CN101918455B

CN101918455B - 羟烷基淀粉衍生物及其制备方法

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Publication number: CN101918455B
Application number: CN200880125164XA
Authority: CN
Inventors: F·哈克特; T·海; F·豪席尔德; H·克内勒; M·席梅尔; K·佐默迈尔
Original assignee: FREZENEWSKABUE GERMANY Co Ltd
Current assignee: FREZENEWSKABUE GERMANY Co Ltd
Priority date: 2007-12-14
Filing date: 2008-12-15
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2028-12-15
Also published as: IL206223A0; US20100305033A1; ZA201004220B; US8404834B2; EA018222B1; EP2070950A1; JP5486507B2; WO2009077154A8; IL206223A; BRPI0821133A2; WO2009077154A1; NZ586021A; KR101578955B1; EP2070950A8; KR20100099282A; US20130230898A1; AU2008337931B2; CN101918455A; JP2011506652A; EA201000798A1

Abstract

本发明涉及一种制备羟烷基淀粉衍生物的方法，包括：使羟烷基淀粉(HAS)通过HAS的任选氧化的还原末端与交联化合物的氨基M反应，所述交联化合物除了氨基之外还包含特别保护的羰基，即缩醛基或缩酮基。

Description

羟烷基淀粉衍生物及其制备方法

本发明涉及一种制备羟烷基淀粉衍生物的方法，包括：使羟烷基淀粉(HAS)通过HAS的任选氧化的还原末端与交联化合物的氨基M反应，所述交联化合物除了氨基之外还包含特别保护的羰基(即缩醛基或缩酮基)。该方法可以进一步包括由此获得的HAS衍生物与生物活性化合物的氨基通过烷基化，优选通过还原胺化进行反应。此外，本发明涉及通过本发明的方法可获得的或获得的HAS衍生物，还涉及这样的特定的HAS衍生物。本发明还涉及包含含有生物活性化合物的HAS衍生物的药物组合物，作为治疗剂或预防剂的这些HAS衍生物，及特定的HAS衍生物用于制备药物的用途。

羟烷基淀粉(HAS)，尤其是羟乙基淀粉(HES)，是天然存在的碳水化合物聚合物支链淀粉的取代的衍生物，其在玉米淀粉中以高达95重量％的浓度存在，且在体内由α-淀粉酶降解。特别是HES显示出有利的生物学性质，并在临床中用作血容量置换剂和用于血液稀释治疗(Sommermeyer 等人，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；Weidler 等人，1991，Arzneimittel-forschung/Drug Res.，41，494-498)。

现有技术中描述了一些制备羟乙基淀粉衍生物的方法。

DE 2616086公开了血红蛋白与羟乙基淀粉的偶联，其中，在第一步骤中，交联剂(如bromocyane)结合羟乙基淀粉，随后血红蛋白连接到中间产物上。

HES使用的一个重要方面是稳定应用于例如循环系统以获得特殊生理效应的多肽。这些多肽的一个具体例子是促红细胞生成素，它是分子量大约为34,000kDa的酸性糖蛋白，对于调节血液循环中血红细胞的水平是必需的。

多肽和酶应用的公知的问题是，这些蛋白质经常不能显示出理想的稳定性。尤其是，促红细胞生成素具有相对短的血浆半衰期(Spivak和Hogans，1989，Blood 73，90；McMahon等人，1990，Blood 76，1718)。这意味着，治疗血浆水平迅速丧失，因而必须进行重复的静脉施用。此外，在某些情况下，观察到对于肽的免疫反应。

人们普遍认为，当多肽与聚合物分子偶合时，多肽的稳定性可以得到改善，且对于这些多肽的免疫反应降低。

WO 94/28024公开了用聚乙二醇(PEG)修饰的生理活性的多肽显示出降低的免疫原性和抗原性，并在血流中的循环明显长于非偶联的蛋白质，即具有更长的清除率。但是，PEG-药物偶联物显示出一些缺点，例如，它们没有显示出可以由体内降解途径的元件识别的天然结构。因此，除了PEG-偶联物外，还制备了其他偶联物和蛋白质polymerates。

WO 02/080979公开了包含活性剂与羟烷基淀粉的偶联物的化合物，其中，活性剂和羟烷基淀粉直接连接或通过连接化合物连接。就直接连接而言，活性剂和羟烷基淀粉的反应在包含至少1O重量％的水的水性介质中进行。该专利文献没有给出涉及通过所述交联化合物的氨基连接到交联化合物上的羟烷基淀粉的例子(其中所述交联化合物进一步包含保护的羰基)。此外，没有给出显示出通过使所述HAS衍生物通过所述羰基与生物活性剂的氨基反应来获得HAS衍生物的例子。

WO 03/074087公开了羟烷基淀粉蛋白偶联物，其中，羟烷基淀粉分子和蛋白质之间的结合是共价的，且是由羟烷基淀粉的末端醛基或由所述醛基的反应产生的官能团与蛋白质的官能团偶合产生的。

WO 03/074088公开了羟烷基淀粉与低分子量化合物的偶联物，其中，羟烷基淀粉和低分子量化合物之间的结合是共价的，且是羟烷基淀粉的末端醛基或由所述醛基的反应产生的官能团与低分子量化合物的官能团偶合产生的。

WO 2005/014024公开了由氨氧基或其衍生物官能化的聚合物，偶联物，其中，官能化的聚合物通过肟连接基团与蛋白质共价偶合，还公开了制备官能化聚合物的方法，制备偶联物的方法，通过本发明的方法获得的官能团化聚合物，通过所述方法获得的偶联物，和包含至少一种偶联物的药物组合物，以及所述偶联物和组合物用于预防或治疗人类或动物身体的用途。

WO 2005/092390公开了羟烷基淀粉和蛋白质的偶联物，其中，这些偶联物通过羟烷基淀粉或羟烷基淀粉的衍生物与蛋白质之间的共价键合形成，以及公开了制备这些偶联物的方法和这些偶联物的用途。

WO 2004/024777公开了羟烷基淀粉衍生物，尤其是可通过羟烷基淀粉与连接化合物的伯氨基或仲氨基反应的方法获得的羟烷基淀粉衍生物。根据特别优选的实施方式，WO 2004/024777公开了可通过下述方法获得的羟烷基淀粉衍生物：羟烷基淀粉与连接化合物的伯氨基或仲氨基反应，产生的反应产物通过连接化合物的至少一个其他的反应基团与多肽，优选与糖蛋白，尤其优选与促红细胞生成素反应。特别优选的羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。根据WO 2004/024777，羟烷基淀粉且优选羟基乙基淀粉在没有在反应之前被氧化的其还原末端与连接化合物反应。

WO 2004/024776公开了羟烷基淀粉衍生物，尤其是可通过下述方法获得的羟烷基淀粉衍生物：羟烷基淀粉与交联化合物的伯氨基或仲氨基反应，或者与两个交联化合物反应，其中产生的羟烷基淀粉衍生物具有至少一个能够与另一种化合物的官能团Y反应的官能团X，且其中该另一种化合物的该基团Y是醛基、酮基、半缩醛基、缩醛基或硫醇基。根据特别优选的实施方式，WO 2004/024776涉及可通过下述方法获得的羟烷基淀粉衍生物：羟烷基淀粉与交联化合物的伯氨基或仲氨基反应，产生的反应产物任选地进一步与第二交联化合物反应，其中产生的羟烷基淀粉衍生物具有至少一个能够与另一种化合物的官能团Y反应的官能团X，且其中该基团Y是醛基、酮基、半缩醛基、缩醛基或硫醇基，且产生的反应产物与多肽，优选与如AT III、IFN-β或促红细胞生成素的多肽，尤其优选与促红细胞生成素反应，该多肽包含这些官能团Y中的至少一种。尤其优选的羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。根据WO2004/024776，羟烷基淀粉，优选羟基乙基淀粉，在反应之前任选氧化的还原末端与连接化合物反应。

WO 2005/092928公开了羟烷基淀粉(优选羟乙基淀粉)与蛋白质的偶联物，其中，这些偶联物通过羟烷基淀粉或羟烷基淀粉衍生物的至少一个醛基与蛋白质的至少一个氨基之间的还原胺化反应形成，使得羟烷基淀粉或其衍生物通过甲亚胺(azomethine)连接或氨基亚甲基(aminomethylene)连接与蛋白质共价连接。WO 2005/092928还涉及制备这些偶联物的方法及这些偶联物的特定用途。

US 2006/0194940A1公开了水溶性聚合物链烷醛。其中，公开了与聚合物反应的保护醛试剂。虽然一般地提及多糖，但特别优选的聚合物是聚乙二醇。US 2006/0194940A1并没有公开淀粉或尤其是改性淀粉(例如羟烷基淀粉)。因此，US 2006/0194940A1没有公开涉及将特定连接化合物与羟烷基淀粉偶合的具体方法。上述情况也存在于US7157546B2、EP 1591467A1和WO 2004/022630A2中。

US 6,916,962B2公开了未保护和保护形式的氨基乙缩醛交联化合物。该文件中没有公开有关该交联化合物可能与聚乙二醇之外的聚合物的偶合。特别是，US 6,916,962B2没有公开淀粉，更不用说改性淀粉如羟烷基淀粉。因此，US 6,916,962B2没有公开给定的连接化合物与羟烷基淀粉偶合的具体方法。上述情况也存在于US 6,956,135B2和WO 03/049699A2中。

US 5,990,237公开了包含保护的醛基的结构。包含这些结构的化合物优选与聚乙二醇偶合，且偶合经过作为含保护的醛基的化合物中包含的官能团的卤素进行，该卤素基团与聚乙二醇的羟基反应。

本发明的目的是提供一种获得羟烷基淀粉衍生物的新的方法。

本发明的进一步目的是提供新的羟烷基淀粉衍生物，如通过将HAS与特定官能化的交联化合物反应获得的或可获得的HAS衍生物。

本发明的另外一个目的是提供进一步的新的HAS衍生物，如通过将HAS衍生物(通过将HAS与特定官能化的交联化合物反应获得的或可获得的HAS衍生物)与生物活性化合物的合适的官能团反应获得的或可获得的HAS衍生物。

令人惊讶地发现，为了制备特定的HAS衍生物，可以使用交联化合物，所述交联化合物一方面可以通过氨基选择性地偶合到羟烷基淀粉的任选氧化的还原末端上，另一方面具有作为第二官能团的完全保护的羰基，即缩醛基或缩酮基。相比于使用具有游离的醛基或酮基或例如作为官能团的半缩醛基的交联化合物的实施方式，采用这种完全保护的基团大幅减少了以下风险：在HAS与交联化合物的反应过程中，在交联化合物分子间发生不希望的低聚反应(oligomerisation)或聚合。意想不到的是，据发现在没有至少部分地破坏羟烷基淀粉，尤其是羟乙基淀粉的以许多官能团(如缩醛基和醚基)为特征的特定化学结构的情况下，产生的HAS衍生物中包含的缩醛或缩酮基的脱保护是可能的。因此，本发明允许通过使各个交联化合物分子之间的低聚或聚合的风险最小化非常有效的制备第一HAS衍生物，同时具有在不至少部分破坏HAS结构的情况下产生的HAS衍生物中包含的官能团脱保护的可能性，以提供允许有效偶合生物活性化合物的HAS衍生物。

因此，本发明涉及一种制备羟烷基淀粉衍生物的方法，包括：

(i)将式(I)的羟烷基淀粉(HAS)

通过HAS的还原末端的碳原子C*与式(II)的交联化合物的氨基M反应，

M-L-A

其中，A是缩醛基或缩酮基；和L是桥连M和A的间隔物(spacer)，其中，C*在HAS与M反应之前任选被氧化，

从而获得式(III)的HAS衍生物

其中，X是氨基M与HAS通过HAS的任选氧化的还原末端的碳原子C*反应产生的官能团，和

其中，HAS′是羟烷基淀粉分子的其余部分，和R₁、R₂和R₃独立地为氢或者直链或分支羟烷基。

此外，本发明涉及通过本方法可获得的或获得的羟烷基淀粉(HAS)衍生物。

另外，本发明涉及式(III)的羟烷基淀粉(HAS)衍生物

其中，A是缩醛基或缩酮基；L是桥连X和A的间隔物；

其中，X是式(II)的交联化合物

M-L-A

的氨基M与式(I)的羟烷基淀粉(HAS)

通过HAS的碳原子C*反应产生的官能团，其中，C*在HAS与M反应之前任选被氧化，

羟烷基淀粉

在本发明中，术语“羟烷基淀粉”(HAS)指已被至少一个羟烷基取代的淀粉衍生物。本发明优选的羟烷基淀粉具有式(I’)的构成(constitution)：

其中，HAS′是羟烷基淀粉分子的其余部分，且R₁、R₂和R₃独立地为氢、直链或分支羟烷基或-[(CR¹R²)_mO]_n[CR³R⁴]_o-OH基团，

其中，R¹、R²、R³和R⁴独立地选自氢和烷基，优选氢和甲基，

m是2至4，其中，m个CR¹R²基团中的残基R¹和R²可以相同或不同；

n为0至20，优选0至4；

o是2至20，优选2至4，其中，o个CR³R⁴基团中的残基R³和R⁴可以相同或不同。

优选地，R₁、R₂和R₃独立地为基团-(CH₂CH₂O)_n-H，其中，n是整数，优选是0、1、2、3、4、5或6，且特别地，R₁、R₂和R₃独立地为氢或2-羟乙基。

在式(I)和(I’)中，淀粉分子的还原末端显示为非氧化形式，且HAS的末端糖单元显示为半缩醛形式，其可以根据例如溶剂的不同与(游离的)醛形式相平衡。用于本发明的缩写HAS′指在HAS分子的还原末端没有末端糖单元的HAS分子。这可以由用于本发明的术语“羟烷基淀粉分子的其余部分”来表示。

用于本发明的术语“羟烷基淀粉”并不局限于其中末端糖部分包含在式(I)和(I’)中为简洁起见所描述的羟烷基R₁、R₂和/或R₃的化合物，还指其中存在于任何位置的至少一个羟基(在末端糖部分中和/或在羟烷基淀粉分子的其余部分HAS′中)被羟烷基R₁、R₂和/或R₃取代的化合物。

包含两个或多个不同羟烷基的羟烷基淀粉也是可能的。

HAS中包含的至少一个羟烷基可以包含一个或多个，尤其是两个或多个羟基。根据优选的实施方式，HAS中包含的至少一个羟烷基包含一个羟基。

词语“羟烷基淀粉”还包括其中烷基被单取代或多取代的衍生物。在本文中，优选烷基被卤素(尤其是氟)或芳基取代。此外，羟烷基的羟基可以被酯化或醚化。

此外，可以使用直链或分支的取代或未取代的链烯基代替烷基。

羟烷基淀粉是淀粉的醚衍生物。除了所述醚衍生物，在本发明中也可以使用其他淀粉衍生物。例如，包含酯化羟基的衍生物是有用的。这些衍生物可以是，例如，未取代的2-12个碳原子的单或二羧酸的衍生物或其取代的衍生物。特别有利的是未取代的2-6个碳原子的单羧酸衍生物，尤其是乙酸衍生物。在本文中，乙酰淀粉、丁酰淀粉和丙酰淀粉是优选的。

此外，未取代的2-6个碳原子的二羧酸的衍生物是优选的。

在二羧酸衍生物的情况下，有用的是二羧酸的第二羧基也被酯化。此外，二羧酸的单烷基酯的衍生物也适用于本发明中。

对于取代的单或二羧酸，取代基可以优选地与上述对于取代的烷基残基的取代基相同。

淀粉酯化技术是本领域已知的(参见，例如，Klemm D.等人，Comprehensive Cellulose Chemistry第2卷，1998，Whiley-VCH，Weinheim，New York，尤其是第4.4章，Esterification of Cellulose(ISBN 3-527-29489-9))。

根据本发明优选的实施方式，使用上述式(I)的羟烷基淀粉。HAS′中包含的其他糖环结构可能与明确描述的糖环相同或不同，区别在于它们缺少还原末端。

对于式(I)的残基R₁、R₂和R₃没有特别的限制。根据优选的实施方式，R₁、R₂和R₃独立地为氢或在各自的烷基残基具有2到10个碳原子的羟烷基、羟基芳烷基或羟基烷芳基。优选氢和具有2至10个碳原子的羟烷基。更优选羟烷基具有2至6个碳原子，更优选2到4个碳原子，甚至更优选2到3个碳原子。在优选的实施方式，羟烷基淀粉是羟乙基淀粉，其中，R₁、R₂和R₃独立地为氢或(CH₂CH₂O)_n-H基团，其中，n是整数，优选是0、1、2、3、4、5或6。

因此，“羟烷基淀粉”优选包括羟乙基淀粉、羟丙基淀粉和羟基丁基淀粉，其中，羟乙基淀粉和羟丙基淀是特别优选的，且羟乙基淀粉是最优选的。

烷基、芳烷基和/或烷芳基可以是直链或分支的和被适当取代的。

因此，本发明还涉及如上所述的方法和HAS衍生物，其中，R₁、R₂和R₃独立地为氢或具有2至6个碳原子的直链或分支羟烷基。

因此，R₁、R₂和R₃优选可以为氢、羟己基、羟戊基、羟丁基、羟丙基(如2-羟丙基、3-羟丙基、1-羟异丙基)、羟乙基(如2-羟乙基)，氢和2-羟乙基是特别优选的。

因此，本发明还涉及如上所述的方法和HAS衍生物，其中，R₁、R₂和R₃独立地为氢或2-羟乙基，其中至少一个残基R₁、R₂和R₃是2-羟乙基的实施方式是特别优选的。

羟乙基淀粉(HES)对于本发明的所有实施方式是最优选的。

因此，本发明涉及如上所述的方法和HAS衍生物，其中，聚合物是羟乙基淀粉，且衍生物是羟乙基淀粉(HES)衍生物。

HAS，尤其是HES，主要由分子量分布、取代度和C₂∶C₆取代比来表征。有两种描述取代度的可能方式：

HAS的取代度(DS)对于取代的葡萄糖单体相对于所有葡萄糖部分的比例相对地进行描述。

HAS的取代模式也可以描述为摩尔取代度(MS)，其中计算每个葡萄糖部分的羟乙基的数目。

在本发明中，HAS(优选HES)的取代模式被称为MS，如上所述(也参见Sommermeyer等人，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278，尤其是第273页)

在HES分子全部水解后，通过气相色谱法测定MS。给出各个HAS(尤其是HES)起始原料的MS值。假定，在本发明方法的步骤a)和b)的衍生化过程中MS值不受影响。

HAS(尤其是HES)溶液作为多分散的组合物存在，其中各个分子在聚合度、分支位点的数目和模式及取代模式方面与其它分子不同。HAS(尤其是HES)因此是具有不同分子量的化合物的混合物。因此，在统计方法的帮助下，通过平均分子量确定特定的HAS(尤其是HES)溶液。在本文中，M_n计算为取决于分子数目的算术平均值。可选择地，M_w(或MW)，重均分子量，代表取决于HAS(尤其是HES)质量的单位。

在本文中，数均分子量通过等式1定义：

{\overset{&OverBar;}{M}}_{n} = \frac{\underset{i}{Σ} n_{i} \cdot M_{i}}{\underset{i}{Σ} n_{i}}

其中，n_i是摩尔质量为M_i的种类i的分子数目。

表示值是平均值，但横线(line)按照惯例通常省略。

M_w是重均分子量，由等式2定义：

{\overset{&OverBar;}{M}}_{w} = \frac{\underset{i}{Σ} n_{i} \cdot M_{i}^{2}}{\underset{i}{Σ} n_{i} M_{i}}

其中，n_i是摩尔质量为M_i的种类i的分子数目。

表明值是平均值，但横线按照惯例通常省略。

优选用于本发明中的羟烷基淀粉、尤其是羟乙基淀粉具有1到大约1000kDa，更优选大约1至大约800kDa，更优选大约1至大约500kDa的平均分子量(重量平均)。羟乙基淀粉可以进一步显示0.1至3、优选0.1至2、更优选0.1至0.9或0.4至2、优选0.4至1.3的优选摩尔取代度，和对于羟乙基的2至20的优选C₂∶C₆取代的比例。

用于本发明的术语“平均分子量”涉及根据Sommermeyer等人，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278和Weidler等人，1991，Arzneim.-Forschung/Drug Res.，41，494-498所述的LALLS-(小角激光光散射)-GPC方法测定的重量。另外，对于10kDa和更小的平均分子量，用预先通过LALLS-GPC证明的标准进行校准。

根据本发明优选的实施方式，使用的羟乙基淀粉的平均分子量是大约1至大约1000kDa，更优选大约1至大约800kDa，更优选大约1至大约500kDa，更优选大约2至大约400kDa，更优选大约5至大约300kDa，更优选大约10至大约200kDa，尤其是大约50至大约150kDa。

此外，HAS(尤其是HES)的摩尔取代度为优选大约0.1至大约3，优选大约0.4至大约1.3，如0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2或1.3。

具有大约5至300kDa、优选50到150kDa的平均分子量的HES的例子是具有0.1至3，优选是0.4至1.3，如0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2或1.3的摩尔取代度的HES。

至于C₂∶C₆取代的比例，所述取代比优选在2到20，更优选2到15，甚至更优选3至12的范围内。

除了羟烷基淀粉之外的其它淀粉

一般情况下，也可以使用除了上述羟烷基淀粉(尤其是羟乙基淀粉)之外的其他淀粉进行本发明的方法和制备本发明的衍生物，条件是这些淀粉也包含以半缩醛形式(任选地与(游离的)醛形式相平衡)存在的还原末端，该还原末端可以被适当氧化以产生相应的氧化形式。特别地，可以使用高度分支的、未取代的或低取代的淀粉产物，即具有比支链淀粉明显更高的分支度，并具有糖原的α-1，6分支程度，或者甚至超过糖原的α-1，6分支程度，并且如果取代的话，仅具有最高达0.3，优选0.05到0.3的摩尔取代度MS的淀粉。此处使用的术语高度分支的、未取代或低取代的淀粉产物的MS(摩尔取代度)是指每脱水葡萄糖单元的羟乙基或羟丙基基团的平均数。通常通过测定样品中羟乙基或羟丙基基团的含量和对其中存在的脱水葡萄糖单元的计算分配来测量MS。也可以通过气相色谱法测定MS。可以通过气相色谱甲基化分析以聚合物中的α-1，4，6-糖苷连接的脱水葡萄糖的摩尔％测定分支度。每种情况下分支度是平均值，因为本发明的高度分支的、未取代或低取代的淀粉产物是多分散的化合物。所述高度分支的、未取代或低取代的淀粉产物中葡萄糖单元通过α-1，4-和α-1，6-键连接。分支度是指以全部脱水葡萄糖中以总体的摩尔％计的α-1，4，6-连接葡萄糖单元的比例。C₂/C₆比例表示C₂处与C₆处取代的比例。高度分支的、未取代或低取代的淀粉产物具有可通过在分支酶帮助下的转糖苷步骤获得的优选6％至50％的分支度。甚至更优选地，分支度为10至45，更优选20至40(如20、25、30、35或40)。也优选为大于20至40，优选大于20至30如21到40，优选21至30。

