KR20030032977A - 키모카인 수용체 조절제, 제조 및 사용 - Google Patents

키모카인 수용체 조절제, 제조 및 사용 Download PDF

Info

Publication number
KR20030032977A
KR20030032977A KR1020027018043A KR20027018043A KR20030032977A KR 20030032977 A KR20030032977 A KR 20030032977A KR 1020027018043 A KR1020027018043 A KR 1020027018043A KR 20027018043 A KR20027018043 A KR 20027018043A KR 20030032977 A KR20030032977 A KR 20030032977A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
chemokine
rantes
terminus
chemokine receptor
amino acid
Prior art date
Application number
KR1020027018043A
Other languages
English (en)
Inventor
로빈 이. 오퍼드
올리버 하트레이
휴베르트 가에르트너
Original Assignee
그리폰 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 그리폰 테라퓨틱스, 인코포레이티드 filed Critical 그리폰 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Publication of KR20030032977A publication Critical patent/KR20030032977A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7158—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

효능 및 약물동태학 성질을 조절하는 화학적으로 변형된 카르복실-말단(C-말단) 및/또는 아미노-말단(N-말단)을 포함하는 키모카인 수용체 조절제, 및 제조 방법 및 사용이 개시된다. 본 발명의 화합물 및 방법은 CC 및 CXC 키모카인의 신규한 N-말단, C-말단 및 N/C-말단 유사체로 예증된다. 본 발명의 키모카인 수용체 조절제 유사체는 HIV 및 AIDS 관련 장애의 치료용 및 천식, 알레르기 비염, 아토피성 피부염, 죽종/죽상경화증, 이식 거부반응, 및 류마티스관절염의 치료용과 같은 본 발명의 유사체가 길항하는 천연 발생 키모카인을 포함하는 장애의 치료에 유용하다.

