KR20000069408A

KR20000069408A - 수용체에 결합하는 펩티드 및 화합물

Info

Publication number: KR20000069408A
Application number: KR1019997005169A
Authority: KR
Inventors: 윌리암 제이. 다우어; 로날드 더블유. 배렛; 스티븐 이. 퀼라; 크리스찬 엠. 게이츠; 피터 제이. 섀츠; 팔라니아판 발라수브라마니안; 크리스토퍼 알. 왁스트롬; 리차드 웨인 헨드렌; 랜돌프 비. 디프린스; 수레카 파두투리; 쿤 인
Original assignee: 그레이엄 브레레톤, 레슬리 에드워즈; 글락소 그룹 리미티드
Priority date: 1996-12-11
Filing date: 1997-12-09
Publication date: 2000-11-25
Also published as: AR010752A1; JP4128225B2; ZA9711045B; WO1998025965A3; CN100379760C; AU5854798A; ATE420893T1; HRP970683A2; TNSN97201A1; DE69739219D1; BRPI9713914B8; CA2274149C; PA8442601A1; US5869451A; AU725731B2; UY24805A1; EP0948539B1; CO5080768A1; EP2336165A1; SV1997000104A

Abstract

본 발명은 트롬보포이에틴 수용체에 결합하고 활성화시키는 펩티드 및 화합물에 관한 것이다. 이러한 펩티드 및 화합물은 혈액학적 장애, 특히 화학 요법, 방사능 요법, 또는 골수 이식과 관련된 혈소판 감소증을 치료하는 방법뿐만 아니라 표지된 펩티드 및 화합물을 사용하는 진단상 방법에서 유용하다.

Description

수용체에 결합하는 펩티드 및 화합물 {Peptides and Compounds That Bind to a Receptor}

본 발명은 트롬보포이에틴 수용체 (c-mpl 또는 TPO-R)에 결합하고 이를 활성화시키거나 그렇지 않으면 다른 방식으로 TPO 작용제로 작용하는 펩티드 및 화합물을 제공한다. 본 발명은 생화학 및 의약화학 분야에 응용되며, 특히 인간 질병의 치료에 사용되는 TPO 작용제를 제공한다.

트롬보포이에틴 수용체에 결합하여 이를 활성화시키는 펩티드 및 화합물은 국제 공개 제 WO96/40705호에 개시되었다.

혈소판 감소증으로 고통을 겪는 환자에게 있어서 혈소판 수준의 회복이 느린 것은 심각한 문제이고, 이 때문에 혈소판 재생을 촉진할 수 있는 혈액 성장 인자 작용제를 찾아내는 것이 더욱 절박하다. 본 발명은 이러한 작용제를 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 화학식 1의 화합물 및 이들의 제약상 허용되는 유도체를 제공한다.

상기 식에서,

X₁은 수소 또는 아실이고,

X₂는 G 또는 사르코신 (Sar)이고,

X₃은 R, A, 노르류신 (Nle) 또는 N-아세틸리신 (Ac-Lys)이고,

X₄는 Q 또는 E이고,

X₅는 W, L-1-나프틸알라닌 (1-Nal) 또는 F이고,

X₆은 A, 5-아미노펜탄산 (Ava) 또는 2-아미노부티르산 (Abu)이고,

X₇은 A, 디페닐알라닌 (Diphe)이거나 또는 존재하지 않고,

X₈은 R, p-아미노페닐알라닌 (p-아미노-Phe), N-아세틸리신 (Ac-Lys)이거나 또는 존재하지 않고,

X₉및 X_9'는 같거나 다르고, A, βA, n-메틸알라닌 (n-Me-Ala), 사르코신 (Sar)이거나, 또는 X₉또는 X_9'는 존재하지 않고,

X₁₀및 X_10'는 같거나 다르고, βA이거나, 또는 X₁₀및 X_10'는 존재하지 않되,

다음 화학식의 화합물을 제외한다.

본 발명은 또한 다음 식의 화합물 및 이들의 제약상 허용되는 유도체를 제공한다.

(H)-ADGPTLREWISF(Ava)ADGPTLREWISF(NH₂) 및

상기 정의 및 하기에서 기호 A, βA, C, D, E, F, G, I, K, L, P, Q, R, S, W, T는 다음과 같은 통상적 아미노산에 대한 표준 한 글자 부호이다.

A 알라닌

C 시스테인

D 아스파르트산

E 글루탐산

F 페닐알라닌

G 글리신

I 이소류신

K 리신

L 류신

P 프롤린

Q 글루타민

R 아르기닌

S 세린

W 트립토판

T 트레오닌

확실히 하기 위하여, 본 명세서에서 나타나는 다음과 같은 생략형은

다음과 같은 구조를 지시한다.

화학식 1의 화합물의 적합한 제약상 허용되는 유도체는 제약상 허용되는 염 및 산부가염, 제약상 허용되는 에스테르, 제약상 허용되는 아미드, 표지된 화합물 및 다음에 설명된 다양한 친수성 중합체 중 하나 이상에 공유결합으로 부착된 화합물을 포함한다.

바람직하게는 화학식 1의 화합물은 다양한 친수성 중합체 중 하나 이상 (예, 하나)에 공유결합으로 부착된다. 친수성 중합체(들)은 예를 들면, 화학식 1의 화합물의 펩티드 사슬 중 하나 또는 둘 모두에 부착될 수 있다. 친수성 중합체가 양쪽의 펩티드 사슬 모두에 부착된다면, 친수성 중합체는 같거나 다를 수 있고, 바람직하게는 같을 것이다. 화학식 1의 화합물이 X₁위치를 통해 다양한 친수성 중합체 중 하나 이상에 공유결합으로 부착될 때, X₁이 아실이 아니라는 것은 당업자들에게 명백할 것이다.

화학식 1의 화합물 중 바람직한 것들은 다음 화합물과 이들의 제약상 허용되는 유도체이고 여기서 키랄 아미노산은 바람직하게는 L-형이다.

와 이들의 제약상 허용되는 유도체이고, 이 때, 키랄 아미노산은 바람직하게는 L-형이다.

화학식 1의 화합물 중 더 바람직한 것에는 다음 화합물

및, 특히

및 이들의 제약상 허용되는 유도체가 있고 여기서 키랄 아미노산은 바람직하게는 L-형이다.

이하에서 본 발명에 따른 화합물이라 함은 화학식 1의 화합물 및 이들의 제약상 허용되는 유도체를 모두 말한다.

화학식 1의 화합물은 다수의 키랄 중심을 포함하며 그에 따라 광학적 이성질체 (즉, 에난티오머) 쌍 및 라세미 혼합물을 비롯한 이성질체 혼합물의 형태로 존재한다는 것은 당업자들에게 명백할 것이다. 화학식 1의 화합물의 모든 이성질체들과 라세미 혼합물을 비롯한 이들의 혼합물들은 본 발명의 범위 안에 포함된다. 바람직하게는 키랄 아미노산은 L-형이다.

화학식 1의 화합물은 TPO-R에 강한 결합성을 가지고 TPO-R을 활성화시킬 수 있다. 따라서, 이러한 화합물은 예컨대 혈소판, 거핵구 및 다른 간세포 등에 있는 TPO 수용체의 자극에 의하여 개선될 수 있는 질병, 예를 들면, 화학요법 (유도, 경화 또는 유지 화학요법 등), 방사능 요법, 자가, 동종이계 및 동계 골수 이식, 말초혈액 선조 세포 및 제대혈액 선조 세포 이식, 악성 및 비악성 질환에 대한 생물학적 또는 다른 치료 (예, 인터페론 및 다른 사이토킨), 전이성 종양 및 백혈병에 의한 골수 침입, 비악성 질환의 골수 침윤 또는 잠식 (예, 대리석골병, 고셔 (Gaucher) 병), 무형성 빈혈, 척수이형성증, 골수섬유증 및 관련된 증후군 (제1기 및 제2기)의 결과일 수 있는 혈소판 감소증, 자가면역 및 동종 면역 혈소판 감소증을 비롯한 면역 및 특발성 질환, 및 약물 유발 면역 혈소판 감소증, 약물 유발 혈소판 감소증, (예, HIV 양성 환자에서 항레트로바이러스 요법으로 인한 것), 만성 간 질환 (예, 알코올성 및 다른 형태의 경화증) 및 만성 신부전, 혈전성 혈소판 감소 자반병, 용혈성 요독증 및 다른 미소혈관증을 비롯한 과도한 혈소판 파괴, 및 비장기능항진증, 불충분하거나 비정상인 혈소판 때문에 출혈이 발생하는 글란즈만 (Glanzmann) 혈소판 무력증과 같은 선천성 증후군, 혈소판감소-요골흠손증후군 (TAR), 그레이 혈소판 증후군, 간장 이식, 대동맥 동맥류의 회복, 대동맥내 벌룬 카운터펄세이션, 관상 동맥 측관 이식술 및 체외 순환 및(또는) 대량의 수혈을 필요로 하는 다른 외과적 과정, 또는 HIV 관련 혈소판 감소증; 또한 악성 및 비악성 질환 (상기에 언급된 바와 같음)을 위한 화학 요법, 방사능 요법 및 다른 요법 등의 결과일 수 있는 과립구 감소 및 빈혈증, 악성, 악성 전 및 비악성 질환 (상기에 언급된 바와 같음)에서 골수 침윤, 면역성 및 비면역성, 특발성 및 의약 관련 빈혈증 및 과립구 감소증; 또는 혈액학적 악성 종양 그 자체의 치료에 치료상 목적을 위하여 유용하다. 본 발명에 따른 화합물은 자가, 동종이계 및 동계 이식을 위한 말초혈액 선조 세포의 이동성 부여시, 혈소판과 다른 혈액 제공제로부터 수율을 증가시킬 때, 생체 외에서 혈소판의 생존 및 품질 연장시, 시험관내에서 혈소판 및(또는) 선조 세포의 생산 또는 팽창시, 등 혈소판, 거핵구 및 다른 간세포 등에 있는 TPO 수용체의 자극이 요망되는 치료상, 진단상 및 연구 목적을 위하여, 그리고 조혈의 메커니즘을 연구하는 진단상 목적과 거핵구 및 분화가 결정된 선조 세포의 시험관내 팽창을 위하여 유용할 수도 있다.

본 발명의 화합물은 낮은 IC₅₀이 TPO-R에 대한 강한 결합 친화도를 표시하는, 하기 실시예 3에서 설명된 결합 친화도 분석법에 의하여 측정하여 IC₅₀이 약 2 mM 미만이다. 바람직하게는 진단용으로는, 본 발명에 따른 화합물의 IC₅₀은 약 2 mM 미만이고, 제약용으로는, 본 발명에 따른 화합물의 IC₅₀은 약 100 μM 미만이다.

진단 목적을 위하여 사용될 때, 본 발명에 따른 화합물은 바람직하게는 탐지 가능한 표식으로 표지하며, 따라서, 이러한 표식이 없는 본 발명의 화합물은 표지된 화합물의 제조에 중간체가 된다.

본 발명에 따른 화합물이 상기에 설명된 대로 친수성 중합체로 유도체화된다면, 이러한 화합물의 분자량은 약 500 내지 약 120,000 달톤, 보다 바람직하게는 약 8,000 내지 약 80,000 달톤의 범위일 수 있다.

상기에 설명된 바와 같이, 더 바람직한 실시양태에서는, 화학식 1의 화합물은 하나 이상의 다양한 친수성 중합체에 공유결합으로 부착된다. 일반적으로는, 이러한 친수성 중합체의 평균 분자량은 약 500 내지 약 100,000 달톤, 예를 들면, 약 500 내지 약 40,000 달톤, 바람직하게는 약 2,000 내지 약 40,000 달톤, 보다 바람직하게는 약 5,000 내지 약 40,000 달톤, 보다 더 바람직하게는 약 5,000 내지 약 20,000 달톤, 예를 들면, 약 18,000 내지 약 22,000 달톤 범위이다. 바람직한 실시양태에서는, 이러한 친수성 중합체의 평균 분자량은 약 5,000 달톤, 10,000 달톤 및 20,000 달톤이다. 친수성 중합체는 분지되거나 분지되지 않을 수 있다.

적합한 친수성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜로 예시되는 폴리알킬에테르, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리옥시알켄, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 및 이들의 공중합체 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 친수성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜로 예시되는 폴리알킬에테르, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 및 이들의 공중합체를 포함한다. 놀랍게도, 펩티드 화합물이 이러한 중합체에 의해 유도체로 되면, 그들의 결합 친화도는 거의 감소하지 않으면서도 용해도 및 순환 반감기가 증가하며 그들의 면역원성이 가려진다는 것이 밝혀졌다. 바람직한 실시양태에서는, 화학식 1의 펩티드 화합물의 2량체 서브유니트 (펩티드 사슬)의 각각이 친수성 중합체에 공유결합으로 부착된다. 더 바람직한 실시양태에서는, 본 발명의 화합물은 PEG화, 즉, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 공유결합으로 부착된다.

PEG는 2개의 말단 히드록실기를 가지는, 에틸렌옥시드 반복 단위로 된 선형, 수용성 중합체이다. PEG는 전형적으로 약 500 달톤 내지 약 40,000 달톤 범위 예컨대, 5,000, 10,000, 20,000, 30,000 또는 40,000 달톤 (5 K, 10 K, 20 K, 30 K 또는 40 K)등 인 분자량에 의하여 분류된다. 현재 바람직한 실시양태에서는, 사용되는 PEG의 분자량은 5,000 달톤 내지 20,000 달톤이다. 본 발명의 펩티드 화합물에 결합되는 PEG는 분지되거나 분지되지 않을 수 있다 (몬파르디니 (Monfardini), C., 등의 Bioconjugate Chem., 6;62-69 (1995) 참조). 이러한 PEG는 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 (MePEG-OH), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-숙시네이트 (MePEG-S), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-숙신이미딜 숙시네이트 (MePEG-S-NHS), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-아민 (MePEG-NH₂), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-트레실레이트 (MePEG-TRES) 및 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-이미다졸릴-카르보닐 (MePEG-IM)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 화합물은 모노- 또는 디-PEG화될 수 있고, 예를 들면, 모노PEG화는 고분자량의 PEG가 사용될 때 바람직할 수 있다.

