RS51130B - Novi peptidi koji se vezuju za eritropoietinski receptor - Google Patents

Novi peptidi koji se vezuju za eritropoietinski receptor

Info

Publication number
RS51130B
RS51130B YUP-2005/0838A YUP20050838A RS51130B RS 51130 B RS51130 B RS 51130B YU P20050838 A YUP20050838 A YU P20050838A RS 51130 B RS51130 B RS 51130B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
peptide
epo
peg
monomer
compound
Prior art date
Application number
YUP-2005/0838A
Other languages
English (en)
Inventor
Christopher P. Holmes
Qun Yin
Guy Lalonde
Peter Schatz
David Tumelty
Balu Palani
Gemete H. Zemede
Original Assignee
Affymax Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Affymax Inc. filed Critical Affymax Inc.
Priority to MEP-2008-533A priority Critical patent/ME00356B/me
Publication of RS20050838A publication Critical patent/RS20050838A/sr
Publication of RS51130B publication Critical patent/RS51130B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Jedinjenje koje se vezuje za i aktivira eritropoietin receptor (EPO-R), gde jedinjenje uključuje peptidni dimer koji ima formulu:gde(i) u svakom peptidnom monomeru iz peptidnog dimera, svaka aminokiselina je označena sa standardnom jednoslovnom skraćenicom, AcG je N- acetilglicin, 1-nal je 1-naftilalanin;(ii) svaki peptidni monomer iz peptidnog dimera sadrži intramolekulsku disulfidnu vezu izmedju dva cistein (C) ostatka svakog monomera(iii) ["PEG"] uključuje najmanje jedan linearni polietilen glikolni (PEG) deo, svaki PEG deo ima molekulsku težinu od oko 20,000 do oko 40,000 Daltona.Prijava sadrži još 10 nezavisnih i 4 zavisna patentna zahteva.

