ES2323465T3 - Peptidos novedosos que se unen al receptor de la eritropoyetina. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que se une a, y activa el receptor de la eritropoyetina (EPO-R), compuesto que comprende un dímero peptídico que tiene la fórmula: ** ver fórmula** en la que (i) en cada monómero peptídico del dímero peptídico, cada aminoácido se indica por la abreviatura convencional de una letra, AcG es N-acetilglicina y 1-nal es 1-naftilalanina; (ii) cada monómero peptídico del dímero peptídico contiene un enlace disulfuro intramolecular entre los dos residuos de cisteína (C) de cada monómero, (iii) ["PEG"] comprende al menos un resto de polietilenglicol (PEG) lineal, presentando cada resto de PEG un peso molecular de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 40.000 Daltons.
Description
Péptidos novedosos que se unen al receptor de la
eritropoyetina.
La presente invención se refiere a compuestos
peptídicos que son agonistas del receptor de la eritropoyetina
(EPO-R). La invención también se refiere a métodos
terapéuticos que utilizan tales compuestos peptídicos para tratar
trastornos asociados con una producción insuficiente o defectuosa de
eritrocitos. También se proporcionan composiciones farmacéuticas,
las cuales comprenden los compuestos peptídicos de la invención.
La eritropoyetina (EPO) es una hormona
glucoproteica de 165 aminoácidos, con un peso molecular de
aproximadamente 34 kilodaltons (kD), y sitios de glucosilación
preferidos en las posiciones de los aminoácidos 24, 38, 83 y 126.
Se produce inicialmente como una proteína precursora con un péptido
de señal de 23 aminoácidos. La EPO puede estar presente en tres
formas: \alpha, \beta y asialo. Las formas \alpha y \beta
difieren ligeramente en sus componentes de carbohidratos, pero
tienen la misma potencia, actividad biológica y peso molecular. La
forma asialo es una forma \alpha o \beta con el carbohidrato
terminal (ácido siálico) eliminado. Se han publicado las secuencias
de ADN que codifican la EPO [Patente de EE.UU. No. 4.703.008, de
Lin].
La EPO estimula la división mitótica y la
diferenciación de las células precursoras de los eritrocitos, y por
lo tanto asegura la producción de eritrocitos. Se produce en el
riñón cuando predominan las condiciones hipóxicas. Durante la
diferenciación inducida por la EPO en las células precursoras de los
eritrocitos, se induce la síntesis de la globina; se estimula la
síntesis del complejo hemo; y se incrementa el número de receptores
de ferritina. Estos cambios permiten que la célula capte más hierro
y sintetice la hemoglobina funcional, la cual en los eritrocitos
maduros, se une al oxígeno. Así, los eritrocitos y su hemoglobina
juegan un papel clave en el suministro de oxígeno al cuerpo. Estos
cambios se inician por la interacción de la EPO con un receptor
apropiado en la superficie celular de las células precursoras de los
eritrocitos [Véase, por ejemplo, Graber y Krantz (1978) Ann. Rev.
Med. 29, 51-66].
La EPO se presenta en concentraciones muy bajas
en el plasma cuando el cuerpo está en un estado saludable, en donde
los tejidos reciben suficiente oxigenación del número existente de
eritrocitos. Esta concentración baja normal es suficiente para
estimular el reemplazo de los eritrocitos, los cuales se pierden
normalmente por envejecimiento.
La cantidad de EPO en la circulación se
incrementa bajo condiciones de hipoxia, cuando el transporte del
oxígeno por las células sanguíneas en la circulación se reduce.
Puede causarse hipoxia, por ejemplo, por una pérdida sanguínea
sustancial por hemorragia, destrucción de los eritrocitos por
sobreexposición a la radiación, reducción en la captación de
oxígeno debido a una gran altitud o inconsciencia prolongada, o
varias formas de anemia. En respuesta a tales agresiones hipóxicas,
los niveles elevados de EPO incrementan la producción de
eritrocitos, estimulando la proliferación de las células
progenitoras eritroides. Cuando el número de eritrocitos en la
circulación es mayor que el necesario para los requisitos normales
de oxígeno en el tejido, los niveles de EPO en la circulación
disminuyen.
Debido a que la EPO es esencial en el proceso de
la formación de los eritrocitos, esta hormona tiene aplicaciones
potencialmente útiles tanto en el diagnóstico como en el tratamiento
de trastornos sanguíneos, caracterizados por una producción de
eritrocitos baja o defectuosa. Los estudios recientes han
proporcionado una base para la proyección de la eficacia de la
terapia con EPO para una variedad de estados patológicos, trastornos
y estados de irregularidad hematológica, incluyendo:
beta-talasemia [véase, Vedovato, y col. (1984) Acta.
Haematol. 71:211-213]; fibrosis quística [véase,
Vichinsky, y col. (1984) J. Pediatric 105:15-21];
trastornos del embarazo y menstruales [véase, Cotes, y col. (193)
Brit. J. Ostet. Gyneacol. 90:304-311]; anemia
temprana de la premadurez [véase, Haga, y col. (1983) Acta Pediatr.
Scand. 72; 827-831]; lesión de la médula [véase,
Claus-Walker, y col. (1984) Arch. Phys. Med.
Rehabil. 65:370-374]; vuelos en el espacio [véase,
Dunn, y col. (1984) Eur. J. Appl. Physiol.
52:178-182]; pérdida aguda de sangre [véase, Miller,
y col. (1982) Brit. J. Haematol. 52:545-590];
envejecimiento [véase, Udupa, y col. (1984) J. Lab. Clin. Med.
103:574-580 y 581-588 y Lipschitz, y
col. (1983) Blood 63:502-509]; varios estados de
enfermedad neoplásica acompañados por eritropoyesis anormal [véase,
Dainiak, y col (1983) Cancer 5:1101-1106 y
Schwartz, y col. (1983) Otolaryngol. 109:269-272]; e insuficiencia renal [véase, Eschbach. y col. (1987) N. Eng. J. Med. 316:73-78].
Schwartz, y col. (1983) Otolaryngol. 109:269-272]; e insuficiencia renal [véase, Eschbach. y col. (1987) N. Eng. J. Med. 316:73-78].
Se ha caracterizado la EPO purificada homogénea
[Patente de EE.UU. No. 4.677.195 de Hewick]. Se purificó, clonó y
expresó una secuencia de ADN que codifica la EPO para producir
polipéptidos recombinantes con las mismas propiedades bioquímicas e
inmunológicas que la EPO natural. También se ha producido una
molécula de EPO recombinante con oligosacáridos idénticos a
aquéllos de la EPO natural [véase, Sasaki, y col. (1987) J. Biol.
Chem. 262:12059-12076].
El efecto biológico de la EPO parece mediarse,
en parte, a través de la interacción con un receptor que se une a
la membrana de la célula. Los estudios iniciales, que utilizan
células eritroides inmaduras aisladas de bazo de ratón, sugirieron
que las proteínas de la superficie celular que se unen a la EPO,
comprenden dos polipéptidos que tienen pesos moleculares
aproximados de 85.000 Daltons y 100.000 Daltons, respectivamente
[Sawyer, y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:3690-3694]. El número de sitios que se unen a la
EPO se calculó para promediar de 800 a 1000 por superficie celular.
De estos sitios de unión, aproximadamente 300 se unen a la EPO con
una K_{d} de aproximadamente 90 pM (picomolar), mientras que el
resto se une a la EPO con una afinidad reducida de aproximadamente
570 pM [Sawyer, y col. (1987) J. Biol. Chem.
262:5554-5562]. Un estudio independiente sugirió
que los eritroblastos del bazo sensibles a la EPO preparados a
partir de ratones inyectados con la cepa anémica (FVA) del virus de
la leucemia de Friend, poseen un total de aproximadamente 400
sitios de unión de la EPO de alta y baja afinidad con valores de
K_{d} de aproximadamente 100 pM y 800 pM, respectivamente
[Landschulz, y col.1989) Blood 73:1476-1486].
El trabajo subsiguiente indicó que las dos
formas del receptor de la EPO (EPO-R), se
codificaban por un solo gen. Este gen se ha clonado [Véase, por
ejemplo, Jones, y col. (1990) Blood 76, 31-35;
Noguchi, y col. (1991) Blood 78:2548-2556; Maouche,
y col. (1991) Blood 78:2557-2563]. Por ejemplo, las
secuencias de ADN y las secuencias peptídicas codificadas para las
proteínas EPO-R murinas y humanas, se describen en
la Publicación del PCT No. WO 90/08822 de D'Andrea, y col. Los
modelos actuales sugieren que la unión de la EPO a
EPO-R resultan en la dimerización y activación de
dos moléculas de EPO-R, lo cual da lugar a los pasos
subsiguientes de transducción de señales [Véase, por ejemplo,
Watowich, y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:2140-2144].
La disponibilidad de los genes clonados para la
EPO-R facilita la búsqueda de agonistas y
antagonistas de este importante receptor. La disponibilidad de la
proteína del receptor recombinante permite el estudio de la
interacción receptor-ligando en una variedad de
sistemas de generación de diversidad de péptidos aleatorios y
semialeatorios. Estos sistemas incluyen el sistema de "péptidos
sobre plásmidos" [descrito en la Patente de EE. UU. No.
6.270.170]; el sistema de "péptidos sobre un fago" [descrito en
la Patente de EE.UU. No. 5.432.018 y Cwirla, y col. (1990) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382]; el sistema de
"biblioteca sintética codificada" (ESL) [descrito en la
solicitud de patente de EE.UU. No. de Serie 946,239, presentado el
16 de Septiembre de 1992]; y el sistema de "síntesis polimérica
inmovilizada a escala muy grande" [descrito en la Patente de
EE.UU. No. 5,143,854; Publicación del PCT No. 90/15070; Fodor, y
col. (1991) Science 251:767-773; Dower y Fodor
(1991) Ann. Rep. Med. Chem. 26:271-180; y la Patente
de EE.UU. No. 5.424.186].
Se han identificado los péptidos que interactúan
al menos en algún grado con el EPO-R y se describen,
por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nos. 5.773.569; 5.830.851; y
5.986.047 de Wrighton, y col.; Publicación del PCT No. WO 96/40749
de Wrighton, y col.; Patente de E.U.A. No. 5.767.078 y Publicación
del PCT No. 96/40772 de Johnson y Zivin; Publicación del PCT No.
WO01/38342 de Balu; y WO 01/91780 de
Smith-Swintosky, y col. En particular, se ha
identificado un grupo de péptidos que contienen un motivo peptídico,
los miembros del cual se unen al EPO-R y estimulan
la proliferación celular dependiente de la EPO. Incluso, los
péptidos identificados hasta la fecha que contienen el motivo,
estimulan la proliferación celular dependiente de la EPO in
vitro con valores de CE50 de aproximadamente 20 nanomolar (nM)
a aproximadamente 250 nM. Así, se requieren concentraciones
peptídicas de 20 nM a 250 nM para estimular el 50% de la
proliferación celular máxima estimulada por la EPO.
Dado el inmenso potencial de los agonistas del
EPO-R, tanto para los estudios de las importantes
actividades biológicas mediadas por este receptor como para el
tratamiento de enfermedades, existe una necesidad para la
identificación de agonistas peptídicos del EPO-R de
potencia y actividad mejoradas. La presente invención proporciona
tales compuestos.
La cita y/o discusión de las referencias citadas
en esta sección y a lo largo de la memoria descriptiva, se
proporciona simplemente para aclarar la descripción de la presente
invención y no es una admisión de que tal referencia es la
"técnica anterior" de la presente invención.
La presente invención proporciona compuestos
peptídicos novedosos, los cuales son agonistas del
EPO-R de potencia y actividad muy mejoradas.. Estos
compuestos peptídicos son homodímeros de monómeros peptídicos que
tienen la secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK
(SEQ ID NO:1), u homodímeros de monómeros peptídicos que tienen la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K
(SEQ ID NO: 2), homodímeros de monómeros peptídicos que tienen la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)
(SEQ ID NO: 3); en donde cada aminoácido se indica por la
abreviatura convencional de una letra, "(AcG)" es
N-acetilglicina, "(1-nal)" es
1-naftilalanina, y "(MeG)" es
N-metilglicina, también conocida como sarcosina.
Cada monómero peptídico de un dímero peptídico contiene un enlace
disulfuro intramolecular entre los residuos de cisteína del
monómero.
Los monómeros peptídicos pueden dimerizarse
mediante la unión covalente a un enlazante de amida terciaria
ramificada. El enlazante de amida terciaria puede describirse
como:
-C^{1}O-CH_{2}-X-CH_{2}-C^{2}O-
en donde: X es
NCO-(CH_{2})_{2}-N^{1}H-; C^{1} del
enlazante forma el enlace de amida con el grupo
\varepsilon-amino del residuo de lisina C terminal
del primer monómero peptídico; C^{2} del enlazante forma un
enlace de amida con el grupo \varepsilon-amino del
residuo de lisina C terminal del segundo monómero peptídico; y
N^{1} de X se une vía un enlace de carbamato o un enlace de amida
a un resto activado de polietilenglicol (PEG), en donde el PEG
tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 a aproximadamente
40.000 Daltons (el término "aproximadamente" indica que en las
preparaciones del PEG, algunas moléculas pesarán más, otras menos,
que el peso molecular
indicado).
Cuando cada monómero del homodímero tiene la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)
VCQPLRK (SEQ ID NO: 1) y N^{1} del enlazante se une vía un enlace de carbamato a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
VCQPLRK (SEQ ID NO: 1) y N^{1} del enlazante se une vía un enlace de carbamato a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando cada monómero del homodímero tiene la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)
VCQPLRK (SEQ ID NO: 1) y N^{1} del enlazante está unido vía un enlace de amida a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
VCQPLRK (SEQ ID NO: 1) y N^{1} del enlazante está unido vía un enlace de amida a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Cuando cada monómero del homodímero tiene la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)
VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2) y N^{1} del enlazante está unido vía un enlace de carbamato a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2) y N^{1} del enlazante está unido vía un enlace de carbamato a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
Cuando cada monómero del homodímero tiene la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)
VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2) y N^{1} del enlazante está unido vía un enlace de amida a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2) y N^{1} del enlazante está unido vía un enlace de amida a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
Los monómeros peptídicos también pueden
dimerizarse mediante la unión covalente a un enlazante de amida
terciaria ramificada. El enlazante de amida terciaria puede
describirse como:
-C^{1}O-CH_{2}-X-CH_{2}-C^{2}O-
en donde: X es
NCO-(CH_{2})_{2}-NH-C^{3}O;
C^{1} del enlazante forma un enlace de amida con el grupo
\varepsilon-amino del residuo de lisina C terminal
del primer monómero peptídico; y C^{2} del enlazante forma un
enlace de amida con el grupo \varepsilon-amino del
residuo de lisina C terminal del segundo monómero peptídico. Los
dímeros peptídicos de la invención comprenden además un resto
espaciador de la siguiente
estructura:
-N^{1}H-(CH_{2})_{4}-C^{4}H-N^{2}H-
en donde: C^{4} del espaciador
está unido covalentemente a C^{3} de X; N^{1} del espaciador
está unido covalentemente vía un enlace de carbamato o de amida a
un resto activado de polietilenglicol (PEG); y N^{2} del
espaciador está unido covalentemente vía un enlace de carbamato o de
amida a un resto activado de PEG, en donde el PEG tiene un peso
molecular de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 50.000 Daltons
(el término "aproximadamente" indica que en las preparaciones
del PEG, algunas moléculas pesarán más, otras menos, que el peso
molecular indicado). Cada resto de PEG puede ser individualmente de
10.000 Daltons (10 kD), 20 kD, 30 kD, 40 kD o 50
kD.
Cuando cada monómero del homodímero tiene la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)
VCQPLRK (SEQ ID NO: 1), y tanto N^{1} como N^{2} del espaciador están unidos covalentemente vía un enlace de carbamato a un resto activado de PEG, los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
VCQPLRK (SEQ ID NO: 1), y tanto N^{1} como N^{2} del espaciador están unidos covalentemente vía un enlace de carbamato a un resto activado de PEG, los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
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\vskip1.000000\baselineskip
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En las formas de realización preferidas, la
lisina C terminal de los dos monómeros peptídicos es
L-lisina. Los expertos en la técnica también
apreciarán de las estructuras químicas anteriores que los dos restos
lineales de PEG están unidos por lisina (por ejemplo, como
mPEG_{2}-Lys-NHS o como
mPEG_{2}-Lisinol-NPC), la cual
también es de manera preferida L-lisina y dan lugar
a la siguiente estereoquímica.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De manera alternativa, uno o más de los residuos
de lisina pueden ser D-lisina, dando lugar a las
estereoquímicas alternativas que apreciarán fácilmente los expertos
en la técnica.
\newpage
Cuando cada monómero del homodímero tiene la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)
VCQPLRK (SEQ ID NO: 1) y tanto N^{1} como N^{2} del espaciador están unidos covalentemente vía un enlace de amida a un resto activado de PEG, los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
VCQPLRK (SEQ ID NO: 1) y tanto N^{1} como N^{2} del espaciador están unidos covalentemente vía un enlace de amida a un resto activado de PEG, los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Nuevamente, las moléculas de lisina en este
compuesto son de manera preferida todas de L-lisina,
dando lugar a la siguiente estereoquímica.
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\vskip1.000000\baselineskip
De manera alternativa, uno o más de los residuos
de lisina pueden ser D-lisina, dando lugar a las
estereoquímicas alternativas, las cuales apreciarán fácilmente los
expertos en la técnica.
\newpage
Cuando cada monómero del homodímero tiene la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)
VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2) y tanto N^{1} como N^{2} del espaciador están unidos covalentemente vía un enlace de carbamato a un resto activado de PEG, en donde Y es un grupo carbamato, los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2) y tanto N^{1} como N^{2} del espaciador están unidos covalentemente vía un enlace de carbamato a un resto activado de PEG, en donde Y es un grupo carbamato, los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De manera preferida, los residuos de lisina que
unen el monómero peptídico y los restos lineales de PEG en esta
molécula son todos de L-lisina, dando lugar a la
siguiente estereoquímica:
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\vskip1.000000\baselineskip
De manera alternativa, uno o más de los residuos
de lisina pueden ser D-lisina, dando lugar a las
estereoquímicas alternativas que apreciarán fácilmente los expertos
en la técnica.
\newpage
Cuando cada monómero del homodímero tiene la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)
VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2) y tanto N^{1} como N^{2} del espaciador están unidos covalentemente vía un enlace de amida a un resto activado de PEG, los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2) y tanto N^{1} como N^{2} del espaciador están unidos covalentemente vía un enlace de amida a un resto activado de PEG, los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
De manera preferida, los residuos de lisina que
unen el monómero peptídico y los restos lineales de PEG en esta
molécula son todos de L-lisina, dando lugar a la
siguiente estereoquímica.
\vskip1.000000\baselineskip
En otras formas de realización, uno o más de los
residuos de lisina pueden ser D-lisina, dando lugar
a las estereoquímicas alternativas que apreciarán fácilmente los
expertos en la técnica.
Los monómeros peptídicos también pueden
dimerizarse por la unión a un enlazante de lisina, en donde un
monómero peptídico está unido por su extremo C terminal al grupo
\varepsilon-amino de la lisina y el segundo
monómero peptídico está unido por su extremo C terminal al grupo
\alpha-amino de la lisina.
Los dímeros peptídicos de la invención
comprenden además un resto espaciador de la siguiente
estructura:
-N^{1}H-(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{2}-N^{2}H-
En un extremo, N^{1} del espaciador se une vía
un enlace de amida a un carbono carbonílico del enlazante de
lisina. En el extremo opuesto, N^{2} del espaciador está unido vía
un enlace de carbamato o un enlace de amida a un resto activado de
polietilenglicol (PEG), en donde el PEG tiene un peso molecular de
aproximadamente 20.000 a aproximadamente 40.000 Daltons (el término
"aproximadamente" indica que en las preparaciones de PEG,
algunas moléculas pesarán más, otras menos, que el peso molecular
indicado).
Cuando el espaciador está unido vía un enlace de
carbamato a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los
compuestos peptídicos novedosos de la invención (SEQ ID NO: 3)
pueden representarse como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona además composiciones
farmacéuticas que comprenden tales compuestos peptídicos, y métodos
para tratar varios estados médicos, utilizando tales compuestos
peptídicos.
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Los residuos de aminoácidos en los péptidos se
abrevian como sigue: Fenilalanina es Phe o F; Leucina es Leu o L;
Isoleucina es Ile o I; Metionina es Met o M; Valina es Val o V;
Serina es Ser o S; Prolina es Pro o P; Treonina es Thr o T; Alanina
es Ala o A; Tirosina es Tyr o Y; Histidina es His o H; Glutamina es
Gln o Q; Asparagina es Asn o N; Lisina es Lys o K; el Acido
Aspártico es Asp o D; el Acido Glutámico es Glu o E; Cisteína es
Cys o C; Triptófano es Trp o W; Arginina es Arg o R; y Glicina es
Gly o G. Los aminoácidos no convencionales en los péptidos se
abrevian como sigue: 1-naftilalanina es
1-nal o Np; N-metilglicina (también
conocida como sarcosina) es MeG o Sc; y la glicina acetilada
(N-acetilglicina) es AcG.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "polipéptido" o "proteína" se refiere a un
polímero de monómeros de aminoácidos que son alfa aminoácidos
unidos a través de enlaces de amida. Los polipéptidos son, por lo
tanto, de al menos dos residuos de aminoácidos de longitud, y son
usualmente más largos. Generalmente, el término "péptido" se
refiere a un polipéptido que es de sólo unos pocos residuos de
aminoácidos de longitud. Los péptidos agonistas de
EPO-R novedosos de la presente invención son de
manera preferida de no más de aproximadamente 50 residuos de
aminoácidos de longitud. Son de manera más preferida de
aproximadamente 17 a aproximadamente 40 residuos de aminoácidos de
longitud. Un polipéptido, al contrario que un péptido, puede
comprender cualquier número de residuos de aminoácidos. Por lo
tanto, el término polipéptido incluye péptidos así como secuencias
más largas de aminoácidos.
Como se utiliza en la presente memoria, la frase
"farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades
moleculares y composiciones que "se consideran generalmente como
seguras", por ejemplo, que son fisiológicamente tolerables y que
no producen típicamente una reacción alérgica o indeseada similar,
tal como problemas gástricos, mareo y lsimilares, cuando se
administran a un ser humano. De manera preferida, como se utiliza en
la presente memoria, la expresión "farmacéuticamente
aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del
gobierno federal o estatal o listado en la Farmacopea de los
Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para
utilizarse en animales, y más particularmente en seres humanos. El
término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante,
excipiente o vehículo, con el cual el compuesto se administra. Tales
portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como
agua y aceites, incluyendo aquéllos de origen de petróleo, animal,
vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuate, aceite de
soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Como portadores
se emplean de manera preferidael agua o una solución acuosa,
soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol,
particularmente para soluciones inyectables. Los portadores
farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's
Pharmaceutical Sciences", por E. W. Martin.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "agonista" se refiere a un ligando biológicamente
activo, que se une a su receptor biológicamente activo
complementario y activa el último para causar una respuesta
biológica en el receptor, o mejorar una actividad biológica
preexistente del receptor.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona compuestos
peptídicos novedosos, los cuales son agonistas del
EPO-R de potencia y actividad muy mejoradas. Estos
compuestos peptídicos son homodímeros de monómeros peptídicos que
tienen la secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK
(SEQ ID NO: 1), u homodímeros de monómeros peptídicos que tienen la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K
(SEQ ID NO: 2); en donde cada aminoácido está indicado por la
abreviatura convencional de una letra, "(AcG)" es
N-acetilglicina, "(1-nal)" es
1-naftilalanina, y "(MeG)" es
N-metilglicina, también conocida como sarcosina.
Cada monómero peptídico de un dímero peptídico contiene un enlace
disulfuro intramolecular entre los residuos de cisteína del
monómero. Tales monómeros pueden representarse esquemáticamente
como sigue:
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\vskip1.000000\baselineskip
Estos péptidos monoméricos se dimerizan para
proporcionar dímeros peptídicos de actividad agonista mejorada del
EPO-R. El resto enlazante (L_{K}) es una amida
terciaria ramificada, la cual une los extremos C terminales de dos
monómeros peptídicos por la unión simultánea al residuo de lisina C
terminal de cada monómero. El enlazante de amida terciaria puede
representarse como:
-C^{1}O-CH_{2}-X-CH_{2}-C^{2}O-
en donde: X es
NCO-(CH_{2})_{2}-N^{1}H-; C^{1} del
enlazante forma el enlace de amida con el grupo
\varepsilon-amino del residuo de lisina C terminal
del primer monómero peptídico; C^{2} del enlazante forma un
enlace de amida con el grupo \varepsilon-amino del
residuo de lisina C terminal del segundo monómero peptídico; y
N^{1} de X se une vía un enlace de carbamato o un enlace de amida
a un resto activado de polietilenglicol (PEG), en donde el PEG
tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 a aproximadamente
40.000 Daltons (el término "aproximadamente" indica que en la
preparación del PEG, algunas moléculas pesarán más, otras menos,
que el peso molecular
indicado).
El enlazante de amida terciaria también puede
representarse como:
-C^{1}O-CH_{2}-X-CH_{2}-C^{2}O-
en donde: X es
NCO-(CH_{2})_{2}-NH-C^{3}O;
C^{1} del enlazante forma un enlace de amida con el grupo
\varepsilon-amino del residuo de lisina C terminal
del primer monómero peptídico; y C^{2} del enlazante forma un
enlace de amida con el grupo \varepsilon-amino del
residuo de lisina C terminal del segundo monómero peptídico. Los
dímeros peptídicos de la invención comprenden además un resto
espaciador de la siguiente
estructura:
-N^{1}H-(CH_{2})_{4}-C^{4}H-N^{2}H-
en donde: C^{4} del espaciador
está unido covalentemente a C^{3} de X; N^{1} del espaciador
está unido covalentemente vía un enlace de carbamato o de amida a
un resto activado de PEG; y N^{2} del espaciador está unido
covalentemente vía un enlace de carbamato o de amida a un resto
activado de PEG, en donde el PEG tiene un peso molecular de
aproximadamente 10.000 a aproximadamente 60.000 Daltons (el término
"aproximadamente", indica que en las preparaciones del PEG,
algunas moléculas pesarán más, otras menos, que el peso molecular
indicado).
