SK2772003A3

SK2772003A3 - Synthetic erythropoiesis stimulating proteins

Info

Publication number: SK2772003A3
Application number: SK277-2003A
Authority: SK
Inventors: Gerd G Kochendoerfer; Paolo Botti; James A Bradburne; Shiah-Yun Chen; Sonya Cressman; Chriestie L Hunter; Stephen B H Kent; Donald W Low
Original assignee: Gryphon Therapeutics Inc
Priority date: 2000-09-08
Filing date: 2001-07-12
Publication date: 2003-10-07
Also published as: WO2002019963A3; NO20031049L; MXPA03001469A; EE200300089A; IL153923A0; HUP0303854A2; AU2001273388B2; AU7338801A; US20030208046A1; EP1315513A2; AU2001273385B2; KR20030057529A; IL153924A0; US7030218B2; KR20030061784A; JP2007269799A; EP1318827A1; NO20031047L; CA2412277A1; CA2412279A1

Description

SYNTETICKÉ PROTEÍNY STIMULUJÚCE ERYTROPOÉZU

Oblasť techniky

Vynález sa týka syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu, ktoré sú polyméme modifikované definovaným spôsobom, a ďalej sa týka spôsobov prípravy týchto proteínov a ich použitia.

Odkaz na súvisiace prihlášky:

Táto prihláška je pokračovaním patentových prihlášok Spojených štátov č. 60/231 330 (podaná 8. septembra 2000) a 60/236 377 (podaná 29. septembra 2000), ktoré obidve sú vcelku zahrnuté v tomto texte ako odkazy).

Doterajší stav techniky

Erytropoéza je proces tvorby červených krviniek, ktorý nastáva pri regulácii obratu a straty červených krviniek. Erytropoetín (EPO) je proteínový hormón, ktorý stimuluje erytropoézu. Prirodzene sa vyskytujúci humánny EPO je glykoproteín obsahujúci 165 aminokyselín, ktorý sa tvorí primárne v obličkách, sekretuje do krvného obehu a stimuluje produkciu červených krviniek z prekurzorových buniek v kostnej dreni. Hoci gén kódujúci humánny EPO predurčuje molekulu so 166 aminokyselinovými zvyškami, karboxykoncový arginín sa odstráni pri posttranslačnej modifikácii na zrelú formu proteinu.

Glykozylovaný humánny EPO má tri N-viazané sacharidové reťazce i . ;

pripojené v polohách 24, 38 a 83. Má tiež jednu O-viazanú sacharidovú skupinu prítomnú v polohe 126. Účinky glykozylácie sú komplexné. Neglykozylovaný EPO je účinný in vitro. Avšak štúdie preukázali, že glykozylácia je nutná pre plnú aktivitu in vivo. Štúdie tiež ukázali, že variabilný typ glykozylácie prejavuje variabilné účinky. Napríklad desialyzovaný EPO prejavuje tak zosilnenú aktivitu in vitro, ako aj zníženú aktivitu in vivo, účinok prisudzovaný expozícii galaktózových zvyškov, ktoré sa rozpoznávajú, viažu a odstraňujú hepatocytmi.

PP 0277-2003

32081/T

Tiež sa ukázalo, že typ vetvenia plne sialyzovaného EPO spôsobuje rozdiely v biologickej aktivite. Prevažne štvornásobne rozvetvený EPO vykazuje aktivitu ekvivalentnú štandardnému” EPO, zatiaľ čo prevažne dvojnásobne rozvetvený EPO vykazuje trojnásobne väčšiu aktivitu in vitro, ale iba 15 % normálnej aktivity in vivo. Navyše rôzne štúdie preukázali, že pre účinok EPO sú dôležité len N-viazané sacharidy a nie O-viazané sacharidy.

K dispozícii je niekoľko farmaceutických produktov obsahujúcich rekombinantné vytvorený glykozylovaný EPO. Avšak v súčasnosti dostupné EPO farmaceutické výrobky sú limitované krátkym plazmatickým polčasom a citlivosťou na degradáciu proteázami. Obsahujú tiež komplexné zmesi rôznych glykoforiem kvôli vysokému stupňu heterogenity vetvenia a obsahu sialovej kyseliny, ktorý sa vyskytuje v každom N-viazanom glykozylačnom mieste a medzi miestami. Tieto nedostatky im zabránili dosiahnuť maximálnu klinickú účinnosť.

Aby sa zlepšil polčas cirkulácie a iné vlastnosti týchto EPO proteínov, pripájali sa polyméry rozpustné vo vode, ako je napríklad PEG (polyetylénglykol), ale s nestálymi výsledkami vzhľadom na ťažkosti ich pripájania riadeným spôsobom a s presnosťou definovanou užívateľom. Použil sa napríklad celý rad prostriedkov na pripojenie polymémych skupín, ako je napríklad PEG a príbuzné polyméry, k reaktívnym skupinám zisteným na proteínoch (pozri patent Spojených štátov 4 179 337 (Davis a kol.) a patent Spojených štátov 4 002 531 (Royer). Kvôli prehľadu pozri Abuchovski a kol., v Enzymes as Drugs” (J. S. Holcerberg a J. Roberts, vyd., s. 367 - 383, 1981, a Zalipsky, S. (Bioconjugate Chemistry, 1995, 6, 150 - 165). O použití PEG a iných polymérov na modifikáciu proteínov tiež diskutujú autori Cheng, T. L. a kol., Bioconjugate Chem., 1999, 10, 520 - 528, Belcheva, N. a kol., Bioconjugate Chem., 1999, 10, 932 - 937, Bettinger, T. a kol., Bioconjugate Chem., 1998, 9, 842 - 846, Huang, S. Y. a koľ, Bioconjugate Chem., 1998, 9, 612 - 617, Xu, B. a kol., Langmuir, 1997, 13, 2447 - 2456, Schwarz, J. B. a kol., J. Amer. Chem. Soc., 1999, 121, 2662 - 2673, Reuter, J. D. a kol., Bioconjugate Chem., 1999, 10, 271 - 278, Chán, T. H. a koľ, J. Org. Chem.,

PP 0277-2003

32081/T

1997, 62, 3500 - 3504. Typické miesta pripojenia vproteínoch zahrňujú primárne aminoskupiny, ako sú napríklad skupiny na lyzínových zvyškoch alebo na N-konci, tiolové skupiny, ako sú napríklad skupiny na cysteínových bočných reťazcoch a karboxylové skupiny, ako sú napríklad skupiny na glutamátových alebo asparágových zvyškoch alebo na C-konci. Niektoré najčastejšie miesta pripojenia sú k sacharidovým zvyškom glykoproteínov, cysteínom alebo k Nkoncu a lyzínom cieľových proteínov.

Hoci o kondenzácii polymérov k EPO bolo opísaných veľa rôznych prístupov, postup kondenzácie nie je bez komplikácií. Musí sa venovať starostlivosť obmedzeniu straty biologickej aktivity spôsobenej kondenzačnou reakciou. Napríklad na minimalizáciu počtu miest pripojenia sa typicky používajú zvinuté alebo opätovne zvinuté proteíny. Avšak ak je k cieľovému proteinu alebo polypeptidu pripojeného príliš veľa aktivovaného polyméru, biologická aktivita sa môže závažne redukovať alebo stratiť. Podobne, ak sa použije zlý linker (spojovací úsek) spájajúci polymér s proteínom alebo ak je k cieľu pripojené nedostatočné množstvo polyméru, terapeutická hodnota výsledného konjugátu sa môže limitovať a nemusí vykazovať dostatočné predĺženie cirkulujúceho polčasu, aby sa vynahradila strata jeho biologickej aktivity. Problémy môžu tiež vyplývať z blokády aktívneho miesta proteinu modifikujúcim polymérom. Tomuto problému možno ťažko zabrániť, pretože polymér a proteín sa typicky spájajú v reakciách prebiehajúcich v roztoku. Navrhlo sa zablokovať vopred aktívne miesta látkami, ako je napríklad pyridoxalfosfát, ale výsledky boli rozporuplné (pozri patent Spojených štátov 4 179 337 (Davis a kol.)). Tieto problémy sú obzvlášť naliehavé u proteínov a peptidov s nižšou molekulovou hmotnosťou, ktoré často majú málo miest pripojenia, ktoré neasociujú s biologickou aktivitou.

PP 0277-2003

32081/T

Napríklad bežnou technikou je pripojenie polymérov rozpustných vo vode k primárnym amínom v cieľovom proteíne (napríklad N-koncová aminoskupina a epsilon aminoskupiny lyzínov). Na pripojenie polymérov k tiolovým bočným reťazcom cysteínov sa tiež použili tiol-reaktívne polymérne konjugáty. Oba prístupy predstavujú významné problémy, pretože väčšina proteínov obsahuje mnohonásobné kópie takýchto reaktívnych skupín rozprestretých cez rôzne úseky hlavného reťazca polypeptidu, ktoré sú dôležité pre definíciu aktivity, zvinutia, opätovného zvinutia a stabilitu proteinu. Takže i keď sa veľmi používajú, trpia tieto prístupy viac alebo menej neúplným alebo nežiaducim znížením biologickej aktivity proteinu a zvyčajne vznikajú komplexné zmesi, ktoré je ťažko separovať a charakterizovať (Delgada a kol., Pharmaceutical Sciences, 1997, 3, 59 - 66).

Pri pokusoch redukovať náhodné pripojenia sa vyrobili proteíny, v ktorých sa prírodné lyzíny odstránili v spojitosti s pridaním lyzínov na požadované miesta pripojenia polyméru (patent Spojených štátov č. 4 904 584). Týmto spôsobom sa modifikovali napríklad G-CSF a IL-2. V ďalších pokusoch zabrániť náhodnému pripojeniu sa vyrábali proteíny, v ktorých sa prírodné cysteiny odstránia v spojitosti s pridaním cysteínov na požadované miesta pripojenia polyméru alebo sa cysteiny pridajú bez odstránenia prírodných cysteínov, ak sú prítomné (EP 0 668 353). Napríklad EPO sa vytvoril týmto spôsobom. Zatiaľ čo takéto varianty cysteínu alebo lyzínu teoreticky umožňujú miestne špecifické pripojenie polyméru, stále neexistuje záruka, že všetky vybraté miesta sa môžu modifikovať riadeným spôsobom.

Vzhľadom na neschopnosť miestne špecificky modifikovať proteíny obsahujúce mnohonásobné aminokyseliny s bočnými reťazcami nesúcimi rovnaké alebo podobné reaktívne funkčné skupiny, nedávne úsilie sa zameralo na modifikáciu amino- alebo karboxy-konca proteínov. Modifikácia amino- alebo karboxy-konca spolieha na schopnosť niektorých chemických kondenzačných techník tieto miesta unikátne modifikovať (WO 90/02136 a WO 90/02135). Táto technika sa napríklad použila na pripojenie PEG reťazcov k N-koncovému zvyšku G-CSF a chemokínu IL-8 (Gaertner a kol., Bioconjug. Chem., 1996, 7,

PP 0277-2003

32081Π

1, 38 - 44 a WO 96/41813). Avšak modifikácia N- alebo C-koncov typicky redukuje aktivitu proteínu (pozri napríklad patent Spojených štátov 5 985 265 diskutujúci o pripojení PEG k N-koncu a lyzínovým bočným reťazcom G-CSF). Napriek nedostatkom modifikácie proteínov polymérmi rozpustnými vo vode pokračuje snaha o PEGyláciu (pripojenie PEG) a pripojenie ďalších polymérov rozpustných vo vode k proteínom. Oopísalo sa napríklad pripojenie PEG k sacharidovým reťazcom erytropoetínu (EPO) a vnútorným aminokyselinám, ako sú napríklad lyzíny (EP 0 605 963 a WO 00/32772) a k N-koncu (patent Spojených štátov 6 077 939 a WO 00/32772). Bohužiaľ, tieto PEGylované EPO majú za následok komplexné zmesi, ktoré je ťažko separovať a charakterizovať.

Ďalším problémom je, že vyššie diskutované polyméry sú veľmi nehomogénne, čo spôsobí, že analytická charakterizácia a purifikácia zmesí polyméme modifikovaných proteínov je problematická (Delgada a koľ, Pharmaceutical Sciences, 1997, 3, 59 - 66). Napríklad techniky použité na prípravu PEG reťazcov alebo reťazcov založených na PEG, dokonca i tých s celkom nízkou relatívnou molekulovou hmotnosťou, ako je napríklad 3 400, zahrňujú slabo riadený krok polymerizácie, ktorý vedie k preparátom majúcim rozsah dĺžok reťazcov s priemernou hodnotou, t.j. zahrňujú polyméme preparáty (CH₂CH2O)_ni kde n nemá spojitú hodnotu, ale skôr má približne priemerný rozsah hodnôt. Výsledná heterogenita derivatizovaných proteínov sa často združuje s radom vlastností, ktoré nemožno samostatne ľahko identifikovať.

Bohužiaľ, problém identifikácie a použitia vhodného polyméru sa znova však oživuje faktom, že všetky EPO proteíny teraz využívané na terapeutické použitie pochádzajú z technológie rekombinantnej DNA. Použitie technológie rekombinantnej DNA kladie závažné obmedzenia na typy a špecifickosť väzieb, ktoré sa môžu vytvoriť medzi skupinami zosilňujúcimi účinnosť a rekombinantné vytvoreným EPO proteínom. To preto, že po prvé existuje len veľmi obmedzený počet funkčných skupín vhodných na väzbu a po druhé, všeobecne je niekoľko kópií reaktívnych funkčných skupín v modifikovanom proteíne, čo vylučuje

PP 0277-2003

3208177 niektoré špecifickosti modifikácie. Napríklad sa ukázalo, že v prípade neselektívnej kondenzácie superoxiddismutázy s PEG bolo niekoľko frakcií modifikovaného enzýmu kompletne inaktívnych (P. McGoff a kol., Chem. Pharm. Bull., 1988, 36, 3079 - 3091). Tiež, ak sa náhodne pripojí odlišné množstvo takýchto skupín, farmakokinetika terapeutického proteínu sa nemôže presne predvídať; čo je veľkým problémom pre dávkovanie. Okrem toho nedostatok kontroly pripojenia môže viesť (a) k redukovanej účinnosti, (b) k potrebe komplikovaných purifikačných schém na separáciu obrovskej zmesi derivátov a (c) je možné nestále pripojenie modifikujúcej skupiny. O niekoľkých väzbách v odbore známych, ako sú napríklad väzby založené na trezylchloride, sa tiež vie, že sú imunogénne.

Aby sa teda zlepšil polčas cirkulácie, znížila sa proteolýza a imunogenicita a zlepšili sa iné vlastnosti biologicky vytvorených proteínov, môžu sa pripojiť polyméry rozpustné vo vode, ako je napríklad PEG, ale s nestálymi výsledkami vzhľadom k problémom ich pripájania riadeným spôsobom a s presnosťou definovanou užívateľom. Tiež vďaka obmedzeným úspechom v pripájaní polymérov v presných miestach definovaných užívateľom je známe veľmi málo o výhodných miestach pripojenia, ktoré by mohli byť vhodné pre proteíny všeobecne. Okrem toho, kvôli stochastickej povahe pripojenia a heterodisperznej povahe PEG a ďalších polymérov rozpustných vo vode v súčasnosti používaných na tieto účely, je ťažká purifikácia a analytická charakterizácia konjugátov PEG-proteínov. Tak kombinovaný problém zlej kontroly reprodukovateľného pripojenia a heterogenita polyméru závažne bráni rutinnému schváleniu polyméme modifikovaných proteínov ako liečiv (doteraz bolo schválených len niekoľko na terapeutické použitie napriek ich zavedeniu v skorých 70. rokoch).

PP 0277-2003

32081/T

V súlade s tým existuje potreba spôsobov produkcie bioaktívnych proteínov stimulujúcich erytropoézu, ktorá sa odlišuje od technológie rekombinantnej DNA a technológie polymérov používaných na modifikáciu prírodného a rekombinantne vytvoreného EPO. Sú tiež potrebné proteíny stimulujúce erytropoézu, ktoré majú vylepšené klinické vlastnosti. Predložený vynález uspokojuje tieto a iné potreby.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu, spôsobov ich výroby a použitia. Konkrétne sa vynález týka syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu majúcich k sebe naviazaný jeden alebo viacero polymérov rozpustných vo vode. Poskytujú sa tiež farmaceutické prípravky obsahujúce syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu podľa vynálezu.

Vynález sa ďalej týka liečenia cicavca syntetickými proteínmi modifikovanými polymérmi stimulujúcimi erytropoézu podľa vynálezu. Jedno uskutočnenie sa týka spôsobu zvyšovania hematokritu u cicavca. Ďalšie uskutočnenie sa týka spôsobu zvyšovania tvorby červených krviniek u cicavca. Ďalšie uskutočnenie sa týka spôsobu zvyšovania hemoglobínu u cicavca. Ďalšie uskutočnenie sa týka spôsobu zvyšovania množstva retikulocytov u cicavca. Tieto spôsoby zahrňujú podávanie účinného množstva polymérne modifikovaného syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu podľa vynálezu cicavcovi kvôli dosiahnutiu požadovaného účinku.

Tiež sa poskytujú spôsoby výroby syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu podľa vynálezu, vrátane výhodných polymérne modifikovaných foriem a medziproduktov. Spôsob obsahuje chemickú ligáciu peptidových segmentov obsahujúcich neprekrývajúce sa aminokyselinové sekvencie polypeptidového reťazca syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu, pričom sa vytvorí polypeptidový reťazec obsahujúci syntetický proteín stimulujúci erytropoézu.

PP 0277-2003

32081/T

Syntetické proteiny stimulujúce erytropoézu podľa vynálezu

Vo výhodnom uskutočnení sa vynález týka syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu majúceho k sebe pripojený jeden alebo viacero polymérov rozpustných vo vode. Termín proteín stimulujúci erytropoézu znamená proteín, ktorý má in vitro biologickú aktivitu podporujúcu rast bunkovej línie závislú od erytropoetinu. Vo výhodnom uskutočnení syntetické proteiny stimulujúce erytropoézu podľa vynálezu majú in vivo biologickú aktivitu podporujúcu produkciu červených krviniek. Erytropoézu stimulujúca aktivita proteínu sa môže určiť ktorýmkoľvek z celého radu prostriedkov, ako je napríklad sledovanie erytropoézy po in vivo podávaní, testovaním schopnosti proteínu sprostredkovať proliferáciu bunkovej línie závislej od erytropoetinu a podobne.

Termín polymér rozpustný vo vode znamená v podstate neantigénny polymér, ktorý je rozpustný vo vode.

Ako sa v tomto texte používa, proteín je syntetický”, ak sa použila nerekombinantná technológia na polymerizáciu niektorých a najvýhodnejšie všetkých jeho aminokyselinových zvyškov. Termín nerekombinantná technológia” je určený na rozlišovanie technológií, ktoré zahrňujú organickú chémiu a iné syntetické polymérne prístupy, od technológií zahrňujúcich transláciu RNA na proteín, buď in vivo alebo in vitro. Syntetické proteiny zahrňujú úplne syntetické a polosyntetické proteiny. Úplne syntetický proteín sa vytvorí, keď všetky ligačné zložky sa vytvoria chemickou syntézou, t.j. syntézou bez účasti ribozómov. Polosyntetický proteín sa vytvorí, keď aspoň časť ligačnej zložky je vytvorená biologickou syntézou, t.j. pomocou ribozómov v bunkovom alebo nebunkovom translačnom systéme a ďalšia časť sa vytvorí chemickou syntézou.

Vo výhodnom uskutočnení syntetické proteiny stimulujúce erytropoézu podľa vynálezu obsahujú polypeptidový reťazec majúci aminokyselinovú sekvenciu z ribozomálne špecifikovaného erytropoetinu a jeden alebo viacero neprekrývajúcich sa peptidových segmentov kovalentne naviazaných jedným alebo viacerými miestami chemickej ligácie. Najvýhodnejší je erytropoetín

PP 0277-2003

32081/T cicavčieho pôvodu a výhodnejšie humánneho pôvodu alebo jeho deriváty. Známa je napríklad aminokyselinová sekvencia mnohých erytropoetínov a vytvorilo sa veľa účinných variantov humánnych erytropoetínov (pozri napríklad patent Spojených štátov č. 5 856 298, 5 955 422, 8 888 772, 5 858 347, 5 614 184, 5 457 089 a 6 077 939 a WO 00/32772), a tak syntetický proteín stimulujúci erytŕopoézu podľa vynálezu môže zahrňovať polypeptidový reťazec majúci tieto aminokyselinová sekvencie.

Vo výhodnom uskutočnení ribozomálne špecifikovaný erytropoetín obsahuje jedno alebo viacero glykozylačných miest a polymér rozpustný vo vode je pripojený k polypeptidovému reťazcu syntetického proteinu stimulujúceho erytŕopoézu v jednom alebo viacerých miestach zodpovedajúcim jednému alebo viacerým glykozylačným miestam ribozomálne špecifikovaného erytropoetínu. Vo výhodnejšom uskutočnení polymér rozpustný vo vode je pripojený k polypeptidovému reťazcu výhradne v jednom alebo viacerých miestach zodpovedajúcich jednému alebo viacerým takýmto glykozylačným miestam. Tento aspekt vynálezu zahrňuje syntetické proteiny stimulujúce erytŕopoézu, kde sa rekombinantne vytvorí ribozomálne špecifikovaný erytropoetín. V súlade stým, ribozomálne špecifikovaný erytropoetín môže byť prírodný erytropoetín alebo neprírodný” erytropoetín, druhý uvedený môže ďalej zahrňovať jedno alebo viacero neprírodných glykozylačných miest.

Termín glykozylačné miesto znamená aminokyselinovú sekvenciu proteinu, ktorá kóduje enzymatické pripojenie oligosacharidového (sacharidového) reťazca k bočnému reťazcu aminokyselinového zvyšku aminokyselinovej sekvencie proteinu, ako príklad možno uviesť N-viazané a 0viazané glykozylačné miesta. Je potrebné uznať, že erytropoetíny, ktoré sa mutovali tak, aby sa eliminovalo jedno alebo viacero takýchto glykozylačných miest, sú zahrnuté do definície glykozylačné miesto”, pretože reziduálne miesto pre modifikáciu polyméru je pozične rovnaké. Termín prirodzene sa vyskytujúce glykozylačné miesto” znamená glykozylačné miesto erytropoetínového glykoproteínu, ktoré sa nachádza v prírode. Termín neprirodzene sa vyskytujúce glykozylačné miesto znamená glykozylačné

PP 0277-2003

32081/T miesto, ktoré sa geneticky vpravilo do erytropoetínu. Napríklad rekombinantný humánny EPO sa geneticky upravil týmto spôsobom (pozri napríklad patent Spojených štátov č. 5 856 298).

Toto uskutočnenie vynálezu je čiastočne založené na zistení, že keď syntetický protein stimulujúci erytropoézu majúci polypeptidový reťazec humánneho erytropoetínu sa modifikuje v jeho jednom alebo viacerých glykozylačných miestach polymérom rozpustným vo vode, ako sú napríklad polyméry opísané v tomto texte, polymér rozpustný vo vode sa môže použiť na využitie jedného alebo viacerých biologických účinkov prisudzovaných sacharidovému reťazcu normálne sa vyskytujúcemu v tejto polohe v analogickom prirodzene sa vyskytujúcom erytropoetínovom glykoproteíne. Tieto biologické účinky zahrňujú moduláciu rezistencie na proteázy, imunogenicitu, receptorovú špecifičnosť, špecifickú aktivitu, účinnosť a farmakokinetiku. Avšak elimináciou výskytu sacharidového reťazca a jeho nahradením výhodným polymérom rozpustným vo vode podľa vynálezu sa získajú významné výhody vrátane zabránenia enzymatickému rozpadu a clearancii, ako napríklad vtedy, keď sa odstránia pripojené zvyšky sialovej kyseliny sacharidového reťazca, nestabilita, obmedzený polčas v cirkulácii, distribúcia, zlé manipulačné vlastnosti a podobne. Významne sa tiež zistilo, že takéto polymérne modifikované syntetické proteiny stimulujúce erytropoézu podľa vynálezu si zachovajú tieto výhodné biologické vlastnosti pri podstatnej neprítomnosti straty biologickej aktivity v porovnaní s nemodifikovaným analogickým syntetickým proteínom, vrátane zvýšenej biologickej aktivity, dokonca keď monomérna molekulová hmotnosť syntetického proteínu je väčšia ako 25 kD.

PP 0277-2003

32081/T

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa teda vynález týka syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu obsahujúceho polypeptidový reťazec zahrňujúci aminokyselinovú sekvenciu ribozomálne špecifikovaného erytropoetínu, kde polypeptidový reťazec má k sebe pripojený jeden alebo viacero polymérov rozpustných vo vode a monomérnu molekulovú hmotnosť väčšiu ako 25 kD a kde syntetický proteín stimulujúci erytropoézu zahrňuje biologickú aktivitu, ktorá je rovnaká alebo lepšia ako zodpovedajúceho syntetického proteínu majúceho polypeptidový reťazec, ktorý nemá polymér rozpustný vo vode. Biologická aktivita môže byť in vitro, in vivo alebo obidve. Vo výhodnom uskutočnení je biologická aktivita in vivo. V ďalšom výhodnom uskutočnení sa vynález týka syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu obsahujúceho polypeptidový reťazec zahrňujúci aminokyselinovú sekvenciu ribozomálne špecifikovaného erytropoetínu, kde polypeptidový reťazec má k sebe pripojený jeden alebo viacero polymérov rozpustných vo vode a monomérnu molekulovú hmotnosť väčšiu ako 25 kD a kde syntetický proteín stimulujúci erytropoézu zahrňuje biologickú aktivitu, ktorá je rovnaká alebo lepšia ako ribozomálne špecifikovaného erytropoetínu. Tu opäť, biologická aktivita môže byť in vitro, in vivo alebo obidve. Vo výhodnom uskutočnení je biologická aktivita in vivo. Najvýhodnejšie majú takéto polymérne modifikované syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu k sebe pripojený individuálny počet polymérov rozpustných vo vode.

Termín miesto chemickej ligácie” znamená N-koncovú aminokyselinu prvého peptidu alebo polypeptidu a C-koncovú aminokyselinu druhého peptidu alebo polypeptidu, ktoré tvoria alebo sú schopné vytvoriť ireverzibilnú kovalentnú väzbu medzi nimi chemickou ligáciou. Ako sa v tomto texte používa, termín chemická ligácia sa týka chemoselektívnej reakcie zahrňujúcej kovalentné spojenie dvoch chemických skupín, každá z týchto skupín nesie vzájomne reaktívnu funkčnú skupinu, ktorá je unikátne schopná vytvorenia ireverzibilnej kovalentnej väzby s druhou skupinou. Chemická ligácia zahrňuje kovalentnú ligáciu (1) prvého peptidu alebo polypeptidu nesúceho unikátne reaktívnu C-koncovú skupinu s (2) druhým peptidom alebo polypeptidom nesúcim unikátne reaktívnu N-koncovú skupinu, kde C-koncové a N-koncové

PP 0277-2003

32081/T reaktívne skupiny tvoria ireverzibilnú kovalentnú väzbu medzi nimi. Konkrétne, chemická ligácia zahrňuje ktorúkoľvek chemoselektívnu reakčnú chémiu, ktorá sa môže aplikovať na ligáciu nechránených peptidových segmentov.

Čo sa týka polyméru rozpustného vo vode, výhodné polyméry rozpustné vo vode sa môžu reprezentovať vzorcom:

UN-s1-B-s2-Polymér-s3-J*

U je zvyšok unikátnej funkčnej skupiny kovalentne spojenej s polypeptidovým reťazcom syntetického proteinu stimulujúceho erytropoézu. Konkrétne U skupina je pripojená k vzájomne reaktívnej unikátnej funkčnej skupine bočného reťazca n jednej alebo viacerých aminokyselín jedného alebo viacerých neprekrývajúcich sa peptidových segmentov syntetického proteinu stimulujúceho erytropoézu a kde n je individuálne celé číslo 1 až 6. Výhodnejšie bočný reťazec n je individuálne celé číslo 1 až 4 a najvýhodnejšie 1 až 2. Ako sa v tomto texte používa termín aminokyselina”, predpokladá sa, že zahrňuje 20 geneticky kódovaných aminokyselín, vzácnych alebo nezvyčajných aminokyselín, ktoré sú v prírode a ktorúkoľvek z neprirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín, ako sú napríklad nebežné (neregulárne) aminokyseliny, niekedy nazývané aminokyselinové zvyšky v kontexte peptidu, polypeptidu alebo proteinu. Výhodné uskutočnenia U a bočného reťazca n sú kovalentné väzby tvorené z unikátnych vzájomne reaktívnych skupín, kde sú tieto väzby vybrané zo skupiny, ktorú tvorí oxím, amid, amín, uretán, éter, tioéter, ester, hydrazid, oxazolidín, tiazolidín, tioéter, éter a ester. Najvhodnejšia U a n väzba je tá, kde U je kovalentne naviazaný k bočnému reťazcu n väzbou vytvorenou chemickou ligáciou vybranou zo skupiny, ktorú tvorí amid, oxím, tioester, hydrazón, tiazolidín, oxazolidín.

B je rozvetvené jadro majúce tri alebo viacero vetiev, ktoré môžu byť rovnaké alebo rôzne a môžu byť prítomné alebo chýbajú. Najvýhodnejší B je prítomný a obsahuje tri alebo viacero vetiev a dokonca výhodnejšie štyri alebo viacero vetiev. Konkrétne jedna vetva B je spojená s U (voliteľne cez spacer alebo linker s1) a druhá vetva B je spojená s polymérom (voliteľne cez spacer alebo linker s2). Zvýhodnený polymérne modifikovaný syntetický proteín

PP 0277-2003

32081 /T stimulujúci erytropoézu je ten, v ktorom aspoň jeden z rozvetvených ramien skupiny B obsahuje zvyšok väzby vybranej zo skupiny, ktorú tvorí oxim, amid, amín, uretán, tioéter, ester, hydrazid, oxazolidín a tiazolidín. Výhodná rozvetvujúca skupina B polymérne modifikovaného syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu podľa vynálezu obsahuje rozvetvené jadro vybrané zo skupiny, ktorú tvorí aminoskupina, karboxylát a zmiešaný amino-karboxylát. Výhodné aminoskupinové rozvetvené jadro obsahuje lyzín, výhodné karboxylátovo rozvetvené jadro zahrňuje glutámovú alebo asparágovú kyselinu a výhodné zmiešané amino-karboxylátové rozvetvené jadro obsahuje γglutámovú kyselinu alebo jej deriváty.

Polyméma zložka je v podstate neantigénny polymér rozpustný vo vode, ktorý môže byť rovnaký alebo rôzny, keď je prítomný B. Termín polymér rozpustný vo vode znamená v podstate neantigénny polymér, ktorý je rozpustný vo vode a má molekulovú hmotnosť väčšiu ako približne 1 000 daltonov. Polymér výhodne má účinnú hydrodynamickú molekulovú hmotnosť väčšiu ako 10 000 D a výhodnejšie približne 20 000 až 500 000 D a najvýhodnejšie približne 40 000 až 300 000 D. Termín účinná hydrodynamická molekulová hmotnosť znamená účinnú veľkosť reťazca polyméru ako solvátu vo vode, ako je určená vylučovacou chromatografiou vo vodnom prostredí (SEC). Keď polymér rozpustný vo vode obsahuje polymérne reťazce majúce polyalkylénoxidové repetičné jednotky, ako sú napríklad etylénoxidové repetičné jednotky, je výhodné, že každý reťazec má atómovú molekulovú hmotnosť približne medzi 200 a približne 80 000 D a výhodne približne medzi 1500 a približne 42 000 D, pričom 2 000 až približne 20 000 D je najvýhodnejšie. Ak nie je špecificky uvedené, molekulová hmotnosť odkazuje na atómovú molekulovú hmotnosť.

PP 0277-2003

32081/T

Polymérna zložka môže mať široký rozsah molekulovej hmotnosti a polymérnych podjednotiek. Tieto podjednotky môžu zahrňovať biologický polymér, syntetický polymér alebo ich kombinácie. Príklady takýchto polymérov rozpustných vo vode zahrňujú: dextrán a deriváty dextránu vrátane dextránsulfátu, P-amino-zosieťovaný dextrín a karboxymetyldextrín, celulózu a celulózové deriváty, vrátane metylcelulózy a karboxymetylcelulózy, škrob a dextríny a deriváty a hydroxylaktáty škrobu, polyalkylénglykol a jeho deriváty, vrátane polyetylénglykolu, metoxypolyetylénglykolu, homopolymérov polyetylénglykolu, homopolyméry polypropylénglykolu, kopolyméry etylénglykolu s propylénglykolom, kde homopolyméry a kopolyméry sú nesubstituované alebo substituované na jednom konci alkylovou skupinou, heparínom a fragmentmi heparínu, polyvinylalkoholom a polyvinyletylétermi, polyvinylpyrolidónom, aspartamidom a polyoxyetylovými polyolmi, dextránom a derivátmi dextránu, dextrínom a derivátmi dextrínu. Je nutné uznať, že sa tiež zvažujú rôzne deriváty špecificky uvedených polymérov rozpustných vo vode.

Polyméry rozpustné vo vode, ako sú napríklad opísané vyššie, sú dobre známe, konkrétne polyméry založené na polyalkylénoxide, ako je napríklad polyetylénglykol ”PEG” (pozri napr. Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, vyd. Plénum Press, New York, NY, 1992 a Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, J. M. Harris a S. Zalipsky, vyd. ACS, 1997 a medzinárodné patentové prihlášky: WO 90/13540, WO 92/00748, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28937, WO

95/11924, WO 96/00080, WO 96/23794, WO 98/07713, WO 98/41562,WO

98/48837, WO 99/30727, WO 99/32134, WO 99/33483, WO 99/53951,WO

01/26692, WO 95/13312, WO 96/21469, WO 97/03106, WO 99/45964 a patenty Spojených štátov č. 4 179 337, 5 075 046, 5 089 261, 5 100 992, 5 134 192, 5 166 309, 5 171 264, 5 213 891, 5 219 564, 5 275 838, 5 281 698,5 298

643, 5 312 808, 5 321 095, 5 324 844, 5 349 001, 5 352 756, 5 405 877,5 455

027, 5 446 090, 5 470 829, 5 478 805, 5 567 422, 5 605 976, 5 612 460,5 614

549, 5 618 528, 5 672 662, 5 637 749, 5 643 575, 5 650 388, 5 681 567,5 686

110, 5 730 990, 5 739 208, 5 756 593, 5 808 096, 5 824 778, 5 824 784,5 840

PP 0277-2003

32081/T

900, 5 874 500, 5 880 131, 5 900 461, 5 902 588, 5 919 442, 5 919 455, 5 932

462, 5 965 119, 5 965 566, 5 985 263, 5 990 237, 6 011 042, 6 013 283, 6 077

939, 6 113 906, 6 127 355, 6 177 087, 6 180 095, 6 194 580, 6 214 966).

Výhodnejšia polymérna zložka obsahuje polyalkylénoxid, polyamidalkylénoxid alebo ich deriváty. Výhodnejší polyalkylénoxid a polyamidalkylénoxid zahrňujú etylénoxidovú repetičnú jednotku vzorca -(CH₂CH2-O)-. Ešte výhodnejšia polymérna zložka je polyamid majúci molekulovú hmotnosť väčšiu ako približne 1 000 D vzorca -[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]Nalebo -[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]N-, kde X a Y sú dvojmocné skupiny, ktoré môžu byť rovnaké alebo rôzne a môžu byť rozvetvené alebo lineárne a n je individuálne celé číslo 2 až 100 a výhodnejšie 2 až 50, a kde jeden alebo oba X a Y obsahujú biologicky kompatibilnú v podstate neantigénnu repetičnú jednotku rozpustnú vo vode, ktorá môže byť lineárna alebo rozvetvená. Najvýhodnejšia repetičná jednotka rozpustná vo vode obsahuje etylénoxid vzorca -(CH2CH2-O)- alebo -(CH2-CH2-O)-. Počet týchto repetičných jednotiek rozpustných vo vode sa môže významne meniť, ale výhodnejší počet takýchto jednotiek je 2 až 500, 2 až 400, 2 až 300, 2 až 200, 2 až 100 a najvýhodnejšie 2 až 50. Príklad výhodnejšieho uskutočnenia je, keď jeden alebo oba X a Y sú vybrané zo skupiny, ktorú tvoria: -((CH₂)_ni-(CH₂-CH2-O)n2-(^cH₂)ni-)- alebo ((CH₂)ni-(O-CH₂-CH₂)_n2-(CH2)ni-). kde n 1 je 1 až 6, 1 až 5, 1 až 4 a najvýhodnejšie 1 až 3 a kde n2 je 2 až 50, 2 až 25, 2 až 15, 2 až 10, 2 až 8 a najvýhodnejšie 2 až 5. Príkladom veľmi výhodného uskutočnenia je, keď X je (CH₂-CH₂)- a keď Y je -(CH₂-(CH₂-CH2-O)3-CH2-CH2-CH₂)- alebo -(CH₂-CH₂CH2-(O-CH₂-CH₂)₃-CH2)-.

Polymérna zložka alebo jeden či viacero spacerov alebo linkerov, keď sú prítomné, môžu zahrňovať polymérne reťazce alebo jednotky, ktoré sú biologicky stabilné alebo biologicky rozložiteľné. Napríklad polyméry s repetitívnymí väzbami majú kolísavý stupeň stability vo fyziologických podmienkach v závislosti od lability väzby. Polyméry s takýmito väzbami sa môžu roztriediť podľa ich relatívnej rýchlosti hydrolýzy vo fyziologických podmienkach na základe známej rýchlosti hydrolýzy analógov s nízkou

PP 0277-2003

32081/T molekulovou hmotnosťou, napríklad od menej stabilných k viac stabilným, polykarbonáty (O-C-(O)-O-) > polyestery (-C (O)-O-) > polyuretány (-NH-C(O)O-) > polyortoestery (-O-C((OR)(R'))-O-) > polyamidy (-C(O)-NH-). Podobne väzbové systémy pripájajúce polymér rozpustný vo vode k cieľovej molekule môže byť biologicky stabilný alebo biologicky rozložiteľný, napríklad od menej stabilných k viac stabilným, karbonát (-O-C(O)-O-) > ester (-C(O)-O-) > uretán (NH-C(O)-O-) > ortoester (-O-C((OR)(R')-O-) > amid (-C(O)NH-). Tieto väzby sa poskytli ako príklad a nemajú v úmysle limitovať typy väzieb použiteľných v polymérnych reťazcoch alebo väzbových systémoch polymérov rozpustných vo vode podľa vynálezu.

Zložka J* je zvyšok pripojenej skupiny majúcej čistý náboj vo fyziologických podmienkach vybraný zo skupín, ktoré sú negatívne, pozitívne a neutrálne. To je alkylová skupina, arylová skupina, heteroalkylová skupina, heteroarylová skupina, arylalkylová skupina, acylová skupina, alkoxyskupina, alkenylové skupina, alkinylová skupina, amidoskupina, aminoskupina, karbonylová skupina a podobne, ktoré sú substituované alebo nesubstituované, a tiež ich soli. Neutrálne skupiny sú výhodne alkylová skupina alebo alkoxyskupina a môžu zahrňovať, ale bez obmedzenia, skupiny obsahujúce 1 až 18 uhlíkov a môžu byť lineárne alebo rozvetvené. Keď sa poskytne ako skupina s nábojom, J* zahrňuje ionizovateľnú funkčnú skupinu. Príklady funkčných skupín zahrňujú, ale bez obmedzenia, karboxylové kyseliny, estery, amidy, nitrily, tiolové skupiny a hydroxylové skupiny. Takéto J* skupiny môžu byť zložkou aminokyselín, nukleových kyselín, mastných kyselín, sacharidov a ich derivátov a skupiny, ako je napríklad chitín, chitosan, heparín, heparansulfát, chondroitín, chondroitínsulfát, dermatan a dermatansulfát, cyklodextrín, dextrán, hyaluronová kyselina, fosfolipid, sialová kyselina a podobne. J* výhodne obsahuje ionizovateľnú skupinu vybranú zo skupiny, ktorú tvorí karboxylová skupina, aminoskupina, tiolová skupina, hydroxylová skupina, fosforylová skupina, guanidínium, imidazol a ich soli. Najvýhodnejšie je, keď J* obsahuje ionizovateľnú karboxylátovú skupinu a vo fyziologických podmienkach má čistý negatívny náboj. Napríklad výhodné polyméme modifikované syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu podľa vynálezu majú izoelektrický

PP 0277-2003

32081Π bod medzi 3 a 7, a tak J* skupiny s negatívnymi nábojmi sa môžu využívať na jemné ladenie pl.

Zložky s1, s2 a s3 sú skupiny spacerov alebo linkerov, ktoré môžu byť rovnaké alebo rôzne a môžu byť individuálne prítomné alebo neprítomné. Výhodné spacery alebo linkery zahrňujú lineárne alebo rozvetvené skupiny obsahujúce jednu alebo viacero repetičných jednotiek použitých v polyméri rozpustnom vo vode, jednotky diaminoskupín a/alebo dvojsýtnych kyselín, prírodné alebo neprirodzené aminokyseliny alebo ich deriváty, a tiež alifatické skupiny, vrátanej alkylovej skupiny, arylovej skupiny, heteroalkylovej skupiny, heteroarylovej skupiny, alkoxyskupiny a podobne, ktoré výhodne obsahujú až 18 atómov uhlíka alebo dokonca ďalší polymérny reťazec. Najvýhodnejší spacer alebo linker obsahuje polymérny reťazec.

Alternatívne vyššie uvedený vzorec UN-s1-B-s2-Polymér-s3-J* sa môže reprezentovať ako ”UN-B-Polymér-J*, kde s1, s2 a s3 skupiny môžu byť prítomné alebo chýbajú.

Výhodnejšia polymérna zložka je tá, kde polymér rozpustný vo vode Us1-B-s2-Polymér-s3-J* je vytvorený ako celok stupňovitou syntézou. Toto umožní konštrukciu polymérov majúcich presnú molekulovú hmotnosť a definovanú štruktúru. Na rozdiel od toho normálna syntéza polyméru, čo je polymerizácia, má za následok zmes, v ktorej sú reťazce odlišných dĺžok, a tak existuje rozloženie molekulových hmotností a veľkostí, ktoré je ťažké, ak nie nemožné, separovať. Schopnosť kontrolovať molekulárnu čistotu je výhodná v tom, že sa môže konštruovať syntetický proteín, ktorý má k sebe pripojený polymér rozpustný vo vode a ktorý je mono-disperzný. To predstavuje významnú výhodu νίοπή že sa môže zabrániť variabilným vlastnostiam, ktoré sú dôsledkom heterogénnych zlúčenín a môžu sa pripraviť len zlúčeniny s najvýhodnejšími vlastnosťami a relatívne ľahko izolovať.

V ďalšom výhodnom uskutočnení syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu podľa predloženého vynálezu obsahujú jednu alebo viacero neregulárnych aminokyselín. Ako sa v tomto texte používa, termín nereguláma aminokyselina” sa týka aminokyseliny majúcej negeneticky kódovaný bočný

PP 0277-2003

32081/T reťazec, negeneticky kódovaný hlavný reťazec, negeneticky kódovanú substituovanú Na alebo aC(O) skupinu alebo ich kombinácie, t.j. iné aminokyseliny ako je jedna z ribozomálne inkorporovaných 20 aminokyselín kódovaných geneticky. Príklady výhodných neregulárnych aminokyselín zahrňujú aminokyseliny majúce bočné reťazce nesúce unikátnu funkčnú skupinu inú ako geneticky kódovanú funkčnú skupinu, a tiež pseudoaminokyseliny a rôzne aminokyselinové deriváty. V tomto ohľade predložený vynález umožňuje široký výber a flexibilitu pri navrhovaní a/alebo konštrukcií syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu. Príklady neribozomálne inkorporovaných aminokyselín, ktoré sa môžu použiť podľa predloženého vynálezu, zahrňujú, ale bez obmedzenia, D-aminokyseliny, βaminokyseliny, pseudoglutamát, γ-aminobutyrát, ornitín, homocysteín, Nsubstituované aminokyseliny (R. Šimon a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, 89, 9367 - 9371, WO 91/19735 (Bartlett a koľ), patent Spojených štátov č. 5 646 285 (Baindur), α-aminometylénoxyoctové kyseliny (izoster dipeptidu aminokyselina-Gly) a α-aminooxy kyseliny a iné aminokyselinové deriváty majúce negeneticky kódované funkčné skupiny bočného reťazca a podobne. Môžu sa použiť peptidové analógy obsahujúce tioamid, vinyloidný amid, hydrazín, metylénoxy, tiometylén, fosfónamidy, oxyamid, hydroxyetylén, redukovaný amid a substituované redukované amidové izostery a βsulfónamidy. Termín pseudoaminokyselina” označuje aminokyselinu majúcu totožnú štruktúru hlavného reťazca a skupinu bočného reťazca ako geneticky kódovaná aminokyselina, ale odlišujúca sa v atómovom zložení atómov bočného reťazca.

PP 0277-2003

32081/T

Vo výhodnom uskutočnení sa poskytli syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu, ktoré majú polymér rozpustný vo vode pripojený k nepravidelnej aminokyseline polypeptidového reťazca. Výhodnejšie neregulárne aminokyseliny na pripojenie polyméru rozpustného vo vode používajú chemoselektívnu ligačnú chémiu, ktorá sa môže použiť v prítomnosti geneticky kódovaných funkčných skupín bez toho, aby s nimi prebiehala reakcia.

Ako je uvedené vyššie, polyméry rozpustné vo vode, ktoré sú tvorené celkovo stupňovitým zostavením, sa môžu vytvoriť ako mono-disperzné, napríklad výhodné polyamidetylénoxidy podľa vynálezu. Ďalšie výhodné uskutočnenie teda je, keď polymér rozpustný vo vode je mono-disperzný (t.j. molekulárne homogénny prípravok obsahujúci jeden a štrukturálne definovaný požadovaný molekulárny druh). Tiež, pretože syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu sa môžu vyrobiť celkovo chemickou syntézou, môžu sa tiež vytvoriť mono-disperzné. Takéto zlúčeniny majú výhodu, že sú veľmi čisté a vyhnú sa problémom purifikácie a analytickej charakterizácie, ako keď sa použijú heterodisperzné polyméry. Takéto zlúčeniny sú tiež výhodné, čo sa týka reprodukovateľného dávkovania a podobne (napríklad jeden molekulárny druh oproti zmesiam typickým pre glykoproteíny a PEGylované rekombinantne vytvorené proteíny).

Ako je uvedené vyššie, syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa vynálezu môže mať monomérnu molekulovú hmotnosť väčšiu ako 25 kD. Pre účely predloženého vynálezu tieto stanovenia molekulovej hmotnosti sa vykonávajú elektroforézou na denaturujúcom SDS-polyakrylamidovom géli. Termín monomérna molekulová hmotnosť” odkazuje na molekulovú hmotnosť monoméru syntetického proteínu, ako sa odlišuje od syntetických proteínov, ktoré môžu mať mnohonásobné kópie proteínu alebo polypeptidu. Termín molekulová hmotnosť monoméru polypeptidu” odkazuje na molekulovú hmotnosť monoméru polypeptidu, ako sa odlišuje od syntetických proteínov, ktoré môžu mať k sebe pripojené polyméry a/alebo mnohonásobné kópie proteínu alebo polypeptidu. Výhodnejšie má syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa vynálezu monomérnu molekulovú hmotnosť nad 40 kD a

PP 0277-2003

32081/T výhodnejšie 50 kD a vyššie, pričom najvýhodnejšie je nad 60 až 70. Napríklad výhodný syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa vynálezu, tzv. SEP1B51, má monomérnu molekulovú hmotnosť približne 73 kD. Avšak predpokladá sa, že oveľa väčšie konštrukty sú dobre v rozsahu predloženého vynálezu.

