PL228735B1 - Zastosowanie koniugatu składającego się z nośnika i zawiązanego z nim kowalencyjnie leku - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie koniugatu składającego się z nośnika i związanego z nim kowalencyjnie leku.

Skrobia jest ogólną nazwą mieszaniny polimerów cukrowych, pełniących rolę magazynu energii wielu roślin. Pod względem chemicznym są to polimery glukozy, zawierające wiązania a-1-4 oraz a-1-6 glikozydowe, analogicznie jak w przypadku glikogenu, który w stosunku do skrobi zawiera proporcjonalnie więcej wiązań a-1-6 glikozydowych [1], Można wyróżnić dwie główne frakcje wchodzące w skład skrobi różnego pochodzenia. Są to: 1) amyloza stanowiąca ok. 20%, będąca przede wszystkim liniowym polimerem glukozy, gdzie (C6H10O5)n o n=5000 2) amylopektyna stanowiąca ok. 80%, będąca w znacznym stopniu polimerem rozgałęzionym, gdzie (C6H10O5)n o n=50000.

Amyloza, zwłaszcza w podwyższonej temperaturze, jest rozpuszczalna w wodzie, natomiast amylopektyna tworzy z wodą tzw. hydrożel. W zależności od pochodzenia skrobi poszczególne jej frakcje mogą różnić się średnimi masami cząsteczkowymi, ilością rozgałęzień a także drobnymi modyfikacjami łańcuchów jak metylacja, fosforylacja itp. [2], Specjalne odmiany roślin mogą syntezować skrobie praktycznie pozbawione amylozy, są to tzw. skrobie woskowe.

Znane są chemicznie modyfikowane formy skrobi, w tym hydroksyalkiloskrobia (HAS). W cząsteczce glukozy, będącej częścią struktury skrobi, są trzy pozycje, do których poprzez eteryfikację mogą być wprowadzone modyfikujące ugrupowania hydrofilowe. Są to odpowiednio pozycje przy C:, C3 i Ce atomie węgla jednostki glukozy. Pozycje te w odniesieniu do modyfikacji chemicznych nie są równo-cenne. A więc przy MS=0,33 co trzecia cząsteczka glukozy w 70% zostanie podstawiona w pozycji 2, w 15% w pozycji 3 i w 15% w pozycji 6. Grupy hydroksyalkilowe stosowane do modyfikacji skrobi mogą być liniowe lub rozgałęzione i zawierać jedną lub więcej grup hydroksylowych. Do celów medycznych najkorzystniejsze okazały się pochodne skrobi zawierające grupy hydroksyetylowe.

Hydroksyetyloskrobia (130/0.4) jest polimerem syntetycznym stosowanym w terapii objętościowej. Efekt objętościowy tego polimeru determinowany jest poprzez jego średnią masę cząsteczkową (Mw), stopień podstawienia grupami hydroksyetylowymi (na jednostkę glukozy) (MS) oraz stosunek stopnia podstawienia określonych miejsc cząsteczek glukozy określany jako stosunek C2/C6 - a więc podstawienia przy atomach węgla C: i Ce pierścienia glukozy. Wpływ na efekt objętościowy ma także stężenie polimeru w preparacie medycznym, zawartość soli oraz zastosowana dawka. Ogólnie obowiązuje zasada, że im wyższy stopień podstawienia polimeru grupami hydroksyetylowymi i stosunek podstawienia C2/C6, tym wolniejszy metabolizm polimeru w organizmie realizowany przede wszystkim przez a-amylazy [3], Polimery HES są charakteryzowane parametrami Mw, MS i stosunkiem podstawienia C2/C6. Mogą jednak występować różnice we właściwościach, związane z pochodzeniem polimeru. HES 130/0.4 wyprodukowany z woskowej skrobi kukurydzianej zawierającej 98% amylopektyny i HES 130/0.42 wyprodukowany ze skrobi ziemniaczanej będącej mieszaniną amylopektyny (75%) i liniowej amylozy, zawierający dodatkowo estry fosforanowe, mogą różnić się właściwościami [4],

Substratem do otrzymywania hydroksyetyloskrobi jest naturalna skrobia otrzymywana z kukurydzy lub ziemniaków, będąca polimerem glukozy z wiązaniami a-1-4 glikozydowymi oraz licznymi rozgałęziającymi wiązaniami a-1-6 glikozydowymi. Stopień rozgałęzień, czyli stosunek wiązań a-1-6 do a-1-4 zazwyczaj wynosi ok. 1:20 [5],

Polimery HES charakteryzują się pewnym stopniem polidyspersji, ze względu na swoje naturalne pochodzenie. Średnia masa cząsteczkowa polimeru HES może zostać obliczona ze wzoru:

oraz Af, - ilość i masa cząsteczkowa indywiduum i.

Parametr ten jest jednym z kilku istotnych parametrów mających wpływ na właściwości biologiczne HES. Między polimerami o tej samej średniej masie cząsteczkowej mogą ujawniać się różnice we właściwościach biologicznych. Przykładem jest HES 200/0.62 i HES 200/0.5 [6], gdzie wyższy stopień podstawienia (MS) skutkuje znacznie wyższym stopniem kumulacji polimeru w osoczu.

Naturalna skrobia charakteryzuje się ograniczoną rozpuszczalnością w roztworach wodnych. Modyfikacja polimeru grupami hydroksyetylowymi diametralnie zmienia właściwości naturalnego polimeru czyniąc go łatwo rozpuszczalnym. Stopień podstawienia grupami hydroksyetylowymi definiuje się jako stosunek molowy ilości grup hydroksyetylowych do ilości jednostek glukozy polimeru. W organizmie ludzkim i zwierzęcym modyfikowany polimer ulega enzymatycznej degradacji z udziałem amylaz a szybkość degradacji determinowana jest przez stopień podstawienia (MS) oraz pozycję modyfikacji - w szczególności przy atomie C2. Modyfikacja polimeru spowalnia degradację enzymatyczną co przekłada się na wydłużenie wewnątrznaczyniowej retencji [7; 8].

Modyfikacja reszty glukozy grupami hydroksyetylowymi dotyczyć może trzech pozycji pierścienia piranozowego - C2, C3, Ce. Reaktywność grup w poszczególnych pozycjach nie jest równocenna a więc końcowy produkt może charakteryzować się różnym stopniem podstawienia względem poszczególnych pozycji. Modyfikacji w przeważającej ilości ulegają pozycje C2 i Ce. Pozycja C2 jest szczególnie ważna gdyż jej modyfikacja ogranicza dostępność wiązania a-1,4-glikozydowego polimeru dla enzymów litycznych. Skutkuje to spowolnieniem enzymatycznej degradacji polimeru w organizmie i co za tym idzie zmianą wielu parametrów biologicznych. Najlepiej dokumentują ten fakt prace porównujące właściwości HES o różnych wartościach stosunku podstawienia C2/C6 i identycznych parametrach Mw i MS [9; 10]. Wyniki badań na pacjentach wyraźnie wskazują biologiczne różnice wynikające z odmiennego stosunku podstawienia C2/C6. Z molekularnego punktu widzenia modyfikacja celowana na konkretną pozycję pierścienia piranozowego pozwala na selektywną i precyzyjną modulację właściwości biologicznych pochodnych HES pod kątem sposobu ich dalszego wykorzystania jako nośnika leków lub markerów diagnostycznych. Kumulacja HES-u w organizmie jest dodatnio skorelowana ze stopniem podstawienia. Klirens wysokopodstawionych HES (I i II generacji) jest wolniejszy. Wielokrotne infuzje tych preparatów prowadziły do ich kumulacji w organizmie [11; 12]. Z punktu widzenia terapii objętościowej kumulacja HES w osoczu lub tkankach jest efektem niepożądanym. Polimery HES 130/0.4, HES 200/0.5 i HES 650/0.7 wywołują zbliżony efekt objętościowy, natomiast stopień ich kumulacji w organizmie wzrasta gwałtownie ze stopniem podstawienia (MS) [13; 14; 15].

Frakcje polimeru HES o masach cząsteczkowych poniżej progu nerkowego (45-60 kDa) [16] po podaniu dożylnym ulegają usunięciu z organizmu. Frakcje o wyższych masach cząsteczkowych podlegają trawieniu enzymatycznemu i analogicznie usuwane są przez nerki. Część polimeru dyfunduje do przestrzeni śródmiąższowej, ulega redystrybucji i częściowo eliminacji. Część polimeru może ulec umiejscowieniu w układzie siateczkowo-śródbłonkowym, gdzie będzie stopniowo hydrolizowany enzymatycznie. Szczegółowy los HES w organizmie zależy przede wszystkim od jego struktury chemicznej [17].

Około 60% podanego dożylnie polimeru HES (70/0.5) zostaje wydalone z moczem. Nie ma jednoznacznych dowodów na lokalizację lub proces jakiemu uległo pozostałe 40%, (pewne ilości mogą być przechowywane w układu siateczkowo-śródbłonkowym) [6].

Polimery HES, zwłaszcza o wyższych masach cząsteczkowych i wyższych stopniach podstawienia (MS), zanim ulegną metabolizmowi podlegają kumulacji w wielu tkankach (wątroba, skóra). Kumulacja może utrzymywać się przez różny czas w zależności od rodzaju tkanki i zastosowanej dawki HES. Obserwowano kumulację różnych generacji HES w histiocytach, keratynocytach, komórkach nabłonka gruczołów potowych, komórkach śródbłonka oraz komórkach okołonerwowyc h [18] [19] [20] [21] [22].

Stopień kumulacji zależy od masy cząsteczkowej i struktury HES. Polimery nieznacznie różniące się pod względem strukturalnym mogą wykazywać znacząco różne właściwości kumulacji [23].

Zaobserwowano wpływ polimerów HES na płytki krwi i proces krzepnięcia krwi w szczególności przez starsze generacje polimeru. Najnowsze generacje (HES 130/0.4) wywierają minimalny wpływ na układ krzepnięcia ale wciąż efekt ten jest dostrzegalny [24] [25] [26] [27]. Polimery 130/0.4, 70/0.5, 200/0.5 nie wykazują różnic w efektach wywieranych na hemodynamikę, hematokryt oraz agregację płytek krwi. Polimery HES, zwłaszcza typu 130/0.4, mogą zmniejszać tendencję erytrocytów do agregacji wpływając tym samym na lepkość krwi [28].

Istnieją dowody na pozytywny wpływ polimerów HES na perfuzję tkanek, ich natlenowanie, aktywację komórek śródbłonka oraz przepuszczalność naczyń krwionośnych [17]. Wykazano, że HES 130/0.4 wywołuje wzrost utlenowania tkanek mięśni szkieletowych [29]. Wpływ HES na VIII czynnik krzepnięcia jest powiązany z wpływem polimeru na komórki śródbłonka. Dane kliniczne wskazują, że polimery HES (130/0.4) znacząco obniżają ekspresję cytokin prozapalnych IL-6 i IL-8 stymulowanych zabiegami chirurgicznymi w obrębie jamy brzusznej [30]. Obniżona aktywacja komórek śródbłonka oraz obniżenie ekspresji cytokin prozapalnych może być skutkiem wpływu HES na adhezję określonych komórek. Wykazano, że HES obniża adhezję neutrofili in vitro. Obniżenie przesiąkania naczyń krwionośnych w obecności HES było przedmiotem badań in vivo [31] [32] [33]. Potwierdziły one redukujący, zależny od dawki, wpływ polimeru na omawiany proces. Niezależnie HES wpływa na obniżenie poziomu mediatorów zapalnych: TNF-α, IL1-b i czynnika NF-kB. HES 130/0.4 może selektywnie obniżać aktywność metaloproteinazy-9 (MMP-9), co wykazano w doświadczeniach in vitro i potwierdzono w badaniach klinicznych [34], MMP-9 metatoproteinaza należąca do gelatynaz, odpowiedzialna jest obok MMP-2 za degradację kolagenu typu IV, który stanowi fizyczną barierę uniemożliwiającą komórkom migrację. Dzięki temu zjawisku możliwa jest migracja leukocytów podczas stanów zapalnych, komórek uczestniczących w procesie morfogenezy oraz szereg procesów, takich jak angiogeneza, proces miejscowego wzrostu nowotworów i powstawanie przerzutów.

