JP2004525170A - Ｈａｓ−活性成分コンジュゲート - Google Patents

Abstract

【課題】
ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）−活性成分コンジュゲート、及び当該コンジュゲートの調製方法を提供すること。
【解決手段】
ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）と活性成分とのコンジュゲートであって、ヒドロキシアルキルデンプンが活性成分と直接又はリンカーを介して結合するコンジュゲートを含む化合物を提供する。更に、水、又は少なくとも１０質量％の水を含む水と有機溶媒との混合溶液から構成される反応溶媒においてＨＡＳと活性成分とが互いに反応する共有結合型ＨＡＳ−活性成分コンジュゲートの調製方法を提供する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）と活性成分とのコンジュゲートであって、ヒドロキシアルキルデンプンが活性成分と直接又はリンカーを介して結合するコンジュゲートを含む化合物に関する。本発明は、更に、水、又は少なくとも１０質量％の水を含む水と有機溶媒との混合溶液から構成される反応溶媒においてＨＡＳと活性成分とが互いに反応する共有結合型ＨＡＳ−活性成分コンジュゲートの調製方法に関する。本発明は、更に、上記コンジュゲートの医薬的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬の活性成分の多くは、臨床的使用に際し、数々の問題から不利な影響を受ける（非特許文献１参照）。非経口的に投与される天然タンパク質は、例えば、細網内皮系、肝臓、腎臓及び脾臓によって排出される。排出は、糖鎖の電荷、当該タンパク質に対する細胞レセプターの存在、及び分子の形状・大きさに依存する。腎臓の糸球体濾過の排出限界は、例えば、およそ６７ｋＤである。
【０００３】
タンパク質分解の結果として、生物活性の急速な喪失を観察することもできる。
【０００４】
細菌により発現されるタンパク質やその他の組換タンパク質は、免疫原性が大きく、生命を脅かすような過敏感反応を引き起こしうる。対応する反応のため、これら産生物を医薬的に使用することはできないことは当然である。
【０００５】
このため、従来技術では、既に７０年代末から、化学的修飾、とりわけ重合又は高分子ポリマーとの結合（カップリング）による外来タンパク質の性質の改良に関し系統的に研究が行なわれてきた。一方ではタンパク質又は他の活性成分、他方ではポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からコンジュゲートを調製することに多くの研究が集中的に行なわれた（特許文献１参照）。結合反応の各々から予想される利点としては、タンパク質のin vivoにおける半減期の改善、毒性の低減、安定性の向上及び活性成分の溶解性の改善がある（非特許文献２参照）。
【０００６】
しかしながら、活性成分の結合プロセスは、問題があることが判明した。というのは、タンパク質の活性基がＰＥＧとの結合により不活性化されたり、その反応からは、反応生成物が適切な収率で得られなかったからである。活性成分の活性に不利な影響を与えない特異的な結合を達成するために、活性基をＰＥＧに導入したり、活性成分又は化合物をリンカーと結合させたりした。これを行なうために、通常、ＰＥＧには、タンパク質の結合可能基に対し引き続き共有結合的に結合可能な活性基が配される。
【０００７】
そのため、例えば、ＰＥＧとの結合後の抗体及びそのフラグメントの結合活性の喪失についての報告がある（非特許文献３及び４参照）。この問題を解決するために、抗体の所定の結合領域にＰＥＧを結合することが提案されている（非特許文献５参照）。
【０００８】
結合パートナの活性の喪失についても報告がある（特許文献２参照）。解決策として、反応基によってＰＥＧを活性化すること及び界面活性剤の存在下当該反応基を介してＰＥＧをα−インターフェロンと結合することが提案されている。好ましい反応基として言及されているのは、Ｎ−サクシンイミドカーボネートであるが、これは、指定された条件下でリジンのε−アミノ基とウレタン結合を形成するということである。
【０００９】
ポリマー（とりわけＰＥＧ）が特定の領域で誘導体化されてからポリペプチドと結合される、ポリマー−ポリペプチドコンジュゲートの調製方法も開示されている（特許文献３参照）。アミノオキシアセチル基をＰＥＧに導入し、この化合物をポリペプチド（とりわけＩＬ−８、ｈＧ−ＣＳＦ及びＩＬ−１）と結合することが好ましい。
【００１０】
文献には、対応するコンジュゲートに関する多数の例が報告されている；例えば、ＰＥＧ−インスリンコンジュゲート（特許文献１参照）、ＰＥＧ−ウシヘモグロビンコンジュゲート（特許文献４参照）、ＰＥＧ−リボヌクレアーゼコンジュゲート及びＰＥＧスーパーオキシドジスムターゼコンジュゲート（非特許文献６参照）、ＰＥＧ−ＩＬ−２コンジュゲート又はＰＥＧ−ＩＦＮ−βコンジュゲート（特許文献５参照）、ＰＥＧ−ポリミキシンコンジュゲート（特許文献６参照）、及びＰＥＧ−ＩＬ−２コンジュゲート（特許文献７参照）がある。コンジュゲートの中には、現在、臨床的に応用されているものもある。例えば、酵素アスパラギナーゼの性質は、ＰＥＧとコンジュゲートを形成することにより改善され、ＰＥＧ−アスパラギナーゼコンジュゲートは、ガン治療剤としてOncaspar（登録商標）という商標で今や商業的に入手可能である。最近、ＰＥＧ結合Ｇ−ＣＳＦが米国食品医薬品局によって認可された（Pegfilgastim）。多数の更にＰＥＧ化された生産物が、臨床的開発の種々異なる段階にある。例えば、ＰＥＧ−ＣＤＰ８７０、ＰＥＧ−ドロナビノール等である（非特許文献７参照）。
【００１１】
タンパク質だけではなく他の化合物も、この方法によってＰＥＧ及び他のポリマーに結合された。例えば、パクリタキセルとＰＥＧを結合し、このコンジュゲートを腫瘍の治療に使用することが開示されている（特許文献８及び特許文献９参照）。腫瘍の治療へのＰＥＧ−カンプトテシンコンジュゲートの使用が、エンゾンによって研究されている（臨床試験第Ｉ期）。
【００１２】
抗生物質をＰＥＧと結合した例もある。例えば、オキシテトラサイクリン−ＰＥＧコンジュゲートの薬物動態が報告されている（非特許文献８参照）。従来技術では、新たな機能を獲得するために、他の方法によって抗生物質を誘導体化した例もある。例えば、徐放性ペニシリンが生産されたが、これは、プロカインペニシリン誘導体、即ちペニシリンとプロカイン塩基の塩である。この誘導体は、拡大された活性を有し、例えば梅毒の治療に使用される。
【００１３】
３つ以上の化合物の結合反応も行なわれている。例えば、抗Ｂ細胞リンパ腫抗体、活性化ＰＥＧ及び毒素からなる結合生成物の調製が開示されている（特許文献１０参照）。
【００１４】
しかしながら、ＰＥＧ−活性成分コンジュゲートは、in vivoにおける分解経路が解明されている天然構造を持っていない。とりわけこの理由のため、ＰＥＧコンジュゲートに加えて、他のコンジュゲート及びタンパク質ポリマーが、上述の問題を解決するために生産された。例えば、異なるタンパク質間の架橋及びタンパク質と巨大分子との結合のための方法がいくつかある（非特許文献９の要約参照）。
【００１５】
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、天然に存在するアミロペクチンの誘導体であり、α−アミラーゼによって体内で分解される。ＨＥＳ−タンパク質コンジュゲートの調製は、既に従来技術により説明されている（ＨＥＳ−ヘモグロビンコンジュゲートに関して特許文献１１又は特許文献１２参照）。
【００１６】
ヘモグロビンは、血液代替物及び酸素担体（いわゆるヘモグロビンによる酸素キャリア、ＨＢＯＣ）として臨床上極めて重要でありうるタンパク質である。しかしながら、そのような生産物に対する需要が早くから認識されているにもかかわらず（非特許文献１０参照）、既知のＨＢＯＣ産物は何れも未だに薬剤として認可されるに至っていない。
【００１７】
天然型ヘモグロビンは、ペプチドからなるそれぞれ２つのα鎖及びβ鎖から構成され、これらペプチド鎖の各々が、補欠分子族としてのヘムと結合している。しかしながら、単離されたヘモグロビン分子は、非常に不安定であり、急速に分解してより安定なα、βダイマー（分子量３２ｋＤａ）になる。血液循環中の単離ヘモグロビンの生物学的半減期は、およそ１時間であり、腎臓を介してダイマーとして急速に除去される。この過程で、ダイマーは、腎毒性の副作用を引き起こす（非特許文献１１参照）。従って、誘導体化ヘモグロビン分子の開発作業は、第一に、ヘモグロビンの分子内架橋、ＨＢＯＣ重合体を形成するための分子間架橋及び／又はポリマーとの結合に向けられた。
【００１８】
既知のヘモグロビンコンジュゲートが幾つか報告されている（例えば、非特許文献１２、並びに特許文献１１及び特許文献１２参照）。後者の文献は、まずＨＥＳと過ヨウ素酸ナトリウムを反応させてからヘモグロビンとＨＥＳを結合する方法を開示している。ヘモグロビンが結合しているジアルデヒドが生成される。他方、特許文献１１によれば、まず架橋剤（例えばブロムシアン（Bromcyan））とＨＥＳを結合し、次にヘモグロビンと当該中間生成物を結合する方法により、ヘモグロビンとＨＥＳを結合することが開示されている。
【００１９】
ＨＥＳは、多糖であるアミロペクチンの置換誘導体であり、９５％以下の濃度でトウモロコシデンプン中に存在する。ＨＥＳは、有利なレオロジ特性を有し、現在、容積補充剤（Volume-replacement agent）として及び血液希釈療法のために臨床的に使用されている（非特許文献１３及び非特許文献１４参照）。
【００２０】
アミロペクチンは、グルコース単位からなり、その主鎖は、α−１,４−グリコシド結合を有するが、枝分かれ部位には、α−１,６−グリコシド結合も存在する。アミロペクチンの物理化学的性質は、グリコシド結合の種類によって本質的に決定される。枝分かれしたα−１,４−グリコシド結合があるため、１巻き当りおよそ６個のグルコース残基からなるヘリックス構造が形成される。
【００２１】
ポリマーの物理化学的及び生物化学的性質は、置換によって変化させることが可能である。ヒドロキシエチル基の導入は、アルカリ性ヒドロキシエチル化によって行なうことができる。ヒドロキシエチル化をしたものと比べた、未置換のグルコースモノマーの関連する水酸基の反応性の相違は、反応条件を介して利用することができ、従って、置換パターンへの影響を限定することができる。
【００２２】
それゆえ、ＨＥＳは、分子量分布と置換度によって本質的に特徴付けられる。置換度は、グルコース単位全体に対する置換されたグルコースモノマーの比に関するＤＳ（degree of substitution）、又はグルコース単位当りのヒドロキシエチル基の数を与えるＭＳ（モル置換：molar substitution）として表すことができる。
【００２３】
ＨＥＳ溶液は、重合度、枝分かれ部位の数及び位置、及び置換パターンに関し互いに異なる分子から構成される多分散系混合物として存在する。従って、ＨＥＳは、異なる分子量を持つ化合物からなる混合物である。それゆえ、ＨＥＳ溶液は、それぞれ、統計変数を用いた平均分子量によって特定される。Ｍ_ｎは、分子数に関する単純な相加平均として計算され（数平均）、他方Ｍ_ｗ（質量平均）は、質量に関連した測定変数を表している。
【００２４】
しかしながら、タンパク質のＨＥＳへの選択的化学結合は、これまでのところ、ＨＥＳの活性化は選択的に行なわれないという事実によって妨げられてきた。従って、従来技術から既知のタンパク質−ＨＥＳコンジュゲートは、ブロムシアン活性化ＨＥＳとヘモグロビンとの非選択的結合に由来している（特許文献１１参照）。対応する方法により得られる多分散系生成物は、不均一な性質と潜在的な毒性の副作用を有しうる。