Así, los péptidos novedosos de la invención
también pueden contener un resto de PEG, el cual está unido
covalentemente vía un enlace de carbamato o un enlace de amida al
enlazante de amida terciaria del dímero peptídico. El PEG es un
polímero soluble en agua que es farmacéuticamente aceptable. El PEG
para uso en la presente invención puede ser un PEG lineal, no
ramificado, que tiene un peso molecular de aproximadamente 20
kilodaltons (20K) a aproximadamente 60K (el término
"aproximadamente" indica que en las preparaciones de PEG,
algunas moléculas pesarán más, otras menos, que el peso molecular
indicado). De manera más preferida, el PEG tiene un peso molecular
de aproximadamente 30K a aproximadamente 40K. El experto en la
técnica será capaz de seleccionar el tamaño del polímero deseado,
basándose en tales consideraciones como la dosificación deseada; el
tiempo de circulación; la resistencia a la proteólisis; los
efectos, si los hay, sobre la actividad biológica; la facilidad del
manejo; el grado o falta de antigenicidad; y otros efectos
conocidos del PEG en un péptido terapéutico.
Los péptidos, dímeros peptídicos y otras
moléculas basadas en péptidos de la invención pueden unirse a
polímeros solubles en agua (por ejemplo, PEG), utilizando
cualquiera de una variedad de químicas para enlazar los polímeros
solubles en agua a la porción de la molécula que se une al receptor
(por ejemplo, péptido + espaciador). Una forma de realización
típica emplea un solo punto de unión para unir covalentemente los
polímeros solubles en agua a la porción que se une al receptor, sin
embargo, en las formas de realización alternativas, pueden
utilizarse múltiples puntos de unión, incluyendo variaciones
adicionales, en donde diferentes especies del polímero soluble en
agua se unen a la porción que se une al receptor en puntos de unión
distintos, que pueden incluir puntos de unión covalente al
espaciador y/o a una o ambas cadenas peptídicas. En algunas formas
de realización, el dímero o el multímero de orden superior
comprenderá especies distintas de la cadena peptídica (es decir, un
heterodímero u otro heteromultímero). A manera de ejemplo y no de
limitación, un dímero puede comprender una primera cadena peptídica
que tiene un punto de unión de PEG y una segunda cadena peptídica
puede carecer del punto de unión de PEG o utilizar una química de
enlace diferente que la primera cadena peptídica y en algunas
variaciones, el espaciador puede contener o carecer de un punto de
unión de PEG y el espaciador, si está PEGilado, puede utilizar una
química de enlace diferente que aquella de la primera y/o segunda
cadenas peptídicas. Una forma de realización alternativa emplea un
PEG unido a una porción espaciadora de la porción que se une al
receptor, y un polímero soluble en agua diferente (por ejemplo, un
carbohidrato), conjugado a una cadena lateral de uno de los
aminoácidos de la porción peptídica de la
molécula.
molécula.
Puede utilizarse una amplia variedad de especies
de polietilenglicol (PEG) para la PEGilación de la porción que se
une al receptor (péptidos + espaciador). Puede utilizarse
sustancialmente cualquier reactivo que reaccione con el PEG
adecuado. En las formas de realización preferidas, el reactivo que
reacciona con el PEG dará lugar a la formación de un enlace de
carbamato o de amida tras la conjugación a la porción que se une al
receptor. Las especies reactivas frente al PEG adecuadas incluyen,
de manera no exclusiva, aquéllas que están disponibles para la
venta en el catálogo de los Sistemas de Suministro de Fármacos
(2003) de la Corporación NOF (Yebisu Garden Place Tower,
20-3 Ebisu 4-chome,
Shibuya-ku, Tokio 150-6019), y el
catálogo de Ingeniería Molecular (2003) de Nektar Therapeutics (490
Discovery Drive, Huntsville, Alabama 35806). Por ejemplo y de manera
no exclusiva, los siguientes reactivos de PEG se prefieren con
frecuencia en varias formas de realización:
mPEG2-NHS, mPEG2-ALD, PEG con
múltiples brazos, mPEG(MAL)2, mPEG2(MAL),
mPEG-NH2, mPEG-SPA,
mPEG-SBA, mPEG-tioésteres,
mPEG-ésteres dobles, mPEG-BTC,
mPEG-ButirALD, mPEG-ACET, PEG
heterofuncionales (NH2-PEG-COOH,
Boc-PEG-NHS,
Fmoc-PEG-NHS,
NHS-PEG-VS,
NHS-PEG-MAL), acrilatos de PEG
(ACRL-PEG-NHS),
PEG-fosfolípidos (por ejemplo,
mPEG-DSPE), PEG con múltiples brazos de las series
SUNBRITE, incluyendo la serie GL de PEG basados en glicerina
activados por la química elegida por los expertos en la técnica,
cualquiera de los PEG activados de SUNBRITE (incluyendo, de manera
no exclusiva, carboxil-PEG,
p-NP-PEG,
Tresil-PEG, aldehído PEG,
acetal-PEG, amino-PEG,
tiol-PEG, maleimido-PEG,
hidroxil-PEG-amina,
amino-PEG-COOH,
hidroxil-PEG-aldehído, PEG del tipo
de anhídrido carboxílico, PEG-fosfolípido
funcionalizado, y otros PEG reactivos similares y/o adecuados
seleccionados por los expertos en la técnica para su aplicación y
uso particular.
Los péptidos novedosos de la invención también
pueden contener dos restos de PEG que están unidos covalentemente
vía un enlace de carbamato o de amida a un resto espaciador, en
donde el resto espaciador está unido covalentemente al enlazante de
amida terciaria del dímero peptídico. Cada uno de los dos restos de
PEG utilizados en tales formas de realización de la presente
invención pueden ser lineales y pueden enlazarse entre sí en un solo
punto de unión. Cada resto de PEG tiene de manera preferida un peso
molecular de aproximadamente 10 kilodaltons (10K) a aproximadamente
60K (el término "aproximadamente" indica que en las
preparaciones de PEG, algunas moléculas pesarán más, otras menos,
que el peso molecular indicado). Los restos lineales de PEG son
particularmente preferidos. De manera más preferida, cada uno de
los dos restos de PEG tiene un peso molecular de aproximadamente
20K a aproximadamente 40K, y aún de manera más preferida de entre
aproximadamente 20K y aproximadamente 40K. Aún de manera más
preferida, cada uno de los dos restos de PEG tiene un peso molecular
de aproximadamente 20K. El experto en la técnica será capaz de
seleccionar el tamaño deseado del polímero basándose en
consideraciones tales como la dosificación deseada; el tiempo de
circulación; la resistencia a la proteólisis; los efectos, si los
hay sobre la actividad biológica; facilidad de manejo; grado o falta
de antigenicidad; y otros efectos conocidos del PEG en un péptido
terapéutico.
La presente invención también comprende
agonistas peptídicos que son homodímeros de monómeros peptídicos que
tienen la secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)
(SEQ ID NO: 3), en donde cada aminoácido está indicado por la
abreviatura convencional de una letra, "(AcG)" es
N-acetilglicina, "(1-nal)" es
1-naftilalanina, y "(MeG)" es
N-metilglicina, también conocida como sarcosina.
Cada monómero peptídico del dímero peptídico contiene un enlace
disulfuro intramolecular entre los residuos de cisteína del
monómero. Tales monómeros pueden representarse esquemáticamente
como sigue:
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\newpage
Estos péptidos monoméricos se dimerizan para
proporcionar dímeros peptídicos con actividad agonista del
EPO-R mejorada. La porción enlazante (L_{K}) es
un residuo de lisina, el cual une los extremos C terminales de los
dos monómeros peptídicos mediante la unión simultánea al aminoácido
C terminal de cada monómero. Un monómero peptídico está unido por
su extremo C terminal al grupo \varepsilon-amino
de la lisina, y el segundo monómero peptídico está unido al extremo
C terminal del grupo \alpha-amino de la lisina.
Por ejemplo, el dímero puede ilustrarse estructuralmente como se
muestra en la Fórmula I, y resumirse como se muestra en la Fórmula
II:
En la Fórmula I y la Fórmula II, N^{2}
representa el átomo de nitrógeno del grupo
\varepsilon-amino de la lisina y N^{1}
representa el átomo de nitrógeno del grupo
\alpha-amino de la lisina.
Los dímeros peptídicos de la invención
comprenden además un resto espaciador de la siguiente
estructura:
-N^{1}H-(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{2}-N^{2}H-
En un extremo, N^{1} del espaciador se une vía
un enlace de amida a un carbono carbonílico del enlazante de
lisina. En el extremo opuesto, N^{2} del espaciador está unido vía
un enlace de carbamato o un enlace de amida a un resto activado de
polietilenglicol (PEG), en donde el PEG tiene un peso molecular de
aproximadamente 10.000 a aproximadamente 60.000 Daltons (el término
"aproximadamente" indica que en las preparaciones de PEG,
algunas moléculas pesarán más, otras menos, que el peso molecular
indicado). De manera más preferida, el PEG tiene un peso molecular
de aproximadamente 20.000 a 40.000 Daltons.
Así, los péptidos novedosos de la invención
también contienen un resto de PEG, el cual está unido covalentemente
al dímero peptídico. El PEG es un polímero soluble en agua que es
farmacéuticamente aceptable. El PEG para uso en la presente
invención puede ser un PEG lineal, no ramificado, que tiene un peso
molecular de aproximadamente 20 kilodaltons (20K) a aproximadamente
60K (el término "aproximadamente" indica que en las
preparaciones de PEG, algunas moléculas pesarán más, otras menos,
que el peso molecular indicado). De manera más preferida, el PEG
tiene un peso molecular de aproximadamente 20K a aproximadamente
40K, y aún de manera más preferida, un peso molecular de
aproximadamente 30K a aproximadamente 40K. Un experto en la técnica
será capaz de seleccionar el tamaño deseado del polímero basándose
en consideraciones tales como la dosificación deseada; el tiempo de
circulación; la resistencia a la proteólisis; los efectos, si los
hay, en la actividad biológica; facilidad de manejo; grado o falta
de antigenicidad; y otros efectos conocidos del PEG en un péptido
terapéutico.
Cuando cada monómero del homodímero tiene la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)
VCQPLRK (SEQ ID NO: 1) y N^{1} del enlazante está unido vía un enlace de carbamato a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
VCQPLRK (SEQ ID NO: 1) y N^{1} del enlazante está unido vía un enlace de carbamato a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
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Cuando cada monómero del homodímero tiene la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK
(SEQ ID NO: 1) y N^{1} del enlazante está unido vía un enlace de
amida a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los compuestos
peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como
sigue:
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Cuando cada monómero del homodímero tiene la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)
VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2) y N^{1} del enlazante está unido vía un enlace de carbamato a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2) y N^{1} del enlazante está unido vía un enlace de carbamato a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Cuando cada monómero del homodímero tiene la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)
VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2) y N^{1} del enlazante está unido vía un enlace de amida a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2) y N^{1} del enlazante está unido vía un enlace de amida a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Los dímeros peptídicos preferidos de la presente
invención incluyen, de manera no exclusiva:
\newpage
Cuando cada monómero del homodímero tiene la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)
VCQPLRK (SEQ D NO: 1) y tanto N^{1} como N^{2} del espaciador están unidos covalentemente vía un enlace de carbamato a un resto activado de PEG, los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
VCQPLRK (SEQ D NO: 1) y tanto N^{1} como N^{2} del espaciador están unidos covalentemente vía un enlace de carbamato a un resto activado de PEG, los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
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\vskip1.000000\baselineskip
Cuando cada monómero del homodímero tiene la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)
VCQPLRK (SEQ ID NO: 1) y tanto N^{1} como N^{2} del espaciador están unidos covalentemente vía un enlace de amida a un resto activado de PEG, los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
VCQPLRK (SEQ ID NO: 1) y tanto N^{1} como N^{2} del espaciador están unidos covalentemente vía un enlace de amida a un resto activado de PEG, los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Cuando cada monómero del homodímero tiene la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)
VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2) y tanto N^{1} como N^{2} del espaciador están unidos covalentemente vía un enlace de carbamato a un resto activado de PEG, los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2) y tanto N^{1} como N^{2} del espaciador están unidos covalentemente vía un enlace de carbamato a un resto activado de PEG, los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
Cuando cada monómero del homodímero tiene la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)
VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2) y tanto N^{1} como N^{2} del espaciador están unidos covalentemente vía un enlace de amida a un resto activado de PEG, los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2) y tanto N^{1} como N^{2} del espaciador están unidos covalentemente vía un enlace de amida a un resto activado de PEG, los compuestos peptídicos novedosos de la invención pueden representarse como sigue:
Los dímeros peptídicos preferidos de la presente
invención incluyen, de manera no exclusiva:
Cuando el espaciador está unido vía un enlace de
carbamato a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los
compuestos peptídicos novedosos de la invención (SEQ ID NO: 3)
pueden representarse como sigue:
Cuando el espaciador está unido vía un enlace de
amida a un resto activado de polietilenglicol (PEG), los compuestos
peptídicos novedosos de la invención (SEQ ID NO: 3) pueden
representarse como sigue:
Esta estructura dimérica puede escribirse
[Ac-péptido,
disulfuro]_{2}Lys-espaciador-PEG_{20-40K}
para denotar un péptido acetilado en el extremo N terminal unido a
los grupos \alpha- y \varepsilon-amino de la
lisina, con cada péptido que contiene un bucle disulfuro
intramolecular y una molécula espaciadora formando un enlace
covalente entre el extremo C terminal de la lisina y un resto de
PEG, en donde el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente
20.000 a aproximadamente 40.000 Daltons.
Los dímeros peptídicos preferidos de la presente
invención incluyen, de manera no exclusiva:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los estereoisómeros (por ejemplo,
D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos
convencionales, los aminoácidos no naturales tales como aminoácidos
a,a-disustituidos, aminoácidos
N-alquilados, ácido láctico y otros aminoácidos no
convencionales, también pueden ser componentes adecuados para los
compuestos de la presente invención. Los ejemplos de los
aminoácidos no convencionales incluyen, de manera no exclusiva:
\beta-alanina, 3-piridilalanina,
4-hidroxiprolina, O-fosfoserina,
N-metilglicina, N-acetilserina,
N-formilmetionina, 3-metilhistidina,
5-hidroxilisina, nor-leucina, y
otros aminoácidos e iminoácidos similares. Otras modificaciones
también son posibles, incluyendo modificación del extremo amino
terminal, modificación del extremo carboxi terminal, reemplazo de
uno o más de los aminoácidos codificados genéticamente naturales
por un aminoácido no convencional, modificación de la cadena
lateral de uno o más residuos de aminoácidos, fosforilación
peptídica y similares.
Las secuencias peptídicas de la presente
invención están presentes solas o en combinación con las extensiones
N terminales y/o C terminales de la cadena peptídica. Tales
extensiones pueden ser secuencias peptídicas codificadas
naturalmente, opcionalmente con, o sustancialmente sin secuencias no
naturales; las extensiones pueden incluir cualesquiera adiciones,
deleciones, mutaciones puntuales u otras modificaciones o
combinaciones de la secuencias conforme lo deseen los expertos en
la técnica. Por ejemplo y de manera no exclusiva, las secuencias
naturales pueden ser de longitud completa o de longitud parcial, y
pueden incluir sustituciones de aminoácidos para proporcionar un
sitio de unión de carbohidrato, PEG, otro polímero o similares, por
medio de la conjugación de la cadena lateral. En una variación, la
sustitución de aminoácidos resulta en la humanización de una
secuencia para hacerla compatible con el sistema inmune humano. Se
proporcionan proteínas de fusión de todos tipos, incluyendo
secuencias de inmunoglobulina adyacentes a, o en proximidad cercana
de las secuencias que activan el EPO-R de la
presente invención, con o sin una secuencia espaciadora que no sea
de inmunoglobulina. Una forma de realización es una cadena de
inmunoglobulina que tiene la secuencia que activa el
EPO-R en lugar de la región variable (V) de la
cadena pesada y/o ligera.
Los péptidos de la invención pueden prepararse
mediante métodos clásicos conocidos en la técnica. Estos métodos
convencionales incluyen métodos de síntesis en fase sólida
exclusiva, de síntesis en fase sólida parcial, condensación de
fragmentos, síntesis en solución clásica y tecnología de ADN
recombinante [véase, por ejemplo, Merrifield J. Am. Chem. Soc. 1963
85:2149].
En una forma de realización, los monómeros
peptídicos de un dímero peptídico se sintetizan individualmente y
se dimerizan posteriormente a la síntesis.
En otra forma de realización, los monómeros
peptídicos de un dímero están enlazados vía su extremo C terminal
mediante un resto enlazante L_{K} de amida terciaria ramificada
que tiene dos grupos funcionales capaces de servir como sitios de
iniciación para la síntesis peptídica, y un tercer grupo funcional
(por ejemplo, un grupo carboxilo o un grupo amino), que permite la
unión a otro resto molecular (por ejemplo, como puede estar
presente en la superficie de un soporte sólido). En este caso, los
dos monómeros peptídicos pueden sintetizarse directamente en dos
grupos nitrógeno reactivos del resto enlazante L_{K} en una
variación de la técnica de síntesis en fase sólida. Tal síntesis
puede ser secuencial o simultánea.
En otra forma de realización, los dos monómeros
peptídicos pueden sintetizarse directamente en dos grupos nitrógeno
reactivos del resto enlazante L_{K} en una variación de la técnica
de síntesis en fase sólida. Tal síntesis puede ser secuencial o
simultánea. En esta modalidad, se utiliza un resto enlazante de
lisina (L_{K}) que tiene dos grupos amino capaces de servir como
sitios de iniciación para la síntesis peptídica y un tercer grupo
funcional (por ejemplo, el grupo carboxilo de una lisina; o el grupo
amino de una amida de lisina, un residuo de lisina en donde el
grupo carboxilo se ha convertido en un resto amido -CONH_{2}),
que permite la unión a otro resto molecular (por ejemplo, como puede
estar presente en la superficie de un soporte sólido).
Si se va a realizar la síntesis secuencial de
las cadenas peptídicas de un dímero en un enlazante, dos grupos
funcionales amino de la molécula enlazante se protegen con dos
grupos protectores de amina diferentes que se pueden eliminar
ortogonalmente. El enlazante protegido se acopla a un soporte sólido
vía el tercer grupo funcional del enlazante. El primer grupo
protector de amina se elimina, y el primer péptido del dímero se
sintetiza en el primer resto amino desprotegido. A continuación, se
elimina el segundo grupo protector de amina, y el segundo péptido
del dímero se sintetiza en el segundo resto amino desprotegido. Por
ejemplo, el primer resto amino del enlazante puede protegerse con
Alloc, y el segundo con Fmoc. En este caso, el grupo Fmoc (pero no
el grupo Alloc) puede eliminarse mediante el tratamiento con una
base suave [por ejemplo, piperidina al 20% en dimetilformamida
(DMF)], y se sintetiza la primera cadena peptídica. Posteriormente,
el grupo Alloc puede eliminarse con un reactivo adecuado [por
ejemplo, Pd(PPh_{3})/4-metilmorfolina y
cloroformo], y se sintetiza la segunda cadena peptídica. Nótese que
si se van a utilizar diferentes grupos protectores de tiol para la
cisteína para controlar la formación del enlace de disulfuro (como
se discute a continuación), esta técnica debe utilizarse incluso
cuando las secuencias de aminoácidos finales de las cadenas
peptídicas de un dímero son idénticas.
Si se va realizar la síntesis simultánea de las
cadenas peptídicas de un dímero en un enlazante, dos grupos
funcionales amino de la molécula enlazante se protegen con el mismo
grupo protector de amina que se puede eliminar. El enlazante
protegido se acopla a un soporte sólido vía el tercer grupo
funcional del enlazante. En este caso, los dos grupos funcionales
protegidos de la molécula enlazante se desprotegen simultáneamente,
y las dos cadenas peptídicas se sintetizan simultáneamente en las
aminas desprotegidas. Nótese que al usar esta técnica, las
secuencias de las cadenas peptídicas del dímero serán idénticas, y
los grupos protectores del tiol para los residuos de cisteína son
todos iguales.
Un método preferido para la síntesis peptídica
es la síntesis en fase sólida. Los procedimientos de síntesis
peptídica en fase sólida son bien conocidos en la técnica [véase,
por ejemplo, Stewart Solid Phase Peptide Syntheses (Freeman and
Co.: San Francisco) 1969; 2002/2003 General Catalog de Novabiochem
Corp, San Diego, USA; Goodman Synthesis of Peptides and
Peptidomimetics (Houben-Weyl, Stuttgart) 2002]. En
la síntesis en fase sólida, la síntesis se comienza típicamente a
partir del extremo C terminal del péptido utilizando una resina
\alpha-amino protegida. Puede prepararse un
material de partida adecuado, por ejemplo, uniendo el
\alpha-aminoácido requerido a una resina
clorometilada, una resina hidroximetilada, una resina de
poliestireno, una resina de benzhidrilamina o similares. Una resina
clorometilada se vende bajo la marca comercial
BIO-BEADS SX-1 por Bio Rad
Laboratories (Richmond, CA). La preparación de la resina
hidroximetilada se ha descrito [Bodonszky, y col. (1966) Chem. Ind.
London 38:1597]. La resina de benzhidrilamina (BHA) se ha descrito
[Pietta y Marshal (1970) Chem. Commun. 650], y la forma de
clorhidrato está comercialmente disponible de Beckman Instruments,
Inc. (Palo Alto, CA). Por ejemplo, un aminoácido protegido en
\alpha-amino puede acoplarse a una resina
clorometilada con la ayuda de un catalizador de bicarbonato de
cesio, de acuerdo con el método descrito por Gisin (1973) Helv.
Chim. Acta 56:1467.
Después del acoplamiento inicial, el grupo
protector de \alpha-amino se elimina, por ejemplo,
utilizando soluciones de ácido trifluoroacético (TFA) o ácido
clorhídrico (HCl) en disolventes orgánicos a temperatura ambiente.
Posteriormente, los aminoácidos protegidos en
\alpha-amino se acoplan sucesivamente a una cadena
peptídica creciente unida a un soporte. Los grupos protectores de
\alpha-amino son aquéllos conocidos como útiles
en la técnica de la síntesis paso a paso de péptidos, incluyendo:
grupos protectores del tipo acilo (por ejemplo, formilo,
trifluoroacetilo, acetilo), grupos protectores del tipo uretano
aromáticos [por ejemplo, benciloxicarbonilo (Cbz) y Cbz
sustituido], grupos protectores de uretano alifáticos [por ejemplo,
t-butiloxicarbonilo (Boc), isopropiloxicarbonilo,
ciclohexiloxicarbonilo], y grupos protectores del tipo alquilo (por
ejemplo, bencilo, trifenilmetilo), fluorenilmetil- oxicarbonilo
(Fmoc), aliloxicarbonilo (Alloc), y
1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)etilo
(Dde).
Los grupos protectores de la cadena lateral
(típicamente éteres, ésteres, tritilo, PMC, y similares), permanecen
intactos durante el acoplamiento y no hay disociación durante la
desprotección del grupo protector del extremo amino terminal o
durante el acoplamiento. El grupo protector de la cadena lateral
debe ser eliminable tras la terminación de la síntesis del péptido
final y bajo unas condiciones de reacción que no alteren el péptido
objetivo. Los grupos protectores de la cadena lateral para Tyr
incluyen tetrahidropiranilo, terc-butilo, tritilo,
bencilo, Cbz, Z-Br-Cbz y
2,5-diclorobencilo. Los grupos protectores de la
cadena lateral para Asp incluyen bencilo,
2,6-diclorobencilo, metilo, etilo, y ciclohexilo.
Los grupos protectores de la cadena lateral para Thr y Ser incluyen
acetilo, benzoilo, tritilo, tetrahidropiranilo, bencilo,
2,6-diclorobencilo y Cbz. Los grupos protectores de
la cadena lateral para Arg incluyen nitro, Tosilo (Tos), Cbz,
adamantiloxicarbonil mesitoilsulfonilo (Mts),
2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo
(Pbf),
4-metoxi-2,3,6-trimetil-bencenosulfonilo
(Mtr) o Boc. Los grupos protectores de la cadena lateral para Lys
incluyen Cbz, 2-clorobenciloxicarbonilo
(2-Cl-Cbz),
2-bromobenciloxicarbonilo
(2-Br-Cbz), Tos o
Boc.
Boc.
Después de la eliminación del grupo protector de
\alpha-amino, los aminoácidos protegidos restantes
se acoplan paso a paso en el orden deseado. Cada aminoácido
protegido se hace reaccionar generalmente en aproximadamente un
exceso de 3 veces, utilizando un activador del grupo carboxilo
apropiado, tal como hexafluorofosfato de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(HBTU) o diciclohexilcarbodimida (DCC) en solución, por ejemplo, en
cloruro de metileno (CH_{2}Cl_{2}), N-metil
pirrolidona, dimetil formamida (DMF), o mezclas de los mismos.
