TW515804B - Peptides binding and activating thrombopoietin receptor and pharmaceutical composition thereof - Google Patents
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Description
515804 A7 --—-—___ B7 五、發明説明 t明背景-, ·、 本發明提供與血小板生成素受體(c-mpl或TPO-R)結合之’ 肽及化合物,以及活化血小板生成素受體(c-mpl或TP〇-R) 之肽及化合物’或是提供作爲T p 〇促進劑之肤及化合物。 本發明應用於生化及醫藥、化學領域中,特別是提供作爲治 療人類疾病之T P 〇促進劑。 與血小板生成素受體鍵結並活化血小板生成素受體之肽 及化合物已揭,示於W096/40750。 身受血小板減少症之苦的病患恢複血小板數量緩慢,此 是個嚴重的問題,因而急迫要找出血液生長因子促進劑, 以便能加速血小板的增生,本發明即是提供此種的促進 劑。 ' ’ 發明 本發明提供式(I)化合物: 10 (I) K_2) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 X] ex2ptlx3x4x5lx6x7x8x9.x10. 其中: X l是氫或酸基; X2是G或肌胺酸(Sar); X3是R,A,正白胺酸(Nle)或N,乙醯基離胺酸(Ac Lys): -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(2丨〇X 297公釐) 515804 λΊ B7 五、發明説明(: x4是 Q 或 E ; , 、 X 5是W,L - 1-践基丙胺酸(1 - N a 1)或F ;, X6是A,5-胺基戊酸(Ava)或2-胺基丁酸(Abu)_ ; X7是A,.二苯丙胺酸(Diphe)或X7是不存在的; 是R,對-胺基苯丙胺酸(P-amino_Phe),N_乙醯基離胺 酸(A c - Ly s)或X 8不存在: X9及X9,相同或不相同,爲A,y5A,η -甲基.丙胺酸^·!^。-Α 1 a),肌胺§’《(Sar) ’或Χ9及Χ9’不存在; X i 〇及X ! 〇,相同或不相同,爲A,咸X i〇及X 1 〇,不存在的; 及其醫藥學上可接受的衍生物; 但是下列化合物除外。
(H)-IEGPTLRQWLAARA K(NH2) (請先閱讀背面之注意事項再頁 —裝 β 、=口
(H)-IEGPTLRQWLAARA^A 本發明亦提供化合物 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (H)-ADGPTLREWISF(Ava)ADGPTLREWISF(NH2);及 (H)- CIEGPTLRQWLAARA、 Is Is (^-CIEGPTLRQWLAARA7 5- Κ(ΝΗ2) 本紙悵尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 515804 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明(3 ) 及其醫藥學上可接受之衍生物。 在前述的定義中,以及後文中所用A,pA,C,D,E, F,G.,I,K,L,P,Q,R,S,W,T等符號爲一般胺 基酸之標準單字母縮寫,換言之 A 丙胺酸 C 半光胺酸 D 天冬胺酸 E 麩胺酸 F 苯丙胺酸 G 甘胺酸 I 異白胺酸 K 離胺酸 L 白胺酸 P 脯胺酸 Q 麩胺醯胺 R 精胺酸 S 絲胺酸 W 色胺酸 T 蘇胺酸 未免懷疑,下列縮寫 (請先閱讀背面之注意事項再 -裝- 頁) 訂 線 K(NH2) -6- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公釐) 804
太紙張尺度適用中國國家標準(CNS -8- )Λ4規格(210X 297公釐) 5804 A7 B7 五、發明説明 /6 (H)-!EGPTLRQ(1-Nal)LAAR-(Sar) 。 K(NH2); /、 (HHEGPTLRQ(l-Nal)LAAR-(Sar) 1 (H)-IEGPTLCRQFLAAR-M^ / (H)-IEGPTLRQFLAAR-^A (H)-IEGPTLRQ(1-Nal)LAA(Ac-Lys)-(Sar)^ / (H)-IEGPTLRQ(1-Nal)LAA(Ac-Lys)-(Sar) (H)-IEGPTLRE(1-Nal)LAA(Ac-Lys)-(Sar) ^ (H)-IEGPTLRE(1-Nal)LAA(Ac-Lys)-(Sar) (H)-iEGPTLAQ(1-Nai)LAA(Ac-LysHSar) K(NH2); K(NH2); K(NH2); K(NH2); (H)-IEGPTLAQ(1-Nai)U\A(Ac-Lys)-(Sar) (H)-IEGPTU\E(1-Nal)LAA(Ac-Lys)-(Sar). K(NH2);/ 經 部 中 央 標 準 Μ 員 工 消 合 作丨 社 印 製
(H)-lEGPTLAE(1-Na!)LAA(Ac-Lys)-(Sar) r. (H)-IEGPTLRQ(1-Nal)LAA(Nle)-(Sar^ (H)-!EGPTLRQ(1-Nal)LAA(NleHSar/ (H)-IEGPTL(Nle)Q(1-NaI)LAA(Nle)-(Sar)- - 、 (H)-lEGPTL(Nle)Q(1-Na!)LAA(Nle)-(Sar) (H)-IEGPTLRQWL(Abu)(Diphe)、 (H)-IEGPTLRQWL(Abu)(Diphe)-/3A ^ (H)-IEGPTLRQWL(Abu)(Diphe)-R \ / (H)-IEGPTLRQWL(Abu)(Diphe)-R-/3A (H)-ADGPTLREWI(Abu)(Diphe)、 I (H)-ADGPTLREWI(Abu)(Diphe)-iQA K(NH2); K(NH2); •k(nh2); K(NH2); K(NH2);
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS )
515804 A7 B7 五、發明説明(8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 例如,’化療(包括誘發、強化或維持性化療),放射性洋 7目、同種異基因及同基因骨隨移植,周圍血液母知 :及脊髓血液母細胞移植,治療惡性及非惡性疾病(如干損 素與其他的細胞素)之生物或其他治療方法,轉移腫瘤及白 血病的骨隨浸潤,非惡性疾病(如骨質石化症,高歇氏病 (Gaugher"s disease)之骨隨浸潤或侵害,成形不全性首 =,骨隨發育不良症狀,骨隨纖維變性,及相關的症狀(原 1或再發性兩者),免疫及自發性疾病,包括自體免疫性及 同種異體免疫血小板減少症’及藥物誘發之免疫性血小板 減少症,藥物誘發性血小板減少症(如治療则_陽性病患 反ττ綠病母所引起),十交性肝疾病(如、酒精性及其他形式 的肝硬化)及性腎衰竭,過度血小板破壞,包括血检性血 小板減少紫斑病,溶血性尿毒症及其他小血管疾病,與脾 腫大’由於血小板不足或不正常(如格蘭茲曼氏血小板官能 不足,缺少丰徑距離之血小板不足(TAR)症候群,灰血小 板症狀,肝臟移植,主動脈動脈瘤修復,主動脈内小球反 搏動,植狀動脈繞道移植手術及其他需形體外循環及/或 大量輸血之手術方法,或HIV_相關之血小板減少症:又粒 性細胞過少症及貧血症可能是由於,例如,化療、放射性 治療及其他治療惡性及非惡性疾病的方法(如前所述),惡 性、則惡性及非惡性疾病(如前所述)之骨隨浸潤,免疫及 非免疫,自發性及藥物相關性的貧血症與粒性細胞^症 等治療方法所造成的:或是治療血液惡性疾病方法的本身 所造成的。根據本發明的化合物可用以治療、診斷及搜尋 11 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X29*7公釐) 515804 Α7 Β7 五 、發明説明(9 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 因剌激T P 0受體(如位於A ^ ^ u 、血小板,巨核細胞及其他幹細胎 上)’而流通自體、同種显其m /、基因及同基因的移植作用之周圍 血液母細胞,增加得自‘ t P 小板及其他血液捐獻者的產能, I長ex vivo血小板活性陆PEj π ^ ^ / 、 .『時間及品質,增加活體外血小板及 /或母細胞的產量或擴展太 '展本發明化合物可研究造血作用 機制及研究活體外巨核細胎乃夭 、田胞及委任母細胞的擴張作用以i| 診斷目的。 ^ 以範例3中所述之鍵社雜人+、, 、 1〜 親合力分析方法測定本發明化合物 UC50約爲2mM或更低’較低的IC5〇表示與Tp〇_R有較強 《鍵結親合力。以診斷爲目的時,根據本發明化合物較佳 的IC5。約爲2mM或更低,而以醫藥爲目的時,根據本發明 化合物的IC5〇則約爲100/,M或更低。 當作爲診斷目的時,較佳的9 铋佳的疋以可偵測之標記物標記根 據本發明之化合物,因此, 力 』$用/又有“記物的根據本發 明化合物作爲製備標記化合物的中間物質。 假若以本發明説明書中所述之親水性聚合物將根據本發 明化合物衍生化後,此種化合物分子量的範圍自約5〇〇‘ 約12^_道爾頓,較佳的是約8,_至約8〇,_道爾頓。 如W所討論,在另一個較佳的具體實例中,可將一個戋 多個各種不同之親水性聚合物以共價方式聯結至式⑴化: 物上,it t此種親水性聚合物的平肖分子量範圍自約⑽ 至約100,000道耳頓,例如約5〇〇至約4〇 〇〇〇道耳頓,較佳 的是自約2,000至約40,_道耳頓,更佳的是自約5,〇〇〇至 約40’_道耳頓,甚至更佳的是約5,_至約2〇_道; L----- -12- 本纸银尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210Χ 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再 •裝· 、11 -線—— Μ 5158〇4 ^~----- —___ 克、發明説明(1〇 ) 頓,例如約18,800至約22 〇〇〇道 , , 、今頌 在較佳的具體實例 中,此種親水性聚合物之平均分子 、、 10,〇〇〇道耳頓及20,000道耳锜,,、耳也、 或不具支鏈的。 爾聚合物可具有支键 合適的親水性聚合物包括(但不局限於)聚境基酸,範例 如聚乙二醇.及聚丙二醇,聚乙酸,聚幾基乙酸,聚氧綠, 心乙#醇’聚乙稀,纖維素及纖維素衍生物,葡 聚糖及葡聚糖衍生物,及其共聚物等。較佳的聚合物包栝 聚烷基醚,範例如聚乙二醇及聚丙二醇,聚乙酸,聚羧基 乙酸’及其共聚物。令人驚奇的是當肽化合物與此種聚合 物進行衍生化時,其溶解度及循環半衰期會增加但只會減 少些許(若是有的話)的鍵結活性,且其免疫性能力受到隱 蔽。在較佳的具體實例中,式(1)肽化合物上的每個二元單 位(肽鏈)是以共價方式聯結至親水化合物上的,另外較佳 的具體實例中,本發明的化合物是與P E G化合,換言之, 也就是共價方式聯結至聚乙二醇(p E G )上。 PEG是爲直鏈,並含兩個羥基的氧化伸乙基重複單位之 水溶性聚合物’ p E G s的分子量範圍約自5 〇 〇道耳頓至約 40,000道耳頓’可將其分類如5〇〇〇,10,000,2〇,⑻〇, 30,000或40,000 道耳頓(5&,10【,20〖,30〖,或 4 0 K ),在目前較佳的具體實例中,所用的p e g s分子量範 圍爲5,000道耳頓至約2〇,〇〇〇道耳頓。聯結至本發明肽化合 物之PEGs可具支鏈或不具支鏈的(參考,如瑪法迪尼 (Monfardini),C·,等人.,Bioconjugate Chem.,6 : 62- -13 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項存
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 515804 A7 B7 五、發明説明(11 ) 。 (請先閱讀背面之注意事項再頁 69(1 9 95 )),此種的PEGs包括(。但不侷/艮於)單甲氧基聚乙 二醇(MePEG-OH),琥珀酸-單曱氧盖聚乙二醇酯 (MePEG-S),丁二醯亞胺基琥珀酸-單甲氧基聚乙二醇酯 (MePEG-S-NHS),單甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2), 單曱氧基聚乙二醇-tresylate(MePEG-TRES),及單甲氧基 聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。 根據本發明的化合物可爲單_ p E G或二-P E G化的化合 物,例如,單PEG化合作用較佳是選用分子量較高的Peg 進行化合。 可聯結至式(I)化合物之P E G鏈範例包括:
CH3〇-(CH2CH20)n-CH2CH2-CH2-NH-酸-聯結(ALDH)PEG 其中η約爲45 0 CH3〇-(CH2CH20)n-CH2CH2-CH2-NH- g旨-聯結(SPA)PEG 其中 η 約爲 1 12-900 ,例如約.1 12 , 225 , 450(浚口 425_ 500 ),675 或900 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)NH (CH2)4. / CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)-NH-CH-C(0)NH- Branched PEG 其中 n 約爲 1 12-4、5 0,bj6m, 1 12,225,或 45 0 _____ - 14 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X29*7公釐) 5 04 8 5 經濟部中央標準局員工消費合作、社印製 A7 B7 _ 五、發明説明(12 )
CH30-(CH2CH20)n-CH2CHr0C(0)CH2CHrC(0)NH- SS PEG 其中 η 約爲 1 12-450,如 1 12,225,或 45 0 根據本發明化合物與P E G化合較佳的範例包括如下(·但不 侷限於): -
CH3〇-(CH2CH20)n-CH2CH2-CHrNH-!EGPTLRQWLAARA K(NH2)