Description

키모카인 수용체 조절제, 제조 및 사용{CHEMOKINE RECEPTOR MODULATORS, PRODUCTION AND USE}
키모카인은 백혈구 세포내이동(trafficing) 및 다양한 생물학적 과정에 관련된 작은 단백질이다. 대부분의 키모카인은 편재되어, 주화성 유도에 의한 염증, 및 염증부위에 전형적으로 존재하는 상이한 유형의 염증세포의 세포 활성화를 증강시킨다. 몇몇의 키모카인은, 킬러 세포의 증식과 활성화를 유도함, 조혈 선구 세포형의 성장을 조절함, 염증 상태, 혈관신생 및 종양 성장에서 골수 안밖으로의 조혈 선구 세포의 세포내이동과 같은, 주화성과는 다른 성질을 가진다 (예를 들어, Baggiolini et al., Ann. Rev. Immunology (1997) 15 : 675-705; Zlotnik et al., Critical Rev. Immunology (1999) 19 (1) : 1-4; Wang et al., J Immunological Methods (1998) 220 (1-2) : 1-17; 및 Moser et al., Intl. Rev. Immunology(1998) 16 (3-4) : 323-344 참조).
다수의 키모카인의 아미노산 서열, 구조 및 기능이 알려져 있다. 키모카인은 약 8-10 kDa의 분자량을 가지고, 단백질 수준에서 서로 약 20-50 % 서열 상동성을 나타낸다. 단백질은 또한 공통의 3차 구조를 공유한다. 모든 키모카인은 분자내 이황화 결합 형성에 관여하는 다수의 보존적 시스테인 잔기를 갖는데, 이는 키모카인을 동정하고 분류하는데 이용된다. 예를 들어, 한개의 아미노산에 의하여 분리되는 제 1의 두개의 시스테인 잔기를 가지는 키모카인은 ("α" 키모카인이라고도 불리우는) "C-X-C" 키모카인이라 불린다. 서로 인접한 제 1의 두개의 시스테인 잔기를 가진 키모카인은 ("β" 키모카인이라고도 불리우는) "CC" 키모카인이라 불린다. "C" 키모카인은 시스테인 잔기 하나가 결여된 점이 다른 키모카인과 다르다 ("γ" 키모카인이라고도 불린다). C 키모카인은 CC 키모카인의 몇몇의 구성원과 유사성을 나타내지만 CC 와 CXC 키모카인의 특징인 제 1 및 제 3의 시스테인 잔기가 없다. 세 개의 아미노산에 의하여 분리되는 제 1의 두개의 시스테인 잔기를 가지는 키모카인 소그룹의 구성원은 (또한 "CX3C" 또는 "δ" 키모카인으로도 불리우는) "CXXXC" 키모카인이라 불리운다. 키모카인의 서브그룹 또한 있다. 예를 들어, 두개의 추가의 보존적 시스테인 잔기를 함유하는 CC 키모카인이 알려져 있고, 종종 "C6-β" 키모카인이라는 용어가 이 서브그룹에 대하여 사용된다. 현재까지 동정된 대부분의 키모카인은 CC 와 CXC 키모카인 부류의 구성원이다.
키모카인의 생물학적 활성은 수용체에 의해서 조절된다. 수용체는 키모카인-특이적 수용체 뿐만 아니라 CC 키모카인 또는 CXC 키모카인의 군에 속하는 몇몇의 상이한 키모카인과 결합하는 중복 리간드 특이성을 가진 수용체를 포함한다. 예를 들어, CC 키모카인 SDF-1α 는 CXCR4 수용체에 특이적인 반면에, CXC 키모카인 RANTES 는 CCR1, CCR3 및 CCR5 수용체에 결합한다. 다른 예는 키모카인 에오택신(Eotaxin)인데, CCR3(또는 CKR3로 알려짐) 수용체에 대한 리간드이다(예를 들어, Cyster, J.G., Science(1999) 286:2098-2102;Ponath et al., J.Experimental Medicine(1996) 183(6):2437-2448;Ponath et al., J. Clinical Investigation(1996) 97(3):604-12; 및 Yamada et al., Biochem. Biophys. Res. Communications(1997) 231(2):365-368 참조).
키모카인은 천식, 알레르기 비염, 아토피성 피부염, 암, 바이러스성 질병, 죽종/죽상경화증, 류마티스관절염 및 기관 이식 거부반응과 같은 중요한 질병 경로에 관련되어 왔다. 그러나, 다수의 키모카인 및 그것의 치료법으로서의 잠재적 사용에 수반하는 일반적인 문제는 그것의 고유한 성질인 백혈구 염증 반응 및 감염의 촉진 또는 악화를 포함한다. 이런 결과에 대하여, 대응하는 야생형 키모카인의 길항제를 제조하려는 시도에서 키모카인의 다수의 변형이 수행되어 왔다. 고전적이고 대표적인 예는 RANTES에 대한 상황이다. 특정 조건에서, 야생형 RANTES는 염증과 HIV 감염을 촉진할 수 있다 (Gordon et al., R Virol. (1999) 73: 684-694; Czaplewski et al., J Biol. Chem. (1999) 274 : 16077-16084). 반대로, RANTES 폴리펩티드 사슬의 위치 26 (E26A) 및 66 (E66S)에서의 치환체는 분자를 그것의 비-염증성 형태로 전환시키고 그것의 HIV에 대한 수용체와 경쟁하는 그것의 능력을 향상시킨다 (Appay et al., J. Biol. Chem. (1999) 274 (39) : 27505-27512). 게다가, N-말단 절단 [RANTES 9-68], 메티오닌 ("Met-RANTES"), 아미노옥시펜탄("AOP-RANTES"), 또는 논아노일 ("NNY-RANTES")의 부가를 포함하는 RANTES의 N-말단 변형은 HIV-1 감염을 차단할 수 있는 길항제를 결과하였다. (Arenzana-Seisdedos, et al., Nature (1996) 383 : 400; Mack, et al., J Exp. Med. (1998) 187 : 1215-1224; Proudfoot, et al., J Biol. Chem. (1996) 271 : 2599-2603; Wells, et al., WO 96/17935; Simmons, et al., Science (1997) 276 : 276-279; Offord et al., WO 99/11666; 및 Mosier et al., J Virology (1999) 73 (5) : 3544-3550).
이 같은 접근법은 몇몇 케이스에서 길항제-연관 효능을 개선시켰지만, 키모카인 수용체 조절제 제조에서의 과제 중 하나는 약물동태학과 같은 다른 약물 성질을 개선하면서 효능을 증가시키는 것이다. 또한, 키모카인의 잠재적 길항제 및 대응하는 키모카인 수용체 조절제 화합물 및 질병의 예방 및/또는 치료에서 사용되기 위한 의약의 제조에서의 이들의 사용에 대한 일반적 전략과 방법을 발견하는 것이 요구된다. 본 발명은 이런 및 다른 요구에 접근한다.
(발명의 개요)
본 발명은 대응하는 천연 발생 키모카인의 작용을 억제하는 아미노-말단("N-말단") 및 카르복시-말단("C-말단") 변형 키모카인 수용체 조절제에 관한 것이다. 본 발명의 N-말단 키모카인 수용체 조절제는 그것의 N-말단에서 지방족 사슬과 하나 이상의 아미노산 유도체로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 본 발명의 C-말단 키모카인 수용체 조절제는 그것의 C-말단에서 지방족 사슬 또는 다환으로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 또한, 본 발명의 N- 및 C-말단 키모카인 수용체 조절제는 조합적으로 N 및 C-말단 모두에서의 변형을 포함한다. 본 발명의 키모카인 수용체 조절제의 제조 및 사용 방법이 또한 제공된다. 본 발명은 대응하는 천연발생 야생형 키모카인 또는 그것의 수용체의 잠재적 억제제인 화합물을 제조하기 위한 일반적 접근법을 제공한다는 점에서 유의하다.
상세하게는, 본 발명은 N-말단에서 지방족 사슬 및 하나 이상의 아미노산 유도체를 가지는 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함하는 키모카인 수용체 조절제에 관한 것이다.
본 발명은 특히 키모카인 폴리펩티드 사슬이 천연 발생 야생형 키모카인의 아미노산 서열에 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 포함하는 이러한 키모카인 수용체 조절제의 구체예에 관한 것이다(CC 키모카인, CXC 키모카인 등).
본 발명은 N-말단이 키모카인 폴리펩티드 사슬의 제1의 이황화-형성 시스테인에 대한 N-말단인 키모카인 폴리펩티드 사슬의 아미노산을 포함하는 키모카인 수용체 조절제의 구체예에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 지방족 사슬이 5 내지 26 개의 탄소를 포함하는 탄화수소이고, 및/또는 아미노산 유도체가 식 -(N-CnR-CO)- 를 가지고, 상기식에서 n 은 1-22 이고, R 은 히드로겐, 알킬 또는 방향족이고, N 및 Cn, N 및 R, 또는 Cn 및 R 은 환구조를 형성할 수 있는, 키모카인 수용체 조절제의 구체예에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 C-말단에서 지방족 사슬(특히, 지방족 사슬이 5 내지 22 개의 탄소를 포함한다) 또는 다환으로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함하는 키모카인 수용체 조절제에 관한 것이고, 특히 지방족 사슬 또는 다환은 지질이다.
본 발명은 더욱이 N-말단에서 지방족 사슬 및 하나 이상의 아미노산 유도체로, C-말단에서 지방족 사슬 또는 다환으로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함하는 키모카인 수용체 조절제에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 N-말단에서 지방족 사슬 및 하나 이상의 아미노산 유도체로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함하는 키모카인 수용체 조절제, 또는 약학적으로 허용가능한 그것의 염을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 C-말단에서 지방족 사슬 또는 다환으로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함하는 키모카인 수용체 조절제, 또는 약학적으로 허용가능한 그것의 염을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 N-말단에서 지방족 사슬 및 하나 이상의 아미노산 유도체로, C-말단에서 지방족 사슬 또는 다환으로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함하는 키모카인 수용체 조절제, 또는 약학적으로 허용가능한 그것의 염을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 키모카인 수용체 조절제로의 치료에 의해서 (사람을 포함하는) 포유동물에서 (특히 질병 상태가 염증 질병, 또는 질병 상태가 HIV 감염으로 유발되거나 이와 연관되는) 질병 상태를 경감시키는 치료 방법을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이고, 이 치료 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 포유동물에 키모카인 수용체 조절제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 키모카인 수용체 조절제는 (A) N-말단에서 지방족 사슬 및 하나 이상의 아미노산 유도체로 변형된, (B) C-말단에서 지방족 사슬 또는 다환으로 변형된, 또는 (C) N-말단에서 지방족 사슬 및 하나 이상의 아미노산 유도체로 변형되고, C-말단에서 지방족 사슬 또는 다환으로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
본 발명은 키모카인 수용체 조절제, 및 그것의 제조방법과 사용에 관한 것이다.
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 여기에 참고문헌으로써 수록된 미국 특허 출원 번호 제 60/217,683 호 (2000년, 6월 12일 출원)의 부분계속출원이다.
도 1은 천연 발생 키모카인의 4 가지 부류와, "C"가 시스테인에 대한 1문자 코드이고 "X"는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산을 나타내는, 보존적 시스테인 패턴에 의하여 정의되는 바와 같은 그것의 대응하는 N-말단, N-루프 및 C-말단 영역의 일반적인 구조를 나타내는 도식이다.
도 2A-2E는 이들 키모카인의 대응하는 N-말단, N-루프 및 C-말단 영역을 포함하는 다양한 키모카인 폴리펩티드 사슬의 천연 발생 아미노산 서열의 예를 도시한다. 20 개의 유전적으로 코딩되는 아미노산에 대한 표준 1문자 아미노산 코드가 사용된다.
본 발명은 N- 및 C-말단 키모카인 수용체 조절제에 관한 것이다. 본원에 사용될 때, 용어 "키모카인 수용체 조절제"는 적당한 키모카인 생물학적검정에 의하여 측정될 때 천연 발생 키모카인의 활성을 조절하거나 저해하는 폴리펩티드, 또는 유도된 폴리펩티드를 말하고자 함이다. 이같은 억제제는 결합하는 키모카인 수용체의 하나 이상의 성질에 대하여 길항작용함으로써 (예를 들어 바이러스 감염을 저해하거나, 수용체 하향조절을 유발하거나, 수용체 내재화를 유발함으로써) 세포 표면으로 재순환하여 회귀하는 수용체의 정상적인 순환에 대하여 길항작용함에 의하여 작동한다. 다른 생물학적 반응의 문맥에서, 이같은 조절제는 수용체의 작동제로 작용할 수 있는데, 예를 들어 칼슘 흐름을 유도하거나 주화성을 개시시키는 등이 그것이다. 그러므로, 본 발명의 키모카인 수용체 조절제는 (부분 길항제를 포함하는) 길항제로 작용할 수 있지만, 또한 (부분 작동제를 포함하는) 작동제 또는 둘의 혼합으로서도 작용할 수 있다. 적어도 하나의 길항제 특성, 즉 그것이 결합하는 키모카인 수용체의 하나 이상의 생물학적 성질에 대하여 (예를 들어 (1)바이러스 감염, (2) 주화성, (3) 수용체 순환 등을 차단 또는 부분적으로 차단하는 것과 같은) 길항작용할 수 있는 능력을 나타내는 키모카인 수용체 조절제가 바람직하다. 이같은 키모카인 수용체 조절제는 키모카인 수용체에 결합하지만 활성화시키지 않음으로써 작동하거나 다른 수단으로 그것의 작용을 매개한다.
본 발명의 N-말단 키모카인 수용체 조절제는 N-말단에서 지방족 사슬 및 하나 이상의 아미노산 유도체로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함한다. N-말단 키모카인 수용체 조절제는 N-말단에서 C-말단 방향으로 읽을때 다음 식: J1-X1-Z1-CHEMOKINE을 갖는데, 식 중: J1은 지방족 사슬이고; XI은 키모카인 폴리펩티드 사슬의 N-말단 아미노산 서열의 0 이상의 아미노산을 포함하는 스페이서이고; Z1은 아미노산 유도체이고; CHEMOKINE는 키모카인 폴리펩티드 사슬의 나머지 아미노산 서열이며; 데쉬 ("-")는 공유결합을 나타낸다. 이들 화합물은 폴리펩티드 사슬의 N-말단 영역의 전체 길이에 관련되도록 고안된다. 따라서, 지방족 사슬의 길이 및 아미노산 유도체의 위치에 따라서, N-말단 길항제는 대응하는 천연발생 키모카인폴리펩티드 사슬에 비교하여 N-말단에 하나 이상의 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다.
C-말단 키모카인 수용체 조절제는 그것의 C-말단에서 지방족 사슬 또는 다환으로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 이러한 화합물은 N-말단에서 C-말단 방향으로 읽을때 다음 식: CHEMOKINE-X2-J2을 갖는데, 식 중: X2는 키모카인 폴리펩티드 사슬의 C-말단 아미노산 서열의 0 이상의 아미노산을 포함하는 스페이서이고; J2는 지방족 사슬 또는 다환이고; CHEMOKINE는 키모카인 폴리펩티드 사슬의 나머지 아미노산 서열이며; 데쉬 ("-")는 공유결합을 나타낸다. 키모카인의 C-말단 영역은, 삽입, 결실 또는 C-말단에 하나 이상의 아미노산 또는 다른 화학적 부분을 추가하여 대응하는 야생형 분자에 비교하여 폴리펩티드 사슬의 C-말단 연장을 추가하는 것 뿐 아니라 형광 표지와 생물학적으로 허용되는 폴리머의 추가 및 작은 유기분자, 펩티드, 단백질 등과 같은 다른 화합물과의 접합을 포함하는 상당한 변형이 용이하다.
본 발명의 N- 및 C-말단 키모카인 수용체 조절제는 그것의 N- 및 C-말단 영역 모두에서 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함하는데, 그것은 구체적으로 지칭될 때, N-/C-말단 키모카인 수용체 조절제로 표시된다. 이들 화합물은 식: J1-X1-Z1-CHEMOKINE-X2-J2을 갖는데, 식 중: J1, XI, Z1, CHEMOKINE, X2, J2 및 "-" 는 상기된 바와 같다. 이들 화합물은 주어진 말단 사용에 의존하는 시너지 방식으로 N-및 C-말단 변형의 이점을 조합한다.
"키모카인 폴리펩티드 사슬"에 의하여는 천연 발생 야생형 키모카인 폴리펩티드 사슬에 실질적으로 상동인 폴리펩티드 사슬을 의도한다. "N-말단 아미노산 서열"에 의하여는 천연발생 키모카인 폴리펩티드 사슬의 제 1의 이황화-형성 시스테인에 인접하고 N-말단인 키모카인 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열을 의도한다. "C-말단 아미노산 서열"에 의하여는 천연발생 키모카인 폴리펩티드 사슬의 마지막 이황화-형성 시스테인에 인접하고 C-말단인 키모카인 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열을 의도한다. 본 발명의 키모카인 수용체 조절제의 기초를 형성하는 키모카인 폴리펩티드 사슬, N-말단 아미노산 서열, C-말단 아미노산 서열, 및 제 1의 및 마지막 이황화-형성 시스테인은 대응하는 천연 발생 키모카인의 아미노산 서열로부터 뿐만 아니라, 알려진 C, CC, CXC 및 CXXXC 키모카인의 아미노산 서열과 비교와 같은, 동일한 부류의 다른 키모카인 상동성 모델링에 의하여 용이하게 추론할 수 있다.
예를 들어, 다음: 6Ckine, 9E3, ATAC, ABCD-1, ACT-2, ALP, AMAC-1, AMCF-1, AMCF-2, AIF, ANAP, Angie, β-R1, β-트롬보글로불린, BCA-1, BLC, blr-1 리간드, BRAK, C10, CCF18, Ck-β-6, Ck-β-8, Ck-β-8-1, Ck-β-10, Ck-β-11, cCAF, CEF-4, CINC, C7, CKA-3, CRG-2, CRG-10, CTAP-3, DC-CK1, ELC, Eotaxin, Eotaxin-2, Exodus-1, Exodus-2, ECIP-1, ENA-78, EDNAP, ENAP, FIC, FDNCF, FINAP, 프랙타카인(Fractalkine), G26, GDCF, GOS-19-1, GOS19-2, GOS-19-3, GCF, GCP-2, GCP-2-유사, GRO1, GR02, GR03, GRO-α, GRO-β, GRO-γ, H400, HC-11, HC-14, HC-21, HCC-1, HCC-2, HCC-3, HCC-4 H174, 헤파린 중화 단백질, Humig, I-309, ILINCK, I-TAC, IfilO, IL8, IP-9, IP-10, IRH, JE, KC, Lymphotactin, L2G25B, LAG-1, LARC, LCC-1, LD78-α, LD78-β, LD78-γ, LDCF, LEC, Lkn-1, LMC, LAI, LCF, LA-PF4, LDGF, LDNAP, LIF, LIX, LUCT, Lungkine, LYNAP, Manchester 저해제, MARC, MCAF, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, MDC, MIP-1-α, MIP-1-β, MIP-1-δ, MIP-1-γ, MIP-3, MIP-3-α, MIP-3-β, MIP-4, MIP-5, Monotactin-1, MPIF-1, MPIF-2, MRP-1, MRP-2, M119, MDNAP, MDNCF, 거핵구-자극-인자, MGSA, Mig, MIP-2, mob-1, MOC, MONAP, NC28, NCC-1, NCC-2, NCC-3, NCC-4 N51, NAF, NAP-1, NAP-2, NAP-3, NAP-4, NAP S, NCF, NCP, Neurotactin, Oncostatin A, P16, P500, PARC, pAT464, pAT744, PBP, PBP-유사, PBSF, PF4, PF4-유사, PF4-ALT, PF4V1, PLF, PPBP, RANTES, SCM-1-α, SCI, SCY A26, SLC, SMC-CF, ST38, STCP-1, SDF-1-α, SDF-1-β, TARC, TCA-3, TCA-4, TDCF, TECK, TSG-8, TY5, TCF, TLSF-α, TLSF-β, TPAR-1, TSG-1 은 공지의 천연발생 키모카인의 예인데, 이들중 다수는 상이한 명칭으로 기재되고 따라서 여러 차례 등장하였다.
제한되지 않는 예로서, 상기 열거된 야생형 키모카인 폴리펩티드 사슬의 몇몇 및 그것의 대응 N-말단, N-루프 및 C-말단 아미노산 서열은 도 2A -2E에 도시되어있다. 충분히 인식될 수 있는 바와 같이, 추가적 키모카인 폴리펩티드 사슬은 알려져 있고, Genome Database (Johns Hopkins University, Maryland USA), Protein Data Bank (Brookhaven National Laboratory & Rutgers University, New Jersey USA), Entrez (National Institutes of Health, Maryland USA), NRL 3D (Pittsburgh Supercomputing Center, Carnegie Mellon University, Pennsylvania USA), CATH (University College London, London, UK), NIH Gopher Server (NIH,Maryland USA), ProLink (Boston University, Massachusetts USA), The Nucleic Acid Database (Rutgers University, New Jersey USA), Genebank (National Library of Medicine, Maryland USA), Expasy (Swiss Institute of Bioinformatics, Geneva Switzerland)등과 같은 공중 이용가능한 데이타베이스를 포함하는 다수의 상이한 공급원으로부터 구입할 수 있다. 또한, 데이터 베이스 및 이런 목적달성을 위한 관련 도구를 포함하는 당업계 공지의 표준 기술에 따라, 다양한 유전자 및 단백질 서열결정 프로그램으로부터 유래한 신규의 키모카인이 상동성 및 패턴 매치에 의하여 동정될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 증가된 수용체 특이성을 갖는 키모카인을 제작하는데 파지 디스플레이 또는 모듈 셔플링 같은 결정 진화 기술이 사용될 수 있다. 파지 디스플레이를 사용하여 키모카인 유도체 또는 유도체를 키모카인 수용체에 결합하는 능력에 대하여 시험하는 것은 HIV의 치료 및 예방에서 기술되었다(U. S. 특허 6,214,540 ; DeVico et al.). 파지 디스플레이 기술은 또한 CXC 키모카인 수용체 3 (CXCR3)에 대한 수용체 단백질의 리간드, 저해제 또는 촉진제를 검출 또는 동정하는데 또한 사용되었는데(U.S. 특허번호 6,140,064, Loetscher et al.), 그것은 세포 반응을 유도하는 능력을 가지는 하나 이상의 키모카인의 선택적 결합을 특징으로 한다(U.S. 특허 6,184,358, Loetscher et al.). 파지 디스플레이의 사용은 분자의 표지 및 선택(U.S. 특허 6,180,336, Osbourn et al.), 특이적 항원에 대한 결합 분자의 표지 및 연이은 정제(예를 들어, W092/01047 참조), 및 HIV 감염 및 면역 장애의 예방 및 치료를 위한 펩티드 조성물의 결정(U.S. 특허 6,090,388, Wang)에서 기술되었다.
N-루프 영역에서의 결정 진화를 위한 바람직한 부분(Konigs, C,"2 Monoclonal antibody screening of a phage-displayed random peptide library reveals mimotopes of chemokine receptor CCR5 : implications for the tertiary structure of the receptor and for an N-terminal binding site for HIV-1 gpl20,"Eur. J. Immunol. 2000 Apr; 30 (4): 1162-71; Sidhu, S. S. et al., "High copy display of large proteins on phage for functional selections," J Mol Biol 2000 Feb 18 ; 296 (2): 487-95; Fielding, A. K. et al.,"A hyperfusogenic gibbon ape leukemia envelope glycoprotein: targeting of a cytotoxic gene by ligand display," Hum Gene Ther 2000 Apr 10; 11 (6): 817-26), N-루프와 C-말단 사이의 영역, 및 C-말단 (Cain, S. A. et al. "Selection of novel ligands from a whole-molecule randomly mutated C5a library," Protein Eng 2001 Mar; 14 (3): 189-93; Heller, T. et al., "Selection of a C5a receptor antagonist from phage libraries attenuating the inflammatory response in immune complex disease and ischemia/reperfusion injury," J. Immunol. 1999 Jul 15; 163 (2): 985-94; Chang, C. et al., "Dissection of the LXXLL nuclear receptorcoactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta," Mol Cell Biol 1999 Dec; 19 (12) : 8226-39)과 함께 G-단백질-결합 수용체와 관련된 파지 디스플레이 방법 또한 기술되었다(예를 들어, Doorbar, J. et al.,"Isolation of a peptideantagonist to the thrombin receptor using phage display,"J. Mol. Biol., 244: 361-9 (1994) 참조).
J1 과 J2의 적당한 지방족 사슬은 5(C5) 내지 22(C22) 탄소 길이인 지방족 사슬을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 사슬은 불포화 및/또는 비분지이거나 다양한 정도의 포화 및/또는 분지의 정도를 갖는다. 지방족 사슬은 일반식 Cn(Rm)-을 가지는데, 식 중 Cn은 탄소수이고 Rm은 수소, 알킬, 아실, 방향족 또는 그것들의 조합으로부터 선택되는 치환기의 수이고 n과 m은 동일하거나 상이할 수 있다. J1과 J2 기는 X1, X2 또는 키모카인 폴리펩티드 사슬에 임의의 적당한 공유결합을 통하여 결합한다. 적당한 공유결합의 예는: 아미드, 케톤, 알데히드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 티오에스테르, 티오졸리딘, 옥심, 옥시졸리딘, 쉬프-염기 및 쉬프-염기형 결합(예를 들어, 히드라지드)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이같은 결합은:
