JP4128225B2 - レセプターに結合するペプチドおよび化合物 - Google Patents
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Description
本発明は、トロンボポエチンレセプター(c−mplまたはTPO−R)に結合して活性化する、あるいはTPO作動薬として作用するペプチドおよび化合物に関する。本発明は、生化学および医化学の分野で用いられ、特にヒトの疾患の治療に用いられるTPO作動薬を提供する。
トロンボポエチンレセプターに結合して活性化するペプチドおよび化合物は、WO96/40750号明細書に記載されている。
血小板減少症に罹っている患者の血小板濃度の回復が遅いことは重要な問題であり、血小板再生を促進することができる血液成長因子を見出だすことが緊急の課題となっている。本発明は、このような作動薬を提供するものである。
発明の概要
本発明は、式(I)
(上記式中、
X1は、水素、またはアシルであり、
X2は、G、またはサルコシン(Sar)であり、
X3は、R、A、ノルロイシン(Nle)、またはN−アセチルリシン(Ac−Lys)であり、
X4は、Q、またはEであり、
X5は、W、L−1−ナフチルアラニン(1−Nal)、またはFであり、
X6は、A、5−アミノペンタン酸(Ava)、または2−アミノ酪酸(Abu)であり、
X7は、A、ジフェニルアラニン(Diphe)であるか、またはX7は存在せず、
X8は、p−アミノフェニルアラニン(p−アミノ−Phe)、N−アセチルリシン(Ac−Lys)であるか、またはX8は存在せず、
X9およびX9′は同一であるかまたは異なっており、A、βA、n−メチルアラニン(n−Me−Ala)、サルコシン(Sar)であるか、またはX9およびX9′は存在せず、
X10およびX10′は同一であるかまたは異なっており、βAであるか、またはX10およびX10′は存在しない)
を有する化合物、および
その薬学上許容可能な誘導体であって、
但し、化合物
を除くものを提供する。
本発明は、化合物
(H)−ADGPTLREWISF(Ava)ADGPTLREWISF(NH2)、および
および
その薬学上許容可能な誘導体も提供する。
上記の定義および以下において、記号A、βA、C、D、E、F、G、I、K、L、P、Q、R、S、W、Tは、通常のアミノ酸に対する標準的な一文字コード、すなわち
A アラニン
C システイン
D アスパラギン酸
E グルタミン酸
F フェニルアラニン
G グリシン
I イソロイシン
K リシン
L ロイシン
P プロリン
Q グルタミン
R アルギニン
S セリン
W トリプトファン
T トレオニン
である。
重複をさけるため、略号
を本明細書で用いるときには、構造
を示すことを意味する。
式(I)の化合物の適当な薬学上許容可能な誘導体としては、薬学上許容可能な塩および酸付加塩、薬学上許容可能なエステル、薬学上許容可能なアミド、標識化合物、および以下に定義される各種の親水性ポリマーの1種類以上に共有結合している化合物が挙げられる。
式(I)の化合物は、各種の親水性ポリマーの1種類以上、例えば1種類に共有結合しているのが好ましい。(複数の)親水性ポリマーは、例えば式(I)の化合物のペプチド鎖の一方または両方に結合することができる。親水性ポリマーが両方のペプチド鎖に結合しているときには、親水性ポリマーは同一でもまたは異なっていてもよく、好ましくはそれらは同一である。当業者であれば、式(I)の化合物がX1で各種の親水性ポリマーの1種類以上に共有結合するときには、X1はアシルではないことを理解されるであろう。
式(I)の化合物の好ましい群は、
それらの薬学上許容可能な誘導体であって、キラルアミノ酸が好ましくはL型をしているものである。
式(I)の化合物の更に好ましい群としては、
特に
その薬学上許容可能な誘導体であって、キラルアミノ酸が好ましくはL型であるものが挙げられる。
本発明による化合物という以後の表現は、式(I)の化合物およびそれらの薬学上許容可能な誘導体の両方を包含する。
式(I)の化合物は多数のキラル中心を含んでいるので、光学異性体の対(すなわち、鏡像異性体)、およびラセミ体混合物などのそれらの混合物の形態で存在することが、当業者によって理解されるであろう。式(I)の化合物の総ての異性体およびラセミ体混合物などのそれらの混合物は、本発明の範囲内に包含される。キラルアミノ酸はL型であるのが好ましい。
式(I)の化合物はTPO−Rに対する強力な結合特性を有し、TPO−Rを活性化することができる。従って、このような化合物は、例えば血小板、巨核球および他の幹細胞上で、TPOレセプターの刺激によって改善することができる症状、例えば化学療法(導入補助化学療法、地固め療法、または維持化学療法など)、放射線療法、自己、同種および同系骨髄移植、末梢血前駆細胞および臍帯血前駆細胞移植、悪性および非悪性疾患に対する生物学的または他の治療(例えば、インターフェロンおよび他のサイトカイン)、転移腫瘍および白血病による骨髄浸潤、非悪性疾患(例えば、骨粗鬆症、ゴシェ病)での骨髄浸潤または浸食、再生不良性貧血、骨髄形成異常症候群、骨髄線維症および関連症候群(原発性および二次的)、自己免疫および異種免疫血小板減少症などの免疫および特発性疾患、および薬剤によって誘導される免疫血小板減少症、薬剤によって誘導される血小板減少症(例えば、HIV陽性患者での抗レトロウイルス療法による)、慢性肝疾患(例えば、アルコール性または他の形態の肝硬変)および慢性腎不全、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群および他の細小血管障害などの過剰血小板破壊、および脾機能亢進症、欠陥または異常血小板による出血が起こる先天性症候群、例えばグランツマン血小板無力症、アブセント・レイディアス血小板減少症(TAR)症候群(thrombocytopenia with absent radius(TAR)syndrome)、灰色血小板症候群(gray platelet syndrome)、肝移植、大動脈瘤の修復、大動脈内バルーンカウンターパルセーション、冠状動脈バイパス移植および体外循環および/または多量の輸血を必要とする他の外科的処置、またはHIV関連の血小板減少症、悪性および非悪性疾患(上記)の化学療法、放射線療法および他の療法などの結果見られることがある顆粒球減少症および貧血、悪性、前悪性および非悪性疾患(上記)における骨髄浸潤、免疫および非免疫の特発性および薬剤に関連した貧血および顆粒球減少症の治療、または血液学的悪性疾患自体の治療における治療目的に有用である。本発明による化合物は、例えば血小板、巨核球および他の幹細胞上で、TPOレセプターの刺激が、例えば自己、同種および同系移植のための末梢血前駆細胞の可動化、血小板および他の血液供与体からの収率の増加、エクス・ビボでの血小板生存および品質の向上、血小板および/またはイン・ビトロでの前駆細胞の産生または増大に望ましいものであり、造血機構の検討における診断目的、および巨核球および上記前駆細胞のイン・ビトロでの増大に望ましい治療、診断および研究目的に用いることもできる。
本発明の化合物は、低めのIC50がTPO−Rに対するより強力な結合親和性に相関する下記の実施例3に記載の結合親和性分析によって測定したIC50が約2mM以下である。好ましくは、診断目的には、本発明による化合物はIC50が約2mM以下であり、医薬目的には、本発明による化合物は約100μM以下である。
診断目的に用いるときには、本発明による化合物は検出可能な標識で標識されるので、このような標識のない本発明の化合物は標識化合物の調製における中間体として用いられる。
本発明による化合物を本明細書に記載の親水性ポリマーで誘導体形成するときには、このような化合物の分子量は約500〜約120,000ダルトン、更に好ましくは約8,000〜約80,000ダルトンの範囲とすることができる。
上記のように、更に好ましい態様では、式(I)の化合物は、各種の親水性ポリマーの1種類以上に共有結合している。一般に、このような親水性ポリマーの平均分子量はやく500〜約100,000ダルトンの範囲であり、例えば約500〜約40,000ダルトンであり、好ましくは約2,000〜約40,000ダルトンであり、更に好ましくは約5,000〜約40,000であり、更に一層好ましくは約5,000〜約20,000ダルトンであり、例えば約18,000〜約22,000ダルトンである。好ましい態様では、このような親水性ポリマーの平均分子量は約5,000ダルトン、10,000ダルトンおよび20,000ダルトンである。親水性ポリマーは、分岐状であってもまたは分岐状でなくてもよい。
適当な親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのようなポリアルキルエーテル、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体、およびそれらのコポリマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのようなポリアルキルエーテル、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、およびそれらのコポリマーが挙げられる。意外なことには、ペプチド化合物がこのようなポリマーで誘導体形成されると、それらの溶解度および循環半減期は増加するが、その結合活性はほとんど減少せず、もしあったとしてもわずかであり、その免疫原性は遮蔽されることを見出だした。好ましい態様では、式(I)のペプチド化合物の二量体性サブユニット(ペプチド鎖)のそれぞれは、親水性ポリマーに共有結合している。更に好ましい態様では、本発明の化合物はPEG化しており、すなわちポリエチレングリコール(PEG)に共有結合している。
PEGは、2個の末端ヒドロキシル基を有するエチレンオキシド繰返し単位の線状の水溶性ポリマーである。PEGは、典型的には約500ダルトン〜約40,000ダルトンの範囲であり、例えば5,000、10,000、20,000、30,000または40,000ダルトン(5K、10K、20K、30K、または40K)の分子量によって分類される。現在のところ好ましい態様では、使用されるPEGの分子量は5,000〜約20,000ダルトンの範囲である。本発明のペプチド化合物にカップリングしたPEGは、分岐状であってもまたは分岐状でなくてもよい。(例えば、Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem., 6: 62-69(1995)を参照されたい)。このようなPEGとしては、モノメトキシポリエチレングリコール(MePEG−OH)、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシネート(MePEG−S)、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルスクシネート(MePEG−S−NHS)、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン(MePEG−NH2)、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート(MePEG−TRES)、およびモノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル(MePEG−IM)が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明による化合物はモノ−またはジーペジル化(pegylated)していてもよく、例えば高分子量のPEGを用いる場合には、モノペジル化が好ましい。
式(I)の化合物に結合することができるPEG鎖の例としては、
(但し、nは例えば約450である)
(但し、nは例えば約112〜900であり、例えば約112、225、450、(例えば、425〜500)、675または900である)
(但し、nは例えば約112〜450であり、例えば約112、225または450である)
(但し、nは例えば約112〜450であり、例えば約112、225または450である)
が挙げられる。
本発明の好ましいPEG化した化合物の例としては、下記の
および
