JP2007302667A - ポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインならびにその製造方法および使用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】炎症性疾患に重要な役割を果たすケモカイン、特にRANTES類に対する、強力なアンタゴニストの提供。
【解決手段】RANTES G1755,G1805,及びG1806等の合成ケモカインで、N末端および/またはC末端に結合する水溶性ポリマーを有し、対応する受容体のダウンモジュレーション(downmodulation)によって特徴付けられるin vitro生物活性を有する合成ケモカイン。水溶性ポリマーは、デキストラン等の多糖類や、ポリエチレングリコール等の合成高分子であり、脂肪族鎖、アミノ酸およびアミノ酸誘導体等の部分によって、ケモカインN末端/C末端を修飾している。
【選択図】図1A
【解決手段】RANTES G1755,G1805,及びG1806等の合成ケモカインで、N末端および/またはC末端に結合する水溶性ポリマーを有し、対応する受容体のダウンモジュレーション(downmodulation)によって特徴付けられるin vitro生物活性を有する合成ケモカイン。水溶性ポリマーは、デキストラン等の多糖類や、ポリエチレングリコール等の合成高分子であり、脂肪族鎖、アミノ酸およびアミノ酸誘導体等の部分によって、ケモカインN末端/C末端を修飾している。
【選択図】図1A
Description
本発明は、合成ケモカインに関する。
(関連出願の相互参照)
本出願は、米国特許出願第60/217,683号(2000年7月12日出願)(これは引用により本明細書中に組み込まれる)の一部継続出願である。
本出願は、米国特許出願第60/217,683号(2000年7月12日出願)(これは引用により本明細書中に組み込まれる)の一部継続出願である。
ケモカインは、白血球の輸送および様々な他の生物学的プロセスに関与する小さいタンパク質である(Murphy他、PharmacologicalRev.(2000)51(1):145〜176;Rollins,BJ.、Blood(1997)90(3):909〜928;Wells他、InflammationRes.(1999)48:353〜362)。ほとんどのケモカインは局在しており、炎症部位に典型的に存在する種々のタイプの炎症性細胞の走化性および細胞活性化を誘導することによって炎症を増強している。一部のケモカインは、走化性のほかに、例えば、キラー細胞の増殖および活性化の誘導、造血始原細胞タイプの増殖の調節、炎症状態において骨髄の内外へ造血前駆細胞の輸送、血管形成および腫瘍増殖などの様々な性質を有する(例えば、Baggiolini他、Ann.Rev.Immunology(1997)15:675〜705;Zlotnik他、CriticalRev.Immunology(1999)19(1):1〜4;Wang他、J.Immunological Methods(1998)220(1−2):1〜17;Moser他、Intl.Rev.Immunology(1998)16(3−4):323〜344を参照のこと)。
多くのケモカインのアミノ酸配列、構造および機能が知られている。ケモカインは、分子量が約8kDa〜10kDaであり、タンパク質レベルでは相互間で約20%〜50%の配列相同性を示す。これらのタンパク質はまた、共通した三次構造をともに有する。すべてのケモカインは、分子内ジスルフィド結合の形成に関与する多数の保存されたシステイン残基を有しており、これらは、ケモカインの同定および分類のために利用されている。例えば、最初の2つのシステイン残基が1個のアミノ酸によって隔てられているケモカインは、「C−X−C」ケモカインと呼ばれている(これはまた「α」ケモカインと呼ばれている)。最初の2つのシステイン残基が隣接しているケモカインは、「CC」ケモカインと呼ばれている(これはまた「β」ケモカインと呼ばれている)。「C」ケモカインは、1個のシステイン残基が存在しないことによって、それ以外のケモカインとは異なる(これはまた「γ」ケモカインと呼ばれている)。Cケモカインは、CCケモカインのいくつかのメンバーに対して類似性を示すが、CCケモカインおよびCXCケモカインに特徴的な第1および第3のシステイン残基を有していない。最初の2つのシステイン残基が3つのアミノ酸によって隔てられているケモカインの小さいグループのメンバーは、「CXXXC」ケモカインと呼ばれている(これはまた「CX3C」ケモカインまたは「δ」ケモカインと呼ばれている)。ケモカインのサブグループもまた存在する。例えば、2つのさらなる保存されたシステイン残基を含有するCCケモカインが知られており、用語「C6−β」ケモカインがこのサブグループに対して使用されることがある。今日までに同定されたほとんどのケモカインは、CCケモカインクラスおよびCXCケモカインクラスのメンバーである。
ケモカインは、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、ガン、ウイルス性疾患、アテローム/アテローム性動脈硬化、慢性関節リウマチおよび臓器移植拒絶などの重要な疾患経路に関係している。しかしながら、多くのケモカインおよび治療薬としてのそれらの潜在的な使用に関する1つの一般的な問題は、白血球の炎症性応答および感染を促進または悪化させるというそれらの固有の性質に関連する。この目的のために、ケモカインの数多くの修飾が、対応する野生型ケモカインのアンタゴニストを生成しようとする試みにおいてなされている。Proudfoot他(J.Biol.Chem.(1996)271(5):2599〜2603);Simmons他(Science、276:276〜279);Gong他(J.Biol.Chem.(1996)271(18):10521〜10527);Baggiolini他(J.Exp.Med.(1997)186(8):1189〜1191)、Polo他(Eur.J.Immunol.(2000)30:3190〜3198)、Nibbs他(J.Immunol.(2000)164:1488〜1497)およびTownson他(J.Biol.Chem.(2000)276(50):39254〜39261)は、N末端が修飾された様々なケモカインについて報告している。
古典的、かつ代表的な一例が、RANTESに対する状況である。ある種の条件下において、野生型RANTESは炎症およびHIV感染を増強し得る(Gordon他、J.Virol.(1999)73:684〜694;Czaplewski他、J.Biol.Chem.(1999)274:16077〜16084)。対照的に、RANTESポリペプチド鎖の26位の置換(E26A)および66位の置換(E66S)により、分子はその非炎症性の形態に変換され、HIVに対するその受容体と競合するその能力が改善されている(Appay他、J.Biol.Chem.(1999)274(39):27505〜27512;米国特許第6,214,540号(これはHIV感染を阻害するケモカインおよびそれの基づく方法を開示する)もまた参照のこと)。さらに、HIV−1感染を阻止し得るアンタゴニストをもたらすRANTESの様々なN末端修飾がなされており、これらには、N末端の短縮化[RANTES9−68]、メチオニンの付加(「Met−RANTES」)、アミノオキシペンタンの付加(「AOP−RANTES」)またはノナノイルの付加(「NNY−RANTES」)が含まれる(Arenzana−Seisdedos他、Nature(1996)383:400;Mack他、J.Exp.Med.(1998)187:1215〜1224;Proudfoot他、J.Biol.Chem.(1996)271:2599〜2603;Wells他、国際特許出願公開WO96/17935;Simmons他、Science(1997)276:276〜279;Offord他、国際特許出願公開WO99/11666;およびMosier他、J.Virology(1999)73(5):3544〜3550)。米国特許第6,168,784号には、ケモカイン類似物NNY−Rantesが開示され、そしてPEG鎖をC末端に有する類似物の修飾が示唆されている。Wilkin他(Curr.OpinionBiotech.(1999)9:412〜426)はタンパク質の化学合成を概説している。
ケモカインの生物学的活性は受容体によって媒介される(Murphy他、PharmacologicalRev.(2000)51(1):145〜176;Rollins,BJ.、Blood(1997)90(3):909〜928;Wells他、InflammationRes.(1999)48:353〜362)。これには、ケモカイン特異的受容体、ならびにCCケモカインまたはCXCケモカイン群のいずれかに属するいくつかの異なるケモカインと結合し、リガンド特異性が重複する受容体が含まれる。例えば、CCケモカインのSDF−1αはCXCR4受容体に対して特異的であり、これに対して、CXCケモカインのRANTESは、CCR1受容体、CCR3受容体およびCCR5受容体に結合する。別の例として、CCR3(これはCKR3としても知られている)の受容体に対するリガンドであるケモカインのエオタキシンが挙げられる(例えば、Cyster,J.G.、Science(1999)286:2098〜2102;Ponath他、J.ExperimentalMedicine(1996)183(6):2437〜2448;Ponath他、J.Clinical Investigation(1996)97(3):604〜12;およびYamada他、Biochem.Biophys.Res.Communications(1997)231(2):365〜368を参照のこと)。
ケモカインがその同族の受容体を活性化する能力は、ケモカインのN末端領域に対する修飾によって大きく影響を受ける。これらの変化は、タンパク質分解の方法、変異誘発または化学的修飾から生じ得る(例えば、Proudsfoot,A.E.他、J.Biol.Chem.(1996)271:2599;Grzegorzewski他、Cytokine(2001)13(4):209〜219;Clark−Lewis他、J.Biol.Chem.(1991)266(34):23128〜23134;Moser他、J.Biol.Chem.(1993)268:7125〜7128;Harrison,J.他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)95:10896;Mack他、J.Exp.Med.(1998)187:1215;Gong他、J.Biol.Chem.(1996)271:10521;Struyf他、Eur.J.Immunol.(1998)28:1262;Weber他、J.Exp.Med.(1996)183:681;Proot他(1998)J.Immunol.、160:4034;Yang他、J.Virol.(1999)73(6):4582〜4589;Rusconi他、AntivirTher.(2000)5(3):199〜204;Wyuts他、J.Immunol.(1999)163(11):6155〜6613;Detheux他、J.Exp.Med.(2000)192:1501〜1508;Nibbs他、J.Immunology(2000)164:1488〜1497;McCole他、J.Immunol.(1999)163(5)2829〜2835;Nufer他、Biochemistry(1999)38(2):636〜642;およびWyuts他、Eur.J.Biochem.(1999)260(2):421〜429を参照のこと)。
これらの修飾されたタンパク質の多くは、ケモカイン受容体によって媒介される効果にinvitroで拮抗し、ウイルス感染を阻害し、そしていくつかの動物モデルにおいて炎症を著しく低下させることができる。いくつかの場合には、そのようなタンパク質は、その受容体を活性化する能力を保持し、そして初代細胞においては、この活性は受容体の発現レベルを反映している。N末端領域に対するある種の修飾はまた、ケモカイン受容体の輸送において顕著な効果を有している。したがって、そのような修飾されたケモカインは、その受容体および対応する野生型ケモカインに拮抗することができるが、アンタゴニスト、アゴニストまたはその変化体であるかの分類は異なり得る。
ケモカインが治療薬として提案されているが、その潜在的な大きい欠点の1つは、in vivoでのその循環半減期が典型的にはほんの数分と良くないことである。循環半減期を改善するために、PEG(ポリエチレングリコール)などの水溶性ポリマーをタンパク質に結合させることができることが知られているが、様々な混じり合った結果は、制御された様式で、そして使用者によって規定される精密さで水溶性ポリマーを結合させることが困難さを与える種々の結果が伴う(Zalipsky,S.、BioconjugateChemistry(1995)6:150〜165;Mehvar,R.、J.Pharm.Pharmaceut.Sci.(2000)3(1):125〜136;およびMonfardini他、BioconjugateChem.(1998)9:418〜450)。
これに関して、PEG鎖をタンパク質のN末端残基に部位特異的に結合させるための技術が、増殖因子の顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)およびケモカインのIL−8の場合について開発され、実証された(Gaertner他、Bioconjug.Chem.(1996)7(1):38〜44)。その両方はその活性の大部分を保持していることが報告されていた。しかしながら、効力は、受容体に基づくウイルス感染阻害剤として使用される薬物など、アンタゴニストとして用いられる薬物にとっては特に重要である。したがって、IL−8以外のケモカイン(特にケモカインアンタゴニスト)のN末端残基にPEGまたは他の水溶性ポリマーを結合することは、N末端残基の感受性ならびに活性および効力に対するその寄与を考えた場合には、好適であるとは考えられない。国際特許出願公開WO00/53223は、報告によれば、新規なケモカインを開示している点で多数のケモカイン文献の多くを網羅しており、またアンタゴニストを生成することができること、そしてPEGまたは他の水溶性ポリマーを結合させることができることを報告しているが、鎖をどこに結合すべきであるかに関して、もしくはどのようなタイプの鎖を結合すべきであるかに関して何らの特異性、またはそれに伴う何らの活性をも報告していない。
野生型のケモカインを治療剤として使用する際の別の潜在的な不都合は、高濃度で凝集しやすい傾向、ならびにケモカイン受容体の非選択的な結合および差のある活性化を持っていることである(Murphy他、PharmacologicalRev.(2000)51(1):145〜176;Rollins,BJ.、Blood(1997)90(3):909〜928;およびWells他、InflammationRes.(1999)48:353〜362)。凝集は処方に対して問題になり得るし、場合によっては病状を悪化させ得る(Czaplewski他、J.Biol.Chem.(1999)274(23):16077〜16084;Czaplewski他、「hMIP−1αの操作、生物学および臨床的開発」(1999)、Chemokines in Disease:Biology andClinical Research(C.A.Herbert編、Humana Press Inc.、Totwa、NJ);Trkola他、J.Virol.(1999)73(8)6370〜6379;Appay他、J.Biol.Chem.(1999)274(39)27505〜27512;Hunter他、Blood(1995)86(12):4400〜4408;Lord他、Blood(1995)85(12):3412〜3415;Lord他、Brit.J.Cancer(1996)74:1017〜1022)。非選択的な結合はケモカインの特徴であり、いくつかの治療的状況ではあまり望ましいことではないと考えられる。それにも関わらず、ケモカインは治療剤として重要な有望性を保っている(Murphy他、PharmacologicalRev.(2000)51(1):145〜176;Rollins,BJ.、Blood(1997)90(3):909〜928;およびWells他、InflammationRes.(1999)48:353〜362)。
そのような取組みにより、いくつかの場合にはアンタゴニストに関連した効力が改善されてきたが、ケモカインアンタゴニストを製造する際の課題の1つは、薬物動態学などの他の薬物特性を改善しながら効力を増大させることである。また、ケモカインの強力な阻害剤およびその対応するケモカイン阻害剤化合物を製造するための一般的な方策および方法、ならびに疾患の予防および/または処置において使用される医薬品の調製にそれらの使用を見出すことが望まれている。
したがって、改善された循環半減期ならびに所望する活性および効力を含む改善された治療的特性を有する新規なケモカインおよび修飾されたケモカイン、特に、天然に存在するケモカインの活性を阻害またはその活性に拮抗するように機能し得る新規なケモカインおよび修飾されたケモカインが求められている。改善された循環半減期ならびに変化した受容体活性および効力を有するケモカインおよび修飾されたケモカインを提供することもまた求められている。
本発明は、合成ケモカイン、特に、RANTES G1755,RANTES G1805,及びRANTES G1806から成る群から選択される合成ケモカインであって、当該合成ケモカインに結合する水溶性ポリマーを有し、該合成ケモカインが結合するケモカイン受容体のダウンモジュレーション(downmodulation)によって特徴付けられるin vitro生物活性を有する合成ケモカインに関する。本発明の合成ケモカインは、
(A)脂肪族鎖、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってN末端が修飾されているか、
または、
(B)脂肪族鎖、多環、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってC末端が修飾されているか、
または、
(C)脂肪族鎖、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってN末端が修飾され、かつ脂肪族鎖、多環、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってC末端が修飾され、
ここで、当該アミノ酸誘導体が式−(N−CnR−CO)−で表され (式中、nは1−22であり、Rは水素、アルキルまたは芳香族であり、N及びCn、N及びR、または、Cn及びRは環状構造を形成することができる。)、当該アミノ酸誘導体は他のアミノ酸誘導体と同じであっても異なっていてもよく、
ここで、当該水溶性ポリマーは、デキストラン、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストリン;グリコサミノグリカン;ヘパリン;硫酸ヘパラン;硫酸コンドロイチン;硫酸デルマタン;ヒアロロニン;ヒアルロン酸;ポリラクチド;オリゴアクチル−アクリレート;セルロース;メチルセルロース;カルボキシメチルセルロース;コラーゲン;ゼラチン;アルギン酸;デンプン;ポリアルキレンオキシド;ポリエチレンオキシド;エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール;エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー;ポリビニルアルコール、ポリビニルエチルエーテル;ポリビニルピロリドン;ポリオキシエチル化ポリオール(プルロニックポリオールを含む);ポリエステル、例えば、ポリ(グリコール酸);ポリ(L−乳酸);ポリ(D−乳酸);ポリ(DL−乳酸);ラクチド/グリコリドコポリマー;ポリ−1,3,6−トリオキサン;ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ(p−ジオキサノン)及びコポリマー;ポリカプロラクトン;PEG−ポリエステルコポリマー;ポリ(リン酸エステル);ポリ無水物;ポリグリセロール;からなる群より選択される、
合成ケモカインである。
本発明は、対応する天然に存在する野生型ケモカインまたはその受容体の強力なアンタゴニストである化合物を生成するための一般的な方策を提供するという点で重要である。
(A)脂肪族鎖、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってN末端が修飾されているか、
または、
(B)脂肪族鎖、多環、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってC末端が修飾されているか、
または、
(C)脂肪族鎖、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってN末端が修飾され、かつ脂肪族鎖、多環、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってC末端が修飾され、
ここで、当該アミノ酸誘導体が式−(N−CnR−CO)−で表され (式中、nは1−22であり、Rは水素、アルキルまたは芳香族であり、N及びCn、N及びR、または、Cn及びRは環状構造を形成することができる。)、当該アミノ酸誘導体は他のアミノ酸誘導体と同じであっても異なっていてもよく、
ここで、当該水溶性ポリマーは、デキストラン、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストリン;グリコサミノグリカン;ヘパリン;硫酸ヘパラン;硫酸コンドロイチン;硫酸デルマタン;ヒアロロニン;ヒアルロン酸;ポリラクチド;オリゴアクチル−アクリレート;セルロース;メチルセルロース;カルボキシメチルセルロース;コラーゲン;ゼラチン;アルギン酸;デンプン;ポリアルキレンオキシド;ポリエチレンオキシド;エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール;エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー;ポリビニルアルコール、ポリビニルエチルエーテル;ポリビニルピロリドン;ポリオキシエチル化ポリオール(プルロニックポリオールを含む);ポリエステル、例えば、ポリ(グリコール酸);ポリ(L−乳酸);ポリ(D−乳酸);ポリ(DL−乳酸);ラクチド/グリコリドコポリマー;ポリ−1,3,6−トリオキサン;ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ(p−ジオキサノン)及びコポリマー;ポリカプロラクトン;PEG−ポリエステルコポリマー;ポリ(リン酸エステル);ポリ無水物;ポリグリセロール;からなる群より選択される、
合成ケモカインである。
本発明は、対応する天然に存在する野生型ケモカインまたはその受容体の強力なアンタゴニストである化合物を生成するための一般的な方策を提供するという点で重要である。
本発明は、合成ケモカインに関する。本発明の新規な合成ケモカインは、適切なケモカイン・バイオアッセイによって測定されたとき、天然に存在するケモカインの活性を好ましくは阻害する。そのような分子は、それらが結合するケモカイン受容体の性質の1つまたは複数に拮抗することによって作用することができ(例えば、ウイルス感染を阻害し、受容体のダウンモジュレーションを生じさせ、受容体の内在化を生じさせ)、それにより、細胞表面に再生利用される受容体の正常な循環に「拮抗」することができる。他の生物学的応答に関連して、そのような分子は受容体のアゴニストとして作用することができ、例えば、カルシウム流動の誘導、走化性の開始などを行わせることができる。したがって、本発明の合成ケモカインはアンタゴニスト(部分的な拮抗作用を含む)として作用することができるが、場合によりアゴニスト(部分的なアゴニストを含む)として、または両者の混合体としても作用することができる。少なくとも1つのアンタゴニスト特性、すなわち、それらが結合するケモカイン受容体の1つまたは複数の生物学的性質に拮抗する能力(例えば、(1)ウイルス感染、(2)走化性、(3)受容体循環などを阻止するか、または部分的に阻止する能力)を示す分子が好ましい。そのような分子は、ケモカインの受容体を活性化するのではなく、ケモカインの受容体に結合(または関与)することによって作用することができ、または他の手段によってその作用を媒介することができる。
A.N末端およびC末端が修飾された本発明の生物活性な合成ケモカイン
本発明は特に、対応する天然に存在するケモカインの活性を阻害する生物活性な合成されたケモカインに関する。好ましくは、そのような分子はN末端修飾および/またはC末端修飾を有する。本発明のN末端修飾された生物活性な合成ケモカインは、脂肪族鎖および1つまたは複数のアミノ酸誘導体によってそのN末端が修飾されているケモカインポリペプチド鎖を含む。本発明のN末端修飾された生物活性な合成ケモカインは、N末端からC末端の方向で読んだとき、下記の式を有する:J1−X1−Z1−CHEMOKINE(式中、J1は脂肪族鎖であり、X1は、ケモカインポリペプチド鎖のN末端アミノ酸配列の0個または1個以上のアミノ酸を含むスペーサーであり、Z1はアミノ酸誘導体であり、CHEMOKINEはケモカインポリペプチド鎖の残りのアミノ酸配列であり、ダッシュ(「−」)は共有結合による結合を表す)。このような化合物は、ポリペプチド鎖のN末端領域の全長を考慮して設計される。したがって、疎水性の脂肪族鎖の長さおよびアミノ酸誘導体の位置に依存して、N末端アンタゴニストは、対応する天然に存在するケモカインポリペプチド鎖に対して、1つまたは複数の置換、挿入または欠失をN末端において含むことができる。
本発明は特に、対応する天然に存在するケモカインの活性を阻害する生物活性な合成されたケモカインに関する。好ましくは、そのような分子はN末端修飾および/またはC末端修飾を有する。本発明のN末端修飾された生物活性な合成ケモカインは、脂肪族鎖および1つまたは複数のアミノ酸誘導体によってそのN末端が修飾されているケモカインポリペプチド鎖を含む。本発明のN末端修飾された生物活性な合成ケモカインは、N末端からC末端の方向で読んだとき、下記の式を有する:J1−X1−Z1−CHEMOKINE(式中、J1は脂肪族鎖であり、X1は、ケモカインポリペプチド鎖のN末端アミノ酸配列の0個または1個以上のアミノ酸を含むスペーサーであり、Z1はアミノ酸誘導体であり、CHEMOKINEはケモカインポリペプチド鎖の残りのアミノ酸配列であり、ダッシュ(「−」)は共有結合による結合を表す)。このような化合物は、ポリペプチド鎖のN末端領域の全長を考慮して設計される。したがって、疎水性の脂肪族鎖の長さおよびアミノ酸誘導体の位置に依存して、N末端アンタゴニストは、対応する天然に存在するケモカインポリペプチド鎖に対して、1つまたは複数の置換、挿入または欠失をN末端において含むことができる。
本発明のC末端修飾された生物活性な合成ケモカインは、脂肪族鎖または多環によってそのC末端が修飾されているケモカインポリペプチド鎖を含む。このような化合物は、N末端からC末端の方向で読んだとき、下記の式を有する:CHEMOKINE−X2−J2(式中、X2は、ケモカインポリペプチド鎖のC末端アミノ酸配列の0個または1個以上のアミノ酸を含むスペーサーであり、J2は脂肪族鎖または多環であり、CHEMOKINEはケモカインポリペプチド鎖の残りのアミノ酸配列であり、ダッシュ(「−」)は共有結合による結合を表す)。ケモカインのC末端領域は実質的な修飾を容易に行うことができ、このような修飾には、挿入、欠失、または対応する野生型分子と比較して、ポリペプチド鎖のC末端端部を延長するための1個以上のアミノ酸または他の化学的部分の付加、ならびに蛍光標識および生体適合性ポリマーの付加、そして小さい有機分子、ペプチド、タンパク質などの他の化合物との結合が含まれる。
本発明のN末端修飾およびC末端修飾された生物活性な合成ケモカインはN末端領域およびC末端領域の両方において修飾を含むことができ、特に参照されるときに、N末端/C末端が修飾された生物活性な合成ケモカインと呼ばれる。このような化合物は下記の式を有する:J1−X1−Z1−CHEMOKINE−X2−J2(式中、J1、X1、Z1、CHEMOKINE、X2、J2および「−」は上記に記載される通りである)。このような化合物は、所与の最終的な使用に依存して相乗的な様式でN末端修飾およびC末端修飾の利点を併せ持つ。
「ケモカインポリペプチド鎖」により、天然に存在する野生型ケモカインのポリペプチド鎖に対して実質的に相同的であるポリペプチド鎖が意図される。「N末端アミノ酸配列」により、天然に存在するケモカインポリペプチド鎖の最初のジスルフィド形成システインに隣接してN末端側にあるケモカインポリペプチド鎖のアミノ酸配列が意図される。「C末端アミノ酸配列」により、天然に存在するケモカインポリペプチド鎖の最後のジスルフィド形成システインに隣接してC末端側にあるケモカインポリペプチド鎖のアミノ酸配列が意図される。ケモカインポリペプチド鎖、N末端アミノ酸配列、C末端アミノ酸配列、ならびに本発明の生物活性な合成ケモカインの基礎を形成する最初および最後のジスルフィド形成システインは、天然に存在するケモカインの対応するアミノ酸配列から容易に推定することができ、そして同様に、知られているCケモカイン、CCケモカイン、CXCケモカインおよびCXXXCケモカインのアミノ酸配列と比較することなどの、同じクラスの他のケモカインとの相同性モデリングによっても容易に推定することができる。
例えば、下記は、知られている天然に存在するケモカインの例であり、その多くは異なる名称で記載され、したがって数回現れる:6Ckine、9E3、ATAC、ABCD−1、ACT−2、ALP、AMAC−1、AMCF−1、AMCF−2、AIF、ANAP、Angie、β−R1、β−トロンボグロブリン、BCA−1、BLC、blr−1リガンド、BRAK、C10、CCF18、Ck−β−6、Ck−β−8、Ck−β−8−1、Ck−β−10、Ck−β−11、cCAF、CEF−4、CINC、C7、CKA−3、CRG−2、CRG−10、CTAP−3、DC−CK1、ELC、エオタキシン、エオタキシン−2、エキソダス−1、エキソダス−2、ECIP−1、ENA−78、EDNAP、ENAP、FIC、FDNCF、FINAP、フラクタルカイン、G26、GDCF、GOS−19−1、GOS−19−2、GOS−19−3、GCF、GCP−2、GCP−2様、GRO1、GRO2、GRO3、GRO−α、GRO−β、GRO−γ、H400、HC−11、HC−14、HC−21、HCC−1、HCC−2、HCC−3、HCC−4H174、ヘパリン中和タンパク質、Humig、I−309、ILINCK、I−TAC、Ifi10、IL8、IP−9、IP−10、IRH、JE、KC、リンホタクチン、L2G25B、LAG−1、LARC、LCC−1、LD78−α、LD78−β、LD78−γ、LDCF、LEC、Lkn−1、LMC、LAI、LCF、LA−PF4、LDGF、LDNAP、LIF、LIX、LUCT、ランカイン、LYNAP、マンチェスター阻害剤、MARC、MCAF、MCP−1、MCP−2、MCP−3、MCP−4、MCP−5、MDC、MIP−1−α、MIP−1−β、MIP−1−δ、MIP−1−γ、MIP−3、MIP−3−α、MIP−3−β、MIP−4、MIP−5、モノタクチン−1、MPIF−1、MPIF−2、MRP−1、MRP−2、M119、MDNAP、MDNCF、巨核球刺激因子、MGSA、Mig、MIP−2、mob−1、MOC、MONAP、NC28、NCC−1、NCC−2、NCC−3、NCC−4N51、NAF、NAP−1、NAP−2、NAP−3、NAP−4、NAP S、NCF、NCP、ニューロタクチン、オンコスタチンA、P16、P500、PARC、pAT464、pAT744、PBP、PBP様、PBSF、PF4、PF4様、PF4−ALT、PF4V1、PLF、PPBP、RANTES、SCM−1−α、SCI、SCY A26、SLC、SMC−CF、ST38、STCP−1、SDF−1−α、SDF−1−β、TARC、TCA−3、TCA−4、TDCF、TECK、TSG−8、TY5、TCF、TLSF−α、TLSF−β、TPAR−1、TSG−1。
限定としてではなく例示として、上記に列記された野生型ケモカインポリペプチド鎖ならびにそれらの対応するN末端アミノ酸配列およびNループアミノ酸配列およびC末端アミノ酸配列のいくつかの例が図10A〜図10Dに示される。理解され得るように、さらなるケモカインポリペプチド鎖が知られており、それらは、GenomeDatabase(Johns Hopkins大学、Maryland、米国)、Protein Data Bank(Brookhaven国立研究所&Rutgers大学、NewJersey、米国)、Entrez(国立衛生研究所、Maryland、米国)、NRL 3D(Pittsburgh Supercomputing Center、Carnegie Mellon大学、Pennsylvania、米国)、CATH(UniversityCollege London、London、英国)、NIH Gopher Server(NIH、Maryland、米国)、ProLink(Boston大学、Massachusetts、米国)、TheNucleic Acid Database(Rutgers大学、NewJersey、米国)、Genebank(National Library of Medicine、Maryland、米国)、Expasy(Swiss Institute of Bioinformatics、Geneva、スイス)などの公開されているデータベースを含む多くの種々の提供元から得ることができる。また、新しいケモカイン、例えば、様々な遺伝子配列決定プログラムおよびタンパク質配列決定プログラムから得られるケモカインを、データベースおよびこの目的を達成するための関連ツールを含むこの分野で知られている標準的な技術に従った相同性マッチングおよびパターン・マッチングによって同定することができる。
本発明の1つの実施形態において、ファージ・ディスプレイおよびモジュラー・シャフリングなどの制御された進歩した技法を使用して、受容体特異性を増大させたケモカインを生成することができる。ファージ・ディスプレイを使用してケモカイン受容体と結合する能力についてケモカインの誘導体または類似物を試験することが、HIVの処置および防止において記載されている(米国特許第6,214,540号;DeVico他)。ファージ・ディスプレイ技術はまた、CXCケモカイン受容体3(CXCR3)に対する受容体タンパク質のリガンド、阻害剤または促進因子を検出または同定するために使用されている(米国特許第6,140,064号、Loetscher他)。これらの受容体は、細胞応答を誘導する能力を有する1つまたは複数のケモカインが選択的に結合することを特徴とする(米国特許第6,184,358号、Loetscher他)。ファージ・ディスプレイの使用は、分子の標識および選択(米国特許第6,180,336号、Osbourn他)において、特定の抗原に結合する分子の標識付けおよびその後の精製(例えば、国際特許出願公開WO92/01047を参照のこと)において、そしてHIV感染および免疫障害を防止および処置するためのペプチド組成物の決定(米国特許第6,090,388号、Wang)において記載されている。
Gタンパク質を結合した受容体を伴うファージ・ディスプレイ法もまた記載されている(例えば、Doorbar,J.他、「ファージ・ディスプレイを使用するトロンビン受容体に対するペプチドアンタゴニストの単離」、J.Mol.Biol.、244:361〜9(1994)を参照のこと)。これは、Nループ領域における制御された進化に対する好ましい領域(Konigs,C.、「ファージ・ディスプレイによるランダムペプチドライブラリーの2モノクローナル抗体スクリーニングによりケモカイン受容体CCR5のミモトープが解明される:HIV−1gp120に対する受容体の三次構造およびHIV−1 gp120に対するN末端結合部位の関係」、Eur.J.Immunol.2000(4月):30(4):1162〜71;Sidhu,S.S.他、「機能的選択のためのファージにおける大きいタンパク質の高コピーディスプレイ」、JMol Biol、2000(2月18日):296(2):487〜95;Fielding,A.K.他、「過融合性のテナガザル白血病エンベロープ糖タンパク質:リガンドディスプレイによる細胞傷害性遺伝子の標的化」、HumGene Ther、2000(4月10日):11(6):817〜26)、NループとC末端との間の領域、およびC末端(Cain,S.A.他、「分子全体のランダム変異化C5aライブラリーからの新規なリガンドの選択」、ProteinEng、2001(3月):14(3):189〜93;Heller,T.他、「免疫複合疾患および虚血/再潅流傷害における炎症性応答を弱めるC5a受容体アンタゴニストのファージライブラリーからの選択」、J.Immunol.1999(7月15日):163(2):985〜94;Chang,C.他、「コンビナトリアルペプチドライブラリーを使用するLXXLL核受容体−活性化補助因子相互作用モチーフの分析:エストロゲン受容体αおよびβのペプチドアンタゴニストの発見」、Mol Cell Biol、1999(12月);19(12):8226〜39)を伴っている。
J1およびJ2の好適な疎水性の脂肪族鎖には、長さが5炭素(C5)〜22炭素(C22)である疎水性の脂肪族鎖が含まれるが、これに限定されない。鎖は不飽和および/または非分枝状であってもよく、あるいは様々な程度の飽和度および/または分岐度を有してもよい。疎水性の脂肪族鎖は一般式Cn(Rm)−を有し、この式において、Cnはん個の炭素であり、Rmは、m個の水素、アルキル、アシル、芳香族またはそれらの組合せから選択される置換基であり、nおよびmは同じまたは異なっていてよい。J1基およびJ2基は、任意の好適な共有結合した連結を介して、X1、X2またはケモカインポリペプチド鎖に結合する。好適な共有結合した連結の例には、アミド、ケトン、アルデヒド、エステル、エーテル、チオエーテル、チオエステル、チオゾリジン、オキシム、オキシゾリジン、シッフ塩基およびシッフ塩基型連結(例えば、ヒドラジド)が含まれるが、これらに限定されない。限定されないが、そのような連結には下記が含まれ得る:
−C(O)−NH−(CH2)−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)x−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)−NH−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)x−NH−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;
−NH−(CH2)−C(O)−;−NH−(CH2)x−C(O)−;−NH−(CH2)−NH−C(O)−;−NH−(CH2)x−NH−C(O)−;−NH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−NH−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−NH−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−NH−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−NH−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−NH−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;
−ONH−C(O)−;−ONH−(CH2)−C(O)−;−ONH−(CH2)x−C(O)−;−ONH−(CH2)−NH−C(O)−;−ONH−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−ONH−(CH2)x−NH−C(O)−;−ONH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−ONH−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−ONH−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−ONH−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−ONH−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−ONH−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;
−OCH2−C(O)−;−OCH2−(CH2)−C(O)−;−OCH2−(CH2)x−C(O)−;−OCH2−(CH2)−NH−C(O)−;−OCH2−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−OCH2−(CH2)x−NH−C(O)−;−OCH2−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−OCH2−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−OCH2−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−OCH2−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−OCH2−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−OCH2−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−OCH2−NH−C(O)−;−OCH2−NH−(CH2)−C(O)−;−OCH2−NH−(CH2)x−C(O)−;−OCH2−NH−(CH2)−NH−C(O)−;−OCH2−NH−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−OCH2−NH−(CH2)x−NH−C(O)−;−OCH2−NH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−OCH2−NH−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−OCH2−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−OCH2−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−OCH2−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−OCH2−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)x−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)−NH−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)y−C(O)−;
−O−C(O)−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)x−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−NH−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)x−NH−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−O−C(O)−NH−C(O)−;−O−C(O)−NH−(CH2)−C(O)−;−O−C(O)−NH−(CH2)x−C(O)−;−O−C(O)−NH−(CH2)−NH−C(O)−;−O−C(O)−NH−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−O−C(O)−NH−(CH2)x−NH−C(O)−;−O−C(O)−NH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−O−C(O)−NH−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−O−C−(O)−(CH2)NH−CH2−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−C(O)−;−O−C(O)N(CH3)−(CH2)−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)x−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)−NH−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;
−CH=CH−C(O)−;−CH=CH−(CH2)−C(O)−;−CH=CH−(CH2)x−C(O)−;−CH=CH−(CH2)−NH−C(O)−;−CH=CH−(CH2)x−NH−C(O)−;−CH=CH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−CH=CH−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−CH=CH−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−CH=CH−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−CH=CH−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−CH=CH−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;
−SCH2−N(CH3)−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)x−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)−NH−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;
−S−C(O)−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)x−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−NH−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)x−NH−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−S−C(O)−NH−C(O)−;−S−C(O)−NH−(CH2)−C(O)−;−S−C(O)−NH−(CH2)x−C(O)−;−S−C(O)−NH−(CH2)−NH−C(O)−;−S−C(O)−NH−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−S−C(O)−NH−(CH2)x−NH−C(O)−;−S−C(O)−NH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−S−C(O)−NH−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)x−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)−NH−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−C3H6SN−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)x−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)x−NH−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−C3H6SN−NH−C(O)−;−C3H6SN−NH−(CH2)−C(O)−;−C3H6SN−NH−(CH2)x−C(O)−;−C3H6SN−NH−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6SN−NH−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6SN−NH−(CH2)x−NH−C(O)−;−C3H6SN−NH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−C3H6SN−NH−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)x−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;
−C3H6ON−C−(O)−;−C3H6ON−(CH2)−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)x−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)x−NH−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−C3H6ON−NH−C(O)−;−C3H6ON−NH−(CH2)−C(O)−;−C3H6ON−NH−(CH2)x−C(O)−;−C3H6ON−NH−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6ON−NH−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6ON−NH−(CH2)x−NH−C(O)−;−C3H6ON−NH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−C3H6ON−NH−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)x−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−O−C(O)−;−C(O)−
または共有結合(式中、xおよびyは2、3、4またはそれ以上であり、そして同じまたは異なっていてよい)。
−C(O)−NH−(CH2)−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)x−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)−NH−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)x−NH−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−C(O)−NH−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;
−NH−(CH2)−C(O)−;−NH−(CH2)x−C(O)−;−NH−(CH2)−NH−C(O)−;−NH−(CH2)x−NH−C(O)−;−NH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−NH−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−NH−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−NH−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−NH−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−NH−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;
−ONH−C(O)−;−ONH−(CH2)−C(O)−;−ONH−(CH2)x−C(O)−;−ONH−(CH2)−NH−C(O)−;−ONH−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−ONH−(CH2)x−NH−C(O)−;−ONH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−ONH−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−ONH−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−ONH−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−ONH−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−ONH−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;
−OCH2−C(O)−;−OCH2−(CH2)−C(O)−;−OCH2−(CH2)x−C(O)−;−OCH2−(CH2)−NH−C(O)−;−OCH2−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−OCH2−(CH2)x−NH−C(O)−;−OCH2−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−OCH2−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−OCH2−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−OCH2−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−OCH2−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−OCH2−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−OCH2−NH−C(O)−;−OCH2−NH−(CH2)−C(O)−;−OCH2−NH−(CH2)x−C(O)−;−OCH2−NH−(CH2)−NH−C(O)−;−OCH2−NH−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−OCH2−NH−(CH2)x−NH−C(O)−;−OCH2−NH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−OCH2−NH−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−OCH2−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−OCH2−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−OCH2−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−OCH2−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)x−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)−NH−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−OCH2−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)y−C(O)−;
−O−C(O)−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)x−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−NH−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)x−NH−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−O−C(O)−NH−C(O)−;−O−C(O)−NH−(CH2)−C(O)−;−O−C(O)−NH−(CH2)x−C(O)−;−O−C(O)−NH−(CH2)−NH−C(O)−;−O−C(O)−NH−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−O−C(O)−NH−(CH2)x−NH−C(O)−;−O−C(O)−NH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−O−C(O)−NH−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−O−C−(O)−(CH2)NH−CH2−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−O−C(O)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−C(O)−;−O−C(O)N(CH3)−(CH2)−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)x−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)−NH−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−O−C(O)−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;
−CH=CH−C(O)−;−CH=CH−(CH2)−C(O)−;−CH=CH−(CH2)x−C(O)−;−CH=CH−(CH2)−NH−C(O)−;−CH=CH−(CH2)x−NH−C(O)−;−CH=CH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−CH=CH−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−CH=CH−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−CH=CH−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−CH=CH−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−CH=CH−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;
−SCH2−N(CH3)−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)x−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)−NH−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−SCH2−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;
−S−C(O)−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)x−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−NH−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)x−NH−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−S−C(O)−NH−C(O)−;−S−C(O)−NH−(CH2)−C(O)−;−S−C(O)−NH−(CH2)x−C(O)−;−S−C(O)−NH−(CH2)−NH−C(O)−;−S−C(O)−NH−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−S−C(O)−NH−(CH2)x−NH−C(O)−;−S−C(O)−NH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−S−C(O)−NH−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)x−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)−NH−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−S−C(O)−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−C3H6SN−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)x−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)x−NH−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−C3H6SN−NH−C(O)−;−C3H6SN−NH−(CH2)−C(O)−;−C3H6SN−NH−(CH2)x−C(O)−;−C3H6SN−NH−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6SN−NH−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6SN−NH−(CH2)x−NH−C(O)−;−C3H6SN−NH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−C3H6SN−NH−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−C3H6SN−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)x−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−C3H6SN−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;
−C3H6ON−C−(O)−;−C3H6ON−(CH2)−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)x−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)x−NH−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−C3H6ON−NH−C(O)−;−C3H6ON−NH−(CH2)−C(O)−;−C3H6ON−NH−(CH2)x−C(O)−;−C3H6ON−NH−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6ON−NH−(CH2)−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6ON−NH−(CH2)x−NH−C(O)−;−C3H6ON−NH−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−C3H6ON−NH−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−S−C(O)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−C3H6ON−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)x−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)−NH−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)x−NH−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)−NH]y−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)−[(CH2)x−NH]y−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)−NH−CH2−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)−NH−(CH2)x−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)x]y−C(O)−;−C3H6ON−N(CH3)−(CH2)−[NH−(CH2)]y−C(O)−;−O−C(O)−;−C(O)−
または共有結合(式中、xおよびyは2、3、4またはそれ以上であり、そして同じまたは異なっていてよい)。
連結システムのために好適な様々な化学反応がよく知られており、これらはこの目的のために利用することができる(例えば、“Chemistry of Protein Conjugation and Cross−Linking”、S.S.Wong編、CRC Press,Inc.(1993);Perspectives in Bioconjugate Chemistry、ClaudeF.Modres編、ACS(1993)を参照のこと)。
J1およびJ2をX1、X2またはケモカインポリペプチド鎖に結合させることに加えて、用いられる連結システムは、得られる分子がそのアンタゴニスト特性を保持しているならば、標的分子の物理化学的性質および/または生物学的性質を調節するために選択することができる。これは、例えば、半減期などを調節するために、あるいは様々な長さ、剛性、荷電および/またはキラリティの連結システムを利用することにより効力および特異性などを調節するために、別の連結システムと比較して、あるタイプの条件のもとでの安定性がより大きい(または、より小さい)連結システムを取り込むことによって達成することができる。炭化水素鎖をケモカインポリペプチド鎖に結合する連結ユニットは、J1および/またはJ2の全体的な長さおよび空間充填が、最も好ましくは、天然に存在するケモカインの全体的な長さおよび空間充填に近づくならば、実質的に変化させることができる。
好ましい実施形態において、疎水性の脂肪族鎖J1は、長さが5炭素(C5)から10炭素(C10)の炭化水素鎖であり、疎水性の脂肪族鎖J2は、長さが12炭素(C12)から20炭素(C20)の脂質である。J1のC5〜C10炭化水素鎖の例には、下記が含まれるが、それらに限定されない:
−C5H11,−C5H9,−C5H7,−C5H5,−C5H3,−C6H13,−C6H11,−C6H9,−C6H7,−C6H5,−C6H3,−C7H15,−C7H13,−C7H11,−C7H9,−C7H7,−C7H5,−C7H3,−C8H17,−C8H15,−C8H13,−C8H11,−C8H9,−C8H7,−C8H5,−C8H3,−C9H19,C9H17,−C9H15,−C9H13,−C9H11,−C9H9,−C9H7,−C9H5,−C9H3,−C10H21,−C10H19,C10H17,−C10H15,−C10H13,−C10H11,−C10H9,−C10H7,−C10H5,および−C10H3.
