MXPA03000310A - Quimiocinas sinteticas bioactivas, modificadas con polimeros y metodos para su elaboracion y uso. - Google Patents

Abstract

La invencion se relaciona con quimiocinas sinteticas bioactivas modificadas con polimero, y a metodos para su produccion y uso. Las quimiocinas sinteticas bioactivas de la invencion comprenden una estructura principal de quimiocina polipeptidica modificada con polimero. Los compuestos y metodos de la invencion son utiles para el tratamiento de desordenes que involucran quimiocinas que se presentan de manera natural, tales como las que se usan para el tratamiento de VIH y desordenes relacionados con SIDA, y para el tratamiento de asma, rinitis alergica , dermatitis atopica, ateroma/aterosclerosis, rechazo de trasplante de organos y artritis reumatoide.

Description

QUIMIOCINAS SINTÉTICAS BIOACTIVAS, MODIFICADAS CON POLÍMEROS Y MÉTODOS PARA SU ELABORACIÓN Y USO CAMPO TÉCNICO La invención ae relaciona con quimiocinas sintéticas bioactivas modificadas con polímeros, especialmente antagonistas y agonistas de quimiocina así como métodos para su producción y uso. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las quimiocinas son proteínas pequeñas involucradas en el tráfico de leucocitos y en diversos procesos biológicos adicionales (Murphy et al., Pharmacological ev. (2000) 51 (1) : 145-176, Rollins, BJ . , Blood (1977) 90 ( 3 ) : 909 - 928 y Wells et al., Inflammation Res. (1999) 48:353-362) . La mayor parte de las quimiocinas localizan y mejoran la inflamación al inducir quimiotaxia y activación celular de diferente tipos de células inflamatorias, típicamente presentes en sitios inflamatorios. Algunas quimiocinas tienen propiedades adicionales a la quimiotaxia, tales como inducción de proliferación y activación de linfocitos citolíticos, modulación en el crecimiento de tipos de células progenitoras hematopoyéticas , tráfico de células progenitoras hematopoyéticas dentro y fuera de médula ósea en condiciones inflamatorias, angiogénesis y crecimiento de tumores. (Véase, por ejemplo, Baggiolini et al., Ann. Rev. Inwnunology (1997) REF: 144217 15:675-705; Zlotnik et al., Critical Rev. Iwmunology (1999) 1 (1):1-4; Wang et al . , J. Immunological Methods (1998) 220 (1-2) : 1-17; y Moser et al . , Jntl. Rev. Immunology (1998) 16 {3-4) :323-344) . Se conoce la secuencia de aminoácidos, estructura y función de muchas quimiocinas. Las quimiocinas tienen masas moleculares de aproximadamente 8 a 10 unidades kDa y muestran aproximadamente 20 a 50 por ciento de homología de secuencia entre sí a nivel proteínico. Las proteínas también comparten estructuras terciarias comunes. Todas las quimiocinas poseen muchos residuos cisterna conservados relacionados en la formación de enlaces disulfuro intramoleculares, los cuales se utilizan para identificar y clasificar las quimiocinas. Por ejemplo, las quimiocinas tienen dos primeros residuos cisteína separados por un solo aminoácido se les denominan quimiocinas "C-X-C" (también denominadas quimiocinas "alfa"). Las quimiocinas que tienen los primeros dos residuos cisteína adyacentes se les denomina quimiocinas "CC" (también denominadas quimiocinas "beta") . Las quimiocinas "C" difieren de otras quimiocinas por ausencia de un residuo cisteína (también denominadas quimiocinas "gamma") . Las quimiocinas C muestran similitud con algumos miembros de las quimiocinas CC pero han perdido el primero y tercer residuos cisteína que son característicos de las quimiocinas CC y CXC . Los miembros del pequeño grupo de quimiocinas con los dos primeros residuos cisteina separados por tres aminoácidos se denominan quimiocinas "CXXXC" (también denominadas quimiocinas "CX3C" o "delta") . También existen subgrupos de quimiocinas. Por ejemplo, se conocen quimiocinas CC que contienen dos residuos cisteina conservados adicionales, y algunas veces para este subgrupo se utiliza el término quimiocina "C6-beta". La mayor parte de las quimiocinas identificadas hasta la fecha son miembros de las clases de quimiocinas CC y CXC . Las quimiocinas se han relacionado en vías de enfermedad importantes, tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, cáncer, enfermedades virales, ateroma/aterosclerosis , artritis reumatoide y rechazo de transplante de órganos. Sin embargo, un problema general con muchas quimiocinas y su uso potencial como sustancias terapéuticas se relacionan con su propiedad inherente de promover o agravar las respuestas inflamatorias leucocíticas y la infección. Para este fin, se han realizado muchas modificaciones de las quimiocinas en un intento por generar un antagonista de la quimiocina de tipo silvestre correspondiente. Proudfot et al. (J. Biol . Chem. (1996) 271 (5) : 2599-2603) Simmons et al. (Science 276:276-279); Gong et al. (J. Biol. Chem. (1996) 271 ( 18 ): 10521 - 10527 ; Baggiolini et al. (J. Exp. Med. (1997) 186 (8) : 1189-1191) , Polo et al. (Eur. J. Immunol. (2000) 30:3190-3198), Nibba et al. (J. Immunol. (2000) 164:1488-1497) y Townson et al. (J. Biol.

Chem. (2000) . 276(50)39254-39261) reportan .de varias quimiocinas modificadas en la parte N terminal . Un ejemplo clásico y representativo de esta situación son las RANTES . Bajo ciertas condiciones, las RANTES de tipo silvestre pueden mejorar la inflamación e infección por VIH (Gordon et al., J. Virol . (1999) 73:684-694; Czaplewski et al., J. Biol. Chem. (1999) 274:16077-16084) . En contraste, las sustituciones en las posiciones 26 (E26A) y 66 (E66S) de la cadena polipeptídica de RANTES convierten a la molécula a su versión inflamatoria y mejoran su capacidad para competir con los receptores por VIH (Appay et al., J. Biol. Chem. (1999) 574 (39) : 27505 -27512 ; véase también la patene de E.U.A. 6,214,540, la cual describe quimiocinas que inhiben la infección por VIH y métodos basados en la misma) . Además, se han realizado modificaciones en la parte N terminal de RANTES que resultan en antagonistas que pueden bloquear la infección por VIH-1, que incluye un corte en la parte N terminal [RANTES 9-68], adición de metionina ( "Met -RANTES" ) , aminooxipentano ( "AOP-RANTES" ) o nonanoilo ( "NNY-RANTES" ) (Arenzana-Seisdedos , et al., Nature (1996) 333:400; Mack, et al., J. Exp . Med. (1998) 187:1215-1224; Proudfoot, et al., J. Biol. Chem. (1996) 271:2599-2603; Wells, et al., WO 96/17935; Simmons, et al., Science (1997) 276 -.216-219 ; Offord et al., WO 99/11666; y Mosier et al., J. Virology (1999) 73 (5) 3544-3550) . La patente de E.U.A. 6,168,784 describe el análogo de quimiocina NNY-Rantes y sugiere la modificación del análogo con cadenas de PEG en la parte C terminal. Wilkin et al. (Curr. Opinión Biotech. (1999) 9:412-426) revisan la síntesis química de proteínas. Las actividades biológicas de las quimiocinas están mediadas por receptores (Murphy et al., Pharmacological Rev. (2000) 51 (1) : 145-176, Rollins, BJ. , Blood (1997) 90 (3) :909-928 y Wells et al., Inflammation Res. (1999) 48:353-362). Estos incluyen receptores específicos de quimiocina así como receptores con especificidad superpuesta con ligandos que unen varias quimiocinas diferentes que pertenecen ya sea a las quimiocinas CC o al grupo de quimiocinas CXC . Por ejemplo, la quimiocina CC SDF-?a es específica para el receptor CXCR4 , mientras que las quimiocinas CXC RANTES se une a los receptores CCR1 , CCR3 y CCR5. Otro ejemplo es la quimiocina eotaxina, la cual es un ligando para los receptores CCR3 (también conocido como CKR3 ) . (Véase, por ejemplo, Cyster, J.G., Science (1999) 286:2098-2102; Ponath et al., J. Experimental Medicine (1996) 183 (6) : 2437-2448 ; Ponath et al., J. Clinical Investigatíon (1996) 97 (3) : 604 - 12 ; y Yamada et al., Biochem. Biophys . Res. Communications (1997) 231 (2) : 365-368. La capacidad de las quimiocinas para activar sus receptores análogos es afectada en gran medida por modificaciones en la región N terminal de las quimiocinas.

Estos cambios pueden resultar del procesamiento proteolítico, mutagénesis, o modificación química. (Véase, por ejemplo Proudfoot, A. E. et al., J. Biol . Chem. (1996) 271:2599; Grzegorzewski et al., Cytokine (2001) 13(4) : 209-219; Clark-Lewis et al., J. Biol. Chem. (1991) 266 (34 ): 23128 -23134 ; Moser et al., J. Biol. Chem. (1993) 268-7125-7128; Harrison, J. et al., Proc. Nat. Acad. Sci . USA (1998) 95:10896; Mack et al., J. Exp. Med. (1998) 187:1215; Gong et al., J. Biol. Chem. (1996) 271:10521; Struyf et al., Eur. J. Immunol . (1998) 28:1262; eber et al., J. Exp. Med. (1996) 183:681; Proot et al. (1998) J. Immunol., 160:4034; Yang et al., J. Virol. (1999) 73 (6) :4582-4589 ; Rusconi et al., Antivir. Ther. (2000) (5 (3) : 199-204 ; Wyuts et al., J. Immunol. (1999) 163.(11) : 6155-6613 ; Detheux et al., J. Exp. Med. (2000) 192: 1501-1508; Nibbs et al., J. Immunology (2000) 164:1488-1497; McCole et al., J Immunol. (1999) 163 (5) : 2829-2835 ; Nufer et al., Biochemistry (1999) 38 (2) : 636-642 ; y Wyuts et al., Eur. J. Biochem. (1999) 260 (2 ) : 421-429) . Muchas de estas proteínas modificadas son capaces de antagonizar los efectos mediados por receptor de quimiocina in vítro, inhibir la infección viral y reducir significativamente la inflamación en varios modelos animales. En algunos casos requieren su capacidad para activar sus receptores y en células primarias esta actividad refleja el nivel de expresión del receptor. Ciertas modificaciones en la región en N terminal también tienen efectos profundos en el tráfico de los receptores de quimiocina. Así, aunque tales quimiocinas modificadas pueden antagonizar con sus receptores y la quimiocina de tipo silvestre correspondiente, la clasificación como un antagonista, agonistas o variaciones del mismo pueden diferir. Aunque se han propuesto las quimiocinas como sustancias terapéuticas, uno de los inconvenientes principales potenciales es su pobre vida media útil circulante in vivo, típicamente de solo algunos minutos. Para mejorar la vida media en circulación, se sabe que se pueden unir a las proteínas polímeros hidrosolubles tales como PEG (polietilenglicol) , pero se obtienen resultados no concluyentes dada la dificultad de unirlos de una manera controlada y con una precisión definida por el usuario (Zalipsky, S., Bioconjugate Chemistry (1995) 6:150-165; Mehvar, R., J. Pharmaceut. Sci (2000) 3 (1) : 125-136; y Monfardini et al., Bioconjugate Chem. (1998) 9:418-450). A este respecto, se ha desarrollado una técnica para la unión específica de sitios de cadenas de PEG al residuo N terminal de proteínas y se ha demostrado en el factor de estimulación de colonias de granulocitos de factor de crecimiento (G-CSF) y en la quimiocina IL-8 (Gaertner et al., Bioconjug. Chem. (1996) 7(l) :38-44) . Se ha reportado que ambas retienen la mayor parte de su actividad. Sin embargo. la potencia es particularmente importante para medicamentos utilizados como antagonistas, tales como los utilizados como inhibidores basados en receptor de infección viral . Por lo tanto, la unión de PEG u otros polímeros hidrosolubles al residuo N terminal de las quimiocinas diferente de IL-8, particularmente antagonistas de quimiocina, pueden no ser adecuado dado la sensibilidad del residuo N terminal y su contribución a actividad y potencia. La publicación WO 00/53223 es representativa de mucho del gran cuerpo de la literatura respecto a las quimiocinas en la medida en que describe, según se informa, quimiocinas novedosas, e informan que se pueden elaborar antagonistas y que se puede unir PEG y otros polímeros hidrosolubles, pero sin especificidad respecto a en qué lugar o en qué tipo de cadenas se pueden unir, y la actividad relacionada con las mismas. Otro inconveniente potencial en la utilización de quimiocinas tipo silvestre como agentes terapéuticos es su tendencia a agregarlos en altas concentraciones, y la unión promiscua y la activación diferencial de receptores de quimiocina (Murphy et al., Pharmacological Rev. (2000) 51 (1) : 145-176) , Rollms, BJ . , Blood (1997) 90 (3) : 909-928 ; y Wells et al., Inílammation Res. (1999) 48:353-362)) . La agregación puede ser problemática para formulaciones y en algunos casos puede empeorar la patología (Czaplewski et al., J. Biol. Chem. (1999) 274 ( 23 ) : 16077 - 16084 ; Czaplewski et al., "Engineering, Biology, and Clinical Development of MIP-la, (1999) In: Chemokines in Disease: Biology and Clinical Research, Ed. , C.A., Herbert, Humana Press Inc., Totwa, NJ; Trkola et al., J. Virol. (1999) 73 (8) : 6370-6379; Appay et al., J. Biol. Chem. (1999) 274 (39) : 27505-27512 ; H nter et al., Blood (1995) 86 (12 ): 4400 -4408 ; Lord et al., Blood (1995) 85 (12) :3412-3415; Lord et al., Brit. J. Cáncer (1996) 74:1017-1022). La unión promiscua es un elemento distintivo de las quimíocinas y puede aer menos deseable en algunas formulaciones terapéuticas. No obstante, las quimiocinas aún representan una promesa significativa como sustancias terapéuticas. (Murphy et al., Pharwacologica Rev. (2000) 51(1) : 145-176), Rollins, BJ . , Blood (1997) 90 (3 ) : 909- 928 ; y Wells et al., Inflammation Res. (1999) 48:353-362) . Aunque tales enfoques han mejorado la potencia asociada con el antagonista en algunos casos, uno de los retos al elaborar antagonistas de quimiocina es aumentar la potencia mientras se mejoran otras propiedades de los medicamentos tales como la farmacocinética . Además, se desea encontrar una estrategia y método generales para elaborar inhibidores potentes de quimiocinas y los compuestos inhibidores de quimiocina correspondientes y su uso en la preparación de medicamentos para uso en la prevención o tratamiento de enfermedades.

En consecuencia, existe la necesidad de quimiocinas novedosas y quimiocinas modificadas que tengan propiedades terapéuticas mejoradas, que incluyen una vida media en circulación y una actividad y potencia deseadas, mejoradas y particularmente para quimiocinas novedosas y quimiocinas modificadas que puedan funcionar para inhibir o antagonizar la actividad de las quimiocinas que se presentan de manera natural. También existe la necesidad de proporcionar quimiocinas y quimiocinas modificadas que tengan una vida media en circulación mejorada y una actividad y potencia de receptor alterada. La presente invención resuelve esta y otras necesidades. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención está relacionada con quimiocinas sintéticas bioactivas, modificadas por polímeros, y especialmente con quimiocinas modificadas en las partes N o C terminal, y con métodos para su producción y uso. Las quimiocinas sintéticas bioactivas modificadas en la parte N terminal, de la presente invención, comprenden una cadena polipeptídica de quimiocina modificada en su parte N terminal con una cadena alifática y uno o más derivados de aminoácidos. Las quimiocinas sintéticas bioactivas modificadas en la parte C terminal de la presente invención comprenden una cadena polipeptídica de quimiocina modificada en su parte C terminal con una cadena alifática o policíclica. Las quimiocinas sintéticas bioactivas modificadas en sus partes N y C terminales de la presente invención, también incluyen modificaciones en la combinación N y C terminales. También se proporcionan métodos de producción y uso de las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención. La presente invención es significativa en la medida en que proporciona un enfoque general para elaborar compuestos que son antagonistas potentes de la quimiocina de tipo silvestre que se presenta de manera natural correspondiente o de sus receptores. DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A a 1E muestran esquemas de proceso para preparar las proteínas bioactivas sintéticas modificadas con polímero, de la invención. Las figuras 2A a 2C muestran esquemas de procesos para preparar las proteínas bioactivas sintéticas de la invención . Las figuras 3a a 3B muestran esquemas de procesos para ligaciones de segmentos múltiples que involucran la ligación química de tres o más segmentos peptídicos no superponibles , es decir, por lo menos un segmento es un segmento medio que corresponde al producto de ligación de longitud completa final . Las figuras 4A a 4C ilustran la ligación química nativa y la modificación química del tiol de la cadena lateral resultante. Las figuras 5A a 5B muestran un proceso en fase sólida para la generación de un núcleo ramificado (B) y un grupo funcional quimioselectivo único (U) de un polímero hidrosoluble U-V-polímero-J* de la invención. Las figuras 6A a 6D muestran un proceso en fase sólida para la generación de componentes de polímero-J* de poliamida hidrosolubles sustancialmente no antigénicos preferidos, de la invención, con unión subsecuente al núcleo U-B . La figura 7 muestra un proceso para acoplar el componente U-B al componente de polímero-J* para generar las construcciones de polímero sintético preferidas de la invención de la fórmula U-B polímero-J*. La figura 8 muestra una ruta alternativa para unión con precisión de un polímero hidrosoluble a un segmento peptídico utilizable para ligación y producción de proteínas sintéticas bioactivas de la invención. La figura 9 es un esquema que muestra una estructura general de cuatro clases de quimiocina que se presentan de manera natural y sus regiones correspondientes N terminal, bucle N y C terminal, como se definen por los patrones de cisteína conservados, en donde "C" es el código de una letra para cisteína y "X" representa cualquier aminoácido diferente de cisteína.

Las figuras 10A a 10D muestran ejemplos de secuencias de aminoácidos que se presentan de manera natural de diversas cadenas polipeptídicas de quimiocina que incluyen las regiones correspondientes N terminal, bucle de N y C terminal de estas quimiocinas . Se utiliza el código de aminoácidos de una letra estándar para los veinte aminoácidos codificados genéticamente. La figura 11 muestra una quimiocina sintética denominada Rantes G1755-01, la cual es un análogo de Rantes modificado en el polímero. La figura 12 muestra una quimiocina sintética denominada Rantes G1755, la cual es un análogo de Rantes modificado por polímero. La figura 13 muestra una quimiocina sintética designada como Rantes G1805, la cual es un análogo de Rantes modificada por polímero. La figura 14 muestra una quimiocina sintética designada Rantes G1806, la cual es un análogo de Rantes modificado por polímero. La figura 15 muestra un gen de SDS-PAGE representativo que comprende los pesos moleculares relativos de Rantes de tipo silvestre respecto al análogo de quimiocina sintético Rantes G1806 bajo condiciones reductoras (R) y no reductoras (N) . Los pesos moleculares relativos se muestran en el lado izquierdo de cada gel , que corresponden a un estándar de peso molecular que se corre en el mismo gel . La figura 16 muestra un perfil farmacocinético representativo que compara la concentración plasmática, en picogramos por mililitros (pg/ml) de un análogo de Rantes dado versus tiempo en minutos. Los compuestos que se ilustran en esta figura son AOP-Rantes y Rantes G1755, G1806 y G1805. DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La invención se relaciona con quimiocinas sintéticas bioactivas, y especialmente con moléculas de quimiocina modificadas en sus partes N o C terminales. Las quimiocinas sintéticas bioactivas novedosas de la presente invención preferiblemente inhiben la actividad de una quimiocina que se presenta de manera natural como se determina por un bioensayo de quimiocina adecuado. Tales moléculas pueden actuar al antagonizar una o más propiedades de un receptor de quimiocina al cual se unen (por ejemplo inhibir infección viral, provocar modulación por disminución del receptor, provocar internalización del receptor) y de esta manera "antagonizan" el ciclo normal de reciclado de receptor de regreso a la superficie celular. En el contexto de otras respuestas biológicas, tales moléculas actúan como agonistas de un receptor, por ejemplo induciendo flujo de calcio, iniciando quimiotaxia, etc. Por lo tanto, las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención pueden actuar como antagonistas (incluyendo antagonismo parcial) , pero también pueden actuar como agonistas (que incluyen agonistas parciales) o mezclas de ambos. Se prefieren moléculas que muestran por lo menos una propiedad antagonista, es decir, la capacidad de antagonizar una o más propiedades biológicas de un receptor de quimiocina al cual se unen (por ejemplo bloqueando o bloqueando parcialmente (1) una infección viral, (2) quimiotaxia, (3) ciclado de receptores, etc) . Tales moléculas quimiocina pueden actuar al unirse (o acoplar) pero no al activar un receptor de quimiocina o bien pueden mediar su acción por otros medios. A. Quimiocinas sintéticas bioactivas modificadas en sus partes N y C terminales y de la presente invención La invención se relaciona particularmente con quimiocinas sintéticas bioactivas que inhiben la actividad de una quimiocina que se produce naturalmente correspondiente. Preferiblemente, tales moléculas poseen modificaciones en las partes terminales N o C. Las quimiocinap sintéticas bioactivas modificadas en su parte N terminal, de la presente invención, comprenden una cadena polipeptídica de quimiocina modificada en su parte N terminal con una cadena alif tica y uno o más derivados de aminoácidos. Las quimiocinas sintéticas bioactivas modificadas en su parte N terminal de la presente invención tienen, como se lee en la dirección N terminal respecto al C terminal, la siguiente fórmula: Jl-Xl-Zl -QUIMIOCINA, en donde: Jl es una cadena alifática; XI es un separador que comprende cero o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la parte N terminal de la cadena polipeptídica de quimiocina; Zl es un derivado de aminoácido; QUIMIOCINA es la secuencia de aminoácido remanente de la cadena polipeptídica de quimiocina; y los guiones ("-") representan un enlace covalente. Los compuestos se designan respecto a la longitud total de la región N terminal de la cadena polipeptídica. En consecuencia, en base en la longitud de la cadena alifática hidrofóbica y la posición del derivado de aminoácido, el antagonista en la parte N terminal puede incluir uno o más sustituciones, inserciones o supresiones en la parte N terminal en relación a la cadena polipeptídica de quimiocina que se presente de manera natural, correspondiente . Las quimiocinas sintéticas bioactivas modificadas en la parte C terminal de la presente invención comprenden una cadena polipeptídica de quimiocina modificada en su parte C terminal con una cadena alifática o policíclica. Estos compuestos tienen, como se lee en la dirección de la parte N terminal a C terminal, la siguiente fórmula: QUIMIOCINA-X2 -J2 , en donde : X2 es un separador que comprende cero o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la parte C terminal de la cadena polipeptídica de quimiocina; J2 es una cadena alifática o policíclica; QUIMIOCINA es la secuencia de aminoácido remanente de la cadena polipeptídica de quimiocina ; y los guiones ("-") representan un enlace covalente. La región C terminal de las quimiocinas es susceptible de modificación sustantiva que incluye inserción, supresión o adición de uno o más aminoácidos y otras porciones químicas para extender el extremo C terminal de la cadena polipeptídica en comparación con la molécula correspondiente de tipo silvestre, así como la adición de etiquetas fluorescentes y polímeros biocompatibles y conjugación a otros compuestos tales como moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, proteínas y similares. Las quimiocinas sintéticas bioactivas modificadas en sus partes N y C terminales de la invención pueden ser modificaciones en las regiones N y C terminales, las cuales, cuando se mencionan específicamente, se designan como quimiocinas sintéticas bioactivas modificadas en sus partes N/C terminales. Estos compuestos tienen la fórmula J1-X1-Z1-QUIMIOCINA-X2-J2, en donde: Jl , XI, Zl QUIMIOCINA, X2 , J2 y son como se describe en lo anterior. Estos compuestos combinan las ventajas de las modificaciones en las partes N y C terminales de una manera sinergística, en base en el uso final dado. Por "cadena de polipéptido de quimiocina" se quiere significar una cadena polipeptídica que sea sustancialmente homóloga a la cadena polipeptídica de una quimiocina de tipo silvestre que se presente de manera natural. Por "secuencia de aminoácido de la parte N terminal" se pretende que la secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica de quimiocina que esté adyacente y la parte N terminal respecto a la primera cisteína formadora de disulfuro de una cadena polipeptídica de quimiocina que se presente de manera natural. Por "secuencia de aminoácidos en la parte C terminal" se pretende mencionar una secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica de quimiocina que este adyacente y en la parte C terminal de la última cisteína formadora de disulfuro de una cadena polipeptídica de quimiocina que se presente de manera natural. La cadena polipeptídica de quimiocina, la secuencia de aminoácidos en la parte N terminal, la secuencia de aminoácidos en la parte C terminal y la primera y última cisteínas formadoras de disulfuro que forman las bases de una quimiocina bioactiva de la presente invención se pueden deducir fácilmente a partir de la secuencia correspondiente de aminoácidos de una quimiocina que se presente de manera natural, así como por modelado por homología con otras quimiocinas de la misma clase, tal como la comparación con las secuencias de aminoácidos de las quimiocinas conocidas C, CC, CXC y CXXXC . Por ejemplo, los siguientes son ejemplos de quimiocinas conocidas que se presenten de manera natural, muchas de las cuales se han descrito bajo nombres diferentes y por lo tanto aparecen varias veces: 6Ckine, 9E3 , ATAC, ABCD-1, ACT-2, ALP, AMAC-1, AMCF-1, AMCF-2, AIF, ANAP, Angie, beta-Rl, Beta-Thromboglobulin, BCA-1, BLC , ligando blr-1, BRAK, CIO, CCF18, Ck-beta-6, Ck-beta-8, Ck-beta-8-1, Ck-beta-10, Ck-beta-ll, cCAF, CEF-4, CINC, C7, CKA-3, CRG-2, CRG-10, CTAP-3, DC-CK1, ELC, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-l, Exodus-2, ECIP-1, ENA-78, EDNAP, ENAP, FIC, FDNCF, FINAP, Fractalcina, G26, GDCF , GOS-19-1, GOS-19-2, GOS-19-3, GCF, GCP-2, similar a GCP-2, GR01, GR02, GR03 , GRO-alfa, GRO-beta, GRO-gamma, H400, HC-11, HC-14, HC-21, HCC-1, HCC-2, HCC-3, HCC-4 H174, proteína neutralizante de heparina, Humig, 1-309, ILINCK, I-TAC, IfilO, IL-8, lP-9, IP-10, 1RH, JE, KC, linfotactina, L2G25B, LAG-1, LARC , LCC-1, LD78-alfa, LD78-beta, LD78-gamma, LDCF , LEC, Lkn-1, LMC, LAI , LCF, LA-PF4, LDGF, LDNAP , LIF , LIX, LUCT, Lungcina, LYNA , inhibidor Manchester, ARC, MCAF , MCP-1, CP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, MDC , ???-1-alfa, ???-1-beta, ??-1-delta, ???-1-gamma, MIP-3, ??-3-alfa, ???-3-beta, MIP-4, MIP-5, Monotactina-1 , MPIF-1, MPIF-2, RP-1, MRP-2, M119, MDNAP, MDNCF, factor estimulador de megacariocito, MGSA, Mig, MIP-2, mob-1, MOC, MONAP, NC28, NCC-1, NCC-2, NCC-3, NCC-4 N51, NAF, NAP-1, NAP-2, NAP-3, NAP-4, NAP S, NCF, NCP, Neurotactina , Oncostatina A, P16, P500, PARC, pAT464, pAT744, PBP, similar a PBP, PBSF, PF4 , similar a PF , PF4-ALT, PF4V1 , PLF, PPBP, RANTES, SCM-l-alfa. SCI, SCY A26, SLC, SMC-CF, ST38, STCP-1, SDF-1, alfa, SDF-1-beta, TARC , TCA-3, TCA-4, TDCF, TECK, TSG-8, TY5, TCF , TLSF-alfa, TLSF-beta, TPAR-1, TSG-1. A modo de ilustración, y no a modo de limitación, los ejemplos de algunas de las cadenas polipeptídicas de quimiocinas de tipo silvestres incluidas en lo anterior y sus secuencias de aminoácidos correspondientes de la parte N terminal, N-bucle y C terminal se muestran en las figuras 10A a 10D. Como se puede apreciar, las cadenas polipeptídicas de quimiocina adicionales se conocen y se pueden obtener de muchas fuentes diferentes que incluyen bases de datos accesibles públicamente tales como la Genome Datábase (Johns Hopkins University, Maryland E.U.A), Protein Data Bank (Brookhaven National Laboratory & Rutgers University, New Jersey E.U.A. ), Entrez (National Institutes of Health, Maryland E.U.A.) , NRL 3D (Pittsburgh Supercomputing Center, Carnegie Mellon University, Pennsylvania E.U.A.), CATH (University College London, Londres, Reino Unido), NIH Gopher Server (NIH, Maryland E.U.A.) , ProLink (Boston University, Massachusetts E.U.A.), The Nucleic Acid Datábase (Rutgers University, New Jersey E.U.A.) , Genebank (National Library of Medicine, Maryland E.U.A.), Expasy (Swiss Institute of Bioinformatics , Ginebra, Suiza), y similares. También se pueden identificar quimiocinas nuevas, tales como aquellas derivadas de diversos programas de secuenciado de genes y proteínas por homología y coincidencia en el patrón después de técnicas estándar conocidas en el arte, que incluyen bases de datos y herramientas relacionadas para obtener este propósito . En una modalidad de la presente invención, se pueden utilizar técnicas de evolución dirigida, tales como exhibición de fagos o desplazamiento modular para generar quimiocinas con especificidad aumentada por receptor. Se han descrito pruebas de derivados de quimiocina o análogos para determinar su capacidad para unir receptores de quimiocina utilizando exhibición de fagos, en el tratamiento y prevención de VIH (Patente de E.U.A. 6,214,540; DeVico et al . ) . También se ha utilizado la técnica de exhibición de fagos para detectar o identificar ligandos, inhibidores o promotores de proteínas receptoras para el receptor de quimiocina CXC 3 (CXCR3) (Patente de E.U.A. 6,140,064, Loetscher et al.), la cual ha sido caracterizada por unión selectiva de una o más quimiocinas con la capacidad para inducir una respuesta celular (Patente de E.U.A. 6,184,358, Loetscher et al . ) . Se ha descrito el uso de exhibición de fago en el marcado y selección de moléculas (Patente de E.U.A. 6,180,336, Osbourn et al.), el marcado y purificación subsecuente de moléculas de unión para antígenos específicos (véase, por ejemplo, O92/01047) y en la determinación de la composición peptídica, para prevención (impedimento) y tratar infección por VIH y desórdenes inmunítarios (Patente de E.U.A. 6,090,388, Wang) .

