CN111051332A - 免疫调节剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新颖大环肽，其抑制PD‑1/PD‑L1和PD‑L1/CD80蛋白质/蛋白质相互作用且因此适用于改善各种疾病，包括癌症及感染性疾病。

Description

免疫调节剂
相关申请案的交叉参考
本申请要求2017年10月3日申请的美国临时申请62/567,323的权益，其全部内容全文并入。
技术领域
本发明提供新颖的大环肽，其抑制PD-1/PD-L1及CD80/PD-L1蛋白质/蛋白质相互作用且因此适用于改善各种疾病，包括癌症及感染性疾病。
现有技术
蛋白程序死亡1(PD-1)为受体CD28家族的抑制成员，该家族亦包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1表达于活化B细胞、T细胞及骨髓细胞上(Agata等人,见上文；Okazaki等人,Curr.Opin.Immunol.,14:779-782(2002)；Bennett等人,J.Immunol.,170:711-718(2003))。
PD-1蛋白质为作为Ig基因超家族之一部分的55kDa I型跨膜蛋白(Agata等人,Int.Immunol.,8:765-772(1996))。PD-1含有膜近端免疫受体酪氨酸抑制基元(ITIM)及膜远程基于酪氨酸的切换基元(ITSM)(Thomas,M.L.,J.Exp.Med.,181:1953-1956(1995)；Vivier,E.等人,Immunol.Today,18:286-291(1997))。虽然结构上与CTLA-4类似，但PD-1缺乏对CD80CD86(B7-2)结合至关重要的MYPPY基元。已鉴别PD-1的两种配体，PD-L1(B7-H1)及PD-L2(b7-DC)。已展示在与表达PD-L1或PD-L2的细胞相互作用后，表达PD-1的T细胞的活化下调(Freeman等人,J.Exp.Med.,192:1027-1034(2000)；Latchman等人,Nat.Immunol.,2:261-268(2001)；Carter等人,Eur.J.Immunol.,32:634-643(2002))。PD-L1及PD-L2皆为B7蛋白质家族成员，其结合至PD-1，但不结合至其它CD28家族成员。PD-L1配体在多种人类癌症中为充足的(Dong等人,Nat.Med.,8:787-789(2002))。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润性淋巴球减少、T细胞受体介导的增生减少及癌细胞免疫逃避(Dong等人,J.Mol.Med.,81:281-287(2003)；Blank等人,Cancer Immunol.Immunother.,54:307-314(2005)；Konishi等人,Clin.Cancer Res.,10:5094-5100(2004))。免疫抑制可通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用而逆转，且当PD-1与PD-L2的相互作用亦阻断时，效应相加(Iwai等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:12293-12297(2002)；Brown等人,J.Immunol.,170:1257-1266(2003))。
亦已展示PD-L1与CD80相互作用(Butte MJ等人,Immunity；27:111-122(2007))。已展示PD-L1/CD80对表达免疫细胞的相互作用为抑制相互作用。已展示阻断此相互作用即消除此抑制相互作用(Paterson AM等人,J Immunol.,187:1097-1105(2011)；Yang J等人,J Immunol.Aug 1；187(3):1113-9(2011))。
当表达PD-1的T细胞接触表达其配体的细胞时，响应于抗原性刺激的功能活性(包括增生、细胞激素分泌及细胞毒性)减少。PD-1/PD-L1或PD-L2相互作用在感染或肿瘤溶解期间或在自身耐受性出现期间下调免疫反应(Keir,M.E.等人,Annu.Rev.Immunol.,26:Epub(2008))。慢性抗原刺激，诸如在肿瘤疾病或慢性感染期间出现的慢性抗原刺激，导致T细胞表达升高含量的PD-1且在针对慢性抗原的活性方面功能异常(评述于Kim等人,Curr.Opin.Imm.(2010)中)。此称为“T细胞耗竭”。B细胞亦呈现PD-1/PD-配体抑制及“耗竭”。
已展示使用针对PD-L1的抗体阻断PD-1/PD-L1接合恢复且强化许多系统中的T细胞活化。患有晚期癌症的患者受益于使用针对PD-L1的单克隆抗体的疗法(Brahmer等人,New Engl.J.Med.(2012))。肿瘤及慢性感染的临床前动物模型已展示通过单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1路径可增强免疫反应且引起肿瘤排斥反应或控制感染。经由PD-1/PD-L1阻断的抗肿瘤免疫疗法可强化针对许多组织学相异肿瘤的治疗性免疫反应(Dong,H.等人,“B7-H1pathway and its role in the evasion of tumor immunity”,J.Mol.Med.,81(5):281-287(2003)；Dong,H.等人,“Tumor-associated B7-H1promotes T-cell apoptosis:apotential mechanism of immune evasion”,Nat.Med.,8(8):793-800(2002))。
干扰PD-1/PD-L1相互作用使得具有慢性感染的系统中的T细胞活性增强。阻断PD-L1使得具有慢性淋巴球性脉络丛脑膜炎病毒感染的小鼠改良病毒清除且恢复免疫力(Barber,D.L.等人,“Restoring function in exhausted CD8T cells during chronicviral infection”,Nature,439(7077):682-687(2006))。感染HIV-1的人类化小鼠展示CD4+T细胞针对病毒血症的保护及病毒消耗增强(Palmer等人,J.Immunol.(2013))。经由针对PD-L1的单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1可恢复HIV患者(Day,Nature(2006)；Petrovas,J.Exp.Med.(2006)；Trautman,Nature Med.(2006)；D'Souza,J.Immunol.(2007)；Zhang,Blood(2007)；Kaufmann,Nature Imm.(2007)；Kasu,J.Immunol.(2010)；Porichis,Blood(2011)),HCV patients(Golden-Mason,J.Virol.(2007)；Jeung,J.Leuk.Biol.(2007)；Urbani,J.Hepatol.(2008)；Nakamoto,PLoS Path.(2009)；Nakamoto,Gastroenterology(2008))and HBV patients(Boni,J.Virol.(2007)；Fisicaro,Gastro.(2010)；Fisicaro等人，Gastroenterology(2012)；Boni等人，Gastro.(2012)；Penna等人，J.Hep.(2012)；Raziorrough,Hepatology(2009)；Liang,World J.Gastro.(2010)；Zhang,Gastro.(2008))的T细胞的活体外抗原特异性功能。
亦已展示阻断PD-L1/CD80相互作用刺激免疫力(Yang J.等人,J Immunol.Aug 1；187(3):1113-9(2011))。已展示由PD-L1/CD80相互作用的阻断产生的免疫刺激经由与另外PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2相互作用的阻断组合而增强。
假设免疫细胞表型改变为败血性休克的重要因素(Hotchkiss等人,Nat RevImmunol(2013))。这些改变包括PD-1及PD-L1的含量增加(Guignant等人,Crit.Care(2011))，PD-1及PD-L1的含量增加的败血性休克患者的细胞展现T细胞细胞凋亡水平增加。针对PD-L1的抗体可降低免疫细胞凋亡的水平(Zhang等人,Crit.Care(2011))。此外，缺少PD-1表达的小鼠与野生型小鼠相比对败血性休克症状更具抗性。Yang J.等人,JImmunol.Aug 1；187(3):1113-9(2011))。研究已揭示使用抗体阻断PD-L1相互作用可抑制不当免疫反应且改善病征。
除增强对慢性抗原的免疫反应以外，亦已展示阻断PD-1/PD-L1路径增强对疫苗接种(包括在慢性感染的情形下的治疗性疫苗接种)的反应(Ha,S.J.等人,“Enhancingtherapeutic vaccination by blocking PD-1-mediated inhibitory signals duringchronic infection”,J.Exp.Med.,205(3):543-555(2008)；Finnefrock,A.C.等人,“PD-1blockade in rhesus macaques:impact on chronic infection and prophylacticvaccination”,J.Immunol.,182(2):980-987(2009)；Song,M.-Y.等人,“Enhancement ofvaccine-induced primary and memory CD8+t-cell responses by soluble PD-1”,J.Immunother.,34(3):297-306(2011))。
本申请所述的分子在生物化学及基于细胞的实验系统中证明阻断PD-L1与PD-1的相互作用的能力。这些结果与治疗性给药增强癌症或慢性感染的免疫力的潜能(包括治疗性疫苗)相符。
本申请所述的大环肽能够抑制PD-L1与PD-1及与CD80的相互作用。这些化合物已证明高度有效结合至PD-L1、阻断PD-L1与PD-1或CD80的相互作用且能够促进增强T细胞功能活性，因此使其成为非经肠、经口、经肺、经鼻、经颊及持续释放制剂的候选物。
在第一方面，本公开提供式(I)的化合物
Figure BDA0002391600630000041
或其药学上可接受的盐，其中：
A选自键，
Figure BDA0002391600630000051
其中：
Figure BDA0002391600630000052
表示与羰基基团的连接点且
Figure BDA0002391600630000053
表示与氮原子的连接点；
z为0、1或2；
w为1或2；
n为0或1；
m为1或2；
m’为0或1；
p为0、1或2；
Rx选自氢、氨基、羟基和甲基；
R14和R15独立地选自氢和甲基；和
Rz选自氢和–C(O)NHR16；其中R16选自氢、-CHR17C(O)NH2、-CHR17C(O)NHCHR18C(O)NH2和-CHR17C(O)NHCHR18C(O)NHCH2C(O)NH2；其中R17选自氢和–CH2OH且其中R18选自氢和甲基；
Rv为氢或天然氨基酸侧链；
Rc、Rf、Rh、Ri和Rm为氢；
RL为甲基；
Rn为氢或甲基，或Rv和Rn形成吡咯烷环；
Ra、Rj和Rk各自独立地选自氢和甲基；
R1、R3、R6、R8、R9、R10和R13独立地选自天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链；
Q为5至12元碳链，其任选地含有一个碳-碳双键或苯氧基基团；
R2、R4、R5和R7独立地选自天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链，或与以下所述的偕偶R基团形成环；
Rb为甲基，或Rb和R2与它们所连接的原子一起形成环，所述环选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑；其中各个环任选地取代有1至4个基团，所述基团独立地选自氨基、氰基、甲基、卤素和羟基；
Rd为氢或甲基，或Rd和R4与它们所连接的原子一起可形成环，所述环选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑；其中各个环任选地取代有1至4个基团，所述基团独立地选自氨基、氰基、甲基、卤素、羟基和苯基；
Re为氢或甲基，或Re和R5与它们所连接的原子一起可形成环，所述环选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑；其中各个环任选地取代有1至4个基团，所述基团独立地选自氨基、氰基、甲基、卤素和羟基；和
Rg为氢或甲基，或Rg和R7与它们所连接的原子一起可形成环，所述环选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑；其中各个环任选地取代有1至4个基团，所述基团独立地选自氨基、经卤素基团任选取代的苄基、苄基氧基、氰基、环己基、甲基、卤素、羟基、经甲氧基基团任选取代的异喹啉基氧基、经卤素基团任选取代的喹啉基氧基、和四唑基；且其中所述吡咯烷和所述哌啶环任选地稠合至环己基、苯基或吲哚基团。
在第一方面的第一实施方案中，本公开提供式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐，其中A为
Figure BDA0002391600630000061
在第二实施方案中，
z为0；
w为1；
R14和R15为氢；和
Rz为–C(O)NHR16；其中R16为-CHR17C(O)NH2。
在第三实施方案中，根据权利要求3所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中
R1为经羟基任选取代的苄基；
R2为甲基，或与Rb一起形成环，所述环选自哌啶、哌嗪和吗啉；
R3选自-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H；
R4与Rd一起形成吡咯烷环；
R5选自-CH2(咪唑基)和-CH2NH2；
R6选自异丁基、-(CH2)2CO2H和-(CH2)2CONH2；
R7为氢，或与Rg一起形成经羟基任选取代的吡咯烷环；
R8为–(CH2)吲哚基；
R9选自-CH2OH和-(CH2)2NH2；和
R10选自–(CH2)吲哚基和–(CH2)苯并噻吩基，其各自任选地取代有–CH2CO2H。
在其它实施方案中，本发明提供一种增强、刺激和/或增加有需要的受试者的免疫反应的方法，该方法包括向所述受试者给药治疗有效量的式(I)化合物或其治疗学上可接受的盐。在其它实施方案中，该方法另外包含在式(I)化合物或其治疗学上可接受的盐之前、之后或同时给药额外药剂。在其它实施方案中，所述额外药剂为抗微生物剂、抗病毒剂、细胞毒性剂和/或免疫反应调节剂。在其它实施方案中，所述额外药剂为HDAC抑制剂。在其它实施方案中，所述额外药剂为TLR7和/或TLR8激动剂。
在其它实施方案中，本发明提供一种抑制有需要的受试者的癌细胞生长、增生或转移的方法，该方法包括向所述受试者给药治疗有效量的式(I)化合物或其治疗学上可接受的盐。应理解，该抑制可为直接或间接的。在其它实施方案中，所述癌症选自黑素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结肠直肠癌、去势抵抗性的前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰脏癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌及乳癌、及血液科恶性病。
在其它实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者的感染性疾病的方法，该方法包括向所述受试者给药治疗有效量的式(I)化合物或其治疗学上可接受的盐。在其它实施方案中，所述感染性疾病由病毒引起。在其它实施方案中，所述病毒选自HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒及流感病毒。
在其它实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者的败血性休克的方法，该方法包括向所述受试者给药治疗有效量的本申请所述的一或多种大环肽。
在其它实施方案中，本发明提供一种阻断受试者的PD-L1与PD-1和/或CD80的相互作用的方法，该方法包括向所述受试者给药治疗有效量的本申请所述的至少一种大环肽。
在式(I)化合物中，优选R1侧链为：苯丙氨酸、酪氨酸、3-噻吩-2-基、4-甲基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、异色氨酸、3-甲基苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、3,4-二氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、3,4-二甲氧基苯丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸、4-二氟甲基苯丙氨酸、2-甲基苯丙氨酸、2-萘基丙氨酸、色氨酸、4-吡啶基、4-溴苯丙氨酸、3-吡啶基、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、联苯丙氨酸及3-氯苯丙氨酸；以及2,4-二氨基丁烷。
在R2并非环的一部分的式(I)化合物中，优选R2侧链为：丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸。
在式(I)化合物中，优选R3侧链为：天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、丙氨酸、2,3-二氨基丙烷和2,4-二氨基丁烷。
在R4并非环的一部分的式(I)化合物中，优选R4侧链为：缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸和甘氨酸。
在式(I)化合物中，优选R5侧链为：氨基甲烷、组氨酸、天冬酰胺、2,3-二氨基丙烷、丝氨酸、甘氨酸、2,4-二氨基丁烷、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和3-噻唑基丙氨酸。
在式(I)化合物中，优选R6侧链为：亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、赖氨酸、3-环己烷、苏氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁烷、丙氨酸、精氨酸及鸟氨酸(COCH3)。
在R7并非环的一部分的式(I)化合物中，优选R7侧链为：甘氨酸、2,4-二氨基丁烷、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸及2,4-二氨基丁烷(C(O)环丁烷)。
在式(I)化合物中，优选R8侧链为色氨酸及1,2-苯并异噻唑啉基丙氨酸。
在式(I)化合物中，优选R9侧链为：丝氨酸、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、2,4-二丁胺、苏氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸、2,3-二氨基丙烷、精氨酸、天冬氨酸和酪氨酸。
在式(I)化合物中，优选R10侧链为：任选经取代的色氨酸、苯并异噻唑基丙氨酸、1-萘基丙氨酸及甲硫氨酸。
在式(I)化合物中，优选R11侧链为：正亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、甲硫氨酸、乙氧基甲烷、丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯基丙烷、谷氨酸、己烷和庚烷。
在R12并非环的一部分的式(I)化合物中，优选R12侧链为：正亮氨酸、丙氨酸、乙氧基甲烷、甲硫氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、甲氧基乙烷、亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、己烷、庚烷和甘氨酸。
在式(I)化合物中，优选R13侧链：精氨酸、鸟氨酸、丙氨酸、2,4-二氨基丁烷、2,3-二氨基丙烷、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、环丙基甲烷、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和2-氨基丁烷。
根据本发明，我们已发现特异性结合至PD-L1且能够抑制PD-L1与PD-1及CD80的相互作用的肽。这些大环肽展现活体外免疫调节功效，因此使其成为用于治疗包括癌症及感染性疾病的各种疾病的治疗性候选物。
术语“特异性结合(specific binding或specifically bind)”是指蛋白质与结合分子(诸如化合物或配体)之间的相互作用。相互作用取决于由结合分子识别的蛋白质的特别结构(亦即酶结合位点、抗原决定子或抗原决定基)的存在。举例而言，若化合物特异性结合蛋白质结合位点“A”，则在含有包括结合位点A的蛋白质及特异性结合至蛋白质结合位点A的经标记肽的反应物中存在该化合物将减小结合至该蛋白质的经标记肽的量。相比的下，化合物对蛋白质的非特异性结合并不导致经标记肽自蛋白质的浓度依赖性置换。
本发明意欲包括存在于本发明化合物中的原子的所有同位素。同位素包括原子数相同、但质量数不同的彼等原子。作为一般实例但非限制性地，氢的同位素包括氘及氚。碳的同位素包括13C及14C。本发明的同位素标记化合物一般可通过本领域普通技术人员已知的常规技术或通过类似于本申请所述的方法，使用适当同位素标记试剂代替原来使用的未标记试剂来制备。此类化合物可具有多种潜在用途，例如在测定生物活性时用作标准物及试剂。在稳定同位素的情况下，此类化合物可具有有利地调节生物学、药理学或药物动力学特性的潜能。
本申请所述的目标物的另一方面为所揭示的肽作为放射性标记配体用于配体结合分析的显影或用于监测活体内吸附、代谢、分布、受体结合或占有率或化合物处置的用途。举例而言，本申请所述的大环肽可使用放射性同位素125I制备，且所得放射性标记肽可用于显影结合分析或用于代谢研究。作为替代方案且出于相同目的，本申请所述的大环肽可通过使用本领域普通技术人员已知的方法的催化性氚化转化成放射性标记形式。