−C5H11,−C5H9,−C5H7,−C5H5,−C5H3,−C6H13,−C6H11,−C6H9,−C6H7,−C6H5,−C6H3,−C7H15,−C7H13,−C7H11,−C7H9,−C7H7,−C7H5,−C7H3,−C8H17,−C8H15,−C8H13,−C8H11,−C8H9,−C8H7,−C8H5,−C8H3,−C9H19,C9H17,−C9H15,−C9H13,−C9H11,−C9H9,−C9H7,−C9H5,−C9H3,−C10H21,−C10H19,C10H17,−C10H15,−C10H13,−C10H11,−C10H9,−C10H7,−C10H5,および−C10H3.
好適なJ2脂質には、脂肪酸に由来する脂質および多環ステロイドに由来する脂質が含まれるが、これらに限定されない。脂肪酸には、飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸が含まれるが、これらに限定されない。飽和脂肪酸の例には、ラウリン酸(C12)、ミリスチン酸(C14)、パルミチン酸(C16)、ステアリン酸(C18)およびアラキジン酸(C20)が挙げられる。不飽和脂肪酸の例には、オレイン酸(C18)、リノレイン酸(C18)、リノレン酸(C18)、エレオステリン酸(C18)およびアラキドン酸(C20)が挙げられる。多環には、アルドステロン、コレスタノール、コレステロール、コール酸、コプロスタノール、コルチコステロン、コルチゾン、デヒドロコレステロール、デスモステロール、ジギトゲニン、エルゴステロール、エストラジオール、ヒドロキシコルチコステロン、ラソステロール、プレドニゾン、プレグネノロン、プロゲステロン、テストステロン、チモステロールなどが含まれるが、これらに限定されない。脂肪酸は、通常、酸成分を介してケモカインポリペプチド鎖に結合し、それにより、アシル結合した成分をもたらすが、他の連結を用いることができる。炭化水素鎖をケモカインポリペプチド鎖に結合する連結ユニットは、N末端領域の全体的な長さおよび空間充填が、天然に存在するケモカインの全体的な長さおよび空間充填に近づくならば、実質的に変化させることができる。C末端領域は、この点に関してより柔軟であることが見出されているので、全体的な長さおよび空間充填を、N末端領域の場合よりも大きく変化させることができる。
別の好ましい実施形態において、J1成分およびJ2成分は、本発明の生物活性な合成ケモカインに含まれるとき、ノナノイル、ノネノイル、アミノオキシペンタン、ドデカノイル、ミリストイル、パルミテート、ラウリル、パルミトイル、エイコサノイル、オレオイルまたはコリルなどのC5〜C20の飽和アシル鎖または不飽和アシル鎖を含む。例えば、J1置換基はノナノイルまたはアミノオキシペンタンであることができ、J2置換基は飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸(好ましくはC12〜C20脂肪酸)または多環ステロイド脂質(コレステロールなど)であることができる。
疎水性の脂肪族鎖の性質および長さに依存して、本発明の生物活性な合成ケモカインは、疎水性の脂肪族成分に対するスペーサー基および/または離れた結合部位を提供するために、特にC末端端部においてポリペプチド鎖に付加されるさらなるアミノ酸または他の成分を含むことができる。
「アミノ酸誘導体」により、遺伝子によってコードされる20個の天然に存在するアミノ酸とは異なるアミノ酸またはアミノ酸様の化学的実在物が意図される。具体的には、アミノ酸誘導体Z1は、遺伝子によってコードされる20個の天然に存在するアミノ酸のいずれでもなく、式−(N−CnR−CO)−を有する(式中、Cnは1〜22個の炭素であり、Rは、水素、アルキルまたは芳香族であり、NおよびCn、NおよびR、またはCnおよびRは環状構造を形成することができる)。また、N、CnおよびRはそれぞれ、アミノ酸誘導体に依存するその還元型形態において1個以上の水素を有することができる。上記のアルキル成分は置換体または非置換体であり得るし、直鎖状または分枝状または環状であり得るし、1個以上のヘテロ原子を含んでもよい。上記の芳香族は置換または非置換であり得るし、1個以上のヘテロ原子を含むことができる。上記のアミノ酸誘導体は新たに生成することができ、または市販元から得ることができる(例えば、Calbiochem−NovabiochemAG(スイス);Advanced Chemtech(Louisville、KY、米国);LancasterSynthesis,Inc.(Windham、NH、米国);Bachem California,Inc.(Torrance、CA、米国);GenzymeCorp.(Cambridge、MA、米国)を参照のこと)。アミノ酸誘導体の例には、アミノイソ酪酸(Aib)、ヒドロキシプロリン(Hyp)、1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−COOH(Tic)、インドリン−2−カルボン酸(indol)、4−ジフルオロプロリン(P(4,4DiF))、L−チアゾリジン−4−カルボン酸(Thz)、L−ホモプロリン(HoP)、3,4−デヒドロプロリン(ΔPro)、3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン(F(3,4−DiOH))、pBzl−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン(F(3,4−DiOH,pBzl))、ベンゾフェノン(p−Bz)、シクロヘキシルアラニン(Cha)、3−(2−ナフチル)アラニン(βNal)、シクロヘキシルグリシン(Chg)およびフェニルグリシン(Phg)が含まれるが、これらに限定されない。
X1、CHEMOKINEおよびX2に関して、これらの成分のアミノ酸配列は、対応する天然に存在する野生型分子と実質的に相同的である。用語「実質的に相同的」は、本明細書中で使用される場合、所与の配列との配列相同性が少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%であるアミノ酸配列を包含する(95%〜99%が好ましい)。この用語は、得られるポリペプチドが、対応する天然に存在するケモカインのアンタゴニストとして作用するならば、所与の配列に対して1個〜20個、1個〜10個または1個〜5個の単一アミノ酸の欠失、挿入または置換を有するアミノ酸配列を包含し得るが、これに限定されない。
例えば、いくつかのアミノ酸は、ポリペプチドの性質の実質的な変化を生じさせない他のアミノ酸で置換できることがこの分野では十分に知られている。これには、アミノ酸の保存的置換が含まれるが、これに限定されない。そのような可能性は本発明の範囲内である。ポリペプチドの性質を実質的に変化させないアミノ酸の欠失または挿入が多くの場合には行われることにもまた留意しなければならない。本発明は、(例えば、長さが、対応する天然に存在するケモカインの特異的なアンタゴニストの配列の10%までであり得るか、または20%までであり得るか、または50%までであり得る)そのような欠失体または挿入体を含む。さらに、ケモカインは、さらなる多様性を作り出すために異なるケモカインポリペプチドセグメントを混合し、組み合わせることを含む実質的な修飾に供することができ、例えば、国際特許出願公開WO99/11655(その参照はその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)に記載されるモジュラー「クロスオーバー」合成法などに供することができる。
N末端および/またはC末端における変化に加えて、本発明の生物活性な合成ケモカインはまた、ポリペプチド鎖内のどこかに、すなわち、上記の式においてCHEMOKINEによって表されるポリペプチド鎖内のどこかに、1つまたは複数のアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を含むことができる。好ましい実施形態において、変化を、標的受容体に対するその特異性/選択性を増大させるためにケモカインのNループにおいて行うことができる。このようにして、本発明の生物活性な合成ケモカインのNループは、特異的な受容体を阻止することができ、同時に、他の受容体に対するその可能な共受容体のアンタゴニスト効果を最小限に抑えることができる。「Nループ」により、所与のケモカインポリペプチド鎖のN末端領域を規定する最初の保存されたシステイン・パターンに対する隣接/C末端側の20〜26アミノ酸の配列領域が意図される(図9および図10A〜図10Dを参照のこと)。例えば、ケモカインポリペプチド鎖のN末端からC末端への方向で読んだとき、CCケモカインのNループは、第1および第2の保存されたシステインアミノ酸に対する隣接/C末端側と、第3の保存されたシステインアミノ酸に対する隣接/N末端側との間に位置するアミノ酸の領域である。
別の実施形態において、置換体および挿入体は、天然アミノ酸、ならびにアミノ酸誘導体、またはポリマーで修飾されたアミノ酸を含むことができる。ポリマー結合のための好ましい位置はケモカインのC末端部分である。天然のグリコシル化部位を有するケモカインの場合、ポリマーを、グリコシル化のためにコードされているアミノ酸(例えば、N−結合型グリコシル化部位のアルギニン)の1つまたは複数に結合させることができる。ポリマーの結合は、天然に存在するアミノ酸や天然に存在するアミノ酸の代わりに使用されているアミノ酸誘導体の側鎖に対して、または標的グリコシル化位置におけるアミノ酸の側鎖に結合している炭水化物もしくは他の成分に対して行うことができる。これらの目的のために好適なポリマーは生体適合性であり、すなわち、そのようなポリマーは生物学的系に対して非毒性であり、多くのそのようなポリマーが知られている。そのようなポリマーは、本質的には疎水性もしくは親水性であり、生分解性、非生分解性またはそれらの組合せであり得る。これらのポリマーには、コラーゲン、ゼラチン、セルロース、ヒアルロン酸、多糖類およびポリアミノ酸などの天然ポリマー、ならびにポリエステル、ポリオルトエステル、ポリ無水物などの合成ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。疎水性の非分解性ポリマーの例には、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニルおよびポリメタクリル酸メチルが含まれる。親水性の非分解性ポリマーの例には、ポリ(メタクリル酸2−ヒドロキシエチル)、ポリビニルアルコール、ポリ(N−ビニルピロリドン)、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、およびそれらのコポリマーが含まれる。好ましいポリマーは、連続した繰り返しユニットとして、式−(CH2−CH2−O−)n−(式中、n=エチレンオキシドユニットの数)のエチレンオキシドを含む。好ましいエチレンオキシド含有ポリマーの例には、例えば、下記および国際特許出願公開WO00/12587にそれぞれ記載されるようなポリエチレングリコール(「PEG」)およびポリアミドエチレンオキシドがある。
例えば、PEG型鎖は、両親媒性で、非免疫原性であり、そしてタンパク質分解酵素による切断を受けない。PEGまたはPEG型鎖によって修飾されている物質の調製物は、免疫原性および抗原性が低下している。例えば、Abuchowski他、J.Biol.Chem.(1977)252(11):3578〜3581;Tsutsumi他、Jpn.J.CancerRes.(1994)85:9〜12;Poly(ethylene glycol) Chemistry and BiologicalApplications、ACSシンポジウムシリーズ680、J.M.HarrisおよびS.Zalipsky編、アメリカ化学会、1997;およびPoly(ethyleneglycol) Chemistry,Biotechnical and Biomedical Applications,Topics in Applied Chemistry、J.M.Harris編、Plenum Press、New York、NY、1992を参照のこと。PEGはまた、PEGが結合している物質の分子サイズを増大させ、それにより、その生物学的半減期を増大させるために役立つ。PEGで修飾された物質のこれらの有益な性質により、PEGで修飾された物質は様々な治療的適用において非常に有用になる。したがって、本発明はまた、タンパク質にその固有の生物学的活性を保持させていると考えられる部位においてポリペプチドを修飾または「PEG化」することによって本発明のポリペプチドの薬物動態学を改善することを包含する。そのような部位には、ポリペプチドのC末端が含まれるが、これに限定されない。PEG鎖またはPEG型鎖をタンパク質にグラフト結合させることは知られている。例えば、Zalipskyの米国特許第5,122,614号を参照のこと。これには、PEGがそのN−スクシンイミドカーボネート誘導体に変換されることが記載されている。タンパク質に対するグラフトを容易にするための反応性基で修飾されたPEG鎖もまた知られている。例えば、Harrisの米国特許第5,739,208号(これは、分子上および表面上のチオール成分に選択的に結合するスルホン成分で活性化されているPEG誘導体を記載する)、そしてHarris他の米国特許第5,672,662号(これは、1つのプロピオン酸成分または酪酸成分を有するPEG酸の活性エステルを開示する)を参照のこと。この分野は、Zalipsky、BioconjugateChemistry(1995)6:150〜165に広範囲に概説されている。PEGの使用に加えて、Wrightの欧州特許EP0605963A2には、タンパク質上のアルデヒド基とのヒドラゾン連結を形成する水溶性ポリマーを含有する連結試薬が記載される。上記の参考文献はすべて参考として本明細書中に組み込まれる。
B.本発明の生物活性な合成ケモカインのポリマー修飾
本発明はさらに、ポリマー付加化合物によって修飾されている生物活性な合成ケモカインに関し、そしてその製造方法および使用方法に関する。本発明は特に、そのN末端領域の1つまたは複数の残基における変化を有するそのような合成ケモカインに関する。そのような変化を有する修飾されたケモカインは、典型的には、その対応する受容体の強力なアンタゴニストである。一般に、今日までに見出されている最も強力な変化は本質的には疎水性であり、例えば、それぞれの主要なカテゴリーのケモカインのN末端に対するメチオニン−(Met−)修飾、アミノオキシペンタン−(AOP−)修飾およびノナノイル−(NNY−)修飾である:効力のさらなる増大を、N末端領域内の野生型アミノ酸をアミノ酸または疎水性誘導体で置換することによって行うことができる(例えば、Rantes、MCPおよびMIPなどのCCケモカイン、ならびにSDF1およびIL−8などのCXCケモカイン)(米国特許出願第60/217,683号を参照のこと、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)。さらに、ケモカインのC末端領域に対する疎水性の修飾を導入することにより、効力がなおさらに増大する。このことは、N末端領域およびC末端領域の両方の疎水性が効力に影響を及ぼすという考えを裏付けている(米国特許出願第60/217,683号を参照のこと)。したがって、所与のケモカインのN末端およびC末端の疎水性を増大させることによってダウンモジュレーションが増強され得るとすれば、水溶性ポリマーの結合は、通常、そのようなケモカインの所望するアンタゴニスト活性、特に、ポリマー修飾されたケモカインが結合する対応する受容体のダウンモジュレーションを著しく低下させるか、破壊さえすることが予想される。Zalipsky,S.(BioconjugateChemistry(1995)6:150〜165)、Mehvar,R.(J.Pharm.Pharmaceut.Sci.(2000)3(1):125〜136)およびMonfardini他(BioconjugateChem.(1998)9:418〜450)は、様々な水溶性ポリマー、ペプチドおよびタンパク質に対するそれらの結合、ならびに生物学的効果を概説している。
本発明はさらに、ポリマー付加化合物によって修飾されている生物活性な合成ケモカインに関し、そしてその製造方法および使用方法に関する。本発明は特に、そのN末端領域の1つまたは複数の残基における変化を有するそのような合成ケモカインに関する。そのような変化を有する修飾されたケモカインは、典型的には、その対応する受容体の強力なアンタゴニストである。一般に、今日までに見出されている最も強力な変化は本質的には疎水性であり、例えば、それぞれの主要なカテゴリーのケモカインのN末端に対するメチオニン−(Met−)修飾、アミノオキシペンタン−(AOP−)修飾およびノナノイル−(NNY−)修飾である:効力のさらなる増大を、N末端領域内の野生型アミノ酸をアミノ酸または疎水性誘導体で置換することによって行うことができる(例えば、Rantes、MCPおよびMIPなどのCCケモカイン、ならびにSDF1およびIL−8などのCXCケモカイン)(米国特許出願第60/217,683号を参照のこと、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)。さらに、ケモカインのC末端領域に対する疎水性の修飾を導入することにより、効力がなおさらに増大する。このことは、N末端領域およびC末端領域の両方の疎水性が効力に影響を及ぼすという考えを裏付けている(米国特許出願第60/217,683号を参照のこと)。したがって、所与のケモカインのN末端およびC末端の疎水性を増大させることによってダウンモジュレーションが増強され得るとすれば、水溶性ポリマーの結合は、通常、そのようなケモカインの所望するアンタゴニスト活性、特に、ポリマー修飾されたケモカインが結合する対応する受容体のダウンモジュレーションを著しく低下させるか、破壊さえすることが予想される。Zalipsky,S.(BioconjugateChemistry(1995)6:150〜165)、Mehvar,R.(J.Pharm.Pharmaceut.Sci.(2000)3(1):125〜136)およびMonfardini他(BioconjugateChem.(1998)9:418〜450)は、様々な水溶性ポリマー、ペプチドおよびタンパク質に対するそれらの結合、ならびに生物学的効果を概説している。
本発明の1つの態様は、生物活性な合成ケモカインに対する水溶性ポリマーの結合は、上記の一般論が示すように、効力に影響を及ぼすが、結合部位、結合するポリマーの性質、およびポリマー修飾のために標的化された前駆体ケモカインに依存して、効力および受容体特異性が制御され得るという発見から得られる。本発明はまた、生物活性な合成ケモカインの効力が、所望するアンタゴニスト特性と循環半減期とのバランスを系統的に改善することによって増大し得るという発見からも得られる。この最適化は3要素のプロセスを伴い、このプロセスは、これらの要素を連続して組み合わせたときに、効力および循環半減期が増大している合成ケモカインをもたらす。このプロセスは、すべてのケモカインに対して一般に適用することができる。それぞれの要素もまた、水溶性ポリマーが結合している生物活性な合成ケモカインで、合成ケモカインが結合する対応するケモカイン受容体をダウンモジュレーションするinvitro生物活性を有する生物活性な合成ケモカインの生成における一般的な適用性を有するからである。本明細書中で使用される用語「ケモカイン受容体をダウンモジュレーションする」は、カルシウムシグナル伝達、白血球走化性およびウイルス感染の1つまたは複数を特徴とするケモカイン受容体の正常な基礎活性を低減させることが、ケモカインまたはケモカイン類似物に対するその結合の後に生じることを意味することを意図する。これには、細胞表面からの受容体の長期間除去または増強された除去が含まれ得る。
第1の要素は、前駆体の生物活性な合成ケモカインを、そのin vitro生物活性を保持する1つまたは複数の部位において、目的とする水溶性ポリマーで精密に修飾することに関する。in vitro生物活性は、機能を評価するための良好な基準であり、個々のケモカインに対する標準的なアッセイがこの目的のために十分に知られている(例えば、CytokineReference、第1巻、リガンド(宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要)、J.J.OppendheimおよびM.Feldmann編、AcedemicPress、2001;およびCytokine Reference、第2巻、受容体(宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要)、J.J.OppendheimおよびM.Feldmann編、AcedemicPress、2001を参照のこと)。好ましい結合部位は、C末端部位、凝集部位、グリコシル化部位およびグリコサミノグリカン(「GAG」)結合部位に対応する前駆体ケモカインの残基から選択される。Kuschert他(Biochem.(1999)38:12959〜12968)、Koppman他(J.Immunol.(1999)163:2120〜2127)、およびProudfoot他(J.Biol.Chem.(2001)276(14):10620〜10626)はGAG結合およびケモカインについて報告している。
第2の要素は、結合しているポリマーの性質に関する。ポリマーは、好ましくは、式U−B−Polymer−Jを有しており、この式において、Uは、タンパク質に結合する官能基の残基であり、Bは、3つ以上のアームを有する分岐コアであり、存在または非存在であってもよく、Polymerは、1000ダルトン(「Da」)以上の分子量を有する実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり、Jは、負、中性または正から選択される所望する正味の荷電を生理学的条件下で有するペンダント基である。
本発明のポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインに関して予想外の発見は、約1000Da〜1500Daほどの小さい水溶性ポリマー構造物が、前駆体ケモカインの血清循環半減期を約10倍増大させるためには十分であり得るということである。別の予想外の発見は、小さい直鎖状ポリマー構造物およびはるかに大きい分枝状ポリマー構造物が、同じ部位に結合したときに、効力および受容体ダウンモジュレーションに対して類似する効果を有し得るということである。別の発見は、ポリマー構造物におけるペンダント基Jの性質および数が、生物活性な合成されたポリマー修飾ケモカインのダウンモジュレーションおよび受容体特異性に影響を及ぼし得るということである。
例えば、複数のイオン化性のペンダント基Jを有する分枝状ポリマー構造物の使用により、GAGおよび受容体の結合を意図的に変化させることができる。例として、RANTESの類似物である合成ケモカインが挙げられる。この場合、負に荷電した基を(生理学的条件下で)有する分枝状ポリマーは、負である正味の静電的表面を有するCCR1とは対照的に、中性であるような正味の静電的表面を有するCCR5に対する結合に傾く。したがって、複数の負に荷電したペンダント基Jを含む水溶性ポリマーを有するポリマー修飾された生物活性な合成Rantes類似物は、正味の中性表面または正味の正荷電表面を有する受容体と優先的に相互作用することができる。同様に、GAGは典型的には正味の負荷電を示すので、GAGとの相互作用を操作することができる。当然のことではあるが、上記に記されるように、ポリマーの結合部位は、目的とする生物活性な合成されたポリマー修飾ケモカインの所与の最終的な使用に依存して、受容体結合およびGAG結合のエレメントを細かく調節するために利用することができる。
第3の要素は、それが結合するケモカイン受容体のダウンモジュレーションを特徴とする最適なinvitro生物活性を有するポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインの生成に関する。これには、(関連するin vitro細胞系アッセイにおけるEC50によって見積もられる場合)、ポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインの所望する効力の範囲よりも約1倍〜5倍以上大きく、好ましくは約5倍〜10倍以上大きい効力を有する前駆体ケモカイン(すなわち、水溶性ポリマーを結合させる相手として選ばれる天然ケモカインまたは修飾ケモカイン)の選択が伴う。そのような前駆体ケモカインの選択により、効力とinvivo血清循環半減期との所望するバランスを示すポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインが得られることが見出されている。用語「EC50」は、用量応答(または濃度応答)曲線において基礎的応答と最大応答との半分の応答を引き起こす化合物の濃度を意味することが意図される。例えば、EC50は効力の1つの尺度である。この場合、測定される所与の応答に対するEC50がより小さいことは、より大きいEC50を有する化合物と比較して、より強力な化合物であることを表している。EC50はまた、ED50またはIC50と一般には呼ばれており、ウイルス感染に関連しては、ウイルス産生の50%、ウイルス感染性の50%、またはウイルス誘導による細胞変性効果の50%を阻止する有効濃度である。
これらの要素(すなわち、ポリマー結合部位、ポリマーの性質、およびポリマー修飾のための前駆体ケモカインの選択)のそれぞれから単独または組合せで得ることできる合成ケモカインが提供されることが理解される。ポリマー結合部位はまた、合成ケモカインにおいて重なってもよく、または1つであり得る。例えば、凝集部位およびGAG部位が隣接するか、または同じ部位において局在化する。さらに、2つ以上のポリマーが結合している合成ケモカインが提供される。例えば、本発明にはまた、ケモカインポリペプチド鎖と、GAG部位から選択される第1の部位において、そして凝集部位およびC末端部位から選択される第2の部位においてケモカインポリペプチド鎖に結合している水溶性ポリマーとを含む生物活性な合成ケモカインが含まれる。本発明のこの態様により、特に、分子量および水溶性を増大させることができ(したがって、循環半減期、および水溶性ポリマーによってもたらされる他の望ましい性質を改善することができ)、同時に、ポリマー結合部位における凝集および特定のタイプのGAG結合などのあまり望ましくない性質を除くことができる。
1.ポリマー結合部位
本発明の好ましい生物活性な合成ケモカインは、C末端部位、凝集部位、グリコシル化部位およびGAG結合部位から選択される1つまたは複数の部位の残基において本発明の生物活性な合成ケモカインタンパク質を目的の水溶性ポリマーで精密に修飾することによって生成することができる。これらの部位における残基は、それらがポリマー結合を受けやすい側鎖(すなわち、官能基を有するアミノ酸の側鎖、例えば、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、ヒスチジンなど)を有するならば、結合のために使用することができる。あるいは、これらの部位における残基は、ポリマー結合を受けやすい側鎖を有する異なるアミノ酸で置換することができる。また、遺伝子によってコードされるアミノ酸の側鎖をポリマー結合のために化学修飾することができ、または適切な側鎖官能基を有する非天然アミノ酸を用いることができる。好ましい結合方法では、ペプチド合成および化学的連結の組合せが用いられる。
本発明の好ましい生物活性な合成ケモカインは、C末端部位、凝集部位、グリコシル化部位およびGAG結合部位から選択される1つまたは複数の部位の残基において本発明の生物活性な合成ケモカインタンパク質を目的の水溶性ポリマーで精密に修飾することによって生成することができる。これらの部位における残基は、それらがポリマー結合を受けやすい側鎖(すなわち、官能基を有するアミノ酸の側鎖、例えば、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、ヒスチジンなど)を有するならば、結合のために使用することができる。あるいは、これらの部位における残基は、ポリマー結合を受けやすい側鎖を有する異なるアミノ酸で置換することができる。また、遺伝子によってコードされるアミノ酸の側鎖をポリマー結合のために化学修飾することができ、または適切な側鎖官能基を有する非天然アミノ酸を用いることができる。好ましい結合方法では、ペプチド合成および化学的連結の組合せが用いられる。
本発明のそのような生物活性な合成ケモカインは、好ましくは、アミノ酸残基を縮合することによって合成される。そのようなアミノ酸残基は、核酸によってコードされ、リボソームに取り込まれる下記のアミノ酸であり得る:アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、システイン、グルタミン酸塩、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン。1つの実施形態において、本発明の生物活性な合成ケモカインの特定部分について選択されるアミノ酸配列は、そのタンパク質の配列におけるその位置において見出される本来のアミノ酸残基、すなわち、天然に存在するアミノ酸残基である。代わりの実施形態において、選択されたアミノ酸配列は、そのタンパク質の本来の配列または天然の配列に存在するアミノ酸残基の代わりにN末端システイン残基を含有し得るポリペプチドフラグメントから構成されるか、またはそのようなポリペプチドフラグメントから構築される。そのような残基を含むことにより、天然の化学的連結、ペプチド合成および/または収束的合成の原理および方法を使用して、ポリペプチドを、(カルボキシチオエステル基を含有するように修飾された)別のポリペプチドに連結することができる(米国特許出願第60/231,339号、同60/236,377号および同09/097,094号を参照のこと;これらはすべて参考として本明細書中に組み込まれる)。そのような原理は、好ましくは、本発明の生物活性な合成ケモカインを合成するために用いられる。
さらなる実施形態において、本発明の合成された生物活性なタンパク質は「非通常型」のアミノ酸残基を含むことができる。本明細書中で使用される用語「非通常型」のアミノ酸残基は、RNAによってコードされず、リボソームに取り込まれないアミノ酸を示すことが意図される。これに関して、本発明は、合成された生物活性なタンパク質の設計および/または構築における広い選択性および柔軟性を可能にする。本発明に従って使用され得る、リボソームに取り込まれないアミノ酸の例には、D−アミノ酸、β−アミノ酸、プソイドグルタミン酸塩、γ−アミノ酪酸塩、オルニチン、ホモシステイン、N−置換アミノ酸(R.Simon他、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1992)89:9367〜71;国際特許出願公開WO91/19735(Bartlett他)、米国特許第5,646,285号(Baindur)、α−アミノメチレンオキシ酢酸(アミノ酸−Glyのジペプチド等電子配置体)、およびα−アミノオキシ酸などが含まれる。チオアミド、ビニル性アミド、ヒドラジノ、メチレンオキシ、チオメチレン、ホスホンアミド、オキシアミド、ヒドロキシエチレン、還元アミドおよび置換された還元アミドの等電子配置体ならびにβ−スルホンアミドを含有するペプチド類似物を用いることができる。
特に、天然型をまねた(pseudo−native)化学的連結の使用は好都合である。なぜなら、R鎖の修飾は、合成されたタンパク質へのポリマー付加物の結合を可能にするからである。同様に、N末端のNα−置換された2炭素鎖もしくは3炭素鎖のアルキルチオールアミノ酸またはアリールチオールアミノ酸を用いることができる。そのような残基は、(末端端部またはポリペプチドに存在する場合)、本明細書中に記載される拡張された天然の化学的連結の方法に従って、そのようなポリペプチドを、カルボキシチオエステル成分を有するポリペプチドに連結するために都合よく使用することができる。
ペプチド合成は、標準的な自動化されたペプチド合成機を使用する、1960年代の初期に開発された「メリーフィールド」化学の段階的な固相ペプチド合成プロトコルに好ましくは基づいている。ペプチド連結段階では固相連結法または溶液相連結法を用いることができる。化学的連結には、第1の化学的成分と第2の化学的成分との間で選択的な共有結合した連結を形成させることが含まれる。第1の化学的成分および第2の化学的成分に存在する特徴的な相互反応性の官能基を、連結反応を化学選択的にするために使用することができる。例えば、ペプチドおよびポリペプチドの化学的連結は、適合し得る特徴的な相互反応性のC末端アミノ酸残基およびN末端アミノ酸残基を有するペプチドセグメントまたはポリペプチドセグメントを化学選択的に反応させることを伴う。
1つの実施形態において、合成された生物活性なタンパク質のアミノ酸残基のすべてをペプチド結合(すなわち、アミド結合)によって結合させることができる。あるいは、2つのアミノ酸残基(または2つのポリペプチドのC末端残基およびN末端残基)を非アミド結合(チオエステル結合、オキシム結合、チオエーテル結合、制御されたジスルフィド結合、チオゾリジン結合、ヒドラゾン形成連結、オキサゾリジン形成連結など)によって相互に連結することができ(Schnolzer,M.およびKent,S.B.H.、Science(1992)256:221〜225;Rose,K.、J.Amer.Chem.Soc.(1994)116:30〜33;Englebretsen,D.R.他、TetrahedronLett.36:8871〜8874;Baca,M.他、J.Amer.Chem.Soc.(1995)117:1881〜1887;Liu,C.F.他、J.Amer.Chem.Soc.(1994)116:4149〜4153;Liu,C.F.他、J.Amer.Chem.Soc.(1996)118:307〜312;Dawson,P.E.他、Science(1994)266:776〜779;Gaertner他、Bioconj.Chem.(1994)5(4):333〜338;Zhang他、Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16):9184〜9189;Tam他、国際特許出願公開WO95/00846;米国特許第5,589,356号)、または他の方法によって相互に連結することができる(Yan,L.Z.およびDawson,P.E.、「脱イオウと組み合わせた天然の化学的連結によるシステイン残基を有しないペプチドおよびタンパク質の合成」、J.Amer.Chem.Soc.2001、123、526〜533(これは参考として本明細書中に組み込まれる);Gieselnan他、Org.Lett.2001、3(9):1331〜1334;Saxon,E.他、「アミド結合の化学選択的合成に対する「無痕跡」スタウジンガー連結」、Org.Lett.2000、2、2141〜2143)。したがって、本発明により、様々なペプチド結合修飾、代用体および等電子配置的置換を、生物活性なタンパク質の調製において利用することができる。
連結が、N末端システイン残基を有するポリペプチドの結合を伴う場合には、天然の化学的連結の手法が好ましくは用いられる(Dawson他、Science(1994)266:776〜779;Kent他、国際特許出願公開WO96/34878;Kent他、国際特許出願公開WO98/28434)。この方法論は、天然のアミド結合を連結部位において生じさせるための、影響を受けにくい方法論であることが証明されている。天然の化学的連結は、C末端のα−カルボキシチオエステル成分を有する第1のペプチドセグメントまたはポリペプチドセグメントと、N末端システイン残基を有する第2のペプチドまたはポリペプチドとの間での化学選択的な反応を伴う。チオール交換反応により、最初のチオエステル連結された中間体が生じ、これは自発的に転位して、天然のアミド結合を連結部位においてもたらし、同時にシステイン側鎖チオールを再生する。多くの場合、N末端システイン残基を有するポリペプチドフラグメントが合成され、天然の化学的連結反応において使用され得るように、天然タンパク質の配列は、好適に設置されたシステイン残基を含む。他の場合には、ペプチド合成を、この目的のためにシステイン残基をポリペプチドに導入するように行うことができる。
しかしながら、システイン残基がポリペプチドのN末端において導入されるように天然タンパク質の配列を修飾することが不都合であるか、またはそのような修飾が望ましくない場合には、天然の化学的連結の方法は、N置換(好ましくは、Nα−置換)された2炭素鎖または3炭素鎖のアミノアルキルチオールまたはアミノアリールチオールを含有するようにそのN末端が修飾されているポリペプチドを使用して伸張することができる。そのような「拡張された天然の化学的連結」が米国特許出願第60/231,339号および同第60/236,377号(これらは参考として本明細書中に組み込まれる)に記載されている。
簡単に記載すると、この方法は、カルボキシルチオエステル(より好ましくは、α−カルボキシルチオエステル)を含む第1の成分を、酸に安定なN置換(好ましくは、Nα−置換)された2炭素鎖または3炭素鎖のアミノアルキルチオールまたはアミノアリールチオールを含む第2の成分と連結することを伴う。第1の成分のカルボキシチオエステルと、第2の成分のN置換された2炭素鎖または3炭素鎖のアルキルチオールまたはアリールチオールのチオールとの間での化学選択的な反応が、チオエステル連結された中間体を経て進行し、最初の連結生成物を生じさせる。より詳細には、COSRチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間で生じるチオール交換により、チオエステル連結された中間体の連結生成物が生じ、これは、自発的に転位した後、アミノアルキルチオール成分が下記の式Iまたは式IIをそれぞれ有するかどうかに依存して、5員環または6員環の中間体を介して、アミドで連結された最初の連結生成物をもたらす:
(式中、J1は、場合により保護された1つまたは複数のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、色素、好適に官能化された表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張された天然の化学的連結と適合し得る任意の他の化学的成分であり;R1、R2およびR3は独立して、水素、またはC1に結合した電子供与基であり、ただし、R1、R2およびR3の少なくとも1つは、C1に結合した電子供与基を含み;およびJ2は、場合により保護された1つまたは複数のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、色素、好適に官能化された表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張された天然の化学的連結と適合し得る任意の他の化学的成分である)。
(式中、J1は、場合により保護された1つまたは複数のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、色素、好適に官能化された表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張された天然の化学的連結と適合し得る任意の他の化学的成分であり;R1、R2およびR3は独立して、水素、またはC1に結合した電子供与基であり、ただし、R1、R2およびR3の少なくとも1つは、C1に結合した電子供与基を含み;およびJ2は、場合により保護された1つまたは複数のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、色素、好適に官能化された表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張された天然の化学的連結と適合し得る任意の他の化学的成分である)。
連結部位におけるN置換された2炭素鎖または3炭素鎖のアルキルチオールまたはアリールチオール[HS−C2−C1(R1)−]または[HS−(C3(R3)−C2(R2)−C1(R1)−)は、生成物に対する損傷を伴うことなく、ペプチドに適合し得る条件のもとで除去することが容易であり、連結部位に天然のアミド結合を有する下記の式IIIの最終的な連結生成物をもたらす:
J1−C(O)−HN−J2 III
(式中、J1、J2、R1、R2およびR3は上記に定義される通りである)。
J1−C(O)−HN−J2 III
(式中、J1、J2、R1、R2およびR3は上記に定義される通りである)。
R1基、R2基およびR3基は、ペプチドと適合し得る切断条件のもとでのN−C1結合の切断を容易にするために選択される。例えば、C1に結合している場合には特に、電子供与基を、切断を容易にする共鳴安定化されたカチオンをC1において形成させるために使用することができる。化学的連結反応は、好ましくは、添加剤としてチオール触媒を含み、水性条件または混合有機水性条件におけるほぼ中性pHの条件において行われる。第1の成分および第2の成分の化学的連結は、N置換されたアミド連結の連結生成物を生じさせる自発的な転位を受ける5員環または6員環を経由して進行し得る。第1の成分および第2の成分がペプチドまたはポリペプチドである場合、N置換されたアミド連結の連結生成物は下記の式IVまたは式Vを有する:
(式中、J1、J2およびR1、R2、R3は上記に定義される通りであり、Z2はアミノ酸側鎖であるか、またはそのような側鎖の誘導体である)。
(式中、J1、J2およびR1、R2、R3は上記に定義される通りであり、Z2はアミノ酸側鎖であるか、またはそのような側鎖の誘導体である)。
N置換されたアミド結合の連結生成物の結合している電子供与基のR1、R2またはR3は、N−C1結合の切断、およびN置換されたアミド結合の連結生成物からの2炭素鎖または3炭素鎖のアルキルチオールまたはアリールチオールの除去を促進する。ペプチドに適合し得る切断条件のもとでNのアルキルチオール鎖またはアリールチオール鎖を除去することにより、天然のアミド結合を連結部位において有する連結生成物が得られる。第1の成分および第2の成分がペプチドまたはポリペプチドである場合、連結生成物が下記の式を有する:
J1−CONαH−CH(Z2)−C(O)−J2 VI
J1−CONαH−CH(Z2)−C(O)−J2 VI