【００２５】
糖の還元性アルデヒド末端基を選択的に酸化し、反応性エステル（ラクトン）を得る方法が、ハシモトによって最初に開示された（非特許文献１５参照）。
【００２６】
この方法に基づいて、ヘモグロビンとＨＥＳとが、ヘモグロビンの遊離アミノ基とＨＥＳの酸化された状態の還元性末端基との間のアミド結合を介して互いに選択的に結合されるヘモグロビン−ヒドロキシエチルデンプンコンジュゲートを得ることができることが示されている（特許文献１３参照）。しかしながら、非特許文献１５に記載されている方法も特許文献１３による方法も、何れも、有機溶媒中での糖（ＨＥＳ）とタンパク質（ヘモグロビン）との間の反応に基づいている。これら刊行物によると、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が実際に使用されている。
【００２７】
タンパク質の多くは、有機溶媒中において、水溶液中において不可逆的な構造の変化を受けるという事実は、当業者であれば認識している。活性の喪失は、構造の変化によってよく起こる。何れにせよ、費用は嵩むが、有機溶媒の除去は必須である。というのは、有機溶媒は僅かに残っていても目的の医薬的使用には許容することができないからである。不純物の潜在的危険性及びタンパク質の構造の如何なる変化でさえも目的の使用の観点から排除されるべきである。
【００２８】
【特許文献１】
ＵＳ ４，１７９，３３７
【特許文献２】
ＷＯ ９５／１３０９０
【特許文献３】
ＷＯ ９６／４１８１３
【特許文献４】
ＵＳ ４，４１２，９８９
【特許文献５】
ＵＳ ４，７６６，１０６
【特許文献６】
ＷＯ ９０／１５６２８
【特許文献７】
ＷＯ ９０／０７９３９
【特許文献８】
ＷＯ ９７／３３５５２
【特許文献９】
ＷＯ ９７／３８７２７
【特許文献１０】
ＷＯ ９３／２３０６２
【特許文献１１】
ＤＥ ２６ １６ ０８６
【特許文献１２】
ＤＥ ２６ ４６ ８５４
【特許文献１３】
ＷＯ ９８／０１１５８
【非特許文献１】
Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, Vol. 9 (3, 4), (1992) pp. 249-304
【非特許文献２】
Abuchowski and Davis, Enzymes as drugs, Holcenberg and Rubberts, Publisher, pp. 367-383, John Wiley & Sons N.Y. (1981)
【非特許文献３】
Kitamura et al., Cancer Res., Vol. 51 (1991), pp. 4310-4315
【非特許文献４】
Pedley, et al., Br. J. Cancer, Vol. 79 (1994), pp. 1126-1130
【非特許文献５】
Chapman et al., Nature Biotech., Vol. 17 (1999), pp. 780-783
【非特許文献６】
Veronese et al., Applied Biochem. Biotech., Vol. 11, 141-152 (1995)
【非特許文献７】
PEG-pipeline: www.enzon.com又はwww.inhalte.com
【非特許文献８】
Dowling and Russell, J. Vet. Pharmacol. Ther., Vol. 23 (2000), 107 - 110
【非特許文献９】
Wong, S.S., "Chemistry of protein conjugation and cross linking", CRCS, Inc. (1993)
【非特許文献１０】
Rabiner, J. Exp. Med. 126, (1967) 1127
【非特許文献１１】
Bunn & Jandl, J. Exp. Med. 129, (1967) 925-934
【非特許文献１２】
Xue and Wong, Meth. in Enzymol., 231 (1994), pp. 308-322
【非特許文献１３】
Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, Vol. 8(8), (1987), pp. 271-278
【非特許文献１４】
Weidler et al., Arzneim.-Forschung/Drug RES., 41, (1991) 494-498
【非特許文献１５】
Hashimoto et al., Kunststoffe, Kautschuk, Fasern, VOl. 9, (1992) pp. 1271-1279
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
それゆえ、本発明の課題は、日常の臨床実務で使用可能な生理活性コンジュゲートとなるような改善されたヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）−活性成分コンジュゲート、及び当該コンジュゲートの調製方法を提供することである。本発明の更なる課題は、無視できない量の副生成物（これらの副生成物は、更には、引き続き行なわれる生産物の精製にもかなりの程度悪影響を及ぼす）が生成されないような、ヒドロキシアルキルデンプン−活性成分コンジュゲートの調製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
上記の課題は、ヒドロキシアルキルデンプンと活性成分とのコンジュゲートであって、該ヒドロキシアルキルデンプンが該活性成分と直接又はリンカーを介して共有結合するコンジュゲートを含む化合物によって解決される。対応するＨＡＳ−活性成分コンジュゲートは、例えば、水、又は少なくとも１０質量％の水を含む水と有機溶媒の混合溶液からなる反応溶媒中で、ＨＡＳと活性成分とを結合する方法によって得られる。
【００３１】
上記の課題を解決するために、本発明により、共有結合型ＨＡＳ−活性成分コンジュゲートの調製方法が提供される。この調製方法は、ＨＡＳと少なくとも１つの活性成分とを水性反応溶媒中で結合させ、該水性反応溶媒が、水、又は少なくとも１０質量％の水を含む水と有機溶媒との混合溶液から構成されることを特徴とする。
【００３２】
ＨＡＳは、活性成分と結合する前に酸化されることが好ましく、還元性末端基を特異的に酸化するのがとりわけ好ましい。また、結合は、中間生成物としてのＨＡＳとアミン基担持活性成分との間のシッフ塩基の形成を介して起こりうる。この中間生成物は、次いで、還元され、メチレンアミン基を形成する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンと活性成分とのコンジュゲートであって、該ヒドロキシアルキルデンプンが該活性成分と直接又はリンカーを介して共有結合するコンジュゲートから構成される化合物を初めて提供する。本発明は、更に、ＨＡＳと少なくとも１つの活性成分とを水性反応溶媒中で互いに反応させる方法によって調製可能なＨＡＳ−活性成分コンジュゲートを提供する。この方法は、更に、該反応溶媒が、水、又は少なくとも１０質量％の水を含む水と有機溶媒との混合溶液から構成されることを特徴とする。
【００３４】
本発明の意味において、化学化合物は、該化合物が治療ないし診断目的のための組成物の活性要素たるべき場合、活性成分というものとする。活性成分は、薬物の活性要素、即ち被験対象への投与後生理学的効果を奏する医薬処方物中の化合物であることが好ましい。
【００３５】
認可薬物及びその活性成分の概要は、薬局方に見出される。薬局方に挙げられている活性成分はすべて、本発明の方法によるＨＡＳ−活性成分コンジュゲートの調製に使用することができる。しかしながら、本発明によれば、用語「活性成分」は、診断ないし治療への使用に適することが知られているにもかかわらず、上述の問題のため、これまでのところ当該目的のために使用することができなかった化合物をすべて含む。活性成分は、ビタミン、ワクチン、トキシン、抗生物質（ないし抗感染薬）、抗不整脈薬、食欲抑制剤、麻酔薬、鎮痛薬、抗リウマチ薬、抗アレルギー薬、抗喘息薬、抗うつ薬、抗糖尿病薬、抗ヒスタミン薬、抗高調薬（antihypertonic）、又は抗悪性腫瘍薬であることが好ましい。活性成分は、構造的には、例えば、ホルモン、ステロイド、脂質、タンパク質、オリゴ−又はポリペプチド、核酸でありうるが、とりわけ、Ｄ−ＤＮＡ、Ｌ−ＤＮＡ、Ｄ−ＲＮＡ又はＬ−ＲＮＡ等のＤ−又はＬ−核酸でありうる。タンパク質、ペプチド、Ｄ−又はＬ−核酸をＨＡＳ結合パートナーとして使用するととりわけ好ましい。
【００３６】
本発明により調製された化合物は、活性成分の活性とＨＡＳの有利な性質を維持する。更に有利には、本発明の方法により調製したコンジュゲートでは、活性成分のin vivoでの半減期の改善、毒性の低減、安定性の向上、及び／又は活性成分の溶解性の改善が実現されている。
【００３７】
投与後、ＨＡＳ鎖は、血漿中のα−アミラーゼによって切断（短縮）される。従って、結合生産物の活性は、原結合生産物の、即ち結合直後の結合生産物の活性として、又は被代謝結合生産物の、即ちin vivoでの代謝後の結合生産物の活性として求めることができる。In vivo代謝は、in vitro分解によってシミュレートすることができる。
【００３８】
活性成分の活性は、従来技術において当該化合物について既知の方法によって求めることができる。例えば、抗悪性腫瘍薬の活性は、抑制濃度（ＩＣ）として求められ、抗感染薬の活性は、最小抑制濃度（ＭＩＣ）として求められる。活性測定は、適切な標的細胞を用いin vitroで行なうことが好ましい（Chow et al., Haematologica, Volume 86 (2001), pages 485-493参照）。In vitroでの効果は、更に、関連動物モデルによって確認することができる（例えば、腎細胞癌のマウスモデルについて、Changnon et al., BJU Int., Volume 88 (2001), page 418-424参照）。
【００３９】
非結合物質と比べると、原結合生産物は、上昇又は低下した活性を有しうる。しかしながら、その活性は、５倍より大きく低下しないことが好ましく、３倍ないし２倍より大きく低下しないことがより好ましい。被代謝結合生産物は、非結合物質、即ち結合前の活性成分の活性と同等の活性を有することが好ましく、被代謝コンジュゲートは、活性成分の活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％の活性を有し、少なくとも９５％活性が保持されていればとりわけ好ましい。
【００４０】
本発明の意味において、用語「ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）」は、１〜３個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基で置換されたデンプン誘導体をいうものとする。従って、「ヒドロキシアルキルデンプン」と称される群は、ヒドロキシメチルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン及びヒドロキシプロピルデンプンを含む。ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を結合パートナとして使用するのが、本発明のすべての実施形態の中でもとりわけ好ましい。
【００４１】
本発明によれば、ヒドロキシエチルデンプンは、平均分子量（質量平均）が１〜３００ｋＤａであることが好ましく、平均分子量が、５〜２００ｋＤａであればとりわけ好ましい。更に、ヒドロキシエチルデンプンは、何れの場合もヒドロキシエチル基を基準として、モル置換度が０．１〜０．８であり、Ｃ_２：Ｃ_６置換比が２〜２０の範囲にあってもよい。