本发明的大环肽亦可通过使用本领域普通技术人员已知的方法添加放射性示踪剂而用作PET成像剂。
优选肽包括本申请所提供的大环肽中的至少一者且这些肽可包括于药物组合物及组合中。
除非在特定情形中另外限制，否则本申请所提供的定义非限制性地适用于本说明书通篇所用的术语。
一般熟习氨基酸及肽化学的技术者了解氨基酸包括由以下通式结构表示的化合物：
Figure BDA0002391600630000101
其中R和R′如本文所论述。
除非另外指明，否则如本申请中单独或作为另一基团之一部分使用的术语“氨基酸”包括(但不限于)连接至称为“α”碳的同一碳的氨基及羧基，其中R和/或R'可为天然或非天然侧链，包括氢。在“α”碳处的绝对“S”组态通常称为“L”或“天然”组态。在“R”及“R'“(主要)取代基等于氢的情况下，氨基酸为甘氨酸且并非手性。
如本申请所用，术语“天然氨基酸侧链”及“天然存在的氨基酸侧链”是指通常呈S-组态的任何天然存在的氨基酸(亦即L-氨基酸)(亦即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)的侧链。
如本申请所用，术语“非天然氨基酸侧链”及“非天然存在的氨基酸侧链”是指通常呈R-组态的任何天然存在的氨基酸(亦即D-氨基酸)侧链或除呈R-或S-组态的天然存在的氨基酸侧链(亦即分别D-或L-氨基酸)以外的选自以下的基团：
C2-C7烯基、C1-C3烷氧基C1-C3烷基、C1-C6烷氧基羰基C1-C3烷基、C1-C7烷基、C1-C3烷基硫基C1-C3烷基、酰氨基C1-C3烷基、氨基C1-C3烷基、氮杂吲哚基C1-C3烷基、苯并噻唑基C1-C3烷基、苯并噻吩基C1-C3烷基、苯甲氧基C1-C3烷基、羧基C1-C3烷基、C3-C14环烷基C1-C3烷基、二苯甲基、呋喃基C1-C3烷基、咪唑基C1-C3烷基、萘基C1-C3烷基、吡啶基C1-C3烷基、噻唑基C1-C3烷基、噻吩基C1-C3烷基；
联苯C1-C3烷基，其中联苯任选经甲基取代；
杂环基，其任选经一个、两个、三个、四个或五个独立地选自以下的基团取代：C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C1-C3烷基磺酰基氨基、酰氨基、氨基、氨基C1-C3烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、卤素、卤素C1-C3烷基、羟基、-NC(NH2)2、硝基及-OP(O)(OH)2；
吲哚基C1-C3烷基，其中所述吲哚基部分任选经一个选自C1-C3烷基、羧基C1-C3烷基、卤素、羟基及苯基的基团取代，其中所述苯基另外任选经一个、两个或三个独立地选自C1-C3烷氧基、C1-C3烷基及卤素的基团取代；
NRyRy’(C1-C7烷基)，其中Ry和Ry’独立地选自氢、C2-C4烯基氧基羰基、C1-C3烷基、C1-C3烷基羰基、C3-C14环烷基羰基、呋喃基羰基和苯基羰基。当所述烷基连接基团含有一个以上碳时，另一NRyRy’基团可在链上。
NRqRt羰基C1-C3烷基，其中Rq和Rt独立地选自氢、C1-C3烷基和三苯基甲基；
苯基，其任选经一个、两个、三个、四个或五个独立地选自以下的基团取代：C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C1-C3烷基磺酰基氨基、酰氨基、氨基、氨基C1-C3烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、卤素、卤素C1-C3烷基、羟基、-NC(NH2)2、硝基及-OP(O)(OH)2；
NRa'Rb'(C1-C7烷基)，其中Ra'及Rb'独立地选自氢、C2-C4烯氧基羰基、C1-C3烷基、C1-C3烷基羰基、C3-C6环烷基羰基、呋喃基羰基及苯基羰基。当烷基连接基团含有一个以上碳时，另一NRa'Rb'基团可在链上。
NRc'Rd'羰基C1-C3烷基，其中Rc'及Rd'独立地选自氢、C1-C3烷基及三苯甲基；
苯基C1-C3烷基，其中所述苯基部分任选经一个、两个、三个、四个或五个独立地选自以下的基团取代：C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C1-C3烷基磺酰基氨基、酰氨基、氨基、氨基C1-C3烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、卤素、卤素C1-C3烷基、羟基、-NC(NH2)2、硝基及-OP(O)(OH)2；以及
苯氧基C1-C3烷基，其中苯基任选经C1-C3烷基取代。
如本申请所用，术语“C2-C4烯基”是指具有二至四个碳原子、含有至少一个碳-碳双键的直链或分支链基团。
如本申请所用，术语“C2-C7烯基”是指具有二至七个碳原子、含有至少一个碳-碳双键的直链或分支链基团。
如本申请所用，术语“C2-C4烯氧基”是指经由氧原子连接至母分子部分的C2-C4烯基。
如本申请所用，术语“C1-C3烷氧基”是指经由氧原子连接至母分子部分的C1-C3烷基。
如本申请所用，术语“C1-C4烷氧基”是指经由氧原子连接至母分子部分的C1-C4烷基。
如本申请所用，术语“C1-C6烷氧基”是指经由氧原子连接至母分子部分的C1-C6烷基。
如本申请所用，术语“C1-C3烷氧基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的C1-C3烷氧基。
如本申请所用，术语“C1-C6烷氧基羰基”是指经由羰基连接至母分子部分的C1-C6烷氧基。
如本申请所用，术语“C1-C6烷氧基羰基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的C1-C6烷氧基羰基。
如本申请所用，术语“C1-C3烷基”是指衍生自含有一至三个碳原子的直链或分支链饱和烃的基团。
如本申请所用，术语“C1-C4烷基”是指衍生自含有一至四个碳原子的直链或分支链饱和烃的基团。
如本申请所用，术语“C1-C6烷基”是指衍生自含有一至六个碳原子的直链或分支链饱和烃的基团。
如本申请所用，术语“C1-C3烷基羰基”是指经由羰基连接至母分子部分的C1-C3烷基。
如本申请所用，术语“C1-C3烷基硫基”是指经由硫原子连接至母分子部分的C1-C3烷基。
如本申请所用，术语“C1-C3烷基硫基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的C1-C3烷基硫基。
如本申请所用，术语“C1-C3烷基磺酰基”是指经由磺酰基连接至母分子部分的C1-C3烷基。
如本申请所用，术语“C1-C3烷基磺酰基氨基”是指经由氨基连接至母分子部分的C1-C3烷基磺酰基。
如本申请所用，术语“酰氨基”是指-C(O)NH2。
如本申请所用，术语“酰氨基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的酰氨基。
如本申请所用，术语“氨基”是指-NH2。
如本申请所用，术语“氨基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的氨基。
如本申请所用，术语“氨基磺酰基”是指经由磺酰基连接至母分子部分的氨基。
如本申请所用，术语“氮杂吲哚基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子的氮杂吲哚基。氮杂吲哚基可经由基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本申请所用，术语“苯并噻唑基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子的苯并噻唑基。苯并噻唑基可经由基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本申请所用，术语“苯并噻吩基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子的苯并噻吩基。苯并噻吩基可经由基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本申请所用，术语“苯甲氧基”是指经由氧原子连接至母分子部分的苯甲基。
如本申请所用，术语“苯甲氧基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的苯甲氧基。
如本申请所用，术语“联苯C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的联苯基。联苯基可经由基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本申请所用，术语“羰基”是指-C(O)-。
如本申请所用，术语“羧基”是指-CO2H。
如本申请所用，术语“羧基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的羧基。
如本申请所用，术语“氰基”是指-CN。
如本申请所用，术语“C3-C14环烷基”是指具有三至十四个碳原子及零个杂原子的饱和单环、双环或三环烃环系统。双环及三环环可为稠合、螺环或桥接的。环烷基的代表性实例包括(但不限于)环丙基、环戊基、双环[3.1.1]庚基及金刚烷基。
如本申请所用，术语“C3-C14环烷基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的C3-C14环烷基。
如本申请所用，术语“C3-C14环烷基羰基”是指经由羰基连接至母分子部分的C3-C14环烷基。
如本申请所用，术语“呋喃基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的呋喃基。呋喃基可经由基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本申请所用，术语“呋喃基羰基”是指经由羰基连接至母分子部分的呋喃基。
如本申请所用，术语“卤素”及“卤代”是指F、Cl、Br或I。
如本申请所用，术语“卤素C1-C3烷基”是指经一个、两个或三个卤素原子取代的C1-C3烷基。
如本申请所用，术语“卤甲基”是指经一个、两个或三个卤素原子取代的甲基。
如本申请所用，术语“杂环基”是指含有一个、两个或三个独立地选自氮、氧及硫的杂原子的五元、六元或七元环。五元环具有零至两个双键且六元及七元环具有零至三个双键。术语“杂环基”亦包括双环基团，其中杂环基环与四元至六元芳族或非芳族碳环或另一单环杂环基稠合。本发明的杂环基经由基团中的碳原子连接至母分子部分。杂环基的实例包括(但不限于)苯并噻吩基、呋喃基、咪唑基、吲哚啉基、吲哚基、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基、噁唑基、哌嗪基、哌啶基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、吡咯并吡啶基、吡咯基、噻唑基、噻吩基及硫代吗啉基。
如本申请所用，术语“羟基”是指-OH。
如本申请所用，术语“咪唑基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的咪唑基。咪唑基可经由基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本申请所用，术语“吲哚基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的吲哚基。吲哚基可经由基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本申请所用，术语“萘基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的萘基。萘基可经由基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本申请所用，术语“硝基”是指-NO2。
如本申请所用，术语“NRa'Rb'“是指经由氮原子连接至母分子部分的两个基团Ra'及Rb'。Ra'及Rb'独立地选自氢、C2-C4烯氧基羰基、C1-C3烷基羰基、C3-C6环烷基羰基、呋喃基羰基及苯基羰基。
如本申请所用，术语“NRa'Rb'(C1-C3)烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的NRa'Rb'基团。
如本申请所用，术语“NRc'Rd'“是指经由氮原子连接至母分子部分的两个基团Rc'及Rd'。Rc'及Rd'独立地选自氢、C1-C3烷基及三苯甲基。
如本申请所用，术语“NRc'Rd'羰基”是指经由羰基连接至母分子部分的NRc'Rd'基团。
如本申请所用，术语“NRc'Rd'羰基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的NRc'Rd'羰基。
如本申请所用，术语“苯氧基”是指经由氧原子连接至母分子部分的苯基。
如本申请所用，术语“苯氧基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的苯氧基。
如本申请所用，术语“苯基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的苯基。
如本申请所用，术语“苯基羰基”是指经由羰基连接至母分子部分的苯基。
如本申请所用，术语“吡啶基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的吡啶基。吡啶基可经由基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本申请所用，术语“硫基”是指-S-。
如本申请所用，术语“磺酰基”是指-SO2-。
如本申请所用，术语“噻唑基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的噻唑基。噻唑基可经由基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本申请所用，术语“噻吩基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母分子部分的噻吩基。噻吩基可经由基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
术语“治疗”是指：(i)预防可能易患疾病、病症和/或病状、但尚未诊断出患病的患者出现该疾病、病症或病状；(ii)抑制该疾病、病症或病状，亦即遏制其发展；以及(iii)缓解该疾病、病症或病状，亦即使得该疾病、病症和/或病状和/或与该疾病、病症和/或病状相关联的症状消退。
大环肽与PD-L1的结合可例如通过诸如均相时间分辨荧光(HTRF)、表面等离子共振(SPR)、等温滴定量热法(ITC)、核磁共振光谱(NMR)及其类似物的方法测量。另外，大环肽与表达于细胞表面上的PD-L1的结合可如本申请所述在细胞结合分析中测量。
给药本申请所述的治疗剂包括(但不限于)给药治疗有效量的治疗剂。如本申请所用，术语“治疗有效量”是指(但不限于)治疗或预防通过给药本申请所述的PD-1/PD-L1结合抑制剂的组合物可治疗的病状的治疗剂的量。该量为足以展现可检测的治疗性或预防性或改善性效应的量。效应可包括例如(但不限于)本申请中所列举的病状的治疗或预防。受试者的精确有效量将取决于受试者的体型及健康状况、欲治疗的病状的性质及程度、治疗医师的建议及选择用于给药的治疗剂或治疗剂组合。因此，事先规定精确有效量为不适用的。
在另一个方面中，本发明系关于使用本发明的大环肽抑制受试者肿瘤细胞生长的方法。如本申请所证实，本发明的大环肽能够结合至PD-L1、妨碍PD-L1与PD-1之间的相互作用、与PD-L1与已知阻断与PD-1的相互作用的抗PD-1单克隆抗体的结合竞争、增强CMV特异性T细胞IFNγ分泌及增强HIV特异性T细胞IFNg分泌。因此，本发明的大环肽适用于调节免疫反应、治疗诸如癌症或感染性疾病的疾病、刺激保护性自体免疫反应或刺激抗原特异性免疫反应(例如通过共给药PD-L1阻断肽与所关注的抗原)。
为了使本发明可更易于理解，首先定义某些术语。在整个实施方案中，阐述其它定义。
术语“程序死亡配体1”、“程序细胞死亡配体1”、“蛋白质PD-L1”、“PD-L1”、“PDL1”、“PDCDL1”、“hPD-L1”、“hPD-LI”、“CD274”及“B7-H1”可互换使用且包括人类PD-L1的变体、同功异型物、物种同源物及具有至少一个与PD-L1共同的抗原决定基的类似物。完整PD-L1序列可见于
Figure BDA0002391600630000171
寄存编号NP_054862。
术语“程序死亡1”、“程序细胞死亡1”、“蛋白质PD-1”、“PD-1”、“PD1”、“PDCD1”、“hPD-1”及“hPD-I”可互换使用且包括人类PD-1的变体、同功异型物、物种同源物及具有至少一个与PD-1共同的抗原决定基的类似物。完整PD-1序列可见于
Figure BDA0002391600630000172
寄存编号U64863。
术语“细胞毒性T淋巴球相关抗原-4”、“CTLA-4”、“CTLA4”、“CTLA-4抗原”及“CD152”(参见例如Murata,Am.J.Pathol.,155:453-460(1999))可互换使用且包括人类CTLA-4的变体、同功异型物、物种同源物及具有至少一个与CTLA-4共同的抗原决定基的类似物(参见例如Balzano,Int.J.Cancer Suppl.,7:28-32(1992))。完整CTLA-4核酸序列可见于
Figure BDA0002391600630000173
寄存编号L15006。
术语“免疫反应”是指例如淋巴球、抗原呈现细胞、吞噬细胞、粒细胞及由以上细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括大环肽、细胞激素及补体)产生对侵入病原体、感染有病原体的细胞或组织、癌细胞或在自体免疫或病理性炎症的情况下正常人类细胞或组织的选择性损坏、破坏或自人体消除的作用。
如本申请所用，“不良事件”(AE)为与医药治疗的使用相关联的任何不利且一般不希望、甚至不当迹象(包括异常实验室研究结果)、症状或疾病。举例而言，不良事件可与响应于治疗的免疫系统活化或免疫系统细胞(例如T细胞)扩增相关联。医药治疗可具有一或多个相关AE且各AE可具有相同或不同的严重程度。提及能够“改变不良事件”的方法意指降低与不同治疗方案的使用相关联的一或多个AE的发生率和/或严重程度的治疗方案。
如本申请所用，“过度增生性疾病”是指细胞生长增加超过正常水平的病状。举例而言，过度增生性疾病或病症包括恶性疾病(例如食道癌、结肠癌、胆道癌)及非恶性疾病(例如动脉粥样硬化、良性增生及良性前列腺肥大)。
如本申请所用，“约”或“基本上包含”意指在如由本领域普通技术人员所测定的特定值的可接受的误差范围内，其将部分取决于如何测量或测定该值，亦即测量系统的局限性。举例而言，“约”或“基本上包含”可意指根据此项技术中的实践在一个或一个以上标准偏差内。或者，“约”或“基本上包含”可意指至多20％的范围。此外，尤其在生物系统或方法方面，所述术语可意指值的至多一个数量级或至多5倍。当在本申请案及申请专利范围中提供特定值时，除非另外陈述，否则“约”或“基本上包含”的含义应假定为在该特定值的可接受的误差范围内。
如本申请所述，除非另外指明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括在所列举范围内的任何整数值及(在适当时)其分数(诸如整数的十分之一及百分之一)。
竞争分析
本发明也涉及能够与参考抗PD-L1抗体(MDX-1105)竞争结合达至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％及至少约100％的大环肽。此类大环肽可与一或多种本申请所揭示的大环肽共有结构同源性，包括突变体、保守取代形式、功能取代形式及缺失形式，条件是其特异性结合至PD-L1。举例而言，若大环肽与参考抗PD-L1抗体实质上结合至相同PD-L1区，则大环肽应结合至与抗PD-L1单克隆抗体所结合的PD-L1抗原决定基至少重叠的PD-L1抗原决定基。重叠区可在一个氨基酸残基至数百个氨基酸残基的范围内变化。大环肽应接着在竞争分析中与抗PD-L1单克隆抗体与PD-L1的结合竞争和/或阻断所述结合，且从而减少抗PD-L1单克隆抗体与PD-L1的结合，优选达至少约50％。
出于竞争分析目的可用作参考抗体的抗PD-L1抗体为此项技术中已知的。举例而言，可使用以下代表性抗PD-L1抗体：MDX-1105(BMS)；L01X-C(Serono)、L1X3(Serono)、MSB-0010718C(Serono)及PD-L1Probody(CytomX)及共同拥有的WO 2007/005874中所揭示的PD-L1抗体。
出于竞争分析目的可用作参考抗体的抗PD-1抗体为此项技术中已知的。举例而言，可使用以下代表性抗PD-1抗体：尼沃单抗(nivolumab，BMS)；共同拥有的美国专利第8,008,449号中所分别揭示的17D8、2D3、4H1、4A11、7D3及5F4(BMS)、MK-3475(Merck，美国专利第8,168,757号中所揭示)及美国专利第7,488,802号中所揭示的抗体。
药物组合物
在另一个方面中，本发明提供一种组合物(例如药物组合物)，含有与药学上可接受的载剂一起调配的一种本发明的大环肽或本发明的大环肽组合。此类组合物可包括一种本发明的大环肽或免疫结合物或双特异性分子或(例如两种或两种以上不同的)本发明的大环肽或免疫结合物或双特异性分子的组合。举例而言，本发明的药物组合物可包含结合至靶抗原上的不同抗原决定基或具有互补活性的大环肽(或免疫结合物或双特异性物)的组合。
本发明的药物组合物亦可在组合疗法中(亦即与其它药剂组合)给药。举例而言，组合疗法可包括大环肽与至少一种其它消炎剂或免疫抑制剂的组合。可用于组合疗法的治疗剂的实施例更详细地描述于下文关于本发明的大环肽的用途的部分中。
如本申请所用，“药学上可接受的载剂”包括生理学上相容的任何及全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂及吸收延迟剂及其类似物。优选地，载剂适用于静脉内、肌肉内、皮下、非经肠、脊椎或表皮给药(例如通过注射或输注)。视投药途径而定，活性化合物(亦即大环肽、免疫结合物或双特异性分子)可包覆在材料中以保护该化合物免受酸作用及可使该化合物不活化的其它天然条件。
