CN101597337A - 羟烷基淀粉-活性物质-偶联物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含由羟烷基淀粉(HAS)和活性物质组成的偶联物的化合物，其中羟烷基淀粉直接或经由连接基团共价连接在活性物质上。本发明还涉及制备共价的HAS－活性物质－偶联物的方法，其中HAS和活性物质在反应介质中相互反应，其特征在于，该反应介质是水或含水量至少是10重量％的水和有机溶剂的混合物。

Description

羟烷基淀粉-活性物质-偶联物
本申请是国际申请日是2002年3月15日(国际申请号为PCT/EP02/02928)、进入国家阶段申请号为02806722.3的题为“羟烷基淀粉-活性物质-偶联物”的专利申请的分案申请。
技术领域：
本发明涉及化合物，它们含由羟烷基淀粉(HAS)和活化剂组成的偶联物(Konjugate)，其中该羟烷基淀粉是直接或通过连接基团共价结合在活性物质上。本发明还涉及制备共价HAS-活性物质偶联物的方法，在该方法中使HAS与活性物质在反应介质中相互反应，其特征在于，该反应介质是水或含至少10重量％水的水和有机溶剂的混合物。本发明还涉及该偶联物的医学应用。
背景技术：
许多药物-活性物质的临床应用均受一系列问题的有害影响(参见Delgado等人，Critical Review in Therapeutic Drug CarrierSystem，第9卷(3，4)，(1992)，249-304页)。例如，肠胃外给药天然的蛋白质会通过网状内皮系统、肝、肾和脾的排泄而失去作用。这种排泄依碳水化合物链的电荷、适于该蛋白质的细胞受体的存在和分子的形式和大小而发生。例如肾小球过滤的排出限值约为67kD。
此外，蛋白水解降解的结果是可观察到的生物活性的快速损失。
细菌表达的蛋白质以及其它的重组蛋白质具有高的免疫原性，并激发危及生命的过敏性。当然，相应的反应妨碍这些产物的医学应用。
由此，在现有技术中，自70年代末以来系统研究了通过化学改性、特别是在大分子聚合物上的聚合或偶联以改进外源蛋白质的特性。大量工作集中于制备由蛋白质或其它活性物质和聚乙二醇的偶联物(参看US 4179337)。由该偶联反应所期待的优点包括蛋白质在体内的半衰期的改进、活性物质的毒性下降、稳定性改进及溶解度的改进(Abuchowski和Davis，作为药物的酶(Enzymes as drugs)，Holcenberg和Rubberts，Herausgeber，367-383页，John Wiley &Sons N.Y.(1981))。
但是活性物质的偶联方法表明是有问题的。因为蛋白质的活性基通过在PEG上的偶联会失活，或者该反应的反应产物的收率不合适。为了实现活性物质的活性不受损的特殊结合，要将活性基引入PEG中或引入活性物质或这些化合物以连接基团互相相结合。对此，通常是PEG提供活性基，然后它与可偶联的蛋白质的基团经共价相结合。
例如，曾描述过在其偶联到PEG上后抗体和其断片的结合活性的损失(Kitamura等，Cancer Res.，第51卷(1991)，4310-4315页；Pedley等，Br.J.Cancer，第79卷(1994)，1126-1130页)。为解决这个问题，Chapman等(Nature Biotech.，第17卷(1999)，780-783页)建议，将PEG结合在抗体的某些结合位置上。
此外，在WO 95/13090中描述过偶合组分(partner)的活性损失。为解决这一问题，曾建议活化具有反应性基团的PEG，并且在有表面活性物质存在下通过该反应性基团使PEG结合在α-干扰素上。优选的反应性基团是N-琥珀酰亚胺-碳酸酯，在所述条件下，它与细胞溶素的ε-氨基应形成氨酯键。
WO 96/41813也公开了一种制备聚合物-多肽-偶联物的方法，其中，该聚合物(特别是PEG)在特定位置被衍生化，接着结合到多肽上。优选是将氨基-氧-乙酰-基引入PEG中，接着将该化合物结合到多肽上，特别是IL-8、hG-CSF和IL-1上。
在文献上可找到大量相应偶联物的实例；参看US 4179337中的PEG-胰岛素-偶联物；US 4412989中的牛-PEG-血红蛋白-偶联物；在Veronese等人的“应用生物化学和生物技术(Applied Biochem.Bioteeh.)”，第11卷，141-152(1995)中的PEG-核糖核酸酶-偶联物和PEG-超氧化物歧化酶-偶联物；US-4766106中的PEG-IL-2-偶联物或PEG-IFN-β-偶联物；WO 90/15628中的PEG-多粘菌素-偶联物；和WO 90/07939中的PEG-IL-2-偶联物。一些偶联物现已用于临床应用中。例如天冬酰胺酶的特性可通过与PEG的共轭形成而得到改进，并且PEG-天冬酰胺酶-偶联物可以商标
Figure A20091020352200041
从市售得到而用于治疗癌。最近，美国食品和药物管理局批准了一种在PEG上偶联的G-CSF(Pegfilgastim)。在临床研究的各个阶段还存在有大量的其它pegylierter产物，其中例如PEG-CDP 870、PEG-屈大麻酚等(参看www.enzon.com或www.inhale.com中的PEG-渠道)。
不仅蛋白质，而且其它化合物都可按这种方法偶联到PEG和其它聚合物上。例如WO 97/33552和WO 97/38727中公开了紫杉醇在PEG上的偶联，以及该偶联物在治疗肿瘤上的应用。PEG-喜树碱-偶联物在治疗肿瘤上的应用已由Euzon公司研究，并处于第I期临床阶段。
抗生素也已偶联到PEG上。Dowling和Russell描述过关于土霉素-PEG-偶联物的药物动力学的实例(J.Vet.Pharmacol.Ther，第23卷(2000)，107-110)。为了得到新的功能，在现有技术中也通过另外的方法来衍生化抗生素。例如制备了长效-青霉素，它是普鲁卡因-青霉素衍生物，即青霉素与普鲁卡因碱的盐。这种衍生物具有长的作用时间，并用来治疗梅毒。
同样，还描述过与多于两种化合物的偶联反应。WO 93/23062公开了例如由抗B-细胞-淋巴瘤的抗体、活化的PEG和毒素组成的偶联产物的制备。
但是PEG-活性物质-偶联物不具有曾描述过其在体内分解途径的天然结构。为此，除PEG-偶联物外，还制备了其它偶联物和蛋白质-聚合物来解决上述问题。由此有大量方法用于交联各种蛋白质和用于蛋白质在大分子上的结合(参看Wong，S.S的综述“Chemistry ofprotein conjugation and cross linking”，CRCS，Inc.(1993))。
羟乙基淀粉(HES)作为天然存在的支链淀粉的衍生物在体内被α-淀粉酶分解。现有技术已描述HES-蛋白质-偶联物的制备(参看DE2616086和DE 2646854中的HES-血红蛋白-偶联物)。
血红蛋白是一种蛋白质，它作为血液代用剂和氧输送剂(所谓的“血红蛋白-基-氧载体”，HBOC)在临床上有很大意义。但是尽管对这类产品的需要早就已知(参看Rabiner，J.Exp.Med.，126，(1967)1127)，但至今还没有已知的HBOC-产品达到批准作为药物使用的状态。
该天然的血红蛋白由两条α-肽链和β-肽链组成，它们作为辅基总是结合血红素。但分离的血红蛋白分子非常不稳定，并在较稳定的α，β-二聚物(MG 32kDa)中快速分解。该分离的血红蛋白的生物半衰期在血液循环中约为1小时，因为该二聚物经肾快速排泄。这时二聚物产生肾中毒的副作用(参看Bann和Jandl，J.Exp.Med.，129(1967)925-934)。因此，对衍生的血红蛋白分子的研究工作主要是分子内交联血红蛋白，为形成聚合的HBOC-形式，进行分子内偶联和/或在聚合物上偶联。
已知的血红蛋白-偶联物描述于Xue和Wong(Meth.In Enzymol，231(1994)，308-322页)和DE 2616086和DE 2646854中。后者公开的方法是将血红蛋白结合在HES上，其中HES首先与高碘酸钠反应。这时得到血红蛋白结合其上的二醛。与此相反，DE 2616086中描述了一种偶联血红蛋白到HES上的方法，其中将交联剂(如溴化氰)首先结合到HES上，接着将血红蛋白结合到中间产物上。
HES是玉米淀粉中存在达95％的碳水化物-聚合物即支链淀粉的取代衍生物。HES具有有利的流变学特性，目前作为体液增量性补偿剂并临床用于血红素稀释治疗(Sommermeyer等，医院药物学(Krankenhauspharmazie)，第8(8)卷，(1987)，271-278页；Weidler等，Arzneim.-Forschung/Drug Res.，41(1991)494-498)。
支链淀粉由葡萄糖单元组成，其中在主链中有α-1，4-配糖键，但在分支位置上有α-1，6-配糖键。这种分子的物理化学特性主要由配糖键的种类来确定。由于弯曲的α-1，4-配糖键，形成每个螺族具有约6个葡萄糖单体的螺旋形结构。
该聚合物的物理化学和生物化学性质可通过取代来改变。羟乙基的引入可通过碱性羟乙基化来实现。通过反应条件可利用在未取代葡萄糖单体上各种羟基对羟乙基化的不同反应性，由此就可对取代模式施加有限的影响。
因此HES主要是由分子量分布和取代度来表征。该取代度可用DS(“degree of Substitution”)表示，它与所有葡萄糖单元中取代的葡萄糖单体的份额有关，也可用MS(“摩尔取代”)表示，它表明每葡萄糖单元中羟乙基的数目。
HES溶液以多分散组合物存在，其中各个分子在聚合度、分支位置数及排列以及其取代模式均互不相同。因此HES是具有不同分子量的化合物的混合物。由此一定的HES溶液是由根据统计大小的平均分子量来确定。Mn是与分子数有关的简单的算术平均值(数均值)，而Mw是以与重量有关的测量参数表示的重量平均值。
但是蛋白质在HES上的选择性的化学结合至今受阻于HES的活化不能选择性地进行。所以在现有技术中已知的蛋白质-HES-偶联物均来自溴化氰活化的HES在血红蛋白上的非选择性偶联(参看DE2616086)。相应方法可导致具有非单一性和有潜在毒性副作用的多分散产物。
Hashimoto(Hashimoto等，“Kunststoffe，Kautschuk，Fasern(塑料、橡胶、纤维)”，第9卷，(1992)，1271-1279页)首次公开过一种方法，其中糖类的还原性的醛端基可经选择性氧化，以得到反应性的酯(内脂)。
基于这种方法，WO 98/01158公开并制得一种血红蛋白-羟乙基淀粉-偶联物，其中，通过血红蛋白的游离氨基与以氧化形式存在的HES的还原端基之间的酰胺键而使血红蛋白在HES上选择性地相互偶联。但是Hashimoto等人公开的方法和按照WO 98/01158的方法都基于糖类(HES)和蛋白质(血红蛋白)在有机溶剂中的反应。具体地说，在该公开件中是采用二甲基亚砜(DMSO)。
但是，专业人员已知，许多蛋白质在有机溶剂中会遭受结构改变，这种改变在水溶液中是不会回复的。通常，随结构改变又引来活性损失。在所有情况下，有机溶剂必须经昂贵的分离，因为对所计划的医学应用，这种残余的有机溶剂是不可接受的。从所计划的应用来看，甚至蛋白质的污染和结构变化的可能危险都是要排除的。
发明内容：
因此，本发明的目的在于提供一种改进的羟烷基淀粉-活性物质-偶联物及其制备方法，它导致一种可在临床日常工作中应用的有生物活性的偶联物。本发明的另一目的在于，提供一种制备羟烷基淀粉-活性物质偶联物的方法，该方法不产生明显量的副产物，因为这些副产物在很大程度上也对产物的随后纯化有害。
本发明的目的意外地是通过一种含由羟烷基淀粉和活性物质构成的偶联物的化合物解决的，其中羟烷基淀粉直接或经连接基团共价结合在活性物质上。相应的HAS-活性物质偶联物例如可通过下述方法得到：使HAS与活性物质在反应介质中相互反应，其中反应介质是水或水含量至少为10重量％的水和有机溶剂的混合物。
此外，本发明还涉及一种制备共价HAS-活性物质偶联物的方法，其中使HAS与至少一种活性物质在水性反应介质中相互反应，其特征在于，该反应介质是水或水含量至少为10重％的水和有机溶剂的混合物。
优选是HAS在键合到活性物质上之前先经氧化，其中还原性端基的特定氧化是特别优选的。或者，HAS与带氨基的活性物质之间经席夫碱的键的偶联形成中间产物。该中间产物接着经还原而形成亚甲基氨基。
附图简述
图1按方法A.III的OX-HES 130kD和HSA之间的偶联反应的GPC色谱图；