【００４２】
活性成分とＨＡＳを結合するために、第一段階において、活性基を活性成分及び／又はＨＡＳに導入することが必要となることがある。このような活性基としては、例えば、チオール基又はアミノ基が挙げられる（実施例参照）。
【００４３】
更に、活性成分とＨＡＳは、リンカーを用いて互いに結合されることができる。どのような架橋剤もリンカーとして使用することができる。ＳＭＣＣ（サクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、実施例７参照）のような架橋剤の多くは商業的に入手可能であり、当業者には周知である（Perbio社の製品カタログの「架橋剤（cross-linking reagents）」のアルファベット順リスト及びwww.piercent.com参照）。
【００４４】
本発明の更なる一実施形態によれば、アミノ糖を含む水溶性抗生物質誘導体、とりわけＨＡＳ−ダウノルビシンコンジュゲート及びＨＡＳ−ドキソルビシンコンジュゲート、並びにそれらの調製方法は、DE 101 29 369に開示されている限りにおいて、本発明の範囲から除外されるものとする。
【００４５】
本発明の好ましい一実施形態は、ＨＡＳと抗悪性腫瘍活性成分のコンジュゲートから構成される化合物、及び腫瘍治療に対する当該コンジュゲートの使用に関する。
【００４６】
とりわけ、腫瘍細胞は、生理学的な増殖調節を最早受けず、それゆえ細胞分裂の速度が加速されているという点で、腫瘍細胞は正常な体細胞とは異なる。腫瘍治療における抗悪性腫瘍活性成分の治療的使用は、この相違をその基礎としているが、それは、抗悪性腫瘍活性成分の毒物活性は、主として、成長（増殖）中の細胞に対して作用するからである。そのため、化合物は、成長（増殖）細胞に対し毒物活性を示す場合、抗悪性腫瘍活性成分又は細胞分裂停止剤と称される（腫瘍学及び現在の治療方法の基礎は、例えば、Internistic Oncology, Schmoll et al. (eds.), Springer, 1996にまとめられている）。
【００４７】
化学的側面から見ると、抗悪性腫瘍活性成分は、極めて不均一な群をなしている。成長（増殖）阻害の他に、アポトーシス、即ちプログラム細胞死の誘導は、ここ何年かに亘る議論において重要性を増している。抗悪性腫瘍活性成分の分類は、例えば、関連する標的分子に基づいて行なうことができる（Schmoll et al.、上記文献参照）：
１．例えば、ＭＴＸ、５−ＦＵ、Ａｒａ−Ｃ及びヒドロキシ尿素等の代謝拮抗剤のようなＤＮＡ生合成を阻害する化合物。
２．例えば、アルキル化剤、白金錯体、アントラサイクリン、ブレオマイシン、アクチノマイシン−Ｄ及びエピポドフィロトキシン（epipodophyllo toxin）等の、ストランド切断誘導、挿入、ストランド間架橋の修飾、トポイソメラーゼ等の作用によりＤＮＡに作用する化合物。
３．例えば、アントラサイクリン、ブレオマイシン、アクチノマイシン−Ｄ及び代謝拮抗剤等の、ｍＲＮＡへの挿入又はとりこみによるｍＲＮＡ合成の阻害によりＲＮＡに作用する化合物。
４．例えば、（例えばビンカアルカロイドによる）チューブリンポリメライゼーションの阻害、（例えばアルキル化剤による）タンパク質架橋又は（例えばプロテインキナーゼＣの阻害剤による）リン酸化による、（例えばホルモン又はアンタゴニストの）レセプター結合能に関連して、タンパク質に作用する化合物。
【００４８】
抗悪性腫瘍活性により、活性成分はすべて、第１に、組織の急速な増殖（成長）の阻害として現れるかなりの副作用を有する。このため、とりわけ赤血球新生、白血球生成及びトロンボポイエシス（trombopoiesis）が阻害され、粘膜上皮（細胞）の増殖（成長）は不利な影響を受ける。そのため、胃腸疾患又は精子形成の不可逆的機能障害又は無排卵が生じうる。皮膚及び皮膚補助器官も通常影響を受ける。例えば、可逆的脱毛を患う患者は多い。
【００４９】
深刻な場合では、副作用により、急性腎機能喪失や心臓、肺、肝臓及び神経系に対する毒物関連器官障害が起こることもある。最後に、免疫抑制効果により、感染症の罹患数の増加を予期しなければならない。
【００５０】
それゆえ、抗悪性腫瘍剤を含有するコンジュゲートの調製及び研究は、活性成分のトレランス（生体親和性ないし非障害性）を改善することに集中して行なわれた。この目的のため、相異なる抗悪性腫瘍活性成分を結合し、例えば、デキストラン（Kojima et al., J. Pharm. Pharmakol., vol. 32 (1980), p. 30-34; Nakane et al., J. Pharm. Pharmakol., vol. 40 (1988), p. 1-6, Nomura et al., J. Controlled Release, vol. 52 (1998), p. 239-252; Sato et al., J. Pharm. Sci., vol. 78 (1989), p. 11-16参照）等の巨大分子を生成した。幾つかの事例では、当該コンジュゲートの抗腫瘍効果の改善が見られた。
【００５１】
他の一実施形態として、マイトマイシンＣのような活性成分をＮ−サクシニルキトサン（Song et al., J. Controlled Release, Vol. 42 (1996), p. 93-100）、カルボキシメチルキチン（Song et al., Arch. Pract. Pharm. Vol. 53 (1993), p. 141-147）、オリゴペプチド（Soyez et al., J. Controlled Release, Vol. 47 (1997), p. 71-80）への結合も行なわれた。抗悪性腫瘍活性成分それ自体と比べると、この場合も、大多数の分析において、コンジュゲートの抗腫瘍活性が改善されることが観察された。
【００５２】
本発明によれば、抗悪性腫瘍活性成分を含有するＨＡＳ−活性成分コンジュゲートは、腫瘍細胞に対する毒性効果の改善及び／又は他の細胞に対する毒性の低減を示すことが確認されている。従って、本発明のコンジュゲートは、広範な治療へ適用可能である。
【００５３】
本発明のコンジュゲートの血漿中半減期は、大幅に増加されている。このため、長期間に亘る曝露により、腫瘍細胞の修復機構を克服することができる。同時に、本発明により、とりわけ正常組織への大量流入を緩和することができるので、最大濃度の低減と、患者に対するトレランスの改善が達成される。
【００５４】
本発明のコンジュゲートを調製するためには、抗悪性腫瘍活性成分であればどのような成分でも使用することができる。抗悪性腫瘍活性成分は、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、及び天然物質からなる群から選択することができる。
【００５５】
本発明の一実施形態によれば、抗悪性腫瘍活性成分は、マイトマイシンＣ、シクロホスファミド、ブレオチン（bleocin）、クロラムブシル、シスプラチン、Ａｒａ−Ｃ、フルダラビン（fludarabine）、ドキソルビシン、エトポシド、５−ＦＵ、ＭＴＸ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ヒドロキシ尿素、６−ＭＰ又はＣＣＮＵから選択される。
【００５６】
活性成分として、マイトマイシンＣを使用するのがとりわけ好ましい。マイトマイシンＣは、抗生物質の群に属し、アジリジン基、キノン基及びマイトサン（mitosane）環を含む。この活性成分は、腎細胞癌、膀胱腫瘍、及びその他の泌尿器系疾患の治療に使用される。この化合物は、細胞内において酵素的ないし自然発生的に行なわれるキノンの化学的還元及びメトキシ基の化学的喪失により、ハイポキシ（hypoxyic）細胞（これは腫瘍細胞に関して好んで使用される）における代謝に関してのみその活性を獲得する。ＨＡＳが、リンカーを介してこのメトキシ基と結合可能であると好ましい。細胞内での置換基の切断後、当該活性成分は、細胞内に留まって、アルキル化によりＤＮＡを架橋し、以って毒性効果を呈する。或いは、ＨＡＳは、２つのＮＨ_２基のうちの一方と結合することも可能である。マイトマイシンＣは、典型的な組織特異性を示す。本発明によれば、、この−とりわけ排泄器官に対する−特異性が、ＨＡＳとの結合によって増強されることが好ましい。
【００５７】
本発明によれば、抗悪性腫瘍活性成分は、方法を問わずＨＡＳと結合することができる。しかしながら、ＨＡＳの還元性末端基への特異的結合が好ましい。というのは、この方法により、（構造が）限定された（明確な）コンジュゲートを生成することができるからである。
【００５８】
本発明の一実施形態によれば、ヒドロキシエチルデンプンは、マイトマイシンＣのメトキシ基と結合することができる。マイトマイシンＣのメトキシ基との結合は、リンカーを介して行なうことができる。
【００５９】
本発明の更なる一実施形態によれば、ＨＡＳと抗悪性腫瘍活性成分とのコンジュゲートを含む化合物の調製方法が提供される。この方法には、ＨＡＳが抗悪性腫瘍活性成分と、直接的又はリンカーを介して共有結合的に結合するステップと、当該コンジュゲートを単離するステップとが含まれる。
【００６０】
更に、本発明は、ＨＡＳと抗悪性腫瘍活性成分とのコンジュゲートを含む化合物を含有する医薬組成物に関する。医薬組成物は、更に、医薬適合的な担体及び／又はサイトカインを含有することも可能である。サイトカインは、ＩＬ−２、α−インターフェロン、又はγ−インターフェロンであることが好ましい。
【００６１】
医薬組成物は、従来技術において既知の如何なる投与形態をとることもできる。例えば、医薬組成物を、経口的又は非経口的投与に適するよう処方することができる。医薬組成物の処方は、従来技術において既知の方法により行なうことが好ましい。活性成分の他にも、組成物は、一般に、医薬適合的な担体、１又は２以上の助剤、更に任意的に保存剤、可溶化剤等を含有する。
【００６２】
更に、本発明は、腫瘍及び／又はその転移の治療、とりわけ泌尿器の腫瘍及び／又は泌尿器の腫瘍の転移の治療、腎細胞癌の転移の治療、又は例えばＣＬＬ、ホジキンリンパ腫、ＮＨＬ、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム症等のリンパ系疾患の治療のための薬剤を調製するための、ＨＡＳと抗悪性腫瘍活性成分とのコンジュゲートの使用に関する。本発明のこの実施形態によれば、当該薬剤は、更に、例えばＩＬ−２、α−インターフェロン、γ−インターフェロン等のサイトカインを含む。
【００６３】
腎細胞癌の転移の治療のような泌尿器の腫瘍及び／又は泌尿器の腫瘍の転移の治療のための薬剤を調製するために、本発明の化合物を使用するのがとりわけ好ましい。現状では、腎細胞癌の有効な治療は、併用化学療法でも、マイトマイシンＣ単独でも達成できていない。これは、化合物の好ましくない薬物動態のためかもしれない。というのは、腎排出の部分は、およそ１８％にしかならないからである。ＨＡＳは、腎臓を介して殆ど完全に排出されるので、本発明のコンジュゲートは、非コンジュゲート化物質と比べてより大きい割合の腎排出を示す。本発明のこの実施形態では、ＨＡＳの細胞内中間貯蔵を使用する。特に、置換度の大きいＨＡＳ種（ＨＡＳ ２００／０．６２）は、細胞内貯蔵の増加を示すが、極端な場合は過貯蔵さえも示す。この現象は、近位尿細管の領域においても観察された（Peron et al., Clinical Nephrology, Vol. 55 (2001), p. 408-411）。
【００６４】
本発明のこの実施形態によれば、所定の標的細胞又は組織における抗悪性腫瘍活性成分の蓄積が提供される。そのため、本発明のコンジュゲートの薬物動態の改善により、全身における濃度が低くても、標的器官の細胞内にかなり大きい濃度を形成することができる。この医学的使用は、全組織型のおよそ９０％を占める副腎癌及びクロモフィリック（chromophylic）腎癌に適用するのが好ましい。