Dlatego fakt ten może okazać się niezwykle istotny w hipotezach związanych z terapią przeciwno wotworową [35], MMP-9 może także modyfikować receptor a IL-2 (receptor interleukiny 2) umiejscowiony na powierzchni limfocytów T, obniżając tym samym ich zdolność do odpowiedzi na interleukinę 2. Proces ten sprzyja rozwojowi nowotworów, hamując zdolność do infiltracji guza przez limfocyty T. MMP-9 bierze także udział w aktywacji IL-8 [36],

Metotreksat jest jednym z najstarszych stosowanych obecnie leków, jest antymetabolitem kwasu foliowego. Został zaprojektowany w latach 40 jako związek hamujący proliferację komórek nowotworowych [37], ΜΤΧ jest specyficznym inhibitorem reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), jednak pośrednio lub bezpośrednio oddziałuje na szereg innych celów molekularnych wpływając na replikację DNA i proliferację komórek. ΜΤΧ znalazł szerokie zastosowanie w leczeniu chorób nowotworowych i jest stosowany zarówno samodzielnie jak i w połączeniu z innymi chemioterapeutykami do czasów obecnych. Wykorzystywany jest w terapii m.in. ostrej białaczki limfatycznej, chłoniaka nieziarniczego, mięsaka kostninowego, nabło-niaka kosmówkowego złośliwego, a także w przypadkach raków piersi, głowy i szyi. Od lat 80 ΜΤΧ (w mniejszych dawkach niż w chemioterapii nowotworów) stosowany jest do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów a w latach następnych stosowano go również w innych chorobach o podłożu immunologicznym: toczniu rumieniowatym, łuszczycy i w profilaktyce choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi [38],

Transport ΜΤΧ do wnętrza komórki może odbywać się na kilka sposobów. Aktywny transport do komórki za pośrednictwem białka zwanego przenośnikiem zredukowanych folianów (RFC1 - reduced folate carrier) [39], który transportuje także fizjologiczne formy kwasu foliowego. Konkurencja transportowa między ΜΤΧ i folianami jest częścią obserwowanego efektu zahamowania replikacji DNA przez lek. Aktywny transport może także być realizowany za pomocą białka wiążącego foliany (FBP - folate-binding protein), do którego ΜΤΧ ma znacząco niższe powinowactwo w porównaniu z fizjologicznymi formami kwasu foliowego [40], Transport ΜΤΧ do wnętrza komórek za pośrednictwem RFC jest znacznie skuteczniejszy niż za pośrednictwem FBP [41]. Ze względu na fakt, że ekspresja FBP jest zmienna i zależna od zewnątrzkomórkowego stężenia folianów, transport za pośrednictwem RFC jest głównym sposobem transportu ΜΤΧ nawet przy wysokim zewnątrzkomórkowym fizjologicznym stężeniu folianów [42], Komórkowy proces usuwania ΜΤΧ zachodzi przede wszystkim za pośrednictwem białek oporności wielolekowej (MRPs - multidrug resistance-associated proteins) i glikoproteiny P (P-gp). Powinowactwo ΜΤΧ do MRPs jest niższe niż do białek uczestniczących w transporcie ΜΤΧ do wewnątrz komórki więc lek może być efektywnie metabolizowany w komórkach wykazujących wysoką ekspresję MRPs [43], ΜΤΧ w komórce ulega poliglutamylacji do formy MTX(Glu)n. Stężenie MTX(Glu)n jest zależne od FPGS (folylpoly-y-glutamate synthetase), enzymu który przyłącza reszty glutamylowe i GGH (γ-glutamyl hydrolase), który usuwa je z ΜΤΧ. Postacie poliglutamylowe są wolniej usuwane z komórki, skuteczniej hamują TS (thymidylate synthase) i dysocjują wolniej po związaniu z DHFR. W lizosomach reszty glutamylowe są kolejno odłączane przez enzym lizosomalny GGH. Dochodzi do przekształcenia długołańcuchowych MTX(Glu)n w krótkołańcuchowe MTX(Glu)n, a następnie w ΜΤΧ [44], Metotreksat jest częściowo metabolizowany w wątrobie przez oksydazę aldehydową. W wyniku działania tego enzymu dochodzi do hydroksylacji cząsteczki w pozycji 7 pierścienia pterydynowego z wytworzeniem 7-ΟΗ-ΜΤΧ. Na uwagę zasługuje fakt, że MTX(Glu)n znacznie mniej wydajnie ulega procesowi hydroksylacji [45], ΜΤΧ ulega także metabolizmowi pod wpływem karboksypeptydazy wytwarzanej przez bakterie jelitowe do formy DAMPA (4-amino-4-deoxy-N-methylpteroic acid) pozbawionej reszty glutaminowej. Zarówno DAMPA jak i 7-ΟΗ-ΜΤΧ są znacznie słabszymi inhibitorami DHFR niż wolny ΜΤΧ [46],

Badania na szczurzym modelu poadiuwantowego zapalenia stawów wykazały, że MTX prowadzi do zmniejszenia poziomu TNF-α w płynie maziowym [47]. Badania ex vivo potwierdziły właściwości przeciwzapalne MTX wynikające m.in. z jego wpływu na wytwarzanie cytokin. Podawanie MTX myszom z zapaleniem stawów indukowanym kolagenem powodowało obniżenie produkcji TNF-α przez komórki śledziony stymulowane ex vivo przeciwciałami anty-CD3/CD28, octanem mirystynianu forbolu (PMA) i LPS-em [48].

Wpływ MTX na produkcję TNF-α potwierdziły również badania in vitro wykazujące, że inkubacja komórek T aktywowanych poprzez TCR z MTX prowadziła do spadku wytwarzania TNF-α [49]. Badania in vitro i in vivo wskazują także na inhibicję przez MTX S-adenozylotransferazy metioniny (MAT), enzymu uczestniczącego w przemianie metioniny do S-adenozylometioniny (SAM) - ważnego donora grup metylowych. Niedobór tego związku powoduje zahamowanie syntezy glutationu (GSH) [50].

Dzięki zwiększeniu masy cząsteczkowej substancji aktywnej biologicznie poprzez skoniugowanie jej z wysokocząsteczkowym polimerem, koniugaty mogą wykazywać znacznie wydłużony okres połowicznej eliminacji z osocza w porównaniu do substancji nieskoniugowanej. W przypadku makrocząsteczek terapeutycznych (np. białek) modyfikacja polimerem może umożliwić obniżenie ich ewentualnej antygenowości, a tym samym pozwoli zmniejszyć ich immunogenne działania uboczne.

Znane są doniesienia literaturowe na temat koniugatów HES z polipeptydami i białkami, zwłaszcza z erytropoetyną, w przypadku której celowana koniugacja z HES daje duże profity potęgując aktywność biologiczną EPO in vivo [51]. Spowodowane jest to wydłużeniem czasu cyrkulacji koniugatu HES-EPO w krwioobiegu. Polimer pełni rolę maskującą sprawiając, że koniugat jest wolniej wychwytywany przez komórki wątroby a zwiększenie masy cząsteczkowej względem natywnej EPO skutkuje zmniejszeniem klirensu nerkowego.

Znane są koniugaty hydroksyalkiloskrobi i białka, czynnika stymulującego tworzenie kolonii gra-nulocytów - G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor), utworzonych przez wiązanie kowalencyjne pomiędzy hydroksyalkiloskrobią a białkiem [52]. Rekombinowany ludzki G-CSF (rhG-CSF) zazwyczaj stosuje się do leczenia różnych postaci leukopenii. Koniugacja z polimerem skrobi znacząco zmienia farmakokinetykę i farmakodynamikę G-CSF wpływając pozytywnie na skuteczność działania. Znane są również koniugaty pochodnych skrobi z innymi białkami oraz polinukleotydami [53] [54].

Wykorzystanie HES do syntezy nanokoniugatów zostało także opisane [55]. Koniugat HES z che-latorem żelaza deferoksaminą (HES-DFO) wykazywał dobrą tolerancję oraz zmniejszony klirens i toksyczność przy jednoczesnym zwiększonym poziomie wydalania żelaza z moczem [56] [57].

Otrzymywanie koniugatów pochodnych skrobi z aktywnymi substancjami białkowymi jest także przedmiotem patentu [58].

Polimery HES były również wykorzystywane to tworzenia mikrokapsułek (4-15 μm) mających w swym wnętrzu antygeny wykorzystywane w immunoterapii nowotworów. Kapsułki miały pełnić rolę ochronną i regulującą proces uwalniania leku. Kapsułki wytwarzane były na drodze chemicznego sieciowania polimeru. We wstępnych badaniach wykorzystano albuminę bydlęcą jako białko modelowe [59]. Mikrokapsułki nie wykazywały cytotoksyczności a zamknięte w ich wnętrzu białko było stopniowo uwalniane aż do momentu całkowitej degradacji enzymatycznej polimerowej kapsułki.

Trwają badania nad wykorzystaniem skrobi sieciowanej za pomocą POCI3 jako matrycy nośnikowej dla dojelitowych form leków. W takim modelu można osiągnąć cel terapeutyczny, w tym przypadku okrężnicę, i optymalizując stopień posieciowania nośnika kontrolować proces uwalniania leku [60].

Dobrym przykładem tzw. inteligentnych koniugatów jest układ zawierający antybiotyk, który uwalniany jest do środowiska jedynie w przypadku wystąpienia infekcji [61]. Antybiotyk związany jest z matrycą hydrożelu za pomocą peptydowego linkera, zawierającego sekwencję ulegającą proteolizie przy udziale enzymów produkowanych przez określone bakterie chorobotwórcze.

Innym podejściem jest wykorzystywanie HES-u jako matrycy dla tworzenia kompleksów. Znane są doniesienia na temat kompleksów substancji leczniczych z pochodnymi skrobi o dużej masie cząsteczkowej w których substancję nośnikową funkcjonalizuje się, poddaje reakcji z substancją leczniczą i po rozpuszczeniu w roztworach wodnych tworzy się preparaty do iniekcji [62]. W szczególności Q. Luo, P. X. Wang, Y. Q. Miao, H. B. He and X. Tang, Carbohydr. Polym., 2012, 87, 2642-2647 dotyczy stosowania HES jako nośnika dla 5-FU. Celem było uzyskanie systemu do spowolnionego uwalniania 5-FU. Autorzy przyłączają do HES zmodyfikowany lek FUAC. Przeprowadzają badania farmakokinetyczne i udowadniają, że lek uwalnia się wolniej. W publikacji nie opisano jednak leczenia nowotworów. Publikacja nie ujawnia również żadnych informacji odnośnie możliwości wykorzystania w terapii koniugatów HES i ΜΤΧ, ani nie sugerują możliwości korzyści wynikających ze stosowania takiego koniugatu. W opisie US2006188472 A1 sugeruje się możliwość uzyskania koniugatów HES z różnymi che-mioterapeutykami. Jednak w treści dokumentu przyznaje się, że efekt przyłączenia substancji aktywnej do HES jest trudny do przewidzenia i może on prowadzić zarówno do zwiększenia jak i do poprawy aktywności substancji aktywnej. W dokumencie tym nie ujawnia się również żadnych danych dotyczących efektów stosowania koniugatu HES i ΜΤΧ w terapii przeciwnowotworowej ani tym bardziej możliwości uzyskania efektu ujawnionego w przedmiotowym zgłoszeniu.

Znane jest wykorzystanie pochodnych skrobi jako nośników antybiotyków zawierających amino-cukry z założenia mające na celu zmniejszenie ich toksyczności [63],

Obszerna informacja zawierająca metody otrzymywania pochodnych skrobi została ujawniona także w patencie [64],

Znane jest wykorzystanie HES 600/0.7 jako roztworu nośnikowego w chemioterapii dootrzewnowej. Obecność wysokocząsteczkowego polimeru powodowała wzrost efektywności dystrybucji leku (paklitaksel) oraz zwiększoną odpowiedź komórek nowotworowych obecnych w jamie otrzewnej na pa-klitaksel [65], W literaturze jest wiele doniesień na temat wykorzystywania koniugatów zawierających ΜΤΧ w doświadczalnej terapii nowotworów oraz chorób autoimmunizacyjnych. Intensywnie badane były ko-niugaty ΜΤΧ z albuminami - doprowadzone do etapu badań klinicznych [66] [67] [68] [69] [70] [71], Znane są także sieciowane koniugaty HSA-ΜΤΧ tworzące nanostruktury [72], Jako nośnik metotreksatu wykorzystywany był także fibrynogen [73] oraz glikowany fibrynogen [74], i wykazana została wyższość koniugatu nad wolnym lekiem w doświadczeniach in vivo.

Znane są również prace dotyczące wykorzystania jako nośnika ΜΤΧ polisacharydów, takich jak mannan [75] czy dekstrany [76] [77]. Kowalencyjne połączenie polisacharyd - ΜΤΧ realizowane było z wykorzystaniem grup karboksylowych leku w reakcji bezpośrednio z polimerem lub z wykorzystaniem dodatkowego linkera, np. peptydowego zawierającego określoną sekwencję - cel molekularny [78], W terapii chorób o podłożu autoimmunizacyjnym, szczególnie reumatoidalnego zapaleniu stawów, trwają badania nad wykorzystaniem koniugatów ΜΤΧ z kwasem hialuronowym [79] [80], W przypadku polimerów syntetycznych znane są prace dotyczące układów ΜΤΧ-PEG (glikol polietylenowy) otrzymywanych według zróżnicowanych strategii syntetycznych [81], Obszerną grupę badawczą dotyczącą koniugatów ΜΤΧ stanowią także układy wykorzystujące dendrymery o różnej strukturze. Znane są koniugaty wykorzystujące do połączeń kowalencyjnych grupy aminowe, karboksylowe ΜΤΧ [82] bezpośrednio a także za pośrednictwem określonych linkerów [83] [84], W celu nadania charakteru tropowego wysokocząsteczkowym koniugatom metotreksatu, wykorzystuje się przeciwciała. Przykładem jest „potrójny” koniugat zawierający dendrymer z przyłączonym kowalencyjnie (wiązanie estrowe) ΜΤΧ i następnie skoniugowany z przeciwciałem jako cząsteczką tropową (np. anti-HER2 mAb) [85],

Należy zwrócić uwagę, że do aktywności ΜΤΧ (właściwości inhibitora DHFR) niezbędna jest wolna grupa α-karboksylowa, co zostało udowodnione podczas syntezy szeregu koniugatów ΜΤΧ o właściwościach lipofilowych [86] [87] [88] [89],

Celem wynalazku jest zaproponowanie alternatywnej postaci leku przeciwnowotworowego lub przeciwzapalnego, która nadawała by się do ukierunkowanej terapii wymagającej wybiórczego dostarczania leku do komórek chorej tkanki. Zwiększy to efektywność terapii i obniży poziom niepożądanych efektów ubocznych wynikających z oddziaływania leku na komórki zdrowej tkanki leczonego organizmu.