OX-HES 130kD在HSA上的偶联III的GPC色谱图
图2按方法A.IV的OX-HES 130kD和HSA之间的偶联反应的GPC色谱图；
OX-HES 130kD在HSA上的偶联IV的GPC色谱图
图3按方法A.V和反应时间为2小时的OX-HES 130kD和HSA之间的偶联反应的GPC色谱图；
OX-HES 130kD在HSA上的偶联V的GPC色谱图(反应时间2小时)
图4按方法A.V和反应过夜的OX-HES 130kD和HSA之间的偶联反应的GPC色谱图；
OX-HES 130kD在HSA上的偶联V的GPC色谱图(完全反应后)
图5按方法A.V的2小时后(图5a)和过夜后(图5b)的OX-HES10kD和HSA之间的偶联反应的GPC色谱图；
图5a：OX-HES 10kD在HSA上的偶联V的反应动力学的GPC-分析(2小时后)
图5b：OX-HES 10kD在HSA上的偶联V的反应动力学的GPC-分析(16小时后)
图6按方法A.VII的24小时反应时间后的OX-HES 130kD和HSA之间的偶联反应的GPC色谱图；
OX-HES 130kD在HSA上的偶联VII在24小时温育后的反应混合物的GPC-分析
图7按方法B.V的OX-HES 130kD和HSA之间的偶联反应的GPC色谱图；
HES 130kD在HSA上的偶联V和氢化硼还原的GPC-色谱图
图8 HES和HSA之间的各种偶联反应的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)和Western Blot(蛋白质印迹)；
上图：分别为银着色的HSA和OX-HES 130kD和
HES 130kD之间的偶联反应III(方法A和B)的
SDS-PAGE，(带1：偶联III，方法A)；
带2：转铁蛋白；带3：肌酸酶；带4：未改性HSA；
带5：偶联III(方法B)；带6：标记物
下图：相同样品用聚糖证明的Western Blot，
其中转铁蛋白(带2)作为正对照，HSA(带4)
作为负对照。
图9HES和HSA之间的各种偶联反应的SDS-PAGE和WesternBlot；
OX-HES 10kD和HSA的偶联V的反应混合物银着色的SDS-PAGE，12％PAA(上)和Western Blot/聚糖(下)
图10制备HES-DNA-偶联物的反应路线；
氨基-HES，SMCC和硫代-DNA之间的偶联反应图示
图11用限制酶消化前和后的HES-DNA-偶联物的凝胶照片。
本发明首次提供了一种包含羟烷基淀粉和活性物质的偶联物的化合物，其中羟烷基淀粉直接或经连接基团共价结合到活性物质上。此外，本发明还提供一种可通过下述方法制备的HAS-活性物质-偶联物，其中HAS和至少一种活性物质在水性反应介质中相互反应。此外，该方法的特征在于，该反应介质是水或水含量至少为10重量％的水和有机溶剂的混合物。
在本发明的范围内，当化合物是适用于治疗或诊断目的的任意药物的活性成分时，将该化学化合物看作是活性物质。优选该活性物质是药物的活性成分，即药剂配方内的化合物，该化合物在给药后在受药者身上产生生理作用。
在Roten目录上可找到有关批准的药物和其活性物质的概况。在Roten目录上所列的活性物质可用于按本发明方法制备HAS-活性物质偶联物。按本发明，术语“活性物质”也包括在治疗和诊断应用上已知是适用的但又由于上述所提到的问题，至今还未能用于此目的所有化合物。优选的活性物质包括维生素、疫苗、毒素、抗生素(抗感染药)、抗心律失常药、抑食欲药、麻醉药、镇痛药、抗风湿药、抗变应药、平喘药、抗抑郁药、抗糖尿病药、抗组胺药、抗高血压药、或抗肿瘤剂。从结构上看，可以是例如激素、甾类化合物、脂质、蛋白质、寡肽或多肽、核酸，特别是D-核酸或L-核酸，如D-DNA、L-DNA、D-RNA或L-RNA。蛋白质、肽、D-核酸或L-核酸作为HAS-偶联组分是特别优选的。
按本发明制备的化合物保留了活化剂的活性及HAS的有利特性。本发明的偶联物的另一些优点是改进活化剂在体内的半衰期、减小毒性、改进活性物质的稳定性和/或改进其溶解度。
HAS链在给药后于血浆中由α-淀粉酶变短。由此偶联产物的活性可用偶联产物本身的活性，即偶联后的活性，或可用代谢的偶联产物的活性，即偶联产物在体内代谢后的活性来确定。体内代谢可通过体外分解来模拟。
活性物质的活性可按现有技术中用于这些物质的已知方法来确定。在抗肿瘤剂情况下，该活性例如用抑制浓度(IC)来确定，或在抗感染剂情况下，该活性用最小抑制浓度(MHK)来确定。该确定优选在体外以适用的靶细胞来进行(参看Chow等，Haematologica(血液病学)，第86卷(2001)，485-493页)。此外，体外效果可通过相关动物模型来确认(参看例如肾细胞癌的小鼠模型，由Changnon等人描述过，参看BJU Int.，第88卷(2001)，418-424页)。
与未偶联的物质相比较，偶联产物本身具有升高或降低的活性。但是，该活性的降低优选不大于5倍，特别优选不大于3倍或2倍。代谢产物优选具有与未偶联物质相当的活性，即代谢偶联物的活性是偶联前活性物质的至少50％，优选至少75％，其中特别优选保持该活性的至少95％。
在本发明的范围内，术语“羟烷基淀粉”用于表示淀粉衍生物，它被具有1-3个碳原子的羟烷基取代。作为“羟烷基淀粉”包括羟甲基淀粉、羟乙基淀粉和羟丙基淀粉。对本发明实施方案，以羟乙基淀粉(HES)作为偶联组分是特别优选的。
按照本发明，优选羟乙基淀粉的平均分子量(重均分子量)为1-300kDa，其中平均分子量为5-200kDa是特别优选的。此外，羟乙基淀粉的摩尔取代度为0.1-0.8；C2∶C6-取代比为2-20，均按羟乙基计。
为使活性物质在HAS上偶联，在第一步必须将活性基团引入到活性物质和/或HAS中。相应的活性基团例如是巯基或氨基(参看实施例)。
此外，活性物质和HAS可用连接基团相偶联。可用任何交联剂作为连接基团。大量的交联剂如SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-甲酸酯，参看实施例7)，是市售可得的，并是专业人员所熟知的(参看Perbio公司和www.piercenet.com的产品分类中“交联剂”顺序目录)。
按本发明的一个实施方案，水溶性的具有氨基糖的抗生素衍生物，特别是HAS-柔红霉素和HAS-多柔比星-偶联物，以及其制备方法，只要在DE 10129369中公开的，在本发明中就不包括了。
按一个优选实施方案，本发明涉及一种化合物，它包含由HAS和抗肿瘤活性物质组成的偶联物以及其在治疗肿瘤中的应用。
肿瘤细胞与正常的体细胞不同在于，肿瘤细胞摆脱了生物生长控制，并因此具有增大的细胞分裂速率。在肿瘤治疗中抗肿瘤活性物质的治疗应用是基于这种区别，因为抗肿瘤活性物质的毒性活性主要是针对增殖的细胞。因此如果化合物具有对增殖细胞的毒性活性，将它们看作是抗肿瘤活性物质或细胞抑制药(肿瘤学基础及现时的治疗方案例如综述于Internistische Onkologie(内科肿瘤学)，Schmoll等(编者)，Springer，1996)。
在化学上可将抗肿瘤活性物质归于非常不同的类。除增殖抑制外，在最近几年的讨论中细胞程序死亡具有重要的意义。抗肿瘤活性物质的分类例如可通过关键的目标分子来进行(Schmoll等，同上)：
(1)抑制DNS-生物合成的化合物，例如通过抗代谢药如MTX、5-FU、Ara-C或羟基脲。
(2)影响DNS的化合物，例如通过诱导断链、嵌入、链间交联改变、拓扑异构酶毒物如烷化剂(Alkylantien)、铂配合物、蒽环类抗生素、博来霉素、放线霉素D或表鬼臼毒素。
(3)影响RNS的化合物，例如通过嵌入或引入到RNS中来阻断mRNS合成，其中蒽环类抗生素、博来霉素、放线霉素D或抗代谢物。
(4)影响蛋白质的化合物，例如在受体结合水平上(例如激素或拮抗剂)，通过阻止微管蛋白的聚合作用(如借助长春花生物碱)，通过蛋白质交联作用(如借助烷化剂)或磷酸化作用(如借助蛋白激酶-C-抑制剂)。
由于抗肿瘤活性，所有活性物质均具有大的副作用，明显的是主要起抑制快速增殖组织的作用。特别是抑制红细胞生成、白细胞生成和血小板生成，以及减退粘膜上皮的生成。结果，出现胃肠紊乱或不可逆的有害于精子形成或不排卵。通常也涉及皮肤和皮肤附属器官，例如使许多病人可逆性的脱发。
在严重情况下，该副作用还会导致急性肾机能衰竭和对心脏、肺、肝和神经系统严重毒性的器官损伤。最后，由于免疫抑制作用必须考虑到各种的感染。
因此，包含抗肿瘤活性物质的偶联物的制备和研究目的是要改进活性物质的耐受性，为此，在大分子如葡聚糖上偶联了各种抗肿瘤活性物质(参看Kojima等，J.Pharm.Sci.，第32卷(1980)，30-34页；Nakane等，J.Pharm.Sci.，第40卷(1988)，1-6页；Nomura等，J.Controlled Release第52卷(1998)，239-252页；Sato等，“J.Pharm.Sci.”，第78卷(1989)，11-16页)。在一些情况下，可确证偶联物的改进的抗肿瘤作用。
另外，活性物质如丝裂霉素C也偶联到N-琥珀酰脱乙酰壳多糖(Song等，J.Controlled Release，第42卷(1996)，93-100页)，羧甲基壳多糖(Song等，Arch.Pract.Pharm.第53卷(1993)，141-147页和低聚肽上(Soyez等，J.Controlled Release，第47卷(1997)，71-80页)。在大多数分析中，与单独的抗肿瘤活性物质比较，偶联物再次显示改进的抗肿瘤活性。
按本发明意外地发现，包含抗肿瘤活性物质的HAS-活性物质偶联物对肿瘤细胞有改进的毒性作用和/或对其它细胞有低的毒性。因此，该偶联物可具有较宽的治疗范围。
偶联物的血浆半衰期明显增长。这就可通过较长时间接触使肿瘤细胞中的修复机制断裂。同时本发明可达到较长的起效期，特别是在健康组织中，因此对患者可达到较小峰浓度和改进的耐受性。
可采用任意的抗肿瘤活性物质来制备本发明的偶联物。抗肿瘤活性物质例如可选自烷化剂、抗代谢物、抗生素或天然物质。
按照一种优选实施方案，该抗肿瘤活性物质是丝裂霉素C、环磷酰胺、博来霉素、苯丁酸氮芥、顺铂、阿糖胞苷、氟达拉滨、阿霉素、依托泊苷、5-FU、MTX、长春花碱、长春花新碱、长春地辛、羟基脲、6-MP或CCNU。
丝裂霉素C作为活性物质的应用是特别优选的。丝裂霉素C属抗生素类，并含氮丙啶基以及醌基和白消安环。该活性物质用于治疗肾细胞癌、膀胱肿瘤和其它泌尿疾病。该化合物仅在低氧(即优选肿瘤)细胞内代谢后通过苯醌的细胞内的酶还原或自行化学还原并去掉甲氧基而达到活性。HAS可优选通过连接基团偶联到该甲氧基上。在细胞内该取代基分裂后，细胞内仍存在同样的活性物质，它起到DNA烷基化交联作用，并由此发挥毒性作用。或者，HAS也可偶联到一个或两个NH2基上。丝裂霉素C具有典型的组织特异性。按照本发明，优选的是这种特异性，特别是对排泄器官的特异性通过HAS-偶联来提高。
按本发明，抗肿瘤活性物质可按任意方法偶联到HAS上。但是，在HAS还原性端基上的特定偶联是优选的，因为通过此过程产生特定的偶联物。
按本发明的一个实施方案，使羟乙基淀粉偶联在丝裂霉素C的甲氧基上。对此，在丝裂霉素C的甲氧基上的偶联是经由连接基团实现的。
按照另一实施方案，本发明涉及一种制备含由HAS和抗肿瘤活性物质组成的偶联物的化合物的方法。该方法包括使HAS直接或经由连接基团共价偶联到抗肿瘤活性物质上的步骤，并分离该偶联物。
此外，本发明涉及一种含化合物的药物组合物，所述化合物含有由HAS和抗肿瘤活性物质组成的偶联物。此外，该药物组合物还含有可药用载体和/或细胞因子。该细胞因子优选是IL-2、α-干扰素、γ-干扰素。
该药物组合物可以在现有技术中已知的任意应用形式存在。例如可配制成口服或胃肠外给药的组合物。组合物的配制可按现有技术的常规方法进行。除活性物质外，该组合物还含有通常的可药用载体和一种或多种助剂，以及任选的防腐剂、增溶剂等。
最后，本发明涉及含由HAS和抗肿瘤活性物质组成的偶联物的化合物在制备治疗下述疾病的药物中的应用：肿瘤和/或其转移灶，特别是治疗泌尿科肿瘤和/或泌尿科肿瘤转移灶、肾细胞癌转移灶，或淋巴系统的疾病如CLL、淋巴网状细胞瘤、NHL、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏病。此外，按本发明实施方案，该药物也可包含细胞因子如IL-2、α-干扰素、γ-干扰素。
