EA018222B1 - Производные гидроксиалкилкрахмала и способ их получения - Google Patents
Производные гидроксиалкилкрахмала и способ их получения Download PDFInfo
- Publication number
- EA018222B1 EA018222B1 EA201000798A EA201000798A EA018222B1 EA 018222 B1 EA018222 B1 EA 018222B1 EA 201000798 A EA201000798 A EA 201000798A EA 201000798 A EA201000798 A EA 201000798A EA 018222 B1 EA018222 B1 EA 018222B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- group
- substituted
- derivative
- alkyl
- reaction
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
- C08B31/08—Ethers
- C08B31/12—Ethers having alkyl or cycloalkyl radicals substituted by heteroatoms, e.g. hydroxyalkyl or carboxyalkyl starch
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
- C08B31/08—Ethers
- C08B31/12—Ethers having alkyl or cycloalkyl radicals substituted by heteroatoms, e.g. hydroxyalkyl or carboxyalkyl starch
- C08B31/125—Ethers having alkyl or cycloalkyl radicals substituted by heteroatoms, e.g. hydroxyalkyl or carboxyalkyl starch having a substituent containing at least one nitrogen atom, e.g. cationic starch
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу получения производного гидроксиалкилкрахмала, включающему реакцию гидроксиалкилкрахмала (HAS) посредством необязательно окисленной редуцирующей конечной группы HAS с аминогруппой М связующего соединения, которое кроме аминогруппы включает определенным образом защищенную карбонильную группу, а именно ацетальную группу или кетальную группу.
Description
Изобретение относится к способу получения производных гидроксиалкилкрахмала, который включает реакцию гидроксиалкилкрахмала (НА8) посредством необязательно окисленной редуцирующей концевой группы НА8 с аминогруппой М сшивающего соединения, которое кроме аминогруппы включает определенным образом защищенную карбонильную группу, а именно ацетальную группу или кетальную группу. Способ может также включать реакцию полученного таким образом производного НА8 с аминогруппой биологически активного соединения посредством алкилирования, предпочтительно посредством восстановительного аминирования. Кроме того, изобретение относится к производным НА8, которые могут быть получены или получаются описываемым в изобретении способом, а также к конкретным производным НА8 как таковым. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим производные НА8, содержащие биологически активное соединение, этим производным НА8 как терапевтическим или профилактическим веществам и использованию конкретных производных НА8 для получения лекарственных средств.
Гидроксиалкилкрахмал (НА8), в частности гидроксиэтилкрахмал (НЕ8), является замещенным производным природного полимера класса углеводов - амилопектина, который содержится в кукурузном крахмале в концентрации до 95 мас.% и расщепляется в организме альфа-амилазой. НЕ8, в частности, проявляет полезные биологические свойства и используется как кровезаменитель и в лечении гемоделюции в больницах (Зотшстшсусг с! а1., 1987, Кгапкспйаизрйагта/к, 8(8), 271-278; Ус1б1сг с! а1., 1991, Аг/псшШ1с1-[ог5с1шпд/Огид Всз., 41, 494-498).
Существующий уровень техники предлагает несколько способов получения производных гидроксиэтилкрахмала.
ЭЕ 2616086 раскрывает конъюгирование (связывание) гемоглобина с гидроксиэтилкрахмалом, где на первом этапе сшивающее вещество, например бромциан, связывают с гидроксиэтилкрахмалом, а затем гемоглобин связывают с промежуточным продуктом.
Одной из важных областей применения НЕ8 является стабилизация полипептидов, которые применяются, например, для кровеносной системы с целью получения определенного физиологического эффекта. Одним из конкретных примеров этих полипептидов является эритропоэтин, кислый гликопротеин с молекулярной массой примерно 34000 кД, необходимый для регулирования уровня красных кровяных клеток в кровеносной системе.
Хорошо известной проблемой применения полипептидов и энзимов является то, что эти протеины часто имеют неудовлетворительную стабильность. Особенно это касается эритропоэтина, который характеризуется сравнительно коротким периодом полураспада в плазме (8р1уак апб Нодапз, 1989, В1ооб 73, 90; МсМайоп с! а1., 1990, В1ооб 76, 1718). Это означает, что терапевтические уровни в плазме быстро утрачиваются и требуются повторные внутривенные введения. Более того, при некоторых обстоятельствах наблюдается иммунная реакция против пептидов.
Считается, что стабильность полипептидов повышается, а иммунная реакция против этих полипептидов снижается, когда полипептиды соединены с полимерными молекулами.
Согласно νθ 94/28024 физиологически активные полипептиды, модифицированные полиэтиленгликолем (РЕО), имеют сниженную иммуногенность и антигенность и циркулируют в кровотоке значительно дольше, чем неконьюгированные протеины, т.е. имеют меньшую скорость очищения крови. Однако коньюгаты медикаментов на основе РЕО имеют несколько недостатков, например они не имеют естественной структуры, которую могли бы распознавать элементы деградации ίη у1уо. Поэтому, кроме РЕО-коньюгатов, были получены другие коньюгаты и полимераты протеинов.
Заявка νθ 02/080979 описывает соединения, включающие коньюгат активного вещества и гидроксиалкилкрахмала, где активное вещество и гидроксиалкилкрахмал связаны либо напрямую, либо посредством связующего соединения. Что касается прямой связи, реакция активного вещества и гидроксиалкилкрахмала проводится в водной среде, содержащей не менее 10 мас.% воды. Не приводится никаких примеров связи гидроксиалкилкрахмала со сшивающим веществом посредством аминогруппы данного сшивающего вещества, в котором сшивающее вещество также содержит защищенную карбонильную группу. Кроме того, не приводится никаких примеров, показывающих производное НА8, полученное реакцией данного производного НА8 посредством данной карбонильной группы с аминогруппой биологически активного вещества.
νθ 03/074087 описывает коньюгаты гидроксиалкилкрахмала с протеином, в которых связь между молекулой гидроксиалкилкрахмала и протеина ковалентная и является результатом взаимодействия концевой альдегидной группы гидроксиалкилкрахмала или функциональной группы, полученной в результате реакции вышеуказанной альдегидной группы с функциональной группой протеина.
νθ 03/074088 описывает коньюгаты гидроксиалкилкрахмала с низкомолекулярным соединением, в котором связь между гидроксиалкилкрахмалом и низкомолекулярным соединением ковалентная и является результатом взаимодействия концевой альдегидной группы гидроксиалкилкрахмала или функциональной группы, полученной в результате реакции вышеуказанной альдегидной группы, с функциональной группой протеина.
νθ 2005/014024 описывает полимеры, функционализированные аминооксигруппой или ее производным, коньюгаты, где функционализированные полимеры ковалентно связаны с протеином связующей
- 1 018222 оксимовой группой, способ получения функционализированных полимеров, способ получения конъюгатов, функционализированные полимеры, получаемые способом, описываемым в данном изобретении, конъюгаты, получаемые данным способом, и фармацевтические композиции, включающие по крайней мере один конъюгат, а также использование указанных конъюгатов и композиций для профилактики или лечения организма человека или животного.
νθ 2005/092390 описывает конъюгаты гидроксиалкилкрахмала и протеина, где эти конъюгаты образуются посредством ковалентного соединения между гидроксиалкилкрахмалом или производным гидроксиалкилкрахмала и протеином, и способ получения этих конъюгатов и их исполъзование.
νθ 2004/024777 описывает производные гидроксиалкилкрахмала, в частности производные гидроксиалкилкрахмала, которые можно получатъ способом, при котором гидроксиалкилкрахмал реагирует с первичной или вторичной аминогруппой связующего соединения. В соответствии с наиболее предпочтителъным вариантом осуществления νθ 2004/024777 описывает производные гидроксиалкилкрахмала, которые можно получатъ способом, в соответствии с которым гидроксиалкилкрахмал реагирует с первичной или вторичной аминогруппой связующего соединения, а полученный в резулътате реакции продукт реагирует с полипептидом, предпочтителъно гликопротеином и особенно предпочтителъно с эритропоэтином посредством по крайней мере еще одной другой реакционно-способной группы связующего соединения. Особо предпочтителъным гидроксиалкилкрахмалом является гидроксиэтилкрахмал. В соответствии с νθ 2004/024777, гидроксиалкилкрахмал и предпочтителъно гидроксиэтилкрахмал реагирует со связующим соединением на своем редуцирующем конце, не окисленном до реакции.
νθ 2004/024776 описывает производные гидроксиалкилкрахмала, в частности производные гидроксиалкилкрахмала, получаемые способом, при котором гидроксиалкилкрахмал вступает в реакцию с первичной или вторичной аминогруппой сшивающего соединения или с двумя сшивающими соединениями, при котором получаемое в резулътате производное гидроксиалкилкрахмала имеет по крайней мере одну функционалъную группу X, способную реагироватъ с функционалъной группой Υ последующего соединения и при котором данная группа Υ последующего соединения является алъдегидной группой, кетогуппой, полуацеталъной группой, ацеталъной группой или тиогруппой. В соответствии с особо предпочтителъным вариантом осуществления изобретения νθ 2004/024776 описывает производные гидроксиалкилкрахмала, получаемые способом, в соответствии с которым гидроксиалкилкрахмал реагирует с первичной или вторичной аминогруппой сшивающего соединения, а получаемый в резулътате продукт реакции далее необязателъно реагирует со вторым сшивающим соединением, где полученное в резулътате производное гидроксиалкилкрахмала имеет по крайней мере одну функционалъную группу X, способную вступатъ в реакцию с функционалъной группой Υ последующего соединения, и где эта группа Υ является алъдегидной группой, кетогруппой, полуацеталъной группой, ацеталъной группой или тиогруппой, а полученный в резулътате реакции продукт реагирует с полипептидом, предпочтителъно с таким полипептидом, как АТ III, 1ЕЫ-Ье!а или эритропоэтин, и особо предпочтителъно эритропоэтином и включает по крайней мере одну из этих функционалъных групп Υ. Особо предпочтителъным гидроксиалкилкрахмалом является гидроксиэтилкрахмал. В соответствии с νθ 2004/024776 гидроксиалкилкрахмал и предпочтителъно гидроксиэтилкрахмал реагирует со связующим соединением на своем редуцирующем конце, необязателъно окисленном до реакции.
νθ 2005/092928 описывает конъюгаты гидроксиалкилкрахмала, предпочтителъно гидроксиэтилкрахмала, и протеина, получаемые реакцией восстановителъного аминирования между по крайней мере одной алъдегидной группой гидроксиалкилкрахмала или производного гидроксиалкилрахмала и по крайней мере одной аминогруппой протеина, при которой гидроксиалкилкрахмал или его производное ковалентно связываются с протеином посредством азометиновой связи или аминометиленовой связи. νθ 2005/092928 также описывает способ получения этих конъюгатов и их исполъзование.
υδ 2006/0194940 А1 описывает водорастворимые алканали. Описываются также защищенные алъдегиды, реагирующие с полимерами. Хотя упоминаются полисахариды вообще, наиболее предпочтителъными полимерами являются полиэтиленгликоли. Крахмалы или, в частности модифицированные крахмалы, такие как гидроксиалкилкрахмалы, не описываются в υδ 2006/0194940 А1. Следователъно, И8 2006/0194940 А1 не описывает специфические способы соединения данного связующего соединения с гидроксиалкилкрахмалом. То же относится и к И8 7157546 В2, ЕР 1591467 А1 и νθ 2004/022630 А2.
И8 6916962 В2 описывает аминоацеталъное связующее соединение в незащищенном и защищенном виде. Данный документ не содержит никакого описания, относящегося к возможному соединению этого связующего соединения с иными полимерами, кроме полиэтиленгликоля. В частности, в υδ 6916962 В2 не раскрываются крахмалы, не говоря о модифицированных крахмалах, таких как гидроксиалкилкрахмалы. Следователъно, υδ 6916962 В2 не содержит описания специфических способов соединения данного связующего соединения с гидроксиалкилкрахмалом. То же самое относится к υδ 6956135 В2 и νθ 03/049699 А2.
υδ 5990237 описывает структуры, содержащие защищенную алъдегидную группу. Соединения, включающие эти структуры, предпочтителъно связаны с полиэтиленгликолем, и связъ осуществляется посредством галогенида, как функционалъной группы, содержащейся в соединениях с защищенной алъдегидной группой, и галогенидная группа реагирует с гидроксигруппой полиэтиленгликоля.
- 2 018222
Объектом данного изобретения является обеспечение нового способа получения производных гидроксиалкилкрахмала.
Кроме того, еще одним объектом данного изобретения является обеспечение новых производных ИА8, таких как производные ИА8, которые получают или которые можно получить посредством реакции ИА8 со специально функционализированными сшивающими веществами.
Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение других новых производных ИА8, таких как производные ИА8, которые получают или которые можно получить посредством реакции производных ИА8, которые получают или которые можно получить посредством реакции ИА8 со специально функционализированными сшивающими соединениями с подходящей функциональной группой биологически активного соединения.
Было установлено, что для получения определенных производных ИА8 можно использовать сшивающее соединение, которое, с одной стороны, может селективно присоединяться к необязательно окисленной редуцирующей концевой группе гидроксиалкилкрахмала посредством аминогруппы, а с другой стороны, имеет в качестве второй функциональной группы полностью защищенную карбонильную группу, а именно ацетальную группу или кетальную группу. По сравнению с осуществлениями изобретения, где используется сшивающее соединение, имеющее в качестве функциональной группы свободную альдегидную или кетогруппу или, например, полуацетальную группу, использование такой полностью защищенной группы резко минимизирует риск того, что во время реакции ИА8 со сшивающим соединением будет происходить нежелательная олигомеризация или полимеризация между молекулами сшивающего соединения. Было также обнаружено, что снятие защиты с ацетальной или кетальной групп, включенной в полученное производное ИА8. возможно даже без частичного разрушения специфической химической структуры гидроксиалкилкрахмала, в частности гидроксиэтилкрамала, характеризующейся многочисленными функциональными группами, такими как ацетальные группы и эфирные группы. Поэтому настоящее изобретение обеспечивает очень эффективный способ получения первого производного ИА8 посредством минимизации риска олигомеризации или полимеризации между отдельными молекулами сшивающего соединения, а также возможность снятия защиты функциональных групп полученных производных ИА8 без даже частичного разрушения структуры ИА8 для получения производных ИА8, позволяющих эффективное связывание с биологически активным соединением.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения производного гидроксиалкилкрахмала, включающему:
посредством атома углерода С* редуцирующей концевой группы ИА8 с аминогруппой М сшивающего соединения в соответствии с формулой (II)
М--ь--А где А является ацетальной группой или кетальной группой; а к является спейсером между М и А, где С* является необязательно окисленным до реакции ИА8 с М, с получением производного ИА8 формулы (III)
где X является функциональной группой, полученной в результате реакции аминогруппы М с ИА8 посредством атома углерода С* необязательно окисленной редуцирующей концевой группы ИА8, и где ИА8' является остатком молекулы гидроксиалкилкрахмала, а Κι, К2 и К3 являются независимо друг от друга водородом или гидроксиалкильной группой с линейной или разветвленной цепью.
Кроме того, настоящее изобретение относится к производному гидроксиалкилкрахмала (ИА8), который получают или который можно получить данным способом.
Кроме того, настоящее изобретение относится к производному гидроксиалкилкрахмала (ИА8) формулы (III)
- 3 018222
где А является ацетальной или кетальной группой;
Ь является спейсером между X и А;
где X является функциональной группой, получаемой посредством реакции аминогруппы М сшивающего соединения формулы (II) с гидроксиалкилкрахмалом (НА8) формулы (I)
ОК. | ||
н / | ||
о | 1 \ | |
2 | | \ с*н | |
н | ок3 %О11 | |
Н | (I) |
посредством атома углерода С* НА8, где С* является необязательно окисленным до реакции НА8 с М, где НА8' является остатком молекулы гидроксиалкилкрахмала, а Кь К2 и К3 независимо друг от друга являются водородом или гидроксиалкильной группой с линейной или разветвленной цепью.
Г идроксиалкилкрахмал
В контексте настоящего изобретения термин гидроксиалкилкрахмал (НА8) относится к производному крахмала, замещенному по крайней мере одной гидроксиалкильной группой. Предпочтительный гидроксиалкилкрахмал по настоящему изобретению имеет структуру, соответствующую формуле (I')
где НА8' является остатком молекулы гидроксиалкилкрахмала, а Кь К2 и К3 независимо друг от друга являются водородом, гидроксиалкильной группой с линейной или разветвленной цепью или группой —[(Ск'к2)гаО]п[СК3К4]—он где К1, К2, К3 и К4 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из водорода и алкильной группы, предпочтительно водорода и метильной группы, т составляет от 2 до 4, где остатки К1 и К9 могут быть одинаковыми или разными в т группах СК1К2;
η составляет от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 4;
о составляет от 2 до 20, предпочтительно от 2 до 4, где остатки К3 и К4 могут быть одинаковыми или разными в о-группах СК3К4.
Предпочтительно К1, К2 и К3 являются независимо друг от друга группой -(СН2СН2О)П-Н, где η является целым числом, предпочтительно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 и, в частности, К1, К2 и К3 являются независимо друг от друга водородом или 2-гидроксиэтилом.
В формуле (I) и (I') редуцирующая концевая группа молекулы крахмала показана в неокисленной форме, а концевое моносахаридное звено НА8 показано в полуацетальной форме, которая в зависимости, например, от растворителя, может находиться в равновесии со (свободной) альдегидной формой. Сокращение НА8', используемое в контексте настоящего изобретения, относится к молекуле НА8 без концевого сахаридного звена на редуцирующем конце молекулы НА8. Это подразумевается под термином остаток молекулы гидроксиалкилкрахмала в контексте настоящего изобретения.
Термин гидроксиалкилкрахмал применительно к настоящему изобретению не ограничен соединениями, где концевая углеводная часть включает гидроксиалкильные группы К1, К2 и/или К3, как было описано для краткости в формулах (I) и (I'), а относится также к соединениям, в которых по крайней мере одна гидроксильная группа, присутствующая в любом месте, в конечной углеводной части и/или в остат
- 4 018222 ке молекулы гидроксиалкилкрахмала, НА8', замещена гидроксиалкильной группой Κι, К2 и/или К3.
Гидроксиалкилкрахмал, включающий две или более разных гидроксиалкильных групп, также возможен.
По крайней мере одна гидроксиалкильная группа, содержащаяся в НА8, может иметь одну или более, в частности, две или более гидроксильных групп. В соответствии с предпочтительным осуществлением изобретения по крайней мере одна гидроксиалкильная группа, содержащаяся в НА8, имеет одну гидроксильную группу.
Выражение гидроксиалкилкрахмал также включает производные, в которых алкильная группа является моно- или полизамещенной. В связи с этим предпочтительно, чтобы алкильная группа была замещена галогеном, особенно фтором, или арильной группой. Кроме того, гидроксильная группа гидроксиалкильной группы может быть превращена в сложный или простой эфир.
Кроме того, вместо алкила могут также использоваться замещенные или незамещенные алкенильные группы с линейной или разветвленной цепью.
Гидроксиалкилкрахмал является эфирным производным крахмала. Кроме эфирных производных в контексте настоящего изобретения могут также использоваться другие производные крахмала. Например, полезны производные, включающие этерифицированные гидроксильные группы. Эти производные могут быть, например, производными незамещенных моно- или дикарбоновых кислот с 2-12 атомами углерода или их замещенных производных. Особо полезны производные незамещенных монокарбоновых кислот с 2-6 атомами углерода, особенно производные уксусной кислоты. В данном контексте предпочтительны ацетилкрахмал, бутилкрахмал и пропилкрахмал.
Кроме того, предпочтительны производные незамещенных дикарбоновых кислот с 2-6 атомами углерода.
В случае производных дикарбоновых кислот полезно, если вторая карбоксильная группа дикарбоновой кислоты также этерифицирована. Кроме того, в контексте настоящего изобретения подходят также производные сложных моноалкиловых эфиров дикарбоновых кислот.
Для замещенных моно- или дикарбоновых кислот замещающие группы могут быть предпочтительно такие же, как были ранее указаны для замещенных алкильных остатков.
Способы этерификации крахмала известны в данной области (см., например, К1етт Ό. с( а1, СотргсйспЦус Се11и1о5е Сйет151гу, νοί. 2, 1998, \У1п1еу-УСН. ХУетйепп. Ыете Уотк, е5рес1а11у сйар!ет 4.4, Е§!еп1юа!юп о! Се11и1о5е (Ι8ΒΝ 3-527-29489-9).
В соответствии с предпочтительным осуществлением настоящего изобретения используется гидроксиалкилкрахмал вышеупомянутой формулы (I). Другие сахаридные циклические структуры, включенные в НА8', могут быть такими же или отличаться от конкретно описанного сахаридного цикла отсутствием редуцирующей концевой группы.
Что касается остатков Κ1, Κ2 и Κ3 в соответствии с формулой (I), не существует никаких специальных ограничений. В соответствии с предпочтительным осуществлением изобретения Κ1, Κ2 и Κ3 являются независимо друг от друга водородом или гидроксиалкильной группой, гидроксиаралкильной группой или гидроксиалкарильной группой, имеющей от 2 до 10 атомов углерода в соответствующем алкильном остатке. Предпочтительны водород и гидроксиалкильные группы, имеющие от 2 до 10 атомов углерода. Более предпочтительно, если гидроксиалкильная группа имеет от 2 до 6 атомов углерода, еще более предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода и еще более предпочтительно от 2 до 3 атомов углерода. В предпочтительном варианте осуществления изобретения гидроксиалкилкрахмал является гидроксиэтилкрахмалом, где Κ1, Κ2 и Κ3 являются независимо друг от друга водородом или группой (СН2СН2О)П-Н, в которой η представлено целым числом, предпочтительно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Поэтому гидроксиалкилкрахмал предпочтительно включает гидроксиэтилкрахмал, гидроксипропилкрахмал и гидроксибутилкрахмал, где гидроксиэтилкрахмал и гидроксипропилкрахмал особо предпочтительны, а гидроксэтилкрахмал наиболее предпочтителен.
Алкильная, аралкильная и/или алкарильная группа может иметь линейную или разветвленную цепь и быть соответствующим образом замещена.
Поэтому настоящее изобретение также относится к вышеописанным способу и производному НА8, где Κ1, Κ2 и Κ3 независимо друг от друга являются водородом или гидроксиалкильной группой с линейной или разветвленной цепью, имеющей от 2 до 6 атомов углерода.
Таким образом, Κ1, Κ2 и Κ3 могут быть предпочтительно Н, гидроксигексилом, гидроксипентилом, гидроксибутилом, гидроксипропилом, таким как 2-гидроксипропил, 3-гидроксипропил, 1гидроксиизопропил, гидроксиэтилом, таким как 2-гидроксиэтил, причем наиболее предпочтительными являются водород и 2-гидроксиэтиловая группа.
Поэтому настоящее изобретение также относится к вышеописанным способу и производному НА8, где Κ1, Κ2 и Κ3 независимо друг от друга являются водородом или 2-гидроксиэтиловой группой, причем наиболее предпочтительным является вариант осуществления изобретения, где по крайней мере один остаток Κ1, Κ2 и Κ3 является 2-гидроксиэтилом.
Гидроксиэтилкрахмал (НЕ8) является наиболее предпочтительным для всех вариантов осуществления настоящего изобретения.
- 5 018222
Поэтому настоящее изобретение относится к вышеописанным способу и производному НЛ8, где полимер является гидроксиэтилкрахмалом, а производное является производным гидроксиэтилкрахмала (НБ8).
НА8, в частности, НБ8 характеризуется главным образом распределением молекулярной массы, степенью замещения и соотношением замещения С2 : С6. Существует две возможности описания степени замещения.
Степень замещения (Ό8) НА8 описывается как отношение замещенных мономерных звеньев глюкозы ко всем мономерным звеньям глюкозы.
Тип замещения НА8 можно также описать как молярное замещение (М8), где считается количество гидроксиэтильных групп на звено глюкозы.
В контексте настоящего изобретения тип замещения НА8, предпочтительно НБ8, называется М8, как описано выше (см. также Зошшегшеуег е! а1., 1987, Кгапкепйаи8рйагшаг1е, 8(8), 271-278, ΐπ рагйеи1аг р. 273).
М8 определяется посредством газовой хроматографии после полного гидролиза молекулы НБ8. Приводятся значения М8 соответствующего исходного материала НА8, в частности НБ8. Предполагается, что значение М8 не подвергается изменениям в течение процесса получения производных на стадиях а) и Ь) способа, предлагаемого в изобретении.
Растворы НА8 и, в частности, НБ8 присутствуют в виде полидисперсных композиций, где каждая молекула отличается от другой по степени полимеризации, количеству и типу точек разветвления и типу замещения. Поэтому НА8 и, в частности, НБ8 является смесью соединений с разной молекулярной массой. Следовательно, определенный раствор НА8 и, в частности, НБ8 определяется средней молекулярной массой с использованием статистических методов. В данном контексте Мп вычисляется как среднее арифметическое в зависимости от количества молекул. Или же М„ (или М^), среднемассовая молекулярная масса, представляет собой единицу, которая зависит от массы НА8, в частности НБ8.
В данном контексте среднемассовая молекулярная масса определяется уравнением 1:
где п является числом молекул типа ΐ молярной массы Мр
М п означает, что значение является средним, но линию обычно принято опускать. М„ является среднемассовой молекулярной массой, определяемой
уравнением 2, где щ означает количество молекул типа ΐ молярной массы М) означает, что значение является средним, но линию обычно принято опускать.
Предпочтительно, чтобы гидроксиалкилкрахмал, в частности гидроксиэтилкрахмал, используемый в изобретении, имел среднюю молекулярную массу (среднее значение) от 1 до примерно 1000 кД, более предпочтительно от 1 до примерно 800 кД, еще более предпочтительно от 1 до примерно 500 кД. Гидроксиэтилкрахмал может также иметь предпочтительную степень молярного замещения от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,1 до 2, более предпочтительно от 0,1 до 0,9 или от 0,4 до 2, предпочтительно от 0,4 до 1,3 и предпочтительное отношение замещений С2 : С6 в диапазоне от 2 до 20 относительно гидроксиэтильных групп.
Термин средняя молекулярная масса применительно к данному изобретению относится к массе, определяемой методом БАББ8-(1о^ апд1е 1а§ег Бдй! зеаПеппд (лазерной дифракции)-СРС, описанным в Зошшегшеуег е! а1., 1987, Кгапкепйаи8рйагшаг1е, 8(8), 271-278; апб ^е1б1ег е! а1., 1991, Атгпехш.РогзеНипд/Игид Ке§., 41, 494-498. Для значений средней молекулярной массы в 10 кД и ниже выполнялась дополнительная калибровка при помощи стандарта, предварительно подтвержденного БАББ8-СРС.
В соответствии с предпочтительным осуществлением настоящего изобретения средняя молекулярная масса используемого гидроксиэтилкрахмала составляет от примерно 1 до примерно 1000 кД, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 800 кД, еще более предпочтительно от примерно 1 до примерно 500 кД, еще более предпочтительно от примерно 2 до примерно 400 кД, еще более предпочтительно от примерно 5 до примерно 300 кД, еще более предпочтительно от примерно 10 до примерно 200 кД, в частности от примерно 50 до примерно 150 кД.
Кроме того, молярное замещение НА8 и, в частности, НБ8 составляет предпочтительно от 0,1 до примерно 3, предпочтительно от примерно 0,4 до примерно 1,3, например, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 или 1,3.
Примером НБ8, имеющего среднюю молекулярную массу от 5 до примерно 300 кД, предпочтительно от 50 до 150 кД, является НБ8 с молярным замещением от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,4 до 1,3,
- 6 018222 таким как 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 или 1,3.
Что касается соотношения замещения С2 : С6, данное замещение предпочтительно находится в диапазоне от 2 до 20, более предпочтительно в диапазоне от 2 до 15 и еще более предпочтительно в диапазоне от 3 до 12.
Крахмалы, отличные от гидроксиалкилкрахмала
Способы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно также осуществить, а производные можно также получить, используя иные крахмалы, нежели гидроксиалкилкрахмы, в частности, описанный выше гидроксиэтилкрахмал при условии, что эти крахмалы также содержат редуцирующую концевую группу, присутствующую в полуацетальной форме, необязательно в равновесии со (свободной) альдегидной формой, который может быть соответствующим образом окислен для получения соответствующей окисленной формы. В частности, может использоваться незамещенный или низкозамещенный крахмальный продукт с сильно разветвленной цепью, то есть крахмал, который имеет значительно более высокую степень разветвленности, чем амилопектин, и имеет степень разветвленности альфа-1,6 гликогена или даже превосходит ее, и, если это замещенный крахмал, то имеет молярное замещение М8 только до 0,3, предпочтительно от 0,05 до 0,3. Термин М8 (молярное замещение) применительно к этому сильно разветвленному незамещенному или низкозамещенному крахмальному продукту означает среднее количество гидроксиэтильных или гидроксипропильных групп на звено ангидроглюкозы. М8 обычно измеряется определением содержания гидроксиэтильных или гидроксипропильных групп в образце и рассчитывается как их доля от присутствующих в нем звеньев ангидроглюкозы. М8 можно также определить посредством газовой хроматографии. Степень разветвленности можно определить газовой хроматографией по анализу метилирования как содержание (в мольных процентах) в полимере альфа-1,4,6глюкозидносвязанных ангидроглюкоз. Степень разветвленности в каждом случае является средней величиной, потому что сильно разветвленный незамещенный или низкозамещенный крахмальный продукт, описываемый в изобретении, является полидисперсным соединением. Звенья глюкозы в этом сильно разветвленном незамещенном или низкозамещенном крахмальном продукте связаны альфа-1,4- и альфа1,6-связями. Степень разветвленности означает пропорцию звеньев глюкозы, связанных альфа-1,4,6связями, в мольных процентах к общему количеству всех ангидроглюкоз. Отношение С2/С6 выражает соотношение или замещение при С-2 к соотношению или замещению при С-6. Сильноразветвленный незамещенный или низкозамещенный крахмальный продукт имеет предпочтительную степень разветвленности от 6 до 50%, которая достигается стадией трансглюгозидации с помощью гликоген-ветвящих ферментов. Еще более предпочтительно, если степень разветвленности находится в диапазоне от 10 до 45, еще более предпочтительно - от 20 до 40, например 20, 25, 30, 35 или 40. Также предпочтительными являются диапазоны от более 20 до 40, предпочтительно от более 20 до 30, такие как от 21 до 40, предпочтительно от 21 до 30. Исходным материалом, который может использоваться для этой цели, является в принципе любой крахмал, но предпочтительно восковые крахмалы с высокой пропорцией амилопектина или амилопектиновой фракции. Степень разветвленности, необходимая для использования предлагаемых в изобретении крахмальных продуктов - насколько это касается других крахмалов - находится в диапазоне от 8 до 20%, выраженных в мольных процентах ангидроглюкоз. Это означает, что крахмальные продукты, которые можно использовать для целей данного изобретения, имеют в среднем одну альфа-1,6-связь, и, таким образом, одну точку ветвления на каждые 12,5 - 5 звеньев глюкозы. Предпочтительные сильно разветвленные незамещенные или низкозамещенные крахмальные продукты имеют степень разветвленности более 10 и до 20%, в частности, от 11 до 18%. Более высокая степень разветвленности означает более высокую растворимость крахмальных продуктов, описываемых в изобретении, и более высокую биодоступность этих растворенных крахмальных продуктов в организме. Особое предпочтение отдается немодифицированным крахмальным продуктам, имеющим степень разветвленности более 10%, в частности от 11 до 18%. Сильно разветвленный незамещенный или низкозамещенный крахмальный продукт может быть получен целенаправленной ферментативной сборкой, используя так называемые гликоген-ветвящие ферменты или ферменты переноса, за которыми следует, где это необходимо, частичное превращение свободных гидроксильных групп в гидроксиэтильные или гидроксипропильные группы. Вместо этого возможно преобразовывать гидроксиэтилированный или гидроксипропилированный крахмал путем ферментативной сборки, используя так называемые гликоген-ветвящие ферменты или ферменты переноса, в сильно разветвленный, незамещенный или низкозамещенный крахмальный продукт. Известен ферментативный способ получения разветвленных крахмальных продуктов из пшеничного крахмала со степенью разветвленности до 10%, описанный, например, в νθ 00/66633 А. Подходящие гликоген-ветвящие ферменты или ферменты переноса, а также их получение описаны в νθ 00/18893 А, И8 4454161, ЕР 0418945 А, ДР 2001294601 А или И8 2002/065410 А. Последняя из этих публикаций описывает немодифицированные крахмальные продукты со степенью разветвленности от более 4 и до 10% или выше. Ферментативное трансгликозилирование можно выполнять известным способом, например, инкубированием воскового кукурузного крахмала, картофельного крахмала, полученного из картофеля с высоким содержанием амилопектина, или крахмала, полученного из риса, маниока, пшеницы с высоким содержанием амилопектина, из кукурузы, из кукурузы с высоким содержанием амилопектина или из кукурузы с высоким содержанием амилозы, с подходящими ферментами в мягких условиях
- 7 018222 при значениях рН между 6 и 8 и температурой между 25 и 40°С в водном растворе. Применительно к сильно разветвленным незамещенным или низкозамещенным крахмальным продуктам молекулярная масса Ми означает среднемассовую молекулярную массу. Ее можно определить различными известными способами, то есть ОРС (гельпроникающей хроматографией) или высокоэффективной жидкостной хроматографией в сочетании с определением интенсивности светорассеяния и показателя преломления. Для замещенных крахмалов предпочтительно соотношение С2/С6 в диапазоне от 5 до 9. Высокая степень разветвленности сильно разветвленных незамещенных или низкозамещенных крахмальных продуктов увеличивает их растворимость в воде до такой степени, что можно полностью или частично обойтись без гидроксиэтильного или гидроксипропильного замещения для удержания крахмального продукта в растворе. Среднюю молекулярную массу сильно разветвленного незамещенного или низкозамещенного крахмального продукта можно увеличить до некоторой степени посредством ограничения проницаемости мембраны. Характерной переменной, которую можно использовать в данном случае, является также значение ОРС так называемой последней фракции отгонки БЕ90% (молекулярная масса при 90% площади пика как мера пропорции фракций меньших молекул). Более высокая эффективность ультрафильтрации (ИЕ) может быть достигнута соответствующим повышением молекулярной массы с одновременным резким снижением всасывания всей перитониальной мембраны. В то же время остаточные фрагменты с высокой молекулярной массой, полученные расщеплением эндогенной амилазой, которые не могут далее расщепляться амилазой и которые хранятся в органах и тканях, более не встречаются или же встречаются лишь в небольшой степени.
В соответствии с изобретением, гидроксиалкилкрахмал реагирует со сшивающим соединением МБ-Л, где М является аминогруппой, а А является ацетальной или кетальной группой и где группа М и группа Б разделены соответствующим спейсером.
Ацетальная и кетальная группа А
В отношении ацетальной или кетальной группы А не существует специальных ограничений. Применительно к данному изобретению термин ацетальная группа также включает серосодержащие ацетали и азотсодержащие ацетали, а термин кетальная группа включает также серосодержащие кетали и азотсодержащие кетали. Кроме того, в отношении термина ацетальная группа полностью исключаются полуацетали, а в отношении термина кетальная группа полностью исключаются полукетали.
В соответствии с предпочтительным осуществлением изобретения группа А сшивающего соединения М-Б-А является остатком по формуле (11а)
--С—Ζ1Α1
А3 (Па) где
Ζ1 и Ζ2 каждый независимо является О или 8 или ΝΚΧ, предпочтительно О, где Кх является Н или низшим алкилом, таким как метил, этил или пропил, такой как н-пропил или изопропил, или С(О)-Ку, где Ку предпочтительно выбирают из группы, состоящей из СГС6 алкила и С6-С14 арила, еще более предпочтительно из группы, состоящей из необязательно замещенного, предпочтительно незамещенного метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила и трет-бутила; Кх предпочтительно является Н;
А1 и А2 каждый независимо является метилом, этилом, н-пропилом, изопропилом, н-бутилом, третбутилом, бензилом, 1,1,1-трихлорэтилом, нитробензилом, метоксибензилом, этоксибензилом или образуют цикл по формуле (11Ь)
С---Ζ1Α1 (ПЬ) где А1 и А2, взятые вместе, являются -(СН2)2- или -(СН-2)3- или -(СН2СН(СН3))- и где
А3 является Н или метилом, этилом, н-пропилом, изопропилом, н-бутилом, изобутилом, пентилом, бензилом или образует цикл с атомом N аминогруппы М или с подходящим атомом, входящим в Б.
Предпочтительно по крайней мере один из Ζ1 и Ζ2 является О, предпочтительно оба - и Ζ1 и Ζ2 представлены О.
Что касается остатка А3, в соответствии с изобретением предпочтительны ацетальные группы, т.е. А3 предпочтительно является Н.
Если А является кетальной группой, предпочтительно, чтобы А3 было метилом. Поэтому возможными кетальными группами А по настоящему изобретению являются среди других
- 8 018222
Если, например, А3 образует цикл с атомом N аминогруппы М или с подходящим атомом, входящим в Ь, возможными сшивающими соединениями по настоящему изобретения являются, например,
Особо предпочтительным сшивающим соединением по настоящему изобретению является
т.е. аминогруппа М является вторичным амином, и Ζ1 и Ζ2 являются О, а Л! и А2, вместе взятые, являются -(СН2)2-.
В соответствии с предпочтительным осуществлением каждый из Л! и А2 является метилом или этилом, более предпочтительно этилом. Поэтому особо предпочтительной ацетальной группой А по изобретению является -СН(ОСН3)2 или -СН(ОС2Н5)2, в особенности -СН(ОС2Н5)2.
В соответствии с еще одним осуществлением изобретения, где Αΐ и А2 образуют цикл по формуле (ИЬ), Α1 и А2, взятые вместе, предпочтительно являются -(СН2)2-. Что касается данного варианта осуществления изобретения, особо предпочтительными ацетальными группами А согласно изобретению являются
Аминогруппа М
В отношении аминогруппы М не существует каких-либо специальных ограничений с той оговоркой, что аминогруппа может реагировать либо с окисленной, либо с неокисленной редуцирующей концевой группой, т.е. посредством атома углерода С* редуцирующего конечного сахаридного звена ΗΑ8, предпочтительно ΗΕ8 в неокисленном состоянии, т.е. как полуацеталь или как свободная альдегидная группа, или в окисленном состоянии, т.е. как лактон или свободная карбоксильная группа. Термин аминогруппа применительно к данной заявке также включает подходящие соли аминогруппы, такие как, например, протонированные аминогруппы с фармацевтически приемлемым анионом, например хлорид, сульфат водорода, сульфат, карбонат, карбонат водорода, цитрат, фосфат или фосфат водорода.