本发明的医药化合物可包括一或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”或“治疗学上可接受的盐”是指保留母化合物的所需生物活性且未赋予任何不合需要的毒理学效应的盐(参见例如Berge,S.M.等人,J.Pharm.Sci.,66:1-19(1977))。此类盐的实例包括酸加成盐及碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸(诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸及其类似物)以及衍生自无毒有机酸(诸如脂族单羧酸及二羧酸、经苯基取代的烷酸、羟基烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸及其类似物)的盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属(诸如钠、钾、镁、钙及其类似物)以及衍生自无毒有机胺(诸如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因(procaine)及其类似物)的盐。
本发明的药物组合物亦可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠及其类似物；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚及其类似物；以及(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及其类似物。
可用于本发明药物组合物中的适合水性及非水性载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇及其类似物)及其适合混合物、植物油(诸如橄榄油)及可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。可例如通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度及通过使用界面活性剂来维持适当流动性。
这些组合物亦可含有佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂及分散剂。可通过灭菌程序(见上文)及通过包括各种抗细菌剂及抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸及其类似物)而确保防止微生物存在。亦可能需要在组合物中包括等张剂，诸如糖、氯化钠及其类似物。另外，可注射医药形式的延长吸收可通过包括延迟吸收剂(诸如单硬脂酸铝及明胶)来达成。
药学上可接受的载剂包括无菌水溶液或分散液及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌散剂。此类介质及药剂用于医药活性物质的用途为此项技术中已知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不兼容，否则考虑将其用于本发明的药物组合物中。组合物中亦可并入补充性活性化合物。
治疗组合物通常必须在制造及储存条件下无菌且稳定。组合物可调配为溶液、微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其它有序结构。载剂可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇及液体聚乙二醇及其类似物)及其适合混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度及通过使用界面活性剂来维持适当流动性。在许多情况下，组合物中将优选包括等张剂，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收剂(例如单硬脂酸盐及明胶)来达成。
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物与一种上列成分或成分组合一起并入适当溶剂中，并视需要接着灭菌微过滤来制备。一般而言，分散液通过将活性化合物并入含有碱性分散介质及所需上列其它成分的无菌媒剂中来制备。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，优选制备方法为真空干燥及冷冻干燥(冻干)，所述方法自其预先无菌过滤溶液产生活性成分粉末加任何额外所需成分。
可与载剂物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将视所治疗的受试者、特定投药模式而变化。可与载剂物质组合以产生单一剂型的活性成分的量一般为产生治疗性效应的组合物的量。一般而言，在100％中，此量将介于约0.01％至约99％的活性成分、优选约0.1％至约70％、最优选约1％至约30％的活性成分与药学上可接受的载剂组合。
调节剂量方案以得到最优选所需反应(例如治疗反应)。举例而言，可给药单一药团，可随时间给药若干分次剂量，或可如治疗情形的紧急程度所指示而按比例减少或增加剂量。就投药简便性及剂量均一性而言，将非经肠组合物调配成单位剂型尤其有利。如本申请所用的单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗的受试者的实体上离散单位；各单位含有与所需医药载剂结合的经计算以产生所需治疗性效应的预定量活性化合物。本发明的单位剂型的规格通过以下情况指定且直接取决于以下情况：(a)活性化合物的独特特征及欲达成的特定治疗性效应，及(b)混配用于治疗受试者敏感性的此类活性化合物的技术中的固有限制。
关于大环肽的给药，剂量范围介于宿主体重的约0.0001至100mg/kg且更通常0.01至5mg/kg。举例而言，剂量可为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。例示性治疗方案需要每天一次、每天两次、两周一次、三周一次、一周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、一月一次、每3个月一次或每3至6个月一次给药。本发明的大环肽的优选剂量方案包括经由静脉内给药1mg/kg体重或3mg/kg体重，同时使用以下给药时程中之一者给与大环：(i)每四周六次剂量，接着每三个月；(ii)每三周；(iii)3mg/kg体重一次，接着每三周1mg/kg体重。
在一些方法中，同时给药具有不同结合特异性的两种或两种以上大环肽，在此情况下，所给药的各化合物的剂量属于所指示的范围内。化合物通常在多个时刻给药。单次剂量之间的间隔可为例如每周、每月、每三个月或每年。间隔亦可为不规律的，通过测量患者中针对靶抗原的大环肽的血液含量所指示。在一些方法中，调节剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆浓度，且在一些方法中达到约25-300μg/ml。
或者，大环肽可以持续释放制剂形式给药，在此情况下不需要频繁给药。给药的剂量及频率可视治疗为预防性或治疗性而变化。在预防性应用中，在长时期内，以相对不频繁之间隔给药相对较低的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对较短之间隔给药相对较高的剂量，直至疾病的进展降低或终止，且优选直至患者展示疾病的症状的部分或完全改善。此后，可向患者给药预防性方案。
可改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量，以便获得在对患者无毒性的情况下有效达成特定患者、组合物及投药模式的所需治疗反应的量的活性成分。所选剂量将视多种药物动力学因素而定，包括本发明所用特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性；投药途径；投药时间；所用特定化合物的排泄率；治疗持续时间；与所用特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或物质；所治疗患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况及先前病史；以及医药技术中熟知的类似因素。
“治疗有效剂量”的本发明的大环肽优选使得疾病症状的严重程度降低、无疾病症状期的频率或持续时间增加或预防疾病病痛所致的损伤或失能。举例而言，关于肿瘤治疗，“治疗有效剂量”优选相对于未经治疗的受试者抑制细胞生长或肿瘤生长达至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％且再更优选至少约80％。化合物抑制肿瘤生长和/或HIV的能力可在预测对人类肿瘤的功效或病毒功效的动物模型系统中评估。或者，组合物的此特性可通过利用本领域普通技术人员已知的分析检查化合物的抑制能力(诸如活体外抑制)来评估。治疗有效量的治疗性化合物可在受试者体内减小肿瘤尺寸、减少病毒负荷或以其它方式改善症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者体型、受试者症状的严重程度及所选特定组合物或投药途径的因素来确定所述量。
在另一个方面中，本发明提供一种分装部分的医药试剂盒，其如本申请所述包含大环肽及另一种免疫调节剂。该试剂盒亦可另外包含治疗过度增生性疾病(诸如，如本申请所述的癌症)和/或抗病毒疾病的使用说明书。
本发明的组合物可经由一或多种投药途径、使用此项技术中已知的多种方法中的一或多者来给药。如本领域普通技术人员应了解，投药途径和/或模式将视所需结果而变化。本发明的大环肽的优选投药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊椎或其它非经肠投药途径，例如通过注射或输注。如本申请所用，词组“非经肠给药”意指除肠内及局部给药以外通常通过注射进行的投药模式，且包括(但不限于)静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注。
或者，本发明的大环肽可经由非非经肠途径给药，诸如局部、表皮或黏膜投药途径，例如鼻内、经口、经阴道、经直肠、舌下或局部。
活性化合物可与将保护化合物免于快速释放的载剂一起制备，诸如控制释放制剂，包括植入物、经皮贴剂及微胶囊化递送系统。可使用可生物降解的生物兼容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法已获得专利或一般为本领域普通技术人员已知。参见例如Robinson,J.R.编,Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,Marcel Dekker,Inc.,NewYork(1978)。
治疗性组合物可用此项技术中已知的医疗装置给药。举例而言，在一个优选实施方案中，本发明的治疗性组合物可用无针皮下注射装置给药，诸如美国专利第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号或第4,596,556号中所揭示的装置。适用于本发明的熟知插入物及模块的实例包括：美国专利第4,487,603号，其揭示一种以受控速率施配药物的可植入微输注泵；美国专利第4,486,194号，其揭示一种经由皮肤给药药物的治疗性装置；美国专利第4,447,233号，其揭示一种以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利第4,447,224号，其揭示一种用于连续药物递送的可变流动可植入输注装置；美国专利第4,439,196号，其揭示一种具有多腔隔室的渗透药物递送系统；以及美国专利第4,475,196号，其揭示一种渗透药物递送系统。这些专利以引用的方式并入本申请中。许多其它此类插入物、递送系统及模块为本领域普通技术人员已知的。
在某些实施方案中，本发明的大环肽可经调配以确保恰当活体内分布。举例而言，血脑屏障(BBB)排除多种高度亲水性化合物。为确保本发明的治疗性化合物穿过BBB(必要时)，其可调配成例如脂质体。关于制造脂质体的方法，参见例如美国专利第4,522,811号、第5,374,548号及第5,399,331号。脂质体可包含选择性输送至特定细胞或器官中的一或多个部分，由此增强靶向药物递送(参见例如Ranade,V.V.,J.Clin.Pharmacol.,29:685(1989))。例示性靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如Low等人的美国专利第5,416,016号)；甘露糖(Umezawa等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,153:1038(1988))；大环肽(Bloeman,P.G.等人,FEBS Lett.,357:140(1995)；Owais,M.等人,Antimicrob.AgentsChemother.,39:180(1995))；界面活性剂蛋白质A受体(Briscoe等人,Am.J.Physiol.,1233:134(1995))；p120(Schreier等人,J.Biol.Chem.,269:9090(1994))；亦参见Keinanen,K.等人,FEBS Lett.,346:123(1994)；Killion,J.J.等人,Immunomethods 4:273(1994)。
本发明的用途及方法
本发明的大环肽、组合物及方法具有许多活体外及活体内效用，涉及例如检测PD-L1或通过阻断PD-L1增强免疫反应。举例而言，这些分子可给药培养物中、活体外或离体的细胞或给药人类受试者(例如活体内)以在多种情形中增强免疫力。因此，在一个方面中，本发明提供一种调节受试者的免疫反应的方法，其包含向所述受试者给药本发明的大环肽以便调节所述受试者的免疫反应。优选地，增强、刺激或上调反应。在其它方面中，大环肽可具有抗猕猴、抗小鼠和/或抗土拨鼠结合及治疗活性。
如本申请所用，术语“受试者(subject)”意欲包括人类及非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，诸如非人类灵长类动物、羊、犬、猫、牛、马、鸡、土拨鼠、两栖动物及爬行动物，但哺乳动物为优选，诸如非人类灵长类动物、羊、犬、猫、牛及马。优选受试者包括需要增强免疫反应的人类患者。所述方法尤其适用于治疗患有可通过强化T细胞介导的免疫反应治疗的病症的人类患者。在一个特定实施方案中，所述方法尤其适用于活体内处理癌细胞。为实现抗原特异性免疫力增强，大环肽可连同所关注的抗原一起给药。当针对PD-L1的大环肽连同另一药剂一起给药时，两者可以任一次序或同时给药。
本发明另外提供用于检测样品中人类、土拨鼠、猕猴和/或小鼠PD-L1抗原的存在或测量人类、土拨鼠、猕猴和/或小鼠PD-L1抗原的量的方法，其包含使该样品及对照样品与特异性结合至人类、土拨鼠、猕猴和/或小鼠PD-L1的参考大环肽在允许在该大环与人类、土拨鼠、猕猴和/或小鼠PD-L1之间形成复合物的条件下接触。接着检测复合物的形成，其中样品与对照样品相比的差异复合物形成指示样品中存在人类、土拨鼠、猕猴和/或小鼠PD-L1抗原。
鉴于本发明的大环肽对于PD-L1与CD28、ICOS及CTLA-4相比的特异性结合，本发明的大环肽可用于特异性检测细胞表面上的PD-L1表达，且此外，可用于经由免疫亲和力纯化来纯化PD-L1。
癌症
通过大环肽阻断PD-1可增强患者针对癌细胞的免疫反应。PD-1的配体PD-L1并不表达在正常人类细胞中，但大量存在于多种人类癌症中(Dong等人,Nat.Med.,8:787-789(2002))。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润性淋巴球减少、T细胞受体介导的增生减少及癌细胞免疫逃避(Dong等人,J.Mol.Med.,81:281-287(2003)；Blank等人,CancerImmunol.Immunother.,54:307-314(2005)；Konishi等人,Clin.Cancer Res.,10:5094-5100(2004))。免疫抑制可通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用而逆转，且当PD-1与PD-L2的相互作用亦阻断时，效应相加(Iwai等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,99:12293-12297(2002)；Brown等人,J.Immunol.,170:1257-1266(2003))。虽然先前研究已展示T细胞增生可通过抑制PD-1与PD-L1的相互作用而恢复，但尚未报导通过阻断PD-1/PD-L1相互作用对活体内癌症肿瘤生长的直接效应。在一个方面中，本发明系关于使用大环肽活体内治疗受试者，使得癌性肿瘤生长受到抑制。大环肽可单独用于抑制癌性肿瘤生长。或者，大环肽可如下所述与其它免疫原性剂、标准癌症治疗或其它大环肽结合使用。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种抑制受试者的肿瘤细胞生长的方法，其包含向所述受试者给药治疗有效量的大环肽。
可使用本发明的大环肽抑制生长的优选癌症包括通常响应于免疫疗法的癌症。治疗的优选癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾细胞癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺癌及去势抵抗性的前列腺癌)、乳癌、结肠直肠癌及肺癌(例如鳞状及非鳞状非小细胞肺癌)。另外，本发明包括可使用本发明的大环肽抑制生长的难治性或复发性恶性病。
可使用本发明的方法治疗的其它癌症的实例包括骨癌；胰脏癌；皮肤癌；头颈癌；皮肤或眼内恶性黑素瘤；子宫癌；卵巢癌；结肠癌；直肠癌；肛门区癌；胃癌；睾丸癌；子宫癌；输卵管癌；子宫内膜癌；子宫颈癌；阴道癌；外阴癌；霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)；非霍奇金氏淋巴瘤；食道癌；小肠癌；内分泌系统癌；甲状腺癌；副甲状腺癌；肾上腺癌；软组织肉瘤；尿道癌；阴茎癌；慢性或急性白血病，包括急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴球性白血病；儿童实体肿瘤；淋巴球性淋巴瘤；膀胱癌；肾癌或输尿管癌；肾盂癌；中枢神经系统(CNS)赘瘤；原发性CNS淋巴瘤；肿瘤血管生成；脊轴肿瘤；脑干神经胶质瘤；垂体腺瘤；卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)；表皮样癌；鳞状细胞癌；T细胞淋巴瘤；环境诱发癌，包括由石棉诱发的癌症；以及所述癌症的组合。本发明亦适用于治疗转移性癌症，尤其表达PD-L1的转移性癌症(Iwai等人,Int.Immunol.,17:133-144(2005))。
任选地，针对PD-L1的大环肽可与以下免疫原性剂组合，诸如癌细胞、经纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白质、化合物及碳水化合物分子)、细胞及转染有编码免疫刺激细胞激素的基因的细胞(He等人,J.Immunol.,173:4919-4928(2004))。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，诸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽，或经转染以表达细胞激素GM-CSF的肿瘤细胞(下文进一步论述)。
在人类中，已展示一些肿瘤具有免疫原性，诸如黑素瘤。预期通过利用PD-L1阻断升高T细胞活化的临限值，我们可预计活化宿主中的肿瘤反应。
当与疫苗接种方案组合时，PD-L1阻断可能最有效。已设计出针对肿瘤的许多实验性疫苗接种策略(参见Rosenberg,S.,Development of Cancer Vaccines,ASCOEducational Book Spring:60-62(2000)；Logothetis,C.,ASCO Educational BookSpring:300-302(2000)；Khayat,D.,ASCO Educational Book Spring:414-428(2000)；Foon,K.,ASCO Educational Book Spring:730-738(2000)；亦参见Restifo,N.等人,Cancer Vaccines,第61章,第3023-3043页,DeVita,V.等人编,Cancer:Principles andPractice of Oncology,第五版(1997))。在这些策略中之一者中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。已显示这些细胞疫苗在肿瘤细胞经转导以表达GM-CSF时最有效。已显示GM-CSF为用于肿瘤疫苗接种的抗原呈现的强活化剂(Dranoff等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:3539-3543(1993))。
各种肿瘤中基因表达及大规模基因表达模式的研究已产生所谓肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg,S.A.,Immunity,10:281-287(1999))。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原为肿瘤中及出现肿瘤的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原及Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可展示为宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。PD-L1阻断可与表达于肿瘤中的重组蛋白质和/或肽的集合结合使用以产生针对这些蛋白质的免疫反应。这些蛋白质通常被免疫系统视为自体抗原且因此对其具耐受性。肿瘤抗原亦可包括蛋白质端粒酶，其为合成染色体的端粒所必需的且表达于超过85％的人类癌症中且仅表达于有限数目的体细胞组织中(Kim,N等人,Science,266:2011-2013(1994))。(可通过各种方法保护这些体细胞组织免受免疫攻击)。肿瘤抗原亦可为由于改变蛋白质序列或在两个无关序列之间形成融合蛋白(亦即费城染色体(Philadelphia chromosome)中的bcr-abl)的体细胞突变而在癌细胞中表达的“新抗原”或B细胞肿瘤的受试者基因型。
其它肿瘤疫苗可包括人类癌症中所牵涉的病毒的蛋白质，所述病毒诸如人类乳头状瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV及HCV)及卡堡氏疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可与PD-L1阻断结合使用的肿瘤特异性抗原的另一形式为自肿瘤组织自身分离的经纯化热休克蛋白质(HSP)。这些热休克蛋白质含有肿瘤细胞蛋白质的片段且这些HSP高效递送至抗原呈现细胞以引发肿瘤免疫力(Suot,R.等人,Science,269:1585-1588(1995)；Tamura,Y.等人,Science,278:117-120(1997))。