可用于这一目的的起始原料在原则上可以为任何淀粉，但优选具有高比例支链淀粉的蜡质淀粉(waxy starch)或支链淀粉部分本身。淀粉产物(涉及这些“其他淀粉”)用于本发明必要的分支度以脱水葡萄糖的摩尔％表示在8％到20％的范围内。这意味着，可用于本发明目的的淀粉产物平均每12.5至5个葡萄糖单元具有一个α-1，6连接，因而具有一个分支点。优选的高度分支的、未取代或低取代的淀粉产物具有超过10％至高达20％，且尤其是11％至18％的分支度。较高的分支度意味着本发明的淀粉产物的较高溶解度和这些溶解的淀粉产物在体内的较高的生物利用度。特别优选具有超过10％，尤其是11％至18％的分支度的未改性淀粉产物。可以通过以使用所谓分支或转移酶的酶效应组装(enzymatic assembly)为靶标，在适当情况下接着用羟乙基或羟丙基对游离的羟基进行部分衍生化而制备高度分支的、未取代或低取代的淀粉产物。代替这种方法，可以通过使用所谓分支或转移酶的酶效应组装将羟乙基化或羟丙基化的淀粉转化成为高度分支的、未取代或低取代的淀粉产物。从具有最高达10％分支度的小麦淀粉通过酶作用获得的分支淀粉产物本身是已知的，并在例如WO 00/66633A中有描述。WO 00/18893A、US 4,454,161、EP 0418945A、JP 2001294601A或US 2002/065410A公开了合适的分支或转移酶和其获得方法。后一公开文献描述了具有超过4％至高达10％或更高的分支度的未改性的淀粉产物。可以以本身已知的方法完成酶促转糖苷作用(transglycosilation)，例如，通过在6至8的pH值和25至40℃的温度的温和条件下在水溶液中，与适当的酶一起温育蜡质玉米淀粉、由具有高支链淀粉含量的马铃薯获得的马铃薯淀粉、或由大米、木薯、小麦、具有高支链淀粉含量的小麦、玉米、具有高支链淀粉含量的玉米、或者具有高直链淀粉含量的玉米获得的淀粉。分子量M_w用于高度分支的、未取代或低取代的淀粉产物时是指重均分子量。这可以通过各种方法由本身已知的方式测定，即通过凝胶渗透色谱(GPC)或高压液相色谱法(HPLC)结合光散射和RI检测测定。取代淀粉优选的C₂/C₆比是5至9的范围。高度分支的、未取代或低取代的淀粉产物的高分支度提高其水溶解性至羟乙基或羟丙基取代可完全或基本上分散的程度，以将淀粉保持在溶液中。可以经过腹膜的通透性限制以合适的方式增加高度分支的、未取代或低取代的淀粉产物的平均分子量。可以用于这种情况中的特征变量也是所谓底部分BF90％(作为较小分子部分的比例的量度的90％峰面积的分子量)的GPC值。通过在跨腹腔膜吸收急剧降低的同时适当提高分子量可以达到更大的超滤(UF)效率。同时，由内源性淀粉酶的降解作用产生的(其不再进一步由淀粉酶降解)且存储在器官或组织中的高分子量残留片段不再出现或此时只以较低的程度出现。

根据本发明，羟烷基淀粉与交联化合物M-L-A反应，其中，M是氨基，A是缩醛基或缩酮基，基团M和基团L被适当的间隔物隔开。

缩醛基或缩酮基A

至于缩醛基或缩酮基A，没有特别的限制存在。在本发明中，术语“缩醛基”还包括硫缩醛和氮缩醛，和术语“缩酮基”还包括硫缩酮和氮缩酮。此外，至于涉及的术语“缩醛基”，半缩醛被明确地排除，而至于涉及的术语“缩酮基”，半缩酮被明确地排除。

根据本发明优选的实施方式，交联化合物M-L-A的基团A是式(IIa)的残基

其中，

Z₁和Z₂各个独立地为O或S或NR_x，优选为O，其中，R_x是H或低级烷基(如甲基、乙基或丙基(如正丙基或异丙基)或C(O)-R_y，其中R_y优选选自C₁-C₆烷基和C₆-C₁₄芳基，甚至更优选选自任选取代的，优选非取代的甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基；R_x优选是H；

A₁和A₂各个独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、苯甲基、1，1，1-三氯乙基、硝基苯甲基、甲氧基苯甲基、乙氧基苯甲基，或形成式(IIb)的环：

其中，A₁和A₂一起为-(CH₂)₂-或-(CH₂)₃-或-(CH₂CH(CH₃))-，和

其中，A₃是H或甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、戊基、苯甲基，或与氨基M的N原子或L中包含的合适的原子形成环。

优选，Z₁和Z₂中的至少一个是O，更优选Z₁和Z₂都是O。

至于残基A₃，根据本发明优选是缩醛基，即A₃优选是H。

如果A是缩酮基，则优选A₃是甲基。因此，根据本发明可以设想的缩酮基A尤其是以下几种：

或或或

或或

如果A₃例如与氨基M的N原子或L中包含的合适的原子形成环，本发明的可以设想的交联化合物是，例如，

或

或

根据本发明，特别优选的交联化合物是

即，氨基M是仲胺，Z₁和Z₂都是O，A₁和A₂结合在一起为-(CH₂)₂-。

根据优选的实施方式，A₁和A₂各个是甲基或乙基，甚至更优选是乙基。因此，根据本发明，特别优选的缩醛基A是-CH(OCH₃)₂或-CH(OC₂H₅)₂，尤其是-CH(OC₂H₅)₂。

根据其中A₁和A₂形成式(IIb)的环的进一步的实施方式，A₁和A₂一起优选是-(CH₂)₂-。至于这一实施方式，根据本发明尤其优选的缩醛基A是

和

氨基M

至于涉及的氨基M，没有特别的限制存在，条件是氨基可以与氧化的或非氧化的还原末端反应，即，通过HAS(优选HES)的还原末端糖单元的碳原子的C*以非氧化状态(即作为半缩醛或游离醛基)或氧化状态(即，作为内酯或作为游离羧基)。用于本申请中的术语“氨基”也包括氨基的适当的盐，例如，质子化的氨基与药学上可接受的阴离子(例如，氯根、硫酸氢根、硫酸根、碳酸根、碳酸氢根、柠檬酸根、磷酸根或磷酸氢根)的盐。

优选地，本发明的交联化合物M-L-A的氨基是式(IIc)的基团

其中，Y不存在，或是选自以下的化学部分

其中，G是O或S或NH，且如果存在两个的话，各个G独立地为O或S或NH，G优选是O，和

其中，R′是H或羟基或选自烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、烷基芳基和取代的烷基芳基的有机残基。在本文中，术语“烷基”涉及非分支的烷基残基，分支的烷基残基和环烷基残基。优选，这些有机残基中的每个具有1到10个碳原子。作为可以设想的取代基，可能提及如F、Cl或Br的卤素。优选，有机残基是非取代的烃类。

如果R′是羟基，本发明的优选的氨基是HO-NH-，即Y不存在。

优选，如果R′是有机残基，R′选自烷基和取代的烷基，尤其优选烷基残基。甚至更优选，任选取代的烷基残基具有1到10、更优选1至6、更优选从1到4，如1、2、3或4个碳原子。因此，本发明的优选的有机残基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。根据特别优选的实施方式，有机残基R′是甲基或乙基，尤其是甲基。

因此，如果R′是有机残基，本发明优选的氨基是，例如，H₃C-CH₂-NH-、H₃C-NH-、H₅C₆-NH-、H₃C-CH₂-NH-O-、H₃C-NH-O-、H₅C₆-NH-O-，特别优选H₃C-NH-、H₅C₆-NH-和H₃C-NH-O-。

根据本发明，以下也是可能的：R′不是独立的残基，但与L包含的合适的原子或与交联化合物的基团A的残基A3形成环结构。这些结构也包括在上述关于R′的术语“烷基”的定义中。举例来说，R′可以与交联化合物的基团A的残基A₃形成环结构，A为缩酮基。可以设想的交联化合物是，例如，

或或

在这种情况下，本发明的尤其优选的交联化合物是，

即，氨基M是仲胺，Z₁和Z₂都是O，A₁和A₂在一起为-(CH₂)₂-。

在本发明优选的实施方式中，R′是H。因此，优选的氨基M是

其中，G是O或S，和如果存在两个的话，G独立地为O或S，优选为O。

如果R′是H，则本发明的尤其优选的氨基是H₂N-、H₂N-O-和H₂N-NH-(C＝O)-。

因此，本发明还涉及上述的方法和衍生物，其中，氨基M是H₂N-、H₂N-O-、H₂N-NH-(C＝O)-、H₃C-NH-或H₃C-NH-O-，优选H₂N-、H₂N-O-或H₂N-NH-(C＝O)-。

间隔物L

根据本发明，交联化合物的官能团M和A被合适的间隔物隔开。用于本申请中的术语“间隔物”涉及桥连M和A的任何合适的化学部分。

一般来说，对于间隔物L的化学性质没有特别的限制，条件是L具有使其能够进行本发明的制备新型衍生物的方法，并为新型衍生物提供与其预期用途相关的合适化学性质的特定化学性质。

根据本发明优选的实施方式，桥连M和A的L是包含的至少一个式(IId)的结构单元的间隔物

其中，L₁和L₂彼此独立地为H或选自烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、烷芳基和取代的烷芳基的有机残基，和残基-O-R″的有机残基，其中，R″选自烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、烷芳基和取代的烷芳基。

在这方面，术语“烷基”涉及非分支的烷基残基、分支的烷基残基和环烷基残基。作为优选的取代基，可能提及如F、Cl或Br的卤素。

优选地，L₁和L₂彼此独立地为H或选自烷基和取代的烷基的有机残基；更优选，L₁和L₂彼此独立地为H或烷基；甚至更优选，L₁和L₂都是H。

优选地，如果L₁和L₂是有机残基，L₁和L₂各可以独立地包含1到20、优选1至10、更优选1至8、更优选1至6、更优选1至4个碳原子。尤其优选的残基L₁和L₂是任选取代的，优选非取代的甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基残基。根据本发明，L₁可以是H和L₂可以是上述定义的有机残基。

至于涉及的整数n，n优选1到20，优选1到10，更优选1到6，更优选1到4，更优选2。

如果整数n大于1，基团(CL₁L₂)可能相同或彼此不同。根据本发明优选的实施方式，彼此直接连接的基团(CL₁L₂)具有相同的构成。

根据本发明优选的实施方式，间隔物L由式(IId)的结构单元组成，其中，L₁和L₂如上定义。更优选，整数n是1到20，更优选1到10，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。甚至更优选，各基团(CL₁L₂)是(CH₂)，这样桥连M和A的间隔物L具有结构

其中，n是1到20的整数，更优选1到10，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。甚至更优选，n的范围为1到6，更优选1到4的范围，如1、2、3或4，尤其是2。

因此，根据本发明的尤其优选的实施方式，间隔物L为-CH₂-CH₂-。

根据本发明进一步的实施方式，交联化合物的间隔物L包含至少一个式(IId)的结构单元

其中，n、L₁和L₂如上定义，优选

并且其中，L进一步包含至少一个不同于-(CL₁L₂)-的化学部分。

在这方面，可以提及以下实施方式，其中，间隔物L由结构单元-(CL₁L₂)_n-和分隔-(CL₁L₂)_n-和基团M或A的进一步的化学部分T组成。另外的实施方式是可以想象的，其中，间隔物L由结构单元-(CL₁L₂)_n-和两个另外的化学部分T₁和T₂组成，其中，T₁分隔-(CL₁L₂)_n-和基团M，T₂分隔-(CL₁L₂)_n-和基团A。因此，本发明还包括实施方式，其中交联化合物具有以下结构之一：

M-T-(CL₁L₂)_n-A

M-(CL₁L₂)_n-T-A

M-T₁-(CL₁L₂)_n-T₂-A

至于化学部分T、T₁和T₂，对于其化学性质没有特别的限制，条件是L具有使其能够进行本发明的制备新型衍生物的方法，并为该新型衍生物提供涉及其预期用途的合适化学性能的特定化学性质。

因此，T、T₁和/或T₂可以包含任选取代的芳基残基、合适的杂原子、合适的官能团等。至于涉及的官能团，可以提及其中这些官能团由制备交联化合物产生的实施方式，其中至少第一化合物和至少第二化合物彼此反应以产生化合物M-L-A。举例来说，第一化合物M-L′-W₁和第二化合物W₂-L″-A可以反应以产生交联化合物M-L-A，其中-L-是-L′-F-L″-，F代表由官能团W₁与官能团W₂的反应产生的官能团，并且其中L′和L″中的至少一个包含结构单元-(CL₁L₂)_n-。可以适当选择这样的官能团W₁和W₂。举例来说，基团W₁和W₂中的一个，即W₁或W₂，可以从以下罗列的官能团中选择，而另一基团，W₂或W₁，可适当选择且能够与W₁或W₂形成化学连接，其中W₂或W₁也优选选自上述的基团：

-C-C-双键或C-C-三键或芳香C-C键；

-硫醇(thio)基或羟基；

-烷基磺酸肼、芳基磺酸肼；

-1，2-二醇类；

-1，2-氨基硫醇；

-叠氮化合物；

-1，2-氨基醇；

-氨基-NH₂或包含结构单元-NH-的氨基的衍生物(如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷基芳氨基)；

-羟氨基-O-NH₂，或包含结构单元-O-NH-的羟氨基的衍生物(如羟烷基氨基、羟芳基氨基、羟基芳烷基氨基或羟基烷芳基氨基)

-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，各包含结构单元-NH-O；

-具有羰基的残基-Q-C(＝G)-M′，其中，G为O或S，和M′为，例如：

---OH或-SH；

--烷氧基、芳氧基、芳烷氧基或烷芳氧基；

--烷硫基、芳硫基、芳烷硫基或烷芳硫基；

--烷羰氧基、芳羰氧基、芳烷羰氧基或烷芳羰氧基；

--活化的酯，如具有酰亚胺(imid)结构的羟胺酯，如N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxylsuccinimid)；

--NH-NH₂或-NH-NH-；

--NO₂；

-腈基；

-羰基，如醛基或酮基；

-羧基；

--N＝C＝O基团或-N＝C＝S基团；

-乙烯基卤化物基团，如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基团或三氟甲磺酸盐(triflate)；

--C≡C-H；

--(C＝NH₂Cl)-O烷基；

-基团-(C＝O)-CH₂-Hal，其中，Hal是Cl、Br或I；

--CH＝CH-SO₂-；

-包含结构-S-S-的二硫基；

-基团

-基团

举例来说，W₁或W₂可以是羧基或活化的酯，和W₂或W₁可以是氨基或羟基，从而使得由官能团W₁与官能团W₂的反应产生的官能团表示的F是酰胺(amid)或酯。

因此，举例来说，具有除了结构单元-(CL₁L₂)_n-之外还包含官能团的间隔物L的交联化合物可能具有以下结构，例如M-L′-(C＝O)-NH-(CL₁L₂)_n-A，或M-L′-(C＝O)-O-(CL₁L₂)_n-A，或M-L′-NH-(C＝O)-(CL₁L₂)_n-A，或M-L′-O-(C＝O)-(CL₁L₂)_n-A，或M-(CL₁L₂)_n-(C＝O)-NH-L″-A，或M-(CL₁L₂)_n-(C＝O)-O-L″-A，或M-(CL₁L₂)_n-NH-(C＝O)-L″-A，或M-(CL₁L₂)_n-O-(C＝O)-L″-A，

其中，L′和L″的可能包含或不包含结构单元-(CL₁L₂)_n-。

在这些结构中，交联化合物优选具有结构

M-L′-(C＝O)-NH-(CL₁L₂)_n-A，

或M-(CL₁L₂)_n-(C＝O)-NH-L″-A。

此外，在这些结构中，优选其中L′和L″，如果存在的话，包含结构单元-(CL₁L₂)_n-的间隔物。在这些情况下，甚至更优选n在1到4的范围内，更优选1到3的范围内，如1、2或3。如果给定的间隔物包含，例如，两个结构单元-(CL₁L₂)_n-，各结构单元的指数n可能相同或不同。

因此，优选具有下列结构的交联化合物：

M-(CL₁L₂)_n-(C＝O)-NH-(CL₁L₂)_n-A

其中各个n彼此独立地在优选1到4的范围内，更优选1到3的范围内，如1、2或3。因此，优选间隔物L具有结构-(CL₁L₂)_n-(C＝O)-NH-(CL₁L₂)_n-。

因此，包含-(C＝O)-NH-的特别优选的交联化合物是M-(CL₁L₂)₃-(C＝O)-NH-(CL₁L₂)₃-A或M-(CL₁L₂)₃-(C＝O)-NH-(CL₁L₂)₂-A或M-(CL ₁L₂)₂-(C＝O)-NH-(CL ₁L₂)₃-A或M-(CL₁L₂)₂-(C＝O)-NH-(CL₁L₂)₂-A。

包含-(C＝O)-NH-的更优选的交联化合物是M-(CL₁L₂)₃-(C＝O)-NH-(CL₁L₂)₂-A或M-(CL₁L₂)₂-(C＝O)-NH-(CL₁L₂)₂-A。

甚至更优选，L₁和L₂都为H。因此，特别优选具有下列结构的交联化合物M-(CH₂)₃-(C＝O)-NH-(CH₂)₃-A或M-(CH₂)₃-(C＝O)-NH-(CH₂)₂-A或M-(CH₂)₂-(C＝O)-NH-(CH₂)₃-A或M-(CH₂)₂-(C＝O)-NH-(CH₂)₂-A。

最优选具有下列结构的交联化合物M-(CH₂)₃-(C＝O)-NH-(CH₂)₂-A或M-(CH₂)₂-(C＝O)-NH-(CH₂)₂-A。

举例来说，本发明优选的交联化合物是

或

或

或

或

再次举例来说，且为了说明上面讨论的结构，在本发明中可以设想的交联化合物可以是

根据本发明的进一步实施方式，间隔物L可以包含一个以上结构单元-(CL₁L₂)_n-，其中，这些结构单元可能相同或不同，即结构在n和/或L₁和/或L₂方面不同，其中，至少两个这样的结构单元可以由杂原子(如O或S)隔开。根据这一实施方式，优选间隔物L包含至少一个结构单元-(CL₁L₂)_n1-O-(CL₁L₂)_n2-，优选-(CH₂)_n1-O-(CH₂)_n2-，其中，n1等于或不等于n2，并且其中，且其中间隔物L通过-(CL₁L₂)_n1-连接到交联化合物的氨基M上，即交联化合物包含以下亚结构M-(CL₁L₂)_n1-O-(CL₁L₂)_n2-。

根据优选可以设想的实施方式，可以提及间隔物结构如-((CL₁L₂)_n1-O)_m-(CL₁L₂)_n2-，m是1到2的整数，优选1到10，更优选1至6，如1、2、3、4、5或6。尤其优选，m是1、2或3，更优选2或3。优选，n1是2至4，更优选2。优选，n2是1至4，更优选1或2。因此，优选的结构，举例来说，是-((CL₁L₂)₂-O)_m-(CL₁L₂)-，和更优选-((CH₂)₂-O)_m-CH₂-。

再次举例来说，且为了说明上面讨论的结构，优选用于在本发明中的交联化合物是

或

或

根据本发明的进一步实施方式，基团M和基团A可以被2个合适的化学部分隔开，其中至少一个包含-(CL₁L₂)_n-，使得基团M的N原子和缩酮基A的C原子形成环。以上已经提出优选的实施方式，且结构为

本发明的尤其优选的交联化合物是具有作为基团M的基团H₂N-、或基团H₂N-O-、或基团H₂N-NH-(C＝O)-、尤其优选基团H₂N-，与作为基团A的缩醛基、优选具有以下结构的缩醛基

其中，更优选，Z₁和Z₂都是O，和更优选，A₁和A₂都是乙基。甚至更优选，间隔物基团L由结构单元-(CL₁L₂)_n-组成，L₁和L₂优选是H，和整数n甚至更优选为1到20，优选1到10，更优选1至6，更优选1至4，更优选2。

因此，本发明优选的交联化合物是，举例来说，

或

或

或

或

或

或

或

或

或

或

或

或

或

或

或

或

或

或

甚至更优选，交联化合物选自结构(a2)、(a4)、(a11)、(a12)、(a14)、(a16)和(a18)。更优选，交联化合物选自结构(a2)、(a11)、(a12)、(a14)、(a16)和(a18)。尤其是，交联化合物选自结构(a2)、(a11)、(a12)和(a16)。

尤其优选的交联化合物M-L-A是1-氨基-3，3-二乙氧基丙烷，

举例来说，本发明的可以设想的氨基-缩醛交联化合物是：

4，4-二乙氧基-2-甲基丁-2-胺

1-(1，3-二氧杂环己-2-基)-2-甲基丙-2-胺

1-(1，3-二氧戊环-2-基)-2-甲基丙-2-胺

4，4-二乙氧基-N，2-二甲基丁-2-胺

1-(1，3-二氧杂环己-2-基)-N，2-二甲基丙-2-胺

1-(1，3-二氧戊环-2-基)-N，2-二甲基丙-2-胺

2，2-二乙氧基-N-甲基乙胺

4，4-二乙氧基丁酰亚胺肼

3，3-二甲氧基丙酰亚胺肼。

举例来说，本发明的可以设想的氨基-缩醛交联化合物是：

1-氧杂-4-硫杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷

1，4-二硫杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷

N-甲基-1-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)甲胺

1-(3，4-二甲氧基苯基)-2-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)乙胺

4-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)丁-1-胺

1-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)己-2-胺

2-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)-1-苯乙胺

1-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)丙-2-胺

3-甲基-1-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)丁-2-胺

2-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)乙胺

3-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)戊-2-胺

2-甲基-1-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)丙-2-胺

2-(4-甲氧苯基)-2-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)乙胺

2-(3，4-二甲氧苯基)-2-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)乙胺

2，2-二甲基3-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)丙-1-胺

3-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)-3-苯基丙-1-胺

4-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)丁-2-胺

5-甲基-5-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)己-1-胺

2，2-二甲基-3-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)丙-1-胺

7-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)庚-1-胺

2-甲基-4-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)丁-2-胺

4-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)己-1-胺

4-氨基-1-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)戊-3-醇

3-(2，4-二甲基-1，3-二氧戊环-2-基)-2，2-二甲基丙-1-胺

2-甲基-1-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)丙-2-胺

N-甲基-3-(2-甲基-1，3-二氧戊环-2-基)丁-1-胺

1-(2，5，5-三甲基-1，3-二氧杂环己-2-基)庚-4-胺

3-(2-甲基-1，3-二噻烷-2-基)丙-1-胺

3，3-二甲基-1-(2-甲基-1，3-二噻烷-2-基)丁-2-胺

3-(2-甲基-1，3-二氧杂环己-2-基)丁-2-胺

1-(2-甲基-1，3-二氧杂环己-2-基)戊-2-胺

3-甲基-1-(2-甲基-1，3-二氧杂环己-2-基)丁-2-胺

1，1，1-三氟-3-(2-甲基-1，3-二氧杂环己-2-基)丙-2-胺。

羟烷基淀粉衍生物

因此，本发明涉及通过上述方法可获得的或获得的羟烷基淀粉(HAS)衍生物。

此外，本发明涉及式(III)的HAS衍生物

其中，A是缩醛基或缩酮基；L是桥连X和A的间隔物；

其中，X是由式(II)的交联化合物

M-L-A

的氨基M与式(I)的羟烷基淀粉(HAS)

通过HAS的碳原子C*反应产生的官能团，其中，C*在HAS与M的反应之前任选被氧化，

关于HAS(优选HES)、L、A、R₁、R₂和R₃的优选实施方式，特别参考上文所述的实施方式。

此外，本发明涉及如上所述的HAS衍生物，其中，R₁、R₂和R₃独立地为基团-(CH₂CH₂O)_n-H，其中，n是整数，优选是0、1、2、3、4、5或6。

此外，本发明涉及如上所述的HAS衍生物，其中，羟烷基淀粉是羟乙基淀粉(HES)。

此外，本发明涉及如上所述的HAS衍生物，其中，A是式(IIa)的残基

其中，

Z₁和Z₂各自独立地为O或S或NR_x，优选O，其中，R_x是H或低级烷基(如甲基、乙基或丙基)，优选为H；

A₁和A₂各自独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、苯甲基、1，1，1-三氯乙基、硝基苯甲基、甲氧基苯甲基、乙氧基苯甲基，或形成式(IIb)的环：

其中，A₁和A₂结合在一起为-(CH₂)₂-或-(CH₂)₃-或-(CH₂CH(CH₃))-，知

其中，A₃是H或甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、戊基、苯甲基，或与氨基M的N原子或L中包含的合适的原子形成环，A₃优选为H。