V ďalšom uskutočnení sa vynález týka syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu obsahujúceho pseudoaminokyselinu v mieste ligácie proteínu a voliteľne, polymér rozpustný vo vode pripojený k proteínu. Tieto zlúčeniny sa vytvárajú tvorbou ligačného produktu, ktorý má nechránenú funkčnú skupinu bočného reťazca v mieste ligácie, ligáciou prvého peptidu alebo polypeptidového segmentu majúceho N-koncovú aminokyselinu obsahujúcu chemoselektívnu reaktívnu funkčnú skupinu ako je napríklad cysteín, k druhému peptidu alebo polypeptidu majúcemu C-koncovú funkčnú skupinu kompatibilnú s chemickou ligáciou, ako je napríklad a-karboxytioester, a chemickou konverziou nechránenej funkčnej skupiny bočného reťazca v mieste ligácie na pseudoaminokyselinu, ako je napríklad karboxymetylácia cysteínu tiolového bočného reťazca za vzniku aminokyseliny pseudoglutamátu. Konverzia cysteinov v miestach natívnej chemickej ligácie vytvárajúca pseudoaminokyseliny sa v tomto texte nazýva pseudo-natívna chemická ligácia”, ktorá je opísaná podrobne nižšie.

Tiež sa poskytuje syntetický proteín stimulujúci erytropoézu obsahujúci polymér rozpustný vo vode, spojený s bočným reťazcom aminokyseliny v mieste ligácie proteínu. Tieto zlúčeniny sa syntetizujú vytvorením ligačného produktu majúceho nechránenú funkčnú skupinu bočného reťazca v mieste ligácie, ligáciou prvého peptidu alebo polypeptidového segmentu majúceho Nkoncovú aminokyselinu obsahujúcu chemoselektívnu reaktívnu funkčnú skupinu, ako je napríklad cysteín, k druhému peptidu alebo polypeptidu majúcemu C-koncovú funkčnú skupinu kompatibilnú s chemickou ligáciou, ako je napríklad α-karboxytioester, a pripojením polyméru rozpustného vo vode k nechránenej funkčnej skupine bočného reťazca v mieste ligácie.

Využitie pseudoaminokyselinovej chemickej ligácie a modifikácie polyméru chemickou ligáciou, t.j. spôsoby podľa vynálezu, poskytuje niekoľko

PP 0277-2003

32081/T výhod oproti stavu techniky, vrátane rozsiahlej syntézy pestrej škály proteínov stimulujúcich erytropoézu, ktoré sú inak bez vhodných miest ligácie, expanzia miest (a chémia pripájania), kde sa môžu použiť miestne špecifické modifikácie polyméru rutinne a ekonomicky, a tiež syntéza syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu značnej molekulovej hmotnosti. Sú tiež konkrétne vhodné pre vysoký výkon a na dolaďovanie požadovaných biologických vlastností, vrátane skenovania jednotlivých alebo mnohonásobných miest na pripojenie polyméru rozpustného vo vode.

Ako je uvedené vyššie, biologické vlastnosti polymérne modifikovaných syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu podľa vynálezu sa môžu modifikovať presným nastavením miest a väzbovej chémie na pripojenie polyméru v kombinácii s presnou úpravou molekulovej hmotnosti, zložením polyméru, štruktúrou (napr. lineárnou oproti rozvetvenej alebo ich zmesi) a pripojenou skupinou (napr. s nábojom oproti bez náboja alebo ich zmesi) polyméru rozpustného vo vode. Konkrétne okrem zvyšovania molekulovej hmotnosti proteinu kvôli zlepšeniu polčasu a rozvetvenia a podobne, pripojený polymér rozpustný vo vode môže prepožičiavať syntetickému proteinu stimulujúcemu erytropoézu presný náboj, ako je merané izoelektrickým bodom, ktorý sa približne rovná náboju zodpovedajúceho biologicky vytvorenému proteinu, na ktorom je založená aminokyselinová sekvencia syntetického proteinu stimulujúceho erytropoézu. To má výhodu napodobňovania prírodného náboja zodpovedajúceho ribozomálne špecifikovaného proteinu. Výhodné uskutočnenie vynálezu sa tak týka syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu, ktoré kombinujú vyššie uvedené vlastnosti, a tiež použitých polymérov rozpustných vo vode, konkrétne štrukturálne definovaných adičných zlúčenín polymérov, ktoré sú schopné pripojenia do preselektovaných polôh.

PP 0277-2003

32081/T

Konkrétne výhodné syntetické proteiny stimulujúce erytropoézu (”SEP”) podľa predloženého vynálezu sú výhodne polyméme modifikované syntetické analógy humánneho EPO z moču. Vo výhodnom uskutočnení obsahujú jeden alebo viacero polymérov rozpustných vo vode pripojených k jednému alebo viacerým peptidovým zvyškom prostredníctvom tioéterovej, oxímovej, amidovej alebo inej väzby. Vo veľmi výhodnom uskutočnení sú takéto väzby v jednej alebo viacerých polohách, ktoré sú prirodzene glykozylované v humánnom močovom EPO (t.j. polohy 24, 38, 83 a 126). Najvýhodnejšie molekuly SEP majú polymérne skupiny v dvoch alebo viacerých takýchto polohách. V alternatívnom uskutočnení sa ďalšie proteínové zvyšky môžu modifikovať skupinami polyméru. Polohy modifikácie pre syntetické proteiny stimulujúce erytropoézu podľa predloženého vynálezu zahrnujú zvyšky lokalizované v porušenej slučke, úseku alebo doméne proteínu alebo v mieste či blízko miesta potenciálneho štiepenia proteázou. Napríklad polymérne modifikácie sa môžu zaviesť v jednej alebo viacerých polohách 9, 69 a/alebo 125 EPO. Navyše, ak jedno alebo viacero prírodných glykozylačných miest sa nechá bez modifikácie polymérom, jedna alebo viacero aminokyselín v týchto oblastiach sa môže konvertovať na iné zvyšky, ak je to žiaduce, napríklad lyzíny, ak je žiaduci pozitívny náboj alebo asparágovú či glutámovú kyselinu, kde je žiaduci negatívny náboj alebo alanín a podobne. Celková molekulová hmotnosť SEP molekúl podľa predloženého vynálezu sa môže meniť od približne 25 do približne 150 kD a výhodnejšie od približne 30 do približne 80 kD. Molekulová hmotnosť sa môže riadiť zvýšením alebo znížením množstva polyméru a štruktúry polyméru rozpustného vo vode použitého pre modifikáciu daného analógu.

Napríklad oxímom spojené polymérne SEP analógy sa výhodne konštruujú pripojením aminooxyskupinou, ketónom alebo aldehydom funkcionalizovaného polyméru rozpustného vo vode k SEP proteínu v neprirodzene kódovanej aminokyseline nesúcej aminooxyskupinu, ketónovú alebo aldehydovú funkčnú skupinu bočného reťazca. Napríklad polohy 89 a

PP 0277-2003

32081/T

117 SEP-0 a 1 obsahujú pseudoglutamáty (neprirodzene kódovaná aminokyselina nesúca bočný reťazec vzorca -CHa-CH₂-S-COOH (v porovnaní s glutamátovým bočným reťazcom -CHa-CH₂-CH2-COOH)). SEP analógy používajúce tioéterové väzby sa výhodne konštruujú tak, aby obsahovali tiolovú funkčnú skupinu poskytovanú cysteínom alebo neprirodzenou aminokyselinou s bočným reťazcom nesúcim tiolovú skupinu. Obrázok 10 ukazuje základnú štruktúru jedného typu výhodného syntetického proteinu stimulujúceho erytropoézu.

V alternatívnom uskutočnení SEP molekuly podľa predloženého vynálezu môžu zahrňovať cirkulárne permutované” EPO analógy, v ktorých sa presunul prírodný amino- a karboxy-koniec EPO. Najvýhodnejšie takýto presun presťahuje amino- a karboxy-konce do polôh s nízkym štrukturálnym obmedzením ako napríklad do porušených slučiek a podobne. Porušená slučka okolo polôh 125 a 126 (relatívne k číslovaciemu systému zvyšku natívneho EPO) je príkladom takéhoto miesta presunu. Najvýhodnejšie, takéto SEP sú bez disulfidu a sú chemicky modifikované tak, aby obsahovali polyméme skupiny v preselektovaných zvyškoch.

Alternatívne môžu mať SEP molekuly amino- a karboxy-konce presunuté na prirodzene sa vyskytujúce glykozylačné miesto alebo na iné miesta prístupné glykozylácii, ako napríklad poloha 126 a 125. SEP molekuly môžu tiež zahrňovať modifikácie amino- a karboxy-koncov, aby sa eliminoval alebo modifikoval náboj (ako napríklad karboxyamidácia a podobne). Vo výhodnom

I príklade takýchto cirkulárne permutovaných molekúl sa poskytli nové N- a Ckonce polohami 126 a 125, v danom poradí. Prírodné cysteíny tvoriace disulfid v polohách 7, 29, 33 a 161 sa výhodne nahradia neprirodzene kódovanou aminokyselinou, L-a-N-maslovou kyselinou (Aba), ktorá nemôže tvoriť disulfidové mostíky. Zvyšky R166, E37 a V82 sa výhodne nahradia alanínmi kvôli zlepšeniu produkcie. Tiež ďalší cysteín sa výhodne vloží medzi polohy 1 a 166 relatívne k číselnej schéme natívneho EPO, ktorý sa čísluje pod ”0. Výsledná molekula obsahuje štyri cysteíny (v polohách 126, 0, 38 a 83 (čítané v

PP 0277-2003

32081/T smere od N- k C-koncovej časti)), ktoré sa použijú ako (1) miesta ligácie a (2) miesta pripojenia pPEG vytvorené tioéterom. Voliteľne cysteín môže nahradiť A125 za vzniku ďalšieho pPEG miesta pripojenia.

Celková molekulová hmotnosť týchto SEP molekúl podľa predloženého vynálezu sa môže meniť od približne 25 do približne 150 kD a výhodnejšie od približne 30 do približne 80 kD. Molekulová hmotnosť sa môže riadiť zvýšením alebo znížením množstva polyméru a štruktúry polyméru (ako napríklad pPEG) použitého na modifikáciu daného analógu. PPEG sprostredkovaná hydrodynamická molekulová hmotnosť (MW) pre väčšie konštrukty je väčšia ako 100 kD. Voliteľné miesta pripojenia pPEG sa lokalizujú v polohách 125, 9 a 24 (čítané v smere od N- k C-koncovej časti). Ďalšie návrhy SEP analógov majú alternatívne N- a C-konce v úseku porušenej slučky a/alebo skrátených zvyškov z nových N- a/alebo C-koncov. Základná štruktúra výhodných cirkulárne permutovaných molekúl je ukázaná na obrázku 11. Obrázok 12 ukazuje štruktúru výhodného polyméru rozpustného vo vode a rôzne lineárne a rozvetvené konštrukty.

Napríklad okrem špecifických SEP konštruktov opísaných v príkladoch v tomto texte sa navrhli sekvencie cirkulárne permutovanej natívnej sekvencie humánneho EPO nasledujúcim spôsobom: prírodný N-koncový Ala¹ a Ckoncový Arg¹⁶⁶ sa spojili ďalším Cys zvyškom za vzniku polypeptidu zo 167 aminokyselín, nové N- a C-konce sa vytvorili rozdelením reťazca vo zvyškoch 125 - 126 natívnej sekvencie, všetky natívne Cys zvyšky sa nahradili zvyškami kyseliny L-^aamino-N-maslovej a vytvorili sa nasledujúce substitúcie: Glu37Ala, Asn38Cys, Val82Ala, Asn83Cys, Ser126Cys, Arg166Ala (všetky čísla zvyškov založené na natívnej sekvencii humánneho EPO). Spoločne tieto navrhnuté prvky mali za následok aminokyselinovú sekvenciu SEP-5, ako je ukázané. Proteín SEP-5-Ľ28 sa polyméme modifikoval v Cys zvyškoch 126, 0, 24, 38 a 83 (číslovanie vychádza z humánnej EPO sekvencie) maleimidom modifikovaným lineárnym (TTD-Sukcjs karboxylátovým polymérnym konštruktom Michaelovou adičnou reakciou. Tieto zmeny sa navrhli na

PP 0277-2003

32081/T zlepšenie syntézy a manipulácie so SEP-5-L28 proteínom. Navrhnutá sekvencia sa vytvorila zo štyroch peptidových segmentov, každý s N-koncovým Cys zvyškom. Chemické ligačné miesta boli Cys°, Cys³⁸, Cys⁸³. Peptidy sa syntetizovali, kde C-koncový peptid bol α-karboxylát, ďalšie tri peptidy boli atioestery a N-koncové Cys zvyšky boli teda bočné reťazce chránené Acm. Cys²⁴bol nechránený bočný reťazec. Segmenty sa pripojili postupne natívnou chemickou ligáciou, počnúc dvoma C-koncovými segmentmi. Po ligácii voľný Cys bočný reťazec v mieste ligácie reagoval s maleimidom modifikovaným lineárnym (TTD-Sukc)6 karboxylátovým polymérnym konštruktom Michaelovou adičnou reakciou, potom sa odstránila Acm chrániaca skupina Cys bočného reťazca a ligácia ďalšieho segmentu a polymérna modifikácia sa vykonávala podobným spôsobom. Po odstránení Acm skupiny sa vykonávala ligácia ďalšieho (štvrtého) segmentu, konečná Acm skupina sa odstránila a polymérna modifikácia sa vykonávala podobným spôsobom za vzniku cirkulárne permutovaného, polymérne modifikovaného SEP konštruktu opísaného vyššie a ukázaného na obrázku 30.

II. Produkcia syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu podľa vynálezu

Hoci polymérne modifikované proteíny stimulujúce erytropoézu boli opísané prv, predložený vynález sa výrazne odlišuje od skorších prác. Napríklad syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu podľa predloženého vynálezu sa syntetizujú chemicky, celkovo alebo čiastočne. Okrem toho syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu podľa vynálezu sa modifikujú polymérmi rozpustnými vo vode v jednom alebo viacerých konkrétnych, užívateľom vybraných a užívateľom definovaných miestach.

PP 0277-2003

32081/T

Okrem toho syntetická produkcia proteínov stimulujúcich erytropoézu podľa predloženého vynálezu umožní zaistiť, že takéto modifikácie sú prítomné v každom mieste vybranom užívateľom a definovanom užívateľom každej molekuly v prípravku. Takáto jednotnosť a kontrola syntézy výrazne odlišuje

I predložený vynález od náhodných modifikácii tolerovaných na použitie v spôsoboch stavu techniky. Predložený vynález významne umožňuje navrhnúť syntetický proteín stimulujúci erytropoézu, v ktorom ktorýkoľvek nerozhodujúci zvyšok sa môže derivatizovať tak, aby obsahoval polymérnu adičnú zlúčeninu. Navyše pre každé takéto miesto, vybrané užívateľom a definované užívateľom, môže užívateľ definovať presnú väzbu (amid, tioester, tioéter, oxím a podobne), ktorej prostredníctvom tieto adičné zlúčeniny budú naviazané k hlavnému reťazcu polypeptidu alebo proteínu. Ďalej konkrétne polymérne adičné zlúčeniny, u ktorých je žiaduce, aby boli prítomné v konkrétnom mieste, sa môžu zmeniť a riadiť tak, že sa získa konečný preparát, v ktorom každý prítomný proteín alebo polypeptid obsahuje presne rovnaké derivatizované adičné zlúčeniny v presne rovnakých derivatizovaných miestach. Predložený vynález teda umožňuje tvorbu homogénnych preparátov polymérne modifikovaných polypeptidov a proteínov stimulujúcich erytropoézu.

Okrem poskytnutia prostriedku na zmeny polohy a počtu miest pripojenia, ku ktorým sa môže viazať polymér rozpustný vo vode, predložený vynález umožňuje meniť povahu viazaného polyméru. Polymérne adičné zlúčeniny, ktoré sa môžu inkorporovať do ktoréhokoľvek konkrétneho miesta vybraného užívateľom a definovaného užívateľom, môžu byť ktorejkoľvek definovanej dĺžky. Podobne, súhlasne so spôsobmi podľa predloženého vynálezu, je možné používať polyméry odlišných dĺžok v rôznych miestach. Tak v jednom uskutočnení polymérne modifikované syntetické proteiny stimulujúce erytropoézu podľa predloženého vynálezu môžu byť buď mono-modifikované alebo poly-modifikované, s polymérnou adičnou zlúčeninou rozpustnou vo vode. Kde je do konkrétneho polypeptidu alebo proteínu zavedená viac ako jedna polyméma adičná zlúčenina, použité polyméry môžu byť mono-druhové”,

PP 0277-2003

32081/T poly-druhové”, jednotného druhu alebo rôzneho druhu. Ako sa v tomto texte používa, termín mono-druhový odkazuje na polypeptid alebo proteín, ktorý sa modifikoval jedným druhom polyméru. Na rozdiel od toho termín ”poly-druhový” odkazuje na polypeptid alebo proteín, ktorý sa modifikoval viac ako jedným druhom polyméru. Tieto poly-druhové polypeptidy alebo proteíny sú jednotného druhu”, ak v každom modifikovanom mieste polypeptidu alebo proteínu je prítomný jeden rovnaký druh polyméru. Na rozdiel od toho polydruhový polypeptid alebo proteín je rôzneho druhu”, ak modifikované miesta polypeptidu alebo proteínu sa modifikujú rôznymi druhmi polyméru.

Navyše je možné meniť rozsah linearity alebo rozvetvenosti polymérnej adičnej zlúčeniny v každom mieste vybranom užívateľom v miestach definovaných užívateľom. Polymérne adičné zlúčeniny môžu byť teda lineárne, rozvetvené alebo jednotne rozvetvené. Termín jednotne rozvetvené” znamená, že všetky vetvy polyméru v konkrétnom mieste majú rovnakú štruktúru a dĺžku. Ako autori oceňujú, že predložený vynález umožňuje nezávisle meniť tak dĺžku ktorejkoľvek individuálnej vetvy, ako aj štruktúru polyméru prítomného v takom bode vetvenia.

Súhrnne, predložený vynález umožňuje definovať (1) lokalizáciu a (2) frekvenciu polymérne modifikovaných miest vybraných užívateľom a definovaných užívateľom v polypeptide alebo hlavnom reťazci proteínu, a tiež riadiť (3) dĺžku, (4) druh a (5) stupeň vetvenia prítomný v každom takom mieste. Ďalej, vzhľadom k polypeptidom a proteínom majúcim mnohonásobné polymérne modifikácie, predložený vynález umožňuje samostatne definovať každú z vyššie uvedených piatich premenných pre každé miesto. Navyše, s ohľadom na syntetické polypeptidy a proteíny stimulujúce erytropoézu majúcu modifikácie rozvetveného polyméru, predložený vynález umožňuje samostatne definovať každú z vyššie uvedených piatich premenných pre každý bod vetvenia. To umožňuje syntézu homogénnych prípravkov presne polymérne modifikovaných syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu majúcich

PP 0277-2003

32081/T mnohonásobné kópie ktorejkoľvek alebo všetkých prítomných 20 geneticky kódovaných aminokyselinových bočných reťazcov a nezaťažených nechceným pripojením polyméru.

Tak vynález umožňuje významnú flexibilitu navrhovania, syntézy a použitia polymérne modifikovaných syntetických proteinov stimulujúcich erytŕopoézu. Napríklad aminokyselinová sekvencia syntetických proteinov stimulujúcich erytŕopoézu podľa vynálezu môže zahrňovať jednu alebo viacero delécií, inzercií alebo substitúcií relatívne k aminokyselinovej sekvencii geneticky kódovaného proteinu, na ktorom je založená. Aminokyselinová sekvencia sa môže substituovať jednou alebo viacerými neregulárnymi aminokyselinami, ako je napríklad pseudoaminokyselina a/alebo inou aminokyselinou nesúcou neprirodzený bočný reťazec, ako je napríklad ten, ktorý sa modifikuje tak, aby niesol unikátnu chemoselektívnu funkčnú skupinu na pripojenie polymémej adičnej zlúčeniny rozpustnej vo vode. Tak polymér rozpustný vo vode sa môže pripojiť prostredníctvom neregulárnej aminokyseliny alebo geneticky kódovanej aminokyseliny. Polymér rozpustný vo vode môže byť lineárny alebo rozvetvený a môže mať koncovú skupinu obsahujúcu chemickú skupinu, ako je napríklad karboxylová kyselina, alifatická skupina, amid alebo amín. Navyše, polymér rozpustný vo vode môže byť mono-disperzný, t.j. môže sa vytvoriť tak, aby zahrňoval jeden molekulárny druh presne definovanej štruktúry a zloženia. Tak polymér rozpustný vo vode sa môže navrhnúť tak, aby obsahoval vlastnosti presne vyladeného polčasu, imunogenicity, účinnosti, skladovateľnosti, dávkovania, aplikovateľnosti a podobne, takto modifikovaného cieľového proteinu.

PP 0277-2003

32081/T

Obzvlášť môže byť produkcia polymérne modifikovaných syntetických proteinov stimulujúcich erytropoézu podľa vynálezu predstavená takto: navrhnutie, syntéza peptidov, ligácia peptidu, zvinutie kompletného ligačného produktu za vzniku proteínu a hodnotenie biologickej aktivity proteínu. Autori zistili, že polymérna modifikácia sa môže vykonávať pri jednom alebo viacerých krokoch syntézy peptidov, ligácie alebo pri zvinutí produktu. Avšak je výhodné pripojiť polymér k peptidom alebo k ligačnému produktu pred zvinutím. Proteíny vytvárané týmto spôsobom, ktoré prejavujú požadovanú biologickú aktivitu, sa vyberú a predstavujú syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu podľa vynálezu.

Vo výhodnom spôsobe polypeptidový reťazec obsahujúci syntetický proteín stimulujúci erytropoézu sa tvorí chemickou ligáciou peptidových segmentov obsahujúcich neprekrývajúce sa aminokyselinové sekvencie polypeptidového reťazca syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu. Konkrétne, molekuly syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu podľa vynálezu sa môžu vyrobiť chemickou ligáciou peptidových segmentov obsahujúcich neprekrývajúce sa aminokyselinové sekvencie polypeptidového reťazca požadovaných molekúl syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu, kde jeden alebo viacero peptidových segmentov použitých na ligáciu majú k sebe pripojený polymér rozpustný vo vode v mieste definovanom užívateľom a preselektovanom užívateľom. Polymérne modifikovaný polypeptidový reťazec sa môže potom zvinúť za vzniku polymérne modifikovaného syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu podľa vynálezu.

>

. Ďalší výhodný spôsob prípravy syntetických proteinov stimulujúcich erytropoézu podľa vynálezu obsahuje chemickú ligáciu peptidových segmentov obsahujúcich neprekrývajúce sa aminokyselinové sekvencie polypeptidového reťazca syntetického polymérne modifikovaného proteínu stimulujúceho erytropoézu podľa vynálezu a pripojenie jedného alebo viacerých polymérov rozpustných vo vode k bočnému reťazcu aminokyseliny v jednom alebo viacerých miestach chemickej ligácie. Polymérne modifikovaný polypeptidový

PP 0277-2003

320817Τ reťazec sa môže potom zvinúť za vzniku polymérne modifikovaného syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu podľa vynálezu.

I keď je to menej výhodné, syntetické proteiny stimulujúce erytropoézu sa môžu vyrobiť (1) chemickou ligáciou peptidových segmentov obsahujúcich neprekrývajúce sa aminokyselinové sekvencie polypeptidového reťazca syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu za vzniku kompletného polypeptidového reťazca zodpovedajúceho syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu, kde aspoň jeden peptidový segment obsahuje neregulárnu aminokyselinu majúcu prvú chemoselektívnu funkčnú skupinu, (2) zvinutie polypeptidového reťazca a (3) pripojenie k sebe polyméru rozpustného vo vode, ktorý obsahuje druhú chemoselektívnu skupinu, ktorá je unikátne a navzájom reaktívna s prvou chemoselektívnou skupinou.

Konkrétne tieto rôzne spôsoby uskutočnené vo vynáleze a ilustrované v príkladoch sa môžu znázorniť tak, ako je ukázané na obrázkoch všeobecne pre syntetické proteiny stimulujúce erytropoézu. Napríklad obrázky A1 - 1E zobrazujú ligačné schémy zahrňujúce pripojenie polyméru rozpustného vo vode (U-B-Poiymér-J*, ako bolo definované v tomto texte) k čiastočne alebo úplne nechráneným peptidovým segmentom ( ) pred alebo po ligácii alebo ich kombinácie. Na obrázkoch 1A - 1D, Y_aa predstavuje C-koncovú aminokyselinu na prvom peptidovom segmente, ktorá nesie unikátnu chemoselektívnu skupinu (napr. aminokyselina nesúca α-karboxyltioester) pre chemickú ligáciu k druhému peptidovému segmentu nesúcemu unikátnu a navzájom reaktívnu N-koncovú aminokyselinovú X_aa (napríklad aminokoncový cysteín) skupinu, ktorá je schopná chemoselektívnej chemickej ligácie s Y_aa. Chemoselektívna reakcia medzi Y_aa a Xaa tvorí kovalentnú väzbu (napríklad amidovú väzbu). Tak Y_aa a X_aa tvoria chemoselektívnu ligačnú dvojicu. UN-, ako je ukázané na obrázkoch, predstavuje druhú unikátnu chemoselektívnu skupinu, ktorá bola zavedená do presného miesta definovaného užívateľom na bočnom reťazci aminokyseliny a je chemoselektívna a navzájom reaktívna so skupinou U- polyméru rozpustného vo vode U-B-Polymér-J*. Napríklad, keď U_nje bočný reťazec, ktorý sa modifikoval tak, aby niesol ketónovú skupinu, U

PP 0277-2003

32081/T polyméru rozpustného vo vode U-Polymér-J*, je skupina chemoselektívna pre reakciu s ketónom, napríklad aminooxyskupina, ktorá poskytuje oxímovú väzbu medzi nimi. Index n vo výraze U_n- predstavuje počet aminokyselín a ich bočných reťazcov navrhnutých tak, aby niesli chemoselektívne skupiny, napríklad, kde dve špecifické miesta a miesta definované užívateľom sú polymérne modifikované, n = 2, čo sa môže tiež výjadriť ako U₂ alebo U_n=2· Vo všetkých prípadoch n je pozitívne celé číslo, ktoré je presne riadené návrhom. Tak U_n a U predstavujú druhú chemoselektívnu ligačnú dvojicu, ktorá je kompatibilná a nereaktívna s chemoselektívnymi skupinami X_aa a Y_aa. Obrázky 1A a 1B ilustrujú dve rôzne potenciálne reakcie. V prvej ukázanej reakcii je polypeptidový reťazec nesúci U_n funkčnú skupinu ligovaný k druhému polypeptidu, a potom reaguje so skupinou U-B-Polymér-J*, aby sa získal polymérne modifikovaný polypeptid. V druhej ukázanej reakcii polypeptidový reťazec nesúci U_n funkčnú skupinu reaguje so skupinou U-B-Polymér-J*, aby sa získal polymérne modifikovaný polypeptid, a potom sa liguje k druhému polypeptidu za zisku väčšieho polymérne modifikovaného polypeptidu. Obrázky sa odlišujú vtom, že na obrázku 1A polypeptid nesúci X_aa zvyšok prijíma polymérnu modifikáciu, zatiaľ čo na obrázku 1B polymérnu modifikáciu prijíma polypeptid nesúci Y_aa zvyšok. Obrázok 1C ukazuje schopnosť podľa predloženého vynálezu modifikovať mnohonásobné polypeptidové reťazce, buď pred alebo po ich ligácii za vzniku väčšieho polypeptidu. Na obrázku 1 D, PG a PG' predstavujú chrániace skupiny, pričom PG' ukazuje ortogonálnu chrániacu skupinu, t.j. PG a PG' sú odstrániteľné v rôznych podmienkach a sú použiteľné, kde rôzne polyméry rozpustné vo vode sú pripojené prostredníctvom rovnakých chemických postupov k U_n skupinám alebo kde U_n skupiny predstavujú funkčné skupiny bočného reťazca, ktoré nie je žiaduce modifikovať polymérom (napríklad bočné reťazce nesúce reaktívne skupiny - NH₂ alebo -SH, kde U skupina polyméru rozpustného vo vode sa navrhla tak,

PP 0277-2003

32081/T aby reagovala výlučne s primárnou aminoskupinou alebo tiolovými skupinami bočného reťazca). Obrázok 1D ukazuje, že sa môžu použiť chrániace skupiny, aby chránili požadované bočné reťazce ligačných polypeptidov podľa spôsobov podľa predloženého vynálezu.

Obrázok 1E ukazuje heterogenitu skupín, ktoré môžu byť prítomné alebo chýbať v peptidových segmentoch použitých v ligácii a polymérnu modifikáciu podľa obrázkov 1A - 1D.

Obrázky 2A - 2C zobrazujú ďalšie schémy spôsobov prípravy syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu podľa vynálezu. Konkrétne obrázky 2A - 2B zobrazujú ligačnú schému zahrňujúcu pripojenie polyméru rozpustného vo vode U-B-Polymér-J* k bočnému reťazcu amino-koncovej skupiny X_aa v mieste ligácie (napríklad tiolová skupina cysteinu bočného reťazca). Obrázok 2C ukazuje heterogenitu skupín, ktoré môžu byť prítomné alebo chýbať v peptidových segmentoch použitých v ligácii a polymérnu modifikáciu podľa obrázkov 2A - 2B.

Obrázky 3A - 3B zobrazujú ďalšie schémy spôsobov dosiahnutia multisegmentových ligácii, ktoré zahrňujú chemickú ligáciu troch alebo viacerých neprekrývajúcich sa peptidových segmentov, t.j. aspoň jeden segment je prostredný segment zodpovedajúci konečnému kompletnému ligačnému produktu. Peptidy pripravené týmto spôsobom sa môžu použiť na prípravu peptidových segmentov zapojených do ďalšej ligačnej reakcie, napríklad ako je ukázané na obrázkoch 1A -1E, obrázkoch 2A - 2C a obrázkoch 4A - 4C. Všeobecne pre multi-segmentové ligácie má stredný segment buď chránenú X_aa skupinu alebo chránenú Y_aa skupinu, aby sa zabránilo cyklizácii alebo tvorbe konkatemérov tohto peptidu v závislosti od použitej chemickej ligácie. Kvôli následným alebo sériovým ligáciám sa chráni X_aa skupina stredného segmentu (napr. Cys(Acm)), zatiaľ čo Y_aa skupina je nechránená (napr. Y_aaCOSR, kde -COSR je α-karboxyltioester). Tu je Y_aa skupina voľná pre reakciu s druhým peptidom nesúcim nechránenú X_aa skupinu, kde druhý peptid je bez voľnej Y_aa skupiny. Po ligácii sa chrániaca skupina odstráni kvôli regenerácii X_aaskupiny kvôli ďalšej ligačnej reakcii. Tento postup môže pokračovať, ako je

PP 0277-2003

32081/T potrebné pre tvorbu predĺženého polypeptidového reťazca. Ochrana Y_aaskupiny je obzvlášť užitočná pre konvergentnú chemickú ligáciu zahrňujúcu produkciu konečného ligačného produktu zloženého zo štyroch alebo viacerých segmentov. Napríklad pre cieľový proteín vzniknutý zo štvorsegmentovej ligácie (t.j. tri ligačné reakcie), dva segmenty zodpovedajúce jednému koncu proteinu a dva segmenty zodpovedajúce druhému koncu proteinu sa môžu ligovať súbežne, na rozdiel od postupnej reakcie, a dva konce spojené v konečnej ligačnej reakcii. Takéto schémy konvergentnej chemickej ligácie môžu tiež používať ortogonálne ligačné chemické postupy. Tu opäť heterogenita skupín, ktoré môžu byť prítomné alebo chýbať v takýchto peptidových segmentoch, je znázornená na obrázkoch 1 E, 2C a 4C.

Obrázky 4A - 4C ilustrujú, ako sa môže vykonávať natívna chemická ligácia a chemická modifikácia výsledných tiolových skupín bočného reťazca podľa princípov predloženého vynálezu. Konkrétne, obrázky 4A - 4B zobrazujú použitie natívnej chemickej ligácie a chemickej modifikácie výsledných tiolových skupín cysteínu bočného reťazca v mieste ligácie za vzniku pseudoaminokyseliny (zobrazené TX_aa) prostredníctvom tioalkylácie a vytvorenie chemicky modifikovaného bočného reťazca (zobrazené Ψ) obsahujúceho tioéterovú väzbu. V neukázanom alternatívnom uskutočnení sa môže tiolová skupina bočného reťazca konvertovať na alanín desulfuráciou (Liang a kol., J. Amer. Chem. Soc., 2001, 123, 4, 526 - 533). Významným aspektom pre obidve reakcie je, že ktorékoľvek ďalšie tiolové skupiny bočného reťazca, ktoré nie je žiaduce konvertovať alebo modifikovať, sa môžu chrániť vhodnou chrániacou skupinou (PG) alebo pre multi-segmentové ligácie, a ortogonálnou chrániacou skupinou (PG'), kde segment nesúci karboxy-koncovú Y_aa skupinu obsahuje chránenú amino-koncovú X_aa skupinu, t.j. PG-X_aa-peptid, ktorý sa poskytol ako príklad na obrázku 4B. Obrázok 4C ukazuje heterogenitu skupín, ktoré môžu byť prítomné alebo chýbať v peptidových segmentoch použitých v ligácii a polymérnej modifikácii podľa obrázkov 4A - 4B, a tiež obrázkov 1A -1 E, obrázkov 2A - 2C a obrázkov 3A - 3B.

Podľa návrhu sa konštruujú peptidy alebo polypeptidové segmenty

PP 0277-2003

32081/T použité na syntézu polypeptidového hlavného reťazca. To zahrňuje selekciu vhodných miest ligácie, ktoré sa zvolili na základe chemickej ligácie vybranej na zostrojenie rôznych segmentov polypeptidového hlavného reťazca, chemického postupu na pripojenie polyméru zvoleného pre daný cieľový proteín a konkrétnych miest pripojenia polyméru. Keď sa použije natívna ^chemická ligácia, cysteínové miesta ligácie sa určia skenovaním aminokyselinovej sekvencie hlavného reťazca cieľového polypeptidu na vhodný prirodzene sa vyskytujúci cysteínový zvyšok. Keď sa použije predĺžená natívna chemická ligácia”, ako je opísaná v tomto texte, miesta ligácie sa môžu vybrať skenovaním aminokyselinovej sekvencie hlavného reťazca cieľového polypeptidu na vhodné prirodzene sa vyskytujúce miesta ligácie, ktoré umožňuje masívna ligácia, ako napríklad miesta X_aa-Gly. Pretože predĺžená natívna chemická ligácia sa neobmedzuje na ligáciu cysteínových zvyškov, ktorýkoľvek počet zvyškov môže slúžiť ako miesta ligácie. V niektorých príkladoch môže byť súčasťou návrhu kombinácia natívnej a predĺženej natívnej chemickej ligácie.

Vo výhodnom uskutočnení sa použije natívna chemická ligácia na vytvorenie časti alebo celého kompletného polypeptidového reťazca. Cysteíny prítomné v prirodzene sa vyskytujúcom proteíne, na ktorom je založený syntetický proteín stimulujúci erytropoézu, sa môžu použiť ako miesta chemickej ligácie. Avšak kde je výhodné spojenie ligácií bez vhodného cysteínu, aminokyselina, ktorá nie je cysteín v tejto polohe, sa môže nahradiť cysteínom, aby sa umožnila natívna chemická ligácia v tomto mieste. Ak je to žiaduce, novo zavedený cysteín sa môže konvertovať na pseudoaminokyselinový zvyšok zodpovedajúci originálnej aminokyseline v tejto polohe, ako bolo opísané v tomto texte. Alternatívne, keď sa cysteín zavedie do miesta pre polymérnu modifikáciu, tiolová skupina bočného reťazca sa môže využiť na pripojenie tiol-reaktívneho polymérneho konštruktu rozpustného vo vode za predpokladu, že všetky ďalšie cysteíny v cieľovom polypeptide, ktoré nie je žiaduce modifikovať, sa chránia.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa môže použiť predĺžená natívna

PP 0277-2003

32081/T chemická ligácia, ako je opísaná v tomto texte, pre vznik časti alebo celého kompletného polypeptidu. V tomto spôsobe sa môže použiť aminokyselina Nkoncovo Να-substituovaná alkyltiolovou skupinou alebo aryltiolovou skupinou s reťazcom s 2 alebo 3 uhlíkmi. Takéto zvyšky (keď sú prítomné na N-koncí peptidu alebo polypeptidového segmentu použitého na ligáciu) sa môžu výhodne použiť na ligáciu tohto polypeptidu k polypeptidu majúcemu C-koncovú α-karboxytioesterovú skupinu podľa spôsobu predĺženej natívnej chemickej ligácie, opísaného v tomto texte.

Typicky syntéza peptidov používa stupňovitú štandardnú syntézu peptidov na pevnej fáze s Boe a/alebo Fmoc s použitím štandardných automatizovaných peptidových syntetizátorov alebo ručne podľa štandardných protokolov alebo objednaných a zakúpených od komerčných predajcov. (Synthetic Peptides, a User's Guide”, G. A. Grant, vyd., W. H. Freeman and Company, New York, NY, 1992, Principles of Peptide Synthesis”, 2. vyd., M. Bodanszky, vyd., Springer - Verlag, 1993, ”The Practice of Peptide Synthesis,

2. vyd., M. Bodanszky a A. Bodanszky, vyd., Springer - Verlag, 1994 a Protecting Groups, P. J. Kocienski, vyd., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nemecko, 1994, Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Aproach”, vyd. W. C. Chán a P. D. White, Oxford University Press, 2000). Peptidy použité pre tioesterom sprostredkované ligácie, ako napríklad pre natívnu chemickú ligáciu, sa môžu vytvoriť tiež podľa štandardných protokolov (pozri napríklad Dawson a kol., Science, 1994, 266, 776 - 779), Canne a kol., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 1217 - 1220, Kent a kol., WO 96/34878, Kent a kol., WO 98/28434, Ingenito a koľ, JACS, 1999, 121, 49, 11 369 - 11 374 a Hackeng a koľ, Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 1999, 96, 10 068- 10 073), Amiato a koľ, vyššie).

PP 0277-2003

32081/T

Na ligáciu a miestne špecifické pripojenie polymérov rozpustných vo vode sa v syntéze peptidov použili chemické ortogonálne stratégie (pozri napríklad obrázky 1 - 4 a príklady), aby sa zabránilo vedľajším reakciám, ktoré majú za následok nechcené pripojenie. Napríklad v závislosti od navrhnutia ligácie a postupu pripojenia polyméru sa môže použiť celý rad ortogonálnych stratégií syntézy. Konkrétne sa uvažuje povaha pripájaného polyméru rozpustného vo vode a konkrétne funkčná skupina na pripojenie k polypeptidu, napríklad ako sa diskutuje nižšie pre výhodné glykomimetické polyméry podľa vynálezu.

Obzvlášť sa polymér rozpustný vo vode vytvorí tak, aby obsahoval unikátnu funkčnú skupinu U, ktorá je selektívne reaktívna s unikátnou funkčnou skupinou na cieľovom peptide používanom na ligáciu, kompletnom materiáli alebo dokonca zvinutom polypeptide. Pretože sa použije chemická syntéza, peptid sa vytvorí tak, aby obsahoval vzájomne reaktívnu chemoselektívnu skupinu v presnom mieste definovanom užívateľom. Tento aspekt vynálezu stelesní princípy syntézy peptidov (stratégia chrániacich skupín) a chemickej ligácie (stratégia parciálnej alebo žiadnej chrániacej skupiny). V stratégii chrániacich skupín sú všetky potenciálne reaktívne charakteristické skupiny okrem požadovanej funkčnej skupiny na polyméri rozpustnom vo vode a ich vzájomne reaktívna funkčná skupina prítomné na cieľovej molekule blokované vhodnými chrániacimi skupinami. Je známych veľa chrániacich skupín vhodných pre tento účel (pozri napr. Protecting Groups in Organic Synthesis”,

3. vyd., T. W. Greene a P. G. M. Wuts, vyd., John Wiley and Sons, Inc,. 1999, NovaBiochem Catalog 2000, Synthetic Peptides, A User s Guide”, G. A. Grant, vyd. W. H. Freeman and Company, New York, NY, 1992, Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial and Solid Phase Organic Chemistry”, W. D. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. Ľ. Peterson, M. R. Rhodes a H. H. Saneii, vyd., Advanced Chemtech, 1998, Principles of Peptide Synthesis”,

2. vyd., M. Bodanszky, vyd. Springer - Verlag, 1993, ”The Practice of Peptide Synthesis”, 2. vyd., M. Bodanszky a A. Bodanszky, vyd., Springer - Verlag, 1994 a Protecting Groups”, P. J. Kocienski, vyd., Georg Thieme Verlag,

PP 0277-2003

32081/T

Stuttgart, Nemecko, 1994).

Polymér rozpustný vo vode sa môže teda vytvoriť tak, aby mal široký rozsah funkčných skupín, ako sú napríklad tie opísané vyššie. Čo sa týka stratégie parciálnej alebo žiadnej chrániacej skupiny, funkčná skupina na polyméri a ich vzájomná reaktívna funkčná skupina prítomná na cieľovom peptide alebo polypeptide používa chemoselektívny reakčný pár, kedy iné funkčné skupiny môžu byť prítomné v reakčnom systéme, ale nie sú reaktívne. To zahrňuje skupiny prístupné stratégiám zachytávajúcim aminoskupinu (napr. ligácia tvorbou hemiaminalu, tvorbou imínu a Michaelovou adíciou), stratégia zachytávajúca tiolovú skupinu (napr. ligácia tvorbou merkaptidu, výmenou disulfidu), stratégia natívnej chemickej ligácie (napr. ligácia výmenou tioesteru zahrňujúceho cysteín alebo tiolovú skupinu obsiahnutú v bočnom reťazci aminokyselinového derivátu) a stratégia ortogonálnej ligačnej kondenzácie (napr. ligácia tvorbou tiazolidínu, výmenou tioesteru, tvorbou tioesteru, výmenou disulfidu a tvorbou amidu) (pozri napr. Coltart, DM., Tetrahedron, 2000, 56, 3449-3491).

Výhodná chemoselektívna U skupina pre toto uskutočnenie zahrňuje zvyšok unikátnej funkčnej skupiny použitej vo vodnom kompatibilnom ligačnom chemickom postupe, ako je napríklad natívna chemická ligácia (Dawson a kol., Science, 1994, 266, 776 - 779, Kent a kol., WO 96/34878, predĺžená všeobecná chemická ligácia (Kent a kol., WO 98/28434), chemická ligácia tvoriaca oxím (Rose a kol., J. Amer. Chem. Soc., 1994, 116, 30 - 33), ligácia tvoriaca tioester (Schnôlzer a kol., Science, 1992, 256, 221 - 225), ligácia tvoriaca tioéter (Englebretsen a kol., Tet. Letts., 1995, 36, 48, 8871 - 8874), ligácia tvoriaca hydrazón (Gaertner a kol., Bioconj. Chem., 1994, 5, 4, 333 338) a ligácia tvoriaca tiazolidín a ligácia tvoriaca oxazolidín (Zhang a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., 1998, 95, 16, 9184 - 9189, Tam a kol., WO 95/00846) alebo ďalšie metódy (Yan, L. Z. a Dawson, P. E., Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization”, J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, 526 - 533, tu zaradená ako odkaz, Gieselnan a kol., Org. Lett., 2001, 3, 9, 1331 - 1334, Saxon a kol.,

PP 0277-2003

32081/T

Traceless”, Staudinger Ligation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds. Org. Lett., 2000, 2, 2141 - 2143).

Vzhľadom k rôznym chemickým postupom pripojenia opisovaným vyššie, väzba vytvorená medzi polymérom rozpustným vo vode a cieľovým peptidom alebo, polypeptidom môže zahrňovať zvyšok väzby vybranej zo skupiny, ktorá zahrňuje karbonát, ester, uretán, ortoester, amid, amín, oxím, imid, močovinu, tiomočovinu, tioéter, tiouretán, tioester, éter, tiazolidín, hydrazón, oxazolidín a podobne, najvýhodnejšie väzby sú oxímové a amidové väzby.

Krok peptidovej ligácie, napríklad ako je ukázaný na obrázkoch 1 - 4, môže používať ligačnú stratégiu na pevnej fáze alebo v roztoku. Obrázok 8 ukazuje ďalší spôsob presného pripojenia polyméru rozpustného vo vode k peptidovému segmentu, použiteľný na ligáciu a produkciu polyméme modifikovaných syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu podľa vynálezu. Prvý krok používa syntézu peptidov na pevnej fáze (SPPS) (napr. Fmoc alebo Boe SPPS), v ktorej aminokyselinový bočný reťazec zacielený na pripojenie polyméru sa chráni ortogonálnou chrániacou skupinou (napr. ak sa používa Fmoc SPPS, môže sa použiť Boe skupina na ochranu miesta pripojenia polyméru alebo ak sa používa Boe SPPS, môže sa použiť Fmoc skupina ako ortogonálna chrániaca skupina). Po syntéze peptidov sa ortogonálne chrániaca skupina selektívne odstráni, zatiaľ čo zvyšok peptidu zostane chránený. To umožní jedno miesto pripojenia pre ďalší krok - syntézu polyméru na pevnej fáze. Len čo sa ortogonálna chrániaca skupina odstráni, polymérny reťazec sa pripojí ako prekurzor. Výhodnejšie, polymérny reťazec je tvorený postupnými cyklami syntézy polyméru s použitim postupu ukázaného na obrázkoch 6A - 6D. Hoci sa ukázalo jedno miesto pripojenia polyméru, môže sa poskytnúť viac ako jedno. Obrázok 9 ukazuje všeobecnú reakčnú schému.

PP 0277-2003

32081/T

Ako je uvedené vyššie, chemická ligácia zahrňuje tvorbu selektívnej kovalentnej väzby medzi prvou chemickou zložkou a druhou chemickou zložkou. Môžu sa použiť unikátne vzájomne reaktívne funkčné skupiny prítomné na prvej a druhej zložke, ktoré spôsobia to, že ligačná reakcia je chemoselektívna. Napríklad chemická ligácia peptidov a polypeptidov zahrňuje chemoselektívnu reakciu peptidových alebo polypéptidových segmentov nesúcich kompatibilné unikátne vzájomne reaktívne C-koncové a N-koncové aminokyselinové zvyšky. Za týmto účelom sa použilo niekoľko rôznych chemických postupov, príklady zahrňujú natívnu chemickú ligáciu (Dawson a kol., Science, 1994, 266, 776 - 779, Kent a koľ, WO 96/34878, Kent a kol., WO 98/28434), chemickú ligáciu tvoriacu oxím (Rose a kol., J. Amer. Chem. Soc., 1994, 116, 30 - 34), ligáciu tvoriacu tioester (Schnolzer a kol., Science, 1992, 256, 221 - 225), ligáciu tvoriacu tioéter (Englebretsen a kol., Tet. Letts., 1995, 36, 48, 8871 - 8874), ligáciu tvoriacu hydrazón (Gaertner a kol., Bioconj. Chem., 1994, 5, 4, 333 - 338) a ligáciu tvoriacu tiazolidin a ligáciu tvoriacu oxazolidín (Zhang a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., 1998, 95, 16, 9184 - 9189, Tam a koľ, WO 95/00846, patent Spojených štátov č. 5,589,356), Gieselman a kol., Selenocysteine-mediated native chemical ligation (Org. Lett., 2001, 3, 9, 1331 1334) a chemickou ligáciou tvoriacou Staudingerov amid (Saxon a kol., Org. Lett., 2000, 2, 2141 - 2143). Uznáva sa teda, že ktorýkoľvek chemoselektívny reakčný chemický postup, ktorý sa môže aplikovať na ligáciu nechránených peptidových segmentov, je modifikovateľný pre tento účel.