树突状细胞(DC)为可用于引发抗原特异性反应的强抗原呈现细胞。DC可离体产生且负载有各种蛋白质及肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle,F.等人,Nat.Med.,4:328-332(1998))。DC亦可通过基因方法转导以亦表达这些肿瘤抗原。DC亦已出于免疫目的而直接与肿瘤细胞融合(Kugler,A.等人,Nat.Med.,6:332-336(2000))。作为疫苗接种的方法，DC免疫作用可与PD-L1阻断有效组合以活化更强抗肿瘤反应。
PD-L1阻断亦可与标准癌症治疗组合。PD-L1阻断可与化学治疗方案有效组合。在这些情形中，有可能减小所给药的化学治疗剂的剂量(Mokyr,M.等人,Cancer Res.,58:5301-5304(1998))。此类组合的一个实施例为大环肽与达喀尔巴嗪(decarbazine)组合用于治疗黑素瘤。此类组合的另一个实施例为大环肽与介白素-2(IL-2)组合用于治疗黑素瘤。支持PD-L1阻断与化学疗法组合使用的科学基本原理在于作为大部分化学治疗化合物的细胞毒性作用结果的细胞死亡应使得抗原呈现路径中肿瘤抗原的含量增加。可经由细胞死亡而与PD-L1阻断产生协同作用的其它组合疗法为辐射、手术及激素去除。这些方案中的每一者产生宿主中的肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂亦可与PD-L1阻断组合。抑制血管生成导致肿瘤细胞死亡，其可将肿瘤抗原馈至宿主抗原呈现路径中。
PD-L1阻断大环肽亦可与使表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性大环肽组合使用(参见例如美国专利第5,922,845号及第5,837,243号)。双特异性大环肽可用于靶向两个单独抗原。举例而言，抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如Her-2/neu)双特异性大环肽已用于使巨噬细胞靶向肿瘤位点。此靶向可更有效地活化肿瘤特异性反应。这些反应的T细胞臂通过使用PD-L1阻断来强化。或者，可通过使用结合至肿瘤抗原及树突状细胞特异性细胞表面标记的双特异性大环肽将抗原直接递送至DC。
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。许多这些机制可通过使肿瘤所表达且具免疫抑制性的蛋白质不活化来克服。这些蛋白质尤其包括TGF-β(Kehrl,J.等人,J.Exp.Med.,163:1037-1050(1986))、IL-10(Howard,M.等人,Immunology Today,13:198-200(1992))及Fas配体(Hahne,M.等人,Science,274:1363-1365(1996))。针对这些实体中的每一者的大环肽可与抗PD-L1组合使用，以抵消免疫抑制剂的效应且促进宿主的肿瘤免疫反应。
可用于活化宿主免疫反应的其它大环肽可与抗PD-L1组合使用。这些大环肽包括树突状细胞表面上的活化DC功能及抗原呈现的分子。抗CD40大环肽能够有效替代辅助T细胞活性(Ridge,J.等人,Nature,393:474-478(1998))且可与PD-1抗体结合使用(Ito,N.等人,Immunobiology,201(5):527-540(2000))。活化针对以下T细胞协同刺激分子的大环肽亦可使得T细胞活化水平增加，诸如CTLA-4(例如美国专利第5,811,097号)、OX-40(Weinberg,A.等人,Immunol.,164:2160-2169(2000))、4-1BB(Melero,I.等人,Nat.Med.,3:682-685(1997)及ICOS(Hutloff,A.等人,Nature,397:262-266(1999))。
骨髓移植目前用于治疗多种造血来源的肿瘤。虽然移植物抗宿主病为此治疗之后果，但可自移植物抗肿瘤反应获得治疗效益。PD-L1阻断可用于增加供体移植的肿瘤特异性T细胞的有效性。
亦存在涉及抗原特异性T细胞的离体活化及扩增及将这些细胞授受性转移至受体中以便抗原特异性T细胞抗肿瘤的数个实验性治疗方案(Greenberg,R.等人,Science,285:546-551(1999))。这些方法亦可用于活化针对诸如CMV的感染物的T细胞反应。在大环肽存在下的离体活化可预期增加授受性转移T细胞的频率及活性。
感染性疾病
本发明的其它方法用于治疗已暴露于特定毒素或病原体的患者。因此，本发明的另一个方面提供一种治疗受试者的感染性疾病的方法，其包含向所述受试者给药本发明的大环肽，以便治疗所述受试者的感染性疾病。
与其如上文所论述的针对肿瘤的应用类似，PD-L1阻断可单独使用或作为佐剂与疫苗组合使用以刺激针对病原体、毒素及自体抗原的免疫反应。此治疗方法可特别适用的病原体的实例包括当前无有效疫苗的病原体或常规疫苗不完全有效的病原体。这些病原体包括(但不限于)HIV、肝炎(A、B及C)、流感、疱疹、梨形鞭毛虫属(Giardia)、疟疾(Butler,N.S.等人,Nature Immunology 13,188-195(2012)；Hafalla,J.C.R.等人,PLOSPathogens；February 2,2012))、利什曼原虫属(Leishmania)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas Aeruginosa)。PD-L1阻断特别适用于抵抗由经感染过程呈现改变抗原的感染物(诸如HIV)所确立的感染。这些新颖抗原决定基在给药抗人类PD-L1时识别为外来的，因此经由PD-L1引起通过阴性信号未抑制的强T细胞反应。
引起可通过本发明方法治疗的感染的病原性病毒的一些实例包括HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II及CMV、埃-巴二氏病毒(Epstein Barrvirus))、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、科沙奇病毒(coxsackie virus)、冠状病毒、呼吸道融合病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头状瘤病毒、软疣病毒(molluscumvirus)、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒及虫媒病毒性脑炎病毒。
引起可通过本发明方法治疗的感染的病原菌的一些实例包括衣原体(chlamydia)、立克次体细菌(rickettsial bacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)及淋球菌(conococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、军团菌(legionella)、白喉(diphtheria)、沙门氏菌(salmonella)、杆菌(bacilli)、霍乱(cholera)、破伤风(tetanus)、肉毒中毒(botulism)、炭疽病(anthrax)、瘟疫(plague)、钩端螺旋体病(leptospirosis)及莱姆病(Lymes disease)细菌。
引起可通过本发明方法治疗的感染的病原性真菌的一些实例包括念珠菌属(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克鲁斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲菌属(Aspergillus)(烟曲霉(fumigatus)、黑曲菌(niger)等)、毛霉目(Mucorales)属(毛霉菌属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉属(rhizophus))、申克氏胞丝菌(Sporothrixschenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可通过本发明方法治疗的感染的病原性寄生虫的一些实例包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、大肠纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴原虫(Naegleriafowleri)、棘阿米巴虫属(Acanthamoeba sp.)、兰比亚梨形鞭毛虫(Giardialambia)、隐胞子虫属(Cryptosporidium sp.)、肺炎肺囊虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫、微小巴倍虫、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondi)及巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
在所有以上方法中，PD-L1阻断可与以下其它形式的免疫疗法组合，从而提供增强的肿瘤抗原呈现，诸如细胞激素治疗(例如干扰素、靶向VEGF活性或VEGF受体的药剂、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或双特异性抗体疗法(参见例如Holliger,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)；Poljak,Structure,2:1121-1123(1994))。
自体免疫反应
大环肽可引起且放大自体免疫反应。实际上，使用肿瘤细胞及肽疫苗诱发抗肿瘤反应揭示许多抗肿瘤反应涉及抗自体反应性(在抗CTLA-4+GM-CSF调节的B 16黑素瘤中观测到去色素(van Elsas等人,见上文)；Trp-2疫苗接种小鼠中的去色素(Overwijk,W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:2982-2987(1999))；由TRAMP肿瘤细胞疫苗引起的自体免疫前列腺炎(Hurwitz,A.,见上文(2000))、在人类临床试验中观测到黑素瘤肽抗原疫苗接种及白斑病(Rosenberg,S.A.等人,J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.,19(1):81-84(1996))。
因此，可能考虑抗PD-L1阻断与各种自身蛋白质结合使用以便设计高效产生针对这些自身蛋白质的免疫反应用于疾病治疗的疫苗接种方案。举例而言，阿兹海默氏病涉及类淀粉沉积物的β肽在脑中的不当积聚；针对类淀粉的抗体反应能够清除这些类淀粉沉积物(Schenk等人,Nature,400:173-177(1999))。
其它自身蛋白质亦可用作靶标，诸如用于过敏症及哮喘治疗的IgE及用于类风湿性关节炎治疗的TNFα。最后，针对各种激素的抗体反应可通过使用本申请所揭示的大环类诱发。针对生殖激素的中和抗体反应可用于避孕。针对特定肿瘤生长所需的激素及其它可溶性因子的中和抗体反应亦可视为可能的疫苗接种靶标。
如上所述使用抗PD-L1大环类的类似方法可用于诱发治疗性自体免疫反应以治疗具有其它自身抗原(诸如类淀粉沉积物，包括阿兹海默氏病中的β；细胞激素，诸如TNFα及IgE)不当积聚的患者。
疫苗
大环肽可通过抗PD-1大环与所关注的抗原(例如疫苗)的共给药而用于刺激抗原特异性免疫反应。因此，在另一个方面中，本发明提供一种增强受试者体内针对抗原的免疫反应的方法，其包含向所述受试者给药：(i)该抗原；以及(ii)抗PD-1大环，使得受试者体内针对该抗原的免疫反应得以增强。抗原可为例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。此类抗原的非限制性实例包括以上部分中所论述的抗原，诸如上文所论述的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)、或来自上文所述的病毒、细菌或其它病原体的抗原。
活体内及活体外给药本发明组合物(例如大环肽、多特异性及双特异性分子及免疫结合物)的适合途径为此项技术中所熟知，且可由一般技术者选择。举例而言，组合物可通过注射(例如静脉内或皮下)给药。所用分子的适合剂量将视受试者的年龄及体重以及组合物的浓度和/或制剂而定。
如先前所述，本发明的大环肽可与一或多种其它治疗剂(例如细胞毒性剂、放射毒性剂或免疫抑制剂)共给药。所述肽可连接至药剂(以免疫复合物形式)或可与药剂分开给药。在后一情况(分开给药)中，所述肽可在药剂之前、之后或同时给药或可与其它已知疗法(例如抗癌疗法，例如辐射)共给药。此类治疗剂尤其包括抗赘生性剂，诸如小红莓(doxorubicin)(阿德力霉素(adriamycin))、顺铂博莱霉素硫酸盐(cisplatin bleomycinsulfate)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、达喀尔巴嗪及环磷酰胺羟基脲(cyclophosphamide hydroxyurea)，其本身仅在对患者具毒性或亚毒性的含量下有效。顺铂每四周以100mg/剂量静脉内给药一次，且阿德力霉素每21天以60-75mg/ml剂量静脉内给药一次。本发明的大环肽与化学治疗剂的共给药提供两种经由不同机制操作的抗癌剂，其产生针对人类肿瘤细胞的细胞毒性效应。此类共给药可解决因耐药性出现或肿瘤细胞的抗原性改变而将使其不与化合物起反应所致的问题。
包含本发明组合物(例如大环肽、双特异性或多特异性分子或免疫结合物)及使用说明书的试剂盒亦在本发明的范畴内。试剂盒可另外含有至少一种额外试剂或一或多种本发明的额外大环肽(例如具有结合至PD-L1抗原中与大环不同的抗原决定基的互补活性的人类抗体)。试剂盒通常包括指示试剂盒内含物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起供应或以其它方式伴随试剂盒的任何书写或记录材料。
组合疗法
本发明的大环肽与另一PD-L1拮抗剂和/或其它免疫调节剂的组合适用于增强针对过度增生性疾病的免疫反应。举例而言，这些分子可给药培养物中、活体外或离体的细胞或给药人类受试者(例如活体内)以在多种情形中增强免疫力。因此，在一个方面中，本发明提供一种调节受试者的免疫反应的方法，其包含向所述受试者给药本发明的大环肽以便调节所述受试者的免疫反应。优选地，增强、刺激或上调反应。在另一个实施方案中，本发明提供一种改变与用免疫刺激性治疗剂治疗过度增生性疾病相关联的不良事件的方法，其包含向受试者给药本发明的大环肽及低于治疗剂量的另一种免疫调节剂。
通过大环肽阻断PD-L1可增强患者针对癌细胞的免疫反应。可使用本发明的大环肽抑制生长的癌症包括通常响应于免疫疗法的癌症。用本发明的组合疗法治疗的癌症的代表性实例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌、前列腺癌、乳癌、结肠癌及肺癌。可使用本发明的方法治疗的其它癌症的实例包括骨癌；胰脏癌；皮肤癌；头颈癌；皮肤或眼内恶性黑素瘤；子宫癌；卵巢癌；直肠癌；肛门区癌；胃癌；睾丸癌；子宫癌；输卵管癌；子宫内膜癌；子宫颈癌；阴道癌；外阴癌；霍奇金氏病；非霍奇金氏淋巴瘤；食道癌；小肠癌；内分泌系统癌；甲状腺癌；副甲状腺癌；肾上腺癌；软组织肉瘤；尿道癌；阴茎癌；慢性或急性白血病，包括急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴球性白血病；儿童实体肿瘤；淋巴球性淋巴瘤；膀胱癌；肾癌或输尿管癌；肾盂癌；中枢神经系统(CNS)赘瘤；原发性CNS淋巴瘤；肿瘤血管生成；脊轴肿瘤；脑干神经胶质瘤；垂体腺瘤；卡堡氏肉瘤；表皮样癌；鳞状细胞癌；T细胞淋巴瘤；环境诱发癌，包括由石棉诱发的癌症；以及所述癌症的组合。本发明亦适用于治疗转移性癌症。
在某些实施方案中，含有至少一种本申请中论述的大环肽的治疗剂组合可以在药学上可接受的载剂中的单一组合物形式同时给药，或以各药剂可依次给药的分开组合物形式同时给药。举例而言，第二免疫调节剂及本发明的大环肽可依次给药，诸如首先给药第二免疫调节剂且其次给药大环肽，或首先给药大环肽且其次给药第二免疫调节剂。此外，若依次给药一次以上剂量的组合疗法，则依次给药的次序在每一给药时间点可颠倒或保持相同次序，依次给药可与同时给药组合或其任何组合。举例而言，第二免疫调节剂及大环肽的第一次给药可同时，第二次给药可依次，其中首先给药第二免疫调节剂且其次给药大环肽，且第三次给药可依次，其中首先给药大环肽且其次给药第二免疫调节剂等。另一代表性给药方案可涉及首先依次给药，其中首先给药大环肽且其次给药第二免疫调节剂，且后续给药可同时。
任选地，大环肽及第二免疫调节剂的组合可另外与免以下疫原性剂组合，诸如癌细胞、经纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白质、肽及碳水化合物分子)、细胞及转染有编码免疫刺激细胞激素的基因的细胞(He等人,J.Immunol.,173:4919-4928(2004))。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，诸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽，或经转染以表达细胞激素GM-CSF的肿瘤细胞(下文进一步论述)。
经组合的PD-L1大环肽及第二免疫调节剂可另外与疫苗接种方案组合。已设计出针对肿瘤的许多实验性疫苗接种策略(参见Rosenberg,S.,Development of CancerVaccines,ASCO Educational Book Spring:60-62(2000)；Logothetis,C.,ASCOEducational Book Spring:300-302(2000)；Khayat,D.,ASCO Educational Book Spring:414-428(2000)；Foon,K.,ASCO Educational Book Spring:730-738(2000)；亦参见Restifo等人,Cancer Vaccines,第61章,第3023-3043页,DeVita等人编,Cancer:Principles and Practice of Oncology,第五版(1997))。在这些策略中之一者中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。已显示这些细胞疫苗在肿瘤细胞经转导以表达GM-CSF时最有效。已显示GM-CSF为用于肿瘤疫苗接种的抗原呈现的强活化剂(Dranoff等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:3539-3543(1993))。
各种肿瘤中基因表达及大规模基因表达模式的研究已产生所谓肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg,Immunity,10:281-287(1999))。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原为肿瘤中及出现肿瘤的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原及Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可展示为宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。在某些实施方案中，经组合的PD-L1大环肽及第二免疫调节剂可与表达于肿瘤中的重组蛋白质和/或肽的集合结合使用以产生针对这些蛋白质的免疫反应。这些蛋白质通常被免疫系统视为自体抗原且因此对其具耐受性。肿瘤抗原亦可包括蛋白质端粒酶，其为合成染色体的端粒所必需的且表达于超过85％的人类癌症中且仅表达于有限数目的体细胞组织中(Kim等人,Science,266:2011-2013(1994))。(可通过各种方法保护这些体细胞组织免受免疫攻击)。肿瘤抗原亦可为由于改变蛋白质序列或在两个无关序列之间形成融合蛋白(亦即费城染色体中的bcr-abl)的体细胞突变而在癌细胞中表达的“新抗原”或B细胞肿瘤的受试者基因型。
其它肿瘤疫苗可包括人类癌症中所牵涉的病毒的蛋白质，所述病毒诸如人类乳头状瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV及HCV)及卡堡氏疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可与PD-L1大环肽阻断结合使用的肿瘤特异性抗原的另一形式为自肿瘤组织自身分离的经纯化热休克蛋白质(HSP)。这些热休克蛋白质含有肿瘤细胞蛋白质的片段且这些HSP高效递送至抗原呈现细胞以引发肿瘤免疫力(Suot等人,Science,269:1585-1588(1995)；Tamura等人,Science,278:117-120(1997))。
树突状细胞(DC)为可用于引发抗原特异性反应的强抗原呈现细胞。DC可离体产生且负载有各种蛋白质及肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle等人,Nat.Med.,4:328-332(1998))。DC亦可通过基因方法转导以亦表达这些肿瘤抗原。DC亦已出于免疫目的而直接与肿瘤细胞融合(Kugler等人,Nat.Med.,6:332-336(2000))。作为疫苗接种的方法，DC免疫作用可与经组合的抗PD-L1大环肽及第二免疫调节剂进一步有效组合以活化更强抗肿瘤反应。
经组合的抗PD-L1大环肽及额外免疫调节剂亦可与标准癌症治疗进一步组合。举例而言，大环肽与第二免疫调节剂的组合可与化学治疗方案有效组合。在这些情形中，如在大环肽与第二免疫调节剂的组合下所观测，有可能减小与本发明的组合一起给药的其它化学治疗剂的剂量(Mokyr等人,Cancer Res.,58:5301-5304(1998))。此类组合的一个实施例为大环肽与第二免疫调节剂的组合与达喀尔巴嗪进一步组合用于治疗黑素瘤。另一个实施例为大环肽与第二免疫调节剂的组合与介白素-2(IL-2)进一步组合用于治疗黑素瘤。支持PD-L1大环肽及另一种免疫调节剂与化学疗法组合使用的科学基本原理在于作为大部分化学治疗化合物的细胞毒性作用结果的细胞死亡应使得抗原呈现路径中肿瘤抗原的含量增加。可经由细胞死亡而与经组合的抗PD-L1大环肽及额外免疫调节剂产生协同作用的其它组合疗法包括辐射、手术及激素去除。这些方案中的每一者产生宿主中的肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂亦可与经组合的PD-L1及第二免疫调节剂组合。抑制血管生成导致肿瘤细胞死亡，其亦可为馈至宿主抗原呈现路径中的肿瘤抗原的来源。