本发明的化合物在制备用于治疗泌尿科肿瘤和/或泌尿科肿瘤转移灶，如治疗肾细胞癌转移灶的药物中的应用是特别优选的。目前肾细胞癌的有效的治疗既不能以联合-化疗也不能以单独的丝裂霉素C达到。这可能是由于化合物的不合适的药物动力学，因为肾的排出量仅约18％。由于HAS几乎完全经肾排出，所以与非偶联物质相比，该偶联物有高的肾排出的百分数。本发明的该实施方案利用HAS的细胞内的中间储存。特别是高取代的HAS类型(HAS 200/0.62)具有增强的细胞内储存，在极端情况下甚至具有过量储存。这种现象在近端肾小管范围内也观察到(Peron等，Clinical Nephrology，第55卷(2001)，408-411页)。
因此，按该实施方案，本发明提供一种抗肿瘤活性物质在某些靶细胞或靶组织中的浓集作用。偶联物的改进的药物动力学可在低的全身浓度下在靶器官的细胞中达到明显高的浓度。这种医学应用优选用于透明细胞肾癌和易染细胞肾癌，这些癌一起构成约90％的组织型癌。
按另一实施方案，本发明涉及本发明的化合物在制备治疗淋巴系统疾病的药物中的用途，这些病如CLL、淋巴网状细胞瘤、NHL、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏病。通过HAS在抗肿瘤活性物质上按本发明的偶联，该活性物质的细胞内的吸收将依链长和取代度而减慢。此外，放射性动力学研究表明，HAS在某些器官，对此为淋巴器官中的储存比在全身中储存更长(参看Bepperling等，Crit.Care，第3卷，增补1，(1999)，153页)。由此达到该偶联物在靶细胞中的浓集，这就在较小的全身毒性下得到改进的药物动力学。
采用氟达拉滨作为活性物质来治疗淋巴系统疾病是优选的。氟达拉滨是一种卤化的腺嘌呤类似物，它有抗脱氨作用。
此外，本发明涉及本发明化合物在制备用于治疗皮肤/局部原生恶性肿瘤或其转移灶的药物中的应用。其中利用其两种效应，即靶向增大由所述组织的吸收和延缓HAS偶联物从该组织中排出。这二者导致该偶联物在靶细胞中的浓集。
此外，本发明还涉及本发明化合物在制备用于治疗血液系统疾病或肿瘤学疾病的药物中的应用，这些病如非-小细胞和小细胞的支气管癌、乳腺癌、食管鳞状细胞癌、肾细胞癌、睾丸癌、恶性黑素瘤、ALL或CML。特别是在用偶联物治疗肾细胞癌的情况下，由于化合物在相关组织中的强浓集，通过偶联物的较大亲水性及由此达到的较强的肾排出就产生了其优点。长春地辛作为活性物质的特别适于本发明的这一实施方案。
此外，本发明还涉及本发明化合物在制备药物中的应用，其中该化合物用于与一种或多种其它抗肿瘤活性物质或细胞因子的联合治疗。该联合治疗可通过给药一种含所有活性物质的药物，或通过给药2种不同的或多种其中各配有活性物质的药物进行。
此外，本发明还提供一种制备药物的方法，该药物包含细胞因子和本发明的化合物，并适用于新的联合治疗。相应的药物特别适用于治疗继发性的肾细胞癌。
按本发明的另一个特别优选的实施方案，本发明提供由HAS和抗心律失常活性物质组成的偶联物以及其在治疗心律失常中的应用。
心律失常意指心动周期一时的和有规律地偏离正常的心率。在多数情况下，这种偏离是由于心脏兴奋形成障碍或兴奋传导障碍引起的。作为抗心律失常活性物质或抗失律失常药物是适用于治疗心律失常，特别是心室心律失常的物质。
按抗心律失常活性物质的作用类型可区分为钠通道阻断剂(奎尼丁、普鲁卡因酰胺、双异丙吡胺等)、β-受体阻断剂(阿替洛尔(atenolol)、普奈洛尔等)、选择性复极化延长剂(胺碘酮、索他洛尔等)、钙-拮抗剂(维拉帕米、加罗帕米等)和局部麻醉药。
但是在现有技术中通常的抗心律失常的活性物质一部分具有短的作用时间。例如阿糖腺苷是一种具有非常短的半衰期的抗心律失常的活性物质。这种物质的作用时间仅几分钟。在许多情况下需要延长半衰期和作用时间。
一些抗心律失常的活性物质具有促心律不齐的副作用，部分甚至会增加死亡率。
本发明特别提供一种改进的抗心律失常的活性物质，例如它具有延长的作用时间。本发明意外发现，HAS-抗心律失常药-偶联物在体内血浆中有明显较长的半衰期，并且该活性物质的活性不会由于在HAS上的偶联而明显受损。
在本发明范围内，任何抗心律失常的活性物质均可用于制备偶联物。该活性物质可选自钠通道阻断剂、β-受体阻断剂、选择性复极化延长剂、钙-拮抗剂和局部麻醉药。优选的活性物质为阿糖腺苷、奎尼丁、普鲁卡因酰胺、双异丙吡胺、利多卡因、苯妥因、美西律、西萝芙木碱、Parjmalium、普罗帕酮、阿替洛尔、普奈洛尔、胺碘酮、索他洛尔、维拉帕米、加罗帕米或地尔硫
Figure A20091020352200161
，其中特别优选阿糖腺苷。
按本发明的一个实施方案，抗心律失常活性物质与HAS之间的连接是经HAS的还原性端基实现的。
在采用阿糖腺苷时，这种活性物质例如是经氨基与HAS连接的，其中阿糖腺苷的氨基与HAS的还原性端基之间的偶联是特别优选的。优选的偶联方案是在经代谢(HAS解离)后存在本来的阿糖腺苷。
另外，该活性物质经所谓的连接基团偶联在HAS上。
本发明还涉及一种含本发明化合物的药物组合物。该药物组合物还包含通常的可药用载体，例如可能制成用于静脉应用的药物组合物。
最后，本发明涉及本发明化合物在制备用于治疗心律失常，特别是治疗心室心律失常的药物中的应用。
按另一实施方案，本发明涉及本发明化合物在制备用于诱导细胞程序死亡，例如在肿瘤组织或炎症组织中的细胞程序死亡的药物中的应用。
本发明涉及含由HAS和抗感染活性物质或抗生素组成的偶联物的化合物，以及其在治疗传染病中的应用。
微生物(病毒、细菌、真菌、原虫)侵入大生物(植物、动物、人)中并在其中繁殖称为感染。传染病的发生及病程主要与微生物的致病性和大生物的免疫性有关。
为了防治传染病，数十年来应用抗感染活性物质作为化疗剂。1928年根据在培养皿中无葡萄球菌的区域形成的活性物质的特性，A.Flemings鉴定出青霉素。青霉素曾是第一个能以工业规模生产的并在临床实践中具有重要性的抗生素。
现在，来自β-内酰胺类的活性物质也看作青霉素，它们是由青霉素类(例如黄氰霉素和青霉菌)的真菌形成的。该杀菌剂的作用是基于阻滞细菌细胞壁的合成。青霉素使细菌酶，即转肽酶失活，由此，阻碍了细胞壁的胞壁质的多糖链的交联。
自从发现以来，已分离出和合成了无数的可抑制微生物生长和杀死这些微生物的活性物质。大多数的抗生素均来源于由土壤分离出的链霉菌属(约65％)。设想可利这种微生物物质来压制土壤中的竞争者。
分离出的抗生素数目估计约为8000种，其中约100种可用于医学上。将活性物质分成不同的物质类是按不同的观点进行的，例如按化学结构或作用机理来分。
目前，抗生素不仅用于防治传染病，也作为免疫抑制剂、抗肿瘤治疗中的细胞抑制药，作为植物保护剂，用于食品的防腐，作为动物饲料的催肥助剂。
近年来，出现大量耐抗生素的微生物菌种。除简单的抗性菌种外，还发现众多的多重的抗性菌种，它使得防治某些疾病特别困难。
在针对某些病原体的各种抗生素的活性的研究中发现，某些活性物质(如阿莫西林或氨苄西林)几乎只在细胞外起作用(Scaglione等，Chemotherapie，第39卷(1993)，416-423；Ballaud等，J.Antimicrob.Chemother.，第37卷(1996)，105-115)。因此，这些活性物质不能用于抗主要存在于细胞内的微生物。为改进细胞内的活性，生产了氨苄西林-纳米微粒(参看Balland等，同上)。
正如结核病或其它分支杆菌病感染的情况下，由于总是希望联合治疗，所以展宽治疗可能性的范围是希望的。在另一些细胞内的感染如衣原体感染情况下，近来已认识到它对关节硬化的发病机理有可能的意义(Stille和Dittmann，Herz，第33卷(1998)，185-192页)，由此细胞内的具有长效作用的各种抗生素在治疗和预防上可能具有重要意义。
根据本发明，现已意外地发现，抗感染活性物质在HAS上的偶联导致了活性物质药物动力学特性的改进，特别是延长了体内半衰期、改进了细胞内的吸收和/或活性物质的有效性。
按本发明，可采用任何抗感染活性物质或任何抗生素。优选是该活化剂选自氨基青霉素、头孢菌素和氨基头孢菌素、β-内酰胺-抗生素、碳青霉烯、氨基苷、四环素、大环内酯-抗生素、回旋酶抑制剂、糖肽抗生素、林可霉素、链阳性菌素、晚霉素、噁唑烷酮、硝基咪唑、磺胺类药物、复方新诺明、局部抗生素、抑病毒药、抗霉菌药、抗结核菌药。
其中可涉及氨苄西林、阿莫西林、头孢氨噻、头孢他定、万古霉素、氯林可霉素、甲硝唑、异烟肼、利福平、利福布丁、利福喷丁、乙胺丁醇、吡拉辛酰胺(pyracinamid)、链霉素、丙硫异烟胺或氨苯砜，其中优选采用氨基青霉素如氨苄西林、阿莫西林、大环内脂或链霉素。
按本发明的一个实施方案，采用氨基青霉素作为活性物质，它直接或经氨基青霉素的氨基共价偶联到羟乙基淀粉上。
按本发明的另一实施方案，采用氨基头孢菌素代替氨基青霉素，由此达到小的过敏性。另一实施方案是大环内脂-HAS偶联，它涉及红霉素或其衍生物，特别是红霉素胺。另外，可采用链霉素作为活性物质。
按本发明的特别优选的实施方案，抗感染活性物质与羟乙基淀粉之间的偶联是经羟乙基淀粉的还原性端基进行的。
按本发明另一实施方案，抗感染活性物质通过连接基团偶联到羟乙基淀粉上。
本发明还包括具有本发明化合物的药物组合物。通常该药物组合物还含有可药用载体。
最后本发明涉及本发明化合物在制备用于治疗传染病的药物中的应用。该药物组合物特别适于治疗通过细胞内病原体引起的传染病。它涉及病原的和兼性病原的病原体整个范围，如细菌的、病毒的或寄生的病原体、支原体属、分支杆菌属、衣原体属、立克次体属等。
在本发明的另一方面，提供HAS-核酸-偶联物。目前的核酸库在很大范围内研究了具有一定活性的核酸。相应的活性可以是例如所述核酸在某些其它核酸、受体或病毒蛋白质上结合的能力。通过结合可以刺激或抑制生物信号。为此，除了天然存在的D-DNA分子和D-RNA分子外，还采用L-DNA分子和L-RNA分子，其与天然存在的分子的区别在于，其具有L-核糖或L-脱氧核糖代替D-形式作为核酸的成分(参看WO 98/08856)。在本发明范围内可表明，可制备HAS-核酸-偶联物，该偶联物保持了天然的功能性(参看实施例7)。
本发明还提供一种制备共价的HAS-活性物质-偶联物的方法。该方法可在水性或有机的反应介质中进行，但是在水相中进行偶联是优选的。
因此，提供一种制备共价的HAS-活性物质-偶联物的方法，其中HAS和至少一种活性物质在反应介质中相互反应。其特征在于该反应介质是水或含至少10重量％水的水与有机溶剂的混合物。
本发明方法的反应介质包括至少10重量％，优选至少50重量％，特别优选至少80重量％，如90重量％或甚至达100重量％的水，和相应最高90重量％，优选最高50重量％，特别优选最高20重量％，如10重量％或甚至达0重量％的有机溶剂。该反应也可在含水相中进行。优选的反应介质是水。
因此本发明方法的优点在于，因为不是必须用有毒性危害的有机溶剂，并由此在本发明制备的产物情况下，就不需分离掉甚至少量残余的有毒性危害的溶剂，但在按已知方法的生产中，为了避免溶剂带来的不希望的污染，分离工作总是必须要做的。此外，按至今的方法必须附加的对残余的有毒性危害的溶剂的质量控制就不需要了，因为本发明方法优选使用无毒性危害的溶剂。本发明优选的溶剂例如是无毒性危害的质子溶剂如乙醇或丙二醇。
此外，本发明方法的优点是，基本上避免了由有机溶剂引起的蛋白质或肽的不可逆或可逆的结构变化，而在有机溶剂的方法中，不能完全排除这一点。由此按本发明方法得到的多肽就和在DMSO中制备的不一样。
本发明还意外地发现，在水溶液中可进行HAS与活性物质的偶联，对此，不会产生明显量的副产物。由此，本发明方法直接得到高纯度的改进产物。本发明方法首次使得简单地制备HAS-活性物质-偶联物成为可能，并在该偶联物中活性物质以活性形式存在，同时保持了HAS的有利特性。为从反应混合物中分离HAS-活性物质-偶联物不需特殊方法，因为该反应是在水相进行，也就不一定必须要纯化去除有机溶剂。
本发明优选使HAS直接连接在活性物质的ε-NH2基、α-NH2基、SH-基、COOH基或-C(NH2)2-基团上。另外，也可将其它反应性基团引入HAS中或HAS与活性物质之间的连接通过连接基团进行。在PEG上连接活性物质所用的相应的连接基团是现有技术已知的。优选采用氨基酸，特别是甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸以及肼的衍生物和羟胺(Oxylamin)的衍生物作为连接基团，如在WO 97/38727和EP 605963中所公开的。