Una vez terminada la secuencia de aminoácidos
deseada, el péptido deseado se desacopla del soporte de la resina
mediante el tratamiento con un reactivo, tal como ácido
trifluoroacético (TFA) o ácido fluorhídrico (HF), lo cual no sólo
escinde el péptido de la resina, sino que también escinde todos los
grupos protectores de la cadena lateral. Cuando se utiliza una
resina clorometilada, el tratamiento con ácido fluorhídrico resulta
en la formación de los ácidos peptídicos libres. Cuando se utiliza
la resina de benzhidrilamina, el tratamiento con ácido fluorhídrico
resulta directamente en la amida peptídica libre. De manera
alternativa, cuando se emplea una resina clorometilada, el péptido
protegido en la cadena lateral puede desacoplarse mediante el
tratamiento de la resina peptídica con amoniaco, para dar la amida
protegida en la cadena lateral deseada o con una alquilamina para
dar una alquilamida o dialquilamida protegida en la cadena lateral.
La protección de la cadena lateral se elimina entonces de la manera
usual mediante el tratamiento con ácido fluorhídrico para
proporcionar las amidas, alquilamidas o dialquilamidas libres.
En la preparación de los ésteres de la
invención, se emplean las resinas utilizadas para preparar los
ácidos peptídicos, y el péptido protegido en la cadena lateral se
escinde con la base y el alcohol apropiados (por ejemplo, metanol).
Los grupos protectores de la cadena lateral se eliminan entonces de
la manera usual mediante el tratamiento con ácido fluorhídrico para
obtener el éster deseado.
Estos procedimientos también pueden utilizarse
para sintetizar péptidos en los cuales los aminoácidos diferentes
de los 20 aminoácidos naturales, codificados genéticamente, se
sustituyen en una, dos o más posiciones de cualquiera de los
compuestos de la invención. Los aminoácidos sintéticos que pueden
sustituirse en los péptidos de la presente invención incluyen, de
manera no exclusiva, N-metilo,
L-hidroxipropilo,
L-3,4-dihidroxifenilalanilo,
\delta aminoácidos tales como
L-\delta-hidroxilisilo y
D-\delta-metilalanilo,
L-\alpha-metilalanilo,
\beta-aminoácidos e isoquinolilo. Los
D-aminoácidos y los aminoácidos sintéticos no
naturales también pueden incorporarse en los péptidos de la
presente invención.
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También se pueden modificar los extremos amino
y/o carboxi terminales de los compuestos peptídicos de la invención,
para producir otros compuestos de la invención. Por ejemplo, los
extremos amino terminales pueden acetilarse con ácido acético o un
derivado halogenado del mismo, tal como ácido
\alpha-cloroacético, o ácido
\alpha-bromoacético o ácido
\alpha-yodoacético.
Se puede reemplazar las cadenas laterales
naturales de los 20 aminoácidos codificados genéticamente (o los D
aminoácidos estereoisoméricos) con otras cadenas laterales, por
ejemplo, con grupos tales como alquilo, alquilo inferior, alquilo
cíclico de 4, 5, 6 a 7 miembros, amida, alquil inferior amida,
di(alquil inferior) amida, alcoxi inferior, hidroxi, carboxi
y los derivados de ésteres inferiores de los mismos, y con un
heterociclo de 4, 5, 6 a 7 miembros. En particular, pueden
emplearse los análogos de prolina en los cuales el tamaño del
anillo del residuo de prolina se cambia de 5 miembros a 4, 6 ó 7
miembros. Los grupos cíclicos pueden ser saturados o no saturados,
y si no están saturados, pueden ser aromáticos o no aromáticos. Los
grupos heterocíclicos contienen, de manera preferida, uno o más
heteroátomos de nitrógeno, oxígeno y/o azufre. Los ejemplos de tales
grupos incluyen el furazanilo, furilo, imidazolidinilo,
imidazolilo, imidazolinilo, isotiazolilo, isoxazolilo, morfolinilo
(por ejemplo, morfolino), oxazolilo, piperacinilo (por ejemplo,
1-piperacinilo), piperidilo (por ejemplo,
1-piperidilo, piperidino), piranilo, piracinilo,
pirazolidinilo, pirazolinilo, pirazolilo, piridacinilo, piridilo,
pirimidinilo, pirrolidinilo (por ejemplo,
1-pirrolidinilo), pirrolinilo, pirrolilo,
tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo, tiomorfolinilo (por ejemplo,
tiomorfolino) y triazolilo. Estos grupos heterocíclicos pueden
estar sustituidos o no sustituidos. Cuando un grupo está sustituido,
el sustituyente puede ser alquilo, alcoxi, halógeno, oxígeno o
fenilo sustituido o no sustituido.
También se pueden modificar fácilmente los
péptidos mediante fosforilación y otros métodos [por ejemplo, como
se describe en Hruby, y col. (1990) Biochem J.
268:249-262].
Los compuestos peptídicos de la invención
también sirven como modelos estructurales para compuestos no
peptídicos con una actividad biológica similar. Los expertos en la
técnica reconocerán que está disponible una variedad de técnicas
para construir los compuestos con la misma o similar actividad
biológica deseada como el compuesto peptídico original, pero con
una actividad más favorable que el original con respecto a la
solubilidad, estabilidad y susceptibilidad a la hidrólisis y a la
proteólisis [Véase, Morgan y Gainor (1989) Ann. Rep. Med. Chem.
24:243-252]. Estas técnicas incluyen reemplazar la
cadena principal peptídica con una cadena principal compuesta de
fosfonatos, amidatos, carbamatos, sulfonamidas, aminas secundarias
y N-metilaminoácidos.
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Los compuestos de la presente invención
contienen dos enlaces de disulfuro intramoleculares. Tales enlaces
de disulfuro pueden formarse mediante la oxidación de los residuos
de cisteína de cada monómero peptídico.
En una forma de realización, el control de la
formación del enlace de cisteína se ejerce eligiendo un agente
oxidante del tipo y concentración eficaces para optimizar la
formación del isómero deseado. Por ejemplo, la oxidación de un
dímero peptídico para formar dos enlaces disulfuro intramoleculares
(uno en cada cadena peptídica), se logra de manera preferida (con
respecto a la formación de los enlaces disulfuro intermoleculares),
cuando el agente oxidante es DMSO o yodo (I_{2}).
En otras formas de realización, la formación de
los enlaces de cisteína se controla mediante el uso selectivo de
grupos protectores de tiol durante la síntesis peptídica. Por
ejemplo, cuando se desea un dímero con dos enlaces disulfuros
intramoleculares, la cadena peptídica del primer monómero se
sintetiza con los dos residuos de cisteína de la secuencia del
núcleo protegidos con un primer grupo protector de tiol [por
ejemplo, tritilo (Trt), aliloxicarbonilo (Alloc) y
1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)etilo
(Dde) o similar], entonces se sintetiza el segundo monómero
peptídico con los residuos de cisteína de la secuencia del núcleo
protegidos con un segundo grupo protector de tiol diferente del
primer grupo protector de tiol [por ejemplo, acetamidometilo (Acm),
t-butilo (tBu) o similar]. Posteriormente, los
primeros grupos protectores de tiol se eliminan efectuando la
ciclación del bisulfuro del primer monómero, y a continuación los
segundos grupos protectores de tiol se eliminan efectuando la
ciclación del bisulfuro del segundo monómero.
Otras formas de realización de esta invención
proporcionan análogos de estos derivados de disulfuro, en los
cuales uno de los azufres se ha reemplazado por un grupo CH_{2} u
otro isóstero para el azufre. Estos análogos pueden prepararse a
partir de los compuestos de la presente invención, en donde cada
monómero peptídico contiene al menos un residuo C o de homocisteína
y un ácido
\alpha-amino-\gamma-butírico
en lugar del segundo residuo de C, vía un desplazamiento
intramolecular o intermolecular, utilizando métodos conocidos en la
técnica [Véase, por ejemplo, Barker, y col. (1992) J. Med. Chem.
35:2040-2048 y Or, y col. (1991) J. Org. Chem.
56:3146-3149]. Un experto en la técnica reconocerá
fácilmente que este desplazamiento puede ocurrir también utilizando
otros homólogos del ácido
\alpha-amino-\gamma-butírico
y homocisteína.
Además de las estrategias de ciclación
anteriores, pueden emplearse otras estrategias de ciclación del
péptido distintas de las del disulfuro. Tales estrategias de
ciclación alternativas incluyen, por ejemplo, estrategias de
ciclación de la amida, así como aquéllas que involucran la formación
de enlaces tioéter. Así, los compuestos de la presente invención
pueden existir en una forma ciclada con un enlace de amida
intramolecular o un enlace tioéter intramolecular. Por ejemplo,
puede sintetizarse un péptido en el que una cisteína de la secuencia
del núcleo se reemplaza con lisina y la segunda cisteína se
reemplaza con ácido glutámico. Posteriormente, puede formarse un
monómero cíclico a través de un enlace de amida entre las cadenas
laterales de estos dos residuos. De manera alternativa, puede
sintetizarse un péptido en el que una cisteína de la secuencia del
núcleo se reemplaza con lisina (o serina). Puede formarse un
monómero cíclico a través de un enlace tioéter entre las cadenas
laterales del residuo de lisina (o serina) y el segundo residuo de
cisteína de la secuencia del núcleo. Por lo tanto, además de las
estrategias de ciclación del disulfuro, las estrategias de ciclación
de la amida y las estrategias de ciclación del tio-éter pueden
utilizarse fácilmente para ciclar los compuestos de la presente
invención. De manera alternativa, el extremo amino terminal del
péptido puede rematarse con un ácido acético \alpha- sustituido,
en el que el sustituyente \alpha es un grupo saliente, tal como
ácido \alpha-haloacético, por ejemplo, ácido
\alpha-cloroacético, ácido
\alpha-bromoacético o ácido
\alpha-yodoacético.
Los monómeros peptídicos pueden dimerizarse
mediante un resto enlazante de amida terciaria ramificada. En una
forma de realización, el enlazante se incorpora en el péptido
durante la síntesis peptídica. Por ejemplo, cuando un resto L_{K}
enlazante contiene dos grupos funcionales capaces de servir como
sitios de iniciación para la síntesis peptídica y uno o más de los
otros grupos funcionales (por ejemplo, un grupo carboxilo o un
grupo amino), que permiten la unión a uno o más restos moleculares,
el enlazante puede conjugarse con un soporte sólido. A
continuación, pueden sintetizarse directamente dos monómeros
peptídicos en los dos grupos nitrógeno reactivos del resto
enlazante L_{K} en una variación de la técnica de síntesis en fase
sólida.
En formas de realización alternativas, el
enlazante puede conjugarse con los dos monómeros peptídicos de un
dímero peptídico después de la síntesis peptídica. Tal conjugación
puede lograrse por métodos bien establecidos en la técnica. En una
forma de realización, el enlazante contiene dos grupos funcionales
adecuados para la unión a los grupos funcionales objetivo de los
monómeros peptídicos sintetizados. Por ejemplo, un enlazante que
contiene dos grupos carboxilo, preactivados o en presencia de un
reactivo de acoplamiento adecuado, puede hacerse reaccionar con los
grupos amino de la cadena lateral de lisina objetivo de cada uno de
los dos monómeros peptídicos.
Por ejemplo, los monómeros peptídicos pueden
acoplarse químicamente al enlazante de amida terciaria,
A*-C^{1}O-CH_{2}-X-CH_{2}-C^{2}O-B*
en donde: X es
NCO-(CH_{2})_{2}-NH-Y, e
Y es un grupo protector adecuado, tal como un grupo protector de
t-butiloxicarbonilo (Boc); A* es un grupo funcional
adecuado, tal como N-oxisuccinimida, utilizado para
conjugar C^{1} del enlazante al grupo
\varepsilon-amino del residuo de lisina C terminal
del primer monómero peptídico; y B* es un grupo funcional adecuado,
tal como N-oxisuccinimida, utilizado para conjugar
C^{2} del enlazante al grupo \varepsilon-amino
del residuo de lisina C terminal del segundo monómero
peptídico.
Adicionalmente, por ejemplo, los monómeros
peptídicos pueden acoplarse químicamente al enlazante de amida
terciaria,
A*-C^{1}O-CH_{2}-X-CH_{2}-C^{2}O-B*
en donde: X es
NCO-(CH_{2})_{2}-NH-C^{3}O-;
A* es un grupo funcional adecuado, tal como
N-oxisuccinimida, utilizado para conjugar C^{1}
del enlazante al grupo \varepsilon-amino del
residuo de lisina C terminal del primer monómero peptídico; y B* es
un grupo funcional adecuado, tal como N-oxi
succinimida, utilizado para conjugar C^{2} del enlazante al grupo
\varepsilon-amino del residuo de lisina C terminal
del segundo monómero peptídico; y el enlazante de amida terciaria
se une químicamente al resto
espaciador,
Y-NH-(CH_{2})_{4}-C^{4}H-NH-Y
en donde: C^{3} de X se une
covalentemente a C^{4} del espaciador; e Y es un grupo protector
adecuado, tal como un grupo protector de
t-butiloxicarbonilo
(Boc).
Los monómeros peptídicos pueden dimerizarse
mediante un resto enlazante L_{K} de lisina. En una forma de
realización, el enlazante de lisina se incorpora en el péptido
durante la síntesis peptídica. Por ejemplo, cuando el resto del
enlazante L_{K} de lisina contiene dos grupos funcionales capaces
de servir como sitios de iniciación para la síntesis peptídica, y
un tercer grupo funcional (por ejemplo, un grupo carboxilo o un
grupo amino), que permite la unión a otra porción molecular, el
enlazante puede conjugarse a un soporte sólido. Posteriormente,
pueden sintetizarse directamente dos monómeros peptídicos en los dos
grupos nitrógeno reactivos del resto enlazante L_{K} de lisina en
una variación de la técnica de síntesis en fase sólida.
En las formas de realización alternativas en las
que un dímero peptídico se dimeriza mediante un resto L_{K} del
enlazante de lisina, el enlazante puede conjugarse a los dos
monómeros peptídicos de un dímero peptídico después de la síntesis
peptídica. Tal conjugación puede lograrse por métodos bien
establecidos en la técnica. En una forma de realización, el
enlazante contiene al menos dos grupos funcionales adecuados para la
unión a los grupos funcionales objetivo de los monómeros peptídicos
sintetizados. Por ejemplo, los dos grupos amino libres de la lisina
pueden hacerse reaccionar con los grupos carboxilo C terminales de
cada uno de los dos monómeros peptídicos.
Los compuestos peptídicos de la invención
comprenden además un resto espaciador. En una forma de realización,
el espaciador puede incorporarse en el péptido durante la síntesis
peptídica. Por ejemplo, cuando un espaciador contiene un grupo
amino libre y un segundo grupo funcional (por ejemplo, un grupo
carboxilo o un grupo amino), que permiten la unión a otra porción
molecular, el espaciador puede conjugarse al soporte sólido.
En una forma de realización, el espaciador que
contiene dos grupos funcionales se acopla primero al soporte sólido
vía un primer grupo funcional. A continuación, la porción L_{K}
enlazante de lisina que tiene dos grupos funcionales capaces de
servir como sitios de iniciación para la síntesis peptídica y un
tercer grupo funcional (por ejemplo, un grupo carboxilo o un grupo
amino), que permite la unión a otro resto molecular, se conjuga al
espaciador vía el segundo grupo funcional del espaciador y el tercer
grupo funcional del enlazante. Posteriormente, pueden sintetizarse
dos monómeros peptídicos directamente en los dos grupos nitrógeno
reactivos del resto enlazante L_{K} en una variación de la
técnica de síntesis en fase sólida. Por ejemplo, un espaciador
acoplado a un soporte sólido con un grupo amino libre puede hacerse
reaccionar con un enlazante de lisina vía el grupo carboxilo libre
del enlazante.
En las formas de realización alternativas, el
espaciador puede conjugarse al dímero peptídico después de la
síntesis peptídica. Tal conjugación puede lograrse por métodos bien
establecidos en la técnica. En una forma de realización, el
enlazante contiene al menos un grupo funcional adecuado para la
unión al grupo funcional del péptido sintetizado. Por ejemplo, un
espaciador con un grupo amino libre puede hacerse reaccionar con un
grupo carboxilo C terminal del péptido. En otro ejemplo, un
enlazante con un grupo carboxilo libre puede hacerse reaccionar con
el grupo amino libre de una amida de lisina.
En años recientes, los polímeros solubles en
agua, tales como el polietilenglicol (PEG), se han utilizado para
la modificación covalente de péptidos de importancia terapéutica y
diagnóstica. Se piensa que la unión de tales polímeros mejora la
actividad biológica, prolonga el tiempo de circulación en la sangre,
reduce la inmunogenicidad, incrementa la solubilidad acuosa y
mejora la resistencia a la digestión de la proteasa. Por ejemplo,
se ha informado de que la unión covalente del PEG a polipéptidos
terapéuticos tales como las interleucinas [Knauf, y col. (1988) J.
Biol. Chem. 263; 15064; Tsutsumi, y col. (1995) J. Controlled
Release 33:447), interferones (Kita, y col. (1990) Drug Des.
Delivery 6:157), catalasa (Abuchowski, y col. (1977) J. Biol. Chem.
252:582), superóxido dismutasa (Beauchamp, y col. (1983) Anal.
Biochem. 131:25), y adenosina desaminasa (Chen, y col. (1981)
Biochim. Biophy. Acta 660:293), extiende su semivida in vivo,
y/o reducen su inmunogenicidad y antigenicidad.
Los compuestos peptídicos de la invención pueden
comprender un resto de polietilenglicol (PEG), el cual está unido
covalentemente al enlazante de amida terciaria ramificada del
espaciador del dímero peptídico vía un enlace de carbamato o vía un
enlace de amida. Un ejemplo del PEG utilizado en la presente
invención es un PEG lineal, no ramificado, que tiene un peso
molecular de aproximadamente 20 kiloDaltons (20K) a aproximadamente
40K (el término "aproximadamente" indica que en las
preparaciones de PEG, algunas moléculas pesarán más, otras menos,
que el peso molecular indicado). De manera preferida, el PEG tiene
un peso molecular de aproximadamente 30K a aproximadamente 40K.
Otro ejemplo del PEG utilizado en la presente
invención es un PEG lineal que tiene un peso molecular de
aproximadamente 10K a aproximadamente 60K (el término
"aproximadamente" indica que en las preparaciones de PEG,
algunas moléculas pesarán más, otras menos, que el peso molecular
indicado). De manera preferida, el PEG tiene un peso molecular de
aproximadamente 20K a aproximadamente 40K. De manera más preferida,
el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20K.
A continuación se describen ejemplos de los
métodos para la unión covalente del PEG (PEGilación). Estas
descripciones ilustrativas no pretenden ser limitantes. Un experto
normal en la técnica apreciará que está bien establecida en la
técnica una variedad de métodos para la unión covalente de una
amplia gama de PEG. Por lo tanto, la presente invención abarca los
compuestos peptídicos a los cuales se ha unido el PEG mediante
cualquiera de los numerosos métodos de unión conocidos en la
técnica.
Por ejemplo, el PEG puede estar unido
covalentemente al enlazante vía un grupo reactivo, al cual puede
unirse una molécula activada de PEG (por ejemplo, un grupo amino o
un grupo carboxilo libre). Las moléculas de PEG pueden unirse a los
grupos amino utilizando PEG metoxilado ("mPEG"), que tiene
diferentes restos reactivos. Tales polímeros incluyen succinato de
PEG-succinimidilo, carbonato de
mPEG-succinimidilo, mPEG-imidato,
carbonato de mPEG-4-nitrofenilo y
cloruro cianúrico de mPEG. De manera similar, las moléculas de PEG
pueden unirse a los grupos carboxilo utilizando PEG metoxilado con
un grupo amino libre (mPEG-NH_{2}).
En algunas formas de realización, el enlazante o
el espaciador contiene un grupo amino terminal (es decir, colocado
en el extremo del espaciador). Este grupo amino terminal puede
hacerse reaccionar con una molécula activada de PEG adecuada, tal
como carbonato de
mPEG-para-nitrofenilo
(mPEG-NPC), para hacer un enlace carbamato
covalente estable. De manera alternativa, este grupo amino terminal
puede hacerse reaccionar con una molécula activada de PEG adecuada,
tal como butirato de mPEG-succinimidilo
(mPEG-SBA) o propionato de
mPEG-succinimidilo (mPEG-SPA), que
contiene un grupo reactivo de
N-hidroxi-succinimida (NHS), para
hacer un enlace carbamato covalente estable. En otras formas de
realización, el grupo reactivo enlazante contiene un grupo carboxilo
capaz de activarse para formar un enlace covalente con una molécula
de PEG que contiene amina bajo condiciones de reacción adecuadas.
Las moléculas de PEG adecuadas incluyen
mPEG-NH_{2}, y las condiciones de reacción
adecuadas incluyen formación de amina mediada por carbodiimida o
similar.
Los ensayos de unión competitiva in vitro
cuantifican la capacidad del péptido de prueba para competir con la
EPO para unirse al EPO-R. Por ejemplo (véase, por
ejemplo, como se describe en la Patente de EE.UU. 5,773,569), el
dominio extracelular del EPO-R humano (proteína que
se une a la EPO, EBP), puede producirse por recombinación en E.
coli y la proteína recombinante acoplarse a un soporte sólido,
tal como una placa de microtitulación o una perla sintética [por
ejemplo, perlas Sulfolink de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)].
La EBP inmovilizada se incuba a continuación con EPO recombinante
marcada, o con EPO recombinante marcada y un péptido de prueba. Se
emplean diluciones seriadas del péptido de prueba para tales
experimentos. Los puntos de ensayo sin péptido de prueba agregado
definen la unión total de la EPO a la EBP. Para reacciones que
contienen el péptido de prueba, la cantidad de EPO unida se
cuantifica y expresa en porcentaje de la unión del control (total =
100%). Estos valores se representan frente a la concentración del
péptido. El valor de CI50 se define como la concentración del
péptido de prueba, la cual reduce la unión de la EPO a la EBP en un
50% (es decir, 50% de inhibición de la unión de la EPO).
Un ensayo de unión competitiva in vitro
diferente mide la señal luminosa generada como una función de la
proximidad de dos perlas: una perla conjugada con EPO y una perla
conjugada con EPO-R. La proximidad de la perla se
genera por la unión de la EPO al EPO-R. Un péptido
de prueba que compite con la EPO para unirse al
EPO-R evitará esta unión, causando una disminución
en la emisión de luz. La concentración del péptido de prueba que
produce una disminución del 50% en la emisión de luz, se define como
el valor de la CI50.
Los péptidos de la presente invención compiten
de manera muy eficiente con la EPO para unirse al
EPO-R. Esta función mejorada se manifiesta en su
capacidad para inhibir la unión de la EPO a concentraciones
sustancialmente menores del péptido (es decir, tienen valores de
CI50 muy bajos).
La actividad biológica y la potencia de los
agonistas de EPO-R peptídicos monoméricos y
diméricos de la invención, que se unen específicamente al receptor
de la EPO, pueden medirse utilizando ensayos funcionales basados en
células in vitro.
Un ensayo se basa en una línea de prelinfocitos
B murinos, que expresan el EPO-R humano y que se
transfectan además con un constructo del gen reportero de
luciferasa dirigido por el promotor fos. Tras la exposición a la
EPO o a otro agonista del EPO-R, tales células
responden sintetizando luciferasa. La luciferasa causa la emisión
de luz tras la adición de su sustrato luciferina. Así, el nivel de
activación del EPO-R en tales células puede
cuantificarse midiendo la actividad de la luciferasa. La actividad
de un péptido de prueba se mide agregando diluciones seriadas del
péptido de prueba a las células, las cuales se incuban después
durante 4 horas. Después de la incubación, el sustrato de
luciferina se agrega a las células, y se mide la emisión de luz. La
concentración del péptido de prueba que produce una emisión de luz
ssemimáxima se registra como la CE50.
Los péptidos de la presente invención muestran
una capacidad muy aumentada para promover la expresión de la
luciferasa dependiente de la señalización del EPO-R
en este ensayo. Esta función mejorada se manifiesta en su capacidad
para proporcionar la mitad de la actividad máxima de la luciferasa a
concentraciones sustancialmente menores del péptido (es decir,
tienen valores de CE50 muy bajos). Este ensayo es un método
preferido para estimar la potencia y la actividad de un péptido
agonista del EPO-R de la invención.
Otro ensayo puede realizarse utilizando células
FDC-P1/ER [Dexter, y col. (1980) J. Exp. Med.
152:1036-1047], una línea celular derivada de la
médula ósea murina no transformada bien caracterizada, en la cual se
ha transfectado de manera estable el EPO-R. Estas
células exhiben proliferación dependiente de la EPO.
En un ensayo de este tipo, las células se
cultivan a la mitad de la densidad estacionaria en presencia de los
factores de crecimiento necesarios (véase, por ejemplo, como se
describe en la Patente de EE.UU. 5.773.569). A continuación las
células se lavan en PBS y se detienen durante 16-24
horas en medio completo sin factores de crecimiento. Después de
determinar la viabilidad de las células (por ejemplo, mediante
tinción con azul de tripano), se hacen soluciones madre (en medio
completo, sin los factores de crecimiento), para proporcionar
aproximadamente 10^{5} células por 50 \muL. Las diluciones
seriadas de los compuestos agonistas de EPO-R
peptídicos (típicamente el péptido libre en fase de solución, en
oposición a uno unido a un fago u otro péptido unido o
inmovilizado) que se han de ensayar se realizan en placas de cultivo
de tejido de 96 pocillos para un volumen final de 50 \muL por
pocillo. Se agregan las células (50 \muL) a cada pocillo, y las
células se incuban 24-48 horas, punto en el cual
los controles negativos deben morir o ser inactivos. La
proliferación celular se mide a continuación mediante técnicas
conocidas en la técnica, tales como el ensayo MTT que mide la
incorporación de H^{3}-timidina como una
indicación de la proliferación celular [véase, Mosmann (1983) J.
Immunol. Methods 65:55-63]. Los péptidos se evalúan
en la línea celular que expresa el EPO-R y la línea
celular original que no lo expresa. La concentración del péptido de
prueba necesaria para proporcionar la mitad de la proliferación
celular máxima se registra como la CE50.