También se han descrito procedimientos de exhibición de fagos que involucran receptores acoplados a proteína G (véase, por ejemplo, Doorbar, J, et al., "Isolation of a peptide antagonist to the thrombin receptor using phage display, 11 J. Mol. Biol . , 244:361-9 (1994)), con regiones preferidas para evolución dirigida de la región del bucle N (Konigs, C, "2 Monoclonal antibody screening of a phage-displayed random peptide library reveáis mimotopes of chemokine receptor CCR5 : implications for the tertiary structure of the receptor and foran N-terminal binding site for HIV-1 gpl20," Eur. J. Immunol . 2000 Apr; 30 (4 ) : 1162-71 ; Sidhu, S.S. et al., "High copy display of large proteins on phage for functional selections, " J Mol Biol 2000 Feb 1S;296 (2) :487-95; Fielding, A.K. et al., "A hyperfusogenic gibbon ape leukemia envelope glycoprotein : targeting of a cytotoxic gene by ligand display, " Hum Gene Ther 2000 Apr 10 : 11 (6) : 817-26) , la región entre el bucle N y la parte C terminal, y la parte C terminal (Cain, S.A. et al., "Selection of novel ligands from a whole-molecule randomly mutated C5a library," ProLeín Eng 2001 Ma ; 14 (3) : 189- 93 ; Heller, T. et al., "Selection of a C5a receptor antagonist from phage librarles anttenuating the inflammatory response in inmune complex disease and ischemia/reperfusion injury, " J. Immunol. 1999 Jul 15 ; 163 (2 ) : 985 - 94 ; Chang, C. et al., "Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivador interaction motif using combinatoria! peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estogen receptora alpha and beta," Mol Cell Biol 1999 Dec; 19 (12) : 8226-39) . Las cadenas alifáticas hidrofóbicas adecuadas de Jl y J2 incluyen, pero no se limitan a, cadenas alifáticas hidrofóbicas que tienen cinco (C5) a veintidós (C22) átomos de carbono de longitud. La cadena puede estar insaturada o sin ramificar, o puede tener grados variables de saturación o ramificación. Las cadenas alifáticas hidrofóbicas tienen la fórmula general Cn(Rm)-, en donde Cn es el número de carbonos y Rm es el número de grupos sustituyentea que se seleccionan de hidrógeno, alquilo, acilo, aromático o combinaciones de los mismos, y n y m pueden ser iguales o diferentes. Los grupos Jl y J2 se unen a XI , X2 o a la cadena polipeptídica de quimiocina vía cualquier enlace covalente adecuado. Los ejemplos de enlaces covalentes adecuados incluyen, pero no se limitan a: amida, cetona, aldehido, éster, éter, tioéter, tioéster, tiozolid na, oxima, oxizolidina, base de Schiff, enlaces de tipo de base de Schiff (por ejemplo, hidrazida) . Sin limitación, tales enlaces pueden comprender: -C (O) -NH- (C¾) -C (O) - ; -C (O) -NH- (CH2) X-C (O) ~ ; -C (O) -NH- (CH2) -NH-C (O) - ; -C (O) -NH- (CH2) -NH-C (O) - ; -C (O) -NH- (CH2) -[ (CH2) -NH]y-C(0) -; -C (O) NH- (CH2) - [ (CH2) X-NH] y-C (O) - ; -C(0)-NH-(CH2) -NH-CH2-C (O) - ; -C (O) -NH (CH2) -NH- (CH2) X-C (O) - ; -C (O) -NH-(CH2) - [NH- (CH2)x]y-C(0) -; -C (O) -NH- (C¾) [NH- (CH2) ] y- (O) - ; -NH- (CHa) -C(0) - ; -NH- (CH2) X-C (0) - ; -NH- (CH2) -NH-C (O) - ; -NH- (CH2) -NH-C (O) -; -NH- (CH2) - [ (CH2) -NH] y-C (0) - ; - H- (CH2) - [ (CH2)x-NH] y-C (0) - ; -NH (CH2) -NH-CH2-C (0) - ; - H- (CH2) -NH- (CH2)x-C (0) -; -NH- (CH2) - [NH- (CH2) yC (0) - ; -NH- (CH2) - [NH- (CH2) ]y-C(0) -; -ONH-C (O) - ; - ONH - ( CH2 ) - ( 0 ) - ; -ONH- (CH2) X-C (O) - ; -ONH- (CH2) -NH-C (O) - ; -ONH- (CH2) - (CH2) -NH-C (O) - ; -ONH- (CH2) X-NH-C(0) - ; -O H- (CH2) [ (CH2) -NH]y-C(0) - ; -O H- (CH2) - [ (CH2) ?-NH] y-C (0) - ; -ONH- (CH2) -NH-CH2-C (0) - -ONH- (CH2) -NH- (CH2) Xf -C (O) - ; -ONH- (CH2) - [NH- (CH2)x]y-C (0) -; -ONH (CH2) - [NH- (CH2) ] y-C (0) - ; -0CH2-C (0) -; -OCH2- (CH2) -C (O) -; -OCH2- (CH2) X-C (O) - ; -OCH2- (CH2)NH-C {0) - ; -0CH2- (CH2) - (CH2) -NH-C (O) - ; -OCH2- (CH2)X-NH-C(O) - ; -OCH2 (CH2) - [ (CH2) -NH] y-C (O) - ; -OCH2- (CH2) - [ (CH2) XNH] y-C (0) - ; -0CH2^ (CH2) -NH-CH2-C (0) - ; -OCH2- (CH2) -NH- (CH2) X-C (0) - ; -0CÜ2 - (CH2) - [NH- (CH2)x] y-C (0) - ; -OCH2- (C¾) - [NH- (CH2) ]y-C (0) - ; -OCH2-NH-C (0) - ; -OCH2-NH- (CH2) -C (0) - ; -OCH2-NH- (CH2) X-C (O) - ; -OCH2-NH- (CH2) -NH-C (O) - ; -OCH2-NH- (CH2) - (CH2)NH-C(0) - ; -OCH2-NH- (CH2) X-NH-C (O) - ; -OCH2-NH- (CH2) - [ (CH2) -NH] y-C (O) - ; -OCH2-NH- [ (CH2)x-NH] y-C (0) - ; -OCH2- (CH2) -NH-CH2-C (O) - ; -OCH2- (CH2) -NH(CH2) x-C (0) - ; -OCH2- (CH2) - [NH- (CH2) x] y-C (0) - ; -0CH2- (CH2) - [ H-(CH2) ]yC (0) - ; -OCH2-N(CH3) -C(0) -; -0CH2-N (CH3) - (CH2) -C (0) - ; -OCH2-N(CH3) (CH2) X-C (O) - ; -OCH2-N (CH3) - (CH2) -NH-C (O) - ; -OCH2-N(CH3) - (CH2)x-NH-C (0) - ; -0CH2-N (CH3) - (CH2) X-NH-C (0) - ; -OCH2-N(CH3) - (CH2) - [ (CH2) - H] y-C (0) - ; -OCH2-N (CH3) - (C¾ ) - [ (CH2 ) x-NH]y-C (0) - ; -0CH2-N (CH3) - (CH2) -NH-CH2-C (0) ; -OCH2-N (CH3) - (CH2) - NH- (CHa)x-C(O) - ; -OCH2-N (CH3) - (CH2) - [ ?- (CH2) x] yC (0) - ; -OCH2-N(CH3) - (CH2) - [NH- (CH2 ) ] y-C (0) - ; -O-C (O) -C (0) - ; -O-C (O) - (CH2) -C(0) - ; -0-C (0) - (CH2) x-C (0) -; -O-C (O) (CHa) -NH-C (0) - ; -0-C (0) - (CH2) - (CH2) -NH-C (0) - ; -O-C(O) - (CH2)x-NH-C(0) -; -0-C (0) - (CH2) - [ (CH2) - H] y-C (0) - ; -0-C (0) - (CHa) - [ (CH2)x- H]y-C (0) - ; -0-C (O) (CH2) - H-CH2-C (O) - ; -0-C (0) - (CH2) - ?- (CH2)x-C(0) - ; -O-C (O) - (CH2) - [NH (CH2) x] y-C (0) - ; -O-C(O) - (CH2) - [NH- (CHa) ] y-C (O) - ; -0-C (O) -NH-C (O) - ; -O-C(0)NH-(CH2) -C (0) -; -O-C (O) - ?- (CH2)x-C (0) -0-C (0) -NH- (CH2) - H-C (0) - ; -OC (O) -NH- (CH2) - (CH2) -NH-C (0) - ; -O-C(O) -NH- (CH2)X-NH-C (0) - ; -O-C (O) -NH(CH2) - [ (CH2) NH] y-C (0) -0-C(0) -NH- [ (CH2) x [NH] y-C (0) - ; -0-C (0) - (CH2) -NH-CH2-C (0) - ; -0-C (0) - (CH2) -NH - ( CH2 ) x - C ( 0 ) - ; -0-C (O) - (CH2) - [NH- (CH2) x] y-C (0) - ; -0-C (0) -(CH2) - [NH- (CH2) ] y-C(0) -; -0-C (O) -N (CH3) -C (O) - ; -0-C (O) (CH3) -(CH2) -C (0) - ; -O-C (O) -N(CH3) - (CH2)x-C (0) -; -0-C (O) -N (CH3) - (CH2)NH-C (0) - ; -O-C(O) -N(CH3) - (CH2) X-NH-C (0) - ; -O-C (O) -N(CH3) -(CH2)X-NH-C (0) - ; -0-C (0) -N (CH3) - (CH2) - [ (CH2) -NH] y-C (0) - ; -0-C (0) -N(CH3) - (CH2) - [ (CH2) x- H]y-C (0) - ; -O-C (O) -N(CH3) - (CH2) -NH-CH2-C (0) - ; -O-C (O) -N(CH3) (CH2) - H- (CH2)x-C (0) - ; -C-C (O) -N (CH3) -(CH2) - [NH- (CH2)x] y-C (0) - ; -0-C (0) N (CH3) - (CH2) - [NH- (CH2) ] y-C(0) - ; -CH=CH-C(0) -; -CH=CH- (CH2) -C(0) -; -CH=CH- (CH2) x-C (0) - ; -CH=CH (CHa) -NH-C (0) - ; -CH=CH- (CH2) X-NH-C (0) - ; -CH~CH-(CH2) - [ (CH2) -NH] y-C (0) -; -CH=CH- (CHa) - [ (CH2) x [NH] y-C (0) - ; -CH=CH- (CH2) - H-CH2-C (0) - ; -CH=CH(CH2) -NH- (CH2)x-C (0) - ; -CH=CH-(CH2) - [NH- (CH2) ] yC (0) -; -CH=CH- (CH2) [ H- (CH2) x] y-C (0) - ; -SCH2-N(CH3) -C(0) -SCH2-N(CH3) - (C¾) -C (0) - ; -SCH2-N(CH3) - (CH2)xC (0) - ; -SCH2-N (CH3) - (CH2) - H-C (0) - ; -SCH2-N (CH3) - (CHa)x- H-C (O) - ; -SCH2N (CH3) - (CH2) X-NH-C (0) - ; -SCH2-N (CH3 ) - (CH2) - [ (CH2) -NH]y-C (0) ; -SCH2N(CH3) - (CH2) - [ (CH2) XNH] y-C (O) -SCH2-N(CH3) - (CH2) -NH-CH2-C (O) - ; -SCH2-N (CH3) - (CH2) -NH- (CH2)X-C (0) - ; -SCH2-N(CH3) - (CH2) - [ H- (CH2)x]yC(0) - ; -SCH2-N(CH3) - (CH2) - [NH- (CH2) ]y-C (0) - ; -S-C (O) -C(O) - ; -S-C (O) - (CH2) -C(0) -; -S-C (O) - (C¾) x" C(0) - ; -S-C (O) (CH2) -NH-C (O) - ; -S-C (0) - (CH2) - (CH2) -NH-C (0) - ; -S-C(O) - (CH2)X-NH-C (O) - ; -SC (0) - (CH2) - [ (CH2) -NH] y-C (0) - ; -S-C(0) - (CH2) - [ (CH2) x-NH]y-C (0) - ; -S-C (O) (CH2) -NH-CH2-C (O) - ; -S-C (0) - (CH2) -NH- (CH2)x-C (0) - ; -S-C (O) - (CH2) - [NH (CH2) *] y-C (O) - ; -S-C(O) - (CH2) - [ H- (CH2) ]y-C(0) - ; -S-C (O) - H-C (0) - ; -S-C(0)NH- (CH2) -C (0) - ; -S-C(O) - H- (CH2)x-C (0) - -S-C (0) -NH- (CH2) - H-C (0) - ; -SC (O) -NH- (CH2) - (CH2) -NH-C (O) - ; -S-C (O) -NH- (CH2) X-NH-C (O) - ; -S-C (O) -NH (CH2) - [ (CH2) -NH]y-C(0) - ; -S-C (O). - NH- [ (CH2)X- H] y-C (0) - ; -S-C(O) - (CH2) - H-CH2-C(0) - ; -S-C (0) - (CH2) -NH- (CH2)x-C (0) - ; -S-C (O) - (CH2) - [NH- (CH2) x] y-C (O) -; -S-C (O) - (CH2) - [NH- (CH2) ] y-C (0) - -S-C(O) -N(CH3) -C (O) - S - C ( O ) -N ( CH3 ) ( CH2 ) -C (O) - ; -S-C (O) -N(CH3) - (CH2)x-C (0) -; -S-C (O) -N(CH3) - (CH2) -NH-C (0) - ; -S-C (O) -N(CH3) : (CH2) X- H-C (0) - ; -S-C (0) -N (CH3) - (CH2) x-NH-C (O) - ; -S-C (0)N(CH3) - (CH2) - [ (CH2) -NH]y-C (0) -; -S-C (O) - N(CH3) - (C¾) - [ (CH2)x-NH] y-C (0) - ; -S-C (O) -N(CH3) - (CH2) -NH-CH2- C(O) - ; -S-C (O) -N(CH3) - (CH2) -NH- (CH2) X-C (O) ; -S-C (O) -N (CH3) -(CH2) - [NH- (CH2)Jy-C(0) -S-C(O) -N(CH3) - (CH2) - [NH(CH2) ]y-C(0) - ; -C3H6ON-C(0) -; -C3H6SN- (CH2) -C(0) - ; - C3H6SN- (CH2) x-C(0) -; -C3H6SN(CH2) -NH-C (0) - ; - C3H6SN- (CH2) - (CH2) -NH-C (0) - ; -C3H6SN- (CH2)x-NH-C(0) - ; -C3HeSN- (CH2) - [ (CH2) -NH]y-C(0) -; -C3H6SN- (CH2) - [ (CH2)x- H]y-C(0) -; C3H6SN- (CH2) -NH-CH2-C(0) -C3H6SN- (CH2) -NH- (CH2)x-C(0) - ; -C3H6SN(CH2) - [ H- (CH2) x] y-C (0) - ; -C3H6SN- (CH2) - [ H- (CH2) ]y-C (0) - ; -C3H6SN-NH-C (0) - ; -C3H6SN-NH- (CH2) -C (0) - ; -C3H6SN-NH- (CH2) X-C (0) - ; -C3H6SN-NH (CH2) - H-C (0) - ; -C3H6SN-NH- (CH2) - (CH2) -NH-C(O) -; -C3HfiSN-NH- ( CH2 ) X-NH-C (0) - ; -C3H6SN-NH- (CH2) - [ (CH2) -NH] y-C (O) - ; -C3H6SN- H- [ (CH2) x- H]yC(0) -; -C3H6SN- (CH2) -NH-CH2-C(0) -; -S-C (0) - (CH2) -NH- (CH2) x-C(0) - ; -C3H6SN- (CH2) - [NH- (CH2) x] y-C (O) - ; -C3H6SN- (CH2) - [NH- (CH2) ] y-C (0) - ; -C3H6SN-N (CH3) -C (0) - ; -C3H6SN-N (CH3) - (CH2) -C (0) - ; -C3H6SN-N(CH3) (CH2)x-C(0) -; -C3H6SN-N (CH3) - (C¾) -NH-C (O) - ; -C3H6SN-N(CH3) - (CH2)x-NHC(0) -; -C3H6SN-N (CH3) - (CH3) X-NH-C (0) -; -C3H6SN-N (CH3) - (CH2) - [ (CH2) -NH]yC(0) - ; -C3H6SN-N (CH3) - (CH2) - [ (CH2)x-NH]y-C(0) -; - C3H6SN-N ( CH3 ) - (CH2) NH-CH2-C (O) -; -C3H6SN-N(CH3) - (CH2) -NH- (CH2)x-C(0) -; -C3H6SN-N (CH3 ) (CH2) - [ H- (CH2)x]y-C(0) -; -C3H6SN-N(CH3) - (CH2) - [NH- (CH2) ]y-C (O) -; -C3H6ON-C (0) - ; -C3H6ON- (CH2) -C(0) -; -C3H6ON- (CH2) X-C (0) - ; -C3H6ON- (CH2) - H-C(0) - ; -C3H6ON- (CH2) - (CH2) - H-C(O) - ; -C3H6ON- (CH2) XNH-C (O) - ; -C3HfiON- (CH2) - [ (CH2) -NH]y-C(0) -; -C3H6ON- (CH2) - [ (CH2) X-NH] yC (0) - ; -C3H6ON- (CH2) -NH-CH2-C (0) - ; -C3H6ON- (CH2) -NH- (CH2) X-C (O) - , -C3H6ON- (CH2) - [ H- (CH2)x]y-CC0) - ; -C3H6ON- (CH2) - [NH- (C¾) ]y C(0) -; - -C3H6ON-NH-C (0) - ; -C3H6ON-NH- (CH2) -C (O) - ; -C3H6ON-NH-(CH2)x-C(0) -; -C3H6ON-NH- (CH2) -NH-C (O) - ; -C3H6ON-NH- (CH2) - (CH2) - H-C(O)- -C3HeON-NH- (CH2) X- H-C (0) - ; -C3H6ON-NH- (CH2) - [ (CH2) -NH]y-C(0)-; -C3HeON-NH[ (CH2) -NH]y-C(0) - -C3H6ON- (CH2) -NH-CH2-C(0)-; -S-C(O) - (CH2) -NH- (CH2)x-C(0) -; -C3HsON- (CH2) - [NH- (CH2)x]y-C (O) - ; -C3H6ON- (CH2) - [NH- (CH2 ) ]y-C(0) - ; -C3H6ON-N (CH3) -C(O)-; -C3H6ON-N(CH3) - (CH2) -C (0) - ; -C3H6ON-N (CH3) (CH2) x] -C (O) - ; -C3H6ON-N(CH3) - (CH2) - H-C(O) -; -C3H6ON-N (CH3) - (CH2) X-NHC (0) -; -C3¾ON-N(CH3) - (CH2)x- H-C(0) - ; -C3H6ON- (CH3) - (CH2) - [ (CH2)NH]y- C(0) -; -C3H5ON-N(CH3) - (CH2) - [ (CH2) - H]y-C(0) -; -C3HsON-N (CH3) - (CH2) - H-CHa-C (0) - ; -C3HsON-N (CH3) (CH2) -NH- (CH2) ?-C (O) - ; C3HsON-N(CH3) - (C¾) - [NH- (CH2) x] y-C (0) -; -C3H6ON-N (CH3) - (CH2) - [ H- (CH2) ]y-C(0) -; -O-C(O)-; -C(O)-, o un enlace covalente, en donde x e y son 2, 3, 4 o más, y pueden ser iguales o diferentes. Las químicas adecuadas para sistemas de enlace son bien conocidas y se pueden utilizar para este propósito (véase, por ejemplo, "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking" , S.S. Wong, Ed., CRC Press, Inc. (1993); Perspectives in Bioconjugate Chemistry, Claude F. Modres, Ed. , ACS (1993) ) . Además de unir Jl y J2 a XI , X2 o a la cadena polipeptídica de quimiocina, el sistema de enlace utilizado se puede seleccionar para sintonizar las propiedades fisicoquímicas o biológicas de la molécula objetivo, con la condición de que la molécula resultante retenga sus propiedades antagonistas. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, al incorporar un sistema de enlace que sea más (o menos) estable bajo un tipo de condición en comparación con otro para regular la vida media y similar, o para ajustar la potencia, especificidad y similar mediante la utilización de los sistemas de enlace de longitud, rigidez, carga o quiralidad variables. La unidad de enlace que une las cadenas de hidrocarburos con la cadena polipeptídica de quimiocina puede variar sustancialmente , con la condición de que la longitud completa y el espacio de llenado de Jl o de J2 de manera más preferible se aproxime al de la quimiocina que se presenta de manera natural . En una modalidad preferida, la cadena alif tica hidrofóbica Jl es una cadena de hidrocarburo de cinco (C5) a diez (CIO) carbonos de longitud, y la cadena alif tica hidrofóbica J2 es un lípido de 12 (C12) a veinte (C20) carbonos de longitud. Los ejemplos de cadenas de hidrocarburo de Jl C5-C10 incluyen, pero no se limitan a -CsHn, -CSH9, -C5H7 , -C5H5 , -C5H3, CsHn , -CgH9, -CgH7, -CgH5, -C6H3, -C7H15 , " C7H13 , -C7IÍH , -C7H9, -C7H7, -C7H5, -C7H3, -CgHi7, -C8Hi5, -CeHi3 , -CgHg , -CaH7, CeH5, -CeH3, -C3Hi9: -C9H17, -C9H15, -C9H13 , - C^Hn , -C9H9 , - C9H7 , -C9H5, --C9H3, -C10H21, -C10H19, ~ C10H15 , ' -C10H13 , -C10H11 , -CioHg, -C10H7, -C10H5 Y -C10H3. Los lípidos J2 adecuados incluyen, pero no se limitan a los lípidos derivados de ácidos grasos y lípidos derivados de esteroides policíclicos . Los ácidos grasos incluyen, pero no se limitan a ácidos grasos saturados o insaturados . Los ejemplos de ácidos grasos saturados son ácido láurico (C12) , ácido mirístico (C14), ácido palmítico (C16) , ácido esteárico (C18) , y ácido araquídico (C20) . Los ejemplos de ácidos grasos insaturados incluyen ácido oleico (C18) , ácido linoleico (C18) , ácido linolénico (C18) , ácido eleostérico (C18) y ácido araquidónico (C20) . Los policíclicos incluyen, pero no se limitan a: aldosterona, colestanol, colesterol, ácido cólico, coprostanol, corticosterona, cortisona, deshidrocolesterol , desmosterol , digitogenina, ergosterol, estradiol, hidroxicorticosterona, latosterol, prednisona, pregnenolona , progesterona, testosterona, zimosterol, etc. Los ácidos grasos habitualmente se unen a la cadena polipeptídica de quimiocina a través del componente ácido, y de esta manera proporciona una porción unida a acilo, aunque se pueden utilizar otros enlaces. La unidad de enlace que une las cadenas de hidrocarburo a la cadena polipeptídica de quimiocina puede variar sustancialmente , con la condición de que la longitud total y el espacio de llenado de la región N terminal se aproxime a la de una quimiocina que se presente de manera natural . La región C terminal se ha encontrado que es más flexible a este respecto, de manera que la longitud total y el espacio de llenado puede variar en mayor grado en comparación con la región N terminal.

En otra modalidad preferida, los componentes Jl y J2 cuando están constituidos en una quimiocina sintética bioactiva de la invención comprenden una cadena acilo saturada o insaturada de 5 a 20 átomos de carbono, tal como nonanoilo, nonenoilo, aminooxipentano, dodecanoilo, miristoilo, palmitato, laurilo, palmitoilo, eicosanoilo, oleoilo o colilo. Por ejemplo, el sustituyente Jl puede ser nonanoilo o aminooxipentano y el sustituyente J2 puede ser un ácido graso saturado o insaturado, preferiblemente un ácido graso de 2 a 20 átomos de carbono o un lípido esteroide policíclico tal como colesterol . Dependiendo de la naturaleza y longitud de la cadena alifática hidrofóbica, las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención pueden incluir aminoácidos adicionales u otras porciones que se agreguen a la cadena polipeptídica, particularmente en el extremo C terminal para proporcionar un grupo separador o un sitio de unión separado para la porción alifática hidrofóbica. Por "derivado de aminoácidos" se entiende un aminoácido o una entidad química similar a aminoácido diferente de los 20 aminoácidos que se presentan de manera natural codificados genéticamente. En particular, el derivado aminoácido Zl es diferente de uno de los 20 aminoácidos que se presentan de manera natural codificados genéticamente, y tiene la fórmula - (N-CnR-CO) - , en donde Cn tiene 1 a 22 carbonos, R es hidrógeno, alquilo o aromático y en donde N y Cn, N y R o Cn y R pueden formar una estructura cíclica. Además, N, Cn y R pueden tener cada uno, uno o más hidrógenos en su forma reducida, en base en el derivado de aminoácido. La porción alquilo puede estar sustituida o no sustituida, puede ser lineal, ramificada o cíclica y puede incluir uno o más heteroátomos . La porción aromática puede estar sustituida o no sustituida y puede incluir uno o más heteroátomos. Los derivados de aminoácidos se pueden elaborar de novo o se pueden obtener de fuentes comerciales (Véase por ejemplo, Calbiochem-Novabiochem AG, Suiza; Advanced Chemtech, Louisville, KY, E.U.A.; Lancaster Synthesis, Inc., Windham, NH, E.U.A; Bachem California, Inc., Torrance, CA, E.U.A; Genzyme Corp., Cambridge, MA, E.U.A.). Los ejemplos de derivados de aminoácidos incluyen, pero no se limitan a ácido aminoisobutírico (Aib) , hidroxiprolina (Hyp) , 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3 -COOH (Tic) , ácido indolin-2-carboxílico (indol), 4 -difluoroprolina (P(4,4DiF)), ácido L-tiazolidin-4-carboxílico (Thz) , L-homoprolina (HoP) , 3,4-deshidroprolína (Apro) , 3 , -dihidroxifenilalanina (F(3,4-DiOH) ) , pBzl-3 , 4-dihidroxifenilalanina (F (3 , 4-DiOH, pBzl) ) , benzofenona (p-Bz) , ciclohexilalanina (Cha) , (2-naftil) -alanina (PNal) , ciclohexilglicina (Chg) y fenilglicina (Phg) . Con respecto a XI, la quimiocina y X2 , la secuencia de aminoácidos de estos componentes es sustancialmente homologa a la molécula de tipo silvestre que se presenta de manera natural correspondiente. El término "sustancialmente homóloga" , cuando se utiliza en la presente, incluye secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ó 99% por ciento de homología de secuencia con la secuencia dada (preferiéndose 95-99%) . Este término puede incluir pero no se limita a, secuencias de aminoácido que tengan entre 1 a 20, de 1 a 10 o de 1 a 5 supresiones, inserciones o sustituciones de aminoácidos únicos, en relación a una secuencia dada con la condición de que el polipéptido resultante actúe como un antagonista de la quimiocina correspondiente que se presente de manera natural . Por ejemplo, es bien conocido en la técnica que ciertos aminoácidos se pueden suetituir con otros, lo que resulta en que no se genera cambio sustancial en las propiedades de un polipéptido, que incluyen, pero que no se limitan a sustituciones conservadoras de aminoácidos. Tales posibilidades están dentro del alcance de la presente invención. También debe hacerse notar que las supresiones o inserciones de aminoácido con frecuencia se pueden realizar y las cuales no cambian sustancialmente las propiedades de un polipéptido. La presente invención incluye tales supresiones o inserciones (las cuales pueden ser, por ejemplo, de hasta 10, 20 ó 50% de la longitud de la secuencia antagonista específica de una quimiocina que se presenta de manera natural correspondiente). Además, las quimiocinas se pueden someter a modificaciones sustanciales que incluyen mezclado y pareamiento con segmentos polipeptídicoa de quimiocina diferentes para generar diversidad adicional tal como el enfoque de síntesis "cruzado" modular descrito en WO 99/11655, cuya referencia se incorpora en la presente en su totalidad como referencia. Además de los cambios a las partes N o C terminales, las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención también pueden incluir uno o más sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos en cualquier otra parte en la cadena polipeptídica, es decir, en la cadena polipeptídica representada en las fórmulas anteriores por QUIMIOCINA. En una modalidad preferida, se realizan cambios en el bucle N de la quimiocina para aumentar su especificidad/selectividad por un receptor objetivo. De esta manera, el bucle N de la quimiocina sintética bioactiva de la presente invención puede bloquear un receptor específico y al mismo tiempo minimizar el efecto antagonista en otro de sus posibles correceptores. Por "bucle N" , se entiende la región de la secuencia de 20 a 26 aminoácidos adyacente a la parte C terminal respecto al primer patrón de cisteína conservado que define la región N terminal de una cadena polipeptídica de quimiocina dada (véanse las figuras 9 y 10A-10D) . Por ejemplo, como se lee en la direción de la parte N a la C terminal de la cadena polipeptídica de quimiocina, el bucle N de una quimiocina CC es la región de aminoácidos que se encuentra entre la parte C terminal adyacente, al primero y segundo aminoácidos conservados de cisteína y la parte N terminal adyacente al tercer aminoácido de ciateína conservado. En otra modalidad, las sustituciones e inserciones pueden incluir aminoácidos naturales así como derivados de aminoácidos o aminoácidos modificados con un polímero. La ubicación preferida para la unión del polímero es en la porción C terminal de la quimiocina. Para quimiocinas que tienen sitios de glucosilación naturales, el polímero se puede unir a uno o más de los aminoácidos que están codificados para glucosilación, por ejemplo una arginina de un sitio de glucosilación unido a N. La unión del polímero también puede ser a la cadena lateral de un aminoácido que se presenta de manera natural, un derivado de aminoácido que sustituye al aminoácido que se presenta de manera natural o a un carbohidrato u otra porción que se une a la cadena lateral del aminoácido en la posición de glucosilación objetivo. Los polímeros adecuados para estos propósitos son biocompatibles , específicamente son no tóxicos a los sistemas biológicos y se conocen muchos de tales polímeros. Estos polímeros pueden ser de naturaleza hidrofóbica o hidrofílica, biodegradables o no biodegradables o una combinación de los mismos. Estos polímeros incluyen, pero no se limitan a polímeros naturales, tales como colágeno, gelatina, celulosa, ácido hielurónico, polisacáridos y poliaminoácidos así como polímeros sintéticos tales como poliésteres, poliortoésteres , polianhídridos y similares. Los ejemplos de polímeros no degradables hidrofóbicos incluyen polidimetilsiloxanos , poliuretanos , politetrafluoroetilenos , polietilenos , cloruros de polivinilo y metacrilatos de polimetilo. Los ejemplos de polímeros no degradables hidrofílicos incluyen poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) , alcohol polivinílico, poli (N-vinilpirrolidona) , polialquilenos , poliacrilamida y copolímeros de los mismos. Los polímeros preferidos comprenden como una unidad repetida secuencial óxido de etileno de la fórmula - (C¾-CH2-0- ) n- en donde n = el número de unidades de óxido de etileno. Los ejemplos de polímeros preferidos que contienen óxido de etileno son polietilenglicol ("PEG") y óxidos de etileno y poliamída tales como los que se describen en lo siguiente y en el documento WO 00/12587, respectivamente. Por ejemplo, las cadenas basadas en PEG son anfífílicas, no inmunogénicas y no son susceptibles de separación por enzimas proteolíticas . Las preparaciones de materiales que han sido modificadas por PEG o cadenas basadas en PEG tienen inmunogenicidad y antigenicidad reducidas.

Véase, por ejemplo Abuchowski, et al., j. Biol . Che . (1977) 252(11) .-3578-3581; Tsutsumi, et al, Jpn. J. Cáncer Rea. (1994) 85: 9- 12; Poly (ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, ACS Symposium Series 680, J.M. Harria y S. Zalipsky, Eds . , American Chemical Society, 1997; y Poly (ethylene glycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, Topics in Applied Chemistry, J.M. Harris, Ed. , Plenum Press, New York, NY, 1992). PEG también sirve para aumentar el tamaño molecular del material, al cual se une y de esta manera incrementa su vida media biológica. Estas propiedades benéficas de los materiales modificados con PEG lo vuelven muy útil en diversas aplicaciones terapéuticas. En consecuencia, esta invención también contempla mejorar la farmacocinética de los polipéptidos de la invención por la modificación o "pegilación" (formación de un derivado de polietilenglicol ) de los polipéptidos en sitios que es probable que permitan que las proteínas retengan su actividad biológica intrínseca. Tales sitios incluyen, pero no se limitan a la parte C terminal del polipéptido. Se conoce la formación de injertos de cadenas de PEG o cadenas basadas en PEG sobre las proteínas. Véase, por ejemplo, Zalipsky, patente de E.U.A. No. 5,122,614, la cual describe PEG que se convierte en un derivado de carbonato de N-succínimida . También se conocen cadenas de PEG modificadas con grupos reactivos que facilitan la formación de injertos sobre proteínas. Véase, por ejemplo, Harris, patente de E.U.A. No. 5,739,208, la cual describe un derivado de PEG que se activa con una porción sulfona para unión selectiva a porciones tiol sobre moléculas y superficies, y Harris et al., patente de E.U.A. No. 5,672,662, la cual describe ésteres activos de ácidos de PEG que tienen una sola porción de ácido propiónico o butanoico. Esta área es revisada extensamente en Zalipsky, Bioconjugate Chemistry (1995) 6:150-165. Además del uso de PEG, Wright, EP 0 605 963 A2 describe reactivos enlazantes que contienen polímeros hidrosolubles que forman un enlace hidrazona con un grupo aldehido en una proteína. La totalidad de las referencias mencionadas antes se incorporan en la presente como referencia . B. Modificación del polímero de las quimiocinas sintéticas bloactivas de la presente invención La presente invención se relaciona adicionalmente con quimiocinas sintéticas bioactivas que han sido modificadas por un aducto polimérico, y con métodos para su producción y uso. La invención se relaciona particularmente con tales quimiocinas sintéticas que poseen cambios en uno o más residuos de su región N terminal. Las quimiocinas modificadas que poseen tales cambios típicamente son antagonistas potentes de sus receptores correspondientes . En general, los cambios más potentes encontrados hasta ahora han sido de naturaleza hidrofóbica, por ejemplo, modificaciones de metionina (Met) , aminooxipentano (AOP) y nonanoilo ( Y) a la parte N terminal de cada categoría principal de quimioc nas ; se pueden realizar incrementos adicionales en la potencia mediante la sustitución de aminoácidos de tipo silvestre dentro de la región N terminal, con aminoácidos o derivados hidrofóbicos (por ejemplo quimiocinas CC tales como las quimiocinas Rantes, CP y MIP y CXC tales como SDF1 e IL-8) (Véase la solicitud de patente de E.U.A. No. de Serie 60/217,683 (la cual se incorpora como referencia en su totalidad)). Además, la introducción de modificaciones hidrofóbicas en la región C terminal de las quimiocinas aumenta su potencia aún más, lo que fundamenta el concepto de que la hidrofobicidad de ambas regiones terminales, N y C, puede influir en la potencia (Véase la solicitud de patente de E.U.A. No. de Serie 60/217,683). Por lo tanto, la unión de un polímero hidrosoluble habitualmente se esperará que reduzca de manera significativa o que incluso destruya la actividad antagonista deseada de tales quimiocinas, particularmente la modulación por disminución del receptor correspondiente al cual se une la quimiocina modificada en el polímero, dado que la modulación por disminución puede incrementarse al aumentar la naturaleza hidrofóbica de las partes terminales N y C de una quimiocina dada. Zalipsky, S. (Bioconjugate Chemistry (1995) 6:150-165), Me var, . (J.

Pharm. Pharmaceut. Sci. (2000) 3 (1) : 125-136) y Monfardini et al. (Bioconjugate Chem. (1998) 9:418-450) revisan diversos polímeros hidrosolubles , su unión a péptidos y proteínas así como sus efectos biológicos. Un aspecto de la presente invención deriva del hallazgo de que la unión de los polímeros hidrosolubles a quimiocinas sintéticas bioactivas no afecta la potencia como lo indica la teoría general anterior, sino que esta potencia y la especificidad al receptor se pueden controlar en base en el sitio de unión, la naturaleza del polímero que se une y la quimiocina precursora dirigida, para modificación polimérica. La presente invención también deriva del hallazgo de que se puede incrementar la eficacia de una quimiocina sintética bioactíva al mejorar sistemáticamente el equilibrio entre la propiedad antagonista deseada y la vida media en circulación. Esta optimización involucra un proceso de tres componentes, lo que proporciona quimiocinas sintéticas con una potencia y una vida media en circulación cada vez mayores cuando los componentes se combinan sucesivamente. Este proceso es aplicable generalmente a todas las quimiocinas, con cada componente que también tiene una aplicación general en la generación de quimiocinas sintéticas bioactivas ^ue tienen un polímero hidrosoluble unido a las mismas y que tienen la bioactividad in vi tro de modulación por disminución de un receptor de quimiocina correspondiente al cual se une la quimiocina sintética. El término "modulación por disminución de un receptor de quimiocina" como se utiliza en la presente, indica provocar una reducción en la actividad basal normal de un receptor de quimiocina caracterizado por uno o más de señalización de calcio, quimiotaxia leucocítica e infección viral, después de su unión a una quimiocina o análogo de quimiocina; que puede incluir la separación prolongada o aumentada del receptor desde una superficie celular. El primer componente se relaciona con la modificación de precisión de un precursor de quimiocina sintética bioactiva con un polímero hidrosoluble de interés en uno o más sitios que retienen la bioactividad in vi tro del precursor de las quimiocinas sintéticas bioactiva. La bioactividad in vi tro es un buen criterio para determinar la función y los ensayos estándar para quimiocinas individuales bien conocidas para este propósito (Véase, por ejemplo, Cytokine Reference, Vol . 1, Ligands, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds . J.J. Oppendheim and M. Feldmann, Academic Press, 2001; y Cytokine Reference, Vol. 2, Receptora, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds. J.J. Oppendheim and M. Feldmann, Academic Press, 2001) . Los sitios de unión preferidos se seleccionan de un residuo de la quimiocina precursora correspondiente al sitio C terminal, un sitio de agregación, un sitio de glucosilación y un sitio de unión de glucosilaminoglucanos ("GAG") . Kuschert et al. (Biochem. (1999) 38 ¡12959-12968), Koppman et al . (J. I munol . (1999) 163 :2120-2127) y Proudfoot et al . (J. Biol . Chem. (2001) 276 (14) : 10620-10626) reportan unión de GAG y quimiocinas. El segundo componente se relaciona con la naturaleza del polímero que se una, el cual preferiblemente tiene la fórmula U-B-Polímero-J, en donde U ea un residuo de un grupo funcional unido a la proteína, B es un núcleo de ramificación que tiene 3 ó más brazos y que puede estar presente o no, polímero es un polímero hidrosoluble sustancialmente no antigénico que tiene un peso molecular equivalente a o mayor de 1000 unidades Dalton ("Da") y J es un grupo pendiente que tiene la carga neta deseada bajo condiciones fisiológicas seleccionadas de negativo, neutro o positivo. Un hallazgo inesperado con respecto a las quimiocinas sintéticas bioactivas modificadas con polímero de la invención es que un constructo polimérico hidrosoluble tan pequeño como aproximadamente 1000 - 1500Da puede ser suficiente para aumentar la vida media circulante en suero de la químiocina precursora en aproximadamente 10 veces. Otro hallazgo inesperado es que una construcción polimérica lineal pequeña y una construcción de polímero ramificado mucho más grande, cuando se unen en el mismo sitio, tienen efectos similares en la potencia y en la modulación por disminución del receptor. Otro hallazgo es que la naturaleza y la cantidad de grupos J pendientes en la construcción polimérica pueden alterar la modulación por disminución y la especificidad de receptor de la quimiocina modificada con polímero, sintética y bioactiva. Por ejemplo, el uso de construcciones poliméricas ramificadas que tienen una plualidad de grupos J pendientes ionizables puede alterar a GAG y la unión de receptor por diseño. A modo de un ejemplo, las quimiocinas sintéticas que son análogos de RANTES, en donde un polímero ramificado que tiene grupos cargados negativamente (bajo condiciones fisiológicas) desvía la unión hacia CCR5, el cual tiene una superficie electrostática neta que aparece neutra, en oposición a CCR1 , el cual tiene una superficie electrostática neta que es negativa. Por lo tanto, un análogo de Rantes sintético bioactivo modificado con polímero que tenga un polímero hidrosoluble que comprenda una pluralidad de grupos J pendientes cargados negativamente, puede interactuar de manera preferencial con un receptor que tenga una superficie neta neutra o neta positiva. De manera similar, dado que los GAG típicamente muestran una carga neta negativa, se puede manipular su interacción con ellos. Por supuesto, como se indica en lo anterior, el sitio de unión del polímero se puede aprovechar para un ajuste preciso de los elementos del receptor y la unión de GAG dependiendo del uso final dado de una quimiocina modificada con polímero sintética bioactiva, de interés . El tercer componente se relaciona con la generación de quimiocinas sintéticas bioactivas modificadas por polímero que tienen una bioactividad óptima in vi tro, caracterizadas por modulación por disminución de un receptor de quimiocina al cual se unen. Esto involucra selección de una quimiocina precursora (es decir, una quimiocina natural o modificada que se elige de la unión de un polímero hidrosoluble la misma) , que tiene una potencia que es aproximadamente de 1 a 5 veces o más, y de manera preferible de aproximadamente 5 a 10 veces mayor, o aún más (medida por CE50 en un ensayo relevante in vitro, basado en células) en comparación con el intervalo de potencia deseado de la quimiocina sintética bioactiva modificada con polímero. Se ha encontrado que la selección de tales quimiocinas precursoras proporcionan quimiocinas sintéticas bioactivas modificadas con polímero que muestran un equilibrio deseado de potencia y una vida media circulante en suero in vivo. Se pretende que el término "CE50" indique la concentración de un compuesto que induce una respuesta que es la mitad entre un valor basal y la respuesta máxima en una curva de dosis y respuesta (o concentración-respuesta) . Por ejemplo, CE50 puede ser una medida de potencia, en donde una CE50 más pequeña para una respuesta dada puede medirse y que representa un compuesto más potente en comparación con un compuesto que tiene una CE50 más alta. CE50 también se denomina comúnmente como DE50 o CI50, y en el contexto de infección viral es la concentración eficaz que inhibe 50% de la producción viral, 50% de la infectividad viral o 50% del efecto citopático inducido por virus. Se apreciará que se proporcionan quimiocinas sintéticas que se pueden derivar de cada uno de estos componentes (es decir, el sitio de unión polimérico, la naturaleza del polímero y la quimiocina seleccionada del precursor para la modificación polimérica) solo o en combinación. Los sitios de unión poliméricos también se pueden superponer o ser uno o el mismo, por ejemplo, el sitio de agregación y el sitio de GAG están adyacentes o se localizan en el mismo sitio. Además, se proporcionan quimiocinas sintéticas que tienen dos o más polímeros unidos al mismo. Por ejemplo, la invención también incluye quimiocinas sintéticas bioactívas que comprenden una cadena polipeptídica de quimiocina y un polímero hidrosoluble unido al mismo en un primer sitio que se selecciona de un sitio GAG y un segundo sitio que se selecciona de un sitio de agregación y un sitio C terminal. Este aspecto de la invención permite, por ejemplo, que uno incremente el peso molecular y la hidrosolubilidad (y por lo tanto se mejora la vida media circulante y otras propiedades deseables proporcionadas por el polímero hidrosoluble) y al mismo tiempo se eliminan propiedades menos deseables tales como degradación y tipos particulares de unión GAG en sitios de unión de polímeros. 1. Sitios de unión de polímero Las quimiocinas sintéticas bioactivas preferidas de la invención se pueden elaborar por modificación de precisión de las proteínas de quimiocina sintéticas bioactivas de la presente invención con un polímero hidrosoluble de interés en un residuo de uno o más sitios que se seleccionan de un sitio en la parte C terminal, un sitio de agregación, un sitio de glucosilación y un sitio de unión de GAG. Los residuos en estos sitios se pueden utilizar para unión, con la condición de que tengan una cadena lateral susceptible de unión de polímero (es decir, la cadena lateral de un aminoácido que presente un grupo funcional, por ejemplo, lisina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, histidina, etc.). Alternativamente, un residuo en estos sitios se puede sustituir con un aminoácido diferente que tenga una cadena lateral susceptible de unión polimérica . Además, las cadenas laterales de los aminoácidos codificados genéticamente se pueden modificar químicamente para unión polimérica, o se pueden utilizar aminoácidos no naturales con grupos funcionales con cadena lateral apropiada. El método preferido de unión utiliza una combinación de síntesis peptídica y ligación química.