Nieoczekiwanie cel taki został osiągnięty w przedmiotowym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie koniugatu składającego się z nośnika i związanego z nim kowalencyjnie leku do wytwarzania leku do leczenia guzów białaczki, przy czym wytwarzany lek jest przeznaczony do podawania dożylnego, natomiast rzeczony koniugat posiada wzór ogólny:

gdzie: m jest liczbą całkowitą od 60 do 60000, R1 oznacza podstawnik wybrany z grupy obejmującej: wodór, -CH2CH2OH, -Lek, -ChhChhO-Lek, R2 oznacza podstawnik wybrany z grupy obejmującej: wodór, -CH2CH2OH, -Lek, -ChhChLO-Lek, jednostkę glukozy, przy czym nośnikiem jest skrobia o masie cząsteczkowej od 10 do 1000 kDa i stopniu podstawienia grupami hydroksyetylowymi od 0,1 do 0,9 mol/jednostkę glukozy, a Lekiem jest metotreksat.

Szczegółowe omówienie istoty wynalazku przedstawiono poniżej. Ponadto przykładowe realizacje wynalazku zostały przedstawione w załączonych przykładach.

Zdaniem twórców, niezwykle ważne z punktu widzenia rozwoju nowotworu jest chemiczno-fi-zyczne spojrzenie na zagadnienie (wpływ takich parametrów jak ciśnienie osmotyczne, tarcie, lepkość, dyfuzja, stres mechaniczny itp.). Ciśnienie osmotyczne panujące w otoczeniu komórek ma istotny wpływ na osiągane stężenia leków w ich sąsiedztwie i we wnętrzu. Obserwacje te poczyniono także dla komórek nowotworowych [90], W literaturze można napotkać pojęcie ciśnienia homeostatycznego jako wyniku mechanicznej presji dzielących się komórek wobec otaczających tkanek [91],

Zgodnie z wynalazkiem, dystrybucja polimerów HES (lub koniugatów zawierających HES) w tkankach prowadzi do zmiany wymienionych wcześniej parametrów fizykochemicznych w tkance nowotworowej i jej bezpośrednim otoczeniu, co przekłada się na przenikanie przez ściany naczyń krwionośnych, internalizację, proteolizę, transport komórkowy itp.

Syntezując polimery HES dysponuje się obszernym wachlarzem możliwości wpływania na jego późniejsze właściwości fizykochemiczne i przede wszystkim biologiczne. Polimer wyjściowy (naturalna skrobia) w zależności od pochodzenia charakteryzuje się odmiennymi właściwościami (średnia masa cząsteczkowa, liczba wiązań a-1,6-glikozydowych). W procesie modyfikacji grupami hydroksyetylowymi można precyzyjnie regulować stopień podstawienia i jego lokalizację co w konsekwencji prowadzi do otrzymania polimeru o zadanych właściwościach adekwatnych do konkretnych celów biologicznych.

Ujawniono koniugaty zbudowane z nośnika i związanego z nim leku. Nośnikiem może być dowolna pochodna skrobi (hydroksyalkiloskrobia, HAS), lekiem natomiast dowolna znana substancja chemiczna o właściwościach przeciwzapalnych lub przeciwnowotworowych zawierająca w swej strukturze wolną grupę karboksylową lub aktywną postać grupy karboksylowej jak bezwodnik, azydek, ester aktywny itp. W kontekście niniejszego wynalazku, określenie „hydroksyalkiloskrobia” (HAS) odnosi się do pochodnej skrobi, która została podstawiona co najmniej jedną grupą hydroksyalkilową, która z kolei: • może zawierać jedną lub większą liczbę grup hydroksylowych, • jest liniowa lub rozgałęziona, • zawiera jedną lub większą liczbę podstawników.

Możliwe są także hydroksyalkiloskrobie zawierające dwie lub większą liczbę różnych grup hy-droksyalkilowych. W odniesieniu do wszystkich postaci niniejszego wynalazku najkorzystniejszym polimerem jest hydroksyetyloskrobia (HES). 1. Materiały i metody. 1.1. Oznaczania analityczne. 1.1.1. Oznaczenia zawartości glukozy.

Oznaczenia zawartości glukozy w koniugatach zawierających HES dokonano metodą fenolową według [92], 1.1.2. Oznaczanie całkowitej zawartości metotreksatu.

Oznaczanie całkowitej zawartości metotreksatu w koniugatach i roztworze reakcyjnym ΜΤΧ dokonano metodą spektrofotometryczną przy długości fali 372 nm, zastosowaniu współczynnika absorpcji 8570 Μ1 cnrr1 i roztworu NaHCC>3 o stężeniu 100 mM jako rozpuszczalnika. Pomiary zostały wykonane za pomocą spektrofotometru dwuwiązkowego Specord250 (Analytik Jena). 1.1.3. Oznaczanie wolnego metotreksatu.

Oznaczanie wolnego (nie związanego z nośnikiem) metotreksatu w koniugatach HES-ΜΤΧ wykonywano za pomocą metody chromatograficznej specyficznej, opartej o filtrację żelową na złożu chromatograficznym Superdex™ Peptide, z wykorzystaniem kolumny o wymiarach 150x4.6 mm i fazy ruchomej - 0.10 M NaHC03 przy przepływie 0.4 ml/min: o Detekcja 302 nm: - Liniowość - 0.1000 - 0.001 mg/ml ΜΤΧ - Granica detekcji (LOD) (S/N=2H/h) wynosi poniżej 0.001 mg/ml ΜΤΧ - Granica oznaczalności (LOQ) (S/N=10/1) wynosi 0.001 mg/ml ΜΤΧ o Detekcja 372 nm: - Liniowość 0.1000 - 0.004 mg/ml ΜΤΧ - Granica detekcji (LOD) (S/N=2H/h) wynosi poniżej 0.001 mg/ml ΜΤΧ - Granica oznaczalności (LOQ) (S/N=10/1) wynosi 0.004 mg/ml ΜΤΧ

Analizy chromatograficzne wykonane zostały za pomocą zestawu HPLC Waters 515/990+ (Waters Corp.) oraz Ultimate 3000 (Dionex Corp.). 1.2. Oczyszczanie koniugatów HES-MTX.

Koniugaty oczyszczano od nadmiaru wolnego ΜΤΧ wykorzystując dializę równowagową. Dializy wykonano przy użyciu membran dializacyjnych Visking 12 kDA (Serva GmbH) oraz Pellicon®XL (Milli- pore Corp.) 1.3. Badania stabilności koniugatów. W badaniach stabilności dokonywano inkubacji preparatów w zadanych warunkach w stężeniu 0.4 mg/ml ΜΤΧ. Siłę jonową roztworu ustalano dodając odpowiednią ilość chlorku sodu (NaCI) do roztworu buforowego. Pomiarów produktu rozkładu koniugatu HES-ΜΤΧ dokonywano metodą chromatograficzną (pkt 1.1.3) w zadanych odstępach czasu. Następnie przy założeniu kinetycznej reakcji l-rzędu obliczono stałą szybkości reakcji rozkładu i czas półtrwania to,5 (czas po upływie którego uwolnieniu ulegnie połowa ogólnej zawartości ΜΤΧ w koniugacje). 1.4. Badanie parametrów hydrodynamicznych koniugatów. 1.4.1. Badania DLS (Dynamie Light Scatering).

Pomiary wyznaczania średnicy hydrodynamicznej koniugatów metodą dynamicznego rozpraszania światła dokonano przy stężeniu koniugatu 1 mg/ml w roztworze buforu fosforanowego o stężeniu 10 mM, pH=7.20.

Pomiary potencjału zeta koniugatów dokonano przy stężeniu koniugatu 1 mg/ml w roztworze wodnym. 1.4.2. Badania SLS (Static Light Scatering)

Pomiary wyznaczania masy cząsteczkowej i drugiego współczynnika wirialnego koniugatów metodą statycznego rozpraszania światła dokonano dla szeregu rozcieńczeń koniugatu (zakres stosowanych stężeń 0.1-1 mg/ml) w roztworze NaCI 154 mM. Zastosowano różnicowy przyrost współczynnika załamania światła rozcieńczalnika (dn/dc) - 1.500 ml/g [93], W pomiarach jako standard zastosowano toluen. 1.4.3. Wyznaczanie potencjału zeta.

Pomiary potencjału zeta koniugatów wykonywano przy stężeniu koniugatu 1 mg/ml w roztworze buforu fosforanowego o stężeniu 10 mM, pH=7.2

Pomiary parametrów hydrodynamicznych i potencjału zeta dokonane zostały za pomocą aparatu Zetasizer Nano (Malvern Instruments Ltd.). 1.5. Badania biologiczne in vitro.

Roztwory wyjściowe testowanych związków o stężeniu 1 mg/ml przygotowywano ex tempore do każdego doświadczenia, rozpuszczając w soli fizjologicznej.

Rozpuszczalnikiem dla dalszych rozcieńczeń było medium hodowlane. Koniugaty HES-ΜΤΧ przetestowano w przedziałach stężeń od 1 do 0,001 μg/ml, metotreksat (ΜΤΧ) przetestowano w przedziale stężeń od 0,1 do 0,001 pg/ml. 1.5.1. Linie komórkowe. W badaniach zastosowano następujące linie ludzkich białaczek: MV4-11, K562, HEL92, CCRF. Linie te znajdują się w kolekcji linii komórkowych IITD. Komórki hodowane były w medium RPMI 1640 z dodatkiem 10% FBS oraz glutaminy (2 mM). Wszystkie media zawierały antybiotyki: 100 μρ/ιηΙ streptomycyny i 100 U/ml penicyliny. Komórki hodowano w wilgotnej atmosferze, 5% CO2 w 37°C. 1.5.2. Test cytotoksyczny (SRB).

Badania wykonano przy użyciu testu SRB mierzącego zahamowanie proliferacji komórek docelowych w 96-godzinnej hodowli in vitro [94], W każdym doświadczeniu próbki zawierające określone stężenia preparatu nanoszono w trzech powtórzeniach. Doświadczenia dla wszystkich czterech linii powtarzano od dwóch do czterech razy.

Analizę uzyskanych wyników przeprowadzono przy użyciu programu Excel i Cheburator. Otrzymane wyniki przedstawiono za pomocą parametru IC50 (half maximal inhibitory concentration), który opisuje maksymalne stężenie preparatu jakie jest konieczne do zahamowania proliferacji 50% komórek w populacji. Przyjmuje się, iż dla substancji chemicznych kryterium aktywności jest IC50 nie wyższe niż 4 μg/ml w badanym przedziale stężeń od 100 pg/ml do 0,1 pg/ml. Koniugaty HES-ΜΤΧ (oraz sam ΜΤΧ) wykazywały wyższą aktywność antyproliferacyjną od założonego kryterium, dlatego przedział stężeń, w których badano ich aktywność obniżono odpowiednio od 1 do 0,001 pg/ml. 1.6. Badania biologiczne in vivo. 1.6.1. Model mysiej białaczki P388.

Myszy szczepu CDF (samice, samce) zostały obarczone mysią białaczką P388. Komórki nowotworowe wszczepiono dootrzewnowo w liczbie 1x106 komórek/0,25 ml/mysz.

Liczba myszy w grupach: kontrola - 8 (5$, 3c?); metotreksat podawany jednokrotnie (MTXx 1) -7 (3$, 4(?); HES-ΜΤΧ 130/0.4/52 - 8 (5?, 2$).

Preparaty podano 1-go dnia trwania eksperymentu, jednokrotnie, dootrzewnowo, w dawce 20 mg/kg/dzień. W dniu 23 eksperyment zakończono. Dokonywano pomiarów masy ciała myszy w trakcie eksperymentu, codziennie.

Analizę statystyczną czasu przeżycia przeprowadzono za pomocą testu Pęto &amp; Pęto Wilcoxon (*p<0.05 w stosunku do kontroli). Różnice w masie ciała myszy analizowano za pomocą testu Kruskal-Wallis ANOVA, test dla wielokrotnych porównań oraz porównanie grup wg Mann-Whitney U test.

Przedłużenie czasu życia myszy leczonych koniugatami metotreksatu obliczano na podstawie wzoru: ILS [%] = ((cżL / cżK) *100)-100

Gdzie: ILS [%] increased life span - czas wydłużenia życia cżL - średni czas życia myszy leczonych cżK - czas życia myszy kontrolnych. 1.6.2. Model ludzkiej białaczki MV-4-11 - eksperyment 1.