-C(O)-NH-(CH2)-C(O)-; -C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-; -C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)-; -C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-; -C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -C(O)-NH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -C(O)-NH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(0)- ; -C(0)-NH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(0)-; -C(O)-NH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-;
-NH-(CH2)-C(O)-; -NH-(CH2)x-C(O)-; -NH-(CH2)-NH-C(O)-; -NH-(CH2)x-NH-C (O)-; -NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -NH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -NH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -NH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -NH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -NH-(CH2)- [NH-(CH2)]y-C(O)-;
-ONH-C(O)-; -ONH-(CH2)-C(O)-; -ONH-(CH2)x-C(O)-; -ONH-(CH2)-NHC(O)-; -ONH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-; -ONH-(CH2)x-NH-C(O)-; -ONH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -ONH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -ONH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -ONH-(CH2)-NH-(CH2)x-C (O)-; -ONH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -ONH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-;
-OCH2-C(O)-; -OCH2-(CH2)-C(O)-; -OCH2-(CH2)x-C(O)-; -OCH2-(CH2)-NH-C(O)- ; -OCH2-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-; -OCH2-(CH2)x-NH-C(O)-; -OCH2-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -OCH2-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -OCH2-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -OCH2-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)- ;-OCH2-NH-C (O)-; -OCH2-NH-(CH2)-C(O)-; -OCH2-NH-(CH2)x-C(O)-;-OCH2-NH-(CH2)-NH-C(O)-; -OCH2-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-; -OCH2-NH-(CH2)x-NH-C(O)-; -OCH2-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -OCH2-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -OCH2-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -OCH2-(CH2)-NH-(CH2)x-C(0)-; -OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(0)- ;-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -OCH2-N-(CH3)-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -OCCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-;
-O-C(O)-C(O)-;-O-C(O)-(CH2)-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)x-C(O)-;-O-C(O)(CH2)-NH-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)x-NH-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -O-C(O)(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)- ;-0-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -O-C(O)-NH-C(O)-; -O-C(O)NH-(CH2)-C(O)-; -O-C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-; -O-C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)-; -O-C(O)-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-; -O-C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-; -O-C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -O-C(O)-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -O-C-(O)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-C(O)-; -O-C(O)N(CH3)-(CH2)-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-;-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O); -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-;
-CH=CH-C(O)-; -CH=CH-(CH2)-C(O)-; -CH=CH-(CH2)x-C(O)-; -CH=CH-(CH2)-NH-C(O)-; -CH=CH-(CH2)x-NH-C(O)-; -CH=CH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -CH=CH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -CH=CH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -CH=CH(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -CH=CH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -CH=CH-(CH2)[NH-(CH2)x]y-C(O)-;
-SCH2-N(CH3)-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-;-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-;
-S-C(O)-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)x-C(O)-; -S-C(O)(CH2)-NH-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)x-NH-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -S-C(O)(CH2)-NH-CH2-C(O)-;-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -S-C(O)-NH-C(O)-; -S-C(O)NH-(CH2)-C(O)-; -S-C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-; -S-C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)- ; -S-C(O)-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-; -S-C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-; -S-C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -S-C(O)-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)- ; -S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]yC(O)-;
-C3H6SN-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)x-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-NH-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-;-C3H6SN-(CH2)x-NH-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -C3H6SN(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -C3H6SN-NH-C(O)-; -C3H6SN-NH-(CH2)-C(O)-; -C3H6SN-NH-(CH2)x-C(O)-; -C3H6SN-NH-(CH2)-NH-C(O)-; -C3H6SN-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-; -C3H6SN-NH-(CH2)x-NH-C(O)-; -C3H6SN-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -C3H6SN-NH-[(CH2)x-NH]yC(O)-; -C3H6SN-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)- ;-C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-C(O)-;-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(0)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(0)-;
-C3H60N-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)x-C(O)-; -C3H60N-(CH2)-NH-C(0)-; -C3H60N-(CH2)-(CH2)-NH-C(0)-; -C3H60N-(CH2)x-NH-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-;-C3H60N-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -C3H60N-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -C3H60N-NH-C(O)-; -C3H60N-NH-(CH2)-C(O)-; -C3H60N-NH-(CH2)x-C(O)-;-C3H60N-NH-(CH2)-NH-C(0)-; -C3H60N-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(0)-; -C3H60N-NH-(CH2)x-NH-C(O)-; -C3H6ON-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)- ;-C3H60N-NH [(CH2)x-NH]y-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -C3H60N-N(CH3)-C(O)-; -C3H60N-N(CH3)-(CH2)-C(O)- ;-C3H60N-N(CH3)(CH2)x-C(O)-; -C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-; -C3H6ON-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(0)-; -C3H60N-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(0)-; -C3H60N-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -C3H60N-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -C3H60N-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -C3H60N-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -C3H60N-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -O-C(O)-; -C(O)-, 또는 공유결합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 식중, x 및 y는 2,3,4 또는 그 이상이고 동일하거나 상이할 수 있다.
결합 시스템에 적당한 화학은 주지이고 이 목적에 이용될 수 있다 (예를 들어,"Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking", S. S. Wong, Ed., CRC Press, Inc. (1993); Perspectives in Bioconjugate Chemistry, Claude F. Modres, Ed., ACS (1993) 참조).
J1과 J2를 XI, X2 또는 키모카인 폴리펩티드 사슬에 결합하는 것에 추가하여, 결과의 분자가 그것의 길항제 성질을 보유하는 한, 채택된 결합 시스템이 표적분자의 물리화학적 및/또는 생물학적 성질을 조율하기 위하여 선택될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 다양한 길이, 견고성, 전하 및/또는 광학구조의 결합 시스템을 이용함에 의하여, 한 유형의 조건하에서, 다른 것에 비하여 반감기 등을 변화시키는데, 또는 효능, 특이성 등을 조정하는데 더 (또는 덜) 안정한 결합 시스템을 삽입함으로써 이루어질 수 있다. 탄화수소 사슬을 키모카인 폴리펩티드 사슬에 연결시키는 결합 단위는, J1 및/또는 J2를 채우는 전체 길이와 간격은 가장 바람직하게는 천연 발생 키모카인에 근접한다면, 실질적으로 다양할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 지방족 사슬 Jl은 5(C5) 내지 10(C10) 탄소 길이의 탄화수소 사슬이고, 지방족 사슬 J2는 12(C12) 내지 20(C20) 탄소 길이의 지질이다. J1 C5-C10 탄화수소 사슬의 예는: -C5H11, -C5H9, -C5H7, -C5H5,-C5H3, -C6H13, -C6H11, -C6H9, -C6H7, -C6H5, -C6H3, -C7H15, -C7H13, -C7H11, -C7H9, -C7H7, -C7H5, -C7H3, -C8H17, -C8H15, -C8H13, -C8H11, -C8H9, -C8H7, -C8H5, -C8H3, -C9H19, -C9H17, -C9H15, -C9H13, -C9H11, -C9H9, -C9H7, -C9H5, -C9H3, -C10H21, -C10H19, -C10H17, -C10H15, -C10H13, -C10H11, -C10H9, -C10H7, -C10H5, 및 -C10H3을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
적당한 J2 지질은 지방산 유래 지질과 다환 스테로이드 유래 지질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 지방산은 포화 및 불포화 지방산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 포화지방산의 예는 라우르산(C2), 미리스트산(C14), 팔미트산 (C16), 스테르산(C18), 및 아라키드산(C20)이다. 불포화지방산의 예는 올레산(C18), 리놀레산(C18), 리놀렌산(C18), 엘레오스테르산(C18), 및 아라키돈산(C20)이다. 다환은: 알도스테론, 콜레스탄올, 콜레스테롤, 콜산, 코프로스타놀, 코르티코스테론, 코티손, 디히드로콜레스테롤, 데스모스테롤, 디지토제닌, 에르고스테롤, 에스트라디올, 히드록시코르티코스테론, 라토스테롤, 프레드니손, 프레그네놀론, 프로게스테론, 테스토스테론, 자이모스테롤 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 지방산은 통상 키모카인 폴리펩티드 사슬에 산 성분을 통하여 연결됨으로써 아실-결합 부분을 형성하지만 다른 결합도 채택될 수 있다. 탄화수수 사슬을 키모카인 폴리펩티드 사슬에 연결시키는 결합 단위는, N-말단 영역을 채우는 전체 길이와 간격이 천연발생 키모카인에 근접하는한, 실질적으로 다양할 수 있다. 이 관점에서 C-말단 영역이 더 유연하여, 채우는 전체 길이와 간격은 N-말단 영역의 것보다 더 다양할 수 있는 것으로 발견되었다.
다른 바람직한 구체예에서, J1 과 J2 성분은 본 발명의 키모카인 유도체에 포함될 때, 논아노일, 논에노일, 아미노옥시펜탄, 도데카노일, 미리스토일, 팔미테이트, 라우릴, 팔미토일, 에이코사노일, 올레오일, 또는 콜일 같은 C5 내지 C20 포화 또는 불포화 아실 사슬을 포함한다. 예를 들어, J1 치환체는 논아오일 또는 아미노옥시펜탄일 수 있고, J2 치환체는 포화 또는 불포화 지방산, 바람직하게는 C12-C20 지방산, 또는 콜레스테롤 같은 다환 스테로이드 지질일 수 있다.
지방족 사슬의 형태와 길이에에 따라서, 본 발명의 키모카인 수용체 조절제는, 특히 C-말단에서 폴리펩티드 사슬에 부가되어 스페이서 기 및/또는 지방족 부분에 대한 별개의 부착 부위를 제공하는 추가적 아미노산 또는 다른 부분을 함유할수 있다.
"아미노산 유도체"에 의하여는 아미노산 또는 20 개의 유전적으로 코딩되는 천연 발생 아미노산을 제외한 아미노산-유사 화학물질을 의도한다. 특히, 아미노산 유도체 Z1은 20 개의 유전적으로 코딩되는 천연 발생 아미노산 이외의 것이고 식 -(N-CnR-CO)-을 가지는데, 식 중 Cn 은 1-22 탄소이고, R 은 수소, 알킬 또는 방향족이고 N과 Cn, N과 R, 또는 Cn 과 R은 고리 구조를 형성할 수 있다. 또한 N, Cn 및 R은 아미노산 유도체에 따라서 각각 그것의 환원 형태에서 하나 이상의 수소를 가질 수 있다. 알킬 부분은 치환되거나 비치환일 수 있고, 선형, 분지 또는 환형일 수 있고 하나 이상의 헤테로 원자를 포함할 수 있다. 방향족은 치환 또는 비치환일 수 있고, 하나 이상의 헤테로 원자를 포함한다. 아미노산 유도체는 새로이 제작하거나 시중 공급원(예를 들어, Calbiochem-Novabiochem AG, Switzerland; Advanced Chemtech, Louisville, KY, USA; Lancaster Synthesis, Inc., Windham, NH, USA; Bachem California, Inc., Torrance, CA, USA; Genzyme Corp., Cambridge, MA, USA)으로부터 구입할 수 있다. 아미노산 유도체의 예는 아미노이소부틸산(Aib), 히드록시프롤린(Hyp), 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-COOH(Tic), 인돌린-2 카르복실산(indol), 4-디플로로프롤린(P(4,4DiF)), L-티오아졸리딘-4-카르복실산 (Thz), L-호모프롤린(HoP), 3,4-데하이드로프롤린(△Pro), 3, 4디히드록시페닐알라닌(F(3,4-DiOH)), pBzl,-3,4 디히드록시페닐알라닌(F(3,4DiOH, pBzl)), 벤조페논 (p-Bz), 스클로헥실알라닌(Cha), 3-(2-나프틸)알라닌(βNal), 시클로헥실글리신 (Chg), 및 페닐글리신(Phg)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
XI, CHEMOKINE 및 X2에 관하여는, 이들 성분의 아미노산은 대응하는 천연발생 야생형 분자에 실질적으로 상동성이다. 용어 "실질적으로 상동성"은 여기에서 사용될 때, 주어진 서열과 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 (바람직하게는 95-99%) 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 용어는, 결과의 폴리펩티드가 대응하는 천연발생 키모카인의 길항제로서 역할을 하는한, 주어진 서열에 비교하여 1 내지 20, 1 내지 10 또는 1 내지 5 개의 단일 아미노산 결실, 삽입 또는 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 특정 아미노산이, 아미노산의 보존적 치환을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 폴리펩티드의 성질이 실질적으로 변화하지 않는 결과를 초래하면서 다른 아미노산으로 대체될 수 있다는 것은 당업계 주지이다. 이같은 가능성은 본 발명의 범위내에 있다. 아미노산의 결실 또는 삽입은 종종 폴리펩티드의 성질을 실질적으로 변화시키지 않고 이루어질 수 있음 또한 주목하여야 한다. 본 발명은 (대응하는 천연 발생 키모카인의 특이적 길항제 서열의, 예를 들어, 10, 20 또는 50% 까지의 길이의) 이같은 결실 또는 삽입을 포함한다. 게다가, 키모카인은, 여기에 참고문헌으로써 전체가 수록된 WO 99/11655에 기재된 모듈 '크로스오버' 합성 접근법 같은, 상이한 키모카인 폴리펩티드 단편을 혼합 또는 결합시켜 추가적 다양성을 생성하는 것을 포함하며 실질적으로 변형될 수 있다.
N- 및/또는 C-말단에서의 변형에 추가하여, 본 발명의 키모카인 수용체 조절제는 또한 폴리펩티드 사슬의 다른 위치, 즉, 상기 식에서 CHEMOKINE으로 나타낸폴리펩티드 사슬에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다. 한 바람직한 구체예에서 변형은 키모카인의 N-루프에서 이루어져 표적 수용체에 대한 그것의 특이성/감도를 증가시킨다. 이런 방식으로, 본 발명의 변형된 키모카인 수용체 조절제의 N-루프는 특이적 수용체를 차단하는 한편 그것의 다른 잠재적 공-수용체에 대한 길항제 효과를 최소화한다. "N-루프"에 의하여는 주어진 키모카인 폴리펩티드 사슬의 N-말단 영역을 정의하는 제 1의 보존적 시스테인 패턴에 인접하는/C-말단 20 내지 26 개의 아미노산 서열 영역을 의도한다(도 1 및 2 참조). 예를 들어, 키모카인 폴리펩티드 사슬의 N-으로부터 C-말단 방향으로 읽을 때, CC 키모카인의 N-루프는 제 1의 및 제 2의 보존적 시스테인 아미노산에 인접하는/C-말단 및 제 3의 보존적 아미노산에 인접하는/N-말단 사이에 위치하는 아미노산 영역이다.
본 발명의 키모카인 수용체 조절제는 또한, 형광단, 및 특이적, 선택 부위에 도입된 다른 치환체를 포함하는, 분자를 키모카인 작용, 바이러스 저해 등의 막 및 세포-생물학적 사건의 프로브로 전환시키는 것뿐만 아니라 약물동태학등을 모니터할 수 있는 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 검출가능한 표지는 본 발명의 키모카인 수용체 조절제의 C-말단 영역에 바람직하게 부착된다. 검출가능한 표지는 키모카인 폴리펩티드 사슬의 합성동안 또는 합성 후에 삽입된 수 있다. 한 예로서, 검출가능한 표지는 사슬 조립동안 사전-라이게이션 펩티드 단편에 삽입될 수 있고, 예를 들어, 다른 보호기의 제거 및 수지로부터 표지 펩티드의 배출 전에 형광단를 수지-결합 펩티드 상의 비보호 반응성기에 접합시키는 것이 편리하다. 검출가능한표지를 포함하는 아미노산 유도체 및 펩티드나 폴리펩티드 서열 내에 삽입하기 위하여 사용되는 화학적 합성 기술은 주지이고 이 목적을 위하여 사용될 수 있다. 이 방법에서 결과의 키모카인 폴리펩티드 사슬 라이게이션 산물은 선택의 사전 특정 위치에 하나 이상의 검출 가능한 표지를 함유하도록 고안될 수 있다. 대안으로 검출 가능한 표지는, 펩티드 단편 라이게이션 전 또는 라이게이션 후 폴리펩티드 사슬의 주어진 아미노산 상에 존재하는, 부위-특이적 부착을 허용하는 케토 또는 알데히드기 같은 반응성기, 바람직하게는 화학선택성 반응성기에 첨가될 수 있다.
이 목적에 적당한 검출 가능한 표지는 광활성기 뿐아니라, 형광단과 다른 염료를 포함하는 발색단, 또는 비오틴 같은 헵텐을 포함한다. 이 같은 표지는 다수의 상이한 시중 공급원으로부터(예를 들어, Molecular Probes, Oregon USA; Sigma and affiliates, St. Louis MO, USA; 등) 구입가능하다. 수지 표지의 표지를 위하여는, 플루오레세인, 에오신, 오레곤 그린, 로다민 그린, 로돌 그린, 테트라메틸로다민, 로다민 레드, 텍사스 레드, 쿠마린 및 NBD 형광단, 답실 발색단 및 비오틴이 모두 플루오르화 수소(HF) 뿐아니라 대부분의 다른 산에 대하여 적당하게 안정적이고, 따라서 고상 합성 과정을 통한 삽입에 적당하다. (Peled, et al., Biochemistry (1994) 33 : 7211; Ben-Efraim, et al., Biochemistry (1994) 33: 6966).
쿠마린외에 이들 형광단은 또한 Fmoc 화학을 사용하여 합성된 펩티드의 보호기 제거에 사용되는 시약에 대하여도 안정하다 (Strahilevitz, et al., Biochemistry (1994) 33: 10951). ε-답실-L-리신의 t-Boc 과 α-Fmoc 유도체는 또한 답실 발색단을 폴리펩티드 서열 내 선택의 부위에 삽입시키는데 사용될 수 있다. 답실 발색단은 넓은 가시적 흡수성을 가지며, 소광기로서 사용될 수 있다.답실기는 또한 답실 숙신이미딜 에스테르를 사용하여 N-말단에 삽입될 수 있다 (Maggiora, et al., JMed Chem (1992) 35 : 3727). EDANS 는 FRET 실험에서 답실 소광체와 짝짓기 위한 일반적 형광단이다. 이 형광단은 5-((2-t-Boc)-γ-글루타밀아미노에틸)아미노)나프탈렌-1-술폰산을 사용하는 펩티드의 자동화 합성 중에 편리하게 도입된다 (Maggiora, et al., J Med Chem. (1992) 35 : 3727). α-(t-Boc)-ε-단실-L-리신은 화학적 합성 동안 단실 형광단의 폴리펩티드 내로의 삽입에 사용될 수 있다 (Gauthier, et al., Arch Biochem. Biophys. (1993) 306 : 304). EDANS와 함께 사용될 때, 이 형광단의 형광은 답실의 흡광과 중복된다. 펩티드의 부위-특이적 비오틴화는 비오시틴의 t-Boc-보호된 유도체(Geahlen, et al., Anal. Biochem. (1992) 202: 68) 또는 다른 주지의 NHS-비오틴 등 같은 비오틴화 유도체를 사용하여 달성될 수 있다. 라세미 벤조페논 페닐알라닌 유사체는 또한 그것의 t-Boc 또는 Fmoc 보호에 이어 펩티드 내로 삽입될 수도 있다(Jiang, et al., Intl. J Peptide Prot. Res. (1995) 45 : 106). 디아스트로머의 분해는 산물의 HPLC동안 성취될 수 있고; 비보호된 벤조페논 또한 당업계 표준 기술에 의하여 분해될 수 있다. 옥심 결합을 위한 케토-함유 아미노산은, 아자/히드록시 트립토판, 비오틸-리신 및 D-아미노산이 수지상 표지 용도로 사용될 수 있는 아미노산의 다른 예이다. 자동화 펩티드 합성 용도로 당업계 표준기술을 따라 관용 합성법에 의하여 다른 보호된 아미노산이 제조될 수 있다는 것이 이해될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 키모카인 수용체 조절자는 융합된 약물을 포함 할 수 있다 (예를 들어,WO 00/04926 참조).