【００６５】
他の一実施形態によれば、本発明は、ＣＬＬ、ホジキンリンパ腫、ＮＨＬ、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム症等のようなリンパ系疾患の治療用の薬剤の調製のための、本発明の化合物の使用に関する。本発明によるＨＡＳと抗悪性腫瘍活性成分との結合により、活性成分の細胞内吸収は、鎖長及び置換度に応じて減速される。更に、放射性動態学的研究により、ＨＡＳは、所定の器官、とりわけリンパ器官においては、全身中よりもより長い時間にわたって蓄積されることが示された（Bepperling et. al., Crit. Care, Vol. 3, Suppl. 1 (1999), p. 153）。従って、標的細胞にコンジュゲートが蓄積することにより、薬物動態が改善され、全身に対する毒性はより小さくなる。
【００６６】
リンパ系疾患の治療に対し、活性成分としてフルダラビン（fludarabin）を使用することが好ましい。フルダラビンとは、脱アミノ化に耐性のあるハロゲン化されたアデニンアナログをいう。
【００６７】
本発明は、更に、皮膚癌／局所原発悪性腫瘍又はそれらの転移の治療用の薬剤の調製のための、本発明の化合物の使用に関する。これのために、２つの効果、即ち、標的組織による特異的吸収の増加及びＨＡＳコンジュゲートの当該組織外への輸送の減速が利用される。この２つの効果により、該コンジュゲートは標的細胞に蓄積される。
【００６８】
本発明は、更に、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳癌、食道扁平上皮癌、腎細胞癌、精巣（睾丸）癌、悪性黒色腫、ＡＬＬ、又はＣＭＬのような血液系疾患又は腫瘍疾患の治療用の薬剤の調製のための、本発明の化合物の使用に関する。とりわけ、腎細胞癌の治療のために本発明のコンジュゲートを使用する場合、該コンジュゲートの親水性の増加及びそれにより引き起こされる腎排出の増加により影響を受ける組織に該化合物が多量に蓄積されるので有利である。本発明のこの実施例では、活性成分として、ビンデシンを使用するのがとりわけ好ましい。
【００６９】
本発明は、更に、薬剤の調製のための、本発明の化合物であって、１又は２以上の更なる抗悪性腫瘍活性成分又はサイトカインを用いる併用療法に使用される化合物の使用に関する。併用療法は、活性成分をすべて含む１つの剤の投与、又はそれぞれ１つの活性成分を含む２又は３以上の異なる組成物の投与によって実行される。
【００７０】
本発明は、更に、サイトカイン及び新たな併用療法に好適な本発明の化合物を含有する薬剤の調製方法を提供する。対応する剤は、進行した腎細胞癌の治療にとりわけ好適である。
【００７１】
本発明のとりわけ好ましい他の一実施形態によれば、ＨＡＳと抗不整脈活性成分とのコンジュゲート、及び不整脈の治療のためのそれらコンジュゲートの使用が提供される。
【００７２】
正常な心拍数からの心拍の一時的順序及び規則性からのずれ（不整脈）を不整脈という。大多数の場合、これらのずれは、心臓の興奮又は伝導系の障害によって引き起こされる。不整脈、とりわけ心室性不整脈の治療に好適な物質を抗不整脈活性成分又は抗不整脈剤という。
【００７３】
抗不整脈活性成分の効果に応じて、ナトリウムチャンネル遮断剤（キニジン、プロカインアミド、ジソピラミド等）、ベータレセプター遮断剤（アテノロール、プロパノロール等）、選択的再分極延長（selective repolarisation prolonging）活性成分（アミオダロン、ソタロール等）、カルシウム拮抗剤（ベラパミル、ガロパミル等）及び局所麻酔剤に分けられる。
【００７４】
しかしながら、従来技術で通常使用される抗不整脈活性成分には、作用時間が短いものが一部みられる。例えば、アデノシンは、半減期が非常に短い抗不整脈活性成分である。アデノシンの作用時間は、ほんの数分である。多くの場合、半減期及び作用時間の延長が必要である。
【００７５】
更に、抗不整脈活性成分のなかには、前不整脈副作用を有するものもあり、一部には、死の危険を高めるものさえある。
【００７６】
本発明は、とりわけ、例えば作用時間が延長されているような、改善された抗不整脈活性成分を提供する。本発明によれば、ＨＡＳ−抗不整脈剤コンジュゲートは、in vivoの血漿中における半減期が著しく延長されていること、及び当該活性成分の活性は、ＨＡＳとの結合により相当な程度の不利な影響を受けないことが確認されている。
【００７７】
本発明によれば、抗不整脈活性成分であれば何れでも本発明のコンジュゲートの調製に使用することができる。当該活性成分は、ナトリウムチャンネル遮断剤、ベータレセプター遮断剤、選択的再分極延長（selective repolarisation prolonging）活性成分、カルシウム拮抗剤及び局所麻酔剤からなる群から選択することができる。該活性成分は、アデノシン、キニジン、プロカインアミド、ジイソピラミド、リドカイン、フェニトイン、メキシレチン、アジャマリン（ajamaline）、パリマリウム（Parjmalium）、プロパフェノン、アテノロール、プロパノロール、アミオダロン、ソタロール、ベラパミル、ガロパミル又はジルチアゼムであることが好ましいが、アデノシンを使用するのがとりわけ好ましい。
【００７８】
本発明の一実施形態によれば、抗不整脈活性成分とＨＡＳとの結合は、ＨＡＳの還元性末端基を介して行われる。
【００７９】
アデノシンを使用する場合、この活性成分は、例えば、アミノ基を介してＨＡＳと結合することができるが、アデノシンのアミノ基とＨＡＳの還元性末端基とを結合するのがとりわけ好ましい。代謝（ＨＡＳからの分離）後、本来の（未変化の）アデノシンが生成するような結合の変形形態が好ましい。
【００８０】
また、活性成分は、いわゆるリンカーを介してＨＡＳと結合することもできる。
【００８１】
本発明は、更に、本発明の化合物のうちの１つを含有する医薬組成物に関する。一般に、医薬組成物は、更に、医薬適合性担体を含有し、例えば、静脈内投与のために処方可能である。
【００８２】
更に、本発明は、不整脈の治療、とりわけ心室性不整脈の治療用の薬剤の調製のための、本発明の化合物の使用に関する。
【００８３】
他の一実施形態によれば、本発明は、例えば腫瘍組織又は炎症組織においてアポトーシスを誘導するための薬剤の調製のための、本発明の化合物の使用に関する。
【００８４】
本発明は、ＨＡＳと抗感染活性成分又は抗生物質とのコンジュゲートを含む化合物、及び感染症の治療のためのそれらの化合物の使用に関する。
【００８５】
微生物（ウイルス、細菌、真菌、原生動物）のマクロ生物（植物、動物、人間）への侵入及びこれらマクロ生物内での増殖を感染という。感染症の形成及び経過は、だいたいにおいて微生物の病原性及びマクロ生物の免疫に依存する。
【００８６】
何十年もの間、感染症を治療するために、抗感染活性成分が化学療法剤として使用されてきた。
【００８７】
フレミングは、既に１９２８年には、培養プレート上にブドウ球菌が存在しない領域を形成するという活性成分の性質によって、ペニシリンを同定した。ペニシリンは、工業レベルで生産された最初の抗生物質であり、臨床的応用において極めて重要な地位を占めた。
【００８８】
現在では、ペニシリウム属（例えば、ペニシリウム・クリソゲナム、ペニシリウム・ノタトゥム）の真菌が産生する抗生物質β−ラクタムの群から得られる活性成分をペニシリンという。その殺菌効果は、細菌の細胞壁合成の遮断を基礎としている。ペニシリンは、細菌の酵素トランスペプチダーゼを失活させ、細胞壁のムレインの糖鎖の架橋を阻止する。
【００８９】
ペニシリンの発見後、微生物の成長を阻害したり微生物を死滅させる多数の活性成分が単離及び合成された。抗生物質のほとんどは、土から単離されたストレプトマイセス属から得られる（ほぼ６５％）。これらの物質は、土中において競合者を抑圧するために微生物によって使用されているということが推測される。
【００９０】
単離された抗生物質の数は、およそ８０００と見積もられ、そのうちおよそ１００は、医薬分野で使用することができる。異なる物質種別へのこれら活性成分の分類が、異なる観点、例えば化学構造又は作用機構の観点から行われた。
【００９１】
ところで、抗生物質は、感染症の治療のほかにも、免疫抑制剤、腫瘍の治療における細胞成長（増殖）抑制剤、食品保存のための植物保護剤、動物の飼料中の肥育補助剤等としても認められている。
【００９２】
近年、抗生物質に耐性のある多数の系統の微生物が発生した。単剤耐性株に加えて、所定の疾病の治療を複雑化する多剤耐性株もしばしば発見された。
【００９３】
所定の病原体に対する異なる複数の抗生物質の活性についての研究により、活性成分のうちの幾つか、例えばアモキシシリンやアンピシリンは、専ら細胞外でのみ作用するということが見出された（Scaglione et al., Chemotherapie, Vol. 39 (1993), 416-423; Balland et al., J. Antimicrob. Chemother. Vol. 37 (1996), 105-115）。そのため、このような活性成分は、主として細胞内に存在する微生物に対しては使用することができない。細胞内活性を改善するために、アンピシリン・ナノパーティクルが生産された（上記Balland et. al.参照）。
【００９４】
放線菌によって引き起こされる結核及びその他の感染症のような感染症に対し、いまや必須の併用療法のために、治療の可能性の範囲を広げることが望まれるであろう。クラミジア感染症のような他の細胞内感染症のために−クラミジアによる動脈硬化の病因の潜在的重要性はつい最近になって発見された（Stille und Dittmann, Herz, Vol. 23 (1998), p. 185-192）−持効性の細胞内抗生物質は、治療及び予防に対し重要な進歩を示すであろう。
【００９５】
本発明によれば、抗感染活性成分とＨＡＳとの結合により、当該活性成分の薬物動態的性質の改善、とりわけin vivoでの半減期の延長、当該活性成分の細胞内摂取及び／又は細胞内効果の改善が確認された。
【００９６】
本発明によれば、抗感染性成分ないし抗生物質であれば、どのようなものでも使用することができる。活性成分は、アミノペニシリン、セファロスポリン、アミノセファロスポリン、ベータラクタム系抗生物質、カルバペネム、アミノグリコシド、テトラサイクリン、マクロライド系抗生物質、ギラーゼ阻害剤、グリコペプチド系抗生物質、リンコマイシン、ストレプトグラミン（streptogramins）、エベルニノマイシン（everninomicins）、オキサゾリジノン（oxazolidinones）、ニトロイミダゾール、スルホンアミド、コトリモキサゾール、局所抗生物質、ウイルス抑止剤、抗真菌剤、抗結核剤からなる群から選択されるのが好ましい。
【００９７】
上記の活性成分は、例えば、アンピシリン、アモキシリン、セフォタキシム、セフタジジム、バンコマイシン、クリンダマイシン、メトロニダゾール、イソニアジド、リファンピシン、リファブチン、リファペンチン、エタンブトール、ピラシナミド、ストレプトマイシン、プロチオナミド又はダプソンでありうるが、アンピシリン、アモキシシリン、マクロライドのようなアミノペニシリン、又はストレプトマイシンを使用するのがとりわけ好ましい。
【００９８】
本発明の一実施形態によれば、アミノペニシリンは、そのアミノ基を介して直接的かつ共有結合的にヒドロキシエチルデンプンと結合する活性成分として使用される。
【００９９】
本発明の他の一実施形態によれば、アミノペニシリンの代わりに、アミノセファロスポリンが使用され、これによりアレルゲン性が低下する。更なる実施形態によれば、マクロライド−ＨＡＳ結合体を使用することもできが、この場合、エリスロマイシン又はその誘導体、とりわけエリスロマイシラミン（erythromycylamin）が使用される。また、活性成分として、ストレプトマイシンを使用することもできる。
