JP2001505898A - レセプターに結合するペプチドおよび化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 トロンボポエチンレセプターに結合して、活性化するペプチドおよび化合物が記載されている。このようなペプチドおよび化合物は、血液学的疾患、特に化学療法、放射線療法、または骨髄輸液から生じる血小板減少症の治療法、並びに標識ペプチドおよび化合物を用いる診断法に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 レセプターに結合するペプチドおよび化合物 発明の背景 本発明は、トロンボポエチンレセプター（ｃ−ｍｐｌまたはＴＰＯ−Ｒ）に結 合して活性化する、あるいはＴＰＯ作動薬として作用するペプチドおよび化合物 に関する。本発明は、生化学および医化学の分野で用いられ、特にヒトの疾患の 治療に用いられるＴＰＯ作動薬を提供する。 トロンボポエチンレセプターに結合して活性化するペプチドおよび化合物は、 ＷＯ９６／４０７５０号明細書に記載されている。 血小板減少症に罹っている患者の血小板濃度の回復が遅いことは重要な問題で あり、血小板再生を促進することができる血液成長因子を見出だすことが緊急の 課題となっている。本発明は、このような作動薬を提供するものである。 発明の概要 本発明は、式(I) （上記式中、 Ｘ₁は、水素、またはアシルであり、 Ｘ₂は、Ｇ、またはサルコシン（Ｓａｒ）であり、 Ｘ₃は、Ｒ、Ａ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、またはＮ−アセチルリシン（Ａｃ− Ｌｙｓ）であり、 Ｘ₄は、Ｑ、またはＥであり、 Ｘ₅は、Ｗ、Ｌ−１−ナフチルアラニン（１−Ｎａｌ）、またはＦであり、 Ｘ₆は、Ａ、５−アミノペンタン酸（Ａｖａ）、または２−アミノ酪酸（Ａｂｕ ）であり、 Ｘ₇は、Ａ、ジフェニルアラニン（Ｄｉｐｈｅ）であるか、またはＸ₇は存在せず 、 Ｘ₈は、ｐ−アミノフェニルアラニン（ｐ−アミノ−Ｐｈｅ）、Ｎ−アセチルリ シン（Ａｃ−Ｌｙｓ）であるか、またはＸ₈は存在せず、 Ｘ₉およびＸ_9'，は同一であるかまたは異なっており、Ａ、βＡ、ｎ−メチルア ラニン（ｎ−Ｍｅ−Ａｌａ）、サルコシン（Ｓａｒ）であるか、またはＸ₉およ びＸ_9'は存在せず、 Ｘ₁₀およびＸ_10'は同一であるかまたは異なっており、βＡであるか、または Ｘ₁₀およびＸ_10'は存在しない） を有する化合物、および その薬学上許容可能な誘導体であって、 但し、化合物 を除くものを提供する。 本発明は、化合物 （Ｈ）−ＡＤＧＰＴＬＲＥＷＩＳＦ（Ａｖａ）ＡＤＧＰＴＬＲＥＷＩＳＦ（ＮＨ₂ ）、および および その薬学上許容可能な誘導体も提供する。 上記の定義および以下において、記号Ａ、βＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ 、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｗ、Ｔは、通常のアミノ酸に対する標準的な一文字コー ド、すなわち Ａ アラニン Ｃ システイン Ｄ アスパラギン酸 Ｅ グルタミン酸 Ｆ フェニルアラニン Ｇ グリシン Ｉ イソロイシン Ｋ リシン Ｌ ロイシン Ｐ プロリン Ｑ グルタミン Ｒ アルギニン Ｓ セリン Ｗ トリプトファン Ｔ トレオニン である。 重複をさけるため、略号 を本明細書で用いるときには、構造 を示すことを意味する。 式(I)の化合物の適当な薬学上許容可能な誘導体としては、薬学上許容可能な 塩および酸付加塩、薬学上許容可能なエステル、薬学上許容可能なアミド、標識 化合物、および以下に定義される各種の親水性ポリマーの１種類以上に共有結合 している化合物が挙げられる。 式(I)の化合物は、各種の親水性ポリマーの１種類以上、例えば１種類に共有 結合しているのが好ましい。（複数の）親水性ポリマーは、例えば式(I)の化合 物のペプチド鎖の一方または両方に結合することができる。親水性ポリマーが両 方のペプチド鎖に結合しているときには、親水性ポリマーは同一でもまたは異な っていてもよく、好ましくはそれらは同一である。当業者であれば、式(I)の化 合物がＸ₁で各種の親水性ポリマーの１種類以上に共有結合するときには、Ｘ₁は アシルではないことを理解されるであろう。 式(I)の化合物の好ましい群は、 それらの薬学上許容可能な誘導体であって、キラルアミノ酸が好ましくはＬ型を しているものである。 式(I)の化合物の更に好ましい群としては、 特に その薬学上許容可能な誘導体であって、キラルアミノ酸が好ましくはＬ型である ものが挙げられる。 本発明による化合物という以後の表現は、式(I)の化合物およびそれらの薬学 上許容可能な誘導体の両方を包含する。 式(I)の化合物は多数のキラル中心を含んでいるので、光学異性体の対（すな わち、鏡像異性体）、およびラセミ体混合物などのそれらの混合物の形態で存在 することが、当業者によって理解されるであろう。式(I)の化合物の総ての異性 体およびラセミ体混合物などのそれらの混合物は、本発明の範囲内に包含される 。キラルアミノ酸はＬ型であるのが好ましい。 式(I)の化合物はＴＰＯ−Ｒに対する強力な結合特性を有し、ＴＰＯ−Ｒを活 性化することができる。従って、このような化合物は、例えば血小板、巨核球お よび他の幹細胞上で、ＴＰＯレセプターの刺激によって改善することができる症 状、例えば化学療法（導入補助化学療法、地固め療法、または維持化学療法など ）、放射線療法、自己、同種および同系骨髄移植、末梢血前駆細胞および臍帯血 前駆細胞移植、悪性および非悪性疾患に対する生物学的または他の治療（例えば 、インターフェロンおよび他のサイトカイン）、転移腫瘍および白血病による骨 髄浸潤、非悪性疾患（例えば、骨粗鬆症、ゴシェ病）での骨髄浸潤または浸食、 再生不良性貧血、骨髄形成異常症候群、骨髄線維症および関連症候群（原発性お よび二次的）、自己免疫および異種免疫血小板減少症などの免疫および特発性疾 患、および薬剤によって誘導される免疫血小板減少症、薬剤によって誘導される 血小板減少症（例えば、ＨＩＶ陽性患者での抗レトロウイルス療法による）、慢 性肝 疾患（例えば、アルコール性または他の形態の肝硬変）および慢性腎不全、血栓 性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群および他の細小血管障害などの過剰 血小板破壊、および脾機能亢進症、欠陥または異常血小板による出血が起こる先 天性症候群、例えばグランツマン血小板無力症、アブセント・レイディアス血小 板減少症（ＴＡＲ）症候群(thrombocytopenia with absent radius（TAR）syndr ome)、灰色血小板症候群(gray platelet syndrome)、肝移植、大動脈瘤の修復、 大動脈内バルーンカウンターパルセーション、冠状動脈バイパス移植および体外 循環および／または多量の輸血を必要とする他の外科的処置、またはＨＩＶ関連 の血小板減少症、悪性および非悪性疾患（上記）の化学療法、放射線療法および 他の療法などの結果見られることがある顆粒球減少症および貧血、悪性、前悪性 および非悪性疾患（上記）における骨髄浸潤、免疫および非免疫の特発性および 薬剤に関連した貧血および顆粒球減少症の治療、または血液学的悪性疾患自体の 治療における治療目的に有用である。本発明による化合物は、例えば血小板、巨 核球および他の幹細胞上で、ＴＰＯレセプターの刺激が、例えば自己、同種およ び同系移植のための末梢血前駆細胞の可動化、血小板および他の血液供与体から の収率の増加、エクス・ビボでの血小板生存および品質の向上、血小板および／ またはイン・ビトロでの前駆細胞の産生または増大に望ましいものであり、造血 機構の検討における診断目的、および巨核球および上記前駆細胞のイン・ビトロ での増大に望ましい治療、診断および研究目的に用いることもできる。 本発明の化合物は、低めのＩＣ₅₀がＴＰＯ−Ｒに対するより強力な結合親和性 に相関する下記の実施例３に記載の結合親和性分析によって測定したＩＣ₅₀が約 ２ｍＭ以下である。好ましくは、診断目的には、本発明による化合物はＩＣ₅₀が 約２ｍＭ以下であり、医薬目的には、本発明による化合物は約１００μＭ以下で ある。 診断目的に用いるときには、本発明による化合物は検出可能な標識で標識され るので、このような標識のない本発明の化合物は標識化合物の調製における中間 体として用いられる。 本発明による化合物を本明細書に記載の親水性ポリマーで誘導体形成するとき には、このような化合物の分子量は約５００〜約１２０，０００ダルトン、更に 好ましくは約８，０００〜約８０，０００ダルトンの範囲とすることができる。 上記のように、更に好ましい態様では、式(I)の化合物は、各種の親水性ポリ マーの１種類以上に共有結合している。一般に、このような親水性ポリマーの平 均分子量はやく５００〜約１００，０００ダルトンの範囲であり、例えば約５０ ０〜約４０，０００ダルトンであり、好ましくは約２，０００〜約４０，０００ ダルトンであり、更に好ましくは約５，０００〜約４０，０００であり、更に一 層好ましくは約５，０００〜約２０，０００ダルトンであり、例えば約１８，０ ００〜約２２，０００ダルトンである。好ましい態様では、このような親水性ポ リマーの平均分子量は約５，０００ダルトン、１０，０００ダルトンおよび２０ ，０００ダルトンである。親水性ポリマーは、分岐状であってもまたは分岐状で なくてもよい。 適当な親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレ ングリコールのようなポリアルキルエーテル、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ポ リオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース およびセルロース誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体、およびそれ らのコポリマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい親水性ポ リマーとしては、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのよ うなポリアルキルエーテル、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、およびそれらのコポ リマーが挙げられる。意外なことには、ペプチド化合物がこのようなポリマーで 誘導体形成されると、それらの溶解度および循環半減期は増加するが、その結合 活性はほとんど減少せず、もしあったとしてもわずかであり、その免疫原性は遮 蔽されることを見出だした。好ましい態様では、式(I)のペプチド化合物の二量 体性サブユニット（ペプチド鎖）のそれぞれは、親水性ポリマーに共有結合して いる。更に好ましい態様では、本発明の化合物はＰＥＧ化しており、すなわちポ リエチレングリコール（ＰＥＧ）に共有結合している。 ＰＥＧは、２個の末端ヒドロキシル基を有するエチレンオキシド繰返し単位の 線状の水溶性ポリマーである。ＰＥＧは、典型的には約５００ダルトン〜約４０ ，０００ダルトンの範囲であり、例えば５，０００、１０，０００、２０，００ ０、３０，０００または４０，０００ダルトン（５Ｋ）１０Ｋ、２０Ｋ、３０Ｋ 、または４０Ｋ）の分子量によって分類される。現在のところ好ましい態様では 、使用されるＰＥＧの分子量は５，０００〜約２０，０００ダルトンの範囲であ る。本発明のペプチド化合物にカップリングしたＰＥＧは、分岐状であってもま たは分岐状でなくてもよい。（例えば、Monfardini，C.，et al.，Bioconjugate Chem.，6:62-69(1995)を参照されたい）。このようなＰＥＧとしては、モノメ トキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレ ングリコール−スクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレング リコール−スクシンイミジルスクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメ トキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ₂）、モノメトキシ ポリエチレングリコール−トレシレート（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、およびモノ メトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−Ｉ Ｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。 本発明による化合物はモノ−またはジ−ペジル化(pegylated)していてもよく 、例えば高分子量のＰＥＧを用いる場合には、モノペジル化が好ましい。 式(I)の化合物に結合することができるＰＥＧ鎖の例としては、 CH₃O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-CH₂-NH- アルデヒド結合（ＡＬＤＨ）ＰＥＧ （但し、ｎは例えば約４５０である） CH₃O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-C(O)-NH- エステル結合（ＳＰＡ）ＰＥＧ （但し、ｎは例えば約１１２〜９００であり、例えば約１１２、２２５、４５０ 、（例えば、４２５〜５００）、６７５または９００である） （但し、ｎは例えば約１１２〜４５０であり、例えば約１１２、２２５または４ ５０である） CH₃O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OC(O)CH₂CH₂-C(O)NH- ＳＳ ＰＥＧ （但し、ｎは例えば約１１２〜４５０であり、例えば約１１２、２２５または４ ５０である） が挙げられる。 