Myszy szczepu NOD/SCID (samce) obarczone ludzką białaczką MV-4-11; komórki nowotworowe wszczepiono podskórnie w liczbie 8x106 komórek/0,25 ml/mysz.

Liczba myszy w grupach: kontrola - 7; metotreksat (ΜΤΧ) - 7; HES-ΜΤΧ 130/0.4/52-7.

Leczenie myszy rozpoczęto 6-go dnia trwania eksperymentu. ΜΤΧ: dawka 20 mg/kg/dzień, podanie dożylne, jednokrotnie w 6-tym dniu eksperymentu. HES-ΜΤΧ 130/0.4/52 dawka 20 mg/kg, podanie dożylne, jednokrotnie w 6-tym dniu eksperymentu. W dniu 22-gim eksperyment zakończono, uśmiercono myszy z grup: kontrola i ΜΤΧ, pobrano krew i guzy do dalszej analizy. Grupę HES-ΜΤΧ 130/0.4/52 pozostawiono do obserwacji.

Dokonywano pomiarów guzów podskórnych w trakcie eksperymentu, 3x w tygodniu.

Wykonano analizę statystyczną z użyciem testu Kruskal-Wallis ANOVA, test dla wielokrotnych porównań oraz porównanie grup z użyciem Mann-Whitney U test. 1.6.3. Model ludzkiej białaczki MV-4-11 - eksperyment 2.

Myszy szczepu NOD/SCID (samce) obarczone ludzką białaczką MV-4-11; komórki nowotworowe wszczepiono podskórnie w liczbie 7x106 komórek/0,25 ml/mysz.

Liczba myszy w grupach: kontrola - 7; metotreksat (ΜΤΧ) - 7; HES-ΜΤΧ 130/0.4/59 - 7; HES-ΜΤΧ 130/0.4/48 - 6, HES-ΜΤΧ 200/0.5/23 - 7, HES-ΜΤΧ 130/0.4/25 - 7, HES-ΜΤΧ 130/0.4/11 -7, 3% HES 130/0.4-5.

Leczenie myszy rozpoczęto 8-go dnia trwania eksperymentu. ΜΤΧ oraz wszystkie preparaty HES-ΜΤΧ: dawka 20 mg/kg/dzień, podanie dożylne, jednorazowo w 8-mym dniu eksperymentu. 3% HES oraz 0,9% sól fizjologiczna: podanie dożylne, jednorazowo w 8 dniu eksperymentu, 0,01 ml/1 g masy ciała. W dniu 29-tym eksperyment zakończono, myszy uśmiercono, pobrano krew i guzy do dalszej analizy. W trakcie eksperymentu dokonywano pomiarów guzów podskórnych 3x w tygodniu.

Wykonano analizę statystyczną stosując test Kruskal-Wallis ANOVA, test dla wielokrotnych porównań oraz porównanie grup stosując Mann-Whitney U test. 1.7. Materiały: W badaniach wykorzystano:

Voluven 6% (Fresenius Kabi) HES: średnia masa cząsteczkowa 130 kDa, średni stopień podstawienia grupami hydroksyetylowymi MS 0.4 (0.38 - 0.45), stosunek podstawienia C2/C6 - 9:1 HAES-steril 10% (Fresenius Kabi) HES: średnia masa cząsteczkowa 200 kDa, średni stopień podstawienia grupami hydroksyetylowymi MS 0.5 (0.43 - 0.55), stosunek podstawienia C2/C6 - 5:1 oraz: Ν,Ν’-dicykloheksylokarbodiimid (Fluka), bezwodne DMSO (Sigma), bezwodny DMF (Fluka), ΜΤΧ (Pliva-Lachema), osocze ludzkie (data pobrania 25.06.2010, grupa krwi B), bufory i sole nieorganiczne (POCH SA). W przykładowej realizacji wynalazku jako lek zawarty w koniugacie według wynalazku zastosowano metotreksat. Zsyntezowano szereg koniugatów ΜΤΧ z HES o różnej średniej masie cząsteczkowej, stopniu podstawienia grupami -CH2CH2OH oraz stopniu podstawienia ΜΤΧ wg ogólnego wzoru przedstawionego na załączonych figurach. Na figurze 1 przedstawiony został schemat modyfikacji skrobi grupami hydroksyetylowymi oraz podstawienia ΜΤΧ. Ponadto na figurze 2 przedstawiona została struktura cząsteczki ΜΤΧ z zaznaczonymi grupami uczestniczącymi w reakcji z polimerem HES.

Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty potwierdzające właściwości fizyczne, chemiczne i biologiczne otrzymanych koniugatów. 1.7.1. Stosowane oznaczenia koniugatów Przykład: HES-MTX 130/0.4/52 HES-ΜΤΧ -> koniugat zawierający HES z kowalencyjnie przyłączonym ΜΤΧ 130 -> średnia masa cząsteczkowa HES [kDa] 0.4 -> średni stopień podstawienia HES grupami hydroksyetylowymi [mol/jednostkę glukozy] 52 -> średni stopień podstawienia HES metotreksatu x10 3 [mol/jednostkę glukozy] 1.7.2. Synteza aktywnej formy leku

Ogólny schemat aktywacji ΜΤΧ przedstawia figura 3. 1.7.2.1. Aktywacja leku ΜΤΧ - metoda bezwodnikowa ΜΤΧ w formie kwasowej (MTX-(COOH)2) rozpuszczono w bezwodnym DMF (lub DMSO) do końcowego stężenia ΜΤΧ 90 mg/ml. Otrzymany roztwór poddawano działaniu DCC (N,N’-dicykloheksylo-karbodiimid lub innego związku sprzęgającego z grupy karbodiimidów) w stosunku molowym MTX:DCC wynoszącym 1:0.9. Reakcja przebiega w ciągu 48 godzin w temperaturze 4°C. Po tym czasie odsączono uboczne produkty reakcji (pochodne mocznikowe) a przesącz wykorzystano jako substrat do dalszych syntez. 330 mg ΜΤΧ rozpuszczono w 3.5 ml DMF. Dodano 0.5 ml DMF zawierającego 150 mg DCC. Reakcję prowadzono 48 godzin w temperaturze 4°C. Odsączono osad dicykloheksylo mocznika. Wyznaczono stężenie aktywnej formy ΜΤΧ w końcowym roztworze reakcyjnym na 80.5 mg/ml (pkt 1.1.2) z czego bezwodnik ΜΤΧ stanowił ok. 72 mg/ml. 1.7.2.2. Aktywacja leku ΜΤΧ - metoda aktywnych estrów. ΜΤΧ w formie kwasowej (MTX-(COOH)2) rozpuszczono w bezwodnym DMF (lub DMSO) do końcowego stężenia ΜΤΧ ok. 90 mg/ml. Otrzymany roztwór poddano działaniu DCC (N,N‘-dicykloheksylo-karbodiimid lub innego związku sprzęgającego z grupy karbodiimidów) w stosunku molowym MTX:DCC wynoszącym ok. 1:0.9 i NHS (N-hydroksysukcynoimid lub inny związek dający aktywne wiązania es- trowe np. N-hydroksybenzotriazol) w stosunku molowym MTX:NHS wynoszącym ok. 1:4. Reakcja przebiega w ciągu 48 godzin w temperaturze 4°C. Po tym czasie odsączono uboczne produkty reakcji (pochodne mocznikowe) a przesącz wykorzystano jako substrat do dalszych syntez. 330 mg MTX rozpuszczono w 3.5 ml DMF. Dodano 0.5 ml DMF zawierającego 150 mg DCC. Reakcję prowadzono 48 godzin. Dodano 0.5 ml DMF zawierającego 334 mg NHS i reakcję prowadzono kolejne 24 godziny w temperaturze 4°C. Odsączono osad dicykloheksylo mocznika. Wyznaczono spek-trofotometrycznie stężenie aktywnej formy MTX w końcowym roztworze reakcyjnym na 73 mg/ml z czego aktywny ester MTX stanowił ok. 66 mg/ml. 1.7.3. Synteza koniugatów. 1.7.3.1. P r z y k ł a d 1.

Roztwór HES 130/0.4 6% (Voluven) w NaCI 154 mM zalkalizowano do pH>10. Wkraplano roztwór bezwodnika MTX otrzymanego w pkt 1.7.2.1 z szybkością ok 0.4 ml/min z intensywnym mieszaniem, utrzymując pH na zadanym poziomie. Po wkropleniu wyznaczonej ilości bezwodnika MTX obniżono pH do wartości ok. 7 i niezwłocznie rozpoczęto intensywną dializę preparatu wobec wody (18.2 MQ-cm) do momentu zadanego poziomu oczyszczenia koniugatu od wolnego leku. 18 ml HES 130/0.4 6% (Voluven) roztwór w NaCI 154 mM zalkalizowano za pomocą stałego bezwodnego Na2CO3 (100 mg) i rozpoczęto wkraplanie roztworu bezwodnika MTX otrzymanego w pkt 1.7.2.1 z szybkością 0.4 ml/min z intensywnym mieszaniem, utrzymując pH na zadanym poziomie. Po wkropleniu wyznaczonej ilości bezwodnika MTX obniżono pH do wartości ok. 7 i niezwłocznie rozpoczęto intensywną dializę preparatu wobec wody (18.2 MQ-cm) do momentu zadanego poziomu oczyszczenia koniugatu od wolnego leku. Dobierając odpowiednio stechiometrię i pH reakcji, można według powyższego protokołu otrzymać koniugaty o różnych stopniach podstawienia HES metotreksatem. 1.7.3.2. P r z y k ł a d 2.

Roztwór HES 200/0.5 10% (HAES-steril) zawierający NaCI 154 mM zalkalizowano do pH>10. Wkraplano roztwór aktywnego estru MTX otrzymanego w pkt 1.7.2.2 z szybkością ok 0.4 ml/min z intensywnym mieszaniem, utrzymując pH na zadanym poziomie. Po wkropleniu wyznaczonej ilości estru MTX obniżono pH do wartości ok 7 i niezwłocznie rozpoczęto intensywną dializę preparatu wobec wody (18.2 MQ-cm) do momentu zadanego poziomu oczyszczenia koniugatu od wolnego leku.

Roztwór HES 200/0.5 10% (HAES-steril) 11 ml zawierający NaCI 154 mM zalkalizowano za pomocą stałego bezwodnego Na2CO3 (100 mg) i rozpoczęto wkraplanie roztworu bezwodnika MTX otrzymanego w pkt 1.7.2.1 z szybkością 0.4 ml/min z intensywnym mieszaniem, utrzymując pH na zadanym poziomie. Po wkropleniu wyznaczonej ilości bezwodnika MTX obniżono pH do wartości ok 7 i niezwłocznie rozpoczęto intensywną dializę preparatu wobec wody (18.2 MQ-cm) do momentu zadanego poziomu oczyszczenia koniugatu od wolnego leku.

Dobierając odpowiednio stechiometrię i pH reakcji można według powyższego protokołu otrzymać koniugaty o różnych stopniach podstawienia HES metotreksatem. 1.7.3.3. P r z y k ł a d 3.

Roztwór HES zawierający NaCI 154 mM dializowano wobec wody (18.2 MQ-cm). Odsolony polimer zliofilizowano a następnie rozpuszczono w rozpuszczalniku organicznym. Do otrzymanego w ten sposób roztworu dodano MTX w formie kwasowej oraz odczynnik sprzęgający z grupy karbodiimidów w stosunku molowym do MTX wynoszącym ok. 0.9:1 i dodatkowo 4-(dimetyloamino)pirydynę w stosunku molowym do MTX wynoszącym ok. 0.1:1. Reakcja przebiega w ciągu 48 godzin w temperaturze 4°C. Po tym czasie odsączono uboczne produkty reakcji a z przesączu usunięto rozpuszczalnik organiczny. Otrzymany w ten sposób produkt rozpuszczono w wodzie destylowanej i niezwłocznie rozpoczęto intensywną dializę preparatu wobec wody destylowanej do momentu zadanego poziomu oczyszczenia koniugatu od wolnego leku. 10 ml roztworu HES 130/0.4 6% (Voluven) zawierającego NaCI 154 mM dializowano wobec wody destylowanej. Odsolony polimer zliofilizowano a następnie rozpuszczono w rozpuszczalniku organicznym (DMSO). Do otrzymanego w ten sposób roztworu dodano MTX w formie kwasowej 165 mg oraz DCC 75 mg, DMAP (4-(dimetyloamino)pirydynę) 5 mg. Reakcję prowadzono przez 48 godzin w temperaturze 4°C. Po tym czasie odsączono uboczne produkty reakcji. Przesącz poddano suszeniu próżniowemu. Otrzymany w ten sposób produkt rozpuszczono w wodzie destylowanej i niezwłocznie rozpoczęto intensywną dializę preparatu wobec wody destylowanej do momentu zadanego poziomu oczyszczenia koniugatu od wolnego leku.