Предпочтительно, если аминогруппа сшивающего соединения М-Ь-Α по настоящему изобретению является группой формулы (11с)
К'--N—Υ-Н где Υ либо отсутствует, либо является химической структурой, выбранной из группы, состоящей из
где О является О или 8 или ΝΗ, а, если представлен дважды, каждый О является независимо О или 8 или ΝΗ, причем О предпочтительно представлен О, и где В' является Н или гидроксильной группой или органическим остатком, выбранным из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила, замещенного арила, арилалкила, замещенного арилалкила, алкиларила и замещенного алкиларила. В данном контексте термин алкил относится к неразветвленным алкильным остаткам, разветвленным алкильным остаткам и циклоалкильным остаткам. Предпочтительно, чтобы каждый из этих органических остатков имел от 1 до 10 атомов углерода. В качестве возможных заместителей можно упомянуть галогены, такие как Е, С1 или Вг. Предпочтительно, чтобы органические остатки были незамещенными углеводородами.
Если В' является гидроксильной группой, предпочтительной аминогруппой по настоящему изобретению является ΗΟ-ΝΗ-, т.е. Υ отсутствует.
В случае если В' является органическим остатком, желательно, чтобы В' выбирали из группы, состоящей из алкила и замещенного алкила, причем особо предпочтителен алкильный остаток. Еще более
- 9 018222 предпочтительно, если необязательно замещенный алкильный остаток имеет от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 6, еще более предпочтительно от 1 до 4, например 1, 2, 3, или 4 атома углерода. Таким образом, предпочтительными органическими остатками по настоящему изобретению являются метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил. В соответствии с особо предпочтительным осуществлением органический остаток К' является метилом или этилом, в особенности метилом.
Поэтому, если К' является органическим остатком, предпочтительными аминогруппами в соответствии с изобретением являются, например, Η3Ο-ΟΗ2-ΝΗ-, Η3Ο-ΝΗ-, Η5Ο6-ΝΗ-, Η3Ο-ΟΗ2-ΝΗ-Ο-, Η3Ο-ΝΗΟ-, Η5Ο6-ΝΗ-Ο-, причем особо предпочтительными являются Η3Ο-ΝΗ-, Η5Ο6-ΝΗ- и Η3Ο-ΝΗ-Ο-.
В соответствии с изобретением К' может не быть отдельными остатком, а образовывать циклическую структуру с подходящим атомом, входящим в состав Ь, или с остатком А3 группы А сшивающего соединения. Эти структуры также входят в вышеприведенное определение термина алкил по отношению к К'. Например, К' может образовывать циклическую структуру с остатком А3 группы А сшивающего соединения, причем А является кетальной группой. Возможными сшивающими соединениями могут быть, например
В этом случае особо предпочтительным сшивающим соединением в соответствии с изобретением является
т.е. аминогруппа М является вторичным амином, и Ζ1 и Ζ2 представлены О, а А1 и Аг, взятые вместе, представляют собой -(СН2)2-.
В предпочтительном осуществлении изобретения К' представлено Η. Таким образом, предпочти тельными аминогруппами М являются
Η2Ν-
Θ
НА °
Ν-8—
Н II о н
/Ν. .(А Ηχ γ о
где О представлено О или 8, и, если присутствуют в двойном количестве, являются независимо О или 8, причем О предпочтительно.
Если К' представлено, особо предпочтительными аминогруппами М по настоящему изобретению являются Η2Ν-, Η2Ν-Ο- и Η2Ν-ΝΗ-(Ο=Ο)-.
Следовательно, настоящее изобретение относится также к упомянутым выше способу и производным, где аминогруппой М являются Η2Ν-, Η2Ν-Ο-, Η2Ν-ΝΗ-(Ο=Ο)-, И3С-\И- или IЬС-ΧΠ-Ο-, предпочтительно Η2Ν-, Η2Ν-Ο- или ΗΝ-ΝΗ^ΟΟ)-.
Спейсер Е
В соответствии с настоящим изобретением функциональные группы М и А сшивающего соединения разделены подходящим спейсером. Применительно к данной заявке термин спейсер относится к любой подходящей химической структуре, соединяющей М и А.
В целом нет каких-либо специальных ограничений относительно химической природы спейсера Ь при условии, что Ь имеет, в частности, химические свойства, позволяющие осуществление предлагаемого в изобретении способа получения новых производных и обеспечивающие нужные химическое свойст ва для новых производных с точки зрения их предполагаемого использования.
В соответствии с предпочтительным осуществлением изобретения Ь, соединяющий М и А, является спейсером, включающим по крайней мере одно структурное звено формулы (ΙΙά)
где Π и Ь2 независимо друг от друга представлены Н или органическим остатком, выбираемым из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, заме
- 10 018222 щенного алкинила, арила, замещенного арила, арилалкила, замещенного арилалкила, алкиларила, замещенного алкиларила и остатков -Ο-Κ, где Κ выбирается из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила, замещенного арила, арилалкила, замещенного арилалкила, алкиларила, замещенного алкиларила.
В данном контексте термин алкил относится к неразветвленным алкильным остаткам, разветвленным алкильным остатками и циклоалкильным остаткам. В качестве предпочтительных заместителей можно упомянуть галогены, такие как Г, С1 и Вг.
Предпочтительно, чтобы и Ь2 были независимо друг от друга представлены Н или органическим остатком, выбранным из группы, состоящей из алкила и замещенного алкила; более предпочтительно чтобы Ь1 и Ь2 независимо друг от друга были представлены Н или алкилом; еще более предпочтительно, чтобы и Ь1 и Ь2 были представлены Н.
Если Ь1 и Ь2 являются органическими остатками, предпочтительно, чтобы каждый из Ь1 и Ь2 мог независимо друг от друга содержать от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10, еще более предпочтительно от 1 до 8, еще более предпочтительно от 1 до 6, еще более предпочтительно от 1 до 4 атома углерода. Особо предпочтительными являются остатки Ь1 и Ь2, такие как необязательно замещенные, предпочтительно незамещенные метальные, этильные, н-пропильные, изопропильные, н-бутильные, изобутильные, трет-бутильные остатки. В соответствии с изобретением Ь1 может быть Н, а Ь2 может быть органическим остатком, как описано выше.
Что касается целого числа п, оно составляет предпочтительно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 4, еще более предпочтительно 2.
Если целое число п больше 1, группы (СЬ1Ь2) могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения группы (СЬ1Ь2), непосредственно связанные друг с другом, имеют одинаковое строение.
В соответствии с предпочтительным осуществлением изобретения спейсер Ь состоит из структурного звена в соответствии с формулой (Πά), где Ь1 и Ь2 соответствуют вышеописанному. Более предпочтительно, если целое число п составляет от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Еще более предпочтительно, если каждая группа (СЬ1Ь2) является (СН2), так что спей-
где п является целым от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Еще более предпочтительно, если п находится в диапазоне от 1 до 6, более предпочтительно в диапазоне от 1 до 4, например, 1, 2, 3 или 4, и в особенности 2.
Поэтому, в соответствии с особо предпочтительным осуществлением настоящего изобретения, спейсер Ь представлен -СН2-СН2-.
В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего изобретения спейсер Ь сшивающего соединения включает по крайней мере одно структурное звено формулы (Πά)
где п, Ь1 и Ь2 соответствуют определению, данному выше, предпочтительно Н
Н и где Ь также включает по крайней мере одну химическую структуру, отличную от -(СЬ1Ь2)-.
В данном контексте можно упомянуть варианты осуществления, в которых спейсер Ь состоит из структурных звеньев -(СЬ1Ь2)п- и дополнительной химической структуры Т, которая отделяет -(СЬ1Ь2)пот группы М или А. Также возможны варианты, когда спейсер Ь состоит из структурных звеньев -(СЬ1Ь2)п- и двух дополнительных химических структур Т1 и Т2, где Т1 отделяет -(СЬ1Ь2)п- от группы М, а Т2 отделяет -(СЬ1Ь2)п- от группы А. Таким образом, настоящее изобретение также охватывает варианты осуществления, в соответствии с которыми сшивающее соединение имеет одну из следующих структур:
- 11 018222
М-Т-(СЬ1Ц)П-А
М-(СЬ1Ь2)п-Т-А
М-ТНСЦЬг^-Тз-А
В отношении химических структур Т, Ц или Т2 не существует каких-либо специальных ограничений, что касается их химической природы, при условии, что Ь имеет, в частности, химические свойства, позволяющие осуществлять описываемый в изобретении способ для получения новых производных и обеспечивающие для новых производных соответствующие химические свойства, необходимые для их предполагаемого использования.
Поэтому Т, Τι и/или Т2 могут включать необязательно замещенные арильные остатки, подходящие гетероатомы, подходящие функциональные группы и т.д. Что касается функциональных групп, можно упомянуть варианты осуществления, в соответствии с которыми эти функциональные группы являются результатом получения связующих соединений, где, по крайней мере, первое соединение и, по крайней мере, второе соединение реагируют друг с другом и дают соединение М-Ь-Л.
Например, первое соединение М-Ь'-Ш1 и второе соединение Ш2-Ь-Л могут вступать в реакцию и давать связующее соединение М-Ь-Л, где -Ь- является -Ь'-Р-Ь-, а Р представляет функциональную группу, полученную посредством реакции функциональной группы Ш1 с функциональной группой Ш2 и где по крайней мере один из Ь' и Ь включает структурное звено -(СЬ1Ь2)П-. Могут быть выбраны соответствующие функциональные группы Ш1 и Ш2. Например, одну из групп Ш1 и Ш2, т.е. Ш1 или Ш2 можно выбрать из группы, состоящей из функциональных групп из следующего списка, а другая группа Ш1 или Ш2 соответствующим образом выбирается и способна образовывать химическую связь с Ш1 или Ш2, где Ш2 или Ш1 также предпочтительно выбирают из вышеуказанной группы:
двойные связи С-С или тройные связи С-С или ароматические связи С-С;
тиогруппа или гидроксильная группа;
гидразиды алкилсульфоновой кислоты, гидразиды арилсульфоновой кислоты:
1.2- диолы;
1.2- аминотиоспирты;
азиды;
1.2- аминоспирты;
аминогруппа -ΝΗ2 или производные аминогрупп, включающие структурное звено -ΝΗ-, такие как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламиногруппы;
гидроксиламиногруппа -Ο-ΝΗ2 или производные гидроксиламиногруппы, включающие структурное звено -Ο-ΝΗ-, такое как гидроксилалкиламиногруппы, гидроксилариламиногруппы, гидроксиларалкиламиногруппы или гидроксилалкариламиногруппы;
алкоксиаминогруппы, арилоксиаминогруппы, аралкилоксиаминогруппы или алкарилоксиаминогруппы, каждая из которых включает структурное звено -ΝΗ-Ο-;
остатки, имеющие карбонильную группу, -Р-С(=С)-М', где О представлено О или 8, а М' является, например, ОН или -8Η;
алкоксильной группой, арилоксильной группой, аралкилоксильной группой или алкарилоксильной группой;
алкотиогруппой, арилтиогруппой, аралкилтиогруппой или алкарилтиогруппой;
алкилкарбонилоксильной группой, арилкарбонилоксильной группой, аралкилкарбонилоксильной группой, алкарилкарбонилоксильной группой;
сложными активированными эфирами, такими как сложные эфиры гидроксиламинов, имеющие имидную структуру, как, например, Ν-гидроксисукцинимид;
-ΝΗ-ΝΗ2 или -ΝΗ-ΝΗ-;
-ΝΟ2;
нитрильная группа;
карбонильные группы, такие как альдегидная группа или кетогруппа;
карбоксильная группа;
группа -Ы=С=О или группа -Ы=С=8;
винилгалогенидная группа, такая как винилйодидная и винилбромидная группа или трифлат;
-С С-Н;
-(С=ЫП2С1)-Оалкил;
группы -(С=О)-СН2Ша1, где ΗαΙ представлен С1, Вг или I;
-№=№-802-;
дисульфидная группа, включающая структуру -8-8-;
- 12 018222 группа группа
Например, ^1 или могут быть карбоксильной группой или сложным активированным эфиром, а или ^1 могут быть аминогруппой или гидроксильной группой, так что Р, представляющий функциональную группу, получаемую в результате реакции функциональной группы 1 с функциональной группой ^2, является амидом или сложным эфиром.
Поэтому, например, сшивающее соединение, имеющее спейсер Ь, включающий кроме структурного звена -(СР1Р2)П- функциональную группу, может иметь такую, например, структуру
М-Ь'-(С=О)-НН-(СЬ1Ь2)п-А или
М-Ь'-(С=О)-О-(СЬ1Ь2)П-Л или
М-Ь’-НН-(С=О)-(СЬ1Ь2)п-А или
М-Ь'-О-(С=О)-(СР1Ь2)п-А или
М-(СЕ1Ь2)п-(С=О)-НН-Ь-А или
М-(СЬ1Ь2)п-(С=О)-О-Е-А или
Μ-(ΟΕιΕ2)η-ΝΗ-(Ό=Ο)-Ε-Α или
М-(СЕ1Е2)п-О-(С=О)-Е-А где Ь' и Ь могут включать или не включать структурное звено -(СЬ1Ь2)П-.
Среди этих структур предпочтительны сшивающие соединения, имеющие следующую структуру:
Μ-Ε'-(0=0)-ΝΗ-(ΟΕιΕ2)η-Α или
Μ-(ΟΕιΕ2)η-(Ό=Ο)-ΝΗ-Ε-Α
Также среди этих структур предпочтительны спейсеры, где Ь'и Ь, если они имеются, содержат структурное звено -(СЬ1Ь2)П-. В этих случаях еще более предпочтительно, чтобы η находился в диапазоне от 1 до 4, более предпочтительно в диапазоне от 1 до 3, например 1, 2 или 3. Если данный спейсер содержит, например, два структурных звена -(СЬ1Ь2)П-, индекс η каждого структурного звена может быть одинаковым или разным.
Поэтому предпочтительны сшивающие вещества, имеющие следующее структуру:
М-(СЕ1Е2)п-(С=О)-НН-(СЕ1Е2)п-А где каждый из η находится независимо друг от друга в диапазоне от 1 до 4, более предпочтительно в диапазоне от 1 до 3, например 1, 2 или 3. Соответственно предпочтительные спейсеры I. имеют структуру
-(СЕ^МС^-НЩСЕ^пТаким образом, особо предпочтительными сшивающими соединениями, содержащими -(С=О)-НН-, являются
- 13 018222
Более предпочтительными сшивающими соединениями, содержащими -(£=Ο)-ΝΗ-, являются
М-(СЬ1Ь2)з-(С=О)-НН-(СЬ]Ь2)2-А или
М-(СЕ1Б2)2-(С=О)-МН-(СЬ1Ь2)2-А
Еще более предпочтительно, если и Ь1 и Б2 представлены Н. Таким образом, особо предпочтительными являются сшивающие соединения, имеющие следующее строение:
Наиболее предпочтительными являются сшивающие соединения, имеющие следующую структуру:
Например, предпочтительными сшивающими соединениями по настоящему изобретению являются
- 14 018222
Также в качестве примера и с целъю иллюстрации вышеописанных структур возможным сшивающим соединением в контексте данного изобретения может бытъ
В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения спейсер Ь может включатъ более одного структурного звена -(СЬ1Ь2)п-, где эти структурные звенъя могут бытъ одинаковыми или разными, т.е. структура может различатъся в η и/или Ц и/или Ь2, где по крайней мере два таких структурных звена могут бытъ разделены гетероатомом, таким как О или δ. Предпочтителъно в данном варианте, чтобы спейсер Ь включал по крайней мере одно структурное звено -(СЬ1Ь2)п1-О-(СЬ1Ь2)п2-, предпочтителъно -(СН2)П1-О-(СН2)п2, где п1 равно или отличается от п2 и где спейсер Ь связан посредством -(СЬ1Ь2)п1- с аминогруппой М сшивающего соединения, т.е. сшивающее соединение имеет следующую подструктуру:
М-(СЬ1Ь2)П1-О-(СЬ1Ь2)п2В соответствии с предпочтителъным возможным вариантом осуществления можно упомянутъ такие структуры спейсера, как
-((СЬ1Ь2)п1-О)т-(СЬ1Ь2)П2где т является целым числом от 1 до 20, предпочтителъно от 1 до 10, более предпочтителъно от 1 до 6, например 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Особо предпочтителъно, если т равно 1, 2 или 3, более предпочтителъно 2 или 3. Предпочтителъно, чтобы п1 составляло от 2 до 4, более предпочтителъно 2. Предпочтителъно, чтобы п2 составляло от 1 до 4, более предпочтителъно 1 или 2. Поэтому предпочтителъными структурами могут бытъ, например, и более предпочтителъно
-((СН2)2-О)га-СН2Также для примера и с целъю иллюстрации вышеописанных структур предпочтителъным сшивающим соединением, исполъзуемым применителъно к данному изобретению, является
В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения группа М и группа А могут разделятъся двумя подходящими химическими структурами, причем по крайней мере одна их них должна включатъ -(СЬ1Ь2)п-, так чтобы атом N группы М и атом С кеталъной группы А образовывали цикл. Предпочтителъный вариант осуществления был уже представлен выше и имеет структуру
Особо предпочтителъными сшивающими соединениями по настоящему изобретению являются соединения, имеющие в качестве группы М группу Η2Ν- или группу Η2Ν-Ο- или группу Н2Ы-ПН-(С=О)-, особо предпочтителъно группу Η2Ν- и в качестве группы А предпочтителъно ацеталъную группу, имеющую структуру
- 15 018222 ζ2α2 —с—ΖΛ
Η где более предпочтительно, чтобы Ь1 и Ь2 были представлены О и еще более предпочтительно, чтобы Л! и А2 были оба этилом. Еще более предпочтительно, чтобы спейсер Ь состоял из структурного звена -(С1.|1.2)„-. где I.; и Ь2 были бы предпочтительно представлены Н, а целое число η еще более предпочтительно было бы от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 6, еще более предпочтительно от 1 до 4 и еще более предпочтительно 2.
В связи с этим предпочтительными сшивающими соединениями в соответствии с настоящим изобретением являются, например,
- 16 018222
- 17 018222
Еще более предпочтительно, если сшивающие соединения выбираются из группы, состоящей из структур (а2), (а4), (а11), (а12), (а14), (а16) и (а18). Более предпочтительно, если сшивающие соединения выбираются из группы, состоящей из структур (а2), (а11), (а12), (а14), (а16) и (а18). В частности, сшивающие соединения выбираются из группы, состоящей из структур (а2), (а11), (а12) и (а16).
- 18 018222
Особо предпочтительным сшивающим соединением М-к-А является 1-амино-3,3-диэтоксипропан,
Например, возможными аминоацетальными сшивающими соединениям в соответствии с настоящим изобретением являются
Например, возможными аминокетальными сшивающими соединениями в соответствии с настоящим изобретением являются:
- 19 018222
- 20 018222
Производное гидроксиалкилкрахмала
Таким образом, изобретение относится к производному гидроксиалкилкрахмала (ΗΑ8), которое может быть получено или которое получают вышеописанным способом.
Кроме того, изобретение относится к производному ΗΑ8 формулы (III)
- 21 018222
где А является ацетальной или кетальной группой;
Ь является спейсером, соединяющим X и А;
где X является функциональной группой, полученной в результате реакции аминогруппы М сшивающего соединения формулы (II)
М--Ь--А
посредством атома углерода С* ΗΑ8, где С* необязательно окислен до реакции ΗΑ8 с М, где ΗΑ8' является остатком молекулы гидроксиалкилкрахмала, а К15 К2 и К3 являются независимо друг от друга водородом или гидроксиалкильной группой с линейной или разветвленной цепью.
Что касается предпочтительных вариантов осуществления в отношении ΗΑ8, особенно ΗΕ8, Е, А, К15 К2 и К3, конкретная ссылка делается на вышеописанные варианты осуществления.
Кроме того, настоящее изобретение относится к вышеописанным производным ΗΑ8, где К15 К2 и К3 являются независимо друг от друга группой -(С112С112Ο)η-Ι I, где η является целым числом, предпочтительно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Кроме того, настоящее изобретение относится к вышеописанным производным ΗΑ8, где гидроксиалкилкрахмал является гидроксиэтилкрахмалом (ΗΕ8).
Кроме того, настоящее изобретение относится к вышеописанному производному, где А является остатком в соответствии с формулой (11а)
--С—Ζ,Α
А (Па) где
Ζ1 и Ζ2 независимо друг от друга являются О или 8 или ΝΗχ, предпочтительно О, где Кх является Н или низшим алкилом, таким как метил, этил или пропил, предпочтительно Н;
А1 и А2 независимо друг от друга являются метилом, этилом, н-пропилом, изопропилом, н-бутилом, трет-бутилом, бензилом, 1,1,1-трихлорэтилом, нитробензилом, метоксибензилом, этоксибензилом или образуют цикл в соответствии с формулой (ПЬ) ^2А2^
----С---Ζ1Α1
Д 3 (ПЬ) где А1 и А2, взятые вместе, являются -(СН2)2- или -(СН2)3- или -(СН2СН(СН3))-, и где А3 является Н или метилом, этилом, н-пропилом, изопропилом, н-бутилом, изобутилом, пентилом, бензилом или образуют цикл с атомом Ν аминогруппы М или с соответствующим атомом, входящим в Е, причем А3 предпочтительно является Н.
Точная химическая природа группы X производного ΗΑ8, описываемого в изобретении, зависит от соответствующей химической природы группы М, от окислительного состояния атома углерода С* редуцирующей концевой группы ΗΑ8 и от условий реакции, таких как растворитель, температура и т.д., используемых для реакции. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, в которых атом углерода С* используется в окисленном и неокисленном состоянии, далее детально обсуждаются конкретные и предпочтительные примеры.
- 22 018222
Что касается X, настоящее изобретение предпочтительно относится к вышеописанному производному НА8, где X выбирается из группы, состоящей из -СН=№, -СНг-ΝΗ-, -СН=№О-, -СНг-ΝΗ-Ο-, -С(=О)-ХН-, -С(=О)-ХН-ХН-, -СН=№ХН-(С=О)-, -СН2-ХН-ХН-(С=О)-, предпочтительно состоящей из -СН2-КН-, -СН=^, -СН=^О-, -СН2-№-О-, -СН=^т-(С=О)- и -СН2-^-^-(С=О)-, еще более предпочтительно состоящей из -СЩ-ΝΉ-, -СН=№, -СН=№О- и -СН2-ХН-О-.
Для некоторых вариантов осуществления группы X возможно, что конечное сахаридное звено НА8, присутствующее в производном НА8, присутствует в циклической структуре, которая может находиться в равновесии с открытой структурой в соответствии с вышеприведенной формулой (III), причем циклическая структура и открытая структура имеют определенное равновесное распределение. В этих случаях и для целей настоящего изобретения вышеприведенная формула (III) включает открытую структуру, а также циклическую структуру и формула (III) не ограничивает производное НА8 открытой структурой. Для конкретных и предпочтительных примеров, которые детально обсуждаются далее, в некоторых случаях показана циклическая структура.
Настоящее изобретение также относится к вышеописанному производному НА8, где Ь, соединяющий М и А, является спейсером, включающим по крайней мере одно структурное звено в соответствии с формулой (ТИ), предпочтительно состоящее из структурного звена в соответствии с формулой (Πά) (Πά) где Ь1 и Ь2 независимо друг от друга являются Н или органическим остатком, выбранным из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила, замещенного арила, арилалкила, замещенного арилалкила, алкиларила, замещенного алкиларила и остатков -О-К, где К выбрано из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила, замещенного арила, арилалкила, замещенного арилалкила, алкиларила, замещенного алкиларила; предпочтительно Н или органическим остатком, выбранным из группы, состоящей из алкила и замещенного алкила; более предпочтительно Н или алкилом; более предпочтительно Н, где η является целым числом от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 6, еще более предпочтительно от 1 до 4, более предпочтительно 2.
Необязательно окисленная редуцирующая концевая группа НА8, предпочтительно НЕ8
В соответствии с изобретением, НА8, предпочтительно НЕ8 может реагировать посредством атома С* конечной редуцирующей группы крахмала с аминогруппой М сшивающего соединения, где С* необязательно окислен до реакции НА8 с М.
Термин НА8 реагирует посредством редуцирующей концевой группы или НА8 реагирует посредством атома углерода С* конечной редуцирующей группы применительно к данному изобретению может относиться к процессу, в соответствии с которым НА8 реагирует преимущественно посредством своей (необязательно селективно окисленной) редуцирующей концевой группы.
Термин преимущественно посредством своей (необязательно селективно окисленной) редуцирующей концевой группы относится к процессам, в соответствии с которыми статистически более 50%, предпочтительно не менее 55%, более предпочтительно не менее 60%, более предпочтительно не менее 65%, более предпочтительно не менее 70%, более предпочтительно не менее 75%, более предпочтительно не менее 80%, более предпочтительно не менее 85%, более предпочтительно не менее 90% и еще более предпочтительно не менее 95%, например 95, 96, 97, 98 или 99% молекул НА8, используемых для данной реакции, реагируют посредством по крайней мере одной (необязательно селективно окисленной) редуцирующей концевой группы на одну молекулу НА8, где данная молекула НА8, которая реагирует посредством по крайней мере одной (необязательно селективно окисленной) редуцирующей концевой группы, может реагировать в той же самой реакции посредством по крайней мере одной другой подходящей функциональной группы, входящей в данную молекулу полимера и не являющейся редуцирующей концевой группой. Если одна или более молекул НА8 реагируют посредством по крайней мере одной (необязательно селективно окисленной) редуцирующей концевой группы и одновременно посредством по крайней мере еще одной подходящей функциональной группы, включенной в эту(эти) молекулу (молекулы) НА8 и не являющейся (необязательно селективно окисленной) редуцирующей концевой группой, статистически предпочтительно более 50%, предпочтительно не менее 55%, более предпочтительно не менее 60%, более предпочтительно не менее 65%, более предпочтительно не менее 70%, более предпочтительно не менее 75%, более предпочтительно не менее 80%, предпочтительнее не менее 85%, более предпочтительно не менее 90% и еще более предпочтительно не менее 95%, например 95, 96, 97, 98 или 99% всех прореагировавших функциональных групп этих молекул НА8, включающих (необязательно селективно окисленные) редуцирующие концевые группы, являются (селективно окисленными) редуцирующими концевыми группами.
- 23 018222
Применительно к данному изобретению термин редуцирующая концевая группа относится к концевой альдегидной группе молекулы НА8, которая может присутствовать как альдегидная группа и/или соответствующая полуацетальная форма и/или как ацетальная группа, причем ацетальная группа имеет следующую структуру:
которая может присутствовать, если остатком -ОК3 по вышеприведенной формуле (I) является -ОСН2-СН2-ОН.
В случае если редуцирующая концевая группа окислена, окисленная редуцирующая концевая группа имеет форму карбоксильной группы и/или соответствующего лактона.
Окисленная редуцирующая концевая группа
Таким образом, в соответствии с первым вариантом осуществления настоящего изобретения сшивающее соединение реагирует посредством аминогруппы с окисленным атомом С* концевой редуцирующей группы НА8, предпочтительно НЕ8.
Хотя окисление может осуществляться любым соответствующим способом или способами, приводящими к окислению редуцирующей концевой группы гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно, если оно выполняется с использованием щелочного раствора йода, как описано в 8оттегтеуег еТ а1., И8 6083909, стр. 5, строки 63-67 и стр. 7, строки 25-39; стр. 8, строка 53, стр. 9, строка 20. Соответствующее содержание инкорпорировано в настоящее изобретение на правах ссылки.
Селективное окисление НА8, предпочтительно НЕ8 приводит к тому, что НА8, предпочтительно НЕ8, является лактоном.
и/или карбоновой кислотой
или соответствующей солью карбоновой кислоты, такой как соль щелочного металла, предпочтительно соль натрия и/или калия, а НА8 предпочтительно является НЕ8'.
В соответствии с первым вариантом изобретения эта форма НА8, предпочтительно НЕ8 как таковая реагирует с аминогруппой М сшивающего соединения.
В соответствии со вторым вариантом изобретения НА8, предпочтительно НЕ8, селективно окисленный на редуцирующей концевой группе, сначала реагирует с подходящим соединением для получения НА8, предпочтительно НЕ8, включающего реакционноспособную карбоксильную группу.
Введение реакционноспособной карбоксильной группы в НА8, селективно окисленный на редуцирующей концевой группе, может выполняться всеми возможными способами и соединениями.
В соответствии с конкретным способом по настоящему изобретению НА8, селективно окисленный на редуцирующей концевой группе, реагирует на окисленном редуцирующей концевой группе по крайней мере с одним спиртом, предпочтительно по крайней мере одним кислотным спиртом, таким как кислотные спирты, имеющие значение рКА в диапазоне от 6 до 12 или от 7 до 11 при температуре 25°С. Молекулярная масса кислотного спирта может быть в диапазоне от 80 до 500 г/моль, например от 90 до 300 г/моль или от 100 до 200 г/моль.
Подходящими кислотными спиртами являются все спирты Н-О-КА, имеющие кислотный протон и способные реагировать с окисленным НА8 с получением соответствующего реакционноспособного сложного эфира НА8, предпочтительно в соответствии с формулой
- 24 018222
еще более предпочтительно в соответствии с формулой
Предпочтительными спиртами являются Ν-гидроксисукцинимиды, такие как Νгидроксисукцинимид или сульфо-^гидроксисукцинимид, соответствующим образом замещенные фенолы, такие как р-нитрофенол, о,р-динитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,6трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,6-трифторфенол или 2,4,5трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол или гидроксиазолы, такие как гидроксибензотриазол. Особо предпочтительными являются Ν-гидроксисукцинимиды, причем наиболее предпочтительны Νгидроксисукцинимид и сульфо-^гидроксисукцинимид. Все спирты могут использоваться отдельно или как соответствующее сочетание одного их них или более. В контексте настоящего изобретения возможно также использовать соединение, которое выделяет соответствующий спирт, например, при добавлении диэфиров карбоновой кислоты.
Поэтому настоящее изобретение также относится к вышеописанному способу, где НА8, селективно окисленный на редуцирующей концевой группе, активируется реакцией окисленного НА8 с кислотным спиртом, предпочтительно с Ν-гидроксисукцинимидом и/или сульфо^-гидроксисукцинимидом.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения НА8, селективно окисленный на редуцирующей концевой группе, реагирует на окисленной редуцирующей концевой группе по крайней мере с одним диэфиром карбоновой кислоты КВ-О-(С=О)-О-Кс, где КВ и Кс могут быть одинаковыми и разными. Этот метод предпочтительно дает реакционноспособный НА8 формулы:
где НА8' предпочтительно является НЕ8'.
В качестве карбоновых диэфиров могут использоваться соединения, спиртовые составляющие которых независимо друг от друга являются Ν-гидроксисукцинимидами, такими как Νгидроксисукцинимид или сульфо-^гидроксисукцинимид, соответствующим образом замещенные фенолами, такими как р-нитрофенол, о,р-динитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,6трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,6-трифторфенол или 2,4,5трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол или гидроазолами, такими как гидроксибензотриазол. Особо предпочтительны Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат и сульфо-^№-дисукцинимидилкарбонат, причем наиболее предпочтительным является Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат.
В связи с этим настоящее изобретение также относится с вышеописанному способу, где НА8, селективно окисленный на редуцирующей концевой группе, активирован реакцией окисленного НА8 с Ν,Ν' -дисукцинимидилкарбонатом.
Кислотый спирт реагирует с окисленным НА8 или солью окисленного НА8 при молярном соотношении кислотного спирта и НА8 предпочтительно от 5:1 до 50:1, более предпочтительно от 8:1 до 20:1, при предпочтительной температуре реакции от 2 до 40°С, более предпочтительно от 10 до 30°С и особо предпочтительно от 15 до 25°С. Время реакции предпочтительно находится в диапазоне от 1 до 10 ч, более предпочтительно от 2 до 5 ч, еще более предпочтительно от 2 до 4 ч и особо предпочтительно от 2 до 3 ч.
Диэфир карбоновой кислоты реагирует с окисленным НА8 или солью окисленного НА8 при молярном соотношении диэфира и НА8, обычно составляющем от 1:1 до 3:1, например, от 1:1 до 1,5:1. Время реакции обычно находится в диапазоне от 0,1 до 12 ч, например от 0,2 до 6 ч, или от 0,5 до 2 ч или
- 25 018222 от 0,75 до 1,25 ч.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения реакция окисленного НА8 с кислотным спиртом и/или диэфиром карбоновой кислоты осуществляется по крайней мере в одном апротонном растворителе, таком как безводный апротонный растворитель с содержанием воды не более 0,5 мас.%, предпочтительно не более 0,1 мас.%. Подходящими растворителями являются, среди прочих, диметилсульфоксид (ЭМ8О), Ν-метилпирролидон, диметилацетамид (ЭМА), диметилформамид (ЭМР) и смеси двух из них или более. Температуры реакции находятся предпочтительно в диапазоне от 2 до 40°С, более предпочтительно от 10 до 30°С.
Для реакции окисленного НА8 по крайней мере с одним кислотным спиртом используется по крайней мере один дополнительный активирующий агент.
Подходящими активирующими агентами являются, среди прочих, карбонилдиимидазол, карбодиимиды, такие как диизопропилкарбодиимид (Э1С), дициклогексилкарбодиимиды (ЭСС), 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимид (ЭС), причем наиболее предпочтительны дициклогексилкарбодиимид (ЭСС) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид (ЕЭС).
В связи с этим настоящее изобретение также относится к вышеописанному способу, где НА8, окисленный на редуцирующей концевой группе, реагирует с кислотным спиртом в присутствии дополнительного активирующего агента с получением реакционноспособного сложного эфира НА8.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения реакция окисленного НА8 с диэфиром карбоновой кислоты и/или кислотным спиртом осуществляется при низкой активности основания, что можно установить, добавляя реакционную смесь в воду с объемным соотношением воды и реакционной смеси 10:1. Перед добавлением вода, в основном не содержащая никакого буфера, имеет значение рН, равное 7 при 25°С. После добавления реакционной смеси и измерения рН получают активность основания реакционной смеси, имеющую предпочтительно значение не более 9,0, более предпочтительно не более 8,0 и особо предпочтительно не более 7,5.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения окисленный НА8 вступает в реакцию с Ν-гидроксисукцинимидом в сухом ЭМА в отсутствие воды с ЕЭС и селективно дает сложный эфир Ν-гидроксискуцинимида в соответствии с формулой
О причем более предпочтительно, чтобы НА8' был НЕ8'.
Эта реакция не дает побочных продуктов, являющихся результатом реакции ЕЭС с группами ОН НЕ8, и реакция перегруппировки О-ацилизомочевины, образованной ЕЭС и окисленным НА8, в соответствующую Ν-ацилмочевину подавляется.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения окисленный НА8 вступает в реакцию с Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонатом в сухом ЭМЕ в отсутствие воды и в отсутствие активирующего агента и селективно дает сложный эфир НА8-№гидроксисукцинимида в соответствии с формулой
причем НА8' предпочтительно является НЕ8'.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения НА8, селективно окисленный на редуцирующей концевой группе, реагирует на окисленном редуцирующей концевой группе с азолидом, таким как карбонилдиимидазол или карбонилдибензимидазол с получением полимера, имеющего реакционноспособную карбоксильную группу. В случае карбонилдиимидазола в результате получают реакционноспособное производное имидазолид НА8 в соответствии с формулой
- 26 018222
где НА8' является преимущественно НЕ8'.
Реакционноспособное производное НА8, включающее по крайней мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, предпочтительно полученную, как описано выше, реакцией НА8 с кислотным спиртом, карбонатом и/или азолидом, затем реагирует с аминогруппой М сшивающего соединения М.
Реакция НА8 посредством окисленной редуцирующей концевой группы, необязательно далее активированной, как описано выше, аминогруппой М может осуществляться любыми подходящими способами. Аминогруппа М предпочтительно является первичной аминогруппой Н2К- или вторичной аминогруппой.
Обычно используются предпочтительно полярные апротонные растворители, которые могут также содержать определенное количество воды, например, до 10 мас.%. Предпочтительными используемыми апротонными растворителями являются среди прочих ΏΜ8Θ или ΏΜΕ.
Примером предпочтительного диапазона температуры реакции является 0-80°С, более предпочтительно 0-70°С, еще более предпочтительно 0-60°С, еще более предпочтительно 0-50°С и еще более предпочтительно 0-40°С.
Если для реакции с НА8, имеющим редуцирующую концевую группы в окисленной форме, используются сшивающие соединения, которые в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления имеют IΕΝ- в качестве аминогруппы М, производное НА8 получают на стадии (ΐ) изобретения, где НА8 и сшивающее соединение, используемые как исходные материалы, связаны посредством амидной связи, где полученное производное НА8 также содержит ацетальную или кетогруппу А.
В связи с этим изобретение также относится к вышеописанному способу, где на стадии (ΐ) НА8 реагирует посредством своей окисленной редуцирующей концевой группы с аминогруппой М сшивающего соединения, причем М является IΕΝ-, где реакция протекает при температуре в диапазоне от 0 до 80°С и где X является -(С=О)^Н-.
Соответственно изобретение также относится к производному НА8, которое можно получить или которое получают вышеописанным способом.
Кроме того, изобретение также относится к производному НА8 как к таковому, имеющему следующую структуру
ОК, | |||
И / 1 | |||
НА8Ч | \ Н | -ОН | |
^0^ 1 | К' | ||
С-м-Ь-А | |||
н | ок3 | II 0 | |
н |
где К' является Н, если аминогруппа М сшивающего соединения является первичной аминогруппой и где К' является химической структурой, отличной от Н, если аминогруппа М сшивающего соединения является вторичной аминогруппой. Точная химическая природа К' зависит от сшивающего соединения и, таким образом, ссылка делается на вышеприведенное рассмотрение возможных в целом и предпочтительно используемых сшивающих соединений.
В соответствии с вышеописанными предпочтительными сшивающими соединениями, используемыми в целях данного изобретения, для примера можно упомянуть как предпочтительные следующие производные НА8, где в каждом случае НА8 является НЕ8 в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления изобретения:
- 27 018222
- 28 018222
- 29 018222
Более предпочтительны производные НА8, основанные для сшивающих соединений, выбранных из группы, состоящей из структур (а2), (а4), (а11), (а12), (а14), (а16) и (а18). Еще более предпочтительны производные НА8, основанные для сшивающих соединений, выбранных из группы, состоящей из структур (а2), (а11), (а12), (а14), (а16) и (а18). Особо предпочтительны производные НА8, основанные на сшивающих соединениях, выбранных из группы, состоящей из структур (а2), (а11), (а12) и (а16).
В соответствии с особо предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к производному НЕ8, имеющему следующую структуру:
где еще более предпочтительно НЕ8 имеет среднюю молекулярную массу от примерно 1 до примерно 1000 кД, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 800 кД, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 500 кД, более предпочтительно от примерно 2 до примерно 400 кД, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 300 кД, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 200 кД, в особенности, от примерно 50 до примерно 150 кД, молярное замещение от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,4 до 1,3, такое как 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1,1,2 или 1,3, и соотношение замещения С2: С6 предпочтительно в диапазоне от 2 до 20, более предпочтительно в диапазоне от 2 до 15 и еще более предпочтительно в диапазоне от 3 до 12.
