NO344233B1 - Peptider og forbindelser som binder til thrombopoietin-reseptorer - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer peptidforbindelser som binder seg til og aktiverer trombopoietinreseptoren (c-mpl eller TPO-R) eller på annen måte virker som en TPO-agonist. Oppfinnelsen har anvendelse innen feltet for biokjemi og medisinsk kjemi og tilveiebringer spesielt TPO-agonister for anvendelse i behandling av human sykdom.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Megakaryocytter er benmargutledede celler som er ansvarlig for å produsere sirkulerende blodplater. Selv om de omfatter <0,25% av benmargcellene i de fleste arter, så har de >10 ganger volumet av vanlige margceller. Se Kuter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11104-11108 (1994). Megakaryocytter gjennomgår en prosess kjent som endomitose hvor de replikerer deres kjerne, men mislykkes i å gjennomgå celledeling og gir dermed opphav til polyploide celler. Som respons på et nedsatt platetall, så øker den endomitotiske hastigheten, høyere ploide megakaryocytter dannes og antallet megakaryocytter kan øke opp til 3 ganger. Se Harker, J. Clin. Invest., 47:458-465 (1968). Som respons på et forhøyet platetall, så går i motsetning til dette den endomitotiske hastigheten ned, mindre ploide megakaryocytter dannes og antallet megakaryocytter kan gå ned med 50%.

Den eksakte fysiologiske feedback-mekanismen hvor massen med sirkulerende blodplater regulerer den endomitotiske hastigheten og antallet benmargmegakaryocytter er ikke kjent. Den sirkulerende trombopoietiske faktor som er involvert i å styre denne feedback-sløyfen tror man nå er trombopoietin (TPO). Mer spesifikt så har TPO vært vist å være hoved humoral regulator i situasjoner som involverer trombocytopeni. Se for eksempel Metcalf, Nature, 369:519-520 (1994). TPO har vært vist i flere studier å øke blodplatetallet, øke blodplatestørrelsen og øke isotop inkorporering i blodplater hos mottakerdyr. Spesifikt så tror man TPO påvirker megakaryocytopoiesen på flere måter: (1) den produserer økning i megakaryocyttstørrelse og -antall; (2) den produserer en økning i DNA-innhold, i form av polyploiditet, i megakaryocytter; (3) den øker megakaryocytt-endomitose; (4) den produserer øket modning av megakaryocytter; og (5) den produserer en økning i prosent forløperceller, i form av små acetylkolinesterase-positive celler, i benmargen.

Blodplater (trombocytter) er nødvendig for blodkoagulering. Når deres antall er veldig lavt i en pasient, så er det en alvorlig risk for død fra katastrofal blødning. TPO har derfor potensial som nyttig for bruk i både diagnosen og behandlingen av forskjellige hematologiske forstyrrelser, for eksempel sykdommer som primært skyldes blodplatedefekter. Pågående kliniske utprøvinger med TPO har indikert at TPO kan administreres trygt til pasienter. I tillegg har nylige studier tilveiebrakt en basis for projeksjonen av effekten av TPO-terapi i behandlingen av trombocytopeni, og spesielt trombocytopeni som resultat av kjemoterapi, strålingsterapi eller benmargstransplantasjon som behandling for cancer eller lymphoma. Se f. eks.

McDonald, Am. J. Ped. Hematology/Oncology, 14:8-21 (1992).

Genet som koder for TPO er blitt klonet og karakterisert. Se Kuter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11104-11108 (1994); Barley, et al., Cell, 77: 1117-1124 (1994); Kaushansky et al., Nature 369:568-571 (1994); Wending, et al., Nature, 369:571-574 (1994); og Sauvage et al., Nature 369:533-538 (1994). Trombopoietin er et glykoprotein med minst to former, med tilsynelatende molekulær masse på 25 kDa og 31 kDa, med en felles N-terminal aminosyresekvens. Se Bartley, et al., Cell, 77:1117-1124 (1994). Trombopoietin synes å ha to distinkte regioner separert av et potensielt Arg-Arg kløyvningssete. Den aminoterminale regionen er veldig konservert hos menneske og mus og har noe homologi med erytropoietin og interferon- α og interferon-ß. Den karboksyterminale regionen viser bred arts divergens.

DNA-sekvensene og de kodede peptidsekvensene for humant TPO-R (også kjent som cmp1) er blitt beskrevet. Se Vigon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5640-5644 (1992). TPO-R er et medlem av hematopoietin-vekstfaktorreseptorfamilien, en familie som er karakterisert ved en felles strukturell design av det ekstracellulære domene, inkludert fire konserverte C-residier i den N-terminale delen og et WSXWS-motiv (SEQ ID NO: 1) nær den transmembrane regionen. Se Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6934-6938 (1990). Bevis for at denne reseptor spiller en funksjonell rolle i hematopoiese inkluderer observasjoner at dets uttrykk er begrenset til milt, benmarg eller føtal lever hos mus (se Souyri, et al, Cell, 63:1137-1147 (1990)) og til megakaryocytter, blodplater og CD34+ celler hos mennesker (se Methia, et al., Blood 82:1395-1401 (1993)). Videre så hemmer eksponering av CD34+ celler for syntetiske oligonukleotider som er antisens for mp1 RNA signifikant tilsynekomsten av megakaryocytt-kolonier uten å påvirke erytroid eller myeloid kolonidannelse. Noen forskere postulerer at reseptoren fungerer som en homodimer, lignende situasjonen med reseptorene for G-CSF og erytropoietin.

Tilgjengeligheten av klonede gener for TPO-R fasiliterer søker for agonister til denne viktige reseptor. Tilgjengeligheten av det rekombinante reseptorproteinet tillater studien av reseptorligandinteraksjon i en rekke tilfeldige og halv-tilfeldige peptidmangfoldige generasjonssystemer. Disse systemene er utgreiet i US patentnummere 6,251,864, 6,083,913, 6,121,238, 5,932,546, 5,869,451, 6,506,362 og 6,465,430, og i Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382 (1990).De Serres et al., Stem Cells (1999) 17:316-326 diskuterer farmakonkinetikken og hematologiske effekter av PEGylert trombopoietin peptid mimetiske substansen GW395058 i rotter og aper etter intravenøs og subkutant administrasjon.

WO 96/40750 A1 beskriver peptider og mimetiske peptider som binder og aktiverer trombopoietin reseptoren samt anvendelsen av disse i diagnose og i behandling av hematologiske forstyrrelser som trombocytopenia.

Chwirla et al., Science, American association for the advancement of science (1997) vol. 276:1696-1699, beskriver at en peptidagonist av1-66 trombopoietinreseptoren er like potent som et naturlig cytokin.

Den sakte gjenvinning av blodplatenivåene i pasienter som lider av trombocytopeni er et alvorlig problem og har ført til nødvendigheten av søket etter en blodvekstfaktoragonist som er i stand til å akselerere blodplateregenerering. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en slik agonist.

Oppsummering av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører definerte lavmolekylvekts peptidforbindelser som har sterke bindingsegenskaper for TPO-R, som kan aktivere TPO-R og som potensielt tillater reduserte bieffekter sammenlignet med kjente TPO-agonister. Følgelig så kan peptidforbindelsene være nyttige for terapeutiske formål ved å behandle tilstander som er styrt av TPO (f. eks. trombocytopeni som er et resultat av kjemoterapi, strålingsterapi eller benmargstransfusjoner) så vel som for diagnostiske formål i å studere mekanismen for hematopoiese og for in vitro ekspansjonen av megakaryocytter og avkomsceller.

Peptidforbindelser som passende for terapeutiske og/eller diagnostiske formål har en IC50på ca.2 mM eller mindre, bestemt ved for eksempel bindingsaffinitetsanalysen satt fram i Eksempel 3 i US patent nr.5,869,451, hvor en lavere IC50korrelerer til en sterkere bindingsaffinitet for TPO-R. Analysen i US patent nr.5,869,451 er som følger: Bindingsaffiniteter av peptidforbindelser måles i en konkurranse-bindingsanalyse.

Brønnene i en mikrotiterplate belegges med et 1 mg streptavidin, blokkeres med PBS/1% BSA, etterfulgt av 50 ng biotinylert antireseptor immobiliseringsantistoff (Ab179). Brønnene ble så behandlet med en 1:10 gangers fortynning av løselig TPO-R høst. Forskjellige konsentrasjoner av peptidforbindelse blandes med en konstant mengde av en avkortet form av TPO som består av residier 1-156 fusert med den C-terminale enden til maltosebindende protein (MBP-TPO156). Peptid MBP-TPO156blandingene blir tilsatt til de TPO-R belagte brønnene, inkubert i 2 timer ved 4ºC og deretter vasket med PBS. Mengden MBP-TPO156som er bundet ved likevekt måles ved å tilsette et kanin-antiserum rettet mot MBP, etterfulgt av alkalisk fosfatasekonjugert geite-antikanin IgG. Mengden alkalisk fosfatase i hver brønn blir så bestemt ved å anvende standard fremgangsmåter. Analysen blir utført over et område med peptidforbindelsekonsentrasjoner og resultatene er satt opp i en graf slik at y-aksen representerer mengden bundet MBP-TPO156og x-aksen representerer konsentrasjonen av peptidforbindelse. Man kan så bestemme konsentrasjonen hvor peptidforbindelsen vil redusere med 50% (IC50) mengden MBP-TPO156bundet til immobilisert TPO-R. Dissosiasjonskonstanten (Kd) for peptidet bør være lignende den målte IC50ved å anvende disse analysebetingelsene. For farmasøytiske formål så har peptidforbindelsene helst en IC50som ikke er større enn ca.100 µm, mer ønskelig ikke større enn 500 nm. I en fortrukket utførelsesform så er molekylvekten av peptidforbindelsen fra ca.250 til ca. 8000 dalton. Hvis peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen er oligomerisert, dimerisert og/eller derivatisert med en hydrofil polymer som beskrevet her, så vil molekylvektene av slike peptidforbindelser være vesentlig høyere og kan være i et område fra ca.500 til ca.120.000 dalton, mer ønskelig fra ca.8000 til ca.80.000 dalton.

