KR20030046411A - '위'-천연 화학적 라이게이션 - Google Patents

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KR20030046411A
KR20030046411A KR10-2003-7002085A KR20037002085A KR20030046411A KR 20030046411 A KR20030046411 A KR 20030046411A KR 20037002085 A KR20037002085 A KR 20037002085A KR 20030046411 A KR20030046411 A KR 20030046411A
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파올로 보티
제임즈 에이. 브래드번
시아-윤 첸
소냐 크레스맨
스티븐 비.에이치. 켄트
거드 지. 코첸도에르페르
도날드 더블유. 로우
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그리폰 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 아미드 결합을 통해 더 넓은 범위의 펩티드, 폴리펩티드, 다른 폴리머 및 다른 분자의 천연 화학적 라이게이션 기술을 확장하기 위한 방법 및 조성물에 관련된다. 본 발명은 나아가 이러한 단백질 및 유도된 단백질에 대한 방법 및 사용을 제공한다. 본 발명은 임의적으로 폴리머-변경된, 합성 생물활성 단백질, 및 이러한 단백질을 함유한 약제학적 조성물의 합성의 이용에 특히 적당하다.

Description

'위'-천연 화학적 라이게이션{'Pseudo'-Native Chemical Ligation}
지난 30년간, 의학적 관심은 질병의 치료를 위한 치료제로서 자연적으로 생산되는 단백질을 이용하는 가능성으로 점점 변화해 왔다.
재조합 DNA 기술은 세균 및 다른 숙주 세포에서 생산될 수 있는 광대한 양 때문에 많은 폴리펩티드 및 단백질의 상업적 생산을 위한 1차적 방법이 되었다. 재조합 단백질 생산은 원하는 외인성 단백질을 암호화하는 DNA로 숙주 세포를 트랜스펙션 또는 트랜스포메이션 시키는 것 및 재조합 단백질의 발현을 유리하게 하는 조건하에서 세포를 성장시키는 것을 포함한다. E.coli 및 효모는 높은 농도로 재조합단백질을 생산하도록 제작될 수 있기 때문에 숙주로서 유리하다 (미국 특허 제 5,756,672 (Builderet al.) 참조).
수많은 미국 특허가 재조합-DNA-암호화 단백질의 일반 세균 발현에 관하여 발행되었다 (예를 들어, 미국 특허 제 4,565,785 호; 제 4,673,641 호; 제 4,738,921 호; 제 4,795,705 호; 제 4,710,473 호 참조). 불행하게도, 재조합 DNA 기술은 예외없이 성공적인 것은 아니다. 몇몇 조건 하에서, 세균성 숙주로부터 대량으로 발현되는 어떤 이형 단백질은 조밀한 집괴로 세포내에 침전되는데, 이는 위상차 현미경 하에서 세포의 범주 내에 밝은 점으로서 인정된다. 침전된 단백질의 이러한 집괴는 "광굴절 소체"로서 지칭되고, 전체 세포 단백질의 유의한 부분을 구성할 수 있다 (Bremset al.,Biochemistry (1985) 24:7662).
이 소체로부터 단백질의 회복은, 세포 내에 담겨진 단백질을 품고 있는 세포성 물질 및 단백질로부터 이를 분리하는 방법 및 봉입체 (inclusion body) 단백질을 생물학적으로 활성인 형태로 회복하는 방법과 같은, 수많은 문제를 나타내었다. 광굴절 소체에 대한 일반 리뷰 논문을 위해, Marston, 상기; Mitraki and King, Bio/Technology, 7: 690 (1989); Marston and Hartley, Methods in Enzymol., 182: 264-276 (1990); Wetzel, "Protein Aggregation In Vivo: Bcaterial Inclusion Bodies and Mammalian Amyloid", in Stability of Protein Pharmaceuticals: In Vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization, Ahern and Manning (eds.) (Plenum Press, 1991); 및 Wetzel, "Enhanced Folding and Stabilization of Protein by Suppression of Aggregation In Vitro and In Vivo",in Protein Engineering--A Practical Approach, Rees, A.R.et al.(eds.) (IRL Press at Oxford University Press, Oxford, 1991)을 참조한다. 그러므로 필요는 생산하는 생물 활성 단백질의 대안적 방법을 위해 존재한다.
단백질의 재조합 생산의 한 대안은 단백질을 합성하는데 유기 화학의 원칙의 이용을 포함한다. 단백질의 화학적 합성을 위한 현존하는 방법은 순차적인 고체상 합성 및, 용액 또는 고체상에서의 절편 농축을 포함한다. Merrifield의 전통적인 순차적 고체상 합성은 원하는 펩티드 사슬의 카르복시-말단 아미노산에 상응하는 아미노산을 한 고체 지지물에 공유적으로 연결시키는 것 및 활성화된 카르복실기를 갖는 활성화된 아미노산 유도체의 순차적인 커플링에 의해 아미노 말단 쪽으로 폴리펩티드 사슬을 연장시키는 것을 포함한다. 완전히 보호된 고체상 결합 펩티드 사슬의 조립 완료 후, 펩티드-고체상 공유 부착은 적당한 화학법으로 절단하고 보호 기를 제거하여 폴리펩티드를 얻는다.
불행하게도 순차적 고체상 합성 방법에는, 각 주기에서 커플링 및 탈보호 단계에서의 불완전한 반응으로부터 생기는 산물에 의한 고체-상 결합의 형성을 포함하는 다수의 단점이 있다. 펩티드 사슬이 길어질수록 명확하게 정의된 고-순도의 산물을 얻기가 힘들어진다. 이 경로에 의한 단백질 및 큰 폴리펩티드의 합성은 시간이 걸리고 힘든 작업이다.
고체상 절편 농축 접근법 (단편 농축으로도 공지됨)은 고체상 순차적 합성 방법을 통한 긴 폴리펩티드의 획득에서의 어려움을 극복하도록 디자인되었다. 단편 농축 방법은 고체상 순차적 방법에 의한 여러 펩티드 단편의 준비 후, 고체상으로부터의 절단 및 최대한 보호된 이들 단편의 정제를 포함한다. 보호된 단편은, 고체상에 결합된 최초의 단편에 하나씩 농축된다. 그러나, 종종 고체상 단편 농축의 많은 단계에서 기술적 어려움과 조우한다. E. Atgherton,et al.,"Solid Phase Fragment Condensation -The Problems", in Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis 11-25 (R. Epton,et al. 1990)를 참조한다. 예를 들어, 원치 않는 라이게이션 반응을 차단하는 단편 상의 보호 기의 사용은 빈번하게 보호되는 단편의 가용성을 부족하게 만들어, 카르복실기의 효과적인 활성화를 방해한다. 보호된 단편의 제한된 가용성은 또한 보호된 단편의 정제를 방해할 수 있다. K. Akajiet al.,Chem,. Pharm, Bull. (Tokyo) 33:184-102 (1985)를 참조한다. 보호된 단편은 순도 및 공유 구조에 관하여 특성 결정하기가 어렵고, 고해상도 분석적 ESMS (전자 분무 질량 분석법)를 받을 수 없다 (전하에 기초됨). 각 활성화된 펩티드 단편의 C-말단 잔기의 라세미화 또한, 글리신 잔기에서 라이게이션이 수행된 경우를 제외하면, 하나의 문제이다. 더욱이, 완전히 집합된 고체상 결합 폴리펩티드의 고체상으로부터의 절단 및 보호기의 제거는 완전히 집합된 폴리펩티드의 분해를 일으키는 엄한 화학적 절차 및 긴 반응 시간을 필요로 할 수 있다.
단편 농축은 고체상에서 보다는 용액 내에서 행할 수 있다. H. Muramatsuet al.,Bichem. and Biophys. Res. Commn. 203(2):1131-1139 (1994)를 참조한다. 그러나, 용액 내에서의 단편 농축은 라이게이션에 앞선 단편의 정제는 물론이고 다수의 원치 않는 부반응을 막는 상이한 측쇄 작용기의 범위 상에 보호기의 사용을 필요로 한다. 더욱이, 용액 내에서의 라이게이션은 용이한 정제 및 고체상 라이게이션으로 얻어진 세척 단계를 허용하지 않는다. 나아가, 보호된 펩티드 단편 및 보호된 펩티드 중간 반응 산물의 용해성에 관한 제한은 더욱 심하다.
펩티드 단편의 화학적 라이게이션은 최대한 보호된 펩티드와 빈번하게 조우하는 용해성 문제를 극복하기 위해 탐구되었다. 화학적 라이게이션은 제 1 화학 성분과 제 2 화학 성분간의 선택적 공유 연결의 형성을 포함한다. 제 1 및 제 2 성분상에 존재하는 유일하고, 상호 반응적인 작용기는 라이게이션 반응을 화학선택적으로 만드는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 및 폴리펩티드의 화학적 라이게이션은 상용성의 유일하고, 상호-반응적인 C-말단 및 N-말단 아미노산 잔기를 낳는 펩티드 또는 폴리펩티드의 화학선택적 반응을 포함한다. 여러 상이한 화학법들은, 예를 들어, 천연 화학적 라이게이션 (Dawson,et al., Science(1994) 266:776-779; Kent,et al.,WO 96/34878; Kent,et al.,WO 98/28434), 옥심 형성 화학적 라이게이션 (Rose,et al., J. Amer. Chem. Soc.(1994) 116:30-34), 티오에스테르 형성 라이게이션 (Schnolzer,et al., Science(1992) 256:221-225), 티오에테르 형성 라이게이션 (Englebretsen,et al., Tet, Letts.(1995) 26(48):8871-8874), 히드라존 형성 라이게이션 (Gaertner,et al., Bioconj. Chem.(1994) 5(4):333-338), 및 티아졸리딘 형성 라이게이션 및 옥사졸리딘 형성 라이게이션 (Zhang,et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(1998) 95(16): 9184-9189; Tamet al.,WO 95/00846; 미국 특허 제 5,589,356)을 포함하는 목적으로 또는 다른 방법 (Yan. L.Z. and Dawson, P.E., "Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization",J. Am.Chem. Soc.2001, 123, 526-533 (참고문헌으로서 여기 수록); Gieselnanet al.,Org. Lett. 2001 3(9):1331-1334; Saxon, E.et al.,"Traceless" Staudinger Ligation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds. Org. Lett. 2000, 2, 2141-2143)에 의해 사용되었다.
이러한 방법들 중에서, 오직 천연 화학적 라이게이션 접근법만이 라이게이션 부위에 천연 아미드 (즉, 펩티드) 결합을 갖는 라이게이션 생성물을 산출한다. 본래의 천연 화학적 라이게이션 방법론 (Dawsonet al., 상기; 및 WO 96/34878)은 라이게이션 부위에서 천연 아미드 결합을 생성하기 위한 확고한 방법론을 증명하였다. 천연 화학적 라이게이션은 C-말단 α-카르복시티오에스테르 부분을 갖는 제 1 펩티드 또는 폴리펩티드 단편과, N-말단 시스테인 잔기를 갖는 제 2 펩티드 또는 폴리펩티드 간의 화학선택적 반응을 포함한다. 티올 교환 반응은 초기 티오에스테르-연결 중간 물질을 수득하는데, 이는 시스테인 측쇄 티올을 재생하는 동안 자발적으로 재배열하여 라이게이션 부위에 천연 아미드 결합을 갖게 한다. 본래의 천연 화학적 라이게이션 접근법의 1차적 결점은 N-말단 시스테인을 필요로 한다는 점, 즉, N-말단 시스테인을 갖는 펩티드 및 폴리펩티드 단편의 결합만을 허용한다는 점이다.
이 결점에도 불구하고, 시스테인 이외의 N-말단 아미노산을 갖는 펩티드의 천연 화학적 라이게이션이 보고되었다 (WO98/28434). 이 접근법에서, 라이게이션은 C-말단 α-카르복시티오에스테르를 갖는 제 1 펩티드 또는 폴리펩티드 및 N-말단을화학식 HS-CH2-CH2-O-NH-[펩티드]로 표현되는 N-{티올-치환된 보조}기로 갖는 제 2 펩티드 또는 폴리펩티드를 사용하여 수행된다. 라이게이션 후, N-{티올 치환된 보조}기는 HS-CH2-CH2-O-보조기를 절단함으로써 제거하여 라이게이션 부위에 천연 아미드 결합을 생성한다. 이 방법의 한 제한점은 머캅토에톡시 보조기의 사용이 오직 글리신 잔기에서만 아미드 결합 형성을 성공적으로 가져올 수 있다는 것이다. 이는 절단 후 제 2 펩티드 또는 폴리펩티드 단편의 N-치환 아미노산의 부위에서 글리신 잔기를 생성하는 라이게이션 생성물을 생산한다. 이와 같이, 방법의 이러한 구체예는 반응의 라이게이션 생성물이 이 부위에 글리신 잔기를 함유하도록 할 때에만 적당하고, 라이게이션 수율, 전구체의 안정성, 및 O-연결된 보조기를 제거하는 능력에 관한 어떠한 사건에서도 문제가 될 수 있다. HSCH2CH2NH-[펩티드]와 같은, 다른 보조기가 사용될 수 있음에도 불구하고, 반응을 글리신 잔기에서의 라이게이션으로 제한하지 않으면, 이러한 보조기는 라이게이션된 생성물로부터 제거될 수 없다.
따라서, 요구되는 것은, 효과적이고 손쉽게 제거될 수 있는 티올-함유 보조기에 의하여 천연 화학적 라이게이션을 다양한 종류의 상이한 아미노산 잔기, 펩티드, 폴리펩티드, 폴리머 및 다른 분자로 확장하고, 이러한 분자들을 라이게이션 부위에 천연 아미드 결합과 함께 결합시키는, 널리 적용가능하고 확고한 화학적 라이게이션 시스템이다. 본 발명은 이들 및 다른 요구를 제기한다.
본 발명은 아미드 결합을 통해 더 넓은 범위의 펩티드, 폴리펩티드, 다른 중합체 및 다른 분자의 라이게이션을 허용하는 천연 화학적 라이게이션의 기술을 확장하기 위한 방법 및 조성물에 관련된다. 본 발명은 나아가 이러한 단백질 및 유래 단백질에 대한 방법 및 사용을 제공한다.
관련된 출원의 상호참조
본 출원은 미국 특허 출원 제 60/231,339 호 (2000년 9월 8일 제출) 및 제 60/236,377 호 (2000년 9월 29일 제출)의 일부계속이고, 두 출원은 모두 참고문헌으로서 여기에 전문이 수록된다.
도 1은 위 천연 화학적 라이게이션의 총체적인 반응을 예시한다.
도 2는 본 발명의 합성 생물활성 단백질 제조의 전반적인 과정을 예시한다.
도 3은 합성 적혈구생성 자극 단백질의 바람직한 타입의 기본 구조를 묘사한다.
도 4는 유리 아미노 또는 카르복시 말단을 갖지 않는 원의 형태로 순차교환된 SEP 유사체의 일반 구조를 나타낸다. pPEG (여기 묘사될 때 "정밀 PEG") 부착 부위는 SEP 유사체와 비교하여 위치상으로 동일하다. SEP 유사체는 P126C 및 A125X와 같은, 새로운 N-/C-말단 위치 간의 옥심 연결에 의해 원을 형성한다. SEP 유사체의 전체 분자량은 약 50 내지 80 kDa의 범위로, 이는 주어진 유사체의 변경에 사용되는 pPEG에 의존하며, pPEG 중재된 유체역학적 MW는 약 100 kDa보다 더 크게 확립된다.
도 5는 합성 생물활성 GCSF 단백질의 기본 구조를 나타낸다. 도에서, "J"는 소수성 측쇄를 갖는 비-자연적으로 암호화된 잔기를 명시한다.
도 6은 바람직한 합성 RANTES 유사체의 구조를 나타낸다. 도에서, NNY = 비아노일, X = 소수성 측쇄를 갖는 비-자연적으로 암호화된 아미노산, pPEG 및 FA = 지방산이다.
도 7은 분지-사슬 pPEG 폴리머의 형성을 도식적으로 묘사한다.
발명의 개요다
본 발명은 아미드 결합을 통해 보다 넓은 범위의 펩티드, 폴리펩티드, 다른 폴리머 및 다른 분자의 라이게이션을 허용하는 천연 화학적 라이게이션의 기술을확장하기 위한 방법 및 조성물에 관련된다. 본 발명은 나아가 이러한 단백질 및 유래된 단백질에 대한 방법 및 사용을 제공한다. 본 발명은 임의적으로 폴리머-변화된, 합성 생물활성 단백질, 및 이러한 단백질을 함유한 약제학적 조성물의 합성에서의 이용에 특히 적당하다.
자세히 말하면, 본 발명은 화학식 -S-Raa를 갖는 측쇄의 위-아미노산 잔기를 함유하는 합성 단백질 (특히 약 25 kDa보다 더 큰 모노머 분자량을 갖는 단백질)을 제공하는데, 여기에서 Raa는 리보솜-지정 아미노산 측쇄의 임의적으로 치환되는 말단 부분이거나, 또는 리보솜-지정 아미노산 측쇄의 말단 부분의 유사체이다.
본 발명은 특히 이러한 합성 단백질의 구체예를 제공하는데 여기에서 단백질은 리보솜-생산 생물활성 단백질에 의해 소유되는 생물학적 활성을 갖는다.
본 발명은 나아가 단백질의 아미노산 잔기 다수가 아미드 결합에 의해 인접한 아미노산 잔기와 결합된 이러한 합성 단백질 및, 아미노산 잔기 다수 중 이러한 아미노산 잔기의 적어도 하나는 비-아미드 결합 (예를 들어, 티오에스테르 결합, 티오에테르 결합, 및 옥심 결합)에 의해 인접한 아미노산에 결합된 합성 단백질에 관련된다.
본 발명은 나아가 위-아미노산 잔기가 D-배열 아미노산 잔기 또는 L-배열 아미노산 잔기인 합성 단백질, 또는 이러한 합성 단백질이 D-배열에서의 위-아미노산 잔기(군) 및 L-배열에서의 위-아미노산 잔기 모두를 함유하는 합성 단백질에 관련된다.
본 발명은 나아가 위-아미노산 잔기가 위-아르기닌; 위-아스파라긴; 위 아스파테이트; 위-도파민, 위-글루타메이트; 위-글루타민; 위-히스티딘; 위-이소류신; 위-류신; 위-리신; 위-메티오닌; 위-페닐알라닌; 위-세린; 위-트레오닌; 위-트립토판; 위-티로신; 및 위-발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 합성 단백질에 관련된다.
본 발명은 나아가 리보솜-지정 생물활성 단백질이 포유류 단백질 (예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 쥐, 돼지, 양, 또는 말의 단백질)인 합성 단백질에 관련된다.
본 발명은 나아가 단백질이 단백질 수용체 또는 그것의 절편, 단백질 수용체 리간드 또는 그것의 절편, 또는 사이토카인 (특히 여기에서 사이토카인은 인터류킨, 림포카인, RANTES 단백질, 적혈구생성 자극 단백질, 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론, 성장 인자 및 단일 펩티드 호르몬으로 구성된 군으로부터 선택된다) 중에서 선택된 생물활성을 갖는 합성 단백질에 관련된다.
본 발명은 나아가 합성 단백질 SEP-0, SEP-1 및 SEP-3에 관련된다.
본 발명은 나아가 하나 이상의 아미노산 잔기가 하나 이상의 폴리머 부가물에 의해 변환되고, 특히 합성 단백질이 리보솜-암호화된 생물활성 단백질의 글리코실화 부위 중 적어도 하나에 상응하는 아미노산 잔기(군)에서, 하나 이상의 폴리머 부가물에 의해 변환되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 이러한 모든 합성 단백질에 관련된다.
본 발명은 또한 합성 단백질을 포함하는 분자적으로 상동인 약제학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 단백질은 리보솜-지정 생물활성 포유동물 단백질과 연관된 생물학적 활성을 모방한 생물학적 활성을 갖고, 약 25kDa보다 더 큰 모노머 분자량을 갖고, 측쇄가 화학식 -S-Raa를 갖는 위-아미노산 잔기를 함유하며, 여기에서 Raa는 리보솜-지정 아미노산 측쇄, 또는 그것의 유사체의 임의적으로 치환된 말단 부분으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 인간 질병 또는 상태를 치료하는 방법을 제공하는데, 이는 합성 단백질을 각각 포함하는 하나 이상의 분자적으로 상동인 약제학적 조성물의 유효량을 이러한 치료를 요구하는 대상에 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 합성 단백질은 약 25kDa 보다 큰 모노머 분자량을 갖고 측쇄가 화학식 -S-Raa를 갖는 위-아미노산 잔기를 함유하는데, 여기에서 Raa는 리보솜-지정 아미노산 측쇄, 또는 그것의 유사체의 임의적으로 치환된 말단 부분으로 구선된 군으로부터 선택되고; 합성 단백질은 리보솜-지정 생물활성 인간 단백질 수용체 또는 그것의 절편, 단백질 수용체 리간드 또는 그것의 절편, 또는 사이토카인의 생물학적 활성을 모방하는 생물학적 활성을 갖는다.
본 발명은 또한 바람직한 폴리펩티드를 합성하기 위한 방법 및 이런 방법을 통해 만들어진 바람직한 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 바람직한 폴리펩티드는 다음의 화학식을 갖는다:
aaNH2-Q-aax-aay-W-aaCOOH
여기에서 Q 및 W는 각각 하나 이상의 추가적인 아미노산 잔기의 임의적 존재를 표시하고, aaNH2는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 잔기를 표시하고; aax및 aay는 각각 측쇄 x 및 y를 갖는 내부 인접 아미노산 잔기를 표시하고, aaCOOH는 폴리펩티드의 C-말단 아미노산 잔기를 표시한다; 방법은:
(A) 화학식: aaNH2-Q-aax-COSR (여기에서 R은 티오에스테르기에 상용성인 어떠한 기이고, 이는 아릴, 벤질, 및 알킬기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다)를 갖는 제 1 펩티드를 화학식 : Cys-W-aaCOOH를 갖는 제 2 펩티드에 라이게이션 함으로써 폴리펩티드: aaNH2-Q-aax-Cys-W-aaCOOH를 형성하도록 하는 단계; 및
(B) 시약 Raa-X의 존재하에 폴리펩티드를 인큐베이션 하는 단계를 포함한다 (여기에서 Raa는 그 구조가 아미노산 잔기 aay의 측쇄의 말단 부분을 모방하고; X는 양호한 이탈기 (특히 F, I, 또는 Br과 같은 할로겐)이고; 인큐베이션은 바람직한 폴리펩티드를 형성하기에 충분한 조건 하에서 행한다).
본 발명은 나아가 이러한 방법 및 폴리펩티드의 구체예를 제공하는데 여기에서 아미노산 잔기 aay는 위-아르기닌; 위-아스파라긴; 위-아스파테이트; 위-도파민; 위-글루타메이트; 위-글루타민; 위-히스티딘; 위-이소류신; 위-류신; 위-리신; 위-메티오닌; 위-페닐알라닌; 위-세린; 위-트레오닌; 위-트립토판; 위-티로신; 및 위-발린으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직한 구체예의 설명
본 발명은 아미드 결합을 통해 보다 넓은 범위의 펩티드, 폴리펩티드, 다른 폴리머 및 다른 분자의 라이게이션을 허용하는 천연 화학적 라이게이션의 기술을 확장하기 위한 방법 및 조성물에 관련되므로, 이러한 분자의 화학적 합성을 용이하게 한다. 본 발명은 나아가 이러한 단백질 및 유래된 단백질에 대한 방법 및 사용을 제공한다. 본 발명은 특히 임의적으로 폴리머-변환된, 바람직하게 약 25kDa 보다 더 큰 모노머 분자량을 갖는 합성 생물활성 단백질 및, 이러한 단백질을 함유한 약제학적 조성물의 합성에서의 사용에 적당하다.
I. 생물활성 펩티드 및 단백질의 화학적 합성
전형적으로, 생물활성 펩티드 및 단백질의 합성은, 표준 자동 펩티드 합성기를 이용한, 1960년대 초에 개발된 "Merrifield"-화학 단계적 고체상 펩티드 합성 프로토콜을 채택한다. 이러한 합성은 고체 또는 용액상 라이게이션 전략을 채택할 수 있다. 이러한 화학법이 많은 폴리펩티드를 생산하는데 손쉽게 채택될 수 있는 반면, 연관된 수율 결실, 부산물 생산, 및 불완전 반응으로 인해 단백질 또는 거대 폴리펩티드의 생산에는 부적당하다. 이러한 제한점을 처리하기 위해, 더 큰 폴리펩티드 및 단백질의 합성을 성취하기 위하여 사전형성된 펩티드 절편을 함께 라이게이션 하도록 허용하는 화학적 라이게이션의 기술이 개발되었다.
화학적 라이게이션은 제 1 화학 성분 및 제 2 화학 성분 간의 선택적인 공유 연결의 형성을 포함한다. 유일하고, 상호 반응적인, 제1 및 제 2 성분 상에 존재하는 작용기는 라이게이션 반응이 화학선택적이 되도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 및 폴리펩티드의 화학적 라이게이션은 상용성의 유일하고, 상호 반응적인,C-말단 및 N-말단 아미노산 잔기를 산출하는 펩티드 또는 폴리펩티드 단편의 화학선택적 반응을 포함한다. 여러 상이한 화학법들은, 예를 들어, 천연 화학적 라이게이션 (Dawson,et al., Science(1994) 266:776-779; Kent,et al.,WO 96/34878; Kent,et al.,WO 98/28434), 옥심 형성 화학적 라이게이션 (Rose,et al., J. Amer. Chem. Soc.(1994) 116:30-34), 티오에스테르 형성 라이게이션 (Schnolzer,et al., Science(1992) 256:221-225), 티오에테르 형성 라이게이션 (Englebretsen,et al., Tet, Letts.(1995) 26(48):8871-8874), 히드라존 형성 라이게이션 (Gaertner,et al., Bioconj. Chem.(1994) 5(4):333-338), 및 티아졸리딘 형성 라이게이션 및 옥사졸리딘 형성 라이게이션 (Zhang,et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(1998) 95(16): 9184-9189; Tamet al.,WO 95/00846; 미국 특허 제 5,589,356)을 포함하는 목적으로 또는 다른 방법 (Yan. L.Z. and Dawson, P.E., "Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization",J. Am. Chem. Soc.2001, 123, 526-533 (참고문헌으로서 여기 수록); Gieselnanet al.,Org. Lett. 2001 3(9):1331-1334; Saxon, E.et al.,"Traceless" Staudinger Ligation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds. Org. Lett. 2000, 2, 2141-2143)에 의해 사용되었다.
라이게이션이 N-말단 시스테인 잔기를 갖는 폴리펩티드의 결합을 포함하는 부위에서, 천연 화학적 라이게이션의 방법이 바람직하게 채택된다 (참고문헌으로서 여기 수록된, Dawson,et al., Science(1994) 266:776-779; Kent,et al.,WO96/34878; Kent,et al.,WO 98/28434; 미국 특허 출원 제 09/097,094 호). 천연 화학적 라이게이션은 C-말단 α-카르복시티오에스테르 부분을 갖는 제 1 펩티드 또는 폴리펩티드 단편과, N-말단 시스테인 잔기를 갖는 제 2 펩티드 또는 폴리펩티드 간의 화학선택적 반응을 포함한다. 티올 교환 반응은 초기 티오에스테르-연결 중간 물질을 수득하는데, 이는 시스테인 측쇄 티올을 재생하는 동안 자발적으로 재배열하여 라이게이션 부위에 천연 아미드 결합을 갖게 한다. 많은 예에서, 자연 단백질의 서열은 적당히 위치된 시스테인 잔기를 포함하여, N-말단 시스테인 잔기를 갖는 폴리펩티드 절편을 천연 화학적 라이게이션 반응에서 합성하고 사용할 수 있다.