Reakčné podmienky pre daný ligačný chemický postup sa vyberú tak, aby sa udržiavala požadovaná interakcia peptidových alebo polypéptidových segmentov použitých na ligáciu. Napríklad pH a teplota, rozpustnosť ligačnej značky vo vode, pomer prvého segmentu k druhému segmentu, obsah vody a zloženie reakčnej zmesi sa môžu meniť tak, aby sa ligácia optimalizovala. Pridanie alebo vylúčenie činidiel, ktoré do rôznej miery solubilizujú ligačné segmenty, sa môže ďalej použiť na kontrolu špecifičnosti a rýchlosti požadovanej ligačnej reakcie, t.j. riadenie expozície a prezentácie reaktívnych skupín manipuláciou rozpustnosti peptidových alebo polypéptidových segmentov. Reakčné podmienky sa ľahko určia testovaním požadovaného

PP 0277-2003

32081/T chemoselektívneho reakčného produktu v porovnaní s jednou alebo viacerými vnútornými a/alebo vonkajšími kontrolami.

Kde ligácia zahrňuje pripojenie polypeptidu, ktorý má N-koncový cysteínový zvyšok, je výhodné použiť postup natívnej chemickej ligácie (Dawson a kol., Science, 1994, 266, 776 - 779, Kent a kol., WO 96/34878, Kent a kol., WO 98/28434)). Ukázalo sa, že táto metodológia je silnou metódou tvorby natívnej amidovej väzby v mieste ligácie. Natívna chemická ligácia zahrňuje chemoselektívnu reakciu medzi prvým peptidovým alebo polypeptidovým segmentom majúcim C-koncovú α-karboxytioesterovú skupinu a druhým peptidom alebo polypeptidom majúcim N-koncový cysteínový zvyšok. Výmenná reakcia tiolovej skupiny poskytla východiskový medziprodukt spojený tioesterom, ktorý sa spontánne preskupil za vzniku natívnej amidovej väzby v mieste ligácie, zatiaľ čo sa regeneruje tiolová skupina cysteínu bočného reťazca. V mnohých prípadoch sekvencia prírodného proteínu zahrňuje vhodne umiestnené cysteínové zvyšky tak, že polypeptidové fragmenty majúce Nkoncový cysteínový zvyšok sa môžu syntetizovať a použiť v natívnej chemickej ligačnej reakcii. V iných prípadoch sa môže syntéza peptidov riadiť tak, aby sa za týmto účelom zaviedli cysteínové zvyšky do polypeptidu. Vo svojej štandardnej forme teda natívna chemická ligácia zahrňuje chemoselektívnu reakciu sprostredkovanú tioesterom vcysteínovom zvyšku v cieľovej polypeptidovej sekvencii, peptidová väzba je vytvorená v mieste ligácie a bočný reťazec Cys sa regeneruje v natívnej forme.

Alternatívne proteíny podľa predloženého vynálezu sa môžu syntetizovať použitím pseudonatívnej chemickej ligácie” alebo predĺženej natívnej chemickej ligácie. Pseudonatívna chemická ligácia zahrňuje použitie neprirodzene sa vyskytujúcich pseudoaminokyselinových zvyškov v preselektovaných polohách v peptidoch použitých v syntéze proteinov (napríklad pozri obrázok 4). Štruktúry týchto pseudoaminokyselín napodobňujú ako štruktúry cysteínu, tak štruktúry aminokyselín, ktoré sa prirodzene nachádzajú v týchto preselektovaných polohách v proteíne, ktorý sa syntetizuje. Pseudonatívna chemická ligácia tak smeruje k tioalkylácii cysteínových

PP 0277-2003

32081/T bočných reťazcov tvorených v miestach ligácie z natívnej chemickej ligácie. Výhodným aspektom je tioalkylácia cysteínových miest ligácie, kde aspoň jeden peptid obsahuje natívny cysteín majúci svoj tiolový bočný reťazec chránený vhodnou chrániacou skupinou.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je tiolová skupina cysteínovej skupiny modifikovaná na požadovaný bočný reťazec, napríklad na bočný reťazec ribozomálne špecifikovanej aminokyseliny, analóg takejto aminokyseliny alebo na neribozomálne špecifikovanú aminokyselinu. Ako sa v tomto texte používa, ribozomálne špecifikovaná aminokyselina je aminokyselina, ktorá sa rozpoznáva ribozómami pri translácii proteínu a môže sa inkorporovať do ribozomálne vytvoreného proteínu. Existuje značné množstvo publikovaných článkov opisujúcich chemické modifikácie tiolovej skupiny bočného reťazca cysteínu (pozri napríklad Current Protocols in Protein Science, vyd. John E. Coligan a kol., John Wiley and Sons, NY (2000)). Kaiser, E. T. opísal konverziu bočných reťazcov cysteínových zvyškov napodobňujúcu chemické vlastnosti prirodzene sa vyskytujúceho aminokyselinového bočného reťazca (pozri napríklad Kaiser, E T. a kol., Chemical Mutation of Enzýme Active Sites, Science, 1984, Nov. 2, 226 (4674), 505 - 511)). Ďalej sa opísalo použitie bočného reťazca cysteínu na zavedenie značky do peptidu alebo proteínu. Modifikácie bočného reťazca cysteínu sú uvedené v prehľade v Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, S. S. Wong (1991, CRC Press), Chemical Modification of Proteins, Gary E. Means a kol. (1971, Holden-Day), Chemical Modification of Proteins: Selected Methods and Analytical Procedures, Glazer, A. N. a kol.

I , · (1975, Elsevier), Chemical Reagents for Protein Modification, RL Lundblad (1991, CRC Press). Tam a kol. (Biopolymers, 1998, 46, 319 - 327) opísali použitie homocysteínu (-CH₂-CH₂-SH) pre noN-cys natívnu chemickú ligáciu nasledovanú tioalkyláciou s použitím metyl-p-nitrobenzénsulfonátu (metylačné činidlo) pre konverziu homocysteínového bočného reťazca na natívny metionínový bočný reťazec (-CH₂-CH₂-S-CH3). Predložený vynález sa môže tiež použiť na konverziu homocysteínov na pseudoaminokyseliny, t.j. na aminokyseliny iné ako metionín. Avšak, ako u konverzie cysteínov opísanej

PP 0277-2003

32081/T v tomto texte, podľa predloženého vynálezu je nutné použitie chrániacich skupín, aby sa zabránilo zničeniu natívnych cysteínov zapojených do disulfidových dvojíc peptidov, ktoré obsahujú aspoň jeden natívny cysteín, ktorý nie je žiaduce konvertovať. Vhodné chrániace skupiny sú opísané nižšie.

Zatiaľ čo spôsob pseudonatívnej chemickej ligácie neuľahčí napodobňovanie bočných reťazcov určitými ribozomálne špecifikovanými aminokyselinami (napr. bočné reťazce glycínu, alanínu, valínu a prolínu) (bočný reťazec alanínu sa však môže vytvoriť prostredníctvom desulfurácie (Liang, Z. Y a Dawson, P. E., Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization”, J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, 526 - 533, zahrnuté formou odkazu v tomto texte), môže sa použiť pre vznik bočných reťazcov, ktoré napodobňujú mnoho ribozomálne špecifikovaných alebo nekódovaných aminokyselín. Aminokyseliny vytvorené podľa spôsobu pseudonatívnej chemickej ligácie podľa predloženého vynálezu obsahujú tioéterovú väzbu a nemajú β-vetvenie (v tom, že všetky zahrňujú metylovú skupinu v β polohe, t.j. aa-CH₂-S-). Tak sa môžu vytvoriť pseudoaminokyselinové verzie β-vetvených aminokyselín, izoleucínu a treonínu, majúce pripojenú štruktúru bočného reťazca, bez β geometrie a s ňou súvisiacimi obmedzeniami.

Významné je, že spôsoby podľa predloženého vynálezu sa môžu použiť na tvorbu aminokyselinových bočných reťazcov, ktoré majú rovnakú dĺžku ako reťazce ribozomálne špecifikovaných aminokyselín alebo sú dlhšie či kratšie ako tieto dĺžky. Táto zmena v dĺžke bočného reťazca sa môže použiť na stabilizáciu (alebo destabilizáciu) trojrozmernej konformácie kvôli zvýšeniu proteínovej stability (alebo na zosilnenie schopnosti proteínu zmeniť svoju konformáciu, a tým prijímať rôzny rad substrátov, inhibítorov, receptorov, ligandov a podobne, relatívne k týmto prijímaným, prirodzene sa vyskytujúcim proteínom. Napríklad Cys-CH₂-SH + Br-CH₂-COOH poskytuje Cys-CH₂-S-CH₂COOH (taká pseudoglutámová kyselina” má jeden ďalší atóm bočného reťazca, a to skupiny -S-, alternatívne, ak sa použije v mieste asparágovej kyseliny, bude mať dva ďalšie atómy bočného reťazca, a to skupiny -CH₂-S-).

PP 0277-2003

32081/T

Iné bočné reťazce majú rovnaký počet atómov v bočnom reťazci, ale odlišujú sa zahrnutím tioéterovej väzby (-S-). Napríklad Cys-CH₂-SH + Br-CH₂-CH₂-NHPG, nasledované odstránením PG poskytne Cys-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH₂-. Výsledná štruktúra nemá žiadne ďalšie atómy v bočnom reťazci, ale jedna CH₂- skupina je nahradená -S-. Metionín je ďalším príkladom, Cys-CH₂-SH + ICH₂-CH₃ poskytne Cys-CH₂-S-CH₂-CH₃ (oproti natívnej metionínovej štruktúre Met-CH₂-CH₂-S-CH₃), presunie sa teda tioéter. Arginín tiež: Cys-CH₂-SH + BrCH₂-NH-CH-((-NH₂) (=NH₂ ⁺) poskytne Cys-CH₂-S-CH₂-NH-CH ((-NH₂) (=NH₂)). Výhodne sa môže použiť ochrana reaktívnych aminoskupín, konkrétne pre konštrukciu pseudolyzínu, aby sa zabránilo nechceným vedľajším reakciám. Keď sa vykoná tioalkylačná reakcia, môže sa odstrániť chrániaca skupina.

Všeobecne, kde je žiaduce čo najviac napodobniť prirodzene sa vyskytujúci proteín, je najvýhodnejšie používať molekulu pseudoaminokyseliny, ktorá má dĺžku bočného reťazca, ktorá je rovnaká ako dĺžka ribozomálne špecifikovanej aminokyseliny normálne prítomnej v tejto polohe v proteíne, menej výhodné je používať molekulu pseudoaminokyseliny, ktorá má dĺžku bočného reťazca, ktorá je o jeden atóm dlhšia ako dĺžka ribozomálne špecifikovanej aminokyseliny a ešte menej výhodné je používať molekulu pseudoaminokyseliny, ktorá má dĺžku bočného reťazca, ktorá je o dva atómy dlhšia ako dĺžka ribozomálne špecifikovanej aminokyseliny. Navyše je výhodné vybrať cysteínové miesto ligácie, ktoré je v lokalizácii, kde nie je pravdepodobné, že genetické zmeny porušia funkciu alebo kde sú aminokyseliny v tomto mieste v príbuzných proteínoch konzervatívne. Takéto miesta sa môžu identifikovať skenovaním alanínu, modelovaním homológie a ďalšími metódami.

PP 0277-2003

32081/T

V pseudonatívnej chemickej ligácii sa peptid obsahujúci amino-koncový cysteínový zvyšok liguje k peptidu majúcemu karboxy-koncový tioester, ako v natívnej chemickej ligácii. Tiolový bočný reťazec cysteínu potom reaguje so zlúčeninou vzorca R_aa-X, kde X je dobre odstupujúca skupina a R_aa je skupina, ktorej štruktúra napodobňuje koncovú časť bočného reťazca ribozomálne špecifikovanej alebo syntetickej aminokyseliny.

Je významné, že reakcie pseudonatívnej chemickej ligácie fungujú buď s prírodnou L-konfiguráciou cysteínového bočného reťazca alebo s Dkonfiguráciou. Použitie D-konfigurácie môže poskytnúť rezistenciu na proteázy v tomto mieste ligácie, a tak môže byť žiaduce, keď sa požaduje zvýšená stabilita k proteolýze. Avšak pri použití D-cysteínu sa štruktúra hlavného reťazca v tomto mieste zmení. Takáto zmena, okrem rezistencie k proteázam, sa môže požadovať pre zmenu biologickej aktivity. Avšak, aby sa minimalizoval dopad na biologickú aktivitu, je výhodné lokalizovať D-cysteín na miesto s vysokou flexibilitou, ako je napríklad porušený úsek, ako je napríklad porušená slučka, ktorá sa bude lokalizovať na povrchu výslednej zvinutej molekuly, na porušený koniec molekuly. Je žiaduce, aby reakcie pseudonatívnej chemickej ligácie sa použili na umiestnenie veľkých, nabitých bočných reťazcov (napr. bočné reťazce Lys, Arg, Asp alebo Glu) na povrch syntetizovanej molekuly.

Príklady vhodných dobre odstupujúcich skupín, X, zahrňujú halogény, obzvlášť jód a bróm. Príklady R_aa skupín zahrňujú PO₄, COOH, COO, CONH_2|guanidínium, amín, alkylovú skupinu, substituovanú alkylovú skupinu, arylovú skupinu, substituovanú arylovú skupinu, imidazolovú skupinu, alkylovanú imidazolovú skupinu, indolovú skupinu alebo alkylovanú indolovú skupinu.

Selekcia, ktorú R_aa použije, závisí od požadovaného aminokyselinového bočného reťazca, ktorý má byť prítomný v konkrétnej polohe. Tak napríklad požadovaný polypeptid alebo proteín majúci aminokyselinovú sekvenciu:

PP 0277-2003

32081/T

93ΝΗ2·0·θθχ·3θγ·Μ·θθΟΟΟΗ kde Q a W každý označuje voliteľnú prítomnosť alebo neprítomnosť ďalších aminokyselinových zvyškov a aa_x a aa_y označujú interné susedné zvyšky (majúce bočné reťazce x a y, v danom poradí) a aa_NH2 a aacooH v danom poradí označujú amino-(N-)koncový zvyšok a karboxy-(C-)-koncový zvyšok polypeptidu alebo proteínu, sa môžu syntetizovať prípravou dvoch peptidových fragmentov:

aa_NH2-Q-aa_x-COSR a Cys-W-aa_CooH kde Cys označuje nahradenie aa_y cysteínom a R je ktorákoľvek skupina kompatibilná s tioesterovou skupinou, vrátane, ale bez obmedzenia, arylovej skupiny, benzylovej skupiny a alkylovej skupiny. Príklady R zahrňujú 3-karboxy4-nitrofenyltioestery, benzylestery a leucinylestery merkaptopropriónovej kyseliny (pozri napríklad Dawson a kol., Science, 1994, 266, 776 - 779, Canne a kol., Tetrahedron Letí, 1995, 36, 1217 - 1220, Kent a kol., WO 96/34878, Kent a kol., WO 98/28434, Ingenito a kol., JACS, 1999, 121, 49, 11 369 - 11 374, a Hackeng a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 1999, 96, 10 068 - 10 073). Ďalšie príklady zahrňujú ditiotreitol alebo alkyl- či aryltioestery, ktoré sa môžu vytvoriť biologickými technikami sprostredkovanými inteínom, ktoré sú tiež dobre známe (pozri napríklad Chong a kol., Gene, 1997, 192, 277 - 281, Chong a kol., Nucl. Acids Res., 1998, 26, 5 109 - 5 115, Evans a kol., Protein Science, 1998, 7, 2 256 - 2 264 a Cotton a kol., Chemistry and Biology, 1999, 6, 9, 247 - 256) a potom ligáciou fragmentov spolu za vzniku:

aa_NH2-Q-aa_x-Cys-W-aa_CooH

Ligačný fragment potom reagoval s R_y-X, kde R_y je bočná skupina, ktorá napodobňuje štruktúru y bočného reťazca). Reakcia sa vykonáva v podmienkach dostatočných na konverziu tiolovej skupiny cysteínu na pseudoy” bočný reťazec. Napríklad, ak R_aa sa vyberie a je CH₂-COOH alebo (CH2)2COOH, potom reakcia povedie k tvorbe aminokyselinového zvyšku, ktorý napodobňuje štruktúru a funkciu asparágovej kyseliny (pseudo-Asp”) alebo glutámovej kyseliny (”pseudo-Glu”). Ako je zrejmé z opisu uvedeného vyššie,

PP 0277-2003

32081/T môže sa vykonávať komplikovanejšia syntéza s použitím viacerých ako dvoch peptidových fragmentov.

Významnou vlastnosťou tohto prístupu je, že cysteínové zvyšky, ktoré nie je žiaduce modifikovať v reagujúcich segmentoch, môžu byť chránené bočnými reťazcami, napríklad ako Cys(Acm), kvôli prevencii chemickej modifikácie Cys zvyškov iných ako je zvyšok (zvyšky) v mieste (miestach) ligácie alebo ktorýchkoľvek iných Cys zvyškov v reakčných segmentoch určených pre súčasnú tvorbu totožných pseudoaminokyselín” chemickou modifikáciou po ligácii.

Ako sa v tomto texte používa, symbol Ψ označuje benzylovú skupinu, IM označuje imidazolovú skupinu a IN označuje indolovú skupinu, PG označuje chrániacu skupinu. Nižšie je zhrnutie R_aa bočných skupín, ktoré sa môžu použiť na syntézu peptidov obsahujúcich pseudoaminokyselinové zvyšky podľa predloženého vynálezu (kde X je atóm halogénu (I, Br, Cl, F, pričom I a Br sú najvýhodnejšie a F je výhodný pre Ψ pripojenie):

Bázické aminokyseliny:

Lys (žiadne zvláštne atómy)

-CH2-SH + X-CH2-CH2-NH-PG, nasleduje odstránenie chrániacej skupiny za vzniku -CH2-S-CH2-CH2-NH2

Arg (žiadne zvláštne atómy)

-CH₂-SH + X-CH₂-NH-C(NH₂)(= NH₂+) za vzniku -CH₂-S-CH₂-NH-C((NH₂)(=NH₂+))

His (2 zvláštne atómy)

-CH₂-SH + X-CH₂-/M za vzniku -CH₂-S-CH₂-/M

PP 0277-2003

32081/T

Kyslé aminokyseliny:

Asp (2 zvláštne atómy)

-CH₂-SH + X-CH2-COOH za vzniku -CH₂-S-CH₂-COOH

Glu (1 zvláštny atóm)

-CH₂-SH + X-CH2-COOH za vzniku -CH2-S-CH2-COOH

Polárne aminokyseliny bez náboja:

Tyr (žiaden alebo 1 zvláštny atóm)

-CH2-SH + F-Ψ-ρΟΗ za vzniku -CH₂-S-T-pOH (žiadne zvláštne atómy, rovnaká geometria)

-CH2-SH + Βγ/Ι-ΟΗ2-Ψ-ρΟΗ za vzniku -ΟΗ₂-8-ΟΗ₂-Ψ-ρΟΗ (1 zvláštny atóm)

Gin (1 zvláštny atóm)

-CH₂-SH + X-CH₂-C(O)(NH₂) za vzniku -CH₂-S-CH₂-C(O)(NH2)

Asn (2 zvláštne atómy)

-CH₂-SH + X-CH₂-C(O)(NH₂) za vzniku -CH₂-S-CH₂-C(O)(NH2)

Ser (2 alebo 3 zvláštne atómy)

-CH₂-SH + X-CH2OH) za vzniku -CH2-S-CH2OH (2 zvláštne atómy)

-CH₂-SH + X-CH2-CH2-OH za vzniku -CH2-S-CH2-CH2OH (3 zvláštne atómy)

Thr (2 alebo 3 zvláštne atómy, chýba β rozvetvenie)

-CH2-SH + X-CH((CH3)(O-PG) nasleduje odstránením PG za vzniku -CH₂-S-CH((CH₃)(OH) (2 zvláštne atómy)

PP 0277-2003

32081/T

-CH₂-SH + X-CH₂-CH((CH₃)(O-PG) nasleduje odstránením PG za vzniku -CH₂-S-CH₂-CH((CH₃)(OH) (3 zvláštne atómy)

Nepoláme aminokyseliny:

I

Leu (1 alebo 2 zvláštne atómy)

-CH₂-SH + X-CH((CH₃)(CH₃)) za vzniku -CH₂-S-CH((CH₃)(CH₃)) (1 zvláštny atóm)

-CH₂-SH + X-CH₂-CH((CH₃)(CH₃)) za vzniku -CH₂-S-CH₂-CH((CH₃) (CH₃)) (2 zvláštne atómy) lle (2 alebo 3 zvláštne atómy, chýba β rozvetvenie)

-CH₂-SH + X-CH(CH₃)-CH₂-CH₃ za vzniku -CH₂-S-CH(CH₃)-CH₂-CH₃ (2 zvláštne atómy)

-CH₂-SH + X-CH₂-CH(CH₃)-CH₂-CH₃ za vzniku -CH₂-S-CH₂-CH(CH₃)CH₂-CH₃ (3 zvláštne atómy)

Phe (1 alebo 2 zvláštne atómy)

-CH₂-SH + F-Ψ za vzniku -CH₂-S-T (1 zvláštny atóm)

-CH₂-SH + Br/I-CH₂-T za vzniku -CH₂-S-CH₂-T (2 zvláštne atómy)

Met (žiaden zvláštny atóm)

-CH₂-SH + l-CH₂-CH₃ za vzniku -CH₂-S-CH₂-CH₃

Trp (1 zvláštny atóm)

-CH₂-SH + F-/N za vzniku -CH₂-S-IN

Avšak, kde je buď nevyhovujúce alebo nežiaduce modifikovať proteínovú sekvenciu tak, aby sa zaviedol cysteínový alebo homocysteínový zvyšok do daného N-konca polypeptidu použitého na ligáciu alebo použiť pseudoaminokyselinu v mieste ligácie, sa môže spôsob natívnej chemickej ligácie rozšíriť s použitím polypeptidov, ktorých N-koniec sa modifikoval tak, aby obsahoval N-substituovanú a výhodne Να-substituovanú aminoalkyltiolovú

PP 0277-2003

32081/T skupinu alebo aryltiolovú skupinu s reťazcom s 2 alebo 3 uhlíkmi, a preto umožní, aby sa použili princípy natívnej chemickej ligácie s polypeptidmi bez cysteínových zvyškov (pozri patentová prihláška Spojených štátov č. 60/231 339, zahrnutá formou odkazu v tomto texte).

Spôsob predĺženej natívnej chemickej ligácie zahrňuje ligáciu prvej zložky obsahujúcej karboxyltioester a výhodnejšie, a-karboxyltioester s druhou zložkou obsahujúcou N-substituovanú a výhodne Na-substituovanú aminoalkyltiolovú skupinu stabilnú v kyslom prostredí alebo aryltiolovú skupinu s reťazcom s 2 alebo 3 uhlíkmi. Chemoselektívna reakcia medzi karboxyltioesterom prvej zložky a tiolovou skupinou N-substituovanej alkyltiolovej skupiny alebo aryltiolovej skupiny s reťazcom s 2 alebo 3 uhlíkmi druhej zložky pokračuje cez medziprodukt spojený tioesterom a rozloží sa na východiskový ligačný produkt. Konkrétnejšie, výmena tiolovej skupiny nastávajúca medzi COSR tioesterovou zložkou a aminoalkyltiolovou zložkou vytvára medziproduktový ligačný produkt spojený tioesterom, ktorý po spontánnom preskupení vytvára amidom spojený prvý ligačný produkt prostredníctvom kruhového medziproduktu s 5 členmi alebo so 6 členmi v závislosti od toho, či aminoalkyltiolová zložka má vzorec I alebo II, v danom poradí:

J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 I

J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2 II kde J1 je peptid alebo polypeptid majúci jeden alebo viacero voliteľne chránených aminokyselinových bočných reťazcov alebo skupina takéhoto peptidu alebo polypeptidu, polymér, farbivo, vhodne funkcionalizovaný povrch, linker alebo detekovateľný markér alebo ktorákoľvek ďalšia chemická skupina kompatibilná s chemickou syntézou peptidov alebo predĺženou natívnou chemickou ligáciou, R1, R2 a R3 sú nezávisle atóm H alebo skupina poskytujúca elektrón kondenzovaná k C1, s podmienkou, že aspoň jeden z R1, R2 a R3 obsahuje skupinu poskytujúcu elektrón kondenzovanú k C1 a J2 je peptid alebo polypeptid majúci jeden alebo viacero voliteľne chránených

PP 0277-2003

32081/T aminokyselinových bočných reťazcov alebo skupina takéhoto peptidu alebo polypeptidu, polymér, farbivo, vhodne funkcionalizovaný povrch, linker alebo detegovateľný markér alebo ktorákoľvek ďalšia chemická skupina kompatibilná s chemickou syntézou peptidov alebo predĺženou natívnou chemickou ligáciou.

N-substituovaná alkyltiolová skupina alebo aryltiolová skupina , s reťazcom s 2 alebo 3 uhlíkmi [HS-C2-C1(R1)-J alebo [HS-(C3(R3)-C2(R2)C1(R1)-J v mieste ligácie je prístupná k tomu, aby sa odstránila, v podmienkach kompatibilných pre peptid, bez poškodenia produktu, za vzniku konečného ligačného produktu vzorca III, majúca natívnu amidovú väzbu v mieste ligácie:

J1-C(O)-HN-J2 III kde J1, J2, R1, R2 a R3 sú ako bolo definované vyššie.

R1, R2 a R3 skupiny sa vybrali kvôli uľahčeniu štiepenia N-C1 väzby v podmienkach kompatibilných pre štiepenie peptidu. Napríklad skupiny poskytujúce elektrón, obzvlášť keď sa kondenzujú kC1, sa môžu použiť za vzniku rezonančné stabilizovaného katiónu v C1, ktorý uľahčuje štiepenie. Chemická ligačná reakcia výhodne zahrňuje ako excipient tiolový katalyzátor a vykonáva sa v podmienkach približne neutrálneho pH vo vodnom alebo zmiešanom organickom-vodnom prostredí. Chemická ligácia prvej a druhej zložky môže pokračovať cez kruh s piatimi alebo šiestimi členmi, ktorý podstúpi spontánne preskupenie za vzniku N-substituovaného amidom spojeného ligačného produktu. Keď je prvá a druhá zložka peptid alebo polypeptid, Nsubstituovaný amidom spojený ligačný produkt má vzorec IV alebo V:

J1-C(O)-N-a(C1(R1)-C2-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 IV

J1-C(O)-N-a(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 V

PP 0277-2003

32081/T kde J1, J2 a R1, R2, R3 a Z2 sú ako bolo definované vyššie.

Kondenzované skupiny poskytujúce elektrón R1, R2 alebo R3 Nsubstituovaného amidom spojeného ligačného produktu uľahčujú štiepenie NC1 väzby a odstránenie alkyltiolovej skupiny alebo aryltiolovej skupiny s reťazcom s 2 alebo 3 uhlíkmi z N-substituovaného amidom spojeného ligačného produktu. Odstránenie alkyltiolového alebo aryltiolového reťazca z N v podmienkach kompatibilných pre štiepenie peptidu tvorí ligačný produkt majúci natívnu amidovú väzbu v mieste ligácie. Keď prvá a druhá zložka sú peptidy alebo polypeptidy, ligačný produkt má vzorec:

J1-CONaH-CH(Z2)-C(O)-J2 X

Príklady R1 substituentov pre vzorec I sú ukázané v tabuľke 1.

Tabuľka I

PP 0277-2003

320817Γ

Príklady R1, R2 a R3 substituentov pre vzorec II sú ukázané v tabuľke 2.

Tabuľka II

Čo sa týka N-substituovaných zlúčenín s reťazcom s 2 uhlíkmi, umiestnenie benzylových a pikolylových substituentov poskytujúcich elektrón RT, R3' a R5' v orto- alebo para- polohách je nutné kvôli udržaniu elektrónovej kondenzácie k C1 uhlíku kvôli masívnemu štiepeniu Na-C1 väzby po ligácii. Avšak keď R2 a R3 tvoria benzylovú skupinu s C2 a C3, aspoň jeden z Rľ a R3' obsahuje silnú skupinu poskytujúcu elektrón, kde Rľ alebo R3' sa vyberie zo skupiny, ktorú tvorí metoxyskupina (-OCH3), tiolová skupina (-SH), hydroxylová skupina (-OH) a tiometylová skupina (-SCH3). Čo sa týka Nsubstituovaných tiolových skupín s reťazcom s 3 uhlíkmi, v ktorých R2 a R3 sú

PP 0277-2003

32081/T atómy vodíka, R1 zahrňuje benzylovú skupinu alebo pikolylovú skupinu, v ktorej Rľ, R3' a R5' zahrňujú buď silné alebo stredne silné skupiny poskytujúce elektrón alebo ich kombinácie. Čo sa týka N-substituovaných alkyltiolových skupín alebo aryltiolových skupín s reťazcom s 2 uhlíkmi, silné skupiny poskytujúce elektrón zosilňujú senzitivitu alkyltiolovej skupiny alebo aryltiolovej skupiny s reťazcom s 3 uhlíkmi na štiepenie po ligácii. Podľa toho sa môžu teda vyberať konkrétne skupiny poskytujúce elektrón alebo ich kombinácie.

Podobne ako N-substituované zlúčeniny s reťazcom s 2 uhlíkmi, Nsubstituované zlúčeniny s reťazcom s 3 uhlíkmi podľa predloženého vynálezu môžu zahrňovať tiolovú skupinu ako substituent R1 v polohách Rľ a R5', keď sú dostupné na substitúciu v požadovanom konštrukte. Tu je opäť tiolová skupina poskytujúca elektrón kondenzovaná k C1 a jej zavedenie v týchto lokalizáciách umožní to, že zlúčeniny majú dva spôsoby ligácie tvoriacej kruh so 6 členmi. To tiež zvyšuje lokálnu koncentráciu dostupných tiolových skupín na reakciu s α-karboxytioesterom a poskytuje ďalšie konformácie v termínoch štrukturálnych obmedzení, ktoré môžu zlepšiť ligáciu.

Syntéza N-koncovo N-substituovaných alkyltiolových skupín alebo aryltiolových skupín s reťazcom s 2 alebo 3 uhlíkmi aminokyselín podľa vynálezu sa môže vykonávať tak, ako bolo opísané v tomto texte, napríklad v schéme I a schéme II, a podľa štandardných techník organickej chémie v odbore známych (pozri napríklad Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms, and Structure, 4. vyd., J. March (vyd ), John Wiley and Sons, New York, NY, 1992, Comprehensive Organic Transformatións, A Guide to Functional Group Preparations, R. La rock (vyd.), VCH Publishers, New York, NY, 1989). Môžu sa syntetizovať v roztoku, syntézou na polymérnom nosiči alebo ich kombináciou. Výhodný prístup používa N a chránené N alkylované Schránené aminoalkyltiolové alebo aryltiolové aminokyselinové prekurzory. Činidlá použité na syntézu sa môžu získať z ktoréhokoľvek komerčného zdroja. Tiež sa chápe, že východiskové zložky a rôzne medziprodukty, ako napríklad

PP 0277-2003

3208171 jednotlivé aminokyselinové deriváty, sa môžu uložiť na neskoršie použitie, poskytované súpravách a podobne.

Pri príprave N-koncovo N α-substituovaných alkyltiolových skupín alebo aryltiolových skupín s reťazcom s 2 alebo 3 uhlíkmi aminokyselín podľa vynálezu sa používajú stratégie chrániacich skupín. Výhodné chrániace skupiny (PG) použité v rôznych stratégiách syntézy sú všeobecne kompatibilné so syntézou peptidov na pevnej fáze (SPPS”). V niektorých prípadoch je tiež nutné použiť ortogonálne chrániace skupiny, ktoré možno odstrániť za rôznych podmienok. Mnohé takéto chrániace skupiny sú známe a vhodné na tento účel (pozri napríklad Protecting Groups in Organic Synthesis, 3. vyd., T. W. Greene a P. G. M. Wuts, vyd. John Wiley and Sons, Inc., 1999, NovaBiochem Catalog 2000, Synthetic Peptides, A User's Guide”, G. A. Grant, vyd. W. H. Freeman and Company, NewYork, NY, 1992, Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial and Solid Phase Organic Chemistry, W. D. Bennet, J. W. Chrístensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes a H. H. Saneii, vyd., Advanced Chemtech, 1998, Principles of Peptide Synthesis, 2. vyd., M. Bodanszky, vyd., Springer - Verlag, 1993, The Practice of Peptide Synthesis”, 2. vyd., M. Bodanszky a A. Bodanszky, vyd., Springer - Verlag, 1994 a Protecting Groups”, P. J. Kocienski, vyd., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nemecko, 1994). Príklady zahrňujú benzyloxykarbonylovú skupinu (Z), Boe, Bpoc, Trt, Nps, FmocCI-Z, Br-Z, NSC, MSC, Dde a podobne. Čo sa týka sírových skupín, príklady vhodných chrániacich skupín zahrňujú, ale bez obmedzenia, benzylovú skupinu, 4-metylbenzylovú skupinu, 4metoxybenzylovú skupinu, tritylovú skupinu, ACM, TACAM, xantylovú skupinu, disulfidové deriváty, pikolylovú skupinu a fenacylovú skupinu.

PP 0277-2003

32081/T

Konkrétne, N α-substituované alkyltiolové skupiny alebo aryltiolové skupiny s reťazcom s 2 alebo 3 uhlíkmi sa môžu pripraviť podľa schémy I (príprava N α-substituovaného prekurzora na pevnej fáze), schémy II (príprava N α-substituovaného prekurzora na pevnej fáze). V schéme I N asubstituované alkyltiolové skupiny alebo aryltiolové skupiny s reťazcom s 2 alebo 3 uhlíkmi sa skladajú priamo na pevnej fáze s použitím štandardných metód organickej syntézy na nosnom polyméri, zatiaľ čo N α-chránený, Nalkylovaný, S-chránený, aminoalkyltiolový alebo aryltiolový aminokyselinový prekurzor zo schémy II sa kondenzuje k živici s použitím štandardných kondenzačných protokolov. Pri tvorbe racemických alebo diastereoizomémych produktov môže byť nevyhnutné ich separovať štandardnými metódami pred použitím v predĺženej natívnej chemickej ligácii.

Schéma I

Syntéza ECĽ pomocných derivatizovaných molekúl na pevnej fáze

X = atóm halogénu

PP 0277-2003

320B1/T

Schéma II

r₂

^R2

Rj

PP 0277-2003

32081/T α-karboxytioestery sa môžu vytvárať chemickými alebo biologickými metódami, ktoré nasledujú po štandardných technikách v odbore známych, ako sú napríklad techniky opísané v tomto texte, vrátane príkladov. Čo sa týka chemickej syntézy, α-karboxytioesterové peptidy sa môžu syntetizovať v roztoku alebo na živiciach tvoriacich tioester, pričom tieto techniky sú dobre známe (pozri napríklad Dawson a kol., Science, 1994, 266, 776 - 779, Canne a kol., Tetrahedron. Letí, 1995, 36,1217 -1220, Kent a kol., WO 96/34878, Kent a kol., WO 98/28434, Ingenito a kol., JACS, 1999, 121, 49, 11 369 - 11 374 a Hackeng a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1999, 96, 10 068 - 10 073), Amiato a kol., vyššie). Napríklad chemicky syntetizované tioesterové peptidy sa môžu vytvoriť zo zodpovedajúcich peptid-a-tiokyselín, ktoré sa môžu ďalej syntetizovať na tioesterovej živici alebo v roztoku, hoci výhodný je postup so živicou. Peptid-a-tiokyseliny sa môžu konvertovať na zodpovedajúce 3-karboxy4-nitrofenyltioestery, na zodpovedajúci benzylester alebo na ktorýkoľvek z celého radu alkyltioesterov. Všetky z týchto tioesterov poskytujú uspokojivo odstupujúce skupiny pre ligačné reakcie, pričom 3-karboxy-4-nitrofenyltioestery demonštrujú trochu rýchlejšie rýchlosť reakcie ako zodpovedajúce benzyltioestery, ktoré môžu byť ďalej reaktívnejšie ako alkyltioestery. Ako ďalší príklad sa môže použiť trityl-viazaná leucinylmerkaptopropriónová živica, poskytujúca tioester, na konštrukciu C-koncových tioesterov (Hackeng a kol., vyššie). Syntéza C-koncového tioesteru sa môže tiež vykonávať s použitím 3karboxypropánsulfónamidového safety-catch” linkeru aktiváciou diazometánom alebo jódacetonitrilom nasledovanou nahradením vhodnou tiolovou skupinou, (Ingenito a koľ, vyššie, Bertozzi a kol.).

Peptidy s C-koncovým a-karboxytioesterom sa tiež môžu vytvárať s použitím biologických spôsobov, ako sú napríklad biologické techniky sprostredkované inteínom (pozri napr. Chong a kol., Gene, 1997, 192, 277 281, Chong a koľ, Nucl. Acids Res., 1998, 26, 5 109 - 5 115, Evans a koľ, Proteín Science, 1998, 7, 2 256 - 2 264 a Cotton a kol., Chemistry and Biology, 1999, 6, 9, 247 - 256). Napríklad inteínové expresné systémy, so značkami

PP 0277-2003

32081/T alebo bez nich, ako sú napríklad afinitné značky, sa môžu použiť na využitie indukovateľnej samoštiepiacej aktivity inteín proteín-splicing” prvku (prvku štiepiaceho proteín) za vzniku C-koncového ditiotreitol (DTT) esteru peptidu alebo polypeptidového segmentu. Konkrétne, inteín podstupuje špecifické samoštiepenie (self-cleavage) v prítomnosti tiolov, ako je napríklad DTT, βmerkaptoetanol alebo cysteín, ktorý tvorí peptidový segment nesúci C-koncový tioester (pozri napr. Chong a kol., 1997, vyššie, Chong a kol., 1998, vyššie, Evans a kol., vyššie, a Cotton a kol., vyššie). Avšak pri použití rekombinantné vytvoreného segmentu chemicky syntetizovaná časť konečného konštruktu typicky obsahuje polymérnu modifikáciu, kde bola zahrnutá.

Ligácia N-substituovaných alkyltiolových skupín alebo aryltiolových skupín s reťazcom s 2 alebo 3 uhlíkmi zložiek podľa vynálezu s prvou karboxytioesterovou zložkou tvorí ligačný produkt majúci N-substituovanú amidovú väzbu v mieste ligácie. Ligačné podmienky reakcie sa zvolia tak, aby udržiavali selektívnu reaktivitu tioesteru s N-substituovanou alkyltiolovou skupinou alebo aryltiolovou skupinou s reťazcom s 2 alebo 3 uhlíkmi. Vo výhodnom uskutočnení sa ligačná reakcia vykonávala v pufrovacom roztoku majúcom pH 6 - 8, s výhodným rozsahom pH 6,5 - 7,5. Pufrovací roztok môže byť vodný, organický alebo ich zmes. Ligačná reakcia tiež môže zahrňovať jeden alebo viacero katalyzátorov a/alebo jedno alebo viacero redukčných činidiel, lipidov, detergentov, iných denaturačných činidiel alebo solubilizačných činidiel a podobne. Príkladmi výhodných katalyzátorov sú tiol a fosfín obsahujúce skupiny, ako je napríklad tiofenol, benzylmerkaptan, TCEP a alkylfosfíny. Príklady denaturačných a/alebo solubilizačných činidiel zahrňujú guanidínium, močovinu, vo vode alebo organických rozpúšťadlách, ako je napríklad TFE, HFIP, DMF, NMP, acetonitril zmiešaný s vodou alebo s guanidíniom a močovinou vo vode. Kvôli regulácii rýchlosti ligačnej reakcie sa môže použiť teplota, ktorá je zvyčajne medzi 5 °C a 55 °C, pričom výhodná teplota je medzi 15 °C a 40 °C. Ako príklad, ligačná reakcia dobre postupuje v reakčnom systéme, ktorý má 2 % tiofenol v 6M guanidínia pri pH medzi 6,8 a

PP 0277-2003

32081/T

7,8.

Čo sa týka N-substituovaných alkyltiolových skupín alebo aryltiolových skupín s reťazcom s 2 uhlíkmi, ligácia je dôsledkom výmeny tiolovej skupiny, ktorá nastane medzi COSR tioesterovou zložkou a aminoalkyltiolovou zložkou. Výmena vytvára tioesterom spojený ligačný medziprodukt, ktorý po spontánnom preskupení cez medziprodukt s 5-členným kruhom tvorí prvý ligačný produkt vzorca J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Na(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-J2 majúci odstrániteľnú N-substituovanú alkyltiolovú skupinu alebo aryltiolovú skupinu s reťazcom s 2 uhlíkmi [HS-C2-C1(R1)-J v mieste ligácie, kde sú substituenty, ako bolo definované vyššie. N-substituovaná alkyltiolová skupina alebo aryltiolová skupina s reťazcom s 2 uhlíkmi [HS-C2-C1(R1)-J v mieste ligácie je prístupná na odstránenie v podmienkach kompatibilných pre peptid, za vzniku konečného ligačného produktu vzorca J1-HN-CH(Z1)-CO-NHCH(Z2)-CO-J2 majúceho natívnu amidovú väzbu v mieste ligácie.

Čo sa týka N-substituovaných aryltiolových skupín alebo alkyltiolových skupín s reťazcom s 3 uhlíkmi, výmena tiolovej skupiny medzi COSR tioesterovou zložkou a aminoalkyltiolovou zložkou vytvára tioesterom spojený ligačný medziprodukt, ktorý po spontánnom preskupení cez kruhový medziprodukt so 6 členmi tvorí prvý ligačný produkt vzorca J1-HN-CH(Z1)C(O)-Na(C1-C2(R2)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-J2 majúci odstrániteľnú Nsubstituovanú alkyltiolovú skupinu alebo aryltiolovú skupinu s reťazcom s 3 uhlíkmi [HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-J v mieste ligácie. N-substituovaná aryltiolová skupina s reťazcom s 3 uhlíkmi [HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-J v mieste ligácie je prístupná na odstránenie, v podmienkach kompatibilných pre peptid, za vzniku konečného ligačného produktu vzorca J1-HN-CH(Z1)-CO-NHCH(Z2)-CO-J2 majúceho natívnu amidovú väzbu v mieste ligácie.

PP 0277-2003

32081/T

Odstránenie N-substituovanej alkyltiolovej skupiny alebo aryltiolovej skupiny sa výhodne vykonáva v kyslých podmienkach, aby sa uľahčilo štiepenie N-C1 väzby, poskytujúcej stabilizovanú nesubstituovanú amidovú väzbu v mieste ligácie. Termín podmienky kompatibilné pre štiepenie peptidu” označuje fyzikálnochemické podmienky kompatibilné pre peptidy a vhodné na odštiepenie alkyltiolovej skupiny alebo aryltiolovej skupiny z ligačného produktu. Všeobecne sa podmienky kompatibilné pre štiepenie peptidu vyberú v závislosti od použitej α-substituovanej zlúčeniny, ktoré sa môžu ľahko odvodiť rutinnými a dobre známymi prístupmi (pozri napr. Protecting Groups in Organic Synthesis,

3. vyd., T. W. Greene a P. G. M. Wuts, vyd. John Wiley and Sons, Inc., 1999, NovaBiochem Catalog 2000, Synthetic Peptides, A User's Guide, G. A. Grant, vyd., W. H. Freeman and Company, New York, NY, 1992, Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial and Solid Phase Organic Chemistry”, W. D. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes a H. H. Saneii, vyd., Advanced Chemtech, 1998, Principles of Peptide Synthesis”, 2. vyd., M. Bodanszky, vyd., Springer - Verlag, 1993, ”The Practice of Peptide Synthesis”, 2. vyd., M. Bodanszky a A. Bodanszky, vyd., Springer Verlag, 1994, a Protecting Groups”, P. J. Kocienski, vyd., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nemecko, 1994).

Napríklad, kde R1, R2 alebo R3 substituenty obsahujú metoxyskupinu, hydroxylovú skupinu, tiolovú skupinu alebo tiometylovú skupinu, metylovú skupinu a podobne, univerzálnejší spôsob odstránenia zahrňuje kyslé podmienky štiepenia typické pre chemické postupy syntézy peptidov. To zahrňuje štiepenie N-C1 väzby v silno kyslých podmienkach alebo vodných kyslých podmienkach, s redukčnými činidlami alebo bez nich a/alebo so systémami lapačov (napr. kyselina ako je napríklad bezvodý fluorovodík (HF), trifluóroctová kyselina (TFA) alebo trimetylsulfonylfluóroctová kyselina (TMSFA) a podobne). Môžu sa vybrať špecifickejšie systémy kyslého štiepenia, aby sa zoptimalizovalo štiepenie Na-C1 väzby kvôli odstráneniu aryltiolovej skupiny alebo alkyltiolovej skupiny pre daný konštrukt. Takéto podmienky sú dobre

PP 0277-2003

32081/T známe a sú kompatibilné s udržaním integrity peptidov. Môže sa zahrnúť lapač tiolovej skupiny, konkrétne keď sú v peptidovej alebo polypeptidovej sekvencií prítomné tryptofány, aby sa zabránilo reakcii tryptofánového bočného reťazca s uvoľnenou aryltiolovou skupinou alebo alkyltiolovou skupinou. Príklady lapačov tiolovej skupiny zahrňujú etándiol, cysteín, β-merkaptoetanol a tiokrezol.

Ďalšie špecializované podmienky štiepenia zahrňujú svetlo alebo podmienky redukčného štiepenia, keď substituentom je pikolylová skupina. Napríklad, keď R1 alebo R2 a R3 substituenty zahrňujú pikolylovú skupinu, môže sa použiť fotolýza (napr. ultrafialové svetlo), systém zinok/octová kyselina alebo elektrolytická redukcia na štiepenie podľa štandardných protokolov. Kde R1 N-substituovaná tiolová skupina s reťazcom s 2 uhlíkmi obsahuje tiometán vR1, sa môže použiť ortuť alebo štiepenie HF. Štiepny systém sa môže tiež použiť na súčasné štiepenie od pevnej fázy a/alebo ako činidlo na odstránenie chrániacej skupiny, keď prvá alebo druhá ligačná zložka zahrňuje ďalšie chrániace skupiny.

V jednom uskutočnení predloženého vynálezu N a-substituované alkyltiolové skupiny alebo aryltiolové skupiny s reťazcom s 2 alebo 3 uhlíkmi sa použijú v syntéze peptidov (konkrétne v automatizovanej syntéze peptidov a stratégiách ortogonálnej a konvergentnej ligácie) za vzniku vhodne N-koncovo derivatizovaných polypeptidov, ktoré sa môžu použiť ako substráty pre predĺženú chemickú ligáciu za vzniku syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu. Tieto zlúčeniny zahrňujú plne chránenú, čiastočne chránenú alebo plne nechránenú v kyslom prostredí stabilnú Na-substituovanú aminoalkyltiolovú skupinu alebo aryltiolovú skupinu s reťazcom s 2 alebo 3 uhlíkmi vzorca (PG1) S-C2-C1(R1)-Na(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2 alebo (PG1)SC3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-Na(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2, ktoré sú nižšie v tabuľke III a tabuľke IV. Konkrétne, jeden alebo viacero R1, R2 a R3 obsahuje skupinu, poskytujúcu elektrón, kondenzovanú kC1, ktorá je po konverzii Na

PP 0277-2003

32081/T substituovanej aminoalkyltiolovej skupiny alebo aryltiolovej skupiny na Nasubstituovanú amidoalkyltiolovú skupinu alebo aryltiolovú skupinu schopná vytvoriť rezonančné stabilizovaný katión vC1, ktorý uľahčí štiepenie Na-C1 väzby v podmienkach kompatibilných pre štiepenie peptidu. PG1 a PG2 sú chrániace skupiny, ktoré sú prítomné individuálne alebo v kombinácii alebo sú neprítomné a môžu byť rovnaké alebo rôzne, kde Z2 je ktorákoľvek chemická skupina kompatibilná s chemickou syntézou peptidov alebo predĺženou natívnou chemickou ligáciou a kde J2 je ktorákoľvek chemická skupina kompatibilná s chemickou syntézou peptidov alebo predĺženou natívnou chemickou ligáciou. PG1 (alebo X1) je skupina chrániaca amin. PG2 (alebo X2) je skupina chrániaca tiolovú skupinu. Je známych veľa takýchto chrániacich skupín vhodných na tento účel (pozri napr. Protecting Groups in Organic Synthesis’’, 3. vyd., T. W. Greene a P. G. M. Wuts, vyd. John Wiley and Sons, Inc., 1999, NovaBiochem Catalog 2000, Synthetic Peptides, A User's Guide”, G. A. Grant, vyd., W. H. Freeman and Company, New York, NY, 1992, Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial and Solid Phase Organic Chemistry”, W. D. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes a H. H. Saneii, vyd., Advanced Chemtech, 1998, Principles of Peptide Synthesis, 2. vyd., M. Bodanszky, vyd., Springer - Verlag, 1993, ”The Practice of Peptide Synthesis”, 2. vyd., M. Bodanszky a A. Bodanszky, vyd., Springer - Verlag, 1994 a Protecting Groups, P. J. Kocienski, vyd., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nemecko, 1994).