Når de anvendes for diagnostiske formål, så er peptidforbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen helst merket med en detekterbar merking, og følgelig så tjener peptidforbindelsene uten en slik merking som intermediater i fremstillingen av merkede peptidforbindelser.

En peptidforbindelse som møter de definerte kriteriene for molekylvekt og bindingsaffinitet for TPO-R omfatter 9 eller flere aminosyrer hvor aminosyrene er naturlig forekommende eller syntetiske (ikke-naturlig forekommende) aminosyrer.

Følgelig så omfatter foretrukne peptidforbindelser en forbindelse som har:

(1) en molekylvekt på mindre enn ca.5000 dalton, og

(2) en bindingsaffinitet for TPO-R uttrykt ved en IC50på ikke mer enn ca.100 µm,

hvor fra null til alle --C(O)NH--koblingene av peptidforbindelsen er blitt erstattet av en kobling valgt fra gruppen som består av en --CH2OC(O)NR--kobling; en fosfonatkobling; en --CH2S(O)2NR--kobling; en --CH2NR--kobling; en --C(O)NR<6>--kobling og en --NHC(O)NH--kobling hvor R er hydrogen eller laverealkyl og R<6>er laverealkyl,

videre hvor den N-terminale enden av nevnte peptidforbindelse er valgt fra gruppen som består av en --NRR<1>-gruppe; en --NRC(O)R-gruppe; en --NRC(O)OR-gruppe; en --NRS(O)2R-gruppe; en --NHC(O)NHR-gruppe; en succinimidgruppe; en benzyloksykarbonyl-NH-gruppe og en benzyloksykarbonyl-NH-gruppe som har fra 1 til 3 substituenter på fenylringen valgt fra gruppen som består av laverealkyl, laverealkoksy, klor og brom, hvor R og R<1>er uavhengig valgt fra gruppen som består av hydrogen og laverealkyl,

og enda videre hvor den C-terminale enden av nevnte peptidforbindelse har formelen --C(O)R<2>hvor R<2>er valgt fra gruppen som består av hydroksy, laverealkoksy og --NR<3>R<4>hvor R<3>og R<4>er uavhengig valgt fra gruppen som består av hydrogen og laverealkyl og hvor nitrogenatomet i -NR<3>R<4>-gruppen valgfritt kan være amingruppen i den N-terminale enden av peptidet slik at det danner et syklisk peptid,

og fysiologisk akseptable salter av dem.

Det beskrives også en merket peptidforbindelse som omfatter en peptidforbindelse som beskrevet over som har kovalent festet til seg en merking som er i stand til å detekteres.

Spesielt er kjernepeptidforbindelsen en sekvens omfattende H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2, hvor X10er selektert fra gruppen bestående av sarcosin eller βalanin, hvor 2-nal er β-(2-naphthyl)alanin, og hvor den nevnte forbindelsen er kovalent bundet til en hydrofil polymer i henhold til kravene.

Når X10er et sarcosin, så har forbindelsen den følgende strukturen:

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R -(Sar)

\

K(NH2)

/

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R -(Sar),

hvor (2-Nal) er ß-(2-naftyl)alanin og (Sar) er sarcosin (SEQ ID NO: 7). Denne peptidforbindelse, som også kan representeres ved den følgende strukturen (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAAR(Sar))2K-NH2, er referert til her som ”TPO-forbindelse nr.1”.

Passende hydrofile polymer inkluderer, men er ikke begrenset til, polyalkyletere som eksemplifisert ved polyetylenglykol og polypropylenglykol, polymelkesyre, polyglykolsyre, polyoksyalkener, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, cellulose og cellulosederivater, dekstran og dekstranderivater, osv., som beskrevet i US patent nr. 5,869,451.

Peptidforbindelsene beskrevet her er nyttige for forebygging og behandling av sykdommer styrt av TPO, og spesielt for behandling av hematologiske forstyrrelser, inkludert, men ikke begrenset til, trombocytopeni som er et resultat av kjemoterapi, strålingsterapi eller benmargstransfusjoner. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer dermed også forbindelser til bruk i en fremgangsmåte for behandling hvor en pasient som har en forstyrrelse som er mottakelig for behandling med en TPO-agonist mottar, eller blir gitt, en terapetutisk effektiv dose eller mengde av en peptidforbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse.

Oppfinnelsen tilveiebringer også farmasøytiske sammensetninger som omfatter en eller flere peptidforbindelser beskrevet her og en fysiologisk akseptabel bærer. Disse farmasøytiske sammensetningene kan være i en rekke former, inkludert orale doseringsformer så vel som inhalerbare pulvere og injiserbare og infuserbare løsninger.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 viser og sammenligner aktiviteten av TPO-forbindelse nr.1 og en peptidforbindelse i fagfeltet (referert til gjennom hele teksten her som ”fagfelt peptidforbindelse”). Forskjellen mellom TPO-forbindelse nr.1 og fagfelt peptidforbindelsen er at fagfelt peptidforbindelsen har en ß-(1-naftyl)alanin (1-Nal) hvor (2-Nal) er på TPO-forbindelse nr.1.

Fig. 2 viser og sammenligner aktiviteten av PEGylert TPO-forbindelse nr. 1 med PEGylert fagfelt peptidforbindelse.

Fig. 3 viser og sammenligner in vivo forandringen i blodplatetall i rotte som viser den relative potensen av PEGylert TPO-forbindelse nr.1 og PEGylert fagfelt peptidforbindelse.

Fig. 4 og 5 viser og sammenligner antallet og volumet av sirkulerende blodplater, på en doseavhengig måte, henholdsvis ved anvendelsen av PEGylert fagfelt peptidforbindelse og anvendelsen av PEGylert TPO-forbindelse nr.1.

Beskrivelse av spesifikke utførelsesformer

I. Definisjoner og generelle parametere

De følgende definisjonene er satt fram for å illustrere og definere betydningen og omfanget av de forskjellige uttrykkene anvendt for å beskrive oppfinnelsen her.

”Agonist” refererer til en biologisk aktiv ligand som binder seg til dets komplementære biologisk aktive reseptor og aktiverer den sistnevnte enten til å forårsake en biologisk respons i reseptoren eller til å øke allerede eksisterende biologisk aktivitet av reseptoren.

”Peptidforbindelse” refererer til et molekyl som hydrolyseres til aminosyrer og/eller aminosyrederivater og/eller aminosyresubstitutter.

”Farmasøytisk akseptable salter” refererer til det ikke-toksiske alkaliske metallet, jordalkalimetallet og ammoniumsalter som anvendes i den farmasøytisk industrien inkludert natrium-, kalium-, litium-, kalsium-, magnesium-, barium-, ammonium- og protaminsinksalter, som lages ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent i fagfeltet. Uttrykket inkluderer også ikke-toksiske, sure tilleggssalter, som generelt lages ved å la forbindelsene i denne oppfinnelse reagere med en passende organisk eller uorganisk syre. Representative salter inkluderer hydroklorid, hydrobromid, sulfat, bisulfat, acetat, oksalat, valerat, oleat, laurat, borat, benzoat, laktat, fosfat, tosylat, sitrat, maleat, fumarat, succinat, tartrat, napsylat og lignende.

”Farmasøytisk akseptable sure tilleggssalter” refererer til de salter som bevarer den biologiske effektiviteten og egenskapene til de frie basene og som ikke er biologisk eller på annen måte uønsket, formet med uorganiske syrer slik som hydroklorsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, salpetersyre, fosforsyre og lignende, og organiske syrer slik som eddiksyre, propionsyre, glykolsyre, pyrodruesyre, oksalsyre, eplesyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, tartarsyre, sitronsyre, benzosyre, kanelsyre, mandelsyre, mentansulfonsyre, etansulfonsyre, p-toluensulfonsyre, salicylsyre og lignende. For en beskrivelse av farmasøytisk akseptable sure tilleggssalter som promedikamenter, se Bundgaard, H., supra.

”Farmasøytisk akseptabel ester” refererer til de estere som bevarer, ved hydrolyse av esterbindingen, den biologiske effektiviteten og egenskapene til karboksylsyren eller alkoholen og som ikke er biologisk eller på annen måte uønsket. For en beskrivelse av farmasøytisk akseptable estere som promedikamenter, se Bundgaard, H., ed., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Disse estere er vanligvis dannet fra den korresponderende karboksylsyren og en alkohol. Vanligvis så kan esterdannelse utføres via konvensjonelle synteseteknikker (se f. eks. March, Advanced Organic Chemistry, 4. utg., John Wiley & Sons, New York (1992), 393-396, og referanser sitert deri, og Mark, et al., Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). Alkoholkomponenten til esteren vil vanligvis omfatte (i) en C2-C12alifatisk alkohol som kan eller som ikke trenger inneholde en eller flere dobbeltbindinger og som kan eller ikke trenger inneholde forgrenede karboner eller (ii) en C7-C12aromatisk eller heteroaromatisk alkohol. Denne oppfinnelse overveier også anvendelsen av de sammensetninger som er både estere som beskrevet her og samtidig farmasøytisk akseptable, sure tilleggssalter av dem.

”Farmasøytisk akseptabelt amid” refererer til de amider som bevarer, ved hydrolyse av amidbindingen, den biologiske effektiviteten og egenskapene til karboksylsyren eller aminet og som ikke er biologisk eller på annen måte uønsket. For en beskrivelse av farmasøytisk akseptable amider som promedikamenter, se Bundgaard, H., ed., Design og Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Disse amider blir vanligvis dannet fra den korresponderende karboksylsyren og en amin. Vanligvis så kan amiddannelse utføres via konvensjonelle syntetiske teknikker (se f. eks. March, Advanced Organic Chemistry, 4. utg., John Wiley & Sons, New York (1992), s.393, og Mark, et al., Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). Denne oppfinnelse overveier også anvendelsen av de sammensetninger som er både amider som beskrevet her og samtidig er farmasøytisk akseptable, sure tilleggssalter av dem.

”Farmasøytisk eller terapeutisk akseptabel bærer” refererer til et bærermedium som ikke interfererer med effektiviteten av den biologiske aktiviteten til de aktive ingrediensene og som ikke er toksisk for verten eller pasienten.