Description

UNAKRSNE REFERENCE ZA SRODNE PRITAVE
Prioritetni su zahtevi dati u privremenim prijavama za Sjedinjene Države pod serijskim brojevima 60/469,993 i 60/470,244 koje su popunjene 12. maja 2003. Sadržaji ovih privremenih prijava su inkorporisani u ovom pronalasku referencama i u svojoj celosti.
OBLAST TEHNIKE
Ovaj pronalazak se odnosi na peptidna jedinjenja koja su agonisti za eritropoietinski receptor (EPO-R). Pronalazak se takodje odnosi na terapeutske metode koje koriste takva peptidna jedinjenja za lečenje oboljenja koja su udržena sa nedovoljnom ili defektnom produkcijom crvenih krvnih zrnaca. Farmaceutske kompozicije, koje obuhvataju peptidna jedinjenja iz pronalaska, su takodje obezbedjena.
STANJE TEHNIKE
Eritropoietin (EPO) je glikoproteinski hormon sa 165 aminokiselina, sa molekulskom težinom od oko 34 kilodaltona (kD) i prioritetnim mestom za glikozilaciju na aminokiselinskim pozicijama 24,38,83 i 126. On se inicijalno proizvodi kao prekursor protein sa signalnim peptidom od 23 aminokiselina. EPO se može javiti u tri oblika: a, (3 i asijalo. a i p" oblik se malo razlikuju u svojim ugljenohidratnim komponentama ali imaju istu potentnost, biološku aktivnost i molekulsku težinu. Asijalo oblik je a ili (3 oblik sa uklonjenim terminalnim ugljenim hidratom (sijalinska kiselina). DNK sekvence koje kodiraju za EPO su zabeležene [U.S. Pat. Br. 4,703,008 za Lin].
EPO stimuliše mitotičku deobu i diferencijaciju eritrocitnih prekursorskih ćelija i tako obezbedjuje produkciju eritrocita. On se proizvodi u bubrezima kada prevladavaju hipoksični uslovi. Tokom EPO-indukovane diferencijacije eritrocitnih prekursorskih ćelija, indukuje se sinteza globina; stimuliše se sinteza hem kompleksa; i broj feritin receptora se povećava. Ove promene omogućavaju ćeliji da koristi više gvoždja i sintetiše funkcionalni hemoglobin, koji u zrelim eritrocitima vezuje kiseonik. Tako, eritrociti i njihov hemoglobin imaju ključnu ulogu u snabdevanju tela sa kiseonikom. Ove promene započinju interakcijom EPO sa odgovarajućim receptorom na ćelijskoj površini eritrocitnih prekursorskih ćelija [Videtina pr.,Graber and Krantz (1978) Ann. Rev. Med. 29, 51-66].
EPO se nalazi u veoma niskim koncentracijama u plazmi kada je telo u zdravom statusu u kome tkivo dobija dovoljno kiseonika iz postojećeg broja eritrocita. Ova normalno niska koncentracija je dovoljna da stimuliše zamenu crvenih krvnih ćelija koje se normalno gube tokom starenja.
Količina EPO u cirkulaciji se povećava u uslovima hipoksije kada je transport kiseonika sa krvnim ćelijama u cirkulaciji smanjena. Hipoksija može biti prouzrokovana, na primer, znatnim gubitkom krvi usled hemoragije, destrukcijom crvenih krvnih ćelija usled prekomernog izlaganja radijaciji, smanjenjem uzimanja kiseonika zbog velike visine ili produžene nesvestice ili različitih oblika anemije. Kao odgovor na takve hipoksične stresove, podignut EPO nivo povećava produkciju crvenih krvnih zrnaca stimulacijom proliferacije eritroidnih progenitorskih ćelija. Kada je broj crvenih krvnih ćelija u cirkulaciji veći od normalnih potreba tkiva za kiseonikom, EPO nivo u cirkulaciji se smanjuje.
Zbog toga što je EPO esencijalan u procesima formiranja crvenih krvnih zrnaca, ovaj hormon ima potencijalno korisnu primenu kako u dijagnozi tako i u lečenju oboljenja krvi za koja je karakteristična niska ili defektna produkcija crvenih krvnih zrnaca. Skorija istraživanja su obezbedila osnove za projekciju efikasnosti EPO terapije za različita bolesna stanja, poremećaje i stanja hematoloških nepravilnosti, uključujući: beta-talasemiju [videti Vedovato,/sar (1984)Acta. Haematol. 71: 211 - 213]; cistične fibroze [videti Vichinskv,/ sar(1984) J. Pediatric 105:15 - 21]; menstrualna i oboljenja u trudnoći [videti Cotes,i sar(193) Brit. J. Ostet. Gvneacol. 90:304 - 311]; rane anemije prevremeno rodjene dece [videti Haga,/ .sar (1983)Acta Pediatr. Scand. 72; 827-831]; ozlede kičmene moždine [videti Claus-Walker,i sar (1984)Arch. Phys. Med. Rehabil. 65:370
- 374]; svemirske letove [videti Dunn,i sar (1984)Eur. J. Appl. Phvsiol. 52:178 - 182]; akutni gubitak krvi [videti Miller,i sar(1982) Brit. J. Haematol. 52: 545 - 590]; starenje [videti Udupa,i sar
(1984) J. Lab. Cbn. Med. 103: 574 - 580 i 581 - 588 i Lipschitz,i sar (1983)Blood 63:502 - 509]; različita neoplastična bolesna stanja koja su udružena sa abnormalnom eritropoiezom [videti Dainiak,i sar (1983)Cancer 5:1101 -1106 iSchwartz, i sar (1983)Otolarvngol. 109: 269 - 272]; i bubrežne insuficijencije [videti Eschbach.etal( 1987)N. Eng. J. Med. 316: 73 - 78].
Prečišćeni, homogeni EPO je okarakterisan [U.S. Pat. Br. 4, 677,195 za Hewick], DNK sekvence koje kodiraju za EPO su prečišćene, klonirane i eksprimirane za proizvodnju rekombinantnih polipeptida sa istim biohemijskim i imunološkim svojstvima kao i prirodni EPO. Rekombinantni EPO molekuli sa oligosaharidima koji su identični prirodnim EPO su takodje proizvedeni [Videti Sasaki,I sar(1987) J. Biol. Cherh. 262:12059 -12076].
Izgleda da je biološki efekat EPO posredovan, delom, preko interakcija sa graničnim receptorom ćelijske membrane. Početna ispitivanja, u kojima su korišćene nezrele eritroidne ćelije izolovane iz mišije slezine, sugerišu da EPO-vezujući proteini na ćelijskoj površini sadrže dva polipeptida koji imaju približno molekulake težine od 85,000 Daltona i 100,000 Daltona, respektivno [Sawyer,/ sar(1987) Proc. Natl Acad. Sci. USA 84: 3690 - 3694], Izračunato je da je broj EPO-vezujućih mesta u prošeku od 800 do 1000 po površini ćelije. Od ovih vezujućih mesta, približno 300 vezuju EPO sa K? od približno 90 pM (pikomola), dok preostala vezuju EPO sa smanjenim afinitetom od približno 570 pM[Sawyer, i sar(1987) J. Biol. Chem. 262: 5554 - 5562]. Jedna nezavisna studija sugeriše da EPO-senzitivni eritroblasti slezine, dobijeni iz miševa kojima je ubrizgana anemična vrsta (FVA) Friend virusa leukemije, poseduju ukupno približno 400 visoko i nisko afinitetnih EPO vezujućih mesta sa Kj vrednostima od približno 100 pM i 800 pM, respektivno[Landschulz,i5ar(1989)krv 73:1476-1486].
Sledeći rad ukazuje da su dva oblika EPO receptora (EPO-R) kodirana jednim genom. Taj gen je kloniran [Videtina pr., Jones, i sar (1990)Blood 76,31 - 35; Noguchi,/' sar (1991)Blood 78: 2548 - 2556; Maouche,i sar.(1991) Blood 78:2557 - 2563]. Na primer, DNK sekvence i kodirane peptidne sekvence za mišije i humane EPO-R proteine su opisane u PCT Pub. Br. WO 90/08822 od strane D'Andrea,i sar.Aktuelni modeli sugerišu da vezivanje EPO za EPO-R dovodi do dimerizacije i aktivacije dva EPO-R molekula, što dovodi do narednih koraka u signalnoj transdukciji [Videtina pr.,Watowich,i sar(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2140 - 2144].
Dostupnost kloniranih gena za EPO-R olakšava potragu za agonistima i antagonistima ovih važnih receptora. Dostupnost rekombinantnog receptor proteina omogućava ispitivanja interakcija receptor-ligand kod raznovrsnih nasumičnih i polu-nasumičnih peptidnih različitih sistema generisanja. Ovi sistemi uključuju sistem "peptida na plazmidima" [opisano u U.S. Pat. Br. 6,270,170]; sistem "peptida na fagu" [opisano u U.S. Pat. Br. 5,432,018 i Cwirla,i sar (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382]; sistem "kodirane sintetisane biblioteke" (ESL) [opisano u U.S. patentnoj prijavi Ser. Br. 946,239, popunjenoj 16. Sep. 1992]; i sistem "sinteze imobilisanih polimera u veoma velikoj razmeri " [opisano u U.S. Pat. Br. 5,143,854; PCT Pub. Br. 90/15070; Fodor,i sar
(1991) Science 251: 767 - 773; Dower i Fodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem. 26: 271 -180; i U.S. Pat. Br. 5,424,186].
Peptidi koji reaguju, barem u nekom obimu, sa EPO-R su identifjkovani i opisani, na primer u U.S. Pat. Br. 5, 773,569; 5,830,851; i 5,986,047 od strane Wrighton,/ sar; PCTPub. Br. WO 96/40749 od strane Wrighton,i sar; U.S.Pat. Br. 5,767,78 i PCT Pub. Br. 96/40772 od strane Johnson i Živin; PCT Pub. Br. WO 01/38342 od strane Balu; i WO 01/91780 od strane Smith-Swintoskyi sar.Posebno je identifikovana grupa peptida koji sadrže peptidni motiv, čiji članovi se vezuju za EPO-R i stimulišu EPO-zavisnu proliferaciju ćelija. Takodje, peptidi identifikovani do danas koji sadrže motiv, stimulišu EPO-zavisnu proliferaciju ćelijain vitrosa EC50 vrednostima od oko 20 nanomola (nM) do oko 250 nM. Tako, potrebna je koncentracija peptida od 20 nM do 250 nM za stimulaciju 50 % od maksimalne proliferacije ćelija koje su stimulisane sa EPO.
Imajući u vidu ogromne potencijale EPO-R agonista, i za ispitivanja važnih bioloških aktivnosti posredovanih ovim receptorom i za lečenje oboljenja, još uvek ostaje potreba za identifikacijom peptida EPO-R agonista sa povećanom potentnošću i aktivnošću. Ovaj pronalazak obezbedjuje takva jedinjenja.
Citati i/ih' diskusije citiranih referenci u ovom odeljku i do kraja specifikacije su dati samo radi razjašnjavanja opisa iz ovog pronalaska i nisu u svrhu tvrdjenja da bilo koja od tih referenci je "prethodno iskustvo" za ovaj pronalazak.
KRATAK OPIS PRONALASKA
Ovaj pronalazak obezbedjuje nova peptidna jedinjenja, koja su EPO-R agonisti za dramatično povećanu potentnost i aktivnost. Ova peptidna jedinjenja su homodimeri peptidnih monomera koji imaju aminokiselinsku sekvencu (AcG) GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLRK (SEKID BR: 1) ili homodimeri peptidnih monomera koji imaju aminokiselinsku sekvencu (AcG)GLYACHMGPIT (l-nal)VCQPLR(MeG)K (SEKID BR: 2), homodimeri peptidnih monomera koji imaju aminokiselinsku sekvencu (AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG) (SEKID BR: 3); gde svaka aminokiselina je označena sa standardnom jednoslovnom skraćenicom, "(AcG)" je N-acetilglicin, "(1-nal)" je 1-naftilalanin i "(MeG)" je N-metilglicin, takodje poznat kao sarkozin. Svaki peptidni monomer peptidnog dimera sadrži intramolekulsku disulfidnu vezu izmedju cisteinskih ostataka monomera.
Peptidni monomeri mogu da dimerizuju kovalentnim vezivanjem za razgranati tercijarni amidni povezivač (linker). Tercijarni amidni linker se može opisati kao:
gde: X je NCO-(CH2)2-N<1>H-; C1 linkera formira amidnu vezu sa s-amino grupom iz C-terminalnog lizinskog ostatka prvog peptidnog monomera; C2 linkera formira amidnu vezu sa e-amino grupom iz C-terminalnog lizinskog ostatka drugog peptidnog monomera; i N<1>iz X je povezan preko karbamatne veze ili amidne veze za aktivirani polietilen glikolni (PEG) deo, gde PEG ima molekulsku težinu od oko 20,000 do oko 40,000 Daltona (termin "oko" ukazuje da u preparatima sa PEG, neki molekuli će težiti više, neki manje, od navedene molekulske težine).
Kada svaki monomer homodimera ima aminokiselinsku sekvencu, (AcG)GLYACHMGPIT (1- nal)VCQPLRK (SEK ID BR: 1) i N1 linker je povezan preko karbamatne veze sa aktiviranim polietilen glikolnim (PEG) delom, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Kada svaki monomer homodimera ima aminokiselinsku sekvencu, (AcG)GLYACHMGPIT (l-nal)VCQPLRK (SEK ID BR: 1) i N1 linkera je povezan preko amidne veze za aktivirani polietilen glikolni (PEG) deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Kada svaki monomer homodimera ima aminokiselinsku sekvencu, (AcG)GLYACHMGPIT (l-nal)VCQPLR(MeG)K (SEK ID BR: 2) i N1 linkera je povezan preko karbamatne veze za aktivirani polietilen glikolni (PEG) deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Kada svaki monomer homodimera ima aminokiselinsku sekvencu, (AcG)GLYACHMGPIT (l-nal)VCQPLR(MeG)K (SEK ID BR: 2) i N1 linkera je povezan preko amidne veze za aktivirani polietilen glikolni (PEG) deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Peptidni monomeri takodje mogu biti dimerizovani kovalentnim vezivanjem za razgranati tercijarni amidni linker. Tercijarni amidni linker se može opisati kao:
gde: X je NCO-(CH2)2-NH-C<3>0-; C1 linkera formira amidnu vezu sa e-amino grupom iz C-terminalnog lizinskog ostatka prvog peptidnog monomera; i C<2>linkera formira amidnu vezu sa e-amino grupom iz C-terminalnog lizinskog ostatka drugog peptidnog monomera. Peptidni dimeri iz pronalaska dalje obuhvataju deo za držanje odstojanja (spejser) sa sledećom strukturom: gde: C<4>spejsera je kovalentno vezan za C<3>izX; N<1>spejsera je kovalentno povezan preko karbamatne ili amidne veze za aktivirani polietilen glikolni (PEG) deo; i N<2>spejsera je kovalentno povezan preko karbamatne ili amidne veze za aktivirani PEG deo, gde PEG ima molekulsku težinu od oko 10,000 do oko 50,000 Daltona (termin "oko" ukazuje na to da u preparatima sa PEG, neki molekuli će težiti više, neki manje od navedene molekulske težine). Svaki PEG deo može biti, pojedinačno, 10,000 Daltona (10 kD), 20 kD, 30 kD, 40 kD ili 50 kD. Kada svaki monomer homodimera ima aminokiselinsku sekvencu, (AcG)GLYACHMGPIT (l-nal)VCQPLRK (SEK ID BR: 1) i oba N<1>i N<2>spejsera su kovalentno vezana preko karbamatne veze za aktivirani PEG deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
U prioritetnim rešenjima, C-terminalni lizin iz dva peptidna monomera je L-lizin. Takodje, onaj ko ima iskustva u oblasti će razumeti iz gore navedenih hemijskih struktura da su dva linearna PEG dela spojena sa lizinom (na pr., kao mPEG2-Liz-NHS ili kao mPEG^Lizinol-NPC), što je takodje poželjno daje L-lizin i što daje sledeću stereohemiju.
Alternativno, jedan ili više lizinskih ostataka mogu biti D-lizin, dajući alternativnu stereohemiju koja će biti lakše prepoznatljiva onome ko ima iskustva u oblasti.
Kada svaki monomer homodimera ima aminokiselinsku sekvencu, (AcG)GLYACHMGPIT (1-nal) VCQPLPJC (SEK ID BR: 1) i oba N<1>i N<2>spejsera su kovalentno vezana preko amidne veze za aktivirani PEG deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti, kao što sledi:
Ponovo, lizinski molekuli u ovom jedinjenju su poželjno svi L-lizin, što daje sledeću stereohemiju.
Alternativno, jedan ili više lizinskih ostataka mogu biti D-lizin, što daje alternativnu stereohemiju koja će biti Iako prepoznatljiva onome ko ima iskustva u oblasti.
Kada svaki monomer homodimera ima aminokiselinsku sekvencu, (AcG)GLYACHMGPIT (l-nal)VCQPLR(MeG)K (SEK ID BR: 2) i oba N<1>i N<2>spejsera su kovalentno vezana preko karbamatne veze za aktivirani PEG deo, nova pepudna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Poželjno je da lizinski ostaci koji su pridruženi peptidnom monomeru i linearnim PEG delovima u ovom molekulu su svi L-lizin, što daje sledeći stereohemiju:
Alternativno, jedan ili više lizinskih ostataka mogu biti D-lizin, dajući alternativnu stereohemiju koja će biti lako prepoznatljiva onima koji imaju uobičajena iskustva u oblasti.
Kada svaki monomer homodimera ima aminokiselinsku sekvencu, (AcG)GLYACHMGPIT (l-nal)VCQPLR(MeG)K (SEK ID BR: 2) i oba N<1>i N<2>spejsera su kovalentno vezana preko amidne veze za aktivirani PEG deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Poželjno je da lizinski ostaci koji su pridruženi peptidnom monomeru i linearnim PEG delovima ovog molekula su svi L-lizin, što daje sledeću stereohemiju.
U drugim rešenjima, jedan ili više lizinskih ostataka mogu biti D-lizin, dajući alternativnu stereohemiju koja će biti lako prepoznatljiva osobi sa uobičajenim iskustvom u oblasti..
Peptidni monomeri takodje mogu biti dimerizovani pomoću vezivanja za lizinski linker, gde je jedan peptidni monomer vezan svojim C-terminusom za lizinovu e-amino grupu i drugi peptidni monomer je vezan svojim C-terminusom za lizinovu a-amino grupu.
Peptidni dimeri iz pronalaska dalje obuhvataju deo za održavanje rastojanja (spejser) sa sledećom strukturom:
Na jednom kraju, N<1>spejsera je povezan preko amidne veze za karbonilni ugljenik lizinskog linkera. Na suprotnom kraju, N<2>spejsera je povezan preko karbamatne veze ili amidne veze za aktivirani polietilen glikolni (PEG) deo, gde PEG ima molekulsku težinu od oko 20,000 do oko 40,000 Daltona (termin "oko" ukazuje na to da u preparatima sa PEG, neki molekuli će težiti više, neki manje od navedene molekulske težine).
Kada je spejser povezan preko karbamatne veze za aktivirani polietilen glikolni (PEG) deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Kada je spejser povezan preko amidne veze za aktivirani polietilen glikolni (PEG) deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Pronalazak dalje obezbedjuje farmaceutske kompozicije koje sadrže takva peptidna jedinjenja i metode za lečenje različitih medicinskih stanja u kojima se koriste takva peptidna jedinjenja.
DETALJNI OPIS PRONALASKA
Definicije;
Aminokiselinski ostaci u peptidima su obeleženi skraćenicama kao što sledi: Fenilalanin je Fen ili F; Leucin je Leu ili L; Izoleucin je Ile ili I; Metionin je Met ili M; Valin je Val ili V; Serin je Ser ili S; Prolin je Pro ili P; Treonin je Tr ili T; Alanin je Ala ili A; Tirozin je Tir ili Y; Histidin je His ili H; Glutamin je Gln ili Q; Asparagin je Asn ili N; Lizin je Liz ili K; Aspartinska kiselina je Asp ili D; Glutaminska kiselina je Glu ili E; Cistein je Cis ili C; Triptofan je Trp ili W; Arginin je Arg ili R; i Glicin je Gli ili G. Nekonvencionalne aminokiseline u peptidima su obeležene skraćenicama kao što sledi: 1-naftilalanin je 1-nal ili Np; N-metilglicin (takodje poznat kao sarkozin) je MeG ili Sc; i acetilovani Glicin (N-acetilglicin) je AcG.
Kako je ovde korišćen, termin "polipeptid" ili "protein" se odnosi na polimer aminokiselinskih monomera koji su alfa aminokiseline spojene zajedno preko amidnih veza. Polipeptidi su prema tome dužine od najmanje dva aminokiselinska ostatka a obično su duži. Generalno, termin "peptid" se odnosi na polipeptid koji ima dužinu od samo nekoliko aminokiselinskih ostatka. Novi EPO-R agonist peptidi iz ovog pronalaska su poželjno dužine od ne više od oko 50 aminokiselinskih ostataka. Još poželjnije je da su dužine od oko 17 do oko 40 aminokiselinskih ostataka. Polipeptid, za razliku od peptida, može sadržati bilo koji broj aminokiselinskih ostataka. Prema tome, termin polipeptid uključuje peptide kao i duže sekvence aminokiselina.
Kako je ovde korišćeno, fraza "farmaceutski prihvatljiv" se odnosi na molekulske entitete i kompozicije koje se "generalno smatraju bezbednim", na pr., koji su fiziološki tolerantni i obično ne izazivaju alergijske ili slične neželjene reakcije, kao što je gastrično uznemirenje, vrtoglavica i slično, kada se primenjuju kod ljudi. Poželjno je da, kako je ovde korišćen, termin "farmaceutski prihvatljiv" označava entitete koji su odobreni od strane regulatornih agencija Federalnih ili državnih uprava ili koji su navedeni u U.S. Farmakopeji ili u drugim opšte prihvaćenim farmakopejama za upotrebu kod životinja a posebno kod ljudi. Termin "nosač" se odnosi na diluent, adjuvant, ekscipijent ili prenosioc sa kojim se jedinjenje primenjuje. Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što je voda i ulja, uključujući ona koja su naftnog, animalnog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što su kikiriki ulje, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Voda ili vodeni rastvori, slani rastvori i vodeni rastvori dekstroze i glicerolni rastvori su poželjni da se primenjuju kao nosači, posebno za injektibilne rastvore. Pogodni farmaceutski nosači su opisani u "Remington's Pharmaceutical Sciences" od strane E.W. Martin.
Kako je ovde korišćeno, termin "agonist" se odnosi na biološki aktivni ligand koji se vezuje za svoj komplemetarni biološki aktivni receptor i aktivira ga bilo da prouzrokuje biološki odgovor u receptoru ili da pojača postojeću biološku aktivnost receptora.
Novi peptidi koji su EPO- R agonisti
Ovaj pronalazak obezbedjuje nova peptidna jedinjenja, koja su EPO-R agonisti za dramatično pojačanje potentnosti i aktivnosti. Ova peptidna jedinjenja su homodimeri peptidnih monomera koji imaju aminokiselinsku sekvencu (AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLRK (SEKID BR: 1) ili homodimeri peptidnih monomera koji imaju aminokiselinsku sekvencu (AcG)GLYACHMGPIT (1-nal) VCQPLR(MeG) K (SEK ID BR: 2); gde je svaka aminokiselina obeležena sa standardnom jednoslovnom skraćenicom, "(AcG)" je N-acetilglicin, "(1-nal)" je 1-naftilalanin i "(MeG)" je N-metilglicin, takodje poznat kao sarkozin. Svaki peptidni monomer peptidnog dimera sadrži intramolekulsku disulfidnu vezu izmedju cistein ostataka monomera. Takvi monomeri se mogu predstaviti shematski kao što sledi:
Ovi monomerni peptidi su dimerizovani da bi se dobili peptidni dimeri sa pojačanom EPO-R agonističnom aktivnošću. Linker (Lk) deo je razgranati tercijarni amid, koji povezuje Gterminale dva peptidna monomera, pomoću istovremenog vezivanja za C-terminalni lizinski ostatak svakog monomera. Tercijarni amidni linker se može opisati kao:
gde: X je NCO-(CH2)2-N<1>H-; C1 linkera formira amidnu vezu sa s-amino grupom iz C-terminalnog lizinskog ostatka prvog peptidnog monomera; C2 linkera formira amidnu vezu sa s-amino grupom iz C-terminalnog lizinskog ostatka drugog peptidnog monomera; i N<1>iz X je povezan preko karbamatne veze ili amidne veze za aktivirani polietilen glikolni (PEG) deo, gde PEG ima
molekulsku težinu od oko 20,000 do oko 40,000 Daltona (termin "oko" ukazuje na to da u preparatima sa PEG, neki molekuli će težiti više, neki manje od navedene molekulske težine). Tercijarni amidni linker takodje može biti prikazan kao: gde: X je NCO-(CH.2)2-NH-C30-; C1 linkera formira amidnu vezu sa e-amino grupom iz C-terminalnog lizinskog ostatka prvog peptidnog monomera; i C<2>linkera formira amidnu vezu sa e-amino grupom iz C-terminalnog lizinskog ostatka drugog peptidnog monomera. Peptidni dimeri iz pronalaska dalje obuhvataju deo za održavanje rastojanja (spejser) sa sledećom strukturom:
gde: C<4>spejsera je kovalentno vezan za C<3>iz X; N<1>spejsera je kovalentno povezan preko karbamatne ili amidne veze za aktivirani PEG deo; i N<2>spejsera je kovalentno povezan preko karbamatne ili amidne veze za aktivirani PEG deo, gde PEG ima molekulsku težinu od oko 10,000 do oko 60,000 Daltona (termin "oko ukazuje na to da u preparatima sa PEG, neki molekuli će težiti više, neki manje od navedene molekulske težine).
Tako, novi peptidi iz pronalaska mogu takodje sadržati PEG deo, koji je kovalentno povezan preko karbamatne veze ili amidne veze za tercijarni amidni linker iz peptidnog dimera. PEG je u vodi rastvoran polimer koji je farmaceutski prihvatljiv. PEG za korišćenje u ovom pronalasku može biti linerani, nerazgranati PEG koji ima molekulsku težinu od oko 20 kilodaltona (20 K) do oko 60 K (termin "oko" ukazuje na to da u preparatima sa PEG, neki molekuli će težiti više, neki manje od navedene molekulske težine). Najpoželjnije je da PEG ima molekulsku težinu od oko 30 K do oko 40 K. Onaj ko ima iskustva u oblasti će biti u stanju da odabere željenu veličinu polimera na osnovu takvih razmatranja kao što su poželjna doza; vreme cirkulacije; otpornost na proteolizu; efekti, ako ih ima, na biološku aktivnost; lakoća korišćenja; stepen ili izostanak antigenosti; i drugi poznati efekti PEG na terapeutske peptide.
Peptidi, peptidni dimeri i drugi peptidni molekuli iz pronalaska se mogu vezati za u vodi rastvorne polimere (na pr., PEG) korišćenjem bilo koje od različitih hemijskih reakcija za vezivanje u vodi rastvornih polimera za receptor-vezujući deo molekula (na pr., peptid + spejser). Obično rešenje uključuje spajanje jednostruke veze za kovalentno mesto spajanja, u vodi rastvornih polimera, za receptor-vezujući deo, medjutim u alternativnim rešenjima spajanje multiplih veza se može koristiti, uključujući dalje varijacije u kojima različite vrste u vodi rastvornih polimera se spajaju sa receptor-vezujućim delom na različitim vezujućim spojevima, koji mogu uključiti kovalentno vezujuće spajanje za spejser i/ili za jedan ili oba peptidna lanca. U nekim rešenjima, dimer ili multimer višeg reda će obuhvatati različite vrste peptidnog lanca (na pr., heterodimer ili drugi heteromultimer). Prema primeru a bez ograničenja, dimer može sadržati prvi peptidni lanac koji ima PEG vezujući spoj i drugi peptidni lanac može biti bez PEG vezujućeg spoja ili da koristi druge reakcije povezivanja u odnosu na prvi peptidni lanac i u nekim varijacijama spejser može sadržati ili biti bez PEG vezujućeg spoja i navedeni spejser, ako je PEGilovan, može koristiti reakciju povezivanja koja se razlikuje od prvog i/ili drugog peptidnog lanca. Alternativno rešenje uključuje PEG pripojen za spejserski deo na receptor-vezujućem delu i drugačiji u vodi rastvoran polimer (napr., ugljenohidratni) konjugovan za spoljašnji lanac jedne od aminokiselina iz peptidnog dela molekula.
Veoma širok spektar polietilen-glikolnih (PEG) vrsta se može upotrebiti za PEGilaciju receptor-vezujućeg dela (peptidi + spejser). U osnovi, bilo koji pogodan reaktivni PEG reagens se može upotrebiti. U prioritetnom rešenja, reaktivni PEG reagens će dovesti do formiranja karbamatne ili amidne veze nakon konjugacije za receptor-vezujući deo. Pogodne reaktivne PEG vrste uključuju, ali nisu ograničene na, one koje su dostupne za prodaju u Katalogu sistema za snabdevanje lekovima (2003) NOF Korporacije (Yebisu Garden Place Tower, 20-3 Ebisu 4-chome, Shibuya-ku, Tokyo 150-6019) i Katalogu molekularnog inženjerstva (2003) iz Nektar Therapeutics (490 Discoveoma Drive, Huntsville, Alabama 35806). Na primer i bez ograničenja, sledeći PEG reagensi su često prioritetni u različitim rešenjima: mPEG2-NHS, mPEG2-ALD, multi-Arm PEG, mPEG(MAL)2, mPEG2(MAL), mPEG-NH2, mPEG-SPA, mPEG-SBA, mPEG-tioestri, mPEG-dvostruki estri, mPEG-BTC, mPEG-ButirALD, mPEG-ACET, heterofunkcionalrii PEG (NH2-PEG-COOH, Bok-PEG-NHS, Fmok-PEG-NHS, NHS-PEG-VS, NHS-PEG-MAL), PEG akrilati (ACRL-PEG-NHS), PEG-fosfolipidi (na pr., mPEG-DSPE), multipli PEG iz serija SUNBRITE uključujući GL serije Glicerinskih PEG koji su aktivirani pomoću reakcije koja je odabrana od strane onoga ko ima iskustva u oblasti, bilo koji od SUNBRITE aktiviranih PEG (uključujući ali bez ograničavanja karboksilne-PEG, p-NP-PEG, Trezil-PEG, aldehidne PEG, acetalne-PEG, amino-PEG, tiolne-PEG, maleimido-PEG, hidroksilne-PEG-amine, amino-PEG-COOH, hidroksilne-PEG-aldehide, PEG karboksilno anhidridnog tipa, funkcionalizovane PEG-fosfolipide i druge slične i/ili pogodne reaktivne PEG koje bi odabrao onaj ko ima iskustva u oblasti za njihovu posebnu primenu i korišćenje.
Novi peptidi iz pronalaska mogu takodje sadržati dva PEG dela koja su kovalentno vezana preko karbamatne ili amidne veze za deo spejsera, gde je spejserni deo kovalentno vezan za tercijarni amidni linker iz peptidnog dimera. Svaki od dva PEG dela koji se koriste u takvim rešenjima iz ovog pronalaska može biti linearan i mogu biti povezani zajedno u jednoj tački vezivanja. Poželjno je da svaki PEG deo ima molekulsku težinu od oko 10 kilodaltona (10 K) do oko
60 K (termin "oko" ukazuje na to da u preparatima sa PEG, neki molekuli će težiti više, neki manje od navedene molekulske težine). Linearni PEG delovi su posebno poželjni. Poželjnije je da, svaki od dva PEG dela ima molekulsku težinu od oko 20 K do oko 40 K i još poželjnije je izmedju oko 20 K i oko 40 K. Još poželjnije je da svaki od dva PEG dela ima molekulsku težinu od oko 20 K. Onaj sa iskustvom u oblasti će biti u mogućnosti da odabere željenu veličinu polimera na osnovu takvih razmatranja kao što su željena doza; vreme cirkulacije; otpornost na proteolizu; efekti, ako ih ima, na biološku aktivnost; lakoća rukovanja; stepen ili izostanak antigenosti; i drugi poznati efekti PEG na terapeutske peptide. Ovaj pronalazak takodje obuhvata peptidne agoniste koji su homodimeri peptidnih monomera koji imaju aminokiselinsku sekvencu (AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG) (SEK ID BR: 3), gde je svaka aminokiselina označena sa standardnom jednoslovnom skraćenicom, "(AcG)" je N-acetilglicin, "(1-nal)" je 1-naftilalanin i "(MeG)" je N-metilglicin, takodje poznat kao sarkozin. Svaki peptidni monomer iz peptidnog dimera sadrži intramolekulsku disulfidnu vezu izmedju cistein ostataka monomera. Takvi monomeri se mogu predstaviti shematski kao što sledi:
Ovi monomerni peptidi su dimerizovani da bi se dobili peptidni dimeri sa pojačanom EPO-R agonističnom aktivnošću. Linker (Lk) deo je lizinski ostatak, koji povezuje C-terminuse dva peptidna monomera, uz pomoć istovremenog vezivanja za C-terminalnu aminokiselinu u svakom monomeru. Jedan peptidni monomer je vezan svojim C-terminusom za lizinovu e-amino grupu i drugi peptidni monomer je vezan svojim C-terminusom za lizinovu a-amino grupu. Na primer, dimer se može ilustrovati strukturno kao što je prikazano u Formuli I i rezimirati kao što je prikazano u Formuli II:
U Formuli I i u Formuli II, N<2>predstavlja atom azota iz lizinove e-amino grupe i N<1>predstavlja atom azota iz lizinove a-amino grupe.
Peptidni dimeri iz pronalaska dalje obuhvataju deo za održavanje rastojanja (spejser) sa sledećom strukturom:
Najednom kraju, N<1>spejsera je povezan preko amidne veze za karbonilni ugljenik lizinskog linkera. Na suprotnom kraju, N<2>spejsera je povezan preko karbamatne veze ili amidne veze za aktivirani polietilen glikolni (PEG) deo, gde PEG ima molekulsku težinu od oko 10,000 do oko 60,000 Daltona (termin "oko" ukazuje na to da u preparatima sa PEG, neki molekuli će težiti više, neki manje od navedene molekulske težine). Poželjnije je da, PEG ima molekulsku težinu od oko 20,000 do 40,000 Daltona.
Tako, novi peptidi iz pronalaska takodje sadrže PEG deo, koji je kovalentno pripojen za peptidni dimer. PEG je u vodi rastvoran polimer koji je farmaceutski prihvatljiv. PEG za korišćenje u ovom pronalasku može biti linerani, nerazgranati PEG koji ima molekulsku težinu od oko 20 kilodaltona (20 K) do oko 60 K (termin "oko" ukazuje na to da u preparatima sa PEG, neki molekuli će težiti više, neki manje od navedene molekulske težine). Najpoželjnije je da PEG ima molekulsku težinu od oko 20 K do oko 40 K i još poželjnije je molekulsku težinu od oko 30 K do oko 40 K. Onaj sa iskustvom u oblasti će biti u mogućnosti da odabere željenu veličinu polimera na osnovu takvih razmatranja kao što su željena doza; vreme cirkulacije; otpornost na proteolizu; efekti, ako ih ima, na biološku aktivnost; lakoća rukovanja; stepen ili izostanak antigenosti; i drugi poznati efekti PEG na terapeutske peptide.
Kada svaki monomer homodimera ima aminokiselinsku sekvencu, (AcG)GLYACHMGPIT (1-nal) VCQPLRK (SEK ID BR: 1) i N1 linkera je povezan preko karbamatne veze za aktivirani polietilen glikolni (PEG) deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Kada svaki monomer homodimera ima aminokiselinsku sekvencu, (AcG)GLYACHMGPIT (1-nal) VCQPLRK (SEKID BR: 1) i N1 linkera je povezan preko amidne veza za aktivirani polietilen glikolni (PEG) deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Kada svaki monomer homodimera ima aminokiselinsku sekvencu, (AcG)GLYACHMGPIT (1-nal) VCQPLR(MeG)K (SEK ID BR: 2) i N1 linkera je povezan preko karbamatne veze za aktivirani polietilen glikolni (PEG) deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Kada svaki monomer homodimera ima aminokiselinsku sekvencu, (AcG)GLYACHMGPIT (1-nal) VCQPLR(MeG)K (SEK ID BR: 2) i N1 linkera je povezan preko amidne veze za aktivirani polietilen glikolni (PEG) deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Prioritetni peptidni dimeri iz ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na:
Kada svaki monomer homodimera ima aminokiselinsku sekvencu, (AcG)GLYACHMGPIT (1-nal) VCQPLRK (SEK ID BR: 1) i oba N<1>i N<2>spejsera su kovalentno vezana preko karbamatne veze za aktivirani PEG deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Kada svaki monomer homodimera ima aminokiselinsku sekvencu, (AcG)GLYACHMGPIT (lnal)VCQPLRK (SEK ID BR: 1) i oba N<1>i N<2>spejsera su kovalentno vezana preko amidne veze za aktivirani PEG deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Kada svaki monomer homodimera ima aminokiselinsku sekvencu, (AcG)GLYACHMGPIT (1-nal) VCQPLRK (SEK ID BR: 2) i oba N<1>i N<2>spejsera su kovalentno vezana preko karbamatne veze za aktivirani PEG deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Kada svaki monomer homodimera ima aminokiselinsku sekvencu, (AcG)GLYACHMGPIT (1-nal) VCQPLRK (SEK ID BR: 2) i oba N<1>i N<2>spejsera su kovalentno vezana preko amidne veze za aktivirani PEG deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Prioritetni peptidni dimeri iz ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na:
Kada je spejser povezan preko karbamatne veze za aktivirani polietilen glikolni (PEG) deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Kada je spejser povezan preko amidne veze za aktivirani pohetilen glikolni (PEG) deo, nova peptidna jedinjenja iz pronalaska se mogu predstaviti kao što sledi:
Ove dimerne strukture se mogu napisati [Ac-peptid, disulfid]2Liz-spejser-PEG20-40Kza označavanje N-terminalne acetilovane peptidne veze za obe i a i e amino grupe na lizinu sa svakim peptidom koji sadrži intramolekulsku disulfidnu petlju i spejser molekulom koji formira kovalentnu vezu izmedju C-terminusa na lizinu i PEG dela, gde PEG ima molekulsku težinu od oko 20,000 do oko 40,000 Daltona.
Prioritetni peptidni dimeri iz ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na:
Stereoizomeri (napr., D-aminokiseline) dvadeset konvencionalnih aminokiselina, aminokiselina koje se prirodno ne javljaju, kao što su a, a-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, mlečna kiselina i drugih nekonvencionalnih aminokiselina takodje mogu biti pogodne komponente za jedinjenja iz ovog pronalska. Primeri za nekonvencionalne aminokiseline uključuju, ali nisu ograničeni na: (3-alanin, 3-pridilalanin, 4-hidroksiprolin, O-fosfoserin, N-metilglicin, N-acetilserin, N- formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, nor-leucin i druge slične aminokiseline i iminokiseline. Druge modifikacije su takodje moguće, uključujući modifikacije amino terminusa, modifikacije karboksi terminusa, zamene jedne ili više prirodnih genetski kodiranih aminokiselina sa nekonvencionalnim aminokiselinama, modifikacije bočnog lanca jednog ili više aminokiselinskog ostatka, peptidne fosforilacije i slično.
