ES2321038T3 - Peptidos y compuestos que se unen a un receptor. - Google Patents
Peptidos y compuestos que se unen a un receptor. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2321038T3 ES2321038T3 ES97954363T ES97954363T ES2321038T3 ES 2321038 T3 ES2321038 T3 ES 2321038T3 ES 97954363 T ES97954363 T ES 97954363T ES 97954363 T ES97954363 T ES 97954363T ES 2321038 T3 ES2321038 T3 ES 2321038T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- acid
- peptide
- compounds
- compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/524—Thrombopoietin, i.e. C-MPL ligand
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
EL OBJETO DE ESTA INVENCION CONSISTE EN UNOS PEPTIDOS Y COMPUESTOS QUE SE UNEN CON EL RECEPTOR DE TROMBOPOIETINA Y ACTIVAN ESTE. DICHOS PEPTIDOS Y COMPUESTOS SON UTILES EN PROCEDIMIENTOS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS HEMATOLOGICOS Y ESPECIALMENTE LA TROMBOCITOPENIA QUE RESULTA DE LA QUIMIOTERAPIA, LA TERAPIA DE LA RADIACION O TRANSFUSIONES DE MEDULA OSEA ASI COMO EN PROCEDIMIENTOS DE DIAGNOSTICOS QUE USAN COMPUESTOS Y PEPTIDOS ETIQUETADOS.
Description
Péptidos y compuestos que se unen a un
receptor.
La presente invención proporciona péptidos y
compuestos que se unen al receptor de trombopoyetina
(c-mpl o TPO-R) y activan el mismo,
o actúan de otro modo como agonistas de la TPO. La invención tiene
aplicación en los campos de la bioquímica y química médica, y
particularmente proporciona agonistas de TPO para uso en el
tratamiento de enfermedades humanas.
Los péptidos y compuestos que se unen al
receptor de trombopoyetina y lo activan, han sido descritos en el
documento WO96/40750.
La lenta recuperación de los niveles de
plaquetas en pacientes que sufren de trombocitopenia es un problema
grave y ha convertido en urgente la búsqueda de un agonista del
factor de crecimiento en la sangre, capaz de acelerar la
regeneración de las plaquetas. La presente invención proporciona
dicho agonista.
La presente invención proporciona compuestos de
la fórmula (I):
en la
que:
X_{1} es hidrógeno o acilo;
X_{2} es G o sarcosina (Sar);
X_{3} es R, A, norleucina (Nle) o
N-acetillisina (Ac-Lys);
X_{4} es Q o E;
X_{5} es W,
L-1-naftilalanina
(1-Nal) o F;
X_{6} es A, ácido
5-aminopentanoico (Ava) o ácido
2-aminobutírico (Abu);
X_{7} es A, difenilalanina (Diphe) o X_{7}
está ausente;
X_{8} es R,
p-aminofenilalanina
(p-amino-Phe),
N-acetillisina (Ac-Lys) o X_{8}
está ausente;
X_{9} y X_{9'} son iguales o diferentes y
son A, \betaA, n-metilalanina
(n-Me-Ala), sarcosina (Sar), o
X_{9} o X_{9'} está ausente;
X_{10} y X_{10'} son iguales o diferentes y
son \betaA, o X_{10} o X_{10'} está ausente;
y derivados farmacéuticamente aceptables de los
mismos.
con la condición de que el compuesto
está
excluido.
La invención proporciona también los
compuestos:
\vskip1.000000\baselineskip
y derivados farmacéuticamente
aceptables de los
mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
En la definición anterior y de aquí en adelante
los símbolos A, \betaA, C, D, E, F, G, I, K, L, P, Q, R, S, W, T
son los códigos estándar de una letra para los aminoácidos comunes,
esto es
- A
- Alanina
- C
- Cisteína
- D
- Ácido aspártico
- E
- Ácido glutámico
- F
- Fenilalanina
- G
- Glicina
- I
- Isoleucina
- K
- Lisina
- L
- Leucina
- P
- Prolina
- Q
- Glutamina
- R
- Arginina
- S
- Serina
- W
- Triptófano
- T
- Treonina
\vskip1.000000\baselineskip
Para evitar dudas, la abreviatura
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
siempre que se utilice en esta
memoria, quiere indicar la
estructura
Los derivados farmacéuticamente aceptables
adecuados de los compuestos de la fórmula (I) incluyen sales y
sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables, ésteres
farmacéuticamente aceptables, amidas farmacéuticamente aceptables,
compuestos marcados y compuestos que están unidos covalentemente a
uno o más de una variedad de polímeros hidrófilos como se definen
de aquí en adelante.
Preferiblemente los compuestos de la fórmula (I)
están unidos covalentemente a uno o más, p.ej. a uno, de una
variedad de polímeros hidrófilos. Los polímeros hidrófilos pueden
estar unidos, por ejemplo, a una o a ambas cadenas peptídicas de
los compuestos de la fórmula (I). Si un polímero hidrófilo está
unido a ambas cadenas peptídicas, entonces los polímeros hidrófilos
pueden ser iguales o diferentes, preferiblemente serán iguales. Los
expertos en la técnica podrán apreciar que cuando los compuestos de
la fórmula (I) están unidos covalentemente a uno o más de una
variedad de polímeros hidrófilos en X_{1}, entonces X_{1} no es
acilo.
Un grupo preferido de los compuestos de la
fórmula (I) es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y sus derivados farmacéuticamente
aceptables, donde los aminoácidos quirales están preferiblemente en
la forma
L.
\newpage
Otro grupo preferido de los compuestos de la
fórmula (I) incluye:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y sus derivados farmacéuticamente
aceptables, donde los aminoácidos quirales están preferiblemente en
la forma
L.
\vskip1.000000\baselineskip
La referencia de aquí en adelante a un compuesto
según la invención incluye tanto los compuestos de la fórmula (I)
como sus derivados farmacéuticamente aceptables.
Los expertos en la técnica podrán apreciar que
los compuestos de la fórmula (I) contienen una serie de centros
quirales y por tanto existen en la forma de pares de isómeros
ópticos (esto es, enantiómeros) y sus mezclas incluyendo las
mezclas racémicas. Todos los isómeros de los compuestos de la
fórmula (I) y sus mezclas incluyendo las mezclas racémicas están
incluidos dentro del alcance de la invención. Preferiblemente los
aminoácidos quirales están en la forma L.
Los compuestos de la fórmula (I) tienen fuertes
propiedades de unión al TPO-R y pueden activar el
TPO-R. Por tanto, tales compuestos son útiles con
fines terapéuticos para tratar enfermedades que se pueden mejorar
por estimulación de los receptores TPO, p.ej. en las plaquetas,
megacariocitos y otras células madre, por ejemplo la
trombocitopenia que puede ser resultado, por ejemplo, de la
quimioterapia (incluyendo la quimioterapia de inducción,
consolidación o mantenimiento), radioterapia, transplante autólogo,
alogénico y singénico de médula ósea, transplante de células
progenitoras de sangre periférica y transplante de células
progenitoras de sangre del cordón umbilical, tratamientos
biológicos u otros tratamientos para enfermedades malignas y no
malignas (p.ej. interferón y otras citocinas), infiltración de la
médula ósea por tumores metastásicos y leucemia, infiltración o
invasión de la médula ósea en enfermedades no malignas (p.ej.
osteopetrosis, enfermedad de Gaucher), anemia aplásica, síndrome
mielodisplásico, mielofibrosis, y síndromes relacionados (tanto
primarios como secundarios), enfermedades inmunes e idiopáticas,
incluyendo las trombocitopenias autoinmunes y aloinmunes, y la
trombocitopenia inmune inducida por fármacos, la trombocitopenia
inducida por fármacos (p.ej. debida a una terapia
anti-retroviral en pacientes
HIV-positivos), enfermedad hepática crónica (p.ej.
cirrosis alcohólica y otras formas de cirrosis) y la insuficiencia
renal crónica, destrucción excesiva de plaquetas, incluyendo
púrpura trombocitopénica trombótica, síndrome urémico hemolítico y
otras microangiopatías, e hiperesplenismo, síndromes congénitos en
los que aparece hemorragia debida a plaquetas deficientes o
anormales p.ej. trombastenia de Glanzmann, síndrome de
trombocitopenia con aplasia radial (TAR), síndrome de las plaquetas
grises, transplante de hígado, reparación de aneurismas aórticos,
balón de contrapulsación intra-aórtico, derivación
aortocoronaria y otros procedimientos quirúrgicos que requieran
circulación extracorpórea y/o transfusión masiva de sangre, o
trombocitopenia relacionada con HIV; también granulocitopenia y
anemia que pueden ser el resultado, por ejemplo, de la
quimioterapia, radioterapia y otras terapias para enfermedades
malignas y no malignas (como se ha discutido antes), infiltración
de la médula ósea en enfermedades malignas,
pre-malignas y no malignas (como se ha discutido
antes), anemia y granulocitopenia inmunes y no inmunes, idiopáticas
y relacionadas con fármacos; o el tratamiento de enfermedades
malignas hematológicas per se. Los compuestos según la
invención se pueden utilizar también con fines terapéuticos, de
diagnóstico y de investigación cuando es deseable la estimulación
de los receptores TPO, p.ej. en las plaquetas, megacariocitos y
otras células madre, por ejemplo en la movilización de las células
progenitoras de sangre periférica para transplante autólogo,
alogénico o singénico, aumentando el rendimiento de las plaquetas y
otros donantes de sangre, la prolongación de la supervivencia de
las plaquetas y la calidad ex vivo, la producción o expansión
de las plaquetas y/o de las células progenitoras in vitro;
con fines de diagnóstico para estudiar el mecanismo de la
hematopoyesis y para la expansión in vitro de los
megacariocitos y células progenitoras
implicadas.
implicadas.
Los compuestos de la invención tienen una
CI_{50} de aproximadamente 2 mM o menos, determinada por el ensayo
de afinidad de unión indicado en el Ejemplo 3 que sigue, en el que
una CI_{50} más baja se correlaciona con una afinidad de unión
más fuerte al TPO-R. Preferiblemente, para fines de
diagnóstico, los compuestos según la invención tienen una CI_{50}
de aproximadamente 2 mM o menos y, para fines farmacéuticos, los
compuestos según la invención tienen una CI_{50} de
aproximadamente 100 \muM o menos.
Cuando se utilizan para fines de diagnóstico,
los compuestos según la invención están preferiblemente marcados
con una marca detectable y, por tanto, los compuestos de la
invención sin dicha marca sirven como intermedios en la preparación
de los compuestos marcados.
Si los compuestos según la invención se
derivatizan con un polímero hidrófilo como se describe en esta
memoria, los pesos moleculares de dichos compuestos pueden variar
desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente 120.000 dalton, más
preferiblemente desde aproximadamente 8.000 hasta aproximadamente
80.000 dalton.
Como se ha expuesto antes, en otra realización
preferida, los compuestos de la fórmula (I) están unidos
covalentemente a uno o más de una variedad de polímeros hidrófilos.
Generalmente, tales polímeros hidrófilos tienen un peso molecular
medio que varía desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente
100.000 dalton, p.ej. desde aproximadamente 500 hasta
aproximadamente 40.000 dalton, preferiblemente desde aproximadamente
2.000 hasta aproximadamente 40.000 dalton, más preferiblemente
desde aproximadamente 5.000 hasta aproximadamente 40.000 y, aún más
preferiblemente, desde aproximadamente 5.000 hasta aproximadamente
20.000 dalton, p.ej. desde aproximadamente 18.800 hasta
aproximadamente 22.000 dalton. En las realizaciones preferidas,
tales polímeros hidrófilos tienen pesos moleculares medios de
aproximadamente 5.000 dalton, 10.000 dalton y 20.000 dalton. Los
polímeros hidrófilos pueden ser ramificados o no ramificados.
Los polímeros hidrófilos adecuados incluyen,
pero sin limitarse a ellos, polialquiléteres como por ejemplo
polietilenglicol y polipropilenglicol, ácido poliláctico, ácido
poliglicólico, polioxialquenos, poli(alcohol vinílico),
polivinilpirrolidona, celulosa y derivados de celulosa, dextrano y
derivados de dextrano, y sus copolímeros etc. Los polímeros
hidrófilos preferidos incluyen polialquiléteres como por ejemplo
polietilenglicol y polipropilenglicol, ácido poliláctico, ácido
poliglicólico, y sus copolímeros. Se ha descubierto
sorprendentemente que cuando los compuestos peptídicos son
derivatizados con dichos polímeros, se aumenta su solubilidad y su
semivida de circulación con una pequeña disminución, si hay alguna,
de su actividad de unión, y se enmascara su inmunogenicidad. En una
realización preferida, cada una de las subunidades diméricas
(cadenas peptídicas) de los compuestos peptídicos de la fórmula (I)
está unida covalentemente a un polímero hidrófilo. En otra
realización preferida, los compuestos de está invención están
PEGilados, esto es, unidos covalentemente a polietilenglicol
(PEG).
El PEG es un polímero lineal, soluble en agua,
de unidades repetidas de óxido de etileno con dos grupos hidroxilo
terminales. Los PEG se clasifican por sus pesos moleculares que
típicamente varían desde aproximadamente 500 dalton hasta
aproximadamente 40.000 dalton por ejemplo, 5.000, 10.000, 20.000,
30.000 o 40.000 dalton (5K, 10K, 20K, 30K o 40K). En una
realización actualmente preferida, los PEG empleados tienen pesos
moleculares que varían desde 5.000 dalton hasta aproximadamente
20.000 dalton. Los PEG acoplados con los compuestos peptídicos de
la presente invención pueden ser ramificados o no ramificados.
(Véase, p.ej., Monfardini, C., et al., Bioconjugate
Chem., 6:62-69 (1995)). Tales PEG
incluyen, pero sin limitarse a ellos, monometoxipolietilenglicol
(MePEG-OH), succinato de monometoxipolietilenglicol
(MePEG-S), succinato de
monometoxipolietilenglicol-succinimidilo
(MePEG-S-NHS),
monometoxipolietilenglicol-amina
(MePEG-NH_{2}), tresilato de
monometoxipolietilenglicol (MePEG-TRES), y
monometoxipolietilenglicol-imidazolil-carbonilo
(MePEG-IM).
Los compuestos según la invención pueden ser
mono- o di-pegilados, por ejemplo la monopegilación
puede ser preferida cuando se emplea un PEG de alto peso
molecular.
\newpage
Ejemplos de cadenas de PEG que se pueden unir a
los compuestos de la fórmula (I) incluyen:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos de compuestos PEGilados preferidos de
esta invención incluyen, pero sin limitarse a ellos, los
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y los derivados farmacéuticamente
aceptables de los mismos, en los que los aminoácidos quirales están
preferiblemente en la forma L y en los que "n" es un número
entero que tiene un valor que varía desde aproximadamente 5 hasta
aproximadamente 1000, p. ej. de 10 hasta aproximadamente 1000, más
preferiblemente desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 900
y, aún más preferiblemente, desde aproximadamente 110 hasta
aproximadamente 900, p.ej. aproximadamente 112, 225, 450 (p.ej.,
425-500), 675 o 900. Por ejemplo para los PEG (ALDH)
unidos a aldehído, n es por ejemplo aproximadamente 450, p.ej.
aproximadamente 348 - 452; para los PEG (SPA) unidos a éster, n es
por ejemplo aproximadamente 112 - 900, p.ej. aproximadamente 112,
225, 450 (p.ej., 425-500), 675 o 900; para los PEG
ramificados, n es por ejemplo aproximadamente 112 - 450, p.ej.
aproximadamente 112, 225 o 450; y para los PEG SS, n es por ejemplo
aproximadamente 112 - 450, p.ej. aproximadamente 112, 225 o
450.
\newpage
Un compuesto particularmente preferido según la
invención es:
en el que n es aproximadamente 450,
p.ej. aproximadamente 425 - 500, y sus derivados farmacéuticamente
aceptables, donde los aminoácidos quirales están preferiblemente en
la forma
L.
Como se ha expuesto anteriormente en esta
memoria los compuestos según la invención son útiles para la
prevención y el tratamiento de enfermedades mediadas por la TPO,
por ejemplo trastornos hematológicos incluyendo trombocitopenia,
granulocitopenia y anemia, y en el tratamiento de enfermedades
hematológicas malignas. Así, la presente invención proporciona
también un método para tratar a un paciente que sufre un trastorno
que es susceptible al tratamiento con un agonista de la
trombopoyetina, que comprende administrar al paciente una dosis o
cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente
invención.
La invención proporciona además un compuesto
según la invención para uso en terapia, en particular en la medicina
humana.
Se proporciona también como un aspecto adicional
de la invención el uso de un compuesto según la invención en la
preparación de un medicamento para uso en el tratamiento de
enfermedades mediadas por los agonistas de la trombopoyetina.
Se apreciará que la referencia al tratamiento
pretende incluir la profilaxis, así como el alivio de los síntomas
demostrados.