Tales quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención preferiblemente se aintetizan por la condensación de residuos aminoácidos. Tales residuos aminoácidos pueden ser el ácido nucleico codificado, aminoácidos instalados ribosómicamente : alanina, arginina, asparagina, aspartato, cisteína, glutamato, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófap?, tirosina y valina. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos seleccionada para una posición particular de una quimiocina sintética bioactiva de la presente invención será el residuo de aminoácido nativo o presente de manera natural que se encuentre en esa posición en la secuencia de esa proteína. En una modalidad alternativa, la secuencia seleccionada de aminoácidos estará constituida, o construida a partir de fragmentos polipeptídicos que puedan contener un residuo cisteína en la parte N terminal, en lugar de los residuos aminoácidos presentes en la secuencia nativa o natural de esa proteína. La inclusión de tal residuo permite que el polipéptido se ligue a otro polipéptido (modificado para contener un grupo carboxitioéster) utilizando los principios y métodos de la ligación química nativa, síntesis peptídica o síntesis convergente (véanse las solicitudes de patentes de E.U.A. Nos. de Serie 60/231,339, 60/236,377 y 09/097,094, todas incorporadas en la presente como referencia) , principios los cuales se utilizan preferiblemente para sintetizar las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención. En una modalidad adicional, las proteínas bioactivas sintéticas de la presente invención puede contener residuos aminoácidos "irregulares" . Como se utiliza en la presente el término "residuos aminoácidos irregulares" se pretende que se refiera a aminoácidos que no sean codificados por ARN o que no se instalan ribosómicamente . A este respecto, la presente invención permite una amplia capacidad de selección y flexibilidad en el diseño o construcción de proteínas bioactivas sintéticas. Los ejemplos de aminoácidos instalados no ribosómicamente que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención incluyen: D-aminoácidos , ß-aminoácidos, pseudoglutamato , ?-aminobutirato, ornitina, homocisteína , aminoácidos sustituidos en N (R. Simón et al., Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. (1992) B9: 9367-71; O 91/19735 (Bartlett et al.), patente E.U.A. 5,646,285 (Baindur) , ácidos cc-aminometilenoxiacético (un isóstero de dipéptido de aminoácido-Gly) , y -aminooxiácidos , etc. Se pueden utilizar análogos peptídicos que contengan tioamida, amida viniloga, hidrazino, metilenoxi, tiometileno, fosfonamidas , oxiamida, hidroxietileno , amida reducida e isoésteres de amida reducida sustituidos y ß- sulfonamidas .

En particular, el uso de una ligación química pseudonativa es útil dado que la modificación en la cadena R permite la unión de aductos poliméricos a la proteína sintetizada. De igual manera, se pueden utilizar aminoácidos de alquil o ariltiol de cadena de 2 ó 3 carbonos a-sustituidos en la parte N terminal. Tales residuos (cuando están presentes en la parte terminal o polipéptido de extremo) se pueden utilizar ventajosamente para ligar ése polipéptido a un polipéptido que tenga la porción carboxitioéster , de acuerdo con los métodos de ligación química nativa extendida descritos en la presente. La síntesis peptídica preferiblemente se basa en el protocolo de síntesis peptídica en fase sólida paulatino de la química de " errifield" desarrollado a inicios de la década de 1960 utilizando sintetizadores peptídicos automatizados estándar. La etapa de ligación de péptidos puede utilizar estrategias de ligación en fase sólida o en solución. La ligación química involucra la formación de un enlace covalente selectivo entre un primer componente químico y un segundo componente químico. Se pueden utilizar grupos funcionales mutuamente reactivos, únicos, que estén presentes en el primero y segundo componentes para volver a la reacción de ligación quimioselectiva . Por ejemplo, la ligación química de péptidos involucra la reacción quimioselectiva de segmentos peptídicos o polipeptídicos que presenten residuos de aminoácidos en la parte C terminal y N terminal, mutuamente reactivos únicos y compatibles. En una modalidad, la totalidad de los residuos aminoácidos de la proteína bioactiva sintética se pueden unir mediante un enlace peptídico (es decir, un enlace amida) . Alternativamente, se pueden unir entre sí dos residuos aminoácidos (o los residuos de las partes C terminal y N terminal de dos polipéptidos) entre sí, mediante un enlace diferente de amida (tal como un enlace tioéster, un enlace oxima, un enlace tioéter, un enlace disulfuro dirigido, un enlace tiozolidina, una ligación formadora de hidrazona, una ligación formadora de oxazolidina, etc.) (Schnólzer, M. y Kent, ?. B. H. , Science (1992) 256:221-225; Rose, K. , J. Amer. Chem. Soc . (1994) 116:30-33; Englebretsen, D,R. et al., Tetrahedron Lett. 36:8871-8874; Baca, M. et al., J. Amer. Chem. Soc. (1995) 117:1881-1887; Liu, C.F. et al., J. Amer. Chem. Soc. (1994) 116:4149-4153; Liu, C.F. et al., J. Amer. Chem. Soc. (1996) 118:307-312; Dawson, P.E. et al. (1994) Science 266:776-779; Gaertner, et al., Bioconj . Chem. (1994) 5 (4) : 333-338 ; Zhang, et al., Proc . Nati. Acad. Sci. (1998) 95 (16) :9184-9189; Tara, et al., WO 95/00846; patente de E.U.A. No. 5,589,356) o por otros métodos (Yan, L.Z. y Dawson, P.E., "Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residuea by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization" , J. Am. Chem. Soc . 2001, 123, 526-533, incorporada en la presente como referencia; Gieselnan et al., Org. Lett . 2001 3 (9) : 1331-1334; Saxon, E. et al., "Traceless" Staudinger Ligation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds . Org. Lett. 2000, 2, 2141-2143. La invención por lo tanto permite una variedad de modificaciones de enlaces peptídicos, sustituciones auxiliares e isostéricas que se pueden aprovechar en la preparación de las proteínas bioactivas. Cuando la ligación involucra la unión de un polipéptido que posee un residuo cisteína en la parte N terminal, el procedimiento de ligación química nativa preferiblemente es el que se utiliza (Dawson, et al., Science (1994) 266:776-779; Kent , et al., WO 96/34878; Kent , et al., WO . 98/28434) ) . Esta metodología ha demostrado ser una metodología robusta para generar un enlace amida nativo en el sitio de ligación. La ligación química nativa involucra una reacción quimíoselectiva entre un primer segmento peptídico o polipeptídico que tiene una porción a-carboxitioéster en la parte C terminal y un segundo péptido o polipéptido que tiene un residuo cisteína en la parte N terminal. Una reacción de intercambio tiol proporciona un intermediario inicial unido a tioéster, el cual se rearregla espontáneamente para proporcionar un enlace amida nativo en el sitio de ligación mientras regenera el tiol de la cadena lateral cisteína. En muchos casos, la secuencia de la proteína natural comprenderá residuos cisterna colocados adecuadamente tales como fragmentos polipeptídicos que tienen un residuo cisteína en al parte N terminal que pueden ser sintetizados y utilizados en una reacción de ligación química nativa. En otros casos, la síntesis peptídica se puede llevar a cabo de manera que se introduzcan residuos cisteína en un polipéptido para este propósito . Sin embargo, cuando no es conveniente o es deseable modificar una secuencia proteína natural de manera que se introduce un residuo cisteína en la parte N terminal de un polipéptido, el método de la ligación química nativa se puede extender utilizando polipéptidos cuyas partes N terminales se hayan modificado para contener un tiol de una cadena aminoalquilo o arilo de 2 ó 3 carbonos N sustituida y preferiblemente ?a-sustituida . Tal "ligación química nativa extendida" se describe en las solicitudes de patentes de E.U.A. Nos. de Serie 60/231,399 y 60/236,377, incorporadas en la presente como referencia. Brevemente, el método involucra ligar un primer componente que comprende un tioéster carboxilo, y de manera más preferible un tioéster ct-carboxilo, con un segundo componente que comprende un aminoalquil o ariltiol de cadena de 2 ó 3 átomos de carbono N-sustituido y preferiblemente Na-sustituido estable en ácido. La reacción quimioselectiva entre el carboxitioéster del primer componente y el tiol de la cadena alquilo o ariltiol de 2 ó 3 átomos de carbono N-sustituida del segundo componente avanza a través del intermediario unido a tioéster y se separa en un producto de ligación inicial. De manera más específica, el intercambio de tiol se produce entre el componente tioéster COSR y el componente aminoalquiltiol genera un producto de ligación intermediario unido por tioéster que, después de rearreglo espontáneo, genera un primer producto de ligación unido a amina a través de un intermediario de anillo de 5 ó 6 miembros que depende de si los componentes aminoalquiltiol tienen la fórmula I o II, respectivamente .- J1-C(0) -N(Cl)Rl) -C2-SH) -J2 I Jl-C(O) -N(C1 (Rl) -C2 (R2) -C3 (R3) -??) -J2 II en donde Jl es un péptido o polipéptido que tiene una o más cadenas laterales de aminoácidos opcionalmente protegidas, o una porción de tal péptido o polipéptido, un polímero, un colorante, una superficie funcional izada adecuadamente, un enlazante o un marcador detectable, o cualquier otra porción química compatible con la síntesis peptídica química o la ligación química nativa extendida; Rl , R2 y R3 son independientemente H o un grupo electrodonador conjugado a Cl; con la condición de que por lo menos uno de Rl , R2 y R3 comprenda un grupo electrodonador conjugado a Cl; y J2 es un péptido o polipéptido que tiene uno o más cadenas laterales de aminoácidos opcionalmente protegidas o una porción de tal péptido o polipéptido, un polímero, un colorante, una superficie funcionalizada adecuadamente, un enlazante o marcador detectable; o cualquier otra porción química compatible con la síntesis peptídica química o con la ligación química nativa extendida. La cadena alquilo o ariltiol de 2 ó 3 carbonos N sustituida [HS-C2-C1 (Rl) -] o [??- (C3 (R3 ) -C2 (R2 ) -Cl (Rl) -] en el sitio de ligación es susceptible de ser separada, bajo condiciones compatibles peptídicas, sin daño al producto, para generar un producto de ligación final de fórmula III, que tiene un enlace amida nativo en el sitio de ligación: Jl-C (0) -HN-J2 III en donde Jl, J2 , Rl , R2 y R3 son como se definen en lo anterior. Los grupos Rl, R2 y R3 se seleccionan para facilitar la separación del enlace N-Cl bajo condiciones de separación compatibles con el péptido. Por ejemplo, se pueden utilizar grupos electrodonadores , particularmente si se conjugan a Cl, para formar un catión estabilizado en cuanto a resonancia en Cl que facilite la separación. La reacción de ligación química preferiblemente incluye como un excipiente un catalizador tiol, se lleva a cabo aproximadamente en condiciones de pH neutro en condiciones acuosas o acuosas orgánicas, mixtas. La ligación química del primero y segundo componentes se puede llevar a cabo a través de un anillo de 5 ó 6 miembros que experimenta arreglo espontáneo para proporcionar un producto de ligación unido a amida N-sustituido. Cuando el primero y segundo componentes son péptidos o polipéptidos , el producto de ligación unido a amina N-sustituido tiene la fórmula IV o V: J1-C(0) -Na(Cl (Rl) -C2-HS) -CH(Z2) -C(0) -J2 IV J1-C(0) -Na(Cl (Rl) -C2 (R2) -C3 (R3) -HS) -CH(Z2) -C(0) -J2 V en donde Jl, J2 y R1,R2, R3 son como se definen en lo anterior y Z2 es una cadena lateral de aminoácido o un derivado de tal cadena lateral . Los grupos electrodonadores conjugados Rl, R2 o R3 del producto de ligación unido a amida N-sustituido facilita la separación del enlace N-Cl y la separación de la cadena alquil o ariltiol de 2 ó 3 carbonos, del producto de ligación unido a amida N-sustituido. La separación de la cadena alquil o ariltiol de N bajo condiciones de separación compatibles con el péptído generan un producto de ligación que tiene un enlace amida nativo en el sitio de ligación. Cuando el primero y segundo componentes son péptidos o polipéptidos, el producto de ligación tendrá la fórmula: Jl-CON H-CH (22) -C (0) -J2 VI Una ventaja de unión al sitio C terminal es que puede minimizar la pérdida potencial en la actividad debido a una separación máxima de las regiones funcionales conocidas de la mayor parte de las quimiocinas. Una ventaja de unión a quimiocinas que poseen uno o más sitios de agregación es que el polímero hidrosoluble puede romper la agregación y al mismo tiempo minimiza la pérdida potencial de actividad, y mejora el manejo/formulación y la eficacia in vivo. La unión a sitios de glucosilación tiene la ventaja de imitar los efectos positivos de una cadena azúcar que normalmente se encuentra en el sitio, mientras que minimiza la pérdida potencial en la actividad por unión del polímero sintético en un sitio de unión polimérico natural. Otra ventaja de la modificación de polímero en el sitio de glucosilación es que se puede utilizar un polímero que comprenda un enlazador separable de manera que proporcione una quimiocina sintética en forma de precursor (promedicamento) particularmente cuando los sitios de glucosilación se presentan en o cerca de la región farmacófora N terminal. Una ventaja de unión del sitio de unión GAG es que se puede aprovechar el polímero para separar la unión de GAG en el sitio y, en algunos casos, la agregación en donde tales sitios se superponen y al mismo tiempo minimizar la pérdida potencial de actividad, mejorar la vida media en circulación al reducir la unión a superficies indeseables que presentan porciones GAG, y mejorar el manej o/formulación y la eficacia in vivo. Alternativamente, en base en el material hidrosoluble utilizado para unión, se puede mejorar la unión a GAG, o se puede mejorar la unión de tipos particulares de GAG. Por supuesto, en base en la quimiocina objetivo para modificación, se puede preferir un sitio para unión polimérica con respecto a otro, por ejemplo, aunque todas las quimiocinas tienen una región C terminal y uno o más sitios de unión de GAG, no todas las quimiocinas parecen poseer sitios de agregación y glucosilación . Venta osamente, la unión de un polímero hidrosoluble será a través de un enlazante biodegradable, especialmente en la región N terminal de una proteína. Tal modificación actúa para proporcionar a la proteína en una forma de precursor (o "promedicamento") de modo que, ante la degradación del enlazante se libera la proteína sin modificación del polímero. La unión a través y el uso de enlaces biodegradables tales como enlaces és ^ es bien conocido y se describe con mayor detalle en lo que sigue. a. Sitios en la parte C terminal Las quimiocinas sintéticas bioactivas preferidas de la invención tienen un polímero hidrosoluble unido en el sitio C terminal . Por "sitio C terminal" se entiende un residuo de una cadena polipeptídica de quimiocina que se encuentra C terminal a la a-hélice de la parte C terminal de una quimiocina. Esto incluye el residuo C terminal pendiente que presenta un a-carboxilato libre y residuos adyacentes al mismo. Una característica estructural secundaria prominente de todas las quimiocinas es la lámina ß-antiparalela de triple cadena que forma un piso de lámina para la a-hélice C terminal hidrofóbica que la atraviesa. Por lo tanto, la a-hélice C terminal es una característica consistente de las quimiocinas que es identificable fácilmente, por ejemplo, por modelado de homología y comparación, por ejemplo al comparar secuencias primarias o estructuras tridimensionales de quimiocinas conocidas, o estructuras predichas a través de algoritmos de sustitución molecular y minimización de energía (véase, por ejemplo Cytokine Reference, Vol . 1, Liganda, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds . J.J. Oppendheim and M. Feldmann, Academic Press, 2001). Un sitio C terminal preferido es uno que está adyacente al residuo C terminal pendiente de una quimiocina precursora dirigida para modificación polimérica. Un ejemplo es para análogos de Rantes . El residuo C terminal de Rantes tipo silvestre (1-68) es la serina en la posición 68 (es decir, Ser68 o S68) . La unión de un polímero hidrosoluble a un residuo adyacente al residuo C terminal pendiente de una quimiocina precursora tal como NY-Rantes (2-68) puede incluir la metionina en la posición 67 (M67) así como porciones enlazantes unidas a residuos que corresponden a M67 o S68, o ambos. Por ejemplo, la adición de un componente enlazador o separador que tenga una cadena lateral funcional para acoplar un polímero hidrosoluble a la parte C terminal de una quimiocina de interés minimiza el impacto potencial en la función del grupo C terminal original en o cerca de esa posición. Por ejemplo, la adición de un enlazador en la posición S68 de Rantes, tal como el enlazante dipeptídico Lys69-Leu70 proporciona Rantes ( (1-68) - (K69-L70) ) y proporciona un grupo de acoplamiento funcional para unión polimérica al nitrógeno epsilón en la cadena lateral de la porción enlazante Lys69, y un aminoácido con un a-carboxilato libre en la parte C terminal recién generada. La adición de un separador o enlazador a un residuo que corresponde a la posición 67 (por ejemplo, sustitución de Met67 con Lys67, y unión del enlazante al grupo amino de cadena lateral epsilón) también es posible. Se ha encontrado que ambos retienen la bioactividad y este diseño parece ser de aplicación general a otras quimiocinas. Por ejemplo, las modificaciones análogas de SDF-la o SDF-?ß pueden generar análogos de SDF-1 modificados en el polímero que retengan la bioactividad deseada. En otro ejemplo adicional, cuando la quimiocina sintética es un análogo de MCP1 o de eotaxina, y cuando el polímero hidrosoluble se une a un residuo que está adyacente a la parte C terminal, el sitio de unión del polímero comprende un aminoácido que corresponde a D68 de MCP-1 o D66 de eotaxina, respectivamente. Aquí nuevamente, los residuos en el sitio C terminal que están adyacentes a estas posiciones se pueden aprovechar para unión polimérica, tal como K69 de CP1 o K68 de eotaxina. Además, la adición de una porción enlazante o separadora permite más flexibilidad en la adición de otras porciones en o cerca de la parte C terminal, tal como una porción hidrofóbica similar a un lípido o un material policíclico. En consecuencia, las quimiocinas sintéticas bioactivas modificadas en los polímeros preferidas adicionales de la invención comprenden un polímero hidrosoluble unido en el sitio C terminal a través de la cadena lateral de una porción enlazante o separadora, b. Sitios de agregación Son de interés particular las quimiocinas sintéticas que tienen un polímero hidrosoluble unido a uno o más sitios de agregación. Por "sitio de agregación" se quiere significar uno o varios residuos que provocan autoasociación de monómeros proteínicos. La mayor parte de las quimiocinas tienen potencial para formar homodímeros, y muchas son capaces de formar tetrámeros y algunas incluso multímeros más grandes (Cytokine Reference, Vol . 1, Ligands, A compendium of cytokines and other mediators of host defen3e,- Eds . J.J.

Oppendheim and M. Feldmann, Academic Press, 2001). Los sitios de agregación de las quimiocinaa típicamente se encuentran en quimiocinas capaces de formar complejos diméricos y multiméricos a altas concentraciones (Cytokine Reference, Vol . 1 , Ligands , A compendium of cytokineb and other mediators of host defense, Eds . J.J. Oppendheim and M. Feldmann, Academic Press, 2001) . Por ejemplo, las quimiocinas tales como Rantes y ????ß forman agregados mediante autoasoación de monómeros a alta concentración, mientras que las quimiocinas tales como IL-8, SDFla y vMIP no presentan esta tendencia en algún grado significativo. Los sitios de agregación son identificables vía numerosos métodos bien conocidos tales como modelado de homología, exploración de alanina y comparación de compuestos activos a concentraciones cada vez mayores en solución y examen para determinar agregación, autoasociación utilizando diversas técnicas conocidas en el arte (Véase por ejemplo, Czaplewski et al., J. Biol. Chem. (1999) 274 (23) : 16077-16084 ; Czaplewski et al., "Engineering , Biology, and Clinical Development of hmip-la," (1999) In: Chemokines in Disease: Biology and Clinical Research, Ed. , C.A. Herbert , Humana Press Inc., Totwa, NJ; Trkola et al., J. Virol . (1999) 73 (8 ): 6370-6379 ; Appay et al., J. Biol. Chem. (1999) 274 (39) : 27505-27512 ; Hunter et al., Blood (1995) 86 ( 12 ) : 4400-4408 ; Lord et al., Blood (1995) 85 (12) :3412-3415; Lord et al., Brit. J. Cáncer (1996) 74:1017-1022) . Y como se indica en lo anterior, se conocen los sitios de agregación de muchas quimiocinas así como las técnicas para identificar sitios de agregación putativos (Véase también Cytokine Reference, Vol . 1, Ligands, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds . , J.J. Oppendheim and M. Feldmann, Academic Press, 2001). Por lo tanto, se pueden identificar sitios de agregación de quimiocinas a partir de información publicada, modelado por homología, mediante cribado o una combinación de cada una de las anteriores. Por lo tanto, los ejemplos que se presentan aquí son ilustrativos de la invención y por lo tanto no se pretende que limiten la invención. A modo de ejemplo, se han identificado sitios de agregación en muchas quimiocinas mediante diversas técnicas tales como las descritas antes. Por ejemplo Rantes de tipo silvestre posee por lo menos dos residuos involucrados en agregación: los ácidos glutámicos en las posiciones de residuos 26 y 66 (es decir Glu26 y Glu66; o E26 y E66) . De esta manera, cuando la quimiocina sintética es un análogo de Rantes, cuando se une un polímero hidrosoluble en un sitio de agregación, el sitio de agregación puede comprender un aminoácido que corresponda a un residuo de Rantes que se selecciona de E26 y E66. Por ejemplo, hemos unido un polímero hidrosoluble que está adyacente a E66 de Rantes, específicamente, en una posición que corresponde a metionina 67 (es decir, Met67 o M67) . Esta modificación de polímero interrumpe la agregación y mejora las propiedades de manejo generales, debido probablemente a una gran cubierta hidrofóbica contribuida por el polímero que interrumpe las propiedades de agregación del residuo de ácido glutámico adyacente. Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, el sitio de agregación en Rantes corresponde no solo a E26 y E66, sino también aminoácidos que estén adyacentes a estos. Así, el sitio de agregación en Rantes comprende un aminoácido que corresponde a un residuo de Rantes que se selecciona de E26 y E66 y que incluye a M67. Como otro ejemplo, cuando la quimiocina sintética es un análogo de ????a, y cuando el polímero hidrosoluble se une en un sitio de agregación del mismo, el sitio de agregación comprende un aminoácido que corresponde a un residuo de ????a que se selecciona de D26 y E66. Similarmente , cuando la quimiocina sintética es un análogo de ????ß, y cuando el polímero hidrosoluble se une en un sitio de agregación del mismo, tal sitio de agregación puede comprender un aminoácido que corresponda a un residuo de ????ß que se selecciona de las posiciones D27 y E67 , En otro ejemplo adicional, cuando la quimiocina sintética es un análogo de MCP-1 o de eotaxina, y cuando el polímero hidrosoluble se une a un sitio de agregación, el sitio de agregación comprende un aminoácido que corresponde al residuo P8 y D68 de MCP-1 o D66 de eotaxina, respectivamente. Aquí nuevamente, se pueden aprovechar los residuos adyacentes a estas posiciones para unión de polímero con el fin de interrumpir la agregación, tal como K69 de MCP-1 o K68 de eotaxina, y por lo tanto se constituye en quimiocinas sintéticas bioactivas de la invención que tienen un polímero hidrosoluble unido en un sitio de agregación del mismo. Como se puede apreciar, los sitios de agregación son identificables fácilmente y son sitios preferidos para modificación por polímeros y se pueden seleccionar para unión preferencial mediante cribado sistemático en búsqueda de la bioactividad que se desee. En una modalidad más preferida, el polímero hidrosoluble se une en un sitio de agregación que se localiza en la región C terminal de la quimiocina de interés. Un sitio de agregación incluso más preferido para la unión de polímero es uno que está C terminal respecto a la a-hélice en la parte C terminal de las quimiocinas tal como E66 y M67 de Rantes, E66 de ????a, E67 de ????ß, D68 de MCP-1, o D66 de eotaxina. En consecuencia, las quimiocinas sintéticas bioactivas preferidas de la invención incluyen aquéllas que tienen un polímero hidrosoluble unido en el sitio de agregación C terminal que está C terminal respecto a la -hélice C terminal del mismo. Las quimiocinas sintéticas bioactivas más preferidas de este aspecto de la invención son aquéllas que tienen un polímero hidrosoluble unido en el sitio de agregación C terminal que está C terminal respecto a la a-hélice C terminal del mismo que está adyacente al residuo C terminal pendiente de una quimiocina precursora, c. Sitios de glucosilacióxi En otra modalidad preferida, se proporcionan quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención que tienen un polímero hidrosoluble unido en un sitio de glucosilación . Por "sitio de glucosilación" se entienden residuos que codifican para unión enzimática de la cadena de carbohidrato (oligosacáridos) tal como sitio de glucosilación unidos a N o unidos a O. De manera más preferida, los sitios de glucosilación son aquéllos que se presentan en la región C terminal de una quimiocina. Los sitios de glucosilación unidos a N son los más preferidos. Los sitios de glucosilación pueden ser un sitio natural o bien sometido a ingeniería en una proteína objetivo. Se pueden identificar en una molécula de tipo silvestre por pruebas analíticas para determinar la presencia de sacárido y su sitio de unión, homología, comparación o por exploración de secuencias de consenso o estructuras contra bases de datos de genes y proteínas. Una ventaja de someter a ingeniería genética un sitio de glucosilación en una proteína objetivo es que se pueden identificar sitios preferidos adicionales para unión de polímeros con la condición de que los sitios sometidos a ingeniería no interrumpan la bioactividad deseade de interés. En particular, la mayor parte de las proteínas sintetizadas por los ribosomas del retículo endoplásmico rugoso contienen cadenas cortas de carbohidratos (oligosacáridos) y se denominan glicoproteínas (Véase, por ejemplo Van den Steen et al., Critical Rev. Biochem. Mol. Biol. (1998) 33 (3) :151-208) . Y se conocen muchas quimiocinas que están glicosiladas o que contienen sitios de consenso para glucosilación unida a N o unida a 0, o ambas opciones. En realidad, muchas quimiocinas producidas de manera natural están altamente glicosiladas. Esto vuelve a los sitios de glucosilación de las quimiocinas de interés particular para modificación del polímero. Por ejemplo, las glicoproteínas son responsables de muchas propiedades importantes de la proteína (por ejemplo pl, tamaño molecular, solubilidad, estabilidad, estructura y carga superficial electrostática) así como de la superficie de las células eucariotas (por ejemplo reconocimiento y adhesión célula-célula, protección de carga célula-superficie contra "usar y desgarrar" antígenos específicos de grupo sanguíneo, virus, bacterias y receptores de protozoarios , antígenos de transplante (histocompatibilidad) canales de iones y muchos otros) . Por lo tanto, la unión de polímeros hidrosolubles en tales sitios se puede aprovechar para imitar propiedades útiles (por ejemplo pl, tamaño, solubilidad, estabilidad, antigenicidad reducida, vida media prolongada en circulación) , mientras que se eliminan otras (por ejemplo heterogeneidad, depuración mediada por sacáridos y adhesión no deseada) para generar un compuesto medicamento que tenga propiedades mejoradas. Además, la unión de un polímero hidrosoluble en uno o más sitios de glucosilación en general debe reducir el impacto en la bioactividad y posiblemente mejorar dado que la naturaleza ha seleccionado tales sitios para unión de polímeros hidrosolubles grandes. El contenido de carbohidrato de las glicoproteínas (con frecuencia 50% o mayor del peso total) se une covalentemente al polipéptido como cadenas laterales oligosacáridos que típicamente contienen 4 a 15 azúcares) . Pueden existir varias cadenas laterales en el mismo polipéptido y las cadenas pueden estar ramificadas. Hemos encontrado que los sitios de glucosilación son indicadores relativamente buenos de los sitios susceptibles de unión de polímeros, particularmente polímeros hidrosolubles ramificados de peso molecular relativamente alto que tienen grupos de carga pendientes que imitan la contribución de carga neta de las cadenas oligosacáridas unidas a través de glucosilación.

Al identificar I03 sitios de glucosilación, los oligosacáridos de las glicoproteínas son de dos tipos principales: unidas a 0 y unidas a N. Los oligosacáridos unidos a O habitualmente se unen a la proteína vía enlaces 0-glicosídicos a los grupos OH de las cadenas laterales de serina y treonina. Los oligosacáridos unidos a N se enlazan a la proteína vía enlaces N glicosílicos a los giupos NH2 de las cadenas laterales de asparagina en donde la asparagina se presenta en la secuencia, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina y aspartato. Las cadenas de carbohidratos N-glicosiladas se unen al residuo Asn en Asn-X-Ser/Thr (X es cualquier aminoácido diferente de Pro) en polipéptidos , como se menciona en lo anterior. Sin embargo, muchas proteínas contienen una o varias secuencas Asn-X-Ser/Thr no glicosiladas y la presencia de esta secuencia no siempre resulta en la adición de una cadena de carbohidratos en la misma. Sin embargo, la presencia o ausencia de N-glicosilación se puede probar fácilmente (Biller, M. et al . , J. Virol Methods 1998 Dic; 76(1-2) 87-100 ; Taverna, M. et al., J. Biotechnol 1999 Feb 5; 68 (1) :37-48; Friedman, Y. et al.. Anal Biochem 1995 Jul 1; 228(2) : 221-5) . Por otra parte, las cadenas de carbohidratos 0 glicosilados se unen al residuo Ser o Thr en los polipéptidos, pero a diferencia del caso de la N-glucosilación, no hay una regla respecto a la secuencia de aminoácidos necesaria para la glucosilación . Sin embargo, se sabe que la tendencia a la glucosilación aumenta cuando se presenta Pro en la vecindad, por ejemplo, en las secuencias Pro-Thr/Ser, Thr/Ser-Pro y Thr/Ser-Xl-3 -Pro (X es cualquier aminoácido) (Takahashi et al.: Proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A. (1984) 81:2021). Una vez más, aquí se puede probar fácilmente la glucosilación unida a O. Se conocen muchas quimiocinas que están glicosiladas o que contienen sitios de glucosilación putativos (Véase, por ejemplo Cytokine Reference, Vol . 1, Ligands, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds . J.J. Oppendheim and M. Feldmann, Academic Press, 2001) . Por lo tanto, los sitios de glucosilación de las quimiocinas se pueden identificar a partir de información publicada. Para los sitios predichos, una manera preferida de confirmar los sitios de glucosilación unidos a N u O es a través de comparaciones de homología (por ejemplo utilizando bases de datos y sistemas de pareamiento de patrones adecuados para este propósito, véase, por ejemplo Xiang, Y. et al., Virology 1999 Mayo 10 ; 257 (2 ): 297-302 ; Hoops, T.C. et al., J. Biol Chem 1991 Marzo 5 ; 266 ( 7 ) : 4257 - 63 ) ; Apweiler, R. et al., Biochim Biophys Acta 1999 Dic 6 1473 ( 1 ) : 4 -8 ) , seguido por prueba de una quimiocina precursora en un sistema de expresión celular de levadura o mamífero y llevar a cabo pruebas analíticas para caracterizar el conteindo de sacárido y los sitios de unión. Alternativamente, se pueden modificar los sitios putativos identificados a través de comparaciones de homología con un polímero hidrosoluble de interés y después simplemente cribar en un bioensayo in vitro relevante para determinar la bioactividad de interés (por ejemplo flujo de calcio, quimotaxia o inhibición de la entrada viral) siguiendo protocolos estándar adecuados para este propósito. A modo de ejemplo, el modelado por homología identifica un sitio de glucosilación unido a O putativo en la serina en la posición 5 (es decir, Ser5 o S5) en Rantes, el cual está soportado por otros estudios (Kameyoshi et al . , J Exp ed (1992) 176 (2 ): 587-592 ) el cual muestra que la forma glicosilada tiene actividad quimiotáctica en el intervalo de 2-1.0 Nm. Para los análogos de Rantes que son antagonistas tales como los análogos de NNY-Rantes , el cambio de la serina en la posición 5 de Rantes a una porción de grupo soluble cargado tal como Glu o Lys reduce la potencia, mientras que la introducción de una porción de aminoácido tal como una t-butilalanina (tBuA) retiene la potencia, cuando se mide en un ensayo basado en células para infección viral/fusión. Así, para los antagonistas de Rantes, la unión de un polímero hidrosoluble en el sitio que corresponde a la posición S5 en Rantes de tipo silvestre preferiblemente es a través de un enlazante biodegradable , por ejemplo, un enlace éster a la cadena lateral hidroxilo de serina o grupo similar, el cual puede proporcionar al compuesto antagonista de Rantes sustancialmente en forma de precursor. La degradación y liberación del análogo de Rantea del polímero hidrosoluble en un sistema in vivo de esta manera genera la forma activa. La unión a través, y el uso de enlaces biodegradables tales como enlaces éster es bien conocido y se describe con mayor detalle en lo siguiente. Se ha encontrado una situación similar para otras quimiocinaa tales como ????a y ????ß, las cuales tienen uno o dos sitios de glucosilación unidos a O potenciales. Por ejemplo, ???? tiene un sitio de glucosilación predicho que comprende un aminoácido que corresponde al residuo T7 , y para ????ß, en donde el sitio de glucosilación predicho que comprende un aminoácido corresponde al residuo S5. Estos dos ejemplos son análogos a Rantes en la medida en que se predicen los sitios de glucosilación unidos a 0, y por lo tanto para análogos antagonistas MIP la unión preferida será a través de un enlace biodegradable de manera que se permita la formación de la forma activa después de liberación in vivo del polímero. Muchas quimiocinas adicionales tienen sitios de glucosilación y se pueden sintetizar y modificar con uno o más polímeros hidrosolubles , de acuerdo con la presente invención. Por lo tanto, los ejemplos presentados en la presente son ilustrativos de la invención y por lo tanto no se considera que limiten la invención. Por ejemplo, la lifotact na es una quimiocina de 93 residuos que contiene 8 sitios de glucosilación unidos a O. Este compuesto se ha sintetizado utilizando la ligación química nativa, con un solo residuo GalNAc incorporado en cada sitio de glucosilación utilizando la química Fmoc estándar (Marcaurelle et al., Chemistry (2001) 7 (5) : 1129-1132) . En otras quimiocinas, tales como MCP-1, el sitio de glucosilación comprende un aminoácido que corresponde al residuo T71 de MCP-1. Aunque está presente una secuencia de N-glucosilación canónica en MCP-1 en la posición N14, no hay un azúcar unido a N detectable. En vez de esto, se agrega una cantidad pequeña de carbohidrato O unido sialilado a la parte C terminal de la proteína (Zhang et al., J. Biol . Chem. (1994) 269:15918-15924), con el sitio predicho constituido por T71. Se ha reportado que la forma glicosilada tiene únicamente 2 a 3 veces menos potencia en comparación con MCP1 no glicosilada en ensayos de quimiotaxia de monocitos in vitro (Proost et al., J. Immunology (1998) 160:4034-4041). Otra quimiocina glicosilada es HCC-1, la cual es la única quimiocina CC conocida hasta ahora la cual circula en concentraciones nanomolares en plasma humano (Richter et al., Biochemistry (2000) 39(35) : 10799-10805) . HCC-1 existe en diversas formas procesadas, con la forma de 74 aminoácidos de longitud completa que tiene O-glucosilación en la posición 7 (Ser7) con dos ácidos N-acetilneuramínicos y el disacárido N-acetilgalactosamína galactosa. En una modalidad más preferida, el polímero hidrosoluble se une a un sitio de glucosilación que se localiza en la región C terminal de la quimiocina de interés. El sitio de glucosilación más preferido para la unión de polímero es uno que está C terminal respecto a la hélice a C terminal de las quimiocinas. Por ejemplo, cuando la quimiocina sintética es MCP-1, un polímero hidrosoluble preferiblemente se unirá en el sitio de glucosilación que corresponde a la posición de residuo T71 de MCP-1 silvestre. En consecuencia, las quimiocinas sintéticas bioactivaa preferidas de la invención incluyen aquéllas que tienen un polímero hidrosoluble unido en un sitio de glucosilación C terminal que está C terminal a la hélice a C terminal del mismo . d. Sitios de unión de GAG En otra modalidad preferida de la invención, se proporcionan quimiocinas sintéticas bioactivas que tienen un polímero hidrosoluble unido a un sitio de unión de GAG del mismo. Por "sitio de unión de GAG" se entienden residuos que codifican para unión de GAG; típicamente residuos con aminas primarias o secundarias tales como lisina y arginina, y algunas veces histidina que forma un grupo de carga positiva en la superficie de una proteína. Las quimiocinas que se conocen que se unen a GAG incluyen heparina, sulfato de heparano, sulfato de condroitina y sulfato de dermatano, las cuales se presentan de manera natural en superficies de células endoteliales y matriz extracelular (Véase, por ejemplo Wells et al., Inflairan. Res. (1999) 48:353-3362; Lalani et al., J. Virol . (1997) 71:4356-4363; Rot, A., Eur J Immunol (1993) 23:303-306; Witt et al., Curr Biol (1994) 4:394-400; Hoogewerf et al., Biochem (1997) 36:13570-13578; Marquezini et al., Cardiology (1995) 86:143-146; Wasty et al., Diabetologia (12993) 36:316-322). Kuschert et al. (Biochem. (1999) 38:12959-12968), Koppman et al. (J. Immunol. (1999) 163:2120-2127) y Proudfoot et al. (J. Biol. Che . (2001) 276 (14) : 10620-10626) que reportan en unión de GAG y quimiocinas . Aunque no es esencial para la función, se reporta que las capacidades de unión de GAG de las quimiocinas modulan las interacciones con el receptor así como la migración aptotáctica de células que presentan receptor sobre proteína de matriz y caras celulares (Véase, por ejemplo, Rot, A., Eur J Immunol (1993) 23:303-306; Witt et al., Curr Biol (1994) 4:394-400; Hoogewerf et al., Biochem (1997) 36:13570-13578; Marquezini et al., Cardiology (1995) 86:143-146; Wasty et al., Diabetologia (1993) 36:316-322; Kuschert et al., Methods Enzymol . (1997) 287 : 369-378 ; Kuschert et al . , Biochem. (1998) 37:11193-11201; Kuschert et al . , Biochem. (1999) 38:12959-12968) . La unión de quimiocinas con GAG solubles impide la unión de las quimiocinas a sus receptores en la mayor parte de los casos ' (Kuschert et al., Biochem. (1999) 38:12959-12968). Sin embargo, la interacción de las quimiocinas con GAG en algunos caaos se ha reportado que potencia la actividad (Wbb et al . , Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. (1993) 90:7158-7162; y Wagner et al., Arteriesclerosis (1989) 9:21-32)). Por lo tanto, se pueden aprovechar las quimiocinas sintéticas que tengan un polímero hidrosoluble unido a un sitio de unión de GAG de la misma para modular la función biológica ya sea reducir la unión a GAG o la desviación de la unión de ciertos GAG que dependen del sitio elegido para unión y su uso final propuesto. En consecuencia, una modalidad preferida de la invención se relaciona con quimiocinas sintéticas bioactivas que tienen un polímero hidrosoluble unido al mismo en un sitio de unión de GAG, y que tienen la bioactividad in vi tro de modular por disminución un receptor de quimiocina al cual se unen. Como se indica en lo anterior, todas las quimiocinas conocidas son susceptibles de unir heparina, aunque con afinidades variables y por lo tanto todas tienen sitios de unión de GAG. Al seleccionar un sitio GAG para modificación del polímero, son adecuadas para este propósito muchas técnicas diferentes. Por ejemplo, se ha demostrado que los motivos BBXB y BBBXXB, en donde B representa un residuo básico son un motivo común de unión de heparina para diversas proteínas, que incluye varias quimiocinas (Véase, por ejemplo, Cardin et al., Arteriesclerosis (1989) 9:21-32; Hileman et al., Bioessays (1998) 20 (2) : 156-167 ; y Proudfoot et al., J. Biol. Che . (2001) 276 (14) : 10620-10626) . Sin embargo, los sitios de unión de GAG no se limitan a los motivos BBXB o BBBXXB. Por ejemplo, los sitios de unión GAG en Rantes (4RKNR47 y S5KKWVR59) , SDF-1 (24KHLK27) , MIP-lcc (4SKRSR48) y ???-?ß ( SKRSK48) , tienen un motivo BBXB, mientras que los residuos princpales que unen GAG en IL-8 (Lys20, Lys64 y Arg68) y MCP-1 (Lys59 y Arg66) están separados espacialmente , pero forman un grupo de carga básica sobre la superficie de la proteína. Por lo tanto, la carga básica de estos ligandos explica sus propiedades de unión a heparina. Los sitios GAG también son identificables mediante exploración de residuos básicos de alanina (por ejemplo Lys, His y Arg) , RM y comparación de los compuestos activos en ensayos de unión de GAG/heparina, así como estudios de RMN adaptados para este propósito (Véase, por ejemplo Proudfoot et al., J. Biol. Chem. (2001) 276 ( 14 ) : 10620- 10626 ; Trkola et al., J. Virol. (1999) 73 (8) : 6370-6379; Appay et al., J. Biol.