PD-L1与另一种免疫调节剂的组合亦可与使表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性大环肽组合使用(参见例如美国专利第5,922,845号及第5,837,243号)。双特异性大环可用于靶向两个单独抗原。举例而言，抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如Her-2/neu)双特异性大环肽已用于使巨噬细胞靶向肿瘤位点。此靶向可更有效地活化肿瘤特异性反应。这些反应的T细胞臂通过使用经组合的PD-L1及第二免疫调节剂来强化。或者，可通过使用结合至肿瘤抗原及树突状细胞特异性细胞表面标记的双特异性大环肽将抗原直接递送至DC。
在另一个实施例中，大环肽与第二免疫调节剂的组合可与以下抗赘生性大环剂结合使用，诸如
Figure BDA0002391600630000351
(利妥昔单抗(rituximab))、
Figure BDA0002391600630000352
(曲妥珠单抗(trastuzumab))、
Figure BDA0002391600630000353
(托西莫单抗(tositumomab))、
Figure BDA0002391600630000354
(布突默单抗(ibritumomab))、
Figure BDA0002391600630000355
(阿仑单抗(alemtuzumab))、Lymphocide(依帕珠单抗(eprtuzumab))、
Figure BDA0002391600630000356
(贝伐单抗(bevacizumab))及
Figure BDA0002391600630000357
(埃罗替尼(erlotinib))及其类似物。举例而言且不希望受理论束缚，用抗癌抗体或与毒素结合的抗癌抗体治疗可导致癌细胞死亡(例如肿瘤细胞)，其将强化通过第二免疫调节剂靶标或PD-L1介导的免疫反应。在一个示例性实施方案中，过度增生性疾病(例如癌症肿瘤)的治疗可包括抗癌抗体与同时或依次或其任何组合给药的大环肽及第二免疫调节剂的组合，其可强化宿主的抗肿瘤免疫反应。
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。许多这些机制可通过使肿瘤所表达且具免疫抑制性的蛋白质不活化来克服。这些蛋白质尤其包括TGF-β(Kehrl,J.等人,J.Exp.Med.,163:1037-1050(1986))、IL-10(Howard,M.等人,Immunology Today,13:198-200(1992))及Fas配体(Hahne,M.等人,Science,274:1363-1365(1996))。在另一个实施例中，针对这些实体中的每一者的抗体可与大环肽及另一种免疫调节剂进一步组合，以抵消免疫抑制剂的效应且促进宿主的肿瘤免疫反应。
可用于活化宿主免疫反应性的其它药剂可与本发明的大环肽进一步组合使用。这些药剂包括树突状细胞表面上的活化DC功能及抗原呈现的分子。抗CD40大环肽能够有效替代辅助T细胞活性(Ridge,J.等人,Nature,393:474-478(1998))且可与单独或与抗CTLA-4组合组合的本发明的大环肽结合使用(Ito,N.等人,Immunobiology,201(5):527-540(2000))。活化针对以下T细胞协同刺激分子的大环肽亦可使得T细胞活化水平增加，诸如OX-40(Weinberg,A.等人,Immunol.,164:2160-2169(2000))、4-1BB(Melero,I.等人,Nat.Med.,3:682-685(1997)及ICOS(Hutloff,A.等人,Nature,397:262-266(1999))。
骨髓移植目前用于治疗多种造血来源的肿瘤。虽然移植物抗宿主病为此治疗之后果，但可自移植物抗肿瘤反应获得治疗效益。单独或与另一种免疫调节剂组合的本发明的大环肽可用于增加供体移植的肿瘤特异性T细胞的有效性。
亦存在涉及抗原特异性T细胞的离体活化及扩增及将这些细胞授受性转移至受体中以便抗原特异性T细胞抗肿瘤的数个实验性治疗方案(Greenberg,R.等人,Science,285:546-551(1999))。这些方法亦可用于活化针对诸如CMV的感染物的T细胞反应。在单独或与另一种免疫调节剂组合的本发明的大环肽存在下的离体活化可预期增加授受性转移T细胞的频率及活性。
在某些实施方案中，本发明提供一种改变与用免疫刺激剂治疗过度增生性疾病相关联的不良事件的方法，其包含向受试者给药本发明的大环肽与低于治疗剂量的另一种免疫调节剂的组合。举例而言，本发明的方法提供一种通过向患者给药不可吸收类固醇而降低免疫刺激性治疗抗体诱发的结肠炎或腹泻的发病率的方法。由于任何将接受免疫刺激性治疗抗体的患者处于罹患由此类治疗诱发的结肠炎或腹泻的风险下，故此整个患者群体适合于根据本发明方法的疗法。虽然已给药类固醇以治疗发炎性肠病(IBD)及预防IBD恶化，但其尚未用于尚未诊断患有IBD的患者预防(降低发病率)IBD。与类固醇(甚至不可吸收类固醇)相关联的显著副作用已阻碍预防性使用。
在其它实施方案中，单独或与另一种免疫调节剂组合的本发明的大环肽可与任何不可吸收类固醇的使用进一步组合。如本申请所用，“不可吸收类固醇”为展现深入首次代谢的糖皮质激素，使得在肝脏中代谢后，类固醇的生物利用率低，亦即小于约20％。在本发明的一个实施方案中，不可吸收类固醇为布地奈德(budesonide)。布地奈德为局部起效的糖皮类固醇，其在经口给药后主要通过肝脏深入代谢。
Figure BDA0002391600630000371
EC(Astra-Zeneca)为经研发以使药物递送至回肠及贯穿结肠最优选化的布地奈德的pH及时间依赖性经口制剂。
Figure BDA0002391600630000372
EC在美国核准用于治疗涉及回肠和/或升结肠的轻度至中度克罗恩氏病(Crohn's disease)。用于治疗克罗恩氏病的
Figure BDA0002391600630000373
EC的常用口服剂量为6至9毫克/天。
Figure BDA0002391600630000374
EC在肠中释放，随后吸收且保留在肠道黏膜中。一次其通过肠道黏膜目标组织，
Figure BDA0002391600630000375
EC在肝脏中通过细胞色素P450系统深入代谢成具有可忽略的糖皮质激素活性的代谢物。因此，生物利用率较低(约10％)。布地奈德的低生物利用率使得与具有较不深入的首次代谢的其它糖皮质激素相比的治疗比率得以改善。布地奈德与全身起效的皮质类固醇相比产生较少不良作用，包括下丘脑-垂体抑制作用较小。然而，长期给药
Figure BDA0002391600630000376
EC可导致全身性糖皮质激素效应，诸如肾上腺皮质机能亢进症及肾上腺抑制。参见Physicians'Desk Reference Supplement,第58版,608-610(2004)。
在其它实施方案中，PD-L1及另一种免疫调节剂与不可吸收类固醇结合的组合可与水杨酸进一步组合。水杨酸包括5-ASA剂，诸如：柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)(
Figure BDA0002391600630000377
Pharmacia&Upjohn)；奥色拉嗪(olsalazine)(
Figure BDA0002391600630000378
Pharmacia&UpJohn)；巴柳氮(balsalazide)(
Figure BDA0002391600630000379
Salix Pharmaceuticals,Inc.)；以及美色拉嗪(mesalamine)(
Figure BDA00023916006300003710
Procter&Gamble Pharmaceuticals；
Figure BDA00023916006300003712
Shire US；
Figure BDA00023916006300003711
Axcan Scandipharm,Inc.；
Figure BDA00023916006300003713
Solvay)。
剂量和制剂
式I的适合肽或更具体而言本申请所述的大环肽可作为单独化合物及或与可接受的载剂混合以医药制剂形式给药患者以治疗糖尿病及其它相关疾病。熟习治疗糖尿病的技术者可易于确定向需要此类治疗的哺乳动物(包括人类)给药化合物的剂量及途径。投药途径可包括(但不限于)经口、口内、经直肠、经皮、经颊、鼻内、经肺、皮下、肌肉内、皮内、舌下、结肠内、眼内、静脉内或肠道给药。根据投药途径，基于可接受的药学实践调配化合物(Fingl等人,The Pharmacological Basis of Therapeutics,第1章,第1页(1975)；Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1990))。
本申请所述的药学上可接受的肽组合物可以多种剂型给药，诸如片剂、胶囊(其各包括持续释放或定时释放制剂)、丸剂、散剂、颗粒、酏剂、原位凝胶、微球体、晶体复合物、脂质体、微乳液、酊剂、悬浮液、糖浆、气溶胶喷雾剂及乳液。本申请所述的组合物亦可以经口、静脉内(快速注射或输注)、腹膜内、皮下、经皮或肌肉内形式给药，全部使用一般熟习医药技术者熟知的剂型。组合物可单独给药，但一般将与基于所选投药途径及标准医药实践选择的医药载剂一起给药。
本申请所述的组合物的给药方案将当然视已知因素而变化，诸如特定药剂的药力学特征及其投药模式及途径；接受者的物种、年龄、性别、健康状况、医学病状及体重；症状的性质及程度；同时发生的治疗的种类；治疗频率；投药途径、患者的肾功能及肝功能以及所需效应。医师或兽医可确定预防、对抗或遏止疾病状态的进程所需的有效量的药物且开具该有效量的药物的处方。
根据一般指导，活性成分在用于指定效应时的口服日剂量将介于每公斤体重约0.001至约1000mg范围内，优选每天每公斤体重约0.01至约100mg，且最优选每天每公斤约0.6至约20mg。活性成分在用于指定效应时的静脉内日剂量将在恒定速率输注期间介于每公斤体重每分钟0.001ng至100.0ng范围内。此类恒定静脉内输注可优选以每公斤体重每分钟0.01ng至50ng且最优选每公斤体重每分钟0.01ng至10.0mg的速率给药。本申请所述的组合物可以单次日剂量给药，或每日总剂量可分成每日两次、三次或四次分次给药给药。本申请所述的组合物亦可视需要通过将允许经数天/周/月的时段持续释放药物的储槽式制剂给药。
本申请所述的组合物可经由局部使用适合的鼻内媒剂以鼻内形成或使用经皮皮肤贴片经由经皮途径给药。当以经皮递送系统形式给药时，剂量给药将当然在整个给药方案中为连续而非间断的。
组合物通常与根据预定投药形式(亦即口服片剂、胶囊、酏剂、在推进剂存在或不存在下生成的气溶胶喷雾剂及糖浆)适当选择且与常规医药实践相符的适合医药稀释剂、赋形剂或载剂(在本申请中统称为医药载剂)混合给药。
举例而言，对于以片剂或胶囊形式经口给药，活性药物组分可与以下经口、无毒、药学上可接受的惰性载剂组合，诸如(但不限于)乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇及山梨醇；对于以液体形式经口给药，经口药物组分可与以下任何经口、无毒、药学上可接受的惰性载剂组合，诸如(但不限于)乙醇、丙三醇及水。此外，当需要或必要时，亦可将适合的黏合剂、润滑剂、崩解剂及着色剂并入混合物中。适合的黏合剂包括(但不限于)淀粉；明胶；天然糖，诸如(但不限于)葡萄糖或β-乳糖；玉米甜味剂；天然及合成胶，诸如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠；羧基甲基纤维素；聚乙二醇及蜡。用于这些剂型的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠及氯化钠。崩解剂包括(但不限于)淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土及三仙胶。
本申请所述的组合物亦可以混合微胞或脂质体递送系统形式给药，诸如单层小微脂粒、单层大微脂粒及多层微脂粒。脂质体可由多种磷脂形成，诸如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱。可添加渗透增强剂以增强药物吸收。
由于已知前药增强许多所需医药质量(亦即溶解性、生物可用性、制造等)，故本申请所述化合物可以前药形式递送。因此，本申请所述的目标物意欲涵盖本发明所主张的化合物的前药、递送其的方法及含有其的组合物。
本申请所述的组合物亦可与作为靶向药物载剂的可溶性聚合物偶合。此类聚合物可包括聚乙烯-吡咯烷酮、哌喃共聚物、聚羟丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或经软脂酰基残基取代的聚氧化乙烯-聚赖氨酸。此外，本申请所述的组合物可与以下适用于实现药物控制释放之一类可生物降解聚合物组合，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸与聚乙醇酸的共聚物、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢哌喃、聚氰基丙烯酸酯及水凝胶的交联或两性嵌段共聚物。
适于给药的剂型(药物组合物)可含有每剂量单位约0.01毫克至约500毫克活性成分。在这些药物组合物中，活性成分将通常以按该组合物的总重量计约0.5-95重量％的量存在。
明胶胶囊可含有活性成分及粉末状载剂，诸如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁及硬脂酸。类似稀释剂可用于制造压制片剂。片剂及胶囊可制造为持续释放产物以提供药物经数小时时段的连续释放。压制片剂可经糖包覆或经膜包覆以掩盖任何令人不愉快的味道且保护片剂不受大气影响，或经肠溶包衣包覆以便在胃肠道中选择性崩解。
用于经口给药的液体剂型可含有着色剂及调味剂以增加患者接受性。
一般而言，水、适合的油、生理盐水、右旋糖(葡萄糖)及相关糖水溶液及二醇(诸如丙二醇或聚乙二醇)为适用于非经肠溶液的载剂。用于非经肠给药的溶液优选含有活性成分的水溶性盐、适合的稳定剂及(若需要)缓冲物质。单独或合并的抗氧化剂，诸如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸为适合的稳定剂。亦使用柠檬酸及其盐及EDTA钠。另外，非经肠溶液可含有防腐剂，诸如氯化苯甲烃铵、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯及氯丁醇。
适合的医药载剂描述于本领域的标准参考本申请Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第十九版,Mack Publishing Company(1995)中。
适用于本申请所述化合物给药的代表性医药剂型可说明如下：
胶囊
大多数单位胶囊可通过用100毫克粉末状活性成分、150毫克乳糖、50毫克纤维素及6毫克硬脂酸镁填充标准分半硬明胶胶囊来制备。
软明胶胶囊
可制备活性成分于可消化油(诸如大豆油、棉籽油或橄榄油)中的混合物且藉助于正排量泵注入明胶中以形成含有100毫克活性成分的软明胶胶囊。胶囊应洗涤且干燥。
片剂
片剂可通过常规程序制备以使得剂量单位例如为100毫克活性成分、0.2毫克胶态二氧化硅、5毫克硬脂酸镁、275毫克微晶纤维素、11毫克淀粉及98.8毫克乳糖。可施用适当包衣以增加可口性或延迟吸收。
可注射剂
本申请所述的肽组合物的可注射制剂可或可不需要使用赋形剂，诸如已经监管机构核准的赋形剂。这些赋形剂包括(但不限于)溶剂及共溶剂、增溶剂、乳化剂或增稠剂、螯合剂、抗氧化剂及还原剂、抗微生物防腐剂、缓冲剂及pH调节剂、增积剂、保护剂及张力调节剂及专门添加剂。可注射制剂必须无菌、无热原质且在溶液情况下，不含微粒物质。
适于通过注射给药的非经肠组合物可通过将例如1.5重量％活性成分搅拌于可或可不含有共溶剂或其它赋形剂的可药用缓冲液中来制备。溶液应用氯化钠等张且灭菌。
悬浮液
可制备用于经口和/或非经肠给药的水性悬浮液，以使得例如各5mL含有100mg细粉状活性成分、20mg羧甲基纤维素钠、5mg苯甲酸钠、1.0g山梨醇溶液U.S.P.及0.025mL香草精或其它可口调味剂。
可生物降解微粒
适于通过注射给药的持续释放非经肠组合物可例如通过将适合的可生物降解聚合物溶解于溶剂中，将欲并入的活性剂添加至聚合物溶液且自基质移除溶剂，由此形成活性剂分布于整个基质中的聚合物基质来制备。
肽合成
本申请中的本发明的描述应视为与化学键结的定律及原理一致。应理解，本发明涵盖的化合物为适当稳定地用作药剂的彼等化合物。基于化学键结及稳定性的一般原理，本领域普通技术人员将知晓何等化合物将稳定及将不稳定。
本发明的大环肽的化学合成可使用多种此项技术公认的方法进行，包括逐步固相合成、经由构形辅助的肽片段再接合的半合成、选殖或合成肽区段的酶促接合及化学接合。合成本申请所述的大环肽及其类似物的优选方法为使用各种固相技术的化学合成，诸如描述于Chan,W.C.等人编,Fmoc Solid Phase Synthesis,Oxford University Press,Oxford(2000)；Barany,G.等人,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,第2卷:“SpecialMethods in Peptide Synthesis,Part A”,第3-284页,Gross,E.等人编,Academic Press,New York(1980)；以及Stewart,J.M.等人,Solid-Phase Peptide Synthesis,第2版,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984)中的固相技术。优选策略系基于用于临时保护α-氨基的Fmoc(9-芴基甲基甲基-氧基羰基)基团与用于临时保护氨基酸侧链的叔丁基组合(参见例如Atherton,E.等人,“The芴基甲氧基羰基氨基Protecting Group”,ThePeptides:Analysis,Synthesis,Biology,第9卷:“Special Methods in PeptideSynthesis,Part C”,第1-38页,Undenfriend,S.等人编,Academic Press,San Diego(1987)。
所述肽可以逐步方式在不溶性聚合物负载物(亦称为“树脂”)上自肽的C端开始合成。通过将化合物的C端氨基酸经由形成酰胺或酯键附接至树脂开始合成。此使得所得肽最终分别以C端酰胺或羧酸形式释放。
用于合成的C端氨基酸及所有其它氨基酸需要使其α-氨基及侧链官能基(若存在)有差异地受保护，使得α-氨基保护基可在合成期间选择性移除。氨基酸的偶合通过将其羧基活化为活性酯且使其与附接至树脂的N端氨基酸未封端的α-氨基反应来进行。重复α-氨基脱保护及偶合的顺序，直至组装整个肽序列为止。肽接着自树脂释放，同时伴随侧链官能基脱保护，通常在适当清除剂存在下进行以限制副反应。所得肽最终通过反相HPLC纯化。
作为最终肽之前驱物所需的肽基-树脂的合成利用市售交联聚苯乙烯聚合物树脂(Novabiochem,San Diego,CA；Applied Biosystems,Foster City,CA)。C端甲酰胺的优选固体负载物为：4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基乙酰基-对甲基二苯甲胺树脂(Rink酰胺MBHA树脂)；9-Fmoc-氨基-二苯并哌喃-3-基氧基-Merrifield树脂(Sieber酰胺树脂)；4-(9-Fmoc)氨基甲基-3,5-二甲氧基苯氧基)戊酰基-氨基甲基-Merrifield树脂(PAL树脂)。第一及后续氨基酸的偶合可使用HOBt、6-Cl-HOBt或分别由DIC/HOBt、HBTU/HOBt、BOP、PyBOP生产或由DIC/6-Cl-HOBt、HCTU、DIC/HOAt或HATU生产的HOAt活性酯实现。受保护的肽片段的优选固体负载物为：2-氯三苯甲基氯树脂及9-Fmoc-氨基-二苯并哌喃-3-基氧基-Merrifield树脂(Sieber酰胺树脂)。第一氨基酸装载于2-氯三苯甲基氯树脂上最优选通过使受Fmoc保护的氨基酸与树脂在二氯甲烷及DIEA中反应来实现。若需要，可添加少量DMF以促进氨基酸溶解。
本申请所述的肽类似物的合成可通过使用单信道或多信道肽合成器来进行，诸如CEM Liberty Microwave合成器或Protein Technologies,Inc.Prelude(6信道)或Symphony(12信道)合成器。
对于其相应肽的肽基-树脂前驱物可使用任何标准程序裂解且脱保护(参见例如King,D.S.等人,Int.J.Peptide Protein Res.,36:255-266(1990))。所需方法为在水及作为清除剂的TIS存在下使用TFA。通常，肽基-树脂在室温下于TFA/水/TIS(94:3:3，v:v:v；1mL/100mg肽基树脂)中搅拌2-6小时。接着滤出已用树脂且浓缩TFA溶液或在减压下干燥。所得粗物质肽沉淀且用Et2O洗涤或直接再溶解于DMSO或50％乙酸水溶液中以便通过制备型HPLC纯化。
具有所需纯度的肽可通过例如在Waters型号4000或Shimadzu型号LC-8A液体色谱仪上使用制备型HPLC纯化来获得。将粗物质肽溶液注入YMC S5 ODS(20×100mm)管柱中且用MeCN/水(均用0.1％TFA缓冲)的线性梯度使用14-20mL/min的流动速率洗脱，同时通过在220nm下的UV吸亮度监测流出物。经纯化肽的结构可通过电喷雾MS分析确认。
实施例
本申请案中所用(具体包括在以下示例性方案及实施例中)的缩写为本领域普通技术人员所熟知。一些所用缩写如下：HOBt为1-羟基苯并三唑；HOAt为1-羟基-7-氮杂苯并三唑；DIC为N,N'-二异丙基碳二亚胺；HBTU为O-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐；BOP为苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐；PyBOP为(苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷并鏻六氟磷酸盐)；HCTU为O-(6-Cl-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐；HATU为(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐)；Fmoc为9-芴基甲氧基羰基；DIEA或DIPEA为二异丙基乙胺；DMF为N,N-二甲基甲酰胺；TFA为三氟乙酸；TIS为三异丙基硅烷；Et2O为乙醚；DMSO为二甲基亚砜；DCM为1,1-二氯甲烷；NMM为N-甲基吗啉；NMP为N-甲基吡咯烷酮；Ac为乙酰；min和mins为分钟；h和hr和hrs为小时；RT为保留时间或室温(上下文将提示)；ACN或MeCN为乙腈；TES为三乙基硅烷；pTsOH为对-甲苯磺酸；DEM为二乙氧基甲烷；DCE为二氯乙烷；和Et为乙基。