Peptidne sekvence iz ovog pronalaska mogu biti prisutne same ili u sprezi sa N-terminalnim i/ili C-terminalnim produženjem peptidnog lanca. Ovakvi produžeci mogu biti prirodno kodirane peptidne sekvence opciono sa ili bitno bez sekvenci koji se prirodno ne javljaju; produžeci mogu da uključuju bilo koju adiciju, deleciju, tačkastu mutaciju ili dinge modifikacije sekvence ili kombinacije u zavisnosti od potrebe onoga ko ima iskustva u oblasti. Na primer, a bez ograničenja, prirodne sekvence mogu biti pune dužine ili delimične dužine i mogu uključivati aminokiselinsku supstituciju da bi se dobila mesta za vezivanje ugljenih hidrata, PEG, drugih polimera ili slično, preko konjugacije bočnog lanca. U varijacijama, aminokiselinska supstitucija dovodi do humanizacije sekvence kako bi postala kompatibilne sa humanim imunim sistemom. Fuzioni proteini svih tipova su obezbedjeni, uključujući imunoglobulinske sekvence u susedstvu ili u samoj blizini sa EPO-R aktivirajućim sekvencama iz ovog pronalaska sa ili bez ne-imunoglobulinske spejser sekvence. Jedan tip rešenja je imunoglobulinski lanac koji ima EPO-R aktivirajuće sekvence u mestu varijabilnog (V) regiona na gustom i/ili jednostavnom lancu.
Pobijanje pe ptidnih jedinjenja iz pronalaska:
Sinteza peptida
Peptidi iz pronalaska se mogu dobiti uz pomoć klasičnih metoda poznatih u oblasti. Ove standardne metode uključuju metode isključivo čvrsto-fazne sinteze, delimično čvrsto-fazne sinteze, kondenzaciju fragmenata, klasične sinteze u rastvoru i tehnologije rekombinantne DNK [Videti na pr., Merrifield J. Am. Chem. Soc. 1963 85: 2149].
U jednom rešenju, peptidni monomeri iz peptidnog dimera se sintetišu pojedinačno i zatim dimerizuju za sintezu.
U drugom rešenju, peptidni monomeri iz dimera se povezuju preko svojih C-terminusa uz pomoć razgranatog tercijarnog amidnog linker Lkdela koji ima dve funkcionalne grupe koje mogu da služe kao inicijalna mesta za sintezu peptida i treću funkcionalnu grupu (na pr., karboksilna grupa ili amino grupa) koja omogućava vezivanje za drugi molekulski deo (na pr., koji može biti prisutan na površini čvrstog nosača). U ovom slučaju, dva peptidna monomera mogu biti sintetisana direktno na dve reaktivne azotne grupe iz linker Lkdela sa varijacijama u tehnikama za čvrsto-faznu sintezu. Takve sinteze mogu biti u nizu ili istovremene.
U drugom rešenju, dva peptidna monomera mogu biti sintetisana direktno na dve reaktivne azotne grupe iz linker Lkdela sa varijacijama u tehnikama čvrsto-fazne sinteze. Takve sinteze mogu biti u nizu ili istovremene. U ovom rešenju koristi se lizinski linker (Lk) deo koji ima dve amino grupe koje mogu služiti kao inicijalna mesta za sintezu peptida i treću funkcionalnu grupu (na pr., karboksilnu grupu iz lizina; ili amino grupu iz lizinskog amida, lizinski ostatak u kome se karboksilna grupa konvertuje do amidnog dela -CONH2) koja omogućava vezivanje za drugi molekulski deo (na pr., koji može biti prisutan na površini čvrstog nosača).
Kada se izvodi u nizu sinteza peptidnih lanaca dimera na linkeru, dve amino funkcionalne grupe na linker molekulu se zaštićuju (protektuju) sa dve različite ortogonalne uklanjajuće aminske zaštitne grupe. Zaštićeni linker se kupluje sa čvrstim nosačem preko linkerove treće funkcionalne grupe. Prva aminska zaštitna grupa se uklanja i prvi peptid dimera je sintetisan na prvom aminskom delu kome je skinuta zaštita. Zatim se uklanja druga aminska zaštitna grupa i drugi peptid iz dimera se sintetiše na drugom aminskom delu kome je skinuta zaštita. Na primer, prvi aminski deo linkera može biti zaštićen sa Alok i drugi sa Fmok. U tom slučaju, Fmok grupa (ali ne i Alok grupa) može biti uklonjena uz pomoć tretiranja sa slabom bazom [na pr., 20 % piperidina u dimetil formamidu (DMF)] i prvi peptidni lanac sintetisan. Nakon toga, Alok grupa može biti uklonjena uz pomoć pogodnog reagensa [na pr., Pd(PPh3)/4-metil morfolin i hlorform] i drugi peptidni lanac sintetisan. Treba primetiti da kada se koriste različite tiol-zaštitne grupe za cistein, kako bi se kontrolisalo formiranje disulfidne veze (kao što je diskutovano dole) ova tehnika se mora primeniti čak i kada su finalne aminokiselinske sekvence peptidnih lanaca identične.
Kada se izvodi istovremena sinteza peptidnih lanaca dimera na linkeru, dve aminske funkcionalne grupe linker molekula se zaštićuju sa istim uklanjajućim aminskim zaštitinim grupama. Zaštićeni linker se kupluje za čvrsti nosač preko linkerove treće funkcionalne grupe. U tom slučaju dve zaštićene funkcionalne grupe linker molekula se istovremeno oslobadjaju zaštite i dva peptidna lanca se istovremeno sintetišu na aminima kojima je skinuta zaštita. Primetiti da korišćenjem ove tehnike, sekvence peptidnih lanaca u dimeru će biti identične i tiol-zaštitne grupe za cisteinske ostatke su sve iste.
Prioritetni metod za sintezu peptida je čvrsto-fazna sinteza. Postupci za čvrsto-faznu
sintezu peptida su dobro poznate u oblasti [videti na pr., Stewart Solid Phase Pe ptide Svntheses (Freeman i Co.: San Francisco) 1969; 2002/2003 General Catalog iz Novabiochem Corp, San Diego, USA; Goodman Svnthesis of Peptides and Peptidomimetics (Houben-Weil, Stuttgart) 2002]. U čvrsto-faznoj sintezi, sinteza se obično započinje od C-terminalnog kraja peptida korišćenjem a-amino zaštićene smole. Pogodan polazni materijal se može dobiti, na primer, pomoću pripajanja tražene a-aminokiseline za hlormetilovanu smolu, hidroksimetil smolu, polistirensku smolu, benzhidrilaminsku smolu ili slično. Jedna takva hlormetilovana smola se prodaje pod komercijalnim nazivom BIO-BEADS SX-1 a proizvodi je Bio Rad Laboratories (Richmond, CA). Dobijanje hidroksimetil smole je opisano u [Bodonszkv,i sar.(1966) Chem. Ind. London 38:1597]. Benzhidril-aminska (BHA) smola je opisana u [Pietta i Marshall (1970) Chem. Commun. 650] i hidrohloridni oblik je komercijalno dostupan od proizvodjača Beckman Instruments, Inc. (Palo Alto, CA). Na primer, a-amino zaštićena amino kiselina može biti kuplovana za hlormetilovanu smolu uz pomoć
katalize sa cezijum bikarbonatom, prema metodi koju je opisao Gisin (1973) Helv. Chim, Acta 56: 1467.
Nakon inicijalnog kuplovanja, a-amino zaštitna grupa se uklanja, na primer, korišćenjem trifluorsirćetne kiseline (TFA) ili hlorvodonične kiseline (HC1) rastvorene u organskim rastvaračima na sobnoj temperaturi. Nakon toga, a-amino zaštićena aminokiselina se uzastopno kupluje za rastući, na nosaču vezani, peptidni lanac, a-amino zaštitne grupe su one za koje se zna da su korisne u oblasti sinteza peptida u koracima, uključujući: zaštitne grupe acilnog tipa (na pr., formil, trifluoroacetil, acetil), zaštitne grupe tipa aromatičnog uretana [napr., benziloksikarboil (Cbz) i supstituisani Cbz], zaštitne grupe alifatičnih uretana [na pr., t-butiloksikarbonil (Bok), izopropiloksikarbonil, cikloheksiloksikarbonil] i zaštitne grupe alkilnog tipa (na pr., benzil, trifenilmetil), fluorenilmetil oksikarbonil (Fmok), aliloksikarbonil (Alok) i l-(4,4-dimetil-2,6-dioksocikloheks-l-iliden)etil (Dde).
Bočni lanac zaštitne grupe (obično etri, estri, tritil, PMC i slično) ostaje netaknut u toku kuplovanja i ne odcepljuje se u toku skidanja zaštite amino-terminalnih zaštitnih grupa ili u toku kuplovanja. Bočni lanac zaštitne grupe mora biti uklanjajući nakon završetka sinteze finalnog peptida i u reakcionim uslovima koji neće uticati na menjanje ciljanog peptida. Bočni lanac zaštitne grupe za Tir uključuje tetrahidropiranii, terc-butil, tritil, benzil, Cbz, Z-Br-Cbz i 2,5-dihlorbenzil. Bočni lanac zaštitne grupe za Asp uključuje benzil, 2,6-dihlorbenzil, metil, etil i cikloheksil. Bočni lanac zaštitne grupe zaTr i Ser uključuje acetil, benzoil, tritil, tetrahidropiranii, benzil, 2,6-dihlorbenzil i Cbz. Bočni lanac zaštitne grupe za Arg uključuje nitro, Tozil (Tos), Cbz, adamantiloksikarbonil mezitoilsulfonil (Mts), 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonil (Pbf), 4-metoksi-2,3,6-trimetil-benzensulfonil (Mtr) ili Bok. Bočni lanac zaštitne grupe za Liz uključuje Cbz, 2-hlorbenziloksikarbonil (2-Cl-Cbz), 2-brombenziloksikarbonil (2-Br-Cbz), Tos ili Bok.
Nakon uklanjanja a-amino zaštitne grupe, preostale zaštićene aminokiseline se kupluju u koracima u željenom redu. Svaka zaštićena aminokiselina generalno reaguje u oko 3-ostrukom višku, korišćenjem odgovarajućeg aktivatora karboksilne grupe kao što je 2-(lH-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3 tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HBTU) ili dicikloheksilkarbodimid (DCC) u rastvoru, na primer, u metilen hloridu (CH2CI2), N-metil pirolidonu, dimetil formamidu (DMF) ili u njihovim smešama.
Nakon što je željena aminokiselinska sekvenca kompletirana, željeni peptid se dekupluje sa nosača od smole uz pomoć tretiranja sa reagensom, kao što je trifluorosirćetna kiselina (TFA) ili fluorovodonik (HF), koji ne samo da čepa peptid od smole, već takodje čepa sve preostale zaštitine grupe bočnog lanca. Kada se koriste hlormetilovane smole, tretman sa fluorovodonikom dovodi do formiranja slobodnih peptidnih kiselina. Kada se koriste benzhidrilaminske smole, tretman sa fluorovodonikom dovodi direktno do stvaranja slobodnih peptidnih amida. Alternativno, kada se koriste hlormetilovane smole, peptid sa zaštićenim bočnim lancem može biti dekuplovan uz pomoć tretiranja peptidne smole sa amonijakom za dobijanje željenog bočnog lanca zaštićenog amida ili sa alkilaminom za dobijanje bočnog lanca zaštićenog alkilamida ili dialkilamida. Zaštita bočnog lanca se zatim uklanja na uobičajeni način uz pomoć tretiranja sa fluorovodonikom za dobijanje slobodnih amida, alkilamida ili dialkilamida.
Za dobijanje estara iz pronalaska, smole koje se koriste za dobijanje peptidnih kiselina se primenjuju i bočni lanac zaštićenog peptida se čepa sa bazom i odgovarajućim alkoholom (na pr., metanol). Bočni lanac zaštitne grupe se zatim uklanja na uobičajeni način uz pomoć tretiranja sa fluorovodonikom do dobijanja željenog estra.
Ovi postupci se takodje mogu koristiti za sintezu peptida u kojima se nalaze druge aminokiseline u odnosu na 20 prirodnih, genetski kodiranih aminokiselina koje su supstituisane na jednoj, dve ili više od mogućih pozicija na jedinjenjima iz pronalaska. Sintetske aminokiseline koje mogu biti supstituisane u peptidima iz ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničene na, N-metil, L-hidroksipropil, L-3,4-dihidroksifenilalan<i>l, 5 aminokiseline kao što je L- 5-hidroksilizil i D- 6-metilalanil, L-a-metilalanil, (3 aminokiseline i izokinolil. D-aminokiseline i sintetske aminokiseline koje se prirodno ne javljaju se takodje mogu inkorporisati u peptide iz ovog pronalska.
Modifikacije peptida
Moguće je takodje modifikovati amino i/ili karboksi terminuse peptidnih jedinjenja iz pronalaska za proizvodnju drugih jedinjenja iz pronalaska. Na primer, amino terminus može biti acetilovan sa sirćetnom kiselinom ili njenim halogenovanim derivatom (kao što je a-hlorsirćetna kiselina, a-bromsirćetna kiselina ili a-jođsirćetna kiselina).
Moguće je zameniti prirodni bočni lanac iz 20 genetski kodiranih aminokiselina (ili stereoizomernih D aminokiselina) sa drugim bočnim lancima, na primer sa grupama kao što su alkil, niži alkil, ciklični 4-, 5-, 6-, do 7-o člani alkil, amid, amid niži alkil, amid di (niži alkil), niži alkoksi, hidroksi, karboksi i njihovi niži estarski derivati i sa 4-, 5-, 6-, do 7-o članim heterociklima. Posebno, mogu se primeniti prolin analozi u kojima je veličina prstena prolin ostatka izmenjena od 5-o članog do 4, 6 ili 7-o članog. Ciklične grupe mogu biti zasićene ili nezasićene i ako su nezasićene, mogu biti aromatične ili ne-aromatične. Poželjno je da heterociklične grupe sadrže jedan ili više azotnih, kiseoničnih i/ili sumpornih heteroatoma. Primeri takvih grupa uključuju furazanil, furil, imidazolidinil, imidazolil, imidazolinil, izotiazolil, izoksazolil, morfolinil (na pr. morfolino), oksazolil, piperazinil (na pr., 1-piperazinil), piperidil (na pr. 1-piperidil, piperidino), piranil, pirazinil, pirazolidinil, pirazolinil, pirazolil, piridazinil, piridil, pirimidinil, pirolidinil (na pr., 1-pirolidinil), pirolinil, pirolil, tiadiazolil, tiazolil, tienil, tiomorfolinil (na pr. tiomorfolino) i triazolil. Ove heterociklične grupe mogu biti supstituisane ili nesupstituisane. Kada je grupa supstituisana, supstituent može biti alkil, alkoksi, halogen, kiseonik ili supstituisani ili nesupstituisani fenil.
Peptidi se takodje mogu lako modifikovati uz pomoć fosforilacije i drugih metoda [na pr., koje su opisane uHruby, i sar.(1990) Biochem J. 268: 249 - 262].
Peptidna jedinjenja iz pronalaska takodje služe kao strukturni modeli za ne-peptidna jedinjenja sa sličnom biološkom aktivnošću. Onaj ko ima iskustva u oblasti će shvatiti da su različite tehnike dostupne za konstrukciju jedinjenja sa istom ili sličnom željenom biološkom aktivnošću kao glavno peptidno jedinjenje, ali sa povoljnijom aktivnošću od glavnog u odnosu na rastvorljivost, stabilnost i podložnost hidrolizi i proteolizi [Videti Morgan i Gainor (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24:243 - 252]. Ove tehnike uključuju zamenu peptidnog oslonca sa osloncem koji se sastoji od fosfonata, amidata, karbamata, sulfonamida, sekundarnih amina i N-metilaminokiselina.
Formiranje disulfidnih veza
Jedinjenja iz ovog pronalaska sadrže dve intramolekulske disulfidne veze. Takve disulfidne veze mogu biti formirane uz pomoć oksidacije cisteinskih ostataka na svakom peptidnom monomeru.
U jednom rešenju, kontrola formiranja cisteinske veze je primenjena odabiranjem tipa oksidujućeg agensa i njegove koncentracije koja je efikasna za optimizaciju formiranja željenog izomera. Na primer, oksidacija peptidnog dimera do formiranja dve intramolekulske disulfidne veze (jedna na svakom peptidnom lancu) je prioritetno postignuta (u odnosu na formiranje intermolekulske disulfidne veze) kada su oksidujući agensi DMSO ili jod (I2).
U drugim rešenjima, formiranje cisteinskih veza je kontrolisano uz pomoć selektivnog korišćenja tiol-zaštitne grupe u toku sinteze peptida. Na primer, kada je poželjan dimer sa dve intramolekulske disulfidne veze, prvi monomeraki peptidni lanac se sintetiše sa dva cisteinska ostatka iz jezgra sekvence koji je zaštićen sa prvom tiolnom zaštitnom grupom [na pr., tritil (Trt), aliloksikarbonil (Alok) i l-(4,4-dimetil-2,6-dioksocikloheks-l-iliden)etil (Dde) ili slično], zatim se sintetiše drugi peptidni monomer sa dva cisteinska ostatka iz jezgra sekvence koji je zaštićen sa drugom tiolnom zaštitnom grupom koja se razlikuje od prve tiolne zaštitne grupe [na pr., acetamidometil (Acm), t-butil (tBu) ili slično]. Nakon toga, prva tiolna zaštitna grupe se uklanja što daje bisulfidnu ciklizaciju prvog monomera i zatim se uklanja druga tiolna zaštitna grupa što daje bisulfidnu ciklizaciju drugog monomera.
Druga rešenja iz ovog pronalaska obezbedjuju analoge ovih disulfidnih derivata kod kojih se jedan od sumpora zamenjuje sa CH2grupom ili drugim izoterom za sumpor. Ovi analozi se mogu dobiti iz jedinjenja iz ovog pronalska, u kojima svaki peptidni monomer sadrži najmanje jedan C ili homocisteinski ostatak i a-amino-y-buternu kiselinu umesto drugog C ostatka, preko intramolekulskog ili intermolekulskog premeštanja, korišćenjem metoda koje su poznate u oblasti [Videti na pr., Barker,/ sar(1992) J. Med. Chem. 35: 2040 - 2048 i Or,i sar(1991) J. Org. Chem. 56: 3146 - 3149]. Onaj ko ima iskustva u oblasti će lako prepoznati da se ova premeštanja takodje javljaju korišćenjem drugih homologa a-amino^-buterne kiseline i homocisteina.
Pored prethodno navedene strategije ciklizacije, druge strategije ne-disulfidne peptidne ciklizacije se mogu upotrebiti. Takve alternativne strategije ciklizacije uključuju, na primer, strategije amidne ciklizacije kao i one koje uključuju formiranje tio-etarskih veza. Tako, jedinjenja iz ovog pronalaska mogu postojati u cikličnom obliku sa, bilo intramolekulskom amidnom vezom ili sa intramolekulskom tio-etarskom vezom. Na primer, peptidi mogu biti sintetisani kada se jedan cistein jezgarne sekvence zameni sa lizinom a drugi cistein se zameni sa glutaminskom kiselinom. Nakon toga ciklični monomer može biti formiran preko amidne veze izmedju bočnih lanaca ova dva ostatka. Alternativno, peptid može biti sintetisan kada se jedan cistein jezgarne sekvence zameni sa lizinom (ili serinom). Ciklični monomer se može zatim formirati preko tio-etarskog povezivanja izmedju bočnih lanaca lizinskog (ili serinskog) ostatka i drugog cisteinskog ostatka jezgarne sekvence. Kao takve, pored strategije disulfidne ciklizacije, strategija amidne ciklizacije i strategija tio-etarske ciklizacije se mogu lako primeniti za ciklizaciju jedinjenja iz ovog pronalska. Alternativno, amino-terminus peptida se može kaptirati sa a-supstituisanom sirćetnom kiselinom, gde a-supstituent je odlazeća grupa, kao što je a-halosirćetna kiselina, na primer, a-hlorsirćetna kiselina, a-bromsirćetna kiselina ili a-jodosirćetna kiselina.
Dodavanje razgranatog tercijarnog amidnog linkera
Peptidni monomeri mogu da dimerizuju uz pomoć razgranatog tercijarnog amidnog linker dela. U jednom rešenju, linker je inkorporisan u peptid u toku sinteze peptida. Na primer, kada linker Lkdeo sadrži dve funkcionalne grupe koje služe kao inicijalna mesta za sintezu peptida i jednu ili više drugih funkcionalnih grupa (na pr., karboksilnu grupu ili amino grupu) koje mogu da se vezuju za jedan ili više drugih molekulskih delova, linker može biti konjugovan za čvrsti nosač. Nakon toga, dva peptidna monomera mogu biti sintetisana direktno na dve reaktivne azotne grupe linker Lkdela sa varijacijama u tehnikama čvrsto-fazne sinteze.
U alternativnom rešenju, linker može biti konjugovan za dva peptidna monomera peptidnog dimera nakon sinteze peptida. Takva konjugacija se može postići uz pomoć metoda koje su dobro poznate u oblasti. U jednom rešenju, linker sadrži dve funkcionalne grupe koje su pogodne za vezivanje za ciljane funkcionalne grupe sintetisanih peptidnih monomera. Na primer, linker koji sadrži dve funkcionalne grupe, bilo prethodno aktivirane ili u prisustvu pogodnih reagenasa kuplovanja, može reagovati sa ciljanim lizinskim bočnim lancem amino grupe iz svakog od dva peptidna monomera.
Na primer, peptidni momomeri mogu biti hemijski kuplovani do tercijarni amidni linker,
gde: X je NCO-(CH2)2-NH-Y i Y je pogodna zaštitna grupa, kao što je t-butiloksikarbonil (Bok) zaštitna grupa; A<*>je pogodna funkcionalna grupa, kao što je N-oksi sukcinimid, koja se koristi za konjugaciju C1 linkera za e-amino grupu iz C-terminalnog lizinskog ostatka prvog peptidnog monomera; i B<*>je pogodna funkcionalna grupa, kao što je N-oksi sukcinimid, koja se koristi za konjugaciju C2 linkera za s-amino grupu iz C-terminalnog lizinskog ostatka drugog peptidnog monomera. Pored toga, na primer, peptidni monomeri mogu biti hemijski kuplovani do tercijarni amidni linker, gde: X je NCO-(CH2)2-NH-C<3>0-; A<*>je pogodna funkcionalna grupa, kao što je N-oksi sukcinimid, koja se koristi za konjugaciju C1 linkera za e-amino grupu iz C-terminalnog lizinskog ostatka prvog peptidnog monomera; i B<*>je pogodna funkcionalna grupa, kao što je N-oksi sukcinimid, koja se koristi za konjugaciju C<2>linkera za s-amino grupu iz C-terminalnog lizinskog ostatka drugog peptidnog monomera; i tercijarni amidni linker je hemijski povezan za spejser,
gde: C<3>izX je kovalentno vezan za C<4>spejsera; i Y je pogodna zaštitna grupa, kao što je t-butiloksikarbonil (Bok) zaštitna grupa.
Dodavanje lizinskog linkera
Peptidni monomeri mogu biti dimerizovani uz pomoć lizinskog linker Lkdela. U jednom rešenju, lizinski linker je inkorporisan u peptid u toku sinteze peptida. Na primer, kada lizinski linker Lkdeo sadrži dve funkcionalne grupe koje mogu da služe kao inicijalna mesta za sintezu peptida i treću funkcionalnu grupa (na pr., karboksilna grupa ili amino grupa) koja može da se vezuje za drugi molekulski deo, linker može biti konjugovan za čvrsti nosač. Nakon toga, dva peptidna monomera mogu biti sintetisana direktno na dve reaktivne azotne grupe lizinskog linker Lkdela sa varijacijama u tehnikama čvrsto-fazne sinteze.
U alternativnim rešenjima, kada je peptidni dimer dimerizovan uz pomoć lizinskog linker Lkdela, navedeni linker može biti konjugovan za dva peptidna monomera peptidnog dimera nakon sinteze peptida. Takva konjugacija se može postići uz pomoć metoda koje su dobro poznate u oblasti. U jednom rešenju, linker sadrži najmanje dve funkcionalne grupe koje su pogodne za vezivanje za ciljane funkcionalne grupe sintetisanog peptidnog monomera. Na primer, lizinske dve slobodne amino grupe mogu reagovati sa C-terminalnom karboksilnom grupom svakog od dva peptidna monomera.
Dodavanje spejsera
Peptidna jedinjenja iz pronalaska dalje obuhvataju deo za održavanje rastojanja (spejser). U jednom rešenju spejser može biti inkorporisan u peptid u toku sinteze peptida. Na primer, kada spejser sadrži slobodnu amino grupu i drugu funkcionalnu grupu (na pr., karboksilnu grupu ili amino grupu) koja može da se vezuje za drugi molekulski deo, spejser može biti konjugovan za čvrsti nosač.
U jednom rešenju, spejser koji sadrži dve funkcionalne grupe se prvo kupluje za čvrsti nosač preko prve funkcionalne grupe. Zatim se lizinski linker Lkdeo koji ima dve funkcionalne grupe koje mogu da služe kao inicijalna mesta za sintezu peptida i treću funkcionalnu grupu (na pr., karboksilnu grupu ili amino grupu) koja može da se vezuje za drugi molekulski deo, konjuguje za spejser preko spejserove druge funkcionalne grupe i linkerove treće funkcionalne grupe. Nakon toga, dva peptidna monomera mogu biti sintetisana direktno na dve reaktivne azotne grupe linker Lkdela sa varijacijama u tehnikama čvrsto-fazne sinteze. Na primer, spejser kuplovan na čvrstom nosaču sa slobodnom amino grupom može reagovati sa lizinskim linkerom preko linkerove slobodne karboksilne grupe.
U alternativnim rešenjima spejser može biti konjugovan za peptidni dimer nakon sinteze peptida. Takva konjugacija se može postići uz pomoć metoda koje su dobro poznate u oblasti. U jednom rešenju, linker sadrži najmanje jednu funkcionalnu grupu koja je pogodna za vezivanje za ciljanu funkcionalnu grupu sintetisanog peptida. Na primer, spejser sa slobodnom amino grupom može reagovati sa peptidnom Gterminalnom karboksilnom grupom. U drugom primeru, linker sa slobodnom karboksilnom grupom može reagovati sa slobodnom amino grupom iz lizinskog amida.
Vezivanje polietilen glikola ( PEG)
Poslednjih godina, u vodi rastvorni polimeri, kao što je polietilen glikol (PEG), se koriste za kovalentne modifikacije peptida od terapeutskog i dijagnostičkog značaja. Vezivanje takvih polimera se vrši zbog povećanja biološke aktivnosti, produženja vremena cirklacije krvi, smanjenja imunogenosti, povećanja rastvorljivosti u vodi i povećanja otpornosti na digestiju proteaza. Na primer, zabeleženo je da kovalentno vezivanje PEG za terapeutske polipeptide kao što su interleukini [Knauf,i sar.(1988) J. Biol. Chem. 263; 15064; Tsutsumi,i sar.(1995) J. Controlled Release 33:447), interferoni (Kita,i sar (1990)Drug Des. Deliverv 6:157), katalaza (Abuchowski,i sar(1977)J. BioLChem. 252:582), superoksid dismutaza (Beauchamp,/sar (1983)Anal. Biochem. 131: 25) i adenozin deaminaza (Chen,i sar (1981)Biochim. Biophv. Acta 660: 293), produžava njihovo vreme polutrajanjain vivo,i/ili smanjuje njihovu imunogenost i antigenost.
Peptidna jedinjenja iz pronalaska mogu sadržati polietilen glikolni (PEG) deo, koji je kovalentno pripojen za razgranati tercijarni amidni linker ili spejser iz peptidnog dimera preko karbamatne veze ili preko amidnog povezivanja. Jedan primer za PEG koji je korišćen u ovom pronalasku je linearni, nerazgranati PEG koji ima molekulsku težinu od oko 20 kiloDaltona (20 K) do oko 40 K (termin "oko" ukazuje na to da u preparatima sa PEG, neki molekuli će težiti više, neki manje od navedene molekulske težine). Poželjno je da PEG ima molekulsku težinu od oko 30 K do oko 40 K.
Još jedan primer za PEG koji je korišćen ovom pronalasku je linearni PEG koji ima molekulsku težinu od oko 10 K do oko 60 K (termin "oko" ukazuje na to da u preparatima sa PEG, neki molekuli će težiti više, neki manje od navedene molekulske težine). Poželjno je da, PEG ima molekulsku težinu od oko 20 K do oko 40 K. Poželjnije je da, PEG ima molekulsku težinu od oko 20 K.
Primeri za metode za kovalentno vezivanje PEG (PEGilaciju) su opisani u daljem tekstu. Ovi ilustrativni opisi su dati ali bez ograničavanja. Neko sa uobičajenim iskustvom u oblasti će razumeti da su različite metode za kovalentno vezivanje širokog spektra različitih PEG dobro poznate u oblasti. Kao takva, peptidna jedinjenja za koje PEG treba da se vezuju uz pomoć bilo koje od brojnih metoda za vezivanje koje su poznate u oblasti, su obuhvaćena ovim pronalaskom.
Na primer, PEG može biti kovalentno vezan za linker preko reaktivne grupe za koju se aktivirani PEG molekul može vezati (na pr., slobodnu amino grupu ili karboksilnu grupu). PEG molekuli mogu biti pripojeni za amino grupe korišćenjem metoksilovanog PEG ("mPEG") koji ima različite reaktivne delove. U takve polimere su uključeni mPEG-sukcinimidil sukcinat, mPEG-sukcinimidil karbonat, mPEG-imidat, mPEG-4-nitrofenil karbonat i mPEG-cijanurni hlorid. Slično, PEG molekuli mogu biti pripojeni za karboksilne grupe korišćenjem metoksilovanog PEG sa slobodnom amino grupom (mPEG-NH-2).
U nekim rešenjima, linker ili spejser sadrži terminalnu amino grupu (odnosno, pozicioniranu na terminusu spejsera). Ova terminalna amino grupa može reagovati sa pogodno aktiviranim PEG molekulom, kao što je mPEG-para-nitrofenilkarbonat (mPEG-NPC), kako bi se dobila stabilna kovalentna karbamatna veza. Alternativno, ova terminalna amino grupa može reagovati sa pogodno aktiviranim PEG molekulom, kao što je mPEG-sukcinimidil butirat (mPEG-SBA) ili mPEG-sukcinimidil propionat (mPEG-SPA) koji sadrži reaktivnu N-hidroksi-sukcinimid (NHS) grupu, kako bi se dobila stabilna kovalentna karbamatna veza. U drugim rešenjima, linkerova reaktivna grupa sadrži karboksilnu grupu koja može da se aktivira i da formira kovalentnu vezu sa PEG molekulom koji sadrži amin pod pogodnim reakcionim uslovima. U pogodne PEG molekule su uključeni mPEG-NH2i pogodni reakcioni uslovi uključuju formiranje amida posredstvom karbodiimida ili slično.
Analiza aktivnosti EPO- R agonista:
In vitrofunkcionalna analiza
In vitroispitivanja kompetitivnog vezivanja kvantifikuju sposobnost testiranog peptida u kompeticiji sa EPO u vezivanju za EPO-R. Na primer (videti na pr., kako je opisano u U.S. Patentu 5,773,569), ekstracelularna oblast humanog EPO-R (EPO vezujući protein, EBP) može biti rekombinantno proizvedena uE. colii rekombinantni protein se kupluje za čvrsti nosač, kao što je mikrotitarska posuda ili sintetske mikrosfere [na pr., Sulfolink beads proizvodjača Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)]. Imobilisani EBP se zatim inkubira sa obeleženim rekombinantnim EPO ili sa obeleženim rekombinantnim EPO i testiranim peptidom. Serijska razblaženja testiranog peptida se primenjuju za takve eksperimente. Analitičke tačke bez dodatog testiranog peptida definišu ukupno EPO vezivanje za EBP. Za reakcije koje sadrže testirani peptid, količina vezanog EPO se kvantifikuje i izražava kao procenat od kontrolnog (ukupno = 100 %) vezivanja. Ove vrednosti se nanose u odnosu na koncentracije peptida. IC50 vrednost se definiše kao koncentracija testiranog peptida koja smanjuje vezivanje EPO za EBP za 50 % (odnosno, 50 % inhibicije EPO vezivanja).
Različite analizein vitrokompetitivnog vezivanja mere slab signal koji se stvara kao funkcija blizine dve mikrosfere : jedne EPO-konjugovane mikrosfere i jedne EPO-R-konjugovane mikrosfere. Blizina mikrosfera je nastala vezivanjem EPO za EPO-R. Testirani peptid koji je u kompeticiji sa EPO za vezivanje za EPO-R će sprečiti to vezivanje, dovodeći do smanjenja emisije svetla. Koncentracija testiranog peptida koja dovodi do 50 % smanjenja emisije svetla je definisana kao IC50 vrednost.
Peptidi iz ovog pronalaska su u veoma efikasnoj kompeticiji sa EPO u vezivanju za EPO-R. Ova pojačana funkcija je predstavljena njihovom sposobnošću da inhibiraju vezivanje EPO pri znatno nižim koncentracijama peptida (odnosno, oni imaju veoma niske IC50 vrednosti).
Biološka aktivnost i potentnost monomernih i dimernih peptida EPO-R agonista iz pronalaska, koji se vezuju specifično za EPO-receptor, može biti merena korišćenjemin vitrofunkcionalnih ispitivanja na bazi ćelija.
Jedna analiza se zasniva na pre-B-ćelijskoj liniji miševa koja eksprimira humani EPO-R i dalje se transficira sa fos genskom konstrukcijom koja sadrži promoterom-vodjeni reporter luciferaze. Nakon izlaganja EPO ili drugom EPO-R agonistu, ćelija reaguje tako da sintetiše luciferazu. Luciferaza dovodi do emisije svetlosti nakon dodavanja njenog supstrata luciferina. Tako, nivo EPO-R aktivacije u takvim ćelijama može biti kvantifikovan preko merenja aktivnosti luciferaze. Aktivnost testiranog peptida se meri uz pomoć dodavanja serijskih razblaženja testiranog peptida u ćelije, koje se zatim inkubiraju u toku 4 sata. Nakon inkubacije, luciferin supstrat se dodaje u ćelije i meri se emisija svetla. Koncentracija testiranog peptida koja dovodi do polovine od maksimalne emisije svetla se beleži kao EC50.
Peptidi iz ovog pronalaska pokazuju dramatično povećanu sposobnost da potpomognu EPO-R signalizirajuće-zavisnu ekspresiju luciferaze u ovoj analizi. Ova pojačana funkcija predstavlja njihovu sposobnost da dovedu do polovine od maksimalne aktivnosti luciferaze pri znatno nižim koncentracijama peptida (odnosno, oni imaju veoma niske EC50 vrednosti). Ova analiza je prioritetni metod za odredjivanje potentnosti i aktivnosti EPO-R agonist peptida iz pronalaska.
Druga analiza može biti izvedena korišćenjem FDC-P1/ER ćelija [Dexter,i sar.(1980) J. Exp. Med. 152:1036-1047], dobro okarakterisanih netransformisanih ćelijskih linija iz koštane srži miševa, u kojoj je EPO-R postojano transfikovan. Ove ćelije pokazuju EPO-zavisnu proliferaciju.
U jednoj takvoj analizi, ćelije rastu do polovine stacionarne gustine u prisustvu neophodnih faktora rasta (videti na pr., kako je opisano u U.S. Patentu 5,773,569). Ćelije se zatim ispiraju u PBS i izgladnjuju u toku 16-24 sata u kompletnom medijumu bez faktora rasta. Nakon odredjivanja vijabilnosti ćelija (na pr., uz pomoć bojenja sa tripan plavim), stok rastvori (u kompletnom medijumu bez faktora rasta) se pripremaju kako bi se dobilo oko IO<5>ćelija u 50 uL. Serijska razblaženja peptidnih EPO-R agonist jedinjenja (obično slobodnih, rastvorenih peptida za razliku od fag-vezanih ili drugačije vezanih ili imobilisanih peptida) koja se testiraju se pripremaju u 96-bunarčića na ploči za kultivaciju ćelija tkiva u finalnoj zapremini od 50 uL po bunarčiću. Ćelije (50 uL) se dodaju u svaki bunarčić i ćelije se inkubiraju 24-48 sata, u kom vremenu negativne kontrole treba da uginu ili da budu u stanju mirovanja. Proliferacija ćelija se zatim meri uz pomoć tehnika poznatih u oblasti, kao stoje MTT analiza koja meri H<3->timidin inkorporaciju kao indikaciju za proliferaciju ćelija [videti Mosmann (1983) J. Imunol. Metode 65: 55 - 63]. Peptidi se ispituju na obe, EPO-R-eksprimirajuće ćelijske linije i roditeljsku ne-ekspirmirajuću ćelijsku liniju. Koncentracija testiranog peptida koja je neophodna da dovede do jedne polovine od maksimalne proliferacije ćelija se beleži kao EC50.
Peptidi iz ovog pronalaska pokazuju dramatično povećanu sposobnost da potpomognu EPO-zavisni ćelijski rast u ovoj analizi. Ova pojačana funkcija je predstavljena njihovom sposobnošću da dovedu do polovine od maksimalne stimulativne aktivnosti za proliferaciju ćelija pri znatno nižim koncentracijama peptida (odnosno, oni imaju veoma nisku EC50 vrednosti). Ova analiza je prioritetni metod za odredjivanje potentnosti i aktivnosti EPO-R agonist peptida iz pronalaska.
U drugoj analizi, ćelije rastu do stacionarne faze u EPO-snabdevenom medijumu, sakupljaju se i zatim kultivišu u toku dodatnih 18 h u medijumu bez EPO. Ćebje se dele na tri grupe sa jednakom ćelijskom gustinom: jedna grupa bez dodatih faktora (negativna kontrola), grupa sa EPO (pozitivna kontrola) i eksperimentalna grupa sa testiranim peptidom. Kultivisane ćelije se zatim sakupljaju u različitim vremenskim intervalima, fiksiraju i boje sa DNK-vezujućom fluorescentnom bojom (na pr., propidijum jodidom ili Hoečst (Hoechst) bojom, koje su dostupne kod proizvodjača Sigma). Zatim se meri fluorescencija, na primer, korišćenjem FACS Scan Flow citometra. Procenat ćelija u svakoj fazi ćelijskog ciklusa može se zatim odrediti, na primer, korišćenjem SOBR modela sa CellFIT softverom (Becton Dickinson). Ćelije tretirane sa EPO ili sa aktivnim peptidom će pokazati veću proporciju ćelija u S fazi (što se odredjuje povećanom fluorescencijom kao indikatorom povećanja sadržaja DNK) u odnosu na negativnu kontrolnu grupu.
Slična ispitivanja se mogu izvesti korišćenjem FDCP-1 [videti napr., Dexteri sar.(1980) J.
Exp. Med. 152:1036 -1047] ili TF-1 [Kitamura,/' sar.(1989) Blood 73:375 - 380] ćelijskih linija. FDCP-1 je multi-potencijalna primitivna hematopoietska progenitorska ćelijska linija iz miševa koja je zavisna od faktora rasta i koja može da se umnožava ali ne i da se diferencira, kada joj se doda WEHI-3-kondicionirani medijum (medijum koji sadrži IL-3, ATCC broj TIB-68). Za takve eksperimente, FDCP-1 ćelijska linija se transficira sa humanim ili mišijim EPO-R za proizvodnju FDCP-l-hEPO-R ili FDCP-l-mEPO-R ćelijskih linija, respektivno, koje mogu da se umnožavaju, ali ne mogu da diferenciraju, u prisustvu EPO. TF-1, jedna EPO-zavisna ćelijska linija, takodje može biti korišćena za merenje efekata peptida EPO-R agonista na ćelijsku proliferaciju.
U još jednoj analizi, postupak koji je iznet u Krystal (1983) Exp. Hematol 11: 649 - 660 za mikroanalizu koja se zasniva na H<3->timidin inkorporaciji u ćelijama slezine se može primeniti za ispitivanje sposobnosti jedinjenja iz ovog pronalaska da služe kao EPO agonisti. Ukratko, B6C3Fimiševima se ubrizgava, dnevno u toku dva dana, fenilhidrazin (60 mg/kg). Trećeg dana, se uklanjaju ćelije slezine i ispituje se njihova sposobnost da se umnožavaju tokom perioda od 24 sata korišćenjem MTT analize.