화학식 1의 화합물에 부착될 수 있는 PEG 사슬의 예로는

(상기 식에서, n은 약 450임)

(상기 식에서, n은 약 112-900, 예컨대, 112, 225, 450 (예, 425-500), 675 또는 900임)

(상기 식에서, n은 약 112-450, 예컨대, 112, 225 또는 450임)

바람직한 PEG화된 본 발명의 화합물의 예는

및 이들의 제약상 허용되는 유도체를 포함하지만 이에 제한되지는 않고, 여기서 키랄 아미노산은 바람직하게는 L-형이고, "n"은 약 5 내지 1000, 예를 들면, 10 내지 1000, 보다 바람직하게는 약 100 내지 약 900, 보다 바람직하게는 약 110 내지 약 900 범위, 예컨대, 약 112, 225, 450 (예, 425-500, 675) 또는 900의 값을 가지는 정수이다. 알데히드 연결된 (ALDH)PEG의 경우, n은 약 450, 예를 들면, 약 348-452이고, 에스테르 연결된 (SPA)PEG의 경우, n은 약 112-900, 예를 들면, 약 112, 225, 450 (예, 425-500), 675 또는 900이고, 분지된 PEG의 경우, n은 약 112-450, 예를 들면, 약 112, 225 또는 450이고, SS PEG의 경우, n은 약 112-450, 예를 들면, 112, 225 또는 450이다.

본 발명의 특히 바람직한 화합물은

(상기 식에서, n은 약 450, 예를 들면, 425-500임)

및 제약상 허용되는 이들의 유도체이고, 여기서 키랄 아미노산은 바람직하게는 L-형이다.

상기에서 설명된 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물은 TPO에 의하여 매개되는 질병, 예를 들면, 혈소판 감소증, 과립구 감소증 및 빈혈증을 포함하는 혈액학적 질환의 예방과 치료, 및 혈액학적 악성 종양의 치료에 유용하다. 그러므로, 본 발명은 환자에게 본 발명의 화합물의 치료상 유효한 투여량 또는 양을 투여하는 것을 포함하는, 트롬보포이에틴 작용제 치료에 반응하는 질환에 걸린 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명은 치료법 특히 인간 의약에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 더 제공한다.

본 발명의 추가 면으로 트롬보포이에틴 작용제에 의하여 매개되는 질병의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에 대한 본 발명에 따른 화합물의 용도를 제공한다.

치료라 함은 확인된 증상의 완화뿐만 아니라 예방을 포함하려는 것임을 알 수 있을 것이다.

본 발명은 또한 본 명세서에서 설명된 1종 이상의 화합물과 생리학상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이러한 제약 조성물은 흡입용 산제 및 용액제 및 주사용 및 관주용 용액제뿐만 아니라 경구 투여 형태를 포함하는 다양한 형태일 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 인간 혈청에서 AF13948 및 GW350781 (di-PEG(5K)-AF13948)의 안정도를 예시하고, PEG화된 화합물이 비PEG화된 화합물에 대하여 증가된 안정도, 즉, 증가된 반감기를 가지는 것을 설명한다.

도 2는 PEG로 다양하게 유도체화된 본 발명의 펩티드 화합물의 약물 동력학 분포를 예시한다. 이 실험에서, 펩티드 AF15705는 분지된 PEG (PEG2)로, 에스테르 연결된 PEG (SPA)로 및 알데히드 연결된 PEG (ALDG)로 유도체화된다. 얻어진 결과는 PEG로 다양하게 유도체화된 3 가지 펩티드 화합물 모두가 바람직한 약물 동력학 분포를 가진 것을 보여준다.

도 3-4는 쥐에서 카르보플라틴 (CBP)-유발 혈소판 감소증에 대한 본 발명의 PEG화된 펩티드 화합물의 효과를 예시한다. 도 3은 GW350781 (di-PEG(5K)-AF13948)이 쥐 모델에서 혈소판 감소증을 개선할 수 있는 것을 나타낸다. 도 4는 GW350805 (di-PEG(20K)-AF13948)이 또한 카르보플라틴 유발 혈소판 감소증을 개선하고 이는 GW350781보다 더 효능이 있는 것을 나타낸다.

도 5-6은 보통 쥐에서 혈소판 감소증에 대한 GW350781 및 GW350805의 효과를 예시한다. 얻어진 결과는 본 발명의 PEG화 펩티드 화합물이 혈소판 감소증에 대하여 유리한 효과를 나타내며, 20K-디PEG화된 펩티드가 5K-디PEG화된 펩티드보다 약 100배 더 효능이 있다는 것을 보여준다.

도 7-8은 보통 쥐에서 혈소판 농도에 대한 GW350781 및 GW350805의 여러가지 투여량의 효과를 예시한다. 이러한 데이터는 본 발명의 PEG화된 펩티드 화합물이 보통 쥐에서 혈소판의 농도를 증가시킨다는 것을 나타낸다.

도 9는 보통 쥐에서 혈소판 농도에 대한 GW350805의 단일 투여 대 다중 투여의 효과를 예시한다.

도 10은 β-Ala를 포함하는 2량체 펩티드를 제조하는 전반적 합성 반응식을 예시한다.

도 11은 β-Ala를 포함하지 않는 2량체 펩티드를 제조하는 전반적 합성 반응식을 예시한다.

특정 실시양태의 설명

다음 정의는 본 명세서에서 본 발명을 설명하는 데 사용되는 다양한 용어의 의미와 범위를 예시하고 정의하는 것이다.

"작용제"는 상보적인 생물학적 활성 수용체에 결합하고 이를 활성화하여 수용체에서 생물학적 응답을 야기하거나 수용체의 이미 존재하는 생물학적 활성을 강화시키는 생물학적 활성 리간드에 대하여 언급한다.

"제약적으로 허용되는 염"은 비독성 알칼리금속, 알칼리토금속, 및 당업계에서 잘 알려진 방법에 의하여 제조되는 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 바륨, 암모늄 및 프로타민 아연 염을 포함하는 제약 산업에서 통상적으로 사용되는 암모늄 염을 언급한다. 이 용어는 일반적으로 본 발명의 화합물을 적합한 유기 또는 무기산과 반응시켜 제조되는, 비독성산 부가염도 포함한다. 대표적인 염은 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 중황산염, 인산염, 토실레이트, 시트르산염, 말레산염, 푸마르산염, 숙신산염, 타르트레이트, 납실레이트 등을 포함한다.

"제약상 허용되는 산 부가염"은 생물학적 유효성과 유리염기의 특성을 유지하고, 생물학적으로 또는 다른 점에서 바람직스럽지 못하지 않다면, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산 및 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등의 유기산으로 형성된다. 전구약물로서 제약상 허용되는 산 부가염의 설명에 대해서는 상기 분가드 (Bundgaard, H.)를 참조한다.

"제약상 허용되는 에스테르"는 에스테르 결합의 가수분해시에, 카르복실산 또는 알코올의 생물학적 유효성과 특성을 유지하고, 생물학적으로 또는 다른 점에서 바람직한 에스테르를 언급한다. 전구약물로서 제약상 허용되는 에스테르의 설명에 대해서는, [Bungaard, H., ed., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985)]를 참조한다. 이러한 에스테르는 전형적으로는 대응하는 카르복실산과 알코올로부터 형성된다. 일반적으로는, 에스테르 형성은 통상적 합성 기술에 의하여 달성될 수 있다 [마치 (March) 등의 Advanced Organic Chemistry, 4th Ed., John Wiley ＆ Sons, New York (1992), 393-396 및 거기에 인용된 참고 문헌 마크 (Mark) 등의 Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley ＆ Sons, New York (1980)]. 에스테르의 알코올 성분은 일반적으로는 (i) 분지된 탄소를 포함하거나 포함하지 않는 C₂-C₁₂지방족 알코올 또는 (ii) C₇-C₁₂방향족 또는 헤테로방향족 알코올을 포함할 것이다. 본 발명은 본 명세서에서 설명된 두 개의 에스테르이고 동시에 이들의 제약상 허용되는 산 부가염인 조성물의 사용도 기도한다.

"제약상 허용되는 아미드"는 아미드 결합의 가수분해시에, 카르복실산 또는 알코올의 생물학적 유효성과 특성을 유지하고, 생물학적으로 또는 다른 점에서 바람직한 에스테르를 언급한다. 전구약물로서 제약상 허용되는 에스테르의 설명에 대해서는, [Bundgaard, H., ed., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985)]를 참조한다. 이러한 아미드는 전형적으로는 대응하는 카르복실산과 아민으로부터 형성된다. 일반적으로는, 아미드 형성은 통상적 합성 기술에 의하여 달성될 수 있다 [마치 등의 Advanced Organic Chemistry, 4th Ed., John Wiley ＆ Sons, New York (1992), p 393 및 마크 등의 Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley ＆ Sons, New York (1980)]. 본 발명은 또한 본 명세서에서 설명된 두 개의 아미드이고 동시에 이들의 제약상 허용되는 산 부가염인 조성물의 사용도 기도한다.

"제약상 또는 치료상 허용되는 담체"는 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않고 숙주 또는 환자에 독성이 아닌 담체 매질을 언급한다.

"입체 이성질체"는 다른 하나와 분자량, 화학적 조성 및 구성이 같지만, 원자 가 다르게 배치된 화학적 화합물을 언급한다. 즉, 특정 동일한 화학적 잔기는 공간에서 서로 다른 배향이고 그러므로, 순수한 경우, 편광 면을 회전시킬 수 있다. 그러나, 일부 순수한 입체 이성질체는 너무 근소하여 현재의 기구로 측정할 수 없는 광학적 회전을 할 수 있다. 본 발명의 화합물은 하나 이상의 비대칭 탄소 원자를 가질 수 있으므로 다양한 입체 이성질체를 포함한다. 모든 입체 이성질체는 본 발명의 범위 안에 포함된다.

본 발명의 조성물에 적용되는 "치료상 또는 제약상 유효량"은 원하는 생물학적 결과를 유도하기에 충분한 조성물의 양을 언급한다. 이 결과는 징후, 증상, 또는 질병의 원인, 또는 생물학적계의 다른 목적하는 변질을 경가시킬 수 있다. 본 발명에서, 그 결과는 전형적으로 감염 또는 조직 상해에 대한 면역 감시 및(또는) 염증성 응답의 감소를 수반할 것이다.

약자는 다음과 같이 사용된다:

OtBu 및 tBu는 모두 t-부틸옥시 (OtBu는 통상적으로는 3 글자 아미노산 약자로 사용되고 tBu는 통상적으로 1 글자 아미노산 약자로 사용됨), Bzl은 벤질이고, Ac는 아세틸이고, Me는 메틸이고, Abu는 2-아미노부티르산이고, Thi는 티에닐알라닌이고, Ac-Lys은 N-아세틸리신이고, p-아미노-Phe는 p-아미노페닐알라닌이고, N-메틸-Ala는 N-메틸알라닌이고, Diphe는 디페닐알라닌이고, Sar는 사르코신이고, Ava는 5-아미노펜탄산이고, Nle는 노르류신이고, trt는 트리틸이다.

"탐지 가능한 표지"는 본 발명의 펩티드와 펩티드 모방체에 공유결합으로 부착될 때, 펩티드 또는 펩티드 모방체를 투여한 환자의 생체내에서 펩티드 및 펩티드 모방체의 탐지를 허용하는 물질을 언급한다. 적합한 탐지 가능한 표지는 당업계 잘 알려져 있고, 예로, 방사성 동위원소, 형광성 표지 (예, 플루오레세인) 등을 포함한다. 특정한 탐지 가능한 표지를 사용하는 것이 중요하지는 않으며, 사용해야 할 표지의 양 뿐만 아니라 사용되는 양에서의 표지의 독성과 관련하여 선택된다. 이러한 요인에 관련된 표지의 선택은 물론 당업자의 기술 수준 이내에 존재한다.

펩티드 또는 펩티드 모방체에 대한 탐지 가능한 표지의 공유결합적 부착은 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 의해 성취될 것이다. 예를 들면,¹²⁵I 방사성 동위원소를 탐지 가능한 표지로서 사용할 때, 펩티드 또는 펩티드 모방체에 대한¹²⁵I의 공유결합적 부착은 아미노산 티로신을 펩티드 또는 펩티드 모방체내로 도입시키고, 이어서, 펩티드를 요오드 처리함으로써 성취할 수 있다 (예로, 위너 (Weaner) 등의 Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds, pp. 137-140 (1994)를 참조). 티로신이 펩티드 또는 펩티드 모방체 중에 존재하지 않는다면, 펩티드 또는 펩티드 모방체의 N 또는 C 말단에 티로신을 도입하는 것은 잘 알려진 화학적 방법에 의해 성취할 수 있다. 마찬가지로,³²P를 인산 잔기로 펩티드 또는 펩티드 모방체에, 예를 들면, 통상적인 화학적 방법을 사용하여 펩티드 또는 펩티드 모방체에 존재하는 히드록실기를 통하여 도입할 수 있다.

본 발명은 TPO-R에 결합하여 이를 활성화시키거나, 그렇지 않으면 다른 방식으로 TPO 작용제로 작용하는 화합물을 제공한다. 이들 화합물은 "리드" 펩티드 화합물 및 리드 화합물과 동일하거나 유사한 분자 구조 또는 형태를 갖지만, 가수분해 또는 단백질 분해에 대한 민감성 및(또는) 수용체에 대한 증가된 친화도 등의 다른 생물학적 특성에 관해서는 리드 화합물과 구별되도록 구성된 "유도체" 화합물 포함한다. 본 발명은 또한 TPO 작용제의 유효량을 포함하는 조성물, 보다 구체적으로는 혈액학적 장애, 특히 화학 요법, 방사능 요법, 또는 골수 이식과 관련된 혈소판 감소증을 치료하는데 유용한 화합물을 제공한다.