分析数据：
质谱分析：“ESI-MS(+)”表示在阳离子模式中进行的电喷雾电离质谱分析；“ESI-MS(-)”表示在阴离子模式中进行的电喷雾电离质谱分析；“ESI-HRMS(+)”表示在阳离子模式中进行的高分辨率电喷雾电离质谱分析；“ESI-HRMS(-)”表示在阴离子模式中进行的高分辨率电喷雾电离质谱分析。所检测的质量在“m/z”单位名称后报导。精确质量大于1000的化合物常常检测为双电荷或三电荷离子。
分析数据：
质谱分析：“ESI-MS(+)”表示在阳离子模式中进行的电喷雾电离质谱分析；“ESI-MS(-)”表示在阴离子模式中进行的电喷雾电离质谱分析；“ESI-HRMS(+)”表示在阳离子模式中进行的高分辨率电喷雾电离质谱分析；“ESI-HRMS(-)”表示在阴离子模式中进行的高分辨率电喷雾电离质谱分析。所检测的质量在“m/z”单位名称后报导。精确质量大于1000的化合物常常检测为双电荷或三电荷离子。
分析LCMS条件A：
管柱：BEH C18,2.1×50mm,1.7-μm粒子；流动相A：水+0.05％TFA；流动相B：乙腈+0.05％TFA；温度：50℃；梯度：经2分钟2％B至98％B，接着在98％B下保持0.5分钟；流速：0.8mL/min；检测：UV，220nm。
分析LCMS条件B：
管柱：BEH C18,2.1×50mm,1.7-μm粒子；流动相A：5:95乙腈:水+0.05％TFA；流动相B：95:5乙腈:水+0.05％TFA；温度：50℃；梯度：经3分钟0-100％B，接着在100％B下保持0.75分钟；流速：1.11mL/min。
分析LCMS条件C：
管柱：BEH C18,2.1×50mm,1.7-μm粒子；流动相A：水+0.2％甲酸及0.01％TFA；流动相B：乙腈+0.2％甲酸0.01％TFA；温度：50℃；梯度：经2分钟2％B至80％B，经0.1分钟80％B至98％B，接着在98％B下保持0.5分钟；流速：0.8mL/min；检测：UV，220nm。
分析LCMS条件D：
管柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1×50mm,1.7-μm粒子；流动相A：5:95乙腈:水+10mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水+10mM乙酸铵；温度：50℃；梯度：经3分钟0-100％B，接着在100％B下保持0.75分钟；流速：1.11mL/min；检测：UV，220nm。
分析LCMS条件E：
管柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1×50mm,1.7-μm粒子；流动相A：5:95乙腈:水+0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水+0.1％三氟乙酸；温度：50℃；梯度：经3分钟0-100％B，接着在100％B下保持0.75分钟；流速：1.11mL/min；检测：UV，220nm。
分析LCMS条件F：
管柱：Waters Xbridge C18,2.1×50mm；流动相A：5:95乙腈:水+10mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水+10mM乙酸铵；温度：35℃；梯度：经4分钟0-100％B，接着在100％B下保持1分钟；流速：4mL/min；检测：UV，220nm。
分析LCMS条件G：
Finnigan LTQ质谱仪；管柱：Phenomenex Jupiter C4,1×50mm；流动相A：1％甲酸/水；流动相B：0.1％甲酸/乙腈；温度：30℃；梯度：1％B，保持1分钟；经3分钟1-95％B，接着在95％B下保持3分钟；流速：0.15mL/min。
分析HPLC条件A：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；流动相A：水+0.1％TFA；流动相B：乙腈+0.1％TFA；温度：60℃；梯度：经25分钟35％B至80％B；流速：1mL/min；检测：UV，217nm。
分析HPLC条件B：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；流动相A：水+0.1％TFA；流动相B：乙腈+0.1％TFA；温度：60℃；梯度：经25分钟25％B至75％B；流速：1mL/min；检测：UV，217nm。
分析HPLC条件C：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；流动相A：水+0.1％TFA；流动相B：乙腈+0.1％TFA；温度：60℃；梯度：经25分钟20％B至70％B；流速：1mL/min；检测：UV，217nm。
分析HPLC条件D：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；流动相A：水+0.1％TFA；流动相B：乙腈+0.1％TFA；温度：60℃；梯度：经25分钟15％B至65％B；流速：1mL/min；检测：UV，217nm。
分析HPLC条件E：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；流动相A：水+0.1％TFA；流动相B：乙腈+0.1％TFA；温度：60℃；梯度：经20分钟25％B至60％B；流速：1.25mL/min；检测：UV，217nm。
分析HPLC条件F：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；流动相A：水+0.1％TFA；流动相B：乙腈+0.1％TFA；温度：60℃；梯度：经20分钟25％B至65％B；流速：1.25mL/min；检测：UV，217nm。
分析HPLC条件G：
管柱：Sunfire C18 3.5um,3.0×150mm；流动相A：5:95乙腈:水+0.05％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水+0.05％三氟乙酸；温度：50℃；梯度：经12分钟10-100％B，接着在100％B下保持3分钟；流速：1mL/min；检测：UV，220nm。
分析HPLC条件H：
管柱：Xbridge苯基3.5×150um，流动相A：5:95乙腈:水+0.05％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水+0.05％三氟乙酸；温度：50℃；梯度：经12分钟10-100％B，接着在100％B下保持3分钟；流速：1mL/min；检测：UV，220nm。
分析HPLC条件I：
管柱：Phenomenex Luna 5u C18(2)150×4.6mm；流动相A：水+0.1％三氟乙酸，流动相B：乙腈+0.1％三氟乙酸，梯度：经20分钟5-100％B，接着在100％B下保持5分钟；流速：1mL/min，检测：UV，220
分析HPLC条件J：
管柱：Phenomenex Luna 5u C18(2)150×4.6mm；流动相A：水+0.1％三氟乙酸，流动相B：乙腈+0.1％三氟乙酸，梯度：经20分钟10-100％B，接着在100％B下保持5分钟；流速：1mL/min，检测：UV，220
分析HPLC条件K：
柱-Ascentis Express C18 50X2.1mm-2.7μm；流动相A：0.1％HCOOH/水，流动相B：乙腈，梯度：经1.7分钟0-100％B，接着在100％B保持1.55分钟；流速：1mL/min，检测：UV，254
一般操作：
Prelude方法A：
所有操作在Prelude肽合成器(Protein Technologies)上自动进行。除非另外指出，否则所有操作在装配有底部玻璃料的10或45mL聚丙烯管中进行。该管经由该管的底部及顶部连接至Prelude肽合成器。DMF及DCM可经由管顶部添加，其向下同等洗涤管侧。其余试剂经由管底部添加且向上穿过玻璃料以接触树脂。所有溶液经由管底部移除。“周期性搅动”描述经由底部玻璃料的短暂N2气脉冲；脉冲持续约5秒且每隔30秒出现。一般不使用制备超过三周的氨基酸溶液。DMF＝二甲基甲酰胺；DIC＝N,N’-二异丙基碳二亚胺；HOAt＝1-羟基-7-氮杂苯并三唑；Sieber＝Fmoc-氨基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述与聚苯乙烯树脂连接的位置及类型。所用树脂为具有Sieber连接基团(在氮处受Fmoc保护)的Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g装载量。常用氨基酸列于以下，其中侧链保护基在括号内指出：
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。
“Prelude方法A”的程序描述以0.100mmol规模进行的实验，其中所述规模通过结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。此规模相当于大致140mg上文所述的Sieber-Merrifield树脂。所有操作可通过规模的倍量来调整所述体积，以便按比例放大超过0.100mmol规模。在氨基酸偶合之前，所有肽合成顺序始于树脂溶胀操作，下文描述为“树脂溶胀操作”。将氨基酸偶合至伯胺N端使用下文所述的“单偶合操作”。Fmoc-N-甲基氨基酸的偶合及偶合至二级胺N端使用下文所述的“二级胺偶合操作”。将氯乙酰基偶合至肽的N端通过下文详述的“氯乙酰氯偶合操作”或“氯乙酸偶合操作”描述。
树脂溶胀操作：
向40mL聚丙烯固相反应容器中添加Merrifield:Sieber树脂(140mg，0.100mmol)。树脂如下洗涤三次：向反应容器中添加DMF(5.0mL)及DCM(5.0mL)，接着通过自反应容器底部的N2鼓泡周期性搅动混合物10分钟，随后排出溶剂。
单偶合操作：
向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤五次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物60秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸及HOAt的溶液(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)，接着添加DIC(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)。周期性搅动混合物60分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF的溶液(10:1:89v/v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
仲胺偶合操作：
向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤五次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物60秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸及HOAt的溶液(0.2M于DMF中，5.0mL，5当量)，接着添加DIC(0.2M于DMF中，5.0mL，5当量)。周期性搅动混合物300分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF的溶液(10:1:89v/v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
氯乙酰氯偶合操作：
向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤五次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加3.0mL DIPEA(4.0mmol，0.699mL，40当量)及氯乙酰氯(2.0mmol，0.160mL，20当量)于DMF中的溶液。周期性搅动混合物12至18小时，接着排出溶液。树脂如下连续洗涤三次：对于每次洗涤，将DMF(4.0mL)添加至容器顶部且周期性搅动所得混合物90秒，随后排出溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，将DCM(4.0mL)添加至容器顶部且周期性搅动所得混合物90秒，随后排出溶液。
Prelude方法B：
所有操作在Prelude肽合成器(Protein Technologies)上自动进行。所有操作在装配有底部玻璃料的10或45mL聚丙烯管中进行。DMF及DCM可经由管顶部添加，其向下同等洗涤管侧。其余试剂经由管底部添加且向上穿过玻璃料以接触树脂。所有溶液经由管底部移除。“周期性搅动”描述经由底部玻璃料的短暂N2气脉冲；脉冲持续约5秒且每隔30秒出现。一般不使用制备超过三周的氨基酸溶液。DMF＝二甲基甲酰胺；HCTU＝2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；DIPEA＝二异丙基乙胺；Sieber＝Fmoc-氨基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述与聚苯乙烯树脂连接的位置及类型。所用树脂为具有Sieber连接基团(在氮处受Fmoc保护)的Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g装载量。常用氨基酸列于以下，其中侧链保护基在括号内指出：
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。
“Prelude方法B”的程序描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模通过结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。此规模相当于大致140mg上文所述的Sieber-Merrifield树脂。所有操作可通过规模的倍量来调整所述体积，以便按比例放大超过0.100mmol规模。在氨基酸偶合之前，所有肽合成顺序始于树脂溶胀操作，下文描述为“树脂溶胀操作”。将氨基酸偶合至伯胺N端使用下文所述的“单偶合操作”。将氨基酸偶合至仲胺N端使用下文所述的“仲胺偶合操作”。将氯乙酰基偶合至肽的N端通过下文详述的“氯乙酰氯偶合操作”或“氯乙酸偶合操作”描述。
树脂溶胀操作：
向40mL聚丙烯固相反应容器中添加Merrifield:Sieber树脂(140mg，0.100mmol)。树脂如下洗涤(溶胀)三次：向反应容器中添加DMF(5.0mL)及DCM(5.0mL)，接着通过自反应容器底部的N2鼓泡周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出溶剂。
单偶合操作：
向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤五次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物60秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)，接着添加HCTU(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，2.5mL，20当量)。周期性搅动混合物30分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF的溶液(10:1:89v/v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
双偶合操作：
向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤五次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物60秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)，接着添加HCTU(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，2.5mL，20当量)。周期性搅动混合物15分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂用经由容器顶部的DMF(4.0mL)连续洗涤3次且周期性搅动所得混合物60秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)，接着添加HCTU(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，2.5mL，20当量)。周期性搅动混合物15分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
仲胺偶合操作：
向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤五次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，2.5mL，10当量)，接着添加HCTU(0.2M于DMF中，2.5mL，10当量)且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.5mL，12当量)。周期性搅动混合物12小时，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
氯乙酰氯偶合操作A：
向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤五次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加DMF中的DIPEA(4.0mmol,0.699mL,40当量)和氯乙酰氯(2.0mmol,0.160mL，20当量)。周期性搅动混合物12至18小时，接着经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤三次：对于每次洗涤，将DMF(4.0mL)添加至容器顶部且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，将CH2Cl2(2.0mL)添加至容器顶部且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。
氯乙酰氯偶合操作B：
向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤五次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加DMF(2.0mL)、氯乙酸(1.2mmol,113mg,12当量)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(1.2mmol,0.187mL,12当量)。周期性搅动混合物12至18小时，接着经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤三次：对于每次洗涤，将DMF(4.0mL)添加至容器顶部且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，将CH2Cl2(2.0mL)添加至容器顶部且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。
Prelude方法C：
所有操作在Prelude肽合成器(Protein Technologies)上自动进行。除非另外指出，否则所有操作在装配有底部玻璃料的10或45mL聚丙烯管中进行。该管经由该管的底部及顶部连接至Prelude肽合成器。DMF及DCM可经由管顶部添加，其向下同等洗涤管侧。其余试剂经由管底部添加且向上穿过玻璃料以接触树脂。所有溶液经由管底部移除。“周期性搅动”描述经由底部玻璃料的短暂N2气脉冲；脉冲持续约5秒且每隔30秒出现。一般不使用制备超过三周的氨基酸溶液。HATU溶液在制备5天内使用。DMF＝二甲基甲酰胺；HCTU＝2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；HATU＝1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐；DIPEA＝二异丙基乙胺；Sieber＝Fmoc-氨基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述与聚苯乙烯树脂连接的位置及类型。所用树脂为具有Sieber连接基团(在氮处受Fmoc保护)的Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g装载量。常用氨基酸列于以下，其中侧链保护基在括号内指出：
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。
“Prelude方法C”的程序描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模通过结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。此规模相当于大致140mg上文所述的Sieber-Merrifield树脂。所有操作可通过规模的倍量来调整所述体积，以便按比例放大超过0.100mmol规模。在氨基酸偶合之前，所有肽合成顺序始于树脂溶胀操作，下文描述为“树脂溶胀操作”。将氨基酸偶合至伯胺N端使用下文所述的“单偶合操作”。将氨基酸偶合至仲胺N端使用下文所述的“仲胺偶合操作”。树脂的最终洗涤使用下文所述的“最终洗涤操作”。
树脂溶胀操作：
向40mL聚丙烯固相反应容器中添加Merrifield:Sieber树脂(140mg，0.100mmol)。树脂如下洗涤(溶胀)三次：向反应容器中添加DMF(5.0mL)及DCM(5.0mL)，接着通过自反应容器底部的N2鼓泡周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出溶剂。
单偶合操作：