按本发明方法的一个实施方案，HAS在连接到活性物质上前要经氧化。氧化可按一种现有技术已知方法进行，优选是选择性氧化HAS的还原性端基。该过程就使得如下方法成为可能，即HAS的经氧化的还原性端基与活性物质的氨基反应以形成酰胺。该实施方案具有特别的优点，即HAS和活性物质之间达到特定连接，并由此得到特别均匀的产物。
使具有经氧化的还原性端基的HAS和活性物质相互反应至少12，优选至少24小时。此外，希望的是加入任意的活化剂如乙基二甲基-氨基丙基-碳二亚胺(EDC)。反应期间的HAS与活性物质的摩尔比可任意选定，通常HAS∶活性物质为20∶1-1∶20，优选6∶1-1∶6。当HAS∶活性物质的摩尔比约为2∶1时达到最好结果。
活性物质的氨基与HAS之间的其它偶联反应当然也包括在本发明的范围内。例如HAS与活性物质直接互相反应的方法，其中得到HAS与活性物质之间的席夫碱作为中间产物。接着席夫碱的偶氮次甲基-CH＝N-在随后<2H>的缩醛加成(formal addition)下还原成亚甲基氨基-CH2-NH2-。对此反应，专业人员可采用大量现有技术中已知的还原剂，其中优选的还原剂是BH4。
HAS可在活性物质的任意基团上偶联。偶联优选如此进行，即，使代谢的偶联物具有至少50％，优选至少75％的偶联前活性物质的活性，特别优选保持至少95％的活性。该偶联反应当然也可如此控制，即，使HAS的结合仅在活性物质的一个或多个确定的基团上进行，例如在肽的赖氨酸基团或半胱氨酸基团上进行。当HAS通过氧化的还原性端基结合到活性物质的一个或多个确定的基团上时出现特别的优点，因为在相应的过程中得到均匀的HAS-活性物质-偶联物。
按本发明方法的一个优选实施方案，采用HAS和蛋白质或肽作为反应的原料。也可应用天然的或重组来源的任意的治疗蛋白质或诊断蛋白质。在Pharma Business，2000年7月/8月，45-60页中可找到现时市场上可买到的重组生产的活性物质的目录。本发明包括制备包含该出版物中提到的任一种活性物质的HAS-活性物质-偶联物。
特别优选的是应用细胞因子如干扰素、白细胞介素、生长因子、酶、酶-抑制剂、受体、受体-断片、胰岛素、因子VIII、因子IX、抗生素(或抗感染剂)、肽-抗生素、病毒鞘-蛋白质、血红蛋白、红细胞生成素、白蛋白、hTPA、抗体、抗体断片、单链抗体、DNA、RNA或其衍生物来制备偶联物。在本发明方法中应用重组蛋白质或肽是特别有利的。如已提到的，相应的蛋白质由于其对人体的抗原特性经常不能作为活性物质。但通过本发明方法在HAS上偶联后就减少了重组蛋白质的免疫原性，这就可在医学上用于人体。
此外，HAS在短链蛋白质和较小的肽上偶联是特别有利的。现已建立了大量的肽库，例如噬菌体-展示库，其中将短的低聚肽(例如3-20聚物)表达到噬菌体的表面上。此外，将来自单一多肽链(所谓的单链抗体)的抗体表达到细菌中或噬菌体的表面上。可在这些库中查找某些活性物质的活性或结合活性。但是，相应的肽-活性物质和抗体的治疗或诊断应用至今是失败的，这是因为其较小，在机体中很快被排出了(参看Chapman等，1999，同上)。按本发明方法，将这种肽有利地偶联在HAS上，就具有可作为活性物质应用的体内半衰期。
另外的实施方案是可应用激素、甾类激素、从氨基酸衍生的激素或从脂肪酸衍生的激素作为活性物质。在个别情况下，可能需在连接到HAS上之前在激素中引入活性基如借助于连接基团连接。
按本发明，可应用任意的在生理上相容的HES作为原料。平均分子量(重均分子量)为1-300kDa，特别是1-150kDa的HES是优选的。特别优选平均分子量为2-40kDa的HES。优选地，HES的摩尔取代度为0.1-0.8，C2∶C6-取代的比为2-20，均以羟乙基计。
本发明还涉及按上述方法制备的HAS-活性物质-偶联物。该偶联物具有有利的特性，即高的活性物质活性、小的免疫原性、长的体内停留时间和优异的流变学特性，这就提高了该偶联物在医学上的适用性。
因此，本发明还包括制备药剂或诊断剂的方法，其中按上述方法之一制备HAS-活性物质-偶联物，并用现有技术已知的可药用载体、佐剂或助剂混合，以及按此方法得到药剂和诊断剂。
相应药剂的医学应用与活性物质的种类有关。例如在应用血红蛋白作活性物质时，该偶联物可用作载氧剂。另外，在应用细胞因子作为制备用的活性物质时，该偶联物例如可用在肿瘤治疗中。所有情况下，在药剂中所用的偶联物的浓度可由一般专业人员毫无困难地按剂量-效应试验确定。
该诊断剂可在体内或体外用于诊断疾病和障碍。当用抗体或抗体片断作为活性物质时，则该偶联物例如适用于实施在现有技术中通常的ELISA-检测法。
具体实施方式：
在实施例中，应用下面所述的材料：
人血清白蛋白(HSA)：Sigma-Aldrich A3782
HES 130kD：        130/0.5型，由T91SEP制备(Fresenius Kabi)
数据：             Mw：130000±20000D
Mn：               42600D
HES 10kD：         HHH 4-2型，(Fresenius Kabi)
数据：             Mw 9800D
Mn：               3695D
EDC：              Sigma-Aldrich No.16.146-2
(乙基二甲基-氨基丙基-碳二亚胺)
HOBt：             Sigma-Aldrich No.15.726-0
(1-羟基-1H-苯并三唑水合物)
DIG-聚糖测定试剂盒：Roche-Boehringer No.1142 372
下列的实施例1-6描述HSA和二氨基丁烷在具有氧化的还原性端基的HES上的偶联或HSA直接在HES上的偶联。HSA和二氨基丁烷仅是对上述定义的活性物质的举例。实施例7描述低聚核苷酸在HES上的偶联。
实施例1：羟乙基淀粉的还原性端基的选择性氧化：
为选择性氧化羟乙基淀粉(130kD和10kD)的还原性端基，将其溶于最少量的水中，并加入不同量的碘溶液和KOH溶液。
搅拌该混合物，直到证实I2的颜色消失。多次重复该程序，以达到加入大量的碘溶液和KOH溶液。接着将该溶液通过Amberlite IR120Na+型阳离子交换树脂纯化，相对水进行渗析(具有4-6kD排出限值的渗析小管)20小时，并冷冻干燥。
其氧化度总是用Somoyi，N.公开的方法(Method in CarbohydrideChemistry，第1卷(1962)，384-386页)测定。氧化反应记录列于表1。
表1 HES(130kD和10kD)的还原性端基在各种条件下的氧化
  方法   HES(Mn)   碘溶液0.1N   KOH-溶液0.1N   溶剂   反应时间   产率
  氧化(1)HES 130   1g2.4×10-5mol   0.3ml3.0×10-5mol   0.5ml5.0×10-5mol   水4.0ml   4h25℃   30.1％
  氧化(2)HES 130   4g9.4×10-5mol   1.0ml1.0×10-4mol   1.5ml1.5×10-4mol   水6.0ml   25℃过夜   24.8％
  氧化(3)HES 130   5g1.2×10-4mol   1.2ml1.2×10-4mol   1.5ml1.5×10-4mol   水7.5ml   25℃过夜   24.3％
  氧化(4)HES 130   5g1.2×10-4mol   3.0ml3.0×10-4mol   4.5ml4.5×10-4mol   水7.5ml   25℃过夜   60.8％
  氧化(5)HES 130   5g1.2×10-4mol   4.0ml4.0×10-4mol   5ml5.0×10-4mol   水7.5ml   25℃过夜   80.0％
  氧化(6)HES 130   8g1.9×10-4mol   7.0ml7.0×10-4mol   11.5ml1.2×10-3mol   水7.5ml   25℃过夜   88.4％
  氧化(7)HES 130   10g2.4×10-4mol   10ml1.0×10-3mol   20ml2.0×10-3mol   水7.5ml   25℃过夜   100％
  氧化(1)HES 10   5g1.4×10-3mol   2.0ml2.0×10-4mol   2.0ml2.0×10-4mol   水10.0ml   20h25℃   3.0％
  氧化(2)HES 10   5g1.4×10-3mol   3.5ml3.5×10-4mol   4.5ml4.5×10-4mol   水10.0ml   25℃过夜   5.3％
  氧化(3)HES 10   15g4.1×10-3mol   21.0ml2.1×10-3mol   31.0ml3.1×10-3mol   水   25℃过夜   10.5％
  氧化(4)HES 10   8g2.2×10-3mol   83.0ml8.3×10-3mol   180.0ml1.8×10-2mol   水   25℃过夜   80.0％
  氧化(5)HES 10   7g1.9×10-3mol   95.0ml9.5×10-3mol   210.0ml2.1×10-2mol   水   25℃过夜   100.0％
  氧化(6)HES 10   6.4g1.7×10-3mol   50ml5.0×10-3   150ml1.5×10-2   水   25℃过夜   100.0％
下面详细重复表中综述记录中的氧化(6)，HES 10kD：将6.4g HES 10kD(1.7毫摩尔)在反应容器中于搅拌下溶于数毫升的水中。向其中加入50ml的0.1N碘溶液(5.0毫摩尔)和150ml的0.1NKOH溶液(15毫摩尔)。将该混合物在25℃下放置过夜。该混合物经Amberlite IR 120(Na+型)纯化，并相对水渗析(渗析管，纤维素乙酸酯；除去4-6kD)。渗析产物经冷冻干燥(Heraeus-ChristAlpha，烧瓶干燥过夜)。
如表1所示，在碘量从3.0×10-5摩尔提高到1.0×10-3摩尔后，达到了HES 130kD还原性端基的完全氧化(相应产率100％)。
对于HES 10kD的还原性端基的完全氧化需继续提高碘量到大于2.1×10-3摩尔。
实施例2：具有氧化的还原性端基的HES在水相中与HSA的连接：
为进行偶联，将具有氧化的还原性端基的羟乙基淀粉(ox-HES)和HSA完全溶于水中。当溶液透明时，将乙基二甲基-氨基丙基-碳二亚胺(EDC)加到水中溶解。在适度搅拌下经EDC活化后，再进一步加入EDC。需要时用HOBt活化该反应，并且放置过夜。将该产物对蒸馏水渗析15小时以纯化，并接着经冷冻干燥(此后称为方法A)。偶联反应的记录列于表2。
表2具有氧化的还原性端基的HES(130kD和10kD)与HSA在不同条件下的偶联反应(方法A，在HES栏的括号中的数给出按表1的氧化方法)
  方法A   HSA   o×-HES(Mn)   EDC   HOBt   溶剂   活化剂   反应
  偶联Io×-HES 130   300mg4.4×10-6mol   100mg(1)2.4×10-6mol   25mg1.6×10-4mol   100mg7.7×10-4mol   H2O/二噁烷13ml/2ml   1.5h3-4℃   4h25℃
  偶联IIo×-HES 130   100mg1.5×10-6mol   300mg(2)7.0×10-6mol   15mg9.7×10-5mol   100mg7.7×10-4mol   H2O/二噁烷10ml/3ml   1.5h3-4℃   25℃过夜
  偶联IIIo×-HES 130   200mg3.0×10-6mol   3.8g(5)8.9×10-5mol   46.5mg3.0×10-4mol   20mg1.5×10-4mol   H2O/二噁烷10ml/3ml   0h   24h25℃
  偶联IVo×-HES 130   100mg1.5×10-6mol   1.9g(5)4.5×10-5mol   25mg1.6×10-4mol   20mg1.5×10-4mol   水   1.5h3-4℃   25℃过夜