それらの薬学上許容可能な誘導体であって、キラルアミノ酸が好ましくはL型であり、「n」が約5〜約1000の範囲の値、例えば10〜約1000、更に好ましくは約100〜約900であり、更に一層好ましくは約110〜約900であり、例えば約112、225、450(例えば、425〜500)、675または900であるものが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、アルデヒド結合(ALDH)PEGについては、nは例えば約450であり、例えば348〜452であり、エステル結合(SPA)PEGについては、nは例えば約112〜900であり、例えば約112、225、450(例えば、425〜500)、675または900であり、分岐状PEGについては、nは例えば約112〜450であり、例えば約112、225または450であり、SS PEGについては、nは例えば約112〜450であり、例えば約112、225または450である。
本発明による特に好ましい化合物は、
であって、nが約450であり、例えば約425〜500であるもの、およびその薬学上許容可能な誘導体であって、キラルアミノ酸が好ましくはL型であるものである。
上記のように、本発明による化合物は、TPOが介在する疾患、例えば血小板減少症、顆粒球減少症、および貧血のような血液学的障害の予防および治療、および血液学的悪性疾患の治療に有用である。従って、本発明は、トロンボポエチン作動薬による治療の影響を受けやすい疾患に罹っている患者の治療法であって、患者に治療上有効投与量または量の本発明の化合物を投与することを含んでなる方法も提供する。
本発明は、治療、特にヒトの医療に用いる本発明による化合物も提供する。
本発明の別態様として、トロンボポエチン作動薬が介在する症状の治療に用いられる医薬の製造における本発明による化合物の使用も提供される。
治療という表現は、予防並びに発症した症状の緩和を包含することを意図するものであることが理解されるであろう。
本発明は、本発明に記載の1種類以上の化合物および生理学的に許容可能なキャリヤーを含んでなる医薬組成物も提供する。これらの医薬組成物は、経口投与形態、並びに吸入粉末および溶液、および注射用および輸液用溶液など様々な形態であることもできる。
【図面の簡単な説明】
第1図は、ヒト血清中でのAF13948およびGW350781(ジ−PEG(5K)−AF13948)の安定性を示し、PEG化化合物が非PEG化化合物と比較して安定性が増加しており、すなわち半減期が増加していることを示している。
第2図は、PEGで様々に誘導体形成した本発明のペプチド化合物の薬物動態プロフィールを示している。この実験では、ペプチドAF15705を、分岐状PEG(PEG2)、エステル結合PEG(SPA)、およびアルデヒド結合PEG(ALDH)で誘導体形成した。得られた結果は、PEGで様々に誘導体形成した3種類のペプチド化合物総てが良好な薬物動態プロフィールを有することを示している。
第3〜4図は、マウスでのカルボプラチン(CBP)によって誘発される血小板減少症に対する本発明のPEG化したペプチド化合物の効果を示している。第3図は、GW350781(ジ−PEG(5K)−AF13948)がマウスモデルでの血小板減少症を緩和することができることを示している。第4図は、GW350805(ジ−PEG(20K)−AF13948)も血小板減少症を緩和することができ、これはGW350781よりも強力であることを示している。
第5〜6図は、正常マウスでの血小板増加症に対するGW350781およびGW350805の効果を示している。得られた結果は、本発明のPEG化したペプチド化合物が血小板増加症に対して良好な効果を有し、20K−ジPEG化したペプチドが5K−ジPEG化したペプチドより約100倍強力であることを示している。
第7〜8図は、正常マウスでの血小板濃度に対するGW350781およびGW350805の様々な投与量の効果を示している。これらのデータは、本発明のPEG化したペプチド化合物が正常マウスの血小板濃度を増加することができることを示している。
第9図は、正常マウスでの血小板濃度に対するGW350805の単回投与量対複数回投与量の効果を示している。
第10図は、β−Alaを有する二量体ペプチドを製造するための一般的合成工程図を示している。
第11図は、β−Alaを持たない二量体ペプチドを製造するための一般的合成工程図を示している。
具体的態様の説明
下記の定義は、本発明の説明に用いる様々な用語の意味および範囲を例示し、定義する目的で提示されている。
「作動薬」とは、相補的な生物学的に活性なレセプターに結合し、これを活性化してレセプターに生物学的応答を引起させ、またはレセプターの先在的生物学的活性を増強させる生物学的に活性なリガンドを表す。
「薬学上許容可能な塩」とは、医薬産業でよく用いられるナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムおよびプロタミン亜鉛塩などの非毒性アルカリ金属、アルカリ土類金属およびアンモニウム塩であって、当該技術分野で公知の方法によって調製されるものを表す。この用語は、非毒性酸付加塩であって、通常は本発明の化合物を適当な有機または無機酸と反応させることによって調製されるものも包含する。代表的な塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナプシル酸塩などが挙げられる。
「薬学上許容可能な酸付加塩」とは、遊離塩基の生物学的有効性および特性を保持し、かつ生物学的などに望ましくないものでない、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸を用いて形成した塩を表す。プロドラッグとしての薬学上許容可能な酸付加塩の説明については、上記のBundgaard, H.を参照されたい。
「薬学上許容可能なエステル」とは、エステル結合を加水分解したときに、カルボン酸またはアルコールの生物学的有効性および特性を保持し、かつ生物学的などに望ましくないものでないエステルを表す。プロドラッグとしての薬学上許容可能なエステルの説明については、Bundgaard, H.監修「プロドラッグのデザイン(Design of Prodrugs)」, Elsevier Science Publishers, アムステルダム(1985年)を参照されたい。これらのエステルは、典型的には相当するカルボン酸とアルコールから形成される。一般に、エステル形成は、通常の合成法によって行うことができる。(例えば、March, 最新有機化学(Advanced Organic Chemistry),第4版,John Wiley & Sons, ニューヨーク(1992年),393〜396頁およびそこに引用されている文献、およびMark et al., 化学技術の百科事典(Encyclopedia of Chemical Technology), John Wiley & Sons, ニューヨーク(1980年)を参照されたい。)エステルのアルコール成分は、一般に(i)1個以上の二重結合を含むことができるまたはできない、かつ分岐状炭素を含むことができるまたはできないC2〜C12脂肪族アルコール、またはC7〜C12芳香族または複素芳香族アルコールを含んでなる。本発明は、本明細書に記載されているエステル、および同時にそれらの薬学上許容可能な酸付加塩である組成物の使用も意図しているものである。
「薬学上許容可能なアミド」とは、アミド結合を加水分解したときに、カルボン酸またはアミンの生物学的有効性および特性を保持し、かつ生物学的などに望ましくないものでないアミドを表す。プロドラッグとしての薬学上許容可能なアミドの説明については、Bundgaard, H.監修「プロドラッグのデザイン(Design of Prodrugs)」, Elsevier Science Publishers, アムステルダム(1985年)を参照されたい。これらのアミドは、典型的には相当するカルボン酸およびアミンから形成される。一般に、アミド形成は、通常の合成法によって行うことができる。(例えば、March, 最新有機化学(Advanced Organic Chemistry),第4版,John Wiley & Sons, ニューヨーク(1992年),393頁、およびMark et al., 化学技術の百科事典(Encyclopedia of Chemical Technology), John Wiley & Sons, ニューヨーク(1980年)を参照されたい。)本発明は、本明細書に記載されているアミド、および同時にそれらの薬学上許容可能な酸付加塩である組成物の使用も意図しているものである。
「薬学上または治療上許容可能なキャリヤー」とは、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げずかつ宿主または患者にとって毒性でないキャリヤー媒質を表す。
「立体異性体」とは、もう一方のものと分子量、化学組成および構成が同じであるが、原子を異なるグループ分けをした化合物を表す。すなわち、ある種の同一の化学残基同士は空間的に異なる配向をしており、従って、純粋なときには、偏光面を回転させる能力を有する。しかしながら、幾つかの純粋な立体異性体では、旋光が現在の装置では検出することができないほどわずかであることがある。本発明の化合物は、1個以上の不整炭素原子をし、従って様々な立体異性体を包含することがある。総ての立体異性体は、本発明の範囲内に包含される。
本発明の組成物に適用される「治療上または薬学上有効量」とは、所望な生物学的結果を誘発するのに十分な組成物の量を表す。この結果は、疾患の徴候、症状または原因の緩和、または生物学的系の任意の他の所望な変更であることができる。本発明において、本発明において、この結果は、典型的には感染症または組織損傷に対する免疫学的および/または炎症反応の減少を伴う。
下記の略号を用いる。
OtBuおよびtBuは、両方とも第三−ブチルオキシであり(OtBuは3文字アミノ酸略号と共に慣習的に用いられ、tBuは1文字アミノ酸略号と共に慣習的に用いられる)、Bzlはベンジルであり、Acはアセチルであり、Meはメチルであり、Abuは2−アミノ酪酸であり、Thiはチエニルアラニンであり、Ac−LysはN−アセチルリシンであり、p−アミノ−Pheはp−アミノフェニルアラニンであり、N−メチル−AlaはN−メチルアラニンであり、Dipheはジフェニルアラニンであり、Sarはサルコシンであり、Avaは5−アミノペンタン酸であり、Nleはノルロイシンであり、trtはトリチルである。
「検出可能な標識」とは、本発明のペプチドおよびペプチド類似体に共有結合するとき、このペプチドまたはペプチド類似体を投与した患者でイン・ビボでペプチドおよびペプチド類似体を検出することができる材料を表す。適当な検出可能な標識は当該技術分野で公知であり、例えば放射性同位体、蛍光標識(例えば、フルオレセイン)などが挙げられる。用いられる特定の検出可能な標識は決定的なものではなく、用いる標識の量並びに用いた標識の量での標識の毒性に対して選択される。このような因子に対する標識の選択は、完全に当該技術分野の技術の範囲内である。
ペプチドまたはペプチド類似体への検出可能な標識の共有結合は、当該技術分野で公知の従来法によって行う。例えば、放射性同位体125Iを検出可能な標識として用いるときには、125Iのペプチドまたはペプチド類似体への共有結合は、アミノ酸チロシンをペプチドまたはペプチド類似体へ配合した後、ペプチドをヨウ素化(iodimating)することによって行うことができる(例えば、Weather et al., 同位体標識化合物の合成および応用(Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compounds),137〜140頁(1994年)を参照されたい)。チロシンがペプチドまたはペプチド類似体に含まれていないときには、公知の化学によってペプチドまたはペプチド類似体のNまたはC末端にチロシンを配合することができる。同様に、32Pをリン酸残基としてのペプチドまたはペプチド類似体に、例えば従来の化学的方法を用いてペプチドまたはペプチド類似体のヒドロキシル基を介して配合することができる。
本発明は、TPO−Rに結合して活性化する、あるいはTPO作動薬として作用する化合物を提供する。これらの化合物としては、「先導(lead)」ペプチド化合物、および先導化合物と同一または同様な分子構造または形状を有するように構築されているが、加水分解またはタンパク質分解に対する感受性に関しおよび/またはレセプターに対する親和性の増加のような他の生物学的特性に関して先導化合物と異なる「誘導体」化合物が挙げられる。本発明は、TPO作動薬、更に具体的には血液学的疾患、特に化学療法、放射線療法、または骨髄輸液に関連した血小板減少症の治療に有用な化合物の有効量を含んでなる組成物も提供する。