本発明の好ましいＰＥＧ化した化合物の例としては、下記の アルデヒド結合（ＡＬＤＨ）ジＰＥＧ−ＡＦ１３９４８ エステル結合（ＳＰＡ）ジＰＥＧ−ＡＦ１３９４８ 分岐状（ＰＥＧ２）ジＰＥＧ−ＡＦ１３９４８ ＳＳ（ＰＥＧ２）ジＰＥＧ−ＡＦ１３９４８ アルデヒド結合（ＡＬＤＨ）ジＰＥＧ−ＡＦ１５７０５ エステル結合（ＳＰＡ）ジＰＥＧ−ＡＦ１５７０５および それらの薬学上許容可能な誘導体であって、キラルアミノ酸が好ましくはＬ型で あり、「ｎ」が約５〜約１０００の範囲の値、例えば１０〜約１０００、更に好 ましくは約１００〜約９００であり、更に一層好ましくは約１１０〜約９００で あり、例えば約１１２、２２５、４５０（例えば、４２５〜５００）、６７５ま たは９００であるものが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、アルデ ヒド結合（ＡＬＤＨ）ＰＥＧについては、ｎは例えば約４５０であり、例えば３ ４８〜４５２であり、エステル結合（ＳＰＡ）ＰＥＧについては、ｎは例えば約 １１２〜９００であり、例えば約１１２、２２５、４５０（例えば、４２５〜５ ００）、６７５または９００であり、分岐状ＰＥＧについては、ｎは例えば約１ １２〜４５０であり、例えば約１１２、２２５または４５０であり、ＳＳ ＰＥ Ｇについては、ｎは例えば約１１２〜４５０であり、例えば約１１２、２２５ま たは４５０である。 本発明による特に好ましい化合物は、であって、ｎが約４５０であり、例えば約４２５〜５００であるもの、およびそ の薬学上許容可能な誘導体であって、キラルアミノ酸が好ましくはＬ型であるも のである。 上記のように、本発明による化合物は、ＴＰＯが介在する疾患、例えば血小板 減少症、顆粒球減少症、および貧血のような血液学的障害の予防および治療、お よび血液学的悪性疾患の治療に有用である。従って、本発明は、トロンボポエチ ン作動薬による治療の影響を受けやすい疾患に罹っている患者の治療法であって 、患者に治療上有効投与量または量の本発明の化合物を投与することを含んでな る方法も提供する。 本発明は、治療、特にヒトの医療に用いる本発明による化合物も提供する。 本発明の別態様として、トロンボポエチン作動薬が介在する症状の治療に用い られる医薬の製造における本発明による化合物の使用も提供される。 治療という表現は、予防並びに発症した症状の緩和を包含することを意図する ものであることが理解されるであろう。 本発明は、本発明に記載の１種類以上の化合物および生理学的に許容可能なキ ャリヤーを含んでなる医薬組成物も提供する。これらの医薬組成物は、経口投与 形態、並びに吸入粉末および溶液、および注射用および輸液用溶液など様々な形 態であることもできる。 図面の簡単な説明 第１図は、ヒト血清中でのＡＦ１３９４８およびＧＷ３５０７８１（ジ−ＰＥ Ｇ（５Ｋ）−ＡＦ１３９４８）の安定性を示し、ＰＥＧ化化合物が非ＰＥＧ化化 合物と比較して安定性が増加しており、すなわち半減期が増加していることを示 している。 第２図は、ＰＥＧで様々に誘導体形成した本発明のペプチド化合物の薬物動態 プロフィールを示している。この実験では、ペプチドＡＦ１５７０５を、分岐状 ＰＥＧ（ＰＥＧ２）、エステル結合ＰＥＧ（ＳＰＡ）、およびアルデヒド結合Ｐ ＥＧ（ＡＬＤＨ）で誘導体形成した。得られた結果は、ＰＥＧで様々に誘導体形 成した３種類のペプチド化合物総てが良好な薬物動態プロフィールを有すること を示している。 第３〜４図は、マウスでのカルボプラチン（ＣＢＰ）によって誘発される血小 板減少症に対する本発明のＰＥＧ化したペプチド化合物の効果を示している。第 ３図は、ＧＷ３５０７８１（ジ−ＰＥＧ（５Ｋ）−ＡＦ１３９４８）がマウスモ デルでの血小板減少症を緩和することができることを示している。第４図は、Ｇ Ｗ３５０８０５（ジ−ＰＥＧ（２０Ｋ）−ＡＦ１３９４８）も血小板減少症を緩 和することができ、これはＧＷ３５０７８１よりも強力であることを示している 。 第５〜６図は、正常マウスでの血小板増加症に対するＧＷ３５０７８１および ＧＷ３５０８０５の効果を示している。得られた結果は、本発明のＰＥＧ化した ペプチド化合物が血小板増加症に対して良好な効果を有し、２０Ｋ−ジＰＥＧ化 したペプチドが５Ｋ−ジＰＥＧ化したペプチドより約１００倍強力であることを 示している。 第７〜８図は、正常マウスでの血小板濃度に対するＧＷ３５０７８１およびＧ Ｗ３５０８０５の様々な投与量の効果を示している。これらのデータは、本発明 のＰＥＧ化したペプチド化合物が正常マウスの血小板濃度を増加することができ ることを示している。 第９図は、正常マウスでの血小板濃度に対するＧＷ３５０８０５の単回投与量 対複数回投与量の効果を示している。 第１０図は、β−Ａｌａを有する二量体ペプチドを製造するための一般的合成 工程図を示している。 第１１図は、β−Ａｌａを持たない二量体ペプチドを製造するための一般的合 成工程図を示している。 具体的態様の説明 下記の定義は、本発明の説明に用いる様々な用語の意味および範囲を例示し、 定義する目的で提示されている。 「作動薬」とは、相補的な生物学的に活性なレセプターに結合し、これを活性 化してレセプターに生物学的応答を引起させ、またはレセプターの先在的生物学 的活性を増強させる生物学的に活性なリガンドを表す。 「薬学上許容可能な塩」とは、医薬産業でよく用いられるナトリウム、カリウ ム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムおよびプロ タミン亜鉛塩などの非毒性アルカリ金属、アルカリ土類金属およびアンモニウム 塩であって、当該技術分野で公知の方法によって調製されるものを表す。この用 語は、非毒性酸付加塩であって、通常は本発明の化合物を適当な有機または無機 酸と反応させることによって調製されるものも包含する。代表的な塩としては、 塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オ レイン酸塩、ラウリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナプシル酸塩などが挙げら れる。 「薬学上許容可能な酸付加塩」とは、遊離塩基の生物学的有効性および特性を 保持し、かつ生物学的などに望ましくないものでない、塩酸、臭化水素酸、硫酸 、硝酸、リン酸などの無機酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピル ビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒 石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンス ルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸を用いて形成した 塩を表す。プロドラッグとしての薬学上許容可能な酸付加塩の説明については、 上記のBundgaard，H.を参照されたい。 「薬学上許容可能なエステル」とは、エステル結合を加水分解したときに、カ ルボン酸またはアルコールの生物学的有効性および特性を保持し、かつ生物学的 などに望ましくないものでないエステルを表す。プロドラッグとしての薬学上許 容可能なエステルの説明については、Bundgaard，H.監修「プロドラッグのデザ イン(Design of Prodrugs)」，Elsevier Science Publishers，アムステルダム （１９８５年）を参照されたい。これらのエステルは、典型的には相当するカル ボン酸とアルコールから形成される。一般に、エステル形成は、通常の合成法に よって行うことができる。（例えば、March，最新有機化学(Advanced Organic C hemistry)，第４版，John Wiley & Sons，ニューヨーク（１９９２年），３９３ 〜３９６頁およびそこに引用されている文献、およびMark et al.，化学技術の 百科事典(Encyclopedia of Chemical Technology)，John Wiley & Sons，ニュー ヨーク（１９８０年）を参照されたい。）エステルのアルコール成分は、一般に (i)１個以上の二重結合を含むことができるまたはできない、かつ分岐状炭素を 含むことができるまたはできないＣ_{2 〜}Ｃ₁₂脂肪族アルコール、またはＣ₇〜Ｃ₁₂ 芳香族または複素芳香族アルコールを含んでなる。本発明は、本明細書に記載さ れているエステル、および同時にそれらの薬学上許容可能な酸付加塩である組成 物の使用も意図しているものである。 「薬学上許容可能なアミド」とは、アミド結合を加水分解したときに、カルボ ン酸またはアミンの生物学的有効性および特性を保持し、かつ生物学的などに望 ましくないものでないアミドを表す。プロドラッグとしての薬学上許容可能なア ミドの説明については、Bundgaard，H.監修「プロドラッグのデザイン(Design o f Prodrugs)」，Elsevier Science Publishers，アムステルダム（１９８５年） を参照されたい。これらのアミドは、典型的には相当するカルボン酸およびアミ ンから形成される。−般に、アミド形成は、通常の合成法によって行うことがで きる。（例えば、March，最新有機化学(Advanced Organic Chemistry)，第４版 ，John Wiley & Sons，ニューヨーク（１９９２年），３９３頁、およびMark et al.，化学技術の百科事典(Encyclopedia of Chemical Technology)，John Wile y & Sons，ニューヨーク（１９８０年）を参照されたい。）本発明は、本明細書 に記載されているアミド、および同時にそれらの薬学上許容可能な酸付加塩であ る組成物の使用も意図しているものである。 「薬学上または治療上許容可能なキャリヤー」とは、活性成分の生物学的活性 の有効性を妨げずかつ宿主または患者にとって毒性でないキャリヤー媒質を表す 。 「立体異性体」とは、もう一方のものと分子量、化学組成および構成が同じで あるが、原子を異なるグループ分けをした化合物を表す。すなわち、ある種の同 一の化学残基同士は空間的に異なる配向をしており、従って、純粋なときには、 偏光面を回転させる能力を有する。しかしながら、幾つかの純粋な立体異性体で は、旋光が現在の装置では検出することができないほどわずかであることがある 。本発明の化合物は、１個以上の不整炭素原子をし、従って様々な立体異性体を 包 含することがある。総ての立体異性体は、本発明の範囲内に包含される。 本発明の組成物に適用される「治療上または薬学上有効量」とは、所望な生物 学的結果を誘発するのに十分な組成物の量を表す。この結果は、疾患の徴候、症 状または原因の緩和、または生物学的系の任意の他の所望な変更であることがで きる。本発明において、本発明において、この結果は、典型的には感染症または 組織損傷に対する免疫学的および／または炎症反応の減少を伴う。 下記の略号を用いる。 ＯｔＢｕおよびｔＢｕは、両方とも第三−ブチルオキシであり（ＯｔＢｕは３ 文字アミノ酸略号と共に慣習的に用いられ、ｔＢｕは１文字アミノ酸略号と共に 慣習的に用いられる）、Ｂｚｌはベンジルであり、Ａｃはアセチルであり、Ｍｅ はメチルであり、Ａｂｕは２−アミノ酪酸であり、Ｔｈｉはチエニルアラニンで あり、Ａｃ−ＬｙｓはＮ−アセチルリシンであり、ｐ−アミノ−Ｐｈｅはｐ−ア ミノフェニルアラニンであり、Ｎ−メチル−ＡｌａはＮ−メチルアラニンであり 、Ｄｉｐｈｅはジフェニルアラニンであり、Ｓａｒはサルコシンであり、Ａｖａ は５−アミノペンタン酸であり、Ｎｌｅはノルロイシンであり、ｔｒｔはトリチ ルである。 「検出可能な標識」とは、本発明のペプチドおよびペプチド類似体に共有結合 するとき、このペプチドまたはペプチド類似体を投与した患者でイン・ビボでペ プチドおよびぺプチド類似体を検出することができる材料を表す。適当な検出可 能な標識は当該技術分野で公知であり、例えば放射性同位体、蛍光標識（例えば 、フルオレセイン）などが挙げられる。用いられる特定の検出可能な標識は決定 的なものではなく、用いる標識の量並びに用いた標識の量での標識の毒性に対し て選択される。このような因子に対する標識の選択は、完全に当該技術分野の技 術の範囲内である。 ペプチドまたはペプチド類似体への検出可能な標識の共有結合は、当該技術分 野で公知の従来法によって行う。例えば、放射性同位体¹²⁵Ｉを検出可能な標識 として用いるときには、¹²⁵Ｉのペプチドまたはペプチド類似体への共有結合は 、アミノ酸チロシンをペプチドまたはペプチド類似体へ配合した後、ペプチドを ヨウ素化(iodimating)することによって行うことができる（例えば、Weather et al.，同位体標識化合物の合成および応用(Synthesis and Application of Isot opically Labelled Compounds)，１３７〜１４０頁（１９９４年）を参照された い）。チロシンがペプチドまたはペプチド類似体に含まれていないときには、公 知の化学によってペプチドまたはペプチド類似体のＮまたはＣ末端にチロシンを 配合することができる。同様に、32Ｐをリン酸残基としてのペプチドまたはペプ チド類似体に、例えば従来の化学的方法を用いてペプチドまたはペプチド類似体 のヒドロキシル基を介して配合することができる。 本発明は、ＴＰＯ−Ｒに結合して活性化する、あるいはＴＰＯ作動薬として作 用する化合物を提供する。これらの化合物としては、「先導(lead)」ペプチド化 合物、および先導化合物と同一または同様な分子構造または形状を有するように 構築されているが、加水分解またはタンパク質分解に対する感受性に関しおよび ／またはレセプターに対する親和性の増加のような他の生物学的特性に関して先 導化合物と異なる「誘導体」化合物が挙げられる。本発明は、ＴＰＯ作動薬、更 に具体的には血液学的疾患、特に化学療法、放射線療法、または骨髄輸液に関連 した血小板減少症の治療に有用な化合物の有効量を含んでなる組成物も提供する 。 様々な方法を、ＩＣ₅₀値を評価するのに用いることができる。