  偶联Vo×-HES 130   200mg3.0×10-6mol   4.3g(5)1.0×10-4mol   100mg6.0×10-4mol   0mg   水   0h   25℃过夜
  偶联VIo×-HES 130   100mg1.5×10-6   130mg(7)3.0×10-5mol   50mg3.0×10-4mol   0mg   水5ml+10ml   0h   5h25℃
  偶联VIIo×-HES 10   100mg1.5×10-6   130mg(7)3.0×10-6mol   200mg3.0×10-4mol   0mg   水5ml+2×10ml   0h   24h25℃
  偶联Io×-HES 10   100mg1.5×10-6mol   300mg(1)8.1×10-5mol   5mg3.0×10-5mol   100mg7.7×10-4mol   H2O/二噁烷13ml/2ml   1.5h3-4℃   25℃过夜
  偶联IIo×-HES 10   70mg1.0×10-6mol   1.0g(2)2.7×10-4mol   15.5mg1.0×10mol   0mg   水   10ml0h   25℃过夜
  偶联IIIo×-HES 10   200mg3.0×10-6mol   3.0g(3)8.1×10-4mol   77.5mg5.0×10-4mol   20mg1.5×10-4mol   水   0h   6h25℃
  偶联IVo×-HES 10   50mg7.4×10-7mol   7.4g(4)2.0×10-3mol   282mg1.5×10-3mol   0mg   水   0h   25℃过夜
  偶联Vo×-HES 10   100mg1.5×10-6mol   103g(6)2.8×10-5mol   93mg5.6×10-4mol   0mg   水4ml   0h   20h25℃
  偶联VIo×-HES 10   100mg1.5×10-6mol   103g(6)2.8×10-5mol   200mg1.2×10-3mol   0mg   水3×5ml   0h   30h25℃
-在60分钟内用滴液漏斗加EDC-溶液。
下面详细说明ox-HES 130kD和HSA之间的偶联反应VII：在圆底烧瓶中将130mg的ox-HES 130kD(氧化度约100％)和100mg的HSA于室温、搅拌中溶于约5ml水中。一旦溶液透明，在各种情况下将溶于5-10ml水中的200mg EDC以3份在1小时内滴入该溶液中。每次加入之间要在室温下搅拌约4小时。24小时反应后，将该混合物相对水渗析(渗析管，纤维素乙酸酯，除去4-6kD)。接着冷冻干燥该产物。
实施例3：在水相中HES直接连接到HSA上：
此反应的原理是基于在HES和蛋白质的氨基之间形成席夫碱，该反应通过席夫碱借助于NaBH4生成相应胺的反应来控制(下面称为方法B)。
为此，将HES完全溶于少许水中。并加入在硼酸盐缓冲液(pH 9.0)溶解的HSA。在该溶液中加入NaBH4并在室温下搅拌。加入另一份HES130kD，接着加入另外的NaBH4。反应结束后，进行所述的渗析和冷冻干燥。
各实验记录列于表3。
表3 HES(130kD和10kD)与HSA在各种条件下的直接偶联(方法B)
Figure A20091020352200261
详细描述是，为了与HES 130kD偶联，将2.0g这种化合物完全溶于水中(约3ml)。再加入50mg的溶于1ml的0.1M硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中的HSA。向此溶液中加入30mg的NaBH4，并在室温下搅拌。18小时后再加入另一份2.0g的HES 130kD，并接着加另外的30mg的NaBH4。在总共100小时的反应时间后，对其进行渗析和冷冻干燥(偶联V，HES 130kD)。
对于与HES 10kD的偶联，将1.4g此种化合物完全溶于水中(约5ml)，再加入50mg的溶于1ml 0.1M的硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中的HSA。向此溶液中加入14mg NaBH4，并在室温下搅拌。18小时后，再加入另一份1.4g的HES 10kD，并接着加另外的14mg的NaBH4。在总共80小时的反应时间后，对其进行渗析和冷冻干燥(偶联I，HES 10kD)。
实施例4：借助GPC对偶联产物的分析：
首先应用凝胶-渗透-色谱(GPC)对反应产物进行分析。
4.1.对GPC，采用FPLC仪器(Pharmacia)，该仪器与HPLC UV检测器相连。此外采用下列条件：
柱：Superose 12HR 10/30(1×30cm)(Pharmacia)
UV检测器：280nm
泵：0.2ml/min
缓冲液：50mM磷酸盐/150mM氯化钠，pH 7.2
在此条件下，HSA-峰通常在63分钟后出现，另外，在约57分钟时测到一小峰，它是来自HSA-二聚物。由GPC得到的色谱图可分析如下：
4.2.图1是ox-HES 130kD在HSA上偶联后的产物大小分布的色谱图(偶联III)。在此偶联方法中，无HOBt-活化也得到很好的结果。在37分钟时测到分明的单宽峰，在45分钟时测到另一小的带，它表明其分子量高于HSA的偶联产物。同时发现痕量未改性的HSA。
图2是ox-HES 130kD在HSA上偶联后的产物大小的分布(偶联IV)。该反应用HOBt活化。结果表明，这种活化使产率下降，可能是有助于副反应的结果。
图3和4表示ox-HES 130kD在HSA上偶联反应期间和反应后的反应产物大小的分布(偶联V)。反应2小时后，未改性的HSA是具有最高浓度的产物，此外，还发现第一个有较高分子量的偶联产物。反应结束后，发现停留时间约35分钟的高浓度的均匀偶联产物。未改性的HSA和其它偶联产物均以较小的浓度存在。
图5表示ox-HES 130kD在HSA上偶联反应期间和反应后的反应产物大小的分布(偶联V)。结果表明，其分子量大于HSA的偶联产物的浓度在反应过程中增加。
最后在图6中表明几乎所有HSA分子均能转变成均匀偶联产物的偶联反应(偶联VII的反应产物)。
4.3.图7表明HES在HSA上直接偶联所得到的分析色谱图(方法B，HES 130kD，偶联V)。在约65分钟得到分明的峰(HSA)。此外，也还检测到了一种偶联产物(约42分钟时的峰)。
实施例5借助SES-PAGE和Western Blot的偶联产物分析：
5.1.PAGE是在十二烷基硫酸钠(SDS)存在下应用Miniprotean II仪器(Biorad公司)和7.5％的丙烯酸酰胺凝胶进行的。电泳是按制造商的规定实施的。按照Blum方法(Elektrophoresis，第8卷，(1997)，93-99页)，该凝胶用银着色，以可目视蛋白质。
聚糖的存在可借助Western-Blot和Roche-Boehringer公司的聚糖-试剂盒来证实。产物用SDS-PAGE分离后，应用Miniprotean II的Blotting仪器，将其转移到硝基纤维素膜上的电泳单元上。接着该膜在仅能将邻位OH基氧化的条件下用高碘酸盐氧化。然后与氨基官能化的异羟基洋地黄毒苷元(Digoxygenin)反应。结合的异羟基洋地黄毒苷元通过结合在碱性磷酸酶上的特异性单克隆抗体来证实。为此，加入磷酸酶的底物(4-硝基-四唑鎓-氯化物/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯)，它产生难溶的蓝-紫色产物。这种产物沉淀在膜上，并使该带可以目视。未改性的HSA和肌酸酶用作负对照，而转铁蛋白作为正对照。
准确的方法程序描述在该试剂盒的附单中。
5.2.图8和9表明银-着色的SDS-PAGE-凝胶(上)的吸收和转移到膜上后相应产物的吸收和聚糖的检测(下)。如图所示，在偶联反应中作为反应产物形成了相对均匀的聚糖，而同时未改性的HSA的浓度下降。
实施例6.可能的副反应的确证
为了弄清副反应是否以具有氧化的还原性端基的HES的自缩合形式产生，制备了下列反应混合物：
表4.为确证副反应的反应混合物
  o×-HES   EDC   HOBt   水   反应时间
  HES 130kD   500mg1.2×10-5mol   15mg7.8×10-5mol   -   5.0ml   30h25℃
  HES 130kD   500mg1.2×10-5mol   15mg7.8×10-5mol   饱和溶液   5.0ml   30h25℃
  HES 10kD   100mg2.7×10-5mol   3.4mg1.8×10-5mol   -   5.0ml   30h25℃
  HES 10kD   100mg2.7×10-5mol   3.4mg1.8×10-5mol   饱和溶液   5.0ml   30h25℃
  HES 130kD   700mg1.6×10-5mol   31mg1.6×10-4mol   -   5.0ml   30h25℃
  HES 130kD   700mg1.6×10-5mol   31mg1.6×10-4mol   饱和溶液   5.0ml   30h25℃
这些实验的目的是为证实在有或无HOBt的存在下HES可能的自缩合发生到何种程度。样品经冷冻干燥和分析。
借助GPC和散射光测量，在数个百分点的测量极限内未发现分子量增大的证据。
实施例7：氧化的HES在DNA上的偶联和偶联产物官能度的分析
反应原理：
反应图示列于图10。在第一步中，胺-HES 12kD3的氨基与SMCC4的N-羟基琥珀酰亚胺基反应生成偶联物5。通过用离心-渗析部件的离心处理，分离未反应的SMCC 4。然后偶联物5的马来酰亚胺基与硫代-DNA 1的巯基反应以形成所需的产物6。在6中的粗体标出的区域仅是间隔基，并可以是任何形式。
偶联物6的生物活性的检测是由通过限制酶EcoR1的分裂进行的。限制酶仅切断具有完整识别序列的双链DNA。
DNA：
应用由MWG生物技术公司，Ebersberg，合成的双链DNA，单链的序列是：
SEQ ID NO.1：5’-GTAGAGACAGGAGGCAGCAGTTGAATTCGCAGGGT-GAGTAGCAGTAGAGC-3’；
SEQ ID NO.2：5’-G C T C T A C T G C T A C T C A C C C T G C G A A T T-CAACTGCTGCCTCCTGTCTCTAC-3’；
它是用5′硫羟C6 S-S通过MWG改性的(参看图10)。
将两种DNA单链溶于二次蒸馏水中，其浓度均为2μg/μl，并以1∶1在96℃下杂交成浓度为2μg/μl的双链硫代-DNA 1。
产物分析：
该分析是在4％琼脂糖凝胶中通过凝胶电脉进行的，用含有45mMTris-硼酸盐、1mM EDTA、pH 8.0的TBE-洗脱缓冲液，每1μg DNA，有每100ml凝胶、50μg溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓。其图片是在312nm用CCD-系统模块(I NTAS成象仪，
Figure A20091020352200301
D)和UV-透照仪UVT-20S/M/L(Herolab公司，Wiesloch，D)摄取的。
从反应混合物中取出1μl(1μg DNA)，并用1μl(20U)EcoR1-限制酶(New England Biolabs公司，Schwalbach/Taunus，D)、1μl反应缓冲液(50mM氯化钠、100mM Tris-HCl、10mM氯化镁、0.025％Triton X-100，pH 7.5，New England Biolabs)和7μl二次蒸馏水在37℃下酶解3小时。
HES的改性：
将平均摩尔重量为12000g/摩尔的HES 12KD(Fresenius，Charge2540 SR 2.5P)用碘溶液氧化成Oxo-HES12KD 2的氧化按DE 19628705所公开的方法进行。
1，4-二氨基丁烷与Oxo-HES12KD 2的反应：