【０１００】
本発明のとりわけ好ましい一実施形態によれば、抗感染活性剤とヒドロキシエチルデンプンとの結合は、ヒドロキシエチルデンプンの還元性末端基を介して行ってもよい。
【０１０１】
本発明の更なる一実施形態によれば、抗感染活性剤は、リンカーを介してヒドロキシエチルデンプンと結合される。
【０１０２】
本発明は、更に、本発明の化合物を含有する医薬組成物を含む。通常、該医薬組成物は、更に、医薬適合的な担体を含有する。
【０１０３】
更に、本発明は、感染症の治療用の薬剤の調製のための、本発明の化合物のうちの１つの使用に関する。医薬組成物は、とりわけ細胞内病原体によって引き起こされる感染症の治療にとりわけ好適であろう。このような病原体は、例えば細菌性、ウイルス性又は寄生虫性病原体、マイコプラズマ、放線菌、クラミジア、リケッチア等の病原体及び条件的病原体の完全なスペクトルに由来しうる。
【０１０４】
本発明の更なる一観点によれば、ＨＡＳ−核酸コンジュゲートが提供される。現在、所望の活性を有する核酸のために大規模に核酸ライブラリがスクリーニングされている。例えば、活性としては、所定の他の核酸、レセプター又はウイルスタンパク質への核酸の結合能が挙げられる。この結合は、生体シグナルによって刺激又は阻害されうる。この目的のために、自然発生のＤ−ＤＮＡ及びＤ−ＲＮＡ分子のほかに、核酸成分としてＤ−リボース又はＤ−デオキシリボースの代わりにＬ−リボース又はＬ−デオキシリボースを含む（WO 98/08856参照）という点で自然発生分子とは異なるＬ−ＤＮＡ及びＬ−ＲＮＡが使用される。本発明に関連して、その本来の機能を保存しうるＨＡＳ−核酸コンジュゲートを調製できることが示された（実施例７参照）。
【０１０５】
本発明は、更に、共有結合的ＨＡＳ−活性成分コンジュゲートの調製方法を提供する。この方法は、水性又は有機性反応溶媒において実行可能であるが、水性溶媒中で結合（反応）を行うのが好ましい。
【０１０６】
それゆえ、ＨＡＳと少なくとも１つの活性成分とを反応溶媒中で反応させる共有結合的ＨＡＳ−活性成分コンジュゲートの調製方法が提供される。該反応溶媒は、水、又は少なくとも１０質量％の水を含む水と有機溶媒の混合溶媒から構成されることを特徴とする。
【０１０７】
本発明の方法に用いられる反応溶媒は、少なくとも１０質量％、好ましくは少なくとも５０質量％、とりわけ、例えば、９０質量％又はほぼ１００質量％のような、少なくとも８０質量％の水を含み、これに応じて、９０質量％未満、好ましくは５０質量％未満、とりわけ、例えば、１０質量％未満又はほぼ０質量％のような、２０質量％未満の有機溶媒を含む。反応は、水相で起こる。好ましい反応溶媒は、水である。
【０１０８】
毒物学的に許容不能な溶媒を必ずしも使用する必要はなく、従って、本発明により調製された生成物により、溶媒による望ましくない汚染を阻止するために既知の方法では常に必要とされるような、毒物学的に許容不能な有機溶媒の僅かな残滓であっても必須な除去は不要という点からして本発明の方法は有利である。更に、本発明の方法は、毒物学的に許容可能な溶媒を好んで使用するので、毒物学的に有害な溶媒の残滓に対し従来技術の方法では必須の付加的な品質管理を省略することができる。本発明の好ましい溶媒は、例えば、エタノール又はプロピレングリコールのような毒物学的に無害なプロトン性溶媒である。
【０１０９】
更に、本発明の方法は、有機溶媒によって誘起されるタンパク質又はペプチドの不可逆的又は可逆的構造変化−これは有機溶媒中での処理プロセスにおいては系統的に排除することはできない−を本質的に阻止することができるという点でも有利である。従って、本発明の方法によって得られる生成物は、ＤＭＳＯ中で調製される生成物とは異なる。
【０１１０】
本発明によれば、更に、ＨＡＳと活性成分との結合は、かなりの範囲で観察される二次反応を伴うことなく、水性溶液中で実行可能であることが確認されている。従って、本発明の方法によって直接的に、生成物の純度は大きく改善される。従って、本発明の方法は、第一に、ＨＡＳ−活性成分コンジュゲート（このコンジュゲートでは、活性成分は活性状態で存在し、ＨＡＳの有利な性質は保存されている）の単純な調製を可能にする。反応は水相で行われるので、即ち有機溶媒を必ずしも除去する必要はないので、反応混合溶媒から当該ＨＡＳ−活性成分コンジュゲートを単離するための特別な方法は不要である。
【０１１１】
本発明によれば、ＨＡＳが活性成分のε−ＮＨ_２基、α−ＮＨ_２基、ＳＨ基、ＣＯＯＨ基又は−Ｃ（ＮＨ_２）_２基と直接結合するのが好ましい。また、更なる反応基をＨＡＳに導入したり、ＨＡＳと活性成分との間の結合リンカーを介して行うことも可能である。活性成分とＰＥＧとの結合のための相応のリンカーの使用は、従来技術でも既知である。WO 97/38727及びEP 605 963に開示されているような、アミノ酸、とりわけグリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、及びフェニルアラニン、並びにヒドラジン及びオキシルアミン誘導体をリンカーとして使用するのが好ましい。
【０１１２】
本発明の方法の一実施形態によれば、ＨＡＳは、活性成分と結合する前に酸化される。酸化は、従来技術で既知の何れか１つの方法によって行うことができるが、ＨＡＳの還元性末端基を選択的に酸化するのが好ましい。これによって、ＨＡＳの酸化された還元性末端基が活性成分のアミノ基と反応してアミドを形成する方法の実行が容易になる。この実施形態は、ＨＡＳと活性成分との特異的結合、従ってとりわけ均一な生成物が得られるのでとりわけ有利である。
【０１１３】
ＨＡＳは、酸化された還元性末端基及び活性成分と共に、好ましくは少なくとも１２時間、最も好ましくは少なくとも２４時間反応を行うことができる。更に、任意の賦活剤、例えば、エチルジメチル−アミノプロピル−カルボジイミド（ＥＤＣ）を添加するのが好ましい。反応中のＨＡＳと活性成分との間のモル比は、任意に選択することができるが、ＨＡＳ：活性成分の範囲は、通常、２０：１〜１：２０であり、その範囲が６：１〜１：６であるととりわけ好ましい。ＨＡＳ：活性成分のモル比がほぼ２：１のとき最良の結果が得られた。
【０１１４】
活性成分のアミノ基とＨＡＳとの間の他の形態の結合反応も、本発明の範囲に含まれることはいうまでもなく、例えば、ＨＡＳと活性成分とを直接互いに反応させ、その際中間性生物としてＨＡＳと活性成分との間にシッフ塩基を形成する方法が含まれる。この場合、＜２Ｈ＞のモル付加によって、シッフ塩基のアゾメチン基−ＣＨ＝Ｎ−をメチレンアミン基−ＣＨ_２−ＮＨ−に還元することができる。この還元を行うために、当業者であれば、従来技術で既知の幾つかの還元剤を使用することができるが、ＢＨ_４を使用する還元がとりわけ好ましい。
【０１１５】
ＨＡＳは、活性成分の任意の基と結合することができる。コンジュゲートが、結合前の活性成分の活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％を示すように、結合が行われることが好ましいが、当該活性の少なくとも９５％が保存されているのがとりわけ好ましい。結合反応は、ＨＡＳが活性成分の１又は２以上の特定の基、例えばペプチドのリジン又はシステイン残基とのみ結合するよう制御できることもいうまでもない。ＨＡＳが活性成分の１又は２以上の特定の基と、酸化されている還元性末端基を介して結合するのがとりわけ好ましい。その理由は、相応の方法により、均一なＨＡＳ−活性成分コンジュゲートが得られるからである。
【０１１６】
本発明の方法の好ましい一実施形態によれば、（結合）反応の開始物質としてＨＡＳとタンパク質又はペプチドとが使用される。任意の天然又は組換えタイプの治療用又は診断用タンパク質を使用することができる。現在市場で入手可能な組換えタイプの活性成分のリストは、Pharma Business, July/August 2000, 45〜60頁に見出すことができる。本発明は、この刊行物に列挙されている任意の活性成分を含むＨＡＳ−活性成分コンジュゲートの調製を含む。
【０１１７】
コンジュゲートの調製は、サイトカイン、例えばインターフェロン、インターロイキン、成長因子、酵素、酵素阻害物質、レセプター、レセプターのフラグメント、インスリン、第VIII因子、第IX因子、抗生物質（ないし抗感染剤）、ペプチド系抗生物質、ウイルスのコートタンパク質、ヘモグロビン、エリスロポイエチン、アルブミン、ｈＴＰＡ、抗体、抗体のフラグメント、単鎖抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらの誘導体を使用するものがとりわけ好ましい。本発明の方法において組替えタンパク質又はペプチドを使用するととりわけ有利である。上述のとおり、相応のタンパク質は、その性質上人間に対し抗原性を示すため、活性成分として使用することができないことがしばしばある。しかしながら、本発明の方法によりＨＡＳと結合した後は、組換えタンパク質の免疫原性は減少するため、人間に対する医薬的使用が可能となる。
【０１１８】
更に、ＨＡＳと、短鎖を有するタンパク質及びより短いペプチドとの結合は、とりわけ有利である。現在、多数のペプチドライブラリ、例えば短いオリゴペプチド（例えば３〜２０個）がファージ表面に発現されるファージディスプレイライブラリの作成が行われている。更に、単鎖ポリペプチドから得られる抗体（いわゆる「単鎖抗体」）は、細菌内、又はファージ表面に発現する。これらライブラリは、特定の活性成分ないし結合活性に対してスクリーニングされる。しかしながら、これまでのところは、相応のペプチド活性成分又は抗体の治療的及び診断的使用は、失敗に終わっている。というのは、これら物質は、その大きさが小さいため、生物から極めて急速に排出されるからである（Chapman et al., 1999, loc. cit.参照）。本発明の方法により、これらペプチドは、ＨＡＳと結合可能であり、活性成分として使用可能な長さのin vivoでの半減期を有するので有利である。
【０１１９】
また、上記の実施形態では、ホルモン、ステロイドホルモン、アミノ酸由来のホルモン、又は脂肪酸由来のホルモンを活性成分として使用することができる。特別な場合では、例えばリンカーを使用して、ＨＡＳと結合する前に活性基をホルモンに導入する必要がありうる。
【０１２０】
本発明によれば、任意の生理学的に許容可能なＨＥＳを、開始物質として使用することができる。平均分子量（質量平均）１〜３００ｋＤＡ、とりわけ１〜１５０ｋＤＡのＨＥＳが好ましいが、平均分子量２〜４０ｋＤＡのＨＥＳが更に好ましい。ＨＥＳは、何れの場合もヒドロキシエチル基に対し、０．１〜０．８のモル置換度、及び２〜２０の範囲のＣ_２：Ｃ_６置換比を有することが好ましい。
【０１２１】
本発明は、更に、上記の方法により得られるＨＡＳ−活性成分コンジュゲートに関する。これらコンジュゲートは、有利な性質、即ち活性成分の高活性、低い免疫原性、生体内における長時間の滞留、良好なレオロジ特性−これらはコンジュゲートの医薬としてのメリットを高める−を有する。
【０１２２】
それに応じて、本発明は、更に、ＨＡＳ−活性成分コンジュゲートを上記方法の何れか１つにより調製し、従来技術において既知の薬学的に許容可能な担体、アジュバント又は助剤を混合することによる薬剤又は診断用薬の調製方法、及び当該方法により得られる薬剤又は診断用薬を含む。
【０１２３】
相応する薬剤の医薬的使用は、使用される活性成分のタイプに依存する。例えば、ヘモグロビンを活性成分として使用する場合、コンジュゲートは酸素輸送剤として使用することができる。他方、サイトカインを調製のための活性成分として使用する場合、コンジュゲートは、例えば、腫瘍の治療に使用することができる。薬剤に使用される場合はどのような場合であってもコンジュゲートの濃度は、当業者であれば用量効果試験によって直ちに確認することができる。