이 방법론이 거대 폴리펩티드 및 단백질의 합성에 실용적이고, 확고하며 유용한 것으로 증명되었음에도 불구하고, 라이게이션의 부위에서 시스테인 잔기에 대한 필요성은 그 응용성을 제한한다. 시스테인은 가장 적은 통상의 아미노산 중 하나이다. 전형적인 단백질 도메인은 150 내지 200 아미노산을 포함하는데; 많은 단백질이 시스테인 잔기를 함유하지 않은 구역 (길이로 60 아미노산 이상)을 함유한다. 이 문제에 대한 하나의 해결책은 단백질의 자연적으로 생겨나는 하나 이상의 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 교체하여, 채택되는 천연 화학적 라이게이션 방법을 허용하는, 비-자연적으로 생겨나는 단백질의 디자인을 포함한다. 이 해결책은 시스테인 잔기가 단백질 구조 또는 기능상 가질 수 있는 예측할 수 없는 효과에 의해 종종 복잡하게 된다. 이러한 시스테인 잔기는 합성된 단백질을 공유적으로 고정하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 이 문제에 대해 독립적으로 또는 결합적으로 채택될 수 있는 두개의 대안적 해결책을 제공한다. 그 첫번째 해결책 (여기서 "위-천연 화학적 라이게이션"으로 칭함)은 단백질 합성에 채택된 펩티드 내의 사전선택된 위치에서 비-자연적으로 일어나는 위-아미노산 잔기의 사용을 포함한다. 이러한 위-아미노산의 구조는 합성될 단백질 내의 이러한 사전선택된 위치에서 자연적으로 생겨나는 시스테인의 구조 및 아미노산의 구조를 모방한다. 그 두번째 해결책 (여기서 "확장된 천연 화학적 라이게이션"으로 칭함)은 참고문헌으로서 여기 수록된 미국 특허 출원 제 60/231,339 호 (Kent,et al., 2000년 9월 8일 제출)에 설명되는 것으로, 이는 카르복실 티오에스테르, 더욱 바람직하게는 α-카르복실 티오에스테르를 포함하는 제 1 성분을, 산에 안정한 N-치환된, 바람직하게는 Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 함유하는 제 2 성분에 라이게이션 하는 것을 포함한다. 아러한 해결책은 각각 아래에 자세히 고찰된다.
A. 위-천연 화학적 라이게이션
위-천연 화학적 라이게이션은 라이게이션 부위에 천연 화학적 라이게이션으로부터 생성되는 시스테인 측쇄의 티오알킬화로 지향된다. 바람직한 양태는 적어도 하나의 펩티드가 적당한 보호기로 보호된 티올 측쇄를 갖는 천연 시스테인을 함유하는 시스테인 라이게이션 부위의 티오알킬화이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 시스테인기의 티올 부분은 원하는 측쇄, 예를 들어, 리보솜-지정 아미노산의 측쇄, 이러한 아미노산의 유사체, 또는 비-리보솜-지정 아미노산으로 변환된다. 여기에 사용될 때, 리보솜-지정 아미노산은 단백질 번역의 과정에서 리보솜에 의해 인식되어 리보솜으로 생산되는 단백질 내로 통합될 수 있는 아미노산이다. 상당수의 발표된 논문이 시스테인 측쇄 티올 부분의 화학적 변경을 설명하고 있다 (예를 들어, "Current Protocols in Protein Science", John E, Coliganet al.편저, John Wiley & Sons, NY (2000) 참조). Kaiser, E.T.는 자연적으로 생겨나는 아미노산 측쇄의 화학적 특징을 모방하기 위한 시스테인 잔기 측쇄의 전환을 설명하였다 (Kaiser, E.T.et al., "Chemical Mutation Of Enzyme Active Sites", Science, 1984 Nov. 2;226(4674):505-11 참조). 게다가, 펩티드 또는 단백질 내로 표지를 도입하는 시스테인 측쇄의 사용이 설명되었다. 시스테인 측쇄 변경은 Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, S.S.Wong, (1991, CRC Press); Chemical Modification of Proteins, Gary E. Meanset al., (1971, Holden-Day), Chemical Modification of Proteins: Selected methods and analytical procedures, Glazer, A.N.et al.(1975, Elsevier); Chemical Reagents for Protein Modification, RL Lundblad (1991, CRC Press)에 개설된다. Tamet al.(Biopolymers (1998) 46:319-327)은 비-cys 천연 화학적 라이게이션에 대한 호모시스테인 (-CH2-CH2-SH)의 이용 후, 호모시스테인 측쇄를 천연 메티오닌 측쇄 (-CH2-CH2-S-CH3)로 전환하는데 메틸 p-니트로벤젠설포네이트 (메틸화 시약)를 이용한 티오알킬화를 개시하였다. 본 발명은 또한 호모시스테인을 위 아미노산으로, 즉, 메티오닌 외의 아미노산으로도 전환하는데 이용될 수 있다. 그러나, 여기 설명된 시스테인의 전환에 관하여, 본 발명에 따라서 보호기를 사용하는 것은 전환되기를 원치 않는 적어도 하나의 천연 시스테인을 함유한 펩티드에 대한 이황화 결합에 포함된 천연 시스테인의 파괴를 회피하기 위해 필요하다. 적당한 보호기는 아래에 설명된다.
위-천연 화학적 라이게이션의 방법은 어떤 리보솜-지정 아미노산 측쇄 (예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 및 프롤린의 측쇄)의 모방을 용이하게 하지 않는 반면 (그러나, 알라닌의 측쇄는 탈황화반응을 통해 형성될 수 있다 (Yan, L.Z. 및 Dawson, P.E., "Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization",J. Am. Chem. Soc.2001, 123, 526-533, 참고문헌으로서 여기 수록)), 많은 리보솜-지정 또는 비-암호화된 아미노산을 모방하는 측쇄를 형성하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 위-천연 화학적 라이게이션 방법에 따라 생산된 아미노산은, 티오에테르 연결은 함유하되, 베타-분지는 갖지 않을 것이다 (아미노산은 베타 위치에 메틸기를 모두 포함할 것이다, 즉 aa-βCH2-S-). 그러므로, 베타-분지된 아미노산의 위-아미노산 버전인, 이소류신 및 트레오닌이, 베타 기하구조 및 그것의 부수적인 구속을 갖지 않고, 팬던트 측쇄 구조를 갖도록 할 수 있다.
중요하게도, 본 발명의 방법은 리보솜-지정 아미노산의 측쇄와 동일한, 또는 이러한 길이보다 더 길거나 짧은 아미노산 측쇄를 형성하는데 이용될 수 있다. 측쇄 길이에서의 이러한 변경은 3차원적 형태를 안정화 (또는 불안정화)하여 단백질 안정성을 증가시키도록 (또는 단백질의 형태를 변경하여 상이한 범위의 기질, 저해제, 수용체, 리간드 등을 받아들이는 단백질의 능력을 자연적으로 생겨나는 단백질에 비해 향상시키도록) 이용될 수 있다. 예를 들어, Cys-CH2-SH + Br-CH2-COOH는 Cys-CH2-S-CH2-COOH를 산출한다 (이러한 "위-글루탐산"은 하나의 추가적인 측쇄 원자, 다시 말해 -S-기를 갖는다; 대안으로, 만약 아스파라트산의 위치에 사용되면, 이것은 두개의 추가적인 측쇄 원자, 다시 말해 -CH2-S-기를 가질 것이다). 다른 측쇄는 측쇄에 동일한 수의 원자를 갖되, 티오에테르 연결 (-S-)의 포함에 의해 상이하다. 예를 들어, Cys-CH2-SH + Br-CH2-CH2-NH-PG후,PG의 제거는 Cys-CH2-S-CH2-CH2-NH2를 산출한다. 결과적 구조는 측쇄에 추가적인 원자를 갖지 않지만, 한 -CH2-기는 -S-로 대치된다. 메티오닌은 여기서 또 다른 예로서, Cys-CH2-SH + I-CH2-CH3은 Cys-CH2-S-CH2-CH3(천연 met 구조인 Met-CH2-CH2-S-CH3과 비교)을 산출한다; 그러므로 티오에테르가 재배치된다. 아르기닌 또한: Cys-CH2-SH + Br-CH2-NH-CH((-NH2) (=NH2 +))는 Cys-CH2-S-CH2-NH-CH((-NH2) (=NH2 +))를 산출한다. 바람직하게는, 반응 아미노기의 보호, 특히 위 리신을 구성하기 위한 보호가 원치 않는 부반응을 회피하는데 채택될 수 있다. 일단 티오알킬화 반응이 수행되면, 보호기는 제거될 수 있다.
일반적으로, 가능한 한 근접하게 자연적으로 생겨나는 단백질을 모방하는 것이 요구된다면, 단백질 내의 이러한 위치에 통상적으로 존재하는 리보솜-지정 아미노산의 측쇄 길이와 동일한 측쇄 길이를 갖는 위 아미노산 분자를 채택하는 것이가장 바람직하고; 리보솜-지정 아미노산의 측쇄보다 한 원자 더 긴 측쇄 길이를 갖는 위 아미노산 분자를 채택하는 것은 덜 바람직하며, 리보솜-지정 아미노산의 측쇄보다 두 원자 더 긴 측쇄 길이를 갖는 위 아미노산 분자를 채택하는 것은 더욱 덜 바람직하다. 게다가, 한 위치에 있는 시스테인 라이게이션 부위를 선택하는 것이 바람직한데, 이 부위는 유전적 변화가 기능을 방해할 것으로 생각되지 않거나 관련된 단백질 내의 이 부위에서 아미노산이 보존되는 부위가다. 이러한 부위는 알라닌 스캐닝, 상동성 모델링 및 다른 방법에 의해 식별될 수 있다.
위-천연 화학적 라이게이션에서, 아미노 말단 시스테인 잔기를 함유한 펩티드는, 천연 화학적 라이게이션과 같이, 카르복시 말단 티오에스테르를 갖는 펩티드와 라이게이션 된다. 시스테인의 티올 측쇄는 그 다음 화학식 Raa-X의 화합물과 반응하는데, 여기에서 X는 양호한 이탈기이고, Raa는 그 구조가 리보솜-지정 또는 합성 아미노산의 측쇄의 말단 부분을 모방한 기이다.
중요하게도, 위-천연 화학적 라이게이션의 반응은 시스테인 측쇄의 자연적인 L-배열, 또는 D-배열로 작용한다. C-배열의 사용은 이 라이게이션 부위에서 프로테아제 내성을 부여하므로, 단백질 가수분해에 대한 증가된 안정성이 요구될 때 바람직할 수 있다. 그러나, D-시스테인의 사용에 있어서, 이 부위에서 백본 구조는 변경될 것이다. 이러한 변경은, 프로테아제 내성 외에, 생물활성을 변경하는데 바람직할 수 있다. 그러나, 생물활성 상에서 충격을 최소화하기 위해, (분자의 혼란된 말단 상에서, 결과적 폴딩된 분자의 표면에 위치할 혼란된 루프와 같은) 혼란된 영역과 같은, 높은 유연성의 부위에 D-시스테인을 위치시키는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 위-천연 화학적 라이게이션의 반응이 합성된 분자의 표면 상에 거대하고, 하전된 측쇄 (예를 들어, Lys, Arg, Asp 또는 Glu의 측쇄)를 위치시키도록 이용될 수 있다.
적당한 양호 이탈기인, X의 예는 할로겐, 특히 요오드 및 브롬을 포함한다. Raa기의 예는 PO4, COOH, COO, CONH2, 구아니디늄, 아민, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 이미다졸, 알킬화된 이미다졸, 인돌, 또는 알킬화된 인돌기를 포함한다.
어떤 Raa를 채택하는가에 대한 선택은 특정 위치에서 존재하기를 원하는 아미노산 측쇄에 의존할 수 있다. 그러므로, 예를 들어 다음의 아미노산 서열을 갖는 원하는 폴리펩티드 또는 단백질은:
aaNH2-Q-aax-aay- W-aaCOOH
(상기 식에서 Q 및 W는 각각 추가적인 아미노산 잔기의 임의적 존재 또는 부재를 표시하고, aax및 aay는 (각각 측쇄 x 및 y를 가진) 내부 인접 잔기를 나타내며, aaNH2및 aaCOOH는 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노 (N-) 말단 잔기 및 카르복시 (C-) 말단 잔기를 각각 표시) 다음의 두 펩티드 절편을 제조함으로써 합성될 수 있다.
aaNH2-Q-aax-COSR 및 Cys-W-aaCOOH
상기 식에서 Cys는 시스테인으로 aay의 대치를 표시하고, R은 티오에스테르기와 융합성인 어떤 기인데, 아릴, 벤질, 및 알킬기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. R의 예는 3-카르복시-4-니트로페닐 티오에스테르, 벤질 에스테르, 및 머캅토프로프리온산 류신 에스테르를 포함한다 (Dawsonet al., Science (1994) 266: 776-779; Canneet al., Tetrahedron Lett. (1995) 36: 1217-1220; Kent,et al., WO 96/34878; Kent,et al., WO 98/28434; Ingenitoet al., JACS (1999) 121(49): 11369-11374; 및 Hackenget al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96: 10068-10073 참조). 다른 예는 디티오트레이톨 또는, 알킬 또는 아릴 티오에스테르를 포함하는데, 이는 또한 주지된 인테인-중재 생물학적 기술 (Chonget al., Gene (1997) 192:277-281; Chonget al., Nucl. Acids Res. (1998) 26:5109-5115; Evanset al., Protein Science (1998) 7: 2256-2264; 및 Cottonet al., Chemistry & Biology (1999) 6(9): 247-256 참조)로 생산될 수 있고; 그 후 절편을 함께 라이게이션하여 다음을 형성한다:
aaNH2-Q-aax-Cys-W-aaCOOH.
라이게이션된 절편은 그 다음 Ry-X와 반응하는데, 여기에서 Ry는 y 측쇄의 구조를 모방하는 측기이다. 반응은 시스테인의 티올기가 "위-y" 측쇄로 전환되기 충분한 조건 하에서 수행된다. 예를 들어, Raa가 CH2-COOH 또는 (CH2)2-COOH로 되도록 선택된다면, 반응은 아스파르트산 또는 글루탐산의 기능 및 구조를 모방하는 아미노산 잔기 (각각 "위-Asp", "위-Glu")의 형성을 일으킬 것이다. 위의 설명의 관점에서 인정될 것이기 때문에, 더욱 복잡한 합성은 둘 이상의 펩티드 절편을 채택하도록 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 "위 아미노산"을 포함하는 천연 화학적 라이게이션은 단백질의 화학적 합성을 위한 천연 화학적 라이게이션 방법의 응용성을 유의하게 확장시킨다. "위 아미노산"을 포함하는 천연 화학적 라이게이션은, Cys 잔기에서 천연 티올-함유 측쇄 기능성을 갖는 펩티드 결합을 형성하는, 라이게이션 단계에서 동일한 화학법을 이용한다; 유일한 제 2 단계에서, 라이게이션 부위에 있는 Cys의 천연 티올-함유 측쇄는 화학선택적 반응에 의해 전환되어, 비-천연 측쇄를 제외하면 유전적으로-암호화된 아미노산과 동일한, 작용기를 함유한 비-천연 측쇄를 산출한다.
예를 들어, 라이게이션 부위에서의 시스테인은 중성 pH인 물에서 브로모아세트산 (또는 다른 할로아세트산)과 반응할 수 있다; 라이게이션 부위에 있는 Cys의 유일하게 보호되지 않은 티올은 이러한 조건하에서 반응하여 라이게이션 부위에 S-카르복시메틸화된 잔기를 함유한 폴리펩티드를 얻는다, 즉:
이 비-천연 아미노산은 측쇄에, 글루탐산 또는 아스파라트산 잔기와 동일한 작용기인, 카르복실 부분을 함유한다. S-카르복시메틸화된 Cys는 여기에서 "위 글루탐산" ("위-글루타메이트", "위-Glu")으로 지칭된다 (하나의 잉여 측쇄 원자가 존재하고 이는 티오에테르 연결을 형성하는 -S-기이다)(이것은 또한 두개의 잉여 측쇄 원자가 존재하는 "위-아스파르트산"으로도 지칭되는데, 그 중 하나는 티오에테르 연결을 형성하는 -S-기이다). 많은 단백질에 관하여, 이 "위 아미노산"에서 조차 하전된 카르복실화 측쇄의 단순한 보존은 원하는 특징을 단백질이 보유하도록 하고 이 특징을 단백질에 부여하는데 충분할 것이다. 핵심적인 차이점은 그것이 적당한 시스테인이 결여된 위치에서 천연 화학적 라이게이션 부위로서 작용한다는 것이다.
라이게이션 부위(군)에서 Cys 잔기에 있는 측쇄 티올을 변화시키는 다른 시약의 이용은 다른 "위 아미노산" 잔기를 부여할 수 있다. 예를 들어, 브로모아세트아미드와 같은 할로아세트아미드를 가지고 티올을 반응시키는 것은 라이게이션 부위에 "위-글루타민"을 부여할 수 있다, 즉:
이와 유사하게, 예를 들어,
와 같은 N-보호된 할로알킬아민으로 반응시킨 후 아미노 보호기를 제거하는 것은 '위-리신' 잔기를 부여할 것이다, 즉:
라이게이션 부위(군)에서, 예를 들어,
와 같은 적당한 할로알칸을 가지고 Cys 잔기(군)을 반응시키는 것은 '위 류신' 아미노산을 산출할 것이다, 즉:
다른 적당하게 선택된 아릴-함유 할로겐화물은 Phe, Tyr, 또는 Trp 잔기에상응하는 위 아미노산을 생성하는 것과 유사하게 사용될 수 있다, 즉:
여기에서 R은 H, OH, 아릴 등이 될 수 있다. 예를 들어:
이러한 접근법의 중요한 특징은 변경되지 말아야 할 시스테인 잔기가 반응하는 단편 내에서 Cys(Acm)과 같이 측쇄 보호되어, 라이게이션 부위(군) 외의 Cys 잔기의 화학적 변경을 막거나, 또는 반응하는 단편 내의 어떤 다른 Cys 잔기가 라이게이션 후 화학적 변경 반응에 의해 동일한 '위 아미노산'의 동시 형성에 의도된다는 것이다. 동일한 원칙이 라이게이션 부위에서 호모시스테인의 사용에 적용된다는 것이 인정될 것이다. 또한 셀레노시스테인이 셀로노시스테인-중재 천연 화학적 라이게이션을 통하여 라이게이션 부위에서 채택될 수 있고, 유사한 알킬화 반응에 의해 전환되어 본 발명의 위 아미노산을 생성할 수 있으며, 여기에서 셀레노에테르기는 티오에테르기를 치환한다는 것이 인정될 것이다.
여기서 사용될 때, 상징 φ는 벤질기를 표시하고;IM은 이미다졸기를 표시하고,IN은 인돌기를 표시하고;PG는 보호기를 표시한다. 아래는 본 발명에 따른 위-아미노산 잔기를 포함한 펩티드를 합성하는데 사용될 수 있는 Raa 측기의 요약이다 (여기에서 X 는 활로겐이다 (대부분에 있어서 I 및 Br을 갖는 I, Br, Cl, F가 바람직하고, φ부착에 대하여 F가 바람직하다)):
염기성 아미노산
Lys (잉여 원자 없음)
-CH2-SH + X-CH2-CH2-NH-PG후, 탈보호는 -CH2-S-CH2-CH2-NH2를 부여
Arg (잉여 원자 없음)
-CH2-SH +X-CH2-NH-C((NH2)(=NG2+))는 -CH2-S-CH2-NH-C((NH2)(=NH2+)를 부여
His (2개의 잉여 원자)
-CH2-SH + X-CH2-IM-PG후, 탈보호는 -CH2-S-CH2-IM을 부여
산성 아미노산
Asp (2개의 잉여 원자)
-CH2-SH + X-CH2-COOH는 -CH2-S-CH2-COOH를 부여
Glu (1개의 잉여 원자)
-CH2-SH + X-CH2-COOH는 -CH2-S-CH2-COOH를 부여
비하전된 극성 아미노산
Tyr (잉여 원자 없음 또는 1개)
-CH2-SH + F-φ-pOH는 -CH2-S-φ-pOH를 부여(잉여 원자 없음, 동일한 기하 구조)
-CH2-SH + Br/I-CH2-φpOH는 -CH2-S-CH2-φpOH를 부여 (1개의 잉여 원자)
Gln (1개의 잉여 원자)
-CH2-SH + X-CH2-C(O)(NH2)는 -CH2-S-CH2-C(O)(NH2)를 부여
Asn (2개의 잉여 원자)
-CH2-SH + X-CH2-C(O)(NH2)는 -CH2-S-CH2-C(O)(NH2)를 부여
Ser (2 또는 3개의 잉여 원자)
-CH2-SH + X-CH2OH는 -CH2-S-CH2-OH를 부여 (2개의 잉여 원자)
-CH2-SH + X-CH2CH2OH는 -CH2-S-CH2-CH2OH를 부여 (3개의 잉여 원자)
Thr (2 또는 3개의 잉여 원자, 베타 분지 결손)
-CH2-SH + X-CH((CH3)(O-PG)) 후PG의 제거는 -CH2-S-CH((CH3)(OH))를 부여 (2개의 잉여 원자)
-CH2-SH + X-CH2-CH((CH3)(O-PG)) 후PG의 제거는 -CH2-S-CH2-CH((CH3)(OH))를 부여 (3개의 잉여 원자)
비-극성 아미노산
Leu (1 또는 2개의 잉여 원자)
-CH2-SH + X-CH((CH3)(CH3))는 -CH2-S-CH((CH3)(CH3))를 부여 (1개의 잉여 원자)
-CH2-SH + X-CH2-CH((CH3)(CH3))는 -CH2-S-CH2-CH((CH3)(CH3))를 부여 (2개의 잉여 원자)
Ile (2 또는 3개의 잉여 원자, 베타 분지 결손)
-CH2-SH + X-CH(CH3)-CH2-CH3은 -CH2-S-CH(CH3)-CH2-CH3을 부여 (2개의 잉여 원자)
-CH2-SH + X-CH2-CH(CH3)-CH2-CH3은 -CH2-S-CH2-CH(CH3)-CH2-CH3을 부여 (3개의 잉여 원자)
Phe (1 또는 2개의 잉여 원자)
-CH2-SH + F-φ는 -CH2-S-φ를 부여 (1개의 잉여 원자)
-CH2-SH + Br/I-CH2-φ는 -CH2-S-CH2-φ를 부여 (2개의 잉여 원자)
Met (잉여 원자 없음)
-CH2-SH + I-CH2-CH3은 -CH2-S-CH2-CH3을 부여
Trp (1개의 잉여 원자)
-CH2-SH + F-IN은 -CH2-S-IN을 부여
일반 위 화학적 라이게이션 반응은도 1에 예시된다. 바람직한 위-아미노산을 형성하는데 이용될 수 있는 바람직한 Raa및 X 기는 표 1에 나타난다. 잔기는 하전된 것으로 나타내었으나, NH2또는 COOH와 같이 이온화될 수 있는 기는 그것의 대전된 형태이거나, 염으로서 제공될 수 있다는 것이 인정될 수 있다. 위-리신을 형성하는데 이용되는 것을 제외하고 모든 반응은 수성 상태이고 pH 8 내지 9에서 수행되는데, 여기에서 반응의 스토키오메트리 (stocheometry) 및 최적화는 표준 프로토콜에 따라 조절될 수 있다. 위-리신은 pH 8 내지 9에서 수행된 수성 반응 내에서 형성된 후, 피페리딘/H2O에서 반응한다 (트리플루오르아세트산(TFA)).
본 발명의 더 나아간 구체예에서, 시스테인 잔기의 티올기는 산화되거나 (-SH → -SO3), 또는 산소로 대치될 수 있어서 세린을 형성한다 (-SH → -OH). 이러한 대치는 시스테인을 토실-Cl (Tos-Cl)과 반응시켜서 티올기, -SH를 -S-Tos기로 전환함으로써 성취될 수 있다. 강염기의 존재하에, OH는 Tos 치환기를 대치하고, 그러므로 원하는 -OH기를 형성한다.
게다가, 시스테인의 티올기는, 아래 나타난 것과 같이, Michael 첨가 반응을 통해 변화될 수 있다:
상기 식에서 R은 H, 알킬, 아릴, 알킬아릴, 아미노이거나, 또는 폴리머 분자인데, 이는 분지 또는 비분지이고, 무정형 또는 정형이다.
본 발명의 나아간 양태는 그 아미노 말단 시스테인 잔기가 변화되어 알킬아미노 (및 바람직하게는 메틸아미노) 부분을 함유한 펩티드 절편의 사용으로 향한다:
알킬아미노 부분의 아미노기를 보호함으로써, 펩티드 A를 화학식: 펩티드 B-αCOSR을 갖는 제 2 펩티드에 라이게이션 할 수 있다.보호기의 제거 후, 화학식: 펩티드 C-αCOSR을 갖는 추가적인 펩티드를 앞서 라이게이션된 펩티드에 라이게이션 하여, 분지된 펩티드 복합체를 형성할 수 있다:
분지된 단백질은 여전히 시스테인의 티올기를 함유하므로, 이는 위에 설명된방식으로 Raa-X 분자와 반응할 것이고, 그럼으로써 측쇄의 더 나아간 변경을 허용할 것이다. 특히, R 치환기로서 알킬아미드를 사용함에 의해, 추가적인 아미노기가 분자 내로 도입될 수 있고, 그럼으로써 더 나아간 분지, 또는 더 나아간 라이게이션 반응을 허용한다.
본 발명의 더 나아간 구체예에서, 시스테인 측쇄의 변경은 어떤 다양한 표지 또는 결합 분자를 도입하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 전자 스핀 공명, 형광 (예를 들어, 암모늄 4-클로로-7-설포벤조-푸라잔 (SBF) Pierce Chemical Co.) 또는 자기 이미지화에 의해 검출될 수 있는 표지가 채택될 수 있다. 이러한 표지화는 질병 및 상태의 진단은 물론이고, 분자 상호작용의 분석 (예를 들어, 세포막내 단백질에서 거리의 측정)에 유용하다. 본 발명의 방법론은 표지 및 결합 분자의 이용에 관하여 몇가지 현저한 장점을 갖는다. 이러한 치환기는 부위 특이적, 비-무작위 수단으로 통합될 수 있다. 게다가, 표지 부분은 (만약 있다면) 그 다음의 화학적 라이게이션 단계에 안정하기만 하면 된다. 이러한 반응은 일반적으로 (천연 화학적 라이게이션; Acm 또는, 다른 시스테인 잔기의 티올기를 (Hg(CH2COOH)2와 같은 것으로) 보호하는데 임의적으로 이용될 수 있는 다른 보호기의 제거; 및 역상 HPLC 정제에 채택되는 것과 같은) 매우 온화한 조건에서 수행된다. 이러한 추가적인 티올기의 보호는 Cys-함유 펩티드의 산화적 폴리머형성을 방해하고 그럼으로써 그것의 정제 및 조작을 용이하게 한다.
B. 확장된 천연 화학적 라이게이션
위에 지적한 것과 같이, 적당한 시스테인 잔기를 함유하지 않은 자연 단백질의 서열, 및 폴리펩티드의 N-말단에 시스테인 잔기를 도입하도록 자연 단백질 서열을 변경하는데 알맞지 않거나 또는 바람직하지 않은 서열에서, "확장된 천연 화학적 라이게이션"의 방법은 N-말단이 N-치환된, 바람직하게는 Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 함유하도록 변환된 폴리펩티드를 라이게이션하는데 이용됨으로써, 천연 화학적 라이게이션의 원칙을 시스테인 잔기가 결여된 폴리펩티드로 채택되도록 허용할 수 있다 (참고문헌으로 여기 수록된, 미국 특허 출원 제 60/231,339 참조).