Dobierając odpowiednio stechiometrię i pH reakcji można według powyższego protokołu otrzymać koniugaty o różnych stopniach podstawienia HES metotreksatem. 1.7.4. HES-ΜΤΧ - charakterystyka fizykochemiczna. W dwóch niezależnych syntezach otrzymano koniugaty według protokołów opisanych w pkt 1.7.2, 1.7.3. Koniugaty oczyszczono od nadmiaru wolnego leku (pkt 1.2) i sklasyfikowano pod kątem stopnia podstawienia metotreksatem oraz rodzaju zastosowanego polimeru HES (pkt 1.1). 1.7.4.1. HES ΜΤΧ - charakterystyka składu. W poniższych tabelach przedstawiono wyniki dla koniugatów uzyskanych w opisanych powyżej syntezach.

Tabela 1. Charakterystyka koniugatu HES-ΜΤΧ zastosowanego w leczeniu mysiej białaczki p388 (pkt 1.6.1 i 1.7.5.2.1) oraz w modelu ludzkiej białaczki MV-4-11 w eksperymencie 1 (pkt 1.6.2 i 1.7.5.2.2). Oznaczenia: HES - 130/0.4 —► 130 - średnia masa cząsteczkowa [kDa], 0.4 - stopień podstawienia grupami -CH2-CH2-OH [mol/jednostkę glukozy], Cg [M\ - doświadczalne dane otrzymane metodą fenolową odnoszące się do stężenia glukozy, C^TX - całkowite stężenie ΜΤΧ w preparacie, 0¾¾ - stężenie ΜΤΧ związanego kowalencyjnie z polimerem, SL - stopień podstawienia polimeru ΜΤΧ [mol/jednostkę glukozy], %MTX-COOH - zawartość ΜΤΧ niezwią-zanego z nośnikiem [%]

Tabela 2. Charakterystyka koniugatów HES-ΜΤΧ zastosowanych w modelu ludzkiej białaczki MV-4-11 w eksperymencie 2 (pkt 1.6.3, 1.7.5.2.3). Oznaczenia: HES - 130/0.4 —>130 - średnia masa cząsteczkowa [kDa], 0.4 - stopień podstawienia grupami -CH2-CH2-OH [mol/jednostkę glukozy], Cg [M\ - doświadczalne dane otrzymane metodą fenolową odnoszące się do stężenia glukozy, CjJfTX - całkowite stężenie ΜΤΧ w preparacie, (¾¾ - stężenie ΜΤΧ związanego kowalencyjnie z polimerem, SL - stopień podstawienia polimeru ΜΤΧ [mol/jednostkę glukozy], %MTX-COOH - zawartość ΜΤΧ niezwiązanego z nośnikiem [%]

Na figurze 1 przedstawiona została analiza chromatograficzna koniugatu HES-ΜΤΧ 130/0.4/59. Metoda wykorzystywana do oznaczania zawartości niezwiązanego z nośnikiem leku i badań stabilności koniugatów. Chromatografia size-exclusion, złoże Superdex™ Peptide, faza ruchoma - NaHCCte 100 mM, przepływ - 0.4 ml/min, Detekcja 302 nm, kolumna o wymiarach 150x4.6 mm.

Na figurze 5 przedstawiona została analiza ilościowa koniugatów HES-ΜΤΧ pod kątem zawartości wolnego leku. Chromatografia size-exclusion, złoże Superdex™ Peptide, faza ruchoma -NaHC03 100 mM, przepływ - 0.4 ml/min, detekcja 302 nm, liniowość metody: 0.1000 - 0.001 mg/ml ΜΤΧ, Krzywa kalibracyjna oraz przykładowe chromatogramy metody. 1.7.4.2. Charakterystyka hydrodynamiczna.

Analiza parametrów hydrodynamicznych koniugatów - Synteza 1

Tabela 3. Parametry hydrodynamiczne koniugatu HES-MTX 130/04/52. d - średnica hydrodynamiczna, Pd - polidyspersja, PDI - współczynnik polidyspersji. Stężenie koniugatu 1 mg/ml, rozpuszczalnik - bufor fosforanowy 10 mM, pH=7.2.

Tabela 4. Parametry hydrodynamiczne koniugatu HES-MTX 130/04/52. ZP - potencjał zeta, ME -ruchliwość elektroforetyczna. Stężenie koniugatu 1 mg/ml, rozpuszczalnik - bufor fosforanowy 10 mM, pH=7.2.

Tabela 5. Parametry hydrodynamiczne koniugatu HES-MTX 130/04/52. Stężenia koniugatu 0.1—1 mg/ml, rozpuszczalnik - roztwór NaCI, 154 mM. A2 - drugi współczynnik wirialny, MW - wyznaczona masa cząsteczkowa, R2 - współczynnik korelacji krzywej Debye’a.

Analiza parametrów hydrodynamicznych koniugatów - Synteza 2.

Tabela 6. Parametry hydrodynamiczne koniugatów HES-ΜΤΧ. d - średnica hydrodynamiczna, Pd -polidyspersja, PDI - współczynnik polidyspersji. Stężenie koniugatu 1 mg/ml, rozpuszczalnik - bufor fosforanowy 10 mM, pH=7.2.

Ponadto na figurze 6 przedstawione zostało porównanie parametrów hydrodynamicznych dla HES 130/0.4 i HES-ΜΤΧ 130/0.4/59. Stężenie koniugatów 1 mg/ml, rozpuszczalnik - bufor fosforanowy 10 mM, pH=7.2.

Tabela 7. Parametry hydrodynamiczne koniugatów HES-ΜΤΧ. ZP - potencjał zeta, ME - ruchliwość elektroforetyczna. Stężenie koniugatu 1 mg/ml, rozpuszczalnik - bufor fosforanowy 10 mM, pH=7.2

Ponadto na figurze 7 przedstawiony został HES-ΜΤΧ 130/0.4/48 - rozkład potencjału zeta. Stężenie koniugatu 1 mg/ml, rozpuszczalnik - bufor fosforanowy 10 mM, pH=7.2.

Tabela 8. Parametry hydrodynamiczne koniugatów HES-ΜΤΧ. Stężenia koniugatu 0.1-1 mg/ml, rozpuszczalnik - roztwór NaCI, 154 mM. A2 - drugi współczynnik wirialny, MW - wyznaczona masa cząsteczkowa, R2 - współczynnik korelacji krzywej Debye'a.

Na figurze 8 przedstawiona została krzywa Debye’a uzyskana dla HES 130/0.4. Stężenia koniugatu 0.1-1 mg/ml, rozpuszczalnik - roztwór NaCI 154 mM.

Na figurze 9 przedstawiona została krzywa Debye'a uzyskana dla HES-ΜΤΧ 130/0.4/48. Stężenia koniugatu 0.1-1 mg/ml, rozpuszczalnik - roztwór NaCI 154 mM. Przeprowadzone badania wskazują na wzrost średnicy hydrodynamicznej molekuł koniugatów w porównaniu z wyjściowym (niemodyfikowa-nym) polimerem. Wzrost średnicy hydrodynamicznej jest tym większy, im wyższy jest stopień podstawienia danego koniugatu ΜΤΧ. Towarzyszy temu zwiększenie polidyspersyjności koniugatów. Obojętne pod względem elektrycznym polimery HES w procesie koniugacji nabierają ładunku. Potencjał zeta ko-niugatów jest tym bardziej ujemny im wyższy jest stopień podstawienia danego koniugatu ΜΤΧ. Zmiana właściwości elektrycznych tych molekuł może mieć kluczowe znaczenie w odniesieniu do ich właściwości biologicznych. Pomiary statycznego rozpraszania światła ujawniają drastyczną zmianę właściwości koniugatów w roztworach względem niemodyfikowanego polimeru. Różnice dotyczą przede wszystkim oddziaływania molekuł koniugatu z otoczeniem (rozpuszczalnikiem). Zmiana znaku drugiego współczynnika wirialnego wskazuje na odmienny charakter oddziaływań ze środowiskiem wolnego HES-u i koniugatów, oraz że różnice potęguje wzrost stopnia podstawienia polimeru metotreksatem.

Podsumowując, molekuły hybrydowe HES-ΜΤΧ wykazują drastycznie różne parametry hydrodynamiczne i elektryczne w porównaniu z niemodyfikowanym polimerem HES. Różnice dotyczą średnicy hydrodynamicznej, polidyspersji, ładunku molekuł oraz oddziaływania z innymi molekułami otoczenia. 1.7.4.3. Badania stabilności koniugatów HES-ΜΤΧ in vitro. 1.7.4.3.1. Badania stabilności koniugatów w warunkach syntezy i przechowywania.

Tabela 9. Stabilność preparatu HES-MTX 130/0.4/59 w zależności od pH roztworu. I - siła jonowa roztworu [mM], T-temperatura inkubacji [°C], fes-czas półtrwania po upływie którego uwolnieniu ulegnie połowa ogólnej zawartości ΜΤΧ w koniugacie.

Tabela 10. Stabilność preparatu HES-MTX 130/0.4/59 w zależności od temperatury. I - siła jonowa roztworu [mM], T - temperatura inkubacji [°C], to 5 -czas półtrwania po upływie którego uwolnieniu ulegnie połowa ogólnej zawartości ΜΤΧ w koniugacie.

Tabela 11. Stabilność preparatu HES-MTX 130/0.4/59 w zależności od siły jonowej roztworu. I - siła jonowa roztworu [mM], T-temperatura inkubacji [°C], to.s-czas półtrwania po upływie którego uwolnieniu ulegnie połowa ogólnej zawartości ΜΤΧ w koniugacie.

Przytoczone dane ujawniają zachowanie wiązań między HES a ΜΤΧ w sposób typowy dla estrów. Hydroliza tych wiązań katalizowana jest przez zasady (szybki rozkład w pH alkalicznym) i silnie zależy od temperatury. 1.7.4.3.2. Badania stabilności koniugatów w osoczu.

Tabela 12. Stabilność preparatu HES-MTX 130/0.4/59 w osoczu ludzkim i buforze fosforanowym. T - temperatura inkubacji [°C], to s- czas półtrwania po upływie którego uwolnieniu ulegnie połowa ogólnej zawartości ΜΤΧ w koniugacie.

Stabilność koniugatów (czas półtrwania) w osoczu sięga 65 godzin i jest blisko dwukrotnie krótsza niż czas półtrwania w buforze fosforanowym o zbliżonym pH. Fakt ten wskazuje na katalityczny wpływ składników osocza na rozkład koniugatu HES-MTX. 1.7,5. HES-ΜΤΧ - badania biologiczne. 1.7.5.1. HES-ΜΤΧ - badania in vitro.

Wykonano badanie aktywności antyproliferacyjnej in vitro koniugatów HES-ΜΤΧ wobec komórek 4 linii ludzkich białaczek: MV4-11, K562, HEL92 oraz CCRF/CEM.

Badaniom zahamowania proliferacji poddano koniugaty HES-ΜΤΧ w celu wyznaczenia wartości IC50 (inhibitory concentration 50%): HES-ΜΤΧ 130/0.4/59 HES-ΜΤΧ 130/0.4/48 HES-ΜΤΧ 200/0.5/23 HES-ΜΤΧ 130/0.4/25 HES-ΜΤΧ 130/0.4/11 ΜΤΧ - metotreksat - kontrola pozytywna, związek referencyjny.

Wszystkie badane związki wykazywały wysoką aktywność antyproliferacyjną wobec komórek linii białaczkowych wg przyjętego założenia aktywności. Wartości IC50 dla badanych koniugatów mieściły się w przedziale od 0,01 do 0,07 ^ig/ml. Wszystkie preparaty HES-ΜΤΧ wykazywały mniejszą aktywność niż sam ΜΤΧ. Dane doświadczalne zawarte są poniżej (Tabela 13).

Tabela 13. Wartości IC50 otrzymane dla badanych koniugatów HES-ΜΤΧ na komórkach czterech ludzkich linii białaczkowych: MN/4-11, K562, HEL92 oraz CCRF/CEM

Na figurze 10 przedstawione zostało zahamowanie proliferacji komórek linii MV4-11, pod wpływem działania koniugatów HES-ΜΤΧ przedstawione jako wartości IC50 (średnie + odchylenia standardowe).

Na figurze 11 przedstawione zostało zahamowanie proliferacji komórek linii K562, pod wpływem działania koniugatów HES-ΜΤΧ przedstawione jako wartości IC50 (średnie + odchylenia standardowe). 1,7.5.2. HES-ΜΤΧ - badania in vivo. 1.7.5.2.1. Model mysiej białaczki P388.

Myszy szczepu CDF (samice, samce) obarczone mysią białaczką P388, dootrzewnowo w liczbie 1x106 komórek/0,25 ml/mysz.

Preparaty podano 1 dnia trwania eksperymentu, jednokrotnie, dootrzewnowo w dawce 20 mg/-/kg/dzień. Przedłużenie czasu życia myszy leczonych koniugatami metotreksatu obliczano na podstawie wzoru: ILS [%] = ((cżL/cżK) *100)-100

Gdzie: ILS [%] increase in life span - czas wydłużenia życia cżL - średni czas życia myszy leczonych cżK - czas życia myszy kontrolnych.