IC₅₀값을 측정하는 데에는 다양한 방법들이 사용될 수 있다. 예를 들어, MBP-TPO 또는 lacI-펩티드 탐침 중의 어느 것을 이용한 평형 결합 ELISA 분석을 이용하여 펩티드가 TPO 수용체의 세포외 도메인에 대한 TPO의 결합을 억제하는지의 여부를 결정하였다. 대표적으로, 경우에 따라 C-말단 아미드화될 수 있고, 에스테르 또는 다른 카르복시 아미드로 제조될 수도 있는 유리 펩티드를 사용하여 측정할 수 있다.

IC₅₀및 EC₅₀값은 본 명세서에서 부호상으로 기호 "-", "+" 및 "++"로 표시한다. 예를 들어, 200 μM를 초과하는 IC₅₀값을 나타낸 펩티드들은 "-"로 표시한다. 200 μM 이하의 IC₅₀값을 나타내는 펩티드들은 "+"로 나타낸 반면, 500 nm 이하의 IC₅₀값은 "++"로 표시하였다. 특정 기호에 대한 한계 또는 그 근처의 IC₅₀값을 나타내는 펩티드들은 혼합 기호, 즉 "+/-"로 표시한다. IC₅₀값이 결정되지 않은 펩티드들은 "N.D."로 열거하였다.

본 발명의 펩티드 및 펩티드 모방체는 하기 실시예 2에서 보다 상세히 기재된 바와 같이, 트롬보포이에틴 의존성 세포 증식 분석법으로 또한 평가하였다. 세포 증식은 세포 증식의 지표로서³H-티미딘 도입과 상호관련되어 있는 MTT 분석과 같은 당업계에 공지되어 있는 기술에 의해 측정한다 [Mossmann J. Immunol. Methods 65:55 (1983) 참조].

도 3-4는 본 발명의 펩티드 및 펩티드 모방체의 활성을 평가하기 위한 추가의 분석 결과를 나타낸다. 이 분석에 있어서, 카르보플라틴을 사용하여 쥐의 혈소판을 감소시켰다. Balb/C 쥐를 0 일에 카르보플라틴 (복강내 125 mg/ml)으로 처리한다. 이 결과는 본 발명의 펩티드가 쥐 모델에서 혈소판 감소증을 개선시킬 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 펩티드의 결합과 활성의 특이성은 국제 공개 제WO96/40750호에 설명된 방법에 따른 에리트로포이에틴 수용체 (EPO-R)에 대한 펩티드의 교차 반응성을 연구하여 조사한다.

펩티드 및 펩티드 모방체의 제조

고상 합성

본 발명의 펩티드는 당업계에 공지된 대표적인 방법, 예를 들어 표준 고상 기술을 사용함으로써 제조될 수 있다. 표준 방법은 배타적 고상 합성, 부분 고상 합성, 단편 농축, 고전적 용매 합성 및 심지어 재조합 DNA 기술도 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 참고문헌으로 채택되는 문헌 [메리필드 (Merrifield)의 J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)]을 참조한다. 고상에서, 합성은 대표적으로 알파 아미노 보호 수지를 사용하여 펩티드의 C-말단 단부로부터 개시한다. 적합한 출발 물질은 예를 들어, 목적하는 알파 아미노산을 클로로메틸화 수지, 히드록시메틸수지 또는 벤즈히드릴아민 수지에 부착시킴으로써 제조할 수 있다. 이러한 클로로메틸화 수지 중의 하나는 캘리포니아주, 리치몬드 소재 바이오 래드 래버러토리 (Bio Rad Laboratpoies)사의 바이오-비드 (BIO-BEADS) SX-1 제품으로 시판되고 있고, 히드록시메틸 수지의 제조는 문헌 [보돈스즈키 (Bodonszky) 등의 Chem. Ind. (London) 38:1966) 참조]에 기재되어 있다. 벤즈히드릴아민 (BHA) 수지는 문헌 [피에타 (Pietta)와 마샬 (Marshall) 등의 Chem. Commn. 650 (1970) 참조]에 기재되어 있고 캘리포니아주, 팔로 알토 소재 베크만 인스트루먼트 인크. (Beckman Instruments, Inc.) 사로부터 히드로클로라이드 형태로 상업적으로 입수 가능하다.

따라서, 본 발명의 화합물은 알파 아미노 보호된 아미노산을 예를 들어, 문헌 [지신 (Gisin)의 Helv. Chim. Acta., 56:1467 (1973) 참조]에 기재되어 있는 방법에 따라 중탄산 세슘을 보조제로 사용하여 클로로메틸화 수지에 커플링시킴으로써 제조할 수 있다. 초기 커플링 후, 알파 아미노 보호기는 실온에서 유기 용매 중에 트리플루오로아세트산 (TFA) 또는 염산 (HCl) 용액을 포함하는 시약을 선택함으로써 제거될 수 있다.

알파 아미노 보호기는 펩티드의 단계별 합성의 분야에서 유용한 것으로 공지되어 있는 것들이다. 이들은 아실 타입 보호기 (예를 들어, 포르밀, 트리플루오로아세틸, 아세틸), 방향족 우레탄 타입 보호기 (예컨대, 벤질옥시카르보일 (Cbz) 및 치환된 Cbz, 지방족 우레탄 보호기 (예컨대, t-부틸옥시카르보닐 (Boc), 이소프로필옥시카르보닐, 시클로헥실옥시카르보닐) 및 알킬 타입 보호기 (예컨대, 벤질, 트리페닐메틸)을 포함한다. Boc와 Fmoc가 바람직한 보호기이다. 측쇄 보호기는 커플링 동안 손상되지 않은 채로 존재하고 아미노 말단 보호기의 탈보호 동안 또는 커플링 동안 절단되지 않는다. 측쇄 보호기는 최종 펩티드의 합성이 완료되고 목적 펩티드를 변형시키지 않는 조건하에서 제거되어야 한다.

Thr 및 Ser에 대한 측쇄 보호기는 아세틸, 벤조일, 트리틸, 테트라히드로피라닐, 벤질, 2,6-디클로로벤질 및 Cbz를 포함한다. Arg (R)에 대한 측쇄 보호기는 니트로, 토실 (Tos), Cbz, 아다멘틸옥시카르보닐 메시토일술포닐 (Mts), Pmc 또는 Boc를 포함한다. Lys (K)에 대한 측쇄 보호기는 Cbz, 2-클로로벤질옥시카르보닐 (2-Cl-Cbz), 2-브로모벤질옥시카르보닐 (2-BrCbz), Tos 또는 Boc를 포함한다.

알파-아미노기를 제거한 후, 잔류 보호 아미노기는 목적하는 순서로 단계적으로 커플링한다. 일반적으로 각각 보호되는 대량의 아미노산의 과량이 예를 들어 메틸렌 클로라이드 (CH₂Cl₂), 디메틸 포름아미드 (DMF) 혼합물 등의 용액 중에 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC)와 같은 적절한 카르복실기 활성제와 함께 사용될 수 있다.

목적하는 아미노산 서열을 완료한 후, 목적하는 펩티드는 수지로부터의 펩티드를 절단할 뿐만 아니라, 잔류하는 측쇄 보호기도 절단하는 트리플루오로아세트산 또는 불화수소 (HF) 등의 시약으로 처리함으로써 수지 지지체로부터 탈커플링시킨다. 클로로메틸화 수지를 사용할 경우, 불화수소 처리는 유리 펩티드산의 형성을 초래한다. 벤즈히드릴아민 수지를 사용할 경우, 불화수소 처리는 직접적으로 유리 펩티드를 초래한다. 다른 방법으로는, 클로로메틸화 수지를 사용할 경우 측쇄 보호 펩티드 수지를 암모니아로 처리하여 탈커플링하여 목적하는 측쇄 보호된 아미드를 얻고, 알킬아민으로 처리하여 측쇄 보호된 알킬아미드 또는 디알킬아미드를 얻는다. 이어서 측쇄 보호는 불화수소로 처리하는 통상적인 방식으로 제거하여 유리 아미드, 알킬아미드 또는 디아킬아미드를 얻는다.

이들 고상 펩티드 합성 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고 문헌 [존 모로우 스튜어트 (John Morrow Stewart)와 재니스 딜라하 영 (Dillaha Young)의 Solid Phase Peptide Synthesis 2판, Pierce Chemical Company, 1984]에 더 설명되어 있다.

본 발명의 화합물은 1990년 5월 7일에 출원된 미국 특허 출원 제07/492,462호; 1990년 12월 6일에 출원된 제07/624,120호; 1991년 12월 6일에 출원된 제07/805,727호에 기재되어 있는 "코딩된 합성 라이브러리" 또는 "거대 크기의 고정화된 중합체 합성" 시스템을 사용하여 제조할 수도 있다.

합성 아미노산

이들 방법은 또한 20 개의 천연의, 유전학적으로 코딩되는 아미노산 이외의 아미노산이 본 발명의 임의의 화합물의 하나, 둘 또는 그 이상의 위치에서 치환된 펩티드를 합성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 나프틸알라닌은 합성을 촉진하기 위해 트립토판으로 대체될 수 있다. 본 발명의 펩티드 내로 치환될 수 있는 다른 합성 아미노산은 β 아미노산, D-아미노산, 비천연 합성 아미노산을 포함한다 [로버츠 (Roberts) 등의 Unusual Amino/Acids in Peptide Synthesis, 5(6):341-449 (1983) 참조].

N-말단 변형

펩티드는 전형적으로 유리산으로 합성되지만, 상기한 바와 같이 아미드 또는 에스테르로 용이하게 제조될 수 있다. 본 발명의 펩티드 화합물의 아미노 및(또는) 카르복시 말단을 변형시켜서 본 발명의 다른 화합물을 제조할 수도 있다. 아미노 말단 변형은 메틸화 (즉, NHCH₃또는 -NH(CH₃)₂임), 아세틸화, 벤질옥시카르보닐기 첨가 또는 RCOO- (여기서, R은 나프틸, 아크리디닐, 스테로이딜 및 유사기로부터 선택된 것임)에 의해 정의된 카르복실레이트 관능성을 함유하는 임의의 차단기를 사용하여 아미노 말단을 차단하는 것을 포함한다. 카르복시 말단 변형은 유리산을 카르복스아미드기로 대체시키거나 또는 카르복시기 말단에서 시클릭 락탐을 형성시킴으로써 구조적 제한을 도입하는 것을 포함한다.

아미노 말단 변형은 상기한 바와 같고 알킬화, 아세틸화, 카르보벤조일기 첨가, 숙신이미드기 형성 등을 포함한다 [무레이 (Murray) 등의 Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th ed., Vol. 1, Manfred E. Wolf, ed., John Wiley and Sons, Inc. (1995) 참조]. 구체적으로, 그 다음에 N-말단기는 다음과 같이 반응시킬 수 있다:

(a) 산 할로겐화물 [예를 들어, RC(O)Cl] 또는 대칭성 산무수물과의 반응에 의한 화학식 RC(O)NH-의 아미드기를 형성한다 (여기서, R은 상기에 정의한 바와 같음). 전형적으로, 반응은 산 할로겐화물의 대략 등량 또는 과량 (예를 들어, 5 당량)을 반응시키는 동안 발생되는 산을 제거하기 위해 바람직하게는, 디이소프로필에틸아민 등의 3급 아민의 과량 (예컨대, 약 10 당량)을 함유하는 불활성 희석제 (예컨대, 디클로로메탄) 중에서 펩티드에 접촉시킴으로써 수행할 수 있다. 다른 반응 조건은 통상적이다 (예를 들어, 실온에서 30 분임). 저급 알킬 N-치환을 제공하기 위해 말단 아미노기의 알킬화에 이어서, 상기와 같은 산 할로겐화물과 반응시킴으로써 화학식 RC(O)NR-의 N-알킬 아미드기가 제공될 것이다;

(b) 숙신산 무수물과의 반응에 의한 숙신이미드기를 형성한다. 상기와 같이 숙신산 무수물의 대략 등량 또는 과량 (예컨대, 약 5 당량)을 사용하여, 아미노기를 디이소프로필에틸아민 등의 과량 (예컨대, 10 당량)의 3급 아민의 사용을 포함하는 당업계에 공지되어 있는 방법에 의해 적합한 용매 (예를 들어, 디클로로메탄) 중에서 숙신이미드로 전환시킨다 (본 명세서에 참고문헌으로 채택되는 월렌버그 (Wollenberg) 등의 미국 특허 제4,612,132호 참조) 숙신기는 예를 들면, 펩티드의 N-말단에 치환된 숙신이미드를 제공하기 위해 통상적 방법으로 제조되는 C₂-C₆알킬 또는 -SR 치환체로 치환될 수 있다. 이러한 알킬 치환체는 저급 올레핀 (C2-C6)을 말레산 무수물과 함께 상기 월렌버그 등에 의해 기재되어 있는 방법으로 반응시켜 제조할 수 있고, -SR 치환체는 RSH를 R이 상기 정의한 바와 같은 R말레산 무수물과 함께 반응시켜 제조될 수 있다;

(c) 바람직하게는, 반응하는 동안 발생되는 산을 제거하기 위해 3급 아민을 함유하는 적합한 불활성 희석제 (예를 들어, 디클로로메탄) 중에서 적합하게는 등량 또는 과량 (예컨대, 5 당량)의 CBZ-Cl (즉, 벤질옥시카르보닐 클로라이드임) 또는 치환된 CBZ-Cl과의 반응에 의해 벤질옥시카르보닐-NH- 또는 치환된 벤질옥시카르보닐-NH-기를 형성한다;

(d) 등량 또는 과량 (예를 들어, 5 당량)의 R-S(O)₂Cl (여기서, R은 상기 정의한 바와 같음)과 적합한 불활성 희석제 (디클로로메탄) 중에서 반응시켜 말단 아민을 술폰아미드로 전환시킴으로써 술폰아미드기를 형성한다. 불활성 희석제는 반응시 발생되는 산을 제거하기 위해 디이소프로필에틸아민 등의 3급 아민 대량을 함유하는 것이 바람직하다. 다른 반응 조건은 통상적이다 (예를 들어, 실온에서 30 분임);

(e) 등량 또는 과량 (예를 들어, 5 당량)의 R-OC(O)Cl 또는 R-OC(O)OC₆H₄-p-NO₂(여기서, R은 상기 정의한 바와 같음)과 불활성 희석제 (디클로로메탄)중에서 반응시켜 말단 아민을 카르바메이트로 전환시킴으로써 카르바메이트기를 형성한다. 불활성 희석제는 반응시 발생되는 산을 제거하기 위해 디이소프로필에틸아민 등의 3급 아민을 대량 함유하는 것이 바람직하다. 다른 반응 조건은 통상적이다 (예를 들어, 실온에서 30 분임);

(f) 등량 또는 과량 (예를 들어, 5 당량)의 R-N=C=O (여기서, R은 상기 정의한 바와 같음)과 불활성 희석제 (디클로로메탄)중에서 반응시켜 말단 아민을 우레아 (즉, RNHC(O)NH-) (여기서, R은 상기 정의한 바와 같음)기로 전환시킴으로써 카르바메이트기를 형성한다. 불활성 희석제는 디이소프로필에틸아민 등의 3급 아민을 과량 (예, 약 10 당량) 함유하는 것이 바람직하다. 다른 반응 조건은 통상적이다 (예를 들어, 실온에서 30 분임).

