원심분리기 내의 10 kD 한외여과막을 어려움 없이 사용할 수 있었다. 이 실험의 결과를 도 10에 나타내었다.
실시예 4.2 :
옥소-HES10/0.4 (MW = 10,559 D, DS = 0.4)을 DE 196 28 705 Al에 따라 독일 로스바흐-로드하임의 수프라몰 파렌테랄 콜로이드 게엠베하 (Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)가 제조하였다. 옥소-HES의 산화 정도는 95% 이었다.
옥소-HES10/0.4 400 mg을 무수 DMF 1 ml에 녹였다. 이 용액에 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트 21 ㎎을 가하고, 혼합물을 실온에서 2 시간동안 교반하였다. 생성된 용액의 반응성 HES 농도는 40 중량% 이었다.
농도가 ml 당 G-CSF 약 0.5 mg인 G-CSF (Strathmann Biotec AG, Hamburg, D) 용액을 냉각된 원심분리기를 사용하여 10 kD 컷오프에서 초원심분리하여 10 mg/ml의 농도로 농축시켰다.
상기 농축된 G-CSF 용액 0.5 ml에 소듐 바이카보네이트 용액 180 ㎕를 가하였다. 단백질 용액에 반응성 HES 용액 3 분획 (각각 100 ㎕)을 약 30분이 경과하기까지 적가하여 반응을 종료시켰다. 이에 따라 반응성 HES:G-CSF 의 전체적인 몰비는 50:1이 되었다. 0.1 N HCl을 사용하여 혼합물의 pH를 4.0 으로 조정하였다.
HPGPC 분석 (High-Performance Gel Permeation Chromatography)에 의한 수율은 95 % 초과였다. 미반응 G-CSF는 검출되지 않았다. 결과는 도 11에 나타내었다.
한외여과 기술을 사용하여 어려움 없이 혼합물을 정제하였다. 이 실험의 결 과를 도 12에 나타내었다.
실시예 5
5.1. 정제
상업 제품 Neupogenⓡ (Amgen)과 본질적으로 동일한 특성을 갖는 정제된 G-CSF를 얻고, 1분획을 대조군으로서 변형시키지 않은 채 보관하였다.
5.2 HES 및 G- CSF 컨쥬게이트의 합성
컨쥬게이트는 옥소-HES50/0.7 (샘플 코드 A60)을 사용하는 점을 제외하고는 본질적으로 실시예 4.2와 동일한 방법으로 합성하거나, 실시예 2.5 (샘플 코드 A32)의 방법에 따라 합성하였고, 추후 완충액 교환 및 정제에 사용하였다.
5.3 음이온-교환 크로마토그래피에 의한 정제 전에 G- CSF 및 HES-변형된 G-CSF 샘플의 완충액 교환
비바스핀 6 농축기 유닛 (Vivaspin 6 Concentrator units; 10.000 MWCO PES, Vivascience, Cat. Nr. VS0602)을 사용하여 HES-변형된 G-CSF 샘플 또는 변형되지 않은 G-CSF (대조군) (0.5-5 mg 단백질)를 완충액 교환하였다. 샘플을 0.5-0.7 ml로 농축시키고 10 mM Na-포스페이트 완충액 (pH 7.2)를 사용하여 5 ml로 희석하였다. 각 샘플에 대해 이러한 농축/완충액 교환 사이클을 3회씩 수행하였다.
5.4 DEAE - 세파로스 칼럼 상에서 G- CSF 및 그의 HES-변형 형태의 음이온 교환 크로마토그래피
HES-변형시킨 G-CSF 샘플, 그리고 비교를 위한 비변형 G-CSF를 기술된 바와 같이 AKTA 익스플로러 10 시스템을 사용하여 실온에서 음이온 교환 크로마토그래피하여 정제하고 분석하였다. HES화 전후의 G-CSF 분획을 완충액 A (10 mM Na-포스페이트, pH 7.2)에 대하여 한외여과하여 투석하거나, 완충액 A 약 13 부피(volume)로 희석하였다. DEAE-세파로스 (DEAE-Sepharose CL-6B, Pharmacia Kat. Nr. 17-0710-01) 2 ml를 함유한 칼럼에 5.0 칼럼 부피 (CV)의 6.5 M 구아니딘/HCl, 5.0 CV의 완충액 A, 5.0 CV의 완충액 C (10 mM Na-포스페이트 중의 1.5 M NaCl, pH 7.2), 및 10 CV의 완충액 A를 적용하여 재생시켰다. 0.6 ml/분의 유속으로 샘플 (10 mM Na-포스페이트 완충액(pH 7.2 중의 0.8-4.5 ml)을 주입하였다. 완충액 A 10 ml (2 ml 샘플 루프) 또는 20 ml (5 ml 샘플 루프)로 샘플 루프를 세척한 후, 적용된 샘플에 따라 칼럼을 0-22 CV의 완충액 A로 추가 세척하였다 (유속 = 0.8 ml/분). 0.6 ml/분의 유속에서 5 CV에 걸쳐 0-100% 완충액 B의 선형 구배를 적용하여 용출시키고, 2.5 CV의 100% 완충액 B를 사용하여 일정용매 전개(isocratic run)를 실시하였다. 5 CV의 완충액 A를 사용하여 칼럼을 재평형화하고 1 ml/분의 유속으로 상기 설명한 바와 같이 재생시켰다.
필요한 경우, 비바스핀 농축기(Vivaspin concentrator)를 사용하여 샘플을 농축시키고 상기 설명한 방법에 따라 완충액 교환하였다. 0.2 ㎛ 여과 유닛(Corning, Cat. No. 431215)을 사용하여 멸균 여과 하기 전후에 10 mM Na-아세테이트 완충액 (pH 4.0) 중에 0-8 ℃에서 샘플을 보관하였다. 시험관내 생화학적 정량(bioassay) 및 추가의 화학 분석을 위하여 하기 샘플을 제조하였다. 단백질 농축은 하기 섹션 6.1에 기술된 방법으로 결정하였다.
I. 0401-15/A33, 0.44 mg/ml, 부피 = 500 ㎕
G-CSF (E.coli)
II. 0402-03/A60, 0.35 mg/ml, 부피 = 600 ㎕
H-G-CSF (HES 변형된 G-CSF, 10/0.4)
III. 0401-13/A32, 0.28 mg/ml, 부피 = 900 ㎕
HES 변형된 G-CSF (E.coli), 10/0.4
IV. 0401-28/A58, 0.60 mg/ml, 부피 = 350 ㎕
Neupogen
V. 0401-28/A57, 0.50 mg/ml, 부피 = 400 ㎕
Neulasta
5.5. G- CSF 샘플의 추가 분석
샘플 분획의 단백질 함량 및 변형을 분석하였다.
5.5(a) RP- HPLC 에 의한 G- CSF 단백질 정량
비변형 단백질 (농도: 0.453 mg/ml)을 표준으로 하여 샘플중의 G-CSF 단백질 함량을 정량하였다.