Na figurze 12 przedstawiony został czas przeżycia myszy CDF obarczonych mysią białaczką P388 podczas leczenia koniugatami metotreksatu; - samice

Na figurze 13 przedstawiony został czas przeżycia myszy CDF obarczonych mysią białaczką P388 podczas leczenia koniugatami metotreksatu; - samce.

Tabela 14. Czas przedłużenia życia myszy CDF obarczonych mysią białaczką P388 - średni czas życia, parametr ILS, liczba myszy w grupie (N). Analizę statystyczną czasu przeżycia przeprowadzono za pomocą testu Pęto &amp; Pęto Wilcoxon (*p<0.05 w stosunku do kontroli)

Preparat HES-ΜΤΧ 130/0.4/52 wydłużył czas życia samic o 66% w porównaniu do czasu życia myszy kontrolnych, natomiast czas życia samców wydłużył się o 45,2% w stosunku do samców w grupie kontrolnej. Długość życia myszy w grupach leczonych preparatem HES-ΜΤΧ 130/0.4/52 przewyższała długość życia myszy leczonych metotreksatem. 1.7.5.2.2. Model ludzkiej białaczki MV-4-11 - Eksperyment 1.

Przeprowadzenie badania in vivo na ludzkim modelu białaczki MV4-11 miało na celu zbadanie aktywności przeciwnowotworowej preparatów wobec komórek białaczki ludzkiej wszczepionych podskórnie w celu uformowania guza. Do badania użyto koniugat HES-ΜΤΧ 130/0.4/52. Metotreksat zastosowano jako związek odniesienia.

Tabela 15. Dni eksperymentu, w których różnice w wielkości guzów pomiędzy grupami były istotne statystycznie (p<0,05) wg testów Kruskal-Wallis ANOVA oraz Mann-Whitney U test.

* - duży rozrzut w masie guzów, dwie myszy z siedmiu nie mają guza (zanikł), dwie mają duże guzy (676,88 i 810,00 mm3)

Tabela 16. Wpływ koniugatów metotreksatu na wzrost guzów u myszy obarczonych ludzką białaczką MN/-4-11 - średnia masa guza, odchylenie standardowe, % zahamowania wzrostu guza TGI, liczba myszy w grupach, a p<0.05 Kruskal-Wallis test i bp<0.05 Mann-Whitney U test jako porównanie do kontroli; c p<0.05 Kruskal-Wallis test i dp<0.05 Mann-Whitney U test - porównanie do metotreksatu; N - liczba myszy w grupie; TGI [%] liczone wg wzoru: TGI=100 - [(średnia masa guza w grupie leczonej/średnia masa guza w kontroli)x100). Tak obliczony % TGI wyraża o ile procent guzy w danej grupie są mniejsze od guzów w kontroli.

Kinetyka wzrostu guza MV4-11

Na figurze 14 przedstawiona została kinetyka wzrostu guzów u myszy obarczonych białaczką MV-4-11 traktowanych koniugatem HES-MTX 130/0.4/52 oraz metotreksatem, jako związkiem referencyjnym. Średnia objętość guza i odchylenia standardowe.

Preparat HES-MTX 130/0.4/52 w znacznym stopniu (p<0.05) obniża masę guzów MV4-11 w stosunku do kontroli począwszy od dnia 8 do dnia 22. Porównując wielkość guzów w grupie, która otrzymała preparat HES-MTX 130/0.4/52 jednokrotnie, do wielkości guzów w grupie otrzymującej metotrek-sat (również podanie jednokrotne) zaobserwowano istotne różnice w wielkości guzów w dniach od 11 do 22 (Kruskal-Wallis ANOVA).

Analizując parametr zahamowania wzrostu guza TGI (tumorgrowth inhibition) zaobserwowano, iż zahamowanie wzrostu guzów w grupie myszy, która otrzymała jednokrotnie preparat HES-MTX 130/0.4/52 wynosiło od 59% w dniu 8 do 91% w dniu 11 i utrzymywało się na tym poziomie do końca eksperymentu (wahania od 89,67 do 98,11%). Wartość TGI dla grupy otrzymującej metotreksat nie zwiększyła się ponad poziom 39,8%. 1.7.5.2.3. Model ludzkiej białaczki MV-4-11 - Eksperyment 2.

Eksperyment miał na celu potwierdzenie wcześniejszych wyników otrzymanych dla preparatu HES-MTX 130/0.4/52. W przypadku poniższego eksperymentu, myszy otrzymywały koniugaty HES- ΜΤΧ ο różnym stopniu podstawienia polimeru lekiem oraz zastosowano dwa różne pod względem Mw i MS polimery nośnikowe - HES 130/0.4 oraz HES 200/0.5.

Oznaczenia preparatów wykorzystanych w eksperymencie: HES-MTX 130/0.4/59, HES-MTX 130/0.4/48, HES-MTX 200/0.5/23, HES-MTX 130/0.4/25, HES-MTX 130/0.4/11. 6% HES 130/0.4 rozcieńczony 0,9% solą fizjologiczna do stężenia 3%, podawany 0,01 ml/1 g masy ciała; ΜΤΧ - metotrek-sat, stężenie wyjściowe 50 mg/ml, 0,9% sól fizjologiczna - podawana 0,01 ml/1 g masy ciała.

Myszy szczepu NOD/SCID (samce) obarczone ludzką białaczką MV-4-11; komórki nowotworowe wszczepiono podskórnie w liczbie 7x106 komórek/0,25 ml/mysz. ΜΤΧ, HES-ΜΤΧ: dawka 20mg/kg/dzień, podanie dożylne, jednorazowo w 8-mym dniu eksperymentu. 3% HES oraz 0,9% sól fizjologiczna: podanie dożylne, jednorazowo w 8-mym dniu eksperymentu, w objętości 0,01 ml/1 g masy ciała. W dniu 29 eksperyment zakończono.

Tabela 17. Wpływ koniugatów metotreksatu na wzrost guzów u myszy obarczonych ludzką białaczką MN/-4-11 - średnia masa guza, odchylenie standardowe, % zahamowania wzrostu guza TGI, liczba myszy w grupach, a p<0.05 Kruskal-Wallis test i bp<0.05 Mann-Whitney U test jako porównanie do kontroli. Oznaczenia: c p<0.05 Kruskal-Wallis test i dp<0.05 Mann-Whitney U test - porównanie do 3% HES; * - średnia masa guzów większa od średniej masy guzów w kontroli; N - liczba myszy w grupie; TGI [%] liczone wg wzoru: TGI=100-[(śred-nia masa guza w grupie leczonej/średnia masa guza w kontroli)x 100). Tak obliczony % TGI wyraża o ile procent guzy w danej grupie są mniejsze od guzów w kontroli; ***Masę guza można również przedstawić jako procent masy guza grupy kontrolnej jaki stanowi masa guza w grupie badanej. Wtedy masę guza w kontroli przyjmuje się jako 100%.

Kinetyka wzrostu guza MV4-11

Na figurze 15 przedstawiona została kinetyka wzrostu guzów u myszy obarczonych białaczką MV-4-11 traktowanych koniugatami HES-ΜΤΧ oraz metotreksatem, jako związkiem referencyjnym (ΜΤΧ, HES-MTX: 20 mg/kg/dzień). Wszystkie grupy - średnia objętość guza i odchylenia standardowe.

Na figurze 16 przedstawiona została kinetyka wzrostu guzów u myszy obarczonych białaczką MV-4-11 traktowanych koniugatami HES-ΜΤΧ oraz metotreksatem, jako związkiem referencyjnym (ΜΤΧ, HES-ΜΤΧ: 20 mg/kg/dzień). Wybrane grupy - średnia objętość guza i odchylenia standardowe.

Na figurze 17 przedstawiona została kinetyka wzrostu guzów u myszy obarczonych białaczką MV-4-11 traktowanych koniugatami HES-ΜΤΧ oraz metotreksatem, jako związkiem referencyjnym (ΜΤΧ, HES-ΜΤΧ: 20 mg/kg/dzień). Wybrane grupy - średnia objętość guza i odchylenia standardowe.

Na figurze 18 przedstawiona została kinetyka wzrostu guzów u myszy obarczonych białaczką MV-4-11 traktowanych koniugatami HES-ΜΤΧ oraz metotreksatem, jako związkiem referencyjnym (ΜΤΧ, HES-ΜΤΧ: 20 mg/kg/dzień). Wybrane grupy - średnia objętość guza i odchylenia standardowe.

Na figurze 19 przedstawione zostało zahamowanie wzrostu guzów MV-4-11 u myszy NOD/SCID traktowanych preparatami HES-ΜΤΧ oraz ΜΤΧ - wybrane grupy.

Tabela 18. Zestawienie eksperymentalne - dni eksperymentu, w których różnice w wielkości guzów pomiędzy grupami były istotne statystycznie (p<0,05) wg testów Kruskal-Wallis ANOVA oraz Mann-Whitney U test.

Na figurze 20 przedstawione zostały zmiany masy ciała myszy NOD/SCID obarczonych ludzką białaczką MV-4-11 podczas podawania koniugatów HES-ΜΤΧ.

Koniugaty HES-ΜΤΧ 130/0.4/59 oraz HES-ΜΤΧ 130/0.4/48 wykazały najwyższą aktywność spośród wszystkich badanych koniugatów. W znacznym stopniu (p<0.05) oba koniugaty obniżają masę guzów MV4-11 w stosunku do kontroli począwszy od dnia 13 do dnia 29. Porównując wielkość guzów w grupie, która otrzymała preparat HES-ΜΤΧ 130/0.4/59 jednorazowo, do wielkości guzów w grupie otrzymującej metotreksat (podanie jednorazowe) zaobserwowano istotne różnice w wielkości guzów w dniach od 15 do 29, natomiast w grupie HES-MTX 130/0.4/48 w porównaniu do ΜΤΧ w dniach 13 do 29 (Kruskal-Wallis ANOVA, Mann-Whitney U test).

Preparaty HES-MTX 200/0.5/23, 130/0.4/25 oraz 130/0.4/11 wykazywały słabszy efekt w hamowaniu wzrostu guza w porównaniu do koniugatów HES-MTX 130/0.4/59 i 130/0.4/48, jednakże ich aktywność była większa niż samego metotreksatu.

Analizując parametr zahamowania wzrostu guza TGI (tumor growth inhibition) w 29 dniu eksperymentu najwyższe zahamowanie wzrostu guza wynosiło 83,8% w grupie HES-MTX 130/0.4/59, kolejno wartości TGI wynosiły 74,8% dla HES-MTX 130/0.4/48, 61,6% dla HES-MTX 200/0.5/23, 45,8% i 41,8% odpowiednio dla HES-MTX 130/0.4/11 i HES-MTX 130/0.4/25. Dla porównania wartość TGI dla wolnego metotreksatu w dniu 29 wynosiła 28.97%.

Nie zaobserwowano toksyczności w przyjętym schemacie podawania preparatów na podstawie analizy zmian masy ciała myszy. W żadnej z obserwowanych grup średnia masa ciała myszy w trakcie podawania preparatów nie była niższa niż w pierwszym dniu leczenia.

Podsumowanie W wyniku kowalencyjnego przyłączenia przykładowego leku przeciwnowotworowego (ΜΤΧ), zawierającego wolną grupę karboksylową, do hydroksyalkilo skrobi otrzymano nanocząsteczkę przejawiającą zupełnie nowe właściwości fizykochemiczne a co za tym idzie zupełnie nowe, spotęgowane działanie przeciwnowotworowe. Koniugat został szczegółowo scharakteryzowany pod względem fizykochemicznym oraz biologicznym z testami na zwierzętach o obniżonej odporności umożliwiającymi badania z wykorzystaniem komórek ludzkich linii nowotworowych. Zastosowane rozwiązanie spowodowało wzmocnienie działania przeciwnowotworowego leku ΜΤΧ. Na uwagę zasługuje fakt, że działanie przeciwnowotworowe w doświadczeniach in vivo było najsilniejsze gdy nowotwór tworzył się w formie guza. Wynalazek otwiera drogę do zastosowania modyfikowanych skrobi jako nośników leków, przede wszystkim leków przeciwnowotworowych.