例えば、ＭＢＰ −ＴＰＯまたはｌａｃＩ−ペプチドトレーサーを用いる平衡結合ＥＬＩＳＡ分析 法を用いて、ペプチドがＴＰＯレセプターの細胞外ドメインへのＴＰＯの結合を 阻害するかどうかを決定した。ＩＣ₅₀値は、遊離ペプチドであって、場合によっ てはＣ末端をアミド化することができるまたはエステルまたは他のカルボキシア ミドとして調製することができるものを用いて決定することができる。 ＩＣ₅₀およびＥＣ₅₀値は、本発明では符号「−」、「＋」および「＋＋」によ って象徴的に表す。例えば、２００μＭを上回るＩＣ₅₀値を示すペプチドは、「 −」で表される。ＩＣ₅₀値が２００μＭ以下のペプチドには、「＋」が与えられ 、ＩＣ₅₀値が５００ｎＭ以下のものは、「＋＋」で示される。特定の符号につい て切断点またはその付近のＩＣ₅₀値を与えたペプチドは、ハイブリッド表示(hyb rid designator)、例えば「＋／−」で示される。ＩＣ₅₀値が決定されなかった ペプチドは、「Ｎ．Ｄ．」として示す。 本発明のペプチドおよびペプチド類似体は、下記の実施例２に更に詳細に記載 されているトロンボポエチン依存細胞増殖分析法でも評価した。細胞増殖は、細 胞増殖の指標としての³Ｈ−チミジン取り込みと相関しているＭＴＴ分析法のよ うな当該技術分野で知られている手法によって測定される(Mossmann，J．Immuno l．Methods，65:55(1983)を参照されたい）。 第３〜４図は、本発明のペプチドおよびペプチド類似体の活性を評価する他の 分析法の結果を示している。この分析法では、マウスをカルボプラチンを用いて 血小板減少症とする。Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、０日目にカルボプラチン（１２５ ｍｇ／Ｋｇ腹腔内）を投与する。これらの結果は、本発明のペプチドがマウスモ デルの血小板減少症を緩和することができることを示している。 本発明のペプチドの結合および活性の特異性も、ＷＯ９６／４０７５０号明細 書に記載の方法によるエリトロポエチンレセプター（ＥＰＯ−Ｒ）に対するペプ チドの交差反応を検討することによって検討した。ペプチドおよびペプチド類似体の調製 固相合成 本発明のペプチドは、当該技術分野で知られている古典的方法、例えば標準的 固相法を用いることによって調製することができる。標準的方法としては、独占 的固相合成、部分的固相合成法、断片縮合、古典的溶液合成、および組換えＤＮ Ａ技術による方法が挙げられる。例えば、Merrifield，J．Am．Chem．Soc.，85: 2149(1963)を参照されたい。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書 に引用される。固相では、合成は、α−アミノ保護樹枝を用いるペプチドのＣ− 末端から開始される。適当な出発材料は、例えば必要なα−アミノ酸をクロロメ チル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂またはベンズヒドリルアミン樹脂に結合する ことによって調製することができる。このようなクロロメチル化樹脂はBIO-BEAD S SX-1（Bio Rad Laboratories，リッチモンド，カリフォルニア）という商品名 で発売されており、ヒドロキシメチル樹脂の調製は、Bodonszky，et al.，Chem ．Ind．(London)，38:1597(1966)に記載されている。ベンズヒドリルアミン（Ｂ ＨＡ）樹脂はPietta and Marshall，Chem．Commn.，650(1970)に記載されており 、Beckman Instruments，Inc.，パロアルト，カリフォルニアから塩酸塩の形態 で市販されている。 従って、本発明の化合物は、Gisin，Helv．Chim．Acta.，56:1467(1973)に記 載の方法に従って、例えば重炭酸セシウム触媒を用いてα−アミノ基を保護した アミノ酸をクロロメチル化樹脂にカップリングすることによって調製することが できる。最初のカップリングの後、α−アミノ保護基を、有機溶媒中室温にてト リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または塩酸（ＨＣｌ）溶液などの試薬の選択によって 除去する。 α−アミノ保護基は、ペプチドの段階的合成の技術において有用であることが 知られているものである。アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリフルオロア セチル、アセチル）、芳香族ウレタン型保護基（例えば、ベンジルオキシカルボ ニル（Ｃｂｚ）および置換Ｃｂｚ）、脂肪族ウレタン保護基（例えば、第三ブチ ルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシ ルオキシカルボニル）、およびアルキル型保護基（例えば、ベンジル、トリフェ ニルメチル）が挙げられる。ＢｏｃおよびＦｍｏｃは、好ましい保護基である。 側鎖保護基はカップリング中は完全な儘であり、アミノ末端保護基の脱保護中ま たはカップリング中は開裂しない。側鎖保護基は、最終的なペプチドの合成が完 了した時点および標的ペプチドを変化させない反応条件下で除去されねばならな い。 Ｔｈｒ（Ｔ）およびＳｅｒの側鎖保護基としては、アセチル、ベンゾイル、ト リチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、および Ｃｂｚが挙げられる。Ａｒｇ（Ｒ）の側鎖保護基としては、ニトロ、トシル（Ｔ ｏｓ）、Ｃｂｚ、アダマンチルオキシカルボニル メシトイルスルホニル（Ｍｔ ｓ）、ＰｍｃまたはＢｏｃが挙げられる。Ｌｙｓ（Ｋ）の側鎖保護基としては、 Ｃｂｚ、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｃｂｚ）、２−ブロ モベンジルオキシカルボニル（２−ＢｒＣｂｚ）、Ｔｏｓ、またはＢｏｃが挙げ られる。 α−アミノ保護基を除去した後、残りの保護基を所望の順序で段階的にカップ リングする。それぞれの保護されたアミノ酸の過剰量を、通常は例えば塩化メチ レン（ＣＨ₂Ｃｌ₂）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）混合物のような溶液中で ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のような適当なカルボキシル基活性 剤と共に用いる。 所望なアミノ酸配列を完了した後、樹脂からペプチドを開裂するだけでなく、 総ての残りの側鎖保護基も開裂するトリフルオロ酢酸またはフッ化水素（ＨＦ） のような試薬で処理することによって、所望なペプチドを樹脂支持体から脱カッ プリングする。クロロメチル化樹脂を用いるときには、フッ化水素処理により、 遊離ペプチド酸が形成される。ベンズヒドリルアミン樹脂を用いるときには、フ ッ化水素処理により直接遊離ペプチドアミドを生じる。あるいは、クロロメチル 化樹脂を用いるときには、側鎖を保護したペプチドをアンモニアで処理して脱カ ップリングして所望な側鎖を保護したアミドを得、またはアルキルアミンで処理 して側鎖を保護したアルキルアミンまたはジアルキルアミドを得ることができる 。次いで、フッ化水素で処理することによる通常の方法で側鎖保護を外し、遊離 のアミド、アルキルアミドまたはジアルキルアミドを得る。 これらの固相ペプチド合成法は当該技術分野で公知であり、John Morrow Stew art and Janis Dilaha Young，固相ペプチド合成(Solid Phase Peptide Synthes es)（第２版，Pierce Chemical Company，１９８４年）に更に記載されている。 本発明の化合物は、１９９０年３月７日出願の米国特許出願連続番号第０７／ ４９２，４６２号明細書、１９９０年１２月６日出願の第０７／６２４，１２０ 号明細書、および１９９１年１２月６日出願の第０７／８０５，７２７号明細書 に記載の「コードした合成ライブラリー」または「大規模固定ポリマー合成」系 を用いて製造することもできる。 Ｂ． 合成アミノ酸 これらの方法を用いて、２０種類の天然に存在する遺伝学的にコードされたア ミノ酸以外のアミノ酸が本発明の化合物のいずれかの１、２またはそれ以上の位 置で置換されているペプチドを合成することもできる。例えば、ナフチルアラニ ンをトリプトファンの代わりに用いて、合成を促進することができる。本発明の ペプチドに置換することができる他の合成アミノ酸としては、β−アミノ酸、Ｄ −アミノ酸、および天然には存在しない合成アミノ酸が挙げられる（例えば、Ro berts，et al.，Unusual Amino Acids in Peptide Synthesis，5(6)：341-449(1 983)を参照されたい）。 Ｎ−末端修飾 ペプチドは、典型的には遊離酸として合成されるが、上記のように、アミドま たはエステルとして容易に調製することができる。また、本発明のペプチド化合 物のアミノおよび／またはカルボキシ末端を修飾して、本発明の他の化合物を生 成させることもできる。アミノ末端修飾としては、メチル化（すなわち、−ＮＨ ＣＨ₃または−ＮＨ（ＣＨ₃）₂）、アセチル化、ベンジルオキシカルボニル基の 付加、またはアミノ末端のＲＣＯＯ−（但し、Ｒはナフチル、アクリジニル、ス テロイジル、および同様な基からなる群から選択される）によって定義されるカ ルボキシレート官能基を含む任意のブロッキング基でのアミノ末端のブロッキン グが挙げられる。カルボキシ末端修飾としては、遊離酸のカルボキサミド基によ る置換、または構造的束縛を導入するためのカルボキシ末端における環状ラクタ ムの形成が挙げられる。 アミノ末端修飾は、上記に引用されている通りであり、アルキル化、アセチル 化、カルボベンゾイル基の付加、スクシンイミド基の形成などが挙げられる（例 えば、Murray，et al.，ブルガーの医化学および薬剤発見(Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery)，第５版，第１巻，Manfred E．Wolf監修，John Wiley and Sons，Inc．（１９９５年）を参照されたい）。具体的には、次にＮ −末端アミノ基を下記のようにして反応させることができる。 (a)酸ハロゲン化物［例えば、ＲＣ（Ｏ）Ｃｌ］または非対称無水物と反応させ ることによる式ＲＣ（Ｏ）ＮＨ−（式中、Ｒは上記で定義した通りである）のア ミド基の形成。典型的には、反応は、等モルまたは過剰量（例えば、約５当量） の酸ハロゲン化物を、好ましくは、過剰（例えば、約１０当量）のジイソプロピ ルエチルアミンのような第三アミンを含む不活性希釈剤（例えば、ジクロロメタ ン）中でペプチドに接触させて、反応中に生成した酸を除くことによって行うこ とができる。反応条件は、ほかの点では通常のものである（例えば、室温３０分 間）。低級アルキルＮ−置換を提供するための末端アミノのアルキル化の後、上 記のように酸ハロゲン化物と反応させると、式ＲＣ（Ｏ）ＮＲ−のＮ−アルキル アミド基を生じる。 (b)無水コハク酸と反応させることによるスクシンイミド基の形成。上記と同様 に、無水コハク酸を約等モル量または過剰量（例えば、約５当量）を用いること ができ、アミノ基を適当な不活性溶媒（例えば、ジクロロメタン）中で過剰（例 えば、約１０当量）のジイソプロピルエチルアミンのような第三アミンの使用な どの当該技術分野で公知の方法によってスクシンイミドに転換する。例えば、Wo llenberg et al.の米国特許第４，６１２，１３２号明細書を参照されたい。こ の特許明細書の内容は、全体がその開示の一部として本明細書に引用される。コ ハク酸基は、ペプチドのＮ−末端で置換スクシンイミドを提供するための通常の 方法で調製されるＣ₂〜Ｃ₆アルキルまたは−ＳＲ置換基で置換することができる ことが理解される。このようなアルキル置換基は、Wollenberg et al.，上記引 用に記載の方法で低級オレフィン（Ｃ₂〜Ｃ₆）を無水マレイン酸と反応させるこ とによって調製され、−ＳＲ置換基はＲＳＨと無水マレイン酸との反応（但し、 Ｒは上記で定義した通りである）によって調製される。 (c)好ましくは第三アミンを含む適当な不活性希釈剤（例えば、ジクロロメタン ）中で約当量または過剰量のＣＢＺ−Ｃｌ（すなわち、ベンジルオキシカルボニ ルクロリド）または置換ＣＢＺ−Ｃｌと反応させることによるベンジルオキシカ ルボニル−ＮＨ−または置換ベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−基を形成して、 反応中に生成する酸を除くこと。 (d)適当な不活性希釈剤（例えば、ジクロロメタン）中で当量または過剰量（例 えば、５当量）のＲ−Ｓ（Ｏ）₂Ｃｌとの反応によるスルホンアミド基を形成し 末端アミンをスルホンアミド（但し、Ｒは上記で定義した通りである）に転換す ること。好ましくは、不活性希釈剤は、ジイソプロピルエチルアミンのような過 剰の第三アミン（例えば、１０当量）を含み、反応中に生成した酸を除去する。 反応条件は、ほかの点では通常のものである（例えば、室温３０分間）。 (e)適当な不活性希釈剤（例えば、ジクロロメタン）中で当量または過剰量（例 えば、５当量）のＲ−ＯＣ（Ｏ）ＣｌまたはＲ−ＯＣ（Ｏ）ＯＣ₆Ｈ₄−ｐ−ＮＯ₂ との反応によりカルバメート基を形成し、末端アミンをカルバメート（但し、 Ｒは上記で定義した通りである）に転換すること。好ましくは、不活性希釈剤は 、過剰量（例えば、約１０当量）のジイソプロピルエチルアミンのような第三ア ミンを含み、反応中に生成した酸を除去する。反応条件は、ほかの点では通常の ものである（例えば、室温３０分間）。 (f)適当な不活性希釈剤（例えば、ジクロロメタン）中で当量または過剰量（例 えば、５当量）のＲ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏとの反応により尿素基を形成し、末端アミンを 尿素（但し、Ｒは上記で定義した通りである）に転換すること。好ましくは、不 活性希釈剤は、過剰量（例えば、約１０当量）のジイソプロピルエチルアミンの ような第三アミンを含み、反応中に生成した酸を除去する。反応条件は、ほかの 点では通常のものである（例えば、室温３０分間）。 