将1.44g(0.12mmol)的Oxo-HES12KD 2溶于1ml无水的二甲亚砜(DMSO)中，在氮气下滴加到由1.5ml(1.50mmol)的1，4-二氨基丁烷的溶液中，并在40℃下搅拌19小时。再将该反应混合物加到由80ml乙醇和80ml丙酮组成的混合物中。所形成的沉淀经离心分离，并加到40ml水中。将该溶液相对水渗析4天(SnakeSkin渗析管，截断值3.5KD，Perbio Seience Dentschland公司，Bonn，D)，并接着冷冻干燥。产率为80％(1.06g)的氨基-HES 12KD 3。
氨基-HES12KD 3在硫代-DNA 1上的偶联：
将溶于50μl无水DMSO中的1mg SMCC 4加到在由10mM磷酸钠和150mM氯化钠组成的pH为7.44的缓冲液中的400μl浓度为10mg/ml的氨基-HES12KD 3的溶液中，将该混合物在室温下处理80分钟及在46℃下处理10分钟。然后离心该混合物，取出上清液并重新离心。从上清液中取出200μl，并用MICROCON YM-3(Amicon，Millipore公司，Eschborn，D)离心渗析部件在14000g下离心45分钟。加入400μl由10mM磷酸钠和150mM氯化钠组成的pH为7.44的缓冲液后，再离心45分钟，再加400μl缓冲液，并再离心60分钟。将在渗析部件中保留的偶联物溶液量补至50μl。将10μl该溶液加到10μl硫代-DNA溶液1中，并在室温下反应14小时。取1μl进行分析。结果列于图11的带2和3中。
上述实验的反应条件和按变化的反应条件所作的实验的反应条件综述于表1，结果列于图11。
结果综述：
对下列条件进行研究：
1.SMCC的量：1mg(带2、6、10、14)或5.6mg(带4、8、12、16)；
2.与硫代-DNA 1的反应温度：
室温(带2、4、6、8)或37℃(带10、12、14、16)；
3.缓冲条件：
10mM磷酸盐、150mM NaCl，无EDTA，pH 7.44(带2、4、10、12)；或
100mM磷酸盐、150mM NaCl+50mM EDTA，pH 7.23(带6、8、14、16)
在图11中，带2-18表示借助SMCC进行的氨基-HES12KD 3在硫代-DNA 1上的8个偶联实验的结果。对此表示的是直接由反应或反应后和接着剪切DNA得到的结果。在带1中是各种对比-DNA的混合物作为长度标记载上的，带18和19表示硫代-DNA 1或切断的硫代-DNA 1。除了未起反应的硫代-DNA 1外，所有实验还表明较高质量的偶联产物(带2、4、6、8、10、12、14、16)。因为HES12KD是不同大小分子的混合物，所以偶联产物也显示出摩尔重量的分布。所有偶联产物均含完整的DNA，因为它们能由EcoR 1完全消化。这表现在剪切后相应扩散带的几乎完全消失(带3、5、7、9、11、13、15、17)。
表1.氨基-HES12KD 3在硫代-DNA 1上的偶联的反应条件
  带   实验   温度[℃]   SMCC[mg]   DNA   HES12KD   缓冲液
  1   标记物
  2   19A1   RT   1   硫代-DNA   氨基-HES12KD   7.44，10mM
  3   切断
  4   19B1   RT   5.6   硫代-DNA   氨基-HES12KD   7.44，10mM
  5   切断
  6   19C1   RT   1   硫代-DNA   氨基-HES12KD   7.23，100mM
  7   切断
  8   19D1   RT   5.6   硫代-DNA   氨基-HES12KD   7.23，100mM
  9   切断
  10   19A2   37℃   1   硫代-DNA   氨基-HES12KD   7.44，10mM
  11   切断
  12   19B2   37℃   5.6   硫代-DNA   氨基-HES12KD   7.44，10mM
  13   切断
  14   19C2   37℃   1   硫代-DNA   氨基-HES12KD   7.23，100mM
  15   切断
  16   19D2   37℃   5.6   硫代-DNA   氨基-HES12KD   7.23，100mM
  17   切断
  18   硫代-DNA
  19   切断

Claims (15)

1.制备核酸偶联物的方法，包括在反应介质中通过羟烷基淀粉(HAS)的还原性端基使其和核酸偶联，其中该反应介质是水或含至少10重量％水的水与有机溶剂的混合物。
2.权利要求1的方法，其中HAS直接或通过连接基团连接到核酸上。
3.权利要求1的方法，其中所述核酸为D-或L-核酸。
4.权利要求3的方法，其中所述核酸为D-DNA、L-DNA、D-RNA或L-RNA。
5.权利要求1的方法，其中，在第一步中，将氨基或巯基作为活性基团引入核酸中。
6.权利要求5的方法，其中，在第一步中，将氨基作为活性基团引入核酸中。
7.权利要求6的方法，其中，通过HAS与带有氨基的核酸之间形成席夫碱中间体进行偶联。
8权利要求7的方法，其中的中间体被还原成亚甲基氨基。
9.权利要求1的方法，其中HAS为羟乙基淀粉。
10.权利要求9的方法，其中羟乙基淀粉的平均分子量为1-300kDa。
11.权利要求9的方法，其中羟乙基淀粉的平均分子量为5-200kDa。
12.权利要求9的方法，其中羟乙基淀粉的摩尔取代度为0.1-0.8，C2∶C6取代的比例为2-20，均以羟乙基计。
13.权利要求1的方法，其中在与核酸偶联前将还原性端基选择性氧化。
14.权利要求13的方法，其中HAS的经氧化的还原性端基与核酸的氨基反应以形成酰胺。
15.一种HAS-核酸偶联物，其可通过权利要求1的方法得到。
16.一种药物组合物，其中含有权利要求15的偶联物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108743963A (zh) * 2018-06-14 2018-11-06 华中科技大学 一种含有四价铂的抗癌偶联物及其制备方法和应用
CN114617957A (zh) * 2022-03-10 2022-06-14 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 羟乙基淀粉血红蛋白偶联物及其制备方法与应用

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002039951A2 (en) * 2000-11-15 2002-05-23 Globe Immune, Inc. Yeast-dentritic cell vaccines and uses thereof
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
DE10129369C1 (de) * 2001-06-21 2003-03-06 Fresenius Kabi De Gmbh Wasserlösliches, einen Aminozucker aufweisendes Antibiotikum in Form eines Pol ysaccharid-Konjugats
JP2005501930A (ja) 2001-08-22 2005-01-20 スピラモール パレンテラル コロイズ ゲー・エム・ベー・ハー 哺乳動物の外科的若しくは治療的な処置方法、又は診断方法に使用、特に血漿増量剤に使用をする高度分枝アミロペクチン
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
GB0218830D0 (en) * 2002-08-13 2002-09-18 Syngenix Ltd Anaesthetic conjugate
EP1400533A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-24 Fresenius Kabi Deutschland GmbH HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
BR0314106A (pt) * 2002-09-11 2005-07-19 Fresenius Kabi De Gmbh Polipeptìdeos hasilados, especialmente eritropoietina hasilada
DE10242076A1 (de) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh HAS-Allergen-Konjugate
AU2003273413A1 (en) 2002-10-08 2004-05-04 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
DE10256558A1 (de) * 2002-12-04 2004-09-16 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Ester von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
DE10324710A1 (de) * 2003-05-30 2004-12-16 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Stärkederivatkomplexe
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
HRP20110056T1 (hr) * 2003-08-08 2011-02-28 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Konjugati hidroksialkil škroba i g-csf
EP1653991A2 (en) * 2003-08-08 2006-05-10 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group
KR101154343B1 (ko) * 2003-08-08 2012-07-05 프레제니우스 카비 도이치란트 게엠베하 히드록시알킬 스타치 및 ｇ-ｃｓｆ의 컨쥬게이트
JP2007501870A (ja) * 2003-08-08 2007-02-01 フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ヒドロキシアルキルデンプンとｇ−ｃｓｆの複合体
ES2397241T3 (es) 2004-01-21 2013-03-05 Novo Nordisk Health Care Ag Conjugación de péptidos mediante transglutaminasa
JP5193468B2 (ja) 2004-02-09 2013-05-08 ノクソン・フアルマ・アクチエンゲゼルシヤフト 多糖とポリヌクレオチドの複合体を製造する方法
EP1732609B1 (en) * 2004-03-11 2012-07-11 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
EP1758608A2 (en) * 2004-03-11 2007-03-07 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyethyl starch and erythropoietin
SG151261A1 (en) 2004-03-11 2009-04-30 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
EP1765411B2 (en) * 2004-06-30 2017-10-11 Nektar Therapeutics Polymer-factor ix moiety conjugates
CA2598528A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Production of bioactive glycoproteins from inactive starting material