Los péptidos de la presente invención muestran
una capacidad muy mejorada para promover el crecimiento celular
dependiente de la EPO en este ensayo. Esta función mejorada se
manifiesta en su capacidad para proporcionar la mitad de la
actividad de estimulación de la proliferación celular máxima a
concentraciones sustancialmente menores del péptido (es decir,
tienen valores de CE50 muy bajos). Este ensayo es un método
preferido para estimar la potencia y la actividad de un péptido
agonista del EPO-R de la invención.
En otro ensayo, las células se cultivan hasta la
fase estacionaria en medio suplementado con EPO, se recolectan, y a
continuación se cultivan durante 18 horas adicionales en medio sin
EPO. Las células se dividen en tres grupos de densidad celular
igual: un grupo sin factor agregado (control negativo), un grupo con
EPO (control positivo), y un grupo experimental con el péptido de
prueba. Las células cultivadas se recolectan entonces a diferentes
intervalos de tiempo, se fijan y se tiñen con un tinte fluorescente
que se une al ADN (por ejemplo, yoduro de propidio o tinte de
Hoechst, ambos disponibles de Sigma). A continuación se mide la
fluorescencia, por ejemplo, utilizando un citómetro FACS Scan Flow.
El porcentaje de células en cada fase del ciclo celular puede
determinarse entonces, por ejemplo, utilizando el modelo SOBR del
programa CelIFIT (Becton Dickinson). Las células tratadas con EPO o
un péptido activo mostrarán una proporción mayor de células en la
fase S (como se determina por el incremento de fluorescencia como
un indicador del contenido incrementado de ADN), con relación al
grupo de control negativo.
Pueden realizarse ensayos similares utilizando
las líneas celulares FDCP-1 [véase, por ejemplo,
Dexter y col. (1980) J. Exp. Med. 152:1036-1047] o
TF-1 [Kitamura, y col. (1989) Blood
73:375-380]. La FDCP-1 es una línea
celular progenitora hematopoyética primitiva pluripotente murina,
dependiente de factores de crecimiento, que puede proliferar, pero
no diferenciarse cuando se suplementa con medio acondicionado con
WEHI-3 (un medio que contiene IL-3,
número ATCC TIB-68). Para tales experimentos, la
línea celular FDCP-1 se transfecta con el
EPO-R humano o murino, para producir las líneas
celulares
FDCP-1-hEPO-R o
FDCP-1-mEPO-R,
respectivamente, que pueden proliferar, pero no diferenciarse, en
presencia de EPO. La TF-1, una línea celular
dependiente de la EPO, también puede utilizarse para medir los
efectos de los agonistas peptídicos de EPO-R en la
proliferación celular.
En aún otro ensayo, el procedimiento expuesto en
Krystal (1983) Exp. Hematol 11:649-660 para un
microensayo basado en la incorporación de
H^{3}-timidina en las células del bazo, puede
emplearse para determinar la capacidad de los compuestos de la
presente invención para servir como agonistas de la EPO. Brevemente,
los ratones B6C3F_{1} se inyectaron diariamente durante dos días
con fenilhidracina (60 mg/kg). Al tercer día, se retiraron las
células del bazo y se determinó su capacidad para proliferar durante
un periodo de 24 horas utilizando un ensayo con MTT.
La unión de la EPO al EPO-R en
una línea celular sensible a la eritropoyetina induce la
fosforilación de la tirosina en el receptor y en numerosas
proteínas intracelulares, incluyendo Shc, vav y la cinasa JAK2. Por
lo tanto, otro ensayo in vitro mide la capacidad de los
péptidos de la invención para inducir la fosforilación de la
tirosina del EPO-R y de las proteínas de
transducción de señales intracelulares corriente abajo. Los
péptidos activos, identificados por ensayos de unión y proliferación
descritos anteriormente, provocan un patrón de fosforilación casi
idéntico a aquél de la EPO en las células sensibles a la
eritropoyetina. Para este ensayo, las células
FDC-P1/ER [Dexter, y col. (1980) J Exp Med
152:1036-47], se mantienen en medio suplementado
con EPO, y se cultivan hasta la fase estacionaria. Estas células se
cultivan a continuación en medio sin EPO durante 24 horas. Un
número definido de tales células se incuba entonces con un péptido
de prueba durante aproximadamente 10 minutos a 37ºC. También se
corrió con cada ensayo una muestra de control de las células con
EPO. Las células tratadas se recolectaron entonces mediante
centrifugación, se resuspendieron en tampón de lisis con SDS, y se
sometieron a electroforesis sobre gel de poliacrilamida con SDS. Las
proteínas sometidas a electroforesis en el gel se transfirieron a
nitrocelulosa, y las proteínas transferidas que contienen la
fosfotirosina se visualizan mediante técnicas inmunológicas
convencionales. Por ejemplo, el material transferido puede
sondearse con un anticuerpo antifosfotirosina (por ejemplo, IgG
antifosfotirosina de ratón de Upstate Biotechnology, Inc.),
lavarse, y a continuación sondearse con un anticuerpo secundario
[por ejemplo, IgG de anti-ratón de cabra marcado
con peroxidasa de Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.
(Washington, DC)]. Posteriormente, las proteínas que contienen la
fosfotirosina pueden visualizarse mediante técnicas convencionales,
incluyendo ensayos colorimétricos, quimioluminiscentes o
fluorescentes. Por ejemplo, puede realizarse un ensayo
quimioluminiscente utilizando el Sistema de ECL Western Blotting de
Amersham.
Otro ensayo in vitro basado en células
que puede utilizarse para valorar la actividad de los péptidos de
la presente invención, es un ensayo de colonias que usa células de
médula ósea murinas o de sangre periférica humana. La médula ósea
puede obtenerse de fémures de ratones, mientras que una muestra de
sangre periférica humana puede obtenerse de un donante sano. En el
caso de la sangre periférica, las células mononucleares se aíslan
primero a partir de la sangre, por ejemplo, mediante centrifugación
a través de un gradiente de Ficoll-Hypaque [Stem
Cell Technologies, Inc. (Vancouver, Canadá)]. Para este ensayo, se
realiza un recuento de las células nucleadas para establecer el
número y concentración de las células nucleadas en la muestra
original. Un número definido de células se siembra en metil
celulosa conforme a las instrucciones del fabricante [Stem Cell
Technologies, Inc. (Vancouver, Canadá)]. Un grupo experimental se
trata con un péptido de prueba, un grupo de control positivo se
trata con EPO, y un grupo de control negativo no recibe tratamiento.
A continuación se puntúa el número de colonias en crecimiento para
cada grupo después de periodos definidos de incubación, generalmente
de 10 días y 18 días. Un péptido activo fomentará la formación de
colonias.
Otros ensayos biológicos in vitro que
pueden utilizarse para demostrar la actividad de los compuestos de
la presente invención se describen en Greenberger, y col. (1983)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2931-2935 (línea
celular progenitora hematopoyética dependiente de la EPO); Quelle y
Wojchowski (1991) J. Biol. Chem. 266:609-614
(fosforilación de la proteína tirosina en células B6SUt.EP);
Dusanter-Fourt, y col. (1992) J. Biol. Chem.
287:10670-10678 (fosforilación de la tirosina del
receptor de la EPO en células humanas sensibles a la EPO); Quelle,
y col. (1992) J. Biol. Chem. 267:17055-17060
(fosforilación de la tirosina de una proteína citosólica, pp 100,
en células FDC-ER); Worthington, y col. (1987) Exp.
Hematol. 15:85-92 (ensayo colorimétrico para la
hemoglobina); Kaiho y Miuno (1985) Anal. Biochem.
149:117-120 (detección de la hemoglobina con
2,7-diaminofluoreno); Patel, y col. (1992) J. Biol.
Chem. 267:21300-21302 (expresión de
c-myb); Witthuhn, y col. (1993) Cell
74:227-236 (asociación y fosforilación de la
tirosina de JAK2); Leonard, y col. (1993) Blood
82:1071-1079 (expresión de los factores de
transcripción GATA); y Ando, y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90:9571-9575 (regulación de la transición
G_{1} ciclando D2 y D3).
Se ha informado de que un instrumento diseñado
por Molecular Devices Corp., conocido como microfisiómetro, se ha
utilizado con éxito para mediciones del efecto de los agonistas y
antagonistas en varios receptores. La base para este aparato es la
medición de las alteraciones en la velocidad de acidificación del
medio extracelular en respuesta a la activación del receptor.
Un ensayo funcional in vivo que puede
utilizarse para valorar la potencia de un péptido de prueba es el
bioensayo de ratón exhipóxico policitémico. Para este ensayo, los
ratones se sometieron a un ciclo de acondicionamiento alterno
durante varios días. En este ciclo, los ratones alternan entre
periodos de condiciones hipobáricas y condiciones de presión
ambiental. Posteriormente, los ratones se mantienen a presión
ambiental durante 2-3 días antes de la
administración de las muestras de prueba. Las muestras del péptido
de prueba o el patrón de EPO en el caso de los ratones de control
positivo, se inyectan subcutáneamente en los ratones acondicionados.
Se administra hierro radiomarcado (por ejemplo, Fe^{59}) 2 días
después, y las muestras de sangre se toman dos días después de la
administración del hierro radiomarcado. Las mediciones de los
hematocritos y la radiactividad se determinaron entonces para cada
muestra de sangre mediante técnicas convencionales. Las muestras de
sangre de ratones inyectados con los péptidos de prueba activos
mostrarán mayor radiactividad (debido a la unión del Fe^{59} a la
hemoglobina de los eritrocitos), que los ratones que no recibieron
los péptidos de prueba o EPO.
Otro ensayo funcional in vivo que puede
utilizarse para valorar la potencia de un péptido de prueba es el
ensayo de reticulocito. Para este ensayo, los ratones no tratados
normales se inyectaron subcutáneamente en tres días consecutivos
con EPO o el péptido de prueba. En el tercer día, los ratones se
inyectaron intraperitonealmente con dextrano de hierro. En el día
cinco, se recolectaron las muestras de sangre de los ratones. El
porcentaje (%) de reticulocitos en la sangre se determinó mediante
tinción con naranja de tiazol y análisis con el citómetro de flujo
(programa retic-count). Además, los hematocritos se
determinaron manualmente. El porcentaje de reticulocitos corregido
se determinó utilizando la siguiente fórmula:
%RETIC_{CORREGIDO} =
%RETIC_{OBSERVADO} X
(Hematocritos_{INDIVIDUALES}/Hematocritos_{NORMALES}),
Los compuestos de prueba activos mostrarán un
nivel incrementado de %RETIC_{CORREGIDO} con relación a los
ratones que no recibieron los péptidos de prueba o EPO.
Los compuestos peptídicos de la invención son
útiles in vitro como herramientas para entender el papel
biológico de la EPO, incluyendo la evaluación de muchos factores que
se piensa influyen y son influenciados por la producción de EPO y
la unión de la EPO al EPO-R (por ejemplo, el
mecanismo de transducción de la señal
EPO/EPO-R/activación del receptor). Los péptidos
presentes también son útiles en el desarrollo de otros compuestos
que se unen al EPO-R, debido a que los presentes
compuestos proporcionan una importante información de la relación
estructura-actividad que facilita el desarrollo.
Además, basándose en su capacidad para unirse al
EPO-R, los péptidos de la presente invención pueden
utilizarse como reactivos para detectar el EPO-R en
células vivas; células fijas; en fluidos biológicos; en homogenados
de tejido; en materiales biológicos naturales purificados; etc. Por
ejemplo, marcando tales péptidos, se pueden identificar las células
que tienen EPO-R en sus superficies. Además,
basándose en su capacidad para unirse al EPO-R, los
péptidos de la presente invención pueden utilizarse en tinción in
situ, análisis FACS (clasificación de las células activada por
fluorescencia), transferencia Western, ELISA (ensayo de
inmunoabsorción con enzimas ligadas), etc. Además, basándose en su
capacidad para unirse al EPO-R, los péptidos de la
presente invención pueden utilizarse en la purificación del
receptor, o en la purificación de células que expresan el
EPO-R en la superficie celular (o dentro de células
permeabilizadas).
Los péptidos de la invención también pueden
utilizarse como reactivos comerciales para diversos propósitos de
investigación y diagnóstico médico. Tales usos pueden incluir, de
manera no exclusiva: (1) uso como patrón de calibración para
cuantificar las actividades de los agonistas candidatos de
EPO-R en una variedad de ensayos funcionales; (2)
uso como reactivos bloqueantes en un cribado de péptidos aleatorios,
es decir, al buscar nuevas familias de ligandos peptídicos para
EPO-R, los péptidos pueden utilizarse para bloquear
la recuperación de los péptidos de EPO de la presente invención;
(3) uso en la cocristalización con EPO-R, es decir,
pueden formarse cristales de los péptidos de la presente invención
unidos al EPO-R, permitiendo la determinación de la
estructura receptor/péptido mediante cristalografía con rayos X; (4)
uso para medir la capacidad de las células precursoras de los
eritrocitos para inducir la síntesis de globina y la síntesis del
complejo hemo, y para incrementar el número de receptores de
ferritina, iniciando la diferenciación; (5) uso para mantener la
proliferación y crecimiento de las líneas celulares dependientes de
la EPO, tales como las líneas celulares
FDCP-1-mEPO-R y
TF-1; (6) uso relacionado con el marcado de los
péptidos de la invención con un cromóforo radioactivo; y (7) otras
aplicaciones de investigación y diagnóstico, en las que el
EPO-R se activa de manera preferida o tal
activación es calibrada convenientemente contra una cantidad
conocida de un agonista de EPO-R y similares.
En aún otro aspecto de la presente invención, se
proporcionan métodos de tratamiento y fabricación de un medicamento.
Los compuestos peptídicos de la invención pueden administrarse a
animales de sangre caliente, incluyendo seres humanos, para
estimular la unión de la EPO al EPO-R in
vivo. Así, la presente invención abarca métodos para el
tratamiento terapéutico de trastornos asociados con una deficiencia
de la EPO, métodos los cuales comprenden administrar un péptido de
la invención en cantidades suficientes para estimular el
EPO-R y así aliviar los síntomas asociados con una
deficiencia de la EPO in vivo. Por ejemplo, los péptidos de
esta invención encontrarán uso en el tratamiento de la
insuficiencia renal y/o en el fallo renal en estado
terminaldiálisis; anemia asociada con el SIDA; anemia asociada con
enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, artritis
reumatoide e inflamación crónica del intestino) y enfermedad
autoinmune; y para reforzar el recuento de eritrocitos de un
paciente antes de la cirugía. Otros estados patológicos, trastornos
y estados de irregularidad hematológica que pueden tratarse
mediante la administración de los péptidos de esta invención
incluyen: beta-talasemia; fibrosis quística;
embarazo y trastornos menstruales; anemia temprana de la premadurez;
lesión de la médula espinal; vuelos al espacio; pérdida aguda de
sangre; envejecimiento; apoplejía; isquemia (tanto del SNC como
cardiaca); y varios estados de enfermedad neoplásica acompañados por
eritropoyesis anormal.
En otras formas de realización, los compuestos
peptídicos de la invención pueden utilizarse para el tratamiento de
trastornos que no están caracterizados por eritrocitos bajos o
deficientes, por ejemplo, como un pretratamiento antes de las
transfusiones. Además, la administración de los compuestos de esta
invención puede resultar en una disminución en el tiempo de
sangrado y así encuentra uso en la administración a los pacientes
antes de la cirugía o para indicaciones en donde se espera que
ocurra sangrado. Además, los compuestos de esta invención
encontrarán uso en la activación de los megacariocitos.
Puesto que la EPO ha mostrado tener un efecto
mitogénico y quimiotáctico en las células endoteliales vasculares,
así como un efecto en las neuronas colinérgicas centrales [véase,
por ejemplo, Amagnostou, y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:5978-5982 y Konishi, y col. (1993) Brain Res.
609:29-35], los compuestos de esta invención
también encontrarán uso en el tratamiento de una variedad de
trastornos vasculares, tales como: promover la curación de las
heridas; promover el crecimiento de los vasos sanguíneos coronarios
colaterales (tales como aquéllos que pueden ocurrir después de un
infarto del miocardio); tratamiento de traumatismos; y tratamiento
del injerto postvascular. Los compuestos de esta invención también
encontrarán uso en el tratamiento de una variedad de trastornos
neurológicos, caracterizados generalmente por bajos niveles
absolutos de acetilcolina o niveles relativamente bajos de
acetilcolina, en comparación con otras sustancias neuroactivas, por
ejemplo neurotransmisores.
En aún otro aspecto de la presente invención, se
proporcionan composiciones farmacéuticas de los compuestos
peptídicos agonistas del EPO-R anteriores. Los
estados aliviados o modulados por la administración de tales
composiciones incluyen aquéllos indicados anteriormente. Tales
composiciones farmacéuticas pueden ser para la administración por
vía oral, parenteral (inyección intramuscular, intraperitoneal,
intravenosa (IV) o subcutánea), transdérmica (ya sea pasivamente o
utilizando iontoforesis o electroporación), transmucosal (nasal,
vaginal, rectal o sublingual) o utilizando insertos bioerosionables
y pueden formularse en formas de dosificación apropiadas para cada
vía de administración. En general, están comprendidas por la
invención las composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades
efectivas de un péptido agonista del EPO-R, o
productos derivados de la invención, junto con diluyentes,
conservadores, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o
portadores farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones
incluyen diluyentes de diferentes contenidos de tampón (por ejemplo,
Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica;
aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (por
ejemplo, Tween 20, Tween 80, Polisorbato 80), antioxidantes (por
ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservadores
(por ejemplo, Timersol, alcohol bencílico) y sustancias de carga
(por ejemplo, lactosa, manitol); incorporación del material en
preparaciones particuladas de compuestos poliméricos, tales como
ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., o en liposomas.
También puede utilizarse el ácido hialurónico. Tales composiciones
pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de
liberación in vivo, y la velocidad de aclaramiento in
vivo de las proteínas y derivados presentes. Véase, por ejemplo,
Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. (1990, Mack Publishing
Co., Easton, PA 18042), páginas 1435-1712,. Las
composiciones pueden prepararse en forma líquida, o pueden ser en
forma de polvo seco (por ejemplo,
liofilizado).
liofilizado).
Para el uso en la presente invención están
contempladas las formas de dosificación sólidas orales, las cuales
se describen generalmente en Remington's Pharmaceutical Sciences,
18a Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042) en el Capítulo
89. Las formas de dosificación sólida incluyen comprimidos,
cápsulas, píldoras, pastillas o grageas, sellos, pellets, polvos o
gránulos. También puede utilizarse la encapsulación liposomal o
proteinoide para formular las presentes composiciones (como por
ejemplo, las microesferas proteinoides descritas en la Patente de
EE.UU. No. 4.925.673). Puede utilizarse la encapsulación liposomal y
los liposomas pueden derivarse con diversos polímeros (por ejemplo,
Patente de EE.UU. No. 5.013.556). Marshall, K. En: Modern
Pharmaceutics, Editado por G. S. Banker y C. T. Rhodes, Capítulo
10, 1979, proporcionauna descripción de posibles formas de
dosificación sólidas para el agente terapéutico. En general, la
formulación incluirá los péptidos agonistas de
EPO-R (o las formas modificadas químicamente de los
mismos), e ingredientes inertes que permitirán la protección contra
el medio estomacal, y la liberación del material biológicamente
activo en el intestino.
También contempladas para el uso en la presente
invención están las formas de dosificación líquidas para la
administración oral, que incluyen emulsiones, soluciones,
suspensiones y jarabes farmacéuticamente aceptables, que pueden
contener otros componentes, que incluyen diluyentes inertes;
adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y
de suspensión; y agentes edulcorantes, saborizantes y
perfumantes.
Los péptidos pueden modificarse químicamente de
manera que la administración oral del derivado sea eficaz.
Generalmente, la modificación química contemplada es la unión de al
menos un resto a la molécula del componente misma, en donde el
resto permite (a) la inhibición de la proteólisis; y (b) la
captación en la corriente sanguínea del estómago o el intestino.
También se desea el incremento en la estabilidad total del
componente o componentes y un incremento en el tiempo de
circulación en el cuerpo. Como se discutió anteriormente, la
PEGilación es la modificación química preferida para el uso
farmacéutico. Otros restos que pueden utilizarse incluyen:
propilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol,
carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico),
polivinilpirrolidona, poliprolina,
poli-1,3-dioxolano y
poli-1,3,6-tioxocano [véase, por
ejemplo, Abuchowski y Davis (1981) "Soluble
Polymer-Enzyme Adducts", en Enzymes as Drugs.
Hocenberg y Roberts, eds. (Wiley-Interscience: New
York, NY) pp. 367-383; y Newmark, y col. (1982) J.
Appl. Biochem. 4:185-189].
Para las formulaciones orales, la ubicación de
la liberación puede ser el estómago, el intestino delgado (el
duodeno, el yeyuno o el íleo), o el intestino grueso. Un experto en
la técnica tiene formulaciones disponibles que no se disolverán en
el estómago, aunque liberarán el material en el duodeno o en algún
otro lugar en el intestino. De manera preferida, la liberación
evitará los efectos nocivos del medio estomacal, ya sea mediante la
protección del péptido (o derivado), o mediante la liberación del
péptido (o derivado) más allá del medio estomacal, tal como en el
intestino.
Para asegurar la resistencia gástrica completa,
es esencial un recubrimiento impermeable a un pH de al menos 5,0.
Los ejemplos de los ingredientes inertes más comunes que se utilizan
como recubrimientos entéricos son acetato trimelitato de celulosa
(CAT), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), HPMCP 50,
HPMCP 55, acetato ftalato de polivinilo (PVAP), Eudragit L30D,
Aquateric, acetato ftalato de celulosa (CAP), Eudragit L, Eudragit
S y Shellac. Estos recubrimientos pueden utilizarse como películas
mixtas.
Un recubrimiento o mezcla de recubrimientos
puede utilizarse también en los comprimidos, en los cuales no se
pretande una la protección contra el estómago. Estos pueden incluir
recubrimientos de azúcar, o recubrimientos que hacen que el
comprimido resulte más fácil de deglutir. Las cápsulas pueden
constar de una cubierta dura (tal como gelatina) para la
administración del agente terapéutico seco (es decir, polvo), para
formas líquidas se puede utilizar una cubierta de gelatina blanda.
El material de cubierta de los sellos debe ser almidón grueso u
otro papel comestible. Para las píldoras, grageas, comprimidos
moldeados o triturados de comprimidos, pueden utilizarse técnicas
de aglomeramiento en húmedo.
El péptido (o derivado) puede incluirse en la
formulación como múltiples partículas finas en forma de gránulos o
pellets de un tamaño de partícula de aproximadamente 1 mm. La
formulación del material para la administración en cápsulas podría
ser en polvo, cilindros ligeramente comprimidos, o incluso como
comprimidos. Estos agentes terapéuticos pueden prepararse mediante
compresión.
También pueden incluirse agentes colorantes y/o
saborizantes. Por ejemplo, el péptido (o derivado) puede formularse
(tal como mediante encapsulación en liposomas o microesferas), y a
continuación introducirse además dentro de un producto comestible,
tal como una bebida refrigerada que contiene agentes colorantes y
saborizantes.
Se puede diluir o incrementar el volumen del
péptido (o derivado) con un material inerte. Estos diluyentes
podrían incluir carbohidratos, especialmente manitol,
\alpha-lactosa, lactosa anhidra, celulosa,
sacarosa, dextranos modificados y almidón. Ciertas sales
inorgánicas pueden utilizarse también como cargas, incluyendo
trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio.
Algunos diluyentes comercialmente disponibles son
Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500,
Emcompress y Avicell.
Pueden incluirse desintegrantes en la
formulación del agente terapéutico en una forma de dosificación
sólida. Los materiales utilizados como desintegrates incluyen, de
manera no exclusiva, almidón, incluyendo el desintegrante comercial
basado en almidón, Explotab. Pueden utilizarse glicolato de almidón
sódico, Amberlite, carboximetilcelulosa sódica, ultramilopectina,
alginato de sodio, gelatina, cáscara de naranja, carboximetil
celulosa ácida, esponja natural y bentonita. Los desintegrantes
pueden también ser resinas de intercambio catiónico insolubles.
Pueden utilizarse gomas en polvo como desintegrantes y como
aglutinantes, y pueden incluir gomas en polvo tales como agar,
Karaya o tragacanto. El ácido algínico y su sal de sodio son también
útiles como desintegrantes.
Pueden utilizarse aglutinantes para mantener el
agente peptídico (o derivado) unido, para formar un comprimido duro
e incluir materiales de productos naturales tales como acacia,
tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen metilcelulosa (MC),
etilcelulosa (EC) y carboximetilcelulosa (CMC). La
polivinilpirrolidona (PVP) y la hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC),
podrían utilizarse ambas en soluciones alcohólicas para granular el
péptido (o derivado).
Puede incluirse un agente antifricción en la
formulación del péptido (o derivado), para evitar la adhesión
durante el procedimiento de formulación. Pueden utilizarse
lubricantes como capa entre el péptido (o derivado) y la pared de
la matriz, y estos pueden incluir, de manera no exclusiva, ácido
esteárico, incluyendo sus sales de magnesio y calcio,
politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, aceites vegetales y
ceras. También pueden utilizarse lubricantes solubles tales como
laurilsulfato sódico, laurilsulfato de magnesio, polietilenglicol
de varios pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000.
Pueden agregarse deslizantes que pueden mejorar
las propiedades de flujo del fármaco durante la formulación y
ayudar a la reorganización durante la compresión. Los deslizantes
pueden incluir almidón, talco, sílice pirogénica y silicoaluminato
hidratado.