Неокисленная редуцирующая концевая группа
В соответствии со вторым и предпочтительным вариантом осуществления изобретения сшивающее
- 31 018222 соединение реагирует посредством аминогруппы с неокисленным атомом С* терминального редуцирующего конца ΗΑ8. предпочтительно ΗΕ8, т.е. концевая альдегидная группа молекулы ΗΑ8 может быть представлена альдегидной группой и/или соответствующей полуацетальной формой.
Реакция ΗΑ8 посредством неокисленной редуцирующей концевой группы с аминогруппой М может осуществляться всеми подходящими способами. Предпочтительно аминогруппа М представлена Η2Ν-, соответствующей вторичной группой ΗΝΒ'-, такой как, например, Η3ί'.'-ΝΗ- Η2Ν-Ο-, или подходящей вторичной гидроксиаминогруппой ΗΝΒ'-Ο-, такой как, например, НзС-ΝΗ-Ο- или Η2Ν-ΝΗ-(Ό=Ο)-.
Аминогруппа М предпочтительно представлена Η2Ν-, Η2Ν-Ο- или Η2Ν-ΝΗ-(Ό=Ο)-, еще более предпочтительно Η2Ν- или Η2Ν-Ο- и, в частности, Η2Ν-.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения эта реакция проводится в водной среде. Применительно к данному тексту термин водная среда относится к растворителю или смеси растворителей, включая воду, в диапазоне от не менее 10 мас.%, предпочтительно не менее 50 мас.%, более предпочтительно не менее 80 мас.%, еще более предпочтительно не менее от 90 до 100 мас.%, исходя из массы используемых растворителей. В качестве дополнительных растворителей можно упомянуть такие, как ΌΜ8Ο, ΌΜΕ, этанол или метанол.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, если ΗΑ8 вступает в реакцию со сшивающим соединением в водной среде, а аминогруппой М сшивающего соединения является гидроксиламин или гидразид, температура реакции находится предпочтительно в диапазоне от 5 до 45°С, более предпочтительно в диапазоне от 10 до 30°С и особо предпочтительно в диапазоне от 15 до 25°С.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, если ΗΑ8 вступает в реакцию со сшивающим соединением в водной среде, аминогруппой М сшивающего соединения является группа Η2Ν- или Β'ΗΝ-, а реакция является реакцией восстановительного аминирования, температура находится предпочтительно в диапазоне до 100°С, более предпочтительно в диапазоне от 10 до 90°С, еще более предпочтительно в диапазоне от 20 до 80°С, более предпочтительно в диапазоне от 30 до 70°С и особо предпочтительно в диапазоне от 40 до 60°С.
В ходе реакции температура может изменяться предпочтительно в вышеуказанных пределах или оставаться в основном постоянной.
Время реакции ΗΑ8 со сшивающим соединением М может быть отрегулировано в зависимости от конкретных потребностей и обычно находится в диапазоне от 1 ч до 7 дней. В случае, например, если аминогруппа М является гидроксиламином или гидразидом, время реакции предпочтительно находится в диапазоне от 1 ч до 3 дней, более предпочтительно от 2 до 48 ч и особо предпочтительно от 3 до 24 ч.
В том случае, например, если реакция ΗΑ8 со сшивающим соединением является реакцией восстановительного аминирования, время реакции предпочтительно находится в диапазоне от 1 ч до 4 дней, более предпочтительно в диапазоне от 4 ч до 6 дней, еще более предпочтительно в диапазоне от 8 ч до 5 дней и еще более предпочтительно в диапазоне от 16 ч до 3 дней.
Значение рН для реакции ΗΑ8 со сшивающим соединением может быть отрегулировано для конкретных требований, таких как химическая природа участвующих в реакции веществ. Например, если группа М сшивающего соединения представлена гидроксиламином или гидразидом, значение рН предпочтительно находится в диапазоне от 3 до 9, более предпочтительно от 4 до 8 и еще более предпочтительно от 4,5 до 6,5.
В случае, например, когда реакция ΗΑ8 со сшивающим соединением является реакцией восстановительного аминирования, значение рН находится предпочтительно в диапазоне от 3 до 9, более предпочтительно в диапазоне от 3,5 до 8 и еще более предпочтительно - в диапазоне от 4 до 6.
Подходящее значение рН в реакционной смеси можно отрегулировать для каждой стадии реакции, добавив по крайней мере один подходящий буфер. Среди предпочтительных буферов находятся ацетатные буферы, предпочтительно натрий-ацетатный буфер, а также фосфатный и боратный буфер.
Если сшивающие соединения используются для реакции с ΗΑ8, имеющим редуцирующую концевую группу в неокисленной форме, который в соответствии с предпочтительным осуществлением имеет Η2Ν- в качестве аминогруппы М, производное ΗΑ8 получают на стадии (ί) изобретения, где ΗΑ8 и сшивающее соединение, используемые как исходные материалы, связаны иминной связью, где полученное производное ΗΑ8 также содержит ацетальную или кетогруппу А. Если реакция протекает в условиях восстановительного аминирования в присутствии подходящего восстанавливающего агента, производное ΗΑ8 получают на стадии (ί) настоящего изобретения, где ΗΑ8 и сшивающее соединение, используемые как исходные материалы, связаны аминной связью, где полученное производное ΗΑ8 также содержит ацетальную или кетогруппу А.
В связи с этим настоящее изобретение также относится к вышеописанному способу, где на стадии (ί) ΗΑ8 реагирует, предпочтительно в водной системе, посредством своего неокисленной редуцирующей группы с аминогруппой А сшивающего соединения, причем М представлена Η2Ν-, и где реакция протекает при температуре в диапазоне от 20 до 80°С при значении рН в диапазоне от 4 до 7, причем X является <Η=Ν·.
Кроме того, изобретение также относится к вышеописанному способу, где на стадии (ί) реакция протекает в присутствии восстанавливающего агента, такого как борогидрид натрия, цианоборогидрид
- 32 018222 натрия, органические борановые комплексные соединения, такие как 4-(диметиламин)пиридинборановый комплекс, Ν-этилдиизопропиламинборановый комплекс, Ν-этилморфолинборановый комплекс, Ν-метилморфолинборановый комплекс, Ν-фенилморфолинборановый комплекс, лутидинборановый комплекс, триэтиламинборановый комплекс или триметиламинборановый комплекс, предпочтительно Ναί.'ΝΒΗ3. с получением производного НАЗ, причем X является -ΟΗ2-ΝΗ-.
Концентрация этих восстанавливающих агентов, используемых для восстановительного аминирования в соответствии с изобретением, находится предпочтительно в диапазоне от 0,01 до 2,0 моль/л, предпочтительно в диапазоне от 0,05 до 1,5 моль/л и еще более предпочтительно в диапазоне от 0,1 до 1,0 моль/л, в каждом случае в отношении к объему реакционного раствора.
В соответствии с вышеописанным предпочтительным осуществлением, где М является Η2Ν-, реакция сшивающего соединения с НАЗ протекает в условиях восстановительного аминирования, молярное соотношение сшивающего соединения и НАЗ предпочтительно находится в диапазоне от 1:1 до 100:1, более предпочтительно от 2:1 до 80:1, еще более предпочтительно от 3:1 до 70:1, еще более предпочтительно от 4:1 до 60:1 и еще более предпочтительно от 5:1 до 50:1.
В соответствии с вышеописанным предпочтительным осуществлением, где М является Η2Ν- и реакция сшивающего соединения с НАЗ протекает в условиях восстановительного аминирования, концентрация НАЗ, предпочтительно НЕЗ в водной системе предпочтительно находится в диапазоне от 1 до 50 мас.%, более предпочтительно от 3 до 45 мас.% и еще более предпочтительно от 5 до 40 мас.%, в каждом случае в отношении к массе реакционного раствора.
Если сшивающие соединения используются для реакции с НАЗ, имеющим редуцирующую концевую группу в неокисленной форме, который в соответствии с предпочтительным осуществлением имеет 42Ν-Θ- или Н2Ы-НН-(С=0)- в качестве аминогруппы М, производное НАЗ получают на стадии (ί) изобретения, где НАЗ и сшивающее соединение, используемые в качестве исходных материалов, связаны посредством связи -СН=К-О- или -СН=К-ХН-(С=0)-, где полученное производное НАЗ также содержит ацетальную или кетогруппу А. Если реакция протекает в восстановительных условиях в присутствии подходящего восстанавливающего агента, производное НАЗ получают на стадии (ί) изобретения, где НАЗ и сшивающее соединение, используемые как исходные материалы, связаны посредством связи -СН2-ХН-0-или связи -СН2-ХН-ХН-(С=0)-, где полученное производное НАЗ также содержит ацетальную или кетогруппу А.
В связи с этим настоящее изобретение относится также с вышеописанному способу, где на стадии (ί) НАЗ реагирует предпочтительно в водной системе посредством своей неокисленной редуцирующей конечной группы с аминогруппой М сшивающего соединения, причем М является Н2К-0- или Н^-ИН(С=0)-, и где реакция протекает при температуре в диапазоне от 5 до 80°С при рН в диапазоне от 4,5 до 6,5, причем X является -СН=К-0- или -СН=К-ХН-(С=0)-.
Кроме того, изобретение также относится к вышеописанному способу, где на стадии (ί) реакция протекает в присутствии восстанавливающего агента, такого как борогидрат натрия, цианоборогидрат натрия, органические борановые комплексные соединения, такие как 4-(диметиламин)пиридинборановый комплекс, Ν-этилдиизопропиламинборановый комплекс, Ν-этилморфолинборановый комплекс, Ν-метилморфолинборановый комплекс,
Ν-фенилморфолинборановый комплекс, лутидинборановый комплекс, триэтиламинборановый комплекс или триметиламинборановый комплекс, предпочтительно NаСNΒΗ3, с получением производного НАЗ, причем X является -СН2-ХН-0- или -СН2-ХН-ХН-(С=0)-.
Концентрация этих восстанавливающих агентов, используемых для этой реакции по изобретению, находится предпочтительно в диапазоне от 0,001 до 2,0 моль/л, предпочтительно в диапазоне от 0,01 до 1,0 моль/л и еще более предпочтительно в диапазоне от 0,1 до 0,8 моль/л, в каждом случае относительно объема реакционного раствора.
В соответствии с вышеописанным предпочтительным осуществлением изобретения, где М является Н2К-0- или Н2К-ХН-(С=0)-, а реакция сшивающего соединения с НАЗ протекает в восстановительных условиях, молярное соотношение сшивающего соединения и НАЗ предпочтительно находится в диапазоне от 1:1 до 100:1, более предпочтительно от 2:1 до 80:1, более предпочтительно от 3:1 до 70:1, более предпочтительно от 4:1 до 60:1 и еще более предпочтительно от 5:1 до 50:1.
В соответствии с вышеописанным предпочтительным осуществлением изобретения, где М является Н2К-, а реакция сшивающего соединения с НАЗ протекает в условиях восстановительного аминирования, концентрация НАЗ, предпочтительно НЕЗ в водной системе предпочтительно находится в диапазоне от 1 до 50 мас.%, более предпочтительно от 3 до 45 мас.% и еще более предпочтительно от 5 до 40 мас.%.
Соответственно настоящее изобретение также относится к производному НАЗ, которое может быть получено или которое получают вышеописанным способом или способами.
Кроме того, изобретение также относится к производному НАЗ как таковому, имеющему следующую структуру:
- 33 018222
ок. | |
н / | |
д^ОН | |
0 \ | |
\^С—N--Ь--А | |
н | ок3 н |
н |
где в зависимости от условий реакции и/или конкретной химической природы сшивающего соединения двойная связь С-Ν может присутствовать в конформации Е или Ζ, где также может присутствовать смесь обеих форм, имеющих определенное равновесное распределение; или, что касается соответствующей циклической структуры, которая в целях настоящего изобретения будет рассматриваться как идентичная вышеприведенной открытой структуре
где в зависимости от условий реакции и/или конкретной химической природы сшивающего соединения эти производные ИА8 могут присутствовать с атомом N в экваториальной или аксиальной позиции, где также может присутствовать смесь обеих форм, имеющих определенное равновесное распределение
или соответствующую циклическую структуру
или соответствующую циклическую структуру
- 34 018222
В соответствии с вышеописанными предпочтителъными сшивающими соединениями, в качестве примера можно упомянутъ следующие производные ΗΑδ, где в каждом случае ΗΑδ - в соответствии с предпочтителъными вариантами осуществления изобретения - является ΗΕδ:
куда включена соответствующая циклическая структура, или
куда включена соответствующая циклическая структура, или
куда включена соответствующая циклическая структура, или
- 35 018222
куда включена соответствующая циклическая структура, или
куда включена соответствующая циклическая структура, или
куда включена соответствующая циклическая структура, или
- 36 018222
куда включена соответствующая циклическая структура, или
куда включена соответствующая циклическая структура, или
куда включена соответствующая циклическая структура, или
куда включена соответствующая циклическая структура, или
- 37 018222
куда включена соответствующая циклическая структура, или
куда включена соответствующая циклическая структура, или
куда включена соответствующая циклическая структура, или
куда включена соответствующая циклическая структура, или
- 38 018222
куда включена соответствующая циклическая структура, или
куда включена соответствующая циклическая структура, или
Наиболее предпочтительны производные ΗΑ8 на основе сшивающих соединений, выбранных из группы, состоящей из структур (а2), (а4), (а11), (а12), (а14), (а16) и (а18). Еще более предпочтительны производные ΗΑ8 на основе сшивающих соединений, выбранных из группы, состоящей из структур (а2), (а11), (а12), (а14), (а16) и (а18). Особо предпочтительны производные ΗΑ8 на основе сшивающих соединений, выбранных и группы, состоящей из структур (а2), (а11), (а12) и (а16).
В соответствии с особо предпочтительным вариантом осуществления изобретение относится к производному ΗΕ8, имеющему следующую структуру:
соответствующую циклическую структуру
- 39 018222
где, еще более предпочтительно ΗΕ8 имеет среднюю молекулярную массу от примерно 1 до примерно 1000 кД, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 800 кД, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 500 кД, более предпочтительно от примерно 2 до примерно 400 кД, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 300 кД, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 200 кД, в особенности от примерно 50 до примерно 150 кД, молярное замещение от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,4 до 1,3, такое как 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 или 1,3, и соотношение замещения С2 : С6 предпочтительно в диапазоне от 2 до 20, предпочтительно в диапазоне от 2 до 15 и еще более предпочтительно в диапазоне от 3 до 12.
Другие возможные варианты осуществления относительно НА8
Ради полноты описания следует упомянуть, что возможно, хотя и не является предпочтительным в соответствии с изобретением, окислять ΗΑ8 до реакции со сшивающим соединением, так чтобы не менее двух альдегидных групп были введены в ΗΑ8 в соответствии со следующей формулой:
В целом можно было бы использовать каждый окисляющий агент или сочетание окисляющих агентов, способных окислять по крайней мере один сахаридный цикл полимера с образованием открытого сахаридного цикла, имеющего по крайней мере одну, предпочтительно две альдегидные группы. Эту реакцию можно было бы проиллюстрировать следующей схемой, показывающей сахаридный цикл ΗΑ8, окисленный для образования открытого цикла, имеющего две альдегидные группы:
Подходящими окисляющими агентами являются среди прочих такие, как периодаты щелочных металлов или смеси одного или более таких периодатов, причем предпочтительными являются периодаты натрия и периодаты калия. Возможна реакция этих альдегидных групп со сшивающим соединением МЬ-Α посредством аминогруппы М.
Выделение в чистом виде и/или очистка
В дальнейшем обычно возможна нижеописанная реакция производного ΗΑ8, полученного на стадии (1) изобретения. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления производное ΗΑ8, полученное на стадии (1), соответствующим образом очищается после реакционной стадии (1).
Для очистки производного ΗΑ8, полученного на стадии (1), можно, к примеру, упомянуть следующие возможности, где возможность А) является предпочтительной:
Α) Ультрафильтрация с использованием воды или водного раствора буфера, имеющего концентра
- 40 018222 цию предпочтительно от 0,1 до 100 ммоль/л, более предпочтительно от 1 до 50 ммоль/л и еще более предпочтительно от 5 до 20 ммоль/л, такую как примерно 10 ммоль/мл, рН в диапазоне предпочтительно от 2 до 10, еще более предпочтительно от 4 до 10, еще более предпочтительно от 6 до 10 и еще более предпочтительно от 8 до 10, например, около 9; количество обменных циклов предпочтительно составляет от 10 до 50, еще более предпочтительно от 10 до 40 и еще более предпочтительно от 10 до 30, например около 20.
B) Диализ с использованием воды или водного раствора буфера, имеющего концентрацию предпочтительно от 0,1 до 100 ммоль/л, более предпочтительно от 1 до 50 ммоль/л и еще более предпочтительно от 5 до 20 ммоль/л, например около 10 ммоль/мл, рН в предпочтительном диапазоне от 2 до 10, более предпочтительно от 4 до 10, еще более предпочтительно от 6 до 10 и еще более предпочтительно от 7 до 9; где используется раствор, содержащий производное НА8 в предпочтительной концентрации от 5 до 20 мас.%; и где буфер или вода используются в основном в избытке примерно 100:1 к раствору производного НЕ8.
C) Осаждение этанолом или изопропанолом, центрифугирование и повторное растворение в воде для получения раствора с предпочтительной концентрацией около 10 мас.% и последующая ультрафильтрация с использованием воды или водного раствора буфера, имеющего концентрацию предпочтительно от 0,1 до 100 ммоль/л, более предпочтительно от 1 до 50 ммоль/л и еще более предпочтительно от 5 до 20 ммоль/л, например, около 10 ммоль/мл, рН в предпочтительном диапазоне от 2 до 10, еще более предпочтительно от 4 до 10, еще более предпочтительно от 6 до 10 и еще более предпочтительно от 7 до 9; количество обменных циклов предпочтительно составляет от 10 до 40, более предпочтительно от 10 до 30 и еще более предпочтительно от 10 до 20, например 10.
После предпочтительной стадии очистки производное НА8 предпочтительно получают в виде твердого вещества. В соответствии с другими возможными вариантами осуществления изобретения можно упомянуть растворы производного НА8 или замороженных растворов производного НА8, имеющие предпочтительное содержание производного НА8 от 2 до 40 мас.%, где рН этих растворов предпочтительно находится в диапазоне от 3 до 10, а концентрация используемого буфера предпочтительно находится в диапазоне от 0,1 до 1 моль/л.
В связи с этим изобретение также относится к вышеописанному способу, где после стадии (1) производное НА8, полученное на стадии (1), очищают посредством ультрафильтрации с использованием воды или водного раствора буфера с концентрацией от 0,1 до 100 ммоль/л, рН в диапазоне от 2 до 10; количество обменных циклов составляет 10 до 50.
Реакция с биологически активным веществом ВА
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения настоящее изобретение относится к способу, где вышеописанное производное НЕ8
также соответствующим образом реагирует с биологически активным соединением ВА посредством ацетальной или кетальной группы А, которая предпочтительно преобразуется в соответствующую альдегидную или кетогруппу до реакции с ВА.
Наиболее предпочтительно, если группа А, предпочтительно соответствующая альдегидная или кетогруппа, реагирует с аминогруппой, еще более предпочтительно с первичной аминогруппой, содержащейся в ВА. Для таких случаев и в целях настоящего изобретения ВА также представлено в виде 112\ВА', где ВА' является остатком ВА.
В связи с этим изобретение также относится к вышеописанному способу, включающему также:
(ΐΐ) реакцию производного НА8 по формуле (III) посредством группы А с аминогруппой биологически активного вещества 112\-ВЛ' посредством восстановительного аминирования с получением производного НА8 формулы (IV)
В соответствии с первым вариантом осуществления изобретения производное НА8, полученное на
- 41 018222 стадии (ΐ), предпочтителъно очищенное, подвергается соответствующему преобразованию группы А в соответствующую алъдегидную или кетогруппу, где полученное в резулътате производное ΗΑδ проходит соответствующую стадию очистки и/или выделения чистого вещества до реакции с ВА. Преобразование в алъдегидную или кетогруппы предпочтителъно осуществляется посредством реакции гидролиза катализированной кислотой. Реакция предпочтителъно осуществляется при температуре от 0 до 100°С, более предпочтителъно от 10 до 80°С и еще более предпочтителъно от 20 до 60°С при рН предпочтителъно в диапазоне от 1 до 6, более предпочтителъно от 1 до 5, еще более предпочтителъно от 1 до 4, еще более предпочтителъно от 1 до 3 и еще более предпочтителъно от 1 до менее 3. Очистка и буферный обмен продукта реакции гидролиза могут производитъся способами, хорошо известными специалистам в данной области, например диализом или улътрафилътрацией. Преобразованный материал можно извлечъ из раствора в виде твердого вещества, например, лиофилизацией.
В соответствии со вторым вариантом осуществления изобретения производное ΗΑδ, полученное на стадии (ΐ), предпочтителъно очищенное, подвергается соответствующему преобразованию группы А в соответствующую алъдегидную или кетогруппы, где полученное в резулътате производное ΗΑδ непосредственно реагирует с ВА, т.е. без отделъной специалъной стадии очистки и/или выделения чистого производного ΗΑδ, включающего алъдегидную или кетогруппу. Преобразование в алъдегидную или кетогруппы предпочтителъно выполняется реакцией гидролиза, катализированного кислотой. Реакция предпочтителъно осуществляется при температуре от 0 до 100°С, более предпочтителъно от 10 до 80°С и еще более предпочтителъно от 20 до 60°С при рН предпочтителъно в диапазоне от 1 до 6, более предпочтителъно от 1 до 5, более предпочтителъно от 1 до 4, более предпочтителъно от 1 до 3 и еще более предпочтителъно от 1 до менее 3. Продукт реакции гидролиза можно соединитъ с ВА в растворе буфера либо сразу, либо после установления значения рН, соизмеримого с реакцией с ВА.
В связи с этим настоящее изобретение относится также к вышеописанному способу, где до стадии (ΐΐ) группа А производного ΗΑδ в соответствии с формулой (III) преобразуется в соответствующую алъдегидную или кетогруппу.
В соответствии с третъим возможным вариантом осуществления настоящего изобретения производное ΗΑδ, полученное на стадии (1), предпочтителъно предварителъно очищенное, непосредственно реагирует с ВА, т.е. реагирует с ВА в условиях реакции, позволяющих преобразование группы А т §йи в соответствующую алъдегидную или кетогруппу без отделъной специалъной стадии очистки и/или выделения чистого вещества и без отделъной стадии преобразования группы А в соответствующую алъдегидную или кетогруппу. Преобразование алъдегидной или кетогруппы предпочтителъно осуществляется реакцией гидролиза, катализированной кислотой. Реакция предпочтителъно осуществляется при температуре от 0 до 100°С, более предпочтителъно от 10 до 80°С и еще более предпочтителъно от 20 до 60°С при рН предпочтителъно в диапазоне от 1 до 6, более предпочтителъно от 1 до 5, более предпочтителъно от 1 до 4, более предпочтителъно от 1 до 3 и еще более предпочтителъно от 1 до менее 3. Реакция гидролиза продукта может бытъ соединена с ВА в растворе буфера либо сразу, либо после установления значения рН, соизмеримого с реакцией с ВА.
То, какой метод из указанных в вышеприведенных вариантах осуществления применятъ, зависит, например, от конкретной природы исполъзуемого биологически активного вещества ВА. Если, например, в качестве ВА применяется такой протеин как ЕРО, 6-(δ1; или Π;Ν алъфа, обычно подходит первый или второй вариант.
На стадии (ίί) реакция предпочтителъно протекает в водной среде. Термин водная среда применителъно к данному изобретению означает растворителъ или смесъ растворителей, включающую воду в диапазоне от не менее 10 мас.%, предпочтителъно не менее 50 мас.%, более предпочтителъно не менее 80 мас.% и еще более предпочтителъно не менее 90 мас.% или до 100 мас.% относителъно массы исполъзуемых растворителей. В качестве дополнителъных растворителей можно упомянутъ такие как ΌΜδΟ, ΌΜΓ, этанол или метанол.
Хотя возможно выполнятъ реакцию на стадии (ίί) в условиях получения невосстановленной формы производного ΗΑδ в соответствии с формулой (IV), т.е.
особо предпочтителъно выполнятъ реакцию стадии (ίί) в условиях восстановителъного аминирования в присутствии по крайней мере одного подходящего восстанавливающего агента. В частности, в этих условиях группа ^Η=Ν-, полученная посредством реакции алъдегида или кетогруппы, являющейся резулътатом группы А производного ΗΑδ и Η^-группы ΒΑ, восстанавливается до -С^-ΝΗ-.
- 42 018222
Например, могут использоваться следующие восстанавливающие агенты: NаΒН(ОАс)з, борогидрид натрия, цианоборогидрид натрия, органические борановые комплексы, такие как 4(диметиламин)пиридинборановый комплекс, Ν-этилдиизопропиламинборановый комплекс, Νэтилморфолинборановый комплекс, Ν-метилморфолинборановый комплекс, Ν-фенилморфолинборановый комплекс, лутидинборановый комплекс, триэтиламинборановый комплекс или триметиламинборановый комплекс. Предпочтительны NаΒН4 и №1С.’НВН3. а наиболее предпочтителен №СИВН3.
В одном варианте осуществления производное НА8 добавляется к водному раствору, содержащему биологически активный агент. Предпочтительно, чтобы затем был добавлен по крайней мере один восстанавливающий агент, в частности №СИВН3.
В другом варианте в водный раствор может быть необязательно добавлено производное НА8, а затем ВА. Предпочтительно, чтобы затем был добавлен по крайней мере один восстанавливающий агент, в частности №1С.’НВН3.
Реакция производного НА8 с аминогруппой биологически активного соединения ВА на стадии (ίί) предпочтительно выполняется при значении рН от 3 до 9, предпочтительно от 3 до 8, более предпочтительно от 3 до 7, еще более предпочтительно от 3 до менее 7, например, при значении рН, равном 3 или 4 или 5 или 6. Установить подходящее значение рН реакционной смеси можно посредством добавления по крайней мере одного подходящего буфера. Среди предпочтительных буферов можно упомянуть такие, как ацетатные буферы, предпочтительно ацетат натрия, фосфатные или боратные буферы.
Реакция производного НА8, полученного на стадии Ь), с аминогруппой биологически активного соединения ВА на стадии (ίί) предпочтительно осуществляется при температуре от -10 до 100°С, предпочтительно от 0 до 50°С, более предпочтительно от 0 до 37°С, более предпочтительно от 0 до 25°С, например 0, 5, 10, 15, 20 или 25°С.
Время реакции на стадии (ίί) зависит от температуры, соотношения НА8, в частности, НЕ8 производного и соединения ВА и абсолютной концентрации производного НА8 и соединения ВА. Время реакции может быть от 5 мин до 7 дней, предпочтительно от 1 ч до 7 дней.
Молярное отношение полученного производного НА8 к соединению ВА на стадии (ίί) составляет предпочтительно от 0:1 до 200:1 эквивалентов, еще более предпочтительно от 1:1 до 100:1, исходя из среднемассовой молекулярной массы (Мп) производного НА8. Молярное отношение предпочтительно составляет от 1:1 до 50:1. Возможны низкие молярные отношения, такие как 50:1 или ниже, предпочтительно от 1:1 до 20:1, более предпочтительно от 1:1 до 10:1 и еще более предпочтительно от 2:1 до 9:1, еще более предпочтительно от 3:1 до 8:1 и еще более предпочтительно от 4:1 до 7:1, например, если ВА является протеином, в частности ΙΡΝ а1рйа.
В особо предпочтительном варианте осуществления концентрация производного НА8, используемого на стадии (ίί), выше примерно 10 мас.%, в частности выше примерно 15 мас.%, в каждом случае относительно массы реакционного раствора на стадии (ίί).
В связи с этим настоящее изобретение также относится к вышеописанному способу, где на стадии (ίί) реакция осуществляется предпочтительно в водной среде в присутствии восстанавливающего агента, предпочтительно №С№ВН3 при температуре в диапазоне от 0 до 37°С, предпочтительно от 0 до 25°С и значении рН в диапазоне от 3 до 9, предпочтительно от 3 до менее 7 и где на стадии (ίί) молярное отношение производного НА8 к биологически активному агенту ВА составляет от 0,1:1 до 200:1 эквивалентов, предпочтительно от 1:1 до 50:1 эквивалентов, исходя из среднемассовой молекулярной массы (МД производного НА8.
Предпочтительные концентрации ВА, такие, например, как предпочтительные концентрации протеина в растворе, предпочтительно в водном растворе на стадии (ίί), находятся в диапазоне от 0,1 до 10 г/л, более предпочтительно от 1 до 9 г/л. Концентрация производного НА8 в данном растворе до стадии (ίί), данная в (м/о), предпочтительно находится в диапазоне от 0,1 до 50%, более предпочтительно от 0,5 до 45% и еще более предпочтительно от 1 до 40%.
В соответствии с возможным вариантом осуществления биологически активный агент ВА можно растворить в водной среде, предпочтительно в водном буферном растворе, в частности в буферном растворе ацетата натрия. Водный раствор может дополнительно содержать добавки, такие как очищающие средства и/или диспергирующие средства, в частности, выбранные из группы, состоящей из 8Ό8, Сйарк, Т\уссп 20, Т\уссп 80, №1йбс1 Р-40 и Тгйоп X 100. Если используется очищающее средство и/или диспергирующее средство, оно предпочтительно присутствует в количестве от 0,005 до 3 мас.%, предпочтительно от 0,05 до 3 мас.%, предпочтительно примерно 0,5 мас.%, исходя из общей массы водного раствора.
Если используется хотя бы один восстанавливающий агент в соответствии с изобретением, а X, присутствующий в производном НА8, используемом для реакции с ВА, является, например, -СН=К-, -СН=К-О- или -СН=К-МН-(С=О)- предпочтительно восстанавливается, давая функциональную группу X, являющуюся -СЩ-ΝΉ-, -СЩ-ΝΉ-Ο- или -СН2-МН-МН-(С=О)- в условиях восстанавливающего аминирования, используемых для реакции на стадии (ίί).
Таким образом, настоящее изобретение также относится к производному НА8, которое получают или которое можно получить вышеописанным способом, в частности, вышеописанным способом, где на
- 43 018222 стадии (ΐΐ) реакция осуществляется предпочтительно в водной среде в присутствии восстанавливающего агента, предпочтительно NаСNΒН3 при температуре в диапазоне от 0 до 37°С, предпочтительно от 0 до 25°С и значении рН в диапазоне от 3 до 9, более предпочтительно от 3 до 7, более предпочтительно от 3 до менее 7 и где на стадии (ΐΐ) молярное отношение производного НЛ8 к биологически активному агенту ВА составляет от 0,1:1 до 200:1 эквивалентов, предпочтительно от 1:1 до 10:1 эквивалентов, исходя из среднемассовой молекулярной массы (Мп) производного НА8, используемого на стадии (и), в каждом случае при условии, что X не является амидной группой. Особо предпочтительные молярные отношения производного НА8 к биологически активному агенту ВА ниже 10, например от 1:1 до 9:1, более предпочтительно от 1:1 до 8:1, более предпочтительно от 1:1 до 7:1, более предпочтительно от 1:1 до 6:1 и еще более предпочтительно от 1:1 до 5:1, например, примерно 1:1, примерно 2:1, примерно 3:1, примерно 4:1 или примерно 5:1. Хотя такие низкие молярные отношения как 50:1 или ниже, более предпочтительно 10:1 или ниже возможны для нескольких биологически активных агентов, они предпочтительны, например, для протеинов, где особо предпочтительным является ΙΡΝ а1рйа. Что касается, например, ОС8Е и ЕРО, предпочтительны молярные отношения 50:1 или ниже, такие как, например от 1:1 до 50:1. В целом в качестве примера можно упомянуть молярные отношения в диапазоне от 1:1 до 50:1 или от 2:1 до 40:1 или от 3:1 до 30:1 или от 4:1 до 20:1 или от 5:1 до 15:1.
В случае, если в качестве биологически активного вещества ВА по настоящему изобретению используется протеин, особенно при предпочтительных диапазонах рН, приведенных выше, особенно при рН ниже 7 и выше или равном 3, производное НА8 преимущественно реагирует с Ν-концевой аминогруппой протеина.
Термин преимущественно применительно к данному изобретению относится к варианту осуществления, где не менее 50%, предпочтительно не менее 60%, предпочтительно не менее 70%, предпочтительно не менее 80%, предпочтительно не менее 85% имеющихся Ν-концевых аминогрупп реагируют посредством реакции восстановительного аминирования. Возможна также реакция не менее 90% или не менее 95% или не менее 96% или не менее 97% или не менее 98% или не менее 99% имеющихся Νконцевых аминогрупп. Хотя связывание с иными аминогруппами, нежели Ν-концевые аминогруппы, нельзя полностью исключать, считается, что связывание посредством восстановительного аминирования по настоящему изобретению при рН ниже 7 имеет место в основном селективно на Ν-концевых аминогруппах. В частности, эти условия реакции предпочтительны для протеинов, которые устойчивы при таких условиях. Если же протеин, например, альфа1-антитрипсин (А1АТ), является неустойчивым к кислоте, желательно выбрать подходящие условия реакции, в частности, рН от менее 7,5 до более 5.
В связи с этим настоящее изобретение также относится к способу получения производного НА8, включающего ВА', производного НА8, которое получают или которое можно получить таким способом, и производного НА8 в соответствии с формулой (IV) как такового, как описано выше, где протеин включает Ν-концевую аминогруппу и по крайней мере еще одну аминогруппу, причем данное производное НА8 включает НА8, который преимущественно присоединен к Ν-концевой аминогруппе.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к производному НА8 в соответствии с формулой (IV)
Кроме того, изобретение также относится к производному гидроксиалкилкрахмала формулы (IV)
ок. | |||
н / ’ | |||
Л--ОН | |||
О \ | |||
н | |||
2 1 | х—ь—с— | -Ν---ВА' | |
н | ок3 | 1 | Н |
н | Ач | ||
3 | (IV) |
где X является функциональной группой, полученной в результате реакции аминогруппы М сшивающего соединения формулы (II)
где X является не амидной группой -С(=О)-МН-, с гидроксиалкилкрахмалом (НА8) формулы (I)
- 44 018222
посредством атома углерода С* НА8, где С* является необязательно окисленным, наиболее пред почтительно неокисленным до реакции НА8 с М, где НА8' является остатком молекулы гидрксиалкилкрахмала, а Кь К2 и К3 независимо друг от дру га являются гидроксиалкильной группой с линейной или разветвленной цепью, где А является остатком в соответствии с формулой (11а) ζ2α2 —с—ΖΑ Аз где
Ζ1 и Ζ2 независимо друг от друга являются О или 8 или ΝΚΧ, предпочтительно О, где Кх является Н или низшим алкилом, таким как метил, этил или пропил, такой как н-пропил или изопропил, или С(О)Ку, где Ку предпочтительно выбирается из группы, состоящей из С1-С6алкила и С6-С14арила, еще более предпочтительно из группы, состоящей из необязательно замещенного, предпочтительно незамещенного метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила и трет-бутила; причем Кх предпочтительно является Н;
А1 и А2 независимо друг от друга являются метилом, этилом, н-пропилом, изопропилом, н-бутилом, трет-бутилом, бензилом, 1,1,1-трихлорэтилом, нитробензилом, метоксибензилом, этоксибензилом или образуют цикл по формуле (ПЬ)
где А1 и А2, взятые вместе, являются -(СН2)2- или -(СН2)3- или -(СН2СН(СН3))-, и где А3 является Н или метилом, этилом, н-пропилом, изопропилом, н-бутилом, изобутилом, пентилом, бензилом или образует цикл с атомом N аминогруппы М или с подходящим атомом, включенным в Ь, причем А3 предпочтительно является Н;
и где Ь является спейсером, соединяющим М и А, где ВА' является остатком биологически активного вещества ВА'-ΝΙ 12, оставшимся после реакции аминогруппы ВА посредством реакции восстановительного аминирования с А или с альдегидной группой или кетогруппой, соответствующей А.
Что касается предпочтительных вариантов осуществления НА8, предпочтительно НЕ8 и сшивающего соединения, ссылка делается на соответствующее вышеприведенное описание.
Что касается производного НА8 формулы (IV), X предпочтительно выбирается из группы, состоящей из -СН2^Н-, -СН=№, -СН2^Н-О- и -СН=№О, более предпочтительно -СН2^Н- и -С1Ь-ΝΙ1-О-, наиболее предпочтительно -СН2^Н-.
Кроме того, что касается производного НА8 формулы (IV), В, соединяющий М и А, является предпочтительно спейсером, включающим по крайней мере одно структурное звено формулы (Πά), предпочтительно состоящим из структурного звена формулы (Πά)
где Ь1 и Ь2 независимо друг от друга являются Н или органическим остатком, выбранным из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила, замещенного арила, арилалкила, замещенного арилалкила, алкиларила, замещенного алкиларила и остатков -О-Κ, где Κ выбрано из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила, замещенного арила, арилалкила, замещенного арилалкила, алкиларила, замещенного алкиларила; предпочтительно Н или органическим остатком, выбранным из группы, состоящей из алкила и замещенного алкила; более предпочтительно Н или алкилом; еще более предпочтительно Н, где η является целым числом от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 4, еще более предпочтительно 2.
- 45 018222
Термин биологически активное вещество (ВА) применительно к контексту данного изобретения относится к веществу, которое может действовать на любые физические или биохимические свойства биологического организма, включая, не ограничиваясь, вирусы, бактерии, грибы, растения, животных и людей. В частности, термин биологически активное вещество применительно к данному изобретению относится к веществу, предназначенному для диагностирования, лечения, облегчения, излечения или предотвращения болезней у людей или животных или же для улучшения физического или психического состояния людей или животных.