펌프 P 680 A HPG, 가스 제거 유닛 Degasys DG 1210, 오토 샘플러 및 주입기 ASI-100, 샘플 루프 250 ㎕, 온도 조절 장치가 부착된 칼럼 부문 TCC 100, 및 소프트웨어 크로멜레온 크로마토그래피 매니지먼트 시스템이 장착된 UV/Vis-Detektor UVD170U로 구성된 Dionex HPLC 시스템을 사용하였다. 예비 칼럼 CC 8/4 Nucleosil 120-5 C4 (Macherey-Nagel, Cat. No. 721889) 및 분리 칼럼 40 C-4 Nucleosil MPN, 5 ㎛, 125 x 4 mm RP-칼럼 (Macherey-Nagel, ordering No. 7200 45.40)을 사용하였다. 용매 A는 H20 플러스 0.06% (v/v) 트리플루오로아세트산이고, 용매 B는 0.06 % (v/v) 트리플루오로아세트산을 함유하는 90 % 아세토니트릴 수용액이며, 유속은 1 ml/분이었다. 214, 221, 260 및 280 nm 파장에서 UV 검출하였다.
대략 10-20 ㎍의 샘플을 RP-HPLC 칼럼에 주입하였다. 하기 구배를 사용하였다:
0-5 분: 0-10 % B
- 17 분: 10-45 % B
- 35 분: 45-80 % B
- 36 분: 80-100 % B
- 38 분: 100 % B
- 39 분: 10% B
- 45 분: 10% B
표준 G-CSF의 용출 위치에서 생긴 피크 면적을 사용하여 280 nm 파장에서 약 29 분에 보인 피크와 비교함으로써 참조 표준과 비교하였다.
5.5 (b) G- CSF 단백질의 환원 + 카복스아미도메틸화
문헌[Guillermina Forno, Mariela Bollati Fogolin, Marcos Oggero, Ricardo Kratje, Marina Etcheverrigaray, Harald S. Conradt, Manfred Nimtz (2004) 차이니스 햄스터 오바리 세포주로부터 분비된 재조합 인간 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자에서의 N- 및 O-결합 탄수화물 및 글리코실화 부위 빈도; European J. Biochem, 273 (5), 907-919]에 기재된 방법에 따라 G-CSF 단백질 샘플 분획을 환원시키고 카복스아미도메틸화시켰다. 카복스아미도메틸화에 의해 시스테인 잔기가 변형되었다. 1M 우레아 (pH 7.8)을 함유하는 25 mM NH4HCO3 에서 카복스아미도메틸화된 단백질을 0.2:10의 효소/기질 비율에서 18-24 시간동안 엔도프로테이나제 Glu-C로 분해하였다.
5.5 (c) RP- HPLC 에 의한 Endo - Glu -C 펩티드의 분리
펌프 P 680 A HPG, 가스 제거 유닛 Degasys DG 1210, 오토 샘플러 및 주입기 ASI-100, 샘플 루프 250 ㎕, 온도 조절 장치가 부착된 칼럼 부문 TCC 100, 및 소프트웨어 크로멜레온 크로마토그래피 매니지먼트 시스템이 장착된 UV/Vis-Detektor UVD170U로 구성된 Dionex HPLC 시스템을 사용하여 Endo-Glu-C 분해에 의해 생성된 펩티드를 분리하였다. 예비 칼럼 CC 8/4 Nucleosil 120-5 C4 (Macherey-Nagel, Cat. No. 721889) 및 분리 칼럼 40 C-4 Nucleosil MPN, 5 ㎛, 125 x 4 mm RP-칼럼 (Macherey-Nagel, ordering No. 7200 45.40)을 사용하였다. 용매 A는 H20 플러스 0,06% (v/v) 트리플루오로아세트산이고, 용매 B는 0,06 % (v/v) 트리플루오로아세트산을 함유하는 90 % 아세토니트릴 수용액이며, 유속은 1 ml/분이었다. 하기 구배를 적용하였다:
0-5 분: 10% B
- 17 분: 45 % B
- 65 분: 100 % B
- 67 분: 100 % B
- 69 분: 10% B
- 75 분: 10 % B
214, 221, 260 및 280 nm 파장에서 UV 검출하였다. Endo-Glu-C 분해에 의해 생성된 펩티드를 분리하였다 (데이터는 나타내지 않음).
5.5 (d) MALDI / TOF / TOF -MS (Matrix-Assisted Laser Desorption /Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry)에 의한 단백질분해 펩티드의 분석
준비된 상이한 샘플에서 G-CSF의 온전한 N-말단을 검출하기 위하여 질량분석법(Mass spectrometry)을 사용하였다. 환원되고 카복스아미도메틸화된 단백질 샘플의 엔도프로테이나제 Glu-C 분해에 의해 생성된 샘플 (3-5 ㎍)을 직접적으로 MS-분석에 사용하고(스텝 6.3의 RP-HPLC 없이), 제조자의 지시에 따라 C18 역상 물질을 함유하는 ZipTip 피펫 팁을 사용하여 정제하였다. 포름산 0.1% (v/v)로 세척한 후, 60% (v/v) 아세토니트릴 중의 0.1% (v/v) 포름산 10 ㎕를 사용하여 펩티드를 용출시켰다.
아세토니트릴 400 ㎕ 중의 3,5-디메톡시-4-히드록시-신남산 22.4 ㎎ 및 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산 수용액 600 ㎕의 매트릭스를 사용하여 선형 포지티브 이온 모드에서 BrukerULTRAFLEX time-of-flight (TOF/TOF) 기기로 단백질분해성 (Endo-Glu-C) 펩티드 단편을 분석하고; 동일 용매 혼합물 중의 α-시아노-4-히드록시신남산 19 mg의 매트릭스를 사용하고 개선된 해상도(resolution)를 위한 리플렉트론(reflectron)법을 사용하여 (글리코)펩티드를 측정하였다. 대략 1-10 pmol·㎕-1 농도의 샘플 용액 1 ㎕를 동량의 각 매트릭스와 혼합하였다. 혼합물을 스테인레스 스틸 표적(target)에 점적하고 분석 전에 실온에서 건조시켰다. 질량 범위 900-5000 달톤에서 스펙트라를 기록하였다. 하기 표는 각 G-CSF 펩티드에 대해 예측된 질량과 관련시킨 것이다.
표: XM02로부터 생성된 Endo-Glu-C 펩티드의 이론적 (단일동위원소) 질량
Figure 112006009433098-pct00088
시스테인 잔기가 카복스아미도메틸화되었고; 지질(fat)로 표지된 펩티드를 비변형 G-CSF의 MALDI/TOF 스펙트럼에서 검출하였다.
엔도프로테이나제 Glu-C를 사용하여 G-CSF를 상기 언급한 방법에 따라 단백질 분해적으로 처리한 후 단백질 포지션 1-20을 포함하는 N-말단 Endo-Glu-C 펩티드 (MTPLGPASSLPQSFLLKCLE; m/z 2189.1)를 샘플의 MALDI/TOF-MS 스펙트라에서 검출하였다.
5.6. 결과
5.6 (a) G- CSF 및 HES 변형된 변이체의 정제
A4 하에서 기술된 방법에 따라 DEAE-세파로즈 CL-6B 칼럼을 사용하여 A32, A60 및 비변형 G-CSF를 정제하였다.