"확장된 천연 화학적 라이게이션"의 방법은 카르복실 티오에스테르, 더욱 바람직하게는 α-카르복실 티오에스테르를 포함한 제 1 성분을, 산에 안정한 N-치환된, 바람직하게는 Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 포함한 제 2 성분에 라이게이션 시키는 것을 포함한다. 제 1 성분의 카르복시티오에스테르와 제 2 성분의 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 티올 간의 화학선택적 반응은 티오에스테르-연결된 중간물을 통해 진행되고, 초기 라이게이션 생성물로 분해된다. 보다 명확하게 말하자면, COSR 티오에스테르 성분 및 아미노 알킬 티올 성분 간에 발생하는 티올 교환은 티오에스테르-연결된 중간물 라이게이션 생성물을 생성하는데, 이 생성물은 자발적인 재배열 후 아미노 알킬 티올성분이 화학식 I 또는 II 중 어떤 것을 갖느냐에 의존하여 5-원 또는 6-원 고리 중간물을 통해 아미드-연결된 제 1 라이게이션 생성물을 생성한다:
J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 I
J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2 II
상기 식에서 J1은 하나 이상의 임의적으로 보호되는 아미노산 측쇄를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이거나, 또는 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드, 폴리머, 염료, 적당히 기능화된 표면, 링커 또는 검출가능한 마커이거나, 또는 화학적 펩티드 합성 또는 확장된 천연 화학적 라이게이션에 융화적인 어떠한 다른 화학적 부분이고; R1, R2 및 R3은 독립적으로 H이거나 또는 C1에 접합된 전자 공여기이고; 단, R1, R2 및 R3 중 적어도 하나는 C1에 접합된 전자 공여기이고; J2는 하나 이상의 임의적으로 보호되는 아미노산 측쇄를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이거나, 또는 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드, 폴리머, 염료, 적당히 기능화된 표면, 링커 또는 검출가능한 마커이거나; 또는 화학적 펩티드 합성 또는 확장된 천연 화학적 라이게이션에 융화적인 어떠한 다른 화학적 부분이다.
라이게이션 부위에 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C2-C1(R1)-] 또는 [HS-(C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]은 펩티드-상용성 조건 하에서, 생성물의 손상 없이 제거되어, 라이게이션 부위에 천연 아미드 결합을 갖는, 화학식 III의 최종 라이게이션 생성물을 생성할 수 있다:
J1-C(O)-HN-J2 III
여기에서 J1, J2, R1, R2 및 R3은 위에 정의된 것과 같다.
R1, R2 및 R3 기는 펩티드 상용성 절단 조건 하에서 N-C1 결합의 절단을 용이하게 하도록 선택된다. 예를 들어, 전자 공여군은, 특히 C1에 접합되어 있다면, 절단을 용이하게 하는 C1에서 공명 안정화된 양이온을 형성하는데 이용될 수 있다. 화학적 라이게이션 반응은 바람직하게 첨가제로서 티올 촉매를 포함하고, 수성 또는 혼합된 유기-수성 조건의 대략 중성 pH 조건에서 수행된다. 제 1 및 제 2 성분의 화학적 라이게이션은 자발적으로 재배열이 일어나 N-치환된 아미노 연결된 라이게이션 생성물을 산출하는 5 또는 6 원 고리를 통해 진행될 수 있다. 제 1 및 제 2 성분이 펩티드 또는 폴리펩티드이면, N-치환된 아미드 연결 라이게이션 생성물은 화학식 IV 또는 V를 가진다:
J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 IV
J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 V
상기 식에서 J1, J2 및 R1, R2, R3은 위에 정의된 것과 같고 Z2는 아미노산 측쇄 또는 이러한 측쇄의 유도체이다.
N-치환된 아미드 결합 라이게이션 생성물의, 접합된 전자 공여기 R1, R2 또는 R3은 N-C1 결합의 절단 및 N-치환된 아미드-연결 라이게이션 생성물로부터 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 제거를 용이하게 한다. 펩티드 상용성 절단 조건 하에서 N의 알킬 또는 아릴 티올 사슬의 제거는 라이게이션 부위에 천연 아미드 결합을 갖는 라이게이션 생성물을 생성한다. 제 1 및 제 2 성분이 펩티드 또는 폴리펩티드이면, 라이게이션 생성물은 다음의 화학식을 가질 것이다:
J1-CONαH-CH(Z2)-C(O)-J2 X
화학식 I에 대하여 대표적인 R1 치환기는표 2에 묘사된다.
화학식 II에 대하여 대표적인 R1, R2 및 R3 치환기는표 3에 묘사된다.
N-치환된 2 탄소 사슬 화합물에 관하여, 오르토 또는 파라 위치에서 벤질 및 피콜릴 전자-공여 치환기 R1', R3' 및 R5'의 위치결정은 라이게이션 후 Nα-결합의 확고한 절단을 위해 C1 탄소로의 전자적 접합을 유지시킬 필요가 있다. 그러나, R2 및 R3가 C2 및 C3과 벤질기를 형성할 때, R1' 및 R3' 중 적어도 하나는 강력한 전자 공여기를 포함하는데, 여기에서 R1' 또는 R3'은 메톡시 (-OCH3), 티올 (-SH), 히드록시 (-OH), 및 티오메틸 (-SCH3)로부터 선택된다. R2 및 R3이 수소인 N-치환된 3 탄소 사슬 티올에 대하여, R1은 R1', R3' 및 R5'가 강력한 또는 중간의 전자-공여기, 또는 그들의 조합을 포함하는 벤질 또는 피콜릴기를 포함한다. N-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올에 관하여, 강력한 전자-공여기는 라이게이션 후 절단에 대한 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 민감성을 향상시킨다. 그러므로 특별한 전자-공여기 또는 그것의 조합은 그에 따라 선택될 수 있다.
N-치환된 2 탄소 사슬 화합물과 유사하게, 본 발명의 N-치환된 3 탄소 사슬 화합물은 흥미있는 구성체에서 치환에 대하여 이용가능할 때 R1' 및 R5' 위치에서 R1'의 치환기로서 티올을 포함한다. 여기서 다시, 전자-공여 티올기는 C1에 접합되고 이 위치에서 그것의 도입은 화합물이 라이게이션 사건을 형성하는 6-원 고리에 대한 두 개의 경로를 갖게 할 수 있다. 이는 또한 이용가능한 티올의 국소 농도를 α-카르복시 티오에스테르와 반응하도록 증가시키고, 라이게이션을 개선할 수 있는 구조적 구속에 의한 추가적인 형태에 제공한다.
본 발명의 N-말단 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 아미노산의 합성은, 여기 설명된 것과 같이 수행될 수 있고 (예를 들어개요도 I및개요도 II), 업계에 공지된 표준 유기 화학 기술에 따라서 수행될 수도 있다. 예를 들어, "Advanced Organic Chemistry Mechanisms, and Structure", 4th Edition, J. March (Ed.), John Wiley & Sons, New York, NY, 1992; "Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group Preparations", R. Larock (Ed.), VCH Publishers, New York, NY, 1989를 참조한다. 이 아미노산은 용액에서, 폴리머-지지 합성에 의해, 또는 그들의 조합으로 합성될 수 있다. 바람직한 접근법은 N 알파 보호 N 알킬화 S-보호된 아미노 알킬- 또는 아릴- 티올 아미노산 전구체를 채택한다. 합성에 이용되는 시약은 다수의 제조사로부터 얻을 수 있다. 또한, 시작 성분 및 개개의 아미노산 유도체와 같은, 다양한 중간물이 차후 사용을 위해 저장될 수 있고, 키트 등으로 제공될 수 있다는 것이 잘 이해될 것이다.
본 발명의 N-말단 Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 아미노산의 제조에, 보호기 전략이 채택된다. 일반적으로 다양한 합성 전략에 사용되는 바람직한 보호기 (PG)는 고체상 펩티드 합성 (Solid Phase Peptide Synthesis, "SPPS")과 융화적이다. 몇몇 예에서, 상이한 조건 하에서 제거 가능한 직교성 보호기를 사용하는 것이 또한 필요하다. 많은 이러한 보호기는 공지되고 본 목적에 적당하다 (예를 들어, "Protecting Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition, T. W. Greene and P.G.M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; "Syythetic Peptides, A User's Guide", G.A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry", W.D. Bennet, J.W.Christensen, L.K. Hamaker, M.L. Peterson, M.R. Rhodes, and H.H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; 및 "Protecting Groups", P.J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994 참조). 예는 벤질옥시카르보닐 (Z), Boc, Bpoc, Trt, Nps, FmocCl-Z, Br-Z; NSC; MSC, Dde 등을 포함한다. 황 부분에 대하여, 적당한 보호기의 예는 벤질, 4-메틸벤질, 4-메톡시벤질, 트리틸, ACM, TACAM, 크산틸, 디설피드 유도체, 피콜릴, 및 페나실을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
더욱 특별하게, Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올은개요도 I(Nα-치환된 전구체의 고체-상 제조),개요도 II(Nα-치환된 전구체의 용액-상 제조)에 따라서 제조될 수 있다.개요도 I에서, Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올은 폴리머-지지 유기 합성의 표준 방법을 이용하여 고체 상에 직접 집합하고, 반면개요도 II의 Nα-보호된, N-알킬화된, S-보호된, 아미노알킬 또는 아릴티올 아미노산 전구체는 표준 커플링 프로토콜을 이용하여 레진에 커플링 된다. 라세미체 또는 부분입체 이성질체 생성물이 생산되면, 확장된 천연 화학적 라이게이션에 사용하기에 앞서 표준 방법에 의해 이들을 분리할 필요가 있다.
(개요도 I)
(개요도 II)
α-카르복시티오에스테르는, 실시예를 포함하여 여기 설명된 것과 같은, 업계에 공지된 표준 기술 후 화학적 또는 생물학적 방법에 의해서 생성될 수 있다.화학적 합성을 위하여, α-카르복시티오에스테르 펩티드는 용액내 또는 티오에스테르-생성 레진으로부터 합성될 수 있는데, 이 기술은 주지된다 (예를 들어, Dawsonet al.,상기; Canneet al.,상기; Hackenget al.,상기, Aimotoet al.참조).
예를 들어, 화학적으로 합성되는 티오에스테르 펩티드는 상응하는 펩티드 α-티오산으로부터 만들어질 수 있는데, 이는 차례로 티오에스테르-레진 상에서 또는 용액 내에서 합성될 수 있지만, 레진 접근법이 바람직하다. 펩티드-α-티오산은 상응하는 3-카르복시-4-니트로페닐 티오에스테르, 상응하는 벤질 에스테르, 또는 다양한 알킬 티오에스테르의 어떤 것으로 전환될 수 있다. 이 모든 티오에스테르는, 상응하는 벤질 티오에스테르보다 어느 정도 더 빠른 반능 속도를 예증하는 3-카르복시-4-니트로페닐 티오에스테르를 가지고 한, 라이게이션 반응에 만족스러운 이탈기를 제공하는데, 이는 차례로 알킬 티오에스테르보다 더 반응적일 수 있다. 또 다른 예로서, 트리틸-결합 머캅토프로프리온산 류신 티오에스테르-생성 레진은 C-말단 티오에스테르를 구성하는데 사용될 수 있다 (Hackenget al., 상기). C-말단 티오에스테르 합성은 또한 3-카르복시프로판설폰아미드 안전-장치 링커를 이용하여 디아조메탄 또는 요오드아세토니트릴로 활성화시킨 후 적당한 티올로 대치함으로써 성취될 수 있다 (Ingenitoet al.,상기; Bertozziet al.).
제 1 카르복시티오에스테르 성분을 갖는 본 발명의 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 성분의 라이게이션은, 라이게이션 부위에 N-치환된 아미드 결합을 갖는 라이게이션 생성물을 생성한다. 반응의 라이게이션 조건은 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 부분을 갖는 티오에스테르의 선택적인반응성을 유지하도록 선택된다. 바람직한 구체예에서, 라이게이션 반응은 pH 6 내지 8, 바람직한 pH범위는 6.5 내지 7.5인 완충용액에서 수행한다. 완충용액은 수성, 유기성 또는 그들의 혼합물이 될 수 있다. 라이게이션 반응은 또한 하나 이상의 촉매 및/또는 하나 이상의 환원제, 지질, 세제, 다른 변성제 또는 용해제 등을 포함할 수 있다. 바람직한 촉매의 예는 티올 및 포스핀으로, 이는 티오페놀, 벤질머캅탄, TCEP 및 알킬 포스핀과 같은, 부분을 함유한다. 변성 및/또는 용해제의 예는 구아니디늄, 물 또는 TFE, HFIP, DMF, NMP와 같은 유기 용매 중 유레아, 물과 혼합한 아세토니트릴, 또는 구아니디늄과 혼합한 아세토니트릴 및 물 중 유레아를 포함한다. 온도는 또한 라이게이션 반응의 속도를 조절하는데 이용될 수 있는데, 이는 보통 5℃에서 55℃ 사이이고, 바람직한 온도는 15℃에서 40℃ 사이이다. 한 예에서, 라이게이션 반응은 6.8 내지 7.8 사이의 pH에서 6M 구아니디늄 중 2% 티오페놀을 갖는 반응 시스템에서 양호하게 진행한다.
N-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올에 대하여, 라이게이션 사건은 COSR 티오에스테르 성분 및 아미노 알킬 티올 성분 사이에서 발생하는 티올 교환으로부터 일어난다. 교환은, 5-원 고리 중간물을 통한 자발적인 재배열 후 화학식 J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-J2의 제 1 라이게이션 생성물을 생성하는 티오에스테르-연결 중간 라이게이션 생성물을 생성하는데, 이 화학식은 라이게이션 부위에 제거 가능한 N-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C2-C1(R1)-]을 가지며 치환기는 위에 정의된 것과 같다. 라이게이션 부위에 N-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C2-C1(R1)-]은, 펩티드-상용성 조건 하에서,제거되어 라이게이션 부위에 천연 아미드 결합을 갖는 화학식 J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2의 최종 라이게이션 생성물을 생성할 수 있다.
N-치환된 3 탄소 사슬 아릴 또는 알킬 티올에 대하여, COSR 티오에스테르 성분 및 아미노 알킬 티올 성분 간의 티올 교환은 6-원 고리 중간물을 통한 자발적인 재배열 후 화학식 J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1-C2(R1)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-J2의 제 1 라이게이션 생성물을 생성하는 티올에스테르-연결 중간 라이게이션 생성물을 생성하는데, 이 화학식은 라이게이션 부위에 제거 가능한 N-치환된 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]을 갖는다. 라이게이션 부위에 N-치환된 3 탄소 사슬 아릴 티올 [HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]은, 펩티드-상용성 조건 하에서, 제거되어 라이게이션 부위에 천연 아미드 결합을 갖는 화학식 J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2의 최종 라이게이션 생성물을 생성할 수 있다.
N-치환된 알킬 또는 아릴 티올기의 제거는 바람직하게 N-C1 결합의 절단을 용이하게 하기 위해 산성 조건에서 수행되어, 라이게이션 부위에 안정화되고, 치환되지 않은 아미드 결합을 산출한다. "펩티드-상용성 절단 조건"에 의하여, 펩티드와 융화적이고 라이게이션 생성물로부터 알킬 또는 아릴 티올 부분의 절단에 적당한 물리-화학적 조건이 의도된다. 일반적으로 펩티드-융화적 절단 조건은 채택되는 α-치환된 화합물에 의존하여 선택되는데, 이 조건은 일상적이고 주지된 접근법을 통해 손쉽게 추론될 수 있다 (예를 들어, "Protecting Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition, T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; "Synthetic Peptides, A User'sGuide", G.A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry", W.D. Bennet, J.W. Christensen, L.K. Hamaker, M.L. Peterson, M.R. Rhodes, and H.H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; 및 "Protecting Groups", P.J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994 참조).
예를 들어, R1, R2 또는 R3 치환기가 메톡시, 히드록시, 티올 또는 티오메틸, 메틸 등을 포함할 때, 제거를 위한 더욱 보편적인 방법은 펩티드 합성 화학법에 대하여 전형적인 산성 절단 조건을 포함한다. 이것은 강한 산성 조건 또는 물-산성 조건 하에서, 환원제 및/또는 스캐빈져 시스템 (예를 들어, 무수 플루오르화 수소 (HF), 트리플루오로아세트산 (TFA), 또는 트리메틸술포닐 플루오르아세트산 (TMSFA)등과 같은 산)을 갖거나 갖지 않고, N-C1 결합의 절단을 포함한다. 더욱 특유한 산성 절단 시스템은 주어진 구조에 대한 아릴 또는 알킬 티오 부분을 제거하기 위해 Nα-C1 결합을 최적화하도록 선택될 수 있다. 이러한 조건은 주지되고 펩티드 본래 모습의 유지에 융화적이다. 특히 유리 아릴 또는 알킬 티올 부분과 트립토판 측쇄의 반응을 회피하기 위해 트립토판이 펩티드 또는 폴리펩티드 서열에 존재할 때, 티올 스캐빈져가 포함될 수 있다. 티올 스캐빈져의 예는 에탄디올, 시스테인, 베타-머캅토에탄올 및 티오크레졸을 포함한다.
다른 전문화된 절단 조건은 피콜릴기가 치환기일 때 광 또는 환원-절단 조건을 포함한다. 예로서, R1, R2 및 R3 치환기가 피콜릴 부분을 포함할 때, 광분해 (예를 들어, 자외선광), 아연/아세트산 또는 전자분해 환원이 표준 프로토콜 후 절단에 이용될 수 있다. N-치환된 2 탄소 사슬 티올의 R1이 R1에 티오메탄을 포함하면, 수은 또는 HF 절단이 이용될 수 있다. 절단 시스템은 또한 제 1 또는 제 2 라이게이션 성분이 다른 보호기를 포함할 때 고체 지지물로부터의 동시 절단 및/또는 탈보호제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서 Nα-치환된 2 또는 3 사슬 알킬 또는 아릴 티올이 펩티드 합성 단계 (특히 자동 펩티드 합성 및, 직교성 및 수렴성 라이게이션 전략)에 채택되어, 합성 생물활성 단백질을 산출하기 위한 확장된 화학적 라이게이션에 기질로서 사용될 수 있는 적당히 N-말단으로 유래된 폴리펩티드를 산출한다. 이러한 화합물은 화학식 (PG1)S-C2-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2 또는 (PG1)S-C3 (R3)-C2(R2)-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2의 완전히 보호된, 부분적으로 보호된 또는 완전히 보호되지 않은 산에 안정한 Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 포함하는데, 이는 아래표 IV및표 V에 묘사된다. 특히, 하나 이상의 R1, R2 및 R3은, Nα-치환된 아미드 알킬 또는 아릴 티올로 Nα-치환된 아미노 알킬 또는 아릴 티올의 전환 후, 펩티드 상용성 절단 조건 하에서 Nα-C1 결합의 절단을 용이하게 하는 공명 안정화된 양이온을 C1에서 형성할 수 있는, C1에 접합된 전자 공여기를 포함한다. PG1 및 PG2는 개별적으로 또는 조합으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있고 동일하거나 상이할 수 있는 결합기인데, 여기에서Z2는 화학적 펩티드 합성 또는 확장된 천연 화학적 라이게이션과 상용성인 어떠한 화학적 부분이고, J2는 화학적 펩티드 합성 또는 확장된 천연 화학적 라이게이션에 융화적인 어떠한 화학적 부부분이다. PG1 (또는 X1)은 아민을 보호하기 위한 기이다. PG2 (또는 X2)는 티올을 보호하기 위한 기이다. 많은 이러한 보호기가 공지되고 본 목적에 적당하다 (예를 들어, "Protecting Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition, T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide", G.A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry", W.D. Bennet, J.W. Christensen, L.K. Hamaker, M.L. Peterson, M.R. Rhodes, and H.H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; 및 "Protecting Groups", P.J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994 참조).
PG1 및 X1에 대한 바람직한 보호기의 예는 [Boc(t-부틸카르바메이트), Troc (2,2,2,-트리클로로에틸카르바메이트), Fmoc(9-플루오르에닐메틸카르바메이트), Br-Z 또는 Cl-Z(Br- 또는 Cl-벤질카르바메이트), Dde(4,4,-디메틸-2,6-디옥소시클로에틸-일리덴), MsZ(4-메틸설피닐벤질카르바메이트), Msc(2-메틸설포에틸카르바메이트), Nsc(4-니트로페닐에틸설포닐-에틸옥시-카르보닐)]을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 PG1 및 X1 보호기는 "Protecting Groups in Organic Synthesis" (Greene and Wuts, Third Edition, Wiley-Interscience, (1999))로부터 선택되고 Fmoc 및 Nsc가 가장 바람직하다. PG2에 대한 바람직한 보호기의 예는 [Acm(아세트아미도메틸), MeoBzl 또는 Mob(p-메톡시벤질), Meb(p-메틸벤질), Trt(트리틸), Xan(크산테닐), tButhio(s-t-부틸), Mmt(p-메톡시트리틸), 2 또는 4 피콜릴(2 또는 4 피리딜), Fm(9-플루오르에닐-메틸), tbut(t-부틸), Tacam(트리메틸아세트아미도메틸)]을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 보호기 PG2 및 X2는 "Protective Groups in Organic Synthesis"(Green and Wuts, Third Edition,Wiley-Interscience, (1999))로부터 선택되고, Acm, Mob, MeB, 피콜릴이 가장 바람직하다.
본 발명의 Nα-치환된 2 또는 3 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 보호 형태는 위의 개요도 I 및 II에서와 같이 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물은, 할로겐-중재 아미노 알킬화, 환원성 아민화를 포함하는 어떠한 다양한 수단 및, 고체상 아미노산 합성 방법과 융화적인 Nα-보호된, N-알킬화된, S-보호된, 아미노 알킬- 또는 아릴-티올 아미노산 전구체에 의해서 생산될 수 있다. 바람직하다면, 허용되는 키랄 순도의 화합물을 부여하기 위해 생산된 라세미체 또는 부분입체 이성질체의 분해는, 표준 방법에 의해 수행될 수 있다.
II. 본 발명의 생물활성 펩티드 및 단백질
A. 합성 생물활성 단백질
상술된 방법이 합성 생물활성 펩티드 및 단백질을 합성하는데 이용될 수 있다. 여기서 사용될 때, 만약 비-재조합 기술이 몇몇, 가장 바람직하게는 모든 아미노산 잔기를 폴리머화하는데 채택되었다면, 생물활성 단백질은 "합성"이라고 한다. 용어 "비-재조합 기술"은 유기화학 및 다른 합성 폴리머화를 포함하는 기술과 생체내 또는 시험관내에서 단백질로 RNA의 번역을 포함하는 기술을 구분하도록 의도된다. 가장 바람직하게, 본 발명의 합성 생물활성 단백질은 유기 화학의 원칙, 특히 여기에 고찰된 것과 같이, "천연 화학적 라이게이션" 및 "확장된 천연 화학적 라이게이션"의 방법을 이용하여 시험관 내에서 생산될 것이다. 이러한 화학적 합성은 수렴성 합성 접근법을 이용하여 바람직하게 이행될 수 있는데 여기에서 폴리펩티드 절편은 합성된 다음 또 다른 것과 라이게이션하여 합성 생물활성 단백질을 형성할 수 있다. 대안으로, 본 발명의 합성 생물활성 단백질은 단일 비-수렴 합성으로 합성될 수 있다.
위에 지적한 것과 같이, 본 발명의 합성 생물활성 단백질은 상당한 분자량을 갖는데, 바람직하게는 25 kDa보다 더 큰 것이다. 본 발명을 위하여, 이러한 분자량의 측정은 변성 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동에 의해 실행된다. 용어 "모노머 분자량"은, 다수의 단백질 또는 폴리펩티드 카피를 소유할 수 있는 합성 단백질과 구분하여, 모노머 합성 단백질의 분바량을 지칭하는 것으로 의도된다.
여기서 사용될 때, 합성 단백질은 만일 이것이 합성 단백질의 구조 또는 아미노산 서열에 의존하는 식별가능한 생물활성을 소유한다면 "생물학적 활성"을 가진다고 하는데, 이러한 구조 또는 서열에서의 이러한 변화는 단백질의 생물활성을 향상, 변경 또는 감약시킨다. 이러한 "생물학적 활성"은 촉매, 신호전달 또는 유도반응을 중재하는 단백질의 능력을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 여기서 사용될 때, 단백질은 자체의 소모 또는 영구 변경없이 기질을 산물로 전환함으로써 "촉매 활성을 중재한다"고 한다. 만약 단백질의 존재가 생물체,또는 그것의 조직 또는 세포로 하여금 유전자 발현, 세포 분화, 또는 세포 증식을 개시, 계속, 향상, 변경 또는 감약시키는 것을 야기하도록 한다면, 단백질은 "신호전달 또는 유도 반응을 중재한다"고 한다. 이러한 신호전달 또는 유도 반응에 대한 예는 사이토카인 발현 또는 사이토카인 발현에 대한 반응 유도, 적혈구생성 유도, 염증 및/또는 염증 과정 유도 또는 감약, 혈관신생 또는 혈관형성 개시, 아팝토시스 유도, 세포 주기 영향 등을 포함한다.
본 발명의 합성 생물활성 단백질의 생물활성은 또한 수용체, 리간드 또는 항체에 특이적으로 결합하는 단백질의 능력을 포함한다. 여기에서 사용될 때, 용어 "특이적" 결합은, 하전, 용해도, 소수성 등에 기초한 "비-특이적" 결합과 구분하여, 호르몬과 그것의 수용체, 또는 항체와 항원의 항원결정기 간에 존재하는 것과 같은, 구조적으로-기초된 결합 상호작용을 지칭하도록 의도된다.
본 발명의 합성 생물활성 단백질은 아미노산 잔기의 축합에 의하여 바람직하게 합성된다. 이러한 아미노산 잔기는 핵산으로 암호화되고, 리보솜에서 인스톨되는 아미노산: 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 시스테인, 글루타메이트, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린이 될 수 있다. 한 구체예에서, 특정 바람직한 합성 생물활성 단백질을 위해 선택된 아미노산 잔기는 그 단백질의천연, 또는 자연 서열이 될 것이다. 대안적 구체예에서, 선택된 아미노산 서열은 그 단백질의 천연 또는 자연 서열에 존재하는 아미노산 잔기의 위치에 N-말단 시스테인 잔기를 함유할 수 있는 폴리펩티드 절편으로부터 구성된 모든 것으로 구성될 수 있다. 이러한 잔기의 포함은 여기 설명된 천연 화학적 라이게이션의 원칙을 이용하여 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드와 라이게이션하는 것을 허용하고, 합성 생물활성 단백질을 생산하는 수렴 합성의 이용을 용이하게 한다.
나아간 구체예에서, 본 발명의 합성 생물활성 단백질은 "불규칙" 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 여기에서 사용될 때, 용어 "불규칙" 아미노산 잔기는 RNA에 의해 암호화되지 않고 리보솜으로 인스톨되지 않는 아미노산을 지칭하도록 의도된다. 이 관점에 있어서, 본 발명은 합성 생물활성 단백질의 디자인 및/또는 구성에 광범위한 선택성 및 융통성을 허용한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 비-리보솜 인스톨되는 아미노산의 예는: D-아미노산, β-아미노산, 위-글루타메이트, γ-아미노부티레이트, 오르니틴, 호모시스테인, N-치환된 아미노산 (R. Simonet al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89:9367-71; WO 91/19735 (Bartlettet al.), 미국 특허 제 5,646,285호 (Baindur)), α-아미노메틸렌옥시 아세트산 (아미노산-Gly 디펩티드 동소체), 및 α-아미노옥시산 등을 포함한다. 티오아미드, 비닐위치 아미드, 히드라지노, 메틸렌옥시, 티오메틸렌, 포스폰아미드, 옥시아미드, 히드록시에틸렌, 환원된 아미드 및 치환된 환원 아미드 동소체를 함유한 펩티드 유사체 및 β-설폰아미드(군)가 채택될 수 있다.