C末端部位への結合の利点は、そのような結合は、ほとんどのケモカインの知られている機能的領域から最大限に分離されるために、活性の潜在的な喪失を最小限に抑えることができるということである。1つまたは複数の凝集部位を有するケモカインへの結合の利点は、水溶性ポリマーが、活性の潜在的な喪失を最小限にしながら凝集を破壊することができ、そして取扱い/配合およびinvivo効力を改善することができるということである。グリコシル化部位への結合は、天然のポリマー結合部位における合成ポリマーの結合による活性の潜在的な喪失を最小限にしながら、その部位において通常的に見出される糖鎖の正の効果を模倣するという利点を有する。グリコシル化部位におけるポリマー修飾の別の利点は、グリコシル化部位がN末端のファルマコホア領域またはその近くに存在する場合には特に、合成ケモカインがプロドラッグの形態で提供されるように切断可能なリンカーを含むポリマーが用いられ得るということである。GAG結合部位への結合の利点は、上記ポリマーを利用して、その部位におけるGAG結合を破壊することができ、またそのような部位が重なっているいくつかの場合には凝集を破壊することができ、同時に活性の潜在的な喪失を最小限にし、そしてGAG成分を有する望ましくない表面に対する結合を低下させることによって循環半減期を改善することができ、そして取扱い/配合およびinvivo効力を改善することができるということである。あるいは、結合のために用いられる水溶性ポリマーに依存して、GAG結合を増強することができ、または特定タイプのGAGの結合を増強することができる。当然のことではあるが、修飾される標的ケモカインに依存して、ポリマー結合の部位が他の部位よりも好ましい場合がある。例えば、すべてのケモカインはC末端領域および1つまたは複数のGAG結合部位を有する一方で、必ずしもすべてのケモカインが凝集部位およびグリコシル化部位を有しないようである。
都合が良いことには、水溶性ポリマーの結合は、特にタンパク質のN末端領域において生分解性リンカーを介して行われる。そのような修飾は、リンカーが分解したとき、ポリマー修飾を有しないタンパク質を放出する前駆体(または「プロドラッグ」)の形態でタンパク質を提供するように作用する。生分解性連結(エステル連結など)による結合およびその使用は十分に知られており、下記においてより詳細に記載される。
a.C末端部位
本発明の好ましい生物活性な合成ケモカインは、水溶性ポリマーがC末端部位において結合している。「C末端部位」により、ケモカインのC末端からC末端α−らせんまでのケモカインポリペプチド鎖の残基が意図される。これには、自由なα−カルボン酸塩を有するペンダントC末端残基、およびそれに隣接する残基が含まれる。すべてのケモカインの顕著な二次構造上の特徴は、疎水性のC末端α−らせんが拡がるシート面を形成する三重鎖の逆平行β−シートである。したがって、C末端α−らせんは、例えば、知られているケモカインの一次配列および/または三次元構造、あるいは分子置換アルゴリズムおよびエネルギー最小化アルゴリズムによる予測構造を比較することによる、例えば、相同性モデリングおよび相同性比較によって、容易に同定可能なケモカインの一環した特徴である(例えば、CytokineReference、第1巻、リガンド(宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要)、J.J.OppendheimおよびM.Feldmann編、AcademicPress、2001を参照のこと)。
本発明の好ましい生物活性な合成ケモカインは、水溶性ポリマーがC末端部位において結合している。「C末端部位」により、ケモカインのC末端からC末端α−らせんまでのケモカインポリペプチド鎖の残基が意図される。これには、自由なα−カルボン酸塩を有するペンダントC末端残基、およびそれに隣接する残基が含まれる。すべてのケモカインの顕著な二次構造上の特徴は、疎水性のC末端α−らせんが拡がるシート面を形成する三重鎖の逆平行β−シートである。したがって、C末端α−らせんは、例えば、知られているケモカインの一次配列および/または三次元構造、あるいは分子置換アルゴリズムおよびエネルギー最小化アルゴリズムによる予測構造を比較することによる、例えば、相同性モデリングおよび相同性比較によって、容易に同定可能なケモカインの一環した特徴である(例えば、CytokineReference、第1巻、リガンド(宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要)、J.J.OppendheimおよびM.Feldmann編、AcademicPress、2001を参照のこと)。
好ましいC末端部位は、ポリマー修飾のために標的化された前駆体ケモカインのペンダントC末端残基に隣接する部位である。一例として、Rantesの類似物の場合が挙げられる。野生型Rantes(1−68)のC末端残基は68位におけるセリン(すなわち、Ser68またはS68)である。NNY−Rantes(2−68)などの前駆体ケモカインのペンダントC末端残基に隣接する残基に対する水溶性ポリマーの結合には、67位におけるメチオニン(M67)、ならびにM67および/またはS68に対応する残基に結合するリンカー部分が含まれる。例えば、目的とするケモカインのC末端への水溶性ポリマーをカップリングするための機能的な側鎖を有するリンカー部分またはスペーサー部分の付加は、そのような位置またはその近くにおける元のC末端基の機能に対する潜在的な影響を最小限に抑える。例えば、ジペプチドリンカーLys69−Leu70などの、RantesのS68位へのリンカーの付加は、Rantes((1−68)−(K69−L70))を生じさせ、そしてリンカー部分Lys69の側鎖上のε−窒素へのポリマー結合のための機能的なカップリング基、および新しく生成したC末端における自由なα−カルボン酸塩を有するアミノ酸をもたらす。67位に対応する残基に対するスペーサーまたはリンカーの付加(例えば、Lys67によるMet67の置換、およびε−側鎖アミノ基に対するリンカーの結合)もまた可能である。両者は生物活性を保持することが見出されており、この設計は、他のケモカインに対して一般に適用されると考えられる。例えば、SDF−1αまたはSDF−1βの類似した修飾により、所望する生物活性を保持するポリマー修飾されたSDF−1類似物を生成することができる。さらに別の例において、合成ケモカインがMCP−1またはエオタキシンの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがC末端に隣接する残基において結合する場合、ポリマー結合部位は、それぞれ、MCP−1のD68またはエオタキシンのD66に対応するアミノ酸を含む。ここで再度ではあるが、これらの位置に隣接するC末端部位における残基(MCP−1のK69またはエオタキシンのK68など)はポリマー結合のために利用することができる。さらに、リンカー部分またはスペーサー部分の付加により、C末端またはその近くにおける他の成分(脂質または多環のような疎水性成分など)を付加する際のより大きい柔軟性が可能になる。したがって、本発明のさらなる好ましいポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインは、リンカー部分またはスペーサー部分の側鎖を介してC末端部位において結合している水溶性ポリマーを含む。
b.凝集部位
水溶性ポリマーが1つまたは複数の凝集部位に結合している合成ケモカインは特に注目される。「凝集部位」により、タンパク質分子の自己会合を生じさせる残基(1つまたは複数)が意図される。ほとんどのケモカインは、ホモニ量体を形成する能力を有しているが、多くは四量体を形成することができ、そして一部はさらに大きい多量体を形成することができる(CytokineReference、第1巻、リガンド(宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要)、J.J.OppendheimおよびM.Feldmann編、AcademicPress、2001)。ケモカインの凝集部位は、典型的には、高濃度で二量体および多量体の複合体を形成することができるケモカインにおいて見出されている(CytokineReference、第1巻、リガンド(宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要)、J.J.OppendheimおよびM.Feldmann編、AcademicPress、2001)。例えば、RantesおよびMIP−1βなどのケモカインは高濃度で分子の自己会合による凝集体を形成し、これに対して、IL−8、SDF−1αおよびvMIPなどのケモカインは何ら著しい程度でこの傾向を有していない。凝集部位は、相同性モデリング、アラニン走査、および溶液における高濃度での活性な化合物の比較、およびこの分野で知られている様々な技術を使用して自己会合である凝集についてモニターリングすることなどの多数のよく知られている方法によって同定することができる(例えば、Czaplewski他、J.Biol.Chem.(1999)274(23):16077〜16084;Czaplewski他、「hMIP−1αの操作、生物学および臨床的開発」、(1999)、In:Chemokines in Disease:Biology andClinical Research、C.A.Herbert編、Humana Press Inc.、Totwa、NJ;Trkola他、J.Virol.(1999)73(8):6370〜6379;Appay他、J.Biol.Chem.(1999)274(39):27505〜27512;Hunter他、Blood(1995)86(12):4400〜4408;Lord他、Blood(1995)85(12):3412〜3415;Lord他、Brit.J.Cancer(1996)74:1017〜1022を参照のこと)。そして上記に記されるように、多くのケモカインの凝集部位が知られており、そして推定される凝集部位を同定するための技術もよく知られている(CytokineReference、第1巻、リガンド(宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要)、J.J.OppendheimおよびM.Feldmann編、AcademicPress、2001もまた参照のこと)。したがって、ケモカインの凝集部位は、好評された情報、相同性モデリングから、スクリーニングによって、またはそれぞれの組合せによって同定することができる。したがって、本明細書中に示されている例は本発明の例示であり、したがって本発明を限定することを意図していない。
水溶性ポリマーが1つまたは複数の凝集部位に結合している合成ケモカインは特に注目される。「凝集部位」により、タンパク質分子の自己会合を生じさせる残基(1つまたは複数)が意図される。ほとんどのケモカインは、ホモニ量体を形成する能力を有しているが、多くは四量体を形成することができ、そして一部はさらに大きい多量体を形成することができる(CytokineReference、第1巻、リガンド(宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要)、J.J.OppendheimおよびM.Feldmann編、AcademicPress、2001)。ケモカインの凝集部位は、典型的には、高濃度で二量体および多量体の複合体を形成することができるケモカインにおいて見出されている(CytokineReference、第1巻、リガンド(宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要)、J.J.OppendheimおよびM.Feldmann編、AcademicPress、2001)。例えば、RantesおよびMIP−1βなどのケモカインは高濃度で分子の自己会合による凝集体を形成し、これに対して、IL−8、SDF−1αおよびvMIPなどのケモカインは何ら著しい程度でこの傾向を有していない。凝集部位は、相同性モデリング、アラニン走査、および溶液における高濃度での活性な化合物の比較、およびこの分野で知られている様々な技術を使用して自己会合である凝集についてモニターリングすることなどの多数のよく知られている方法によって同定することができる(例えば、Czaplewski他、J.Biol.Chem.(1999)274(23):16077〜16084;Czaplewski他、「hMIP−1αの操作、生物学および臨床的開発」、(1999)、In:Chemokines in Disease:Biology andClinical Research、C.A.Herbert編、Humana Press Inc.、Totwa、NJ;Trkola他、J.Virol.(1999)73(8):6370〜6379;Appay他、J.Biol.Chem.(1999)274(39):27505〜27512;Hunter他、Blood(1995)86(12):4400〜4408;Lord他、Blood(1995)85(12):3412〜3415;Lord他、Brit.J.Cancer(1996)74:1017〜1022を参照のこと)。そして上記に記されるように、多くのケモカインの凝集部位が知られており、そして推定される凝集部位を同定するための技術もよく知られている(CytokineReference、第1巻、リガンド(宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要)、J.J.OppendheimおよびM.Feldmann編、AcademicPress、2001もまた参照のこと)。したがって、ケモカインの凝集部位は、好評された情報、相同性モデリングから、スクリーニングによって、またはそれぞれの組合せによって同定することができる。したがって、本明細書中に示されている例は本発明の例示であり、したがって本発明を限定することを意図していない。
例として、凝集部位が、上記の技術などの様々な技術によって多数のケモカインにおいて同定されている。例えば、野生型Rantesは、凝集に関与する少なくとも2つの残基を有する:26位および66位の残基位置におけるグルタミン酸(すなわち、Glu26およびGlu66、またはE26およびE66)。したがって、合成ケモカインがRantesの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーが凝集部位において結合する場合、凝集部位は、E26およびE66から選択されるRantesの残基に対応するアミノ酸を含むことができる。例えば、本発明者らは、RantesのE66に隣接する残基において、すなわち、メチオニン67(すなわち、Met67またはM67)に対応する位置において水溶性ポリマーを結合させている。このポリマー修飾により、凝集が破壊され、そして全体的な取扱い性が改善される。これは、おそらくは、隣接するグルタミン酸残基の凝集性を破壊するポリマーによってもたらされる大きい疎水性の殻のためである。したがって、本発明に関連して、Rantesにおける凝集部位は、E26およびE66にだけ対応するのではなく、それらに隣接するアミノ酸にも対応する。したがって、Rantesにおける凝集部位は、M67を含む、E26およびE66から選択されるRantesの残基に対応するアミノ酸を含む。
別の例として、合成ケモカインがMIP−1αの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがその凝集部位において結合する場合、凝集部位は、D26およびE66から選択されるMIP−1αの残基に対応するアミノ酸を含む。同様に、合成ケモカインがMIP−1βの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがその凝集部位において結合する場合、そのような凝集部位は、D27位置およびE67位置から選択されるMIP−1βの残基に対応するアミノ酸を含む。さらに別の例において、合成ケモカインがMCP−1またはエオタキシンの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーが凝集部位において結合する場合、凝集部位は、MCP−1の残基P8および残基D68またはエオタキシンの残基D66にそれぞれ対応するアミノ酸を含む。ここで再度ではあるが、これらの位置に隣接する残基(MCP−1のK69またはエオタキシンのK68など)は、凝集を破壊するために、ポリマー結合のために利用することができ、したがって水溶性ポリマーがその凝集部位に結合している本発明の生物活性な合成ケモカインに含まれる。理解され得るように、凝集部位は容易に同定することができ、ポリマー修飾するための好ましい部位であり、そして所望する生物活性に対する日常的なスクリーニングによって優先的な結合のために選択することができる。
より好ましい実施形態において、水溶性ポリマーは、目的とするケモカインのC末端領域に位置する凝集部位において結合する。ポリマー結合のためのさらにより好ましい凝集部位は、ケモカインのC末端α−らせんのC末端側にある部位であり、例えば、RantesのE66およびM67、MIP−1αのE66、MIP−1βのE67、MCP−1のD68、またはエオタキシンのD66などである。したがって、本発明の好ましい生物活性な合成ケモカインは、水溶性ポリマーが、そのC末端α−らせんのC末端側にあるC末端凝集部位において結合している合成ケモカインである。本発明のこの態様の最も好ましい生物活性な合成ケモカインは、そのC末端α−らせんのC末端側にあるC末端凝集部位で、前駆体ケモカインのペンダントC末端残基に隣接するC末端凝集部位において水溶性ポリマーが結合している合成ケモカインである。
c.グリコシル化部位
別の好ましい実施形態において、水溶性ポリマーがグリコシル化部位において結合している本発明の生物活性な合成ケモカインが提供される。「グリコシル化部位」により、N−結合型グリコシル化部位およびO−結合型グリコシル化部位などの、炭水化物(オリゴ糖)鎖の酵素的結合をコードする残基が意図される。より好ましいグリコシル化部位は、ケモカインのC末端領域において存在するグリコシル化部位である。N−結合型グリコシル化部位が最も好ましい部位である。グリコシル化部位は天然の部位であり得るか、または標的タンパク質に操作して入れることができる。グリコシル化部位は、多糖およびその結合部位の存在に対する分析的試験、相同性比較、または遺伝子データベースおよびタンパク質データベースに対するコンセンサス配列および/もしくはコンセンサス構造を調べることによって野生型分子において同定することができる。グリコシル化部位を標的タンパク質に操作して入れることの利点は、操作された部位が目的とする所望の生物活性を破壊しないならば、ポリマー結合のためのさらなる好ましい部位が同定され得るということである。
別の好ましい実施形態において、水溶性ポリマーがグリコシル化部位において結合している本発明の生物活性な合成ケモカインが提供される。「グリコシル化部位」により、N−結合型グリコシル化部位およびO−結合型グリコシル化部位などの、炭水化物(オリゴ糖)鎖の酵素的結合をコードする残基が意図される。より好ましいグリコシル化部位は、ケモカインのC末端領域において存在するグリコシル化部位である。N−結合型グリコシル化部位が最も好ましい部位である。グリコシル化部位は天然の部位であり得るか、または標的タンパク質に操作して入れることができる。グリコシル化部位は、多糖およびその結合部位の存在に対する分析的試験、相同性比較、または遺伝子データベースおよびタンパク質データベースに対するコンセンサス配列および/もしくはコンセンサス構造を調べることによって野生型分子において同定することができる。グリコシル化部位を標的タンパク質に操作して入れることの利点は、操作された部位が目的とする所望の生物活性を破壊しないならば、ポリマー結合のためのさらなる好ましい部位が同定され得るということである。
具体的には、粗面小胞体のリボソームによって合成されるほとんどのタンパク質は短い鎖の炭水化物(オリゴ糖)を含有しており、糖タンパク質と呼ばれている(例えば、Vanden Steen他、Critical Rev.Biochem.Mol.Biol.(1998)33(3):151〜208を参照のこと)。そして、多くのケモカインがグリコシル化されること、またはN−結合型および/またはO−結合型のグリコシル化のコンセンサス部位を含有することが知られている。実際、多くの天然において産生されるケモカインは非常にグリコシル化されている。このことにより、ケモカインのグリコシル化部位がポリマー修飾のために特に注目される。例えば、糖タンパク質は、タンパク質の多くの重要な性質(例えば、pI、分子サイズ、溶解性、安定性、構造および静電的表面荷電)、および真核生物細胞表面の多くの重要な性質(例えば、細胞−細胞の認識および接着、「すり切れ」からの細胞表面の荷電保護、血液型特異的抗原、ウイルスおよび細菌および原生動物の受容体、移植(組織適合性)抗原、イオンチャンネルなど)に関わっている。したがって、そのような部位における水溶性ポリマーの結合を利用して、改善された性質を有する薬物化合物を生成するために、好都合な性質(例えば、pI、サイズ、溶解性、安定性、低下した抗原性、延長された循環半減期)を模倣することができ、同時に、他の性質(例えば、異種性、糖類媒介によるクリアランス、および望ましくない接着)を除くことができる。
さらに、1つまたは複数のグリコシル化部位における水溶性ポリマーの結合は、一般に、生物活性に対する影響を低下させ、そしておそらくは生物活性を改善させるはずである。これは、自然が、そのような部位を大きい水溶性ポリマーの結合のために選択しているからである。糖タンパク質の炭水化物含有物(多くの場合、総重量の50%以上である)は、4個〜15個の糖を典型的には含有するオリゴ糖側鎖としてポリペプチドに共有結合により結合している。いくつかの側鎖が同じポリペプチドに存在することがあり、そしてその鎖が分岐している場合がある。そして、本発明者らは、グリコシル化部位が、ポリマー結合、特に、グリコシル化を介して結合したオリゴ糖鎖の正味荷電の寄与を模倣するペンダント荷電基を有する比較的大きい分子量の分枝状水溶性ポリマーの結合を容易に行うことができる部位の比較的良好な指標であることを見出した。
グリコシル化部位の同定において、糖タンパク質のオリゴ糖には、O−結合型およびN−結合型の2つの主要なタイプがある。O−結合型オリゴ糖は、一般には、セリンおよびトレオニンの側鎖のOH基に対するO−グリコシド結合を介してタンパク質に結合している。N−結合型オリゴ糖は、アスパラギンの側鎖のNH2基に対するN−グリコシド結合を介してタンパク質に結合しており、この場合、アスパラギンは、配列の中のXがプロリンおよびアスパラギン酸塩を除く任意のアミノ酸である位置に存在している。
N−グリコシル化された炭水化物鎖は、上記に述べられたように、ポリペプチド内のAsn−X−Ser/Thr(XはPro以外の任意のアミノ酸である)におけるAsn残基に結合している。しかし、多くのタンパク質には、グリコシル化されていないAsn−X−Ser/Thr配列が1つまたは複数含まれており、この配列の存在は必ずしもそれに対する炭水化物鎖の付加をもたらさない。しかしながら、N−グリコシル化の有無は容易に調べることができる(Biller,M.他、J.Virol.Methods、1998(12月):76(1−2):87〜100;Taverna,M.他、J.Biotechnol.、1999(2月5日):68(1):37〜48;Friedman,Y.他、Anal.Biochem.、1995(7月1日):228(2):221〜5)。一方、O−グリコシル化された炭水化物鎖はポリペプチド内のSer残基またはThr残基に結合しているが、N−グリコシル化の場合とは異なり、グリコシル化のために要求されるアミノ酸配列に対する規則はない。しかし、Proが近くに存在するとき、例えば、Pro−Thr/Ser、Thr/Ser−ProおよびThr/Ser−X1〜3−Pro(Xは任意のアミノ酸である)の配列において、グリコシル化に対する傾向が増大することが知られている(Takahashi他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81:2021)。ここで再度ではあるが、O−結合型グリコシル化は容易に調べることができる。
多くのケモカインがグリコシル化されること、または推定的なグリコシル化部位を含むことが知られている(例えば、CytokineReference、第1巻、リガンド(宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要)、J.J.OppendheimおよびM.Feldmann編、AcademicPress、2001を参照のこと)。したがって、ケモカインのグリコシル化部位を発表された情報から同定することができる。予測される部位について、N−結合型グリコシル化部位および/またはO−結合型グリコシル化部位を確認する好ましい方法は、(例えば、この目的のために好適なデータベース・マッチング・システムおよびパターン・マッチング・システム(例えば、Xiang,Y.他、Virology、1999(5月10日):257(2):297〜302;Hoops,T.C.他、J.Biol.Chem.、1991(3月5日):266(7):4257〜63;Apweiler,R.他、Biochim.Biophys.Acta.、1999(12月6日):1473(1):4〜8を参照のこと)を使用して)相同性比較を行い、その後、酵母細胞または哺乳動物細胞の発現システムにおいて前駆体サイトカインを試験し、そして糖類含有物および結合部位を特徴付ける分析試験を行うことによる。あるいは、相同性比較によって同定された推定的な部位は、目的とする水溶性ポリマーで修飾することができ、その後、この目的のために好適な標準的なプロトコルに従って目的とする生物活性(例えば、カルシウム流動、走化性、および/またはウイルス進入の阻害)について、関連するinvitroバイオアッセイにおいて単にスクリーニングすることができる。
例として、相同性モデリングにより、推定的なO−結合型グリコシル化部位が、Rantesにおける5位のセリン(すなわち、Ser5またはS5)において同定される。この位置は、グリコシル化された形態が2nM〜10nMの範囲で走化活性を有することを示す他の研究により裏付けられている(Kameyoshi他、J.Exp.Med.(1992)176(2):587〜592)。アンタゴニストであるRantes類似物(NNY−Rantes類似物など)の場合、Rantesの5位のセリンをGluまたはLysなどの荷電した可溶性基成分に変化させると、ウイルス感染/融合に対する細胞系アッセイにおいて測定されたとき、効力が低下し、これに対して、t−ブチルアラニン(tBuA)などのアミノ酸成分の導入は効力を保持している。したがって、Rantesアンタゴニストの場合、野生型RantesにおけるS5位置に対応する部位における水溶性ポリマーの結合は、好ましくは、生分解性リンカーによって、例えば、セリンの側鎖ヒドロキシルまたは類似する基に対するエステル連結によってなされ、これにより、Rantesアンタゴニスト化合物は実質的にはプロドラッグ形態でもたらされる。invivo環境における水溶性ポリマーからのRantes類似物の分解および放出により、その後、その活性形態が得られる。エステル連結などの生分解性連結による結合およびその使用は十分に知られており、下記においてより詳しく記載される。
類似する状況が、1つまたは2つの潜在的なO−結合型グリコシル化部位をそれぞれ有するMIP−1αおよびMIP−1βなどの他のケモカインについて見出されている。例えば、MIP−1αは、残基T7に対応するアミノ酸を含む予測されるグリコシル化部位を有し、そしてMIP−1βについては、予測されるグリコシル化部位は、残基S5に対応するアミノ酸を含む。これらの2つの例は、O−結合型グルコシル化部位が予測される点でRantesと類似しており、したがってMIPのアンタゴニスト類似物の場合、好ましい結合は、ポリマーがinvivoで放出された後でその活性形態の形成が可能になるような生分解性連結による。
多くの他のケモカインはグリコシル化部位を有しており、本発明に従って合成することができ、そして1つまたは複数の水溶性ポリマーで修飾することができる。したがって、本明細書中に示される例は本発明の例示であり、したがって本発明を限定することを意図していない。例えば、リホタクチンは、8個のO−結合型グリコシル化部位を含有する93残基のケモカインである。この化合物は、天然の化学的連結を使用して合成され、1個のGalNAc残基が、標準的なFmoc化学を使用してそれぞれのグリコシル化部位において取り込まれている(Marcaurelle他、Chemistry(2001)7(5):1129〜1132)。MCP−1などの他のケモカインでは、グリコシル化部位は、MCP−1の残基T71に対応するアミノ酸を含む。一般的なN−グリコシル化配列がMCP−1にはN14位置に存在するが、N−結合型の糖を検出することができない。それどころか、少量のシアリル化されたO−結合型炭水化物がタンパク質のC末端に付加されている(Zhang他、J.Biol.Chem.(1994)269:15918〜15924)。その予測される部位はT71である。そのグリコシル化された形態は、invitro単球走化性アッセイにおいて、非グリコシル化MCP−1の1/2〜1/3の効力を有するだけであると報告されている(Proost他、J.Immunology(1998)160:4034〜4041)。別のグリコシル化ケモカインはHCC−1であり、これは、ヒト血漿中にナノモル濃度水準で循環しているこれまでに知られている唯一のCCケモカインである(Richter他、Biochemistry(2000)39(35):10799〜10805)。HCC−1は様々なプロセシングされた形態で存在し、74アミノ酸の全長型形態は、2つのN−アセチルノイラミン酸および二糖のN−アセチルガラクトサミンガラクトースとともにO−グリコシル化を7位(Ser7)において有する。
より好ましい実施形態において、水溶性ポリマーは、目的とするケモカインのC末端領域に位置するグリコシル化部位において結合する。ポリマー結合のための最も好ましいグリコシル化部位は、ケモカインのC末端α−らせんのC末端側にあるグリコシル化部位である。例えば、合成ケモカインがMCP−1であるとき、水溶性ポリマーは、好ましくは、野生型MCP−1の残基位置T71に対応するグリコシル化部位において結合する。したがって、本発明の好ましい生物活性な合成ケモカインには、そのC末端α−らせんのC末端側にあるC末端グリコシル化部位において水溶性ポリマーが結合しているものが含まれる。
d.GAG結合部位
本発明の別の好ましい実施形態において、水溶性ポリマーがそのGAG結合部位において結合している生物活性な合成ケモカインが提供される。「GAG結合部位」により、GAG結合をコードする残基、すなわち、典型的には、一級アミンおよび二級アミンを有する残基(リジンおよびアルギニンなど)、そして場合によりタンパク質の表面に正の荷電クラスターを形成するヒスチジンが意図される。ケモカインは、ヘパリン、硫酸ヘパラン、硫酸コンドロイチンおよび硫酸デルマタン(これらは、天然には内皮細胞表面および細胞外マトリックスに存在する)を含むGAGと結合することが知られている(例えば、Wells他、Inflamm.Res.(1999)48:353〜3362;Lalani他、J.Virol.(1997)71:4356〜4363;Rot,A.、Eur.J.Immunol.(1993)23:303〜306;Witt他、Curr.Biol.(1994)4:394〜400;Hoogewerf他、Biochem.(1997)36:13570〜13578;Marquezini他、Cardiology(1995)86:143〜146;Wasty他、Diabetologia(1993)36:316〜322)。Kuschert他(Biochem.(1999)38:12959〜12968)、Koppman他(J.Immunol.(1999)163:2120〜2127)およびProudfoot他(J.Biol.Chem.(2001)276(14):10620〜10626)はGAG結合およびケモカインについて報告している)。
本発明の別の好ましい実施形態において、水溶性ポリマーがそのGAG結合部位において結合している生物活性な合成ケモカインが提供される。「GAG結合部位」により、GAG結合をコードする残基、すなわち、典型的には、一級アミンおよび二級アミンを有する残基(リジンおよびアルギニンなど)、そして場合によりタンパク質の表面に正の荷電クラスターを形成するヒスチジンが意図される。ケモカインは、ヘパリン、硫酸ヘパラン、硫酸コンドロイチンおよび硫酸デルマタン(これらは、天然には内皮細胞表面および細胞外マトリックスに存在する)を含むGAGと結合することが知られている(例えば、Wells他、Inflamm.Res.(1999)48:353〜3362;Lalani他、J.Virol.(1997)71:4356〜4363;Rot,A.、Eur.J.Immunol.(1993)23:303〜306;Witt他、Curr.Biol.(1994)4:394〜400;Hoogewerf他、Biochem.(1997)36:13570〜13578;Marquezini他、Cardiology(1995)86:143〜146;Wasty他、Diabetologia(1993)36:316〜322)。Kuschert他(Biochem.(1999)38:12959〜12968)、Koppman他(J.Immunol.(1999)163:2120〜2127)およびProudfoot他(J.Biol.Chem.(2001)276(14):10620〜10626)はGAG結合およびケモカインについて報告している)。
機能には必須ではないが、ケモカインのGAG結合能により、受容体相互作用、およびマトリックスタンパク質および細胞面を覆う受容体保有細胞のハプトタクティック(haptotactic)遊走が調節されることが報告されている(例えば、Rot,A.、Eur.J.Immunol.(1993)23:303〜306;Witt他、Curr.Biol.1994)4:394〜400;Hoogewerf他、Biochem.(1997)36:13570〜13578;Marquezini他、Cardiology(1995)86:143〜146;Wasty他、Diabetologia(1993)36:316〜322;Kuschert他、MethodsEnzymol.(1997)287:369〜378;Kuschert他、Biochem.(1998)37:11193〜11201;Kuschert他、Biochem.(1999)38:12959〜12968)。ケモカインを可溶性GAGと結合することにより、ほとんどの場合、ケモカインのその受容体に対する結合が妨げられる(Kuschert他、Biochem.(1999)38:12959〜12968)。しかし、少数の場合ではあるが、ケモカインとGAGとの相互作用により、活性が強化されることが報告されている(Wbb他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:7158〜7162;Wagner他、Arteriosclerosis(1989)9:21〜32)。したがって、水溶性ポリマーがそのGAG結合部位に結合している合成ケモカインは、結合およびその意図された最終的な使用のために選ばれた部位に依存して、GAGの結合を低下させること、または特定のGAGの結合に傾かせることのいずれかによって生物学的機能を調節するために利用することができる。したがって、本発明の好ましい実施形態は、水溶性ポリマーがGAG結合部位において結合している生物活性な合成ケモカインであって、それが結合するケモカイン受容体をダウンモジュレーションするinvitro生物活性を有する生物活性な合成ケモカインに関する。
上記のように、すべての知られているケモカインは、異なる親和性ではあるが、ヘパリンと結合することができ、したがってそれらはすべてGAG結合部位を有する。GAG部位をポリマー修飾のために選択する際には、多くの種々の技術がこの目的のためには好適である。例えば、BBXBモチーフおよびBBBXXBモチーフ(式中、Bは塩基性残基を表す)が、いくつかのケモカインを含むいくつかのタンパク質について共通するヘパリン結合モチーフであることが示されている(例えば、Cardin他、Arteriosclerosis(1989)9:21〜32;Hileman他、Bioessays(1998)20(2):156〜167;およびProudfoot他、J.Biol.Chem.(2001)276(14):10620〜10626を参照のこと)。しかし、GAG結合部位はBBXBモチーフまたはBBBXXBモチーフに限定されない。例えば、RantesにおけるGAG結合部位(44RKNR47および55KKWVR59)、SDF−1におけるGAG結合部位(24KHLK27)、MIP−1αにおけるGAG結合部位(45KRSR48)およびMIP−1βにおけるGAG結合部位(45KRSK48)はBBXBモチーフを有しており、これに対して、IL−8における主要なGAG結合残基(Lys20、Lys64およびArg68)およびMCP−1における主要なGAG結合残基(Lys59およびArg66)は空間的に離れているが、タンパク質表面において塩基性の荷電クラスターを形成している。したがって、これらのリガンドの塩基性荷電により、それらのヘパリン結合特性が説明される。
GAG部位はまた、塩基性残基(例えば、Lys、HisおよびArg)のアラニン走査、NMR、およびGAG/ヘパリン結合アッセイにおける活性な化合物の比較、ならびにこの目的のために適合したNMR研究によって同定することができる(例えば、Proudfoot他、J.Biol.Chem.(2001)276(14):10620〜10626;Trkola他、J.Virol.(1999)73(8):6370〜6379;Appay他、J.Biol.Chem.(1999)274(39):27505〜27512;Hunter他、Blood(1995)86(12):4400〜4408;Lord他、Blood(1995)85(12):3412〜3415;Lord他、Brit.J.Cancer(1996)74:1017〜1022を参照のこと)。そして、上記のように、多くのケモカインのGAG結合部位が知られており、そして推定されるGAG部位を同定する技術も十分に知られている(CytokineReference、第1巻、リガンド(宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要)、J.J.OppendheimおよびM.Feldmann編、AcademicPress、2001もまた参照のこと)。したがって、ケモカインのGAG結合部位を、発表された情報、相同性モデリングから、またはスクリーニングによって、またはそれらの組合せによって同定することができる。さらに、GAG結合に関与する残基の側鎖の少なくとも1つがN末端のファルマコホア領域から離れて分子表面に位置するので、これらの部位は、一般に水溶性ポリマーの結合を容易に行うことができるはずである。
例として、野生型Rantesは少なくとも2つの主要なGAG結合部位を有しており、これらは、Lys44、Lys45、Arg47、Lys55、Lys56、およびArg59(すなわち、K44、K45、R47、K55、K56、およびR59)から選択されるRantesの残基に対応するアミノ酸を含む。したがって、合成ケモカインがRantesの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがそのGAG結合部位において結合する場合、GAG結合部位は、K44、K45、R47、K55、K56、およびR59から選択されるRantesの残基に対応するアミノ酸を含む。好ましい実施形態において、水溶性ポリマーは、K44、K45、R47から選択されるRantesの残基に対応する位置において結合するが、K45の位置がより好ましい。この実施形態において、45位におけるポリマー結合は、CCR5に対する結合を実質的に保持する一方で、CCR1受容体に対する合成Rantesケモカイン類似物の結合を低下させるという効果を有する。
別の例として、合成ケモカインがMIP−1αの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがそのGAG結合部位において結合する場合、GAG結合部位は、R17、R45およびR47から選択されるMIP−1αの残基に対応するアミノ酸を含む。同様に、合成ケモカインがMIP−1βの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがそのGAG結合部位において結合する場合、そのような凝集部位は、R18、R45およびR46から選択されるMIP−1βの残基に対応するアミノ酸を含む。これらの2つの例において、ポリマー結合のための好ましい部位はMIP−1αのR45であり、MIP−1βのR46である。Rantesの場合と同様に、これらの修飾は、CCR5に対するケモカイン類似物の結合にバイアスをかけるために計画される。
さらなる例において、合成ケモカインがSDF1−αの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがそのGAG結合部位において結合する場合、GAG結合部位は、SDF1−αのK24、H25およびK27の残基に対応するアミノ酸を含む。ここで再度ではあるが、これらの位置に隣接する残基(N22またはN30またはN33など、特にN33)は、実質的に同じ結果を達成するために、ポリマー結合のために利用することができ、したがって、水溶性ポリマーがそのGAG結合部位において結合している本発明の生物活性な合成ケモカインに含められる。
さらに別の例において、合成ケモカインがIL−8の類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがそのGAG結合部位において結合する場合、GAG部位は、K20、R60、K64、K67およびR68から選択されるIL−8の残基に対応するアミノ酸を含む。IL−8の合成類似物に対するポリマー結合の好ましい部位はそのK64位置に対応する。別の例はMCP−1であり、したがって、合成ケモカインがMCP−1の類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがそのGAG部位において結合する場合、GAG部位は、K58およびH66から選択されるMCP−1の残基に対応するアミノ酸を含み、K58が好ましい。
理解され得るように、GAG結合部位は、容易に同定することができ、そしてGAG結合部位は、ポリマー結合のための好ましい部位であり、所望する生物活性に対する日常的なスクリーニングによって優先的な結合のために選択することができる。この目的のために好適な様々なバイオアッセイが十分に知られており、文献に多数記載されている(CytokineReference、第1巻、リガンド(宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要)、J.J.OppendheimおよびM.Feldmann編、AcademicPress、2001)。
2.水溶性ポリマー
好ましくは、本発明の生物活性な合成ケモカインに結合する本発明のポリマー修飾は水溶性ポリマーである。本明細書中で使用される用語「水溶性ポリマー」は、水に溶解し得る実質的に非抗原性のポリマー構築物を意味することが意図される。生物学的な水溶性ポリマーの例には、(a)デキストラン、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストリン;(b)グリコサミノグリカン、例えば、ヘパリン、硫酸ヘパラン、硫酸コンドロイチンおよび硫酸デルマタンなど;(c)ヒアロロニンおよびヒアルロン酸;(d)ポリラクチドおよびオリゴアクチル−アクリレート;(e)セルロース、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロース;(f)コラーゲン;(g)ゼラチン;(h)アルギン酸;ならびに(i)デンプンが含まれるが、これらに限定されない。