【０１２４】
診断剤は、疾病又は疾患を診断するためにin vivo又はin vitroで使用することができる。抗体又は抗体フラグメントを活性成分として使用する場合、コンジュゲートは、例えば、当技術分野において日常的に使用されている検出法ELISAを実行するために好適である。
【実施例】
【０１２５】
本実施例において、以下に記載された材料を用いた。
ヒト血清アルブミン： シグマ-アルドリッチＡ３７８２
ＨＥＳ１３０ｋＤ： タイプ１３０／０．５、Ｔ９１ＳＥＰから調製
（フレゼニウス カビ社製）
データ： 分子量：１３００００±２００００Ｄ
Ｍｎ： ４２６００Ｄ
ＨＥＳ１０ｋＤ タイプＨＨＨ４−２（フレゼニウス カビ社製）
データ： 分子量：９８００Ｄ
Ｍｎ： ３６９５Ｄ
ＥＤＣ： シグマ-アルドリッチＮｏ．１６．１４６−２
（エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド）
ＨＯＢｔ シグマ-アルドリッチＮｏ．１５．７２６−０
（１-ヒドロキシ-１Ｈ-ベンゾトリアゾールハイドレート）
ＤＩＧグリカン検出キット：ロッシュ-ベーリンガーＮｏ．１１４２−３７２
【０１２６】
以下の実施例１〜６は、酸化された還元性末端基によるＨＳＡとジアミノブタンのＨＥＳへの結合、又はＨＳＡのＨＥＳへの直接結合について記載する。ＨＳＡとジアミノブタンは上記活性成分の単なる例である。実施例７はオリゴヌクレオチドのＨＥＳへの結合について記載する。
【０１２７】
［実施例１］ヒドロキシエチルデンプンの還元性末端基の選択的酸化
ヒドロキシエチルデンプン（１３０ｋＤ及び１０ｋＤ）の還元性末端基を選択的に酸化するため、これを最小容量の水に溶解し、異なる容量のヨウ素溶液及びＫＯＨ溶液と反応した。
【０１２８】
反応混合液はヨウ素（Ｉ_２）の色が消えるまで撹拌した。より多くのヨウ素溶液及びＫＯＨ溶液を添加するため、この操作を数回繰り返した。この溶液は、続いてアンバーライトＩＲ１２０Ｎａ^＋カチオン交換樹脂を用いて精製し、２０時間蒸留水に対して透析し（排除限界４〜６ｋＤの透析チューブ）、そして凍結乾燥した。
【０１２９】
酸化の程度は、ケース毎に、Somogyi, N. (Method in Carbohydride Chemistry,第１巻、1962年、384〜386頁)に開示された方法を用いて決定した。当該酸化反応のプロトコルを表１に再現する。
【０１３０】
【表１】

【０１３１】
この表にまとめられたプロトコルについて、酸化（６）、ＨＥＳ１０ｋＤの処理工程を以下に詳細に再現する：６．４ｇのＨＥＳ１０ｋＤ（１．７ｍｍｏｌ）を反応容器中で数ｍｌの水に溶解し、引き続き攪拌を継続した。０．１Ｎのヨウ素溶液５０ｍｌ（５．０ｍｍｏｌ）と０．１ＮのＫＯＨ溶液１５０ｍｌ（１５ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を２５℃で一晩放置した。反応混合物はアンバーライトＩＲ１２０（Ｎａ^＋型）で精製し、水に対して透析した（酢酸セルロース透析チューブ；分画（カットオフ）４〜６ｋＤ）。透析産物は凍結乾燥した（Heraeus-Christ Alpha、一晩フラスコ乾燥）。
【０１３２】
表１から推測できるように、ヨウ素量を３．０×１０^−５から１．０×１０^−３へと増加させた後に、ＨＥＳ１３０ｋＤの還元性末端基の完全な酸化（収率１００％に対応）が達成された。
【０１３３】
ＨＥＳ１０ｋＤの還元性末端基の完全な酸化のためには、ヨウ素量を２．１×１０^−３以上の濃度へさらに増加させることが必要であった。
【０１３４】
［実施例２］水溶液中におけるＨＥＳの酸化された還元性末端基によるＨＳＡへの結合
結合反応を行うため、酸化された還元性末端基（ｏｘ−ＨＥＳ）を有するヒドロキシエチルデンプンとＨＳＡとを水に完全に溶解させた。溶液が透明になったとき、水に溶解したＥＤＣを添加した。穏やかに攪拌することによりＥＤＣで活性化した後、ＥＤＣをさらに追加した。適切な箇所でＨＯＢｔを添加して反応を活性化し、一晩放置した。反応産物は１５時間、蒸留水に対して透析することにより精製し、引き続いて凍結乾燥した（以下、工程Ａと呼ぶ）。
【０１３５】
結合反応のプロトコルは表２に示したとおりである。
【０１３６】
【表２】

【０１３７】
ｏｘ−ＨＥＳ１３０ｋＤとＨＳＡとの間の結合反応ＶＩＩについて以下に詳細に説明する：丸底フラスコ内に１３０ｍｇのｏｘ−ＨＥＳ１３０ｋＤ（酸化度約１００％）と１００ｍｇのＨＳＡとを、室温で約５ｍｌの水に攪拌しながら溶解した。溶液が透明になるやいなや２００ｍｇのＥＤＣを３分割し、それぞれ５〜１０ｍｌの水に溶解したものを１時間にわたって加えた。それぞれの添加の間は、反応混合液を室温で約４時間攪拌した。２４時間の反応時間経過後、反応混合物を水に対して透析した（酢酸セルロース透析チューブ；分画（カットオフ）４〜６ｋＤ）。反応生成物はその後凍結乾燥した。
【０１３８】
［実施例３］水溶液中でのＨＥＳのＨＳＡへの直接結合
この反応原理は、ＨＥＳとタンパク質のアミノ基との間のシッフ塩基の形成に基づいており、ＮａＢＨ_４によるシッフ塩基の対応アミンへの反応を通じて調節される（以下、工程Ｂと呼ぶ）。
【０１３９】
このため、ＨＥＳは少量の水に溶解した。このために、ホウ酸緩衝液ｐＨ９．０に溶解したＨＳＡを加えた。この溶液にＮａＢＨ_４を加え、全体を室温にて攪拌しながら放置した。ＨＥＳ１３０ｋＤをさらに一定量添加し、続いてさらにＮａＢＨ_４を加えた。反応が完了した後、既述したように透析及び凍結乾燥を行った。
個々のテストのプロトコルを表３にまとめた。
【０１４０】
【表３】

【０１４１】
ＨＥＳ１３０ｋＤの結合のための詳細については、この化合物２．０ｇを約５ｍｌの水に完全に溶解した。ホウ酸緩衝液ｐＨ９．０に溶解したＨＳＡ５０ｍｇを加えた。この溶液に３０ｍｇのＮａＢＨ_４を加え、全体を室温にて攪拌しながら放置した。１８時間後、ＨＥＳ１３０ｋＤをさらに２．０ｇ添加し、続いてさらに３０ｍｇのＮａＢＨ_４を加えた。全部で１００時間の反応後、透析及び凍結乾燥を行った（結合反応Ｖ，ＨＥＳ１３０ｋＤ）。
【０１４２】
ＨＥＳ１０ｋＤの結合のために、この化合物１．４ｇを約５ｍｌの水に完全に溶解した。ホウ酸緩衝液ｐＨ９．０に溶解したＨＳＡ５０ｍｇを加えた。この溶液に１４ｍｇのＮａＢＨ_４を加え、全体を室温にて攪拌しながら放置した。１８時間後、ＨＥＳ１０ｋＤをさらに１．４ｇ添加し、続いてさらに１４ｍｇのＮａＢＨ_４を加えた。全部で８０時間の反応後、透析及び凍結乾燥を行った（結合反応Ｉ，ＨＥＳ１０ｋＤ）。
【０１４３】
［実施例４］ＧＰＣを用いる結合反応産物の解析
反応生成物は、まず最初にゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により分析を行った。
【０１４４】
４．１ ＨＰＬＣのＵＶモニターに連結したＦＰＬＣ装置（ファルマシア社製）を用いてＧＰＣを行った。さらに、以下の分析条件を用いた：
カラム：Superose 12 HR 10/30 (1 x 30 cm)（ファルマシア社製）
ＵＶモニター：２８０ｎｍ
ポンプ：０．２ｍｌ／分
緩衝液：５０ｍＭリン酸／１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２
【０１４５】
これらの条件下において、ＨＳＡのピークは通常６３分後に観察され、ＨＳＡ２量体による小さなピークもまた約５７分に検出される。ＧＰＣによって得られたクロマトグラムは以下のように分析することができる。
【０１４６】
４．２ 図１は、ｏｘ−ＨＥＳ１３０ｋＤのＨＳＡへの結合（結合反応III）後の生成物の大きさ（分子量）分布を示すクロマトグラムである。この結合工程により、ＨＯＢｔ活性化なしでも非常に良好な結果が達成された。はっきりした単一の幅広いピークが３７分に、更により小さいバンドが４５分に測定され、ＨＳＡよりも高分子量の生成物であることを示している。同時に、修飾されなかったＨＳＡがわずかに見出された。
【０１４７】
図２は、ｏｘ−ＨＥＳ１３０ｋＤのＨＳＡへの結合（結合反応IV）後の生成物の大きさ（分子量）分布を示す。反応はＨＯＢｔで活性化された。この活性化は、おそらく２次反応を促進することにより収率を下げることが示される。
【０１４８】
図３及び４は、ｏｘ−ＨＥＳ１３０ｋＤのＨＳＡへの結合（結合反応Ｖ）中及びその後の反応生成物の大きさ（分子量）分布を示す。反応時間２時間後、非修飾ＨＳＡが最も高い生成物として見出されるが、更により大きい分子量の第１次結合産物が見出される。反応終了後、保持時間がおおよそ３５分の均一な結合反応生成物が高濃度で見出された。非修飾ＨＳＡ及びその他の結合産物は比較的低濃度で存在した。
【０１４９】
図５は、ｏｘ−ＨＥＳ１０ｋＤのＨＳＡへの結合（結合反応Ｖ）中及びその後の反応生成物の対応する大きさ（分子量）分布を示す。ここでも、ＨＳＡ以上の分子量を有する結合反応生成物濃度は反応経過と共に増加することが示される。
【０１５０】
最後に、ほとんどすべてのＨＳＡ分子が均一な結合反応生成物に移行しうる結合反応を図６に示す（結合反応ＶＩＩの反応産物）。
【０１５１】
４．２ ＨＥＳのＨＳＡへの直接結合反応の解析に際し得られるクロマトグラムの１つの例を図７に示した（工程Ｂ、ＨＥＳ１３０ｋＤ、結合反応Ｖ）。大きなピークがおおよそ６５分に同定された（ＨＳＡ）。しかしながら、更に結合反応生成物もまた示される（おおよそ４２分のピーク）。
【０１５２】
［実施例５］ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットによる結合産物の解析
５．１ バイオラッド社のミニプロテインＩＩ装置を用いてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下にＰＡＧＥを行った。電気泳動は、製造業者の説明書に従って行った。ゲルは、タンパク質を可視化するためにブラムの方法(Blum process, Elektrophoresis, 第8巻、93-99頁)を用いて銀染色した。
【０１５３】
結合反応産物中のグリカン化合物の存在は、ウェスタンブロット及びロシュ−ベーリンガー社のグリカン検出キット(Glycan-Detection-Kit)により検出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって結合反応産物を分離した後、ミニプロテインＩＩ電気泳動ユニットのブロッティング装置を用いてニトロセルロース膜にこれらを移行した。隣接するＯＨ基のみが酸化される条件下、過ヨウ素酸塩を用いてこの膜を酸化処理した。これらを続いてアミノ基の官能性を持たせたジゴキシゲニンと反応させた。結合したジゴキシゲニンは、アルカリホスファターゼの結合した特異的なモノクローナク抗体によって検出した。このために、難溶性の青紫色の産物を形成するホスファターゼの基質（４−ニトロ−テトラゾリウムクロライド／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸）を添加した。この産物は膜上に沈殿し、バンドを可視化する。非修飾ＨＳＡ及びクレアチナーゼをネガティブコントロールとして使用し、一方、トランスフェリンをポジティプコントロールとして使用した。
【０１５４】
正確な処理工程はこのキット（ロッシューベーリンガー社）に同封される説明書に記載されている。
【０１５５】
５．２ 図８及び９はそれぞれ銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真（上図）と、膜に移行した後にグリカン検出したこれに対応する産物の写真（下図）を示す。これらの図から推測されるように、一つの比較的均一なグリカンが結合反応中に反応産物として形成され、それと同時に非修飾ＨＳＡの濃度が減少する。
【０１５６】
［実施例６］潜在的な２次反応の解析
酸化された還元性末端基によるＨＥＳの自己縮合の形態の２次反応が起こるかどうか調べるために、以下の反応混合物を調製した：