PP 0277-2003

32081/T

Tabuľka III

Príklady výhodných chrániacich skupín pre PG1 a X1 zahrňujú, ale bez obmedzenia, (Boc(t-butylkarbamát), Troc(2,2,2-trichlóretylkarbamát), Fmoc-(9fluorenylmetylkarbamát), Br-Z alebo CI-Z(Br- alebo Cl-benzylkarbamát), Dde(4,4-dimetyl-2,6-dioxocyklohex-1-ylidén), MsZ-(4-metylsulfinylbenzyl-karbamát), Msc-(2-metylsulfoetylkarbamát), Nsc-(4-nitrofenyletylsulfonyletyloxykarbonylová skupina]. Výhodné PG1 a X1 chrániace skupiny sú vybrané z Protective Groups in Organic Synthesis”, Greene a Wuts, 3. vyd., Wiley Interscience, 1999, pričom najvýhodnejšie sú Fmoc a Nsc. Príklady výhodných chrániacich skupín pre PG2 zahrňujú, ale bez obmedzenia, [Acm(acetamidometylová skupina), MeoBzl alebo Mob (p-metoxybenžylová skupina), Meb(p-metylbenzylová skupina), Trt(tritylová skupina), Xan(xantenylová skupina), tButio(s-t-butylová skupina), Mmt(p-metoxytritylová skupina), 2- alebo 4-pikolylová skupina (2- alebo 4-pyridylová skupina)), Fm (9fluorenylmetylová skupina), tbut(t-butylová skupina), Tacam (trimetylacetamidometylová skupina)]. Výhodné chrániace skupiny PG2 a X2 sa vyberú z Protective Groups in Organic Synthesis, Greene a Wuts, 3. vyd.,

PP 0277-2003

32081rr

Wiley-lnterscience (1999), pričom najvýhodnejšie sú Acm, Mob, MeB, pikolylová skupina.

Tabuľka IV

Chránené formy Να-substituovaných alkyltiolových skupín alebo aryltiolových skupín s reťazcom s 2 alebo 3 uhlíkmi podľa vynálezu sa môžu pripraviť ako je uvedené v schémach I a II vyššie.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa môžu vytvárať ktorýmkoľvek z celého radu prostriedkov, vrátane aminoalkylácie sprostredkovanej halogénom, redukčnej aminácie a prípravou Να-chránených, N-alkylovaných,

S-chránených, aminoalkyltiolových alebo aryltiolových aminokyselinových prekurzorov kompatibilných s metódami syntézy aminokyselín na pevnej fáze. Ak je to žiaduce, štiepenie vytvorených racemátov alebo diastereoizomérov za vzniku zlúčenín prijateľnej chirálnej čistoty sa môže vykonávať štandardnými

PP 0277-2003

32081Π metódami.

III. Syntéza a produkcia výhodných polymérov rozpustných vo vode podľa vynálezu

Ako sa v tomto texte používa, termín molekulárna heterogenita odkazuje na variácie počtu molekúl polyméru pripojených ku každému proteínu proteínového preparátu. Termín molekulárna diverzita odkazuje (a) na zmenu miesta (miest) proteínu, ktoré je polyméme modifikované, (b) na zmenu dĺžky polymérnych adičných zlúčenín z rôznych miest rovnakého proteínu alebo rovnakého miesta (miest) v rôznych proteínoch proteínového preparátu alebo (c) na zmenu rozsahu a/alebo povahy ktoréhokoľvek vetvenia polymérnych adičných zlúčenín z rôznych miest rovnakého proteínu alebo rovnakého miesta (miest) v rôznych proteínoch proteínového preparátu. Ako sa v tomto texte používa, termín molekulárne homogénny odkazuje na proteínový preparát, v ktorom všetky proteínové molekuly obsahujú aminokyselinovú sekvenciu a rovnaké polyméme modifikácie v rovnakých polohách. Zmes dvoch alebo viacerých molekulárne homogénnych” proteínových preparátov sa v tomto texte nazýva molekulárne definovaný” preparát.

Podľa tohto aspektu vynálezu riešenie vyššie uvedených problémov heterogenity polyméru, diverzity a nevhodnosti zahrňuje produkciu novej skupiny biologicky kompatibilných polymérov, ktoré spájajú výhody oboch polypeptidov (presnú dĺžku, vhodnú syntézu) a pPEG” (presný PEG”), flexibilného, amfifilného, neimunogénneho polyméru, ktorý nie je citlivý

I k proteázam) (Rose, K. a kol., patentová prihláška Spojených štátov č. 09/379 297, v tomto texte zahrnutá formou odkazu). Táto nová skupina biologicky kompatibilných polymérov má vzorec:

PP 0277-2003

32081/T

-[CO-X-CO-NH-Y-NH]nkde n je celé číslo, výhodne od 1 do 100 a výhodnejšie od 2 do 100, kde X a Y sú biologicky kompatibilné repetičné prvky presnej štruktúry spojené amidovou väzbou.

Výhodne sú X a Y dvojmocné organické skupiny bez reaktívnej funkčnej skupiny alebo sú neprítomné, a sú rovnaké alebo rôzne a môžu sa meniť nezávisle s každou repetičnou jednotkou (n). Výhodne, keď n = 2, aspoň jeden z X alebo Y sa vyberie zo skupiny, ktorú tvorí substituovaná, nesubstituovaná, rozvetvená a lineárna alifatická a aromatická skupina. Výhodnejšie, jeden z X alebo Y sa vyberie zo skupiny, ktorú tvorí fenylová skupina, alkylénová skupina obsahujúca 1 až 10 atómov uhlíka, alkylová skupina obsahujúca 1 až 10 atómov uhlíka, fenylová skupina obsahujúca heteroatóm, alkylénová skupina obsahujúca 1 až 10 atómov uhlíka obsahujúca heteroatóm, alkylová skupina obsahujúca 1 až 10 atómov uhlíka obsahujúca heteroatóm a ich kombinácie.

Obzvlášť výhodné pPEG skupiny majú vzorce:

-{CO-(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)3-(OCH₂CH₂)3-CH₂-NH}nkde n sa výhodne mení od 1 do 100 a výhodnejšie od 2 do 100 alebo

-{CO-(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)₆-NH-CO-(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃CH₂-NH}_nkde n sa výhodne mení od 1 do 50 a výhodnejšie od 2 do 50.

Takéto pPEG skupiny sa môžu syntetizovať ktorýmkoľvek z celého radu spôsobov. Tieto skupiny sa však výhodne tvoria skôr s použitím stupňovitého reťazového zostavenia jednotiek na pevnej fáze ako polymérnym postupom. Použitie takéhoto zostavenia umožňuje skupinám preparátu to, že majú definovanú a homogénnu štruktúru, pokiaľ ide o ich dĺžku, povahu ich X a Y substituentov, polohu (polohy) (ak vôbec) bodov vetvenia a dĺžku, X a Y substituenty a polohu (polohy) každej vetvy.

PP 0277-2003

32081/T

Výhodne sa tieto skupiny syntetizujú krokmi ako sú napríklad:

a) acylácia aminoskupiny alebo hydroxylovej skupiny zlúčeniny vzorca Z-Qnosič molárnym nadbytkom derivátu dvojsýtnej kyseliny majúcej vzorec HOOCX-COOH, kde Z je H₂N- alebo HO, Q je linker alebo cieľová molekula a nosič je pevná fáza, matrix alebo povrch,

b) aktivácia voľnej karboxylovej skupiny produktu z kroku (a),

c) aminolýza produktu z kroku (b) s molárnym nadbytkom diamínu majúceho vzorec NH₂-Y-NH₂ a

d) voliteľne opakovanie krokov (a) - (c) s použitím HOOC-X-COOH a NH₂-YNH₂, kde X a Y sú dvojmocné organické skupiny alebo chýbajú, a sú rovnaké alebo rôzne a môžu sa meniť nezávisle s každou z voliteľne repetičných jednotiek, a sú rovnaké alebo rôzne oproti X a Y substituentom použitým v ktoromkoľvek predchádzajúcom kroku acylácie a aminolýzy.

Vo výhodnom uskutočnení sa použijú 6-méry, 12-méry, 18-méry a 32méry vyššie uvedenej repetičnej jednotky. Kde je to žiaduce, sa môže repetičná jednotka použiť napríklad v spojení s aminoskupinou lyzinu za vzniku rozvetvenej štruktúry pPEG. pPEG sa môže pripojiť k syntetickým proteínom podľa predloženého vynálezu celým radom chemických postupov, vrátane tvorby tioéterovej, oxímovej a amidovej väzby.

V jednom uskutočnení stupňovité reťazové zostavenie jednotiek na pevnej fáze obsahuje:

Krok 1: kondenzácia chránenej alebo nechránenej dvojsýtnej kyseliny k aminoskupine na živici za vzniku amidovej väzby vo väzbovom mieste (kde PG je chrániaca skupina, ktorá je prítomná alebo chýba v závislosti od použitej dvojsýtnej kyseliny):

PG-OOC-X-COOH + NHz-Y-NH-živica

PP 0277-2003

32081/T

Krok 2: odstránenie chrániacej skupiny (PG) na živici, ak je prítomná:

HOOC-X-CO-NH-Y-NH-živica

Krok 3: kondenzácia chránenej alebo nechránenej diaminoskupiny ku karboxyskupine na živici za vzniku amidovej väzby vo väzbovom mieste (kde PG je prítomná alebo chýba v závislosti od použitej diaminoskupiny):

PG-NH-Y-NH + HOOC-X-CO-NH-Y-NH-živica

Krok 4: Odstránenie chrániacej skupiny (PG) na živici, ak je prítomná:

-NH-Y-NH-OC-X-CO-NH-Y-NH-živica

Krok 5: opakovanie krokov 1 až 4 'n' krát kvôli pridaniu 'n' jednotiek, potom odštiepiť od živice:

-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[COX-CO-NH-Y-NHJ.

Ako bolo uvedené, lineárne a rozvetvené pPEG konštrukty sú výhodné polyméry rozpustné vo vode na pripojenie k syntetickým molekulám stimulujúcim erytropoézu podfa vynálezu. Použité pPEG nesú pripojené skupiny, ktoré sú nabité alebo neutrálne vo fyziologických podmienkach a môžu sa vytvoriť tak, aby sa odlišovali v chemickom postupe použitom na pripojenie, v dĺžke, vetvení a rozpustnosti v závislosti od použitej pPEG štruktúry. Ako je uvedené vyššie, výhodné pPEG podľa vynálezu zahrňujú polyamid rozpustný vo vode majúci repetičnú jednotku -CO-X-CO-ΝΗΎ-ΝΗ-, kde jeden alebo obidva X a Y obsahujú repetičnú jednotku rozpustnú vo vode a najvýhodnejšie repetičnú jednotku založenú na 'PEG'. Hoci oligomočoviny sú v princípe dostupné s použitím jednoduchého dvojstupňového postupu na pevnej fáze, ako je ukázané nižšie pre prípade amino-živice, NH2-živice a symetrického diamínu, NH2-Y-NH2:

Aktivácia karbonyldiimidazolom -> im-CO-NH-živica

Aminolýza diamínom NH₂-Y-NH₂ -> NH2-Y-NH-CO-NH-živica

PP 0277-2003

32081n

I keď sa tieto dva kroky môžu opakovať veľakrát za vzniku oligomočoviny s repetičnou jednotkou NH-Y-NH-CO-, tento prístup je menej výhodný. To preto, že výťažky vyššie uvedených krokov nemusia byť vysoké pri teplote miestnosti, dokonca i pri veľmi vysokom nadbytku činidiel a dlhých reakčných časov. V súlade s tým je výhodné použiť trojstupňový postup na pevnej fáze, ukázaný nižšie pre prípad použitia aminoživice, Nhfe-živice, za vzniku polyamidu. Reagencie HO2C-X-CO2H a NH₂-Y-NH₂ by mali byť symetrické, aby sa zabránilo tvorbe izomérnych produktov.

Acylácia dvojsýtnou kyselinou HO2C-X-CO2H -> HO-CO-X-CO-NH-živica

Aktivácia karbonyldiimidazolom -> im-CO-OCO-X-CO-NH-živica

Aminolýza diamínom NH2-Y-NH2 -> NH2-Y-NH-CO-X-CO-NH-živica

Tieto tri kroky sa môžu opakovať v sekvencií veľakrát za vzniku polyamidu s repetičnou jednotkou -NH-Y-NH-CO-X-CO-. Polymér obsahuje presný počet monomérnych jednotiek, X a Y sa môžu zmeniť samostatne v každom kroku a môžu sa tiež vybrať koncové skupiny. Napríklad pri použití anhydridu kyseliny jantárovej, sukcinátu (Suke”) na acyláciu a 4,7,10-trioxa1,13-tridekándiamínu (tiež nazývaného EDA” alebo TTD”) na aminolýzu, sú tvorené 'PEG'-založené polyamidy, kde X je -CH2CH2-, Y je -NH-CH2CH2CH2(OCH₂CH2)3-CH2-NH- a repetičná jednotka je -NH-CH2CH₂CH₂-(OCH2CH2)3CH2-NH-COCH2CH2CO-. Napriek faktu, že postup zahrňuje dvojmocné reagencie činidla bez chrániacich skupín, zosietenie nie je problémom, keď sa použijú štandardné komerčné živice ha syntézu peptidov (Rose a kol., patentová prihláška Spojených štátov č. 09/379 297) a Rose a kol., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 7034), okrem toho, ako je uvedené nižšie v prípade rozvetvených Lys jadier na výrobu rozvetvených konštruktov.

Napríklad rozvetvené pPEG konštrukty sa môžu tvoriť podobne, pokiaľ ide o konštrukty nazývané chemobody”, opísané v práci Rose a kol. (patentová prihláška Spojených štátov č. 09/379 297) a Rose, K. a Vizzavona, J. (J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 7034). Môžu sa teda vytvoriť rozvetvené pPEG

PP 0277-2003

32081/T konštrukty, ktoré majú rozvetvené jadro, ako je napríklad rozvetvené jadro lyzínu, ktoré sa kondenzuje cez oxímové linkery na výhodný polyamid rozpustný vo vode, ako je napríklad -(COCH₂CH2CO-NH-CH₂CH₂CH₂(OCH₂CH₂)3-CH2-NH)n-. Napríklad oxímové väzby sa môžu ľahko vytvoriť medzi

I aminooxyacetylovou skupinou na Lys bočnom reťazci na druhom konci polyamidu a glyoxylylovými skupinami na lyzinovom jadre, napríklad tetramérnom jadre (O=CHCO)₄Lys₂Lys-. Oxímový linker z každého bodu rozvetvenia lyzínu sa môže pripraviť ako štruktúra -Lys(COCH₂ON=CHCO)amid-. Alternatívna konštrukcia môže umiestniť oxímovú väzbu medzi polyamid a voľnú pripojenú skupinu polyamidu, výhodne s použitím monochráneného diamínu a odstránením chrániacej skupiny po kondenzácii polyamidu za vzniku štvormocného rozvetveného konštruktu uvedeného nižšie:

[0=CHCO-(NH-CH₂CH₂CH₂-[OCH2CH₂]3-CH₂-NH-COCH2CH₂CO-)_n]4LyS2LysChémia oxímov sa môže použiť nielen na prípravu dimérnych a tetramérnych rozvetvených konštruktov, ale je tiež vhodná na spájanie oktamérnych rozvetvených konštruktov (Rose, K., J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 30, Rose, K. a kol., Bioconj. Chem., 1996, 7, 552). Pri použití týchto pPEG polyamidov je samozrejme možné použiť na tieto účely iné chemické postupy (pozri napr. obrázok 13). Navyše sa môže zaviesť do syntetickej schémy tvorba polyamidu pre syntézu peptidov zahrňujúca Boe alebo Fmoc chemické postupy, ale pri vypracovávaní takýchto schém treba mať na mysli, že aminolýza odstráni Fmoc skupinu a odstráni formylovú ochranu indolu, ak sa použije Boe chemický postup.

V súlade s tým sa môžu vytvoriť pPEG, ktoré majú rôzne rozvetvené jadrá (napr. lyzínové rozvetvené jadro a podobne), spojené väzbou voľby (napríklad amidovou, tioéterovou, oxímovou a podobne) k lineárnemu polyamidu rozpustnému vo vode (napr. -(Sukc-TTD)_n- a podobne), kde voľný koniec každého lineárneho polyamidu rozpustného vo vode sa môže opatriť požadovanou pripojenou skupinou (napr. karboxylát, aminoskupina,

PP 0277-2003

32081 π amidoskupina a podobne) za vzniku požadovaného náboja. Navyše lineárne a rozvetvené pPEG podľa predloženého vynálezu sa môžu vytvoriť tak, aby zahrňovali unikátnu funkčnú skupinu na pripojenie k syntetickému proteínu nesúcemu jednu alebo viacero unikátnych a navzájom reaktívnych charakteristických skupín a pripojené skupiny pPEG budú výhodne neantigénne (pozri napr. obrázok 13).

V obzvlášť výhodnom uskutočnení syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu podľa vynálezu sa modifikovali molekulárne homogénnymi glykomimetickými polymérmi rozpustnými vo vode vzorca:

U-s1-B-s2-Polymér-s3-J* kde U je zvyšok unikátnej funkčnej skupiny, B je rozvetvené jadro majúce tri alebo viacero vetiev, ktoré môžu byť rovnaké alebo rôzne a môžu byť prítomné alebo chýbať, polymér je polyamid majúci molekulovú hmotnosť väčšiu ako približne 5 000 D vzorca -[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]_n- alebo -[NH-YNH-C(O)-X-C(O)]_n-, kde X a Y sú dvojmocné skupiny, ktoré môžu byť rovnaké alebo rôzne a môžu byť rozvetvené alebo lineárne a n je individuálne celé číslo od 2 do 50, a kde každý alebo oba X a Y obsahujú v podstate neantigénnu repetičnú jednotku rozpustnú vo vode, ktorá môže byť lineárna alebo rozvetvená, J* je zvyšok v podstate neantigénnej pripojenej skupiny majúcej čistý náboj vo fyziologických podmienkach vybraný zo skupiny, ktorú tvorí negatívny, pozitívny a neutrálny náboj a kde s1, s2 a s3 sú skupiny spacerov alebo linkerov, ktoré môžu byť rovnaké alebo rôzne, a môžu byť individuálne prítomné alebo neprítomné. Takéto polyméry zahrňujú polyméry opísané v patentovej prihláške Spojených štátov č. 60/236 377, ktorá je vcelku zahrnutá v tomto texte formou odkazu. Vzorec U-s1-B-s2-Polymér-s3-J* sa môže tiež reprezentovať vzorcom U-B-Polymér-J* kde skupiny spacerov alebo linkerov s1, s2, s3 môžu byť prítomné alebo chýbať.

PP 0277-2003

32081/T

Výhodný postup tvorby výhodných glykomimetických polymérov podľa vynálezu je znázornený na obrázkoch 5 až 7. Obrázky 5A - 5B zobrazujú postup tvorby rozvetveného jadra (B) na pevnej fáze a unikátne chemoselektívne funkčné skupiny (U) polyméru rozpustného vo vode U-BPolymér-J* podľa vynálezu. Postup sa môže vykonávať v roztoku, hoci postup na pevnej fáze je výhodný, ako je ukázané. Konkrétne, obrázok 5A ukazuje ortogonálne chránenú U-B prekurzorovú skupinu s reaktívnou skupinou (—0) a základná geometrická štruktúra takéhoto konštruktu je zobrazená bodkami spojenými väzbou (·—·); táto základná geometrická štruktúra sa nezamýšľa ako obmedzenie použitých typov chemických väzieb alebo skupín, ale iba znázorňuje relatívne body geometrie na budovanie štruktúr a body chemického spracovania vhodné na vytvorenie U-B skupín podľa vynálezu. Ortogonálne chránený U-B prekurzor sa kondenzuje k polymérnemu nosiču/živici obsahujúcemu vhodný štiepiteľný linker a ko-reaktívnu skupinu (—0) po aktivácii, ktorá je schopná kovalentnej väzby k U-B prekurzoru:

<H3I

Polymérny nosič

Linker

Tento systém využíva princípy organickej chémie používajúcej polymérny nosič. Po kondenzácii sa spracováva rozvetvené jadro (je ukázaný iba prvý bod vetvenia a ďalšie body vetvenia môžu byť prítomné alebo chýbať), ako je znázornené, za vzniku rozvetveného jadra, ktoré je vhodné na následné pripojenie požadovanej Polymémej zložky, ako je napríklad v podstate neantigénny lineárny polymér rozpustný vo vode. Tiež je ukázaná U skupina, ktorá sa môže poskytnúť na začiatku syntézy ako časť ortogonálne chráneného U-B prekurzora alebo vypracovať počas vytvorenia rozvetveného jadra B alebo po vytvorení jadra. Zatiaľ čo pripojenie Polymémej zložky sa môže dosiahnuť na živici, t.j. pred odštiepením, výhodným spôsobom je odštiepenie U-B skupiny

P P 0277-2003

32081/T od polymérneho nosiča/živice tak, aby sa vytvorilo U-B jadro, ktoré sa môže purifikovať kvôli následnému pripojeniu Polymémej zložky.

Ako je znázornené, pripojené body vetvenia jadra skupiny B sú zostavené tak, aby zahrňovali funkčnú skupinu (Func), ktorá môže byť rovnaká alebo rôzna a môže byť reverzibilne chránená (PG, PG' alebo PG”) alebo nechránená. V každom prípade konečný krok pripojenia Polymémej zložky zahrňuje vytvorenie funkčnej skupiny (Func) v pripojených bodoch vetvenia a vytvorenie skupiny U (pozri obrázok 7). Obrázok 5B ukazuje alternatívny postup, v ktorom sa chránený U-B prekurzor použije v kombinácii s polymérnym nosičom nesúcim linker, ktorý po odštiepení vytvorí požadovanú chránenú alebo nechránenú U skupinu. Obrázok 5B tiež ukazuje pripojenie vopred zostaveného rozvetveného jadra B k polymérnemu nosiču a použitie živice tvoriacej U skupinu, aby vznikla U-B skupina kvôli následnému pripojeniu Polymémej zložky.

Obrázky 6A - 6D zobrazujú postup na pevnej fáze tvorby výhodných v podstate neantigénnych vo vode rozpustných polyamidových Polymér-J* zložiek podľa vynálezu kvôli následnému pripojeniu k U-B jadru. Hoci je znázornený postup na pevnej fáze, čo je výhodný postup, postup vo fáze roztoku sa môže upraviť tak, aby sa dosiahol rovnaký konečný výsledok. Na obrázkoch 6A a 6B sú jednotky dvojsýtnej kyseliny a diaminoskupiny kondenzované s použitím princípov organickej chémie na pevnej fáze. Voliteľne, chránené jednotky amino-X'-kyseliny a/alebo amino-Y'-kyseliny sa môžu zaviesť kvôli ďalšej diverzite skupín X a Y do konečného štiepneho produktu majúceho polyamidovú štruktúru vzorca -[NH-Y-NHCO-X-CO]-.

I ·

Obrázok 6A ukazuje syntézu v smere od N-konca k C-koncu, zatiaľ čo obrázok 6B ukazuje syntézu v smere od C-konca k N-koncu. Na obrázkoch 6C a 6D sa chránené jednotky amino-X'-kyseliny a/alebo amino-Y'-kyseliny kondenzovali s použitím princípov organickej chémie na pevnej fáze. Obrázok 6C ukazuje syntézu v smere od N-konca k C-koncu, zatiaľ čo obrázok 6D ukazuje syntézu v smere od C-konca k N-koncu. Ako je to zjavné z obrázkov 6A - 6D, povaha konečných polyamidových produktov sa môže presne riadiť, čo závisí od počtu

PP 0277-2003

32081/T cyklov, ktoré sa uskutočnia v syntéze. Navyše pripojená skupina J* sa môže vytvoriť podľa prakticky ktoréhokoľvek opisu definovaného užívateľom. Kde sa použijú mono-disperzné repetičné jednotky X, Y, X' a Y', môže sa presne riadiť presná molekulárna štruktúra konečného polyamidového produktu.

Výhodný postup kondenzácie U-B zložky k Polymér-J* zložke za vzniku výhodných syntetických polymérnych konštruktov podľa vynálezu vzorca U-BPolymér-J* je ukázaný na obrázku 7. Ako je znázornené, môžu sa poskytnúť rôzne chrániace skupiny a sú voliteľné v závislosti od zamýšľaného konečného použitia daného konštruktu. Tiež sú znázornené rôzne spôsoby vzniku požadovaných U-B-Polymér-J* konštruktov, vrátane postupu na pevnej fáze a postupu vo fáze roztoku.

Ako je uvedené vyššie, výhodné vo vode rozpustné repetičné jednotky zahrňujú polyalkylénoxid, polyamidalkylénoxid alebo ich deriváty. Najvýhodnejšia repetičné jednotka vo vode rozpustná obsahuje etylénoxid vzorca -(CH₂-CH₂-O)- alebo -(CH₂-CH₂-O)-. Počet takýchto vo vode rozpustných repetičných jednotiek sa môže významne meniť, ale výhodnejšie počet takýchto jednotiek je 2 až 500, 2 až 400, 2 až 300, 2 až 200, 2 až 100, 2 až 50 a výhodnejšie 2 až 32, pričom 3 až 8 je najvýhodnejší. Príklad výhodnejšieho uskutočnenia je, keď jeden alebo oba X a Y sa vyberú zo skupiny, ktorú tvoria: -((CH₂)_n1-(CH₂-CH₂-O)n2-(CH₂)_ni-or-((CH₂)ni-(O-CH₂CH₂)_n2-(CH₂)ni-) kde n1 je 1 až 6, 1 až 5, 1 až 4 a najvýhodnejšie 1 až 3 a kde n2 je 2 až 50, 2 až 25, 2 až 15, 2 až 10, 2 až 8 a najvýhodnejšie 2 až 5. Príklad veľmi výhodného uskutočnenia je, keď X je -(CH₂-CH₂)- a keď Y je -(CH₂-(CH₂CH₂-O)₃-CH₂-CH₂CH₂)- alebo -(CH₂-CH₂-CH₂-(O-CH₂CH₂)₃-CH₂-. Ešte výhodnejšie sú mono-disperzné prípravky, kde každý n je nespojité celé číslo. Vo veľmi výhodnom uskutočnení X je -(CH₂-CH₂)- a Y je -(CH₂-(CH₂-CH₂-O)₃CH₂-CH₂-CH₂)_n- alebo -(CH₂-CH₂-CH₂-(O-CH₂-CH₂)₃-CH₂)_n, kde n je 12 až 36.

PP 0277-2003

32081/T

Obzvlášť výhodný polymér, keď ide o polymér rozpustný vo vode obsahujúci polymérne reťazce majúce polyalkylénoxidové repetičné jednotky, ako napríklad etylénoxidové repetičné jednotky, je výhodné, keď každý reťazec má molekulovú hmotnosť medzi približne 1 500 až približne 42 000 D a

I výhodne medzi približne 2 000 až približne 20 000 D, čo je najvýhodnejšie.

Výhodná U skupina obsahuje skupinu schopnú chemickej ligácie. Výhodné polyméry sú rozvetvené, kde skupina B obsahuje tri alebo viacero vetiev. Výhodná zložka J* obsahuje skupinu, ktorá je ionizovateľná vo fyziologických podmienkach a najvýhodnejšie jednu, ktorá je záporne nabitá. Každá alebo obidve U a J môžu obsahovať chrániacu skupinu, ktorá je schopná odstránenia bez poškodenia integrity konštruktu.

Výhodné spacery alebo linkery zahrňujú lineárne alebo rozvetvené skupiny obsahujúce jednu alebo viacero repetičných jednotiek použitých v polyméri rozpustnom vo vode, diaminoskupiny a/alebo jednotky dvojsýtnej kyseliny, prírodné alebo neprirodzené aminokyseliny alebo ich deriváty, a tiež alifatické skupiny, vrátane alkylovej skupiny, arylovej skupiny, heteroalkylovej skupiny, heteroarylovej skupiny, alkoxyskupiny a podobne, ktoré výhodne obsahujú až 18 atómov uhlíka alebo dokonca ďalší polymémy reťazec.

Ako je uvedené vyššie, zložka U je zvyšok funkčnej skupiny, ktorá je schopná pripojenia alebo je pripojená k cieľovej molekule, ako je napríklad peptid alebo polypeptid alebo iný požadovaný povrch. Keď U je zvyšok funkčnej skupiny pre kondenzáciu k cieľovej molekule, obsahuje U nukleofilnú skupinu alebo elektrofilnú skupinu a cieľová molekula obsahuje navzájom reaktívnu elektrofilnú skupinu alebo nukleofilnú skupinu, v danom poradí.

Veľa takýchto navzájom reaktívnych funkčných skupín je známych a sú schopné pripojiť sa k funkčným skupinám bočného reťazca spoločným peptidom a polypeptidom alebo derivatizovaným funkčným skupinám bočného reťazca (Zalipsky a kol., Bioconjugate Chemistry, 1995, 6, 150 - 165,

PP 0277-2003

32081/T

Perspectives in Bioconjugate Chemistry, C. F. Meares, vyd. ACS, 1993, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking”, S. S. Wong, vyd. CRC Press, Inc. (1993)). Príklady funkčných skupín zahrňujú skupiny schopné reakcie s aminoskupinou, ako sú napríklad (a) uhličitany, ako je napríklad pnitrofenylová skupina alebo sukcínimidylová skupina, (b) karbonylimidazoly, (c) azlaktóny, (d) cyklické imidtióny a (e) izokyanáty alebo izotiokyanáty. Príklady funkčných skupín schopných reakcie so skupinami karboxylovej kyseliny a reaktívnymi karbonylovými skupinami zahrňujú (a) primáme amíny alebo (b) hydrazínové a hydrazidové funkčné skupiny, ako sú napríklad acylhydrazidy, karbazáty, semikarbamáty, tiokarbazáty, aminooxyskupiny a podobne. Funkčné skupiny schopné reakcie s merkaptoskupinami alebo sulfhydrylovými skupinami zahrňujú fenylglyoxalové skupiny, maleimidy a halogény. Príklady funkčných skupín schopných reakcie s hydroxylovými skupinami, ako sú napríklad (karboxylové) kyseliny alebo iné nukleofily schopné reakcie s elektrofilným centrom, zahrňujú hydroxylovú skupinu, aminoskupinu, karboxylovú skupinu, tiolové skupiny, aktívny metylén a podobne.

Napríklad vyššie uvedený polymér sa môže pripraviť tak, aby niesol zložku U ako funkčnú skupinu na pripojenie k cieľovej molekule, kde funkčná skupina je akrylát, aldehyd, ketón, aminooxyskupina, amín, karboxylová kyselina, ester, tioester, atóm halogénu, tiolová skupina, kyanoacetát, dipalmitoylfosfatidyletanolamín, distearylfosfatidyletanolamín, epoxid, hydrazid, azid, izokyanát, maleimid, metakrylát, nitrofenylkarbonát, ortopyridyldisulfid, silán, sulfhydrylová skupina, vinylsulfóny, sukcípimidylglutarát, sukcimidylsukcinát, jantárová kyselina, trezylát a podobne. U sa tiež môže poskytnúť v aktivovateľnej forme, napríklad ako karboxylová kyselina, ktorá sa môže konvertovať na svoj účinný ester, ktorý je schopný reakcie s nukleofilom, ako je napríklad amín.

PP 0277-2003

32081/T

Vo výhodnom uskutočnení U je zvyšok unikátnej funkčnej skupiny, ktorá je selektívne reaktívna s unikátnou funkčnou skupinou na cieľovej molekule. Tento aspekt vynálezu stelesňuje princípy syntézy peptidov (stratégia chrániacich skupín) a chemickej ligácie (parciálna alebo žiadna stratégia chrániacich skupín), ako sa pojednáva v časti II. Tak U môže predstavovať zvyšok širokého spektra funkčných skupín, ako sú napríklad skupiny opísané vyššie. Výhodné U skupiny sú prístupné stratégiám zachytávajúcim amín (napr. ligácia tvorbou hemiaaminalu, tvorbou imínu a Michaelovou adíciou), stratégia zachytávajúca tiolovú skupinu (napr. ligácia tvorbou merkaptidu, výmenou disulfidu), stratégia natívnej chemickej ligácie (napr. ligácia výmenou tioesteru zahrňujúca cysteín alebo tiolovú skupinu obsiahnutú v bočnom reťazci aminokyselinového derivátu) a stratégia ortogonálnej ligačnej kondenzácie (napr. ligácia tvorbou tiazolidínu, výmenou tioesteru, tvorbou tioesteru, výmenou disulfidu a tvorbou amidu) (pozri napr. Coltart, D. M., Tetrahedron, 2000, 56, 3 449 - 3 491). Konkrétne výhodný U obsahuje zvyšok unikátnej funkčnej skupiny použitej v chémii vodnej kompatibilnej chemickej ligácie, ako je napríklad opísaná vyššie v časti II. V súlade s tým U môže byť funkčná skupina schopná vytvárať väzby vybrané zo skupiny, ktorú tvorí karbonát, ester, uretán, ortoester, amid, amín, oxím, imid, močovina, tiomočovina, tioéter, tiouretán, tioester, éter, tiazolidín, hydrazón, oxazolidin a podobne. Výhodné väzby sú oxímové a amidové väzby.

Ako je uvedené vyššie, B je skupina rozvetveného jadra majúca tri alebo viacero vetiev a môže byť prítomná alebo chýbať. Keď B je prítomná, jedna vetva je pripojená k U alebo k spaceru či linkeru pripojenému k U a každá ďalšia vetva je pripojená k polyméru alebo k spaceru či linkeru pripojenému k polyméru. Príklady rozvetvených jadier B zahrňujú, ale bez obmedzenia, aminoskupinu, amidoskupinu, karboxylovú skupinu a ich kombinácie. Tie zahrňujú oligoamidy lyzínu a podobne alebo oligoméry pripravené z alkándiamínov a akrylovej kyseliny (polyamidoamíny), druhé uvedené poskytujú čistý pozitívny náboj v rozvetvenom jadre (pozri napr. Zeng a kol., J.

PP 0277-2003

32081/T

Pept. Sci., 1996, 2, 66 - 72, Rose a kol., Bioconjugate Chem., 1996, 7, 5, 552 556, NovoBiochem Catalog and Peptide Synthesis Handbook, Laufelfingen, 2001, Wells a kol., Biopolymers, 1998, 47, 381 - 396, Mahajan a kol., 1999, 40, 4 909 - 4 912, Judson a kol., 1998, 39, 1 299 - 1 302, Swali a kol., 1997, 62, 4 902 - 4 903, patenty Spojených štátov č. 5 932 462, 5 919 455, 5 643 575, 5 681 567). Môže sa použiť mnoho ďalších rôznych rozvetvených jadier a na tento účel sú vhodné, vrátane substituovaných diamínov, substituovaných dvojsýtnych kyselín, alkylových kyselín, ako je napríklad glycerol a ďalšie skupiny majúce tri alebo viacero funkčných alebo aktivovateľných skupín vrátane multivalentnej alkylovej skupiny, arylovej skupiny, heteroalkylovej skupiny, heteroarylovej skupiny a alkoxyskupín a podobne a oligosacharidov (napr. Nierengarten a koľ, Tetrahedron Lett., 1999, 40, 5 681 - 5 684, Matthews a koľ, Prog. Polym. Sci., 1998, 1 - 56, Suner a kol., Macromolecules, 2000, 33, 253, Fischer a koľ, Angew. Chem. Int. Ed., 1999, 38, 884, Sunder a koľ, Adv. Mater., 2000, 12, 235, Mulders a koľ, Tetrahedron Lett., 1997, 38, 631 - 634, Mulders a kol., Tetrahedron Lett., 1997, 38, 30 - 3 088 a Tumbull a koľ, Chembiochem, 2000, 1, 1, 70 - 74). Najvýhodnejšie je rozvetvené jadro pripojené k Polymérnej zložke amidovými väzbami.

Výhodné rozvetvené jadrá vychádzajú z aminoskupiny, karboxylových alebo zmiešaných amino- a karboxylových funkčných skupín. Príkladmi výhodných rozvetvených jadier sú jadrá z aminoskupín lyzínu, rozvetvené jadrá z asparágovej alebo glutámovej kyseliny a rozvetvené jadrá z γ-glutámovej kyseliny, v danom poradí. Navyše, výhodné rozvetvené polymérne konštrukty sú tie, v ktorých rozvetvenie pochádza z jedného rozvetveného jadra, ako je napríklad oligoamidové alebo polyamidoamínové jadro. Môžu sa však použiť ďalšie skupiny rozvetvených konštruktov, ako sú napríklad červovité” (wormlike”) štruktúry, v ktorých rozvetvenie vychádza zo sekvencie mnohonásobných rozvetvených jadier distribuovaných pozdĺž hlavného reťazca polyméru (Schluter a koľ, Chem. Int. Ed., 2000, 39, 864). V závislosti od chemického zloženia a/alebo objemnosti hlavného reťazca polyméru a repetičných jednotiek

PP 0277-2003

32081/T sa môžu výsledné ”worm-like” štruktúry navrhnúť tak, aby boli rozpustné vo vode alebo náchylné k indukcii kvapalnej kryštalickej organizácie (Ouali a kol., Macromolecules, 2000, 33, 6 185), čo môže byť výhodné na aplikačné použitie, stabilitu a dobu pôsobenia. Ako ďalšie rozvetvené polymérne konštrukty podľa vynálezu, ”worm-like” konštrukty sú vytvorené tak, aby obsahovali pripojenú funkčnú skupinu obsahujúcu U.

Polymérna zložka alebo jeden či viacero spacerov alebo linkerov môžu zahrňovať polymérne reťazce alebo vmedzerené linkery alebo väzby, ktoré sú biologicky stabilné alebo biologicky rozložiteľné, napríklad ako sa diskutovalo vyššie v časti I. Ako sa tiež poznamenáva vyššie v časti I, zložka J* je zvyšok pripojenej skupiny majúcej čistý náboj vo fyziologických podmienkach vybraný zo skupiny, ktorú tvorí negatívny, pozitívny a neutrálny náboj. Najvýhodnejšie je, keď J* obsahuje ionizovateľnú karboxylátovú skupinu a má čistý negatívny náboj vo fyziologických podmienkach. Zložky s1, s2 a s3 sú skupiny spaceru alebo linkeru, ktoré môžu byť rovnaké alebo rôzne a môžu byť individuálne prítomné alebo neprítomné, ako sú napríklad skupiny uvedené v časti I. Najvýhodnejší spacer alebo linker obsahuje polymémy reťazec, kde spacer alebo linker obsahuje jednu alebo viacero repetičných jednotiek vzorca [CO-X-CO-NH-Y-NH]n-.

IV. Farmakológia

Polymérne modifikované syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu podľa predloženého vynálezu sa môžu použiť ako farmaceutické prípravky na vykonávanie liečby chorôb a chorobných stavov. V súlade s tým v ďalšom uskutočnení sa vynález týka farmaceutických prípravkov obsahujúcich syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa vynálezu alebo jeho farmaceutický prijateľných solí. Takéto farmaceutické prípravky môžu obsahovať jeden alebo viacero excipientov. Výhodné excipienty sú vybrané zo

PP 0277-2003

32081/T skupiny, ktorú tvorí pufor, proteínový nosič, aminokyselina, detergent, lipid, polymér rozpustný vo vode a konzervačné činidlo. Farmaceutické prípravky tiež môžu kombinovať jeden alebo viacero pridaných účinných farmaceutických zložiek, ako napríklad jeden alebo viacero ďalších bioaktívnych prípravkov (napr. malé organické molekuly, ďalšie proteínové liečivá a podobne) okrem syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu. Takéto farmaceutické prípravky sa môžu použiť vo výhodných spôsoboch podľa vynálezu. Tie zahrňujú spôsob zvyšovania tvorby červených krviniek u cicavca, hematokritu, hemoglobínu a množstva retikulocytov. Tieto spôsoby zahrňujú podávanie účinného množstva syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu cicavcovi podľa vynálezu tak, aby sa sledoval požadovaný účinok.

Najvýhodnejšie, pri podávaní pacientovi alebo jedincovi, ktorý túto liečbu potrebuje pri terapii, sa tieto syntetické polypeptidy a/alebo proteíny stimulujúceho erytropoézu podávajú s použitím liekového aplikačného systému. Použitie takéhoto systému umožní, že liek sa prezentuje pacientovi spôsobom, ktorý je prijateľný pre pacienta a zvýši účinnosť požadovanej biologickej aktivity. Pre účely predloženého vynálezu výhodné liekové aplikačné systémy zahrňujú systémy schopné podávania polypeptidov alebo proteínov perorálnou, nazálnou alebo inhalačnou cestou alebo intramuskulárne, subkutánne, transdermálne, intravenózne, intraurálne alebo intraokulárne.

Takéto liekové aplikačné systémy môžu zahrňovať formulácie, ktoré poskytujú miestne špecifické uvoľňovanie alebo ktoré zvyšujú ochranu intestinálnej sliznice. Vhodné formulácie zahrňujú: suché práškové formulácie, aplikáciu opuzdrením vírusovými časticami, opuzdrenie lipozómami, transdermálne náplasti, elektricky podporovaný transport (elektroporačná terapia) a kondenzácia polymér/niazón.

PP 0277-2003

32081/T

Vo výhodnom uskutočnení takéto liekové aplikačné systémy reagujú na zmeny biologického prostredia a dodávajú alebo prestávajú dodávať lieky na základe týchto zmien. Na kontrolu uvoľňovania liekov a ďalších účinných látok sa použil celý rad látok: poly(uretány), poly(siloxány), poly(metylmetakrylát), poly(vinylalkohol) na hydrofíliu a koncentráciu, poly(etylén), poly(vinylpyrolidón), poly-(2-hydroxyetylmetakrylát), poly-(N-vinylpyrolidón), poly(metylmetakrylát), poly(vinylalkohol), poly(akrylová kyselina), polyakrylamid, poly(etylén-kovinylacetát), poly(etylénglykol), poly(metakrylová kyselina) a podobne. V ďalšom výhodnom uskutočnení biologicky odbúrateľné polyméry sa používajú na uľahčenie aplikácie lieku. Takéto polyméry zahrňujú polylaktidy (PLA), polyglykolidy (PGA), poly(laktido-ko-glykolidy) (PLGA), polyanhydridy a polyortoestery. Zariadenia na aplikáciu liekov a spôsoby ich použitia sú opísané v patentoch Spojených štátov č. 6 072 041, 6 041 253, 6 018 678, 6 017 318, 6 002 961, 5 879 712, 5 849 331, 5 792 451, 5 783 212, 5 766 633, 5 759 566, 5 690 954, 5 681 811,5 654 000, 5 641 511, 5 438 040, 4 810 499 a 4 659 558.

V súlade s tým sa ďalší aspekt vynálezu týka farmaceutických prípravkov a spôsobov liečenia cicavca, ktorý to potrebuje, podávaním terapeuticky účinného množstva zlúčenín obsahujúcich polyméme modifikované syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu podľa vynálezu alebo ich farmaceutický prijateľné soli. Termín farmaceutický prijateľná soľ” znamená soľ, ktorá si podrží biologickú účinnosť a vlastnosti polypeptidov podľa vynálezu a ktorá nie je biologicky či inak nežiaduca. Soli môžu pochádzať z kyselín alebo báz. Kyslé adičné soli pochádzajú z anorganických kyselín, ako je napríklad chlorovodíková kyselina, bromovodíková kyselina, sírová kyselina (za vzniku, sulfátových a bisulfátových solí), dusičná kyselina, fosforečná kyselina a podobne a organických kyselín, ako je napríklad octová kyselina, propiónová kyselina, glykolová kyselina, pyrohroznová kyselina, oxalová kyselina, jablčná kyselina, malónová kyselina, jantárová kyselina, maleínová kyselina, fumáová kyselina, vínna kyselina, citrónová kyselina, benzoová kyselina, škoricová kyselina, mandlová kyselina, metánsulfónová kyselina, etánsulfónová kyselina, salicylová kyselina, p-toluénsulfónová kyselina a podobne. Bázické adičné soli môžu pochádzať z anorganických báz a zahrňujú sodné, draselné, lítne,

PP 0277-2003

32081/T amónne, vápenaté, horečnaté soli a podobne. Soli pochádzajúce z organických báz zahrňujú soli tvorené z primárnych, sekundárnych a terciárnych amínov, substituovaných amínov vrátane prirodzene sa vyskytujúcich substituovaných amínov a cyklických amínov, vrátane izopropylamínu, trimetylamínu, dietylamínu, trietylamínu, tripropylamínu, etanolamínu, 2-dimetylaminóetanolu, trometamínu, lyzínu, arginínu, histidínu, kofeínu, prokaínu, hydrabamínu, cholínu, betaínu, etyléndiamínu, glukózamínu, N-alkylglukamínov, teobrómu, purínov, piperazínu, piperidínu, N-etylpiperidínu a podobne. Výhodné organické bázy sú izopropylamín, dietylamín, etanolamín, piperidín, trometamin a cholín.

Termín liečenie”, ako sa v tomto texte používa, pokrýva každé liečenie chorôb alebo chorobného stavu (napr. anémia) u cicavca, najmä človeka, a zahrňuje: (i) prevenciu chorôb alebo chorobného stavu, aby nenastal u pacienta, ktorý môže byť náchylný na chorobu, ale u ktorého sa ešte nediagnostikovala, (ii) inhibíciu choroby alebo chorobného stavu, t.j. zastavenie jej rozvoja alebo (iii) úľavu od choroby alebo chorobného stavu, t.j. vyvolanie jej regresie alebo zlepšenie jej symptómov.

Termín chorobný stav u cicavcov, ktorému sa zabránilo alebo je zmiernený pôsobením proteinu stimulujúceho erytropoézu”, ako sa v tomto texte používa, sa uvažuje na pokrytie všetkých chorobných stavov, u ktorých sa v odbore všeobecne pripúšťa, že sú užitočne liečené proteínmi stimulujúcimi erytropoézu všeobecne, a tých chorobných stavov, u ktorých sa zistilo, že im je možné zabrániť alebo ich zmierniť liečením špecifickými zlúčeninami podľa vynálezu. Tie zahrňujú, ako príklad bez obmedzenia, anémiu, β-talasémiu, pernicióznu anémiu, kosákovitú anémiu, chronickú bakteriálnu endokarditídu, osteomyelitídu, juvenilnú reumatickú artritídu, reumatickú horúčku, Crohnovu chorobu, ulceratívnu kolitídu a podobne.