好ましくは、本発明の生物活性な合成ケモカインに結合する本発明のポリマー修飾は水溶性ポリマーである。本明細書中で使用される用語「水溶性ポリマー」は、水に溶解し得る実質的に非抗原性のポリマー構築物を意味することが意図される。生物学的な水溶性ポリマーの例には、(a)デキストラン、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストリン;(b)グリコサミノグリカン、例えば、ヘパリン、硫酸ヘパラン、硫酸コンドロイチンおよび硫酸デルマタンなど;(c)ヒアロロニンおよびヒアルロン酸;(d)ポリラクチドおよびオリゴアクチル−アクリレート;(e)セルロース、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロース;(f)コラーゲン;(g)ゼラチン;(h)アルギン酸;ならびに(i)デンプンが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の水溶性ポリマーは、直鎖状または分枝状または星型形状またはそのような高次構造の組合せであってもよく、広範囲の分子量および様々なポリマーサブユニットを有することができる。これらのサブユニットには、生物学的ポリマー、合成ポリマーまたはそれらの組合せを挙げることができる。
そのような生物学的水溶性ポリマーの誘導体が多く知られており、本明細書中に含まれる。合成された水溶性ポリマーの例には、下記が含まれるが、それらに限定されない:(a)ポリアルキレンオキシド、ポリエチレンオキシド、エチレン/無水マレイン酸コポリマーおよびそれらの誘導体を含むポリマー(それらのホモポリマーおよびコポリマーを含む)、例えば、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、およびそれらの誘導体など、この場合、そのようなホモポリマーおよびコポリマーは非置換であるか、または1つの末端においてアルキル基で置換される;(b)ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル;(c)ポリビニルピロリドン;(d)ポリオキシエチル化ポリオール(プルロニックポリオールを含む);(e)ポリエステル、例えば、ポリ(グリコール酸)、ポリ(L−乳酸)、ポリ(D−乳酸)、ポリ(DL−乳酸)、ラクチド/グリコリドコポリマー、ポリ−1,3,6−トリオキサン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ(p−ジオキサノン)およびコポリマー、ポリカプロラクトン、PEG−ポリエステルコポリマー、ポリ(リン酸エステル)など;(f)ポリ(オルトエステル);(g)ポリ無水物;(h)プソイドポリ(アミノ酸)(ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか);(i)ポリグリセロール;(j)デキストラン、カルボキシメチルセルロース;その他。
上記のポリマーなどの水溶性ポリマーはよく知られており、そしてペプチドおよびポリペプチドおよび他の化合物に対する連結のために、生体安定性構築物、生分解性構築物ならびにプロドラッグ構築物として様々な結合化学反応、連結システムおよび構造とともに用いられる(例えば、国際特許出願公開WO90/13540、同WO92/00748、同WO92/16555、同WO94/04193、同WO94/14758、同WO94/17039、同WO94/18247、同WO94/28937、同WO95/11924、同WO96/00080、同WO96/23794、同WO98/07713、同WO98/41562、同WO98/48837、同WO99/30727、同WO99/32134、同WO99/33483、同WO99/53951、同WO01/26692、同WO95/13312、同WO96/21469、同WO97/03106、同WO99/45964、および米国特許第4,179,337号、同第5,075,046号、同第5,089,261号、同第5,100,992号、同第5,134,192号、同第5,166,309号、同第5,171,264号、同第5,213,891号、同第5,219,564号、同第5,275,838号、同第5,281,698号、同第5,298,643号、同第5,312,808号、同第5,321,095号、同第5,324,844号、同第5,349,001号、同第5,352,756号、同第5,405,877号、同第5,455,027号、同第5,446,090号、同第5,470,829号、同第5,478,805号、同第5,567,422号、同第5,605,976号、同第5,612,460号、同第5,614,549号、同第5,618,528号、同第5,672,662号、同第5,637,749号、同第5,643,575号、同第5,650,388号、同第5,681,567号、同第5,686,110号、同第5,730,990号、同第5,739,208号、同第5,756,593号、同第5,808,096号、同第5,824,778号、同第5,824,784号、同第5,840,900号、同第5,874,500号、同第5,880,131号、同第5,900,461号、同第5,902,588号、同第5,919,442号、同第5,919,455号、同第5,932,462号、同第5,965,119号、同第5,965,566号、同第5,985,263号、同第5,990,237号、同第6,011,042号、同第6,013,283号、同第6,077,939号、同第6,113,906号、同第6,127,355号、同第6,177,087号、同第6,180,095号、同第6,194,580号、同第6,214,966号を参照のこと)。好適なポリマーに関するさらなる情報が下記により提供される:Turnbull,W.B.他(Calbiochem(2000)、「大きいオリゴ糖型デンドリマーの合成について」、1:70〜74)、vanDuijvenbode,R.C.他(Macromolecules(2000)、「カルボキシラート官能化ポリ(プロピレンイミン)デンドリマーの合成およびプロトン化挙動」、33:46〜52)、Marcaurelle,L.A.(「ムチン型糖タンパク質の合成における最近の進歩」、http://www.chem.unt.edu/acs/pdf/marcaur.pdf)、Domenek,S.(「ヒトゲノム・プロジェクト:社会および化学に対する挑戦」、http://www.orgc.tugraz.at/orgc/hoegroup/chem_ges/domenek.PDF)、Imperiali,B.他(「糖ペプチド構造および糖タンパク質構造に対するN−結合型グリコシル化の効果」、CurrentOpinion in Chemical Biology、1999、3:643〜649)、Rudd,P.M.他(「グリコシル化および免疫系」、Science(2000)291:2370〜2376)、Vanden Steen,P.他(「O−結合型グリコシル化の概念および原理」、CriticalReviews in Biochemistryand Molecular Biology、33(3):151〜208(1998))、Knischka,R.他(「ポリグリセロールコアに基づく星型形状ポリマー:合成、特徴付けおよび架橋」、http://www−ics.u−strasbg.fr/〜equipe3/Poster4.pdf)、Rudd,P.M.他(「細胞性免疫認識に関与する細胞表面受容体のグリコシル化に対する役割」、J.Mol.Biol.(1999)293、351〜366)、およびDavis,B.G.(「糖結合体における最近の開発」、J.Chem.Soc.,PerkinTrans.I、1999(22)3215〜3237)。
本発明の水溶性ポリマーは、好ましくは、有効流体力学的分子量が10,000ダルトン(「Da」)よりも大きく、より好ましくは約20,000Da〜500,000Daであり、最も好ましくは約40,000Da〜300,000Daである。「有効流体力学的分子量」により、水系のサイズ排除クロマトグラフィ(SEC)によって測定されるようなポリマー鎖の有効水溶媒和サイズが意図される。水溶性ポリマーが、エチレンオキシドの繰り返しユニットを有するポリマー鎖を含む場合、それぞれの鎖が、約200Da〜約80,000Da(好ましくは約1,500Da〜約42,000Da、最も好ましくは約2,000Da〜約20,000Da)の、原子に基づく分子量を有することが好ましい。特に指定されない限り、分子量は、原子に基づく分子量を示すことが意図される。
そのような水溶性ポリマーは、生物安定性または生分解性であるポリマー鎖を含むことができる。例えば、反復した連結を有するポリマーは、結合の不安定性に依存して、生理学的条件下で様々な程度の安定性を有する。そのような結合を有するポリマーは、低分子量類似物の知られている加水分解速度に基づいて、生理学的条件下でのそれらの相対的加水分解速度によって、例えば、安定性がより小さいからより大きいまで分類することができる:ポリカーボネート(−O−C(O)−O−)>ポリエステル(−C(O)−O−)>ポリウレタン(−NH−C(O)−O−)>ポリオルトエステル(−O−C((OR)(R’))−O−)>ポリアミド(−C(O)−NH−)。同様に、水溶性ポリマーを標的分子に結合させている連結システムは生物安定性または生分解性であってもよく、例えば、安定性がより小さいからより大きいまでであり得る:カーボネート(−O−C(O)−O−)>エステル(−C(O)−O−)>ウレタン(−NH−C(O)−O−)>オルトエステル(−O−C((OR)(R’))−O−)>アミド(−C(O)−NH−)。これらの結合は例として示されており、本発明の水溶性ポリマーのポリマー鎖または連結システムにおいて用いることができる結合のタイプを限定することを意図していない。上記のように、本発明の合成タンパク質の生物活性は、それに結合する水溶性ポリマーの性質を変化させることによって改変することができる。
この目的のための好ましい水溶性ポリマーは下記の式を有する:
U−B−Polymer−J
式中、Uは、標的分子に結合し得る官能基の残基、または標的分子に結合する官能基の残基であり、Bは、3つ以上のアームを有する分岐コアであり、存在しても存在しなくてもよく、Polymerは、1000Da以上の分子量を有する実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり、Jは、負または中性または正から選択される正味の荷電を生理学的条件下で有するペンダント基である。そのようなポリマーには、米国特許出願第60/236,377号(これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)に記載されるポリマーが含まれる。
U−B−Polymer−J
式中、Uは、標的分子に結合し得る官能基の残基、または標的分子に結合する官能基の残基であり、Bは、3つ以上のアームを有する分岐コアであり、存在しても存在しなくてもよく、Polymerは、1000Da以上の分子量を有する実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり、Jは、負または中性または正から選択される正味の荷電を生理学的条件下で有するペンダント基である。そのようなポリマーには、米国特許出願第60/236,377号(これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)に記載されるポリマーが含まれる。
U、B、PolymerおよびJの各成分は、1つまたは複数のスペーサー部分またはリンカー部分によって水溶性ポリマーの他の基から分離されていてもよい。したがって、水溶性ポリマーU−B−Polymer−Jは下記の式によって表すことができる:
U−s1−B−s2−Polymer−s3−J
式中、s1、s2およびs3は、同じまたは異なっていてよいスペーサー部分またはリンカー部分であり、個々に存在していても存在していなくてもよい。好ましいスペーサー部分またはリンカー部分には、水溶性ポリマーにおいて用いられる1つまたは複数の繰り返しユニットを含む直鎖状または分枝状の部分、ジアミノおよび/または二酸のユニット、天然アミノ酸または非天然アミノ酸またはそれらの誘導体、ならびに18個までの炭素原子を好ましくは含有する、アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アルコキシなどを含む脂肪族成分が含まれ、あるいはさらなるポリマー鎖さえ含まれる。
U−s1−B−s2−Polymer−s3−J
式中、s1、s2およびs3は、同じまたは異なっていてよいスペーサー部分またはリンカー部分であり、個々に存在していても存在していなくてもよい。好ましいスペーサー部分またはリンカー部分には、水溶性ポリマーにおいて用いられる1つまたは複数の繰り返しユニットを含む直鎖状または分枝状の部分、ジアミノおよび/または二酸のユニット、天然アミノ酸または非天然アミノ酸またはそれらの誘導体、ならびに18個までの炭素原子を好ましくは含有する、アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アルコキシなどを含む脂肪族成分が含まれ、あるいはさらなるポリマー鎖さえ含まれる。
上記に記されるように、成分Uは、標的分子(ペプチドまたはポリペプチドなど)に結合し得る官能基の残基、または標的分子(ペプチドまたはポリペプチドなど)に結合する官能基の残基である。Uが標的分子に対する結合のための官能基の残基である場合、Uは求核基または求電子基を含み、標的分子は相互に反応し得る求電子基または求核基をそれぞれ含む。
上記のポリマーは、水溶性ポリマーで修飾され、且つタンパク質−Wの式を含むタンパク質を製造するために使用することができる:この場合、Wは式−s0−U−s1−B−s2−Polymer−s3−Jの水溶性ポリマー基であり、式中、Uは、タンパク質において直接的に結合する官能基の残基、またはs0を介してタンパク質に結合されている官能基の残基であり、Bは、3つ以上のアームを有する分岐コアであり、存在していても存在していなくてもよく、Polymerは、1000Da以上の分子量を有する実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり、Jは、負、中性または正から選択される正味の荷電を生理学的条件下で有するペンダント基であり、そしてs0、s1、s2およびs3は、同じまたは異なっていてよいスペーサー部分またはリンカー部分であり、個々に存在していても存在していなくてもよい。
多くのそのような相互反応性の官能基が知られており、ペプチドおよびポリペプチドに共通する側鎖官能基に、または誘導体化された側鎖官能基に結合させることができる(Zalipsky他、BioconjugateChemistry(1995)6:150〜165;“Perspectives in BioconjugateChemistry”、C.F.Meares編、ACS、1993;“Chemistry of Protein Conjugation and Cross−Linking”、S.S.Wong編、CRC Press,Inc.(1993))。官能基の例には、アミノ基と反応し得る基が含まれ、例えば、(a)p−ニトロフェニルまたはスクシンイミジルなどのカルボナート;(b)カルボニルイミダゾール;(c)アズラクトン;(d)環状イミドチオン;および(e)イソシアナートまたはイソチオシアナートなどが挙げられる。カルボン酸基および反応性カルボニル基と反応し得る官能基の例には、(a)一級アミン;または(b)ヒドラジンおよびヒドラジドの官能基(アシルヒドラジド、カルバザート、セミカルバマート、チオカルバザート、アミノオキシなど)が含まれる。メルカプト基またはスルフヒドリル基と反応し得る官能基の例には、フェニルグリオキサール類、マレイミドおよびハロゲンが含まれる。ヒドロキシル基(例えば、(カルボン)酸など)と反応し得る官能基、または求電子中心と反応し得る他の求核種の例には、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、活性メチレンなどが含まれる。
例えば、標的分子に対する結合のための官能基としての成分Uを有する水溶性ポリマーを調製することができる。この場合、上記の官能基は、アクリラート、アルデヒド、ケトン、アミノオキシ、アミン、カルボン酸、エステル、チオエステル、ハロゲン、チオール、シアノアセタート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エポキシド、ヒドラジド、アジド、イソシアナート、マレイミド、メタクリラート、ニトロフェニルカルボナート、オルトピリジルジスルフィド、シラン、スルフヒドリル、ビニルスルホン類、スクシンイミジルグルタラート、スクシンイミジルスクシナート、コハク酸、トレシラートなどである。Uはまた、活性化可能な形態で、例えば、アミンなどの求核種と反応し得るその活性エステルに変換され得るカルボン酸で提供され得る。
好ましい実施形態において、Uは、標的分子に1つしか存在しない官能基と選択的に反応し得る1つしか存在しない官能基の残基である。本発明のこの態様には、ペプチド合成(保護基法)および化学的連結(部分保護基法または無保護基法)の原理が包含される。保護基法の場合、Uと、標的分子に存在するその相互反応性の官能基とを除く、すべての潜在的に反応し得る官能基が好適な保護基でブロックされる。多くの保護基がこの目的のために知られており、好適である(例えば、“Protecting Groups in Organic Synthesis”(第3版)、T.W.GreeneおよびP.G.M.Wuts編、John Wiley&Sons,Inc.、1999;NovaBiochemカタログ2000;“Synthetic Peptides、A User’s Guide”、G.A.Grant編、W.H.Freeman&Company、NewYork、NY、1992;“AdvancedChemtech Handbook of Combinatorial&Solid Phase Organic Chemistry”、W.D.Bennet、J.W.Christensen、L.K.Hamaker、M.L.Peterson、M.R.Rhodes、およびH.H.Saneii編、AdvancedChemtech、1998;“Principlesof Peptide Synthesis(第2版)”、M.Bodanszky編、Springer−Verlag、1993;“The Practice of Peptide Synthesis(第2版)”、M.BodanszkyおよびA.Bodanszky編、Springer−Verlag、1994;および“Protecting Groups”、P.J.Kocienski編、Georg Thieme Verlag、Stuttgart(ドイツ)、1994を参照のこと)。
したがって、Uは、上記のような広範囲の官能基の残基を表すことができる。部分保護基法または無保護基法の場合、U、および標的分子に存在するその相互反応性の官能基には、他の官能基が反応系に存在してもよいが、反応性を有しない化学選択的な反応対が用いられる。これには、アミン捕獲法(例えば、ヘミアミナール形成による連結、イミン形成による連結およびマイケル付加による連結)、チオール捕獲法(例えば、メルカプチド形成による連結、ジスルフィド交換による連結)、天然の化学的連結法(例えば、システインまたはチオールを含有する側鎖アミノ酸誘導体を伴うチオエステル交換による連結)、および直交(orthogonal)連結カップリング法(例えば、チアゾリジン形成による連結、チオエステル交換による連結、チオエステル形成による連結、ジスルフィド交換による連結、およびアミド形成による連結)が容易であるU基が含まれる(例えば、Coltart,DM.、Tetrahedron(2000)56:3449〜3491を参照のこと)。
好ましいUは、天然の化学的連結(Dawson他、Science(1994)266:776〜779;Kent他、国際特許出願公開WO96/34878)、拡張された一般的な化学的連結(Kent他、国際特許出願公開WO98/28434)、オキシム形成の化学的連結(Rose他、J.Amer.Chem.Soc.(1994)116:30〜33)、チオエステル形成の連結(Schnolzer他、Science(1992)256:221〜225)、チオエーテル形成の連結(Englebretsen他、Tet.Letts.(1995)36(48):8871〜8874)、ヒドラゾン形成の連結(Gaertner他、Bioconj.Chem.(1994)5(4):333〜338)、ならびにチアゾリジン形成の連結およびオキサゾリジン形成の連結(Zhang他、Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16):9184〜9189;Tam他、国際特許出願公開WO95/00846)などの水性の適合し得る連結化学反応において用いられる1つしか存在しない官能基の残基を含むか、または他の方法(Yan,L.Z.およびDawson.P.E.、「脱イオウと組み合わせた天然の化学的連結によるシステイン残基を有しないペプチドおよびタンパク質の合成」、J.Am.Chem.Soc.2001、123、526〜533(これは参考として本明細書中に組み込まれる);Gieselnan他、Org.Lett.2001、3(9):1331〜1334;Saxon,E.他、「アミド結合の化学選択的合成に対する「無痕跡」スタウジンガー連結」、Org.Lett.2000、2、2141〜2143)によって用いられる1つしか存在しない官能基の残基を含む。
上記のような様々な結合化学反応を考えた場合、Uが標的分子に結合する官能基の残基であるとき、Uは、カルボナート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、アミン、オキシム、イミド、ウレア、チオウレア、チオエーテル、チオウレタン、チオエステル、エーテル、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキサゾリジンなどから選択される結合の残基を含み得ることが明らかである。好ましい結合はオキシム結合およびアミド結合である。
上記のように、Bは、3つ以上のアームを有する分岐コア成分であり、存在していても非存在していなくてももよい。Bが存在するとき、1つのアームがUに結合しているか、またはUに結合したスペーサーもしくはリンカーに結合しており、他のアームはそれぞれ、Polymerに結合しているか、またはPolymerに結合したスペーサーもしくはリンカーに結合している。分岐コアBの例には、アミノ、アミド、カルボン酸およびそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。これらには、リジンおよび/またはアルギニンのオリゴアミドまたはその組合せ、あるいはアルカンジアミンおよびアクリル酸から調製されるオリゴマー(「ポリアミドアミン」)が含まれ、後者は、分岐コアにおいて正味の正荷電をもたらす(例えば、Zeng他、J.Pept.Sci.(1996)2:66〜72;Rose他、BioconjugateChem.(1996)7(5):552〜556;NovoBiochemカタログおよびPeptide Synthesis Handbook、Laufelfingen、2001;Wells他、Biopolymers(1998)47:381〜396;Mahajan他、(1999)40:4909〜4912;Judson他、(1998)39:1299〜1302;Swali他、(1997)62:4902〜4903;米国特許第5,932,462号、同第5,919,455号、同第5,643,575号、同第5,681,567号を参照のこと)。多くの他の種々の分岐コアをこの目的のために使用することができ、そして好適であり、これには、置換されたジアミン、置換された二酸、グリセロールなどのアルキル酸、そして多価のアルキル成分、アリール成分、ヘテロアルキル成分、ヘテロアリール成分およびアルコキシ成分などを含む3つ以上の官能基または活性化可能な基を有する他の成分、そしてオリゴ糖が含まれる(例えば、Nierengarten他、TetrahedronLett.(1999)40:5681〜5684;Matthews他、Prog.Polym.Sci.(1998)1〜56;Suner他、Macromolecules(2000)33:253;Fischer他、Angew.Chem.Int.Ed.(1999)38:884;Sunder他、Adv.Mater.(2000)12:235;Mulders他、TetrahedronLett.(1997)38:631〜634;Mulders他、Tetrahedron Lett.(1997)38:30〜3088;およびTurnbull他、Chembiochem(2000)1(1):70〜74)。
好ましい分岐コアは、アミノ、カルボキシル基、ならびに混合アミノおよび混合カルボキシル基である。さらにまた、好ましい分枝状ポリマー構築物は、分岐が1つの分岐コア(例えば、オリゴアミドコアまたはポリアミドアミンコア)から生じているポリマー構築物である。しかし、他のクラスの分枝状構築物を用いることができ、例えば、ポリマー骨格に沿って分布する一連の多数の分岐コアから分岐が生じているイモムシ様構造体を用いることができる(Schluter他、Chem.Int.Ed.(2000)39:864)。化学的組成および/またはポリマー骨格および繰り返しユニットの嵩高さに依存して、得られるイモムシ様構造体は、水溶性であるように、または液晶組織を誘導しやすいように設計することができ(Ouali他、Macromolecules(2000)33:6185)、これは、配送用途、安定性および作用継続期間のためには好都合であり得る。本発明の他の分枝状ポリマー構築物の場合と同様に、このイモムシ様構築物は、Uを含むペンダント官能基を含有するように生成される。
式U−B−Polymer−Jの水溶性ポリマーの成分であるPolymerには、上記のような水溶性ポリマーが含まれる。好ましいPolymer成分は下記から選択される:(a)ポリアルキレンオキシド(ポリエチレンオキシド)およびその誘導体を含むポリマー(それらのホモポリマーおよびコポリマーを含む)、例えば、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、およびそれらの誘導体など、この場合、そのようなホモポリマーおよびコポリマーは非置換であるか、または1つの端部においてアルキル基で置換される;(b)ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル;(c)ポリビニルピロリドン;(d)ポリオキシエチル化ポリオール(プルロニックポリオールを含む);(e)ポリエステル、例えば、ポリ(グリコール酸)、ポリ(L−乳酸)、ポリ(D−乳酸)、ポリ(DL−乳酸)、ラクチド/グリコリドコポリマー、ポリ(p−ジオキサノン)およびコポリマー、ポリカプロラクトン、PEG−ポリエステルコポリマー、ポリ(リン酸エステル);(f)ポリ(オルトエステル);(g)ポリ無水物;(h)プソイド−ポリ(アミノ酸);および(i)ポリグリセロール;その他。これらの中で、好ましいPolymerはポリアルキレンオキシドを含み、特に、式(−CH2−CH2−O−)nまたは式(O−CH2−CH2−)n(式中、nは2以上である)のポリエチレンオキシドおよびその誘導体(それらのホモポリマーおよびコポリマーを含む)を含む(例えば、“Poly(ethylene glycol)Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications”、J.M.Harris編、Plenum Press、New York、NY(1992);および“Poly(ethylene glycol) Chemistryand Biological Applications”、J.M.HarrisおよびS.Zalipsky編、ACS(1997)を参照のこと)。
より好ましいPolymer成分は、水溶性ポリマーであるU−B−Polymer−Jの全てが段階的な合成で製造される場合である。このことは、これらのポリマーが正確な分子量および規定された構造を有することを意味する。対照的に、重合プロセスである通常のポリマー合成は、鎖が種々の長さを有する混合物をもたらし、したがって、分離することが不可能ではないが困難である様々な分子量およびサイズの分布が存在する。分子的純度の制御が可能であることは、水溶性ポリマーが結合している単分散の合成タンパク質が構築され得るという点で好都合である。このことは、不均一な化合物から生じる性質が変動するのを避けることができ、そして最も好ましい性質を有するそのような化合物のみを比較的容易に調製および単離することができるという点で重要な利点を表している。
最も好ましいPolymer成分は、国際特許出願公開WO00/12587に記載されるような式−[C(O)−X−C(O)−NH−Y−NH]n−または式−[NH−Y−NH−C(O)−X−C(O)]n−(式中、nは1〜100(より好ましくは2〜100)の正の整数であり、XおよびYは、例えば、アミド結合により連結される精密な構造の生体適合性の繰り返しエレメントである)のポリアミドを含む。XおよびYは二価の基などであり得る。XおよびYは同じまたは異なっていてもよく、分枝状または直鎖状であってもよい。非常に好ましい例においては、XおよびYの少なくとも1つが水溶性ポリマーの繰り返しユニットを含む。
X、Yに対する好ましい水溶性の繰り返しユニットは、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレンオキシド、およびそれらの誘導体(それらのホモポリマーおよびコポリマーを含む)を含む。この場合、そのようなホモポリマーおよびコポリマーは非置換または置換で、直鎖状または分枝状であり得るし、そしてアルキル基、アリール基、アリールアルキル基などを含む隣接基、例えば、ポリオキシエチル化ポリオール(プルロニックポリオールを含む)、およびC1〜C18の脂肪族隣接基を含むことができる。小さい変化には、式−[C(O)−X−NHC(O)−Y−NH]n−または式−[NH−Y−C(O)NH−X−C(O)]nのポリアミドが含まれることが理解される。X’およびY’は、XおよびYの下位実施形態であって、この場合、X=X’−NHまたはNH−X’で、Y=Y’−NHまたはNH−Y’である。X’、Y’に対するより好ましい水溶性の繰り返しユニットは式(−CH2−CH2−O−)nまたは式(O−CH2−CH2−)n(式中、nは2〜50、3〜25、3〜10で、より好ましくは3〜5である)のポリエチレンオキシドを含む。
上記のように、成分Jは、中性または正または負から選択される正味の荷電を生理学的条件下で有する任意の基であり得る。これには、置換または非置換のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、アシル基およびカルボニル基、そして同様にそれらの塩が含まれる。そのような基は、アミノ酸、核酸、脂肪酸、炭水化物およびそれらの誘導体の要素であり得るし、そしてキチン、キトサン、ヘパリン、硫酸ヘパラン、コンドロイチン、硫酸コンドロイチン、デルマタンおよび硫酸デルマタン、シクロデキストリン、デキストラン、ヒアルロン酸、リン脂質、シアル酸などである成分であり得る。Jは、好ましくは、カルボキシル、アミノ、チオール、ヒドロキシル、ホスホリル、グアニジニウム、イミダゾールおよびそれらの塩から選択されるイオン性の成分を含む。最も好ましいものは、Jがイオン性のカルボキシラート成分を含み、かつ生理学的条件下で正味の負荷電を有する場合である。
本発明によれば、ポリマーの不均一性、多様性および不適合性の問題に対する好ましい解決は、ポリペプチド(精密な長さ、便利な合成)およびグリコシル化模倣基(「糖模倣基」、プロテアーゼ感受性を有しない柔軟な両親媒性の非免疫原性ポリマー)の両方の利点を併せ持つ新しいクラスの生体適合性ポリマーを製造することを伴う(Rose,K.他、米国特許出願第09/379,297号;これは参考として本明細書中に組み込まれる)。
そのような好ましいPolymerの好ましい実施形態において、−[C(O)−X−NHC(O)−Y−NH]n−または−[NH−Y−C(O)NH−X−C(O)]n、XおよびYは、反応性の官能基を有しない二価有機基であるか、または非存在であり、そして同じまたは異なっていてもよく、そしてそれぞれの繰り返しユニット(n)について独立的に変化させることができる。好ましくは、n=2であるとき、XまたはYの少なくとも1つは、置換、非置換、分枝状および直鎖状の脂肪族基および芳香族基からなる群から選択される。より好ましくは、そのような二価有機基は、フェニル基、C1〜C10アルキレン部分、C1〜C10アルキル基、ヘテロ原子含有フェニル基、ヘテロ原子含有C1〜C10アルキレン部分、ヘテロ原子含有C1〜C10アルキル基、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
特に好ましい糖模倣部分は、下記の式:
−{CO−(CH2)2−CO−NH−(CH2)3−(OCH2CH2)3−CH2−NH}n−
(式中、nは、好ましくは1から100まで変化し、より好ましくは2から100まで変化する)
または
−{CO−(CH2)2−CO−NH−(CH2)6−NH−CO−(CH2)2−CO−NH−(CH2)3−(OCH2CH2)3−CH2−NH−}n−
(式中、nは、好ましくは1から50まで変化し、より好ましくは2から50まで変化する)
によって表すことができる。特に好ましい糖模倣基はn=12を有し、Xは−(CH2)2−であり、Yは、
−(CH2)3O(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3−
である。
−{CO−(CH2)2−CO−NH−(CH2)3−(OCH2CH2)3−CH2−NH}n−
(式中、nは、好ましくは1から100まで変化し、より好ましくは2から100まで変化する)
または
−{CO−(CH2)2−CO−NH−(CH2)6−NH−CO−(CH2)2−CO−NH−(CH2)3−(OCH2CH2)3−CH2−NH−}n−
(式中、nは、好ましくは1から50まで変化し、より好ましくは2から50まで変化する)
によって表すことができる。特に好ましい糖模倣基はn=12を有し、Xは−(CH2)2−であり、Yは、
−(CH2)3O(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3−
である。
本発明の糖模倣部分は様々な方法のいずれかによっても合成することができる。しかし、そのような成分は、好ましくは、重合プロセスより、むしろ、ユニットの固相での段階的な鎖組立て法を使用して生成される。そのような組立てプロセスの使用により、調製物の成分が、それらの長さ、それらのX置換基およびY置換基の性質、分岐点の位置(存在する場合)、ならびに任意の分岐の長さ、X置換基およびY置換基、そして位置に関して、規定され且つ均一な構造を得るることができる。好ましくは、そのような成分は、例えば、下記のステップによって合成される:
(a)式Z−Q−担体の化合物のアミノ基またはヒドロキシル基を、式HOOC−X−COOHを有する二酸の誘導体のモル過剰量でアシル化するステップ(こで、ZはH2N−またはHO−であり、Qはリンカーまたは標的分子であり、担体は固相、マトリックスまたは表面である);
(b)ステップ(a)の生成物の自由なカルボキシル基を活性化するステップ;
(c)ステップ(b)の生成物を、式NH2−Y−NH2を有するジアミンのモル過剰量でアミノリシスするステップ;および
(d)場合により、ステップ(a)〜ステップ(c)を、HOOC−X−COOHおよびNH2−Y−NH2を使用して繰り返すステップ(ここで、上記のXおよびYは二価有機基であるか、非存在であり、そして同じまたは異なり、そして上記の場合により繰り返されるユニットのそれぞれについて独立して変化させることができ、そして以前のアシル化ステップおよびアミノリシスステップのいずれにおいても使用されたX置換基およびY置換基と同じまたは異なる)。
(a)式Z−Q−担体の化合物のアミノ基またはヒドロキシル基を、式HOOC−X−COOHを有する二酸の誘導体のモル過剰量でアシル化するステップ(こで、ZはH2N−またはHO−であり、Qはリンカーまたは標的分子であり、担体は固相、マトリックスまたは表面である);
(b)ステップ(a)の生成物の自由なカルボキシル基を活性化するステップ;
(c)ステップ(b)の生成物を、式NH2−Y−NH2を有するジアミンのモル過剰量でアミノリシスするステップ;および
(d)場合により、ステップ(a)〜ステップ(c)を、HOOC−X−COOHおよびNH2−Y−NH2を使用して繰り返すステップ(ここで、上記のXおよびYは二価有機基であるか、非存在であり、そして同じまたは異なり、そして上記の場合により繰り返されるユニットのそれぞれについて独立して変化させることができ、そして以前のアシル化ステップおよびアミノリシスステップのいずれにおいても使用されたX置換基およびY置換基と同じまたは異なる)。
好ましい実施形態において、上記繰り返しユニットの6量体、12量体、18量体および32量体が用いられる。所望する場合には、繰り返しユニットは、例えば、分枝状の糖模倣構造を形成させるために、リジンのアミノ基との組合せで使用することができる。糖模倣基は、チオエーテル連結形成、オキシム連結形成およびアミド連結形成を含む様々な化学反応によって本発明の合成タンパク質に結合させることができる。
1つの実施形態において、ユニットの固相での段階的な鎖組立ては下記のステップを含む:
ステップ1:保護または非保護の二酸を樹脂上のアミノにカップリングして、連結部位においてアミド結合を生じさせること(この場合、PGは、用いられる二酸に依存して存在または非存在である保護基である):
PG−OOC−X−COOH + NH2−Y−NH−樹脂
ステップ2:存在する場合には、樹脂上の保護基(PG)を除去すること:
HOOC−X−CO−NH−Y−NH−樹脂
ステップ3:保護または非保護のジアミノを樹脂上のカルボキシにカップリングして、連結部位においてアミド結合を生じさせること(ここで、PGは、用いられるジアミノに依存して存在または非存在である):
PG−NH−Y−NH + HOOC−X−CO−NH−Y−NH−樹脂
ステップ4:存在する場合には、樹脂上の保護基(PG)を除去すること:
−NH−Y−NH−OC−X−CO−NH−Y−NH−樹脂
ステップ5:ステップ1〜ステップ4を「n」回繰り返して、「n」個のユニットを付加し、その後、樹脂から切断すること:
−[CO−X−CO−NH−Y−NH]−[CO−X−CO−NH−Y−NH]−[CO−X−CO−NH−Y−NH]−[CO−X−CO−NH−Y−NH]−
ステップ1:保護または非保護の二酸を樹脂上のアミノにカップリングして、連結部位においてアミド結合を生じさせること(この場合、PGは、用いられる二酸に依存して存在または非存在である保護基である):
PG−OOC−X−COOH + NH2−Y−NH−樹脂
ステップ2:存在する場合には、樹脂上の保護基(PG)を除去すること:
HOOC−X−CO−NH−Y−NH−樹脂
ステップ3:保護または非保護のジアミノを樹脂上のカルボキシにカップリングして、連結部位においてアミド結合を生じさせること(ここで、PGは、用いられるジアミノに依存して存在または非存在である):
PG−NH−Y−NH + HOOC−X−CO−NH−Y−NH−樹脂
ステップ4:存在する場合には、樹脂上の保護基(PG)を除去すること:
−NH−Y−NH−OC−X−CO−NH−Y−NH−樹脂
ステップ5:ステップ1〜ステップ4を「n」回繰り返して、「n」個のユニットを付加し、その後、樹脂から切断すること:
−[CO−X−CO−NH−Y−NH]−[CO−X−CO−NH−Y−NH]−[CO−X−CO−NH−Y−NH]−[CO−X−CO−NH−Y−NH]−
3.本発明の水溶性ポリマーの合成
本発明の水溶性ポリマーは様々な方法のいずれによっても合成することができる。図1A〜図1Eは、水溶性ポリマー(本明細書中に定義されるようなU−B−Polymer−J*)を、連結前または連結後またはその組合せで、部分的または完全に保護されていないペプチドセグメント
に結合することを含む連結スキームを示す。図1A〜図1Dにおいて、Yaaは、Yaaとの化学選択的な化学的連結が可能な1つしか存在せず且つ相互反応性のN末端アミノ酸Xaa(例えば、アミノ末端システイン)成分を有する第2のペプチドセグメントに対する化学的連結のための1つしか存在しない化学選択的な成分を有する第1のペプチドセグメントにおけるC末端アミノ酸(例えば、α−カルボキシルチオエステルを有するアミノ酸)を表す。YaaとXaaとの間での化学選択的な反応により、共有結合による連結(例えば、アミド結合)がそれらの間に生じる。したがって、YaaおよびXaaは化学選択的な連結対形成を形成する。これらの図に示されるように、Un−は、第2の1つしか存在しない化学選択的な成分を表し、この化学選択的な成分は、アミノ酸の側鎖において使用者によって規定される正確な部位において取り込まれており、そして水溶性ポリマーU−B−Polymer−J*の基U−に対して化学選択的であり、基U−と相互に反応し得る。例えば、Unが、ケトン基を有するように修飾されている側鎖であるとき、水溶性ポリマーU−Polymer−J*のU−は、ケトンと反応するための化学選択的な基であり、例えば、オキシム結合をそれらの間に生じさせるアミノオキシ基である。Un−の添え字「n」は、化学選択的な基Uを有するように設計されたアミノ酸およびその側鎖の数を表し、例えば、使用者によって規定される2つの特異的な部位がポリマー修飾される場合、n=2であり、これはまた、U2またはUn=2として表すことができる。すべての場合において、nは、意図的に精密に制御される正の整数である。したがって、UnおよびUは、XaaおよびYaaの化学選択的な基との適合性および非反応性を有する第2の化学選択的な連結対形成を表す。図1Aおよび図1Bには、2つの異なる潜在的な反応が例示されている。第1の示された反応では、Un官能性を有するポリペプチド鎖が第2のポリペプチドに連結され、その後、ポリマー修飾されたポリペプチドを得るためにU−B−Polymer−J*成分と反応させられる。第2の示された反応では、Un官能性を有するポリペプチド鎖が、ポリマー修飾されたポリペプチドを得るためにU−B−Polymer−J*成分と反応させられ、その後、より大きいポリマー修飾されたポリペプチドを得るために第2のポリペプチドに連結される。これらの図は、図1Aでは、Xaa残基を有するポリペプチドがポリマー修飾を受けることになり、これに対して、図1Bでは、Yaa残基を有するポリペプチドがポリマー修飾を受けるという点で異なる。図1Cは、多数のポリペプチド鎖が、より大きいポリペプチドを形成させるためにそれらの連結前またはそれらの連結後のいずれかで本発明によって修飾され得ることを例示している。図1Dにおいて、PGおよびPG’は保護基を表しており、PG’は直交的に保護する基を示す。すなわち、PGおよびPG’は、異なる条件のもとで除去可能であり、したがって異なる水溶性ポリマーがUn基に対して同じ化学反応によって結合する場合、またはUn基が、ポリマーで修飾することが望まれない側鎖官能基(例えば、水溶性ポリマーのU基が一級アミノまたは側鎖チオールともっぱら反応するように設計されている場合、反応性の−NH2または−SHを有する側鎖)を表す場合には有用である。図1Dは、本発明の方法に従って連結されているポリペプチドの所望する側鎖を保護するために、保護基が用いられ得ることを示している。