Chem. (1999) 274 (39) : 27505-27512 ; Hunter et al . , Blood (1995) 86 (12).:4400-4408 Lord et al . , Blood (1995) 85 (12 ) : 3412 -3415 ; Lord et al., Brit. J. Cáncer (1996) 74:1017-1022). Y como se indica en lo anterior, se conocen muchos sitios de unión de GAG de muchas quimiocinas, y son bien conocidas las técnicas para identificar sitios GAG putativos (Véase también, Cytokine Reference, Vol . 1, Ligands, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds . J.J. Oppendheim y M. Feldmann, Academic Press, 2001) . Por lo tanto, se pueden identificar los sitios de unión de GAG de las quimiocinas a partir de la información publicada, modelado por homología, a través de cribado o una combinación de cada uno de estos. Además, dado que por lo menos una de las. cadenas laterales de un residuo relacionado con la unión de GAG se localizará en la superficie de la molécula y alejado de la región de farmacóforo N terminal, estos sitios generalmente son susceptibles de unirse a un polímero hidrosoluble . A modo de ejemplo, con Rantes tipo silvestre que posee por lo menos dos sitios de unión GAG principales, los cuales comprenden un aminoácido que corresponde a un residuo de Rantes que se selecciona de Lys44, Lys45, Arg47, Lys55, Lys56, y Arg59 (es decir, K44, K45, R47, K55, K56 y R59) . Por lo tanto, cuando la quimiocina sintética es un análogo de Rantes y cuando se une un polímero hidrosoluble en el sitio de unión de GAG de la misma, el sitio de unión de GAG comprende un aminoácido que corresponde a un residuo de Rantes que se selecciona de K44, K45, R47, K55, 56 y R59. En una modalidad preferida, se une un polímero hidrosoluble en una posición que corresponde a un residuo de Rantes que se selecciona de K44, K45, R47, prefiriéndose adicionalmente la posición K45. En esta modalidad, la unión del polímero en la posición 45 tiene el beneficio de reducir la unión del análogo de quimiocina Rantes sintético al receptor CCR1, mientras que retiene sustancialmente la unión a CCR5. Como otro ejemplo, cuando la quimiocina sintética es un análogo de MlPla, y cuando se une un polímero hidrosoluble en un sitio de unión de GAG del mismo, el sitio de unión de GAG comprende un aminoácido que corresponde a un residuo de MlPla que se selecciona de R17, R45 y R47. De manera similar, cuando la quimiocina sintética es un análogo de ????ß, y cuando el polímero hidrosoluble se une en un sitio de unión de GAG del mismo, tal sitio de agregación puede comprender un aminoácido que corresponde a un residuo de ????ß que se selecciona de las posiciones R18, R45 y R46. En estos dos ejemplos, el sitio preferido para unión del polímero está en R45 de ??1- y R46 de ????ß. A] igual que con Rantes, estas modificaciones se diseñan para desviar la unión del análogo de quimiocina a CCR5.

En un ejemplo adicional, cuando la quimiocina sintética es un análogo de SDFl-a, y cuando el polímero hidrosoluble se une a un sitio de unión de GAG, el sitio de unión GAG comprende un aminoácido que corresponde al residuo K24, H25 y K27 de SDFl-cc. Aquí nuevamente, se pueden aprovechar los residuos adyacentes a estas posiciones para unión del polímero con el fin de obtener sustancialmente el mismo resultado, tal como N22 o N30 o N33, particularmente N33 y por lo tanto está constituido en quimiocinas sintéticas bioactivas de la invención que tienen un polímero hidrosoluble unido en un sitio de unión de GAG del mismo. En otro ejemplo adicional, cuando la quimiocina sintética es un análogo de IL-8, y cuando el polímero hidrosoluble se une en el sitio de unión GAG, el sitio GAG comprende un aminoácido que corresponde a un residuo de IL-8 que se selecciona de K20, R60, K64, KS7 y R68. El sitio preferido de unión de polímero para un análogo sintético de IL-8 corresponde a la posición K64 del mismo. Otro ejemplo es MCP-1, de manera que cuando la quimiocina sintética es un análogo de MCP-1 y cuando se une un polímero hidrosoluble en el sitio GAG del mismo, el sitio GAG comprende un aminoácido que corresponde a un residuo de MCP-1 que se selecciona de K58 y H66, prefiriéndose K58. Como se puede apreciar, los sitios de unión de GAG son identificables fácilmente y son sitios preferidos para modificación de polímeros y se pueden seleccionar para unión preferencial a través de cribado sistemático para determinar la bioactividad deseada. Los bioensayos adecuados para este propósito son bien conocidos y la literatura se encuentra repleta de estos (Cytokine Reference, Vol . 1, Ligands, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds . , J.J. Oppendheim y M. Feldmann, Academic Press, 2001). 2. Polímeros hidrosolubles Preferiblemente, la modificación polimérica de la invención que se va a unir a una quimiocína sintética bioactiva de la invención será un polímero hidrosoluble . El término "polímero hidrosoluble", como se utiliza en la presente, se diseña para indicar una construcción de un polímero sustancialmente no antigénico que es soluble en agua. Los ejemplos de polímeros hidrosolubles biológicos incluyen, pero no se limitan a: (a) dextrano, sulfato de dextrano, carboximetildextrina (b) glucosaminoglucanos tales como heparina, sulfato de heparano, sulfato de condroitina y sulfato de dermatano; (c) hialuronina y ácido hialurónico ; (d) ; polilactida y acri ato de oligolactilo ; (e) celulosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa (f) colágeno; (g) gelatina; (h) algínato; y (i) almidones. Los polímeros hidrosolubles de la presente invención pueden ser lineales, ramificados, en forma de estrella o una mezcla de tales conformaciones y pueden tener una amplia gama de pesos moleculares y subunidades poliméricas. Estas subunidades pueden incluir un polímero biológico, un polímero sintético o una combinación de loa mismos . Muchos derivados de tales polímeros hidrosolubles biológicos se conocen y están incluidos en la presente. Los ejemplos de polímeros hidrosolubles sintéticos incluyen, pero no se limitan a; (a) polímeros que comprenden óxido de polialquileno , óxido de polietileno, copolímero de et ileno/anhídrido maleico y derivados de los mismos, que incluyen homopol ímeros y copolímeros de los mismos tales como polietilenglicol , monometoxipolietilenglicol , homopolímeros de polipropilenglicol , copolímeros de etilenglicol con propilenglicol y derivados de los mismos en donde tales homopolímeros y copolímeros están no sustituidos o sustituidos en un extremo con un grupo alquilo; (b) alcohol polivinílico y éteres de poliviniletilo ; (c) polivinilpirrolidona; (d) polioles polioxietilados que incluyen polioles pluronic; (e) poliésteres tales como poli (ácido glucólico) ; poli (ácido L-láctico) ; poli (ácido D-láctico) ; poli (ácido DL-láctico) ; copolímeros de lactida/glicolida; poli- 1 , 3 , 6- trioxano ; poli - 1 , 3 -dioxolano, poli (p-dioxanona) y copolímeros; policaprolactona; copolímeros de PEG-poliéster ; poli (ásteres de fosfato) ; (f) poli (ortoésteres) (g) polianhídridos ,- (h) pseudopoli (aminoácidos) (ya sea homopolimeros o copolímeroa aleatorios); (i) poligl icerol ; (j) dextrano, carboxímetilcelulosa ; y similares. Los polímeros hidrosolubles tales como los que se acaban de describir en lo anterior son bien conocidos y se han utilizado con diversas químicas de unión, sistemas de enlace y estructuras como construcciones bioestables, biodegradables así como precursores para enlace a péptidos, polipéptidos y otros compuestos (Véanse, por ejemplo, las solicitudes de patantes internacionales: WO 90/13540, WO 92/00748, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28937, WO 95/11924, WO 96/00080, WO 96/23794, WO 98/07713, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/30727, WO 99/32134, WO 99/33483, WO 99/53951, WO 01/26692, WO 95/13312, WO 96/21469, WO 97/03106, WO 99/45964 y las patentes de E.U.A. NOS . 4,179,337; 5; 075, 046,¦ 5,089,261; ,100,992; 5, 134 ,192 ; 5, 166,309; 5, 171, 264; 5,213,891; , 219, 56 ; 5,275,838; 5,281,698; 5, 298, 643 ; 5, 312, 808 ,¦ , 321 , 095 ; 5, 324 ,844 ; 5,349,001; 5, 352, 756; 5, 405, 877; ,455, 027; 5, 446, 090; 5,470,829; 5, 478, 805; 5, 567, 422 ; , 605, 976; 5 , 61 , 60 ; 5, 614549; 5, 618, 528; 5, 672,662; , 637, 749; 5, 643,575; 5, 650, 388; 5, 681, 567; 5, 686, 110; , 730, 990; 5, 739, 208; 5,756,593; 5, 808, 096; 5,824,778; ,824,784; 5,840,900; 5,874,500; 5 , 880 , 131 ; 5, 900,461; ,902,588? 5,919,442; 5,919,455; 5,932,462; 5,965,119; 5,965,566; 5,985,263; 5,990,237; 6,011,042; 6,013,283; 6,077,939; 6,113,906; 6,127355; 6,177,087; 6,180,095; 6,194,580; 6,214,966) . La información adicional respecto a los polímeros adecuados se proporciona por Turnbull, W.B. et al. (Calbiochem (2000), Toward the Synthesis of Large Oligosaccharide-Based Dendrimers", 1:70-74), van Duijvenbode , R.C. et al. (Macromolecules (2000) "Synthesis and Protonation Behavior of Carboxylate-Functionalized Pol (propyleneimine) Dendrimers", 33:46-52), Marcaurelle, L.A. ("Recent Advances in the Synthesis of Mucin-Type Glycoproteins" , htt : / /www . chem. unt . edu/acs/pdf/marcaur . df ) , Domenek, S. ("The Human Genome Project: Challenge for Society and Chemistry" , http : //ww . orgc . tugraz . at/orgc/ hoegroup/chem ges/domenek . PDF) , Imperiali, B. et al. ("Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure," Current Opinión in Chemical Biology 1999, 3:643-649), Rudd, P.M. et al. ("Glycosylation and the Immune System," Science (2000) 291:2370-2376), Van den Steen, P. et al. ("Concepts and Principies of O-Linked Glycosylation," Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 33 (3) : 151-208 (1998)), nischka, R. et al. ( "Star- Shaped Polymers Based On Polyglycerol Cores: Synthesis, Characterization And Crosslinking, " http: //www-ics.u-strasbg. r/~equipe3 /Poster4.pdf) , Rudd, P.M. et al ("Roles for Glycosylation of Cell Surface Receptora Involved in Cellular Immune Recognition, J. Mol. Biol . (1999) 293, 351-366) y Davis, B.G. ( "Recent developments in glycoconjugates , " J. Chem. Soc, Perkin Trans . 1 1999, (22), 3215-3237). Los polímeros hidrosolubles de la presente invención preferiblemente tendrán un peso molecular hidrodinámico efectivo mayor de 10,000 unidades Dalton ("Da") y de manera más preferible, de aproximadamente 20,000 a. 500,000 Da, y de manera mucho más preferible de aproximadamente 40,000 a 300,000 Da. Por "peso molecular hidrodinámico efectivo" se entiende el tamaño efectivo solvatado en agua de una cadena polimérica, determinado por cromatografía de exclusión de tamaño en base acuosa (SEC, por sus siglas en inglés) . Cuando el polímero hidrosoluble contiene cadenas poliméricas que tienen unidades repetidas de óxido de etileno, se prefiere que cada cadena tenga un peso molecular atómico de entre aproximadamente 200 y aproximadamente 80,000 Da y preferiblemente entre aproximadamente 1,500 y aproximadamente 42,000 Da, prefiriéndose adicionalmente entre 2,000 y aproximadamente 20,000 Da. A menos que se haga referencia específica, el peso molecular se considera que se refiere al peso molecular atómico . Tales polímeros hidrosolubles pueden incluir cadenas poliméricas que son bioestables o biodegradables . Por ejemplo, los polímeros con enlaces repetidos que tienen grados variables de estabilidad bajo condiciones fisiológicas dependen de la labilidad de las uniones. Los polímeros con tales uniones pueden clasificar por sus tasas relativas de hidrólisis bajo condiciones fisiológicas en base en las velocidades de hidrólisis conocidas de análogos de peso molecular bajo, por ejemplo, a partir de policarbonatos menos estables a más estables ( -0-C (0) -0- ) > poliésteres (-C(0)-0-)> poliuretanos ( -NH-C (0) -0- ) > poliortoésteres ( -0-C ( (OR) (R' ) ) -0-)> políamidas (-C(O)-NH-). De manera similar, los sistemas de enlace que se unen a un polímero hidrosoluble con una molécula objetivo pueden ser bioestables o biodegradables , por ejemplo, del carbonato menos estable al más estable (-0-C(0.)-0-)> éster (-C(0)-0-)> uretano ( -NH-C (0) -0- ) > ortoéster (-0-C((OR) (R'))-0-)> amida (-C(O)-NH-). Estas uniones se proporcionan a modo de ejemplo y no se pretende que limiten los tipos de uniones utilizables en las cadenas poliméricas o en los sistemas de enlace los polímeros hidrosolubles de la invención. Como se indica en lo anterior, la bioactividad de una proteína sintética de la invención se puede modificar al alterar la naturaleza del polímero hidrosoluble que se une a la misma. Un polímero hidrosoluble preferido para este propósito tiene la fórmula: U-B-Polímero-J en donde U es un residuo de un grupo funcional que es capaz de unirse o que se une a una molécula objetivo, B es un núcleo de ramificación que tiene 3 ó más brazos y que puede estar presente o ausente, Polímero es un polímero hidrosoluble sustancialmente no antigénico que tiene un peso molecular equivalente igual o mayor de 1000 Da y J es un grupo pendiente que tiene una carga neta bajo condiciones fisiológicas que se selecciona de negativo, neutro o positivo. Tales polímeros incluyen a los que se describen en la solicitud de patente de E.U.A. No. de Serie 60/236,377, la cual se incorpora en la presente en su totalidad. Los componentes U, B, Polímero y J se pueden separar de otros grupos del polímero hidrosoluble por uno o más porciones separadoras o enlazadoras. Por lo tanto, el polímero hidrosoluble U-B-Polímero-J se puede representar por la fórmula: U- si-B-S2- Polímero- s3-J en donde Si, s2 y s3 son porciones separadoras o enlazadoras que pueden ser iguales o diferentes y que individualmente pueden estar presentes o ausentes. Los separadores o enlazadores preferidos incluyen porciones lineales o ramificadas que comprenden una o más unidades repetidas utilizadas en un polímero hidrosoluble, unidades diamino o diácido, aminoácidos naturales o no naturales, o derivados de los mismos, así como porciones alifáticas que incluyen alquilo, arilo, heteroalquilo, heteroarilo, alcoxi, y similares, las cuales preferiblemente contienen hasta 18 átomos de carbono o incluso una cadena polimérica adicional. Como se indica en lo anterior, el componente U es un residuo de un grupo funcional que es capaz de unirse o que se une a una molécula objetivo, tal como un péptido o polipéptido. Cuando U es un residuo de un grupo funcional para conjugación a una molécula objetivo, U comprende un grupo nucleofílico o un grupo electrofílico , y la molécula objetivo comprende un grupo electrofílico mutuamente reactivo o un grupo nucleofílico, respectivamente. El polímero descrito en lo anterior se puede utilizar para producir una proteína modificada con polímero hidrosoluble, que comprende la fórmula: Proteína-W, en donde W es el grupo de polímero hidrosoluble de fórmula: -aO-U-sl-B- s2 -Polímero- s3 -J; en donde U es un residuo de un grupo funcional que se une a la proteína en la proteína directamente o a través de sO, y en donde B es un núcleo de ramificación que tiene tres o más brazos y que puede estar presente o ausente, Polímero es un polímero sustancialmente hidrosoluble y no antigénico que tiene un peso molecular equivalente igual o mayor de 1000 Da, J es un grupo pendiente que tiene una carga neta bajo condiciones fisiolológicas que se seleccionan de negativo, neutro o positivo, y sO, si, s2 y s3 son porciones separadoras o enlazadoras que pueden ser iguales o diferentes y que pueden estar individualmente presentes o ausentes . Se conocen muchos de tales grupos funcionales mutuamente reactivos y que son capaces de unión a grupos funcionales de cadena lateral comunes a péptidos y polipéptidoa o grupos funcionales de cadena lateral derivatizados (que forman derivados) (Zalipsky et al., Bioconjugate Chemistry (1995) 6:150-165; "Perspectives in Bioconjugate Chemistry" , C.F. Meares, Ed., ACS, 1993; "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking" , S.S. Wong, Ed., CRC Press, Inc. (1993)). Los ejemplos de grupos funcionales incluyen grupos capaces de reaccionar con un grupo amino tal como: (a) carbonatos tales como p-nitrofenilo, o succinimidilo ; (b) carbonilimidazol ; (c) azlactonas; (d) tionas imida cíclicas; y (e) isocianatos o isotiocianatos . Los ejemplos de grupos funcionales capaces de reaccionar con grupos de ácido carboxílico y grupos carbonilo reactivos incluyen: (a) aminas primarias; o (b) grupos funcionales hidrazina e hidrazida tales como acilhidrazidas , carbazatos, semicarbamatos , tiocarbazatos, aminooxi, etc. Los grupos funcionales capaces de reaccionar con grupos mercapto o sulfhidrilo incluyen fenilglioxales , maleimidas y halógenos. Los ejemplos de grupos funcionales capaces de reaccionar con grupos hidroxilo tales como ácidos (carboxílico) u otros nucleófilos capaces de reaccionar con un centro electrofílico incluyen hidroxilo, amino, carboxilo, grupos tiol, metileno activo y similares. Por ejemplo, se pueden preparar polímeros idrosolubles que presenten el componente U como un grupo funcional para unión a una molécula objetivo, en donde el grupo funcional es acrilato, aldehido, cetona, aminooxi , amina, ácido carboxílico, éster, tioéster, halógeno, tiol, cianoacetato, dipalmitoilofosfatidiletanolamina, diestearoil fosf tidiletanolamina, epóxido, hidrazida, azida, isocianato, maleimida, metacrilato, carbonato de nitrofenilc, disulfuro de ortopiridilo, silano, sulfhidrílo, vinilsulfonas , glutarato de succinimidilo, succinato de succinimidilo, ácido succínico, tresilato y similares. U también se puede proporcionar en una forma activable, por ejemplo un ácido carboxílico que se puede convertir a un éster activo del mismo que sea capaz de reaccionar con un nucleófilo tal como una amin . En una modalidad preferida, U es un residuo de un grupo funcional único que es reactivo selectivamente con un grupo funcional único sobre la molécula objetivo. Este aspecto de la invención constituye los principios de la síntesis peptídica (estrategia de grupos protectores) y ligación química (estrategia parcial o no de grupos protectores) . Para la estrategia de grupos protectores, todos los grupos funcionales potencialmente reactivos excepto para U y su grupo mutuamente reactivo funcional en la molécula objetivo se bloquean con grupos protectores adecuados. Se conocen muchos grupos protectores y son adecuados para este propósito (Véase, por ejemplo "Protecting Groups in Organic Synthesis", 31 edición, T.W. Greene y P.G.M. Wuts, Eds., John iley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; "Synthesic Peptides, A User's Guide," G.A. Grant, Ed. , W.H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry, " .D.. Bennet, J.W. Christensen, L.K. Hamaker, M.L. Peterson, M.R. Rhodes, y H.H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principies of Peptide Synthesis, 2* ed.," . Bodanszky, Ed. , Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, l ed.," M. Bodanszky y A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; y "Protecting Groups," P.J. Kocienski, Ed. , Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1994) . Por lo tanto, U puede representar un residuo de una amplia gama de grupos funcionales, tales como los descritos antes. Para la estrategia de grupo parcial o sin grupo protector, U y su grupo funcional mutuamente reactivo presente en la molécula objetivo utiliza un par de reacción quimioselectivo en el cual pueden estar presentes otros grupos funcionales en el sistema de reacción pero que no son reactivos. Esto incluye grupos U susceptibles de estrategias de retención de amina (por ejemplo, ligación por formación hemiaminal, por formación de imina y por adición de Michael) , estrategia de retención de tiol (por ejemplo ligación por formación de mercapturo por intercambio de disulfuro) , estrategias de ligación química nativa (por ejemplo ligación por intercambios de tioéster que involucra un derivado de aminoácido de cadena lateral que contiene cisteína o tiol) y estrategias de acoplamiento de ligación ortogonal (por ejemplo, ligación por formación de tiazolidina, por intercambio tioéster, por formación de tioéster, por intercambio de disulfuro y por formación de amida) (Véase, por ejemplo, Coltart, DM. , Tetrahedron (2000) 56:3449-3491). Un U preferido comprende un residuo de un grupo funcional único utilizado en una química de ligación compatible acuosa tal como la ligación química nativa (Dawson, et al., Science (1994) 266:776-779; Kent , et al., WO 96/34878), ligación química general extendida (Kent, et al., WO 98/28434) , ligación química de formación de oxima (Rose, et al., J. Amer. Chem. Soc . (1994) 116:30-33), ligación de formación de tioéster (Schnólzer, et al., Science (1992) 256:221-225), ligación de formación de tioéter (Englebretsen, et al., Tet. Letts. (1995) 36 (48) : 8871-8874) , ligación de formación de hidrazona (Gaertner, et al., Bioconj . Chem. (1994) 5 (4) :333-338) , y ligación de formación de tiazolidina y ligación de formación de oxazolidina (Zhang, et al., Proc.

Nati. Acad. Sci. (1998) 95 (16) : 9184-9189; Tam, et al . , WO 95/00846), o por otros métodos (Yan, L.Z. y Dawson, P.E., "Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization, " J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 526-533, que se incorpora en la presente por referencia Gieselnan et al., Org. Lett . 2001 3 (9) : 1331-1334 ; Saxon, E. et al., "Traceless" Staudinger Ligation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds . Org. Lett. 2000, 2, 2141-2143). Dadas las diversas químicas de unión descritas en lo anterior, será evidente que cuando U es un residuo de un grupo funcional conjugado a una molécula objetivo, U puede comprender un residuo de un enlace que se selecciona de carbonato, éster, uretano, ortoéster, amida, amina, oxima, imida, urea, tiourea, tioéter, tiouretano, tioéster, éter, tiazolidina, hidrazona, oxazolidína y similar. Los enlaces preferidos son enlaces oxima y amida. Como se indica en lo anterior, B es una porción de núcleo de ramificación que tiene tres o más brazos, y puede estar presente o ausente. Cuando está presente B, un brazo se una a U o un separador o enlazante se une a U y cada otro brazo se une a un Polímero o un separador o enlazador unido a un Polímero. Los ejemplos de núcleos de ramificación B incluyen, pero no se limitan a amino, amida, carboxílico y combinaciones de los mismos. Estos incluyen oligoamidas de lisina o argin na, o una combinación de loa mismos, u oligómeros preparados a partir de alcanodiaminas y ácido acrílico ( "poliamidoaminas" ) , estas últimas proporcionan una carga positiva neta en el núcleo de ramificación (Véase, por ejemplo Zeng et al., J. Pept . Sci. (1996) 2:66-72; Rose et al., Bioconjugate Chem. , (1996) 7 (5) : 552 -556 ; NovoBiochem Catalog and Peptide Synthesis Handbook, Laufelfingen, 2001; Wells et al., Biopolymers (1998) 47:381-396; Mahajan et al., (1999) 40:4909-49-12; Judson et al. (1998) 39:1299-1302; Swali et al., (1997) 62:4902-4903; patentes de E.U.A. Nos. ,932,462, 5,919,455,5,643,575, 5,681,567) . Se pueden utilizar muchos otros núcleos de ramificación diferentes y que son adecuados para este propósito, que incluyen diaminas sustituidas, diácidos sustituidos, ácidos de alquilo tales como glicerol y otras porciones que tienen tres o más grupos funcionales o activables que incluyen porciones multivalentes alquilo, arilo, heteroalquilo , heteroarilo y alcoxi y similares, y oligosacáridos (por ejemplo, Nierengarten et al., Tetrahedron Lett. (1999) 40:5681-5684; Matthe s et al., Prog. Polym. Sci. (1998) 1-56; Suner et al., Macromolecules (2000) 33:253; Fischer et al., Angew. Chem. Int. Ed. (1999) 38:884; Sunder et al., Adv. Mater. (2000) 12:235; Mulders et al., Tetrahedron Lett. (1997) 38:631-634; Mulders et al., Tetrahedron Lett. (1997) 38:30-3088; y Turnbull et al., Chembiocehm (2000) l(l):70-74).

Los núcleos de ramificación preferidos son amino, carboxílico y, mixtos , amino y carboxílico. Además, las construcciones de polímero ramificado preferidas son aquéllas en las cuales las ramas que surgen del núcleo de ramificación único, tal como un núcleo oligoamida o poliamidoamina . Sin embargo, se pueden utilizar otras clases de construcciones ramificadas tales como estructuras similares a gusanos, en las cuales la ramificación surge de la secuencia de núcleos de ramificación múltiples distribuidos a lo largo de una estructura principal polimérica (Schlüter et al., Chem. Int. Ed. (2000) 39:864) . En base en la composición química o en el volumen de la estructura principal polimérica y las unidades repetidas, se pueden diseñar estructuras similares a gusanos resultantes para que sean hidrosolubles o susceptibles a inducir organización cristalina líquida (Ouali et al., Macromolecules (2000) 33:6185), lo cual puede ser útil para aplicaciones de suministro, estabilidad y duración de acción. Al igual que con otras construcciones de polímero ramificadas de la invención, las construcciones similares a gusanos se elaboran para que contengan un grupo funcional pendiente que contiene U. El componente Polímero del polímero hidrosoluble de la fórmula U-B-Polímero-J incluye a los polímeros hidrosolubles descritos antes . Se selecciona un componente de Polímero preferido de: (a) polímeros que comprenden óxido de polialquileno, óxido de polietileno y derivados de los mismos que incluyen homopolímeros y copolímeros de los mismos tales como polietilenglicol , monometoxipoletilenglicol , homopolímeros de polipropilenglicol , copolímeros de etilenglicol con propilenglicol y derivados de los mismos, en donde tales homopolímeros y copolímeros están no sustituidos o sustituidos en un extremo con un grupo alquilo; (b) alcohol polivinílico y éteres de poliviniletilo; (c) polivinilpirrolidona ; (d) polioles polioxietilados que incluyen polioles de pluronic; (e) poliésteres tales como poli (ácido glicólico) ; poli (ácido L-láctico) ; poli (ácido D-láctico) ; poli (ácido DL-láctico) ; copolímeros de lactida/glicolida, poli (p-dioxanona) y copolímeros; policaprolactona ; copolímeros de PEG-poliéster; poli (ésteres de fosfato); (f) poli (ortoésteres) ; (g) polianhídridos ; (h) pseudo-poli (aminoácidos) ; e (i) poliglicerol ; y similares. Entre estos polímeros preferidos comprenden óxido de polialquileno, particularmente aquéllos que comprenden óxido de polietileno de la fórmula ( -CH2-CH2-0) n o (0-CH2-CH2- ) n en donde n es 2 o más, y derivados de los mismos, que incluyen homopolímeros y copolímeros de los mismos (Véase por ejemplo, "Poly (ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications", J.M. Harris, Ed., Plenum Press, New York, NY (1992); y "Poly (ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications", J.M. Harris y S. Zalipsky, Eds . , ACS (1997).