CH3〇-(CH2CH20)n-CH2CH2-CHrNH-IEGPTLRQWLAARA-pA 醛聯結(ALDH)diPEGV\F13948
CH3〇-(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)-NH-IEGPTLRQWLAARA K(NH2)
v I
CH3〇-(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)-NH-IEGPTLRQWLAARA-pA 酯聯結(SPA) diPEG-Αή3948
CH30-(CH2CH20)n-CH2CHrC(0)NH (CH2)4
CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)-NH-CH-C(0)NH-IEGPTLRQWLAARA K(NH2)
CH3〇-(CH2CH20)nCH2CH2C(0)-NHCHC(0)NH-IEGPTLRQWLAARA -pA (CH2)4 . · CH3〇-*(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)NH^ 支鏈(PEG2) diPEG-AF13948 • 、,
^ CH30(CH2)20)n(CH2)20C(0)CH2CH2C(0)NH-IEGPTLRQWLAARA \ P K(NH2)
CH30(CH2)20)n(CH2)20C(0)CH2CH2C(0)NH-IEGPTLRQWLAARA-pA SS (PEG2) diPEG-AF13948 ___-15-_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(2l〇X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再 頁) 515804 A7 B7 五、發明説明(13 ) 〇 CH3〇-(CH2CH2〇)n'-CH2CH2-CH2-NH-IEGPTLRE(1-Nal)L^A(Ac-Lys)(Sar) K(NH2) CH3〇-(CH2CH2〇)n-CH2CH2-CH2-NH-IEGPTLRE(1-Nal)LAA(Ac-Lys)(Sar) CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)-NH-IEGPTLRE(1-NaI)LAA(Ac-Lys)(Sar) ! K(NH2) CH3〇-(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)-NH-IEGPTLRE(1-Nal)LAA(Ac-Lys)(Sar) CH30-*(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)NH ^ ~ (CH2)4 CH30((CH2)20)n(CH2)2 C(0)NHCHC(0)NHIEGPTLRE(1-Nal)LAA(Ac-Lys)(Sar) K(NH2) CH30((CH2)20)n(CH2)2 C(0)NHCHC(0)NHIEGPTLRE(1-Nal)LAA(Ac-Lys)(Sar) (CH2)4
CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)NH CH3CKCH2CH2〇)n-CH2CHrCHrNH:lEGPTLRQ(1-Nal)LAAR」(Sar)、 / K(NH2) CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-CH2-NH-IEGPTLRQ(1-Nal)LAAR-(Sar) ; 醛-聯結(ALDH) diPEG-AF15705 CH30~(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)-NH-lEGPTLRQ(1>Nal)LAAR-(Sar) · K(NH2) / CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)-NH-IEGPTLRQ(1-Nal)l^AR-(Sar) 聯結(SPA) diPEG-AF15705 -16-
本纸張尺度^用中國國家標绛(CNS ) A4規格(210X29^¥T ---------批衣! (請先閲讀背面之意事項再本百( 訂 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 -II 1-1 515804 A7 B7 五、發明说明( 14 CH3〇-(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)NH 、 :(CH2)4 CH30((CH2)20)n(CH2)2C(9)NHCHC(0)NH-iEGPTLRQ(1-Nal)LAAR-(Sar) K(NH2) CH30((CH2)20)n(CH2)2 C(0)NHCHC(0)NH-!EGPTLRQ(1-Nal)LAAR-(Sar) ' (ch2^4 QH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)NH ' 支鏈(PEG2) diPEG-AF15705 CH30(CH2)20)n(CH2)20C(0)CH2CH2C(0)NHIEGPTLRQ(1-Na!)LAAR-(Sar) / CH30(CH2)20)n(CH2)20C(0)CH2CH2C(0)NHIEGPTLRQ(1-Na!)LAAR-(Sar) SS (PEG2) diPEG-AF15705 K(NH2) I--------装! (請先閱讀背面之注t事項再本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 及其醫藥學上可接受之衍生物’其中對掌胺中心基故較佳 是L-形式,而,’η,,是約5至1000之整數,如10至約1000 ’ 較佳是自約100至900,更佳是自約1 1.0至約900,如约 1 ( 1 12,22 5,450 (如 42 5-5 00),675 或 900。例如以酸聯結 (A L D H) P E G s而言,η爲例如約4 5 0,如約3 4 8 - 4 5 2,以酉曰 聯結(SPA)PEGs 而言 ’ η 是約 112-900 ’ 如 112 ’ 225, 450(如425-500) ’ 675或900 ;以支鏈PEGs而言’是約爲 112-450,如約 112 ’ 225或 450 ;而以SS PEGs而 s ’ 疋約 112-450,如約 H2 ’ 225 或 450 ° · 特別佳的根據本發明化合物爲: -17- ^氏張尺度適3中國國家$?'((^5)六4規格(2丨0>< 297公潑) 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 515804 Α7 Β7 五、發明説明(15 ) CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)^NH>IEGPTLRQ(1-Nal)LAAR(Sar) , 1 CH3〇-(CH2CH2〇)n-CH2CHrC(〇)-NH-lEGPTLRQ(1-Nal)LAAR(Sar)K(NH2) (di-PEG(20K) AF15705) 其中η約450,如約425-500,及其醫藥學上可接受之衍生 物,其對掌中心胺基酸較佳是L-形式。 如削所讨論’根據本發明之化合物可用以預防及治療 ΤΡΟ所媒介的疾病,例如血液性疾病,包括血小板減少 症,粒狀細胞減少症及貧血,並可治療血液性惡性 因此,本發明亦提供以血小板生成促進劑治療罹患疾病的 方法,其包括投與病患有政的根據本發明化合物醫藥劑且 或含量。 · 本發明另外提供根據本發明化合物之治療用㊣,特別β 人類用之藥物。 . 疋 本發明另-個主旨是根據本發明化合物於製.fe_ 用途,以治療由血小板生成促進劑媒介的疾病。 ,常用的治療參考是包括已發生的症狀之預防醫學及改 〇 t 本發明亦提供醫藥組成物,其内含—種 裡或多種本專利载 明書中所述之化合物及生理學上可接受、、 v , π又夂载體,這些醫藥 -組成物可以各種的形式存在,包括口服南 4里开> 式,及吸入 性粉末與溶液,與注射溶液及滲入性溶液。 k 圖形簡要説明 __· _ 18_ ‘本纸張尺度適财 ( CNS ) Λ4規格(21Gx 297公潑)^ (請先閲讀背面之注意事項再?Pf本頁} 裝 、11 515804 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五 '發明説明(16 圖 1 説明 AF13948 及 GW3 5 078 1 (二- PEG(5K)-AF13 948) 在人類血清中的穩定性,並證明P E G化合之化合物較未化 合P E G之化合物穩定性高,即半衰期增加。 圖2説明以各種P E G衍生化之本發明肽化合物的藥物動 力學特性。在此實驗中,以支鏈PEG(PEG2),酯聯結 PEG(SPA)及醛聯結PEG(ALDH)將肽AF15705衍生化,結 果顯示此三種用不同P E G衍生化的肽化合物具有良好的藥 物動力學特性。 圖3 - 4説明本發明經P E G化的肽化合物於carb〇piatin (C B P)引發罹患血小板減少症的老鼠之效果。圖3證明 〇〜3 5 078 1 (二彳£〇(5〖)-八?13 948)可舒緩老鼠模式中的血 小板減少症,而圖4證明GW350805 (二-PEG(20K)-AF13948 )也能舒緩carboplatin所引發的血小板減少症,甚 至其效能高於GW35078 1。 圖5-6說明GW35〇78 1及GW35〇805增加正常動物中血小 板的效果。此結果顯示本發明經P E G化的肽化合物在小血 小板增加上有良好的效果,經2 0 K -二P E G化肽的效果約爲 5 K-二PEG化肽的100倍。 圖7-8說明不同GW35?81及GW35〇8〇5劑量在正常動物 中對血小板含量的效果,這些數據顯示本發明經p E g化的 肽能增加正常動物體中血小板含量。 圖9説明單劑量GW35〇805與多劑量GW350805對正常動 物體中血小板含量效果。 圖1 0說明製造内含/5 - A1 a雙元肽的一般合成流程。 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) ---------t-- (請先閲讀背面之注意事項再百〇 、11 515804 A7 B7 五、發明説明(17 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 圖1 1説明不含/? - A1 a雙元肽的一般合成流程。 特定具體實例之説明 下列定義用以説明並界定本發明中所述各種名詞的音義 及範圍。 ”促進劑”意指可與互補性生物活性受體結合之生物活性 配爲體,結合後可活化受體進而造成使受體發生生物性反 應’或是增進受體先前即存在的生物活性。 ”醫藥學上可接受之鹽類,,意指用於醫藥工業上之無毒性 鹼金屬,鹼土金屬,及銨鹽,包括鈉,鉀,鋰,鈣,鎂, 鋇,銨,及魚精蛋白鋅鹽,其可以技藝中已知的方法製備 之。此阔亦包括典毒性的加成鹽,通常是將本發發明化合 物與合適的有機酸或無機酸反應後而得,代表性的鹽類包 括或氣鹽’鼠溴鹽’硫酸鹽,重硫酸鹽,乙酸鹽,草 酸鹽,戊酸鹽,油酸鹽,月桂酸鹽,硼酸鹽,苯甲酸鹽, 乳酸鹽,磷酸鹽,曱苯磺酸鹽,檸檬酸鹽,馬來酸鹽,延 胡索酸鹽,琥珀酸鹽,酒石酸鹽,萘磺酸鹽,及其類似 物0 ”醫藥學上可接受之酸加成鹽,,意指仍保有自由鹼的生物 效力及特性之鹽類,但這些鹽類沒有生物或其他方面預期 外的效果’其疋與典機g父(如氫氣酸’氫溴酸,硫酸,磷酸 及類似物)即有機酸(如乙酸,丙酸,羧基乙酸,丙酮酸, 草酸,蘋果酸,丙二酸,琥珀酸,馬來酸,延胡索酸,酒 石酸,擰檬酸,苯甲酸,肉桂酸,杏仁酸,曱燒磺酸,乙 烷磺酸,p -曱苯磺酸,水揚酸及類似物。以醫藥學上可接 ___- 20 _ 本纸張用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(2丨〇>< 297公楚) -^ (請先閱讀背面之注意事項再 -裝 頁) 訂 515804 A7 _ B7 五、發明説明(18 ) (請先閱讀背面之注意事項再ip?本頁 受之酸加成鹽類作爲前藥之説明可參考前述布德格 (Bundgaard),H·,文獻。 ”醫藥學上可接受之酯”意指在水解酯鍵後,仍保有羧基 酉父或醇類的生物效力及特性的酯類,且這些酯類沒有生物 與其他方面預期外的效果。以醫藥學上可接受之酯類作爲 前藥之説明可參考布德格(Bundgaard),H.,出版.,Design of Piodiugs,又爾系佛科學出版商(Elsevier Science Publishers),艾姆斯坦登(Amsterdam)( 1985 )。這些酯類主 要是由對應的羧基酸及醇類所形成的,通常,經由傳統的 &成技術可以形成醋類(參考,如,馬許(March), Advanced Organic Chemistry·,第 4 版·,約翰威利(John Wiley)及桑斯 (Sons),紐約(1"2),393-396及該文中所列的參考文獻,與 馬兄(Mark),等人·,Encyclopedia of Chemical Technology, 約翰威利(John Wiley)及桑斯(Sons),紐約( 1980))。這些 醋類中醇的成分通常含有(i)具有一個或多個雙键的C2-C12 脂防醇,其亦可具有支鏈或不具支鏈,或(ii)C7-C12芳香 或雜芳香醇。本發明亦設計内含如本文所述的兩種酯類及 其醫藥學上可接受之酸加成鹽的組成物的用途。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 π醫藥學上可接受之醯胺”意指在水解醯胺键後,仍保有 羧基酸或胺類的生物效力及特性的酯類,且這些醯胺沒有 生物與其他方面預期外的效果。以醫藥學上可接受之醯胺 作爲前藥之説明可參考布德格(Bundgaard),H·,出 版·,Design of Prodrugs,艾爾系佛科學出版商(Elsevier Science Publishers),艾姆斯坦登(Amsterdam)( 1985 )。