本发明HAS衍生物的基团X的确切的化学性质取决于基团M的相应的化学性质、取决于HAS还原末端的碳原子C*的氧化状态和取决于反应条件(如用于反应的溶剂、温度等)。根据其中使用氧化和非氧化态的碳原子C*的本发明的实施方式，下面详细讨论具体的和优选的实施例。

优选地，对于X，本发明涉及如上所述的HAS衍生物，其中，X选自-CH＝N-、-CH₂-NH-、-CH＝N-O-、-CH₂-NH-O-、-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-NH-NH-、-CH＝N-NH-(C＝O)-、-CH₂-NH-NH-(C＝O)-，优选选自-CH₂-NH-、-CH＝N-、-CH＝N-O-、-CH₂-NH-O-、-CH＝N-NH-(C＝O)-和-CH₂-NH-NH-(C＝O)-，更优选选自-CH₂-NH-、-CH＝N-、-CH＝N-O-和-CH₂-NH-O-。

对于基团X的某些实施方式，可以设想的是，存在于HAS衍生物中的HAS的末端糖单元以可能与上述式(III)的开放结构相平衡的环结构的形式存在，该环结构和开放结构具有一定的平衡分布。在这些情况下且出于本发明的目的，上面给出的式(III)包括开放结构和环结构，且式(III)不限制HAS衍生物为开放结构。对于下面详细讨论的具体的和优选的实施例，某些情况中显示环结构。

此外，本发明涉及如上所述的HAS衍生物，其中，桥连M和A的L是包含至少一个式(IId)的结构单元，优选由式(IId)的结构单元组成的间隔物

其中，L₁和L₂彼此独立地为H或选自烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、烷芳基和取代的烷芳基及残基-O-R″的有机残基，其中，R″选自烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、烷芳基和取代的烷芳基；优选为H或选自烷基和取代的烷基的有机残基；更优选为H或烷基；更优选为H，

其中，n是1到20的整数，优选1到10，更优选1到6，更优选1到4，更优选2。

HAS(优选HES)的任选氧化的还原末端

根据本发明，HAS(优选HES)可以通过淀粉的末端还原端的碳原子C*与交联化合物的氨基M反应，其中，C*在HAS与M的反应之前任选被氧化。

用于本发明中的术语“HAS通过还原末端反应”或“HAS通过末端还原端的碳原子C*反应”可能涉及其中HAS主要通过其(任选选择性氧化的)还原末端反应的过程。

术语“主要通过其(任选选择性氧化的)还原末端”涉及其中统计上超过50％、优选至少55％、更优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、还更优选至少95％如95％、96％、97％、98％或99％的用于给定反应的HAS分子通过每HAS分子至少一个(任选选择性氧化的)还原末端反应的过程，其中通过至少一个(任选选择性氧化的)还原末端反应的给定HAS分子可以在给定的同样反应中通过所述聚合物分子中包含的且为非还原末端的至少一个另外的适当官能团反应。如果一个或多个HAS分子通过至少一个(任选选择性氧化的)还原末端并同时通过这一(这些)HAS分子中包含的且不是(任选选择性氧化的)还原末端的至少一个另外的适当官能团反应，那么，这些HAS分子的所有反应的官能团(所述官能团包括(任选选择性氧化的)还原末端)统计学上优选超过50％、优选至少55％、更优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、还更优选至少95％如95％、96％、97％、98％或99％是(选择性氧化的)还原末端。

用于本发明中的术语“还原末端”涉及HAS分子的末端醛基，其可以作为醛基和/或作为相应的半缩醛形式和/或作为缩醛基存在，所述缩醛基具有下面的结构

如果上述式(I)的残基-OR₃是-O-CH₂-CH₂-OH，则其可以存在。

在还原末端被氧化的情况下，氧化的还原末端为羧基和/或相应的内酯的形式。

氧化的还原末端

因此，根据本发明的第一实施方式，交联反应化合物通过氨基与HAS(优选HES)的末端还原端的氧化的C*原子反应。

虽然可以根据产生氧化的羟烷基淀粉还原末端的所有合适的一种或多种方法进行氧化，但优选使用碱性碘溶液进行，如Sommermeyer等人，US 6,083,909，第5栏第63-67行和第7栏第25-39行，第8栏第53行至第9栏第20行所述，相应的内容被通过引用引入本发明。

选择性地氧化HAS(优选HES)导致HAS(优选HES)成为内酯

和/或羧酸

或羧酸的合适的盐，如碱金属盐，优选钠盐和/或钾盐，且HAS′优选是HES′。

根据本发明的第一替代方式，HAS(优选HES)的这种形式原样与交联化合物的氨基M反应。

根据本发明的第二替代方式，在其还原末端选择性地氧化的HAS(优选HES)首先与合适的化合物反应以产生包含反应性羧基的HAS(优选HES)。

可以通过所有可以设想的方法和所有合适的化合物将反应性的羧基引入在还原末端选择性地氧化的HAS中。

根据本发明的特定方法，还原末端选择性地氧化的HAS在氧化的还原末端与至少一种醇反应，优选与至少一种酸性醇(例如在25℃下，具有6至12或7至11的pK_A值的酸性醇)反应。酸性醇的分子量可以是80到500克/摩尔，如90至300克/摩尔或100到200克/摩尔。

合适的酸性醇是所有具有酸性质子并能够与氧化的HAS反应而产生相应反应性的HAS酯的醇H-O-R_A，该HAS酯优选具有结构式

更优选结构式

优选的醇是如N-羟基琥珀酰亚胺类(如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺)、适当取代的酚类(如对-硝基苯酚、邻，对-二硝基苯酚、邻，邻-二硝基苯酚)、三氯苯酚(如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚)、三氟苯酚(如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚)、五氯苯酚、五氟苯酚或羟基唑类(hydroxyazole)(如羟基苯并三唑)。尤其优选的是为N-羟基琥珀酰亚胺类，特别优选N-羟基琥珀酰亚胺和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。所有醇可以单独或作为其两种或多种的适当组合使用。在本发明中，也可以使用释放相应醇的化合物，例如通过加入碳酸二酯。

因此，本发明还涉及如上所述的方法，其中，通过将氧化的HAS与酸性醇(优选与N-羟基琥珀酰亚胺和/或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺)反应而使其还原末端选择性地氧化的HAS活化。

根据本发明优选的实施方式，还原末端选择性地氧化的HAS在氧化的还原末端与至少一种碳酸二酯R_B-O-(C＝O)-O-R_C反应，其中，R_B和R_C可能相同或不同。优选，此方法产生下式的反应性HAS

其中，HAS′优选是HES′。

作为合适的碳酸二酯化合物，可以使用以下化合物，其醇成分独立地为N-羟基琥珀酰亚胺类(如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺)、适当取代的酚类(如对-硝基苯酚、邻，对-二硝基苯酚、邻，邻-二硝基苯酚)、三氯苯酚(如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚)、三氟苯酚(如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚)、五氯苯酚、五氟苯酚或羟基唑类(如羟基苯并三唑)。尤其优选N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和磺基-N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，特别优选N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯。

因此，本发明还涉及如上所述的方法，其中，通过将氧化的HAS与N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应而使还原末端选择性地氧化的HAS活化。

在优选0至40℃、更优选10至30℃和尤其优选15至25℃的反应温度下，酸性醇与氧化的HAS或氧化的HAS的盐以优选5∶1到50∶1、更优选8∶1到20∶1的酸性醇：HAS的摩尔比进行反应。反应时间优选1到10小时，更优选2至5小时，更优选2至4小时，尤其优选2到3小时。

碳酸二酯化合物与氧化的HAS或氧化的HAS的盐以一般1∶1到3∶1、如1∶1到1.5∶1的碳酸二酯化合物：HAS的摩尔比进行反应。反应时间一般是0.1至12小时，如0.2至6小时、或0.5至2小时、或0.75至1.25小时。

根据本发明优选的实施方式，氧化的HAS与酸性醇和/或碳酸二酯的反应在至少一种非质子溶剂中进行，如在具有不超过0.5重量％、优选不超过0.1重量％的水含量的无水非质子溶剂中。合适的溶剂尤其为二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)或其两种或多种的混合物。反应温度优选2到40℃，更优选10到30℃。

对于氧化的HAS与至少一种酸性醇的反应，使用至少一种另外的活化剂。

合适的活化剂尤其是羰二咪唑、碳二亚胺(如二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC))，尤其优选二环己基碳二亚胺(DCC)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。

因此，本发明还涉及上文所述的方法，其中，在另外的活化剂的存在下，还原末端氧化的HAS与酸性醇反应而产生反应性的HAS酯。

根据本发明的一种实施方式，氧化的HAS与碳酸二酯和/或酸性醇的反应在低碱活性下进行，所述低碱活性可以通过以10∶1的水和反应混合物的体积比向反应混合物中加入水来测定。加入之前，基本上不包含缓冲剂的水在25℃下具有7的pH值。在加入反应混合物后测量pH值，获得反应混合物的碱活性，使其具有优选不超过9.0、更优选不超过8.0、尤其优选不超过7.5的值。

根据本发明的另一种实施方式，在不存在水和EDC的情况下，氧化的HAS在干燥的DMA中与N-羟基琥珀酰亚胺反应，以选择性地产生聚合物N-羟基琥珀酰亚胺酯，结构式为

更优选HAS′是HES′。

这一反应不产生源自EDC与HES的羟基的反应的副产物，且由EDC和氧化的HAS形成的O-酰基异脲向相应的N-酰基脲的重排反应令人惊讶地受到抑制。

根据本发明另一种优选的实施方式，在不存在水和不存在活化剂的情况下，氧化的HAS在干燥的DMF中与N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应，以选择性地产生HAS-N-羟基琥珀酰亚胺酯，结构式为

更优选HAS′是HES′。

根据本发明的另一种实施方式，还原末端选择性地氧化的HAS在氧化的还原末端与azolide(如羰二咪唑或羰基二苯并咪唑)反应，以产生具有反应性的羧基的聚合物。在羰二咪唑的情况下，产生下式的反应性的咪唑化物(imidazolide)HAS衍生物

其中，HAS′优选是HES′。

包含至少一个反应性羧基的反应性HAS衍生物(如上所述优选由HAS与酸性醇、碳酸酯和/或azolide的反应产生的)然后进一步与交联化合物M的氨基M反应。

可以根据所有合适的方法进行HAS通过氧化的还原末端(如上所述任选地进一步活化)与氨基M的反应。优选，氨基M是伯氨基H₂N-或仲氨基。

一般来说，优选使用还可能包含一定量(例如最多10重量％)的水的极性非质子溶剂。优选的非质子溶剂尤其是DMSO或DMF。

优选的反应温度范围的例子是0到80℃，更优选0到70℃，更优选0到60℃，更优选0到50℃，甚至更优选0到40℃。

如果交联化合物用于与具有氧化形式的还原末端的HAS的反应，根据优选的实施方式，所述交联化合物具有H₂N-作为氨基M，则通过本发明的步骤(i)获得HAS衍生物，其中，HAS和用作起始原料的交联化合物通过酰胺键连接，其中，获得的HAS衍生物进一步包含缩醛基或酮基A。

因此，本发明还涉及如上所述的方法，其中，在(i)中，HAS通过其氧化的还原末端与交联化合物的氨基M反应，M为H₂N-，且其中，在0到80℃的温度范围进行该反应，和其中，X是-(C＝O)-NH-。

因此，本发明还涉及通过上述方法可获得的或获得的HAS衍生物。

此外，本发明还涉及这样的HAS衍生物，具有以下结构

其中，如果交联化合物的氨基M是伯氨基，则R′是H，且其中，如果交联化合物氨基的M是仲氨基，则R′是除H之外的化学部分。R′的确切的化学性质取决于交联化合物，并因此，参见以上对一般可能的和优选使用的交联化合物的讨论。

根据以上所述的优选的用于本发明的交联化合物，可以提及下列HAS衍生物作为优选的实施方式的例子，其中在各种情况下，根据本发明的优选方式，HAS是HES：

或

或

或

或

或

或

或

或

或

或

或

或

或

或

更优选基于选自结构(a2)、(a4)、(a11)、(a12)、(a14)、(a16)和(a18)的交联化合物的HAS衍生物。甚至更优选，基于选自结构(a2)、(a11)、(a12)、(a14)、(a16)和(a18)的交联化合物的HAS衍生物。尤其优选，基于选自结构(a2)、(a11)、(a12)和(a16)的交联化合物的HAS衍生物。

根据特别优选的实施方式，本发明涉及具有以下结构的HES衍生物：

其中，甚至更优选，HES具有1到大约1000kDa，更优选大约1至大约800kDa，更优选大约1至大约500kDa，更优选大约2至大约400kDa，更优选大约5至大约300kDa，更优选大约10至大约200kDa，尤其是大约50至大约150kDa的平均分子量，和0.1至3、优选0.4至1.3如0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2或1.3的摩尔取代度，和优选2至20、更优选2到15和甚至更优选3至12的C₂∶C₆取代比。

非氧化的还原末端

根据本发明的第二和优选的实施方式，交联化合物通过氨基与HAS(优选HES)的末端还原端的非氧化的C*原子反应，即，HAS分子的末端醛基可以以醛基和/或相应的半缩醛的形式存在。

可以根据所有合适的方法进行HAS通过非氧化的还原末端与氨基的反应。优选，氨基M是H₂N-或合适的仲氨基HNR′-(如H₃C-NH-、H₂N-O-)或合适的羟氨基HNR′-O-(如H₃C-NH-O-或H₂N-NH-(C＝O)-)。

优选地，氨基M是H₂N-、H₂N-O-或H₂N-NH-(C＝O)-，甚至更优选H₂N-或H₂N-O-，尤其是H₂N-。

根据本发明优选的实施方式，这一反应在水性体系中进行。用于本发明中的术语“水性体系”是指包含至少10重量％、优选至少50重量％、更优选至少80重量％、甚至更优选至少90重量％或最高100重量％(基于涉及的溶剂的重量)水的溶剂或溶剂混合物。作为另外的溶剂，可以提及如DMSO、DMF、乙醇或甲醇的溶剂。

根据优选的实施方式，如果HAS在水性介质中与交联化合物反应，且交联化合物的氨基M是羟胺或酰肼，那么反应温度优选为5至45℃，更优选10至30℃，尤其优选15至25℃。

根据另一种优选的实施方式，如果HAS在水性介质中与交联化合物反应，且交联化合物的氨基M是H₂N-或R′HN-基团，该反应是还原胺化反应，则温度优选最高100℃，更优选10至90℃，更优选20至80℃，更优选30至70℃，尤其优选在40至60℃。

在反应过程中，温度可以变化，优选在上述给定范围内变化，或保持基本恒定。

可以调整HAS与交联化合物M反应的反应时间来适应特定的需要，且一般为1小时至7天。在例如氨基M是羟胺或酰肼的情况下，反应时间优选为1小时至3天，更优选2小时至48小时，尤其优选3至24小时。

在例如HAS与交联化合物的反应是还原胺化反应的情况下，反应时间优选为1小时至7天，更优选4小时到6天，更优选是8小时到5天，和甚至更优选16小时到3天。

可以调整HAS与交联化合物的反应的pH值来适应特定需要，如反应物的化学性质。在例如交联化合物的基团M是羟胺或酰肼的情况下，pH值优选为3至9，更优选4至8，和甚至更优选4.5到6.5。

在例如HAS与交联化合物的反应是还原胺化反应的情况下，pH值优选为3至9，更优选3.5到8，甚至更优选4至6。

对于各个反应步骤，可以通过加入至少一种合适的缓冲剂来调整反应混合物的适当pH值。在优选的缓冲剂中，可以提及醋酸盐缓冲液(优选醋酸钠缓冲液)、磷酸盐或硼酸盐缓冲液。

如果交联化合物用于与具有非氧化形式的还原末端的HAS反应(根据优选的实施方式，所述交联化合物具有H₂N-作为氨基M)，则通过本发明的步骤(i)获得HAS衍生物，其中，用作起始原料的HAS和交联化合物通过亚胺键连接，其中，获得的HAS衍生物进一步包含缩醛基或酮基A。如果反应是在存在合适的还原剂的情况下在还原胺化条件下进行的，通过本发明的步骤(i)获得HAS衍生物，其中，用作起始原料的HAS和交联化合物通过胺键连接，其中，获得的HAS衍生物进一步包含缩醛基或酮基A。

因此，本发明还涉及如上所述的方法，其中，在(i)中，HAS通过其非氧化的还原末端优选在水性介质中与交联化合物的氨基M反应，M为H₂N-，和其中，在20到80℃的温度和4至7的pH值下进行反应，X是-CH＝N-。

此外，本发明还涉及如上所述的方法，其中，在(i)中，反应在还原剂如硼氢化钠、氰基硼氢化钠、有机硼烷络合化合物(如4-(二甲基氨基)-吡啶硼烷络合物、N-乙基二异丙基胺硼烷络合物、N-乙基吗啉硼烷络合物、N-甲基吗啉硼烷络合物、N-苯基吗啉硼烷络合物、二甲基吡啶硼烷络合物、三乙胺硼烷络合物或三甲胺硼烷络合物)，优选NaCNBH₃的存在下进行，以获得HAS衍生物，而X是-CH₂-NH-。

用于本发明的还原胺化反应的这些还原剂的浓度优选为0.01至2.0摩尔/升，更优选0.05至1.5摩尔/升，更优选0.1到1.0摩尔/升，在各种情况下，相对于反应溶液的体积。

根据其中M为H₂N-且交联化合物与HAS的反应在还原胺化条件下进行的上述优选实施方式，交联化合物：HAS的摩尔比优选为1∶1到100∶1，更优选2∶1到80∶1，更优选3∶1到70∶1，更优选4∶1到60∶1，更优选5∶1至50∶1。

根据其中M为H₂N-且交联化合物与HAS的反应在还原胺化条件下进行的上述优选实施方式，HAS(优选HES)在水性体系中的浓度优选为1重量％到50重量％，更优选3重量％到45重量％，更优选5重量％至40重量％，在各种情况下，相对于反应溶液的重量。

如果交联化合物用于与具有非氧化形式的还原末端的HAS反应(根据优选的实施方式，所述交联化合物具有H₂N-O-或H₂N-NH-(C＝O)-作为氨基M)，通过本发明的步骤(i)获得HAS衍生物，其中，用作起始原料的HAS和交联化合物通过-CH＝N-O-键或-CH＝N-NH-(C＝O)-键连接，其中，获得的HAS衍生物进一步包含缩醛基或酮基A。如果反应在合适的还原剂的存在下在还原条件下进行，通过本发明的步骤(i)获得HAS衍生物，其中，用作起始原料的HAS和交联化合物通过-CH₂-NH-O-键或-CH₂-NH-NH-(C＝O)-键连接，其中，获得的HAS衍生物进一步包含缩醛基或酮基A。

因此，本发明还涉及如上所述的方法，其中，在(i)中，HAS通过其非氧化的还原末端优选在水性体系中与交联化合物的氨基M反应，M为H₂N-O-或H₂N-NH-(C＝O)-，和其中在5到80℃的温度和4.5至6.5的pH值下进行反应，X是-CH＝N-O-或-CH＝N-NH-(C＝O)-。

此外，本发明还涉及如上所述的方法，其中，在(i)中，反应在还原剂如硼氢化钠、氰基硼氢化钠、有机硼烷络合化合物(如4-(二甲基氨基)吡啶硼烷络合物、N-乙基二异丙基胺硼烷络合物、N-乙基吗啉硼烷络合物、N-甲基吗啉硼烷络合物、N-苯基吗啉硼烷络合物、二甲基吡啶硼烷络合物、三乙胺硼烷络合物或三甲胺硼烷络合物)，优选NaCNBH₃的存在下进行以获得HAS衍生物，而X是-CH₂-NH-O-或-CH₂-NH-NH-(C＝O)-。

用于本发明的这一反应的这些还原剂的浓度优选为0.001至2.0摩尔/升，更优选0.01至1.0摩尔/升，更优选0.1到0.8摩尔/升，在各种情况下相对于反应溶液的体积。

根据其中M为H₂N-O-或H₂N-NH-(C＝O)-且交联化合物与HAS的反应在还原条件下进行的上述优选实施方式，交联化合物：HAS的摩尔比优选为1∶1到100∶1，更优选2∶1到80∶1，更优选3∶1到70∶1，更优选4∶1到60∶1，更优选5∶1至50∶1。

根据其中M为H₂N-且交联化合物与HAS的反应在还原胺化条件下进行的上述优选实施方式，HAS(优选HES)在水性体系中的浓度优选为1重量％到50重量％，更优选3重量％到45重量％，更优选5重量％至40重量％，在各种情况下相对于反应溶液的重量。

此外，本发明还涉及这样的HAS衍生物，具有以下结构

其中，取决于反应条件和/或交联化合物的特定的化学性质，C-N双键可能以E或Z构象存在，其中，两种形式的混合物也可能以一定的平衡分布而存在；

或者，至于相应的环结构，其对于本发明的目的来说应视为等同于上述的开放结构，

其中，取决于反应条件和/或交联化合物的特定的化学性质，这些HAS衍生物可能以N原子处于平伏或直立的位置而存在，其中，两种形式的混合物也可能以一定的平衡分布而存在；

或

或

或相应的环结构

或

或

或相应的环结构

或

根据所述的优选交联化合物，下列HAS衍生物可以提及作为优选实施方式的例子，其中，在各种情况下，根据本发明的优选实施方式，HAS是HES：

其中包括相应的环结构，

或

或

其中包括相应的环结构，

或

其中包括相应的环结构，

或

或

其中包括相应的环结构，

或

或

其中包括相应的环结构，

或

或

或

其中包括相应的环结构，

或

其中包括相应的环结构，

或

或

其中包括相应的环结构，

或

其中包括相应的环结构，

或

或

其中包括相应的环结构，

或

或

其中包括相应的环结构，

或

或

其中包括相应的环结构，

或

或

其中包括相应的环结构，

或

或

其中包括相应的环结构，

或

或

其中包括相应的环结构，

或

或

其中包括相应的环结构，或

更优选基于选自结构(a2)、(a4)、(a11)、(a12)、(a14)、(a16)和(a18)的交联化合物的HAS衍生物。甚至更优选，基于选自结构(a2)、(a11)、(a12)、(a14)、(a16)和(a18)的交联化合物的HAS衍生物。尤其优选基于选自结构(a2)、(a11)、(a12)和(a16)的交联化合物的HAS衍生物。

相应的环结构

和/或

关于HAS的其他可以设想的实施方式

为了完整起见，应当提到，虽然根据本发明不是优选的，但可以设想，HAS在与交联化合物的反应之前被氧化，从而使得至少两个醛基如下式所示被引入HAS中

一般来说，可使用能够氧化聚合物的至少一个糖环以产生具有至少一个，优选至少两个醛基的开放糖环的各种氧化剂或氧化剂的组合。该反应可通过下面的反应路线举例说明，其显示被氧化以产生具有两个醛基的开放环的HAS糖环：

合适的氧化剂尤其是高碘酸盐，如高碘酸碱金属盐或其两种或多种的混合物，优选高碘酸钠和高碘酸钾。可以设想，这些醛基可通过氨基M与交联化合物M-L-A反应。

分离和/或纯化

一般来说，可以设想，来自本发明的步骤(i)的HAS衍生物随后如下文所述进行反应。根据优选的实施方式，来自步骤(i)的HAS衍生物在反应步骤(i)后适当地纯化。

对于来自步骤(i)的HAS衍生物的纯化，举例来说，可以提到以下可能方式A)到C)，其中优选可能方式A)：

A)使用水或水性缓冲液的超滤，该水性缓冲液具有优选0.1到100毫摩尔/升、更优选1到50毫摩尔/升和更优选5至20毫摩尔/升如大约10毫摩尔/升的浓度和优选2到10、更优选4至10、更优选6到10和更优选8到10如大约9的pH；交换循环的次数优选为10到50，更优选10到40和甚至更优选10到30，如大约20。