El componente de Polímero más preferido es en donde el polímero hidrosoluble de U-B-Polímero-J se produce en una síntesis total o paulatina. Esto significa que estos polímeros tendrán un peso molecular preciso y una estrutura definida. En constraste, la síntesis de polímero norm l, la cual es un proceso de polimerización, resulta en una mezcla en la cual las cadenas son de longitudes diferentes y de esta manera existe una distribución de pesos y tamaños moleculares que es difícil, si no imposible, de separar. La capacidad de controlar la pureza molecular es útil en la medida en que se puede construir una proteína sintética que tenga un polímero hidrosoluble unido al mismo y que esté monodispersado . Esto representa una ventaja importante en que se pueden evitar propiedades variables que resulten de compuestos heterogéneos y que se pueden preparar únicamente aquéllos compuestos con las propiedades más preferidas, con facilidad relativa. El componente de Polímero más preferido comprende poliamidas de las fórmulas - [C (O) -X-C (O) -NH-Y-NHJ n- o - [NH-Y-NH- (O) -X-C (O) ] n- como se describe en O 00/12587, en donde n es un número entero positivo de 1 a 100, y de manera más preferible de 2 a 100, y en donde X e Y son elementos repetidos biocompatibles de estructura precisa unidos, por ejemplo, por un enlace amida. X e Y pueden ser radicales divalentes, etc. X e Y pueden ser iguales o diferentes y pueden estar ramificados o ser lineales. En ejemplos altamente preferidos, por lo menos uno de X e Y comprende una unidad repetida de polímero hidrosoluble. Una unidad repetida hidrosoluble repetida para X, Y comprende un óxido de polialquileno , un óxido de polietileno y derivados de los mismos, que incluyen homopolímeros y copolímeros de los mismos, en donde tales homopolímeros y copolímeros pueden estar no sustituidos o sustituidos, lineales o ramificados y pueden incluir grupos flanqueantes que comprenden grupos alquilo, arilo, arilalquilo y similares, por ejemplo polioles polioxietilados que incluyen polioles de Pluronic y grupos flanqueantes alifáticos de 1 a IB átomos de carbono. Se apreciará que las variaciones menores incluyen poliamidas de la fórmula - [C (O) -X- HC (O) -Y-NH]n- o - [NH-Y-C (O)NH-X-C (O) ]n. X' e Y' son submodalidades de X e Y en donde X = X' -NH o NH-X' e Y=Y ' e Y=Y' -NH o NH-Y' . Una unidad repetida hidrosoluble más preferida para X' e Y' comprende una fórmula de óxido de polietileno ( -CH2-CH2-0- ) n o (0-CH2-CH2- ) n en donde n es 2 a 50, 3 a 25, 3 a 10 y de manera más preferible 3 a 5. Como se indica en lo anterior, el componente J puede ser cualquier grupo que tenga una carga neta bajo condiciones fisiológicas que se seleccionan de neutra, positiva o negativa. Esto incluye grupos alquilo, arilo, arilalquilo, acilo y carbonilo que están sustituidos o no sustituidos así como sales de los mismos. Tales grupos pueden ser un componente de aminoácidos, ácidos nucleicos, ácidos grasos, carbohidratos y derivados de los mismos y porciones tales como quitina, quitosana, heparina, sulfato de heparano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatano y sulfato de dermatano, ciclodextrina , dextrano, ácido hialurónico, fosfollpido, ácido siálico y similares. J preferiblemente comprende una porción ionizable que se selecciona de carboxilo, amino, tiol, hidroxilo, fosforilo, guanidinio, imidazol y sales de los mismos. El más preferido es cuando J comprende una porción carboxilato ionizable y tiene una carga negativa neta bajo condiciones fisiológicas. De acuerdo con la presente invención, una solución preferida a los problemas de heterogeneidad de polímero, diversidad y carencia de adecuabilidad involucra la producción de una clase nueva de polímeros biocompatibles que combine las ventajas tanto de los polipéptidos (longitud precisa, síntesis conveniente) como grupos que imiten la glucosilación ("grupos glucomiméticos" ) , un polímero no inmunogénico anfifílico y flexible no susceptible a proteasas) Rose, K. et al. (solicitud de patente de E.U.A. No. de Serie 09/379,297, incorporado en la presente como referencia) . En una modalidad preferida de tales Polímeros preferidos, - [C (O) -X-NHC (O) -Y-NH] n- o - [ H-Y-C (0) NH-X-C (0) ] n, X e Y serán radicales orgánicas divalentes que carecen de grupos funcionales reactivos o estarán ausentes y pueden ser iguales o diferentes, y pueden variar independientemente con cada unidad repetida (n) . Preferiblemente, cuando n = 2, por lo menos uno de X o Y se seleccionará del grupo que consiste de un grupo alifático y aromático sustituido, no sustituido, ramificado y lineal. De manera más preferible, los radicales orgánicos divalentes se seleccionarán del grupo que consiste de fenilo, una porción alquileno de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, un fenilo que contiene heteroátomo, una porción alquileno que de 1 a 10 átomos de carbono que contiene heteroátomo, un grupo alquilo de 1 a 10 átomos de carbono que contiene heteroátomo y combinaciones de los mismos. Las porciones glucomiméticas particularmente preferidas están representadas por la fórmula: -{CO- (CH2) 2-CO-NH- (CH2)3- (OCH2CH2) 3-CH2-NH}„-en donde n varía preferiblemente de 1 a 100 y de manera más preferible de 2 a 100; o - {CO- (CH2) 2-CO-NH- (CH3) 6-NH-C0- (CH2) 2-CO-NH- (CH2) 3- (OCH2CH2) 3- CH2-NH-}n-, en donde n preferiblemente varía de 1 a 50, y de manera más preferible de 2 a 50. Un grupo glucomimético particularmente preferido tiene n = 12, X es -(CH2)2-/ e Y es : - (CH2) 30 (CH2) 20 (CH2) 20 (C¾) 3- . Las porciones glucomiméticas de la presente invención se pueden sintetizar de diversas maneras. Tales porciones, sin embargo, se producen preferiblemente utilizando el ensamblado de unidades de cadena paulatina en fase sólida, en vez de un proceso de polimerización. El uso de tal proceso de ensamblado permite que las porciones de una preparación tengan una estructura definida y homogénea, respecto a su longitud, la naturaleza de sus sustituyentes X e Y, una o varias de las posiciones (si las hay) de los puntos de ramificación y la longitud de los sustituyentes X e Y así como una o varias de las posiciones de cualquiera de las ramas. Preferiblemente, tales porciones se sintetizarán por etapas tales como: (a) acilar el grupo amino o hidro ilo de un compuesto de la fórmula Z-Q-soporte con un exceso molar de un derivado de un diácido que tiene la fórmula, HO0C-X-CO0H, en donde 2 es H2N- o H0-; Q es un enlazante o una molécula dirigida; y el soporte es una fase sólida, matriz o superfici ; (b) activar el grupo carboxilo libre del producto de la etapa (a) ; (c) aminolisar el producto de la etapa (b) con un exceso molar de una diamina que tiene la fórmula, NH2-Y-NH2 ; y (d) opcionalmente repetir las etapas (a) - (c) utilizando HOOC-X-COOH y N¾-Y-NH2, en donde X e Y son radicales orgánicos divalentes o están ausentes y son iguales o diferentes y pueden variar independientemente con cada una de las unidades repetidas opcionalmente, y son iguales o diferentes de los sustituyentes X e Y utilizados en cualquiera de las etapas acilantes y aminolisantes previas. En modalidades preferidas, se utilizan grupos de 6, 12, 18 ó 32 unidades de la unidad repetida anterior. Cuando se desea, la unidad repetida puede ser utilizada (por ejemplo, en conjunción con el grupo amino de lisina para formar estructuras glucomiméticas ramificadas. Los grupos glucomiméticos se pueden unir a las proteínas sintéticas de la presente invención por una diversidad de procedimientos químicos que incluyen formación de enlaces tioéter, oxima y amida . En una modalidad, el montaje de cadena paulatino en fase sólida de las unidades comprende: Etapa 1 : Acoplar el diácido protegido o sin proteger a amino en la resina para generar un enlace amida en el sitio de enlace (en donde PG es un grupo protector que está presente o ausente, dependiendo del diácido utilizado) : PG-OOOX-COOH + NH2-Y-NH- esina Etapa 2: Separar el grupo protector (PG) de la resina, si está presente HOOC-X-CO- H-Y-NH-Resina Etapa 3 : Acoplar el diamino protegido o sin proteger al carboxi en la resina para generar un enlace amida en el sitio de unión (en donde PG está presente o ausente, en base en el diamino utilizado) PG- H-Y-NH + HOOC-X-CO-NH-Y- H-Resina Etapa 4: Separar el grupo protector (PG) en la resina, si está presente -NH-Y-NH-OC-X-CO-NH-Y-NH-Resina Etapa 5: Repetir las etapas 1 a 4 "n" veces para agregar "n" unidades y después separarlas de la resina - [CO-X-CO-NH-Y-NH] - [CO-X-CO-NH-Y-NH] - [CO-X-CO-NH-Y- H] - [CO-X- CO-NH-Y-NH] - 3. La síntesis de los polímeros hidrosolubles de la presente invención Los polímeros hidrosolubles de la presente invención se pueden sintetizar por cualquiera de diversos métodos. Las figuras 1A a 1E muestran esquemas de ligación que involucran la unión de un polímero hidrosoluble (U-B-Polímero-J* como ge define en la presente) a segmentos peptídicos parcial o completamente no protegidos ('w wwv j antes o después de la ligación, o combinaciones de los mismos. En las figuras 1A a ID, Yaa representa el aminoácido en la parte C terminal de un primer segmento peptidico que presenta una porción quimioselectiva única (por ejemplo un aminoácido que presenta un tioéster carboxilo alfa) para ligación química a un segundo segmento peptidico que presenta una porción única y mutuamente reactiva de un aminoácido en la parte N terminal Xaa (por ejemplo una cisteína amino terminal) que es capaz de ligación química quimioselectiva con Yaa. La reacción quimioselectiva entre Yaa y Xaa genera un enlace covalente dentro (por e emplo enlace amida) . Por lo tanto Yaa y Xaa forman un pareamiento de ligación quimioselectivo . Un- , como se muestra en las figuras, representa una segunda porción quimioselectiva única que se ha incorporado en un sitio preciso definido por el usuario en la cadena lateral de un aminoácido y es quimioselectivo para, y mutuamente reactivo con el grupo U- del polímero hidrosoluble U-B-Polímero-J* . Por ejemplo, cuando Un es una cadena lateral que se ha modificado para presentar un grupo cetona, U- del polímero hidrosoluble U-Polímero-J* es un grupo quimioselectivo para reaccionar con la cetona, por ejemplo, un grupo aminooxi el cual presenta un enlace oxima dentro. El subíndice "n" de Un- representa el número de aminoácidos y sus cadenas laterales diseñado para presentar un grupo U quimioselectivo, por ejemplo, cuando dos sitios específicos y definidos por el usuario van a ser modificados por el polímero n = 2, el cual también está representado como U2 o Un = 2. En todos los casos, n es un número entero positivo y se controla con precisión por diseño. Por lo tanto Un y U representan un segundo pareamiento de ligación quimioselectivo que es compatible y que no reacciona con los grupos quimioselectivos de Xaa e Yaa. Las figuras 1A y IB ilustran dos reacciones potenciales diferentes. En la primera reacción que se muestra, se liga una cadena polipeptídica que presenta una funcionalidad Un a un segundo polipéptido y después se hace reaccionar con una porción U-B-Polímero-J* con el fin de obtener un polipéptido modificado en el polímero. En la segunda reacción que se muestra, la cadena polipeptídica que presenta la funcionalidad Un se hace reaccionar con una porción U-B-Polímero-J* con el fin de obtener un polipéptido modificado en el polímero, y después se liga a un segundo polipéptido, para obtener un polipéptido más grande, modificado con polímero. Las figuras difieren en que la figura 1A, el polipéptido que tiene el residuo Xaa es para recibir la modificación del polímero, mientras que en la figura IB, el polipéptido que tiene el residuo Yaa recibe la modificación del polímero. La figura 1C ilustra la capacidad de la presente invención para modificar cadenas polipeptídicas múltiples, ya sea antes o después de su ligación para formar un polipéptido más grande. En la figura ID, PG y PG' representan grupos protectores, en donde PG' muestra un grupo protector ortogonal, es decir, PG y PG' se pueden separar bajo condiciones diferentes y son útiles cuando los polímeros hidrosolubles diferentes se unen vía la misma química a grupos Un, o en donde los grupo Un representan grupos funcionales de cadena lateral que uno no desea modificar con un polímero (por ejemplo, cadenas laterales que presentan -NH2 o -SH reactivos en donde el grupo U del polímero hidrosoluble se diseña para reaccionar exclusivamente con un amino primario o con tioles de cadena lateral) . La figura ID muestra que se pueden utilizar grupos protectores con el fin de proteger las cadenas laterales deseadas de los polipéptidos que se ligan, de acuerdo con los métodos de la presente invención. La figura 1E ilustra la diversidad de grupos que pueden estar presentes o ausentes en los segmentos peptídicos utilizados en ligación y modificación de polímero, de acuerdo con las figuras 1A-1D. Las figuras 2A-2C muestran esquemas adicionales de procesos para preparar proteínas bioactivas sintéticas de la invención. En particular, las figuras 2A-2B muestran un esquema de ligación que involucra la unión de un polímero hidrosoluble U-B-Polímero-J* a la cadena lateral de un grupo terminal amino Xaa en el sitio de ligación (por ejemplo, la cadena lateral tiol de cisteína) . La figura 2C ilustra la diversidad de grupos que pueden estar presentes o ausentes en los segmentos peptídicos utilizados en la ligación y modificación de polímero, de acuerdo con las figuras 2A-2B. Las figuras 3A-3B son esquemas de representación adicional de un proceso para llevar a cabo ligaciones de segmentos múltiples que involucran la ligación química de tres o más segmentos peptídicos que no se superponen, es decir, por lo menos un segmento se encuentra en un segmento medio que corresponde al producto de ligación de longitud completa final. Los péptidos preparados de esta manera se pueden utilizar para preparar segmentos peptídicoa involucrados en otra reacción de ligación, por ejemplo, como se muestra en las figuras 1A-1E, figuras 2A-2C y figuras 4A-4C. En general, para ligaciones de segmentos múltiples, uno o varios segmentos medios que tienen un grupo Xaa protegido o un grupo Yaa protegido para evitar la ciclización o formación de concatómeros de ese péptido dependen de la química de ligación que se utilice. Para ligaciones secuenciales o en serie, el grupo Xaa del segmento medio está protegido (por ejemplo Cys (Acm) ) mientras que el grupo Yaa no está protegido (por ejemplo, Yaa-COSJ?, en donde -COSR es un tioéster alfa-carboxilo) . Aquí, el grupo Yaa es libre de reaccionar con un segundo péptido que presenta un grupo Xaa no protegido, en donde el segundo péptido carece de un grupo Yaa libre. Después de la ligación, el grupo protector se separa para regenerar el grupo Xaa para la siguiente reacción de ligación. Este proceso continúa, según se necesite y de esta manera se genera una cadena polipeptídica alargada. La protección del grupo Yaa es particularmente útil para ligación qúimica convergente que involucra la producción de un producto de ligación final constituido de cuatro o más segmentos. Por ejemplo, para una proteína objetivo generada a partir de ligación de cuatro segmentos (es decir, tres reacciones de ligación) , se pueden ligar en paralelo dos segmentos que correspondan a un extremo de la proteína y dos segmentos que correspondan al otro extremo de la proteína, en oposición a una realización en secuencia, y los dos extremos se unen en una reacción de ligación final. Tal esquema de ligación química convergente se describe para reacciones de ligación química mediadas por tioéster (por ejemplo, la ligación química nativa y nativa extendida) en la solicitud de patente de E.U.A. No. de Serie 60/231,339, la cual se incorpora como referencia. Aquí nuevamente, la diversidad de los grupos que pueden estar presentes o ausentes en tales segmentos peptídicos se ilustran en las figuras 1E, 2C y 4C. Las figuras 4A-4C ilustran la manera en que se puede llevar a cabo de acuerdo con los principios de la presente invención una ligación química nativa y modificación química del tiol de la cadena lateral resultante. En particular, las figuras 4A-4B muestran el uso de ligación química nativa y la modificación química del tiol de la cadena lateral cisteína resultante en uno o varios de los sitios de ligación para formar un "pseudoaminoácido" (representado por ¾¾aa) vía tioalquilación y generación de una cadena lateral modificada químicamente (mostrada por ?) que comprende un enlace tioéter. En una modalidad alternativa, que no se muestra, el tiol de la cadena lateral se puede convertir a una alanina en la reacción de desulfuración (Liang et al., J". A er. Che . Soc. (2001) 123 (4) : 526-533 ) . Un aspecto importante de ambas reacciones es que cualquier otro tiol de cadena lateral que uno no desee convertir o modificar debe estar protegido con un grupo protector adecuado (PG) o para ligaciones de segmentos múltiples y un grupo protector ortogonal (PC) en donde el segmento que presenta el grupo Yaa carboxi terminal comprenda un grupo Xaa amino terminal protegido, es decir, un PG-Xaa-péptido, el cual se proporciona a modo de ejemplo en la figura 4B. La figura 4C ilustra la diversidad de grupos que pueden estar presentes o ausentes en los segmentos peptídicos utilizados en ligación y modificación de polímero, de acuerdo con las figuras 4A-4B, así como las figuras 1A-1E, figuras 2A-2C y figuras 3A-3B. Las figuras 5A-5B muestran el proceso en fase sólida para generar un núcleo de ramificación (B) y un grupo funcional quimioselectivo único (U) del polímero hidrosoluble U-B-Polímero-J* de la invención. El proceso se puede llevar a cabo en solución, aunque se prefiere el enfoque en fase sólida, como se muestra. En particular, la figuiá 5A muestra una porción precursora U-B protegida ortogonalmente con el grupo reactivo y la estruct ^ ^^métrica básica de tal construcción se muestra con puntos unidos con enlaces ; esta estructura g + 't \ica básica no se pretende que limite aquéllos tipos de enlaces químicos o grupos utilizados, sino que únicamente sea ilustrativa de los puntos de geometría relativos para construir estructuras y puntos de elaboración química adecuados para generación de porciones U-B de la invención. ^__^^cursor U-B protegido ortogonalmente se acopla a un soporte/resina de polímero que comprende un enlazante separable adecuado y un grupo correactivo seguido por activación que se capaz de enlace covalente al precursor U-B: Soporte de polímero Enlazante Este sistema utiliza los principios de la química orgánica de polímero soportado. Después del acoplamiento, el núcleo de ramificación se elabora (se muestra únicamente un primer punto de ramificación, y los puntos de ramificación adicionales pueden estar presentes o ausentes) , como se ilustra para generar un núcleo de ramificación que sea adecuado para unión subsecuente de un componente de Polímero deseado, tal como un polímero lineal hidrosoluble , sustancialmente no antigénico. También se muestra el grupo U, el cual se puede proporcionar en la salida de la síntesis como parte del precursor U-B protegido ortogonalmente, o elaborado durante o después de la elaboración del núcleo B de ramificación. Aunque la unión del componente Polimérico se puede obtener en resina, es decir, antes de la separación, una ruta preferida es la separación de la porción U-B del polímero de soporte/resina de manera que se genera un núcleo U-B que puede ser purificado para unión subsecuente al componente de Polímero. Como se ilustra, los puntos de ramificación pendientes del grupo B de núcleo so construyen para comprender un grupo funcional (Func) , el cual puede ser igual o diferente y se puede proteger de manera reversible [PG, PG' o PG' ') o puede quedar sin protección. En cada caso, la etapa final para unión del componente de Polímero involucra la generación de un grupo funcional (Func) en los puntos de ramificación pendientes y generación del grupo U (véase la figura 7) . La figura 5B muestra un proceso alternativo en el cual se utiliza un precursor U-B protegido en combinación con un soporte de polímero que tiene un enlazante, el cual ante la separación genera el grupo U protegido o sin proteger, deseado. La figura 5 también muestra la unión de un núcleo B de ramificación preensamblado a un soporte del polímero, y el uso de un grupo U que genera resina para elaborar la porción U-B para unión subsecuente del componente de Polímero. Las figuras 6A-6D muestran un proceso en fase sólida para generar componentes de polímero-J* de poliamida hidrosolubles sustancialmente no antigénicos preferidos, de la invención para unión subsecuente al núcleo U-B. Aunque se ilustra el proceso en fase sólida, el cual es el proceso preferido, se puede adaptar un proceso en fase en solución para obtener el mismo resultado final . En las figuras 6A y 6B, las unidades diácido y diamino se acoplan utilizando los principios de la química orgánica en fase sólida. Opcionalmente , las unidades protegidas amino-X' -ácido o amino-Y' -ácido se pueden incorporar para diversidad adicional de los grupos X e Y en el producto de separación final que tiene una estructura poliamida de la fórmula - [NH-Y-NHCO-X-CO] - . La figura 6A muestra la síntesis en la dirección N a C terminal, mientras que la figura 6B muestra la síntesis en la dirección C a N terminal. En las figuras 6C y 6D, se acoplan las unidades protegidas a amino-X' -ácido o amino-Y' -ácido utilizando los principios de la química orgánica en fase sólida. La figura 6C muestra la síntesis en la dirección N o C terminal, mientras que la figura 6D muestra una síntesis en la dirección C a N terminal. Como es evidente de las figuras 6A-6D, se puede controlar con precisión la naturaleza de los productos de poliamida finales, lo que depende de la cantidad de ciclos que se llevan a cabo para la síntesis. Además, el grupo J* pendiente se puede construir para virtualmente cualquier especificación definida por el usuario. Cuando se utilizan unidades repetidas monodispersas X, Y, X' e Y' se puede controlar con precisión la estructura molecular exacta del producto de poliamida final.

En la figura 7 se muestra un proceso preferido para acoplamiento del componente U-B al componente de polímero J* para generar construcciones de polímero sintéticas preferidas de la invención de la fórmula U-B-Polímero-J* . Como se ilustra, se pueden proporcionar diversos grupos protectores y son opcionales dependiendo del uso final propuesto de una construcción dada. También se ilustran diferentes rutas para producir las construcciones deseadas de U-B-Polímero-J* que incluyen un enfoque en fase sólida y un enfoque en fase en solución. La figura 8 muestra una ruta alternativa para la unión de precisión de un polímero hidrosoluble a un segmento peptídico utilizable para ligación y producción de las proteínas sintéticas bioactivas de la invención. La primera etapa utiliza la síntesis peptídica en fase sólida ("SPPS", por sus siglas en inglés) (por ejemplo SPPS Fmoc o Boc) , en la cual la cadena lateral de aminoácidos dirigida para unión polimérica se protege con un grupo protector ortogonal (por ejemplo, si se utiliza SPPS Fmoc, se puede utilizar un grupo Boc para proteger el sitio de unión de polímero, o si se utiliza SPPS Boc, se puede utilizar un grupo Fmoc como el grupo protector ortogonal) . Después de la síntesis peptídica, se separa selectivamente el grupo protector ortogonal mientras el resto del péptido permanece protegido. Esto proporciona un sitio de unión único para la siguiente etapa -síntesis de polímero en fase sólida. Una vez que se separa el grupo protector ortogonal, la cadena polimérica se une como un precursor. De manera más preferible, se construye la cadena polimérica mediante rondas suscesivas de síntesis de polímero utilizando un proceso que se muestra en las figuras 6A a 6D. Aunque se muestra un solo sitio de unión de polímero, se puede proporcionar más de uno. 4. Quimiocina precursora El tercer componente se relaciona con la generación de quimiocinas sintéticas bioactivas modificadas en el polímero que tienen bioactividad óptima in vi tro caracterizadas por regulación por disminución del receptor de quimiocina al cual se unen. Esto involucra la selección de una quimiocina precursora (es decir, una quimiocina objetivo que se elige para unión de un polímero hidrosoluble a la misma) que tiene una potencia que es aproximadamente 1 a 5 veces y de manera preferible aproximadamente 5 a 10 veces más grande o mayor (en donde la potencia se mide por CE50 en un ensayo relevante in vitro basado en células) en comparación con el intervalo de potencia deseado de la quimiocina sintética bioactiva modificada con polímero. A modo de ejemplo, al identificar una quimiocina sintética que comprende un análogo de Rantes modificado con polímero que tenga una DE50 deseada para inhibición de infección viral, se sintetizan y se someten a cribado un grupo de análogos precursores no modificados en el polímero, en ensayos de fusión celular para determinar infección por VIH. Se establece la potencia objetivo contra la fusión de la forma modificada con polímero en el intervalo de 10 nM o menor, en comparación con Rantes de tipo silvestre, la cual es de aproximadamente 20 nM o mayor. Al generar una quimiocina de Rantes de precursor deseado, se elaboran una serie de modificaciones para: (1) el residuo en la parte N terminal; (2) interno a la región N terminal; y (3) respecto a la región en la parte C terminal. Se encuentra un análogo de precursor particularmente potente en el cual la serina que corresponde a la posición 1 de Rantes de tipo silvestre está sustituida con una porción n-nonanoilo, la tirosina que corresponde a la posición 3 de Rantes de tipo silvestre está sustituida con L-ciclohexilglicina y una porción de ácido graso está unida al residuo C terminal a través de una porción enlazante dipeptídica (Lys69-Leu70 ) ; se encuentra un análogo incluso más potente el cual incluye estos cambios combinados con la sustitución de la prolina que corresponde a la posición 2 de Rantes de tipo silvestre con L-tioprolina . Se ha encontrado que cuando se une un polímero hidrosoluble lineal o ramificado en el sitio de la parte C terminal de tales análogos de Rantes que contienen uno o más de est09 cambios de manera que se puede obtener la potencia antifusión objetivo deseada de la forma modificada con polímero.

Específicamente, se obtienen una serie de quimiocinas sintéticas que comprenden análogos de Rantes que tienen unas DES0 para inhibición de infección viral en el intervalo de 10 nM o menor. En particular, ambas construcciones de polímero hidrosoluble lineales y ramificadas se unen al sitio en la parte C terminal (posición 67, que corresponde a la metionina en la posición 67 de Rantes de tipo silvestre) que está adyacente a un sitio de agregación conocido en Rantes de tipo silvestre (posición 66, que corresponde al ácido glutámico en la posición 66 de Rantes tipo silvestre) . La adición del polímero hidrosoluble en ese sitio no solo interrumpe la agregación no deseada, las formas de polímero modificadas presentan intervalos de potencia en el intervalo objetivo de 10 nM y menores. Dado que esta observación concuerda con el hallazgo de que una quimiocina precursora dirigida para modificación con polímero preferiblemente tendrá una potencia inicial que sea de aproximadamente 1 a 5 veces y de manera preferible de aproximadamente 5 a 10 veces más grande o mayor (cuando la potencia se mide por CE50 en un ensayo relevante in vi tro basado en células) en comparación con el intervalo de potencia deseado de la quimiocina sintética bioactiva modificada con polímero. Además, se ha encontrado que cada uno de los análogos modificados con polímero de Rantes presenta una vida media en circulación significativamente mejorada, medida en un modelo animal relevante, por ejemplo rata o ratón. Este enfoque sistemático de incorporación de cambios que aumentan la potencia de una quimiocina precursora generalmente es aplicable a otras quimiocinas . En consecuencia, se puede aprovechar la selección de tales quimiocinas precursoras para proporcionar quimiocinas sintéticas bioactivas modificadas en el polímero que muestren un equilibrio preferido de potencia y una vida media en circulación en suero, in vivo. C. Marcado detectable de las quimiocinas de la presente invención Las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención también pueden incluir una marca detectable, tal como un fluoróforo, y otros sustituyentes que se introducen en sitios escogidos específicos que convierten a las moléculas en sondas de la membrana y los fenómenos biológicos celulares relacionados con la acción de quimiocinas, inhibición de virus y similares, así como para la vigilancia de la farmacocinética y similares. Las marcas detectables preferiblemente se unen a la región en la parte C terminal de las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención. Se puede incorporar una marca detectable durante la síntesis o después de la síntesis de la cadena polipeptídica de quimiocina. Como un ejemplo, se puede incorporar una marca detectable en un segmento peptídico antes de la ligación durante el ensamblado de cadena, por ejemplo, puede ser conveniente conjugar un fluróforo a un grupo reactivo no protegido en un péptido unido a resina antes de la separación de otros grupos protectores y liberación del péptido marcado de la resina. Son bien conocidos los derivados aminoácidos que comprenden una marca detectable y las técnicas de síntesis química utilizadas para incorporarlos en un péptido o en una secuencia polipeptídica, y los cuales se pueden utilizar para este propósito. De esta manera, el producto de ligación de la cadena polipeptídica de quimiocina resultante se puede diseñar para contener una o más marcas detectables en posiciones de elección, especificadas previamente. Alternativamente, se puede agregar una marca detectable a los grupos reactivos, preferiblemente grupos reactivos quimioselectivos tales como grupos ceto o aldehido que permiten la unión específica en el sitio, presente en un aminoácido dado de un segmento peptídico antes de la ligación o incluso la cadena de polipéptido después de la ligación. Las marcas detectables adecuadas para este propósito incluyen grupos fotoactivos así como cromóforos que incluyen fluoróforos y otros colorantes, o un hapteno tal como biotina. Tales marcas están disponibles de muchas fuentes comerciales diferentes (Véase, por ejemplo, Molecular Probes, Oregon E.U.A; Sigma and affiliates, S . Louis MO, E.U.A. y similares). Para marcado en resina, la fluoresceína, eosina, Oregon Green, hodamine Green, Rhodol Green, tetrametilrhodamina , Rhodamine Red, Texas Red, cumarina y fluoróforos de NBD, el cromóforo dabcilo y la biotina son, todos, razonablemente estables al fluoruro de hidrógeno (HF) , así como a la mayor parte de otros ácidos y por jo tanto son adecuados para incorporación vía síntesis en fase sólida. (Peled, et al., Biochemistry (1994) 33:7211; Ben-Efraim, et al., Biochemistry (1994) 33:6966). Además de las cumarinas, estos fluoróforos también son estables a reactivos utilizados para la desprotección de péptidos sintetizados utilizando la química Fmoc (Strahilevitz, et al., Biochemisry (1994) 33:10951). También se pueden utilizar los derivados de t-Boc y ct~Fmoc de e-dabcil-L-lisina para incorporar el cromóforo dabcilo en sitios seleccionados en una secuencia polipeptídica . El cromóforo dabcilo tiene una absorción visible amplia y se puede utilizar como un grupo de extinción. El grupo dabcilo también se puede incorporar en la parte N terminal mediante la utilización de dabcilsuccinimidiléster (Maggiora, et al., J Med Chem (1992) 35:3727) . EDANS es un fluoróforo común para pareamiento con el extintor dabcilo en experimentos FRET. Este fluoróforo se introduce convenientemente durante la síntesis automatizada de péptidos mediante la utilización del ácido 5- ( (2- (t-Boc) -?-glutamilaminoetil) amino) naftalen- 1 -sulfónico (Maggiora, et al., J. Med. Chem. (1992) 35:3727). Se puede utilizar una a- (t-Boc) -e-dansil-L-lisina para incorporación del fluoróforo dansilo en los polipéptidos durante la síntesis química (Gauthier, et al., Arch Biochem. Biophys. (1993) 306:304). Al igual que con EDA S, la fluorescencia de este fluoróforo se superpone con la absorción de dabcilo. Se puede obtener la biotinación específica de sitio de los péptidos utilizando el derivado protegido con t-Boc de biocitina (Geahlen, et al., Anal. Biochem. (1992) 202:68), u otros derivados de biotinado bien conocidos tales como NHS-biotina y similares. También se puede incorporar el análogo racémico de benzofenona fenilalanina en péptidos después de su protección con t-Boc o Fmoc (Jíang, et al., Intl. J. Peptide Prot. Res (1995) 45:106) . La separación de los diastereómeros se puede llevar a cabo durante la purificación por CLAP de los productos; la benzofenona no protegida también se puede separar por técnicas estándar en el arte. Los aminoácidos que presentan ceto para acoplamiento de oxima, aza/hidroxitriptofano, biotil -lisina y D-aminoácidos están entre otros ejemplos de aminoácidos que se pueden utilizar para marcado en resina. Se reconocerá que se pueden preparar otros aminoácidos protegidos para síntesis peptídica automatizada mediante la síntesis adaptada siguiendo las técnicas estándar en el arte. En otra modalidad, las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención pueden incluir un medicamento conjugado al mismo (véase, por ejemplo, WO 00/04926) . D. Síntesis de las Quimiocinas de la Presente Invención Y Unión de Polímero Hidrosoluble : También se proporcionan métodos para producir las quimiocinas sintéticas reactivas de la presente invención. El método involucra: (i) síntesis de un análogo de una quimiocina que se presenta de manera natural que comprende una cadena polipeptídica que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a una quimiocina que se presenta de manera natural, en donde la cadena polipeptídica está modificada en una o más de sus porciones N terminal, bucle de N y C terminal con una porción que se selecciona de una cadena alífática y un derivado de aminoácido; y (ii) cribado del análogo de quimiocina para determinar actividad antagonista en comparación con una quimiocina correspondiente que se presenta de manera natural . En particular, el método para producción de las quimiocinas sintéticas bioactivas modificadas en la parte N terminal de la presente invención comprende: (i) sintetizar un análogo de una quimiocina que se presenta de manera natural, que comprende una cadena polipeptídica que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a la quimiocina que se presenta de manera natural, en donde la cadena polipeptídica se modifica en su parte N terminal con una cadena alifática y uno o más derivados de aminoácidos; y (ii) cribar el análogo de quimiocina para determinar actividad antagonista en comparación con la quimiocina correspondiente que se presenta de manera natural . El método para la producción de las quimiocinas sintéticas bioactivas modificadas en la parte C terminal de la presente invención comprende: (i) sintetizar un análogo de una quimiocina que se presenta de manera natural, que comprenda una cadena polipeptídica que tenga una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a la quimiocina que se presenta de manera natural, en donde la cadena polipeptídica se modifica en su parte C terminal con una cadena alifática o policíclica; y (ii) cribar el análogo de quimiocina para determinar actividad antagonista en comparación con la quimiocina que se presenta de manera natural . El método para la producción de las quimiocinas sintéticas bioactivas modifiadas en las partes N/C terminales de la presente invención comprende: (i) sintetizar un análogo de una quimiocina que se presenta de manera natural que comprende una cadena polipeptídica que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a la quimiocina que se presenta de manera natural, en donde la cadena polipeptídica se modifica en su parte N terminal con una cadena alifática y uno o más derivados de aminoácidos y se modifica en su parte C terminal con una cadena alifática o policíclica; y (ii) cribar el análogo de quimiocina para determinar actividad antagonista en comparación con la quimiocina que se presenta de manera natural . La síntesis de las quimiocinas sintéticas bioactivas de la invención se lleva a cabo por síntesis química (es decir, síntesis sin ribosomas) , o una combinación de síntesis biológica (es decir, síntesis ribosómica) y química. Para la síntesis química, las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención se pueden elaborar completamente mediante ensamblado de cadena paulatina o técnicas de condensación de fragmentos, tales como síntesis peptídica en fase sólida o en solución utilizando los enfoques Fmoc y tBoc, o por ligación química de segmentos, peptídicos elaborados por completo mediante ensamblado de cadena o una combinación de ensamblado de cadena y producción biológica. Tales técnicas paulatinas de ensamblado de cadena o condensación y ligación de fragmentos son bien conocidas en el arte (véase, por ejemplo, Kent, S.B.H., Ann. Rev. Biochem. (1988) 57:957-989; Dawson et al., Methods Enzymol . (1991) 287:34-45; Muir et al . , Methods Enzymol. (1997) 289 : 266 -298 ; Wilken et al., Current Opinión In Biotechnology (1998) 5:412-426; Ingénito et al., J. Amer. Chem. Soc . (1999) 121 (49) : 11369-11374 ; y Muir et al., Chemistry & Biology (1999) :R247-R256) . Para ligación química, un primer segmento peptídico que tiene un grupo funcional en la parte N terminal se liga a un segundo segmento peptídico que tiene un grupo funcional en la parte C terminal que reaccione con el grupo funcional de la parte N terminal para formar un enlace covalente entre los mismos. En base en los grupos funcionales seleccionados, la reacción de ligación genera un producto que tiene un enlace amida nativo o un enlace covalente no nativo en el sitio de ligación. El primero o segundo segmentos peptidicos utilizados para ligación química típicamente se elaboran utilizando un montaje de cadena paulatino o condensación por fragmentos. En particular, cuando las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención se elaboran por ligación de segmentos peptidicos, los segmentos se elaboran para contener los grupos reactivos quimioselectivcs pendientes apropiados con respecto a la química de reacción quimioselectiva propuesta que se va a utilizar para ligación. Estas reacciones químicas incluyen, pero no se limitan a ligación química nativa (Dawson, et al., Science (1994) 266:716-719; Kent , et al., O 96/34878), ligación química general extendida (Kent, et al., WO 98/28434), ligación química formadora de oxima (Rose, et al., J. Amer. Chem. Soc. (1994) 115:30-33), ligación formadora de tioéster (Schnólzer, et al., Science (1992) 256:221-225), ligación formadora de tioéter (Englebretsen, et al., Tet. Letts. (1995) 36 (48) :8871-8874) , ligación formadora de hidrazona (Gaertner, et al., Bioconj . Chem. (1994) 5 (4) : 333 -338 ) , y ligación formadora de tiazolidina y ligación formadora de oxazolidina (Zhang, et al., Proc . Nati. Acad. Sci . (1998) 95(16) :9184-9189; Tam, et al., O 95/00846) . Las condiciones de reacción para una química de ligación dada se seleccionan para mantener la interacción deseada de los componentes de ligación. Por ejemplo, se pueden variar el pH y la temperatura, la solubilidad en agua de los péptidos y los componentes, la relación de péptidos, el contenido de agua y la composición de loa péptidos , para optimizar la ligación. adición o exclusión de reactivos que solubilizan los péptidos en diferentes grados pueden utilizarse además para controlar la especificidad y velocidad de la reacción de ligación deseada. Las condiciones de reacción se determinan fácilmente al realizar ensayos para el producto de reacción quimioselectivo deseado en comparación con uno o más controles internos o externos . Un método preferido de síntesis química utiliza la ligación química nativa, la cual se describe en ent et al., WO 96/34878, y un método para preparar proteínas modificadas químicamente en las partes N o C terminales se describe en Offord et al., WO 99/11666, cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia. En general, se hace reaccionar un primer péptido que contiene un tioéster en la parte C terminal con un segundo péptido con una cisteína en la parte N terminal que tiene una cadena lateral sulfhidrilo no oxidada. La cadena lateral sulfhidrilo no oxidada de la cisteína en la parte N terminal se condensa con el tioéster en la parte C terminal en presencia de una cantidad catalítica de un tiol, preferiblemente bencilmercaptano , tiofenol, 2 -nitrotiofenol , ácido 2 -tiobenzoico , 2 -tiopiridina y similares. Se produce un péptido intermediario por unión del primero y segundo péptidos vía un enlace ß-aminotioéster, el cual se rearregla para producir un producto peptídico que comprende al primero y segundo péptidos unidos por un enlace amida . Para una combinación de una producción química y biológica, se elabora un segmento peptídico por síntesis química mientras que otro se elabora utilizando enfoques recombinantes, segmentos los cuales después se unen utilizando ligación química para generar un producto de longitud completa. Por ejemplo, se pueden utilizar los sistemas de expresión de inteína para aprovechar la actividad autoseparable inducible de un elemento de separación de proteína de "inteína" para generar un segmento peptídico de tioéster en la parte C terminal. En particular, la inteína experimenta autoseparación específica en presencia de tioles tales como DTT, b-mercaptoetanol o cisteína, lo que genera un segmento peptídico que presenta un tioéster en la parte C terminal. (Véase, por ejemplo, Muir et al., Chemistry & Biology (1999) 6 :R247-R256 ; Chong et al., Gene (1997) 192:277-281; Chong et al., Nucí. Acids Res. (1998) 26:5109-5115; Evans et al., Protein Science (1998) 7:2256-2264; y Cotton et al., Chemistry & Biology (1999J 6 ( 9 ) : 247 -256) . Este péptido que presenta tioéster en la parte C terminal después se puede utilizar para ligación de un segundo péptido que presente una funcionalidad reactiva con tioéster en la parte N terminal, tal como un segmento peptídico que tiene una cisteína en la parte N terminal, como se utiliza para una ligación química nativa. Las cadenas alifáticas hidrofóbicas y los derivados de aminoácidos se pueden incorporar durante el ensamblado de la cadena, después del ensamblado de la cadena o en una combinación de los mismos. Para incorporación durante el ensamblado de la cadena, los derivados de aminoácidos o los aminoácidos que tengan la cadena alifática unida a la misma se incorporan de manera paulatina o por condensación de fragmentos, o el proceso de ensamblado de cadena de ligación. Estos aminoácidos se pueden agregar de manera paulatina a la cadena peptídica en crecimiento durante la síntesis peptídica, para ensamblar los segmentos peptídicos dirigidos para ligación, o en algunos casos se pueden proporcionar modificaciones en las partes N o C terminal pendientes por separación a partir de un soporte polimérico, por lo que el producto de separación proporciona la cadena alifática hidrofóbica deseada. Para la etapa posterior al ensamblado de cadena, los aminoácidos o derivados de los mismos que tienen un grupo funcional reactivo se incorporan durante el ensamblado de la cadena (en forma protegida o sin protección) , los cuales después se utilizan en su forma reactiva no protegida para unión de la porción hidrofóbica deseada, es decir, en una reacción de conjugación posterior a la síntesis peptídica. La unión posterior al ensamblado de cadena se puede realizar en una cadena peptídica lineal desnaturalizada, o después de plegamiento o naturalización de la cadena polipeptídica . En una modalidad preferida, el derivado de aminoácido se agrega durante la síntesis peptídica en una posición de interés del aminoácido, mientras que la cadena alifática hidrofóbica en las partes N terminal, C terminal o N/C terminal se agrega después de la síntesis peptídica a través de una reacción de conjugación. Se puede utilizar cualquiera de las numerosas químicas de conjugación (véase, por ejemplo, Plaue, S et al., Biologicals. (1990) 18 (3) : 147-57 ; ade, J.D. et al., Australas Biotechnol . (1993) 3(6) :332-6; Doscher, M.S., Methods Enzymol . (1977) 47:578-617; Hancock, D.C. et al., Mol Biotechnol. (1995) 4(l):73-86; Albericio, F. et al., Methods Enzymol. (1997) 289:313-36), así como químicas de ligación dependiendo del enlace covalente que se desee. Se puede obtener el plegado o naturalización de las quimiocinas sintéticas bioactivas de la invención siguiendo técnicas estándar en el arte. Véase, por ejemplo, WO 99/11655; WO 99/11666; Dawaon et al., Methods Enzymol. (1997) 287:34-45). Para someter a cribado los compuestos de quimiocina sintetizados para determinar actividad antagonista, se examinan los compuestos por medio de ensayos basados in vitro o in vivo caracterizados por unión directa o indirecta del ligando de quimiocina a su receptor correspondiente. Los ejemplos de receptores de quimiocina y su quimiocina de tipo silvestre correspondientes incluyen CXXXCR1 (Fractalcina) ; XCR1 (SCM-1) ; CXCR2 (GRO , LIX, MIP-2) ; CXCR3 (MIG, IP-10) ; CXCR4 (SDF-1); CXCR5 (BLC) ; CCR1 (???-?a, RANTES , MCP-3); CCR2 (MCP-1, MCP-3, MCP-5) ; CCR3 (Eotaxina RNATES, ???-?a) ; CCR4 (MDC, TARC) ; CCR5 (RANTES, MIP-l , MIP-1ß; CCR6 (MIP-3a) ; CCR7 (SLC, ???-3ß); CCR8 (TCA-3) ; y CCR9 (TECK) . Los ensayos in vitro e in vivo para estos sistemas son bien conocidos, y están disponibles fácilmente o se pueden crear de novo. Véanse, por ejemplo, los documentos de E.U.A. 5,652,133; 5,834,419; WO 97/44054; WO 00/04926; y WO 00/0492. Por ejemplo, líneas celulares naturales, transformadas o transgénicas que expresan uno o más receptores de quimiocina típicamente se utilizan para determinar el efecto de la quimiotaxia inducida por quimiocina o la inhibición de este fenómeno cuando se expone a una quiraiocina sintética bioactiva de la presente invención. También se pueden utilizar modelos animales, por ejemplo, para determinar un perfil de respuesta junto con el tratamiento con una quimiocina sintética bioactiva de la presente invención, o para caracterizar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de los compuestos. Para caracterizar los compuestos de la invención como inhibidores de la infección viral, se pueden utilizar ensayos de fusión celular mediados por envoltura que utilizan una línea celular objetivo y una línea celular de envoltura, para cribar las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención para determinar su capacidad para impedir la infección por VIH. Por supuesto, se pueden utilizar también para este propósito ensayos de infección viral sin células. Como un ejemplo, para determinar el antagonismo de quimiotaxia en general, se pueden utilizar leucocitos de sangre periférica, tales como los que se aislan de donadores normales, de acuerdo con protocolos establecidos para purificación de monocitos, linfocitos T y neutrófilos. Se puede construir y evaluar un panel de células de prueba que expresen receptores de quimiocina C, CC, CXXXC y CXC, después de exposición a diluciones seriadas de compuestos individuales de la invención. Las quimiocinas nativas se pueden utilizar como controles. Por ejemplo, son adecuados para estos propósitos un panel de células transíectadas con casetes de expresión que codifiquen para diversos receptores de quimiocina. Por ejemplo, se puede cribar el antagonista de quimiocinas tales como RANTES, SDF-? o SDF-?ß y MIP utilizando transformantes de expresión CXCR4/Fusión/LESTR, CCR3, CCR5 , CXC4 (tales células están disponibles de varias fuentes comerciales o académicas, o se pueden preparar siguiendo protocolos estándar; véase, por ejemplo Risau, et al., Nature 387:671-674 (1997); Angiololo, et al., Annals NY Acad. Sci, (1996) 795:158-167; Friedlander, et al., Science (1995) 870:1500-1502). Los resultados se pueden expresar como un Índice de quimiotaxia ("IQ") que representa el número de veces de aumento, en la migración celular inducido por estímulos versus medio de control, y se determina la significancia estadística. También se pueden realizar ensayos de unión de receptor, por ejemplo, para evaluar la inhibición competitiva versus los efectos de reciclado de receptor (véase, Signoret, N. et al., "Endocytosis and recycling of the HIV coreceptor CCR5 , " J Cell Biol. 2000 151 (6 ) : 1281- 94 ; Signoret, N. et al., "Analysis of chemokine receptor endocytosis and recycling, " Methods Mol Biol. 2000; 138:197-207; Pelchen-Matthews , A. et al., "Chemokine receptor trafficking and viral replication, " Immunol Rev. 1999 Apr; 168 : 33 -49 ; Daugherty, B.L. et al., "Radiolabeled chemokine binding assays," Methods Mol Biol. 2000,138:129-34; Mack, M . et al. "Downmodulation and recycling of chemokine receptora," Methods Mol Biol . 2000;138:191-5; todos incorporados en la presente como referencia) . Este enfoque es bien conocido y típicamente utilizará quimiocinas sintéticas bioactivas marcadas de la presente invención en presencia de concentraciones cada vez mayores de quimiocinas nativas sin marcar, siguiendo protocolos estándar. Por supuesto, el marcado puede ser en cualquiera o en ambos ligandos. En este tipo de ensayo, los datos de unión se pueden analizar, por ejemplo, con un programa de computadora tal como LIGAND (P. Munson, División of Computer Research and Technology, NIH , Bethesda, MD) , y se pueden someter a análisis en gráfica Scatchard tanto con modelos de "un sitio" como de "dos sitios" en comparación con leucocitos nativos o el panel de células transíectadas por receptor que expresan el receptor de quimiocina objetivo. La velocidad de competencia para unión de ligandos sin marcar después se puede calcular con la siguiente fórmula: % de inhibición 1 (unión en presencia de quimiocina sin marcar/unión en presencia de medio solo) x 100. Para el cribado de compuestos para determinar su capacidad para impedir o aliviar la infección viral y la enfermedad, los compuestos pueden someterse a cribado contra un panel de células que expresen de manera estable ya sea el receptor apropiado expuesto a diversas cepas virales así como los controles. Por ejemplo, se pueden utilizar células U87/CD4 que expresen receptores CCR3 , CCR5, CXC4 o CXCR4 para determinar infección de cepas de VIH con tropismo M, tropismo T o tropismo doble. Se puede tener acceso a la inhibición de la infección viral como un porcentaje de infección en relación a la concentración de quimiocina y concentraciones control. Véase, por ejemplo, Mc night , et al., Virology (1994) 201:8-18); y Mosier, et al., Science (1993) 260:689-692; Simmons, et al., Science (1997) 276 ·.276 -279 ; Wu, et al., J. Exp. Med. (1997) 185:168-169; y Trkola, et al., Nature (1996) 384:184-186). Los ensayos de movilización de calcio son otro ejemplo útil para la determinación en busca de antagonistas de unión de receptor, por ejemplo para identificar antagonistas de quimiocinas nativas que son quimiotácticas para neutrófilos y eosinófilos (José, et al., J. Exp. Med. 179:881-887 (1994)) . Como otro ejemplo, se pueden evaluar las actividades angiogénicas de los compuestos de la invención mediante el ensayo con membrana corioalantoica de pollo (CA ) (Oika a, et al., Cáncer Lett. (1991) 59 : 57-66) . Las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención tienen muchos usos, que incluyen el uso como herramienta de investigación, de diagnóstico y como sustancias terapéuticas. En particular, se ha encontrado que las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención poseen propiedades farmacológicas útiles, y se ha demostrado que bloquean eficazmente los efectos inflamatorios relacionados con las moléculas de tipo silvestre correspondientes - las cuales se relacionan con diversos desórdenes que incluyen asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, ateroma/aterosclerosis, rechazo de transplante de órganos y artritis reumatoide. En consecuencia, son útiles para el tratamiento de asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, ateroma/aterosclerosis, rechazo de transplante de órganos y artritis reumatoide. Por ejemplo, varias de las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención tales como los antagonistas de ' RANTES y SDF-? o SDF-?ß también se ha demostrado que inhiben la infección por VIH-1 y se pueden utilizar los antagonistas (por ejemplo análogos de vMIP-II) para el mismo propósito. Por lo tanto, los antagonistas de RANTES o SDF-?a o SDF-?ß y los análogos de vMIP-II de la invención se pueden utilizar para inhibir a VIH-1 en mamíferos. Se determina el potencial de los compuestos para utilidad contra VIH-1 mediante el método descrito en los siguientes ejemplos. Se determina el potencial de los compuestos para utilidad contra efectos inflamatorios por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Además, se comprenderá que las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención se pueden utilizar solas, o en combinación entre si, así como en combinación con otros medicamentos que no son quimiocinas y que e?? sinergíáticos para tratar un desorden dado. A modo de ejemplo, pero sin que signifique una limitación, los siguientes son algunos ejemplos específicos de moléculas de quimiocinas de tipo silvestre y sus propiedades biológicas relacionadas para ilustrar la utilidad general de elaborar las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención. Por ejemplo, SCM-1 es una quimiocina C que se expresa en bazo. Se relaciona sustancialmente con las quimiocinas CC y CXC, con una diferencia principal de que únicamente tienen la segunda y cuarta de las cuatro cisteínas conservadas en estas proteínas (Yoshída et al., FEBS Letters (1995) 360(2) :155-159) ; Yoshida et al., J. Biol. Chem. (1998) 273 (26) : 16551-16554) . En los humanos, existen dos proteínas SCM-1 altamente homólogas, SCM-?a y SCM-?ß, las cuales difieren por dos sustituciones de aminoácidos. Se encuentra que SCM-1 es aproximadamente 60% idéntica a linfotactina, una quimiocina específica de linfocitos murinos . Por lo tanto SCM-1 y linfotactina pueden representar los prototipos humano y murino de las quimiocinas C o quimiocinas ?. Ambas moléculas de SCM-1 inducen específicamente migración en células Ll .2 murinas sometidas a ingeniería genética para que expresen el receptor huérfano, GPR5 , el cual se expresa principalmente en placenta, y débilmente en bazo y timo entre los diversos tejidos humanos. En consecuencia, los antagonistas de SCM-1 son útiles en el bloqueo de la función normal de GPR4. Como otro ejemplo, la forma soluble de fractalcina, una quimiocina CXXXC de 76 aminoácidos, es un quimioatrayente potente de linfocitos T y monocitos, pero no de neutrófilos . La fractalcina aumenta notablemente después de estimulación con TNF o IL1. El receptor humano para fractalcina se designa CX3CR1. El receptor media tanto las funciones adhesivas como migratoria de fractalcina. El receptor humano se expresa en neutrófilos, monocitos, linfocitos T y varios órganos sólidos, incluyendo el cerebro. Se ha demostrado que el receptor funciona con CD4 como un correceptor para la proteína de envoltura de un aislado primario de VIH-1. Un ensayo de fusión célula-célula demuestra que la fractalcina inhibe de manera potente y específica tal fusión (véase, por ejemplo, Bazan et al Nature (1997) 385 (6617) : 640-644 ; Combadíere et al. J. Biol . Chem. (1998) 273 (37) : 23799-23804 ; Rossi et al. Genomics (1998) 47 (2) : 163-170 ; y Faure et al. Science (2000) 287:2274-2277) . Por lo tanto, es evidente que loa antagonistas de fractalcina pueden ser utilizados en el tratamiento de diversos desórdenes artríticos que involucran la vía TNF o IL1, tales como artritis, y también son útiles como bloqueadores de infección por VIH. La eotaxina es un ejemplo adicional. Esta proteína es de 74 aminoácidos de longitud, y se clasifica como una quimiocina CC debido a su patrón de cisteína característico.