Vezivanje EPO za EPO-R u eritropoietin-osetljivoj ćelijskoj liniji indukuje tirozin fosforilaciju kako receptora tako i brojnih intracelularnih proteina, uključujući Shc, vav i JAK2 kinaze. Prema tome, još jednain vitroanaliza meri sposobnost peptida iz pronalaska da indukuju tirozin fosforilaciju EPO-R i dalje utiču na intracelularne signalne transducerne proteine. Aktivni peptidi, koji su identifikovani uz pomoć ispitivanja vezivanja i proliferacije koja su gore opisana, iznose obrazac fosforilacije skoro identičan onome koji ima EPO u eritropoietin-osetljivim ćelijama. Za te analize, FDC-P1/ER ćelije [Dexter,i sar(1980) J Exp Med 152:1036 - 47] se održavaju u EPO-snabdevenom medijumu gde su rasle do stacionarne faze. Ove ćelija se zatim kultivišu u medijumu bez EPO u toku 24 h. Definisan broj takvih ćelija se zatim inkubira sa testiranim peptidom u toku približno 10 min na 37 °C. Kontrolni uzorak ćelija sa EPO se takodje uvodi u svaku analizu. Tretirane ćelije se zatim sakupljaju uz pomoć centrifugiranja, resuspenduju u SDS lizirajućem puferu i podvrgavaju SDS poliakrilamidnoj gel elektroforezi. Elektroforezirani proteini u gelu se prebacuju na nitrocelulozu a proteini koji sadrže fosfotirozin na blot koji se pregleda uz pomoć standardnih imunoloških tehnika. Na primer, blot može biti ispitan sa anti-fosfoitrozinskim antitelima (na pr., anti-fosfoitrozinski IgG iz miševa, od proizvodjača Upstate Biotechnologv, Inc.), ispran i zatim ispitan sa sekundarnim antitelima [na pr., peroksidazom obeleženi anti-mišiji IgG iz koze proizvodjača Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. (VVashington, DC)]. Nakon toga, proteini koji sadrže fosfotirozin mogu biti vizualizovani uz pomoć standardnih tehnika uključujući kolorimetrijska, hemiluminescentna ili fluorescentna ispitivanja. Na primer, hemiluminescentna analiza može biti izvedena korišćenjem ECL Westera Blotting Svstem prozivodjača Amersham.
Još jednain vitroanaliza na bazi ćelija koja se može koristiti za procenu aktivnosti peptida iz ovog pronalaska je analiza kolonija, koja se izvodi korišćenjem ćelija koštane srži iz miševa ili humanih ćelija periferne krvi. Mišija koštana srž se može dobiti iz femura miševa, dok se uzorak humane periferne krvi može dobiti iz zdravih donora. U slučaju periferne krvi, mononuklearne ćelije se prvo izoluju iz krvi, na primer, pomoću centrifugiranja preko Fikol-Hipakovog (Ficoll-Hypaque) gradijenta [Stem Cells Technologies, Inc. (Vancouver, Canada)]. Za ovu analizu se izvodi brojanje nukleisanih ćelija kako bi se ustanovio broj i koncentracija nukleisanih ćetija u originalnom uzorku. Definisani broj ćelija se prevlači prko metil celuloze prema uputstvu proizvodjača [Stem Cells Technologies, Inc. (Vancouver, Canada)]. Jedna eksperimentalna grupa se tretira sa testiranim peptidom, pozitivna kontrolna grupa se tretira sa EPO i negativna kontrolna grupa se ne tretira. Broj rastućih kolonija za svaku grupu se zatim beleži nakon definisanih perioda inkubacije, generalno nakon 10 dana i 18 dana. Ukoliko je aktivan, peptid će potpomognuti formiranje kolonija.
Drugain vitro biološkaispitivanja koja se mogu upotrebiti za ispitivanje aktivnosti jedinjenja iz ovog pronalaska su opisana uGreenberger, i sar(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2931 - 2935 (EPO-zavisna hematopoietska progenitorska ćelijska linija); Quelle i Wojchowski (1991) J. Biol.
Chem. 266: 609 - 614 (protein tirozin fosforilacija u B6SUt.EP ćelijama); Dusanter-Fourt,i sar.
(1992) J. Biol. Chem. 287:10670 -10678 (Tirozin fosforilacija EPO-receptora u humanim EPO-osetljivim ćelijama); Quelle,i sar (1992)J. Biol. Chem. 267:17055 -17060 (Tirozin fosforilacija citozolnih proteina, str. 100, u FDC-ER cells); Wortington,i sar.(1987) Exp. Hematol. 15:
85 - 92 (kolorimetrijska analiza za hemoglobin); Kaiho i Miuno (1985) Anal. Biochem. 149:
117 -120 (detekcija hemoglobina sa 2,7-diaminofluorenom); Patel,i sar (1992) J.Biol. Chem. 267: 21300 - 21302 (ekspresija c-mib); Witthuhn,i sar (1993)Cell 74: 227 - 236 (asocijacija i tirozin fosforilacija JAK2); Leonard,i sar (1993)Blood 82:1071 -1079 (ekspresija GATA transkripcionih faktora); i Ando,i sar(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9571 - 9575 (regulacija Gitranzicije pomoću ciklovanja D2 i D3).
Instrument koji je dizajnirala Molecular Devices Corp., poznat kao mikrofiziometar, se uspešno koristi za merenje efekata agonista i antagonista na različite receptore. Osnova ovog aparata je merenje promena acidifikacionog stepena ekstracelularnog medijuma kao odgovor na aktivaciju receptora.
In vivo funkcionalna ispitivanja
Jednain vivo funkcionalnaanaliza koja se može koristiti za ispitivanje potentnosti testiranog peptida je bioanaliza policitemičnih ekshipoksičnih miševa. Za ovu analizu, miševi se podvrgavaju naizmenično kondicioniranom ciklusu u toku nekoliko dana. U ovom ciklusu, miševi su naizmenično izmedju perioda hipobarnih uslova i uslova ambijentalnog pritiska. Nakon toga, miševi se održavaju na ambijentalnom pritisku u toku 2-3 dana pre primene testiranih uzoraka. Testirani peptidni uzorci ili EPO standardi u slučaju miševa iz pozitivne kontrolne grupe, se ubrizgavaju subkutano u kondicionirane miševe. Radioobeleženo gvoždje (na pr. Fe<59>) se primenjuje 2 dana kasnije i uzorci krvi se uzimaju dva dana nakon primene radioobeleženog gvoždja. Merenja hematokrita i radioaktivnosti se zatim odredjuju za svaki uzorak krvi pomoću standardnih tehnika.
Uzorci krvi iz miševa kojima su ubrizgani aktivni testirani peptidi pokazuju veću radioaktivnost (zbog vezivanja Fe<59>za hemoglobin iz eritrocita) nego miševi koji nisu dobili testirane peptide ili
EPO.
Još jednain vivofunkcionalna analiza koja se može koristiti za odredjivanje potentnosti testiranog peptida je analiza retikulocita. Za tu analizu, normalnim netretiranim miševima se ubrizgava subkutano u tri uzastopna dana bilo EPO ili testirani peptid. U trećem danu, miševima se takodje ubrizgava, intraperitonealno, gvoždje dekstran. Petog dana, uzorci krvi se sakupljaju iz miševa. Procenat (%) retikulocita u krvi se odredjuje uz pomoć tiazol narandžastog bojenja i protočne citometarske analize (retikcount program). Pored toga, hematokriti se manuelno odredjuju. Procenat korigovanih retikulocita se odredjuje korišćenjem sledeće formule:
% RETIKK0R[G0VANtH<=><%><RF>TIKDobuenih X (HematokritiNDmDUALNI/ HematocritNORMALNI)
Aktivna testirana jedinjenja<p>okazuju povećanje nivoa % RETIKKORIGOvanihu odnosu na miševe koji nisu primali testirane peptide ili EPO.
Korišćenje EPO- R agonist peptida iz pronalaska
Peptidna jedinjenja iz pronalaska su korisna uin vitro analizikoja služi za razumevanje biološke uloge EPO, uključujući procenu mnogih faktora za koje se smatra da utiču na i koji su pod uticajem produkcije EPO i vezivanja EPO za EPO-R (na pr., mehanizam za EPO /EPO-R signalnu transdukciju/ aktivaciju receptora). Peptidi iz pronalaska su takodje korisni za razvoj drugih jedinjenja koja se vezuju za EPO-R, jer jedinjenja iz pronalaska obezbedjuju važne informacije o odnosu struktura-aktivnost koje olakšavaju taj razvoj.
Pored toga, na osnovu njihove sposobnosti da se vezuju za EPO-R, peptidi iz ovog pronalaska se mogu upotrebiti kao reagensi za detekciju EPO-R na živim ćelijama; fiksiranim ćelijama; u biološkim fluidima; u homogenatima tkiva; u prečišćenim, prirodnim biološkim materijalima; i td. Na primer, uz pomoć obeležavanja takvih peptida, mogu se identifikovati ćelije koje imaju EPO-R na svojim površinama. Poreci toga, na osnovu njihove sposobnosti da se vezuju za EPO-R, peptidi iz ovog pronalaska se mogu upotrebiti uin situbojenju, FACS (odvajanje fluorescencijom-aktiviranih ćelija) analizama, Western blotovanju, ELISA (enzim-vezanim imunosorbentnim analizama), i td. Dodatno, na osnovu njihove sposobnosti da se vezuju za EPO-R, peptidi iz ovog pronalaska se mogu upotrebiti u prečišćavanju receptora ili u prečišćavanju ćeuja koje eksprimiraju EPO-R na ćelijskoj površini (ili unutar permeabilizovanih ćelija).
Peptidi iz pronalaska se takodje mogu koristiti kao komercijalni reagensi za različita medicinska istraživanja i u dijagnostičke svrhe. Takva korišćenja mogu uključivati, ali nisu ograničena na: (1) korišćenje kao kalibracionog standarda za kvantifikaciju aktivnosti mogućih EPO-R agonista u različitim funkcionalnim ispitivanjima; (2) korišćenje kao blokirajućih reagenasa u nasumičnom skriningu peptida, odnosno, u potrazi za novim familijama EPO-R peptidnih Uganda, peptidi se mogu upotrebiti da blokiraju izdvajanje EPO peptide iz ovog pronalska; (3) korišćenje u kokristalizaciji sa EPO-R, odnosno, kristali peptida iz ovog pronalaska vezani za EPO-R se mogu formirati, omogućavajući determinaciju strukture receptor/peptid uz pomoć X-zračne kristalografije; (4) korišćenje u merenju kapaciteta eritrocitnih prekursorskih ćelija da indukuju sintezu globina i sintezu kompleksa hema i da povećaju broj feritin receptora, uz pomoć iniciranja diferencijacije; (5) korišćenje u održavanju proliferacije i rasta EPO-zavisnih ćelijskih linija, kao što su FDCP-l-mEPO-Ri TF-1 ćelijske linije; (6) korišćenje srodnih, za obeležavanje peptida iz pronalaska sa radioaktivnim hromoforama; i (7) druge istraživačke primene u kojima je poželjno da je EPO-R aktiviran ili je takva aktivacija obično kalibrisana prema poznatoj količini EPO-R agonista i slično.
U daljim aspektima iz ovog pronalska, obezbedjene su metode za tretman i proizvodnju medikamenata. Peptidna jedinjenja iz pronalaska mogu biti primenjena kod toplokrvnih životinja, uključujući ljude, za stimulaciju vezivanja EPO za EPO-Rin vivo.Tako, ovaj pronalazak obuhvata metode za terapeutski tretman oboljenja koja su udružena sa nedostatkom EPO, gde metode uključuju primenu peptida iz pronalaska u količinama koje su dovoljne za stimulaciju EPO-R i na taj način, ublažavanje simptoma koji su posledica nedostatka EPOin vivo.Na primer, peptidi iz ovog pronalaska će naći upotrebu u tretmanu bubrežne insuficijencije i/ili krajnjem stadijumu otkazivanja bubrega/dijalizama; anemija koje su udružene sa AIDS; anemija koje su udružene sa hroničnim inflamatornim oboljenjima (na primer, reumatoidni artritis i hronična inflamacija creva) i autoimunih oboljenja; i za povećanje broja crvenih krvnih zrnaca kod pacijenata pre hirurške intervencije. Druga bolesna stanja, poremećaji i stanja hematoloških neregularnosti koja mogu biti tretirana primenom peptida iz ovog pronalaska uključuju: beta-talasemiju; cistične fibroze; oboljenja u trudnoći i menstrualna oboljenja; ranu anemiju kod nedonoščadi; povrede kičmene moždine; svemirske letove; akutni gubitak krvi; starenje; udar, ishemije (i CNS i kardijalne); i različita neoplastična bolesna stanja koja su udružena sa abnormalnom eritropoiezom.
U drugim rešenjima, peptidna jedinjenja iz pronalaska mogu biti korišćena za tretman oboljenja kod kojih nije karakterističan nizak nivo ili nedostatak crvenih krvnih ćelija, na primer kao u tretmanu koji prethodi transfuzijama. Dodatno, primena jedinjenja iz ovog pronalaska može dovesti do smanjenja vremena krvarenja i tako, može naći primenu kod pacijenata pre hirurške intervencije ili kada postoje indikacije da se očekuje pojava krvarenja. Pored toga, jedinjenja iz ovog pronalaska mogu naći primenu u aktivaciji megakariocita.
Pošto je EPO pokazao da ima mitogeni i hemotaktni efekat na vaskularne endotelne ćelije kao i efekat na centralne holinergične neurone [videti na pr., Amagnostou,i sar (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5978 - 5982 i Konishi, /sar(1993) Brain Res. 609:29 - 35], jedinjenja iz ovog pronalaska takodje mogu naći primenu u tretmanu različitih vaskularnih oboljenja, kao što je: poboljšanje izlečenja rana; poboljšanje rasta bočnih koronarnih krvnih sudova (kao što su oni koji se mogu javiti nakon infarkta miokarda); tretman povreda; i post-tretman vaskularnog grafta. Jedinjenja iz ovog pronalaska takodje mogu naći primenu u tretmanu različitih neuroloških poremećaja, koji se generalno odlikuju niskim apsolutnim nivoima acetil holina ili niskim relativnim nivoima acetil holina u poredjenju sa drugim neuroaktivnim supstancama na pr., neurotransmiterima.
Farmaceutske kompozicije
U još jednom aspektu iz ovog pronalska, farmaceutske kompozicije gore pomenutih EPO-R agonist peptidnih jedinjenja su obezbedjena. Stanja koja se ublažavaju ili moduliraju primenom ovih kompozicija uključuju ona koja su navedena ranije. Takve farmaceutske kompozicije mogu biti za primenu oralnim, parenteralnim (intramuskularnim, intraperitonealnim, intravenoznim (TV) ili subkutanim injekcijama), transdermalnim (bilo pasivno ili korišćenjem jontoforeze ili elektroporacije), transmukozalnim (nazalnim, vaginalnim, rektalnim ili sublingvinalnim) putevima primene ili korišćenjem bioerozivnih umetaka i mogu biti formulisane u doznim oblicima koji odgovaraju za svaki način primene. Generalno, u okviru pronalaska su farmaceutske kompozicije koje sadrže efikasne koučine EPO-R agonist peptide ili derivatne proizvode, iz pronalaska zajedno sa farmaceutski prihvatljivim diluentima, konzervansima, solubilizerima, emulgatorima, adjuvantima i/ili nosačima. Takve kompozicije uključuju diluente sa različitim puferima (na pr., Tris-HCl, acetatni, fosfatni), pH i jonskom jačinom; aditive kao što su deterdženti i solubilizirajući agensi (na pr., Tween 20, Tween 80, Polisorbat 80), anti-oksidanse (na pr., askorbinska kiselina, natrijum metabisulfit), konzervanse (na pr., Timerzol, benzil alkohol) i punioce (na pr., laktoza, manitol); može se vršiti inkorporisanje materijala u preparate čestica polimernih jedinjenja kao što su polilaktična kiselina, poliglikolna kiselina, i td. ili u lipozome. Hijalurinska kiselina se takodje može koristiti. Takve kompozicije mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, stepenin vivo otpuštanjai stepenin ^Voklirensaproteina i derivata iz ovog pronalaska. Videti na pr., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) strane 1435 - 1712 koji su ovde inkorporisane referencama. Kompozicije se mogu dobiti u tečnom obliku ili mogu biti u obliku suvih prahova (na pr., liofilizovani) oblik.
Oralna primena
Ovde je predvidjeno korišćenje oralnih čvrstih doznih oblika, koji su opisani generalno
u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042)
u Poglavlju 89, koje je ovde inkorporisano referencama. Čvrsti dozni oblici uključuju tablete, kapsule, pilule, troheje ili pastile, ljuspice, pelete, prahove ili granule. Takodje, lipozomalna ili proteinoidna inkapsulacija se mogu koristiti za formulaciju kompozicije iz ovog pronalaska (kao, na primer, proteinoidne mikrosfere koje su navedene u U.S. Patentu Br. 4,925,673). Lipozomalna inkapsulacija se može koristiti a lipozomi mogu biti derivatizovani sa
različitim polimerima (na pr., U.S. Patent Br. 5,013,556). Opis mogućih čvrstih doznih oblika za terapeutike je dao Marshall, K. u:Modem PharmaceuitcsEditedby G.S. Banker i C.T. Rhodes Chapter 10,1979, što je ovde inkorporisano referencom. Generalno, formulacija će uključivati EPO-R agonist peptide (ili njihove hemijski modifikovane oblike) i inertne sastojke koji omogućavaju zaštitu od uslova sredine u stomaku i otpuštanje biološki aktivnih materijala u intestinalnom traktu.
Takodje je ovde predvidjeno korišćenje tečnih doznih oblika za oralnu primenu, uključujući farmaceutski prihvatljive emulzije, rastvore, suspenzije i sirupe, koji mogu sadržati druge komponente uključujući inertne diluente; adjuvante kao što su vlažeći agensi, emulgatore i agensi za suspendiranje; i zasladjivače, arome i mirisne agense.
Peptidi mogu biti hemijski modifikovani takod da oralna primena derivata bude efikasna. Generalno, hemijska modifikacija na koju se misli je vezivanje najmanje jednog dela za komponentu samog molekula, gde navedeni deo dozvoljava (a) inhibiciju proteolize; i (b) uvodjenje u struju krvi iz želuca ili intestinuma. Takodje je poželjno povećanje ukupne stabilnosti komponente ili komponenti i ubrzanje vremena cirkulacije u telu. Kako je navedeno ranije, PEGilacija je prioritetna hemijska modifikacija za farmaceutsku upotrebu. Drugi delovi koji se mogu koristiti uključuju: propilenglikol, kopokmere etilenglikola i propilenglikola, karboksimetil celulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poliprolin, poli-l,3-dioksolan i poli-l,3,6-tioksokan [videti na pr., Abuchowski i Daviš (1981) "Soluble Polimer-Enzvme Adducts," uEnzymes as Drugs.Hocenberg i Roberts, eds. (Wiley-Interscience: New York, NY) str. 367 - 383; i Newmark,i sar.(1982) J. Appl. Biochem. 4:185-189].
Za oralne formulacije, lokacije otpuštanja mogu biti želudac, tanka creva (duodenum, jejunum ili ileum) ili debelo crevo. Neko sa iskustvom u oblasti zna koje formulacije se neće rastvarati u želucu već će osloboditi materijal u duodenumu ili negde drugde u crevima. Poželjno je da oslobadjanje bude zaštićeno od štetnih efekata želudačne sredine, bilo pomoću zaštite peptida (ili derivata) ili pomoću oslobadjanja peptida (ili derivata) nakon želudačne sredine, kao na pr. u crevima.
Za obezbedjenje potpune gastrične rezistencije za najmanje pH 5,0, esencijalan je
nepropusni premaz. Primeri za uobičajenije inertne sastojke koji se koriste kao enterični premazi su celuloza acetat trimelitat (CAT), hidroksipropilmetilceluloza ftalat (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, polivinil acetat ftalat (PVAP), Eudragit L30D, Akvaterik, celuloza acetat ftalat (CAP), Eudragit L, Eudragit S i Selak. Ovi premazi se mogu koristiti kao mešani filmovi.
Premaz ili premazne smeše se takodje mogu koristiti na tabletama, koje nemaju ulogu zaštite od želuca. One mogu uključivati šećerne premaze ili premaze koji čine da se tablete lakše gutaju. Kapsule se mogu sastojati od tvrdog omotača (kao što je želatin) za primenu suvih terapeutika (odnosno, prahova), a za tečne oblike mogu se koristiti meki želatinski omotači. Materijal za omotavanje ljuspica može biti škrobna navlaka ili drugi jestivi papir. Za pilule, pastiie, ukalupljene tablete ili izdrobljene tablete, tehnika vlažnog mešenja se može upotrebiti.
Peptid (ili derivat) se može uključiti u formulaciju kao sitne multičestice u obliku granula iU peleta sa veličinom čestica od oko 1 mm. Formulacija materijala za primenu u vidu kapsula može takodje biti prah, blago komprimovani komadi ili čak tablete. Ovi terapeutici se mogu proizvesti komprimovanjem.
Koloranti i/ili agensi arome takodje mogu biti uključeni. Na primer, peptid (ili derivat) može biti formulisan (na primer u vidu lipozoma ili pomoću mikrosferne inkapsulacije) a zatim smešten unutar jestivog proizvoda, kao što su ohladjeni napitci koji sadrže boju i agense za ukus.
Može se razblažiti ili povećati zapremina peptida (ili derivata) sa nekim inertnim materijalom. Ovi diluenti (rablaživači) mogu uključiti ugljenehidrate, posebno manitol, a-laktozu, anhidrovanu laktozu, celulozu, saharozu, modiiikovane dekstrane i škrob. Odredjene neorganske soli se mogu takodje koristiti kao punioci uključujući kalcijum trifosfat, magnezijum karbonat i natrijum hlorid. Neki komercijalno dostupni diluenti su Fast-Flo, Emdeks, STA-Rx 1500, Emkompres i Avicel.
Dezintegrišući agensi mogu biti uključeni u formulaciju terapeutika čvrstog doznog oblika. Materijali koji se koriste kao dezintegrišući agensi uključuju ali nisu ograničeni na škrob, uključujući komercijalni dezintegrant na bazi škroba, Eksplotab. Škrobni natrijum glikolat, Amberlit, natrijum karboksimetil celuloza, ultramilopektin, natrijum alginat, želatin, narandžina kora, kisela karboksimetil celuloza, prirodni sundjer i bentonit se takodje mogu koristiti. Dezintegrišući agensi takodje mogu biti nerastvorne katjonizmenjivačke smole. Praskaste gume mogu biti korišćene kao dezintegrišući agensi i kao binderi (vezivni agensi) i mogu uključivati praškaste gume kao što su agar, Karaja ili tragacant. Alginska kiselina i njene natrijumove soli su takodje korisni kao dezintegrišući agens.
Binderi mogu biti korišćeni za držanje peptida (ili derivata) i agenasa zajedno kako bi se formirale tvrde tablete i uključuju materijale iz prirodnih proizvoda kao što je akacija, tragacant, škrob i želatin. Drugi uključuju metil celulozu (MC), etil celulozu (EC) i karboksimetil celulozu (CMC). Polivinil pirolidon (PVP) i hidroksipropilmetil celuloza (HPMC) se mogu koristiti u alkoholnim rastvorima za granulisanje peptida (ili derivata).
Agensi protiv trenja mogu biti uključeni u formulaciju peptida (ili derivata) za sprečavanje lepljenja u toku postupka formulisanja. Lubrikanti se mogu koristiti kao sloj izmedju peptida (ili derivata) i zida kalupa i oni mogu uključiti ali bez ograničavanja, stearinsku kiselinu uključujući njene magnezijumove i kalcijumove soli, politetrafluoroetilen (PTFE), tečni parafin, biljna ulja i voskovi. Rastvorni lubrikanti takodje mogu da se koriste, kao što je natrijum lauril sulfat, magnezijum lauril sulfat, polietilen glikol različitih molekulskih težina, Karbovaks 4000 i 6000.
Klizajući agensi (glidanti), koji mogu popraviti protočna svojstva leka u toku formulacije i da pomognu ponovno uredjenje u toku kompresije, mogu se dodati. Glidanti mogu uključiti škrob, talk, pirogeni silicijum i hidratisani silikoaluminat.
Za potpomaganje rastvaranja peptida (ili derivata) u vodenoj sredini mogu se dodati površinski aktivne materije (surfaktanti) kao vlažeći agens. Surfaktanti mogu uključiti anjonske deterdžente kao što je natrijum lauril sulfat, dioktil natrijum sulfosukcinat i dioktil natrijum sulfonat. Katjonski deterdženti se takodje mogu koristiti i mogu uključiti benzalkonijum hlorid ili benzetomijum hlorid. Lista potencijalnih nejonskih deterdženata koji se mogu uključiti u formulaciju kao surfaktanti su lauromakrogol 400, polioksil 40 stearat, polioksietilen hidrogenovano ricinusovo ulje 10, 50 i 60, Glicerol monostearat, polisorbat 20,40, 60, 65 i 80, saharozni estri masnih kiselina, metil celuloza i karboksimetil celuloza. Ovi surfaktanti mogu biti prisutni u formulaciji proteina ili derivata bilo pojedinačno ili kao smeša sa različitim odnosima.
Dodaci koji potencijalno pojačavaju iskorišćenje peptida (ili derivata) su na primer masne kiseline, oleinska kiselina, linolenska kiselina i linolna kiselina.
Kontrob'sano otpuštanje formulacija može biti poželjno. Peptid (ili derivat) se može inkorporisati u inertni matriks koji dozvoljava otpuštanje bilo pomoću difuzije ili mehanizama raskvasivanja, na pr., u gume. Sporo razlažuće matrice takodje mogu biti inkorporisane u formulaciju. Neki enterični premazi takodje odlažu efekat otpuštanja. Još jedan oblik kontrolisanog otpuštanja je pomoću metode na bazi Oros terapeutskog sistema (Alza Corp.), odnosno, lek je okružen polupropustljivom membranom koja omogućava vodi da udje i izgura lek kroz jedan mali otvor, pomoću osmotskih efekata.
Drugi premazi mogu biti korišćeni za formulaciju. Oni uključuju različite šećere koji mogu da se primene u sudu za premazivanje. Peptid (ili derivat) može takodje biti primenjen u vidu
tablete premazane filmom i materijali koji se u tom slučaju koriste su podeljeni u 2 grupe. Prva grupa su neenterični materijab i uključuju metil celulozu, etil celulozu, hidroksietil celulozu, metilhidroksi-etil celulozu, hidroksipropil celulozu, hidroksipropil-metil celulozu, natrijum karboksimetil celulozu, providon i polietilen glikole. Druga grupa se sastoji od enteričnih materijala koji su obično estri ftalne kiseline.
Smeše materijala se mogu koristiti da bi se dobili optimalni filmovani premazi. Filmovani premazi se mogu izraditi u posudama za premazivanje ili u fluidizovanom sloju ili pomoću komprimovanog pemazivanja.
Parenteralna primena
Preparati prema ovom pronalasku za parenteralnu primenu uključuju sterilne vodene ili ne-vodene rastvore, suspenzije ili emulzije. Primeri za ne-vodene rastvarače ili nosioce su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje i kukuruzno ulje, želatin i injekcioni organski estri kao što je etil oleat. Takvi dozni oblici mogu takodje sadržati adjuvante kao što su konzervišući, vlažeći, emulgujući i dispergujući agensi. Oni mogu biti sterilisani pomoću, na primer, filtracije preko bakterijskih filtera, pomoću ubacivanja sterilizirajućih agenasa u kompozicije, pomoću zračenja kompozicija ili pomoću zagrevanja kompozicija. Oni se takodje mogu proizvesti korišćenjem sterilne vode ili nekih drugih sterilnih injektibilnih medijuma, neposredno pre upotrebe.
Rektalna ili vaginalna primena
Kompozicije za rektalnu ili vaginalnu primenu su poželjno supozitorije koje mogu sadržati, pored aktivne supstance, ekscipijente kao što su kakao buter ili supozitorijski vosak. Kompozicije za nazalnu ili subbngvinalnu primenu se takodje proizvode sa standardnim ekscipijentima koji su dobro poznati u oblasti.
Pulmonarna primena
Takodje ovde predvidjena je pulmonarna primena EPO-R agonist peptida (ili njihovih derivata). Peptid (ili derivat) se primenjuje za plućnu inhalaciju kod sisara i prelazak preko plućnog epitela u krvni tok [videti na pr., Adjei,i sar(1990) Pharmaceutical Research 7: 565 - 569; Adjei, /sar.(1990) Int. J. Pharmaceutics 63:135 -144 (leuprolid acetat); Braquet,i sar.(1989) J. Cardiovascular Pharmacologv 13(sup 5): 143 -146 (endotelin-1); Hubbard,/ sar (1989)Annals of Internal Medicine, Vol. III, str. 206-212 (al-antitripsin); Smith,i sar (1989)J. Clin. Invest. 84:1145 - 1146 (a-l-proteinaza); Oswein,/sar(1990)"Aerosolization of Proteins", Proceedings of Svmposium on Respiratorv Drug Deliverv II Kevstone, Colorado (rekombinantni humani hormon rasta); Debs,i sar(1988) J. Imunol. 140:3482 - 3488 (interferon-y i tumor nekrotični faktor a); i U.S. Pat. Br. 5,284,656 za Platz,i sar(stimulirajući faktor granulocitnih kolonija). Metod i kompozicija za pulmonarnu primenu lekova za sistemski efekat je opisan u U.S. Pat. Br. 5,451,569 zaWong,i sar.
Predvidjeni za korišćenje, prema ovom pronalasku, su mnogi mehanički uredjaji za pulmonarnu primenu terapeutskih proizvoda, uključujući ali bez ograničavanja, rasprskivače, merne dozne inhalatore i praškaste inhalatore, sve koji su poznati onima sa iskustvom u oblasti. Neki specifični primeri komercijalno dostupnih uredjaja koji su pogodni za primenu prema ovom pronalasku su Ultravent rasprskivač (Mallinckrodt Inc., St. Louis, MO); Akorn II rasprskivač
(Marquest Medical Proizvod s, Englewood, CO); Ventolin merni dozniinhalator (Glaxo Inc., ResearchTriangle Park, NC); i Spinhaler praškasti inhalator (Fizons Corp., Bedford, MA).
Svi ovi uredjaji zahtevaju korišćenje formulacija koje su pogodne za raspodeljivanje peptida (ili derivata). Obično, svaka formulacija je specifična za tip uredjaja koji je primenjen i može uključiti korišćenje odgovarajućih propelantnih materijala, pored uobičajenih diluenata, adjuvanata i/ili nosača korisnih u terapiji. Takodje, korišćenje lipozoma, mikrokapsula ili mikrosfera, inkluzionih kompleksa ili drugih tipova nosača je predvidjeno. Hemijski modifikovan peptid takodje se može dobiti u različitim formulacijama u zavisnosti od tipa hemijske modifikacije ili tipa uredjaja
koji se primenjuje.
Formulacija koja je pogodna za primenu sa rasprskivačem, bilo mlaznim ili ultrasoničnim, obično sadrži peptid (ili derivat) rastvoren u vodi u koncentraciji od oko 0,1 do 25 mg biološki aktivnog proteina po mL rastvora. Formulacija može takodje uključiti pufer i pojedinačni šećer (na pr., za stabilizaciju proteina i regulaciju osmotskog pritiska). Rasprskivač formulacija može takodje da sadrži surfaktant, za smanjenje ili sprečavanje površinske indukovane agregacije peptida (ili derivata) što dovodi do atomizacije rastvora u obliku aerosola.
Formulacije za korišćenje sa mernim doznim inhalatorskim uredjajima generalno obuhvataju fino raspodeljen prah koji sadrži peptid (ili derivat) suspendovan u propelantu uz pomoć surfaktanta. Propelant može biti bilo koji konvencionalni materijal za primenu u te svrhe, kao što je hlorfluorokarbon, hidrohlorfluorokarbon, hidrofluorokarbon ili hidrokarbon, uključujući trihlorfluorometan, dihlordifluorometan, dihlortetrafluoroetanol i 1,1,1,2-tetrafluoroetan ili njihove kombinacije. Pogodni surfaktanti uključuju sorbitan trioleat i sojin lecitin. Oleinska kiselina takodje može biti korišćena kao surfaktant.
Formulacije za raspodeljivanje iz praškastih inhalatorskih uredjaja obuhvataju fino raspodeljen suvi prah koji sadrži peptid (ili derivat) i može takodje uključiti punioce, kao što su laktoza, sorbitol, saharoza ili manitol u količinama koje olakšavaju disperziju praha iz uredjaja, na pr., 50 do 90 % od težine formulacije. Peptid (ili derivat) mora biti pogodno pripremljen u posebnom obliku sa prosečnom veličinom čestica manjom od 10 mm (ili mikrona), najpoželjnije je od 0,5 do 5 mm za najefikasniju primenu za distalna pluća.
Nazalna primena
Nazalna primena EPO-R agonist peptida (ib derivata) je takodje predvidjena. Nazalna primena omogućava prolazak peptida u krvni tok direktno nakon primene terapeutskog proizvoda u nosu, bez potrebe za prodorom proizvoda u pluća. Formulacije za nazalnu primenu uključuju one sa dekstranom ni ciklodekstranom.
Doze
Za sva peptidna jedinjenja, kako su dalja ispitivanja vodjena, informacije će izroniti u odnosu na odgovarajuće dozne nivoe za tretman različitih stanja kod različitih pacijenata i radnik sa uobičajenim iskustvom, ramatrajući terapeutski kontekst, starost i opšte zdravlje primaoca, će biti sposoban da ustanovi odgovarajuće doziranje. Odabrana doza zavisi od željenog terapeutskog efekta, od načina primene i od trajanja željenog tretmana. Generalno dozni nivoi od 0,001 do 10 mg/kg telesne težine dnevno se primenjuju kod sisara. Generalno, za intravenozne injekcije ili infuzije, doze mogu biti niže. Dozni raspored može varirati, u zavisnosti od poluživota cirkulacije i od korišćene formulacije.
Peptidi iz ovog pronalaska (ili njihovi derivati) mogu biti primenjeni zajedno sa jednim ili više dodatnih aktivnih sastojaka ili farmaceutskih kompozicija.
Primeri
Ovaj pronalazak je dalje opisan sledećim primerima. Medjutim, korišćenje ovih i drugih primera bilo gde u specifikaciji je samo ilustrativno i ni u kom slučaju ne ograničava polje i značenje pronalaska ili bilo kog navedenog oblika. Isto tako, pronalazak nije ograničen na bilo koje posebno prioritetno rešenje koje je ovde opisano. U stvari, mnoge modifikacije i varijacije iz pronalaska mogu biti očigledne onome ko ima iskustva u oblasti nakon čitanja ovih specifikacija i mogu biti učinjene bez odstupanja od oblasti i polja pronalaska. Pronalazak je zbog toga ograničen samo uslovima iz pridodatih zahteva, zajedno sa punim oblastima ekvivalenata za koje su zahtevi dati.
Primer 1: Sinteza EPO-R agonist peptidnih dimera uz pomoć čvrsto-fazne sinteze
Korak 1 - Sinteza Cbz- TAP:Rastvor koji sadrži komercijalno dostupan diamin ("TAP" proizvodjača Aldrich Chemical Co.) (lOg, 67,47mmol) u anhidrovanom DCM (100 ml) je ohladjen do 0 °C. Rastvor benzil hlorformata (4,82ml, 33,7mmol) u anhidrovanom DCM (50ml) je dodat polako kroz levak za ukapavanje u toku perioda od 6-7 h, održavajući temperaturu reakcione smeše na 0 °C do kraja, zatim dopuštajući da se zagreje do sobne temperature (-25 °C). Nakon narednih 16 h, DCM je uklonjen pod vakuumom i ostatak je raspodeljen izmedju 3N HC1 i etra. Vodeni slojevi su sakupljeni i neutralisani sa 50 % vod. NaOH do pH 8-9 i ekstrahovani sa etil acetatom. Etil acetatni sloj je osušen preko anhidrovanog Na2S04, zatim koncentrovan pod vakuumom da bi se dobio sirovi mono-Cbz-TAP (5g, oko 50 % prinosa). Ovo jedinjenje je korišćeno za sledeću reakciju bez bilo kakvog daljeg prečišćavanja.
Korak 2 ■ Sinteza Cbz- TAP- Bok:U snažno mešanu suspenziju sa Cbz-TAP (5g, 17,7mmol) u heksanu (25ml) je dodat Bok20 (3,86g, 17,7mmol) i mešanje je nastavljeno na ST preko noći. Reakciona smeša je razblažena sa DCM (25ml) i isprana sa 10 % vod. limunskom kiselinom (2X), vodom (2X) i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen preko anhidrovanog Na2S04i koncentrovan pod vakuumom. Sirovi proizvod (prinosa 5g) je korišćen direktno u sledećoj reakciji.
Korak 3- Sinteza Bok- TAP:Siroviproizvod iz prethodne reakcije je rastvoren u metanolu (25 ml) i hidrogenovan u prisustvu 5 % Pd na Ugljeniku(5 % t/t) pod pritiskom balona u toku 16 h. Smeša je filtrirana, isprana sa metanolom i filtrat je koncentrovan u vakuumu da bi se dobio sirovi H-TAP-Bok proizvod (prinosa 3,7g). Ukupan približan prinos Bok-TAP nakon Koraka 1-3 je bio 44 %
(sračunato na osnovu korišćenih količina Cbz-Cl).
Korak 4- Sinteza TentaGel- Linker:Tent2LGe\bromid (2,5 g, 0,48 mmol/g, proizvodjača Rapp Polimere, Germanv), fenolni linker (5 ekvivalenta) i K2CO3(5 ekvivalenta) su zagrevani u 20 mL DMF do 70 °C u toku 14 h. Nakon hladjenja do sobne temperature, smola je isprana (0,1 N HC1, voda, ACN, DMF, MeOH) i osušena do dobijanja smole boje ćilibara.
Korak5- Sinteza TentaGel- linker- TAP( Bok) :2, 5g gore dobijene smole i H-TAP-Bok (1,5 g, 5 ekv.) i glacijalne AcOH (34 ul, 5 ekv.) je stavljeno u smešu sa 1:1 MeOH-THF i mešano preko noći. 1 M rastvor natrijum cijanoborhidrida (5 ekv.) u THF je dodat u ovo i sve je mešano u toku narednih 7 h. Smola je isprana filtriranjem (DMF, THF, 0,1 N HC1, voda, MeOH) i osušena. Mala količina smole je benzolovana sa Bz-Cl i DIEA u DCM i razdvojena sa 70 % TFA-DCM i proverena uz pomoć LCMS i HPLC.
Korak 6- Sinteza TentaGel- lmker- TAF- Iiz: Smolagore d obijena je tretirana sa aktiviranim rastvorom Fmok-Liz(Fmok)-OH (dobijen iz 5 ekv. aminokiseline i 5 ekv. HATU rastvoren do 0,5 M u DMF, nakon čega je dodato 10 ekv. DIEA) i ostavljena je na blagom mešanju 14 h. Smola je isprana (DMF, THF, DCM, MeOH) i osušena do dobijanja zaštićene smole. Rezidualne amino grupe su kaptirane uz pomoć tretiranja smole sa rastvorom 10 % sirćetnog anhidrida, 20 % piridina u DCM u toku 20 minuta, nakon čega je isprana kao gore. Fmok grupe su uklonjene uz pomoć blagog mešanja smole u 30 % piperidina u DMF u toku 20 minuta, nakon čega je isprana (DMF, THF, DCM, MeOH) i osušena.
Korak 7- Sinteza TentaGel- Linker- TAP- Liz( Peptid)^;Gore dobijena smola je podvrgnuta ponovljenim ciklusima Fmok-aminokiselinskog kuplovanja sa HBTU/HOBt aktivacijom i Fmok uklanjanjem sa piperidinom kako bi se izgradila oba peptidna lanca istovremeno. Ovo se obično izvodi na ABI433 automatizovanom sintetizeru peptida koji je dostupan kod proizvodjača Applied Biosvstems, Inc. Nakon finalnog Fmok uklanjanja, terminalne amino grupe su acilovane sa sirćetnim anhidridom (10 ekv.) i DIEA (20 ekv.) u DMF u toku 20 minuta, što je praćeno ispiranjem kao gore.
Korak 8- Odvajanje od smole: Goredobijena smola je suspendovana u rastvoru sa TFA (82,5 %), fenolom (5 %), etanditiolom (2,5 %), vodom (5 %) i tioanizolom (5 90 u toku 3 h na sobnoj temperaturi. Alternativna smeša za odvajanje, kao što je TFA (95 %), voda (2,5 %) i triizopropilsilan
(2,5 %) se takodje može koristiti. TFA rastvor je ohladjen do 5 °C i stavljen u Et20 da bi se istaložio peptid. Filtracija i sušenje pod sniženim pritiskom daje željeni peptid. Prečišćavanje pomoću preparativne HPLC sa C18 kolonom daje čist peptid.
Korak 9- Oksidacije peptida do formiranja intramolekulske disulfidne veze: Peptidnidimer je rastvoren u 20 % smeše DMSO/voda (1 mg suve težine peptida/mL) i ostavljen da stoji na sobnoj temperaturi u toku 36 h. Peptid je prečišćen uvodjenjem reakcione smeše u C18 HPLC kolonu (VVaters Delta-Pak C18, veličine čestica od 5 mikrona, veličine pora od 300 angstrem, 40 mm x 200 mm dužine), nakon čega sledi linearni ACN/voda/0,01 % TFA gradijent iz 5 do 95 % ACN preko 40 minuta. Liofilizacijom frakcija koje sadrže željeni peptid dobija se proizvod u obliku paperjasto bele čvrste supstance.