もう一つの別態様では、Ｃ−末端カルボキシル基またはＣ−末端エステルをそ れぞれカルボキシル基またはエステルの−ＯＨまたはエステル（−ＯＲ）をＮ− 末端アミノ基で内部置換することにより環化を誘発して、環状ペプチドを形成す ることができる。例えば、合成および開裂を行い、ペプチド酸を得た後、遊離酸 は、溶液中、例えば塩化メチレン（ＣＨ₂Ｃｌ₂）、ジメチルホルムアミド（ＤＭ Ｆ）混合物中でジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のような適当なカル ボキシル基活性剤によって活性化エステルに転換される。次いで、環状ペプチド を、活性化エステルをＮ−末端アミンで内部置換することによって形成する。重 合とは異なり内部環化は、極めて稀薄な溶液を用いることによって増進すること ができる。このような方法は、当該技術分野で公知である。 本発明のペプチドを環化し、またはペプチドの末端にデスアミノまたはデスカ ルボキシ残基を組み込み、プロテアーゼに対する感受性を減少させまたはペプチ ドの配置を制限するための末端アミノまたはカルボキシル基がないようにするこ ともできる。本発明の化合物のＣ−末端官能基としては、アミド、アミド低級ア ルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、およびカル ボキシ、およびそれらの低級エステル誘導体、およびそれらの薬学上許容可能な 塩が挙げられる。 上記のＮ−末端およびＣ−末端修飾に加えて、本発明の化合物は、上記定義の 様々な親水性ポリマーの１種類以上により有利に修飾し、または共有結合するこ とができる。 本発明のペプチド化合物は、Zallipsky，S.，Bioconjugate Chem.，6:150-165 (1995)、Monfardini，C．et al.，Bioconjugate Chem.，6:62-69(1995)、米国特 許第４，６４０，８３５号明細書、米国特許第４，４９６，６８９号明細書、米 国特許第４，３０１，１４４号明細書、米国特許第４，６７０，４１７号明細書 、米国特許第４，７９１，１９２号明細書、米国特許第４，１７９，３３７号明 細書、またはＷＯ９５／３４３２６号明細書に記載の方法のいずれかを用いて上 記ポリマーと誘導体形成しまたはこれにカップリングすることができ、上記文献 の内容は、全体がその開示の一部として本明細書に引用される。ＰＥＧは、Shea rwater Polymers，Inc．（ハンツビル、アラバマ）、Sigma Chemical Co.、およ び他の会社から市販されている。 現在のところ好ましい態様では、本発明のペプチド化合物は、ポリエチレング リコール（ＰＥＧ）で誘導体形成される。 簡単には、一つの代表的な態様では、用いられる親水性ポリマー、例えばＰＥ Ｇは、メトキシまたはエトキシ基のような未反応基によって一端をキャッピング するのが好ましい。次いで、ポリマーを他端でハロゲン化シアヌル酸（例えば、 塩化、臭化またはフッ化シアヌル酸）、ジイミダゾール、無水試薬（例えば、無 水ジブロモコハク酸のような無水ジハロコハク酸）、アシルアジド、ｐ−ジアゾ ニウムベンジルエーテル、３−（ｐ−ジアゾニウムフェノキシ）−２−ヒドロキ シプロピルエーテル）などの適当な活性剤と反応させることによって活性化する 。次に、活性化ポリマーを本発明のペプチド化合物と反応させて、ポリマーで誘 導 体形成したペプチド化合物を生成する。本発明の化合物のペプチドアームの一つ が例えばアシル基によって保護されていると、モノペジル化化合物が形成される 。あるいは、本発明のペプチド化合物の官能基をポリマーで活性化して反応させ 、または２個の基を既知のカップリング法を用いて協奏カップリング反応で結合 することができる。反応工程図１〜４は、本発明のペプチド化合物を例えばポリ エチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて誘導体形成するための代表的な反応工程 図を示している。本発明のペプチド化合物を、当業者に知られておりかつ用いら れている幾多の他の反応工程図を用いてＰＥＧと誘導体形成することができるこ とが容易に理解されるであろう。 本発明のペプチド化合物の親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）による誘導体形 成に加えて、他の小さなペプチド、例えばレセプターに結合する他のペプチドま たはリガンドも、このような親水性ポリマーと誘導体形成して、生物学的活性（ 例えば、結合活性、作動薬活性、拮抗薬活性など）の損失があったとしても僅か にすることができることを見出だした。これらの小さなペプチドを親水性ポリマ ーで誘導体形成するときには、その溶解度および循環半減期が増加し、その免疫 原性が減少することを見出だした。また、極めて意外なことには、上記のことは 、生物学的活性をほとんど損失することなく、あったとしてもごく僅かの損失で 行うことができる。好ましい態様での脂肪では、誘導体形成したペプチドの活性 は、未修飾ペプチドの０．１〜０．０１倍である。更に好ましい態様では、誘導 体形成したペプチドの活性は、未修飾ペプチドの０．１〜１倍である。更に一層 好ましい態様では、誘導体形成したペプチドは、未修飾ペプチドより大きな活性 を有する。 この態様で使用するのに適したペプチドとしては、一般に、例えばＴＰＯ、Ｅ ＰＯ、ＩＬ−１、Ｇ−ＣＳＦ、およびＩＬ−５レセプター、造血成長因子レセプ ター、サイトカインレセプター、Ｇ−タンパク質結合レセプター、細胞表面レセ プターなどのレセプターに結合するペプチド、すなわちリガンドが挙げられる。 このようなペプチドは、典型的には約１５０個以下のアミノ酸残基、更に好まし くは約１００個以下のアミノ酸残基（例えば、約１０〜１２ｋＤａ）を含んでな る。本発明で用いるのに適当な親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコー ルおよびポリプロピレングリコールによって代表されるようなポリアルキルエー テル、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコー ル、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストラン およびデキストラン誘導体などが挙げられるが、それらに限定されない。一般に 、このような親水性ポリマーの平均分子量は約５００〜約１００，０００ダルト ンの範囲であり、更に好ましくは約２，０００〜約４０，０００ダルトンであり 、更に一層好ましくは約５，０００〜約２０，０００ダルトンである。好ましい 態様では、このような親水性ポリマーの平均分子量は、約５，０００ダルトン、 １０，０００ダルトン、および２０，０００ダルトンである。この態様によるペ プチド化合物は、上記および引用文献の方法を用いて誘導体形成することができ る。 ジスルフィド結合の形成 本発明の化合物 は、システインのチオール基の間に分子内ジスルフィド結合を有する。この化合 物は、当該技術分野で知られている方法を用いて分子内置換によって作成するこ とができる（例えば、Frank A．Robey，Meth．in Mol．Bio.，35(6):73-90(1990 )を参照されたい）。 もう一つの態様によれば、本発明は、元から生理学的活性を有するポリペプチ ドから生理学的に活性であり、実質的に非免疫原性の水溶性ポリペプチドの製造 法であって、 (a)分子量が約５００〜約２０，０００ダルトンのポリマーのヒドロキシ基を 有する少なくとも１個の末端炭素原子を活性化し、上記ポリマーが未置換である か、またはアルコキシまたはアルキル基によって置換されており、上記アルコキ シまたはアルキル基が５個未満の炭素原子を有し、 (b)式(I)の生理活性ポリペプチドを上記ポリマーの反応性末端基にカップリン グすることによって、上記ポリペプチドを、ポリペプチド１モル当たり上記活性 化ポリマー１０〜１００モルと反応させて、上記の生理学的に活性であり、実質 的に非免疫原性の水溶性ポリペプチド組成物を提供する 段階を含んでなる方法を提供する。好ましくは、ポリマーは、ポリエチレングリ コールである。好ましくは、カップリング剤は塩化シアヌル酸である。有用性 本発明の化合物は、ＴＰＯの産生およびレセプター結合工程に影響しかつこれ によって影響されると考えられる多くの因子の評価など、ＴＰＯの生物学的役割 を理解するための独特な手段としてイン・ビトロで有用である。 これらの化合物は、新規なＴＰＯレセプター作動薬をスクリーニングするため の分析法における競合的結合剤としても有用である。このような分析法の態様で は、本発明の化合物は修飾なしに用いることができ、または様々な方法で、例え ば検出可能な信号を直接または間接的に提供する残基を共有的にまたは非共有的 に結合することのような標識によって修飾することができる。これらの分析法の いずれかでは、そのための材料を直接または間接的に標識することができる。直 接標識の可能性としては、¹²⁵Ｉのような放射能標識、ペルオキシダーゼおよび アルカリ性ホスファターゼのような酵素（米国特許第３，６４５，０９０号明細 書）、および蛍光強度、波長シフトまたは蛍光分極の変化を監視することができ る蛍光標識（米国特許第３，９４０，４７５号明細書）のような標識基が挙げら れる。間接標識の可能性としては、１成分のビオチン化の後、上記標識基の一つ にカップリングしたアビジンへの結合が挙げられる。これらの化合物としては、 化合物が固形支持体へ結合させる場合には、スペーサーまたはリンカーを挙げる こともできる。 更に、ＴＰＯレセプターへ結合する能力に基づいて、本発明のペプチドを、生 物学的流体中、組織ホモジネート中、精製した天然の生物学的材料などでの生活 細胞、固定細胞上でＴＰＯレセプターを検出するための試薬として用いることが できる。例えば、これらのペプチドを標識することによって、表面にＴＰＯ−Ｒ を有する細胞を同定することができる。更に、ＴＰＯレセプターを結合する能力 に基づいて、本発明のペプチドをイン・シトゥ染色、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞 分類）、ウェスタン・ブロット法、ＥＬＩＳＡなどに用いることができる。また 、 ＴＰＯレセプターに結合する能力に基づいて、本発明のペプチドをレセプター精 製、または細胞表面上（または透過性にした細胞内部）でＴＰＯレセプターを発 現する細胞の精製に用いることができる。 本発明の化合物を、様々な医学研究および診断目的の商業的試薬として用いる こともできる。このような用途としては、(1)様々な機能分析における候補のＴ ＰＯ作動薬の活性を定量するための較正標準としての使用、(2)TＰＯ依存性細胞 系の増殖および成長を保持するための使用、(3)同時結晶化によるＴＰＯ−レセ プターの構造分析における使用、(4)ＴＰＯ信号の形質導入／レセプター活性化 の機構を検討するための使用、および(5)ＴＰＯ−レセプターを好ましくは活性 化し、またはこのような活性化が、既知量のＴＰＯ作動薬に対して好都合に較正 する、他の研究および診断用途が挙げられるが、これらに限定されない。 本発明の化合物を用いて、いずれも付加サイトカインと結合したまたはそれら 自身の巨核球および上記前駆細胞をイン・ビトロで増大させることができる。Di Giusto et al.，ＰＣＴ公表第９５／０５８４３号明細書を参照されたい。上記 の特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。化学療法 および放射線療法は、巨核球の速やかに分割し、一層成熟した個体を殺すことに よって血小板減少症を引起す。しかしながら、これらの治療法により、未成熟で 有糸分裂活性が大きくない巨核球前駆体細胞の数および成育可能性を減少させる こともできる。従って、ＴＰＯまたは本発明の化合物による血小板減少症の緩和 は、イン・ビトロ培養によって巨核球および未成熟前駆体数が増加した化学療法 または放射線療法の後の患者自身の細胞をこの患者に輸液することによって速め ることができる。 本発明の化合物を、ヒトなどの温血動物に投与して、ＴＰＯ−Ｒをイン・ビボ で活性化することもできる。従って、本発明は、ＴＰＯ関連疾患の治療法であっ て、本発明の化合物をイン・ビボでのＴＰＯ−Ｒに対するＴＰＯの効果を模倣す るのに十分な量で投与することを含んでなる方法を包含する。例えば、本発明の ペプチドおよび化合物は、上記に定義したように、様々な血液学的疾患を治療す る目的で投与することができる。 本発明の幾つかの態様では、ＴＰＯ拮抗薬を、化学療法または放射線療法を行 う患者に最初に投与した後、本発明のｔｐｏ作動薬を投与するのが好ましい。 本発明の化合物の活性は、McDonald，Am．J．of Pediatric Hematology/Oncol ogy，14:8-21(1992)に記載の多数のモデルの一つでイン・ビトロまたはイン・ビ ボで評価することができ、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に 引用される。 一態様によれば、本発明の組成物は、骨髄輸液、放射線療法、または化学療法 と組合わせた血小板減少症の治療に有用である。化合物は、典型的には化学療法 、放射線療法、または骨髄移植の前に、またはそのような暴露の後に予防的に投 与される。 従って、本発明は、活性成分として、本発明のペプチドまたはペプチド類似体 の少なくとも１種類を、医薬キャリヤーまたは希釈剤と組合わせて含んでなる医 薬組成物も提供する。本発明の組成物は、経口、肺、非経口（筋肉内、腹腔内、 静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、吸入（微粉末処方物による）、経皮、鼻内、 腟内、直腸、または舌下投与経路によって投与することができ、またそれぞれの 投与経路に適当な投与形態に処方することができる。例えば、Berrstein et al. ，ＰＣＴ特許公表第ＷＯ９３／２５２２１号明細書、Pitt et al.，特許公表第 ＷＯ９４／１７７８４号明細書、およびPitt et al.