US7597924B2 (en) * 2005-08-18 2009-10-06 Boston Scientific Scimed, Inc. Surface modification of ePTFE and implants using the same
EP1762250A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
DE102006020035A1 (de) * 2006-04-26 2007-10-31 B. Braun Melsungen Ag Herstellung und Verwendung von Poly(hydroxyethylstärke)chitin- und Poly(Carboxymethylstärke)chitin-Verbindungen
JP5094850B2 (ja) 2006-05-31 2012-12-12 ジェンザイム コーポレーション 酵素活性の促進のための多糖の使用
CN101199856B (zh) * 2006-12-15 2011-04-20 天津协和生物科技发展有限公司 一种携氧抗休克药物
EP2070951A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
GB0811743D0 (en) * 2008-06-26 2008-07-30 Hemosol Biopharma Inc Composition
UA118536C2 (uk) 2008-07-23 2019-02-11 Амбркс, Інк. Модифікований поліпептид бичачого гранулоцитарного колонієстимулювального фактора та його застосування
US9433684B2 (en) 2008-08-19 2016-09-06 Nektar Therapeutics Conjugates of small-interfering nucleic acids
EP2370105B1 (de) * 2008-12-06 2016-03-16 B. Braun Melsungen AG Verbindungen bestehend aus einem Glykosaminoglykan und einer Stärke zum Transport eines kovalent gebundenen Arzneimittelwirkstoffes oder Fluoreszenzmarkers
US8871922B2 (en) * 2009-03-20 2014-10-28 Fpinnovations Cellulose materials with novel properties
KR20110137788A (ko) * 2009-03-31 2011-12-23 베. 브라운 멜중엔 악티엔게젤샤프트 아미노화된 다당류의 결합생성물
NZ600363A (en) 2009-12-21 2014-07-25 Ambrx Inc Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
EP2516454A4 (en) 2009-12-21 2013-05-22 Ambrx Inc MODIFIED BOVINE SOMATOTROPIN POLYPEPTIDES AND ITS USES
US20140088298A9 (en) * 2010-07-09 2014-03-27 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation
US20140073778A9 (en) * 2010-07-09 2014-03-13 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
MX2014000031A (es) 2011-07-01 2014-07-09 Bayer Ip Gmbh Polipeptidos de fusion de relaxina y usos de los mismos.
CN102911276A (zh) * 2011-08-03 2013-02-06 四川科伦药业股份有限公司 一种处理羟乙基淀粉中内毒素的方法
CN103717614A (zh) 2011-08-09 2014-04-09 普罗法尔马封闭式股份公司 重组蛋白质的衍生物、粒细胞集落刺激因子的同多聚体及其制备方法
WO2013021056A1 (en) * 2011-08-10 2013-02-14 Ludwig-Maximilians-Universität München Method for the controlled intracellular delivery of nucleic acids
WO2013113503A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and an oligonucleotide
EP2712629A1 (en) 2012-09-28 2014-04-02 B. Braun Melsungen AG Colloid bonded Medicinal Compounds
EP2712868A1 (en) 2012-09-28 2014-04-02 B. Braun Melsungen AG 5-Fluoruoracil Derivatives
CN103768081B (zh) * 2014-01-22 2016-10-12 东北师范大学 一种羟乙基淀粉-阿霉素键合药的制备方法
WO2015132724A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Pfizer Inc. Improved muteins of clotting factor viii
AU2015323769A1 (en) 2014-09-26 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Stabilized adrenomedullin derivatives and use thereof
CA3143584A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Bayer Aktiengesellschaft Adrenomedullin-analogues for long-term stabilization and their use
CN112891555B (zh) * 2021-01-31 2024-04-02 华中科技大学 一种羟乙基淀粉接枝二氢卟吩e6的偶联物、其制备和应用
AR131133A1 (es) 2023-05-24 2025-02-19 Ambrx Inc INTERFERÓN l BOVINO PEGILADO Y MÉTODOS DE USO DEL MISMO

Family Cites Families (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE279486C (zh)
US3191291A (en) 1959-01-21 1965-06-29 Continental Can Co Art of producing very thin steel and like sheets in wide strips
DE2233977A1 (de) 1971-07-14 1973-02-01 Unilever Nv Verfahren zur herstellung oxydierter kohlenhydrate
GB1419080A (en) 1972-12-29 1975-12-24 Cheminova As Chemical compounds having juvenile hormone activity
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4125492A (en) 1974-05-31 1978-11-14 Pedro Cuatrecasas Affinity chromatography of vibrio cholerae enterotoxin-ganglioside polysaccharide and the biological effects of ganglioside-containing soluble polymers
US4061736A (en) 1975-02-02 1977-12-06 Alza Corporation Pharmaceutically acceptable intramolecularly cross-linked, stromal-free hemoglobin
US4001200A (en) 1975-02-27 1977-01-04 Alza Corporation Novel polymerized, cross-linked, stromal-free hemoglobin
US4001401A (en) 1975-02-02 1977-01-04 Alza Corporation Blood substitute and blood plasma expander comprising polyhemoglobin
US4053590A (en) 1975-02-27 1977-10-11 Alza Corporation Compositions of matter comprising macromolecular hemoglobin
CA1055932A (en) 1975-10-22 1979-06-05 Hematech Inc. Blood substitute based on hemoglobin
DE2616086C2 (de) 1976-04-13 1986-04-03 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Substanz zur Verwendung in einem kolloidalen Blutvolumenersatzmittel aus Hydroxyethylstärke und Hämoglobin
GB1578348A (en) 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
FR2378094A2 (fr) 1977-01-24 1978-08-18 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux reactifs biologiques constitues par des supports solides sur lesquels sont couples des composes organiques comportant un residu glucidique
EP0019403B1 (en) 1979-05-10 1985-07-31 American Hospital Supply Corporation Hydroxyalkyl-starch drug carrier
DE3029307A1 (de) 1980-08-01 1982-03-04 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Haemoglobin enthaltendes blutersatzmittel
JPS57206622A (en) 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
FI82266C (fi) 1982-10-19 1991-02-11 Cetus Corp Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein.