向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤五次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物60秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，2.5mL，20当量)。周期性搅动混合物60分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF的溶液(10:1:89v/v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
仲胺偶合操作：
向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤五次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，1.5mL，12当量)。周期性搅动混合物300分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下洗涤两次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，1.5mL，12当量)。周期性搅动混合物300分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下洗涤两次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF的溶液(10:1:89v/v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
常规氨基酸偶合操作：
向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤五次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，0.5至2.5mL，1至5当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，0.5至2.5mL，1至5当量)，且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，0.5至1.5mL，4至12当量)。周期性搅动混合物60分钟至600分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下洗涤两次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(2.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF的溶液(10:1:89v/v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
最终洗涤操作：
树脂如下连续洗涤两次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DCM(4.0mL)且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
氯乙酸偶合操作：
注意手动步骤。向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。混合物在室温下震荡5分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤五次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且搅动所得混合物，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加DMF(2.0mL)、氯乙酸(1.2mmol，113mg，12当量)及N,N'-二异丙基碳化二亚胺(1.2mmol，0.187mL，12当量)。混合物在室温下震荡12至18小时，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤三次：对于每次洗涤，将DMF(4.0mL)添加至容器顶部且搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，将CH2Cl2(4.0mL)添加至容器顶部且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。
Prelude方法D：
所有操作在Prelude肽合成器(Protein Technologies)上自动进行。除非另外指出，否则所有操作在装配有底部玻璃料的10或45mL聚丙烯管中进行。该管经由该管的底部及顶部连接至Prelude肽合成器。DMF及DCM可经由管顶部添加，其向下同等洗涤管侧。其余试剂经由管底部添加且向上穿过玻璃料以接触树脂。所有溶液经由管底部移除。“周期性搅动”描述经由底部玻璃料的短暂N2气脉冲；脉冲持续约5秒且每隔30秒出现。一般不使用制备超过三周的氨基酸溶液。HATU溶液在制备5天内使用。DMF＝二甲基甲酰胺；HCTU＝2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；HATU＝1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐；DIPEA＝二异丙基乙胺；Sieber＝Fmoc-氨基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述与聚苯乙烯树脂连接的位置及类型。所用树脂为具有Sieber连接基团(在氮处受Fmoc保护)的Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g装载量。常用氨基酸列于以下，其中侧链保护基在括号内指出：
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。
“Prelude方法D”的程序描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模通过结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。此规模相当于大致140mg上文所述的Sieber-Merrifield树脂。所有操作可通过规模的倍量来调整所述体积，以便按比例放大超过0.100mmol规模。在氨基酸偶合之前，所有肽合成顺序始于树脂溶胀操作，下文描述为“树脂溶胀操作”。将氨基酸偶合至伯胺N端使用下文所述的“单偶合操作”。将氨基酸偶合至仲胺N端使用下文所述的“仲胺偶合操作”。树脂的最终洗涤使用下文所述的“最终洗涤操作”。
树脂溶胀操作：
向40mL聚丙烯固相反应容器中添加Merrifield:Sieber树脂(140mg，0.100mmol)。树脂如下洗涤(溶胀)三次：向反应容器中添加DMF(5.0mL)及DCM(5.0mL)，接着通过自反应容器底部的N2鼓泡周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出溶剂。
单偶合操作：
向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤五次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物60秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，2.5当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，2.5当量)且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，0.75mL，5当量)。周期性搅动混合物30分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF的溶液(10:1:89v/v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物15分钟，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
仲胺偶合操作：
向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤五次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，2.5当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，2.5当量)且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，0.75mL，5当量)。周期性搅动混合物30分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下洗涤两次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，2.5当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，2.5当量)且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，0.75mL，5当量)。周期性搅动混合物30分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下洗涤两次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF的溶液(10:1:89v/v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物15分钟，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下洗涤两次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF的溶液(10:1:89v/v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物15分钟，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
最终洗涤操作：
树脂如下连续洗涤两次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DCM(4.0mL)且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
氯乙酸偶合操作：
注意手动步骤。向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。混合物在室温下震荡5分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤五次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且搅动所得混合物，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加DMF(2.0mL)、氯乙酸(1.2mmol，113mg，12当量)及N,N'-二异丙基碳化二亚胺(1.2mmol，0.187mL，12当量)。混合物在室温下震荡12至18小时，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤三次：对于每次洗涤，将DMF(4.0mL)添加至容器顶部且搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，将CH2Cl2(4.0mL)添加至容器顶部且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。
CEM方法A：
所有操作在CEM Liberty微波肽合成器(CEM Corporation)上自动进行。除非另外指出，否则所有操作在装配有底部玻璃料至CEM Discovery微波单元的30或125mL聚丙烯管中进行。该管经由该管的底部及顶部连接至CEMLiberty合成器。DMF及DCM可经由管顶部及底部添加，其向下同等洗涤管侧。除了自顶部转移树脂时，所有溶液经由管底部移出。“周期性鼓泡”描述经由底部玻璃料的短暂N2气鼓泡。一般不使用制备超过三周的氨基酸溶液。HATU溶液在制备5天内使用。DMF＝二甲基甲酰胺；HCTU＝2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；HATU＝1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐；DIPEA＝二异丙基乙胺；Sieber＝Fmoc-氨基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述与聚苯乙烯树脂连接的位置及类型。所用树脂为具有Sieber连接基团(在氮处受Fmoc保护)的Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g装载量。可在合成中采用其它常见树脂(诸如Rink、ChloroTrityl)或其它酸敏感性连接基团，除非另外指出，否则在特定实施例中使用Seiber酰胺树脂。常用氨基酸列于以下，其中侧链保护基在括号内指出：
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Orn(Boc)-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。
CEM方法A”的程序描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模通过结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。此规模相当于大致140mg上文所述的Sieber-Merrifield树脂。所有操作可通过规模的倍量来调整所述体积，以便按比例放大超过0.100mmol规模。在氨基酸偶合之前，所有肽合成顺序始于树脂溶胀操作，下文描述为“树脂溶胀操作”。将氨基酸偶合至伯胺N端使用下文所述的“单偶合操作”。将氨基酸偶合至仲胺N端使用下文所述的“仲胺偶合操作”。将氯乙酰基偶合至肽的N端通过上文详述的“氯乙酰氯偶合操作”或“氯乙酸偶合操作”描述。
树脂溶胀操作：
向50mL聚丙烯锥形管中添加Merrifield:Sieber树脂(140mg，0.100mmol)。随后将DMF(7mL)添加至管中，接着添加DCM(7mL)。树脂接着自容器顶部转移至反应容器。再重复程序两次。添加DMF(7mL)，接着添加DCM(7mL)。通过自反应容器底部的N2鼓泡使树脂溶胀15分钟，随后经由玻璃料排出溶剂。
标准偶合操作：
向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤三次：DMF(7mL)自顶部洗涤，接着DMF(7mL)自底部洗涤且最后用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)、HATU(0.5M于DMF中，1.0mL，5当量)及DIPEA(2M于NMP中，0.5mL，10当量)。除了在50℃下偶合的Fmoc-Cys(Trt)-OH及Fmoc-His(Trt)-OH的外，所有氨基酸的混合物在75℃下通过N2鼓泡5分钟来混合，经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤三次：DMF(7mL)自顶部洗涤，接着DMF(7mL)自底部洗涤且最后用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF的溶液(10:1:89v/v/v，5.0mL)。混合物在65℃下周期性鼓泡2分钟，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤三次：DMF(7mL)自顶部洗涤，接着DMF(7mL)自底部洗涤且最后用DMF(7mL)自顶部洗涤。所得树脂直接用于下一步骤。
双偶合偶合操作：
向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤三次：DMF(7mL)自顶部洗涤，接着DMF(7mL)自底部洗涤且最后用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)、HATU(0.5M于DMF中，1.0mL，5当量)及DIPEA(2M于NMP中，0.5mL，10当量)。除了在50℃下偶合的Fmoc-Cys(Trt)-OH及Fmoc-His(Trt)-OH的外，所有氨基酸的混合物在75℃下通过N2鼓泡5分钟来混合，经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤三次：DMF(7mL)自顶部洗涤，接着DMF(7mL)自底部洗涤且最后用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)、HATU(0.5M于DMF中，1.0mL，5当量)及DIPEA(2M于NMP中，0.5mL，10当量)。除了在50℃下偶合的Fmoc-Cys(Trt)-OH及Fmoc-His(Trt)-OH的外，所有氨基酸的混合物在75℃下通过N2鼓泡5分钟来混合，经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤三次：DMF(7mL)自顶部洗涤，接着DMF(7mL)自底部洗涤且最后用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF的溶液(10:1:89v/v/v，5.0mL)。混合物在65℃下周期性鼓泡2分钟，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤三次：DMF(7mL)自顶部洗涤，接着DMF(7mL)自底部洗涤且最后用DMF(7mL)自顶部洗涤。所得树脂直接用于下一步骤。
仲胺偶合操作：
向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加5％哌嗪及0.1M HOBt于DMF(7mL)中的溶液。混合物在75℃下周期性搅动3分钟且随后排出溶液。再重复此程序一次。树脂如下连续洗涤三次：DMF(7mL)自顶部洗涤，接着DMF(7mL)自底部洗涤且最后用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)、HCTU(0.5M于DMF中，1.0mL，5当量)及DIPEA(2M于NMP中，0.5mL，10当量)。所有氨基酸(对于Fmoc-Cys(Trt)-OH及Fmoc-His(Trt)-OH，50℃)的混合物在75℃下通过N2鼓泡5分钟来混合，接着在不加热的情况下混合6小时。在排出后，树脂如下连续洗涤三次：DMF(7mL)自顶部洗涤，接着DMF(7mL)自底部洗涤且最后用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF的溶液(10:1:89v/v/v，5.0mL)。混合物在65℃下周期性鼓泡2分钟，随后排出溶液。树脂如下连续洗涤三次：DMF(7mL)自顶部洗涤，接着DMF(7mL)自底部洗涤且最后用DMF(7mL)自顶部洗涤。所得树脂直接用于下一步骤。
常规氨基酸偶合操作：
向先前步骤的含有树脂的反应容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80v/v，5.0mL)。周期性搅动混合物3分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤三次：DMF(7mL)自顶部洗涤，接着DMF(7mL)自底部洗涤且最后用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加含有HATU(2.5eq至10当量)的氨基酸溶液(1.25mL至5mL，2.5eq至10当量)，且最后添加DIPEA(2M于NMP中，0.5mL至1mL，20当量)。混合物在25℃至75℃下通过N2鼓泡5分钟至2小时来混合，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤三次：DMF(7mL)自顶部洗涤，接着DMF(7mL)自底部洗涤且最后用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF的溶液(10:1:89v/v/v，5.0mL)。混合物在65℃下周期性鼓泡2分钟，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤三次：DMF(7mL)自顶部洗涤，接着DMF(7mL)自底部洗涤且最后用DMF(7mL)自顶部洗涤。所得树脂直接用于下一步骤。
Symphony方法A：
所有操作在Symphony肽合成器(Protein Technologies)上自动进行。除非另外指出，否则所有操作在装配有底部玻璃料的Symphony聚丙烯管中进行。该管经由该管的底部及顶部连接至Symphony肽合成器。所有溶剂、DMF、DCM、氨基酸及试剂经由管底部添加且向上穿过玻璃料以接触树脂。所有溶液经由管底部移除。“周期性搅动”描述经由底部玻璃料的短暂N2气脉冲；脉冲持续约5秒且每隔15秒出现。一般不使用制备超过三周的氨基酸溶液。HATU溶液在制备5天内使用。DMF＝二甲基甲酰胺；HCTU＝2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；HATU＝1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐；NMM＝n-甲基吗啉；DIPEA＝二异丙基乙胺；Sieber＝Fmoc-氨基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述与聚苯乙烯树脂连接的位置及类型。所用树脂为具有Sieber连接基团(在氮处受Fmoc保护)的Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g装载量。其它常见酸敏感性树脂亦可用于合成，诸如Rink或官能化氯三苯甲基树脂。常用氨基酸列于以下，其中侧链保护基在括号内指出：
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH.