다른 별법의 실시태양에 있어서, C-말단 카르복실기 또는 C-말단 에스테르는 카르복실기 또는 에스테르의 -OH 또는 에스테르 (-OR)가 N-말단 아미노기로 내부 치환되어 고리화하도록 유도하여 시클릭 펩티드를 형성할 수 있다. 예를 들어, 합성 및 절단을 행하여 펩티드산을 생성한 후, 유리산은 예를 들어, 메틸렌 클로라이드 (CH₂Cl₂), 디메틸 포름아미드 (DMF) 혼합물 용액 중에서 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC)와 같은 적합한 카르복실기 활성제에 의해 활성화된 에스테르로 전환시킨다. 이어서, 활성화된 에스테르와 N-말단 아민의 내부 치환에 의해 시클릭 펩티드가 형성된다. 중합에 대립되는 것으로서 내부 고리화는 상당히 희석된 용액의 사용에 의해 증진될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.

또한, 본 발명의 펩티드를 고리화하거나 또는 데스아미노 또는 데스카르복시 잔기를 펩티드 말단에 도입함으로써 말단 아미노 또는 카르복실기가 없게 되어, 프로테아제에 대한 감수성을 감소시키거나 또는 펩티드의 형태를 제한시킬 수 있다. 본 발명의 화합물의 C-말단 관능기는 아미드, 아미드 저급 알킬, 아미드 디 (저급 알킬), 저급 알콕시, 히드록시 및 카르복시, 이들의 저급 에스테르 유도체 및 이들의 제약상 허용되는 염을 포함한다.

상기의 N-말단 및 C-말단 변형 외에도, 본 발명의 화합물은 상기에 정의된 바와 같은 하나 이상의 다양한 친수성 중합체로 유리하게는 변형될 수 있거나 공유결합으로 연결될 수 있다.

본 발명의 펩티드 화합물은 모두 본 명세서에서 전문이 참고문헌으로 채택되는 [잘립스키 (Zallipsky, S) 등의 Bioconjugate Chem., 6:150-165 (1995); 몬파르디니 (Monfardini, C) 등의 Bioconjugate Chem., 6:62-69 (1995)]; 미국 특허 제4,640,835호; 미국 특허 제4,496,689호; 미국 특허 제4,301,144호; 미국 특허 제4,670,417호; 미국 특허 제4,791,192호; 미국 특허 제4,179,337호 또는 국제 공개 제WO/95/34326호에 설명된 임의의 방법을 사용하여 이러한 중합체로 유도체화되거나 또는 연결할 수 있다. PEG는 미국 알라바마주 헌츠빌 소재의 쉬어워터 폴리머, 인크 (shearwater Polymers, Inc.)와 시그마 케미칼 캄파니 (Sigma Chemical Co.) 및 다른 회사들로부터 상업적으로 입수할 수 있다.

현재 바람직한 실시양태에서는, 본 발명의 펩티드 화합물은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 유도된다.

간단하게는, 하나의 실시양태에서, PEG와 같은 사용되는 친수성 중합체는 바람직하게는 메톡시 또는 에톡시기와 같은 비반응성기로 한쪽 말단에 캡핑된다. 그 후에, 중합체를 다른 말단에서 할로겐화시아누르 (예, 시아누르 염화물, 브롬화물 또는 플루오르화물), 디이미다졸, 무수 시약 (예, 디브로모숙신산 무수물과 같은 디할로숙신산 무수물), 아실 아지드, p-디아조늄벤질 에테르, 3-(p-디아조늄페녹시)-2-히드록시프로필에테르 등의 적합한 활성화제와의 반응에 의하여 활성화시킨다. 이어서 활성화된 중합체를 본 발명의 펩티드 화합물과 반응시켜서 중합체로 유도체화된 펩티드 화합물을 제조한다. 본 발명의 화합물의 펩티드 가지 중 하나가 예를 들어 아실기로 보호된다면, 단일 PEG화 화합물이 형성될 것이다. 다른 방법으로는, 본 발명의 펩티드 화합물의 관능기는 중합체와의 반응을 위하여 활성화될 수 있거나, 2개의 기는 공지된 커플링 방법을 사용하여 합의된 커플링 반응으로 결합될 수 있다. 반응식 1-4는 본 발명의 펩티드 화합물을 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 유도체화시키는 반응식을 예시한다. 본 발명의 펩티드 화합물은 당업자에 의하여 공지되고 사용되는 다른 무수한 반응식을 사용하여 PEG로 유도체화될 수 있는 것이 쉽게 이해될 것이다.

본 발명의 펩티드 화합물을 친수성 중합체 (예, PEG)로 유도체화시키는 것 외에도, 다른 작은 펩티드 예를 들면, 수용체에 결합하는 다른 펩티드 또는 리간드가 또한 생물학적 활성 (예, 결합 활성, 작용제 활성, 길항제 활성 등)을 거의 손상하지 않으면서 이러한 친수성 중합체에 의해 유도체화될 수 있다는 것이 발견되었다. 이러한 작은 펩티드가 친수성 중합체에 의해 유도체화될 때, 이들의 용해도 및 순환 반감기는 증가하고 이들의 면역원성은 감소한다는 것이 밝혀졌다. 또한, 상당히 놀랍게도, 상기의 것들은 생물학적 활성을 거의 손상하지 않고 이룰 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 지방에서는 유도체화 펩티드가 변형되지 않은 펩티드 활성의 0.1 내지 0.01 배인 활성을 가진다. 보다 바람직한 실시양태에서는, 유도체화 펩티드가 변형되지 않은 펩티드 활성의 0.1 내지 1 배인 활성을 가진다. 보다 더 바람직한 실시양태에서는, 유도체화 펩티드가 변형되지 않은 펩티드 활성보다 큰 활성을 가진다.

이 실시양태에서 사용되기 유용한 펩티드는 일반적으로 TPO, EPO, IL-1, G-CSF 및 IL-5 수용체 등의 수용체에 결합하는 펩티드, 즉 리간드; 혈액 성장 인자 수용체; 시토킨 수용체; G-단백질-연결된 수용체; 세포 표면 수용체 등을 포함한다. 이러한 펩티드는 전형적으로 약 150 미만의 아미노산 잔류물, 보다 바람직하게는 약 100 미만의 아미노산 잔류물 (예, ~10-12kDa)을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 친수성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜로 예시되는 폴리알킬에테르, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리옥시알켄, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 및 이들의 공중합체 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로는 이러한 친수성 중합체의 평균 분자량은 약 500 내지 약 100,000 달톤, 보다 바람직하게는 약 2,000 내지 약 20,000 달톤 범위이다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 친수성 중합체의 평균 분자량은 약 5,000 달톤, 10,000 달톤 및 20,000 달톤이다. 본 발명에 따른 펩티드 화합물은 상기와 인용된 참고문헌에서 설명된 방법을 사용하여 유도체화될 수 있다.

본 발명의 화합물은

시스테인의 티올기 사이에 분자내 이황화 결합을 갖는다. 본 방법은 당업계에 공지된 방법 [프랭크 에이. 로베이 (Frank A. Robey)등의 Meth. in Mol. Bio., 35(6):73-90 (1990) 참조]을 사용하여 분자내 전치를 통해 이루어질 수 있다.

추가로, 본 발명은

(a) 5개 미만의 탄소 원자를 지닌 알콕시 또는 알킬기로 치환되거나 치환되지 않은, 분자량이 약 500 내지 약 20,000 달톤인 중합체의 히드록시기를 함유하는 하나 이상의 말단 탄소 원자를 활성화시키는 단계,

(b) 생리학적으로 활성인 화학식 1의 폴리펩티드를 상기 중합체의 반응성 말단기에 커플링시켜서 상기 폴리펩티드와 폴리펩티드 1몰 당 상기 활성화된 중합체 10 몰 내지 100몰을 반응시켜서 상기 생리학적으로 활성이고, 실질적으로 비면역원성 수용성 폴리펩티드 조성물을 제공하는 단계

를 포함하는 본래 생리학적으로 활성인 폴리펩티드로부터 생리학적으로 활성이고, 실질적으로 비면역원성 수용성 폴리펩티드 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

유용성

본 발명의 화합물은 TPO의 생성 및 수용체 결합 과정에 영향을 주고, 영향을 받을 것으로 생각되는 많은 인자들의 평가를 포함하는 TPO의 생물학적 역할을 이해하기 위한 유일한 도구로서 시험관 내에서 유용하다. 본 발명의 화합물은 또한 TPO-R에 결합하고 활성화시키는 다른 화합물을 개발하는데 유용하며, 그 이유는 본 발명의 화합물은 이러한 개발을 촉진시키는 구조 및 활성 사이의 관계에 대한 중요한 정보를 제공하기 때문이다.

본 화합물은 또한 신규 TPO 수용체 길항제를 스크리닝 분석을 하는데 경쟁적 결합체로서 유용하다. 이러한 분석 실시태양에 있어서, 본 발명의 화합물은 변형없이 사용될 수 있고, 다양한 방식으로 변형될 수 있다; 예를 들어, 직접 또는 간접적으로 검출 가능한 신호를 제공하는 부분을 공유 또는 비공유 결합시키는 것과 같은 표지시킴으로써 변형시킬 수 있다. 임의의 이들 분석에 있어서, 이들에 대한 물질은 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 직접 표지로 가능한 것은 다음과 같은 표지를 포함할 수 있다:¹²⁵I와 같은 방사성표지, 과산화수소 및 알칼린 포스파타제와 같은 효소 (미국 특허 3,645,090호) 및 형광 강도, 파장 이동 또는 형광 극성화에서 변화를 모니터할 수 있는 형광 표지 (미국 특허 제 3,940,475호). 간접 표지로 가능한 것들은 한 성분의 비오티닐화에, 이어서 상기 표지 군 중의 하나에 커플된 아비딘에 결합하는 것을 포함한다. 화합물은 또한 화합물이 고상 지지체에 부착되는 경우에 스페이서 또는 링커를 포함할 수도 있다.

더욱이, TPO 수용체에 결합하는 이들의 능력에 기초하여, 본 발명의 펩티드는 살아 있는 세포, 고정된 세포, 생물학적 유체, 조직 균질물 상에서 TPO 수용체를 검출하기 위한 시약으로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 이러한 펩티드를 표지시킴으로써, 표면상에 TPO-R을 갖고 있는 세포를 동정할 수 있다. 또한, TPO 수용체에 결합하는 이들의 능력에 기초하여, 본 발명의 펩티드는 반응기 자체의 염색, FACS (형광 활성화된 세포 분류), 웨스턴 블롯팅, ELISA 등에 사용될 수 있다. 추가로, TPO 수용체에 결합하는 이들의 능력에 기초하여, 본 발명의 펩티드는 수용체 정제 또는 세포 표면상 (또는 내부 침투가능 세포)에서 TPO 수용체를 발현하는 세포의 정제에 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 다양한 의학 연구 및 진단 용도의 상업상의 시약으로서 이용될 수 있다. 이러한 용도는, 이들에 제한되지 않고, (1) 후보 TPO 길항제의 활성을 다양한 기능 분석으로 정량하기 위한 보정 표준으로서 사용; (2) TPO 의존 세포주의 증식 및 성장을 유지하기 위해 사용; (3) 동시 결정화를 통해 TPO-수용체의 구조 분석에 사용; (4) TPO 시그날 변환/수용체 활성; 및 (5) TPO-수용체가 바람직하게 활성화되거나 또는 이러한 활성이 TPO 길항제의 알려진 양에 대해 용이하게 보정되는 기타 연구 및 진단상의 용용을 포함한다.

본 발명의 화합물은 추가의 시토킨 또는 그들 자신과 결합하여 거핵구 및 이들의 확실한 선조의 시험관내 확장에 사용될 수 있다. 본 명세서에 참고로 인용되는 [디규스토 (DiGiusto) 등의 PCT 제 95/05843] 참고한다. 화학 요법 및 방사능 요법은 급속히 분열하는 거핵구의 보다 성장한 집단을 사멸시킴으로써 혈소판 감소증을 일으킨다. 그러나, 이러한 화학 요법도 또한 미성숙한, 유사분열상 덜 활성화된 전구 거핵구의 수 및 생존력을 감소시킬 수 있다. 따라서, TPO 또는 본 발명의 화합물에 의한 혈소판 감소증의 개선은 화학요법 또는 방사성요법 후의 환자에 시험관 내 배양으로 거핵구 및 미성숙 전구체가 강화된 환자의 세포 집단을 주입함으로써 촉진될 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 인간을 포함한 온혈 동물에 생체내 TPO-R을 활성화하기 위해 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 화합물을 생체내 TPO-R에 미치는 TPO의 효과를 모방하기 위한 치료학상 충분량으로 투여하는 것을 포함하는 TPO 관련 질병의 치료상 처치 방법을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 펩티드 및 화합물은, 상기에 정의된 바와 같이, 다양한 혈액학적 질병을 치료하는데 투여될 수 있다.