Se ha encontrado en el lavado broncoalveolar de cobayos utilizados como modelo de inflamación alérgica, y se ha implicado en desórdenes relacionados con el asma. La eotaxina induce acumulación sustancial de eosinófilos a una dosis de 1-2 pM en la piel sin que afecte de manera significativa la acumulación de neutrófilos. La eotaxina es un estimulador potente de eosinófilos in vitro, para cobayo y humano. El factor parece compartir un sitio de unión con RANTES sobre eosinófilos de cobayo. La eotaxina induce una respuesta de flujo de calcio en eosinófilos humanos normales, pero no en neutrófilos o monocitos. La respuesta no puede ser desensibilizada por tratamiento previo de eosinófilos con otras quimiocinas CC. En los basófilos, la eotaxina induce niveles más altos de respuesta quimiotáctica en comparación con RANTES, pero solo tiene un efecto marginal ya sea en la liberación de histamina o la generación de leucotrieno C . También puede jugar un papel en la quimiotaxia de células de linfoma de linfocitos B. El receptor primario de eotaxina es CCR3. (Véase, por ejemplo, Bartels et al., Biochem. Biophya. Res. Comm. (1996) 225 (3 ) : 1045-51) ; José et al., J. Exp. Med. (1994) 179:881-887); Ponath et al., J. Clin. Investigation (1996) 5*7(3) :604-612) ; Ponath et al., J. Exp. Med. (1996) 183 (6) : 2437-2448) ; Yamada et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1997) 231 (2) : 365-368) . En consecuencia, se pueden utilizar los antagonistas de eotaxina como moduladores potentes de asma y otras enfermedades alérgicas relacionadas con eosinófilos. RANTES es otro ejemplo de una quimiocina objetivo para la cual los antagonistas son de interés particular. Se trata de una quimiocina CC involucrada en muchas enfermedades que varían desde inflamación, rechazo de órganos hasta infección por VIH. Se induce la síntesis de RANTES por TNF-a e ILI-OÍ, pero no por TGF-ß , IFN-? e IL6. Se produce RANTES por linfocitos T circulantes y clones de linfocitos T en cultivo pero no por cualquiera de las líneas de linfocitos T probada hasta ahora. La expresión de RANTES se inhibe después de estimulación de linfocitos T. RANTES es quimiotáctico para linfocitos T, eosinófilos y basófilos humanos, y juega un papel activo en el reclutamiento de leucocitos hacia los sitios inflamatorios. RANTES también activa eosinófilos para liberar, por ejemplo, la proteína catiónica eosinofílica . Cambia la densidad de los eosinófilos y los vuelve hipodensos, lo que se considera que representa un estado de activación celular generalizado y se relaciona con mayor frecuencia con enfermedades tales como asma y rinitis alérgica. RANTES también es un potente activador específico de eosinófilos en el metabolismo oxidativo. RANTES aumenta la adherencia de monocitos a células endoteliales . Soporta selectivamente la migración de monocitos y linfocitos T que expresan los marcadores de superficie celular CD4 y UCHLl. Se considera que estas células son linfocitos T auxiliares estimulados previamente, con funciones de linfocitos T de memoria. RANTES activa a los basófilos humanos desde algunos donadores de basófilos selectos y provoca la liberación de histaminas. Por otra parte, RANTES también inhibe la liberación de histaminas de basófilos inducida por varias citocinas que incluyen uno de los inductores más potentes de histamina, MCAF . Se ha demostrado recientemente que RANTES muestra actividades biológicas diferentes a quimiotaxia. Puede inducir la proliferación y activación de células citolíticas conocidas como CHAK (célula citolítica activada por quimiocina C-C) , las cuales son similares a las células activadas por IL2. RANTES se expresa en fibroblastos sinoviales humanos y pueden participar en el proceso inflamatorio que avanza, en artritis reu atcide. Se han identificado receptores de alta afinidad para RANTES (aproximadamente 700 sitios de unión/célula; Kd = 700 picoM) en la línea de células de leucemia monocítica humana THP-1, la cual responde a RANTES en quimiotaxia y ensayos de movilización de calcio. La respuesta quimiotáctica de células THP-1 a RANTES se inhibe notablemente por incubación previa con MCAF (factor quimiotáctico y activador de monocitos) o por ???-1-a (proteína inflamadora de los macrófagos) . La unión de RANTES a células monocíticas está comprendido por MCAF y ???-1-a. Los receptores para RANTES son CCR1, CCR3 y CCR5. El uso clínico y la importancia de los antagonistas de RANTES son múltiples. Por ejemplo los anticuerpos para RANTES natural pueden inhibir de manera notable la infiltración celular relacionada con la nefritis mesangioproliferativa experimental. Además, RANTES natural parece expresarse altamente en aloinjertos renales humanos que experimentan rechazo celular en relación al rechazo de transplante del riñón (Pattison et al., Lancet (1994) 343 ( 8891 ): 209- 11 (1994) . Las formas modificadas químicamente de RANTES (aminooxipentano-RANTES , o AOP-RANTES; y n-nonanoil -RANTES o NNY-RANTES) se ha demostrado que actúan como un antagonista para el receptor CCR-5 de quimiocinas y que tienen la capacidad de inhibir la infección por VIH-1. En consecuencia, el antagonista de los análogos modificados en las partes N, C y N/C terminal de RANTES de acuerdo con la presente invención son útiles como un agente antiinflamatorio en el tratamiento de enfermedades tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, transplante de órganos, ateroma-aterosclerosis y artritis reumatoide. Los antagonistas de las quimiocinas S "-1OÍ y ß son ejemplos adicionales los cuales pertenecen a la clase CXC de quimiocinas. SDF-?ß difiere en que tiene cuatro aminoácidos adicionales en la parte C terminal . Estas quimiocinas son más de 92% idénticas con sus contrapartes no humanas. SDF-1 se expresa ubicuamente con la excepción de células^ sanguíneas . SDP-1 actúa sobre linfocitos y monocitos pero no sobre neutrófilos in vitro y es un quimioatrayente muy potente para células mononucleares in vivo. También induce la polimerización de actina intracelular en linfocitos. SDF-1 actúa in vitro e in vivo como un quimioatrayente para células progenitora9 hematopoyéticas humanas, lo que da lugar a tipos mixtos de progenitores, y tipos más primitivos. SDF-l también parece estar relacionado en la formación del septo ventricular. La quimiotaxia de células CD34+ aumenta en respuesta a una combinación de SDF-1 e IL-3. Se ha demostrado que SDF también induce una elevación transitoria del calcio citoplásmico en estas células. Un receptor primario para SDF-1 es CXCR4 , el cual también funciona como un correceptor principal de linfocitos T para VIH1. Véase, por ejemplo, Aiuti et al., J. Exp. Med. (1997) 185 (1) : 111-120 (1997); Bleul et al., J. Exp. Med. (1996) 184 (3) : 1101-1109 (1996); Bleul et al., Nature (1996) 382 (6594) : 829-833 ; D'Apuzzo et al., Sur-opean J. Inmuno1. (1997) 27 (7) : 1788-1793 ; Nagasawa et al., Nature (1996) 382:635-638); Oberlin et al., Nature (1996) 382 (6594) : 833-835. Asi, por ejemplo, los antagonistas de SDF-la o SDF-?ß de la presente invención son útiles como un agente antiinflamatorio en el tratamiento de enfermedades tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, ateroma/aterosclerosis y artritis reumatoide . Además, los antagonistas de SDF-?a o SDF-?ß de la invención se pueden utilizar solos o en combinación con otros compuestos, tales como los análogos antagonistas de RANTES de la invención, para bloquear los efectos de SDF-1, RANTES, MIP-cc o MIP-?ß en mamíferos con respecto al reclutamiento o activación de células proin lamatorias , o para tratar o bloquear infección por VIH-1. En consecuencia, otro aspecto de la invención se relaciona con composiciones f rmacéuticas y métodos de tratamiento de un mamífero en necesidad del mismo al administrar cantidades terapéuticamente eficaces de compuestos que comprenden una o más quimiocinas de la presente invención, o sales f rmacéuticamente aceptables de los mismos. Por "sal farmacéuticamente aceptable" se quiere significar una sal que retenga la eficacia biológica y las propiedades de los polipéptidos de la invención y las cuales no sean biológicamente indeseables o indeseables de alguna otra manera. Tales sales se pueden derivar de ácidos o bases. Las sales de adición de ácido se derivan de ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico (lo que proporciona las sales sulfato y bisulfato) , ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, cido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico. ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido salicilico, ácido p-toluensulfónico y similares. Las sales de adición de base se pueden derivar de bases inorgánicas que incluyen sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio y similares. Las sales derivadas de bases orgánicas incluyen aquellas formadas de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas que se presentan de manera natural y aminas cíclicas que incluyen isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2 -dimetilaminoetanol , trometamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilendiamina , glucosamina, N-alquilglucaminas , teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina y similares. Las bases orgánicas preferidas son isopropilamina, dietilamina, etanolamina, piperidina, trometamina y colina. El término "tratamiento" como se utiliza en la presente, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un humano, e incluye: (i) impedir que se produzca la enfermedad en un sujeto el cual puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no se le ha diagnosticado con la misma; (ii) inhibir la enfermedad, es decir, suprimir su desarrollo; o (iii) aliviar la enfermedad, es decir, provocar regresión de la enfermedad. Mediante el término "un estado de enfermedad en mamíferos que se evita o alivia por tratamiento con una quimiocina sintética bioactiva de la presente invención", como ae utiliza en la presente, se quiere cubrir todos los estados de enfermedad los cuales son reconocidos generalmente en la técnica como tratados de manera útil con las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención en general, y aquellos estados de enfermedad los cuales se ha encontrado que se evitan o alivian de manera exitosa por tratamiento con los compuestos específicos de la invención. Estos incluyen, a modo de ilustración y no como una limitación, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, enfermedades virales, ateroma/aterosclerosis , artritis reumatoide y rechazo de transplante de órganos. Como se utiliza en la presente, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a aquella cantidad de quimiocina sintética bioactiva de la presente invención la cual, cuando se administra a un mamífero en necesidad del mismo, es suficiente para llevar a cabo el tratamiento (como se define en lo anterior) , por ejemplo como un agente antiinflamatorio, un agente antiasmático, un agente inmunosupresor o un agente para enfermedades autoinmunitarias , para inhibir la infección viral en mamíferos. La cantidad que constituye un¾ "cantidad terapéuticamente eficaz" variará en base en el derivado de quimiocina, la condición o enfermedad y su gravedad, y el mamífero que sea tratado, su peso, edad, etc., pero se puede determinar de manera sistemática por una persona habitualmente experta en la técnica con respecto al conocimiento contemporáneo y a esta descripción. Como se utiliza en la presente, el término "c.s." significa agregar una cantidad suficiente para obtener la función establecida, por ejemplo, para llevar una solución al volumen deseado (por ejemplo, 100 mi) . Las quimiocinas de esta invención y sus sales farmacéuticamente aceptables, es decir, el ingrediente activo, se administran a una dosificación terapéuticamente eficaz, es decir, aquella cantidad la cual, cuando se administra a un mamífero en necesidad del mismo, es suficiente para llevar a cabo el tratamiento como se describe en lo anterior. La administración de las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención que se describen en la presente puede ser vía cualquiera de los modos de administración aceptados para agentes que presentan utilidad similar. Como se utiliza en la presente, los términos " quimiocinas sintéticas activas de la presente invención", "[sales f rmacéuticamente aceptables de los polipéptidos de la invención" e "ingrediente activo" se utilizan de manera intercambiable.

La concentración de las guimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención que se encuentran en una formulación pueden variar dentro de una gama completa utilizada por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, de aproximadamente 0.01 por ciento en peso (% en peso) a aproximadamente 99.99% en peso de la quimiocina sintética bioactiva de la presente invención en base en la formulación total y aproximadamente 0.01% en peso a 99.99% en peso de excipiente. De manera más típica, las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención estarán presentes en una concentración de aproximadamen e 0.5% en peso a aproximadamente 80% en peso. Si bien las concentraciones de dosificación humana hasta ahora se han optimizado para las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención, generalmente la dosis diaria es de aproximadamente 0.05 a 25 mg por kilogramo de peso corporal al día, y de manera más preferible de aproximadamente 0.01 a 10 mg por kilogramo de peso corporal al día. Así, para la administración a una persona de 70 kg, el intervalo de dosificación será de aproximadamente 0.07 mg a 3.5 g al día, de manera preferible aproximadamente 3.5 mg a 1.75 g al día, y de manera más preferible de aproximadamente 0.7 mg a 0.7 g al día. Las cantidades de antagonista que se administren, por supuesto, dependerán del sujeto y el estado de enfermedad al que se dirige para impedir su presentación o para aliviar, la naturaleza o gravedad de la afección, la manera y el protocolo de administración así como el juicio del médico que realiza la prescripción. Tal optimización se encuentra dentro del ámbito de aquellos habitualmente expertos en la técnica. La administración puede ser por medio de cualquier vía aceptada sistémica o local, por ejemplo por vía parenteral, oral (particularmente para formulaciones en lactantes) , intravenosa, nasal, inhalación bronquial (es decir, formulación en aerosol) vía transdérmica o tópica, en forma de un sólido, aemisólido o líquido o formas de dosificación en aerosol tales como, por ejemplo, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, líquidos, soluciones, emulsiones, inyectables, suspensiones, supositorios, aerosoles o similares. Las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención también se pueden administrar en formas de dosificación de liberación sostenida o controlada, que incluyen inyecciones de depósito, bombas osmóticas, pildoras, parches transdérmicos (que incluyen electrotransporte) y similares, para la administración prolongada del polipéptido a una velocidad determinada previamente, preferiblemente en formas de dosificación unitarias adecuadas para administración única de las dosificaciones precisas. Las composiciones incluirán un vehículo o excipiente farmacéutico convencional o una quimiocina sintética bioactiva de la presente invención y, además, pueden incluir otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, vehículos, adyuvantes, etc. Los vehículos se pueden seleccionar de diversos aceites, que incluyen aquellos de origen de petróleo, animal, vegetales o sintéticos, por ejemplo aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. El agua, la solución salina, la dextrosa acuosa y los glicoles son los vehículos líquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables. Los vehículos farmacéuticos adecuados incluyen almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, greda, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio, leche desnatada seca, glicerol, propilenglicol , agua, etanol y similares. Otros vehículos farmacéuticos adecuados y sus formulaciones se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Si se desea, la composición farmacéutica que se va a administrar también contiene cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsificantes , agentes amortiguadores de pH y similares tales como por ejemplo acetato de sodio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc. Aunque se puede requerir más del ingrediente activo, se puede utilizar la administración oral para suministrar las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención utilizando un régimen de dosificación diario conveniente, el cual se puede a ustar de acuerdo con el grado de prevención que se desee o el alivio de la enfermedad. Para tal administración oral, la composición no tóxica farmacéuticamente aceptable se forma por la incorporación de cualquiera de los excipientes utilizados normalmente tales como, por ejemplo, los grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, povidona, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, carboximetilcelulosa de sodio reticulada, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Tales composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas dispersables , pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. Las formulaciones orales son adecuadas particularmente para el tratamiento de desórdenes gastrointestinales. Se puede ajustar la biodisponibílidad oral para propósitos sistémicos generales mediante la utilización de excipientes que mejoran la captación para la circulación sistémica, tales como una formulación que comprende aminoácidos acetilados. Véanse, por ejemplo, los documentos de E.U.A. 5,935,601 y 5,629,020. Las composiciones pueden tomar la forma de una cápsula, pildora o tableta y por lo tanto la composición contendrá, junto con el ingrediente activo, un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato dicálcico y similares; un desintegrante tal como carboximetilcelulosa de sodio reticulada, almidón o derivados de los mismos; un lubricante tal como estearato de magnesio y similares; un aglutinante tal como almidón, polivinilpirrolidona, goma acacia, gelatina, celulosa y derivados de los mismos, y similares. Se pueden preparar composiciones administrables f rmacéuticamente líquidas, por ejemplo, al disolver, dispersar, etc., una quimiocina sintética bioactiva de la presente invención (aproximadamente 0.5% a aproximadamente 20%) y los adyuvantes farmacéuticos opcionales en un vehículo tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, glicoles, etanol, conservadores y similares, para de esta manera formar una solución o suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica se puede administrar para que también contenga cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes, agentes que mejoren la suspensión, agentes emulsíficantes o agentes solubilizantes, agentes amortiguadores de pH y similares, por ejemplo acetato de sodio, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina, polioxietileno, monolaurato o estearato de sorbitano, etc. Los métodos actuales para preparar tales formas de dosificación se conocen, o serán evidentes para aquellos expertos en la técnica; por ejemplo véase Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennaylvania . La composición o formulación que se va a administrar, en cualquier caso, contendrá una cantidad del ingrediente activo en una cantidad eficaz para evitar o aliviar los síntomas del sujeto que se someta a tratamiento. Para administración oral a lactantes se prefiere una formulación líquida (tal como un jarabe o suspensión) . Para una forma de dosificación sólida que contiene líquido, la solución o suspensión, por ejemplo, en forma de carbonato de propileno, aceites vegetales o triglicéridos se encapsula preferiblemente en una cápsula de gelatina. Para una forma de dosificación líquida, la solución, por ejemplo en un polietilenglicol , se puede diluir con una cantidad suficiente de un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable, por ejemplo agua, para que se mida con facilidad para su administración. De manera alternativa, se pueden preparar formulaciones orales líquidas o semísólidas al disolver o dispersar el ingrediente activo en aceites vegetales, glicoles, triglicéridos, ésteres de propilenglicol (por ejemplo carbonato de propileno) y similares, y encapsular estas soluciones o suspensiones en cubiertas de cápsula de gelatina dura o suave. Al aplicar las quimiocinas sintéticas bioactivas de esta invención para el tratamiento de las condiciones anteriores, la administración de los ingredientes activos descritos en la presente preferiblemente se administran por vía parenteral. La administración parenteral generalmente se caracteriza por inyección, ya sea subcutánea, intramuscular o intravenosa, y puede incluir inyecciones intradérmicas o intraperítoneales así como técnicas de inyección intraesternal o por infusión. Las sustancias inyectables se pueden preparar de manera convencional, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de su inyección, como emulsiones o en microesferas basadas en polímero biocompatibles (por ejemplo liposomas, derivados de polietilenglicol , poli (D, C) lactida y similares) . Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas que se van a administrar también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsificantes , agentes amortiguadores de pH, mejoradores de solubilidad, vehículos de proteína y similares, tales como, por ejemplo, acetato de sodio, polioxietileno, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, ciclodextrinas , albúmina sérica, etcétera. Las quimiocinas sintéticas bioacti vas de la presente invención se pueden administrar parenteralmente, por ejemplo, al disolver tales moléculas en un solvente adecuado (tal como agua o solución salina) o al incorporarlo en una formulación liposómica seguida, por dispersión en un fluido de infusión aceptable. Una dosis diaria típica de un polipéptido de la invención se puede administrar por una infusión o por una serie de infusiones separadas sobre intervalos periódicos. Para administración parenteral, son especialmente adecuadas soluciones acuosas de un ingrediente activo en forma hidrosoluble, por ejemplo en forma de una sal hidrosoluble, o suspensiones acuosas para inyección que contengan sustancias que aumentan la viscosidad, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano y, si se desea, estabilizantes. El ingrediente activo, opcionalmente junto con excipientes, también puede estar en forma de un liofilizado y se puede elaborar en una solución antes de su administración parenteral por adición de los solventes adecuados . El enfoque diseñado más recientemente para administración parenteral utiliza la implantación de un sistema de liberación lenta o de liberación sostenida, de manera que se mantenga un nivel constante de dosificación. Véanse, por ejemplo, la patente de E.U.A. 3,710,795, 5,714,166 y 5,041,292, las cuales se incorporan en la presente como referencia. El porcentaje del ingrediente activo contenido en tales composiciones parenterales depende en gran medida de la naturaleza específica del mismo, así como la actividad del polipéptido y las necesidades del sujeto. Sin embargo, son utilizables porcentajes de ingrediente activo de 0.01% a 10% en solución, y serán mayores si la composición es un sólido el cual posteriormente se diluye a los porcentajes anteriores. Preferiblemente, la composición comprenderá 0.02-8% del ingrediente activo en solución. Otro método para administrar las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención utiliza tanto la inyección en bolo como la infusión continua. Este es un método particularmente preferido cuando el tratamiento terapéutico es para evitar la infección por VIH-1. La administración por aerosol es un medio eficaz para suministrar las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención directamente a las vías respiratorias. Algunas de las ventajas de este método son: 1) evita los efectos de la degradación enzimática, una absorción pobre del tubo digestivo o pérdida del agente terapéutico debido al efecto del primer paso hepático; 2) administra los ingredientes activos que de otra manera no llegarían a sus sitios objetivo en las vías respiratorias debido a su tamaño molecular, carga o afinidad por sitios extrapulmonares ; 3) proporciona una absorción rápida en el cuerpo por medio de los alvéolos de los pulmones; y 4) evita exponer otros sistemas orgánicos al ingrediente activo, lo que constituye un factor importante cuando la exposición puede provocar efectos colaterales indeseables. Por estas razones, la administración en aerosol es ventajosa particualrmente para el tratamiento de asma, infecciones locales de los pulmones y otras enfermedades o condiciones de enfermedad de los pulmones y las vías respiratorias. Existen tres tipos de dispositivos de inhalación farmacéutica, inhaladores nebulizadores , inhaladores de dosis medida e inhaladores de polvo seco. Los dispositivos nebulizadores producen una corriente de aire de alta velocidad que provoca que el derivado de quimiocina (el cual se ha formulado en una forma líquida) se rocíe como una neblina que es transportada a las vías respiratorias del paciente. Los inhaladores de dosis medida típicamente tienen la formulación empacada con un gas comprimido y, cuando son accionados, descargan una cantidad medida del polipéptido por gas comprimido, y de esta manera proporcionan un método confiable de administrar de una cantidad establecida del agente. Los inhaladores de polvo seco administran el polipéptido en forma de un polvo de flujo libre que se puede dispersar en las vías aéreas del paciente durante la respiración, por medio del dispositivo. Para obtener un polvo de flujo libre, el derivado de quimiocina se formula con un excipiente tal como lactosa. Una cantidad medida del derivado de quimiocina se almacena en forma de cápsula y se suministra al paciente con cada accionamiento. La totalidad de los métodos anteriores se pueden utilizar para administrar la presente invención. Las formulaciones farmacéuticas basadas en liposomas también son adecuadas para uso con las quimiocina de esta invención. Véase, por ejemplo, los documentos de E.U.A. 5,631,018, 5,723,147 y 5,766,627. Se considera que los beneficios de los liposomas se relacionan con cambios favorables en la distribución del tejido y parámetros farmacocinéticos que resultan del atrapamiento de los medicamentos en el liposoma, y que se pueden aplicar a los polipéptidos de la presente invención por aquellos expertos en la técnica. También se pueden utilizar formulaciones farmacéuticas líquidas liposómicas de liberación controlada para inyección o administración oral . Para administración sistémica vía supositorio, se pueden utilizar aglutinantes y portadores tradicionales que incluyen, por ejemplo, polietilenglicoles o triglicéridos , por ejemplo PEG 1000 (96%) y PEG 4000 (4%) . Tales supositorios se pueden conformar a partir de mezclas que contengan el ingrediente activo en un intervalo desde aproximadamente 0.5%, p/p a aproximadamente 10%, p/p; preferiblemente de aproximadamente 1% p/p hasta aproximadamente 2%, p/p.