様々な方法を、IC50値を評価するのに用いることができる。例えば、MBP−TPOまたはlacI−ペプチドトレーサーを用いる平衡結合ELISA分析法を用いて、ペプチドがTPOレセプターの細胞外ドメインへのTPOの結合を阻害するかどうかを決定した。IC50値は、遊離ペプチドであって、場合によってはC末端をアミド化することができるまたはエステルまたは他のカルボキシアミドとして調製することができるものを用いて決定することができる。
IC50およびEC50値は、本発明では符号「−」、「+」および「++」によって象徴的に表す。例えば、200μMを上回るIC50値を示すペプチドは、「−」で表される。IC50値が200μM以下のペプチドには、「+」が与えられ、IC50値が500nM以下のものは、「++」で示される。特定の符号について切断点またはその付近のIC50値を与えたペプチドは、ハイブリッド表示(hybrid designator)、例えば「+/−」で示される。IC50値が決定されなかったペプチドは、「N.D.」として示す。
本発明のペプチドおよびペプチド類似体は、下記の実施例2に更に詳細に記載されているトロンボポエチン依存細胞増殖分析法でも評価した。細胞増殖は、細胞増殖の指標としての3H−チミジン取り込みと相関しているMTT分析法のような当該技術分野で知られている手法によって測定される(Mossmann,J. mmunol. Methods, 65: 55(1983)を参照されたい)。
第3〜4図は、本発明のペプチドおよびペプチド類似体の活性を評価する他の分析法の結果を示している。この分析法では、マウスをカルボプラチンを用いて血小板減少症とする。Balb/Cマウスに、0日目にカルボプラチン(125mg/Kg腹腔内)を投与する。これらの結果は、本発明のペプチドがマウスモデルの血小板減少症を緩和することができることを示している。
本発明のペプチドの結合および活性の特異性も、WO96/40750号明細書に記載の方法によるエリトロポエチンレセプター(EPO−R)に対するペプチドの交差反応を検討することによって検討した。
ペプチドおよびペプチド類似体の調製
固相合成
本発明のペプチドは、当該技術分野で知られている古典的方法、例えば標準的固相法を用いることによって調製することができる。標準的方法としては、独占的固相合成、部分的固相合成法、断片縮合、古典的溶液合成、および組換えDNA技術による方法が挙げられる。例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149(1963)を参照されたい。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。固相では、合成は、α−アミノ保護樹枝を用いるペプチドのC−末端から開始される。適当な出発材料は、例えば必要なα−アミノ酸をクロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂またはベンズヒドリルアミン樹脂に結合することによって調製することができる。このようなクロロメチル化樹脂はBIO-BE ADS SX-1(Bio Rad Laboratories,リッチモンド,カリフォルニア)という商品名で発売されており、ヒドロキシメチル樹脂の調製は、Bodonszky, et al., Chem. Ind.(London), 38: 1597(1966)に記載されている。ベンズヒドリルアミン(BHA)樹脂はPietta and Marshall, Chem. Commn., 650(1970)に記載されており、Beckman Instruments, Inc., パロアルト,カリフォルニアから塩酸塩の形態で市販されている。
従って、本発明の化合物は、Gisin, Helv. Chim. Acta., 56:1467(1973)に記載の方法に従って、例えば重炭酸セシウム触媒を用いてα−アミノ基を保護したアミノ酸をクロロメチル化樹脂にカップリングすることによって調製することができる。最初のカップリングの後、α−アミノ保護基を、有機溶媒中室温にてトリフルオロ酢酸(TFA)または塩酸(HCl)溶液などの試薬の選択によって除去する。
α−アミノ保護基は、ペプチドの段階的合成の技術において有用であることが知られているものである。アシル型保護基(例えば、ホルミル、トリフルオロアセチル、アセチル)、芳香族ウレタン型保護基(例えば、ベンジルオキシカルボニル(Cbz)および置換Cbz)、脂肪族ウレタン保護基(例えば、第三ブチルオキシカルボニル(Boc)、イソプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル)、およびアルキル型保護基(例えば、ベンジル、トリフェニルメチル)が挙げられる。BocおよびFmocは、好ましい保護基である。側鎖保護基はカップリング中は完全な儘であり、アミノ末端保護基の脱保護中またはカップリング中は開裂しない。側鎖保護基は、最終的なペプチドの合成が完了した時点および標的ペプチドを変化させない反応条件下で除去されねばならない。
Thr(T)およびSerの側鎖保護基としては、アセチル、ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、2,6−ジクロロベンジル、およびCbzが挙げられる。Arg(R)の側鎖保護基としては、ニトロ、トシル(Tos)、Cbz、アダマンチルオキシカルボニル メシトイルスルホニル(Mts)、PmcまたはBocが挙げられる。Lys(K)の側鎖保護基としては、Cbz、2−クロロベンジルオキシカルボニル(2−Cl−Cbz)、2−ブロモベンジルオキシカルボニル(2−BrCbz)、Tos、またはBocが挙げられる。
α−アミノ保護基を除去した後、残りの保護基を所望の順序で段階的にカップリングする。それぞれの保護されたアミノ酸の過剰量を、通常は例えば塩化メチレン(CH2Cl2)、ジメチルホルムアミド(DMF)混合物のような溶液中でジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)のような適当なカルボキシル基活性剤と共に用いる。
所望なアミノ酸配列を完了した後、樹脂からペプチドを開裂するだけでなく、総ての残りの側鎖保護基も開裂するトリフルオロ酢酸またはフッ化水素(HF)のような試薬で処理することによって、所望なペプチドを樹脂支持体から脱カップリングする。クロロメチル化樹脂を用いるときには、フッ化水素処理により、遊離ペプチド酸が形成される。ベンズヒドリルアミン樹脂を用いるときには、フッ化水素処理により直接遊離ペプチドアミドを生じる。あるいは、クロロメチル化樹脂を用いるときには、側鎖を保護したペプチドをアンモニアで処理して脱カップリングして所望な側鎖を保護したアミドを得、またはアルキルアミンで処理して側鎖を保護したアルキルアミンまたはジアルキルアミドを得ることができる。次いで、フッ化水素で処理することによる通常の方法で側鎖保護を外し、遊離のアミド、アルキルアミドまたはジアルキルアミドを得る。
これらの固相ペプチド合成法は当該技術分野で公知であり、John Morrow Stewart and Janis Dilaha Young, 固相ペプチド合成(Solid Phase Peptide Syntheses)(第2版,Pierce Chemical Company, 1984年)に更に記載されている。
本発明の化合物は、1990年3月7日出願の米国特許出願連続番号第07/492,462号明細書、1990年12月6日出願の第07/624,120号明細書、および1991年12月6日出願の第07/805,727号明細書に記載の「コードした合成ライブラリー」または「大規模固定ポリマー合成」系を用いて製造することもできる。
B.合成アミノ酸
これらの方法を用いて、20種類の天然に存在する遺伝学的にコードされたアミノ酸以外のアミノ酸が本発明の化合物のいずれかの1、2またはそれ以上の位置で置換されているペプチドを合成することもできる。例えば、ナフチルアラニンをトリプトファンの代わりに用いて、合成を促進することができる。本発明のペプチドに置換することができる他の合成アミノ酸としては、β−アミノ酸、D−アミノ酸、および天然には存在しない合成アミノ酸が挙げられる(例えば、Roberts, et al., Unusual Amino Acids in Peptide Synthesis, 5(6): 341-449(1983)を参照されたい)。
N−末端修飾
ペプチドは、典型的には遊離酸として合成されるが、上記のように、アミドまたはエステルとして容易に調製することができる。また、本発明のペプチド化合物のアミノおよび/またはカルボキシ末端を修飾して、本発明の他の化合物を生成させることもできる。アミノ末端修飾としては、メチル化(すなわち、−NHCH3または−NH(CH3)2)、アセチル化、ベンジルオキシカルボニル基の付加、またはアミノ末端のRCOO−(但し、Rはナフチル、アクリジニル、ステロイジル、および同様な基からなる群から選択される)によって定義されるカルボキシレート官能基を含む任意のブロッキング基でのアミノ末端のブロッキングが挙げられる。カルボキシ末端修飾としては、遊離酸のカルボキサミド基による置換、または構造的束縛を導入するためのカルボキシ末端における環状ラクタムの形成が挙げられる。
アミノ末端修飾は、上記に引用されている通りであり、アルキル化、アセチル化、カルボベンゾイル基の付加、スクシンイミド基の形成などが挙げられる(例えば、Murray, et al., ブルガーの医化学および薬剤発見(Burger′s Medicinal Chemistry and Drug Discovery),第5版,第1巻,Manfred E. Wolf監修,John Wiley and Sons, Inc.(1995年)を参照されたい)。具体的には、次にN−末端アミノ基を下記のようにして反応させることができる。
(a)酸ハロゲン化物[例えば、RC(O)Cl]または非対称無水物と反応させることによる式RC(O)NH−(式中、Rは上記で定義した通りである)のアミド基の形成。典型的には、反応は、等モルまたは過剰量(例えば、約5当量)の酸ハロゲン化物を、好ましくは、過剰(例えば、約10当量)のジイソプロピルエチルアミンのような第三アミンを含む不活性希釈剤(例えば、ジクロロメタン)中でペプチドに接触させて、反応中に生成した酸を除くことによって行うことができる。反応条件は、ほかの点では通常のものである(例えば、室温30分間)。低級アルキルN−置換を提供するための末端アミノのアルキル化の後、上記のように酸ハロゲン化物と反応させると、式RC(O)NR−のN−アルキルアミド基を生じる。
(b)無水コハク酸と反応させることによるスクシンイミド基の形成。上記と同様に、無水コハク酸を約等モル量または過剰量(例えば、約5当量)を用いることができ、アミノ基を適当な不活性溶媒(例えば、ジクロロメタン)中で過剰(例えば、約10当量)のジイソプロピルエチルアミンのような第三アミンの使用などの当該技術分野で公知の方法によってスクシンイミドに転換する。例えば、Wollenberg et al.の米国特許第4,612,132号明細書を参照されたい。この特許明細書の内容は、全体がその開示の一部として本明細書に引用される。コハク酸基は、ペプチドのN−末端で置換スクシンイミドを提供するための通常の方法で調製されるC2〜C6アルキルまたは−SR置換基で置換することができることが理解される。このようなアルキル置換基は、Wollenberg et al., 上記引用に記載の方法で低級オレフィン(C2〜C6)を無水マレイン酸と反応させることによって調製され、−SR置換基はRSHと無水マレイン酸との反応(但し、Rは上記で定義した通りである)によって調製される。
(c)好ましくは第三アミンを含む適当な不活性希釈剤(例えば、ジクロロメタン)中で約当量または過剰量のCBZ−Cl(すなわち、ベンジルオキシカルボニルクロリド)または置換CBZ−Clと反応させることによるベンジルオキシカルボニル−NH−または置換ベンジルオキシカルボニル−NH−基を形成して、反応中に生成する酸を除くこと。
(d)適当な不活性希釈剤(例えば、ジクロロメタン)中で当量または過剰量(例えば、5当量)のR−S(O)2Clとの反応によるスルホンアミド基を形成し末端アミンをスルホンアミド(但し、Rは上記で定義した通りである)に転換すること。好ましくは、不活性希釈剤は、ジイソプロピルエチルアミンのような過剰の第三アミン(例えば、10当量)を含み、反応中に生成した酸を除去する。反応条件は、ほかの点では通常のものである(例えば、室温30分間)。