，欧州特許出願第６１３， ６８３号明細書を参照されたい。上記の特許明細書の内容は、その開示の一部と して本明細書に引用される。 経口投与のための固形投与形態としては、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、およ び顆粒が挙げられる。このような固形投与形態では、活性化合物を、スクロース 、 ラクトース、または澱粉のような少なくとも１種類の不活性な薬学上許容可能な キャリヤーと混合する。このような投与形態は、通常の実施がそうであるように 、不活性希釈剤以外の添加物質、例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑 剤を含んでなることもできる。カプセル、錠剤および丸薬の場合には、投与形態 は緩衝剤を含んでなることもできる。錠剤および丸薬は、更に腸溶性コーティン グを施して調製することもできる。 経口投与用の液体投与形態としては、薬学上許容可能なエマルション、溶液、 懸濁液、シロップ、および水のような当該技術分野で一般的に用いられる不活性 希釈剤を含むエリキシルが挙げられる。このような不活性希釈剤の他に、組成物 は、湿潤剤、乳化および懸濁剤、および甘味料、香味料および香料のようなアジ ュバントを挙げることもできる。 非経口投与用の本発明による製剤としては、滅菌した水性または非水性溶液、 懸濁液またはエマルションが挙げることができる。非水性溶媒またはビヒクルの 例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびトウ モロコシ油のような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能な有機エステル である。このような投与形態は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、静菌剤および分散剤 、酸化防止剤、緩衝剤、懸濁剤、増量剤、凍結防止剤のようなアジュバントを含 むこともできる。それらは、例えば細菌保持フィルターを介する濾過、組成物へ の滅菌剤の配合、または組成物の加熱によって滅菌することができる。それらは 、使用直前に、滅菌水やある種の他の滅菌注射用媒質を用いて製造することもで きる。 あるいは、化合物を、（注射用）水、食塩またはデキストロース溶液で再構成 するための凍結乾燥固形物として提供することもできる。このような処方物は、 通常はバイアル、アンプル、または使い捨て注射装置のような単位投与形態で提 供される。それらは、適当な投与量を取り出すことができるボトルのような複数 投与形態で提供することもできる。 直腸または腟内投与用の組成物は、好ましくは活性成分の他に、カカオ脂また は座薬ワックスのような賦形剤を含むことができる座薬である。鼻内または皮下 投与用の組成物は、当該技術分野で公知の標準的な賦形剤を用いて調製される。 化合物を含む組成物は、予防治療および治療の目的で投与することができる。 治療目的では、組成物は、上記のような疾患に既に罹っている患者に、その疾患 およびその合併症の症状を治癒しまたは少なくとも部分的に抑制するのに十分な 量で投与される。これを行うのに適する量は、「治療上有効量」として定義され る。この使用に有効な量は、疾患の重篤さおよび患者の体重および一般的状態に よって変化する。 本発明の組成物は、例えばTiceとBibiの方法（制御薬剤送達に関する論文(Tre atise on Controlled Drug Delivery)，A．Kydonieus監修，Marcel Dekker，ニ ューヨーク（１９９２年），３１５〜３３９頁）によってマイクロカプセル化す ることもできる。 予防目的では、本発明の化合物を含む組成物を特定の疾患に対して感受性を有 するあるいはその危険性のある患者に投与する。このような量は、「予防上有効 量」と定義される。この使用では、正確な量は患者の健康状態および体重によっ て変化する。 効果的な治療に要するＴＰＯ作動薬の量は、投与の手段、標的部位、患者の生 理状態、および投与される他の医薬などの多くの様々な要因によって変化する。 従って、治療投与量は、安全性および有効性を最適にするように決定すべきであ る。典型的には、イン・ビトロで用いられる投与量は、これらの試薬のイン・シ トゥ投与で有用な量の有用な指標を提供することができる。特定の疾患の治療の ための有効投与量の動物試験により、更にヒトでの投与量が予想される。様々な 考察が、例えばGilman et al.監修，Goodman and Gilmanの治療薬の薬理学的基 礎(Goodman and Gilman's:The Pharmacological Basis of Therapeutics),第８ 版，Pergamon Press（１９９０年）、およびRemingtonの薬科学(Remington's Ph armaceutical Science)，第７版，Mack Publishing Co.，イーストン，ペンシル バニア（１９８５年）に記載されており、上記文献の内容は、その開示の一部と して本明細書に引用される。 本発明のペプチドおよびペプチド類似体は、１日当たり約０．００１ｍｇ〜約 １０ｍｇ／ｋｇ体重の投与範囲で投与するとき、ＴＰＯが介在する症状の治療に 有効である。用いられる具体的投与量は、治療を行う特定の症状、投与経路、並 びに症状の重篤度、患者の年齢および一般症状などの要因により担当医師の判断 によって調整される。 ヒトに投与するのに適当な非経口医薬製剤は、好ましくは溶液または複数投与 量バイアル用の複数の溶液中に式(I)の化合物またはその薬学上許容可能な誘導 体を１〜５０ｍｇ／ｍｌ含む。 好ましい処方物は、式(I)の化合物を水、塩水またはデキストロース溶液に溶 解したものである。特に好ましい溶液は、ｐＨが約４．０〜５．０である。 別態様によれば、本発明は、生理学的に活性であり、実質的に非免疫原性の水 溶性ポリペプチド組成物であって、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレ ングリコールからなる群から選択される分子量が約５００〜約２０，０００ダル トンであるポリマーにカップリング剤を用いてカップリングした式(I)の化合物 を含んでなり、上記ポリマーが未置換であるか、またはアルコキシまたはアルキ ル基によって置換されており、上記アルコキシまたはアルキル基が５個未満の炭 素原子を有する組成物を提供する。好ましくは、上記ポリマーの分子量は約７５ ０〜約１５，０００ダルトンであり、更に好ましくは約５，０００〜約１０，０ ００ダルトンである。好ましくは、上記ポリマーはポリエチレングリコールであ る。 本発明の好ましい態様のみを上記に具体的に記載したが、本発明の修飾および 変更は、本発明の精神および意図する範囲から離反することなく可能であること が理解されるであろう。 実施例１ 固相ペプチド合成 本発明の様々なペプチドを、手動操作により、またはApplied Biosystems Inc .Model 431Aまたは433Aペプチド合成装置を用いて、Merrifield固相合成法(Stew ard and Young，固相ペプチド合成(Solid Phase Peptide Synthesis)，第２版， Pierce Chemical，ロックフォード，イリノイ（１９８４年）、およびMerrifiel d，J．Am．Chem．Soc.，85:2149(1963)を参照されたい）を用いて合成した。 それぞれのカップリングは、ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンザトリアゾール−１− イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロ−ホスフェ ート）およびＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）を用いて２×３０ 分間行った。 使用した樹脂は、ＨＭＰ樹脂（ｐ−ヒドロキシメチルフェノキシメチル）ポリ スチレン樹脂、または架橋剤としての５−（４’−Ｆｍｏｃ−アミノメチル−３ ，５’−ジメチルオキシフェノキシ）吉草酸で架橋したポリスチレン樹脂である ＰＡＬ(Milligen/Biosearch)であった。ＰＡＬ樹脂を使用すると、樹脂からペプ チドを開裂させるとカルボキシル末端アミド官能基が生じる。開裂を行うと、Ｈ ＭＰ樹脂は最終生成物のＣ−末端にカルボン酸残基を生成する。ほとんどの試薬 、樹脂および保護されたアミノ酸（遊離または樹脂上）は、MilliporeまたはApp lied Biosystems Inc.から購入した。 Ｆｍｏｃ基は、カップリング処理の際にアミノ保護に用いた。アミノ酸の第一 アミンの保護はＦｍｏｃで行い、側鎖保護基は、セリン、グルタミン酸およびト レオニンについては第三ブチルであり、グルタミンについてはトリチルであり、 アルギニンについてはＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６ −スルホニル）であり、トリプトファンについてはＮ−第三−ブチルオキシカル ボニルであり、システインについてはＳ−トリチルであった。 樹脂からのペプチドの除去および側鎖官能基の同時脱保護は、試薬Ｋまたはそ れを若干修飾したもので処理することによって行った。あるいは、アミド化した カルボキシル末端を有するペプチドの合成において、完全に集めたペプチドを９ ０％トリフルオロ酢酸、５％エタンジチオールおよび５％水で、最初は４℃で、 徐々に室温まで増加させて開裂した。総ての場合に、精製は、Ｃ₁₈結合シリカゲ ルカラム上で、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル／水のグラディ エントを用いて調製用の逆相高性能液体クロマトグラフィーによって行った。均 質なペプチドは、迅速原子衝撃マススペクトル分析法または電子スプレーマスス ペクトル分析法、および適用可能な場合にはアミノ酸分析によって特性決定した 。 好ましい態様では、本発明のペプチドは、当業者に知られておりかつ用いられ ている標準的合成法を用いて二量体化される。本発明の二量体ペプチド化合物を 製造するための代表的な合成工程図を、第１０および１１図に示す。これらの合 成工程図に従って、当業者は、本発明による二量体ペプチド化合物を容易に調整 することができる。また、二量体サブユニットは、第１０および１１図に記載さ れている方法および架橋剤を用いて容易に結合することができることは、当業者 には容易に明らかになるであろう。 Ａ． ＡＦ１５７０５の合成 ＡＦ１５７０５への工程図 Ｆｍｏｃ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）Ｌ−ＯＨの合成 １リットルのペプチドチャンバーに、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＨＭＰＢ−ＢＨＡ［ ４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）−酪酸ベンズヒドリル アミン］樹脂（３５ｇ，１８．９ミリモル）と、１−メチル−２−ピロリジノン （ＮＭＰ）を充填した。樹脂を溶媒中で窒素攪拌を行いながら約３０分間コンデ ィショニングし、ビーズを膨潤させた。末端アミンからのＦｍｏｃ（９−フルオ ロメチルオキシカルボニル）の除去は、ＮＭＰ中ピペリジンの３０％溶液２×２ ５０ｍｌを用いてそれぞれ１０分間行った。次に、陰性クロラニル試験によって 決定されるように、樹脂を６×３００ｍｌのＮＭＰで洗浄して、Ｆｍｏｃ副生成 物（ジベンゾフルベンおよびそのピペリジン付加物）を除去した。Ｆｍｏｃ−Ｔ ｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（１５．０ｇ，２当量）および１−ヒドロキシベンゾトリ アゾール（ＨＯＢＴ）（５．８ｇ，２当量）を、室温でＮＭＰ２５０ｍｌに溶 解した。溶液を氷浴で０〜５℃まで冷却した。ジイソプロピルエチルアミン（Ｄ ＩＰＥＡ）（８．２ｍｌ，２．５当量）を加え、３〜５分間攪拌した。Ｏ−ベン ゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキ サフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（１４．３ｇ，２当量）およびジクロロメ タン（ＤＣＭ）７５ｍｌを加え、約５分間攪拌溶解した。活性化酸の溶液を、排 液した樹脂上に加えて、Ｎ₂を通じながら１時間攪拌した。カップリングの完了 を、ニンヒドリン試験によって監視した。樹脂から排液し、３×３００ｍｌのＮ ＭＰで洗浄した。 次いで、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（１２．８ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（ １１．２ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１６．８ｇ）、およびＦ ｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（１３．４ｇ）を用いてサイクルを反復し、ペプチド断片 の次のマーを得た。最終的なカップリング反応の後、樹脂をＮＭＰ４×３００ｍ ｌで、次にＤＣＭ４×３００ｍｌで洗浄した。 ペプチドを、１％トリフルオロ酢酸／ＤＣＭを用いて樹脂から開裂した。画分 を集めて、生成物含量についてＨＰＬＣによって分析した。４個の３００ｍｌ画 分、４個の５００ｍｌ画分、次いで６個の２５０ｍｌ画分を集めて、分析した。 画分３〜９をピリジンでｐＨ約３〜４に調整した後、合わせて、ロータリ−エバ ポレーター上で濃縮し、ほぼ乾固した。エタノール約２００ｍｌをフラスコに加 え、濃縮を継続して、残留ＤＣＭを除去した。生成する部分溶液を蒸気浴上で加 熱して、完全な溶液を得た。溶液を氷浴で０〜５℃まで冷却し、水４００ｍｌを 激しく攪拌しながら加えた。粘稠なスラリー状生成物を氷浴で約１時間攪拌し、 濾過して、水１００ｍｌで洗浄した。生成物を、漏斗を介して気流を一晩引くこ とによって漏斗上で風乾し、定量的収率およびＨＰＬＣによる９８．