本発明の水溶性ポリマーは様々な方法のいずれによっても合成することができる。図1A〜図1Eは、水溶性ポリマー(本明細書中に定義されるようなU−B−Polymer−J*)を、連結前または連結後またはその組合せで、部分的または完全に保護されていないペプチドセグメント
図1Eには、図1A〜図1Dに従った連結およびポリマー修飾において用いられるペプチドセグメントに存在していても存在していなくてもよい基の多様性が例示される。
図2A〜図2Cには、本発明の合成された生物活性なタンパク質を調製するためのプロセスのさらなる概略図が示される。具体的には、図2A〜図2Bには、水溶性ポリマーU−B−Polymer−J*を連結部位においてアミノ末端基Xaaの側鎖(例えば、システインの側鎖チオール)に結合させることを伴う連結スキームが示される。図2Cには、図2A〜図2Bに従った連結およびポリマー修飾において用いられるペプチドセグメントに存在していても存在していなくてもよい基の多様性が例示される。
図3A〜図3Bには、3つ以上の重複しないペプチドセグメントの化学的連結を伴う多セグメント連結を達成するためのプロセスのさらなる概略図が示される(すなわち、少なくとも1つのセグメントが、最終的な全長の連結生成物に対応する中央のセグメントである)。この様式で調製されるペプチドは、例えば、図1A〜図1E、図2A〜図2Cおよび図4A〜図4Cに示されるように、別の連結反応に関与するペプチドセグメントを調製するために使用することができる。一般に、多セグメント連結の場合、中央のセグメント(1つまたは複数)は、用いられる連結化学反応に依存するペプチドの環化またはコンカトテマー(concatomer)形成を避けるために、保護されたXaa基または保護されたYaa基のいずれかを有する。逐次的または連続的な連結のために、中央セグメントのXaa基は保護され(例えば、Cys(Acm))、一方、Yaa基は保護されない(例えば、Yaa−COSR、式中、−COSRはα−カルボキシルチオエステルである)。この場合、Yaa基は、保護されていないXaa基を有し、かつ自由なYaa基を有しない別のペプチドと自由に反応することができる。連結後、保護基は除かれ、Xaa基が次の連結反応のために再生される。このプロセスは必要に応じて続けることができ、それにより、伸長したペプチド鎖が生じる。Yaa基の保護は、4つ以上のセグメントから構成される最終的な連結生成物を製造することを伴う収束的な化学的連結には特に有用である。例えば、4つのセグメントを連結すること(すなわち、3回の連結反応)から得られるタンパク質標的の場合、タンパク質の一方の端部に対応する2つのセグメントと、タンパク質の他方の端部に対応する2つのセグメントとを、逐次的とは対照的に、同時に連結させることができ、そしてこの2つの端部を最後の連結反応において結合させることができる。そのような収束的化学的連結スキームが、米国特許出願第60/231,339号(これは参考として組み込まれる)において、チオエステル媒介による化学的連結反応(例えば、天然の化学的連結および拡張された天然の化学的連結)のために記載されている。ここで再度ではあるが、そのようなペプチドセグメントに存在していても存在していなくてもよい基の多様性が図1E、図2Cおよび図4Cに例示される。
図4A〜図4Cには、生じる側鎖チオールの天然の化学的連結および化学的修飾が、本発明の原理に従っていかに達成され得るかが例示される。具体的には、図4A〜図4Bには、チオアルキル化、そしてチオエーテル結合を含む化学修飾された(Ψで示される)側鎖の生成を介して(ΨXaaで示される)「プソイドアミノ酸」を形成させるために、連結部位(1つまたは複数)における生じたシステイン側鎖チオールの天然の化学的連結および化学的修飾を使用することが示される。示されていない別の実施形態において、側鎖チオールは脱イオウ反応でアラニンに変換することができる(Liang他、J.Amer.Chem.Soc.(2001)123(4):526〜533)。両反応の重要な面は、カルボキシ末端Yaa基を有するセグメントが保護されたアミノ末端Xaa基を含む場合(すなわち、例として、図4Bにおいて示されるPG−Xaa−ペプチド)、変換または修飾することが望まれないどちらかの側鎖チオールが好適な保護基(PG)で保護されるか、または多セグメント連結および直交的な保護基(PG’)で保護されるということである。図4Cには、図4A〜図4Bならびに図1A〜図1E、図2A〜図2Cおよび図3A〜図3Bに従った連結およびポリマー修飾に用いられるペプチドセグメントの中に存在していても存在していなくてもよい基の多様性が例示される。
図5A〜図5Bには、本発明の水溶性ポリマーU−B−Polymer−J*の分岐コア(B)および1つしか存在しない化学選択的な官能基(U)を生成するための固相プロセスが示される。示されるような固相法が好ましいが、このプロセスは溶液中で行うことができる。具体的には、図5Aは、反応性基
を有する直交的に保護されたU−B前駆体成分を示しており、そのような構築の基本的な幾何構造が、結合で連結されたドット:
によって示されている;この基本的な幾何構造は、用いられる化学的連結または基のタイプに限定することを意図するのではなく、構造を組み立てるための幾何学的な相対的な点および本発明のU−B成分を生成するための好適な化学的処理点を単に例示しているにすぎない。直交的に保護されたU−B前駆体は、U−B前駆体に対する共有結合による連結が可能である活性化の後、好適な切断可能なリンカー基および共反応性基
を含むポリマー担体/樹脂にカップリングされる:
このシステムでは、ポリマー担持による有機化学の原理が用いられる。カップリング後、分岐コアが、所望するPolymer成分(実質的に非抗原性の水溶性直鎖状ポリマーなど)のその後の結合のための好適な分岐コアを生成するために、例示されるように処理される(第1の分岐点のみが示されているが、さらなる分岐点は存在していても存在していなくてもよい)。U基もまた示されているが、これは、直交的に保護されたU−B前駆体の一部として合成の最初で提供され得るか、または分岐コアBを処理中もしくはその処理後において処理することができる。Polymer成分の結合を、樹脂上で、すなわち、切断に先立って達成することができるが、好ましい経路は、Polymer成分のその後の結合のために精製することができるU−Bコアが生じるようにU−B成分をポリマー担体/樹脂から切断することである。例示されているように、コア基Bのペンダント状の分岐点は、官能基(Func)を含むように組み立てられる。この官能基(Func)は同じまたは異なっていてもよく、そして可逆的に保護され得るか(PG、PG’またはPG”)、または非保護であり得る。それぞれの場合において、Polymer成分を結合するための最終的な段階は、ペンダント状の分岐点における官能基(Func)の生成、および基Uの生成を伴う(図7を参照のこと)。図5Bには、保護されたU−B前駆体が、切断時に所望する保護されたU基または非保護のU基をもたらすリンカーを有するポリマー担体と組み合わせて用いられる別のプロセスが示される。図5Bにはまた、事前に組み立てられた分岐コアBをポリマー担体に結合すること、およびPolymer成分のその後の結合のためにU−B成分を生成するためのU基生成樹脂の使用が示される。
図6A〜図6Dには、U−Bコアへのその後の結合のための本発明の好ましい実質的に非抗原性の水溶性ポリアミドPolymer−J*成分を生成するための固相プロセスが示される。好ましいプロセスである固相プロセスが例示されているが、液相プロセスを適合させて、同じ最終結果を達成することができる。図6Aおよび図6Bでは、二酸ユニットおよびジアミノユニットが、固相有機化学の原理を使用してカップリングされる。場合により、保護されたアミノ−X’−酸ユニットおよび/またはアミノ−Y’−酸ユニットを、式−[NH−Y−NHCO−X−CO]−のポリアミド構造を有する最終的な切断生成物における基Xおよび基Yのさらなる多様性のために取り込むことができる。図6Aは合成をN末端からC末端の方向で示しているが、図6Bは合成をC末端からN末端の方向で示している。図6Cおよび図6Dでは、保護されたアミノ−X’−酸ユニットおよび/またはアミノ−Y’−酸ユニットが、固相有機化学の原理を使用してカップリングされる。図6Cは合成をN末端からC末端の方向で示しているが、図6Dは合成をC末端からN末端の方向で示している。図6A〜図6Dから明らかであるように、最終的なポリアミド生成物の性質を精密に制御することができ、その性質は、合成のために行われるサイクル数に依存している。さらに、ペンダント基J*は、使用者によって規定される事実上すべての仕様に合わせて組み立てることができる。単分散の繰り返しユニットX、Y、X’およびY’が用いられる場合、最終的なポリアミド生成物の正確な分子構造を精密に制御することができる。
式U−B−Polymer−J*の本発明の好ましい合成ポリマー構築物を生成するためにU−B成分をPolymer−J*成分にカップリングするための好ましいプロセスが図7に示される。例示されているように、様々な保護基が提供され得るが、それらは、所与構築物の意図された最終的な使用に依存して必要に応じて使用される。また、所望するU−B−Polymer−J*構築物を製造するための種々の経路が例示されているが、これには、固相法および液相法が含まれる。
図8には、本発明の生物活性な合成タンパク質の連結および製造のために用いることができるペプチドセグメントに水溶性ポリマーを精密に結合させるための別の経路が示される。最初の段階では、ポリマー結合のために標的化されたアミノ酸側鎖が直交的な保護基で保護されている固相ペプチド合成(「SPPS」)(例えば、FmocSPPSまたはBoc SPPS)が用いられる(例えば、Fmoc SPPSを使用する場合には、Boc基を、ポリマー結合部位を保護するために使用することができ、またはBoc SPPSを使用する場合には、Fmoc基を直交的な保護基として用いることができる)。ペプチド合成の後、ペプチドのそれ以外の部分が保護されたまま、直交的な保護基が選択的に除かれる。これにより、単一の結合部位が次の段階(すなわち、固相ポリマー合成)のために得られる。直交的な保護基が除かれると、ポリマー鎖が前駆体として結合させられる。より好ましくは、ポリマー鎖は、図6A〜図6Dに示されるいずれかのプロセスを使用するポリマー合成を連続して繰り返すことによって組み立てられる。1つのポリマー結合部位が示されているが、2つ以上が提供され得る。
4.前駆体ケモカイン
第3の要素は、結合するケモカイン受容体のダウンモジュレーションを特徴とする最適なinvitro生物活性を有するポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインの生成に関する。これには、(効力が、関連するin vitro細胞系アッセイにおけるEC50によって見積もられる場合)、ポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインの所望する効力の範囲よりも約1倍〜約5倍以上大きく、好ましくは約5倍〜10倍以上大きい効力を有する前駆体ケモカイン(すなわち、それに対する水溶性ポリマーの結合のために選ばれる標的ケモカイン)を選択することが含まれる。
第3の要素は、結合するケモカイン受容体のダウンモジュレーションを特徴とする最適なinvitro生物活性を有するポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインの生成に関する。これには、(効力が、関連するin vitro細胞系アッセイにおけるEC50によって見積もられる場合)、ポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインの所望する効力の範囲よりも約1倍〜約5倍以上大きく、好ましくは約5倍〜10倍以上大きい効力を有する前駆体ケモカイン(すなわち、それに対する水溶性ポリマーの結合のために選ばれる標的ケモカイン)を選択することが含まれる。
例として、ウイルス感染の阻害に対して所望するED50を有するポリマー修飾されたRantes類似物を含む合成ケモカインを同定する際、非ポリマーで修飾された前駆体類似物のパネルが合成され、HIV感染について細胞融合アッセイにおいてスクリーニングされた。ポリマー修飾された形態の標的抗融合効力は、約20nM以上である野生型Rantesと比較して、10nM以下の範囲に設定された。所望する前駆体Rantesケモカインを生成する際には、一連の修飾が、(1)N末端残基、(2)N末端領域までの内部、そして(3)C末端領域に対して行われた。特に強力な前駆体類似物が見出され、これは、野生型Rantesの1位に対応するセリンがn−ノナノイル部分で置換され、野生型Rantesの3位に対応するチロシンがL−シクロヘキシルグリシンで置換され、そして脂肪酸成分が、ジペプチド(Lys69−Leu70)リンカー部分を介してC末端残基に結合していた。さらにより強力な類似物が見出され、これは、これらの変化を、野生型Rantesの2位に対応するプロリンをL−チオプロリンで置換することとの組合せを含んでいた。これらの変化の1つまたは複数を含有するそのようなRantes類似物のC末端部位において直鎖状または分枝状の水溶性ポリマーを結合させたときに、ポリマー修飾された形態の所望する標的抗融合効力が達成できることが見出された。すなわち、ウイルス感染の阻害に対するED50が10nM以下の範囲にある、Rantesの類似物を含む一連の合成ケモカインが得られた。具体的には、直鎖状水溶性ポリマー構築物および分枝状水溶性ポリマー構築物の両方を、野生型Rantesにおける知られている凝集部位(野生型Rantesの66位のグルタミン酸に対応する66位)に隣接するC末端部位(野生型Rantesの67位のメチオニンに対応する67位)に結合させた。水溶性ポリマーをそのような部位において付加することにより、望ましくない凝集が破壊されただけでなく、ポリマー修飾された形態は効力の範囲を10nM以下の標的範囲に有していた。この観測結果は、ポリマー修飾のために標的化された前駆体ケモカインが、(関連するinvitro細胞系アッセイにおけるEC50によって効力が見積もられる場合)、ポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインの所望する開始効力の範囲よりも約1倍〜約5倍以上大きく、好ましくは約5倍〜10倍以上大きい効力を好ましくは有するという発見と一致している。さらに、Rantesのポリマー修飾された類似物のそれぞれが、関連する動物モデル(例えば、ラットまたはマウス)において測定されたときに著しく改善された循環半減期を有することが見出された。前駆体ケモカインの効力を増大させる様々な変化を含むこの系統的な方法は他のケモカインに対して一般に適用可能である。したがって、そのような前駆体ケモカインの選択は、効力とinvivo血清循環半減期との好ましいバランスを示すポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインを得るために利用することができる。
C.本発明のケモカインの検出可能な標識
本発明の生物活性な合成ケモカインはまた、特定の選ばれた部位に導入された検出可能な標識(発蛍光団など)および他の置換基を含むことができ、これらは、ケモカインの作用、ウイルスの阻害などと関連した膜および細胞の生物学的事象のプローブに分子を変換し、同様に薬物動態学などをモニターするために分子を変換する。検出可能な標識は、好ましくは、本発明の生物活性な合成ケモカインのC末端領域に結合される。検出可能な標識はケモカインポリペプチド鎖の合成時またはケモカインポリペプチド鎖の合成後に取り込むことができる。一例として、検出可能な標識を、鎖組立てのときに連結前のペプチドセグメントに取り込むことができ、例えば、樹脂に結合しているペプチドにおける非保護の反応性基に発蛍光団を結合させ、その後、他の保護基を除去し、そして標識されたペプチドを樹脂から遊離させることは好都合であり得る。検出可能な標識を含むアミノ酸誘導体、およびそれらをペプチド配列またはポリペプチド配列に取り込むために使用された化学合成技術は十分に知られており、この目的のために使用することができる。この方法では、得られるケモカインポリペプチド鎖連結生成物は、予め選ばれた所定位置に1つまたは複数の検出可能な標識を含有するように設計することができる。あるいは、検出可能な標識は反応性の基に付加することができ、好ましくは、連結前のペプチドセグメントの所与アミノ酸に存在するか、または連結後のポリペプチド鎖にさえ存在する化学選択的な反応性の基(部位特異的な結合を可能にするケト基またはアルデヒド基など)に付加することができる。
本発明の生物活性な合成ケモカインはまた、特定の選ばれた部位に導入された検出可能な標識(発蛍光団など)および他の置換基を含むことができ、これらは、ケモカインの作用、ウイルスの阻害などと関連した膜および細胞の生物学的事象のプローブに分子を変換し、同様に薬物動態学などをモニターするために分子を変換する。検出可能な標識は、好ましくは、本発明の生物活性な合成ケモカインのC末端領域に結合される。検出可能な標識はケモカインポリペプチド鎖の合成時またはケモカインポリペプチド鎖の合成後に取り込むことができる。一例として、検出可能な標識を、鎖組立てのときに連結前のペプチドセグメントに取り込むことができ、例えば、樹脂に結合しているペプチドにおける非保護の反応性基に発蛍光団を結合させ、その後、他の保護基を除去し、そして標識されたペプチドを樹脂から遊離させることは好都合であり得る。検出可能な標識を含むアミノ酸誘導体、およびそれらをペプチド配列またはポリペプチド配列に取り込むために使用された化学合成技術は十分に知られており、この目的のために使用することができる。この方法では、得られるケモカインポリペプチド鎖連結生成物は、予め選ばれた所定位置に1つまたは複数の検出可能な標識を含有するように設計することができる。あるいは、検出可能な標識は反応性の基に付加することができ、好ましくは、連結前のペプチドセグメントの所与アミノ酸に存在するか、または連結後のポリペプチド鎖にさえ存在する化学選択的な反応性の基(部位特異的な結合を可能にするケト基またはアルデヒド基など)に付加することができる。
この目的のために好適な検出可能な標識には、光活性な基、ならびに発蛍光団および他の色素を含む発色団、またはビオチンなどのハプテンが含まれる。そのような標識は多くの種々の市販元から入手することができる(例えば、MolecularProbes(Oregon、米国)、Sigmaおよび支社(St.Louis、MO、米国)、などを参照のこと)。樹脂上で標識する場合、フルオレセイン、エオシン、オレゴングリーン、ローダミングリーン、ロードルグリーン、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、クマリンおよびNBD発蛍光団、ダブシル発色団およびビオチンはすべて、フッ化水素(HF)ならびにほとんどの他の酸に対して適度に安定であり、したがって固相合成を介して取り込むことに対して適している(Peled他、Biochemistry(1994)33:7211;Ben−Efraim他、Biochemistry(1994)33:6966)。クマリンを除いて、これらの発蛍光団は、Fmoc化学を使用して合成されたペプチドの脱保護のために使用される試薬に対してもまた安定である(Strahilevitz他、Biochemistry(1994)33:10951)。ε−ダブシル−L−リジンのt−Boc誘導体およびα−Fmoc誘導体もまた、ポリペプチド配列における選択された部分においてダブシル発色団を取り込むために使用することができる。ダブシル発色団は広い可視吸収を有しており、消光基として使用することができる。ダブシル基はまた、ダブシルスクシンイミジルエステルを使用することによってN末端において取り込むことができる(Maggiora他、J.Med.Chem.(1992)35:3727)。EDANSは、FRET実験におけるダブシル消光剤と対形成させるための一般的な発蛍光団である。この発蛍光団は、5−((2−(t−Boc)−γ−グルタミルアミノエチル)アミノ)ナフタレン−1−スルホン酸を使用することによって、自動化されたペプチド合成のときに都合よく導入される(Maggiora他、J.Med.Chem.(1992)35:3727)。α−(t−Boc)−ε−ダンシル−L−リジンは、化学合成時にダンシル発蛍光団をポリペプチドに取り込むために使用することができる(Gauthier他、Arch.Biochem.Biophys.(1993)306:304)。EDANSの場合と同様に、この発蛍光団の蛍光はダブシルの吸収と重なる。ペプチドの部位特異的なビオチン化を、ビオシチンのt−Boc保護誘導体(Geahlen他、Anal.Biochem.(1992)202:68)または他のよく知られているビオチン化誘導体(NHS−ビオチンなど)を使用して達成することができる。ラセミのベンゾフェノンフェニルアラニン類似物もまた、そのt−Boc保護またはFmoc保護の後においてペプチドに取り込むことができる(Jiang他、Int.J.PeptideProt.Res.(1995)45:106)。ジアステレオマーの分割を生成物のHPLC精製のときに達成することができる。非保護のベンゾフェノンもまた、この分野での標準的な技術によって分割することができる。オキシムカップリングのためにケトを有するアミノ酸、アザ/ヒドロキシトリプトファン、ビオチル−リじンおよびD−アミノ酸は、特に、樹脂上での標識のために利用することができるアミノ酸の例である。自動化されたペプチド合成のための他の保護されたアミノ酸は、この分野での標準的な技術に従ったカスタム合成によって調製することができる。別の実施形態において、本発明の生物活性な合成ケモカインは、それに結合した薬物を含むことができる(例えば、国際特許出願公開WO00/04926を参照のこと)。
D.本発明のケモカインの合成および水溶性ポリマーの結合
本発明の生物活性な合成ケモカインを製造する方法もまた提供される。この方法は、(i)天然に存在するケモカインの類似物で、天然に存在するケモカインに対して実質的に相同的であるアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含む類似物を合成すること、この場合、ポリペプチド鎖は、そのN末端、NループおよびC末端の1つまたは複数において、脂肪族鎖およびアミノ酸誘導体から選択された部分で修飾されている;そして(ii)対応する天然に存在するケモカインと比較して、ケモカイン類似物をアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることを伴う。
本発明の生物活性な合成ケモカインを製造する方法もまた提供される。この方法は、(i)天然に存在するケモカインの類似物で、天然に存在するケモカインに対して実質的に相同的であるアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含む類似物を合成すること、この場合、ポリペプチド鎖は、そのN末端、NループおよびC末端の1つまたは複数において、脂肪族鎖およびアミノ酸誘導体から選択された部分で修飾されている;そして(ii)対応する天然に存在するケモカインと比較して、ケモカイン類似物をアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることを伴う。
具体的には、本発明のN末端修飾された生物活性な合成ケモカインを製造するための方法は、(i)天然に存在するケモカインの類似物で、天然に存在するケモカインに対して実質的に相同的であるアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含む類似物を合成すること、この場合、ポリペプチド鎖は、そのN末端において脂肪族鎖および1つまたは複数のアミノ酸誘導体で修飾されている;そして(ii)対応する天然に存在するケモカインと比較して、ケモカイン類似物をアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることを含む。本発明のC末端修飾された生物活性な合成ケモカインを製造するための方法は、(i)天然に存在するケモカインの類似物で、天然に存在するケモカインに対して実質的に相同的であるアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含む類似物を合成すること、この場合、ポリペプチド鎖は、そのC末端において脂肪族鎖または多環で修飾されている;そして(ii)対応する天然に存在するケモカインと比較して、ケモカイン類似物をアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることを含む。本発明のN末端修飾/C末端修飾された生物活性な合成ケモカインを製造するための方法は、(i)天然に存在するケモカインの類似物で、天然に存在するケモカインに対して実質的に相同的であるアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含む類似物を合成すること、この場合、ポリペプチド鎖は、そのN末端において脂肪族鎖および1つまたは複数のアミノ酸誘導体で修飾され、かつそのC末端において脂肪族鎖または多環で修飾されている;そして(ii)対応する天然に存在するケモカインと比較して、ケモカイン類似物をアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることを含む。
本発明の生物活性な合成ケモカインの合成は、化学的合成(すなわち、リボソームを伴わない合成)によって、または生物学的合成(すなわち、リボソームによる合成)と化学的合成との組合せによって達成される。化学的合成の場合、本発明の生物活性な合成ケモカインは、Fmoc法およびtBoc法を使用する固相ペプチド合成または液相ペプチド合成などの段階的な鎖組立て技術またはフラグメント縮合技術によって全体を生成することができ、あるいは鎖組立てによるか、または鎖組立てと生物学的製造との組合せにより全体が生成されたペプチドセグメントの化学的連結によって全体を生成することができる。そのような段階的な鎖組立て技術またはフラグメント縮合技術および連結技術はこの分野では十分に知られている(例えば、Kent,S.B.H.、Ann.Rev.Biochem.(1988)57:957〜989;Dawson他、MethodsEnzymol.(1997)287:34〜45;Muir他、Methods Enzymol.(1997)289:266〜298;Wilken他、CurrentOpinion In Biotechnology(1998)9:412〜426;Ingenito他、J.Amer.Chem.Soc.(1999)121(49):11369〜11374;およびMuir他、Chemistry&Biology(1999)6:R247〜R256を参照のこと)。
化学的連結の場合、N末端官能基を有する第1のペプチドセグメントが、N末端官能基と反応して、それらにおいてその間で共有結合による結合を形成するC末端官能基を有する第2のペプチドセグメントに連結される。選択された官能基に依存して、連結反応により、天然のアミド結合または非天然の共有結合による結合を連結部位において有する生成物が得られる。化学的連結のために用いられる第1のペプチドセグメントまたは第2のペプチドセグメントは、典型的には、段階的な鎖組立てまたはフラグメント縮合を使用して生成される。具体的には、本発明の生物活性な合成ケモカインがペプチドセグメントの連結によって生成されるとき、セグメントは、連結のために使用されると意図された化学選択的な反応化学に関して適切なペンダント状の化学選択的な反応性基を含有するように生成される。これらの化学反応には、天然の化学的連結(Dawson他、Science(1994)266:776〜779;Kent他、国際特許出願公開WO96/34878)、拡張された一般的な化学的連結(Kent他、国際特許出願公開WO98/28434)、オキシム形成の化学的連結(Rose他、J.Amer.Chem.Soc.(1994)116:30〜33)、チオエステル形成の連結(Schnolzer他、Science(1992)256:221〜225)、チオエーテル形成の連結(Englebretsen他、Tet.Letts.(1995)36(48):8871〜8874)、ヒドラゾン形成の連結(Gaertner他、Bioconj.Chem.(1994)5(4):333〜338)、ならびにチアゾリジン形成の連結およびオキサゾリジン形成の連結(Zhang他、Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16):9184〜9189;Tam他、国際特許出願公開WO95/00846)が含まれるが、これらに限定されない。
特定の連結化学反応に対する反応条件は、連結成分の所望する相互作用を維持するように選択される。例えば、pHおよび温度、ペプチドおよび成分の水溶性、ペプチドの比率、個々のペプチドの水分含有量および組成を、連結を最適化するために変化させることができる。ペプチドを種々の程度に可溶化する試薬の添加または排除を、所望する連結反応の特異性および速度を制御するためにさらに使用することができる。反応条件は、1つまたは複数の内部コントロールおよび/または外部コントロールと比較して、所望する化学選択的な反応生成物についてアッセイすることによって容易に決定される。
化学的合成の好ましい方法では、天然の化学的連結が用いられ、これはKent他の国際特許出願公開WO96/34878に開示され、そしてN末端および/またはC末端が化学修飾されたタンパク質を調製する方法がOfford他の国際特許出願公開WO99/11666に開示されている(これらの開示は参考として本明細書中に組み込まれる)。一般に、C末端チオエステルを含有する第1のペプチドが、酸化されていないスルフヒドリル側鎖を有するN末端システインを有する第2のペプチドと反応させられる。N末端システインの酸化されていないスルフヒドリル側鎖は、触媒量のチオール(好ましくは、ベンジルメルカプタン、チオフェノール、2−ニトロチオフェノール、2−チオ安息香酸、2−チオピリジンなど)の存在下でC末端チオエステルと縮合する。中間体のペプチドが、β−アミノチオエステル結合を介して第1のペプチドおよび第2のペプチドを連結することによって生成されるが、これは転位して、アミド結合により連結された第1のペプチドおよび第2のペプチドを含むペプチド生成物が生成される。
化学的製造と生物学的製造との組合せの場合、1つのペプチドセグメントが化学的合成により生成され、一方、他方のペプチドセグメントが組換え法を使用して生成され、その後、これらのセグメントが、全長の生成物を生成するために、化学的連結を使用して結合させられる。例えば、インテイン(intein)発現システムを、「インテイン」タンパク質スプライシングエレメントの誘導可能な自己切断活性を利用して、C末端チオエステルペプチドセグメントを生成するために利用することができる。具体的には、インテインは、DTT、b−メルカプトエタノールまたはシステインなどのチオールの存在下で特異的な自己切断を受け、C末端チオエステルを有するペプチドセグメントをもたらす(例えば、Muir他、Chemistry&Biology(1999)6:R247〜R256;Chong他、Gene(1997)192:277〜281;Chong他、Nucl.AcidsRes.(1998)26:5109〜5115;Evans他、Protein Science(1998)7:2256〜2264;およびCotton他、Chemistry&Biology(1999)6(9):247〜256を参照のこと)。このC末端チオエステル含有ペプチドセグメントは、その後、N末端のチオエステル反応性官能基を有する第2のペプチド、例えば、天然の化学的連結のために用いられるようなN末端システインを有するペプチドセグメントなどを連結するために利用することができる。
疎水性の脂肪族鎖およびアミノ酸誘導体を、鎖組立てのときに、または鎖組立ての後に、またはその組合せで取り込むことができる。鎖組立てのときに取り込まれる場合、アミノ酸誘導体および/または脂肪族鎖が結合しているアミノ酸が、段階的もしくはフラグメントの縮合プロセス、および/または連結鎖組立てプロセスにおいて取り込まれる。これらのアミノ酸は、ペプチド合成時における成長中のペプチド鎖に、または連結のために標的化された組み立てられているペプチドセグメントに段階的な様式で付加させることができ、あるいはいくつかの場合には、ペンダント状のN末端修飾体またはC末端修飾体をポリマー担体からの切断によって得ることができ、それにより、切断生成物が所望する疎水性の脂肪族鎖をもたらす。鎖組立ての後の場合、反応性の官能基を有するアミノ酸またはその誘導体が、(保護された形態または非保護の形態で)鎖組立てのときに取り込まれ、これらは、その後、所望する疎水性成分を結合させるためにその非保護の形態で、すなわち、ペプチド合成後の結合反応において利用される。鎖組立ての後の結合は、変性させた直鎖状ペプチド鎖上で行うことができ、またはポリペプチド鎖を折り畳ませた後に行うことができる。好ましい実施形態において、アミノ酸誘導体が、ペプチド合成時に目的とするアミノ酸位置において付加され、これに対して、N末端、C末端および/またはN末端/C末端の疎水性の脂肪族鎖は、ペプチド合成の後に結合反応によって付加される。多数の結合化学反応はどれも、所望する共有結合による連結に依存して、連結化学反応と同様に利用することができる(例えば、Plaue,S.他、Biologicals.(1990)18(3):147〜57;Wade,J.D.他、AustralasBiotechnol.(1993)3(6):332〜6;Doscher,M.S.、Methods Enzymol.(1977)47:578〜617;Hancock,D.C.他、Mol Biotechnol.(1995)4(1):73〜86;Albericio,F.他、Methods Enzymol.(1997)289:313〜36を参照のこと)。本発明の生物活性な合成ケモカインの折り畳みはこの分野での標準的な技術に従って達成することができる(例えば、国際特許出願公開WO99/11655、同WO99/11666;Dawson他、MethodsEnzymol.(1997)287:34〜45を参照のこと)。
合成されたケモカイン化合物をアンタゴニスト活性についてスクリーニングする場合、化合物は、ケモカインリガンドがその対応する受容体に直接的または間接的に結合することを特徴とするinvitro型アッセイまたはin vivo型アッセイによって調べられる。ケモカイン受容体およびその対応する野生型ケモカインの例には、CXXXCR1(フラクタルカイン);XCR1(SCM−1);CXCR2(GRO、LIX、MIP−2);CXCR3(MIG、IP−10);CXCR4(SDF−1);CXCR5(BLC);CCR1(MIP−1α、RANTES、MCP−3);CCR2(MCP−1、MCP−3、MCP−5);CCR3(エオタキシン、RANTES、MIP−1α);CCR4(MDC、TARC);CCR5(RANTES、MIP−1α、MIP−1β);CCR6(MIP−3α);CCR7(SLC、MIP−3β);CCR8(TCA−8);およびCCR9(TECK)が含まれる。これらの系に対するinvitroアッセイおよびin vivoアッセイは十分に知られており、容易に利用することができ、または新たに創出することができる。例えば、米国第5,652,133号、同第5,834,419号、国際特許出願公開WO97/44054、同WO00/04926および同WO00/0492を参照のこと。例えば、1つまたは複数のケモカイン受容体を発現する天然の細胞株、形質転換細胞株および/または遺伝子導入細胞株が、典型的には、本発明の生物活性な合成ケモカインにさらされたときのケモカイン誘導による走化性の効果またはこの事象の阻害をモニターするために使用される。動物モデルもまた、例えば、本発明の生物活性な合成ケモカインを用いた処置と組み合わせて応答プロフィルをモニターするために、または化合物の薬物動態学的性質および薬効学的性質を特徴付けるために用いることができる。本発明の化合物をウイルス感染の阻害剤として特徴付けるために、標的細胞株およびエンベロープ細胞株を用いるエンベロープ媒介による細胞融合アッセイを、HIV感染を防止するその能力について本発明の生物活性な合成ケモカインをスクリーニングするために用いることができる。当然のことではあるが、無細胞ウイルス感染アッセイもまたこの目的のために用いることができる。
一例として、一般に走化性の拮抗作用を評価する場合、末梢血白血球を用いることができる。例えば、単球、Tリンパ球および好中球を精製するために確立されたプロトコルに従って正常なドナーから単離された末梢血白血球などを用いることができる。Cケモカイン、CCケモカイン、CXXXCケモカインおよびCXCケモカインの受容体を発現する試験細胞のパネルを構築することができ、そして本発明の個々の化合物の一連の希釈物にさらした後に評価することができる。天然のケモカインをコントロールとして使用することができる。例えば、様々なケモカイン受容体をコードする発現カセットでトランスフェクションされた細胞のパネルはこの目的のためには好適である。例えば、RANTES、SDF−1αまたはSDF−1βおよびMIPなどのケモカインのアンタゴニストを、CXCR4/融合/LESTR、CCR3、CCR5、CXC4を発現する形質転換体を使用してスクリーニングすることができる(そのような細胞は様々な市販元および/または学術的供給元から入手することができ、あるいは標準的なプロトコルに従って調製することができる;例えば、Risau他、Nature、387:671〜674(1997);Angiololo他、AnnalsNY Acad.Sci.(1996)795:158〜167;Friedlander他、Science(1995)870:1500〜1502を参照のこと)。その結果は、コントロール培地に対して、刺激によって誘導される細胞遊走の増大倍数を表す走化性指数(「CI」)として表すことができ、そして統計学的有意性を決定することができる。
受容体結合アッセイもまた、例えば、受容体再生利用効果に対する競合的阻害を評価するために行うことができる(Signoret,N.他、「HIV共受容体CCR5のエンドサイトーシスおよび再生利用」、JCell Biol.2000、151(6):1281〜94;Signoret,N.他、「ケモカイン受容体のエンドサイトーシスおよび再生利用の分析」、MethodsMol Biol.2000、138:197〜207;Pelchen−Matthews,A.他、「ケモカイン受容体の輸送およびウイルス複製」、ImmunolRev.1999(4月)、168:33〜49;Daugherty,B.L.他、「放射能標識されたケモカインの結合アッセイ」、MethodsMol Biol.2000、138:129〜34;Mack,M.他、「ケモカイン受容体のダウンモジュレーションおよび再生利用」、MethodsMol Biol.2000、138:191〜5を参照のこと;これらはすべて参考として本明細書中に組み込まれる)。この方法は十分に知られており、この方法では、典型的には、標識された本発明の生物活性な合成ケモカインが、濃度を増大させながら非標識の天然ケモカインの存在下、標準的なプロトコルに従って用いられる。当然のことではあるが、標識はいずれかのリガンドまたは両方のリガンドにおいて行うことができる。このタイプのアッセイでは、結合データを、例えば、LIGAND(P.Munson、Divisionof Computer Research and Technology、NIH、Bethesda、MD)などのコンピュータ・プログラムを用いて分析することができ、そして天然の白血球と比較するか、または標的のケモカイン受容体を発現する受容体トランスフェクション細胞のパネルと比較して、「一部位」モデルおよび「二部位」モデルの両方を用いてスキャッチャード・プロット分析に供することができる。その後、非標識のリガンドによる結合に対する競合速度を次の式によって計算することができる:阻害%=1−(非標識ケモカイン存在下での結合/培地単独の存在下での結合)x100。
ウイルス感染および疾患を防止または緩和するその能力について化合物をスクリーニングする場合、化合物は、様々なウイルス株およびコントロールにさらされた、適切な受容体のいずれかを安定的に発現する細胞のパネルに対してスクリーニングすることができる。例えば、CCR3受容体、CCR5受容体、CXC4受容体またはCXCR4受容体を発現するU87/CD4細胞を、M親和性HIV株、T親和性HIV株および二重親和性HIV株の感染をスクリーニングするために用いることができる。ウイルス感染の阻害は、ケモカインの濃度に対する感染とコントロール濃度に対する感染との割合として評価することができる(例えば、McKnight他、Virology(1994)201:8〜18;およびMosier他、Science(1993)260:689〜692;Simmons他、Science(1997)276:276〜279;Wu他、J.Exp.Med.(1997)185:168〜169;およびTrkola他、Nature(1996)384:184〜186を参照のこと)。カルシウム動態化アッセイは、例えば、好中球および好酸球に対して走化性である天然ケモカインのアンタゴニストを同定するために、受容体結合のアンタゴニストについてスクリーニングするための有用な別の例である(Jose他、J.Exp.Med.179:881〜887(1994))。もう1つの例として、本発明の化合物の血管形成活性を、ヒヨコの漿尿膜(CAM)アッセイによって評価することができる(Oikawa他、CancerLett.(1991)59:57〜66)。
本発明の生物活性な合成ケモカインには、多くの使用法があり、これには、研究用具、診断剤および治療剤としての使用が含まれる。具体的には、本発明の生物活性な合成ケモカインは有益な薬理学的性質を有することが見出されており、そして対応する野生型分子(すなわち、これらの分子は、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アテローム/アテローム性動脈硬化、臓器移植拒絶および慢性関節リウマチを含む様々な障害に関与している)に関連した炎症効果を効果的に阻止することが示されている。したがって、本発明の生物活性な合成ケモカインは、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アテローム/アテローム性動脈硬化、臓器移植拒絶および慢性関節リウマチを処置するために有用である。例えば、本発明の生物活性な合成ケモカインのいくつか、例えば、RANTESアンタゴニストおよびSDF−1αアンタゴニストまたはSDF−1βアンタゴニストなどもまた、HIV−1感染を阻害することが示されており、そしてアンタゴニスト(例えば、vMIP−II類似物)を同じ目的のために使用することができる。したがって、本発明のRANTESアンタゴニストまたはSDF−1αアンタゴニストまたはSDF−1βアンタゴニストおよびvMIP−II類似物を、哺乳動物においてHIV−1を阻害するために使用することができる。HIV−1に対して有用であるためにこれらの化合物の可能性が、下記の実施例に記載される方法によって明らかにされる。炎症作用に対して有用であるためにこれらの化合物の可能性が、当業者に十分に知られている方法によって明らかにされる。さらに、本発明の生物活性な合成ケモカインは単独で、または相互に組み合わせて、そして同様に所与の疾患を処置する際に相乗的である他の非ケモカイン薬物と組み合わせて利用できることが理解される。