비변형 샘플 0401-15/A33의 경우, 플로우-드로우(flow-through)에서 280 nm에서의 유의한 흡광을 보이지 않았으며, 40-50% 농도의 버퍼 B (0.16-0.20 M NaCl)에서 6 ml 부피로 용출된 단백질은 280 nm에서 660 mAU x ml x mg-1의 비피크 면적을 나타내었다.
샘플 0401-14/A32 (0401-15/A33 유래; 알데히도HES 10/0.4에 의한 HES 화)은 20-80% (0.08-0.32 M NaCl)의 광범위한 농도 구배의 버퍼 B에서 12 ml의 부피로 용출되었다. 280 nm에서 검출된 총 피크 면적의 약 90%는 플로우-드로우에서 발견되었으며, 용출 단백질과 비교하여 외견상으로 약간 더 고분자량인 총단백질의 약 50%를 함유하는 것으로 상기 도 13에 나타낸 SDS-PAGE 분석에 의해 검출되었다.
샘플 0402-03/A60 (실시예 4.2의 전체 절차에 따라 HES 10/0.4에 의해 HES 화)은 버퍼 B 20-80%의 유사 농도에서 10.5 ml의 부피로 용출되었다. 그러나, SDS-PAGE 분석에 의할 때, 이 경우에는 총 피크 면적의 약 35%가 플로우-드로우에서 280 nm에서 검출되었고, 이 분획에서는 비결합 단백질이 검출되지 않았다. 샘플 0401-15/A33의 비피크 면적과 비교하여 샘플 0402-03/A60의 용출액에서의 단백질 함량은 칼럼에 적용된 것으로 언급된 단백질 양에 비해 45% 더 높았다.
용출 분획의 피크 면적 (A280 nm)에 기초하여 비변형 G-CSF 단백질과 비교된 단백질 회수를 계산하였다.
표 1: 280 nm 검출에서 피크 면적의 비교
Figure 112006009433098-pct00089
** 단백질의 RP-HPLC 정량화에 의해 이 결과를 확인하였다.
5.6 (b) 엔도프로테이나제 Glu -C로 처리한 후 펩티드 매핑 (peptide mapping) 및 MALDI / TOF MS에 의한 단백질 분석
카복스아미도메틸화되고 비변형된 G-CSF (도 14) 및 시판 제품 Neupogen (데이터는 나타내지 않음)의 엔도프로테이나제 Glu-C 분해 결과 생성된 N-말단 펩티드를 MALDI/TOF-MS (MTPLGPASSLPQSFLLKC*LE, m/z 2189.1; 카복스아미도메틸화된 시스테인)로 분명하게 검출하였다. 이 시그널은 환원성 아미노화에 의해 HES-변형시킨 샘플 (도 15) 및 Neulasta (데이터는 나타내지 않음)에서는 보이지 않았는데, 이는 이 펩티드의 변형을 나타낸다. 활성화된 에스테르 화학에 의해 HES-변형된 G-CSF의 경우, 비변형 출발물질 A32의 것에 필적하는 상대적인 시그널 강도로 N-말단 펩티드를 검출하였는데 (도 16) 이는 이 유도체의 HES 변형이 상이한 아미노산 측쇄 에서 이루어졌음을 보여준다.
HES 변형된 G-CSF (샘플 A33 및 시판 제품 Neulasta)의 N-말단 서열분석 결과 N-말단이 블로킹되었으며, 사실상 이 단백질 유도체의 N-말단 메티오닌 잔기가 HES 유도체에 의해 변형되었음을 알 수 있었다. 아미노산 잔기 pos. 35-47 (KLCATYKLCHPEE ; 카복스아미도메틸화된 양쪽 시스테인 잔기 m/z 1648.78)을 포함하는 펩티드에 상응하는 시그널이 샘플 A60에서는 검출되지 않았으므로 리신 잔기의 하나 또는 둘다 (at pos 35 및 pos 41)가 HES에 의해 변형되었을 것이라고 결론지었다.
참고문헌:
Figure 112006009433098-pct00090
실시예 6: 실시예 2.5 및 4.2에서 수득되고 실시예 5에 따라 정제된 G- CSF -컨쥬게이트의 시험관내 결과: 마우스 NFS-60 세포에 대한 G- CSF 변이체의 유사분열 촉진성 ( mitogenicity )
G-CSF는 호중성 과립구 계통의 증식, 분화, 조혈 세포의 활성화에 특이적 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 마우스 NFS-60 세포를 사용하여 G-CSF 변이체의 유사분열 촉진능을 테스트하였다 (N. Shirafuji 등. , Exp. Hematol. 1989, 17,116-119). 외인성 IL-3 공급원으로서 5-10 % WEHI-3B (DSMZ, Braunschweig, D; DSMZ에 의해 기술된 방법에 따라 배양)와 10% 소 태자 혈청 (Gibco INVITROGEN GmbH, Karlsruhe, D)을 함유하도록 조절된 RPMI 배지에서 자란 세포를 원심분리하여 수확하고, 세척하고 24-웰 플레이트에 웰당 100,000 세포씩 나누었다. 세포를 WEHI-3B 를 함유하지 않도록 조절된 RPMI 배지에서 1 시간동안 37℃로 적응시킨 후 동일 배지에 희석시킨 G-CSF 성장 인자 샘플을 가하였다. NFS-60 세포를 정제된 G-CSF 변이체에 37 ℃에서 3 일간 노출시킨 후 세포를 전자적으로 계수하였다 (Casy TT Cell Counter, Scharfe System, Reutlingen, D). 결과를 도 12에 요약하였다. 도 12로부터 알 수 있듯이, 상이한 G-CSF 변이체 (0.5-50 pg/ml)는 성장 인자가 첨가되지 않은 배지와 비교하여 3 일 후에 세포 수에 있어서의 증가를 유발할 수 있었다.
비변형 대조군 단백질 G-CSF/A33 및 G-CSF/A58 은 매우 유사한 정도로 세포를 자극한 반면 (ED50=5-10 pg/ml) G-CSF 컨쥬게이트 G-CSF/A60, G-CSF/A32 및 G-CSF/A57은 비변형 단백질과 비교하여 활성에 있어서 미소한 감소만을 나타내었다 (ED50= 10-25 pg/ml) (도 8 참조).
실시예 7. G- CSF - 컨쥬게이트의 합성
실시예 7.1. 알데히도 -HES 유도체의 합성
실시예 7.1 (a) 아미노 HESlO /0.4의 합성
옥소 HES10/0.4 (MW = 10000 D, DS = 0.4, DE 196 28 705 A1에 따른 Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) 5.12 g을 진공하에 밤새 80℃로 가열하고, 질소 대기하에 무수 디메틸설폭시드 (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) 25 ml에 녹인 다음, 1,4-디아미노부탄 5.13 ml를 가하였다. 40℃에서 17 시간 동안 교반한 후 반응 혼합물을 빙 냉각된 아세톤 및 에탄올 1:1 혼합물(v/v) 150 ml에 가하였다. 침전된 생성물을 4℃에서 원심분리로 회수하고, 빙 냉각된 아세톤 및 에탄올 1:1 혼합물(v/v) 40 ml로 세척하고 원심분리로 회수하였다. 조생성물을 물 80 ml에 녹이고, 물에 대하여 4일간 투석한 다음 (SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 67% 이었다.