Para ayudar a la disolución del péptido (o
derivado) en el medio acuoso, puede agregarse un tensioactivo como
agente humectante. Los tensioactivos pueden incluir detergentes
aniónicos tales como laurilsulfato sódico, dioctil sulfosuccinato
sódico y dioctil sulfonato sódico. Pueden utilizarse detergentes
catiónicos y pueden incluir cloruro de benzalconio o cloruro de
bencetomio. La lista de detergentes no iónicos potenciales que
pueden incluirse en la formulación como tensioactivos son
lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino
hidrogenado de polioxietileno 10, 50 y 60, monoestearato de
glicerol, polisorbato 20, 40, 60, 65 y 80, éster de ácido graso y
sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Estos tensioactivos
podrían estar presentes en la formulación de la proteína o el
derivado ya sea solos o como mezcla en diferentes proporciones.
Los aditivos que potencialmente mejoran la
captación del péptido (o derivado) son, por ejemplo, los ácidos
grasos ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico.
Pueden ser deseables las formulaciones orales de
liberación controlada. El péptido (o derivado) puede incorporarse
en una matriz inerte, que permite la liberación mediante mecanismos
de difusión o lixiviación, por ejemplo, gomas. Las matrices de
degeneración lenta también pueden incorporarse en la formulación.
Algunos recubrimientos entéricos también tienen un efecto de
liberación retardada. Otra forma de liberación controlada es
mediante el método basado en el sistema terapéutico Oros (Alza
Corp.), es decir, el fármaco se encierra en una membrana
semipermeable, la cual permite que el agua entre y empuje el fármaco
a través de una sola abertura pequeña debido a los efectos
osmóticos.
Pueden utilizarse otros recubrimientos para la
formulación. Estos incluyen una variedad de azúcares que podrían
aplicarse en una artesa de recubrimiento. El péptido (o derivado)
podría también administrarse en un comprimido recubierto con una
película, y los materiales utilizados en este caso se dividen en 2
grupos. El primero son los materiales no entéricos e incluyen
metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa,
metilhidroxi-etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa,
hidroxipropil-metil celulosa,
carboxi-metilcelulosa sódica, povidona y los
polietilenglicoles. El segundo grupo consta de los materiales
entéricos que son comúnmente ésteres de ácido ftálico.
Puede utilizarse una mezcla de materiales para
proporcionar el recubrimiento de película óptimo. El recubrimiento
de película puede llevarse a cabo en un recubridor de artesa o en un
lecho fluidizado o mediante recubrimiento por compresión.
Las preparaciones de acuerdo con esta invención
para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones
o emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Los ejemplos de
disolventes o vehículos no acuosos son propilenglicol,
polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y
aceite de maíz, gelatina y ésteres orgánicos inyectables, tales
como oleato de etilo. Tales formas de dosificación pueden contener
también adyuvantes tales como agentes conservadores, humectantes,
emulsionantes y dispersantes. Pueden esterilizarse mediante, por
ejemplo, filtración a través de un filtro que retenga las bacterias,
incorporando agentes esterilizantes en las composiciones, mediante
irradiación de las composiciones, o calentando las composiciones.
Pueden también fabricarse utilizando agua estéril, o algún otro
medio inyectable estéril, inmediatamente antes del uso.
Las composiciones para la administración rectal
o vaginal son de manera preferida supositorios que pueden contener,
además de la sustancia activa, excipientes tales como manteca de
cacao o una cera para supositorio. Las composiciones para la
administración nasal o sublingual también se preparan con
excipientes convencionales bien conocidos en la técnica.
También contemplado en la presente está la
administración pulmonar de los péptidos agonistas del
EPO-R (o derivados de los mismos). El péptido (o
derivado) se suministra a los pulmones de un mamífero por inhalación
y atraviesa el recubrimiento epitelial del pulmón hacia la
corriente sanguínea [véase, por ejemplo, Adjei, y col. (1990)
Pharmaceutical Research 7:565-569; Adjei, y col.
(1990) Int. J. Pharmaceutics 63:135-144 (acetato de
leuprolida); Braquet, y col. (1989) J. Cardiovascular Pharmacology
13 (sup5):143-146 (endotelina-1);
Hubbard, y col. (1989) Annals of Internal Medicine, Vol. III, pp.
206-212 (\alpha1-antitripsina);
Smith, y col. (1989) J. Clin. Invest. 84:1145-1146
(\alpha-1-proteinasa); Oswein, y
col. (1990) "Aerosolization of Proteins", Proceedings of
Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone, Colorado
(hormona de crecimiento humana recombinante); Debs, y col. (1988)
J. Immunol. 140:3482-3488
(interferon-\gamma y factor \alpha de necrosis
tumoral); y la Patente de EE.UU. No. 5.284.656 de Platz, y col.
(factor estimulador de colonias de granulocitos). En la Patente de
EE.UU. No. 5.451.569 de Wong, y col. se describe un método y una
composición para la administración pulmonar de los fármacos para el
efecto sistémico.
Para el uso en la práctica de esta invención se
contempla una amplia gama de dispositivos mecánicos diseñados para
la administración pulmonar de productos terapéuticos, que incluyen,
de manera no exclusiva, nebulizadores, inhaladores dosificadores e
inhaladores de polvo, todos los cuales son familiares para los
expertos en la técnica. Algunos ejemplos específicos de
dispositivos comercialmente disponibles adecuados para la práctica
de esta invención son el nebulizador Ultravent (Mallinckrodt Inc.,
St. Louis, MO); el nebulizador Acorn II (Marquest Medical Products,
Englewood, CO); el inhalador dosificador Ventolin (Glaxo Inc.,
Research Triangle Park, NC); y el inhalador de polvo Spinhaler
(Fisons Corp., Bedford, MA).
Todos estos dispositivos requieren el uso de
formulaciones adecuadas para la administración del péptido (o
derivado). Típicamente, cada formulación es específica para el tipo
de dispositivo empleado, y puede involucrar el uso de un material
propelente apropiado, además de los diluyentes, adyuvantes y/o
portadores usuales útiles en la terapia. También se contempla el
uso de liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de
inclusión u otros tipos de portadores. Los péptidos modificados
químicamente también pueden prepararse en diferentes formulaciones
dependiendo del tipo de modificación química o el tipo de
dispositivo empleado.
Las formulaciones adecuadas para el uso con un
nebulizador, ya sea a chorro o ultrasónico, comprenderá típicamente
el péptido (o derivado) disuelto en agua a una concentración de
aproximadamente 0,1 a 25 mg de la proteína biológicamente activa
por mL de solución. La formulación también puede incluir un tampón y
un azúcar simple (por ejemplo, para la estabilización de una
proteína y la regulación de la presión osmótica). La formulación
del nebulizador puede contener también un tensioactivo, para reducir
o evitar la agregación inducida por la superficie del péptido (o
derivado), causada por la atomización de la solución en la formación
del aerosol.
Las formulaciones para el uso con un dispositivo
inhalador dosificador comprenderá generalmente un polvo finamente
dividido que contiene el péptido (o derivado) suspendido en un
propelente con la ayuda de un tensioactivo. El propelente puede ser
cualquier material convencional empleado para este propósito, tal
como un clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un
hidrofluorocarbono, o un hidrocarbono, incluyendo
triclorofluorometano, diclorodifluorometano,
diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano
o combinaciones de los mismos. Los tensioactivos adecuados incluyen
trioleato de sorbitan y lecitina de soja. El ácido oleico puede
también ser útil como tensioactivo.
Las formulaciones para la administración desde
un dispositivo inhalador de polvo comprenderán un polvo seco
dividido finamente que contiene el péptido (o derivado), y pueden
incluir también un agente de carga, tal como lactosa, sorbitol,
sacarosa o manitol en cantidades que faciliten la dispersión del
polvo desde el dispositivo, por ejemplo, 50 a 90% en peso de la
formulación. El péptido (o derivado) debe prepararse de manera más
ventajosa en una forma particulada con un tamaño medio de partícula
menor que 10 mm (o micras), de manera más preferida de 0,5 a 5 mm,
para una administración más eficaz hacia el pulmón distal.
También está contemplada la administración nasal
de los péptidos (o derivados) agonistas del EPO-R.
La administración nasal permite el paso del péptido a la corriente
sanguínea directamente después de la administración del producto
terapéutico a la nariz, sin la necesidad de deposición del producto
en el pulmón. Las formulaciones para la administración nasal
incluyen aquéllas con dextrano o ciclodextrano.
Para todos los compuestos peptídicos, conforme
se realicen estudios adicionales, surgirá información con respecto
a los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento de
diversos estados en diferentes pacientes, y el experto normal será
capaz de determinar la dosificación apropiada, considerando el
contexto terapéutico, la edad, y la salud general del receptor. La
dosificación seleccionada depende del efecto terapéutico deseado,
de la vía de administración y de la duración del tratamiento
deseado. Generalmente se administran a los mamíferos niveles de
dosificación diarios de 0,001 a 10 mg/kg de peso corporal.
Generalmente, para la inyección intravenosa o infusión, la
dosificación puede ser menor. El esquema de dosificación puede
variar, dependiendo de la semivida en circulación y de la
formulación utilizada.
Los péptidos de la presente invención (o sus
derivados) pueden administrarse en combinación con uno o más
ingredientes activos o composiciones farmacéuticas adicionales.
La presente invención se describe a continuación
por medio de los siguientes ejemplos. Sin embargo, el uso de estos
y otros ejemplos en cualquier otro lugar de la memoria descriptiva
es sólo ilustrativo, y de ninguna manera limita el alcance y el
significado de la invención o de cualquier forma ejemplificada. De
igual manera, la invención no está limitada a ninguna de las formas
de realización preferidas descritas en la presente memoria. De
hecho, los expertos en la técnica podrán apreciar, tras la lectura
de esta memoria descriptiva, muchas modificaciones y variaciones de
la invención que pueden hacerse sin apartarse de su espíritu y
alcance. La invención por lo tanto, está limitada sólo por los
términos de las reivindicaciones anexas, junto con el alcance
completo de los equivalentes a los cuales las reivindicaciones
tienen derecho.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Paso
1
Una solución que contenía la diamina
comercialmente disponible ("TAP" de Aldrich Chemical Co.) (10
g, 67,47 mmoles) en DCM anhidro (100 ml) se enfrió a 0ºC. Una
solución de cloroformiato de bencilo (4,82 ml, 33,7 mmoles) en DCM
anhidro (50 ml) se agregó lentamente a través de un embudo de goteo
durante un periodo de 6-7 horas, manteniendo la
temperatura de la mezcla de reacción a 0ºC durante todo el tiempo, y
a continuación se dejó calentar a temperatura ambiente
(\sim25ºC). Después de 16 horas adicionales, el DCM se eliminó
bajo vacío y el residuo se repartió entre HCl 3N y éter. Las capas
acuosas se recolectaron y neutralizaron con NaOH acuoso al 50% a pH
8-9 y se extrajeron con acetato de etilo. La capa de
acetato de etilo se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, a
continuación se concentró bajo vacío para proporcionar el
mono-Cbz-TAP crudo (5 g,
aproximadamente 50% de rendimiento). Este compuesto se utilizó para
la siguiente reacción sin ninguna purificación adicional.
Paso
2
A una suspensión agitada vigorosamente de
Cbz-TAP (5 g, 17,7 mmoles) en hexano (25 ml), se le
agregó Boc_{2}O (3,86 g, 17,7 mmoles) y la agitación continuó a
TA durante la noche.
La mezcla de reacción se diluyó con DCM (25 ml)
y se lavó con ácido cítrico acuoso al 10% (2X), agua (2X) y
salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y
se concentró bajo vacío. El producto bruto (rendimiento 5 g) se
utilizó directamente en la siguiente reacción.
Paso
3
El producto bruto de la reacción previa se
disolvió en metanol (25 ml) y se hidrogenó en presencia de Pd sobre
carbono al 5% (5% peso/peso) bajo presión de globo durante 16
horas. La mezcla se filtró, se lavó con metanol y el filtrado se
concentró al vacío para proporcionar el producto bruto
H-TAP-Boc (rendimiento 3,7 g). El
rendimiento aproximado total de Boc-TAP después de
los Pasos 1-3 fue del 44% (calculado basándose en la
cantidad utilizada de Cbz-Cl).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Paso
4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se calentaron bromuro de TentaGel (2,5 g, 0,48
mmoles/g, de Rapp Polymere, Alemania), enlazante fenólico (5
equivalentes) y K_{2}CO_{3} (5 equivalentes) en 20 mL de DMF a
70ºC durante 14 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente,
la resina se lavó (NHCl 0,1N, agua, ACN, DMF, MeOH) y se secó para
proporcionar una resina color ámbar.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso
5
Se suspendieron 2,5 g de la resina anterior y
H-TAP-Boc (1,5 g, 5 equivalentes) y
AcOH glacial (34 \mul, 5 equivalentes) en una mezcla 1:1 de
MeOH-THF y se agitó durante la noche. Se añadió na
solución 1M de cianoborohidruro de sodio (5 equivalentes) en THF y
se agitó durante otras 7 horas. La resina se filtró, se lavó (DMF,
THF, HCl 0,1N, agua, MeOH) y se secó. Una pequeña cantidad de la
resina se benzoiló con Bz-Cl y DIEA en DCM y se
escindió con TFA-DCM al 70% y se verificó mediante
LCMS y HPLC.
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\newpage
Paso
6
La resina anterior se trató con una solución
activada de Fmoc-Lys (Fmoc)-OH
(preparada a partir de 5 equivalentes de aminoácido y 5
equivalentes de HATU disueltos a 0,5M en DMF, seguido por la adición
de 10 equivalentes de DIEA) y se dejó agitar suavemente durante 14
horas. La resina se lavó (DMF, THF, DCM, MeOH) y se secó para
proporcionar la resina protegida. Los grupos amino residuales se
remataron tratando la resina con una solución de anhídrido acético
al 10%, piridina al 20% en DCM durante 20 minutos, seguido por
lavado, como anteriormente. Los grupos Fmoc se eliminaron mediante
agitación suave de la resina en piperidina al 30% en DMF durante 20
minutos, seguido por lavado (DMF, THF, DCM, MeOH) y secado.
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Paso
7
La resina anterior se sometió a ciclos repetidos
de acoplamiento de Fmoc-aminoácido con activación
con HBTU/HOBt y eliminación de Fmoc con piperidina para construir
ambas cadenas peptídicas simultáneamente. Esto se llevó a cabo de
manera conveniente en un sintetizador de péptidos automatizado ABI
433 disponible de Applied Biosystems, Inc. Después de la
eliminación final del Fmoc, los grupos amino terminales se acilaron
con anhídrido acético (10 equivalentes) y DIEA (20 equivalentes) en
DMF durante 20 minutos, seguido por lavado, como anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso
8
La resina anterior se suspendió en una solución
de TFA (82,5%), fenol (5%), etanoditiol (2,5%), agua (5%) y
tioanisol (5%) durante 3 horas a temperatura ambiente. También
pueden utilizarse cócteles de escisión alternativos, tales como TFA
(95%), agua (2,5%) y triisopropilsilano (2,5%). La solución de TFA
se enfrió a 5ºC y se vertió en Et_{2}O para precipitar el
péptido. La filtración y el secado bajo presión reducida
proporcionaron el péptido deseado. La purificación por HPLC
preparativa con una columna C18 proporcionó el péptido puro.
\newpage
Paso
9
El dímero peptídico se disolvió en DMSO/agua al
20% (1 mg de peso seco de péptido/mL) y se dejó reposar a
temperatura ambiente durante 36 horas. El péptido se purificó
cargando la mezcla de reacción en una columna C18 de HPLC (Waters
Delta-Pak C18, 15 micras de tamaño de partícula, 300
ángstrom de tamaño de poro, 40 mm x 200 mm de longitud), seguido
por un gradiente lineal de ACN/agua/TFA al 0,01% de 5 a 95% de ACN
durante 40 minutos. La liofilización de las fracciones que
contenían el péptido deseado proporcionó el producto en forma de un
sólido blanco esponjoso.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso
10
El dímero peptídico se mezcló con 1,5
equivalentes (base en moles) de las especies activadas de PEG
(mPEG-NPC de NOF Corp. Japón) en DMF seco para
proporcionar una solución clara. Después de 5 minutos, se agregaron
4 equivalentes de DIEA a la solución anterior. La mezcla se agitó a
temperatura ambiente durante 14 horas, seguido por la purificación
con HPLC C18 en fase inversa. La estructura del péptido PEGilado se
confirmó mediante la masa por MALDI. El péptido purificado se
sometió también a purificación por cromatografía de intercambio
catiónico como se expone a continuación. El esquema siguiente
muestra la PEGilación con mPEG-NPC usando la SEQ ID
No:3.
El dímero peptídico se mezcla con 1,5
equivalentes (base en moles) de 1 equivalente de especies activadas
de PEG (PEG-SPA-NHS de Shearwater
Corp, EUA) en DMF seca para proporcionar una solución clara. Después
de 5 minutos, se agregaron 10 equivalentes de DIEA a la solución
anterior. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2
horas, seguido por purificación mediante HPCL C18 en fase inversa.
La estructura del péptido PEGilado se confirmó mediante la masa con
MALDI. El péptido purificado también se sometió a purificación vía
cromatografía de intercambio catiónico como se indica a
continuación. El esquema siguiente muestra la PEGilación con
PEG-SPA-NHS usando la SEQ ID
No:3.
Paso
11
Se investigaron varios soportes de intercambio
respecto a su capacidad para separar el conjugado
péptido-PEG anterior del PEG sin reaccionar (o
hidrolizado), además de su capacidad para retener los péptidos
diméricos iniciales. La resina de intercambio iónico
(2-3 g) se cargó en una columna de 1 cm, seguido por
la conversión a la forma sódica (NaOH 0,2N cargado en la columna
hasta que el eluyente estaba a pH 14, aproximadamente 5 volúmenes
de la columna), y a la forma de hidrógeno (eluida con HCl 0,1N o
HOAc 0,1M hasta que el eluyente coincidió con el pH de la carga,
aproximadamente 5 volúmenes de la columna), seguido por lavado con
ACN/agua al 25% hasta pH 6. El péptido antes de la conjugación o el
conjugado de péptido-PEG se disolvió en ACN/agua al
25% (10 mg/mL) y el pH se ajustó a < 3 con TFA, a continuación se
cargó en la columna. Después de lavar con 2-3
volúmenes de la columna de ACN/agua al 25%, y recolectar fracciones
de 5 mL, el péptido se liberó de la columna mediante elución con
NH_{4}OAc 0,1M en ACN/agua al 25%, nuevamente recolectando
fracciones de 5 mL. Los análisis por HPLC revelaron las fracciones
que contenían el péptido deseado. Los análisis con un Detector
Evaporativo de Dispersión de la Luz (ELSD) indicaron que cuado el
péptido se retuvo en la columna, y se eluyó con la solución de
NH_{4}OAc (generalmente entre las fracciones 4 y 10), no se
observó PEG no conjugado como contaminante. Cuando el péptido se
eluyó en el tampón de lavado inicial (generalmente las primeras 2
fracciones), no se observó separación del conjugado de PEG deseado
ni un exceso de PEG.
Las siguientes columnas retuvieron con éxito
tanto el péptido como el conjugado péptido-PEG, y
purificaron con éxito el conjugado péptido-PEG del
péptido no conjugado:
Ejemplo
2
Paso
1
La lisina se hizo reaccionar bajo condiciones
convencionales con una solución de cloroformiato de bencilo para
obtener la lisina protegida en sus dos grupos amino con un grupo
Cbz.
Paso
2
El Boc-TAP se sintetizó como se
describió en los Pasos 1 hasta 3 del Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso
3
El (Cbz)_{2}-Lys y el
Boc-TAP se acoplan bajo condiciones de acoplamiento
convencionales para obtener
(Cbz)_{2}-Lys-TAP-Boc.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso
4
El producto bruto de la reacción previa se
disolvió en metanol (25 ml) y se hidrogenó en presencia de Pd sobre
carbono al 5% (5% peso/peso) bajo presión del globo durante 16
horas.
La mezcla se filtró, se lavó con metanol y el
filtrado se concentró al vacío para proporcionar el producto
Lys-TAP-Boc bruto.
Paso
5
Se sintetizan cuatro fragmentos peptídicos de la
secuencia peptídica del monómero mediante técnicas convencionales.
Estos fragmentos protegidos parcialmente se someten entonces a dos
rondas independientes de acoplamiento. En la primera ronda, la
mitad N-terminal del monómero se forma acoplando dos
de los fragmentos peptídicos, mientras que la mitad
C-terminal del monómero se forma acoplando los otros
fragmentos peptídicos. En la segunda ronda de acoplamiento, las
mitades N-terminal y C-terminal se
acoplan para formar el monómero completamente protegido. El
monómero se desprotege con OBn mediante técnicas convencionales.
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\vskip1.000000\baselineskip
Paso
6
Los monómeros peptídicos condensados
desprotegidos con OBn se oxidan entonces bajo yodo para formar
enlaces disulfuro intramoleculares entre los residuos de cisteína
protegidos con Acm de los monómeros.
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\newpage
Paso
7
El Lys-TAP-Boc
se acopla a un exceso molar de dos veces de los monómeros
desprotegidos con OBn oxidados, bajo condiciones convencionales,
para formar un dímero peptídico. El dímero peptídico se desprotege
entonces bajo condiciones convencionales.
Paso
8
El dímero peptídico desprotegido se PEGila a
continuación como se describe en el Paso 10 del Ejemplo 1.
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Paso
9
El dímero peptídico PEGilado se purifica
entonces como se describió en el Paso 11 del Ejemplo 1.
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Ejemplo
3
Este ejemplo describe varios ensayos in
vitro que son útiles para evaluar la actividad y la potencia de
los péptidos agonistas del EPO-R de la invención.
Los resultados de estos ensayos demuestran que los péptidos
novedosos de esta invención se unen al EPO-R y
activan la señalización del EPO-R. Además, los
resultados de estos ensayos muestran que las nuevas composiciones
peptídicas exhiben un incremento sorprendente en la afinidad de
unión al EPO-R y en la actividad biológica en
comparación con los péptidos miméticos de la EPO que se han
descrito previamente.
Los dímeros peptídicos agonistas del
EPO-R se prepararon de acuerdo con los métodos
proporcionados en el Ejemplo 1 o el Ejemplo 2. La potencia de estos
dímeros peptídicos se evalúa utilizando una serie de ensayos de la
actividad in vitro, incluyendo: un ensayo reportero, un
ensayo de proliferación, un ensayo de unión competitiva y un ensayo
C/BFU-e. Estos cuatro ensayos se describen con más
detalle a continuación.
Los resultados de estos ensayos de la actividad
in vitro se resumen en la Tabla 2.
Este ensayo se basa en una célula reportera
derivada de la línea celular de prelinfocitos B murina,
Baf3/EpoR/
GCSFR fos/lux. Esta línea celular reportera expresa un receptor quimérico que comprende la porción extracelular del receptor humano de la EPO y la porción intracelular del receptor humano de GCSF. Esta línea celular se transfecta además con un constructo de un gen reportero de luciferasa dirigido por el promotor fos. La activación de este receptor quimérico a través de la adición del agente eritropoyético resulta en la expresión del gen reportero de la luciferasa, y por lo tanto, en la producción de luz tras la adición del sustrato de la luciferasa, la luciferina. Así, el nivel de activación del EPO-R en tales células puede cuantificarse midiendo la actividad de la luciferasa.
GCSFR fos/lux. Esta línea celular reportera expresa un receptor quimérico que comprende la porción extracelular del receptor humano de la EPO y la porción intracelular del receptor humano de GCSF. Esta línea celular se transfecta además con un constructo de un gen reportero de luciferasa dirigido por el promotor fos. La activación de este receptor quimérico a través de la adición del agente eritropoyético resulta en la expresión del gen reportero de la luciferasa, y por lo tanto, en la producción de luz tras la adición del sustrato de la luciferasa, la luciferina. Así, el nivel de activación del EPO-R en tales células puede cuantificarse midiendo la actividad de la luciferasa.
Las células Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux se cultivan
en medio DMEM/F12 (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al
10% (FBS; Hyclone), sobrenadante de WEHI-3 al 10%
(el sobrenadante de un cultivo de células WEHI-3,
ATCC nº TIB-68), y penicilina/estreptomicina.
Aproximadamente 18 horas antes del ensayo, las células se
subalimentan transfiriéndolas a medio DMEM/F12 suplementado con FBS
al 10% y sobrenadante de WEHI-3 al 0,1%. En el día
del ensayo, las células se lavan una vez con medio DMEM/F12
suplementado con FBS al 10% (sin sobrenadante de
WEHI-3), a continuación se cultivan 1 X 10^{6}
células/mL en presencia de una concentración conocida del péptido
de prueba o con EPO (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN) como
control positivo, en medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 10%
(sin sobrenadante de WEHI-3). Se prueban
simultáneamente diluciones seriadas del péptido de prueba en este
ensayo. Las placas de ensayo se incuban durante 4 horas a 37ºC en
una atmósfera de CO_{2} al 5%, después de lo cual se agrega
luciferina a cada pocillo (Steady-Glo; Promega,
Madison, Wi). Después de una incubación de 5 minutos, se mide la
emisión de luz en un Luminómetro Topcount de Packard (Packard
Instrument Co., Downers Grove,III.). Los recuentos de luz se
representan en función de la concentración del péptido de prueba y
se analizan utilizando el programa Graph Pad. La concentración del
péptido de prueba que resulta en la mitad de la emisión de luz
máxima se registra como la CE50 [Véase la Tabla 2: CE50
Reportera].
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Este ensayo se basa en una línea de
prelinfocitos B murina, Baf3, transfectada para expresar el
EPO-R humano. La proliferación de la línea celular
resultante, BaF3/Gal4/Elk/EPOP, es dependiente de la activación del
EPO-R. El grado de proliferación celular se
cuantifica utilizando MTT, en donde la señal en el ensayo con MTT es
proporcional al número de células viables.