ATE78293T1 (de) 1983-05-27 1992-08-15 Texas A & M Univ Sys Verfahren zur herstellung eines rekombinanten baculovirus-expressionsvektors.
IE57931B1 (en) 1983-10-11 1993-05-19 Fidia Spa Hyaluronic acid fractions having pharmaceutical activity,methods for preparation thereof,and pharmaceutical compositions containing the same
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
IL77081A (en) 1984-12-04 1999-10-28 Genetics Inst Dna sequence encoding human erythropoietin process for the preparation thereof and a pharmaceutical composition of human erythropoietin
US4667016A (en) 1985-06-20 1987-05-19 Kirin-Amgen, Inc. Erythropoietin purification
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4863964A (en) * 1985-07-02 1989-09-05 Biomedical Frontiers, Inc. Method for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid
US5217998A (en) 1985-07-02 1993-06-08 Biomedical Frontiers, Inc. Composition for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid
GB8610551D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Hoffmann La Roche Polypeptide & protein derivatives
IT1203814B (it) 1986-06-30 1989-02-23 Fidia Farmaceutici Esteri dell'acido alginico
FR2600894B1 (fr) 1986-07-02 1989-01-13 Centre Nat Rech Scient Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
US5214132A (en) 1986-12-23 1993-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5362853A (en) 1986-12-23 1994-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
EP0307827A3 (en) 1987-09-15 1989-12-27 Kuraray Co., Ltd. Novel macromolecular complexes, process for producing same and medicinal use of such complexes
IL84252A (en) * 1987-10-23 1994-02-27 Yissum Res Dev Co Phospholipase inhibiting compositions
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
JPH01223473A (ja) * 1988-03-02 1989-09-06 Fuji Photo Film Co Ltd 平版印刷版の不感脂化処理方法
DK110188D0 (da) 1988-03-02 1988-03-02 Claus Selch Larsen High molecular weight prodrug derivatives of antiinflammatory drugs
FR2630329B1 (fr) 1988-04-20 1991-07-05 Merieux Inst Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
IT1219942B (it) 1988-05-13 1990-05-24 Fidia Farmaceutici Esteri polisaccaridici
US4900780A (en) * 1988-05-25 1990-02-13 Masonic Medical Research Laboratory Acellular resuscitative fluid
US4925677A (en) * 1988-08-31 1990-05-15 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
US5420105A (en) * 1988-09-23 1995-05-30 Gustavson; Linda M. Polymeric carriers for non-covalent drug conjugation
US5218092A (en) 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
DE3836600A1 (de) 1988-10-27 1990-05-03 Wolff Walsrode Ag Kohlensaeureester von polysacchariden und verfahren zu ihrer herstellung
US5003022A (en) * 1989-02-10 1991-03-26 Penford Products Company Starch graft polymers
US6261800B1 (en) 1989-05-05 2001-07-17 Genentech, Inc. Luteinizing hormone/choriogonadotropin (LH/CG) receptor
DE19975071I2 (de) 1989-06-16 2000-02-03 Fresenius Ag Hydroxyethylstaerke als Plasmaexpander Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung als kolloidales Plasmaersatzmittel
JP2896580B2 (ja) 1989-08-25 1999-05-31 チッソ株式会社 アミロース―リゾチームハイブリッドと活性化糖およびその製造法
WO1991005867A1 (en) 1989-10-13 1991-05-02 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
US5169784A (en) 1990-09-17 1992-12-08 The Texas A & M University System Baculovirus dual promoter expression vector
JPH04199065A (ja) * 1990-11-29 1992-07-20 Fuji Photo Film Co Ltd 電子写真式製版用平版印刷原版および端面処理剤
DK130991D0 (da) 1991-07-04 1991-07-04 Immunodex K S Polymere konjugater
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
DE4130807A1 (de) 1991-09-17 1993-03-18 Wolff Walsrode Ag Verfahren zur herstellung von polysaccharidcarbonaten
US6172208B1 (en) * 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
GB2270920B (en) * 1992-09-25 1997-04-02 Univ Keele Alginate-bioactive agent conjugates
JPH06167837A (ja) * 1992-11-27 1994-06-14 Fuji Photo Film Co Ltd 平版印刷版製造方法
JPH08504210A (ja) * 1992-12-07 1996-05-07 マガイニン ファーマシューティカルズ，インク． 結合生物活性ペプチドを使用した敗血症性ショックの治療
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
EP0601417A3 (de) 1992-12-11 1998-07-01 Hoechst Aktiengesellschaft Physiologisch verträglicher und physiologisch abbaubarer, Kohlenhydratrezeptorblocker auf Polymerbasis, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
NZ262349A (en) 1993-03-16 1996-05-28 Hemosol Inc Chemically modifying haemoglobin by crosslinking with a polyaldehyde produced by ring opening oxidation of a saccharide; for use in a blood substitute
CN1057534C (zh) 1993-08-17 2000-10-18 柯瑞英-艾格公司 促红细胞生成素类似物
US5876980A (en) 1995-04-11 1999-03-02 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of oligosaccharides
WO1996040662A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
US5736533A (en) * 1995-06-07 1998-04-07 Neose Technologies, Inc. Bacterial inhibition with an oligosaccharide compound
US5981507A (en) * 1995-12-14 1999-11-09 Advanced Magnetics, Inc. Polymeric carriers linked to nucleotide analogues via a phosphoramide bond
US5723589A (en) 1995-12-21 1998-03-03 Icn Pharmaceuticals Carbohydrate conjugated bio-active compounds
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
DE19628705A1 (de) 1996-07-08 1998-01-15 Fresenius Ag Neue Sauerstoff-Transport-Mittel, diese enthaltende Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung als Blutersatzstoffe
US5770645A (en) * 1996-08-02 1998-06-23 Duke University Medical Center Polymers for delivering nitric oxide in vivo
WO1998020905A2 (en) * 1996-11-08 1998-05-22 Biomedical Frontiers, Inc. Treatment of iron overload disorders
US6011008A (en) 1997-01-08 2000-01-04 Yissum Research Developement Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Conjugates of biologically active substances
US5952347A (en) 1997-03-13 1999-09-14 Merck & Co., Inc. Quinoline leukotriene antagonists
US6299881B1 (en) * 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
ATE317703T1 (de) * 1997-06-12 2006-03-15 Innovata Plc Polymer-wirkstoff-konjugate zur behandlung von krebs
CA2299271C (en) 1997-08-07 2009-02-03 University Of Utah Prodrugs and conjugates of thiol- and selenol- containing compounds and methods of use thereof
US6875594B2 (en) 1997-11-13 2005-04-05 The Rockefeller University Methods of ligating expressed proteins
DE19808079A1 (de) 1998-02-20 1999-08-26 Schering Ag Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Mittel
CA2233725A1 (en) * 1998-03-31 1999-09-30 Hemosol Inc. Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes
US6261594B1 (en) * 1998-11-25 2001-07-17 The University Of Akron Chitosan-based nitric oxide donor compositions
EP1035137A1 (en) 1999-03-12 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Method for the reductive amination of polysaccharides
WO2000078355A2 (en) * 1999-06-18 2000-12-28 Ml Laboratories Plc Biologically active materials
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US6555660B2 (en) 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6749865B2 (en) * 2000-02-15 2004-06-15 Genzyme Corporation Modification of biopolymers for improved drug delivery
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
US6417347B1 (en) * 2000-08-24 2002-07-09 Scimed Life Systems, Inc. High yield S-nitrosylation process
DE10041541A1 (de) 2000-08-24 2002-03-14 Michael Duchene Rekombinante Allergene aus der Motte Plodia interpunctella
DE10105921A1 (de) 2001-02-09 2002-08-14 Braun Melsungen Ag An Kolloide gebundene Arzneiwirkstoffe
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
DE10126158A1 (de) 2001-05-30 2002-12-12 Novira Chem Gmbh Eine Methode zur Synthese von Gemischen einfach aktivierter und nicht aktivierter Polyoxyalkylene zur Modifizierung von Proteinen
DE10129369C1 (de) 2001-06-21 2003-03-06 Fresenius Kabi De Gmbh Wasserlösliches, einen Aminozucker aufweisendes Antibiotikum in Form eines Pol ysaccharid-Konjugats
DE10135694A1 (de) 2001-07-21 2003-02-06 Supramol Parenteral Colloids Amphiphile Stärke-und Hydroxyethylstärke-Konjugate
US7125843B2 (en) 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
US7179617B2 (en) 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US6375846B1 (en) 2001-11-01 2002-04-23 Harry Wellington Jarrett Cyanogen bromide-activation of hydroxyls on silica for high pressure affinity chromatography
DE10155098A1 (de) 2001-11-09 2003-05-22 Supramol Parenteral Colloids Mittel zur Prävention von mykotischen Kontaminationen bei der Zell- und Gewebekultur bakteriellen, pflanzlichen, animalischen und humanen Ursprungs, bestehend aus Polyen-Makrolid-Konjugaten mit Polysacchariden
DE10207072A1 (de) 2002-02-20 2003-08-28 Supramol Parenteral Colloids Stärkederivate, ihre Konjugate und Verfahren zur Herstellung derselben
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10217994A1 (de) 2002-04-23 2003-11-06 Supramol Parenteral Colloids Konjugate von hyperverzweigten Polysacchariden
US20040101546A1 (en) 2002-11-26 2004-05-27 Gorman Anne Jessica Hemostatic wound dressing containing aldehyde-modified polysaccharide and hemostatic agents
EP1400533A1 (en) 2002-09-11 2004-03-24 Fresenius Kabi Deutschland GmbH HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
BR0314106A (pt) 2002-09-11 2005-07-19 Fresenius Kabi De Gmbh Polipeptìdeos hasilados, especialmente eritropoietina hasilada
DE10254745A1 (de) 2002-11-23 2004-06-03 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Imidazolide von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
DE10256558A1 (de) 2002-12-04 2004-09-16 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Ester von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
JP2009093397A (ja) * 2007-10-09 2009-04-30 Panasonic Corp タッチパネル及びこれを用いた入力装置

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108743963A (zh) * 2018-06-14 2018-11-06 华中科技大学 一种含有四价铂的抗癌偶联物及其制备方法和应用
CN114617957A (zh) * 2022-03-10 2022-06-14 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 羟乙基淀粉血红蛋白偶联物及其制备方法与应用
CN114617957B (zh) * 2022-03-10 2024-01-16 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 羟乙基淀粉血红蛋白偶联物及其制备方法与应用

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ATE529134T1 (de) 2011-11-15
CN1498115A (zh) 2004-05-19
DE10112825A1 (de) 2002-10-02
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WO2002080979A2 (de) 2002-10-17

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