３面積％の 純度でＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（ｔＢ ｕ）−Ｌｅｕ−ＯＨを１８．８ｇ（１９．５ミリモル）得た。ＦｍｏｃＲ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１−Ｎａｌ）ＬＡ−ＯＨの合成 １リットルのペプチドチャンバーに、ＨＭＰＢ−ＢＨＡ（３５ｇ，３０．８ミ リモル）と、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）を充填した。樹脂を溶媒 中で窒素攪拌を行いながら約３０分間コンディショニングし、ビーズを膨潤させ た。一方、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（２８．８ｇ，３当量）をＮＭＰ２００ｍｌ に室温で溶解した。溶液をメタノール／水／氷浴で−５℃〜０℃まで冷却した後 、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（７５０ｍｇ，０．２当量）を加えて溶 解させた。ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（１４．３ｍｌ，３当量） およびジクロロメタン（ＤＣＭ）１００ｍｌを加え、溶液を約０℃で２０〜３０ 分間攪拌した。明黄色溶液を得た。樹脂を排液し、活性化したアミノ酸の溶液を チャンバーに充填した。混合物をＮ₂を通じて５時間攪拌した。樹脂を排液し、 ＮＭＰ３×３００ｍｌで洗浄した。試料を取り出し、ＮＭＰおよびＤＣＭで十分 に洗浄し、一晩乾燥した。樹脂を、無水安息香酸（２０．９ｇ，３当量）とピリ ジン７．５ｍｌ（３当量）をＮＭＰ２５０ｍｌに溶解したもので末端キャッピン グした。スラリーを室温で１．５時間攪拌した。樹脂を排液し、ＮＭＰ３×３０ ０ｍｌで洗浄した。末端アミンからのＦｍｏｃ（９−フルオレニル−メチルオキ シカルボニル）の除去は、ピペリジンをＮＭＰに溶解した３０％溶液２×２５０ ｍｌを用いてそれぞれ１０分間行った。次いで、陰性クロラニル試験によって決 定されるように、樹脂を６×３００ｍｌのＮＭＰで洗浄して、Ｆｍｏｃ副生成物 （ジベンゾフルベンおよびそのピペリジン付加物）を除去した。 Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（２１．８ｇ，２当量）および１−ヒドロキシベンゾ トリアゾール（ＨＯＢＴ）（９．４ｇ，２当量）を、室温でＮＭＰ２２５ｍｌに 溶解した。溶液を氷浴で０〜５℃まで冷却した。ジイソプロピルエチルアミン（ ＤＩＰＥＡ）（１３．４ｍｌ，２．５当量）を加え、３〜５分間攪拌した。Ｏ− ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウ ムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（２３．４ｇ，２当量）およびＤＣ Ｍ７５ｍｌを加え、約５分間攪拌溶解した。活性化酸の溶液を、排液した樹脂上 に加えて、Ｎ₂を通じながら１時間攪拌した。カップリングの完了を、ニンヒド リン試験によって監視した。樹脂から排液し、３×３００ｍｌのＮＭＰで洗浄し た。 次いで、Ｆｍｏｃ−（１−Ｎａｌ）−ＯＨ（２７．０ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ （ｔｒｔ）−ＯＨ（３７．６ｇ）、およびＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（ ４０．０ｇ）を用いてサイクルを反復し、エプチド断片の次のマーを得た。最終 的なカップリング反応の後、樹脂をＮＭＰ４×３００ｍｌで、次にＤＣＭ４×３ ００ｍｌで洗浄した。 ペプチドを、１％トリフルオロ酢酸／ＤＣＭを用いて樹脂から開裂した。画分 を集めて、生成物含量についてＨＰＬＣによって分析した。４個の２００ｍｌ画 分、３個の５００ｍｌ画分、次いで５個の２５０ｍｌ画分を集めて、分析した。 画分５〜１１をピリジンでｐＨ約３〜４に調整した後、合わせて、ロータリーエ バポレーター上で濃縮し、ほぼ乾固した。エタノール約２００ｍｌをフラスコに 加え、濃縮を継続して、残留ＤＣＭを除去した。生成する部分溶液を蒸気浴上で 加熱して、完全な溶液を得た。溶液を氷浴で０〜５℃まで冷却し、０．１Ｎ Ｈ Ｃｌ ２００ｍｌを加えた後、水２００ｍｌを加えた。粘稠なスラリー状生成物 を氷浴で約１時間攪拌し、濾過して、水１００ｍｌで洗浄した。生成物を、漏斗 を介して気流を一晩引くことによって漏斗上で風乾し、樹脂からの収率７４％（ 分析した樹脂からの収率＞９５％）およびＨＰＬＣによる９４．８面積％の純度 でＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−（１−Ｎａｌ）−Ｌｅｕ− Ａｌａ−ＯＨ（３１．９ｇ，２２．８ミリモル）を得た。 Ｈ−ＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）−ＯＢｚｌの合成 ＦｍｏｃＡｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（３当量）、ジメチルアミノピリジン（０． ３当量）およびジイソプロピルカルボジイミド（３当量）を攪拌して、１−メチ ル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ，１０容）中で室温にて溶解した。溶液を、ペプ チドチャンバー中の［４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ） −酪酸］（ＨＭＰＢ）樹脂に加え、Ｎ₂を通じながら３〜６時間攪拌した。添加 効率を、開裂試料の定量的ＨＰＬＣ分析によって測定した。樹脂に結合したＦｍ ｏｃＡｒｇ（Ｐｂｆ）を３０％ピペリジン／ＮＭＰ（２×１０容）に１０〜１５ 分間暴露し、末端アミンを脱保護した。樹脂をＮＭＰ（６０〜８０容）で洗浄し 、ピペリジンの陰性クロラニル試験を行った。ＦｍｏｃＡｌａ−ＯＨ（２当量） を、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウ ロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ，２当量）と１−ヒドロキシベ ンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ，２当量）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰ ＥＡ，２．１当量）を用いてＮＭＰ（５〜１０容）中で０〜５℃で予備活性化し た後、樹脂混合物に移し、窒素置換を行いながら３０〜９０分間攪拌した。カッ プリング効率をニンヒドリン試験により監視した。樹脂をＮＭＰ（２５〜３０容 ）で洗浄し、カップリングサイクルを繰返し、側鎖が完全に保護された樹脂結合 ペプチドを得た。樹脂を塩化メチレン（ＤＣＭ，４０〜６０容）で洗浄してＮＭ Ｐを除去した後、ペプチドを開裂した。側鎖が保護された断片を、樹脂から１％ トリフルオロ酢酸／ＤＣＭ（２０容）で数回洗浄することによって除いた。ペプ チドを放出すると、樹脂は暗紫色に変化した。開裂断片をＨＰＬＣによって監視 した後、ピリジンで中和し、濃縮して固形残渣とし、これを更に精製した。固形 生成物に、水３０ｍｌを加えた。溶液のｐＨを０．１Ｎ ＨＣｌ（１００ｍｌ） で２に調整した。懸濁液を酢酸エチル（２×３００ｍｌ）で洗浄した。合わせた 酢酸エチル抽出物を飽和塩化ナトリウム水溶液（１５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳ Ｏ₄上で乾燥し、濃縮してフォーム状生成物とした。フォーム状生成物を粉砕し 、メチル第三−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ，１００ｍｌ）で粉砕した。生成する 固形生成物 を集めて、乾燥し、ＦｍｏｃＡＲ（Ｐｂｆ）−ＯＨを樹脂から約１００％の収率 で得た。 ＦｍｏｃＡＲ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（１当量）、ＳａｒＯＢｚＩ、トシレート塩（ １当量）、ＨＯＡＴ（１．２当量）、およびＤＩＰＥＡ（２．５当量）をＤＭＦ （１３容）に溶解したものを０℃に冷却し、ＨＢＴＵ（１．２当量）を加えた。 溶液を０℃で１０分間攪拌した後、周囲温度まで加熱し、４０分間攪拌した。ペ プチドを沈澱させるため、塩水／水の１：１溶液（４０容）を加えた。固形生成 物を集めて、メタノール（８容）に溶解し、水（１０容）で沈澱した。溶媒を粘 稠な半固形生成物から傾瀉によって除去し、半固形生成物を真空乾燥してフォー ム状生成物とした。フォーム状生成物を粉砕し、ＭＴＢＥ（８容）で粉砕した。 溶媒を傾瀉によって除去し、固形生成物を乾燥した。収率１５．２ｇ、樹脂から ９２％、ＨＰＬＣにより９９面積％。生成物を９：１ＴＨＦ／ピペリジン（１０ 容）に溶解し、周囲温度で５０分間攪拌した。ペプチドを沈澱させるため、ＭＴ ＢＥ（２６容）とヘキサン（３３容）を加えた。溶媒を半固形生成物から傾瀉に よって除去し、半固形生成物（空気に暴露するとゴム状になる）を真空乾燥して 、フォーム状生成物とした。フォーム状生成物を粉砕し、ＭＴＢＥ（１０容）で 粉砕し、溶媒を傾瀉により除去した。粉砕を２回繰返し、生成物を乾燥した。収 率９３％、ＨＰＬＣ純度，９５面積％。 第三−Ｂｏｃ保護を用いるＨ−ＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）−ＯＢｚＩの交互溶 液合成 Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ・ＤＣＨＡ（４．９６ｇ）を、酢酸エチル５ ０ｍｌと０．２５Ｍクエン酸の２回の４０ｍｌ分量との間で分配した。有機相を 水３０ｍｌの容積で２回、塩水３０ｍｌで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し て、蒸発させ、フォーム状生成物とした。このフォーム状生成物、Ｓａｒ−ＯＢ ｚｌトシレート塩（２．７１ｇ）およびＨＯＡｔ（０．９８ｇ）を、塩化メチレ ン５０ｍｌに溶解した。溶液を氷浴で冷却し、ＣＤＤ（１．５０ｇ）およびＤＩ ＰＥＡ（１．８ｍｌ）を加えた。反応混合物を低温で１／２時間攪拌した後、室 温で１８時間攪拌した。混合物を濾過して、沈澱したＤＣＵを除去し、塩化メチ レンを真空留去した。残渣の油状生成物を酢酸エチルに溶解し、０．１Ｍクエン 酸、水、重炭酸ナトリウム溶液、水および塩水で繰返し洗浄した。洗浄溶液を硫 酸マグネシウム上で乾燥して、濾過し、蒸発させて、ガラス状のフォーム状生成 物（４．１５ｇ）とした。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｓａｒ−ＯＢｚＩ（３． ８０ｇ）を塩化メチレン２０ｍｌに溶解し、この溶液にＨＣｌをＭＴＢＥ（１０ ｍｌ）に溶解したものを加えた。混合物を、ＴＬＣ分析により出発材料が検出さ れなくなるまで少なくとも１時間攪拌した。溶液を蒸発乾固し、高真空下に一晩 保持した。フォーム状生成物、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（１．１４ｇ）およびＨＯ Ａｔ（０．８１ｇ）を、塩化メチレン２０ｍｌに溶解した。溶液を氷浴で冷却し 、ＤＣＣ（１．２４ｇ）およびＤＩＰＥＡ（１．５ｍｌ）で処理した。反応混合 物を低温で０．５時間攪拌した後、室温で１．５時間攪拌した。沈澱したＤＣＵ を濾去し、塩化メチレンを酢酸エチル５０ｍｌで置換し、溶液をクエン酸、水、 重炭酸塩溶液、水、および塩水で洗浄した。洗浄した有機溶液を硫酸マグネシウ ム上で乾燥し、蒸発してフォーム状生成物（３．６６ｇ）とした。フォーム状生 成物を、ジペプチドについて上記したようにＨＣｌで処理し、Ｈ−Ａｌａ−Ａｒ ｇ（Ｐｂｆ）−Ｓａｒ−ＯＢｚｌを塩酸塩として得た。 Ｈ−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ） −ＯＢｚＩの合成 ＦｍｏｃＲ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１−Ｎａｌ）ＬＡ−ＯＨ（１当量）、Ｈ −Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｓａｒ−ＯＢｚＩ（１当量）、ＨＯＡＴ（１．２ 当量）およびＤＩＰＥＡ（２．２当量）をＤＭＦ（１２容）に溶解したものを０ ℃に冷却し、ＨＢＴＵ（１．２当量）を加えた。溶液を周囲温度まで加熱し、５ ０分間攪拌した。この溶液に水（２５容）を加えて、ペプチドを沈澱させた。固 形生成物を濾過によって集めた。湿りの残っている固形生成物を熱エタノール（ １５容）に溶解した後、３０℃まで冷却しながら攪拌した。生成する固形生成物 を濾過によって集め、乾燥して、生成物を７５％の収率で得た。ＨＰＬＣ純度９ １面積％。固形生成物を９：１ＴＨＦ／ピペリジン（１５容）に溶解し、周囲温 度で５０分間攪拌した。ペプチドを沈澱させるため、ＭＴＢＥ（１５容）を加え た。固形生成物を濾過によって集めた後、温エタノール（８容）で粉砕した。攪 拌しながら周囲温度まで冷却した後、固形生成物を集めて、乾燥した。収率，９ ２％。ＨＰＬＣ純度，９３面積％。 ＦｍｏｃＩＥ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）ＬＲ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１− Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）−ＯＢｚＩの合成 ＦｍｏｃＩＥ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）Ｌ−ＯＨ（１当量）、Ｈ−Ｒ（Ｐｂ ｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）−ＯＢｚＩ（１ 当量）、ＨＯＡＴ（１．