실시예 7.1 (b) 알데히도HESlO /0.4의 합성
4-포르밀벤조산 105 mg 및 1-히드록시-lH-벤조트리아졸 135 mg (둘다 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)을 N,N-디메틸포름아미드 (펩티드 합성 등급, Biosolve, Valkenswaard, NL) 7 ml에 녹이고, N,N'-디이소프로필카보디이미드 (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) 135 ㎕ 을 가하였다. 21℃에서 30분간 인큐베이션한 후, 아미노HES10/0.4 (1.1에서 기술된 방법에 따라 합성) 0.7g을 가하였다. 22℃에서 18 시간동안 진탕한 후, 반응 혼합물을 빙 냉각된 아세톤 및 에탄올 1:1 혼합물 (v/v) 42 ml에 가하였다. 침전된 생성물을 4℃에서 원심분리로 회수하고, DMF 5 ml에 다시 녹이고 상기 기술된 방법에 따라 에탄올/아세톤 42 ml로 침전시켰다. 원심분리하여 회수된 침전물을 물에 녹이고, 물에 대하여 1일간 투석하고 (SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 95% 이었다.
실시예 7.1(c) 아미노 HESlO /0.7의 합성
옥소-HES 10/0.7 (MW = 10000 D, DS = 0.7, DE 196 28 705에 따른 Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) 6.02 g을 질소 대기하에 무수 디메틸 설폭시드 (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) 32 ml에 녹이고 1,4-디아미노부탄 6.03 ml을 가하였다. 40℃에서 17 시간동안 교반한 후 반응 혼합물을 빙 냉각된 아세톤 및 에탄올 1:1 혼합물 (v/v) 150 ml에 가하였다. 침전된 생성물을 4℃에서 원심분리로 회수하고, 빙 냉각된 아세톤 및 에탄올 1:1 혼합물 (v/v) 40 ml로 세척하고 원심분리로 회수하였다. 조생성물을 물 80 ml에 녹이고, 물에 대하여 4일간 투석하고 (SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은52% 이었다.
실시예 7.1 (d) 알데히도HES10 /0.7의 합성
4-포르밀벤조산 150 mg 및 1-히드록시-lH-벤조트리아졸 230 mg (둘다 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)을 N,N-디메틸포름아미드 (펩티드 합성 등급, Biosolve, Valkenswaard, NL) 10 ml에 녹이고, N,N'-디이소프로필카보디이미드 (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) 204 ㎕ 을 가하였다. 21℃에서 30분간 인큐베이션한 후, 아미노HES10/0.7 (1.3에서 기술된 방법에 따라 합성) 1g을 가하였다. 22℃에서 19 시간동안 진탕한 후, 반응 혼합물을 빙 냉각된 2-프로판올 84 ml에 가하였다. 침전된 생성물을 4℃에서 원심분리로 회수하고, 물 50 ml에 다시 녹이고 물에 대하여 2일간 투석하고 (SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 83% 이었다.
실시예 7.1 (e) 아미노 HES30 /0.4의 합성
옥소-HES30/0.4 (MW = 30000 D, DS = 0.4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D, DE 196 28 705 A1에 따른 성분 몰비 사용) 5 g을 진공하에 밤새 80℃로 가열하고, 질소 대기하에 무수 디메틸설폭시드 (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) 28 ml에 녹인 다음, 1,4-디아미노부탄 1.67 ml를 가하였다. 40℃에서 17 시간동안 교반한 후 반응 혼합물을 빙 냉각된 아세톤 및 에탄올 1:1 혼합물(v/v) 175 ml에 가하였다. 침전된 생성물을 4℃에서 원심분리로 회수하였다. 조생성물을 물 40 ml에 녹이고, 물에 대하여 2일간 투석한 다음 (SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 결정되지 않았다.
실시예 7.1 (f) 알데히도HES30 /0.4의 합성
4-포르밀벤조산 130 mg 및 1-히드록시-lH-벤조트리아졸 153 mg (둘다 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)을 N,N-디메틸포름아미드 (펩티드 합성 등급, Biosolve, Valkenswaard, NL) 36 ml에 녹이고, N,N'-디이소프로필카보디이미드 (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) 110 ㎕ 을 가하였다. 21℃에서 30분간 인큐베이션한 후, 아미노HES30/0.4 (1.5에서 기술된 방법에 따라 합성) 2.61g을 가하였다. 22℃에서 22.5 시간동안 진탕한 후, 반응 혼합물을 빙 냉각된 아세톤 및 에탄올 1:1 혼합물 (v/v) 160 ml에 가하였다. 침전된 생성물을 4℃에서 원심분리로 회수하고, 빙 냉각된 아세톤 및 에탄올 1:1 혼합물 (v/v)로 세척하였다. 원심분리 후, 침전물을 물 30 ml에 녹이고, 물에 대하여 1일간 투석하고 (SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 81% 이었다.
실시예 7.1 (g) 아미노 HES30 /0.7의 합성
옥소-HES30/0.7 (MW = 30000 D, DS = 0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D, DE 196 28 705 A1에 따른 성분 몰비 사용) 5 g을 진공하에 밤새 80℃로 가열하고, 질소 대기하에 무수 디메틸설폭시드 (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) 28 ml에 녹인 다음, 1,4-디아미노부탄 1.67 ml를 가하였다. 40℃에서 17 시간동안 교반한 후 반응 혼합물을 빙 냉각된 아세톤 및 에탄올 1:1 혼합물(v/v) 175 ml에 가하였다. 침전된 생성물을 4℃에서 원심분 리로 회수하였다. 조생성물을 물 40 ml에 녹이고, 물에 대하여 2일간 투석한 다음 (SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 결정되지 않았다.
실시예 7.1 (h) 알데히도HES30 /0.7의 합성
4-포르밀벤조산 122 mg 및 1-히드록시-lH-벤조트리아졸 144 mg (둘다 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)을 N,N-디메틸포름아미드 (펩티드 합성 등급, Biosolve, Valkenswaard, NL) 34 ml에 녹이고, N,N'-디이소프로필카보디이미드 (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) 103 ㎕ 을 가하였다. 21℃에서 30분간 인큐베이션한 후, 아미노HES30/0.7 (1.7에서 기술된 방법에 따라 합성) 2.46g을 가하였다. 22℃에서 22.5 시간동안 진탕한 후, 반응 혼합물을 빙 냉각된 아세톤 및 에탄올 1:1 혼합물 (v/v) 160 ml에 가하였다. 침전된 생성물을 4℃에서 원심분리로 회수하고, 빙 냉각된 아세톤 및 에탄올 1:1 혼합물 (v/v)로 세척하였다. 원심분리 후, 침전물을 물 30 ml에 녹이고, 물에 대하여 1일간 투석하고 (SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 87% 이었다.