본 발명의 키모카인 수용체 조절자를 제작하는 방법이 또한 제공된다.
방법은 (i) 천연 발생 키모카인에 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드 사슬을 포함하는 천연 발생 키모카인의 유사체를 합성하는 단계로서, 폴리펩티드 사슬은 그것의 N-말단, N-루프 및 C-말단 중 하나 이상에서 지방족 사슬 및 아미노산 유도체로부터 선택되는 부분으로 변형된 것을 특징으로 하는 합성 단계: 및 (ii) 대응 천연 발생 키모카인과 비교하여 길항제 활성에 대하여 키모카인 유사체를 스크리닝하는 단계를 포함한다.
특히, 본 발명의 N-말단 키모카인 수용체 조절자의 제조방법은: (i) 천연 발생 키모카인에 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드 사슬을 포함하는 천연 발생 키모카인의 유사체를 합성하는 단계로서, 폴리펩티드 사슬은 그것의 N-말단에서 지방족 사슬 또는 하나 이상의 아미노산 유도체로 변형된 것을 특징으로 하는 합성 단계: 및 (ii) 대응 천연 발생 키모카인과 비교하여 길항제 활성에 대하여 키모카인 유사체를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 본 발명의 C-말단 키모카인 수용체 조절자의 제조방법은: (i) 천연 발생 키모카인에 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드 사슬을 포함하는 천연 발생 키모카인의 유사체를 합성하는 단계로서, 폴리펩티드 사슬은 그것의 C-말단에서 지방족 사슬 또는 다환으로 변형된 것을 특징으로 하는 합성 단계: 및 (ii) 천연 발생 키모카인과 비교하여 길항제 활성에 대하여 키모카인 유사체를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 본 발명의 N-/C-말단 키모카인 수용체 조절제의 제조방법은: (i) 천연 발생 키모카인에실질적으로 상동인 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드 사슬을 포함하는 천연 발생 키모카인의 유사체를 합성하는 단계로서, 폴리펩티드 사슬은 그것의 N-말단에서 지방족 사슬 또는 하나 이상의 아미노산 유도체로 변형되고, 그것의 C-말단에서 지방족 사슬 또는 다환으로 변형된 것을 특징으로 하는 합성 단계: 및 (ii) 천연 발생 키모카인과 비교하여 길항제 활성에 대하여 키모카인 유사체를 스크리닝하는 단계를 포함한다.
본 발명의 키모카인 수용체 조절제의 합성은 화학적 합성(즉, 무-리보솜 합성), 또는 생물학적 (즉, 리보솜 합성) 및 화학적 합성의 조합에 의하여 달성된다. 화학적 합성을 위하여, 본 발명의 키모카인 수용체 조절제는, Fmoc 과 tBoc 접근법을 사용한 고상 또는 용액상 펩티드 합성 같은, 전체적 단계적 사슬 조립 또는 단편 축합 기술에 의하여, 또는 전체적 사슬 조립으로 제조된 펩티드 단편의 화학적 라이게이션, 또는 사슬 조립 및 생물학적 제조의 조합에 의하여 제조될 수 있다. 이같은 단계적 사슬 조립 또는 단편 축합 및 라이게이션 기술은 당업계에 주지이다 (예를들어, Kent, S. B. H., Ann. Rev. Biochem. (1988) 57 : 957-989; Dawson et al., Methods Enzymol. (1997) 287 : 34-45; Muir et al., Methods Enzymol. (1997) 289 : 266-298; Wilken et al., Current Opinion In Biotechnology (1998) 9 : 412-426; Ingenito et al., J Amer. Chem. Soc. (1999) 121 (49): 11369-11374 ; and Muir et al., Chemistry & Biology (1999) 6 : R247-R256 참조).
화학적 라이게이션에 대하여는, N-말단 관능기를 갖는 제 1의 펩티드 단편은 N-말단 관능기와 반응하는 C-말단 관능기를 갖는 제 2의 펩티드 단편과 라이게이션하여 그들 사이에서 공유결합을 형성한다. 선택되는 관능기에 따라서, 라이게이션 반응은 라이게이션 부위에서 천연 아미드결합 또는 비-천연 공유결합을 갖는 산물을 생성한다. 화학적 라이게이션용으로 채용되는 제 1 또는 제 2의 펩티드 단편은 단계적 사슬 조립 또는 단편 축합을 사용하여 전형적으로 제조된다. 특히, 본 발명의 키모카인 수용체 조절제는 펩티드 단편의 라이게이션에 의하여 제조되고, 단편은 라이게이션에 사용될 의도된 화학선택성 반응 화학에 관하여 적당한 부가 화학선택성 반응기를 포함하도록 제조된다. 이들 화학은 천연 화학적 라이게이션 (Dawson, et al., Science (1994) 266: 776-779; Kent, et al., WO 96/34878), 연장 일반적 화학적 라이게이션 (Kent, et al., WO 98/28434), 옥심 형성 화학적 라이게이션 (Rose, et al., J Amer, Chem. Soc. (1994) 116 : 30-33), 티오에스테르 형성 라이게이션 (Schnolzer, et al., Science (1992) 256 : 221-225), 티오에테르 형성 라이게이션 (Englebretsen, et al., Tet, Letts. (1995) 36 (48): 8871-8874), 히드라존 형성 라이게이션 (Gaertner, et al., Bioconj. Chem. (1994) 5 (4): 333-338), 및 티아졸리딘 형성 라이게이션 및 옥사졸리딘 형성 라이게이션(Zhang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1998) 95 (16): 9184-9189; Tam, et al., WO 95/00846)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
주어진 라이게이션 화학에 대한 반응 조건은 라이게이션 성분의 소망의 상호작용을 유지하기 위하여 선택된다. 예를 들어, pH와 온도, 펩티드와 성분의 용해도, 펩티드의 비율, 물 성분과 각 펩티드의 조성은 라이게이션을 최적화하기 위하여 변화시킬 수 있다. 펩티드를 상이한 정도로 용해시키는 시약의 첨가 또는 배제가 더 사용되어 특이성 및 소망의 라이게이션 반응의 속도를 제어할 수 있다. 반응 조건은 하나 이상의 내인적 및/또는 외인적 대조 표준에 비교한 소망의 화학선택적 반응 산물에 대한 검정에 의하여 결정될 수 있다.
화학적 합성의 바람직한 방법은 Kent et al., WO 96/34878에 개시된 천연 화학 라이게이션을 채용하고, N- 및/또는 C-말단에서 화학적으로 변형된 단백질을 제조하는 방법은 여기에 참고문헌으로 수록된 Offord et al., WO 99/11666에 개시된다. 일반적으로, C-말단 티오에스테르를 함유하는 제 1 펩티드는 비산화 술프히드릴 측쇄를 갖는 N-말단 시스테인을 갖는 제 2 펩티드와 반응한다. 촉매적 양의 티올, 바람직하게는 벤질 메르캅탄, 티오페놀, 2-니트로티오페놀, 2-티오벤조산, 2-티오피리딘 등의 존재하에서, N-말단 시스테인의 비산화 술프히드릴 측쇄는 C-말단 티오에스테르와 축합된다. 제 1 및 제 2의 펩티드를 β-아미노티오에스테르 결합에 의하여 결합함으로써 중간체 펩티드가 생성되고, 이것은 재배열되어 제 1 및 제 2 펩티드가 아미노 결합으로 결합된 것을 포함하는 펩티드 산물이 생성된다.
화학적 및 생물학적 제조의 조합에 관하여는, 하나의 펩티드 단편이 화학적 합성에 의하여 제조되는 한편, 다른 하나는 재조합 접근법을 사용하여 제도되는데, 단편들은 그 후 화학적 라이게이션을 사용하여 연결되어 전장 산물을 생성한다. 예를 들어, intein 발현 시스템은 'intein' 단백질-스플라이싱 원소의 유도성 자기-절단 활성을 이용하여 C-말단 티오에스테르 펩티드 단편을 생성하도록 사용될 수 있다. 특히, intein은 DTT, β-메르캅토에탄올 또는 시스테인 같은 티올의 존재하에서, C-말단 티오에스테르를 함유하는 펩티드 단편을 생성하는 특이적 자기-절단을 수행한다 (예를 들어, Muir et al., Chemistry & Biology (1999) 6 : R247-R256; Chong et al., Gene (1997) 192 : 277-281; Chong et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26 : 5109-5115; Evans et al., Protein Science (1998) 7: 2256-2264; 및 Cotton et al., Chemistry & Biology (1999) 6 (9): 247-256 참조). 이 C-말단 티오에스테르 함유 펩티드 단편은, 그 다음 천연 화학적 라이게이션에서 채용되는 것과 같은 N-말단 시스테인을 갖는 펩티드 단편 같은 N-말단 티오에스테르-반응성 관능성을 함유하는 제 2의 펩티드를 라이게이션 하는데 사용될 수 있다.
지방족 사슬과 아미노산 유도체는 사슬 조립, 사슬 조립 이후 또는 그것의 조합 동안 삽입될 수 있다. 사슬 조립 동안의 삽입을 위하여는, 아미노산 유도체 및/또는 부착된 지방족 사슬을 갖는 아미노산은 단계적 또는 단편 축합, 및/또는 라이게이션 사슬 조립 과정으로 삽입된다. 이들 아미노산은 펩티드 합성 동안 성장하는 펩티드 사슬, 라이게이션을 위하여 표적화되는 조립된 펩티드 단편에 단계적 방식으로 첨가될 수 있어서, 어느 정도 부가 N- 또는 C-말단 변형은 폴리머 지지체로부터 절단에 의하여 제공될 수 있고, 그로써 절단 산물은 소망의 지방족 사슬을 생성한다. 사슬 조립 후에는, 반응성 관능기를 갖는 아미노산 또는 그것의 유도체는 사슬 조립 동안 삽입되고(보호 또는 비보호 형태) 그것은 그 후 비보호 반응성 형태로 소망의 부분의 부착, 즉, 펩티드 합성후 접합 반응에 사용된다. 사슬 조립 후 부착은 변성 선형 펩티드 사슬 상에서, 또는 폴리펩티드 사슬의 폴딩에 이어 수행될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 아미노산 유도체는 펩티드 합성 동안 소망의 아미노산 위치에서 첨가되는 한편, N-, C- 및/또는 N-/C-말단 지방족 사슬은 펩티드 합성 후에 접합 반응에 의하여 첨가된다. 어떤 다수의 접합 화학 (예를 들어, Plaue, S et al., Biologicals. (1990) 18 (3): 147-57; Wade, J. D. et al., Australas Biotechnol. (1993) 3 (6): 332-6; Doscher, M. S., Methods Enzymol. (1977) 47 : 578-617; Hancock, D. C. et al., Mol Biotechnol. (1995) 4 (1) : 73-86; Albericio, F. et al., Methods Enzymol. (1997) 289 : 313-36 참조) 뿐 아니라, 라이게이션 화학도 소망의 공유결합에 따라서 사용될 수 있다. 본 발명의 키모카인 수용체 조절제의 폴딩은 당업계 표준 기술을 따라 달성될 수 있다. 예를 들어, WO 99/11655 ; WO 99/11666; Dawson et al., Methods Enzymol. (1997) 287 : 34-45 참조.
길항제 활성에 대한 합성된 키모카인 화합물을 스크리닝하기 위하여, 화합물은, 대응 수용체에 대한 키모카인 리간드의 직접 또는 간접 결합을 특징으로 하는 시험관내 또는 생체내 기초 검정에 의하여 시험된다. 키모카인 수용체와 그것의 대응하는 야생형 키모카인의 예는 CXXXCR1 (프랙타카인); XCR1 (SCM-1); CXCR2 (GRO, LIX, MIP-2); CXCR3 (MIG, IP-10); CXCR4 (SDF-1); CXCR5 (BLC); CCR1 (MIP-lα, RANTES, MCP-3); CCR2 (MCP-1, MCP-3, MCP-5); CCR3 (Eotaxin, RNATES, MIP-lα) ; CCR4 (MDC, TARC); CCR5 (RANTES, MIP-lα, MIP-lβ ; CCR6 (MIP3α) ; CCR7 (SLC, MIP-3 β) ; CCR8 (TCA-3); 및 CCR9 (TECK)를 포함한다. 이 시스템에 대한 시험관내 및 생체내 검정은 주지이고, 바로 이용가능하거나 새로이 만들 수 있다. 예를 들어, US 5,652,133; US 5,834,419; WO 97/44054; WO 00/04926; 및 WO 00/0492 참조. 예를 들어, 하나 이상의 키모카인 수용체를 발현하는 천연, 형질전환, 및/또는트렌스제닉 세포주는 본 발명의 화합물과 같은 키모카인 수용체 조절제에 노출되었을 때, 키모카인-유도 주화성의 효과나 이 사건의 저해를 모니터링하는데 전형적으로 사용된다. 동물 모델 또한, 본 발명의 키모카인 수용체 조절제로의 처리와 조합한 반응 프로필을 모니터링 하거나, 화합물의 약물동력학과 약물동력학적 특성을 특성결정하는데 채용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 바이러스 감염의 저해제로서 특성결정하기 위하여, 표적 세포주와 외피 세포주가 채용되는, 외피-매개 세포 융합 검정이 본 발명의 키모카인 수용체 조절제에 대하여 HIV 감염을 막는 능력에 대하여 채용될 수 있다. 물론, 무-세포 바이러스 감염 검정 또한 이 목적으로 채용될 수 있다.
예로서, 일반적으로 주화성의 길항제 성질을 평가하기 위하여, 단핵구, T 림프구 및 호중구에 대한 확립된 프로토콜에 따라 정상 공여자로부터 분리된 것과 같은 말초혈 백혈구가 채용될 수 있다. 일련의 C, CC, CXXXC 및 CXC 키모카인 수용체-발현 시험 세포가 제작되고, 본 발명의 개별 화합물의 일련의 희석물에 노출된 후, 평가될 수 있다. 천연 키모카인이 대조표준으로서 사용될 수 있다. 예를 들어 다양한 키모카인 수용체를 코딩하는 발현 카세트로 트렌스펙션된 일련의 세포들이 이 목적에 적당하다. 예를 들어, RANTES, SDF-1α나 SDF-1β 및 MIP 같은 키모카인 길항제가 형질전환체 발현 CXCR4/융합/LESTR, CCR3, CCR5, CXC4 (이같은 세포는 다양한 시중 및/또는 학술적 공급원으로 부터 입수가능하고 표준 프로토콜에 따라 제조할 수 있는데; 예를 들어, Risau, et al., Nature 387: 671-674 (1997); Angiololo, et al., Annals NYAcad. Sci. (1996) 795 : 158-167; Friedlander, etal., Science (1995) 870: 1500-1502 참조)를 사용하여 스크리닝 될 수 있다. 결과는, 대조 표준 배지에 비한 자극된 세포 이동의 증가된 배수, 및 결정된 통계학적 유의수준를 나타내는 주화성 지수("CI")로서 표현될 수 있다.
예를 들어, 경쟁적 저해 대 수용체 순환 효과를 평가하기 위하여, 수용체 결합 검정 또한 수행될 수 있다 (모두가 참고문헌으로써 수록된 Signoret, N. et al., "Endocytosis and recycling of the HIV coreceptor CCR5,"J Cell Biol. 2000 151 (6): 1281-94; Signoret, N. et al.,"Analysis of chemokine receptor endocytosis and recycling,"Methods Mol Biol. 2000; 138: 197-207; Pelchen-Matthews, A. et al., "Chemokine receptor trafficking and viral replication,"Immunol Rev. 1999 Apr; 168: 33-49; Daugherty, B. L. et al.,"Radiolabeled chemokine binding assays," Methods Mol Biol. 2000 ; 138 : 129-34; Mack, M. et al."Downmodulation and recycling of chemokine receptors,"Methods Mol Biol. 2000; 138: 191-5 참조). 이 접근법은 주지이고, 표준 프로토콜에 따라 비표지 천연 키모카인이 농도가 증가되면서 존재하는 중에 본 발명의 표지된 키모카인 수용체 조절제를 전형적으로 채택할 것이다. 물론 표지는 리간드 중 어느 하나 또는 둘 모두에 존재할 수 있다. 이 유형의 검정에서, 결합 데이터는, 예를 들어, LIGAND (P. Munson, Division of Computer Research and Technology, NIH, Bethesda, MD) 같은 컴퓨터 프로그램으로 분석될 수 있고, 천연 백혈구 또는 표적 키모카인 수용체를 발현하는 일련의 수용체-트렌스펙션 세포에 비교한 "1 부위" 및 "2 부위" 모델 모두에 의한 스케쳐드 플롯 분석을 받을 수 있다. 비표지 리간드에 의한 결합 경쟁률을 그 후 다음 식: % 저해 = 1 - (비표지 키모카인 존재하의 결합/배지 단독 존재하의 결합) x 100 에 따라 계산할 수 있다.
화합물을 그것의 바이러스 감염과 질병을 예방하거나 완화시키는 능력에 대하여 스크리닝 하기 위하여, 화합물은 다양한 바이러스 균주와 대조표준에 노출된, 적당한 수용체를 안정하게 발현하는 일련의 세포에 대하여 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, CCR3, CCR5, CXC4 또는 CXCR4 수용체를 발현하는 U87/CD4 세포는 M-반응, T-반응, 및 양쪽 반응 HIV 균주의 감염을 스크리닝하는데 채용될 수 있다. 바이러스 감염의 저해는 키모카인 농도와 대조표준 농도에 대한 감염의 백분율로서 평가될 수 있다. 예를 들어, McKnight, et al., Virology (1994) 201 : 8-18) ; 및 Mosier, et al., Science (1993) 260 : 689-692; Simmons, et al, Science (1997) 276: 276-279; Wu, et al., J. Exp. Med. (1997) 185 : 168-169; 및 Trkola, et al., Nature (1996) 384 : 184-186 참조.
칼슘 이동 검정은, 예를 들어, 호중구와 호산구에 대한 주화성인 천연 키모카인의 길항제를 동정하기 위한 (Jose, et al., J. Exp. Med 179 : 881-887 (1994)), 수용체 결합의 길항제에 대한 스크리닝에 유용한 다른 예이다. 다른 예로서, 본 발명의 화합물의 맥관형성 활성은 병아리 융모막요막(CAM) 검정 (Oikawa, et al., Cancer Lett, (1991) 59 : 57-66)에 의하여 평가될 수 있다.
본 발명의 키모카인 수용체 조절제는, 연구 도구로서, 진단제 및 치료제로서의 용도를 포함하는 다수의 용도를 갖는다. 특히, 본 발명의 키모카인 수용체 조절제는 가치있는 약학적 성질을 갖는 것으로 발견되었고, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 죽상종/중상 경화증, 기관 이식 거부반응 및 류마티스성 관절염을 포함하는 다양한 이상과 관련된 - 대응 야생형 분자와 관련된 염증 효과를 효과적으로 막는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 그것은 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 죽상종/중상 경화증, 기관 이식 거부반응 및 류마티스성 관절염의 치료에 유용하다. 예를 들어, RANTES 및 SDF-lα나 SDF-1β 길항제 같은 본 발명의 생물활성 합성 키모카인의 몇몇은 HIV-1 감염을 저해하는 것으로 또한 밝혀졌고, 길항제(예를 들어, vMIP-II 유사체)는 동일한 목적으로 유용할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 RANTES, 또는 SDF-lα나 SDF-1β 길항제와 vMIP-II 유사체는 포유동물에서 HIV-1을 저해하는데 유용할 수 있다. 방법에 의하여 측정되는 화합물의 HIV-1에 대항한 사용을 위한 잠재적인 화합물은 다음 실시예에서 기재된다. 염증 효과에 대항한 사용에의 잠재적인 화합물은 당업계 숙련자에게 주지인 방법에 의하여 결정된다. 게다가, 본 발명의 키모카인 수용체 조절제는 단독으로, 또는 서로 조합하여 뿐 아니라, 주어진 이상을 치료하는데 상승적인 다른 비-키모카인 약물과 조합하여 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
이에 제한되지 않는 예로서, 다음은 야생형 키모카인 분자의 몇몇의 특이적 예 및 본 발명의 키모카인 수용체 조절제를 제조하는 일반적 이용법을 설명하기 위한 관련 생물학적 성질이다. 예를 들어, SCM-1은 비장에서 발현되는 C-키모카인이다. 이것은 CC- 및 CXC-키모카인과 실질적으로 관련되는데, 그것이 이들 단백질에서 보존적인 4개의 시스테인 중 오직 두번째 및 네번째 것만을 갖는다는 점에서 다르다 (Yoshida et al. FEBS Letters (1995) 360 (2): 155-159); Yoshida et al. J.Biol. Chem. (1998) 273 (26): 16551-16554). 인간에서, 두개의 고도로 상동적인 SCM-1 단백질인, 두 개의 아미노산 치환 만큼 상이한 SCM-1α 및 SCM-1β가 있다. SCM-1과 림포텍틴은 그러므로 C-키모카인 또는 γ-키모카인의 인간과 마우스의 전구형태이다. SCM-1 은 림포펙틴, 뮤린-백혈구-특이적 키모카인과 약 60% 상동성인 것으로 밝혀졌다. SCM-1 분자 둘 모두, 다양한 인간 조직 중 태반에서 주로 발현되고, 비장 및 흉선에서 약하게 발현되는 희소 수용체인 GPR5를 발현하도록 조작된 뮤린 L1.2 세포에서 특이적으로 이동을 유도한다. 따라서, SCM-1의 길항제는 GPR4의 정상적인 기능을 막는 것에서 용도를 찾는다.
다른 예로서, 76 개 아미노산 CXXXC-키모카인인 프랙탈카인의 용해성 형태는 T-세포와 단핵구에 대한 강력한 화학유인물질이지만 호중구에 대하여는 그렇지 않다. 프랙탈카인은 TNF 또는 IL1에 의한 자극 후에 현저하게 증가한다. 프랙탈카인에 대한 인간 수용체는 CX3CR1으로서 표시된다. 수용체는 프랙탈카인의 점착 및 이동 기능 둘 모두를 매개한다. 인간 수용체는 호중구, 단핵구, T-림프구, 및 뇌를 포함하는 몇몇 실질 기관에서 발현된다. 수용체는 HIV-1의 주요 분리체로부터의 외피 단백질에 대한 공수용체로서 CD4와 함께 기능하는 것으로 밝혀졌다. 세포-세포 융합 검정은 프랙탈카인이 융합을 실질적으로 및 특이적으로 저해하는 것을 나타낸다. (예를 들어, Bazan et al Nature (1997) 385 (6617): 640-644; Combadiere et al. J. Biol. Chem. (1998) 273 (37): 23799-23804; Rossi et al. Genomics (1998) 47 (2): 163-170; 및 Faure et al. Science (2000) 287 : 2274-2277 참조). 그러므로, 프랙탈카인의 길항제는, 관절염 같은, TNF 나 IL1 경로와 관련된 다양한 관절염성 이상의 치료에서 용도를 발견할 수 있을 뿐 아니라 HIV 감염의 차단제로서의 용도를 발견할 수 있다.
에오탁신은 추가적 예이다. 이 단백질은 74 아미노산 길이이고, 그것의 특징적 시스테인 패턴 때문에 CC-키모카인으로서 분류된다. 알레르기 염증의 모델로서 사용되고, 천식-관련 이상에서 관련되는 기니아 피그의 기관지꽈리 세척에서 발견되었다. 에오탁신은 피부에서 호중구의 축적에 있어서 유의한 영향 없이 1-2pM 투여량에서의 실질적인 호산구 축적을 유도한다. 에오탁신은 시험관내에서 기니아 피그와 인간 호산구 둘 모두의 강력한 자극제이다. 이 인자는 기니아 피그 호산구 상의 RANTES와 결합부위를 공유하는 것으로 보인다. 에오탁신은 정상 인간 호산구에서 칼슘 흐름 반응을 유도하지만, 호중구나 단핵구에서는 그러하지 않는다. 반응은 호산구를 다른 CC-키모카인으로 사전처리함에 의하여 둔감화될 수 없다. 호염구에서 에오탁신은 RANTES보다 더 높은 수준의 주화성 반응을 유도하지만, 오직 히스타민 배출이나 류코트리엔 C4 형성에 대한 이동성 효능을 갖을 뿐이다. 그것은 또한 B세포 림프종 세포의 주화성에서 역할을 할 수 있다. 에오탁신의 주요 수용체는 CCR3이다. (예를 들어, Bartels et al., Biochem. Biophys. Res. Comme (1996) 225 (3): 1045-51) ; Jose et al., J Exp. Med. (1994) 179 : 881-887); Ponath et al., J. Clin. Investigation (1996) 97 (3): 604-612); Ponath et al., J. Exp. Med. (1996) 183 (6): 2437-2448); Yamada et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1997) 231 (2): 365-368 참조). 따라서, 에오탁신의 길항제는 천식과 다른 호산구 관련 알레르기 이상의 강력한 조절제로서 사용될 수 있다.
RANTES는 길항제가 특히 관심있는 표적 키모카인의 다른 예이다. 염증, 기관 거부반응으로부터 HIV 감염에 이르는 범위의 다수의 이상에서 CC-키모카인이 관련된다. RANTES의 합성은 TNF-α 및 IL1-α에 의하여 유도되지만, TGF-β, IFN-γ 및 IL6에 의하여는 유도되지 않는다. RANTES는 배양물내 순환 T-세포 및 T-세포 클론에 의하여 생산되지만, 지금까지 시험된 T-세포주에 의하여는 생산되지 않는다. RANTES 의 발현은 T-림프구의 자극 후에 억제된다. RANTES는 T-세포, 인간 호산구 및 호염구에 대하여 주화성이 있고, 백혈구를 염증부위에 보충하는데 능동적 역할을 한다. RANTES는 또한 호산구가, 예를 들어, 호산구성 양이온 단백질을 배출하도록 활성화한다. 그것은 호산구의 밀도를 변화시켜 저밀도로 만들며, 그것은 일반화된 세포 활성화의 상태를 나타내고 천식과 알레르기성 비염과 같은 질병과 가장 빈번하게 연관되는 것으로 생각된다. RANTES는 또한 산화 기작의 강력한 호산구-특이적 활성화제이다. RANTES는 단핵구의 내피세포에 대한 점착을 증가시킨다. 그것은 세포표면 마커 CD4와 UCHL1을 발현하는 단핵구와 T-림프구의 이동을 선택적으로 지지한다. 이들 세포는 기억 T-세포로 헬퍼 T-세포를 사전-자극하는 것으로 생각된다. RANTES는 몇몇의 선택 호염구 공여자로부터 인간 호염구를 활성화시키고 히스타민의 배출을 야기한다. 다른 한편, RANTES는 또한 가장 강력한 히스타민 유도제 중 하나인 MCAF를 포함하는 몇몇의 시토카인에 의하여 유도되는 히스타민의 배출을 저해할 수도 있다.