특히, 위-글루타메이트의 사용은 R 사슬 변경이 합성된 단백질로의 폴리머부가물 부착을 허용하므로 유리하다. 마찬가지로, N-말단 Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 아미노산이 채택될 수 있다. (말단에 존재하는) 이러한 잔기 (또는 폴리펩티드)는, 여기 설명된 확장된 천연 라이게이션의 방법에 따라, 카르복시 티오에스테르 부분을 갖는 폴리펩티드에 이 폴리펩티드를 라이게이션 하는데 유리하게 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 합성 생물활성 단백질의 모든 아미노산 잔기는 펩티드 결합(다시 말해, 아미드 결합)에 의해서 결합될 수 있다. 대안으로, 두 아미노산 잔기 (또는 두 폴리펩티드의 c-말단 및 N-말단 잔기)는 (티오에스테르 결합, 옥심 결합, 티오에테르 결합, 적접 이황화 결합, 티오졸리딘 결합 등과 같은) 비-아미드 결합에 의해서 다른 하나에 연결될 수 있다 (Schnolzer, M and Kent, S.B.H., Science (1992) 256:211-255; Rose, K., J. Amer. Chem. Soc. (1994) 116:30-33; Englebretsen, D.R.et al., Tetrahedron Lett. 36:8871-8874; Baca, M.et al., J. Amer. Chem. Soc. (1995) 117:1881-1887; Liu, C.F.et al., J. Amer. Chem. Soc (1994) 116:4149-4153; Liu, C.F.et al., J. Amer. Chem. Soc. (1996) 118:307-312; Dawson, P.E.et al.(1994) Science 266:776-779). 그러므로 본 발명은 다양한 펩티드 결합 변경, 대행 및 등전자의 교체가 생물활성 단백질의 제조에서 활용되도록 허용한다.
본 발명의 합성 생물활성 단백질은 포유류 (인간, 원숭이, 소, 쥐, 돼지, 양, 말 포함), 조류 또는 어류 단백질과 연관된 생물활성을 모방하는 생물활성을 소유하도록 디자인될 수 있다. 여기에서 사용될 때, 제 1 단백질은 만약 이 단백질이 제 2 단백질의 활성에 관하여 변경되거나, 향상되거나 또는 감약된 생물활성을 가진다면 제 2 단백질을 모방한다고 한다. 생물활성은 만약 이것의 존재가 적접 또는 간접적으로 단백질의 아미노산 서열에 의존한다면 단백질에 "연관되었다"고 한다.
대안의 구체예에서, 본 발명의 생물활성 단백질은 어떠한 상응하는 자연적 생물활성 대응체에 관계없이, 전체적 또는 부분적으로 엔지니어링될 수 있다. 본 발명의 바람직한 합성 생물활성 단백질은 수용체, 단백질 수용체 리간드를 포함한다. 이러한 단백질의 예는 부신피질자극 호르몬 수용체 및 그것의 생물활성 절편, 앤지오텐신 수용체, 심방근 나트륨이뇨 수용체, 브래디키닌 수용체, 성장 호르몬 수용체, 주화성 수용체, 다이놀핀 수용체, 엔돌핀 수용체, 효소 저해제 수용체, 피브로넥틴 및 그것의 생물활성 절편에 대한 수용체, 위장 및 성장 호르몬-방출 펩티드 호르몬, 황체형성 호르몬 방출 펩티드에 대한 수용체, 멜라닌세포 자극 호르몬에 대한 수용체, 뉴로텐신 수용체, 오피오이드 수용체, 옥시토신 수용체, 바소프레신 수용체, 바소토신 수용체, 부갑상선 호르몬 및 절편에 대한 수용체, 단백질 키나아제 수용체, 소마토스타틴 수용체, 기질 P 수용체를 포함한다.
본 발명의 합성 생물활성 단백질은 또한 효소, 및 키틴 또는 콜라겐 등과 같은 구조상의 분자를 포함한다.
더 나아간 구체예에서, 본 발명의 합성 생물활성 단백질은 사이토카인을 포함한다. 사이토카인은 세포에 의해 방출되어 세포-세포 상호작용, 통신 및 다른 세포의 행동 상의 특이적 효과를 조절하는 소형 단백질 또는 생물학적 인자 (5 내지20 kDa의 범위)이다. 여기에서 사용될 때, 용어 "사이토카인"은 인터류킨 ("IL")(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, 등); 림포키신 및 신호전달 분자 (예를 들어, 적혈구생성 자극 단백질(예를 들어, 에리스로포이에틴 (erythropoietin; EPO)), 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론), 성장 인자 (형질전환 성장 인자, 신경 성장 인자, 뇌 유래 성장 인자, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 간세포 성장 인자, T-세포 성장인자 (TGF, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3 등), 콜로니 자극 인자 (G-CSF, GM-CSF, M-CSF 등), 상피 성장 인자 (EGF, LIF, KGF, OSM, PDGF, IGF-I 등), 섬유아세포 성장 인자 (αFGF, βFGF 등)), 및 호르몬, 특히 성장 호르몬과 같은 단일 펩티드 호르몬을 포함하도록 의도된다.
사이토카인, 및 특히 주화성 사이토카인은 또한, 아미노산 서열이 본 발명의 범위 내에서 합성 생물활성 단백질의 디자인에 도움이 되도록 이용될 수 있는 단백질의 특히 바람직한 예를 포함한다. 사이토카인은 직접 또는 간접적으로 중재하는 백혈구 보충에 의하여, 또는 미생물 침입의 특정 부위에 축적되어 있는 백혈구의 활성화에서 중요한 신호로서 작용함으로써 선천성 및 후천성 면역반응에 관여한다. 프로-염증성 사이토카인인, 인터류킨-1β(IL-1β) 및 인터류킨-6(IL-6), 및 조절자는, 가용성 세포간 고착 분자인 인터류킨-8(IL-8)을 함유한 호중구의 보충 및 활성화를 반영한다 (Kotecha S.,European Journal of Pediatrics(1996) 155 Suppl 2:S14-17). 인터류킨-6은 급성기 반응, B 세포 분화, 및 항체 생산에 일차적으로 관련된 다기능성 사이토카인이다 (Akira S,et al: Interleukin-6 in biology andmedicine. Adv Immunol (1993) 54:1-78). 이 사이토카인은 단핵구, 대식세포, T 및 B 세포, 내피세포 및 섬유아세포를 포함하는 여러 상이한 세포에서 합성되고 분비된다. IL-6은 종종 많은 경고 상태에서 프로염증성 사이토카인인 TNF알파 및 IL-1으로 유도되고, 순환 IL-6은 급성기 반응의 유도에서 중요한 역할을 담당한다 (Xing Z,et al., J. Clin. Invest. (1998) 101(2):311-20). 백혈구 보충 및 활성화 모두에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미치는 사이토카인은 TNF-알파, 과립구-콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포-콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 및 케모카인 패밀리의 구성원을 포함한다. 백혈구 활성화의 상태를 지배적으로 조절하는 사이토카인은 인터페론-감마 (IFN-γ), 인터류킨-10 (IL-10), 및 인터류킨-12 (IL-12)를 포함한다. 사이토카인은 또한 다른 효과기 분자의 발현을 유도 또는 조절함으로써 미생물 제거에 영향을 미칠 수 있는데, 이는 자율분비 또는 측분비 형식으로 일어날 수 있다.
콜로니-자극 인자는 조혈모세포의 증식 및 성숙에 요구되는 다양한 골수 및 기질 세포에 의해 생산되는 사이토카인이다. 게다가, 이러한 인자가 성숙한 백혈구 집단의 효과기 세포 활성을 증가시키는 것으로 나타난다. 특히, G-CSF는 시험관 내 호중구의 생존을 연장하고, 호중구 식균 활성을 증가시키며, 호중구 호흡 격발을 향상시칸다 (Standiford TJ,et al., J. Invest. Med. (1997) 45:335-345). 반대로, GM-CSF는 호중구 및 대식세포 모두의 증식 및 성숙을 촉진하여; 이 사이토카인의 활성화 특징은 일차적으로 성숙한 대식세포 집단으로 지향한다 (Chen GH,et al., J. Immunol. (1994) 152:724-734).
케모카인으로도 지칭되는, 주화성 사이토카인의 6개의 밀접하게 관련된 하위패밀리가 특성 결정되었다. 이들 중, 적어도 두 하위 패밀리의 구성원은 폐의 항균 숙주 방어에 기여한다 (Mandujano J,et al., Amer. J. Respir. Crit. Care Med. (1995) 151:1233-1238; Baggiolini M,et al., Ann. Rev. Immunol. (1997) 15:675-705). IL-8, MIP (대식세포 염증 단백질)-2, KC, ENA-78, 및 NAP-2를 포함하는, C-X-C 케모카인 패밀리의 구성원은 우세한 호중구 자극 및 주화성 활성을 갖고, 반면 MCP (단핵구 화학유인 단백질)-1, MCP-2, MCP-3, RANTES, MIP-1알파, 및 MIP-1베타를 포함하는, C-C 패밀리는 대식세포, 림프구 및 호산구에 우세한 주화성 및/또는 활성화 효과를 나타낸다 (Huffnagle GB,et al., The Role Of Chemokines In Pneumonia, In Koch A, Strieter R, eds. Chemokines in Disease. Texas: R.G. Landis Co,:1996:151-168).
인터페론-감마는 T 세포 (알파 베타- 및 감마 델타- T 세포) 및 NK 세포에 의해 생산되는 사이토카인으로, 광범위의 폐 병원체에 대항하는 세포-중제 면역에 수단이 된다. 이 사이토카인은, 호흡기 격발의 자극, 항원을 나타내는 능력, 대식세포-유래 TNF 분비의 기폭, 및 균, 진균, 및 마이코박테리아 생물에 대항하는 향상된 시험관내 대식세포 항균 활성을 포함하는, 여러 대식세포 효과기 세포 기능을 활성화한다.
인터류킨-12는 Th1-타입 면역반응을 촉진하는 반면, Th2-타입 면역반응을 저해하는 사이토카인이다. 특히, IL-12는 Th1 T 세포 및 NK 세포의 발생을 자극하고, CD8+ 세포 및 NK 세포의 세포용해 활성을 증가시킨다. 가장 중요하게는, IL-12는 T세포 및 NK 세포로부터 IFN-감마의 주된 유도체로서 작용한다.
IL-12와 반대로, IL-10은 Th2-타입 면역반응의 발생을 촉진하는 반면, 세포-중재 (Th1-타입)면역반응을 저해한다 (Howard M,et al., J. Clin. Immunol. (1992) 12:239-247). 이 사이토카인은, 부분적으로 호중구 및 대식세포의 직접적인 탈-활성화 및, TNF, IFN-감마, 및 C-X-C 및 C-C 케모카인 두 패밀리 구성원 발현의 하향조절에 의해서, 유력한 항염증성을 발휘하는 것으로 나타났다. IL-10은 전신적 면역 세포 활성화의 상태에서 프로염증 사이토카인의 바람직하지 않은 생산을 감약시키는 수단이 된다.
EPO는 아미노산 서열이 적혈구생성-자극 활성을 갖는 합성 생물활성 단백질의 디자인에 도움이 되도록 사용될 수 있는 단백질의 특히 바람직한 예이다. EPO는 정상 상태 도중 적혈구 생산의 조절 및 출혈 후 적혈구량 회복의 가속화를 초래하는 중요한 인자이다 (Jelkmann, W. (1992) Physiol. Reviews 72:449; Krantz, S.B. (1991) Blood 77:419; Porter, D.L. and M.A. Goldbert (1993) Exp. Hematol. 21:399; Nissenson, A.R. (1994) Blood Purif. 12:6). 인간 EPO의 순환 형태는 대략 30,000의 분자량을 갖는 165 아미노산(aa) 글리코단백질이다 (Sawyer, S.T.et al.(1994) Hematol. Oncol. Clinics NA 8:895; Jacobs, K.J.et al.Nature (1985) 313:806; Lin, F-K.et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:7580). EPO에 대한 cDNA는 166 아미노산 잔기를 가진 분자를 예견함에도 불구하고, 카르복시-말단의 아르기닌은 번역-후 번경에서 제거된다 (12). N-연결된 글리코실화를 위한 세 개의 잠재적 부위가 있고 모두가 충족된다. 하나의 O-연결된 카르보히드레이트 부분이 또한 존재한다 (13). 글리코실화의 효과는 복잡하다. 글리코실화되지 않은 E.coli-유래 EPO가 시험관내에서 완전한 생물학적 활성을 나타냈음에도 불구하고, 글리코실화는 생체내에서 완전한 활성을 위해 확실히 필요하다. 그러므로, E.coli-생산 및 탈글리코실화된, 자연적으로 유래된 EPO는 동물 연구에서 매우 낮은 활성을 나타낸다 (Krantz, S.B. (1991) Blood 77:419; Sasaki, H.et al.(1987) J. Biol. Chem. 262:12059; Lowy, P.H.et al.(1960) Nature 185:102; Wojchowski, D.M.et al.Biochem. Biophys. Acta 910:224; Dordal, M.S.et al.(1985) Endocrinology 116:2293).
위와 마찬가지로, 다양한 글리코실화 패턴은 다양한 효과를 나타낸다. 예를 들어, 탈시알산화된 EPO는 향상된 시험관내 및 감소된 생체내 활성 모두를 나타내는데, 이는 인지되고, 결합되고, 간세포에 의해 제거되는 갈락토오스 잔기의 노출에 기여하는 효과이다 (Spivak, J.L. and B.B. Hogans (1989) Blood 73v:90; Goldwasser, E.et al.(1974) J. Biol. Chem. 249:4202). 완전히 시알산화된 EPO의 분지 패턴은 또한 생물학적 활성에서 차이점을 만든다. 우세하게 테트라-안테나형으로 분지된 EPO는 "표준"EPO와 동등한 활성을 나타내고, 반면 우세하게 바이-안테나형으로 분지된 EPO는 시험관 내에서 세배의 활성을 나타내나 생체내에서는 정상 활성의 15%만을 나타낸다 (Takeuchi, M.et al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7819). 연구는 O-연결된 당이 아닌, N-연결된 당만이 EPO 기능에 중요하다는 것을 지적하였다 (Higuchi, M.et al.(1992) J. Biol. Chem. 267:770319).
콜로니-자극 인자 및 RANTES는 또한 특히 바람직한 단백질의 예를 포함하는데 이 단백질의 아미노산 서열은 본 발명의 범위 내에서 합성 생물활성 단백질의 디자인에 도움이 되도록 사용될 수 있다.
B. 폴리머-변경 단백질 및 폴리펩티드
본 발명의 제 2 특성은 단백질 또는 폴리펩티드가 사전선택된 부위에 하나 이상의 구조적으로 정의된 폴리머 부가물을 함유하도록 변경시키는 능력에 관계있다. 폴리머-변경 단백질이 앞서 설명되었음에도 불구하고, 본 발명의 가능한 폴리머-변경의 성질 및 수단은 이러한 앞선 노력과 현저하게 상이하다.
본 발명의 합성 생물활성 단백질이, 전부 또는 일부 화학적으로 합성되었기 때문에, 폴리펩티드 및 단백질 백본에 있는 하나 이상의 특정한, 사용자-선택된, 사용자-정의된 부위에 폴리머 (폴리에틸렌 글리콜, 글리콜, 히알루론산 등과 같은 폴리머 또는 당)를 공유적으로 결합시키는 것을 허용하는 수단으로 이러한 단백질을 합성하는 것이 가능하다. 더구나, 본 발명에서 단백질의 합성 생산은 이러한 변경이 제조에서 모든 분자의 사용자-선택된 및 사용자-정의된 부위 각각에 존재한다는 것을 보장하도록 허용한다. 이러한 합성의 균일성 및 제어는 종래 기술의 방법의 이용에 허용되는 무작위 변경과 본 발명을 현저하게 구별한다. 중요하게, 본 발명은 어떠한 비-중요 잔기가 폴리머 부가물을 함유하도록 유도될 수 있는 합성 단백질을 디자인하도록 허용한다. 더구나, 이러한 각각의 사용자-선택된 및 사용자-정의된 부위에 있어서, 사용자는 이러한 부가물들이 폴리펩티드 또는 단백질 백본에 결합됨을 통해 정확한 연결 (아미드, 티오에스테르, 티오에테르, 옥심 등)을 정의할 수 있다. 게다가, 특정 부위에 존재하는 것이 바람직한 특정 폴리머 부가물은다양화 및 제어될 수 있어서, 존재하는 모든 단백질 또는 폴리펩티드가 정확하게 동일한 유도 부위에 정확하게 동일한 유도 부가물을 함유하는 데에서 최종 제조물을 얻는다. 그러므로, 본 발명은 폴리머-변경 폴리펩티드 및 단백질의, 동종의 제조물의 형성을 허용한다.
폴리머가 결합할 수 있는 부착 부위의 위치 및 수를 다양하게 하기 위한 수단을 제공하는 것 외에, 본 발명은 결합 폴리머의 성질을 다양하게 하도록 허용한다. 어떠한 특정 사용자-선택된 및 사용자-정의된 부위 내로 통합될 수 있는 폴리머 부가물은, 어떠한 정의된 길이의 것일 수 있다. 이와 유사하게, 본 발명의 방법과 마찬가지로, 상이한 부위에 상이한 길이의 폴리머를 채택하는 것이 가능하다. 그러므로, 한 구체예에서, 본 발명의 합성 생물활성 단백질은 폴리머 부가물을 갖는 모노-변경되거나, 또는 폴리-변경될 수 있다. 하나 이상의 폴리머 부가물이 특정 폴리펩티드 또는 단백질 내로 도입되었다면, 채택 폴리머는 "모노-종분화", "폴리-종분화", "균일 종분화", 또는 "다양하게 종분화"될 수 있다. 여기서 사용될 때, 용어 "모노-종분화"는 단일 종의 폴리머에 의해 변경된 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭하도록 의도된다. 반대로, 용어 "폴리-종분화"는 단일 폴리머 종 이상의 것에 의해 변경된 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭하도록 의도된다. 만약, 폴리펩티드 또는 단백질 각각의 변경된 부위에, 동일한 단일 폴리머 종이 존재한다면, 이러한 폴리-종분화 폴리펩티드 또는 단백질은 "균일-종분화"된 것이라고 한다. 반대로, 만약 폴리펩티드 또는 단백질의 변경된 부위가 상이한 종의 폴리머로서 변경된다면, 폴리-종분화 폴리펩티드 또는 단백질은 "다양하게-종분화"된 것이라고 한다.
더욱이, 각각의 사용자-선택된 및 사용자-정의된 부위에서 폴리머 부가물의 직선 길이 또는 분지 형성의 정도를 다양하게 하는 것이 가능하다. 그러므로 폴리머 부가물은 직선이거나, 분지되거나, 또는 균일하게 분지될 수 있다. 용어 "균일하게 분지된"은 특정 부위에서 폴리머의 모든 분지가 동일한 구조 및 길이를 갖는 것을 의미하도록 의도된다. 본 실험자들이 인정한 것과 같이, 본 발명은 어떠한 각 분지의 길이는 물론이고, 이러한 분부위에 존재하는 폴리머의 구조 모두를 독립적으로 다양하게 하는 것을 허용한다.
결국, 본 발명은 폴리펩티드 또는 단백질 백본에서 폴리머-변경된, 사용자-선택된 및 사용자 정의된 부위의 (1)위치 선정 및 (2)빈도를 정의하는 것은 물론이고, 이러한 각 부위에 존재하는 분지의 (3)길이, (4)종, 및 (5)등급을 제어하는 것을 허용한다. 게다가, 다수의 폴리머 변경을 갖는 폴리펩티드 및 단백질에 관하여, 본 발명은 각 부위에 대해 각각의 상기-규명된 5개의 변수를 독립적으로 정의하도록 허용한다. 더욱이, 분지된 폴리머 변경을 갖는 폴리펩티드 및 단백질에 관하여, 본 발명은 각 분부위에 대해 각각의 상기-규명된 5개의 변수를 독립적으로 정의하도록 허용한다. 그러므로, 본 발명은 폴리머 변경의 실질적인 유동성을 제공한다.
C. 단백질 및 펩티드 송달
본 발명의 임의적으로 폴리머-변경된 합성 생물활성 폴리펩티드 및 단백질은 질병 및 상태의 치료를 이루기 위한 약제로서 채택될 수 있다. 가장 바람직하게는, 치료를 필요로하는 환자 또는 개체로 투여될 때, 이러한 합성 생물활성 폴리펩티드 및/또는 단백질은 약물 송달 시스템을 이용하여 투여될 것이다. 이러한 시스템의이용은 환자에게 허용되고 바람직한 생물활성의 효과를 향상시키는 수단으로, 환자에게 약물이 공급되게 할 수 있다. 본 발명의 목적인, 바람직한 약물 송달 시스템은 경구, 경비, 또는 흡입 경로, 또는 근육내, 피하, 경피, 혈관내, 벽내 또는 안구내로 폴리펩티드 또는 단백질을 투여할 수 있는 시스템을 포함한다.
이러한 약물 송달 시스템은 부위-특이적 분비를 제공하거나, 장 점막에 대한 보호를 향상시키는 제제를 포함할 수 있다. 적당한 제제는: 건조 분말 제제, 바이러스 입자 캡슐화를 통한 송달, 리포솜 캡슐화, 경피 팻치, 전기적으로 원조되는 전달(전기영동 요법) 및 폴리머/니아존 접합을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 이러한 약물 송달 장치는 생물학적 환경에서의 변화에 반응하고 이러한 변화에 기초하여 약물을 송달하거나-또는 송달 중지-할 것이다. 재료의 범위는 약물 침 다른 활성제의 분비를 제어하도록 채택되었다. :친수성 및 강도를 위한 폴리(우레탄), 폴리(실록산), 폴리(메틸 메트아크릴레이트), 폴리(비닐 알콜) 및, 폴리(에틸렌), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(2-히드록시 에틸 메트아크릴레이트), 폴리(n-비닐 피롤리돈), 폴리(메틸 메트아크릴레이트), 폴리(비닐 알콜), 폴리(아크릴산), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌-공-비닐 아세테이트), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(메트아크릴산) 등. 그 이상의 바람직한 구체예에서, 생분해가능성 폴리머가 약물 송달을 용이하게 하기 위해 채택될 수 있다. 이러한 폴리머는 폴리락티드 (PLA), 폴리글리콜리드 (PGA), 폴리(락티드-공-글리콜리드) (PLGA), 폴리안히드리드 및 폴리오르토에스테르를 포함한다. 약물 송달 장치 및 이들의 이용 방법은 미국 특허 제 6,072,041; 6,041,253; 6,018,678; 6,017,318; 6,002,961;5,879,712; 5,849,331; 5,792,451; 5,783,212; 5,766,633; 5,759,566; 5,690,954; 5,681,811; 5,654,000; 5,6410,511; 5,438,040; 5,810,499; 및 4,659,558 호에 설명된다.
Ⅲ. 합성 생물활성 단백질의 생산
본 발명의 합성 생물활성 단백질의 생산은 다음 단계 또는 성분을 가짐으로써 계획될 수 있다: 디자인, 합성. 펩티드 라이게이션, 단백질 폴딩, 생물활성의 평가, 폴리펩티드 백본의 폴리머 변경(도 2).
A. 바람직한 합성 생물활성 단백질의 디자인
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 합성 생물활성 단백질은 적혈구생성 자극 단백질이 될 것이다. 여기에서 사용될 때, 적혈구생성 자극 단백질은 적혈구 세포의 생산을 중재하는 단백질이다. 단백질의 적혈구생성 자극 생물활성은 어떤 다양한 수단에 의해서 측정될 수 있는데, 이러한 수단은 생체내 투여 후 적혈구생성의 추적, EPO-의존 세포주의 증식을 중재하는 단백질 능력의 검정 등이다.
바람직한 적혈구생성 자극 단백질은 포유류, 가장 바람직하게는 인간의 EPO 및 그것의 유사체이다. 에리스로포이에틴은 우세하게 합성되고 신장의 관 및 측관 모세혈관 내피 및 간질 세포에 의해 분비된다. 만성 신장 질환은 신장에서 EPO-생산 세포의 파괴를 야기한다. EPO의 결과적 결여는 빈번하게 빈혈증을 유도한다. 그러므로 EPO의 주된 임상적 사용은 보통 수혈을 받는 중증 신장 부전 (0.3 이하의 적혈구 용적률) 환자의 치료는 물론이고 화학요법 후 빈혈 환자의 치료이다. 전형적으로, EPO는 임상적 사용을 위해 햄스터 난소에서 재조합적으로 합성된다. EPO는성숙 형태에 있어서 165 아미노산 잔기의 비교적 열- 및 산-안정성 산성 (pI=4.5) 단백질이다. EPO는 EPO-수용체를 통하여 그 활성을 운반한다. EPO 분자량의 대략 40 퍼센트 정도가 그것의 글리코실화에 기인한다. 글리코실화는 생체내 EPO의 약물동력 작용을 결정하는 중요한 인자이다. 여전히 그 수용체와 결합하여 시험관내에서 더 높은 특이적 활성을 가질 수도 있다. 그러나, 최근 실험은 EPO의 PEG화가 그것의 수명을 유의하게 향상시키는 반면, 세포-기초 검정 시스템에서 EPO 활성을 유의하게 감소시킨다는 것을 나타내었다.
본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질 ("SEP")는 바람직하게 인간 비뇨 EPO의 화학적으로 변경된 유사체이다. 바람직한 구체예에서, 이 단백질은 티오에테르, 옥심, 아미드 또는 다른 연결을 통하여 하나 이상의 펩티드 잔기에 부착된 하나 이상의 폴리머 부분 (가장 바람직하게는 pPEG 부분)을 함유한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 이러한 연결은 인간 비뇨 EPO에서 자연적으로 글리코실화된 하나 이상의 위치 (즉, 위치 24, 38, 83 및 126)에 있을 것이다. 가장 바람직하게는, SEP 분자가 둘 이상의 이러한 위치에 pPEG를 갖을 것이다. 대안적 구체예에서, 다른 단백질 잔기는 폴리머 부분에 의해 변경될 수 있다. 본 발명의 합성 생물활성 단백질에 대한 변경의 위치는 혼란된 루프, 단백질의 영역 또는 도메인, 또는 잠재적 프로타아제 절단의 위치 또는 그 부근에 위치하는 잔기를 포함한다. 예를 들어, 폴리머 변경은 EPO의 9, 69 및/또는 125 중 하나 이상의 위치에 도입될 수 있다. 본 발명의 SEP 분자의 전체 분자량은 약 25부터 약 150kDa, 및 더욱 바람직하게는 약 30부터 약 80kDa까지 다양할 수 있다. 분자량은 주어진 유사체의 변경에 이용되는(pPEG과 같은) 폴리머의 수 및 구조를 증가 또는 감소시킴으로써 제어될 수 있다. 더 큰 구성체에 대해 pPEG 중재 유체역학적 MW는 약 100kDa보다 크다. 인간 EPO 수용체를 발현하는 세포에서 시험관내 검정은, 본 발명의 SEP가 재조합으로 생산된 글리코실화 인간 EPO의 ED50과 동등한 ED50을 갖는다는 것을 지적한다.
옥심-연결된 pPEG 유사체는 바람직하게 아미노옥시, 케톤 또는 알데히드 기능화된 pPEG를 SEP 단백질의 측쇄 아미노옥시, 케톤 또는 알데히드 기능성을 가진 자연적으로 암호화된 아미노산에 부착시킴으로써 구성된다. 예를 들어, SEP-0 및 1의 위치 89 및 117은 위 글루타메이트 (화학식 -CHα-CH2-S-COOH의 측쇄를 가진 비-자연적으로 암호화된 아미노산 (글루타메이트 측쇄 -CHα-CH2-CH2-COOH와 비교))를 함유한다. 티오에테르 연결을 이용하는 SEP 유사체는 바람직하게 티올을 가진 측쇄를 갖는 시스테인 또는 비자연적 아미노산에 의해 제공되는 티올 기능성을 함유하도록 제작된다.도 3은 바람직한 합성 적혈구생성 자극 단백질의 한 타입의 기본 구조를 나타낸다.
대안적 구체예에서, 본 발명의 SEP 분자는 EPO의 자연적 아미노 및 카르복시 말단이 재위치된 "환상 치환된" EPO 유사체를 포함한다. 가장 바람직하게는, 이러한 재배치가 아미노 및 카르복시 말단을 혼란된 루프 등과 같은 낮은 구조적 구속의 위치로 이동시킬 것이다. 위치 125 및 126 (천연 EPO 잔기 넘버링 시스템에 관련)주위의 혼란된 루프는 이러한 재위치 부위의 예이다. 가장 바람직하게는, 이러한 SEP는 2황화물이 없고, 사전선택된 잔기에 폴리머 부분을 함유하도록 화학적으로 변경될 것이다.