Korak 10- PEGilacija terminalnih - NH2grupa:
PEGilacija preko karbamatne reze: Peptidnidimer je mešan sa 1,5 ekv. (molska osnova) aktiviranih PEG vrsta (mPEG-NPC proizvodjača NOF Corp. Japan) u suvom DMF do dobijanja bistrog rastvora. Nakon 5 minuta 4 ekv. DIEA je dodato u gornji rastvor. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 14 h, nakon čega je prečišćena sa C18 reverzno faznom HPLC. Struktura PEGilovanog peptida je potvrdjena pomoću MALDI masene. Prečišćen peptid je takodje podvrgnut prečišćavanju preko kationizmenjivačke hromatografije što je prikazano dole.
PEGilacija preko amidne veze: Peptidnidimer je mešan sa 1,5 ekv. (molska osnova) od 1 ekv. aktiviranih PEG vrsta (PEG-SPA-NHS proizvodjača Sheanvater Corp, USA) u suvom DMF do dobijanja bistrog rastvora. Nakon 5 minuta 10 ekv. DIEA je dodato u gornji rastvor. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 h, nakon čega je prečišćena sa C18 reverzno faznom HPLC. Struktura PEGilovanog peptida je potvrdjena pomoću MALDI masene. Prečišćeni peptid je takodje podvrgnut prečišćavanju preko katjonizmenjivačke hromatografije što je prikazano dole.
Korak 11 - Jonoizmenjivačkoprečišćavanje:^nekoliko izmenjivačkih nosača je ispitana njihova sposobnost da razdvoje gornji peptid-PEG konjugata iz neproreagovanog (ili hidrolizovanog) PEG, pored njihove sposobnosti da zadrže polazne dimerne peptide. Jonoizmenjivačke smole (2-3 g) su ubačene u kolonu od 1 cm, nakon čega je izvršena konverzija u natrijumov oblik (0,2 N NaOH je ubačen u kolonu dok eluent nije postigao pH 14, ca. 5 zapreraina kolone) i zatim u hidrogenovani oblik (eluiran sa bilo 0,1 N HC1 ili 0,1 M HOAc dok eluent ne postigne pH punjenja, ca. 5 zapremina kolone), nakon čega su isprane sa 25 % smeše ACN/voda do postizanja pH 6. Bilo peptid pre konjugacije ili peptid-PEG konjugat je rastvoren u 25 % smeše ACN/voda (10 mg/mL) i pH je podešen na < 3 sa TFA, zatim je napunjena kolona. Nakon ispiranja sa 2-3 zapremine kolone sa 25 % smeše ACN/voda i sakupljanja 5 mL frakcija, peptid je ispušten iz kolone pomoću elucije sa 0,1 M NH4OACu 25 % smeše ACN/voda, ponovo sakupljeno 5 mL frakcije. Analize preko HPLC pokazuju koja frakcija sadrži željeni peptid. Analize sa Evaporativnim svetlosno-rasipajućim detektorom (ELSD) pokazuju da kada peptid ostaje na koloni i kada se eluira sa rastvorom NH4OAC(generalno izmedju frakcija 4 i 10), nema prisutnih ne-konjugovanih PEG kao kontaminanata. Kada se peptid eluira u inicijalnom puferu za ispiranje (generalno prve 2 frakcije), nema izdvajanja željenih PEG-konjugata i višak PEG se uočava.
Sledeće kolone uspešno zadržavaju i peptid i peptid-PEG konjugat i uspešno prečišćavaju peptid-PEG konjugat iz nekonjugovanih peptida:
Primer 2: Sinteza EPO-R agonist peptidnih climera pomoću kondenzacije fragmenata
Korak 1 - Sinteza ( Cbz) 2- Liz: Lizinreaguje pod standardnim uslovima sa rastvorom benzil hlorformata kako bi se dobio lizin zaštićen na svoje dve amino grupe sa Cbz grupom.
Korak 2- Sinteza Bok- TAP: Bok-TAP jesintetisan kako je opisano u Koracima 1 do 3 iz Primera 1.
Korak3- Kuplovanje ( Cbz) 2- LJzi Bok- TAP:(Cbz)2-Liz i Bok-TAP su kuplovani pod standardnim uslovima kuplovanja do dobijanja (Cbz)2-Liz-TAP-Bok.
Korak 4- Liz- TAP- Bok:Siroviproizvod iz prethodne reakcije je rastvoren u metanolu (25ml) i hidrogenovan u prisustvu 5 % Pd na ugljeniku (5 % t/t) pod pritiskom balona u toku 16 h. Smeša je filtrirana, isprana sa metanolom i filtrat je koncentrovan u vakuumu da bi se dobio sirovi Liz-TAP-Bok proizvod.
Korak 5 - Sinteza peptidnih monomera pomoću kondenzacije fragmenata:Četiri peptidna fragmenta peptidnih monomernih sekvenci su sintetisana uz pomoć standardnih tehnika. Ovi delimično zaštićeni fragmenti su zatim izloženi dvema nezavisnim serijama kuplovanja. U prvoj seriji, N-terminalna polovina monomera je formirana uz pomoć kuplovanja dva peptidna fragmenta, dok je C-terminalna polovina monomera formirana uz pomoć kuplovanja druga dva peptidna fragmenta. U drugoj seriji kuplovanja, N-terminalne i C-terminalne polovine su kuplovane tako da formiraju potpuno zaštićen monomer. Monomer je zatim OBn-deprotektovan (skinuta zaštita) uz pomoć standardnih tehnika.
Korak 6 - Oksidacija peptidnih monomera do formiranja intramolekulskih disulfidnih veza:OBn-deprotektovani kondenzovani peptidni monomeri su zatim oksidovani pod jodom tako da formiraju intramolekulske disulfidne veze izmedju Acm-zaštićenih cisteinskih ostataka monomera.
Korak 7- Kuplovanje Liz- TAP- Bok za oksidovane OBn-deprotektovane monomere do formiranja peptidnog dimera: Liz-TAP-Bok jekuplovan za dvostruki višak oksidovanog OBn-deprotektovanog monomera pod standardnim uslovima do formiranja peptidnog dimera. Peptidni dimer je zatim deprotektovan pod standardnim uslovima.
Korak 8- PEGilacija deprotektovanog dimera:Deprotektovanipeptidni dimer je zatim PEGilovan kako je opisano u Koraku 10 iz Primera 1.
Korak 9 - Jonoizmenjivačko prečišćavanje:PEGilovani peptidni dimer je zatim prečišćen kako je opisano u Koraku 11 iz Primera 1.
Primer 3:In vitro ispitivanjaaktivnosti
Ovaj primer opisuje različitain vitro ispitivanjakoja su korisna u procenjivanju aktivnosti i potentnosti EPO-R agonist peptida iz pronalaska. Rezultati iz ovih ispitivanja ukazuju na to da se novi peptidi iz ovog pronalaska vezuju za EPO-R i aktiviraju EPO-R signalizaciju. Pored toga, rezultati iz ovih ispitivanja ukazuju na to da nove peptidne kompozicije pokazuju iznenadjujuće povećanje EPO-R vezujućeg afiniteta i biološke aktivnosti u odnosu na EPO mimične peptide koji su ranije opisani.
EPO-R agonist peptidni dimeri su dobijeni prema metodama prikazanim u Primeru 1 ili Primeru 2. Potentnost ovih peptidnih dimera je procenjena korišćenjem nizain vitro ispitivanjaaktivnosti, uključujući: reporter analizu, analizu proliferacije, analizu kompetitivnog vezivanja i C/BFU-e analizu. Ove četiri analize su opisane u više detalja u daljem tekstu.
Rezultati ovihin vitroispitivanja aktivnosti su prikazani u Tabeli 2.
1. Reporter analiza
Ova analiza se zasniva na reporter ćelijama dobijenim iz pre-B-ćelijskih linija iz miševa, Baf3/EpoR/GCSFRfos/lux. Ove reporter ćelijske linije eksprimiraju himerne receptore koje uključuju ekstra-celulami deo humanog EPO receptora za intra-celularni deo humanog GCSF receptora. Ove ćelijske linije su dalje transficirane sa fos genskom konstrukcijom koja sadrži promoterom-vodjeni reporter luciferaze. Aktivacija ovog himernog receptora putem dodavanja eritropoietskog agensa dovodi do ekspresije luciferaznog reporter gena i na taj način produkcije svetlosti nakon dodavanja luciferaznog supstrata luciferina. Tako nivo EPO-R aktivacije u takvim ćelijama može biti kvantifikovan preko merenja aktivnosti luciferaze.
Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux ćelije su kultivisane u DMEM/F12 medijumu (Gibco) koji je obogaćen sa 10 % fetalnog govedjeg seruma (FBS; Hvclone), 10 % WEHI-3 supernatanta (supernatant iz kulture WEHI-3 ćelija, ATCC # TIB-68) i smešom penicilin/streptomicin. Približno 18 h pre analize, ćelije su izgladnjivane njihovim prebacivanjem u DMEM/F12 medijum koji je obogaćen sa 10 % FBS i 0,1 % WEHI-3 supernatanta. Na dan analize, ćelije su isprane jednom sa DMEM/F12 medijumom koji je obogaćen sa 10 % FBS (bez WEHI-3 supernatanta), zatim je 1X IO<6>ćelija/mL kultivisano u prisustvu poznate koncentracije testiranog peptida ili sa EPO (R & D Svstems Inc., Minneapolis, MN) kao pozitivnom kontrolom, u DMEM/F12 medijumu obogaćenom sa 10 % FBS (bez WEHI-3 supernatanta). Serijska razblaženja testiranog peptida su istovremeno testirana u ovoj analizi. Analitičke ploče su inkubirane u toku 4 h na 37 °C u atmosferi 5 % CO2, nakon čega je dodat luciferin (Steady-Glo; Promega, Madison, Wi) u svaki bunarčić. Nakon 5-o minutne inkubacije, meri se emisija svetla na Packard Topcount Luminometru (Packard Instrument Co., Dovvners Grove, HI.). Vrednosti za svetlost su nanete u odnosu na koncentracije testiranog peptida i analizirane korišćenjem Graph Pad softvera. Koncentracija testiranog peptida koja dovodi do polovine od maksimalne emisije svetla se beleži kao EC50 [Videti Tabelu 2: Reporter EC50].
2. Analiza proliferacije
Ova analiza se zasniva na pre-B-ćelijskoj liniji iz miševa, Baf3, transficiranoj tako da eksprimira humani EPO-R. Proliferacija dobijenih ćelijskih linija, BaF3/Gal4/Elk/EPOR, je zavisna od EPO-R aktivacije. Stepen proliferacije ćelija je kvantifikovan korišćenjem MTT, gde signal u MTT analizi je proporcionalan broju vijabilnih ćelija.
BaF3/Gal4/Elk/EPOR ćelije su kultivisane u obrtnim bocama u DMEM/F12 medijumu (Gibco) koji je obogaćen sa 10 % FBS (Hyclone) i 2 % WEHI-3 supernatanta (ATCC # TIB-68). Kultivisane ćelije su izgladnjivane preko noći, u obrtnim bocama pri gustim ćelija od 1 x IO<6>ćelija/ml, u DMEM/F12 medijumu koji je obogaćen sa 10%FBS i 0,1 % WEHI-3 supernatanta. Izgladnjivane ćelija su zatim isprane dva puta sa Dulbecco's PBS (Gibco) i resuspendovane sa gustinom od 1 x IO<6>ćelija/ml u DMEM/F12 koji je obogaćen sa 10 % FBS (bez WEHI-3 supernatanta). Alikvoti od 50 pL (~50,000 ćelija) ćelijske suspenzije su zatim ubačeni, u triplikatu, u analitičku ploču sa 96 bunarčića. Alikvoti od 50 pL serijskih razblaženja testiranih EPO mimičkih peptida ili 50 pL EPO (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN) ili Aranesp™ (darbpoeitin alfa, EPO-R agonist komercijalno dostupan od proizvodjača Amgen) u DMEM/F12 medijumu koji je obogaćen sa 10 % FBS (bez WEHI-3 supernatanta I) su dodati u anabtičke ploče sa 96 bunarčića (finalna zapremina bunarčića od 100 pL). Na primer, 12 različitih razblaženja može biti testirano gde finalna koncentracija testiranog peptida (ili kontrolni EPO peptid) se kreće izmedju 810 pM do 0,0045 pM. Ćelije u pločama su zatim inkubirane u toku 48 h na 37 °C. Nakon toga, 10 pL MTT (Roche Diagnostics) je dodato u svaki bunarčić sa kulturom a zatim su ostavljene u inkubatoru u toku 4 h. Reakcija je zatim zaustavljena dodavanjem 10 % SDS + 0,01 N HC1. Ploče su zatim inkubirane preko noći na 37 °C. Apsorbanca na talasnoj dužini od 595 nM, za svaki bunarčić je zatim merena na spektrofotometru. Dijagrami vrednosti apsorbance prema koncentracijama testiranog peptida su konstruisani i EC50 vrednost je sračunata korišćenjem Graph Pad softvera. Koncentracija testiranog peptida koja dovodi do polovine od maksimalne apsorbance se beleži kao EC50 [Videti Tabelu 2: Proliferacija EC50].
3. Analiza kompetitivnog vezivanja
Izračunavanja kompetitivnog vezivanja su izvedena korišćenjem analize u kojoj se svetlosni signal generiše kao funkcija od blizine dve mikrosfere: mikrosfere donora streptavidina koja nosi biotinilovan trejser EPO-R-vezujući peptid i mikrosfere akceptora za koju se vezuje EPO-R. Svetlost se generiše pomoću transfera neradijacione energije, u toku koga se jedan kiseonik oslobadja iz prve mikrosfere pri osvetljavanju i dolazi u kontakt sa oslobodjenim jednim kiseonikom dovodeći do toga da druga mikrosfera emituje svetlost. Skupovi ovih mikrosfera su komercijalno dostupni (Packard). Blizina mikrosfera se stvara vezivanjem EPO-R-vezujućeg peptidnog trejsera za EPO-R. Testirani peptid koji je u kompeticiji sa EPO-R-vezujućim peptidnim trejserom u vezivanju za EPO-R će sprečiti to vezivanje, dovodeći do smanjenja emisije svetla.
Detaljniji prikaz metode je kao što sledi: 4 pL serijskih razblaženja testiranog EPO-R agonist peptida ili pozitivne ili negativne kontrola se dodaje u bunarčiće na ploči sa 384 bunarčića. Nakon toga, dodje se 2 pL /po bunarčiću smeše receptor/mikrosfere. Smeša receptora i mikrosfera se sastoji od: 15 pL od 5mg/ml streptavidin donorskih mikrosfera (Packard), 15 pL od 5mg/ml monoklonalnih antitela abl79 (ova antitela prepoznaju deo proteina humane placentalne alkalne fosfataze koja se nalazi u rekombinantnim EPO-R), akceptorskih mikrosfera obloženih sa proteinom A (protein A se vezuje za abl79 antitela; Packard), 112,5 pL rekombinantnog EPO-R u razblaženju 1 : 6,6 (koji je proizveden u ovarijalnim ćehjama Kineskog hrčka kao fuzioni protein u delu proteina humane placentalne alkalin fosfataze koji sadrži abl79 ciljane epitope) i 607,5 pLAlfakvest pufera (40 mM HEPES, pH 7,4; 1 mM MgCl2; 0,1 % BSA, 0,05 %Tween 20). Sve se spaja da bi se izmešalo. Doda se 2 uL/po bunarčiću biotinilovanog EPO-R-vezujućeg peptidnog trejsera, AF33068 (30 nM finalna koncentracija). AF33068, jedan EPO-R vezujući peptid (videtiTabelu 3 "Reporter EC50 (pM)"), je dobijen prema metodama koje su opisane u Primeru 1.
Centrifugira se 1 min da bi se izmešalo. Ploča se zapečati sa Packard Top Seal i zamota u foliju. Inkubira se preko noći na sobnoj temperaturi. Nakon 18 sati čita se emisija svetla korišćenjem AlphaQuest čitača (Packard). Podaci o emisiji svetla se nanose u dijagram u odnosu na koncentraciju peptida i analizira se sa programima Graph Pad ili Excel.
Koncentracija testiranog peptida koja dovodi do 50 % smanjenja emisije svetla, u odnosu na onu koja se dobija bez testiranog peptida, se beleži kao IC50 [Videti Tabela 2: AQ IC50].
4. C/ BFU- e analiza
EPO-R signalizacija stimuliše diferencijaciju ćebjske loze iz koštane srži u proliferativne prekursore crvenih krvnihzrnaca.Ova analiza meri sposobnost testiranih peptida da stimulišu proliferaciju i diferencijaciju prekursora crvenih krvnih zrnaca iz primarnih humanih višepotentnih ćelijskih linija koštane srži.
Za ovu analizu, serijska razblaženja testiranog peptida su pripremljena u IMDM medijumu (Gibco) koji je obogaćen sa 10 % FBS (Hvelone). Ova serijska razblaženja ili pozitivna kontrola EPO peptida, su zatim dodata u metilcelulozu do d obijanja finalne zapremine od 1,5 mL. Smeša metilceluloze i peptida je zatim snažno vorteksovana. Alikvoti (100,000 ćelija/mL) humanih CD34+ ćelija, dobijenih iz koštane srži (Poietics/Cambrex) su otopljeni. Otopljene ćelije su polako dodate u 0,1 mL 1 mg/ml DNAze (ćelijska linija) u epruvetama od 50 mL. Zatim se, 40-50 mLIMDM medijuma polako doda u ćelije: medijum se dodaje kap po kap duž bočnih zidova epruveta od 50 mL za prvih 10 mL i zatim se preostala zapremina medijuma polako sbva duž bočnih zidova epruvete. Ćelije se zatim centrifugiraju na 900 rpm u toku 20 min i medijum se pažljivo uklanja pomoću blagog aspiriranja. Ćelije se resuspenduju u 1 ml IMDM medijuma i odredjuje se gustina ćelija po mL na hemacitometarskom slajdu (alikvot od 10 pL ćebjske suspenzije na slajdu a gustina ćelija je prosečan broj X 10,000 ćelija/ml). Ćelije su zatim razblažene u IMDM medijumu do gustine ćelija od 15,000 ćelija/mL. 100 pL razblaženih ćelija se zatim dodaje u svakih 1,5 mL metil celuloze i peptidnog uzorka (finalna koncentracija ćelija u analitičkom medijumu je 1000 ćelija/mL) i smeša se vorteksuje. Ostavi se da mehurići u smeši nestanu i zatim se aspirira 1 mL korišćenjem igle sa tupim vrhom. Dodaje se 0,25 mL aspirirane smeše iz svakog uzorka u svaki od 4 bunarčića na ploči sa 24 bunarčića (Falcon brand). Smeše u ploči se inkubiraju na 37 °C pod atmosferom 5 % CO2u vlažnom inkubatoru u toku 14 dana. Ocenjuje se prisustvo eritroidnih kolonija korišćenjem faznog mikroskopa (5X-10X objektiv, finalnog uvećanja od 100X). Koncentracija testiranog peptida pri kojoj je broj formiranih kolonija 90 % od maksimalnog, u odnosu na broj dobijen sa EPO pozitivnom kontrolom, se beleži kao EC90 [Videti Tabela 2: C/BFU-e EC90].
5. Analiza kompetitivnog vezivanja radioliganda
Alternativna analiza kompetitivnog vezivanja radioliganda se takodje može koristiti za merenje IC50vrednosti peptida u ovom pronalasku. Ova analiza meri vezivanje<125>I-EPO za EPOr. Poželjno je da se anabza izvodi prema sledećoj proceduri koja je data kao primer:
A. Materijali
B. Odredjivanje odgovarajuće koncentracije receptora
Jedna boca od 50 pg liofilizovane rekombinantne EPOr ekstracelularne oblasti spojene za Fc deo humanog IgGl je rekonstituisana u 1 mL analitičkog pufera. Za odredjivanje potrebne količine receptora za korišćenje u analizi, 100 pL serijskih razblaženja ovog preparata receptora je kombinovano sa približno 20,000 cpm u 200 pL jođiranog rekombinantnog humanog Eritropoietina (<125>I-EPO) u 12 x 75 mm polipropilenskim epruvetama za testiranje. Epruvete su kaptirane i blago mešane na 4 °C preko noći na LabQuake rotacionom šejkeru.
Sledećeg dana, 50 pL 50 % suspenzije Protein-G Sefaroze je dodato u svaku epruvetu. Epruvete su zatim inkubirane u toku 2 sata na 4 °C, uz blago mešanje. Epruvete su zatim centrifugirane u toku 15 min na 4000 RPM (3297 x G) kako bi se istaložila protein-G sefaroza. Supernatanti su pažljivo uklonjeni i odbačeni. Nakon ispiranja 3 puta sa 1 mL analitičkog pufera na 4 °C, talog je izbrojan u Wallac Wizard gama brojaču. Rezultati su zatim analizirani i razblaženje potrebno za dostizanje 50 % od maksimalne vrednosti vezivanja je izračunato.
C. Odredjivanje ICso za peptid
Za odredjivanje IC50za AF37702, serijska razblaženja od 100 pL peptida su kombinovana sa 100 pL rekombinantnog eritropoietin receptora (100 pg/po epruveti) u 12 x 75 mm polipropilenskim epruvetama za testiranje. Zatim je dodato 100 pL jođiranog rekombinantnog humanog Eritropoietina (<125>I-EPO) u svaku epruvetu i epruvete su kaptirane i blago mešane na 4 °C preko noći.
Sledećeg dana, vezani<125>I-EPO je kvantifikovan kako je opisano u tekstu gore. Rezultati su analizirani i IC50vrednosti su sračunate korišćenjem Graphpad Prism verzija 4.0, proizvodjača GraphPad Somvare, Inc. (San Diego, CA). Analiza je ponovljena dva ili više puta za svaki testirani peptid, u ukupno 3 ili više replikata odredjivanja IC50.
Primer 4: Ispitivanjain vivoaktivnosti
Ovaj primer opisuje različitain vivoispitivanja koji su korisna za procenu aktivnosti i potentnosti EPO-R agonist peptida iz pronalaska. EPO-R agonist peptidni dimeri su dobijeni prema metodama koje su date u Primeru 1 ili Primeru 2.In vivo aktivnostovih peptidnih monomera i dimera je procenjena korišćenjem serije ispitivanja, uključujući bioanakze na policitemičnim ekshipoksičnim miševima i analize retikulocita. Ova dva ispitivanja su opisana u više detalja dole.
1. Bioanaliza na policitemičnim ekshipoksičnim miševima
Bioanalizom je ispitivanain vivoaktivnost testiranih peptida u policitemičnim ekshipoksičnim miševima koja je usvojena iz metode koju je opisao Cotes i Bangham (1961), Nature 191:1065 -1067. Ova analiza ispituje sposobnost testiranog peptida da funkcioniše kao EPO mimik: odnosno, da aktivira EPO-R i indukuje sintezu novih crvenih krvnih zrnaca. Sinteza crvenih krvnih zrnaca je kvantifikovana na osnovu inkorporisanja radioaktivno obeleženog gvoždja u hemoglobin sintetisanih crvenih krvnih ćelija.
BDF1 miševi su ostavljeni da se aklimatizuju na ambijentalne uslove u toku 7-10 dana. Telesne težine su odredjene za sve životinje i životinje sa malom težinom (<15 grama) nisu korišćene. Miševi su podvrgnuti uzastopnim kondicioniranim ciklusima u hipobarnoj komori u toku ukupno 14 dana. Svaki 24 satni ciklus se sastoji od 18 h na 0,40±0,02 % atmosferskog pritiska i 6 h na ambijentalnom pritisku. Nakon kondicioniranja miševi su održavani na ambijentalnom pritisku u toku dodatnih 72 h pre doziranja.
Testirani peptidi ili rekombinantni humani EPO standardi, su razblaženi u PBS + 0,1 % BSA nosiocu (PBS/BSA). Stok rastvori peptidnih monomera su prvo rastvoreni u dimetil sulfoksidu (DMSO). Negativne kontrolne grupe uključuju jednu grupu miševa kojima je ubrizgan PBS/BSA sam i jednu grupu kojoj je ubrizgan 1 % DMSO. Grupa za svaku dozu sadrži 10 miševa. Miševima je subkutano ubrizgano (u potiljak vrata) 0,5 mL odgovarajućeg uzorka.
Četrdeset osam sati nakom ubrizgavanja uzorka, miševima je dara intrapeirtonealna injekcija sa 0,2 ml Fe<59>(Dupont, NEN), za dozu od približno 0,75 pKirija/po mišu. Telesne težine miševa su odredjivane 24 h nakon Fe<59>primene i miševi su žrtvovani 48 h nakon Fe<59>primene. Krv je sakupljena iz svake životinje pomoću kardijalne punkture i odredjivani su hematokriti (heparin je korišćen kao antikoagulant). Svaki uzorak krvi (0,2 ml) je analiziran za Fe<59>inkorporaciju korišćenjem Packard gama brojača. Neosetljivi miševi (odnosno, oni miševi kod kojih je radioaktivna inkorporacija manja od negativne kontrolne grupe) su eliminisani iz odgovarajućeg seta podataka. Miševi kod kojih su vrednosti hematokrita manje od 53 % od negativne kontrolne grupe su takodje eliminisani.
Rezultati su dobijeni iz setova od 10 životinja za svaku eksperimentalnu dozu. Prosečna količina radioaktivnosti koja je inkorporisana [iznos po minuti (CPM)] u uzorcima krvi iz svake grupe je obračunata.
2. Analiza retikulocita.
Normalni BDF1 miševi su dozirani (0,5 mL, ubrizgano subkutano) u tri uzastopna dana bilo sa EPO kontrolom ili testiranim peptidom. Trećeg dana, miševi su takodje dozirani (0,1 mL, ubrizgano intraperitonealno) sa gvoždje dekstranom (100 mg/ml). Petog dana, miševi su anestezirani sa CO2i uzorci krvi su uzeti pomoću kardijalne punkture. Procenat (%) retikulocita za svaki uzorak krvi je odredjen pomoću tiazol narandžastog bojenja i analize protočne citometrije (retik-count program). Hematokriti su manuelno odredjeni. Korigovani procenat reitkulocita je odredjen korišćenjem sledeće formule:
% RETIKkori<g>ovani = % RETIKDObueno X (HematokritiNDiviDUALNi / HematokritNORMALAN)
3. Hematološka analiza
Normalni CD1 miševi su dozirani sa četiri nedeljne bolusne intravenozne injekcije bilo sa EPO pozitivnom kontrolom, testiranim peptidom iU nosiocem. Opseg doza pozitivne kontrole i testiranih peptida, koje su izražene kao mg/kg, je testiran uz pomoć variranja koncentracije aktivnog jedinjenja u formulaciji. Ubrizgane zapremine su 5 ml/kg. kontrolna grupa sa nosiocem je obuhvatala dvanaest životinja, dok je po 8 životinja bilo u svakoj od preostalih doziranih grupa. Dnevna vijabilnost i nedeljne telesne težine su beležene.
Dozirani miševi su izgladnjivani i zatim anestezionirani inhaliranjem izoflurana i terminalni uzorci krvi su sakupljeni putem punkture kardijalne ili abdominalne aorte, 1. dana (za kontrolne miševe sa nosiocem) i dana 15 i 29 (4 miša/grupa/dnevno). Krv je prebačena u Vacutainer® brand epruvete. Poželjan antikoagulantje etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA).
U uzorcima krvi je procenjivana krajnja tačka u kojoj je izmerena sinteza crvenih krvnih zrnaca i fiziologija kao što je hematokrit (Hct), hemoglobin (Hgb) i ukupan broj eritrocita (RBC) korišćenjem automatizovanih kliničkih analizatora poznatih u oblasti (na pr., onih od proizvodjača Coulter, Inc.).
Primer 5: Sinteza EPO-R agonist peptidnih homodimera peptidnih monomera koji imaju arninokiselinsku sekvencu (AcG) GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLRK (SEK ID BR: 1)
Korak 1 - Sinteza peptidnih monomera:Peptidnimonomeri su sintetisani korišćenjem standardne Fmok hemijske reakcije na ABI431A peptidnom sintetizeru, korišćenjem TG-RAM smole (0,18 mmol/g Rapp Polvmere, Germanv). Za sintezu peptidnih monomera sa amidovanim karboksi terminusom, potpuno sklopljeni peptid je izdvojen iz smole sa 82,5 % TFA, 5 % vode, 6,25 % anizola, 6,25 % etanditiola. Deprotektovani proizvod je filtriran iz smola i precipitiran sa dietil etrom. Nakon potpunog sušenja, proizvod je prečišćen pomoću C18 reverzno fazne tečne hromatografije visokih performansi sa gradijentom acetonitril/voda u 0,1 % trifluorosirćetne kiseline. Struktura peptida je potvrdjena uz pomoć elektrosprejne masene spektrometrije. Peptid je rastvoren u 1:1 rastvoru DMSO : voda u koncentraciji od 1 mg/rnL kako bi se podržalo formiranje disulfida. Proizvod je prečišćen pomoću C18 reverzno fazne tečne hromatografije visokih performansi sa gradijentom acetonitril/voda u 0,1 % trifluorosirćetne kiseline. Peptidni monomeri mogu biti ilustrovani kao što sledi:
Korak 2- Sinteza trimnkcionalnog linkera:Urastvor sa dietil iminoacetatom (10,0 g, 52,8 mmol) i Bok-beta-Alaninom (10,0 g, 52,8 mmol) u 100 mL DCM je dodat diizopropilkarbodiimid (8,0 mL, 51,1 mmol) tokom 10 minuta na sobnoj temperturi. Reakciona smeša je zagrevana do~10 stepeni u toku dodavanja, zatim ohladjena nazad do sobne temperature tokom 20 minuta. Reakciona smeša je ostavljena da se meša preko noći i precipitirana diizopropilurea je odfiltrirana. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom do dobijanja gume i ostatak je rastvoren u etil acetatu i ponovo filtriran kako bi se uklonila dodatno precipitirana urea. Organska faza je smeštena u levak za odvajanje, isprana (zas. NaHC03, slanim rastvorom, 0,5 N HC1, slanim rastvorom), osušena (MgS04), filtrirana i koncentrovana pod sniženim pritiskom do dobijanja diestarskog proizvoda u obliku bezbojnog ulja. Diestar je ubačen u 1:1 smešu sa MeOH : THF (100 mL) i u ovo je dodata voda (25 mL) i zatim NaOH (5g, 125 mmol). pH je meren da bude >10. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi u toku 2 h i zatim zakišeljena do pH 1 sa 6N HC1. Vodena faza je zasićena sa NaCl i ekstrahovana 4 puta sa etil acetatom. Kombinovana organska faza je isprana (slani rastvor), osušena (MgS04) i koncentrovana pod sniženim pritiskom do dobijanja bele polučvrste supstance. Čvrsta supstanca je rastvorena u 50 mL DCM i u ovo je dodato 300 mL heksana do dobijanja bele suspenzije. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom do dobijanja dikiseline u obliku bele čvrste supstance (14,7 g, 91,5 % prinosa u 2 koraka). U rastvor dikiseline (1 g, 3,29 mmol) u 20 mL DMF je dodat N-hidroksisukcinimid (770 mg, 6,69 mmol) i diizopropilkarbodiimid (1,00 mL, 6,38 mmol) i 4-dimetilaminopiridin (3 mg, 0,02 mmol). Reakciona smeša je mešana preko noći i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Ostatak je stavljen u etil acetat i filtriran kako bi se uklonila precpitirana urea. Organska faza je smeštena u levak za odvajanje, isprana (zas. NaHC03, slanim rastvorom, 0,5 N HC1, slanim rastvorom), osušena (MgS04), filtrirana i koncentrovana pod sniženim pritiskom do dobijanja di-NHS estarskog proizvoda u obliku bele čvrste supstance (l,12g, 68 % prinosa).
Korak 3 - Kuplovanje trif<u>nkcionakto<g>linkera za peptidne monomere:Za kuplovanje za linker, 2 ekv. peptida je mešano sa 1 ekv. trifunkcionalnog linkera u suvom DMF do dobijanja bistrog rastvora, 5 ekv. DIEA je dodato nakon 2 minuta. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u toku 14 h. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i sirovi proizvod je rastvoren u 80 % TFA u DCM tokom 30 min kako bi se uklonila Bok grupa, nakon čega je sledilo prečišćavanje sa C18 reverzno faznom HPLC. Struktura dimera je potvrdjena pomoću elektrosprejne masene spektrometrije. Ova reakcija kuplovanja vezuje linker za atom azota sa e-amino grupe iz lizinskog ostatka svakog monomera.
Korak 4 - PEGilacija peptidnog dimera:
PEGilacija preko karbamatne veze: Peptidnidimer je mešan sa jednakom količinom (molska osnova) aktivirane PEG vrste (mPEG-NPC proizvodjača NOF Corp. Japan) u suvom DMF do dobijanja bistrog rastvora. Nakon 5 minuta 4 ekv, DIEA je dodato u gornji rastvor. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 14 h, nakon čega je sledilo prečišćavanje sa C18 reverzno faznom HPLC. Struktura PEGilovanog peptida je potvrdjena pomoću MALDI masene. Prečišćeni peptid je takodje podvrgnut prečišćavanju preko katjonizmenjivačke hromatografije kako je prikazano dole.
PEGilacija preko amidne veze:Peptidni dimer je mešan sa jednakom količinom (molska osnova) aktivirane PEG vrste (PEG-SPA-NHS proizvodjača Sheanvater Corp, USA) u suvom DMF do dobijanja bistrog rastvora. Nakon 5 minuta 10 ekv. DIEA je dodato u gornji rastvor, Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 h, nakon čega je sledilo prečišćavanje sa C18 reverzno faznom HPLC. Struktura PEGilovanog peptida je potvrdjena pomoću MALDI masene. Prečišćeni peptid je takodje podvrgnut prečišćavanju preko katjonizmenjivačke hromatografije kako je prikazano dole.
KorakS:- Jonoizmenjivačko prečišćavanje peptida: Za nekolikoizmenjivačkih nosača je ispitana sposobnost da razdvoje gore dobijene peptid-PEG konjugate iz neproreagovanih (ili hidrolizovanih) PEG, pored njihove sposobnosti da zadrže polazne dimerne peptide. Jonoizmenjivačke smole (2-3g) su stavljene u kolonu od 1 cm, nakon čega je vršena konverzija u natrijumov obuk (0,2 N NaOH napunjeno u kolonu dok eluent ne postigne pH 14, ca. 5 zapremina kolona) i zatim u hidrogenovani oblik (eluirana ili sa 0,1 N HC1 ili sa 0,1 M HOAc dok eluent ne postigne pH punjenja, ca. 5 zapremina kolone), nakon čega su isprane sa 25 % smeše ACN/voda do postizanja pH 6. Bilo peptid pre konjugacije ili peptid-PEG konjugat su rastvoreni u 25 % smeše ACN/voda (10 mg/mL) i pH je podešen do <3 sa TFA, zatim su smešteni u kolonu. Nakon ispiranja sa 2-3 zapremine kolone sa 25 % smeše ACN/voda i prikupljanja frakcija od 5 mL, peptidi su ispušteni iz kolone pomoću eluiranja sa 0,1 M NH4OACu 25 % smeše ACN/voda, ponovo prikupljane frakcije od 5 mL. Analize preko HPLC pokazuju koja frakcija sadrži željeni peptid. Analize sa Evaporacionim Light-Scattering Detektorom (ELSD) ukazuju na to da kada se peptidi zadrže na koloni kada se eluiraju sa NH4OACrastvorom (generalno izmedju frakcija 4 i 10), nema prisutnih nekonjugovanih PEG kao kontaminanata. Kada se peptidi eluiraju u inicijalnom puferu za ispiranje (generalno prve 2 frakcije), nema primećenog izdvajanja željenog PEG-konjugata i viška PEG.
Sledeće kolone uspežno zadržavaju oba peptida i peptid-PEG konjugate i uspešno prečišćavaju peptid-PEG konjugat iz nekonjugovanih peptida:
Primer 6: Sinteza EPO-R agonist peptidnih homodimera peptidnih monomera koji imaju aminokiselinsku sekvencu (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEKID BR: 1)
EPO-R agonist peptidni homodimeri peptidnih monomera koji imaju aminokiselinsku sekvencu (AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)K (SEK ID BR: 2) su sintetisani kako je opisano u Primeru 1, osim što u Koraku 1 sintetisani peptidni monomeri su:
Gde je PEG pripojen za linker preko karbamatne veze, finalni proizvod ove sinteze može biti ilustrovan strukturno kao što sledi:
Gde je PEG pripojen za linker preko amidne veze, finalni proizvod ove sinteze može biti ilustrovan strukturno kao što sledi:
Primer 7: IspitivanjaIn vitroaktivnosti
Ovaj primer opisuje razbčitain vitroispitivanja koja su korisna u proceni aktivnosti i potentnosti EPO-R agonist peptida iz pronalaska. Rezultati iz ovih ispitivanja ukazuju na to da se novi peptidi iz ovog pronalaska vezuju za EPO-R i aktiviraju EPO-R signalizaciju. Pored toga, rezultati iz ovih ispitivanja ukazuju na to da nove peptidne kompozicije pokazuju iznenadjujuće povećanje u afinitetu EPO-R vezivanja i u biološkoj aktivnosti u poredjenju sa EPO mimičnim peptidima koji su bili ranije opisani.
EPO-R agonist peptidni monomeri i dimeri su dobijeni prema metodama koje su date u Primeru 1 ili Primeru 2. Potentnost ovih peptidnih dimera je procenjena korišćenjem serijein vitroispitivanja aktivnosti, uključujući: reporter analizu, analizu probferacije, analizu kompetitivnog vezivanja i C/BFU-e anabzu. Ove četiri analize su opisane u više detalja dole.
Rezultati ovih ispitivanjain vitroaktivnosti su prikazani u Tabeli 2.
1. Reporter analiza
Ova analiza se zasniva na reporter ćelijama dobijenim iz pre-B-ćelijskih Unija iz miševa, Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux. Ove reporter ćelijske linije eksprimiraju himerne receptore koje uključuju ekstra-celularni deo humanog EPO receptora za intra-celularni deo humanog GCSF receptora. Ove ćelijske linije su dalje transficirane sa fos genskom konstrukcijom koja sadrži promoterom-vodjeni reporter luciferaze. Aktivacija ovog himernog receptora putem dodavanja eritropoietskog agensa dovodi do ekspresije luciferaznog reporter gena i na taj način produkcije svetlosti nakon dodavanja luciferaznog supstrata luciferina. Tako nivo EPO-R aktivacije u takvim ćelijama može biti kvantifikovan preko merenja aktivnosti luciferaze.
Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux ćelije su kultivisane u DMEM/F12 medijumu (Gibco) koji je obogaćen sa 10 % fetalnog govedjeg seruma (FBS; Hvclone), 10 % WEHI-3 supernatanta (supernatant iz kulture WEHI-3 ćelija, ATCC # TIB-68) i smešom penicilin/streptomicin. Približno 18 h pre anabze, ćelije su izgladnjivane njihovim prebacivanjem u DMEM/F12 medijum koji je obogaćen sa 10 % FBS i 0,1 % WEHi-3 supernatanta. Na dan analize, ćelije su isprane jednom sa DMEM/F12 medijumom koji je obogaćen sa 10 % FBS (bez WEHI-3 supernatanta), zatim je 1X IO<6>ćelija/mL kultivisano u prisustvu poznate koncentracije testiranog peptida ili sa EPO (R & D Svstems Inc., Minneapolis, MN) kao pozitivnom kontrolom, u DMEM/F12 medijumu obogaćenom sa 10 % FBS (bez WEHI-3 supernatanta). Serijska razblaženja testiranog peptida su istovremeno testirana u ovoj analizi. Analitičke ploče su inkubirane u toku 4 h na 37 °C u atmosferi 5 % CO2, nakon čega je dodat luciferin (Steady-Glo; Promega, Madison, Wi) u svaki bunarčić. Nakon 5-o minutne inkubacije, meri se emisija svetla na Packard Topcount Luminometru (Packard Instrument Co., Downers Grove, HI.). Vrednosti za svetlost su nanete u odnosu na koncentracije testiranog peptida i analizirane korišćenjem Graph Pad softvera. Koncentracija testiranog peptida koja dovodi do polovine od maksimalne emisije svetla se beleži kao EC50.
2. Analiza proliferacije
Ova analiza se zasniva na pre-B-ćelijskoj liniji iz miševa, Baf3, transficiranoj tako da eksprimira humani EPO-R. Proliferacija dobijenih ćelijskih linija, BaF3/Gal4/Elk/EPOR, je zavisna od EPO-R aktivacije. Stepen proliferacije ćelija je kvantifikovan korišćenjem MTT, gde signal u MTT analizi je proporcionalan broju vijabilnih ćelija.