실시예 7.1 (i) 아미노 HES50 /0.7의 합성
옥소-HES50/0.7 (MW = 50000 D, DS = 0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D, DE 196 28 705 A1에 따른 성분 몰비 사용) 6.09 g을 진 공하에 밤새 80℃로 가열하고, 질소 대기하에 무수 디메틸설폭시드 (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) 32 ml에 녹인 다음, 1,4-디아미노부탄 1.22 ml를 가하였다. 40℃에서 17 시간동안 교반한 후 반응 혼합물을 빙 냉각된 아세톤 및 에탄올 1:1 혼합물(v/v) 150 ml에 가하였다. 침전된 생성물을 4℃에서 원심분리로 회수하고, 빙 냉각된 아세톤 및 에탄올 1:1 혼합물 (v/v) 40 ml로 세척하고, 원심분리로 회수하였다. 조생성물을 물 80 ml에 녹이고, 물에 대하여 4일간 투석한 다음 (SnakeSkin dialysis tubing, 3.5kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 82% 이었다.
실시예 7.1 (j) 알데히도HES50 /0.7의 합성
4-포르밀벤조산 125 mg 및 1-히드록시-lH-벤조트리아졸 174 mg (둘다 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)을 N,N-디메틸포름아미드 (펩티드 합성 등급, Biosolve, Valkenswaard, NL) 38 ml에 녹이고, N,N'-디이소프로필카보디이미드 (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) 155 ㎕ 을 가하였다. 21℃에서 30분간 인큐베이션한 후, 아미노HES50/0.7 (1.9에서 기술된 방법에 따라 합성) 3.8g을 가하였다. 22℃에서 19 시간동안 진탕한 후, 반응 혼합물을 빙 냉각된 아세톤 및 에탄올 1:1 혼합물 (v/v) 160 ml에 가하였다. 침전된 생성물을 4℃에서 원심분리로 회수하고, N,N-디메틸포름아미드 20 ml에 다시 녹이고, 상기 기술된 방법에 따라 빙 냉각된 아세톤 및 에탄올 1:1 혼합물 (v/v) 80 ml로 침전시켰다. 원심분리 후, 침전물을 물 50 ml에 녹이고, 물에 대하여 2일간 투석하고 (SnakeSkin dialysis tubing, 3.5 kD cut off, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 77% 이었다.
실시예 7.2 환원성 아미노화에 의한 HES-G-CSF 컨쥬게이트의 합성
실시예 7.2 (a) 버퍼 교환 A:
10 mM 소듐 아세테이트 중의 0.454 mg/ml 농도의 hG-CSF (XM02, BioGeneriX AG, Mannheim, D) 용액 33 ml, 50 mg/ml 솔비톨 및 0.004% 트윈 80 (pH 4.0)을 0℃에서 비바스핀 15R 농축기(Vivaspin 15R concentrator; VS15RH11, 5KD MWCO, Vivascience AG, Hannover, D)를 사용하여 4 ml까지 투석여과로 농축하고 0.1 M 소듐 아세테이트 버퍼 (pH 5.0)로 15 ml까지 다시 희석하였다. 이 투석여과를 2회 반복하였다. 마지막 투석여과 단계에서의 최종 농도는 3 mg/ml 이었다.
실시예 7.2 (b) hG - CSF 와 실시예 7.1 (b), 7.1 (d) 및 7.1 (j)의 알데히도 HES 유도체의 반응
0.1 M 소듐 아세테이트 버퍼 (pH 5.0)로 버퍼 교환을 완료한 hG-CSF 용액 1.67 ml (상기 7.2(a)에 기술된 방법에 따라)에 동일 버퍼 중의 HES-유도체 용액 1.67 ml 및 60 mM 소듐 시아노보로하이드리드 용액 1.67 ml를 가하고 용액을 4℃에서 15.5 시간동안 인큐베이션하였다. 모든 용액을 혼합 전에 0℃로 냉각하였다.
하기 최종 HES 농도를 사용하였다:
실시예 7.1(b) 및 7.1(d)에 따라 제조한 HES 유도체 39.4 mg/ml
실시예 7.1(j)에 따라 제조한 HES 유도체 197 mg/ml
반응 대조군으로서 HES50/0.7 (MW = 50000 D, DS = 0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) 197 mg/ml.
반응 혼합물을 겔 전기영동으로 분석하였다 (도 17 참조).
실시예 7.2 (c) 버퍼 교환 B:
10 mM 소듐 아세테이트 중의 0.454 mg/ml 농도의 hG-CSF (XM02, BioGeneriX AG, Mannheim, D) 용액 20 ml, 50 mg/ml 솔비톨 및 0.004% 트윈 80 (pH 4.0)을 15℃에서 비바스핀 15R 농축기(Vivaspin 15R concentrator; VS15RH11, 5KD MWCO, Vivascience AG, Hannover, D)를 사용하여 4 ml까지 투석여과로 농축하고 0.1 M 소듐 아세테이트 버퍼 (pH 5.0)로 15 ml까지 다시 희석하였다. 이 투석여과를 2회 반복하였다. 마지막 투석여과 단계에서의 최종 농도는 1.5 mg/ml 이었다.
실시예 7.2 (d) hG - CSF 와 실시예 7.1 (f) 및 7.1 (h)의 알데히도 HES 유도체의 반응
0.1 M 소듐 아세테이트 버퍼 (pH 5.0)로 버퍼 교환을 완료한 hG-CSF 용액 3.3 ml (상기 실시예 7.2(c)에 기술된 방법에 따라)에 동일 버퍼 중의 HES-유도체 789 mg의 용액 3.3 ml 및 60 mM 소듐 시아노보로하이드리드 용액 3.3 ml를 가하고 용액을 4℃에서 30 시간동안 인큐베이션하였다. 모든 용액을 혼합 전에 0℃로 냉 각하였다.
17 시간 후에 반응 조절을 위하여 샘플을 제거하였다. 반응 혼합물을 겔 전기영동으로 분석하였다 (도 18 참조).
실시예 7.3 N,N'- 숙신이미딜 카보네이트 커플링에 의한 HES- GCSF 컨쥬게이트의 합성
실시예 7.3 (a) 반응성 에스테르 그룹을 갖는 히드록시에틸 스타치와 G- CSF 의 반응에 의한 G- CSF 컨쥬게이트의 합성
옥소-HES10/0.7 (DE 196 28 705 Al에 따라 Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D 제조; 옥소-HES의 산화 정도는 95%) 400 mg을 무수 DMF 1 ml에 녹였다. 이 용액에 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트 21 mg을 가하고, 혼합물을 실온에서 2 시간동안 교반하였다. 생성된 용액은 40중량%의 반응성 HES 농도를 가졌다.
ml 당 약 0.5 mg G-CSF 농도의 G-CSF 용액 (Strathmann Biotec AG, Hamburg, D)을 냉각 원심분리기를 사용한 100 kD 컷-오프에서 한외 원심분리에 의해 10 mg/ml의 농도로 농축시켰다.