這 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210x297公楚) 515804 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明(19 ) 些醯胺主要是由對應的羧基酸及胺所形成的,通常,經由 傳統的合成技術可以形成醯胺(參考,如.,馬許 (March),Advanced Organic Chemistry .,第 4 版.,約翰威利 (John Wiley)及桑斯(Sons),紐約(1992),393,與馬克 (Mark ),等人·,Encyclopedia of Chemical Technology,约 翰威利(John Wiley)及桑斯(Sons),紐約(1980))。本發明 亦設計内含如本文所述的兩種酯類及其醫藥學上可接受之 酸加成鹽的組成物之用途。 ’’醫藥學或治療上可接受之載體”意指不會干擾活性成份 生物活性之效力的載體媒介,且其對宿主或病患是無毒 的0 π互體異構體’’意指與他種化合物具相同分子量、化學組 成及組構之化學化合物,但是其卻有不同的原子團,換言 之,在空間上某些相同的化學部分是不同的方向。因此, 當其爲純物質時,則具有旋轉光平面的能力。然而,某些 純互體異構體光學旋轉能力太弱,以至於目前的儀器尚無 法偵測。由於本發明化合物具有一個或多個不對稱的碳原 子,因而包括了各種的立體異構體。所有的立體異構體均 包含於本發明範圍内。 ’’治療或醫藥有效含量”意指投與足以引發所期望的生物 結果之本發明組成物含量,此結果是指改善病徵、症狀或 病程,.或期望任何其他生物系統的改變。在本發明中,此 結果主要是指減低感染症或組織傷害的免疫反^ 或發 炎反應。 _______-22- 本纸張尺度適用中國國家標季(CNS ),\4規格(2丨Q>< 297公潑) (讀先閎讀背面之注意事項再尽頁} •裝 -訂 515804 A7 B7 五、發明説明(21 ) ^ 經由肽及肽擬似物上的羥基將32p以磷酸部分引入至肽及 擬似物上。 本發明提供可與丁!>〇-11键結並活化71>〇-11的化合物,或 是作爲TPO促進劑的化合物。這些化合物包括”先鋒”肽化 合物及與先鋒化合物具相同或相似分子結構或形狀之,,衍生 性·’化合物,但是此衍生性化合物與先鋒化合物之水解感受 性及/或其他生物特性(如對受體的親合力增加)不同。本 發明亦提供内含有效含量之TP0促進劑的組成物,而較特 別的是内含用於治療血液性疾病(特別是與化療、放射性治 療或骨隨移植相關的血小板減少症)之化合物。 许多方法可用以評估I c 5 0數値,例如利用Μ Β Ρ - τ P Q或 lacl-肽追蹤劑之平衡結合ELISA分析法,此兩種方法可測 定是否肽會抑制T P 0鍵結至T P 0受體的細胞外區域上,利 用自由肽可測定I C 5〇,這些自由肽可選擇性的進行c _端醯 胺化作用,或製備成酯類或其他幾基醯胺。 本專利説明書中I C 50及E C 50是以符號,,—“,,,+,,及,,+ +,’表示之。例如,I C 50大於200从Μ的肽以,,—,,表示之, I C π小於或等於200 " Μ的肽以” + ”表示之,而I c 5〇小於或 等於50〇11111肽則以”++”表示之,若是1(:5()數値接近臨界 値則以π屮/ - 表示之。未測I C 5 〇的肤以’’ N . D . 表示。 本發明肽及肽擬似物亦可以血小板生成有關的細胞增生 分析法(如後文範例2中較詳述的方法)評估之,以技藝中已 知的技術(如與3 Η -胸腺核苷併入相關之Μ Τ Τ分析法作爲細 胞增生的指標)測定細胞的增生(參考摩斯曼(Mossmann,J. -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X297公楚) (請先閱讀背面之注意事項再本頁) •裝 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 515804 Α7 Β7 經濟部中央標準局—工消費合作社印製 五、發明説明(22 ) ^ ~—~ Immunol.Method,65 ·· 55(1983 )) 〇 圖3及圖4列出另一種評估本發明肽及肽擬似物活性的分 析結果。在本分析法中以卡布拉丁老鼠產 生血小板減少症。第〇天時以卡布拉丁(12〇毫克/公斤腹 膜/王射)處理Balb/C老鼠,這些結果顯示本發明肽可舒緩 老鼠模型中血小板減少症。 根據W096/40 750中所述研究肽對紅血球受體(Ep〇_R) 义又反應之方法可測定本發明肽的鍵結專一性及活性。 成法製備肽及肽描 以技#中傳統已知的方法可製備本發明肽,例如標準固 相技術。“準方法包括唯一固相合成法,部分固相合成 法,片&固化法,古典溶液合成法,甚至是重組性D N A技 術)考,如·,馬瑞菲爾(Merrifield),J. Am· Chem. Soc.,85 : 2 149( 1963 ),此文件併入本專利説明書參考。在 固相合成法中,是利用α _胺基保護之樹脂從肽的c端開始 進仃合成作用,例如,將所需的α _胺基酸鍵結至氯曱基化 树月曰,羚基甲基化樹脂,或二苯甲胺化樹脂上,以製備合 適的起始物質。其中一種氣甲基化樹脂爲拜歐雷德實驗室 (Bio Rad Laboratories),瑞奇摩,CA 所出品之 ΒΙ〇_ beads sx-i ’而利用柏德斯奇(B〇d〇nszky)等 人.,Chem.Ind.(倫敦),38 : 1597(1966)所述的方法可製備 為'基甲基化樹脂,另外匹特(Pietta)及馬歇爾 (Marshall),ChemC〇mmn 65〇(197〇)曾敘述過二苯甲基化 (Β Η A )树脂,自貝克曼儀器公司,帕蘿拉託,c a,可購 (請先閲讀背面之注t事項再 F本頁) 1- I ·1 · 裝_ 線 25- 本纸狀錢用怍國格(2—) 515804 A7 B7 五、發明説明(23 得氫氯酸形式的此種樹脂。 (請先閱讀背面之注意事項再頁 因此根據季辛(〇1511〇,以1^^.八^,56:1467(1973 ) 所述的方法,在碳酸氫绝催化劑輔助下,可將“_胺基保護 之胺基酸偶合至氯甲基化樹脂上,以製備本發明之化合 物。在初期的偶合作用後,選用試劑(包括内含三氟乙酸 (τ F A )或鹽酸(H C 1)之有機溶液)於室溫下去除“ _胺基保 護基。 技藝中逐步進行肽的合成作用時可用“ _胺基保護基,包 括醞基保護基(如甲醯基,三氟乙醯基,乙醯基),芳香族 胺甲酸型保護基(如苄基氧基羰基(Cbz)及取代的cbz), 月旨肪·族胺甲酸型保護基(如第三-丁基氧基羰基(B〇c),異 丙基氧基援基,環己基氧基羰基)及燒基型保護基(芊基, 三苯甲基)。Boc及Fmoc是較佳的保護基。在偶合期間支 鏈的保護基仍保持完整,並在胺基端進行去保護作用時或 在偶合作用時,仍不會分離,但最終肽完成合成之後,則 必須去除支鏈上的保護基,且在此反應條件下不會改變標 的肽。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 蘇胺酸(T )及絲胺酸所用的支鏈保護基包括乙醯基,苯曱 醯基,三苯甲基,四氫吡喃基,苄基,2,6 -二氯芊基,及 C b z。精胺酸所用的支鏈保護基包括硝基,甲苯磺醯基 (T 〇 s ),C b z,金剛烷氧羰基三甲苯磺醯基(μ t s ),P m c或 B o c。離胺酸所用的支鏈保護基包括C b z,2 -氯芊基氧基 被基(2-Cl-Cbz),2 -溴爷基氧基談基(2-BrCbz),Tos, 或 B o c 0 -26- 本纸張尺度適用中國國家標隼(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 515804 A7 B7 五、發明説明(24 在去除胺基保護基之後,逐步以期望的順序進行所剩 保獲性胺基酸偶合作用,通常將每種過量之保護胺基酸盘 杈基活化物(如内含二環己基羰二亞胺(DCC)之溶液,如 二氯甲垸(CH2Cl2) ’ =甲基甲酿胺(DMF)混合物)—起使 用0 在完成所期望的胺基酸順序後,以試劑(如三氟乙酸 (HF))處理樹脂,以便將所期望的肽自樹脂支持物上脱離 下來,而這些所用的試劑不但可將肽自樹脂上切除下來, 亦可刀所有仍存在的支鏈保謾基。當使用的是氣曱基化 樹脂時,經氫氟酸處理後直接可形成自由肽酸,當使用的 是二苯甲基胺樹脂時,經氫氟酸處理後會直接形成肽醯 胺。另一種情形是,當使用的是氯甲基化樹脂時,利用胺 處理肤樹脂可進行支鏈保護肽的去偶合作用,如此會產生 所期望的具支鏈保護醯胺,若是以烷基胺處理時則會產生 具支鏈保i隻的烷基醯胺或二燒基醯胺。而後再利用氫氟酸 以通用的方式去除支鏈上保護基以產生自由醯胺、烷基醯 胺,或二烷基醯胺。 技藝中詳列這些固相肽合成步驟,另外約翰馬羅史都華 (John Morrow Stewart)及貞尼斯戴哈拉楊(Janis Dillaha
Young),固相肽合成(第二版.,皮爾斯化學公司,ι984)亦 曾進一步敘述。 本發明化合物亦可利用美國專利案07/492,462( 1990年3 月7日建檔)及07/624,120(1990年12月6日建檔),及 07/805,727(1991年12月6日建檔)中所述之’’編碼合成庫’’ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(21〇χ 297公釐) 請' 閲 讀' 背 面 5 事 項 再 i 頁 裝 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五 、發明説明(25 A7 B7 或大量固化聚合物合成作用”系、統製備之。 B、|成胺基酸_ 這些步驟亦可用以合成天⑽種胺基酸之外胺基酸所组 :肤’以及合成其中i個’ 2個或多個之遺傳編碼胺基酸 :發明任何之化合物所取代之肽,例如,茶基丙胺酸可 取=色胺酸以助合成作i其他可取代本發明肽中胺基酸 :口成胺基酸包括卢胺基酸,D胺基酸及非天然存在之合 ^胺基酸(參考羅柏特(R〇b叫,等人,加議ai nuno/Acids in Peptide Synthisis,5(6) : 341-449(1983 ) i o (請先閱讀背面之注意事項再頁) —裝. β 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 之修飾作用 肽主要是以自由酸的形式合成的,但如前所㉛,亦可製 備成醯胺或醋的形式。吾人亦可修飾本發明肽化合物之胺 基及/或叛基端,以產生本發明其他之化合物。胺基端修飾 作用包括甲基化作用(即_NHCH3或韻(CH3)2),乙酿化 作用,卞基乳基羰基的加成作用,或是用内含絲功能(定 義爲RCOO- ’其R選自茶基"丫咬基’類固醇基,及相 的基團)之阻斷基阻斷胺基端,羧基端的修飾作用包括以 醞胺基團取代自由酸或是在羧基端形成内酯以造成結構 的阻斷。 θ 胺基端的修飾作用如前所述,包括燒基化㈣,乙碎化 作用,碳苯甲醯基的加成作用,形成丁二醯亞胺等(參^, 如莫填(Murray),等人.,Burge,s Medlcinal _ Drug Discovery,第五版·,第!册,曼福瑞德e瓦爾夫 似 羧 性 訂 -28 515804 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明(27 ) 内含三級胺以去除反應期間所產生的酸)反應,.以形成苄基 氧基碳醯基-NH -或取代芊基氧基碳醯基- NH-; (d) 與内含等量或過量(如5倍量)R_s(0)2ci之合適惰性 稀釋劑(二氯甲烷)反應以便將末端胺基轉換成磺醯胺,其 中R的i義如前。幸父佳的疋惰性稀釋劑中含有過量的三級 胺(如1 0倍量).(如二異丙基乙胺),以去除反應期間所產生 的酸。反應條件不同於慣用者(如室溫下3 〇分鐘); (e) 與内含等量或過量(如5倍量)R-〇c(0)Cl或 R-0C(O)OC6H4_p-N〇2之合適惰性稀釋劑(二氯甲烷)反應 以便將末端胺基轉換成胺基甲酸,其中r的意義如前。較 佳的是惰性稀釋劑中含有過量的三級胺(如1 〇倍量)(如二 異丙基乙胺),以去除反應期間所產生的酸,反應條件不同 於慣用者(如室溫下3 0分鐘):及 (f) 與内含等量或過量(如5倍量)R-N = C = 0之合適惰性稀 釋劑(,二氣甲烷)反應以便將末端胺基轉換成脲基(即 R N H C ( 0 ) N Η -),其中R的意義如前。較佳的是惰性稀釋 劑中含有過量的三級胺(如1 0倍量)(如二異丙基乙胺),以 去除反應期間所產生的酸。反應條件不同於慣用者(如室溫 下3 0分鐘)。 在另一個具體實例中,將Ν端胺基分別取代分子内叛基 的〇Η-或酯之-OR,可引發C-端羧基或C-端酯進行環化作 用,而產生環狀肽。例如,合成作用及切除作巧之後可產 生肽酸,利用内含適當的羧基活化劑(如溶於二氯甲規 (CH2C12),二甲基曱醯胺(DMF)混合液之二環己基碳二 -30- I紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4ϋΤ210Χ 297公釐) ~ - ---------批衣I- (請先閲讀背面之注意事項再^本頁) 、11 線 515804 A7 B7 28 五、發明説明( I--------1 — (請先閱讀背面之注意事項再本頁 胺落液)可將自由酸轉換成活化性的酯,而後藉由N -端胺 將活性化g旨進行分子内取代作用以形成環狀肽,利用極稀 釋的落液可增強不同於聚合作用之分子内環化作用,此種 方法熟知於技藝中。 吾人亦可將本發明肽進行環化作用,或將肽的兩端進行 去胺基化或去羧基化作用,因此產生不具有胺基端或羧基 端的肽’此可減低本發明肽對蛋白酶感受性或限制本發明 肽的组構。本發明化合物C-端功能基包括醯胺,醯胺低碳 燒基,醯胺二(低碳烷基),低碳烷氧基,羥基,及羧基, 與其低碳酯衍生物,及其醫藥學上可接受的鹽類。 訂 除了前述N端及C端的修飾外,可用一種或多種的前述親 水性聚合物修飾本發明化合物,或是將本發明肽偶合至一 種或多種前述不同的親水性聚合物上。 藉由吉利斯奇(Zallipsk),S.,Bioconjugate Chem.,6 : 150-165( 1995 ):瑪法迪尼(Monfardini),C 等人.,Bi〇conjUgate Chem.,6: 62-69(1995):美國專利案4,640,835 :美國專利 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 案4,4·96,6δ9 :美國專利案4,3〇1,丨44 ;美國專利案 4,670,471:美國專利案4,791,192;美國專利案4,179 337 或W095/34326中所述任何的方法,可將本發明肽化合物 以此種聚合物衍生化之,或是將本發明肽化合物偶合至此 種聚合物上,以上所有整體文件均併入本專利説明書參 考。