본 발명의 일부 실시태양에 있어서, TPO 길항제를 먼저 화학 요법 및 방사능 요법을 받고 있는 환자에게 투여하고, 이어서 본 발명의 TPO 작용제를 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 화합물의 활성은 시험관 내 또는 생체 내 중의 어느 것에서 본 명세서에 참고로 인용하는 문헌 [맥도날드 (McDohald), Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology 14:8-21 (1992)]에 기재되어 있는 다수의 모델중의 하나로 평가할 수 있다.

하나의 실시태양에 따르면, 본 발명의 조성물은 골수 수혈, 방사능 치료 및 화학 요법와 관련한 혈소판 감소증을 치료하는데 유용하다. 대표적으로, 화합물은 화학 요법, 방사능 요법 또는 골수 이식을 하기 전 또는 이러한 노출 후에 예방적으로 투여할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 활성 성분으로 제약상 담체 또는 희석제와 함께 하나 이상의 본 발명의 펩티드 및 펩티드 모방체로 이루어진 제약 조성물을 제공한다. 본 발명의 화합물은 경구, 폐, 비경구 (근육내, 복강내, 정맥내 (IV) 또는 피하 주사), 흡입 (미세한 분말 제형을 통해), 경피, 비강, 질, 직장 또는 설하 경로에 의해 투여될 수 있고, 투여 경로 각각에 적합한 투여 형태로 제형화될 수 있다. 본 명세서에 이들 각각을 참고로 인용하는 번스타인 (Bernstein) 등의 PCT 제 93/25221호, 피트 (Pitt) 등의 PCT 제 94/17784호 및 피트 등의 유럽 특허 출원 제613,683호를 참조한다.

경구 투여를 하기 위한 고체 투여 형태는 캡슐, 환제, 정제, 분말 및 과립을 포함한다. 이러한 고상 투여 형태에 있어서, 활성 화합물은 수크로스, 락토오스 또는 전분 등의 제약상 허용되는 불활성 담체 하나 이상과 함께 혼합한다. 이러한 투여 형태는 또한, 정상적인 관례에 있어서와 같이 예를 들면, 스테아르산 마그네슘 등의 활제와 같은 불활성 희석제 외에 추가의 물질을 포함할 수 있다. 캡슐, 환제 및 정제의 경우에 있어서, 투여 형태는 또한 완충제를 포함할 수 있다. 정제 및 환제는 장용성 코팅으로 제조할 수 있다.

경구 투여를 하기 위한 액상 투여 형태는 물과 같은 통상적으로 당업계에 사용되는 불활성 희석제를 함유하는 엘릭시르와 함께 제약상 허용되는 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽을 포함한다. 이러한 불활성 희석제 외에, 조성물은 또한 습윤제, 에멀젼화 및 현탁화제 등의 보조제, 감미제, 풍미제 및 방향제도 포함할 수 있다.

비경구 투여를 하기 위한 본 발명에 따른 제형은 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 또는 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매 또는 담체의 예들은 프로필렌 글리콜, 펄리에틸렌 글리콜, 올리브유 및 옥수수 유 등의 식용유, 젤라틴 및 올레산 에틸 등의 주사용 유기산 에스테르를 들 수 있다. 이러한 투여 형태는 또한 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제 등의 보조제를 포함한다. 이들은 예를 들어, 세균 잔류 여과기를 통한 여과, 조성물로의 멸균제 도입, 조성물 조사 또는 조성물 열처리에 의해 멸균될 수 있다. 이들은 또한 사용하기 바로 전에, 멸균수 또는 다른 멸균 주사용 매질을 이용하여 제조될 수 있다.

다른 방법으로는, 화합물은 물 (주사용), 염수 또는 덱스트로스 용액으로 액화시키기 위한 동결 건조된 고체로 제공될 수 있다. 이러한 제형은 보통 유리병, 앰플 또는 일회용 주사 장치 등의 단위 투여 형태로 보통 제공된다. 이들은 적절한 복용량이 나올수 있는 병 등의 다중 투여 형태로 제공될 수도 있다. 이러한 모든 제형은 무균이여야 한다.

직장 또는 질투여를 하기 위한 조성물은 활성 성분 외에, 코코아 버터 또는 좌약 왁스 등의 부형제를 함유하는 것이 바람직하다. 비강 또는 설하 투여를 하기 위한 조성믈은 또한 당업계에 잘 공지되어 있는 표준 부형제와 함께 제형될 수 있다.

본 발명을 함유하는 조성물은 예방용 및(또는) 치료용 처치를 하기 위해 투여될 수 있다. 치료 적용을 위해, 조성물은 상기와 같은 질병을 이미 겪고 있는 환자에게 치료 또는 질병 및 합병증의 증후를 치료하거나 또는 적어도 부분적으로 정지시키는데 충분량으로 투여할 수 있다. 이를 성취하는데 적합한 양은 "치료상 유효량"으로 정의한다. 이 용도에 대한 유효량은 질병의 심도 및 환자의 체중 및 일반적인 상태에 따라 다르다.

본 발명의 조성물은 또한 예를 들면, 문헌 [타이스 (Tice)와 비비 (Bibi)의 in Treatise on Controlled Drug Delivery, ed., A. Kydonieus, Marcel Dekker, N.Y. (1992), 315-339 p]의 방법에 의해 마이크로 캡슐화시킬수 있다.

예방적인 적용에 있어서, 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물을 이에 민감한 환자 또는 달리 특정 질병의 위험에 처한 환자에게 투여한다. 이러한 양은 "예방상 유효 복용량"으로 정의된다. 이 용도에 있어서, 정확한 양은 마찬가지로 환자의 건강 상태 및 체중에 의존한다.

유효 치료에 필수적인 TPO 작용약의 정량은 투여 수단, 표적 부위, 생리학적 상태, 및 다른 투여 약물을 포함하는 수많은 요인에 의존할 것이다. 그러므로, 치료 투여량은 안정도 및 효능을 최대로 하도록 적정되어야 한다. 전형적으로, 시험관내 사용되는 투여량은 이들 시약을 본래 장소로 투여하는데 유용한 양에 있어서 유용한 지시를 제공할 수도 있다. 특정 장애의 치료에 대한 유효 투여량의 동물 시험은 추가로 인간 투여량의 예언적 지시를 제공할 것이다. 다양한 고찰이 예를 들면, 문헌 [본 명세서에 참고문헌으로서 인용되는, 길만 (Gilman) 등의 (eds), Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press (1990); 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 7th ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1985)]에 기재되어 있다.

본 발명의 펩티드 및 펩티드 모방체는 1일에 단위 체중 당 약 0.001 ㎎ 내지 약 10 ㎎의 투여량 범위로 투여될 때 TPO 매개 질병을 치료하는데 유효하다. 사용되는 구체적인 투여량은 치료할 특정 질병, 투여 경로 뿐만 아니라 질병의 심각도, 환자의 나이 및 전반적인 상태 등과 같은 요인에 의존하는 주치의의 판단에 의해 조절된다.

인간에 투여하기 위한 적합한 제약 비경구 제제는 바람직하게는 용액 중에 화학식 1의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 유도체의 1-50 mg/ml, 또는 다중 투여 유리병용으로 그의 몇배를 포함할 것이다.

바람직한 제형은 물, 염수 또는 덱스트로스 용액 중의 화학식 1의 화합물의 용액이다. 특히 바람직한 용액의 pH는 약 4.0-5.0이다.

본 발명의 추가 면에 따라서, 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 분자량이 약 500 내지 약 20,000 달톤이고, 5개 미만의 탄소 원자를 지닌, 알콕시 또는 알킬기로 치환되거나 치환되지 않은 하나 이상의 중합체에 커플링제를 사용하여 커플링된 화학식 1의 화합물을 포함하는 생리학적으로 활성이고, 실질적으로 비면역원성 수용성 폴리펩티드 조성물을 제공하는 단계를 제공한다. 바람직한 상기 중합체의 분자량은 약 750 내지 약 15,000 달톤이고, 보다 바람직하게는 약 5,000 내지 약 10,000 달톤이다. 상기 중합체는 바람직하겐느 폴리에틸렌 글리콜이다.

본 발명의 바람직한 실시태양만이 상기 구체적으로 기술되어 있을 뿐이지만, 본 발명의 변형 및 변이는 본 발명의 정신 및 의도하는 범위에서 벗어남 없이 가능한 것으로 인식될 것이다.

실시예 1

본 발명의 다양한 펩티드를 메리필드 고상 합성 기술 [스튜어드 (Steward)와 영 (Young), Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. edition, Pierce Chemical, Rockford, IL (1984) 및 메리필드, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1963) 참조]을 사용하여 손으로 또는 어플라이드 바이오시스템즈 인크. (Applied Biosystems Inc.) 모델 431A 또는 433A 펩티드 합성기를 사용하여 합성할 수 있다. 이 펩티드들을 어플라이드 바이오시스템즈 인크. Synth Assist1.00 또는 Assist2.0.2의 표준 방법을 사용하여 조립하였다. 실시예에서 달리 언급되지 않는다면, 각 커플링은 HBTU (2-(1H-벤즈아트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로-포스페이트) 및 HOBt (1-히드록시벤조트리아졸)을 사용하여 2x30 분 동안 수행하였다.

사용된 수지는 링커로 5-(4'-Fmoc-아미노메틸-3,5'-디메톡시옥시페녹시)발레르산과 교차 연결된 폴리스티렌 수지인, HMP 수지 또는 PAL (밀리겐/바이오서치)였다. PAL 수지의 사용으로 인해 수지로부터 펩티드의 절단시 카르복실 말단 아미드 관능성이 초래된다. 절단시, HMP 수지는 최종 생성물의 C-말단에 카르복실산 성분을 만들어 낸다. 대부분의 시약, 수지, 및 보호된 아미노산 (유리 또는 수지 상의)을 밀리포어 (Millipore) 또는 어플라이드 바이오시스템즈 인크.에서 구입하였다.

Fmoc기를 커플링 방법 동안 아미노 보호에 사용하였다. 아미노산 상의 1급 아민 보호는 Fmoc를 사용하여 성취하였고, 측쇄 보호기는 세린, 글루타민 및 트레오닌에 대해서는 t-부틸; 글루타민에 대해서는 트리틸; 아르기닌에 대해서는 Pmc (2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐); 트립토판에 대해서는 N-t-부틸옥시카르보닐; 시스테인에 대해서는 S-트리틸을 사용하였다.

수지로부터 펩티드의 제거 및 측쇄 관능의 동시 탈보호는 시약 K 또는 이들의 약간의 변형물을 사용하여 성취하였다. 다른 방법으로, 그들 펩티드의 합성에 있어서 아미드화 카르복실 말단과 함께, 완전히 조립된 펩티드는 초기에는 4 ℃, 점차 실온으로 증가시키면서 트리플루오로아세트산 90 %, 에탄디티올 5 %, 및 물 5 %의 혼합물을 사용하여 절단하였다. 탈보호된 펩티드는 디에틸 에테르를 사용하여 침전시켰다. 모든 경우에 있어서, 정제는 0.1 % 트리플루오로아세트산을 함유하는 아세토니트릴/물의 구배를 사용하는 C₁₈결합 실리카 겔 칼럼 상에서 정제 역상 HPLC로 행하였다. 동종 펩티드는 적용할 수 있는 경우, 급속 원자 충격 물질 분광법 (Fast Atom Bombardment mass spectrometry) 또는 일렉트로스프레이 (electrospray) 물질 분광법 및 아미노산 분석에 의해 특징 지워졌다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드를 당업자에 알려지고 사용되는 표준 합성 방법을 사용하여 2량체화하였다. 본 발명의 2량체 펩티드 화합물을 제조하기 위한 예시적 합성 반응식은 도 10 및 11에 나타내었다. 이러한 합성 반응식을 따라서 당업자들은 본 발명에 따른 2량체 펩티드 화합물을 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 2량체 서브유니트가 도 10 및 11에 설명된 것 이외의 방법과 링커를 사용하여 용이하게 연결될 수 있다는 것이 당업자에 쉽게 명백해질 것이다.

A. AF15705의 합성

AF15705에 대한 반응식

FmocIE(tBu)GPT(tBu)L-OH의 합성

Fmoc-Leu-HMPB-BHA [4-(4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시)-부티르산 벤즈히드릴아민] 수지 (35 g, 18.9 mmol) 및 1-메틸-2-히롤리디논 (NMP) 300 ml로 1 L 펩티드 챔버를 충전시켰다. 수지를 30 분 동안 질소 교반으로 용매 중에 컨디셔닝켜 비드를 팽윤시켰다. 말단 아민으로부터 NMP 용액 중의 피페리딘 30 % 용액 2 x 250 ml를 각각 10 분 동안 사용하여 Fmoc(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)를 제거하였다. 이어서 수지를 부의 클로라닐 시험에 의하여 측정된 바와 같이, NMP 6 x 300 ml를 사용하여 Fmoc 부산물 (디벤조풀벤 및 이들의 피페리딘 부가물)이 없도록 세척하였다. Fmoc-Thr(tBu)-OH (15.0 g, 2 당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBT) (5.8 g, 2 당량)를 실온에 NMP 250 ml 중에 용해시켰다. 용액을 얼음조에서 0-5℃로 냉각시켰다. 디이소프로필에틸아민 (DIPEA) (8.2 g, 2 당량)를 가하고 3-5 분 동안 교반시켰다. O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU) (14.3 g, 2 당량) 및 디클로로메탄 (DCM) 75 ml를 가하고 약 5 분에 결쳐 교반시켜 용해시켰다. 활성화 산의 용액을 수분이 빠진 수지 상에 충전하고 1 시간 동안 N₂버블링으로 교반시켰다. 커플링 완결은 닌히드린 시험으로 모니터하였다. 수지를 배수시키고 3 x 300 ml NMP로 세척하였다.

이어서 Fmoc-Pro-OH (12.8 g), Fmoc-Gly-OH (11.2 g), Fmoc-Glu(OtBu)-OH (16.8 g), 및 Fmoc-lle-OH (13.4 g)을 사용하여 펩티드 단편의 머들에 대하여 순환을 반복하였다.