B)使用水或水性缓冲液的渗析，该水性缓冲液具有优选0.1到100毫摩尔/升、更优选1到50毫摩尔/升和更优选5至20毫摩尔/升如大约10毫摩尔/升的浓度和优选2到10、更优选4至10、更优选6到10和更优选7到9的pH；其中，使用含有优选5重量％至20重量％浓度的HAS衍生物的溶液；和其中，缓冲液和水相对于HES衍生物溶液特别地以超过大约100∶1的量使用。

C)用乙醇或异丙醇进行沉淀，离心和再溶解于水中以获得具有优选大约10重量％浓度的溶液，并随后使用水或具有优选0.1到100毫摩尔/升、更优选1到50毫摩尔/升和甚至更优选5至20毫摩尔/升如大约10毫摩尔/升的浓度和优选2到10、更优选4至10、更优选6到10和更优选7到9的pH的水性缓冲液进行超滤；交换循环的次数优选为10到40，更优选10到30和甚至更优选10到20，如10。

优选的纯化步骤后，优选获得固体的HAS衍生物。根据本发明的进一步可以设想的实施方式，可能提及具有优选的2重量％至40重量％的HAS衍生物含量的HAS衍生物溶液或冷冻的HAS衍生物溶液，其中，这些溶液的pH优选为3至10，且使用的缓冲液浓度优选为0.1至1摩尔/升。

因此，本发明还涉及如上所述的方法，其中在(i)后，使用水或具有0.1到100毫摩尔/升的浓度和2到10的pH的水性缓冲溶液进行超滤以纯化(i)中获得的HAS衍生物；交换循环的次数为10到50。

与生物活性剂BA的反应

根据进一步优选的实施方式，本发明涉及一种方法，其中上述的HES的衍生物

进一步适当地通过缩醛基或缩酮基A与生物活性化合物BA反应，所述基团A优选在与BA反应之前转化为相应的醛基或酮基。

最优选地，基团A(优选相应的醛基或酮基)与氨基反应，更优选与BA中包含的伯氨基反应。对于这些情况和出于本发明的目的，BA也表示为H₂N-BA′，其中，BA′是BA的其余部分。

因此，本发明还涉及如上所述的方法，进一步包括

(ii)式(III)的HAS衍生物经还原胺化反应通过基团A与生物活性剂H₂N-BA′的氨基反应，获得式(IV)的HAS衍生物

根据本发明的第一实施方式，从(i)获得的已经优选经过纯化的HAS衍生物适当地进行基团A向相应的醛基或酮基的转化，其中产生的HAS衍生物在与BA反应之前进行适当的纯化和/或分离步骤。向醛基或酮基的转化优选通过酸催化的水解反应进行。反应优选在以下条件下进行：0到100℃、更优选10到80℃和更优选20到60℃的温度，优选1到6、更优选1至5、更优选1到4、更优选1至3和甚至更优选1到小于3的pH值。可以通过本领域的技术人员熟知的方法，例如，通过渗析或超滤，实现水解反应产物的纯化和缓冲液交换。转化的材料可以作为固体从溶液中回收，例如通过冷冻干燥。

根据本发明的第二实施方式，从(i)获得的已经优选经过纯化的HAS衍生物适当地进行基团A向相应的醛基或酮基的转化，其中，产生的HAS衍生物直接与BA反应，即不进行包含醛基或酮基的HAS衍生物的单独的适当纯化和/或分离步骤。向醛基或酮基的转化优选通过酸催化的水解反应进行。反应优选在以下条件下进行：0到100℃、更优选10到80℃和更优选20到60℃的温度，优选1到6、更优选1至5、更优选1到4、更优选1至3和甚至更优选1到小于3的pH值。水解产物可直接或在调整pH到与BA反应相容的值后与缓冲溶液中的BA合并。

因此，本发明还涉及如上所述的方法，其中在(ii)之前，式(III)的HAS衍生物的基团A转化为相应的醛基或酮基。

根据本发明的第三种可设想的实施方式，从(i)获得的已优选经过纯化的HAS衍生物直接与BA反应，即，在允许基团A向相应的醛基或酮基原位转化的反应条件下而不进行单独的适当纯化和/或分离步骤且不进行单独的基团A向相应的醛基或酮基的转化的步骤直接与BA反应。向醛基或酮基的转化优选通过酸催化的水解反应进行。反应优选在以下条件下进行：0到100℃、更优选10到80℃和更优选20到60℃的温度，优选1到6、更优选1至5、更优选1到4、更优选1至3和甚至更优选1到小于3的pH值。水解反应产物可直接或在调整pH到与BA反应相容的值后，与缓冲溶液中的BA合并。

执行上述三种实施方式中的哪种方法取决于，例如，使用的生物活性物质BA的特定性质。如果，例如使用蛋白质如EPO、G-CSF或IFN-α作为BA，上述的第一或第二实施方式一般是适用的。

步骤(ii)中的反应优选在水性体系中进行。用于本发明中的术语“水性体系”是指包含至少10重量％、优选至少50重量％、更优选至少80重量％、甚至更优选至少90重量％或最多100重量％(基于涉及的溶剂的重量)的水的溶剂或溶剂混合物。作为另外的溶剂，可以提及如DMSO、DMF、乙醇或甲醇的溶剂。

虽然可以设想到在获得式(IV)的非还原形式的HAS衍生物的条件下进行步骤(ii)中的反应，

但尤其优选在至少一种合适的还原剂的存在下的还原胺化条件下进行步骤(ii)中的反应。特别地，在这些条件下，通过由HAS衍生物的基团A产生的醛基或酮基与BA的H₂N-基团的反应获得的基团-CH＝N-还原为-CH₂-NH-。

举例来说，可使用下面的还原剂：NaBH(OAc)₃、硼氢化钠、氰基硼氢化钠、有机硼烷络合化合物(如4-(二甲基氨基)-吡啶硼烷络合物、N-乙基二异丙基胺硼烷络合物、N-乙基吗啉硼烷络合物、N-甲基吗啉硼烷络合物、N-苯基吗啉硼烷络合物、二甲基吡啶硼烷络合物、三乙胺硼烷络合物或三甲胺硼烷络合物)。优选NaBH₄和NaCNBH₃，尤其优选NaCNBH₃。

在一种实施方式中，将HAS衍生物添加到含有生物活性剂的水溶液中。优选地，随后添加该至少一种还原剂，尤其是NaCNBH₃。

在一种替代的实施方式中，HAS衍生物可以任选地成为水溶液中，然后加入BA。优选地，随后添加该至少一种还原剂，尤其是NaCNBH₃。

步骤(ii)中HAS衍生物与生物活性化合物BA的氨基的反应优选在3到9、优选3至8、更优选3至7、更优选3至低于7的pH如3或4或5或6的pH值下进行。可以通过加入至少一种合适的缓冲剂调整反应混合物的合适的pH值。在优选的缓冲剂中，可以提及醋酸盐缓冲液(优选醋酸钠缓冲液)、磷酸盐或硼酸盐缓冲。

步骤b)获得的HAS衍生物与生物活性化合物BA的氨基在步骤(ii)中的反应优选在-10到100℃、优选0到50℃、更优选0到37℃、更优选0到25℃如0、5、10、15、20或25℃的温度下进行。

步骤(ii)的反应时间取决于温度、HAS衍生物(尤其是HES衍生物)与化合物BA的比例及HAS衍生物和生物活性剂BA的绝对浓度。一般来说，5分钟至7天，优选1小时至7天的反应时间是可以想象的。

在步骤(ii)中，基于HAS衍生物的数均分子量(M_n)，获得的HAS衍生物与化合物BA的摩尔比优选为0.1∶1至200∶1当量、甚至更优选1∶1到大约100∶1。优选摩尔比为1∶1到50∶1。低的摩尔比如50∶1或更低，优选1∶1到20∶1、更优选1∶1到10∶1和甚至更优选2∶1到9∶1、更优选3∶1到8∶1和甚至更优选4∶1到7∶1是可以设想的，例如，如果BA是蛋白质，尤其是IFN-α。

在一种特别优选的实施方式中，步骤(ii)中使用的HAS衍生物的浓度高于大约10重量％，尤其是高于大约15重量％，在各种情况下相对于(ii)的反应溶液的重量。

因此，本发明还涉及如上所述的方法，其中在(ii)中，反应优选在水性体系中，在还原剂(优选NaCNBH₃)的存在下，在0到37℃、优选0至25℃的温度和3至9、优选3至低于7的pH值下进行，且其中在(ii)中，基于HAS衍生物的数均分子量(M_n)，HAS衍生物与生物活性剂BA的摩尔比为0.1∶1至200∶1当量、优选1∶1到50∶1当量。

进行步骤(ii)的溶液(优选水溶液)的BA的优选浓度，例如，优选的蛋白质浓度，为0.1至10克/升，更优选1到9克/升。在步骤(ii)前，以(w/v)表示的所述溶液中HAS衍生物的浓度优选为0.1至50％、更优选0.5％至45％和更优选1％至40％。

根据可以设想的实施方式，生物活性剂BA可以溶于水性介质中，优选在水性缓冲溶液中，尤其在醋酸钠缓冲溶液中。水性溶液中可以另外包含添加剂，如洗涤剂和/或分散剂，特别地选自SDS、Chaps、Tween20、Tween 80、Nonidet P-40和Triton X 100。如果使用洗涤剂和/或分散剂，其优选以基于水性溶液总重量的0.005重量％至3重量％、优选0.05重量％至3重量％、优选大约0.5重量％的量存在。

如果根据本发明使用该至少一种还原剂，且用于与BA的反应的HAS衍生物中存在的X为，例如，-CH＝N-、-CH＝N-O-或-CH＝N-NH-(C＝O)-，优选在用于(ii)的反应中的还原胺化反应条件下被还原以产生官能团X，其为-CH₂-NH-、-CH₂-NH-O-或-CH₂-NH-NH-(C＝O)-。

因此，本发明还涉及通过上述方法可获得的或获得的HAS衍生物，尤其是通过如上所述的方法，其中在(ii)中，反应优选在水性体系中，在还原剂(优选NaCNBH₃)的存在下，在0到37℃、优选0至25℃的温度和3至9、更优选3至7、更优选3至低于7的pH值下进行，且其中在(ii)中，基于用于步骤(ii)中的HAS衍生物的数均分子量(M_n)，HAS衍生物与生物活性剂BA的摩尔比为0.1∶1至200∶1当量、优选1∶1到10∶1当量，在各种情况下条件是X不是酰胺基。特别优选的HAS衍生物与生物活性剂BA的摩尔比低于10，例如1∶1到9∶1，更优选1∶1到8∶1，更优选1∶1到7∶1，更优选1∶1到6∶1和甚至更优选1∶1到5∶1，如大约1∶1、大约2∶1、大约3∶1、大约4∶1或大约5∶1。尽管这样低的摩尔比如50∶1或更低、更优选10∶1或更低对于几种生物活性剂是可以想象的，但它们对于例如蛋白质是优选的，其中特别优选是IFN-α。至于例如G-CSF和EPO，优选50∶1或更低，例如1∶1到50∶1的摩尔比。在一般情况下，举例来说，可能提及1∶1到50∶1、或2∶1到40∶1、或3∶1到30∶1、或4∶1到20∶1、或5∶1到15∶1的摩尔比。

如果蛋白质用作本发明的生物活性剂BA，且尤其是在上述优选的pH值范围，尤其是在低于7和大于或等于3的pH值下，HAS衍生物主要与位于蛋白质的N末端的氨基反应。用于本发明的术语“主要”指的是其中可用的N末端氨基中至少50％、优选至少60％、优选至少70％、优选至少80％、优选是至少85％通过还原胺化来反应的实施方式。也可能使可用的N末端氨基的至少90％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％反应。虽然不能完全排除对N-末端氨基以外的氨基的偶合，但相信在低于7的pH值下通过本发明的还原胺化的偶合基本上选择性地在N-末端氨基发生。特别地，这些反应条件对于在这些条件下稳定的蛋白质是优选的。如果一种蛋白质例如是酸不稳定的，如α1-抗胰蛋白酶(A1AT)，则优选选择其合适的反应条件，尤其是低于7.5至大于5的pH。

因此，本发明还涉及制备包含BA′的HAS衍生物的方法、通过这种方法可获得的或获得的HAS衍生物及如上所述的这样的式(IV)的HAS衍生物，其中，蛋白质包含N末端氨基和至少一个另外的氨基，所述HAS衍生物包含主要与N-末端氨基偶合的HAS。

因此，本发明还涉及式(IV)的HAS衍生物

另外，本发明还涉及式(IV)的羟烷基淀粉衍生物

其中，X是式(II)的交联化合物

M-L-A

的氨基M

其中，X不是酰胺基-C(＝O)-NH-，

与式(I)的羟烷基淀粉(HAS)

通过HAS的碳原子C*反应产生的官能团，其中，C*在HAS与M的反应之前任选被氧化，最优选不氧化。

其中，HAS′是羟烷基淀粉分子的其余部分，和R₁、R₂和R₃独立地为氢或者直链或分支的羟烷基，

其中，A是式(IIa)的残基

其中，

Z₁和Z₂各独立地为O或S或NR_x，优选O，其中，R_x是H或低级烷基如甲基、乙基或丙基(如正丙基或异丙基)，或C(O)-R_y，其中R_y优选选自C₁-C₆烷基和C₆-C₁₄芳基，甚至更优选选自任选取代的，优选非取代的甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基；R_x优选是H；

A₁和A₂各独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、苯甲基、1，1，1-三氯乙基、硝基苯甲基、甲氧基苯甲基、乙氧基苯甲基，或形成式(IIb)的环：

其中，A₁和A₂在一起为-(CH₂)₂-或-(CH₂)₃-或-(CH₂CH(CH₃))-，和

其中，A₃是H或甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、戊基、苯甲基，或与氨基M的N原子或L中包含的合适的原子形成环，A₃优选是H；

和其中，L是桥连M和A的间隔物，

其中，BA′是BA的氨基通过还原胺化反应与对应于A的醛基或酮基反应之后残留的生物活性剂H₂N-BA′的其余部分。

至于HAS(优选HES)和交联化合物的优选实施方式，参考上述的相应公开内容。

至于式(IV)的衍生物，X优选选自-CH₂-NH-、-CH＝N-、-CH₂-NH-O-和-CH＝N-O-，更优选-CH₂-NH-和-CH₂-NH-O-，最优选-CH₂-NH-。

此外，至于式(IV)的HAS衍生物，桥连M和A的L优选是包含至少一个式(IId)的结构单元，优选由式(IId)的结构单元组成的间隔物

其中，L₁和L₂彼此独立地为H或选自烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、烷芳基和取代的烷芳基的有机残基，及残基-O-R″，其中，R″选自烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、烷芳基和取代的烷芳基；优选为H或选自烷基和取代的烷基的有机残基；更优选为H或烷基；更优选为H，

其中，n是1到20、优选1到10、更优选1到6、更优选1到4、更优选2的整数。

用于本发明中的术语“生物活性物质”(BA)涉及可以影响生物有机体(包括但不限于：病毒、细菌、真菌、植物、动物和人类)的任何物理或生化性质的物质。具体地，用于本发明中的术语“生物活性物质”涉及用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或动物的疾病或另外地提高人类或动物的身体或精神健康的物质。活性物质的例子包括但不限于：肽、多肽、蛋白质、酶、小分子药物、染料、脂类、核苷、核苷酸、寡核苷酸(如具有合适的间隔物如5′-氨基己基间隔物的寡核苷酸)、多核苷酸、核酸、细胞、病毒、脂质体、微粒和胶束。优选本发明的生物活性物质包含天然的氨基。

蛋白质的例子包括但不限于：促红细胞生成素(EPO)如重组人EPO(rhEPO)或EPO模拟物、集落刺激因子(CSF)如G-CSF，如重组人G-CSF(rhG-CSF)、α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)或γ-干扰素(IFN-γ)如IFN-α和IFN-β，如重组人IFN-α或IFN-β(rhIFN-α或rhIFN-β)、白介素例如，IL-1至IL-34，如IL-2或IL-3或IL-11，如重组人IL-2或IL-3(rhIL-2或rhIL-3)、血清蛋白如凝血因子II-XIII，如因子VIII、因子VII、因子IX、因子II、因子III、因子IV、因子V、因子VI、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、丝氨酸蛋白酶抑制剂如α1-抗胰蛋白酶(A1AT)、活化蛋白C(APC)、纤溶酶原激活物如组织型纤溶酶原激活物(tPA)，如人类组织纤溶酶原激活物(hTPA))、AT III如重组人AT III(rhAT III)、肌红蛋白、白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、生长因子如表皮生长因子(EGF)、血小板生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、脑源性生长因子(BDGF)、神经生长因子(NGF)、B细胞生长(BCGF)、脑源性的神经营养生长因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、转化生长因子(如TGF-α或TGF-β)、BMP(骨形态发生蛋白)、生长激素如人生长激素(hGH)，如重组人生长激素(rhGH)、肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β、生长抑素(somatostatine)、促生长素(somatotropine)、生长调节素(somatomedine)、血红蛋白、激素或激素原如胰岛素、促性腺激素、黑色素细胞刺激素(α-MSH)、曲普瑞林(triptorelin)、下丘脑(hypothalamic)激素(如抗利尿激素(ADH)和催产素以及释放激素和释放抑制激素)、甲状旁腺激素、甲状腺激素(如甲状腺素、促甲状腺激素、促甲状腺素释放素)、降钙素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽(GLP-1、GLP-2等)、exendines(如Exendin-4)、瘦素(leptin)如重组人瘦素(rhLeptin)、Kemptide(Trp4-Kemptide)、加压素、胃泌素、胰泌素(secretin)、整联蛋白、糖蛋白激素(如LH、FSH等)、melanoside-刺激激素、脂蛋白和载脂蛋白(如apo-B、apo-E、apo-La)、免疫球蛋白(如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及其片段，如源自人类免疫球蛋白G分子的Fab片段(hFab)、鼠免疫球蛋白G(mIgG))、水蛭素、组织途径抑制剂、植物蛋白(如植物凝集素或蓖麻毒蛋白)、蜂毒、蛇毒、免疫毒素、抗原E、α-蛋白酶抑制剂、豚草过敏原、黑色素、寡赖氨酸(oligolysine)蛋白、RGD蛋白或这些蛋白质之一的任选相应的受体；催乳素或其突变体，如G129R(其中，在129位的野生型氨基酸甘氨酸被精氨酸取代)(这一突变体的商品名称是“LactoVert”)，和这些蛋白质或受体的功能性衍生物或片段。

多肽优选选自促红细胞生成素(EPO)(如重组人EPO(rhEPO))、集落刺激因子(CSF)(如G-CSF，如重组人G-CSF(rhG-CSF))、干扰素(IFN)(如IFN-α、IFN-β、IFN-γ，如重组人IFN-α(rhIFN-α)或重组人IFN-β(rhIFN-β))、因子VII(如重组人因子VIIa(rhFVIIa))、因子IX(如重组人因子IX(rhFIX))、生长激素(GH)如重组人生长激素(rhGH)、Fab片段(如源自人类免疫球蛋白G分子的Fab片段(hFab))、免疫球蛋白G(鼠免疫球蛋白G(mIgG))、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、天冬酰胺酶(如重组天冬酰胺酶(rAsparaginase))、瘦素(如重组人瘦素(rhLeptin))、白介素-2、白介素-11、α-1-抗胰蛋白酶、抗体或抗体片段及可替换的蛋白质支架(scaffold)。

更优选地，多肽选自促红细胞生成素(EPO)(如重组人EPO(rhEPO))、集落刺激因子(CSF)(如G-CSF，如重组人G-CSF(rhG-CSF))、干扰素(IFN)(如IFN-α、IFN-β、IFN-γ，如重组人IFN-α(rhIFN-α)或重组人IFN-β(rhIFN-β))、因子VII(如重组人因子VIIa(rhFVIIa))、因子IX(如重组人因子IX(rhFIX))、生长激素(GH)如重组人生长激素(rhGH)、Fab片段(如源自人类免疫球蛋白G分子的Fab片段(hFab))、免疫球蛋白G(鼠免疫球蛋白G(mIgG))、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、天冬酰胺酶(如重组天冬酰胺酶(rAsparaginase))、瘦素(如重组人瘦素(rhLeptin))、白介素-2、白介素-11和α-1-抗胰蛋白酶。

活性物质优选选自抗生素、抗抑郁药、抗糖尿病药物、抗利尿药、抗胆碱能药、抗心律失常药、止吐药、镇咳药、抗癫痫药、抗组胺药、抗真菌药、antisympathotonics、抗血栓药、雄激素、抗雄激素、雌激素、抗雌激素、抗骨质疏松药(antiosteoporotics)、抗肿瘤药物、血管扩张药、其他抗高血压药、解热药、镇痛药、抗炎药、β-受体阻滞剂、免疫抑制药和维生素。

活性物质的某些另外的、非限制性的例子是阿仑膦酸(alendronate)、amikazin、阿替洛尔、脒唑硫嘌呤、西咪替丁、可乐定、替可克肽(cosyntropin)、环丝氨酸、去氨加压素、双氢麦角胺、多巴酚丁胺、多巴胺、ε-氨基己酸、麦角新碱、艾司洛尔、法莫替丁、氟卡尼、叶酸、氟胞嘧啶、呋塞米、更昔洛韦、胰高血糖素、hydrazaline、异丙基肾上腺素、氯胺酮、碘塞罗宁、LHRH、merpatricin、甲基多巴、美托洛尔、新霉素(neomicin)、尼莫地平、制霉菌素、催产素、酚妥拉明、苯肾上腺素(phenylephrine)、普鲁卡因胺、普鲁卡因、普萘洛尔、利托君、索他洛尔、特布他林、硫胺素、替鲁膦酸(tiludronate)、妥拉唑林(tolazoline)、甲氧苄氨嘧啶、氨丁三醇、加压素；氨磷汀、胺碘达隆、氨基己酸、对氨基马尿酸钠(aminohippurate sodium)、氨鲁米特、氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)、氨基水杨酸、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、天冬酰胺酶(如重组天冬酰胺酶，如来自大肠杆菌(rAsparaginase))、蒽环类(anthracycline)、蓓萨罗丁(bexarotene)、比卡鲁胺、博来霉素、布舍瑞林、白消安、卡麦角林、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥(chlorambucin)、西司他丁钠、顺铂、克拉屈滨(cladribine)、氯曲膦酸(clodronate)、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、喜树碱、13-顺视黄酸、全反式视黄酸；达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、去铁胺、地塞米松、双氯芬酸、己烯雌酚、多西他赛、多柔比星、表柔比星、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、非索非那定、氟达拉滨、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟羟甲睾酮(fluoxymesterone)、氟他米特、吉西他滨、肾上腺素、左旋多巴、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、依立替康、伊曲康唑、戈舍瑞林、来曲唑、甲酰四氢叶酸、左旋咪唑、赖诺普利(lisinopril)、左旋甲状腺素钠(lovothyroxine sodium)、洛莫司汀、氮芥、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、重酒石酸间羟胺、甲氨喋呤、甲氧氯普胺、美西律、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、纳洛酮、烟碱、尼鲁米特、奥曲肽、奥沙利铂、帕米膦酸(pamidronate)、喷司他丁、普卡霉素(pilcamycin)、卟吩姆(porfimer)、泼尼松、丙卡巴肼(procarbazine)、丙氯拉嗪、昂丹司琼、雷替曲塞(raltitrexed)、西罗莫司、链佐星、他克莫司、他莫昔芬、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷、睾酮、四氢大麻酚、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、拓扑替康、维甲酸、戊柔比星(valrubicin)、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、多拉司琼、格拉司琼；福莫特罗、氟替卡松、亮丙瑞林(leuprolide)、咪达唑仑、阿普唑仑、两性霉素B、鬼臼毒素(podophylotoxins)、核苷类抗病毒药物、芳酰基腙类、舒马曲坦；大环内酯类抗生素如红霉素、竹桃霉素、醋竹桃霉素、罗红霉素、克拉霉素(clarithromycin)、环酯红霉素(davercin)、阿奇霉素、氟红霉素、地红霉素、交沙霉素、螺旋霉素(spiromycin)、麦迪霉素、柱晶白霉素(leucomycin)、美欧卡霉素(miocamycin)、罗他霉素、andazithromycin和swinolide A；氟喹诺酮类药物如环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、曲伐沙星、阿拉曲沙星、莫西沙星(moxifloxicin)、诺氟沙星、依诺沙星、格帕沙星、加替沙星、洛美沙星、司帕沙星、替马沙星、培氟沙星、氨氟沙星、氟罗沙星、托氟沙星、普卢利沙星、伊洛沙星、帕珠沙星、克林沙星和西他沙星；氨基糖苷类如庆大霉素、奈替米星、草履虫素(paramecin)、妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素和链霉素、万古霉素、替考拉宁(teicoplanin)、雷莫拉宁(rampolanin)、麦地拉宁、粘菌素(colistin)、达托霉素、短杆菌肽、甲磺酸粘菌素(colistimethate)；多粘菌素类如多粘菌素乙(polymixin B)、卷曲霉素、杆菌肽、青霉烯类；青霉素类包括青霉素敏感剂，如青霉素G、青霉素V；抗青霉素酶剂，如甲氧西林、苯唑西林(oxacillin)、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、萘夫西林；革兰氏阴性微生物活性剂，如氨苄西林、阿莫西林和海他西林、cillin及galampicillin；抗假单胞菌青霉素，如羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林和哌拉西林；头孢菌素，如头孢泊肟、头孢丙烯、头孢布坦(ceftbuten)、头孢唑肟、头孢曲松、头孢噻吩、头孢匹林、头孢氨苄、头孢拉定(cephradrine)、头孢西丁、头孢孟多、头孢唑啉、头孢利定、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢来星(cephaloglycin)、头孢氨呋肟、头孢雷特(ceforamide)、头孢噻肟、头孢曲秦、氰乙酰头孢菌素(cephacetrile)、头孢吡肟、头孢克肟、头孢尼西、头孢哌酮、头孢替坦、头孢美唑(cefinetazole)、头孢他啶、氯碳头孢和拉氧头孢，及单环β-内酰胺(monobactam)类，如氨曲南；及碳青霉烯类，如亚胺培南、美罗培南、喷他脒羟乙基磺酸盐、硫酸沙丁胺醇、利多卡因、奥西那林硫酸盐、丙酸倍氯米松(beclomethasone diprepionate)、曲安西龙乙酰胺、布地奈德丙酮化合物、氟替卡松、异丙托溴铵、氟尼缩松、色甘酸钠和酒石酸麦角胺；紫杉烷类、如紫杉醇；SN-38和tyrphostines。