La invención proporciona también composiciones
farmacéuticas que comprenden uno o más de los compuestos descritos
en este documento y un vehículo fisiológicamente aceptable. Estas
composiciones farmacéuticas pueden estar en una diversidad de
formas que incluyen formas farmacéuticas orales, así como también
polvos y soluciones inhalables, y soluciones inyectables y para
perfusión.
La Figura 1 ilustra la estabilidad de AF13948 y
GW350781 (di-PEG(5K)-AF13948)
en suero humano y demuestra que el compuesto PEGilado ha aumentado
la estabilidad, esto es, ha aumentado la semivida, en comparación
con el compuesto no PEGilado.
La Figura 2 ilustra los perfiles
farmacocinéticos de un compuesto peptídico de la presente invención
diversamente derivatizado con PEG. En este experimento, el péptido
AF15705 fue derivatizado con PEG (PEG2) ramificado, con un PEG
(SPA) unido a éster y con un PEG (ALDH) unido a aldehído. Los
resultados obtenidos indican que los tres compuestos peptídicos
diversamente derivatizados con PEG tienen perfiles farmacocinéticos
favorables.
Las figuras 3-4 ilustran los
efectos de los compuestos peptídicos PEGilados de la presente
invención sobre la trombocitopenia inducida por carboplatino (CBP)
en ratones. La Figura 3 demuestra que GW350781
(di-PEG(5K)-AF13948) puede
mejorar la trombocitopenia en un modelo de ratón. La Figura 4
demuestra que GW350805
(di-PEG(20K)-AF13948) puede
mejorar también la trombocitopenia inducida por carboplatino y que
es aún más potente que GW350781.
Las figuras 5-6 ilustran los
efectos de GW350781 y GW350805 sobre la trombocitosis en ratones
normales. Los resultados obtenidos indican que los compuestos
peptídicos PEGilados de la invención tienen un efecto favorable
sobre la trombocitosis, siendo el péptido
20K-diPEGilado aproximadamente 100 veces más potente
que el péptido 5K-diPEGilado.
Las figuras 7-8 ilustran los
efectos de dosis variables de GW350781 y GW350805 sobre los niveles
de plaquetas en ratones normales. Tales datos demuestran que los
compuestos peptídicos PEGilados de la invención pueden aumentar los
niveles de plaquetas en ratones normales.
La Figura 9 ilustra el efecto de la dosis única
frente a la dosis múltiple de GW350805 sobre los niveles de
plaquetas en ratones normales.
La Figura 10 ilustra un esquema general de
síntesis para preparar péptidos diméricos con
\beta-Ala.
La Figura 11 ilustra un esquema general de
síntesis para preparar péptidos diméricos sin
\beta-Ala.
Las siguientes definiciones se exponen para
ilustrar y definir el significado y alcance de los diversos términos
utilizados para describir la invención en este documento.
"Agonista" se refiere a un ligando
biológicamente activo que se une a su receptor biológicamente activo
complementario y activa este último o bien para causar una
respuesta biológica en el receptor o bien para potenciar una
actividad biológica pre-existente del receptor.
"Sales farmacéuticamente aceptables" se
refiere a las sales no tóxicas de metales alcalinos, metales
alcalinotérreos y de amonio, comúnmente utilizadas en la industria
farmacéutica, que incluyen las sales de sodio, potasio, litio,
calcio, magnesio, bario, amonio y protamina cinc, que se preparan
por métodos bien conocidos en la técnica. El término incluye
también sales de adición de ácido no tóxicas, que se preparan
generalmente haciendo reaccionar los compuestos de esta invención
con un ácido orgánico o inorgánico adecuado. Las sales
representativas incluyen los hidrocloruros, hidrobromuros,
sulfatos, bisulfatos, acetatos, oxalatos, valeratos, oleatos,
lauratos, boratos, benzoatos, lactatos, fosfatos, tosilatos,
citratos, maleatos, fumaratos, succinatos, tartratos, napsilatos, y
similares.
"Sal de adición de ácido farmacéuticamente
aceptable" se refiere a aquellas sales que retienen la eficacia
biológica y las propiedades de las bases libres y que no son
biológicamente ni de algún otro modo indeseables, formadas con
ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico,
ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y con
ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido
glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido
malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido
tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido
mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido
p-toluenosulfónico, ácido salicílico y similares.
Para una descripción de sales de adición de ácido farmacéuticamente
aceptables como profármacos, véase Bundgaard, H., citado antes.
"Éster farmacéuticamente aceptable" se
refiere a aquellos ésteres que retienen, tras hidrólisis del enlace
éster, la eficacia biológica y las propiedades del ácido carboxílico
o del alcohol y que no son biológicamente ni de algún otro modo
indeseables. Para una descripción de ésteres farmacéuticamente
aceptables como profármacos, véase Bundgaard, H., ed., Design of
Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Estos
ésteres se forman típicamente a partir del ácido carboxílico
correspondiente y un alcohol. En general, la formación del éster se
puede lograr por técnicas sintéticas convencionales. (Véase, p. ej.,
March, Advanced Organic Chemistry, 4th Ed., John Wiley &
Sons, New York (1992), 393-396 y las referencias
citadas allí, y Mark, et al., Encyclopedia of Chemical
Technology, John Wiley & Sons, New York (1980).) El
componente alcohol del éster en general comprenderá (i) un alcohol
alifático C_{2}-C_{12} que puede contener o no,
uno o más dobles enlaces y que puede contener o no, carbonos
ramificados o (ii) un alcohol C_{7}-C_{12}
aromático o heteroaromático. Esta invención contempla también el
uso de aquellas composiciones que son tanto los ésteres descritos
en la presente memoria como al mismo tiempo sus sales de adición de
ácido farmacéuticamente aceptables.
"Amida farmacéuticamente aceptable" se
refiere a aquellas amidas que retienen, tras la hidrólisis del
enlace amida, la eficacia biológica y las propiedades del ácido
carboxílico o la amina y que no son biológicamente ni de algún otro
modo indeseables. Para una descripción de amidas farmacéuticamente
aceptables como profármacos, véase Bundgaard, H., ed., Design of
Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Estas
amidas se forman típicamente a partir del ácido carboxílico
correspondiente y una amina. En general, la formación de la amida
se puede lograr por técnicas sintéticas convencionales. (Véase,
p.ej., March, Advanced Organic Chemistry, 4th Ed., John
Wiley & Sons, New York (1992), p. 393 y Mark, et al.
Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New
York (1980).) Esta invención contempla también el uso de aquellas
composiciones que son tanto las amidas descritas en la presente
memoria como al mismo tiempo sus sales de adición de ácido
farmacéuticamente aceptables.
"Vehículo farmacéutica o terapéuticamente
aceptable" se refiere a un medio vehículo que no interfiere con
la eficacia de la actividad biológica de los ingredientes activos y
que no es tóxico para el hospedante o paciente.
"Estereoisómero" se refiere a un compuesto
químico que tiene el mismo peso molecular, composición química y
constitución que otro, pero con los átomos agrupados de modo
diferente. Es decir, determinados restos químicos idénticos están
en orientaciones diferentes en el espacio y, por tanto, cuando son
puros, tienen la capacidad de rotar el plano de la luz polarizada.
No obstante, algunos estereoisómeros puros pueden tener una rotación
óptica que es tan leve que es indetectable con la instrumentación
actual. Los compuestos de la presente invención pueden tener uno o
más átomos de carbono asimétricos y, por tanto, pueden incluir
diferentes estereoisómeros. Todos los estereoisómeros se incluyen
dentro del alcance de la invención.
"Cantidad terapéutica o farmacéuticamente
eficaz", como se aplica a las composiciones de la presente
invención, se refiere a la cantidad de composición suficiente para
inducir un resultado biológico deseado. Este resultado puede ser el
alivio de los signos, síntomas o causas de una enfermedad, o
cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. En la
presente invención, el resultado implicará típicamente una
disminución en las respuestas inmunológicas y/o inflamatorias a la
infección o lesión tisular.
Se utilizan las siguientes abreviaturas:
OtBu y tBu son ambos terc-butiloxi (OtBu
se utiliza convencionalmente con las abreviaturas de 3 letras de
los aminoácidos y tBu se utiliza convencionalmente con las
abreviaturas de 1 letra de los aminoácidos), Bzl es bencilo, Ac es
acetilo, Me es metilo, Abu es ácido 2-aminobutírico,
Thi es tienilalanina, Ac-Lys es
N-acetillisina,
p-amino-Phe es
p-aminofenilalanina,
N-metil-Ala es
N-metilalanina, Diphe es difenilalanina, Sar es
sarcosina, Ava es ácido 5-aminopentanoico, Nle es
norleucina, trt es tritilo.
"Marcador detectable" se refiere a
materiales, que cuando se unen covalentemente a los péptidos y
miméticos de péptidos de la presente invención, permiten la
detección del péptido y de los miméticos de péptidos in vivo
en el paciente al que se ha administrado el péptido o el mimético de
péptido. Los marcadores detectables adecuados son bien conocidos en
la técnica e incluyen, a modo de ejemplo, radioisótopos, marcadores
fluorescentes (p. ej., fluoresceína) y similares. El marcador
detectable particular empleado no es crítico y se selecciona en
relación con la cantidad de marcador que se ha de emplear así como
también en relación con la toxicidad del marcador a la cantidad de
marcador empleada. La selección del marcador en relación con dichos
factores es conocida en la
técnica.
técnica.
La unión covalente del marcador detectable al
péptido o mimético de péptido se logra por métodos convencionales
bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, cuando se emplea
elradioisótopo ^{125}I como el marcador detectable, la unión
covalente de ^{125}I al péptido o al péptido mimético se puede
conseguir incorporando el aminoácido tirosina al péptido o péptido
mimético y después acoplando con el iodo el péptido (Véase, por
ejemplo, Weaner, et al., Synthesis and Applications of
Isotopically Labelled Compounds, pp. 137-140
(1994)). Si la tirosina no está presente en el péptido o mimético
de péptido, la incorporación de tirosina al terminal N o C del
péptido o mimético de péptido se puede lograr mediante química bien
conocida. Asimismo, se puede incorporar ^{32}P al péptido o
mimético de péptido como un resto fosfato, por ejemplo, a través de
un grupo hidroxilo del péptido o mimético de péptido, usando la
química convencional.
La presente invención proporciona compuestos que
se unen al TPO-R y lo activan, o que se comportan de
otra forma como agonistas de la TPO. Estos compuestos incluyen
compuestos peptídicos "líderes" y compuestos "derivados"
construidos de tal modo que tienen la misma o similar estructura
molecular o forma que los compuestos líderes pero que difieren de
los compuestos líderes con respecto a la susceptibilidad para la
hidrólisis o proteolisis y/o con respecto a otras propiedades
biológicas, tales como un aumento de afinidad por el receptor. La
presente invención proporciona también composiciones que comprenden
una cantidad eficaz de un agonista de TPO, y más particularmente un
compuesto, que es útil para tratar trastornos hematológicos y,
particularmente, la trombocitopenia asociada con quimioterapia,
radioterapia o transfusiones de médula ósea.
Se pueden usar una diversidad de métodos para
evaluar los valores de CI_{50}. Por ejemplo, se utilizó un ensayo
ELISA de unión de equilibrio, que usa o bien MBP-TPO
o un trazador del péptido lacI, para determinar si los péptidos
inhiben la unión de TPO al dominio extracelular del receptor TPO. El
valor de CI_{50} se puede determinar utilizando el péptido libre,
que opcionalmente puede ser amidado en C-terminal, o
se puede preparar como un éster u otra carboxi-
amida.
amida.
Los valores de CI_{50} y CE_{50} se indican
simbólicamente aquí por los símbolos "-", "+", y
"++". Por ejemplo, aquellos péptidos que presentaron valores
de CI_{50} superiores a 200 \muM se indican con un "-".
Aquellos péptidos que dieron valores de C_{I50} inferiores o
iguales a 200 \muM se les da un "+", mientras que aquellos
que dieron valores de CI_{50} de 500 nm o menos se indican con un
"++". Aquellos péptidos que dieron valores de CI_{50} en el
valor de corte o próximos a él, para un símbolo en particular se
indican con un designador híbrido, p. ej., "+/-". Aquellos
péptidos para los cuales los valores de CI_{50} no se
determinaron se mencionan como "N.D."
Los péptidos y miméticos de péptidos de la
presente invención se evaluaron también en un ensayo de
proliferación celular dependiente de trombopoyetina, como se
describe en más detalle en el Ejemplo 2 a continuación. La
proliferación celular se mide por métodos conocidos en la técnica,
tales como un ensayo MTT que se correlaciona con la incorporación
de ^{3}H-timidina como una indicación de la
proliferación celular (véase Mossmann J. Immunol. Methods
65:55 (1983)).
Las figuras 3-4 muestran los
resultados de otro ensayo que evalúa la actividad de los péptidos y
miméticos de péptidos de la invención. En este ensayo, los ratones
se tornan trombocitopénicos con carboplatino. Se trataron ratones
Balb/C con carboplatino (125 mg/kg intraperitonealmente) el Día 0.
Estos resultados demuestran que los péptidos de la invención pueden
aliviar la trombocitopenia en un modelo de ratón.
La especificidad de la unión y actividad de los
péptidos de la invención se examinó también estudiando la
reactividad cruzada de los péptidos para el receptor de
eritropoyetina (EPO-R) según el método descrito en
el documento WO96/40750.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos de la invención se pueden preparar
por métodos clásicos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando
técnicas de fase sólida convencionales. Los métodos convencionales
incluyen la síntesis de fase sólida exclusiva, métodos de síntesis
de fase sólida parcial, condensación de fragmentos, síntesis de
disolución clásica e incluso tecnología de ADN recombinante. Véase,
por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1963),
incorporado aquí como referencia. En fase sólida, la síntesis
comienza típicamente por el extremo C-terminal del
péptido, usando una resina protegida por un
alfa-aminoácido. Se puede preparar un material de
partida adecuado, por ejemplo, uniendo el
alfa-aminoácido requerido a una resina
clorometilada, una resina de hidroximetilo o una resina de
benzhidrilamina. Una resina clorometilada de este tipo es
comercializada con la marca BIO-BEADS
SX-1 por Bio Rad Laboratories, Richmond, CA. y la
preparación de la resina de hidroximetilo está descrita por
Bodonszky et al. Chem. Ind. (Londres) 38:1597 (1966). La
resina de benzhidrilamina (BHA) ha sido descrita por Pietta and
Marshall Chem. Commun. 650 (1970), y es comercializada por
Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA, en la forma de
hidro-
cloruro.
cloruro.
Por tanto, los compuestos de la invención se
pueden preparar acoplando un aminoácido protegido con
alfa-amino a la resina clorometilada con la ayuda,
por ejemplo, de un catalizador de bicarbonato de cesio, según el
método descrito por Gisin Helv. Chim. Acta. 56:1467 (1973).
Después del acoplamiento inicial, el grupo protector de
alfa-amino se elimina por una elección de reactivos
que incluyen soluciones de ácido trifluoroacético (TFA) o ácido
clorhídrico (HCl) en disolventes orgánicos a temperatura
ambiente.
Los grupos protectores de
alfa-amino son aquellos conocidos como útiles en la
técnica de síntesis gradual de péptidos. Se incluyen los grupos
protectores de tipo acilo (p. ej. formilo, trifluoroacetilo,
acetilo), los grupos protectores de tipo uretano aromático (p. ej.
benciloxicarboílo (Cbz) y Cbz sustituido), grupos protectores de
uretano alifáticos (p. ej. t-butiloxicarbonilo
(Boc), isopropiloxicarbonilo, ciclohexiloxicarbonilo) y grupos
protectores de tipo alquilo (p. ej. bencilo, trifenilmetilo). Se
prefieren los grupos protectores Boc y Fmoc. El grupo protector de
la cadena lateral permanece intacto durante el acoplamiento y no se
separa durante la desprotección del grupo protector del amino
terminal ni durante el acoplamiento. El grupo protector de la
cadena lateral debe ser eliminable después de completar la síntesis
del péptido final y bajo condiciones de reacción que no alterarán
el péptido objetivo.
Los grupos protectores de la cadena lateral para
Thr y Ser incluyen acetilo, benzoílo, tritilo, tetrahidropiranilo,
bencilo, 2,6-diclorobencilo y Cbz. Los grupos
protectores de la cadena lateral para Arg (R) incluyen nitro,
Tosilo (Tos), Cbz, adamantiloxicarbonil mesitoilsulfonilo (Mts), Pmc
o Boc. Los grupos protectores de la cadena lateral para Lys (K)
incluyen Cbz, 2-clorobenciloxicarbonilo
(2-Cl-Cbz),
2-bromobenciloxicarbonilo (2-BrCbz),
Tos o
Boc.
Boc.
Después de la eliminación del grupo protector de
alfa-amino, los aminoácidos protegidos restantes se
acoplan gradualmente en el orden deseado. En general se utiliza un
exceso de cada aminoácido protegido con un activador apropiado del
grupo carboxilo tal como diciclohexilcarbodiimida (DCC) en solución,
por ejemplo, en mezclas de cloruro de metileno (CH_{2}Cl_{2}) y
dimetilformamida (DMF).