Las células BaF3/Gal4/Elk/EPOR se cultivan en
matraces de agitación en medio DMEM/F12 (Gibco) suplementado con
FBS al 10% (Hyclone) y sobrenadante de WEHI-3 al 2%
(ATCC nº TIB-68). Las células cultivadas se
subalimentan durante la noche en un matraz de agitación a una
densidad celular de 1x10^{6} células/ml, en medio DMEM/F12
suplementado con FBS al 10% y sobrenadante de WEHI-3
al 1%. Las células subalimentadas se lavan entonces dos veces con
PBS de Dulbecco (Gibco), y se resuspenden a una densidad de
1x10^{6} células/ml en DMEM/F12 suplementado con FBS al 10% (sin
sobrenadante de WEHI-3). A continuación se siembran
alícuotas de 50 \muL (\sim50.000 células) de la suspensión
celular por triplicado en placas de ensayo de 96 pocillos. Se
agregan alícuotas de 50 \muL de la serie de diluciones de los
péptidos miméticos de la EPO o 50 \muL de EPO (R & D Systems
Inc., Minneapolis, MN) o Aranesp^{TM} (darbepoyetina alfa, un
agonista del EPO-R comercialmente disponible de
Amgen) en medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 10% (sin
sobrenadante de WEHI-3 I) a las placas de ensayo de
96 pocillos (volumen final del pocillos 100 \muL). Por ejemplo,
pueden probarse 12 diluciones diferentes en las que la
concentración final del péptido de prueba (o el péptido control de
la EPO) varía de 810 pM a 0,0045 pM. Las células sembradas se
incuban entonces durante 48 horas a 37ºC. A continuación, se agregan
10 \muL de MTT (Roche Diagnostics) a cada pocillo de la placa de
cultivo, y se dejan incubar durante 4 horas. La reacción de detiene
entonces agregando SDS al 10% + HCl 0,01N. Las placas son incubadas
entonces durante la noche a 37ºC. Después se mide la absorbancia de
cada pocillo a una longitud de onda de 595 nm mediante
espectrofotometría. Se elaboran gráficas de las lecturas de la
absorbancia frente a la concentración del péptido de prueba y se
calcula la CE50 utilizando el programa Graph Pad. La concentración
del péptido de prueba que resulta en una absorbancia semimáxima se
registra como la CE50 [Véase la Tabla 2: CE50 de Proliferación].
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Los cálculos de la unión competitiva se hacen
utilizando un ensayo en el cual una señal luminosa se genera como
una función de la proximidad de dos perlas: una perla donadora de
estreptavidina que porta un indicador radiactivo peptídico que se
une al EPO-R biotilinado y una perla receptora a la
cual se une el EPO-R. La luz es generada mediante
transferencia de energía no radiactiva, durante lo cual se libera un
oxígeno de singulete de una primera perla tras la iluminación, y el
contacto con el oxígeno de singulete liberado causa que la segunda
perla emita luz. Estos conjuntos de perlas están comercialmente
disponibles (Packard). La proximidad de las perlas se genera
mediante la unión del indicador radiactivo peptídico que se une al
EPO-R al EPO-R. Un péptido de
prueba que compite con el indicador radiactivo peptídico que se une
al EPO-R para unirse al EPO-R
evitará esta unión, causando una disminución en la emisión de
luz.
Con más detalle, el método es como sigue:
Agregar 4 \muL de las diluciones seriadas del péptido agonista
del EPO-R de prueba, o los controles positivos o
negativos, a los pocillos de una placa de 384 pozos. Posteriormente,
agregar 2 \muL/pocillo del cóctel de receptor/perla. El cóctel de
perlas del receptor consta de: 15 \muL de 5 mg/ml de perlas
donadoras de estreptavidina (Packard), 15 \muL de 5 mg/ml de
anticuerpo monoclonal ab179 (este anticuerpo reconoce la porción de
la proteína fosfatasa alcalina de la placenta humana contenida en
el EPO-R recombinante), perlas receptoras
recubiertas con la proteína A (la proteína A se unirá al anticuerpo
ab179; Packard), 112,5 \muL de una dilución 1:6,6 del
EPO-R recombinante (producido en las células de
Ovario de Hámster Chino como una proteína de fusión a una porción
de la proteína fosfatasa alcalina de placenta humana que contiene
el epitopo objetivo ab179) y 607,5 \muL de tampón Alphaquest
(HEPES 40 mM, pH 7,4; MgCl_{2} 1 mM; BSA al 0,1%, Tween 20 al
0,05%). Golpear ligeramente para mezclar. Agregar 2 \muL/pocillo
del indicador radiactivo peptídico que se une al
EPO-R biotilinado, (concentración final de 30 nM).
El indicador peptídico, un péptido que se une al
EPO-R se hace de acuerdo con los métodos descritos
en el Ejemplo 1, con la secuencia
biotina-GGLYACHMGPITWVCQPLRG (SEQ ID NO:4).
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Centrifugar durante 1 minuto para mezclar.
Sellar la placa con Top Seal de Packard y envolver en una hoja
delgada de metal. Incubar durante la noche a temperatura ambiente.
Después de 18 horas leer la emisión de luz utilizando un lector
AlphaQuest (Packard). Representar la emisión de luz frente a la
concentración del péptido y analizar con Graph Pad o Excel.
La concentración del péptido de prueba que
resulte en una disminución del 50% en la emisión de la luz, con
relación a aquélla observada sin el péptido de prueba, se registra
como la CI50 [Véase la Tabla 2: CI50 AQ].
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La señalización del EPO-R
estimula la diferenciación de las células germinales de la médula
ósea en precursores de los eritrocitos proliferantes. Este ensayo
mide la capacidad de los péptidos de prueba para estimular la
proliferación y diferenciación de los precursores de eritrocitos de
las células germinales primarias pluripotentes de la médula ósea
humana.
Para este ensayo, se hacen diluciones seriadas
del péptido de prueba en medio IMDM (Gibco) suplementado con FBS al
10% (Hyclone). Estas diluciones seriadas, o péptido de EPO de
control positivo, se agregan entonces a la metilcelulosa para dar
un volumen final de 1,5 mL. La mezcla de metilcelulosa y péptido se
agita a conciencia mediante un vortex.. Se descongelan alícuotas
(100.000 células/mL) de células CD34+ derivadas de médula ósea
humana (Poietics/Cambrex). Las células descongeladas se agregan con
cuidado a 0,1 mL de 1 mg/ml de ADnasa (Células Germinales) en un
tubo de 50 mL. A continuación, se agregan con cuidado
40-50 mL de medio IMDM a las células: el medio se
agrega gota a gota a lo largo del borde del tubo de 50 mL para los
primeros 10 mL, y a continuación el volumen restante del medio de
distribuye lentamente a lo largo del borde del tubo. Las células se
centrifugan entonces a 900 rpm durante 20 minutos, y el medio se
elimina cuidadosamente mediante aspiración suave. Las células se
resuspenden en 1 ml de medio IMDM y la densidad celular por mL se
cuenta en un portaobjetos del hemacitómetro (alícuota de 10 \muL
de la suspensión celular en el portaobjetos, y la densidad celular
es el recuento promedio X 10.000 células/ml). Las células se
diluyen entonces en medio IMDM a una densidad celular de 15,000
células/mL. 100 \muL de las células diluidas se agregan entonces a
cada 1,5 mL de metil celulosa más la muestra del péptido (la
concentración celular final en el medio de ensayo es de 1000
células/mL), y la mezcla se agita en un vortex. Dejar que
desparezcan las burbujas en la mezcla, y a continuación, aspirar 1
mL utilizando una aguja con extremo romo. Agregar 0,25 mL de la
mezcla aspirada de cada muestra a cada uno de los 4 pocillos de una
placa de 24 pocillos (marca Falcon). Incubar las mezclas sembradas a
37ºC bajo CO_{2} al 5% en un incubador húmedo durante 14 días.
Evaluar la presencia de colonias eritroides utilizando un
microscopio de fase (objetivo 5X-10X, amplificación
final de 100X). La concentración del péptido de prueba a la cual el
número de colonias formadas constituye el 90% del máximo, con
relación a aquél observado con el control positivo de la EPO, se
registra como la CE90 [Véase la Tabla 2: CE90 de
C/BFU-e].
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También puede utilizarse un ensayo alternativo
de unión competitiva al radioligando para medir los valores de la
CI_{50} de los péptidos en esta invención. Este ensayo mide la
unión de la ^{125}I-EPO a EPOr. El ensayo es
realizado de manera preferida de acuerdo con el siguiente protocolo
ejemplar:
Un vial de 50 \mug de dominio extracelular de
EPOr recombinante, liofilizado, fusionado a la porción Fc de la
IgG1 humana, se reconstituye en 1 mL de tampón de ensayo. Para
determinar la cantidad correcta del receptor que ha de usarse en el
ensayo, se combinaron 100 \muL de diluciones seriadas de esta
preparación del receptor con aproximadamente 20.000 cpm en 200
\muL de la Eritropoyetina humana recombinante yodada
(^{125}I-EPO) en tubos de prueba de polipropileno
de 12 x 75 mm. Los tubos se taparon y mezclaron suavemente a 4ºC
durante la noche en un agitador giratorio LabQuake.
El siguiente día, se agregan a cada tubo 50
\muL de una suspensión al 50% de Proteína-G
Sepharose. Los tubos se incuban entonces durante 2 horas a 4ºC,
mezclando suavemente. Los tubos se centrifugan a continuación
durante 15 minutos a 4000 RPM (3297 x G) para sedimentar la
proteína-G sepharose. Los sobrenadantes se eliminan
cuidadosamente y se desechan. Después de lavar 3 veces con 1 mL de
tampón de ensayo a 4ºC, los sedimentos se cuentan en un contador
gamma Wallac Wizard. A continuación se analizan los resultados y se
calcula la dilución requerida para alcanzar 50% del valor máximo de
unión.
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Para determinar la CI_{50} del Péptido I, se
combinan 100 \muL de diluciones seriadas del péptido con 100
\muL de receptor recombinante de eritropoyetina (100 pg/tubo) en
tubos de prueba de polipropileno de 12 x 75. A continuación, se
agregan 100 \muL de Eritropoyetina humana recombinante yodada
(^{125}I-EPO) a cada tubo y los tubos se tapan y
mezclan suavemente a 4ºC durante la noche.
Al día siguiente, la
^{125}I-EPO unida se cuantifica como se describió
anteriormente. Los resultados se analizan y el valor de la
CI_{50} se calcula utilizando Graphpad Prism versión 4.0, de
GraphPad Software, Inc. (San Diego, CA). El ensayo se repite dos o
más veces para cada péptido probado, para un total de 3 o más
determinaciones repetidas de la CI_{50}.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Ejemplo
4
Este ejemplo describe varios ensayos in
vivo que son útiles para evaluar la actividad y la potencia de
los péptidos agonistas del EPO-R de la invención.
Los dímeros peptídicos agonistas del EPO-R se
preparan de acuerdo con los métodos proporcionados en el Ejemplo 1
o el Ejemplo 2. La actividad in vivo de estos monómeros y
dímeros peptídicos se evalúa utilizando una serie de ensayos,
incluyendo el bioensayo del ratón exhipóxico policitémico y un
ensayo de reticulocito. Estos dos ensayos se describen con mayor
detalle a continuación.
Los péptidos de prueba se ensayan para la
actividad in vivo en el bioensayo del ratón exhipóxico
policitémico adaptado del método descrito por Cotes y Bangham
(1961), Nature 191: 1065-1067. Este ensayo examina
la capacidad de un péptido de prueba para funcionar como un
mimético de la EPO: es decir, para activar el EPO-R
e inducir la síntesis de nuevos eritrocitos. La síntesis de
eritrocitos se cuantifica basándose en la incorporación de hierro
radiomarcado en la hemoglobina de los eritrocitos sintetizados.
Los ratones BDF1 se dejan aclimatar a
condiciones ambientales durante 7-10 días. Los pesos
corporales se determinan para todos los animales, y no se utilizan
animales con bajo peso (< 15 gramos). Los ratones se someten a
ciclos de acondicionamiento sucesivos en una cámara hiperbárica
durante un total de 14 días. Cada ciclo de 24 horas consta de 18
horas a 0,40\pm0,02% de presión atmosférica y 6 horas a presión
ambiental. Después de acondicionar a los ratones, se mantienen a
presión ambiental durante 72 horas adicionales antes de la
dosificación.
Los péptidos de prueba, o los patrones de EPO
recombinante humana se diluyen en vehículo de PBS + BSA al 0,1%
(PBS/BSA). Las soluciones madre del monómero peptídico se
solubilizan primero en dimetilsulfóxido (DMSO). Los grupos del
control negativo incluyen un grupo de ratones inyectados con PBS/BSA
solo y un grupo inyectado con DMSO al 1%. Cada grupo de dosis
contiene 10 ratones. Los ratones se inyectan subcutáneamente (piel
de la nuca del cuello) con 0,5 mL de la muestra apropiada.
Cuarenta y ocho horas después de la inyección de
la muestra, se les administra a los ratones una inyección
intraperitoneal de 0,2 ml de Fe^{59} (Dupont, NEN), para una dosis
de aproximadamente 0,75 \muCurios/ratón. Los pesos corporales de
los ratones se determinan 24 horas después de la administración del
Fe^{59}, y los ratones se sacrifican 48 horas después de la
administración del Fe^{59}. La sangre se recolecta de cada animal
mediante punción cardiaca y se determinan los hematocritos (se
utilizó heparina como anticoagulante). Cada muestra de sangre (0,2
ml) se analiza para la incorporación de Fe^{59} utilizando un
contador gamma de Packard. Los ratones que no responden (es decir,
aquellos ratones con una incorporación radiactiva menor que el
grupo de control negativo) se eliminan del conjunto de datos
apropiado. Los ratones que tienen valores de hematocritos menores
que el 53% del grupo de control negativo también se eliminan.
Los resultados se derivan de los conjuntos de 10
animales para cada dosis experimental. Se calcula la cantidad
promedio de radiactividad incorporada [recuento por minuto (CPM)] en
las muestras de sangre de cada grupo.
Ratones BDF1 normales se tratan (0,5 mL,
inyectados subcutáneamente) en tres días consecutivos con el control
de EPO o con el péptido de prueba. En el día tres, los ratones
también se tratan (0,1 mL, inyectados intraperitonealmente) con
dextrano de hierro (100 mg/ml). En el día cinco, los ratones se
anestesian con CO_{2} y se desangran mediante punción cardiaca.
El porcentaje (%) de reticulocitos para cada muestra de sangre se
determina mediante tinción con naranja de tiazol y con análisis del
citómetro de flujo (programa retic-count). Los
hematocritos se determinan manualmente. El porcentaje corregido de
reticulocitos de determina utilizando la siguiente fórmula:
%RETIC_{CORREGIDO} =
%RETIC_{OBSERVADO} X
Hematocrito_{INDIVIDUAL}/Hematocrito_{NORMAL})
Ratones CD1 normales se tratan con cuatro
inyecciones intravenosas a la semana de un bolo del control positivo
de la EPO, el péptido de prueba o el vehículo. Se ensaya una gama
de dosis del control positivo y del péptido de prueba, expresadas
en mg/kg, variando la concentración del compuesto activo en la
formulación. Los volúmenes inyectados son de 5 ml/kg. El grupo de
control del vehículo está compuesto por doce animales, mientras que
en cada uno de los grupos de dosis restantes están 8 animales. Se
registran la viabilidad diaria y los pesos corporales
semanales.
Los ratones tratados dejan en ayunas y a
continuación se anestesian con isofluorano inhalado y se recolectan
muestran de sangre terminal vía punción cardiaca o de la aorta
abdominal en el Día 1 (para los ratones del control del vehículo) y
en los Días 15 y 29 (4 ratones/grupo/día). La sangre se transfiere a
tubos marca Vacutainer®. El anticoagulante preferido es el ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA).
Las muestras de sangre se evalúan para los
puntos finales midiendo la síntesis de eritrocitos y la fisiología,
tales como los hematocritos (Hct), hemoglobina (Hgb) y recuento
total de eritrocitos (RBC) utilizando analizadores clínicos
automatizados, bien conocidos en la técnica (por ejemplo, aquéllos
hechos por Coulter, Inc.).
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Ejemplo
5
Paso
1
Los monómeros peptídicos se sintetizan
utilizando la química convencional de Fmoc en un sintetizador de
péptidos ABI 431A, utilizando resina TG-RAM (0,18
mmoles/g Rapp Polymere, Alemania). Para la síntesis de los monómeros
peptídicos con un extremo carboxi terminal amidado, el péptido
completamente ensamblado se escinde de la resina con TFA al 82,5%,
agua al 5%, anisol al 6,25%, etanoditiol al 6,25%. El producto
desprotegido se filtra de la resina y se precipita con éter
dietílico. Después de secar completamente, el producto se purifica
mediante cromatografía líquida de alta resolución C18 en fase
inversa con un gradiente de acetonitrilo/agua en ácido
trifluoroacético al 0,1%. La estructura del péptido se confirma
mediante espectrometría de masas por electropulverización. El
péptido se disuelve en una solución 1:1 de DMSO:agua a una
concentración de 1 mg/mL para efectuar la formación del disulfuro.
El producto se purifica mediante cromatografía líquida de alta
resolución C18 en fase inversa con un gradiente de
acetonitrilo/agua en ácido trifluoroacético al 0,1%.
Los monómeros peptídicos pueden ilustrarse como
sigue:
Paso
2
A una solución de iminoacetato de dietilo (10,0
g, 52,8 mmoles) y Boc-beta-alanina
(10,0 g, 52,8 mmoles) en 100 mL de DCM se le agregó
diisopropilcarbodiimida (8,0 mL, 51,1 mmoles) durante 10 minutos a
temperatura ambiente. La mezcla de reacción se calentó a \sim10
grados durante la adición, a continuación se enfrió nuevamente a
temperatura ambiente durante 20 minutos. La mezcla de reacción se
dejó agitar durante la noche y la diisopropilurea precipitada se
filtró. El disolvente se eliminó bajo presión reducida para
proporcionar una goma, y el residuo se disolvió en acetato de etilo
y se filtró nuevamente para eliminar la urea precipitada adicional.
La fase orgánica se colocó en un embudo de separación, se lavó
(NaHCO_{3} saturado, salmuera, HCl 0,5N, salmuera), se secó
(MgSO_{4}), se filtró y concentró bajo presión reducida para
proporcionar el producto de diéster en forma de un aceite incoloro.
El diéster se suspendió en una mezcla 1:1 de MeOH:THF (100 mL) y se
le agregó agua (25 mL), y a continuación NaOH (5 g, 125 mmoles). El
pH se midió a > 10. La mezcla de reacción se agitó a temperatura
ambiente durante 2 horas, y a continuación se acidificó a pH 1 con
HCl 6N. La fase acuosa se saturó con NaCl y se extrajo 4 veces con
acetato de etilo. La fase orgánica combinada se lavó (salmuera), se
secó (MgSO_{4}), y se concentró bajo presión reducida para
proporcionar un semisólido blanco. El sólido se disolvió en 50 mL
de DCM y se le agregaron 300 mL de hexano para crear una suspensión
blanca. El disolvente se eliminó bajo presión reducida para
proporcionar el diácido en forma de un sólido blanco (14,7 g, 91,5%
de rendimiento para 2 pasos). A una solución del diácido (1 g, 3,29
mmoles) en 20 mL de DMF se le agregó
N-hidroxisuccinimida (770 mg, 6,69 mmoles) y
diisopropilcarbodiimida (1,00 mL, 6,38 mmoles) y
4-dimetilaminopiridina (3 mg, 0,02 mmoles). La
mezcla de reacción se agitó durante la noche y el disolvente se
eliminó bajo presión reducida. El residuo se suspendió en acetato
de etilo y se filtró para eliminar la urea precipitada. La fase
orgánica se colocó en un embudo de separación, se lavó (NaHCO_{3}
saturado, salmuera, HCl 0,5 N, salmuera), se secó (MgSO_{4}), se
filtró y se concentró bajo presión reducida para proporcionar el
producto éster de di-NHS en forma de un sólido
blanco (1,12 g, 68% de rendimiento).
Paso
3
Para acoplar el enlazante, se mezclan 2
equivalentes del péptido con 1 equivalente del enlazante
trifuncional en DMF seca para proporcionar una solución clara y se
agregan 5 equivalentes de DIEA después de 2 minutos. La mezcla se
agita a temperatura ambiente durante 14 horas. El disolvente se
elimina bajo presión reducida y el producto bruto se disuelve en
TFA al 80% en DCM durante 30 minutos para eliminar el grupo Boc,
seguido por la purificación con HPLC C18 en fase inversa. La
estructura del dímero se confirma mediante espectrometría de masas
por electropulverización. Esta reacción de acoplamiento une el
enlazante al átomo de nitrógeno del grupo
\varepsilon-amino del residuo de lisina de cada
monómero. El proceso se muestra a continuación con la SEQ ID NO:
1.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Paso
4
El dímero peptídico se mezcla con una cantidad
igual (base en moles) de la especie activada de PEG
(mPEG-NPC de NOF Corp. Japón) en DMF seca para
proporcionar una solución clara. Después de 5 minutos, se agregan 4
equivalentes de DIEA a la solución anterior. La mezcla se agita a
temperatura ambiente durante 14 horas, seguido por la purificación
con HPLC C18 en fase inversa. La estructura del péptido PEGilado se
confirma mediante la masa por MALDI. El péptido purificado se
sometió también a purificación por cromatografía de intercambio
catiónico como se expone a continuación. A continuación se muestra
la PEGilación con mPEG-NPC usando la SEQ ID NO:
1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El dímero peptídico se mezcla con una cantidad
igual (base en moles) de una especie activada de PEG
(PEG-SPA-NHS de Shearwater Corp,
EE.UU.) en DMF seca para proporcionar una solución clara. Después de
5 minutos, se agregaron 10 equivalentes de DIEA a la solución
anterior. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 2 horas,
seguido por purificación mediante HPCL C18 en fase inversa. La
estructura del péptido PEGilado se confirmó mediante la masa con
MALDI. El péptido purificado también se sometió a purificación por
cromatografía de intercambio catiónico como se indica a
continuación. A continuación se muestra la PEGilación con
PEG-SPA-NHS usando la SEQ ID No:
1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Paso
5
Se investigaron varios soportes de intercambio
respecto a su capacidad para separar el conjugado
péptido-PEG anterior del PEG sin reaccionar (o
hidrolizado), además de su capacidad para retener los péptidos
diméricos iniciales. La resina de intercambio iónico
(2-3 g) se cargó en una columna de 1 cm, seguido por
la conversión a la forma sódica (NaOH 0,2N cargado en la columna
hasta que el eluyente estaba a pH 14, aproximadamente 5 volúmenes
de la columna), y a la forma de hidrógeno (eluida con HCl 0,1N o
HOAc 0,1M hasta que el eluyente coincidió con el pH de la carga,
aproximadamente 5 volúmenes de la columna), seguido por lavado con
ACN/agua al 25% hasta pH 6. El péptido antes de la conjugación o el
conjugado de péptido-PEG se disolvió en ACN/agua al
25% (10 mg/mL) y el pH se ajustó a < 3 con TFA, y a continuación
se cargó en la columna. Después de lavar con 2-3
volúmenes de la columna de ACN/agua al 25%, y recolectar fracciones
de 5 mL, el péptido se liberó de la columna mediante elución con
NH_{4}OAc 0,1M en ACN/agua al 25%, nuevamente recolectando
fracciones de 5 mL. Los análisis por HPLC revelaron las fracciones
que contenían el péptido deseado. Los análisis con un Detector
Evaporativo de Dispersión de la Luz (ELSD) indicaron que cuado el
péptido se retuvo en la columna, y se eluyó con la solución de
NH_{4}OAc (generalmente entre las fracciones 4 y 10), no se
observó PEG no conjugado como contaminante. Cuando el péptido se
eluyó en el tampón de lavado inicial (generalmente las primeras 2
fracciones), no se observó separación del conjugado de PEG deseado
ni un exceso de PEG.
Las siguientes columnas retuvieron con éxito
tanto el péptido como el conjugado péptido-PEG, y
purificaron con éxito el conjugado péptido-PEG del
péptido no conjugado:
Ejemplo
6
Los homodímeros peptídicos agonistas del
EPO-R de monómeros peptídicos que tienen la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K
(SEQ ID NO: 2) se sintetizan como se describe en el Ejemplo 1,
excepto que en el Paso 1, los monómeros peptídicos sintetizados
son:
| (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K | (SEQ ID NO: 2) |
Cuando el PEG está unido a un enlazante vía un
enlace de carbamato, el producto final de esta síntesis usando la
SEQ ID NO: 2 puede ilustrarse estructuralmente como sigue:
Cuando el PEG está unido al enlazante vía un
enlace de amida, el producto final de esta síntesis usando la SEQ
ID NO: 2 puede ilustrarse estructuralmente como sigue:
Ejemplo
7
Este ejemplo describe varios ensayos in
vitro que son útiles para evaluar la actividad y la potencia de
los péptidos agonistas del EPO-R de la invención.
Los resultados de estos ensayos demuestran que los péptidos
novedosos de esta invención se unen al EPO-R y
activan la señalización del EPO-R. Además, los
resultados para estos ensayos muestran que las nuevas composiciones
peptídicas exhiben un incremento sorprendente en la afinidad de
unión al EPO-R y en la actividad biológica en
comparación con los péptidos miméticos de la EPO que se han
descrito previamente.
Los monómeros y dímeros peptídicos agonistas del
EPO-R se preparan de acuerdo con los métodos
proporcionados en el Ejemplo 1 o el Ejemplo 2. La potencia de estos
dímeros peptídicos se evalúa utilizando una serie de ensayos de la
actividad in vitro, que incluyen: un ensayo reportero, un
ensayo de proliferación, un ensayo de unión competitiva y un ensayo
C/BFU-e. Estos cuatro ensayos se describen con más
detalle a continuación.
Los resultados de estos ensayos de la actividad
in vitro se resumen en la Tabla 2.