”Stereoisomer” refererer til en kjemisk forbindelse som har den samme molekylvekten, kjemiske sammensetningen og konstitusjonen som en annen, men med atomene gruppert forskjellig. Det vil si, visse identiske kjemiske deler er ved forskjellige orienteringer i rom og derfor, når de er rene, så har de evnen til å rotere planet med polarisert lys. Imidlertid så kan noen rene stereoisomerer ha en optisk rotasjon som er så liten at den ikke er detekterbar med nåværende instrumentering. Forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen kan ha et eller flere asymmetriske karbonatomer og derfor inkludere forskjellige stereoisomerer. Alle stereoisomere er inkludert innen omfanget av oppfinnelsen.

”Terapeutisk eller farmasøytisk effektiv mengde” som brukt om sammensetningene i den foreliggende oppfinnelsen refererer til mengden av sammensetning som er nødvendig for å indusere et ønsket biologisk resultat. Det resultatet kan være lindring av tegnene, symptomene eller årsakene til en sykdom, eller enhver annen ønsket forandring av et biologisk system. I den foreliggende oppfinnelsen så vil resultatet vanligvis involvere en nedgang i de immunologiske og/eller inflammatoriske responsene på infeksjon eller vevsskade.

Aminosyreresidier i peptider er forkortet som følger: Fenylalanin er Phe eller F; leucin er Leu eller L; isoleucin er Ile eller I; metionin er Met eller M; valin er Val eller V; serin er Ser eller S; prolin er Pro eller P; treonin er Thr eller T; alanin er Ala eller A; tyrosin er Tyr eller Y; histidin er His eller H; glutamin er Gln eller Q; asparagin er Asn eller N; lysin er Lys eller K; asparginsyre er Asp eller D; glutaminsyre er Glu eller E; cystein er Cys eller C; tryptofan er Trp eller W; arginin er Arg eller R; og glycin er Gly eller G. I tillegg så er t-Buo tert-bulyloksy, Bzl er benzyl, CHA er cykloheksylamin, Ac er acetyl, Me er metyl, Pen er penicillamin, Aib er aminoisosmørsyre, Nva er norvalin, Abu er aminosmørsyre, Thi er tienylalanin, OBn er O-benzyl og hyp er hydroksyprolin.

Peptidanaloger er vanligvis anvendt i den farmasøytiske industrien som ikke-peptid medikamenter med egenskaper som er analoge til de hos templatpeptidet. Disse typer non-peptid forbindelser blir klat ”peptidetterligninger” eller ”peptid etterligninger” eller ”peptidoetterligninger” (Luthman, et al., A Textbook of Drug Design and Development, 14:386-406, 2. utg., Harwood Academic Publishers (1996); Joachim Grante, Angew.

Chem. Int. Ed. Engl., 33:1699-1720 (1994); Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber og Freidinger TINS, s.392 (1985); og Evans, et al., J. Med. Chem.30: 1229 (1987)). Peptidetterligninger som er strukturelt like terapeutisk nyttige peptider kan anvendes for å produsere en ekvivalent eller forsterket terapeutisk eller profylaktisk effekt. Vanligvis så er peptidetterligninger strukturelt like et paradigma polypeptid (dvs. et polypeptid som har en biologisk eller farmakologisk aktivitet), slik som naturlig forekommende reseptorbindings-polypeptid, men som har en eller flere peptidkoblinger valgfritt erstattet av en alternativ kobling slik som --CH2NH--, --CH2S--, osv. ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent i fagfeltet og som videre er beskrevet i de følgende referansene: Spatola, A. F., Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, s.267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (mars 1983), vol.1, utgave 3, Peptide Backbone Modifications (generell oversikt); Morley, Trends Pharm. Sci. s.463-468 (1980) (generell oversikt); Hudson, et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 14:177-185 (1979); Spatola et al., Life Sci., 38: 1243-1249 (1986); Hann, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 307-314 (1982); Almquist, et al., J. Med. Chem., 23: 1392-1398 (1980); Jennings-White, et al., Tetrahedron Lett.23: 2533 (1982); Szelke, et al., European Appln. EP 45665 (1982); Holladay, et al., Tetrahedron Lett., 24:4401-4404 (1983); og Hruby, Life Sci., 31: 189-199 (1982).En bestemt foretrukket ikke-peptid kobling er -CH2NH--. Slike peptidetterligninger kan ha signifikante fordeler i forhold til polypeptid utførelsesformer, inkludert for eksempel: Mer økonomisk produksjon, større kjemisk stabilitet, forsterkede farmakologiske egenskaper (halveringstid, absorpsjon, potens, effektivitet, osv.), forandret spesifisitet (f. eks. et bredt spekter av biologiske aktiviteter), redusert antigenisitet og andre.

Merking av peptidetterligninger involverer vanligvis kovalent festing av en eller flere merkinger, direkte eller gjennom en spacer (f. eks. en amidgruppe), til ikkeinterfererende posisjon eller posisjoner på peptidetterligningen som er forutsagt av kvantitative strukturaktivitetsdata og/eller molekulær modellering. Slike ikkeinterfererende posisjoner er vanligvis posisjoner som ikke danner direkte kontakter med makromolekylet eller -molekylene (f. eks. immunoglobulin-superfamilie molekyler) som peptidetterligningene binder seg til for å produsere den terapeutiske effekten.

Derivatisering (f. eks. merking) av peptidetterligninger bør ikke vesentlig interferere med den ønskede biologiske eller farmakologiske aktiviteten til peptidetterligningen. Vanligvis så binder peptidetterligninger av reseptor-bindingspeptider seg til reseptoren med høy affinitet og innehar detekterbar biologisk aktivitet (f. eks. er agonistiske eller antagonistiske for en eller flere reseptorstyrte fenotypiske forandringer).

Systematisk substitusjon av en eller flere aminosyrer av en konsensussekvens med en D-aminosyre av den samme typen (f. eks. D-lysin istedenfor L-lysin) kan anvendes for å generere mer stabile peptider. I tillegg så kan tvungne peptider som omfatter en konsensussekvens eller en vesentlig identisk konsensussekvensvariasjon genereres ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent i fagfeltet (Rizo, et al., Ann. Rev. Biochem., 61: 387 (1992)); for eksempel ved å tilsette interne cysteinresidier som er i stand til å danne intramolekylære disulfidbroer som syklerer peptidet.

”Detekterbar merking” refererer til materialer som, når de er kovalent festet til peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen, tillater deteksjon av peptidforbindelsene in vivo i pasienten som peptidforbindelsen er blitt gitt til. Passende detekterbare merkinger er velkjent i fagfeltet og inkluderer for eksempel radioisotoper, fluorescerende merkinger (f. eks. fluorescein) og lignende. Den bestemte detekterbare merking som benyttes er ikke kritisk og er valgt relativt til mengden merking som skal brukes så vel som toksisiteten av merkingen ved mengden av merking som brukes. Seleksjon av merkingen i forhold til slike faktorer er godt innenfor kunnskapen til en fagperson.

Kovalent festing av den detekterbare merkingen på peptidforbindelsen utføres ved konvensjonelle fremgangsmåter som er velkjent i fagfeltet. For eksempel, når<125>I radioisotopen benyttes som den detekterbare merkingen, så kan kovalent festing av<125>I til peptidforbindelsen oppnås ved å inkorporere aminosyren tyrosin inn i peptidforbindelsen og deretter jodinere peptidforbindelsen (se f. eks. Weaner, et al., Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds, s. 137-140 (1994)). Inkorporering av tyrosin til den N- eller C-terminale enden av peptidforbindelsen kan oppnås ved velkjent kjemi. På samme måte så kan<32>P inkorporeres i peptidforbindelsen som en fosfat-enhet gjennom for eksempel en hydroksylgruppe på peptidforbindelsen ved å anvende konvensjonell kjemi.

II. Oversikt

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer peptidforbindelser som binder seg til og aktiverer TPO-R eller på annen måte oppfører seg som en TPO-agonist i henhold til kravene. Disse peptidforbindelser inkluderer ”lede”peptidforbindelser og ”derivat”peptidforbindelser som er konstruert slik at de har den samme eller lignende molekylære struktur eller fasong som lede-peptidforbindelsene, men som skiller seg fra lede-peptidforbindelsene enten med hensyn til mottakelighet for hydrolyse eller proteolyse og/eller med hensyn til andre biologiske egenskaper, slik som økt affinitet for reseptoren. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også sammensetninger, i henhold til kravene, som omfatter en effektiv mengde av en peptidforbindelse, og mer bestemt, en peptidforbindelse som er nyttig for å behandle hematologiske forstyrrelser, og spesielt, trombocytopeni assosiert med kjemoterapi, strålingsterapi eller benmargstransfusjoner.

Det ble funnet at kjernepeptidforbindelsen kan omfatte en sekvens med aminosyrer (SEQ ID NO: 2): X9X8G X1X2X3X4X5X6X7, hvor X6kan være ß-(2-naftyl)alanin og hvor X9er A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T eller V; og X8er A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T eller V. Mer ønskelig så er X9A eller I; og X8er D, E eller K. Videre så er X1C, L, M, P, Q, V; X2er F, K, L, N, Q, R, S, T eller V; X3er C, F, I, L, M, R, S, V eller W; X4er enhver av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene; X5er A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V eller Y; og X7er C, G, I, K, L, M, N, R eller V.

Som beskrevet videre her, så har det imidlertid blitt funnet at ved å erstatte X6med ß-(2-naftyl)alanin, så tilveiebringer forbindelsen forskjellige egenskaper fra forbindelsen som inneholder ß-(1-naftyl)alanin. Følgelig så inkluderer et bestemt foretrukket peptid aminosyresekvensen H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2, hvor X10er selektert fra gruppen bestående av sarcosin eller β-alanin, hvor 2-nal er β-(2-naphthyl)alanin, og hvor den nevnte forbindelsen er kovalent bundet til en hydrofil polymer.