DCM 중의 1 % 트리플루오로아세트산을 사용하여 수지로부터 펩티드를 절단하였다. 분획물을 수집하고 생성물 함량에 대해 HPLC로 분석하였다. 300 ml 4 분획, 500 ml 4 분획, 그 다음에 250 ml 6 분획을 수집하고 분석하였다. 분획 3-9를 피리딘으로 pH ~3-4로 조절하고 나서, 배합하고 회전 증발기에서 거의 건조될 때까지 농축시켰다. 에탄올 200 ml를 플라스크에 도입하고 농축을 계속하여 잔류 DCM을 제거하였다. 결과의 부분적 용액을 증기조에서 가열하여 완전한 용액을 얻었다. 용액을 얼음조에서 0-5℃로 냉각시키고 ~1 시간 동안 얼음조에서 교반시키고, 여과하고, 물 100 ml로 세척하였다. 생성물을 밤새 깔때기를 통해서 공기 스트림으로 깔때기 상에서 공기 건조시켜서 정량적 수율과 98.3 면적 % HPLC 순도의 Fmoc-lle-Glu(OtBu)-Gly-Pro-Thr(tBu)-Leu-OH 18.8 g을 얻었다.

FmocR(Pbff)Q(trt)(1-Nal)LA-OH의 합성

1 L 펩티드 챔버를 HMPB-BHA 수지 (35 g, 30.8 mmol) 및 1-메틸-2-피롤리디논 (NMP) 300 ml로 충전시켰다. 수지를 약 30 분 동안 질소 교반으로 용매 중에 컨디셔닝시켜서 비드를 팽윤시켰다. 동시에 Fmoc-Ala-OH (28.8 g, 3 당량)을 실온에서 NMP 200 ml 중에 용해시켰다. 용액을 메탄올/물/얼음조에서 -5℃ 내지 0℃로 냉각시키고 나서 디메틸아미노피리딘 (DMAP) (750 mg, 0.2 당량)을 가하고 용해시켰다. 디이소프로필카르보디이미드 (DIC) (14.3 ml, 3 당량) 및 디클로로메탄 (DCM) 100 ml를 가하고 용액을 20-30 분 동안 약 0℃에서 교반시켰다. 밝은 황색 용액을 얻었다. 수지를 배수시키고 활성화된 아미노산 용액을 챔버에 충전시켰다. 혼합물을 5 시간 동안 N₂버블링으로 교반시켰다. 수지를 배수하고 3 x 300 ml NMP로 세척하였다. 샘플을 제거하고, NMP 및 DCM으로 잘 세척하고 밤새 건조시켰다. 수지를 NMP 250 ml 중의 벤조산 무수물 (20.9 g, 3 당량) 및 피리딘 7.5 ml (3 당량)의 용액으로 말단 캡핑시켰다. 슬러리를 배수시키고 3 x 300 ml NMP로 세척하였다. 말단 아민에서 Fmoc(9-플루오레닐-메틸옥시카르보닐)을 제거하는 것은 NMP 중의 30 % 피페리딘 용액 2 x 250 ml를 사용하여 달성하였다. 이어서 수지를 부의 클로라닐 시험에 의하여 측정된 바와 같이, NMP 6 x 300 ml를 사용하여 Fmoc 부산물 (디벤조풀벤 및 이들의 피페리딘 부가물)이 없도록 세척하였다.

Fmoc-Leu-OH (21.8 g, 2 당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBT) (9.4 g, 2 당량)를 실온에서 NMP 225 ml 중에 용해시켰다. 용액을 얼음조에서 0-5℃로 냉각시켰다. 디이소프로필에틸아민 (DIPEA) (13.4 g, 2.5 당량)를 가하고 3-5 분 동안 교반시켰다. O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU) (23.4 g, 2 당량) 및 DCM 75 ml를 가하고 약 5 분에 걸쳐 교반시켜 용해시켰다. 활성화 산의 용액을 수분이 빠진 수지 상에 충전하고 1 시간 동안 N₂버블링으로 교반시켰다. 커플링 완결은 닌히드린 시험으로 모니터하였다. 수지를 배수시키고 3 x 300 ml NMP로 세척하였다.

이어서 Fmoc-(1-Nal)-OH (27.0 g), Fmoc-Gln(trt)-OH (37.6 g), 및 Fmoc-Arg(Pbf)-OH (40.0 g)을 사용하여 펩티드 단편의 머들에 대하여 순환을 반복하였다.

DCM 중의 1 % 트리플루오로아세트산을 사용하여 수지로부터 펩티드를 절단하였다. 분획물을 수집하고 생성물 함량에 대해 HPLC로 분석하였다. 200 ml 4 분획, 500 ml 3 분획, 그 다음에 250 ml 5 분획을 수집하고 분석하였다. 분획 5-11을 피리딘으로 pH ~3-4로 조절하고 나서, 배합하고 회전 증발기에서 거의 건조될 때까지 농축시켰다. 에탄올 200 ml를 플라스크에 도입하고 농축을 계속하여 잔류 DCM을 제거하였다. 결과의 부분적 용액을 증기조에서 가열하여 완전한 용액을 얻었다. 용액을 얼음조에서 0-5℃로 냉각시키고 0.1 N HCl 200 ml와 이어서 물 200 ml를 가하였다. 진한 생성물 슬러리를 ~1 시간 동안 얼음조에서 교반시키고 여과하고 물 100 ml로 세척하였다. 생성물을 밤새 깔때기를 통해서 공기 스트림으로 깔때기 상에서 공기 건조시켜서 94.8 면적 % HPLC 순도의 수지로부터 74 % 수율인 Fmoc-Arg(Pbf)-Gln(trt)-(1-Nal)-Leu-Ala-OH (31.9 g, 22.8 mmol)를 얻었다.

H-AR(Pbf)(Sar)-OBzl의 합성

FmocArg(Pbf)-OH (3 당량), 디메틸아미노피리딘 (0.3 당량) 및 디이소프로필 카르보디이미드 (3 당량)을 실온에서 교반시켜 1-메틸-2-피롤리디논 (NMP, 10 vol) 중에 용해시켰다. 용액을 펩티드 챔버 중에 [4-(4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시)-부티르산] 수지에 가하고 3-6 시간 동안 N₂버블링으로 교반시켰다. 충전 효율은 절단 샘플의 정량적 HPLC로 측정되었다. 수지 결합된 FmocArg(Pbf)를 10-15 분 동안 30 % 피페리딘/NMP (2 x 10 vol)에 노출시켜 말단 아민을 탈보호시켰다. 피페리딘에 대한 부의 클로라닐 시험 이전에 수지를 NMP (60-80 vol)로 세척하였다. FmocAla-OH (2 당량)을 O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU, 2 당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBT, 2 당량) 및 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 2.1 당량)을 사용하여 0-5℃에서 NMP (5-10 vol) 중에 예비활성화시키고 이어서 수지 혼합물로 옮기고 30-90 분 동안 질소 퍼지로 교반시켰다. 커플링 효율을 닌히드린 시험으로 모니터하였다. 수지를 펩티드의 절단 이전에 메틸렌 클로라이드 (DCM, 40-60 vol)로 NMP이 없도록 세척하였다. 측쇄 보호 단편을 1 % 트리플루오로아세트산/DCM (20 vol)로 몇회 세정하여 수지로부터 제거하였다. 펩티드가 방출될 때 수지는 짙은 보라색으로 변하였다. 절단 단편은 HPLC로 모니터하고 나서, 피리딘으로 중화시키고, 고체 잔류물로 농축시켜서 이를 추가 정제시켰다. 고체에 물 300 ml를 가하였다. 용액의 pH를 0.1 N HCl (100 ml)로 2로 조절하였다. 현탁액을 에틸 아세테이트 (2 x 300 ml)로 세척하였다. 배합된 에틸 아세테이트 추출물을 포화 염화나트륨 수용액 (150 ml)으로 세척하고 MgSO₄상 건조하고 발포체로 농축시켰다. 발포체를 분쇄하고 메틸 t- 부틸 에테르 (MTBE 100 ml)로 미분화하였다. 결과 고체를 수집하고 건조하여 수지로부터 ~100 % 수율로 FmocAR(Pbf)-OH를 얻었다.

DMF (13 vol) 중의 FmocAR(Pbf)-OH (1 당량), SarOBzl, 토실레이트 염 (1 당량), HOAT (1.2 당량) 및 DIPEA (2.5 당량)을 0℃로 냉각시키고 HBTU (1.2 당량)을 가하였다. 용액을 10 분 동안 0℃에서 교반시키고 나서 주변 온도로 가온시키고 40 분 동안 교반시켰다. 펩티드를 침전시키기 위하여, 염수/물 1:1 용액 (40 vol)을 가하였다. 고체를 수집하고, 메탄올 (8 vol) 중에 용해시키고 물 (10 vol)로 침전시켰다. 용매를 점착성 반고체로부터 경사 분리하고 반고체를 진공중에 발포체로 건조시켰다. 발포체를 분쇄하고 MTBE (8 vol)로 미분화하였다. 용매를 경사 분리하고 고체를 건조시켰다. 수율 15.2 g, 수지로부터 92 %, HPLC 면적 %. 생성물을 9:1 THF/피페리딘 (10 vol) 중에 용해시키고 50 분 동안 주변 온도에서 교반시켰다. 침전물에 펩티드 MTBE (26 vol) 및 헥산 (33 vol)을 가하였다. 용매를 반고체로부터 경사 분리하고 반고체 (공기에 노출될 때 검화됨)를 진공 중에 건조하여 발포체로 건조시킨다. 발포체를 분쇄하고 MTBE (10 vol)로 미분화하고 용매를 경사분리하였다. 미분화를 2회 반복하고 생성물을 건조시켰다. 수율 93 %, HPLC 순도 95면적 %.

별법의 t-Boc 보호를 사용하는 H-AR(Pbf)(Sar)-OBz의 용액 합성

Boc-Arg(Pbf)-OHDCHA (4.96 g)을 에틸 아세테이트 50 ml와 0.25 M 시트르산 의 2개의 40 ml 부 사이에 분배하였다. 유기상을 물 30 ml 부피 둘, 염수 30 ml로 세척하고 황산마그네슘 상에 건조시키고 발포체로 증발시켰다. 발포체, Sar-OBzl 토실레이트 염 (2.71 g) 및 HOAT (0.98 g)을 50 ml 메틸렌 클로라이드 중에 용해시켰다. 용액을 얼음조에서 냉각시키고 DCC (1.50 g) 및 DIPEA (1.8 ml)를 가하였다. 반응 혼합물을 1/2 시간 동안 차게 이어서 18 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 혼합물을 여과시켜서 침전되 DCU를 제거하고 메틸렌 클로라이드를 진공 하에서 증발에 의하여 제거하였다. 잔류 오일을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고 0.1 M 시트르산, 물, 중탄산나트륨 용액, 물과 염수의 풍부한 양으로 세척하였다. 세척된 용액을 황산마그네슘 상 건조하고, 여과하고 유리같은 발포체 (4.15 g)으로 증발시켰다. Boc-Arg(Pbf)-Sar-OBzl (3.80 g)을 메틸렌 클로라이드 20 ml 중에 용해시키고 이 용액에 MTBE (10 ml) 중의 HCl 용액을 가하였다. 혼합물을 출발물질이 TLC 분석으로 검출될지 않을 때까지 적어도 1 시간 이상 교반시켰다. 용액을 건조할 때까지 증바릿키고 고도의 진공 하에서 밤새 유지하였다. 발포체, Boc-Ala-OH (1.14 g) 및 HOAt (0.81 g)을 20 ml 메틸렌 클로라이드 중에 용해시켰다. 용액을 얼음조에서 냉각시키고 DCC (1.24 g) 및 DIPEA (1.5 ml)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 차게, 이어서 1.5 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 침전된 DCU를 여과에 의하여 제거하고 메틸렌 클로라이드를 50 ml 에틸 아세테이트로 대체하고 용액을 시트르산, 물 중탄산 용액, 물 과 염수로 세척하였다. 세척된 유기 용액을 황산마그네슘상 건조시키고 발포체 (3.66 g)으로 증발시켰다. 상기에 디펩티드에 대하여 설명된 바와 같이 발포체를 HCl로 처리하여 염산염으로 H-Ala-Arg(Pbf)-Sar-OBzl을 얻었다.

H-R(Pbf)Q(trt)(1-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)-OBzl의 합성

DMF (12 부피) 중의 FmocR(Pbf)Q(trt)(1-Nal)LA-OH (1 당량), H-Ala-Arg(Pbf)-Sar-OBzl (1 당량), HOAT (1.2 당량) 및 DIPEA (2.2 당량)으로 된 용액을 0℃로 냉각시키고 HBTU (1.2 당량)을 가하였다. 이 용액을 실온으로 승온시키고 50분간 교반하였다. 이 용액에 물 25 부피를 가하여 펩티드를 침전시켰다. 고체를 여과하여 수집하였다. 여전히 눅눅한 고체를 고온 에탄올 15 부피에 용해시키고, 30℃로 냉각시키면서 교반하였다. 생성 고체를 여과하여 수집하고 건조시켜 75% 수율로 생성물을 수득하였다. 고체를 9:1 THF/피페리딘 15 부피에 용해시키고 50분간 실온에서 교반하였다. MTBE 15 부피를 가하여 펩티드를 침전시켰다. 고체를 여과하여 수집하고, 따뜻한 에탄올 8 부피로 분쇄하였다. 교반하면서 실온으로 냉각시킨 후, 고체를 수집하고 건조시켰다. 수율 92%. HPLC 순도 93 면적%.

FmoclE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)-OBzl의 합성

DMF (13.5 부피) 중의 FmoclE(tBu)GPT(tBu)L-OH 1 당량, H-R(Pbf)Q(trt)(1-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)-OBzl 1 당량, HOAT 1.2 당량 및 DIPEA 2.2 당량으로 된 용액을 0℃로 냉각시키고 HBTU를 가하였다. 이 용액을 실온으로 승온시키고 1시간 동안 교반하였다. 물 20 부피를 가하여 펩티드를 침전시켰다. 고체를 수집하고 메탄올 8 부피로 분쇄하였다. 고체를 수집하고, 건조시키고 98/2 DCM/메탄올 5 부피에 용해시켰다. 이 용액을 98/2 DCM/메탄올 중에 실리카 겔 700 g을 함유하는 칼럼상에 로딩하였다. 칼럼을 98/2 DCM/메탄올 1.6 리터, 이어서 97/3 DCM/메탄올피페리딘 1 리터 및 95/5 DCM/메탄올 8 리터를 사용하여 용리하였다. 생성물을 함유하는 분획물을 합하고 농축시켜 발포체를 생성하였다. 수율 80.7%. HPLC 순도 85 면적%.