Este ensayo se basa en una célula reportera
derivada de la línea celular de prelinfocitos B murina,
Baf3/EpoR/
GCSFR fos/lux. Esta línea celular reportera expresa un receptor quimérico que comprende la porción extracelular del receptor humano de la EPO y la porción intracelular del receptor humano de GCSF. Esta línea celular se transfecta además con un constructo de un gen reportero de luciferasa dirigido por el promotor fos. La activación de este receptor quimérico a través de la adición del agente eritropoyético resulta en la expresión del gen reportero de la luciferasa, y por lo tanto, en la producción de luz tras la adición del sustrato de la luciferasa, la luciferina. Así, el nivel de activación del EPO-R en tales células puede cuantificarse midiendo la actividad de la luciferasa.
GCSFR fos/lux. Esta línea celular reportera expresa un receptor quimérico que comprende la porción extracelular del receptor humano de la EPO y la porción intracelular del receptor humano de GCSF. Esta línea celular se transfecta además con un constructo de un gen reportero de luciferasa dirigido por el promotor fos. La activación de este receptor quimérico a través de la adición del agente eritropoyético resulta en la expresión del gen reportero de la luciferasa, y por lo tanto, en la producción de luz tras la adición del sustrato de la luciferasa, la luciferina. Así, el nivel de activación del EPO-R en tales células puede cuantificarse midiendo la actividad de la luciferasa.
Las células Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux se cultivan
en medio DMEM/F12 (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al
10% (FBS; Hyclone), sobrenadante de WEHI-3 al 10%
(el sobrenadante de un cultivo de células WEHI-3,
ATCC nº TIB-68), y penicilina/estreptomicina.
Aproximadamente 18 horas antes del ensayo, las células se
subalimentan transfiriéndolas a medio DMEM/F12 suplementado con FBS
al 10% y sobrenadante de WEHI-3 al 0,1%. En el día
del ensayo, las células se lavan una vez con medio DMEM/F12
suplementado con FBS al 10% (sin sobrenadante de
WEHI-3), a continuación se cultivan 1 X 10^{6}
células/mL en presencia de una concentración conocida del péptido
de prueba o con EPO (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN) como
un control positivo, en medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 10%
(sin sobrenadante de WEHI-3). Se ensayan
simultáneamente diluciones seriadas del péptido de prueba en este
ensayo. Las placas de ensayo se incuban durante 4 horas a 37ºC en
una atmósfera de CO_{2} al 5%, después de lo cual se agrega
luciferina a cada pocillo (Steady-Glo; Promega,
Madison, Wi). Después de una incubación de 5 minutos, se mide la
emisión de luz en un Luminómetro Topcount de Packard (Packard
Instrument Co., Downers Grove,III.). Los recuentos de luz se
representan en función de la concentración del péptido de prueba y
se analizan utilizando el programa Graph Pad. La concentración del
péptido de prueba que resulta en la mitad de la emisión de luz
máxima se registra como la CE50.
Este ensayo se basa en una línea de
prelinfocitos B murina, Baf3, transfectada para expresar el
EPO-R humano. La proliferación de la línea celular
resultante, BaF3/Gal4/Elk/EPOP, es dependiente de la activación del
EPO-R. El grado de proliferación celular se
cuantifica utilizando MTT, en donde la señal en el ensayo con MTT es
proporcional al número de células viables.
Las células BaF3/Gal4/Elk/EPOR se cultivan en
matraces de agitación en medio DMEM/F12 (Gibco) suplementado con
FBS al 10% (Hyclone) y sobrenadante de WEHI-3 al 2%
(ATCC nº TIB-68). Las células cultivadas se
subalimentan durante la noche, en un matraz de agitación a una
densidad celular de 1x10^{6} células/ml, en medio DMEM/F12
suplementado con FBS al 10% y sobrenadante de WEHI-3
al 1%. Las células subalimentadas se lavan entonces dos veces con
PBS de Dulbecco (Gibco), y se resuspenden a una densidad de
1x10^{6} células/ml en DMEM/F12 suplementado con FBS al 10% (sin
sobrenadante de WEHI-3). A continuación se siembran
alícuotas de 50 \muL (\sim50.000 células) de la suspensión
celular por triplicado en placas de ensayo de 96 pocillos. Se
agregan alícuotas de 50 \muL de la serie de diluciones de los
péptidos miméticos de la EPO o 50 \muL de EPO (R & D Systems
Inc., Minneapolis, MN) o Aranesp^{TM} (darbepoyetina alfa, un
agonista del EPO-R comercialmente disponible de
Amgen) en medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 10% (sin
sobrenadante de WEHI-3 I) a las placas de ensayo de
96 pocillos (volumen final del pocillo de 100 \muL). Por ejemplo,
pueden probarse 12 diluciones diferentes en las que la
concentración final del péptido de prueba (o el péptido control de
la EPO) varía de 810 pM a 0,0045 pM. Las células sembradas se
incuban entonces durante 48 horas a 37ºC. A continuación, se agregan
10 \muL de MTT (Roche Diagnostics) a cada pocillo de la placa de
cultivo, y se dejan incubar durante 4 horas. La reacción se detiene
entonces agregando SDS al 10% + HCl 0,01N. Las placas son incubadas
entonces durante la noche a 37ºC. Después se mide la absorbancia de
cada pocillo a una longitud de onda de 595 nm mediante
espectrofotometría. Se elaboran gráficas de las lecturas de la
absorbancia frente a la concentración del péptido de prueba y se
calcula la CE50 utilizando el programa Graph Pad. La concentración
del péptido de prueba que resulta en una absorbancia semimáxima se
registra como la CE50.
Los cálculos de la unión competitiva se hacen
utilizando un ensayo en el cual una señal luminosa se genera como
una función de la proximidad de dos perlas: una perla donadora de
estreptavidina que porta un indicador radiactivo peptídico que se
une al EPO-R biotilinado y una perla receptora a la
cual se une el EPO-R. La luz es generada mediante
transferencia de energía no radiactiva, durante lo cual se libera un
oxígeno de singulete de una primera perla tras la iluminación, y el
contacto con el oxígeno de singulete liberado causa que la segunda
perla emita luz. Estos conjuntos de perlas están comercialmente
disponibles (Packard). La proximidad de la perla se genera mediante
la unión del indicador radiactivo peptídico que se une al
EPO-R al EPO-R. Un péptido de
prueba que compite con el indicador radiactivo peptídico que se une
al EPO-R para unirse al EPO-R
evitará esta unión, causando una disminución en la emisión de
luz.
Con más detalle, el método es como sigue:
Agregar 4 \muL de las diluciones seriadas del péptido agonista
del EPO-R de prueba, o los controles positivos o
negativos, a los pocillos de una placa de 384 pocillos.
Posteriormente, agregar 2 \muL/pocillo del cóctel de
receptor/perla. El cóctel de perlas del receptor consta de: 15
\muL de 5 mg/ml de perlas donadoras de estreptavidina (Packard),
15 \muL de 5 mg/ml de anticuerpo monoclonal ab179 (este
anticuerpo reconoce la porción de la proteína fosfatasa alcalina de
la placenta humana contenida en el EPO-R
recombinante), perlas receptoras recubiertas con la proteína A (la
proteína A se unirá al anticuerpo ab179; Packard), 112,5 \muL de
una dilución 1:6,6 del EPO-R recombinante (producido
en las células de Ovario de Hámster Chino como una proteína de
fusión a una porción de la proteína fosfatasa alcalina de placenta
humana que contiene el epitopo objetivo ab179) y 607,5 \muL de
tampón Alphaquest (HEPES 40 mM, pH 7,4; MgCl_{2} 1 mM; BSA al
0,1%, Tween 20 al 0,05%). Golpear ligeramente para mezclar. Agregar
2 \muL/pocillo del indicador radiactivo peptídico que se une al
EPO-R biotilinado (concentración final de 30 nM). El
indicador peptídico un péptido que se une al EPO-R,
se hace de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1 usando
la SEQ ID NO: 4.
Centrifugar durante 1 minuto para mezclar.
Sellar la placa con Top Seal de Packard y envolver en una hoja
delgada de metal. Incubar durante la noche a temperatura ambiente.
Después de 18 horas leer la emisión de luz utilizando un lector
AlphaQuest (Packard). Representar la emisión de luz frente a la
concentración del péptido y analizar con Graph Pad o Excel.
La concentración del péptido de prueba que
resulte en una disminución del 50% en la emisión de la luz, con
relación a aquélla observada sin el péptido de prueba, se registra
como la CI50.
La señalización del EPO-R
estimula la diferenciación de las células germinales de la médula
ósea en precursores de los eritrocitos proliferantes. Este ensayo
mide la capacidad de los péptidos de prueba para estimular la
proliferación y diferenciación de los precursores de eritrocitos de
las células germinales primarias pluripotentes de la médula ósea
humana.
Para este ensayo, se hacen diluciones seriadas
del péptido de prueba en medio IMDM (Gibco) suplementado con FBS al
10% (Hyclone). Estas diluciones seriadas, o péptido de EPO de
control positivo, se agregan entonces a la metilcelulosa para dar
un volumen final de 1,5 mL. La mezcla de metilcelulosa y péptido se
agita a conciencia mediante un vortex. Se descongelan alícuotas
(100.000 células/mL) de células CD34+ derivadas de médula ósea
humana (Poietics/Cambrex). Las células descongeladas se agregan con
cuidado a 0,1 mL de 1 mg/ml de ADnasa (Células Germinales) en un
tubo de 50 mL. A continuación, se agregan con cuidado
40-50 mL de medio IMDM a las células: el medio se
agrega gota a gota a lo largo del borde del tubo de 50 mL para los
primeros 10 mL, y a continuación el volumen restante del medio de
distribuye lentamente a lo largo del borde del tubo. Las células se
centrifugan entonces a 900 rpm durante 20 minutos, y el medio se
elimina cuidadosamente mediante aspiración suave. Las células se
resuspenden en 1 ml de medio IMDM y la densidad celular por mL se
cuenta en un portaobjetos del hemacitómetro (alícuota de 10 \muL
de la suspensión celular en el portaobjetos, y la densidad celular
es el recuento promedio X 10.000 células/ml). Las células se
diluyen entonces en medio IMDM a una densidad celular de 15.000
células/mL. Se agregan entonces 100 \muL de las células diluidas a
cada 1.5 mL de metilcelulosa más la muestra del péptido (la
concentración celular final en el medio de ensayo es de 1000
células/mL), y la mezcla se agita en un vortex. Dejar que
desparezcan las burbujas en la mezcla, y a continuación, aspirar 1
mL utilizando una aguja con extremo romo. Agregar 0,25 mL de la
mezcla aspirada de cada muestra a cada uno de los 4 pocillos de una
placa de 24 pocillos (marca Falcon). Incubar las mezclas sembradas a
37ºC bajo CO_{2} al 5% en un incubador húmedo durante 14 días.
Evaluar respecto a la presencia de colonias eritroides utilizando
un microscopio de fase (objetivo 5X-10X,
amplificación final de 100X). La concentración del péptido de prueba
a la cual el número de colonias formadas constituye el 90% del
máximo, con relación a aquél observado con el control positivo de
la EPO, se registra como la CE90 [Véase la Tabla 2: CE90 de
C/BFU-e].
\newpage
Ejemplo
8
Este ejemplo describe varios ensayos in
vivo que son útiles para evaluar la actividad y la potencia de
los péptidos agonistas del EPO-R de la invención.
Los monómeros y dímeros peptídicos agonistas del
EPO-R se preparan de acuerdo con los métodos
proporcionados en el Ejemplo 1. La actividad in vivo de estos
monómeros y dímeros peptídicos se evalúa utilizando una serie de
ensayos, que incluyen el bioensayo del ratón exhipóxico policitémico
y un ensayo de reticulocito. Estos dos ensayos se describen con
mayor detalle a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos de prueba se ensayan para la
actividad in vivo en el bioensayo del ratón exhipóxico
policitémico adaptado del método descrito por Cotes y Bangham
(1961), Nature 191: 1065-1067. Este ensayo examina
la capacidad de un péptido de prueba para funcionar como un
mimético de la EPO: es decir, para activar el EPO-R
e inducir la síntesis de nuevos eritrocitos. La síntesis de
eritrocitos se cuantifica basándose en la incorporación de hierro
radiomarcado en la hemoglobina de los eritrocitos sintetizados.
Los ratones BDF1 se dejan aclimatar a
condiciones ambientales durante 7-10 días. Los pesos
corporales se determinan para todos los animales, y no se utilizan
animales con bajo peso (< 15 gramos). Los ratones se someten a
ciclos de acondicionamiento sucesivos en una cámara hiperbárica
durante un total de 14 días. Cada ciclo de 24 horas consta de 18
horas a 0,40\pm0,02% de presión atmosférica y 6 horas a presión
ambiental. Después de acondicionar a los ratones, se mantienen a
presión ambiental durante 72 horas adicionales antes de la
dosificación.
Los péptidos de prueba, o los patrones de EPO
recombinante humana se diluyen en vehículo de PBS + BSA al 0,1%
(PBS/BSA). Las soluciones madre del monómero peptídico se
solubilizan primero en dimetilsulfóxido (DMSO). Los grupos del
control negativo incluyen un grupo de ratones inyectados con PBS/BSA
solo y un grupo inyectado con DMSO al 1%. Cada grupo de dosis
contiene 10 ratones. Los ratones se inyectan subcutáneamente (piel
de la nuca del cuello) con 0,5 mL de la muestra apropiada.
Cuarenta y ocho horas después de la inyección de
la muestra, se les administró a los ratones una inyección
intraperitoneal de 0,2 ml de Fe^{59} (Dupont, NEN), para una dosis
de aproximadamente 0,75 \muCurios/ratón. Los pesos corporales de
los ratones se determinan 24 horas después de la administración del
Fe^{59}, y los ratones se sacrifican 48 horas después de la
administración del Fe^{59}. La sangre se recolecta de cada animal
mediante punción cardiaca y se determinan los hematocritos (se
utilizó heparina como el anticoagulante). Cada muestra de sangre
(0,2 ml) se analiza para la incorporación de Fe^{59} utilizando un
contador gamma de Packard. Los ratones que no responden (es decir,
aquellos ratones con una incorporación radiactiva menor que el
grupo de control negativo) se eliminan del conjunto de datos
apropiado.
Los ratones que tienen valores de hematocritos menores que el 53% del grupo de control negativo también se eliminan.
Los ratones que tienen valores de hematocritos menores que el 53% del grupo de control negativo también se eliminan.
Los resultados se derivan de los conjuntos de 10
animales para cada dosis experimental. Se calcula la cantidad
promedio de radiactividad incorporada [recuentos por minuto (CPM)]
en las muestras de sangre de cada grupo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones BDF1 normales se tratan (0,5 mL,
inyectados subcutáneamente) en tres días consecutivos con el control
de EPO o con el péptido de prueba. En el día tres, los ratones
también se tratan (0,1 mL, inyectados intraperitonealmente) con
dextrano de hierro (100 mg/ml). En el día cinco, los ratones se
anestesian con CO_{2} y se desangran mediante punción cardiaca.
El porcentaje (%) de reticulocitos para cada muestra de sangre se
determina mediante tinción con naranja de tiazol y con análisis del
citómetro de flujo (programa retic-count). Los
hematocritos se determinan manualmente. El porcentaje corregido de
reticulocitos de determina utilizando la siguiente fórmula:
%RETIC_{CORREGIDO} =
%RETIC_{OBSERVADO} X
Hematocrito_{INDIVIDUAL}/Hematocrito_{NORMAL})
Ratones CD1 normales se tratan con cuatro
inyecciones intravenosas a la semana de un bolo del control positivo
de la EPO, el péptido de prueba o el vehículo. Se ensaya una gama
de dosis del control positivo y del péptido de prueba, expresadas
en mg/kg, variando la concentración del compuesto activo en la
formulación. Los volúmenes inyectados son de 5 ml/kg. El grupo de
control del vehículo está compueesto por doce animales, mientras que
en cada uno de los grupos de dosis restantes están 8 animales. Se
registran la viabilidad diaria y los pesos corporales
semanales.
Los ratones tratados se dejan en ayunas y a
continuación se anestesian con isofluorano inhalado, y se recolectan
muestran de sangre terminal vía punción cardiaca o de la aorta
abdominal en el Día 1 (para los ratones del control del vehículo) y
en los Días 15 y 29 (4 ratones/grupo/día). La sangre se transfiere a
tubos marca Vacutainer®. El anticoagulante preferido es el ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA).
Las muestras de sangre se evalúan para los
puntos finales midiendo la síntesis de eritrocitos y la fisiología,
tales como los hematocritos (Hct), hemoglobina (Hgb) y recuento
total de eritrocitos (RBC) utilizando analizadores clínicos
automatizados, bien conocidos en la técnica (por ejemplo, aquéllos
hechos por Coulter, Inc.).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Paso
1
Los monómeros peptídicos se sintetizan
utilizando la química convencional de Fmoc en un sintetizador de
péptidos ABI 431A, utilizando resina TG-RAM (0.18
mmoles/g Rapp Polymere, Alemania). Para la síntesis de los monómeros
peptídicos con un extremo carboxi terminal amidado, el péptido
completamente ensamblado se escinde de la resina con TFA al 82,5%,
agua al 5%, anisol al 6,25%, etanditiol al 6,25%. El producto
desprotegido se filtra de la resina y se precipita con éter
dietílico. Después de secar completamente, el producto se purifica
mediante cromatografía líquida de alta resolución C18 en fase
inversa con un gradiente de acetonitrilo/agua en ácido
trifluoroacético al 0,1%. La estructura del péptido se confirma
mediante espectrometría de masas por electropulverización. Los
monómeros peptídicos pueden ilustrarse como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Paso
2
A una solución de iminoacetato de dietilo (10,0
g, 52,8 mmoles) y Boc-beta-alanina
(10,0 g, 52,8 mmoles) en 100 mL de DCM se le agregó
diisopropilcarbodiimida (8,0 mL, 51,1 mmoles) durante 10 minutos a
temperatura ambiente. La mezcla de reacción se calentó a \sim10
grados durante la adición, y a continuación se enfrió nuevamente a
temperatura ambiente durante 20 minutos. La mezcla de reacción se
dejó agitar durante la noche y la diisopropilurea precipitada se
filtró. El disolvente se eliminó bajo presión reducida para
proporcionar una goma, y el residuo se disolvió en acetato de etilo
y se filtró nuevamente para eliminar la urea precipitada adicional.
La fase orgánica se colocó en un embudo de separación, se lavó
(NaHCO_{3} saturado, salmuera, HCl 0,5N, salmuera), se secó
(MgSO_{4}), se filtró y concentró bajo presión reducida para
proporcionar el producto de diéster en forma de un aceite incoloro.
El diéster se suspendió en una mezcla 1:1 de MeOH:THF (100 mL) y se
le agregó agua (25 mL), y a continuación NaOH (5 g, 125 mmoles). El
pH se midió a > 10. La mezcla de reacción se agitó a temperatura
durante 2 horas, y a continuación se acidificó a pH 1 con HCl 6N. La
fase acuosa se saturó con NaCl y se extrajo 4 veces con acetato de
etilo. La fase orgánica combinada se lavó (salmuera), se secó
(MgSO_{4}), y se concentró bajo presión reducida para
proporcionar un semisólido blanco. El sólido se disolvió en 50 mL
de DCM y se le agregaron 300 mL de hexano para crear una suspensión
blanca. El disolvente se eliminó bajo presión reducida para
proporcionar el diácido en forma de un sólido blanco (14,7 g, 91,5%
de rendimiento para 2 pasos). A una solución del diácido (1 g, 3,29
mmoles) en 20 mL de DMF se le agregó
N-hidroxisuccinimida (770 mg, 6,69 mmoles) y
diisopropilcarbodiimida (1,00 mL, 6,38 mmoles) y
4-dimetilaminopiridina (3 mg, 0,02 mmoles). La
mezcla de reacción se agitó durante la noche y el disolvente se
eliminó bajo presión reducida. El residuo se suspendió en acetato
de etilo y se filtró para eliminar la urea precipitada. La fase
orgánica se colocó en un embudo de separación, se lavó (NaHCO_{3}
saturado, salmuera, HCl 0,5 N, salmuera), se secó (MgSO_{4}), se
filtró y se concentró bajo presión reducida para proporcionar el
producto éster de di-NHS en forma de un sólido
blanco (1,12 g, 68% de rendimiento).
\vskip1.000000\baselineskip
Paso
3
Para acoplar el enlazante, se mezclan 2
equivalentes del péptido con 1 equivalente del enlazante
trifuncional en DMF seca para proporcionar una solución clara, y se
agregan 5 equivalentes de DIEA después de 2 minutos. La mezcla se
agita a temperatura ambiente durante 14 horas. El disolvente se
elimina bajo presión reducida y el producto bruto se disuelve en
80% de TFA en DCM durante 30 minutos para eliminar el grupo Boc,
seguido por la purificación con HPLC C18 en fase inversa. La
estructura del dímero se confirma mediante espectrometría de masas
por electropulverización. Esta reacción de acoplamiento une el
enlazante al átomo de nitrógeno del grupo
\varepsilon-amino del residuo de lisina de cada
monómero. A continuación se muestra el acoplamiento usando la SEQ
ID NO: 1.
Paso
4
El lisinol, que puede obtenerse comercialmente,
se trata con un exceso de mPEG2-NPC para obtener
MPEG2-lisinol, que se hace reaccionar a
continuación con NPC para formar
mPEG2-lisinol-NPC.
Este producto puede obtenerse comercialmente,
por ejemplo, del catálogo de Ingeniería Molecular (2003) de Nektar
Therapeutics (490 Discovery Drive, Huntsville, Alabama 35806), no.
de artículo 2Z3XOT01.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso
5
El dímero peptídico y la especie activada de PEG
(mPEG_{2}-Lisinol-NPC) se mezclan
en una relación molar de 1:2 en DMF seca para proporcionar una
solución clara. Después de 5 minutos, se agregan 4 equivalentes de
DIEA a la solución anterior. La mezcla se agita a temperatura
ambiente durante 14 horas, seguido por la purificación con HPLC C18
en fase inversa. La estructura del péptido PEGilado se confirma
mediante la masa por MALDI. El péptido purificado se sometió
también a purificación por cromatografía de intercambio catiónico
como se expone a continuación. A continuación se muestra la
PEGilación usando mPEG-Lisinol-NPC y
la SEQ ID NO: 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El dímero peptídico y la especie activada de PEG
(mPEG_{2}-Lys-NHS de Shearwater
Corp, EE.UU.) se mezclan en una relación molar 1:2 en DMF seca para
proporcionar una solución clara. Después de 5 minutos, se agregan
10 equivalentes de DIEA a la solución anterior. La mezcla se agita a
temperatura ambiente durante 2 horas, seguido por purificación
mediante HPCL C18 en fase inversa. La estructura del péptido
PEGilado se confirmó mediante la masa con MALDI. El péptido
purificado también se sometió a purificación por cromatografía de
intercambio catiónico como se indica a continuación. A continuación
se muestra la PEGilación usando
mPEG_{2}-Lys-NHS y la SEQ
ID
NO: 1.
NO: 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso
6
Se investigaron varios soportes de intercambio
respecto a su capacidad para separar el conjugado
péptido-PEG anterior del PEG sin reaccionar (o
hidrolizado), además de su capacidad para retener los péptidos
diméricos iniciales. La resina de intercambio iónico
(2-3 g) se cargó en una columna de 1 cm, seguido por
la conversión a la forma sódica (NaOH 0,2N cargado en la columna
hasta que el eluyente estaba a pH 14, aproximadamente 5 volúmenes
de la columna), y a la forma de hidrógeno (eluida con HCl 0,1N o
HOAc 0,1M hasta que el eluyente coincidió con el pH de la carga,
aproximadamente 5 volúmenes de la columna), seguido por lavado con
ACN/agua al 25% hasta pH 6. El péptido antes de la conjugación o el
conjugado de péptido-PEG se disolvió en ACN/agua al
25% (10 mg/mL) y el pH se ajustó a < 3 con TFA, a continuación se
cargó en la columna. Después de lavar con 2-3
volúmenes de la columna de ACN/agua al 25%, y recolectar fracciones
de 5 mL, el péptido se liberó de la columna mediante elución con
NH_{4}OAc 0,1M en ACN/agua al 25%, nuevamente recolectando
fracciones de 5 mL. Los análisis por HPLC revelaron las fracciones
que contenían el péptido deseado. Los análisis con un Detector
Evaporativo de Dispersión de la Luz (ELSD) indicaron que cuado el
péptido se retuvo en la columna, y se eluyó con la solución de
NH_{4}OAc (generalmente entre las fracciones 4 y 10), no se
observó PEG no conjugado como un contaminante. Cuando el péptido se
eluyó en el tampón de lavado inicial (generalmente las primeras 2
fracciones), no se observó separación del conjugado de PEG deseado
ni un exceso de PEG.
Las siguientes columnas retuvieron con éxito
tanto el péptido como el conjugado péptido-PEG, y
purificaron con éxito el conjugado péptido-PEG del
péptido no conjugado:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Los homodímeros peptídicos agonistas del
EPO-R de monómeros peptídicos que tienen la
secuencia de aminoácidos
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K
(SEQ ID NO: 2) se sintetizan como se describe en el Ejemplo 1,
excepto que en el Paso 1, los monómeros peptídicos sintetizados
son:
| (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K | (SEQ ID NO: 2) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando el PEG está unido a un espaciador vía un
enlace de carbamato, el producto final de esta síntesis usando la
SEQ ID NO: 2 puede ilustrarse estructuralmente como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Cuando el PEG está unido al espaciador vía un
enlace de amida, el producto final de esta síntesis usando la SEQ
ID NO: 2 puede ilustrarse estructuralmente como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Este ejemplo describe varios ensayos in
vitro que son útiles para evaluar la actividad y la potencia de
los péptidos agonistas del EPO-R de la invención.