因此，技术人员已知为“小、分子”的化合物根据本发明也是可以设想的生物活性物质。用于本发明中的术语“小分子”涉及蛋白质和寡核苷酸之外的生物活性化合物，但是，包括最多50个氨基酸的肽。这种小分子典型的例子如前述段落所列。

寡核苷酸的例子是适体(aptamer)和siRNA。作为可以设想的生物活性物质另外提到的是肽核酸(PNA)。

因此，本发明还涉及上述方法和上述HAS衍生物，其中，蛋白质是促红细胞生成素(EPO)(如重组人EPO(rhEPO))、集落刺激因子(CSF)(如G-CSF，如重组人G-CSF(rhG-CSF))、干扰素(IFN)(如IFN-α、IFN-β、IFN-γ，如重组人IFN-α(rhIFN-α)或重组人IFN-β(rhIFN-β))、因子VII(如重组人因子VIIa(rhFVIIa))、因子IX(如重组人因子IX(rhFIX))、生长激素(GH)如重组人生长激素(rhGH)、Fab片段(如源自人类免疫球蛋白G分子的Fab片段(hFab))、免疫球蛋白G(鼠免疫球蛋白G(mIgG))、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、天冬酰胺酶(如重组天冬酰胺酶(rAsparaginase))、瘦素(如重组人瘦素(rhLeptin))、白介素-2、白介素-11、α-1-抗胰蛋白酶、抗体或抗体片段或可替换的蛋白质支架(scaffold)。

用于本发明中的术语“可替换的蛋白质支架”指的是具有类似于特定抗体的结合能力的分子，其中，所述分子是基于可替换的非抗体蛋白框架。在本文中，可能提及A.Skerra，T.Hey等人和H.K.Binz的文章(见下文的参考文献列表)。

至于本发明的生物活性物质(BA)，这些化合物可以包含一个或多个用于本发明的阶段(ii)的偶合的氨基。对于BA本身不包含适于这种偶合的氨基的情况，可以设想：在使BA进行(ii)之前，使用本领域的技术人员已知的方法，通过合适的官能化将至少一个这样的氨基引入BA中。

根据上述的生物活性剂、尤其是上述优选的生物活性剂，且根据上述优选的交联化合物和由其获得的HAS衍生物，下面的HAS衍生物可以被视为优选的方式实施方式的例子，其中在各种情况下，根据本发明的优选实施方式，HAS是HES：

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或

或

其中，B A′是蛋白质，更优选，其中，蛋白质是促红细胞生成素(EPO)(如重组人EPO(rhEPO))、集落刺激因子(CSF)(如G-CSF，如重组人G-CSF(rhG-CSF))、干扰素(IFN)(如IFN-α、IFN-β、IFN-γ，如重组人IFN-α(rhIFN-α)或重组人IFN-β(rhIFN-β))、因子VII(如重组人因子VIIa(rhFVIIa))、因子IX(如重组人因子IX(rhFIX))、生长激素(GH)如重组人生长激素(rhGH)、Fab片段(如源自人类免疫球蛋白G分子的Fab片段(hFab))、免疫球蛋白G(鼠免疫球蛋白G(mIgG))、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、天冬酰胺酶(如重组天冬酰胺酶(rAsparaginase))、瘦素(如重组人瘦素(rhLeptin))、白介素-2、白介素-11、α-1-抗胰蛋白酶、抗体或抗体片段及可替换的蛋白质支架，尤其是其中蛋白质是EPO、IFN-α或G-CSF。甚至更优选，HAS′是HES′，其中甚至更优选地HES具有大约1到大约1000kDa、更优选大约1至大约800kDa、更优选大约1至大约500kDa、更优选大约2至大约400kDa、更优选大约5至大约300kDa、更优选大约10至大约200kDa、尤其是大约50至大约150kDa的平均分子量，和0.1至3、优选0.4至1.3如0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2或1.3，优选0.7至1.3如0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2或1.3，最优选大约1.0、1.1、1.2或1.3的摩尔取代度，和优选2至20、更优选2到15和甚至更优选3至12的C₂∶C₆取代比。

根据尤其优选的实施方式，本发明涉及下式的HAS衍生物

其中，HAS优选是HES，和其中甚至更优选地HES具有大约1到大约1000kDa、更优选大约1至大约800kDa、更优选大约1至大约500kDa、更优选大约2至大约400kDa、更优选大约5至大约300kDa、更优选大约10至大约200kDa、尤其是大约50至大约150kDa的平均分子量，和0.1至3、优选0.4至1.3如0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2或1.3的摩尔取代度，和优选2至20、更优选2到15和甚至更优选3至12的C₂∶C₆取代比。

根据进一步尤其优选的实施方式，本发明涉及下式的HAS衍生物

其中，HAS优选是HES，和其中甚至更优选地HES具有大约1到大约1000kDa、更优选大约1至大约800kDa、更优选大约1至大约500kDa、更优选大约2至大约400kDa、更优选大约5至大约300kDa更优选大约10至大约200kDa、尤其是大约50至大约150kDa的平均分子量，和0.1至3、优选0.4至1.3如0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.91.0、1.1、1.2或1.3的摩尔取代度，和优选2至20、更优选2到15和甚至更优选3至12的C₂：C₆取代比。

根据进一步的方面，本发明涉及用于治疗人体或动物体的包含上述的BA′的HAS衍生物或通过上述方法可获得的或获得的包含上述的BA′的HAS衍生物。

此外，本发明涉及用作治疗剂或预防剂的包含上述的BA′的HAS衍生物或通过上述方法可获得的或获得的包含上述BA′的HAS衍生物。

此外，本发明涉及包含治疗有效量的包含上述BA′的HAS衍生物或通过上述方法可获得的或获得的包含上述BA′的HAS衍生物的药物组合物。

本发明的包含BA′的HAS衍生物可以通过适当的方法施用，如经肠的、肠胃外或经肺的方法，优选通过i.v.、s.c.或i.m.途径施用。选择的具体途径将取决于待治疗的病症况。优选地，衍生物可以与合适的载体(如本领域已知的载体，例如，用作第一代/未改性的生物制药、不含白蛋白或以白蛋白作为赋形剂的载体)、合适的稀释剂(如用于i.v.、s.c.或i.m.应用的无菌溶液)一起施用。所需的剂量将取决于待治疗的病症的严重程度、患者的个体反应、使用的施用方法等。技术人员能够根据其常识制定正确的剂量。

至于如上所述包含含有BA′的HAS衍生物的本发明药物组合物，HAS衍生物可与药物赋形剂组合使用。一般情况下，HAS衍生物为可与适当的固体或液体形式的药物赋形剂结合的固体形式。作为赋形剂，碳水化合物、无机盐、抗菌剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱及其组合可能被提及。碳水化合物，如糖、衍生的(derivatized)糖(如糖醇(alditol)、醛糖酸(aldonic acid)、酯化的糖和/或糖聚合物可作为赋形剂存在。具体的碳水化合物赋形剂包括，例如：单糖如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；及糖醇，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡萄糖醇)、吡喃糖基山梨醇(pyranosyl sorbitol)、肌醇等。赋形剂还可以包括无机盐或缓冲剂，如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠及其组合。本发明的药物组合物还可以包含用于防止或阻止微生物生长的抗菌剂，如苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、thimersol及其组合。本发明的药物组合物还可以包含抗氧化剂，例如，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole)、丁基化羟氢甲苯(butylated hydroxytoluene)、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛合次硫酸钠(sodium formaldehyde sulfoxylate)、焦亚硫酸钠及其组合。本发明的药物组合物根据还可以包含表面活性剂，例如，聚山梨醇酯(polysorbate)或pluronics山梨聚糖酯；脂质，如磷脂(如卵磷脂和其他磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺酸)和脂肪酸酯)；类固醇类如胆固醇；和螯合剂如EDTA或锌。本发明的药物组合物还可以包含酸或碱，如盐酸、醋酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸及其组合，和/或氢氧化钠、醋酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、醋酸铵、醋酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾及其组合。一般来说，赋形剂在本发明的药物组合物中以0.001重量％到99.99重量％、优选0.1重量％到99.9重量％的量存在，各种情况下基于药物组合物的总重量计算。

根据另一方面，本发明还涉及上述的HAS衍生物(优选是HES衍生物)(其中，BA是EPO)用于制备治疗贫血疾病或造血功能障碍疾病或与其相关的疾病的药物的用途。

根据另一方面，本发明还涉及上述的HAS衍生物(优选是HES衍生物)(其中，BA是G-CSF)用于制备治疗血友病A、治疗以降低的造血或免疫功能为特征的障碍的药物的用途。根据优选的实施方式，以降低的造血或免疫功能为特征的障碍是由化疗、放射治疗、传染性疾病、严重慢性中性粒细胞减少症或白血病导致的。

根据另一方面，本发明还涉及上述的HAS衍生物(优选是HES衍生物)(其中，BA是IFN-α)用于制备治疗白血病(如毛细胞白血病、慢性髓性白血病)、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、癌症(如类癌肿瘤、恶性黑色素瘤)和肝炎(如慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎)的药物的用途。

根据另一方面，本发明还涉及上述的HAS衍生物(优选是HES衍生物)(其中，BA是IFN-γ)用于制备治疗骨质疏松症和/或慢性恶性疾病的药物的用途。

根据另一方面，本发明还涉及上述的HAS衍生物(优选是HES衍生物)(其中，BA是IL-2)用于制备治疗骨质疏松症和/或慢性恶性疾病的药物的用途。

根据另一方面，本发明还涉及上述的HAS衍生物(优选是HES衍生物)(其中，BA是IL-11)用于制备治疗骨髓抑制性化疗后的血小板输血的药物的用途。

根据另一方面，本发明还涉及上述的HAS衍生物(优选是HES衍生物)(其中，BA是A1AT)用于制备治疗肺气肿、囊性纤维化、特应性皮炎和/或支气管炎的药物的用途。

根据另一方面，本发明还涉及上述的HAS衍生物(优选是HES衍生物)(其中，BA是IFN-β)用于制备治疗多发性硬化症，优选复发型多发性硬化症的药物的用途。

根据另一方面，本发明还涉及上述的HAS衍生物(优选是HES衍生物)(其中，BA是因子VII)用于制备治疗血友病A或B的患者中采用因子VIII或因子IX的抑制剂的情形的药物的用途。

根据另一方面，本发明还涉及上述的HAS衍生物(优选是HES衍生物)(其中，BA是因子IX)用于制备控制和预防患有血友病B(例如先天性因子IX缺乏或克里斯马斯病)的患者的出血情形(包括在外科治疗环境中控制和预防出血)的药物的用途。

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K.R.Reddy等人Advanced Drug Delivery Reviews 54(2002)第571-586页。

附图说明：

图1：oxHES55/0.7-IFN-α偶联反应的SDS-PAGE分析

图1显示实施例2的oxHES-IFN-α偶联反应的SDS-PAGE分析。在还原条件下使用具有4％-12％的Bis-Tris凝胶(1.0毫米)和MOPS运行缓冲液的NuPAGE系统(Invitrogen)根据生产商的说明进行分离。

加载：作为反应混合物的10微克蛋白质。

M：标记物，Mark12(Invitrogen)。

道1-4：实施例2的反应混合物。

靶蛋白(19kDa)的成功HES化由于具有30至＞200kDa的宽质量分布的涂色带而变得可见。

图2：oxHES55/0.7-IFN-α偶联反应的阴离子交换色谱

图2显示实施例2的oxHES55/0.7-IFN-α偶联反应在离子交换柱上通过221nm处的紫外可见光谱监测的色谱分离。色谱条件如下：

色谱系统：

Explorer 100(GE Healthcare)。

柱：Hi Trap Q HP 1ml(GE Healthcare)。

洗脱液A：10mM Tris·Cl，pH 8.0。

洗脱液B：10mM Tris·Cl，0.5M NaCl，pH 8.0。

操作条件：流速为1毫升/分钟，21℃。

运行参数：

平衡 10CV 0％B

样品加载

冲洗 2CV 0％B

洗脱 16CV 0-50％B

再生 10CV 100％B

再平衡 8CV 0％B

加载：2毫克蛋白/毫升树脂作为实施例2的反应混合物，用洗脱液A稀释20倍，并调整pH至8.0。

在流体中发现未反应的过量的HES。HES化削弱了蛋白质与柱的相互作用，从而导致相比于未修饰的蛋白质，偶联物的洗脱时间缩短。

图3：oxHES55/0.7-EPO偶联反应的SDS-PAGE分析

图3显示实施例3的oxHES55/0.7-EPO偶联反应的SDS-PAGE分析。在还原条件下，通过使用4％-12％的Bis-Tris凝胶(1.0毫米)和MOPS运行缓冲液的NuPAGE系统(Invitrogen)根据生产商的说明进行分离。

加载：作为反应混合物的10微克蛋白质。

M：标记物，Mark12(Invitrogen)。

道1：实施例3的反应混合物。

道2：偶联前的EPO起始原料。

靶蛋白(大约35-40kDa)的成功HES化由于具有55至＞200kDa的宽质量分布的涂色带变得可见。

图4：oxHES55/0.7-EPO偶联反应的阳离子交换色谱

图4显示实施例3的oxHES55/0.7-EPO偶联反应在离子交换柱上通过221nm处的紫外可见光谱监测的色谱分离。色谱条件如下：

色谱系统：

Explorer 100(GE Healthcare)。

柱：Hi Trap Q HP(GE Healthcare)。

洗脱液A：20mM醋酸钠，pH 4.0。

洗脱液B：20mM醋酸钠，1M NaCl，pH 4.0。

操作条件：流速为5毫升/分钟，21℃。

运行参数：

平衡 10CV 0％B

样品加载

冲洗1 2CV 0％B

冲洗2 2CV 10％B

洗脱 21CV 10-52％B

再生 8CV 100％B

再平衡 5CV 0％B

加载：2毫克蛋白/毫升树脂作为实施例3的反应混合物，用洗脱液A稀释10倍。

在流体中发现未反应的过量的HES。HES化削弱了蛋白质与柱的相互作用，从而导致偶联物与未修饰的蛋白质相比洗脱时间缩短。

图5：oxHES100/1.0-IFN-α偶联反应的SDS-PAGE分析

图5显示实施例5的oxHES-IFN-α偶联反应的SDS-PAGE分析。在还原条件下，通过使用4％-12％的Bis-Tris凝胶(1.0毫米)和MOPS运行缓冲液的NuPAGE系统(Invitrogen)根据生产商的说明进行分离。

加载：作为反应混合物的10微克蛋白质。

M：标记物，Mark12(Invitrogen)。

道1：实施例5的反应混合物。

靶蛋白(19kDa)的成功HES化由于具有50至＞200kDa的宽质量分布的涂色带变得可见。

图6：oxHES100/1.0-IFN-α偶联反应的阴离子交换色谱

图6显示实施例5的oxHES 100/1.0-IFN-α的偶联反应在离子交换柱上通过221nm处的紫外可见光谱监测的色谱分离。色谱条件如下：

色谱系统：

Explorer 100(GE Healthcare)。

柱：Hi Trap Q HP 5ml(GE Healthcare)。

洗脱液A：10mM Tri s·Cl， pH 8.0。

洗脱液B：10mM Tris·Cl，0.5M NaCl，pH 8.0。

操作条件：流速为1毫升/分钟，21℃。

运行参数：

平衡 10CV 0％B

样品加载

冲洗 2CV 0％B

洗脱 12.5CV 0-50％B

再生 5CV 100％B

再平衡 8CV 0％B

加载：2毫克蛋白/毫升树脂作为实施例5的反应混合物，用洗脱液A稀释20倍，并调整pH至8.0。

图7：oxHES100/1.0-IFN-α偶联物的肽图

图7显示用Endo-LysC处理的IEX-纯化的实施例5的oxHES-IFN-α偶联物的色谱分离。

在50mM Tris-Cl(pH 8.6)、0.01％的SDS中37℃o/n下使用7.5％Endo-LysC进行蛋白质水解。用DTT和盐酸胍(guanidinium chloride)使样品变性，并在用带有TFA的水/乙腈梯度运行的4.6x 250mmJupiter C4柱(Phenomenex)上通过RP-HPLC进行分析。显示的色谱图在214nm处监测。

箭头表明其中对于蛋白质(A)和偶联物(B)的色谱图之间可见明显的区别的色谱区域。L1和L1/L2(由Endo-Lys C处理产生的N-末端肽)峰对于偶联物样品显著降低，而其他片段保持实际上不受影响。这些数据表明HES对于IFN-α的N-末端优先偶合。

图8：oxHES 100/1.0-EPO偶联反应的SDS-PAGE分析

图8显示实施例6的oxHES100/1.0-EPO偶联反应的SDS-PAGE分析。在还原条件下，通过使用4％-12％的Bis-Tris凝胶(1.0毫米)和MOPS运行缓冲液的NuPAGE系统(Invitrogen)根据生产商的说明进行分离。

加载：作为反应混合物的10微克蛋白质。

M：标记物，Mark12(Invitrogen)。

道1：10微克偶联前的EPO起始原料。

道2：5微克偶联前的EPO起始原料。

道3：实施例6的反应混合物。

靶蛋白(大约35-40kDa)的成功HES化由于具有70至＞200kDa的宽质量分布的涂色带变得可见。

图9：oxHES100/1.0-EPO偶联反应的阳离子交换色谱

图9显示实施例6的oxHES100/1.0-EPO的偶联反应在离子交换柱上通过221nm处的紫外可见光谱监测的色谱分离。色谱条件如下：

色谱系统：

Explorer 100(GE Healthcare)。

柱：2x 5ml HiTrap SP HP(GE Healthcare)。

洗脱液A：20mM醋酸钠，pH 4.0。

洗脱液B：20mM醋酸钠，1M NaCl，pH 4.0。

操作条件：流速为5毫升/分钟，21℃。

运行参数：

平衡 10CV 0％B

样品加载

冲洗1 2CV 0％B

冲洗2 2CV 10％B

洗脱 21CV 10-52％B

再生 2.5CV 100％B

再平衡 5CV 0％B

加载：2毫克蛋白/毫升树脂作为实施例6的反应混合物，用洗脱液A稀释10倍。

图10：oxHES100/1.0-G-CSF偶联反应的SDS-PAGE分析

图10显示实施例7的oxHES100/1.0-G-CSF偶联反应的SDS-PAGE分析。在还原条件下，通过使用4％-12％的Bis-Tris凝胶(1.0毫米)和MOPS运行缓冲液的NuPAGE系统(Invitrogen)根据生产商的说明进行分离。

加载：作为反应混合物的10微克蛋白质。

M：标记物，Mark12(Invitrogen)。

道1：实施例7的反应混合物。

道2：偶联前的G-CSF起始原料。

靶蛋白(大约18kDa)的成功HES化由于具有55至＞200kDa的宽质量分布的涂色带变得可见。

图11：oxHES 100/1.0-G-CSF偶联反应的RP-HPLC分析

图11显示通过221nm处的紫外可见光谱监测的实施例7的oxHES100/1.0-G-CSF偶联反应的RP-HPLC分析的部分。色谱条件如下：

色谱系统：Summit，P580(HPG)(Dionex)。

柱：Jupiter C18，300A，5μm，4.6x 150mm(Phenomenex)

洗脱液A：0.1％三氟乙酸于水中。

洗脱液B：0.1％三氟乙酸于乙腈中。

操作条件：流速为1毫升/分钟，20℃。

梯度：0-5分钟，5-55％B；5-12分钟，55-68％B；12-17分钟，100％B；17-22分钟，5％B；梯度延迟2.5分钟。

加载：作为反应混合物的10毫克蛋白质，用水稀释至蛋白质浓度为0.1毫克/毫升。

11.5分钟处的主峰是HES蛋白质偶联物，与大约13分钟时洗脱的游离G-CSF分离。

图12：HES100/1.0-IFN-α偶联反应的SDS-PAGE分析

图12显示实施例10的HES-IFN-α偶联反应的SDS-PAGE分析。在还原条件下，通过使用4％-12％的Bis-Tris凝胶(1.0毫米)和MOPS运行缓冲液的NuPAGE系统(Invitrogen)根据生产商的说明进行分离。

加载：作为反应混合物的10微克蛋白质。

M：标记物，未染色的蛋白质标记物(Serva)。

道1：实施例9的反应混合物。

图13：HES100/1.0-IFN-α偶联反应的阴离子交换色谱

图13显示实施例10的HES100/1.0-IFN-α偶联反应在离子交换柱上通过221nm处的紫外可见光谱监测的色谱分离。色谱条件如下：

色谱系统：

Explorer 100(GE Healthcare)。

柱：5ml HiTrap SP HP(GE Healthcare)。

洗脱液A：20mM醋酸钠，pH 4.0。

洗脱液B：20mM醋酸钠，1M NaCl，pH 4.0。

操作条件：流速为5毫升/分钟，21℃。

运行参数：

平衡 10CV 0％B

样品加载

冲洗1 2CV 0％B

洗脱 20CV 0-50％B

再生 10CV 100％B

再平衡 5CV 0％B

加载：3毫克蛋白/毫升树脂作为实施例9的反应混合物，用洗脱液A稀释10倍。

图14：HES100/1.0-EPO偶联反应的SDS-PAGE分析

图14显示实施例11的HES100/1.0-EPO偶联反应的SDS-PAGE分析。在还原条件下，通过使用4％-12％的Bis-Tris凝胶(1.0毫米)和MOPS运行缓冲液的NuPAGE系统(Invitrogen)根据生产商的说明进行分离。