농축된 G-CSF 용액 0.5 ml에 소듐 바이카보네이트 용액 180 ㎕를 가하였다. 단백질 용액에 반응성 HES 용액 3 분획 (각각 100 ㎕)을 약 30분이 경과하기까지 적가하여 반응을 종료시켰다. 이에 따라 반응성 HES:G-CSF 의 전체적인 몰비는 약 50:1 이 되었다. 0.1 N HCl을 사용하여 혼합물의 pH를 4.0 으로 조정하였다.
HPGPC 분석 (High-Performance Gel Permeation Chromatography)에 의한 수율은 95% 초과였다. 미반응 G-CSF는 검출될 수 없었다. 결과는 도 19에 나타내었다.
실시예 7.4 시험관내 어세이
마우스 NFS-60 세포에 대한 G- CSF 변이체의 유사분열 촉진성
G-CSF는 호중성 과립구 계통의 증식, 분화, 조혈 세포의 활성화에 특이적 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 마우스 NFS-60 세포를 사용하여 G-CSF 변이체의 유사분열 촉진능을 테스트하였다 (N. Shirafuji 등. , Exp. Hematol. 1989, 17, 116-119). 외인성 IL-3 공급원으로서 5-10 % WEHI-3B (DSMZ, Braunschweig, D; DSMZ에 의해 기술된 방법에 따라 배양)와 10% 소 태자 혈청 (Gibco INVITROGEN GmbH, Karlsruhe, D)을 함유하도록 조절된 RPMI 배지에서 자란 세포를 원심분리하여 수확하고, 세척하고 24-웰 플레이트에 웰당 100,000 세포씩 나누었다. 세포를 WEHI-3B를 함유하지 않도록 조절된 RPMI 배지에서 1 시간동안 37℃로 적응시킨 후 동일 배지에 희석시킨 G-CSF 성장 인자 샘플을 가하였다. NFS-60 세포를 정제된 G-CSF 변이체 (실시예 5.3, 5.4에 따른 정제, 실시예 5.5(a)에 따른 단백질 정량):
Neupogen(뉴포겐)ⓡ, Neulasta(뉴래스타) ⓡ둘다 Amgen으로부터 구입
실시예 7.2(b)에서 제조된 "HES-GCFS10/0.4 컨쥬게이트",
실시예 7.2(b)에서 제조된 "HES-GCFS10/0.7 컨쥬게이트",
실시예 7.2(d)에서 제조된 "HES-GCFS30/0.4 컨쥬게이트",
실시예 7.2(d)에서 제조된 "HES-GCFS30/0.7 컨쥬게이트",
실시예 7.2(b)에서 제조된 "HES-GCFS50/0.7 컨쥬게이트",
실시예 7.3(a)에서 제조된 "HES-GCFS10/0.7 컨쥬게이트 (Supramol)",
"모의 배양(Mock incubation)" (= 반응 대조군, 197mg/ml HES50/0.7, MW 50000D, DS 7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach Rodheim, Germany)에 37 ℃에서 3 일간 노출시킨 후 세포를 전자적으로 계수하였다 (Casy TT Cell Counter, Scharfe System, Reutlingen, D). 결과를 표 2 및 도 20에 요약하였다. 모든 경우에서, 표 2 및 도 20에 나타낸 단백질 양은 컨쥬게이트 만의 G-CSF 함량을 나타내며, GlycoThera에 의해 결정된 농도에 기초한 것이다. 도 20으로부터 알 수 있듯이, 상이한 G-CSF 변이체 (2.5-250 pg/ml) 모두 성장 인자가 첨가되지 않은 배지와 비교하여 3 일 후에 세포 수에 있어서의 증가를 유발할 수 있었다. 모든 변이체는 250 pg/ml 농도에서 동일한 최대 유발 수준에 도달하였다.
표 2: G-CSF 변이체에 의해 유도된 마우스 NFS-60 세포의 증식
Figure 112006009433098-pct00091
실시예 7.5 랫트에서 hG - CSF 컨쥬게이트의 생체내 생물학적 효과
도착한 후 랫트 [수컷 CRL:CDⓡ 랫트 (7 주령), Charles River Deutschland GmbH, Sanghofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld)]를 무작위로 5 그룹으로 나누었다. 7일간의 환경 순응 후, 좋지 않은 상태의 랫트를 배제하고 여분의 동물로 대체하였다. 도착한 랫트의 체중은 181-203 g 이었다.
무작위로 선택된 랫트의 5 그룹 각각에 하기 비-컨쥬게이트되거나 컨쥬게이트된 G-CSF 샘플 (실시예 5.3, 5.4에 따른 정제, 실시예 5.5(a)에 따른 단백질 정량):
Neupogenⓡ, Neulastaⓡ 둘다 Amgen으로부터 구입
실시예 7.2(b)에서 제조된 "HES-GCFS10/0.4 컨쥬게이트" (10/0.4),
실시예 7.2(b)에서 제조된 "HES-GCFS10/0.7 컨쥬게이트" (10/0.7),
실시예 7.2(d)에서 제조된 "HES-GCFS30/0.4 컨쥬게이트" (30/0.4),
실시예 7.2(d)에서 제조된 "HES-GCFS30/0.7 컨쥬게이트" (30/0.7),
실시예 7.2(b)에서 제조된 "HES-GCFS50/0.7 컨쥬게이트" (50/0.7),
실시예 7.3(a)에서 제조된 "HES-GCFS10/0.7 Supramol" (S10/0.7),
"모의 배양" (= 반응 대조군, 197mg/ml HES50/0.7, MW 50000D, DS 7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach Rodheim, Germany) 및 비히클 대조군을 체중 kg 당 단백질 100 ㎍의 양으로 정맥주사 투여하였다 (주입 속도 15 sec/dosis, 비히클: 5ml PBS/체중 kg).
약한 에테르 마취하에 구후 정맥총(retrobulbar venous plexus)으로부터 EDTA 전체 혈액 약 200 ㎕의 혈액 샘플을 모든 동물로부터 채취하였다. 테스트 시작전 5일에 하룻밤 절식 후 아침에 모든 동물로부터 혈액을 한번 채취하였다. 테스트 시작후 1 내지 8일에 매일 2회씩 12시간의 간격으로 혈액을 채취하였다. 1일째 첫번째 혈액 샘플은 G-CSF/GCSF-컨쥬게이트 투여 전에 채취하였다.
Bayer ADVIATM 120(Fernwald, Germany)를 사용하여 백혈구(WBC)를 계수하였다. 결과를 도 21에 나타내었다.

Claims (78)

  1. 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)인 단백질 및 히드록시알킬 스타치(HAS) 폴리머에 알데히드 그룹, 케토 그룹 및 헤미아세탈기 그룹으로 구성되는 군 중에서 선택되는 작용 그룹 A가 도입되어 수득된 폴리머 유도체를 포함하는 컨쥬게이트 제조 방법으로서,
    폴리머 유도체의 적어도 하나의 작용 그룹 A와 단백질의 적어도 하나의 아미노 그룹인 작용 그룹 Z와 반응시켜 공유결합을 형성하는 것을 포함하고,
    추가로 작용 그룹 M 및 Q를 포함하는 이작용성 화합물과 폴리머를 반응시켜 작용 그룹 A가 도입된 폴리머 유도체를 제공하는 것을 포함하며,
    상기 작용 그룹 M은 폴리머와 반응하며, 하기의 화합물로 이루어진 군에서 선택되고,
    Figure 112011088591063-pct00126
    (상기 식에서 G는 O 또는 S이고, 만일 2가지로 존재하면, 독립적으로 O 또는 S이며, R'은 메틸이다.)