【０１５７】
【表４】

【０１５８】
この実験の目的は、ＨＯＢｔの存在下又は非存在下においてどの程度までＨＥＳの潜在的な自己縮合が起こるかを示すためであった。試料を凍結乾燥し、分析を行うためにフレゼニウス−カビ社へ送付した。
【０１５９】
ＧＰＣ及び光散乱測定法を用い、数パーセントの検出限界内で、分子量の増加は認められなかった。
【０１６０】
［実施例７］酸化されたＨＥＳのＤＮＡへの結合と結合産物の機能解析
反応原理：
反応様式は図１０に模式的に表示される。第一段階において、アミン‐ＨＥＳ１２ｋＤ３のアミノ基は、ＳＭＣＣ４のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基と反応し、コンジュゲート５を形成する。未反応のＳＭＣＣ４は、遠心／透析ユニットを用いて遠心分離によって分離される。コンジュゲート５のマレイミド基は、続いてチオ‐ＤＮＡ１のチオール基と反応し、所望の産物６を与える。太字で特徴付けられた６の領域は単にスペーサーを表すのみであって任意の形を有する。
【０１６１】
コンジュゲート６の生物活性の評価は制限酵素ＥｃｏＲＩによる制限（切断）を介して行われた。制限酵素は無処置の認識配列を有する二本鎖ＤＮＡのみを切断する。
【０１６２】
ＤＮＡ：
MWG Biotech Corporation（Ebersberg、ドイツ）によって合成された二本鎖ＤＮＡを用いた。その一本鎖の配列は次のとおりであり、ＭＷＧにより５’末端がチオールＣ６で修飾されている（図１０参照）。
【０１６３】
配列番号１：5'-GTAGAGACAGGAGGCAGCAGTTGAATTCGCAGGGTGAGTAGCAGTAGAGC-3'
【０１６４】
配列番号２：5'-GCTCTACTGCTACTCACCCTGCGAATTCAACTGCTGCCTCCTGTCTCTAC-3'
【０１６５】
両方の一本鎖ＤＮＡは二回蒸留水に２μｇ／μｌの濃度で溶解し、１：１の比で９６℃にて、２μｇ／μｌの濃度で二本鎖チオ‐ＤＮＡ１になるようにハイブリダイズさせた。
【０１６６】
生成物の分析
４５ｍＭトリスホウ酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０からなるＴＢＥランニングバッファーで４％アガロースゲル電気泳動により、それぞれ１００ｍｌゲル中に５０μｇエチジウムブロマイド存在下１μｇＤＮＡを用いて分析した。ＣＣＤ−システムモジュラー（INTAS Imaging Instruments社、ゲッチンゲン、ドイツ製）とＵＶトランスイルミネーターＵＶＴ−２０ Ｓ／Ｍ／Ｌ（Herolab, Wiesloch社、ドイツ製）を用いて３１２ｎｍにてイメージを記録した。
【０１６７】
１μｇＤＮＡを含む１μｌの反応溶液を取り、１μｌ（２０ユニット）のＥｃｏＲＩ制限酵素（ニューイングランドバイオラボ社、Schwalmbach/Taunus、ドイツ製）と１μｌ反応緩衝液（５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．０２５％Triton X-100、ｐＨ７．５、ニューイングランドバイオラボ社製）と７μｌの２回蒸留水とを用いて３７℃で３時間切断した。
【０１６８】
ＨＥＳの修飾
平均分子量１２０００ｇ／ｍｏｌのＨＥＳ１２ＫＤ（フレゼニウス社製、ロット2540SR2.5P）のｏｘｏ−ＨＥＳ１２ＫＤ２への酸化は、ヨウ素溶液を用いてＤＥ１９６２８７０５に開示された方法に従って行った。
【０１６９】
１，４−ジアミノブタンとｏｘｏ−ＨＥＳ１２ＫＤ２との反応：
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のｏｘｏ−ＨＥＳ１２ＫＤ２を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、窒素雰囲気下に１．５ｍｌ（１．５０ｍｍｏｌ）の１，４−ジアミノブタン溶液中へ一滴ずつ添加し、４０℃で１９時間攪拌した。この反応混合物を８０ｍｌエタノールと８０ｍｌアセトンの混合物中へ加えた。形成された沈殿を遠心分離により分離し、４０ｍｌの水に再懸濁した。この溶液を水に対して４日間透析し（SnakeSkin透析チューブ、３．５ｋＤ分画分子量、Perbio Science Deutschland, Bonn,ドイツ製）、引き続いて凍結乾燥した。収率８０％（１．０６ｇ）でアミノ−ＨＥＳ１２ｋＤ３が得られた。
【０１７０】
アミノ‐ＨＥＳ１２ｋＤ３のチオ‐ＤＮＡ１との結合
５０μｌの無水ＤＭＳＯに溶解した１ｍｇのＳＭＣＣ４を、１０ｍＭリン酸ナトリウムと１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４４の緩衝液中１０ｍｇ／ｍｌのアミノ−ＨＥＳ１２ｋＤ３溶液４００μｌへ添加し、この混合物を室温にて８０分間、及び４６℃で１０分間インキュベートした。続いて、混合物を遠心分離し、上清を沈殿から除去し、再度遠心分離した。２００μｌの上清を取り、MICROCON YM-3(Amicon, Millipore, Eschborn,ドイツ)遠心透析ユニットを用いて１４０００ｇ４５分間遠心分離した。１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４４からなる緩衝液４００μｌを添加した後、再度４５分間遠心分離した。さらに４００μｌの緩衝液を添加し、６０分間遠心分離した。透析ユニットに残されたコンジュゲート溶液の量を５０μｌまで満たした。この溶液１０μｌを１０μｌのチオ−ＤＮＡ溶液１に添加し、両者を室温で１４時間互いに反応させた。１μｌを分析のために取り出した。図１１はこの結果をレーン２及び３に示す。
【０１７１】
上述した実験の反応条件と、これに変更を加えた反応条件を表５にまとめた。その結果を図１１に示した。
【０１７２】
結果のまとめ：
以下の条件について分析した。
１． ＳＭＣＣの量：それぞれ１ｍｇ（レーン２、６、１０、１４）又は５．６ｍｇ（レーン４、８、１２、１６）
【０１７３】
２． チオ−ＤＮＡ溶液１との反応温度：それぞれ、室温（レーン２、４、６、８）又は３７℃（レーン１０、１２、１４、１６）
【０１７４】
３．緩衝液の条件：
それぞれ、ＥＤＴＡを含まない１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４４（レーン２、４、１０、１２）又は１００ｍＭリン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム＋５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４４（レーン６、８、１４、１６）
【０１７５】
図１１において、レーン２〜１８はＳＭＣＣを用いたアミノ−ＨＥＳ１２ｋＤ３のチオＤＮＡ１への８種類の結合実験の結果を表す。結合反応直後の又は結合反応後にＤＮＡを消化した結果をそれぞれ隣のレーンに示した。レーン１には分子量の異なる参照ＤＮＡを長さのマーカーとして添加した。レーン１８と１９はチオＤＮＡ１と消化されたチオＤＮＡ１を示す。未反応のチオＤＮＡ１に加えて、すべての実験で高分子量の結合反応産物が認められる（レーン２、４、６、８、１０、１２、１４、１６）．ＨＥＳ１２ｋＤは異なる大きさの分子の混合物であるから、結合反応産物もまた分子量分布を示す。すべての結合反応産物はＥｃｏＲＩで完全に消化される無処置のＤＮＡを含んでいる。これは、対応する拡散したバンドが酵素消化の後にほとんど完全に消失することからも示される。
【０１７６】
【表５】

【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】工程Ａ．IIIによるｏｘ−ＨＥＳ１３０ｋＤとＨＳＡとの結合反応のＧＰＣクロマトグラムである。
【図２】工程Ａ．IVによるｏｘ−ＨＥＳ１３０ｋＤとＨＳＡとの結合反応のＧＰＣクロマトグラムである。
【図３】工程Ａ．Vによる反応時間２時間後のｏｘ−ＨＥＳ１３０ｋＤとＨＳＡとの結合反応のＧＰＣクロマトグラムである。
【図４】工程Ａ．Vによる反応時間一晩（反応終了後）のｏｘ−ＨＥＳ１３０ｋＤとＨＳＡとの結合反応のＧＰＣクロマトグラムである。
【図５．ａ】工程Ａ．Vによる２時間後のｏｘ−ＨＥＳ１０ｋＤとＨＳＡとの結合反応のＧＰＣクロマトグラムである。
【図５．ｂ】工程Ａ．Vによる一晩（１６時間後）のｏｘ−ＨＥＳ１０ｋＤとＨＳＡとの結合反応のＧＰＣクロマトグラムである。
【図６】工程Ａ．VIIによる反応時間２４時間後のｏｘ−ＨＥＳ１３０ｋＤとＨＳＡとの結合反応のＧＰＣクロマトグラムである。
【図７】工程Ｂ．V（水素化ホウ素還元）によるｏｘ−ＨＥＳ１３０ｋＤとＨＳＡとの結合反応のＧＰＣクロマトグラムである。
【図８】ＨＥＳとＨＳＡとの異なる結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットである。上図はＨＳＡと、それぞれｏｘ−ＨＥＳ１３０ｋＤ及びＨＥＳ１３０ｋＤとの結合反応III（工程Ａ及びＢ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い銀染色したものである。レーン１：結合反応III（工程Ａ）；レーン２：トランスフェリン；レーン３：クレアチナーゼ；レーン４：非修飾ＨＳＡ；レーン５：結合反応III（工程Ｂ）；レーン６：マーカー下図は同じ試料をウェスタンブロットしてグリカン検出したものである。トランスフェリン（レーン２）は陽性コントロールとして、またクレアチナーゼ（レーン３）及びＨＳＡ（レーン４）は陰性コントロールとして機能する。
【図９】ＨＥＳとＨＳＡとの異なる結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットである。ｏｘ−ＨＥＳ１０ｋＤとＨＡＳとの結合反応Ｖの反応混合物を１２％ＰＡＡによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色（上図）及びウェスタンブロット／グリカン検出（下図）した。
【図１０】ＨＥＳ−ＤＮＡコンジュゲートの調製のための反応スキームである。
【図１１】制限酵素による消化前後におけるＨＥＳ−ＤＮＡコンジュゲートを示す写真である。

Claims (72)

1. ＨＡＳと活性成分とを反応溶媒中で混合し、共有結合性のＨＡＳ−活性成分コンジュゲートを調製する方法によって得られるＨＡＳ−活性成分コンジュゲートにおいて、前記反応溶媒が水、又は少なくとも１０質量％の水を含む水と有機溶媒との混合溶液から構成されることを特徴とするＨＡＳ−活性成分コンジュゲート。
2. ＨＡＳと活性成分とのコンジュゲートを含み、該ＨＡＳが、活性成分に直接又はリンカーを介して結合されることを特徴とする化合物。
3. 前記活性成分がビタミン、ワクチン、トキシン、抗生物質、抗不整脈薬、食欲抑制剤、麻酔薬、鎮痛薬、抗リウマチ薬、抗アレルギ薬、抗喘息薬、抗うつ薬、抗糖尿病薬、抗ヒスタミン薬、抗高調薬、又は抗悪性腫瘍薬化合物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の化合物。
4. 前記活性成分はホルモン、ステロイド、脂質、タンパク質、オリゴ若しくはポリペプチド、又は核酸、特に、例えばＤ−ＤＮＡ、Ｌ−ＤＮＡ、Ｄ−ＲＮＡ若しくはＬ−ＲＮＡ等のＤ型又はＬ型の核酸であることを特徴とする請求項１〜３の１項に記載の化合物。
5. 前記活性成分は酵素、酵素阻害物質、レセプター、レセプターのフラグメント、インスリン、第VIII因子、第IX因子、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、増殖因子、ペプチド系抗生物質、ウイルスのコートタンパク質、ヘモグロビン、エリスロポイエチン、アルブミン、ｈＴＰＡ、抗体、抗体のフラグメント、単鎖抗体又はそれらの誘導体であることを特徴とする先行する請求項の１項に記載の化合物。