Примерами активных веществ являются, не ограничиваясь, пептиды, полипептиды, протеины, энзимы, низкомолекулярные лекарства, красители, липиды, нуклеозиды, нуклеотиды, олигонуклеотиды, такие как, например, олигонуклеотиды, имеющие соответствующий спейсер, такой как 5'амилогексиловый спейсер, полинуклеотиды, нуклеиновые кислоты, клетки, вирусы, липосомы, микрочастицы и мицеллы. Примерами протеинов являются, не ограничиваясь, эритропоэтин (ЕРО), такой как рекомбинантный человеческий ЕРО ((гИЕРО) или миметик ЕРО, колониестимулирующие факторы (С8Р), такие как С-С8Р, как рекомбинантный человеческий С-С8Р (гИС-С8Р), альфа-интерферон (ΙΡΝ а1рИа), бета-интерферон (ΙΡΝ Ьс1а) или гамма-интерферон (ΙΡΝ датта), такой как ΙΡΝ а1рИа и ΙΡΝ Ьс1а. как рекомбинантный человеческий ΙΡΝ а1рИа или ΙΡΝ Ьс1а (γΙιΙΡΝ а1рИа и γΙιΙΡΝ Ье1а), интерлейкины, например ГЬ-1 - ГЬ-34, такие как ГЬ-2 или ГЬ-3 или ГЬ-11, как рекомбинантный человеческий ГЬ-2 или ГЬ-3 (гЫЬ-2 и гЫЬ-3), сывороточные протеины, такие как факторы свертывания крови ГЬ-ΧΙΙΙ, как фактор VIII, фактор VII, фактор IX, фактор II, фактор III, фактор IV, фактор V, фактор VI, фактор X, фактор XI, фактор XII, фактор XIII, ингибиторы протеазы серина, такие как альфа1-антитрипсин (А1АТ), активированный протеин С (АРС), активаторы плазминогена, такие как активатор плазминогена тканевого типа (ΐΡΑ), такой как человеческий активатор плазминогена тканевого типа (ΗΤΡΑ), ΑΤ III, такой как рекомбинантный человеческий ΑΤ III (ΎΙιΑΤ III), миоглобин, альбумин, такой как бычий сывороточный альбумин (Β8Α), факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (ЕСР), фактор роста тромбоцитов (ΡΌ6Ρ), фактор роста фибропласта (РСР), мозговой фактор роста (ΒΌ6Ρ), фактор роста нервов (ΝΟΡ), фактор роста Вклеток (ВССР), мозговой нейротрофический фактор роста (ΒΌΝΡ), цилиарный нейротрофический фактор (ΟΝΤΡ), трансформирующий фактор роста, такой как ΤСΡ а1рИа или ΤСΡ Ье1а, ВМР (костные морфогенные протеины), гормоны роста, такие как человеческий гормон роста (ΗΘΗ), как рекомбинантный человеческий гормон роста (Λ6Η), факторы некроза опухоли, такие как ΤΝΤ а1рИа или ΤΝΤ Ье1а, соматостатин, соматотропин, соматомедины, гемоглобин, гормоны или прогормоны, такие как инсулин, гонадотропин, меланоцитстимулирующий гормон ^^^^8^, трипторелин, гипоталамические гормоны, такие как антидиуретические гормоны (ΑΌΗ и окситоцин), а также освобождающие гормоны и гормоны, ингибирующие освобождение, гормон околощитовидной железы, гормоны щитовидной железы, такие как тироксин, тиреотропин, тиролиберин, кальцитонин, глюкагон, глюкагоноподобные пептиды (СЬР-1, СЬР-2 и т.д.), экзендины, такие как экзендин-4, лептин, такой как рекомбинантный человеческий лептин (тйЬерйи), кемптид (Τιρ4 -КетрШе), вазопрессин, гастрин, секретин, интегрины, гликопротеиновые гормоны (например, ЬИ, Ρ8Η и т.д.), меланозидстимулирующие гормоны, липопротеины и аполипопротеины, такие как аро-В, аро-Е, аро-Ьа, иммуноглобулины, такие как Ι§Θ, ΙβΕ, Ι§Α, Ι§ϋ и их фрагменты, такие как антисвязывающие фрагменты, полученные из молекулы человеческого иммуноглобулина О (ИРаЬ), мышиный иммуноглобулин С (т^С), гирудин, ингибитор тканевых путей, растительные белки, такие как лецитин или рицин, пчелиный яд, змеиный яд, иммунотоксины, антиген Е, ингибитор альфапротеиназы, аллерген амброзии, меланин, олиголизиновые протеины, ЯСЭ-протеины или необязательно соответствующие рецепторы для одного из этих протеинов; пролактин или его мутант, такой как С129К, в котором аминокислота дикого типа в позиции 129, глицин, заменена аргинином (фирменное название этого мутанта - Ьае1оХег1) и функциональное производное или фрагмент любого из этих протеинов или рецепторов.
Полипептид предпочтительно выбирается из группы, состоящей из эритропоэтина (ЕРО), такого как рекомбинантный человеческий ЕРО (гИЕРО), колониестимулирующего фактора (С8Р), такого как СС8Р, как рекомбинантный человеческий С-С8Р (гИС-С8Р), интерферона (^Ν), такого как IΡN а1рИа, ШИ ЬеЩ ΤΝ датта, такого как рекомбинантный человеческий ШЫ а1рИа (тЫРХ а1рИа) или рекомбинантный человеческий ΤΝ Ье1а (тЫРХ Ье1а), фактора VII, такого как рекомбинантный человеческий фактор ХПа (тйР’УПа), фактора IX, такого как рекомбинантный человеческий фактор IX (тИРШ), гормона роста (ΟΗ), такого как рекомбинантный человеческий гормон роста (τΗΟΗ), антисвязывающих доменов, таких как антисвязывающий домен, полученный из молекулы человеческого иммуноглобулина С (ИРаЬ), иммуноглобулина С, такого как мышиный иммуноглобулин С (айдС), глюкагоноподобного пептида-1 (СЬР-1), аспарагиназы, такой как рекомбинантная аспарагиназа (^Α8ра^ад^ηа8е), лептина, такого как рекомбинантный человеческий лептин (тйЬерБи), интерлейкина-2, интерлейкина-11, альфа-1-антитрипсина, антитела или фрагмента антитела и альтернативного протеинового каркаса.
Более предпочтительно полипептид выбирается из группы, состоящей из эритропоэтина (ЕРО), такого как рекомбинантный человеческий ЕРО (гИЕРО), колониестимулирующего фактора (С8Р), такого как С-С8Р, как рекомбинантный человеческий С-С8Р (гИС-С8Р), интерферона (^Ν), такого как ΤΝ а1рИа, ΤΝ Ье1а, ΤΝ датта, как рекомбинантный человеческий ΤΝ а1рИа (тЫРХ а1рИа) или рекомбинант
- 46 018222 ный человеческий ΣΡΝ Ьс1а (γΗΣΡΝ Ьс1а). фактора VII, такого как рекомбинантый человеческий фактор УПа (гйРУПа), фактора IX, такого как рекомбинантный человеческий фактор IX (гйЛХ), гормона роста (ОН), такого как рекомбинантный гормон роста (гНСН), антисвязывающих доменов, таких как антисвязывающий домен, полученный из молекулы человеческого иммуноглобулина О (№аЬ), иммуноглобулина О, такого как мышиный иммуноглобулин О (айдО), глюкогоноподобного пептида-1 (ОЬР-1), аспарагиназы, такой как рекомбинантная аспарагиназа (гАкрагадтаке), лептина, такого как рекомбинантный человеческий лептин (гЬЬербп), интерлейкина-2, иинтерлейкина-11 и альфа-1-антитрипсина.
Активное вещество предпочтительно выбирается из группы, состоящей из антибиотиков, антидепрессантов, антидиабетических средств, антидиуретиков, антихолинергических средств, антиаритмических средств, противорвотных средств, противокашлевых средств, противоэпилептических средств, антигистаминов, противогрибковых средств, антисимпатотонических средств, антитромбатических средств, андрогенов, антиандрогенов, эстрогенов, антиэстрогенов, антиостеопорозных средств, противоопухолевых средств, вазодилататоров, других антигипертензивных средств, жаропонижающих средств, анальгетиков, противовоспалительных веществ, бета-блокаторов, иммунодепрессантов и витаминов.
Некоторыми дополнительными, неограничивающими примерами активных веществ являются алендронат, амиказин, атенолол, азатиоприн, циметидин, клонидин, козинтропин, циклосерин, десмопрессин, дигидроэрготамин, добутамин, допамин, эпсилон-аминокапроновая кислота, эргометрин, эсмолол, фамотидин, флекаидин, фолиевая кислота, флюцитозин, фуросемид, ганцикловир, глюкагон, гидразалин, изопротеренол, кетамин, лиотиронин, рилизинг-фактор лютеинизируюещго гормона (РФЛГ), мерпатрицин, метилдопа, метопролол, неомицин, нимодипин, нистатин, окситоцин, фентоламин, фенилэфрин, прокаинамид, прокаин, пропранолол, ритодрин, соталол, тербуталин, тиамин, тилудронат, толазолин, триметоприм, трометамин, вазопрессин; амифостин, амиодарон, аминокапроновая кислота, аминогиппурат натрия, аминоглютетимид, аминолевулиновая кислота, аминосалициловая кислота, амсакрин, анагрелид, анастрозол, аспарагиназа (такая как рекомбинантная аспарагиназа, например, из Е.сой (гАкрагадтае)), антрациклины, бексаротен, бикалутамид, блеомицин, бусерелин, бусульфан, каберголин, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцин, циластатин натрия, цисплатин, кладрибин, клодронат, циклофосфамид, ципротенон, цитарабин, камптотецины, 13-цис ретиноевая кислота, все транс-ретиноевые кислоты; дакарбазин, дактиномицин, дауногубицин, дефероксамин, дексаметазон, диклофенак, диэтилстилбестрол, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, эстрамустин, этопозид, экземестан, фексофенадин, флюдарабин, флюдрокортизон, фторурацил, флуоксиместерон, флутамид, гемцитабин, эпинефрин, ЬДопа, гидроксимочевина, идарубицин, ифосфамид, иматиниб, иринотекан, итраконазол, гозерелин, летрозол, лейковорин, левамизол, лизиноприл, левотироксин натрия, ломустин, мехлорэтамин, медроксипрогестерон, мегестрол, мелфалан, меркапропурин, метараминола битартрат, метотрексат, метоклопрамид, мексилетин, митомицин, митотан, митоксантрон, налоксон, никотин, нилутамид, октреотид, оксалиплатин, памидронат, пентостатин, пилкамицин, порфимер, преднизон, прокарбазин, прохлорперазин, ондансетрон, ралтитрексед, сиролимус, стрептозоцин, такролимус, тамоксифен, темозоломид, тенипозид, тестостерон, тетрагидроканнабинол, талидомид, тиогуанин, тиотепа, топотекан, третиноин, валрубицин, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин, доласетрон, гранисетрон; формотерол, флутиказон, леупролид, мидазолам, алпразолам, амфотерицин В, подофиллотоксины, нуклеозидные антивирусные соединения, ароил-гидразоны, суматриптан; макролиды, такие как эритромицин, олеандомицин, тролеандомицин, рокситромицин, кларитромицин, даверцин, азитромицин, флуритромицин, диритромицин, йозамицин, спиромицин, мидекамицин, лейкомицин, миокамицин, рокитамицин, андазитромицин и свинолид А; фторхинолоны, такие как ципрофлоксацин, офлоксацин, левофлоксацин, тровафлоксацин, алатрофлоксацин, моксифлоксацин, норфлоксацин, эноксацин, грепафлоксацин, гатифлоксацин, ломефлоксацин, спарфлоксацин, темафлоксацин, пефлоксацин, амифлоксацин, флероксацин, тосуфлоксацин, прулифлоксацин, ирлоксацин, пазуфлоксацин, клинафлоксацин и ситафлоксацин; аминогликозиды, такие как гентамизин, нетилмицин, парамицин, тобрамицин, амикацин, канамицин, неомицин и стрептомицин, ванкомицин, теикопланин, рамполанин, медипланин, колистин, даптомицин, грамицидин, колиситметат; полимиксины, такие как полимиксин В, капреомицин, бацитрацин, пенемы; пенициллины, включая чувствительные к пенициллиназе вещества, такие как пенициллин О, пенициллин V; устойчивые к пенициллиназе вещества, такие как метициллин, оксациллин, клоксациллин, диклоксациллин, флоксациллин, нафциллин; вещества, активные по отношению к грамотрицательным микроорганизмам, такие как ампициллин, амоксициллин и гетациллин, циллин и галампициллин; антипсевдомональные пенициллины, такие как карбенициллин, тикарциллин, азлоциллин, мезлоциллин и пиперациллин; цефалоспорины, такие как цефподоксим, цефпрозил, цефтибутен, цефтизоксим, цефтриаксон, цефалотин, цефапирин, цефалексин, цефрадрин, цефокситин, цефамандол, цефазолин, цефалоридин, цефаклор, цефадроксил, цефалоглицин, цефуроксим, цефорамид, цефотаксим, цефатризин, цефацетрил, цефепим, цефиксим, цефоницид, цефоперазон, цефотетан, цефинетазол, цефтазидим, лоракарбеф и моксалактам, монобактамы, как азтреонам; и карбапенемы, как имипенем, меропенем, пентамидин изетионат, альбутерол сульфат, лидокаин, метапротеренол сульфат, бекламетазона дипропионат, триамцинолона ацетамид, ацетонид будезонида, флутиказон, ипратропиум бромид, флунизолид, кромолин-натрий и эрготамина тартат; таксаны, такие как паклитаксель; §N-38 и тирфостины.
- 47 018222
Поэтому все химическое соединения, известные специалистам в данной области как низкомолекулярные (8ша11 шо1сси1с8), являются возможными биологически активными веществами в соответствии с настоящим изобретением. Термин низкомолекулярный (зша11 шо1сси1с) применительно к данному изобретению относится к биологически активному химическому соединению, отличному от протеина и олигонуклеотида, которое, однако, включает пептиды, содержащие до 50 аминокислот. Типичные примеры таких низкомолекулярных соединений перечислены в вышеприведенном параграфе.
Примерами олигонуклеотидов являются аптамеры и δΐΚΝΆ. Как возможные биологически активные вещества можно также упомянуть пептидно-нуклеиновые кислоты (ПНК).
В связи с этим настоящее изобретение также относится к вышеописанному способу и производному НА8, где протеин является эритропоэтином (ЕРО), таким как рекомбинантный человеческий ЕРО (гйЕРО), колониестимулирующим фактором (С8Р), таким как О-С8Р, как рекомбинантный человеческий О-С8Р (гЮ-С8Р), интерфероном (ΙΡΝ), таким как ΙΡΝ а1р1а, ΙΡΝ Ъс!а, ΙΡΝ дашша, как рекомбинантный человеческий ΙΡΝ а1р1а (γΗΙΡΝ а1р1а) или рекомбинантный человеческий ΙΡΝ Ъс!а (γΗΙΡΝ Ъс!а), фактором VII, таким как рекомбинантный человеческий фактор УПа (гйРУПа), фактором ΙΧ, таким как рекомбинантный человеческий фактор ΙΧ (γΗΡΙΧ), гормоном роста (ОН), таким как рекомбинантный человеческий гормон роста (гйОН), антисвязывающими доменами, такими как антисвязывающий домен, полученный из молекулы человеческого иммуноглобулина О (111 лЪ), иммуноглобулина О, такого как мышиный иммуноглобулин О (нйиС), глюкагоноподобным пептидом-1 (ОЬР-1), аспарагиназой, такой как рекомбинантная аспарагиназа (гАзрагадтазс), лептином, таким как рекомбинантый человеческий лептин (гйЕсрпп), интерлейкином-2, интерлейкином-11, альфа-1-антитрипсином, антителом или фрагментом антитела или альтернативным протеиновым каркасом.
Термин альтернативный протеиновый каркас применительно к контексту данного изобретения относится к молекуле, имеющей связывающие способности, подобные данному антителу, где молекула основана на протеиновом каркасе, альтернативном антителу. В данном контексте можно упомянуть статьи А. 8ксгга, Т. Нсу с! а1., апб Н.К. Вт/ (см. библиографический указатель, приведенный ниже).
Что касается биологически активных веществ (ВА), предлагаемых в настоящем изобретении, они могут включать одну или более аминогрупп для связывания в соответствии со стадией (и) изобретения. Для случаев, когда ВА как таковое не включает аминогруппу, подходящую для связывания, можно вводить по крайней мере одну такую аминогруппу в ВА соответствующей функционализацией посредством способов, известных специалистам в данной области, до обработки ВА на стадии (и).
В соответствии с вышеописанными биологически активными веществами, в частности, с вышеописанными предпочтительными биологически активными веществами и в соответствии с вышеописанными предпочтительными сшивающими соединениями и производными НА8, полученными из них, в качестве примера можно упомянуть следующие производные НА8 как нредночтитедьные варианты осуществления изобретения, где в каждом случае НА8, в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления, является НЕ8:
- 48 018222
- 49 018222
- 50 018222
где ВА' является протеином, более предпочтительно, где протеин является эритропоэтином (ЕРО), таким как рекомбинантный человеческий ЕРО (γΕΕΡΟ), колониестимулирующим фактором (С8Р), таким как С-С8Р, как рекомбинантный человеческий С-С8Р (гЬС-С8Р), интерфероном (ΙΡΝ), таким как ΙΡΝ а1рЬа, ΙΡΝ Ье1а, ΙΡΝ датта, как рекомбинантный человеческий ΙΡΝ а1рЬа (гЫЖ а1рЬа) или рекомбинантный человеческий ΙΡΝ Ье1а (гЫЖ Ье1а), фактором VII, таким как рекомбинантный человеческий фактор УПа (гЪТУПа), фактором IX, таким как рекомбинантный человеческий фактор IX (гЬИХ), гормоном роста (СИ), таким как рекомбинантный человеческий гормон роста (гЬСЫ), антисвязывающими доменами, такими как антисвязывающий домен, полученный из молекулы человеческого иммуноглобулина С (ЬРаЬ), иммуноглобулином С, таким как мышиный иммуноглобулин С (т^С), глюкагоноподобным пептидом-1 (СЬР-1), аспарагиназой, такой как рекомбинантная аспарагиназа (^Α8ра^ад^ηа8е), лептином, та
- 51 018222 ким как рекомбинантный человеческий лептин (гйЬерйп), интерлейкином-2, интерлейкином-11, альфа-1антитрипсином, антителом или фрагментом антитела или альтернативным протеиновым каркасом, в особенности, где протеином является ЕРО, ΙΕΝ а!р1та или О-С8Е.
Еще более предпочтительно, если НА8' является НЕ8', где еще более предпочтительно НЕ8 имеет среднюю молекулярную массу от примерно 1 до примерно 1000 кД, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 800 кД, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 500 кД, более предпочтительно от примерно 2 до примерно 400 кД, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 300 кД, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 200 кД, в особенности от примерно 50 до примерно 150 кД, молярное замещение от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,4 до 1,3, например 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 или 1,3, предпочтительно от 0,7 до 1,3, например 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, или 1,3, наиболее предпочтительно примерно 1,0, 1,1, 1,2 или 1,3 и соотношение молярного замещения С2 : С6 предпочтительно в диапазоне от 2 до 20, более предпочтительно в диапазоне от 2 до 15 и еще более предпочтительно в диапазоне от 3 до 12.
В соответствии с особо предпочтительными вариантами осуществления настоящее изобретение относится к производному НА8 формулы
где НА8 предпочтительно является НЕ8 и где еще более предпочтительно НЕ8 имеет среднюю молекулярную массу от примерно 1 до примерно 1000 кД, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 800 кД, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 500 кД, более предпочтительно от примерно 2 до примерно 400 кД, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 300 кД, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 200 кД, в частности от примерно 50 до примерно 150 кД, молярное замещение от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,4 до 1,3, например 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, или 1,3 и соотношение замещения С2 : С6 предпочтительно в диапазоне от 2 до 20, более предпочтительно в диапазоне от 2 до 15 и еще более предпочтительно в диапазоне от 3 до 12.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к производному НА8 формулы
где НА8 предпочтительно является НЕ8 и где еще более предпочтительно НЕ8 имеет среднюю молекулярную массу от примерно 1 до примерно 1000 кД, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 800 кД, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 500 кД, более предпочтительно от примерно 2 до примерно 400 кД, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 300 кД, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 200 кД, в особенности от примерно 50 до примерно 150 кД, молярное замещение от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,4 до 1,3, такое как 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0,
1,1, 1,2 или 1,3, и соотношение замещения С2: С6 предпочтительно в диапазоне от 2 до 20, более предпочтительно в диапазоне от 2 до 15 и еще более предпочтительно в диапазоне от 3 до 12.
В соответствии с другими особо предпочтительными вариантами осуществления настоящее изобретение относится к производному НА8 в соответствии с формулой
ОК., | ||||
н / 1 | [ | |||
НА8Ч | он | |||
н | н | |||
2 I | Ό-Ν. | /Ν-ССЗЕ' | ||
н | оя3 | н2 | С | |
н | 1 2 |
где НА8 предпочтительно является НЕ8 и где еще более предпочтительно НЕ8 имеет среднюю молекулярную массу от примерно 1 до примерно 1000 кД, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 800 кД, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 500 кД, более предпочтительно от примерно 2 до примерно 400 кД, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 300 кД, более пред
- 52 018222 почтительно от примерно 10 до примерно 200 кД, в особенности от примерно 50 до примерно 150 кД, молярное замещение от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,4 до 1,3, такое как 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0,
1,1, 1,2 или 1,3 и соотношение замещения С2 : С6 предпочтительно в диапазоне от 2 до 20, более предпочтительно в диапазоне от 2 до 15 и еще более предпочтительно в диапазоне от 3 до 12.
В соответствии с другими особо предпочтительными вариантами осуществления настоящее изобретение относится к производному НА8 в соответствии с формулой
ОК1 | ||||
Н | I | |||
НА8' х | З^ОН | |||
Х() \ | ||||
А----- Н | н | |||
2 - | /Ν- ΡνΐΓ | |||
н | ок3 | С н | ||
н | 2 |
где НА8 предпочтительно является НЕ8 и где еще более предпочтительно НЕ8 имеет среднюю молекулярную массу от примерно 1 до примерно 1000 кД, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 800 кД, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 500 кД, более предпочтительно от примерно 2 до примерно 400 кД, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 300 кД, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 200 кД, в особенности от примерно 50 до примерно 150 кД, молярное замещение от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,4 до 1,3, такое как 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0,
1,1, 1,2 или 1,3 и соотношение замещения С2 : С6 предпочтительно в диапазоне от 2 до 20, более предпочтительно в диапазоне от 2 до 15 и еще более предпочтительно в диапазоне от 3 до 12.
В соответствии с другими особо предпочтительными вариантами осуществления настоящее изобретение относится к производному НА8 в соответствии с формулой
где НА8 предпочтительно является НЕ8 и где еще более предпочтительно НЕ8 имеет среднюю молекулярную массу от примерно 1 до примерно 1000 кД, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 800 кД, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 500 кД, более предпочтительно от примерно 2 до примерно 400 кД, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 300 кД, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 200 кД, в особенности от примерно 50 до примерно 150 кД, молярное замещение от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,4 до 1,3, например 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0,
1,1, 1,2 или 1,3 и соотношение замещения С2: С6 предпочтительно в диапазоне от 2 до 20, более предпочтительно в диапазоне от 2 до 15 и еще более предпочтительно в диапазоне от 3 до 12.
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к производному НА8, включающему вышеописанное ВА', или производное НА8, включающее вышеописанное ВА', которое получают или которое можно получить вышеописанным способом и которое используется для лечения организма человека или животного.
Кроме того, настоящее изобретение относится к производному НА8, включающему вышеописанное ВА', которое получают или которое можно получить вышеописанным способом и которое используется в качестве терапевтического или профилактического вещества.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей в терапевтически эффективном количестве производное НА8, содержащее вышеописанное ВА', или производное НА8, содержащее вышеописанное ВА', которое получают или которое можно получить вышеописанным способом.
Производные НА8, предлагаемые в настоящем изобретении и включающие ВА', могут вводиться подходящими способами, такими как, например, энтеральный, парентеральный, ингаляционный, которые предпочтительно осуществляются внутривенно, подкожно или внутримышечно. Выбор конкретного способа будет зависеть от заболевания. Производные могут предпочтительно вводиться вместе с соответствующим носителем, известным специалистам в данной области (например, как применяется в биофармацевтических препаратах первого поколения или немодифицированных биофармацевтических препаратах, без альбумина или с альбумином в качестве наполнителя), подходящим разбавителем, таким как стерильные растворы для внутривенного, внутримышечного или подкожного применения. Требуемая доза будет зависеть от степени заболевания, индивидуальной реакции пациента, используемого способа введения и т.д. Стандартная подготовка позволит специалисту назначить конкретную дозу.
Что касается фармацевтических композиций по настоящему изобретению, включающих производ
- 53 018222 ное НА8, содержащее ВА', как описано выше, производные НА8 могут использоваться в сочетании с фармацевтическим наполнителем. Обычно производное НА8 будет находиться в твердой форме, которую можно соединить с подходящим фармацевтическим наполнителем, который может быть либо в твердой, либо в жидкой форме. В качестве наполнителей можно упомянуть карбогидраты, неорганические соли, антимикробные средства, антиоксиданты, поверхностно-активные соединения, буферы, кислоты, основания и их сочетания. В качестве наполнителя может присутствовать карбогидрат, такой как сахар, дериватизированный сахар, такой как альдит, альдоновая кислота, этерифицированный сахар и/или сахарный полимер. Конкретные карбогидратные наполнители включают, например, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, Ό-манноза, сорбоза и т.п.; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и т.п.; полисахариды, такие как рафиноза, мелезитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и т.п.; и альдиты, такие как маннитол, ксилит, мальтитол, лактитол, ксилит, сорбитол (глюцитол), пиранозил сорбитол, миоинозитол и т.п. Наполнитель может также включать неорганическую соль или буфер, например лимонную кислоту, хлорид натрия, хлорид калия, сульфат натрия, нитрат калия, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия и их сочетания. Фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может также включать антимикробное вещество для предотвращения или сдерживания микробного роста, такое как, например, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, бензиловый спирт, хлорид цетилпиридина, хлорбутанол, фенолэтиловый спирт, фенилртутьнитрат, тимерсол и их сочетания. Фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может также включать антиоксидант, такой как, например, аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, фосфорноватистая кислота, монотиоглицерин, пропилгаллат, бисульфит натрия, формальдегид-сульфоксилат натрия, метабисульфит натрия и их сочетания. Фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может также включать поверхностно-активное соединение, такое как, например, полисорбаты, или плюроновые сложные эфиры сорбитана; липиды, такие как фосфолипиды, как лецитин и другие фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины, кислоты и жирные сложные эфиры; стероиды, такие как холестерол, и хелатирующие вещества, такие как ΕΌΤΑ или цинк. Фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может также включать кислоты и основания, такие как, например, соляная кислота, уксусная кислота, фосфорная кислота, лимонная кислота, оксиянтарная кислота, молочная кислота, муравьиная кислота, трихлоруксусная кислота, азотная кислота, перхлорная кислота, фосфорная кислота, серная кислота, фумаровая кислота и их сочетания и/или гидроксид натрия, ацетат натрия, гидроксид аммония, гидроксид калия, ацетат аммония, ацетат калия, фосфат натрия, фосфат калия, цитрат натрия, формиат натрия, сульфат натрия, сульфат калия, фумерат калия и их сочетания.
Как правило, наполнитель будет присутствовать в фармацевтических композициях, предлагаемых в изобретении, в количестве от 0,001 до 99,999 мас.%, предпочтительно от 0,01 до 99,99 мас.%, еще более предпочтительно от 0,1 до 99,9 мас.%, в каждом случае рассчитанных относительно общей массы фармацевтической композиции.
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение также относится к использованию вышеописанного производного НА8, предпочтительно НЕ8, где ВА является ЕРО, для получения лекарственных средств для лечения анемий или дисфункций кроветворения, а также относящихся к ним заболеваний.
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение также относится к использованию вышеописанного производного НА8, предпочтительно НЕ8, где ВА является О-С8Е для получения лекарственного средства для лечения гемофилии А и для лечения нарушений, характеризующихся снижением кроветворной или иммунной функций. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления расстройство, характеризующееся снижением кроветворной или иммунной функции, является результатом химиотерапии, радиационной терапии, инфекционного заболевания, тяжелой хронической нейтропении или лейкемии.
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение также относится к использованию вышеописанного производного НА8, предпочтительно НЕ8, где ВА является ΓΡΝ а1рЬа. для получения лекарственного средства для лечения лейкемии, например лейкемии ворсинчатых клеток, хронической миелогенной лейкемии, множественной миеломы, фолликулярной лимфомы, рака, например карциноидной опухоли, злокачественной меланомы и гепатита, например хронического гепатита В и хронического гепатита С.
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение также относится к использованию вышеописанного производного НА8, предпочтительно НЕ8, где ВА является ΓΡΝ датта, для получения лекарственного средства для лечения остеопороза и/или хронического злокачественного заболевания.
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение также относится к использованию вышеописанного производного НА8, предпочтительно НЕ8, где ВА является Ш-2, для получения лекарственного средства для лечения остеопороза и/или хронического злокачественного заболевания.
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение также относится к использованию вышеописанного производного НА8, предпочтительно НЕ8, где ВА является ГЬ-11, для получения лекарственного средства для переливания тромбоцитов после терапии, направленной на подавление функ
- 54 018222 ции костного мозга.
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение также относится к использованию вышеописанного производного НА8, предпочтительно НЕ8, где ВА является А1АТ, для получения лекарственного средства для лечения эмфиземы, фиброзно-кистозной дегенерации, атопического дерматита и/или бронхита.
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение также относится к использованию вышеописанного производного НА8, предпочтительно НЕ8, где ВА является ГЕ\ Ье1а. для получения лекарственного средства для лечения рассеянного склероза, предпочтительно рецидивирующих форм рассеянного склероза.
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение также относится к использованию вышеописанного производного НА8, предпочтительно НЕ8, где ВА является фактором VII, для получения лекарственного средства для лечения кровотечений у страдающих гемофилией А или В ингибиторами Фактора VIII или Фактора IX.
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение также относится к использованию вышеописанного производного НА8, предпочтительно НЕ8, где ВА является фактором IX, для получения лекарственного средства для контроля и предотвращения кровотечения у пациентов, страдающих гемофилией В, например дефицитом врожденного фактора IX или болезнью Кристмаса, включая контроль и предотвращение кровотечения при хирургических вмешательствах.
Библиографический указатель
8оттегтеуег е! а1., 1987, Кгапкепйаикрйагта71е, 8(8), 271-278 \\е1б1ег е! а1., 1991, Аг7пе1тй!е1Гогксйипд/Пгид Кек., 41, 494-498
ЬЕ 2616086
8р1уак апб Нодапк, 1989, В1ооб 73, 90
МсМайоп е! а1., 1990, В1ооб 76, 1718 \\'О 94/28024 \\'О 02/080979 \О 03/074087 \О 03/074088 \О 2005/014024 \О 2005/092390 \О 2004/024777 \О 2004/024776 \О 2005/092928
И8 2006/0194940 А1
И8 7157546 В2
ЕР 1591467 А1 \О 2004/022630 А2
И8 6916962 В2
И8 6956135 В2 \О 03/049699 А2
И8 5990237
К1етт Ό. е! а1., Сотргейепщуе Се11и1оке СйетЫгу, уо1. 2, 1998, \Ы1еу^СН, \е1пйе1т, \ете Уогк, екрес1а11у сйар!ег 4.4, Ек!егШса!юп оГ Се11и1оке Ц8В\ 3-527-29489-9) \О 00/66633 А \О 00/18893 А
И8 4454161
ЕР 0418945 А
1Р 2001294601 А
И8 2002/065410 А
И8 6083909
А. 8кегга, Сигг Орт Мо1 Тйег. 9(4), 2007, рр. 336-344
Т. Неу е! а1., Тгепбк Вю1есЬпо1. 23 (10), 2005, рр. 514-522
Н.К. Вт/ е! а1., \а! Вю!есйпо1. 23 (10), 2005, рр. 1257-1268 \О 2005/083103 А1
К.К. Кеббу е! а1. Абуапсеб Эгид ЬеНуегу Кеу1е^к 54 (2002), рр. 571-586
Описание фигур
Фиг. 1: Анализ посредством электрофореза в ПААГ (8Ь8-РА6Е) реакции связывания охНЕ855/0,7Ш\а
Разделение выполнялось в восстановительных условиях с использованием системы \иРАСЕ Цпуе!годеп) с 4-12% гелями В1к-Тпк (1,0 мм) и буфера МОР8 Кипшпд ВиГГег в соответствии с инструкциями производителей.
Загрузка: 10 мкг протеина в качестве реакционной смеси.
- 55 018222
М: Маркер, Магк12 (1пу11годеп).
Полосы 1-4: реакционные смеси в соответствии с примером 2.
Успешное связывание с НЕЗ целевого протеина (19 кД) проявляется в виде размытой полосы с широким массовым распределением в диапазоне от 30 до >200 кД.
Фиг. 2: Анионообменная хроматография реакции связывания оxΗЕЗ55/0,7-IΓNа
Фиг. 2 показывает хроматографическое разделение, регистрируемое посредством спектроскопии в видимой и ультрафиолетовой областях света при 221 нм на ионообменной колонке, реакции связывания оxΗЕЗ55/0.7-IΓNа в соответствии с примером 2. Хроматография проводилась при следующих условиях:
Хроматографическая система: Ак1а Ехр1огег 100 (ОЕ Неа11Ьсаге).
Колонка: Н1 Тгар О НР 1 мл (ОЕ Неа11Ьсаге)
Элюент А: 10 мМ Тпз-С1, рН 8,0.
Элюент В: 10 мМ Тп§-С1, 0,5 М ΝηΠ, рН 8,0.
Режим работы: скорость потока 1 мл/мин, 21°С.
Параметры работы:
приведение в равновесие | ЮСУ | 0%В |
загрузка образца | ||
промывание | 2 СУ | 0%В |
элюирование | 16 СУ | 0-5 0%В |
регенерация | ЮСУ | 100%В |
повторное приведение в равновесие | 8 СУ | 0%В |
Загрузка: 2 мг протеина/мл смолы как реакционная смесь в соответствии с примером 2, 20-кратно разбавленная в Элюенте А и с рН, установленным на уровне 8,0.
В выходящем потоке обнаруживается непрореагировавший избыточный НЕЗ. Связывание с НЕЗ ослабляет взаимодействие протеина с колонкой, что приводит к снижению времени элюирования для коньюгата по сравнению с немодифицированным протеином.
Фиг. 3: Анализ посредством электрофореза в ПААГ (ЗЭЗ-РАОЕ) реакции связывания охНЕЗ55/0.7ЕР0
Фиг. 3 показывает анализ реакции связывания охНЕЗ55/0,7-ЕР0 в соответствии с примером 3 посредством электрофореза в ПААГ (ЗОЗ-РАОЕ).
Разделение выполнялось в восстановительных условиях с использованием системы NиРАОЕ (Ιηνΐ1годеп) с 4-12% гелями Βίδ-Τήδ (1,0 мм) и буфера М0РЗ Кшпппд Ви££ег в соответствии с инструкциями производителей. Загрузка: 10 мкг протеина в качестве реакционной смеси.
М: Маркер, Магк12 (ΙιινίΐΐΌμυιι).
Полоса 1: реакционная смесь в соответствии с примером 3.
Полоса 2: исходный материал ЕРО перед конъюгацией.
Успешное связывание с НЕЗ целевого протеина (~35-40 кД) проявляется в виде размытой полосы с широким массовым распределением в диапазоне от 55 до >200 кД.
Фиг. 4: Катионообменная хроматография реакции связывания охНЕЗ55/0,7-ЕР0
Фиг. 4 показывает хроматографическое разделение, регистрируемое посредством спектроскопии в видимой и ультрафиолетовой областях света при 221 нм на ионообменной колонке, реакции связывания охНЕЗ55/0.7-ЕР0 в соответствии с примером 3. Хроматография проводилась при следующих условиях:
Хроматографическая система: Ак1а Ехр1огег 100 (ОЕ Неа1!йсаге).
Колонка: ШТгар ЗР НР (ОЕ Неа1Шсаге).
Элюент А: 20 мМ ацетат натрия, рН 4,0.
Элюент В: 20 мМ ацетат натрия, 1М №С1, рН 4,0.
Режим работы: скорость потока 5 мл/мин, 21°С.
Параметры работы:
приведение в равновесие загрузка образца промывание 1 промывание 2 элюирование регенерация повторное приведение в равновесие
ЮСУ | 0%В |
2 СУ | 0%В |
2 СУ | 10%В |
21 СУ | 10-52%В |
8 СУ | 100%В |
5 СУ | 0%В |
Загрузка: 2 мг протеина/мл смолы как реакционная смесь в соответствии с примером 3, 10-кратно разбавленная в Элюенте А
В выходящем потоке обнаруживается непрореагировавший, избыточный НЕЗ. Связывание с НЕЗ ослабляет взаимодействие протеина с колонкой, что приводит к снижению времени элюирования для коньюгата по сравнению с немодифицированным протеином.
- 56 018222
Фиг. 5: Анализ посредством электрофореза в ПААГ (8Ό8-ΡΑΟΕ) реакции связывания охΗΕ8100/1,0-ΙΡΝα
Фиг. 5 показывает анализ электрофорезом в ПААГ (8Ό8-ΡΑΟΕ) реакции связывания οχΗΕ8-ΙΕΝα в соответствии с примером 5. Разделение выполнялось в восстановительных условиях с использованием системы ΝυΡΑΟΕ (ΙηνίΐΓΟβΘπ) с 4-12% гелями Βίδ-Τίίδ (1,0 мм) и буфера ΜΟΡ8 Випшпд Ви££ег в соответствии с инструкциями производителей.
Загрузка: 10 мкг протеина в качестве реакционной смеси.
М: Маркер, Магк12 (1п\'Игодеп).
полоса 1: реакционная смесь в соответствии с примером 5.
Успешное связывание с ΗΕ8 целевого протеина (19 кД) проявляется как расплывчатая полоса с широким массовым распределением в диапазоне от 50 до >200 кД.
Фиг. 6: Анионообменная хроматография реакции связывания οχΗΕ8100/1.0-ΙΕΝα
Фиг. 6 показывает хроматографическое разделение, регистрируемое спектроскопией в ультрафиолетовом и видимом свете при 221 нм на ионообменной колонке, реакции связывания οχΗΕ8100/1.0-ΙΕΝα в соответствии с примером 5. Хроматография проводилась при следующих условиях:
Хроматографическая система: Ак1а £хр1огег 100 (ΟΕ Ыеа11ксаге).
Колонка: Ηί Тгар О ΗΡ 5 т1 (ΟΕ Ηеа1ΐйса^е).
Элюент А: 10 мМ Тпз-С1, ρΗ 8,0.
Элюент В: 10 мМ Τπδ-Ο, 0,5 М №С1, ρΗ 8,0.
Режим работы: скорость потока 1 мл/мин, 21°С.
Параметры работы:
приведение в равновесие | ЮСУ | 0%В |
загрузка образца | ||
промывание | 2 СУ | 0%В |
элюирование | 12,5 СУ | 0-50%В |
регенерация | 5 СУ | 100%В |
повторное приведение в равновесие | 5 СУ | 0%В |
Загрузка: 2 мг протеина/мл смолы как реакционная смесь в соответствии с примером 5, 20-кратно разбавленная в Элюенте А, с рН, установленным на уровне 8,0.
В выходящем потоке обнаруживается непрореагировавший избыточный ΗΕ8.
Связывание с ΗΕ8 ослабляет взаимодействие протеина с колонкой, что приводит к снижению времени элюирования для коньюгата по сравнению с немодифицированным протеином.