대안으로, SEP 분자는 자연적으로 일어나는 글리코실화 부위, 또는 위치 126 및 125와 같이, 글리코실화될 여지가 있는 다른 부위에 재위치된 아미노 및 카르복시 말단을 가질 수 있다. SEP 분자는 또한 아미노 및 카르복시 말단의 변경을 포함하여 (카르복시 아미드화 등에 의해서) 변화를 제거하거나 변경할 수 있다.
이러한 환상 치환된 분자의 바람직한 예에서, 새로운 N- 및 C-말단은 각각 위치 126 및 125에 의해 제공된다. 위치 7, 29, 32 및 161에 자연적 2황화물 형성 시스테인은 바람직하게, 자연적으로 암호화된 아미노산, L-α-N-부티르산 (Aba)에 의해 대치되는데, 이는 2황화물 다리를 형성할 수 없다. 잔기 R166, E37 및 V82는 바람직하게 생산을 개선하기 위해 알라닌으로 대치된다. 또한, 추가적인 시스테인은 바람직하게 천연 EPO 번호 개요도에 관련된 위치 1 및 166 사이에 삽입되는데, 이는 아래 '0'으로서 번호 매긴다. 결과적 분자는 ((N- 에서 C-말단 방향으로 판독될 때) 위치 126, 0, 38 및 83에) 4개의 시스테인을 함유하고, 이는 (1)라이게이션 부위 및 (2)티오에테르-형성 pPEG 부착 부위로서 사용된다. 임의적으로, 시스테인은 추가적인 pPEG 부착 부위를 제공하기 위해 A125를 대치할 수 있다. 본 발명의 이러한 SEP 분자의 총 분자량은 약 25부터 약 150 kDa까지, 더욱 바람직하게는 약 30부터 약 80 kDa까지 다양할 수 있다. 분자량은 주어진 유사체의 변경에 이용되는 (pPEG과 같은) 폴리머의 수 및 구조를 증가 또는 감소시킴으로써 제어될 수 있다. 더 큰 구성체에 대해 pPEG 중재 유체역학적 MW는 약 100kDa보다 크다. 임의적 pPEG 부착 부위는 (N- 에서 C-말단 방향으로 판독될 때) 위치 125, 9 및 24에 위치된다.추가적인 SEP 유사체 디자인은 혼란된 루프 영역에 대안의 N- 및 C-말단, 및/또는 새로운 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부절단된 잔기를 갖는다. 바람직한 환상 치환된 분자의 기본 구조는도 4에 나타난다.
대안적 구체예에서, 본 발명의 합성 생물활성 단백질은 포유류, 가장 바람직하게는 인간 GCSF이다. GCSF는 호중 과립구의 빠른 증식 및 혈류로의 분비를 유도함으로써, 감염과의 싸움에 치료 효과를 제공한다. 인간 GCSF 단백질은 길이에서 174 아미노산이고 (특허:EP 0459630 (Camble, R.et al.), 그 서열의 변체가 분리되었다. 단백질은 4개의 시스테인 잔기 및 트레오닌 위치 133에 하나의 O-글리코실화 부위를 갖는다.
이러한 합성 GCSF 분자의 한 구체예에서, 분자의 아미노산은, 천연 GCSF의 서열에 비하여, 위치 1, 2 또는 3 중 하나 이상에 자연적, 또는 더욱 바람직하게는 비-자연적으로 암호화된 소수성 잔기를 함유하도록 변화될 것이다. 임의적으로, 이러한 분자는 추가적인 자연, 또는 더욱 바람직하게는, 비-자연적으로 암호화된 소수성 잔기를 GCSF의 위치 5, 및/또는 위치 173 및/또는 174에 함유하도록 더욱 변경될 것이다.
더 나아간 바람직한 구체예에서 합성 GCSF 분자는 위치 63, 64 및/또는 133 중 하나 이상, 및/또는 위치 1 및 174 중 하나 이상에서 폴리머-변경 (바람직하게는 pPEG)될 것이다. pPEG 폴리머는 직선 또는 분지된 것일 수 있고, 하전, 비하전, 또는 혼합될 수 있고; 약 5부터 약 80 kDa까지, 더욱 바람직하게는, 약 40부터 약 70 kDa까지인, 변경에 사용되는 pPEG의 수 및 구조에 의존하는 pPEG 총 MW 분포의분자량 범위를 가질 수 있다. 유체역학적 반경은 생체 내에서 더 큰 MW 효과를 나타낸다 (예를 들어, 10 kDa의 분지된 pPEG는 약 55 kDa의 유효 MW를 나타낸다). 추정된 pPEG 중재 유체역학적 MW는 100 kDa보다 크다.
옥심 연결을 이용하는 유사체에 대하여, pPEG는 바람직하게 측쇄 아미노옥시, 케톤 또는 알데히드 기능성을 갖는 비-자연적으로 암호화된 잔기에 부착된다. 티오에테르 연결을 이용하는 유사체에 대하여, pPEG는 바람직하게 티올을 가진 측쇄를 갖는 시스테인 또는 비자연적 아미노산에 부착된다. 아미드 연결을 이용하는 유사체에 대하여, pPEG는 반응성 측쇄 아민을 갖는 자연적 또는 비자연적 아미노산에 부착된다.
합성 생물활성 GCSF 단백질의 기본 구조는도 5에 나타난다. 이 도면에서, "J"는 소수성 측쇄를 가진 비-자연적으로 암호화된 잔기를 가리킨다.
이러한 합성 생물활성 GCSF 단백질의 생물활성은, 인자-의존성 인간 또는 마우스 세포주 (예를 들어, NF60 세포주)의 증식을 중재하는 능력의 검정에 의한, 또는 (>20일의 반감기/분비를 표적화하는 송달 시스템을 가지고 또는 이것 없이) 생체내에서 호중구 자극, 반감기 및 면역원성의 측정에 의한 것과 같은, 전통적인 수단에 의해서 검정될 수 있다.
한 대안적 구체예에서, 본 발명의 합성 생물활성 단백질은 포유류, 가장 바람직하게는 인간 케모카인인, RANTES이다. RANTES는 1차 수용체 CCR5를 통해 M-향성 HIV 주의 출입을 차단하고, 또한 천식, 이식 거부반응 및 상처 치유에 관련된 염증 경로를 하향-조정한다 (Kalinkovich A,et al., Immunol Lett. (1999) 68:281-287). 본 발명의 합성 RANTES 분자는 바람직하게: (1) RANTES 1 내지 68의 위치 1에서 발견되는 N-말단 세린이 n-논아노일 ("NNY")기로 치환되는 것; 및 (2) 위치 3의 티로신이 소수성 측쇄를 갖은 비-자연적으로 암호화된 아미노산으로 치환되는 것과 같이, 화학적으로 변경되고 있는 RANTES 케모카인과 상이하다. 이러한 화합물은 극히 유력하며, 재조합 "Met-RANTES 1-68"에 대한 mM 범위에 비하여, pM 범위에서 E50을 소유하고 있는 것으로 나타난다.
유력한 RANTES 유사체는, 소수성 측쇄를 갖는 비-자연적으로 암호화된 아미노산으로 위치 2에서 프롤린의 대치, 및 분자의 C-말단에 지방산의 부착에 의한 대치와 같은, 상기된 하나 이상의 추가적 변화를 갖도록 제조되었다. 수용체 특이성은 RANTES 잔기 12 내지 20에 상응하는 N-루프 영역으로의 변경에 의해서 효능과 공동으로 개선되었다. 더 나아간 바람직한 구체예에서, 본 발명의 합성 RANTES 분자는 특히 생체내 반감기를 개선하도록 그것의 N- 또는 C-말단에 (pPEG 또는 논아노이 ("NNY")와 같은) 폴리머 부분 또는 Y3X를 통합한다. pPEG 부분은 바람직하게 옥심 연결, 또는 위치 68, 바람직하게는 위치 67에 있는 링커를 통해 위치 66, 67, 68에 도입된 비-자연적으로 암호화된 아미노산에 부착된다. 지방산은 부람직하게 옥심 연결 (바람직하게는 링커)을 통해 잔기 68에 부착되는데, 이러한 잔기는 아미노-옥시 변경된 아미노산 디- 또는 트리-펩티드 링커이다. 다른 부착 화학법이 대안으로 선택될 수 있다. 이러한 합성 RANTES 유사체의 더 큰 구성체의 분자량은 pPEG 부착의 성질 및 구조에 의존하여 약 25 kDa부터 약 45 kDa까지의 범위이고, 더 큰 구성체에 대하여 60 kDa 이상의 pPEG 중재 유체역학적 MW을 갖는다. 바람직한 합성 RANTES 유사체의 구조는도 6에 나타난다.
B. 합성 생물활성 단백질 및 펩티드의 정의되고 특이적인 폴리머 변경
본 발명의 나아간 양태는 화학적 부분 및 폴리머 (특히 수용성 폴리머) 및 비변경된 단백질에 비해 개선된 성질을 갖는 단백질 약물을 생산하기 위해 단백질을 변경하는 그것의 사용에 관련된다. 이러한 변경의 기대되는 유익 효과는 (a) 개선된 효능 (b) 순환하는 동안, 증가된 단백질 분해 안정성 및 감소된 제거율로 인한 단백질 약물의 더 긴 수명 (c) 감소된 면역원성 및 (d) 비변경된 분자에 비하여 차별적인 표적화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
위에 고찰한 것과 같이, 폴리에틸렌 글리콜이 단백질을 변ㅅ경시키는데 채택되었음에도 불구하고 (예를 들어, 미국 특허 제 6,027,720, Kugaet al.를 참조-이는 G-CSF의 리신 잔기를 변경하여 반응성 아민 기를 통해 폴리에틸렌 글리콜 분자의 부착을 허용하도록 하는 것에 관련된다), 이러한 변경은 분자 이질성 및 분자 다양성에 연관된다.
여기에서 사용될 때, 용어 "분자 이질성"은 단백질 제조물의 각 단백질에 부착된 폴리머 분자 수에서의 변화를 지칭하도록 의도된다. 용어 "분자 다양성"은 (a) 폴리머에 의해 변경되는 단백질 부위에서의 변화, (b) 동일한 단백질의 상이한 부위, 또는 단백질 제조물의 상이한 단백질에 있는 동일한 부위의, 폴리머 부가물 길이에서의 변화, (c) 동일한 단백질에서 상이한 부위의, 또는 단백질 제조물의 상이한 단백질에서 동일한 부위의 폴리머 부가물의 어떠한 분지 형성 정도 및/또는 특성에서의 변화를 지칭하도록 의도된다. 여기에서 사용될 때, 용어 "분자적으로상동한"은 모든 단백질 분자가 동일한 위치에 아미노산 서열 및 동일한 폴리머 변경을 포함하는 단백질의 제조물을 지칭하도록 의도된다. 둘 이상의 "분자적으로 상동한" 단백질 제조물의 혼합물은 여기에서 "분자적으로 정의된" 제조물로서 지칭된다.
본 발명의 이러한 양태에 따라서, 폴리머 이질성, 다양성, 및 부적당성의 상기-규명된 문제에 대한 해결책은 폴리펩티드 (정확한 길이, 편리한 합성) 및 "pPEG" ("정밀 PEG"; 유동성, 양친매성, 비-면역원성인, 프로테아제를 허용하지 않는 폴리머: Rose, K.et al., 미국 특허 출원 제 09/379,297 호, 참고문헌으로서 여기 수록)의 장점을 조합한 새로운 분류의 생체교합성 폴리머의 생산을 포함한다. 이 새로운 분류의 생체교합성 폴리머는 다음의 화학식을 갖는다:
-[CO-X-CO-NH-Y-NH]n-
n은 바람직하게 1 내지 100 및 더욱 바람직하게는 2 내지 100인 정수이고, 상기 식에서, X 및 Y는 아미드 결합에 의해 연결된 정확한 구조의 생체교합성 반복 요소이다. 바람직하게는, X 및 Y가 반응성 작용기가 결여된 2가의 유기 라디칼이거나 없을 수 있고 동일하거나 상이할 수 있으며, 각 반복 유닛으로 독립적으로 변화할 수 있다. 바람직하게는, n=2일 때, X 또는 Y 중 적어도 하나가 치환, 비치환, 분지 및 직쇄상의 지방기 및 방향족으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 2가 유기 라디칼인 X 또는 Y 중 적어도 하나가 페놀, C1-C10알킬렌 부분, C1-C10알킬기, 헤테로원자-함유 페놀, 헤테로원자-함유 C1-C10알킬렌 부분,헤테로원자-함유 C1-C10알킬기, 및 그것의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
특히 바람직한 pPEG 부분은 다음의 화학식을 갖는다:
-{CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-}n-
(상기 식에서 n은 바람직하게 1 내지 100, 더욱 바람직하게는 2 내지 100까지 다양하다); 또는
-{CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-}n-
(상기 식에서 n은 바람직하게 1 내지 50, 더욱 바람직하게는 2 내지 50까지 다양하다).
이러한 pPEG 부분은 어떠한 다양한 방식으로 합성될 수 있다. 그러나, 이러한 부분은 바람직하게, 폴리머형성 과정보다는 유닛의 고체상 순차적 연쇄 집합을 이용하여 생산된다. 이러한 집합 과정의 이용은 제조물의 부분이, 부분의 길이, X 및 Y 치환기의 특성, (만약 있다면) 분부위의 위치, 및 길이에 관하여, 정의되고 상동한 구조, X 및 Y 치환기 및 어떤 분지의 위치를 갖는 것을 허용한다.
바람직하게는, 이러한 부분이 다음과 같은 단계에 의해서 합성될 것이다:
(a) 화학식 HOOC-X-COOH를 갖는 이산 유도체의 몰 초과량으로 화학식 Z-Q-지지체 화합물의 아미노 또는 히드록시 기를 아실화하는 단계 (여기에서 Z는 H2N- 또는 HO-이고; Q는 링커 또는 표적 분자이고; 지지체는 고체상, 매트릭스 또는 표면이다);
(b) 단계 (a) 산물의 유리 카르복시기를 활성화하는 단계;
(c) 화학식 NH2-Y-NH2를 갖는 디아민의 몰 초과량으로 단계 (b)의 산물을 아미노분해하는 단계; 및
(d) HOOC-X-COOH 및 NH2-Y-NH2를 이용하여 단계 (a) 내지 (c)를 임의적으로 반복하는 단계 (여기에서, 상기 X 및 Y는 2가 유기 라디칼이거나 없을 수도 있고 동일하거나 상이하며, 각각의 상기 임의적으로 반복되는 유닛으로 독립적으로 다양할 수 있고, 선행하는 아실화 및 아미노분해 단계에서 사용된 X 및 Y 치환기와 동일 또는 상이하다).
바람직한 구체예에서, 상기 반복 유닛의 6-원소체, 12-원소체, 18-원소체 및 32-원소체가 채택된다. 원한다면, 분지된 pPEG 구조를 형성하기 위해 리신의 아미노기와의 접합에 반복 유닛을 사용할 수 있다. pPEG는 티오에테르, 옥심 및 아미드 연결 형성을 포함하는 다양한 화학법에 의해, 본 발명의 합성 단백질에 부착될 수 있다.
한 구체예에서, 유닛의 고체상 순차적 연쇄 집합은 다음의 단계를 포함한다.
단계 1: 보호 또는 보호되지 않은 이산을 레진 상의 아미노에 커플링하여 연결 부위에 아미드 결합을 생성 (여기에서PG는 채택된 이산에 의존하여 존재 또는 부재하는 보호기이다):
PG-OOC-X-COOH + NH2-Y-NH-레진
단계 2: 만약 존재한다면, 레진 상의 보호기 (PG)를 제거
HOOC-X-CO-NH-Y-NH-레진
단계 3: 보호 또는 보호되지 않은 이산을 레진 상의 카르복시에 커플링하여 연결 부위에 아미드 결합을 생성 (여기에서PG는 채택된 이산에 의존하여 존재 또는 부재하는 보호기이다):
PG-NH-Y-NH + HOOC-X-CO-NH-Y-NH-레진
단계 4: 만약 존재한다면, 레진 상의 보호기 (PG)를 제거
-NH-Y-NH-OC-X-CO-NH-Y-NH-레진
단계 5: 'n'개의 유닛을 첨가하여 단계 1 내지 4를 'n'회 반복한 후 레진으로부터 절단
-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-
고찰된 것과 같이, 직쇄상 및 분지상 pPEG 구성체는 바람직하게 본 발명의 합성 생물활성 분자에 부착되기 위한 수용성 폴리머이다. 채택된 pPEG는 생리학적 조건 하에서 하전되거나 또는 중성인 펜던트기를 갖고, 실험자가 채택한 pPEG 구조에 의존하여 부착 화학법, 길이, 분지 및 용해도에서 다양하게 만들 수 있다. 위에 언급한 것과 같이, 본 발명의 바람직한 pPEG는 반복 유닛 -CO-X-CO-NH-Y-NH-를 갖는 수용성 폴리아미드를 포함하는데, 여기에서 X 및 Y 중 하나 또는 둘 모두는 수용성 반복 유닛, 가장 바람직하게는 'PEG'-기초 반복 유닛을 포함한다. 올리고유레아가 단순 2-단계 고체상 방법을 이용하여 원칙적으로 사용될 수 있음에도 불구하고, 아미노 레진, NH2-레진, 및 대칭성 디아민 NH2-Y-NH2의 경우에 대해 아래 나타난것과 같이:
카르보닐디이미다졸로 활성화 → im-CO-NH-레진
NH2-Y-NH2디아민으로 아미노분해 → NH2-Y-NH-CO-NH-레진
(여기에서 이 2 단계를 수차례 반복하여 반복 유닛 -NH-Y-NH-CO-를 갖는 올리고유레아를 얻을 수 있다), 이 접근법은 덜 바람직하다. 이것은 상기 단계의 수율이, 매우 많은 양의 시약 및 긴 반응 시간을 가지고도, 상온에서 비-양적일 수 있기 때문이다. 따라서, 아미노 레진, NH2-레진,의 경우에 대하여 아래 나타난, 3-단계 고체상 방법을 이용하여 폴리아미드를 형성하는 것이 바람직하다. 시약 HO2C-X-CO2H 및 NH2-Y-NH2는 이소형 산물을 회피하기 위해 대칭성이 되어야 한다.
이산 HO2C-X-CO2H 로 아실화 → HO-CO-X-CO-NH-레진
카르보닐디이미다졸로 활성화 → im-CO-OCO-X-CO-NH-레진
디아민 NH2-Y-NH2로 아미노분해 → NH2-Y-NH-CO-X-CO-NH-레진
이 세 단계를 차례대로 수차례 반복하여 반복 유닛 -NH-Y-NH-CO-X-CO-를 갖는 폴리아미드를 얻을 수 있다. 폴리머는 정확한 수의 모노머 유닛을 함유하고, X 및 Y는 각 단계에서 독립적으로 변화될 수 있으며, 말단-기는 임의대로 선택될 수 있다. 예를 들어, 아실화 단계를 위한 숙신 안히드리드 ("Succ") 및 아미노분해 단계를 위한 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데카네디아민 ("EDA" 또는 "TTD"로도 지칭됨)의 사용에 의해, X가 -CH2CH2-이고, Y가 -NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH-이고, 반복유닛이 -NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH-COCH2CH2CO-인 "PEG"-기초 폴리아미드를 형성한다. 방법이 보호기를 갖지 않는 2가 시약을 포함한다는 사실에도 불구하고, 아래에 언급된, 분지된 구성체를 만들기 위한 분지된 Lys 코어의 경우를 제외하고는, 표준 시중 합성 레진을 사용하면 교차-결합은 문제되지 않는다 (Roseet al.,(미국 특허 출원 제 09/379,297 호); 및 Roseet al.,J. Am. Chem. Soc.(1999) 121: 7034).
예를 들어, 분지된 pPEG 구성체는 Roseet al.,(미국 특허 출원 제 09/379,297호) 및 Rose, K. 및 Vizzavona, J. (J. Am. Chem. Soc.(1999) 121: 7034)에 설명된 "케모바디 (chemobody)"와 유사한 수단으로 만들어 질 수 있다. 그러므로, 분지된 pPEG 구성체는 리신 분지형성 코어와 같은 분지형성 코어를 갖도록 만들어 질 수 있는데, 이 리신 코어는 옥심 링커를 통해 -(COCH2CH2CO-NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH)n-과 같은 바람직한 수용성 폴리아미드에 커플링된다. 예를 들어, 옥심 결합은 폴리아미드의 다른 말단에 있는 Lys 측쇄상의 아미노옥시아세틸기와, 테트라머 코어인 (O=CHCO)4Lys2Lys-과 같은, 리신 코어상의 글리옥실일기 사이에서 손쉽게 형성된다. 그러므로 각 리신 분부위로부터 나온 옥심 링커는 구조 -Lys(COCH2ON=CHCO-)아미드- 로서 제조될 수 있다. 대안적 구성물은, 바람직하게 단일보호 디아민 및 폴리아미드 커플링 후 탈보호를 이용하여, 폴리아미드 및 폴리아미드의 유리 펜던트기 사이에 옥심 결합을 위치시켜서, 아래에 묘사된 4가의 분지된 구성체를 생성할 수 있다:
[O=CHCO-(NH-CH2CH2CH2-[OCH2CH2]3-CH2-NH-COCH2CH2CO-)n]4Lys2Lys-
옥심 화학법은 이중합 및 사중합의 분지된 구성체를 제작하는데에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 팔중합의 분지된 구성체의 집합에도 적당하다 (Rose, K., J. Am. Chem. Soc. (1994) 116:30; Rose, K.et al., Bioconj. Chem. (1996) 7:552). 이러한 pPEG 폴리아미드를 사용할 때, 이러한 목적을 위해 다른 화학법을 이용하는 것도 물론 가능하다 (도 7참조). 더욱이, 폴리아미드 형성은 Bco 또는 Fmoc 화학법을 포함하는 펩티드 합성을 위한 합성 개요도 내로 통합될 수 있으나, 이러한 개요도를 고안할 때에 아미노분해 단계가 Fmoc기를 제거할 수 있고, 만약 Bco 화학법을 사용하려 한다면 이 단계가 인돌의 포르밀 보호를 제거할 수 있어야 한다는 것을 명심하여야 한다.
따라서, 이러한 pPEG는 정선한 결합 (예를 들어, 아미드, 키오에테르, 옥심 등)을 통해 직쇄 수용성 폴리아미드 (예를 들어, -(Succ-TTD)n- 등)에 연결된 다양한 분지형성 코어 (예를 들어, 리신 분지형성 코어 등)을 갖도록 만들어질 수 있는데, 여기에서 각 직쇄 수용성 폴리아미드의 유리 말단은 원하는 변화를 제공하도록 원하는 펜던트기 (예를 들어, 카르복실레이트, 아미노, 아미드 등)로 각각 캡핑될 수 있다. 더욱이 본 발명의 직쇄 및 분지된 pPEG는, 하나 이상의 유일하고 서로 반응성인 작용기를 갖는 합성 단백질에 부착하기 위한 유일한 작용기를 포함하도록 만들어질 수 있고, pPEG의 펜던트기는 바람직하게 비-면역원성일 것이다 (예로서도 7참조).
본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 간행물 또는 특허 출원이 참고문헌으로서 수록되도록 명확하고 개별적으로 지적된 것과 동일하게 참고문헌으로서 여기 수록된다. 본 발명에 대한 배경기술의 고찰은 본 발명의 배경을 설명하도록 포함된다. 이것은 언급된 어떠한 물질이 어느 청구범위의 우선일에서 공표, 공지되거나 종래 기술 또는 전 세계에 통상적인 일반 지식의 일부라는 승인으로서 취해지는 것은 아니다. 본 발명을 일반적으로 설명하였으므로, 다음의 실시예를 참고로 하여 보다 쉽게 이해될 것이고, 이 실시예는 예시로서 제공되고, 상술되지 않는다면 본 발명을 제한하지 않도록 의도된다.
실시예 1
합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-0의 합성
합성 적혈구생성 자극 단백질 (SEP)를 합성하였다. 전장 합성된 단백질의 서열 (SEP-0(1-166)으로 표시)은 다음과 같다:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EHCSLNEKIT
VPETKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LVKSSQPWψP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAIS
PPDAASAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR (SEQ ID NO:1)
여기에서 ψ는 설프히드릴기에서 카르복시메틸화된 시스테인으로 구성된 비-천연 아미노산 잔기를 나타낸다. SEP-0 단백질은 다음의 네 폴리펩티드 단편으로부터 용액내에서 합성하였다:
단편 SEP-0:1 (GRFN 1711; SEQ ID NO:1의 잔기 1 내지 32로 구성됨)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-티오에스테르
단편 SEP-0:2 (GRFN 1712, SEQ ID NO:1의 잔기 33 내지 38로 구성됨)
CSLNEKITVP DTKVNFYAWK RMEVGQQAVE VWQGLALLSE
AVLRGQALLV KSSQPW-티오에스테르 (여기에서 Cys33은 Acm 보호된다)
단편 SEP-0:3 (GRFN 1713, SEQ ID NO:1의 잔기 89 내지 116으로 구성됨)
CPLQLHVDKA VSGLRSLTTL LRALGAQK-티오에스테르 (여기에서 Cys89는 Acm 보호된다)
단편 SEP-0:4 (GRFN 1714, SEQ ID NO:1의 잔기 117 내지 166으로 구성됨)
CAISPPDAAS AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY
TGEACRTGDR-카르복실레이트 (여기에서 C-말단 시스테인 (Cys161)은 피콜릴 (피코) 보호기를 지닌다)
펩티드 SEP-0:1 및 SEP-0:2 및 SEP-0:3은, ABI433A 자동 펩티드 합성기에서 티오에스테르-생성 레진에 결합하여 Boc (tert-부톡시카르보닐) 화학법 및 확립된 SPPS, 측쇄 보호 및 티오에스테르-레진 전략 (Hackeng,et al., PNAS (1999) 96: 10068-10073; Schnolzer,et al., Int. J. Pept. Prot. Res., (1992) 40: 180-193))을 이용한 순차적 고체상 펩티드 합성 (SPPS)을 위한 제자리 (in situ) 중성화 프로토콜로써, 또는 수동 연쇄 집합로 합성하거나, 시중 공급체로부터 주문 공급받았다. 예를 들어, Boc SPPS 보호기의 표준 세트를 사용하였다: 즉, Arg(Tos); Asp(cHex); Cys(4MeBzl) & Cys(Acm); Glu(cHex); His(DNP); Lys(ClZ); Ser(Bzl); Thr(Bzl); Trp(포르밀); Try(BrZ); Met, Asn, Gln을 측쇄 비보호하였다. 단편 SEP-0:4는 -OCH2-Pam-레진 상에서 유사하게 합성하였다. 표준 Boc 화학 방법에 따라서 HF/p-크레졸을 이용하여 펩티드를 탈보호화하고 레진 지지체로부터 동시에 절단하였다; 그러나, HF/p-크레졸에서 제거되지 않은 보호기를 함유한 펩티드를 위해, 보호기를 유지하였다. 예비 C4 역상-고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 펩티드를 정제하였다. ES-MS (전자분무 이온화 질량 분석법)을 이용하여 순수한 펩티드를 함유한 부분을 식별한 후, 이후의 라이게이션을 위해 모아서 동결건조하였다.