Literatura: 1. Jungheinrich C Neff TA. Pharmacokinetics of hydroxyethyl starch. Clin Pharmacokinet. 2005, 44:681-99. 2. Singh N Singh J, Kaur L, Sodhi NS, Gili BS. Morphological, thermal and rheological properties of starches from different botanical sources. Food Chem. 2003, 81:219-31. 3. Jungheinrich C Neff TA. Pharmacokinetics of hydroxyethyl starch. Clin. Pharmacokinet. 2005, 44(7) 681-699. 4. Lehmann G Marx G, Forster H. Bioequivalence comparison between hydroxyethyl starch 130/0.42/6:1 and hydroxyethyl starch 130/0.4/9:1. Drugs RD. 2007, 8:229-40. 5. J. Boldt. Modern rapidly degradable hydroxyethyl starches: current concepts. Anesth Analg. 2009, strony 108(5):1574-82. 6. G Lehmann, F Asskali i H Forster. Pharmacokinetics of hydroxyethyl starch (70/0.5) following repeated infusions. Transfuse Med Hemother. 2003, 30:72-7. 7. Voluven - charakterystyka produktu leczniczego, brak miejsca: Fresenius Kabi Deutschland GmbH, 2008. 8. Morrison RT Boyd RN. Chemia organiczna. T. 2. Warszawa: PWN, 1999. 9. Jung F Kościelny J, Mrowietz C, Forster H, Schimetta W, Kiesewetter H, Wenzel E. The ef-fects of molecular structure of hydroxyethyl starch on the elimination kinetics and fluidity of blood in human volunteers. Arzneimittelforschung. 1993, 43:99-105. 10. Treib J Haass A, Pindur G, Seyfert U, Treib W, Grauer M, Jung F, Wenzel E, Schimrigk K. HES 200/0.5 is not HES 200/0.5. Influence of the C2/C6 hydroxy-ethylation ratio of hydroxy-ethyl starch (HES) on hemorheology, coagulation and elimination kinetics. Thromb Haemost. 1995, 74:1452-6. 11. Weidler B von Bormann B, Sommermeyer K, Lohmann E, Peil J, Hempelmann G. Pharma-cokinetic parameters as criteria for clinical use of hydroxyethyl starch preparations. Arzneimittelforschung. 1991,41:494-8. 12. Yacobi A Stoli RG, Sum CY, Lai C-M, Gupta SD, Hulse JD. Pharmacokinetics of hydroxyethyl starch in normal subjects. J Clin Pharmacol. 1982, 22:206-12. 13. Ickx BE Bepperling F, Melot C, Schulman C, van der Linden PJ. Plasma substitution effects of a new hydroxyethyl starch HES 130/0.4 compared with HES 200/0.5 during and after ex-tended acute normovolaemic haemodilution. Br J. Anaesth. 2003, 91:196-202. 14. James MF Latoo MY, Mythen MG, Mutch M, Michaelis C, Roche AM, Burdett E. Plasma volume changes associated with two hydroxyethyl starch colloids following acute hypovolae-mia in volunteers. Anaesthesia. 2004, 59:738-42. 15. Gandhi SD Weiskopf RB, Jungheinrich C, Koorn R, Miller D, Shangraw RE, Prough DS, Baus D, Bepperling F, Waritier DC. Volume replacement therapy during major orthopaedic surgery using Voluven (hydroxyethyl starch 130/0.4) or hetastarch. ANESTHESIOLOGY. 16. Asskali F Forster HL. The accumulation of different substituted hydroxyethyl starches (HES) following repeated infusions in healthy volunteers. Anasthaesiol Intens Notfall Schmerz. 1999, 34:537-41. 17. Mark A. Warner M.D., Editor. Hydroxyethyl Starches. Different Products - Different Effects. Anesthesiology. 2009,111:187-202. 18. Jesch F Hubner G, Zumtobel V, Zimmermann M, Messmer K. Hydroxyethyl starch (HAS 450/0.7) in human plasma and liver. Course of concentration and histological changes. Infu-sionsther Klin Ernahr. 1979, 6:112-7. 19. Hulse J Yacobi A. Hetastarch: An overview of the colloid and its metabolism. Drug Intell Clin Pharm. 1983, 17:334-41. 20. Sirtl C Laubenthal H, Zumtobel V, Kraft D, Jurecka W. Tissue deposits of hydroxyethyl starch (HES): Dose-dependent and time-related. Br J Anaesth. 1999, 82:510-5. 21. Standers Szepfalusi Z, Bohle B, Stander H, Kraft D, LugerT, Metze D. Differential storage of hydroxyethyl starch (HES) in the skin: An immunoelectronmicroscopical long-term study. Celi Tissue Res. 2001,304:261-9. 22. Metze D. Reimann D., Szepfalusi Z., Bohle B., Kraft D., LugerT. A. Persistent pruritusafter hydroxyethyl starch infusion therapy: a result of long-term storage in cutaneous nerves. Brit-ish Journal of Dermatology. 1997,136(4), 553-559. 23. Leuschner J Opitz J, Winkler A, Scharpf R, Bepperling F. Tissue storage of 14C-labelled hydroxyethyl starch (HES) 130/0.4 and HES 200/0.5 after repeated intravenous administra-tion to rats. Drugs RD. 2003, 4:331-8. 24. S. Kozek-Langenecker. Effects of hydroxyethyl starch Solutions on hemostasis. ANESTHE-SIOLOGY. 2005, 103:654-60. 25. Claes Y van Hemelrijck J, van Gerven M, Arnout J, Vermylen J, Weider B, Van Aken H. Influence of hydroxyethyl starch on coagulation in patients during the perioperative period. Anesth Analg. 1992, 75:24-30. 26. Madjdpou. Dettori N., Frascarolo P., Burski M., Boli M., Fisch A., Bombeli T., Spahan D.R. Molecular weight of hydroxyethyl starch: is there an effect on blood coagulation and pharma-cokinetics? British Journal of Anaesthesia. 2005, 94, 5, 569-576. 27. Janicki M. Zollinger A., Seifer B., Popovic D., Pasch T., Spahn D.R. Comprromised blood coagulation: an vitro comparison of hydroxyethyl starch 130/0. 4 and hydroxyethyl starch 200/0.5 using thrombelastography. Anaesth. Analg. 1998, 87, 989-993. 28. Neff TA Fischler L, Mark M, Stocker R, Reinhart WH. The influence of two different hydroxy-ethyl starch Solutions (6% HES 130/0.4 and 200/0.5) on blood viscosity. Anesth Analg. 2005, 100:1773-80. 29. Standl T Burmeister MA, Schroeder F, et all. Hydroxyethyl starch (HES) 130/0.4 provides larger and faster increases in tissue oxygen tension in comparison with prehemodilution val-ues than HES 70/0.5 or HES 200/0.5 in volunteers undergoing acute normovolemic hemodi-lution. Anesth Analg. 2003, 96(4):936-943. 30. Lang K Suttner S, Boldt J, Kumie B, Nagel D. Volume replacement with HES 130/0.4 may reduce the inflammatory response in patients undergoing major abdominal surgery. Can J Anaesth. 2003, 50:1009-16. 31. Boldt J Scholhorn T, Mayer J, PiperS, Suttner S. The value of an albumin-based intravascular volume replacement strategy in elderly patientsundergoing major abdominal surgery. Anesth Analg . 2006, 103:191-9. 32. Yu G Chi X, Hei Z, Shen N, Chen J, Zhang W, L i S. Smali volume resuscitation with 7.5% hypertonic salinę, hydroxyethyl starch 130/0.4 solution and hypertonic sodium chloride hy-droxyethyl starch 40 injection reduced lung injury in endotoxin shock rats: Comparison with salinę. Pulm Pharmacol Ther. 2011, doi:10.1016/j.pupt.2011.10.003. 33. Feng X Yan W, Wang Z, Liu J, Yu M, Zhu S, Xu J. Hydroxyethyl Starch, but Not Modified Fluid Gelatin, Affects Inflammatory Response in a Rat Model of Polymicrobial Sepsis with Capillary Leakage. Anesth Analg. 2007, 104:624-30. 34. Volta CA Alvis V, Campi M, Marangoni E, Alvis R, Castellazzi M, Fainardi E, Manfrinato MC, Dallocchio F, Bellini T. Influence of different strategies of volume replacement on the activity of matrix metalloproteinases: An in vitro and in vivo study. ANESTHESIOLOGY. 2007, 106:85-91. 35. Lipka D Boratyński J. Metaloproteinazy MMP. Struktura i funkcja. Postępy Hig Med Dosw. 2008, 62:328-336. 36. Hrabec E. Naduk J., Stręk M., Hrabec Z. Kolagenazy typu IV (MMP-2 i MMP-9) i ich substraty - białka macierzy poza kom orkowej, hormony, cytokin, hemokiny i ich receptory. Post. Blochem. 2007, 53:37-45. 37. Seeger D.R. Cosalich D.D.B., Smith J.M., Hultquist Μ E. Analogs of pteroylglutamic acid. II. 4-aminoderivatives. J. Am. Chem. Soc. 1949, 71:1297-1301. 38. JR Bertino. Karnofsky memoriał lecture. Ode to methotrexate. J.Clin.Oncol. 1993, 11:5-14. 39. Nakashima-Matsushita N. Homma T., Yu S., Matsuda T., Sunahara N., Nakamura T., Tsukano M., Ratnam M., Matsuyama T. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheuma-toid arthritis. Arthritis Rheum. 1999, 42:1609-1616. 40. Fan J Vitols KS, Huennekens FM. Biotin derivatives of methotrexate and folate. Synthesis and utilization for affinity purification of two membrane-associated folate transporters from L1210 cells. J. Biol. Chem. 1991,266:14862-14865. 41. Westerhof GR Rijnboutt S, Schornagel JH, Pinedo HM, Peters GJ, Jansen G. Functional activity of the reduced folate carrier in KB, MA104, and IGROV-l cells expressing folatebind-ing protein. Cancer Res. 1995, 55:3795-3802. 42. Antony AC Kane MA, Portillo RM, Elwood PC, Kolhouse JF. Studies ofthe role of a particulate folate-binding protein in the uptake of 5-methyltetrahydrofolate by cultured human KB cells. J. Biol. Chem. 1985, 260:14911-14917. 43. JM Kremer. Toward a better understanding of methotrexate. Arthritis Rheum. 2004, 50:1370-1382. 44. Świerkot J Ślęzak R,. Znaczenie badań farmakogenetycznych w efektywności leczenia me-totreksatem chorych na reumatoidalne zapalenie stawów (część 1). Postępy Hig Med Dosw (Online). 2011,65:195-206. 45. Rosowsky A. Wright J.E., Holden S.A., Waxman D. J. Influence of lipophilicity and carboxyl group content on the ratę of hydroxylation of methotrexate derivatives by aldehyde oxidase. Biochem. Pharmacol. 1990, 40, 851-857. 46. Valerino D.M. Johns D.G., Zaharko D.S., Oliviero V.T., Studies ofthe metabolism of metho-trexate by intestinal flora: Identyfication and study of biological properties ofthe metabolite 4-amino-4-deoxy-N-10metylpteroic acid. Biochem. Pharmacol. 1972, 21,821-831. 47. Smith-Oliver T. Noel L.S., Stimpson S.S., Yarnall D.P., Connolly K.M. Elevated levels of TNF in the joints of adjuvant arthritic rats. Cytokine. 1993, 5:298-304. 48. Neurath M.F. Hildner K., Becker C., Schlaak J.F., Barbulescu K., Germann T., Schmitt E., Schirmacher P., Haralambous S., Pasparakis M., Meyer Zum Buschenfelde K.H., Kollias G., Marker-Hermann E. Methotrexate specifically modulates cytokine production by T cells and macrophages in murine collagen-induced arthritis (CIA): a mechanism for methotrexate-me-diated immunosuppression. Clin. Exp. Immunol. 1999, 115:42-55. 49. Hildner K. Finotto S., Becker C., Schlaak J., Schirmacher P., Galie P.R., MarkerHermann E., Neurath M.F. Tumour necrosis factor (TNF) production by T celi receptor-primed T lympho-cytes is a target for Iow dose methotrexate in rheumatoid arthritis. Clin. Exp. Immunol. 1999, 118:137-146. 50. Wang YC Chiang EP. Low-dose methotrexate inhibits methionine S-adenosyltransferase in vitro and in vivo(t). Mol Med. 2011,10.2119/molmed.2011.00048. 51. Eichner W Lutterbeck K, Zander N, Frank R, Knoller H, Conradt H. Conjugates of hydroxy-ethyl starch and erythropoietin. PCT/EP2005/002639, W02005092369 11 03 2005. 52. EICHNER W KNOLLER H, LUTTERBECK K, ZANDER N. Conjugates of Hydroxyalkyl starch and G-CSF. WO 2005/014050 06 08 2004. 53. SOMMERMEYER K EICHNER W. Hemoglobin N-hydroxyethyl starch conjugates as oxygen carriers. WO/1998/001158 15 01 1998. 54. K Sommermeyer. Process for the production of conjugates from polysaccharides and poly-nucleotides. WO 2005/074993 08 02 2005. 55. Besheer A Hertel TC, Kressler J, Mader K, Pietzsch M. Enzymatically catalyzed HES conju-gation using microbial transglutaminase: proof of feasibility. J Pharm Sci. 2009, 98:4420-4428. 56. Harmatz P., i inni. Phase Ib clinical trial of starch-conjugated deferoxamine (40SD02): a novel long-acting iron chelator. Br. J. Haematol. 2007,138 (3), 374-381. 57. Dragsten PR Hallaway PE, Hanson GJ, Berger AE, Bernard B, Hedlund BE. First human studies with a high-molecular-weight iron chelator. Journal of Laboratory and Clinical Medi-cine. 2000, 135(1), 57-65. 