Una vez que se ha completado la secuencia de
aminoácidos deseada, el péptido deseado se desacopla del soporte de
la resina por tratamiento con un reactivo tal como ácido
trifluoroacético o fluoruro de hidrógeno (HF), que no solamente
escinde el péptido de la resina, sino que también escinde todos los
grupos protectores de la cadena lateral restantes. Cuando se usa la
resina clorometilada, el tratamiento con fluoruro de hidrógeno
produce la formación de los ácidos peptídicos libres. Cuando se usa
la resina de benzhidrilamina, el tratamiento con fluoruro de
hidrógeno produce directamente la amida peptídica libre.
Alternativamente, cuando se emplea la resina clorometilada, el
péptido protegido en la cadena lateral puede ser desacoplado por
tratamiento de la resina peptídica con amoníaco para dar la amida
protegida en la cadena lateral deseada, o con una alquilamina para
dar una alquilamida o dialquilamida protegida en la cadena lateral.
La protección de la cadena lateral se elimina después en el modo
usual por tratamiento con fluoruro de hidrógeno para dar las amidas,
alquilamidas o dialquilamidas libres.
Estos procedimientos de síntesis de péptidos en
fase sólida son bien conocidos en la técnica y están descritos
además por John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young, Solid
Phase Peptide Syntheses (2nd Ed., Pierce Chemical Company,
1984).
Los compuestos de la invención se pueden
preparar también usando la "biblioteca sintética codificada" o
el sistema de "síntesis de polímeros inmovilizados a muy gran
escala" descrito en las Solicitudes de patentes de Estados
Unidos, Números de serie 07/492.462, presentada el 7 de marzo de
1990; 07/624.120, presentada el 6 de diciembre de 1990; y
07/805.727, presentada el 6 de diciembre de 1991.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos procedimientos se pueden utilizar también
para sintetizar péptidos en los que otros aminoácidos distintos de
los 20 que están presentes en la naturaleza, aminoácidos
genéticamente codificados, están sustituidos en una, dos o más
posiciones de cualquiera de los compuestos de la invención. Por
ejemplo, la naftilalanina puede reemplazar al triptófano,
facilitando la síntesis. Otros aminoácidos sintéticos que pueden
estar sustituidos en los péptidos de la presente invención incluyen
los \beta aminoácidos, D aminoácidos y los aminoácidos sintéticos
que no están en la naturaleza (Véase, por ejemplo, Roberts, et
al., Unusual Amino/Acids in Peptide Synthesis,
5(6):341-449
(1983)).
(1983)).
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos se sintetizan típicamente como el
ácido libre pero, como se ha observado antes, se podrían preparar
fácilmente como la amida o el éster. También se puede modificar el
amino y/o carboxi terminal de los compuestos peptídicos de la
invención para producir otros compuestos de la invención. Las
modificaciones del amino terminal incluyen metilación (es decir,
-NHCH_{3} o -NH(CH_{3})_{2}), acetilación,
adición de un grupo benciloxicarbonilo, o el bloqueo del terminal
amino con cualquier grupo bloqueante que contenga una función
carboxilato definida por RCOO-, donde R se selecciona del grupo que
consiste en naftilo, acridinilo, esteroidilo y grupos similares.
Las modificaciones del carboxi terminal incluyen reemplazar el ácido
libre con un grupo carboxamida o formar una lactama cíclica en el
terminal carboxi para introducir restricciones estructurales.
Las modificaciones del terminal amino son como
se han indicado antes e incluyen alquilar, acetilar, añadir un
grupo carbobenzoilo, formar un grupo de succinimida, etc. (Véase,
por ejemplo, Murray, et al., Burger's Medicinal Chemistry and
Drug Discovery, 5th ed., Vol. 1, Manfred E. Wolf, ed., John
Wiley and Sons, Inc. (1995).) Específicamente, el grupo amino
N-terminal se puede hacer reaccionar entonces como
sigue:
- (a)
- para formar un grupo amida de la fórmula RC(O)NH- en la que R es como se ha definido anteriormente por reacción con un haluro de ácido [p. ej., RC(O)Cl] o anhídrido simétrico. Típicamente, la reacción se puede llevar a cabo poniendo en contacto cantidades aproximadamente equimolares o en exceso (p. ej., aproximadamente 5 equivalentes) de un haluro de ácido con el péptido en un diluyente inerte (p. ej., diclorometano) que contiene preferiblemente un exceso (p. ej., aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria, tal como diisopropiletilamina, para depurar el ácido generado durante la reacción. Las condiciones de reacción son, por lo demás, convencionales (p. ej., temperatura ambiente durante 30 minutos). La alquilación del amino terminal para proporcionar una N-sustitución con alquilo inferior seguida por una reacción con un haluro de ácido como se ha descrito antes, proporcionará un grupo N-alquil-amida de la fórmula RC(O)NR-;
- (b)
- para formar un grupo succinimida por reacción con anhídrido succínico. Como antes, se puede emplear una cantidad aproximadamente equimolar o un exceso de anhídrido succínico (p. ej., aproximadamente 5 equivalentes), y el grupo amino se convierte en la succinimida por métodos bien conocidos en la técnica que incluyen el uso de un exceso (p. ej., diez equivalentes) de una amina terciaria tal como diisopropiletilamina en un disolvente inerte adecuado (p. ej., diclorometano). Véase, por ejemplo, Wollenberg, et al., Patente de Estados Unidos Nº. 4.612.132 que se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Se ha de entender que el grupo succínico se puede sustituir con, por ejemplo, alquilo C_{2}-C_{6} o sustituyentes -SR que se preparan de un modo convencional para proporcionar la succinimida sustituida en el terminal N del péptido. Dichos sustituyentes alquilo se preparan por reacción de una olefina inferior (C_{2}-C_{6}) con anhídrido maleico del modo descrito por Wollenberg, et al., cita anterior. y los sustituyentes -SR se preparan por reacción de RSH con anhídrido maleico, donde R es como se ha definido antes;
- (c)
- para formar un grupo benciloxicarbonil-NH- o un grupo benciloxicarbonil-NH- sustituido, por reacción con aproximadamente una cantidad equivalente o con un exceso de CBZ-Cl (es decir, cloruro de benciloxicarbonilo) o un CBZ-Cl sustituido en un diluyente inerte adecuado (p. ej., diclorometano) que contiene preferiblemente una amina terciaria para depurar el ácido generado durante la reacción;
- (d)
- para formar un grupo sulfonamida por reacción con una cantidad equivalente o con un exceso (p. ej., 5 equivalentes) de R-S(O)_{2}Cl en un diluyente inerte adecuado (diclorometano) para convertir la amina terminal en una sulfonamida en la que R es como se ha definido antes. Preferiblemente, el diluyente inerte contiene un exceso de una amina terciaria (p. ej., diez equivalentes) tal como diisopropiletilamina, para depurar el ácido generado durante la reacción. Las condiciones de reacción son, por lo demás, convencionales (p. ej., temperatura ambiente durante 30 minutos).
- (e)
- para formar un grupo carbamato por reacción con una cantidad equivalente o con un exceso (p. ej., 5 equivalentes) de R-OC(O)Cl o R-OC(O)OC_{6}H_{4}-p-NO_{2} en un diluyente inerte adecuado (p. ej., diclorometano) para convertir la amina terminal en un carbamato, donde R es como se ha definido antes. Preferiblemente, el diluyente inerte contiene un exceso (p. ej., aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria, tal como diisopropiletilamina, para depurar cualquier ácido generado durante la reacción. Las condiciones de reacción son, por lo demás, convencionales (p. ej., temperatura ambiente durante 30 minutos). y
- (f)
- para formar un grupo urea por reacción con una cantidad equivalente o con un exceso (p. ej., 5 equivalentes) de R-N=C=O en un diluyente inerte adecuado (p. ej., diclorometano) para convertir la amina terminal en una urea (es decir, RNHC(O)NH-), donde R es como se ha definido antes. Preferiblemente, el diluyente inerte contiene un exceso (p. ej., aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria, tal como diisopropiletilamina. Las condiciones de reacción son, por lo demás, convencionales (p. ej., temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos).
En otra realización alternativa, el grupo
carboxilo C-terminal o un éster
C-terminal se pueden inducir para ciclarse por
desplazamiento interno del -OH o del éster (-OR) del grupo carboxilo
o éster respectivamente con el grupo amino
N-terminal para formar un péptido cíclico. Por
ejemplo, después de la síntesis y escisión para dar el ácido
peptídico, el ácido libre se convierte en un éster activado mediante
un activador del grupo carboxilo apropiado tal como
diciclohexilcarbodiimida (DCC) en solución, por ejemplo, en mezclas
de cloruro de metileno (CH_{2}Cl_{2}) y dimetil formamida
(DMF). El péptido cíclico se forma entonces por desplazamiento
interno del éster activado con la amina N-terminal.
La ciclización interna, en oposición a la polimerización, se puede
potenciar mediante el uso de soluciones muy diluidas. Tales métodos
son bien conocidos en la técnica.
También se pueden ciclar los péptidos de la
invención, o se puede incorporar un residuo desamino o descarboxi
en los terminales del péptido, de modo que no haya ningún grupo
amino ni carboxilo terminal, para disminuir la susceptibilidad a
las proteasas o para restringir la conformación del péptido. Los
grupos funcionales C-terminales de los compuestos
de la presente invención incluyen amida,
amida-alquilo inferior,
amida-di(alquilo inferior), alcoxi inferior,
hidroxi y carboxi, y sus derivados de éster inferior, y sus sales
farmacéuticamente aceptables.
En adición a las modificaciones mencionadas en
N-terminal y C-terminal, los
compuestos de la invención se pueden modificar de forma ventajosa
con uno o más de una variedad de polímeros hidrófilos o se pueden
acoplar covalentemente a los mismos, como se ha definido antes.
Los compuestos peptídicos de la invención pueden
ser derivatizados con tales polímeros o ser acoplados a ellos,
utilizando cualquiera de los métodos detallados en Zallipsky, S.,
Bioconjugate Chem., 6:150-165 (1995);
Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem.,
6:62-69 (1995); patente de Estados Unidos Nº
4.640.835; patente de Estados Unidos Nº 4.496.689; patente de
Estados Unidos Nº 4.301.144; patente de Estados Unidos No 4.670.417;
patente de Estados Unidos Nº 4.791.192; patente de Estados Unidos
Nº4.179.337 o WO 95/34326, todas las cuales se incorporan aquí como
referencia en su totalidad. Los PEG están comercialmente disponibles
de Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Alabama), Sigma Chemical
Co. y otras compañías.
En una realización actualmente preferida, los
compuestos peptídicos de la presente invención se derivatizan con
polietilenglicol (PEG).
En resumen, en una realización modelo, el
polímero hidrófilo que se emplea, por ejemplo, PEG, está
preferiblemente recubierto en un extremo con un grupo no reactivo
tal como un grupo metoxi o etoxi. Después, se activa el polímero en
el otro extremo mediante reacción con un agente activante adecuado,
tal como haluros cianúricos (p.ej., cloruro, bromuro o fluoruro
cianúrico), diimidazol, un anhídrido reactivo (p.ej., un anhídrido
dihalosuccínico, tal como anhídrido dibromosuccínico), azida de
acilo, éter p-diazoniobencílico,
3-(p-diazoniofenoxi)-2-hidroxipropiléter)
y similares. El polímero activado se hace reaccionar entonces con
un compuesto peptídico de la presente invención para producir un
compuesto peptídico derivatizado con un polímero. Si una de las
ramas peptídicas de los compuestos de la invención está protegida,
p.ej. con un grupo acilo, se formará un compuesto monopegilado.
Alternativamente, un grupo funcional de los compuestos peptídicos
de la invención puede ser reactivado para reaccionar con el
polímero, o se pueden unir los dos grupos en una reacción de
acoplamiento concertado utilizando los métodos conocidos de
acoplamiento. Los esquemas 1-4 ilustran ejemplos de
esquemas de reacción para derivatizar los compuestos peptídicos de
la invención, por ejemplo, con polietilenglicol (PEG). Se podrá
apreciar fácilmente que los compuestos peptídicos de la invención
se pueden derivatizar con PEG utilizando un gran número de otros
esquemas de reacción conocidos y usados por los expertos en la
técnica.
En adición a derivatizar los compuestos
peptídicos de esta invención con un polímero hidrófilo (p.ej.,
PEG), se ha descubierto ahora que otros péptidos pequeños, p.ej.,
otros péptidos o ligandos que se unen a un receptor, se pueden
derivatizar también con tales polímeros hidrófilos con escasa
pérdida, si hay alguna, de actividad biológica (p.ej., actividad de
unión, actividad agonista, actividad antagonista, etc.). Se
ha encontrado que cuando estos péptidos pequeños se derivatizan con
un polímero hidrófilo, sus semi-vidas de
solubilidad y circulación se aumentan y su inmunogenicidad se
reduce. Una vez más, y bastante sorprendentemente, lo anterior se
puede conseguir con escasa pérdida, si hay alguna, de la actividad
biológica. De hecho, en las realizaciones preferidas, los péptidos
derivatizados tienen una actividad que es de 0,1 a 0,01 veces la de
los péptidos no modificados. En las realizaciones más preferidas,
los péptidos derivatizados tienen una actividad que es de 0,1 a 1
vez la de los péptidos no modificados. En las realizaciones aún más
preferidas, los péptidos derivatizados tienen una actividad que es
mayor que la de los péptidos no modificados.
En el contexto de esta realización, el término
"péptidos no modificados" generalmente incluye aquellos
péptidos, esto es, ligandos, que se unen a un receptor, tal como
los receptores TPO, EPO, IL-1, G-CSF
y IL-5; los receptores del factor de crecimiento
hematopoyético; los receptores de citocina; los receptores ligados a
la proteína G; los receptores de la superficie celular, etc.
Tales péptidos comprenden típicamente aproximadamente 150 residuos
aminoácidos o menos y, más preferiblemente, aproximadamente 100
residuos aminoácidos o menos (p.ej.,aproximadamente
10-12 kDa). Los polímeros hidrófilos adecuados para
uso en la presente invención incluyen, pero sin limitarse a ellos,
polialquiléteres como por ejemplo polietilenglicol y
polipropilenglicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico,
polioxialquenos, poli(alcohol vinílico),
polivinilpirrolidona, celulosa y derivados de celulosa, dextrano y
derivados de dextrano, etc. Generalmente, dichos polímeros
hidrófilos tienen un peso molecular medio que varía desde
aproximadamente 500 hasta aproximadamente 100.000 dalton, más
preferiblemente desde aproximadamente 2.000 hasta aproximadamente
40.000 dalton y, aún más preferiblemente, desde aproximadamente
5.000 hasta aproximadamente 20.000 dalton. En las realizaciones
preferidas, dichos polímeros hidrófilos tienen un peso molecular
medio de aproximadamente 5.000 dalton, 10.000 dalton y 20.000
dalton. Los compuestos peptídicos según esta realización pueden ser
derivatizados utilizando los métodos descritos antes y los
descritos en las citadas referencias.
Esquema
1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
2
Esquema
3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
4
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto de la presente invención
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
tiene un enlace disulfuro
intramolecular entre los grupos tiol de las cisteínas. Este
compuesto se puede preparar mediante un desplazamiento
intramolecular, utilizando métodos conocidos en la técnica (Véase,
p.ej., Frank A. Robey, Meth. in Mol. Bio.,
35(6):73-90
(1990).
\vskip1.000000\baselineskip
Según otro aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para preparar una composición
polipeptídica soluble en agua, fisiológicamente activa y
sustancialmente no inmunógena a partir de un polipéptido que
originalmente tiene actividad fisiológica, que comprende las etapas
de:
- (a)
- activar al menos un átomo de carbono terminal que lleva un grupo hidroxi de un polímero que tiene un peso molecular de aproximadamente 500 a aproximadamente 20.000 dalton, donde dicho polímero está insustituido o sustituido con grupos alcoxi o alquilo, teniendo dichos grupos alcoxi o alquilo menos de 5 átomos de carbono; y
- (b)
- hacer reaccionar un polipéptido fisiológicamente activo de la fórmula (I) con 10 a 100 moles de dicho polímero activado por mol de polipéptido, acoplando dicho polipéptido al grupo reactivo terminal de dicho polímero para dar la mencionada composición polipeptídica soluble en agua, fisiológicamente activa y sustancialmente no inmunógena. Preferiblemente el polímero es polietilenglicol. Preferiblemente el agente de acoplamiento es cloruro cianúrico.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de la invención son útiles in
vitro como herramientas únicas para entender la función
biológica de la TPO, incluyendo la evaluación de los muchos
factores que se cree que influencian, y que son influenciados por
la producción de TPO y el proceso de unión al receptor.