２当量）、およびＤＩＰＥＡ（２当量）をＤＭＦ（１３ ．５容）に溶解したものを０℃に冷却し、ＨＢＴＵを加えた。溶液を周囲温度ま で加温し、１時間攪拌した。水（２０容）を加えて、ペプチドを沈澱させた。固 形生成物を集め、メタノール（８容）で粉砕した。固形生成物を集めて、乾燥し 、９８／２ ＤＣＭ／メタノール（５容）に溶解した。溶液を、９８／２ ＤＣ Ｍ／メタノール中シリカゲル７００ｇを含むカラムに加えた。カラムを、９８／ ２ ＤＣＭ／メタノール１．６リットル、次いで９７／３ ＤＣＭ／メタノール １リットル、および９５／５ ＤＣＭ／メタノール８リットルで溶出した。生成 物を含む画分を合わせて、濃縮し、フォーム状生成物とした。収率，８０．７％ ，ＨＰＬＣ純度，８５面積％。ＦｍｏｃＩＥ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）ＬＲ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１− Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）−ＯＨの合成 ＦｍｏｃＩＥ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）ＬＲ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１− Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）−ＯＢｚＩを８：１ＤＣＭ／エタノール （１５容）に溶解したものを、Ｐｄ／Ｃ（０．４重量，Degussa型Ｅ１０１，１ ０％乾燥重量，５０％水）と共に充填した。反応容器を窒素置換および排気を３ 回行った後、水素雰囲気下に置き（バルーン）、周囲温度で２０時間攪拌した。 スラリーを、セライトの密に充填したベッドで濾過した。濾液を約２容まで濃縮 し、ＭＴＢＥ（１０容）を加えて、ペプチドを沈澱させた。固形生成物を集めて 、乾燥して灰色固形生成物とした。収率９６％、ＨＰＬＣ純度，８５．５面積％ 。［ＦｍｏｃＩＥ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）ＬＲ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１ −Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）］₂ＬｙｓＮＨ₂の合成 ＦｍｏｃＩＥ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）ＬＲ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１− Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）−ＯＨ（２．４当量）、（ＨＣｌ）₂Ｌ ｙｓＮＨ₂（１当量）、ＨＯＢＴ（２．５当量）、およびＥｔＰｒ₂Ｎ（４．８当 量）をＤＭＦ（１５容）にスラリーにしたものを、総ての固形物が溶解するまで （５分）周囲温度で攪拌した。溶液にＨＢＴＵ（２．５当量）を加えた。周囲温 度で２時間攪拌した後、水（３０容）を加えて、ペプチドを沈澱させた。粗製ペ プチドを濾過によって集めた。湿り残る固形生成物を熱エタノール（１２．５容 ）に溶解した後、一晩攪拌しながら周囲温度まで冷却した。固形生成物を集めて 、乾燥し、生成物を定量的収率で、ＨＰＬＣ純度８０面積％で得た。 ＡＦ１５７０５の合成 ［ＦｍｏｃＩＥ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）ＬＲ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１ −Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）］₂ＬｙｓＮＨ₂を９：１ＮＭＰ／ピペ リジン（１０容）に溶解したものを、周囲温度で１〜２時間攪拌した。水（１２ 容）を加えて、ペプチドを沈澱させた。固形生成物を集め、水（５容）で洗浄し て、乾燥した。乾燥固形生成物をＭＴＢＥ（１２容）で粉砕した後、ＡｃＣＮ（ ８容）で粉砕し、残留ピペリジン、フルベンおよびピペリジン・フルベン付加生 成物を除去した。固形生成物を真空濾過によって集め、乾燥した。収率９７％。 ９５／５ＴＦＡ／水溶液（１３容）を窒素置換した後、０℃まで冷却した。これ に、上記で得た［Ｈ−ＩＥ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）ＬＲ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒ ｔ）（１−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）］₂ＬｙｓＮＨ₂（１重量）を 加えた。懸濁液を、総ての固形物が溶解するまで（３０分）０℃で攪拌した後、 周囲温度まで加温し、１００分間攪拌した。溶媒容積をロータリーエバポレータ ーを用いて５０％だけ減少させた後、氷／水（１５０容）を加えた。懸濁液を０ ℃で１．５時間攪拌して、ペプチドを溶解させた後、焼結ガラスで濾過した。ガ ラス器を水（５０ｍｌ）で洗浄した後、これを濾過し、生成物溶液に加えた。水 溶液を凍結し、凍結乾燥して固形物とし、これを０℃で保管した後、精製した。 生成物を、Ｃ１８改質シリカゲル（１００Å細孔度、１０μｍ球状粒子）のカラ ムに加え、約３０％〜約３５％アセトニトリル／水のグラディエントであって、 いずれの溶媒も０．１％ＴＦＡを含むもので溶出した。少なくとも９０％ＡＵＣ の所望なペプチドを含む画分を合わせ、濃縮して、凍結乾燥した。完全に保護さ れた前駆体からの精製ペプチドの収率は、通常は１０％〜２５％程度である。 集めたペプチドＡＦ１５７０５の端緒になる実施例１Ａにおけるペプチド断片 の構造の確認。マススペクトル分析法（ＭＳ）による分子量の確認、アミノ酸分 析（ＡＡＡ）による組成、およびEdman分解によるペプチド配列情報。 ¹ 結果は、予想されたＡＡ組成と一致する。² 結果は、予想されたＡＡ配列と一致する。³ 測定せず。 親イオン質量は、マススペクトル分析装置の範囲を超過し、保 護基は、分子上で二重荷電（すなわち、［ｍ＋２Ｈ］²⁺）を防止し、従って会合 イオンは検出されない。ペプチドのＰＥＧ化 Ｂ． ＰＥＧ２分岐状ＰＥＧを用いるジ−ＰＥＧ化ＡＦ１３９４８，分子量２０ ，０００の調製（工程図１を参照されたい） ＡＦ１３９４８を１００ｍＭのビシン，ｐＨ８．０に１００ｍｇ／ｍｌの濃度 で溶解し、１．２５倍モル過剰量の粉末状ＰＥＧ２（Shearwater Polymers，Inc .（ハンツビル，アラバマ）から市販されている）に加え、反応が完結するまで 、典型的には１〜２時間室温で攪拌した。反応をYMC ODS AQカラムを用いて、４ ０〜６５％アセトニトリルのグラディエントを用いて逆相ＨＰＬＣによって監視 した。反応が完了したならば、溶液を第二の１．２５モル過剰量の粉末状ＰＥＧ ２に加え、ＡＦ１３９４８の各１モルについて、ＰＥＧ２を全部で５モル用いて 工程を４回反復した。溶液をＰＢＳで２倍に希釈して粘度を減少させ、予めＰＢ Ｓで平衡にして溶出したsuperdex200カラム(Pharmacia)に加えた。サイズ排除カ ラムからの画分を、逆相ＨＰＬＣによって分析した。任意のモノ−ＰＥＧ−ＡＦ １３９４８の前に溶出したジ−ＰＥＧ−ＡＦ１３９４８を含む画分をプールし、 ５℃で保管し、または凍結乾燥した。 Ｃ． ＳＰＡ−ｍＰＥＧを用いるジ−ＰＥＧ化ＡＦ１３９４８，分子量２０，０ ００の調製（工程図３を参照されたい）。 ＡＦ１３９４８を１００ｍＭのビシン，ｐＨ８．０に１００ｍｇ／ｍｌの濃度 で溶解し、５倍モル過剰量の粉末状ＳＰＡ−ｍＰＥＧ（Shearwater Polymers，I nc．（ハンツビル，アラバマ）から市販されている）に加え、反応が完結するま で、典型的には２時間室温で攪拌した。反応を逆相(YMC ODS AQ)ＨＰＬＣにより 監視し、反応が完結したとき、溶液を脱イオン水で１０倍に希釈し、ｐＨ７．０ の２ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡にしたＳＰ−セファロースカラムに加え た。未反応ＰＥＧおよびＮＨＳは、カラム中を流れた。次いで、ＰＥＧ化したＡ Ｆ１３９４８を０〜１５０ｍＭ ＮａＣｌグラディエントを用いて溶出し、ジ −ＰＥＧ化体はモノ−ＰＥＧ化体の前に溶出した。画分を逆相ＨＰＬＣによって 分析し、適当な画分を合わせた。ジ−ＰＥＧ−ＡＦ１３９４８は、緩衝液をＰＢ Ｓに交換し、５℃で保管するかまたは凍結乾燥した。 Ｄ． ｍＰＥＧアルデヒドを用いるジ−ＰＥＧ化ＡＦ１３８４８，分子量２０， ０００の調製（工程図２を参照されたい） ＡＦ１３９４８を１００ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０に１０ｍｇ／ｍｌ の濃度で溶解し、６倍モル過剰量の粉末状ＰＥＧアルデヒド（Shearwater Polym ers，Inc．（ハンツビル，アラバマ）から市販されている）に加え、１Ｍ水素化 シアノホウ素ナトリウムを加え、最終水素化シアノホウ素ナトリウム濃度を１０ ０ｍＭとした。溶液を室温で１８時間攪拌した後、3K(Amicon YM)限外濾過膜を 用いて緩衝液をＰＢＳに交換した。溶液をＰＢＳで２倍に希釈して、粘度を減少 させ、予めＰＢＳで平衡にして溶出したsuperdex 200カラム(Pharmacia)に加え た。サイズ排除カラムからの画分を、逆相ＨＰＬＣによって分析した。任意のモ ノ−ＰＥＧ−ＡＦ１３９４８の前に溶出したジ−ＰＥＧ−ＡＦ１３９４８を含む 画分をプールし、５℃で保管し、または凍結乾燥した。 Ｅ． ＳＰＡ−ｍＰＥＧを用いるジ−ＰＥＧ化ＡＦ１５７０５，分子量２０，０ ００（ジ−ＰＥＧ（２０Ｋ）ＡＦ１５７０５）の調製 ＡＦ１５７０５（重量２．３０ｇ）を、攪拌およびＮ₂置換を備えたフラスコ に入れ、室温に保持した。MilliQ Water(177ml)を加え、材料を溶解するまで攪 拌した。２０μｌ分量を取り出して、水で１ｍｌに希釈し、２８４ｎｍにおける ＵＶの読みから、濃度を測定した（９．３６ｍｇ／ｍｌ）。重炭酸ナトリウム （０．２９２１ｇ）を加えて、総て溶解するまで溶液を攪拌した（測定ｐＨは８ ）。Ｎ₂下でのグローブ・バッグにおいて、４分量のＭ−ＳＰＡ−ＰＥＧ−２０ ｋ(Shearwater Polymers，Inc.)を密封ボトルに秤量した（それぞれの分量は８ ．６７ｇ）。これらを密封したプラスチックバッグに入れ、反応に添加するまで ５℃に保持した。重炭酸ナトリウムが溶解した直後に１分量を加え、第二は０． ５時間後に加えた。第三分量は二回目の添加の１時間後に加え、第四分量は第三 分量を加えてから１時間後に加えた。反応物を室温で一晩攪拌した。反応混合物 を５％ＥｔＯＨ水溶液で９倍に希釈し、０．４５ミクロンの硝酸セルロースフィ ルターで濾過した。この材料を、強カチオン交換カラム(SP Sepharose Fast Flo w,１０ｃｍ×５３ｃｍ）に２０ｍｌ／分で送液した。材料を、２ｍＭリン酸ナト リウム，ｐＨ６．０ ９０分の後、２ｍＭリン酸ナトリウムから１０ｍＭリン酸 ナトリウム，ｐＨ６．０への６０分の傾斜、および最後に１０ｍＭリン酸ナトリ ウムから１００％ＰＢＳ，ｐＨ７．０までの９０分の傾斜からなるグラディエン トを用いてカラムから溶出した。このクロマトグラフィーの流速は１００ｍ１／ 分であり、検出器は２１５ｎｍに設定した。カラム画分を、直列のG3000SWx1お よびG4000SWx1 TSKカラムを用いるＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。＞９５ ％生成物を含む画分をプールし、A/G Technologies UFP-30-C-6A中空繊維カート リッジを用いて３３ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。保持物を５℃の循環浴で冷却し、 Ｎ₂置換した。生成物溶液を、６保持物容を交換するMilliQ水に緩衝液交換した 後、更に濃縮して６６ｍｇ／ｍｌとした。合成、精製および限外濾過の後に、生 成物２１ｇを回収した。MALDI-TOF（マトリックス・アシステド・レーザー・デ ソープション・タイム・オブ・フライト(matrix assisted laser desorption ti me of flight)）マススペクトル分析法による分析で、生成物は４６０００ダル トンを中心とする広汎な分子量分布を有することを決定した。生成物をトリプシ ン症かした後、逆相または混合様式ＨＰＬＣを行い、ＰＥＧＫ結合部位（両Ｎ− 末端）、および基礎になっているペプチドは分解しなかったことが明らかになっ た。 （注：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、出発ＰＥＧは公示されている２０ｋｄより は２１．５ｋｄであることを示しており、従って分子量＝２１５００（ＰＥＧ） ×２＋３２９５（ＡＦ１５７０５）＝４６０００である。） 実施例２ バイオアッセイ ペプチドの生物活性は、トロンボポエチン依存性細胞増殖分析法を用いて測定 することができる。ネズミＩＬ−３依存性Ｂａ／Ｆ３細胞を、全長のヒトＴＰＯ −Ｒでトランスフェクションした。ＩＬ−３が存在しない場合（ＷＥＨＩ−３で コンディショニングした培地）では、これらの細胞は、増殖についてはＴＰＯ依 存性である。親の未トランスフェクション細胞系は、ヒトＴＰＯには反応しない がＩＬ−３依存性のままである。 バイオアッセイは、上記の細胞系の両方について本発明による化合物を用いて 行った。細胞を、１０％ＷＥＨＩ−３でコンディショニングした培地を含む完全 ＲＰＭＩ−１０培地で成長させた後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＷＩＨＩ−３でコン ディショニングした培地を欠いた培地に再懸濁し、ペプチドまたはＴＰＯの希釈 物を２×１０⁴個／ウェルで含むウェルに加えた。