(e)適当な不活性希釈剤(例えば、ジクロロメタン)中で当量または過剰量(例えば、5当量)のR−OC(O)ClまたはR−OC(O)OC6H4−p−NO2との反応によりカルバメート基を形成し、末端アミンをカルバメート(但し、Rは上記で定義した通りである)に転換すること。好ましくは、不活性希釈剤は、過剰量(例えば、約10当量)のジイソプロピルエチルアミンのような第三アミンを含み、反応中に生成した酸を除去する。反応条件は、ほかの点では通常のものである(例えば、室温30分間)。
(f)適当な不活性希釈剤(例えば、ジクロロメタン)中で当量または過剰量(例えば、5当量)のR−N=C=Oとの反応により尿素基を形成し、末端アミンを尿素(但し、Rは上記で定義した通りである)に転換すること。好ましくは、不活性希釈剤は、過剰量(例えば、約10当量)のジイソプロピルエチルアミンのような第三アミンを含み、反応中に生成した酸を除去する。反応条件は、ほかの点では通常のものである(例えば、室温30分間)。
もう一つの別態様では、C−末端カルボキシル基またはC−末端エステルをそれぞれカルボキシル基またはエステルの−OHまたはエステル(−OR)をN−末端アミノ基で内部置換することにより環化を誘発して、環状ペプチドを形成することができる。例えば、合成および開裂を行い、ペプチド酸を得た後、遊離酸は、溶液中、例えば塩化メチレン(CH2Cl2)、ジメチルホルムアミド(DMF)混合物中でジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)のような適当なカルボキシル基活性剤によって活性化エステルに転換される。次いで、環状ペプチドを、活性化エステルをN−末端アミンで内部置換することによって形成する。重合とは異なり内部環化は、極めて稀薄な溶液を用いることによって増進することができる。このような方法は、当該技術分野で公知である。
本発明のペプチドを環化し、またはペプチドの末端にデスアミノまたはデスカルボキシ残基を組み込み、プロテアーゼに対する感受性を減少させまたはペプチドの配置を制限するための末端アミノまたはカルボキシル基がないようにすることもできる。本発明の化合物のC−末端官能基としては、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ(低級アルキル)、低級アルコキシ、ヒドロキシ、およびカルボキシ、およびそれらの低級エステル誘導体、およびそれらの薬学上許容可能な塩が挙げられる。
上記のN−末端およびC−末端修飾に加えて、本発明の化合物は、上記定義の様々な親水性ポリマーの1種類以上により有利に修飾し、または共有結合することができる。
本発明のペプチド化合物は、Zallipsky, S., Bioconjugate Chem., 6: 150-165(1995)、Monfardini, C. et al., Bioconjugate Chem., 6: 62-69(1995)、米国特許第4,640,835号明細書、米国特許第4,496,689号明細書、米国特許第4,301,144号明細書、米国特許第4,670,417号明細書、米国特許第4,791,192号明細書、米国特許第4,179,337号明細書、またはWO95/34326号明細書に記載の方法のいずれかを用いて上記ポリマーと誘導体形成しまたはこれにカップリングすることができ、上記文献の内容は、全体がその開示の一部として本明細書に引用される。PEGは、Shearwater Polymers, Inc.(ハンツビル、アラバマ)、Sigma Chemical Co.、および他の会社から市販されている。
現在のところ好ましい態様では、本発明のペプチド化合物は、ポリエチレングリコール(PEG)で誘導体形成される。
簡単には、一つの代表的な態様では、用いられる親水性ポリマー、例えばPEGは、メトキシまたはエトキシ基のような未反応基によって一端をキャッピングするのが好ましい。次いで、ポリマーを他端でハロゲン化シアヌル酸(例えば、塩化、臭化またはフッ化シアヌル酸)、ジイミダゾール、無水試薬(例えば、無水ジブロモコハク酸のような無水ジハロコハク酸)、アシルアジド、p−ジアゾニウムベンジルエーテル、3−(p−ジアゾニウムフェノキシ)−2−ヒドロキシプロピルエーテル)などの適当な活性剤と反応させることによって活性化する。次に、活性化ポリマーを本発明のペプチド化合物と反応させて、ポリマーで誘導体形成したペプチド化合物を生成する。本発明の化合物のペプチドアームの一つが例えばアシル基によって保護されていると、モノペジル化化合物が形成される。あるいは、本発明のペプチド化合物の官能基をポリマーで活性化して反応させ、または2個の基を既知のカップリング法を用いて協奏カップリング反応で結合することができる。反応工程図1〜4は、本発明のペプチド化合物を例えばポリエチレングリコール(PEG)を用いて誘導体形成するための代表的な反応工程図を示している。本発明のペプチド化合物を、当業者に知られておりかつ用いられている幾多の他の反応工程図を用いてPEGと誘導体形成することができることが容易に理解されるであろう。
本発明のペプチド化合物の親水性ポリマー(例えば、PEG)による誘導体形成に加えて、他の小さなペプチド、例えばレセプターに結合する他のペプチドまたはリガンドも、このような親水性ポリマーと誘導体形成して、生物学的活性(例えば、結合活性、作動薬活性、拮抗薬活性など)の損失があったとしても僅かにすることができることを見出だした。これらの小さなペプチドを親水性ポリマーで誘導体形成するときには、その溶解度および循環半減期が増加し、その免疫原性が減少することを見出だした。また、極めて意外なことには、上記のことは、生物学的活性をほとんど損失することなく、あったとしてもごく僅かの損失で行うことができる。好ましい態様での脂肪では、誘導体形成したペプチドの活性は、未修飾ペプチドの0.1〜0.01倍である。更に好ましい態様では、誘導体形成したペプチドの活性は、未修飾ペプチドの0.1〜1倍である。更に一層好ましい態様では、誘導体形成したペプチドは、未修飾ペプチドより大きな活性を有する。
この態様で使用するのに適したペプチドとしては、一般に、例えばTPO、EPO、IL−1、G−CSF、およびIL−5レセプター、造血成長因子レセプター、サイトカインレセプター、G−タンパク質結合レセプター、細胞表面レセプターなどのレセプターに結合するペプチド、すなわちリガンドが挙げられる。このようなペプチドは、典型的には約150個以下のアミノ酸残基、更に好ましくは約100個以下のアミノ酸残基(例えば、約10〜12kDa)を含んでなる。本発明で用いるのに適当な親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールによって代表されるようなポリアルキルエーテル、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体などが挙げられるが、それらに限定されない。一般に、このような親水性ポリマーの平均分子量は約500〜約100,000ダルトンの範囲であり、更に好ましくは約2,000〜約40,000ダルトンであり、更に一層好ましくは約5,000〜約20,000ダルトンである。好ましい態様では、このような親水性ポリマーの平均分子量は、約5,000ダルトン、10,000ダルトン、および20,000ダルトンである。この態様によるペプチド化合物は、上記および引用文献の方法を用いて誘導体形成することができる。
ジスルフィド結合の形成
本発明の化合物
は、システインのチオール基の間に分子内ジスルフィド結合を有する。この化合物は、当該技術分野で知られている方法を用いて分子内置換によって作成することができる(例えば、Frank A. Robey, Meth. in Mol. Bio., 35(6): 73-90(1990)を参照されたい)。
もう一つの態様によれば、本発明は、元から生理学的活性を有するポリペプチドから生理学的に活性であり、実質的に非免疫原性の水溶性ポリペプチドの製造法であって、
(a)分子量が約500〜約20,000ダルトンのポリマーのヒドロキシ基を有する少なくとも1個の末端炭素原子を活性化し、上記ポリマーが未置換であるか、またはアルコキシまたはアルキル基によって置換されており、上記アルコキシまたはアルキル基が5個未満の炭素原子を有し、
(b)式(I)の生理活性ポリペプチドを上記ポリマーの反応性末端基にカップリングすることによって、上記ポリペプチドを、ポリペプチド1モル当たり上記活性化ポリマー10〜100モルと反応させて、上記の生理学的に活性であり、実質的に非免疫原性の水溶性ポリペプチド組成物を提供する
段階を含んでなる方法を提供する。好ましくは、ポリマーは、ポリエチレングリコールである。好ましくは、カップリング剤は塩化シアヌル酸である。
有用性
本発明の化合物は、TPOの産生およびレセプター結合工程に影響しかつこれによって影響されると考えられる多くの因子の評価など、TPOの生物学的役割を理解するための独特な手段としてイン・ビトロで有用である。
これらの化合物は、新規なTPOレセプター作動薬をスクリーニングするための分析法における競合的結合剤としても有用である。このような分析法の態様では、本発明の化合物は修飾なしに用いることができ、または様々な方法で、例えば検出可能な信号を直接または間接的に提供する残基を共有的にまたは非共有的に結合することのような標識によって修飾することができる。これらの分析法のいずれかでは、そのための材料を直接または間接的に標識することができる。直接標識の可能性としては、125Iのような放射能標識、ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼのような酵素(米国特許第3,645,090号明細書)、および蛍光強度、波長シフトまたは蛍光分極の変化を監視することができる蛍光標識(米国特許第3,940,475号明細書)のような標識基が挙げられる。間接標識の可能性としては、1成分のビオチン化の後、上記標識基の一つにカップリングしたアビジンへの結合が挙げられる。これらの化合物としては、化合物が固形支持体へ結合させる場合には、スペーサーまたはリンカーを挙げることもできる。
更に、TPOレセプターへ結合する能力に基づいて、本発明のペプチドを、生物学的流体中、組織ホモジネート中、精製した天然の生物学的材料などでの生活細胞、固定細胞上でTPOレセプターを検出するための試薬として用いることができる。例えば、これらのペプチドを標識することによって、表面にTPO−Rを有する細胞を同定することができる。更に、TPOレセプターを結合する能力に基づいて、本発明のペプチドをイン・シトゥ染色、FACS(蛍光活性化細胞分類)、ウェスタン・ブロット法、ELISAなどに用いることができる。また、TPOレセプターに結合する能力に基づいて、本発明のペプチドをレセプター精製、または細胞表面上(または透過性にした細胞内部)でTPOレセプターを発現する細胞の精製に用いることができる。
本発明の化合物を、様々な医学研究および診断目的の商業的試薬として用いることもできる。このような用途としては、(1)様々な機能分析における候補のTPO作動薬の活性を定量するための較正標準としての使用、(2)TPO依存性細胞系の増殖および成長を保持するための使用、(3)同時結晶化によるTPO−レセプターの構造分析における使用、(4)TPO信号の形質導入/レセプター活性化の機構を検討するための使用、および(5)TPO−レセプターを好ましくは活性化し、またはこのような活性化が、既知量のTPO作動薬に対して好都合に較正する、他の研究および診断用途が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の化合物を用いて、いずれも付加サイトカインと結合したまたはそれら自身の巨核球および上記前駆細胞をイン・ビトロで増大させることができる。DiGiusto et al., PCT公表第95/05843号明細書を参照されたい。上記の特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。化学療法および放射線療法は、巨核球の速やかに分割し、一層成熟した個体を殺すことによって血小板減少症を引起す。しかしながら、これらの治療法により、未成熟で有糸分裂活性が大きくない巨核球前駆体細胞の数および成育可能性を減少させることもできる。従って、TPOまたは本発明の化合物による血小板減少症の緩和は、イン・ビトロ培養によって巨核球および未成熟前駆体数が増加した化学療法または放射線療法の後の患者自身の細胞をこの患者に輸液することによって速めることができる。