FmoclE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)-OH의 합성

8:1 DCM/메탄올 15 부피 중의 FmoclE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)-OBzl로 된 용액에 Pd/C (0.4 중량%, 데구사형 E101, 10 건조중량%, 물 50%)를 채웠다. 반응 용기를 질소로 채우고 3회 증발시키고, 수소 대기 (풍선)하에 두고 20시간 동안 실온에서 교반하였다. 슬러리를 조밀하게 채워진 셀라이트 베드를 통해 여과하였다. 여액을 약 2 부피로 농축시키고, MTBE 10 부피를 가하여 펩티드를 침전시켰다. 고체를 수집하고 회색 고체로 건조시켰다. 수율 96%. HPLC 순도 85.5 면적%.

[FmoclE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)]₂LysNH₂의 합성

DMF 15 부피 중에 FmoclE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)-OH 2.4 당량, (HCl)₂LysNH₂1 당량, HOBT 2.5 당량 및 EtPr₂N 4.8 당량으로 된 슬러리를 모든 고체가 용해될 때까지 (5 분) 실온에서 교반하였다. 이 용액에 HBTU 2.5 당량을 가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 물 30 부피을 가하여 펩티드를 침전시켰다. 조생성 펩티드를 여과 수집하였다. 여전히 축축한 고체를 고온 에탄올 12.5 부피에 용해시키고, 실온으로 냉각시키면서 밤새 교반하였다. 고체를 수집하고 건조시켜, HPLC 순도 80 면적%의 정량 수율로 고체 생성물을 얻었다.

AF15705의 합성

9:1 NMP/피페리딘 10 부피 중의 [FmoclE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)]₂LysNH₂로 된 용액을 실온에서 1 - 2 시간 동안 교반하였다. 물 12 부피를 가하여 펩티드를 침전시켰다. 고체를 수집하고, 물 5 부피로 세척하고 건조시켰다. 건조 고체를 MTBE 12 부피에 이어 AcCN 8 부피로 분쇄하여 잔류 피페리딘, 풀벤 및 피페리딘 풀벤 부가물을 제거하였다. 고체를 진공 여과하여 수집하고 전조시켰다. 수율 97%. 95/5 TFA/물 용액 13 부피를 질소로 채우고 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에 앞서 생성된 [FmoclE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)]₂LysNH₂1 중량을 가하였다. 현탁액을 고체 전부가 용해될 때까지 (30분) 0℃에서 교반하고, 실온으로 승온시키고 100분간 교반하였다. 회전식 증발기를 사용하여 용매 부피를 50%로 감소시키고 얼음/물 150 부피를 가하였다. 현탁액을 0℃에서 1.5시간 동안 교반하고, 펩티드가 용해되게 두고, 소결 유리를 통해 여과시켰다. 글라스웨어를 물 50 ㎖로 세척하고, 이를 여과하고 생성물 용액에 가하였다. 수용액을 동결시키고 고체로 냉동건조시키고, 이를 0℃에서 저장한 다음 정제하였다. 생성물을 C18 개질된 실리카 겔 (100A°기공 크기, 10 μ 구형 입자) 칼럼 상에 로딩하고 각각 0.1% TFA를 함유하는 수중의 약 30% 내지 약 35% 아세토니트릴 구배를 이용하여 용리하였다. AUC가 90% 이상인 원하는 펩티드를 함유하는 분획물을 합하고, 농축시키고 냉동건조시켰다. 완전히 보호된 전구체로부터 정제된 펩티드의 수율은 거의 10% 내지 25%였다.

조립된 펩티드 AF 15705로 유도하는 실시예 1A에서의 펩티드 절편의 구조 확인. 질량 분광계 (MS)에 의한 분자량 확인, 아미노산 분석 (AAA)에 의한 조성 및 에드만 분해법에 의한 펩티드 서열 정보

1 결과는 예상된 AA 조성물과 일치함.

2 결과는 예상된 AA 서열과 일치함.

3 작동하지 않음 - 모이온 질량은 질량 분광계의 범위를 초과하고 보호기는 분자에서 2배의 전하를 보호하므로, 관련된 이온이 검출되지 않음.

펩티드의 PEG화

B. 분자량이 20,000인 PEG2 분지 PEG를 사용한 이-PEG화 AF13948의 제법 (반응식 1 참조)

AF13948을 pH가 8.0인 100 mM 비신 중에 10 mg/ml의 농도로 용해시켰고 1.25배 몰 과량의 분말화 PEG2 (미국 알라바마주 헌츠빌 소재의 Shearwater Polymers, Inc.사로부터 구매 가능함)에 첨가하였고 실온에서 반응이 완료될 때까지 전형적으로 1 내지 2시간 동안 교반하였다. 반응은 YMC ODS AQ 칼럼을 사용하여 40 내지 65%의 아세토니트릴 구배로 역상 HPLC함으로써 모니터링하였다. 반응이 완료되면 이 용액을 두 번째의 1.25 몰 과량의 분말화 PEG 2에 첨가하였고 이 공정을 AF13948 각 몰 당 전체 5몰의 PEG2를 사용하여 4회 반복하였다. 이 용액을 PBS로 2배로 희석시켜 점도를 감소시켰고 이전에 평형화한 수퍼덱스 (superdex) 200 칼럼 (파마시아사 제품) 상에 로딩하여 PBS로 용출시켰다. 크기 배제 칼럼으로부터의 분획을 역상 HPLC로 분석하였다. 임의의 일-PEG-AF13948 이전에 용출되는 디-PEG-AF13948을 포함하는 분획을 모아 5℃에 보관하거나 동결건조시켰다.

C. 분자량이 20,000인 SPA-mPEG를 사용한 디-PEG화 AF13948의 제법

AF13948을 pH가 8.0인 100 mM 비신 중에 10 mg/ml의 농도로 용해시켰고 5배 몰 과량의 분말화 SPA-mPEG (미국 알라바마주 헌츠빌 소재의 Shearwater Polymers, Inc.사로부터 구매 가능함)에 첨가하였고 실온에서 반응이 완료될 때까지 전형적으로 2시간 동안 교반하였다. 반응은 역상 (YMC ODS AQ) HPLC로 모니터링하였고 반응이 완료되면 이 용액을 10배의 탈이온수로 희석시켰고 pH가 7.0인 2 mM 인산 나트륨 완충제로 평형시킨 SP-세파로스 칼럼 상에 로딩하였다. 미반응 PEG 및 NHS는 칼럼을 통과하였다. 이어서 PEG화 AF13948을 0 내지 150 mM NaCl 구배를 사용하여 용출시켰는데, 이-PEG화 형태는 임의의 일-PEG화 물질의 용출 후에 용출되었다. 분획을 역상 HPLC로 분석하였고 적절한 분획을 모았다. 이-PEG-AF13948을 PBS로 완충제 교환하였고 5℃에 보관하거나 동결건조시켰다.

D. 분자량이 20,000인 mPEG 알데히드를 사용한 이-PEG화 AF13848의 제법 (반응식 2 참조)

AF13948을 pH가 7.0인 100 mM 인산 나트륨 중에 10 mg/ml의 농도로 용해시켰고 6배 몰 과량의 분말화 PEG 알데히드 (미국 알라바마주 헌츠빌 소재의 Shearwater Polymers, Inc.사로부터 구매 가능함)에 첨가하였고 1 M 나트륨 시아노보로히드라이드 용액을 첨가하여 최종 나트륨 시아노보로히드라이드의 농도가 100 mM이 되게 하였다. 이 용액을 실온에서 18시간 동안 교반시킨 후 3K (아미콘 YM) 한외여과 막을 사용하여 PBS로 완충제 교환하였다. 이 용액을 PBS로 2배 희석시켜 점도를 감소시켰고 이전에 PBS로 평형 및 용출시킨 수퍼덱스 200 칼럼 (파마시아사) 상에 로딩하였다. 크기 배제 칼럼ㅇ르ㅗ부터의 분획을 역상 HPLC로 분석하였다. 임의의 일-PEG-AF13948 이전에 용출되는 이-PEG-AF13948을 포함하는 분획을 모아 5℃에 보관하거나 동결건조시켰다.

E. 분자량이 20,000인 SPA-mPEG를 사용한 이-PEG화 AF15705의 제법 (이-PEG(20K)AF15705)

AF15705 (2.30 g)을 교반기 및 N₂퍼지가 갖추어진 플라스크에 넣어 실온에 방치하였다. 밀리Q 물 (177 mL)을 첨가하였고 이 물질을 교반시켜 용해시켰다. 20 ㎕ 분획을 제거하였고 물로 1 mL로 희석시켰고 농도를 284 nm에서 UV 판ㄷ고으로 측정하였다 (9.36 mg/ml). 중탄산 나트륨 (0.2921 g)을 첨가하였고 용액을 교반시켜 모든 것이 용해되게 하였다 (측정된 pH는 8임). N₂하의 글러브 백에서 M-SPA-PEG-20k (Shearwater Polymers, Inc.사 제품)의 네 부분을 밀봉 병에 재어 넣었다 (각각의 분획은 8.67 g임). 이것을 밀봉된 플라스틱 백에 넣었고 반응물에 첨가할 때까지 5℃에 보관하였다. 중탄산 나트륨이 용해된 후에 일부를 첨가하였고 두 번째 분획을 0.5시간 후에 첨가하였다. 세번째 분획을 두 번째 첨가 1시간 후에 첨가하였고 네 번째는 세 번째 분획을 첨가한지 1시간 후에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 5% 수성 EtOH를 사용하여 9배 희석시켰고 0.45 마이크론 셀룰로스 니트레이트 필터를 통하여 여과시켰다. 이 물질을 강력 양이온 교환 칼럼 (SP 세파로스 패스트 플로우 10 cm x 53 cm) 상에 20 ml/분으로 펌핑하였다. 이 물질을 pH 6.0의 2 mM 잉ㄴ산 나트륨으로 90분, 이어서 pH 6.0의 2 내지 10 mM 인산 나트륨으로 60분, 최종적으로 10 mM 인산 나트륨 내지 pH 7.0의 100% PBS로 이루어지는 구배를 사용하여 칼럼으로부터 용출시켰다. 상기 크로마토그래피의 유속은 100 ml/분이었고 검출기는 215 nm에 맞추었다. 칼럼 분획은 G3000SWxI 및 G4000SWxI TSK 칼름을 연속으로 사용하여 SEC-HPLC로 분석하였다. 〉95%의 생성물을 포함하는 분획을 모아 A/G Technologuies사 제품인 UFP-30-C-6A 공동 섬유 카트리지를 사용하여 33 mg/ml로 농축시켰다. 보유물을 5℃의 순환 조로 냉각시켰고 N₂로 퍼징하였다. 생성된 용액을 보유물의 6배 부피로 밀리Q 물로 완충제 교환하였고 이어서 66 mg/mL로 더 농축시켰다. 합성, 정제 및 한외여과 후에 생성물 21 그램이 회수되었다. MALDI-TOF 질량 분광계로 분석한 결과 생성물은 46000 달톤이 그 중심인 넓은 분자량 분포를 가짐이 나타났다. 생성물을 트립신으로 분해한 후 역상 또는 혼합 양상의 HPLC로 분석한 결과 PEG의 부착 위치 (N-말단 모두) 및 기재 펩티드가 분해되지 않았음이 확인되었다.

(주: MALDI-TOF-MS 결과 출발 PEG가 광고된 20 kd이 아니라 21.5 kd임이 나타났고 따라서 분자량=21500(PEG)x2 + 3295(AF15705)=46000임).

실시예 2

생물학적 검정

펩티드의 생활성은 트롬보포이에틴 의존성 세포 증식 분석법을 이용하여 측정할 수 있다. 쥐의 IL-3 의존성 Ba/F3 세포를 전장 인간 TPO-R로 트랜스펙션시켰다. IL-3 부재시 (WEHI-3 조정 배지), 이들 세포의 증식은 TPO 의존적이다. 트랜스펙션되지 않은 모세포주는 인간 TPO에 반응하지 않지만 여전히 IL-3 의존적이다.

생물학적 검정은 본 발명에 따른 화합물을 사용하여 상기 두 가지 세포주 모두에 대해 실행하였다. 세포를 10% WEHI-3 조정 배지를 함유한 완전 RPMI-10 배지에서 배양한 후 PBS로 2회 세척하고, WEHI-3 조정 배지가 결여된 배지에 재현탁시킨 후 펩티드 희석물 또는 TPO를 담은 웰에 2 x 10⁴세포/웰로 가하였다. 세포를 가습 5% CO₂분위기, 37℃에서 48 시간 동안 인큐베이션하고 570 nm에서의 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기에서 측정하면서 MTT에서 포르마잔으로의 환원을 통해 대사 활성을 검정하였다. 시험된 펩티드는 표 1에 나타낸 것과 같이 투여량 의존적 방식으로 TPO-R 트랜스펙션된 Ba/F3 세포의 증식을 자극하였다. 이들 펩티드는 모세포주에는 전혀 영향을 미치지 않았다.