BaF3/Gal4/Elk/EPOR ćelije su kultivisane u obrtnim bocama u DMEM/F12 medijumu (Gibco) koji je obogaćen sa 10 % FBS (Hvclone) i 2 % WEHI-3 supernatanta (ATCC # TIB-68). Kultivisane ćelije su izgladnjivane preko noći, u obrtnim bocama pri gustini ćelija od 1 x IO<6>ćelija/ml, u DMEM/F12 medijumu koji je obogaćen sa 10 % FBS i 0,1 % WEHI-3 supernatanta. Izgladnjivane ćelija su zatim isprane dva puta sa Dulbecco's PBS (Gibco) i resuspendovane sa gustinom od 1 x 10<6>ćelija/ml u DMEM/F12 koji je obogaćen sa 10 % FBS (bez WEHI-3 supernatanta). Alikvoti od 50 pL (~50,000 ćelija) ćelijske suspenzije su zatim ubačeni, u triplikatu, u analitičku ploču sa 96 bunarčića. Alikvoti od 50 pL serijskih razblaženja testiranih EPO mitničkih peptida ili 50 pL EPO (R & D Svstems Inc., Minneapolis, MN) ili Aranesp™ (darbpoeitin alfa, EPO-R agonist komercijalno dostupan od proizvodjača Amgen) u DMEM/F12 medijumu koji je obogaćen sa 10 % FBS (bez WEHI-3 supernatanta I) su dodati u analitičke ploče sa 96 bunarčića (finalna zapremina bunarčića od 100 pL). Na primer, 12 različitih razblaženja može biti testirano gde finalna koncentracija testiranog peptida (ili kontrolni EPO peptid) se kreće izmedju 810 pM do 0,0045 pM. Ćelije u pločama su zatim inkubirane u toku 48 h na 37 °C. Nakon toga, 10 pL MTT (Roche Diagnostics) je dodato u svaki bunarčić sa kulturom a zatim su ostavljene u inkubatoru u toku 4 h. Reakcija je zatim zaustavljena dodavanjem 10 % SDS + 0,01 N HC1. Ploče su zatim inkubirane preko noći na 37 °C. Apsorbanca na talasnoj dužini od 595 nM, za svaki bunarčić je zatim merena na spektrofotometru. Dijagrami vrednosti apsorbance prema koncentracijama testiranog peptida su konstruisani i EC50 vrednost je sračunata korišćenjem Graph Pad softvera. Koncentracija testiranog peptida koja dovodi do polovine od maksimalne apsorbance se beleži kao EC50.
3. Analiza kompetitivnog vezivanja
Izračunavanja kompetitivnog vezivanja su izvedena korišćenjem analize u kojoj se svetlosni signal generiše kao funkcija od blizine dve mikrosfere: mikrosfere donora streptavidina koja nosi biotinilovan trejser EPO-R-vezujući peptid i mikrosfere akceptora za koju se vezuje EPO-R. Svetlost se generiše pomoću transfera neradijacione energije, u toku koga se jedan kiseonik oslobadja iz prve mikrosfere pri osvetljavanju i dolazi u kontakt sa oslobodjenim jednim kiseonikom dovodeći do toga da druga mikrosfera emituje svetlost Skupovi ovih mikrosfera su komercijalno dostupni (Packard). Blizina mikrosfera se stvara vezivanjem EPO-R-vezujućeg peptidnog trejsera za EPO-R. Testirani peptid koji je u kompeticiji sa EPO-R-vezujućim peptidnim trejserom u vezivanju za EPO-R će sprečiti to vezivanje, dovodeći do smanjenja emisije svetla.
Detaljniji prikaz metode je kao što sledi: 4 pL serijskih razblaženja testiranog EPO-R agonist peptida ili pozitivne ili negativne kontrola se dodaje u bunarčiće na ploči sa 384 bunarčića. Nakon toga, dodje se 2 pL /po bunarčiću smeše receptor/mikrosfere. Smeša receptora i mikrosfera se sastoji od: 15 pL od 5mg/ml streptavidin donorskih mikrosfera (Packard), 15 pL od 5mg/ml monoklonalnih antitela abl79 (ova antitela prepoznaju deo proteina humane placentalne alkalne fosfataze koja se nalazi u rekombinantnim EPO-R), akceptorskih mikrosfera obloženih sa proteinom A (protein A se vezuje za abl79 antitela; Packard), 112,5 pL rekombinantnog EPO-R u razblaženju 1 : 6,6 (koji je proizveden u ovarijalnim ćelijama Kineskog hrčka kao fuzioni protein u delu proteina humane placentalne alkalin fosfataze koji sadrži abl79 ciljane epitope) i 607,5 pLAlfakvest pufera (40 mM HEPES, pH 7,4; 1 mM MgCl2; 0,1 % BSA, 0,05 %Tween 20). Sve se spaja da bi se izmešalo. Doda se 2 pL/po bunarčiću biotinilovanog EPO-R-vezujućeg peptidnog trejsera, AF33068 (30 nM finalna koncentracija). AF33068, jedan EPO-R vezujući peptid (videti Tabelu 3 "Reporter EC50 (pM)"), je dobijen prema metodama koje su opisane u Primeru 1.
Centrifugira se 1 min da bi se izmešalo. Ploča se zapečati sa Packard Top Seal i zamota u foliju. Inkubira se preko noći na sobnoj temperaturi. Nakon 18 sati čita se emisija svetla korišćenjem AlphaQuest čitača (Packard). Podaci o emisiji svetla se nanose u dijagram u odnosu na koncentraciju peptida i analizira se sa programima Graph Pad ili Excel.
Koncentracija testiranog peptida koja dovodi do 50 % smanjenja emisije svetla, u odnosu na onu koja se dobija bez testiranog peptida, se beleži kao IC50.
4. C/ BFU- e analiza
EPO-R signalizacija stimuliše diferencijaciju ćelijske loze iz koštane srži u proliferativne prekursore crvenih krvnih zrnaca. Ova analiza meri sposobnost testiranih peptida da stimulišu proliferaciju i diferencijaciju prekursora crvenih krvnih zrnaca iz primarnih humanih višepotentnih ćelijskih linija koštane srži.
Za ovu analizu, serijska razblaženja testiranog peptida su pripremljena u IMDM medijumu (Gibco) koji je obogaćen sa 10 % FBS (Hvclone). Ova serijska razblaženja ili pozitivna kontrola EPO peptida, su zatim dodata u metilcelulozu do dobijanja finalne zapremine od 1,5 mL. Smeša metilceluloze i peptida je zatim snažno vorteksovana. Alikvoti (100,000 ćelija/mL) humanih CD34+ ćelija, dobijenih iz koštane srži (Poietics/Cambrex) su otopljeni. Otopljene ćelije su polako dodate u 0,1 mL 1 mg/ml DNAze (ćelijska linija) u epruvetama od 50 mL. Zatim se, 40-50 mL IMDM medijuma polako doda u ćelije: medijum se dodaje kap po kap duž bočnih zidova epruveta od 50 mL za prvih 10 mL i zatim se preostala zapremina medijuma polako sliva duž bočnih zidova epruvete. Ćelije se zatim centrifugiraju na 900 rpm u toku 20 min i medijum se pažljivo uklanja pomoću blagog aspiriranja. Ćelije se resuspenduju u 1 ml IMDM medijuma i odredjuje se gustina ćelija po mL na hemacitometarskom slajdu (alikvot od 10 pL ćelijske suspenzije na slajdu a gustina ćelija je prosečan broj X 10,000 ćelija/ml). Ćelije su zatim razblažene u IMDM medijumu do gustine ćelija od 15,000 ćelija/mL. 100 pL razblaženih ćelija se zatim dodaje u svakih 1,5 mL metil celuloze i peptidnog uzorka (finalna koncentracija ćelija u analitičkom medijumu je 1000 ćelija/mL) i smeša se vorteksuje. Ostavi se da mehurići u smeši nestanu i zatim se aspirira 1 mL korišćenjem igle sa tupim vrhom. Dodaje se 0,25 mL aspirirane smeše iz svakog uzorka u svaki od 4 bunarčića na ploči sa 24 bunarčića (Falcon brand). Smeše u ploči se inkubiraju na 37 °C pod atmosferom 5 % CO2u vlažnom inkubatoru u toku 14 dana. Ocenjuje se prisustvo eritroidnih kolonija korišćenjem faznog mikroskopa (5X-10X objektiv, finalnog uvećanja od 100X). Koncentracija testiranog peptida pri kojoj je broj formiranih kolonija 90 % od maksimalnog, u odnosu na broj dobijen sa EPO pozitivnom kontrolom, se beleži kao EC90 [Videti Tabela 2: C/BFU-e EC90].
Primer 8: Ispitivanjain vivoaktivnosti
Ovaj primer opisuje različitain vivo ispitivanjakoji su korisna za procenu aktivnosti i potentnosti EPO-R agonist peptida iz pronalaska. EPO-R agonist peptidni dimeri su dobijeni prema metodama koje su date u Primeru 1.In vivoaktivnost ovih peptidnih monomera i dimera je procenjena korišćenjem serije ispitivanja, uključujući bioanalize na policitemičnim ekshipoksičnim miševima i analize retikulocita. Ove dve analize su opisane u više detalja dole.
1. Bioanaiiza na policitemičnim ekshipoksičnim miševima
Bioanalizom je ispitivanain vivoaktivnost testiranih peptida u policitemičnim ekshipoksičnim miševima koja je usvojena iz metode koju je opisao Cotes i Bangham (1961), Nature 191:1065 -1067. Ova analiza ispituje sposobnost testiranog peptida da funkcioniše kao EPO mimik: odnosno, da aktivira EPO-R i indukuje sintezu novih crvenih krvnih zrnaca. Sinteza crvenih krvnih zrnaca je kvantifikovana na osnovu inkorporisanja radioaktivno obeleženog gvoždjau hemoglobin sintetisanih crvenih krvnih ćelija.
BDF1 miševi su ostavljeni da se aklimatizuju na ambijentalne uslove u toku 7-10 dana. Telesne težine su odredjene za sve životinje i životinje sa malom težinom (<15 grama) nisu korišćene. Miševi su podvrgnuti uzastopnim kondicioniranim ciklusima u hipobarnoj komori u toku ukupno 14 dana. Svaki 24 satni ciklus se sastoji od 18 h na 0,40±0,02 % atmosferskog pritiska i 6 h na ambijentalnom pritisku. Nakon kondicioniranja miševi su održavani na ambijentalnom pritisku u toku dodatnih 72 h pre doziranja.
Testirani peptidi ili rekombinantni humani EPO standardi, su razblaženi u PBS + 0,1 % BSA nosiocu (PBS/BSA). Stok rastvori peptidnih monomera su prvo rastvoreni u dimetil sulfoksidu (DMSO). Negativne kontrolne grupe uključuju jednu grupu miševa kojima je ubrizgan PBS/BSA sam i jednu grupu kojoj je ubrizgan 1 % DMSO. Grupa za svaku dozu sadrži 10 miševa. Miševima je subkutano ubrizgano (u potiljak vrata) 0,5 mL odgovarajućeg uzorka.
Četrdeset osam sati nakom ubrizgavanja uzorka, miševima je data intrapeirtonealna injekcija sa 0,2 ml Fe<59>(Dupont, NEN), za dozu od približno 0,75 pKirija/po mišu. Telesne težine miševa su odredjivane 24 h nakon Fe<59>primene i miševi su žrtvovani 48 h nakon Fe<59>primene. Krv je sakupljena iz svake životinje pomoću kardijalne punkture i odredjivani su hematokriti (heparin je korišćen kao antikoagulant). Svaki uzorak krvi (0,2 ml) je analiziran za Fe<59>inkorporaciju korišćenjem Packard gama brojača. Neosetljivi miševi (odnosno, oni miševi kod kojih je radioaktivna inkorporacija manja od negativne kontrolne grupe) su eliminisani iz odgovarajućeg seta podataka. Miševi kod kojih su vrednosti hematokrita manje od 53 % od negativne kontrolne grupe su takodje eliminisani.
Rezultati su dobijeni iz setova od 10 životinja za svaku eksperimentalnu dozu. Prosečna količina radioaktivnosti koja je inkorporisana [iznos po minuti (CPM)] u uzorcima krvi iz svake grupe je obračunata.
2. Analiza retikulocita
Normalni BDF1 miševi su dozirani (0,5 mL, ubrizgano subkutano) u tri uzastopna dana bilo sa EPO kontrolom ili testiranim peptidom. Trećeg dana, miševi su takodje dozirani (0,1 mL, ubrizgano intraperitonealno) sa gvoždje dekstranom (100 mg/ml). Petog dana, miševi su anestezirani sa CO2i uzorci krvi su uzeti pomoću kardijalne punkture. Procenat (%) retikulocita za svaki uzorak krvi je odredjen pomoću tiazol narandžastog bojenja i analize protočne citometrije (retik-count program). Hematokriti su manuelno odredjeni. Korigovani procenat retikulocita je odredjen korišćenjem sledeće formule:
% RETIKrorigovani = % RETIKDObuenoX (HematokritiNDiviDUAi.Ni / HematokritNoRMALAN)
3. Hematološka analiza
Normalni CD1 miševi su dozirani sa četiri nedeljne bolusne intravenozne injekcije bilo sa EPO pozitivnom kontrolom, testiranim peptidom ili nosiocem. Opseg doza pozitivne kontrole i testiranih peptida, koje su izražene kao mg/kg, je testiran uz pomoć variranja koncentracije aktivnog jedinjenja u formulaciji. Ubrizgane zapremine su 5 ml/kg. kontrolna grupa sa nosiocem je obuhvatala dvanaest životinja, dok je po 8 životinja bilo u svakoj od preostalih doziranih grupa. Dnevna vijabilnost i nedeljne telesne težine su beležene.
Dozirani miševi su izgladnjivani i zatim anestezionirani inhaliranjem izoflurana i terminalni uzorci krvi su sakupljeni putem punkture kardijalne ili abdominalne aorte 1. dana (za kontrolne miševe sa nosiocem) i dana 15 i 29 (4 miša/grupa/dnevno). Krv je prebačena u Vacutainer® brand epruvete. Poželjan antikoagulant je etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA).
U uzorcima krvi je procenjivana krajnja tačka u kojoj je izmerena sinteza crvenih krvnih zrnaca i fiziologija kao što je hematokrit (Hct), hemoglobin (Hgb) i ukupan broj eritrocita (RBC) korišćenjem automatizovanih kliničkih analizatora poznatih u oblasti (na pr., onih od proizvodjača Coulter, Inc.).
Primer 9: Sinteza EPO-R agonist peptidnih homodimera peptidnih monomera koji imaju arrrinokiselinsku sekvencu (AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLRK (SEK ID BR 1)
Korak 1 - Sinteza peptidnih monomera:Peptidni monomeri su sintetisani korišćenjem standardne Fmok hemijske reakcije na ABI431A peptidnom sintetizeru, korišćenjem TG-RAM smole (0,18 mmol/g Rapp Polvmere, Germanv). Za sintezu peptidnih monomera sa amidovanim karboksi terminusom, potpuno sklopljeni peptid je izdvojen iz smole sa 82,5 % TFA, 5 % vode, 6,25 % anizola, 6,25 % etanditiola. Deprotektovani proizvod je filtriran iz smola i precipitiran sa dietil etrom. Nakon potpunog sušenja, proizvod je prečišćen pomoću C18 reverzno fazne tečne hromatografije visokih performansi sa gradijentom acetonitril/voda u 0,1 % trifluorosirćetne kiseline. Struktura peptida je potvrdjena uz pomoć elektrosprejne masene spektrometrije. Peptidni monomeri mogu biti ilustrovani kao što sledi:
Korak2- Sinteza trimnkcionalnog linkera:
U rastvor sa dietil iminoacetatom (10,0 g, 52,8 mmol) i Bok-beta-alaninom (10,0 g, 52,8 mmol) u 100 mL DCM je dodat diizopropilkarbodiimid (8,0 mL, 51,1 mmol) tokom 10 minuta na sobnoj temperturi. Reakciona smeša je zagrevana do -10 stepeni u toku dodavanja, zatim ohladjena nazad do sobne temperature tokom 20 minuta. Reakciona smeša je ostavljena da se meša preko noći i precipitirana diizopropilurea je odfiltrirana. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom do dobijanja gume i ostatak je rastvoren u etil acetatu i ponovo filtriran kako bi se uklonila dodatno precipitirana urea. Organska faza je smeštena u levak za odvajanje, isprana (zas. NaHC03, slanim rastvorom, 0,5 N HC1, slanim rastvorom), osušena (MgS04), filtrirana i koncentrovana pod sniženim pritiskom do dobijanja diestarskog proizvoda u obliku bezbojnog ulja. Diestar je ubačen u 1:1 smešu sa MeOH: THF (100 mL) i u ovo je dodata voda (25 mL) i zatim NaOH (5g, 125 mmol). pH je meren da bude >10. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi u toku 2 h i zatim zakišeljena do pH 1 sa 6N HC1. Vodena faza je zasićena sa NaCl i ekstrahovana 4 puta sa etil acetatom. Kombinovana organska faza je isprana (slani rastvor), osušena (MgS04) i koncentrovana pod sniženim pritiskom do dobijanja bele polučvrste supstance. Čvrsta supstanca je rastvorena u 50 mL DCM i u ovo je dodato 300 mL heksana do dobijanja bele suspenzije. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom do dobijanja dikiseline u obliku bele čvrste supstance (14,7 g, 91,5 % prinosa u 2 koraka). U rastvor dikiseline (1 g, 3,29 mmol) u 20 mL DMF je dodat N-hidroksi- sukcinimid (770 mg, 6,69 mmol) i diizopropilkarbodiimid (1,00 mL, 6,38 mmol) i 4-dimetilamino- piridin (3 mg, 0,02 mmol). Reakciona smeša je mešana preko noći i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Ostatak je stavljen u etil acetat i filtriran kako bi se uklonila precpitirana urea. Organska faza je smeštena u levak za odvajanje, isprana (zas. NaHC03, slanim rastvorom, 0,5 N HC1, slanim rastvorom), osušena (MgS04), filtrirana i koncentrovana pod sniženim pritiskom do dobijanja di-NHS estarskog proizvoda u obliku bele čvrste supstance (l,12g, 68 % prinosa).
Korak 3 - Kuplovanje trifunkcionalnog linkera za peptidne monomere:Za kuplovanje za linker, 2 ekv. peptida je mešano sa 1 ekv. trifunkcionalnog linkera u suvom DMF do dobijanja bistrog rastvora, 5 ekv. DIEA je dodato nakon 2 minuta. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u toku 14 h. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i sirovi proizvod je rastvoren u 80 % TFA u DCM tokom 30 min kako bi se uklonila Bok grupa, nakon čega je sledilo prečišćavanje sa C18 reverzno faznom HPLC. Struktura dimera je potvrdjena pomoću elektrosprejne masene spektrometrije. Ova reakcija kuplovanja vezuje linker za atom azota sa e-amino grupe iz lizinskog ostatka svakog monomera.
Korak 4 - Sinteza PEG dela koji uključuje dva linearna PEGS lanca povezana sa Lizinom
mPEG2- LJzmol- NPC
Lizinol, koji se može dobiti komercijalno, je tretiran sa viškom mPEG2-NPC do dobijanja MPEG2-lizinola, koji zatim reaguje sa NPC do formiranja mPEG2-Lizinol-NPC.
mPEG2- Liz- NHS
Ovaj proizvod se može dobiti komercijalno, na primer, iz Molecular Engineering
catalog (2003) proizvodjača Nektar Therapeutics (490 Discoverv Drive, Huntsville, Alabama 35806), predmet Br. 2Z3X0T01.
Korak 5 - PEGilacija peptidnog dimera:
PEGilacija preko karbamatne veze:
Peptidni dimer i PEG vrste (mPEG2-Lizinol-NPC) se mešaju u 1:2 molarnom odnosu u suvom DMF do dobijanja bistrog rastvora. Nakon 5 minuta 4 ekv. DIEA se dodaje u gornji rastvor. Smeša se meša na sobnoj temperaturi 14 h, nakon čega sledi prečišćavanje sa C18 reverzno faznom HPLC. Struktura PEGilovanog peptida je potvrdjena sa MALDI masenom. Prečišćeni peptid je takodje podvrgnut prečišćavanju preko katjonizmenjivačke hromatografije kako je prikazano dole.
PEGilacija preko amidne veze:
Peptidni dimer i PEG vrste (mPEG2-Liz-NHS proizvodjača Sheanvater Corp, USA) su mešani u 1:2 molarnom odnosu u suvom DMF do dobijanja bistrog rastvora. Nakon 5 minuta 10 ekv. DIEA se dodaje u gornji rastvor. Smeša se meša na sobnoj temperaturi 2 h, nakon čega sledi prečišćavanje sa C18 reverzno faznom HPLC. Struktura PEGilovanog peptida je potvrdjena pomoću MALDI masene. Prečišćeni peptid je takodje podvrgnut prečišćavanju preko katjonizmenjivačke hromatografije kako je prikazano dole.
Korak 6: - Jonoizmenjivačko prečišćavanje peptida:Za nekoliko izmenjivačkih nosača je ispitana sposobnost da razdvoje gore dobijen peptid-PEG konjugate iz neproreagovanih (ili hidrolizovanih) PEG, pored njihove sposobnosti da zadrže polazne dimerne peptide. Jonoizmenjivačke smole (2-3g) su stavljene u kolonu od 1 cm, nakon čega je vršena konverzija u natrijumov oblik (0,2 N NaOH napunjeno u kolonu dok eluent ne postigne pH 14, ca. 5 zapremina kolona) i zatim u hidrogenovani oblik (eluirana ili sa 0,1 N HC1 ili sa 0,1 M HOAc dok eluent ne postigne pH punjenja, ca. 5 zapremina kolone), nakon čega su isprane sa 25 % smeše ACN/voda do postizanja pH 6. Bilo peptid pre konjugacije ili peptid-PEG konjugat su rastvoreni u 25 % smeše ACN/voda (10 mg/mL) i pH je podešen do <3 sa TFA, zatim su smešteni u kolonu. Nakon ispiranja sa 2-3 zapremine kolone sa 25 % smeše ACN/voda i prikupljanja frakcija od 5 mL, peptidi su ispušteni iz kolone pomoću eluiranja sa 0,1 M NH4OACu 25 % smeše ACN/voda, ponovo prikupljane frakcije od 5 mL. Analize preko HPLC pokazuju koja frakcija sadrži željeni peptid. Analize sa Evaporacionim Light-Scattering Detektorom (ELSD) ukazuju na to da kada se peptidi zadrže na koloni kada se eluiraju sa NH4OACrastvorom (generalno izmedju frakcija 4 i 10), nema prisutnih nekonjugovanih PEG kao kontaminanata. Kada se peptidi eluiraju u inicijalnom puferu za ispiranje (generalno prve 2 frakcije), nema primećenog izdvajanja željenog PEG-konjugata i viška PEG.
Primer 10: Sinteza EPO-R agonist peptidnih homodimera peptidnih monomera koji imaju aminokiselinsku sekvencu (AcG)GLYACHMGPlTO-nal)VCQPLR(MeG)K (SEKID BR: 1)
EPO-R agonist peptidni homodimeri peptidnih monomera koji imaju aminokiselinsku sekvencu (AcG) GLYACHMGPIT(l-nal) VCQPLR(MeG) K (SEKID BR: 2) su sintetisani kako je opisano u Primeru 1, osim što su u Koraku 1 sintetisani peptidni monomeri:
Gde PEG je pripojen za spejser preko karbamatne veze, finalni proizvod iz ove sinteze može biti ilustrovan strukturno kao što sledi:
Gde je PEG pripojen za spejser preko amidne veze, finalni proizvod ove sinteze može biti ilustrovan strukturno kao što sledi:
Primer 11: Ispitivanjain vitroaktivnosti
Ovaj primer opisuje različitain vitro ispitivanjakoja su korisna u proceni aktivnosti i potentnosti EPO-R agonist peptida iz pronalaska. Rezultati iz ovih ispitivanja ukazuju na to da se novi peptidi iz ovog pronalaska vezuju za EPO-R i aktiviraju EPO-R signalizaciju. Pored toga, rezultati iz ovih ispitivanja ukazuju na to da nove peptidne kompozicije pokazuju iznenadjujuće povećanje u afinitetu EPO-R vezivanja i u biološkoj aktivnosti u poredjenju sa EPO mimičnim peptidima koji su bili ranije opisani.
EPO-R agonist peptidni monomeri i dimeri su dobijeni prema metodama koje su date u Primeru 1 ili Primeru 2. Potentnost ovih peptidnih dimera je procenjena korišćenjem serijein vitroispitivanja aktivnosti, uključujući: reporter analizu, analizu proliferacije, analizu kompetitivnog vezivanja i C/BFU-e analizu. Ove četiri analize su opisane u više detalja dole.
Rezultati ovih ispitivanjain vitroaktivnosti su prikazani u Tabeli 2.
1. Reporter analiza
Ova analiza se zasniva na reporter ćelijama dobijenim iz pre-B-ćelijskih linija iz miševa, Baf3/EpoR/GCSFR fos/tux. Ove reporter ćelijske linije eksprimiraju himerne receptore koje uključuju ekstra-celularni deo humanog EPO receptora za intra-celularni deo humanog GCSF receptora. Ove ćelijske linije su dalje transficirane sa fos genskom konstrukcijom koja sadrži promoterom-vodjeni reporter luciferaze. Aktivacija.ovog himernog receptora putem dodavanja eritropoietskog agensa dovodi do ekspresije luciferaznog reporter gena i na taj način produkcije svetlosti nakon dodavanja luciferaznog supstrata luciferina. Tako nivo EPO-R aktivacije u takvim ćelijama može biti kvantifikovan preko merenja aktivnosti luciferaze.
Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux ćelije su kultivisane u DMEM/F12 medijumu (Gibco) koji je obogaćen sa 10 % fetalnog govedjeg seruma (FBS; Hvclone), 10 % WEHI-3 supernatanta (supernatant iz kulture WEHI-3 ćelija, ATCC # TIB-68) i smešom penicilin/streptomicin. Približno 18 h pre analize, ćelije su izgladnjivane njihovim prebacivanjem u DMEM/F12 medijum koji je obogaćen sa 10 % FBS i 0,1 % WEHI-3 supernatanta. Na dan analize, ćelije su isprane jednom sa DMEM/F12 medijumom koji je obogaćen sa 10 % FBS (bez WEHI-3 supernatanta), zatim je 1X 10<s>ćelija/mL kultivisano u prisustvu poznate koncentracije testiranog peptida ili sa EPO (R & D Svstems Inc., Minneapolis, MN) kao pozitivnom kontrolom, u DMEM/F12 medijumu obogaćenom sa 10 % FBS (bez WEHI-3 supernatanta). Serijska razblaženja testiranog peptida su istovremeno testirana u ovoj analizi. Analitičke ploče su inkubirane u toku 4 h na 37 °C u atmosferi 5 % CO2, nakon čega je dodat luciferin (Steady-Glo; Promega, Madison, Wi) u svaki bunarčić. Nakon 5-o minutne inkubacije, meri se emisija svetla na Packard Topcount Luminometru (Packard Instrument Co., Downers Grove, HI.). Vrednosti za svetlost su nanete u odnosu na koncentracije testiranog peptida i analizirane korišćenjem Graph Pad softvera. Koncentracija testiranog peptida koja dovodi do polovine od maksimalne emisije svetla se beleži kao EC50.
2. Analiza proliferacije
Ova analiza se zasniva na pre-B-ćelijskoj liniji iz miševa, Baf3, transficiranoj tako da eksprimira humani EPO-R. Proliferacija dobijenih ćelijskih linija, BaF3/Gal4/Elk/EPOR, je zavisna od EPO-R aktivacije. Stepen proliferacije ćelija je kvantifikovan korišćenjem MTT, gde signal u MTT analizi je proporcionalan broju vijabilnih ćelija.
BaF3/Gal4/Elk/EPOR ćelije su kultivisane u obrtnim bocama u DMEM/F12 medijumu
(Gibco) koji je obogaćen sa 10 % FBS (Hvclone) i 2 % WEHI-3 supernatanta (ATCC # TIB-68). Kultivisane ćelije su izgladnjivane preko noći, u obrtnim bocama pri gustini ćelija od 1 x IO<6>ćelija/ml, u DMEM/F12 medijumu koji je obogaćen sa 10 % FBS i 0,1 % WEHI-3 supernatanta. Izgladnjivane ćelija su zatim isprane dva puta sa Dulbecco's PBS (Gibco) i resuspendovane sa gustinom od 1 x IO<6>ćelija/ml u DMEM/F12 koji je obogaćen sa 10 % FBS (bez WEHI-3 supernatanta). Alikvoti od 50 pL (-50,000 ćelija) ćelijske suspenzije su zatim ubačeni, u triplikatu, u analitičku ploču sa 96 bunarčića. Alikvoti od 50 pL serijskih razblaženja testiranih EPO mitničkih peptida ili 50 pL EPO (R & D Svstems Inc., Minneapolis, MN) ili Aranesp™ (darbpoeitin alfa, EPO-R agonist komercijalno dostupan od proizvodjača Amgen) u DMEM/F12 medijumu koji je obogaćen sa 10 % FBS (bez WEHI-3 supernatanta I) su dodati u analitičke ploče sa 96 bunarčića (finalna zapremina bunarčića od 100 pL). Na primer, 12 različitih razblaženja može biti testirano gde finalna koncentracija testiranog peptida (ili kontrolni EPO peptid) se kreće izmedju 810 pM do 0,0045 pM. Ćelije u pločama su zatim inkubirane u toku 48 h na 37 °C. Nakon toga, 10 pL MTT (Roche Diagnostics) je dodato u svaki bunarčić sa kulturom a zatim su ostavljene u inkubatoru u toku 4 h. Reakcija je zatim zaustavljena dodavanjem 10 % SDS + 0,01 N HC1. Ploče su zatim inkubirane preko noći na 37 °C. Apsorbanca na talasnoj dužini od 595 nM, za svaki bunarčić je zatim merena na spektrofotometru. Dijagrami vrednosti apsorbance prema koncentracijama testiranog peptida su konstruisani i EC50 vrednost je sračunata korišćenjem Graph Pad softvera. Koncentracija testiranog peptida koja dovodi do polovine od maksimalne apsorbance se beleži kao EC50.
3. Analiza kompetitivnog vezivanja
Izračunavanja kompetitivnog vezivanja su izvedena korišćenjem analize u kojoj se svetlosni signal generiše kao funkcija od blizine dve mikrosfere : mikrosfere donora streptavidina koja nosi biotinilovan trejser EPO-R-vezujući peptid i mikrosfere akceptora za koju se vezuje EPO-R. Svetlost se generiše pomoću transfera neradijacione energije, u toku koga se jedan kiseonik oslobadja iz prve mikrosfere pri osvetijavanju i dolazi u kontakt sa oslobodjenim jednim kiseonikom dovodeći do toga da druga mikrosfera emituje svetlost. Skupovi ovih mikrosfera su komercijalno dostupni (Packard). Blizina mikrosfera se stvara vezivanjem EPO-R-vezujućeg peptidnog trejsera za EPO-R. Testirani peptid koji je u kompeticiji sa EPO-R-vezujućim peptidnim trejserom u vezivanju za EPO-R će sprečiti to vezivanje, dovodeći do smanjenja emisije svetla.
Detaljniji prikaz metode je kao što sledi: 4 pL serijskih razblaženja testiranog EPO-R agonist peptida ili pozitivne ili negativne kontrola se dodaje u bunarčiće na ploči sa 384 bunarčića. Nakon toga, dodje se 2 pL /po bunarčiću smeše receptor/mikrosfere . Smeša receptora i mikrosfera se sastoji od: 15 pLod 5 mg/ml streptavidin donorskih mikrosfera (Packard), 15 pL od 5mg/ml monoklonalnih antitela abl79 (ova antitela prepoznaju deo proteina humane placentalne alkalne fosfataze koja se nalazi u rekombinantnim EPO-R), akceptorskih mikrosfera obloženih sa proteinom A (protein A se vezuje za abl79 antitela; Packar d), 112,5 pL rekombinantnog EPO-R u razblaženju 1 : 6,6 (koji je proizveden u ovarijalnim ćelijama Kineskog hrčka kao fuzioni protein u delu proteina humane placentalne alkalin fosfataze koji sadrži abl79 ciljane epitope) i 607,5 pL Alfakvest pufera (40 mM HEPES, pH 7,4; 1 mM MgCl2; 0,1 % BSA, 0,05 % Tween 20). Sve se spaja da bi se izmešalo. Doda se 2 pL/po bunarčiću biotinilovanog EPO-R-vezujućeg peptidnog trejsera, AF33068 (30 nM finalna koncentracija). AF33068, jedan EPO-R vezujući peptid (videti Tabelu 3 "Reporter EC50 (pM)"), je dobijen prema metodama koje su opisane u Primeru 1.
Centrifugira se 1 min da bi se izmešalo. Ploča se zapečati sa Packard Top Seal i zamota u foliju. Inkubira se preko noći na sobnoj temperaturi. Nakon 18 sati čita se emisija svetla korišćenjem AlphaQuest čitača (Packard). Podaci o emisiji svetla se nanose u dijagram u odnosu na koncentraciju peptida i analizira se sa programima Graph Pad ili Excel.
Koncentracija testiranog peptida koja dovodi do 50 % smanjenja emisije svetla, u odnosu na onu koja se dobija bez testiranog peptida, se beleži kao IC50.
4. C/ BFU- e analiza
EPO-R signalizacija stimuliše diferencijaciju ćebjske loze iz koštane srži u proliferativne prekursore crvenih krvnih zrnaca. Ova analiza meri sposobnost testiranih peptida da stimulišu proliferaciju i diferencijaciju prekursora crvenih krvnih zrnaca iz primarnih humanih višepotentnih ćelijskih linija koštane srži.
Za ovu analizu, serijska razblaženja testiranog peptida su pripremljena u IMDM medijumu (Gibco) koji je obogaćen sa 10 % FBS (Hvclone). Ova serijska razblaženja ili pozitivna kontrola EPO peptida, su zatim dodata u metilcelulozu do dobijanja finalne zapremine od 1,5 mL. Smeša metilceluloze i peptida je zatim snažno vorteksovana. Alikvoti (100,000 ćelija/mL) humanih CD34+ ćelija, dobijenih iz koštane srži (Poietics/Cambrex) su otopljeni. Otopljene ćelije su polako dodate u 0,1 mL 1 mg/ml DNAze (ćelijska linija) u epruvetama od 50 mL. Zatim se, 40-50 mL IMDM medijuma polako doda u ćelije: medijum se dodaje kap po kap duž bočnih zidova epruveta od 50 mL za prvih 10 mL i zatim se preostala zapremina medijuma polako sliva duž bočnih zidova epruvete. Ćelije se zatim centrifugiraju na 900 rpm u toku 20 min i medijum se pažljivo uklanja pomoću blagog aspiriranja. Ćelije se resuspenduju u 1 ml IMDM medijuma i odredjuje se gustina ćelija po mL na hemacitometarskom slajdu (alikvot od 10 pL ćelijske suspenzije na slajdu a gustina ćelija je prosečan broj X 10,000 ćelija/ml). Ćelije su zatim razblažene u IMDM medijumu do gustine ćelija od 15,000 ćelija/mL. 100 pL razblaženih ćelija se zatim dodaje u svakih 1,5 mL metil celuloze i peptidnog uzorka (finalna koncentracija ćelija u analitičkom medijumu je 1000 ćelija/mL) i smeša se vorteksuje. Ostavi se da mehurići u smeši nestanu i zatim se aspirira 1 mL korišćenjem igle sa tupim vrhom. Dodaje se 0,25 mL aspirirane smeše iz svakog uzorka u svaki od 4 bunarčića na ploči sa 24 bunarčića (Falcon brand). Smeše u ploči se inkubiraju na 37 °C pod atmosferom 5 % CO2u vlažnom inkubatoru u toku 14 dana. Ocenjuje se prisustvo eritroidnih kolonija korišćenjem faznog mikroskopa (5X-10X objektiv, finalnog uvećanja od 100X). Koncentracija testiranog peptida pri kojoj je broj formiranih kolonija 90 % od maksimalnog, u odnosu na broj dobijen sa EPO pozitivnom kontrolom, se beleži kao EC90 [Videti Tabela 2: C/BFU-e EC90].
Primer 12: Ispitivanjain vivoaktivnosti
Ovaj primer opisuje različitain vivo ispitivanjakoji su korisna za procenu aktivnosti i potentnosti EPO-R agonist peptida iz pronalaska. EPO-R agonist peptidni dimeri su dobijeni prema metodama koje su date u Primeru 1.In vivo aktivnostovih peptidnih monomera i dimera je procenjena korišćenjem serije ispitivanja, uključujući bioanalize na policitemičnim ekshipoksičnim miševima i analize retikulocita. Ove dve analize su opisane u više detalja dole.
1. Bioanaliza na policitemičnim ekshipoksičnim miševima
Bioanalizom je ispitivanain vivoaktivnost testiranih peptida u policitemičnim ekshipoksičnim miševima koja je usvojena iz metode koju je opisao Cotes i Bangham (1961), Nature 191:1065 -1067. Ova analiza ispituje sposobnost testiranog peptida da funkcioniše kao EPO mimik: odnosno, da aktivira EPO-R i indukuje sintezu novih crvenih krvnih zrnaca. Sinteza crvenih krvnih zrnaca je kvantifikovana na osnovu inkorporisanja radioaktivno obeleženog gvoždja u hemoglobin sintetisanih crvenih krvnih ćelija.
BDF1 miševi su ostavljeni da se aklimatizuju na ambijentalne uslove u toku 7-10 dana. Telesne težine su odredjene za sve životinje i životinje sa malom težinom (<15 grama) nisu korišćene. Miševi su podvrgnuti uzastopnim kondicioniranim ciklusima u hipobarnoj komori u toku ukupno 14 dana. Svaki 24 satni ciklus se sastoji od 18 h na 0,40±0,02 % atmosferskog pritiska i 6 h na ambijentalnom pritisku. Nakon kondicioniranja miševi su održavani na ambijentalnom pritisku u toku dodatnih 72 h pre doziranja.
Testirani peptidi ili rekombinantni humani EPO standardi, su razblaženi u PBS + 0,1 % BSA nosiocu (PBS/BSA). Stok rastvori peptidnih monomera su prvo rastvoreni u dimetil sulfoksidu (DMSO). Negativne kontrolne grupe uključuju jednu grupu miševa kojima je ubrizgan PBS/BSA sam i jednu grupu kojoj je ubrizgan 1 % DMSO. Grupa za svaku dozu sadrži 10 miševa. Miševima je subkutano ubrizgano (u potiljak vrata) 0,5 mL odgovarajućeg uzorka.
Četrdeset osam sati nakom ubrizgavanja uzorka, miševima je data intrapeirtonealna injekcija sa 0,2 ml Fe<59>(Dupont, NEN), za dozu od približno 0,75 pKirija/po mišu. Telesne težine miševa su odredjivane 24 h nakon Fe<59>primene i miševi su žrtvovani 48 h nakon Fe<59>primene. Krv je sakupljena iz svake životinje pomoću kardijame punkture i odredjivani su hematokriti (heparin je korišćen kao antikoagulant). Svaki uzorak krvi (0,2 ml) je analiziran za Fe<59>inkorporaciju korišćenjem Packard gama brojača. Neosetljivi miševi (odnosno, oni miševi kod kojih je radioaktivna inkorporacija manja od negativne kontrolne grupe) su eliminisani iz odgovarajućeg seta podataka. Miševi kod kojih su vrednosti hematokrita manje od 53 % od negativne kontrolne grupe su takodje eliminisani.
Rezultati su dobijeni iz setova od 10 životinja za svaku eksperimentalnu dozu. Prosečna količina radioaktivnosti koja je inkorporisana [iznos po minuti (CPM)j u uzorcima krvi iz svake grupe je obračunata.
2. Analiza retikulocita
Normalni BDF1 miševi su dozirani (0,5 mL, ubrizgano subkutano) u tri uzastopna dana bilo sa EPO kontrolom ili testiranim peptidom. Trećeg dana, miševi su takodje dozirani (0,1 mL, ubrizgano intraperitonealno) sa gvoždje dekstranom (100 mg/ml). Petog dana, miševi su anestezirani sa CO2i uzorci krvi su uzeti pomoću kardijalne punkture. Procenat (%) retikulocita za svaki uzorak krvi je odredjen pomoću tiazol narandžastog bojenja i analize protočne citometrije (retik-count program). Hematokriti su manuelno odredjeni. Korigovani procenat retikulocita je odredjen korišćenjem sledeće formule:
% RETI<K>korigovani = % RETIKDObijenoX (HematokritINDrviDUALNi / HematokritNORMALAN)
3. Hematološka analiza
Normalni CD1 miševi su dozirani sa četiri nedeljne bolusne intravenozne injekcije bilo sa EPO pozitivnom kontrolom, testiranim peptidom ili nosiocem. Opseg doza pozitivne kontrole i testiranih peptida, koje su izražene kao mg/kg, je testiran uz pomoć variranja koncentracije aktivnog jedinjenja u formulaciji. Ubrizgane zapremine su 5 ml/kg. kontrolna grupa sa nosiocem je obuhvatala dvanaest životinja, dok je po 8 životinja bilo u svakoj od preostalih doziranih grupa. Dnevna vijabilnost i nedeljne telesne težine su beležene.
Dozirani miševi su izgladnjivani i zatim anestezionirani inhaliranjem izoflurana i terminalni uzorci krvi su sakupljeni putem punkture kardijalne ili abdominalne aorte 1. dana (za kontrolne miševe sa nosiocem) i dana 15 i 29 (4 miša/grupa/dnevno). Krv je prebačena u Vacutainer® brand epruvete. Poželjan antikoagulant je etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA).
U uzorcima krvi je procenjivana krajnja tačka u kojoj je izmerena sinteza crvenih krvnih zrnaca i fiziologija kao što je hematokrit (Hct), hemoglobin (Hgb) i ukupan broj eritrocita (RBC) korišćenjem automatizovanih kliničkih analizatora poznatih u oblasti (na pr., onih od proizvodjača Coulter, Inc.).
Ovaj pronalazak nije ograničen u obimu sa specifičnim rešenjima koja su ovde opisana. U stvari, različite modifikacije iz pronalaska pored onih koje su ovde opisane će postati očigledne onome ko ima iskustva u oblasti iz prethodnog opisa i priloženih slika. Takve modifikacije su predvidjene da ulaze u okvire polja pridodatih zahteva.
Pofrebno je dalje razumeti da su sve vrednosti približne i da su obezbedjene za opis.
Brojne reference, uključujući patente, patentne prijave i različite publikacije su citirane i diskutovane u opisu ovog pronalaska. Citati i/ili opisi ovih referenci su dati samo da bi se razjasnili opisi iz ovog pronalaska i nije priznavanje takvih referenci kao "prethodna iskustva u oblasti" za ovaj pronalazak. Sve reference koje su citirane i diskutovane u ovoj specifikaciji su inkorporisane ovde referencama u svojoj celosti i sa istim obimom ako je svaka referenca data pojedinačno inkorporisana referencama.