RANTES는 최근 주화성 이외의 생물학적 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그것은 CHAK (C-C-키모카인-활성화 킬러)로 알려진 킬러 세포의 증식과 활성화를유도할 수 있는데, 이는 IL2에 의하여 활성화되는 세포와 유사하다. RANTES는 인간 윤활 섬유모세포에 의하여 발현되고, 류마티스성 관절염에서 진행성 염증 과정에 참여할 수 있다. RANTES에 대한 고친화성 (약 700 결합부위/세포; Kd=700 picoM) 수용체는 인간 단핵구 백혈구 세포주 THP-1에서 동정되었는데, 이는 주화성과 칼슘 이동 검정에서 RANTES에 반응한다. THP-1 세포의 RANTES에 대한 주화성 반응은 MCAF(단핵구 주화성 및 활성화 인자)나 MIP-1-α(마크로파지 염증 단백질)로 사전-인큐베이션함으로써 현저하게 저해될 수 있다. 단핵구에 대한 RANTES의 결합은 MCAF와 MIP-1-α에 의하여 경쟁된다. RANTES에 대한 수용체는 CCR1, CCR3 및 CCR5 이다. RANTES의 길항제의 임상적 사용이나 유의성은 배가된다. 예를 들어, 천연 RANTES에 대한 항체는 실험적 사구체간질증식성 신염과 관련된 세포 침윤을 현저하게 저해할 수 있다. 추가로, 천연 RANTES는 신장의 이식 거부반응과 관련된 세포 거부반응을 겪는 인간 신장 동종이식편에서 고도로 발현되는 것으로 보인다 (Pattison et al., Lancet (1994) 343 (8891): 209-11 (1994)). RANTES의 화학적 변형 형태(아미노옥시펜탄-RANTES 또는 AOP-RANTES ; 및 n-논아노일 RANTES 또는 NNY RANTES)는 키모카인의 CCR-5 수용체에 대하여 길항제로 작용하며 HIV-1감염을 저해하는 능력을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 RANTES의 길항제 N-, C- 및 N-/C-말단 변형 유사체는 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 죽상종/중상 경화증, 기관 이식 거부반응 및 류마티스성 관절염 같은 질병의 치료에서 항-염증제로서 유용하다.
키모카인 SDF-1α 및 β의 길항제는 추가적 예인데, 이는 키모카인의 CXC 부류에 속한다. SDF-1β는 C-말단에서 4 개의 추가적 아미노산을 갖는다는 것이 다르다. 이들 키모카인은 비-인간 대응체와 92 % 초과로 동일하다. SDF-1은 혈세포를 제외하고 도처에 존재한다. SDF-1은 림프구와 단핵구에 작용하지만 시험관내에서 호중구에 작용하지 않고 생체내에서 단핵구에 대하여 고도로 강력한 화학유인물질이다. 그것은 또한 림프구에서 세포내 액틴 중합반응을 유도한다. SDF-1은 시험관내 및 생체내에서 인간 조혈 전구체 세포에 대한 화학유인물질로서 작용하여 전구체의 혼합된 형태 및 더 원시적 유형을 초래한다. SDF-1은 또한 심실격막 형성에 관여하는 것으로 보인다. CD34+ 세포는 SDF-1와 IL-3의 조합에 반응하여 증가된다. SDF는 또한 이들 세포에서 세포질 칼슘의 일시적 증가를 유도하는 것으로도 밝혀졌다. SDF-1에 대한 주요 수용체는 CXCR4인데, 이는 또한 HIV1에 대한 주요 T-림프구 공수용체로서도 기능한다. 예를 들어, Aiuti et al, J. Exp. Med. (1997) 185 (1) : 111-120 (1997); Bleul et al., J Exp. Med. (1996) 184 (3): 1101-1109 (1996) Bleul et al., Nature (1996) 382 (6594): 829-833; D'Apuzzo et al. European J. Immunol. (1997) 27 (7): 1788-1793 ; Nagasawa et al., Nature (1996) 382 : 635-638); Oberlin et al., Nature (1996) 382 (6594): 833-835 참조.
그러므로, 예를 들어, 본 발명의 SDF-1 길항제는 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 죽상종/중상 경화증, 기관 이식 거부반응 및 류마티스성 관절염 같은 질병의 치료에서 항-염증제로서 유용하다. 게다가, 본 발명의 SDF-1 길항제는 단독으로, 또는 본 발명의 RANTES 길항제 유사체 같은 다른 화합물과 조합하여, 염증전 세포의 보충 및/또는 활성화, 또는 HIV-1 감염의 치료나 차단에 관하여 포유동물에서 SDF-1, RANTES, MIP-1α, 및/또는 MIP-1β의 효과를 차단하기 위하여 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 약제학적 조성물과 본 발명의 하나 이사의 키모카인 또는 약제학적으로 허용되는 그것의 염을 포함하는 치료학적 유효량의 화합물을 투여함으로써 그것이 필요한 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. "약제학적으로 허용되는 염"에 의하여는 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 유효성 및 특성을 유지하며, 생물학적으로나 그외의 바람직하지 않은 염을 의미하려는 의도이다. 염은 산이나 염기에서 유래한다. 산 부가염은 염산, 브롬화수소산, (술페이트와 비술페이트 염을 생성하는) 술프산, 질산, 인산 등 같은 무기산, 및 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피르브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸말산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 시남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 살리실산, p-톨루엔술폰산 등 같은 유기산으로부터 유래한다. 염기 부가염은 무기산으로부터 유래하고, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘 염을 포함한다. 유기 염기로부터 유래한 염은 1차, 2차, 및 3차 아민, 천연-발생 치환 아민 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 트로메트아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로케인, 히드라바민, 클로린, 베테인, 에틸렌디아민, 글루코사민, N-알킬글루코사민, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘 등을 포함하는 시클릭 아민을 포함하는 치환 아민으로부터 형성된 것을 포함한다. 바람직한 유기 염기는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 피페리딘, 트로메트아민 및 콜린이다.
용어 "치료"는 여기에서 사용될 때, 표유동물, 특히 인간에서의 질병의 어떤 치료를 포괄하고: (i) 환자에서 잠복되었지만 아직 가진 것으로 진단되지는 않은 질병의 발생을 막는 것; (ii) 질병을 저해하는 것, 즉 그것의 진행을 정지시키는 것; 또는 (iii) 질병을 완화시키는 것, 즉 질병의 퇴행을 야기시키는 것을 포함한다.
용어 "본 발명의 키모카인 수용체 조절제로 치료함으로써 예방되거나 완화되는 포유류에서의 질병 상태"에 의하여는 여기에서 사용될 때 일반적으로 본 발명의 키모카인 수용체 조절제로 유용하게 치료될 당업계에서 일반적으로 인정되는 모든 질병 상태 및 본발명의 특이적 화합물로 치료함으로써 유용하게 예방되거나 완화될 것으로 발견된 질병상태를 포괄하려는 의도이다. 이들은 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 죽상종/중상 경화증, 류마티스성 관절염 및 기관 이식 거부반응을 설명으로서 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
여기에서 사용될 때, 용어 "치료학적 유효량"은 포유동물에 투여될 때, 예를 들어 항-염증제, 항 천식제, 항 면역억제제, 또는 포유동물에서 바이러스 감염을 저해하는 항 자가면역 질환제로서, 효과적 치료에 충분한 본 발명의 키모카인 수용체 조절제의 양을 지칭한다. "치료학적 유효량"을 구성하는 양은 키모카인 유도체, 상태나 질병 및 그것의 중한 정도, 및 치료될 포유동물, 그것의 체중, 연령 등에 따라 다양할 것이지만, 현재 지식과 그 개시를 고려하여 당업자에 의하여 일상적으로 측정될 수 있다. 여기에서 사용될 때, 용어 "q.s."는 기재된 기능을 달성하기에, 예를 들어 소망의 부피(예를 들어 100mL)의 용액을 생성하기에 충분한 양을 첨가하는 것을 의미한다.
본 발명의 키모카인과 그것의 약제학적으로 허용되는 염, 즉 활성 성분은, 상기된 바와 같이 치료학적 유효 투여량, 즉, 그것이 필요한 포유동물에 투여되었을 때의 양으로 투여된다. 본원에 기재된 본 발명의 키모카인 수용체 조절제의 투여는 유사한 용도에 기증하는 작용제의 투여에 허용되는 어떤 방식에 의할 수도 있다. 여기에서 사용될 때, 용어 "본 발명의 키모카인 수용체 조절제" "본 발명의 폴리펩티드[의 약제학적으로 허용되는 염]과 "활성 성분"은 호환적으로 사용된다.
제제에서 존재하는 본 발명의 키모카인 수용체 조절제의 수준은 당업자에 의하여 채용되는 전범위 내, 예를 들어, 전체 제제에 기초하여 약 0.01 중량 백분률 (%w) 내지 약 99.99%w의 본 발명의 키모카인 수용체 조절제와 약 0.01 %w 내지 99.99%w 부형제에서 다양할 수 있다. 더 전형적으로, 본 발명의 생물활성 합성 키모카인 수용체 조절제는 약 0.5%w 내지 약 80%w 수준으로 존재할 것이다.
인간 투여량 수준은 본 발명의 키모카인 수용체 조절제에 대하여 아직 최적화되어야 하지만, 일반적으로 하루 투여량은 매일 kg 체중 당 약 0.05 내지 25 mg, 가장 바람직하게는 하루 kg 체중 당 약 0.01 내지 약 10 mg 이다. 그러므로, 70 kg인 사람에 대한 투여는, 투여량 범위가 하루에 약 0.07 mg 내지 3.5 mg, 바람직하게는 하루에 약 3.5 mg 내지 1.75 g, 및 가장 바람직하게는 하루에 약 0.7 mg 내지 0.7 g이다. 투여되는 길항제의 양은, 물론 예방과 경감을 위하여 표적화되는 환자와 질병 상태, 고통의 형태와 심한 정도, 투여의 방식과 일정 및 처방 의사의 판단에 따를 것이다. 이같은 사용 최적화는 충분히 당업자의 범위내에 있다.
투여는 어떤 허용되는 전신이나 국소 경로, 예를 들어, 비경구, 경구(특히 영아 제제에 있어), 정맥내, 비내, 기관지 흡입 (즉, 에어로졸 제제), 경피나 국소 경로를 통하여, 예를 들어, 정제, 알약, 캡슐, 가루약, 액체, 용액, 에멀젼, 주사제, 현탁액, 좌약, 에어로졸 등 같은 고체, 반고체 형태 또는 액상 또는 에어로졸 투여 형태에 의할 수 있다. 본 발명의 키모카인 수용체 조절제는 또한, 사전 결정된 속도에서의 폴리펩티드의 지속적 투여를 위하여, 바람직하게는 정확한 투여량의 단일 투여에 적당한 단위 투여 형태로서, 저장 주사, 삼투 펌프, 알약, (전기전달을 포함하는) 경피 부착포 등을 포함하는 유지 또는 제어 배출 투여 형태로 투여될 수 있다. 조성물은 종래 약제학적 담체나 부형제 및 본 발명의 키모카인 수용체 조절제를 포함할 것이고, 추가로, 다른 의학적 작용제, 약제학적 작용제, 담체, 아주반트 등을 포함할 수 있다. 담체는 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 다양한 오일, 예를 들어 땅콩 오일, 콩기름, 미네랄 오일, 참깨 오일, 등으로부터 선택될 수 있다. 물, 식염수, 수성 덱스트로스, 및 글리콜은, 특히 주사제 용액을 위한 바람직한 수성 담체이다. 적당한 약제학적 담체는 녹말, 셀룰로스, 탤크, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 말트, 쌀, 밀가루, 실리카겔, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 스테아레이트, 글레세롤 모노스테아레이트, 염화 나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 다른 적당한 약제학적 담체 및 그것의 제제는 E. W. Martin에 의하여 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기재된다.
바람직하다면, 투여될 약제학적 조성물은 또한, 예를 들어, 아세트산 나트륨, 소르비톨 모노로레이트, 트리에탄올아민 올레이트 등 같은 습윤제나 에멀젼화제, pH 완충제 등과 같은 소량의 비독성 부수적 물질을 함유할 수 있다.
더 많은 활성 성분이 요구될 수 있지만, 경구 투여는, 소망의 예방의 정도에 따라서나 고통의 경감에서, 편리한 매일 투여 섭생을 사용하여 본 발명의 키모카인수용체 조절제를 송달하는데 사용될 수 있다. 이같은 경구 투여를 위하여, 약제학적으로 허용되는 비독성 조성물은, 예를 들어, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 녹말, 포비돈, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탈컴, 셀룰로스, 크로살크멜로스 소듐, 포도당, 젤라틴, 수크로스, 탄산 마그네슘 등 같은 정상적으로 채용되는 어떤 부형제의 삽입에 의하여 제조된다. 이 같은 조성물은 용액, 현탁액, 확산가능한 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속 배출 제제 등의 형태를 취한다. 경구 제제는 위장관 이상의 치료에 특히 적당하다. 일반적 전신 목적을 위한 경구적 생물학적 이용가능성은 아세틸화 아미노산을 포함하는 제제 같은 전신 순환으로의 섭취를 개선하는 부형제를 사용함으로써 조절될 수 있다. 예를 들어, US 5,935,601 및 US 5,629,020 참조.
조성물은 캡슐, 알약 또는 정제의 형태를 취할 수 있고, 따라서 조성물은 활성 성분과 함께 락토스, 수크로스, 디칼슘 포스페이트 등관 같은 희석제; 크로스칼멜로스 소듐, 녹말 또는 그것의 유도체와 같은 붕괴제; 마그네슘 스테아레이트 등 같은 윤활제; 및 폴리비닐피롤리돈, 검 아카시아, 젤라틴, 셀룰로스 및 그것의 유도체 등 같은 바인더를 함유할 것이다.
액상의 약제학적으로 투여 가능한 조성물은, 본 발명의 키모카인 수용체 조절제 및, 예를 들어, 물, 식염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 글리콜, 에탄올, 보존제 등 같은 담체 중의 선택적 약제학적 아주반트를, 예를 들어 용해, 확산 등에 의하여 제조함으로써 용액이나 현탁액을 형성시킬 수 있다. 바람직하다면, 투여될 약제학적 조성물은 또한 습윤제, 분산제, 에멀젼화제, 또는 용해제, pH 완충제 등, 예를 들어, 아세트산 나트륨, 시트르산 나트륨, 시클로덱스트린 유도체, 폴리옥시에틸렌, 소르비톨 모노라우레이트 또는 스테아레이트 등 같은 소량의 비독성 부수적 물질을 함유할 수 있다. 이같은 투여 형태를 제조하는 실제 방법은 알려져 있거나, 당업계 숙련자에게 명백할 것인데; 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 참조. 투여될 조성물이나 제제는 어떤 경우에도 치료되는 환자의 증상을 예방하거나 완화시키는데 효과적인 양으로 활성 성분의 양을 함유할 것이다. 영아에 대한 경구 투여를 위하여는, (시럽이나 현탁액 같은) 액상 제제가 바람직하다.
액체를 함유하는 고상 투여 형태를 위하여, 예를 들어 프로필렌 카르보네이트, 야채 오일이나 트리글리세리드 중의 용액 또는 현탁액이 바람직하게 젤라틴 캡슐 내에 캡슐화된다. 액상 투여 형태를 위하여는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 중의 용액은 충분한 양의 약제학적으로 허용되는 액상 담체, 예를 들어 물로 희석되어 투여를 위하여 용이하게 측정될 수 있다.
대안으로, 액상 또는 반고체 경구 제제는 활성 성분을 야채 오일, 글리콜, 트리글리세리드, 프로필렌 글리콜 에스테르 (예를 들어 프로필렌 카르보네이트) 등 중에 용해시키거나 확산시키고 이들 용액 또는 현탁액을 경 젤라틴 또는 연 젤라틴캡슐 껍질에 캡슐화함으로써 제조될 수 있다.
상기 상태의 치료에서 본 발명의 키모카인 수용체 조절제를 적용할 때, 여기 기재된 활성성분의 투여는 비경구적으로 바람직하게 투여된다. 비경구 투여는 일반적으로 피하, 근육내 또는 정맥내 주사를 특징으로 하고, 경피 또는 복막내 주사 뿐아니라 복장내 주사나 주입 기술을 포함할 수 있다. 주사제는 액상 용액 또는 현탁액, 주사 전 액체내 용액 또는 현탁액화에 적당한 고체 형태, 에멀젼 또는 생물학적 조화성 폴리머-기제 마이크로구형(예를 들어, 리포솜, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 폴리(D,C) 락티드 등) 으로서의 종래 형태로 제조될 수 있다. 적당한 부형제는 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 또한, 바람직하다면, 투여될 약제학적 조성물은 또한, 습윤제나 에멀젼화제, pH 완충제, 용해도 증강제, 단백질 담체 등, 예를 들어 아세트산 나트륨, 폴리옥시에틸렌, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트, 시클로덱스트린, 혈청 알부민 등 같은 소량의 비독성 부수적 물질을 함유할 수도 있다.
본 발명의 키모카인 수용체 조절제는, 예를 들어, 이같은 분자를 (물이나 식염수 같은) 적당한 용매에 용해시킴으로써, 또는 다음의 리포좀 제제에 삽입함으로써, 허용되는 주입액 내로 분산함에 의하여 비경구적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 전형적인 매일 투여량은 한번 주입, 또는 일정 간격을 둔 일련의 주입에 의하여 투여될 수 있다. 비경구적 투여를 위하여, 수용성 형태, 예를 들어, 점도-증가 물질, 예를 들어 카르복시메틸 셀룰로스 나트륨, 소르비톨 및/또는 덱스트란, 및 바람직하다면, 안정화제를 함유하는 수용성 염, 또는 수성 주사 현탁액형태의 활성 성분의 특히 적당한 수성 용액이 있다. 활성성분은, 선택적으로 부형제와 함께 또한 동결건조물의 형태일 수 있고 적당한 용매의 첨가에 의하여 비경구적 투여 전에 용액으로 제조될 수 있다.
비경구적 투여에 대하여 더 최근에 고안된 접근법은 서방성 또는 지속-배출 시스템의 주입을 채택하여, 투여량의 일정한 수준이 유지된다. 예를 들어, 참고문헌으로써 본원에 수록된 US 3,710,795, US 5,714,166 및 US 5,041,292 참조.
이 같은 비경구적 조성물에서 함유되는 활성 성분의 백분률은 그것의 특이적 형태 뿐 아니라, 폴리펩티드의 활성과 환자의 필요성에 고도로 의존한다. 그러나, 용액내 0.01 % 내지 10 %의 활성성분 백분률이 채용 가능하고, 조성물이 그후 상기 백분률로 희석될 것인 고체인 경우 더 높을 것이다. 조성물은 0.02 %-8 %의 용액내 활성성분을 포함할 것이다.
본 발명의 키모카인 수용체 조절제를 투여하는 다른 방법은 환약 주사 및 연속 주입 둘 모두를 이용한다. 이는 치료학적 처방이 HIV-1 감염의 예방에 대한 것일 때 특히 바람직한 방법이다.
에어로졸 투여는 본 발명의 키모카인 수용체 조절제를 호흡기에 직접 송달하는 효과적 방법이다. 이 방법의 몇가지 이점은: 1) 그것이 효소적 분해, 위장관으로부터의 불량한 흡수, 또는 간의 제1통과 효과에 의한 치료제의 손실에 의한 영향을 방해한다는 것; 2) 그것이, 그렇지 않으면 분자량, 전하 또는 폐외 부위에 대한 친화성 때문에 호흡기 내 그것의 표적 부위에 도달하기를 실패할 활성 성분을 투여한다는 것; 3) 그것이 폐포를 통하여 체내로의 신속한 흡수를 제공한다는 것; 및4) 그것이, 노출이 바람직하지 않은 부작용을 야기할 수 도 있는 경우에 중요한, 다른 기관 시스템이 활성 성분에 노출되는 것을 막는다는 것이다. 이런 이유 때문에, 에어로졸 투여는 천식, 폐의 국소 감염, 및 폐와 호흡관의 다른 질병 또는 질병 상태 특히 이롭다.
세가지 종류의 약제학적 흡입 장치, 분무기, 흡입기, 측정-투여량 흡입기 및 건조분말 흡입기가 있다. 분무기 장치는 (액체 형태로 조제된) 키모카인 유도체를 환자의 호흡관 내로 운반시키는 연무로서 분무하도록 하는 고속 공기의 증기를 발생시킨다. 측정-투여량 흡입기는 전형적으로 압축 기체를 갖춘 제제를 갖고, 시동되면 측정된 양의 폴리펩티드가 압축 기체에 의하여 배출되고, 따라서 정한 양의 약을 투여하는 신뢰성있는 방법을 제공한다. 건조분말 흡입기는 기구에 의하여 호흡하는 동안 환자의 기류로 분산될 수 있는 자유 유동 분말 형태의 폴리펩티드를 투여한다. 자유 유동 분말을 달성하기 위하여, 키모카인 유도체는 락토스 같은 부형제와 함께 조제된다. 키모카인 유도체의 측정 가능한 양이 캡슐 형태로 저장되고 각 시동에 따라 환자에게 분배된다. 상기 방법 모두는 본 발명을 투여하기 위하여 사용될 수 있다.
리포솜에 기초한 약제학적 제제 또한 본 발명의 키모카인과 사용하기에 적당하다. 예를 들어, US 5,631,018, US 5,723,147, 및 5,766,627 참조. 리포솜의 이점은 조직 분포의 유리한 변화 및 약물의 리포솜 포획으로부터 야기되는 약물동력학적 매개변수와 관련되는 것으로 믿어지고, 당업자에 의하여 본 발명의 폴리펩티드에 적용될 수 있다. 주사 또는 경구 투여를 위한 제어되는 배출 리포솜 액체 약제학적 제제가 또한 사용될 수 있다.
좌약을 통한 전신 투여를 위하여, 전통적 바인더와 담체는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜이나 트리글리세리드, 예를 들어 PEG 1000 (96 %) 및 PEG 4000 (4 %)을 포함한다. 이 같은 좌약은 활성 성분을 약 0.5 w/w% 내지 약 10 w/w%; 바람직하게는 약 1 w/w% 내지 약 2 w/w%의 범위로 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.
상기되고 다음의 구체적 실시예에서 더 설명된 바와 같이, 본 발명의 키모카인 수용체 조절제는 천연 발생 키모카인의 길항제로서 용도를 발견한다. 특히, 길항제로서 증강된 효능을 갖는 본 발명의 키모카인 수용체 조절제는 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 기관 이식 거부반응, 바이러스성 질병, 죽상종/죽상경화증, 류마티스성 관절염 및 기관이식 거부반응 같은 다양한 질병 상태의 분석과 치료에서 용도를 발견한다. 본 발명의 생물활성 합성 키모카인은 또한 그것의 인지 수용체의 소분자 길항제를 고안하고 스크리닝하는데에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물내로 조작된 구조적 다양성은 키모카인 수용체의 천연 활성과 관련된 질병의 치료에서 의약 용도의 더 양호한 소분자 화합물의 고안, 스크리닝 및 정밀 제어에 있어 더 논리적인 접근법을 용이하게 한다.
다음의 제조법 및 실시예는 당업자가 본 발명을 더욱 분명하게 이해하고 실행하도록 하기 위하여 주어진다. 이것은 발명의 범위를 제한하는 것으로 여겨지지 않으며, 단지 그것의 예시적이고 대표적인 것으로 이해되어야만 한다.
약어
DIEA 디이소프로필에틸레아민
DMF N, N-디메틸포름아미드
DNP 2,4-디니트로페닐
GuHCl 구아니디움 히드로클로라이드
HBTU O-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸-우로늄-헥사
플루오로 포스페이트
HF 플루오로화 수소
TFA 트리플루오로아세트산
Aib 아미노이소부틸산
Hyp 히드록시프롤린
Tic 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-COOH
Indol 인돌린-2-카르복실산
P(4,4DiF) 4-디플루오로-프롤린
Thz L-티아졸리딘-4-카르복실산
Hop L-호모프롤린
△Pro 3,4-디히드로-프롤린
F(3,4-DiOH) 3,4디히드록시페닐알라닌
F(3,4-DiOH, pBzl)) pBzl,-3,4디히드록시페닐알라닌
p-Bz 벤조페논
Cha 시클로헥실-알라닌
βNa1 3-(2-나프틸)-알라닌
Chg 사이클로헥실-글리신
Phg 페닐글리신
HoF 호모페닐알라닌
F(F)s 펜타플루오로페닐알라닌
tBuA 테르트-부틸알라닌
F(4-Me) 4-메틸페닐알라닌
tL 테르트-루신
CycP 1-아미노-1-시클로펜탄카르복실산
CycH 1-아미노-1-시클로헥산카르복실산
Nle 노르루신
아미노옥시펜탄-RANTE(2-68) AOP-RANTES
n-논아노일-RANTES(2-68) NNY-RANTES
(실시예 1): 본 발명의 키모카인에 대한 일반적 합성 접근법
본 발명의 키모카인 수용체 조절제에 대한 펩티드를 고체상 펩티드 합성에 의하여 제작하였다. 고체상 합성은 단계적 Boc 화학 사슬 연장을 사용하여, 원위치 중화/2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,1,3,3-테트라메틸루로늄 헥사 플루오로 포스페이트 활성화 프로토콜을 사용하여 Applied Biosystems 유래 주문-변형 430A 펩티드 합성기상에서 수행하였다 (Schnolzer, et al., Int. J. Peptide Protein Res. (1992) 40 : 180-193). N-말단 펩티드 단편은 티오에스테르-생성 수지상에서 합성하였다. 수지는 관찰되는 위치에 선행하는 잔기의 부착 후에 분리하고 펩티드는 0.03 mmol 스케일 상에서 수동적으로 연장하였다. 각 합성 주기는 순수한 TFA로 1 내지 2 분 동안 처리함에 의한 Nα-Boc-제거, 1분간 DMF유동 세척, 10-20 분간 과량의 DIEA 존재하에서 1.0 mmol 사전활성화 Boc-아미노산으로 결합시킴, 및 제 2의 DMF 유동 세척으로 구성된다. Nα-Boc-아미노산 (1.1mmol)을 3 분 동안 과량의 DIEA 존재하에서 (3 mmol) 1 mmol HBTU (DMF 중의 0.5 M)로 사전활성화시켰다. 각각의 수동적 결합 단계 후에, 잔여 자유 아민을 닌히드린 검정으로 평가하였다(Sarin, et al., Anal. Biochem. (1981) 117 : 147-157). 아미노산을 포함하는 C-말단 단편을 표준 -O-CH2-페닐아세트아미도메틸 수지 상에서 합성하였다. 사슬 조립이 완성된 후, 1 시간동안 0 ℃에서 세척제로서 5 % p-크레졸과 함께 무수 HF로 처리함으로써 펩티드를 보호제거하고 수지로부터 절단하였다. 모든 경우에, DNP-제거 과정이 C-말단 티오에스테르 기와 일치하지 않으므로 이미다졸 측쇄 DNP 보호기는 His 잔기 상에 남았다. 그러나, DNP는 라이게이션 반응 동안 티올에 의하여 점차 제거되어 비보호 His를 생성하였다. 절단 후, 두 펩티드는 빙냉 디에틸에테르로 침전시키고, 수성 아세토니트릴 중에 용해시키고 동결건조하였다. 펩티드를 완충액 A (H2O/0.1% 트리플루오로아세트산) 중의 완충액 B(아세토니트릴/10% H20/0.1 % 트리플루오로아세트산)의 선형 구배 및 214nm에서 UV 검출기를 사용하여 Water로부터의 C18 컬럼을 갖는 RP-HPLC에 의하여 정제하였다. 샘플은 Platform II 인스트루먼트 (Micromass, Manchester, England)와 함께 전자분무 질량분석기로 분석하였다. 천연 화학적 라이게이션을 사용하여, 펩티드를 라이게이션에 사용하여전장 키모카인 폴리펩티드 사슬을 생성하였다 (Dawson, et al., Science (1994) 266 : 776-779); Wilken, et al., Chem. Biol. (1999) 6 : 43-51 ; 및 Camarero, et al., Current Protocols in Protein Science (1999) 18.4.1-18.4.21). Cys-SH/(Cys-S)2의 존재하에서 표준 기술(Wilken et al., Chem. Biol. (1999) 6 : 43-51)에 따라 폴리펩티드 사슬의 폴딩을 달성하였다.
(실시예 2): NNY-RANTES, AOP-RANTES, 및 SDF-1의 N-, C-, 및 N-/C-말단 유사체의 합성
실시예 1에서와 본 발명의 CC 및 CXC 키모카인을 제조하는 일반적 접근방법을 설명하는 여기에 기제된 바와 같이 RANTES (1-68) 와 SDF-1 β (1-72)의 유사체를 제조하였다. 특히, N-말단, C-말단, 및 N-/C-말단 변형 RANTES 유사체는 논아노일-RANTES (2-68) 나 "NNY-RANTES"로도 역시 지칭되는, 키모카인 화합물 CH3-(CH2)7-C(O)-RANTES(2-68) 및 아미노옥시펜탄-RANTES나 "AOP-RANTES"로도 또한 지칭되는 CH3-(CH2)4-O-N=CH-CO-RANTES(2-68)에 대한 변형에 기초한다. 이 목적을 위하여 사용되는 NNY-RANTES, AOP-RANTES 및 추가적 RANTES유도체 분자가, 여기에 참고문헌으로써 수록되는 WO 99/11666에 기재된다. SDF-1의 N-, C-, 및 N-/C-말단 유사체가 RANTES 유사체에 대한 접근법의 기초적 고안을 사용하여 제작되었다.