En foretrukket peptidforbindelse er som følger:

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R -(Sar)

\

K(NH2)

/

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R -(Sar)

hvor (2-Nal) er ß-(2-naftyl)alanin og (Sar) er sarcosin (SEQ ID NO: 7). Denne peptidforbindelse refereres til her som ”TPO-forbindelse nr.1”.

Peptidforbindelser som har en IC50større enn ca.100 mM mangler tilstrekkelig binding til å tillate anvendelse i enten diagnostiske eller terapeutiske aspekter av denne oppfinnelse. For diagnostiske formål så har peptidforbindelsene helst en IC50på ca.2 mM eller mindre, og for farmasøytiske formål så har peptidforbindelsene en IC50på ca.

100 µM eller mindre.

Fig. 1 sammenligner aktiviteten av tre forskjellige batcher med TPO-forbindelse nr.1 med en batch av fagfelt peptidforbindelse ved å anvende standard relativ luminescens enhets analyseteknikker. Analysen benytter museceller som er konstruert for stabilt å uttrykke den humane TPO-reseptoren og en luciferase-reporterkonstruksjon drevet av fos promotoren. Forskjellen mellom TPO-forbindelse nr.1 og fagfelt peptidforbindelsen er at fagfelt peptidforbindelsen har en ß-(1-naftyl)alanin (1-Nal) hvor (2-Nal) er på TPO-forbindelse nr. 1. TPO-forbindelse nr.1 refereres til som 2-Nal og fagfelt peptidforbindelsen refereres til som 1-Nal (fagfelt) i Fig.1. Som vist fra Fig.1, så er aktiviteten lignende for begge forbindelser.

Fig. 2 sammenligner aktiviteten av flere forskjellige batcher PEGylert TPO-forbindelse nr. 1 (pegylering av forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen er beskrevet i mer detalj under) til flere batcher med PEGylert fagfelt peptidforbindelse. Begge batchere med PEGylert fagfelt peptidforbindelse viser høy aktivitet med vesentlig det samme nivå av aktivitet som ikke-PEGylert fagfelt peptidforbindelse. De gjenværende linjene illustrerer aktiviteten til forskjellige batcher PEGylert TPO-forbindelse nr.1. Som vist ved Fig.2 i denne modell, så har den sistnevnte mindre aktivitet i forhold til de PEGylerte fagfelt peptidforbindelsene. PEGylert TPO-forbindelse nr.1 refereres til som PEG-2-Nal og PEGylert fagfelt peptidforbindelse refereres til som PEG-1-Nal (fagfelt) i Fig. 2.

Fig. 3 viser den relative potensen til PEGylert fagfelt peptidforbindelse og PEGylert TPO-forbindelse nr. 1. Gjennom en rottemodell viser Fig.3 in vivo forandringen i blodplatetallet etter administrering av PEGylert fagfelt peptidforbindelse og PEGylert TPO-forbindelse nr. 1. Som vist ved Fig.3, så har den høyeste dosen av PEGylert TPO-forbindelse nr.1 den samme aktiviteten som den laveste dosen av PEGylert fagfelt peptidforbindelse. En mindre potent forbindelse kan tilveiebringe en mindre drastisk stimulus til målcellen, som kunne redusere risikoen for bieffekter forårsaket av overstimulering av målcellen, slik som forverret trombocytopeni etter påfølgende syklus med kjemoterapi. PEGylert TPO-forbindelse nr.1 refereres til som PEG-2-Nal og PEGylert fagfelt peptidforbindelse refereres til som PEG-1-Nal (fagfelt) i Fig.3.

Fig. 4 og 5 viser resultatene fra en hode-til-hode doseresponsstudie av en PEGylert fagfelt peptidforbindelse og PEGylert TPO-forbindelse nr.1 i normale mus. PEGylert TPO-forbindelse nr. 1 refereres til som PEG-2-Nal og PEGylert fagfelt peptidforbindelse refereres til som PEG-1-Nal (fagfelt) i figurene 4 og 5. Fig.4 viser økninger i blodplatenivåene, og Fig.5 viser gjennomsnittlig blodplatevolum seks (6) dager etter behandling. Doseområdet var fra 10 til 3000 µg/kg. Begge peptidforbindelser øket antallet sirkulerende blodplater på en doseavhengig måte med økninger i forhold til kontrollgruppen observert ved doser så lave som 30 µg/kg for begge forbindelser. Ved den maksimale responsen så forhøyet disse peptidforbindelser blodplatetallet til nivåer som var opp til 4 ganger høyere enn kontrollverdier.

Doseresponskurvene for disse peptidforbindelsene er veldig like, noe som indikerer at i denne modell så var det essensielt ingen forskjell mellom de to testartiklene basert på disse endepunkter.

III. Fremstilling av peptidforbindelser

A. Fast fase syntese

Peptidforbindelsene i oppfinnelsen kan lages ved hjelp av klassiske fremgangsmåter kjent i fagfeltet, for eksempel ved å anvende standard fast fase teknikker. Standard fremgangsmåtene inkluderer eksklusiv fast fase syntese, delvis fast fase syntese fremgangsmåter, fragmentkondensering, klassisk løsning syntese og til og med rekombinant DNA teknologi. Se f. eks. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1963). På fast fase så er syntesen vanligvis påbegynt fra den C-terminale enden av peptidet ved å anvende et alfa-amino beskyttet resin. Et passende startmateriale kan lages for eksempel ved å feste den nødvendige alfa-aminosyren til et klormetylert resin, et hydroksymetylresin eller et benzhydrylaminresin. Et slikt klormetylert resin selges under varenavnet BIO-BEADS SX-1 av Bio Rad Laboratories, Richmond, CA, og tillagingen av hydroksymetylresinet er beskrevet av Bodonszky, et al., Chem. Ind.

(London), 38:1597 (1966). Benzhydrylamin (BHA) resinet har vært beskrevet av Pietta og Marshall, Chem. Commn., 650 (1970), og er kommersielt tilgjengelig fra Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, Calif., i hydrokloridformen.

Peptidforbindelsene i oppfinnelsen kan dermed lages ved å koble en alfa-amino beskyttet aminosyre til den klormetylerte resinen ved hjelp av for eksempel cesiumbikarbonatkatalysator, i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Gisin, Helv. Chim. Acta., 56: 1467 (1973). Etter den initielle koblingen, så blir den alfa-amino beskyttede gruppen fjernet ved et valg av reagenser inkludert trifluoreddiksyre (TFA) eller saltsyre (HCl) løsninger i organiske løsemidler ved romtemperatur.

De alfa-amino beskyttende gruppene er de som er kjent for å være nyttige i fagfeltet innen trinnvis syntese av peptider. Inkludert er acyltype beskyttende grupper (f. eks.

formyl, trifluoracetyl, acetyl), aromatiske uretantype beskyttende grupper (f. eks. benzyloksykarboyl (Cbz) og substituerte Cbz), alifatiske uretanbeskyttende grupper (f. eks. t-butyloksykarbonyl (Boc), isopropyloksykarbonyl, cykloheksyloksykarbonyl) og alkyltype beskyttende grupper (f. eks. benzyl, trifenylmetyl). Boc og Fmoc er foretrukne beskyttende grupper. Den sidekjedebeskyttende gruppen forblir intakt under kobling og blir ikke avspaltet i løpet av avbeskyttelsen av den aminoterminale beskyttende gruppen eller i løpet av koblingen. Den sidekjedebeskyttende gruppen må være mulig å fjerne ved ferdigstillelsen av syntesen av sluttpeptidet og under reaksjonsbetingelser som ikke vil forandre målpeptidet.

De sidekjedebeskyttende gruppene for Tyr inkluderer tetrahydropyranyl, tert-butyl, trityl, benzyl, Cbz, Z-Br-Cbz og 2,5-diklorbenzyl. De sidekjedebeskyttende gruppene for Asp inkluderer benzyl, 2,6-diklorbenzyl, metyl, etyl og cykloheksyl. De sidekjedebeskyttende gruppene for Thr og Ser inkluderer acetyl, benzoyl, trityl, tetrahydropyranyl, benzyl, 2,6-diklorbenzyl og Cbz. Den sidekjedebeskyttende gruppen for Thr og Ser er benzyl. De sidekjedebeskyttende gruppene for Arg inkluderer nitro, tosyl (Tos), Cbz, adamantyloksykarbonyl-mesitoylsulfonyl (Mts) eller Boc. De sidekjedebeskyttende gruppene for Lys inkluderer Cbz, 2-klorbenzyloksykarbonyl (2-Cl-Cbz), 2-brombenzyloksykarbonyl (2-BrCbz), Tos eller Boc.

Etter fjerning av den alfa-amino beskyttende gruppen, så blir de gjenværende beskyttede aminosyrene koblet trinnvis i den ønskede rekkefølgen. Et overskudd av hver beskyttet aminosyre blir vanligvis anvendt med en passende karboksylgruppeaktivator slik som dicykloheksylkarbodiimid (DCC) i løsning, for eksempel i metylenklorid (CH2Cl2), dimetylformamid (DMF) blandinger.

Etter at den ønskede aminosyresekvensen er fullstendig, så blir det ønskede peptidet koblet fra resinstøtten ved behandling med et reagens slik som trifluoreddiksyre eller hydrogenfluorid (HF), som ikke bare kløyver peptidet fra resinet, men også kløyver alle gjenværende sidekjedebeskyttende grupper. Når det klormetylerte resinet anvendes, så resulterer hydrogenfluoridbehandling i dannelsen av de frie peptidsyrene. Når benzhydrylaminresinet anvendes, så resulterer hydrogenfluoridbehandling direkte i det frie peptidamidet. Alternativt, når det klormetylerte resinet benyttes, så kan det sidekjedebeskyttede peptidet kobles fra ved behandling av peptidresinet med ammoniakk for å gi det ønskede sidekjedebeskyttede amidet eller med en alkylamin for å gi et sidekjedebeskyttet alkylamid eller dialkylamid. Sidekjedebeskyttelse blir så fjernet på den vanlige måten ved behandling med hydrogenfluorid for å gi de frie amider, alkylamider eller dialkylamider.