Los compuestos son útiles también como
enlazadores competitivos en ensayos para detectar nuevos agonistas
del receptor de TPO. En las realizaciones de dicho ensayo, los
compuestos de la invención se pueden utilizar sin modificación o se
pueden modificar en una diversidad de formas; por ejemplo, marcando,
tal como uniendo covalentemente o no covalentemente un resto que
proporciona directa o indirectamente una señal detectable. En
cualquiera de estos ensayos, estos materiales se pueden marcar
directa o indirectamente. Las posibilidades de marcado directo
incluyen grupos de marcadores tales como: radiomarcadores tales como
I, enzimas (Patente de Estados Unidos 3.645.090) tales como
peroxidasa y fosfatasa alcalina, y marcadores fluorescentes (Patente
de Estados Unidos No. 3.940.475) capaces de monitorizar el cambio
en la intensidad de la fluorescencia, el desplazamiento de la
longitud de onda, o la polarización de la fluorescencia. Las
posibilidades de marcado indirecto incluyen la biotinilación de un
constituyente seguida por la unión a la avidina acoplada a uno de
los grupos de marcadores anteriormente mencionados. Los compuestos
pueden incluir también espaciadores o enlazadores en los casos en
que los compuestos se tienen que unir a un soporte sólido.
Además, basándose en su capacidad de unión al
receptor de TPO, los péptidos de la presente invención se pueden
utilizar como reactivos para detectar receptores de TPO en células
vivas, en células fijas, en fluidos biológicos, en homogenatos de
tejido, en materiales biológicos naturales purificados, etc. Por
ejemplo, marcando dichos péptidos, se pueden identificar las
células que tienen el TPO-R en su superficie.
Además, basándose en su capacidad de unión al receptor de TPO, los
péptidos de la presente invención se pueden utilizar para la tinción
in situ, FACS (clasificación celular activada por
fluorescencia), transferencia Western, ELISA, etc. Además,
basándose en su capacidad de unión al receptor de TPO, los péptidos
de la presente invención se pueden utilizar en la purificación del
receptor, o en la purificación de células que expresan los
receptores de TPO en la superficie celular (o dentro de
células
permeabilizadas).
permeabilizadas).
Los compuestos de la presente invención se
pueden utilizar también como reactivos comerciales para diferentes
usos de investigación y diagnóstico médico. Dichos usos incluyen,
aunque sin limitarse a ellos: (1) el uso como un patrón de
calibración para cuantificar las actividades de los candidatos como
agonistas de TPO en una diversidad de ensayos funcionales; (2) el
uso para mantener la proliferación y el crecimiento de líneas
celulares dependientes de TPO; (3) el uso en el análisis estructural
del receptor de TPO a través de la
co-cristalización; (4) el uso para investigar el
mecanismo de la transducción de señal/activación del receptor de
TPO; y (5) otras aplicaciones de diagnóstico y de investigación en
las que el receptor de TPO es preferiblemente activado o dicha
activación es convenientemente calibrada frente a una cantidad
conocida de un agonista de TPO, y similares.
Los compuestos de la presente invención se
pueden utilizar para la expansión in vitro de megacariocitos
y sus progenitores comprometidos, tanto en conjunción con citocinas
adicionales como en forma independiente. Véase, p.ej., DiGiusto,
et al., Publicación PCT No. 95/05843, que se incorpora aquí
como referencia. La quimioterapia y las radioterapias causan
trombocitopenia, destruyendo la población de megacariocitos más
madura que se divide rápidamente. No obstante, estos tratamientos
terapéuticos pueden reducir también el número y la viabilidad de
las células precursoras de megacariocitos inmaduras y menos activas
mitóticamente. Por tanto, el alivio de la trombocitopenia por la
TPO o por los compuestos de la presente invención se puede facilitar
infundiendo a los pacientes después de la quimioterapia o
radioterapia una población de su propias células enriquecidas en
megacariocitos y precursores inmaduros por cultivo in
vitro.
Los compuestos de la invención se pueden
administrar también a animales de sangre caliente, incluyendo los
seres humanos, para activar el TPO-R in vivo.
Por tanto, la presente invención incluye métodos para el
tratamiento terapéutico de trastornos relacionados con la TPO que
comprenden administrar un compuesto de la invención en cantidades
suficientes para imitar el efecto de la TPO sobre el
TPO-R in vivo. Por ejemplo, los péptidos y
compuestos de la invención se pueden administrar para tratar una
variedad de trastornos hematológicos, como se han definido aquí
anteriormente.
En algunas realizaciones de la invención,
preferiblemente se administran en primer lugar antagonistas de la
TPO a los pacientes que reciben quimioterapia o radioterapia,
seguido por la administración de los agonistas de la TPO de la
invención.
La actividad de los compuestos de la presente
invención se puede evaluar in vitro o in vivo en uno
de los numerosos modelos descritos en McDonald, Am. J. of
Pediatric Hematology/Oncology, 14:8-21 (1992),
que se incorpora aquí como referencia.
Según una realización, las composiciones de la
presente invención son útiles para tratar la trombocitopenia
asociada con transfusiones de la médula ósea, radioterapia o
quimioterapia. Los compuestos se administrarán típicamente
profilácticamente antes de la quimioterapia, radioterapia o
trasplante de médula ósea, o después de dicha exposi-
ción.
ción.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona también composiciones farmacéuticas que comprenden, como
ingrediente activo, al menos uno de los péptidos o miméticos de
péptidos de la invención en asociación con un vehículo o diluyente
farmacéutico. Los compuestos de esta invención se pueden administrar
por las vías oral, pulmonar, parental (inyección intramuscular,
intraperitoneal, intravenosa (IV) o subcutánea), inhalación
(mediante una formulación en polvo fino), transdérmica, nasal,
vaginal, rectal o sublingual y se pueden formular en formas
farmacéuticas apropiadas para cada vía de administración. Véase,
p.ej., Bernstein, et al., Publicación de patente PCT No. WO
93/25221; Pitt et al. Publicación de patente PCT No. WO
94/17784; y Pitt, et al., Solicitud de patente europea
613,683, cada una de las cuales se incorpora aquí como
referencia.
Las formas farmacéuticas sólidas para
administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras,
polvos, y gránulos. En dichas formas farmacéuticas sólidas, el
compuesto activo se mezcla al menos con un vehículo inerte
farmacéuticamente aceptable tal como sacarosa, lactosa o almidón.
Dichas formas farmacéuticas pueden comprender también, como es
práctica normal, sustancias adicionales aparte de los diluyentes
inertes, p. ej., agentes lubricantes tales como estearato de
magnesio. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las
formas farmacéuticas pueden comprender también agentes tampón. Los
comprimidos y las píldoras se pueden preparar adicionalmente con
recubrimientos entéricos.
Las formas farmacéuticas líquidas para
administración oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones,
jarabes, farmacéuticamente aceptables, conteniendo los elixires
diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica, tal como
agua. Además de dichos diluyentes inertes, las composiciones pueden
incluir también adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes
emulsionantes y de suspensión, y agentes edulcorantes, saborizantes
y perfu-
mantes.
mantes.
Las preparaciones según esta invención para
administración parental incluyen soluciones, suspensiones o
emulsiones acuosas o no acuosas, estériles. Son ejemplos de
disolventes o vehículos no acuosos, propilenglicol,
polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y
aceite de maíz, gelatina y ésteres orgánicos inyectables tal como
oleato de etilo. Dichas formas farmacéuticas pueden contener también
adyuvantes tales como agentes conservantes, humectantes,
emulsionantes, bacteriostáticos y dispersantes, antioxidantes,
tampones, agentes de suspensión, agentes para aumento del volumen y
crioprotectores. Se pueden esterilizar, por ejemplo, por filtración
a través de un filtro de retención de bacterias, por incorporación
de agentes de esterilización a las composiciones, por irradiación
de las composiciones, o por calentamiento de las composiciones.
También se pueden fabricar utilizando agua estéril, o algún otro
medio inyectable estéril, inmediatamente antes de su uso.
Alternativamente, los compuestos se pueden
presentar como sólidos liofilizados para reconstitución con agua
(para inyección), solución salina o solución de dextrosa. Tales
formulaciones se presentan normalmente en formas de dosificación
unitarias tales como viales, ampollas o dispositivos de un solo uso
para inyección. Se pueden presentar también en formas
multi-dosis tales como un envase del que se puede
sacar la dosis apropiada. Todas estas formulaciones deben ser
estériles.
Las composiciones para administración rectal o
vaginal son preferiblemente supositorios que pueden contener,
además de la sustancia activa, excipientes tales como manteca de
cacao o una cera para supositorios. Las composiciones para
administración nasal o sublingual se preparan también con
excipientes convencionales conocidos en la técnica.
Las composiciones que contienen los compuestos
se pueden administrar para tratamientos profilácticos y/o
terapéuticos. En las aplicaciones terapéuticas, las composiciones
se administran a un paciente que ya padece una enfermedad, como se
ha descrito antes, en una cantidad suficiente para curar o al menos
parar parcialmente los síntomas de la enfermedad y sus
complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define
como "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces
para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del peso
y estado general del paciente.
Las composiciones de la invención también se
pueden microencapsular mediante, por ejemplo, el método de Tice y
Bibi (en Treatise on Controlled Drug Delivery, ed. A. Kydonieus,
Marcel Dekker, N.Y. (1992), pp. 315-339).
En las aplicaciones profilácticas, las
composiciones que contienen los compuestos de la invención se
administran a un paciente susceptible o, de cualquier forma, en
riesgo de una enfermedad particular. Dicha cantidad se define como
"dosis profilácticamente eficaz". En este uso, las cantidades
precisas nuevamente dependen del estado de salud y el peso del
paciente.
Las cantidades del agonista de TPO necesarias
para una terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes,
incluyendo los medios de administración, el sitio diana, el estado
fisiológico del paciente, y otros medicamentos administrados. Por
tanto, las dosis de tratamiento se deben ajustar para optimizar la
seguridad y la eficacia. Típicamente, las dosis utilizadas in
vitro pueden proporcionar una guía útil de las cantidades útiles
para la administración in situ de estos reactivos. Las
pruebas en animales de las dosis eficaces para el tratamiento de
trastornos particulares proporcionarán otra indicación predictiva de
la dosificación a los seres humanos. Diferentes consideraciones
están descritas, p. ej., en Gilman et al. (eds), Goodman
and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8a
ed., Pergamon Press (1990); y en Remington's Pharmaceutical
Sciences, 7a ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1985);
cada uno de los cuales se incorpora aquí como referencia.
Los péptidos y miméticos de péptidos de esta
invención son eficaces para tratar afecciones mediadas por la TPO
cuando se administran en un intervalo de dosis de aproximadamente
0,001 mg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal al día. La
dosis específica empleada es regulada por la afección particular a
ser tratada, la vía de administración, así como también el criterio
del médico, dependiendo de factores tales como la gravedad de la
afección, la edad y el estado general del paciente, y similares.
Una preparación farmacéutica parenteral adecuada
para administración a los seres humanos contendrá preferiblemente
1-50 mg/ml del compuesto de la fórmula (I), o uno de
sus derivados farmacéuticamente aceptables, en solución o múltiples
derivados para viales multi-dosis.
Una formulación preferida es una solución del
compuesto de la fórmula (I) en agua, solución salina, o solución de
dextrosa. Las soluciones particularmente preferidas tienen un pH de
aproximadamente 4,0 - 5,0.
Según otro aspecto, la invención proporciona una
composición polipeptídica soluble en agua, fisiológicamente activa
y sustancialmente no inmunógena que comprende un compuesto de la
fórmula (I) acoplado con un agente de acoplamiento al menos a un
polímero que tiene un peso molecular entre aproximadamente 500 y
aproximadamente 20.000 dalton seleccionado del grupo que consiste
en polietilenglicol y polipropilenglicol, donde dicho polímero está
insustituido o sustituido con grupos alcoxi o alquilo, teniendo
dichos grupos alcoxi o alquilo menos de 5 átomos de carbono.
Preferiblemente dicho polímero tiene un peso molecular de
aproximadamente 750 a aproximadamente 15.000 dalton, más
preferiblemente de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 10.000
dalton. Preferiblemente dicho polímero es polietilenglicol.
Aunque sólo se han descrito anteriormente las
realizaciones preferidas de la invención, se podrá apreciar que son
posibles modificaciones y variaciones de la invención sin separarse
del espíritu ni del alcance pretendido de la invención.
\newpage
Ejemplo
1
Se sintetizaron diferentes péptidos de la
invención utilizando las técnicas de síntesis en fase sólida de
Merrifield (Véase Steward and Young, Solid Phase Peptide
Synthesis, 2d. edición, Pierce Chemical, Rockford, IL (1984) y
Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1963)) manualmente o
utilizando el sintetizador de péptidos Modelo 431A o 433A de
Applied Biosystems Inc.. Se ensamblaron los péptidos utilizando
protocolos estándar de Applied Biosystems Inc. Synth AssistÔ 1.0.0
o Synth AssistÔ 2.0.2. A menos que se indique otra cosa en los
ejemplos, se realizó cada acoplamiento durante 2x30 min, con HBTU
(hexafluoro-fosfato de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio)
y HOBt (1-hidroxibenzotriazol).
La resina utilizada fue resina HMP, resina de
(p-hidroximetil-fenoximetil)poliestireno
o PAL (Milligen/Biosearch), que es una resina de poliestireno
reticulado con ácido
5-(4'-Fmoc-aminometil-3,5'-dimetiloxifenoxi)valérico
como un ligante. El uso de la resina PAL produce una función amida
en el carboxilo terminal tras la escisión del péptido de la resina.
Tras la escisión, la resina HMP produce un resto de ácido
carboxílico en el terminal C del producto final. La mayoría de los
reactivos, resinas y aminoácidos protegidos (libres o en la resina)
se adquirieron de Millipore o Applied Biosystems Inc.
El grupo Fmoc se utilizó para la protección del
amino durante el procedimiento de acoplamiento. La protección de la
amina primaria en los aminoácidos se consiguió con Fmoc y los grupos
de protección de la cadena lateral fueron t-butilo
para la serina, ácido glutámico, y treonina; tritilo para la
glutamina; Pmc
(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo)
para la arginina;
N-t-butoxicarbonilo para el
triptófano; y S-tritilo para la cisteína.
La eliminación de los péptidos de la resina y la
desprotección simultánea de las funciones de la cadena lateral se
lograron por tratamiento con reactivo K o leves modificaciones de
éste. Alternativamente, en la síntesis de estos péptidos, con un
terminal carboxilo amidado, el péptido totalmente ensamblado se
escindió con una mezcla de 90% de ácido trifluoroacético, 5% de
etanoditiol y 5% de agua, inicialmente a 4ºC, y aumentando
gradualmente hasta temperatura ambiente. Los péptidos desprotegidos
se precipitaron con éter dietílico. En todos los casos, se hizo la
purificación por cromatografía de líquidos de alta resolución,
preparativa, de fase inversa, en una columna de gel de sílice unida
a C_{18} con un gradiente de acetonitrilo/agua con ácido
trifluoroacético al 0,1%. Los péptidos homogéneos se caracterizaron
por espectrometría de masas con bombardeo de átomos rápidos o por
espectrometría de masas con electronebulización y análisis de
aminoácidos, cuando era aplicable.
En una realización preferida, los péptidos de
esta invención se dimerizan utilizando procedimientos sintéticos
estándar conocidos y utilizados por los expertos en la técnica.
Modelos de esquemas de síntesis para preparar los compuestos de
péptidos diméricos de esta invención se indican en las Figuras 10 y
11. Siguiendo estos esquemas de síntesis, los expertos en la
técnica pueden preparar fácilmente compuestos de péptidos diméricos
de acuerdo con la presente invención. En adición, estará fácilmente
claro para los expertos en la técnica que las subunidades diméricas
se pueden unir fácilmente utilizando otras metodologías y enlaces
aparte de los descritos en las Figuras 10 y 11.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Esquema para
AF15705
Una cámara para péptidos de 1 L se cargó con
resina de
Fmoc-Leu-HMPB-BHA[ácido
4-(4-hidroximetil-3-metoxifenoxi)-butírico-benzhidrilamina]
(35 g, 18,9 mmol) y 300 mL de
1-metil-2-pirrolidinona
(NMP). Se acondicionó la resina en el disolvente con agitación en
nitrógeno durante aproximadamente 30 minutos para hinchar las
perlas. La separación de Fmoc
(9-fluorenilmetiloxicarbonilo) de la amina terminal
se consiguió utilizando 2 x 250 mL de una solución al 30% de
piperidina en NMP durante 10 minutos cada vez. Se lavó entonces la
resina hasta quedar libre de subproductos de Fmoc (dibenzofulveno y
su aducto de piperidina) con 6 x 300 mL de NMP, como se determina
por un test negativo de cloranilo. Se disolvieron
Fmoc-Thr(tBu)-OH (15,0 g, 2
equivalentes) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) (5,8 g,
2 equivalentes) en 250 mL de NMP a temperatura ambiente. Se enfrió
la solución en un baño de hielo a 0-5ºC. Se añadió
diisopropiletilamina (DIPEA) (8,2 mL, 2,5 equivalentes) y se agitó
durante 3-5 minutos. Se añadieron hexafluorofosfato
de
O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio
(HBTU) (14,3 g, 2 equivalentes) y 75 mL de diclorometano (DCM) y se
agitó para disolver, aproximadamente 5 minutos. Se cargó la
solución de ácido activado sobre la resina drenada y se agitó con
burbujeo de N_{2} durante 1 h. Se monitorizó el final del
acoplamiento con el test de la ninhidrina. Se drenó la resina y se
lavó con 3 x 300 mL de NMP.