RANTES에 대한 NNY 및 AOP 변형 같은, 제공된 표적 키모카인에 대한 N-말단 변형에 대하여, 부가 N-말단 변형(예를 들어, NNY 또는 AOP)을 생성하기 위한 라이게이션을 위하여 채용된 N-말단 펩티드 단편의 수지상 동화를 사용한 후, 절단/보호제거, 정제 및 C-말단 펩티드 단편에 대한 천연 화학적 라이게이션에서의 보호제거된 N-말단 변형된 펩티드 α-티오에스테르의 사용으로 전장 산물을 형성함에 의하여, 상기 및 WO 99/11666 와 Wilken et al., Chem. Biol. (1999) 6 : 4351에 기재된 바와 같이 화학적 변이체를 제조하였다. 실시예 1에서 기재한 바와 같이, 아미노산 유도체를 포함한 펩티드를 합성하고 아미노산 치환체를 펩티드 합성 동안 삽입시켰다. 실시예 1에서와 같은 천연 화학적 라이게이션을 사용하여 선형 산물을 생성하였는데 라이게이션은 RANTES 유사체에 대하여는 Lys31-Cys32부위에 존재하고 SDF-1 유사체에 대하여는 Asn33-Cys34부위에 존재한다. 동일 몰 분량(2-2.5 mM)의 펩티드 단편을 6M GuHCl, 100 mM 포스페이트, pH 7.5, 1% 벤질메르캅탄, 및 3% 티오페놀에 용해시켰다.
반응은 통상 하룻밤 동안 수행하였다. 결과의 폴리펩티드 산물을 정제하고 상기된 바와 같이 펩티드 단편에 대하여 분석하였다. 폴딩된 단백질을 생성하기 위하여, NNY-RANTES 유사체(약 0.5 내지 1 mg/mL)의 정제된 폴리펩티드 사슬을 8mM 시스테인, 1mM 시스틴 및 10mM 메티오닌이 함유된 2M GuHCI, 100mM Tris, pH 8.0에 용해시켰다. 하룻밤 온화한 교반 후, 단백질 용액을 RP-HPLC에 의하여 상기된 바와 같이 정제하였다. SDF-1의 경우 다른 폴딩 조건을 사용하였다: SDF-1 와 Met0 -SDF-1 을 실온의 0. 5mg/mL 의 1M GuHCI, 0. 1M Tris, pH8.5 에서 기중 산화시켰다. 하룻밤 온화한 교반 후, 폴딩을 완성시켰다. SOP-, 카프로일- 및 NNY-SDF-1을 2M GuHCI가 존재한다는 점을 제외하고는 동일한 완충액을 사용하여 산화시켰다.
지방산의 제공된 폴딩된 단백질에 대한 화학적 융합을 위하여, 두 가지 기초단계가 관련되었다. 첫번째로, 지방산을 아미노 옥시기로 관능화시켰다. 두번째로, 반응성 카르보닐기를, 키모카인의 활성에 중요하지 않다고 믿어지는 단백질의 카르복실-말단 도메인에 특이적으로 도입시켰다. 이 목적을 위하여, C-말단 지방산 변형을 위하여 표적화된 키모카인 유사체를 C-말단 Lys(Ser)Gly 서열 연장에 의하여 합성하였다. 그러므로, 예를 들어, NNY-RANTES(2-68)를 합성하여 C-말단에서 Lys(Ser)Gly 서열 연장을 함유하도록 하였다. 재폴딩 단백질의 NaI04 처리에 의하여 반응성 카르보닐기를 생성하였고, 따라서 안정한 옥심 결합을 통한 지방산 부분의 부위-특이적 부착이 야기되도록 하였다.
지방산 관능화를 위하여, 0.2 mmol 지방산 (팔미테이트, 올레이트, 아라키도네이트, 콜레이트)을 0. 5ml DMF/DCM 혼합물 (1:1, v:v) 내의 동일몰량의 DCC 및 HOAt로 활성화시켰고, 0.25mmol Boc-AoA-NH-(CH2)2-NH20.5ml DMF 용액을 첨가시켰고, 겉보기 pH 는 N-에틸모르폴린을 사용하여 pH. 8.0 으로 조정하였다. 콜레스테릴 유도체를 위하여는, 0.2 mmol 콜레스테릴클로로포르메이트를 0.5ml DCM에 용해시키고 0.25mmol Boc-AoA-NH-(CH2)2-NH20.5ml DMF 용액을 첨가시켰고, 겉보기 pH 는 트리에틸아민 사용하여 pH. 9.0 으로 조정하였다. 하룻밤 인큐베이션 후, 휘발성 물질을 진공에서 제거하였고 산물을 C4 컬럼 상에서 순간 크로마토그래프나 준비 HPLC에 의하여 분리하였다. Boc 기를 TFA 처리에 의하여 제거하고 산물을 ESI-MS에 의하여 확인하였다.
단백질 산화를 위하여, 표적 단백질 (2mg/mL)을 pH7.5의 6 M 염화 구아니딘을 함유하는 0.1 M 인산나트륨 완충액에 용해시켰고, 메티오닌을 첨가하여 단백질에 비하여 100 배 몰 과량의 스케빈져를 얻었다. 10 배 과량의 소듐 페리오데이트를 그 후 첨가하여 용액을 10 분간 어두운 곳에서 인큐베이션 하였다. 반응은 페리오데이트에 비하여 1000 배 몰과량의 에틸렌 글리콜을 첨가하여 정지시켰고 용액을 실온에서 15 분간 더 인큐베이션 시켰다. 용액을 0.1 % 아세트산에 대하여 투석시킨 후 최종적으로 동결건조하였다. 예를 들어, C-말단 곁가지 세린의 산화는 ESI-MS에 의하여 거의 정량적인 것으로 나타났는데, 글리옥실일 유도체를 형성하기 위한 31 Da 손실에 대응하여 AOP-RANTES-K (S) G의 경우 8141.1±0.7 Da이 얻어졌고 시작물질의 질랭에 대응하는 정점은 관찰되지 않았다.
지방산의 키모카인에 대한 융합은 0.1 % 살코실, 20 mM 메티오닌과 딘백질에 비교하여 20배 과량의 관능화 지방산 존재하의 0.1 M 아세트산 나트륨 완충액, pH 5.3에서 달성되었다. 16-20 시간동안 37 ℃에서 교반 후, 지방산의 아미노-옥시기와 키모카인 알데히드 사이에서 옥심결합이 형성되었을 때, 융합체를 역상-HPLC를 사용하여 정제하였고 산물을 ESI-MS 에 의하여 특성결정 하였다. 모든 유사체에 대하여, 아미노옥시-관능화 지방산의 산화된 단백질에 대한 결합은, 분석 HPLC에 의하여 제어될 때, 거의 정량적이었다.
(실시예 3): NNY- 및 AOP-RANTES의 N-말단 유사체
N-말단 RANTES 유도체에 대하여, 최초 8 개 아미노산이 다음 서열 -PYSSDTTP-을 갖는, NNY-RANTES (2-68) 또는 AOP-RANTES (2-68)의 최초 8 개 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산의 N-말단 영역의 하나 이상에 대하여 변형을 수행하였다. 천연 발생 RANTES(1-68)의 첫째 잔기 (Ser)가 NNY-RANTES (2-68)에서 n-논아노일 치환체로, AOP-RANTES (2-68)에서 아미노옥시펜탄으로 대체되었기 때문에, 이들은 도 2A-2E에 나타난 68 개의 아미노산 잔기 야생형 RANTES 폴리펩티드 사슬 (즉, RANTES (1-68))의 아미노산 잔기 2-9에 대응한다. 그러므로, 예를 들어, NNY-RANTES (2-68)에서의 아미노산 위치 2에서 치환은 다음 일반 화학식 "NNY P2X- RANTES (3-68)"에 의하여 지시되고, N- 에서 C-말단 방향으로 읽을 때, 식 중 NNY 는 n-논아노일 이고, X는 NNY-RANTES (2-68)의 위치 2의 프롤린에 대하여 치환된 아미노산이고, RANTES (3-68)는 NNY-RANTES (2-68)의 잔여 66 개의 아미노산을 나타낸다. 다른 예로서, NNY-RANTES (268)에서의 아미노산 위치 3에서 치환은 일반식 "NNY-P-Y3X-RANTES (4-68)"로 지시되고, N- 에서 C-말단 방향으로 읽을 때, 식 중 NNY 는 n-논아노일이고, X 는 NNY-RANTES (2-68)의 위치 3의 티로신(Y)에 대하여 치환된 아미노산이고, RANTES (4-68)는 NNY-RANTES (2-68)의 잔여 65 개의 아미노산을 나타낸다. 다중 치환된 NNY-RANTES 유사체를 위하여는, 다음 예의 NNY-RANTES (2-68)의 아미노산 위치 2, 3, 및 9에서의 3개 치환에 대한 화학식이 일반 화학식 "NNY P2X-Y3X-SSDTT-P9X-RANTES (10-68)"에 의하여 지시되고, N- 에서 C-말단 방향으로 읽을 때, 식 중 NNY 는 n-논아노일이고, X 는 NNY-RANTES (2-68)의 위치 2의 프롤린(P), 위치 3의 티로신(Y), 및 프롤린 (P)9에 대하여 치환된, 동일하거나 상이한 아미노산이고, SSDTT 는 NNY-RANTES (2-68)의 아미노산 4-8에 대응하고, RANTES (10-68)는 NNY-RANTES (2-68)의 잔여 59 개의 아미노산을 나타낸다.
다음은 제조된 NNY P2X-RANTES(3-68) 유사체의 예이다.
화합물 번호
NNY-P2Aib-RANTES(3-68) 1
NNY-P2Hyp-RANTES(3-68) 2
NNY-P2Tic-RANTES(3-68) 3
NNY-P2Indol-RANTES(3-68) 4
NNY-P2P(4,4DiF)-RANTES(3-68) 5
NNY-P2Thz-RANTES(3-68) 6
NNY-P2HoP-RANTES(3-68) 7
NNY-P2APro-RANTES(3-68) 8
NNY-P2A-RANTES(3-68) 9
제조된 NNY-P-Y3X-RANTES(4-68) 유사체의 예는 다음과 같다.
화합물 번호
NNY-P-Y3P-RANTES(4-68) 10
NNY-P-Y3A-RANTES(4-68) 11
NNY-P-Y3L- RANTES(4-68) 12
NNY-P-Y3V-RANTES(4-68) 13
NNY-P-Y3F(3,4-DiOH)-RANTES(4-68) 14
NNY-P-Y3F(3,4-DiOH, pBzl)-RANTES(4-68) 15
NNY-P-Y3pBz-RANTES(4-68) 16
NNY-P-Y3Cha-RANTES(4-68) 17
NNY-P-Y3 Nal-RANTES(4-68) 18
NNY-P-Y3Chg-RNATES(4-68) 19
NNY-P-Y3Phg-RANTES(4-68) 20
NNY-P-Y3Hof-RANTES(4-68) 21
NNY P-Y3F(F)5-RANTES(4-68) 22
NNY-P-Y3tbuA-RANTES(4-68) 23
NNY-P-Y3F(4-Me)-RANTES(4-68) 24
NNY-P-Y3tL-RANTES(4-68) 25
NNY-P-Y3CycP-RANTES(4-68) 26
NNY-P-Y3CycH-RANTES(4-68) 27
NNY-P-Y3Nle-RANTES(4-68) 28
제조된 NNY-PY-S4X-RANTES(5-68) 유사체는 다음 화합물이다.
화합물
NNY-PY-S4A-RANTES(5-68) 29
NNY-PY-S4tbuA-RANTES(5-68) 30
제조된 NNY-PYS-S5X-RANTES(6-68)유사체의 예는 다음 화합물이다.
화합물 번호
NNY-PYS-S5tbuA-RANTES(6-68) 31
제조된 NNY-PYSS-D6X-RANTES(7-68) 유사체의 예는 다음 화합물이다.
화합물 번호
NNY-PYSS-D6tbuA-RANTES(7-68) 32
제조된 NNY-PYSSD-T7X-RANTES(8-68) 유사체의 예는 다음 화합물이다.
화합물 번호
NNY-PYSSD-T7tbuA-RANTES(8-68) 33
제조된 NNY-PYSSDT-T8X-RANTES(9-68) 유사체의 예는 다음 화합물이다.
화합물 번호
NNY-PYSSDT-T8tBuA-RANTES(9-68) 34
제조된 NNY PYSSDTT-P9X-RANTES 유사체의 예는 다음 화합물이다.
화합물 번호
NNY-PYSSDTT-P9Hyp-RANTES(10-68) 35
NNY-PYSSDTT-P9Aib-RANTES(10-68) 36
NNY-PYSSDTT-P9△Pro-RANTES(10-68) 37
NNY-PYSSDTT-P9Thz-RANTES(10-68) 38
제조된 이중 치환 유사체 NNY-P2X-Y3X-RANTES(4-68), 및 삼중 치환 유사체 NNY P2X-Y3X-SSDTT-P9X-RANTES(10-68)의 예는 다음 화합물이다.
화합물 번호
NNY-P2Hyp-Y3tButA-RANTES(4-68) 39
NNY-P2Thz-Y3tButA-RANTES(4-68) 40
NNY-P2Hyp-Y3Chg-RANTES(4-68) 41
NNY-P2Thz-Y3Chg-RANTES(4-68) 42
NNY-P2Thz-Y3Chg-SSDTT-P9Aib-RANTES(10-68) 43
(실시예 4) NNY-RANTES 의 N-말단, N-루프 유사체
다음 화합물은 N-루프(RANTES 의 잔기 12-20)가 CCR1 및 CCR3 를 통한 시그널 트랜스덕션에 영향을 주지 않고 CCR5 에 대한 효능을 증가시키도록 변형된, 추가적인 NNY-치환-RANTES 유사체의 예로 의도된다.
N-말단, N-루프 RANTES 유사체의 경우에, NNY-RANTES(2-68)에 대하여 N-루프변형이 이루어졌는데, 이 경우 N-루프는 아미노산 12-20에 해당한다. RNATES 의 N-루프는 아미노산 서열 -FAYIARPLP-(SEQ ID NO:2)를 가진다. 예로서, 아미노산 위치 12에서 NNY-RANTES(2-68)에서의 치환은 일반 화합물 식 "NNY-PYSSDTTPCC-F12pBz-RANTES(13-68)"을 가지고, 이 식에서 NNY 는 n-논아노일이고, PYSSDTTPCC 는 RANTES(1-68)의 아미노산 2-11 에 해당하고, F12pBz 는 RANTES(1-68)의 위치 12에서 페닐알라닌(F)에 대한 아미노산 유도체 pBZ 의 치환을 나타내고, RANTES(13-68)은 N-에서 C-말단방향으로 읽을때, RNATES 의 잔여 아미노산 잔기 13-68 을 나타낸다.
화합물 번호
NNY-PYSSDTTPCC-F12pBz-RANTES(13-68) 44
NNY-PYSSDTTPCC-F12Y-RANTES(13-68) 45
NNY-PYSSDTTPCC-F12F(4-Me)-RANTES(13-68) 46
NNY-PYSSDTTPCC-F12(4-F)-RANTES(13-68) 47
NNY-PYSSDTTPCCF-A13R-RANTES(14-68) 48
NNY-PYSSDTTPCCF-A13S-RANTES(14-68) 49
NNY-PYSSDTTPCCFA-Y14F-RANTES(15-68) 50
NNY-PYSSDTTPCCFA-Yl4Cha-RANTES(15-68) 51
NNY-PYSSDTTPCCFAY-I15tBuA-RANTES(16-68) 52
NNY-PYSSDTTPCCFAY-IlSS-RANTES(16-68) 53
NNY-PYSSDTTPCCFAYI-A16S-RANTES(17-68) 54
NNY-PYSSDTTPCCFAYA-R17A-RANTES(18-68) 55
NNY-PYSSDTTPCCFAYA-R17H-RANTES(18-68) 56
NNY-PYSSDTTPCCFAYAR-P18Thz-RANTES(19-68) 57
NNY-PYSSDTTPCCFAYARP-L19I-RANTES(20-68) 58
NNY-PYSSDTTPCCFAYARP-Ll9Cha-RANTES(20-68) 59
NNY-PYSSDTTPCCFAYARPL-P20Thz-RANTES(21-68) 60
(실시예 5) NNY-RANTES 의 N-말단 RNATES 유사체
다음 화합물은 NNY 치환체 대신에 상이한 지방족 사슬이 사용된 추가의 NNY-치환-RANTES 유사체의 예로서 의도된다.
화합물 번호
CH2=CH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-RANTES(2-68) 61
Nle-Met-RANTES(1-68) 62
화합물 번호
도데카노일-RANTES(3-68) 63
라우릴-Hyp-RANTES(3-68) 64
화합물 번호
미리스토일-RANTES(4-68) 65
도데카노일-Hyp-RANTES(4-68) 66
(실시예 6) NNY 및 AOP-RANTES 의 C-말단 및 N/C-말단 유사체
세린 잔기로 아실화된 Lys 의 ε 아미노산기와 함께 Lys-Gly C 말단 연장을 가지는 AOP-및 NNY-RANTES 를 제조했다. 세린 연장의 페리오데이트 산화 후에, 이러한 유도체를 발색단(FITC, NBD, Cy5 및 BODIPY-Fl) 또는 지질을 포함하는 아미노옥시아세틸-기능화 화합물과 컨쥬게이션시켰다. 이러한 C-말단 표지 키모카인은 그들의 생물학적 성질을 보유하고, CH3-(CH2)14-CONH-(CH2)2-NHCO-CH2-0-NH2와 같은 지방족 부분의 도입은 키모카인의 효능을 개선시키는 것을 나타냈다. 가장 효과적인 화합물을 발견하기 위하여, 상이한 지방산 및 지질을 Boc-AoANH-(CH2)2-NH2와 결합시킴으로써 관능화시킨후, 라우레이트, 팔미테이트, 오에이트, 에이코사노에이트, 콜산 및 콜레스테릴-클로로포름을 Boc 제거시켰다. 이들 유도체의 하나 이상은 산화 NNY-RANTES-K (S) G 또는 AOP-RANTES-K (S) G 에 융합시켰는데, 상기에서 AOP 유사체는 하기 예시된다.
화합물 번호
AOP-RANTES-K(라우릴)-G 67
이식에서 "(라우릴)"은 글록실일=AoA-에틸렌 디아민-라우레이트 등의 약어이다.
AOP-RANTES-K(팔미토일)-G 68
AOP-RANTES-K(에이코사노일)-G 69
AOP-RANTES-K(올레오일)-G 70
AOP-RANTES-K(콜일)-G 71
AOP-RANTES-K(콜레스테릴)-G 72
지질 부분의 화학 변이체가 또한 다른 전략으로 제조되었다. 이러한 화합물을 전장 폴리펩티드를 형성하기 위한 절단, 정제 및 화학적 라이게이션의 사용전에, Fmoc-탈보호된 Boc-펩티드-Lys-Gly-수지에 대하여 지질을 부착함으로써, C-말단 절편의 수지상 동화에 의하여 합성하였다.
이들 화합물의 고안에서, 지질 결합을 사용한 2 가지 주요한 이유가 있다. 첫째로, RANTES 화합물의 항 HIV-1 저해 활성이 수용체의 하향조절능과 관련된다는 점증하는 증거가 현재 있다. 이는 수용체의 재순환과 함께 초기 엔도좀에서 정상적으로 해리되어야 할 리간드-수용체 복합체가 일단 내재화되면 원형질막이나 세포질 지방산 결합 단백질과 또한 상호작용할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 리간드의 지질 변형은 단순히 소수성 상호작용에 의하여 복합체를 특이적 세포내 서브도메인으로 재표적화할 수 있고, 따라서 수용체의 재순환을 지연시킬 수 있다. 세포내 단백질 이동에 관한 몇몇의 최근 논문은 아실화가 단백질의 계면활성제 내성 막에 대한 친화성을 증가시키는 일반적 기작이고 막통과 단백질의 주요한 표적화 기작일 수 있다는 생각을 뒷받침한다(예를 들어, Melkonian et al., J Biol. Chem. (1999) 274 : 3910-3917; Zlatkine et al., J. Cell Sci. (1997) 110 : 673-679; Zhan et al. Cancer Immunol. Immunother. (1998) 46 : 55-60 참조). 둘째로, 변형은 또한 화합물의 약물동태학적 특성을 변화시키기 위하여 수행될 수 있다. 몇몇 최근 논문은 이 개념을 뒷받침한다(예를 들어, Honeycutt et al. Pharm. Res. (1996) 13 : 1373-1377; Kurtzhals et al. J. Pharm. Sci. (1997) 86 : 1365-1368; Marlcussen et al. Diabetologia (1996) 39 : 281-288 참조).
다음의 실시예에서 설명하는 바와 같이, 변형은 약물동태학의 변화를 의도한 것이었으므로, 활성의 증강은 놀랍고도 예상치 못한 것이었다. 예상된 결과는 활성이 감소하는 것이었지만, 약물동태학의 기대한 개선은 허용되는 중간체로서 제공되었다.
(실시예 7) : SDF-1 의 N-말단 유사체
다음 N-말단 SDF-1(1-72) 유사체는 본 발명의 CXC 키모카인을 제조하는 일반적인 방법을 설명하기 위하여 제조하였다. 예로서, SDF-1 의 N-말단을 변형하여 N-말단에 지방족 사슬을 갖는 화합물을 생성하였다. N-말단 영역에 아미노산 유도체를, 및/또는 C-말단 영역에 지방족 사슬을 더 포함하는 화합물을 상기 RANTES 화합물에 대하여 기술한 바와 같이 제조하였다. 특히, 제한으로서가 아닌 설명으로서, Lys, Met-Lys, 카프로일-Lys, CH3-(CH2)7-C(O) 및 CH3-(CH2)4-O-NH-글리옥실일을 포함하는 적당한 N-말단 치환체를 제조하고 시험하였다. 다음 화합물은 제조된 SDF-1유사체의 몇몇 예이다.
화합물 번호
Lys-SDF-1 (2-72) 73
Met-Lys-SDF-1 (2-72) 74
카프로일-Lys-SDF-1 (2-72) 75
NNY-SDF-1 (2-72) 76
AOP-글리옥실일-SDF-1 (2-72) 77
(실시예 8) : 스크리닝 검정
RANTES 와 SDF-1 가 용도를 발견하는 특정 지시에 대한 차단 기능을 특성 결정하는 HIV-기초 검정을 사용하여, 실시예 3-7 에서 제조된 RNATES 와 SDF 유사체의 몇몇과 다른 것을 길항제 활성에 대하여 스크리닝하였다. 일반적으로, 화합물을 그것의 HIV 외피-매개 세포 융합을 저해하는 능력에 대하여 예비적으로 스크리닝하는 것을 통과시켰다. 이들 화합물 중 가장 유력한 것은, 그것의 표적 세포주의 무세포 바이러스 감염을 저해하는 능력에 대하여 그에 이어서 시험하였다. SCID 마우스 모델에서 결정된 바(Mosier et al., J. Virol. (1999) 73: 3544-3550)와 같이, 세포융합 검정과 시험관내 무세포 바이러스 감염 검정이 생체내 효능의 유용한 지표인 것으로 발견되었으므로, 이들 검정을 선택하였다. 게다가, AOP-RANTES 에 비교한 NNY-RANTES 의 항-바이러스 효능의 증가가 CCR5 에 대한 친화도의 증가 이외의 요인에 의한 것임을 발견하였으므로, 화하바물을 CCR5 에 대한 친화도가 아닌 세포 융합 검정에서의 능력 관점에서 평가하였다.
(실시예 9) 외피-매개 세포 융합 검정
CD4 와 CCR5 를 함유하고 수용체 시스템을 갖는 세포외 융합된 바이러스 외피 단백질에 대하여 조작된 세포를 사용하여, 실시예 3-7에서 제공된 일련의 화합물의 CCR5-의존 세포융합을 저해하는 능력을 측정하였다. M.Alizon(Paris)에 의하여 친절하게 제공된 HeLa-PSL 과 HeLa-Env-ADA 세포주를 사용하여, 본질적으로 Simmons et al.(Science(1997)276:276-279)에 기재ㅗ딘 바와 같이 CCR5-반응성 바이러스 외피-매개 세포 융합 검정을 수행하였다. 요약하여 기재하면, HeLa-PSL 세포를 96-웰 플레이트에 접종하였다(100㎕에 104개 세포). 24시간 후에 배지를 제거하였고 웰당 104HeLa-Env-ADA 세포와 키모카인을 함유하는 배지를 첨가하였다(최종농도 200㎕). 추가적 24시간 배양 후에, 세포를 PBS 에서 세척하였고, 50㎕ 의 PBS/0.5% NP-40 에서 15분동안 실온에서 용해시켰다. 세포용해물을 50㎕ 2X CPRG 기질(16mM 클로람페니콜 레드-p-D-칼라토피라노시드; 120mM Na2HP04, 80mM NaH2P04, 20mM KCI, 20mM MgS04, 및 10 mM β 메르캅토에탄올)의 첨가에 의하여 β-갈락토시다제 활성에 대하여 검정한 후, 어두운 곳에서 실온에서 1-2시간동안의 인큐베이션을 수행하였다. 그 후 575 nm 에서의 흡광도를 Labsystems 마이크로플레이트 판독기상에서 판독하였다. 이들 값으로부터, 각 저해 농도에서 저해 백분율[100 x (OD(시험)-OD(음성 대조표준)/ OD(양성 대조표준)-OD(음성 대조표준)]을 계산했다. 저해 농도에 대한 백분율 융합 저해의 플롯팅에 의하여 각 화합물에 대한 IC50값의 계산이 허용된다.
유의하게도, 시험된 대다수의 화합물은 야생형 RANTES 에 상대적으로 더 큰 효능을 나타내었다. 선택된 RANTES 저해제 유사체에 대한 결과는 하기의 표1에 도시된다.
평균 상대 효능에 대한 표1에서, 융합 검정에서의 IC50에 대한 절대값은 활성의 랭크 순위는 일정하지만, 상이한 날에서 수행된 실험에 따라서 다르다. 결과를 표준화하기 위해서, AOP-RANTES 를 각 실험에서 대조표준으로 사용했다. 따라서, 각 실험에서의 IC50은 AOP-RANTES 의 IC50에 비하여 표현되었고, 이것은 100 의 임의값을 나타내었다. 시험된 대부분의 모든 화합물은 야생형 RANTES 에 비하여 상대적으로 큰 효능을 발휘했지만, 화합물 번호 19, 23, 40 및 42 와 같은 어떤 화합물의 효능은 일련의 가장 낮은 희석에서조차 50% 이상의 저해로 얻어졌다.
(실시예 10): 무세포 바이러스 감염 검정
무세포 바이러스 감염 검정을 외피 세포계가 생존한 R5-영양 바이러스로 대체된 것을 제외하고는, 외피-매개 세포 융합 검정과 동일한 방법으로 수행했다. HEK293-CCR5 세포(7, kindly provided by T. Schwartz, Copenhagen)를 24 웰 플레이트에 접종시켰다(1.2 X 105세포/웰). 하룻밤동안 인큐베이션한 후에, 경쟁 결합을 0.5ml의 "결합 완충액"(50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 및 0.5%(w/v) 소혈청 알부민으로 보충됨)에서 12 pM[125I] MIP-1-α(Amersham) 과 다양한 양의 비표지 리간드를 사용하여 4℃에서 3h 동안 전세포에 대하여 수행했다. 인큐베이션후에, 세포를 0.5M NaCl 로 보충된 얼음처럼 차가운 결합 완충액에서 빠르게 4번 세척했다. 세포를 1ml 3 M 아세트산, 8M 우레아 및 2% NP-40 에서 용균시켰다. 용균된 물질을 Beckman Gamma 4000 신틸레이션 계수기를 사용하여 계수했다.이중으로 결정했고 IC50 값을 Prism 소프트웨어를 사용하여 적합화된 단상 농도 저해 곡선으로부터 유도했다. 표2는 화합물 번호 19 및 23으로 예비 스크린에서 보여진 NNY-RANTES 를 증가하는 효력에서의 증가를 도시한다.
세포 바이러스 감염 검정으로부터 선택된 화합물에 대한 체외 감염성 데이타
AOP-RANTES NNY-RANTES 화합물23 화합물19
실험 IC50감염성 결과 140 32 17 15
47 8 3.8 34
260 26 28 9.9
135 30 14 12
평균 감염성 IC50 145pM 24pM 14pM 12pM
비교용 세포 융합 결과 480pM 97pM 38pM 26pM
(실시예 11) 항 CCR5 및 항CXCR4 화합물에 의한 처리의 조합
다음의 실시예는 HIV 감염을 차단하고, HIV 의 R5 균주의 X4 균주로의 잠재적인 전환을 차단하기 위해서 항 CCR5(예를 들어, NNY-RANTES) 및 항-CXCR4(예를 들어, SDF-1 길항체 또는 AMD3100)를 조합하여 채용하는 것의 보호 효과를 설명한다. 특히, NNY-RANTES 와 (작은 유기분자 항-X4 약제인) AMD3100 의 보호 효과는 Mosier, Adv. Immunol(1996)63:79-125; Picchio, et al., J. Virol. (1997)71:7124-7127;Picchio, et al., J. Virol.(1998)72:2002-2009; 및 Offord et al., WO99/11666에 개시된 방법에 따라서, SCID 마우스에서 시험하였고, 사람 말초혈 백혈구로 재집단화하고, HIV-1 으로 항원자극하였다. NNY-RNATES 는 표 X 와 같이 투여하였고, AMD3100 은 200 mg/ml 용액으로서 사용하였다. 항원자극은 AMD3100 군 단독에 대한 경우를 제외하고는 R5 HIV 바이러스로 수행하였다. 조합치료에서는 탈출 변이체는 관찰되지 않았고, 적합하게 치료된 마우스 모두가 실험 전 과정을통하여 바이러스가 없는 상태였다. 이는 본 발명의 N-, C- 및 N-/C-말단 RANTES 유도체가 포유동물에서의 HIV 감염을 차단하기 위하여 본원에 개시된 것과 같은 AMD3100 또는 SDF-1 길항제와 같은 항-X4 균주 화합물과 조합하여 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌 및 특허출원은 각각의 문헌 또는 특허출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고문헌으로 수록되도록 의도되는 것과 동일한 범위로 본원에 참고문헌으로 수록된다.
본 발명은 그 자체로 충분히 기술되었고, 당업자가 첨부된 특허청구의 범위의 취지 또는 범위에서 벗어나지 않고 그 범위내에서 많은 변화 및 변형을 만들 수 있을 것이라는 것은 자명하다.