    상기 작용 그룹 Q는
    (i) 알데히드 그룹, 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹인 작용 그룹 A이거나, 또는
    (ii) 추가로 화학적으로 변형되어 알데히드 그룹, 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 제공하는 작용 그룹으로서, 하기의 화합물로 이루어진 군에서 선택되며,
    Figure 112011088591063-pct00127
    (상기 식에서 G는 O 또는 S이고, 만일 2가지로 존재하면, 독립적으로 O 또는 S이며, R'은 메틸이다),
    상기 폴리머 유도체와 단백질의 반응이 환원성 아미노화 반응인 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 히드록시알킬 스타치가 히드록시에틸 스타치인 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 히드록시에틸 스타치가 2 내지 200 kD의 분자량을 가지는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 이작용성 화합물의 작용 그룹 M이 폴리머와 반응하여 폴리머 유도체가 제공되고, 이때 이작용성 화합물의 작용 그룹 Q는 알데히드 그룹, 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹인 작용 그룹 A인 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 작용 그룹 M이 아미노 그룹(-NH2)을 포함하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 이작용성 화합물의 작용 그룹 M이 폴리머와 반응하여 폴리머 유도체가 제공되고, 이때 이작용성 화합물의 작용 그룹 Q는 제1항의 ii)에 정의된 작용 그룹으로서, 카복시 그룹 및 알데히드 그룹, 케토 그룹 또는 헤미아세탈 그룹을 포함하는 추가적인 화합물과 반응하여 알데히드 그룹, 케토 그룹 또는 헤미아세탈기 그룹인 작용 그룹 A가 도입된 폴리머 유도체가 제공되는 것인 방법.
  7. 제 5항에 있어서, M 및 Q가 아미노 그룹(-NH2)를 포함하는 방법.
  8. 삭제
  9. 제 6항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 화합물이 포르밀벤조산 또는 4-(4-포르밀-3,5-디메톡시페녹시)부티르산인 방법.
  10. 제 6항에 있어서, M이 아미노 그룹(-NH2)을 포함하고, Q가 베타 히드록시 아미노 그룹을 포함하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 폴리머를 그것의 산화된 환원 말단에서 적어도 이작용성 화합물의 작용 그룹 M과 반응시키는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 베타 히드록시아미노 그룹을 산화시켜 알데히드 그룹을 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 산화 반응이 퍼아이오데이트를 사용하여 수행되는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 7항 및 제9항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아미노화가 NaCNBH3의 존재 하에 수행되는 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 환원성 아미노화가 7 이하의 pH에서 수행되는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, pH가 6 이하인 방법.
  17. 제 1항 내지 제 7항 및 제9항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아미노화가 0 내지 25 ℃의 온도에서 수행되는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 7항 및 제9항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아미노화가 수성 매질 중에서 수행되는 방법.
  19. 제 1항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 컨쥬게이트.
  20. 하기 화학식의 구조를 갖는 컨쥬게이트:
    Figure 112011088591063-pct00128
    상기 식에서,
    단백질'는 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)의 잔여 부분이고,
    HAS'는 히드록시알킬 스타치(HAS)의 잔여 부분이고,
    R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 탄소 원자수가 2 내지 10인 히드록시알킬 그룹, 히드록시아릴 그룹, 히드록시아르알킬 그룹 또는 히드록시알크아릴 그룹이고,
    L은 탄소 원자수 1 내지 60의 선형, 측쇄, 사이클릭 탄화수소 잔기 및 이들의 조합에서 선택되는 탄화수소 잔기이다.
  21. 하기 화학식의 구조를 갖는 컨쥬게이트:
    Figure 112011088591063-pct00098
    상기 식에서,
    단백질'는 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)의 잔여 부분이고,
    HAS'는 히드록시알킬 스타치(HAS)의 잔여 부분이고,
    R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 탄소 원자수가 2 내지 10인 히드록시알킬 그룹, 히드록시아릴 그룹, 히드록시아르알킬 그룹 또는 히드록시알크아릴 그룹이고,
    L1 및 L2는 독립적으로 알킬, 아릴 또는 아르알킬 부위를 포함하는, 탄소 원자수 1 내지 60의 선형, 측쇄, 사이클릭 탄화수소 잔기 및 이들의 조합에서 선택되는 탄화수소 잔기이며,
    D는 L1에 결합된 작용기 F2 및 L2에 결합된 작용기 F3에 의해 형성된 결합이며,
    F2는 하기로 이루어진 군에서 선택되고,
    - C-C-이중 결합 또는 C-C-삼중 결합 또는 방향족 C-C-결합;
    - 티올 그룹 또는 히드록시 그룹;
    - 알킬 설폰산 히드라지드, 아릴 설폰산 히드라지드;
    - 1,2-디올;
    - 1,2 아미노-티오알코올;
    - 아지드;
    - 1,2-아미노알코올;
    - 아미노 그룹 -NH2 또는 아미노알킬 그룹, 아미노아릴 그룹, 아미노아르알킬 그룹, 또는 알크아릴아미노그룹;
    - 히드록실아미노 그룹 -O-NH2, 또는 히드록실알킬아미노 그룹, 히드록실아릴아미노 그룹, 히드록실아르알킬아미노 그룹, 또는 히드록살알크아릴아미노 그룹;
    - 각각 구조단위 -NH-O-을 포함하는 알콕시아미노 그룹, 아릴옥시아미노 그룹, 아르알킬옥시아미노 그룹, 또는 알크아릴옥시아미노 그룹;
    - 카보닐 그룹, -Q-C(=G)-M을 가지는 잔기,
    (여기에서 G는 O 또는 S이고, M은
    -- -OH 또는 -SH;
    -- 알콕시 그룹, 아릴옥시 그룹, 아르알킬옥시 그룹, 또는 알크아릴옥시 그룹;
    -- 알킬티오 그룹, 아릴티오 그룹, 아르알킬티오 그룹, 또는 알크아릴티오 그룹;
    -- 알킬카보닐옥시 그룹, 아릴카보닐옥시 그룹, 아르알킬카보닐옥시 그룹, 알크아릴카보닐옥시 그룹;
    -- Q가 존재하지 않거나 NH 또는 S 또는 O인 경우, 활성화된 에스테르이다);
    - -NH-NH2, 또는 -NH-NH-;
    - N02;
    - 니트릴 그룹;
    - 카보닐 그룹;
    - 카복시 그룹;
    - -N=C=O 그룹 또는 -N=C=S 그룹;
    - 비닐 할라이드 그룹, 또는 비닐 아이오다이드 또는 비닐 브로마이드 그룹 또는 트리플레이트;
    - -C≡C-H ;
    - -(C=NH2Cl)-O알킬;
    - -(C=O)-CH2-Hal 그룹 (여기에서 Hal은 Cl, Br, 또는 I이다);
    - -CH=CH-S02-;
    - 구조 -S-S-을 포함하는 디설파이드 그룹;
    - 그룹
    Figure 112011088591063-pct00129
    ; 및
    - 그룹
    Figure 112011088591063-pct00130
    ;
    F3는 F2와 화학 결합을 형성할 수 있는 작용 그룹이다.