加载：作为反应混合物的10微克蛋白质。

M：标记物，Mark12(Invitrogen)。

道1：IEX纯化的HES EPO偶联物。

道2：实施例11的反应混合物。

道3：5微克偶联前的G-CSF起始原料。

图15：HES100/1.0-EPO偶联反应的阳离子交换色谱

图15显示实施例11的HES100/1.0-EPO偶联反应在离子交换柱上通过221nm处的紫外可见光谱监测的色谱分离。色谱条件如下：

色谱系统：

Explorer 100(GE Healthcare)。

柱：4x 5ml HiTrap SP HP(GE Healthcare)。

洗脱液A：20mM醋酸钠，pH 4.0。

洗脱液B：20mM醋酸钠，1M NaCl，pH 4.0。

操作条件：流速为5毫升/分钟，21℃。

运行参数：

平衡 5CV 0％B

样品加载

冲洗1 2CV 0％B

洗脱 13CV 10-52％B

再生 2.5CV 100％B

再平衡 5CV 0％B

加载：3毫克蛋白/毫升树脂作为实施例11的反应混合物，用洗脱液A稀释2倍。

在流体中发现未反应的过量HES。HES化削弱了蛋白质与柱的相互作用，从而导致偶联物未修饰的蛋白质相比洗脱时间缩短。

图16：HES100/1.0-G-CSF偶联反应的SDS-PAGE分析

图16显示实施例12的HES100/1.0-G-CSF偶联反应的SDS-PAGE分析。在还原条件下，通过使用4％-12％的Bis-Tris凝胶(1.0毫米)和MOPS运行缓冲液的NuPAGE系统(Invitrogen)根据生产商的说明进行分离。

加载：作为反应混合物的10微克蛋白质。

M：标记物，Mark12(Invitrogen)。

道1：IEX纯化的HES EPO偶联物。

道2：实施例12的反应混合物。

道3：5微克偶联前的G-CSF起始原料。

靶蛋白(大约18kDa)的成功HES化由于具有50至＞200kDa的宽质量分布的涂色带变得可见。

图17：HES100/1.0-G-CSF偶联反应的RP-HPLC分析

图17显示通过221nm处的紫外可见光谱监测的实施例12的HES100/1.0-G-CSF偶联反应的RP-HPLC分析的部分。色谱条件如下：

色谱系统：Summit，P580(LPG)(Dionex)。

柱：Jupiter C18，300A，5μm，4.6x 150mm(Phenomenex)

洗脱液A：0.1％三氟乙酸于水中。

洗脱液B：0.1％三氟乙酸于乙腈中。

操作条件：流速为1毫升/分钟，20℃。

加载：作为反应混合物的10微克蛋白质，用水稀释至蛋白质浓度为0.1毫克/毫升。

10-11.5分钟处的主峰是HES蛋白质偶联物，与大约12分钟时洗脱的游离G-CSF分离。

图18：HES100/1.0-G-CSF偶联反应的阳离子交换色谱

图18显示实施例12的HES100/1.0-G-CSF偶联反应在离子交换柱上通过221nm处的紫外可见光谱监测的色谱分离。色谱条件如下：

色谱系统：Explorer 100(GE Healthcare)。

柱：2x 5ml HiTrap SP HP(GE Healthcare)。

洗脱液A：20mM醋酸钠，pH 4.0。

洗脱液B：20mM醋酸钠，1M NaCl，pH 4.0。

操作条件：流速为5毫升/分钟，21℃。

运行参数：

平衡 5CV 0％B

样品加载

冲洗 2CV 0％B

洗脱 15CV 0-40％B

再生 5CV 100％B

再平衡 5CV 0％B

加载：3毫克蛋白/毫升树脂作为实施例12的反应混合物，用洗脱液A稀释2倍。

在流体中发现未反应的过量HES。HES化削弱了蛋白质与柱的相互作用，从而导致偶联物与未修饰的蛋白质相比洗脱时间缩短。

图19-23参考相应实施例的说明。

图24

图24显示根据通过280nm处的紫外可见光谱监测的“附加数据(A.2)”的oxHBS-BSA偶联反应的HPGPC分析的部分。色谱条件如下：

色谱系统：Shimadsu LC 10AD/UV-Detektor：TSP UV 2000

柱：Superose 610/300GL(Pharmacia)。

洗脱：磷酸盐缓冲液：(将3.887g Na₂HPO₄x 2H₂O、1.967gNaH₂PO₄x 2H₂O、11.688g NaCl、0.05g NaN₃溶于用于色谱分析的水(Reagent Pharmakopoea Europaea)中至总体积为1.0升。使用0.45微米过滤器过滤溶液)

操作条件：流速为0.4毫升/分钟，20℃。

加载：作为反应混合物的0.9毫克蛋白质，溶于100微升中至蛋白质浓度为9毫克/毫升。

上部显示偶合反应前的BSA起始原料。从左至右，峰位于38.038、39.277和42.272处。

下部显示HBS-BSA偶联物。从左至右，峰位于36.795、39.345和41.521处。

图25：oxHBS-IFN-α偶联反应的SDS-PAGE分析

图25显示根据“附加数据(A.3)”的oxHBS-IFN-α偶联反应的SDS-PAGE分析。在还原条件下，通过使用4％-12％的Bis-Tris凝胶(1.0毫米)和MOPS运行缓冲液的NuPAGE系统(Invitrogen)根据生产商的说明进行分离。

加载：作为反应混合物的10微克蛋白质。

M：标记物，Mark12(Invitrogen)。

道1-4：根据“附加数据(A.3)”的反应混合物。

靶蛋白(19kDa)的成功HES化由于具有30至＞200kDa的宽质量分布的涂色带变得可见。

图26：oxHBS-IFN-α偶联反应的阴离子交换色谱

图26显示使用离子交换柱、按照附加数据(A.3)的oxHBS-IFN-α偶联反应通过221nm处的紫外可见光谱监测的色谱分离。色谱条件如下：

色谱系统：

Explorer 100(GE Healthcare)。

柱：Hi Trap Q HP 1ml(GE Healthcare)。

洗脱液A：10mM Tris·Cl，pH 8.0。

洗脱液B：10mM Tris·Cl，0.5M NaCl，pH 8.0。

操作条件：流速为1毫升/分钟，20℃。

运行参数：

平衡 10CV 0％B

样品加载

冲洗 2CV 0％B

洗脱 16CV 0-50％B

再生 10CV 100％B

再平衡 8CV 0％B

加载：实施例3的反应混合物，用洗脱液A稀释20倍，并调整pH至8.0。

图27：oxHBS-EPO偶联反应的SDS-PAGE分析

图27显示根据“附加数据(A.4)”的oxHBS-EPO偶联反应的SDS-PAGE分析。在还原条件下，通过使用4％-12％的Bis-Tris凝胶(1.0毫米)和MOPS运行缓冲液的NuPAGE系统(Invitrogen)根据生产商的说明进行分离。

加载：作为反应混合物的10微克蛋白质。

M：标记物，Mark12(Invitrogen)。

道1：根据“附加数据(A.4)”的反应混合物。

道2：偶联前的EPO起始原料。

靶蛋白(大约35-40kDa)的成功HES化由于具有45至＞200kDa的宽质量分布的涂色带变得可见。

图28：使用HES100/1.0、接头(a2)和(Trp4)-Kemptide的偶合反应的RP-HPLC分析

图28显示通过221nm处的紫外可见光谱监测的根据实施例18，表3使用HES100/1.0、接头(a2)和(Trp4)-Kemptide的偶合反应的RP-HPLC分析的部分。色谱条件如下：

色谱系统：Shimadzu LC 20Prominence，LC 20AT (LPG)(Shimadzu)。

柱：Jupiter C18，300A，5μm，4.6x 150mm(Phenomenex)。

洗脱液A：0.1％三氟乙酸于水中。

洗脱液B：0.1％三氟乙酸于乙腈中。

操作条件：流速为1毫升/分钟，20℃。

梯度：0-15分钟，2-30％B；15-20分钟，30-98％B；20-27分钟，2％B。

加载：作为反应混合物的5微克蛋白质，用水稀释至蛋白质浓度为0.05毫克/毫升。

11.5-15分钟的主峰是HES肽偶联物，与大约17分钟洗脱的游离的(Trp⁴)-Kemptide分离。

图29：使用HES100/1.0、接头(a16)和(Trp⁴)-Kemptide的偶合反应的RP-HPLC分析

图29显示通过221nm处的紫外可见光谱监测的根据实施例18，表5第13行使用HES100/1.0、接头(a16)和(Trp⁴)-Kemptide的偶合反应的RP-HPLC分析的部分。色谱条件如下：

色谱系统：Shimadzu LC 20Prominence，LC 20AT(LPG)(Shimadzu)。

柱：Jupiter C18，300A，5μm，4.6x 150mm(Phenomenex)。

洗脱液A：0.1％三氟乙酸于水中。

洗脱液B：0.1％三氟乙酸于乙腈中。

操作条件：流速为1毫升/分钟，20℃。

图30：使用HES100/1.0、接头(a11)和(Trp⁴)-Kemptide的偶合反应的RP-HPLC分析

图30显示通过221nm处的紫外可见光谱监测的根据实施例18，表5第24行使用HES100/1.0、接头(a11)和(Trp⁴)-Kemptide的偶合反应的RP-HPLC分析的部分。色谱条件如下：

色谱系统：Shimadzu LC 20Prominence，LC 20AT(LPG)(Shimadzu)。

柱：Jupiter C18，300A，5μm，4.6x 150mm(Phenomenex)。

洗脱液A：0.1％三氟乙酸于水中。

洗脱液B：0.1％三氟乙酸于乙腈中。

操作条件：流速为1毫升/分钟，20℃。

图31：使用HES100/1.0、接头(a12)和(Trp⁴)-Kemptide的偶合反应的RP-HPLC分析

图31显示通过221nm处的紫外可见光谱监测的根据实施例18，表5第30行使用HES100/1.0、接头(a12)和(Trp⁴)-Kemptide的偶合反应的RP-HPLC分析的部分。色谱条件如下：

色谱系统：Shimadzu LC 20Prominence，LC 20AT(LPG)(Shimadzu)。

柱：Jupiter C18，300A，5μm，4.6x 150mm(Phenomenex)。

洗脱液A：0.1％三氟乙酸于水中。

洗脱液B：0.1％三氟乙酸于乙腈中。

操作条件：流速为1毫升/分钟，20℃。

11.5-15分钟的主峰是HES肽偶联物，与大约17分钟时洗脱的游离的(Trp⁴)-Kemptide分离。

图32：HES100/1.0-G-CSF偶联反应的SDS-PAGE分析

图32显示实施例18的HES100/1.0-G-CSF偶联反应的SDS-PAGE分析。在还原条件下，通过使用4％-12％的Bis-Tris凝胶(1.0毫米)和MES运行缓冲液的NuPAGE系统(Invitrogen)根据生产商的说明进行分离。

M：标记物，Mark12(Invitrogen)。

道1：表5第7行的反应混合物(10微克加载的蛋白质)。

道2：表5第16行的反应混合物(10微克加载的蛋白质)。

道3：表5第27行的反应混合物(10微克加载的蛋白质)。

道4：表5第33行的反应混合物(10微克加载的蛋白质)。

道5：0.5微克偶联前的rhG-CSF起始原料。

图33：HES100/1.0-IFN-α和HES100/1.0-EPO偶联反应的SDS-PAGE分析

图33显示实施例18的HES100/1.0与rhIFN-α或rhEPO之间的偶联反应的SDS-PAGE分析。在还原条件下，通过使用4％-12％的Bis-Tris凝胶(1.0毫米)和MOPS运行缓冲液的NuPAGE系统(Invitrogen)根据生产商的说明进行分离。对于右侧显示的电泳分离，使用MES缓冲液来代替MOPS缓冲液。

典型加载：10微克蛋白质作为起始原料或反应混合物。

M：标记物，Mark12(Invitrogen)。

道1：表5第4行的反应混合物。

道2：表5第14行的反应混合物。

道3：表5第25行的反应混合物。

道4：表5第31行的反应混合物。

道5：偶联前的rhIFN-α起始原料。

靶蛋白(大约19kDa)的成功HES化由于具有50至＞200kDa的宽质量分布的涂色带变得可见。

道6：表5第15行的反应混合物。

道7：表5第5行的反应混合物。

道8：表5第32行的反应混合物。

道9：偶联前的rhEPO起始原料。

道10：表5第26行的反应混合物。

靶蛋白(大约35-40kDa)的成功HES化由于具有60至＞200kDa的宽质量分布的涂色带变得可见。

实施例

实施例1：oxHES55/0.7-N-(3-丙醛二乙缩醛)的制备

如WO 2005/083103A的实施例9中所述(在所述文件中，描述了超支化淀粉HBS的制备)，从具有55kDa的分子量和0.7的摩尔取代度的HES(HES55/0.7)开始合成HES醛糖酸(oxHES)。

在80℃下干燥2天的30克oxHES 55/0.7溶于60毫升干燥的二甲基甲酰胺(DMF)中，并将溶液加热到70℃。加入于50毫升干燥DMF中的25克1-氨基-3，3-二乙氧基丙烷，并将反应混合物在70℃加热48小时。

在60-80℃下，使用旋转蒸发器真空除去DMF和过量的1-氨基-3，3-二乙氧基丙烷。用丙酮洗剩余的粗制固体直到洗涤液中察觉不到颜色。该产物溶于500毫升的水中，并使用具有10000道尔顿截止值的膜通过超滤进行纯化。当渗余物的pH值达到了6-7时，使用0.1M的氢氧化钠溶液再调整到9。此过程重复4次。最后，冻干该产物。

实施例2：oxHES 55/0.7干扰素α2b(IFN-α)偶联物的制备

向400毫克实施例1制备的缩醛中加入适量的10mM HCl，以产生40％(w/v)浓度的溶液。在21℃搅拌条件下温孵溶液24小时，以使醛官能团脱保护。通过加入0.1M NaOH调整pH值至用于偶合缓冲液中的值。

使用超滤装置，将干扰素-α(通过使用大肠杆菌(E.coli)的重组DNA技术制造的重组人干扰素α-2b，干扰素α-2b由165个氨基酸组成，并具有与天然的人干扰素α-2b(hIFN-α-2b)相同的氨基酸序列)浓缩到最高16毫克/毫升，并转移到合适的偶合缓冲液中(0.1M的醋酸钠缓冲液，pH值4.0)。

10倍摩尔过量的oxHES醛(基于M_w)用于在反应混合物中6毫克/毫升的蛋白浓度，oxHES醛浓度为20％(w/v)。脱保护的oxHES醛与蛋白质溶液混合，并通过加入新制备的NaCNBH₃溶液(在偶合缓冲液中为0.5M)以产生20mM的还原剂的最终浓度而开始还原胺化反应。彻底搅拌后，在o/n 10℃下温孵反应液。

通过SDS-PAGE(图1)和C18柱(Phenomenex，Jupiter)上的反相色谱法分析反应混合物，以证明成功的偶合和用于测定偶合作用的产率。使用具有0.1％TFA的酸性水/乙腈梯度进行洗脱。

通过在

系统(GE Healthcare)上使用Q HP柱的阴离子交换色谱分离HES化的干扰素-α和未反应的化合物。洗脱液A为10mM的Tris·C1，pH值8.0，洗脱液B为10mM的Tris·Cl，0.5M氯化钠，pH值8.0。用于偶联物和未修饰蛋白的分离的梯度为在16CV下的0％B＝＞50％B(图2)。

实施例3：oxHES 55/0.7促红细胞生成素(EPO)偶联物的制备

向400毫克实施例1制备的缩醛中加入适量的10mM HCl，以产生40％(w/v)浓度的溶液。在21℃搅拌下，温孵溶液24小时，以使醛官能团脱保护。通过加入0.1M NaOH调整pH值至用于偶合缓冲液中的值。

脱保护的oxHES醛与EPO(具有人EPO的氨基酸序列和基本上与市售的

(Ortho Biotech，Jansen-Cilag)或

(Roche)相同的特性的重组人EPO)溶液(在反应缓冲液0.1M的醋酸钠缓冲液，pH 5中为10毫克/毫升)混合。以相对于EPO浓度10倍摩尔过量(基于M_w)的量加入OxHES醛。反应混合物中获得的EPO浓度为5毫克/毫升，oxHES醛浓度为10％(w/v)。通过加入在反应缓冲液中制成的0.5M的NaCNBH₃溶液以产生20mM的还原剂的最终浓度而开始还原胺化反应。彻底搅拌后，在o/n 0℃下，温孵反应液。

通过SDS-PAGE(图3)和C18柱(Phenomenex，Jupiter)上的反相色谱法分析反应混合物，以证明成功的偶合和用于测定偶合作用的产率。使用具有0.1％TFA的酸性水/乙腈梯度进行洗脱。

通过在

系统(GE Healthcare)上使用SP HP柱的阳离子交换色谱分离HES化的EPO和未反应的化合物。洗脱液A为20mM的醋酸钠，pH值4.0，洗脱液B为20mM醋酸钠，1M氯化钠，pH值4.0。用于分离偶联物和未修饰蛋白的梯度为2CV下的10％B；21CV下的10％B＝＞52％B(图4)。

通过IEX-纯化的HES-蛋白质偶联物的肽图鉴定靶蛋白中的HES偶合位点。使用合适的蛋白酶(2％Entoproteinase Lys-C，pH 8.6，37℃，o/n)消化该偶联物，并在C4柱(Phenomenex，Jupiter)上使用具有TFA的酸性水/乙腈梯度通过反相色谱分离产生的片段。蛋白质中的HES化位点可以通过与单独靶蛋白质的对照消化反应的色谱相比相应肽的减少或消失来间接地鉴定。

实施例4：oxHES100/1.0-N-(3-丙醛二乙缩醛)的制备

如WO 2005/083103A(在所述文件中，描述了超支化淀粉HBS的制备)的实施例9所述，从具有100kDa分子量和1.0的摩尔取代度的HES(HES100/1.0)开始合成HES醛糖酸(oxHES)。

在80℃下干燥2天的30克oxHES 100/1.0溶于150毫升干燥二甲基甲酰胺(DMF)中，并将溶液加热到70℃。加入于60毫升干燥DMF中的25克的1-氨基-3，3-二乙氧基丙烷，并将反应混合物在70℃加热48小时。

在60-80℃下，使用旋转蒸发器真空除去DMF和过量的1-氨基-3，3-二乙氧基丙烷。用丙酮洗涤剩余的粗制固体直到洗涤液中察觉不到颜色。该产物溶于500毫升的水中，并使用具有10,000道尔顿截止值的膜通过超滤进行纯化。当渗余物的pH值达到了6-7时，使用0.1M的氢氧化钠溶液再调整pH值到9。此过程重复4次。最后，冻干该产物。

实施例5：由氧化的HES制备HES 100/1.0干扰素α(IFN-α)偶联物

向400毫克实施例4制备的缩醛中加入适量的10mM HCl，以产生40％(w/v)浓度的溶液。在21℃o/n搅拌条件下，温孵溶液24小时，以使醛官能团脱保护。通过加入0.1M NaOH调整pH值至用于偶合缓冲液中的值。

使用超滤装置，将干扰素-α(通过使用大肠杆菌(E.coli)的重组DNA技术制造的重组人干扰素α-2b，该干扰素α-2b由165个氨基酸组成，并具有与天然的人干扰素α-2b(hIFN-α-2b)相同的氨基酸序列)浓缩到最高16毫克/毫升，并转移到合适的偶合缓冲液中(0.1M的醋酸钠缓冲液，pH值4.0)。

6倍摩尔过量的oxHES醛(基于M_n)用于在反应混合物中8毫克/毫升的蛋白浓度，oxHES醛浓度为20％(w/v)。脱保护的oxHES醛与蛋白质溶液结合，并通过加入新鲜制备的NaCNBH₃溶液(在偶合缓冲液中为0.5M)以产生20mM的还原剂的最终浓度而开始还原胺化反应。彻底搅拌后，在o/n 5℃下，温孵反应液。

通过SDS-PAGE(图5)和C18柱(Phenomenex，Jupiter)上的反相色谱法分析反应混合物，以证明成功的偶合和用于测定偶合作用的产率。使用具有0.1％TFA的酸性水/乙腈梯度进行洗脱。

在

系统(GE Healthcare)上使用Q HP柱，通过阴离子交换色谱分离HES化的干扰素-α和未反应的化合物。洗脱液A为10mM的Tris·Cl，pH值8.0，洗脱液B为10mM的Tris·Cl，0.5M氯化钠，pH值8.0。用于分离偶联物和未修饰蛋白的梯度为在12.5CV下的0％B＝＞50％B(图6)。

通过IEX-纯化的HES-蛋白质偶联物的肽图鉴定靶蛋白中的HES偶合位点。使用合适的蛋白酶(2％Entoproteinase Lys-C，pH 8.6，37℃，o/n)消化该偶联物，并在C4柱(Phenomenex，Jupiter)上使用具有TFA的酸性水/乙腈梯度通过反相色谱分离产生的片段。蛋白质中的HES化位点可以通过与单独靶蛋白质的对照消化的色谱相比相应的肽的减少或消失来间接地鉴定(图7)。

实施例6：由氧化的HES制备HES 100/1.0促红细胞生成素(EPO)偶联物

向400毫克实施例4制备的缩醛中加入适量的10mM HCl，以产生40％(w/v)浓度的溶液。在21℃温孵溶液24小时以使醛官能团脱保护。通过加入0.1M NaOH调整pH值至用于偶合缓冲液中的值。

(Ortho Biotech，Jansen-Cilag)或

(Roche)相同的特性的重组人EPO)溶液(在反应缓冲液0.1M的醋酸钠缓冲液，pH 5中为10毫克/毫升)结合。以相对于EPO浓度15倍摩尔过量(基于M_n)的量加入OxHES醛。反应混合物中获得的EPO浓度为3.7毫克/毫升，oxHES醛浓度为15％(w/v)。通过加入在反应缓冲液中制成的0.5M的NaCNBH₃溶液以产生20mM的还原剂的最终浓度而开始还原胺化反应。彻底搅拌后，在o/n 10℃下，温孵反应液。

通过SDS-PAGE(图8)和C18柱(Phenomenex，Jupiter)上的反相色谱法分析反应混合物，以证明成功的偶合和用于测定偶合作用的产率。使用具有0.1％TFA的酸性水/乙腈梯度进行洗脱。

在

系统(GE Healthcare)上使用SP HP柱，通过阳离子交换色谱分离HES化的EPO和未反应的化合物。洗脱液A为20mM的醋酸钠，pH值4.0，洗脱液B为20mM醋酸钠，1M氯化钠，pH值4.0。用于分离偶联物和未修饰蛋白的梯度为2CV下的10％B；21CV下的10％B＝＞52％B(图9)。

通过IEX-纯化的HES-蛋白质偶联物的肽图鉴定靶蛋白中的HES偶合位点。使用合适的蛋白酶(2％Entoproteinase Lys-C，pH 8.6，37℃，o/n)消化该偶联物，并在C4柱(Phenomenex，Jupiter)上使用具有TFA的酸性水/乙腈梯度通过反相色谱分离产生的片段。蛋白质中的HES化位点可以通过与单独靶蛋白质的对照消化的色谱相比相应的肽的减少或消失来间接地鉴定。

实施例7：由氧化的HES制备HES 100/1.0粒细胞集落刺激因子(G-CSF)偶联物

向400毫克实施例4制备的缩醛中加入适量的10mM HCl，以产生40％(w/v)浓度的溶液。在21℃o/n下温孵溶液以使醛官能团脱保护。通过加入0.1M NaOH调整pH值至用于偶合缓冲液中的值。