58. Zander N Frank R. Conjugates of Hydroxyalkyl Starch and a Protein, Prepared by Native Chemical Ligation. US 2010/0311670 A1 US, 9 12 2010. 59. Devy J Baiasse E, Kapłan H, Madoulet C, Andry MC. Hydroxyethylstarch microcapsules: a preliminarystudyfortumorimmunotherapy application. Int J Pharm. 2006, 307(2):194-200. 60. Chen L. Li X., Pang Y., Li L., Zhang X., Yu L. Resistant starch as a canier fo roral colon -targeting drug matrix system. J. mater. Sci. mater. Med. 2007, 18,11,2199-2203. 61. Y. Suzuki M. Tanihara, Y. Nishimura, K. Suzuki, Y. Kakimaru, and Y. Shimizu. A new drug delivery system with controlled release of antibiotic only in the presence of infection. J. Bio-med. Mater. Res. 1998, 42, 112. 62. K Sommermeyer. Compiexing of medicinal substances with high-molecular caniers and in-jection and infusion Solutions containing said complexes. WO 2004/105800 09 12 2004. 63. .—. Water-soluble antibiotic comprising an amino sugar, in the form of a polysaccharide con-jugate. WO 03/000738 03 01 2003. 64. ZANDER N CONRADT H, EICHNER W. METHOD OF PRODUCING HYDROXYALKYL STARCH DERIVATIVES. WO 2004/024776 25 03 2004. 65. Mohamed F. Marchettini P., Stuart O. A., Yoo D., Sugarbaker P.H. A Comparison of he-tastarch and peritoneal dialysis solution for intraperitoneal chemotherapy delivery. EJSO. 2003, 29:261-265. 66. A.N. Vis A. van der Gaast, B.W.G. van Rhijn T.K. Catsburg, C. Schmidt, G.H.J. Mickisch. A phase II trial of methotrexate-human serum albumin (ΜΤΧ-HSA) in patients with metastatic renal celi carcinoma who progressed under immunotherapy. Cancer Chemother Pharmacol. 2002, 49:342-345. 67. Wunder A., Stehle, G., Schrenk, Η. H., Hartung, G., Frei, E., Heene, D. L., Maier-Borst, W., and Sinn, H. Antitumor activity of methotrexate-albumin conjugates in rats bearing a Walker-256 carcinosarcoma. Int. J. Cancer. 1998, 76:884-890. 68. Halbert G. W., Florence, A. T., and Stuart, J. F. Characterization of in vitro drug release and biological activity of methotrexate-bovine serum albumin conjugates. J. Pharm. Pharmacol. 1987, 39:871-876. 69. 35. Stehle G., Sinn, H., Wunder, A., Schrenk, Η. H., Schuott, S., Heene, D. L., and Maier-Borst, W. The loading ratę determines tumortargeting of methotrexate-albumin conjugates in rats. Anticancer Drugs. 1997, 8:677-685. 70. Stehle G., Wunder, A., Sinn, H., Schrenk, Η. H., Schuott, S., Frei, E., Hartung, G., Maier-Borst, W., and Heene, D. L. Pharmacokinetics of methotrexate-albumin conjugates in tumor bearing rats. Anticancer Drugs. 1997, 8:835-844. 71. Bures L., Lichy, A., Bostik, J., and Spundova, M. The use of protein as a carrier of methotrex-ate for experimental cancer chemotherapy. V. Alternative method for preparation of serum albumin-methotrexate derivative. Neoplasma (Bratisl.). 37:225-231. 72. Azade Taheri Fatemeh Atyabi, Faranak Salman Nouri, Fatemeh Ahadi, Mohammad Ali De-rakhshan, Mohsen Amini, Mohammad Hossein Ghahremani, Seyed Nasser Ostad, PooriaMansoori, and Rassoul Dinarvand. Nanoparticles of Conjugated Methotrexate-Human Serum Albumin: Preparation and Cytotoxicity Evaluations. Journal of Nanomaterials. 2011, 2011, Article ID 768201,7 pages, doi: 10.1155/2011/768201. 73. Boratyński J Opolski A, Wietrzyk J, Górski A, Radzikowski C. Cytotoxic and antitumor effect of fibrynogen-methotrexate conjugate. Cancer Letters. 2000,148,189-195. 74. Kańska U Omar M, S, Budzyńska R, Nevozhay D, Jagiełło M, Opolski A, Boratyński J. An-tileukemic Activity of Glycated Fibrinogen-Methotrexate Conjugates. Anticancer Research. 2005, 25:2229-2234. 75. Budzyńska R Nevozhay D, Kańska U, Jagiełło M, Opolski A, Wietrzyk J, Boratyński J. Anti-tumor activity of mannan-methotrexate conjugate in vitro and in vivo. Oncol Res. 2007, 16(9):415-21. 76. Nevozhay D Budzyńska R, Jagiełło M, Kańska U, Omar MS, Opolski A, Wietrzyk J, Boratyński J. The effect of the substitution level of some dextran-methotrexate conjugates on their anti-tumor activity in experimental cancer models. Anticancer Res. 2006, 26(3A):2179-86. 77. Nevozhay D Budzyńska R, Kańska U, Jagiełło M, Omar MS, Boratyński J, Opolski A. Anti-tumor properties and toxicity of dextran-methotrexate conjugates are dependent on the mo-lecularweight ofthe carrier. Anticancer Res. 2006, 26(2A):1135-43. 78. Chau Y Dang N, M, Tan F,E, Langer R. lnvestigation of Targeting Mechanism of New Dex-tran-Peptide-Methotrexate Conjugates Using Biodistribution Study in Matrix-Metalloprotein-ase-Overexpressing Tumor Xenograft Model. Journal Of Pharmaceutical Sciences. 2006, 95,3. 79. Homma H Sato H, Tamura T, Okamachi A, Emura T, Ishizawa T, Kato T, Matsuura T, Sato S, Higuchi Y, Watanabe T, Kitamura H, Asanuma K, Yamazaki T, Ikemi M, Kitagawa H, Mori-kawi T, Ikeya H, Maeda K, Takahashi K, Nohmi K, Izutani N, Kanda M, Suzuki R. Novel hyaluronic acid-methotrexate conjugates for osteoarthritis treatment. Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry. 2009, 17 4647-656. 80. Homma H Sato H, Tamura T, Okamachi A, Emura T, Ishizawa T, Kato T, Matsuura T, Sato S, Higuchi Y, Watanabe T, Kitamura H, Asanuma K, Yamazaki T, Ikemi M, Kitagawa H, Mori-kawi T, Ikeya H, Maeda K, Takahashi K, Nohmi K, Izutani N, Kanda M, Suzuki R. Synthesis and optimization of hyaluronic acid-methotrexate conjugates to maximize benefit in the treatment of osteoarthritis. Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry. 2010,18 1062-1075. 81. G. Yousefi S. M. Forountan, A. Zarghi, A. Sharaati. Synthesis and characterization of meth-otrexate polyethylene glycol esters as a drug delivery system. Chem. Pharm. Buli. 2010, 58(2) 147-153. 82. Gurdag S Khandare J, Stapels S, Matherly L, H, Kannan R, M. Activity of Dendrimer-Metho-trexate Conjugates on Methotrexate-Sensitive and -Resistant Celi Lines. Bioconjugate Chem. 2006,17,275-283. 83. Zhang Z Thomas T.P, Lee K+H, Li M, Zong H, Desai A,M, Kotlyar A, Huang B, Banaszak Holi M,M, Baker J,R. Polyvalent saccharide-functionalized generation 3 poly(amidoamine) den-drimer-methotrexate conjugate as a potential anticancer agent. Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry. 2011, 19; 2557-2564. 84. Targeting the efficacy of a dendrimer-based nanotherapeutic in heterogeneous xenograft tu-mors in vivo. Myc A Kukowska-Latallo J, Cao P, Swanson B, Battista J, Dunham T, Baker JR Jr. Anticancer Drugs. 2010, 21 (2): 186-92. 85. Shukla R Thomas T,P, Desai A,M, Kotlyar A, Park S,J, Baker Jr. J,R. HER2 specific Delivery of Methotrexate by Dendrimer Conjugated anti-HER2 mAb. Nanotechnology. 2008, 19(29): 295-102. 86. Pignatello R., Guccione, S., Forte, S., Di, G. C., Sorrenti, V., Vicari, L., Uccello, B. G., Bal-zano, F., and Puglisi, G. Lipophilic conjugates of methotrexate with short-chain alkylamino acids as DHFR inhibitors. Synthesis, biological evaluation,. Bioorg. Med. Chem. 2004, 12, 2951-2964. 87. Warlick C. A., Sweeney, C. L., and Mclvor, R. S. Maintenance of differential methotrexate toxicity between cells expressing drug-resistant and wild-type dihydrofolate reductase activi-ties in the presence of nucleosides through nucleoside transport inhibition. Biochem. Phar-macol. 2000, 59, 141-151. 88. Pignatello R., Spampinato, G., Sorrenti, V., Di, G. C., Vicari, L., McGuire, J. J., Russell, C. A., Puglisi, G., and Toth, I. Lipophilic methotrexate conjugates with antitumor activity. Eur. J. Pharm. Sci. 2000, 10, 237-245. 89. Pignatello R Puleo A, Puglisi G, Vicari L, Messina A. Effect of liposomal delivery on in vitro antitumor activity of lipophilic conjugates of methotrexate with lipoamino acids. Drug Deliv. 2003,10(2):95-100. 90. Masuko T. Minami A., Iwasaki N., Majima T., LeeYC. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry. 2005, 339, 69-72. 91. Kulicke W-M Kaiser U, Schwengers D, Lemmes R,. Measurements of the Refractive lndex Increment on Hydroxyethyl Starch as a Basis for Absolute Molecular Weight Determinations. Starch. 1991,43(10), 392-396. 92. Skehan P Storenc R, Scudiero D, Monks A, McMahon J, Vistica D, Warren JT, Bokesch H, Kenney S, Boyd MR. New coloriroetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening. J Natl Cancerlnst. 1990, 82:1107-1112. 93. Stephen RL Novak JM, Jensen EM, Kablitz C, Buys SS. Effect of osmotic pressure on uptake of chemotherapeutic agents by carcinoma cells. Cancer Res. 1990, 1; 50(15):4704-8. 94. Basan M Risler T, Joanny JF, Sastre-Garau X, Prost J. Homeostatic competition drives tumor growth and metastasis nucleation. HFSP J. 2009, 3(4):265-272. 95. March Jerry. Organie Chemistry. 96. Dieterich H-J Weissmuller T, Rosenberger P, Eltzschig FIK. Effect of hydroxyethyl starch on vascular leak syndrome and neutrophil accumulation during hypoxia. Crit Care Med. 2006, 34:1775-82. 97. Morgan SL Baggott JE, Vaughn WH, Austin JS, Veitch TA, Lee JY, Koopman WJ, Krumdieck CL, Alarcon GS. Supplementation with folie acid during methotrexate therapy for rheumatoid arthritis. A double-blind, placebo-controlled trial. Ann. Intern. Med. 1994, 121:833-841. 98. Weinblatt ME Maier AL, Coblyn JS. Low dose leucovorin does not interfere with the efficacy of methotrexate in rheumatoid arthritis: an 8 week randomized placebo controlled trial. J.Rheumatol. 1993, 20:950-952. 99. Uga FI Kuramori C, Ohta A, Tsuboi Y, Tanaka H, Hatakeyama M, Yamaguchi Y, Takahashi T, Kizaki M, Handa H. A new mechanism of methotrexate action revealed by target screening with affinity beads. Mol Pharmacol. 2006, 70(5):1832-9. 100. Wessels J.A. Kooloos W.M., De Jonge R., De Vries-Bouwstra J.K., Allaart C.F., Linssen A., Collee G., De Sonnaville P., Lindemans J., Huizinga T.W., Guchelaar H.J. Relationship between genetic variants in the adenosine pathway and outeome of methotrexate treatment in patients with recent-onset rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2006, 54:2830-2839. 101. B.N. Cronstein. Low-dose methotrexate: a mainstay in the treatment of rheumatoid arthritis. Pharmacol. Rev. 2005, 57:163-172. 102. Moura JA Valduga CJ, Tavares ER, Kretzer IF, Maria DA, Maranhao RC. Novel formu-lation of a methotrexate derivative with a lipid nanoemulsion. Int J Nanomedicine. 2011, 6:2285-95. 103. Thomas S Schenk U, Fischer FP, Mettang T, Passlick-Deetjen J, Kuhlmann U. In vitro effects of glucose polymer-containing peritoneal dialysis fluids on phagocytic activity. Am J Kidney Dis. 1997, 29(2):246-53.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe Zastosowanie koniugatu składającego się z nośnika i związanego z nim kowalencyjnie leku do wytwarzania leku do leczenia guzów białaczki, przy czym wytwarzany lek jest przeznaczony do podawania dożylnego, natomiast rzeczony koniugat posiada wzór ogólny:

   gdzie: m jest liczbą całkowitą od 60 do 60000, R1 oznacza podstawnik wybrany z grupy obejmującej: wodór, -CH2CH2OH, -Lek, -CH2CH2O--Lek, R2 oznacza podstawnik wybrany z grupy obejmującej: wodór, -CH2CH2OH, -Lek, -CH:CH20--Lek, jednostkę glukozy, przy czym nośnikiem jest skrobia o masie cząsteczkowej od 10 do 1000 kDa i stopniu podstawienia grupami hydroksyetylowymi od 0,1 do 0,9 mol/jednostkę glukozy, a Lekiem jest meto-treksat.