PP 0277-2003

32081/T

Ako sa v tomto texte používa, termín terapeuticky účinné množstvo sa týka takého množstva polyméme modifikovaného syntetického proteinu stimulujúceho erytropoézu, ktoré, keď sa podáva cicavcovi, ktorý to potrebuje, je dostatočné na uskutočnenie liečby (ako bola definovaná vyššie), napríklad ako induktor produkcie červených krviniek, antianemický prípravok a podobne. Množstvo, ktoré tvorí terapeuticky účinné množstvo, sa bude meniť v závislosti od proteínového derivátu, chorobného stavu alebo choroby a ich závažnosti a od ošetrovaného cicavca, jeho hmotnosti, veku a podobne, ale môže sa určiť rutinne odborníkom s ohľadom na súčasné znalosti a tento opis. Ako sa v tomto texte používa, termín q.S. znamená pridanie množstva dostatočného na dosiahnutie uvedenej funkcie, napr. doplniť roztok na požadovaný objem (napr. 100 ml).

Polyméme modifikované syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu podľa tohto vynálezu a ich farmaceutický prijateľné soli, t.j. účinná zložka, sa podajú v terapeuticky účinnej dávke, t.j. vtákom množstve, ktoré, keď sa podáva cicavcovi, ktorý to potrebuje, je dostatočné na uskutočnenie liečby, ako bolo opísané vyššie. Syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu, opísané v tomto texte, sa môžu podávať prostredníctvom ktorýchkoľvek prijímaných spôsobov podávania prípravkov, ktoré slúžia na podobné použitie. Ako sa v tomto texte používa, termíny polyméme modifikované syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu podľa tohto vynálezu”, (farmaceutický prijateľné soli) polypeptidov podľa vynálezu” a účinná zložka” sa používajú zameniteľné.

Hladina polyméme modifikovaných syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu sa vo formulácii môže meniť v plnom rozsahu používanom odborníkmi, napr. približne od 0,01 hmotn. % (% hmotnosti) do približne 99,99 hmotn. % proteínového antagonistu alebo agonistu na základe celkovej formulácie a približne 0,01 hmotn. % až 99,99 hmotn. % excipientu. Typickejšie, polyméme modifikované syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu budú prítomné v hladine približne 0,5 hmotn. % až približne 80

PP 0277-2003

32081/T hmotn. %.

Zatiaľ čo humánne hladiny dávky sa musia ešte pre polymérne modifikované syntetické proteiny stimulujúce erytropoézu podľa vynálezu optimalizovať, všeobecne množstvo podávanej zlúčeniny je samozrejme závislé od pacienta a chorobného stavu cieleného na prevenciu alebo úľavu, povahy alebo závažnosti utrpenia, spôsobu a schémy podávania a úsudku predpisujúceho lekára. Takáto optimalizácia použitia závisí od schopností odborníka.

Podávanie môže byť prostredníctvom ktoréhokoľvek prijateľného systémového alebo lokálneho spôsobu, napríklad parenterálne, perorálne (konkrétne formulácie určené pre malé deti), intravenózne, nazálnym spôsobom, bronchiálnou inhaláciou (t.j. aerosólová formulácia), transdermálnym alebo topickým spôsobom, vo forme pevnej, polotuhej alebo tekutej alebo aerosólovej liekovej forme, ako sú napríklad tablety, pilulky, tobolky, prášky, kvapaliny, roztoky, emulzie, prípravky pre injekcie, suspenzie, čipky, aerosóly a podobne. Polymérne modifikované syntetické proteiny stimulujúce erytropoézu podľa vynálezu sa môžu tiež podávať v liekových formách s predĺženým uvoľňovaním alebo s riadeným uvoľňovaním liekovej formy, vrátane depotných injekcií, osmotických púmp, piluliek, transdermálnych (vrátane elektrotransportu) náplastí a podobne, na predĺžené podávanie polypeptidu predurčenou rýchlosťou, výhodne v jednotkových liekových formách vhodných na jedno podávanie presných dávok. Prípravky zahrňujú bežný farmaceutický nosič alebo excipient a antagonistu alebo agonistu proteínu podľa vynálezu a okrem toho môžu zahrňovať ďalšie liečivé prípravky, farmaceutické prípravky, nosiče, adjuvans a podobne. Nosiče sa môžu vybrať z rôznych olejov, vrátane minerálneho (ropného), zvieracieho, rastlinného alebo syntetického pôvodu, napríklad arašidový olej, sójový olej, minerálny olej, sezamový olej a podobne. Voda, fyziologický roztok, vodná dextróza a glykoly sú výhodné tekuté nosiče, konkrétne pre injekčné roztoky. Vhodné

PP 0277-2003

32081/T farmaceutické nosiče zahrňujú škrob, celulózu, mastenec, glukózu, laktózu, sacharózu, želatínu, sladidlo, ryžu, múku, kriedu, silikagél, stearát horečnatý, stearát sodný, glycerol monostearát, chlorid sodný, sušené odtučnené mlieko, glycerol, propylénglykol, vodu, etanol a podobne. Ďalšie vhodné farmaceutické nosiče a ich formulácie sú opísané v Remington’s Pharmaceuticaí Sciences od autora E. W. Martina.

Ak je to žiaduce, podávaný farmaceutický prípravok môže tiež obsahovať menšie množstvo netoxických pomocných látok, ako sú napríklad zmáčadlá alebo emulgátory, pH pufrovacie činidlá a podobne, ako je acetát sodný, sorbitan monolaurát, trietanolaminooleát a podobne.

Hoci sa môžu požadovať viac účinné zložky, môže sa použiť perorálne podávanie kvôli aplikácii polymérne modifikovaných syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu podľa vynálezu s použitím vhodnej dennej dávkovacej schémy, ktorá sa môže upraviť podľa požadovaného stupňa prevencie alebo na zmiernenie utrpenia. Na takéto perorálne podávanie sa farmaceutický prijateľný netoxický prípravok vytvorí inkorporáciou ktoréhokoľvek z normálne používaných excipientov, ako napríklad na základe farmaceutického stupňa čistoty manitol, laktóza, škrob, povidón, stearát horečnatý, sacharín sodný, mastenec, celulóza, kroskarmelóza sodná, glukóza, želatína, sacharóza, uhličitan horečnatý a podobne. Takéto prípravky majú formu roztokov, suspenzií, dispergovateľných tabliet, piluliek, toboliek, práškov, s formuláciou predĺženým uvoľňovaním a podobne. Perorálne formulácie sú obzvlášť vhodné na liečbu gastrointestinálnych chorobných stavov. Perorálna biologická dostupnosť pre všeobecné systémové účely sa môže upraviť s využitím excipientov, ktoré zlepšia vychytávanie do systémovej cirkulácie, ako napríklad formulácie obsahujúce acetylované aminokyseliny (pozri napríklad patent Spojených štátov 5 935 601 a patent Spojených štátov 5 629 020).

PP 0277-2003

32081/T

Prípravky môžu mať formu tobolky, pilulky alebo tablety, a tak prípravok obsahuje spolu s účinnou zložkou riedidlo, ako je napríklad laktóza, sacharóza, fosfát vápenatý a podobne, rozvoľňovadlo, ako je napríklad kroskarmelóza sodná, škrob alebo ich deriváty, lubrikant, ako je napríklad stearát horečnatý a podobne, a spojivo, ako je napríklad škrob, polyvinylpyrolidón, arabská guma, želatína, celulóza a ich deriváty a podobne.

Kvapalné farmaceutický aplikovateľné prípravky sa môžu napríklad pripraviť rozpustením, disperziou a podobne polyméme modifikovaných syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu podľa vynálezu (približne 0,5 % až približne 20 %) a voliteľných farmaceutických adjuvans v nosičoch, ako je napríklad voda, fyziologický roztok, vodná dextróza, glycerol, glykoly, etanol, konzervačné činidlá a podobne, a tým vytvorí roztok alebo suspenziu. Ak je to žiaduce, podávaný farmaceutický prípravok môže tiež obsahovať menšie množstvo netoxických pomocných látok, ako sú napríklad zmáčadlá, suspendujúce činidlá, emulgátory alebo solubilizačné činidlá, pH pufry a podobne, napríklad acetát sodný, citrát sodný, cyklodextrínové deriváty, polyoxyetylén, sorbitan monolaurát alebo stearát a podobne. Účinné spôsoby prípravy takýchto liekových foriem sú odborníkom známe alebo sú im zjavné, napríklad pozri Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pensylvania. Podávaný prípravok alebo formulácia bude pri každej príležitosti obsahovať množstvo účinnej zložky v množstve účinnom na prevenciu alebo zmiernenie symptómov liečeného pacienta. Na perorálne podávanie deťom je výhodná kvapalná formulácia (ako je napríklad sirup alebo suspenzia).

Pre pevnú liekovú formu obsahujúcu kvapalinu, roztok alebo suspenziu, napríklad propylénkarbonát, rastlinné oleje alebo triglyceridy, je výhodné opuzdrenie v želatínovej tobolke. Pre kvapalnú liekovú formu roztok, napríklad polyetylénglykolu, sa môže nariediť dostatočným množstvom farmaceutický prijateľného tekutého nosiča, napr. vody, ktorý je ľahko merateľný kvôli podávaniu.

Alternatívne, kvapalné alebo polotuhé perorálne formulácie sa môžu

P P 0277-2003

32081π pripraviť rozpustením alebo disperziou účinnej zložky v rastlinných olejoch, glykoloch, triglyceridoch, propylénglykolesteroch (napr. propylénkarbonát) a podobne a opuzdrením týchto roztokov alebo suspenzií v tvrdých alebo mäkkých želatínových tobolkách.

Pri použití polyméme modifikovaných syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu podľa tohto vynálezu na liečbu vyššie uvedených chorobných stavov sa účinné zložky opísané v tomto texte výhodne podávajú parenterálne. Parenterálne podávanie je všeobecne charakterizované injekciou, buď subkutánne, intramuskulárne alebo intravenózne a môže zahrňovať intradermálne alebo intraperitoneálne injekcie, a tiež injekcie do sterna alebo infúzne techniky. Prípravky pre injekcie sa môžu pripraviť v bežných formách, buď ako kvapalné roztoky alebo suspenzie, pevné formy vhodné na vytvorenie roztoku alebo suspenzie v kvapaline pred injekciou, ako emulzie alebo v biologicky kompatibilných na polyméri založených mikrosférach (napr. lipozómy, deriváty polyetylénglykolu, poly(D,C)laktid a podobne). Vhodné excipienty sú napríklad voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, etanol a podobne. Okrem toho, ak je to žiaduce, podávané farmaceutické prípravky môžu tiež obsahovať menšie množstvo netoxických pomocných látok, ako sú napríklad zmáčadlá alebo emulgátory, pH pufry, zosilňovače rozpustnosti, proteínové nosiče a podobne, ako je napríklad acetát sodný, polyoxyetylén, sorbitan monolaurát, trietanolaminoleát, cyklodextríny, sérový albumín a podobne.

Polyméme modifikované syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu podľa predloženého vynálezu sa môžu podávať parenterálne, napríklad rozpustením zlúčeniny vo vhodnom rozpúšťadle (ako je napríklad voda alebo fyziologický roztok) alebo inkorporáciou v lipozomálnej formulácii nasledovanej disperziou do prijateľnej infúznej tekutiny. Typická denná dávka polypeptidu podľa vynálezu sa môže podávať jednou infúziou alebo sériou infúzií prerušených periodickými intervalmi. Na parenterálne podávanie sú obzvlášť vhodné vodné roztoky účinnej zložky vo forme vo vode rozpustnej, napríklad vo forme soli rozpustnej vo vode alebo vodných injekčných suspenziách, ktoré

PP 0277-2003

32081/T obsahujú látky zvyšujúce viskozitu, napríklad karboxymetylcelulózu sodnú, sorbitol a/alebo dextrán, a ak je to žiaduce, stabilizátory. Účinná zložka, voliteľne spolu s excipientmi, môže tiež byť vo forme lyofilizátu a môže byť pretvorená do roztoku pred parenterálnym podávaním pridaním vhodných rozpúšťadiel.

Novšie vynájdený prístup parenterálneho podávania používa implantáciu systému s pomalým uvoľňovaním alebo s predĺženým uvoľňovaním tak, že sa udržiava konštantná hladina dávky (pozri napr. patent Spojených štátov 3 710 795, patent Spojených štátov 5 714 166 a patent Spojených štátov 5 041 292, ktoré sú týmto zahrnuté ako odkaz).

Percento účinnej zložky obsiahnutej v takýchto parenterálnych prípravkoch je veľmi závislé od ich špecifickej povahy, a tiež od aktivity polypeptidu a potrieb pacienta. Avšak použiteľné percento účinnej zložky je od 0,01 % do 10 % v roztoku a bude vyššie, ak prípravok je pevná látka, ktorá sa nasledovne nariedi na vyššie uvedené percentá. Výhodne prípravok zahrňuje 0,02 až 8 % účinnej zložky v roztoku.

Ďalší spôsob podávania polymérne modifikovaných syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu podľa vynálezu používa injekcie bolusu a kontinuálnu infúziu.

Podávanie aerosólu je účinným prostriedkom aplikácie polymérne modifikovaných syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu podľa vynálezu priamo do respiračného traktu. Niektoré výhody tohto spôsobu sú: 1) obchádza pôsobenie enzymatickej degradácie, zlú absorpciu z gastrointestinálneho traktu alebo stratu terapeutického prípravku po prvom priechode pečeňou, 2) podáva účinné zložky, ktoré by inak zlyhali pri dosiahnutí svojich cieľových miest v respiračnom trakte kvôli svojej molekulárnej veľkosti, náboju alebo afinite k extrapulmonárnym miestam, 3) poskytuje rýchlu absorpciu do organizmu prostredníctvom pľúcnych alveol a 4) zabráni vystaveniu ďalších orgánových systémov účinnej zložke, čo je dôležité tam, kde by expozícia mohla spôsobiť nežiaduce vedľajšie účinky. Z týchto dôvodov je podávanie aerosólu obzvlášť výhodné na liečenie astmy, lokálnych pľúcnych

PP 0277-2003

32081/T infekcií a ostatných chorôb alebo chorobných stavov pľúc a respiračného traktu.

Existujú tri typy farmaceutických inhalačných zariadení, nebulizačné inhalátory, inhalátory s odmeranými dávkami a inhalátory suchého prášku. Nebulizačné zariadenia produkujú prúd vzduchu s vysokou rýchlosťou, ktorý spôsobí, že proteínový derivát (ktorý je formulovaný v kvapalnej forme), sá rozstrekuje ako hmla, ktorá je nesená do pacientovho respiračného traktu. Inhalátory s odmeranými dávkami majú typicky formuláciu balenú so stlačeným plynom a pri uvedení do chodu vypustí odmerané množstvo polypeptidu stlačeným plynom, a tým umožní spoľahlivý spôsob podávania nastaveného množstva prípravku. Inhalátory suchého prášku podávajú polypeptid vo forme voľne plynúceho prášku, ktorý sa môže zariadením dispergovať do pacientových dýchacích ciest v priebehu dýchania. Aby sa dosiahol voľne plynúci prášok, proteínový derivát sa formuluje s excipientom, ako je napríklad laktóza. Odmerané množstvo proteínového derivátu je uložené vtobolkovej forme a dávkuje sa pacientovi pri každom uvedení do chodu. Všetky vyššie uvedené metódy sa môžu použiť na podávanie podľa predloženého vynálezu.

Farmaceutické formulácie založené na lipozómoch sú tiež vhodné na použitie s polymérne modifikovanými syntetickými proteínmi stimulujúcimi erytropoézu podľa tohto vynálezu (pozri napr. patent Spojených štátov č. 5 631 018, patenty Spojených štátov č. 5 723 147 a 5 766 627). Predpokladá sa, že výhody lipozómov sú vo vzťahu k výhodným zmenám v tkanivovej distribúcii a farmakokinetických parametroch, ktoré vyplývajú z lipozómového zachytávania liekov a môžu sa aplikovať na polypeptidy podľa predloženého vynálezu odborníkmi. Môžu sa tiež použiť lipozómové kvapalné farmaceutické formulácie pre injekciu alebo perorálne podávanie s riadeným uvoľňovaním.

PP 0277-2003

32081/T

Čapíky, tradičné spojivá a nosiče pre systémové podávanie zahrňujú napríklad polyetylénglykoly alebo triglyceridy, napríklad PEG 1000 (96 %) a PEG 4000 (4 %). Tieto čapíky sa môžu vytvoriť zo zmesí obsahujúcich účinnú zložku v rozsahu približne od 0,5 hmotn. % do približne 10 hmotn. %, výhodne približne od 1 hmotn % do približne 2 hmotn. %.

Všetky publikácie a patentové prihlášky citované v tomto opise sú v tomto texte zahrnuté formou odkazu v rovnakom rozsahu, ako by každá individuálna publikácia alebo patentová prihláška boli špecificky a individuálne zahrnuté formou odkazu. Teraz po všeobecne opísanom vynáleze nasledujú kvôli lepšiemu pochopeniu príklady, ktoré sú ilustratívne a nemyslia sa ako obmedzenie predloženého vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázky 1A - 1E zobrazujú schémy spôsobov prípravy polymérne modifikovaných syntetických proteinov stimulujúcich erytropoézu podľa vynálezu.

Obrázky 2A - 2C zobrazujú schémy spôsobov prípravy syntetických proteinov stimulujúcich erytropoézu podľa vynálezu.

Obrázky 3A - 3B zobrazujú schémy procesu multi-segmentových ligácií, ktorý zahrňuje chemickú ligáciu troch alebo viacerých neprekrývajúcich sa peptidových segmentov, t.j. aspoň jeden segment je prostredný segment zodpovedajúci konečnému kompletnému ligačnému produktu.

Obrázky 4A - 4C ilustrujú natívnu chemickú ligáciu a chemickú modifikáciu výsledného tiolového bočného reťazca.

Obrázky 5A - 5B zobrazujú postup tvorby na pevnej fáze rozvetveného jadra (B) a unikátne chemoselektivne funkčné skupiny (U) polyméru rozpustného vo vode U-B-Polymér-J* podľa vynálezu.

PP 0277-2003

32081/T

Obrázky 6A - 6D zobrazujú postup tvorby na pevnej fáze výhodných v podstate neantigénnych vo vode rozpustných polyamidových zložiek Polyméru-J* podľa vynálezu kvôli následnému pripojeniu k U-B jadru.

Obrázok 7 ukazuje postup kondenzácie U-B zložky k zložke Polymér-J* za vzniku výhodných syntetických polymémych konštruktov podľa vynálezu vzorca U-B-Polymér-J*.

Obrázok 8 ukazuje alternatívny spôsob presného pripojenia polyméru rozpustného vo vode k peptidovému segmentu použiteľnému na ligáciu a produkciu syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu podľa vynálezu.

Obrázok 9 ukazuje celkový postup prípravy syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu podľa predloženého vynálezu.

Obrázok 10 ukazuje základnú štruktúru výhodného typu syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu. pPEG = presný PEG.

Obrázok 11 ukazuje všeobecnú štruktúru cirkulárne permutovaných SEP analógov majúcich presunuté amino- a karboxy-konce.

Obrázok 12 ukazuje štruktúru výhodného polyméru rozpustného vo vode a jeho rôznych lineárnych a rozvetvených konštruktov.

Obrázok 13 ukazuje schematicky tvorbu pPEG polymérov s rozvetveným reťazcom.

Obrázok 14 ukazuje syntézu syntetického cytokínu nazývaného SEP1L30, ktorý je presný polymérne modifikovaný syntetický analóg humánneho EPO, pripravený ako bolo opísané v príklade 2.

Obrázok 15 ukazuje syntetický cytokín nazývaný SEP1-L30, ktorý je presný polymérne modifikovaný syntetický analóg humánneho EPO, pripravený ako bolo opísané v príklade 2.

PP 0277-2003

32081/T

Obrázok 16 ukazuje syntetický cytokín nazývaný SEP1-L26, ktorý je presný polymérne modifikovaný syntetický analóg humánneho EPO, pripravený ako bolo opísané v príklade 3.

Obrázok 17 ukazuje schematicky tvorbu výhodného polyméru s rozvetveným reťazcom, rozpustného vo vode, ktorý je pripojený k syntetickému cytokínu nazývanému SEP1-B50, ktorý je presný polymérne modifikovaný syntetický analóg humánneho EPO, pripravený ako bolo opísané v príklade 4.

Obrázok 18 ukazuje syntetický cytokín nazývaný SEP1-B50, ktorý je presný polymérne modifikovaný syntetický analóg humánneho EPO, pripravený ako bolo opísané v príklade 4.

Obrázok 19 ukazuje syntézu syntetického cytokínu nazývaného SEP3L42, ktorý je presný polymérne modifikovaný syntetický analóg humánneho EPO, pripravený ako bolo opísané v príklade 5.

Obrázok 20 ukazuje syntetický cytokín nazývaný SEP3-L42, ktorý je presný polymérne modifikovaný syntetický analóg humánneho EPO, pripravený ako bolo opísané v príklade 5.

Obrázok 21 ukazuje syntézu výhodného polyméru rozpustného vo vode na pripojenie k syntetickému cytokínu nazývanému SEP1- B51, ktorý je presný polymérne modifikovaný syntetický analóg humánneho EPO, pripravený ako bolo opísané v príklade 7.

Obrázok 22 ukazuje syntetický cytokín nazývaný SEP1-B51, ktorý je presný polymérne modifikovaný syntetický analóg humánneho EPO, pripravený ako bolo opísané v príklade 7.

Obrázok 23 ukazuje syntézu výhodného polyméru rozpustného vo vode na pripojenie k syntetickému cytokínu nazývanému SEP1-B52, ktorý je presný polymérne modifikovaný syntetický analóg humánneho EPO, pripravený ako bolo opísané v príklade 8,

Obrázok 24 ukazuje syntetický cytokín nazývaný SEP1-B52, ktorý je

PP 0277-2003

32081/T presný polyméme modifikovaný syntetický analóg humánneho EPO, pripravený ako bolo opísané v príklade 8.

Obrázok 25 ukazuje reprezentatívne analytické dáta pre presné polyméme modifikované syntetické analógy humánneho EPO, pripravené ako bolo opísané v príkladoch 2 - 5 a 7 - 8. , Ako je ukázané, reprezentatívny gél izoelektrického zaostrovania” (isoelectric focusing”, IEF) a neredukčný SDSPAGE gél demonštrujú relatívnu monomérnu molekulovú hmotnosť zvinutého purifikovaného SEP1-B51.

Obrázok 26 ukazuje in vitro aktivitu bunkovej línie závislej od faktoru SEP zlúčenín SEPO, SEP1-L26, SEP1-L30, SEP1-B50, SEP1-B51 a SEP3L42.

Obrázok 27 ukazuje reprezentatívny farmakokinetický profil porovnaním plazmatickej koncentrácie v nanogramóch na mililiter (ng/ml) SEP3-L42 a SEP1-B50 oproti času v hodinách.

Obrázok 28 ukazuje analýzu lineárnej regresie in vivo aktivity, ako sa merala 72 - hodinovým vychytávaním ⁵⁹Fe červenými krvinkami (RBC) (ako % dávky) pre SEP1-B51 a rekombinantný glykozylovaný humánny erytropoetín vytvorený v CHO bunkách (rhEPO”) v hypoxickom modeli laboratórnych potkanov.

Obrázok 29 ukazuje reprezentatívny farmakokinetický profil pre clearanciu u laboratórnych potkanov porovnaním plazmatickej koncentrácie v ng/ml SEP1-B51 a rhEPO proti času v hodinách po jednej i.v. dávke 5 μg/kg pre každú zlúčeninu.

Obrázok 30 ukazuje cirkulárne permutovaný, polyméme modifikovaný SEP konštrukt.

PP 0277-2003

32081/T

Príklady uskutočnenia vynálezu

Skratky používané v príkladoch

Acm = acetamidometyltiolová chrániaca skupina (t.j. -CH₂NHCOCH₃)

AoA = aminooxyacetylová skupina

Arg (Tos) = L-arginín (bočný reťazec chránený N^G toluénsulfonylovou skupinou)

ART = absolútne množstvo retikulocytov

Asp(cHex) = L-asparágová kyselina (bočný reťazec chránený cyklohexylesterom)

AUC = oblasť pod krivkou

Boe = terc-butoxykarbonylová skupina

CD = cirkulárny dichroizmus

CDI = karbonyldiimidiazol

CHO = vaječníky čínskeho škrečka

CL = clearancia (ml/h/kg)

Cmax = maximálna koncentrácia

Cys (4 MeBzl) = L-cysteín (bočný reťazec chránený (4-metyl)benzylovou skupinou)

Cys(Acm) = L-cysteín (bočný reťazec chránený acetamidometylovou skupinou (t.j. -CH₂NHCOCH₃-))

DCM = dichlórmetán

PP 0277-2003

32081Π

DIC = diizopropylkarbodiimid

DIEA = diizopropyletylamín

DMF = dimetylformamid

DMSO = dimetylsulfoxid

DPC = dodecylfosfocholín

Dpr = L-1,2-diaminopropiónová kyselina

ED50 = účinná dávka vyžadovaná na dosiahnutie 50 % maximálneho účinku

EDA = (4,7,10)-trioxatridekán-1,13-diamín

ELISA = enzýmová imunoanalýza s viazaným enzýmom

EPO = erytropoetín

ES - MS = elektrosprejová ionizačná hmotnostná spektrometria

FBS = fetálne bovinné sérum

Glu(cHex) = L-glutámová kyselina (bočný reťazec chránený cyklohexylesterom)

GM-CSF = faktor stimulujúci kolónie granulocytov a makrofágov

HATU = O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1_l3,3-tetrametylamóniumhexafluórfosfát

HCT = hematokrit

HGB = hemoglobín

His(Dnp) = L-histidín (bočný reťazec chránený N^1m dinitrofenylovou skupinou)

HOBT = N-hydroxybenzotriazol

HPLC = vysokotlaková kvapalinová chromatografia

IMDM = Dulbeccovo médium modifikované Iscovom

PP 0277-2003

32081/T

ΙΡΑ = izopropanol

Lev = levulová kyselina

Lys(CIZ) = L-lyzín (bočný reťazec chránený 2-chlórbenzyloxykarbonylovou skupinou)

MBHA = 4-metylbenzhydrylamín

MRT = priemerná doba zdržania

MTT = 4-metyltrityl

MTT = tiazolylová modrá

NHS = N-hydroxysukcínimid

-OCH2-Pam-živica = -O-CH2-BZ-CH2CONHCH2 (kopolystyréndivinylbenzén) živica

Pbo = 4-(CH₃S (O)-)-benzylová skupina

PBS = fyziologický roztok pufrovaný fosfátmi

PCV = kompaktný bunkový objem

RBC = červená krvinka

RET = retikulocyt

RhEPO = rekombinantný humánny EPO

RSA = sérový albumín laboratórneho potkana

I

SDS = dodecylsulfát sodný

SDS-PAGE = elektroforéza v SDS-polyakrylamidovom géli

SEP = syntetický proteín erytropoézy

Ser (Bzl) = L-serín (bočný reťazec chránený benzylovou skupinou)

PP 0277-2003

32081/T

Príklad 1

Syntéza syntetického proteinu stimulujúceho erytropoézu SEP-0

Syntetizoval sa syntetický proteín stimulujúci erytropoézu (SEP).

Sekvencia kompletného syntetizovaného proteinu (nazývaného ”SEP-0 (1 166)” je:

APPRLICDSR

VPDTKVNFYA

LVKSSQPWTP

PPDAASAAPL

VLERYLLEAK WKRMEVGQQA LQLHVDKAVS RTITADTFRK

EAEKITTGCA VEVWQGLALL GLRSLTTLLR LFRVYSNFLR

EHCSLNEKIT

SEAVLRGQAL

ALGAQKTAIS

GKLKLYTGEA

CRTGDR (sekv. id. č.: 1) kde Ψ označuje neprirodzený aminokyselinový zvyšok, ktorý tvorí cysteín, ktorý je karboxymetylovaný v sulfhydrylovej skupine. Proteín SEP-0 sa syntetizoval v roztoku zo štyroch polypeptidových segmentov:

Segment SEP-0:1 (GRFN 1711, skladá sa zo zvyškov 1 - 32 sekv. id. č. 1)

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-tioester

Segment SEP-0:2 (GRFN 1712, sa skladá zo zvyškov 33 - 88 sekv. id. č.: 1 ): CSLNEKITVP DTKVNFYAWK RMEVGQQAVE VWQGLALLSE AVLRGQALLV KSSQPW-tioester (kde Cys³³ je chránený Acm)

Segment SEP-0:3 (GRFN 1713, skladá sa zo zvyškov 89-116 sekv. id. č.: 1):

CPLQLHVDKA VSGLRSLTTL LRALGAQK-tioester (kde Cys je chránený Acm)

PP 0277-2003

32081/T

Segment SEP-0:4 (GRFN 1714, skladá sa zo zvyškov 117 -166 sekv. id. č.: 1):

CAISPPDAAS AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY

TGEACRTGDR-karboxylát (kde C-koncový cysteín (Cys¹⁶¹) nesie pikolylovú (piko) chrániacu skupinu)

Peptidy SEP-0:1, SEP-0:2 a SEP-0:3 sa syntetizovali na živici vytvárajúcej tioester podľa in situ neutralizačného protokolu pre Boe (tercbutoxykarbonylová skupina) chemický postup a stupňovitú syntézu peptidov na pevnej fáze (SPPS) s použitím zavedených stratégií SPPS, ochrany bočného reťazca a tioesterovej živice (Hackeng a kol., PNAS, 1999, 96, 10 068 - 10 073 a Schnólzer a kol., Int. J. Pept. Prot. Res., 1992, 40, 180 - 193)) na AB1433A automatizovanom peptidovom syntetizátore alebo ručným zostavením reťazca alebo sa objednali a zakúpili od komerčných predajcov. Napríklad sa použil štandardný súbor Boe SPPS chrániacich skupín, najmä: Arg (Tos), Asp (cHex), Cys (4MeBzl) a Cys (Acm), Glu (cHex), His (DNP), Lys (CIZ), Ser (Bzl), Thr (Bzl), Trp (formylová skupina), Tyr (BrZ), Met, Asn, Gin s nechránenými bočnými reťazcami. Segment SEP-0:4 sa syntetizoval analogicky na -OCH2Pam-živici. Peptidy sa zbavili chrániacich skupín a súčasne odštiepili zo živice s použitím HF/p-krezolu podľa štandardného Boe chemického postupu, avšak u peptidov obsahujúcich chrániace skupiny, ktoré sa neodstránili v HF/p-krezole, sa chrániace skupiny udržali. Peptidy sa purifikovali preparatívnou C4 vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) s prevráteným pomerom fáz. Frakcie obsahujúce čistý peptid sa identifikovali s použitím ES-MS (elektrosprejová ionizačná hmotnostná spektrometria), zlúčili a lyofilizovali kvôli následnej ligácii.

PP 0277-2003

32081/T

Krok 1: Ligácia č. 1

Segment SEP-0:4 a segment SEP-0:3 sa rozpustili v TFE v 15 mM koncentrácii. Pridal sa saturovaný fosfátový pufor (pH 7,9) obsahujúci 6M guanidíniumchlorid a 1 % tiofenol za vzniku číreho roztoku peptidových segmentov. Po ligácii sa ligačná zmes pridala k roztoku 2 ml TFE (trifluóretanol), 6 ml 6M guanidíniumchloridu, 100 mM fosfátu obsahujúceho 25 % β-merkaptoetanol a inkubovala počas 20 minút. Roztok sa acidifikoval roztokom 15 mg/ml TCEP (tris-(2-karboxyetyl)fosfín.HCI) v ľadovej octovej kyseline a naniesol na preparatívnu C4 kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz (priemer 2,54 cm, 1 palec). Peptidy sa potom purifikovali preparatívnym gradientom HPLC s prevráteným pomerom fáz. Frakcie obsahujúce požadovaný ligačný produkt SEP-O.Acm + SEP-0:3 + SEP-0:4 sa identifikovali ES-MS a zlúčili.

Krok 2: Odstránenie Acm č. 1

Kvôli odstráneniu Acm sa vodný roztok acetonitrilu obsahujúci zlúčené frakcie SEP-0:Acm + SEP-0:3 + SEP-0:4 nariedil 1x vodou v kvalite pre HPLC a do konečnej koncentrácie 2M sa pridala pevná močovina. Pridal sa trojnásobný molárny nadbytok (relatívny k celkovej očakávanej koncentrácii cysteínu) 30 mg/ml roztoku Hg(acetát)₂ v 3 % vodnej kyseline octovej a roztok sa miešal počas jednej hodiny. Roztok sa potom nariedil na 20 % β-markaptoetanolom, naniesol na semipreparativnu kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz a purifikoval stupňovým gradientom. Frakcie obsahujúce požadovaný produkt SEP-0:3 SEP-0:4 sa identifikovali ES-MS a lyofilizovali cez noc.

Krok 3: Ligácia č. 2

Rovnaké množstvá SEP-0:3 + SEP-0:4 a SEP-0:2 sa spoločne rozpustili v čistom TFE v 15 mM koncentrácii. 250 mM fosfátový pufor (pH 7,5) obsahujúci 6M guanidíniumchlorid a 1 % tiofenol sa pridal za vzniku číreho

PP 0277-2003

32081/T

100 roztoku peptidových segmentov. Po jednom dni ligácie sa ligačná zmes pridala k roztoku 10 ml TFE, 10 ml β-merkaptoetanolu, 10 ml piperidínu a 20 ml 6M guanidíniumchloridu, pH 4 a inkubovala počas 20 minút, aby sa odstránili všetky zvyšné chrániace skupiny. Roztok sa acidifikoval roztokom 15 mg/ml TCEP v 20 % vodnej. kyseline octovej, naniesol na preparatívnu kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz a purifikoval lineárnym gradientom. Frakcie obsahujúce požadovaný ligačný produkt SEP-0:Acm + SEP-0.2 + SEP-0.3 + SEP-0:4 sa identifikovali ES-MS a lyofilizovali cez noc.

Krok 4: Karboxymetylácia

SEP-0:Acm + SEP-0:2 + SEP-0:3 + SEP-0:4 sa rozpustili v TFE v 15 mM koncentrácii. Dvojnásobný nadbytok (objem/objem) 200 mM fosfátového pufra (pH 7,9) obsahujúceho 6M guanidíniumchlorid sa pridal za vzniku číreho roztoku peptidového segmentu. Pridal sa 25-násobný nadbytok brómoctovej kyseliny rozpustenej v minimálnom množstve metanolu a roztok sa nechal reagovať počas 2 hodín. Roztok sa acidifikoval roztokom 15 mg/ml TCEP v 20 % vodnej kyseline octovej, naniesol na preparatívnu kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz a purifikoval stupňovým gradientom. Frakcie obsahujúce požadovaný karboxymetylovaný produkt SEP-0:Acm + SEP-0:2 + SEP-0:3 + SEP-0:4 + Et sa identifikovali ES-MS a zlúčili.

Krok 5: Odstránenie pikólylovej skupiny

Zinkový prach sa aktivoval v 2M HCI počas 30 minút. Peptid SEP-0:Acm + SEP-0.2 + SEP-0.3 + SEP-0:4 + Et sa rozpustil v čistom TFE v približne 10 mg/ml koncentrácii. Roztok sa nariedil 4x (objem/objem relatívne k TFE) 6M guanidíniumchloridom, 100 mM acetátom, pH 4, obsahujúcim (čerstvo pridaný) 35 mg/ml L-metionínu a 35 mg/ml dodecylsarkozínu (t.j. N-dodekanoylsarkozín sodný). Roztok sa pridal k aktivovanému Zn prášku. Reakcia sa monitorovala

PP 0277-2003

29ΛΑ1ΓΓ

101 v intervaloch asi 1 hodinu a kompletná bola po piatich hodinách. Po skončení sa supernatant odstránil a zvyšný Zn prášok sa dvakrát premyl počas piatich minút 6M guanidíniumchloridom, pH 4, 100 mM acetátom obsahujúcim 35 mg/ml L-metionínu a 35 mg/ml dodecylsarkozínu obsahujúceho 20 % TFE, a tiež raz rovnakým roztokom obsahujúcim 20 % β-merkaptoetahol, Spojené produkty sa acidifikovali roztokom 15 mg/ml TCEP v 20 % vodnej kyseline octovej, naniesli na preparatívnu kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz a purifikovali stupňovým gradientom. Frakcie obsahujúce požadovaný modifikovaný produkt SEP-0:Acm + SEP-0:2 + SEP-0:3 + SEP-0:4 + Et-Piko sa identifikovali ES-MS a zlúčili.

Krok 6: Odstránenie Acm č. 2

Zlúčený roztok SEP-0:Acm + SEP-0:2 + SEP-0:3 + SEP-0:4 + Et-Piko sa nariedil 3x vodou v kvalite pre HPLC a pevná močovina sa pridala do konečnej koncentrácie 2M. Pridal sa trojnásobný molárny nadbytok (relatívny k celkovej očakávanej koncentrácii cysteínu) 30 mg/ml roztoku Hg(acetát)₂ v 3 % vodnej kyseline octovej a roztok sa miešal počas jednej hodiny. Roztok sa potom nariedil na 20 % β-markaptoetanolom, naniesol na semipreparatívnu kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz a purifikoval stupňovým gradientom. Frakcie obsahujúce požadovaný produkt SEP-0:2 + SEP-0:3 + SEP-0:4 + Et-Piko sa identifikovali ES-MS, nariedili 2x (objem/objem) vodou obsahujúcou 2x (hmotnosť/hmotnosť relatívne k peptidovej hmote) DPC (dodecylfosfocholin) a lyofilizovali cez noc.

Krok 7: Ligácia č. 3

Rovnaké množstvá SEP-0:2 + SEP-0:3 + SEP-0:4 + Et-Piko a SEP-0:1 sa spoločne rozpustili v čistom TFE v 15 mM koncentrácii a pridal sa 250 mM fosfátový pufor (pH 7,5) obsahujúci 6M guanidíniumchlorid. K roztoku sa pridal 1 % tiofenol. Po jednom dni ligácie sa ligačná zmes pridala k roztoku 10 ml

PP 0277-2003

32081/T

102

TFE, 10 ml β-merkaptoetanolu, 10 ml piperidínu a 20 ml 6M guanidíniumchloridu, pH 4, a inkubovala počas 20 minút, aby sa odstránili zvyšné chrániace skupiny. Roztok sa acidifikoval roztokom 15 mg/ml TCEP v 20 % vodnej kyseline octovej, naniesol na preparatívnu kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz a purifikoval lineárnym gradientom. Frakcie obsahujúce požadovaný ligačný produkt SEP-0 (1 - 166): (sekv. id. č.: 1) sa identifikovali elektrosprejovou hmotnostnou spektrometriou, nariedili 2x (objem/objem) vodou obsahujúcou 2x (hmotnosť/hmotnosť relatívne k peptidovej hmote) dodecylsarkozínu a lyofilizovali.

Krok 8: Zvinutie

Kompletný ligovaný peptid SEP-0 (1 - 166) sa rozpustil v 200 mM Tris pufra (pH 8,7) obsahujúcom 6 M guanidíniumchlorid a 20 % TFE a desaťnásobný molámy nadbytok (relatívny k Cys zvyškom v proteíne) cysteínu. Tento roztok sa dialyzoval cez noc proti roztoku 200 mM Tris pufra (pH 8,7) obsahujúcemu 3M guanidíniumchlorid pri teplote miestnosti. Roztok sa potom dialyzoval proti roztoku 200 mM Tris pufra (pH 8,7) obsahujúceho 1M guanidíniumchlorid pri teplote miestnosti počas 4 hodín v 4 °C a konečne proti 10 mM fosfátovému pufru (pH 7,0) počas 4 hodín v 4 °C za vzniku konečného zvinutého produktu. Zvinutie sa overilo elektrosprejovou ES-MS a CD (cirkulárny dichroizmus) spektrometriou.

Krok 9: Purifikáčia ' Zvinutý polypeptid sa koncentroval 5x vo fľaštičkách koncentrátora centricon a naniesol na kolónu s meničom katiónov Resource S ekvilibrovanú 10 mM fosfátom, pH 7,0. Zvinutý protein sa eluoval v lineárnom soľnom gradiente do 500 mM NaCl v priebehu 10 minút Frakcie obsahujúce požadovaný zvinutý produkt SEP-0 (1 - 166) sa identifikovali elektroforézou v SDS-polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE), zmrazili a uložili v -80 °C.

PP 0277-2003

32081/T

103

Chromatogram z analytickej HPLC s prevráteným pomerom fáz a ES-MS spektrom zvinutého proteínového produktu, a tiež CD spektrum demonštrovalo prítomnosť zvinutého proteinu.

Príklad 2

Syntéza syntetického proteinu stimulujúceho erytropoézu SEP-1-L30

Druhý syntetický proteín stimulujúci erytropoézu (nazývaný SEP-1-L30) sa syntetizoval tak, aby obsahoval skupiny tvoriace oxím v polohách 24 a 126 SEP-0. Tieto skupiny sa potom použili na vytvorenie SEP-1-L30, v ktorom lineárny (EDA-Sukc)₁₈ karboxylát (EDA = (4,7,10)-trioxatridekán-1,13-diamín_ltiež nazývaný TTD, Suke = -COCH₂CH₂CO-) polyméry sa pripojili k hlavnému reťazcu proteinu. Sekvencia kompletného SEP-1 (1 -166) je:

APPRLICDSR

VPDTKVNFYA

LVKSSQPWTP

PPDAAK^OXAAPL

VLERYLLEAK WKRMEVGQQA LQLHVDKAVS RTITADTFRK

EAEK^OXITTGCA VEVWQGLALL GLRSLTTLLR LFRVYSNFLR

EHCSLNEKIT SEAVLRGQAL ALGAQKTAIS GKLKLYTGEA

CRTGDR (sekv. id. č.: 2) kde Ψ označuje neprirodzený aminokyselinový zvyšok skladajúci sa z cysteínu, ktorý je karboxymetylovaný v sulfhydrylovej skupine a kde K^oxznamená neprirodzený lyzín, ktorý je chemicky modifikovaný vepsilonaminoskupine oxímovým linkerom kondenzovaným k určenému polyméru rozpustnému vo vode oxímovou väzbou. Štruktúra SEP-1-L30 je tiež na obrázku 15.

PP 0277-2003

320817?

104

Schematické zobrazenie chemickej syntézy SEP-1-L30, opísanej nižšie, je na obrázku 14. Stručne, na obrázkoch 14 (A) a 14 (B), polymér rozpustný vo vode GRFN32 (GP32) je pripojený kpeptidom SEP-1:1 a SEP-1.4 chemickou ligačnou reakciou tvoriacou oxímovú väzbu. Ako je ukázané, peptid SEP-1:1 má C-koncovú Y_aa skupinu v polohe 32 obsahujúcu α-karboxyltioester histidínU pre následnú natívnu chemickú ligáciu a neprirodzený lyzínový zvyšok v polohe 24 (glykozylačné miesto prírodného humánneho EPO), ktorého bočný reťazec sa chemicky modifikoval tak, aby niesol U_n=i skupinu obsahujúcu aminooxyacylovú skupinu. N-koncový alanín zodpovedajúci polohe 1 konečného kompletného produktu je ukázaný ako referenčný príklad. Peptid SEP-1:4 má nechránenú N-koncovú X_aa skupinu v polohe 117 obsahujúcej cysteín, U_n=1 skupinu obsahujúcu aminooxyacylovou skupinou modifikovaný Lyzín v polohe 126 (glykozylované miesto prírodného humánneho EPO) a cysteín v polohe 161 (cysteín tvoriaci disulfid), ktorý má svoju tiolovú skupinu bočného reťazca chránenú pikolylovou skupinou. Cys¹⁶¹ je chránený, aby sa zabránilo jeho tioalkylácii v následnej konverzii cysteínov zavedených pre miesta natívnej chemickej ligácie (pozri obrázok 14 (D)), tiež sa použila pikolylová chrániaca skupina, pretože jej odstránenie je ortogonálne pre podmienky vyžadované na odstránenie Acm (acetamidometylová skupina) chráneného cysteínu v prvej natívnej chemickej ligačnej reakcii (pozri obrázok 14 C). Miestne špecifické a exkluzívne pripojenie GP32 polymérnych konštruktov v polohách 24 a 126 sa dosiahne chemickou ligáciou tvoriacou oxím za vzniku presných polyméme modifikovaných peptidov SEP-1:1 + GP32 a SEP-1:4 + GP32. Obrázok 14 C ukazuje natívnu chemickú ligáciu SEP-1:4 + GP32 k strednému peptidovému segmentu SEP-1:3 a vytvorenie SEP-1:3 + SEP-1:4 + GP32, ktorého miesto ligácie je v Lys¹¹⁶ a Cys¹¹⁷. Ako je ukázané, peptid SEP-1:3 obsahuje N-koncovú X_aa skupinu v polohe 89 obsahujúcej Acm chránený cysteín a C-koncovú Y_aa skupinu v polohe 116 obsahujúcej akarboxyltioester lyzínu. Po natívnej chemickej ligácii sa Acm chrániaca skupina odstránila, aby sa tento ligačný produkt pripravil pre nasledujúcu ligačnú

PP 0277-2003

32031/T

105 reakciu. Obrázok 14 (D) ukazuje natívnu chemickú ligáciu SEP-1:3 + SEP-1:4 + GP32 k strednému peptidovému segmentu SEP-1.2 a vytvorenie SEP-1:2 + SEP-1:3 + SEP-1:4 + GP32, ktorého miesto ligácie je v Trp⁸⁸ a Cys⁸⁹. Ako je ukázané, peptid SEP-1:2 obsahuje N-koncovú X_aa skupinu v polohe 33 obsahujúcej Acm cysteín a C-koncovú Y_aa skupinu v polohe 89 obsahujúcej akarboxyltioester tryptofánu. Po natívnej chemickej ligácii sa ligačný produkt exponoval brómoctovej kyseline kvôli karboxymetylácii tiolových skupín bočného reťazca z miesta ligácie cysteínov 89 a 117, a tak ich konverzii na psedoglutámové kyseliny. Po karboxymetylácii sa Acm a pikolylové chrániace skupiny odstránili, aby sa pripravil tento nechránený polymérne modifikovaný ligačný produkt pre nasledujúcu ligačnú reakciu. Obrázok 14 (E) ukazuje natívnu chemickú ligáciu SEP-T.3 - SEP-1:4 + GP32 k peptidovému segmentu SEP-1:1 + GP32 (zodpovedajúcemu N-koncovému segmentu kompletného produktu) a vytvorenie kompletného SEP-1-L30 produktu SEP-1:1 + GP32 + SEP-1:2 + SEP-1:3 + SEP-1:4 + GP32, ktorého konečné miesto ligácie je vHis³² a Cys³³. Ako je ukázané, kompletný SEP-1-L30 produkt obsahuje dva polyméry rozpustné vo vode (G32) pripojené výhradne v miestach definovaných užívateľom, t.j. glykozylačných miestach zodpovedajúcich polohe 24 a polohe 126 prírodného humánneho EPO. Detaily syntézy sú opísané nižšie.