細胞を、かつ下５％ＣＯ₂雰囲 気で３７℃で４８時間インキュベーションし、代謝活性をＭＴＴのホルマザンへ の還元によって測定し、５７０ｎｍでの吸収はＥＬＩＳＡプレートリーダーで測 定した。試験したペプチドは、第１表に示すように用量依存的にＴＰＯ−Ｒでト ランスフェクションしたＢａ／Ｆ３細胞の増殖を促進した。これらのペプチドは 、親細胞系には効果を示さない。実施例３ 結合親和性 本発明による化合物のＴＰＯ−Ｒに対する結合親和性を競合結合分析法で測定 した。マイクロタイター・プレートのウェルに１ｍｇのストレプトアビジンをコ ーティングし、ＰＢＳ／１％ＢＳＡでブロックした後、ビオチン化抗レセプター 固定化抗体（Ａｂ１７９）５０ｎｇでブロックした。次に、ウェルを、可溶性Ｔ ＰＯ−Ｒ回収物の１：１０希釈物で処理した。様々な濃度の試験化合物を、マル トース結合タンパク質のＣ−末端に融合した残基１〜１５６からなるＴＰＯの切 断型（ＭＢＰ−ＴＰＯ₁₅₆）の一定量と混合した。ペプチドＭＢＰ−ＴＰＯ₁₅₆混 合物をＴＰＯ−Ｒをコーティングしたウェルに加え、４℃で２時間インキュベ− ションした後、ＰＢＳで洗浄した。平衡で結合したＭＢＰ−ＴＰＯ₁₅₆の量を、 ＭＢＰに対するウサギ抗血清を加えた後、アルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗 ウサギＩｇＧを加えた。次に、それぞれのウェルにおけるアルカリ性ホスファタ ーゼの量を、標準的方法を用いて測定した。 分析は、試験化合物の濃度範囲に亙って行い、結果をグラフに表し、ｙ軸が結 合したＭＢＰ−ＴＰＯ₁₅₆を表し、ｘ軸が試験化合物の濃度を表すようにする。 次いで、固定化ＴＰＯ−Ｒに結合したＭＢＰ−ＴＰＯ₁₅₆の量の５０％（ＩＣ₅₀ ）だけ還元する濃度を測定することができる。 実施例４ この実施例では、対照化合物ＡＦ１３９４８に対する各種の置換、欠失および 付加を、３種類の分析法を用いて分析した。第一に、ＭＴＴ細胞増殖分析を、上 記の方法で行った。第二に、マイクロフィジオメーター(microphysiometer)分析 法を行った(Molecular Devices Corp.)。基本的には、この分析法では、本発明 の化合物によるＴＰＯレセプター刺激に反応する細胞外培地の酸性化の速度を測 定した。ＥＣ₅₀の範囲を、上記のＩＣ₅₀についてと同様に象徴的に示す。最後に 、レセプター分析法を行った。ｃ−ｆｏｓ／ルシフェラーゼリポータープラスミ ドでトランスフェクションしたＢａＦ３／ＴＰＯＲ細胞を０．１％ＷＥＨＩ−３ でコンディショニングした培地を含む完全ＲＰＭＩ−１０培地で一晩絶食(starv ed)した後、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＷＥＨＩ−３でコンディショニング した培地を欠いている培地に再懸濁し、５×１０⁵個／ウェルのペプチドの連続 希釈物を含むウェルに加えた。細胞を、加湿した５％ＣＯ₂雰囲気で３７°で２ 時間インキュベーションし、ルシフェラーゼ発現を、ルシフェリン基質を添加し た後発光計で測定した。第１表 第２表 実施例５ この実施例では、様々なＰＥＧ化ペプチドの薬物動態挙動を決定した。化合物 の薬物動態は、その薬理活性の重要な決定基である。薬物動態プロフィールの重 要な成分は、実験室動物の血漿中の化合物の持続性である。この持続性は、通常 は投与後の時間の関数として血漿中の化合物濃度に関して表される。 これらの実験を通じて、雄の２０〜２５ｇｋＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。２ ０００ｍｌの容量を、ＩＶまたはＳＣ注射した。ビヒクルはDulbeccoのＰＢＳ、 ５％ＤＭＳＯ、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡであった。血漿は、凝固防止剤として ヘパリンを用いて屠殺時に回収した。 化合物濃度を、リポーター細胞分析法を用いて測定した。血漿の希釈物を、Ｂ ａｆ／３ ＴＰＯｒ／ｆｏｓ／ｌｕｘ構築物３に加えた。ルシフェラーゼ発現を 、ルシフェリン基質を添加した後に、発光計で測定した。個々の血漿試料の刺激 活性を、血漿の容積当たりの化合物のペプチド当量として表した濃度に変換した （ｎＭまたはｎｇ／ｍｌ）。この濃度は、親化合物を用いるリポーター分析法で 構築した標準曲線と比較することによって得た。 第３表に、化合物ＡＦ１３９４８およびジ−ＰＥＧ化ＡＦ１３９４８（ポリエ チレングリコール（ＰＥＧ）平均分子量＝５０００Ｄ）の血漿中の濃度を７００ μｇペプチド当量／ｋｇの注射後の時間の関数として示す。ＡＦ１３９４８を投 与することによって、６０分ＰＩまでビヒクルを注射したマウスに存在する濃度 を上回って検出可能な血漿中の活性を生じる。５Ｋ ＰＥＧを付加すると、血漿 中濃度が１００倍を上回って増加し、血漿中で検出することができる時間が少な くとも２４０分ＰＩまで延長される。第３表 第４表に、５００μｇペプチド当量／ｋｇの注射後の時間の関数としての化合 物ジ−ＰＥＧ（５Ｋ）−ＡＦ１３９４８およびジ−ＰＥＧ（２０Ｋ）−ＡＦ１３ ９４８の血漿中濃度を示す。２０Ｋ ＰＥＧで修飾した化合物の血漿中の濃度お よび持続性は、ジ−ＰＥＧ（５Ｋ）−ＡＦ１３９４８のものより著しく増加する 。 第４表 第５表は、１００、１０および１μｇペプチド当量の注射後の化合物ジ−ＰＥ Ｇ（２０Ｋ）−ＡＦ１３９４８の血漿中濃度を示し、観察の時間を１２０時間Ｐ Ｉまで延長する。血漿中に観察された濃度は、投与用量に比例することが分かっ た。化合物を１００μｇ／ｋｇの単回ＩＶ投与量を投与すると、少なくとも９６ 時間ＰＩ血漿中濃度が上昇した。 第５表 第６表は、ジ−ＰＥＧ（２０Ｋ）−ＡＦ１３９４８の１０μｇペプチド当量を ＳＣおよびＩＶ注射した後の血漿中濃度を示す。単回１０μｇペプチド当量／ｋ ｇ用量のＳＣ注射により、９６時間ＰＩ血漿中活性が増加した。２つの投与経路 で得られた血漿中濃度のプロフィールは、ＳＣ投与したジ−ＰＥＧ（２０Ｋ）− ＡＦ１３９４８のバイオアベイラビリティが良好であることを示している。 第６表 また、第１図は、ＧＷ３５０７８１またはジ−ＰＥＧ（５Ｋ）−ＡＦ１３９４ ８が、ペプチドの非ＰＥＧ化体と比較して高い安定性を有する、すなわち半減期 が長いことを示している。それだけで、第１図は、ＰＥＧ化ペプチドがヒト血清 中で良好なバイオアベイラビリティを有し、安定性が高いことを示している。 実施例６ 上記の分析法を用いて、ＰＥＧで様々に誘導体形成したペプチドの薬物動態プ ロフィールを決定した。この実験では、ペプチドは、工程図１〜３に示されるよ うに分岐状ＰＥＧ２（２０Ｋ）、エステル結合ＰＥＧ（ＳＰＡ）、およびアルデ ヒド結合ＰＥＧ（ＡＬＤＨ）を用いて誘導体形成した。第２図は、１０μｇペプ チド当量／ｋｇをＳＣ注射した後の血漿中濃度を示す。第２図から、ＰＥＧで様 々に誘導体形成した３種類のペプチド化合物は総て、好ましい薬物動態プロフィ ールを有することが明らかである。実施例７ この実験では、ＰＥＧ化ペプチドを、マウスモデルでの血小板減少症に対する 効果を評価した。この分析法では、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、０日目にカルボプラ チン（９０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）を投与することによって、マウスを血小板減少症 にする。ＧＷ３５０７８１（１ｍｇ／ｋｇ／日）、またはジ−ＰＥＧ（５Ｋ）− ＡＦ１３９４８、およびＧＷ３５０８０５（３２．５μｇ／ｋｇ／日）、または ジ−ＰＥＧ（２０Ｋ）−ＡＦ１３９４８を、１〜９日目に投与した（ｓ．ｃ，ｑ ｄ）。第３〜４図から、ＰＥＧ化ペプチドは、約１０日目にはカルボプラチンに よって誘発される血小板減少症を緩和することが明らかである。これらの結果は 、明らかに、本発明のＰＥＧ化ペプチドは、マウスモデルでの血小板減少症を緩 和することができることを示している。 実施例８ この実験では、ＰＥＧ化ペプチドを、正常マウスでの血小板濃度についての効 果を評価した。一態様では、ＧＷ３５０７８１（１ｍｇ／ｋｇ／日、およびＧＷ ３５０８０５（３２．５μｇ／ｋｇ／日）を１〜９日目に投与した（ｓ．ｃ．， ｑｄ）。１〜１５日目に、血液を尾静脈出血によって間隔を置いて採取した。第 ５〜６図から、ＰＥＧ化ペプチドは血小板減少症に効果があり、２０Ｋ−ジＰＥ Ｇ化ペプチドＧＷ５０８０５は５Ｋ−ＰＥＧ化ペプチドＧＷ３５０７８１より約 １００倍強力であることが明らかである。 もう一つの実験では、ＧＷ３５０７８１およびＧＷ３０５８０５を１〜５日目 に投与した（ｓ．ｃ．，ｑｄ）。６日目に、動物を屠殺し、末梢血の血小板数を 得た。第７〜９図は、ＰＥＧ化ペプチドの様々な用量の効果並びに複数回投与に 対する単回投与の効果を示している。これらの結果は、本発明のＰＥＧ化ペプチ ドをマウスモデルでの血小板を増加するのに用いることができることを明らかに 示している。 特許明細書などの総ての著書および文献の本願における開示は、総ての内容は 、その開示の一部として本明細書に引用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ｗ (72)発明者 スティーブン、イー．クウィーラ アメリカ合衆国カリフォルニア州、メンロ ー、パーク、ヘッジ、ロード、111 (72)発明者 クリスチャン、エム．ゲイツ アメリカ合衆国カリフォルニア州、サン タ、クルーズ、ブランシフォーテ、ドライ ブ、3043 (72)発明者 ピーター、ジェイ．シャーツ アメリカ合衆国カリフォルニア州、マウン テン、ビュー、マーリッチ、ウェイ、ナン バー15、2080 (72)発明者 パラニアッパン、バラサブラマニアン アメリカ合衆国カリフォルニア州、クーパ ティノ、ドロアーズ、アベニュ、21856 (72)発明者 クリストファー、アール．ワグストロム アメリカ合衆国カリフォルニア州、ロス、 アルトス、ファーンドン、アベニュ、1909 (72)発明者 リチャード、ウェイン、ヘンドレン アメリカ合衆国ノースカロライナ州、キャ リー、バスティール、コート、105 (72)発明者 ランドルフ、ビー．ディプリンス アメリカ合衆国ノースカロライナ州、ロー リ、ストックブリッジ、サークル、8805― 102 (72)発明者 スレクハ、ポッデュトゥリ アメリカ合衆国カリフォルニア州、サンノ ゼ、モンターラ、プレイス、3280 (72)発明者 キュン、イン アメリカ合衆国カリフォルニア州、サンノ ゼ、モンテージ、コート、1819

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 式(I) （上記式中、 Ｘ₁は、水素、またはアシルであり、 Ｘ₂は、Ｇ、またはサルコシン（Ｓａｒ）であり、 Ｘ₃は、Ｒ、Ａ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、またはＮ−アセチルリシン（Ａｃ− Ｌｙｓ）であり、 Ｘ₄は、Ｑ、またはＥであり、 Ｘ₅は、Ｗ、Ｌ−１−ナフチルアラニン（１−Ｎａｌ）、またはＦであり、 Ｘ₆は、Ａ、５−アミノペンタン酸（Ａｖａ）、または２−アミノ酪酸（Ａｂｕ ）であり、 Ｘ₇は、Ａ、ジフェニルアラニン（Ｄｉｐｈｅ）であるか、またはＸ₇は存在せず 、 Ｘ₈は、ｐ−アミノフェニルアラニン（ｐ−アミノ−Ｐｈｅ）、Ｎ−アセチルリ シン（Ａｃ−Ｌｙｓ）であるか、またはＸ₈は存在せず、 Ｘ₉およびＸ_9'は同一であるかまたは異なっており、Ａ、βＡ、ｎ−メチルアラ ニン（ｎ−Ｍｅ−Ａｌａ）、サルコシン（Ｓａｒ）であるか、またはＸ₉および Ｘ_9'は存在せず、 Ｘ₁₀およびＸ_10'は同一であるかまたは異なっており、βＡであるか、または Ｘ10およびＸ_10'は存在しない） を有する化合物、および その薬学上許容可能な誘導体であって、 但し、化合物を除くもの。 ２． それらの薬学上許容可能な誘導体から選択される、請求項１に記載の化合物。 ３． 上記化合物が親水性ポリマーに共有結合している、請求項１または２に 記載の化合物。 ４． 上記親水性ポリマーの平均分子量が約５００〜約４０，０００ダルトン である、請求項３に記載の化合物。 ５． 上記親水性ポリマーの平均分子量が約５，０００〜約２０，０００ダル トンである、請求項４に記載の化合物。 ６． 上記親水性ポリマーがポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコ ール、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、およびそれらのコポリマーからなる群から 選択される、請求項３〜５のいずれか１項に記載の化合物。 ７． 上記ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項６に記載の化合 物。 ８． 上記化合物の二量体サブユニットのそれぞれが親水性ポリマーに共有結 合している、請求項３〜７のいずれか１項に記載の化合物。 および それらの薬学上許容可能な誘導体から選択される化合物。 １０． 親水性ポリマーに共有結合した化合物 １１． 化合物 （式中、ｎは約４５０である）。 １２． （Ｈ）−ＡＤＧＰＴＬＲＥＷＩＳＦ（Ａｖａ）ＡＤＧＰＴＬＲＥＷＩ ＳＦ（ＮＨ₂）、および および その薬学上許容可能な誘導体 から選択される化合物。 １３． 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物と、薬学上許容可能な キャリヤーを含んでなる、医薬組成物。 １４． 治療に用いるための請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。 １５． トロンボポエチン作動薬での治療に感受性を有する疾患に罹っている 患者の治療法であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物の治療上 有効用量または量を患者に投与することを含んでなる、方法。 １６． トロンボポエチン作動薬が介在する症状の治療に用いる医薬の製造に おける、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物の使用。