P E G s可購自歇爾瓦特(Shearwater)聚合物公司(韓特 斯威力,阿拉巴馬),席格馬(Sigma)化學公司,及其他的 公司。 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210x297公釐) 515804 A7 B7 五、發明説明(29 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在目削較佳的具體貫例中,本發明肽化合物是以聚乙二 醇(P E G)衍生化的。 簡而。之’在其中—個範例的具體實例中,較佳的是將 非反處基(如曱氧基或乙氧基)加在(所用的親水性 永合物(如P E G ) —端上,而後,再與適合的活化劑(如氰化 鹵(如氰化氯,氰化溴或羥化氟),二咪唑,酸酐試劑(如二 卣二丁酸酐,如二溴二丁酸酐),醯基疊氮化物,卜重氮基 芊基鲢,3-(P-二重氮苯氧基卜八羥基丙基醚)及其類似二 反應,以便活化聚合物的另一端,其後將活化的聚合物與 本發明化合物反應之,以產生經聚合物衍生化的肽化合 物。假若本發明化合物肽鏈具有保護基(如乙醯基保護), 則會產生單P E G化合的化合物,另一種方式是,本發明肽 化合物的功能基經活化後可與聚合物反應之,或是利用已 知的偶合方法於協同的偶合反應中,將兩個功能基接合起 來。流程1 - 4説明本發明肽化合物與聚乙二醇(p E G)進行 付生化的範例反應泥程,較常用的是利用技藝中許多可用 的流程將本發明肽化合物以P E G衍生化。 除了用親水性聚合物將本發明欣化合物衍生化外,咸已 發現其他小分子肽(如其他鍵結至受體上的肽及配位體)亦 可用此種親水性聚合物衍生化,且只會失去部分的生物活 性(假若有的話)(如键結活性,促進劑活性,抗促進劑活性 等)。咸已發現這些小分子肽經親水性聚合物衍生化後,其 落解度及循壤性半衣期會增加,而其免疫性則會降低。令 人驚訝的是,前述的作用會伴隨著部分生物活性的減低(假 -32- (請先閣讀背面之注意事項再貧} .裝. 訂 線 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 5158〇4 A7 B7 五、
發明説明(3Q 經濟、邺中央標準局員工消費合作社印製 右有的話)。事貫上’在較佳的且触奋丨丨丄 住妁具體貫例中,衍生化肽的活 性是未修飾肽的0 · 1至0 · 〇 1倍,承4沾 、 话更佳的具體實例是衍生肽的 活性爲未修飾肽的0· 1至1倍,其?承社AA e l 4 土更佳的是衍生肽的活性 較未修飾肽的活性高。 適合用於此具體實例的肽包括鍵拮至受體(如丁p〇, ^。,^卜以^及^巧受體^造血因子受^細胞 素受體:G-蛋白聯結受骨豊:細胞表面受體等受體)上的 肽。此種肽主要約含有或少於15〇個胺基酸,更佳的是約 含有或少於1〇〇個胺基酸(即〜10-12kDa)。適合用於本發 明之親水性聚合物包括(但不侷限於)聚烷基醚(如聚乙二醇 及聚丙二醇),聚乙酸(聚羧基乙酸),聚氧基炔,聚乙晞 醇,聚乙烯吡咯烷酮,纖維素及纖維素衍生物,葡聚糖及 葡聚糖衍生物等。通常,此種親水性聚合物的平均分子量 約爲500至約1〇〇,〇〇〇道耳頓,更佳的是約2,〇qq至約 40,000道耳頓,甚至更佳的是約5,〇〇〇至約2〇,〇〇〇道耳頓。 在較佳的具體實例中,此種親水性聚合物的平均分子量約 爲5,000道耳頓,ι〇,〇〇〇道耳頓,及20,000道耳頓。利用前 述的方法及所列參考資料中的方法可將根據此具鳢實例中 的肽化合物進行衍生化。 -33 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2丨0X 297公漦) ------裝-- (請先閱讀背面之注意事項再頁) 515804 A7 B7 五、發明説明(31
〇II CH3〇——(CH2CH2〇)n CH3〇——(CH2CH2〇)n —
〇II CH2CH2——C—NH«
+ 請_ 閲 讀- 背 面 5
支鍵mPEG (H)-IEGPJLRQWLAARA (H)-IEGPTLRQWLAARA^A AF13948 K(NH2) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)NH ' (CH2)4 CH3CKCH2CH2〇)n-CH2CH2-C(〇)-NH-CH-C(〇)NH-IEGPTLRQWLAARA K(NH2) , / CH30-(CH2CH20)nCH2CH2C(0)-NHCHC(0)NH-IEGPTLRQWLAARA-pA (CH2)4 CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)NH 支鏈(PEG2) diPEG-AFl3948 流程1 -34- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(21 〇X 297公楚) i: 事 項 再,
515804 A7 B7 五、發明説明( 32 CH3-(CH2CH20)n-CH2CH2-G(0)H m PEG 酸:, (H)-IEGPTLRQWLAARA \ / (H):IEGPTLRQWLAARA-/3A AF13948 K(NH2)
NaCNBH,
CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-CH2-NH-IEGPTLRQWLAARA \ K(NH2) CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-CH2-NH-IEGPTLRQWLAARA-f3A •: 醛-聯結(ALDH) diPEG-AF13948 流程2 I.--------辦衣II (請先閱讀背面之注意事項再本頁) d 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製
〇II 〇
H3〇(CH2CH20)n —CH5CH7 —C — 0—N
SPA-mPEG 訂 〇 十 (H)-IEGPTLRQyVLAARA (H)-IEGPTLRQWLAARA-/3A AF13948 K(NH2)
CH30-(CH2CH20)n^CH2CH2-C(0)-NH-IEGPTLRQWLAARA CH30-(CH2CH20)n-CH2CHrC(0)-NH-IEGPTLRQWUV\RA-pA * Λ 酯-聯結(SPA)diPEG-AF13943 n 流程3 K(NH2) 35- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 515804 A7 B7 五、發明説明( 33 CH3O——(CH2CH2〇)n
〇 〇II HI
SS-mPEG (H)-IEGPTLRQ(1-Nal)LAAR(Sar) ,K(NH2) (H)-IEGPTLRQ(l-Nal)UV\R(Sar) AF15705 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 經濟部中央標準局員工消f合作社印製 K(Nhg CH30(CH2CH20)nCH2CH20C(0)(CH2)2C(0)NHIEGPTLRQ(1-Nal)LAAR(Sar) . K(NH2) CH30(CH2CH20)nCH2CH20C(0)(CH2)2C(0)NHIEGPTLRQ(1-Nal)LAAR(Sar)
Di-SS-mPEG-AF15705 流程4 形成雙硫鍵 本發明化合物
(Η 卜 CIEGPTLRQWU\ARA I 、 s :I s (H) - ClEGPTLRQWLAARA7 半胱胺酸之含硫基間形成分子内雙键,以技藝中已知的方 -36 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公釐) 515804 A7 五、發明説明(34 ) ^ ' 法(參考法蘭克(Frnak)A 羅培(Robey),Meth. in Mq1 Βι〇·,35(6) : 73_9〇(199〇)),經由分子内取代作用可製備此 化合物。 根據另一個主旨,本發明提供由原具有生理活性的多肽 來製備具生理活性,且實質上爲非免疫性水溶性的多肽組 成物之方法,其步驟包括: (a) 將分子量約爲500至約20,〇〇〇道耳頓之聚合物中至少— 個末端帶有羥基的碳原子活化,其中該聚合物是未取代 的,或經烷氧基或烷基取代的,且該烷氧基或烷基的碳原 子少於5個··及 (b) 將每莫耳具生理活性的式(1)多肽與1〇至1〇〇莫耳的上 述之聚合物反應,以便將上述的多肽偶合至上述聚合物的 反應性末端基上,如此即可產生具生理活性,實質上爲非 兄疫性水落性具多肽組成物,較佳的聚合物爲聚乙二醇, 較佳的偶合劑爲三聚氯化氰。 用途 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明化合物可作爲活體外探索T P 0之生物功能的獨特 工具,包括評估認爲會影響τρ〇生成及受體鍵結步驟,與 被丁 P 0生成及受體鍵結步驟所影響的因子。 1此化口物亦可作爲分析方法中的競爭性鍵結物,以便篩 C封毛、的T P 〇促進劑。在此分析分法的具體實例中,本發 月所用的化合物無需經過修飾,或是藉由各種方法修飾本 發月化口物(例如’標記作用,如以共價聯結或非共價聯結 方式直接或間接鍵結化學部分以提供可偵測的訊號物)。在 -—----- -37- 本纸張尺度適 515804
發明説明(35 任何的分析方法φ 、 接f 2 L接或間接的方法標記物質。直 包括放射性標記(如125。,酵素(美國專利 二’化,二)(如過氧化酶及驗性蹲酸酶)及能監測螢光強 =化、波長偏移與螢光極性現象的螢光標記物(美國專利 :。,940,475)。間接標記的標記物包括將其中一種成分進 订生物素作用’而後再將其與已經偶合前述—種標記物的 抗生物素蛋白鍵結。在化合物結合至固體支持物例子中, 這些化合物亦包括空間子及聯結子。 除此I外,由於本發明肽鍵結至TPO受體上的能力,因 此本發明可作爲偵測活細胞上,固定化細胞上,生物流體 中,組織均質物中,及經純化物質中,天然生物物質中的 丁 P 0 ^:體·^試劑,例如,利用此種經標記作用的肽,吾人 可鑑定細胞表面上具有T P 〇 - R的細胞。除此之外,基於其 鍵結至T P 0受體的能力,本發明肽可用於原位染色, FACS (螢光活化細胞分類法),魏斯坦恩轉潰法,elis A 等。另外’基於其鍵結至T P 〇受體的能力,本發明肤可用 方卜受體的純化’或純化細胞表面上(或穿透細胞内)能表現 Τ Ρ〇受體的細月包。 本發明化合物亦可作爲市售的試劑,以爲各種醫藥研究 及診斷之用。此種用途包括(但不侷限於):(1 )作爲各種功 能性分析方法中定量可能爲Τ Ρ Ο促進劑之活性的校正標 準:(2 )用於維持Τ Ρ Ο依賴性細胞品系的增生及生長:(3 ) 用於經由共同結晶法ΤΡΟ受體的結構分析:(4)用於研究 ΤΡΟ訊號轉移/受體活化的機轉··及(5)應用於其中ΤΡΟ -38- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210Χ 297公釐) ^-----私衣-- (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 、-口 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 515804 A7 B7 五 、發明説明(36 雙體較佳是經活化或此種活化作用方便對已知量的Tp〇促 進劑作校正之研究或診斷,及類似者。 本發明化合物可用於活體外巨核細胞及其委任母細胞(包 括與另外的細胞素共同結合使用或其本身)的擴展作用,參 考,如.,第吉斯托(DiGiusto),等人. PCT發表文件 95/〇5843,該文件併入本專利説明書參考。由於化療及放 射線治療殺死分裂快速及較爲成熟的巨核細胞群,以至於 造成血小板減少症,然而,這些治療方法也會減少低成熟 度及分裂活性低之巨核母細胞的數目,因此,藉由T p〇或 本發明的化合物在病患接受化療或放射線治療後,輸入活 ^外所增生之自己本身的巨核細胞及不成熟母細胞,將可 加速舒緩血小板減少症。 溫血動物(包括人類)亦可投與本發明化合物,以活化活 體内的T P 〇 - R。因此,本發明包含治療τ p 〇相關疾病的方 法其包括投與模擬活體内Τ Ρ 0激發τ Ρ 0 - R效果之足夠量 的本發明化合物。例如,可投與本發明的肽及化合物以治 療各種血液性疾病,如後文所定義者。 在本發明的某些具體實例中,較佳的是先投與正在接受 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 化療或放射線治療的病患Τρ〇抗促進劑,其後再投與本發 明的促進劑。 用 V 克(McDonald),Am.j.of Pediatric Hematology/ Oneology’ 14 . 8·2 1 (1 992 )n所述之各種模式,以活體外或 把内的方法坪估本發明化合物的活性,該文件併入本專 利説明參考。 515804 Α7 Β7 五、發明説明(37 根據其中-個具體實例,本發明化合物可用於治療與骨 =入,放射線治療,或化療有關的血小板減少症。其特 徵疋在化瘃放射線治療,或骨髓移植之前投與本發明化 合物以預防之’或是在接受這些治療暴露後投與此種化合 物。 ^本心月亦棱供醫藥组成物,其含有至少一種本發 明肽或肽擬似物(爲活性成分)及醫藥載體或稀釋劑。可用 紅口’肺邵’非經腸(肌肉Θ ’腹膜内,靜脈,或皮下注 射)’吸入(經由維繫粉末調配物),經皮,鼻腔,陰道内, 直腸,或舌τ等方式投與本發明化合物,並且可調配成適 合各種投藥途徑的劑量,(參考,如,伯斯坦(Bernst―等 人.,pct專利案w093/25221 :匹特(pitt),等人,pcT專利 案w〇94/17784 :及匹特⑽),等人歐洲專利案 川,683),這些文件均併入本專利說明書來考。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 經口投藥之固態劑量形式包括膠囊,鍵片,藥丸,粉 末,及顆粒。在此種固態劑量形式中,活性化合物至少愈 一種醫藥學上可接受之載體(如廉糖,乳糖,或:殿粉)混 合。除了惰性稀釋劑外,如一般的應用,此種固態劑量形 “可含有另外的物質’如潤滑劑(如硬脂酸錢),而在膠 K,鍵片,及藥丸的形式中,固體劑量形式亦可含有緩衝 Μ,而錠片及藥丸另外可以腸衣製備之。 經口投藥的液態劑量形式包括醫藥上可接受之乳化劑, 溶液,懸浮液,㈣,肖内含—般技藝中利的惰性 劑(如水)之㈣。除了這些惰性稀釋劑外,組成物中 -40-