Claims (15)

1. Jedinjenje koje se vezuje za i aktivira eritropoietin receptor (EPO-R), gde jedinjenje uključuje peptidni dimer koji ima formulu: gde (i) u svakom peptidnom monomeru iz peptidnog dimera, svaka aminokiselina je označena sa standardnom jednoslovnom skraćenicom, AcG je N- acetilglicin, 1-nal je 1-naftilalanin; (ii) svaki peptidni monomer iz peptidnog dimera sadrži intramolekulsku disulfidnu vezu izmedju dva cistein (C) ostatka svakog monomera (iii) ["PEG"] uključuje najmanje jedan linearni polietilen glikolni (PEG) deo, svaki PEG deo ima molekulsku težinu od oko 20,000 do oko 40,000 Daltona.
2. Jedinjenje koje se vezuje za i aktivira eritropoietin receptor (EPO-R), gde jedinjenje uključuje peptidni dimer koji ima formulu: gde (i) u svakom peptidnom monomeru iz peptidnog dimera, svaka aminokiselina je označena sa standardnom jednoslovnom skraćenicom, AcG je N- acetilglicin, 1-nal je 1-naf<u>lalanin, a MeG je N-metilglicin; (ii) svaki peptidni monomer iz peptidnog dimera sadrži intramolekulsku disulfidnu vezu izmedju dva cistein (C) ostatka svakog monomera (iii) PEG uključuje linearni nerazgranati molekul polietilen glikola koji ima molekulsku težinu od oko 20,000 do oko 40,000 Daltona.
3. Jedinjenje koje se vezuje za i aktivira eritropoietin receptor (EPO-R), gde jedinjenje uključuje peptidni dimer koji ima formulu: gde (i) u svakom peptidnom monomeru iz peptidnog dimera, svaka aminokiselina je označena sa standardnom jednoslovnom skraćenicom, AcG je N- acetilglicin, a 1-nal je 1-naftilalanin; (ii) svaki peptidni monomer iz peptidnog dimera sadrži intramolekulsku disulfidnu vezu izmedju dva cistein (C) ostatka svakog monomera (iii) PEG uključuje linearni nerazgranati molekul polietilen glikola koji ima molekulsku težinu od oko 20,000 do oko 40,000 Daltona.
4. Jedinjenje koje se vezuje za i aktivira eritropoietin receptor (EPO-R), gde jedinjenje uključuje peptidni dimer koji ima formulu: gde (i) u svakom peptidnom monomeru iz peptidnog dimera, svaka aminokiselina je označena sa standardnom jednoslovnom skraćenicom, AcG je N- acetilglicin, 1-nal je 1-naftilalanin, a MeG je N-metilglicin; (ii) svaki peptidni monomer iz peptidnog dimera sadrži intramolekulsku disulfidnu vezu izmedju dva cistein (C) ostatka svakog monomera (iii) PEG uključuje linearni nerazgranati molekul polietilen glikola koji ima molekulsku težinu od oko 20,000 do oko 40,000 Daltona.
5. Jedinjenje koje se vezuje za i aktivira eritropoietin receptor (EPO-R), gde jedinjenje uključuje peptidni dimer koji ima formulu: gde (i) u svakom peptidnom monomeru iz peptidnog dimera, svaka aminokiselina je označena sa standardnom jednoslovnom skraćenicom, AcG je N- acetilglicin, a 1-nal je 1-naftilalanin; (ii) svaki peptidni monomer iz peptidnog dimera sadrži intramolekulsku disulfidnu vezu izmedju dva cistein (C) ostatka svakog monomera (iii) ["PEG"] uključuje najmanje dva linearna polietilen glikolna (PEG) dela povezana najednom mestu vezivanja i imaju kombinovanu molekulsku težinu od oko 10,000 do oko 60,000 Daltona.
6. Jedinjenje koje se vezuje za i aktivira eritropoietin receptor (EPO-R), gde jedinjenje uključuje peptidni dimer koji ima formulu: gde (i) u svakom peptidnom monomeru iz peptidnog dimera, svaka aminokiselina je označena sa standardnom jednoslovnom skraćenicom, AcG je N- acetilglicin, 1-nal je 1-naftilalanin, a MeG je N-metilglicin; (ii) svaki peptidni monomer iz peptidnog dimera sadrži intramolekulsku disulfidnu vezu izmedju dva cistein (C) ostatka svakog monomera (iii) PEG uključuje dva linearna polietilen glikolna (PEG) dela koja imaju kombinovanu molekulsku težinu od oko 10,000 do oko 30,000 Daltona.
7. Jedinjenje koje se vezuje za i aktivira eritropoietin receptor (EPO-R), gde jedinjenje uključuje peptidni dimer koji ima formulu: gde (i) u svakom peptidnom monomeru iz peptidnog dimera, svaka aminokiselina je označena sa standardnom jednoslovnom skraćenicom, AcG je N- acetilglicin, a 1-nal je 1-naftilalanin; (ii) svaki peptidni monomer iz peptidnog dimera sadrži intramolekulsku disulfidnu vezu izmedju dva cistein (C) ostatka svakog monomera (iii) PEG uključuje dva linearna polietilen glikolna (PEG) dela koja imaju kombinovanu molekulsku težinu od oko 10,000 do oko 30,000 Daltona.
8. Jedinjenje koje se vezuje za i aktivira eriu-opoietin receptor (EPO-R), gde jedinjenje uključuje peptidni dimer koji ima formulu: gde (i) u svakom peptidnom monomeru iz peptidnog dimera, svaka aminokiselina je označena sa standardnom jednoslovnom skraćenicom, AcG je N- acetilglicin, a 1-nal je 1-naftilalanin; (ii) svaki peptidni monomer iz peptidnog dimera sadrži intramolekulsku disulfidnu vezu izmedju dva cistein (C) ostatka svakog monomera (iii) PEG uključuje linearni nerazgranati polietilen glikolni (PEG) deo koji ima molekulsku težinu od oko 20,000 do oko 40,000 Daltona.
9. Jedinjenje koje se vezuje za i aktivira eritropoietin receptor (EPO-R), gde jedinjenje uključuje peptidni dimer koji ima formulu: gde (i) u svakom peptidnom monomeru iz peptidnog dimera, svaka aminokiselina je označena sa standardnom jednoslovnom skraćenicom, AcG je N- acetilglicin, a 1-nal je 1-naftilalanin; (ii) svaki peptidni monomer iz peptidnog dimera sadrži intramolekulsku disulfidnu vezu izmedju dva cistein (C) ostatka svakog monomera (iii) PEG uključuje dva linearna polietilen glikolna (PEG) dela koja imaju kombinovanu molekulsku težinu od oko 10,000 do oko 60.000 Daltona.
10. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-4, gde svaki PEG ima molekulsku težinu od oko 30,000 Daltona. U.
Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 5-7, gde svaki PEG ima molekulsku težinu od oko 20,000 Daltona.
12. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 4 i 8, gde svaki PEG ima molekulsku težinu od oko 30,000 do oko 40,000 kD.
13. Primena jedinjenja prema bilo kom od predhodnih zahteva za dobijanje medikamenta za lečenje poremećaja okarakterisana neđostatakom eritropoietina ili niskom ili<d>efektnom polulacijom crvenih krvnih zrnaca.
14. Primena prema zahtevu 13 gde je poremećaj odabran iz grupe koja se sastoji od završne faze otkazivanja bubrega ili dijalize; anemije povezana sa AIDS-om, auto imuno obolenje ili malign itet; beta-talasemija; cistična fibroza; preuranjena anemija; anemija povezana sa hroničnim zapaljenskim obolenjem; povreda kičme; akutni gubitak krvi; i stanje neoplastičnog obolenja praćen abnormalnom eritropoeziom.
15. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-12 i farmaceutski prihvatljivi nosač.
YUP-2005/0838A 2003-05-12 2004-05-12 Novi peptidi koji se vezuju za eritropoietinski receptor RS51130B (sr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MEP-2008-533A ME00356B (me) 2003-05-12 2004-05-12 Novi peptidi koji se vezuju za receptor eritropoietina