Los resultados de estos ensayos demuestran que los péptidos
novedosos de esta invención se unen al EPO-R y
activan la señalización del EPO-R. Además, los
resultados de estos ensayos muestran que las nuevas composiciones
peptídicas exhiben un incremento sorprendente en la afinidad de
unión al EPO-R y en la actividad biológica en
comparación con los péptidos miméticos de la EPO que se han
descrito previamente.
Los monómeros y dímeros peptídicos agonistas del
EPO-R se preparan de acuerdo con los métodos
proporcionados en el Ejemplo 1 o el Ejemplo 2. La potencia de estos
dímeros peptídicos se evalúa utilizando una serie de ensayos de la
actividad in vitro, que incluyen un ensayo reportero, un
ensayo de proliferación, un ensayo de unión competitiva y un ensayo
C/BFU-e. Estos cuatro ensayos se describen con más
detalle a continuación.
Los resultados de estos ensayos de la actividad
in vitro se resumen en la Tabla 2.
Este ensayo se basa en una célula reportera
derivada de la línea celular de prelinfocitos B murina,
Baf3/EpoR/
GCSFR fos/lux. Esta línea celular reportera expresa un receptor quimérico que comprende la porción extracelular del receptor humano de la EPO y la porción intracelular del receptor humano de GCSF. Esta línea celular se transfecta además con un constructo de un gen reportero de luciferasa dirigido por el promotor fos. La activación de este receptor quimérico a través de la adición del agente eritropoyético resulta en la expresión del gen reportero de la luciferasa, y por lo tanto, en la producción de luz tras la adición del sustrato de la luciferasa, la luciferina. Así, el nivel de activación del EPO-R en tales células puede cuantificarse midiendo la actividad de la luciferasa.
GCSFR fos/lux. Esta línea celular reportera expresa un receptor quimérico que comprende la porción extracelular del receptor humano de la EPO y la porción intracelular del receptor humano de GCSF. Esta línea celular se transfecta además con un constructo de un gen reportero de luciferasa dirigido por el promotor fos. La activación de este receptor quimérico a través de la adición del agente eritropoyético resulta en la expresión del gen reportero de la luciferasa, y por lo tanto, en la producción de luz tras la adición del sustrato de la luciferasa, la luciferina. Así, el nivel de activación del EPO-R en tales células puede cuantificarse midiendo la actividad de la luciferasa.
Las células Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux se cultivan
en medio DMEM/F12 (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al
10% (FBS; Hyclone), sobrenadante de WEHI-3 al 10%
(el sobrenadante de un cultivo de células WEHI-3,
ATCC nº TIB-68), y penicilina/estreptomicina.
Aproximadamente 18 horas antes del ensayo, las células se
subalimentan transfiriéndolas a medio DMEM/F12 suplementado con FBS
al 10% y sobrenadante de WEHI-3 al 0,1%. En el día
del ensayo, las células se lavan una vez con medio DMEM/F12
suplementado con FBS al 10% (sin sobrenadante de
WEHI-3), a continuación se cultivan 1 X 10^{6}
células/mL en presencia de una concentración conocida del péptido
de prueba o con EPO (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN) como
un control positivo, en medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 10%
(sin sobrenadante de WEHI-3). Se ensayan
simultáneamente diluciones seriadas del péptido de prueba en este
ensayo. Las placas de ensayo se incuban durante 4 horas a 37ºC en
una atmósfera de CO_{2} al 5%, después de lo cual se agrega
luciferina a cada pocillo (Steady-Glo; Promega,
Madison, Wi). Después de una incubación de 5 minutos, se mide la
emisión de luz en un Luminómetro Topcount de Packard (Packard
Instrument Co., Downers Grove, III.). Los recuentos de luz se
representan en función de la concentración del péptido de prueba y
se analizan utilizando el programa Graph Pad. La concentración del
péptido de prueba que resulta en la mitad de la emisión de luz
máxima se registra como la CE50.
Este ensayo se basa en una línea de
prelinfocitos B murina, Baf3, transfectada para expresar el
EPO-R humano. La proliferación de la línea celular
resultante, BaF3/Gal4/Elk/EPOP, es dependiente de la activación del
EPO-R. El grado de proliferación celular se
cuantifica utilizando MTT, en donde la señal en el ensayo con MTT es
proporcional al número de células viables.
Las células BaF3/Gal4/Elk/EPOR se cultivan en
matraces de agitación en medio DMEM/F12 (Gibco) suplementado con
FBS al 10% (Hyclone) y sobrenadante de WEHI-3 al 2%
(ATCC nº TIB-68). Las células cultivadas se
subalimentan durante la noche en un matraz de agitación a una
densidad celular de 1x10^{6} células/ml, en medio DMEM/F12
suplementado con FBS al 10% y sobrenadante de WEHI-3
al 1%. Las células subalimentadas se lavan entonces dos veces con
PBS de Dulbecco (Gibco), y se resuspenden a una densidad de
1x10^{6} células/ml en DMEM/F12 suplementado con FBS al 10% (sin
sobrenadante de WEHI-3). A continuación se siembran
alícuotas de 50 \muL (\sim50.000 células) de las suspensión
celular por triplicado en placas de ensayo de 96 pocillos. Se
agregan alícuotas de 50 \muL de la serie de diluciones de los
péptidos miméticos de la EPO o 50 \muL de EPO (R & D Systems
Inc., Minneapolis, MN) o Aranesp^{TM} (darbepoyetina alfa, un
agonista del EPO-R comercialmente disponible de
Amgen) en medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 10% (sin
sobrenadante de WEHI-3 I) a las placas de ensayo de
96 pocillos (volumen final del pocillo de 100 \muL). Por ejemplo,
pueden probarse 12 diluciones diferentes en las que la
concentración final del péptido de prueba (o el péptido control de
la EPO) varía de 810 pM a 0,0045 pM. Las células sembradas se
incuban entonces durante 48 horas a 37ºC. A continuación, se agregan
10 \muL de MTT (Roche Diagnostics) a cada pocillo de la placa de
cultivo, y se dejan incubar durante 4 horas. La reacción de detiene
entonces agregando SDS al 10% + HCl 0,01N. Las placas son incubadas
entonces durante la noche a 37ºC. Después se mide la absorbancia de
cada pocillo a una longitud de onda de 595 nm mediante
espectrofotometría. Se elaboran gráficas de las lecturas de la
absorbancia frente a la concentración del péptido de prueba y se
calcula la CE50 utilizando el programa Graph Pad. La concentración
del péptido de prueba que resulta en una absorbancia semimáxima se
registra como la CE50.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cálculos de la unión competitiva se hacen
utilizando un ensayo en el cual una señal luminosa se genera como
una función de la proximidad de dos perlas: una perla donadora de
estreptavidina que porta un indicador radiactivo peptídico que se
une al EPO-R biotilinado y una perla receptora a la
cual se une el EPO-R. La luz es generada mediante
transferencia de energía no radiactiva, durante lo cual se libera un
oxígeno de singulete de una primera perla tras la iluminación, y el
contacto con el oxígeno de singulete liberado causa que la segunda
perla emita luz. Estos conjuntos de perlas están comercialmente
disponibles (Packard). La proximidad de la perla se genera mediante
la unión del indicador radiactivo peptídico que se une al
EPO-R al EPO-R. Un péptido de
prueba que compite con el indicador radiactivo peptídico que se une
al EPO-R para unirse al EPO-R
evitará esta unión, causando una disminución en la emisión de
luz.
Con más detalle, el método es como sigue:
Agregar 4 \muL de las diluciones seriadas del péptido agonista
del EPO-R de prueba, o los controles positivos o
negativos, a los pocillos de una placa de 384 pocillos.
Posteriormente, agregar 2 \muL/pocillo del cóctel de
receptor/perla. El cóctel de perlas del receptor consta de: 15
\muL de 5 mg/ml de perlas donadoras de estreptavidina (Packard),
15 \muL de 5 mg/ml de anticuerpo monoclonal ab179 (este
anticuerpo reconoce la porción de la proteína fosfatasa alcalina de
la placenta humana contenida en el EPO-R
recombinante), perlas receptoras recubiertas con la proteína A (la
proteína A se unirá al anticuerpo ab179; Packard), 112,5 \muL de
una dilución 1:6,6 del EPO-R recombinante (producido
en las células de Ovario de Hámster Chino como una proteína de
fusión a una porción de la proteína fosfatasa alcalina de placenta
humana que contiene el epitopo objetivo ab179) y 607,5 \muL de
tampón Alphaquest (HEPES 40 mM, pH 7,4; MgCl_{2} 1 mM; BSA al
0,1%, Tween 20 al 0,05%). Golpear ligeramente para mezclar. Agregar
2 \muL/pocillo del indicador radiactivo peptídico que se une al
EPO-R biotilinado (concentración final de 30 nM). El
indicador peptídico, un péptido que se une al
EPO-R, se hace de acuerdo con los métodos descritos
en el Ejemplo 1 usando la SEQ ID NO: 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Centrifugar durante 1 minuto para mezclar.
Sellar la placa con Top Seal de Packard y envolver en una hoja
delgada de metal. Incubar durante la noche a temperatura ambiente.
Después de 18 horas leer la emisión de luz utilizando un lector
AlphaQuest (Packard). Representar la emisión de luz frente a la
concentración del péptido y analizar con Graph Pad o Excel.
La concentración del péptido de prueba que
resulte en una disminución del 50% en la emisión de la luz, con
relación a aquélla observada sin el péptido de prueba, se registra
como la CI50.
\vskip1.000000\baselineskip
La señalización del EPO-R
estimula la diferenciación de las células germinales de la médula
ósea en precursores de los eritrocitos proliferantes. Este ensayo
mide la capacidad de los péptidos de prueba para estimular la
proliferación y diferenciación de los precursores de eritrocitos de
las células germinales primarias pluripotentes de la médula ósea
humana.
Para este ensayo, se hacen diluciones seriadas
del péptido de prueba en medio IMDM (Gibco) suplementado con FBS al
10% (Hyclone). Estas diluciones seriadas, o péptido de EPO de
control positivo, se agregan entonces a la metilcelulosa para dar
un volumen final de 1,5 mL. La mezcla de metilcelulosa y péptido se
agita a conciencia en un vortex. Se descongelan alícuotas (100.000
células/mL) de células CD34+ derivadas de médula ósea humana
(Poietics/Cambrex). Las células descongeladas se agregan con cuidado
a 0,1 mL de 1 mg/ml de ADnasa (Células Germinales) en un tubo de 50
mL. A continuación, se agregan con cuidado 40-50 mL
de medio IMDM a las células: el medio se agrega gota a gota a lo
largo del borde del tubo de 50 mL para los primeros 10 mL, y a
continuación el volumen restante del medio se distribuye lentamente
a lo largo del borde del tubo. Las células se centrifugan entonces
a 900 rpm durante 20 minutos, y el medio se elimina cuidadosamente
mediante aspiración suave. Las células se resuspenden en 1 ml de
medio IMDM y la densidad celular por mL se cuenta en un portaobjetos
del hemacitómetro (alícuota de 10 \muL de la suspensión celular
en el portaobjetos, y la densidad celular es el recuento promedio X
10.000 células/ml). Las células se diluyen entonces en medio IMDM a
una densidad celular de 15.000 células/mL. Después se agregan 100
\muL de las células diluidas a cada 1,5 mL de metilcelulosa más
la muestra del péptido (la concentración celular final en el medio
de ensayo es de 1000 células/mL), y la mezcla se agita en un
vortex. Dejar que desparezcan las burbujas en la mezcla, y a
continuación, aspirar 1 mL utilizando una aguja con extremo romo.
Agregar 0,25 mL de la mezcla aspirada de cada muestra a cada uno de
los 4 pocillos de una placa de 24 pocillos (marca Falcon). Incubar
las mezclas sembradas a 37ºC bajo CO_{2} al 5% en un incubador
húmedo durante 14 días. Evaluar respecto a la presencia de colonias
eritroides utilizando un microscopio de fase (objetivo
5X-10X, amplificación final de 100X). La
concentración del péptido de prueba a la cual el número de colonias
formadas constituye el 90% del máximo, con relación a aquél
observado con el control positivo de la EPO, se registra como la
CE90 [Véase la Tabla 2: CE90 de C/BFU-e].
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Ejemplo
12
Este ejemplo describe varios ensayos in
vivo que son útiles para evaluar la actividad y la potencia de
los péptidos agonistas del EPO-R de la invención.
Los monómeros y dímeros peptídicos agonistas del
EPO-R se preparan de acuerdo con los métodos
proporcionados en el Ejemplo 1. La actividad in vivo de estos
monómeros y dímeros peptídicos se evalúa utilizando una serie de
ensayos, que incluyen el bioensayo del ratón exhipóxico policitémico
y un ensayo de reticulocito. Estos dos ensayos se describen con
mayor detalle a continuación.
Los péptidos de prueba se ensayan para la
actividad in vivo en el bioensayo del ratón exhipóxico
policitémico adaptado del método descrito por Cotes y Bangham
(1961), Nature 191: 1065-1067. Este ensayo examina
la capacidad de un péptido de prueba para funcionar como un
mimético de la EPO: es decir, para activar el EPO-R
e inducir la síntesis de nuevos eritrocitos. La síntesis de
eritrocitos se cuantifica basándose en la incorporación de hierro
radiomarcado en la hemoglobina de los eritrocitos sintetizados.
Los ratones BDF1 se dejan aclimatar a
condiciones ambientales durante 7-10 días. Los pesos
corporales se determinan para todos los animales, y no se utilizan
animales con bajo peso (< 15 gramos). Los ratones se someten a
ciclos de acondicionamiento sucesivos en una cámara hiperbárica
durante un total de 14 días. Cada ciclo de 24 horas consta de 18
horas a 0,40\pm0,02% de presión atmosférica y 6 horas a presión
ambiental. Después de acondicionar a los ratones, se mantienen a
presión ambiental durante 72 horas adicionales antes de la
dosificación.
Los péptidos de prueba, o los patrones de EPO
recombinante humana se diluyen en vehículo de PBS + BSA al 0,1%
(PBS/BSA). Las soluciones madre del monómero peptídico se
solubilizan primero en dimetilsulfóxido (DMSO). Los grupos del
control negativo incluyen un grupo de ratones inyectados con PBS/BSA
solo y un grupo inyectado con DMSO al 1%. Cada grupo de dosis
contiene 10 ratones. Los ratones se inyectan subcutáneamente (piel
de la nuca del cuello) con 0,5 mL de la muestra apropiada.
Cuarenta y ocho horas después de la inyección de
la muestra, se les administra a los ratones una inyección
intraperitoneal de 0,2 ml de Fe^{59} (Dupont, NEN), para una dosis
de aproximadamente 0,75 \muCurios/ratón. Los pesos corporales de
los ratones se determinan 24 horas después de la administración del
Fe^{59}, y los ratones se sacrifican 48 horas después de la
administración del Fe^{59}. La sangre se recolecta de cada animal
mediante punción cardiaca y se determinan los hematocritos (se
utilizó heparina como el anticoagulante). Cada muestra de sangre
(0,2 ml) se analiza para la incorporación de Fe^{59} utilizando un
contador gamma de Packard. Los ratones que no responden (es decir,
aquellos ratones con una incorporación radiactiva menor que el
grupo de control negativo) se eliminan del conjunto de datos
apropiado. Los ratones que tienen valores de hematocritos menores
que el 53% del grupo de control negativo también se eliminan.
Los resultados se derivan de los conjuntos de 10
animales para cada dosis experimental. Se calcula la cantidad
promedio de radiactividad incorporada [recuentos por minuto (CPM)]
en las muestras de sangre de cada grupo.
Ratones BDF1 normales se tratan (0,5 mL,
inyectados subcutáneamente) en tres días consecutivos con el control
de EPO o con el péptido de prueba. En el día tres, los ratones
también se tratan (0,1 mL, inyectados intraperitonealmente) con
dextrano de hierro (100 mg/ml). En el día cinco, los ratones se
anestesian con CO_{2} y se desangran mediante punción cardiaca.
El porcentaje (%) de reticulocitos para cada muestra de sangre se
determina mediante tinción con naranja de tiazol y con análisis del
citómetro de flujo (programa retic-count). Los
hematocritos se determinan manualmente. El porcentaje corregido de
reticulocitos de determina utilizando la siguiente fórmula:
%RETIC_{CORREGIDO} =
%RETIC_{OBSERVADO} X
Hematocrito_{INDIVIDUAL}/Hematocrito_{NORMAL})
Ratones CD1 normales se tratan con cuatro
inyecciones intravenosas a la semana de un bolo del control positivo
de la EPO, el péptido de prueba o el vehículo. Se ensaya una gama
de dosis del control positivo y del péptido de prueba, expresadas
en mg/kg, variando la concentración del compuesto activo en la
formulación. Los volúmenes inyectados son de 5 ml/kg. El grupo de
control del vehículo está compuesto por doce animales, mientras que
en cada uno de los grupos de dosis restantes están 8 animales. Se
registran la viabilidad diaria y los pesos corporales
semanales.
Los ratones tratados se dejan en ayunas y a
continuación se anestesian con isofluorano inhalado, y se recolectan
muestran de sangre terminal vía punción cardiaca o de la aorta
abdominal en el Día 1 (para los ratones del control del vehículo) y
en los Días 15 y 29 (4 ratones/grupo/día). La sangre se transfiere a
tubos marca Vacutainer®. El anticoagulante preferido es el ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA).
Las muestras de sangre se evalúan para los
puntos finales midiendo la síntesis de eritrocitos y la fisiología,
tales como los hematocritos (Hct), hemoglobina (Hgb) y recuento
total de eritrocitos (RBC) utilizando analizadores clínicos
automatizados, bien conocidos en la técnica (por ejemplo, aquéllos
hechos por Coulter, Inc.).
La presente invención no debe limitase en su
alcance por las formas de realización específicas descritas en la
presente memoria. De hecho, los expertos en la técnica apreciarán
varias modificaciones de la invención, además de aquéllas descritas
en la presente memoria, a partir de la descripción anterior y de las
figuras adjuntas. Tales modificaciones pretenden entrar dentro del
alcance de las reivindicaciones anexas.
Deberá entenderse además, que todos los valores
son aproximados, y se proporcionan para la descripción.
En la descripción de esta invención se citan y
discuten numerosas referencias, que incluyen patentes, solicitudes
de patente y diversas publicaciones. Las citas y/o la discusión de
tales referencias se proporcionan simplemente para aclarar la
descripción de la presente invención, y no es una admisión de que
cualquiera de tales referencias es la "técnica anterior" de la
presente invención.
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[0196] [0228] [0263]
Claims (15)
1. Un compuesto que se une a, y activa el
receptor de la eritropoyetina (EPO-R), compuesto que
comprende un dímero peptídico que tiene la fórmula:
en la que (i) en cada monómero
peptídico del dímero peptídico, cada aminoácido se indica por la
abreviatura convencional de una letra, AcG es
N-acetilglicina y 1-nal es
1-naftilalanina; (ii) cada monómero peptídico del
dímero peptídico contiene un enlace disulfuro intramolecular entre
los dos residuos de cisteína (C) de cada monómero, (iii)
["PEG"] comprende al menos un resto de polietilenglicol (PEG)
lineal, presentando cada resto de PEG un peso molecular de
aproximadamente 20.000 a aproximadamente 40.000
Daltons.
2. Un compuesto que se une a, y activa el
receptor de la eritropoyetina (EPO-R), compuesto que
comprende un dímero peptídico que tiene la fórmula:
en el que (i) en cada monómero
peptídico del dímero peptídico, cada aminoácido se indica por la
abreviatura convencional de una letra, AcG es
N-acetilglicina, 1-nal es
1-naftilalanina, y MeG es
N-metilglicina; (ii) cada monómero peptídico del
dímero peptídico contiene un enlace disulfuro intramolecular entre
los dos residuos de cisteína (C) de cada monómero, (iii) PEG
comprende una molécula de polietilenglicol lineal no ramificada que
tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 a aproximadamente
40.000
Daltons.
3. Un compuesto que se une a, y activa el
receptor de la eritropoyetina (EPO-R), compuesto que
comprende un dímero peptídico que tiene la fórmula:
en la que (i) en cada monómero
peptídico del dímero peptídico, cada aminoácido se indica por la
abreviatura convencional de una letra, AcG es
N-acetilglicina, 1-nal es
1-naftilalanina; (ii) cada monómero peptídico del
dímero peptídico contiene un enlace disulfuro intramolecular entre
los dos residuos de cisteína (C) de cada monómero, (iii) PEG
comprende una molécula de polietilenglicol lineal no ramificada que
tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 a aproximadamente
40.000
Daltons.
4. Un compuesto que se une a, y activa el
receptor de la eritropoyetina (EPO-R), compuesto que
comprende un dímero peptídico que tiene la fórmula:
en la que (i) en cada monómero
peptídico del dímero peptídico, cada aminoácido se indica por la
abreviatura convencional de una letra, AcG es
N-acetilglicina, 1-nal es
1-naftilalanina, y MeG es
N-metilglicina; (ii) cada monómero peptídico del
dímero peptídico contiene un enlace disulfuro intramolecular entre
los dos residuos de cisteína (C) de cada monómero, (iii) PEG
comprende una molécula de polietilenglicol lineal no ramificada que
tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 a aproximadamente
40.000
Daltons.
5. Un compuesto que se une a, y activa el
receptor de la eritropoyetina (EPO-R), compuesto que
comprende un dímero peptídico que tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que (i) en cada monómero
peptídico del dímero peptídico, cada aminoácido se indica por la
abreviatura convencional de una letra, AcG es
N-acetilglicina y 1-nal es
1-naftilalanina; (ii) cada monómero peptídico del
dímero peptídico contiene un enlace disulfuro intramolecular entre
los dos residuos de cisteína (C) de cada monómero, (iii)
["PEG"] comprende al menos dos restos de polietilenglicol (PEG)
lineales enlazados a un solo punto de unión que tienen un peso
molecular combinado de aproximadamente 10.000 a aproximadamente
60.000
Daltons.
6. Un compuesto que se une a, y activa el
receptor de la eritropoyetina (EPO-R), compuesto que
comprende un dímero peptídico que tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que (i) en cada monómero
peptídico del dímero peptídico, cada aminoácido se indica por la
abreviatura convencional de una letra, AcG es
N-acetilglicina, 1-nal es
1-naftilalanina, y MeG es
N-metilglicina; (ii) cada monómero peptídico del
dímero peptídico contiene un enlace disulfuro intramolecular entre
los dos residuos de cisteína (C) de cada monómero, (iii) PEG
comprende dos restos de polietilenglicol (PEG) lineales que tienen
un peso molecular combinado de aproximadamente 10.000 a
aproximadamente 30.000
Daltons.
7. Un compuesto que se une a, y activa el
receptor de la eritropoyetina (EPO-R), compuesto que
comprende un dímero peptídico que tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que (i) en cada monómero
peptídico del dímero peptídico, cada aminoácido se indica por la
abreviatura convencional de una letra, AcG es
N-acetilglicina y 1-nal es
1-naftilalanina, (ii) cada monómero peptídico del
dímero peptídico contiene un enlace disulfuro intramolecular entre
los dos residuos de cisteína (C) de cada monómero, (iii) PEG
comprende dos restos de polietilenglicol (PEG) lineales que tienen
un peso molecular combinado de aproximadamente 10.000 a
aproximadamente 30.000
Daltons.
8. Un compuesto que se une a, y activa el
receptor de la eritropoyetina (EPO-R), compuesto que
comprende un dímero peptídico que tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que (i) en cada monómero
peptídico del dímero peptídico, cada aminoácido se indica por la
abreviatura convencional de una letra, AcG es
N-acetilglicina y 1-nal es
1-naftilalanina; (ii) cada monómero peptídico del
dímero peptídico contiene un enlace disulfuro intramolecular entre
los dos residuos de cisteína (C) de cada monómero, (iii) PEG
comprende un resto de polietilenglicol lineal no ramificado (PEG)
que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 a
aproximadamente 40.000
Daltons.
\newpage
9. Un compuesto que se une a, y activa el
receptor de la eritropoyetina (EPO-R), compuesto
quecomprende un dímero peptídico que tiene la fórmula:
en la que (i) en cada monómero
peptídico del dímero peptídico, cada aminoácido se indica por la
abreviatura convencional de una letra, AcG es
N-acetilglicina y 1-nal es
1-naftilalanina; (ii) cada monómero peptídico del
dímero peptídico contiene un enlace disulfuro intramolecular entre
los dos residuos de cisteína (C) de cada monómero, (iii) PEG
comprende dos restos de polietilenglicol (PEG) lineales que tienen
un peso molecular combinado de aproximadamente 10.000 a
aproximadamente 60.000
Daltons.
10. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de
las reivindicacioesn 1 a 4, en el que el o cada PEG tiene un peso
molecular de aproximadamente 30.000 Daltons.
11. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 5 a 7, en el que el o cada PEG tiene un peso
molecular de aproximadamente 20.000 Daltons.
12. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4 y 8, en el que el o cada PEG tiene un
peso molecular de aproximadamente 30.000 a 40.000 Daltons.
13. Uso del compuesto de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente para preparar un medicamento para el
tratamiento de un trastorno caracterizado por una deficiencia
de eritropoyetina o una población de eritrocitos baja o
defectuosa.
14. Uso de acuerdo con cualquier reivindicación
precedente, en el que el trastorno se selecciona del grupo formado
por fallo renal en estado terminal o diálisis; anemia asociada con
el SIDA, enfermedad autoinmune o una malignidad;
beta-talasemia; fibrosis quística; anemia temprana
de la premadurez; anemia asociada con una enfermedad inflamatoria
crónica; lesión de la médula espinal; pérdida aguda de sangre;
envejecimiento; y estados de enfermedad neoplásica acompañados por
eritropoyesis anormal.
15. Una composición farmacéutica que comprende
el compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
12 y un portador farmacéuticamente aceptable.
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