本発明の化合物を、ヒトなどの温血動物に投与して、TPO−Rをイン・ビボで活性化することもできる。従って、本発明は、TPO関連疾患の治療法であって、本発明の化合物をイン・ビボでのTPO−Rに対するTPOの効果を模倣するのに十分な量で投与することを含んでなる方法を包含する。例えば、本発明のペプチドおよび化合物は、上記に定義したように、様々な血液学的疾患を治療する目的で投与することができる。
本発明の幾つかの態様では、TPO拮抗薬を、化学療法または放射線療法を行う患者に最初に投与した後、本発明のtpo作動薬を投与するのが好ましい。
本発明の化合物の活性は、McDonald, Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology, 14: 8-21(1992)に記載の多数のモデルの一つでイン・ビトロまたはイン・ビボで評価することができ、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
一態様によれば、本発明の組成物は、骨髄輸液、放射線療法、または化学療法と組合わせた血小板減少症の治療に有用である。化合物は、典型的には化学療法、放射線療法、または骨髄移植の前に、またはそのような暴露の後に予防的に投与される。
従って、本発明は、活性成分として、本発明のペプチドまたはペプチド類似体の少なくとも1種類を、医薬キャリヤーまたは希釈剤と組合わせて含んでなる医薬組成物も提供する。本発明の組成物は、経口、肺、非経口(筋肉内、腹腔内、静脈内(IV)または皮下注射)、吸入(微粉末処方物による)、経皮、鼻内、腔内、直腸、または舌下投与経路によって投与することができ、またそれぞれの投与経路に適当な投与形態に処方することができる。例えば、Bernstein et al., PCT特許公表第WO93/25221号明細書、Pitt et al., 特許公表第WO94/17784号明細書、およびPitt et al., 欧州特許出願第613,683号明細書を参照されたい。上記の特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
経口投与のための固形投与形態としては、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、および顆粒が挙げられる。このような固形投与形態では、活性化合物を、スクロース、ラクトース、または澱粉のような少なくとも1種類の不活性な薬学上許容可能なキャリヤーと混合する。このような投与形態は、通常の実施がそうであるように、不活性希釈剤以外の添加物質、例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤を含んでなることもできる。カプセル、錠剤および丸薬の場合には、投与形態は緩衝剤を含んでなることもできる。錠剤および丸薬は、更に腸溶性コーティングを施して調製することもできる。
経口投与用の液体投与形態としては、薬学上許容可能なエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および水のような当該技術分野で一般的に用いられる不活性希釈剤を含むエリキシルが挙げられる。このような不活性希釈剤の他に、組成物は、湿潤剤、乳化および懸濁剤、および甘味料、香味料および香料のようなアジュバントを挙げることもできる。
非経口投与用の本発明による製剤としては、滅菌した水性または非水性溶液、懸濁液またはエマルションが挙げることができる。非水性溶媒またはビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびトウモロコシ油のような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。このような投与形態は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、静菌剤および分散剤、酸化防止剤、緩衝剤、懸濁剤、増量剤、凍結防止剤のようなアジュバントを含むこともできる。それらは、例えば細菌保持フィルターを介する濾過、組成物への滅菌剤の配合、または組成物の加熱によって滅菌することができる。それらは、使用直前に、滅菌水やある種の他の滅菌注射用媒質を用いて製造することもできる。
あるいは、化合物を、(注射用)水、食塩またはデキストロース溶液で再構成するための凍結乾燥固形物として提供することもできる。このような処方物は、通常はバイアル、アンプル、または使い捨て注射装置のような単位投与形態で提供される。それらは、適当な投与量を取り出すことができるボトルのような複数投与形態で提供することもできる。
直腸または腔内投与用の組成物は、好ましくは活性成分の他に、カカオ脂または座薬ワックスのような賦形剤を含むことができる座薬である。鼻内または皮下投与用の組成物は、当該技術分野で公知の標準的な賦形剤を用いて調製される。
化合物を含む組成物は、予防治療および治療の目的で投与することができる。治療目的では、組成物は、上記のような疾患に既に罹っている患者に、その疾患およびその合併症の症状を治癒しまたは少なくとも部分的に抑制するのに十分な量で投与される。これを行うのに適する量は、「治療上有効量」として定義される。この使用に有効な量は、疾患の重篤さおよび患者の体重および一般的状態によって変化する。
本発明の組成物は、例えばTiceとBibiの方法(制御薬剤送達に関する論文(Treatise on Controlled Drug Delivery), A. Kydonieus監修,Marcel Dekker, ニューヨーク(1992年),315〜339頁)によってマイクロカプセル化することもできる。
予防目的では、本発明の化合物を含む組成物を特定の疾患に対して感受性を有するあるいはその危険性のある患者に投与する。このような量は、「予防上有効量」と定義される。この使用では、正確な量は患者の健康状態および体重によって変化する。
効果的な治療に要するTPO作動薬の量は、投与の手段、標的部位、患者の生理状態、および投与される他の医薬などの多くの様々な要因によって変化する。従って、治療投与量は、安全性および有効性を最適にするように決定すべきである。典型的には、イン・ビトロで用いられる投与量は、これらの試薬のイン・シトゥ投与で有用な量の有用な指標を提供することができる。特定の疾患の治療のための有効投与量の動物試験により、更にヒトでの投与量が予想される。様々な考察が、例えばGilman et al.監修,Goodman and Gilmanの治療薬の薬理学的基礎(Goodman and Gilman′s: The Phamacological Basis of Therapeutics),第8版,Pergamon Press(1990年)、およびRemingtonの薬科学(Remington′s Pharmaceutical Science),第7版,Mack Publishing Co., イーストン,ペンシルバニア(1985年)に記載されており、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
本発明のペプチドおよびペプチド類似体は、1日当たり約0.001mg〜約10mg/kg体重の投与範囲で投与するとき、TPOが介在する症状の治療に有効である。用いられる具体的投与量は、治療を行う特定の症状、投与経路、並びに症状の重篤度、患者の年齢および一般症状などの要因により担当医師の判断によって調整される。
ヒトに投与するのに適当な非経口医薬製剤は、好ましくは溶液または複数投与量バイアル用の複数の溶液中に式(I)の化合物またはその薬学上許容可能な誘導体を1〜50mg/ml含む。
好ましい処方物は、式(I)の化合物を水、塩水またはデキストロース溶液に溶解したものである。特に好ましい溶液は、pHが約4.0〜5.0である。
別態様によれば、本発明は、生理学的に活性であり、実質的に非免疫原性の水溶性ポリペプチド組成物であって、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールからなる群から選択される分子量が約500〜約20,000ダルトンであるポリマーにカップリング剤を用いてカップリングした式(I)の化合物を含んでなり、上記ポリマーが未置換であるか、またはアルコキシまたはアルキル基によって置換されており、上記アルコキシまたはアルキル基が5個未満の炭素原子を有する組成物を提供する。好ましくは、上記ポリマーの分子量は約750〜約15,000ダルトンであり、更に好ましくは約5,000〜約10,000ダルトンである。好ましくは、上記ポリマーはポリエチレングリコールである。
本発明の好ましい態様のみを上記に具体的に記載したが、本発明の修飾および変更は、本発明の精神および意図する範囲から離反することなく可能であることが理解されるであろう。
実施例1
固相ペプチド合成
本発明の様々なペプチドを、手動操作により、またはApplied Biosystems Inc. Model 431Aまたは433Aペプチド合成装置を用いて、Merrifield固相合成法(Steward and Young, 固相ペプチド合成(Solid Phase Peptide Synthesis),第2版,Pierce Chemical, ロックフォード,イリノイ(1984年)、およびMerrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149(1963)を参照されたい)を用いて合成した。ペプチドを、
の標準的プロトコールを用いて集めた。実施例に特に記載しない限り、それぞれのカップリングは、HBTU(2−(1H−ベンザトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロ−ホスフェート)およびHOBt(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール)を用いて2×30分間行った。
使用した樹脂は、HMP樹脂(p−ヒドロキシメチルフェノキシメチル)ポリスチレン樹脂、または架橋剤としての5−(4′−Fmoc−アミノメチル−3,5′−ジメチルオキシフェノキシ)吉草酸で架橋したポリスチレン樹脂であるPAL(Milligen/Biosearch)であった。PAL樹脂を使用すると、樹脂からペプチドを開裂させるとカルボキシル末端アミド官能基が生じる。開裂を行うと、HMP樹脂は最終生成物のC−末端にカルボン酸残基を生成する。ほとんどの試薬、樹脂および保護されたアミノ酸(遊離または樹脂上)は、MilliporeまたはApplied Biosystems Inc.から購入した。
Fmoc基は、カップリング処理の際にアミノ保護に用いた。アミノ酸の第一アミンの保護はFmocで行い、側鎖保護基は、セリン、グルタミン酸およびトレオニンについては第三ブチルであり、グルタミンについてはトリチルであり、アルギニンについてはPmc(2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル)であり、トリプトファンについてはN−第三−ブチルオキシカルボニルであり、システインについてはS−トリチルであった。
樹脂からのペプチドの除去および側鎖官能基の同時脱保護は、試薬Kまたはそれを若干修飾したもので処理することによって行った。あるいは、アミド化したカルボキシル末端を有するペプチドの合成において、完全に集めたペプチドを90%トリフルオロ酢酸、5%エタンジチオールおよび5%水で、最初は4℃で、徐々に室温まで増加させて開裂した。総ての場合に、精製は、C18結合シリカゲルカラム上で、0.1%トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル/水のグラディエントを用いて調製用の逆相高性能液体クロマトグラフィーによって行った。均質なペプチドは、迅速原子衝撃マススペクトル分析法または電子スプレーマススペクトル分析法、および適用可能な場合にはアミノ酸分析によって特性決定した。
好ましい態様では、本発明のペプチドは、当業者に知られておりかつ用いられている標準的合成法を用いて二量体化される。本発明の二量体ペプチド化合物を製造するための代表的な合成工程図を、第10および11図に示す。これらの合成工程図に従って、当業者は、本発明による二量体ペプチド化合物を容易に調整することができる。また、二量体サブユニットは、第10および11図に記載されている方法および架橋剤を用いて容易に結合することができることは、当業者には容易に明らかになるであろう。
A. AF15705の合成
Fmoc(tBu)GPT(tBu)L−OHの合成