Disse fast fase peptidsynteseprosedyrene er velkjente i fagfeltet og videre beskrevet av John Morrow Stewart og Janis Dillaha Young, Solid Phase Peptide Synthesis (2. utg., Pierce Chemical Company, 1984).

B. Syntetiske aminosyrer

Disse prosedyrer kan også anvendes for å syntetisere peptider hvor aminosyrer forskjellig fra de 20 naturlig forekommende, genetisk kodede aminosyrene substitueres ved en, to eller flere posisjoner av enhver av forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Man kan erstatte de naturlig forekommende sidekjedene av de 20 genetisk kodede aminosyrene (eller D-aminosyrer) med andre sidekjeder, for eksempel med grupper slik som alkyl, laverealkyl, cykliske 4-, 5-, 6- til 7-medlemmer alkyl, amid, amidlaverealkyl, amid di(laverealkyl), laverealkoksy, hydroksy, karboksy og de lavere esterderivatene av dem, og med 4-, 5-, 6- til 7-medlemmer heterocykliske. Spesielt så kan prolinanaloger hvor ringstørrelsen av prolinresidiet forandres fra 5 medlemmer til 4, 6 eller 7 medlemmer benyttes. Cykliske grupper kan være mettede eller umettede, og hvis umettede, så kan de være aromatiske eller ikke-aromatiske. Heterocykliske grupper inneholder helst et eller flere nitrogen, oksygen og/eller svovel heteroatomer. Eksempler på slike grupper inkluderer furazanyl, furyl, imidazolidinyl, imidazolyl, imidazolinyl, isotiazolyl, isoksazolyl, morfolinyl (f. eks. morfolino), oksazolyl, piperazinyl (f. eks. 1-piperazinyl), piperidyl (f. eks.1-piperidyl, piperidino), pyranyl, pyrazinyl, pyrazolidinyl, pyrazolinyl, pyrazolyl, pyridazinyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyrrolidinyl (f. eks. 1-pyrrolidinyl), pyrrolinyl, pyrrolyl, tiadiazolyl, tiazolyl, tienyl, tiomorfolinyl (f. eks. tiomorfolino) og triazolyl. Disse heterocykliske grupper kan være substituerte eller ikke-substituerte. Der hvor en gruppe er substituert, så kan substituenten være alkyl, alkoksy, halogen, oksygen eller substituert eller ikke-substituert fenyl.

Man kan også lett modifisere peptidene i den foreliggende oppfinnelsen ved fosforylering (se f. eks. W. Bannwarth, et al., Biorganic and Medicinal Chemistry Letters, 6(17): 2141-2146 (1996)), og andre fremgangsmåter for å lage peptidderivater av forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen er beskrevet i Hruby, et al., Biochem. J., 268(2): 249-262 (1990). Peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen kan dermed også tjene som en basis for å lage peptidetterligninger med lignende biologisk aktivitet.

C. Terminale modifikasjoner

Fagfolk vil forstå at en rekke teknikker er tilgjengelig for å konstruere peptidforbindelser med den samme eller lignende ønsket biologisk aktivitet som den korresponderende peptidforbindelsen, men med gunstigere aktivitet enn peptidforbindelsen med hensyn til løselighet, stabilitet og mottakelighet for hydrolyse og proteolyse. Se for eksempel Morgan, et al., Ann. Rep. Med. Chem., 24:243-252 (1989). Det følgende beskriver fremgangsmåter for å lage peptidforbindelser modifisert i den N-terminale aminogruppen, den C-terminale karboksylgruppen og/eller å forandre en eller flere av amidokoblingene i peptidet til en ikke-amidokobling. Det må forstås at to eller flere slike modifikasjoner kan kobles i en peptidforbindelsesstruktur (f. eks. modifikasjon av den C-terminale karboksylgruppen og inklusjon av en -CH2-karbamatkobling mellom to aminosyrer i peptidforbindelsen).

1. N-terminale modifikasjoner

Peptidforbindelsene syntetiseres vanligvis som den frie syren, men som nevnt over, så kan de lett lages som amidet eller esteren. Man kan også modifisere den amino- og/eller karboksyterminale enden av peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen for å produsere andre forbindelser i oppfinnelsen. Aminoterminale modifikasjoner inkluderer metylering, acetylering, tilsetting av en benzyloksykarbonylgruppe, eller blokkering av den aminoterminale enden med enhver blokkeringsgruppe som inneholder en karboksylatfunksjonalitet definert som RCOO--, hvor R er valgt fra gruppen som består av naftyl, akridinyl, steroidyl og lignende grupper. Karboksyterminale modifikasjoner inkluderer å erstatte den frie syren med en karboksamidgruppe eller å danne en cyklisk laktam ved den karboksyterminale enden for å introdusere strukturelle innskrenkninger.

Aminoterminale modifikasjoner er som sitert over og inkluderer alkylering, acetylering, å tilsette en karbobenzoylgruppe, å danne en succinimidgruppe, osv. (se f. eks. Murray, et al., Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5. utg., vol.1, Manfred E. Wolf, ed., John Wiley & Sons, Inc. (1995)). Spesielt så kan den N-terminale aminogruppen så reageres som følger:

(a) å danne en amidgruppe med formelen RC(O)NH-- hvor R er som definert over ved reaksjon med et surt halid eller symmetrisk anhydrid. Vanligvis kan reaksjonen utføres ved å la et surt halid reagere ca. ekvimolart eller i overskuddsmengder (f. eks. ca.5 ekvivalenter) med peptidet i en uvirksom fortynner (f. eks. diklormetan) som helst inneholder et overskudd (f. eks. ca.10 ekvivalenter) av et tertiært amin, slik som diisopropyletylamin, for å fange opp syren som genereres i løpet av reaksjonen. Reaksjonsbetingelser er ellers konvensjonelle (f. eks. romtemperatur i 30 minutter). Alkylering av den terminale amino for å tilveiebringe en laverealkyl N-substitusjon etterfulgt av reaksjon med et surt halid som beskrevet over vil tilveiebringe N-alkylamidgruppe med formelen RC(O)NR--;

(b) å danne en succinimidgruppe ved reaksjon med succinanhydrid. Som før, så kan en ca. ekvimolar mengde eller et overskudd succinanhydrid (f. eks. ca.5 ekvivalenter) benyttes og aminogruppen omdannes til succinimid ved fremgangsmåter som er velkjent i fagfeltet inkludert anvendelsen av et overskudd (f. eks.10 ekvivalenter) av et teriært amin slik som diisopropyletylamin i et passende uvirksomt løsemiddel (f. eks. diklormetan). Se for eksempel Wollenberg, et al., US patent nr.4,612,132.Det må forstås at succiningruppen kan substitueres med for eksempel alkyl eller --SR substituenter som er laget på en konvensjonell måte for å tilveiebringe substituert succinimid ved den N-terminale enden av peptidet. Slike alkylsubstituenter lages ved reaksjon av en lavereolefin med maleinanhydrid på måten som er beskrevet av Wollenberg, et al., supra og --SR substituenter lages ved reaksjon av RSH med maleinanhydrid hvor R er som definert over;

(c) å danne en benzyloksykarbonyl-NH-- eller en substituert benzyloksykarbonyl-NH--gruppe ved reaksjon med ca. en ekvivalent mengde eller et overskudd av CBZ--Cl (dvs. benzyloksykarbonylklorid) eller en substituert CBZ--Cl i en passende uvirksom fortynner (f. eks. diklormetan) som helst inneholder et tertiært amin for å fange opp syren som genereres i løpet av reaksjonen;

(d) å danne en sulfonamidgruppe ved reaksjon med en ekvivalent mengde eller et overskudd (f. eks.5 ekvivalenter) av R--S(O)2Cl i en passende uvirksom fortynner (diklormetan) for å omdanne det terminale aminet til et sulfonamid hvor R er som definert over. Helst så inneholder den uvirksomme fortynneren overskudd tertiært amin (f. eks.10 ekvivalenter) slik som diisopropyletylamin, for å redde syren som genereres i løpet av reaksjonen. Reaksjonsbetingelser er ellers konvensjonelle (f. eks. romtemperatur i 30 minutter);

(e) å danne en karbamatgruppe ved reaksjon med en ekvivalent mengde eller et overskudd (f. eks.5 ekvivalenter) av R--OC(O)Cl eller R--OC(O)OC6H4-p-NO2i en passende uvirksom fortynner (f. eks. diklormetan) for å omdanne det terminale aminet til et karbamat hvor R er som definert over. Helst så inneholder den uvirksomme fortynneren et overskudd (f. eks. ca.10 ekvivalenter) av et tertiært amin, slik som diisopropyletylamin, for å fange opp enhver syre som genereres i løpet av reaksjonen. Reaksjonsbetingelser er ellers konvensjonelle (f. eks. romtemperatur i 30 minutter); og

(f) å danne en ureagruppe ved reaksjon med en ekvivalent mengde eller et overskudd (f. eks.5 ekvivalenter) av R--N=C=O i en passende uvirksom fortynner (f. eks. diklormetan) for å omdanne det terminale aminet til en urea (dvs. RNHC(O)NH--) gruppe hvor R er som definert over. Helst så inneholder den uvirksomme fortynneren et overskudd (f. eks. ca.10 ekvivalenter) av et tertiært amin, slik som diisopropyletylamin. Reaksjonsbetingelser er ellers konvensjonelle (f. eks. romtemperatur i ca.30 minutter).

2. C-terminale modifikasjoner

Til å lage peptidforbindelser hvor den C-terminale karboksylgruppen er erstattet med en ester (dvs. --C(O)OR hvor R er som definert over), så benyttes resinene anvendt for å lage peptidsyrene og det sidekjedebeskyttede peptidet blir kløyvet med base og den passende alkoholen, f. eks. metanol. Sidekjedebeskyttende grupper blir så fjernet på den vanlige måten ved behandling med hydrogenfluorid for å skaffe til veie den ønskede esteren.