6. 前記活性成分はステロイドホルモン、アミノ酸由来のホルモン、又は脂肪酸由来のホルモンであることを特徴とする先行する請求項の１項に記載の化合物。
7. 前記ＨＡＳは活性成分のε‐アミノ基、α‐アミノ基、ＳＨ基、ＣＯＯＨ基、又は‐Ｃ（ＮＨ_２）_２基と結合することを特徴とする先行する請求項の１項に記載の化合物。
8. 前記ＨＡＳはヒドロキシエチルデンプン、及び好ましくは１〜３００ｋＤａの平均分子量（質量平均）、好ましくは５〜２００ｋＤａを有することを特徴とする先行する請求項の１項に記載の化合物。
9. 前記ヒドロキシエチルデンプンはヒドロキシエチル基に対し、０．１〜０．８のモル置換度、及び２〜２０の範囲のＣ_２：Ｃ_６置換比を有することを特徴とする先行する請求項の１項に記載の化合物。
10. 前記抗悪性腫瘍薬活性成分はアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、又は天然化合物からなる群から選択されることを特徴とする先行する請求項の１項に記載の化合物。
11. 前記抗悪性腫瘍薬活性成分はマイトマイシンＣ、シクロホスファミド、ブレオチン、クロラムブシル、シスプラチン、ａｒａ−Ｃ、フルダラビン、ドキソルビシン、エトポシド、５−ＦＵ、ＭＴＸ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ヒドロキシ尿素、６−ＭＰ又はＣＣＮＵと結合することを特徴とする先行する請求項の１項に記載の化合物。
12. 前記抗悪性腫瘍薬活性成分はヒドロキシエチルデンプンの還元性末端基と結合することを特徴とする先行する請求項の１項に記載の化合物。
13. 前記抗悪性腫瘍薬活性成分はマイトマイシンＣであることを特徴とする先行する請求項の１項に記載の化合物。
14. ヒドロキシエチルデンプンはマイトマイシンＣのメトキシ基と連結されることを特徴とする先行する請求項の１項に記載の化合物。
15. ヒドロキシエチルデンプンはマイトマイシンＣのメトキシ基とリンカーを介して連結されることを特徴とする先行する請求項の１項に記載の化合物。
16. 請求項１〜１５の１項の化合物を含む医薬組成物。
17. さらに医薬的に許容される担体を含む請求項１６に記載の医薬組成物。
18. さらにサイトカインを含む請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。
19. 前記サイトカインはＩＬ−２、α‐インターフェロン、又はγ‐インターフェロンである請求項１６〜１８の１項に記載の医薬組成物。
20. 腫瘍及び／又はその転移の治療用の医薬組成物を調製するための請求項１０〜１５の１項に記載の化合物の使用。
21. 泌尿器の腫瘍及び／又は泌尿器の腫瘍の転移の治療用の医薬組成物を調製するための請求項２０に記載の化合物の使用。
22. 腎細胞癌又は腎細胞癌の腫瘍の転移を治療するために用いられる医薬組成物を調製するための請求項２１に記載の化合物の使用。
23. 明細胞性又は好色素性腎臓癌又はその転移の治療のために前記医薬組成物を調製するための請求項２２に記載の使用。
24. 前記医薬組成物がリンパ系疾患の治療のために用いられる請求項２０に記載の使用。
25. 前記リンパ系疾患がＣＬＬ、ホジキンリンパ腫、ＮＨＬ、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム症である請求項２４に記載の使用。
26. 抗悪性腫瘍活性成分がフルダラビンである請求項２５に記載の使用。
27. 前記腫瘍が皮膚癌、局所原発悪性腫瘍又はそれらの転移である請求項２０に記載の使用。
28. 前記腫瘍が非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳癌、食道扁平上皮癌、腎細胞癌、精巣（睾丸）癌、悪性黒色腫、ＡＬＬ、又はＣＭＬのような血液系疾患又は腫瘍疾患である請求項２７に記載の使用。
29. 前記医薬組成物が更にサイトカインを含む請求項２０〜２８の一項に記載の使用。
30. 前記サイトカインがＩＬ−２、α‐インターフェロン、又はγ‐インターフェロンである請求項２０〜２９の一項に記載の使用。
31. 前記抗不整脈活性成分がナトリウムチャンネル遮断剤、β−レセプター遮断剤、選択的再分極延長活性成分、カルシウム拮抗剤及び局所麻酔剤からなる群から選択される請求項１〜９の一項に記載の化合物。
32. 前記抗不整脈活性成分はアデノシン、キニジン、プロカインアミド、ジイソピラミド、リドカイン、フェニトイン、メキシレチン、アジャマリン、パリマリウム、プロパフェノン、アテノロール、プロパノロール、アミオダロン、ソタロール、ベラパミル、ガロパミル又はジルチアゼムである請求項１〜９の一項に記載の化合物。
33. 前記抗不整脈化合物はヒドロキシエチルデンプンの還元性末端基と結合する請求項１〜９の一項に記載の化合物。
34. 前記抗不整脈化合物はアデノシンである請求項１〜９の一項に記載の化合物。
35. 前記抗不整脈活性成分がアミノ基を介してヒドロキシエチルデンプンと結合するアデノシンである請求項１〜９の一項に記載の化合物。
36. 前記抗不整脈活性成分はリンカーを介してヒドロキシエチルデンプンと結合する請求項１〜９の一項に記載の化合物。
37. 請求項３１〜３６の一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
38. さらに医薬的に許容される担体を含む請求項３７に記載の医薬組成物。
39. 心臓律動疾患治療用の医薬組成物を調製するための請求項３１〜３６の一項に記載の化合物の使用。
40. 好ましくは腫瘍組織において誘導されるアポトーシスを誘導するための医薬組成物の調製のための、請求項３１〜３６の一項に記載の化合物の使用。
41. 前記活性成分は好ましくはアミノペニシリン、セファロスポリン、アミノセファロスポリン、ベータラクタム系抗生物質、カルバペネム、アミノグリコシド、テトラサイクリン、マクロライド系抗生物質、ジャイレース阻害剤、グリコペプチド系抗生物質、リンコマイシン、ストレプトグラミン、エベルニノマイシン、オキサゾリジノン、ニトロイミダゾール、スルホンアミド、コトリモキサゾール、局所抗生物質、ウイルス抑止剤、抗真菌剤、又は抗結核剤からなる群から選択される抗感染性活性成分又は抗生物質である請求項１〜９の一項に記載の化合物。
42. 前記抗感染性活性成分がアンピシリン、アモキシリン、セフォタキシム、セフタジジム、バンコマイシン、クリンダマイシン、メトロニダゾール、イソニアジド、リファンピシン、リファブチン、リファペンチン、エタンブトール、ピラシナミド、ストレプトマイシン、プロチオナミド又はダプソンである請求項１〜９の一項に記載の化合物。
43. 前記抗感染性活性成分がアンピシリン、アモキシシリン、マクロライドのようなアミノペニシリン、又はストレプトマイシンである請求項１〜９の一項に記載の化合物。
44. 前記活性成分はアミノペニシリンのアミノ基を介して直接的にヒドロキシエチルデンプンと共有結合的に結合する当該アミノペニシリンである請求項１〜９の一項に記載の化合物。
45. 前記抗感染性活性成分がエリスロマイシン又はその誘導体である請求項１〜９の一項に記載の化合物。
46. 前記エリスロマイシン誘導体はエリスロマイシルアミンである請求項１〜９の一項に記載の化合物。
47. 前記抗感染性活性成分はストレプトマイシンである請求項１〜９の一項に記載の化合物。
48. 前記抗感染性活性成分はヒドロキシエチルデンプンの還元性末端基と結合する請求項１〜９の一項に記載の化合物。
49. 前記抗感染性活性成分がリンカーを介してヒドロキシエチルデンプンと結合する請求項１〜９の一項に記載の化合物。
50. 請求項４１〜４９の一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
51. さらに医薬的に許容される担体を含む請求項５０に記載の医薬組成物。
52. 感染症の治療用の医薬組成物を調製するための請求項４１〜４９の一項に記載の化合物の使用。
53. 前記医薬組成物がとりわけ細胞内病原体によって引き起こされる感染症の治療に好適である請求項５２に記載の使用。
54. 前記医薬組成物が細菌性、ウイルス性又は寄生虫性病原体、マイコプラズマ、放線菌、クラミジア、又はリケッチア等の病原体又は通性病原性病原体によって引き起こされる感染症の治療に好適である請求項５２又は５３に記載の使用。
55. ＨＡＳと活性成分とが反応媒体中で結合する共有結合性のＨＡＳ−活性成分コンジュゲートの調製方法において、前記反応媒体が水、又は少なくとも１０質量％の水を含む水と有機溶媒との混合溶液であることを特徴とする方法。
56. 前記活性成分は、ビタミン、ワクチン、毒素、抗生物質、抗不整脈剤、食欲抑制剤、麻酔薬、鎮痛薬、抗リウマチ薬、抗アレルギー薬、抗喘息薬、抗うつ薬、抗糖尿病薬、抗ヒスタミン剤、高血圧治療薬、又は抗悪性腫瘍薬であることを特徴とする請求項５５に記載
    の方法。
57. 前記活性成分は、ホルモン、ステロイド脂質、タンパク質、オリゴ又はポリペプチド、又は核酸であることを特徴とする請求項５５又は５６に記載の方法。
58. 前記活性成分が、酵素、酵素阻害剤、受容体、受容体断片、インスリン、第８因子、第９因子、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、増殖因子、ペプチド性抗生物質、ウイルス外皮タンパク質、ヘモグロビン、エリスロポエチン、アルブミン、ヒトＴＰＡ、抗体、抗体断片、一本鎖抗体、又はそれらの誘導体であることを特徴とする請求項５５〜５７の一項に記載の方法。
59. 前記活性成分は、ステロイドホルモン、アミノ酸に由来するホルモン又は脂肪酸に由来するホルモンであることを特徴とする請求項５５〜５８の一項に記載の方法。
60. ＨＡＳは前記活性化合物のε‐ＮＨ_２基、α‐ＮＨ_２基、ＳＨ基、ＣＯＯＨ基又はＣ（ＮＨ_２）_２基に結合することを特徴とする先行する何れか一項に記載の方法。
61. ＨＡＳは前記活性成分と結合する前に酸化されることを特徴とする先行する何れか一項に記載の方法。
62. 前記ＨＡＳの還元性末端基が選択的に酸化されることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
63. ＨＡＳの酸化された還元性末端基が、活性成分のアミノ基と反応し、アミドを生成することを特徴とする先行する何れか１項に記載の方法。
64. 前記活性成分のアミノ基がシッフ塩基を形成するようにＨＡＳに結合することを特徴とする先行する何れか一項に記載の方法。
65. 前記シッフ塩基のアゾメチン基−ＣＨ＝Ｎ−はメチレンアミン基−ＣＨ_２−ＮＨ−に還元されることを特徴とする請求項６３に記載の方法。
66. ＢＨ_４が還元剤として使用されることを特徴とする先行する何れか一項に記載の方法。
67. 前記活性成分又はＨＡＳが前記コンジュゲートの調製前にリンカーに結合することを特徴とする先行する何れか一項に記載の方法。
68. 平均分子量（質量平均）が１〜３００ｋＤａのヒドロキシエチルデンプンが用いられることを特徴とする先行する何れか一項に記載の方法。
69. 平均分子量が２〜４０ｋＤａのヒドロキシエチルデンプンが用いられることを特徴とする先行する何れか一項に記載の方法。
70. ヒドロキシエチル基に対し、０．１〜０．８のモル置換度、及び２〜２０の範囲のＣ_２：Ｃ_６置換比を有するヒドロキシエチルデンプンを用いることを特徴とする先行する何れか一項に記載の方法。
71. 請求項５５〜７０の一項に従ってＨＡＳ−活性成分コンジュゲートを調製する工程、及び医薬的に許容される担体、アジュバント又は補助化合物と混合する工程を含むことを特徴とする医薬又は診断薬の調製方法。
72. 請求項７１に記載の方法に従って得られる医薬組成物。

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