Фиг. 7: Картирование пептидов коньюгата οχΗΕ8100/1,0-IЕNа
Фиг. 7 показывает хроматографическое разделение очищенного ионообменной хроматографией коньюгата οχΗΕ8-IЕNа в соответствии с примером 5, обработанного Επάο-ΕγδΟ
Протеолиз выполняли с использованием Επάο-^уδС в 50 мМ Τίίδ-Ο, рН 8,6, 0,01% 8Ό8 при 37°С о/п. Образцы денатурировали при помощи ΌΤΤ и хлоридов гуанидина и проанализировали ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке 4,6 х 250 мм ,1ирИег С4 со1итп ^йепотепех) посредством ΤΕΑ и при градиенте воды и ацетонитрила. Показанные хроматограммы регистрировались при 214 нм. Стрелка указывает на участки хроматограммы, где наблюдаются большие различия между хроматограммами для протеина (А) и для коньюгата. Пики для Е1 и Е1/Е2 (Ν-концевой пептид, полученный в результате обработки Επάο-^уδ С) значительно снижены для образца коньюгата, в то время как другие фрагменты практически не подверглись воздействию. Эти данные предполагают предпочтительное связывание ΗΕ8 с Ν-концом ΙΕΝ&
Фиг. 8: Анализ посредством электрофореза в ПААГ (8Ό8-ΡΑΟΕ) реакции связывания охΗΕ8100/1.0-ΕΡΟ
Фиг. 8 показывает анализ посредством электрофореза в ПААГ (8Ό8-ΡΑΟΕ) реакции связывания οχΗΕ8100/1.0-ΕΡΟ в соответствии с примером 6. Разделение выполняли в восстановительных условиях с использованием системы ΝυΡΑΟΕ οχΗΕ8 100/1.0-ЕРО (Юуйгодеп), 4-12% гелей Βίδ-Τίίδ (1,0 мм) и буфера ΜΟΡ8 Випшпд Ви££ег в соответствии с инструкциями производителей.
Загрузка: 10 мкг протеина в качестве реакционной смеси.
М: Маркер, Магк 12 (Ыуйгодеп).
Полоса 1:10 мкг исходного материала ЕРО до конъюгации.
Полоса 2: 5 мкг исходного материала ЕРО до конъюгации.
Полоса 3: реакционная смесь в соответствии с примером 6.
Успешное связывание с ΗΕ8 целевого протеина (~35-40 кД) проявляется в виде размытой полосы с широким массовым распределением в диапазоне от 70 до >200 кД.
Фиг. 9: Катионообменная хроматография реакции связывания οχΗΕ8100/1,0-ΕΡΟ
Фиг. 9 показывает хроматографическое разделение, регистрируемое посредством спектроскопии в ультрафиолетовом и видимом свете при 221 нм на ионообменной колонке, реакции связывания ох
- 57 018222
НЕ8100/1.0-ЕРО в соответствии с примером 6. Хроматография проводилась при следующих условиях: Хроматографическая система: Ак!а Ехр1огег 100 (ОЕ НеаЙНсаге).
Колонка: 2х 5 мл НгТгар 8Р НР (ОЕ НеаИЪсаге).
Элюент А: 20 мМ ацетат натрия, рН 4,0.
Элюент В: 20 мМ ацетат натрия, 1М №С1, рН 4,0.
Режим работы: скорость потока 5 мл/мин, 21°С.
Параметры работы:
приведение в равновесие | ЮСУ | 0%В |
загрузка образца | ||
промывание 1 | 2 СУ | 0%В |
промывание 2 | 2 СУ | 10%В |
элюирование | 21 СУ | 10-52%В |
регенерация | 2.5 СУ | 100%В |
повторное приведение в равновесие | 5 СУ | 0%В |
Загрузка: 2 мг протеина/мл смолы как реакционная смесь в соответствии с примером 6, 10-кратно разбавленная в Элюенте А
В выходящем потоке обнаруживается непрореагировавший избыточный НЕ8. Связывание с НЕ8 ослабляет взаимодействие протеина с колонкой, что приводит к снижению времени элюирования для коньюгата по сравнению с немодифицированным протеином.
Фиг. 10: Анализ посредством электрофореза в ПААГ (8О8-РАОЕ) реакции связывания охНЕ8100/1.0-О-С8Г
Фиг. 10 показывает анализ посредством электрофореза в ПААГ (8О8-РАОЕ) реакции связывания охНЕ8100/1.0-О-С8Г в соответствии с примером 7.
Разделение выполнялось в восстановительных условиях с использованием системы №РАОЕ ^ηνί(годеп), 4-12% гелей В18-Тп8 (1,0 мм) и буфера МОР8 Кипшпд Вийег в соответствии с инструкциями производителей.
Загрузка: 10 мкг протеина в качестве реакционной смеси.
М: Маркер, Магк12 (1пт11годеп).
Полоса 1: реакционная смесь в соответствии с примером 7.
Полоса 2: исходный материал О-С8Г до коньюгации.
Успешное связывание с НЕ8 целевого протеина (~18 кД) проявляется в виде размытой полосы с широким массовым распределением в диапазоне от 50 до >200 кД.
Фиг. 11: Анализ посредством ВЭЖХ с обращенной фазой реакции связывания охНЕ8100/1.0-О-С8Г
Фиг. 11 показывает часть анализа реакции связывания охНЕ8100/1.0-О-С8Г в соответствии с примером 7 посредством ВЭЖХ с обращенной фазой, регистрируемого посредством спектроскопии в ультрафиолетовом и видимом свете при 221 нм.
Хроматография выполнялась при следующих условиях:
Хроматографическая система: 8иттй, Р580 (НРО) (Оюпех).
Колонка: ,Ιιιρίΐο С18, 300А, 5 мкг, 4,6 х 150 мм (Рйепотепех).
Элюент А: 0,1% трифторуксусная кислота в воде.
Элюент В: 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитрите.
Режим работы: скорость потока 1 мл/мин, 20°С.
Градиент: 0-5 мин, 5-55%В; 5-12 мин, 55-68%В; 12-17 мин, 100%В; 17-22 мин, 5% В; задержка градиента 2,5 мин.
Загрузка: 10 мгк протеина как реакционная смесь, разбавленная в воде до концентрации протеина, равной 0,1 мг/мл.
Главным пиком при 11,5 мин является коньюгат НЕ8 и протеина, отделенный от свободного ОС8Г, элюирующего при ~13 тт.
Фиг. 12. Анализ посредством электрофореза в ПААГ (808-Раде) реакции связывания НЕ8100/1.0та
Фиг. 12 показывает анализ посредством электрофореза в ПААГ (8О8-РАОЕ) реакции связывания НЕ8-ГГ№ в соответствии с примером 10. Разделение выполняли в восстановительных условиях с использованием системы №РАОЕ (ЗптЧгодеп), 4-12% гелей Βίδ-Τηζ (1,0 мм) и буфера МОР8 Кипшпд ВиГГег в соответствии с инструкциями производителей.
Загрузка: 10 мкг протеина в качестве реакционной смеси.
М: Маркер, неокрашенный маркер протеина 5-200 кД (8егуа).
Полоса 1: реакционная смесь в соответствии с примером 9.
Успешное связывание с НЕ8 целевого протеина (19 кД) проявляется в виде размытой полосы с широким массовым распределением в диапазоне от 50 до >200 кД.
- 58 018222
Фиг. 13: Анионообменная хроматография реакции связывания ΗΕ8100/1,0-IΕ\а
Фиг. 13 показывает хроматографическое разделение, регистрируемое спектроскопией в ультрафиолетовом и видимом свете при 221 нм на ионообменной колонке, реакции связывания ΗΕ8100/1.0-IΕ\а в соответствии с примером 10. Хроматография проводилась при следующих условиях:
Хроматографическая система: Ак1а Ехр1огег 100 (СЕ Ηеа1ίйса^е).
Колонка: 5 т1 ШТгар 8Р ΗΡ (СЕ Ηеа1ίйса^е).
Элюент А: 20 мМ ацетат натрия, рН 4,0.
Элюент В: 20 мМ ацетат натрия, 1М №С1, рН 4,0.
Режим работы: скорость потока 5 мл/мин, 21°С.
Параметры работы:
приведение в равновесие | ЮСУ | 0%В |
загрузка образца | ||
промывание 1 | 2 СУ | 0%В |
элюирование | 20 СУ | 0-50%В |
регенерация | ЮСУ | 100%В |
повторное приведение в равновесие | 5 СУ | 0%В |
Загрузка: 3 мг протеина/мл смолы как реакционная смесь в соответствии с примером 9, 10-кратно разбавленная в Элюенте А
В выходящем потоке обнаруживается непрореагировавший избыточный ΗΕ8. Связывание с ΗΕ8 ослабляет взаимодействие протеина с колонкой, что приводит к снижению времени элюирования для коньюгата по сравнению с немодифицированным протеином.
Фиг. 14: Анализ посредством электрофореза в ПААГ (8Ώ8-ΡΑΘΕ) реакции связывания ΗΕ8100/1.0ΕΡΟ
Фиг. 14 показывает анализ посредством электрофореза в ПААГ (8Ώ8-ΡΑΘΕ) реакции связывания ΗΕ8100/1.0-ΕΡΟ в соответствии с примером 11. Разделение выполняли в восстановительных условиях, используя систему ΝηΡΑΘΕ (Юуйгодеп) с 4-12% гелями Βΐδ-Τπδ (1,0 мм) и буфером ΜΟΡ8 Киппшд Вийег в соответствии с инструкциями производителей.
Загрузка: 10 мкг протеина в качестве реакционной смеси.
М: Маркер, Магк12 (Юуйгодеп).
Полоса 1: коньюгат ΗΕ8 и ЕРО, очищенный ионной хроматографией.
Полоса 2: реакционная смесь в соответствии с примером 11.
Полоса 3: 5 мкг исходного материала ЕРО до конъюгации.
Успешное связывание с ΗΕ8 целевого протеина (~35-40 кД) проявляется в виде размытой полосы с широким массовым распределением в диапазоне от 70 до >200 кД.
Фиг. 15: Катионообменная хроматография реакции соединения ΗΕ8100/1.0-ΕΡΟ
Фиг. 15 показывает хроматографическое разделение, регистрируемое спектроскопией в ультрафиолетовом и видимом свете при 221 нм на ионообменной колонке, реакции связывания ΗΕ8100/1.0-ΕΡΟ в соответствии с примером 11. Хроматография проводилась при следующих условиях:
Хроматографическая система: Ак1а Нхр1огег 100 (ΘΕ Ηеа1ίйса^е).
Колонка: 4 х 5 мл ШТгар 8Р ΗΡ (ΘΕ Меа1(Ьсаге).
Элюент А: 20 мМ ацетат натрия, рН 4,0.
Элюент В: 20 мМ ацетат натрия, 1М №С1, рН 4,0.
Режим работы: скорость потока 5 мл/мин, 21°С.
Параметры работы:
Приведение в равновесие | 5 СУ | 0%В |
Загрузка образца | ||
Промывание 1 | 2 СУ | 0%В |
элюирование | 13 СУ | 0-52%В |
регенерация | 2.5 СУ | 100%В |
повторное приведение в равновесие | 2.5 СУ | 0%В |
Загрузка: 3 мг протеина/мл смолы как реакционная смесь в соответствии с примером 11,2-кратно разведенная в Элюенте А.
В выходящем потоке обнаруживается непрореагировавший избыточный ΗΕ8. Связывание с ΗΕ8 ослабляет взаимодействие протеина с колонкой, что приводит к снижению времени элюирования для коньюгата по сравнению с немодифицированным протеином.
Фиг. 16: Анализ посредством электрофореза в ПААГ (8Ώ8-ΡΑΘΕ) реакции связывания ΗΕ8100/1.0С-С8Г
Фиг. 16 показывает анализ посредством электрофореза в ПААГ (8Ώ8-ΡΑΘΕ) реакции связывания I ΙΕ8100/1.0-ϋ-(''8Ι; в соответствии с примером 12. Разделение выполняли в восстановительных условиях,
- 59 018222 используя систему ХиРАОЕ (ΙηνίΐΓΟββπ) с 4-12% гелями Βίδ-Τπδ (1,0 мм) и буфером МОР8 Киишид Бийег в соответствии с инструкциями производителей.
Загрузка: 10 мкг протеина в качестве реакционной смеси.
М: Маркер, Магк12 (Iиν^ΐ^одеи).
Полоса 1: коньюгат НЕ8 О-С8Е, очищенный ионной хроматографией.
Полоса 2: реакционная смесь в соответствии с примером 12.
Полоса 3: 5 мкг исходного материала О-С8Е до конъюгации.
Успешное связывание с НЕ8 целевого протеина (~18 кД) проявляется в виде размытой полосы с широким массовым распределением в диапазоне от 50 до >200 кД.
Фиг. 17: Анализ посредством анализа ВЭЖХ с обращенной фазой реакции связывания НЕ8100/1.0О-С8Е
Фиг. 17 показывает часть анализа реакции связывания НЕ8100/1.0-О-С8Е в соответствии с примером 12 посредством ВЭЖХ с обращенной фазой, регистрируемого спектроскопией в ультрафиолетовом и видимом свете при 221 нм.
Хроматографии проводилась при следующих условиях:
Хроматографическая система: 8ишшй, Р580 (НРО) (Бюиех).
Колонка: .кфПег С18, 300А, 5 мкг, 4,6 х 150 мм (Рйеиошеиех).
Элюент А: 0,1% трифторуксусная кислота в воде.
Элюент В: 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле.
Режим работы: скорость потока 1 мл/мин, 20°С.
Градиент: 0-5 мин, 5-55%В; 5-12 мин, 55-68%В; 12-17 мин, 100%В; 17-22 мин, 5%В; задержка градиента 2,5 мин.
Загрузка: 10 мгк протеина как реакционная смесь, разведенная в воде до концентрации протеина, равной 0,1 мг/мл.
Главным пиком при 10-10,5 мин является коньюгат НЕ8 и протеина, отделенный от свободного ОС8Е, элюирующего при ~12 мин.
Фиг. 18: Катионообменная хроматография реакции связывания НЕ8100/1.0-О-С8Е
Фиг. 18 показывает хроматографическое разделение, регистрируемое посредством спектроскопии в ультрафиолетовом и видимом свете при 221 нм на ионообменной колонке, реакции связывания НЕ8100/1.0-О-С8Е в соответствии с примером 12. Хроматография проводилась при следующих условиях:
Хроматографическая система: Ак1а Ехр1огег 100 (ОЕ Неа11йеаге).
Колонка: 2 х 5 мл ЫТгар 8Р НР (ОЕ Неа11йеаге).
Элюент А: 20 мМ ацетат натрия, рН 4,0.
Элюент В: 20 мМ ацетат натрия, 1М ХаС1, рН 4,0.
Режим работы: скорость потока 5 мл/мин, 21°С.
Параметры работы:
приведение в равновесие | 5 СУ | 0%В |
загрузка образца | ||
промывание | 2 СУ | 0%В |
элюирование | 15 СУ | 0-40%В |
регенерация | 5 СУ | 100%В |
повторное приведение в равновесие | 5 СУ | 0%В |
Загрузка: 3 мг протеина/мл смолы как реакционная смесь в соответствии с примером 12, 2-кратно разведенная в Элюенте А.
В выходящем потоке обнаруживается непрореагировавший избыточный НЕ8. Связывание с НЕ8 ослабляет взаимодействие протеина с колонкой, что приводит к снижению времени элюирования для коньюгата по сравнению с немодифицированным протеином.
На фиг. 19-23 даются ссылки в контексте соответствующих примеров.
Фиг. 24
Фиг. 24 показывает часть анализа реакции связывания охНБ8-Б8А в соответствии с дополнительными данными (А.2) посредством ВЭГХ, регистрируемого спектроскопией в ультрафиолетовом и видимом свете при 280 нм.
Хроматография проводилась при следующих условиях:
Хроматографическая система: 8ЫшаЙ8и ЬС10 АО/ иУ-Ое!ек1ог: Т8Р υν 2000
Колонка: 8ирегозе 6 10/300 ОЬ (Рйагшае1а).
Элюент: Фосфатный буфер: (3,887 г Ха2НРО4 х 2 Н2О, 1,967 г ХаН2РО4 х 2 Н2О, 11,688 г ХаС1, 0,05 г \'а\3 растворили в воде для проведения хроматографии (Кеадеи! Рйагшакороеа Еигораеа) до достижения общего объема 1,0 л. Раствор отфильтровали, используя фильтр на 0,45 мкм)
- 60 018222
Режим работы: скоростъ потока 0,4 мл/мин, 20°С.
Загрузка: 0,9 мг протеина, растворенного в 100 мкл до концентрации протеина, равной 9 мг/мл - в качестве реакционной смеси.
Верхняя частъ показывает исходный материал ΒδΑ до реакции связывания. Слева направо пики при 38,038, 39,277 и 42,272.
Нижняя частъ показывает конъюгат ΗΒδ-ΒδΑ. Слева направо пики при 36,795, 39,345 и 41,521.
Фиг. 25: Анализ реакции связывания οχΗΒδ-ΓΡΝα посредством электрофореза в ПААГ (δΌδ-ΡΑΟΕ)
Фиг. 25 показывает анализ посредством электрофореза в ПААГ (δΌδ-ΡΑΟΕ) реакции связывания οχΗΒδ-ΓΡΝα в соответствии с дополнительными данными (А.3) Разделение выполнялосъ в восстановителъных условиях с использованием системы ΝπΡΑΟΕ Цпуйгодеп), 4-12% гелей Βίδ-Ττίδ (1,0 мм) и буфера ΜΟΡδ Киппгпд ΒοΒόγ в соответствии с инструкциями производителей.
Загрузка: 10 мкг протеина в качестве реакционной смеси.
М: Маркер, Магк12 (Ыуйгодеп).
Полосы 1-4: реакционные смеси в соответствии с доπолнительными данными (А.3).
Успешное связывание с ΗΒδ целевого протеина (19 кД) проявляется в виде размытой полосы с широким массовым распределением в диапазоне от 30 до >200 кД.
Фиг. 26: Анионообменная хроматография реакции связывания οχΗΒδ-ΓΡΝα
Фиг. 26 показывает хроматографическое разделение, регистрируемое посредством спектроскопии в видимой и улътрафиолетовой областях света при 221 нм на ионообменной колонке, реакции связывания οχΗΒδ-ΓΡΝα в соответствии с дополнительными данными (А.3). Хроматография проводиласъ при следующих условиях:
Хроматографическая система: Ак1а ΕχρΙοιχτ 100 (ΟΕ Ηеа1ΐйса^е).
Колонка: Ηί Тгар О ΗΡ 1 мл (ΟΕ Ηеа1ΐйса^е).
Элюент А: 10 мМ ΤτίδΌ, ρΗ 8,0.
Элюент В: 10 мМ Тгш-С1, 0,5 Μ №С1, ρΗ 8,0.
Режим работы: скоростъ потока 1 мл/мин, 20°С.
Параметры работы:
Приведение в равновесие | ЮСУ | 0%В |
Загрузка образца | ||
промывание | 2 СУ | 0%В |
элюирование | 16 СУ | 0-50%В |
регенерация | ЮСУ | 100%В |
повторное приведение в равновесие | 8 СУ | 0%В |
Загрузка: реакционная смесъ в соответствии с примером 3, 20-кратно разведенная в Элюенте А с рН, установленным на уровне 8,0.
В выходящем потоке обнаруживается непрореагировавший, избыточный ΗΒδ. Связывание с ΗΒδ ослабляет взаимодействие протеина с колонкой, что приводит к снижению времени элюирования для конъюгата по сравнению с немодифицированным протеином.
Фиг. 27. Анализ посредством анализа электрофорезом в ПААГ (δΌδ-ΡΑΟΕ) реакции связывания οχΗΒδ-ΕΡΟ
Фиг. 27 показывает анализ посредством электрофореза в ПААГ (δΌδ-ΡΑΟΕ) реакции связывания οχΗΒδ-ΕΡΟ в соответствии с дополнительными данными (А.4). Разделение выполняется в восстановителъных условиях с использованием системы ΝπΡΑΟΕ (Iην^ί^οβеη), 4-12% гелей Βίδ-Ττίδ (1,0 мм) и буфера ΜΟΡδ Киппгпд ΒπίΪΘΓ в соответствии с инструкциями производителей.
Загрузка: 10 мкг протеина в качестве реакционной смеси.
М: Маркер, ΜαιΊχ12 (Ыуйгодеп).
Полоса 1: реакционная смесъ в соответствии с доπолнительными данными (А.4).
Полоса 2: исходный материал ЕРО до конъюгации.
Успешное связывание с ΗΕδ целевого протеина (~35-40 кД) проявляется в виде размытой полосы с широким массовым распределением в диапазоне от 45 до >200 кД.
Фиг. 28: Анализ посредством ВЭЖХ с обращенной фазой реакции связывания с использованием ΗΕδ100/1.0, связывающего соединения (а2) и (Тгр4)-КетрЦ0е
Фиг. 28 показывает частъ анализа посредством ВЭЖХ с обращенной фазой реакции связывания с использованием ΗΕδ 100/1.0, связующего соединения (а2) и (Тгр4)-КетрЦ0е в соответствии с примером 18, табл. 3, регистрируемого спектроскопией в улътрафиолетовом и видимом свете при 221 нм.
Хроматография проводиласъ при следующих условиях:
Хроматографическая система: δΐιιιηαόζιι ЬС 20 Ρ^οт^ηеηсе, ЬС 20ΑΤ (Ι.ΡΟ) (ЗЫта^аф
Колонка: Зирйег С18, 300Α, 5 мкм, 4,6 х 150 мм (Ρйеηοтеηеx).
Элюент А: 0,1% трифторуксусная кислота в воде.
Элюент В: 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле.
- 61 018222
Режим работы: скорость потока 1 мл/мин, 20°С.
Градиент: 0-15 мин, 2-30%В; 15-20 мин, 30-98%В; 20-27 мин, 2%В.
Загрузка: 5 мкг протеина как реакционная смесь, разбавленная в воде до концентрации протеина, равной 0,05 мг/мл.
Главным пиком при 11,5-15 мин является коньюгат НЕ8 и пептида, отделенного от свободного (Тгр4)-Кетрйбе, элюирующего при ~17 мин.
Фиг. 29: Анализ посредством ВЭЖХ с обращенной фазой реакции связывания с использованием НЕ8100/1.0, связующего соединения (а16) и (Тгр4)-Кетрббе
Фиг. 29 показывает часть анализа посредством ВЭЖХ с обращенной фазой реакции связывания с использованием НЕ8 100/1,0, связующего соединения (а16) и (Тгр4)-Кетрббе в соответствии с примером 18, табл. 5, строка 13, регистрируемого спектроскопией в ультрафиолетовом и видимом свете при 221 нм.
Хроматография проводилась при следующих условиях:
Хроматографическая система: δΐιίιηαάζιι ЬС 20 Рготшепсе, ЬС 20АТ (ЬРС) (Ыитабхи).
Колонка: 1ирйег С18, 300А, 5 мкм, 4,6 х 150 мм (РЕепотепех).
Элюент А: 0,1% трифторуксусная кислота в воде.
Элюент В: 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле.
Режим работы: скорость потока 1 мл/мин, 20°С.
Градиент: 0-15 мин, 2-30%В; 15-20 мин, 30-98%В; 20-27 мин, 2%В.
Загрузка: 5 мкг протеина как реакционная смесь, разведенная в воде до достижения концентрации протеина, равной 0,05 мг/мл.
Главным пиком при 11,5-15 мин является коньюгат НЕ8 и пептида, отделенный от свободного (Тгр4)-Кетрйбе, элюирующего при ~17 мин.
Фиг. 30: Анализ посредством ВЭЖХ с обращенной фазой реакции связывания с использованием НЕ8100/1.0, связующего соединения (а11) и (Тгр4)-Кетрйбе
Фиг. 30 показывает часть анализа посредством ВЭЖХ с обращенной фазой реакции связывания с использованием НЕ8100/1.0, связующего соединения (а11) и (Тгр4)-Кетрйбе в соответствии с примером 18, табл. 5, строка 24, регистрируемого спектроскопией в ультрафиолетовом и видимом свете при 221 нм. Хроматография проводилась при следующих условиях:
Хроматографическая система: δй^таάζи ЬС 20 Рготшепсе, ЬС 20АТ (ЬРС) (8й^таάζи).
Колонка: 1ирйег С18, 300А, 5 мкм, 4,6 х 150 м (РЕепотепех).
Элюент А: 0,1% трифторуксусной кислоты в воде.
Элюент В: 0,1% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле.
Режим работы: скорость потока 1 мл/мин, 20°С.
Градиент: 0-15 мин, 2-30%В; 15-20 мин, 30-98%В; 20-27 мин, 2%В.
Загрузка: 5 мкг протеина как реакционная смесь, разбавленная в воде до концентрации протеина, равной 0,05 мг/мл.
Основным пиком при 11,5-15 мин является коньюгат НЕ8 и Пептида, отсепарированный от свободного (Тгр4)-Кетрйбе, элюирующего при ~17 мин.
Фиг. 31: Анализ посредством ВЭЖХ с обращенной фазой реакции связывания с использованием НЕ8100/1.0, связующего соединения (а12)и (Тгр4)-Кетрйбе
Фиг. 31 показывает часть анализа посредством ВЭЖХ с обращенной фазой реакции связывания с использованием НЕ8100/1.0, связующего соединения (а12) и (Тгр4 )-Кетрйбе в соответствии с примером 18, табл. 5, строка 30, регистрируемого спектроскопией в ультрафиолетовом и видимом свете при 221 нм. Хроматография проводилась при следующих условиях:
Хроматографическая система: 81ιίιη;·ιάζιι ЬС 20 Рготшепсе, ЬС 20АТ, (ЬРС) (δЫтаάζи).
Колонка: 1ирйег С18, 300А, 5 мкм, 4,6 х 150 мм (РЕепотепех).
Элюент А: 0,1% трифторуксусная кислота в воде.
Элюент В: 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле.
Режим работы: скорость потока 1 мл/мин, 20°С.
Градиент: 0-15 мин, 2-30%В; 15-20 мин, 30-98%В; 20-27 мин, 2%В.
Загрузка: 5 мкг протеина как реакционная смесь, разбавленная в воде до достижения концентрации протеина, равной 0,05 мг/мл.
Главным пиком при 11,5-15 мин является коньюгат НЕ8 и Пептида, отделенного от свободного (Тгр4)-Кетрйбе, элюирующего при ~17 мин.
Фиг. 32: Анализ посредством электрофореза в ПААГ (δΌδ-РАСЕ) реакции связывания НЕ8100/1.0С-С8Е
Фиг. 32 показывает анализ посредством электрофореза в ПААГ (δΌδ-РАСЕ) реакции связывания НЕ8100/1.0-С-С8Г в соответствии с примером 18. Разделение проводилось в восстановительных условиях с использованием системы NиРАСЕ Цпуйгодеп), 4-12% гелей Вк-Тгк (1,0 мм) и буфера ΜЕδ Випшпд ВиГГег в соответствии с инструкциями производителей М: Маркер, Магк12 Цпуйгодеп).
- 62 018222
Полоса 1: реакционная смесь в соответствии с табл. 5, строка 7 (загружено 10 мкг протеина).
Полоса 2: реакционная смесь в соответствии с табл. 5, строка 16 (загружено 10 мкг протеина).
Полоса 3: реакционная смесь в соответствии с табл. 5, строка 27 (загружено 10 мкг протеина).
Полоса 4: реакционная смесь в соответствии с табл. 5, строка 33 (загружено 10 мкг).
Полоса 5: 0,5 мкг исходного материала Г11С-08Е до конъюгации.
Успешное связывание с НЕ8 целевого протеина (~18 кД) проявляется в виде размытой полосы с широким массовым распределением в диапазоне от 50 до >200 кД.
Фиг. 33: Анализ посредством электрофореза в ПААГ (8Э8-РАСЕ) реакции связывания НЕ8100/1.0ΙΕ№ и НЕ8100/1.0-ЕРО
Фиг. 33 показывает анализ посредством электрофореза в ПААГ (8Э8-РАСЕ) реакции связывания между НЕ8100/1.0 и γΙιΙΕΝπ или гйЕРО в соответствии с примером 18. Разделение выполнялось в восстановительных условиях с использованием системы NиРА6Е (1пуйгодеп), 4-12% гелей Βίδ-Τήδ (1,0 мм) и буфера МОР8 Киппшд ВиГГег в соответствии с инструкциями производителей. Для разделения электрофорезом, показанного справа, вместо буфера МОР8 использовался буфер МЕ8.
Типичная загрузка: 10 мкг протеина либо в качестве исходного материла, либо в качестве реакционной смеси. М: Маркер, Магк12 (1пуйгодеп).
Полоса 1: реакционная смесь в соответствии с табл. 5, строка 4.
Полоса 2: реакционная смесь в соответствии с табл. 5, строка 14.
Полоса 3: реакционная смесь в соответствии с табл. 5, строка 25.
Полоса 4: реакционная смесь в соответствии с табл. 5, строка 31.
Полоса 5: исходный материал γΙιΙΕΝπ до коньюгации.
Успешное связывание с НЕ8 целевого протеина (~19 кД) проявляется как размытая полоса с широким массовым распределением в диапазоне от 50 до >200 кД.
Полоса 6: реакционная смесь в соответствии с табл. 5, строка 15.
Полоса 7: реакционная смесь в соответствии с табл. 5, строка 5.
Полоса 8: реакционная смесь в соответствии с табл. 5, строка 32.
Полоса 9: исходный материал гйЕРО до коньюгации.
Полоса 10: реакционная смесь в соответствии с табл. 5, строка 26.
Успешное связывание с НЕ8 целевого протеина (~35-40 кД) проявляется как размытая полоса с широким массовым распределением в диапазоне от 60 до 200 кД.
Примеры
Пример 1. Получение охНЕ855/0.7-№(3-Пропиоальдегид-диэтилацеталя)
НЕ8 в форме альдоновой кислоты (окисленный НЕ8) синтезировали, как описано в примере 9 \УО 2005/083103 А (в данном документе получение описано для сильноразветвленного крахмала, НВ8), начиная с НЕ8 с молекулярной массой 55 кД и молярным замещением 0,7 (НЕ855/0.7).
г охНЕ8 55/0.7, подвергавшегося сушке в течение 2 дней при 80°С, растворили в 60 мл сухого диметилформамида (ΌΜΕ) и раствор нагрели до 70°С. Добавили 25 г 1-амино-3,3-диэтоксипропана в 50 мл сухого ΌΜΕ и нагревали реакционную смесь при 70°С в течение 48 ч.
ΌΜΕ и избыток 1-амино-3,3-диэтоксипропана удалили при 60-80°С вакуумизацией, используя роторный испаритель. Твердый остаток промывали ацетоном до исчезновения цвета в промывочном растворе. Затем продукт растворили в 500 мл воды и очистили ультрафильтрацией, используя мембрану с границей пропускания 10 тыс. дальтон. Когда рН ретентата достигло значения 6-7, его довели до значения 9, используя 0,1 М раствор гидроксида натрия. Эту процедуру повторили 4 раза. После этого продукт лиофилизировали.
Пример 2. Получение коньюгата охНЕ8 55/0.7 1п1егГегоп а1рНа 2Ь (ΙΕΝα)
К 400 мг ацеталя, полученного в примере 1, добавили нужное количество 10 мМ НС1 и получили раствор с концентрацией 40% (мас./об.). Раствор инкубировали при перемешивании при 21°С в течение 24 ч для снятия защиты с альдегидной функции. Добавив 0,1 М №ОН, установили значение рН на уровне значения, используемого в буфере конъюгации.
Интерферон-альфа (рекомбинантый человеческий интерферон а1рйа-2Ь, изготовленный по технологии рекомбинантной ДНК с использованием ЕксйепсЫа сой (Е. сой), состоящий из 165 аминокислот и представляющий аминокислотную последовательность, идентичную природному человеческому интерферону а1рНа-2Ь (ЫЕ№а1рйа-2Ь)), сконцентрировали до 16 мг/мл и перенесли в подходящий буфер конъюгации (0,1 М ацетат натрия, рН 4,0), используя устройства для ультрафильтрации.
В реакционной смеси с концентрацией протеина 6 мг/мл использовали 10-кратный избыток охНЕ8 альдегида (исходя из Μν); концентрация охНЕ8 альдегида составила 20% (мас./об.). охНЕ8 альдегид со снятой защитой соединили с раствором протеина и, добавив свежеприготовленный раствор NаСNΒНз (0,5 мМ в буфере конъюгации), начали реакцию восстановительного аминирования для получения конечной концентрации восстанавливающего агента 20 мМ. После тщательного перемешивания реакцию инкубировали о/п при 10°С. Реакционные смеси проанализировали посредством электрофореза в ПААГ (8Э8-РАСЕ) (фиг. 1) и хроматографией с обращенной фазой на колонке С18 (Рйепошепех, 1ирйег), чтобы
- 63 018222 подтвердить успешное связывание и определить выход коньюгата. Элюирование проводилось с использованием градиента кислой воды/ацетонитрила с 0,1% ТРА.
Связанный с НЕ8 интерферон-а1рйа отделили от непрореагировавших соединений посредством анионообменной хроматографии, используя колонку О НР на системе Ак!а (СЕ НсаИЪсатс). Элюент А был представлен 10 мМ Тп5-С1, рН 8,0, Элюент В был представлен 10 мМ Тп5-С1, 0,5 М КаС1, рН 8,0. Градиент для разделения коньюгата и немодифицированного протеина составлял 0% В => 50% В в 16 СУ (фиг. 2).
Пример 3. Получение коньюгатов охНЕ8 55/0.7 Егу1йгоро1сйп (ЕРО)
К 400 мг ацеталя, полученного в примере 1, добавили нужное количество 10 мМ НС1 и получили раствор с концентрацией 40% (мас./об.). Раствор инкубировали при перемешивании при 21°С в течение 24 ч для снятия защиты с альдегидной функции. Добавив 0,1 М №1ОН, установили значение рН на уровне значения, используемого в буфере конъюгации.
ОхНЕ8-альдегид со снятой защитой соединили с ЕРО (рекомбинантным человеческим ЕРО, имеющим аминокислотную последовательность человеческого ЕРО и в основном те же характеристики, что и имеющийся в продаже раствор Егуро® (Оййо Вю1ссй, Риъсп-СПад) или №оВссоттоп® (Восйс) (10 мг/мл в реакционном буфере 0,1 М ацетата натрия, рН 5). ОхНЕ8-альдегид добавили в 10-кратном молярном избытке (исходя из Мте) в сравнении с концентрацией ЕРО. Полученная в результате концентрация ЕРО в реакционной смеси составила 5 мг/мл, концентрация охНЕ8-альдегида составила 10% (мас./об.). Добавив 0,5 М раствор №СМВН3, приготовленного в реакционном буфере, начали реакцию восстановительного аминирования с получением конечной концентрации восстанавливающего агента 20 мМ. После тщательного перемешивания реакцию инкубировали о/п при 0°С. Реакционные смеси проанализировали посредством электрофореза в ПААГ (808-РАСЕ) (фиг. 3) и хроматографии с обращенной фазой на колонке С18 (Рйспотспсх, Лир11сг) для подтверждения успешного связывания и определения выхода коньюгата. Элюирование при ВЭЖХ с обращенной фазой выполнялось с использованием градиента кислой воды/ацетонитрила с 0,1% ТРА.
Связанный с НЕ8 ЕРО отделили от непрореагировавших соединений посредством катионообменной хроматографии, используя колонку 8Р НР на системе Ак!а хуйст (СЕ НсаИйсатс). Элюент А был представлен 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,0, Элюент В был представлен 20 мМ ацетатом натрия, 1 М №С1, рН 4,0. Градиент для разделения коньюгата и немодифицированного протеина составил 10%В, 2СУ; 10% В => 52% В в 21 СУ (фиг. 4).
Места связывания с НЕ8 в целевом протеине были идентифицированы пептидным картированием коньюгата НЕ8-протеин, очищенного ионной хроматографией. Коньюгаты были расщеплены (деструктированы) с использованием подходящей протеазы (2% ЕпборгсЛстахс Ьу8-С, рН 8,6, 37°С, о/п) и полученные в результате фрагменты были разделены хроматографией с обращенной фазой на колонке С4 (Рйспотспсх, Лир11сг) с использованием градиента кислой воды/ацетонитрила с ТРА. Места связывания с НЕ8 в протеине можно было косвенно идентифицировать по сокращению или исчезновению соответствующих пептидов в хроматограмме по сравнению с результатами контрольных расщеплений в целевом протеине как таковом.
Пример 4. Получение охНЕ8100/1.0-Ы-(3-Пропиоальдегид-диэтилацеталя)
НЕ8 в форме альдоновой кислоты (охНЕ8) синтезировали, как описано в примере 9 \УО 2005/083103 А (в данном документе получение описано для сильноразветвленного крахмала, НВ8), начиная с НЕ8 с молекулярной массой 100 кД и молярным замещением 1,0 (НЕ8 100/1.0).
г охНЕ8 100/1.0, подвергавшегося сушке в течение 2 дней при 80°С, растворили в 150 мл сухого диметилформамида (ОМР) и раствор нагрели до 70°С. Добавили 25 г 1-амино-3,3-диэтоксипропана в 60 мл сухого ОМР и нагревали реакционную смесь при 70°С в течение 48 ч.
ОМР и избыток 1-амино-3,3-диэтоксипропана удалили при 60-80°С вакуумированием с использованием роторного испарителя. Сухой остаток промывали ацетоном до исчезновения цвета в промывочном растворе. Продукт растворили в 500 мл воды и очистили ультрафильтрацией, используя мембрану с границей пропускания 10 тыс. дальтон. Когда рН ретентата достигло значения 6-7, его довели до значения 9, используя 0,1 М раствор гидроксида натрия. Эту процедуру повторили 4 раза. После этого продукт лиофилизировали.
Пример 5. Получение коньюгата НЕ8 100/1.0 1п1сгГсгоп а1рйа (ШЫа) из окисленного НЕ8
К 400 мг ацеталя, полученного в примере 4, добавили нужное количество 10 мМ НС1 и получили раствор с концентрацией 40% (мас./об.). Раствор инкубировали при перемешивании при 21°С о/п для снятия защиты с альдегидной функции. Добавив 0,1 М №1О, установили значение рН на уровне значения, используемого в буфере коньюгации.
Интерферон-а1рйа (рекомбинантый человеческий интерферон а1рйа-2Ь, изготовленный по технологии рекомбинантной ДНК с использованием ЕксйспсЫа сой (Е. сой), состоящий из 165 аминокислот и представляющий аминокислотную последовательность, идентичную природному человеческому интерферону а1рйа-2Ь (ЫРЫ-а1рйа-2Ь)), сконцентрировали до 16 мг/мл и перенесли в подходящий буфер коньюгации (0,1 М ацетат натрия, рН 4,0), используя устройства для ультрафильтрации.
В реакционной смеси с конечной концентрацией протеина 8 мг/мл использовали 6-кратный избы
- 64 018222 ток охНЕ8 альдегида (исходя из Ми); концентрация охНЕ8-альдегида составила 20% (мас./об.). охНЕ8альдегид со снятой защитой соединили с раствором протеина и, добавив свежеприготовленный раствор №1СНВН3 (0,5 мМ в буфере коньюгации), начали реакцию восстановительного аминирования для получения конечной концентрации восстанавливающего агента 20 мМ. После тщательного перемешивания реакцию инкубировали о/п при 10°С. Реакционные смеси проанализировали посредством электрофореза в ПААГ (δΌδ-РАОЕ) (фиг. 1) и хроматографией с обращенной фазой на колонке С18 (РЬспошспсх, Ιιψί1сг), чтобы подтвердить успешное связывание и определить выход коньюгата. Элюирование проводилось с использованием градиента кислой воды/ацетонитрила с 0,1% ТРА.