515804 Α7 Β7 五 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 、發明説明(38 ) 久甜味劑,芳 4有佐劑,諸如濕潤劑,乳化劑 香劑,及香劑。 根據本發明之非經腸投藥方式包括無菌液態或非液能、、容 瑕,懸浮液或乳化液。非液態溶劑或輔劑的範例有^ : 醇,乙二醇,蔬菜油(如橄欖油及玉米油),動物膠,及: 射性有機酯(如油酸乙酯)。此種劑量形式亦本 王 ,, J 0 ,佐劑, 如保存劑,濕潤劑,乳化劑,抑菌劑及分散劑,抗^ 劑,緩衝劑,懸浮劑,防水劑及冷凍保護劑。並 氧化 I, 々毒的方 式,例如,以可將細菌留滯的濾膜過濾消 '疋在組诸 物中加入消毒劑,或是將組成物輻射消毒,或是將組、 加熱消毒,亦可在使用之前,立刻利用無菌水?二:物 他的無菌注射基質製備這些组成物。 /木i其 另一種方式是,本發明化合物可以冷;東乾燥固餘步 現,其可以加入水,生理鹽水或葡萄糖水回復液態王 用),此種調配物一般是以單位劑量开j式 子 王:t兄的(4 1 子,安瓶或丟棄式注射裝置),其亦可以多劑量形弋^ $开 諸如自瓶中抽取適當量的劑量,這些所有 無菌的。 J ^而疋 直腸或陰道内投藥的組成物較佳的是
土 朱’除了、、士 & L 質外’其可包含諸如可可油或坐劑用壞之賦卜鼻lb 舌下投藥的組成物是用技藝中熟知的標準賦形劑制::或 投與内含本發明化合物的組成物可、 衣 勺0 用,在治療的祕,投與罹患前述疾病病患足=療 成物可以治療疾病或至少部分舒緩疾病的症狀及 41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210x 297公缝 515804 A7 B7 五、發明説明(39 症,達成此種治療所需的劑量定義爲”治療有效劑量”,而 此用途所需的劑量視疾病的嚴重性及病患的體重與一般病 況而定。 本發明組成物亦可例如以太斯(Tice)及畢碧(Bibi)(在
Treatise on Controlled Drug Deiivery 出版 a 飢釋尼斯 (Kydonieus),馬些爾地可(Marcel Dekker,N.Y. (1992) pp·3〗5·339 )中所述的方法微膠囊化之。 在預防性應用上’可投與對某特定疾病敏感或是具罹患 某特定疾病危險性病患内含本發明化合物的组成.物,此種 所燊的含量定義爲”預防性有效劑量”。在此用途上,精確 的含量視病患的健康及體重狀況而定。 有效治療所需的TPO促進劑定量視許多的因素而定,包 括投藥的方式’標的位置,病患的生理狀況,及其他的投 藥。因此,治療劑量應要定量以達最高的安全性及有效 性。特有的是,活體外所用的劑量可作爲原位投與這些試 劑有效劑量的指南。動物測試中,治療特定疾病的有效劑 量是提供人體劑量另一種預測性的用藥分針。各種的考量 如吉爾曼(Gilman),等人·(出版),Goodman and Gilman,s : 經濟部中央標準局負工消費合作社印製
The Pharmac〇l〇glcai Basis 〇fTherapeutics 8版,(柏格曼) Pergamon 印行( 1990):及 Remmgt〇n,s
Scienpes,7 版·,麥克印刷公司,East〇n,penn (1985 )中所 述,以上文件併入本專利説明書參考。 當投與劑量範圍自約0.001毫克至約1〇毫克/公斤體重每 日之本發明肽及肽擬似物時,可有效治療丁 p〇媒介的病 515804 A7 B7 五 、發明説明(4〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 症,所用特定的劑量是根據以下而調節的:欲治 :::投藥途徑,看診醫生視病況的嚴重性,病患的年齡 及叙病況,及類似情形的判斷。 適合人體投藥的醫藥非經腸配方較佳是内本〖 式(I)化合物,或其醫藥學上可接受的 ,毛克/ 量溶液。 要又的订生物(落液或多劑 較佳的溶液是將式(1)溶於水,生理食鹽水,或葡萄糖水 溶液中。特別佳的溶液之PH約爲4.0-5 〇。 ° 7 根據本發明另一個主旨是提供具生理活性,而實質上爲 非兄疫性水溶性多肽組成物,其包括用偶合劑將式(r Η匕合 物偶合至至少分子量介於約500至約2〇 〇〇〇道耳頓聚合物 上’這些聚合物選自聚乙二醇及聚丙二醇,其中該聚合物 是未取代的或是經烷氧基或烷基取代的,而該烷氧基或烷 基的碳原子少於5個。較佳的聚合物分子量約爲75〇至約 1 5,〇 〇 〇道耳頓’較佳的是約爲5,〇 〇 〇至约丨〇,〇 〇 〇道耳頓。 較佳的聚合物是聚乙二醇。 雖然本發明較佳的具體實例特別於前敘述,但需了解的 是本發明的修飾及改變均在本發明精髓及範圍。範例1 固相肽合成 ,利用馬瑞菲爾(Merrifield)固相合成技術(參考使都華 (Steward)及楊(Young),Solid Phase Peptide Synthesis,2 版,皮爾斯化學公司羅克月艮,IL( 1984)及馬瑞菲 爾,J.Am.Chem.Soc.,85 ·· 2 149(1963 )),以手動方式或是利 請 先 閱 讀 背 'ij 5 ί 事 項 再 填 m 訂 -43- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2!〇X 297公釐) 515804 A7 B7 五、發明説明(41 ) 用應用生物系統公司型號431A或43 3A的肽合成儀合成本 發明各種的肤’利用應用生物系統公司S y n t h A s s i s 10 1. 〇 〇 或Synth As si st62· 0.2的標準步驟組合肽。除非在範例中有 不同的註明,否則每個偶合作用皆是以HBTU ( 2 - ( 1氫_苯 幷三唑-1 -基-1 , 1 , 3,3 -四甲基脲六氟磷酸鹽)及HOBt( 1 -龜 基苯并三唑)進行2X30分鐘。 所用的樹脂是爲HMP樹脂(p-經基甲基苯氧基甲基)聚苯 乙烯樹脂或PAL樹脂(迷你基因/生物研究),其是以5 _ (4’-Fmoc-胺基甲基_3,5,_二甲氧基苯氧基)戊酸爲聯結子 之交錯聯結的聚苯乙烯。使用PAL樹脂在自樹脂上切除肽 之後,會產生羧基端醯胺功能性。若使用HMP樹脂,則在 切除之後,最終產物的C _端會產生羧基酸部分。大部分的 試劑’樹脂,及保護性胺基酸(自由或在樹脂上)購自迷你 埔耳(Millipore)或應用生物系統公司。 進行偶合步骤時,Fmoc團基是作爲胺基保護作用,胺基 Sk上初級胺的保I隻作用是以Fm〇c完成的,而絲胺酸,越胺 酸,及纈胺酸支鏈上的保護作用是採用第三·丁基;麩胺醯 胺用二苯甲基:精胺酸用p m c ( 2,2,5,7,8 -戊甲基色滿6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 磺醯基);色胺酸用Νβ丁氧基羰基;而半胱胺酸是用^三 苯甲基。 .以試劑K處理或稍爲修飾樹脂肽後,可將肽自樹脂上切 除下來,並同時可將支鏈進行去保護作用,另一種方式 是,將完全組合好的肽以9〇%三氟乙酸,5%乙烷二硫,及 5%水的混合物進行切除作用(初始是在4。〇下進行,而後逐 ---- -44- 本紙張尺度適用中國國家標準(CMS 公釐--- 515804 A7 B7 五、發明説明(44 ) 二咬(H〇BT)(5.8克,2當量)溶於250毫升的NMP中,將 溶液置於0 5 C的冰浴中,加入二異丙基乙胺(DIPEa) ( 8.2 ¢:升’ 2.5當量)並攪拌3-5分鐘,再加入〇_苯并三唑β1_基 -Ν,Ν,Ν’,Ν’ -四甲基脲六氟磷酸(ΗΒΤυ)(14·3克,2當量) 及75毫升二氯甲烷(DC Μ),並攪拌溶解,約5分鐘。活化 的酸溶液加至瀝乾的樹脂,並以N 2打氣丨小時。用水合第 二酮測试控偶合作用的芫成,樹脂瀝乾並以3 X 3 〇 〇毫升 的Ν Μ P沖洗之。
利用·· Fmoc-Pro-〇H(12.8 克),Fmoc-Gly-OH(11.2 克),Fm〇C-GlU(〇tBu)-〇H(16.8 克),及 Fmoc-Ile-OH (1 3 ·4克)重複循環合成肽片段後的胺基酸單體,最終的偶 合反應後’樹脂以4 X 3 0 0毫升的Ν Μ Ρ清洗,而後以4 X 3 00毫升的DCM清洗。 經濟部中央標準局員工消費合作社印1i 利用内含1 〇/〇三氟乙酸之D C Μ將肽自樹脂上切除下來, 收集分液並以HPLC分析產物成分。收集4個300毫升的分 液’ 4個500毫升的分液,及其後6個250毫升的分液並分析 之,分液3 - 9用吡啶調整ρ η至〜3 - 4,而後倒在一起,並在 旋轉的蒸發器上濃縮至近乾,在燒瓶中加入約2〇〇毫升的 乙醇’並持續的濃縮以便去除殘留的D C Μ。所得部分溶解 的落液在蒸汽浴上加熱而得完全溶解的溶液,將溶液置於 冰浴中冷卻至〇 - 5 °C,並加入4 0 0毫升的水,強力的攪拌。 在冰浴中持續攪拌黏稠產物〜1小時,過濾,並以1 〇 〇毫升 的水清洗,透過漏斗隔夜抽氣將產物乾燥後可得Ί 8.8克 (19.5 毫莫耳)Fmoc-Ile-Glu(OtBu)-Gly-Pro-Thr(tBu)-Leu- ____ -47- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 515804 A7 B7 經濟部中央標準局賀工消費合作社印製 五、發明説明(45 ) 〇H,HPLC顯示具98.3%面積的純度。 Fm〇CR(Pbf)Q(tit)(l-Nal)LA-OH 的合成 1公升的肽容器裝入HMPB-BHA樹脂(35克,30.8毫莫耳) 及3〇〇毫升卜甲基-2-吡咯啶酮(NMP)。以氮氣攪拌溶劑中 樹脂約3 0分鐘,以便將其條件化使樹脂小珠膨脹。同時在 室溫下,將Fmoc-Ala-OH(28.8克,3當量)溶於2〇〇毫升之 Ν Μ P中,將該溶液置於曱醇/水/冰浴中降溫_ 5。(3至自〇 °C,而後加入二甲基胺吡啶(DMAP )(750毫克,〇·2當量) 並使其溶解。加入二異丙基碳二亞胺(DIC)(14.3毫升,3 當量)及〗00毫升的二氣甲烷(DC M),在0°C下攪掉該溶液 2 0 - 3 0分鐘,如此可得淡黃色的溶液。將樹脂避乾並將活 化的胺基酸落液倒入容器中,以N 2通氣攪拌混合物5小 時,瀝乾樹脂並以3 X 3 00毫升Ν Μ P清洗,去除樣品,以 Ν Μ Ρ及D C Μ充分清洗,並隔夜乾燥之。用内含苯甲酸奸 (20.9克,3當量)及7.5毫升(3當量)吡啶之ΝΜΡ溶液將樹 脂進行封端,在室溫下攪拌黏稠物1 · 5小時,瀝乾樹脂並以 3 X 3 0 0毫升的Ν Μ Ρ清洗。利用2 X 2 5 0毫升3 0 % Ν Μ Ρ之 六氫吡啶溶液(每次1 〇分鐘)將Fmoc ( 9 -氟基甲基氧基羰基) 自末端胺去除下來,而後用6 X 3 0 0毫升Ν Μ P沖洗樹脂上 F m 〇 c的副產物(二木幷富歸及其六氫ρ比咬内轉物),以陰性 四.氣混試驗測定之。 室溫下,將Fmoc-Leu-〇H(21.8克,2當量)及1-羥基苯 幷三唑(HOBT)(9.4克,2當量)溶於225毫升的NMP中, 將溶液置於0 - 5 °C的冰浴中,加入二異丙基乙胺(DIPeA) _ -48- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
A 訂
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(21 Ox 297公釐) 515804 A7 B7 五、發明説明(46 ) (13.4¾升’ 2.5當量)並攪拌3-5分鐘’再加入0 -苯幷三峻 -1-基-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)(23.4克,2 當量)及7 5毫升D C Μ,並攪拌溶解,約5分鐘。將活化的 酸溶液加至瀝乾的樹脂中,並以Ν 2通氣攪拌1小時。用水 合第三自同測試監控偶合作用的完成,樹脂遞乾並以3 X 3 〇 〇 毫升的Ν Μ Ρ沖洗之。 利用:Fmoc-( 1-Nal)-OH(27.0 克),Fmoc-Gln(trt)-OH (3 7.6克),Fmoc-Arg(Pbf)_OH(40.0克)重複循環以合成肽 片段後的胺基酸序列,最終的偶合反應後,樹脂以4 X 3 0 0 毫升的Ν Μ P清洗,而後以4 X 3 00毫升的D C Μ清洗。 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填頁) 利用内含1 %三氟乙酸之D C Μ將肽自樹脂上切除下來, 收集分液並以HPLC分析產物成分。收集4個300毫升的分 液,3個500毫升的分液,及其後5個250毫升的分液並分析 之,分液5 - 1 1用吡啶調整ρ Η至〜3 - 4,而後倒在一起,並 在旋轉的蒸發器上濃縮至近乾,在燒瓶中加入約2 〇 〇毫升 的乙醇,並持續的濃縮以便去除殘留的D C Μ。所得部分溶 解的溶液在蒸汽浴上加熱而得完全溶解的溶液,將溶液置 於冰浴中冷卻至0 - 5 Ό,並加入2 0 〇毫升〇 1 ν H C1,其後 加入200毫升的水。在冰浴中持續攪拌黏稠產物〜1小時, 過濾’並以1 00毫升的水清洗,透過漏斗隔夜抽氣將產物 乾燥後可自樹脂上得74%產量(自分析樹脂的產量 >9 5%)Fmoc-Arg(Pbf)-Gln(trt)-(l«Nal)-Leu-Ala-OH(3 1 9 克,22·8毫莫耳),HPLC顯示具94.8%面積的純度。 H-AR(Pbf)(Sar)-OBzl 的合成 -49- 本纸張尺度適用中.國國家標隼(CNS ) A4規格(210X29*7公釐) 515804 A7 B7 i、發明説明(47 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在室溫下,將Fm〇CArg(pbf)_OH(3當量),二甲基胺基口比 啶(〇·3當量),及二異丙基碳二亞胺當量)攪拌溶於卜甲 基-2 -吡咯啶酮(Ν Μ P,1 〇體積),將該溶液加至内含[心 (4-羥基甲基-3-甲氧基本氧基ρ 丁酸](ΗΜρβ)之肽容器 中,並以Ν2通氣攪掉3 - 6小時,藉由切除樣品的HpLc定量 刀析測足負載效率。將鍵結Fm〇cArg(Pbf)之樹脂與3 〇 %六 氫吡啶/NMP(2 X 10體積)反應1〇“5分鐘,將末端胺進 行以去保護作用,以NMP(60-80體積)清洗樹脂至呈現六 氫吡啶陰性四氯混反應。