1リットルのペプチドチャンバーに、Fmoc−Leu−HMPB−BHA[4−(4−ヒドロキシメチル−3−メトキシフェノキシ)−酪酸ベンズヒドリルアミン]樹脂(35g,18.9ミリモル)と、1−メチル−2−ピロリジノン(NMP)を充填した。樹脂を溶媒中で窒素攪拌を行いながら約30分間コンディショニングし、ビーズを膨潤させた。末端アミンからのFmoc(9−フルオロメチルオキシカルボニル)の除去は、NMP中ピペリジンの30%溶液2×250mlを用いてそれぞれ10分間行った。次に、陰性クロラニル試験によって決定されるように、樹脂を6×300mlのNMPで洗浄して、Fmoc副生成物(ジベンゾフルベンおよびそのピペリジン付加物)を除去した。Fmoc−Thr(tBu)−OH(15.0g,2当量)および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)(5.8g,2当量)を、室温でNMP250mlに溶解した。溶液を氷浴で0〜5℃まで冷却した。ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(8.2ml,2.5当量)を加え、3〜5分間攪拌した。O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N′,N′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)(14.3g,2当量)およびジクロロメタン(DCM)75mlを加え、約5分間攪拌溶解した。活性化酸の溶液を、排液した樹脂上に加えて、N2を通じながら1時間攪拌した。カップリングの完了を、ニンヒドリン試験によって監視した。樹脂から排液し、3×300mlのNMPで洗浄した。
次いで、Fmoc−Pro−OH(12.8g)、Fmoc−Gly−OH(11.2g)、Fmoc−Glu(OtBu)−OH(16.8g)、およびFmoc−Ile−OH(13.4g)を用いてサイクルを反復し、ペプチド断片の次のマーを得た。最終的なカップリング反応の後、樹脂をNMP4×300mlで、次にDCM4×300mlで洗浄した。
ペプチドを、1%トリフルオロ酢酸/DCMを用いて樹脂から開裂した。画分を集めて、生成物含量についてHPLCによって分析した。4個の300ml画分、4個の500ml画分、次いで6個の250ml画分を集めて、分析した。画分3〜9をピリジンでpH約3〜4に調整した後、合わせて、ロータリーエバポレーター上で濃縮し、ほぼ乾固した。エタノール約200mlをフラスコに加え、濃縮を継続して、残留DCMを除去した。生成する部分溶液を蒸気浴上で加熱して、完全な溶液を得た。溶液を氷浴で0〜5℃まで冷却し、水400mlを激しく攪拌しながら加えた。粘稠なスラリー状生成物を氷浴で約1時間攪拌し、濾過して、水100mlで洗浄した。生成物を、漏斗を介して気流を一晩引くことによって漏斗上で風乾し、定量的収率およびHPLCによる98.3面積%の純度でFmoc−Ile−Glu(OtBu)−Gly−Pro−Thr(tBu)−Leu−OHを18.8g(19.5ミリモル)得た。
FmocR(Pbt)Q(trt)(1−Nal)LA−OHの合成
1リットルのペプチドチャンバーに、HMPB−BHA(35g,30.8ミリモル)と、1−メチル−2−ピロリジノン(NMP)を充填した。樹脂を溶媒中で窒素攪拌を行いながら約30分間コンディショニングし、ビーズを膨潤させた。一方、Fmoc−Ala−OH(28.8g,3当量)をNMP200mlに室温で溶解した。溶液をメタノール/水/氷浴で−5℃〜0℃まで冷却した後、ジメチルアミノピリジン(DMAP)(750mg,0.2当量)を加えて溶解させた。ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(14.3ml,3当量)およびジクロロメタン(DCM)100mlを加え、溶液を約0℃で20〜30分間攪拌した。明黄色溶液を得た。樹脂を排液し、活性化したアミノ酸の溶液をチャンバーに充填した。混合物をN2を通じて5時間攪拌した。樹脂を排液し、NMP3×300mlで洗浄した。試料を取り出し、NMPおよびDCMで十分に洗浄し、一晩乾燥した。樹脂を、無水安息香酸(20.9g,3当量)とピリジン7.5ml(3当量)をNMP250mlに溶解したもので末端キャッピングした。スラリーを室温で1.5時間攪拌した。樹脂を排液し、NMP3×300mlで洗浄した。末端アミンからのFmoc(9−フルオレニル−メチルオキシカルボニル)の除去は、ピペリジンをNMPに溶解した30%溶液2×250mlを用いてそれぞれ10分間行った。次いで、陰性クロラニル試験によって決定されるように、樹脂を6×300mlのNMPで洗浄して、Fmoc副生成物(ジベンゾフルベンおよびそのピペリジン付加物)を除去した。
Fmoc−Leu−OH(21.8g,2当量)および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)(9.4g,2当量)を、室温でNMP225mlに溶解した。溶液を氷浴で0〜5℃まで冷却した。ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(13.4ml,2.5当量)を加え、3〜5分間攪拌した。O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N′,N′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)(23.4g,2当量)およびDCM75mlを加え、約5分間攪拌溶解した。活性化酸の溶液を、排液した樹脂上に加えて、N2を通じながら1時間攪拌した。カップリングの完了を、ニンヒドリン試験によって監視した。樹脂から排液し、3×300mlのNMPで洗浄した。
次いで、Fmoc−(1−Nal)−OH(27.0g)、Fmoc−Gln(trt)−OH(37.6g)、およびFmoc−Arg(Pbf)−OH(40.0g)を用いてサイクルを反復し、ペプチド断片の次のマーを得た。最終的なカップリング反応の後、樹脂をNMP4×300mlで、次にDCM4×300mlで洗浄した。
ペプチドを、1%トリフルオロ酢酸/DCMを用いて樹脂から開裂した。画分を集めて、生成物含量についてHPLCによって分析した。4個の200ml画分、3個の500ml画分、次いで5個の250ml画分を集めて、分析した。画分5〜11をピリジンでpH約3〜4に調整した後、合わせて、ロータリーエバポレーター上で濃縮し、ほぼ乾固した。エタノール約200mlをフラスコに加え、濃縮を継続して、残留DCMを除去した。生成する部分溶液を蒸気浴上で加熱して、完全な溶液を得た。溶液を氷浴で0〜5℃まで冷却し、0.1N HCl 200mlを加えた後、水200mlを加えた。粘稠なスラリー状生成物を氷浴で約1時間攪拌し、濾過して、水100mlで洗浄した。生成物を、漏斗を介して気流を一晩引くことによって漏斗上で風乾し、樹脂からの収率74%(分析した樹脂からの収率>95%)およびHPLCによる94.8面積%の純度でFmoc−Arg(Pbf)−Gln(trt)−(1−Nal)−Leu−Ala−OH(31.9g,22.8ミリモル)を得た。
H−AR(Pbf)(Sar)−OBzIの合成
FmocArg(Pbf)−OH(3当量)、ジメチルアミノピリジン(0.3当量)およびジイソプロピルカルボジイミド(3当量)を攪拌して、1−メチル−2−ピロリジノン(NMP,10容)中で室温にて溶解した。溶液を、ペプチドチャンバー中の[4−(4−ヒドロキシメチル−3−メトキシフェノキシ)−酪酸](HMPB)樹脂に加え、N2を通じながら3〜6時間攪拌した。添加効率を、開裂試料の定量的HPLC分析によって測定した。樹脂に結合したFmocArg(Pbf)を30%ピペリジン/NMP(2×10容)に10〜15分間暴露し、末端アミンを脱保護した。樹脂をNMP(60〜80容)で洗浄し、ピペリジンの陰性クロラニル試験を行った。FmocAla−OH(2当量)を、O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N′,N′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU,2当量)と1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT,2当量)とジイソプロピルエチルアミン(DIPEA,2.1当量)を用いてNMP(5〜10容)中で0〜5℃で予備活性化した後、樹脂混合物に移し、窒素置換を行いながら30〜90分間攪拌した。カップリング効率をニンヒドリン試験により監視した。樹脂をNMP(25〜30容)で洗浄し、カップリングサイクルを繰返し、側鎖が完全に保護された樹脂結合ペプチドを得た。樹脂を塩化メチレン(DCM,40〜60容)で洗浄してNMPを除去した後、ペプチドを開裂した。側鎖が保護された断片を、樹脂から1%トリフルオロ酢酸/DCM(20容)で数回洗浄することによって除いた。ペプチドを放出すると、樹脂は暗紫色に変化した。開裂断片をHPLCによって監視した後、ピリジンで中和し、濃縮して固形残渣とし、これを更に精製した。固形生成物に、水30mlを加えた。溶液のpHを0.1N HCl(100ml)で2に調整した。懸濁液を酢酸エチル(2×300ml)で洗浄した。合わせた酢酸エチル抽出物を飽和塩化ナトリウム水溶液(150ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濃縮してフォーム状生成物とした。フォーム状生成物を粉砕し、メチル第三−ブチルエーテル(MTBE,100ml)で粉砕した。生成する固形生成物を集めて、乾燥し、FmocAR(Pbf)−OHを樹脂から約100%の収率で得た。
FmocAR(Pbf)−OH(1当量)、SarOBzI、トシレート塩(1当量)、HOAT(1.2当量)、およびDIPEA(2.5当量)をDMF(13容)に溶解したものを0℃に冷却し、HBTU(1.2当量)を加えた。溶液を0℃で10分間攪拌した後、周囲温度まで加熱し、40分間攪拌した。ペプチドを沈澱させるため、塩水/水の1:1溶液(40容)を加えた。固形生成物を集めて、メタノール(8容)に溶解し、水(10容)で沈澱した。溶媒を粘稠な半固形生成物から傾瀉によって除去し、半固形生成物を真空乾燥してフォーム状生成物とした。フォーム状生成物を粉砕し、MTBE(8容)で粉砕した。溶媒を傾瀉によって除去し、固形生成物を乾燥した。収率15.2g、樹脂から92%、HPLCにより99面積%。生成物を9:1THF/ピペリジン(10容)に溶解し、周囲温度で50分間攪拌した。ペプチドを沈澱させるため、MTBE(26容)とヘキサン(33容)を加えた。溶媒を半固形生成物から傾瀉によって除去し、半固形生成物(空気に暴露するとゴム状になる)を真空乾燥して、フォーム状生成物とした。フォーム状生成物を粉砕し、MTBE(10容)で粉砕し、溶媒を傾瀉により除去した。粉砕を2回繰返し、生成物を乾燥した。収率93%、HPLC純度,95面積%。
第三−Boc保護を用いるH−AR(Pbf)(Sar)−OBzIの交互溶液合成
Boc−Arg(Pbf)−OH・DCHA(4.96g)を、酢酸エチル50mlと0.25Mクエン酸の2回の40ml分量との間で分配した。有機相を水30mlの容積で2回、塩水30mlで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥して、蒸発させ、フォーム状生成物とした。このフォーム状生成物、Sar−OBzIトシレート塩(2.71g)およびHOAt(0.98g)を、塩化メチレン50mlに溶解した。溶液を氷浴で冷却し、CDD(1.50g)およびDIPEA(1.8ml)を加えた。反応混合物を低温で1/2時間攪拌した後、室温で18時間攪拌した。混合物を濾過して、沈澱したDCUを除去し、塩化メチレンを真空留去した。残渣の油状生成物を酢酸エチルに溶解し、0.1Mクエン酸、水、重炭酸ナトリウム溶液、水および塩水で繰返し洗浄した。洗浄溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥して、濾過し、蒸発させて、ガラス状のフォーム状生成物(4.15g)とした。Boc−Arg(Pbf)−Sar−OBzI(3.80g)を塩化メチレン20mlに溶解し、この溶液にHClをMTBE(10ml)に溶解したものを加えた。混合物を、TLC分析により出発材料が検出されなくなるまで少なくとも1時間攪拌した。溶液を蒸発乾固し、高真空下に一晩保持した。フォーム状生成物、Boc−Ala−OH(1.14g)およびHOAt(0.81g)を、塩化メチレン20mlに溶解した。溶液を氷浴で冷却し、DCC(1.24g)およびDIPEA(1.5ml)で処理した。反応混合物を低温で0.5時間攪拌した後、室温で1.5時間攪拌した。沈澱したDCUを濾去し、塩化メチレンを酢酸エチル50mlで置換し、溶液をクエン酸、水、重炭酸塩溶液、水、および塩水で洗浄した。洗浄した有機溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発してフォーム状生成物(3.66g)とした。フォーム状生成物を、ジペプチドについて上記したようにHClで処理し、H−Ala−Arg(Pbf)−Sar−OBzIを塩酸塩として得た。