脱保护的oxHES醛与rh-Met-G-CSF溶液(在反应缓冲液0.1M的醋酸钠缓冲液，pH值5中为5毫克/毫升；由大肠杆菌表达的具有与可由Amgen，Miinchen，D购得的

相同的氨基酸序列和基本上相同特性的G-CSF)混合。以相对于G-CSF浓度30倍摩尔过量(基于M_n)的量加入OxHES醛。反应混合物中产生的G-CSF浓度为1.9毫克/毫升，oxHES醛浓度为20％(w/v)。通过加入在反应缓冲液中制成的0.5M的NaCNBH₃溶液以产生20mM的还原剂的最终浓度而开始还原胺化反应。彻底搅拌后，在o/n 0℃下，温孵反应液。

通过SDS-PAGE(图10)和C18柱(Phenomenex，Jupiter)上的反相色谱法(图11)分析反应混合物，以证明成功的偶合和用于测定偶合作用的产率。使用具有0.1％TFA的酸性水/乙腈梯度进行洗脱。

实施例8：HES 100/1.0-N-(3-丙醛二乙缩醛)的制备

将15克HES 100/1.0溶于35克醋酸钠缓冲液(pH＝5和c＝1摩尔/升)中，并加入2.07毫升的1-氨基-3，3-二乙氧基丙烷和1.885克氰基硼氢化钠。在60℃下，反应混合物搅拌16-24小时，用100毫升水稀释，用稀释的氢氧化钠溶液中和，并通过使用具有10,000Da截止值的膜相对于碳酸氢铵缓冲液(pH＝9，c＝10毫摩尔/升，45循环)进行超滤以及最后的5次交换循环相对于水进行操作。纯化和浓缩的HES衍生物溶液(大约20重量％)在60℃下，使用具有10,000Da的截止值的膜，相对于氢氧化钠溶液(pH＝12)进行渗析。此后通过冻干分离该产物。

实施例9：HES100/1.0-N-(3-丙醛)的制备

将实施例8制备的10克HES 1o0/1.0-N-(3-丙醛二乙缩醛)溶于100毫升的盐酸水溶液，pH值＝2(c＝10毫摩尔/升)，并在40℃下搅拌16-24小时。使用具有10,000Da的截止值的膜相对于pH＝2的盐酸水溶液(10循环)进行超滤以及最后的5次交换循环相对于水进行超滤而纯化反应混合物。通过冻干分离该产物。

实施例10：由HES制备HES 100/1.0干扰素α(IFN-α)偶联物

向400毫克实施例8制备的缩醛中加入适量的10mM HCl，以产生40％(w/v)浓度的溶液。在21℃o/n搅拌下，温孵溶液以使醛官能团脱保护。通过加入0.1M NaOH调整pH值至用于偶合缓冲液中的值。

5倍摩尔过量的HES醛(基于M_w)用于在反应混合物中7毫克/毫升的最终蛋白浓度，HES醛浓度为18％(w/v)。脱保护的HES醛与蛋白质溶液混合，并通过加入新鲜制备的NaCNBH₃溶液(在偶合缓冲液中为0.5M)以产生20mM的还原剂的最终浓度而开始还原胺化反应。彻底搅拌后，在o/n 5℃下，温孵反应液。

通过SDS-PAGE(图12)和C18柱(Phenomenex，Jupiter)上的反相色谱法分析反应混合物，以证明成功的偶合和用于测定偶合作用的产率。使用具有0.1％TFA的酸性水/乙腈梯度进行洗脱。

在

系统(GE Healthcare)上使用SP HP柱，通过阳离子交换色谱分离HES化的IFN-α与未反应的化合物。洗脱液A为20mM的醋酸钠，pH值4.0，洗脱液B为20mM醋酸钠，1M氯化钠，pH值4.0。用于分离偶联物和未修饰蛋白的梯度为20CV下的0％B＝＞50％B(图13)。

实施例11：由HES制备HES 100/1.0促红细胞生成素(EPO)偶联物

实施例9的脱保护的HES醛与EPO(具有人EPO的氨基酸序列和基本上与市售的

(Ortho Biotech，Jansen-Cilag)或

(Roche)相同的特性的重组人EPO)溶液(在反应缓冲液0.1M的醋酸钠缓冲液，pH 5中为10毫克/毫升)混合。以相对于EPO浓度40倍摩尔过量(基于M_n)的量加入HES醛。反应混合物中产生的EPO浓度为3.2毫克/毫升，HES醛浓度为30％(w/v)。通过加入在反应缓冲液中制成的0.5M的NaCNBH₃溶液以产生20mM的还原剂的最终浓度而开始还原胺化反应。彻底搅拌后，在o/n 5℃下，温孵反应液。

通过SDS-PAGE(图14)和C18柱(Phenomenex，Jupiter)上的反相色谱法分析反应混合物，以证明成功的偶合和用于测定偶合作用的产率。使用具有0.1％TFA的酸性水/乙腈梯度进行洗脱。

在

系统(GE Healthcare)上使用SP HP柱，通过阳离子交换色谱分离HES化的EPO和未反应的化合物。洗脱液A为20mM的醋酸钠，pH值4.0，洗脱液B为20mM醋酸钠，1M氯化钠，pH值4.0。用于分离偶联物和未修饰蛋白的梯度为13CV下的0％B＝＞52％B(图15)。

实施例12：由HES制备HES 100/1.0粒细胞集落刺激因子(G-CSF)偶联物

实施例9的脱保护的HES醛与rh-Met-G-CSF溶液(在反应缓冲液0.1M的醋酸钠缓冲液，pH5中为5毫克/毫升；由大肠杆菌表达的具有与可由Amgen，Miinchen，D购得的相同的氨基酸序列和基本上相同的特性的G-CSF)混合。以相对于G-CSF浓度40倍摩尔过量(基于M_n)的量加入HES醛。反应混合物中产生的G-CSF浓度为1.3毫克/毫升，HES醛浓度为20％(w/v)。通过加入在反应缓冲液中制成的0.5M的NaCNBH₃溶液以产生20mM的还原剂的最终浓度而开始还原胺化反应。彻底搅拌后，在o/n 10℃下，温孵反应液。

通过SDS-PAGE和C18柱(Phenomenex，Jupiter)上的反相色谱法分析反应混合物，以测定偶合作用的产率。使用具有0.1％TFA的酸性水/乙腈梯度进行RP-HPLC的洗脱。

通过SDS-PAGE(图16)和C18柱(Phenomenex，Jupiter)上的反相色谱法(图17)分析反应混合物，以证明成功的偶合和用于测定偶合作用的产率。使用具有0.1％TFA的酸性水/乙腈梯度进行RP-HPLC的洗脱。

在

系统(GE Healthcare)上使用SP HP柱，通过阳离子交换色谱分离HES化的G-CSF和未反应的化合物。洗脱液A为20mM的醋酸钠，pH值4.0，洗脱液B为20mM醋酸钠，1M氯化钠，pH值4.0。用于偶联物和未修饰蛋白分离的梯度为15CV下的0％B＝＞40％B(图18)。

实施例13：在小鼠中的药效学体内生物分析(实施例11的HES-EPO偶联物)

在21℃的室温和55％的相对湿度下，在欧盟标准的III型(LxBxH425x266x185mm)笼中(最多每笼10只)喂养从Harlan WinkelmannGmbH(Borchen，Germany)获得的大约18-20克重的Balb C小鼠，TapveiEinstreu″4x4x1mm(Aspen木)用作笼子的垫料。额外提供木刨花。每周更换并清洗笼子一次。自由提供饮水(pH值3.8-4，硫酸)。对动物笼编号。对在笼中的动物进行耳标并另外颜色编码。在大致分笼的当天和在开始治疗前一周，完成初步的健康检查。只使用健康的动物。

基于样品的蛋白质含量，对每组4只小鼠以100微克/千克体重的剂量进行皮下给药，实施例11获得的HES EPO偶联物、未修饰的起始原料(rHuEPO)和从Amgen获得的

作为单次推注进行测试。包括相同体积的PBS作为溶剂对照。

使用包含肝素钠的

(Hirschmann

Germany)，在几个时间点(第0、3、6、9、13、16、20和23天)从尾静脉或眼球后静脉丛采集大约30-60微升的全血样品，且将全血在

离心机(Tuttlingen，Germany)上以10.000rpm的转速离心6分钟，以确定各个全血样品的血细胞比容。对红血球生成反应和持续时间进行监测作为随时间变化的血细胞比容的功能变化[％](参见图19)。

这些数据表明，所有含有EPO、

或EPO偶联物的样品能够提高血细胞比容。

相比起始原料能够提高效力3-4倍，以及HES EPO的偶联物相比能够提高效力1.5-2倍。

实施例14：在小鼠中的药效学体内生物分析(实施例5的HES-IFNα偶联物)

对实施例5制备的1种oxHES 100/1.0干扰素-α偶联物在实施例13的体内分析中进行测试。血清样品的EC50稀释相对于静脉注射后的时间半对数地作图。从指数拟合曲线的斜率计算半衰期。该样品的半衰期为8.9小时(见图20)。

实施例5制备的oxHES 100/1.0干扰素-α偶联物相比于Intron A的相对体外活性如图21所示(至于体外活性测定，见下文的实施例16)。

实施例15：在小鼠中的药效学体内生物分析(实施例10的HES-IFNα偶联物)

对实施例10制备的3种HES 100/1.0干扰素-α偶联物在实施例13的体内分析中进行测试。血清样品的EC50稀释相对于静脉注射后的时间半对数地作图。从指数拟合曲线的斜率计算半衰期。该样品的平均半衰期为9.7小、时(见图22)。

对于未修饰的干扰素-α，血清的抗病毒活性过低而难以计算血清半衰期。在K.R.Reddy等人，Advaced Drug Delivery Reviews 54(2002)第571-586页中，测定了大鼠中(i.v.)的IFN-α的血清半衰期为2小时。

实施例10制备的3种HES 100/1.0干扰素-α偶联物相比于Intron A的相对体外活性如图23所示(至于体外活性测定，见下文的实施例16)。实施例16：测试过程的描述：干扰素α的抗病毒活性(实施例14和15)

在细胞培养基中预稀释测试物后，制备连续的2倍稀释物。在96孔微量滴定板中，以每个稀释度四份的方式向新胰蛋白酶化的MDBK细胞(每孔40.000细胞)加入稀释的干扰素。在37℃下温孵测试板24小时(每孔总体积：175微升)。

随后，向各孔(除了阳性对照孔)中加入50微升稀释的VSV原液，导致0.1的感染复数。

在各测试中包括以下对照：接受病毒加细胞培养基而不加干扰素(阴性对照)的12个孔，和接受细胞培养基而不加干扰素和病毒(阳性对照)的12个孔。

在37℃下温孵这些测试板42小时。

温孵期结束时，用50微升MTT溶液(在细胞培养基中，至少2毫克/毫升)代替各孔的细胞培养上清液。温孵细胞3小时。通过向各孔中加入100微升异丙醇/盐酸(具有40mM HCl的异丙醇)溶液溶解由增殖细胞形成的紫色甲

(formazan)染料。随后，在微量滴定板阅读器中，在570/630nm下测量溶液的吸光度值。

对于干扰素的各稀释度，如下计算在干扰素和VSV存在下生长的MDBK细胞的增殖活性：

((干扰素处理的4个孔的平均吸光度)-(阴性对照的平均吸光度))*100

(阳性对照的平均吸光度)-(阴性对照平均吸光度)

对于各个测试物，在4个独立的测试中测定干扰素α的抗病毒活性。

在上述测试系统中，相对于未修饰的IFN-α起始材料(即Intron A)，测试了相应的偶联物：HES 100/1.0干扰素-α偶联物(分别为实施例15和10)和oxHES100/1.0-干扰素-α偶联物(分别为实施例14和5)。计算物质的CPE50浓度。

实施例17：本发明的HES-接头衍生物的制备

在实施例17中，生产HES-接头衍生物。一方面，对于给定的接头结构，HES在平均分子量和其摩尔取代度方面变化。另一方面，对于给定的HES起始原料，接头的化学性质发生变化。

通过强烈搅拌和适度加热(最高40℃)，将下面的表1和2中所示的一定量的HES溶于适当体积的醋酸钠缓冲液(1摩尔/升，pH＝5)(“缓冲液V”)中。向澄清溶液中加入指示量的接头(相对于HES物质的M_n的40当量)。在某些情况下，所述量的接头作为“DMF-接头”溶液加入。因此，将所需量的接头溶解在少量的DMF中，并将产生的澄清的DMF-接头溶液(在表2中表示为“DMF-接头溶液V”)加入反应混合物。最后，将表示为NaCNBH₃量的固体NaCNBH₃溶于搅拌的溶液中，以产生通常0.6M的最终浓度，并加热反应混合物，在60℃下搅拌18-24小时。

为完成反应，用超纯水稀释混合物，以产生大约100毫克/毫升(10％m/V)的HES衍生物的最终浓度，并使用具有10kDa的截止值的膜和超纯水作为溶剂，通过超滤(UF)或渗析(D)进行纯化。在接头(a2)和(a3)的情况下，超纯水之后使用10mM NH₄HC0₃-缓冲液(pH＝9)进行超滤。

对于随后的脱保护，由浓盐酸溶液酸化纯化的HES衍生物溶液(10％，100毫克/毫升)，以产生具有适当的“pH水平”的“c(HC1)”。搅拌混合物，并在反应时间“t”内在40℃下加热，之后中和(稀释的NaOH)，并使用合适的“处理溶剂(work up solvent)”通过超滤(膜截止值10kDa)来处理，最后冻干以产生白色至微黄色粉末。

通过成功地偶合到靶分子(Kemptide，参见下面的实施例18表3、4和5)上来验证衍生化。对于使用接头(a15)和(a10)制备的HES衍生物，通过光谱特性来验证成功的衍生化。所有上述制备的HES衍生物被用于偶联实施例18中的表3、4和5列出的靶标。

用于表1和2中的缩写：

D 渗析

DMF 二甲基甲酰胺

HES 羟乙基淀粉

HCl 盐酸

NaCNBH₃ 氰基硼氢化钠

NaOH 氢氧化钠

UF 超滤

V 体积

Water 超纯水(MilliQ)

根据本发明的实施例8和9制备HES 100/1.0与接头的结构(a2)的HES衍生物。接头结构(a2)涉及本文上面定义的结构(a2)，即1-氨基-3，3-二乙氧基丙烷。

表1：HES部分的变化(实施例17)

*NH₄HCO₃-缓冲液(10mM，pH＝9)，接着用超纯水进行超滤。

表1：HES部分的变化(实施例17；续)

表2：接头结构的变化(实施例17)

如本发明中定义

*DMSO代替醋酸钠缓冲液

**在超滤前，稀释和中和的反应混合物进行离心

使用20当量而不是40当量(参照HES的M_n)。

表2：接头结构的变化(实施例17；续)

如在本发明中定义的

实施例18：本发明的HES-接头-生物活性剂衍生物的制备

将一定量如下面的表3、4和5中所指示的靶分子转移到适当的反应缓冲液中。将标示量的HES-接头衍生物(由接头和HES物质形成)溶于反应缓冲液中，并与靶物质溶液混合。加NaCNBH₃-通常作为在反应缓冲液中新鲜制备的0.5M的原液-至通常20mM的最终浓度。在温度控制下，在温度“rxn T”下温孵反应混合物反应时间“rxn t”。

反应物的最终反应体积(“rxn V”)和产生的浓度和比例列于表3、4和5中。

通过色谱分析(RP-HPLC、SE-HPLC)或SDS-PAGE(对于选定的衍生物参见图28至33)显示偶合反应的成功。在本文所述的所有偶合反应中，检测到靶物质-HES偶联物。没有优化各种靶分子的反应条件。

使用的缩略语：

rhIFNα 重组人干扰素-α2b

rhEPO 重组人促红细胞生成素

rhG-CSF 具有附加的N-末端甲硫氨酸的重组人粒细胞集落刺

激因子

rhFIX 重组人凝血因子IX

rhFVIIa 重组人凝血因子VIIa

rhGH 重组人生长激素

hFab 源自人类免疫球蛋白G分子的Fab片段

mIgG 鼠免疫球蛋白G

GLP-1 胰高血糖素样肽-1；氨基酸1-37

rAsparaginase 来自大肠杆菌的重组天冬酰胺酶

NH₂-DNA 具有序列为GGCTACGTCCAGGAGCCACCT的5′-氨

基己基间隔物的寡核苷酸

rhLeptin 重组人瘦素

AmphoB 两性霉素B，CAS号1397-89-3

Kemptide Trp⁴-Kemptide(Leu-Arg-Arg-Trp-Ser-Leu-Gly)，CAS

号80224-16-4

NaOAc 含醋酸钠的缓冲液

HEPES 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，CAS号7365-45-9

表3：靶物质的变化(实施例18)

表3：靶物质的变化(实施例18；续)

接头结构	HES物质	靶分子	靶浓度[g/I]	NaCNBH₃[mg]	rxn V[μl]	rxn T[℃]	rxn t[h]
								(a2)	100/1.0	rhIFNα	7	20	425	5	18
(a2)	100/1.0	rhFIX	6.7	20	531	10	18
								(a2)	100/1.0	rhFVIIa	2.5	20	16	10	18
(a2)	100/1.0	rhGH	2.5	20	41	5	18
								(a2)	100/1.0	mlgG	0.9	20	107	5	48
(a2)	100/1.0	hFab	2.7	20	19	5	18
								(a2)	100/1.0	GLP-1	0.2	20	83	21	18
(a2)	100/1.0	rAsparaginase	2	20	15	5	18
								(a2)	100/1.0	NH₂-DNA	0.4	20	16	30	18
(a2)	100/1.0	rhLeptin	1.1	20	90	10	18
								(a2)	100/1.0	AmphoB	0.1	20	195	21	18
(a2)	100/1.0	Kemptide	0.5	20	61	5	18

表4：HES部分的变化(实施例18)

接头

HES物质

靶

缓冲体系

靶[mg]

HES[mg]

HES：靶

HES％

(a2)

30/0.4

rhIFN α

0.1MNaOAc pH 4

5

40

8∶1

6.5

(a2)

30/1.0

rhIFN α

0.1M NaOAc pH 4

5

52

8∶1

8.3

(a2)

60/0.7C2/C6＝6

rhIFN α

0.1M NaOAc pH 4

5

97

8∶1

16

(a2)

60/0.7C2/C6＝8.5

rhIFN α

0.1M NaOAc pH 4

5

82

g∶1

13

(a2)

60/1.0C2/C6＝6

rhIFN α

0.1MNaOAc pH 4

5

94

8∶1

15

(a2)

60/1.0C2/C6＝8.5

rhIFN α

0.1MNaOAc pH 4

5

85

8∶1

14

(a2)

100/0.4

rhIFN α

0.1M NaOAc pH 4

10

314

8∶1

25

(a2)

100/0.7

rhIFN α

0.1M NaOAc pH 4

5

130

8∶1

21

(a2)

100/1.0

rhIFN α

0.1M NaOAc pH 4

5

125

8∶1

20

(a2)

100/1.3

rhIFN α

0.1M NaOAc pH 4

5

154

8∶1

15

(a2)

150/0.4

rhIFN α

0.1MNaOAc pH 4

10

415

8∶1

33

(a2)

150/10

rhIFN α

0.1MNaOAc pH 4

5

187

8∶1

30

(a2)

300/1.0

rhIFN α

0.1MNaOAc pH4

10

2437

24∶1

40

(a2)

30/1.0

rhEPO

0.1M NaOAc pH 5

4.5

173

50∶1

23

(a2)

60/1.0

rhEPO

0.1M NaOAc pH 5

4.5

313

40∶1

30

(a2)

100/10

rhEPO

0.1M NaOAc pH 5

60

5683

40∶1

30

(a2)

150/1.0

rhEPO

0.1M NaOAc pH 5

4.5

885

50∶1

35

表4：HES部分的变化(实施例18，续)

接头	HES物质	靶	靶浓度[g/I]	NaCNBH₃[mM]	rxn V	rxn T[℃]	rxn t[h]
								(a2)	30/0.4	rhIFN α	8	20	626μl	5	18
(a2)	30/1.0	rhIFNα	8	20	625μl	5	18
								(a2)	60/0.7C2/C6＝6	rhIFN α	8	20	625μl	5	18
(a2)	60/0.7C2/C6＝8.5	rhIFN α	8	20	625μl	5	18
								(a2)	60/1.0C2/C6＝6	rhIFNα	8	20	628μl	5	18
(a2)	60/1.0C2/C6＝8.5	rhIFN α	8	20	625μl	5	18
								(a2)	100/0.4	rhIFN α	8	20	1257μl	5	18
(a2)	100/0.7	rhIFNα	8	20	624μl	5	18
								(a2)	100/1.0	rhIFN α	8	20	625μl	5	18
(a2)	100/1.3	rhIFNα	8	20	627μl	5	18
								(a2)	150/0.4	rhIFNα	8	20	1257μl	5	18
(a2)	150/1.0	rhIFN α	8	20	623μl	5	18
								(a2)	300/1.0	rhIFN α	1.6	20	6093μl	5	18
(a2)	30/1.0	rhEPO	6	20	750μl	10	18
								(a2)	60/1.0	rhEPO	4.3	20	1043μl	10	18
(a2)	100/1.0	rhEPO	3.2	20	18.9ml	10	18
								(a2)	150/1.0	rhEPO	1.8	20	2528μl	10	18

表5：接头结构的变化(实施例18)

接头

HES物质

靶

缓冲体系

靶

HES[mg]

HES：靶

1

(a1)

100/1.0

Kemptide

0.1M NaOAc pH 5

30μg

12.3

5.6∶1

2

(a3)

100/1.0

rhEPO

0.1M NaOAc pH 5

0.1mg

10.4

40∶1

3

(a4)

100/1.0

Kemptide

0.1MNaOAc pH 5

30μg

12.1

5.6∶1

4

(a4)

100/1.0

rhIFNα

0.1M NaOAc pH 4

0.1mg

2.7

8∶1

5

(a4)

100/1.0

rhEPO

0.1MNaOAc pH 5

100μg

4.3

20∶1

6

(a4)

100/1.0

rhG-CSF

0.1M NaOAc pH 5

53μg

5.2

30∶1

7

(a4)

100/1.0

rh Leptin

0.1M NaOAc，pH 5

0.1mg

22.5

60∶1

8

(a4)

100/1.0

NH₂-DNA

0.05M HEPES，pH 7

10μg

5.5

60∶1

9

(a4)

100/1.0

rhFVIIa

0.1M NaOAc pH 5

40μg

2.6

50∶1

10

(a4)

100/1.0

hFab

0.1M NaOAc，PH 5

50μg

3.8

60∶1

11

(a4)

100/1.0

rhGH

0.1M Citrate，pH 6

0.1mg

17

60∶1

12

(a4)

100/1.0

AmphoB

0.1M NaOAe，pH 5；80％DMSO

20μg

83

60∶1

13

(a16)

100/1.0

Kemptide

0.1M NaOAc pH 5

30μg

12.1

5.6∶1

14

(a16)

100/1.0

rhIFNα

0.1M NaOAc pH 4

0.1mg

2.7

8∶1

15

(a16)

100/1.0

rhEPO

0.1M NaOAc pH 5

100μg

8.6

40∶1

16

(a6)

100/1.0

rhG-CSF

0.1M NaOAc pH 5

44μg

4.3

30∶1

17

(a16)

100/1.0

rhLeptin

0.1M NaOAc，pH 5

0.1mg

22.5

60∶1

18

(a16)

100/1.0

hFab

0.1M NaOAc，pH 5

50μg

3.8

60∶1

19

(a16)

100/1.0

rhGH

0.1M Citrate，pH 6

0.1mg

18

60∶1

20

(a17)

100/1.0

Kemptide

0.1M NaOAc pH 5

30μg

12.1

5.6∶1

21

(a17)

100/1.0

rhEPO

0.1M NaOAcpH 5

4mg

513

60∶1

22

(a17)