Claims (22)

  1. N-말단에서 지방족 사슬 및 하나 이상의 아미노산 유도체로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 키모카인 수용체 조절제.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 키모카인 폴리펩티드 사슬은 천연 발생 야생형 키모카인의 아미노산 서열에 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키모카인 수용체 조절제.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 천연 발생 야생형 키모카인은 CC 키모카인인 것을 특징으로 하는 키모카인 수용체 조절제.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 천연 발행 야생형 키모카인은 CXC 키모카인인 것을 특징으로 하는 키모카인 수용체 조절제.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 N-말단이 키모카인 폴리펩티드 사슬의 제1의 이황화-형성 시스테인에 대한 N-말단인 키모카인 폴리펩티드 사슬의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 키모카인 수용체 조절제.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 지방족 사슬은 5 개 내지 26 개의 탄소로 이루어지는 탄화수소 사슬인 것을 특징으로 하는 키모카인 수용체.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 아미노산 유도체는 식-(N-CnR-CO) 를 가지고, 이 식에서 n 은 1-22 이고, R은 히드로겐, 알킬 또는 방향족이고, N 및 Cn, N 및 R, 또는 Cn 및 R 은 환구조를 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 키모카인 수용체 조절제.
  8. C-말단에서 지방족 사슬 또는 다환으로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 키모카인 수용체 조절제.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 지방족 사슬은 5 내지 22개의 탄소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키모카인 수용체 조절제.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 지방족 사슬 또는 다환은 지질인 것을 특징으로 하는 키모카인 수용체 조절제.
  11. N-말단에서 지방족 사슬 및 하나 이상의 아미노산 유도체, 및 C-말단에서 지방족 사슬 또는 다환으로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 키모카인 수용체 조절제.
  12. N-말단에서 지방족 사슬 및 하나 이상의 아미노산 유도체로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함하는 키모카인 수용체 조절제, 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 가진 혼합물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. C-말단에서 지방족 사슬 또는 다환으로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함하는 키모카인 수용체 조절제, 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제 14 항의 키모카인 수용체 조절제 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 가진 혼합물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. N-말단에서 지방족 사슬 및 하나 이상의 아미노산 유도체, 그리고 C-말단에서 지방족 사슬 또는 다환으로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함하는 키모카인 수용체 조절제, 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제와의 혼합물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  19. 포유동물에서 키모카인 수용체 조절제로의 치료에 의해서 질병 상태를 경감시키는 치료방법으로서, 이 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 포유동물에 키모카인 수용체 조절제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 키모카인 수용체 조절제는 (A) N-말단에서 지방족 사슬 및 하나 이상의 아미노산 유도체로 변형된, (B) C-말단에서 지방족 사슬 또는 다환으로 변형된, 또는 (C) N-말단에서 지방족 사슬 및 하나 이상의 아미노산 유도체, 그리고 C-말단에서 지방족 사슬 또는 다환으로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 질병 상태는 염증 상태인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 감염 질병은 천식, 알레르기 비염, 아토피성 피부염, 죽종, 죽상경화증, 또는 류마티스관절염인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 19 항에 있어서, 질병 상태는 HIV 감염으로 유발되거나 이와 연관되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020027018043A 2000-07-12 2001-07-12 키모카인 수용체 조절제, 제조 및 사용 KR20030032977A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21768300P 2000-07-12 2000-07-12
US60/217,683 2000-07-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20030032977A true KR20030032977A (ko) 2003-04-26