H−R(Pbf)Q(trt)(1−Nal)LAAR(Pbf)(Sar)−OBzIの合成
FmocR(Pbf)Q(trt)(1−Nal)LA−OH(1当量)、H−Ala−Arg(Pbf)−Sar−OBzI(1当量)、HOAT(1.2当量)およびDIPEA(2.2当量)をDMF(12容)に溶解したものを0℃に冷却し、HBTU(1.2当量)を加えた。溶液を周囲温度まで加熱し、50分間攪拌した。この溶液に水(25容)を加えて、ペプチドを沈澱させた。固形生成物を濾過によって集めた。湿りの残っている固形生成物を熱エタノール(15容)に溶解した後、30℃まで冷却しながら攪拌した。生成する固形生成物を濾過によって集め、乾燥して、生成物を75%の収率で得た。HPLC純度91面積%。固形生成物を9:1THF/ピペリジン(15容)に溶解し、周囲温度で50分間攪拌した。ペプチドを沈澱させるため、MTBE(15容)を加えた。固形生成物を濾過によって集めた後、温エタノール(8容)で粉砕した。攪拌しながら周囲温度まで冷却した後、固形生成物を集めて、乾燥した。収率,92%。HPLC純度,93面積%。
FmocIE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1−Nal)LAAR(Pbf)(Sar)−OBzIの合成
FmocIE(tBu)GPT(tBu)L−OH(1当量)、H−R(Pbf)Q(trt)(1−Nal)LAAR(Pbf)(Sar)−OBzI(1当量)、HOAT(1.2当量)、およびDIPEA(2当量)をDMF(13.5容)に溶解したものを0℃に冷却し、HBTUを加えた。溶液を周囲温度まで加温し、1時間攪拌した。水(20容)を加えて、ペプチドを沈澱させた。固形生成物を集め、メタノール(8容)で粉砕した。固形生成物を集めて、乾燥し、98/2 DCM/メタノール(5容)に溶解した。溶液を、98/2 DCM/メタノール中シリカゲル700gを含むカラムに加えた。カラムを、98/2 DCM/メタノール1.6リットル、次いで97/3 DCM/メタノール1リットル、および95/5 DCM/メタノール8リットルで溶出した。生成物を含む画分を合わせて、濃縮し、フォーム状生成物とした。収率,80.7%,HPLC純度,85面積%。
FmocIE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1−Nal)LAAR(Pbf)(Sar)−OHの合成
FmocIE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1−Nal)LAAR(Pbf)(Sar)−OBzIを8:1DCM/エタノール(15容)に溶解したものを、Pd/C(0.4重量,Degussa型E101,10%乾燥重量,50%水)と共に充填した。反応容器を窒素置換および排気を3回行った後、水素雰囲気下に置き(バルーン)、周囲温度で20時間攪拌した。スラリーを、セライトの密に充填したベッドで濾過した。濾液を約2容まで濃縮し、MTBE(10容)を加えて、ペプチドを沈澱させた。固形生成物を集めて、乾燥して灰色固形生成物とした。収率96%、HPLC純度,85.5面積%。
[FmocIE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1−Nal)LAAR(Pbf)(Sar)] 2 LysNH 2 の合成
FmocIE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1−Nal)LAAR(Pbf)(Sar)−OH(2.4当量)、(HCl)2LysNH2(1当量)、HOBT(2.5当量)、およびEtPr2N(4.8当量)をDMF(15容)にスラリーにしたものを、総ての固形物が溶解するまで(5分)周囲温度で攪拌した。溶液にHBTU(2.5当量)を加えた。周囲温度で2時間攪拌した後、水(30容)を加えて、ペプチドを沈澱させた。粗製ペプチドを濾過によって集めた。湿り残る固形生成物を熱エタノール(12.5容)に溶解した後、一晩攪拌しながら周囲温度まで冷却した。固形生成物を集めて、乾燥し、生成物を定量的収率で、HPLC純度80面積%で得た。
AF15705の合成
[FmocIE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1−Nal)LAAR(Pbf)(Sar)]2LysNH2を9:1NMP/ピペリジン(10容)に溶解したものを、周囲温度で1〜2時間攪拌した。水(12容)を加えて、ペプチドを沈澱させた。固形生成物を集め、水(5容)で洗浄して、乾燥した。乾燥固形生成物をMTBE(12容)で粉砕した後、AcCN(8容)で粉砕し、残留ピペリジン、フルベンおよびピペリジン・フルベン付加生成物を除去した。固形生成物を真空濾過によって集め、乾燥した。収率97%。95/5TFA/水溶液(13容)を窒素置換した後、0℃まで冷却した。これに、上記で得た[H−IE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1−Nal)LAAR(Pbf)(Sar)]2LysNH2(1重量)を加えた。懸濁液を、総ての固形物が溶解するまで(30分)0℃で攪拌した後、周囲温度まで加温し、100分間攪拌した。溶媒容積をロータリーエバポレーターを用いて50%だけ減少させた後、氷/水(150容)を加えた。懸濁液を0℃で1.5時間攪拌して、ペプチドを溶解させた後、焼結ガラスで濾過した。ガラス器を水(50ml)で洗浄した後、これを濾過し、生成物溶液に加えた。水溶液を凍結し、凍結乾燥して固形物とし、これを0℃で保管した後、精製した。生成物を、C18改質シリカゲル(100Å細孔度、10μm球状粒子)のカラムに加え、約30%〜約35%アセトニトリル/水のグラディエントであって、いずれの溶媒も0.1%TFAを含むもので溶出した。少なくとも90%AUCの所望なペプチドを含む画分を合わせ、濃縮して、凍結乾燥した。完全に保護された前駆体からの精製ペプチドの収率は、通常は10%〜25%程度である。
集めたペプチドAF15705の端緒になる実施例1Aにおけるペプチド断片の構造の確認。マススペクトル分析法(MS)による分子量の確認、アミノ酸分析(AAA)による組成、およびEdman分解によるペプチド配列情報。
ペプチドのPEG化
B. PEG2分岐状PEGを用いるジ−PEG化AF13948,分子量20,000の調製(工程図1を参照されたい)
AF13948を100mMのビシン,pH8.0に100mg/mlの濃度で溶解し、1.25倍モル過剰量の粉末状PEG2(Shearwater Polymers, Inc.(ハンツビル,アラバマ)から市販されている)に加え、反応が完結するまで、典型的には1〜2時間室温で攪拌した。反応をYMC ODS AQカラムを用いて、40〜65%アセトニトリルのグラディエントを用いて逆相HPLCによって監視した。反応が完了したならば、溶液を第二の1.25モル過剰量の粉末状PEG2に加え、AF13948の各1モルについて、PEG2を全部で5モル用いて工程を4回反復した。溶液をPBSで2倍に希釈して粘度を減少させ、予めPBSで平衡にして溶出したsuperdex 200カラム(Pharmacia)に加えた。サイズ排除カラムからの画分を、逆相HPLCによって分析した。任意のモノ−PEG−AF13948の前に溶出したジ−PEG−AF13948を含む画分をプールし、5℃で保管し、または凍結乾燥した。
C. SPA−mPEGを用いるジ−PEG化AF13948,分子量20,000の調製(工程図3を参照されたい)。
AF13948を100mMのビシン,pH8.0に100mg/mlの濃度で溶解し、5倍モル過剰量の粉末状SPA−mPEG(Shearwater Polymers, Inc.(ハンツビル,アラバマ)から市販されている)に加え、反応が完結するまで、典型的には2時間室温で攪拌した。反応を逆相(YMC ODS AQ)HPLCにより監視し、反応が完結したとき、溶液を脱イオン水で10倍に希釈し、pH7.0の2mMリン酸ナトリウム緩衝液で平衡にしたSP−セファロースカラムに加えた。未反応PEGおよびNHSは、カラム中を流れた。次いで、PEG化したAF13948を0〜150mM NaClグラディエントを用いて溶出し、ジ−PEG化体はモノ−PEG化体の前に溶出した。画分を逆相HPLCによって分析し、適当な画分を合わせた。ジ−PEG−AF13948は、緩衝液をPBSに交換し、5℃で保管するかまたは凍結乾燥した。
D. mPEGアルデヒドを用いるジ−PEG化AF13848,分子量20,000の調製(工程図2を参照されたい)
AF13948を100mMリン酸ナトリウム,pH7.0に10mg/mlの濃度で溶解し、6倍モル過剰量の粉末状PEGアルデヒド(Shearwater Polymers, Inc.(ハンツビル,アラバマ)から市販されている)に加え、1M水素化シアノホウ素ナトリウムを加え、最終水素化シアノホウ素ナトリウム濃度を100mMとした。溶液を室温で18時間攪拌した後、3K(Amicon YM)限外濾過膜を用いて緩衝液をPBSに交換した。溶液をPBSで2倍に希釈して、粘度を減少させ、予めPBSで平衡にして溶出したsuperdex 200カラム(Pharmacia)に加えた。サイズ排除カラムからの画分を、逆相HPLCによって分析した。任意のモノ−PEG−AF13948の前に溶出したジ−PEG−AF13948を含む画分をプールし、5℃で保管し、または凍結乾燥した。
E. SPA−mPEGを用いるジ−PEG化AF15705,分子量20,000(ジ−PEG(20K)AF15705)の調製
AF15705(重量2.30g)を、攪拌およびN2置換を備えたフラスコに入れ、室温に保持した。MilliQ Water(177ml)を加え、材料を溶解するまで攪拌した。20μ1分量を取り出して、水で1mlに希釈し、284nmにおけるUVの読みから、濃度を測定した(9.36mg/ml)。重炭酸ナトリウム(0.2921g)を加えて、総て溶解するまで溶液を攪拌した(測定pHは8)。N2下でのグローブ・バッグにおいて、4分量のM−SPA−PEG−20k(Shearwater Polymers, Inc.)を密封ボトルに秤量した(それぞれの分量は8.67g)。これらを密封したプラスチックバッグに入れ、反応に添加するまで5℃に保持した。重炭酸ナトリウムが溶解した直後に1分量を加え、第二は0.5時間後に加えた。第三分量は二回目の添加の1時間後に加え、第四分量は第三分量を加えてから1時間後に加えた。反応物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を5%EtOH水溶液で9倍に希釈し、0.45ミクロンの硝酸セルロースフィルターで濾過した。この材料を、強カチオン交換カラム(SP Sepharose Fast Flow, 10cm×53cm)に20ml/分で送液した。材料を、2mMリン酸ナトリウム,pH6.0 90分の後、2mMリン酸ナトリウムから10mMリン酸ナトリウム,pH6.0への60分の傾斜、および最後に10mMリン酸ナトリウムから100%PBS,pH7.0までの90分の傾斜からなるグラディエントを用いてカラムから溶出した。このクロマトグラフィーの流速は100ml/分であり、検出器は215nmに設定した。カラム画分を、直列のG3000SWxlおよびG4000SWxl TSKカラムを用いるSEC−HPLCによって分析した。>95%生成物を含む画分をプールし、A/G Technologies UFP-30-C-6A中空繊維カートリッジを用いて33mg/mlまで濃縮した。保持物を5℃の循環浴で冷却し、N2置換した。生成物溶液を、6保持物容を交換するMilliQ水に緩衝液交換した後、更に濃縮して66mg/mlとした。合成、精製および限外濾過の後に、生成物21gを回収した。MALDI-TOF(マトリックス・アシステド・レーザー・デソープション・タイム・オブ・フライト(matrix assisted laser desorption time of flight))マススペクトル分析法による分析で、生成物は46000ダルトンを中心とする広汎な分子量分布を有することを決定した。生成物をトリプシン症かした後、逆相または混合様式HPLCを行い、PEGK結合部位(両N−末端)、および基礎になっているペプチドは分解しなかったことが明らかになった。