A. Oximácia GRFN1776 a GRFN1711 s GRFNP32

Pripravil sa oxím, aby sa pripojili polyméry rozpustné vo vode nesúce aminooxyacetylovú skupinu kpeptidom nesúcim ketónkarbonylovú skupinu. Aby sa toto dosiahlo, syntetizovali sa nasledujúce peptidové segmenty:

Segment-1:4 (GRFN 1776, skladá sa zo zvyškov 117 - 166 sekv. id. č.: 2):

CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY

TGEACRTGDR-karboxylát (kde Lys¹²⁶ je modifikovaný zvyškom levulovej

PP 0277-2003

32081/T

106 kyseliny v epsilon-aminoskupine a kde Cys¹¹⁷ je chránený Acm)

Segment SEP-1:1 (GRFN 1711, skladá sa zo zvyškov 1 - 32 sekv. id. č.: 2)

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-tioester (kde Lys²⁴ je modifikovaný zvyškom levulovej kyseliny)

Segment SEP-1:1 (GRFN 1711) sa syntetizoval na živici vytvárajúcej tioester a segment SEP-1:4 (GRFN 1776) na -OCH₂-Pam-živici, ako v príklade 1. Lyzíny 24 a 126 týchto dvoch peptidových segmentov sa spočiatku chránili Fmoc skupinou v epsilon-aminoskupine. Po tom, ako sa skončilo zostavenie reťazca, Fmoc-nesúce aminoskupiny sa zbavili chrániacej skupiny po štandardných postupoch Fmoc odstránenia chrániacej skupiny a modifikovali pripojením levulovej kyseliny ku každej peptidovej živici, v danom poradí. Peptidy sa potom zbavili chrániacej skupiny a súčasne odštiepili od nosnej živice, ako bolo opísané v príklade 1. Peptidy sa purifikovali preparatívnou C4 HPLC s prevráteným pomerom fáz. Frakcie obsahujúce čistý peptid sa identifikovali s použitím ES-MS, zlúčili a lyofilizovali kvôli následnej ligácii. GRFNP32 [-(EDA-Sukc)₁₈karboxylátj sa zostavil na Sasrin živici poskytujúcej karboxylovú väzbu podľa štandardných protokolov (Rose, K. a kol., patentová prihláška Spojených štátov č. 09/379 297, Rose a kol., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 7034). Aminooxyacetylová (AoA) skupina sa pripojila kN-koncovej aminoskupine polyméru kondenzáciou päťnásobného nadbytku aktivovanej Boc-aminooxyoctovej kyseliny. Polymérny reťazec sa odštiepil od nosnej živice s použitím klasických Fmoc chemických postupov. Polymérny reťazec sa purifikoval preparatívnou C4 HPLC s prevráteným pomerom fáz. Frakcie obsahujúce čistý polymér sa identifikovali s použitím ES-MS, zlúčili a lyofilizovali kvôli následnej ligácii.

PP 0277-2003

32081/T

107

Segmenty SEP-1:4 a GRFNP32 sa spoločne rozpustili v ekvimolárnom pomere v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA. Roztok sa potom lyofilizoval. Usušený prášok sa rozpustil a polymérne modifikovaný peptid sa oddelil od nemodifikovaného peptidu a nezreagovaného polyméru preparatívnou gradientovou C4 HPLC s prevráteným pomerom fáz. Frakcie obsahujúce požadovaný oxímový produkt SEP-1:4 + GP32 sa identifikovali ESMS, zlúčili a lyofilizovali.

Segmenty SEP-T.1 a GRFNP32 sa spoločne rozpustili v ekvimolárnom pomere v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA. Roztok sa potom lyofilizoval. Usušený prášok sa rozpustil a polymérne modifikovaný peptid oddelil od nezreagovaného polyméru preparatívnou gradientovou C4 HPLC s prevráteným pomerom fáz. Frakcie obsahujúce požadovaný oxímový produkt SEP-1:1 + GP32 sa identifikovali ES-MS, zlúčili a lyofilizovali.

B. Syntéza syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu SEP-1-L30

SEP-1-L30 sa syntetizoval v roztoku zo štyroch polypeptidových segmentov:

Segment SEP-T.1 + GP32 (GRFN 1711 + GRFNP32, zodpovedajúci zvyškom 1-32 sekv. id. č.: 2):

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^0XITTGCA EH-tioester (kde Lys²⁴ je modifikovaný v epsilon-aminoskupine oxímovým linkerom levulovej kyseliny, ktorá sa kondenzuje k GRFNP32 kyselina levulová aminooxyacetyl(Lev-AoA-oxímovou väzbou označovanou K^ox) , J

Segment SEP-1:2 (GRFN 1712, zodpovedajúci zvyškom 33 - 88 sekv. id. č.: 2):

CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW-tioester (kde Cys³³ je chránený Acm)

PP 0277-2003

32081/T

108

Segment SEP-1:3 (GRFN 1713, zodpovedajúci zvyškom 89 - 116 sekv. id. č.: 2):

CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-tioester (kde Cys⁸⁹ je chránený Acm)

Segment SEP-1:4 + GP32 (GRFN 1776 + GRFNP32, zodpovedajúci zvyškom 117-166 sekv. id. č.: 2):

CAIS PPDAAK^0X AAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR

GKLKLYTGEA CRTGDR-karboxylát (kde Lys¹²⁶ je modifikovaný v epsilon-aminoskupine oxímovým linkerom levulovej kyseliny, ktorá sa kondenzuje k GRFNP32 kyselina levulová - aminooxyacetyl(Lev-AoA)oxímovou väzbou označovanou K^ox a kde C-koncový cysteín nesie pikolylovú (piko) chrániacu skupinu).

Syntéza ďalších peptidov, ligačné reakcie, karboxymetylácia, deprotekčné reakcie, zvinutie a purifikácie sa vykonávali, ako bolo opísané v príklade 1 za vzniku kompletného zvinutého SEP-1-L30. Chromatogram z analytickej HPLC s prevráteným pomerom fáz a ES-MS spektrum zvinutého proteínového produktu, a tiež CD spektrum demonštrovalo prítomnosť zvinutého proteínu.

Príklad 3

I _t

Syntéza syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu SEP-1-Ĺ26

Tretí syntetický proteín stimulujúci erytropoézu (nazývaný SEP-1-L26) sa syntetizoval tak, aby obsahoval skupiny tvoriace oxím v polohách 24 a 126 SEP-0. Tieto skupiny sa potom použili na vytvorenie SEP-1-L26, v ktorom lineárne polyméry (EDA-Sukc)ia-karboxylát a (EDA-Sukc)₆-amid sa spojili s hlavným reťazcom proteínu cez oxímové väzby v polohách 24 a 126, v danom poradí. Sekvencia kompletného SEP-1 (1 -166) je:

PP 0277-2003

32081/T

109

APPRLICDSR

VPDTKVNFYA ΐνΚδδΟΡννψΡ PPDAAK^0XAAPL

VLERYLLEAK WKRMEVGQQA LQLHVDKAVS RTITADTFRK

EAE^OXKITTGCA VEVWQGLALL GLRSLTTLLR LFRVYSNFLR

EHCSĽNEKIT SEAVLRGQAL ALGAQKTAIS GKLKLYTGEA

CRTGDR (sekv. id. č.: 2) kde Ψ označuje neprirodzený aminokyselinový zvyšok skladajúci sa zcysteínu, ktorý je karboxymetylovaný v sulfhydrylovej skupine a kde K^oxznamená neprirodzený lyzín, ktorý je chemicky modifikovaný vepsilonaminoskupine oxímovým linkerom kondenzovaným k určenému polyméru rozpustnému vo vode oxímovou väzbou.

Na rozdiel od SEP-1-L30, SEP-1-L26 konštrukt sa navrhol tak, aby niesol menší polymér rozpustný vo vode bez náboja pripojený v polohe 126. Polymér pripojený v polohe 24 je rovnaký ako VSEP-1-L30. Zostavenie kompletného produktu bolo rovnaké, ako bolo opísané v príklade 2. Štruktúra SEP-1-Ľ26 je ukázaná na obrázku 16.

A. Oximácia GRFN 1776 s GRFNP6 a oximácia GFRN 1711 s GRFNP32

Pripravil sa oxím, aby sa pripojili polyméry rozpustné vo vode nesúce aminooxyacetylovú skupinu k peptidom nesúcim ketónkarbonylovú skupinu. Aby sa toto dosiahlo, syntetizovali sa nasledujúce peptidové segmenty:

Segment SEP-1:4 (GRFN 1776, skladá sa zo zvyškov 117 -166 sekv. id. č.: 2):

CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY

TGEACRTGDR-karboxylát (kde Lys¹²⁶ je modifikovaný zvyškom levulovej kyseliny v epsilon-aminoskupine a kde Cys¹¹⁷ je chránený Acm)

PP 0277-2003

32081/T

110

Segment SEP-1:1 (GRFN 1711, skladá sa zo zvyškov 1 - 32 sekv. id. č.: 2)

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-tioester (kde Lys je modifikovaný zvyškom levulovej kyseliny). .

Segment SEP-1:1 (GRFN 1711) sa syntetizoval na živici vytvárajúcej tioester a segment SEP-1:4 (GRFN 1776) na -OCFh-Pam-živici, ako v príklade 1. Lyzíny 24 a 126 týchto dvoch peptidových segmentov sa spočiatku chránili Fmoc skupinou v epsilon-aminoskupine. Po tom, ako sa skončilo zostavenie reťazca, Fmoc-nesúce aminoskupiny sa zbavili chrániacej skupiny podľa štandardných postupov Fmoc deprotekčných postupov a modifikovali pripojením levulovej kyseliny ku každej peptidovej živici, v danom poradí. Peptidy sa potom zbavili chrániacej skupiny a súčasne odštiepili od nosnej živice podľa štandardných Boe chemických postupov, ako v príklade 1. Peptidy sa samostatne purifikovali preparatívnou C4 HPLC s prevráteným pomerom fáz. Pre každý peptid sa frakcie obsahujúce čistý peptid identifikovali s použitím ES-MS, zlúčili a lyofilizovali kvôli následnej ligácii.

Vo vode rozpustný polymér (EDA-Sukc)ie-karboxylátu (GRFNP32) sa zostavil na Sasrin živici tvoriacej karboxylovú väzbu podľa štandardných protokolov (Rose, K. a koľ, patentová prihláška Spojených štátov č. 09/379 297, Rose a kol., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 7034). Polymér rozpustný vo vode (EDA-Sukc)6-amid (GRFNP6) sa zostavil na Sieber živici tvoriacej amidovú väzbu podľa štandardných protokolov (Rose, K. a kol., patentová prihláška Spojených štátov č. 09/379 297, Rose a kol., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 7034). Aminooxyacetylová (AoA) skupina sa pripojila k N-koncovej aminoskupine každého polyméru naviazaného na živicu kondenzáciou päťnásobného nadbytku aktivovanej Boc-aminooxyoctovej kyseliny. Dva polymérne reťazce sa oddelene odštiepili od príslušnej nosnej živice s použitím klasických Fmoc chemických postupov. Každý polymémy reťazec sa purifikoval preparatívnou HPLC s prevráteným pomerom fáz. Pre každý polymér sa frakcie

PP 0277-2003

32081/T

111 obsahujúce čistý polymér identifikovali s použitím ES-MS, zlúčili a lyofilizovali kvôli následnej ligácii.

Segmenty SEP-1:4 a GRFNP6 sa spoločne rozpustili v ekvimolárnom pomere v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA. Roztok sa potom lyofilizoval. Usušený prášok sa rozpustil a polyméme modifikovaný peptid sa oddelil od nemodifikovaného peptidu a nezreagovaného polyméru preparatívnou gradientovou C4 HPLC s prevráteným pomerom fáz. Frakcie obsahujúce požadovaný oxímový produkt SEP-1:4 + GP6 sa identifikovali ESMS, zlúčili a lyofilizovali.

Segmenty SEP-1:1 a GRFNP32 sa spoločne rozpustili v ekvimolárnom pomere v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA. Roztok sa potom lyofilizoval. Usušený prášok sa rozpustil a polyméme modifikovaný peptid oddelil od nezreagovaného polyméru preparatívnou gradientovou C4 HPLC s prevráteným pomerom fáz. Frakcie obsahujúce požadovaný oxímový produkt SEP-1:1 + GP32 sa identifikovali ES-MS, zlúčili a lyofilizovali.

B. Syntéza syntetického proteinu stimulujúceho erytropoézu SEP-1-L26

SEP-1-L26 sa syntetizoval v roztoku zo štyroch polypeptidových segmentov:

Segment SEP-1:1 + GP32 (GRFN 1711 + GRFNP32, zodpovedajúci zvyškom 1-32 sekv. id. č. : 2):

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^0XITTGCA EH-tioester (kde Lys²⁴ je modifikovaný v epsilon-aminoskupine oxímovým linkerom levulovej kyseliny, ktorá sa kondenzovala kGRFNP32 kyselina levulová - aminooxyacetyl(LevAoA)-oxímovou väzbou označovanou K^ox)

PP 0277-2003

32081/T

112

Segment SEP-1:2 (GRFN 1712, zodpovedajúci zvyškom 33 - 88 sekv. id. č.: 2);

CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEWVQGLALL

SEAVLRGQAL LVKSSQPW-tioester (kde Cys je chránený Acm)

Segment SEP-1:3 (GRFN 1713, zodpovedajúci zvyškom 89-116 sekv. id. č.: 2):

CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-tioester (kde Cys⁸⁹ je chránený Acm)

Segment SEP-1: 4 + GP6 (GRFN 1776 + GRFNP6, zodpovedajúci zvyškom 117-166 sekv. id. č.: 2):

CAIS PPDAAK^OXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR

GKLKLYTGEA CRTGDR-karboxylát (kde Lys¹²⁶ je modifikovaný v epsilon-aminoskupine oxímovým linkerom levulovej kyseliny, ktorá sa kondenzuje k GRFNP6 kyselina levulová - aminooxyacetyl(Lev-AoA)-oxímovou väzbou označovanou K^ox a kde C-koncový cysteín (t.j. Cys¹⁶¹) nesie pikolylovú (piko) chrániacu skupinu).

Syntéza ďalších peptidov, ligačné reakcie, karboxymetylácia, deprotekčné reakcie, zvinutie a purifikácie sa vykonávali, ako bolo opísané v príklade 1 a 2 za vzniku kompletného zvinutého SEP-1-L26. Chromatogram z analytickej C4 HPLC s prevráteným pomerom fáz a ES-MS spektrum zvinutého proteínového produktu, a tiež CD spektrum demonštrovalo prítomnosť zvinutého proteínu.

Príklad 4

Syntéza syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu SEP-1-B50

PP 0277-2003

32081/T

113

Syntetizoval sa štvrtý syntetický proteín stimulujúci erytropoézu (nazývaný SEP-1-B50). Aminokyselinová sekvencia kompletného SEP-1-B50 je rovnaká ako sekvencia SEP-1-L30:

APPRLICDSR

VPDTKVNFYA

LVKSSQPWTP

PPDAAK^0XAAPL

VLERYLLEAK WKRMEVGQQA LQLHVDKAVS RTITADTFRK

EAEK^OXITTGCA VEVWQGLALL GLRSLTTLLR LFRVYSNFLR

EHCSLNEKIT SEAVLRGQAL ALGAQKTAIS GKLKLYTGEA

CRTGDR (sekv. id. č.: 2) kde Ψ označuje neprirodzený aminokyselinový zvyšok skladajúci sa z cysteínu, ktorý je karboxymetylovaný v sulfhydrylovej skupine a kde K^oxoznačuje neprirodzený lyzín, ktorý je chemicky modifikovaný vepsilonaminoskupine oxímovým linkerom kondenzovaným k určenému polyméru rozpustnému vo vode oxímovou väzbou.

Avšak proteín sa derivatizoval radšej rozvetveným polymérnym konštruktom majúcim štyri lineárne (Sukc-EDA)i2 skupiny ako lineárnym (SukcEDA)ie polymérom SEP-1-L30. Derivatizácia sa uskutočnila oxímovou väzbou.

Obrázok 17 je schematické zobrazenie chemickej syntézy rozvetveného polyméru rozpustného vo vode GRFNP29 (GP29), ktorý sa pripojil k SEP-1-B50 ligáciou tvoriacou oxím, ako je opísané podrobne nižšie. Ako je ukázané na obrázku 17, ortogonálne chránený prekurzor lyzínu U-B sa použil na vytvorenie U-B zložky GRFN17 (GP17) nesúcej aminooxyacylovú skupinu ako U skupinu a majúci 3x lyzínové rozvetvené jadro B nesúce štyri pripojené tiolové skupiny pre následnú kondenzáciu tioéterovými väzbami k lineárnemu vo vode rozpustnému polyamidovému etylénoxidovému konštruktu nazývanému GP29, ktorý má pripojený karboxylát darovaný zvyškom jantárovej kyseliny. Zostavenie kompletného produktu bolo rovnaké, ako bolo opísané v príklade 2. Štruktúra SEP-1-B50 je ukázaná na obrázku 18.

PP 0277-2003

32081/T

114

A. Syntéza templátu GRFNP17 nesúceho mnohonásobné tiolové skupiny

Templát GRFNP17 sa syntetizoval ručne na (4-metyl)benzhydrylamínovú (MBHA)-živicu tvoriacu amid v 0,4 mmol meradle. Fmoc-Lys (Boc)-OH sa kondenzoval s použitím štandardných kondenzačných protokolov (Schnôlzer, M., Int. J. Pept. Protein Res., 1992, 40, 180 - 193). Použilo sa 2,1 mmólu aminokyseliny, 10 % DIEA v 3,8 ml 0,5M HBTU, t.j. päťnásobný nadbytok aminokyseliny. Po odstránení Fmoc chrániacej skupiny sa Fmoc-Lys(Fmoc)-OH kondenzoval s použitím štandardných protokolov kondenzácie aminokyselín (2,1 mmol aminokyseliny, 10 % DIEA v 3,8 ml 0,5 M HBTU, t.j. päťnásobný nadbytok aminokyseliny). Po druhom kroku odstránenia Fmoc sa FmocLys(Fmoc)-Ph kondenzoval s použitím štandardných protokolov kondenzácie aminokyselín (4,2 mmol aminokyseliny, 10 % DIEA v 7,6 ml 0,5 M HBTU, t.j. päťnásobný nadbytok aminokyseliny relatívne k voľnému amínu). Po konečnom kroku odstránenia Fmoc chrániacej skupiny sa päťnásobný nadbytok (relatívne k voľným amínom) pentafluórfenylesteru S-acetyltioglykolovej kyseliny (SAMAoPfp) v DMF kondenzoval počas 30 minút. Boe chrániaca skupina bočného reťazca C-koncového lyzylového zvyšku sa odstránila dvoma jednominútovými premytiami čistým TFA, potom nasledovala neutralizácia živice premytím 10 % DIEA v DMF. 2 mmóly Boc-aminooxyoctovej kyseliny a 2 mmóly Nhydroxysukcínimidu (NHS) sa rozpustili v 3 ml DMF. Po pridaní 2 mmol DIC (diizopropylkarbodiimidu) sa kyselina aktivovala počas 30 až 60 minút. Roztok sa pridal k neutralizovanej živici a kondenzoval 1 hodinu. Nakoniec sa Sspojené acetylové skupiny odstránili 20 % piperidínom v DMF počas 30 minút. Templát sa zbavil chrániacej skupiny a súčasne odštiepil od nosnej živice s použitím HF/p-krežolu podľa štandardných Boe chemických postupov v prítomnosti cysteínu ako lapača voľného aldehydu (Schnôlzer M., Int. J. Pept. Protein Res., 1992, 40, 180 - 193). Získaný polyamid v 50 % B (t.j. 50 % vodný acetonitril obsahujúci 0,1 % TFA) (bez aldehydu) sa zmrazil a lyofilizoval. Kvôli purifikácii sa templátový surový produkt rozpustil v 2 ml 50 % B a 100 ml 100 % A (t.j. 0,1 % TEA vo vode) sa pridalo kvôli nariedeniu vzorky (zabrániť pridaniu guanidíniumchloridu alebo acetátu, pretože pridanie aldehydu sa zabezpečilo). Templát sa naniesol na C4 preparatívnu kolónu pre HPLC s prevráteným

PP 0277-2003

32081/T

115 pomerom fáz, ekvilibrovanú pri teplote T = 40 °C v 3 % B. Soli sa eluovali izokraticky, požadovaný templát, GRFNP17, sa purifikoval lineárnym gradientom. Frakcie obsahujúce požadovaný produkt sa identifikovali ES-MS, zlúčili a lyofilizovali.

B. Syntéza rozvetveného, vo vode rozpustného polyméru GRNP29

GRFNP29, rozvetvený (EDA-Sukc)i2 polymér s molekulovou hmotnosťou 15 kD sa syntetizoval ligáciou tvoriacou tioéter purifikovaného tiolovú skupinu obsahujúceho templátu GRFNP17 a lineárneho polyméru GRFNP31, Br-acetyl(EDA-Sukc)i2-karboxylátu, kde GRFNP31 sa syntetizoval na Sasrin živici tvoriacej karboxylovú väzbu podľa štandardných protokolov (Rose, K. a kol., patentová prihláška Spojených štátov č. 09/379 297, Rose a kol., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 7034).

1,3x molárny nadbytok (proti celkovým tiolovým skupinám) purifikovaného GRFNP31, Br-acetylovaný (EDA-Sukc)i₂ a purifikovaný tiolobsahujúci templát GRFNP17 sa spoločne rozpustili v 0,1 M Tris-HCI/6M guanidíniumchloride, pH 8,7 v ~ 10 mM koncentrácii. Po rozpustení sa roztok nariedil trojnásobným objemom (objem/objem) pufra 0,1 M Tris - HCl, pH 8,7. Ligačná zmes sa miešala pri teplote miestnosti a reakcia sa monitorovala HPLC s prevráteným pomerom fáz a ES/MS. Ďalší reaktant GRFNP31 sa pridal podľa potreby, kým hlavným produktom nebol požadovaný reakčný produkt. Kvôli spracovaniu sa pridal 3x (objem/objem k ligačnej zmesi) objem 0,1 M acetátu/6M guanidíniumchloridu, pH 4, a roztok sa naniesol na preparatívnu C4 kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom. fáz a purifikoval lineárnym gradientom. Frakcie obsahujúce čistý GRFNP29 konštrukt sa identifikovali s použitím ES-MS, zlúčili a lyofilizovali.

PP 0277-2003

32081/T

116

C. Oximácia GRFN 1776 a GRFN 1711 s GRFNP29

Segment SEP-1:4 a segment SEP-1:1 sa syntetizovali tak, ako bolo opísané v príklade 2. Segmenty SEP-1:4 a GRFNP29 sa spoločne rozpustili v ekvimolárnom pomere v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA. Roztok sa lyofilizoval. Usušený prášok sa naniesol na preparatívnu kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz (priemer 2,54 cm, 1 palec). Polymérne modifikovaný peptid sa oddelil od nemodifikovaného peptidu a nezreagovaného polyméru preparatívnou gradientovou C4 HPLC s prevráteným pomerom fáz. Frakcie obsahujúce požadovaný oxímový produkt SEP-1: 4 + GP29 sa identifikovali ES-MS a zlúčili.

Segmenty SEP-1:1 a GRFNP29 sa spoločne rozpustili v ekvimolárnom pomere v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA. Roztok sa zmrazil a lyofilizoval. Usušený prášok sa rozpustil v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA a naniesol na preparatívnu GPC (gélová chromatografia) kolónu (priemer 2,54 cm, 1 palec). Polymérne modifikovaný peptid sa oddelil od nemodifikovaného peptidu a nezreagovaného polyméru izokratickou elúciou. Frakcie obsahujúce požadovaný oxímovaný produkt SÉPII + GP29 sa identifikovali ES-MS a zlúčili.

D. Syntéza syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu SEP-1-B50

SEP-1-B50 (sekv. id. č.: 2) sa syntetizoval v roztoku zo štyroch polypeptidových segmentov:

Segment SEP-1:1 + GP29 (GRFN 1711 + GRFNP29, zodpovedajúci zvyškom 1 - 32 sekv. id. č.: 2):

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^0XITTGCA EH-tioester (kde Lys²⁴ je modifikovaný v epsilon-aminoskupine oxímovým linkerom levulovej kyseliny, ktorá sa kondenzuje k GRFNP29 kyselina levulová-aminooxyacetyl(Lev-AoA)» ox oximovou väzbou označovanou K )

PP 0277-2003

32081/T

117

Segment SEP-1:2 (GRFN 1712, zodpovedajúci zvyškom 33 - 88 sekv. id. č.: 2):

Segment SEP-1:3 (GRFN 1713, zodpovedajúci zvyškom 89-116 sekv. id. č.: 2):

CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-tioester (kde Cys je chránený Acm)

Segment SEP-1:4 + GP29 (GRFN 1776 + GRFNP29, zodpovedajúci zvyškom 117-166 sekv. id. č.: 2):

CAIS PPDAAK^0X AAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR

GKLKLYTGEA CRTGDR-karboxylát (kde Lys¹²⁶ je modifikovaný v epsilon-aminoskupine oxímovým linkerom levulovej kyseliny, ktorá sa kondenzuje k GRFNP29 kyselina levulová-aminooxyacetyl(Lev-AoA)-oxímovou väzbou označovanou K^ox a kde C-koncový cysteín nesie pikolylovú (piko) chrániacu skupinu).

Syntéza ďalších peptidov, ligačné reakcie, karboxymetylácia, deprotekčné reakcie, zvinutie a purifikácie sa vykonávali, ako bolo opísané v príklade 1 a 2, okrem toho, že purifikácia sa vykonávala na kolóne Resource Q, za vzniku kompletného zvinutého SEP-1-B50 (sekv. id. č.: 2). Chromatogram z analytickej C4 HPLC s prevráteným pomerom fáz a ES-MS spektrum zvinutého proteínového produktu SEP-1-B50, a tiež CD spektrum demonštrovalo prítomnosť zvinutého proteínu.

PP 0277-2003

32081/T

118

Príklad 5

Syntéza syntetického proteinu stimulujúceho erytropoézu SEP-3-L42

Syntetizoval sa piaty syntetický proteín stimulujúci erytropoézu

SEP-3-L42). Aminokyselinová sekvencia kompletného SEP-3 (nazývaný proteinu je:

APPRLICDSR

VPDTKVNFYA

LACSSQPWEP

PPDAACAAPL

VLERYLLEAK WKRMEVGQQA LQLHVDKAVS RTITADTFRK

EAECITTGCA VEVWQGLALL GLRSLTTLLR LFRVYSNFLR

EHCSLNECIT SEAVLRGQAL ALGAQKEAIS GKLKLYTGEA

CRTGDR (sekv. id. č.: 3)

Cysteínové zvyšky v polohách: 24, 38, 83 a 126 sa modifikovali maleimidom-funkcionalizovanými (EDA-Sukc)ie (GRFNP32) polymérnymi jednotkami (prostredníctvom Michaelovej adície) za vzniku SEP-3-L42. Štruktúra SEP-3-L4 je ukázaná na obrázku 20.

Schematické zobrazenie chemickej syntézy SEP-3-L42 opísané nižšie je ukázané na obrázku 19. Stručne, obrázky 19 (A) a 19 (B) ukazujú natívnu chemickú ligáciu štyroch SEP-3-L42 peptidových segmentov SEP-3:1 cez SEP3:4, ktorá tvorí cysteiny v miestach ligácie zodpovedajúcich všetkým štyrom natívnym glykozylačným miestam v humánnom EPO. Konkrétne obrázok 19 (B) ukazuje kompletný polypeptid, ktorý má všetky cysteiny tvoriace disulfid chránené, čo umožňuje miestne špecifické pripojenie štyroch nabitých lineárnych vo vode rozpustných polymérov (nazývaný GRFN32-maleimid (GP32 - maleimid)) v cysteínových ligačných miestach prostredníctvom Michaelovej adície. Obrázok 19 (B) tiež ukazuje konečný deprotekčný krok cysteínov tvoriacich disulfid a vytvorenie kompletného polymérne modifikovaného produktu.

PP 0277-2003

32081/T

119

Podrobnejšie, SEP-3 sa syntetizoval v roztoku zo štyroch polypeptidových segmentov:

Segment SEP-3:1 (GRFN 1747, zodpovedajúci zvyškom 1 - 37 sekv. id. č. 3)

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNE-tioester (kde Cys⁷, Cys²⁹ a Cys³³ sú chránené Acm)

Segment SEP-3:2 (GRFN 1774, zodpovedajúci zvyškom 38 - 82 sekv. id. č.: 3):

CIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL

SEAVLRGQAL LA-tioester (kde Cys³⁸ je bočný reťazec chránený skupinou Acm)

Segment SEP-3:3 (GRFN 1749, zodpovedajúci zvyškom 83 - 125 sekv. id. č.: 3):

CSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS

PPDAA-tioester (kde Cys⁸³ je bočný reťazec chránený skupinou Acm)

Segment SEP-3:4 (GRFN 1750, zodpovedajúci zvyškom 126-166 sekv. id. č.: 3):

CAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR-karboxylát (kde Cys¹⁶¹ je chránený Pbo (t.j. 4-(CH₃S (O)-benzylová skupina-))

PP 0277-2003

32081/T

120

Syntéza peptidov

Peptidy SEP-3:1, SEP-3.2 a SEP-3:3 sa syntetizovali na živici vytvárajúcej tioester in situ neutralizačným protokolom pre Boe chemický postup SPPS, s použitím zavedených ochranných stratégií pre bočný reťazec, ako bolo opísané v príklade 1, so zmenami v stratégii chrániacich· skupín, ako sa poznamenalo pre špecifické peptidy vyššie. Segment SEP-3:4 sa syntetizoval analogicky na -OCH2-Pam-živici. Peptidy sa zbavili chrániacej skupiny a súčasne odštiepili z nosnej živice tak, ako bolo opísané v príklade 1. Výsledné peptidy opísané vyššie sa purifikovali preparatívnou RP-HPLC. Frakcie obsahujúce čistý peptid sa identifikovali s použitím ES-MS, zlúčili a lyofilizovali kvôli následnej ligácii.

Krok 1: Ligácia č. 1

Segment SEP-3:4 a segment SEP-3:3 sa rozpustili v TFE v 15 mM koncentrácii. Pridal sa saturovaný fosfátový pufor (pH 7,5) obsahujúci 6M guanidíniumchlorid a 1 % tiofenol za vzniku číreho roztoku peptidových segmentov. Po ligácii sa ligačná zmes (definovaná ako 1 objem) pridala k 2 objemom roztoku (2 ml TFE, 6 ml 6M guanidíniumchloridu, 100 mM fosfát obsahujúci 25 % β-merkaptoetanol) a inkubovala počas 20 minút. Roztok sa acidifikoval roztokom 15 mg/ml TCEP v ľadovej kyseline octovej, naniesol na preparatívnu C4 kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz a purifikoval lineárnym gradientom. Frakcie obsahujúce požadovaný ligačný produkt SEP3:Acm + SEP-3:3 + SEP-3:4 sa identifikovali ES-MS a zlúčili.

Krok 2: Odstránenie Acm č. 1

Kvôli odstráneniu Acm sa vodný roztok acetonitrilu obsahujúci zlúčené frakcie SEP-3:Acm + SEP-3:3 - SEP-3:4 nariedil 1 x vodou v kvalite pre HPLC a do konečnej koncentrácie 2M sa pridala pevná močovina. Pridal sa trojnásobný molárny nadbytok (relatívny k celkovej očakávanej koncentrácii cysteínu) 30 mg/ml roztoku Hg (acetát)₂ v 3 % vodnej kyseline octovej a roztok sa miešal

PP 0277-2003

32081/T

121 počas jednej hodiny. Roztok sa potom nariedil na 20 % v β-markaptoetanole, naniesol na semipreparatívnu C4 kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz a purifikoval stupňovým gradientom. Frakcie obsahujúce požadovaný ligačný produkt SEP-3:3 + SEP-3:4 sa identifikovali ES-MS a lyofilizovali cez noc.

Krok 3: Ligácia č. 2

Rovnaké množstvá SEP-3:3 + SEP-3:4 a SEP-3:2 sa spoločne rozpustili v čistom TFE trifluóretanolu v 15 mM koncentrácii. 250 mM fosfátový pufor (pH

7,5) obsahujúci 6M guanidínium a 1 % tiofenol sa pridal za vzniku číreho roztoku peptidových segmentov. Po jednom dni ligácie sa ligačná zmes (definovaná ako 1 objem) pridala k 2 objemom roztoku 10 ml TFE, 10 ml βmerkaptoetanolu, 10 ml piperidínu a 20 ml 6M guanidínia, pH 4, a inkubovala počas 20 minút, aby sa odstránili všetky zvyšné chrániace skupiny. Roztok sa acidifikoval roztokom 15 mg/ml TCEP v 20 % vodnej kyseline octovej, naniesol na preparatívnu C4 kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz a purifikoval lineárnym gradientom. Frakcie obsahujúce požadovaný ligačný produkt SEP3:Acm + SEP-3:2 + SEP-3:3 + SEP-3:4 sa identifikovali ES-MS a lyofilizovali cez noc.

Krok 4: Odstránenie Acm

Kvôli odstráneniu Acm sa vodný roztok acetonitrilu obsahujúci zlúčené frakcie SEP-3:Acm + SEP-3:2 + SEP-3:3 + SEP-3:4 nariedil 1x vodou v kvalite pre HPLC a pridala sa pevná močovina do konečnej koncentrácie 2M. Pridal sa trojnásobný molárny nadbytok (relatívny k celkovej očakávanej koncentrácii cysteínu) 30 mg/ml roztoku Hg (acetát)₂ v 3 % vodnej kyseline octovej a roztok sa miešal počas jednej hodiny. Roztok sa potom nariedil na 20 % v βmerkaptoetanole, naniesol na C4 semipreparatívnu kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz a purifikoval stupňovým gradientom. Frakcie obsahujúce požadovaný ligačný produkt SEP-3:2 + SEP-3:3 + SEP-3:4 sa identifikovali ES-MS a lyofilizovali cez noc.

PP 0277-2003

32081/T

122

Krok 5: Ligácia č. 3

Rovnaké množstvá SEP-3:2 + SEP-3:3 + SEP-3:4 a SEP-3:1 sa spoločne rozpustili v čistom TFE v 15 mM koncentrácii. Pridal sa 250 mM fosfátový pufor (pH 7,5) obsahujúci 6M guanidínium a 1 % tiofenol za vzniku číreho roztoku peptidových segmentov. Po jednom dni ligácie sa ligačná zmes (definovaná ako 1 objem) pridala k 2 objemom roztoku 10 ml TFE, 10 ml βmerkaptoetanolu, 10 ml piperidínu a 20 ml 6M guanidinia, pH 4, a inkubovala počas 20 minút, aby sa odstránili všetky zvyšné chrániace skupiny. Roztok sa acidifikoval roztokom 15 mg/ml TCEP v 20 % vodnej kyseline octovej, naniesol na preparatívnu C4 kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz a purifikoval lineárnym gradientom. Frakcie obsahujúce požadovaný ligačný produkt SEP3:1+ SEP-3:2 + SEP-3:3 + SEP-3:4 sa identifikovali ES-MS a lyofilizovali cez noc.

Krok 6: Pripojenie polyméru GRFNP32

Maleimidom - funkcionalizovaný lineárny (EDA-Sukc)ie polymér nazývaný GRFNP32 - maleimid sa pripravil funkcionalizáciou GRFNP32 s BMPS (NHS ester 3-maleimidopropiónovej kyseliny, Pierce, USA) podľa protokolov výrobcu za vzniku maleimidom - funkcionalizovaného (EDA-Sukc)ia polyméru (t.j. maleimid-(EDA-Sukc)ie). SEP-3:1 + SEP-3.2 + SEP-3.3 + SEP3:4 sa rozpustil v minimálnom vyžadovanom množstve TFE. Trojnásobný nadbytok GRFNP32-maleimidu sa rozpustil v 6M guanidíniumchloridu, 100 mM fosfátu, pH 7,5, a pridal sa k TFE roztoku. Postup Michaelovej adičnej reakcie sa sledoval analytickou HPLC s prevráteným pomerom fáz. Po tom, ako sa reakcia skončila, sa roztok naniesol na preparatívnu C4 kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz a purifikoval lineárnym gradientom. Frakcie obsahujúce požadovaný polymérne modifikovaný produkt SEP-3:Acm + SEP3:1 + SEP-3:2 + SEP-3:3 + SEP-3:4 + pPEG (t.j. ligovaný kompletný polypeptidový reťazec so 166 zvyškami so štyrmi kópiami GRFNP32

PP 0277-2003

32081/T

123 pripojenými k tiolovým skupinám bočného reťazca Cys²⁴, Cys³⁸, Cys⁸³ a Cys¹²⁶, a teda nazývaný tiež SEP-3:Acm + SEP-3:1 + SEP-3:2 + SEP-3:3 + SEP-3:4 + GP32) sa identifikovali ES-MS a lyofilizovali cez noc.

Krok 7: Pbo odstránenie

Kvôli redukcii Pbo sa rozpustil lyofilizovaný prášok SEP-3:Acm + SEP3:1 + SEP-3:2 + SEP-3:3 + SEP-3:4 + GP32 v čistom TFA obsahujúcom 5 % etánditiol. Pbo skupina sa potom odštiepila pridaním 10 % tioanizolu a 15 % brómtrimetylsilánu počas 30 minút. Roztok sa usušil v rotačnej odparke a nabral do vodného acetonitrilu obsahujúceho 0,1 % TFA. Výsledný roztok sa naniesol na semipreparatívnu kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz a purifikoval stupňovým gradientom. Frakcie obsahujúce požadovaný Cys¹⁶¹produkt zbavený chrániacej skupiny SEP-3:Acm + SEP-3:1 + SEP-3:2 + SEP3:3 + SEP-3:4 + GP32-Pbo sa identifikovali ES-MS a lyofilizovali cez noc.

Krok 8: Odstránenie Acm

Kvôli konečnému odstráneniu Acm z bočných reťazcov Cys⁷, Cys²⁹ a Cys³³ sa vodný roztok acetonitrilu obsahujúci zlúčené frakcie SEP-3:Acm + SEP-3:1 + SEP-3:2 + SEP-3:3 + SEP-3:4 + GP32-Pbo nariedil 1x vodou v kvalite pre HPLC a pridala sa pevná močovina do konečnej koncentrácie 2M. Pridal sa trojnásobný molárny nadbytok (relatívny k celkovej očakávanej koncentrácii cysteínu) 30 mg/ml roztoku Hg (acetát)₂ v 3 % vodnej kyseline octovej a roztok sa miešal počas jednej hodiny. Roztok sa potom nariedil na 20 % v β-merkaptoetanole, naniesol na semipreparatívnu C4 kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz a purifikoval stupňovým gradientom. Frakcie obsahujúce požadovaný ligovaný polymérne modifikovaný produkt SEP-3 (1 166) sa identifikovali ES-MS a lyofilizovali cez noc.

Krok 9: Zvinutie

PP 0277-2003

32081/T

124

Kompletný ligovaný polyméme modifikovaný peptid SEP-3 (1 - 166) sa rozpustil v 200 mM Tris pufra (pH 8,7) obsahujúcom 6M guanidíniumchlorid a 20 % TFE a desaťnásobný molárny nadbytok (relatívny k Cys zvyškom v ΘΕΡΟ) cysteínu. Tento roztok sa dialyzoval cez noc proti roztoku 200 mM Tris pufra (pH 8,7) obsahujúcemu 3M guanidíniumchlorid pri teplote miestnosti. Roztok sa potom dialyzoval proti roztoku 200 mM Tris pufra (pH 8,7) obsahujúcemu 1M guanidíniumchlorid počas 4 hodín v 4 °C a konečne proti 10 mM fosfátovému pufru (pH 7,0) počas 4 hodín v 4 °C za vzniku konečného zvinutého produktu. Zvinutie sa overilo elektrosprejovou ES-MS a CD spektrometriou.

Krok 10: Purifikácia

Zvinutý polypeptid sa koncentroval 5x v kyvetách koncentrátora Centricon a naniesol na kolónu s meničom katiónov Resource S, ekvilibrovanú 10 mM fosfátom, pH 7,0. Zvinutý proteín sa eluoval v lineárnom soľnom gradiente do 500 mM NaCI v priebehu 10 minút. Frakcie obsahujúce požadovaný zvinutý produkt SEP-3-L42 sa identifikovali SDS-PAGE, zmrazili a uložili v -80 °C.

PP 0277-2003

32081/T

125

Príklad 6 .

Test biologickej aktivity syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu

Biologická aktivita zvinutých syntetických proteínov stimulujúcich erytropoézu, SEP-0, SEP-1-L26, SEP-1-L30, SEP-1-B50 a SEP-3-L42 sa určila s použitím bunkových línií ÚT/7 a 32D 103197, v testoch proliferácie bunkovej línie závislej od faktoru s použitím komerčného rekombinantného erytropoetínu ako kontrolného štandardu. UT-7 je humánna bunková línia megakaryoblastovej leukémie s absolútnou závislosťou od jedného faktoru z interleukínu-3, faktoru stimulujúceho kolónie granulocytov a makrofágov (GMCSF) alebo erytropoetínu (EPO) pre rast a prežitie (Miura, Y. a kol., Acta Haematol., 1998, 99, 180 - 184, Komatsu, N. a koľ, Cancer Res., 1991, 51, 341 - 348). 32 D 103197 je myšia hemopoetická bunková línia (Metcalf, D., Int. J. Celí Cloning, 1992, 10, 116 -125).

Zásobné roztoky SEP konštruktov sa tvorili v Dulbeccovom médiu modifikovanom podľa Iscoveho (IMDM), 10 % FBS (fetálne bovinné sérum), glutamínu a Penstrepu a pridali sa sériové 2x riedenia týchto zásobných roztokov do jamiek mikrotitračnej doštičky, ku ktorým sa pridali humánne bunky UT/7 EPO v koncentrácii 5 000 buniek/50 μΙ. Doštičky sa inkubovali pri 37 °C v prítomnosti 5 % CO2 a rast sa denne monitoroval. Po štyroch dňoch sa pridalo 20 μΐ 2,5 mg/ml MTT (metyltiazoltetrazóium) v PBS (fyziologický roztok pufrovaný fosfátmi) a doštičky sa inkubovali počas 4 hodín. Pridalo sa 150 μΙ IPA a absorbancia každej jamky sa odčítala v 562 nm. Určili sa hodnoty ED50 (účinná dávka na dosiahnutie 50 % maximálneho účinku) pre SEP zlúčeniny a porovnali sa s hodnotami pre rhEPO (rekombinantný humánny erytropoetín) tvorený CHO bunkami (bunky vaječníkov čínskeho škrečka). Výsledky z týchto experimentov demonštrovali, že všetky syntetické proteíny stimulujúce erytropoézu prejavovali biologickú aktivitu. Výsledky ED50 pre SEP-0, SEP-1L26, SEP-1-L30 a SEP-1-B50 sú v tabuľke VI.

PP 0277-2003

32081/T

126

Tabuľka VI

Proteín stimulujúci erytropoézu	Hodnoty ED50 in vitro (pM)
Bunky UT-7 (humánne)	Bunky 32D 103197 (myšie)
SEP-0	1,570	863
SEP-1-L26	46,5	100,8
SEP-1-L30	71,5	182,5
SEP-1-B50	182	6 200
rh EPO	32,5	136,3

Ďalšie výsledky z týchto experimentov po normalizácii na obsah peptidu iba s použitím extinkčného koeficientu pre výpočet koncentrácie proteínu absorbancií pre polyméme modifikovaný SEP-1-L30 sú v tabuľke VII a na obrázku 26 pre SEP-0, SEP-1-L26, SEP-1-L30, SEP-1-B50, SEP-3-L42 a SEP1-B51 (syntéza SEP-1-B51 zlúčeniny je opísaná v príklade 7 nižšie). Súborne tieto in vitro testy preukázali rozdielny účinok meniacich sa polymérnych štruktúr a miest pripojenia na in vitro biologickú aktivitu, kde tieto zlúčeniny mali nasledujúce relatívne poradie účinnosti, keď sa testovali (1) na aktivitu receptoru humánneho EPO (od najúčinnejšej k najmenej účinnej zlúčenine): SEP-1-L26 « SEP-1-L30 > SEP-1-B50 « SEP-1-B51 > SEP-3-L42 > SEP-0 a (2) na aktivitu receptoru myšieho EPO (od najúčinnejšej k najmenej účinnej zlúčenine): SEP-1-L26 > SEP-1-L30 > SEP-0 > SEP-3-L42 >SEP-1_ľB50 « SEP-1-B51.

PP 0277-2003

32081/T

127

Tabuľka VII

Proteín stimulujúci erytropoézu	Hodnoty ED50 in vitro (pM)
Bunky UT-7 (humánne EPO R)	Bunky 32D 103197 (myšie EPO R)
SEP-0	11	20
SEP-1-L26	0,8	1
SEP-1-L30	0,8	4
SEP-3-L42	7	70
SEP-1-B50	2,5	125
SEP-1-B51	2	125

Výsledky v tabuľke VII a obrázok 26 tiež ukazujú významný rozdiel v preferencii receptoru pre polyméme modifikované SEP konštrukty v porovnaní s nepolymérne modifikovaným konštruktom SEP-0. Konkrétne, SEP1-Ľ26 sa modifikoval rôznymi lineárnymi polymérmi pripojenými v zodpovedajúcej polohe 24 glykozylačného miesta humánneho EPO (lineárny polymér s veľkosťou 5,5 kD s pripojeným negatívnym nábojom, pripojený k tomuto miestu) a polohe 126 (lineárny polymér s veľkosťou 1,8 kD s pripojeným neutrálnym nábojom, pripojený k tomuto miestu), tento konštrukt mal podobnú aktivitu ako proti humánnym, tak proti myším receptorom. SEP-1L30 sa modifikoval lineárnym polymérom s veľkosťou 5,5 kĎ, ktorý má pripojený negatívny náboj v zodpovedajúcich polohách 24 a 126 glykozylačných miest humánneho EPO, tento konštrukt bol približne 5x účinnejší ako humánny receptor v porovnaní s myším receptorom. SEP-3-L42, ktorý sa modifikoval lineárnym polymérom s veľkosťou 5,5 kD, majúcim pripojený negatívny náboj v zodpovedajúcich polohách 24, 38, 83 a 126 glykozylačných miest humánneho EPO, bol približne 10x účinnejší ako humánny receptor v porovnaní s myším receptorom. Najväčší rozdiel sa pozoroval pre SEP-1-B50 a SEP-1-B51, ktoré

PP 0277-2003

32081/T

128 sa modifikujú rozvetvenými záporne nabitými polymérmi s veľkosťou 15 kD pripojenými v zodpovedajúcich polohách 24 a 126 glykozylačných miest humánneho EPO a majúce pl približne 5 (podobne humánnemu EPO), tieto dva konštrukty boli ~ 60x účinnejšie ako humánny receptor v porovnaní s myším receptorom.

Pretože myší EPO nemá glykozylačné miesto v polohe zodpovedajúcej polohe 126 humánneho EPO (myší EPO má neglykozylovaný prolín namiesto O-glykozylovaného serínu nájdeného v humánnom EPO), zmenená receptorová aktivita môže byť spôsobená čiastočne týmto rozdielom, a teda preferenciou myšieho receptoru pre EPO, ktorý nemá O-viazanú glykozyláciu v zodpovedajúcej polohe 126. To je v súlade s porovnaním SEP-1-L26 a SEP1-L30 kSEP-1-B50 a SEP-1-B52. Napríklad SEP-1-L26 má polymér bez náboja s veľkosťou 1,8 kD v polohe 126, zatiaľ čo SEP-1-L30 má záporne nabitý polymér s veľkosťou 5,5 kD v polohe 126. Hoci oproti humánnemu EPO receptoru sa pozorovala totožná aktivita, oproti myšiemu EPO receptoru sa zistil štvornásobný rozdiel. Najväčší rozdiel sa pozoroval pre konštrukty SEP-1B50 a SEP-1-B51 so záporne nabitými polymérmi s veľkosťou 15 kD pripojenými v zodpovedajúcej polohe 126 glykozylačného miesta humánneho EPO. Pridanie záporne nabitých polymérov s veľkosťou 5,5 kD v miestach zodpovedajúcich všetkým štyrom natívnym glykozylačným polohám v humánnom EPO, t.j. 24, 38, 83 a 126 ako u konštruktu SEP-3-L42 znížilo preferenciu pre myší receptor ešte viac, ale menej ako u konštruktov SEP-1B50 a SEP-1-B51. Tieto výsledky demonštrujú, že receptorová špecificita sa môže modulovať presnou modifikáciou miest zodpovedajúcich glykozylačným miestam v biologicky vytvorenom, glykozylovanom proteíne a upravením veľkosti, povahy vetvenia a náboja polyméru.