Como se describe en lo anterior, y como se ilustra adicionalmente en los ejemplos específicos que siguen, las quimiocina sintéticas bioactivas de la presente invención encuentran uso como antagonistas de las quimiocinas que se presentan de manera natural. En particular, las quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención que tienen potencia aumentada como un antagonista encuentran uso en el análisis y tratamiento de diversos estados de enfermedad, tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, rechazo de transplante de órganos, enfermedades virales, ateroma/aterosclerosis, artritis reumatoide y rechazo de transplante de órganos. Las quimiocinas sintétcias bioactivas de la presente invención también se pueden utilizar en el diseño y cribado de un antagonista de molécula pequeña de sus receptores análogos. Por ejemplo, la diversidad estructural sometida a ingeniería en los compuestos de la invención facilita un enfoque más razonado en el diseño, cribado y un ajuste preciso de compuestos de moléculas pequeñas mejores para uso como medicamentos en el tratamiento de enfermedades que involucran la actividad natural de los receptores de quimiocina . EJEMPLOS Se proporcionan las siguientes preparaciones y ejemplos para permitir a las personas expertas en la técnica comprender con mayor claridad y llevar a la práctica la presente invención. No se deben considerar como limitantes del alcance de la invención, sino únicamente como ilustrativas y representativas de la misma. Abreviaturas DIEA diisopropiletilamina DMF N, N-dimetilformamida DNP 2 , 4 -dinitrofenilo GuHCl clorhidrato de guanidinio HBTU hexafluorofosfato de 0- ( IH-benzotriazol - l-il)-l,l,3, 3 - tetrametil -uronio HF fluoruro de hidrógeno TFA ácido trifluoroacético Aib ácido aminoisobutí ico Hyp hidroxiprolina Tic 1, 2, 3, 4-tetrahidroisoquinolin-3-COOH Indol ácido indolin-2-carboxílico P(4,4DiF) 4 -difluoro-prolina Thz ácido L-tiazolidin-4 -carboxílico Hop L-homoprolina APro 3 , 4 -deshidro-prolina F (3 , 4-DiOH) 3 , 4-dihidroxifenilalanina F(3,4-DiQH, pBzl)) pBzl , - 3 , -dihidroxifenilalanina p-Bz benzofenona Cha ciclohexil -alanina pNal 3- (2-naftil) -alanina Chg ciclohexil-glicina Phg fenilglicina HoF homofenilalanina F (F) s pentafluorofenilalanina tBuA terbutilalanina F (4-Me) 4 -metilfenilalanina tL ter- leucina CycP ácido l-amino-l-ciclopentanocarboxílico CycH ácido 1 - amino-l-ciclohexanocarboxí1 ico Nle norleucina AOP-RANTES aminooxipentano-RANTE (2-68) NNY-RANTES n-Nonanoil - A TES (2 -68 ) Ejemplo 1: Enfogue de síntesis general para gulmloclnas de la presente invención. Se fabrican péptidos para quimiocinas sintéticas bioactivas de la presente invención, mediante síntesis peptídica en fase sólida. La síntesis en fase sólida se lleva a cabo en un sintetizador de péptidos 430A modificado a las necesidades, de Applied Biosystems, utilizando protocolos de neutralización in si tu/activación con hexafluorosfato de 2-(lH-benzotriazol-l-il) -1, 1, 1,3, 3-tetrametiluronio para la elongación de la cadena por química Boc paulatina (Schnólzer, et al., Int. J. Peptide Protein Res. (1992) 40:180-193) . Los fragmentos peptídicos N-terminal se sintetizan sobre una resina generadora de tioéster. La resina se divide después de unión del residuo precedente a la posición investigada (alargamiento de las partes terminales C a N) y el péptido se alarga manualmente a una escala de 0.03 mmoles. Cada ciclo de síntesis consiste de separación de ?a-Boc por un tratamiento durante 1 a 2 minutos con TFA puro, un lavado de flujo de 1 min con DMF, un tiempo de acoplamiento de 10 a 20 minutos con 1.0 mmoles de Boc-aminoácido preactivado en presencia de DIEA en exceso, y un segundo lavado de flujo con DMF. Los NOÍ-BOC-aminoácidos (1.1 mmol) se preactivan durante 3 minutos con 1 mmol de HBTU (0.5M en DMF) en presencia de un exceso de 3 mmoles de DIEA. Después de cada etapa de acoplamiento manual, se evalúa la amina libre residual con el ensayo de ninhidrina (Sarin, et al., Anal. Biochem. (1981) 117:147-157). El fragmento C terminal que comprende los aminoácidos se sintetiza sobre una resina estándar -0-CH2-fenilacetamidometilo . Después de que se completa el montaje de la cadena, los péptidos se desprotegen y se separan de la resina por tratamiento con HF anhidro durante 1 hora a 0°C con p-cresol 5%, como eliminador. En todos los casos, los grupos protectores de DNP de cadena lateral imidazol permanecen sobre residuos His debido a que los procedimientos de separación de DNP son incompatibles con sus grupos tioéster en la parte C terminal. Sin embargo, se elimina gradualmente DNP por tioles durante la reacción de ligación, lo que proporciona His sin protección. Después de la separación, ambos péptidos se precipitan con dietiléter enfriado con hielo, disuelto en acetonitrilo acuoso y se liofilizan. Los péptidos se purifican por CLAR-FI con una columna C18 a partir de aters mediante la utilización de gradientes lineales de amort guador B (acetonitrilo/H20 10%/0.1% ácido trifluoroacético 0.1%) en amortiguador A (H20/ácido trifluoroacético 0.1%) y detección UV a 214 nm. Las muestras se analizan por espectrometría de masas por electroaspersión con un instrumento Platform II (Micromass, Manchester, Inglaterra) . Los péptidos se utilizan para ligación para generar cadenas polipeptídicas de quimiocina de longitud completa utilizando la ligación química nativa (Dawson, et al., Science (1994) 266:116-119) ; ilken, et al., Chem. Biol. (1999) 6:43-51; y Camarero, et al., Current Protocole in Protein Science (1999) 18.4.1-18.4-21) . El plegado o naturalización de las cadenas polipeptídicas se lleva a cabo en presencia de Cys-SH/ (Cys-S) 2 siguiendo técnicas estándar (Wilken et al., Chem. Biol. (1999) 6:43-51) . Ejemplo 2: Síntesis de los análogos de las rtee terminales N, C y N/C de NOT-RANTES, AOP-RANTES y SDF-1 Se preparan análogos de RA TES (1-6B) y SDF-?ß (1-72) como en el ejemplo 1, y se describe en la presente para ilustrar el enfoque general para elaborar los antagonistas de quimiocina CC y CXC . En particular, los análogos de RANTES modificados en las partes terminales N, C y N/C, se basan en modificaciones al compuesto de quimiocina C¾- (CH2) ?-C (O) -RA TES (2-S8) , también denominado como n-nonanoil -RANTES (2-68) o "NNY-RANTES" , y el compuesto de quimiocina CH3- (C¾) 4-0-N-CH-CO-RANTES (2-68) , también denominado como aminooxipentano-RANTES o "AO -RANTES " . Los iYNY-RANTES , AOP-RANTES y las moléculas derivadas de RANTES adicionales utilizadas para este propósito de describen en el documento WO 99/11666, cuya referencia se incorpora en la presente como referencia. Los análogos de las partes terminales N, C y N/C de SDF-1 se construyen utilizando el mismo enfoque de diseño básico que para loa análogos de RANTES. Para las modificaciones en la parte N terminal de una. quimiocina objetivo dada, tales como las modificaciones NNY y AOP para RANTES, se preparan variantes químicas como se describe en lo anterior en el documento WO 99/11666 y en Wilken et al., Chem. Biol. (1996) 6:43-51, utilizando la elaboración en resina del segmento peptídico de la parte N terminal utilizado para ligación a la modificación en la parte N terminal generada pendiente (por ejemplo NNY o AOP), seguido por separación/desprotección, purificación y uso del a-tioéster peptídico modificado en la parte N terminal, no protegido, en la ligación química nativa al segmento peptídico en la parte C terminal para formar el producto de longitud completa. Los péptidos se sintetizan y se incorporan sustituciones de aminoácidos, que incluyen derivados de aminoácidos durante la síntesis peptídica, como se describe en el ejemplo 1. Se utiliza la ligación química nativa al igual que en el ejemplo 1 para generar un producto lineal, en donde la ligación es en el aitio Lys31-Cys32 para 1 oa análogos de RA TES y para los análogos de SDF-1 en el sitio Asn33-Cys3 . Se disuelven cantidades equimolares de los fragmentos peptídicos (2-2.5mM) en GuHCl 6M, fosfato lOOmM, pH 7.5, bencilmercaptano 1% y tiofenol 3%. Las reacciones habitualmente se llevan a cabo durante la noche. Los productos polipeptídicos resultantes se purifican y analizan como se describe en lo anterior para los segmentos peptídicos. Para generar una proteína plegada o naturalizada, las cadenas polipeptídicas purificadas de análogos de NNY-RANTES (de aproximadamente 0.5 a lmg/ml) se disuelven en GuHCl 2M, Tris lOOmM, pH 8.0 que contiene cisteína 8mM, cistina lmM y metionina lOmM. Después de agitación suave durante la noche, la solución proteínica se purifica por CLAR-FI, como se describe en lo anterior. Se utilizan otras condiciones de plegamiento o naturalización en el caso de análogos de SDF-1: se oxidan SDF-1 y Met°-SDF-1 a 0.5 mg/ml en GuHCl 1M, Tris 0.1M, pH 8.5 a temperatura ambiente, en presencia de aire. Después de agitar durante toda la noche, el plegamiento es completo. Se oxidan AOP- , caproil- y NNY-SDF-1 en el mismo amortiguador, pero en presencia de GuHCl 2M. Para la conjugación química del acide- graso a una proteína plegada dada, están involucradas dos etapas básicas. En primer lugar, el ácido graso se funcionaliza con un grupo aminooxi . En segundo lugar, se introduce un grupo carbonilo reactivo específicamente en el dominio carboxilo terminal de la proteína, una región que no se considera crítica para la actividad de las quimiocinas . Para este propósito, los análogos de quimiocina dirigidos para la modificación de ácido graso en la parte C terminal se sintetizan con una extensión de la secuencia en la parte C terminal Lys (Ser)Gly. Así, por ejemplo, se sintetiza NNY-RANTES (2-68) para contener una extensión de la secuencia Lys(Ser)Gly en la parte C terminal. El grupo carbonilo reactivo se genera por tratamiento con NaI04 de la proteína renaturalizada , y de esta manera se permite la unión específica de sitio de la porción de ácido graso a través de un enlace oxima estable. Para la funcionalización del ácido graso, se activan 0.2 mmoles de ácido graso (palmitato, oleato, araquidonato , colato) con cantidades equimolares de DCC y HOAt en 0.5 mi de una mezcla de DMF/DCM (1:1 v/v) y se agregan a una solución de 0.5 mi de DMF de Boc-AoA-NH- (CH2) 2-NH2 0.25 mmoles, y se ajusta el pH aparente a pH 8.0 con N-etilmorfolin . Para el derivado colesterilo, Be disuelven 0.2 mmoles de colesteril -cloroformiato en 0.5 mi de DCM y se agregan a una solución etanólica de 0.25 mmoles de Boc-AoA-NH- (CH2) 2-NH2 Y se ajusta el pH aparente a pH 9.0 con trietilamina . Después de incubación durante la noche se eliminan las partes volátiles bajo vacío y el producto se aisla ya sea por cromatografía instantánea o por CLAR preparativa en una columna C4. Se separa el grupo Boc por tratamiento con TFA y el producto se verifica por ESI-EM. Para la oxidación de la proteína, se disuelve la proteína objetivo (2mg/ml) en amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M, pH 7.5 que contiene cloruro de guanidina 6M y metionina agregada para obtener un exceso molar de 100 veces del eliminador sobre la proteína. Después se agrega un exceso de 10 veces del peryodato de sodio y la solución se incuba durante 10 min en la obscuridad. La reacción se detiene por la adición de un exceso molar de 1000 veces de etilenglicol sobre peryodato y la solución se incuba adicionalmente durante 15 min a temperatura ambiente. La solución después se dializa contra ácido acético 0.1% y finalmente se liofiliza. Por ejemplo, se ha observado que la oxidación de la serina lateral en la parte C terminal ha demostrado que es casi cuantitativa por ESI-EM, en donde se obtiene una masa de 8141.1+0.7 unidades Da en el caso de AOP-RANTES-K ( S ) G, que corresponde a la pérdida de 31 unidades Da para formar el derivado de glioxililo y sin pico correspondiente a la masa del material inicial.

La conjugación del ácido graso con la quimiocina se lleva a cabo en amortiguador de acetato de sodio 0.1M, pH 5.3, en presencia de sarcosil 0.1%, metionina 20 mM y un exceso' de 20 veces del ácido graso funcionalizado sobre la proteína. Después de agitación durante 16-20h a 37°C, el conjugado, como una oxima unida formada entre el grupo amino-oxi del ácido graso y el aldehido de quimiocina, se purifica utilizando CLAR de fase inversa y el producto se caracteriza por ESI-EM. Para todos los análogos, el acoplamiento de los ácidos grasos con funcionalidad aminooxi a la proteína oxidada es casi cuantitativo, controlado por CLAR analítica. Ejemplo 3: Análogos en la parte N terminal de NNY-RA ES y AOP-RANTES Para los derivados de RA TES de la parte N terminal, se realizan modificaciones a uno o más de los aminoácidos de la región de la parte N terminal correspondientes a los primeros ocho residuos de aminoácidos de NNY-RA TE? (2-68) o AOP-RANTES (2-68), primeros ocho residuos aminoácidos los cuales tienen la siguiente secuencia -PYSSDTTP- . Estos corresponden a los residuos aminoácidos 2-9 del residuo de 68 aminoácidos de la cadena polipeptídica de RANTES de tipo silvestre (es decir, RANTES (1-68)) que se muestra en las figuras 2A a 2E, dado que el primer residuo (Ser) de RANTES (1-68) que se presenta de manera natural está sustituido por el sustituyente n-nonanoilo en MVY-RANTES (2-68) y aminooxipentano en AOP-RANTES (2-68) . Así,' por ejemplo, una sustitución en NNY-RANTES (2-68) en la posición de aminoácido 2 se indica por debajo del compuesto general de la fórmula ".N-VY-P2X-RANTES (3-68)", en donde NNY es n-nonanoilo, X es un aminoácido que sustituye a la prolina (P) en la posición 2 de -Wy-RANTES (2-68) y RANTES (3-68) representa los 66 aminoácidos restantes de NNY-RANTES (2-68) , como se leen en la dirección N a C terminal. Por medio de otro ejemplo, una sustitución en .NIVY-RANTES (2-68) en la posición de aminoácido 3 está indicada por el compuesto general de la fórmula "???-??3?- ANTES (4-68) " en donde NNY es n-nonanoilo, X es un aminoácido que sustituye a la tirosina (Y) en la posición 3 de NNY-RANTES (2-68), y RANTES (4-68) representa los 65 aminoácidos remanentes de NNY-RANTES (2-68) , como se lee en la dirección de las partes N a C termínales. Para análogos de NY-RANTES sustituidos de manera múltiple, el siguiente ejemplo de un compuesto de fórmula para tres sustituciones en MNY-RANTES (2-68) en las posiciones de aminoácidos 2,3 y 9 se indica por la fórmula del compuesto general "ÍWY-P2X-Y3X-SSDTT-P9X-RANTES (10-68) " en donde NNY es n-nonanoilo, X es un aminoácido igual o diferente que sustituye a la prolina (P) en la posición 2, tirosina (Y) en la posición 3 y prolina (P) 9 de ?G/?-RANTES (2-68) , SSDTT corresponde a los aminoácidos 4 a 8 de NNY-RANTES (2-68) , y RANTES (10-68) representa los 59 aminoácidos remanentes de NNY-RANTES (2-68) , como se leen en la dirección de las partes terminales N a C. Los siguientes son ejemplos de análogos de ÍV-VY-P2X-RANTES (3-68) preparados. Compuesto Número iVZVY-P2AÍb-RANTES (3-68) 1 HZVy-P2Hyp-RANTES (3-68) 2 WN5T-P2TÍC- ANTES (3-68) 3 _V2VY-P2Indol -RANTES (3-68) 4 MNir-P2P (4 , 4DiF) -RANTES (3-68) 5 _V2Vy-P2Thz-RANTES (3-68) 6 iV7\7y-P2HoP-RANTES (3-68) 7 _VN -P2APro-RANTES (3-68) 8 NNY-P2A-RANTES (3-68) 9 Los siguientes son ejemplos de análogos de NNY-F-Y3X-RANTES (4-68) preparados. Compuesto Número MVY-P-Y3P-RANTES (4-68) 10 iV Y-P-Y3A-RANTES (4-68) 11 My-P-Y3L-RANTES (4-68) 12 _V2VY-P-Y3V-RANTES (4-68) 13 2VNY-P-Y3F (3 , 4-DiOH) -RANTES (4-68) 14 JVNY-P-Y3F (3 , 4-DiOH,pBzl) -RANTES (4-68) 15 WNY-P-Y3pBz-RANTES (4-68) 16 NNY-P-Y3Cha-RANTES (4-68) 17 _VNY-P-Y3PNal-RANTES (4-68) 18 iWY-P-Y3Chg-RANTES (4-68) 19 VY-P-Y3Phg-RANTES (4-68) 20 iV Y-P-Y3Hof -RANTES (4-68) 21 NNY-P-Y3F (F) s-RANTES (4-68) 22 MVY-P-Y3 tbuA-RANTES (4-68) 23 NNY-P-Y3F (4-Me) -RANTES (4-68) 24 ÍW7-P-Y3ÜL-RANTES (4-68) 25 MVY-P-Y3CycP-RANTES (4-68) 26 MVY-P-Y3CycH-RANTES (4-68) 27 MVY-P-Y3Nle -RANTES (4-68) 28 Los siguientes compuestos son ej emplos de análogos de NNY-PY-S4X-RANTES (5-68) preparados. Compuesto Número WWY-PY- S4A-RANTES (5-68) 29 -VN7-PY-S4tbuA-RANTES (5-68) 30 Los siguientes compuestos son ej emplos análogos de NNY- PYS-S5X-RANTES (6-68) preparados. Compuesto Número ÍV2VY-PYS-S5 tbuA-RANTES (6-68) 31 Los siguientes compuestos son ej emplos análogos de NNY- PYSS-D6X-RANTES (7-68) preparados. Compuesto Núme o VY-PYSS-D6 tbuA-RANTES (7-68) 32 Los siguientes compuestos son ej emplos análogos de NNY- PYSSD-T7X-RANTES (8-68) preparados.

Compuesto Número NNY-PYSSD-T7 tbuA-RANTES (8-68) 33 Los siguientes compuestos son ejemplos análogos de NNY- PYSSDT-T8X-RANTES (9-68) preparados. Compuesto Número 2WY-PYSSDT-T8 tbuA-RANTES (9-68) 34 Los siguientes compuestos son ejemplos análogos de -WY-PYSSDTT-P9X-RANTES preparados. Compuesto Número NNY-PYSSDTT-P9Hyp-RANTES (10-68) 35 WiVY-PYSSDTT-P9AÍb-RANTES (10-68) 36 N¡VY-PYSSDTT-P9APro-RANTES (10-68) 37 N Y-PYSSDTT-P9Thz-RANTES (10-68) 38 Los siguientes compuestos son ejemplos de análogos con sustitución doble de NNY-P2X-Y3X-RANTES (4-68) , y análogos de sustitución triple iVNY- P2X-Y3X-SSDTT-P9X-RANTES (10-68) preparados. Compuesto Número MVY-P2Hyp-Y3 ButA-RANTES (4-68) 39 NNY- P2Thz-Y3 tButA-RANTES (4-68) 40 NNY-P2Hyp-Y3Chg-RANTES (4-68) 41 JVNY-P2 hz-Y3Chg-RANTES (4-68) 42 MVY-P2Thz-Y3Chg-SSDTT-P9Aib-RANTES (10-68) 43 Ejemplo 4: Análogos de bucle de N, N terminal de MNy-RANTES Se pretende que los siguientes compuestos sean ilustrativos de análogos de RANTES sustituidos con NNY adicionales en los cuales el bucle N (residuos 12-20 de RANTES) esté modificado para aumentar la potencia hacia CCR5 sin afectar la transducción de señal vía CCR1 y CCR3. Para loa análogos de RANTES con bucle de N, N terminales, las modificaciones en el bucle N se realizan a NNY-RANTES (2-68) en donde el bucle N corresponde a los aminoácidos 12-20. El bucle N de RANTES tiene la secuencia de aminoácidos -FAYIARPLP- (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2) . Así, por ejemplo, una sustitución en ????-RANTES (2-68) en la posición de aminoácido 12 tiene la fórmula de compuesto general " NiVY-PYSSDTTPCC-F12pBz-RANTES (13-68)", en donde NNY es n-nonanoilo, PYSSDTTPCC corresponde a los aminoácidos 2 a 11 de RANTES (1-68), F12pBz indica sustitución del derivado aminoácido pBZ por la fenilalanina (F) en la posición 12 de RANTES (1-68) y RANTES (13-68) representan los residuos aminoácidos restantes 13-68 de RANTES (1-68) , como se lee en la dirección N a C terminal. Compuesto Número MtfY-PYSSDTTPCC-F12pBz-RANTES (13-68) 44 NNY- PYSSDTTPCC- F12Y-RANTES (13-68) 45 NNY- PYSSDTTPCC- F12F (4 -Me) -RANTES (13-68) 46 PYSSDTTPCC- F12 (4-F) -RANTES (13-68) 47 2\/iVy-PYSSDTTPCCF-A13R-RANTES (14-68) 48 NNY- YSSDTTPCCF-A13S-RANTES (14-68) 49 NNY- PYSSDTTPCCFA-Y14F-RANTES (15-68) 50 W.VSr-PYSSDTTPCCFA-Y14Cha-RANTES (15-68) 51 NNY- PYSSDTTPCCFAY- 115 tBuA-RANTES (16-68) 52 NNY- PYSSDTTPCCFAY- I15? -RANTES (16-68) 53 PYSSDTTPCCFAYI -A16S-RANTES (17-68) 54 NNY- PYSSDTTPCCFAYA-R17A-RANTES (18-68) 55 NNY- PYSSDTTPCCFAYA-R17H-RANTES (18-68) 56 NNY- PYSSDTTPCCFAYAR- Pl8Thz -RANTES (19-68) 57 NNY- PYSSDTTPCCFAYARP-Ll9I -RANTES (20-68) 58 NNY-PYSSDTTPCCFAYARP-L19Cha-RANTES (20-68) 59 NNY- PYSSDTTPCCFAYARPL- P20Thz-RANTES (21-68) 60 Ejemplo 5: Análogos de RANTES en la parte N terminal, de NNY-RANTES Se pretende que los siguientes compuestos sean ilustrativos de análogos de RANTES sustituidos en NNY adicionales, en los cuales se utiliza una cadena alifática diferente en vista del sustituyente NNY. Compuesto Número CH2-CH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-RANTES (2-68) 61 NIe -Met -RANTES (1-68) 62 Compuesto Número Dodecanoil -RANTES (3-68) 63 Lauril-Hyp-RANTES (3-68) 64 Compuesto Número Miristoil-RANTES (4-68) 65 Dodecanoil-Hyp-RANTES (4-68) 66 Ejemplo 6: Análogos en la parte C terminal y N/C terminales de MNY-RANTES y AOP-RANTES preparan AOP-RANTES y iwy-RANTES que tienen extensión en la parte C terminal de Lys-Gly, con el grupo epsilon amino de Lys acetilado por un residuo serina. Estos derivados se conjugan después de oxidación con peryodato de la extensión serina con compuestos con funcionalidad aminooxiacetilo que incluyen fluoróforos (FITC, NBD, Cy-5 y B0DIPY-F1) o lípidos. Estas quimiocinas marcadas en la parte C terminal retienen sus propiedades biológicas y la introducción de la porción alifática de manera similar a CH3-(CH2) 14-CONH- (CH2) 2-NHCO-CH2-0-NH2 que se ha demostrado que mejora la potencia de la quimiocina. Para encontrar el compuesto más eficaz, se funcionalizan diferentes ácidos grasos y lípidos con un grupo aminooxi por acoplamiento con Boc-AoA-NH- (CH2) 2-NH2, seguido por remoción de Boc laurato, palmitato, oleato, eicosanoato, ácido cólico y colesteril-cloroformiato . Uno o más de estos derivados se conjugan a las formas oxidadas de iVNY-RANTES-K (S) G o AOP-RANTES-K (S) G, en donde los análogos de AOP se ejemplifican a continuación: Compuesto Número AOP-RANTES-K (lauril) -G 67 en donde " (lauril) " es una abreviatura para gloxilil=AoA-etilendiamino laurato, y así sucesivamente AOP-RANTES-K (palmitoil ) -G 68 AOP-RANTES-K (eicosanoil) -G 69 AOP-RANTES-K (oleoil) -G 70 AOP-RANTES-K (colil) -G 71 AOP-RANTES- (colesteril) -G 72 Las variantes químicas de la porción lipídica también se preparan por otra estrategia. Tales compuestos se sintetizan mediante elaboración sobre resina del segmento C terminal por unión del ácido graso a la porción de Boc-péptido-Lys-Gly-resina desprotegido por Fmoc, antes de separación, purificación y uso en ligación química para formar el polipeptido de longitud completa. Al diseñar estos compuestos, existen dos razones principales por las que se utiliza un acoplamiento lipídico. En primer lugar, ahora existe evidencia cada vez mayor de que la actividad inhibidora contra VIH-1 de los compuestos de RANTES se relacionan con la capacidad para regulación por disminución del receptor. Esto significa que una vez internalizado el complejo ligando-receptor el cual habitualmente se disocia en endosomas tempranos cuando se recicla del receptor, también puede interactuar con la membrana plasmática o algunas proteínas de unión de ácido graso citoplasmáticas . En consecuencia, la modificación lipídica del ligando puede redirigir el complejo a un subdominio intracelular específico simplemente a través de interacciones y por lo tanto retardar el reciclado del receptor. Varios informes recientes que se relacionan con el tráfico de proteínas intracelulares sustentan la idea de que la acilación es un mecanismo común de aumentar la afinidad de proteínas para membranas resistentes a detergentes y pueden ser el mecanismo de direccionamiento primario para proteínas sin alcance en la membrana (véase, por ejemplo, Melkonian et al., J. Biol. Chem, (1999) 274:3910-3917; Zlatkine et al., J. Cell Sci. (1997) 110:673-679; Zhan et al. Cáncer Im unol . Immunother. (1998) 45:55-60). En segundo lugar, la modificación también se lleva a cabo para cambiar las propiedades farmacocinéticas de los compuestos. Varios documentos recientes fundamentan este concepto (véase, por ejemplo, Honeycutt et al. Pharm. Res. (1996) 13 : 1373 -1377 ; Kurtzhals et al. J. Pharm. Sci. (1997) 86: 1365-1368 ; Markussen et al .Diabetologia (1996) 39:281-288) . Como se demuestra en los ejemplos que siguen, el mejoramiento de la actividad es sorprendente e inesperado, dado que la modificación se diseña para cambiar la f rmacocinética . Lo que se esperaría sería una actividad disminuida, pero la mejora que se esperaba en la farmacocinética puede haber proporcionado un balance aceptable.

Ejemplo 7: Análogos en la parte N terminal de SDF-?a para SDF-lp Se preparan los siguientes derivados de N terminal SDF-?ß (1-72) para ilustrar un enfoque general para elaborar un modulador de receptor de quimiocina CXC. A modo de ejemplo, se modifica la parte N terminal de SDF-?ß para generar compuestos que tengan una cadena al i fática en la parte N terminal . Los compuestos que incluyen además un derivado de aminoácido en la región N terminal, o una cadena alifática en la región C terminal se preparan como se describe antes para los compuestos de RANTES. En particular, se preparan tales sustituyentes en la parte N terminal y se prueban de manera que incluyan, a modo de ilustración y no como una limitación, Lys, Met-Lys, caproil-Lys, CH3-(CH2)7-C (O) y CH3- (CH2) 4-O-NH-glioxililo . Los siguientes compuestos son ejemplos de algunos de los análogos de SDF-?ß preparados. Compuesto Número Lys-SDF-1 (2-72) 73 Met-Lys-SDF-1 (2-72) 74 Caproil- Lys-SDF-1 (2-72) 75 NNY-SOF-1 (2-72) 76 AOP-glioxilil-SDF-1 (2-72) ' 77 Ejemplo 8i Ensayos de cribado Varios de los análogos de RANTES y de SDF preparados en los ejemplos 3 a 7 y en otros, se criban para determinar actividad inhibidora, utilizando un ensayo basado en VIH, para caracterizar la función bloqueadora para esta indicación particular para las cuales encuentran uso ANTES y SDF-l. En general, los compuestos se hacen pasar a través de un cribado preliminar para determinar su capacidad para inhibir la fusión de células mediada por envoltura de VIH. El más promisorio de estos compuestos se prueba subsecuentemente para determinar su capacidad para inhibir la infección viral sin células de una línea de células objetivo. Se eligen estos ensayos dado que el ensayo de fusión celular y el ensayo de infección viral sin células in vitro se ha encontrado que son indicadores útiles de potencia in vivo, determinado en el modelo de ratón SCID (Mosier et al., J. Virol . (1999) 73:3544-3550) . Además, dado que incrementa la potencia antiviral de MVY-RANTES sobre AOP RANTES, se ha encontrado que debido a factores diferentes de un incremento en la afinidad por CCR5 , se evalúan los compuestos en términos de actividad en el ensayo de fusión celular, en vez de afinidad por CCR5. Ejemplo 9: Ensayos de fusión celular mediada por envoltura Se determina la capacidad de un grupo dado de compuestos de los ejemplos 3 a 7 para inhibir la fusión celular dependiente de CCR5 utilizando células sometidas a ingeniería para proteínas de envoltura viral fusionadas con células que presentan CD4 y CCR5 y que contienen un sistema indicador. Se llevan a cabo los ensayos de fusión celular mediados por envoltura viral trópicos para CCR5 esencialmente como se describe en Simmons et al. (Science (1997) 276:276-279) utilizando las líneas celulares HeLa- P5L y HeLa-Env-ADA, ambas las cuales fueron proporcionadas amablemente por el laboratorio de . Alizon (París) . Brevemente, se siembran células HeLa-P5L en placas de 96 pozos (104 células por pozo en 100 µ?) . 24 horas después se elimina el medio y se agrega medio que contiene 10* células HeLa-Env-ADA por pozo, más quimiocinas (volumen final de 200 µ?) . Después de 24 horas adicionales, las células se lavan una vez en PBS y se lisan en 50 µ? de PBS/NP-40 0.5% durante 15 min a temperatura ambiente. Se realizan ensayos en los lisados para determinar actividad de ß-galactosidasa mediante la adición de 50 µ? de sustrato CPRG 2X ( ro o/clorofenol-p-D-galactopiranósido 16 mM; Na2HP04 120 mM, NaH2P04 80 mM, KCl 20 mM, MgS04 20 mM y p-mercaptoetanol 10 mM (seguido por incubación durante 1-2 horas en la obscuridad a temperatura ambiente. Después se lee la absorbancia a 575 nm en un lector de microplaca de Labsystems . A partir de estos valores se calcula el porcentaje de inhibición [100 x (D0(prueba) - DO (control negativo) ) / DO(Con roi positivo)- DO(controi negativo)) ] en cada concentración de inhibidor. Una gráfica del porcentaje de inhibición de fusión contra la concentración de inhibidor permite el cálculo de los valores de CIS0 para cada compuesto.