(注:MALDI−TOF−MSは、出発PEGは公示されている20kdよりは21.5kdであることを示しており、従って分子量=21500(PEG)×2+3295(AF15705)=46000である。)
実施例2
バイオアッセイ
ペプチドの生物活性は、トロンボポエチン依存性細胞増殖分析法を用いて測定することができる。ネズミIL−3依存性Ba/F3細胞を、全長のヒトTPO−Rでトランスフェクションした。IL−3が存在しない場合(WEHI−3でコンディショニングした培地)では、これらの細胞は、増殖についてはTPO依存性である。親の未トランスフェクション細胞系は、ヒトTPOには反応しないがIL−3依存性のままである。
バイオアッセイは、上記の細胞系の両方について本発明による化合物を用いて行った。細胞を、10%WEHI−3でコンディショニングした培地を含む完全RPMI−10培地で成長させた後、PBSで2回洗浄し、WIHI−3でコンディショニングした培地を欠いた培地に再懸濁し、ペプチドまたはTPOの希釈物を2×104個/ウェルで含むウェルに加えた。細胞を、かつ下5%CO2雰囲気で37℃で48時間インキュベーションし、代謝活性をMTTのホルマザンへの還元によって測定し、570nmでの吸収はELISAプレートリーダーで測定した。試験したペプチドは、第1表に示すように用量依存的にTPO−RでトランスフェクションしたBa/F3細胞の増殖を促進した。これらのペプチドは、親細胞系には効果を示さない。
実施例3
結合親和性
本発明による化合物のTPO−Rに対する結合親和性を競合結合分析法で測定した。マイクロタイター・プレートのウェルに1mgのストレプトアビジンをコーティングし、PBS/1%BSAでブロックした後、ビオチン化抗レセプター固定化抗体(Ab179)50ngでブロックした。次に、ウェルを、可溶性TPO−R回収物の1:10希釈物で処理した。様々な濃度の試験化合物を、マルトース結合タンパク質のC−末端に融合した残基1〜156からなるTPOの切断型(MBP−TPO156)の一定量と混合した。ペプチドMBP−TPO156混合物をTPO−Rをコーティングしたウェルに加え、4℃で2時間インキュベーションした後、PBSで洗浄した。平衡で結合したMBP−TPO156の量を、MBPに対するウサギ抗血清を加えた後、アルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗ウサギIgGを加えた。次に、それぞれのウェルにおけるアルカリ性ホスファターゼの量を、標準的方法を用いて測定した。
分析は、試験化合物の濃度範囲に亙って行い、結果をグラフに表し、y軸が結合したMBP−TPO156を表し、x軸が試験化合物の濃度を表すようにする。次いで、固定化TPO−Rに結合したMBP−TPO156の量の50%(IC50)だけ還元する濃度を測定することができる。
実施例4
この実施例では、対照化合物AF13948に対する各種の置換、欠失および付加を、3種類の分析法を用いて分析した。第一に、MTT細胞増殖分析を、上記の方法で行った。第二に、マイクロフィジオメーター(microphysiometer)分析法を行った(Molecular Devices Corp.)。基本的には、この分析法では、本発明の化合物によるTPOレセプター刺激に反応する細胞外培地の酸性化の速度を測定した。EC50の範囲を、上記のIC50についてと同様に象徴的に示す。最後に、レセプター分析法を行った。c−fos/ルシフェラーゼリポータープラスミドでトランスフェクションしたBaF3/TPOR細胞を0.1%WEHI−3でコンディショニングした培地を含む完全RPMI−10培地で一晩絶食(starved)した後、PBSで2回洗浄した。細胞をWEHI−3でコンディショニングした培地を欠いている培地に再懸濁し、5×105個/ウェルのペプチドの連続希釈物を含むウェルに加えた。細胞を、加湿した5%CO2雰囲気で37°で2時間インキュベーションし、ルシフェラーゼ発現を、ルシフェリン基質を添加した後発光計で測定した。
実施例5
この実施例では、様々なPEG化ペプチドの薬物動態挙動を決定した。化合物の薬物動態は、その薬理活性の重要な決定基である。薬物動態プロフィールの重要な成分は、実験室動物の血漿中の化合物の持続性である。この持続性は、通常は投与後の時間の関数として血漿中の化合物濃度に関して表される。
これらの実験を通じて、雄の20〜25gkBalb/cマウスを用いた。2000mlの容量を、IVまたはSC注射した。ビヒクルはDulbeccoのPBS、5%DMSO、0.1%(w/v)BSAであった。血漿は、凝固防止剤としてヘパリンを用いて屠殺時に回収した。
化合物濃度を、リポーター細胞分析法を用いて測定した。血漿の希釈物を、Baf/3 TPOr/fos/lux構築物3に加えた。ルシフェラーゼ発現を、ルシフェリン基質を添加した後に、発光計で測定した。個々の血漿試料の刺激活性を、血漿の容積当たりの化合物のペプチド当量として表した濃度に変換した(nMまたはng/ml)。この濃度は、親化合物を用いるリポーター分析法で構築した標準曲線と比較することによって得た。
第3表に、化合物AF13948およびジ−PEG化AF13948(ポリエチレングリコール(PEG)平均分子量=5000D)の血漿中の濃度を700μgペプチド当量/kgの注射後の時間の関数として示す。AF13948を投与することによって、60分PIまでビヒクルを注射したマウスに存在する濃度を上回って検出可能な血漿中の活性を生じる。5K PEGを付加すると、血漿中濃度が100倍を上回って増加し、血漿中で検出することができる時間が少なくとも240分PIまで延長される。
第4表に、500μgペプチド当量/kgの注射後の時間の関数としての化合物ジ−PEG(5K)−AF13948およびジ−PEG(20K)−AF13948の血漿中濃度を示す。20K PEGで修飾した化合物の血漿中の濃度および持続性は、ジ−PEG(5K)−AF13948のものより著しく増加する。
第5表は、100、10および1μgペプチド当量の注射後の化合物ジ−PEG(20K)−AF13948の血漿中濃度を示し、観察の時間を120時間PIまで延長する。血漿中に観察された濃度は、投与用量に比例することが分かった。化合物を100μg/kgの単回IV投与量を投与すると、少なくとも96時間PI血漿中濃度が上昇した。
第6表は、ジ−PEG(20K)−AF13948の10μgペプチド当量をSCおよびIV注射した後の血漿中濃度を示す。単回10μgペプチド当量/kg用量のSC注射により、96時間PI血漿中活性が増加した。2つの投与経路で得られた血漿中濃度のプロフィールは、SC投与したジ−PEG(20K)−AF13948のバイオアベイラビリティが良好であることを示している。
また、第1図は、GW350781またはジ−PEG(5K)−AF13948が、ペプチドの非PEG化体と比較して高い安定性を有する、すなわち半減期が長いことを示している。それだけで、第1図は、PEG化ペプチドがヒト血清中で良好なバイオアベイラビリティを有し、安定性が高いことを示している。
実施例6
上記の分析法を用いて、PEGで様々に誘導体形成したペプチドの薬物動態プロフィールを決定した。この実験では、ペプチドは、工程図1〜3に示されるように分岐状PEG2(20K)、エステル結合PEG(SPA)、およびアルデヒド結合PEG(ALDH)を用いて誘導体形成した。第2図は、10μgペプチド当量/kgをSC注射した後の血漿中濃度を示す。第2図から、PEGで様々に誘導体形成した3種類のペプチド化合物は総て、好ましい薬物動態プロフィールを有することが明らかである。
実施例7
この実験では、PEG化ペプチドを、マウスモデルでの血小板減少症に対する効果を評価した。この分析法では、Balb/Cマウスに、0日目にカルボプラチン(90mg/kg腹腔内)を投与することによって、マウスを血小板減少症にする。GW350781(1mg/kg/日)、またはジ−PEG(5K)−AF13948、およびGW350805(32.5μg/kg/日)、またはジ−PEG(20K)−AF13948を、1〜9日目に投与した(s.c,qd)。第3〜4図から、PEG化ペプチドは、約10日目にはカルボプラチンによって誘発される血小板減少症を緩和することが明らかである。これらの結果は、明らかに、本発明のPEG化ペプチドは、マウスモデルでの血小板減少症を緩和することができることを示している。
実施例8
この実験では、PEG化ペプチドを、正常マウスでの血小板濃度についての効果を評価した。一態様では、GW350781(1mg/kg/日)、およびGW350805(32.5μg/kg/日)を1〜9日目に投与した(s.c.,qd)。1〜15日目に、血液を尾静脈出血によって間隔を置いて採取した。第5〜6図から、PEG化ペプチドは血小板減少症に効果があり、20K−ジPEG化ペプチドGW50805は5K−PEG化ペプチドGW350781より約100倍強力であることが明らかである。
もう一つの実験では、GW350781およびGW305805を1〜5日目に投与した(s.c.,qd)。6日目に、動物を屠殺し、末梢血の血小板数を得た。第7〜9図は、PEG化ペプチドの様々な用量の効果並びに複数回投与に対する単回投与の効果を示している。これらの結果は、本発明のPEG化ペプチドをマウスモデルでの血小板を増加するのに用いることができることを明らかに示している。
特許明細書などの総ての著書および文献の本願における開示は、総ての内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
Claims (16)
- 式(I)
(上記式中、
X1は、水素、またはアシルであり、
X2は、G、またはサルコシン(Sar)であり、
X3は、R、A、ノルロイシン(Nle)、またはN−アセチルリシン(Ac−Lys)であり、
X4は、Q、またはEであり、
X5は、W、L−1−ナフチルアラニン(1−Nal)、またはFであり、
X6は、A、5−アミノペンタン酸(Ava)、または2−アミノ酪酸(Abu)であり、
X7は、A、ジフェニルアラニン(Diphe)であるか、またはX7は存在せず、
X8は、p−アミノフェニルアラニン(p−アミノ−Phe)、N−アセチルリシン(Ac−Lys)であるか、またはX8は存在せず、
X9およびX9′は同一であるかまたは異なっており、A、βA、n−メチルアラニン(n−Me−Ala)、サルコシン(Sar)であるか、またはX9およびX9′は存在せず、
X10およびX10′は同一であるかまたは異なっており、βAであるか、または
X10およびX10′は存在しない)
を有する化合物、および
その薬学上許容可能な誘導体であって、
但し、化合物
を除くもの。 - 上記化合物が親水性ポリマーに共有結合している、請求項1または2に記載の化合物。
- 上記親水性ポリマーの平均分子量が約500〜約40,000ダルトンである、請求項3に記載の化合物。
- 上記親水性ポリマーの平均分子量が約5,000〜約20,000ダルトンである、請求項4に記載の化合物。
- 上記親水性ポリマーがポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、およびそれらのコポリマーからなる群から選択される、請求項3〜5のいずれか1項に記載の化合物。
- 上記ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項6に記載の化合物。
- 上記化合物の二量体サブユニットのそれぞれが親水性ポリマーに共有結合している、請求項3〜7のいずれか1項に記載の化合物。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の化合物と、薬学上許容可能なキャリヤーを含んでなる、医薬組成物。
- 治療に用いるための請求項1〜12のいずれか1項に記載の化合物。
- トロンボポエチン作動薬が介在する症状の治療用の、請求項13に記載の医薬組成物。
- トロンボポエチン作動薬が介在する症状の治療に用いる医薬の製造における、請求項1〜12のいずれか1項に記載の化合物の使用。
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