100/1.0

rhFVlIa

0.1M NaOAc pH 5

40μg

2.6

50∶1

23

(a17)

100/1.0

rhLeptin

0.1M NaOAc，pH 5

0.1mg

22.5

60∶1

24

(a11)

100/1.0

Kemptidc

0.1M NaOAc pH 5

30μg

12.1

5.6∶1

25

(a11)

100/1.0

rhIFNα

0.1M NaOAcpH 4

0.1mg

2.7

8∶1

26

(a11)

100/1.0

rhEPO

0.1MNaOAcpH 5

2mg

173

40∶1

27

(a11)

100/1.0

rhG-CSF

0.1M NaOAc pH 5

55μg

5.4

30∶1

28

(a11)

100/1.0

rhGH

0.1M Citrate，pH 6

0.1mg

18

60∶1

29

(a11)

100/1.0

hFad

0.1M NaOAc，pH 5

50μg

3.8

60∶1

30

(a12)

100/1.0

Kemptide

0.1MNaOAcpH 5

30μg

12.1

5.6∶1

31

(a12)

100/1.0

rhIFNα

0.1M NaOAc pH 4

0.1mg

2.7

8∶1

32

(a12)

100/1.0

rhEPO

0.1MNaOAc pH 5

11mg

478

20∶1

33

(a12)

100/1.0

rhG-CSF

0.1M NaOAc pH 5

47μg

4.6

30∶1

34

(a13)

100/1.0

Kemptide

0.1M NaOAc pH 5

30μg

12.1

5.6∶1

35

(a18)

100/1.0

Kemptide

0.1M NaOAc pH 5

30μg

12.1

5.6∶1

36

(a18)

100/1.0

rhEPO

0.1M NaOAc pH 5

4mg

342

40∶1

37

(a5)

100/1.0

Kemptide

0.1M NaOAc pH 5

30μg

12.1

5.6∶1

38

(a14)

100/1.0

KemPtide

0.1MNaOAe pH 5

30μg

54.3

25∶1

39

(a21)

100/1.0

Kemptide

0.1MNaOAepH 5

30μg

54.3

25∶1

表5：接头结构的变化(实施例18，续)

	接头	HES物质	靶	HES％	靶浓度[g/I]	NaCNBH₃[mM]	rxnV[μl]	rxnT[℃]	rxn t[h]
										1	(a1)	100/1.0	Kemptide	20	0.49	20	61	5	18
2	(a3)	100/1.0	rhEPO	30	2.9	20	35	10	18
										3	(a4)	100/1.0	Kemptide	20	0.5	20	61	5	18
4	(a4)	100/1.0	rhIFNα	20	7.5	20	13	5	18
										5	(a4)	100/1.0	rhEPO	20	4.7	20	21	5	18
6	(a4)	100/1.0	rhG-CSF	15	1.5	20	35	10	18
										7	(a4)	100/1.0	rhLeptin	25	1.1	20	90	5	18
8	(a4)	100/1.0	NH2-DNA	20	0.4	20	16	30	18
										9	(a4)	100/1.0	rhFVIIa	7	1.1	20	39	10	18
10	(a4)	100/1.0	hFab	20	2.7	20	19	5L	18
										11	(a4)	100/1.0	rhGH	40	2.3	20	44	5	18
12	(a4)	100/1.0	AmphoB	40	0.1	20	208	21	18
										13	(a16)	100/1.0	Kemptide	20	0.5	20	61	5	18
14	(a16)	100/1.0	rhIFNα	20	7.5	20	13	5	18
										15	(a16)	100/1.0	rhEPO	30	3.5	20	29	5	18
16	(a16)	100/1.0	rhG-CSF	15	1.5	20	29	10	18
										17	(a16)	100/1.0	rhLeptin	25	1.1	20	90	5	18
18	(a16)	100/1.0	hFab	20	2.7	20	19	5	18
										19	(a16)	100/1.0	rhGH	40	2.3	20	44	5	18
20	(a17)	100/1.0	Kemptide	20	0.5	20	61	5	18
										21	(a17)	100/1.0	rhEpO	40	3.1	20	1284	5	18
22	(a17)	100/1.0	rhFVIIa	6	0.9	20	43	10	18
										23	(a17)	100/1.0	rhLeptin	25	1.1	20	90	10	18
24	(a11)	100/1.0	Kemptide	20	0.5	20	61	5	18
										25	(a11)	100/1.0	rhIFNα	20	7.5	20	13	5	18
26	(a11)	100/1.0	rhEPO	30	3.5	20	579	5	18
										27	(a11)	100/1.0	rhG-CSF	15	1.5	20	36	10	18
28	(a11)	100/1.0	rhGH	40	2.3	20	44	5	18
										29	(a11)	100/1.0	hFab	20	2.7	20	19	5	18
30	(a12)	100/1.0	Kemptide	20	0.5	20	61	5	18
										31	(a12)	100/1.0	rhIFNα	20	7.5	20	13	5	18
32	(a12)	100/1.0	rhEPO	20	4.6	20	2389	5	18
										33	(a12)	100/1.0	rhG-CSF	15	1.5	20	31	10	18
34	(a13)	100/1.0	Kemptide	20	0.5	20	61	5	18
										35	(a18)	100/1.0	Kemptide	20	0.5	20	61	5	18
36	(a18)	100/1.0	EPO	30	3.5	20	1141	5	18
										37	(a5)	100/1.0	Kemptide	20	0.5	20	61	5	18
38	(a14)	100/1.0	Kemptide	20	0.1	20	271	5	18
										39	(a21)	100/1.0	Kemptide	20	0.1	20	271	25	18

附加数据

(A.1)由HBS 7kDa制备oxHBS-N-(3-丙醛二乙缩醛)

根据WO 2005/083103A1的实施例9所述，从超支化淀粉(M_w＝7000Dalton(7kDa)，15摩尔％的平均分支度)开始合成超支化淀粉(HBS)醛糖酸。通过在80℃干燥24小时，将获得的醛糖酸转化为相应的内酯(HBS醛糖酸以及相应的内酯简称为″oxHBS″)。

将5克该内酯溶于15毫升1-氨基-3，3-二乙氧基丙烷和10毫升干燥的DMF中，并在70℃搅拌48小时。真空蒸发过量的1-氨基-3，3-二乙氧基丙烷和DMF(二甲基甲酰胺)，并用丙酮洗涤产生的黄色固体直到黄色消失。将产物溶于水中，并使用具有1000道尔顿的截止值的膜通过超滤进行纯化，直至滤液的pH值达到＞6的值。

用2克的酸性阳离子交换树脂(resign)

处理渗余物2小时，滤树脂，并将残留溶液冻干。

化合物的¹H-NMR谱显示1.7ppm的三重峰和1.2ppm的多重峰，表示连接化合物(1-氨基-3，3-二乙氧基丙烷)的残基在氮原子α-位置上的甲基和亚甲基基团。

(A.2)oxHBS 7kDa-牛血清白蛋白(BSA)偶联物的制备

将(A.1)中制备的750微克的缩醛溶于5毫升0.01N HCl中。用1NHCl调整pH值至2.0，并在21℃搅拌反应混合物18小时。向之前制备的200微升混合物中加入2毫升醋酸盐缓冲液(pH＝7.0)中的1％BSA溶液。将140毫克氰基硼氢化钠溶于5毫升0.1N醋酸盐缓冲液(pH＝7.0)中，并立即向反应混合物中加入50毫升等分的试样。在4℃储存反应混合物15小时。通过排阻色谱对反应混合物的分析显示90％的HBS-BSA偶联物的反应产率(图24)。

(A.3)oxHBS 65kDa-干扰素-α偶联物的制备

向类似于(A.1)制备的400毫克的65kDa HBS-N-(3-丙醛二乙缩醛)中加入适量的10mM的HCl，以产生具有40％(w/v)的浓度和pH值2的溶液。在21℃o/n搅拌条件下温孵溶液(过)，以使醛官能团脱保护。在偶合前，通过加入0.1M NaOH调整pH值至用于偶合缓冲液中的值。

10倍摩尔过量的oxHES醛(基于M_w)用于反应混合物中6毫克/毫升的最终蛋白质浓度，oxHES醛浓度为20％(w/v)。脱保护的oxHES醛与蛋白质溶液混合，并通过加入新鲜制备的NaCNBH₃溶液(在偶合缓冲液中为0.5M)以产生20mM的还原剂的最终浓度而开始还原胺化反应。彻底搅拌后，在o/n 10℃下，温孵反应液。

通过SDS-PAGE(图25)和C18柱(Phenomenex，Jupiter)上的反相色谱法分析反应混合物，以证明成功的偶合和用于测定偶合作用的产率。使用具有0.1％TFA的酸性水/乙腈梯度进行洗脱。

在

系统(GE Healthcare)上使用Q HP柱，通过阴离子交换色谱分离HBS-干扰素-α和未反应的化合物。洗脱液A为10mM的Tris·Cl，pH值8.0，洗脱液B为10mM的Tris·Cl，0.5M氯化钠，pH值8.0。用于分离偶联物和未修饰蛋白的梯度为在16CV下的0％B＝＞50％B(图26)。

(A.4)oxHBS 65促红细胞生成素(EPO)偶联物的制备

向类似于(A.1)制备的400毫克的65kDa HBS-N-(3-丙醛二乙缩醛)中加入适量的10mM的HCl，以产生具有40％(w/v)的浓度的溶液。在21℃o/n搅拌条件下温孵溶液，以使醛官能团脱保护。通过加入0.1M NaOH调整pH值至用于偶合缓冲液中的值。

(Ortho Biotech，Jansen-Cilag)或

(Roche)相同的特性的重组人EPO)溶液(在反应缓冲液0.1M的醋酸钠缓冲液，pH 5中为10毫克/毫升)混合。以相对于EPO浓度20倍摩尔过量(基于M_w)的量加入OxHES醛。反应混合物中产生的EPO浓度为4.6毫克/毫升，oxHES醛浓度为20％(w/v)。通过加入在反应缓冲液中制成的0.5M的NaCNBH₃溶液以产生20mM的还原剂的最终浓度而开始还原胺化反应。彻底搅拌后，在o/n 10℃下，温孵反应液。

通过SDS-PAGE(图27)和C18柱(Phenomenex，Jupiter)上的反相色谱法(图A.4-1)分析反应混合物，以证明成功的偶合和用于测定偶合作用的产率。使用具有0.1％TFA的酸性水/乙腈梯度进行洗脱。

Claims

1.一种制备羟烷基淀粉衍生物的方法，包括：

(i)使式(I)的羟烷基淀粉

通过羟烷基淀粉的还原末端的碳原子C*与式(II)的交联化合物

M——L——A (II)

的氨基M反应，

其中，A是缩醛基或缩酮基；和L是桥连M和A的间隔物，其中，C*在羟烷基淀粉与M的反应之前任选被氧化，

从而获得式(III)的羟烷基淀粉衍生物

其中，X是由氨基M与羟烷基淀粉通过羟烷基淀粉的任选氧化的还原末端的碳原子C*反应产生的官能团，且

2.根据权利要求1所述的方法，其中，R₁、R₂和R₃独立地为基团-(CH₂CH₂O)_n-H，其中，n是0、1、2、3、4、5或6。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，A是式(IIa)的残基

其中，

Z₁和Z₂各独立地为O或S或NR_x，其中，R_x是H或甲基、乙基、正丙基、异丙基或C(O)-R_y，其中，R_y选自C₁-C₆烷基和C₆-C₁₄芳基；

其中，A₃是H或甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、戊基、苯甲基，或与氨基M的N原子形成环。

5.根据权利要求4所述的方法，其中R_x是H或甲基、乙基、正丙基或异丙基，或其中R_y选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。

6.根据权利要求4所述的方法，其中Z₁和Z₂各为O和其中A₃为H。

7.根据权利要求6所述的方法，其中A₁和A₂各为乙基或其中A₁和A₂形成式(IIb)的环，其中A₁和A₂在一起为-(CH₂)₂-。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述氨基M是式(IIc)的基团

其中，Y不存在或是选自以下的化学部分

其中，G是O或S或NH，且如果存在两个的话，各G独立地为O或S或NH，和

其中，R′是H或羟基或选自具有1-10个碳原子的烷基和卤素取代的烷基的有机残基。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述氨基M是H₂N-、H₂N-O-、H₂N-NH-(C＝O)-、H₃C-NH-或H₃C-NH-O-。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在(i)中，羟烷基淀粉通过其氧化的还原末端与交联化合物的氨基M反应，M为H₂N-，和其中，在0到80℃的温度下进行反应，和其中，X是-(C＝O)-NH-。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，在(i)中，羟烷基淀粉通过其非氧化的还原末端与交联化合物的氨基M反应，M为H₂N-，和其中，在20到80℃的温度和4至7的pH值下进行反应，X是-CH＝N-。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，在(i)中，所述反应在还原剂的存在下进行以获得羟烷基淀粉衍生物，X是-CH₂-NH-。

13.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在(i)中，羟烷基淀粉通过其非氧化的还原末端与交联化合物的氨基M反应，M为H₂N-O-或H₂N-NH-(C＝O)-，和其中，在5到80℃的温度和4.5至6.5的pH值下进行反应，X是-CH＝N-O-或-CH＝N-NH-(C＝O)-。

14.根据权利要求1或2所述的方法，其中，桥连M和A的L是包含至少一个式(IId)的结构单元的间隔物

其中，L₁和L₂彼此独立地为H或选自具有1-20个碳原子的烷基和卤素取代的烷基的有机残基，

其中，n是1到20的整数。

15.根据权利要求1或2所述的方法，其中，L为-(CH₂)_n-，其中，n是1至20的整数。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，L包含至少一个结构单元-(CL₁L₂)_n1-O-(CL₁L₂)_n2-，其中，n1等于或不等于n2，并且其中，间隔物L通过-(CL₁L₂)_n1-连接到交联化合物的氨基M上。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，L为-((CL₁L₂)₂-O)_m-(CL₁L₂)-，其中m是1、2或3。

18.根据权利要求17所述的方法，其中L为-((CH₂)₂-O)_m-CH₂-，其中m是1、2或3。

19.根据权利要求1所述的方法，其中，L为-(CL₁L₂)_n-(C＝O)-NH-(CL₁L₂)_n-，其中各个n彼此独立地在1到4的范围内。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，L选自-(CH₂)₃-(C＝O)-NH-(CH₂)₃-、-(CH₂)₃-(C＝O)-NH-(CH₂)₂-、-(CH₂)₂-(C＝O)-NH-(CH₂)₃-和-(CH₂)₂-(C＝O)-NH-(CH₂)₂-。

21.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述式(II)的交联化合物M-L-A选自

H₂N-(CH₂)₂-CH(OCH₂CH₃)₂、

H₂N-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CH(OCH₂CH₃)₂、

H₂N-(CH₂)₂-(C＝O)-NH-(CH₂)₂-CH(OCH₂CH₃)₂、

H₂N-(CH₂)₃-(C＝O)-NH-(CH₂)₂-CH(OCH₂CH₃)₂、

H₂N-(CH₂)₇-CH(OCH₂CH₃)₂、

H₂N-O-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CH(OCH₂CH₃)₂和

H₂N-NH-(C＝O)-(CH₂)₂-(C＝O)-NH-(CH₂)₂-CH(OCH₂CH₃)₂。

22.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述式(II)的交联化合物M-L-A为1-氨基-3，3-二乙氧基丙烷。

23.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：

(ii)使式(III)的羟烷基淀粉衍生物经还原胺化反应通过基团A与生物活性剂H₂N-BA′的氨基反应，从而获得式(IV)的羟烷基淀粉衍生物

其中BA’是生物活性剂的氨基通过还原胺化反应与A或对应于A的醛基或酮基反应后保留的生物活性剂BA′-NH₂的其余部分。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，在(ii)之前，式(III)的羟烷基淀粉衍生物的基团A转化为相应的醛基或酮基。

25.根据权利要求23所述的方法，其中，在(ii)中，所述反应在水性体系中，在还原剂的存在下，在0到37℃的温度和3至9的pH值下进行，和其中在(ii)中，基于羟烷基淀粉衍生物的数均分子量，羟烷基淀粉衍生物与生物活性剂BA的摩尔比为0.1∶1至200∶1当量。

26.根据权利要求23所述的方法，其中，所述生物活性剂为肽、蛋白质、多肽或蛋白质的功能性衍生物、片段或模拟物、小分子化合物或寡核苷酸。

27.根据权利要求23所述的方法，其中，所述生物活性剂为寡肽或多肽。

28.根据权利要求26所述的方法，其中，所述蛋白质为促红细胞生成素、集落刺激因子、干扰素、因子VII、因子IX、生长激素、Fab片段、免疫球蛋白G、胰高血糖素样肽-1、天冬酰胺酶、瘦素、白介素-2、白介素-11、α-1-抗胰蛋白酶、抗体或抗体片段、或可替换的蛋白质支架。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述促红细胞生成素为重组人促红细胞生成素，所述集落刺激因子为重组人G-CSF，所述干扰素为重组人IFN-α或重组人IFN-β或IFN-γ，所述因子VII为重组人因子VIIa，所述因子IX为重组人因子IX，所述生长激素为重组人生长激素，所述Fab片段为源自人类免疫球蛋白G分子的Fab片段，所述免疫球蛋白G为鼠免疫球蛋白G，所述天冬酰胺酶为重组天冬酰胺酶，和所述瘦素为重组人瘦素。

30.式(III)的羟烷基淀粉衍生物

其中，A是缩醛基或缩酮基；L是桥连X和A的间隔物；

其中，X是式(II)的交联化合物

M——L——A (II)

的氨基M与式(I)的羟烷基淀粉

通过羟烷基淀粉的碳原子C*反应产生的官能团，其中，C*在羟烷基淀粉与M的反应之前任选被氧化，

31.根据权利要求30所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，R₁、R₂和R₃独立地为基团-(CH₂CH₂O)_n-H，其中，n是0、1、2、3、4、5或6。

32.根据权利要求30或31所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，所述羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。

33.根据权利要求30所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，A是式(IIa)的残基

其中，

34.根据权利要求33所述的羟烷基淀粉衍生物，其中R_x是H或甲基、乙基、正丙基或异丙基，或其中R_y选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。

35.根据权利要求33所述的羟烷基淀粉衍生物，其中Z₁和Z₂各为O和其中A₃为H。

36.根据权利要求35所述的羟烷基淀粉衍生物，其中A₁和A₂各为乙基或其中A₁和A₂形成式(IIb)的环，其中A₁和A₂在一起为-(CH₂)₂-。

37.根据权利要求30或31所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，X选自-CH＝N-、-CH₂-NH-、-CH＝N-O-、-CH₂-NH-O-、-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-NH-NH-。

38.根据权利要求30所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，桥连M和A的L是包含至少一个式(IId)的结构单元的间隔物

其中，n是1到20的整数。

39.根据权利要求38所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，L为-(CH₂)_n-，其中，n是1至20的整数。

40.根据权利要求38所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，L包含至少一个结构单元-(CL₁L₂)_n1-O-(CL₁L₂)_n2-，其中，n1等于或不等于n2，并且其中，间隔物L通过-(CL₁L₂)_n1-连接到交联化合物的氨基M上。

41.根据权利要求40所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，L为-((CL₁L₂)₂-O)_m-(CL₁L₂)-，其中m是1、2或3。

42.根据权利要求41所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，L为-((CH₂)₂-O)_m-CH₂-，其中m是1、2或3。

43.根据权利要求38所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，L为-(CL₁L₂)_n-(C＝O)-NH-(CL₁L₂)_n-，其中各个n彼此独立地在1到4的范围内。

44.根据权利要求43所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，L选自-(CH₂)₃-(C＝O)-NH-(CH₂)₃-、-(CH₂)₃-(C＝O)-NH-(CH₂)₂-、-(CH₂)₂-(C＝O)-NH-(CH₂)₃-和-(CH₂)₂-(C＝O)-NH-(CH₂)₂-。

45.根据权利要求30所述的羟烷基淀粉衍生物，具有以下结构

46.根据权利要求30所述的羟烷基淀粉衍生物，具有以下结构

47.式(IV)的羟烷基淀粉衍生物

其中，X是式(II)的交联化合物

M——L——A (II)

的氨基M与式(I)的羟烷基淀粉通过羟烷基淀粉的碳原子C*反应产生的官能团，

其中，X不是酰胺基-C(＝O)-NH-，

其中，C*在羟烷基淀粉与M的反应之前任选被氧化，

其中，HAS′是羟烷基淀粉分子的其余部分，和R₁、R₂和R₃独立地为氢或者直链或分支羟烷基，

其中，A是式(IIa)的残基

其中，

Z₁和Z₂各独立地为O或S或NR_x，其中，R_x是H或甲基、乙基、正丙基、异丙基或C(O)-R_y，其中R_y选自C₁-C₆烷基和C₆-C₁₄芳基；

其中，A₃是H或甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、戊基、苯甲基，或与氨基M的N原子形成环；

和其中，L是桥连M和A的间隔物，

其中，BA′是生物活性剂的氨基通过还原胺化反应与A或对应于A的醛基或酮基反应后保留的生物活性剂BA′-NH₂的其余部分。

48.根据权利要求47所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，X选自-CH₂-NH-、-CH＝N-、-CH₂-NH-O-和-CH-N-O-。

49.根据权利要求47所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，桥连M和A的L是包含至少一个式(IId)的结构单元的间隔物

其中，n是1到20的整数。

50.根据权利要求49所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，L为-(CH₂)_n-，其中，n是1至20的整数。

51.根据权利要求49所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，L包含至少一个结构单元-(CL₁L₂)_n1-O-(CL₁L₂)_n2-，其中，n1等于或不等于n2，并且其中，间隔物L通过-(CL₁L₂)_n1-连接到交联化合物的氨基M上。

52.根据权利要求51所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，L为-((CL₁L₂)₂-O)_m-(CL₁L₂)-，其中m是1、2或3。

53.根据权利要求49所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，L为-(CL₁L₂)_n-(C＝O)-NH-(CL₁L₂)_n-，其中各个n彼此独立地在1到4的范围内。

54.根据权利要求53所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，L选自-(CH₂)₃-(C＝O)-NH-(CH₂)₃-、-(CH₂)₃-(C＝O)-NH-(CH₂)₂-、-(CH₂)₂-(C＝O)-NH-(CH₂)₃-和-(CH₂)₂-(C＝O)-NH-(CH₂)₂-。

55.根据权利要求47所述的羟烷基淀粉衍生物，具有以下结构

56.根据权利要求47所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，所述生物活性剂为肽、蛋白质、多肽或蛋白质的功能性衍生物、片段或模拟物、小分子化合物或寡核苷酸。

57.根据权利要求47所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，所述生物活性剂为寡肽或多肽。

58.根据权利要求56所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，所述蛋白质为促红细胞生成素、集落刺激因子、干扰素、因子VII、因子IX、生长激素、Fab片段、免疫球蛋白G、胰高血糖素样肽-1、天冬酰胺酶、瘦素、白介素-2、白介素-11、α-1-抗胰蛋白酶、抗体或抗体片段、或可替换的蛋白质支架。

59.根据权利要求58所述的羟烷基淀粉衍生物，其中，所述促红细胞生成素为重组人促红细胞生成素，所述集落刺激因子为重组人G-CSF，所述干扰素为重组人IFN-α或重组人IFN-β或IFN-γ，所述因子VII为重组人因子VIIa，所述因子IX为重组人因子IX，所述生长激素为重组人生长激素，所述Fab片段为源自人类免疫球蛋白G分子的Fab片段，所述免疫球蛋白G为鼠免疫球蛋白G，所述天冬酰胺酶为重组天冬酰胺酶，和所述瘦素为重组人瘦素。

60.根据权利要求47所述的羟烷基淀粉衍生物，用作治疗剂或预防剂。

61.根据权利要求47所述的羟烷基淀粉衍生物，用于治疗人类或动物身体的方法。

62.包含治疗有效量的权利要求47所述的羟烷基淀粉衍生物的药物组合物。