利用〇_苯幷三唑_卜基_ n,n,n’,n’ -四甲基脲六氟磷酸(HBTU,2當量)及卜羥基 尽并二唑(HOBT,2當量)與二異丙基乙胺(〇11^八,2」當 幻將Fm〇CAla-OH(2當量)於NMp中(5]〇體積)於卜5τ r先活化之,而杈轉移至樹脂混合物中並以氮氣通氣3 〇 · 9 0刀鐘。利用水合第三酮測定監控偶合效率。以 NMPC2 5 -3 0體積)清洗樹脂並重複偶合循環,以提供支鏈 疋全保護且聯結至樹脂的肽。在切除肽之前,《用二氣甲 ^ ( D C Μ,4 0 - 6 〇體積)清洗掉樹脂上之Ν μ p,以數次^ % 一氟乙I / D C Μ ( 2 0體積)清洗,可自樹脂上將支鏈保護的 片丰又刀田肽釋放後,樹脂變成深紫色。以監控 切除分液,而後以吡啶中和之,並濃縮成固態殘餘物以進 行步的純化工作。在固態物中添加3〇〇毫升的水,用 0.1N HC1( 1〇〇笔升)將容易的⑼調整至2,以乙酸乙醋(2 〇〇毛升)π洗恝;予液,將乙酸乙酯的萃取液倒在一起並 以飽和的液態氯化納溶液(15〇毫升)清洗之,以¥〇4乾燥 515804 A7 B7 五、發明説明(48 ) rmt mi I·:-·— nm ml v—、 I- -II 1 -^1Hi— i - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 之並濃縮至泡沫狀,加入甲基第5_·(ΜΤΒΕ i⑻毫升)研 磨並磨碎I,收集固態物並乾燥,如此可自樹脂上產得 〜100%之 FmocAR(Pbf)-〇H。 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 將内含Fm〇cAR(Pbf>OH(1 當量),Sar〇Bzl,μ — ^ 鹽 (1當量),HOAT(丨.2當量)及mPEA(2.5當量)之DMF溶液 冷卻至0X:並加入ΗΒΤυ(1·2當量),在〇χ:下攪拌該溶液1〇 分鐘,而後回溫至室溫,再攪拌4〇分鐘。加入丨:丨鹽水/ 水(40體積)以沉澱肽,收集固態物,溶於甲烷(8體積)並 以水(1 0體積)沉澱之。自黏稠狀半固態物中輕輕倒出溶劑 並知半固毖物置於具i下乾燥形成泡沫狀,以Μ τ b e ( 8體 積)粉碎泡沫並磨碎之,倒出溶劑並乾燥固態物,如此可自 樹脂產得15.2克,92%,而具HPLC 99%面積純度的產 物。將產物溶於9 : 1 T H F /六氲吡啶(丨〇體積)中,並在室 溫下攪拌50分鐘,加入MTBE(26體積)及己烷(3 3體積)以 沉澱肽,自半固態物中輕輕倒出溶劑並將半固態物(which gums on exposure to air)於眞空下乾燥至泡沫狀,粉碎泡 沫並以MTBE ( 1 0體積)磨碎之,輕輕倒出溶劑,磨碎的動 作重複2次並乾燥產物,此得產能9 3 %,9 5 %面積純度 HPLC之產物。 利用t-Boc保護作用進行另一種H-AR(Pbf)(Sar)〇Bzl的溶 液合成作用 取8〇〇八13(?5〇-011.0(:1^八(4.96克)分配在5〇毫升乙酸 乙酯及2份各40毫升的0.25M檸檬酸之間,有機層以2個3〇 毫升的水,3 0毫升的鹽水清洗,以硫酸鎂乾燥之,並蒸發 -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4规格(210X297公釐) 515804 A7 _____________ B7 __ 五、發明説明(49 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 土开> 成泡沫狀。將泡沫狀產物,Sar-〇Bzl tosylate鹽 (2.7 1克)及HOAt( 0.98克)溶於5 0毫升二氣甲烷中,將溶液 至於冰浴中冷卻並加入DCc ( 1.50克)及DIPE A ( 1.8毫升), 在冷卻的條件下攪拌反應混合物丨/ 2小時,而後在室溫下 攪拌1 8小時,過濾混合物去除沉澱的〇 C U,而在眞空下蒸 發去除二氯甲烷,將殘餘的油狀物溶於乙酸乙酯中,並以 〇. 1 Μ檸檬酸,水,碳酸氫鈉溶液,水及鹽水長時間清洗, 清洗液以硫酸鎂乾燥之,過濾並揮發成透明狀的泡沫(41 5 克)。Boc-Arg(Pbf)-Sar-〇Bzl(3.8 克)溶於 20 毫升的二氯曱 燒中,並在此溶液中加入内含H C 1之MTBE ( 1 〇毫升)溶 液 土 ^技摔違’昆合物1小時’直到T L C分析顯示沒有起 始物質的存在,在高壓下隔夜蒸發該溶液至乾。將泡朱狀 物,Boc_Ala-OH(1.14 克)及HOAt(0.81 克)溶於 2〇 毫升的 二氯甲烷中,將該溶液置於冰浴中冷卻並與DCC ( 1 24克) 及DIPEA( 1.5毫升)反應之,在冷卻的條件下攪拌反應混合 物半小時,其後在室溫下攪拌1 · 5小時。以過濾法去除沉 澱的D C U,以5 0毫升的乙酸乙酯取代二氯甲烷,並以棒樣 酸’水’碳氫化鈉溶液,水及鹽水清洗之。清洗的有機層 溶液以硫酸鎂乾燥之,並蒸發至形成泡沫狀(3.6 6克),以 H C 1處理泡沐狀物(如前述二爿大的方法),如此可產生氯酉六 徵形式的 Arg(Pbf)-Sar-OBzl。
H-R(Pbf)Q(Ut)(l-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)-〇Bzl 的合成 將内含 Fmoc(Pbf)Q(trt)(l-Nal)LA-〇H( 1 當量卜^八^ Arg(Pbf)-Sar-OBzl( 1 當量),H0AT( 1.2 當量)及 DIpEA -52- 本纸張尺度適;fl中國囤家標莩(CNS ) Λ4規格(210X 297公犛) 515804 Α7 Β7 五、發明説明(50 ) (2.2當量)之DMF( 12體積)溶液冷卻至〇 °C,並加入 HBTU( 1.2當量),將該溶液回溫並攪拌5〇分鐘。在溶液中 加入水(2 5體積)以沉澱肽,過濾收集固態物。將仍然潮濕 的固態物溶於熱乙醇中(〖5體積),而後冷卻攪拌至3 〇 °C, 以過濾法收集所得的固態物並乾燥之,如此可的產能 7 5 %,9 1 %面積HPLC純度之產物。將固態物溶於9 : 1 T H F /六氫吡啶(1 5體積)中,並在室溫下攪拌5 〇分鐘, 加入ΜΤΒΕ ( 1 5體積)以沉澱肽,過濾收集固態物,而後以 溫乙醇(8體積)磨碎之,在攪拌冷卻至室溫後,收集固態物 並乾燥之。如此可得產能9 2 %,9 3 %面積hplc純度的產 物。
FmocIE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(l-Nal)LAAR(Pbf) (Sar)-OBzl 的合成 將内含Fm〇cIE(tBU)GPT(tBii)L-OH(l 當量),:^ R(Pbf)Q(trt)(l-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)-OBzl( 1 當量), 經濟部中央標李局員工消费合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) HOAT( 1.2 當量)& DIPEA(2 當量)iDMF( 13 5 體積)之溶 液冷卻至0X:,並加入HBTU,將溶液回溫並攪拌1小時, 在落敗中加入水(2 0體積)以沉澱肽。收集固態物並與甲醇 (8體積)磨碎之,收集固態物,乾燥並溶於9 8/2之DC Μ /甲醇(5體積)中,將溶液加至内含700克矽膠(處於9 8 / 2 D-CM/甲醇中)的層析管柱中,以1.6公升98/2之DCM/ 甲醇,1公升97/3之DC M/甲醇及95/5之DCM/甲醇 沖牷層析管柱,收集内含產物的分液並倒在一起,濃縮至 形成此未狀。如此可得產能8〇 7%,85%面積hplc純度的 -~~__ - 53 -本纸張人度通财_家標净_ ( CNS ) Λ4規格( 515804 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明(51 ) 產物。
FmocIE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)( l-Nal)LAAR(Pbf) (Sar)-OH的合成 將内含FmocIE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(l-Nal)LAAR (Pbf)(Sar)-OBzl 之8 : 1 DCM/ 乙醇(15 體積)溶液以 pd/ C ( 0.4重量,第格薩型E i 〇 1,1 〇 〇/0乾重,5 0 %水)處理之, 以氮氣通氣反應槽並抽眞空3次,置於氫氣下(氣球)並在式 溫下攪拌2 0小時’將黏網物過濾至娃藻土爲填充床的過;慮 器,將濾液濃縮至約2體積,並加入MTBE ( i 〇體積)以沉 殿肤,收集固悲物並乾燥至成灰色固態物。如此可得產能 爲96%,85.5 %面積HPLC純度的產物。 [FmocIE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(lNal)LAAR(Pbf)(Sa i)]2LysNH2 的合成 在室溫下攪拌内含 FmocIE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt) (lNal)LAAR(Pbf>(Sar)-〇H(2.4 當量),(HCl)2LysNH2(l 當量),HOBT(2.5 當量)及 EtPr2N(4.8 當量)之 DMF(15 體 積)黏稠液直至所有的固態物溶解(5分鐘),在溶液中加入 HBTU( 2.5當量),在室溫下攪拌2小時後,加入水(3〇體積) 以沉;殿肽,以過;慮法收集粗製的肽,仍然潮濕的固態物溶 解於熱乙醇中(1 2.5體積),而後冷卻至室溫並隔夜攪拌。 收集固態物並乾燥。如此可得8 0 %面積Η P L C純度的產 物。 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公釐) i 丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 515804 A7
7 B 五、發明説明(53 ) 濃縮並冷凍乾燥之。如此可得完全來自保護之前驅物純化 的肽,通常產能在1 0 %至2 5 %。 範例1 A中經確認的結構性肽片段可組合成AF 1 5 705。利 用質譜儀(MS)確認分子量,利用胺基酸分析儀(AAA)確 認組成物,利用艾曼(Edman )分解法定出肽的序列。 化合物# MS/ID [m+ΗΓ AAA1 艾曼 分解法2 H-AR(Pbf)(Sar)-OBzl 659.3 符合 符合 FmocR(Pbf)Q(trt)( l-Nal)LA-OH 14 ⑻.6 '符合 符合 FmocIE(tBu)GPT(tBu)L-OH 963.5 符合 符合 H-R(Pbf)Q(trt)(l- Nal)LAAR(Pbf)(Sar)-OBzl 1818.9 符合 符合 FmocIE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)( l-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)-OBzl 2763.4 符合 符合 FmocIE(iBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)( l-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)-OH 2673.4 符合 符合 [FmocIE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q-(trt)( l-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)]2 LysNH2 未執行3 符合 符合 AF15705 3293.9 符合 符合 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 1結果與期望的A A組成相符 2結果與期望的A A序列相符 3未執行-母離子質量超過質譜儀的範圍,且保護基阻礙分 本纸張尺度適用中國围家標準(CNS ) Λ4規格(2丨0X 297公釐) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 515804 A7 B7 五、發明説明(54 ) 子上的雙價(即[m + 2 Η ]2 + ),因此未偵測到相關的離子。 肽的聚乙二醇化作用 Β、用支鏈PEG(20,000分子量)的PEG2製備二PEG化的 AF 1 3 948 (參考流程1) 將AF13948溶於lOOmM之N -二(經乙基)甘胺酸(pH 8.0) 中,使其濃度爲10毫克/毫升,加入1.25倍莫耳過量的粉 末狀PEG2(購自歇爾瓦特聚合物公司(Huntsville,AL)並 於室溫下攪拌直至反應完全,特徵是需1 · 2小時,利用4 0 -65%乙腈悌度及裝有YMC ODS AQ層析管柱的逆相HPLC 監控反應的進行。當反應完全後,在溶液中第2次加入1.25 莫耳過量的粉末狀P E G 2,且此步驟重複4次,每莫耳的 AF13948共用5莫耳的PEG2。用PBS稀釋溶液2倍以減少 溶液的黏稠性,並加至事先以用P B S平衡及沖提過之 superdex X 2 00層析管柱中(法馬西亞),利用逆相HPLC分 析自區分大小層析管柱得來的分液,將較任何單_ peg· AF 13 948先沖提出來並含二-peg-AF 13948的分液倒在一 起,置於5 °C下保存或冷凍乾燥之。 C、利用SPA-mPEG 20,000分子量製備二-PEG化之 AF13948 (參考流程3) 將AF13 948溶於lOOmM之N-二(羥乙基)甘胺酸(pH 8.0) 中.,使其濃度爲1 0毫克/毫升,加入5倍莫耳過量的粉末 狀SPA-mPEG(購自歇爾瓦特聚合物公司(Huntsville,AL) 並於室溫下攪拌直至反應完全,特徵需2小時。利用逆相 HPLC( YMC ODS AQ)監控反應的進行。當反應完全後, -57- 本紙張尺度適用中國國家標學.(CNS ) Λ4規格(2】0X297公釐) !-- - - a -I - ί_ι - -- I - - ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 515804 A7 _ B7 五、發明说明(55 ) , 用去離子水知此;4·液稀釋1 〇倍,並加至事先以用2 m μ麟酸 鈉緩衝液(pH 7.0 )平衡sp-sepharose層析管柱中,未反應 的P E G及N H S會從層析管柱中流出,而後利用〇至1 5〇mM NaCl梯度將PEG化的AF13948沖提出來,又二_pEG-AF 1 3948形式的物質較任何單_peg_af 13948先沖提出 來’以逆相Η P L C分析分液,並將適當的分液倒在一起, 將二-PEG化-AF 13948緩衝液換成PBS緩衝液,並置於5°c 下保存或冷凍乾燥之。 D、 利用mPEG醛20,000分子量製備二-PEG化之 AF 13 848 (參考流程2) 將AF13 948溶於lOOmM之磷酸鈉溶液(pH 7.0)中,使其 濃度爲10¾克/耄升,加入6倍莫耳過量的粉末狀peg酸 (購自歇爾瓦特聚合物公司(Huntsville,AL),加入氯 氫硼化納溶液使其最終濃度爲1 〇 〇 m Μ。,於室溫下攪拌1 8 小時,而後利用3 Κ (阿米肯Υ Μ )超過濾膜將緩衝液換成 P B S,用P B S將溶液稀釋2倍以減低溶液的黏稠性,並加 至事先以用P B S平衡及沖提過之superdex X 200層析管柱 中(法馬西亞),利用逆相HPLC分析自區分大小層析管柱得 來的分液,將較任何單- PEG-AF 13 948先沖提出來並含二· PEG-AF 13 948的分液倒在一起,置於5 °C下保存或冷;東乾 燥之。 E、 利用SPA-mPEG 20,000分子量製備二-PEG化之 AF 15 705(二-PEG(20K)AF15 705 ) -58- 本紙張尺度適用中國國家標率((,NS ) /U規格(210X297公漦) IT : - I— II -1- ILJ .......I 1- 一 ·. -I— —!; I. in- —ii --- I ----- Hi -Hi (請先閱績背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 515804 A7 __________B7 五、發明説明(56 ) CH3〇-(CH2CH20)452-CK2CH2>C(0)-NH-IEGPTLRQ(1-Nal)LAAR(Sar)