  22. 제 21항에 있어서, L1은 -(CH2)n-이고, n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10인 컨쥬게이트.
  23. 제 21항에 있어서, L2는 탄소 원자수 6의 아릴 부위인 컨쥬게이트.
  24. 제 20항에 있어서, 히드록시알킬 스타치가 히드록시에틸 스타치인 컨쥬게이트.
  25. 제 24항에 있어서, 히드록시에틸 스타치가 2 내지 200 kD의 분자량을 가지는 컨쥬게이트.
  26. 제 19항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 동물의 치료에 사용하기 위한 컨쥬게이트.
  27. 제 19항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 따른 치료적 유효량의 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물.
  28. 제 27항에 있어서, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 희석제, 보조제 또는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  29. 조혈 또는 면역 기능 저하를 특징으로 하는 질환의 치료에 사용하기 위한 제 19항에 따른 컨쥬게이트.
  30. 제 29항에 있어서, 질환은 화학요법, 방사선 치료, 감염성 질환, 중증 만성 호중성 백혈구 감소증 또는 백혈병에 기인한 컨쥬게이트.
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 삭제
  77. 삭제
  78. 삭제
KR1020067002747A 2003-08-08 2004-08-06 히드록시알킬 스타치 및 ｇ-ｃｓｆ의 컨쥬게이트 KR101154343B1 (ko)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EPPCT/EP03/08859 2003-08-08
EPPCT/EP03/08858 2003-08-08
PCT/EP2003/008829 WO2004024776A1 (en) 2002-09-11 2003-08-08 Method of producing hydroxyalkyl starch derivatives
PCT/EP2003/008858 WO2004024761A1 (en) 2002-09-11 2003-08-08 Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin
PCT/EP2003/008859 WO2004024777A1 (en) 2002-09-11 2003-08-08 Hydroxyalkyl starch derivatives
EPPCT/EP03/08829 2003-08-08
US55228104P 2004-03-11 2004-03-11
EP04005874 2004-03-11
US60/552,281 2004-03-11
EP04005874.5 2004-03-11
PCT/EP2004/008818 WO2005014050A2 (en) 2003-08-08 2004-08-06 Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060037431A KR20060037431A (ko) 2006-05-03
KR101154343B1 true KR101154343B1 (ko) 2012-07-05

Family

ID=34139848

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067002747A KR101154343B1 (ko) 2003-08-08 2004-08-06 히드록시알킬 스타치 및 ｇ-ｃｓｆ의 컨쥬게이트

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP1660134B1 (ko)
KR (1) KR101154343B1 (ko)
AU (1) AU2004262921B2 (ko)
CA (1) CA2534418A1 (ko)
MX (1) MXPA06001358A (ko)
PL (1) PL1660134T3 (ko)
RU (1) RU2370281C2 (ko)
WO (1) WO2005014050A2 (ko)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
AU2003253399B2 (en) 2002-09-11 2010-10-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
CN101659704A (zh) 2004-03-11 2010-03-03 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 通过还原氨基化制备的羟烷基淀粉和蛋白质的偶联物
JP5396019B2 (ja) * 2004-03-11 2014-01-22 フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質とのコンジュゲート
CN103169984B (zh) 2006-07-25 2016-08-03 利普生技术有限公司 N末端聚唾液酸化
MX2010002448A (es) 2007-08-27 2010-10-04 Biogenerix Ag Formulacion liquida del g-csf conjugado.
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
WO2011131720A1 (en) 2010-04-20 2011-10-27 Octapharma Ag New stabilizing agent for pharmaceutical proteins
US20140221282A1 (en) 2011-05-25 2014-08-07 Astrazeneca Pharmaceuticals Lp Long duration dual hormone conjugates
AU2014234272A1 (en) * 2013-03-20 2015-10-08 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hydroxyalkyl starch derivatives as reactants for coupling to thiol groups
CA2907471A1 (en) * 2013-03-20 2014-09-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hydroxyalkyl starch derivatives as reactants for coupling to thiol groups
RU2546297C1 (ru) * 2013-11-19 2015-04-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Средство, улучшающее реологические свойства крови
US10188739B2 (en) 2014-02-27 2019-01-29 Xenetic Biosciences, Inc. Compositions and methods for administering insulin or insulin-like protein to the brain
EP3114138B1 (en) 2014-03-05 2021-11-17 Pfizer Inc. Improved muteins of clotting factor viii
RU2625039C1 (ru) * 2016-07-12 2017-07-11 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Химии Коми Научного Центра Уральского Отделения Российской Академии Наук Инъекционная лекарственная форма гидрофильного конъюгата гидроксиэтилкрахмала и 2,6-диизоборнил-4-метилфенола, способ ее получения и применения для лечения сердечно-сосудистых заболеваний

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
DE19628705A1 (de) 1996-07-08 1998-01-15 Fresenius Ag Neue Sauerstoff-Transport-Mittel, diese enthaltende Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung als Blutersatzstoffe
CA2233725A1 (en) * 1998-03-31 1999-09-30 Hemosol Inc. Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes
DE10112825A1 (de) * 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
DE10209821A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
AU2003253399B2 (en) * 2002-09-11 2010-10-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin

Also Published As

Publication number Publication date
EP1660134B1 (en) 2010-12-29
WO2005014050A2 (en) 2005-02-17
AU2004262921B2 (en) 2010-05-13
MXPA06001358A (es) 2006-05-15
RU2006106926A (ru) 2007-09-20
WO2005014050A3 (en) 2005-04-14
KR20060037431A (ko) 2006-05-03
PL1660134T3 (pl) 2011-05-31
CA2534418A1 (en) 2005-02-17
RU2370281C2 (ru) 2009-10-20
EP1660134A2 (en) 2006-05-31
AU2004262921A1 (en) 2005-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2005225513B2 (en) Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
KR101303620B1 (ko) 하이드록시알킬 스타치와 단백질의 컨쥬게이트
KR101154343B1 (ko) 히드록시알킬 스타치 및 ｇ-ｃｓｆ의 컨쥬게이트
KR101578955B1 (ko) 히드록시알킬 전분 유도체 및 이의 제조 방법
JP2012211329A (ja) ヒドロキシアルキルデンプンとｇ−ｃｓｆの複合体
WO2008012525A1 (en) Derivatisation of granulocyte colony-stimulating factor
JP2007501870A (ja) ヒドロキシアルキルデンプンとｇ−ｃｓｆの複合体
ES2357001T3 (es) Conjugados de almidón hidroxialquilico y de g-csf.
MXPA06010189A (en) Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150728

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160526

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170523

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180529

Year of fee payment: 7

LAPS Lapse due to unpaid annual fee