Связанный с НЕ8 интерферон-а1р1а отделили от непрореагировавших соединений посредством анионообменной хроматографии, используя колонку О НР на системе Ак!а (ОЕ НсаИксатс). Элюент А был представлен 10 мМ Тпз-С1, рН 8,0, Элюент В был представлен 10 мМ Тпз-С1, 0,5 М №С1, рН 8,0. Градиент для разделения коньюгата и немодифицированного протеина составлял 0% В => 50% В в 16 СУ (фиг. 6).
Места связывания с НЕ8 в целевом протеине были идентифицированы пептидным картированием коньюгата НЕ8-протеин, очищенного ионной хроматографией. Коньюгаты были расщеплены (деструктированы) с использованием подходящей протеазы (2% Епбортокшазс Ьуз-С, рН 8,6, 37°С, о/п) и полученные в результате фрагменты были разделены хроматографией с обращенной фазой на колонке С4 (РЬспошспсх, 1ир11ст) с использованием градиента кислой воды/ацетонитрила с ТРА. Места связывания с НЕ8 в протеине можно было косвенно идентифицировать по сокращению или исчезновению соответствующих пептидов в хроматограмме по сравнению с результатами контрольных расщеплений в целевом протеине самом по себе (фиг. 7).
Пример 6. Получение коньюгата НЕ8 100/1.0 ЕтуИторосИп (ЕРО) из окисленного НЕ8
К 400 мг ацеталя, полученного в примере 4, добавили нужное количество 10 мМ НС1 и получили раствор с концентрацией 40% (мас./об.). Раствор инкубировали при перемешивании при 21°С в течение 24 ч для снятия защиты с альдегидной функции. Добавив 0,5 М №1ОН, установили значение рН на уровне значения, используемого в буфере конъюгации.
ОхНЕ8 альдегид со снятой защитой соединили с ЕРО (рекомбинантным человеческим ЕРО, имеющим аминокислотную последовательность человеческого ЕРО и в основном те же характеристики, что и имеющийся в продаже раствор Егуро® (Ог11ю Вю1ссЬ, 1ап5сп-С11ад) или №оКссогшоп® (КосЬс) (10 мг/мл в реакционном буфере 0,1 М ацетата натрия, рН 5). ОхНЕ8 альдегид добавили в 15-кратном молярном избытке (на основе Ми ) в сравнении с концентрацией ЕРО. Полученная в результате концентрация ЕРО в реакционной смеси составила 3,7 мг/мл, концентрация охНЕ8 альдегида составила 15% (мас./об.). Добавив 0,5 М раствор №СЫВН3, приготовленный в реакционном буфере, начали реакцию восстановительного аминирования с получением конечной концентрации восстанавливающего агента 20 мМ. После тщательного перемешивания реакцию инкубировали о/п при 10°С. Реакционные смеси проанализировали посредством электрофореза в ПААГ (δΌδ-РАОЕ) (фиг. 8) и хроматографии с обращенной фазой на колонке С18 (РЬспошспсх, 1ирИсг) для подтверждения удачного связывания и определения выхода коньюгата. Элюирование выполнялось с использованием градиента кислой воды/ацетонитрила с 0,1% ТРА.
Связанный с НЕ8 ЕРО отделили от непрореагировавших соединений посредством катионообменной хроматографии, используя колонку 8Р НР на системе Ак!а зузкш (ОЕ НсаИксатс). Элюент А был представлен 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,0, Элюент В был представлен 20 мМ ацетатом натрия, 1 М №С1, рН 4,0. Градиент для разделения коньюгата и немодифицированного протеина составил 10%В, 2СУ; 10% В => 52% В в 21 СУ (фиг. 9).
Места связывания с НЕ8 в целевом протеине были идентифицированы пептидным картированием коньюгата НЕ8-протеин, очищенного ионной хроматографией. Коньюгаты были расщеплены (деструктированы) с использованием подходящей протеазы (2% Епбортокшазс Ьуз-С, рН 8,6, 37°С, о/п), и полученные в результате фрагменты были разделены хроматографией с обращенной фазой на колонке С4 (РЬспошспсх, 1ир11ст) с использованием градиента кислой воды/ацетонитрила с ТРА. Места связывания с НЕ8 в протеине можно было косвенно идентифицировать по сокращению или исчезновению соответствующих пептидов в хроматограмме по сравнению с результатами контрольных расщеплений в целевом протеине самом по себе.
Пример 7. Получение коньюгата НЕ8 100/1/0 с колониеобразующим фактором гранулоцитов (ОС8Р) из охНЕ8
К 400 мг ацеталя, полученного в примере 4, добавили нужное количество 10 мМ НС1 и получили раствор с концентрацией 40% (мас./об.). Раствор инкубировали при перемешивании при 21°С о/п для снятия защиты с альдегидной функции. Добавив 0,1 М №1ОН, установили значение рН на уровне значения, используемого в буфере конъюгации.
ОхНЕ8-альдегид со снятой защитой соединили с раствором тк-Мс1-О-С8Р (5 мг/мл в реакционном буфере 0,1 М ацетата натрия, рН 5; О-С8Р, экспрессируемый Е.со11, имеет ту же самую аминокислотную последовательность и в основном те же характеристики, что и имеющийся в продаже №иродсп® от Ашдсп, Мипсксп, Ό). ОхНЕ8-альдегид добавили в 30-кратном молярном избытке (исходя из МЩ в сравне
- 65 018222 нии с концентрацией С-С8Р. Полученная в результате концентрация С-С8Р в реакционной смеси составила 1,9 мг/мл, концентрация охНЕ8-альдегида составила 20% (мас./об.). Добавив 0,5 М раствор МаСИБНз, приготовленный в реакционном буфере, начали реакцию восстановительного аминирования с получением конечной концентрации восстанавливающего агента 20 мМ. После тщательного перемешивания реакцию инкубировали о/η при 0°С. Реакционные смеси проанализировали посредством электрофореза в ПААГ (808-РАСЕ) и хроматографии с обращенной фазой (фиг. 11) на колонке С18 (Рйепошепех, 1ирйег) для подтверждения успешного связывания и определения выхода коньюгата. Элюирование выполнялось с использованием градиента кислой воды/ацетонитрила с 0,1% ТРА.
Пример 8. Получение НЕ8 100/Е0-Ы-(3-Пропиоалъдегид-диэтилацеталя)
В 35 г буфера ацетата натрия (рН = 5 и к = 1 моль/л) растворили 15 г Е8 100/1.0 и добавили 2,07 мл 1-амино-3,3-диэтоксипропана, а также 1,885 г цианоборогидрида натрия. Реакционную смесь перемешивали при 60°С в течение 16-24 ч, разбавили 100 мл воды, нейтрализовали разбавленным раствором гидроксида натрия и обработали ультрафильтрацией с использованием мембраны с границей пропускания 10000 Д против буфера гидрокарбоната аммония (рН = 9, к = 10 ммоль/л, 45 циклов), а также воды на последних 5 обменных циклах. Очищенный и сконцентрированный раствор производного НЕ8 (приблизительно 20 мас.%) был диализирован против раствора гидроксида натрия (рН = 12) при 60°С с использованием мембраны с границей пропускания 10000 Д. После этого продукт выделили в чистом виде посредством лиофилизации.
Пример 9. Получение НЕ8100/Е0-Ы-(3-Пропиоальдегида)
В 100 мл водной НС1, рН = 2 (к =10 ммоль/л) растворили 10 г НЕ8-N-(3-пропиоалъдегиддиэтилацеталя) из примера 8 и перемешивали при 40°С в течение 16-24 ч. Реакционную смесь очистили ультрафильтрацией с использованием мембраны с границей пропускания 10000 Д против водной НС1, рН = 2(10 циклов), а также воды на последних 5 обменных циклах. Чистый продукт был выделен посредством лиофилизации.
Пример 10. Получение коньюгата НЕ8 100/1.0 1п)егГегоп а1р1а (ΙΕΝη) из НЕ8
К 400 мг ацеталя, полученного в примере 8, добавили нужное количество 10 мМ НС1 и получили раствор с концентрацией 40% (мас./об.). Раствор инкубировали при перемешивании при 21°С о/η для снятия защиты с альдегидной функции. Добавив 0,1 М №ЮН. установили значение рН на уровне значения, используемого в буфере конъюгации.
Интерферон-а1р1а (рекомбинантый человеческий интерферон а1р1а-2Ь, изготовленный по технологии рекомбинантной ДНК с использованием ЕксйепсЫа сой (Е. сой), состоящий из 165 аминокислот и представляющий аминокислотную последовательность, идентичную природному человеческому интерферону а1р1а-2Ь (ЫР№а1рйа-2Ь)), сконцентрировали до 16 мг/мл и перенесли в подходящий буфер конъюгации (0,1 М ацетат натрия, рН 4,0), используя устройства для ультрафильтрации.
В реакционной смеси с конечной концентрацией протеина 7 мг/мл использовали 5-кратный молярный избыток охНЕ8-альдегида (исходя из Мте); концентрация охНЕ8-альдегида составила 18% (мас./об.). ОхНЕ8-альдегид со снятой защитой соединили с раствором протеина и, добавив свежеприготовленный раствор №С№ВН3 (0,5 мМ в буфере конъюгации), начали реакцию восстановительного аминирования для получения конечной концентрации восстанавливающего агента 20 мМ. После тщательного перемешивания реакцию инкубировали о/η при 5°С.
Реакционные смеси проанализировали посредством электрофореза в ПААГ (808-РАСЕ) (фиг. 1) и хроматографией с обращенной фазой на колонке С18 (Рйепошепех, 1ирйег), чтобы подтвердить успешное связывание и определить выход коньюгата. Элюирование проводилось с использованием градиента кислой воды/ацетонитрила с 0,1% ТРА.
Связанный с НЕ8 1Р№11рНа отделили от непрореагировавших соединений посредством катионообменной хроматографии, используя колонку 8Р НР на системе Ак1а (СЕ Неаййсаге). Элюент А был представлен 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,0, Элюент В был представлен 20 мМ ацетатом натрия, 1 М №С1, рН 4,0. Градиент для разделения коньюгата и немодифицированного протеина составлял 0% В => 50% В в 20 СУ (фиг. 13).
Места связывания с НЕ8 в целевом протеине были идентифицированы пептидным картированием коньюгата НЕ8-протеин, очищенного ионной хроматографией. Коньюгаты были расщеплены (деструктированы) с использованием подходящей протеазы (2% Епборго1еша8е Ьук-С, рН 8,6, 37°С, о/η), и полученные в результате фрагменты были разделены хроматографией с обращенной фазой на колонке С4 (Рйепошепех, 1ирйег) с использованием градиента кислой воды/ацетонитрила с ТРА. Места связывания с НЕ8 в протеине можно было косвенно идентифицировать по сокращению или исчезновению соответствующих пептидов в хроматограмме по сравнению с результатами контрольных расщеплений в целевом протеине самом по себе (Фиг. 7).
Пример 11. Получение коньюгата НЕ8 100/1.0 Егу11горо1ейп (ЕРО) из НЕ8
Связанный с НЕ8 альдегид со снятой защитой из примера 9 соединили с ЕРО (рекомбинантным человеческим ЕРО, имеющим аминокислотную последовательность человеческого ЕРО и в основном те же характеристики, что и имеющийся в продаже раствор Егуро® (Оййо Вю1есй, 1ап8еп-Сйад) или №ойе
- 66 018222 соппоп® (Коске) (10 мг/мл в реакционном буфере ОД М ацетат натрия, рН 5).
ОхНЕ8-альдегид добавили в 40-кратном молярном избытке (на основе Μ\ν) в сравнении с концентрацией ЕРО. Полученная в результате концентрация ЕРО в реакционной смеси составила 3,2 мг/мл, концентрация связанного с НЕ8 альдегида составила 30% (мас./об.). Добавив 0,5 М раствор №С№Н3, приготовленный в реакционном буфере, начали реакцию восстановительного аминирования с получением конечной концентрации восстанавливающего агента 20 мМ. После тщательного перемешивания реакцию инкубировали о/п при 5°С. Реакционные смеси проанализировали посредством электрофореза в ПААГ (8Э8-РАОЕ) (фиг. 14) и хроматографией с обращенной фазой на колонке С18 (Ркепотепех, 1ир11ег), чтобы подтвердить успешное связывание и определить выход коньюгата. Элюирование проводилось с использованием градиента кислой воды/ацетонитрила с 0,1% ТЕЛ.
Связанный с НЕ8 ЕРО отделили от непрореагировавших соединений посредством катионообменной хроматографии, используя колонку 8Р НР на системе Ак1а кук!ет (ОЕ НеаНйсаге). Элюент А был представлен 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,0, Элюент В был представлен 20 мМ ацетатом натрия, 1 М №С1, рН 4,0. Градиент для разделения коньюгата и немодифицированного протеина составил 0% В => 52% В в 13 СУ (фиг. 15).
Пример 12. Получение коньюгата НЕ8 100/1.0 с колониестимулирующим фактором гранулоцитов (О-С8Е) из НЕ8
Связанный с НЕ8 альдегид со снятой защитой из примера 9 соединили с раствором гй-Ме!-О-С8Е (5 мг/мл в реакционном буфере 0,1 М ацетата натрия, рН 5; О-С8Е, экспрессируемый Е.сой, имеющий ту же самую аминокислотную последовательность и в основном те же характеристики, что и имеющийся в продаже №иродеи® от Атдеп, Мйпсйеп, Ό). Связанный с НЕ8 альдегид добавили в 40-кратном молярном избытке (исходя из Μ\ν) в сравнении с концентрацией О-С8Е. Полученная в результате концентрация О-С8Е в реакционной смеси составила 1,3 мг/мл, концентрация связанного с НЕ8 альдегида составила 20% (мас./об.). Добавив 0,5 М раствор №С№Н3, приготовленный в реакционном буфере, начали реакцию восстановительного аминирования с получением конечной концентрации восстанавливающего агента 20 мМ. После тщательного перемешивания реакцию инкубировали о/п при 10°С. Реакционные смеси проанализировали посредством электрофореза в ПААГ (8Э8-РАОЕ) и хроматографии с обращенной фазой на колонке С18 (Рйепошепех, 1ир11ег), чтобы подтвердить успешное связывание и определить выход коньюгата. Элюирование при ВЭЖХ с обращенной фазой проводилось с использованием градиента кислой воды/ацетонитрила с 0,1% ТЕА.
Реакционные смеси проанализировали посредством электрофореза в ПААГ (8П8-РАОЕ) (фиг. 16) и хроматографии с обращенной фазой (фиг. 17) на колонке С18 (Рйепошепех, 1ирИег), чтобы подтвердить успешное связывание и определить выход коньюгата. Элюирование при ВЭЖХ с обращенной фазой проводилось с использованием градиента кислой воды/ацетонитрила с 0,1% ТЕА. Связанный с НЕ8 О-С8Е отделили от непрореагировавших соединений посредством катионообменной хроматографии, используя колонку 8Р НР на системе Ак1а (ОЕ НеаНйсаге). Элюент А был представлен 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,0, Элюент В был представлен 20 мМ ацетатом натрия, 1М №С1, рН 4,0. Градиент для разделения коньюгата и немодифицированного протеина составлял 0% В => 40% В в 15 СУ (Рис. 18).
Пример 13. Фармакодинамическое биоисследование т-ущо на мышах (коныогат НЕ8-ЕРО в соответствии с примером 11)
Мышей линии Ва1Ь С от Наг1ап \Уй1кейпапп ОтЬН (Борхен, Германия), имеющих вес приблизительной 19-20 г, группами (максимально 10 на клетку) поместили в клетки Еиго 81апйагй Тур III (ЬхВхН 425x266x185 мм) при комнатной температуре 21°С и относительной влажности 55%. В качестве подстилки для клеток использовался материал Таруе1 ЕтЧгеи 4x4x1 мм (древесина осины). Дополнительно предлагалась древесная шерсть. Клетки меняли и чистили раз в неделю. Питьевая вода (рН 3,8-4; серная кислота) предлагалась по желанию. Клетки с животными пронумеровали. У животных, помещенных в клетки, были промаркированы уши и дополнительно использовался цветовой код. В день размещения, примерно за неделю до начала лечения, проводился начальный медицинский осмотр. Использовались только здоровые животные. Коньюгат НЕ8 и ЕРО, полученный в соответствии с примером 11, немодифицированный исходный материал (гНиЕРО) и Агапекр® от Атдеп испытывались как единая масса, вводимая подкожно четырем мышам из каждой группы в дозе 100 мкг/кг веса тела, исходя из содержания протеина в образцах. Такой же объем РВ8 был введен для контрольного опыта по отношению к носителю (среде).
В определенные моменты времени (день 0, 3, 6, 9, 13, 16, 20 и 23) были взяты образцы примерно по 30-60 мкл цельной крови из хвостовой вены или ретробульбарного венозного сплетения с использованием НатаЮкгй-КарШагеп, содержащего №1-гепарин (Н^^ксйтаии ЬаЬогдега1е, Германия), и цельную кровь центрифугировали в течение 6 мин при 10000 об./мин в центрифуге Не1йсй НетаЮсгй 210 (Ти1Шпдеп, Германия) для определения гематокрита каждого образца цельной крови. Реакция на эритропоэтин и ее продолжительность регистрировались как функция изменения гематокрита (%) в зависимости от времени (см. фиг. 19).
Эти данные показывают, что все образцы, содержащие ЕРО, Агапекр® или коньюгаты ЕРО, были
- 67 018222 способны повышать гематокрит. Агапезр® мог повышать активность в 3-4 раза по сравнению с исходным материалом, а коньюгат НЕ8 ЕРО мог повышать активность в 1,5-2 раза по сравнению с Агапезр®.
Пример 14. Фармакодинамическое биоисследование ίη-νίνο на мышах (коньюгат ΗЕ8-IЕN а1рйа в соответствии с примером 5)
Один коньюгат охНЕ8 100/1.0 НйегТегоп а1рйа, полученный в соответствии с примером 5, протестировали ίη νίνο в соответствии с примером 13. Разбавление ЕС50 образцов сыворотки представлено в координатах полулогарифмической зависимости от времени после внутривенного введения. Период полураспада был рассчитан по наклону экспоненциальной аппроксимированной кривой. Период полураспада образца составил 8,9 ч (см. фиг. 20).
Относительная активность ίη νίίτο коньюгата охНЕ8 100/1.0 ИйегГегоп а1рйа, полученного в соответствии с примером 5, в сравнении с Пйгоп А показана на фиг. 21 (что касается определения активности ίη νίίτο, см. ниже пример 16).
Пример 15. Фармакодинамическое биоисследование ίη-νίνο на мышах (коньюгат ΗЕ8-IЕN а1рйа в соответствии с примером 10)
Три коньюгата НЕ8100/1.0 ИйегГегоп а1рйа, полученные в соответствии с примером 10, были протестированы ίη νίνο в соответствии с примером 13. Разбавление ЕС50 образцов сыворотки представлено в координатах полулогарифмической зависимости от времени после внутривенного введения. Период полураспада был рассчитан по наклону экспоненциальной аппроксимированной кривой. Период полураспада образца составил 9,7 ч (см. фиг. 22).
Для немодифицированного !ЕХ-а1рйа противовирусная активность сыворотки была слишком низкой, чтобы можно было рассчитать период полураспада сыворотки. В К.К. Кеййу еί а1. Айуасей Эгид ЭеНуегу КеУ1е\\ъ 54 (2002) рр. 571-586 был определен период полураспада ШХ-афЬа у крыс (в/в), равный 2 ч.
Относительная активность ίη νίίτο трех коньюгатов НЕ8 100/1.0 Iηίе^ίе^οη а1рйа, полученных в соответствии с примером 10, в сравнении с ййгоп А показана на фиг. 23 (что касается определения активности ίη νίίτο, см. ниже пример 16).
Пример 16. Описание процедуры испытания: антивирусная активность Интерферона-а1рЬа (примеры 14 и 15)
После предварительного разбавления объектов испытания в культуральной среде были получены последовательные двукратные разбавления. В 96-луночный титрационный планшет к свежеобработанным трипсином клеткам МЭБК (40000 клеток на лунку) добавили разбавленный Интерферон - в четырехкратной репликации на одно разведение. Пробы инкубировали в течение 24 ч при 37°С (общий объем на лунку: 175 мкл).
Затем в каждую лунку (кроме лунок с положительным контролем) добавили 50 мкл разбавленного маточного раствора У8У), что привело к иножественному заражению 0,1.
Каждый анализ включал следующие виды контроля сопЛоЕ: 12 лунок, которые получили вирус плюс клеточную питательную среду вместо Интерферона (отрицательный контроль) и 12 лунок, которые получили клеточную питательную среду вместо Интерферона и вируса (положительный контроль).
Пробы инкубировали в течение 42 ч при 37°С.
В конце периода инкубирования надосадочную жидкость каждой лунки заменили 50 мкл раствора МТТ (не менее 2 мг/мл в клеточной питательной среде). Клетки инкубировали в течение 3 ч. Пурпурный формазановый краситель, образованный пролиферирующими клетками, растворили, добавив 100 мкл раствора изопропанола/НС1 (изопропанол с 40 мМ НС1) в каждую лунку. Затем были измерены значения абсорбции в растворах при 570/630 нм в спектрометре для прочтения титрационных микропланшетов.
Для каждого разбавления Интерферона пролиферативную активность клеток МЭБК в присутствии Интерферона и У8У рассчитали следующим образом:
((Средняя величина абсорбции для четырех лунок, обработанных Интерфероном) - (Средняя величина абсорбции отрицательного контроля)) * 100 (Средняя величина абсорбции положительного контроля) - (Средняя величина абсорбции отрицательного контроля)
Противовирусную активность [пЦгТегоп-афЬа определили четырьмя отдельными анализами для каждого объекта испытаний.
В вышеописанной системе анализа соответствующие коньюгаты НЕ8100/1.0 ййегГсгоп а1рйа (пример 15 и 10 соответственно) и коньюгаты οхΗЕ8100/1.0-Iηίе^ίе^οη а1рйа (пример 14 и 5 соответственно) протестировали в сравнении с немодифицированным исходным материалом !ЕХ-а1рйа, а именно [πίτοη А. Рассчитали концентрацию СРЕ50 в материалах.
Пример 17. Получение производных НЕ8 и связующего соединения в соответствии с изобретением
В примере 17 были получены предлагаемые в изобретении производные НЕ8 и связующего соединения. С одной стороны, для данной структуры связующего соединения НЕ8 был изменен в отношении
- 68 018222 средней молекулярной массы и в отношении молярного замещения. С другой стороны, химическая природа связующего соединения была изменена для данного исходного материала НЕ8.
Количества НЕ8, указанные в следующих табл. 1 и 2, растворили в нужном объеме (буфер V) буфера ацетата натрия (1 моль/л, рН = 5) посредством активного перемешивания и умеренного нагревания (до 40°С). К прозрачному раствору добавили указанное количество связующего соединения (40 эквивалентов, исходя из Мп вида НЕ8). В некоторых случаях количество связующего соединения добавили в виде раствора ΏΜΕ-связующее соединение. Поэтому требуемое количество связующего соединения растворили в небольшом количестве ΏΜΕ, полученный прозрачный раствор ΏΜΕ и связующего соединения, обозначенный в табл. 2 как Раствор ДМА и связующего соединения V, растворили в перемешиваемом растворе для получения конечной концентрации, обычно 0,6 М, а реакционную смесь нагрели и перемешивали при 60°С в течение 18-24 ч.
Для подготовки реакции смесь разбавили ультрачистой водой, получив конечную концентрацию примерно 100 мг/мл (10% т/У) производного НЕ8, и очистили либо фильтрацией (УФ), либо диализом (Д), используя мембрану с границей пропускания 10 кД и ультрачистую воду в качестве растворителя. В случае связующего соединения (а2) и (а3) для фильтрации использовали 10 мМ буфер \Н4НСО3, рН = 9, а затем ультрачистую воду.
Для последующего снятия защиты очищенный раствор производного НЕ8 (10%, 100 мг/мл) подкислили концентрированным раствором НС1 с получением с (НС1) с нужным уровнем рН. Смесь перемешивали и нагревали при а! 40°С в течение времени реакции !, а затем нейтрализовали (разб. \аОН), подготовили ультрафильтрацией (граница пропускания мембраны 10 кД), используя нужный растворитель для подготовки и, наконец, лиофилизировали, получив белый или желтоватый порошок.
Дериватизацию подтвердили удачным связыванием с целевой молекулой (КетрЕбе, см. следующий пример 18, табл. 3, 4 и 5). Для производных НЕ8, полученных с использованием связующего соединения (а15) и (а10), успешная дериватизация была проверена по спектральным свойствам. Все производные НЕ8, полученные описанным выше способом, использовались для конъюгации с целями, перечисленными в примере 18 в табл. 3, 4 и 5.
Сокращения, используемые в табл. 1 и 2:
ϋ | диализ |
ϋΜΡ | диметилформамид |
НЕ8 | Г идроксиэтилкрахмал |
НС1 | соляная кислота |
ΝβΟΝΒΗ3 | цианоборогидрид натрия |
ΝαΟΗ | гидроксид натрия |
УФ | ультрафильтрация |
V | Объем |
Вода | ультрачистая вода (πΰΐΐΐζ)) |
Структура (а2) НЕ8-производного НЕ8 100/1.0 и связующего соединения получена в соответствии с примерами 8 и 9 данного изобретения. Структура связующего соединения (а2) относится к структуре (а2) в соответствии с вышеприведенным определением, т.е. к 1-амино-3,3-диэтоксипропану
- 69 018222
Таблица 1. Разновидность структуры НЕЗ (пример 17)
Исходный материла
Дериватизация
связующее соединение | вид НЕЗ | количе- ство НЕЗ [г] | количество связующего соединения [мл] | количество ΝβΟΝΒΗ3 [г] | буфер V [мл] | Вид ПОДГОТОВКИ * |
(а2) | 100/1,0 | 15 | 2,07 | 1,885 | 35 | УФ |
(а2) | 30/0,4 | 5 | 1,7 | 1 0,628 | 11,7 | УФ |
(а2) | 30/1,0 | 10 | 2,94 | : 1,256 | 23,3 | УФ |
(а2) | 60/0,7 С2/С6=6 | 5 | 0,69 | | 0,628 | , Н,67 | УФ |
(а2) | 60/0,7 С2/С6=8,5 | 5 | 0,82 | | 0,628 | 11,67 | УФ |
(а2) | 60/1,0 С2/С6=6 | 15 | 2,25 | 1,884 | 35 | УФ |
(а2) | : 60/1,0 С2/С6=8,5 | 5 | 0,8 | 0,628 | 11,67 | УФ |
(а2) | 100/0,4 | 5 | 0,42 | 0,628 | 11,67 | УФ |
(а2) | 100/0,7 | 5 | 0,52 | 0,628 | 11,67 | УФ |
(а2) | 1 100/1,3 | 5 | 0,43 | 1 0,628 | ί 11,67 | ί УФ |
(а2) | 1 150/0,4 | 5 | 0,32 | : 0,628 | 11,67 | УФ |
(а2) | 150/1,0 | 15 | 0,95 | 1 1,885 | 11,67 | УФ |
(а2) | 300/1,0 | 5 | 0,16 | : 0,628 | 11,67 | УФ |
*Для ультрафильтрации использовался буфер ЫН4НС03 (10 мМ, рН = 9) с последующим применением ультрачистой воды.
- 70 018222
Таблица 1. Разновидность структуры ΗΕ8 (пример 17; продолжение)
Снятие защиты
Исходный материал
связу ί | с (НС1) [мМ] | уровень рН | 1[Ь] | Растворитель для подготовки | |
ющее соеди нение | вид НЕ 8 | ||||
(а2) | 100/1,0 | 10 | 2 | 18-24 | 10 мМ НС1/вода |
(а2) | 30/0,4 | 10 | 2 | 18-24 | 10 мМ НС1 / вода |
(а2) | 30/1,0 | 10 | 2 | 18-24 | 10 мМ НС1/вода |
(а2) | 60/0,7 С2/С6=6 | 10 | 2 | 18-24 | 10 мМ НС1 / вода |
(а2) | 60/0,7 С2/С6=8,5 | 10 | 2 | 18-24 | 10 мМ НС1 / вода |
(а2) | 60/1,0 С2/С6=6 | 10 | 2 | 18-24 | 10 мМ НС1/вода |
(а2) | 60/1,0 С2/С6=8,5 | 10 | 2 | 18-24 | 10 мМ НС1/вода |
(а2) | 100/0,4 | 10 | 2 | 18-24 | 10 мМ НС1/вода |
(а2) | 100/0,7 | 10 | 2 | 18-24 | 10 мМ НС1 / вода |
(а2) | 100/1,3 | 10 | 2 | 18-24 | 10 мМ НС 1 / вода |
(а2) | 150/0,4 | 10 | 2 | 18-24 | 10 мМ НС1/вода |
(а2) | 150/1,0 | 10 | 2 | 18-24 | 10 мМ НС1 / вода |
(а2) | 300/1,0 | 10 | 2 | 18-24 | 10 мМ НС1 / вода |
- 71 018222
Таблица 2. Разновидность структуры связующего соединения (пример 17)
Исходный материал
Дериватизация
связу ющее соеди нение | вид НЕ8 | количе ство НЕЗ [г] | количес | тво связую щего соедине НИЯ [мг] | количество Ν3θΝΒΗ3 [г] | буфер V [мл] | раствор связующего соединения в ϋΜΓ V [мл] | гхп V | Вид подготовки |
(а1) | 100/1,0 | 5 | 366 | 628,3 | 11,67 | - | - | д |
(аЗ)й | 100/1,0 | 15 | 1058 | 1883 | 35 | - | - | УФ |
(а4) | 100/1,0 | 1 | 135,5 | 125,6 | 2 | 0,33 | 2,33 | д |
(а16)‘ | 100/1,0 | 1 | 138 | 125,6 | 2 | 0,33 | 2,33 | д |
(а17) | : 100/1,0 | 10 | 1654 | 1256 | 23,3 | - | - | УФ |
(аП)’ | 1 100/1,0 | 1 | 136 | 125,6 | 2 | 0,33 | 2,33 | д |
(а12)# | 100/1,0 | 1 | 144,6 | 125,6 | 2 | 0,33 | 2,33 | д |
(а13У | 100/1,0 | 0,5 | 72,4 | 62,83 | 1 | 0,16 | 1,67 | д |
1 (а18) | ; 100/1,0 | 10 | 1479 | 1256 | 23,3 | - | - | УФ |
, (а5)# | 1 100/1,0 | 0,5 | 72,72 | 94,25 | *1,95 + 0,05 (НОАс) | - | - | УФ** |
(а14) | 1 100/1,0 | 0,5 | ί 85,81 | 62,8 | 1,17 | - | - | Д |
(а15)# | 100/1,0 | 0,5 | 83 | 62,83 | * 1,0 + 0,08 (НОАс) | - | - | ! уф** |
(аЮ) | 60/1,0 | 0,2 | 20& | 6,5 + 43 мкл ϋΜδο | 1,6 + 0,1 (НОАс) | - | - | Д |
(а21) | 100/1,0 | 1 | 55,3 | - | 3,34 | - | - | Д |
# как определено в контексте настоящего изобретения *^Μ8Ο вместо буфера ацетата натрия **центрифугирование разведенной и нейтрализованной реакционной смеси перед ультрафильтрацией & использовались 20 эквивалентов вместо 40 (исходя из Мп ΗΕ8).
- 72 018222
Таблица 2. Разновидность структуры связующего соединения (пример 17; продолжение)
Исходный материал
Снятие защиты
связую ί | с (НС1) [мМ] | ! уровень рН | ![ч] | Растворитель для подготовки | |
щее : соедине | ние | | вид НЕЗ | ||||
(з1)# | 100/1,0 | 10 | 2 | 18-24 | вода |
(зЗ) ; | 100/1,0 | 10 | 2 | 18-24 | ЮмМ НС1 / вода |
(з4) | 100/1,0 | 10 | 1 2 | 18-24 | вода |
(з16) | 100/1,0 | 100 | ΐ 1 | 2 | вода |
(з!7)” | 100/1,0 | 100 | ! 1 | 2 | вода |
(нН)* | 100/1,0 | 10 | 2 | 18-24 | вода |
(312) | 100/1,0 | 10 | 2 | 18-24 | вода |
(зВ) | 100/1,0 | 10 | 2 | 18-24 | вода |
(318) | | 100/1,0 | 100 | : 1 | 2 | вода |
(з5) | 100/1,0 | 10 | 2 | 18-24 | вода |
(314) ί | 100/1,0 | 10 | 2 | 18-24 | вода |
(315) , | 100/1,0 | 10 | : 2 | 18-24 | вода |
(аЮ) | 60/1,0 | - | - | - | - |
(з21) | 100/1,0 | 10 | 2 | 18-24 | вода |
# как определено в контексте настоящего изобретения
Пример 18. Получение производных НЕ8-связующего соединения-биологически активного агента в соответствии с изобретением
Количество целевой молекулы, указанное в нижеследующих табл. 3, 4 и 5, поместили в соответствующий реакционный буфер. Указанное количество производного НЕ8-связующего соединения (определенного видом связующего соединения и НЕ8) растворили в реакционном буфере и смешали с раствором целевого вещества. NаСNΒНз - обычно в виде свежеприготовленного 0,5 М исходного раствора в реакционном буфере - добавили к конечной концентрации, обычно 20 мМ. Реакционную смесь инкубировали под температурным контролем при температуре гхп Т в течение времени реакции гхп ΐ.
Конечный объем реакции (гхп V) и полученные в результате концентрации и соотношения участвующих в реакции веществ даны в табл. 3, 4 и 5.
Успешность реакции конъюгации была продемонстрирована хроматографическим анализом (ВЭЖС с обращенной фазой, эксклюзионной ВЭЖХ) или электрофорезом в ПААГ (см. фиг. 28-33 для выбранных производных). Во всех описанных здесь реакциях соединения коньюгат цель-НЕ8 поддавался обнаружению. Условия реакции для различных целевых молекул не были оптимизированы.