' I CH30-(CH2CH20)452-CH2CH2-C(0)-NH-IEGPTLRQ(1-Nal)LAAR(Sar)K(NH2) (di-PEG(20K) AF15705) AF 15705 (2.30克重)置於備有攪拌功能的燒瓶中,並通 以氮氣及保持在室溫下,加入MillQ水(177毫升)並攪掉直 至溶解。取出>〇微升溶液,用水稀釋至1毫升,以@284毫 微米的UV讀値(9.36毫克/毫升)測定濃度。·在溶液中加入 後酸氫鈉(0.292 1克)並攪摔溶液直至完全溶解(測定ρ η爲 8 )’在氮氣存在下,戴手套秤重μ-SPA-PEG-2 Ok(些耳 瓦特公司)8.67克至密封的瓶子中,共秤4個瓶子,將其置 於密封的塑膠袋子中,並保存在5。(:下直至加入反應。$ 中一個是在碳酸氫鈉丨容解後立即加入,第二彳固是在〇·5小時 後加入,第三個是在第二加入後丨小時再加入,而第四個 則是在第三個加入後1小時苒加入。於室溫下隔夜攪拌反 應物’以液® 5 % E t Ο Η將反應混合物稀釋9倍,並經〇 * 5微 米之硝酸纖維素濾膜過濾之。將濾液加至強陰離子交換層 析管柱(SP Sepharose Fast Flow,1 〇 公分 X 5 3 公分)中, 流速爲20毫升/分鐘。利用pH 6‘0之2mM磷酸鈉沖提9〇 分鐘’接著以6 X)分鐘内可將p Η 6 · 0之2 m Μ ^粦酸鈉增至 1 0 m Μ磷酸鈉的悌度沖提,最後以9 0分鐘内可將ρΗ 7 〇之 1 OmM磷酸鈉增至100%PBS的梯度沖提,此色層層析法>的 流速爲1 00毫升/分鐘,偵測器定在2 1 5毫微米。利用連續 一 -59- ^^張尺度適川中國國家標绛((:>^)/\4規格(210父297公釐) 一---- 請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 0, 515804 Λ 7 Β7 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明(57 ) 的 G3000SW X 1 及 G4000SW x 1 TSK 層析管柱以 SEC_ HPLC分析層析管柱的分液,將> 9 5 %產物的分液倒在一 起,並利用UFP-30-C-6A空纖維管之a/g技術將其濃縮至 h笔克/笔升。將滯留液以5。(:的循環水槽冷卻之,並以 N 2通氣。將產物落液換成6倍滯留液體積的水,而 後進一步濃縮至66毫克/毫升。在合成,純化及超過濾之 後可得 2 1 克的產物。以 MALDLTowm^nx assisted laser desorption time of flight)質譜儀分析測定產物的分子量分 布很廣,中心位置在46000道耳頓,逆向或混合式HpLC純 化之彳交所得的產物經胰蛋白酶消化之後確認p E G的接合位 置(兩個N端)及位於肽的接合位置均未被破壞。 (狂:MALDI-TOF-MS顯示起始的]?]£(3爲21 5kd而非廣 告上的 20kd,因此,Mw = 2 1500(PEG) X 2 + 3295 (AF15705) = 46000)。 範例2
生物分析I 利用血小板生成依賴細胞增生分析法測定肽的生物活 性。以人類TP0-R全長基因轉植鼠類IL-3依賴8&/;?3細 胞,由於缺乏IL-3(WEHI-3條件化的培養基),這些細胞 需依賴T P 〇以增生。雖然母細胞,未轉植的細胞株對人類 T P 0沒有反應,但仍爲I L - 3依賴性的。 以上述兩種細胞株進行根據本發明的化合物之生物分析 方法’細胞生長於内含10% WEHI-3條件化培養基之完全 R Ρ Μ I - 1 〇培養基’’而後以ρ β s清洗兩次,再懸浮於缺乏 -60- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210 X 297公| ) 1!>-! - - Γ 1= !:1 I = ! - -I. I! 1 I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T Φ! 515804 Α7 Β7 五、發明説明(58 ) WE H r-3條件化培養基中,並將細胞加至含有肽稀釋液或 τ P 0的槽孔中,其加入量爲2 X 1 〇 4細胞/槽孔。將細胞置 於3 7 C下並含5 % C 0 2溼度條件培養4 8小時。在E LIS A培 養盤判讀機上,以5 7 0毫微米的吸收値測定經由MTT成甲 雅的減少量以分析代謝活性,待測肽刺激TP〇-R轉植Ba/ F 3細胞的增生之劑量依賴方式如表1所列,這些肽對母細 胞株沒有效果。 範例3 I建結親合力 · 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 競等性鍵結分析法可測定根據本發明化合物對丁?〇-11的 键結親合力。微定量盤的槽孔先以1毫克的抗生物素 (streptavidin)塗覆,再以Pbs / 1 %BS A阻斷之,繼之以 50毫微克的生物素化抗受體固定抗體處理之(ΑΜ79),而 後以可落性TPO-R收集物之} : 1〇稀釋液處理槽孔,各種 濃度的待測物與定量之截型τρ〇(丨_ 156殘基與麥芽糖鍵結 蛋白質的c端融合一起)(μβρ-τρο156)混合一起。將Μβρ_ ΤΡΟ〗56混合物加至tp〇-R塗覆的槽孔中,置於下培養2 小時’而後用PBS清洗之。加入兔子抗Μβρ之抗血清測定 平衡時鍵結的MBP-TPOm含量,以標準方法 中鹼性磷酸酶之含量。 母個‘孔 利用某範圍濃度之待測化合物進行分析,並將所得絡 圖’ Y.轴代表鍵結MBP-TPOw含量’而乂軸代表待測化| 物的濃度。而後吾人可測定能減少5〇%(IC5〇)鍵結至固^ 化TPO-R上之ΜΒΡ·ΤΡ〇156含量時所需的帶測化濃^ ___ _ -61 - 本紙張尺度適用中樣準(CNS ) Λ4規格(210 Χ 297公釐) ~~ ---- 515804 Λ7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(59 ) 爲何。 範例4— 在此範例中’利用二種分析方法分析參考化合物 AF13948 (H)-IEGPTLRQWLAARA I (Η) -1 E G P T L R Q W L A A R A ([3ala)K(NH2) 的各種取代,,刪減及加成。首先,進行前述的Mtt細胞 增生分析,第二,進4于微生理儀分析方法(分子裝置公 司)’基本上’此分析方法疋測定根據本發明化合物對T p 〇 受體剌激反應後細胞外培養基的酸化速率,E C 5 G的範圍是 以前述ICm方法定之,最後,進行報告分析。將C-f〇s/蟲 螢光素酶報告質體轉植BaF3 / TPOR細胞置於内含 0.1%WEHI-3條件培養基之完全RPMl-io培養基,隔夜不 給予營養物質,而後以P B S清洗。細胞再懸浮於缺乏 WEHI - 3條件培養基的培養基中,並加入含連續稀釋肽之 槽孔中,其加入的細胞量爲5 X 1 〇 5細胞/槽孔。將細胞培 養於3 7°C下,並含5%C02溼度下,添加蟲螢光素後,利用 % 冷光儀測定蟲螢光素酶的表現。 ---— —_ -62- 本紙張尺度·巾關家料(eNS ) A4規格(2U)x 297公楚) 1 丨".1 , ^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 訂 • HJ. ii · 515804 A7 B7 五、發明説明( 表1 肽序列 EC50 _ 細胞 增生 EC50_) 報告 EC50 _) 微生理 儀分析
(H)-IEGPTLRQWLAARA K(NH2) (H)-IEGPTLRQWLAARA'PA 十+ ++ ++
(Ac)-IE(Sar)PTLRQ(1-Nal)LAARA ,K(NH2) (Ac)-IE(Sar)PTLRQ(1-Nal)LAARA-pA ++ :..1 -- - Hi 一-·一 ..1 . 請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁
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(H)-IEGPTLRQWLAARA-pA K(NH2)
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(HHEGPTLRQWL(Ava)R K(NH2) (H)-IEGPTLRQWL(Ava)R-pA
(Η)」ΕΘΡΤΙ^(2ννυ\ΑΚ(Ν-ίτ^ηΊγΙ-Αΐ3) ,k(nh2) (H)-IEGPTLRQWLAAR(N-methyl-Ala)-pA
(Ac)IEGPTLRQWLAAR(N-methyl-Ala) (Ac)IEGPTLRQWLAAR(N-methvl-AlR)-RA 63- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公婊) + +
ND
ND 515804 經濟部中央標準局員工消f合作社印製 A7 B7 五、發明説明(64 ) 範例5 在此範例中,測定各種P E G化肽的藥物動力學特性。化 合物的藥物動力學特性是其藥學活性的重要決定因素,藥 物動力學圖形的主要’分是該化合物在實驗動物血漿中的 持續性,此持續性通常是以在投藥之後,化合物在血裝中 的濃度對時間的函數表現。 這些實驗自始至終所用的是雄性2 0 - 2 5克B alb / c老鼠。 以I V或S C注射2 0 0毫升的體積,媒劑爲杜沛克氏p b S ; 5 % DMSO : 〇· 1 %重量/體積BS A。將動物殺死後收集血漿, 並以肝素爲抗凝血劑。 利用報告細胞分析方涂測定化合物的濃度,血漿稀釋液 加至Baf/3 TPOr/fos/lux構築3中,在添加蟲螢光素 後,利用冷光儀測定蟲螢光素酶的表現,每個血漿樣品的 激發活性轉換成以每單位體積血漿中化合物的肽當量濃度 表現之(η Μ或毫微克/毫升),此濃度用是與母化合物的報 告分析法之標準曲線圖比較而得的。 表3中列有化合物AF 13 948及二-PEG化AF 13948 (聚乙二 醇(PEG)平均MW = 5 000D)於注射700微克肽當量/公斤 後,時間與血漿中的濃度的函數。投與AF 1 3 948後會導致 血漿中可偵測的活性高於媒劑注射老鼠體中的含量,直至 注射6 0分鐘後。添加5K PEG會增加其在血漿濃度達1 〇〇 倍,並延長其在血漿中可偵測的時間,直至至少注射240 分鐘後。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公漦) (1/先閱#背面之注意事項再填寫本頁) 訂 辱· 515804 A7 B7 五、發明説明(65 ) 表3 IV注射700微克肽當量/公斤之AF13948及二-PEG(5K)_AF13948 後,其在血漿中的涑度,以肽當量(毫微克/毫升)表示之 時間(分鐘) 二-P/G(5K)-Af 13948 AF13948 媒劑 10 361.36 0.80 0.02 30 91.49 0.26 0.02 .60 54.59 0.11 0.02 120 16.54 0.04 0.03 240 11.20 0.02 0.01 請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 表4 中列有化合物二-PEG(5K)-AF13948 及二-PEG(20K). AF 13948於注射500微克肽當量/公斤後,時間與其在血 漿中濃度的函數。20K PEG-修飾的化合物在血漿中的濃度 及持續性較前述二-卩£0(5反)-八? 13948增加很多。 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 IV注射500微克肽當量/公斤之AF13948及二-PEG(5K)-AF13948 後,其在血漿中的濃度,以肽當量(毫微克/毫升)表示乏 時間(小時) 5K 20K 媒劑 0.5 54.56 1257.50 ~~ ----- 0.04 1.5 16.89 3481.31 0.03 4 2.76 1970.46 0.02 -68 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(2i〇y 297公趋 515804 A7 B7 7; 發明説明(66 8 1.02 1158.59 0.02 16 0.17 259.41 0.03 24 0.13 710.75 0.04 表5中列有注射1 〇〇,1 〇及1微克肽當量/公斤之二_ PEG(20K)二-AF13948化合物後,其在血漿中的濃度及至 注射120小時後的持續性。結果發現其在血漿中濃度與投 藥的劑量成正比,投與單一 100微克/公斤劑量化合物 後’其在血漿中濃度的時間至少維持到注射後9 6小時。 IV〉王射1,10或100微克肽當量/公斤後, --中二-PEG(20K)-AF13948inMH;詹麿 時間(小時) 劑量(亳克/公斤) 100 10 1 2.93 經濟部中央標準局負工消費合作社印製