Til å lage peptidforbindelser hvor den C-terminale karboksylgruppen er erstattet med amidet --C(O)NR<3>R<4>, så blir en benzhydrylaminresin anvendt som den faste støtten for peptidsyntese. Ved kompletteringen av syntesen, så resulterer hydrogenfluoridbehandling for å frigjøre peptidet fra støtten direkte i det frie peptidamidet (dvs. den C-terminale enden er --C(O)NH2). Alternativt, så gir anvendelse av den klormetylerte resinen i løpet av peptidsyntesen koblet med reaksjon med ammoniakk for å kløyve det sidekjedebeskyttede peptidet fra støtten det frie peptidamidet, og reaksjon med et alkylamin eller et dialkylamin gir et sidekjedebeskyttet alkylamid eller dialkylamid (dvs. den C-terminale enden er --C(O)NRR<1>hvor R og R<1>er som definert over).

Sidekjedebeskyttelse blir så fjernet på den vanlige måten ved behandling med hydrogenfluorid for å gi de frie amidene, alkylamidene eller dialkylamidene.

Man kan også syklere peptidforbindelsene i oppfinnelsen, eller inkorporere et desamino eller deskarboksy residie i endene av peptidforbindelsen, slik at det ikke er noen terminal amino- eller karboksylgruppe, for å senke mottakeligheten for proteaser eller for å begrense konformasjonen av peptidforbindelsen. C-terminale funksjonelle grupper av peptidforbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen inkluderer amid, amidlaverealkyl, amiddi(laverealkyl), laverealkoksy, hydroksy og karboksy, og de lavere esterderivatene av dem, og de farmasøytisk akseptable saltene av dem.

I tillegg til de foregående N-terminale og C-terminale modifikasjonene, så kan peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen, inkludert peptidetterligninger, med fordel modifiseres med eller kovalent kobles til en eller flere av en rekke hydrofile polymerer. Det har blitt funnet at når peptidforbindelsene er derivatisert med en hydrofil polymer, så økes deres løselighet og sirkulasjonshalveringstid og deres immungenisitet blir maskert. Det foregående kan oppnås med liten, hvis noen i det hele tatt, reduksjon i deres bindingsaktivitet. Ikke-proteinaktige polymerer som er passende for anvendelse i henhold til den foreliggende oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, polyalkyletere som eksemplifisert ved polyetylenglykol og polypropylenglykol, polymelkesyre, polyglykolsyre, polyoksyalkener, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, cellulose og cellulosederivater, dekstran og dekstranderivater, osv. Generelt så har slike hydrofile polymerer en gjennomsnittlig molekylvekt i området fra ca. 500 til ca.100.000 dalton, mer ønskelig fra ca.2000 til ca.40.000 dalton, og enda mer ønskelig fra c.5000 til ca.20.000 dalton. I foretrukne utførelsesformer så har slike hydrofile polymerer en gjennomsnittlig molekylvekt på ca.5000 dalton, 10.000 og 20.000 dalton.

Peptidforbindelsene i oppfinnelsen kan derivatiseres med eller kobles til slike polymerer ved å anvende enhver av fremgangsmåtene satt fram i Zallipsky, S., Bioconjugate Chem., 6:150-165 (1995); Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem., 6: 62-69 (1995); US patent nr.4,640,835; US patent nr.4,496,689; US patent nr.4,301,144; US patent nr. 4,670,417; US patent nr.4,791,192; US patent nr.4,179,337 eller WO 95/34326.

I en foreliggende foretrukket utførelsesform, så er peptidforbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen derivatisert med polyetylenglykol (PEG). PEG er en lineær, vannløselig polymer av etylenoksid med repeterte enheter med to terminale hydroksylgrupper. PEG’er klassifiseres ved deres molekylvekter som vanligvis er i området fra ca.500 dalton til ca.40.000 dalton. I en foreliggende foretrukket utførelsesform, så har PEG’er som er benyttet molekylvekter i området fra 5000 dalton til ca.20.000 dalton. PEG’er koblet til peptidforbindelser i den foreliggende oppfinnelsen kan enten være forgrenet eller ikke-forgrenet (se f. eks. Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem., 6: 62-69 (1995)). PEG’er er kommersielt tilgjengelig fra Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.) (nå del av Nektar Therapeutics (San Carlo, CA), Sigma Chemical Co. og andre firmaer. Slike PEG’er inkluderer, men er ikke begrenset til, monometoksypolyetylenglykol (MePEG-OH), monometoksypolyetylenglykol-succinat (MePEG-S), monometoksypolyetylenglykolsuccinimidyl-succinat (MePEG-S-NHS), monometoksypolyetylenglykol-amin (MePEG-NH2), monometoksypolyetylenglykol-tresylat (MePEG-TRES) og monometoksypolyetylenglykol-imidazolyl-karbonyl (MePEG-IM).

I en utførelsesform så er i korthet den hydrofile polymeren som anvendes, f. eks. PEG, helst kappet i en ende med en ikke-reaktiv gruppe slik som en metoksy- eller etoksygruppe. Deretter blir polymeren aktivert i den andre enden ved reaksjon med et passende aktiverende middel, slik som cyanurhalider (f. eks. cyanurklorid, -bromid eller -fluorid), diimadozle, et anhydridreagens (f. eks. et dihalosuccininanhydrid, slik som dibromsuccininanhydrid), acylazid, p-diazoniumbenzyleter, 3-(p-diazoniumfenoksy)-2-hydroksypropyleter) og lignende. Den aktiverte polymeren reagerer så med en peptidforbindelse ifølge oppfinnelsen for å produsere en peptidforbindelse derivatisert med en polymer. Alternativt, så kan en funksjonell gruppe i peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen aktiveres for reaksjon med polymeren, eller så kan de to gruppene kobles i en felles koblingsreaksjon ved å anvende kjente koblingsfremgangsmåter. Det vil lett forstås at peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen kan derivatiseres med PEG ved å anvende en myriade av andre reaksjonsskjemaer kjent og anvendt av fagfolk.

Når peptidforbindelsene derivatiseres med en hydrofil polymer, så økes deres løselighet og sirkulasjonshalveringstider og deres immungenisitet går ned. Det foregående kan oppnås med lite, hvis noe, tap i biologisk aktivitet. I foretrukne utførelsesformer så har derivatiserte peptider en aktivitet som er 0,1 til 0,01 ganger den til de ikke-modifiserte peptidene. I mer foretrukne utførelsesformer så har de derivatiserte peptidene en aktivitet som er 0,1 til 1 ganger den til de ikke-modifiserte peptidene. I enda mer foretrukne utførelsesformer så har de derivatiserte peptidene en aktivitet som er større enn de ikke-modifiserte peptider.

D. Ryggrad modifikasjoner

Andre fremgangsmåter for å lage peptidderivater av forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen er beskrevet av Hruby, et al., Biochem J., 268(2); 249-262 (1990).

Peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen tjener også dermed som strukturelle modeller for ikke-peptidforbindelser med lignende biologisk aktivitet. Fagfolk forstår at en rekke teknikker er tilgjengelig for å konstruere forbindelser med den samme eller lignende ønskede biologiske aktivitet som lede-peptidforbindelsen, men med gunstigere aktivitet enn den ledende med hensyn til løselighet, stabilitet og mottakelighet for hydrolyse og proteolyse. Se Morgan, et al., Ann. Rep. Med. Chem., 24: 243-252 (1989).Disse teknikker inkluderer å erstatte peptidryggraden med en ryggrad som er sammensatt av fosfonater, amidater, karbamater, sulfonamider, sekundære aminer og N-metylaminosyrer.

Passende reagenser inkluderer for eksempel aminosyreanaloger hvor karboksylgruppen til aminosyren er blitt erstattet med en del som er passende for å danne en av de ovenfor nevnte koblingene.

På samme måte så kan erstatning av en amidokobling i peptidet med en fosfonatkobling oppnås på måten som er beskrevet i US patentnummere 5,359,115 og 5,420,328.

E. Disulfidbindingsdannelse

Forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen kan eksistere i en syklert form med en intramolekylær disulfidbinding mellom tiolgruppene av inkorporerte cysteiner, hvis de er til stede. Alternativt, så kan en intermolekylær disulfidbinding mellom tiolgruppene av cysteinene produseres for å gi en dimer (eller høyere oligomer) forbindelse. En eller flere av cysteinresidiene kan også substitueres med en homocystein.

IV. Bruk

Peptidforbindelsene i oppfinnelsen er nyttige in vitro som unike verktøy for å forstå den biologiske rollen av TPO, inkludert evalueringen av de mange faktorene man tror influerer på, og influeres av, produksjonen av TPO og reseptorbindingsprosessen. De foreliggende peptidforbindelsene er også nyttige i utviklingen av andre forbindelser som binder til og aktiverer TPO-R, fordi de foreliggende peptidforbindelsene tilveiebringer viktig informasjon om forholdet mellom struktur og aktivitet som bør fasilitere slik utvikling.

Peptidforbindelsene er også nyttige som kompetitive bindere i analyser for å screene etter nye TPO reseptoragonister. I slike analyser så kan peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes uten modifikasjon eller så kan de modifiseres på en rekke måter; for eksempel ved å merke, slik som kovalent eller ikke-kovalent å forbinde en del som direkte eller indirekte tilveiebringer et detekterbart signal. I enhver av disse analyser kan materialene til dem være merket enten direkte eller indirekte. Muligheter for direkte merking inkluderer å merke grupper slik som: Radioaktive merkinger slik som<125>I, enzymer (US patentnr.3,645,090) slik som peroksidase og alkalisk fosfatase, og fluorescerende merkinger (US patentnr.3,940,475) som er i stand til å måle forandringen i fluorescens-intensitet, bølgelengdeskift eller fluorescerende polarisering. Muligheter for indirekte merking inkluderer biotinylering av en bestanddel etterfulgt av binding til avidin koblet til en av de ovenfor nevnte merkingsgruppene.

Peptidforbindelsene kan også inkludere spacere eller linkere i tilfeller hvor peptidforbindelsene skal festes til en fast støtte.