Использованные сокращения:
- 73 018222
ΑΙΓΝα: | рекомбинантный человеческий интерферон а1рЬа 2Ь |
гЬЕРО: | рекомбинантный человеческий эритропоэтин |
гйС-СЗЕ: | рекомбинантный человеческий колониестимулирующий фактор гранулоцитов с дополнительным Ν-концевым метионином |
гЫТХ гЬРУПа: | рекомбинантный человеческий фактор свертывания крови IX рекомбинантный человеческий фактор свертывания крови УПа |
гкОН ИГаЬ | рекомбинантный человеческий гормон роста антисвязывающий домен, полученный из молекулы человеческого иммуноглобулина С |
т1@О СЬР-1 гАзрагадтазе ΝΗ2-ΌΝΑ | мышиный иммуноглобулин С глюкагоноподобный пептид-1; аминокилоты 1-37 рекомбинантная аспарагиназа из Е. соН Олигонуклеотиде 5'-Аминогексилспейсером, имеющим последовательность ОСС ТАС СТС САС САС ССА ССТ |
гНЬерйп | рекомбинантный человеческий лептин |
АтрйоВ Кетрййе | Амфотерицин В, СА8 Νο. 1397-89-3 Тгр4-Кетрйёе (Ьеи-Агд-Аг§-Тгр-8ег-Ееи-С1у), САЗ Νο. 80224- |
16-4
№ОАс НЕРЕ8 | буфер, содержащий ацетат натрия 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота, САЗ Νο. 7365-45-9 |
Таблица 3. Разновидность целевых веществ (пример 18)
связу ющее соеди нение | вид НЕ8 | целевая молекула | буферная система | количест во цели | количест | во ИЕ5 : [мг] | НЕ8: цель | НЕЗ % (м/о) |
(а2) | 100/1,0 | ΛΙΡΝα | 0,1 МЯаОАс, рН 4 | 3 те | 76 ί | 5:1 (МД | 18 |
(а2) | 100/1,0 | гЬР1Х | 0,1 МНЕРЕ8, рН7 | 3,5 тд | 133 : | 29:1 | 25 |
(а2) | 100/1,0 | гкРУПа | 0,1 М №0 Ас, рН 5 | 40 μ£ | 2,6 | 50:1 | 16 |
(а2) | 100/1,0 | гЬОН | 0,1 М Сйга1е, рН 6 | 0,1 т§ | 16 | 60:1 | 40 |
(а2) | 100/1,0 | т1дС | 0,1 МЯаОАс, рН 5 | 0,1 т£ | 3 | 80:1 | 3 |
(а2) | 100/1,0 | ЬРаЬ | 0,1 М ЦаОАс, рН 5 | 50 | 3,8 | 60:1 | 20 |
(а2) | 100/1,0 | СЬР-1 | 0,1 МНаОАс, рН 5 | зо Дё | 26 ! | 60:1 | 20 |
(а2) | 100/1,0 | гАзрага§тазе | 0,1 М ЯаОАс, рН 5 | 30 μ§ | 4 | 80:1 | 26 |
(а2) | 100/1,0 | ΝΗ,-ϋΝΑ | 0,05 Μ НЕРЕ8, рН 7 10 тМ М§2’ | ю Рё | 5,5 | | 60:1 | 20 |
(а2) | 100/1,0 | гЬЬер!т | 0,1 М ЦаОАс, рН 5 | 0,1 тц | 22,5 ί | 60:1 | 25 |
(а2) | 100/1,0 | АтрЬоВ | 0,1 МЦаОАс, рН 5; 80 % ЭМ8О | 20 μ§ | 78 | 60:1 | 40 |
(а2) | 100/1,0 | КетрПбе | 0,1 МЦаОАс, рН 5 | 30 μ§ | 12,1 | | 5,6:1 | 20 |
- 74 018222
Таблица 3. Разновидность целевых веществ (пример 18; продолжение)
структура связующе го соединен ия | вид НЕЗ | целевая молекула | КОНЦ, цели [г/л] | ШСХВНз [мг] | гхп V [μΐ] | гхп Т [°С] | гхп ί [Ь] |
(а2) | 100/1,0 | τΕΙΡΝα | 7 | 20 | 425 | 5 | 18 |
(а2) | 100/1,0 | гЬР1Х | 6,7 | 20 | 531 | 10 | 18 |
(а2) | 100/1,0 | гЬРУПа | 2,5 | 20 | 16 | 10 | 18 |
(а2) | 100/1,0 | гЬСН | 2,5 | 20 | 41 | 5 | 18 |
(а2) | 100/1,0 | т1д6 | 0,9 | 20 | 107 | 5 | 48 |
(а2) | 100/1,0 | НРаЬ | 2,7 | 20 | 19 | 5 | 18 |
(а2) | 100/1,0 | СЬР-1 | 0,2 | 20 | 83 | 21 | 18 |
(а2) | 100/1,0 | гАзрагадтазе | 2 | 20 | 15 | 5 | 18 |
(а2) | 100/1,0 | ΝΗ2-ϋΝΑ | 0,4 | 20 | 16 | 30 | 18 |
(а2) | 100/1,0 | гИЬер1т | 1,1 | 20 | 90 | 10 | 18 |
(а2) | 100/1,0 | АтрйоВ | 0,1 | 20 | 195 | 21 | 18 |
(а2) | 100/1,0 | КетрОёе | 0,5 | 20 | 61 | 5 | 18 |
- 75 018222
Таблица 4. Разновидность ο£ 11те ΗΕδ тспеК ^атр^ 18)
связу ющее соеди нение | вид НЕЗ | цель | буферная система | цель [мг] | НЕЗ [мг] | НЕЗ: цель | НЕЗ % |
(а2) | 30/0,4 | τΗΡΝα | 0,1 МИаОАс рН4 | 5 | 40 | 8:1 | 6.5 |
(а2) | 30/1,0 | τΗΡΝα | 0,1 МИаОАс рН4 | 5 | 52 | 8:1 | 8.3 |
(а2) | 60/0,7 С2/С6=6 | τΗΡΝα | ..................................................................................................... 0,1 ΜΝαΟΑο рН4 | 5 | 97 | 8:1 | 16 |
(а2) | 60/0,7 С2/С6=8,5 | τΗΡΝα | 0,1 МИаОАс рН4 | 5 | 82 | 8:1 | 13 |
(а2) | 60/1,0 С2/С6=6 | τΗΡΝα | 0,1 МИаОАс рН4 | 5 | 94 | 8:1 | 15 |
(а2) | 60/1,0 С2/С6=8,5 | τΗΡΝα | 0,1 МИаОАс рН4 | 5 | 85 | 8:1 | 14 |
(а2) | 100/0,4 | τΗΡΝα | 0,1 М ЫаОАс рН4 | 10 | 314 | 8:1 | 25 |
(а2) | 100/0,7 | τΗΡΝα | 0,1 МИаОАс рН 4 | 5 | 130 | 8:1 | 21 |
(а2) | 100/1,0 | τΗΡΝα | 0,1 МИаОАс рН4 | 5 | 125 | 8:1 | 20 |
(а2) | 100/1,3 | τΗΡΝα | 0,1 МИаОАс рН4 | 5 | 154 | 8:1 | 15 |
(а2) | 150/0,4 | τΗΡΝα | 0,1 МИаОАс рН 4 | 10 | 415 | 8:1 | 33 |
(а2) | 150/1,0 | τΗΙΡΝα | 0,1 Μ ИаОАс рН 4 | 5 | 187 | 8:1 | 30 |
(а2) | 300/1,0 | τΗΡΝα | 0,1 МИаОАс рН4 | 10 | 2437 | 24:1 | 40 |
(а2) | 30/1,0 | гйЕРО | 0,1 МИаОАс рН 5 | 4.5 | 173 | 50:1 | 23 |
(а2) | 60/1,0 | ΛΕΡΟ | 0,1 МИаОАс рН 5 | 4.5 | 313 | 40:1 | 30 |
(а2) | 100/1,0 | гЬЕРО | 0,1 МИаОАс рН 5 | 60 | 5683 | 40:1 | 30 |
(а2) | 150/1,0 | тЬЕРО | 0,1 Μ ИаОАс рН 5 | 4.5 | 885 | 50:1 | 35 |
- 76 018222
Таблица 4. Разновидность структуры НЕЗ (пример 18; продолжение)
связующе е соединен ие | вид НЕЗ | цель | концен трация цели [г/л] | ΝβΟΝΒΗ3 [мМ] | гхп V | гхп Τ [°С] | гхп ί [ч] |
(а2) | 30/0,4 | ΛΙΡΝα | 8 | 20 | 626 μΐ | 5 | 18 |
(а2) ! 30/1,0 | ΛΙΡΝα | 8 | 20 | 625 μΐ | 5 | 18 | |
(а2) | 60/0,7 С2/С6=6 | ΛΙΡΝα | 8 | 20 | 625 μΐ | 5 | 18 |
(а2) | 60/0,7 С2/С6=8,5 | ΛΙΡΝα | 8 | 20 | 625 μΐ | 5 | 18 |
(а2) | 60/1,0 С2/С6=6 | ΛΙΡΝα | 8 | 20 | 628 μΐ | 5 | 18 |
: 60/1,0 (а2) : 1 С2/С6=8,5 | ΛΙΡΝα | 8 | 20 | 625 μΐ | 5 | 18 | |
(а2) 100/0,4 | ΛΙΡΝα | 8 | 20 | 1257 μΐ | 5 | 18 | |
(а2) ί 100/0,7 | ΛΙΡΝα | 8 | 20 | 624 μΐ | 5 | 18 | |
(а2) : 100/1,0 | ΛΙΡΝα | 8 | 20 | 625 μΐ | 5 | 18 | |
(а2) 100/1,3 | ΛΙΡΝα | 8 | 20 | 627 μΐ | 5 | 18 | |
(а2) ί 150/0,4 | ΛΙΡΝα | 8 | 20 | 1257 μΐ | 5 | 18 | |
(а2) : 150/1,0 | ΛΙΡΝα | 8 | 20 | 623 μΐ | 5 | 18 | |
(а2) 1 300/1,0 | ΛΙΡΝα | 1,6 | 20 | 6093 μΐ | 5 | 18 | |
(а2) 1 30/1,0 | ΛΕΡΟ | 6 | 20 | 750 μΐ | 10 | 18 | |
(а2) ί 60/1,0 | ΛΕΡΟ | 4,3 | 20 | 1043 μΐ | 10 | 18 | |
(а2) 1 100/1,0 | ΛΕΡΟ | 3,2 | 20 | 18,9 ю1 | 10 | 18 | |
(а2) 1 150/1,0 | ΛΕΡΟ | 1,8 | 20 | 2528 μΐ | 10 | 18 |
- 77 018222
Таблица 5. Разновидность структуры связующего соединения (пример 18)
связу ющее соеди нение | вид НЕ8 | цель | буферная система | цель | НЕ8 [мг] | ΗΕδ: цель | |
1 | (а1) | 100/1,0 | Кетрббе | 0,1 МЦаОАс рН 5 | 30 мкг | 12,3 | 5,6:1 |
2 | (аЗ) | 100/1,0 | гЬЕРО | 0,1 МЖОАс рН 5 | 0,1 мг | 10,4 | 40:1 |
3 | (а4) | 100/1,0 | Кетрббе | 0,1 МИаОАс рН 5 | 30 мкг | 12,1 | 5,6:1 |
4 | (а4) | 100/1,0 | τΜΕΝα | 0.1 М 1ЧаОАс рН 4 | 0,1 мкг | 2,7 | 8:1 |
...............5................. | (а4) | 100/1,0 | гЬЕРО | 0,1 М 1ЧаОАс рН 5 | 100 мкг | ..................4.3................... | 20:1 |
6 | (а4) | 100/1,0 | гЬО-С8Е | 0,1 МЦаОАсрН5 | 53 мкг | 5,2 | 30:1 |
7 | (а4) | 100/1,0 | гЬЬербп | 0,1 М №ОАс, рН 5 | 0,1 мг | 22,5 | 60:1 |
8 | (а4) | 100/1,0 | ΝΗ,-ΩΝΑ | 0,05 Μ НЕРЕ8, рН 7 | 10 мкг | 5,5 | 60:1 |
9 | (а4) | 100/1,0 | гЬГУПа | 0,1 МЦаОАсрН 5 | 40 мкг | 2,6 | 50:1 |
10 | (а4) | 100/1,0 | ЬЕаЬ | 0,1 МЦаОАс, рН 5 | 50 мкг | 3,8 | 60:1 |
11 | (а4) | 100/1,0 | гЬОН | 0,1 М СЬга1е, рН 6 | 0,1 мг | 17 | 60:1 |
12 | (а4) | 100/1,0 | АтрЬоВ | 0,1 МИаОАс, рН 5; 80 % ΩΜ8Ο | 20 мкг | 83 | 60:1 |
13 | (а 16) | 100/1,0 | Кетрббе | 0,1 МЦаОАс рН 5 | 30 мкг | 12,1 | 5,6:1 |
14 | (а 16) | 100/1,0 | гЫЕ1Чос | 0,1 М ЦаОАс рН 4 | 0,1 мг | 2,7 | 8:1 |
15 | (а 16) | 100/1,0 | гЬЕРО | 0,1 МЦаОАсрН 5 | 100 мкг | 8,6 | 40:1 |
16 | (а16) | 100/1,0 | гЬО-С8Е | 0,1 ΜΝβΟΑο рН 5 | 44 мкг | 4,3 | 30:1 |
17 | (а16) | 100/1,0 | гЬЬербп | 0,1 МЦаОАс, рН 5 | 0,1 мг | 22,5 | 60:1 |
18 | (а 16) | 100/1,0 | ЬЕаЬ | 0,1 МЫаОАс, рН 5 | 50 мкг | 3,8 | 60:1 |
19 | (а 16) | 100/1,0 | гЬСН | 0,1 М СПга1е, рН 6 | 0,1 мг | 18 | 60:1 |
20 | (а17) | 100/1,0 | Кетрббе | 0.1 МТЧаОАсрН 5 | 30 мкг | 12.1 | У6Я |
21 | (а17) | 100/1,0 | гЬЕРО | 0,1 МЦаОАсрН 5 | 4 мг | 513 | 60:1 |
..............22 | (а17)....... | 100/1,0 | гЬЕУПа | 0,1 М №ОАс рН 5 | 40 мкг | 2,6 | 50:1 |
23 | (а 17) | 100/1,0 | гВЕерЫп | 0,1 М ЦаОАс, ρΐ 1 5 | 0,1 мг | 22,5 | 60:1 |
24 | (а11) | 100/1,0 | Кетрббе | 0,1 М №ОАс рН 5 | 30 мкг | 12,1 | 5,6:1 |
25 | (а11) | 100/1,0 | τΗΕΝα | 0,1 М №ОАс рН 4 | 0,1 мг | 2,7 | 8:1 |
26 | (а11) | 100/1,0 | гЬЕРО | 0,1МЦаОАсрН5 | 2 мг | ..................173................ | 40:1 |
..............27............. | (а11) | 100/1,0 | ГЙО-С8Е | 0,1М1ЧаОАсрН5 | 55 мкг | 5,4 | 30:1 |
28 | (а11) | 100/1,0 | гЬОН | 0,1 М СЬга1е, рН 6 | 0,1 мг | 18 | 60:1 |
29 | (а11) | 100/1,0 | ЬЕаЬ | 0,1 МбаОАс, рН 5 | 50 мкг | 3,8 | 60:1 |
30 | (а 12) | 100/1,0 | Кетрббе | 0,1 М 1ЧаОАс рН 5 | 30 мкг | 12Д | 5,6:1 |
31 | (а12) | 100/1,0 | ΗιΙΕΝα | 0,1 М №ОАс рН 4 | 0,1 мг | 2,7 | 8:1 |
..............32............. | (а12) | 100/1,0 | гЬЕРО | 0,1ΜΝαΟΑορΗ5 | 11 мг | 478 | 20:1 |
33 | (а 12) | 100/1,0 | гЬС-С8Е | 0,1 М ЦаОАс рН 5 | 47 мкг | 4,6 | 30:1 |
34 | (а13) | 100/1,0 | Кетрббе | 0,1М1ЧаОАсрН5 | 30 мкг | 12,1 | 5,6:1 |
\ 35 | (а 18) | 100/1,0 | Кетрббе | 0,1М1ЧаОАсрН5 | 30 мкг | 12.1 | 5,6:1 |
: 36 | (а 18) | 100/1,0 | гЬЕРО | 0,1М1МаОАсрН5 | 4 мг | 342 | 40:1 |
1 37 | (а5) | 1 100/1,0 | Кетрббе | 0,1 М ИаОАс рН 5 | 30 мкг | Ё2Д | 5,6:1 |
ί 38 | (а 14) | 100/1,0 | Кетрббе | 0,1ΜΝαΟΑορΗ5 | 30 мкг | 54,3 | 25:1 |
1 39 | (а21) | 100/1,0 | Кетрббе | 0,1МЦаОАсрН5 | 30 мкг | 54,3 | 25:1 |
- 78 018222
Таблица 5. Разновидность структуры связующего соединения (пример 18; продолжение)
связу ющее соеди нение | вид НЕЗ | цель | НЕ8 % | концен трация цели, [г/л] | ΝβΟΝΒΗ3 [мМ] | гхп V [мкл] | гхп Т [°С] | гхп 1 М | |
1 | (а1) | 100/1,0 | Кетрббе | 20 | 0,49 | 20 | 61 | 5 | 18 |
2 | (аЗ) | 100/1,0 | гЬЕРО | 30 | 2,9 | 20 | 35 | 10 | 18 |
3 | (а4) | 100/1,0 | Кетрббе | 20 | 0,5 | 20 | 61 | ..................5................... | 18 |
4 | (а4) | 100/1,0 | ΓΗΕΝα | 20 | 7,5 | 20 | 13 | 5 | 18 |
5 | (а4) | 100/1,0 | гЬЕРО | 20 | ..............4,7.............. | 20 | 21 | ..................5................... | 18 |
6 | (а4) | 100/1,0 | гЬС-СЗЕ | 15 | Ё5 | 20 | 35 | .............ю.............. | 18 |
7 | (а4) | 100/1,0 | гЬЕербп | 25 | 1,1 | 20 | 90 | ..................5................... | 18 |
8 | (а4) | 100/1,0 | ΝΗ,-ϋΝΑ | 20 | 0,4 | 20 | 16 | 30 | 18 |
9 | (а4) | 100/1,0 | гЬЕУПа | 7 | 1,1 | 20 | 39 | 10 | 18 |
10 | (а4) | 100/1,0 | ЬГаЬ | 20 | ..............2,7............... | 20 | 19 | ...................5................... | 18 |
И | (а4) | 100/1,0 | гЬСН | 40 | 23 | 20 | 44 | ...................5................... | 18 |
12 | (а4) | 100/1,0 | АтрЬоВ | 40 | 0,1 | 20 | 208 | ...............21................. | 18 |
13 | (а16) | 100/1,0 | Кетрббе | 20 | 0,5 | 20 | 61 | 5 | 18 |
14 | (а16) | 100/1,0 | τΗΕΝα | 20 ' | 7,5 | 20 | 13 | 5 | 18 |
15 | (а16) | 100/1,0 | гЬЕРО | 30 | ..............3,5............... | 20 | 29 | ..................5................... | 18 |
16 | (316) | 100/1,0 | гИС-СЗГ | 15 | 1,5 | 20 | 29 | 10 | 18 |
17 | (316) | 100/1,0 | гЬЬербп | ...............25................ | 1,1 | 20 | 90 | 5 | 18 |
18 | (316) | 100/1,0 | ЬГаЬ | 20 | 2,7 | 20 | 19 | 5 | 18 |
19 | (316) | 100/1,0 | гЬОН | 40 | 23 | 20 | 44 | 5 | 18 |
20 | (317) | 100/1,0 | Кетрббе | 20 | 0,5 | 20 | 61 | 5 | 18 |
21 | (317) | 100/1,0 | гЬЕРО | 40 | 3,1 | 20 | 1284 | 5 | 18 |
~~72 | (317) | 100/1,0 | гЬГУПа | 6 | 0.9 | 20 | 43 | 10 | 18 |
23 | (317) | 100/1,0 | гНЬерЫп | 25 | 1.1 | ......................20....................... | 90 | .................10............. | 18 |
24 | (з11) | 100/1,0 | Кетрббе | 20 | 0,5 | 20 | 61 | 5 | 18 |
25 | (аИ) | 100/1,0 | τΜΕΝα | 20 | 7,5 | 20 | 13 | 5 | 18 |
26 | (311) | 100/1,0 | гЬЕРО | 30 | 3,5 | 20 | 579 | ..................5................... | 18 |
27 | (аИ) | 100/1,0 | гйС-СЗЕ | 15 | Ё5 | 20 | 36 | 10 | 18 |
28 | (аИ) | 100/1,0 | гЬОН | 40 ’ | ..............23............... | 20 | 44 | ..................5................... | 18 |
29 | (аИ) | 100/1,0 | ЬЕаЬ | 20 | 2Д | 20 | 19 | ..................5................... | 18 |
30 | (312) | 100/1,0 | Кетрббс | 20 | 0,5 | 20 | 61 | 5 | 18 |
31 | (312) | 100/1,0 | τΜΕΝα | 20 | 7,5 | 20 | 13 | 5 | 18 |
32 | (312) | 100/1,0 | гЬЕРО | 20 | 4,6 | 20 | 2389 | ..................5................... | 18 |
33 | (312) | 100/1,0 | гЬС-СЗЕ | 15 | 1,5 | 20 | 31 | 10 | 18 |
34 | (з13) | 100/1.0 | КетрОбе | 20 | 0,5 | 20 | 61 | 5 | 18 |
35 | (318) | 100/1,0 | Кетрббе | 20 | 0,5 | 20 | 61 | 5 | 18 |
36 | (318) | 100/1,0 | ЕРО | 30 | 3,5 | 20 | 1141 | 5 | 18 |
37 | (а5) | 100/1,0 | Кетрббе | 20 | 0,5 | 20 | 61 | 5 | 18 |
38 | (314) | 100/1,0 | Кетрббе | 20 | 0,1 | 20 | 271 | 5 | 18 |
39 | (а21) | 100/1.0 | Кетрббе | 20 | 0,1 | 20 | 271 | 25 | 18 |
Дополнительные данные (А.1) Получение оxΗВ8-\-(3-пропиоальдегид-диэтилацеталя) из ΗΒ8 7 кД
Сильноразветвленный крахмал (ΗΒ8) в виде альдоновой кислоты синтезировали в соответствии с примером 9 \\Ό2005 / 083103 А1, начиная с сильноразветвленного крахмала (Мте==7000 Да (7кД), средняя степень разветвленности: 15 мол.%). Полученную альдоновую кислоту перенесли в соответствующий лактон высушиванием в течение 24 ч при 80°С (сокращение οχΗΒ8 относится к ΗΒ8 в виде альдоновой кислоты, а также к соответствующему лактону). 5 г лактона растворили в 15 мл 1-амино-3,3диэтоксипропана и 10 мл сухого ΌΜΕ и перемешивали при 70°С в течение 48 ч. Избыток 1-амино-3,3диэтоксипропана и ΌΜΕ (диметилформамида) выпарили под вакуумом и полученное в результате бледно-желтое твердое вещество промывали ацетоном до исчезновения желтого цвета. Продукт растворили в воде и очищали ультрафильтрацией, используя мембрану с границей пропускания 1000 Да, до тех пор, пока рН фильтрата не достиг значения > 6.
Ретентат в течение 2 ч обрабатывали 2 г кислотной катионообменной смолы (ΑтЬе^1^ΐе® 120), смо- 79 018222 лу отфильтровали и оставшийся раствор лиофилизировали. Спектр 'Н-ЯМР соединения показал триплет при 1,7 и мультиплет при 1,2 ррт, представляя метальные и метиленовые группы в альфа-позиции к атому азота остатка связующего соединения (1-амино-3,3-диэтоксипропана).
(А.2) Получение коньюгата оxНΒδ 7кД и бычьего сывороточного альбумина (ΒδА)
750 мкг ацеталя, полученного в соответствии с (АЛ), растворили в 5 мл 0,01 Ν НС1. Значение рН установили на уровне 2,0 посредством 1 Ν НС1 и реакционную смесь перемешивали при 21 °С в течение 18
ч. 2 мл 1% раствора ΒδА в ацетатном буфере (рН = 7,0) добавили к 200 мкл ранее приготовленной смеси. 140 мг цианоборогидрида натрия растворили в 5 мл 0,1 Ν ацетатного буфера (рН = 7,0) и к реакционной смеси сразу же добавили аликвоту 50 мл. Реакционную смесь выдержали при 4°С в течение 15 ч. Анализ реакционной смеси посредством экслюзионной хроматографии показал выход 90% коньюгата НΒδ-ΒδА (фиг. 24).
(А.3) Получение коньюгата оxНΒδ 65кД и интерферона-а1рЕа
К 400 мг НΒδ-N-(3-пропиоальдегид-диэтилацеталя) (65кД), полученного в соответствии с (АЛ), добавили нужное количество 10 мМ НС1 и получили раствор с концентрацией 40% (м/о) и значением рН, равным 2. Раствор инкубировали при перемешивании при 21°С о/п (в течение ночи) для снятия защиты с альдегидной функции. Значение рН было установлено на уровне значения, используемого в буфере коньюгации, посредством добавления 0,1 М №1ОН до связывания. Интерферон-а1рЕа (рекомбинантый человеческий интерферон а1рНа-2Ь. изготовленный по технологии рекомбинантной ДНК с использованием ЕксЕепсЫа сой (Е. со11), состоящий из 165 аминокислот и представляющий аминокислотную последовательность, идентичную природному человеческому интерферону а1рЕа-2Ь (ЫЕЫ-а1рЕа-2Ь)), сконцентрировали до 16 мг/мл и перенесли в подходящий буфер коньюгации (0,1 М ацетат натрия, рН 4,0), используя устройства для ультрафильтрации.
В реакционной смеси с конечной концентрацией протеина 6 мг/мл использовали 10-кратный молярный избыток оxНΒδ альдегида (исходя из Μν); концентрация оxНΒδ альдегида составила 20% (мас./об.). Οχ4Βδальдегид со снятой защитой соединили с раствором протеина, и, добавив свежеприготовленный раствор №СЫВН3 (0,5 мМ в буфере коньюгации), начали реакцию восстановительного аминирования для получения конечной концентрации восстанавливающего агента, равной 20 мМ. После тщательного перемешивания реакцию инкубировали о/п при 10°С.
Реакционные смеси проанализировали посредством электрофореза в ПААГ (δΌδ-РАСЕ) (фиг. 25) и хроматографией с обращенной фазой на колонке С18 (РЕепотепех, 1ирЕег), чтобы подтвердить успешное связывание и определить выход коньюгата. Элюирование проводилось с использованием градиента кислой воды/ацетонитрила с 0,1% ТРА.
Связанный с НВδ ШЫа1рЕа отделили от непрореагировавших соединений посредством анионообменной хроматографии, используя колонку О НР на системе Айа (СЕ НеаЕЕсаге). Элюент А был представлен 10 мМ ТГ15-С1, рН 8,0, Элюент В был представлен 10 мМ Тгк-Ск 0,5 М №С1, рН 8,0. Градиент для разделения коньюгата и немодифицированного протеина составлял 0% В => 50% В 1620СV (фиг. 26).
(А.4) Получение коныогата оxНВδ 65 и эритропоэтина (ЕРО)
К 400 мг НВδ-N-(3-пропиоальдегид-диэтилацеталя) (65кД), полученного в соответствии с (АЛ), добавили нужное количество 10 мМ НС1 и получили раствор с концентрацией 40% (м/о). Раствор инкубировали при перемешивании при 21°С о/п для снятия защиты с альдегидной функции. Значение рН было установлено на уровне значения, используемого в буфере коньюгации, посредством добавления 0,1 М №1ОН до связывания.
ΟχΒΒδ-альдегид со снятой защитой соединили с ЕРО (рекомбинантным человеческим ЕРО, имеющим аминокислотную последовательность человеческого ЕРО и в основном те же характеристики, что и имеющийся в продаже раствор Егуро® (ОйЕо В|о1есН, 1ап5еп-С11ад) или №оВесогтоп® (ВосЕе)) (10 мг/мл в реакционном буфере 0,1 М буфере ацетата натрия, рН 5). ΟxНΒδ-альдегид добавили в 20кратном молярном избытке (исходя из Μν) в сравнении с концентрацией ЕРО. Полученная в результате концентрация ЕРО в реакционной смеси составила 4,6 мг/мл, концентрация оxНΒδ альдегида составила 20% (м/о). Добавив 0,5 М раствор №СМВН3, приготовленный в реакционном буфере, начали реакцию восстановительного аминирования с получением конечной концентрации восстанавливающего агента, равной 20 мМ. После тщательного перемешивания реакцию инкубировали о/п при 10°С. Реакционные смеси проанализировали посредством электрофореза в ПААГ (δΌδ-РАСЕ) (фиг. 27) и хроматографией с обращенной фазой (фиг. А.4-1) на колонке С18 (РЕепотепех, 1ирЕег), чтобы подтвердить успешное связывание и определить выход коньюгата. Элюирование проводилось с использованием градиента кислой воды/ацетонитрила с 0,1% ТРА.
Claims (50)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ получения производного гидроксиалкилкрахмала, включающий:(ί) реакцию гидроксиалкилкрахмала (НАδ) формулы (I)- 80 018222 посредством атома углерода С* редуцирующей концевой группы ΗΑ8 с аминогруппой М сшивающего соединения в соответствии с формулой (ΙΙ)М—Ь-А (Π) где А является ацетальной группой или кетальной группой, аЕ является спейсером, соединяющим М и А, где С* является необязательно окисленным до реакции ΗΑ8 с М, причем аминогруппа М является группой в соответствии с формулой (Пс)К'--N—Υ-Н (Пс) где Υ либо отсутствует, либо является химической структурой, выбранной из группы, состоящей из где О является О, или 8, или ΝΗ и, если представлен дважды, каждый О независимо - О или 8 или ΝΗ, иВ' является Н, или гидроксильной группой, или органическим остатком, выбранным из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алки нила, арила, замещенного арила, арилалкила, замещенного арилалкила, алкиларила и замещенного алкиларила, причем каждый из указанных органических остатков содержит от 1 до 10 атомов углерода;и причемЕ, соединяющий М и А, является спейсером, включающим по крайней мере одно структурное звено в соответствии с формулой (ΙΙά) где Ь1 и Е2 независимо друг от друга являются Н или органическим остатком, выбранным из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила, замещенного арила, арилалкила, замещенного арилалкила, алкиларила, замещенного алкиларила и остатков -Ο-В, где В выбрано из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила, замещенного арила, арилалкила, замещенного арилалкила, алкиларила, замещенного алкиларила, причем каждый из указанных органических остатков по Ь1 и Е2 независимо содержит от 1 до 20 атомов углерода; и п является целым числом от 1 до 20;в результате которой получают производное ΗΑ8 в соответствии с формулой (ΙΙΙ) где X является функциональной группой, являющейся результатом реакции аминогруппы М с ΗΑ8 посредством атома углерода С* необязательно окисленной редуцирующей концевой группы ΗΑ8, и где ΗΑ8' является остатком молекулы гидроксиалкилкрахмала, а В1, В2 и В3 независимо друг от друга являются водородом или гидроксиалкильной группой с линейной или разветвленной цепью, содержащей от 2 до 10 атомов углерода, или группой —[(СК'к2)тО]п[СК3Н4)— он где В1, В2, В3 и В4 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из водорода и алкильной группы, т составляет от 2 до 4, где остатки В1 и В2 могут быть одинаковыми или разными в т-группах СВ1В2;- 81 018222 п составляет от 0 до 20 и о составляет от 2 до 20, где остатки К3 и К4 могут быть одинаковыми или разными в о-группах СК3К4.
- 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что К1, К2 и К3 являются независимо друг от друга группой -(СН2СН2О)п-Н, где п является целым числом, предпочтительно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
- 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что гидроксиалкилкрахмал является гидроксиэтилкрахмалом (НЕ8).
- 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что А является остатком в соответствии с формулой (Па) где Ζ1 и Ζ2, каждый независимо, является О, или 8, или ΝΚ^ предпочтительно О, где Кх является Н или низшим алкилом, таким как метил, этил или пропил, такой как н-пропил или изопропил, или С(О)Ку, где Ку предпочтительно выбирается из группы, состоящей из С1-С6 алкила и С6-С14 арила, еще более предпочтительно из группы, состоящей из необязательно замещенного, предпочтительно незамещенного метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила и трет-бутила; причем Кх предпочтительно является Н;А1 и А2, каждый независимо, является метилом, этилом, н-пропилом, изопропилом, н-бутилом, трет-бутилом, бензилом, 1,1,1-трихлорэтилом, нитробензилом, метоксибензилом, этоксибензилом или образует цикл в соответствии с формулой (ПЬ) (ПЬ) где А1 и А2, взятые вместе, являются -(СН2)2- или -(СН2)3- или -(СН2СН(СН3))-, и где А3 является Н или метилом, этилом, н-пропилом, изопропилом, н-бутилом, изобутилом, пентилом, бензилом или образует цикл с атомом N аминогруппы М или с подходящим атомом, входящим в Е, причем А3 предпочтительно является Н.
- 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что Ζ1 и Ζ2 оба являются О; А3 является Н; и где А1 и А2 каждый является этилом или где А1 и А2 образуют цикл в соответствии с формулой (ПЬ), где А1 и А2, взятые вместе, являются -(СН2)2-.
- 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что аминогруппа М является группой в соответствии с формулой (Пс)К'--N—Υ-Н где О является О и где К' является Н или органическим остатком, выбранным из группы, состоящей из алкила и замещенного алкила, предпочтительно Н или алкилом.
- 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что аминогруппа М является ΙΕΝ-, ΙΕΝΑ)-, Н^-КН-(С=О)-, Н3С-КН- или Н3С-КН-О-, предпочтительно НА-, Н^-О- или Н^-КН-(С=О)-.
- 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что на стадии (1) НА8 реагирует посредством своей окисленной редуцирующей концевой группы с аминогруппой М сшивающего соединения, причем М является IΕΝ-, и где реакцию осуществляют при температуре в диапазоне от 0 до 80°С, а X является -(С=О)-КН-.
- 9. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что на стадии (1) НА8 реагирует предпочтительно в водной среде посредством своей неокисленной редуцирующей концевой группы с аминогруппой М сшивающего соединения, причем М является ΙΕΝ-, где реакцию осуществляют при температуре в диапазоне от 20 до 80°С при рН в диапазоне от 4 до 7 и где X является -СН=№.
- 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что на стадии (1) реакцию осуществляют в присутствии восстанавливающего агента, предпочтительно NаСNΒН3, для получения производного НА8, причем X является -СН2-КН-.
- 11. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что на стадии (1) НА8 реагирует предпочтительно в водной среде посредством своей неокисленной редуцирующей концевой группы с аминогруппой М сшивающего соединения, причем М является ΙΕΝ-О- или Н^-КН-(С=О)-, где реакцию осуществляют при температуре в диапазоне от 5 до 80°С при рН в диапазоне от 4,5 до 6,5, и где X является -СН=^О- или -СН=^КН-(С=О)-.
- 12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что Е1 и Е2 независимо друг от друга являются Н или органическим остатком, выбранным из группы, состоящей из алкила и замещенного алкила;- 82 018222 более предпочтительно Н или алкилом; еще более предпочтительно Н, а η является целым числом от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 4, еще более предпочтительно 2.
- 13. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что Ь является -(СЬ1Ь2)п-, предпочтительно -(СН2)п-, где η является целым числом от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10 и где Ь более предпочтительно является -СН2-СН2-.
- 14. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что Ь включает по крайней мере одно структурное звено -(СЕ1Ь2)п1-О-(СЕ1Ь2)п2-, предпочтительно -(СН2)п1-О-(СН2)п2, где η1 равно или отличается от η2 и где спейсер Ь предпочтительно связан посредством -(СЬ1Ь2)п1- с аминогруппой М сшивающего соединения.
- 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что Ь является -((СЕ1Ь1)2-О)т-(СЕ1Ь2)-, предпочтительно -((СН2)2-О)т-СН2-, где т является 1, 2 или 3, более предпочтительно 2 или 3.
- 16. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что Ь является -(СЕ^ДДС^)-^-^^^^-, предпочтительно -(СН2)п-(С=О)-№Н-(СН2)п-, где каждое η независимо находится предпочтительно в диапазоне от 1 до 4, еще более предпочтительно в диапазоне от 1 до 3.
- 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что Е выбрано из группы, состоящей из -(СН2)3-(С=О)-КН-(СН2Ь; -(СН2)3-(С=О)^-(СН2)2-;-(СН2)2-(С=О)-КН-(СН2)3- и -(СН2)2-(С=О)-КН-(СН2)2-;наиболее предпочтительно из группы, состоящей из-(СН2)3-(С=О)-КН-(СН2)2- и (СН2)2(С=О)-КН-(СН2)2-.
- 18. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что сшивающее соединение М-Ь-А в соответствии с формулой (II) выбрано из группы, состоящей изН2№(СН2)2-СН(ОСН2СН3)2;Н2ЩСН2)2-О-(СН2)2-О-СН2-СН(ОСН2СН3)2, Н2№(сН2)2-(С=О)-№Н-(СН2)2-СН(ОСН2СН3)2;Н2№(сН2)3-(с=о)-КН-(сН2)2-Сн(оСН2СН3)2;Н^-(СН2)7-СН(ОСН2СН3)2;Н^-О-(СН2)2-О-(СН2)2-О-СН2-СН(ОСН2СН3)2 и Н2№КН-(С=О)-(СН2)2-(С=О)-КН-(СН2)2-СН(ОСН2СН3)2;предпочтительно из группы, состоящей изН2^(СН2)2-СН(ОСН2СН3)2;Н2ЩСН2)2-О-(СН2)2-О-СН2-СН(ОСН2СН3)2, Н2№(СН2)2-(С=О)-КН-(СН2)2-СН(ОСН2СН3)2;Н2№(сН2)3-(с=о)-КН-(сН2)2-Сн(оСН2СН3)2;Н2^О-(СН2)2-О-(СН2)2-О-СН2-СН(ОСН2СН3)2 и Н2^КН-(С=О)-(СН2)2-(С=О)-КН-(СН2)2-СН(ОСН2СН3)2;и еще более предпочтительно из группы, состоящей изН2№(СН2)2-СН(ОСН2СН3)2;Н2ЩСН2)2-О-(СН2)2-О-СН2-СН(ОСН2СН3)2,Н2ЩСН2)2-(С=О)-КН-(СН2)2-СН(ОСН2СН3)2 и Н2ЩСН2)3-(С=О)-КН-(СН2)2-СН(ОСН2СН3)2.
- 19. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что сшивающее соединение М-Ь-А в соответствии с формулой (II) является 1-амино-3,3-диэтоксипропаном.
- 20. Способ по любому из пп.1-19, отличающийся тем, что дополнительно включает:(ίί) реакцию производного НА8 в соответствии с формулой (III) посредством группы А с аминогруппой биологически активного вещества ΗΝ-ВА', посредством восстановительного аминирования с получением производного НА8 в соответствии с формулой (IV)
- 21. Способ по п.20, отличающийся тем, что до стадии (ίί) группу А производного НА8 в соответствии с формулой (III) преобразуют в соответствующую альдегидную или кетогруппу.
- 22. Способ по п.20 или 21, отличающийся тем, что на стадии (ίί) реакцию осуществляют преимущественно в водной среде в присутствии восстанавливающего агента, предпочтительно NаСNВΗ3, при температуре в диапазоне от 0 до 37°С, предпочтительно от 0 до 25°С и при значении рН в диапазоне от 3 до 9, предпочтительно от 3 до 7, более предпочтительно от 3 до менее 7 и где на стадии (ίί) молярное отношение производного НА8 к биологически активному веществу ВА составляет от 0,1:1 до 200:1 эквива- 83 018222 лентов, предпочтительно от 1:1 до 50:1 эквивалентов относительно среднемассовой молекулярной массы (Мп) производного ΗΑ8.
- 23. Способ по любому из пп.20-22, отличающийся тем, что биологически активным соединением ВА является пептид, олигопептид, полипептид, протеин, функциональное производное, фрагмент или миметик полипептида или протеина, низкомолекулярное соединение или олигонуклеотид.
- 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что протеин является эритропоэтином (ЕРО), таким как рекомбинантный человеческий ЕРО (гИЕРО), колониестимулирующим фактором (С8Р), таким как С-С8Р, как рекомбинантный человеческий С-С8Р (гИС-С8Р), интерфероном (^Ν), таким как а1рИа, №Ν Ье!а, датта, как рекомбинантный человеческий а1рИа (γΗ^Ν а1рИа) или рекомбинантный человеческий Ье!а (γΗ^Ν Ье!а), фактором VII, таким как рекомбинантный человеческий фактор VIIа (^ИΡVIIа), фактором IX, таким как рекомбинантный человеческий фактор IX (гИРК), гормоном роста (СЩ, таким как рекомбинантный человеческий гормон роста (^ИСΗ), антисвязывающими доменами, такими как антисвязывающий домен, полученный из молекулы человеческого иммуноглобулина С (ИРаЬ), иммуноглобулином С, таким как мышиный иммуноглобулин С (т^С), глюкагоноподобным пептидом-1 (СЬР-1), аспарагиназой, такой как рекомбинантная аспарагиназа (^^^1^^), лептином, таким как рекомбинантный человеческий лептин (гИЬерйп), интерлейкином 2, интерлейкином-11, альфа-1антитрипсином, антителом или фрагментом антитела или альтернативным протеиновым каркасом.
- 25. Производное гидроксиалкилкрахмала (ΗΑ8) формулы (III) где А является ацетальной или кетальной группой;Ь является спейсером, соединяющим X и А, где X является функциональной группой, образованной в результате реакции аминогруппы М сшивающего соединения формулы (II) с гидроксиалкилкрахмалом (ΗΑ8) формулы (I) посредством атома углерода С* ΗΑ8, где С* необязательно окислен до реакции ΗΑ8 с М, где ΗΑ8' является остатком молекулы гидроксиалкилкрахмала, а Κι, К2 и К3 независимо друг от друга являются водородом или гидроксиалкильной группой с линейной или разветвленной цепью, содержащей от 2 до 10 атомов углерода, или группой где Κ1, Κ2, Κ3 и Κ4 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из водорода и алкильной группы, т составляет от 2 до 4, где остатки Κ1 и Κ2 могут быть одинаковыми или разными в т-группах С^К2;п составляет от 0 до 20;о составляет от 2 до 20, где остатки Κ3 и Κ4 могут быть одинаковыми или разными в о-группах СК3К4, и причем аминогруппа М является группой в соответствии с формулой (Нс)К' N—Υ Н (Ис) где Υ либо отсутствует, либо является химической структурой, выбранной из группы, состоящей из где С является О, или 8, или ΝΗ и, если представлен дважды, каждый С независимо - О, или 8, или ΝΗ, иΚ' является Н, или гидроксильной группой, или органическим остатком, выбранным из группы, состоя- 84 018222 щей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, ари ла, замещенного арила, арилалкила, замещенного арилалкила, алкиларила и замещенного алкиларила, причем каждый из указанных органических остатков содержит от 1 до 10 атомов углерода;и причем Ь, соединяющий М и А, является спейсером, включающим по крайней мере одно структурное звено в соответствии с формулой (ΙΙά) где Ь1 и Ь2 независимо друг от друга являются Н или органическим остатком, выбранным из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила, замещенного арила, арилалкила, замещенного арилалкила, алкиларила, замещенного алкиларила и остатков -О-К, где К выбрано из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, ал кенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила, замещенного арила, арилалкила, замещенного арилалкила, алкиларила, замещенного алкиларила, причем каждый из указанных органических остатков по I > и Ь2 независимо содержит от 1 до 20 атомов углерода; и п является целым числом от 1 до 20.
- 26. Производное НА8 по п.25, отличающееся тем, что К15 К2 и К3 независимо друг от друга являются группой -(СН2СН2О)п-Н, где п является целым числом, предпочтительно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
- 27. Производное НА8 по п.25 или 26, отличающееся тем, что гидроксиалкилкрахмал является гидроксэтилкрахмалом (НЕ8).