2.63 2.33 0.98 1.39 0.90 0.20 0.06 --------Γ--------訂______---, λ— (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) 紙 度適用中國國家標準 -69- )Λ4規格(210X 297公釐) 515804 A7 B7 五、發明説明(67 ) 72 15.19 0.57 0.01 96 0.42 0.01 0.00 120 0.02 0.01 0.00 表6中列有SC及IV注射1 〇微克肽當量之二_peG(20K)-AF 1 3 948後,其在血漿中的濃度。SC注射單一 1〇微克肽當 量/公斤劑量會增加其在血漿活性達注射後9 6小時,用此 兩種方式投藥後血漿濃度結果顯示SC投與二- PEG(20K> AF1 3 948具良好的生物價値。 .__*___Γ____ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 表6 以IV及SC注射10微克肽當量/公斤後,血漿中二_ PEG(20K)-AF13948 的濃度 時間(小時) SC IV 0.08 0.02 32.89 0.25 0.06 45.48 0.5 0.09 29.16 1.5 0.36 39.12 3 0.82 25.77 8 1.48 8.33 24 7.27 11.79 48 1.09 0.70 -70- 訂 本紙張尺度適Λ中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公釐) 515804 A 7 _ _ B7 五、發明説明(68 ) 72 / 0.03 0.57 / 96 0.01 0.01 120 0.01 0.01 除此之外,圖 1 顯示 GW35078 1 ,4:-PEG(5K)- AF 1 3 948比未P E G化的肽形式穩定性高,如增加其半衰 期。因此,圖1顯示經P E G偶合的肽具良好的生物價値, 並能增加在人類血清中的穩定度。 . 範例6 利用前述的分析方法測定各種用P E G衍生化的肽之藥物 動力學特性,在此實驗中,肽分別經支鏈PEG2(20K)、酯 聯結PEG(SPA)及醛聯結PEG(ALDH)衍生化,説明如流程 1-3。圖2顯示以SC注射10微克肤當量/公斤後,其在血 漿中的濃度,從圖2可明顯看出所有三種經不同P E G衍生 化的肽化合物具良好的藥物動力學特性。 範例7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在此實驗中,以老鼠模式評估P E G衍生化肽對血小板減 少症之效果。在此分析方法中,於第〇天時,B alb / C老鼠 以腹膜内方式投與carboplatin(90毫克/公斤),以使其罹 患血小板減少症,而在第1-9天(s.c.qd)則投與 GW35078 1 ( 1 毫克 / 公斤 / 天),或二-PEG(5K)-AF13948 ,及 GW350805 ( 32.5 微克 / 公斤 / 天),*:_peG(2〇K)-AF 1 3 948。從圖3 - 4明顯看出,在約第1 0天時,p E G衍生 -71 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格( 210X297公釐) 經濟部中央標準局員工消費合作社印51 515804 Λ 7 '^ ---------Β7 五、發明説明(69 ) ' 化的肽可改善carboplatin引發的血小板減少症,這些結果 明顯的顯示出本發明PEG衍生化的肽可以舒緩老鼠模式中 血小板減少症的症狀。 範例8 在此實驗中,以老鼠模式評估p E G衍生化肽對血小板含 量之效果。在其中一個實驗中,於第丨_ 9天時(s. c. qd )投與 GW35078 1 ( 1毫克/公斤/天),在第1 _ 1 5天時,不同間隔 時間自尾部靜脈血管抽取血液樣品。從圖5 _ 6中明顯看 出,P E G衍生化的肽能增加血小板,且2 〇 K -二P E G衍生 化肽GW3 5 0 805的效果約爲5 K-PEG衍生化肽GW35078 1的 100 倍。 另一個實驗中,在第1 - 5天投與GW35078 1及GW305805 ’第6天時殺死動物,並計算循環血液中血小板的數目。 圖7 - 9中列有各種不同p e G衍生化肽單一劑量對多劑量的 效果。此結果明顯的顯示本發明經p E G衍生化的肽可用以 增加老鼠動物模式中血小板的含量。 此專利説明書中所揭示之所有的文獻及參考資料(包括專 利文件)的整體内容,不論何種目的均併入本專利説明書參 考。 -72- 本紙张尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X297公筇) J —J ----------1T-------^9. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Claims (1)
- 515804 第086118867號專利申請案 中文申請專利範圍倐正太(91年4月) A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 W9曰修正補充1· 一種式(I)化合物 X, IEX2PTLX3X4X5LXsX7X3X9X10 , \ " K(NH2) (!) . / Χ1ΙΕΧ2ΡΤίΧ3Χ4Χ5ίΧ6Χ7Χ8Χ9.Χ10. * 其中: Xl是氫或醯基其係選自曱醯基、三氟乙醯基及乙醯基; X2是甘胺酸(Gly)或肌胺酸(Sar); X3是精胺酸(Arg),丙胺酸(Ala),正白胺酸(Nle)或 N -乙酿基離胺酸(Ac-Lys); X4是魏胺醯胺酸(Gin)或鲍胺酸(Glu); X5是色胺酸(Trp),L-1-萘基丙胺酸(i-Nal)或苯丙胺 酸(Phe); X6是丙胺酸(Ala),5 -胺基戊酸(Ava)或2 -胺基丁酸 (Abu); X?是丙胺酸(Ala),二苯丙胺酸(Diphe)或X7不存在; X8是精胺酸(Arg),對-胺基苯丙胺酸(p-axnino-Phe), N-乙醯基離胺酸(Ac-Lys)或X8不存在; X9及X9,相同或不相同,為丙胺酸(Ala),冷丙胺酸(/3 Ala) ’ η -甲基丙胺酸(n-Me-Ala),肌胺酸(Sar), 或X9及X9,不存在; X10&X10,相同或不相同,為丙胺酸(/JAla),或乂10及 X 1 〇,不存在; 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱) 515804 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 及其醫藥學上可接受的衍生物; 但是下列化合物除外, (HHEGPTLRQWLAARA \ : • K(NH2) / (H)-IEGPTLRQWLAARA-/3A 2.根據申請專利範圍第1項之化合物,其係選自: , (Ac)-IE(Sar)PTLRQ(1-Nai)LAARA -K(NH2); (Ac)-IE(Sar)PTLRQ(1-Nal)LAARA-/3A · (HHEGPTLRQWLAARA ’ K(NH2); (H)-IEGPTLRQWLAARA (H )-1 EG PTLRQ WLAARA-/3A· 。 • . /K(NH2); * (H)-IEGPTLRQWLAARA:/3A (H)-!EGPTLRQWLAAR-/3A ,(NH2); (H)-IEGPTLRQWLAAR-/3A (H)-!EGPTLRQWL(Ava)R • . K(NH2); (H)-IEGPTLRQWL(Ava)R-/3A ’ (HHEGPTLRQWLAAR(N—曱基 1-Ala) /K(NH2); (HHEGPTLRQWLAAR(N··甲基-AlaH3A -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 515804 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 (Ac)旧GPTLRQWLAAR(N-.甲基丨-Ala) yK(NH2); (Ac)lEGPTLRQWLAAR(N-·甲基-Ala)-/3A ^ (H)-!EGPTLRQWLAA(p-amino-Phe)A :. K(NH2); / ' Γ (H)-IEGPTLRQWU\A(p-amino-Phe)A · (H)-!EGPTLRQWU\A(Ac-Lys)A K(NH2); (H)-IEGPTLRQWLAA(Ac-Lys)A (H)-IEGPTL(Ac-Lys)QWU\A(Ac-Lys)A K(NH2); - I (H)-IEGPTL(Ac-Lys)QWLAA(Ac-Lys)A' λ . · (H)-IEGPTLRQ(1-Nal)LAAR-/3A K(NH2); (H)-IEGPTLRQ(1-NaI)UV\R-/3A (H)-IEGPTLRQWLAAR-(Sar) ' /K(NH2); (H)-IEGPTLRQWLAAR-(Sar) (H)-lEGPTLRQ(1-Nal)LAAR-(Sar) . K(NH2)^ (HHEGPTLRQ(l-Nal)LAAR-(Sar) (H)-IEGPTLROFLAAR-/3A K(NH2); (H)-IEGPTLRQFLAAR-/3A 3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) D8 六、申請專利範圍 (H)-IEGPTLRQ(1-NaI)LAA(Ac-Lys)-(Sar) /K(NH2); (H)-IEGPTLRQ(1-Nal)LAA(Ac-Lys)-(Sar) (HHEGPTLRE(l-Nal)LAA(Ac-LysHSar)、\ .. ' 聊2); / * (HHEGPTLRE(1-Nal)LA^(Ac-LysHSa「) (H)-IEGPTLAQ(1-NaI)LAA(Ac-Lys)-(Sar)^ K(NH2); , / ' (H)-IEGPTU\Q(1-NaI)UV\(Ac-Lys)-(Sai;). . (HHEGPTLAE(1-Nal)LAA(AoLys)-(Sar)\ .· K(NH2); ' / (HHEGPTLAE(1-Nal)U\A(Ac-Lys;HSar)。 (Η)-1Ε0ΡΤΙ^0(1-Ν3ΐ)ίΑΑ(Ν1θ),·(53「| · ’ · K(NH2); • * / (H)-lEGPTLRQ(1-Nal)LAA(Nle;KSa「) (H)-lEGPtL(Nie)Q(1-NaI)LAA(NleHSar)^ ' K(NH2); • / (H)-lEGPTL(Nle)ci(1-Nal)LAA(Nle;KSar) (HHEGPTLRQWL(Abu)(Diphe)\ ^ . K(NH2); ./ (H)-!EGPTLRQWL(Abu)(Diphe)-/3A (HHEGPTLR〇WL(Abu)(Diphe)-R\ K(NH2); / (HHEGPTLRQWL(Abu)(Diphe)-R-/3A -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 515804 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 (H)-ADGPTLREWI(Abu)(Diphe) K(NH2); • / (H)-ADGPTLREWI(Abu)(Diphe)-/3A 及其醫藥上可接受之衍生物。 根據申請專利範圍第1項或第2項之化合物,其中該化合 物是以共價方式聯結至親水性聚合物上。 根據申請專利範圍第3項之化合物,其中該親水性聚合物 的平均分子量介於約500至約40,000道耳頓之間。 裝 5. 根據申請專利範圍第4項之化合物,其中該親水性聚合物 的平均分子量介於約5,000至約20,000道耳頓之間。 6. 根據申請專利範圍第3項之化合物,其中該聚合物是聚乙 二醇。 7. 根據申請專利範圍第6項之化合物,其中該化合物的每個 二聚次單位以共價方式聯結至親水性聚合物上。 8. 根據申請專利範圍第1項之化合物,其係選自:(H)-IEGPTLRE(1-Nal)LAA(Ac-LysHSar) . ,k(nh2); (H)-IEGPTLRE(I-Nal )LAA(Ac-Lys)-(Sar) (H)-lEGPTLRQ(1-Nal)LAAR-(Sar)\ . K(NH2); (H)-IEGPTLRQ(1^Nal)LAAR-(Sar) 及其醫藥學上可接受之衍生物。 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 515804 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 9· 一種以共價方式聯結至親水性聚合物之化合物,· K(NH2) (H)-iEGPTLRQWLAARA-pA . 10· —種化合物 CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-C(0)-NH-IEGPTLRQ(1-NaI)LAAR(Sar) I CH30-(CH2CH20)rrCH2CH2-C(0)-NH-IEGPTLRQ(1-Nal)LAAR(Sar)K(NH2) 其中n為約450。 11 · 一種化合物,其係選自(H)-CIEGPTLRQWLAARA -k(nh2) (η) - ciegptlrqwlaXra 與其醫藥學上可接受的衍生物。 12. —種治療罹患可接受血小板生成素促進劑治療之疾病之 醫藥組合物,含有根據申請專利範圍第1、2、8、9、1 0 或1 1項中任一項的化合物及醫藥學上可接受之載體。 13·根據申請專利範圍第1 2項之醫藥組合物,其中該疾病係 血小板減少症。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)
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