Basert på deres evne til å binde seg til TPO-reseptoren, så kan videre peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes som reagenser for å detektere TPO-reseptorer på levende celler, fikserte celler, i biologiske væsker, i vevshomogenater, i rensede, naturlige biologiske materialer, osv. For eksempel, ved å merke slike peptidforbindelser, så kan man identifisere celler som har TPO-R på deres overflate. I tillegg, basert på deres evne til å binde seg til TPO-reseptoren, så kan peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes i in situ farging, FACS (fluorescensaktivert cellesortering), Western blotting, ELISA, osv. I tillegg, basert på deres evne til å binde seg til TPO-reseptoren, så kan peptidforbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen anvendes i reseptorrensing, eller i å rense celler som uttrykker TPO-reseptorer på celleoverflaten (eller på innsiden av permeabiliserte celler).

Peptidforbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen kan også benyttes som kommersielle reagenser for forskjellig medisinsk forskning og diagnostiske anvendelser. Slike anvendelser inkluderer, men er ikke begrenset til: (1) anvendelse som en kalibreringsstandard for å kvantitere aktivitetene til kandidat TPO agonister i en rekke funksjonelle analyser; (2) anvendelse for å opprettholde prolifereringen og veksten av TPO-avhengige cellelinjer; (3) anvendelse i strukturell analyse av TPO-reseptoren gjennom ko-krystallisering; (4) anvendelse for å undersøke mekanismen av TPO signaltransduksjon/reseptoraktivering; og (5) annen forsknings- og diagnostisk bruk hvor TPO-reseptoren helst er aktivert eller slik aktivering er passende kalibrert mot en kjent mengde av en TPO-agonist, og lignende.

Peptidforbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes for in vitro ekspansjonen av megakaryocytter og deres forpliktede avkom, både i sammenheng med tilsettingen av cytokiner eller av seg selv. Se f. eks. DiGiusto, et al., PCT-publikasjon nr. 95/05843.. Kjemoterapi og strålingsterapier forårsaker trombocytopeni ved å drepe den hurtig delende, mer modne populasjonen med megakaryocytter. Disse terapeutiske behandlingene kan imidlertid også redusere antallet og viabiliteten til de umodne, mindre mitotisk aktive megakaryocytt forløperceller. Forbedring av trombocytopenien ved hjelp av TPO eller peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen kan dermed fremskyndes ved å infusere pasienter post kjemoterapi eller strålingsterapi med en populasjon med hans eller hennes egne celler anriket med megakaryocytter og umodne forløpere ved in vitro kultur.

Peptidforbindelsene i oppfinnelsen kan også gis til varmblodige dyr, inkludert mennesker, for å aktivere TPO-R in vivo. Den foreliggende oppfinnelsen omfatter dermed anvendelsen av de krevde forbindelsene i fremgangsmåter for terapeutisk behandling av TPO-relaterte forstyrrelser som omfatter å gi en peptidforbindelse ifølge oppfinnelsen i mengder som er tilstrekkelig for

å etterligne effekten av TPO på TPO-R in vivo. For eksempel så kan peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen gis for å behandle en rekke hematologiske forstyrrelser, inkludert, men ikke begrenset til, blodplateforstyrrelser og trombocytopeni, spesielt når de er assosiert med benmargstransfusjoner, strålingsterapi og kjemoterapi.

TPO-antagonister kan bli gitt først til pasienter som gjennomgår kjemoterapi eller strålingsterapi, etterfulgt av administrering av TPO-agonister ifølge oppfinnelsen.

Aktiviteten av peptidforbindelsen i den foreliggende oppfinnelsen kan evalueres enten in vitro eller in vivo i en av de mange modellene som er beskrevet av McDonald, Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology, 14: 8-21 (1992).

Ifølge en utførelsesform så er sammensetningene i den foreliggende oppfinnelsen nyttige for å behandle trombocytopeni som er assosiert med benmargstransfusjoner, strålingsterapi eller kjemoterapi. Peptidforbindelsene vil vanligvis administreres profylaktisk før kjemoterapi, strålingsterapi eller benmargstransplantasjon eller etter slik eksponering.

Følgelig tilveiebringer også den foreliggende oppfinnelsen farmasøytiske sammensetninger som omfatter, som en aktiv ingrediens, minst en av peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen sammen med en farmasøytisk bærer eller fortynner. Peptidforbindelsene i denne oppfinnelse kan gis via orale, lunge, parenterale (intramuskulær, intraperitoneal, intravenøs (IV) eller subkutan injeksjon), inhalering (via en formulering av fint pulver), transdermale, nasale, vaginale, rektale eller sublinguale ruter for administrering og kan formuleres i doseringsformer som er passende for hver administreringsrute. Se f. eks. Bernstein, et al., PCT patentpublikasjon nr. WO 93/25221; Pitt, et al., PCT patentpublikasjon nr. WO 94/17784; og Pitt, et al., European Patent Application 613,683.

Faste doseringsformer for oral administrering inkluderer kapsler, tabletter, piller, pulvere og granulater. I slike faste doseringsformer blir den aktive peptidforbindelsen blandet med minst en uvirksom farmasøytisk akseptabel bærer slik som sukrose, laktose eller stivelse. Slike doseringsformer kan også omfatte, som er normal praksis, tilleggssubstanser som er forskjellig fra uvirksomme fortynnere, f. eks. smøremidler slik som magnesiumstearat. I tilfellet med kapsler, tabletter og piller, så kan doseringsformene også omfatte buffermidler. Tabletter og piller kan i tillegg lages med enteriske overtrekk.

Flytende doseringsformer for oral administrering inkluderer farmasøytisk akseptable emulsjoner, løsninger, suspensjoner, siruper, med eliksirer som inneholder uvirksomme fortynnere som vanligvis brukes i fagfeltet, slik som vann. I tillegg til slike uvirksomme fortynnere, så kan sammensetninger også inkludere adjuvanter, slik som bløtgjøringsmidler, emulgatorer og suspenderingsmidler, og søtningsstoffer, smaksstoffer og luktmidler.

Preparater ifølge denne oppfinnelse for parenteral administrering inkluderer sterile vandige eller ikke-vandige løsninger, suspensjoner eller emulsjoner. Eksempler på ikkevandige løsemidler eller verktøy er propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer, slik som olivenolje og maisolje, gelatin og injiserbare organiske estere slik som etyloleat. Slike doseringsformer kan også inneholde adjuvanter slik som konserverings-, bløtgjørings-, emulgerings- og fordelingsmidler. De kan steriliseres ved for eksempel filtrering gjennom et filter som holder igjen bakterier ved å inkorporere steriliseringsmidler inn i sammensetningene, ved å bestråle sammensetningene eller ved å varme opp sammensetningene. De kan også produseres ved å anvende sterilt vann, eller noe annet sterilt injiserbart medium, rett før bruk.

Sammensetninger for rektal eller vaginal administrering er helst stikkpiller som kan inneholde, i tillegg til den aktive substansen, hjelpemidler slik som kakaosmør eller en voks for stikkpiller. Sammensetninger for nasal eller sublingual administrering lages også med standard hjelpemidler som er velkjent i fagfeltet.

Sammensetningene som inneholder peptidforbindelsene kan administreres for profylaktiske og/eller terapeutiske behandlinger. I terapeutisk bruk så blir sammensetningene gitt til en pasient som allerede lider av en sykdom, som beskrevet over, i en mengde som er tilstrekkelig for å kurere eller i det minste delvis stoppe symptomene av sykdommen og dens komplikasjoner. En mengde som er adekvat for å oppfylle dette er definert som ”terapeutisk effektiv dose”. Mengder som er effektive for denne anvendelse vil være avhengig av alvorligheten av sykdommen og vekten og den generelle tilstanden til pasienten.

Sammensetningene i oppfinnelsen kan også pakkes inn i mikrokapsler ved for eksempel fremgangsmåten til Tice og Bibi (i Treatise on Controlled Drug Delivery, ed. A.

Kydonieus, Marcel Dekker, New York (1992), s.315-339).

I profylaktiske bruk så blir sammensetninger som inneholder peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen gitt til en pasient som er mottakelig for eller som på annen måte er i risikoen for en spesiell sykdom. En slik mengde er definert som å være en ”profylaktisk effektiv dose”. I denne anvendelse så avhenger de nøyaktige mengdene igjen på pasientens tilstand med hensyn på helse og vekt.

Mengdene av peptidforbindelsen som er nødvendig for effektiv terapi vil være avhengig av mange forskjellige faktorer, inkludert administreringsmåter, målsete, fysiologisk tilstand hos pasienten og andre medisiner som blir gitt. Behandlingsdosene bør derfor titreres for å optimalisere trygghet og effektivitet. Vanligvis så kan doser anvendt in vitro tilveiebringe nyttig veiledning i mengdene som er nyttige for in situ administrering av disse reagensene. Dyretesting av effektive doser for behandling av bestemte forstyrrelser vil tilveiebringe enda mer forutsigende indikasjon på human dosering. Forskjellige betraktninger er beskrevet f. eks. i Gilman, et al. (eds.), Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8. utg., Pergamon Press (1990); og Remington’s Pharmaceutical Sciences, 7, utg., ; Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1985).

Peptidforbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen er effektive i å behandle TPO-styrte betingelser når de gis i et doseringsområde fra ca.0,001 mg til ca.10 mg per kg kroppsvekt per dag. Den spesifikke dosen som benyttes reguleres av den bestemte tilstanden som behandles, administreringsruten så vel som av legens bedømmelse av faktorer slik som alvorligheten av tilstanden, alderen og den generelle tilstanden til pasienten og lignende.

EKSEMPEL 1

Fast fase peptidsyntese

Peptidforbindelsene i oppfinnelsen kan syntetiseres for eksempel ved å anvende Merrifield fast fase syntese teknikkene (se Stewart og Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. utgave, Pierce Chemical, Rockford, Ill. (1984) og Merrifield, J. Am.

Chem. Soc., 85:2149 (1963)) eller en Applied Biosystems Inc. Model 431A eller 433A peptidsyntesemaskin. Peptidforbindelsene kan sammenstilles ved å anvende standard protokoller for Applied Biosystems Inc. Synth Assist� 1.0.0 eller Synth Assist� 2.0.2. Hver kobling kan utføres i 2x30 minutter med HBTU (2-(1H-benzatriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametyluronium-heksafluorfosfat) og HOBt (1-hydroksybenzotriazol).