Se repitió después el ciclo para los
subsiguientes fragmentos poliméricos del fragmento peptídico
utilizando: Fmoc-Pro-OH (12,8 g),
Fmoc-Gly-OH (11,2 g),
Fmoc-Glu(OtBu)-OH (16,8 g), y
Fmoc-Ile-OH (13,4 g). Después de la
reacción final de acoplamiento, se lavó la resina con 4 x 300 mL de
NMP, después con 4 x 300 mL de DCM.
Se escindió el péptido de la resina utilizando
ácido trifluoroacético al 1% en DCM. Se recogieron las fracciones y
se analizaron por HPLC para determinar el contenido en producto. Se
recogieron y analizaron cuatro fracciones de 300 mL, cuatro
fracciones de 500 mL, y después seis fracciones de 250 mL. Se
ajustaron las fracciones 3-9 a pH
-3-4 con piridina, después se reunieron, y se
concentraron hasta casi sequedad en un evaporador rotatorio. Se
introdujeron en el matraz unos 200 mL de etanol y se continuó la
concentración para eliminar el DCM residual. Se calentó la solución
parcial resultante en un baño de vapor para obtener una solución
completa. Se enfrió la solución en un baño de hielo a
0-5ºC y se añadieron 400 mL de agua con agitación
vigorosa. Se agitó la mezcla espesa del producto en el baño de
hielo durante aproximadamente 1 h, se filtró, y se lavó con 100 mL
de agua. Se secó el producto al aire en el embudo haciendo pasar una
corriente de aire a través del embudo durante la noche para dar
18,8 g (19,5 mmol) de
Fmoc-Ile-Glu(OtBu)-Gly-Pro-Thr(tBu)-Leu-OH
en cantidad cuantitativa y 98,3% de pureza en área, por HPLC.
Una cámara para péptidos de 1 L se cargó con
resina HMPB-BHA (35 g, 30,8 mmol) y 300 mL de
1-metil-2-pirrolidinona
(NMP). Se acondicionó la resina en el disolvente con agitación en
nitrógeno durante aproximadamente 30 minutos para hinchar las
perlas. Mientras tanto se disolvió
Fmoc-Ala-OH (28,8 g, 3 equivalentes)
en 200 mL de NMP a temperatura ambiente. Se enfrió la solución en
un baño de metanol/agua/hielo de -5ºC a 0ºC y después se añadió
dimetilaminopiridina (DMAP) (750 mg, 0,2 equivalentes) y se dejó que
se disolviera. Se añadieron diisopropilcarbodiimida (DIC) (14,3 mL,
3 equivalentes) y 100 mL de diclorometano (DCM) y se agitó la
solución a aproximadamente 0 ºC durante 20-30
minutos. Se obtuvo una solución amarillo brillante. Se drenó la
resina y la solución de aminoácido activado se cargó en la cámara.
Se agitó la mezcla con burbujeo de N_{2} durante 5 horas. Se drenó
la resina y se lavó con 3 x 300 mL de NMP. Se separó una muestra,
se lavó bien con NMP y DCM, y se secó durante la noche. La resina
fue recubierta en los extremos con una solución de anhídrido
benzoico (20,9 g, 3 equivalentes) y 7,5 mL (3 equivalentes) de
piridina en 250 mL de NMP. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente
durante 1,5 horas. Se drenó la resina y se lavó con 3 x 300 mL de
NMP. La separación de Fmoc
(9-fluorenilmetiloxicarbonilo) de la amina terminal
se consiguió utilizando 2 x 250 mL de una solución al 30% de
piperidina en NMP durante 10 minutos cada vez. Se lavó entonces la
resina hasta quedar libre de subproductos de Fmoc (dibenzofulveno y
su aducto de piperidina) con 6 x 300 mL de NMP, como se determina
por un test negativo de cloranilo.
Se disolvieron
Fmoc-Leu-OH (21,8 g, 2 equivalentes)
y 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) (9,4 g, 2
equivalentes) en 225 mL de NMP a temperatura ambiente. Se enfrió la
solución en un baño de hielo a 0-5ºC. Se añadió
diisopropiletilamina (DIPEA) (13,4 mL, 2,5 equivalentes) y se agitó
durante 3-5 minutos. Se añadieron hexafluorofosfato
de
O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio
(HBTU) (23,4 g, 2 equivalentes) y 75 mL de DCM y se agitó para
disolver, aproximadamente 5 minutos. Se cargó la solución de ácido
activado sobre la resina drenada y se agitó con burbujeo de N_{2}
durante 1 h. Se monitorizó el final del acoplamiento con el test de
la ninhidrina. Se drenó la resina y se lavó con 3 x 300 mL de
NMP.
Se repitió después el ciclo para los
subsiguientes fragmentos poliméricos del fragmento peptídico
utilizando: Fmoc-(1-Nal)-OH (27,0
g), Fmoc-Gln(trt)-OH (37,6
g), y Fmoc-Arg(Pbf)-OH (40,0
g). Después de la reacción final de acoplamiento, se lavó la resina
con 4 x 300 mL de NMP y después con 4 x 300 mL de DCM.
Se escindió el péptido de la resina utilizando
ácido trifluoroacético al 1% en DCM. Se recogieron las fracciones y
se analizaron por HPLC para determinar el contenido en producto. Se
recogieron y analizaron cuatro fracciones de 200 mL, tres
fracciones de 500 mL, y después cinco fracciones de 250 mL. Se
ajustaron las fracciones 5-11 a pH
-3-4 con piridina, después se reunieron, y se
concentraron hasta casi sequedad en un evaporador rotatorio. Se
introdujeron en el matraz unos 200 mL de etanol y se continuó la
concentración para eliminar el DCM residual. Se calentó la solución
parcial resultante en un baño de vapor para obtener una solución
completa. Se enfrió la solución en un baño de hielo a
0-5ºC y se añadieron 200 mL de HCl 0,1 N seguido por
200 mL de agua. Se agitó la mezcla espesa del producto en el baño
de hielo durante aproximadamente 1 h, se filtró, y se lavó con 100
mL de agua. Se secó el producto al aire en el embudo haciendo pasar
una corriente de aire a través del embudo durante la noche para dar
Fmoc-Arg(Pbf)-Gln(trt)-(1-Nal)-Leu-Ala-OH
(31,.9 g, 22,8 mmol) con rendimiento del 74% a partir de la resina
(rendimiento >95% a partir de la resina analizada) con una pureza
del 94,8% en área, por HPLC.
Se agitaron
FmocArg(Pbf)-OH (3 equivalentes),
dimetilaminopiridina (0,3 equivalentes), y diisopropilcarbodiimida
(3 equivalentes) para disolver en
1-metil-2-pirrolidinona
(NMP, 10 vol) a temperatura ambiente. Se añadió la solución a la
resina [ácido
4-(4-hidroximetil-3-metoxifenoxi)-butírico
](HMPB) en una cámara para péptidos y se agitó con burbujeo de
N_{2} durante 3-6 horas. Se determinó la
eficiencia de la carga por análisis cuantitativo por HPLC de una
muestra escindida. El FmocArg(Pbf) unido a la resina se
expuso a NMP al 30% en piperidina (2 x10 vol) durante
10-15 minutos para desproteger la amina terminal. Se
lavó la resina con NMP (60-80 vol) hasta un test
negativo, con cloranilo, de la piperidina. Se preactivó
FmocAla-OH (2 equivalentes) en
NMP(5-10 vol) a 0-5ºC
utilizando hexafluorofosfato de
O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio
(HBTU, 2 equivalentes) y 1-hidroxibenzotriazol
(HOBT, 2 equivalentes), y diisopropiletilamina (DIPEA, 2,1
equivalentes), y después se transfirió a la mezcla de resina y se
agitó con una purga de nitrógeno durante 30-90
minutos. Se monitorizó la eficiencia del acoplamiento con el test
de la ninhidrina. Se lavó la resina con NMP (25-30
vol) y se repitió el ciclo de acoplamiento para proporcionar el
péptido unido a la resina totalmente protegido en las cadenas
laterales. Se lava la resina hasta quedar libre de NMP con cloruro
de metileno (DCM, 40-60 vol) antes de la escisión
del péptido. Se separó de la resina el fragmento protegido en las
cadenas laterales con varios lavados con ácido trifluoroacético al
1% en DCM (20 vol). La resina se volvió de un color violeta intenso
cuando se liberó el péptido. Se monitorizaron por HPLC las
fracciones escindidas, se neutralizaron después con piridina y se
concentraron hasta un residuo sólido que se sometió a purificación
adicional. Se añadieron a los sólidos 300 mL de agua. Se ajustó el
pH de la solución a 2 con HCl 0,1N (100 mL). Se lavó la suspensión
con acetato de etilo (2 x 300 mL). Se lavaron los extractos de
acetato de etilo reunidos con cloruro de sodio acuoso saturado (150
mL), se secaron sobre MgSO_{4} y se concentraron hasta una espuma.
Se rompió la espuma, y se trituró con metil t-butil
éter (MTBE 100 mL). Se recogió el sólido resultante y se secó para
dar FmocAR(Pbf)-OH con aproximadamente 100%
de rendimiento a partir de la resina.
Una solución de
FmocAR(Pbf)-OH (1 equivalente), SarOBzl, sal
tosilato (1 equivalente), HOAT (1,2 equivalentes) y DIPEA (2,5
equivalentes) en DMF (13 vol), se enfrió a 0ºC y se añadió HBTU (1,2
equivalentes). Se agitó la solución a 0ºC durante 10 minutos y
después se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 40
minutos. Para precipitar el péptido, se añadió una solución de
salmuera/agua 1:1 (40 vol). Se recogió el sólido, se disolvió en
metanol (8 vol) y se precipitó con agua (10 vol). Se decantó el
disolvente del semi-sólido pegajoso y se secó el
semi-sólido a vacío hasta una espuma. Se
rompió la espuma y se trituró con MTBE (8 vol). Se decantó el
disolvente y se secó el sólido. Rendimiento 15,2 g, 92% a
partir de la resina, 99% en área por HPLC. Se disolvió el producto
en THF/piperidina 9:1 (10 vol) y se agitó a temperatura ambiente
durante 50 minutos. Para precipitar el péptido se añadieron MTBE
(26 vol) y hexano (33 vol). Se decantó el disolvente del
semi-sólido y se secó el semi-sólido
(que forma gomas al exponerlo al aire) a vacío hasta una
espuma. Se rompió la espuma, se trituró con MTBE (10 vol) y
se decantó el disolvente. Se repitió la trituración dos veces y se
secó el producto. Rendimiento 93%, pureza por HPLC, 95% en área.
Se sometió a reparto
Boc-Arg(Pbf)-OH.DCHA (4,96 g)
entre 50 ml de acetato de etilo y dos porciones de 40 ml de ácido
cítrico 0,25 M. Se lavó la fase orgánica con dos volúmenes de 30 ml
de agua, 30 ml de salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio y se
evaporó hasta una espuma. Se disolvieron la espuma, la sal tosilato
de Sar-OBzl (2,71 g) y HOAt (0,98 g) en 50 ml de
cloruro de metileno. Se enfrió la solución en un baño de hielo y se
añadieron DCC (1,50 g) y DIPEA (1,8 ml). Se agitó la mezcla de
reacción en frío durante 1/2 hora y después a temperatura ambiente
durante 18 horas. Se filtró la mezcla para eliminar el DCU
precipitado, y se eliminó el cloruro de metileno por evaporación a
vacío. El aceite residual se disolvió en acetato de etilo y se lavó
copiosamente con ácido cítrico 0,1 M, agua, solución de bicarbonato
de sodio, agua y salmuera. La solución lavada se secó sobre sulfato
de magnesio, se filtró y se evaporó hasta una espuma vítrea (4,15
g). Se disolvió
Boc-Arg(Pbf)-Sar-OBzl
(3,80 g) en 20 ml de cloruro de metileno, se añadió a esta solución
una solución de HCl en MTBE (10 ml). Se agitó la mezcla durante al
menos una hora hasta que no se detectó ningún material de partida
por análisis por cromatografía en capa fina (TLC). Se evaporó la
solución a sequedad y se mantuvo durante la noche bajo alto vacío.
Se disolvieron la espuma, Boc-Ala-OH
(1,14 g) y HOAt (0,81 g) en 20 ml de cloruro de metileno. Se enfrió
la solución en un baño de hielo y se trató con DCC (1,24 g) y DIPEA
(1,5 ml). Se agitó la mezcla de reacción en frío durante media hora
y después a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Se separó el
DCU precipitado por filtración, se reemplazó el cloruro de metileno
con 50 ml de acetato de etilo y se lavó la solución con ácido
cítrico, agua, solución de bicarbonato, agua y salmuera. La solución
orgánica lavada se secó sobre sulfato de magnesio y se evaporó
hasta una espuma (3,66 g). Se trató la espuma con HCl, como se ha
descrito antes para el dipéptido, para dar
H-Ala-Arg(Pbf)-Sar-OBzl
como sal hidrocloruro.
Una solución de
FmocR(Pbf)Q(trt)(1-Nal)LA-OH
-(SEQ ID NO:33)-(1 equivalente),
H-Ala-Arg(Pbf)-Sar-OBzl
-(SEQ.ID NO:34)-(1 equivalente), HOAT (1,2 equivalentes) y DIPEA
(2,2 equivalentes) en DMF (12 vol) se enfrió a 0ºC y se añadió HBTU
(1,2 equivalentes). Se calentó la solución a temperatura ambiente y
se agitó durante 50 min. Se añadió a la solución agua (25 vol) para
precipitar el péptido. Se recogió el sólido por filtración. Se
disolvió el sólido todavía húmedo en etanol caliente (15 vol), y
después se agitó mientras se enfriaba a 30ºC. Se recogió el sólido
resultante por filtración y se secó para dar el producto con 75% de
rendimiento. Pureza por HPLC, 91% en área. Se disolvió el sólido en
THF/piperidina 9:1 (15 vol) y se agitó a temperatura ambiente
durante 50 minutos. Para precipitar el péptido, se añadió MTBE (15
vol). Se recogió el sólido por filtración, y después se trituró con
etanol templado (8 vol). Después de enfriar a temperatura ambiente
con agitación, se recogió el sólido y se secó. Rendimiento, 92%.
Pureza por HPLC, 93% en área.
Una solución de
FmoclE(tBu)GPT(tBu)L-OH-(SEQ
ID NO:35)- (1 equivalente),
H-R(Pbf)Q(trt)(1-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)-OBzl-(SEQ
ID NO:36)- (1 equivalente), HOAT (1,2 equivalentes) y DIPEA (2
equivalentes) en DMF (13,5 vol), se enfrió a 0ºC y se añadió HBTU.
Se calentó la solución a temperatura ambiente y se agitó durante 1
hora. Se añadió agua (20 vol) para precipitar el péptido. Se
recogió el sólido y se trituró con metanol (8 vol). Se recogió el
sólido, se secó y se disolvió en DCM/metanol 98/2 (5 vol). Se cargó
la solución en una columna que contiene 700 g de gel de sílice en
DCM/metanol 98/2. Se eluyó la columna con 1,6 L de DCM/metanol 98/2,
después con 1 L de DCM/metanol 97/3 y 8 L de DCM/metanol 95/5. Se
reunieron las fracciones que contienen el producto y se
concentraron hasta una espuma. Rendimiento 80,7%, pureza por HPLC,
85% en área.
Una solución de
FmocIE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)-OBzl-(SEQ
ID NO:37)- en DCM/
etanol 8:1 (15 vol) se cargó con Pd/C (0,4 peso, Degussa tipo E101, 10% peso seco, 50% de agua). Se purgó el envase de reacción con nitrógeno y se evacuó tres veces, se puso después en atmósfera de hidrógeno (balón) y se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. Se filtró la mezcla a través de un lecho de celita fuertemente compactado. Se concentró el filtrado hasta aproximadamente 2 volúmenes y se añadió MTBE (10 vol) para precipitar el péptido. Se recogió el sólido y se secó hasta un sólido gris. Rendimiento 96%. Pureza por HPLC, 85,5% en área.
etanol 8:1 (15 vol) se cargó con Pd/C (0,4 peso, Degussa tipo E101, 10% peso seco, 50% de agua). Se purgó el envase de reacción con nitrógeno y se evacuó tres veces, se puso después en atmósfera de hidrógeno (balón) y se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. Se filtró la mezcla a través de un lecho de celita fuertemente compactado. Se concentró el filtrado hasta aproximadamente 2 volúmenes y se añadió MTBE (10 vol) para precipitar el péptido. Se recogió el sólido y se secó hasta un sólido gris. Rendimiento 96%. Pureza por HPLC, 85,5% en área.