단계 1: 라이게이션 #1단편 SEP-0:4 및 단편 SEP-0:3을 15 mM 농도로 TFE에 용해하였다. 6 M 구아니디늄 클로라이드 및 1% 티오페놀을 함유한 표준 인산 완충용액 (pH 7.9)를 첨가하고, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻었다. 라이게이션 후, 라이게이션 혼합물을 2ml TFE (트리플루오로에탄올), 6 ml 6M 구아니디늄 클로라이드, 25% β-머캅토에탄올을 함유한 100 mM 인산의 용액에 첨가하고 20분 동안 인큐베이션 하였다. 빙초산 중 15mg/ml TCEP (트리(2-카르복시에틸)포스핀.HCl)의 용액으로 용액을 산성화하고 예비 C4 역상 HPLC 컬럼 (지름 1인치) 상에 로딩하였다. 그 다음 예비 구배 역상 HPLC로 펩티드를 정제하였다. 원하는 라이게이션 산물인 SEP-0:Acm+SEP-0:3+SEP-0:4를 함유한 부분을 ES-MS로써 식별한 후 모았다.
단계 2: Acm-제거 #1Acm 제거를 위하여, SEP-0:Acm+SEP-0:3+SEP-0:4의 모아진 부분을 함유한 액체 아세토니트릴 용액을 HPLC 등급수로 1x로 희석하고, 최종 농도 2 몰이 되도록 고체 유레아를 첨가하였다. 3% 수성 아세트산 중 (총 기대되는 시스테인 농도에 대해) 세 배 몰 초과량의 30 mg/ml Hg(아세테이트)2용액을 첨가하고 1시간 동안 용액을 교반하였다. 그 다음 β-머캅토에탄올에서 용액을 20%로 만든 후, 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하여 단계 구배로 정제하였다. 원하는 산물인 SEP-0:3+SEP-0:4를 함유한 부분을 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.
단계 3: 라이게이션 #2순 TFE에 같은 양의 SEP-0:3+SEP-0:4 및 SEP-0:2를 15 mM 농도에서 공동으로 용해하였다. 6 M 구아니디늄 클로라이드 및 1% 티오페놀을 함유한 250 mM 인산 완충용액 (pH 7.5)을 첨가하여, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻는다. 하루동안의 라이게이션 후, 10 ml TFE, 10 ml β-머캅토에탄올, 10 ml 피페리딘 및 20 ml 6M 구아니디늄 클로라이드의 pH 4 용액에 라이게이션 혼합물을 첨가하고, 남아있는 보호기를 제거하기 위해 20분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 20% 수성 아세트산 중 15 mg/ml TCEP의 용액으로 산성화한 후, 예비 역상 HPLC 컬럼 상으로 로딩하고 직선 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 산물인 SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4를 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.
단계 4: 카르복시메틸화SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4를 15 mM 농도에서 TFE에 용해하였다. 6 M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 두 배 초과량 (v/v)의 200 mM 인산 완충용액 (pH 7.9)을 첨가하고, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻었다. 최소량의 메탄올에 용해된 25배 초과량의 브로모-아세트산을 첨가하고, 용액을 2시간 동안 반응하게 하였다. 20% 수성 아세트산 중 15 mg/ml TCEP의 용액으로 용액을 산성화한 후, 예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 단계 구배로 정제하였다. 원하는 카르복시메틸화된 산물인 SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et를 ES-MS로 식별하고 모았다.
단계 5: 피콜릴 제거아연 가루를 2M HCl에서 30분동안 활성화하였다. 펩티드 SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et를 약 10 mg/ml 농도에서 순 TFE에 용해하였다. (새로이 첨가된) 35 mg/ml L-메티오닌 및 35 mg/ml 도데실사르코신 (즉, 소듐 N-도데시카노일사르코신)을 함유한, 4x (v/v; TFE에 대해) 6M 구아니디늄 클로라이드, pH 4의 100 mM 아세테이트로 용액을 희석하였다. 용액을 활성화된 Zn 분말에 첨가하였다. 1시간 간격으로 반응을 모니터링하고 5시간 후 완료하였다. 완료 후, 상청액을 제거하고 남아있는 Zn 분말은 20% TFE 중 35 mg/ml L-메티오닌 및 35 mg/ml 도데실사르코신을 함유한 6M 구아니디늄 클로라이드, pH 4, 100 mM 아세테이트로 5분동안 2회 세척하고 20% β-머캅토에탄올을 함유한 동일한 용액으로 1회 세척하였다. 결합된 산물은 20% 수성 아세트산 중 15 mg/ml TCEP의 용액으로 산성화한 후, 예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 단계 구배로 정제하였다. 원하는 변경된 산물인 SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et-Pico를 함유한 부분은 ES-MS로 식별하고 모았다.
단계 6: Acm-제거 #2SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et-Pico의 모아진용액은 HPLC 등급수로써 3x로 희석하고, 고체 유레아를 첨가하여 최종 농도를 2 몰로 하였다. 3% 수성 아세트산 중 (총 기대되는 시스테인 농도에 대해) 세 배 몰 초과량의 30 mg/ml Hg(아세테이트)2용액을 첨가하고 1시간 동안 용액을 교반하였다. 그 다음 β-머캅토에탄올에서 용액을 20%로 만든 후, 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하여 단계 구배로 정제하였다. 원하는 산물인 SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et-Pico를 함유한 부분을 ES-MS로 식별한 후, 2x (w/w; 펩티드 양에 대해) DPC (도데실포스포콜린)를 함유한 물로 2x (v/v) 희석하고 하루밤동안 동결건조하였다.
단계 7: 라이게이션 #3순 TFE에 같은 양의 SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et-Pico 및 SEP-0:1을 15 mM 농도에서 공동으로 용해하고 6 M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 250 mM 인산 완충용액 (pH 7.5)을 첨가한다. 이 용액에 1% 티오페놀을 첨가하였다. 하루동안의 라이게이션 후, 10 ml TFE, 10 ml β-머캅토에탄올, 10 ml 피페리딘 및 20 ml 6M 구아니디늄 클로라이드의 pH 4 용액에 라이게이션 혼합물을 첨가하고, 남아있는 보호기를 제거하기 위해 20분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 20% 수성 아세트산 중 15 mg/ml TCEP의 용액으로 산성화한 후, 예비 역상 HPLC 컬럼 상으로 로딩하고 직선 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 산물인 SEP-0 (1-166):(SEQ ID NO:1)을 함유한 부분을 전자분무 질량 분석법으로 식별한 후, 2x (w/w; 펩티드 양에 대해) 도데실사르코신을 함유한 물로 2x (v/v) 희석하고 동결건조하였다.
단계 8 폴딩:전장 라이게이션된 펩티드 SEP-0(1-166)은 6 M 구아니디늄 클로라이드 및 20% TFE 및 10배 초과량 (단백질 내 Cys 잔기에 대해)의 시스테인을 함유한 200 mM Tris 완충용액 (pH 8.7)에 용해시켰다. 3 M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 200 mM Tris 완충용액 (pH 8.7)에 대하여 이 용액을 실온에서 하루밤동안 투석하였다. 그 다음 1M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 200 mM Tris 완충용액 (pH 8.7)에 대하여 용액을 4℃에서 4시간동안 투석하고 최종적으로 10 mM 인산 완충용액 (pH 7.0)에 대하여 4℃에서 4시간동안 투석하여 최종 폴딩된 산물을 수득하였다. 전자 분무 ES-MS 및 CD (원편광 2색성) 분석법으로 확인하였다.
단계 9 정제:폴딩된 폴리펩티드를 센트리콘 농축기 바이알에서 5x로 농축하고 10mM 인산, pH 7.0로 평형화된 Resource S 양이온 교환 컬럼 상에 로딩하였다. 폴딩된 단백질을 직선 염 구배에서 500 mM NaCl로 10분 동안 용리하였다. 원하는 폴딩된 산물인 SEP-0 (1-166)을 함유한 부분을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)로 식별한 후, 냉동하여 -80℃에 저장하였다. 폴딩된 단백질 산물의 분석적 역상 HPLC 크로마토그램 및 ES-MS 분석법은 물론이고 CD 분석법 역시 폴딩된 단백질의 존재를 예증하였다.
실시예 2
합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-L30의 합성
두번째 합성 적혈구생성 자극 단백질 (SEP-1-L30으로 표시)은 SEP-0의 위치 24 및 126에 옥심-형성기를 함유하도록 합성하였다. 그 다음 이 기는 SEP-1-L30을 형성하는데 사용하였는데, 여기에서 직선(EDA-Succ)18카르복실레이트 (EDA =(4,7,10)-트리옥사츠리데칸-1,3디아민(TTD라고도 함); Succ = -CO-CH2-CH2CO-) 폴리머는 단백질 백본에 결합되어 있다. 전장 SEP-1 (1-166)의 서열은 다음과 같다:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK OXITTGCA EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LVKSSQPWψP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAIS
PPDAAK OXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR (SEQ ID NO:2)
여기에서 ψ는 설프히드릴기에서 카르복실메틸화된 시스테인으로 구성된 비-천연 아미노산 잔기를 표시하고, KOX는 옥심 결합을 통해 명시된 수용성 폴리머와 커플링된 옥심 링커기로 ε-아미노기에서 화학적으로 변경된 비-천연 리신을 표시한다.
A. GRFNP32로 GRFN1776 및 GRFN1711의 옥심화
옥심 형성은 케톤 카르보닐기를 갖는 펩티드에 아미노옥시아세틸기를 갖는 수용성 폴리머가 부착하도록 수행하였다. 이를 성취하기 위해, 다음의 펩티드 단편을 합성하였다:
단편 SEP-1:4 (GRFN 1776;SEQ ID NO:2의 잔기 117 내지 166으로 구성됨)
CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY
TGEACRTGDR-카르복실레이트 (여기에서 Lys126은 ε-아미노기에서 레불린산으로 변경되고, 여기에서 Cys117은 Acm 보호됨)
단편 SEP-1:1 (GRFN 1711,SEQ ID NO:2의 잔기 1 내지 32로 구성됨)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-티오에스테르
(여기에서 Lys24는 레불린산 잔기로 변경됨)
실시예 1에서와 같이 단편 SEP-1:1 (GRFN 1711)은 티오에스테르-생성 레진 상에서, 단편 SEP-1:4 (GRFN 1776)는 -OCH2-Pam-레진 상에서 합성하였다. 이들 두 펩티드 단편의 리신 24 및 126은 ε-아미노기 부위에서 Fmoc기로 처음에 보호하였다. 연쇄 집합의 완료 후, 표준 Fmoc 탈보호 방법에 따라 Fmoc-보유 아미노기를 탈보호하고 각 펩티드 레진에 레불린산을 각각 부착함으로써 변경하였다. 그 다음 실시예 1에서 설명한 것과 같이 펩티드를 탈보호하고 동시에 레진 지지체로부터 절단하였다. 예비 C4 역상 HPLC로 펩티드를 정제하였다. 순수한 펩티드를 함유한 부분은 ES-MS를 이용하여 식별한 후, 이후의 라이게이션을 위해 모아서 동결건조하였다. GRFNP32[-(EDA-Succ)18카르복실레이트]는 표준 프로토콜 (Rose, K.et al.,미국 특허 출원 제 09/379,297; Rose,et al., J Am Chem Soc.(1999) 121:7034)에 따라 Sasrin 카르복실-생성 레진 상에서 집합하였다. 아미노옥시아세틸 (AoA) 부분은 5배 초과량의 활성화된 Boc-아미노옥시아세트산을 커플링함으로써 폴리머의 N-말단 아미노기에 부착하였다. 전통적 Fmoc-화학 방법을 이용하여 레진 지지체로부터 폴리머 사슬을 절단하였다. 폴리머 사슬은 예비 C4 역상 HPLC로 정제하였다. 순수한 폴리머를 함유한 부분은 ES-MS를 이용하여 식별한 후, 이후의 라이게이션을위하여 모아서 동결건조하였다.
0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 단편 SEP-1:4 및 GRFNP32를 동분자 비율로 공동으로 용해하였다. 그 다음 용액을 동결건조하였다. 건조된 분말을 용해시키고 예비 구배 C4 역상 HPLC로써 비변경된 펩티드 및 비반응된 폴리머로부터 폴리머-변경된 펩티드를 분리하였다. 원하는 옥심화된 산물 SEP-1:4+GP32를 함유한 부분을 ES-MS로 식별한 후 모아서 동결건조하였다.
0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 단편 SEP-1:1 및 GRFNP32를 동분자 비율로 공동으로 용해하였다. 그 다음 용액을 동결건조하였다. 건조된 분말을 용해시키고 예비 구배 C4 역상 HPLC로써 비반응된 폴리머로부터 폴리머-변경된 펩티드를 분리하였다. 원하는 옥심화된 산물 SEP-1:1+GP32를 함유한 부분을 ES-MS로 식별한 후 모아서 동결건조하였다.
B. 합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-L30의 합성
SEP-1-L30은 용액 내에서 다음 네 개의 폴리펩티드 단편으로 합성하였다:
단편 SEP-1:1+GP32 (GRFN 1711 + GRFNP32,SEQ ID NO:2의 잔기 1-32에 상응):
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK OXITTGCA EH-티오에스테르
(여기에서 Lys24는 KOX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸 (Lev-AoA)옥심 결합을 통해 GRFNP32에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변경된다)
단편 SEP-1:2 (GRFN 1712,SEQ ID NO:2의 잔기 33-88에 상응):
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW-티오에스테르 (여기에서 Cys33은 Acm 보호됨)
단편 SEP-1:3 (GRFN 1713,SEQ ID NO:2의 잔기 89-116에 상응):
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-티오에스테르 (여기에서 Cys89는 Acm 보호됨)
단편 SEP-1:4+GP32 (GRFN 1776 + GRFNP32,SEQ ID NO:2의 잔기 117-166에 상응):
CAIS PPDAAK OXAAPL RTIRADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR-카르복실레이트 (여기에서 Lys126은 KOX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸 (Lev-AoA)옥심 결합을 통해 GRFNP32에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변경되고, C-말단 시스테인은 피콜릴 (피코) 보호기를 갖는다)
추가적인 펩티드의 합성, 라이게이션 반응, 카르복시메틸화, 보호기 제거 반응, 폴딩 및 정제는실시예 1에서 설명된 것과 같이 수행하여 전장의, 폴딩된 SEP-1-L30을 수득하였다. 폴딩된 단백질 산물의 분석적 역상 HPLC 크로마토그램 및 ES-MS 분석법은 물론이고 CD 분석법 역시 폴딩된 단백질의 존재를 예증하였다.
실시예 3
합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-L26의 합성
제 3의 합성 적혈구생성 자극 단백질 (SEP-1-L26으로 나타냄)은 SEP-0의 위치 24 및 126에 옥심-형성기를 함유하도록 합성하였다. 이 기는 SEP-1-L26을 형성하는데 사용하였는데, 여기에서 여기에서 직선 폴리머 (EDA-Succ)18카르복실레이트 및 (EDA-Succ)6-아미드는 옥심 연결을 통해 각각 위치 24 및 126에서 단백질 백본에 결합되어 있다. 전장 SEP-1 (1-166)의 서열은 다음과 같다:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK OXITTGCA EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LVKSSQPWψP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAIS
PPDAAK OXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR (SEQ ID NO:2)
여기에서 ψ는 설프히드릴기에서 카르복실메틸화된 시스테인으로 구성된 비-천연 아미노산 잔기를 표시하고, KOX는 옥심 결합을 통해 명시된 수용성 폴리머와 커플링된 옥심 링커기로 ε-아미노기에서 화학적으로 변경된 비-천연 리신을 표시한다.
SEP-1-L30과는 반대로, SEP-1-L26 구성체는 위치 126에 부착된 더 작고 비하전된 수용성 폴리머를 갖도록 디자인한다. 위치 24에 부착된 폴리머는 SEP-1L30에서와 동일하다. 전장 산물의 집합은실시예 2에 설명된 것과 같다.
A. GRFNP6으로 GRFN1776의 옥심화 및 GRFNP32로 GRFN1711의 옥심화
옥심 형성은 케톤 카르보닐기를 갖는 펩티드에 아미노옥시아세틸기를 갖는수용성 폴리머가 부착하도록 수행하였다. 이를 성취하기 위해, 다음의 펩티드 단편을 합성하였다:
단편 SEP-1:4 (GRFN 1776;SEQ ID NO:2의 잔기 117 내지 166으로 구성됨)
CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY
TGEACRTGDR-카르복실레이트 (여기에서 Lys126은 ε-아미노기에서 레불린산으로 변경되고, 여기에서 Cys117은 Acm 보호됨)
단편 SEP-1:1 (GRFN 1711,SEQ ID NO:2의 잔기 1 내지 32로 구성됨)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-티오에스테르
(여기에서 Lys24는 레불린산 잔기로 변경됨)
실시예 1에서와 같이 단편 SEP-1:1 (GRFN 1711)은 티오에스테르-생성 레진 상에서, 단편 SEP-1:4 (GRFN 1776)는 -OCH2-Pam-레진 상에서 합성하였다. 이들 두 펩티드 단편의 리신 24 및 126은 ε-아미노기 부위에서 Fmoc기로 처음에 보호하였다. 연쇄 집합의 완료 후, 표준 Fmoc 탈보호 방법에 따라 Fmoc-보유 아미노기를 탈보호하고, 표준 커플링 프로토콜에 따라 각 펩티드 레진에 레불린산을 각각 부착함으로써 변경하였다. 그 다음실시예 1에서 설명한 것과 같이 Boc-화학 방법에 따라 펩티드를 탈보호하고 동시에 레진 지지체로부터 절단하였다. 예비 C4 역상 HPLC로 펩티드를 정제하였다. 각 펩티드에 대하여, 순수한 펩티드를 함유한 부분은 ES-MS를 이용하여 식별한 후, 이후의 라이게이션을 위해 모아서 동결건조하였다.
수용성 폴리머 (EDA-Succ)18카르복실레이트 (GRFNP32)는 Sasrin 카르복시-생성 레진 상에서 표준 프로토콜 (Rose, K.et al.,미국 특허 출원 제 09/379,297 ; Rose,et al., J Am Chem Soc.(1999) 121:7034) 에 따라 집합하였다. 수용성 폴리머 (EDA-Succ)6-아미드 (GRFNP6)는 Sieber 아미드-생성 레진 상에서 표준 프로토콜 (Rose, K.et al.,미국 특허 출원 제 09/379,297; Rose,et al., J Am Chem Soc.(1999) 121:7034) 에 따라 집합하였다. 아미노옥시아세틸 (AoA)부분은 5배 초과량의 활성화된 Boc-아미노옥시아세트산을 커플링함으로써 각 레진-결합 폴리머의 N-말단 아미노기에 부착하였다. 두 폴리머 사슬은 전통적 Fmoc-화학 방법을 이용하여 각 레진 지지체로부터 분리되도록 절단하였다. 각 폴리머 사슬은 예비 역상 HPLC로 정제하였다. 각 폴리머에 대하여, 순수한 폴리머를 함유한 부분은 ES-MS를 이용하여 식별한 후, 이후의 라이게이션을 위해 모아서 동결건조하였다.
0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 단편 SEP-1:4 및 GRFNP6을 동분자 비율로 공동으로 용해하였다. 그 다음 용액을 동결건조하였다. 건조된 분말을 용해시키고 예비 구배 C4 역상 HPLC로써 비변경된 펩티드 및 비반응된 폴리머로부터 폴리머-변경된 펩티드를 분리하였다. 원하는 옥심화된 산물 SEP-1:4+GP6을 함유한 부분을 ES-MS로 식별한 후 모아서 동결건조하였다.
0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 단편 SEP-1:1 및 GRFNP32를 동분자 비율로 공동으로 용해하였다. 그 다음 용액을 동결건조하였다. 건조된 분말을 용해시키고 예비 구배 C4 역상 HPLC로써 비반응된 폴리머로부터 폴리머-변경된 펩티드를 분리하였다. 원하는 옥심화된 산물 SEP-1:1+GP32를 함유한 부분을 ES-MS로 식별한 후 모아서 동결건조하였다.
B. 합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-L26의 합성
SEP-1-L26은 용액 내에서 다음 네 개의 폴리펩티드 단편으로 합성하였다:
단편 SEP-1:1+GP32 (GRFN 1711 + GRFNP32,SEQ ID NO:2의 잔기 1-32에 상응):
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK OXITTGCA EH-티오에스테르
(여기에서 Lys24는 KOX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸 (Lev-AoA)옥심 결합을 통해 GRFNP32에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변경된다)
단편 SEP-1:2 (GRFN 1712,SEQ ID NO:2의 잔기 33-88에 상응):
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW-티오에스테르 (여기에서 Cys33은 Acm 보호됨)
단편 SEP-1:3 (GRFN 1713,SEQ ID NO:2의 잔기 89-116에 상응):
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-티오에스테르 (여기에서 Cys89는 Acm 보호됨)
단편 SEP-1:4+GP32 (GRFN 1776 + GRFNP32,SEQ ID NO:2의 잔기 117-166에 상응):
CAIS PPDAAK OXAAPL RTIRADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR-카르복실레이트 (여기에서 Lys126은 KOX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸 (Lev-AoA)옥심 결합을 통해 GRFNP32에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변경되고, C-말단 시스테인은 피콜릴 (피코) 보호기를 갖는다)
추가적인 펩티드의 합성, 라이게이션 반응, 카르복시메틸화, 보호기 제거 반응, 폴딩 및 정제는실시예 1에서 설명된 것과 같이 수행하여 전장의, 폴딩된 SEP-1-L26을 수득하였다. 폴딩된 단백질 산물의 분석적 역상 HPLC 크로마토그램 및 ES-MS 분석법은 물론이고 CD 분석법 역시 폴딩된 단백질의 존재를 예증하였다.
실시예 4
합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-B50의 합성
제 4의 합성 적혈구생성 자극 단백질 (SEP-1-B50으로 나타냄)을 합성하였따. 전장 SEP-1-B50의 아미노산 서열은 SEP-1-L50의 그것과 동일하다:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK OXITTGCA EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LVKSSQPWψP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAIS
PPDAAK OXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR (SEQ ID NO:2)
여기에서 ψ는 설프히드릴기에서 카르복실메틸화된 시스테인으로 구성된 비-천연 아미노산 잔기를 표시하고, KOX는 옥심 결합을 통해 명시된 수용성 폴리머와 커플링된 옥심 링커기로 ε-아미노기에서 화학적으로 변경된 비-천연 리신을 표시한다.
그러나, SEP-1-L30의 직선 (Succ-EDA)18폴리머를 갖기 보다는 네 개의 직선 (Succ-EDA)12부분을 갖는 분지된 폴리머 구성체로 단백질을 유도하였다. 옥심 연결을 통해 유도를 성취하였다. 전장 산물의 집합은실시예 2에서 설명된 것과 같다.
A. 다수의 티올기를 갖는 주형 GRFNP17의 합성
주형 GRFNP17은 0.4 mmol 스캐일로 아미드 생성 (4-메틸)벤즈히드릴아민 (MBHA)-레진 상에서 수공으로 합성하였다. Fmoc-Lys(Boc)-OH는 표준 커플링 프로토콜 (Schnolzer, M.,Int J Pept Protein Res.(1992) 40:180-93)을 이용하여 커플링하였다. 2.1mmol 아미노산; 즉, 5배 초과량의 아미노산, 3.8 ml 0.5M HBTU 중 10% DIEA를 사용하였다. Fmoc 보호기의 제거 후, Fmoc-Lys(Fmoc)-OH는 표준 아미노산 커플링 프로토콜을 이용하여 커플링하였다 (2.1 mmol 아미노산; 즉, 5배 초과량의 아미노산, 3.8 ml 0.5M HBTU 중 10% DIEA). 제 2 Fmoc 제거 단계 후, Fmoc-Lys(Fmoc)-OH는 표준 아미노산 커플링 프로토콜을 이용하여 커플링하였다 (4.2 mmol 아미노산; 즉, 유리 아민에 대해 5배 초과량의 아미노산, 3.8 ml 0.5M HBTU 중 10% DIEA). 최종 Fmoc 탈보호 단계 후, DMF 중 (유리 아민에 대해) 5배 초과량의 S-아세틸 티오글리콜산 펜타플루오로페닐 에스테르 (SAMA-oPfp)를 30분 동안 커플링하였다. 순 TFA로 1분간 2회 세척하여 C-말단 리실 잔기 측쇄의 Boc 보호기를 제거한 다음, DMF 중 10% DIEA로 세척하여 레진을 중성화하였다. 2 mmol Boc-아미노옥시아세트산 및 2 mmol N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 3 ml DMF에 용해하였다.2 mmol DIC (디이소프로필카르보디이미드)의 첨가 후, 30 내지 60분동안 산을 활성화하였다. 중성화된 레진에 용액을 첨가하고 1 시간동안 커플링하였다. 최종적으로, S-연결 아세틸기는 DMF 중 20% 피페리딘으로 30분동안 제거하였다. 유리 알데히드에 대한 스캐빈져로서 시스테인이 존재하는 표준 Boc-화학 방법에 따른 HF/p-크레졸을 이용하여 주형을 탈보호하고 동시에 레진 지지체로부터 절단하였다 (Schnolzer, M.,Int J Pept Protein Res.(1992) 40:180-93). 50% B[즉, 0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴] 중 회복된 폴리아미드 (무 알데히드)를 냉동시키고 동결건조하였다. 정제를 위하여, 주형 조 산물을 2ml 50% B에 용해하고, 100 ml 100% A[즉, 물 중 0.1% TFA]를 첨가하여 샘플을 희석하였다 (알데히드의 첨가가 보증되기 때문에, 구아니디늄 클로라이드 및 아세테이트의 첨가는 회피한다). 주형은 T=40℃, 3% B에서 평형화된 C4 예비 역상 HPLC 컬럼 상으로 로딩하였다. 염을 등용매로 용리하고 원하는 주형인, GRFNP17을 직선 구배에서 정제하였다. 원하는 산물을 함유한 부분은 ES-MS로 식별한 후, 모아서 동결건조하였다.
B. 분지된 수용성 폴리머 GRFNP29의 합성
15 kDa 분자량의 분지된 (EDA-Succ)12폴리머인, GRFNP29는 정제된 티올-함유 주형인 GRFNP17 및 직선 폴리머 GRFNP31, Br-아세틸-(EDA-Succ)12의 티오에스테르-생성 라이게이션으로써 합성하였다 (Rose, K.et al.,미국 특허 출원 제 09/379,297; Rose,et al., J Am Chem Soc.(1999) 121:7034).
(총 티올의) 1.3x 몰 초과량의 정제된 GRFNP31, Br-아세틸화 (EDA-Succ)12,및 정제된 티올-함유 주형 GRFNP17을 ~10 mM 농도에서 pH8.7의 0.1 M Tris-HCl/6M 구아니디늄 클로라이드에 공동으로 용해시켰다. 용해 후, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.7 완충용액으로 세 배(v/v) 희석하였다. 실온에서 라이게이션 혼합물을 교반하고 역상 HPLC 및 ES-MS로 반응을 모니터링 하였다. 원하는 반응 산물이 주된 산물일 때까지 추가적인 GRFNP31 반응물을 필요 기준만큼 첨가하였다. 정밀검사를 위해, pH 4인 3x (v/v, 라이게이션 혼합물에 대해) 0.1M 아세테이트 / 6M 구아니디늄 클로라이드를 첨가하고, 용액을 예비 C4 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고, 직선 구배로 정제하였다. 순수한 GRFNP29 구성체를 함유한 부분은 ES-MS를 이용하여 식별한 후, 모아서 동결건조하였다.
C. GRFNP29로 GRFN1776 및 GRFN1711의 옥심화
단편 SEP-1:4 및 단편 SEP-1:1은실시예 2에서 설명된 것과 같이 합성하였다. 단편 SEP-1:4 및 GRFNP29는 0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 동분자 비율로 공동으로 용해시켰다. 용액을 동결건조하였다. 건조된 분말은 예비 역상 HPLC 컬럼 (지름 1 인치)상에 로딩하였다. 폴리머-변경 펩티드는 예비 구배 C4 역상 HPLC로써 비변경된 펩티드 및 비반응 폴리머로부터 분리하였다. 원하는 옥심화된 산물 SEP-1:4+GP29를 함유한 부분은 ES-MS로 식별하여 모았다.