Resinet som anvendes kan være HMP resin (p-hydroksymetylfenoksymetyl)polystyren resin eller PAL (Milligen/Biosearch), som er en krysskoblet polystyrenresin med 5-(4’-Fmoc-aminometyl-3,5’-dimetyoksyfenoksy)valerinsyre som en linker. Anvendelse av PAL-resin resulterer i en karboksylterminal amidfunksjonalitet ved kløyvning av peptidet fra resinet. Ved kløyvning så produserer HMP-resinet en karboksylsyredel ved den C-terminale enden av sluttproduktet. De fleste reagenser, resiner og beskyttede aminosyrer (frie eller på resinet) kan kjøpes fra Millipore eller Applied Biosystems Inc.

Fmoc-gruppen kan anvendes til aminobeskyttelse i løpet av koblingsprosedyren. Primær aminbeskyttelse på aminosyrene kan oppnås med Fmoc- og sidekjedebeskyttende grupper slik som t-butyl for serin, tyrosin, glutaminsyre og treonin; trityl for glutamin; Pmc (2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl) for arginin; N-t-butyloksykarbonyl for tryptofan; N-trityl for histidin og S-trityl for cystein.

Fjerning av peptidforbindelsene fra resinet og samtidig avbeskyttelse av sidekjedefunksjonene kan oppnås ved behandling med reagens K eller lette modifikasjoner av den. Alternativt, i syntesen av disse peptider med en amidert karboksylterminal ende, så kan det fullstendig sammenstimlede peptidet kløyves med en blanding av 90% trifluoreddiksyre, 5% etanditiol og 5% vann, initielt ved 4ºC, og gradvis øke til romtemperatur. De avbeskyttede peptidforbindelsene kan presipiteres med dietyleter. Rensing kan være ved preparativ, revers fase, høy kapasitets flytende kromatografi på en C18bundet silikagelkolonne med en gradient av acetonitril/vann i 0,1% trifluoreddiksyre. De homogene peptidforbindelsene kan karakteriseres ved Fast Atom Bombardment massespektrometri eller elektrospray massespektrometri og aminosyreanalyse når det er egnet.

Peptidforbindelsene i denne oppfinnelse dimerisert ved å anvende standard synteseprosedyrer som er kjent for fagfolk. Ved å følge disse synteseskjemaene, så kan fagfolk lett lage dimer-peptidforbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen. I tillegg vil det være tydelig for fagfolk at de dimere subenhetene lett kan linkes ved å anvende kjente metodologier og linkere.

EKSEMPEL 2

Pegylering av peptidforbindelsene

Pegylering av en peptidforbindelse ifølge oppfinnelsen kan utføres ved velkjente teknikker. For eksempel så kan en peptidforbindelse ifølge oppfinnelsen løses i 100 mM bicin pH 8,0 ved en konsentrasjon på 10 mg/ml, tilsatt til et 1,25 ganger molart overskudd av pulverisert PEG2 (kommersielt tilgjengelig fra Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.)) og rørt ved romtemperatur inntil reaksjonen er fullstendig, vanligvis 1-2 timer. Reaksjonen måles ved revers fase HPLC ved å anvende en 40-65% acetonitril gradient med en YMC ODS AQ kolonne. Når reaksjonen er fullstendig, så blir løsningen tilsatt til et andre 1,25 molart overskudd av pulverisert PEG2 og prosessen repeteres 4 ganger ved å anvende en total på 5 mol PEG2 for hvert mol polypeptid. Denne løsning fortynnes 2 ganger med PBS for å redusere viskositeten og lades på en superdex 200 kolonne (Pharmacia), på forhånd ekvilibrert og eluert med PBS.

Fraksjoner fra størrelseseksklusjonskolonnen kan analyseres ved revers fase HPLC. Fraksjoner som inneholder di-PEG-peptidforbindelsen som eluerer før enhver mono-PEG-peptidforbindelse kan stå sammen og lagres ved 5ºC eller lyofiliseres.

Claims (31)

Patentkrav

1. En forbindelse som binder seg til en trombopoietin-reseptor, k a r a k -t e r i s e r t v e d at nevnte forbindelse omfatter (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2, hvor X10er valgt fra gruppen som består av sarcosin eller ßalanin, hvor 2-Nal er β-(2-naphthyl)alanin og hvor nevnte forbindelse er kovalent bundet til en hydrofil polymer.

2. Forbindelsen ifølge krav 1, der X10er sarcosin.

3. Forbindelsen ifølge krav 1 eller krav 2 der den hydrofile polymeren har en gjennomsnittlig molekylvekt mellom ca.500 til ca.40.000 dalton.

4. Forbindelsen ifølge krav 1 eller krav 2 der den hydrofile polymeren har en gjennomsnittlig molekylvekt på mellom ca.5000 til ca.20.000 dalton.

5. Forbindelsen ifølge krav 1 eller krav 2, der polymeren er valgt fra gruppen som består av polyetylenglykol, polypropylenglykol, polymelkesyre og polyglykolsyre.

6. Forbindelse ifølge krav 5 der forbindelsen er kovalent festet til polyetylenglykol.

7. Forbindelse ifølge krav 1 eller krav 2, der hver av de dimere subenhetene av nevnte forbindelse er kovalent festet til en hydrofil polymer.

8. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 1 eller krav 2, omfattende en peptidforbindelse ifølge krav 1 i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer.

9. Forbindelsen ifølge krav 1 eller krav 2, til bruk i behandling av en pasient som lider av en forstyrrelse som er mottakelig for behandling med en trombopoietinagonist omfattende å gi til pasienten en terapeutisk effektiv dose eller mengde av en peptidforbindelse ifølge krav 1.

10. Fysiologisk aktiv, vesentlig ikke-immunogen vannløselig polypeptidsammensetning, omfattende en forbindelse ifølge krav 1 eller krav 2, og hvor polymeren er valgt fra gruppen som består av polyetylenglykol og polypropylenglykol, hvor nevnte polymer er ikke-substituert eller substituert med alkoksy eller alkylgrupper; nevnte alkoksy eller alkylgrupper innehar mindre enn 5 karbonatomer.

11. Polypeptidsammensetningen ifølge krav 10, der nevnte polymer har en molekylvekt fra ca.750 til ca.15.000 dalton.

12. Polypeptidsammensetning ifølge krav 10, der nevnte polymer har en molekylvekt på ca.5000 til ca.10.000 dalton.

13. Polypeptidsammensetning ifølge krav 11, der nevnte polymer er polyetylenglykol.

14. Vesentlig ikke-immunogen vannløselig polypeptidsammensetning, omfattende en peptidforbindelse ifølge krav 10 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

15. En forbindelse til bruk i aktivering av en trombopoietin-reseptor i en celle, der forbindelsen omfatter (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2, hvor X10er valgt fra gruppen som består av sarcosin eller ß-alanin, der 2-Nal er β-(2-naphthyl)alanin og der forbindelsen er kovalent bundet til en hydrofil polymer.

16. Forbindelsen til bruk ifølge krav 15, der X10er sarcosin.

17. Forbindelsen til bruk ifølge krav 15 eller 16, der de nevnte cellene omfatter humane megakaryocytter, blodplater eller CD34+ celler.

18. Forbindelsen til bruk ifølge krav 15 eller 16, der de nevnte cellene omfatter TPO-avhengige celler.

19. Forbindelsen ifølge krav 1 eller 2 til bruk i en fremgangsmåte for behandling av trombocytopeni i et individ, der fremgangsmåten omfatter:

(a) å skaffe tilveie en populasjon av nevnte individs celler som omfatter megakaryocytt forløperceller;

(b) kontakte nevnte celler med forbindelsen for å aktivere trombopoietin reseptoren i cellene; og

(c) administrere nevnte behandlede celler til nevnte individ, for å øke antallet megakaryocytter som er til stede i nevnte individ sammenlignet med det som ville finne sted uten slik behandling.

20. Forbindelsen til bruk ifølge krav 19, der nevnte trombocytopeni skyldes kjemoterapi.

21.

Forbindelse til bruk ifølge krav 20, der nevnte populasjon av celler skaffes til veie før nevnte kjemoterapi.

22. Forbindelsen til bruk ifølge krav 19, der nevnte trombocytopeni skyldes strålingsterapi.

23. Forbindelsen til bruk ifølge krav 22, der nevnte populasjon av celler skaffes til veie før nevnte strålingsterapi.

24. En forbindelse til bruk for å behandle en pasient som lider av trombocytopeni, omfattende å gi til nevnte pasient en terapeutisk effektiv dose av en forbindelse som omfatter (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2, hvor X10er valgt fra gruppen som består av sarcosin eller ß-alanin, der 2-Nal er β-(2-naphthyl)alanin og der forbindelsen er kovalent bundet til en hydrofil polymer.

25. Forbindelsen til bruk ifølge krav 24, der X10er sarcosin.

26. Forbindelsen til bruk ifølge krav 24 eller 25, der nevnte trombocytopeni skyldes kjemoterapi eller strålingsterapi.

27. Forbindelsen til bruk ifølge krav 24 eller 25, der en TPO-antagonist gis til nevnte pasient før nevnte kjemoterapi eller strålingsterapi.

28. Forbindelsen til bruk ifølge krav 24 eller 25, der nevnte trombocytopeni skyldes benmargstransfusjon.

29. En forbindelse til bruk i profylaktisk behandling av en pasient som er i risikosonen for trombocytopeni, omfattende å gi til nevnte pasient en profylaktisk effektiv mengde av en forbindelse som omfatter (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2, hvor X10er valgt fra gruppen som består av sarcosin eller ß-alanin, der 2-Nal er β-(2-naphthyl)alanin og der forbindelsen er kovalent bundet til en hydrofil polymer.

30. Forbindelsen til bruk ifølge krav 29, der X10er sarcosin.

31. Forbindelsen til bruk ifølge krav 29 eller 30, der nevnte forbindelse gis før benmargstransplantasjon, kjemoterapi eller strålingsterapi.