限定としてではなく、例として、以下は、本発明の生物活性な合成ケモカインを生成することの一般的な有用性を例示するための、野生型ケモカイン分子およびその関連した生物学的性質の具体的な例のいくつかである。例えば、SCM−1は、脾臓で発現しているCケモカインである。SCM−1はCCケモカインおよびCXCケモカインに対して実質的に近縁であり、主要な違いは、これらのタンパク質において保存されている4つのシステインのうちの第2および第4のシステインを有するだけであるということである(Yoshida他、FEBSLetters(1995)360(2):155〜159;Yoshida他、J.Biol.Chem.(1998)273(26):16551〜16554)。ヒトには、2つの非常に相同的なSCM−1タンパク質(SCM−1αおよびSCM−1β)が存在しており、これらは、2つのアミノ酸置換によって異なる。SCM−1は、ネズミのリンパ球特異的ケモカインであるリンホタクチンと約60%同一であることが見出されている。したがって、SMC−1およびリンホタクチンは、Cケモカインまたはγ−ケモカインのヒト原型またはネズミ原型を表していると考えられる。両方のSCM−1分子は、様々なヒト組織の中で主に胎盤で、そして弱く脾臓および胸腺で発現しているオーファン受容体GPR5を発現するように操作されたネズミL1.2細胞において遊走を特異的に誘導する。したがって、SCM−1のアンタゴニストには、GPR4の正常な機能を阻止する際の使用が見出される。
別の例として、可溶性形態のフラクタルカイン(76アミノ酸のCXXXCケモカイン)は、好中球に対してではなく、T細胞および単球に対する強力な化学誘因剤である。フラクタルカインは、TNFまたはIL−1による刺激後に顕著に増大する。フラクタルカインに対するヒト受容体はCX3CR1と呼ばれている。この受容体はフラクタルカインの接着機能および遊走機能の両方を媒介する。ヒト受容体は、好中球、単球、Tリンパ球およびいくつかの充実器官(脳を含む)において発現している。この受容体は、HIV−1の一次単離体に由来するエンベロープタンパク質に対する共受容体としてCD4と一緒に機能することが示されている。細胞−細胞融合アッセイにより、フラクタルカインが融合を強力かつ特異的に阻害することが明らかにされている(例えば、Bazan他、Nature(1997)385(6617):640〜644;Combadiere他、J.Biol.Chem.(1998)273(37):23799〜23804;Rossi他、Genomics(1998)47(2):163〜170;およびFaure他、Science(2000)287:2274〜2277を参照のこと)。したがって、フラクタルカインのアンタゴニストには、TNF経路またはIL−1経路を伴う様々な関節性障害(関節炎など)の処置における使用が見出され得ること、同様にHIV感染の阻止剤としての使用が見出され得ることは明らかである。
エオタキシンはさらなる例である。このタンパク質は、長さが74化のアミノ酸であり、その特徴的なシステイン・パターンのためにCCケモカインとして分類されている。エオタキシンは、アレルギー性炎症のモデルとして使用されているモルモットの気管支肺胞洗浄検査で見出されており、喘息関連障害に関係している。エオタキシンは、好中球の蓄積に著しい影響を及ぼすことなく、皮膚において1pM〜2pMの用量で実質的な好酸球の蓄積を誘導する。エオタキシンは、invitroにおけるモルモット好酸球およびヒト好酸球の両方の強力な刺激因子である。この因子は、モルモット好酸球において、RANTESとの結合部位を有するようである。エオタキシンは、好中球または単球においてではく、正常なヒト好酸球におけるカルシウム流動応答を誘導する。この応答は、他のCCケモカインを用いた好酸球の前処理によって脱感作され得ない。好塩基球において、エオタキシンは、RANTESよりも大きいレベルの走化性応答を誘導するが、ヒスタミン放出またはロイコトリエンC4生成のいずれに対しても限界ぎりぎりの影響を有するだけである。エオタキシンはまた、B細胞リンパ腫細胞の走化性において役割を果たし得る。エオタキシンに対する主要な受容体はCCR3である(例えば、Bartels他、Biochem.Biophys.Res.Comm.(1996)225(3):1045〜51;Joes他、J.Exp.Med.(1994)179:881〜887;Ponath他、J.Clin.Investigation(1996)97(3):604〜612;Ponath他、J.Exp.Med.(1996)183(6):2437〜2448;Yamada他、Biochem.Biophys.Res.Comm.(1997)231(2):365〜368を参照のこと)。したがって、エオタキシンのアンタゴニストは、喘息および他の好酸球関連のアレルギー性障害の強力な調節因子として使用することができる。
RANTESは、そのアンタゴニストが特に注目される標的ケモカインの別の例である。RANTESは、炎症、臓器拒絶からHIV感染にまで及ぶ多くの障害に関与しているCCケモカインである。RANTESの合成はTNF−αおよびIL1−αによって誘導されるが、TGF−β、INF−γおよびIL−6によっては誘導されない。RANTESは、培養においてT細胞およびT細胞クローンを循環させることによって産生されるが、これまでに試験されたどのT細胞株によっても産生されない。RANTESの発現はTリンパ球の刺激後に阻害される。RANTESは、T細胞、ヒトの好酸球および好塩基球に対して走化性であり、白血球を炎症部位に動員する際において活発な役割を果たしている。RANTESはまた好酸球を活性化して、例えば、好酸球性のカチオン性タンパク質を放出させる。これは好酸球の密度を変化させ、好酸球を低密度にする。これは、全身性細胞活性化の状態を表していると考えられ、そしてほとんどの場合には喘息およびアレルギー性鼻炎などの疾患と関連している。RANTESはまた、酸化性代謝の強力な好酸球特異的活性化因子である。RANTESは、内皮細胞に対する単球の接着を増大させる。RANTESは、細胞表面マーカーのCD4およびUCHL1を発現する単球およびTリンパ球の遊走を選択的に助けている。これらの細胞は、メモリーT細胞の機能を有する事前に刺激されたヘルパーT細胞であると考えられる。RANTESは、数人の選択された好塩基球ドナーに由来するヒト好塩基球を活性化して、ヒスタミンの放出を生じさせる。他方で、RANTESはまた、最も強力なヒスタミン誘導因子の1つであるMCAFを含むいくつかのサイトカインによって誘導された好塩基球からのヒスタミンの放出を阻害することができる。
最近、RANTESは、走化性以外の生物学的活性を示すことが明らかにされている。RANTESは、IL−2によって活性化された細胞に類似するCHAK(C−C−ケモカインにより活性化されたキラー)として知られているキラー細胞の増殖および活性化を誘導することができる。RANTESは、ヒトの滑液繊維芽細胞によって発現されており、慢性関節リウマチにおける進行中の炎症プロセスに関与していると考えられる。RANTESに対する高親和性受容体(細胞あたり約700個の結合部位;Kd=700ピコM)が、走化性アッセイおよびカルシウム動態化アッセイにおいてRANTESに応答するヒト単球性白血病細胞株THP−1上に同定されている。RANTESに対するTHP−1細胞の走化性応答は、MCAF(単球の走化性因子で、かつ活性化因子)またはMIP−1α(マクロファージ炎症性タンパク質)を用いたプレインキュベーションによって顕著に阻害される。単球細胞に対するRANTESの結合はMCAFおよびMIP−1αによって競合する。RANTESに対する受容体は、CCR1、CCR3およびCCR5である。RANTESのアンタゴニストの臨床的使用および重要性は多種多様である。例えば、天然型RANTESに対する抗体は、実験的なメサンギウム増殖性腎炎に伴う細胞浸潤を劇的に阻害することができる。さらに、天然型RANTESは、腎臓の移植拒絶に関連する細胞拒絶を受けているヒト腎臓移植片において非常に発現しているようである(Pattison他、Lancet(1994)343(8891):209〜11(1994))。RANTESの化学修飾された形態(アミノオキシペンタン−RANTESまたはAOP−RANTES;およびn−ノナノイル−RANTESまたはNNY−RANTES)は、ケモカインのCCR−5受容体に対するアンタゴニストとして作用すること、そしてHIV−1感染を阻害する能力を有することが示されている。したがって、本発明によるアンタゴニストであり、N末端修飾およびC末端修飾およびN末端修飾/C末端修飾されたRANTESの類似物は、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、臓器移植、アテローム/アテローム性動脈硬化および慢性関節リウマチなどの疾患を処置する際の抗炎症剤として有用である。
SDF−1αおよびSDF−1βのケモカインのアンタゴニストはさらなる例であり、これらはCXCクラスのケモカインに属する。SDF−1βは、4つのさらなるアミノ酸をC末端に有することによって異なる。これらのケモカインは、それらの非ヒト対応体に対する同一性が92%を越える。SDF−1は、血液細胞を除く至るところで発現している。SDF−1は、invitroでは、好中球ではなく、リンパ球および単球に作用し、そしてin vivoでは単核細胞に対する非常に強力な化学誘因物質である。SDF−1はまた、リンパ球において細胞内のアクチン重合を誘導する。SDF−1は、ヒト造血始原細胞に対する化学誘因物質としてinvitroおよびin vivoの両方で作用し、混合タイプの始原細胞およびより原始のタイプを生じさせる。SDF−1はまた、心室中隔形成に関与しているようである。CD34+細胞の走化性が、SDF−1とIL−3との組合せに応答して増大する。SDFは、これらの細胞における細胞質カルシウムの一時的な上昇を誘導することもまた示されている。SDF−1に対する主要な受容体はCXCR4であり、これはまた、HIV−1に対する主要なTリンパ球共受容体として機能する(例えば、Aiuti他、J.Exp.Med.(1997)185(1):111〜120;Bleul他、J.Exp.Med.(1996)184(3):1101〜1109(1996);Bleul他、Nature(1996)382(6594):829〜833;D’Apuzzo他、European J.Immunol.(1997)27(7):1788〜1793;Nagasawa他、Nature(1996)382:635〜638;Oberlin他、Nature(1996)382(6594):833〜835を参照のこと)。したがって、例えば、本発明のSDF−1αアンタゴニストまたはSDF−1βアンタゴニストは、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アテローム/アテローム性動脈硬化および慢性関節リウマチなどの疾患を処置する際の抗炎症剤として有用である。さらに、本発明のSDF−1αアンタゴニストまたはSDF−1βアンタゴニストは、前炎症性細胞の動員および/または活性化に関して哺乳動物におけるSDF−1、RANTES、MIP−1αおよび/またはMIP−1βの作用を阻止するために、あるいはHIV−1感染を処置または阻止するために、単独で、または他の化合物(例えば、本発明のRANTESアンタゴニスト類似物など)と組み合わせて使用することができる。
したがって、本発明の別の態様は、薬学的組成物に関し、そして本発明の1つまたは複数のケモカインまたはその薬学的に受容可能な塩を含む配合物の治療効果的な量を投与することによって、それを必要としている哺乳動物を処置する方法に関する。「薬学的に受容可能な塩」により、本発明のポリペプチドの生物学的な有効性および性質を保持する塩であって、生物学的に、またはそれ以外の場合にも望ましくない塩を意味することが意図される。様々な塩を酸または塩基から得ることができる。酸付加塩が、無機酸から、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸(硫酸塩および重硫酸塩をもたらす)、硝酸、リン酸などから、そして有機酸から、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、サリチル酸、p−トルエンスルホン酸などから得られる。塩基付加塩を無機塩基から得ることができ、これには、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などが含まれる。有機塩基から得られる塩には、一級アミン、二級アミンおよび三級アミン、置換アミン(天然に存在する置換アミンを含む)、ならびに環状アミンから形成される塩が含まれる。そのようなアミンには、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、2−ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、N−アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン類、ピペラジン、ピペリジン、N−エチルピペリジンなどが含まれる。好ましい有機塩基には、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、ピペリジン、トロメタミンおよびコリンが挙げられる。
本明細書中で使用される用語「処置」は、哺乳動物(特に、ヒト)における疾患の任意の処置を包含し、これには、(i)疾患に対する素因を有し得るが、疾患を有するとまだ診断されていない被験者に疾患を発生させないこと;(ii)疾患を阻害すること、すなわち、その発症を停止させること;または(iii)疾患を緩和させること、すなわち、疾患の退行を生じさせることが含まれる。
本明細書中で使用される用語「本発明の生物活性な合成ケモカインを用いた処置によって防止または緩和される哺乳動物における疾患状態」により、一般に本発明の生物活性な合成ケモカインを用いて有用に処置され得ることがこの分野で一般的に認められているすべての疾患状態であって、本発明の特定の化合物を用いた処置によって有用に防止または緩和させられることが見出されているそのような疾患状態を包含することが意図される。これらには、限定としてではなく、例示として、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、ウイルス性疾患、アテローム/アテローム性動脈硬化、慢性関節リウマチおよび臓器移植拒絶が含まれる。
本明細書中で使用される用語「治療効果的な量」は、それを必要とする哺乳動物に投与されたときに、例えば、抗炎症剤、抗喘息剤、免疫抑制剤、または哺乳動物におけるウイルス感染を阻害するための抗自己免疫疾患剤として、(上記に定義されるような)処置を発揮させるためには十分である本発明の生物活性な合成ケモカインのそのような量を示す。「治療効果的な量」を構成する量は、ケモカイン誘導体、状態または疾患およびその重篤度、処置される哺乳動物、その体重、年齢などに依存して変化するが、現代の知識および本開示に関連して当業者によって日常的に決定することができる。本明細書中で使用される用語「q.s.」は、例えば、溶液を所望する容量(例えば、100mL)にするために、述べられた機能を達成するために十分な量を加えることを意味する。
本発明のケモカインおよびその薬学的に受容可能な塩(すなわち、有効成分)は、治療効果的な投薬量で、すなわち、上記に記載されるように、それを必要とする哺乳動物に投与されたときに、処置を発揮させるために十分であるそのような量で投与される。本明細書中に記載される本発明の生物活性な合成ケモカインの投与は、類似する有用性をもたらす薬剤について受け入れられている投与様式のいずれかによって行うことができる。本明細書中で使用される用語「本発明の生物活性な合成ケモカイン」、用語「本発明のポリペプチド[の薬学的に受容可能な塩]」および用語「有効成分」は互いに交換可能に使用することができる。
本発明の生物活性な合成ケモカインの配合物中のレベルは、当業者によって用いられる最大範囲内で変化させることができ、例えば、配合物全体に基づいて約0.01重量パーセント(%w)〜99.99%wの本発明の生物活性な合成ケモカインおよび約0.01%w〜99.99%wの賦形剤であり得る。より典型的には、本発明の生物活性な合成ケモカインは約0.5%w〜約80%wのレベルで存在する。
ヒト投薬量レベルは、本発明の生物活性な合成ケモカインについては依然として最適化されなければならないが、一般には、1日あたりの用量は約0.05〜25mg/キログラム体重/日であり、最も好ましくは約0.01〜10mg/キログラム体重/日である。したがって、70kgの人間に投与する場合、投薬量範囲は1日あたり約0.07mg〜3.5gであり、好ましくは1日あたり約3.5mg〜1.75gであり、最も好ましくは1日あたり約0.7mg〜0.7gである。投与されるアンタゴニストの量は、当然のことではあるが、患者、ならびに防止または緩和のために対象である疾患状態、苦痛の性質または重篤度、投与様式および投与スケジュール、ならびに処方医師の判断に依存している。そのような使用最適化は十分に当業者の能力の範囲内である。
投与は、例えば、錠剤、ピル、カプセル、粉末剤、液体剤、溶液剤、エマルジョン、注射剤、懸濁物、坐薬、エアロゾルなどの固体投薬形態または半固体投薬形態または液体投薬形態またはエアロゾル投薬形態で、任意の受け入れられる全身的経路または局所的経路によって、例えば、非経口的経路、経口的経路(特に幼児用配合物の場合)、静脈内経路、鼻腔内経路、気管支吸入経路(すなわち、エアロゾル配合物)、経皮的経路または局所的経路によって行うことができる。本発明の生物活性な合成ケモカインはまた、所定の速度でポリペプチドを長期間にわたって投与するために、デポ注射剤、浸透圧ポンプ、ピル、経皮パッチ(電気輸送パッチを含む)などを含む持続放出投薬形態または制御放出投薬形態で、好ましくは、正確な投薬量を単回投与するために好適なユニット投薬形態で投与することができる。組成物は、従来の薬学的キャリアまたは賦形剤および本発明の生物活性な合成ケモカインを含み、さらには、他の医学的薬剤、薬学的薬剤、キャリア、アジュバントなどを含むことができる。キャリアは、石油起源、動物起源、植物起源または合成起源のオイルを含む様々なオイル、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などから選択することができる。水、生理的食塩水、デキストロース水溶液およびグリコール類が、特に注射用溶液に対する好ましい液体キャリアである。好適な薬学的キャリアには、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。他の好適な薬学的キャリアおよびそれらの配合物がE.W.Martinによる“Remington’s Pharmaceutical Sciences”に記載されている。
所望する場合には、投与される薬学的組成物はまた、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミンオレアートなどの湿潤化剤または乳化剤、pH緩衝化剤などの非毒性の補助的な物質を少量含有することができる。
より多くの活性成分が要求され得るが、経口投与を、所望される防止の程度に従って調節され得るか、または苦痛の緩和において調節され得る都合のよい日常的な投薬法を使用して本発明の生物活性な合成ケモカインを送達するために使用することができる。そのような経口投与のために、薬学的に受容可能な非毒性の組成物が、通常的に用いられる賦形剤のいずれか、例えば、製薬規格のマンニトール、ラクトース、デンプン、ポビドン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、クロスカルメロースナトリウム、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどを配合することによって形成される。そのような組成物は、溶液剤、懸濁液、分散性錠剤、ピル、カプセル、粉末剤、持続放出配合物などの形態を取る。経口用配合物が、胃腸障害を処置するためには特に好適である。一般的な全身的目的のための経口生物学的利用能を、全身循環に対する取り込みを改善する賦形剤、例えば、アセチル化アミノ酸を含む配合物などを利用することによって調節することができる。例えば、米国特許第5,935,601号および米国特許第5,629,020号を参照のこと。
組成物は、カプセル、ピルまたは錠剤の形態を取ることができ、したがって、組成物は、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムなどの希釈剤;クロスカルメロースナトリウム、デンプンまたはその誘導体などの崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤;そして、デンプン、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、ゼラチン、セルロースおよびその誘導体などの結合剤などを、有効成分と一緒に含有することができる。
液体の薬学的に投与可能な組成物は、例えば、本発明の生物活性な合成ケモカイン(約0.5%〜約20%)および必要に応じて使用される薬学的アジュバントをキャリア(例えば、水、生理的食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、グリコール類、エタノール、保存剤など)に溶解、懸濁などし、それにより溶液または懸濁物を形成することによって調製することができる。所望する場合には、投与される薬学的組成物はまた、例えば、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ポリオキシエチレン、ソルビタンモノラウラートまたはソルビタンステアラートなどの湿潤化剤、懸濁剤、乳化剤、または可溶化剤、pH緩衝化剤などの非毒性の補助的な物質を少量含有することができる。そのような投薬形態物を調製する実際の方法は当業者に知られているか、または当業者には明らかである(例えば、Remington’s PharmaceuticalSciences(Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvania)を参照のこと)。投与される組成物または配合物は、いかなる場合でも、有効成分の量を、処置されている患者の症状を防止または緩和するために効果的な量で含有する。幼児に対する経口投与のためには液体の配合物(シロップまたは懸濁液など)が好ましい。
液体を含有する固体投薬形態物の場合、例えば、プロピレンカーボネート、植物油またはトリグリセリドにおける溶液または懸濁物が、好ましくは、ゼラチンカプセルにカプセル化される。液体投薬形態物の場合、例えば、ポリエチレングリコールにおける溶液は、投与のために容易に計量されるように十分な量の薬学的に受容可能な液体キャリア(例えば、水)で希釈することができる。
あるいは、液体または半固体の経口用配合物は、植物油、グリコール類、トリグリセリド、プロピレングリコールエステル(例えば、プロピレンカーボナート)などに有効成分を溶解または分散し、そしてこれらの溶液または懸濁液を硬ゼラチン・カプセル・シェルまたは軟ゼラチン・カプセル・シェルにカプセル化することによって調製することができる。
本発明の生物活性な合成ケモカインを上記状態の処置に適用する際には、本明細書中に記載される有効成分の投与は、好ましくは非経口投与される。非経口投与は、注射(皮下、筋肉内または静脈内のいずれか)によって一般には特徴付けられ、皮内注射または腹腔内注射ならびに胸骨内注射または注入技術を含むことができる。注射剤は、従来の形態で調製することができ、液体の溶液もしくは懸濁物として、注射前の液体における溶液もしくは懸濁物のために好適な固体形態として、エマルジョンとして、そのいずれでも調製することができ、または生体適合性ポリマーに基づくマイクロスフェア(例えば、リポソーム、ポリエチレングリコール誘導体、ポリ(D,C)ラクチドなど)で調製することができる。好適な賦形剤は、例えば、水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。さらに、所望する場合には、投与される薬学的組成物はまた、例えば、酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレン、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミンオレアート、シクロデキストリン類、血清アルブミンなどの湿潤化剤または乳化剤、pH緩衝化剤、溶解性増強剤、タンパク質キャリアなどの非毒性の補助的な物質を少量含有することができる。
本発明の生物活性な合成ケモカインは、例えば、そのような分子を(水または生理的食塩水などの)好適な溶媒に溶解し、またはリポソーム配合物に配合し、その後、受容可能な注入液に分散させることによって非経口投与することができる。本発明のポリペプチドの典型的な1日用量は、1回の注入によって、または周期的な間隔で間が置かれた一連の注入によって投与することができる。非経口投与のためには、水溶性の形態(例えば、水溶性塩の形態)にある有効成分の水溶液、または粘度増大物質(例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび/またはデキストラン)および所望する場合には安定化剤を含有する水性の注射用懸濁物が特に好適である。場合により賦形剤と一緒にされた有効成分はまた、凍結乾燥物の形態にすることができ、そして好適な溶媒を加えることによって、非経口投与の前に溶液にすることができる。
非経口投与のためのより近年に考案された方法では、一定したレベルの投薬が維持されるような徐放性システムまたは持続放出システムの埋め込みが用いられる。例えば、米国特許第3,710,795号、米国特許第5,714,166号および米国特許第5,041,292号(これらは本明細書に参考として組み込まれる)を参照のこと。
そのような非経口用組成物に含有される有効成分の割合は、ポリペプチドの活性および患者の必要性だけでなく、その特異的な性質に非常に依存している。しかし、溶液における0.01%〜10%の有効成分の割合を用いることができ、そして組成物が固体で、これが、その後、上記の割合に希釈される場合には、その割合はより大きくされる。好ましくは、組成物は、0.02%〜8%の有効成分を溶液において含む。
本発明の生物活性な合成ケモカインを投与する別の方法では、ボーラス注射および連続注入の両方が利用される。これは、治療的処置がHIV−1感染の防止のためであるときには特に好ましい方法である。
エアロゾル投与は、本発明の生物活性な合成ケモカインを気道に対して直接的に送達するための効果的な手段である。この方法の利点のいくつかには次のものがある:1)この方法により、酵素的分解の影響、胃腸管からの良好でない吸収、または肝臓を最初に通過する作用による治療剤の喪失が避けられる;2)この方法により、その分子サイズ、電荷、または肺以外の部位に対する親和性のために気道内のその標的部位に他の方法では到達することができない有効成分が投与される;3)この方法により、肺の肺胞を介した体内への迅速な吸収がもたらされる;そして4)この方法により、他の臓器系を有効成分にさらすことが避けられ、このことは、暴露が望ましくない副作用を生じさせるときには重要である。これらの理由から、エアロゾル投与は、喘息、肺の局所的感染、そして肺および気道の他の疾患または疾患状態を処置するためには特に好都合である。
3タイプの薬学的吸入デバイスがある:ネブライザー吸入器、用量計量吸入器および乾燥粉末吸入器。ネブライザーデバイスは、患者の気道に運ばれるミストとしてケモカイン誘導体(これは液体形態で配合される)を噴霧させる高速度の空気流を生じさせる。用量計量吸入器は、典型的には、配合物が、圧縮されたガスとともに容器に入れられており、作動時に、計量された量のポリペプチドが圧縮ガスによって放出され、したがって、設定量の薬剤を投与する確実な方法をもたらす。乾燥粉末吸入器では、ポリペプチドが、このデバイスにより呼吸時に患者の気流中に分散され得る自由に流動する粉末の形態で投与される。自由に流動する粉末を達成するために、ケモカイン誘導体はラクトースなどの賦形剤とともに配合される。計量された量のケモカイン誘導体はカプセル形態で貯蔵され、そして作動毎によって患者に分配される。上記の方法はすべて、本発明物を投与するために使用することができる。
リポソームに基づく薬学的配合物もまた、本発明のケモカインの使用に好適である。例えば、米国特許第5,631,018号、米国特許第5,723,147号および米国特許第5,766,627号を参照のこと。リポソームの利点は、薬物がリポソームに包まれることから生じる組織分布および薬物動態学的パラメータの有利な変化に関連すると考えられており、当業者によって本発明のポリペプチドに適用され得る。注射または経口投与のための制御放出リポソーム液体薬学的配合物もまた使用することができる。
坐薬による全身投与の場合、従来からの結合剤およびキャリアには、例えば、ポリエチレングリコールまたはトリグリセリドが含まれ、例えば、PEG1000(96%)およびPEG4000(4%)が含まれる。そのような坐薬は、約0.5w/w%〜約10w/w%(好ましくは約1w/w%〜約2w/w%)の範囲で有効成分を含有する混合物から生成することができる。
上記のように、そして以下の具体的な実施例においてさらに例示されるように、本発明の生物活性な合成ケモカインには、天然に存在するケモカインのアンタゴニストとしての使用が見出される。特に、アンタゴニストとしての効力が増強されている本発明の生物活性な合成ケモカインには、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、臓器移植拒絶、ウイルス疾患、アテローム/アテローム性動脈硬化、慢性関節リウマチおよび臓器移植拒絶などの様々な疾患状態の分析および処置における使用が見出される。本発明の生物活性な合成ケモカインはまた、それらの同族受容体の小分子アンタゴニストの設計およびスクリーニングにおいて利用することができる。例えば、本発明の化合物に操作されて入れられている構造的多様性は、ケモカイン受容体の天然の活性を伴う疾患を処置する際の医薬品として使用されるためのより良好な小分子化合物の設計、スクリーニングおよび微調節におけるより合理的な方法を容易にする。
(実施例)
下記の調製および実施例は、当業者が本発明をより明瞭に理解することができるように、そして本発明を実施することができるように示される。下記の調製および実施例は、本発明の範囲を限定するものとしてではなく、本発明を単に例示し、かつ表すものとして考慮されなければならない。
下記の調製および実施例は、当業者が本発明をより明瞭に理解することができるように、そして本発明を実施することができるように示される。下記の調製および実施例は、本発明の範囲を限定するものとしてではなく、本発明を単に例示し、かつ表すものとして考慮されなければならない。
実施例1:本発明のケモカインの一般的な合成法
本発明の生物活性な合成ケモカインのペプチドは固相ペプチド合成によって生成された。固相合成は、AppliedBiosystemsから得られる、使用者により改変された430Aペプチド合成機において、段階的なBoc化学鎖伸長のための中和/2−(1H−ベンゾトリアゾル−1−イル)−1,1,1,3,3−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスファート活性化プロトコル(Schnolzer他、Int.J.PeptideProtein Res.(1992)40:180〜193)をそのまま使用して行われた。N末端ペプチドフラグメントはチオエステル生成樹脂において合成された。この樹脂は、調べられた位置(C末端からN末端への伸長)の前に位置する残基を結合した後に分離された。ペプチドは0.03mmolスケールで手動により伸長された。それぞれの合成サイクルは、純TFAを用いた1分間〜2分間の処理によるNα−Bocの除去、DMFによる1分間のフロー洗浄、過剰なDIEAの存在下における1.0mmolの予備活性化Bocアミノ酸を用いた10分間〜20分間のカップリング、DMFによる2回目のフロー洗浄からなった。Nα−Boc−アミノ酸(1.1mmol)の予備活性化は、過剰なDIEA(3mmol)の存在下、1mmolのHBTU(DMFにおいて0.5M)で3分間行われた。それぞれの手動カップリング段階の後、残留する未反応アミンをニンヒドリン・アッセイ(Sarin他、Anal.Biochem.(1981)117:147〜157)で評価した。C末端フラグメントを含むアミノ酸は標準的な−O−CH2−フェニルアセトアミドメチル樹脂において合成された。鎖の組立てが完了した後、ペプチドは脱保護され、そしてスカベンジャとして5%のp−クレゾールを用いた0℃で1時間の無水HFによる処理によって樹脂から切断された。すべての場合において、このDNP除去手順はC末端チオエステル基に関しては不適合であるので、イミダゾール側鎖のDNP保護基はHis残基に残留した。しかし、DNPは連結反応中にチオールによって徐々に除去され、非保護のHisをもたらした。切断後、両方のペプチドを氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、水性アセトニトリルに溶解して、凍結乾燥した。これらのペプチドは、緩衝液A(H2O/0.1%トリフルオロ酢酸)における緩衝液B(アセトニトリル/10%H2O/0.1%トリフルオロ酢酸)の直線勾配および214nmにおけるUV検出を使用することにより、Watersから得られるC18カラムを用いたRP−HPLCによって精製された。サンプルは、PlatformII装置(Micromass、Manchester、英国)を用いたエレクトロスプレー質量分析によって分析された。ペプチドは、天然の化学的連結(Dawson他、Science(1994)266:776〜779;Wilken他、Chem.Biol.(1999)6:43〜51;Camarero他、CurrentProtocols in Protein Science(1999)18.4.1〜18.4.21)を使用して全長のケモカインポリペプチド鎖を生成するための連結のために利用された。ポリペプチド鎖の折畳みは、標準的な技術(Wilken他、Chem.Biol.(1999)6:43〜51)に従ってCys−SH/(Cys−S)2の存在下で達成された。
本発明の生物活性な合成ケモカインのペプチドは固相ペプチド合成によって生成された。固相合成は、AppliedBiosystemsから得られる、使用者により改変された430Aペプチド合成機において、段階的なBoc化学鎖伸長のための中和/2−(1H−ベンゾトリアゾル−1−イル)−1,1,1,3,3−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスファート活性化プロトコル(Schnolzer他、Int.J.PeptideProtein Res.(1992)40:180〜193)をそのまま使用して行われた。N末端ペプチドフラグメントはチオエステル生成樹脂において合成された。この樹脂は、調べられた位置(C末端からN末端への伸長)の前に位置する残基を結合した後に分離された。ペプチドは0.03mmolスケールで手動により伸長された。それぞれの合成サイクルは、純TFAを用いた1分間〜2分間の処理によるNα−Bocの除去、DMFによる1分間のフロー洗浄、過剰なDIEAの存在下における1.0mmolの予備活性化Bocアミノ酸を用いた10分間〜20分間のカップリング、DMFによる2回目のフロー洗浄からなった。Nα−Boc−アミノ酸(1.1mmol)の予備活性化は、過剰なDIEA(3mmol)の存在下、1mmolのHBTU(DMFにおいて0.5M)で3分間行われた。それぞれの手動カップリング段階の後、残留する未反応アミンをニンヒドリン・アッセイ(Sarin他、Anal.Biochem.(1981)117:147〜157)で評価した。C末端フラグメントを含むアミノ酸は標準的な−O−CH2−フェニルアセトアミドメチル樹脂において合成された。鎖の組立てが完了した後、ペプチドは脱保護され、そしてスカベンジャとして5%のp−クレゾールを用いた0℃で1時間の無水HFによる処理によって樹脂から切断された。すべての場合において、このDNP除去手順はC末端チオエステル基に関しては不適合であるので、イミダゾール側鎖のDNP保護基はHis残基に残留した。しかし、DNPは連結反応中にチオールによって徐々に除去され、非保護のHisをもたらした。切断後、両方のペプチドを氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、水性アセトニトリルに溶解して、凍結乾燥した。これらのペプチドは、緩衝液A(H2O/0.1%トリフルオロ酢酸)における緩衝液B(アセトニトリル/10%H2O/0.1%トリフルオロ酢酸)の直線勾配および214nmにおけるUV検出を使用することにより、Watersから得られるC18カラムを用いたRP−HPLCによって精製された。サンプルは、PlatformII装置(Micromass、Manchester、英国)を用いたエレクトロスプレー質量分析によって分析された。ペプチドは、天然の化学的連結(Dawson他、Science(1994)266:776〜779;Wilken他、Chem.Biol.(1999)6:43〜51;Camarero他、CurrentProtocols in Protein Science(1999)18.4.1〜18.4.21)を使用して全長のケモカインポリペプチド鎖を生成するための連結のために利用された。ポリペプチド鎖の折畳みは、標準的な技術(Wilken他、Chem.Biol.(1999)6:43〜51)に従ってCys−SH/(Cys−S)2の存在下で達成された。
実施例2:NNY−RANTES、AOP−RANTESおよびSDF−1のN末端類似物、C末端類似物およびN末端/C末端類似物の合成
RANTES(1−68)およびSDF−1β(1−72)の類似物を実施例1のように調製した。これらは、本発明のCCケモカインおよびCXCケモカインを生成する一般的な方法を例示するために本明細書中に記載される。具体的には、N末端、C末端およびN末端/C末端が修飾されたRANTES類似物は、ケモカイン化合物CH3−(CH2)7−C(O)−RANTES(2−68)(これはまたn−ノナノイル−RANTES(2−68)または「NNY−RANTES」として示される)およびケモカイン化合物CH3−(CH2)4−O−N=CH−CO−RANTES(2−68)(これはまたアミノオキシペンタン−RANTESまたは「AOP−RANTES」として示される)に対する修飾に基づいていた。NNY−RANTES、AOP−RANTES、およびこの目的のために利用されるさらなるRANTES誘導体分子は国際特許出願公開WO99/11666(その参照は参考として本明細書中に組み込まれる)に記載される。SDF−1のN末端類似物、C末端類似物およびN末端/C末端類似物は、RANTES類似物の場合と同じ基本的設計法を使用して構築された。
RANTES(1−68)およびSDF−1β(1−72)の類似物を実施例1のように調製した。これらは、本発明のCCケモカインおよびCXCケモカインを生成する一般的な方法を例示するために本明細書中に記載される。具体的には、N末端、C末端およびN末端/C末端が修飾されたRANTES類似物は、ケモカイン化合物CH3−(CH2)7−C(O)−RANTES(2−68)(これはまたn−ノナノイル−RANTES(2−68)または「NNY−RANTES」として示される)およびケモカイン化合物CH3−(CH2)4−O−N=CH−CO−RANTES(2−68)(これはまたアミノオキシペンタン−RANTESまたは「AOP−RANTES」として示される)に対する修飾に基づいていた。NNY−RANTES、AOP−RANTES、およびこの目的のために利用されるさらなるRANTES誘導体分子は国際特許出願公開WO99/11666(その参照は参考として本明細書中に組み込まれる)に記載される。SDF−1のN末端類似物、C末端類似物およびN末端/C末端類似物は、RANTES類似物の場合と同じ基本的設計法を使用して構築された。
所与の標的ケモカインに対するN末端修飾(RANTESに対するNNY修飾およびAOP修飾など)の場合、化学的変化体が、上記ならびに国際特許出願公開WO99/11666およびWilken他、Chem.Biol.(1999)6:43〜51に記載されるように調製され、その調製には、ペンダント状のN末端修飾(例えば、NNYまたはAOP)を生成するための、連結のために用いられるN末端ペプチドセグメントの樹脂上での処理、それに続く切断/脱保護、精製、および全長の生成物を形成させるためのC末端ペプチドセグメントに対する天然の化学的連結における非保護のN末端修飾ペプチドα−チオエステルの使用が用いられた。様々なペプチドが合成され、そしてアミノ酸誘導体を含む様々なアミノ酸置換が、実施例1に記載されるようなペプチド合成のときに取り込まれた。実施例1におけるような天然の化学的連結が、直鎖状の生成物を生成するために利用された。この場合、連結が、RANTES類似物についてはLys31−Cys32部位に存在し、SDF−1類似物についてはAsn33−Cys34部位に存在した。等モル量のペプチドフラグメント(2〜2.5mM)を6MGuHCl、100mMリン酸塩(pH7.5)、1%ベンジルメルカプタンおよび3%チオフェノールに溶解した。反応は、通常の場合には一晩行われた。得られたポリペプチド生成物は、ペプチドセグメントについて上記に記載されるように精製および分析された。折り畳まれたタンパク質を生成するために、NNY−RANTES類似物の精製されたポリペプチド鎖(約0.5〜1mg/mL)を、8mMシステイン、1mMシスチンおよび10mMメチオニンを含有する2MGuHCl、100mM Tris(pH8.0)に溶解した。穏やかに一晩撹拌した後、タンパク質溶液を、上記に記載されるようにRP−HPLCによって精製した。他の折畳み条件が、SDF−1類似物の場合には使用された:SDF−1およびMet0−SDF−1は、空気の存在下、室温で、1MGuHCl、0.1M Tris(pH8.5)において0.5mg/mLで酸化された。一晩の撹拌を行った後、折畳みは完了した。AOP−SDF−1、カプロイル−SDF−1およびNNY−SDF−1は、同じ緩衝液ではあるが、2MのGuHClの存在下で酸化された。