실시예 3

결합 친화도

본 발명에 따른 화합물의 TPO-R에 대한 결합 친화도를 경쟁적 결합 분석법으로 측정하였다. 마이크로타이터 플레이트의 웰을 1 mg의 스트렙타비딘으로 코팅하고, PBS/1% BSA로 블로킹한 다음 50 ng의 비오티닐화 항-수용체 고정화 항체 (Ab179)를 가하였다. 그 다음 웰을 가용성 TPO-R 수득물의 1:10 희석물로 처리하였다. 여러 가지 농도의 시험 화합물을 말토스 결합 단백질의 C-말단에 융합시킨 잔기 1-156으로 이루어진 트렁케이티드형 TPO (MBP-TPO₁₅₆) 일정량과 혼합하였다. 펩티드 MBP-TPO₁₅₆혼합물을 TPO-R 코팅된 웰에 가하고, 4℃에서 2 시간 동안 인큐베이션한 다음 PBS로 세척하였다. 평형이 이루어졌을 때 결합되어 있는 MBP-TPO₁₅₆의 양은, MBP에 대항하는 토끼 항혈청을 가하고 뒤이어 알칼린 포스파타제와 결합된 염소 항토끼 IgG를 가하여 측정하였다. 이어서 각 웰의 알칼린 포스파타제 양을 표준 방법으로 측정하였다.

이 분석을 일정 범위의 시험 화합물 농도에 대해 실행하고, 결과를 y축이 결합된 MBP-TPO₁₅₆의 양을 나타내고 x축이 시험 화합물의 농도를 나타내는 그래프로 표시하였다. 그러면 시험 화합물이 고정화된 TPO-R에 결합한 MBP-TPO₁₅₆의 양을 50% 감소시키는 농도 (IC₅₀)를 산출할 수 있다.

실시예 4

이 실시예에서는, 하기 기준 화합물 AF13948

에 각종 치환, 결실 및 부가가 행해진 경우를 세 가지 분석법으로 분석하였다. 먼저 MTT 세포 증식 분석을 상기한 바와 같이 행하였다. 다음으로, 마이크로피지오미터 분석법을 행하였다 (Molecular Devices Corp.). 기본적으로, 이 분석법에서는 본 발명의 화합물에 의한 TPO 수용체 자극에 응하여 일어나는 세포외 매질의 산성화 속도를 측정하였다. EC₅₀의 범위는 상기한 IC₅₀의 경우와 마찬가지로 기호로 나타내었다. 마지막으로, 리포터 분석법을 행하였다. c-fos/루시퍼라제 리포터 플라스미드로 트랜스펙션된 BaF3/TPO4 세포를 0.1% WEHI-3 조정 배지를 함유한 완전 RPMI-10 배지 중에서 하룻밤 동안 영양결핍 상태로 둔 다음 PBS로 2 회 세척하였다. 세포를 WEHI-3 조정 배지가 결여된 배지에 재현탁시킨 다음 펩티드의 순차적 희석물을 담은 웰에 5 x 10⁵세포/웰로 가하였다. 세포를 가습 5% CO₂분위기, 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 루시페린 기질을 가한 후 광도계로 루시퍼라제 발현을 측정하였다.

실시예 5

이 실시예에서는 여러 가지 PEG화 펩티드의 약물동력학적 성질을 결정하였다. 화합물의 약물동력학적 성질은 그들의 약물학적 활성을 결정하는데 중요하다. 약물동력학적 분포의 주요 요소는 실습용 동물의 혈장 중에서 화합물의 지속성이다. 이러한 지속성은 통상적으로 투여 후 시간의 함수로서 혈장 내 화합물의 농도로 표시한다.

실험 전체에 걸쳐, 20-25 g의 숫컷 Balb/c 쥐를 사용하였다. 200 ㎖ 부피로 IV 또는 SC를 주입하였다. 비히클은 둘베코의 PBS; 5% DMSO; 0.1% w/v BSA였다. 항응집제로서 헤파린을 사용하여 치사 시 혈장을 수거하였다.

화합물 농도는 리포터 세포 분석을 사용하여 측정하였다. 혈장 희석물을 Baf/3 TPOr/fos/lux 구성물 3에 첨가하였다. 루시페린 기질을 첨가한 후 광도계로 루시퍼라제 발현을 측정하였다. 각 혈장 샘플의 자극 활성을 혈장 부피 당 화합물의 펩티드 당량으로 표현되는 농도로 전환시켰다 (nM 또는 ng/㎖). 이 농도를 모 화합물을 사용한 리포터 분석에서 제작한 표준 곡선과 비교하여 확정하였다.

표 3은 700 ㎍ 펩티드 당량/㎏의 주입 후 시간의 함수로서 화합물 AF13948과 di-PEG화 AF13948 (폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 평균 MW = 5000D)의 혈장 중의 농도를 나타낸다. AF13948을 투여하면 60 분 PI 까지 비히클 주입한 쥐에 존재하는 수준 이상으로 검출가능한 플라스마 내 활성이 얻어진다. 5K PEG를 첨가하면 100 배 이상으로 혈장 내 농도가 증가하고, 240 분 PI 이상 까지 혈장 중에서 검출될 수 있는 시간이 연장된다.

700 ㎍ 펩티드 당량/㎏을 IV 주입한 후 AF 13948, Di-PEG (5K)-AF13948의 혈장 농도, 펩티드 당량 (ng/㎖)으로 표현
시간 (분)	Di-PEG (5K)-AF 13948	AF 13948	비히클
10	361.36	0.80	0.02
30	91.49	0.26	0.02
60	54.59	0.11	0.02
120	16.54	0.04	0.03
240	11.20	0.02	0.01

표 4는 500 ㎍ 펩티드 당량/㎏의 주입 후 시간의 함수로서 화합물 di-PEG(5K)-AF13948 및 di-PEG(20K)-AF13948의 혈장 내 농도를 나타낸다. 20K PEG-변성 화합물의 혈장 내 농도 및 지속성이 di-PEG(5K)-AF13948 보다 크게 증가한다.

500 ㎍ 펩티드 당량/㎏을 IV 주입한 후의 AF 13948, Di-PEG (5K)-AF13948의 혈장 농도, 펩티드 당량 (ng/㎖)으로 표현
시간 (시)	5K	20K	비히클
0.5	54.56	1257.50	0.04
1.5	16.89	3481.31	0.03
4	2.76	1970.46	0.02
8	1.02	1158.59	0.02
16	0.17	259.41	0.03
24	0.13	710.75	0.04

표 5는 100, 10 및 1 ㎍ 펩티드 당량/㎏을 주입한 후, 화합물 di-PEG(20K)-AF13938의 혈장 농도를 나타내며, 관찰 시간을 120 시간 PI로 연장하였다. 혈장에서 관찰된 농도는 투여된 양에 비래하는 것으로 밝혀졌다. 화합물 100 ㎍/㎏의 단일 IV 투여로 96 시간 IP 이상 동안 증가된 혈장 농도를 얻었다.

1, 10 또는 100 ㎍ 펩티드 당량/㎏의 IV 주입 후 di-PEG(20K)-AF13948 (nM)의 혈장 농도
시간 (시)	투여량 (㎎/㎏)
	100	10	1
0.08	291.66	32.89	2.93
0.25	550.82	45.48	2.63
0.5	1318.53	29.16	2.33
1.5	328.30	39.12	0.98
3	285.43	25.77	1.39
8	134.60	8.33	0.90
24	106.36	11.79	0.20
48	56.64	0.70	0.06
72	15.19	0.57	0.01
96	0.42	0.01	0.00
120	0.02	0.01	0.00

표 6은 di-PEG(20K)-AF13948을 10 ㎍ 펩티드 당량/㎏으로 SC 및 IV 주입한 후의 혈장 농도를 나타낸다. 10 ㎍ 펩티드 당량/㎏ 단일 투여량을 SC 주입하면 96 시간 PI 동안 증가된 혈장 활성이 얻어졌다. 이러한 2 경로 투여로 얻어진 혈장 농도의 분포는 SC 투여한 di-PEG(20K)-AF13948의 우수한 생효용성을 나타낸다.

10 ㎍ 펩티드 당량/㎏을 IV 및 SC 주입한 후의 Di-PEG (20K)-AF13948의 혈장 농도
시간 (시)	SC	IV
0.08	0.02	32.89
0.25	0.06	45.48
0.5	0.09	29.16
1.5	0.36	39.12
3	0.82	25.77
8	1.48	8.33
24	7.27	11.79
48	1.09	0.70
72	0.03	0.57
96	0.01	0.01
120	0.01	0.01

그 밖에, 도 1은 GW350781 또는 di-PEG(5K)-AF13948이 펩티드의 비-PEG화 형태에 대해 증가된 안정도, 즉, 증가된 반감기를 가짐을 나타낸다. 따라서, 도 1은 PEG화 펩티드가 인간 혈청 내에서 우수한 생효용성 및 증가된 안정도를 가짐을 나타낸다.

실시예 6

상기 기재한 분석을 사용하여, PEG로 다양하게 유도된 펩티드의 약물동력학적 분포를 결정하였다. 이 실험에서는, 반응식 1-3에 예시된 바와 같이, 펩티드를 분지된 PEG2(20K), 에스테르 결합된 PEG (SPA) 및 알데히드 결합된 PEG (ALDH)로 유도하였다. 도 2는 10 ㎍ 펩티드 당량/㎏의 SC 주입 후 혈장 농도를 나타낸다. 도 2로부터, 3가지의 PEG로 다양하게 유도된 펩티드 화합물 모두가 바람직한 약물동력학적 분포를 가짐이 명백하다.

실시예 7

이 실험에서는, 쥐 모델에서 PEG화 펩티드의 혈소판 감소증에 대한 효과에 대해 평가하였다. 이 분석에서, 쥐는 Balb/C 종을 0 일에 카르보플라틴 (90 ㎎/㎏ 복막내 주입)로 처리하여 혈소판 감소증에 걸리게 하였다. GW350781 (1 ㎎/㎏/일) 또는 di-PEG(5K)-AF13948 및 GW350805 (32.5 ㎍/㎏/일) 또는 di-PEG(20K)-AF13948을 1일 내지 9일에 투여하였다 (피하 주입, qd). 도 3 및 4로부터, PEG화 펩티드가 약 10일에 카르보플라틴-유도 혈소판 감소증을 개선시킴이 명백하다. 이 결과는 본 발명의 PEG화 펩티드가 쥐 모델에서 혈소판 감소증을 개선시킬 수 있음을 분명히 나타낸다.

실시예 8

이 실험에서는, 정상 쥐의 혈소판 수준에 대한 PEG화 펩티드의 효과를 평가하였다. 한 실험에서, GW350781 (1 ㎎/㎏/일)과 GW350805 (32.5 ㎍/㎏/일)을 1일 내지 9일에 투여하였다 (피하 주입, qd). 1 내지 15 일에 꼬리 정맥 채혈로 간격을 두고 샘플을 채취하였다. 도 5 및 6으로부터, PEG화 펩티드가 혈소판증가증에 대해 효과를 가짐이 명백하며, 20K-diPEG화 펩티드 GW50805가 5K-PEG화 펩티드 GW350781 보다 약 100 배 더 강력한 것으로 나타났다.

다른 실험에서는 GW350781 및 GW305805를 1일 내지 5일에 투여하였다 (피하 주입, qd). 6일에, 동물을 치사시키고, 주변 혈의 혈소판 수를 측정하였다. 도 7-9에 다중 투여에 대한 단일 투여의 효과 뿐만 아니라 여러가지 PEG화 펩티드 투여량의 효과를 제시하였다. 이 결과는 본 발명의 PEG화 펩티드가 쥐 모델에서 혈소판을 증가시키는데 사용될 수 있음을 분명히 나타낸다.

본 출원서에 개시된 특허 문헌을 비롯한 모든 논문 및 참고 문헌은 그 전문을 본원에서 참고 문헌으로 인용하였다.

Claims

화학식 1의 화합물 및 이들의 제약상 허용되는 유도체.

〈화학식 1〉

상기 식에서,

X₁은 수소 또는 아실이고,

X₂는 G 또는 사르코신 (Sar)이고,

X₃은 R, A, 노르류신 (Nle) 또는 N-아세틸리신 (Ac-Lys)이고,

X₄는 Q 또는 E이고,

X₅는 W, L-1-나프틸알라닌 (1-Nal) 또는 F이고,

X₆은 A, 5-아미노펜탄산 (Ava) 또는 2-아미노부티르산 (Abu)이고,

X₇은 A, 디페닐알라닌 (Diphe)이거나 또는 존재하지 않고,

X₈은 R, p-아미노페닐알라닌 (p-아미노-Phe), N-아세틸리신 (Ac-Lys)이거나 또는 존재하지 않고,

X₉및 X_9'는 같거나 다르고, A, βA, n-메틸알라닌 (n-Me-Ala), 사르코신 (Sar)이거나, 또는 X₉또는 X_9'는 존재하지 않고,

X₁₀및 X_10'는 같거나 다르고, βA이거나, 또는 X₁₀또는 X_10'는 존재하지 않되,

다음 화학식의 화합물을 제외한다.
제1항에 있어서,

로부터 선택된 화합물 및 그의 제약상 허용되는 유도체.
제1 또는 2항에 있어서, 상기 화합물이 친수성 중합체에 공유결합으로 부착된 화합물.
제3항에 있어서, 상기 친수성 중합체의 평균 분자량이 약 500 내지 약 40,000 달톤인 화합물.
제4항에 있어서, 상기 친수성 중합체의 평균 분자량이 약 5,000 내지 약 20,000 달톤인 화합물.
제3 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
제6항에 있어서, 상기 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 화합물.
제3 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물의 2량체 서브유니트의 각각이 친수성 중합체에 공유결합으로 부착된 화합물.
제1항에 있어서,

로부터 선택된 화합물 및 그의 제약상 허용되는 유도체.
친수성 중합체에 공유결합으로 부착된 하기 화학식의 화합물.
하기 화학식의 화합물.

상기 식에서 n은 약 450이다.
(H)-ADGPTLREWISF(Ava)ADGPTLREWISF(NH₂) 및

로부터 선택된 화합물 및 그의 제약상 허용되는 유도체.
제약상 허용되는 담체와 함께 제1 내지 12항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 제약 조성물.
제1 내지 12항 중 어느 한 항에 따른 치료용 화합물.
환자에게 제1 내지 12항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 치료상 유효한 투여량 또는 양을 투여하는 것을 포함하는, 트롬보포이에틴 작용제 치료에 반응하는 질환에 걸린 환자의 치료 방법.
트롬보포이에틴 작용제에 의하여 매개되는 질병의 치료용 의약의 제조에서 제1 내지 12항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.