PP 0277-2003

32081/T

129

Príklad 7

Syntéza syntetického proteinu stimulujúceho erytropoézu SEP-1-B51

A. Prípravok SEP-1-B51

Syntetizoval sa šiesty syntetický proteín stimulujúci erytropoézu (nazývaný SEP-1-B51). Aminokyselinová sekvencia kompletného SEP-1-B51 je rovnaká ako sekvencia SEP-1-B50:

APPRLICDSR	VLERYLLEAK
VPDTKVNFYA	WKRMEVGQQA
LVKSSQPWTP	LQLHVDKAVS

PPDAAK^0XAALPL RTITADTFRK

EAEK^oOXITTGCA EHCSLNEKIT

VEVWQGLALL	SEAVLRGQAL
GLRSLTTLLR	ALGAQKTAIS
LFRVYSNFLR	GKLKLYTGEA

CRTGDR (sekv. id. č.: 2) kde Ψ označuje neprirodzený aminokyselinový zvyšok skladajúci sa zcysteínu, ktorý je karboxymetylovaný v sulfhydrylovej skupine a kde K^oxoznačuje neprirodzený lyzín, ktorý je chemicky modifikovaný vepsilonaminoskupine oxímovým linkerom kondenzovaným k určenému polyméru rozpustnému vo vode oxímovou väzbou.

Avšak, na rozdiel od SEP-1-B50, proteín sa derivatizoval rozvetveným polymérnym konštruktom majúcim štyri lineárne (Sukc-TTD)i2-Sukc-Alanín-OH (t.j. (Sukc-TTD)i2-Sukc-Ala-OH alebo (Sukc-TTD)i₂-Sukc-Ala) polyméry kondenzované amidovou väzbou k lyzínovému rozvetvenému jadru. Kondenzácia lineárnych polymérov k rozvetvenému jadru prostredníctvom amidových väzieb sa navrhla kvôli zlepšeniu stability. Sú navrhnuté štyri lineárne polyméry tak, aby niesli alanínovú skupinu a pripojené negatívne náboje, pričom negatívne náboje napodobňujú sialové kyseliny a alanín hydrofóbny charakter podobný pripojeným sacharidovým skupinám sacharidových reťazcov. Rozvetvené polyméry sa navrhli tiež tak, aby mali vo

PP 0277-2003

32081/T

130 vode rozpustný spacer medzi rozvetveným jadrom a miestom pripojenia hlavného reťazca proteínu kvôli zlepšeniu syntézy a manipulačných vlastností rozvetveného templátu jadra a aby napodobňovali rozostupy zisťované v prírodných sacharidových reťazcoch medzi miestom pripojenia sacharidu k hlavnému reťazcu proteínu a prvým bodom vetvenia sacharidu.

Obrázok 21 je schematické zobrazenie chemickej syntézy rozvetveného vo vode rozpustného polyméru GRFNP41 (GP41), ktorý sa pripojil k SEP-1-B51 ligáciou tvoriacou oxím, ako je opísané nižšie. Zostavenie kompletného produktu bolo rovnaké ako bolo opísané v príklade 2. Štruktúra SEP-1-B51 je na obrázku 22.

B. Syntéza (Sukc-TTD)₁₂-Sukc-AlaOtBu (GRFNP39) pre kondenzáciu k rozvetvenému templátu (GRFNP40)

Lineárny polymér (Sukc-TTD)i2-Sukc-AlaOtBu (GRFNP39) sa syntetizoval v 0,5 mol meradle na Sasrin živici, labilnej v kyseline, tvoriacej karboxylovú kyselinu. 0,5 mmol (~ 0,5 g) Sasrin polystyrénové živice, labilné v kyseline, tvoriacej karboxylovú kyselinu (substitúcia hydroxylovej skupiny 1,02 mmol/g), sa nechali napučať v DMF počas 15 minút, a potom sa vysušili. K tejto hydroxyl-funkcionalizovanej živici sa pridalo 450 mg (4,5 mmol) anhydridu kyseliny jantárovej a 488 mg (4 mmol) 4-(dimetylamino)pyridínu rozpusteného v 8 ml DMF obsahujúceho 500 μΙ (3,9 mmol) DIEA (diizopropyletylamín) a nechalo sa reagovať počas 30 minút s trepaním na vortexe a vysušilo. Kondenzácia sa opakovala a nadbytok reaktantov a rozpustné koprodukty sa odstránili 1 minútou trepania na vortexe, prietokovým premytím DMF (~ 50 ml) a potom usušili. HOOC-CH₂CH₂CO-O-živica (0,5 mmol) sa aktivovala pridaním 8 ml čerstvého 1,0 M (8 mmol) CDI (karbonyldiimidazol) roztoku v DMF a nechala reagovať počas 40 minút a potom usušila. Nadbytok reaktantov a rozpustné koprodukty sa odstránili 1 minútou trepania na vortexe, prietokovým

PP 0277-2003

32081/T

131 premytím DMF (~ 50 ml) a potom usušili. Pridali sa 4 ml (4 g, 18,2 mmol) (4,7,10)-trioxatridekán-1,13-diamínu (TTD) rozpustené v 4 ml 0,5M (2 mmol) HOBT roztoku v DMF a nechali reagovať za trepania na vortexe počas 30 minút a potom usušili. Nadbytok reaktantov a rozpustné koprodukty sa odstránili 1 minútou trepania na vortexe, prietokovým premytím DMF (~ 50 ml) a potom usušili. 450 mg (4,5 mmol) anhydridu kyseliny jantárovej rozpustených v 8 ml 0,5 M (4 mmol) HOBT (N-hydroxybenzotriazol) roztoku obsahujúcom 500 μΙ (3,9 mmol) DIEA sa pridalo k živici a nechalo reagovať za trepania na vortexe počas 15 minút a potom usušilo. Tieto tri kroky (CDI aktivácia, TTD kondenzácia, reakcia anhydridu kyseliny jantárovej) sa opakovali jedenásťkrát (t.j. celkovo dvanásťkrát). Nadbytok reaktantov a rozpustné koprodukty sa odstránili 1 minútou trepania na vortexe, prietokovým premytím DMF 50 ml) a usušili. HOOC-CH₂CH₂CO (TTD-sukcinyl)₁₂-O-živica (0,5 mmol) sa aktivovala 8 ml čerstvého 1,0 M (8 mmol) CDI roztoku v DMF a nechala reagovať počas 40 minút a potom usušila. Nadbytok reaktantov a rozpustné koprodukty sa odstránili 1 minútou trepania na vortexe, prietokovým premytím DMF (~ 50 ml) a potom usušili. 2,5 mmol H-AlaOtBu.HCI sa rozpustilo v 4,75 ml 0,5M (2,375 mmol) HOBT v DMF obsahujúcom 150 μΙ (111 mg, 0,825 mmol) DIEA a nechalo reagovať s CDI-aktivovanou HOOC-CH₂CH₂CO (TTD-sukcinyl)i₂-Oživicou (0,5 mmol) počas 1 hodiny za trepania na vortexe a potom usušilo. Nadbytok reaktantov a rozpustné koprodukty sa odstránili 1 minútou trepania na vortexe, prietokovým premytím DMF (~ 50 ml) a potom usušili. Produkt tercBuOOC-CH(CH3)-NH-OC-CH₂CH₂CO (TTD-sukcinyl)i₂-O-živica sa premyl

I ¹ ' . · dôkladne DCM (dichlórmetán), usušil a potom sa živica usušila vo vákuu do konštantnej hmotnosti. Typická hmotnosť produktu - živice bola okolo 2 g.

PP 0277-2003

32081/T

132

Lineárny (Sukc-TTD)i2Sukc-AlaOtBu polymér sa odštiepil od nosnej živice podľa štandardných Fmoc chemických postupov s použitím 4 % TFA v DCM. Precipitovaný surový produkt sa rozpustil v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA a lyofilizoval. Lyofilizovaný polymér sa rozpustil v malom množstve 50 % vodného acetonitrilu obsahujúceho 0,1 % TFA a nariedil tak, aby sa znížila koncentrácia organických látok pod 1 %. Surový produkt sa naniesol na C4 preparatívnu kolónu pre chromatografiu s prevráteným pomerom fáz, ekvilibrovanú pri teplote T = 40 °C v 3 % B. Soli sa eluovali izokraticky a požadovaný templát sa purifikoval lineárnym gradientom 20 - 35 % pufra B (acetonitril obsahujúci 0,1 % TFA) proti 0,1 % vodnej TFA počas 60 minút. Frakcie obsahujúce požadovaný (Sukc-TTD)i₂-Sukc-AlaOtBu materiál (GRFNP39) sa identifikovali ES-MS, zmrazili a lyofilizovali.

C. Syntéza templátu nesúceho mnohonásobné amínové skupiny na rozvetvenie a chránenú aminooxyskupinu pre (neskoršie) pripojenie k proteinu (GRFNP40)

Templát GRFNP40 sa syntetizoval ručne na Sieber živici tvoriacej amidovú väzbu v 0,4 mmol meradle. Vykonáva sa jednominútový krok prietokového premytia DMF medzi každým krokom kondenzácie, odstránenie chrániacej skupiny a aktivácia. 2 mmol N^alfa-Fmoc-N^beta(Boc-aminooxyacetyl)-Ldiaminopropiónovej kyseliny sa kondenzovali k živici s použitím 30-minútovej NHS-ester preaktivácie 2 mmolmi DIC a 2 mmolmi NHS vDCM/DMF (dimetylformamid) počas 1 hodiny. Po odstránení Fmoc chrániacej skupiny (2 x 3 minúty 20 % objem/objem piperidínu v DMF) a premytí sa 4 mmol anhydridu kyseliny jantárovej rozpustenej v 8 ml 0,5 M HOBT (N-hydroxybenzotriazol) roztoku obsahujúcom 2,2 mmol DIEA kondenzovali k živici počas 10 minút. Po tomto kroku sa karboxylová skupina aktivovala 8 ml čerstvého 0,5 M (4 mmol) CDI roztoku v DMF. 4 ml (18,2 mmol) TTD sa pridali v 4 ml 0,5 M HOBT roztoku v DMF a kondenzovali počas 30 minút.

PP 0277-2003

32081/T

133 mmol Fmoc-Lys (Fmoc)-OH sa kondenzovali k výslednej amino-TTDSukc-Dpr(BocAoA)-živici (kde Dpr = diaminopropiónová kyselina) s použitím 30 minút preaktivácie 2 mmolmi DIC a 2 mmolmi NHS v DMF a kondenzácia počas 1 hodiny. Táto kondenzácia sa raz opakovala. Po kroku Fmoc odstránenia (2x3 minúty 20 % objem/objem piperidínu v DMF), 4 mmol FmocLys(Fmoc)-OH sa kondenzovali tak, ako bolo opísané vyššie, vrátane opätovnej kondenzácie. Po konečnom Fmoc ochrannom kroku (2x3 minúty 20 % objem/objem piperidínu v DMF) sa templát odštiepil od nosnej živice podľa štandardných Fmoc chemických postupov s použitím 4 % TFA v DCM. Precipitovaný produkt sa rozpustil v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA a lyofilizoval. Lyofilizovaný surový produkt sa rozpustil v malom množstve 50 % vodného acetonitrilu obsahujúceho 0,1 % TFA a nariedil tak, aby sa znížila koncentrácia organických látok pod 1 %. Templát sa naniesol na C4 preparatívnu kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz, ekvilibrovanú pri teplote T = 40 °C v 3 % pufra B (0,1 % TFA v acetonitrile). Soli a ďalší neamidový materiál sa eluovali izokraticky a požadovaný templát sa purifikoval lineárnym gradientom 5 -12 % pufra B (acetonitril obsahujúci 0,1 % TFA) proti 0,1 % vodnej TFA počas 60 minút. Frakcie obsahujúce požadovanú látku LysLys(Lys)-TTD-Sukc-Dpr (BocAoA).amid (GRFNP40) sa identifikovali ES-MS, zmrazili a lyofilizovali.

D. Zostavenie a odstránenie chrániacej skupiny zamidom kondenzovaného rozvetveného polyméru (GRFNP41)

GRFNP41, rozvetvený (TTD-Sukc)₄9-polymér s molekulovou hmotnosťou 16 kD sa syntetizoval kondenzáciou GRFNP39 [(Sukc-TTD)i2-Sukc-AlaOtBu) k purifikovanému templátu GRFNP40. Purifikovaný (Sukc-TTD)i₂-SukcAlaOtBu (GRFNP39) (1,0 mmol) rozpustený v DMSO (dimetylsulfoxid) pri 60 °C na koncentráciu 20 mg/ml sa aktivoval 0,95 mol HATU {O-(7-azabenzotriazol1-yl)-1,1,3,3-tetrametyluróniumhexafluórfosfát} v DMSO v koncentrácii 10

PP 0277-2003

32081m

134 mg/ml v prítomnosti dvadsaťnásobného (molárneho) nadbytku DIEA. Bezprostredne sa pridal purifikovaný templát GRFNP40 (0,24 mol) rozpustený v DMSO v koncentrácii 3,9 mg/ml. Postup reakcie sa monitoroval C4 analytickou HPLC s prevráteným pomerom fáz a ES-MS. Typicky, kondenzácia sa skončila za pár minút. Kvôli spracovaniu sa pridali 4 objemy (relatívne k ligačnej zmesi) 0,1 M acetátu sodného/6M guanidíniumchloridu, pH 4, a roztok sa naniesol na preparatívnu (C4) kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz. Soli a ďalšie látky neobsahujúce amid sa eluovali izokraticky a požadovaný rozvetvený polymérny produkt sa purifikoval lineárnym gradientom 20 - 35 % pufra B (acetonitril obsahujúci 0,1 % TFA) proti 0,1 % vodnej TFA počas 80 minút. Frakcie obsahujúce požadovanú látku sa identifikovali ES-MS, zmrazili a lyofilizovali.

Výsledný purifikovaný polymér sa rozpustil v čistej TFA v koncentrácii 1 mg/ml počas 1 hodiny, aby sa odstránila Boe skupina z aminooxyacetylovej skupiny a aby sa odstránili skupiny terc-butylesteru z -Ala-OtBu skupín. Roztok sa rotoval do sucha na rotačnej odparke a usušený polymér sa rozpustil v 50 % pufra B (acetonitril obsahujúci 0,1 % TFA). Aminooxyoctová kyselina (tiež karboxymetoxylamín) sa pridala do konečnej koncentrácie 0,5M, aby sa odstránili nečistoty tvoriace adičné zlúčeniny. Po 20 minútach sa roztok nariedil

3,3 objemami pufra A (0,1 % TFA vo vode) a naniesol na preparatívnu C4 kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz a čerpal do 10 % pufra B, kým sa neodstránila všetka aminooxyoctová kyselina, potom sa polymér purifikoval stupňovým gradientom 15 % až 45 % pufra B proti 0,1 % vodnej TFA počas .80 minút. Zlúčené frakcie obsahujúce požadovanú rozvetvenú polymérnu látku (GRFNP41) sa zmrazili a lyofilizovali.

PP 0277-2003

32081/T

135

E. Ligácia tvoriaca oxím (oximácia) peptidových segmentov GRFN 1776 a GRFN 1711 s rozvetveným polymérom GRFNP41

Segment SEP-1:4 (GRFN 1776, skladá sa zo zvyškov 117 -166 sekv. id. č.: 2) a segment SEP-1:1 (GRFN 1711, skladá sa zo zvyškov 1 - 32 sekv. id. č.: 2) sa syntetizovali tak, ako bolo opísané vyššie v príklade 1 s použitím štandardnej in situ neutralizačnej Boe chémie SPPS. Peptid GRFN 1776 sa syntetizoval na -OChk-Pam-živici podľa štandardných protokolov, ako bolo opísané tiež vyššie. Peptid GRFN 1711 sa syntetizoval na živici vytvárajúcej tioester podľa štandardných protokolov, ako bolo opísané vyššie. Segment GRFN 1776 obsahujúci acylovú skupinu levulovej kyseliny na Lys¹²⁶ a AoAobsahujúci GRFNP41 sa spoločne rozpustili v ekvimolárnom pomere v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA. Roztok sa lyofilizoval. Usušený práškový surový produkt sa opäť rozpustil v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA a naniesol na preparatívnu kolónu (C4) pre HPLC s prevráteným pomerom fáz. Polymérne modifikovaný peptid sa oddelil od nemodifikovaného peptidu a nezreagovaného polyméru preparatívnou gradientovou HPLC s prevráteným pomerom fáz. Frakcie obsahujúce požadovaný produkt spojený soxímom (oxímovaný) SEP-1:4 + GP41 sa identifikovali ES-MS, zlúčili a lyofilizovali.

Segment GRFN 1711 obsahujúci acylovú skupinu levulovej kyseliny na Lys²⁴ a AoA-obsahujúci GRFNP41 sa spoločne rozpustili v ekvimolárnom pomere v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA. Roztok sa zmrazil a lyofilizoval. Usušený prášok sa rozpustil v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA a naniesol na C4 preparatívnu kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz. Polymérne modifikovaný peptid sa oddelil od nemodifikovaného peptidu a nezreagovaného polyméru preparatívnou gradientovou elúciou C4 HPLC s prevráteným pomerom fáz. Frakcie obsahujúce požadovaný produkt spojený soxímom (oxímovaný) SEP-1:1 + GP41 sa identifikovali ES-MS, zlúčili a lyofilizovali.

PP 0277-2003

32081Π

136

F. Syntéza syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu SEP-1-B51

SEP-1-B51 (majúci sekv. id. č.: 2) sa syntetizoval v roztoku zo štyroch polypeptidových segmentov:

Segment SEP-1:1 + GP41 (GRFN 1711 + GRFNP41, zodpovedajúci zvyškom 1 - 32 sekv. id. č.: 2):

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^0XITTGCA EH-tioester (kde Lys²⁴ má pripojenú acylovú skupinu levulovej kyseliny spojenú oxímom k rozvetvenému polyméru GRFNP41, ako označené K^ox a kde His³² je chránený Dnp)

Segment SEP-1:2 (GRFN 1712, zodpovedajúci zvyškom 33 - 88 sekv. id. č.: 2):

CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL

SEAVLRGQAL LVKSSQPW-tioester (kde Cys³³ je chránený Acm a kde tri Trp zvyšky sú chránené formylovou skupinou)

Segment SEP-1:3 (GRFN 1713, zodpovedajúci zvyškom 89-116 sekv. id. č.: 2):

CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-tioester (kde Cys⁸⁹ je chránený Acm a kde His⁹⁴ je chránený Dnp)

Segment SEP-1:4 + GP41 (GRFN 1776 + GRFNP41, zodpovedajúci zvyškom 117-166 sekv. id. č.: 2):

CAIS PPDAAK^0XAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR

GKLKLYTGEA CRTGDR-karboxylát (kde C-koncový cysteín (t.j. Cys¹⁶¹) nesie pikolylovú (piko) chrániacu skupinu a kde Lys¹²⁶ má pripojenú acylovú skupinu levulovej kyseliny spojenú oxímom k rozvetvenému polyméru

PP 0277-2003

32081/T

137

GRFNP41, ako označené K^ox).

Syntéza ďalších peptidov, ligačné reakcie, karboxymetylácia, deprotekčné reakcie, zvinutie a purifikácie sa vykonávali za vzniku kompletného zvinutého SEP-1-B51 (sekv. id. č.: 2), ako bolo opísané v príkladoch 1 až 4, s nasledujúcimi modifikáciami:

Krok 1 :Ligácia č. 1

Segment SEP-1:4 + GP41 sa rozpustili vTFE (1 objem) v 3 mM koncentrácii. Segment SEP-1:3 sa rozpustil v 2 objemoch 300 mM Na fosfátového pufra (pH 7,9) obsahujúcom 6M guanidíniumchlorid v koncentrácii

2,25 mM. Tieto dva roztoky sa miešali za vzniku konečnej koncentrácie segmentu 1 mM SEP-1:4 + GP41 a 1,5 mM SEP-1:3 a pridal sa 1 % tiofenol za vzniku roztoku (3 objemy”) peptidových segmentov v pH 6,8 - 7,2. Reakcia pokračovala cez noc pri teplote miestnosti. Po ligácii sa k ligačnej zmesi pridal β-merkaptoetanol (3 objemy), nasledovali 3 objemy 300 mM pufra fosfátu sodného, pH 7,9, obsahujúceho 6M guanidíniumchlorid a pridal sa TCEP (0,25 hmotnosti celkovej hmotnosti peptidových segmentov) a roztok sa miešal počas 20 minút. Roztok sa acidifikoval na hodnotu pH 4,0 ± 0,1 s 0,6 objemom ľadovej kyseliny octovej za vzniku číreho roztoku, ku ktorému sa pridalo 30 objemov pH 4,0, 100 mM riediaceho pufra acetátu sodného, 6M guanidíniumchloridu. Výsledný roztok sa naniesol na preparatívnu kolónu (C4) pre HPLC s prevráteným pomerom fáz. Pufor sa čerpal do 5 % B (teda zvyšok je 95 % pufra A (0,1 % TFA vo vode)), kým sa z kolóny neeluovali všetky nepeptidové látky, potom sa ligačný produkt purifikoval gradientom 25 - 45 % pufra B počas 80 minút. Frakcie obsahujúce požadovaný ligačný produkt (Cys⁸⁹(Acm)) (Sep-1:3 + SEP-1:4 + GP41) sa identifikovali elektrosprejovou hmotnostnou spektrometriou a zlúčili.

PP 0277-2003

32081/T

138

Krok 2: Odstránenie Acm č. 1

Kvôli odstráneniu Acm sa vodný roztok acetónitrilu obsahujúci zlúčené frakcie (Cys⁸⁹(Acm)) (Sep-1:3 + SEP-1:4 + GP41) nariedil 1x vodou v kvalite pre HPLC a do konečnej koncentrácie 2M sa pridala pevná močovina. Pridal sa trojnásobný molárny nadbytok (relatívny k celkovej očakávanej koncentrácii cysteínu) 30 mg/ml roztoku Hg(acetát)2 v 3 % vodnej kyseline octovej a roztok sa miešal počas jednej hodiny. Roztok sa potom nariedil na 20 % βmarkaptoetanolom, naniesol na semipreparatívnu kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz a čerpal do 25 % pufra B, kým sa všetky nepeptidové látky neeluovali a produkt sa potom purifikoval stupňovým gradientom do 50 % pufra B. Frakcie obsahujúce požadovaný ligačný produkt (Sep-1:3 + SEP-1:4 + GP41) sa identifikovali elektrosprejovou hmotnostnou spektrometriou, zlúčili a lyofilizovali.

Krok 3: Ligácia č. 2

Produkt (Sep-1:3 + SEP-1:4 + GP41) (t.j. 1713 - 1776 - GP41) z kroku 2 sa rozpustil v TFE (1 objem) v 3 mM koncentrácii. Segment SEP-1:2 (segment GRFN 1712) sa rozpustil v 2 objemoch 300 mM Na fosfátového pufra (pH 7,9), obsahujúceho 6M guanidíniumchlorid v koncentrácii 2,25 mM. Tieto dva roztoky sa miešali za vzniku konečnej koncentrácie segmentu 1 mM (SEP-1:3 + SEP1:4 + GP41) a 1,5 mM SEP-1:2 a pridal sa 1 % tiofenol za vzniku roztoku (”3 objemy”) peptidových segmentov v pH 6,8 - 7,2. Reakcia pokračovala cez noc pri teplote miestnosti. Potom sa ligačná zmes nariedila 3 objemami (t.j. relatívne k objemu TFE použitému vyššie) riediaceho pufra: 100 mM acetát sodný, pH 4,0, obsahujúci 6M guanidíniumchlorid, a potom sa pridali k roztoku, ochladenému na 4 °C, ktorý tvorili 3 objemy TFE, 3 objemy β-merkaptoetanolu, 3 objemy piperidínu a 6 objemov 6M guanidíniumchloridu, 100 mM acetát sodný, pH 4,0, a miešala sa počas 20 minút pri teplote miestnosti, aby sa

PP 0277-2003

32081/T

139 odstránili všetky zvyšné chrániace skupiny. Roztok sa acidifikoval 1,8 objemami zmrazenej ľadovej kyseliny octovej za vzniku číreho roztoku, ku ktorému sa pridal TCEP (0,25 hmotnosti celkovej hmotnosti peptidových segmentov) a roztok sa inkuboval počas 20 minút. Potom sa pridalo 30 objemov riediaceho pufra 100 mM acetátu sodného, pH 4,0, 6M guanidíniumchloridu, a roztok sa miešal. Výsledný roztok sa naniesol na preparatívnu kolónu (C4) pre HPLC s prevráteným pomerom fáz. Pufor sa čerpal do 30 % C (Pufor C: 0,1 % TFA v zmesi 60 % izopropanol/30 % acetonitril/10 % voda), kým sa z kolóny neeluovali všetky nepeptidové látky, potom sa ligačný produkt purifikoval gradientom 37 - 57 % pufra C počas 80 minút. Frakcie obsahujúce požadovaný ligačný produkt (Cys³³(Acm)) (SEP-1:2 + SEP-1:3 + SEP-1:4 + GP41) sa identifikovali ES-MS, zlúčili a identifikovali.

Krok 4: Karboxymetylácia zvyškov Cys⁸⁹ a Cys¹¹⁷ (Cys³³(Acm))(SEP-1:2 + SEP-1:3 + SEP-1:4 + GP41) (t, j. Cys³³(Acm)1712 - 1713 - 1776 - GP41) sa rozpustil v TFE v 1 mM koncentrácii. Pridalo sa 10 objemov pufra 300 mM fosfátu sodného (pH 7,9) obsahujúceho 6M guanidíniumchlorid. Pridal sa 25-násobný nadbytok (čo sa týka sulfhydrylových skupín) brómoctovej kyseliny rozpustenej v metanole v koncentrácii 75 mg/ml a roztok sa nechal reagovať za miešania počas 2 hodín pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa potom nariedila 11 objemami 100 mM acetátu sodného, pH 4,0, 6M guanidíniumchloridu, naniesla na preparatívnu kolónu (C4) pre HPLC s prevráteným pomerom fáz a čerpala do 20 % pufra C, kým sa neeluovali všetky nepeptidové zložky, potom sa ligačný produkt purifikoval stupňovým gradientom do 55 % pufra C. Frakcie obsahujúce požadovaný modifikovaný produkt (Cys³³(Acm), ψ⁶⁹'¹¹⁷) (Sep-1:2 + SEP-1:3 + SEP-1:4 + GP41) sa identifikovali ES-MS, zlúčili a lyofilizovali.

PP 0277-2003

32081/T

140

Krok 5: Odstránenie pikolylovej skupiny

Zinkový prach (71 mg na miligram peptidu) sa aktivoval v 2M HCI počas 5 minút, aktivácia sa raz opakovala, potom sa zinok premyl počas 10 minút 6M guanidíniumchloridom, 50 mM glycínom, pH 2,2, obsahujúcim (čerstvo pridaný) 35 mg/ml L-metionínu a 35 mg/ml dodekanoylsarkozínu sodného a 10 % (objem/objem) TFE. Odstránil sa nadbytok kyseliny. Premytie sa ešte raz opakovalo. Cys¹⁶¹(Piko)-obsahujúci peptid (Cys³³(Acm), \y^89,117)(Sep-1:2 + SEP1:3 + SEP-1:4 + GP41) sa rozpustil v čistom TFE v približne 30 mg/ml koncentrácii. Roztok sa nariedil 4 objemami (relatívne k TFE) 6M guanidíniumchloridu, 50 mM glycínu, pH 2,2, obsahujúcim (čerstvo pridaný) 35 mg/ml L-metionínu a 35 mg/ml dodekanoylsarkozínu sodného a 10 % (objem/objem) TFE. Roztok sa pridal k aktivovanému zinkovému prášku a miešal počas 50 minút pri teplote miestnosti. Reakcia sa monitorovala analytickou C4 HPLC s prevráteným pomerom fáz alikvótov (podrobených pôsobeniu rovnakým objemom β-merkaptoetanolu a niekoľko zrniek TCEP, potom nariedených 2 objemami 6M guanidíniumchloridu, 100 mM acetátu sodného, pH 4,0, kvôli analýze) v ~ 1 hodinových intervaloch a reakcia bola kompletná po 2 až 5 hodinách. Potom, ako sa odstránenie pikolylovej skupiny skončilo, ako je ukázané ES-MS analýzou vrcholov analytickej HPLC (t.j. strata hmoty s veľkosťou 91 D), supernatant sa odstránil filtráciou a zvyšný Zn prášok sa premyl 3 krát 6M guanidíniumchloridom, pH 4, 100 mM acetátom obsahujúcim 35 mg/ml L-metionínu a 35 mg/ml dodecylsarkozínu obsahujúceho 20 % TFE. Perličky BioRad SM-2 (približne jedna tretina objemu roztoku) sa pridali k zlúčenému supernatantu s premývacím pufrom a miešali pri teplote miestnosti počas 30 minút, potom filtrovali. Pridal sa βmerkaptoetanol do 10 % (objem/objem), potom sa pridalo 0,25 x (spojená hmotnosť peptidov) TCEP a roztok sa miešal počas 5 minút pri teplote miestnosti. Roztok sa nariedil 1 : 1 rovnakým objemom 100 mM acetátu sodného, pH 4,0, 6M guanidíniumchloridu a naniesol na preparatívnu kolónu (C4) HPLC s prevráteným pomerom fáz a 35 % pufra C sa čerpalo, kým sa

PP 0277-2003

32081/Γ

141 neeluovali všetky nepeptidové látky a požadovaný produkt sa purifikoval stupňovým gradientom do 55 % pufra C. Frakcie obsahujúce požadovaný Cys¹⁶¹-odchránený produkt (Cys³³(Acm), \y^89,117){Sep-1:2 + SEP-1:3 + SEP-1:4 + GP41-Piko} sa identifikovali elektrosprejovou hmotnostnou spektrometriou a zlúčili.

Krok 6: Odstránenie Acm č. 2

Zlúčený roztok (Cys³³(Acm), ψ^89,117) (Sep-1:2 + SEP-1:3 + SEP-1:4 + GP41-Piko} (t.j. (Cys³³(Acm), ψ⁸⁹'¹¹⁷) -1712 - 1713 - 1776 - GP41) sa nariedil 3x vodou v kvalite pre HPLC a do konečnej koncentrácie 2M sa pridala pevná močovina. Pridal sa trojnásobný molárny pomer (relatívny k celkovej koncentrácii cysteínu) 30 mg/ml roztoku Hg(acetát)₂ v 3 % vodnej kyseline octovej a roztok sa miešal počas jednej hodiny pri teplote miestnosti. Roztok sa potom nariedil na 20 % β-markaptoetanolom a naniesol na semipreparatívnu kolónu (C4) HPLC s prevráteným pomerom fáz. Pufor C (20 %) sa čerpal, kým sa všetky nepeptidové látky neeluovali, a potom sa požadovaný produkt purifikoval stupňovým gradientom do 55 % pufra C. Frakcie obsahujúce požadovaný ligačný produkt (Cys³³, \y^89,117){Sep-1:2 + SEP-1:3 + SEP-1:4 + GP41-Piko} sa identifikovali ES-MS, nariedili 2x (objem/objem) vodou obsahujúcou 2x (hmotnosť/hmotnosť relatívne k peptidovej hmote) DPC (dodecylfosfocholín) a lyofilizovali sa cez noc.

Krok 7: Ligácia č. 3 (Cys³³, v^89,117){Sep-1:2 + SEP-1:3 + SEP-1:4 + GP41-Piko} (t.j. (Cys³³, ψ⁸⁹'¹¹⁷)- 1712 - 1713 - 1776 - GP41) sa rozpustil v čistom TFE (1 objem) v 3 mM koncentrácii. SEP-1:1 (t.j. 1711-GP41) sa rozpustil v 2 objemoch pufra 300 mM fosfáte sodnom (pH 7,9) obsahujúcom 6M guanidíniumchlorid. Roztoky sa spojili a pridalo sa 1 % (objem/objem) tiofenol. Ligačná zmes sa miešala cez

PP 0277-2003

32081/T

142 noc pri teplote miestnosti. K roztoku sa pridali 3 objemy (relatívne k TFE objemu vyššie) β-merkaptoetanolu a 9 objemov ligačného pufra (300 mM pufor fosfát sodný, pH 7,9, obsahujúci 6M guanidíniumchlorid). K roztoku sa pridalo 0,25x (spojené hmotnosti peptidov) TCEP a roztok sa miešal pri teplote miestnosti počas 20 minút. Pridalo sa 0,6 objemov ľadovej octovej kyseliny kvôli okysličeniu roztoku na pH 4,0 a roztok sa potom nariedil 30 objemami 100 mM acetátu sodného, pH 4,0, obsahujúceho 6M guanidíniumchlorid a naniesol sa na preparatívnu kolónu (C4) HPLC s prevráteným pomerom fáz. Pufor C (25 %) sa čerpal, kým sa neeluovali všetky nepeptidové látky, potom sa ligačný produkt purifikoval lineárnym gradientom pufra C od 35 do 55 % počas 80 minút. Frakcie obsahujúce požadovaný ligačný produkt SEP-1 (1 -166) (ψ^89,117) {Sep-1:1 + (GP41) + SEP-1:2 + SEP-1:3 + SEP-1:4 + GP41] (sekv. id. č. 2) sa identifikovali elektrosprejovou hmotnostnou spektrometriou a zlúčili.

Krok 8: Zvinutie

K spojeným frakciám obsahujúcim kompletný ligovaný peptid SEP-1 (1 166) (ψ⁸⁹¹¹⁷){Sep-1:1 + (GP41) + SEP-1:2 + SEP-1:3 + SEP-1:4 + GP41} (t.j. 1711 (GP41) - 1712 - 1713 - 1776 - GP41) sa pridal pevný guanidíniumchlorid, 1M Tris pufor (pH 8,7) a destilovaná voda za vzniku konečného roztoku 0,1 mg/ml ligovaného peptidu SEP-1 (1 - 166), 6M guanidíniumchloridu, 100 mM Tris. Tento roztok ligovaného peptidu (proteinu”) sa naniesol do 15 ml dialyzačných kaziet a dialyzoval cez noc pri 4 °C proti roztoku 100 mM Tris

I pufra (pH 8,5) obsahujúcemu 3M guanidíniumchlorid, 5 μΜ cysteín a 2 μΜ cystín. Proteínový roztok sa potom dialyzoval proti roztoku 100 mM Tris pufra (pH 8,5) obsahujúcemu 1M guanidíniumchlorid počas 8 hodín v 4 °C a konečne sa dialyzoval proti 10 mM Tris pufra (pH 7,0) počas 14 hodín pri 4 °C za vzniku konečného zvinutého produktu. Zvinuté roztoky obsahujúce roztoky z dialyzačných kaziet sa spojili. Zvinutie sa overilo ES-MS, analytickou RPHPLC a CD spektrometriou.

PP 0277-2003

32081/T

143

Krok 9: Purifikácia

Roztok obsahujúci zvinutý proteín sa naniesol na iónomeničovú kolónu Q-Sepharose ekvilibrovanú 10 mM Tris, pH 7,0. Zvinutý proteín sa eluoval s použitím lineárneho soľného gradientu do 125 mM NaCl. Frakcie obsahujúce požadovaný zvinutý produkt SEP-1-B51 sa identifikovali neredukčnou SDSPAGE a zlúčili. Spojené frakcie sa koncentrovali ultrafiltráciou na koncentráciu približne 2 mg/ml, potom sa roztok proteínu naniesol na 2,6 x 100 cm S-300 gélovú filtračnú kolónu. Purifikovaný SEP-1-B51 sa eluoval 10 mM Tris pH 7,0, 137 mM chloridom sodným. Frakcie obsahujúce SEP-1-B51 s vysokou čistotou sa identifikovali neredukčnou SDS-PAGE, zlúčili, zmrazili a uložili v -80 °C. Konečný purifikovaný zvinutý proteín SEP-1-B51 sa charakterizoval analytickou (C4) HPLC s prevráteným pomerom fáz, ES-MS, neredukčnou SDS-PAGE a CD spektrometriou. Obrázok 25 ukazuje reprezentatívny gél izoelektrickej fokusácie (IEF) a gél z neredukčnej SDS-PAGE ukazujúcej relatívnu molekulovú hmotnosť zvinutého purifikovaného SEP1-B51. Kvôli porovnaniu sú ukázané štandardy molekulovej hmotnosti pustené na rovnakých géloch. Ako je ukázané, relatívna molekulová hmotnosť SEP-1-B51 určená neredukčnou SDS-PAGE je približne 73 kD. Relatívne pl je približne 5,0. Tiež je ukázaný reprezentatívny chromatogram RP-HPLC zvinutého purifikovaného SEP-1-B51 produktu. To ukazuje čistotu a zvýšenú relatívnu molekulovú hmotnosť presných polymérne modifikovaných proteínov podľa predloženého vynálezu.

Príklad 8

I Syntéza syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu SEP-1-B52

A. Prípravok SEP-1-B52

Syntetizoval sa siedmy syntetický proteín stimulujúci erytropoézu (nazývaný SEP-1-B52). Aminokyselinová sekvencia kompletného SEP-1-B52 je rovnaká ako sekvencia SEP-1-B51:

PP 0277-2003

32081/T

144

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^0XITTGCA EHCSLNEKIT

VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL

LVKSSQPV\APP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKTAIS

PPDAAK^0XAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

SEP-1-B52 sa derivatizoval vo zvyškoch 24 a 126 rozvetveným (SukcTTD)₁₂-Sukc-Ala polymérnym konštruktom podobným SEP-1-B51, ale u tohto analógu sa polymér pripojil prostredníctvom oxímovej väzby medzi pyrohroznovou kyselinou a aminooxyoctovou kyselinou. Navyše, epsilonaminoskupina lyzínových zvyškov 24 a 126 sa modifikovala tak, aby niesla aminooxyacetylovú funkčnú skupinu namiesto acylovej skupiny levulovej kyseliny a rozvetvený (Sukc-TTD)₁₂-Sukc-Ala polymérny konštrukt sa vytvoril tak, aby niesol pripojenú acylovú skupinu pyrohroznovej kyseliny. Tieto zmeny sa navrhli kvôli zlepšeniu syntézy a manipulácie a ďalšiemu zvýšeniu stability oxímových väzieb.

Obrázok 23 je schematické zobrazenie chemickej syntézy rozvetveného polyméru rozpustného vo vode GRFNP43 (GP43), ktorý sa pripojil k SEP-1-B52 ligáciou tvoriacou oxím, ako je opísané podrobne nižšie. Zostavenie kompletného produktu bolo rovnaké, ako bolo opísané v príklade 2. Štruktúra SEP-1-B52 je ukázaná na obrázku 24.

PP 0277-2003

32081/T

145

B. Syntéza (Sukc-TTD)i₂-Sukc-AlaOtBu (GRFNP39) pre kondenzáciu k rozvetvenému templátu (GRFNP42) (Sukc-TTD)₁₂-Sukc-AlaOtBu (GRFNP39) sa syntetizoval v 0,5 mmol meradle. 0,5 mmol (~ 0,5 g) Sasrin polystyrénovej živice, labilnej v kyslom prostredí, tvoriacej karboxylovú kyselinu (substitúcia hydroxylovej skupiny 1,02 mmol/g) sa nechalo napučať v DMF počas 15 minút a potom usušilo. K tejto hydroxyl-funkcionalizovanej živici sa pridalo 450 mg (4,5 mmol) anhydridu kyseliny jantárovej a 488 mg (4 mmol) 4-(dimetylamino)pyridínu rozpusteného v 8 ml DMF obsahujúcich 500 μΙ (3,9 mmol) DIEA (diizopropyletylamín) a nechalo sa reagovať počas 30 minút za trepania na vortexe a potom usušilo. Kondenzácia sa opakovala a nadbytok reaktantov a rozpustné koprodukty sa odstránili 1 minútou trepania na vortexe, prietokovým premytím DMF (~ 50 ml) a potom usušili. 0,5 mmol HOOC-CH₂CH₂CO-O-živice sa aktivovalo pridaním 8 ml čerstvého 1,0 ml (8 mmol) CDI roztoku v DMF a nechalo reagovať počas 40 minút a potom usušilo. Nadbytok reaktantov a rozpustné koprodukty sa odstránili 1 minútou trepania na vortexe, prietokovým premytím DMF (~ 50 ml) a usušili. Pridali sa 4 ml (4 g, 18,2 mmol) TTD rozpusteného v 4 ml 0,5 M (2 mmol) HOBT roztoku v DMF a nechali reagovať za trepania na vortexe počas 30 minút a usušili. Nadbytok reaktantov a rozpustné koprodukty sa odstránili 1 minútou trepania na vortexe, prietokovým premytím DMF (~ 50 ml) a usušili. 450 mg (4,5 mmol) anhydridu kyseliny jantárovej rozpustených v 8 ml 0,5 M (4 mmol) HOBT (N-hydroxybenzotriazol) roztoku obsahujúcom 500 μΙ (3,9 mmol) DIEA sa pridalo k živici a nechalo reagovať za trepania na vortexe počas 15 minút a potom usušilo. Tieto tri kroky (CDI aktivácia, TTD kondenzácia, reakcia anhydridu kyseliny jantárovej) sa opakovali jedenásťkrát (t.j. celkovo dvanásťkrát). Nadbytok reaktantov a rozpustné koprodukty sa odstránili 1 minútou trepania na vortexe, prietokovým premytím DMF (~ 50 ml) a usušili. 0,5 mmol HOOC-CH₂CH₂CO (TTD-sukcinyl)i₂-O-živice sa aktivovalo 8 ml čerstvého 1,0M (8 mmol) CDI roztoku v DMF, nechalo reagovať počas 40 minút a usušilo. Nadbytok reaktantov a rozpustné koprodukty sa odstránili 1 minútou trepania na vortexe, prietokovým premytím DMF (~ 50 ml) a usušili. 2,5 mmol

PP 0277-2003

32081/T

146

H-AlaOtBu.HCI sa rozpustilo v 4,75 ml 0,5 M (2,375 mmol) HOBT v DMF obsahujúceho 150 μΙ (111 mg, 0,825 mmol) DIEA a nechalo reagovať sCDIaktivovanou HOOC-CH2CH2CO(TTD-sukcinyl)i2-O-živicou (0,5 mmol) počas 1 hodiny za trepania na vortexe a potom usušilo. Nadbytok reaktantov a rozpustné koprodukty sa odstránili 1 minútou trepania na vortexe, prietokovým premytím DMF (~ 50 ml) a potom usušili. Produkt terc-BuOOC-CH(CH₃)-NHOC-CH₂CH₂CO (TTD-sukcinyl)i₂-O-živice sa premyl dôkladne DCM, usušil a potom sa živica usušila vo vákuu do konštantnej hmotnosti. Typická hmotnosť produktu - živice bola okolo 2 g.

Lineárny GRFNP39 sa odštiepil od nosnej živice podľa štandardných Fmoc chemických postupov s použitím 4 % TFA v DCM. Precipitovaný surový produkt sa rozpustil v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA a lyofilizoval. Lyofilizovaný polymér sa rozpustil v malom množstve 50 % vodného acetonitrilu obsahujúceho 0,1 % TFA a nariedil tak, aby sa znížila koncentrácia organických látok pod 1 %. Surový produkt sa naniesol na C4 preparatívnu kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz, ekvilibrovanú pri teplote T = 40 °C v 3 % soli. Soli sa eluovali izokraticky a požadovaný templát sa purifikoval lineárnym gradientom 20 - 35 % pufra B (acetonitril obsahujúci 0,1 % TFA) proti 0,1 % vodnej TFA počas 60 minút. Frakcie obsahujúce požadovaný (SukcTTD)₁₂-Sukc-AlaOtBu materiál (GRFNP39) sa identifikovali ES-MS, zmrazili a lyofilizovali.

C. Syntéza templátu nesúceho mnohonásobné amínové skupiny pre rozvetvenie a pripojenú acylovú skupinu pyrohroznovéj kyseliny pre (neskoršie) pripojenie k proteínu (GRNP42)

Templát sa syntetizoval ručne na Boc-Leu-OCH₂-Pam-živici v 0,4 mmol meradle. Vykonával sa jednominútový krok prietokového premytia DMF medzi každým krokom kondenzácie, odstránenie chrániacej skupiny a aktivácia. Boe skupina sa odstránila pôsobením čistej (t.j. 100 %) TFA. Po DMF premytí sa 2 mmol Fmoc-(Rinkova spojka)-OH kondenzovali k živici po aktivácii 1,8 mmol HBTU v 3,8 ml DMF obsahujúcom 1 ml DIEA. Po odstránení Fmoc chrániacej

PP 0277-2003

32081/T

147 skupiny (2x3 minúty 20 % piperidínu v DMF), 2 mmol Fmoc-Lys (MTT)-OH (MTT = 4-metyltritylová skupina) sa kondenzovali k živici s použitím NHS-ester aktivácie 2 mmol DIC a 2 mmol NHS v DMF. Po odstránení Fmoc chrániacej skupiny (2 x 1 minúta 0,5 % DBU v DMF) sa 4 mmol anhydridu kyseliny jantárovej rozpustenej v 8 ml z 0,5 M HOBT roztoku, obsahujúcom 2,2 mmol DIEA, kondenzovali k živici počas 10 minút. Po tomto kroku sa karboxylová skupina naviazaná na živicu aktivovala 8 ml čerstvého 0,5 M CDI roztoku v DMF. 4 ml TTD sa pridali v 4 ml 0,5 M HOBT roztoku a kondenzovali počas 30 minút.

mmol Fmoc-Lys(Fmoc)-OH sa kondenzovali k živici s použitím NHSester aktivácie 2 mmolmi DIC a 2 mmolmi NHS v MDF. Po kroku Fmoc odstránenia (2 x 1 minúta 0,5 % DBU v DMF), 4 mmol Boc-Lys (Boc)-NHS sa kondenzovali v 3 ml DMF.

MTT chrániaca skupina sa odstránila mnohonásobným premytím 2 % TFA v DCM. Odstránenie chrániacej skupiny bolo kompletné, keď supematant stratil svoju žltú farbu. Živica sa neutralizovala 10 % DIEA v DMF počas 1 minúty. 2 mmol kyseliny pyrohroznovej sa kondenzovali k živici s použitím NHSesteru aktivácie 2 mmolmi DIC a 2 mmolmi NHS v DMF počas 45 minút. Templát sa zbavil chrániacej skupiny a odštiepil od nosnej živice s použitím čistej TFA obsahujúcej 5 % vody. Štiepený roztok sa evaporoval do sucha v rotačnej odparke. Zvyšok sa rozpustil v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA a lyofilizoval. Lyofilizovaný templát sa rozpustil v malom množstve 50 % vodného acetonitrilu obsahujúceho 0,1 % TFA a nariedil tak, aby sa znížila koncentrácia organických látok pod 1 %. Templát obsahujúci pyruvát sa naniesol na C4 Prep kolónu ekvilibrovanú pri teplote T = 40 °C v 0 % pufra B (t.j. 100 % pufor A = 0,1 % TFA vo vode). Soli sa eluovali izokraticky a požadovaný templát sa purifikoval lineárnym gradientom 5 -12 % pufra B proti 0,1 % vodnej TFA v priebehu 60 minút. Frakcie obsahujúce požadovanú látku (GRFNP42) sa identifikovali ESI-MS, zmrazili a lyofilizovali.