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46999303P 2003-05-12 2003-05-12
US47024403P 2003-05-12 2003-05-12
PCT/US2004/014889 WO2004101606A2 (en) 2003-05-12 2004-05-12 Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS20050838A RS20050838A (sr) 2007-12-31
RS51130B true RS51130B (sr) 2010-10-31

Family

ID=33457168

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-2005/0838A RS51130B (sr) 2003-05-12 2004-05-12 Novi peptidi koji se vezuju za eritropoietinski receptor

Country Status (32)

Country Link
US (4) US7084245B2 (sr)
EP (1) EP1629007B1 (sr)
JP (2) JP4266028B2 (sr)
KR (1) KR101163683B1 (sr)
CN (1) CN100441595C (sr)
AP (1) AP2042A (sr)
AT (1) ATE428727T1 (sr)
AU (1) AU2004238870B8 (sr)
BR (1) BRPI0411155A (sr)
CA (1) CA2525568C (sr)
CR (1) CR8131A (sr)
CY (1) CY1109028T1 (sr)
DE (1) DE602004020610D1 (sr)
DK (1) DK1629007T3 (sr)
EA (1) EA010095B1 (sr)
ES (1) ES2323465T3 (sr)
HR (1) HRP20090251T1 (sr)
IL (1) IL171782A (sr)
IS (1) IS2683B (sr)
ME (1) ME00356B (sr)
MX (1) MXPA05012316A (sr)
NO (1) NO338435B1 (sr)
NZ (1) NZ543905A (sr)
OA (1) OA13164A (sr)
PL (1) PL1629007T3 (sr)
PT (1) PT1629007E (sr)
RS (1) RS51130B (sr)
SG (1) SG160224A1 (sr)
SI (1) SI1629007T1 (sr)
UA (1) UA88146C2 (sr)
WO (1) WO2004101606A2 (sr)
ZA (1) ZA200510010B (sr)

Families Citing this family (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7259146B2 (en) 2000-05-26 2007-08-21 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Neuroprotective peptides
NZ543905A (en) * 2003-05-12 2008-07-31 Affymax Inc Peptides that bind to the erythropoietin receptor
ATE478093T1 (de) * 2003-05-12 2010-09-15 Affymax Inc Neue poly(ethylenglycol) modifizierte erythropoietinagonisten und deren verwendungen
NZ543935A (en) * 2003-05-12 2008-06-30 Affymax Inc Peptides that bind to the erythropoietin receptor
NZ543934A (en) * 2003-05-12 2008-06-30 Affymax Inc Novel spacer moiety for poly (ethylene glycol)-modified peptide-based compounds
PL1718608T3 (pl) 2004-02-20 2013-11-29 Boehringer Ingelheim Int Inhibitory polimerazy wirusowej
DE102004031258A1 (de) * 2004-06-29 2006-02-09 Jennissen, Herbert P., Prof. Dr. Proteinhybride mit polyhydroxyaromatischen Aminosäure-Epitopen
US7589063B2 (en) 2004-12-14 2009-09-15 Aplagen Gmbh Molecules which promote hematopoiesis
WO2006060148A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-08 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
US7919461B2 (en) * 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7550433B2 (en) 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
GB0523954D0 (en) * 2005-11-24 2006-01-04 Ucb Celltech Bioassays
US20080090760A2 (en) * 2005-12-09 2008-04-17 Todd Hembrough Compositions and Methods for Inhibiting Cellular Proliferation
WO2008000517A2 (en) 2006-06-30 2008-01-03 Andre Koltermann Conjugates for innate immunotherapy of cancer
WO2008057537A2 (en) 2006-11-08 2008-05-15 Maine Medical Center Research System and method for identifying erythropoietin-responsive genes
JP2010510794A (ja) 2006-11-28 2010-04-08 ハナル ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 修飾型エリスロポエチンポリペプチド及びこの治療用用途
JP2010520855A (ja) * 2007-01-31 2010-06-17 アフィーマックス・インコーポレイテッド 修飾基をポリペプチドおよびその他の高分子に結合するための窒素ベースのリンカー
MX2009008104A (es) 2007-02-02 2009-08-07 Amgen Inc Hepcidina, antagonistas de hepcidina y metodos de uso.
US20090131317A1 (en) * 2007-06-22 2009-05-21 Affymax, Inc. Compounds and peptides that bind the trail receptor
EP2018835B1 (de) 2007-07-09 2014-03-05 Augustinus Bader Wirkstoff abgebendes Pflaster
WO2009025958A1 (en) * 2007-08-22 2009-02-26 Affymax, Inc. Erythropoietin rceptor peptide formulations and uses
ES2750254T3 (es) 2007-09-27 2020-03-25 Amgen Inc Formulaciones farmacéuticas
EP3381445B1 (en) 2007-11-15 2023-10-25 Amgen Inc. Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration
CN101456911A (zh) * 2007-12-12 2009-06-17 江苏豪森药业股份有限公司 促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐和其制备方法与用途
WO2009088572A2 (en) * 2008-01-07 2009-07-16 Centocor, Inc. Method of treating erythropoietin hyporesponsive anemias
NZ621196A (en) 2008-01-22 2015-08-28 Araim Pharmaceuticals Inc Tissue protective peptides and peptide analogs for preventing and treating diseases and disorders associated with tissue damage
US9175078B2 (en) 2008-01-25 2015-11-03 Amgen Inc. Ferroportin antibodies and methods of use
JP2009191056A (ja) * 2008-02-15 2009-08-27 Affymax Inc 合成ペプチドをベースとするｅｐｏレセプターアゴニストを用いた抗エリスロポエチン抗体に媒介された障害の治療
EP2620448A1 (en) 2008-05-01 2013-07-31 Amgen Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
CA3019967A1 (en) 2008-11-13 2010-05-20 The General Hospital Corporation Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation of bmp-6
WO2011012306A2 (en) 2009-07-30 2011-02-03 Aplagen Gmbh Use of emps for antagonising epo-stimulatory effects on epo-responsive tumors while maintaining erythropoiesis
US9662271B2 (en) 2009-10-23 2017-05-30 Amgen Inc. Vial adapter and system
CA2800919C (en) 2010-06-07 2019-01-15 Amgen Inc. Drug delivery device
EP2590666B1 (en) 2010-07-06 2017-04-26 Augustinus Bader Topical application of erythropoietin for use in the treatment of injuries of the cornea
EP2471945A1 (de) * 2010-12-30 2012-07-04 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Verfahren zur Bestimmung von Inhibitoren der Gerinnung
CA2831100C (en) 2011-03-31 2020-02-18 Mark Dominis Holt Vial adapter and system
CA2833748C (en) 2011-04-20 2019-07-16 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
EP2709648A4 (en) 2011-05-19 2015-04-08 Geysen Hendrik M COMPOUNDS FOR BINDING TO THE ERYTHROPOIETIN RECEPTOR
LT3045189T (lt) 2011-10-14 2018-06-25 Amgen Inc. Inžektorius ir surinkimo būdas
US12115341B2 (en) 2012-11-21 2024-10-15 Amgen Inc. Drug delivery device
JP6463331B2 (ja) 2013-03-15 2019-01-30 イントリンシック ライフサイエンシズ リミテッド ライアビリティ カンパニー 抗ヘプシジン抗体およびその使用
EP2968760B1 (en) 2013-03-15 2024-01-03 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
AU2014228177B2 (en) 2013-03-15 2018-04-26 Amgen Inc. Body contour adaptable autoinjector device
CA2904661C (en) 2013-03-15 2022-03-15 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
IL292270B2 (en) 2013-03-22 2024-04-01 Amgen Inc Injector and method of assembly
CN104231067B (zh) * 2013-06-07 2017-08-11 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 促红细胞生成素模拟肽化学二聚体及其用途
MX2016005315A (es) 2013-10-24 2016-08-11 Amgen Inc Sistema de administracion de farmacos con control sensible a la temperatura.
SG11201602876WA (en) 2013-10-24 2016-05-30 Amgen Inc Injector and method of assembly
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
KR102496507B1 (ko) 2014-05-07 2023-02-03 암겐 인코포레이티드 충격 감소 요소들을 가진 자동 주사기
KR20220143782A (ko) 2014-06-03 2022-10-25 암겐 인코포레이티드 약물 전달 디바이스의 사용자를 보조하기 위한 디바이스들 및 방법들
AU2015321462B2 (en) 2014-09-22 2020-04-30 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
MX2021014323A (es) 2014-10-14 2023-02-02 Amgen Inc Dispositivo de inyección de fármaco con indicadores visuales y audibles.
EP3848072A1 (en) 2014-12-19 2021-07-14 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
US11357916B2 (en) 2014-12-19 2022-06-14 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
CA3069716C (en) 2015-02-17 2021-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
US11806509B2 (en) 2015-02-27 2023-11-07 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a turnable threshold of resistance to needle guard movement
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
CN106554394B (zh) * 2015-09-30 2019-08-16 天津药物研究院有限公司 一种促红细胞生成素模拟肽及其制备方法和应用
US10138273B2 (en) * 2015-10-07 2018-11-27 The Curators Of The University Of Missouri Peptide ligands for hepatic stellate cells
EP3386573B1 (en) 2015-12-09 2019-10-02 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
DK3429663T3 (da) 2016-03-15 2020-09-28 Amgen Inc Reduktion af sandsynligheden for glasbrud i anordninger til indgivelse af lægemidler
US11541168B2 (en) 2016-04-29 2023-01-03 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
GB2550114A (en) * 2016-05-03 2017-11-15 Kymab Ltd Methods, regimens, combinations & antagonists
WO2017197222A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
GB201609083D0 (en) 2016-05-24 2016-07-06 Syntab Therapeutics Gmbh Synthetic compound
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
EP3532127A1 (en) 2016-10-25 2019-09-04 Amgen Inc. On-body injector
JP2020503976A (ja) 2017-01-17 2020-02-06 アムジエン・インコーポレーテツド 注入デバイスならびに関連する使用および組立方法
CA3048520A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
EP3582829A1 (en) 2017-02-17 2019-12-25 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
JP2020508803A (ja) 2017-03-06 2020-03-26 アムジエン・インコーポレーテツド 作動防止特徴部を備える薬物送達デバイス
US11571511B2 (en) 2017-03-07 2023-02-07 Amgen Inc. Insertion mechanism and method of inserting a needle of a drug delivery device
KR102893480B1 (ko) 2017-03-09 2025-11-28 암겐 인코포레이티드 약물 전달 장치용 삽입 메커니즘
CN110446499A (zh) 2017-03-20 2019-11-12 豪夫迈·罗氏有限公司 一种体外糖基工程化红细胞生成刺激蛋白的方法
HUE063805T2 (hu) 2017-03-28 2024-01-28 Amgen Inc Dugattyúrúd és fecskendõ összeállító rendszer és eljárás
AU2018282077B2 (en) 2017-06-08 2023-11-23 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
CA3061982A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
MA49447A (fr) 2017-06-22 2020-04-29 Amgen Inc Réduction des impacts/chocs d'activation d'un dispositif
WO2018237225A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
MA49562A (fr) 2017-07-14 2020-05-20 Amgen Inc Système d'insertion-rétractation d'aiguille présentant un système à ressort en double torsion
MA49626A (fr) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage
JP2020528296A (ja) 2017-07-25 2020-09-24 アムジエン・インコーポレーテツド ギヤモジュールを有する薬物送達デバイス及び関連する組立方法
WO2019022950A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE WITH CONTAINER ACCESS SYSTEM AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
US11077246B2 (en) 2017-08-18 2021-08-03 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
ES2939292T3 (es) 2017-10-04 2023-04-20 Amgen Inc Adaptador de flujo para dispositivo de administración de fármacos
EP3691716B1 (en) 2017-10-06 2023-11-29 Amgen Inc. Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly
US11464903B2 (en) 2017-10-09 2022-10-11 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
WO2019090079A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
JP2021501616A (ja) 2017-11-06 2021-01-21 アムジエン・インコーポレーテツド 配置及び流量検出を備える薬物送達デバイス
US12053618B2 (en) 2017-11-06 2024-08-06 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
MA50557A (fr) 2017-11-10 2020-09-16 Amgen Inc Pistons pour dispositifs d'administration de médicament
IL273638B2 (en) 2017-11-16 2024-10-01 Amgen Inc Door latch mechanism for drug delivery device
WO2019099322A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
MA53379A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
CA3103682A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
MA53320A (fr) 2018-07-31 2021-11-03 Amgen Inc Ensemble de trajet de fluide pour dispositif d'administration de médicament
AU2019347710B2 (en) 2018-09-24 2025-05-08 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
IL281469B2 (en) 2018-09-28 2024-08-01 Amgen Inc Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
US12156991B2 (en) 2018-10-02 2024-12-03 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
WO2020072846A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
US12053617B2 (en) 2018-10-15 2024-08-06 Amgen Inc. Drug delivery device having damping mechanism
WO2020081480A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
US12485219B2 (en) 2018-11-01 2025-12-02 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
US11213620B2 (en) 2018-11-01 2022-01-04 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
ES3032751T3 (en) 2019-04-24 2025-07-24 Amgen Inc Syringe sterilization verification assemblies and methods
MX2022002149A (es) 2019-08-23 2022-03-17 Amgen Inc Dispositivo de suministro de farmacos con componentes de acoplamiento de capuchon de aguja configurable y metodos relacionados.
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction
KR20240011135A (ko) 2021-05-21 2024-01-25 암젠 인크 약물 용기를 위한 충전 레시피를 최적화하는 방법
WO2023209074A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods of restoring erythropoiesis in patients suffering from a sf3b1 mutant myelodysplastic syndrome by correcting coasy mis-splicing
AU2023374183A1 (en) 2022-11-02 2025-03-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing glycoprotein compositions

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4677195A (en) 1985-01-11 1987-06-30 Genetics Institute, Inc. Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions
WO1990008822A1 (en) 1989-02-03 1990-08-09 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin receptor
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
DK0400472T3 (da) 1989-05-27 1996-05-13 Sumitomo Pharma Fremgangsmåde til fremstilling af polyethylenglycolderivater og modificeret protein
US5292654A (en) 1990-12-13 1994-03-08 Whitehead Institute For Biomedical Research Mutant EPO receptor and uses therefor
CA2106079C (en) 1991-03-15 2000-04-25 Robert C. Thompson Pegylation of polypeptides
WO1992016555A1 (en) 1991-03-18 1992-10-01 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
US5614184A (en) 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
US6153407A (en) 1992-07-28 2000-11-28 Beth Israel Deaconess Medical Center Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5830851A (en) 1993-11-19 1998-11-03 Affymax Technologies N.V. Methods of administering peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5773569A (en) 1993-11-19 1998-06-30 Affymax Technologies N.V. Compounds and peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5919758A (en) 1994-03-22 1999-07-06 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with altered biological activity
US5580853A (en) 1994-03-22 1996-12-03 New England Deaconess Hospital Modified polypeptides with increased biological activity
US5747446A (en) 1994-03-22 1998-05-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with increased biological activity
KR100459984B1 (ko) 1995-06-07 2005-06-20 아피맥스 테크놀로지스, 엔.브이. 에리트로포이에틴수용체(epo-r)에결합하는화합물및펩티드
US5767078A (en) 1995-06-07 1998-06-16 Johnson; Dana L. Agonist peptide dimers
US5869451A (en) 1995-06-07 1999-02-09 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
US5677280A (en) 1995-06-07 1997-10-14 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
US5683983A (en) 1995-06-07 1997-11-04 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
US5654276A (en) 1995-06-07 1997-08-05 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
PT885242E (pt) 1995-06-07 2008-06-18 Glaxo Group Ltd Péptidos e compostos que se ligam a um receptor de trombopoietina
WO1996040189A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
US5668110A (en) 1995-06-07 1997-09-16 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
US6251864B1 (en) 1995-06-07 2001-06-26 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
US6346390B1 (en) 1996-03-08 2002-02-12 Receptron, Inc. Receptor derived peptides involved in modulation of response to ligand binding
US6103879A (en) 1996-06-21 2000-08-15 Axys Pharmaceuticals, Inc. Bivalent molecules that form an activating complex with an erythropoietin receptor
CN100471521C (zh) 1996-08-02 2009-03-25 奥索·麦克尼尔药品公司 含有与n-末端共价结合的单个水溶性聚合物的多肽类
US5932546A (en) 1996-10-04 1999-08-03 Glaxo Wellcome Inc. Peptides and compounds that bind to the thrombopoietin receptor
US6221608B1 (en) 1997-01-22 2001-04-24 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods for identifying erythropoietin receptor binding protein
EP1008355A1 (en) 1998-12-08 2000-06-14 Debio Recherche Pharmaceutique S.A. Method for identifying or analyzing polymer linkage sites on macromolecules using amino acid report binding
ES2170042T3 (es) 1998-08-28 2004-10-01 Gryphon Therapeutics, Inc. Procedimiento para la preparacion de cadenas de poliamida de longitud precisa y sus conjugados con proteinas.
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
ATE348163T1 (de) 1998-10-23 2007-01-15 Amgen Inc Thrombopoietin substitute
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
PE20010288A1 (es) 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
AUPQ873300A0 (en) 2000-07-12 2000-08-03 Medvet Science Pty. Ltd. A binding motif of a receptor (2)
DE60032783T2 (de) 1999-09-24 2007-12-06 Smithkline Beecham Corp. Thrombopoietinmimetika
AU7445900A (en) 1999-09-27 2001-04-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Novel hemopoietin receptor protein, nr12
US6703480B1 (en) * 1999-11-24 2004-03-09 Palani Balu Peptide dimers as agonists of the erythropoientin (EPO) receptor, and associated methods of synthesis and use
US6858630B2 (en) 1999-12-06 2005-02-22 Smithkline Beecham Corporation Naphthimidazole derivatives and their use as thrombopoietin mimetics
EP1334118A4 (en) 2000-03-21 2005-10-05 Wisconsin Alumni Res Found METHODS AND REAGENTS FOR REGULATING CELLULAR RESPONSES IN BIOLOGICAL SYSTEMS
US6777387B2 (en) 2000-03-31 2004-08-17 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Terminally-branched polymeric linkers containing extension moieties and polymeric conjugates containing the same
PT1311285E (pt) 2000-05-15 2005-06-30 Hoffmann La Roche Composicao farmaceutica liquida contendo um derivado de eritropoietina
AU7490401A (en) * 2000-05-26 2001-12-11 Ortho Mcneil Pharm Inc Neuroprotective peptides
JP2004505114A (ja) 2000-08-02 2004-02-19 オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド エリスロポエチンの投与による改良された抗ウイルスおよび抗腫瘍化学療法
CZ2003678A3 (cs) 2000-09-08 2004-03-17 Gryphon Therapeutics, Inc. Syntetické proteiny stimulující erytropoézu
JP4656814B2 (ja) 2000-12-20 2011-03-23 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー エリスロポエチンコンジュゲート
US6531121B2 (en) 2000-12-29 2003-03-11 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US7767643B2 (en) 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
MXPA03007392A (es) 2001-02-20 2003-12-04 Enzon Inc Enlazantes polimericos ramificados terminalmente y conjugados polimericos que contienen los mismos.
FR2823220B1 (fr) 2001-04-04 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo)
US20020169128A1 (en) 2001-04-09 2002-11-14 Geroge Sigounas Erythropoietin ameliorates chemotherapy-induced toxicity in vivo
US6784154B2 (en) 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
US7122189B2 (en) 2002-08-13 2006-10-17 Enzon, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
US7087229B2 (en) 2003-05-30 2006-08-08 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
NZ543934A (en) * 2003-05-12 2008-06-30 Affymax Inc Novel spacer moiety for poly (ethylene glycol)-modified peptide-based compounds
ATE478093T1 (de) * 2003-05-12 2010-09-15 Affymax Inc Neue poly(ethylenglycol) modifizierte erythropoietinagonisten und deren verwendungen
NZ543905A (en) 2003-05-12 2008-07-31 Affymax Inc Peptides that bind to the erythropoietin receptor
NZ543935A (en) * 2003-05-12 2008-06-30 Affymax Inc Peptides that bind to the erythropoietin receptor

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200510010B (en) 2006-12-27
CA2525568A1 (en) 2004-11-25
US7414105B2 (en) 2008-08-19
US7084245B2 (en) 2006-08-01
AU2004238870A1 (en) 2004-11-25
CA2525568C (en) 2017-07-25
PT1629007E (pt) 2009-05-06
MEP53308A (en) 2011-05-10
IS2683B (is) 2010-10-15
US7855175B2 (en) 2010-12-21
OA13164A (en) 2006-12-13
HRP20090251T1 (en) 2009-06-30
SG160224A1 (en) 2010-04-29
KR101163683B1 (ko) 2012-07-10
NO20055852L (no) 2006-02-13
EP1629007A2 (en) 2006-03-01
CN1823087A (zh) 2006-08-23
CR8131A (es) 2008-05-05
KR20060022239A (ko) 2006-03-09
AP2005003470A0 (en) 2005-12-31
UA88146C2 (ru) 2009-09-25
WO2004101606A2 (en) 2004-11-25
CY1109028T1 (el) 2014-07-02
EA200501801A1 (ru) 2006-08-25
JP2009108061A (ja) 2009-05-21
US20110245176A1 (en) 2011-10-06
JP4266028B2 (ja) 2009-05-20
JP4768795B2 (ja) 2011-09-07
WO2004101606A3 (en) 2005-09-22
AU2004238870B2 (en) 2009-12-17
AU2004238870B8 (en) 2010-04-15
ME00356B (me) 2011-05-10
US20060040858A1 (en) 2006-02-23
IL171782A (en) 2010-11-30
NO338435B1 (no) 2016-08-15
DK1629007T3 (da) 2009-06-29
DE602004020610D1 (de) 2009-05-28
EA010095B1 (ru) 2008-06-30
NZ543905A (en) 2008-07-31
US20050137329A1 (en) 2005-06-23
SI1629007T1 (sl) 2009-10-31
RS20050838A (sr) 2007-12-31
MXPA05012316A (es) 2006-04-18
US20090048166A1 (en) 2009-02-19
CN100441595C (zh) 2008-12-10
AP2042A (en) 2009-09-07
US8729030B2 (en) 2014-05-20
PL1629007T3 (pl) 2009-09-30
IS8165A (is) 2005-12-02
ATE428727T1 (de) 2009-05-15
ES2323465T3 (es) 2009-07-16
JP2007530441A (ja) 2007-11-01
BRPI0411155A (pt) 2006-07-11
EP1629007B1 (en) 2009-04-15
HK1088616A1 (en) 2006-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS51130B (sr) Novi peptidi koji se vezuju za eritropoietinski receptor
EP1625156B1 (en) Peptides that bind to the erythropoietin receptor
US20130012685A1 (en) Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
CA2609401A1 (en) Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US20120157660A1 (en) Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
HK1088616B (en) Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
HK1088906B (en) Peptides that bind to the erythropoietin receptor