단편 SEP-1:1 및 GRFNP29는 0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 동분자 비율로 공동으로 용해하였다. 용액을 냉동하고 동결건조하였다. 건조된 분말을 0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 용해시키고 예비 GPC (겔 침투 크로마토그래피) 컬럼 (지름 1인치)상에 로딩하였다. 등용매 용리로서 비변경된 펩티드 및 비반응된 폴리머로부터 폴리머-변경 펩티드를 분리하였다. 원하는 옥심화된 산물 SEP-1:1+GP29를 함유한 부분은 ES-MS로 식별하여 모았다.
D. 합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-B50의 합성
SEP-1-B50 (SEQ ID NO:2)은 다음 네 개의 폴리펩티드 단편으로 용액 내에서 합성하였다.
단편 SEP-1:1+GP29 (GRFN 1711 + GRFNP29,SEQ ID NO:2의 잔기 1-32에 상응):
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK OXITTGCA EH-티오에스테르
(여기에서 Lys24는 KOX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸 (Lev-AoA)옥심 결합을 통해 GRFNP29에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변경된다)
단편 SEP-1:2 (GRFN 1712,SEQ ID NO:2의 잔기 33-88에 상응):
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW-티오에스테르 (여기에서 Cys33은 Acm 보호됨)
단편 SEP-1:3 (GRFN 1713,SEQ ID NO:2의 잔기 89-116에 상응):
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-티오에스테르 (여기에서 Cys89는 Acm 보호됨)
단편 SEP-1:4+GP29 (GRFN 1776 + GRFNP29,SEQ ID NO:2의 잔기 117-166에 상응):
CAIS PPDAAK OXAAPL RTIRADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR-카르복실레이트 (여기에서 Lys126은 KOX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸 (Lev-AoA)옥심 결합을 통해 GRFNP29에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변경되고, C-말단 시스테인은 피콜릴 (피코) 보호기를 갖는다)
추가적인 펩티드의 합성, 라이게이션 반응, 카르복시메틸화, 보호기 제거 반응, 폴딩 및 정제는, 정제를 Resource Q 컬럼상에서 한 것을 제외하고는,실시예 1 및 2에서 설명된 것과 같이 수행하여 전장의, 폴딩된 SEP-1-B50 (SEQ ID NO:2)을 수득하였다. 폴딩된 단백질 산물 SEP-1-B50의 분석적 역상 HPLC 크로마토그램 및 ES-MS 분석법은 물론이고 CD 분석법 역시 폴딩된 단백질의 존재를 예증하였다.
실시예 5
합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-3-L42의 합성
제 5 합성 적혈구생성 자극 단백질 (SEP-3-L42로 표시)을 합성하였따. 전장 SEP-3 단백질의 아미노산 서열은 다음과 같다:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNECIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LACSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS
PPDAACAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR (SEQ ID NO:3)
위치: 24, 38, 83 및 126에 있는 시스테인 잔기는 SEP-3-L42를 형성하도록(Michael 첨가 반응을 통하여) 말레이미드-기능화된 (EDA-Succ)18(GRFNP32) 폴리머 유닛으로써 변경하였다.
상술하면, SEP-3은 다음 4 개의 폴리펩티드 단편으로 용액 내에서 합성하였다:
단편 SEP-3:1 (GRFN 1747,SEQ ID NO:3의 잔기 1-37에 상응)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNE-티오에스테르
(여기에서 Cys7, Cys29및 Cys33은 Acm 보호됨)
단편 SEP-3:2 (GRFN 1774,SEQ ID NO:3의 잔기 38-82에 상응)
CIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LA-티오에스테르 (여기에서 Cys38은 Acm기로 보호된 측쇄임)
단편 SEP-3:3 (GRFN 1749,SEQ ID NO:3의 잔기 83-125에 상응)
CSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS
PPDAA-티오에스테르 (여기에서 Cys83은 Acm기로 보호된 측쇄임)
단편 SEP-3:4 (GRFN 1750,SEQ ID NO:3의 잔기 126-166에 상응)
CAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDT-카르복실레이트 (여기에서 Cys161은 Pbo [즉, 4-(CH3S(O)-)벤질-] 보호됨)
펩티드 합성.펩티드 SEP-3:1 및 SEP-3:2 및 SEP-3:3은, 실시예 1에서 설명된 것과 같이 확립된 측쇄 보호 전략을 이용하여, 위의 특정 펩티드에서 언급된 것과 같이 보호기에 변화를 주어, Boc 화학법 SPPS를 위한 제자리 중성화 프로토콜로써 티오에스테르-생성 레진 상에서 합성하였다. 단편 SEP-3:4는 -OCH2-Pam-레진 상에서 유사하게 합성하였다. 실시예 1에서 설명된 것과 같이 펩티드를 탈보호하고 동시에 레진 지지체로부터 절단하였다. 위에 설명된 결과적 펩티드는 예비 RP-HPLC로 정제하였다. 순수한 펩티드를 함유한 부분은 ES-MS를 사용하여 식별한 후, 이후의 라이게이션을 위하여 모아서 동결건조하였다.
단계 1: 라이게이션 #1단편 SEP-3:4 및 단편 SEP-3:3을 15 mM 농도로 TFE에 용해하였다. 6 M 구아니디늄 클로라이드 및 1% 티오페놀을 함유한 표준 인산 완충용액 (pH 7.5)을 첨가하고, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻었다. 라이게이션 후, 라이게이션 혼합물 (1 부피로 정의)을 {2ml TFE, 6 ml 6M 구아니디늄 클로라이드 및 25% β-머캅토에탄올을 함유한 100 mM 인산}의 용액 2 부피에 첨가하고 20분 동안 인큐베이션 하였다. 빙초산 중 15mg/ml TCEP의 용액으로 용액을 산성화한 후, 예비 C4 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 직선 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 산물인 SEP-3:Acm+SEP-3:3+SEP-3:4를 함유한 부분을 ES-MS로써 식별한 후 모았다.
단계 2: Acm-제거 #1Acm 제거를 위하여, SEP-3:Acm+SEP-3:3+SEP-3:4의 모아진 부분을 함유한 액체 아세토니트릴 용액을 HPLC 등급수로 1x로 희석하고, 최종 농도 2 몰이 되도록 고체 유레아를 첨가하였다. 3% 수성 아세트산 중 (총 기대되는시스테인 농도에 대해) 세 배 몰 초과량의 30 mg/ml Hg(아세테이트)2용액을 첨가하고 1시간 동안 용액을 교반하였다. 그 다음 β-머캅토에탄올에서 용액을 20%로 만든 후, 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하여 단계 구배로 정제하였다. 원하는 산물인 SEP-3:3+SEP-3:4를 함유한 부분을 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.
단계 3: 라이게이션 #2순 TFE에 같은 양의 SEP-3:3+SEP-3:4 및 SEP-3:2를 15 mM 농도에서 공동으로 용해하였다. 6 M 구아니디늄 클로라이드 및 1% 티오페놀을 함유한 250 mM 인산 완충용액 (pH 7.5)을 첨가하여, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻는다. 하루동안의 라이게이션 후, 라이게이션 혼합물 (1 부피로 정의)을 10 ml TFE, 10 ml β-머캅토에탄올, 10 ml 피페리딘 및 20 ml 6M 구아니디늄의 pH 4 용액 2 부피에 첨가하고, 남아있는 보호기를 제거하기 위해 20분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 20% 수성 아세트산 중 15 mg/ml TCEP의 용액으로 산성화한 후, 예비 C4 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 직선 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 산물인 SEP-3:Acm+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4를 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.
단계 4: Acm 제거Acm 제거를 위하여, SEP-3:Acm+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4의 모아진 부분을 함유한 수성 아세토니트릴 용액은 HPLC 등급수로써 1x로 희석하고, 고체 유레아를 첨가하여 최종 농도를 2 몰로 하였다. 3% 수성 아세트산 중 (총 기대되는 시스테인 농도에 대해) 세 배 몰 초과량의 30 mg/ml Hg(아세테이트)2용액을 첨가하고 1시간 동안 용액을 교반하였다. 그 다음 β-머캅토에탄올에서 용액을 20%로 만든 후, 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하여 단계 구배로 정제하였다. 원하는 산물인 SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et-Pico를 함유한 부분을 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.
단계 5: 라이게이션 #3순 TFE에 같은 양의 SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4 및 SEP-0:1을 15 mM 농도에서 공동으로 용해하였다. 6 M 구아니디늄 클로라이드 및 1% 티오페놀을 함유한 250 mM 인산 완충용액 (pH 7.5)을 첨가하고, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻는다. 하루동안의 라이게이션 후, 라이게이션 혼합물 (1 부피로 정의)을 10 ml TFE, 10 ml β-머캅토에탄올, 10 ml 피페리딘 및 20 ml 6M 구아니디늄 클로라이드의 pH 4 용액 2 부피에 첨가하고, 남아있는 보호기를 제거하기 위해 20분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 20% 수성 아세트산 중 15 mg/ml TCEP의 용액으로 산성화한 후, 예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 직선 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 산물인 SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4 을 함유한 부분을 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.
단계 6: 폴리머 GRFNP32의 부착.GRFNP32-말레이미드라 불리우는 말레이미드-기능화된 직쇄 (EDA-Succ)18폴리머는 제조사 프로토콜에 따라 BMPS (3-말레이미도 프로피온산 NHS 에스테르, Pierce, USA)로 GRFNP32를 기능화시킴으로써 말레이미드-기능화된 (EDA-Succ)18폴리머 (즉, 말레이미드-(EDA-Succ)18]를 형성하도록 제조하였다. SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4는 필요한 TFE의 최소량에 용해하였다. 세 배 초과량의 GRFNP32-말레이미드를 6M 구아니디늄 클로라이드, 100 mM 인산, pH 7.5에 용해시키고 TFE 용액에 첨가하였다. Michael 첨가 반응의 과정 후 분석적 역상 HPLC를 행하였다. 반응을 완료한 후, 용액을 예비 C4 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 직선 구배로 정제하였다. 원하는 폴리머-변경 산물인 SEP-3:Acm+SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+pPEG [즉 Cys24, Cys38, Cys83및 Cys126의 측쇄 티올에 부착된 GRFNP32의 4개의 카피를 갖는 라이게이션된 전장 166 잔기 폴리펩티드 사슬, 그러므로 SEP-3:Acm+SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+GP32라고도 함]를 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.
단계 7: Pbo 제거Pbo 제거를 위하여, SEP-3:Acm+SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+GP32의 동결건조된 분말을 5% 에탄디티올을 함유한 순 TFA에 용해하였다. 그 다음 Pbo기는 30분 동안 10% 티오아니졸 및 15% 브로모트리메틸실레인을 첨가함으로써 절단하였다. 용액을 회전-증발기에서 건조시키고 0.1% TFA를 함유한 수성 아세토니트릴에 녹였따. 결과 용액은 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 단계 구배로 정제하였다. 원하는 Cys161-탈보호 산물인 SEP-3:Acm+SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+GP32-Pbo를 함유한 부분은 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.
단계 8: Acm 제거Cys7, Cys29 및 Cys33의 측쇄로부터 최종 Acm 제거를 위하여, SEP-3:Acm+SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+GP32의 모아진 부분을 함유한 수성 아세토니트릴 용액을 HPLC 등급수로써 1x로 희석하고, 고체 유레아를 첨가하여 최종 농도가 2 몰이 되게 하였다. 3% 수성 아세트산 중 (총 기대되는 시스테인 농도에 대해) 세 배 몰 초과량의 30 mg/ml Hg(아세테이트)2용액을 첨가하고 1시간 동안 용액을 교반하였다. 그 다음 β-머캅토에탄올에서 용액을 20%로 만든 후, 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하여 단계 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션된, 폴리머-변경 산물인 SEP-3(1-166)을 함유한 부분을 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.
단계 9 폴딩:전장 라이게이션된, 폴리머-변경 펩티드 SEP-3(1-166)은 6 M 구아니디늄 클로라이드 및 20% TFE 및 10배 초과량 (SEP-3 내 Cys 잔기에 대해)의 시스테인을 함유한 200 mM Tris 완충용액 (pH 8.7)에 용해시켰다. 3 M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 200 mM Tris 완충용액 (pH 8.7)에 대하여 이 용액을 실온에서 하루밤동안 투석하였다. 그 다음 1M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 200 mM Tris 완충용액 (pH 8.7)에 대하여 용액을 4℃에서 4시간동안 투석하고 최종적으로 10 mM 인산 완충용액 (pH 7.0)에 대하여 4℃에서 4시간동안 투석하여 최종 폴딩된 산물을 수득하였다. 전자 분무 ES-MS 및 CD 분석법으로 확인하였다.
단계 9 정제:폴딩된 폴리펩티드를 센트리콘 농축기 바이알에서 5x로 농축하고 10mM 인산, pH 7.0로 평형화된 Resource S 양이온 교환 컬럼 상에 로딩하였다. 폴딩된 단백질을 직선 염 구배에서 500 mM NaCl로 10분 동안 용리하였다. 원하는 폴딩된 산물인 SEP-3-L42 (1-166)를 함유한 부분을 SDS-PAGE)로 식별한 후, 냉동하여 -80℃에 저장하였다.
실시예 6
합성 적혈구생성 자극 단백질의 생물활성 검정
폴딩된 합성 적혈구생성 자극 단백질, SEP-0, SEP-1-L26, SEP-1-L30, SEP-1-B50, 및 SEP-3-L42의 생물활성은 대조군 표준으로서 시중 재조합 에리스로포이에틴을 사용한 인자-의존 세포주 증식 검정에서, UT/7 및 32D 103197 세포주를 이용하여 측정하였다. UT/7은 성장 및 생존을 위해 인터류킨-3, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 또는 에리스로포이에틴에 절대적인 의존성을 갖는 인간 거대핵모세포성 백혈병 세포주이다 (Miura Y, et al., Acta Haematol (1998) 99:180-184; Komatsu N, et al., Cancer Res. (1991) 51:341-8). 32D 103197는 쥐의 조혈 세포주이다 (Metcalf, D. Int J Cell Cloning (1992) 10:116-25).
SEP 구성체의 원액은 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), 10% FBS (소태아혈청), 글루타민 및 Penstrep으로 제조하였고, 이 원액의 연속된 2x 희석액을 인간 UT/7 EPO 세포가 5000 세포/50㎕의 농도로 첨가된 멀티-웰 플레이트에 첨가하였다. 5% CO2존재하에 37℃에서 플레이트를 인큐베이션하고 성장에 대해 매일 모니터링 하였다. 4일 후, PBS (인산 완충 식염수) 중 20㎕ 2.5 mg/ml MTT (메틸티아졸 테트라졸륨)을 첨가하고 4시간 동안 플레이트를 인큐베이션 하였다. 150㎕ IPA를 첨가하고 562 nm에서 각 웰의 흡광도를 판독하였다. SEP 화합물에 대한 ED50 (최대 효과의 50%에 도달하기 위한 효과량)수치를 측정하고 CHO (중국산 햄스터 난소)-세포 생산된 rhEPO (재조합 인간 에리스로포이에틴)의 그것과 비교하였다. 이실험으로부터 나온 결과는 모든 합성 적혈구생성 자극 단백질이 생물활성을 나타낸다는 것을 예시하였다. SEP-0, SEP-1-L26, SEP-1-L30 및 SEP-1-B50에 대한 ED50 결과는표 6에 나타난다.
본 발명을 이것의 특정 실시예와 관련하여 설명하였지만, 본 발명이 속한 기술의 범위내에서 공지된 또는 관습적인 실시로 오기 때문에 그리고 앞서 설명된 본질적 특성에 적용될 수 있기 때문에, 더 나아간 변경이 가능하다는 것, 및 본 출원이, 일반적으로 본 발명의 원칙을 따른 것은 물론이고 본 개시로부터의 이러한 일탈을 포함하는 어느 변화, 사용, 또는 적용을 포함하도록 의도된다는 것이 이해될 것이다.

Claims (62)

  1. 화학식: -S-Raa를 갖는 측쇄를 가진 위-아미노산 잔기를 함유하며, 여기에서 Raa는 리보솜-지정 아미노산 측쇄의 임의적으로 치환되는 말단 부분이거나, 또는 리보솜-지정 아미노산 측쇄의 말단 부분의 유사체인 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 측쇄 -S-Raa는 상기 리보솜-지정 아미노산의 측쇄와 동일한 사슬 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 측쇄 -S-Raa는 상기 리보솜-지정 아미노산의 측쇄보다 더 큰 사슬 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 리보솜-지정 생물활성 단백질에 의해 소유된 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 위 아미노산 잔기의 상기 측쇄 -S-Raa는 상기 생물활성 단백질 내의 상응하는 위치에서 리보솜-지정 아미노산의 구조 또는 기능을 모방하는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 위 아미노산 잔기의 상기 측쇄 -S-Raa는 상기 생물활성 단백질 내의 상응하는 위치에서 리보솜-지정 아미노산의 구조 또는 기능을 변화시키는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 합성 단백질은 약 25 kDa보다 더 큰 모노머 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  8. 제 4 항에 있어서, 상기 리보솜으로 생산된 생물활성 단백질은 시스테인 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 위 아미노산 잔기는 상기 리보솜으로 생산되는 생물활성 단백질에서 상기 시스테인 잔기의 위치에 상응하는 위치 외의 위치에 있는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질의 다수의 아미노산 잔기가 아미드 결합에 의해 인접한 아미노산 잔기들에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  11. 제 10 항에 있어서, 각 아미노산 잔기가 아미드 결합에 의해 그것의 인접한 아미노산 잔기에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 다수의 아미노산 잔기로 구성되고 여기에서 이러한 아미노산 잔기의 적어도 하나는 비-아미드 결합에 의해 인접한 아미노산 잔기에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 비-아미드 결합은 티오에스테르 결합, 티오에테르 결합, 및 옥심 결합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 위-아미노산 잔기는 D-배열 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 위-아미노산 잔기는 L-배열 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 합성 단백질
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 위-아미노산 잔기는 위-아르기닌; 위-아스파라긴; 위-아스파테이트; 위-도파민; 위-글루타메이트; 위-글루타민; 위-히스티딘; 위-이소류신; 위-류신; 위-리신; 위-메티오닌; 위-페닐알라닌; 위-세린; 위-트레오닌;위-트립토판; 위-티로신; 및 위-발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 위-아미노산 잔기는 위-글루타메이트인 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  18. 제 4 항에 있어서, 상기 리보솜으로 생산되는 생물활성 단백질은 포유류 단백질인 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 포유류 단백질은 인간, 원숭이, 소, 쥐, 돼지, 양, 및 말 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  20. 제 18 항에 있어서, 상기 포유류 단백질은 인간 단백질인 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  21. 제 19 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 단백질 수용체 또는 그것의 절편, 단백질 수용체 리간드 또는 그것의 절편, 또는 사이토카인의 생물활성 중 선택된 생물활성을 갖는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 합성 생물활성 단백질은 사이토카인의 생물활성을갖는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 사이토카인은 인터류킨, 림포카인, RANTES 단백질, 적혈구생성 자극 단백질, 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론, 성장 인자 및 단일 펩티드 호르몬으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 사이토카인은 적혈구생성 자극 단백질인 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 적혈구생성 자극 단백질은 에리스로포이에틴인 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 합성 생물활성 단백질은 SEP-0, SEP-1, 및 SEP-3으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  27. 제 22 항에 있어서, 상기 사이토카인은 RANTES 단백질인 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  28. 제 22 항에 있어서, 상기 사이토카인은 성장 인자인 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 성장 인자는 G-CSF인 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  30. 제 1 항에 있어서, 상기 합성 단백질은 하나 이상의 폴리머 부가물에 의해 변경된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  31. 제 4 항에 있어서, 상기 리보솜으로 생산된 생물활성 단백질은 하나 이상의 글리코실화 부위에서 글리코실화되는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 합성 단백질은 상기 리보솜으로 생산된 생물활성 단백질의 상기 글리코실화 부위 중 적어도 하나에 상응하는 아미노산 잔기에서 하나 이상의 폴리머 부가물에 의해서 변경되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 단백질.
  33. 합성 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 분자적으로 상동인 약제학적 조성물로서, 상기 단백질은 리보솜-지정 생물활성 포유류 단백질과 연관된 생물학적 활성을 모방하는 생물학적 활성을 소유하고, 약 25 kDa 보다 더 큰 모노머 분자량을 가지며, 측쇄가 화학식: -S-Raa를 갖는 위-아미노산 잔기를 함유하는데, 여기에서 Raa는 리보솜-지정 아미노산 측쇄의 임의적으로 치환된 말단 부분, 또는 그것의 유사체로 구성된 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 2개의 상기 분자적으로 상동인 약제학적 조성물의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  35. 제 33 항에 있어서, 상기 리보솜-지정 생물활성 포유류 단백질은 인간, 원숭이, 소, 쥐, 돼지, 양 및 말 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  36. 제 33 항에 있어서, 상기 리보솜-지정 생물활성 포유류 단백질은 인간 단백질인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 합성 단백질은 단백질 수용체 또는 그것의 절편, 단백질 수용체 리간드 또는 그것의 절편, 또는 사이토카인의 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 합성 단백질은 사이토카인의 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  39. 제 38 항에 있어서, 상기 사이토카인은 인터류킨, 림포카인, RANTES 단백질, 적혈구생성 자극 단백질, 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론, 성장 인자 및 단일 펩티드 호르몬으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 사이토카인은 적혈구생성 자극 단백질인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 적혈구생성 자극 단백질은 에리스로포이에틴인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 합성 단백질은 SEP-0, SEP-1, 및 SEP-3으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  43. 제 38 항에 있어서, 상기 사이토카인은 RANTES 단백질인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  44. 제 39 항에 있어서, 상기 사이토카인은 성장 인자인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 성장 인자는 G-CSF인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  46. 각각 합성 단백질을 포함하는 하나 이상의 분자적으로 상동인 약제학적 조성물을 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 치료가 필요한 개개인에게 투여하는 단계를 포함하는 인간 질병 또는 상태의 치료 방법으로서, 상기 단백질은 약 25 kDa 보다 더 큰 모노머 분자량을 가지며, 측쇄가 화학식: -S-Raa를 갖는 위-아미노산 잔기를 함유하는데, 여기에서 Raa는 리보솜-지정 아미노산 측쇄의 임의적으로 치환된 말단 부분, 또는 그것의 유사체로 구성된 군으로부터 선택되고;상기 합성 단백질은 리보솜-지정 생물활성 인간 단백질 수용체 또는 그것의 절편, 단백질 수용체 리간드 또는 그것의 절편, 또는 사이토카인의 생물학적 활성을 모방하는 생물학적 활성을 소유하는 것을 특징으로 하는 인간 질병 또는 상태의 치료 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 합성 단백질은 사이토카인의 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 47 항에 있어서, 상기 사이토카인은 인터류킨, 림포카인, RANTES 단백질, 적혈구생성 자극 단백질, 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론, 성장 인자 및 단일 펩티드 호르몬으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 48 항에 있어서, 상기 사이토카인은 적혈구생성 자극 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서, 상기 적혈구생성 자극 단백질은 에리스로포이에틴인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 합성 생물활성 단백질은 SEP-0, SEP-1, 및 SEP-3으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 48 항에 있어서, 상기 사이토카인은 RANTES 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 48 항에 있어서, 상기 사이토카인은 성장 인자인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 53 항에 있어서, 상기 성장 인자는 G-CSF인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 다음 화학식:
    aaNH2-Q-aax-aay-W-aaCOOH
    (상기식에서 Q 및 W는 각각 하나 이상의 추가적인 아미노산 잔기의 임의적 존재를 표시하고, aaNH2는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 잔기를 표시하고; aax및 aay는, 각각 측쇄 x 및 y를 갖는 내부 인접 아미노산 잔기를 표시하고, aaCOOH는 폴리펩티드의 C-말단 아미노산 잔기를 표시한다)
    의 원하는 폴리 펩티드의 합성 방법으로서,
    (A) 화학식: aaNH2-Q-aax-COSR (여기에서 R은 티오에스테르기에 상용성인 어떠한 기이고, 이는 아릴, 벤질, 및 알킬기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다)를 갖는 제 1 펩티드를 화학식 : Cys-W-aaCOOH를 갖는 제 2 펩티드에 라이게이션 함으로써 폴리펩티드: aaNH2-Q-aax-Cys-W-aaCOOH를 형성하도록 하는 단계; 및
    (B) 시약 Raa-X의 존재하에 폴리펩티드를 인큐베이션 하는 단계 (여기에서 Raa는 그 구조가 아미노산 잔기 aay의 측쇄의 말단 부분을 모방하고; X는 양호한 이탈기 (특히 F, I, 또는 Br과 같은 할로겐)이고; 인큐베이션은 바람직한 폴리펩티드를 형성하기에 충분한 조건 하에서 행한다)를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  56. 제 55 항에 있어서, X가 할로겐인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 56 항에 있어서, 상기 할로겐은 F, I 또는 Br인 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 55 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기 aay는 위-아르기닌; 위-아스파라긴; 위-아스파테이트; 위-도파민; 위-글루타메이트; 위-글루타민; 위-히스티딘; 위-이소류신; 위-류신; 위-리신; 위-메티오닌; 위-페닐알라닌; 위-세린; 위-트레오닌; 위-트립토판; 위-티로신; 및 위-발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 다음 화학식의 폴리펩티드:
    aaNH2-Q-aax-aay-W-aaCOOH
    (상기식에서 Q 및 W는 각각 하나 이상의 추가적인 아미노산 잔기의 임의적 존재를 표시하고, aaNH2는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 잔기를 표시하고; aax및 aay는, 각각 측쇄 x 및 y를 갖는 내부 인접 아미노산 잔기를 표시하고, aaCOOH는 폴리펩티드의 C-말단 아미노산 잔기를 표시한다)
    의 제조 방법으로서, 상기 폴리 펩티드는
    (A) 화학식: aaNH2-Q-aax-COSR (여기에서 R은 티오에스테르기에 상용성인 어떠한 기이고, 이는 아릴, 벤질, 및 알킬기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다)를갖는 제 1 펩티드를 화학식 : Cys-W-aaCOOH를 갖는 제 2 펩티드에 라이게이션 함으로써 폴리펩티드: aaNH2-Q-aax-Cys-W-aaCOOH를 형성하도록 하는 단계; 및
    (B) 시약 Raa-X의 존재하에 폴리펩티드를 인큐베이션 하는 단계 (여기에서 Raa는 그 구조가 아미노산 잔기 aay의 측쇄의 말단 부분을 모방하고; X는 양호한 이탈기 (특히 F, I, 또는 Br과 같은 할로겐)이고; 인큐베이션은 바람직한 폴리펩티드를 형성하기에 충분한 조건 하에서 행한다)를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 59 항에 있어서, X가 할로겐인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  61. 제 60 항에 있어서, 상기 할로겐은 F, I 또는 Br인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  62. 제 59 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기 aay는 위-아르기닌; 위-아스파라긴; 위-아스파테이트; 위-도파민; 위-글루타메이트; 위-글루타민; 위-히스티딘; 위-이소류신; 위-류신; 위-리신; 위-메티오닌; 위-페닐알라닌; 위-세린; 위-트레오닌; 위-트립토판; 위-티로신; 및 위-발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
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Families Citing this family (182)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7482425B2 (en) 1999-08-26 2009-01-27 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Compositions for lipid matrix-assisted chemical ligation
KR20030032977A (ko) * 2000-07-12 2003-04-26 그리폰 테라퓨틱스, 인코포레이티드 키모카인 수용체 조절제, 제조 및 사용
RU2003109746A (ru) * 2000-09-08 2005-01-27 Грифон Терапьютикс, Инк. (Us) Синтетические белки, стимулирующие эритропоэз
GB0123262D0 (en) * 2001-09-27 2001-11-21 Adprotech Ltd Polymeric compounds
AU2002359855B2 (en) 2001-12-21 2008-08-21 David S. Soane Use of oligomers and polymers for drug solublization, stabilization, and delivery
DE10209822A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
JP2005529931A (ja) * 2002-05-24 2005-10-06 マイラス コーポレイション 膜相互作用の可逆的改質
US7781488B2 (en) * 2002-06-10 2010-08-24 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Post-cleavage sulfur deprotection for convergent protein synthesis by chemical ligation
EP1371689A1 (en) * 2002-06-14 2003-12-17 Dainippon Ink And Chemicals, Inc. Storage stable curable coating compositions
US20060035322A1 (en) * 2002-08-09 2006-02-16 Matthew Baker T-cell epitopes in erythropoietin
US7598224B2 (en) 2002-08-20 2009-10-06 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Dual chain synthetic heparin-binding growth factor analogs
US7166574B2 (en) 2002-08-20 2007-01-23 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Synthetic heparin-binding growth factor analogs
BR0314107A (pt) * 2002-09-11 2005-07-19 Fresenius Kabi De Gmbh Método de produção de derivados de hidroxialquil amido
AU2003300416A1 (en) * 2002-12-30 2004-07-29 Gryphon Therapeutics, Inc. Multiplex polymer ligation
WO2004061094A1 (en) 2002-12-30 2004-07-22 Gryphon Therapeutics, Inc. Water-soluble thioester and selenoester compounds and methods for making and using the same
MXPA05012313A (es) * 2003-05-12 2006-04-18 Affymax Inc Peptidos que se unen al receptor de eritropoyetina.