D. Zostavenie a odstránenie chrániacej skupiny samidom kondenzovaného

PP 0277-2003

32081/T

148 rozvetveného polyméru (GRFNP43)

GRFNP43, rozvetvený (TTD-Sukc)49-polymér s molekulovou hmotnosťou 16 kD sa syntetizoval kondenzáciou GRFNP39 k purifikovanému templátu GRFNP42. 1,0 mmol purifikovaného (Sukc-TTD)₁₂-Sukc-AlaOtBu (GRFNP39) rozpusteného v DMSO v 60 °C v koncentrácii 20 mg/ml sa aktivoval 0,95 molmi HATU v DMSO v koncentrácii 10 mg/ml v prítomnosti dvadsaťnásobného (molárneho) nadbytku DIEA. Bezprostredne sa pridalo 0,24 mol purifikovaného templátu GRFNP42 rozpusteného v DMSO v koncentrácii 3,9 mg/ml. Postup reakcie sa monitoroval analytickou C4 HPLC s prevráteným pomerom fáz a ESMS. Typicky, kondenzácia sa skončila za pár minút. Kvôli spracovaniu sa pridali 4 objemy (relatívne k ligačnej zmesi) 0,1 M acetátu/6M guanidíniumchloridu, pH 4, a roztok sa naniesol na preparatívnu kolónu (C4) HPLC s prevráteným pomerom fáz. Soli a ďalšie látky neobsahujúce amid sa eluovali izokraticky a požadovaný rozvetvený polymérny produkt sa purifikoval lineárnym gradientom 20 - 35 % pufra B (acetonitril obsahujúci 0,1 % TFA) proti 0,1 % vodnej TFA počas 80 minút. Frakcie obsahujúce požadovanú látku sa identifikovali ES-MS, zmrazili a lyofilizovali.

Výsledný purifikovaný rozvetvený polymérny konštrukt GRFNP43 sa rozpustil v čistej TFA v koncentrácii 1 mg/ml počas 1 hodiny, aby sa odstránila Ala-OtBu terc-butylesterová chrániaca skupina. Roztok sa evaporoval do sucha v rotačnej odparke a usušený polymér sa rozpustil v 50 % pufra B (acetonitril obsahujúci 0,1 % TFA). Polymér sa odsolil preparatívnou HPLC s prevráteným pomerom fáz stupňovým gradientom 15 % až 45 % pufra B proti 0,1 % vodnej TFA počas 80 minút. Zlúčené frakcie obsahujúce požadovanú látku (GRFNP43) sa zmrazili a lyofilizovali a usušený prášok sa použil na ligačný krok tvoriaci oximáciu.

PP 0277-2003

32081/T

149

E. Ligácia tvoriaca oxím (oximácia) GRFN 1776 a GRFN 1711 s rozvetveným polymérom GRFNP43

Segment SEP-1:4 a segment SEP-1:1 sa syntetizovali tak, ako bolo opísané vyššie v príkladoch 2, 3, 4 a 7, s tým, že namiesto levulovej kyseliny sa aminooxyacetylová (AoA) skupina pripojila k Lys²⁴ a Lys¹²⁶ v príslušných peptidových segmentoch podľa štandardných kondenzačných protokolov. Tak sa po zostavení peptidovej živice Fmoc skupina bočného reťazca odstránila z každej peptidovej živice a pridali sa 2 mmol Boc-aminooxyoctovej kyseliny k živici s použitím NHS-ester aktiváciou 2 mmolmi DIC a 2 mmolmi NHS v DMF. Tieto dva peptidy sa zbavili chrániacej skupiny a odštiepili od živice HF a purifikovali C4 HPLC s prevráteným pomerom fáz. Urobili sa vhodné opatrenia, aby sa zabránilo expozícii karbonylovým zlúčeninám. Segment SEP-1:4 a GRFNP43 sa spoločne rozpustili v ekvimolárnom pomere v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA (trifluóroctová kyselina). Roztok sa lyofilizoval. Usušený prášok sa opäť rozpustil v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA a naniesol na preparatívnu C4 kolónu pre HPLC s prevráteným pomerom fáz. Polyméme modifikovaný peptid sa oddelil od nemodifikovaného peptidu a nezreagovaného polyméru preparatívnou gradientovou HPLC s prevráteným pomerom fáz. Frakcie obsahujúce požadovaný oxímový produkt SEP-1:4 + GP43 sa identifikovali ES-MS a zlúčili.

Segmenty SEP-1:1 a GRFNP43 sa spoločne rozpustili v ekvimolárnom pomere v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA. Roztok sa zmrazil a lyofilizoval. Usušený prášok sa rozpustil v 50 % vodnom acetonitrile obsahujúcom 0,1 % TFA a naniesol na preparatívnu gradientovú kolónu C4 HPLC s prevráteným pomerom fáz. Polyméme modifikovaný peptid sa oddelil od nemodifikovaného peptidu a nezreagovaného polyméru preparatívnou gradientovou elúciou s prevráteným pomerom fáz. Frakcie obsahujúce požadovaný oxímovaný produkt SEP-1:1 + GP43 sa identifikovali ES-MS a zlúčili.

PP 0277-2003

32081/T

150

F. Príprava syntetického proteinu stimulujúceho erytropoézu SEP-1-B52

SEP-1-B52 (sekv. id. č.: 2) sa syntetizoval v roztoku zo štyroch polypeptidových segmentov:

Segment SEP-1:1 + GP43 (GRFN 1711 + GRFNP43, zodpovedajúci zvyškom 1- 32 sekv. id. č.: 2):

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^OXITTGCA EH-tioester (kde Lys²⁴ má pripojenú skupinu AoA spojenú oxímom k rozvetvenému polyméru GRFNP43, ako označené K^ox a kde His32 je chránený Dnp)

Segment SEP-1:2 (GRFN 1712, zodpovedajúci zvyškom 33 - 88 sekv. id. č.: 2):

CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW-tioester (kde Cys³³ je chránený Acm a kde tri Trp zvyšky sú chránené formylovou skupinou),

Segment SEP-1:3 (GRFN 1713, zodpovedajúci zvyškom 89-116 sekv. id. č.: 2):

CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-tioester (kde Cys³⁹ je chránený Acm a kde His⁹⁴ je chránený Dnp)

Segment SEP-1:4 + GP43 (GRFN 1776 + GRFNP43, zodpovedajúci zvyškom 117-166 sekv. id. č.: 2):

CAIS PPDAAK^0XAAPL RTITADTFRK LFRVYSŇFLR

GKLKLYTGEA CRTGDR-karboxylát (kde C-koncový cysteín (t.j. Cys¹⁶¹) nesie pikolylovú (piko) chrániacu skupinu a kde Lys¹²⁶ má pripojenú skupinu AoA spojenú oxímom k rozvetvenému polyméru GRFNP43, ako je označené K^ox).

PP 0277-2003

32081/T

151

Syntéza ďalších peptidov, ligačné reakcie, karboxymetylácia, deprotekčné reakcie, zvinutie a purifikácie sa vykonávali tak, ako bolo opísané vyššie v príkladoch 1, 2, 3, 4 a 7, za vzniku kompletného zvinutého SEP-1-B52 (sekv. id. č. : 2), ktorý bol charakterizovaný analytickou (C4) HPLC s prevráteným pomerom fáz, ES-MS a neredukčnou SDS-PAGE. Biologické testy sa vykonávajú tak, ako bolo opísané pre iné SEP konštrukty.

Príklad 9

Štúdia účinnosti SEP-3-L42

SEP-3-L42 sa reformuloval v citrátovom pufre (20 mM citrát sodný + 100 mM chlorid sodný) plus 0,25 % sérový albumín laboratórneho potkana (RSA) a podával sa intravenózne normálnym samcom laboratórneho potkana (5 laboratórnych potkanov v skupine) v dávkach 0, 1, 5 alebo 10 pg/kg, tiw, v dňoch 1, 3 a 6. Vzorky krvi sa odoberali 4 dni po poslednej injekcii (9. deň) a analyzovali sa hematologické parametre. Nezistili sa žiadne štatisticky významné rozdiely v hodnotách množstva červených krviniek (RBC), hemoglobínu (HGB), hematokritu (HCT) a retikulocytov (RET) 4 dni po poslednej injekcii SEP-3-L42 v týchto dávkach v porovnaní s hodnotami kontrolnej skupiny.

Príklad 10

Farmakokinetická štúdia SEP-3-L42

SEP-3-L42 sa reformuloval v citrátovom pufre (20 mM citrát sodný + 100 mM chlorid sodný) plus 0,25 % RSA, pH 6,9, a podával sa intravenózne ako jedna dávka normálnym samcom laboratórneho potkana v dávkovej hladine 5 pg/kg. Vzorky krvi sa odoberali 0, 1,2, 4, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 hodín po podaní dávky. Plazmatická koncentrácia SEP-3-L42 sa určila

PP 0277-2003

32081/T

152 pomocou súpravy ELISA anti-EPO (R & D Systems, Human Erythropoietin

Quantikine IVD Immunoassay Kit #DEP00) podľa inštrukcií výrobcu. Výsledky sú na obrázku 27.

Ako je ukázané na obrázku 27, SEP-1-B50 prejavoval o trochu pomalšiu clearanciu v porovnaní so SEP-3-L42. Navzdory svojmu polčasu v cirkulácii, SEP-3-L42 nedokázal prejaviť štatisticky významné rozdiely pri podporovaní produkcie červených krviniek v testovaných dávkach. Na rozdiel od toho, SEP1-B50 v rovnakých dávkach produkciu červených krviniek stimuloval. To ukazuje, že polymérná štruktúra sa môže využívať na ladenie in vivo biologických vlastností, vrátane farmakokinetického režimu a účinnosti.

Príklad 11

Štúdia účinnosti SEP-1-L30

SEP-1-L30 sa reformuloval v citrátovom pufre (20 mM citrát sodný +100 mM chlorid sodný) plus 0,25 % RSA a podával sa intravenózne normálnym samcom laboratórneho potkana (5 laboratórnych potkanov v skupine) v dávkach 0, 1, 5, 25 alebo 50 pg/kg, tiw, v dňoch 1, 3 a 5. Vzorky krvi sa odoberali 4 a 8 dní po poslednej injekcii (dni 9 a 13) a analyzovali na hematologické parametre. Nezistili sa žiadne štatisticky významné rozdiely v hodnotách RBC, HGB a HCT, kedykoľvek po liečbe SEP-1-L30 v porovnaní s hodnotami kontrolnej skupiny. Množstvo retikulocytov bolo vyššie 4 dni po poslednej injekcii (9. deň) u laboratórnych potkanov liečených 25 a 50 pg/kg (štatisticky významný rozdiel v porovnaní s hodnotami kontrolnej skupiny). Žiadne iné rozdiely v hematologických parametroch sa nepozorovali ani v 9. deň ani v 13. deň pre ktorékoľvek zo zvierat liečených SEP-1-L30. (Dáta nie sú ukázané.)

PP 0277-2003

32081/T

153

Príklad 12

Farmakokinetická štúdia SEP-1-L30

SEP-1-L30 sa reformuloval v citrátovom pufre (20 mM citrát sodný + 100 mM chlorid sodný) plus 0,25 % RSA, pH 6,9, a podával sa intravenózne normálnym samcom laboratórneho potkana ako jedna dávka v dávkovej hladine 5 alebo 25 gg/kg. Vzorky krvi sa odoberali 0, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144 a 168 hodín po podaní dávky. Plazmatická koncentrácia SEP-1L30 sa určila súpravou ELISA (R & D Systems, Human Erythropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit#DEP00) podľa inštrukcií výrobcu. SEP-1-L30 sa nezistil v ktoromkoľvek časovom bode v podávaných dávkach.

Príklad 13

Štúdia účinnosti SEP-1-B50

SEP-1-B50 sa reformuloval v sterilnom PBS (fyziologický roztok pufrovaný fosfátmi) plus 0,25 % RSA a podával sa intravenózne normálnym samcom laboratórneho potkana (5 laboratórnych potkanov v skupine) v dávkach 0, 1, 5, 25 alebo 125 gg/kg, tiw, v dňoch 1, 3 a 6. Vzorky krvi sa odoberali 4, 9 a 14 dní po poslednej injekcii (dni 10, 15 a 20) a analyzovali na hematologické parametre. Dáta sú uvedené v tabuľke VIII nižšie. Zvýšenie RBC, HGB, HCT a RET ako reakcia závislá od dávky sa pozorovalo 4 dni po poslednej injekcii (deň 10) u zvierat dostávajúcich 5, 25 a 125 μ/kg SEP-1-B50 (štatisticky významný rozdiel v porovnaní s hodnotami kontrolnej skupiny). RBC, HGB a HCT u týchto zvierat zostali vyššie ako kontrolné hodnoty v 15. deň a zotrvali významne vyššie ako kontrolné hodnoty v 20. deň (14 dní po poslednej injekcii) u zvierat liečených dávkou 125 gg/kg. Produkcia RET sa znížila po 10. dni, s významne nižšími počtami v dňoch 15 a 20 u zvierat s dávkou 25 a 125 gg/kg.

PP 0277-2003

32081/T

154

Tabuľka VIII

Hematologické nálezy po mnohonásobných dávkach SEP-1-B50
RBC	Deň 10	Deň 15	Deň 20
Kontrola	7,01 ±0,301	6,86 ±0,391	6,96 ±0,178
1 pg/kg	7,07 ± 0,482	6,85 ± 0,446	7,00 ±0,315
5 pg/kg	7,16 ±0,402	7,27 ± 0,229	6,92 ±0,238
25	7,98 ± 0,484**	7,73 ± 0,448*	7,20 ±0,331
125 μθ/kg	8,71 ±0,512**	8,89 ± 0,598**	8,25 ± 0,641**

HGB	Deň 10	Deň 15	Deň 20
Kontrola	14,2 ±0,49	14,0 ±0,61	13,9 ±0,36
1 μg/kg	14,4 ± 1,18	14,2 ± 0,44	14,1 ±0,30
5 μ9^ς	15,6 ±0,43*	15,3 ±0,33*	14,4 ±0,30
25 μθ^θ	16,1 ±0,49**	15,1 ±0,57	13,8 ±0,22
125 μθ^	16,9 ±0,82**	16,4 ±0,32**	15,0 ±1,07*


HCT	Deň 10	Deň 15	Deň 20
Kontrola	41,1 ±1,39	40,5 ± 0,93	40,9 ±1,33
1 μθ/kg	42,6 ±1,82	40,6 ±1,83	41,2 ± 1,13
5 μθ^θ	44,7 ±1,69*	44,1 ±1,27	41,5 ±0,90
25 μθ/kg	46,6 ±1,50**	43,6 ±1,61	40,3 ±1,05
125 μθ/kg	49,8 ±2,13**	48,4 ± 3,95**	44,3 ± 3,39*

RET	Deň 10	Deň 15	Deň 20
Kontrola	2,4 ±1,14	2,5 ±1,10	0,9 ±0,13
1 μg/kg	3,8 ± 1,14	2,3 ± 0,46	1,3 ±0,41
5 μθ/kg	6,6 ± 3,60*	1,8 ±0,48	0,8 ± 0,26
25 μθ/kg	6,2 ± 1,12*	1,1 ±0,24*	0,2 ±0,21**
125 μθ/kg	8,4 ±1,60**	0,9 ±0,50**	0,3 ± 0,36**

Významný rozdiel proti kontrolám, p < 0,05

PP 0277-2003

32081/T

155 ** Významný rozdiel proti kontrolám, p < 0,01

Príklad 14

Farmakokinetická štúdia SEP-1-B50

SEP-1-B50 sa reformuloval v citrátovom pufre (20 mM citrát sodný +100 mM chlorid sodný) plus 0,25 % RSA, pH 6,9, a podával sa intravenózne normálnym samcom laboratórneho potkana ako jedna dávka v dávkovej hladine 5 alebo 25 pg/kg. Vzorky krvi sa odoberali 0, 1,2, 4, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 hodín po podaní dávky. Plazmatická koncentrácia SEP-1B50 sa určila súpravou ELISA (R & D Systems, Human Erythropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit #DEP00) podľa inštrukcií výrobcu. Eliminačné polčasy boli určené 9,7 a 9,9 hodiny na dávku 5 a 25 pg/kg, v danom poradí. Pozorovaná MRT (priemerná doba cirkulácie) bola 13,9 a 14,4 hodiny na dávku 5 a 25 pg/kg, v danom poradí. Reprezentatívny farmakokinetický profil pre SEP1-B50 je na obrázku 27.

Príklad 15

Štúdia účinnosti SEP-1-B51

SEP-1-B51 sa podával intravenózne normálnym samcom laboratórneho potkana v dvoch experimentoch.

Experiment 1

SEP-1-B51 sa reformuloval v citrátovom pufre (20 mM citrát sodný + 100 mM chlorid sodný) plus 0,25 % RSA a podával sa intravenózne samcom laboratórneho potkana (5 laboratórnych potkanov v skupine) v dávkach 0,1,5 alebo 25 pg/kg, tiw, v dňoch 1, 3 a 6 a vzorky krvi sa odoberali 4, 9 a 14 dní po poslednej injekcii (dni 10, 15 a 20) na analýzu hematologických parametrov.

PP 0277-2003

32081/T

156

Dáta sú v tabuľke IX nižšie. Štyri dni po tretej a poslednej intravenóznej injekcii SEP-1-B51 (deň 10) sa pozorovalo štatisticky významné zvýšenie RBC, HGB, HCT a absolútne množstvo retikulocytov (ART) pre zvieratá dostávajúce dávku 25 pg/kg SEP-1-B51, v porovnaní s hodnotami kontrolnej skupiny. Hodnota RBC pre tieto zvieratá zostala vyššia ako kontrolná hodnota v 15. deň a porovnateľná s kontrolnou hodnotou v 20. deň. Produkcia retikulocytov sa znížila po 10. dni, pričom významne nižšie počty sa pozorovali u zvierat dostávajúcich dávky 5 a 25 pg/kg v 15. deň.

Tabuľka IX Hematologické nálezy po mnohonásobných dávkach SEP-1-B51

RBC	Deň 10	Deň 15	Deň 20
Kontrola	5,66 ± 0,497	5,62 ± 0,385	5,90 ± 0,286
1 pg/kg	5,32 ±0,275	5,23 ± 0,470	5,77 ± 0,200
5 pg/kg	6,22 ± 0,377	6,18 ±0,298	6,39 ± 0,369
25 pg/kg	6,70 ± 0,257**	6,25 ± 0,348*	5,94 ± 0,294

HGB	Deň 10	Deň 15	Deň 20
Kontrola	14,3 ± 1,10	14,2 ±0,88	14,8 ±0,72
1 pg/kg	13,3 ±0,41	13,2 ±0,93	14,3 ±0,37
5 pg/kg	15,1 ±0,53	14,8 ±0,30	15,4 ±0,25
25 pg/kg	16,5 ±0,52**	15,0 ±0,91	14,3 ±0,64

PP 0277-2003

32081ΓΓ

157


HCT	Deň 10	Deň 15	Deň 20
Kontrola	36,8 ±3,08	36,2 ± 2,59	37,9 ±1,93
1 Mg/kg	34,5 ±1,21	33,4 ± 2,56	37,1 ±0,82
5 Mg/kg	39,9 ± 1,51	38,6 ± 0,91	40,2 ±1,36
25 Mg/kg	43,8 ±1,83**	39,3 ± 2,77	37,2 ±1,60

ART	Deň 10	Deň 15	Deň 20
Kontrola	0,29 ± 0,089	0,28 ± 0,086	0,21 ±0,034
1 Mg/kg	0,34 ± 0,50	0,23 ± 0,055	0,19 ±0,075
5 Mg/kg	0,28 ± 0,059	0,11 ±0,021**	0,20 ±0,081
25 Mg/kg	0,48 ±0,121*	0,06 ± 0,054**	1,45 ±3,100

* Významný rozdiel proti kontrolám, p < 0,01 ** Významný rozdiel proti kontrolám, p < 0,05

Experiment 2

SEP-1-B51 sa reformuloval v citrátovom pufre (20 mM citrát sodný + 100 mM chlorid sodný) plus 0,25 % humánny sérový albumín a podával sa intravenózne samcom laboratórneho potkana (5 laboratórnych potkanov v skupine) v dávkach 0, 1, 5 alebo 25 gg/kg, tiw, v dňoch 1, 3 a 5 a vzorky krvi sa odoberali 2, 4 a 6 dní po poslednej injekcii (dni 7, 9 a 11) na analýzu hematologických parametrov. Okrem toho sa vzorky krvi na meranie len hematokritu (ako kompaktný objem bunky (PCV)) odoberali denne vo zvyšných dňoch štúdie (dni 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 a 13). Dáta sú v tabuľke X nižšie. Hodnoty HCT (PCV alebo vypočítané) sa významne zvýšili u zvierat

PP 0277-2003

32081/T

158 dostávajúcich 5 a 25 pg/kg začínajúc 2 dni po prvej injekcii (3. deň) a zotrvávali dní po tretej a poslednej injekcii (11. deň). RBC a HGB sa tiež významne zvýšili dňoch, keď sa merali (2, 4 a 6 dní po poslednej dávke, dni 7, 9 a 11) u zvierat dostávajúcich 5 a 25 μg/kg. ART sa významne zvýšil iba u skupiny s dávkou 25 pg/kg v dňoch 2 a 4 po poslednej dávke (dni 7 a 9).

Tabuľka X Hematologické nálezy po mnohonásobných dávkach* SEP-1-B51

RBC	Deň 7	Deň 9	Deň 11
Kontrola	5,61 ± 0,679	5,23 ± 0,467	5,34 ± 0,405
1 pg/kg	6,08 ±0,141	5,70 ±0,300	5,67 ±0,547
5 pg/kg	6,29 ± 0,459	6,07 ±0,308**	6,11 ±0,248*
25 pg/kg	6,61 ± 0,295**	6,24 ± 0,268**	6,38 ±0,173**

HGB	Deň 7	Deň 9	Deň 11
Kontrola	13,7 ±1,07	12,9 ±0,79	13,3 ±0,93
1 pg/kg	14,6 ±0,27	13,9 ± 0,19	13,9 ±0,90
5 pg/kg	15,8 ±0,50**	14,9 ±0,53**	14,8 ±0,18*
25 pg/kg	16,7 ±0,86**	15,1 ±0,66**	14,6 ±0,69*

HCT	Deň 7	Deň 9	Deň 11
Kontrola	35,6 ±3,61	33,2 ±2,39 ,	34,5 ±3,19
1 pg/kg	38,9 ± 0,82	35,9 ± 0,94	35,9 ±2,43
5 pg/kg	41,3 ±1,92**	39,1 ±1,01**	39,2 ± 0,78*
25 pg/kg	44,4 ± 2,08**	39,7 ± 2,23**	39,6 ±2,32**

PP 0277-2003

32081/T

159


ART	Deň 7	Deň 9	Deň 11
Kontrola	0,50 ±0,158	0,36 ± 0,093	0,34 ± 0,079
1 pg/kg	0,30 ± 0,044*	0,30 ± 0,026	0,25 ± 0,054
5 pg/kg	0,45 ±0,125	0,36 ± 0,056	0,25 ± 0,045
25 pg/kg	0,78 ±0,117**	0,71 ±0,152**	0,32 ± 0,099

* Významný rozdiel proti kontrolám, p < 0,05 ** Významný rozdiel proti kontrolám, p < 0,01 * poznámka: 7. deň (2 dni po 3. dávke), 9. deň (4 dni po 3. dávke), 11. deň (6 dní po 3 dávke)

Ďalšie skupiny laboratórnych potkanov sa liečili jednou intravenóznou dávkou SEP-1-B51 v dávke 25 pg/kg a vzorky krvi sa odoberali 48 hodín po injekcii na analýzu hematologických parametrov. Vzorky krvi na meranie len hematokritu (ako kompaktný objem bunky) sa odoberali 8, 24 a 72 hodín a 7 dní po injekcii (dni 1, 2, 4 a 8). Hodnoty HCT, HGB a ART u laboratórnych potkanov liečených intravenózne SEP-1-B51 boli vyššie ako hodnoty u kontrolných zvierat (štatisticky významne) v 3. deň (2 dni po injekcii) a u týchto zvierat sa tiež významne zvýšil HCT v 4. deň.

Príklad 16

Štúdia účinnosti SEP-1-B51 v polycytemickom a hypoxickom modeli

Skupiny po 10 normálnych myšiach (kontrolná skupina s vehikulom, rekombinantný glykozylovaný humánny erytropoetín tvorený v bunkách CHO (rhEPO) v 4 dávkových hladinách a SEP-1-B51 v 4 dávkových hladinách: 0,32, 1, 5, 25 pg/kg/dávka s predpokladom 100 mU/ng) boli exponované 18 hodín denne atmosférickému vzduchu udržiavanému pri tlaku 50,65 kPa (506,5 mb) v komore so simulovaným vysokým podtlakom počas 20 dní. Intravenózne (i.v.) sa injikoval rhEPO alebo SEP-1-B51, formulovaný v citrátovom pufre plus

PP 0277-2003

32081/T

160

0,25 % humánny sérum albumín, v objeme 200 μΙ 4. deň po hypoxii. O dva dni neskôr sa každá myš injikovala intraperitoneálne (i.p.) 0,2 pCi ⁵⁹Fe.

Vychytávanie rádioaktívneho železa RBC sa zisťovalo o 3 dni neskôr meraním množstva rádioaktivity prítomného v 500 μΙ krvi odoberanej srdcovou punkciou.

72-hodinové vychytávanie ⁵⁹Fe RBC (% dávky) pre SEP-1-B51 a rhEPO ukázalo jasnú závislosť reakcie od dávky zvýšeným vychytávaním ⁵⁹Fe pri zvyšovaní dávky až do 5 pg/kg, nad touto dávkou reakcia tvorila plateau (25 pk/kg). Tri najnižšie dávky sa preto použili pre výpočet lineárnej regresie. Lineárna regresná analýza pre SEP-1-B51 a rhEPO sa prezentujú na obrázku

28. Reakcie SEP-1-B51 a rhEPO boli v podstate rovnaké. Pomer účinnosti SEP-1-B51 k rhEPO bol 1,0035 (95 % interval spoľahlivosti 0,6947 až 1,4498) a účinnosť SEP-1-B51 určená v tomto teste bola 100 mU/ng (95 % interval spoľahlivosti 69 až 145).

SEP-1-B51 prejavoval in vivo aktivitu podobnú aktivite rhEPO a pôsobí spôsobom závislým od dávky, vrátane plateau reakcie vo vyšších dávkach kvôli indukcii mechanizmu negatívnej spätnej väzby, čo je typické pre rhEPO v tomto modeli. To ukazuje, že polyméme štruktúry pripojené v presných glykozylačných miestach definovaných užívateľom v molekule SEP-1-B51 napodobňujú in vivo aktivitu pripisovanú sacharidovým reťazcom rhEPO.

Príklad 17

Farmakokinetická štúdia SEP-1-B51

Skupinám normálnych samcov laboratórnych potkanov sa podávali dávky intravenózne v jednej dávke 5 pg/kg SEP-1-B51, formulovaného vcitrátovom pufre plus 0,25 % humánny sérový albumín alebo rhEPO (ekvivalent 500 U/kg) a krv sa odoberala v intervale 5, 30, 60 minút, 2, 4, 8 a 24 hodín a 2, 3, 4, 5, 6 a 7 dni po dávke. Koncentrácia SEP-1-B51 alebo rhEPO v plazmatických vzorkách sa určila testami ELISA s použitím súpravy anti-EPO ELISA od firmy R & D Systems (R & D Systems, Human Erytropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit #DEP00) podľa inštrukcií výrobcu.

PP 0277-2003

32081/T

161

Uskutočnila sa analýza najmenších štvorcov logaritmov koncentrácií poskytujúcich farmakokinetické parametre vypísané v tabuľke XI nižšie. Zmena plazmatickej koncentrácie SEP-1-B51 v čase u samcov laboratórnych potkanov dostávajúcich jednu intravenóznu dávku 5 pg/g sa môže opísať monoexponenciálnou farmakokinetickou dispozičnou funkciou s polčasom 10,5 ± 0,5 hodiny. Objem distribúcie centrálneho kompartementu (Vc) pre SEP-1-B51 bol

32,5 ± 2,0 ml/kg. Clearancia (CL) bola 2,15 ml/h/kg, s priemernou dobou cirkulácie (MRT) 15,1 ± 0,7 hodiny. V porovnaní zmena plazmatickej koncentrácie rhEPO u samcov laboratórnych potkanov dostávajúcich intravenóznu dávku 5 pg/kg bola najlepšie opísaná s použitím bi-exponenciálnej farmakokinetickej dispozičnej funkcie sa polčasom 1,24 + 0,22 hodiny a β polčasom 5,51 ± 0,40 hodiny. Vc pre rhEPO bola 57,0 ± 3,2 ml/kg. CL bola 16,0 ± 0,5 ml/h/kg, približne 8 krát väčšia ako CL SEP-1-B51. Priemerná doba cirkulácie (MRT z rhEPO bola 5,73 ±0,17 hodiny, približne 3 krát kratšia ako MRT SEP-1-B51.

Tabuľka XI Farmakokinetické parametre pre SEP-1-B51 v porovnaní s rhEPO

Krivka	AUC (ng/ml-h)	Cmax (ng/ml)	Vc (ml/kg)	CL (ml/kg)
SEP-1-B51	2 326 ±121	154 ±9	32,5 ±2,0	2,15 ± 0,11
rhEPO	312±9	87,9 ± 5,0	57,0 ±3,2	16,0 ±0,5

Krivka	MRT (hodiny)	T1/2a (hodiny)	Τ1/2β (hodiny)
SEP-1-B51	15,1 ±0,7	10,5 ±0,5	N/A
rhEPO	5,73 ±0,17	1,24 ±0,22	5,51 ± 0,40

PP 0277-2003

32081/T

162

Diagram SEP-1-B51 a rhEPO plazmatickej clearancie je uvedený na obrázku 29. Tieto dáta ilustrujú významné zvýšenie polčasu cirkulácie pre SEP1-B51 oproti glykozylovanému rekombinantnému humánnemu EPO a že toto zvýšenie je vďaka polymérnym štruktúram pripojeným v miestach molekuly presne definovaných užívateľom.

I keď vynález bol opísaný v súvislosti so svojimi špecifickými vyhotoveniami, chápe sa, že je možné ďalej ho modifikovať a táto prihláška zamýšľa pokryť všetky variácie, použitia alebo úpravy vynálezu podľa všeobecných princípov vynálezu a zahrňuje také odchýlky od predloženého opisu, ktoré spadajú do známej alebo bežnej praxe v odbore, ktorého sa vynález týka a ktoré sa môžu aplikovať na dôležité rysy uvedené vyššie v tomto texte.

PP 0277-2003

3208VT

163

ZOZNAM SEKVENCII <110> Gryphon Sciences <120> Syntetické erytropoetíny stimulujúce erytropoézu

<130>	03504.265
<140>
<141>
<150>	60/231,330
<151>	2000-09-08
<160>	3
<170>	Patentln ver. 2.1
<210>	1
<211>	166
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	1
Ala Pro Pro	Arg Leu íle Cys Asp
1	5
Leu Glu Ala	Lys Glu Ala Glu Lys
	20
Cys Ser Leu	Asn Glu Lys íle Thr
35	40
Tyr Ala Trp	Lys Arg Met Glu Val
50	55
Gin Gly Leu	Ala Leu Leu Ser Glu
65	70
Leu Val Lys	Ser Ser Gin Pro Trp
	85

Ser Arg 10	Val	Leu	Glu	Arg	Tyr 15	Leu
íle	Thr	Thr	Gly	Cys	Ala	Glu	His
25					30
Val	Pro	Asp	Thr	Lys	Val	i Asn	Phe
				45
Gly	Gin	Gin	Ala	Val	Glu	Val	Trp
			60
Ala	Val	Leu	Arg	Gly	Gin	Ala	Leu
		75					80
Cys	Pro	Leu	Gin	Leu	His	Val	Asp
	90					95

PP 0277-2003

32081/T

164

Lys

Ala

Val

Ser

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Leu

Arg

Ala

Leu

100

105

110

Gly

Ala

Gin

Lys

Cys

Ala

íle

Ser

Pro

Asp

Ala

Ser

Ala

115

120

125

Pro

Leu

Arg

Thr

íle

Thr

Ala

Asp

Thr

Phe

Arg

Lys

Leu

Phe

Arg

Val

130

135

140

Tyr

Šer

Asn

Phe

Leu

Arg

Gly

Lys

Leu

Lys

Leu

Tyr

Thr

Gly

Glu

Ala

145

150

155

160

Cys

Arg

Thr

Gly

Asp

Arg

165

<210>	2
<211>	166
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens

<400> 2

Ala

Pro

Arg

Leu

íle

Cys

Asp

Ser

Arg

Val

Leu

Glu

Arg

Tyr

Leu

1

5

10

15

Leu

Glu

Ala

Lys

Glu

Ala

Glu

Lys

íle

Thr

Gly

Cys

Ala

Glu

His

20

25

30

Cys

Ser

Leu

Asn

Glu

Lys

íle

Thr

Val

Pro

Asp

Thr

Lys

Val

Asn

Phe

35

40

45

Tyr

Ala

Trp

Lys

Arg

Met

Glu

Val

Gly

Gin

Ala

Val

Glu

Val

Trp

50

55

60

Gin

Gly

Leu

Ala

Leu

Ser

Glu

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

Gin

Ala

Leu

65

70

75

80

Leu

Val

Lys

Ser

Gin

Pro

Trp

Cys

Pro

Leu

Gin

Leu

His

Val

Asp

85

90

95

Lys

Ala

Val

Ser

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Leu

Arg

Ala

Leu

100

105

110

Gly

Ala

Gin

Lys

Cys

Ala

íle

Ser

Pro

Asp

Ala

Lys

Ala

115

120

125

Pro

Leu

Arg

Thr

íle

Thr

Ala

Asp

Thr

Phe

Arg

Lys

Leu

Phe

Arg

Val

130

135

140

Tyr

Ser

Asn

Phe

Leu

Arg

Gly

Lys

Leu

Lys

Leu

Tyr

Thr

Gly

Glu

Ala

145

150

155

160

Cys

Arg

Thr

Gly

Asp

Arg

165

ΡΡ 0277-2003

320Θ1/Τ

165

<210>		3
<211>		166
<212>		PRT
<213>		Homo	sapiens
<400>		3
Ala	Pro	Pro	Arg	Leu	íle	Cys	Asp
1				5
Leu	Glu	Ala	Lys	Glu	Ala	Glu	Cys
			20
Cys	Ser	Leu	Asn	Glu	Cys	íle	Thr
		35					40
Tyr	Ala	Trp	Lys	Arg	Met	Glu	Val
	50					55
Gin	Gly	Leu	Ala	Leu	Leu	Ser	Glu
65					70
Leu	Ala	Cys	Ser	Ser	Gin	Pro	Trp
				85
Lys	Ala	Val	Ser	Gly	Leu	Arg	Ser
			100
Gly	Ala	Gin	Lys	Glu	Ala	íle	Ser
		115					120
Pro	Leu	Arg	Thr	íle	Thr	Ala	Asp
	130					135
Tyr	Ser	Asn	Phe	Leu	Arg	Gly	Lys
145					150
Cys	Arg	Thr	Gly	Asp	Arg
				165

Ser Arg	Val	Leu	Glu	Arg	Tyr 15	Leu
	10
íle	Thr	Thr	Gly	Cys	Ala	Glu	His
25					30
Val	Pro	Asp	Thr	Lys	Val	Asn	Phe
				45
Gly	Gin	Gin	Ala	Val	Glu	Val	Trp
			60
Ala	Val	Leu	Arg	Gly	Gin	Ala	Leu
		75					80
Glu	Pro	Leu	Gin	Leu	His	Val	Asp
	90					95
Leu	Thr	Thr	Leu	Leu	Arg	Ala	Leu
105					110
Pro	Pro	Asp	Ala	Ala	Cys	Ala	Ala
				125
Thr	Phe	Arg	Lys	Leu	Phe	Arg	Val
			140
Leu	Lys	Leu	Tyr	Thr	Gly	Glu	Ala
		155					160

PP 0277-2003

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu majúci k sebe pripojený jeden alebo viacero polymérov rozpustných vo vode.
2. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 1 majúci in vivo biologickú aktivitu zvyšovania tvorby červených krviniek.
3. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 1, kde proteín obsahuje polypeptidový reťazec majúci aminokyselinovú sekvenciu z ribozomálne špecifikovaného erytropoetínu a jeden alebo viacero neprekrývajúcich sa peptidových segmentov kovalentne naviazaných jedným alebo viacerými miestami chemickej ligácie.
4. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 3, kde jeden alebo viacero polymérov rozpustných vo vode je pripojený k polypeptidovému reťazcu v mieste zodpovedajúcom glykozylačnému miestu ribozomálne špecifikovaného erytropoetínu.
5. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 3, kde ribozomálne špecifikovaný erytropoetín je ľudského pôvodu.
6. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 3, kde ribozomálne špecifikovaný erytropoetínový glykoproteín je neprirodzený.
7. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 6, kde neprirodzený ribozomálne špecifikovaný erytropoetín má jedno alebo viacero neprirodzených glykozylačných miest.

PP 0277-2003

32081/T

167
8. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 2, kde polymér rozpustný vo vode je pripojený výlučne k polypeptidovému reťazcu v jednom alebo viacerých miestach zodpovedajúcich glykozylačnému miestu ribozomálne špecifikovaného erytropoetínu.
9. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 1, kde jeden alebo viacero polymérov rozpustných vo vode obsahuje repetičnú jednotku obsahujúcu polyalkylénoxid, polyamidalkylénoxid alebo ich deriváty.
10. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 9, kde polyalkylénoxid a polyamidalkylénoxid obsahujú etylénoxidovú repetičnú jednotku vzorca -(CH2-CH2-O)-.
11. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 1, kde jeden alebo viacero polymérov rozpustných vo vode je rozvetvených.
12. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 1, kde jeden alebo viacero polymérov rozpustných vo vode nesie vo fyziologických podmienkach čistý náboj, ktorý je negatívny.
13. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 1, kde syntetický proteín stimulujúci erytropoézu má izoelektrický bod medzi 3 a 7.
14. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 1, kde polymér rozpustný vo vode je mono-disperzný.
15. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 1, kde syntetický proteín stimulujúci erytropoézu je mono-disperzný.

PP 0277-2003

32081/T

168
16. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 1, kde syntetický proteín stimulujúci erytropoézu má monomérnu molekulovú hmotnosť väčšiu ako 25 kD.

, ‘ I
17. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 1, kde syntetický proteín stimulujúci erytropoézu má monomérnu molekulovú hmotnosť väčšiu ako 40 kD.
18. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 1, kde syntetický proteín stimulujúci erytropoézu má monomérnu molekulovú hmotnosť väčšiu ako 50 kD.
19. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 1, kde syntetický proteín stimulujúci erytropoézu má monomérnu molekulovú hmotnosť väčšiu ako 60 kD.
20. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 1, kde syntetický proteín stimulujúci erytropoézu má monomérnu molekulovú hmotnosť väčšiu ako 70 kD.
21. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 1, kde polypeptidový reťazec obsahuje jednu alebo viacero neregulárnych aminokyselín.
22. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 21, kde neregulárna aminokyselina obsahuje neprirodzený bočný reťazec.
23. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 21, kde neregulárna aminokyselina obsahuje pseudoaminokyselinu.

PP 0277-2003

32081/T

169
24. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 23, kde pseudoaminokyselina je pseudoglutamát.
25. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 22, kde neprirodzený bočný reťazec je kovalentne naviazaný k polyméru rozpustnému vo vode.
26. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 25, kde polymér rozpustný vo vode je kovalentne naviazaný k bočnému reťazcu prostredníctvom väzby vytvorenej chemickou ligáciou.
27. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 26, kde väzba vytvorená chemickou ligáciou sa vyberie zo skupiny, ktorú tvorí amidová, oxímová, hydrazónová, tiazolidínová, oxazolidínová a tioesterová väzba.
28. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 3, kde jedno alebo viacero miest chemickej ligácie obsahuje amidovú väzbu.
29. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 1, kde polymér rozpustný vo vode je pripojený k polypeptidovému reťazcu prostredníctvom bočného reťazca aminokyseliny v mieste chemickej ligácie polypeptidového reťazca.
30. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 1, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu syntetického proteinu stimulujúceho erytropoézu vybranú zo skupiny, ktorú tvorí SEP-1 a SEP-3.
31. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu vybraný zo skupiny, ktorú tvorí SEP-0, SEP-1 a SEP-3 a ich analógy.

PP 0277-2003

32081/T

170
32. Syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 31, kde analógy sú vybrané zo skupiny, ktorú tvorí SEP-1-L26, SEP-1-L30, SEP-1-B50, SEP-1-B51 aSEP-1-B52.
33. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje syntetický proteín stimulujúci erytropoézu podľa nároku 1 alebo jeho farmaceutický prijateľné soli.
34. Farmaceutický prípravok podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že obsahuje jeden alebo viacero excipientov vybraných zo skupiny, ktorú tvorí pufor, nosič proteínu, aminokyselina, detergent, lipid, polymér rozpustný vo vode a konzervačné činidlo.
35. Farmaceutický prípravok podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že obsahuje jedno alebo viacero ďalších bioaktívnych činidiel okrem syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu.
36. Spôsob zvyšovania hematokritu u cicavca, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie cicavcovi účinného množstva syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu podľa nároku 1, čím sa hematokrit cicavca zvýši.
37. Spôsob zvyšovania tvorby červených krviniek u cicavca, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie cicavcovi účinného množstva polyméme modifikovaného syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu podľa nároku 1, čím sa zvýši tvorba červených krviniek u cicavca.
38. Spôsob zvyšovania tvorby hemoglobínu u cicavca, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie cicavcovi účinného množstva polyméme modifikovaného syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu podľa nároku 1, čím sa zvýši tvorba hemoglobínu u cicavca.

PP 0277-2003

320817T

171
39. Spôsob zvyšovania množstva retikulocytov u cicavca, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie cicavcovi účinného množstva syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu podľa nároku 1, čím sa zvýši množstvo retikulocytov u cicavca.
40. Spôsob prípravy polypeptidového reťazca obsahujúceho syntetický proteín stimulujúci erytropoézu, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje krok chemickej ligácie peptidových segmentov obsahujúcich neprekrývajúce sa aminokyselinové sekvencie polypeptidového reťazca syntetického proteínu stimulujúceho erytropoézu, pričom sa vytvorí polypeptidový reťazec obsahujúci syntetický proteín stimulujúci erytropoézu.
41. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrňuje krok zvinutia polypeptidového reťazca, pričom sa vytvorí bioaktívny syntetický proteín stimulujúci erytropoézu.
42. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že jeden alebo viacero peptidových segmentov je čiastočne chránených.
43. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že jeden alebo viacero peptidových segmentov je nechránených.
44. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že jeden alebo viacero peptidových segmentov obsahuje k sebe pripojený polymér rozpustný vo vode.
45. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že krok chemickej ligácie zahrňuje chemoselektívne ligačné chemické postupy vybrané z postupov natívnej chemickej ligácie, rozšírenej natívnej chemickej ligácie, pseudonatívnej chemickej ligácie, chemickej ligácie tvoriacej oxím, chemickej

PP 0277-2003

32081/T

172 ligácie tvoriacej hydrazón, chemickej ligácie tvoriacej oxazolidín, chemickej ligácie tvoriacej tiazolidín a chemickej ligácie tvoriacej tioester.
46. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že polypeptidový reťazec obsahuje k sebe pripojený jeden alebo viacero polymérov rozpustných vo vode.
47. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že polypeptidový reťazec obsahuje aminokyselinovú sekvenciu ribozomálne špecifikovaného erytropoetínu.
48. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že jeden alebo viacero polymérov rozpustných vo vode je pripojených k polypeptidovému reťazcu v mieste zodpovedajúcom glykozylačnému miestu ribozomálne špecifikovaného erytropoetínu.
49. Spôsob podľa nároku 48, vyznačujúci sa tým, že ribozomálne špecifikovaný erytropoetínový glykoproteín sa vytvoril rekombinantné.
50. Spôsob podľa nároku 48, vyznačujúci sa tým, že ribozomálne špecifikovaný erytropoetínový glykoproteín je neprirodzený.
51. Spôsob podľa nároku 50, vyznačujúci sa tým, že neprirodzený ribozomálne špecifikovaný erytropoetínový glykoproteín má jedno alebo viacero neprirodzených glykozylačných miest.
52. Spôsob podľa nároku 47, vyznačujúci sa tým, že ribozomálne špecifikovaný erytropoetín je ľudského pôvodu.

PP 0277-2003

32081/T

173
53. Spôsob podľa nároku 48, vyznačujúci sa tým, že polymér rozpustný vo vode je pripojený výlučne k polypeptidovému reťazcu v mieste zodpovedajúcom glykozylačnému miestu ribozomálne špecifikovaného erytropoetínu.
54. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že jeden alebo viacero polymérov rozpustných vo vode obsahuje repetičnú jednotku obsahujúcu polyalkylénoxid, polyamidalkylénoxid alebo ich deriváty.
55. Spôsob podľa nároku 54, vyznačujúci sa tým, že polyalkylénoxid a polyamidalkylénoxid obsahujú etylénoxidovú repetičnú jednotku vzorca -(CH2CH_Z-O)-.
56. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že jeden alebo viacero polymérov rozpustných vo vode je rozvetvených.
57. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že jeden alebo viacero polymérov rozpustných vo vode vo fyziologických podmienkach nesie čistý náboj, ktorý je negatívny.
58. Spôsob podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že syntetický proteín stimulujúci erytropoézu má izoelektrický bod medzi 3 a 7.

I · ’ ·
59. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že polymér rozpustný vo vode je mono-disperzný.
60. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že syntetický proteín stimulujúci erytropoézu je mono-disperzný.

PP 0277-2003

32081/T

174
61. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že syntetický proteín stimulujúci erytropoézu má monomérnu molekulovú hmotnosť väčšiu ako 25 kD.
62. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že syntetický proteín stimulujúci erytropoézu má monomérnu molekulovú hmotnosť väčšiu ako 40 kD.
63. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že syntetický proteín stimulujúci erytropoézu má monomérnu molekulovú hmotnosť väčšiu ako 50 kD.
64. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že syntetický proteín stimulujúci erytropoézu má monomérnu molekulovú hmotnosť väčšiu ako 60 kD.
65. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že syntetický proteín stimulujúci erytropoézu má monomérnu molekulovú hmotnosť väčšiu ako 70 kD.
66. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že polypeptidový reťazec obsahuje jeden alebo viacero neregulárnych aminokyselín.
67. Spôsob podľa nároku 66, vyznačujúci sa tým, že neregulárna aminokyselina obsahuje neprirodzený bočný reťazec.
68. Spôsob podľa nároku 67, vyznačujúci sa tým, že neregulárna aminokyselina obsahuje pseudoaminokyselinu.

PP 0277-2003

32081/T

175
69. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že polypeptidový reťazec obsahuje miesto chemickej ligácie majúce väzbu vybranú zo skupiny, ktorú htvorí amidová, oxímová, hydrazónová, tiazolidínová, oxazolidínová a tioesterová väzba,
70. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že polymér rozpustný vo vode je pripojený k aminokyseline polypeptidového reťazca majúceho neprirodzený bočný reťazec.
71. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že polymér rozpustný vo vode je kovalentne naviazaný k bočnému reťazcu prostredníctvom väzby vytvorenej chemickou ligáciou.
72. Spôsob podľa nároku 71, vyznačujúci sa tým, že väzba vytvorená chemickou ligáciou je vybraná zo skupiny, ktorú tvorí amidová, oxímová, hydrazónová, tiazolidínová, oxazolidínová a tioesterová väzba.
73. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že polymér rozpustný vo vode je pripojený k polypeptidovému reťazcu prostredníctvom bočného reťazca aminokyseliny v mieste chemickej ligácie polypeptidového reťazca.
74. Spôsob podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že bioaktívny syntetický proteín stimulujúci erytropoézu má in vivo biologickú aktivitu zvyšovania tvorby červených krviniek.
75. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že polypeptidový reťazec obsahuje aminokyselinovú, sekvenciu syntetického proteinu stimulujúceho erytropoézu vybranú zo skupiny, ktorú tvorí SEP-1 a SEP-3.

PP 0277-2003

32081/T

176
76. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že syntetický proteín stimulujúci erytropoézu, je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí SEP-0, SEP-1 a SEP3 a ich analógy.
77. Spôsob podľa nároku 76, vyznačujúci sa tým, že analógy sú vybrané zo skupiny, ktorú tvorí SEP-1-L26, SEP-1-L30, SEP-1-B50, SEP-1-B51 a SEP-1-B52.