De manera significativa, la mayor parte de los compuestos probados muestran mayor potencia en relación a RANTES tipo silvestre. Los resultados para los análogos de inhibidor de RANTES seleccionados se muestran en la tabla 1 a continuación. Tabla 1: Cribado de fusión celular NNY-RANTES modificado en la parte N terminal Número de Compuesto Potencia Relativa Media 19 7 23 7 40 4 42 2 NNY-RANTES (control) 18-25 NNY-RANTES modificado en el bucle N Número de Compuesto Potencia Relativa Media 54 15 57 15 58 13 59 14 NNY-RANTES (control) 18-25 AOP-RANTES modificado en la parte C terminal Número de Compuesto Potencia Relativa Media 68 45 AOP-RANTES (control) 100 En la tabla 1, para las potencias relativas medias, los valores absolutos de CI50 en el ensayo de fusión varían a través de los experimentos realizados en días diferentes, aunque los órdenes de alcance de actividad permanecen constantes. Con el fin de normalizar los resultados, se utiliza A0P-RANTES como un control en cada experimento. De manera que la CI50 en cada experimento se expresa en relación a la de AOP-RANTES, la cual proporciona un valor arbitrario de 100. Aunque la mayor parte de la totalidad de los compuestos probados muestran mayor potencia en relación a RANTES de tipo silvestre, las potencias de ciertos compuestos, tales como los compuestos números 19, 23, 40 y 42, son tales que se obtiene más de 50% de inhibición incluso con. las diluciones más bajas en la serie. Ejemplo 10: Ensayos de Infección Viral sin Células Se llevan a cabo ensayos de infección viral sin células de la misma manera que el ensayo de fusión celular mediado por envoltura, excepto que en este caso se sustituye la línea de células de envoltura por virus con tropismo R5 vivos. Se siembran células HEK293 -CCR5 (7, proporcionadas amablemente por T. Schwartz, Copenhaguen) en placas de 24 pozos (1.2 x 105 células/pozo) . Después de la incubación durante la noche, se realiza unión por competencia sobre la totalidad de las células durante 3 h a 4°C utilizando 12 pM [12SI ] MIP-l-oí (Amersham) más cantidades variables de ligando sin marcar en 0.5 mi de "amortiguador de unión" (HEPES 50 mM, pH 7.4, suplementado con CaCl2 1 mM, MgCl2 5 mM y albúmina sérica bovina 0.5% (p/v) ) . Después de incubación, las células se lavan rápidamente cuatro veces en amortiguador de unión enfriado con hielo suplementado con NaCl 0.5 M. Las células se lisan en 1 mi de ácido acético 3M, urea 8 M y NP-40 2%. Se realiza una cuenta del material lisado durante 1 minuto utilizando un contador de centelleo Beckman Gamma 4000. Se realizan determinaciones por duplicado y se derivan los valores de CI5o a partir de las concentraciones monofásicas de las curvas de inhibición ajustadas utilizando el software Prism. La tabla 2 ilustra el aumento en la potencia sobre _V_VY~-RA TES que se muestra en el cribado preliminar por los compuestos números 19 y 23. Tabla 21 Datos de Infectividad In Vitro para Compuestos Seleccionados a Partir del Ensayo de Infección Viral sin Células AOP- NNY- Compuesto Compuesto RANTES RANTES 23 19 Resultados de 140 32 17 15 Infectividad 47 8 3.8 34 Cl5o 260 26 28 9.9 Experimentales 135 30 14 12 CI50 de Infectividad 145 pM 24 pM 14 pM 12 pM Promedio Resultados de Fusión 480 pM 97 pM 38 pM 26 pM Celular para Comparación Ejemplo 11] Tratamiento de Combinación con compuestos contra CCR5 y contra CXCR4 El siguiente ejemplo ilustra los efectos protectores de utilización de una sustancia contra CCR5 (por ejemplo NNY-RANTES) y una contra CXCR4 (por ejemplo, antagonista de SDF-1 o AMD 3100) en combinación para bloquear la infección por VIH, y bloqueo de la conversión potencial de las cepas R5 de VIH a cepas X4. Para este propósito se utiliza un modelo de ratón SCID. En particular, se prueban los efectos protectores de HN7-RANTES y AMD 3100 (una molécula orgánica pequeña de agente contra X4) en ratones SCID, que se vuelven a poblar con leucocitos de sangre periférica humana y se exponen a VIH-1 siguiendo los métodos descritos por Mosier, Adv. Immunol . (1996) 63:79-125; Picchio, et al., J. Virol . (1997) 71:7124-7127; Picchio, et al., J. Virol . (1998) 72:2002-2009; y Offord et al., WO 99/11666. Se administra NNY-RANTES como en la tabla X, y se utiliza AMD 3100 como una solución de 200 mg/ml. La exposición se realiza con un virus de VIH R5 exrepto para el grupo con AMD 3100 solo. No se observan mutantes de escape en la terapia de combinación, y la totalidad de los ratones tratados apropiadamente permanecen sin virus durante el experimento. Esto indica que los derivados de RANTES de la parte N, C y N/C terminal de la invención se pueden utilizar en combinación con compuestos de la cepa contra X4 tales como AMD 3100 o el antagonista de SDF-l tales como los que se describen en la presente, para bloquear la infección por VIH en mamíferos. Ejemplo 12: Preparación del análogo de RANTES G1755-01 El análogo de RANTES, G1755-01, que se muestra en la figura 11 se sintetiza como sigue. 1. Preparación de AOP- [RANTES (2-33) ] -tioéster Secuencia : aminooxipentano-glioxalil-PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK-tioéster (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN N MERO t 30) El segmento peptidico de la parte N terminal AOP- [RANTES (2-33) ] -atioéster (tioéster también mostrado como -C(O)SR) que contiene una porción aminooxipentano -glioxaliloxima N terminal (AOP) se sintetiza por ensamblado de la secuencia RANTES (2-33) sobre una resina generadora de tioéster (Hackeng, et al., PNAS (1999)96: 10068-10073) y después se modifica en la parte N terminal por acoplamiento directo de una porción de aminooxipentano-glioxaliloxima [es decir CH3 (CH2) -0-N=CHCOOH] a la resina, siguiendo protocolos estándar ( ilken et al., Chemistry & Biology (1999) 6 (1) :43-51) . La resina peptídica se separa con fluoruro de hidrógeno y se purifica por CLAR en fase inversa para proporcionar el péptido a-carboxitioéster AOP-RANTES (2-33) -tioéster . Masa observada = 4179.64 Da; masa calculada = 4178.57 Da (composición de isótopo promedio) . 2. Preparación de [RANTES (34-68) ] :Lys69 (GP6) -Leu70 Secuencia: CSNPAWFVT RKNRQVCANP EKK VREYIN SLEMSK (GP6 ) L (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO» 31) en donde GP6 se une a e? de Lys 69: a. Péptido en Fase Sólida y Síntesis de Polímero Hidrosoluble sobre {Resina Peptídica} Se sintetiza el segmento de péptido de la parte C terminal [RANTES (34-68) ] -Lys69 (Fmoc) -Leu70 por síntesis peptídica en fase sólida convencional en una Boc-Leu-OCH2 -Pam-reaina utilizando los protocolos de neutralización in situ/activación con HBTU para la síntesis peptídica en fase sólida de la química Boc como se desribe en Schnolzer, et al., Int. J. Pep. Protein Res. 40:180-193. Después de completar el ensamblado de cadena, el grupo Fmoc sobre el nitrógeno e de Lys69 se separa de la resina peptídica protegida con piperidina 20% en tratamiento con D F . El anhídrido succínico (Succ) después se acopla en una solución de HOBT (hidroxibenzotriazol ) en DMF que contiene DIEA al nitrógeno e en Lys69. Después de lavado, el grupo carboxilo libre del ácido auccínico unido a resina se activa por adición de carbonildiimidazol en DMF . Después de otro ciclo de lavado, se agrega 4 , 7 , 10) -trioxatridecano-1,13 diamina (TTD) 50% en HOBT 0.5 M en DMF. Después del lavado, el polímero unido a resina está listo para el siguiente ciclo de acoplamiento de anhídridosuccinico/activación de CDI/acoplamiento de TTD. Después de 6 ciclos, se acopla el anhídrido succínico a la última amina TTD en HOBT/DMF = solución DIEA para proporcionar el compuesto modificado en Lys69 que tiene un polímero unido a amida - (Succ-TTD) 6-Succ-0H . La resina de polímero hidrosuluble péptido/lineal se separa de la resina con fluoruro de hidrógeno y el producto se purifica por CLAR preparativa en fase inversa para proporcionar [RANTES34 - 6T ) ] -Lys69 (GP6 ) -Leu70. Masa observada = 6253 Da; masa calculada = 6252 Da (composición de isótopo promedio) . 3. Preparación de G1755-01 Secuencia aminooxipentano-glioxalil-PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAWF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY INSLEMSK (GP6)L (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 32) Los segmentos peptídicos completamente sin protegerse N terminal y C terminal descritos en lo anterior se unen por ligación química nativa como se describe por Dawson et al. Science 266:776-779 (1994) . El producto polipeptídico de longitud completa en forma reducida se purifica utilizándose CLAR en fase inversa con un gradiente lineal de aceotonitrilo versus agua que contiene ácido trifluoroacético 0.1%. Masa observada - 10,060 Da. El polipéptido de longitud completa con GP6 unido se naturaliza con formación concomitante de dos enlaces de sulfuro en amortiguador acuoso que contiene un acoplamiento redox cisteína-cistina, y se purifica por CLAR en fase inversa siguiendo protocolos estándar (Wilken et al., Chemistry & Biology (1999) 6 ( 1 ) : 3 - 51 ) . El producto naturalizado es homogéneo cuando se somete a análisis por CLAR. Masa observada = 10,056 Da; Masa calculada = 10,058 Da (composición de isótop promedio) . Ejemplo 131 Preparación del Análogo de RANTES G1755 Se sintetiza como sigue el compuesto G1755 que se muestra en la figura 12. 1. Preparación de n-nonanoil-RANTES (2 -33 ) Secuencia : n-nonanoil-PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK-tioéster (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 33) . Se sintetiza n-nonanoil-RANTES (2 -33) en una resina productora de tioéster como se describe en lo anterior, y después se modifica en la parte N terminal por acoplamiento directo del ácido n-nonanoico a la resina. La resina peptídica se separa con fluoruro de hidrógeno y se purifica por CLAR en fase inversa para proporcionar n-nonanoil-RANTES (2-33) . Masa observada = 4177 Da; masa calculada = 4177.62 Da (composición de isótopo promedio) . 2. Preparación de RANTES (34-68) -Lys69 (GP6) -Leu70 Secuencia : CSNPAWFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN SLEMSK (GP6)L (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO i 34) . a. Síntesis de Péptido en Fase Sólida y de Polímero HidroBoluble en {Resina Peptídica} Se sintetiza RANTES (34 -68 ) -Lys69 (Fmoc) -Leu70 por síntesis peptídica en fase sólida convencional sobre Boc-Leu-0CH2-Pam-resina utilizando los protocolos de neutralización in situ/activación con HBTU para química Boc de síntesis peptídica en fase sólida, como se describe en lo anterior. Después de completar el montaje de cadena, el grupo Fmoc en el nitrógeno e de Lys69 se separa de la resina con el péptido protegido y se sintetiza la construcción GP6 en la resina peptídica como se describe en lo anterior. La resina de polímero hidrosoluble péptido/lineal se separa con fluoruro de hidrógeno y el producto se purifica por CLAR preparativa en fase inversa para proporcionar RANTES (34-68) -Lys69 (GP6) -Leu70. Masa observada = 6252.87 Da; masa calculada = 6252.24 Da (composición de isótopo promedio) . 3. Preparación de G1755 Secuencia: nonanoil-PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAWF VTRKNRQVCA NPEKKWVRIY INSLEMSK (GP6)L (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO i 35) a. Ensamblado del Polipéptido de Longitud Completa por Ligación Química Nativa Los segmentos peptídicos completamente sin protección de la parte N terminal y C terminal se unen por ligación química nativa como se describe antes en el ejemplo 18. El polipéptido de longitud completa en forma reducida se purifica utilizando CLAR en fase inversa con un gradiente lineal de acetonitrilo versus agua que contiene ácido trifluoroacético 0.1%. Masa observada = 10060.74 Da, masa calculada = 10058.67 Da (composición de isótopo promedio) . b. Precalentamiento y Purificación del Polipéptido Modificado con Polímero Hidrosoluble Se pliega el polipéptido de longitud completa con GP6, con formación concomitante de 2 enlaces disulfuro en amortiguador acuoso que contiene un par redox cisteína-cistina y se purifica por CLAR en fase inversa, como se describe en lo anterior. El producto plegado es homogéneo cuando se somete a análisis por CLAR. Masa observada 10057.43 Da; masa calculada = 10054.67 Da (composición de isótopo promedio) . Ejemplo 14: Preparación de Análogo de RANTES G1805 Se sintetiza como sigue el compuesto G1805 que se muestra en la figura 13. 1. Preparación de n-nonanoil-RANTES (2 -33 ) (Tyr3Chg) -tioéster Secuencia: nonanoil-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK-tioéster (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 36). en donde X = L-ciclohexilglicina (Chg) Se sintetiza n-nonanoil -RANTES (2 -33 ) (Tyr3Chg) sobre una resina productora de tioéster como se describe en lo anterior, y después se modifica en la parte N terminal por acoplamiento directo del ácido n-nonanoico a la resina. La resina peptídica se separa con fluoruro de hidrógeno y se purifica por CLAR en fase inversa para proporcionar n-nonanoil-RANTES (2-33) Tyr3Chg) . Masa observada = 4151.98 Da; masa calculada = 4152.6 Da (composición de isótopo promedio). 2. Preparación de RANTES (34-68) (Met67Lys) Lev) ) -Lye69-Leu70 Secuencia : CSNPAWFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN SLEK (Lev) SKL (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO Í 37) . Se sintetiza RANTES (34 - 68 ) (Met67Lys) -Lys69 (Fmoc) -Leu70 por síntesis peptídica en fase sólida convencional sobre una Boc-Leu-OCH2 -Pam-resina utilizando los protocolos de neutralización in situ/activación de HBTU parr. química Boc de síntesis peptídica en fase sólida, como se describe en lo anterior . Después de completar el ensamblado de cadena, el grupo Fmoc en el nitrógeno e de Lys67 se separa de la resina y el péptido protegidos, con piperidina 20% en tratamiento con DMF . Se activa ácido levulínico como el anhídrido simétrico con 1 , 3 -diisopropilcarbodi-imida y se acopla al nitrógeno e de Lys 67. El péptido unido a resina se separa con fluoruro de hidrógeno y el producto se purifica por CLAR preparativo en fase inversa para proporcionar RANTES (34-68) (Met67Lys (Lev) ) -Lys69-Leu70. Masa observada = 4433.22 Da; masa calculada = 4434.19 Da (composición de nuclico promedio) . 3. Preparación de G1805 Secuencia : nonanoil -PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAWF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY INSLEK (Lev-GP29) SKL (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 38) en donde X = L-ciclohexilglicina (Chg) , y en donde GP29 = construcción de polímero hidrosoluble unido a oxima ramificado que se muestra en las figuras 13 y 14. a. Ensamblado del Polipéptido de Longitud Completa por Ligación Química Nativa Los segmentos peptídicos no protegidos completamente N terminal y C terminal se unen por ligación química nativa como se describe en lo anterior. El polipéptido de longitud completa en forma reducida se purifica utilizando CLAR en fase inversa con un gradiente lineal de acetonitrilo versus agua que contiene ácido trifluoroacético 0.1%. Masa observada = 8213.62 Da, masa calculada = 8216.64 Da (composición de isótopo promedio) . b. Síntesis del Polímero Hidrosoluble Gp29 i. Síntesis de la Plantilla GRFNP17 que presenta grupos tiol múltiple Se sintetiza manualmente una plantilla de núcleo ramificado GRFNP17 sobre una amida que genera 4-metil ) bencidrilamina (MBHA) unido a resina, a una escala de 0.4 mmolea . Se acopla Boc . Lys (Fmoc) -OH utilizando protocolos de acoplamiento estándar (Schnólzer, M. , Int J Pept Protein Res. (1992) 40:180-93). 2.1 mmoles de aminoácido, DIEA 10% en 3.8 mi de HBTU 0.5 M; es decir, un exceso de 5 veces de aminoácido. Después de separación del grupo protector de Fmoc, se acopla Fmoc -Lys (Fmoc) -OH utilizando protocolos de acoplamiento de aminoácido estándar (2.1 mmoles de aminoácido, DIEA 10% en 3.8 mi de HBTU 0.5 M es decir, un exceso de aminoácido de 5 veces) . Después de una segunda etapa de remoción de Fmoc, se acopla Fmoc-Lys (Fmoc) -OH) utilizando protocolos de acoplamiento de aminoácido estándar (4.2 mmoles de aminoácido, DIEA 10% en 7.6 mi de HBTU 0.5 M; es decir un exceso de 5 veces en al aminoácido, en relación a la amina libre) . Después de una etapa de desprotección final con Fmoc, se acopla durante 30 minutos un exceso de 5 veces (en relación a las aminas libres) del éster pentafluorofenílico del ácido S-acetiltioglicólico (SAMA-oPfp) en DMF. SE separa el grupo protector de t-Boc del residuo lisil en la parte C terminal por lavados en lote de 1 minuto, dos veces, con TFA puro, seguido por neutralización de la resina por lavado con DIEA 10% en DMF. Se disuelven 2 mmoles de ácido Boc-aminooxiacético y 2 mmoles de N-hidroxisuccinimída (NHS) en 3 mi de DMF. Después de la adición de 2 mmoles de DIC (diisopropilcarbodiimida) , el ácido se activa durante 30-60 minutos. La solución se agrega a la resina neutralizada y se acopla durante 1 h. Finalmente se separan los grupos acetilo unidos en ?, con piperidina 20% en DMF durante 30 minutos. La plantilla de desprotege y simultáneamente se separa del soporte de resina utilizando HF/p-cresol, de acuerdo con los procedimientos de química Boc estándar, en presencia de cisteína como un eliminador para aldehido libre (Schnólzer, M. , Int J Pept Protein Res. (1992) 40:180-93) . La poliamida recuperada en B 50% [es decir, acetonitrilo acuoso 50% que contiene TFA 0.1%] (sin aldehido) se congela y liofiliza. Para purificación, el producto crudo de plantilla se disuelve en 2 mi de B 50% y se agregan 100 mi de A 100% [es decir, TFA 0.1% en agua] para diluir la muestra (evítese la adición de cloruro de guanidinio o acetato, dado que la adición de aldehido está garantizada) . La plantilla se carga en una columna de CLAR en fase inversa preparativa C4 equilibrada a T = 40 °C, con B 3%. Las sales se someten a elusión isocrática y la plantilla deseada, GRFNP17 se purifica en un gradiente lineal. Las fracciones que contienen el producto deseado se identifican por ES-EM, se acumulan y liofilizan. ii. Síntesis del Polímero Hidrosoluble Ramificado G NP29 Se sintetiza GRFNP29, un polímero (TTD-Succ) i2 ramificado de peso molecular 15kD por ligación generadora de tioéter de la plantilla que contiene tiol purificada GRFNP17 y un polímero lineal GRFNP31, Br-acetil- (TDD-Succ) 12-carboxilato, en donde GRFNP31 se sintetiza en una resina generadora de carboxi Sasrin siguiendo protocolos estándar (Rose, K. et al., Solicitud de Patente de E.U.A. No de Serie 09/379,297; Rose, et al . , J Am Che Soc. (1999) 121:7034), ae bromoacetila y purifica. Se disuelven de manera conjunta un exceso molar de 1.3x (sobre los tioles totales) de GRFNP31 purificado, Br-acetilado (EDA-Succ) 12, y la plantilla de GRFNP17 que contiene tiol purificado disuelto en Tris-HCl 0.1 M/cloruro de guanidinio 6 M, pH 8.7 a una concentración - 10 mM. Después de disolución, la solución se diluye 3 veces (v/v) con Tris-HCl 0.1 M, amortiguador pH 8.7. La mezcla de ligación se agita a temperatura ambiente y la reacción se vigila por CIAR en fase inversa y ES/EM. Se agrega reactivo GRFNP31 adicional en una base según se necesite hasta que el producto de reacción deseado es el producto principal. Para tratamiento, se agrega 3x (v/v a mezcla de ligación) de acetato 0.1 M/cloruro de guanidinio 6 M, pH 4, y la solución se carga en una columna de CIAR en fase inversa C4 preparativa y se purifica con un gradiente lineal. Las fracciones que contienen la construcción GRFNP29 puro se identifican utilizan ES-EM, se acumulan y liofilizan. c. Unión de GP29 al PolipÓptido de Longitud Completa Ligado El polipéptido de longitud completa liofilizado se disuelve y se coliofiliza con una cantidad equimolar de una construcción de GP29 de polímero hidrosoluble ramificado que contiene aminooxiacetil (AOA) en acetonitrilo acuoso 50% que contiene TFA 0.1%. El polvo seco se disuelve y purifica en CLAR en fase inversa para proporcionar el polipéptido de longitud completa con GP29 unido covalentemente por un enlace oxima a la funcionalidad ceto en la cadena lateral modificada de la lisina en la posición 67. El péptido modificado con polímero se separa del péptido no modificado y el polímero que no ha reaccionado mediante CLAR en fase inversa con C4 en un gradiente preparativo. Las fracciones que contienen el producto deseado modificado con polímero se identifican por ES-EM y se acumulan. Masa observada = 23,835.92 Da, masa calculada = 23,844.64 Da (composición de núclido promedio). Alternativamente, se une covalentemente GP29 después de naturalización del polipéptido, sin embargo, se observa que esto proporciona un rendimiento menor. d. Plegamiento y Purificación del Polipéptido que Contiene GP29 unido a Oxima El polipéptido de longitud completa con GP29 unido se pliega con formación concomitante de 2 enlaces disulfuro en amortiguador acuoso que contiene un par redox cisteína-cistina y se purifica por CIAR en fase inversa, como se describe en lo anterior. El producto plegado es homogéneo cuando se somete a examen por CLAR . Masa observada = 23,832 Da, masa calculada = 23,840 Da (composición de núclido promedio) . Ejemplo 15: Preparación de Análogo de RANTES, G1806 El análogo de RANTES, G1806, que se muestra en la figura 14, se sintetiza como sigue. 1. Preparación de n-nonanoil-RANTES (2 -33) Tyr3Chg) -tioéster Secuencia : nonanoil-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK-tioéster (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 39) en donde X = L-ciclohexilglicina (Chg) El segmento de péptido n-nonanoil -RANTES (2 -33 ) (Tyr3Chg) -tioéster (tioéster también mostrado como -COSR, en donde R es un grupo alquilo) se sintetizan sobre una resina productora de tioéster como se describe en lo anterior y después se modifica en la parte N terminal por acoplamiento directo de ácido n-nonanoico a la resina. La resina peptídica se separa con fluoruro de hidrógeno y se purifica por CLAR en fase inversa para proporcionar n-nonanoil -RANTES (2 -33)Tyr3Chg. Masa observada = 4151.98 Da, mase calculada = 4152.6 Da (composición de isótopo promedio). 2. Preparación de RANTES (34-68) (Met67Lya (Lev) ) -Lye69 (Palm) -Leu70 Secuencia: CSNPAWFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN SLEK (Lev) SK (Palm) L (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40) en donde K(lev) es un ácido levunílico modificado en el nitrógeno e de Lys67 del cambio Met67Lys para RANTES de tipo silvestre; y en donde K(Palm) es un palmitato modificado en el nitrógeno e de Lys69 unido a través de una porción amino octanoica que tiene la estructura: [eNitrógeno Lys69] -C{0) -CH2-CH2-CH2-CH2--CH2-CH2-CH2-NH-C (0) - (CH2)14-CH3 Se sintetiza RANTES (34 -68 ) (Met67Lys) -Lys69 (Palm) -Leu70 por síntesis peptídica convencional en fase sólida sobre Boc-Leu-OCH2 -Pam-resina utilizando los protocolos de neutralización in situ/activación de HBTU para síntesis peptídica en fase sólida de química Boc como se describe en lo anterior. Después de acoplamiento Boc-Lys (Fmoc) -OH en la posición 69, se separa el grupo Fmoc con piperidina 20% en DMF. Se activa el Fmoc- 8 -amino-ácido octanoico con HBTU/DIEA y se acopla al nitrógeno e de Lys69. Después de separación el grupo Fmoc, se activa ácido palmítico con l-hidroxi-7-azabenzotriazol (HATU) y 1 , 3 -di - isopropilcarbodi - imida y se acopla a la resina. El montaje de cadena después se completa utilizando procedimientos SPPS de química Boc estándar, como se describe en lo anterior. Después de completar el montaje de cadena del grupo Fmoc en el nitrógeno e de Lys67 se separa con tratamiento por piperidina 20% en DMF. Se activa ácido levulínico como el anhídrido simétrico con 1,3-di-ísopropilcarbodi-imida y se acopla al nitrógeno e de Lys67. Se separa la resina peptídica con fluoruro de hidrógeno y el producto se purifica por CLAR preparativa en fase inversa para proporcionar RANTES (34-68) Met57Lys (Lev) ) -Lys69 (Pamitato) -Leu70. Masa observada = 4813.72 Da; masa calculada = 4813.81 Da (composición de isótopo promedio) . 3. Preparación de G1806 Secuencia : nonanoil-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAWF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY INSLEK (Lev-GP29) SK (Palm) L (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 41) en donde X = L-ciclohexilglicina (Chg) y en donde la unión del ácido graso palmitato ("Palm") es a través de la porción amino octanoico; [eNitrógeno Lys69] -C (O) -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- H-C (O) - (C¾)14-CH3 a. Ensamblado del Polipéptido de Longitud Completa Modificado con Ácido Graso por Ligación Química Nativa Se unen los segmentos peptídicos no protegidos completos N terminal y C terminal mediante ligación química nativa, como se describe en lo anterior. El polipéptido de longitud completa en forma reducida se purifica utilizando CLAR en fase inversa con un gradiente lineal de acetonitrilo versus agua que contiene ácido trifluoroacético 0.1%. Masa observada = 8598.21 Da, masa calculada = 8596.27 Da (composición de isótopo promedio) . b. Unión de Polímero Hidrosoluble QP29 a Polipéptido de Longitud Completa Modificado con Ácido Graso, Ligado Se disuelve el polipéptido de longitud completa, liofilizado y se liofiliza con una cantidad equimolar de polímero GP29 que contiene AOA. El polvo seco se disuelve y purifica por CLAR en fase inversa para proporcionar el polipéptido de longitud completa con GP29 unido convalentemente por un enlace oxima a la funcionalidad ceto de la cadena lateral modificada de la lisina en la posición 67. Masa observada = 24217 Da; masa calculada = 24224 Da (composición de núclido promedio) . Al ernativamente, se puede unir covalentemente GP29 después de naturalización del polipéptido, sin embargo, se observa que esto proporciona un rendimiento menor. c, Plegamiento y Purificación de Polipéptidoe que Contienen QP29 Unido a Oxima, y Ácido Graso El polipéptido de longitud completa con GP29 unido se pliega con formación concomitante de dos enlaces disulfuro en amortiguador acuoso que contiene un par redox cisteína-cistina y se purifica por CLAR en fase inversa, como se describe en lo anterior. El producto naturalizado es homogéneo cuando se somete a análisis por CLAR. Masa observada = 24210.10 Da; masa calculada = 24,220.17 Da (composición de osótopo promedio) . La figura 15 muestra datos analíticos representativos de los análogos de Rantes sintéticos purificados, naturalizados finales. En particular, un gel de SDS-PAGE representativo que compara los pesos moleculares relativos de RANTES de tipo silvestre ( t, por a a siglas en inglés) por una químiocina sintética de análogo de RANTES C1806 bajo condiciones reductoras (R) y no reductoras (N) se muestra en la figura 15. Se muestran los pesos moleculares relativos en el lado izquierdo de cada gel, que corresponden a un estándar de peso molecular que se corre en el mismo gel (no mostrado) . También se muestra un cromatograma de CLAR-FI representativo del producto G1806 purificado, naturalizado. Esto ilustra la pureza y el peso molecular relativo aumentado de las construcciones modificadas de polímero de precisión en comparación con RANTES nativo de tipo silvestre. Ejemplo 16: Ensayos de Fusión Celular para 01755-01, G1755, G1805 y G1806 Se realizan ensayos de fusión celular para examinar la actividad contra VIH de los diversos análogos de RANTES modificados en polímero. En el ejemplo 9 se describen los procedimientos de las áreas utilizadas. Los resultados representativos se presentan en la tabla 3 a continuación. Tabla 3 Datos de Fusión de Células HeLa P4-CCR5/Hela-Env-ADA Estos resultados demuestran la retención sustancial de actividad antifusión después de modificación específica de sitio ya sea con construcciones de polímeros hidrosolubles lineales o ramificados. Este resultado es sorprendente dado el aumento observado en la actividad de diversos análogos de RANTES cuando se une una porción hidrofóbica tal como un ácido graso, a la parte C terminal, lo cual fundamenta la hipótesis de que al aumentar la naturaleza hidrofóbica de los análogos de RANTES en general también aumenta la actividad antifusión. En contraste, los polímeros hidrosolubles utilizados para modificación, particularmente los polímeros hidrosolubles ramificados, aunque muy hidrofílieos y cargados negativamente, se observa sólo una reducción marginal en la actividad que se encuentra dentro del intervalo de potencia objetivo que se observa para actividad in vivo. Resulta mucho más inesperada la retención relativa en la actividad de los análogos de RANTES modificados con construcciones de polímero hidrosoluble ramificados con carga negativa, grandes, en comparación con las construcciones de polímero hidrosoluble lineales más pequeñas y que los análogos modificados con polímero lineal pequeño y ramificado grande tienen sustancialmente el mismo efecto en la actividad. Se considera que ésta última observación se debe en parte a las propiedades antiagregación cuando las modificaciones del polímero hidrosoluble se realizan internas al residuo C terminal pendiente de RANTES tipo silvestre en una región de agregación, como se diseña o las propiedades antifusión localizadas de los polímeros hidrosolubles . Los cambios adicionales que incrementan la potencia compensan la pérdida de actividad marginal de la unión de los polímers hidrosolubles, en relación a AOP-RANTES y NNY-RANTES. Estos cambios incluyen introducción de uno o más derivados de aminoácidos hidrofóbicos en la parte N terminal, y además de una porción de ácido graso hidrofóbico en la parte C terminal . Estos resultados indican que los cambios adicionales en la combinación con los polímeros de etileno de poliamida monodispersos (o de otros polímeros hidrosolubles) pueden mejorar la potencia total de las moléculas de quimiocina modificadas del tipo NNY o AOP, tales como AOP-RANTES o NNY-RANTES que tienen el cambio combinado Pro2Thz y Tyr3Chg hacia la parte N terminal, o la adición de una adición lipídica hacia la parte C terminal. Ejemplo 17: Estudios Farmacocinfiticos para G1755, G1805 y G1806 Se realizan estudios farmacocinéticos de análogos de RANTES modificados en los polímeros, en ratas Sprague-Dawley macho, como sigue. Se formulan los análogos de RANTES G1755, G1805 Y G1806, preparados como se describe en lo anterior (junto con AOP-RANTES como control) para inyección intravenosa (IV) justo antes de la inyección de una proteína de choque líofilizada en solución salina amortiguada con fosfato a pH 7.0. Se preparan formulaciones de manera que se proporcionen dosis equimolares de análogos de RANTES a animales en prueba individuales [400ug/kg (AOP-RANTES); 510 Ug/kq (G1755); 1210 µ?/kg (G1805); y 1225 ug/kg (G1806) (ug de análogo/kg de animal)]. Se ajustan las concentraciones finales cuando es necesario para proporcionar un volumen de dosis total de 1 ml/kg para cada animal (es decir, los volúmenes de dosis se mantienen constantes) . Cada análogo formulado se administra intravenosamente por la cola de ratas en el día 1 del experimento, y cada animal recibe una sola dosis.

Después de la inyección, se recolectan aproximadamente 0.25 mi de sangre de la vena/arteria de la cola durante le curso del experimento en cada punto en el tiempo de recolección de muestra, y se preparan muestras de plasma o suero utilizando EDTA como anticoagulante, siguiendo protocolos estándar o convencionales y las líneas de guía para el cuidado de animales de National Institutes od Health así como los procedimientos de prueba recomendados. Los tiempos de recolección de muestras se ajustan en base en la recolección inicial de datos para evitar recolecciones de más de 14 muestras de 0.25 mi de cualquier animal en las siguientes 3 semanas (como se establece en las líneas de guía de cuidado de animales de National Institutes of Health) . Las muestras adicionales se recolectan a intervalos semanales cuando las concentraciones sanguíneas detectab! s persisten más allá de las muestras iniciales. Se determina la concentración plasmática de cada análogo de RANTES en cada punto en el tiempo utilizando Quantikine^Elisa , inmunoensayo de RANTES humano (R&D Systems Catalog#DRN00 ) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Se vigila la salud total de los animales durante el desarrollo del experimento incluyendo peso, hábitos alimenticios, disposición, apariencia, etcétera y no se observaron efectos colaterales. Los resultados representativos se muestran en la figura 16. Estos resultados demuestran el incremento sustantivo en la vida media circulante que se proporciona por la unión de polímeros hidrosolubles a los diversos análogos de precursor de RANTES, con el incremento aparente en la vida media de G1805 > G1806 > G1755 > AOP-RANTES . En relación a AOP-RANTES , el incremento es de aproximadamente 40 veces para G1805, 20 veces para G1806 y 10 veces para G1755. Colectivamente, el equilibrio de la potencia elevada retenida y la vida media circulante mejorada de manera significativa para los análogos de RANTES modificados con polímero hídrosoluble se espera que mejore la eficacia terapéutica de hechos compuestos en un sistema in vivo, y reduce el número y cantidad de dosis necesarias para tratamiento. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionados en esta especificación se incorporan en la presente con referencia en el mismo grado a si cada publicación individual o solicitud de patente fuera indicada específica e individualmente para ser incorporada como referencia . La invención ahora se ha descrito por completo, será evidente para una persona habitualmente e>:perta en la técnica de que muchos cambios y modificaciones se pueden realizar a la misma sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones anexas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (47)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. 1. Una quimiocina sintética que tiene un polímero hidrosoluble unido a la misma y que tiene bioactividad in vitro caracterizada por modulación por disminución de un receptor de quimiocina a la cual se une. 2. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la quimiocina sintética tiene una vida media de circulación sérica in vivo mayor de 10 veces en comparación con la quimiocina sintética que carece del polímero hidrosoluble.
3. 3. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la quimiocina sintética se modifica (A) en su parte N terminal con una porción que se selecciona del grupo que consiste de una cadena alifática, un aminoácido y un derivado de aminoácido; o (B) en su parte C terminal con una porción que se selecciona del grupo que consiste de una cadena alifática, un policíclico, un aminoácido y un derivado de aminoácido; y (C) en ambas partes, la N terminal con una porción que se selecciona del grupo que consiste de una cadena alifática, un aminoácido y un derivado de aminoácido, y en la C terminal con una porción que se selecciona del grupo que consiste de una cadena alifática, un policíclico, un aminoácido y un derivado de aminoácido.
4. 4. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la quimiocina sintética se modifica en su parte N terminal con una porción que se selecciona del grupo que consiste de una cadena alifática, un aminoácido y un derivado de aminoácido.
5. 5. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la quimiocina sintética se modifica en su parte C terminal con una porción que se selecciona del grupo que consiste de una cadena alifática, un policíclico, un aminoácido y un derivado de aminoácido .
6. 6. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la quimiocina sintética se modifica en su parte N terminal con una porción que se selecciona del grupo que consiste de una cadena alifática, un aminoácido y un derivado de aminoácido, y en su parte C terminal con una porción que se selecciona del grupo que consiste de una cadena alifática, un policíclico, un aminoácido y un derivado de aminoácido.
7. 7. La quimiocina sintética, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, caracterizada porque el polímero hidrosoluble se une a la quimiocina sintética en el sitio seleccionado del grupo que consiste de un sitio en la parte C terminal, un sitio de agregación, un sitio de glucosilación y un sitio de unión de glucosilación y un sitio de unión de glucosa amino glucano ("GAG") .
8. 8. La quimiocina sintética, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de Rantes ????a, ???ß, SDF-1, IL-8 o MCP-1.
9. 9. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de Rantes y el polímero hidrosoluble se une a un sitio en la parte C terminal .
10. 10. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de Rantes y el polímero hidrosoluble se une e un sitio de agregación.
11. 11. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de Rantes y el polímero hidrosoluble se une en un sitio de glucosilación.
12. 12. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de Rantes y el polímero hidrosoluble se une en un sitio de GAG.
13. 13. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de MlPla y el polímero hidrosoluble se une a un sitio en la parte C terminal.
14. 14. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de MlPla y el polímero hidrosoluble se une en un sitio de agregación.
15. 15. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de MIPIOÍ y el polímero hidrosoluble se une en un sitio de glucosilación.
16. 16. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de MlPla y el polímero hidrosoluble se une en un sitio de GAG.
17. 17. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de ???ß y el polímero hidrosoluble se une en un sitio en la parte C terminal.
18. 18. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de ????ß y el polímero hidrosoluble se une en un sitio de agregación.
19. 19. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de ????ß y el polímero hidrosoluble se une en un sitio de glucosilació .
20. 20. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de ????ß y el polímero hidrosoluble se une en un sitio de GAG.
21. 21. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de SDF-1 y el polímero hidrosoluble se une en un sitio en la parte C terminal .
22. 22. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de SDF-1 y el polímero hidrosoluble se une en un sitio de GAG.
23. 23. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de IL-8 y el polímero hidrosoluble se une en un sitio en la parte C terminal .
24. 24. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de IL-8 y el polímero hidrosoluble se une a un sitio de GAG.
25. 25. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de MCP-1, y el polímero hidrosoluble se une a un sitio en la parte C terminal.
26. 26. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de MCP-1, y el polímero hidrosoluble se une en un sitio de agregación.
27. 27. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de MCP-1, y el polímero hidrosoluble se une en un sitio de glucosilación.
28. 28. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la quimiocina sintética es un análogo de MCP-1, y el polímero hidrosoluble se une en un sitio de GAG.
29. 29. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polímero hidrosoluble tiene la fórmula: U-B-Polímero-J en donde : U comprende un residuo de un grupo funcional unido covalentemente a la quimiocina sintética; B es un núcleo de ramificación que tiene tres o más bazos y puede estar presente o ausente; Polímero es un polímero hidrosoluble austancxalmente no antigénico; y J es un residuo de grupo pendiente que tiene una carga neta bajo condiciones fisiológicas que se selecciona del grupo que consiste de negativo, positivo y neutro.
30. 30. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque uno o más de U, B, Polímero y J se separan por un separador o enlazador; y el separador o enlazador tienen la fórmula U-sl .B-s2-Polímero-S3-J en donde al, s2 y s3 son porciones separadoras o enlazadoras que pueden ser iguales o diferentes, y pueden estar presentes o ausentes individualmente.
31. 31. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque U es un residuo de un enlace que se selecciona de oxima, amida, amina, uretano, éter, tioéter, éster, hidrazida, oxazolidina y tiazolidina.
32. 32. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque un brazo de B se une a U, y un segundo brazo de B se une a Polímero.
33. 33. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque B comprende cuatro o más brazos .
34. 34. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque dos o más de los brazos comprenden un residuo de un enlace que se selecciona de oxima, amida, amina, uretano, tioéter, éster, hidrazida, oxazolidina y tiazolidina.
35. 35. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque B comprende una porción de núcleo de ramificación que se selecciona de amino, carboxilo y aminocarboxilo mixto.
36. 36. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el polímero se selecciona del grupo que consiste de óxido de polialquileno y óxido de poliamida y alquileno.
37. 37. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el polímero es una poliamida de la fórmula - [C (O) -C (O) NH-Y-NH] n- o [NH-Y-NH-C (O) -X-C (O) ] n- , en donde X e Y son radicales divalentes que pueden ser iguales o diferentes y pueden estar ramificados o ser lineales, y n es un número entero de 1 a 100.
38. 38. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque cualquiera o ambos de X e Y comprende por lo menos una unidad repetida que se selecciona de: - (0-CH2-CH2) n- y -CH2 -CH2 -0) lien donde n es un número entero de 1 a 100.
39. 39. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque J es un grupo ionizable .
40. 40. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el grupo ionizable se selecciona de carboxilo, amina e hidroxilo.
41. 41. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el polímero hidrosoluble tiene una carga negativa neta.
42. 42. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el polímero hidrosoluble tiene una carga positiva neta.
43. 43. La quimiocina sintética, de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el polímero hidrosoluble tiene una carga neutra neta.
44. 44. Una quimiocina sintética bioactiva, caracterizada porque comprende un polímero hidrosoluble unido a la misma, y que tiene una CE5o in vitro que es equivalente a, o menor que la de una quimiocina de tipo silvestre correspondiente para una respuesta biológica que comprende inhibición de infección viral, la CE50 se mide en un ensayo basado en célula in vitro, definido por unión de la quimiocina sintética bioactiva a uno o más de sus receptores de quimiocina correspondientes, en donde uno o más de los receptores es un correceptor para infección viral .
45. 45. La quimiocina sintética bioactíva, de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque la CE50 es menor que una concentración que se selecciona del grupo que consiste de 1000 nM, 700 n , 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 10 nM y 1 nM.
46. 46. Una quimiocina sintética bioactiva, caracterizada porque comprende un polímero hidrosoluble unido a la misma y que tiene: (1) una CE50 que es equivalente a o menor que la de una quimiocina de tipo silvestre correspondiente, la CE50 se mide en un ensayo de infección viral in vitro definido por unión de la quimiocina sintética bioactiva a uno o más de sus receptores de quimiocina correspondientes, en donde uno o más de los receptores es un correceptor viral; y (2) una vida media circulante en suero de más de 10 veces en comparación con la quimiocina sintética que carezca del polímero hidrosoluble.
47. 47. La quimiocina sintética bioactiva, de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la CE50 es menor que una concentración que se selecciona del grupo que consiste de 1000 nM, 700 nM, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 10 nM y 1 nM.