Family

ID=22812056

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2003-7000178A KR20030036591A (ko) 2000-07-12 2001-07-12 폴리머-변형 생물활성 합성 키모카인, 및 그것의 제조와사용방법
KR1020027018043A KR20030032977A (ko) 2000-07-12 2001-07-12 키모카인 수용체 조절제, 제조 및 사용

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2003-7000178A KR20030036591A (ko) 2000-07-12 2001-07-12 폴리머-변형 생물활성 합성 키모카인, 및 그것의 제조와사용방법

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20050089970A1 (ko)
EP (2) EP1307216A4 (ko)
JP (3) JP2004502783A (ko)
KR (2) KR20030036591A (ko)
CN (2) CN1441808A (ko)
AU (2) AU2001273387A1 (ko)
BR (2) BR0112429A (ko)
CA (2) CA2412162A1 (ko)
IL (2) IL153785A0 (ko)
MX (2) MXPA03000311A (ko)
NO (2) NO20030111L (ko)
RU (1) RU2003104024A (ko)
WO (2) WO2002004499A1 (ko)
ZA (2) ZA200300313B (ko)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7482425B2 (en) 1999-08-26 2009-01-27 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Compositions for lipid matrix-assisted chemical ligation
CN1454097A (zh) 2000-09-08 2003-11-05 格莱风治疗公司 聚合物修饰的合成的蛋白质类
DE60313168T2 (de) * 2002-06-12 2007-12-20 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Antagonisten für cxcr3-bindende cxc-chemokine
WO2004017999A1 (en) * 2002-08-16 2004-03-04 University Of Bern Non-glycosylated polyacrylamide conjugates and their use for cytoprotection
US7598224B2 (en) 2002-08-20 2009-10-06 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Dual chain synthetic heparin-binding growth factor analogs
US7166574B2 (en) 2002-08-20 2007-01-23 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Synthetic heparin-binding growth factor analogs
JP2007501811A (ja) * 2003-08-08 2007-02-01 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 治療的な関心対象のタンパク質に対する遅延分子の選択的な化学物質接合のためのガラクトースオキシダーゼの使用。
US7414028B1 (en) 2004-02-04 2008-08-19 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Growth factor analogs
US7528105B1 (en) 2004-02-10 2009-05-05 Biosurface Engineering Technologies Heterodimeric chain synthetic heparin-binding growth factor analogs
US7671012B2 (en) 2004-02-10 2010-03-02 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Formulations and methods for delivery of growth factor analogs
JP4895826B2 (ja) 2004-02-20 2012-03-14 バイオサーフェス エンジニアリング テクノロジーズ，インク． 骨形成蛋白−２の正のモジュレーター
EP1732942A4 (en) * 2004-03-30 2008-12-03 Amylin Pharmaceuticals Inc SYNTHETIC CHEMOKINES, MANUFACTURING METHODS AND APPLICATIONS
US8293890B2 (en) 2004-04-30 2012-10-23 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Hyaluronic acid based copolymers
CN100467487C (zh) * 2004-12-14 2009-03-11 北京大学 具有多种功能的多肽
WO2006069449A1 (en) * 2004-12-29 2006-07-06 The University Of British Columbia Chemokine receptor-independent immunomodulatory and anti-proliferative activity
US20080268287A1 (en) * 2005-11-11 2008-10-30 Elena Donadio Method of Converting Water-Soluble Active Proteins Into Hydrophobic Active Proteins, the Use of the Same for the Preparation of Monomolecular Layers of Oriented Active Proteins, and Devices Comprising the Same
GB0607774D0 (en) * 2006-04-20 2006-05-31 Renovo Group Plc Medicaments
US10741034B2 (en) * 2006-05-19 2020-08-11 Apdn (B.V.I.) Inc. Security system and method of marking an inventory item and/or person in the vicinity
CA2692240C (en) 2006-06-22 2018-03-13 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Composition and method for delivery of bmp-2 amplifier/co-activator for enhancement of osteogenesis
WO2008080112A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 The Regents Of The University Of California New fusion molecule based on novel taa variant
TWI405779B (zh) * 2007-08-01 2013-08-21 私立中原大學 兩性高分子及其形成方法與應用
US7960336B2 (en) 2007-08-03 2011-06-14 Pharmain Corporation Composition for long-acting peptide analogs
WO2011097567A1 (en) * 2010-02-08 2011-08-11 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona, Acting For And On Behalf Of Arizona State University Rantes multiplexed assay, rantes variants related to disease, and rantes variants related to enzymatice activity
US9926365B2 (en) * 2012-06-29 2018-03-27 Bristol-Myers Squibb Company Methods for reducing glycoprotein aggregation
US10995371B2 (en) 2016-10-13 2021-05-04 Apdn (B.V.I.) Inc. Composition and method of DNA marking elastomeric material
WO2018156352A1 (en) 2017-02-21 2018-08-30 Apdn (B.V.I) Inc. Nucleic acid coated submicron particles for authentication
CN110892990B (zh) * 2019-10-11 2023-03-31 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 益生菌益生元食用组合物及其应用
CN112129946A (zh) * 2020-08-16 2020-12-25 陆修委 无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法及应用

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE3815826A1 (de) * 1988-05-09 1989-11-23 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von vicinal diacyloxysubstituierten verbindungen
US5470829A (en) * 1988-11-17 1995-11-28 Prisell; Per Pharmaceutical preparation
ATE135370T1 (de) * 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5089261A (en) * 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
JPH04503607A (ja) * 1989-02-24 1992-07-02 イムノセラピューティックス・インコーポレイテッド 固定化サイトカイン類
US5324844A (en) * 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
IL90193A (en) * 1989-05-04 1993-02-21 Biomedical Polymers Int Polurethane-based polymeric materials and biomedical articles and pharmaceutical compositions utilizing the same
US5650388A (en) * 1989-11-22 1997-07-22 Enzon, Inc. Fractionated polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
US5312808A (en) * 1989-11-22 1994-05-17 Enzon, Inc. Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
US5275838A (en) * 1990-02-28 1994-01-04 Massachusetts Institute Of Technology Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
US5171264A (en) * 1990-02-28 1992-12-15 Massachusetts Institute Of Technology Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
US5219564A (en) * 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
WO1992004942A1 (en) * 1990-09-19 1992-04-02 Atlantic Richfield Company High-stability foams for long-term suppression of hydrocarbon vapors
FR2672053B1 (fr) * 1991-01-30 1993-04-23 Atochem Polyether bloc amides, leur procede de synthese.
FR2673946B1 (fr) * 1991-03-15 1993-05-28 Atochem Polyether bloc amides, leur procede de synthese.
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
JPH07503744A (ja) * 1992-02-13 1995-04-20 カルルスベルグ　アクテイーゼルスカブ ポリエチレンまたはポリプロピレングリコール含有ポリマー
US5614549A (en) * 1992-08-21 1997-03-25 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5298643A (en) * 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
US5349001A (en) * 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) * 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
US5589356A (en) * 1993-06-21 1996-12-31 Vanderbilt University Litigation of sidechain unprotected peptides via a masked glycoaldehyde ester and O,N-acyl rearrangement
US5840900A (en) * 1993-10-20 1998-11-24 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5965566A (en) * 1993-10-20 1999-10-12 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5880131A (en) * 1993-10-20 1999-03-09 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5605976A (en) * 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5618528A (en) * 1994-02-28 1997-04-08 Sterling Winthrop Inc. Biologically compatible linear block copolymers of polyalkylene oxide and peptide units
WO1995033490A1 (en) * 1994-06-02 1995-12-14 Enzon, Inc. Method of solubilizing substantially water insoluble materials
US5730990A (en) * 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5756593A (en) * 1995-05-15 1998-05-26 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkyene oxide carboxylic acids
US5646285A (en) * 1995-06-07 1997-07-08 Zymogenetics, Inc. Combinatorial non-peptide libraries
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5919442A (en) * 1995-08-11 1999-07-06 Dendritech, Inc. Hyper comb-branched polymer conjugates
CA2239775C (en) * 1995-12-18 2008-07-15 Collagen Corporation Crosslinked polymer compositions and methods for their use
GB9712818D0 (en) * 1996-07-08 1997-08-20 Cambridge Antibody Tech Labelling and selection of specific binding molecules
WO1998005363A2 (en) * 1996-08-02 1998-02-12 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Polypeptides having a single covalently bound n-terminal water-soluble polymer
US6140064A (en) * 1996-09-10 2000-10-31 Theodor-Kocher Institute Method of detecting or identifying ligands, inhibitors or promoters of CXC chemokine receptor 3
US6214966B1 (en) * 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US6214540B1 (en) * 1997-03-26 2001-04-10 University Of Maryland Biotechnology Institute Chemokines that inhibit immunodeficiency virus infection and methods based thereon
US5990237A (en) * 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
US6168784B1 (en) * 1997-09-03 2001-01-02 Gryphon Sciences N-terminal modifications of RANTES and methods of use
CA2301846A1 (en) * 1997-09-04 1999-03-11 Gryphon Sciences Modular protein libraries and methods of preparation
US6011042A (en) * 1997-10-10 2000-01-04 Enzon, Inc. Acyl polymeric derivatives of aromatic hydroxyl-containing compounds
MXPA00003885A (es) * 1997-10-22 2004-04-23 Inst Genetics Llc Quimiocinas con modificiaciones de la terminacion amino.
US6111107A (en) * 1997-11-20 2000-08-29 Enzon, Inc. High yield method for stereoselective acylation of tertiary alcohols
US6180095B1 (en) * 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5985263A (en) * 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5965119A (en) * 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
US6090388A (en) * 1998-06-20 2000-07-18 United Biomedical Inc. Peptide composition for prevention and treatment of HIV infection and immune disorders
DK1346731T3 (da) * 1998-07-22 2007-04-10 Osprey Pharmaceuticals Ltd Konjugater til behandling af inflammatoriske forstyrrelser og tilsvarende vævsskade
CN1454097A (zh) * 2000-09-08 2003-11-05 格莱风治疗公司 聚合物修饰的合成的蛋白质类

Also Published As

Publication number Publication date
CN1460023A (zh) 2003-12-03
AU2002218769A1 (en) 2002-01-21
NO20030110L (no) 2003-03-12
EP1299415A4 (en) 2005-01-19
ZA200300313B (en) 2004-02-04
JP2007302667A (ja) 2007-11-22
EP1307216A1 (en) 2003-05-07
IL153789A0 (en) 2003-07-31
BR0112429A (pt) 2003-12-30
EP1307216A4 (en) 2005-01-12
BR0112428A (pt) 2003-11-25
NO20030111L (no) 2003-03-12
US20050089970A1 (en) 2005-04-28
KR20030036591A (ko) 2003-05-09
AU2001273387A1 (en) 2002-01-21
CN1441808A (zh) 2003-09-10
WO2002004015A1 (en) 2002-01-17
WO2002004015A9 (en) 2003-08-07
CA2412150A1 (en) 2002-01-17
WO2002004499A1 (en) 2002-01-17
IL153785A0 (en) 2003-07-31
NO20030111D0 (no) 2003-01-09
ZA200300312B (en) 2004-02-04
CA2412162A1 (en) 2002-01-17
EP1299415A1 (en) 2003-04-09
JP2004517040A (ja) 2004-06-10
RU2003104024A (ru) 2004-06-27
MXPA03000310A (es) 2004-12-13
NO20030110D0 (no) 2003-01-09
MXPA03000311A (es) 2004-12-13
JP2004502783A (ja) 2004-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20030032977A (ko) 키모카인 수용체 조절제, 제조 및 사용
JP6247205B2 (ja) ポリペプチド
JP5703226B2 (ja) アミリン誘導体
US20150374840A1 (en) Modified peptides and proteins
US10392428B2 (en) GLP-1 derivatives and uses thereof
US20040077835A1 (en) Chemokine receptor modulators, production and use
JP2003521521A (ja) ウイルス性ケモカインｖＭＩＰ−ＩＩのＮ末端に由来する、ＣＸＣＲ４の新規ペプチド性拮抗物質
JP2003500334A (ja) 抗ｈｉｖ作用を有するｒａｎｔｅｓ由来ペプチド
WO2005097168A2 (en) Synthetic chemokines, methods of manufacture, and uses
WO2004026893A2 (en) Synthetic chemokines labeled at selected positions
US20110038885A1 (en) Chemokine analogs
RU2575796C2 (ru) Пегилированный конъюгат варианта рекомбинантного консенсусного интерферона и способ его получения, и применение
Boykins et al. Chemical synthesis and characterization of chemokine RANTES and its analogues

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application