折り畳まれた所与のタンパク質に対する脂肪酸の化学的結合のために、2つの基本的な段階が含まれた。最初に、脂肪酸がアミノオキシ基で官能基化された。次に、反応性のカルボニル基が、タンパク質のカルボキシル末端ドメイン内に、すなわち、ケモカインの活性には重要でないと考えられる領域内に特異的に導入された。この目的のために、C末端脂肪酸修飾のために標的化されるケモカイン類似物が、C末端のLys(Ser)Gly配列の伸長を伴って合成された。したがって、例えば、NNY−RANTES(2−68)が、Lys(Ser)Gly配列の伸長をC末端に含有するように合成された。反応性のカルボニル基は、リフォールディングされたタンパク質をNaIO4処理することによって生成され、したがって、これにより、安定なオキシム結合による脂肪酸成分の部位特異的な結合が可能になった。
脂肪酸による官能基化のために、0.2mmolの脂肪酸(パルミチン酸、オレイン酸、アラキドン酸、コール酸)を0.5mlのDMF/DCM混合物(1:1、v:v)中で等モル量のDCCおよびHOAtで活性化して、0.25mmolのBoc−AoA―NH−(CH2)2−NH2の0.5mlのDMF溶液に加え、見かけのpHをN−エチルモルホリンでpH8.0に調節した。コレステリル誘導体については、0.2mmolのクロロギ酸コレステリルを0.5mlのDCMに溶解して、0.25mmolのBoc−AoA―NH−(CH2)2−NH2のエタノール性溶液に加え、見かけのpHをトリエチルアミンでpH9.0に調節した。一晩インキュベーションした後、揮発成分を真空下で除き、生成物をフラッシュ・クロマトグラフィまたはC4カラムでの調製用HPLCによって単離した。Boc基をTFA処理によって除き、生成物をESI−MSによって確認した。
タンパク質を酸化するために、標的タンパク質(2mg/ml)を、6M塩化グアニジンを含有する0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)に溶解し、そしてスカベンジャがタンパク質に対して100倍モル過剰量になるようにメチオニンを添加した。その後、10倍過剰量の過ヨウ素酸ナトリウムを加え、溶液を暗所で10分間インキュベーションした。反応を、過ヨウ素酸塩に対して1000倍モル過剰量のエチレングリコールの添加によって停止させ、さらに室温で15分間インキュベートした。その後、溶液を0.1%酢酸に対して透析し、最後に凍結乾燥した。例えば、C末端側方セリンの酸化はESI−MSによってほぼ定量的であることが明らかにされた。ESI−MSでは、グリオキシリル誘導体を形成させるための31Daの喪失に対応する8141.8±0.7Daの質量がAOP−RANTES−K(S)Gの場合に得られ、そして出発物質の質量に対応するピークは認められなかった。
脂肪酸のケモカインとの結合は、0.1%サルコシル、20mMメチオニン、およびタンパク質に対して20倍過剰量の官能基化脂肪酸の存在下で、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.3)中で達成された。37℃で16時間〜20時間撹拌した後、脂肪酸のアミノオキシ基とケモカインのアルデヒドとの間で形成されたオキシム結合としての結合体を、逆相HPLCを使用して精製して、生成物をESI−MSによって特徴付けた。すべての類似物について、酸化されたタンパク質に対するアミノオキシ官能基化脂肪酸のカップリングは、分析HPLCによって確認されたとき、ほぼ定量的であった。
実施例3:NNY−RANTESおよびAOP−RANTESのN末端類似物
N末端RANTES誘導体については、修飾を、NNY−RANTES(2−68)またはAOP−RANTESN(2−68)の最初の8個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸のN末端領域の1つまたは複数に対して行った。この最初の8個のアミノ酸残基は次の配列を有する:−PYSSDTTP−。これらは、図10A〜図10Dに示される68アミノ酸残基の野生型RANTESポリペプチド鎖(すなわち、RANTES(1−68))のアミノ酸残基2〜9に対応する。天然に存在するRANTES(1−68)の最初の残基(Ser)は、NNY−RANTES(2−68)ではn−ノナノイル置換基によって置換され、そしてAOP−RANTES(2−68)ではアミノオキシペンタンによって置換されているからである。したがって、例えば、アミノ酸位置2におけるNNY−RANTES(2−68)での置換体は、下記では、一般化合物式「NNY−P2X−RANTES(3−68)」によって示される:式中、NNYはn−ノナノイルであり、Xは、NNY−RANTES(2−68)の2位のプロリン(P)の代わりに置換されたアミノ酸であり、RANTES(3−68)は、N末端からC末端の方向で読んだときのNNY−RANTES(2−68)の残りの66アミノ酸を表す。別の例として、アミノ酸位置3におけるNNY−RANTES(2−68)での置換体は、一般化合物式「NNY−P−Y3X−RANTES(4−68)」によって示される:式中、NNYはn−ノナノイルであり、Xは、NNY−RANTES(2−68)の3位のチロシン(Y)の代わりに置換されたアミノ酸であり、RANTES(4−68)は、N末端からC末端の方向で読んだときのNNY−RANTES(2−68)の残りの65アミノ酸を表す。多重置換されたNNY−RANTES類似物については、アミノ酸位置2、3および9におけるNNY−RANTES(2−68)での三置換体に対する化合物式の下記の例が、一般化合物式「NNY−P2X−Y3X−SSDTT−P9X−RANTES(10−68)」によって示される:式中、NNYはn−ノナノイルであり、Xは、NNY−RANTES(2−68)の2位のプロリン(P)、3位のチロシン(Y、および9位のプロリン(P)の代わりに置換された同じまたは異なるアミノ酸であり、SSDTTはNNY−RANTES(2−68)のアミノ酸4〜8に対応し、RANTES(10−68)は、N末端からC末端の方向で読んだときのNNY−RANTES(2−68)の残りの59アミノ酸を表わす。
N末端RANTES誘導体については、修飾を、NNY−RANTES(2−68)またはAOP−RANTESN(2−68)の最初の8個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸のN末端領域の1つまたは複数に対して行った。この最初の8個のアミノ酸残基は次の配列を有する:−PYSSDTTP−。これらは、図10A〜図10Dに示される68アミノ酸残基の野生型RANTESポリペプチド鎖(すなわち、RANTES(1−68))のアミノ酸残基2〜9に対応する。天然に存在するRANTES(1−68)の最初の残基(Ser)は、NNY−RANTES(2−68)ではn−ノナノイル置換基によって置換され、そしてAOP−RANTES(2−68)ではアミノオキシペンタンによって置換されているからである。したがって、例えば、アミノ酸位置2におけるNNY−RANTES(2−68)での置換体は、下記では、一般化合物式「NNY−P2X−RANTES(3−68)」によって示される:式中、NNYはn−ノナノイルであり、Xは、NNY−RANTES(2−68)の2位のプロリン(P)の代わりに置換されたアミノ酸であり、RANTES(3−68)は、N末端からC末端の方向で読んだときのNNY−RANTES(2−68)の残りの66アミノ酸を表す。別の例として、アミノ酸位置3におけるNNY−RANTES(2−68)での置換体は、一般化合物式「NNY−P−Y3X−RANTES(4−68)」によって示される:式中、NNYはn−ノナノイルであり、Xは、NNY−RANTES(2−68)の3位のチロシン(Y)の代わりに置換されたアミノ酸であり、RANTES(4−68)は、N末端からC末端の方向で読んだときのNNY−RANTES(2−68)の残りの65アミノ酸を表す。多重置換されたNNY−RANTES類似物については、アミノ酸位置2、3および9におけるNNY−RANTES(2−68)での三置換体に対する化合物式の下記の例が、一般化合物式「NNY−P2X−Y3X−SSDTT−P9X−RANTES(10−68)」によって示される:式中、NNYはn−ノナノイルであり、Xは、NNY−RANTES(2−68)の2位のプロリン(P)、3位のチロシン(Y、および9位のプロリン(P)の代わりに置換された同じまたは異なるアミノ酸であり、SSDTTはNNY−RANTES(2−68)のアミノ酸4〜8に対応し、RANTES(10−68)は、N末端からC末端の方向で読んだときのNNY−RANTES(2−68)の残りの59アミノ酸を表わす。
下記は、調製されたNNY−P2X−RANTES(3−68)類似物の例である。
下記は、調製されたNNY−P−Y3X−RANTES(4−68)類似物の例である。
下記の化合物は、調製されたNNY−PY−S4X−RANTES(5−68)類似物の例である。
下記の化合物は、調製されたNNY−PYS−S5X−RANTES(6−68)類似物の例である。
下記の化合物は、調製されたNNY−PYSS−D6X−RANTES(7−68)類似物の例である。
下記の化合物は、調製されたNNY−PYSSD−T7X−RANTES(8−68)類似物の例である。
下記の化合物は、調製されたNNY−PYSSDT−T8X−RANTES(9−68)類似物の例である。
下記の化合物は、調製されたNNY−PYSSDTT−P9X−RANTES類似物の例である。
下記の化合物は、調製された二重置換類似物NNY−P2X−Y3X−RANTES(4−68)および三重置換類似物NNY−P2X−Y3X−SSDTT−P9X−RANTES(10−68)の例である。
実施例4:NNY−RANTESのN末端N−ループ類似物
下記の化合物は、CCR1およびCCR3を介したシグナル伝達に影響を及ぼすことなく、CCR5に対する効力を増大させるために、N−ループ(RANTESの残基12〜20)が修飾されているさらなるNNY置換RANTES類似物を例示することを意図している。
下記の化合物は、CCR1およびCCR3を介したシグナル伝達に影響を及ぼすことなく、CCR5に対する効力を増大させるために、N−ループ(RANTESの残基12〜20)が修飾されているさらなるNNY置換RANTES類似物を例示することを意図している。
N末端N−ループのRANTES類似物については、N−ループ修飾をNNY−RANTES(2−68)に対して行った。この場合、N−ループはアミノ酸12〜20に対応する。RANTESのN−ループは−FAYIARPLP−(配列番号29)のアミノ酸配列を有する。したがって、例えば、アミノ酸位置12におけるNNY−RANTES(2−68)での置換体は一般化合物式「NNY−PYSSDTTPCC−F12pBz−RANTES(13−68)」を有する:式中、NNYはn−ノナノイルであり、PYSSDTTPCCはRANTES(1−68)のアミノ酸2〜11に対応し、F12pBzは、RANTES(1−68)の12位のフェニルアラニン(F)の代わりにアミノ酸誘導体pBZへの置換を示し、RANTES(13−68)は、N末端からC末端の方向で読んだときのRANTES(1−68)の残りのアミノ酸残基13〜68を表す。
実施例5:NNY−RANTESのN末端RANTES類似物
下記の化合物は、異なる疎水性の脂肪族鎖がNNY置換基の代わりに用いられたさらなるNNY置換RANTES類似物を例示することを意図している:
下記の化合物は、異なる疎水性の脂肪族鎖がNNY置換基の代わりに用いられたさらなるNNY置換RANTES類似物を例示することを意図している:
実施例6:NNY−RANTESおよびAOP−RANTESのC末端類似物およびN末端/C末端類似物
Lys−GlyのC末端伸長を有し、Lysのε−アミノ基がセリン残基によってアシル化されているAOP−RANTES類似物およびNNY−RANTESを調製した。これらの誘導体を、セリン伸長物の過ヨウ素酸酸化の後、発蛍光団(FITC、NBD、Cy−5およびBODIPY−Fl)または脂質を含むアミノオキシアセチル官能基化化合物と結合した。これらのC末端標識されたケモカインはその生物学的性質を保持しており、そしてCH3−(CH2)14−CONH−(CH2)2−NHCO−CH2−O−NH2と同じように、脂肪族成分の導入は、ケモカインの効力を改善することが明らかにされた。最も効果的な化合物を見出すために、種々の脂肪酸塩および脂質(ラウリン酸塩、パルミチン酸塩、オレイン酸塩、エイコサン酸塩、コール酸およびクロロギ酸コレステリル)を、Boc−AoA−NH−(CH2)2NH2とのカップリング、その後のBoc除去によってアミノオキシ基で官能基化した。これらの誘導体の1つまたは複数を、酸化されたNNY−RANTES−K(S)GまたはAOP−RANTES−K(S)Gに結合させた。AOP類似物を下記に例示する:
Lys−GlyのC末端伸長を有し、Lysのε−アミノ基がセリン残基によってアシル化されているAOP−RANTES類似物およびNNY−RANTESを調製した。これらの誘導体を、セリン伸長物の過ヨウ素酸酸化の後、発蛍光団(FITC、NBD、Cy−5およびBODIPY−Fl)または脂質を含むアミノオキシアセチル官能基化化合物と結合した。これらのC末端標識されたケモカインはその生物学的性質を保持しており、そしてCH3−(CH2)14−CONH−(CH2)2−NHCO−CH2−O−NH2と同じように、脂肪族成分の導入は、ケモカインの効力を改善することが明らかにされた。最も効果的な化合物を見出すために、種々の脂肪酸塩および脂質(ラウリン酸塩、パルミチン酸塩、オレイン酸塩、エイコサン酸塩、コール酸およびクロロギ酸コレステリル)を、Boc−AoA−NH−(CH2)2NH2とのカップリング、その後のBoc除去によってアミノオキシ基で官能基化した。これらの誘導体の1つまたは複数を、酸化されたNNY−RANTES−K(S)GまたはAOP−RANTES−K(S)Gに結合させた。AOP類似物を下記に例示する:
脂質成分の化学的変化体はまた別の方法により調製された。そのような化合物は、脂肪酸をFmoc脱保護されたBoc−ペプチド−Lys−Gly−樹脂に結合することによってC末端セグメントを樹脂上で処理し、その後、切断、精製、および全長のポリペプチドを形成させるための化学的連結において使用することによって合成された。
これらの化合物を設計することにおいて、脂質カップリングが利用された主要な理由は2つあった。第1に、RANTES化合物の抗HIV−1阻害活性が、受容体をダウンモジュレーションする能力に関連しているという証拠が、今や、ますます多くなっている。このことは、一旦内在化されると、受容体の再生利用に伴って初期のエンドソームにおいて通常の場合には解離するはずのリガンド−受容体複合体がまた、形質膜またはいくつかの細胞質の脂肪酸分岐タンパク質と相互作用し得ることを意味している。したがって、リガンドの脂質修飾により、単に疎水性相互作用によって複合体への標的を特定の細胞内サブドメインへの標的に変えることができ、したがって受容体の再生利用を遅らせることができる。細胞内のタンパク質輸送を取り扱ったいくつかの最近の論文は、アシル化が、界面活性剤耐性膜に対するタンパク質の親和性を増大させる共通した機構であり、そして膜貫通部を有しないタンパク質に対する主要な標的化機構であり得るという考えを裏付けている(例えば、Melkonian他、J.Biol.Chem.(1999)274:3910〜3917;Zlatkine他、J.CellSci.(1997)110:673〜679;Zhan他、Cancer Immunol.Immunother.(1998)46:55〜60を参照のこと)。第2に、この修飾はまた、化合物の薬物動態学的性質を変化させるために行われた。いくつかの最近の論文はこの概念を裏付けている(例えば、Honeycutt他、Pharm.Res.(1996)13:1373〜1377;Kurtzhals他、J.Pharm.Sci.(1997)86:1365〜1368;Markussen他、Diabetologia(1996)39:281〜288を参照のこと)。
下記の実施例において明らかにされるように、薬物動態を変化させることを修飾は意図していたので、活性の増強は驚くべきことであり、かつ予想外のことであった。予想される結果は、活性が低下するということであったが、それにも関わらず、薬物動態における期待される改善は受け入れられるほどの有望性をもたらしている。
実施例7:SDF−1αおよびSDF−1βのN末端類似物
下記のN末端SDF−1β(1−72)誘導体は、本発明のCXCケモカインを生成する一般的な方法を例示するために調製された。例として、SDF−1βのN末端を、疎水性の脂肪族鎖をN末端に有する化合物を生成するために修飾した。N末端領域におけるアミノ酸誘導体および/またはC末端領域における脂肪族鎖をさらに含む化合物が、RANTES化合物について上記に記載されるように調製される。具体的には、好適なN末端置換基が調製され、試験された。これには、限定としてではなく、例として、Lys、Met−Lys、カプロイル−Lys、CH3−(CH2)7−C(O)およびCH3−(CH2)4−O−NH−グリオキシリルが含まれた。下記の化合物は、調製されたSDF−1α類似物およびSDF−1β類似物のいくつかの例である。
下記のN末端SDF−1β(1−72)誘導体は、本発明のCXCケモカインを生成する一般的な方法を例示するために調製された。例として、SDF−1βのN末端を、疎水性の脂肪族鎖をN末端に有する化合物を生成するために修飾した。N末端領域におけるアミノ酸誘導体および/またはC末端領域における脂肪族鎖をさらに含む化合物が、RANTES化合物について上記に記載されるように調製される。具体的には、好適なN末端置換基が調製され、試験された。これには、限定としてではなく、例として、Lys、Met−Lys、カプロイル−Lys、CH3−(CH2)7−C(O)およびCH3−(CH2)4−O−NH−グリオキシリルが含まれた。下記の化合物は、調製されたSDF−1α類似物およびSDF−1β類似物のいくつかの例である。
実施例8:スクリーニング・アッセイ
実施例3〜7およびその他で調製されたRANTES類似物およびSDF類似物のいくつかを、RANTESおよびSDF−1において使用が見出されるこの特に示される阻止機能を特徴付けるためのHIV系アッセイを使用してアンタゴニスト活性についてスクリーニングした。一般に、これらの化合物は、HIVエンベロープ媒介による細胞融合を阻害するそれらの能力に対する予備スクリーニングを通した。これらの化合物の中で最も有望な化合物を、続いて、標的細胞株の無細胞ウイルス感染を阻害するその能力について試験した。これらのアッセイが選ばれたが、これは、細胞融合アッセイおよびinvitro無細胞ウイルス感染アッセイが、SCIDマウス・モデルで測定されるようなin vivoでの効力の有用な指標であることが見出されているからである(Mosier他、J.Virol.(1999)73:3544〜3550)。さらに、AOP−RANTESを上回るNNY−RANTESの抗ウイルス効力の増大が、CCR5に対する親和性の増大とは異なる要因のためであることが見出されているので、化合物は、CCR5に対する親和性ではなく、細胞融合アッセイにおける活性に関して評価した。
実施例3〜7およびその他で調製されたRANTES類似物およびSDF類似物のいくつかを、RANTESおよびSDF−1において使用が見出されるこの特に示される阻止機能を特徴付けるためのHIV系アッセイを使用してアンタゴニスト活性についてスクリーニングした。一般に、これらの化合物は、HIVエンベロープ媒介による細胞融合を阻害するそれらの能力に対する予備スクリーニングを通した。これらの化合物の中で最も有望な化合物を、続いて、標的細胞株の無細胞ウイルス感染を阻害するその能力について試験した。これらのアッセイが選ばれたが、これは、細胞融合アッセイおよびinvitro無細胞ウイルス感染アッセイが、SCIDマウス・モデルで測定されるようなin vivoでの効力の有用な指標であることが見出されているからである(Mosier他、J.Virol.(1999)73:3544〜3550)。さらに、AOP−RANTESを上回るNNY−RANTESの抗ウイルス効力の増大が、CCR5に対する親和性の増大とは異なる要因のためであることが見出されているので、化合物は、CCR5に対する親和性ではなく、細胞融合アッセイにおける活性に関して評価した。
実施例9:エンベロープ媒介による細胞融合アッセイ
CCR5に依存する細胞融合を阻害する実施例3〜7の化合物の所与のパネルの能力を、ウイルスエンベロープタンパク質に対して操作された細胞であって、CD4およびCCR5を有する細胞と融合し、かつレポータ・システムを含有する細胞を使用して測定した。CCR5親和性のウイルスエンベロープにより媒介される細胞融合アッセイは、本質的にはSimmons他(Science(1997)276:276〜279)に記載されるように、HeLa−P5L細胞株およびHeLa−Env−ADA細胞株(これらはともに、M.Alizon(Paris)の研究室から厚意により提供された)を使用して行われた。簡単に記載すると、HeLa−P5L細胞を96ウエルプレートに播種した(100μlにおいてウエルあたり104細胞)。24時間後、培地を除き、ウエルあたり104個のHeLa−Env−ADA細胞およびケモカインを含有する培地を加えた(200μlの最終容量)。さらに24時間後、細胞をPBSで1回洗浄して、50μlのPBS/0.5%NP−50において室温で15分間溶解した。溶解液を、50μlの2X CPRG基質(16mMクロロフェノールレッド−β−D−ガラクトピラノシド;120mMのNa2HPO4、80mMのNaH2PO4、20mMのKCl、20mMのMgSO4および10mMのβ−メルカプトエタノール)を添加し、その後、室温で暗所において1時間〜2時間インキュベーションすることによってβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。その後、575nmでの吸光度をLabsystemマイクロプレート・リーダで読み取った。これらの値から、阻害率[100x(OD(試験)−OD(負のコントロール))/(OD(正のコントロール)−OD(負のコントロール))]をそれぞれの阻害剤濃度で計算した。阻害剤濃度に対する融合阻害率のプロットから、それぞれの化合物に対するIC50値を計算することができた。
CCR5に依存する細胞融合を阻害する実施例3〜7の化合物の所与のパネルの能力を、ウイルスエンベロープタンパク質に対して操作された細胞であって、CD4およびCCR5を有する細胞と融合し、かつレポータ・システムを含有する細胞を使用して測定した。CCR5親和性のウイルスエンベロープにより媒介される細胞融合アッセイは、本質的にはSimmons他(Science(1997)276:276〜279)に記載されるように、HeLa−P5L細胞株およびHeLa−Env−ADA細胞株(これらはともに、M.Alizon(Paris)の研究室から厚意により提供された)を使用して行われた。簡単に記載すると、HeLa−P5L細胞を96ウエルプレートに播種した(100μlにおいてウエルあたり104細胞)。24時間後、培地を除き、ウエルあたり104個のHeLa−Env−ADA細胞およびケモカインを含有する培地を加えた(200μlの最終容量)。さらに24時間後、細胞をPBSで1回洗浄して、50μlのPBS/0.5%NP−50において室温で15分間溶解した。溶解液を、50μlの2X CPRG基質(16mMクロロフェノールレッド−β−D−ガラクトピラノシド;120mMのNa2HPO4、80mMのNaH2PO4、20mMのKCl、20mMのMgSO4および10mMのβ−メルカプトエタノール)を添加し、その後、室温で暗所において1時間〜2時間インキュベーションすることによってβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。その後、575nmでの吸光度をLabsystemマイクロプレート・リーダで読み取った。これらの値から、阻害率[100x(OD(試験)−OD(負のコントロール))/(OD(正のコントロール)−OD(負のコントロール))]をそれぞれの阻害剤濃度で計算した。阻害剤濃度に対する融合阻害率のプロットから、それぞれの化合物に対するIC50値を計算することができた。
表1において、平均相対的効力について、融合アッセイでのIC50の絶対値は、異なる日に行われた実験において変動しているが、活性の順位は変わらないままである。結果を正規化するために、AOP−RANTESをそれぞれの実験におけるコントロールとして使用した。したがって、それぞれの実験におけるIC50は、100の値が随意的に与えられたAOP−RANTESのIC50に対して表された。試験された化合物のほとんどすべてが、野生型RANTESに対して、より大きい効力を示したが、化合物番号19、23、40および42などのいくつかの化合物の効力は、50%を超える阻害が系列内の最低希釈においてさえ得られるほどであった。
実施例10:無細胞ウイルス感染アッセイ
無細胞ウイルス感染アッセイを、この場合にはエンベロープ細胞株をR5親和性ウイルスで置き換えたことを除いて、エンベロープ媒介細胞融合アッセイと同じように行った。HEK293−CCR5細胞(7、T.Schwartz(Copenhagen)によって厚意により提供された)を24ウエルプレートに播種した(1.2x105細胞/ウエル)。一晩インキュベーションした後、競合的結合を、0.5mlの「結合緩衝液」(1mMのCaCl2、5mMのMgCl2および0.5%(w/v)ウシ血清アルブミンが補充された50mMのHEPES(pH7.4))において12pMの[125I]MIP−1−α(Amersham)および様々な量の非標識リガンドを使用して、4℃で3時間、細胞全体に対して行った。インキュベーション後、細胞を、0.5MのNaClが補充された氷冷の結合緩衝液で4回素早く洗浄した。細胞を、3M酢酸、8M尿素および2%NP−40からなる1mlに溶解した。溶解物を、Beckmanガンマ4000シンチレーション・カウンタを使用して1分間計数した。測定を二連で行い、IC50値を、Prismソフトウエアを使用して近似された単相の濃度阻害曲線から得た。表2には、化合物番号19および23により予備スクリーニングで示された、NNY−RANTESを上回る効力の増大が例示される。
無細胞ウイルス感染アッセイを、この場合にはエンベロープ細胞株をR5親和性ウイルスで置き換えたことを除いて、エンベロープ媒介細胞融合アッセイと同じように行った。HEK293−CCR5細胞(7、T.Schwartz(Copenhagen)によって厚意により提供された)を24ウエルプレートに播種した(1.2x105細胞/ウエル)。一晩インキュベーションした後、競合的結合を、0.5mlの「結合緩衝液」(1mMのCaCl2、5mMのMgCl2および0.5%(w/v)ウシ血清アルブミンが補充された50mMのHEPES(pH7.4))において12pMの[125I]MIP−1−α(Amersham)および様々な量の非標識リガンドを使用して、4℃で3時間、細胞全体に対して行った。インキュベーション後、細胞を、0.5MのNaClが補充された氷冷の結合緩衝液で4回素早く洗浄した。細胞を、3M酢酸、8M尿素および2%NP−40からなる1mlに溶解した。溶解物を、Beckmanガンマ4000シンチレーション・カウンタを使用して1分間計数した。測定を二連で行い、IC50値を、Prismソフトウエアを使用して近似された単相の濃度阻害曲線から得た。表2には、化合物番号19および23により予備スクリーニングで示された、NNY−RANTESを上回る効力の増大が例示される。
実施例11:抗CCR5化合物および抗CXCR4化合物による組合せ処置
下記の実施例では、HIV感染を阻止するために、そしてHIVのR5株からX4株への潜在的な変換を阻止するために、抗CCR5(例えば、NNY−RANTES)および抗CXCR4(例えば、SDF−1アンタゴニストまたはAMD3100)を組み合わせて用いることの保護効果が例示される。SCIDマウス・モデルがこの目的のために利用された。具体的には、NNY−RANTESおよびAMD3100(小さい有機分子の抗X4剤)の保護効果をSCIDマウスで試験した。この場合、SCIDマウスは、Mosier、Adv.Immunol.(1996)63:79〜125;Picchio他、J.Virol.(1997)71:7124〜7127;Picchio他、J.Virol.(1998)72:2002〜2009;Offord他、国際特許出願公開WO99/11666に記載される方法に従って、ヒト末梢血白血球とともに再度飼育され、HIV−1で抗原刺激された。NNY−RANTESは表Xのように投与され、AMD3100は200mg/mlの溶液として使用された。抗原刺激は、AMD3100群単独を除き、R5のHIVウイルスを用いて行われた。回避変異体は組合せ療法では認められず、そして適切に処置されたマウスはすべて、実験期間を通してウイルスを有しないままであった。このことは、本発明のN末端RANTES誘導体、C末端RANTES誘導体およびN末端/C末端RANTES誘導体が、哺乳動物におけるHIV感染を阻止するために、AMD3100またはSDF−1アンタゴニスト(本明細書中に記載される化合物など)などの抗X4株化合物との組合せで使用できることを示している。
下記の実施例では、HIV感染を阻止するために、そしてHIVのR5株からX4株への潜在的な変換を阻止するために、抗CCR5(例えば、NNY−RANTES)および抗CXCR4(例えば、SDF−1アンタゴニストまたはAMD3100)を組み合わせて用いることの保護効果が例示される。SCIDマウス・モデルがこの目的のために利用された。具体的には、NNY−RANTESおよびAMD3100(小さい有機分子の抗X4剤)の保護効果をSCIDマウスで試験した。この場合、SCIDマウスは、Mosier、Adv.Immunol.(1996)63:79〜125;Picchio他、J.Virol.(1997)71:7124〜7127;Picchio他、J.Virol.(1998)72:2002〜2009;Offord他、国際特許出願公開WO99/11666に記載される方法に従って、ヒト末梢血白血球とともに再度飼育され、HIV−1で抗原刺激された。NNY−RANTESは表Xのように投与され、AMD3100は200mg/mlの溶液として使用された。抗原刺激は、AMD3100群単独を除き、R5のHIVウイルスを用いて行われた。回避変異体は組合せ療法では認められず、そして適切に処置されたマウスはすべて、実験期間を通してウイルスを有しないままであった。このことは、本発明のN末端RANTES誘導体、C末端RANTES誘導体およびN末端/C末端RANTES誘導体が、哺乳動物におけるHIV感染を阻止するために、AMD3100またはSDF−1アンタゴニスト(本明細書中に記載される化合物など)などの抗X4株化合物との組合せで使用できることを示している。
実施例12:RANTES類似物G1755−01の調製
図11に示されるRANTES類似物G1755−01は下記のように合成された。
図11に示されるRANTES類似物G1755−01は下記のように合成された。
1.AOP−[RANTES(2−33)]−チオエステルの調製
配列:アミノオキシペンタン−グリオキサリル−PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK−チオエステル(配列番号30) N末端のアミノオキシペンタン−グリオキサリル−オキシム成分(AOP)を含有するN末端ペプチドセグメントのAOP−[RANTES(2−33)]−αチオエステル(これはまた−C(O)SRとして示される)を、チオエステル生成樹脂(Hackeng他、PNAS(1999)96:10068〜10073)上でRANTES(2−33)配列を組み立てることによって合成し、その後、標準的なプロトコル(Wilken他、Chemistry&Biology(1999)6(1):43〜51)に従ってアミノオキシペンタン−グリオキサリルオキシム成分[すなわち、CH3(CH2)4−O−N=CHCOOH]を樹脂に直接カップリングすることによってN末端において修飾した。ペプチド−樹脂をフッ化水素で切断し、逆相HPLCによって精製して、α−カルボキシチオエステルペプチドのAOP−RANTES(2−33)−チオエステルを得た。測定質量=4179.64Da;計算質量=4178.57Da(平均同位体組成)。
配列:アミノオキシペンタン−グリオキサリル−PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK−チオエステル(配列番号30) N末端のアミノオキシペンタン−グリオキサリル−オキシム成分(AOP)を含有するN末端ペプチドセグメントのAOP−[RANTES(2−33)]−αチオエステル(これはまた−C(O)SRとして示される)を、チオエステル生成樹脂(Hackeng他、PNAS(1999)96:10068〜10073)上でRANTES(2−33)配列を組み立てることによって合成し、その後、標準的なプロトコル(Wilken他、Chemistry&Biology(1999)6(1):43〜51)に従ってアミノオキシペンタン−グリオキサリルオキシム成分[すなわち、CH3(CH2)4−O−N=CHCOOH]を樹脂に直接カップリングすることによってN末端において修飾した。ペプチド−樹脂をフッ化水素で切断し、逆相HPLCによって精製して、α−カルボキシチオエステルペプチドのAOP−RANTES(2−33)−チオエステルを得た。測定質量=4179.64Da;計算質量=4178.57Da(平均同位体組成)。
2.[RANTES(34−68)]−Lys69(GP6)−Leu70の調製
配列:CSNPAVVFVT RKNRQVCANPEKKWVREYIN SLEMSK(GP6)L(配列番号31)(式中、GP6はLys69のεNに結合している):
配列:CSNPAVVFVT RKNRQVCANPEKKWVREYIN SLEMSK(GP6)L(配列番号31)(式中、GP6はLys69のεNに結合している):
a.固相ペプチド合成および{ペプチド樹脂}上での水溶性ポリマー合成
C末端ペプチドセグメントの[RANTES(34−68)]−Lys69(Fmoc)−Leu70を、Schnolzer他、Int.J.Pep.ProteinRes.40:180〜193に記載されるようなBoc化学固相ペプチド合成のためのインシトゥー中和/HBTU活性化プロトコルを使用してBoc−Leu−OCH2−Pam−樹脂における通常の固相ペプチド合成によって合成した。
C末端ペプチドセグメントの[RANTES(34−68)]−Lys69(Fmoc)−Leu70を、Schnolzer他、Int.J.Pep.ProteinRes.40:180〜193に記載されるようなBoc化学固相ペプチド合成のためのインシトゥー中和/HBTU活性化プロトコルを使用してBoc−Leu−OCH2−Pam−樹脂における通常の固相ペプチド合成によって合成した。
鎖の組立てが完了した後、Lys69のε−窒素におけるFmoc基を、20%のピペリジンを含むDMFで処理することによって保護ペプチド−樹脂から除いた。その後、無水コハク酸(Succ)を、DIEAを含有するDMFにおけるHOBT(ヒドロキシベンゾトリアゾール)溶液中でLys69のε−窒素にカップリングした。洗浄後、樹脂に結合したコハク酸の自由なカルボキシル基を、カルボニルジイミダゾールを含むDMFを添加することによって活性化した。もう1回の洗浄サイクルの後、0.5MのHOBTを含むDMFにおける50%の(4,7,10)−トリオキサトリデカン−1,13−ジアミン(TTD)を付加させた。洗浄後、樹脂に結合したポリマーは、次サイクルの無水コハク酸カップリング/CDI活性化/TTDカップリングに使用することができた。6回のサイクルの後、無水コハク酸をHOBT/DMF=DIEA溶液において最後のTTDアミンにカップリングして、アミド連結した−(Succ−TTD)6−Succ−OHポリマーを有するLys69修飾化合物を得た。
ペプチド/直鎖状水溶性ポリマー樹脂をフッ化水素で樹脂から切断し、生成物を調製用の逆相HPLCによって精製して、[RANTES(34−68)]−Lys69(GP6)−Leu70を得た。測定質量=6253Da;計算質量=6252Da(平均同位体組成)。
3.G1755−01の調製
配列:アミノオキシペンタン−グリオキサリル−PYSSDTTPCC FAYIARPLPR RAHIKEYFYTS GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY INSLEMSK(GP6)L(配列番号32)
上記に記載されるN末端完全非保護ペプチドセグメントおよびC末端完全非保護ペプチドセグメントを、Dawson他、Science、266:776〜779(1994)により記載されるような天然の化学的連結によって連結させた。還元型の全長のポリペプチド生成物を、0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水に対するアセトニトリルの直線グラジエントを用いて逆相HPLCを使用して精製した。測定質量=10,060Da。
配列:アミノオキシペンタン−グリオキサリル−PYSSDTTPCC FAYIARPLPR RAHIKEYFYTS GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY INSLEMSK(GP6)L(配列番号32)
上記に記載されるN末端完全非保護ペプチドセグメントおよびC末端完全非保護ペプチドセグメントを、Dawson他、Science、266:776〜779(1994)により記載されるような天然の化学的連結によって連結させた。還元型の全長のポリペプチド生成物を、0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水に対するアセトニトリルの直線グラジエントを用いて逆相HPLCを使用して精製した。測定質量=10,060Da。
GP6が結合している全長のポリペプチドを、標準的なプロトコル(Wilken他、Chemistry&Biology(1999)6(1):43〜51)に従って、システイン−シスチンのレドックス対を含有する水性緩衝液において2つのジスルフィド結合を同時に形成させることによって折り畳ませ、逆相HPLCによって精製した。折り畳まれた生成物はHPLCで均一であった。測定質量=10,056Da;計算質量=10,058Da(平均同位体組成)。
実施例13:RANTES類似物G1755の調製
図12に示されるG1755化合物は下記のように合成された。
図12に示されるG1755化合物は下記のように合成された。
1.n−ノナノイル−RANTES(2−33)の調製
配列:n−ノナノイル−PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK−チオエステル(配列番号33)
n−ノナノイル−RANTES(2−33)を、上記に記載されるようなチオエステル生成樹脂上で合成し、その後、n−ノナン酸を樹脂に直接カップリングすることによってN末端において修飾した。ペプチド樹脂をフッ化水素で切断し、逆相HPLCによって精製して、n−ノナノイル−RANTES(2−33)を得た。測定質量=4177Da;計算質量=4177.62Da(平均同位体組成)。
配列:n−ノナノイル−PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK−チオエステル(配列番号33)
n−ノナノイル−RANTES(2−33)を、上記に記載されるようなチオエステル生成樹脂上で合成し、その後、n−ノナン酸を樹脂に直接カップリングすることによってN末端において修飾した。ペプチド樹脂をフッ化水素で切断し、逆相HPLCによって精製して、n−ノナノイル−RANTES(2−33)を得た。測定質量=4177Da;計算質量=4177.62Da(平均同位体組成)。
2.RANTES(34−68)−Lys69(GP6)−Leu70の調製配列:CSNPAVVFVTRKNRQVCANP EKKWVREYIN SLEMSK(GP6)L(配列番号34)
a.固相ペプチド合成および{ペプチド樹脂}上での水溶性ポリマー合成
RANTES(34−68)−Lys69(Fmoc)−Leu70を、上記に記載されるようなBoc化学固相ペプチド合成のためのインシトゥー中和/HBTU活性化プロトコルを使用して、Boc−Leu−OCH2−Pam−樹脂における通常の固相ペプチド合成によって合成した。
a.固相ペプチド合成および{ペプチド樹脂}上での水溶性ポリマー合成
RANTES(34−68)−Lys69(Fmoc)−Leu70を、上記に記載されるようなBoc化学固相ペプチド合成のためのインシトゥー中和/HBTU活性化プロトコルを使用して、Boc−Leu−OCH2−Pam−樹脂における通常の固相ペプチド合成によって合成した。
鎖の組立てが完了した後、上記に記載されるように、Lys69のε−窒素におけるFmoc基を保護ペプチド−樹脂から除き、GP6構築物をペプチド樹脂上で合成した。ペプチド/直鎖状水溶性ポリマー樹脂をフッ化水素で切断し、生成物を調製用の逆相HPLCによって精製して、RANTES(34−68)−Lys69(GP6)−Leu70を得た。測定質量=6252.87Da;計算質量=6252.24Da(平均同位体組成)。
3.G1755の調製
配列:n−ノナノイル−PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY INSLEMSK(GP6)L(配列番号35)
a.天然の化学的連結による全長ポリペプチドの組立て
N末端完全非保護ペプチドセグメントおよびC末端完全非保護ペプチドセグメントを、実施例18において上記に記載されるような天然の化学的連結によって連結させた。還元型の全長のポリペプチドを、0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水に対するアセトニトリルの直線グラジエントを用いて逆相HPLCを使用して精製した。測定質量=10060.74Da;計算質量=10058.67Da(平均同位体組成)。
配列:n−ノナノイル−PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY INSLEMSK(GP6)L(配列番号35)
a.天然の化学的連結による全長ポリペプチドの組立て
N末端完全非保護ペプチドセグメントおよびC末端完全非保護ペプチドセグメントを、実施例18において上記に記載されるような天然の化学的連結によって連結させた。還元型の全長のポリペプチドを、0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水に対するアセトニトリルの直線グラジエントを用いて逆相HPLCを使用して精製した。測定質量=10060.74Da;計算質量=10058.67Da(平均同位体組成)。
b.水溶性ポリマーで修飾されたポリペプチドの折畳みおよび精製
GP6が結合している全長のポリペプチドを、上記に記載されるように、システイン−シスチンのレドックス対を含有する水性緩衝液において2つのジスルフィド結合を同時に形成させることによって折り畳ませ、逆相HPLCによって精製した。折り畳まれた生成物はHPLCで均一であった。測定質量=10057.43Da;計算質量=10054.67Da(平均同位体組成)。