Una mezcla de
FmocIE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)-OH-(SEQ
ID NO:37)-(2,4 equivalentes), (HCl)_{2}LysNH_{2} (1
equivalente), HOBT (2,5 equivalentes) y EtPr_{2}N (4,8
equivalentes) en DMF (15 vol), se agitó a temperatura ambiente
hasta que se disolvieron todos los sólidos (5 minutos). Se añadió a
la solución HBTU (2,5 equivalentes). Después de agitar durante 2
horas a temperatura ambiente, se añadió agua (30 vol) para
precipitar el péptido. Se recogió el péptido crudo por filtración.
Se disolvió el sólido todavía húmedo en etanol caliente (12,5 vol),
se enfrió después a temperatura ambiente mientras se agitaba durante
la noche. Se recogió el sólido y se secó para dar el producto,
rendimiento cuantitativo con una pureza por HPLC, de 80% en
área.
Una solución de
[FmocIE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)]_{2}LysNH_{2}
-((SEQ ID NO:38)- en NMP/piperidina 9:1 (10 vol) se agitó a
temperatura ambiente durante 1-2 horas. Se añadió
agua (12 vol) para precipitar el péptido. Se recogió el sólido, se
lavó con agua (5 vol) y se secó. Se trituró el sólido seco con MTBE
(12 vol) seguido por AcCN (8 vol) para eliminar la piperidina, el
fulveno y el aducto de piperidina y fulveno, residuales. Se recogió
el sólido por filtración a vacío y se secó. Rendimiento 97%. Una
solución de TFA/agua 95/5 (13 vol) se purgó con nitrógeno, y
después se enfrió a 0ºC. Se añadió a esto
[H-IE(tBu)GPT(tBu)LR(Pbf)Q(trt)(1-Nal)LAAR(Pbf)(Sar)]_{2}LysNH_{2}
-(SEQ ID NO:38)-(1 peso) obtenida como anteriormente. Se agitó la
suspensión a 0ºC hasta que se disolvió todo el sólido (30 min),
después se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 100
minutos. Se redujo el volumen del disolvente en un 50% utilizando
un evaporador rotatorio y después se añadió hielo/agua (150 vol).
Se agitó la suspensión a 0ºC durante 1,5 horas para que se disuelva
el péptido, y después se filtró a través de vidrio sinterizado. Se
lavó el material de vidrio con agua (50 mL) que se filtró después y
se añadió a la solución del producto. Se congeló la solución acuosa
y se liofilizó hasta un sólido que se conservó a 0ºC antes de la
purificación. Se cargó el producto sobre una columna de gel de
sílice C18 modificada (tamaño de poro 100 Aº, partículas esféricas
de 10 \mu) y se eluyó con un gradiente de aproximadamente 30%
hasta aproximadamente 35% de acetonitrilo en agua, conteniendo
ambos disolventes 0,1% de TFA. Se reunieron las fracciones que
contienen el péptido deseado, desde al menos 90% de AUC, se
concentraron y se liofilizaron. Los rendimientos del péptido
purificado, procedentes del precursor completamente protegido, están
generalmente en el orden de 10% a 25%.
Confirmación estructural de fragmentos
peptídicos en el Ejemplo 1A que llevan al péptido ensamblado
AF15705. Confirmación del peso molecular por espectrometría de
masas (MS), composición por análisis de aminoácidos (AAA), e
información de la secuencia peptídica por Degradación de Edman -(SEQ
ID NOS 34, 33,35,36,37,37 & 38, respecti-
vamente)-.
vamente)-.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió AF13948 en bicina 100 mM pH 8,0 a
una concentración de 10 mg/ml; se añadió un exceso 1,25 veces molar
de PEG2 pulverizado (comercialmente disponible de Shearwater
Polymers, Inc. (Huntsville, AL)) y se agitó a temperatura ambiente
hasta que la reacción fue completa, típicamente 1-2
horas. Se monitorizó la reacción por HPLC de fase inversa
utilizando un gradiente de 40-65% de acetonitrilo
con una columna YMC ODS AQ. Cuando se completó la reacción, se
añadió la solución a un segundo exceso 1,25 veces molar de PEG2
pulverizado y se repitió el procedimiento 4 veces utilizando un
total de 5 moles de PEG2 para cada mol de AF13948. Se diluyó la
solución 2 veces con PBS para reducir la viscosidad y se cargó sobre
una columna superdex 200 (Pharmacia), previamente equilibrada y se
eluyó con PBS. Se analizaron las fracciones procedentes de la
columna de exclusión molecular por HPLC de fase inversa. Se
reunieron las fracciones que contienen
di-PEG-AF13948 que se eluyó antes
de cualquier mono-PEG-AF13948 y se
conservaron a 5ºC o se liofilizaron.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió AF13948 en bicina 100 mM a pH 8,0 a
una concentración de 10 mg/ml, se añadió a un exceso 5 veces molar
de SPA-mPEG pulverizado (comercialmente disponible
de Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL)) y se agitó a
temperatura ambiente hasta que la reacción fue completa, típicamente
2 horas. Se monitorizó la reacción por HPLC de fase inversa (YMC
ODS AQ) y cuando se completó, se diluyó la solución 10 veces con
agua desionizada y se cargó sobre una columna de
SP-sefarosa equilibrada con tampón de fosfato de
sodio 2 mM a pH 7,0. El PEG y el NHS sin reaccionar fluyeron a
través de la columna. Se eluyó entonces el AF13948 PEGilado
utilizando un gradiente de NaCl de 0 a 150 mM, eluyendo la forma
di-PEGilada antes que cualquier material
mono-PEGilado. Se analizaron las fracciones por HPLC
de fase inversa y se reunieron las fracciones apropiadas. El
di-PEG-AF13948 fue intercambiado del
tampón al PBS y se conservó a 5ºC o se liofilizó.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió AF13948 en fosfato de sodio 100 mM a
pH 7,0 a una concentración de 10 mg/ml, se añadió a un exceso 6
veces molar de aldehído de PEG pulverizado (comercialmente
disponible de Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL)) y se
añadió solución 1 M de cianoborohidruro de sodio para dar una
concentración final de cianoborohidruro de sodio 100 mM. Se agitó
la solución durante 18 horas a temperatura ambiente, después se
intercambió de tampón a PBS, utilizando una membrana de
ultrafiltración de 3 K (Amicon YM). Se diluyó la solución 2 veces
con PBS para reducir la viscosidad y se cargó sobre una columna
superdex 200 (Pharmacia), previamente equilibrada y se eluyó con
PBS. Se analizaron las fracciones de la columna de exclusión
molecular por HPLC de fase inversa. Se reunieron las fracciones que
contienen di-PEG-AF13948 que se
eluyó antes que cualquier
mono-PEG-AF13948 y se conservaron a
5ºC o se liofilizaron.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se colocó AF15705 (2,30 g peso) en un matraz
equipado con agitación y una purga de N_{2} y se mantuvo a
temperatura ambiente. Se añadió agua de MilliQ (177 mL) y se agitó
el material hasta que se disolvió. Se retiró una porción de 20
\muL, se diluyó hasta 1 mL con agua y se determinó la
concentración a partir de una lectura en UV @284 nm (9,36 mg/ml).
Se añadió bicarbonato de sodio (0,2921 g) y se agitó la solución
hasta que se disolvió todo (el pH medido es 8). En una bolsa de
plástico sellada bajo N_{2}, se pesaron cuatro porciones de
M-SPA-PEG-20k
(Shearwater Polymers, Inc.) en frascos sellados (siendo cada porción
de 8,67 g). Se colocaron estos en una bolsa de plástico sellada y
se mantuvieron a 5ºC hasta que se añadieron a la reacción. Se añadió
una porción inmediatamente después que se disolvió el bicarbonato
de sodio, y la segunda 0,5 horas más tarde. La tercera porción se
añadió 1 hora después de la segunda adición, y la cuarta 1 hora
después de haber añadido la tercera porción. Se dejó la reacción en
agitación a temperatura ambiente durante una noche. Se diluyó la
mezcla de reacción nueve veces con EtOH acuoso al 5% y se filtró a
través de un filtro de nitrato de celulosa de 0,45 micras. Se
bombeó este material a una columna de intercambio catiónico fuerte
(SP Sepharose Fast Flow, 10 cm x 53 cm) a 20 mL/min. Se eluyó el
material de la columna utilizando un gradiente que consiste en 90
minutos de fosfato de sodio 2 mM a pH 6,0, seguido por una rampa de
60 minutos desde fosfato de sodio 2 mM hasta fosfato de sodio 10 mM
a pH 6,0, y finalmente, una rampa de 90 minutos desde fosfato de
sodio 10 mM hasta PBS al 100% a pH 7,0. El caudal de esta
cromatografía fue de 100 mL/min, y el detector se fijó a 215 nm. Se
analizaron las fracciones de la columna por SEC-HPLC
utilizando una columna G3000SWxl y una columna G4000SWxl TSK en
serie. Se reunieron aquellas fracciones que contienen >95% de
producto y se concentraron hasta 33 mg/mL utilizando un cartucho de
fibra hueca
UFP-30-C-6A de A/G
Technologies. Se enfrió el retenido con un baño circulante a 5ºC y
se purgó con N_{2}. La solución del producto fue intercambiada de
tampón a agua MilliQ intercambiando seis volúmenes del retenido y
después se concentró además hasta 66 mg/mL. Se recogieron veintiún
gramos de producto después de síntesis, purificación y
ultrafiltración. El análisis por espectrometría de masas
MALDI-TOF (desorción de láser asistida por matriz en
tiempo de vuelo) determinó que el producto tenía una amplia
distribución de peso molecular centrada en 46000 dalton. Las
digestiones trípticas del producto seguidas por HPLC de fase
inversa o HPLC de modo mixto, confirmaron los sitios de unión del
PEG (ambos N-terminales) y que el péptido
subyacente no había sido degradado.
(Nota: La
MALDI-TOF-MS muestra que el PEG de
partida es de 21,5 kd en lugar de los 20 kd anunciados, por tanto
Mw = 21500(PEG)x2 + 3295(AF15705) =
46000).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La bioactividad de los péptidos se puede medir
usando el ensayo de proliferación celular dependiente de la
trombopoyetina. Se transfectaron células murinas Ba/F3 dependientes
de IL-3 con TPO-R humano de longitud
total. En ausencia de IL-3 (medio acondicionado con
WEHI-3), estas células dependen de la TPO para la
proliferación. La línea celular parental no transfectada, no
responde a la TPO humana, pero permanece dependiente de
IL-3.
Los bioensayos se han llevado a cabo en las dos
líneas celulares mencionadas utilizando los compuestos según la
invención. Se cultivaron las células en medio
RPMI-10 completo, que contenía medio acondicionado
con WEHI-3 al 10%, luego se lavaron dos veces con
PBS, se resuspendieron en medio que carecía de medio acondicionado
con WEHI-3, y se añadieron a pocillos que contenían
diluciones de péptido o de TPO a 2 x 10^{4} células/pocillo. Las
células se incubaron durante 48 horas a 37ºC en una atmósfera
humidificada de CO_{2} al 5% y se ensayó la actividad metabólica
por la reducción de MTT a formazán, con absorbancia a 570 nM medida
en un lector de placas ELISA. Los péptidos ensayados estimularon la
proliferación de células Ba/F3 transfectadas con
TPO-R en un modo dependiente de la dosis como se
muestra en la Tabla 1. Estos péptidos no tienen ningún efecto sobre
la línea celular parental.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Las afinidades de unión de los compuestos según
la invención para TPO-R se midieron en un ensayo de
unión por competición. Los pocillos de una placa de microvaloración
se recubrieron con un 1 mg de estreptavidina, se bloquearon con BSA
al 1% en PBS, seguido de 50 ng de anticuerpo inmovilizante de
anti-receptor biotinilado (Ab179). Los pocillos se
trataron luego con una cosecha de TPO-R soluble a
una dilución 1:10. Las distintas concentraciones del compuesto de
ensayo se mezclaron con una cantidad constante de una forma truncada
de TPO que consistía en los residuos 1-156
condensados al terminal C de la proteína de unión a la maltosa
(MBP-TPO_{156}). Las mezclas de péptido
MBP-TPO_{156} se añadieron a los pocillos
recubiertos con TPO-R, se incubaron durante 2 horas
a 4ºC y luego se lavaron con PBS. La cantidad de
MBP-TPO_{156} que se unió en equilibrio se midió
añadiendo un antisuero de conejo dirigido frente a MBP, seguido por
IgG anticonejo de cabra conjugada con fosfatasa alcalina. La
cantidad de fosfatasa alcalina en cada pocillo se determinó después
utilizando métodos convencionales.
El ensayo se realizó en un intervalo de
concentraciones del compuesto de ensayo y los resultados se
representan gráficamente de tal modo que el eje de las y representa
la cantidad de MBP-TPO_{156} unido y el eje de las
x representa la concentración del compuesto de ensayo. Se puede
determinar entonces la concentración en la que el compuesto de
ensayo reducirá en un 50% (CI_{50}) la cantidad de
MBP-TPO_{156} unida al TPO-R
inmovilizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
En este ejemplo, se analizaron diferentes
sustituciones, deleciones y adiciones al compuesto de referencia
AF13948
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
utilizando tres ensayos. En primer
lugar, se realizó un ensayo de proliferación de las células MTT como
se ha descrito antes. En segundo lugar, se realizó un ensayo
microfisiómetro (Molecular Devices Corp.). Básicamente, en este
ensayo se determinó el índice de acidificación del medio
extracelular en respuesta a la estimulación del receptor de TPO por
los compuestos de la invención. Los intervalos para CE_{50} se
indican simbólicamente como para los valores CI_{50}
anteriormente descritos. Finalmente, se realizó un ensayo
informador. Las células BaF3/TPOR transfectadas con un plásmido
informador de c-fos/luciferasa fueron sometidas a
inanición durante la noche en medio RPMI-10
completo que contiene medio acondicionado con 0,1% de
WEHI-3, y después se lavaron dos veces con PBS. Se
resuspendieron las células en medio que carecía de medio
acondicionado con WEHI-3, y se añadieron a los
pocillos que contienen diluciones seriadas de péptido a 5 x 10^{5}
células/pocillo. Se incubaron las células durante dos horas a 37º
en una atmósfera humidificada con 5% de CO_{2}, y se midió la
expresión de la luciferasa con 2 luminómetros después de la adición
del sustrato de
luciferina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
En este ejemplo, se determinó el comportamiento
farmacocinético de diferentes péptidos PEGilados. El comportamiento
farmacocinético de los compuestos es un importante determinante de
su actividad farmacológica. Un componente clave del perfil
farmacocinético es la persistencia del compuesto en el plasma de
animales de laboratorio. Esta persistencia se expresa usualmente en
términos de la concentración del compuesto en el plasma como una
función del tiempo después de la administración.
Para estos experimentos, se utilizaron ratones
Balb/c, machos, de 20-25 g. Se inyectó un volumen de
200 ml IV o SC. El vehículo fue PBS de Dulbecco; DMSO al 5%; BSA al
0,1% p/v. Se recogió el plasma después del sacrificio utilizando
heparina como anticoagulante.
Las concentraciones del compuesto se midieron
utilizando un ensayo celular informador. Se añadieron diluciones de
plasma a la construcción 3 Baf/3 TPOr/fos/lux. Se midió la expresión
de la luciferasa con un luminómetro después de la adición del
sustrato de luciferina. La actividad estimuladora de las muestras de
plasma individual se convirtió en una concentración expresada como
equivalentes peptídicos de compuesto por volumen de plasma (nM o
ng/ml). Esta concentración se estableció por comparación con una
curva estándar construida en el ensayo informador con el compuesto
parental.
La Tabla 3 muestra las concentraciones
plasmáticas de los compuestos AF13948 y AF13948
di-pegilados (polietilenglicol (PEG) MW medio
=5000D) como una función de tiempo después de la inyección de 700
\mug equivalentes de péptido/kg. La administración de AF13948 da
como resultado una actividad detectable en plasma por encima del
nivel presente en los ratones inyectados con vehículo hasta 60 min
PI. La adición del PEG 5K aumenta la concentración plasmática más
de 100 veces y extiende el tiempo durante el cual puede ser
detectado en el plasma hasta al menos 240 min PI.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 4 muestra las concentraciones
plasmáticas de los compuestos
di-PEG(5K)-AF13948 y
di-PEG(20K)-AF13948 como una
función de tiempo después de la inyección de 500 \mug equivalentes
de péptido/kg. La concentración y persistencia en el plasma del
compuesto modificado con PEG 20K ha aumentado muy por encima de la
de di-PEG(5K)-AF13948.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 5 muestra las concentraciones
plasmáticas del compuesto
di-PEG(20K)-AF13948 después
de inyección de 100, 10 y 1 \mug equivalentes de péptido/kg y
extiende el tiempo de observación hasta 120 horas PI. Se encontró
que las concentraciones observadas en el plasma eran proporcionales
a la dosis administrada. La administración de una única dosis IV de
100 \mug/kg del compuesto dio como resultado concentraciones
plasmáticas elevadas durante al menos 96 horas PI.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 6 muestra las concentraciones
plasmáticas después de la inyección SC e IV de 10 \mug
equivalentes de péptido/kg de
di-PEG(20K)-AF13948. La
inyección SC de una dosis única de 10 \mug equivalentes de péptido
/kg dio como resultado el aumento de las actividades en plasma
durante 96 horas PI. Los perfiles de las concentraciones
plasmáticas alcanzados con estas 2 vías de administración indican la
buena biodisponibilidad de
di-PEG(20K)-AF13946
administrado SC.