EP1628686A2 (en) * 2003-05-12 2006-03-01 Affymax, Inc. Spacer moiety for poly (ethylene glycol)-modified peptides
ATE428727T1 (de) * 2003-05-12 2009-05-15 Affymax Inc Neue, an den erythropoietinrezeptor bindende peptide
BRPI0411160A (pt) * 2003-05-12 2006-07-11 Affymax Inc novos compostos modificados com poli(glicol etilênico) e usos dos mesmos
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
EP1653991A2 (en) * 2003-08-08 2006-05-10 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group
SG145746A1 (en) * 2003-08-08 2008-09-29 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
US7635750B2 (en) 2003-09-05 2009-12-22 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method for preparing polyfunctionalized peptides and/or proteins via native chemical ligation
AU2005319099B2 (en) 2004-02-02 2010-09-16 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone
US7414028B1 (en) 2004-02-04 2008-08-19 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Growth factor analogs
US7528105B1 (en) 2004-02-10 2009-05-05 Biosurface Engineering Technologies Heterodimeric chain synthetic heparin-binding growth factor analogs
US7671012B2 (en) 2004-02-10 2010-03-02 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Formulations and methods for delivery of growth factor analogs
WO2005082005A2 (en) 2004-02-20 2005-09-09 Biosurface Engineering Technologies, Inc., Et Al. Positive modulator of bone morphogenic protein-2
WO2005092391A2 (en) * 2004-03-11 2005-10-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
WO2005092928A1 (en) 2004-03-11 2005-10-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
EP1586334A1 (en) * 2004-04-15 2005-10-19 TRASTEC scpa G-CSF conjugates with peg
KR101100059B1 (ko) * 2004-06-30 2011-12-29 넥타르 테라퓨틱스 중합체­인자 ｉｘ 부분의 접합체
WO2006062685A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-15 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
JP2008519858A (ja) * 2004-11-11 2008-06-12 アフィーマックス・インコーポレイテッド エリスロポエチンレセプターに結合する新規ペプチド
EP1836316A4 (en) * 2004-12-22 2009-07-22 Ambrx Inc PROCESS FOR EXPRESSION AND CLEANING OF RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE
JP5425398B2 (ja) 2004-12-22 2014-02-26 アンブレツクス・インコーポレイテツド 非天然アミノ酸及びポリペプチドを含む組成物、非天然アミノ酸及びポリペプチドに関連する方法並び非天然アミノ酸及びポリペプチドその使用
US20080171695A1 (en) 2005-02-02 2008-07-17 Novo Nordisk A/S Insulin Derivatives
WO2006089228A2 (en) * 2005-02-16 2006-08-24 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an epo moiety and a polymer
AU2006222187A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Production of bioactive glycoproteins from inactive starting material by conjugation with hydroxyalkylstarch
ATE480255T1 (de) 2005-03-31 2010-09-15 Amylin Pharmaceuticals Inc Zusammensetzungen und verfahren zur kontrolle, prävention und behandlung von essstörungen
EP2377884A1 (en) * 2005-05-10 2011-10-19 Neoloch Aps Neuritogenic peptides
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7919461B2 (en) 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US20070092486A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Avigenics, Inc. Glycolated and glycosylated poultry derived therapeutic proteins
US20080171696A1 (en) * 2005-10-21 2008-07-17 Avigenics, Inc. Pharmacodynamically enhanced therapeutic proteins
WO2007049635A1 (ja) * 2005-10-25 2007-05-03 Riken ペプチドチオエステルの製造方法
EP1951890A4 (en) 2005-11-16 2009-06-24 Ambrx Inc PROCESSES AND COMPOSITIONS WITH NON-NATURAL AMINO ACIDS
EP2010556B1 (en) 2006-04-11 2015-09-23 Sloan-Kettering Institute for Cancer Research Homogeneous erythropoietin and method for their preparation
EP2046350A4 (en) 2006-06-22 2011-09-14 Biosurface Eng Tech Inc COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE RELEASE OF A BMP-2 AMPLIFIER / COACTIVATOR FOR REINFORCED OSTEOGENESIS
EP2615108B1 (en) 2006-09-08 2016-10-26 Ambrx, Inc. Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and thier uses
US7985783B2 (en) 2006-09-21 2011-07-26 The Regents Of The University Of California Aldehyde tags, uses thereof in site-specific protein modification
AU2008210434C8 (en) 2007-01-31 2014-03-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Stabilized p53 peptides and uses thereof
US8309522B2 (en) 2007-02-05 2012-11-13 Amylin Pharmaceuticals, Llc Neuromedin and FN-38 peptides for treating psychiatric diseases
EP1972349A1 (en) * 2007-03-21 2008-09-24 Biocompatibles UK Limited GLP-1 fusion peptides conjugated to polymer(s), their production and use
BRPI0809366B8 (pt) 2007-03-28 2021-05-25 Harvard College polipeptídeo substancialmente alfa-helicoidal, método para fabricação do mesmo, aminoácido e composição farmacêutica
ATE554785T1 (de) 2007-03-30 2012-05-15 Ambrx Inc Modifizierte fgf-21 polypeptide und ihre verwendung
WO2008137471A2 (en) 2007-05-02 2008-11-13 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
WO2008153970A1 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Wake Forest University Health Sciences Selective cell therapy for the treatment of renal failure
US9580688B2 (en) 2007-06-08 2017-02-28 Wake Forest University Health Sciences Kidney structures and methods of forming the same
US7960336B2 (en) 2007-08-03 2011-06-14 Pharmain Corporation Composition for long-acting peptide analogs
EP2205280B1 (en) 2007-09-27 2019-09-04 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
WO2009064838A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 Amgen, Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stablised by antioxidants for parenteral administration
EP2930182A1 (en) 2007-11-20 2015-10-14 Ambrx, Inc. Modified insulin polypeptides and their uses
US8101706B2 (en) 2008-01-11 2012-01-24 Serina Therapeutics, Inc. Multifunctional forms of polyoxazoline copolymers and drug compositions comprising the same
WO2009089542A2 (en) 2008-01-11 2009-07-16 Serina Therapeutics, Inc. Multifunctional forms of polyoxazoline copolymers and drug compositions comprising the same
AU2009206306B2 (en) 2008-01-25 2013-06-06 Amgen Inc. Ferroportin antibodies and methods of use
EP2816059A1 (en) 2008-05-01 2014-12-24 Amgen, Inc Anti-hepcidin antibodies and methods of use
US10138283B2 (en) 2008-07-23 2018-11-27 Ambrx, Inc. Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses
MX2011003196A (es) 2008-09-26 2011-04-27 Ambrx Inc Microorganismos y vacunas dependientes de replicacion de aminoacidos no naturales.
EP3693014A1 (en) 2008-11-13 2020-08-12 The General Hospital Corporation Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation bmp-6
WO2010057013A1 (en) 2008-11-14 2010-05-20 Wake Forest University Health Sciences Selective cell therapy for the treatment of renal failure
CN102574896B (zh) 2009-09-30 2015-04-08 科德克希思公司 变异LovD多肽及其用途
US9662271B2 (en) 2009-10-23 2017-05-30 Amgen Inc. Vial adapter and system
BR112012015597A2 (pt) 2009-12-21 2017-01-31 Ambrx Inc peptídeos de somatotropina suínos modificados e seus usos
MX349301B (es) 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
EA032537B1 (ru) 2010-06-07 2019-06-28 Эмджен Инк. Способ работы устройства для доставки лекарственного средства
US8859723B2 (en) 2010-08-13 2014-10-14 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles
HUE045845T2 (hu) 2010-08-17 2021-12-28 Ambrx Inc Módosított relaxin polipeptidek és felhasználásuk
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
WO2012135315A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Amgen Inc. Vial adapter and system
LT2699293T (lt) 2011-04-20 2019-04-25 Amgen Inc. Automatinio purškimo prietaisas
SG10201602076QA (en) 2011-10-01 2016-04-28 Glytech Inc Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same
EP3335747B1 (en) 2011-10-14 2021-04-07 Amgen Inc. Injector and method of assembly
CN108929375A (zh) 2011-10-18 2018-12-04 爱勒让治疗公司 拟肽大环化合物
US8927500B2 (en) 2012-02-15 2015-01-06 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles
US8987414B2 (en) 2012-02-15 2015-03-24 Aileron Therapeutics, Inc. Triazole-crosslinked and thioether-crosslinked peptidomimetic macrocycles
JP6526563B2 (ja) 2012-11-01 2019-06-05 エイルロン セラピューティクス，インコーポレイテッド 二置換アミノ酸ならびにその調製および使用の方法
ES2780395T3 (es) 2012-11-21 2020-08-25 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos
US10492990B2 (en) 2013-03-15 2019-12-03 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
MX359794B (es) 2013-03-15 2018-10-10 Intrinsic Lifesciences Llc Anticuerpos anti-hepcidina y usos de los mismos.
JP6336564B2 (ja) 2013-03-15 2018-06-06 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入器、および自動注入器システム
CN113559363B (zh) 2013-03-22 2023-10-31 美国安进公司 注射器及装配方法
CN104334574B (zh) 2013-03-29 2020-01-14 株式会社糖锁工学研究所 附加唾液酸化糖链的多肽
JP7051293B2 (ja) 2013-10-24 2022-04-11 アムジエン・インコーポレーテツド 温度感知制御を伴う薬剤送達システム
US11097055B2 (en) 2013-10-24 2021-08-24 Amgen Inc. Injector and method of assembly
WO2015081282A1 (en) 2013-11-27 2015-06-04 Redwood Bioscience, Inc. Hydrazinyl-pyrrolo compounds and methods for producing a conjugate
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
SG11201609219QA (en) 2014-05-07 2016-12-29 Amgen Inc Autoinjector with shock reducing elements
KR102506249B1 (ko) 2014-06-03 2023-03-03 암겐 인코포레이티드 약물 전달 시스템 및 사용 방법
CN106714856B (zh) * 2014-09-18 2020-03-03 尚卓耐斯特公司 含有糖胺聚糖和蛋白质的组合物
WO2016049036A1 (en) 2014-09-22 2016-03-31 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
US10905739B2 (en) 2014-09-24 2021-02-02 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles and formulations thereof
SG10201902594QA (en) 2014-09-24 2019-04-29 Aileron Therapeutics Inc Peptidomimetic macrocycles and uses thereof
CA2957960C (en) 2014-10-14 2023-08-22 Amgen, Inc. Drug injection device with visual and audible indicators
EA036697B1 (ru) 2014-10-24 2020-12-09 Бристол-Майерс Сквибб Компани Модифицированные полипептиды fgf-21 и их применение
EP3233159B1 (en) 2014-12-19 2020-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
JP6716566B2 (ja) 2014-12-19 2020-07-01 アムジエン・インコーポレーテツド 近接センサ付き薬物送達装置
ES2748750T3 (es) 2015-02-17 2020-03-17 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con sujeción asistida por vacío y/o realimentación
ES2905870T3 (es) 2015-02-27 2022-04-12 Amgen Inc Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja
MX2017011834A (es) 2015-03-20 2018-04-11 Aileron Therapeutics Inc Macrociclos peptidomimeticos y usos de los mismos.
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
EP3347372A4 (en) 2015-09-10 2019-09-04 Aileron Therapeutics, Inc. PEPTIDOMIMETIC MACROCYCLES AS MODULATORS OF MCL-1
US11351308B2 (en) 2015-12-09 2022-06-07 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
CN106924753B (zh) * 2015-12-30 2021-11-09 北京大学 制备蛋白质-聚氨基酸环状偶联物的方法
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
EP3721922B1 (en) 2016-03-15 2022-05-04 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017192287A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
CN106290329B (zh) * 2016-07-22 2019-05-10 三诺生物传感股份有限公司 一种聚合物的应用以及稳定酶和显色剂的组合物
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
AU2018221351B2 (en) 2017-02-17 2023-02-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
JP7064501B2 (ja) 2017-02-17 2022-05-10 アムジエン・インコーポレーテツド 無菌流体流路を備える薬物送達デバイスおよび関連する組立方法
JP2020509011A (ja) * 2017-02-27 2020-03-26 テグ キョンブク インスティトゥート オブ サイエンス アンド テクノロジー エリスロポエチン由来ペプチドの細胞損傷防止に対する効果を介した活用
CA3050927A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Brian Stonecipher Drug delivery device with activation prevention feature
IL268478B2 (en) 2017-03-07 2023-10-01 Amgen Inc Inserting a needle using super pressure
JP2020509837A (ja) 2017-03-09 2020-04-02 アムジエン・インコーポレーテツド 薬剤送達装置のための挿入機構
CN110446499A (zh) 2017-03-20 2019-11-12 豪夫迈·罗氏有限公司 一种体外糖基工程化红细胞生成刺激蛋白的方法
CN110446512B (zh) 2017-03-28 2022-03-18 美国安进公司 柱塞杆和注射器组件系统以及方法
US11590294B2 (en) 2017-06-08 2023-02-28 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
EP3634546A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
MX2019015472A (es) 2017-06-22 2020-02-19 Amgen Inc Reduccion del impacto/choque de la activacion del mecanismo.
WO2018237225A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Amgen Inc. ELECTRONIC DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A CAP ACTIVATED BY A SWITCH ASSEMBLY
EP3651832B1 (en) 2017-07-14 2023-12-13 Amgen Inc. Needle insertion-retraction system having dual torsion spring system
MA49626A (fr) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage
WO2019022950A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE WITH CONTAINER ACCESS SYSTEM AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
WO2019022951A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE WITH GEAR MODULE AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
EP3664863A2 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
MA49897A (fr) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc Injecteur sur-corps avec patch adhésif stérile
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
US11897917B2 (en) 2017-09-27 2024-02-13 The University Of York Bioconjugation of polypeptides
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
CN111132711B (zh) 2017-10-06 2022-07-01 安进公司 带有联锁组件的药物递送装置及相关组装方法
EP3694578A1 (en) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
WO2019090079A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
WO2019090303A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
WO2019089178A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
CA3079665A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Amgen Inc. Plungers for drug delivery devices
MX2020005066A (es) 2017-11-16 2020-08-20 Amgen Inc Autoinyector con deteccion de detencion y punto final.
WO2019099324A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
US20210228815A1 (en) 2018-07-24 2021-07-29 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
EP3826701A1 (en) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
CA3103682A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
EP3829692A1 (en) 2018-07-31 2021-06-09 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
KR102167641B1 (ko) * 2018-08-27 2020-10-19 주식회사 사이루스 에리스로포이에틴 유래 펩티드를 함유하는 세포증식 촉진용 조성물
MA53724A (fr) 2018-09-24 2021-12-29 Amgen Inc Systèmes et procédés de dosage interventionnel
AU2019350660A1 (en) 2018-09-28 2021-03-18 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
AR116679A1 (es) 2018-10-02 2021-06-02 Amgen Inc Sistemas de inyección para la administración de fármacos con transmisión de fuerza interna
EP3860686A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
SG11202103800RA (en) 2018-10-15 2021-05-28 Amgen Inc Drug delivery device having damping mechanism
CA3109988A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
WO2020092056A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial needle retraction
MA54057A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament à rétraction partielle d'élément d'administration de médicament
EP3873566A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
CN109994163A (zh) * 2019-03-22 2019-07-09 陕西省生物农业研究所 一种模拟天然聚合体的设计模型
US20220160972A1 (en) 2019-04-24 2022-05-26 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
CA3148261A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
CN110882423B (zh) * 2019-10-15 2021-11-02 杭州未名信科科技有限公司 一种抗生物污染的涂层及其制备方法、植入式医疗器械
WO2022032191A1 (en) 2020-08-07 2022-02-10 Tambo, Inc. Trans-cyclooctene bioorthogonal agents and uses in cancer and immunotherapy
CN113160901B (zh) * 2021-03-24 2023-01-03 柳州东风容泰化工股份有限公司 一种提高氯代苯酚合成率的方法及装置
WO2022246055A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
WO2023077129A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Tambo, Inc. Tetrazine conjugates for in vivo targeted delivery of a payload

Family Cites Families (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3853832A (en) * 1971-04-27 1974-12-10 Harmone Res Foundation Synthetic human pituitary growth hormone and method of producing it
US3903262A (en) * 1972-03-13 1975-09-02 Cutter Lab Pharmaceutical compositions comprising intravenously injectable modified serum globulin, its production and use
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4565785A (en) * 1978-06-08 1986-01-21 The President And Fellows Of Harvard College Recombinant DNA molecule
US4659558A (en) * 1982-03-22 1987-04-21 Alza Corporation Oral delivery system comprising a plurality of tiny pills for delivering drug in the stomach and intestine
US4673641A (en) * 1982-12-16 1987-06-16 Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership Co-aggregate purification of proteins
US4710473A (en) * 1983-08-10 1987-12-01 Amgen, Inc. DNA plasmids
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4738921A (en) * 1984-09-27 1988-04-19 Eli Lilly And Company Derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products
US4810499A (en) * 1984-10-01 1989-03-07 Biotek, Inc. Transdermal drug delivery system and method
US4795706A (en) * 1985-01-31 1989-01-03 Eli Lilly And Company Novel expression control sequences
US5362853A (en) * 1986-12-23 1994-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5723147A (en) * 1987-02-23 1998-03-03 Depotech Corporation Multivesicular liposomes having a biologically active substance encapsulated therein in the presence of a hydrochloride
US5690954A (en) * 1987-05-22 1997-11-25 Danbiosyst Uk Limited Enhanced uptake drug delivery system having microspheres containing an active drug and a bioavailability improving material
US5466469A (en) * 1988-06-28 1995-11-14 Cibus Pharmaceutical, Inc. Granular drug delivery system
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
DE3815826A1 (de) * 1988-05-09 1989-11-23 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von vicinal diacyloxysubstituierten verbindungen
US5079230A (en) * 1988-09-12 1992-01-07 Pitman-Moore, Inc. Stable bioactive somatotropins
US5218092A (en) * 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
JPH0296595A (ja) * 1988-09-30 1990-04-09 Suntory Ltd Ａｎｐに対しアンタゴニスト的作用を有する新規ペプチド
US5349052A (en) * 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US5470829A (en) * 1988-11-17 1995-11-28 Prisell; Per Pharmaceutical preparation
DE68925966T2 (de) * 1988-12-22 1996-08-29 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5089261A (en) * 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5324844A (en) * 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
IL90193A (en) * 1989-05-04 1993-02-21 Biomedical Polymers Int Polurethane-based polymeric materials and biomedical articles and pharmaceutical compositions utilizing the same
DE3923963A1 (de) * 1989-07-20 1991-01-31 Behringwerke Ag Muteine des menschlichen erythropoetins, ihre herstellung und ihre verwendung
US5856298A (en) * 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
US5312808A (en) * 1989-11-22 1994-05-17 Enzon, Inc. Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
US5650388A (en) * 1989-11-22 1997-07-22 Enzon, Inc. Fractionated polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
JPH04218000A (ja) * 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
NL194941C (nl) * 1990-02-15 2003-08-04 Cordis Corp Werkwijze voor het aanbrengen van een fysiologisch actieve verbinding op een substraatoppervlak.
US5275838A (en) * 1990-02-28 1994-01-04 Massachusetts Institute Of Technology Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
US5171264A (en) * 1990-02-28 1992-12-15 Massachusetts Institute Of Technology Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
GB9107846D0 (en) 1990-04-30 1991-05-29 Ici Plc Polypeptides
US5219564A (en) * 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
IE66205B1 (en) 1990-06-14 1995-12-13 Paul A Bartlett Polypeptide analogs
FR2672053B1 (fr) * 1991-01-30 1993-04-23 Atochem Polyether bloc amides, leur procede de synthese.
FR2673946B1 (fr) * 1991-03-15 1993-05-28 Atochem Polyether bloc amides, leur procede de synthese.
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
ES2101300T3 (es) * 1992-02-13 1997-07-01 Carlsberg As Polimero que contiene polietilenglicol o polipropilenglicol.
EP0635025B1 (en) * 1992-04-07 2002-11-06 The Scripps Research Institute Process for preparing modified proteins
US5792451A (en) * 1994-03-02 1998-08-11 Emisphere Technologies, Inc. Oral drug delivery compositions and methods
US5614184A (en) * 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
US5654000A (en) * 1992-07-28 1997-08-05 Poli Industria Chimica S.P.A. Pharmaceutical compositions for transmucosal delivery of peptides
US5759566A (en) * 1992-07-28 1998-06-02 Poli Industria Chimica Spa Microemulsion pharmaceutical compositions for the delivery of pharmaceutically active agents
US5614549A (en) * 1992-08-21 1997-03-25 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5738849A (en) * 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
NZ250375A (en) * 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5298643A (en) * 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
US5349001A (en) * 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) * 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
US5395619A (en) * 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
EP1025840B1 (en) * 1993-04-22 2005-06-29 Emisphere Technologies, Inc. Oral drug compositions
JPH08509614A (ja) * 1993-04-29 1996-10-15 アボツト・ラボラトリーズ エリスロポエチン類似体組成物および方法
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5681811A (en) * 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
WO1994028024A1 (en) * 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
US5589356A (en) 1993-06-21 1996-12-31 Vanderbilt University Litigation of sidechain unprotected peptides via a masked glycoaldehyde ester and O,N-acyl rearrangement
US5663304A (en) * 1993-08-20 1997-09-02 Genentech, Inc. Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I
US5965566A (en) * 1993-10-20 1999-10-12 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5880131A (en) * 1993-10-20 1999-03-09 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5840900A (en) * 1993-10-20 1998-11-24 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5605976A (en) * 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5814599A (en) * 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
US5766627A (en) * 1993-11-16 1998-06-16 Depotech Multivescular liposomes with controlled release of encapsulated biologically active substances
US5618528A (en) * 1994-02-28 1997-04-08 Sterling Winthrop Inc. Biologically compatible linear block copolymers of polyalkylene oxide and peptide units
WO1995033490A1 (en) 1994-06-02 1995-12-14 Enzon, Inc. Method of solubilizing substantially water insoluble materials
US5730990A (en) * 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5817327A (en) * 1994-07-27 1998-10-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Incorporation of biologically active molecules into bioactive glasses
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
WO1996041813A2 (en) * 1994-11-09 1996-12-27 Offord Robin E Functionalized polymers for site-specific attachment
MX9703889A (es) 1994-12-08 1997-08-30 Glaxo Group Ltd Peptido rantes y fragmentos y composiciones que lo contienen, para el tratamiento de la inflamacion.
US6017283A (en) * 1994-12-23 2000-01-25 Hagey; Edward H. Contoured grip for a racquet
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
WO1996025186A2 (en) * 1995-02-07 1996-08-22 Gensia, Inc. Feedback controlled drug delivery system
JP3599346B2 (ja) * 1995-05-04 2004-12-08 ザ スクリップス リサーチ インスティチュート 天然型化学連結反応によるタンパク質の合成
US5756593A (en) * 1995-05-15 1998-05-26 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkyene oxide carboxylic acids
US5879712A (en) * 1995-06-07 1999-03-09 Sri International Method for producing drug-loaded microparticles and an ICAM-1 dosage form so produced
US5646285A (en) * 1995-06-07 1997-07-08 Zymogenetics, Inc. Combinatorial non-peptide libraries
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US6041253A (en) * 1995-12-18 2000-03-21 Massachusetts Institute Of Technology Effect of electric field and ultrasound for transdermal drug delivery
US6002961A (en) * 1995-07-25 1999-12-14 Massachusetts Institute Of Technology Transdermal protein delivery using low-frequency sonophoresis
WO1997006833A1 (en) * 1995-08-11 1997-02-27 Dendritech, Inc. Hyper comb-branched polymer conjugates
JP4193917B2 (ja) * 1995-12-18 2008-12-10 アンジオデバイス インターナショナル ゲーエムベーハー 架橋ポリマー組成物およびその使用方法
US5783212A (en) * 1996-02-02 1998-07-21 Temple University--of the Commonwealth System of Higher Education Controlled release drug delivery system
EP0901379B1 (en) 1996-05-22 2000-09-06 University Of Alberta Type-2 chemokine binding proteins and methods of use therefor
US6072041A (en) * 1996-06-03 2000-06-06 Case Western Reserve University Fusion proteins for protein delivery
GB9712818D0 (en) * 1996-07-08 1997-08-20 Cambridge Antibody Tech Labelling and selection of specific binding molecules
CA2262994A1 (en) * 1996-08-02 1998-02-12 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Polypeptides having a single covalently bound n-terminal water-soluble polymer
US6140064A (en) * 1996-09-10 2000-10-31 Theodor-Kocher Institute Method of detecting or identifying ligands, inhibitors or promoters of CXC chemokine receptor 3
US6214966B1 (en) * 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
JP2002506342A (ja) * 1996-11-26 2002-02-26 ジェネンコー インターナショナル インコーポレイテッド 化学修飾された酵素
JP4358307B2 (ja) * 1996-12-24 2009-11-04 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート 一般的化学結合
US6214540B1 (en) * 1997-03-26 2001-04-10 University Of Maryland Biotechnology Institute Chemokines that inhibit immunodeficiency virus infection and methods based thereon
AU7266898A (en) * 1997-04-30 1998-11-24 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US5990237A (en) * 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
NZ502375A (en) * 1997-07-14 2001-11-30 Bolder Biotechnology Inc The addition of non-natural cysteine derivatives to cause the protein to act as antagonists of the GH family
US6410708B1 (en) * 1997-11-21 2002-06-25 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding A-33 related antigen polypeptides
US6168784B1 (en) 1997-09-03 2001-01-02 Gryphon Sciences N-terminal modifications of RANTES and methods of use
AU750244B2 (en) 1997-09-04 2002-07-11 Gryphon Sciences Modular protein libraries and methods of preparation
US6011042A (en) * 1997-10-10 2000-01-04 Enzon, Inc. Acyl polymeric derivatives of aromatic hydroxyl-containing compounds
US6111107A (en) * 1997-11-20 2000-08-29 Enzon, Inc. High yield method for stereoselective acylation of tertiary alcohols
US6180095B1 (en) * 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5985263A (en) * 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5965119A (en) * 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
US6090388A (en) * 1998-06-20 2000-07-18 United Biomedical Inc. Peptide composition for prevention and treatment of HIV infection and immune disorders
IL140217A0 (en) * 1998-06-24 2002-02-10 Innogenetics Nv Particles of hcv envelope proteins: use for vaccination
CN1330675A (zh) * 1998-08-28 2002-01-09 格莱风科学公司 精确长度的聚酰胺链、其制备方法和其与蛋白质的缀合物
EP1135493A2 (en) * 1998-11-30 2001-09-26 Eli Lilly And Company Erythropoietic compounds
KR20030032977A (ko) 2000-07-12 2003-04-26 그리폰 테라퓨틱스, 인코포레이티드 키모카인 수용체 조절제, 제조 및 사용
RU2003109746A (ru) 2000-09-08 2005-01-27 Грифон Терапьютикс, Инк. (Us) Синтетические белки, стимулирующие эритропоэз

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US7030218B2 (en) 2006-04-18
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