GP6が結合している全長のポリペプチドを、上記に記載されるように、システイン−シスチンのレドックス対を含有する水性緩衝液において2つのジスルフィド結合を同時に形成させることによって折り畳ませ、逆相HPLCによって精製した。折り畳まれた生成物はHPLCで均一であった。測定質量=10057.43Da;計算質量=10054.67Da(平均同位体組成)。
実施例14:RANTES類似物G1805の調製
図13に示されるG1805化合物は下記のように合成された。
図13に示されるG1805化合物は下記のように合成された。
1.n−ノナノイル−RANTES(2−33)(Tyr3Chg)−チオエステルの調製
配列:n−ノナノイル−PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK−チオエステル(配列番号36)(式中、X=L−シクロヘキシルグリシン(Chg))
n−ノナノイル−RANTES(2−33)(Tyr3Chg)を、上記に記載されるようなチオエステル生成樹脂上で合成し、その後、n−ノナン酸を樹脂に直接カップリングすることによってN末端において修飾した。ペプチド樹脂をフッ化水素で切断し、逆相HPLCによって精製して、n−ノナノイル−RANTES(2−33)(Tyr3Chg)を得た。測定質量=4151.98Da;計算質量=4152.6Da(平均同位体組成)。
配列:n−ノナノイル−PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK−チオエステル(配列番号36)(式中、X=L−シクロヘキシルグリシン(Chg))
n−ノナノイル−RANTES(2−33)(Tyr3Chg)を、上記に記載されるようなチオエステル生成樹脂上で合成し、その後、n−ノナン酸を樹脂に直接カップリングすることによってN末端において修飾した。ペプチド樹脂をフッ化水素で切断し、逆相HPLCによって精製して、n−ノナノイル−RANTES(2−33)(Tyr3Chg)を得た。測定質量=4151.98Da;計算質量=4152.6Da(平均同位体組成)。
2.RANTES(34−68)(Met67Lys(Lev))−Lys69−Leu70の調製
配列:CSNPAVVFVT RKNRQVCANPEKKWVREYIN SLEK(Lev)SKL(配列番号37)
RANTES(34−68)(Met67Lys)−Lys69(Fmoc)−Leu70を、上記に記載されるようなBoc化学固相ペプチド合成のためのインシトゥー中和/HBTU活性化プロトコルを使用して、Boc−Leu−OCH2−Pam−樹脂における通常の固相ペプチド合成によって合成した。
配列:CSNPAVVFVT RKNRQVCANPEKKWVREYIN SLEK(Lev)SKL(配列番号37)
RANTES(34−68)(Met67Lys)−Lys69(Fmoc)−Leu70を、上記に記載されるようなBoc化学固相ペプチド合成のためのインシトゥー中和/HBTU活性化プロトコルを使用して、Boc−Leu−OCH2−Pam−樹脂における通常の固相ペプチド合成によって合成した。
鎖の組立てが完了した後、Lys67のε−窒素におけるFmoc基を、20%のピペリジンを含むDMFで処理することによって保護ペプチド−樹脂から除いた。レブリン酸を1,3−ジイソプロピルカルボジイミドで対称的な無水物として活性化して、Lys67のε−窒素にカップリングした。ペプチド−樹脂をフッ化水素で切断し、生成物を調製用の逆相HPLCによって精製して、RANTES(34−68)(Met67Lys(Lev))−Lys69−Leu70を得た。測定質量=4433.22Da;計算質量=4434.19Da(平均同位体組成)。
3.G1805の調製
配列:n−ノナノイル−PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY INSLEK(Lev−GP29)SKL(配列番号38)(式中、X=L−シクロヘキシルグリシン(Chg)、GP29=図13および図14に示される分枝状のオキシム連結した水溶性ポリマー構築物)
a.天然の化学的連結による全長ポリペプチドの組立て
N末端完全非保護ペプチドセグメントおよびC末端完全非保護ペプチドセグメントを、上記に記載されるような天然の化学的連結によって連結させた。還元型の全長ポリペプチドを、0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水に対するアセトニトリルの直線グラジエントを用いて逆相HPLCを使用して精製した。測定質量=8213.62Da;計算質量=8216.64Da(平均同位体組成)。
配列:n−ノナノイル−PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY INSLEK(Lev−GP29)SKL(配列番号38)(式中、X=L−シクロヘキシルグリシン(Chg)、GP29=図13および図14に示される分枝状のオキシム連結した水溶性ポリマー構築物)
a.天然の化学的連結による全長ポリペプチドの組立て
N末端完全非保護ペプチドセグメントおよびC末端完全非保護ペプチドセグメントを、上記に記載されるような天然の化学的連結によって連結させた。還元型の全長ポリペプチドを、0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水に対するアセトニトリルの直線グラジエントを用いて逆相HPLCを使用して精製した。測定質量=8213.62Da;計算質量=8216.64Da(平均同位体組成)。
b.水溶性ポリマーGP29の合成
i.多数のチオール基を有するテンプレートGRFNP17の合成
分岐コアテンプレートのGRFNP17を、0.4mmolスケールで、アミド生成(4−メチル)ベンズヒドリルアミン(MBHA)−樹脂上で手作業により合成した。Boc−Lys(Fmoc)−OHを、標準的なカップリング・プロトコル(Schnolzer,M.、IntJ Pept Protein Res.(1992)40:180〜93)、3.8mlの0.5M HBTUにおける4.2mmolのアミノ酸および10%のDIEA(すなわち、5倍過剰のアミノ酸)を使用してカップリングした。Fmoc保護基を除いた後、Fmoc−Lys(Fmoc)−OHを、標準的なカップリング・プロトコル(3.8mlの0.5MHBTUにおける2.1mmolのアミノ酸および10%のDIEA(すなわち、5倍過剰のアミノ酸)を使用してカップリングした。次のFmoc除去ステップの後、Fmoc−Lys(Fmoc)−OHを、標準的なカップリング・プロトコル(7.6mlの0.5MHBTUにおける4.2mmolのアミノ酸および10%のDIEA(すなわち、自由なアミンに対して5倍過剰のアミノ酸)を使用してカップリングした。最後のFmoc脱保護ステップの後、(自由なアミンに対して)5倍過剰のS−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステル(SAMA−oPfp)をDMF中で30分間カップリングした。C末端リシル残基のt−Boc保護基を、純TFAを用いた1分間のバッチ洗浄を2回行い、その後、10%のDIEAを含むDMFで洗浄することによる樹脂の中和により除いた。2mmolのBoc−アミノオキシ酢酸および2mmolのN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を3mlのDMFに溶解した。2mmolのDIC(ジイソプロピルカルボジイミド)を加えた後、酸を30〜60分間活性化した。この溶液を中和後の樹脂に加え、カップリングを1時間行った。最後に、S−連結しているアセチル基の除去を、20%のピペリジンを含むDMFを用いて30分間行った。テンプレートを、自由なアルデヒドに対するスカベンジャとしてのシステインの存在下での標準的なBoc化学手法(Schnolzer,M.、IntJ Pept Protein Res.(1992)40:180〜93)に従ってHF/p−クレゾールを使用して脱保護し、同時に樹脂担体から切断した。50%B[すなわち、0.1%のTFAを含有する50%の水性アセトニトリル](アルデヒド含まず)における回収されたポリアミドを凍結し、凍結乾燥した。精製のために、テンプレートの粗生成物を2mlの50%Bに溶解して、100mlの100%A[すなわち、0.1%のTFAを含む水]を加えて、サンプルを希釈した(アルデヒドの付加が保証されているので、塩化グアニジニウムまたは酢酸塩の添加を避ける)。テンプレートを、3%のBでT=40℃において平衡化された調製用のC4逆相HPLCカラムに負荷した。塩をアイソクラティック溶出して、所望するテンプレートのGRFNP17を直線グラジエントで精製した。所望する生成物を含有する画分をES−MSによって同定して、集め、凍結乾燥した。
i.多数のチオール基を有するテンプレートGRFNP17の合成
分岐コアテンプレートのGRFNP17を、0.4mmolスケールで、アミド生成(4−メチル)ベンズヒドリルアミン(MBHA)−樹脂上で手作業により合成した。Boc−Lys(Fmoc)−OHを、標準的なカップリング・プロトコル(Schnolzer,M.、IntJ Pept Protein Res.(1992)40:180〜93)、3.8mlの0.5M HBTUにおける4.2mmolのアミノ酸および10%のDIEA(すなわち、5倍過剰のアミノ酸)を使用してカップリングした。Fmoc保護基を除いた後、Fmoc−Lys(Fmoc)−OHを、標準的なカップリング・プロトコル(3.8mlの0.5MHBTUにおける2.1mmolのアミノ酸および10%のDIEA(すなわち、5倍過剰のアミノ酸)を使用してカップリングした。次のFmoc除去ステップの後、Fmoc−Lys(Fmoc)−OHを、標準的なカップリング・プロトコル(7.6mlの0.5MHBTUにおける4.2mmolのアミノ酸および10%のDIEA(すなわち、自由なアミンに対して5倍過剰のアミノ酸)を使用してカップリングした。最後のFmoc脱保護ステップの後、(自由なアミンに対して)5倍過剰のS−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステル(SAMA−oPfp)をDMF中で30分間カップリングした。C末端リシル残基のt−Boc保護基を、純TFAを用いた1分間のバッチ洗浄を2回行い、その後、10%のDIEAを含むDMFで洗浄することによる樹脂の中和により除いた。2mmolのBoc−アミノオキシ酢酸および2mmolのN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を3mlのDMFに溶解した。2mmolのDIC(ジイソプロピルカルボジイミド)を加えた後、酸を30〜60分間活性化した。この溶液を中和後の樹脂に加え、カップリングを1時間行った。最後に、S−連結しているアセチル基の除去を、20%のピペリジンを含むDMFを用いて30分間行った。テンプレートを、自由なアルデヒドに対するスカベンジャとしてのシステインの存在下での標準的なBoc化学手法(Schnolzer,M.、IntJ Pept Protein Res.(1992)40:180〜93)に従ってHF/p−クレゾールを使用して脱保護し、同時に樹脂担体から切断した。50%B[すなわち、0.1%のTFAを含有する50%の水性アセトニトリル](アルデヒド含まず)における回収されたポリアミドを凍結し、凍結乾燥した。精製のために、テンプレートの粗生成物を2mlの50%Bに溶解して、100mlの100%A[すなわち、0.1%のTFAを含む水]を加えて、サンプルを希釈した(アルデヒドの付加が保証されているので、塩化グアニジニウムまたは酢酸塩の添加を避ける)。テンプレートを、3%のBでT=40℃において平衡化された調製用のC4逆相HPLCカラムに負荷した。塩をアイソクラティック溶出して、所望するテンプレートのGRFNP17を直線グラジエントで精製した。所望する生成物を含有する画分をES−MSによって同定して、集め、凍結乾燥した。
ii.分枝状水溶性ポリマーGRFNP29の合成
GRFNP29、すなわち、15kDの分子量を有する分枝状の(TTD−Succ)12ポリマーを、精製されたチオール含有テンプレートGRFNP17と直鎖状ポリマーGRFNP31のBr−アセチル−(TTD−Succ)12−カルボキシラートとのチオエステル生成連結によって合成した。GRFNP31は、標準的なプロトコル(Rose他、米国特許出願第09/379,297号;Rose他、JAm Chem Soc.(1999)121:7034)に従ってSasrinカルボキシ生成樹脂上で合成され、ブロモアセチル化され、そして精製された。
GRFNP29、すなわち、15kDの分子量を有する分枝状の(TTD−Succ)12ポリマーを、精製されたチオール含有テンプレートGRFNP17と直鎖状ポリマーGRFNP31のBr−アセチル−(TTD−Succ)12−カルボキシラートとのチオエステル生成連結によって合成した。GRFNP31は、標準的なプロトコル(Rose他、米国特許出願第09/379,297号;Rose他、JAm Chem Soc.(1999)121:7034)に従ってSasrinカルボキシ生成樹脂上で合成され、ブロモアセチル化され、そして精製された。
(全チオールに対して)1.3倍モル過剰の精製されたGRFNP31のBr−アセチル化(EDA−Succ)12と、精製されたチオール含有テンプレートGRFNP17とを0.1MのTris−HCl/6M塩化グアニジニウム(pH8.7)に約10mMの濃度で一緒に溶解した。溶解後、溶液を0.1MのTris−HCl(pH8.7)緩衝液で3倍(v/v)に希釈した。連結混合物を室温で撹拌し、反応を逆相HPLCおよびES/MSによってモニタした。所望する反応生成物が主生成物になるまで、さらなるGRFNP31反応物を必要に応じて加えた。処理のために、3倍(v/v、連結混合物に対して)の0.1M酢酸塩/6M塩化グアニジニウム(pH4)を加え、溶液を調製用のC4逆相HPLCカラムに負荷し、直線グラジエントを用いて精製した。GRFNP29構築物を含有する画分を、ES−MSを使用して同定し、集めて、凍結乾燥した。
c.連結された全長のポリペプチドに対するGP29の結合
凍結乾燥された全長のポリペプチドを溶解して、0.1%のTFAを含有する50%水性アセトニトリルにおける等モル量のアミノオキシアセチル(AOA)含有分枝状水溶性ポリマー構築物GP29とともに同時に凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、逆相HPLCによって精製して、67位のリジンの修飾された側鎖におけるケト官能基へのオキシム結合によってGP29が共有結合的に結合している全長のポリペプチドを得た。このポリマー修飾されたペプチドは、調製的なグラジエントC4逆相HPLCによって非修飾のペプチドおよび未反応のポリマーから分離された。所望するポリマー修飾生成物を含有する画分をES−MSによって同定して、集めた。測定質量=23,835.92Da;計算質量=23,844.64Da(平均同位体組成)。あるいは、GP29を、ポリペプチドの折畳みの後に共有結合的に結合させたが、この場合には、低い収率がもたらされることが認められた。
凍結乾燥された全長のポリペプチドを溶解して、0.1%のTFAを含有する50%水性アセトニトリルにおける等モル量のアミノオキシアセチル(AOA)含有分枝状水溶性ポリマー構築物GP29とともに同時に凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、逆相HPLCによって精製して、67位のリジンの修飾された側鎖におけるケト官能基へのオキシム結合によってGP29が共有結合的に結合している全長のポリペプチドを得た。このポリマー修飾されたペプチドは、調製的なグラジエントC4逆相HPLCによって非修飾のペプチドおよび未反応のポリマーから分離された。所望するポリマー修飾生成物を含有する画分をES−MSによって同定して、集めた。測定質量=23,835.92Da;計算質量=23,844.64Da(平均同位体組成)。あるいは、GP29を、ポリペプチドの折畳みの後に共有結合的に結合させたが、この場合には、低い収率がもたらされることが認められた。
d.オキシム連結によるGP29を含有するポリペプチドの折り畳みおよび精製
GP29が結合している全長のポリペプチドを、上記に記載されるように、システイン−シスチンのレドックス対を含有する水性緩衝液において2つのジスルフィド結合を同時に形成させることによって折り畳ませ、逆相HPLCによって精製した。折り畳まれた生成物はHPLCで均一であった。測定質量=23,832Da;計算質量=23,840Da(平均同位体組成)。
GP29が結合している全長のポリペプチドを、上記に記載されるように、システイン−シスチンのレドックス対を含有する水性緩衝液において2つのジスルフィド結合を同時に形成させることによって折り畳ませ、逆相HPLCによって精製した。折り畳まれた生成物はHPLCで均一であった。測定質量=23,832Da;計算質量=23,840Da(平均同位体組成)。
実施例15:RANTES類似物G1806の調製
図14に示されるRANTES類似物G1806は下記のように合成された。
図14に示されるRANTES類似物G1806は下記のように合成された。
1.n−ノナノイル−RANTES(2−33)(Tyr3Chg)−チオエステルの調製
配列:ノナノイル−PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK−チオエステル(配列番号39)(式中、X=L−シクロヘキシルグリシン(Chg))
ペプチドセグメントのn−ノナノイル−RANTES(2−33)(Tyr3Chg)−チオエステル(−COSR(式中、Rはアルキル基である)として示されるチオエステル)を、上記に記載されるようなチオエステル生成樹脂上で合成し、その後、n−ノナン酸を樹脂に直接カップリングすることによってN末端において修飾した。ペプチド樹脂をフッ化水素で切断し、逆相HPLCによって精製して、n−ノナノイル−RANTES(2−33)Tyr3Chgを得た。測定質量=4151.98Da;計算質量=4152.6Da(平均同位体組成)。
配列:ノナノイル−PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK−チオエステル(配列番号39)(式中、X=L−シクロヘキシルグリシン(Chg))
ペプチドセグメントのn−ノナノイル−RANTES(2−33)(Tyr3Chg)−チオエステル(−COSR(式中、Rはアルキル基である)として示されるチオエステル)を、上記に記載されるようなチオエステル生成樹脂上で合成し、その後、n−ノナン酸を樹脂に直接カップリングすることによってN末端において修飾した。ペプチド樹脂をフッ化水素で切断し、逆相HPLCによって精製して、n−ノナノイル−RANTES(2−33)Tyr3Chgを得た。測定質量=4151.98Da;計算質量=4152.6Da(平均同位体組成)。
2.RANTES(34−68)(Met67Lys(Lev))−Lys69(Palm)−Leu70の調製
配列:CSNPAVVFVT RKNRQVCANPEKKWVREYIN SLEK(Lev)SK(Palm)L(配列番号40)
式中、K(Lev)は、野生型RANTESからのMet67Lys変化体のLys67のレブリン酸修飾されたε−窒素であり、K(Palm)は、下記の構造を有するアミノオクタン酸成分を介して結合してLys69のパルミチン酸修飾されたε−窒素である:
[Lys69のε−窒素]−C(O)−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−NH−C(O)−(CH2)14−CH3
RANTES(34−68)(Met67Lys)−Lys69(Palm)−Leu70を、上記に記載されるようなBoc化学固相ペプチド合成のためのインシトゥー中和/HBTU活性化プロトコルを使用して、Boc−Leu−OCH2−Pam−樹脂における通常の固相ペプチド合成によって合成した。Boc−Lys(Fmoc)−OHを69位においてカップリングした後、Fmoc基を、20%のピペリジンを含むDMF中で切断した。Fmoc−8−アミノオクタン酸をHBTU/DIEAで活性化して、Lys69のε−窒素にカップリングした。Fmoc基を除いた後、パルミチン酸を1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HATU)および1,3−ジイソプロピルカルボジイミドで活性化して、樹脂にカップリングした。その後、鎖の組立てを、上記に記載されるような標準的なBoc化学SPPS法を使用して完了させた。鎖の組立てが完了した後、Lys67のε−窒素におけるFmoc基を、20%のピペリジンを含むDMF中での処理により除いた。レブリン酸を1,3−ジイソプロピルカルボジイミドで対称的な無水物として活性化して、Lys67のε−窒素にカップリングした。ペプチド樹脂をフッ化水素で切断し、生成物を調製用の逆相HPLCによって精製して、RANTES(34−68)(Met67Lys(Lev))−Lys69(パルミタート)−Leu70を得た。測定質量=4813.72Da;計算質量=4813.81Da(平均同位体組成)。
配列:CSNPAVVFVT RKNRQVCANPEKKWVREYIN SLEK(Lev)SK(Palm)L(配列番号40)
式中、K(Lev)は、野生型RANTESからのMet67Lys変化体のLys67のレブリン酸修飾されたε−窒素であり、K(Palm)は、下記の構造を有するアミノオクタン酸成分を介して結合してLys69のパルミチン酸修飾されたε−窒素である:
[Lys69のε−窒素]−C(O)−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−NH−C(O)−(CH2)14−CH3
RANTES(34−68)(Met67Lys)−Lys69(Palm)−Leu70を、上記に記載されるようなBoc化学固相ペプチド合成のためのインシトゥー中和/HBTU活性化プロトコルを使用して、Boc−Leu−OCH2−Pam−樹脂における通常の固相ペプチド合成によって合成した。Boc−Lys(Fmoc)−OHを69位においてカップリングした後、Fmoc基を、20%のピペリジンを含むDMF中で切断した。Fmoc−8−アミノオクタン酸をHBTU/DIEAで活性化して、Lys69のε−窒素にカップリングした。Fmoc基を除いた後、パルミチン酸を1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HATU)および1,3−ジイソプロピルカルボジイミドで活性化して、樹脂にカップリングした。その後、鎖の組立てを、上記に記載されるような標準的なBoc化学SPPS法を使用して完了させた。鎖の組立てが完了した後、Lys67のε−窒素におけるFmoc基を、20%のピペリジンを含むDMF中での処理により除いた。レブリン酸を1,3−ジイソプロピルカルボジイミドで対称的な無水物として活性化して、Lys67のε−窒素にカップリングした。ペプチド樹脂をフッ化水素で切断し、生成物を調製用の逆相HPLCによって精製して、RANTES(34−68)(Met67Lys(Lev))−Lys69(パルミタート)−Leu70を得た。測定質量=4813.72Da;計算質量=4813.81Da(平均同位体組成)。
3.G1806の調製
配列:ノナノイル−PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY INSLEK(Lev−GP29)SK(Palm)L(配列番号41)式中、X=L−シクロヘキシルグリシン(Chg)、パルミタート(「Palm」)脂肪酸結合は下記のアミノオクタン酸成分を介してである:
[Lys69のε−窒素]−C(O)−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−NH−C(O)−(CH2)14−CH3
a.天然の化学的連結による脂肪酸修飾全長ポリペプチドの組立て
N末端完全非保護ペプチドセグメントおよびC末端完全非保護ペプチドセグメントを、上記に記載されるような天然の化学的連結によって連結させた。還元型の全長ポリペプチドを、0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水に対するアセトニトリルの直線グラジエントを用いた逆相HPLCを使用して精製した。測定質量=8598.21Da;計算質量=8596.27Da(平均同位体組成)。
配列:ノナノイル−PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY INSLEK(Lev−GP29)SK(Palm)L(配列番号41)式中、X=L−シクロヘキシルグリシン(Chg)、パルミタート(「Palm」)脂肪酸結合は下記のアミノオクタン酸成分を介してである:
[Lys69のε−窒素]−C(O)−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−NH−C(O)−(CH2)14−CH3
a.天然の化学的連結による脂肪酸修飾全長ポリペプチドの組立て
N末端完全非保護ペプチドセグメントおよびC末端完全非保護ペプチドセグメントを、上記に記載されるような天然の化学的連結によって連結させた。還元型の全長ポリペプチドを、0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水に対するアセトニトリルの直線グラジエントを用いた逆相HPLCを使用して精製した。測定質量=8598.21Da;計算質量=8596.27Da(平均同位体組成)。
b.連結された脂肪酸修飾全長ポリペプチドに対する水溶性ポリマーGP29の結合
凍結乾燥された全長のポリペプチドを溶解して、等モル量のAOA含有ポリマーGP29とともに同時に凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、逆相HPLCによって精製して、67位のリジンの修飾された側鎖におけるケト官能基へのオキシム結合によりGP29が共有結合的に結合している全長のポリペプチドを得た。測定質量=24217Da;計算質量=24,224Da(平均同位体組成)。あるいは、GP29は、ポリペプチドの折畳みの後に共有結合的に結合させることができるが、この場合には、低い収率がもたらされることが認められた。
凍結乾燥された全長のポリペプチドを溶解して、等モル量のAOA含有ポリマーGP29とともに同時に凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、逆相HPLCによって精製して、67位のリジンの修飾された側鎖におけるケト官能基へのオキシム結合によりGP29が共有結合的に結合している全長のポリペプチドを得た。測定質量=24217Da;計算質量=24,224Da(平均同位体組成)。あるいは、GP29は、ポリペプチドの折畳みの後に共有結合的に結合させることができるが、この場合には、低い収率がもたらされることが認められた。
c.オキシム連結によるGP29および脂肪酸を含有するポリペプチドの折畳みおよび精製
GP29が結合している全長のポリペプチドを、上記に記載されるように、システイン−シスチンのレドックス対を含有する水性緩衝液において2つのジスルフィド結合を同時に形成させることによって折り畳ませ、逆相HPLCによって精製した。折り畳まれた生成物はHPLCで均一であった。測定質量=24210.10Da;計算質量=24,220.17Da(平均同位体組成)。
GP29が結合している全長のポリペプチドを、上記に記載されるように、システイン−シスチンのレドックス対を含有する水性緩衝液において2つのジスルフィド結合を同時に形成させることによって折り畳ませ、逆相HPLCによって精製した。折り畳まれた生成物はHPLCで均一であった。測定質量=24210.10Da;計算質量=24,220.17Da(平均同位体組成)。
図15には、精製後の最終的な折り畳まれた合成Rantes類似物を表す分析データが示される。具体的には、還元条件下(R)および非還元条件下(N)において合成ケモカイン類似物RANTESのG1806に対する野生型(Wt)RANTESの相対的分子量を比較する代表的なSDS−PAGEゲルが図15に示される。相対的分子量はそれぞれのゲルの左側に示され、これは、同じゲルで泳動された分子量標準物(示されず)に対応する。折り畳まれた精製後のG1806生成物の代表的なRP−HPLCクロマトグラムもまた示される。これは、野生型の天然RANTESと比較して、精密にポリマー修飾された構築物の純度および増大した相対的分子量を例示している。
実施例16:G1755−01、G1755、G1805およびG1806に対する細胞融合アッセイ
細胞融合アッセイを、これらの様々なポリマー修飾されたRANTES類似物の抗HIV活性を調べるために行った。用いられた手順は実施例9に記載される通りである。代表的な結果を下記の表3に示す。
細胞融合アッセイを、これらの様々なポリマー修飾されたRANTES類似物の抗HIV活性を調べるために行った。用いられた手順は実施例9に記載される通りである。代表的な結果を下記の表3に示す。
これらの結果は、抗融合活性が直鎖状の水溶性ポリマー構築物または分枝状の水溶性ポリマー構築物のいずれかによる部位特異的な修飾の後で実質的に保持されていることを明らかにしている。この結果は、脂肪酸などの疎水性の成分がC末端に結合しているときに様々なRANTES類似物の活性の増大が認められたことを考えれば驚くべきことであったが、このことは、RANTES類似物の疎水性を増大させることは一般に抗融合活性を増大させるという仮説を裏付けていた。対照的に、修飾のために使用された水溶性ポリマー(特に、分枝状の水溶性ポリマー)は非常に親水性で、負に荷電しているが、それにもかかわらず、invivo活性について求められている標的の効力範囲内に十分に含まれる活性のわずかな低下が認められただけであった。さらにより予想外のことは、負に荷電した大きい分枝状の水溶性ポリマー構築物で修飾されたRANTES類似物の活性が、より小さい直鎖状の水溶性ポリマー構築物と比較して相対的に保持されていたことであり、そして小さい直鎖状ポリマーおよび分枝状ポリマーで修飾された類似物が活性に対して実質的に同じ効果を有していたことであった。この後者の観測結果は、部分的には、水溶性ポリマーによる修飾が、設計されたように、凝集部位における野生型RANTESのペンダントC末端残基に対して内側で行われるときの抗凝集性のためであり、かつ/または水溶性ポリマーの局在化した抗融合性のためであると考えられる。
効力を増大させるさらなる変化により、AOP−RANTESおよびNNY−RANTESに対して、水溶性ポリマーの結合から生じる大きくない活性喪失が補償された。これらの変化には、1つまたは複数の疎水性アミノ酸誘導体をN末端に導入すること、疎水性の脂肪酸成分をC末端に付加することが含まれた。これらの結果は、単分散のポリアミドエチレンポリマー(または他の水溶性ポリマー)と組み合わせたさらなる変化は、NNY型およびAOP型の修飾ケモカイン分子、例えば、N末端に対するPro2ThzとTyr3Chgとの混合型変化、および/またはC末端に対する脂質成分の付加を有するAOP−RANTESまたはNNY−RANTESなどの全体的な効力を改善し得ることを示している。
実施例17:G1755、G1805およびG1806に対する薬物動態学的研究
ポリマー修飾されたRANTES類似物の薬物動態学的研究をオスのSprague−Dawleyラットで下記のように行った。上記に記載されるように調製されたRANTES類似物のG1755、G1805およびG1806(およびコントロールとしてのAOP−RANTES)を、pH7.0のリン酸塩緩衝化生理的食塩水における凍結乾燥タンパク質保存物から注射直前に静脈内(IV)注射のために配合した。配合物は、個々の試験動物に対して等モル量のRANTES類似物が与えられるように調製された[400μg/kg(AOP−RANTES);510μg/kg(G1755);1210μg/kg(G1805);および1225μg/kg(G1806)(μg類似物/kg動物)]。最終濃度物は、それぞれの動物について1ml/kgの総投薬容量が与えられるように、必要な場合には調節された(すなわち、投薬容量は一定に保たれた)。それぞれの配合された類似物は実験の1日目にラットの尾を介して静脈内投与された。それぞれの動物は1回の投薬を受けた。
ポリマー修飾されたRANTES類似物の薬物動態学的研究をオスのSprague−Dawleyラットで下記のように行った。上記に記載されるように調製されたRANTES類似物のG1755、G1805およびG1806(およびコントロールとしてのAOP−RANTES)を、pH7.0のリン酸塩緩衝化生理的食塩水における凍結乾燥タンパク質保存物から注射直前に静脈内(IV)注射のために配合した。配合物は、個々の試験動物に対して等モル量のRANTES類似物が与えられるように調製された[400μg/kg(AOP−RANTES);510μg/kg(G1755);1210μg/kg(G1805);および1225μg/kg(G1806)(μg類似物/kg動物)]。最終濃度物は、それぞれの動物について1ml/kgの総投薬容量が与えられるように、必要な場合には調節された(すなわち、投薬容量は一定に保たれた)。それぞれの配合された類似物は実験の1日目にラットの尾を介して静脈内投与された。それぞれの動物は1回の投薬を受けた。
注射後、約0.25mlの血液が、実験期間中、それぞれのサンプル採取時点で尾静脈/動脈から採取され、そして血漿サンプルまたは血清サンプルが、抗凝固剤としてEDTAを使用して調製された。これらは標準的なプロトコルおよび国立衛生研究所動物管理指針および推奨される試験手順に従った。サンプル採取回数は、(国立衛生研究所動物管理指針によって確立されているように)3週間以内にどの動物からも0.25mlの14個を超えるサンプルの採取を避けるために、最初のデータ収集に基づいて調節された。さらなるサンプルは、検出可能な血中レベルが最初のサンプルを超えて持続している場合には1週間の間隔で採取された。各時点におけるそれぞれのRANTES類似物の血漿中濃度は、Quantikine(登録商標)ElisaのヒトRANTES免疫アッセイ(R&DSystemsカタログ#DRN00)を製造者の説明書に従って使用して測定された。体重、摂食癖、習性、外観などを含む動物の全体的な健康状態が実験期間中モニタされたが、明らかな副作用は認められなかった。代表的な結果が図16に示される。
これらの結果は、循環半減期の実質的な増大が、水溶性ポリマーを様々な前駆体RANTES類似物に結合することによってもたらされ、半減期の見かけの増大がG1805>G1806>G1755>AOP−RANTESであることを明らかにしている。AOP−RANTESに対して、増大は、G1805については約40倍であり、G1806については20倍であり、G1755については10倍であった。まとめると、水溶性ポリマーで修飾されたRANTES類似物の保持された大きい効力と著しく改善された循環半減期とのバランスは、invivo環境におけるこれらの化合物の治療効力を増強し、そして処置のために必要とされる投薬回数および投薬量を低下させることが期待される。
本明細書中で言及されるすべての刊行物および特許出願明細書は、それぞれの個々の刊行物または特許出願明細書が参考として組み込まれることが具体的かつ個々に示されたかのように同じ程度に参考として本明細書中に組み込まれる。
本発明はこのように詳しく記載されているので、多くの変化および改変が、添付された特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく本発明に対して行われ得ることは当業者には明らかである。
に有用である。
に有用である。
Claims (20)
- RANTES G1755,RANTES G1805,及びRANTES G1806から成る群から選択される合成ケモカインであって、当該合成ケモカインに結合する水溶性ポリマーを有し、該合成ケモカインが結合するケモカイン受容体のダウンモジュレーション(downmodulation)によって特徴付けられるin vitro生物活性を有する合成ケモカインにおいて、
(A)脂肪族鎖、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってN末端が修飾されているか、
または、
(B)脂肪族鎖、多環、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってC末端が修飾されているか、
または、
(C)脂肪族鎖、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってN末端が修飾され、かつ脂肪族鎖、多環、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってC末端が修飾され、
ここで、当該アミノ酸誘導体が式−(N−CnR−CO)−で表され (式中、nは1−22であり、Rは水素、アルキルまたは芳香族であり、N及びCn、N及びR、または、Cn及びRは環状構造を形成することができる。)、当該アミノ酸誘導体は他のアミノ酸誘導体と同じであっても異なっていてもよく、
ここで、当該水溶性ポリマーは、デキストラン、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストリン;グリコサミノグリカン;ヘパリン;硫酸ヘパラン;硫酸コンドロイチン;硫酸デルマタン;ヒアロロニン;ヒアルロン酸;ポリラクチド;オリゴアクチル−アクリレート;セルロース;メチルセルロース;カルボキシメチルセルロース;コラーゲン;ゼラチン;アルギン酸;デンプン;ポリアルキレンオキシド;ポリエチレンオキシド;エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール;エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー;ポリビニルアルコール、ポリビニルエチルエーテル;ポリビニルピロリドン;ポリオキシエチル化ポリオール(プルロニックポリオールを含む);ポリエステル、例えば、ポリ(グリコール酸);ポリ(L−乳酸);ポリ(D−乳酸);ポリ(DL−乳酸);ラクチド/グリコリドコポリマー;ポリ−1,3,6−トリオキサン;ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ(p−ジオキサノン)及びコポリマー;ポリカプロラクトン;PEG−ポリエステルコポリマー;ポリ(リン酸エステル);ポリ無水物;ポリグリセロール;からなる群から選択される、
合成ケモカイン。 - 水溶性ポリマーを有しない当該合成ケモカインと比較して10倍よりも大きいinvivo血清循環半減期を有する、請求項1に記載の合成ケモカイン。
- 当該水溶性ポリマーが、C末端部位、凝集部位、グリコシル化部位、及びグリコサミノグリカン(「GAG」)結合部位からなる群の中から選択された部位において当該合成ケモカインに結合している、請求項1に記載の合成ケモカイン。
- 当該水溶性ポリマーがC末端部位に結合している、請求項1に記載の合成ケモカイン。
- 当該水溶性ポリマーが凝集部位において結合している、請求項1に記載の合成ケモカイン。
- 当該水溶性ポリマーがグリコシル化部位において結合している、請求項1に記載の合成ケモカイン。
- 当該水溶性ポリマーがGAG部位において結合している、請求項1に記載の合成ケモカイン。
- 当該水溶性ポリマーが、アミノ、アミド、または、カルボン酸の群によって当該ケモカインと結合している、請求項1に記載の合成ケモカイン。
- 複数の水溶性ポリマーが、アミノ、アミド、または、カルボキシルの群によって当該ケモカインと結合しており、1以上の当該水溶性ポリマーが、選択的に、ジアミド・ユニット、ジアシド・ユニット、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、脂肪族成分(moiety)、あるいは、付加的な水溶性ポリマーから成る群から選択されたリンカー成分によって、当該アミノ、アミド、または、カルボキシルの群に結合し、
かつ、
アミノ、アミド、または、カルボン酸の群が、また、選択的に、当該リンカー成分によって当該ケモカインに結合している、
請求項8に記載の合成ケモカイン。 - 当該アミノ、アミド、または、カルボキシルの群が、当該ケモカインに共有結合されている官能基によって当該ケモカインに結合し、当該官能基が、オキシム、アミド、アミン、ウレタン、エーテル、チオエーテル、エステル、ヒドラジド、オキサゾリジン、及びチアゾリンから選択された結合(a bond)である、
請求項8に記載の合成ケモカイン。
- 当該水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド及びポリアミドアルキレンオキシドからなる群から選択される、請求項1に記載の合成ケモカイン。
- 当該水溶性ポリマーが、下記式:
−[C(O)−X−C(O)NH−Y−NH]n− または
−[NH−Y−NH−C(O)−X−C(O)]n−
のポリアミドであり、
該式中、XおよびYは、同じあるいは異なっていてもよく、かつ分枝状または直鎖状であってもよい二価の基であり、nは1〜100の整数である、請求項1に記載の合成ケモカイン。 - XおよびYのいずれかまたはその両方が、下記式:
−(O−CH2−CH2)n− および
−(CH2−CH2−O)n−
から選択された繰り返しユニットを含み、
該式中、nは1〜100の整数である、請求項12に記載の合成ケモカイン。 - 当該水溶性ポリマーが負の正味の荷電を有する、請求項1に記載の合成ケモカイン。
- 当該水溶性ポリマーが正の正味の荷電を有する、請求項1に記載の合成ケモカイン。
- 前記水溶性ポリマーが中性の正味の荷電を有する、請求項1に記載の合成ケモカイン。
- ウイルス感染の阻害を含む生物学的応答について、対応する野生型ケモカインのin vitro EC50と等しいか、またはそれよりも小さいin vitro EC50を有する合成ケモカインであって、当該合成ケモカインがその対応するケモカイン受容体の1つまたは複数に結合することを特徴とするinvitro細胞系アッセイにおいて前記EC50が測定され、当該受容体の1個以上がウイルス感染に対する共受容体である、
請求項1に記載の合成ケモカイン。 - 当該EC50が、1000nM、700nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、10nMおよび1nMからなる群から選択される濃度よりも小さい、請求項17に記載の合成ケモカイン。
- (1)対応する野生型ケモカインのEC50と等しいか、またはそれよりも小さいEC50を有し、前記EC50は、前記生物活性な合成ケモカインがその対応するケモカイン受容体の1つまたは複数に結合することを特徴とするinvitro細胞系アッセイにおいて測定され、前記受容体の1つまたは複数がウイルスの共受容体であり、
(2)水溶性ポリマーを有しない当該合成ケモカインと比較して10倍よりも大きい血清循環半減期を有する、
請求項1に記載の合成ケモカイン。 - 当該EC50が、1000nM、700nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、10nMおよび1nMからなる群から選択される濃度よりも小さい、請求項19に記載の生物活性な合成ケモカイン。
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