En adición, la Figura 1 indica que GW350781, o
di-PEG(5K)-AF13948, han
aumentado la estabilidad, esto es, han aumentado la semivida, sobre
la forma no PEGilada del péptido. De este modo, la Figura 1 indica
que los péptidos PEGilados tienen buena biodisponibilidad y un
aumento de la estabilidad en el suero humano.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Utilizando el ensayo descrito antes, se
determinó el perfil farmacocinético de un péptido derivatizado de
diferentes modos con PEG. En este experimento, el péptido fue
derivatizado con PEG2(20K) ramificado, con un PEG (SPA)
unido a éster y con un PEG (ALDH) unido a aldehído, como se ilustra
en los esquemas 1-3. La Figura 2 muestra las
concentraciones plasmáticas después de inyección SC de 10 \mug
equivalentes de péptido/kg. A partir de la Figura 2, queda claro
que los tres compuestos peptídicos diversamente derivatizados con
PEG tienen perfiles farmacocinéticos favorables.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
En este experimento, se evaluaron los péptidos
PEGilados en cuanto a su efecto sobre la trombocitopenia en un
modelo de ratón. En este ensayo, los ratones se hicieron
trombocitopénicos tratando los ratones Balb/C con carboplatino (90
mg/kg intraperitonealmente) el Día 0. Se administraron GW350781 (1
mg/kg/día), o
di-PEG(5K)-AF13948, y
GW350805 (32,5 \mug/kg/día), o
di-PEG(20K)-AF13948, los días
1-9 (s.c., todos los días). A partir de las Figuras
3-4, queda claro que los péptidos PEGilados mejoran
la trombocitopenia inducida por carboplatino aproximadamente el Día
10. Estos resultados indican claramente que los péptidos PEGilados
de la invención pueden mejorar la trombocitopenia en un modelo de
ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
En este experimento, se evaluaron los péptidos
PEGilados en cuanto a su efecto sobre los niveles de plaquetas en
ratones normales. En un experimento, se administraron GW350781 (1
mg/kg/día) y GW350805 (32,5 \mug/kg/día) los Días
1-9 (s.c., todos los días). Los Días
1-15, se tomaron muestras de sangre a intervalos
mediante sangrados de la vena caudal. De las Figuras
5-6, queda claro que los péptidos PEGilados tienen
un efecto sobre la trombocitosis, siendo el péptido GW50805
20K-diPEGilado aproximadamente 100 veces más potente
que el péptido GW350781 5K-PEGilado.
En otro experimento, se administraron GW350781 y
GW305805 los Días 1-5 (s.c., todos los días). El Día
6, se sacrificaron los animales y se hicieron recuentos de
plaquetas en la sangre periférica. Las Figuras 7-9
indican los efectos de dosis variables de los péptidos PEGilados
así como los efectos de la dosis única frente a dosis múltiples.
Dichos resultados indican claramente que los péptidos PEGilados de
la invención se pueden utilizar para aumentar las plaquetas en un
modelo de ratón.
Las descripciones en esta solicitud de todos los
artículos y referencias, incluyendo documentos de patentes, se
incorporan aquí como referencia en su totalidad a todos los
efectos.
Claims (16)
1. Los compuestos de la fórmula (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
X_{1} es hidrógeno o acilo;
X_{2} es G o sarcosina (Sar);
X_{3} es R. A, norleucina (Nle) o
N-acetillisina (Ac-Lys);
X_{4} es Q o E;
X_{5} es W,
L-1-naftilalanina
(1-Nal) o F;
X_{6} es A, ácido
5-aminopentanoico (Ava) o ácido
2-aminobutírico (Abu);
X_{7} es A, difenilalanina (Diphe) o X_{7}
está ausente;
X_{8} es R,
p-aminofenilalanina
(p-amino-Phe),
N-acetillisina (Ac-Lys) o X_{8}
está ausente;
X_{9} y X_{9'} son iguales o diferentes y
son A, \betaA, n-metilalanina
(n-Me-Ala), sarcosina (Sar), o
X_{9} o X_{9'} está ausente;
X_{10} y X_{10'} son iguales o diferentes y
son \betaA, o X_{10} o X_{10'} está ausente;
y los derivados farmacéuticamente aceptables de
los mismos;
\vskip1.000000\baselineskip
con la condición de que el compuesto
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
está
excluido.
\newpage
2. Un compuesto según la reivindicación 1,
seleccionado entre:
\vskip1.000000\baselineskip
y los derivados farmacéuticamente
aceptables del
mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un compuesto según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que dicho compuesto está unido
covalentemente a un polímero hidrófilo.
4. Un compuesto según la reivindicación 3, en el
que dicho polímero hidrófilo tiene un peso molecular medio entre
aproximadamente 500 y aproximadamente 40.000 dalton.
5. Un compuesto según la reivindicación 4, en el
que dicho polímero hidrófilo tiene un peso molecular medio entre
aproximadamente 5.000 y aproximadamente 20.000 dalton.
6. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en el que dicho polímero se selecciona del
grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, ácido
poliláctico, ácido poliglicólico y sus copolímeros.
7. Un compuesto según la reivindicación 6, en el
que dicho polímero es polietilenglicol.
8. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 7, en el que cada una de las subunidades
diméricas de dicho compuesto está unida covalentemente a un
polímero hidrófilo.
\newpage
9. Un compuesto seleccionado entre
y los derivados farmacéuticamente
aceptables del
mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
10. El compuesto
unido covalentemente a un polímero
hidrófilo.
\vskip1.000000\baselineskip
11. El compuesto
en el que n es aproximadamente
450.
\newpage
12. Un compuesto seleccionado de:
\vskip1.000000\baselineskip
y los derivados farmacéuticamente
aceptables del
mismo.
13. Una composición farmacéutica que comprende
un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en
combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, para uso en terapia.
15. El uso de un compuesto según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12, en la preparación de un medicamento
para tratar a un paciente que padece trombocitopenia.
16. El uso de un compuesto según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12, en la preparación de un medicamento
para uso en el tratamiento de la trombocitopenia.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US764640 | 1996-12-11 | ||
| US08/764,640 US5869451A (en) | 1995-06-07 | 1996-12-11 | Peptides and compounds that bind to a receptor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2321038T3 true ES2321038T3 (es) | 2009-06-01 |
Family
ID=25071323
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97954363T Expired - Lifetime ES2321038T3 (es) | 1996-12-11 | 1997-12-09 | Peptidos y compuestos que se unen a un receptor. |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5869451A (es) |
| EP (3) | EP0948539B1 (es) |
| JP (1) | JP4128225B2 (es) |
| KR (3) | KR100668546B1 (es) |
| CN (1) | CN100379760C (es) |
| AR (2) | AR010752A1 (es) |
| AT (1) | ATE420893T1 (es) |
| AU (1) | AU725731B2 (es) |
| BR (1) | BRPI9713914B1 (es) |
| CA (1) | CA2274149C (es) |
| CO (1) | CO5080768A1 (es) |
| DE (1) | DE69739219D1 (es) |
| ES (1) | ES2321038T3 (es) |
| HR (1) | HRP970683B1 (es) |
| MA (1) | MA26454A1 (es) |
| PA (1) | PA8442601A1 (es) |
| PE (1) | PE27599A1 (es) |
| SV (1) | SV1997000104A (es) |
| TN (1) | TNSN97201A1 (es) |
| TR (2) | TR200401638T2 (es) |
| TW (1) | TW515804B (es) |
| UY (1) | UY24805A1 (es) |
| WO (1) | WO1998025965A2 (es) |
| ZA (1) | ZA9711045B (es) |
Families Citing this family (118)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6251864B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-06-26 | Glaxo Group Limited | Peptides and compounds that bind to a receptor |
| EP2055712A1 (en) * | 1995-06-07 | 2009-05-06 | Glaxo Group Limited | Peptides and compounds that bind to a thrombopoietin receptor |
| US5869451A (en) * | 1995-06-07 | 1999-02-09 | Glaxo Group Limited | Peptides and compounds that bind to a receptor |
| US7091311B2 (en) | 1996-06-07 | 2006-08-15 | Smithkline Beecham Corporation | Peptides and compounds that bind to a receptor |
| US7083983B2 (en) * | 1996-07-05 | 2006-08-01 | Cancer Research Campaign Technology Limited | Inhibitors of the interaction between P53 and MDM2 |
| EP1032387B1 (en) | 1997-10-31 | 2007-03-07 | Smithkline Beecham Corporation | Novel metal complexes |
| ES2301215T3 (es) | 1997-10-31 | 2008-06-16 | Smithkline Beecham Corporation | Complejos de metal con efectos antibacterianos y fungicidas. |
| JP2001521897A (ja) * | 1997-10-31 | 2001-11-13 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | 新規な金属錯体 |
| US7488590B2 (en) * | 1998-10-23 | 2009-02-10 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
| EP1124961B9 (en) * | 1998-10-23 | 2010-07-21 | Kirin-Amgen Inc. | Thrombopoietic compounds |
| US6660843B1 (en) | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
| AU3885901A (en) * | 1999-09-21 | 2001-04-24 | Emory University | Methods and compositions for treating platelet-related disorders |
| US20030190644A1 (en) | 1999-10-13 | 2003-10-09 | Andreas Braun | Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers |
| US6808902B1 (en) | 1999-11-12 | 2004-10-26 | Amgen Inc. | Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules |
| ATE364689T1 (de) | 1999-11-18 | 2007-07-15 | Dendreon Corp | Nukleinsäuren, welche für endotheliasen kodieren, endotheliasen, sowie deren verwendung |
| TWI284639B (en) * | 2000-01-24 | 2007-08-01 | Shionogi & Co | A compound having thrombopoietin receptor agonistic effect |
| US7700341B2 (en) * | 2000-02-03 | 2010-04-20 | Dendreon Corporation | Nucleic acid molecules encoding transmembrane serine proteases, the encoded proteins and methods based thereon |
| WO2001083525A2 (en) * | 2000-05-03 | 2001-11-08 | Amgen Inc. | Modified peptides, comprising an fc domain, as therapeutic agents |
| US20050158838A1 (en) * | 2000-06-19 | 2005-07-21 | Dyax Corp., A Delaware Corporation | Novel enterokinase cleavage sequences |
| DK1642910T3 (da) * | 2000-12-05 | 2012-05-07 | Alexion Pharma Inc | Rationelt designede atistoffer |
| US7396917B2 (en) * | 2000-12-05 | 2008-07-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Rationally designed antibodies |
| US20040253242A1 (en) * | 2000-12-05 | 2004-12-16 | Bowdish Katherine S. | Rationally designed antibodies |
| WO2002072786A2 (en) | 2001-03-13 | 2002-09-19 | Corvas International, Inc. | Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 7, the encoded polypeptides and methods based thereon |
| KR20040011480A (ko) | 2001-03-22 | 2004-02-05 | 덴드레온 샌 디에고 엘엘씨 | 세린 프로테아제 ｃｖｓｐ14를 암호화하는 핵산 분자,암호화된 폴리펩티드 및 이에 근거한 방법 |
| EP1379637A4 (en) | 2001-03-27 | 2005-04-06 | Dendreon Corp | TRANSMEMBRANE SERINE PROTEASE 9 CODING NUCLEIC ACID MOLECULES, THE POLYPEPTIDE CODED, AND METHODS FORMING THEREOF |
| EP1539942A4 (en) | 2001-05-14 | 2005-10-19 | Dendreon Corp | A TRANSMEMBRANE SERINE PROTEASE 10 CODING NUCLEIC ACID MOLECULES, THE POLYPEPTIDE CODED AND METHOD THEREOF |
| US7332474B2 (en) * | 2001-10-11 | 2008-02-19 | Amgen Inc. | Peptides and related compounds having thrombopoietic activity |
| AU2002357004A1 (en) * | 2001-11-20 | 2003-06-10 | Dendreon San Diego Llc | Nucleic acid molecules encoding serine protease 17, the encoded polypeptides and methods based thereon |
| US20030191056A1 (en) | 2002-04-04 | 2003-10-09 | Kenneth Walker | Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins |
| ATE312605T1 (de) * | 2002-06-29 | 2005-12-15 | Aquanova Ger Solubilisate Tech | Isoflavonkonzentrate sowie verfahren zu ihrer herstellung |
| US20040028661A1 (en) * | 2002-08-07 | 2004-02-12 | Bartelmez Stephen H. | Expansion of cells using thrombopoietin and anti-transforming growth factor-beta |
| EP1552828A4 (en) | 2002-08-14 | 2007-01-24 | Nissan Chemical Ind Ltd | THROMBOPOIETIN RECEPTOR ACTIVATOR AND METHOD OF PRODUCTION |
| US7598224B2 (en) * | 2002-08-20 | 2009-10-06 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Dual chain synthetic heparin-binding growth factor analogs |
| US7166574B2 (en) | 2002-08-20 | 2007-01-23 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Synthetic heparin-binding growth factor analogs |
| US8227411B2 (en) * | 2002-08-20 | 2012-07-24 | BioSurface Engineering Technologies, Incle | FGF growth factor analogs |
| US7482427B2 (en) * | 2002-08-20 | 2009-01-27 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Positive modulator of bone morphogenic protein-2 |
| MXPA05003057A (es) * | 2002-09-18 | 2006-04-18 | Johnson & Johnson | Metodos para aumentar la produccion de celulas madre hematopoyeticas y plaquetas. |
| TWI324593B (en) | 2002-10-09 | 2010-05-11 | Nissan Chemical Ind Ltd | Pyrazolone compounds and thrombopoietin receptor activator |
| JP2006522022A (ja) | 2003-02-14 | 2006-09-28 | ザ キュレイターズ オブ ザ ユニバーシティー オブ ミズーリ | プロテアソーム干渉に関連する避妊法および組成物 |
| PT1629007E (pt) * | 2003-05-12 | 2009-05-06 | Affymax Inc | Péptidos novos que se ligam ao receptor da eritropoietina |
| WO2004101611A2 (en) * | 2003-05-12 | 2004-11-25 | Affymax, Inc. | Peptides that bind to the erythropoietin receptor |
| CA2525399A1 (en) * | 2003-05-12 | 2004-11-25 | Affymax, Inc. | Novel spacer moiety for poly(ethylene glycol)-modified peptide-based co mpounds |
| EP1626983B8 (en) * | 2003-05-12 | 2010-12-22 | Affymax, Inc. | Novel poly (ethylene glycol) modified erythropoietin agonists and uses thereof |
| CN1863783A (zh) * | 2003-08-12 | 2006-11-15 | 盐野义制药株式会社 | 具有血小板生成素受体激动作用的化合物 |
| HUE032370T2 (en) * | 2003-08-28 | 2017-09-28 | Janssen Pharmaceuticals Inc | Peptides and compounds that bind to thrombopoietin receptors |
| US7723295B2 (en) * | 2003-08-28 | 2010-05-25 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Peptides and compounds that bind to a receptor |
| WO2005063791A2 (en) | 2003-12-31 | 2005-07-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for peptide synthesis using a reduced amount of deprotection agent |
| US7414028B1 (en) * | 2004-02-04 | 2008-08-19 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Growth factor analogs |
| US7528105B1 (en) | 2004-02-10 | 2009-05-05 | Biosurface Engineering Technologies | Heterodimeric chain synthetic heparin-binding growth factor analogs |
| US20060024347A1 (en) * | 2004-02-10 | 2006-02-02 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Bioactive peptide coatings |
| US20080227696A1 (en) * | 2005-02-22 | 2008-09-18 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Single branch heparin-binding growth factor analogs |
| US7671012B2 (en) | 2004-02-10 | 2010-03-02 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Formulations and methods for delivery of growth factor analogs |
| CA2572765C (en) * | 2004-07-08 | 2013-05-21 | Amgen Inc. | Compound having improved bioefficiency when administered in a multidose regimen |
| US20060210542A1 (en) * | 2004-08-16 | 2006-09-21 | Yurkow Edward J | Use of TPO mimetic compounds and pharmaceutical compositions in the treatment of anemia |
| EA011879B1 (ru) * | 2004-09-24 | 2009-06-30 | Эмджин Инк. | МОЛЕКУЛЫ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ Fc ФРАГМЕНТОМ |
| US7589063B2 (en) | 2004-12-14 | 2009-09-15 | Aplagen Gmbh | Molecules which promote hematopoiesis |
| WO2006062685A2 (en) * | 2004-11-11 | 2006-06-15 | Affymax, Inc. | Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor |
| CA2587382A1 (en) * | 2004-11-11 | 2006-06-08 | Affymax, Inc. | Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor |
| NZ555466A (en) | 2004-12-08 | 2010-08-27 | Nissan Chemical Ind Ltd | 3-ethylidenehydrazino substituted heterocyclic compounds as thrombopoietin receptor activators |
| WO2006064957A1 (ja) | 2004-12-14 | 2006-06-22 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | アミド化合物及びトロンボポエチンレセプター活性化剤 |
| JP5517450B2 (ja) | 2005-03-10 | 2014-06-11 | バイオンテック アーゲー | 二量体または多量体のマイクロタンパク質 |
| WO2006094530A1 (en) * | 2005-03-11 | 2006-09-14 | Siegfried Ltd. | Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation |
| US8324159B2 (en) * | 2005-06-03 | 2012-12-04 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
| US7919461B2 (en) | 2005-06-03 | 2011-04-05 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
| US7550433B2 (en) | 2005-06-03 | 2009-06-23 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
| EP1907417A2 (en) * | 2005-06-23 | 2008-04-09 | AplaGen GmbH | Supravalent compounds |
| TWI368617B (en) | 2005-07-15 | 2012-07-21 | Nissan Chemical Ind Ltd | Thiophene compounds and thrombopoietin receptor activators |
| TWI330184B (en) | 2005-07-20 | 2010-09-11 | Nissan Chemical Ind Ltd | Pyrazole compounds and thrombopoietin receptor activators |
| US8008453B2 (en) | 2005-08-12 | 2011-08-30 | Amgen Inc. | Modified Fc molecules |
| US8026368B2 (en) | 2005-11-07 | 2011-09-27 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Hydrazide compounds and thrombopoietin receptor activators |
| US7879318B2 (en) | 2006-01-23 | 2011-02-01 | Mcw Research Foundation, Inc. | Method of reducing the effects of ischemia by administration of a thrombopoietin receptor ligand |
| WO2007102946A2 (en) | 2006-01-23 | 2007-09-13 | Amgen Inc. | Crystalline polypeptides |
| AU2007208226A1 (en) * | 2006-01-25 | 2007-08-02 | Amgen Inc. | Thrombopoietic compounds |
| EP1834963A1 (en) * | 2006-03-13 | 2007-09-19 | Siegfried Ltd. | Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation |
| JP2009529917A (ja) * | 2006-03-22 | 2009-08-27 | ヴァイラル ロジック システムズ テクノロジー コーポレーション | 標的ポリペプチドの同定方法および免疫学的疾患の治療のためのその使用 |
| JO3324B1 (ar) | 2006-04-21 | 2019-03-13 | Amgen Inc | مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية |
| US8377448B2 (en) * | 2006-05-15 | 2013-02-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University | CD47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders |
| EP2027151A2 (en) * | 2006-05-15 | 2009-02-25 | Viral Logic Systems Technology Corp. | Cd47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders |
| US7820172B1 (en) | 2006-06-01 | 2010-10-26 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Laminin-derived multi-domain peptides |
| JP5157900B2 (ja) | 2006-06-07 | 2013-03-06 | 日産化学工業株式会社 | 含窒素ヘテロ環化合物及びトロンボポエチンレセプター活性化剤 |
| US7981425B2 (en) | 2006-06-19 | 2011-07-19 | Amgen Inc. | Thrombopoietic compounds |
| CA2692240C (en) | 2006-06-22 | 2018-03-13 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Composition and method for delivery of bmp-2 amplifier/co-activator for enhancement of osteogenesis |
| WO2008051383A2 (en) * | 2006-10-19 | 2008-05-02 | Amgen Inc. | Use of alcohol co-solvents to improve pegylation reaction yields |
| CA2676820A1 (en) * | 2007-01-31 | 2008-08-07 | Affymax, Inc. | Nitrogen-based linkers for attaching modifying groups to polypeptides and other macromolecules |
| JP5591691B2 (ja) | 2007-05-22 | 2014-09-17 | アムジエン・インコーポレーテツド | 生物活性を有する融合タンパク質を作製するための組成物及び方法 |
| US20090054332A1 (en) * | 2007-06-21 | 2009-02-26 | Conjuchem Biotechnologies, Inc. | Thombopoietin peptide conjugates |
| US20090088371A1 (en) * | 2007-08-28 | 2009-04-02 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Combination therapy with syk kinase inhibitor |
| US8183342B2 (en) * | 2007-11-06 | 2012-05-22 | Case Western Reserve University | Method of treating chemotherapy-induced thrombocytopenia |
| CN101481352A (zh) | 2008-01-10 | 2009-07-15 | 上海恒瑞医药有限公司 | 双环取代吡唑酮偶氮类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用 |
| MX2010008096A (es) | 2008-01-25 | 2010-09-22 | Amgen Inc | Anticuerpos de ferroportina y metodos de uso. |
| EP2620448A1 (en) | 2008-05-01 | 2013-07-31 | Amgen Inc. | Anti-hepcidin antibodies and methods of use |
| MX347291B (es) | 2009-03-20 | 2017-04-17 | Amgen Inc | Inmunoglobulinas portadoras y usos de las mismas. |
| WO2011012306A2 (en) | 2009-07-30 | 2011-02-03 | Aplagen Gmbh | Use of emps for antagonising epo-stimulatory effects on epo-responsive tumors while maintaining erythropoiesis |
| EP2492262B1 (en) | 2009-10-23 | 2016-04-20 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Fused heterocyclic compound and thrombopoietin receptor activator |
| WO2011098095A1 (en) | 2010-02-09 | 2011-08-18 | Aplagen Gmbh | Peptides binding the tpo receptor |
| EA201370076A1 (ru) | 2010-09-22 | 2013-08-30 | Амген Инк. | Иммуноглобулины-переносчики и их применение |
| WO2014159242A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Novartis Ag | Notch 3 mutants and uses thereof |
| US9308236B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-04-12 | Bristol-Myers Squibb Company | Macrocyclic inhibitors of the PD-1/PD-L1 and CD80(B7-1)/PD-L1 protein/protein interactions |
| EP3191113B1 (en) | 2014-09-11 | 2019-11-06 | Bristol-Myers Squibb Company | Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80 (b7-1)/pd-l1 protein/protein interactions |
| US9732119B2 (en) | 2014-10-10 | 2017-08-15 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
| US9856292B2 (en) | 2014-11-14 | 2018-01-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
| RU2758608C2 (ru) | 2014-11-19 | 2021-11-01 | Конинклейке Филипс Н.В. | Способ диагностики с использованием hnl |
| US9861680B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-01-09 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
| US9944678B2 (en) | 2014-12-19 | 2018-04-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
| US20160222060A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-04 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
| US9809625B2 (en) | 2015-03-18 | 2017-11-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
| US10143746B2 (en) | 2016-03-04 | 2018-12-04 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
| US10358463B2 (en) | 2016-04-05 | 2019-07-23 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
| ES2864091T3 (es) | 2016-05-19 | 2021-10-13 | Bristol Myers Squibb Co | Inmunomoduladores de producción de imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET) |
| ES2910832T3 (es) | 2016-11-07 | 2022-05-13 | Bristol Myers Squibb Co | Inmunomoduladores |
| US11066445B2 (en) | 2017-06-23 | 2021-07-20 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators acting as antagonists of PD-1 |
| EP3658191A1 (en) * | 2017-07-26 | 2020-06-03 | Janssen Pharmaceutica NV | Methods of protecting vascular integrity induced by targeted radiation therapy |
| WO2019070643A1 (en) | 2017-10-03 | 2019-04-11 | Bristol-Myers Squibb Company | IMMUNOMODULATORS |
| WO2020209920A2 (en) | 2019-01-25 | 2020-10-15 | Janssen Pharmaceutica Nv | Methods of mitigating toxic effects of vesicants and caustic gas |
| KR20210119469A (ko) | 2019-01-25 | 2021-10-05 | 잔센파마슈티카엔.브이. | 전신 방사선/화학 노출에 대응한 장기 및 혈관 손상에 대한 보호, 조혈 회복 및 생존을 증진시키는 방법 |
| MA54820A (fr) | 2019-01-25 | 2021-12-01 | Janssen Pharmaceutica Nv | Méthodes d'atténuation d'une lésion hépatique et de promotion d'une hypertrophie hépatique, de régénération du foie et de prise de greffe de cellules hépatiques conjointement avec des traitements par radiothérapie et/ou radiomimétiques |
| US20230104658A1 (en) | 2021-10-01 | 2023-04-06 | Janssen Pharmaceutica Nv | Methods of increasing progenitor cell production |
| WO2024095178A1 (en) | 2022-11-01 | 2024-05-10 | Janssen Pharmaceutica Nv | Thrombopoietin mimetic for use in the treatment of acute liver failure |
Family Cites Families (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3645090A (en) | 1969-06-19 | 1972-02-29 | Citizen Watch Co Ltd | Day-date quick-adjuster for calender timepiece |
| US3940475A (en) | 1970-06-11 | 1976-02-24 | Biological Developments, Inc. | Radioimmune method of assaying quantitatively for a hapten |
| US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| JPS6023084B2 (ja) | 1979-07-11 | 1985-06-05 | 味の素株式会社 | 代用血液 |
| US4640835A (en) | 1981-10-30 | 1987-02-03 | Nippon Chemiphar Company, Ltd. | Plasminogen activator derivatives |
| US4496689A (en) | 1983-12-27 | 1985-01-29 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer |
| US4612132A (en) | 1984-07-20 | 1986-09-16 | Chevron Research Company | Modified succinimides |
| DE3675588D1 (de) | 1985-06-19 | 1990-12-20 | Ajinomoto Kk | Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist. |
| US4791192A (en) | 1986-06-26 | 1988-12-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified protein with polyethyleneglycol |
| US5198424A (en) * | 1989-03-08 | 1993-03-30 | Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Functionally active selectin-derived peptides |
| US5143854A (en) * | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
| US5326558A (en) * | 1989-08-08 | 1994-07-05 | Genetics Institute, Inc. | Megakaryocytopoietic factor |
| IL96477A0 (en) * | 1989-12-01 | 1991-08-16 | Amgen Inc | Megakaryocyte production |
| US5571508A (en) * | 1989-12-18 | 1996-11-05 | Amrad Corporation Limited | Method for the treatment of thrombocytopenia and pharmaceutical compositions useful therefor |
| IT1241395B (it) * | 1990-04-02 | 1994-01-10 | Eniricerche Spa | Composti immunogenici,il procedimento per la loro sintesi e loro impiego per la preparazione di vaccini antimalaria |
| US6552170B1 (en) | 1990-04-06 | 2003-04-22 | Amgen Inc. | PEGylation reagents and compounds formed therewith |
| US5250732A (en) * | 1991-07-18 | 1993-10-05 | Genentech, Inc. | Ketamine analogues for treatment of thrombocytopenia |
| US5270170A (en) * | 1991-10-16 | 1993-12-14 | Affymax Technologies N.V. | Peptide library and screening method |
| DK0644771T4 (da) * | 1992-06-11 | 2006-12-27 | Alkermes Inc | Lægemiddelsystem til levering af erythropoietin |
| US5354934A (en) | 1993-02-04 | 1994-10-11 | Amgen Inc. | Pulmonary administration of erythropoietin |
| EP0722331A4 (en) | 1993-08-25 | 1997-10-01 | Systemix Inc | METHOD FOR PRODUCING A POPULATION OF HIGHLY ENRICHED HEMATOPOIETIC STEM CELLS |
| AU8124694A (en) * | 1993-10-29 | 1995-05-22 | Affymax Technologies N.V. | In vitro peptide and antibody display libraries |
| SG47030A1 (en) * | 1994-01-03 | 1998-03-20 | Genentech Inc | Thrombopoietin |
| WO1995021920A1 (en) * | 1994-02-14 | 1995-08-17 | Zymogenetics, Inc. | Hematopoietic protein and materials and methods for making it |
| CA2169173C (en) * | 1994-02-14 | 2002-10-15 | Kenneth Kaushansky | Methods for stimulating erythropoiesis using thrombopoietin |
| EP0668352A1 (en) * | 1994-02-14 | 1995-08-23 | Kirin Brewery Company, Ltd. | Protein having TPO activity |
| WO1995021919A2 (en) * | 1994-02-14 | 1995-08-17 | Kirin Brewery Company, Limited | Protein having tpo activity |
| TW565568B (en) * | 1994-03-31 | 2003-12-11 | Amgen Inc | Compositions and methods for stimulating megakaryocyte growth and differentiation |
| US5571686A (en) * | 1994-04-14 | 1996-11-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Method of using megapoietin for prolonging the survival & viability of platlets |
| AU4163196A (en) * | 1994-11-30 | 1996-06-19 | Zymogenetics Inc. | Low molecular weight thrombopoietin |
| US5641655A (en) * | 1994-11-30 | 1997-06-24 | Zymogenetics, Inc. | Methods for producing thrombopoietin polypeptides using a mammalian tissue plasminogen activator secretory peptide |
| ATE346096T1 (de) * | 1995-04-26 | 2006-12-15 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | G-csf tpo fusionsproteine |
| EP2055712A1 (en) | 1995-06-07 | 2009-05-06 | Glaxo Group Limited | Peptides and compounds that bind to a thrombopoietin receptor |
| US5869451A (en) * | 1995-06-07 | 1999-02-09 | Glaxo Group Limited | Peptides and compounds that bind to a receptor |
| KR102127408B1 (ko) | 2014-01-29 | 2020-06-29 | 삼성전자주식회사 | 항 Her3 scFv 단편 및 이를 포함하는 항 c-Met/항 Her3 이중 특이 항체 |
-
1996
- 1996-12-11 US US08/764,640 patent/US5869451A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-12-05 PE PE1997001095A patent/PE27599A1/es not_active IP Right Cessation
- 1997-12-08 SV SV1997000104A patent/SV1997000104A/es not_active Application Discontinuation
- 1997-12-09 AR ARP970105779A patent/AR010752A1/es active IP Right Grant
- 1997-12-09 BR BRPI9713914-9A patent/BRPI9713914B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-12-09 CO CO97071692A patent/CO5080768A1/es unknown
- 1997-12-09 TR TR2004/01638T patent/TR200401638T2/xx unknown
- 1997-12-09 AU AU58547/98A patent/AU725731B2/en not_active Expired
- 1997-12-09 EP EP97954363A patent/EP0948539B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-09 CA CA002274149A patent/CA2274149C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-09 EP EP08075855A patent/EP2028191A1/en not_active Withdrawn
- 1997-12-09 KR KR1020057005233A patent/KR100668546B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-12-09 ES ES97954363T patent/ES2321038T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-09 JP JP52619798A patent/JP4128225B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-09 KR KR1020067003807A patent/KR100679576B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-12-09 EP EP20100185440 patent/EP2336165A1/en not_active Withdrawn
- 1997-12-09 KR KR1019997005169A patent/KR100625708B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-12-09 WO PCT/EP1997/006850 patent/WO1998025965A2/en active IP Right Grant
- 1997-12-09 ZA ZA9711045A patent/ZA9711045B/xx unknown
- 1997-12-09 AT AT97954363T patent/ATE420893T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-12-09 DE DE69739219T patent/DE69739219D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-09 CN CNB971816514A patent/CN100379760C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-09 TR TR1999/01971T patent/TR199901971T2/xx unknown
- 1997-12-10 MA MA24894A patent/MA26454A1/fr unknown
- 1997-12-10 TN TNTNSN97201A patent/TNSN97201A1/fr unknown
- 1997-12-10 TW TW086118867A patent/TW515804B/zh active
- 1997-12-10 UY UY24805A patent/UY24805A1/es not_active IP Right Cessation
- 1997-12-10 HR HR970683A patent/HRP970683B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-12-11 PA PA19978442601A patent/PA8442601A1/es unknown
-
1999
- 1999-02-03 US US09/244,298 patent/US6121238A/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-09-20 AR ARP070104172A patent/AR062931A2/es unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2321038T3 (es) | Peptidos y compuestos que se unen a un receptor. | |
| ES2395413T3 (es) | Péptidos que se unen al receptor de eritropoyetina | |
| US6506362B1 (en) | Labeled compounds that bind to a thrombopoietin receptor | |
| ES2303338T3 (es) | Peptidos y compuestos que se unen a un receptor de trombopoyetina. | |
| ES2323465T3 (es) | Peptidos novedosos que se unen al receptor de la eritropoyetina. | |
| ZA200602495B (en) | Peptides and compounds that bind to thrombopoietin receptors | |
| JP2009504650A (ja) | Ｔｐｏ受容体と結合するペプチドの使用 | |
| CA2621857A1 (en) | Peptides and compounds that bind to a receptor | |
| MXPA99005365A (es) | Peptidos y compuestos que se enlazan a un receptor |