- 28. Производное НА8 по любому из пп.25-27, отличающееся тем, что А является остатком в соответствии с формулой (II) (Па) где Ζ1 и Ζ2, каждый независимо, является О, или 8, или N1^, предпочтительно О, где Кх является Н или низшим алкилом, таким как метил, этил или пропил, такой как н-пропил или изопропил, или С(О)Ку, где Ку предпочтительно выбирают из группы, состоящей из С1-С6алкила и С6-С14арила, еще более предпочтительно выбирается из группы, состоящей из необязательно замещенных, предпочтительно незамещенных метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила и трет-бутила; причем Кх предпочтительно является Н;А1 и А2, каждый независимо, является метилом, этилом, н-пропилом, изопропилом, н-бутилом, трет-бутилом, бензилом, 1,1,1-трихлорэтилом, нитробензилом, метоксибензилом, этоксибензилом или образуют цикл в соответствии с формулой (11Ь) где А1 и А2, взятые вместе, являются -(СН2)2- или -(СН2)3-, или -(СН2СН(СН3))- и где А3 является Н или метилом, этилом, н-пропилом, изопропилом, н-бутилом, изобутилом, пентилом, бензилом или образует цикл с атомом N аминогруппы М или с подходящим атомом, содержащимся в Ь, причем А3 предпочтительно является Н.
- 29. Производное НА8 по любому из пп.25-28, отличающееся тем, что X выбран из группы, состоящей из -СН=№, -СН2-ПН-, -СН=№О-, -СН2-КН-О-, -С(=О)-КН-, -^^-ΝΉ-ΝΉ-, предпочтительно состоящей из -ОД-ΝΉ-, -СН=№, -СН=^О-, -СН2-ПН-О- и -СН=^КН-(С=О)-.
- 30. Производное НА8 по любому из пп.25-29, отличающееся тем, что Ь1 и Ь2 независимо друг от друга являются Н или органическим остатком, выбранным из группы, состоящей из алкила и замещенного алкила; предпочтительно Н или алкилом;более предпочтительно Н и п является целым числом от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 4, более предпочтительно 2.
- 31. Производное НА8 по п.30, отличающееся тем, что Ь является -(СЬ1Ь2)п-, предпочтительно -(СН2)п-, где п является целым числом от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10 и где Ь более предпочтительно является -СН2-СН2-.
- 32. Производное НА8 по п.30, отличающееся тем, что Ь включает по крайней мере одно структурное звено -(СЬ1Ь2)п1-О-(СЬ1Ь2)п2-, предпочтительно -(СН2)п1-О-(СН2)п2, где п1 равно или отличается от п2- 85 018222 и где спейсер Е предпочтительно связан посредством -(СЬ1Ь2)п1- с аминогруппой М сшивающего соединения.
- 33. Производное НА8 по п.31, отличающееся тем, что Ь является -((СЬ1Е2)2-О)т-(СЕ1Ь2)-, предпочтительно -((СН2)2-О)т-СН2-, где т составляет 1, 2 или 3, более предпочтительно 2 или 3.
- 34. Производное НА8 по п.30, отличающееся тем, что Ь является -(СЬ1Ь2)п-(С=О)-КН-(СЬ1Ь2)п-, предпочтительно -(СН2)п-(С=О)-КН-(СН2)п-, где каждое п находится независимо друг от друга в диапазоне от 1 до 4, более предпочтительно в диапазоне от 1 до 3.
- 35. Производное НА8 по п.34, отличающееся тем, что Ь выбран из группы, состоящей из -(СН2)3-(С=О)-КН-(СН2)3-;-(СН2)3-(С=О)-КН-(СН2)2-;-(СН2)2-(С=О)-КН-(СН2)3- и -(СН2)2-(С=О)^-(СН2)2-;наиболее предпочтительно выбран из группы, состоящей из-(СН2)3-(С=О)^-(СН2)2- и (СН2)2-(С=О)^-(СН2)2-
- 36. Производное гидроксиалкилкрахмала по любому из пп.25-30, имеющее структуру
- 37. Производное гидроксиалкилкрахмала по любому из пп.25-30, имеющее структуру где X является функциональной группой, образованной в результате реакции аминогруппы М сшивающего соединения формулы (II)М Ь А (П) при условии, что X не является амидной группой -С(=О)-КН- с гидроксиалкилкрахмалом (НА8) формулы (I) посредством атома углерода С* НА8, где С* является необязательно окисленным, наиболее предпочтительно неокисленным до реакции НА8 с М и НА8' является остатком молекулы гидроксиалкилкрахмала, а К1, К2 и К3 независимо друг от друга являются водородом или гидроксиалкильной группой с линейной или разветвленной цепью, содержащей от 2 до 10 атомов углерода, или группой где К1, К2, К3 и К4 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из водорода и алкильной группы, т составляет от 2 до 4, где остатки К1 и К2 могут быть одинаковыми или разными в т-группах СК1К2;- 86 018222 п составляет от 0 до 20;о составляет от 2 до 20, где остатки К3 и К4 могут быть одинаковыми или разными в о-группах СК3К4 и причем аминогруппа М является группой в соответствии с формулой (11с) где Υ либо отсутствует, либо является химической структурой, выбранной из группы, состоящей из где С является О, или 8, или ЫН и, если представлен дважды, каждый С независимо - О или 8, или ЫН, иК' является Н, или гидроксильной группой, или органическим остатком, выбранным из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алки нила, арила, замещенного арила, арилалкила, замещенного арилалкила, алкиларила и замещенного алкиларила, причем каждый из указанных органических остатков содержит от 1 до 10 атомов углерода;и причем А является остатком в соответствии с формулой (11а)--С—Ζ,Α, где Ζ1 и Ζ2 независимо друг от друга являются О, или 8, или ΝΚΧ, предпочтительно О, где Кх является Н или низшим алкилом, таким как метил, этил или пропил, такой как н-пропил или изопропил, или С(О)-Ку, где Ку предпочтительно выбирают из группы, состоящей из СгС6алкила и С6-С14арила, еще более предпочтительно выбирают из группы, состоящей из необязательно замещенного, предпочтительно незамещенного метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила и трет-бутила; причем Кх предпочтительно является Н;А1 и А2 независимо друг от друга являются метилом, этилом, н-пропилом, изопропилом, н-бутилом, трет-бутилом, бензилом, 1,1,1-трихлорэтилом, нитробензилом, метоксибензилом, этоксибензилом или образуют цикл в соответствии с формулой (11Ь) где А1 и А2, взятые вместе, являются -(СН2)2- или -(СН2)3-, или -(СН2СН(СН3))- и где А3 является Н или метилом, этилом, н-пропилом, изопропилом, н-бутилом, изобутилом, пентилом, бензилом или образует цикл с атомом Ν аминогруппы М или с подходящим атомом, включенным в к, причем А3 предпочтительно является Н;и где к является спейсером, соединяющим М и А, причем к, соединяющий М и А, является спейсером, включающим по крайней мере одно структурное звено в соответствии с формулой (ΙΙ6) где Ь1 и к2 независимо друг от друга являются Н или органическим остатком, выбранным из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила, замещенного арила, арилалкила, замещенного арилалкила, алкиларила, замещенного алкиларила и остатков -О-К, где К выбрано из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила, замещенного арила, арилалкила, замещенного арилалкила, алкиларила, замещенного алкиларила, причем каждый из указанных органических остатков по Ы и к2 независимо содержит от 1 до 20 атомов углерода; и п является целым числом от 1 до 20, аВА' является остатком биологически активного вещества ВЛ'-ΝΉ^, оставшимся после реакции аминогруппы ВА посредством реакции восстановительного аминирования с А или с альдегидной группой или кетогруппой, соответствующей А.
- 39. Производное НА8 по п.38, отличающееся тем, что X выбран из группы, состоящей из -СНг-ЫН-, -СН^-, -СН2-ЫН-Ο и -СН^-О-, наиболее предпочтительно -СНг-ЫН- и СН2-ЫН-Ο-, наиболее предпочтительно -СН^-ΝΠ-.
- 40. Производное НА8 по п.38 или 39, отличающееся тем, что к, и к2 независимо друг от друга яв- 87 018222 ляются Н или органическим остатком, выбранным из группы, состоящей из алкила и замещенного алкила; предпочтительно Н или алкилом; более предпочтительно Н, где η является целым числом от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 4, более предпочтительно 2.
- 41. Производное НАЗ по п.40, отличающееся тем, что Ь является -(СЬ1Ь2)п-, предпочтительно -(СН2)п-, где η является целым числом от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10 и где Ь более предпочтительно является -СН2-СН2-.
- 42. Производное НАЗ по п.40, отличающееся тем, что Ь включает по крайней мере одно структурное звено -(СЬ1Ь2)п1-0-(СЕ1Е2)п2-, предпочтительно -(СН2)п1-0-(СН2)п2, где п1 равно или отличается от п2, и где спейсер Ь предпочтительно связан посредством -(СЬ1Ь2)п1- с аминогруппой М сшивающего соеди нения.
- 43. Производное НАЗ по п.42, отличающееся тем, что Ь является -((СЬ1Ь2)2-0)т-(СЕ1Е2)-, предпочтительно -((СН2)2-0)т-СН2-, где т является 1, 2 или 3, предпочтительно 2 или 3.
- 44. Производное НАЗ по п.40, отличающееся тем, что Ь является -(СЦЬДХС^^КНДСЬ^^-, предпочтительно -(СН2)п-(С=0)-КН-(СН2)п-, где каждое п независимо друг от друга предпочтительно находится в диапазоне от 1 до 4, более предпочтительно в диапазоне от 1 до 3.
- 45. Производное НАЗ по п.44, отличающееся тем, что Ь выбрано из группы, состоящей из (СН2)3-(С=0)-ЫН-(СН2)3- ; -(^2)3-^=0)^-(^2)2-(^2)2-^=0)^-(^2)3- и -(^2)2-^=0)^-(^2)2- наиболее предпочтительно из группы, состоящей из -(^2)3-^=0)^-(^2)2- и -(^2)2-^=0)^-(^2)2-.
- 46. Производное НАЗ по любому из пп.38-40, имеющее структуру
- 47. Производное НАЗ по любому из пп.38-46, отличающееся тем, что биологически активное соединение ВА является пептидом, олигопептидом, полипептидом, протеином, функциональным производным, фрагментом или миметиком полипептида или протеина, низкомолекулярным соединением или олигонуклеотидом.
- 48. Производное НАЗ по п.47, отличающееся тем, что протеин является эритропоэтином (ЕРО), таким как рекомбинантный человеческий ЕРО (гЬЕР0), колониестимулирующим фактором (СЗГ), таким как О-СЗГ, как рекомбинантный человеческий О-СЗГ (гГО-СЗГ), интерфероном (ΙΓΝ), таким как ΙΓΝ а1рГа, ΙΓΝ Ъе1а, ΙΓΝ датта, как рекомбинантный человеческий ΙΓΝ а1рГа (γΓΙΓΝ а1рГа) или рекомбинантный человеческий ΙΓΝ Ъе1а (γΓΙΓΝ Ъе1а), фактором УЛ, таким как рекомбинантный человеческий фактор УПа (гЬТУПа), фактором ΙΧ, таким как рекомбинантный человеческий фактор ΙΧ (гГНХ), гормоном роста (ОН), таким как рекомбинантный человеческий гормон роста (гГОН), антисвязывающими доменами, такими как антисвязывающий домен, полученный из молекулы человеческого иммуноглобулина О (ГГаЪ), иммуноглобулином О, таким как мышиный иммуноглобулин О (т^О), глюкагоноподобным пептидом-1 (ОЕР-1), аспарагиназой, такой как рекомбинантная аспарагиназа (гАзрагадтазе), лептином, таким как рекомбинантный человеческий лептин (гГЕерЕп), интерлейкином 2, интерлейкином-11, альфа-1антитрипсином, антителом или фрагментом антитела или альтернативным протеиновым каркасом.
- 49. Производное НАЗ, определенное в любом из пп.38-48, в качестве терапевтического или профилактического средства.
- 50. Производное НАЗ, опреленное в любом из пп.38-48, для применения в способе лечения орга низма человека или животного.
- 51. Фармацевтическая композиция, включающая в терапевтически эффективном количестве производное НАЗ по любому из пп.38-48.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP07024350A EP2070950A1 (en) | 2007-12-14 | 2007-12-14 | Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation |
PCT/EP2008/010660 WO2009077154A1 (en) | 2007-12-14 | 2008-12-15 | Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201000798A1 EA201000798A1 (ru) | 2010-12-30 |
EA018222B1 true EA018222B1 (ru) | 2013-06-28 |
Family
ID=39345136
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201000798A EA018222B1 (ru) | 2007-12-14 | 2008-12-15 | Производные гидроксиалкилкрахмала и способ их получения |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8404834B2 (ru) |
EP (2) | EP2070950A1 (ru) |
JP (1) | JP5486507B2 (ru) |
KR (1) | KR101578955B1 (ru) |
CN (1) | CN101918455B (ru) |
AU (1) | AU2008337931B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0821133A2 (ru) |
CA (1) | CA2707811A1 (ru) |
EA (1) | EA018222B1 (ru) |
ES (1) | ES2399003T3 (ru) |
HK (1) | HK1144780A1 (ru) |
IL (1) | IL206223A (ru) |
NZ (1) | NZ586021A (ru) |
WO (1) | WO2009077154A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201004220B (ru) |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10209821A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid |
DE10209822A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid |
WO2004024761A1 (en) | 2002-09-11 | 2004-03-25 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin |
WO2005014655A2 (en) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein |
EP1732609B1 (en) * | 2004-03-11 | 2012-07-11 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein |
JP5191729B2 (ja) | 2004-03-11 | 2013-05-08 | フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 還元的アミノ化によって製造される、ヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質とのコンジュゲート |
EP1762250A1 (en) * | 2005-09-12 | 2007-03-14 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine |
EP2070950A1 (en) | 2007-12-14 | 2009-06-17 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation |
US9120873B2 (en) | 2008-08-21 | 2015-09-01 | Octapharma Ag | Recombinantly produced human factor VIII and IX |
CA2737040C (en) | 2008-09-19 | 2017-05-02 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of therapeutic peptides |
US8916693B2 (en) * | 2009-09-17 | 2014-12-23 | Nektar Therapeutics | Monoconjugated chitosans as delivery agents for small interfering nucleic acids |
CA3078259A1 (en) * | 2010-04-20 | 2011-10-27 | Octapharma Ag | Melezitose for stabilizing human blood plasma proteins |
EP2591008A1 (en) * | 2010-07-09 | 2013-05-15 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation |
EP2809329B1 (en) * | 2012-01-30 | 2018-08-01 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | Hydroxyalkyl starch in combination with cytostatica for the treatment of cancers by reduction of tumor growth rates |
PL228735B1 (pl) * | 2012-02-27 | 2018-04-30 | Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Pan | Zastosowanie koniugatu składającego się z nośnika i zawiązanego z nim kowalencyjnie leku |
RU2497828C1 (ru) * | 2012-06-22 | 2013-11-10 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Химии Коми Научного Центра Уральского Отделения Российской Академии Наук | Гидрофильный конъюгат гидроксиэтилкрахмала и 2,6-диизоборнил-4-метилфенола |
EP2976366A1 (en) * | 2013-03-20 | 2016-01-27 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | Hydroxyalkyl starch derivatives as reactants for coupling to thiol groups |
PL3008095T3 (pl) * | 2013-06-13 | 2017-08-31 | Coöperatie Avebe U.A. | Kompozycje wodnych klejów na bazie skrobi i ich zastosowania |
CN103554283B (zh) * | 2013-10-10 | 2016-09-14 | 西北大学 | 含多巴胺和聚乙二醇的功能型淀粉及其制备方法和应用 |
KR101702870B1 (ko) * | 2015-08-31 | 2017-02-06 | 한림대학교 산학협력단 | (-)-피니디논 합성방법 |
CN105418754A (zh) * | 2015-09-30 | 2016-03-23 | 天津药物研究院有限公司 | 羟乙基淀粉修饰的促红细胞生成素模拟肽及其制备和应用 |
CN110256069B (zh) * | 2019-06-25 | 2021-11-30 | 济南大学 | 一种可光固化的3d打印成型用染色齿科氧化锆陶瓷料浆的制备方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050238723A1 (en) * | 2002-09-11 | 2005-10-27 | Norbert Zander | Method of producing hydroxyalkyl starch derivatives |
US20070134197A1 (en) * | 2004-03-11 | 2007-06-14 | Wolfram Eichner | Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination |
Family Cites Families (134)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3191291A (en) * | 1959-01-21 | 1965-06-29 | Continental Can Co | Art of producing very thin steel and like sheets in wide strips |
CH397115A (de) * | 1960-10-04 | 1965-08-15 | Hoechst Ag | Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher Farbstoffe |
GB1385403A (en) | 1971-07-14 | 1975-02-26 | Unilever Ltd | Process for preparing oxidised carbohydrates |
GB1419080A (en) | 1972-12-29 | 1975-12-24 | Cheminova As | Chemical compounds having juvenile hormone activity |
US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
US4125492A (en) * | 1974-05-31 | 1978-11-14 | Pedro Cuatrecasas | Affinity chromatography of vibrio cholerae enterotoxin-ganglioside polysaccharide and the biological effects of ganglioside-containing soluble polymers |
US4001200A (en) * | 1975-02-27 | 1977-01-04 | Alza Corporation | Novel polymerized, cross-linked, stromal-free hemoglobin |
CA1055932A (en) * | 1975-10-22 | 1979-06-05 | Hematech Inc. | Blood substitute based on hemoglobin |
DE2616086C2 (de) | 1976-04-13 | 1986-04-03 | Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg | Substanz zur Verwendung in einem kolloidalen Blutvolumenersatzmittel aus Hydroxyethylstärke und Hämoglobin |
GB1578348A (en) * | 1976-08-17 | 1980-11-05 | Pharmacia Ab | Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic |
FR2378094A2 (fr) | 1977-01-24 | 1978-08-18 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveaux reactifs biologiques constitues par des supports solides sur lesquels sont couples des composes organiques comportant un residu glucidique |
EP0019403B1 (en) | 1979-05-10 | 1985-07-31 | American Hospital Supply Corporation | Hydroxyalkyl-starch drug carrier |
DE3029307A1 (de) | 1980-08-01 | 1982-03-04 | Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg | Haemoglobin enthaltendes blutersatzmittel |
US4454161A (en) | 1981-02-07 | 1984-06-12 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Process for the production of branching enzyme, and a method for improving the qualities of food products therewith |
JPS57206622A (en) * | 1981-06-10 | 1982-12-18 | Ajinomoto Co Inc | Blood substitute |
IE56026B1 (en) | 1982-10-19 | 1991-03-27 | Cetus Corp | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins |
EP0127839B1 (en) | 1983-05-27 | 1992-07-15 | THE TEXAS A&M UNIVERSITY SYSTEM | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
DK171029B1 (da) | 1983-10-11 | 1996-04-22 | Fidia Spa | Hyaluronsyrefraktion, fremgangsmåde til fremstilling deraf samt ophthalmiske præparater indeholdende hyaluronsyrefraktion |
US4703008A (en) * | 1983-12-13 | 1987-10-27 | Kiren-Amgen, Inc. | DNA sequences encoding erythropoietin |
NZ210501A (en) | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
US4952496A (en) * | 1984-03-30 | 1990-08-28 | Associated Universities, Inc. | Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase |
IL77081A (en) | 1984-12-04 | 1999-10-28 | Genetics Inst | AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin |
DE3501616A1 (de) | 1985-01-17 | 1986-07-17 | Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen | Verfahren zur herstellung von hydroxylamin-derivaten |
US4667016A (en) * | 1985-06-20 | 1987-05-19 | Kirin-Amgen, Inc. | Erythropoietin purification |
US4766106A (en) * | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
US5217998A (en) | 1985-07-02 | 1993-06-08 | Biomedical Frontiers, Inc. | Composition for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid |
US4863964A (en) | 1985-07-02 | 1989-09-05 | Biomedical Frontiers, Inc. | Method for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid |
DD279486A1 (de) | 1986-03-10 | 1990-06-06 | Akad Wissenschaften Ddr | Verfahren zur aktivierung von hydroxylgruppenhaltigen polymeren verbindungen |
US6673347B1 (en) * | 1986-04-30 | 2004-01-06 | Gryphon Therapeutics | Polypeptide and protein derivatives and process for their preparation |
GB8610551D0 (en) | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Hoffmann La Roche | Polypeptide & protein derivatives |
IT1203814B (it) | 1986-06-30 | 1989-02-23 | Fidia Farmaceutici | Esteri dell'acido alginico |
FR2600894B1 (fr) * | 1986-07-02 | 1989-01-13 | Centre Nat Rech Scient | Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications |
US5362853A (en) * | 1986-12-23 | 1994-11-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
US5214132A (en) * | 1986-12-23 | 1993-05-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
EP0307827A3 (en) | 1987-09-15 | 1989-12-27 | Kuraray Co., Ltd. | Novel macromolecular complexes, process for producing same and medicinal use of such complexes |
IL84252A (en) | 1987-10-23 | 1994-02-27 | Yissum Res Dev Co | Phospholipase inhibiting compositions |
US4904584A (en) * | 1987-12-23 | 1990-02-27 | Genetics Institute, Inc. | Site-specific homogeneous modification of polypeptides |
US4847325A (en) * | 1988-01-20 | 1989-07-11 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
DK110188D0 (da) | 1988-03-02 | 1988-03-02 | Claus Selch Larsen | High molecular weight prodrug derivatives of antiinflammatory drugs |
FR2630329B1 (fr) | 1988-04-20 | 1991-07-05 | Merieux Inst | Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications |
IT1219942B (it) | 1988-05-13 | 1990-05-24 | Fidia Farmaceutici | Esteri polisaccaridici |
US4900780A (en) * | 1988-05-25 | 1990-02-13 | Masonic Medical Research Laboratory | Acellular resuscitative fluid |
US4925677A (en) * | 1988-08-31 | 1990-05-15 | Theratech, Inc. | Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents |
US5420105A (en) * | 1988-09-23 | 1995-05-30 | Gustavson; Linda M. | Polymeric carriers for non-covalent drug conjugation |
US5218092A (en) * | 1988-09-29 | 1993-06-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains |
DE3836600A1 (de) | 1988-10-27 | 1990-05-03 | Wolff Walsrode Ag | Kohlensaeureester von polysacchariden und verfahren zu ihrer herstellung |
ATE135370T1 (de) * | 1988-12-22 | 1996-03-15 | Kirin Amgen Inc | Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor |
US6261800B1 (en) * | 1989-05-05 | 2001-07-17 | Genentech, Inc. | Luteinizing hormone/choriogonadotropin (LH/CG) receptor |
DE19975071I2 (de) * | 1989-06-16 | 2000-02-03 | Fresenius Ag | Hydroxyethylstaerke als Plasmaexpander Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung als kolloidales Plasmaersatzmittel |
NL8902128A (nl) | 1989-08-23 | 1991-03-18 | Avebe Coop Verkoop Prod | Vertakkingsenzym en gebruik daarvan. |
JP2896580B2 (ja) | 1989-08-25 | 1999-05-31 | チッソ株式会社 | アミロース―リゾチームハイブリッドと活性化糖およびその製造法 |
KR100263845B1 (ko) | 1989-10-13 | 2000-08-16 | 스튜어트 엘.왓트 | 에리트로포이에틴 동형체와 그의 제조방법 및 그를 포함하는제약학적 조성물 |
US5169784A (en) | 1990-09-17 | 1992-12-08 | The Texas A & M University System | Baculovirus dual promoter expression vector |
DK130991D0 (da) * | 1991-07-04 | 1991-07-04 | Immunodex K S | Polymere konjugater |
US5281698A (en) * | 1991-07-23 | 1994-01-25 | Cetus Oncology Corporation | Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation |
DE4130807A1 (de) * | 1991-09-17 | 1993-03-18 | Wolff Walsrode Ag | Verfahren zur herstellung von polysaccharidcarbonaten |
US6172208B1 (en) * | 1992-07-06 | 2001-01-09 | Genzyme Corporation | Oligonucleotides modified with conjugate groups |
GB2270920B (en) * | 1992-09-25 | 1997-04-02 | Univ Keele | Alginate-bioactive agent conjugates |
NZ250375A (en) | 1992-12-09 | 1995-07-26 | Ortho Pharma Corp | Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives |
CA2110543A1 (en) | 1992-12-09 | 1994-06-10 | David E. Wright | Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives thereof |
EP0601417A3 (de) * | 1992-12-11 | 1998-07-01 | Hoechst Aktiengesellschaft | Physiologisch verträglicher und physiologisch abbaubarer, Kohlenhydratrezeptorblocker auf Polymerbasis, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung |
US5581476A (en) * | 1993-01-28 | 1996-12-03 | Amgen Inc. | Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs |
JP2594241B2 (ja) | 1993-03-16 | 1997-03-26 | ヘモソール インコーポレイテッド | 酸化開環サッカライドによるヘモグロビンの選択的架橋 |
WO1994028024A1 (en) | 1993-06-01 | 1994-12-08 | Enzon, Inc. | Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity |
ZA946122B (en) | 1993-08-17 | 1995-03-20 | Amgen Inc | Erythropoietin analogs |
US5840900A (en) * | 1993-10-20 | 1998-11-24 | Enzon, Inc. | High molecular weight polymer-based prodrugs |
US5876980A (en) * | 1995-04-11 | 1999-03-02 | Cytel Corporation | Enzymatic synthesis of oligosaccharides |
US6214331B1 (en) * | 1995-06-06 | 2001-04-10 | C. R. Bard, Inc. | Process for the preparation of aqueous dispersions of particles of water-soluble polymers and the particles obtained |
WO1996040662A2 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Cellpro, Incorporated | Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates |
US5736533A (en) * | 1995-06-07 | 1998-04-07 | Neose Technologies, Inc. | Bacterial inhibition with an oligosaccharide compound |
WO1997021452A2 (en) * | 1995-12-14 | 1997-06-19 | Advanced Magnetics, Inc. | Macromolecular prodrugs of nucleotide analogs |
US5723589A (en) * | 1995-12-21 | 1998-03-03 | Icn Pharmaceuticals | Carbohydrate conjugated bio-active compounds |
CN1273589C (zh) | 1996-02-15 | 2006-09-06 | 诺沃奇梅兹有限公司 | 多肽缀合 |
US5717998A (en) * | 1996-03-07 | 1998-02-17 | Everett; Betty L. | Swimsuit with displaceable crotch |
US5696152A (en) | 1996-05-07 | 1997-12-09 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Taxol composition for use as organ preservation and cardioplegic agents |
TW517067B (en) | 1996-05-31 | 2003-01-11 | Hoffmann La Roche | Interferon conjugates |
DE19628705A1 (de) | 1996-07-08 | 1998-01-15 | Fresenius Ag | Neue Sauerstoff-Transport-Mittel, diese enthaltende Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung als Blutersatzstoffe |
US5770645A (en) * | 1996-08-02 | 1998-06-23 | Duke University Medical Center | Polymers for delivering nitric oxide in vivo |
US6011008A (en) * | 1997-01-08 | 2000-01-04 | Yissum Research Developement Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Conjugates of biologically active substances |
US5952347A (en) * | 1997-03-13 | 1999-09-14 | Merck & Co., Inc. | Quinoline leukotriene antagonists |
US6299881B1 (en) * | 1997-03-24 | 2001-10-09 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts |
US5990237A (en) | 1997-05-21 | 1999-11-23 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines |
CA2299271C (en) * | 1997-08-07 | 2009-02-03 | University Of Utah | Prodrugs and conjugates of thiol- and selenol- containing compounds and methods of use thereof |
US6875594B2 (en) * | 1997-11-13 | 2005-04-05 | The Rockefeller University | Methods of ligating expressed proteins |
US6624142B2 (en) * | 1997-12-30 | 2003-09-23 | Enzon, Inc. | Trimethyl lock based tetrapartate prodrugs |
DE19808079A1 (de) | 1998-02-20 | 1999-08-26 | Schering Ag | Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Mittel |
CA2233725A1 (en) | 1998-03-31 | 1999-09-30 | Hemosol Inc. | Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes |
US6153655A (en) * | 1998-04-17 | 2000-11-28 | Enzon, Inc. | Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same |
FR2783838B1 (fr) | 1998-09-25 | 2000-12-01 | Roquette Freres | Procede de preparation d'un melange d'enzymes de branchement de l'amidon extraites d'algues |
US6261594B1 (en) * | 1998-11-25 | 2001-07-17 | The University Of Akron | Chitosan-based nitric oxide donor compositions |
EP1035137A1 (en) * | 1999-03-12 | 2000-09-13 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Method for the reductive amination of polysaccharides |
FR2792941B1 (fr) | 1999-04-30 | 2001-07-27 | Roquette Freres | Polymeres solubles de glucose branches et leur procede d'obtention |
US7279176B1 (en) * | 1999-09-02 | 2007-10-09 | Rice University | Nitric oxide-producing hydrogel materials |
US20020065410A1 (en) | 1999-12-02 | 2002-05-30 | Antrim Richard L. | Branched starches and branched starch hydrolyzates |
US6555660B2 (en) * | 2000-01-10 | 2003-04-29 | Maxygen Holdings Ltd. | G-CSF conjugates |
US6586398B1 (en) * | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
JP2001294601A (ja) | 2000-04-11 | 2001-10-23 | Akita Prefecture | 高度分岐澱粉と該高度分岐澱粉の製造方法 |
JP2002003398A (ja) | 2000-04-17 | 2002-01-09 | Ltt Institute Co Ltd | 徐放製剤、その製造法及びワクチン |
US6417347B1 (en) * | 2000-08-24 | 2002-07-09 | Scimed Life Systems, Inc. | High yield S-nitrosylation process |
DE10041541A1 (de) | 2000-08-24 | 2002-03-14 | Michael Duchene | Rekombinante Allergene aus der Motte Plodia interpunctella |
DE10105921A1 (de) | 2001-02-09 | 2002-08-14 | Braun Melsungen Ag | An Kolloide gebundene Arzneiwirkstoffe |
DE10112825A1 (de) | 2001-03-16 | 2002-10-02 | Fresenius Kabi De Gmbh | HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung |
DE10126158A1 (de) | 2001-05-30 | 2002-12-12 | Novira Chem Gmbh | Eine Methode zur Synthese von Gemischen einfach aktivierter und nicht aktivierter Polyoxyalkylene zur Modifizierung von Proteinen |
DE10129369C1 (de) | 2001-06-21 | 2003-03-06 | Fresenius Kabi De Gmbh | Wasserlösliches, einen Aminozucker aufweisendes Antibiotikum in Form eines Pol ysaccharid-Konjugats |
DE10135694A1 (de) | 2001-07-21 | 2003-02-06 | Supramol Parenteral Colloids | Amphiphile Stärke-und Hydroxyethylstärke-Konjugate |
US7179617B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-02-20 | Neose Technologies, Inc. | Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX |
US7125843B2 (en) * | 2001-10-19 | 2006-10-24 | Neose Technologies, Inc. | Glycoconjugates including more than one peptide |
US6375846B1 (en) * | 2001-11-01 | 2002-04-23 | Harry Wellington Jarrett | Cyanogen bromide-activation of hydroxyls on silica for high pressure affinity chromatography |
DE10155098A1 (de) | 2001-11-09 | 2003-05-22 | Supramol Parenteral Colloids | Mittel zur Prävention von mykotischen Kontaminationen bei der Zell- und Gewebekultur bakteriellen, pflanzlichen, animalischen und humanen Ursprungs, bestehend aus Polyen-Makrolid-Konjugaten mit Polysacchariden |
US6916962B2 (en) | 2001-12-11 | 2005-07-12 | Sun Bio, Inc. | Monofunctional polyethylene glycol aldehydes |
US6956135B2 (en) | 2001-12-11 | 2005-10-18 | Sun Bio, Inc. | Monofunctional polyethylene glycol aldehydes |
AU2002357806A1 (en) | 2001-12-11 | 2003-06-23 | Sun Bio, Inc. | Novel monofunctional polyethylene glycol aldehydes |
DE10209822A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid |
DE10209821A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid |
ATE368066T1 (de) | 2002-03-13 | 2007-08-15 | Beijing Jiankai Technology Co | Hydrophiles polymerderivat mit y-verzweigung und herstellungsverfahren dafür; obige verbindung enthaltender medizinischer verbundwerkstoff |
US6918713B2 (en) * | 2002-04-12 | 2005-07-19 | Kramski Gmbh | Cylindrical pin |
DE10217994A1 (de) | 2002-04-23 | 2003-11-06 | Supramol Parenteral Colloids | Konjugate von hyperverzweigten Polysacchariden |
US20040101546A1 (en) | 2002-11-26 | 2004-05-27 | Gorman Anne Jessica | Hemostatic wound dressing containing aldehyde-modified polysaccharide and hemostatic agents |
EP1591467A1 (en) | 2002-09-09 | 2005-11-02 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugate between a polyethylene glycol having a terminal alkanal group and a human growth hormone |
ES2897470T3 (es) | 2002-09-09 | 2022-03-01 | Nektar Therapeutics | Alcanales poliméricos solubles en agua |
DE10242076A1 (de) * | 2002-09-11 | 2004-03-25 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | HAS-Allergen-Konjugate |
ES2214166T1 (es) * | 2002-09-11 | 2004-09-16 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Polipeptidos has-ilados, especialmente, eriptropoyetina has-ilada. |
DE10254745A1 (de) | 2002-11-23 | 2004-06-03 | Supramol Parenteral Colloids Gmbh | Imidazolide von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe |
DE10256558A1 (de) * | 2002-12-04 | 2004-09-16 | Supramol Parenteral Colloids Gmbh | Ester von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe |
WO2005014024A2 (en) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group |
JP2007501870A (ja) * | 2003-08-08 | 2007-02-01 | フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | ヒドロキシアルキルデンプンとg−csfの複合体 |
KR101154343B1 (ko) | 2003-08-08 | 2012-07-05 | 프레제니우스 카비 도이치란트 게엠베하 | 히드록시알킬 스타치 및 g-csf의 컨쥬게이트 |
WO2005014655A2 (en) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein |
CN1863549A (zh) * | 2003-08-08 | 2006-11-15 | 费森尤斯卡比德国有限公司 | 通过肟连接基团进行连接的聚合物和蛋白质的缀合物 |
DE102004009783A1 (de) | 2004-02-28 | 2005-09-15 | Supramol Parenteral Colloids Gmbh | Hyperverzweigte Stärkefraktion, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Konjugate mit pharmazeutischen Wirkstoffen |
EP1591476A1 (en) | 2004-04-30 | 2005-11-02 | U.S. Greentech, Inc. | Turf filler |
US7258661B2 (en) * | 2004-09-13 | 2007-08-21 | Bristol-Myers Squibb Company | Stoma plug |
JP2009093397A (ja) * | 2007-10-09 | 2009-04-30 | Panasonic Corp | タッチパネル及びこれを用いた入力装置 |
EP2070950A1 (en) | 2007-12-14 | 2009-06-17 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation |
-
2007
- 2007-12-14 EP EP07024350A patent/EP2070950A1/en not_active Withdrawn
-
2008
- 2008-12-15 JP JP2010537332A patent/JP5486507B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-12-15 AU AU2008337931A patent/AU2008337931B2/en not_active Ceased
- 2008-12-15 NZ NZ586021A patent/NZ586021A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-12-15 CN CN200880125164XA patent/CN101918455B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-12-15 ES ES08861816T patent/ES2399003T3/es active Active
- 2008-12-15 EP EP08861816A patent/EP2231711B1/en active Active
- 2008-12-15 CA CA2707811A patent/CA2707811A1/en not_active Abandoned
- 2008-12-15 US US12/747,981 patent/US8404834B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-12-15 EA EA201000798A patent/EA018222B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-12-15 BR BRPI0821133-7A patent/BRPI0821133A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-12-15 KR KR1020107015348A patent/KR101578955B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2008-12-15 WO PCT/EP2008/010660 patent/WO2009077154A1/en active Application Filing
-
2010
- 2010-06-07 IL IL206223A patent/IL206223A/en not_active IP Right Cessation
- 2010-06-14 ZA ZA2010/04220A patent/ZA201004220B/en unknown
- 2010-12-09 HK HK10111429.6A patent/HK1144780A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-02-19 US US13/770,275 patent/US20130230898A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050238723A1 (en) * | 2002-09-11 | 2005-10-27 | Norbert Zander | Method of producing hydroxyalkyl starch derivatives |
US20070134197A1 (en) * | 2004-03-11 | 2007-06-14 | Wolfram Eichner | Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US8404834B2 (en) | 2013-03-26 |
CA2707811A1 (en) | 2009-06-25 |
JP5486507B2 (ja) | 2014-05-07 |
ES2399003T3 (es) | 2013-03-25 |
WO2009077154A8 (en) | 2009-09-11 |
CN101918455A (zh) | 2010-12-15 |
IL206223A0 (en) | 2010-12-30 |
ZA201004220B (en) | 2011-08-31 |
KR20100099282A (ko) | 2010-09-10 |
EA201000798A1 (ru) | 2010-12-30 |
EP2231711A1 (en) | 2010-09-29 |
EP2070950A1 (en) | 2009-06-17 |
NZ586021A (en) | 2012-06-29 |
EP2231711B1 (en) | 2012-11-07 |
KR101578955B1 (ko) | 2015-12-21 |
CN101918455B (zh) | 2013-08-28 |
BRPI0821133A2 (pt) | 2015-06-16 |
WO2009077154A1 (en) | 2009-06-25 |
IL206223A (en) | 2013-06-27 |
AU2008337931A1 (en) | 2009-06-25 |
US20100305033A1 (en) | 2010-12-02 |
HK1144780A1 (en) | 2011-03-11 |
US20130230898A1 (en) | 2013-09-05 |
EP2070950A8 (en) | 2009-08-19 |
JP2011506652A (ja) | 2011-03-03 |
AU2008337931B2 (en) | 2013-10-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA018222B1 (ru) | Производные гидроксиалкилкрахмала и способ их получения | |
JP7054407B2 (ja) | オキシム連結のための求核触媒 | |
EA014103B1 (ru) | Конъюгат, включающий белок и полимер или его производное (варианты), способ его получения, применение конъюгата и содержащая его фармацевтическая композиция | |
JP5909755B2 (ja) | 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化 | |
EA010501B1 (ru) | Конъюгаты гидроксиалкилкрахмала и белка, полученные восстановительным аминированием | |
JP7014844B2 (ja) | オキシム連結のための求核触媒 | |
AU2008337930B2 (en) | Method for producing a hydroxyalkyl starch derivative with two linkers | |
JPH07508727A (ja) | 生体分子と結合したポリオキシメチレン−オキシエチレン共重合体 | |
JP6208269B2 (ja) | 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化 | |
TW201731869A (zh) | 具有延長之半衰期及降低之配位體結合性質的因子viii | |
EA006368B1 (ru) | Химически модифицированные конъюгаты прогенипоэтина | |
JPH0751592B2 (ja) | シクロトリフォスファゼン誘導体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM |
|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): BY RU |