“Symphony方法A”的程序描述以0.050mmol规模进行的实验，其中该规模通过结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。此规模相当于大致70mg上文所述的Sieber-Merrifield树脂。所有操作可通过规模的倍量来调整所述体积，以便按比例放大超过0.050mmol规模。在氨基酸偶合之前，所有肽合成顺序始于树脂溶胀操作，下文描述为“溶胀操作”。将氨基酸偶合至伯胺N端使用下文所述的“标准偶合操作”。将氨基酸偶合至仲胺N端使用“双偶合”，常规氨基酸经由手动空白添加氨基酸，亦即下文所述的“空白偶合”来偶合。
溶胀操作：
向Symphony聚丙烯固相反应容器中添加Merrifield:Sieber树脂(70mg，0.050mmol)。树脂如下洗涤(溶胀)三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，接着通过自反应容器底部的N2鼓泡周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.5mL)。周期性搅动混合物2.5分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤六次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂用经由容器底部添加的DMF(6.25mL)洗涤且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下洗涤三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，接着通过自反应容器底部的N2鼓泡周期性搅动混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶剂。所得树脂直接用于下一步骤。
标准偶合操作：
树脂如下洗涤三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，接着通过自反应容器底部的N2鼓泡周期性搅动混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.5mL)。周期性搅动混合物2.5分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下洗涤6次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂用经由容器底部添加的DMF(6.25mL)洗涤且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤三次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
仲胺偶合操作：
树脂如下洗涤三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，接着通过自反应容器底部的N2鼓泡周期性搅动混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.5mL)。周期性搅动混合物2.5分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下洗涤6次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。周期性搅动混合物300分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂用经由容器底部添加的DMF(6.25mL)洗涤且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。周期性搅动混合物300分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤三次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
常规氨基酸偶合操作：
树脂如下洗涤三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，接着通过自反应容器底部的N2鼓泡周期性搅动混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.5mL)。周期性搅动混合物2.5分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下洗涤6次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。由Symphony软件暂停合成以将常规氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)手动添加至反应容器中，随后重启自动化：以添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。周期性搅动混合物300分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下洗涤六次：经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加Ac2O/DIPEA/DMF(v/v/v 1:1:32.5mL)，周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤三次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
Symphony方法B：
所有操作在Symphony肽合成器(Protein Technologies)上自动进行。除非另外指出，否则所有操作在装配有底部玻璃料的Symphony聚丙烯管中进行。该管经由该管的底部及顶部连接至Symphony肽合成器。所有溶剂、DMF、DCM、氨基酸及试剂经由管底部添加且向上穿过玻璃料以接触树脂。所有溶液经由管底部移除。“周期性搅动”描述经由底部玻璃料的短暂N2气脉冲；脉冲持续约5秒且每隔15秒出现。一般不使用制备超过三周的氨基酸溶液。HATU溶液在制备5天内使用。DMF＝二甲基甲酰胺；HCTU＝2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；HATU＝1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐；NMM＝n-甲基吗啉；DIPEA＝二异丙基乙胺；Sieber＝Fmoc-氨基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述与聚苯乙烯树脂连接的位置及类型。所用树脂为具有Sieber连接基团(在氮处受Fmoc保护)的Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g装载量。其它常见酸敏感性树脂亦可用于合成，诸如Rink或官能化氯三苯甲基树脂。常用氨基酸列于以下，其中侧链保护基在括号内指出：
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。
“Symphony方法B”的程序描述以0.050mmol规模进行的实验，其中该规模通过结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。此规模相当于大致70mg上文所述的Sieber-Merrifield树脂。所有操作可通过规模的倍量来调整所述体积，以便按比例放大超过0.050mmol规模。在氨基酸偶合之前，所有肽合成顺序始于树脂溶胀操作，下文描述为“溶胀操作”。将氨基酸偶合至伯胺N端使用下文所述的“标准偶合操作”。将氨基酸偶合至仲胺N端使用“仲胺偶合操作B”，常规氨基酸经由手动空白添加氨基酸，亦即下文所述的“常规氨基酸偶合操作”偶合，且氯乙酰酸酐使用下文所述的“最终封端操作”添加至序列的最终位置。
溶胀操作：
向Symphony聚丙烯固相反应容器中添加Merrifield:Sieber树脂(70mg，0.050mmol)。树脂如下洗涤(溶胀)三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，接着通过自反应容器底部的N2鼓泡周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.5mL)。周期性搅动混合物2.5分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤六次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂用经由容器底部添加的DMF(6.25mL)洗涤且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下洗涤三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，接着通过自反应容器底部的N2鼓泡周期性搅动混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶剂。所得树脂直接用于下一步骤。
标准偶合操作：
树脂如下洗涤三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，接着通过自反应容器底部的N2鼓泡周期性搅动混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.5mL)。周期性搅动混合物2.5分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下洗涤6次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。周期性搅动混合物15分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下洗涤6次：经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加Ac2O/DIPEA/DMF(v/v/v 1:1:3 2.5mL)，周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤六次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
仲胺偶合操作：
树脂如下洗涤三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，接着通过自反应容器底部的N2鼓泡周期性搅动混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.5mL)。周期性搅动混合物2.5分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下洗涤6次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。周期性搅动混合物15分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂用经由容器底部添加的DMF(6.25mL)洗涤且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，接着添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。周期性搅动混合物15分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤三次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加Ac2O/DIPEA/DMF(v/v/v 1:1:3 2.5mL)，周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤六次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
常规氨基酸偶合操作：
树脂如下洗涤三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，接着通过自反应容器底部的N2鼓泡周期性搅动混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.5mL)。周期性搅动混合物2.5分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下洗涤6次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。由系统暂停系统以将常规氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)手动添加至反应容器中，随后重启自动化以向反应容器中添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。周期性搅动混合物15分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下洗涤6次：经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加Ac2O/DIPEA/DMF(v/v/v 1:1:32.5mL)，周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤六次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物90秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤。
最终封端操作：
树脂如下洗涤三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，接着通过自反应容器底部的N2鼓泡周期性搅动混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.5mL)。周期性搅动混合物2.5分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下洗涤6次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)，接着添加氯乙酸酐(0.4M于DMF中，1.25mL，10当量)。周期性搅动混合物15分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂用经由容器底部添加的DMF(6.25mL)洗涤且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)，接着添加氯乙酸酐(0.4M于DMF中，1.25mL，10当量)。周期性搅动混合物15分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下洗涤6次：经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中添加Ac2O/DIPEA/DMF(v/v/v 1:1:3 2.5mL)，周期性搅动混合物10分钟，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤六次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器底部添加DCM(2.5mL)且周期性搅动所得混合物30秒，随后经由玻璃料排出溶液。所得树脂随后用氮气流干燥10分钟。
整体脱保护方法A：
除非另外指出，否则手动进行所有操作。“整体脱保护方法A”的程序描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模通过结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。程序可通过规模的倍量来调整所述体积，以便按比例放大超过0.100mmol规模。使用三氟乙酸:水:三异丙基硅烷:二硫苏糖醇(92.5:2.5:2.5:2.5v:v:v:w)制备“脱保护溶液”。树脂自反应容器移出且转移至装备有玻璃料的25mL注射器中。向注射器中添加“脱保护溶液”(5.0mL)。混合物在震荡器中混合85分钟。将溶液过滤，浓缩且稀释于乙醚(30mL)中。将沉淀固体离心3分钟。倾析清液层溶液且将固体再悬浮于乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析清液层且将其余固体悬浮于乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析清液层且其余固体在高真空下干燥。获得呈白色至灰白色固体状的粗肽。
整体脱保护方法B：
除非另外指出，否则手动进行所有操作。“整体脱保护方法B”的程序描述以0.04mmol规模进行的实验，其中该规模通过结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。程序可通过规模的倍量来调整所述体积，以便按比例放大超过0.04mmol规模。使用三氟乙酸:三异丙基硅烷(96:4；v:v)制备“脱保护溶液”。树脂自反应容器移出且转移至装备有玻璃料的10mL注射器中。向注射器中添加“脱保护溶液”(2.0-3.0mL)。混合物在震荡器中混合1小时或1.5小时。将溶液过滤，用脱保护溶液(0.5mL)洗涤，浓缩且稀释于乙醚(30mL)中。将沉淀固体离心3分钟。倾析清液层溶液且将固体再悬浮于乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析清液层且将其余固体悬浮于乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析清液层且其余固体在高真空下干燥。获得呈白色至灰白色固体状的粗肽。
整体脱保护方法C：
除非另外指出，否则手动进行所有操作。“整体脱保护方法C”的程序描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模通过结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。程序可通过规模的倍量来调整所述体积，以便按比例放大超过0.100mmol规模。使用三氟乙酸:三异丙基硅烷:二硫苏糖醇(95:2.5:2.5v:v:w)制备“脱保护溶液”。树脂自反应容器移出且转移至Bio-Rad管中。向Bio-Rad管中添加“脱保护溶液”(4.0mL)。混合物在震荡器中混合60分钟。将溶液过滤且稀释于乙醚(30mL)中。将沉淀固体离心3分钟。倾析清液层溶液且将固体再悬浮于乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析清液层且将其余固体悬浮于乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析清液层且其余固体在高真空下干燥。获得呈白色至灰白色固体状的粗肽。
整体脱保护方法D：
除非另外指出，否则手动进行所有操作。“整体脱保护方法B”的程序描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模通过结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。程序可通过规模的倍量来调整所述体积，以便按比例放大超过0.100mmol规模。使用三氟乙酸:三异丙基硅烷:二硫苏糖醇(94:3:3v:v:w)制备“脱保护溶液”。树脂自反应容器移出且转移至装备有玻璃料的25mL注射器中。向注射器中添加“脱保护溶液”(5.0mL)。混合物在震荡器中混合5分钟。将溶液过滤且稀释于乙醚(30mL)中。将沉淀固体离心3分钟。倾析清液层溶液且将固体再悬浮于乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析清液层且将其余固体悬浮于乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析清液层且其余固体在高真空下干燥。获得呈白色至灰白色固体状的粗肽。
整体脱保护方法E：
除非另外指出，否则手动进行所有操作。“整体脱保护方法E”的程序描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模通过结合至树脂的FmocGly-ClTrt连接基团的量来确定。程序可通过规模的倍量来调整所述体积，以便按比例放大超过0.100mmol规模。使用三氟乙酸:三异丙基硅烷:二硫苏糖醇(95:2.5:2.5v:v:w)制备“脱保护溶液”。树脂自反应容器移出且转移至Bio-Rad管中。向Bio-Rad管中添加“脱保护溶液”(2.0mL)。混合物在震荡器中混合3分钟。将溶液过滤且收集于离心管中。向Bio-Rad管中添加“脱保护溶液”(2.0mL)。混合物在震荡器中混合3分钟。将溶液过滤且收集于离心管中。向Bio-Rad管中添加“脱保护溶液”(2.0mL)。混合物在震荡器中混合3分钟。将溶液过滤且收集于离心管中。使离心管中的溶液静置60分钟。随后用乙醚(30mL)稀释所收集的溶液且形成沉淀物。将沉淀固体离心3分钟。倾析清液层溶液且将固体再悬浮于乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析清液层且将其余固体悬浮于乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析清液层且其余固体在高真空下干燥。获得呈白色至灰白色固体状的粗肽。
整体脱保护方法F：
除非另外指出，否则手动进行所有操作。“整体脱保护方法F”的程序描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模通过结合至树脂的Rink连接基团的量来确定。程序可通过规模的倍量来调整所述体积，以便按比例放大超过0.100mmol规模。使用三氟乙酸:三异丙基硅烷:二硫苏糖醇(95:2.5:2.5v:v:w)制备“脱保护溶液”。树脂自反应容器移出且转移至6ml Bio-Rad管中。向Bio-Rad中添加“脱保护溶液”(4.0mL)。混合物在震荡器中混合90分钟。将溶液过滤且稀释于乙醚(30mL)中。将沉淀固体离心3分钟。倾析清液层溶液且将固体再悬浮于乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析清液层且将其余固体悬浮于乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析清液层且其余固体在高真空下干燥。获得呈白色至灰白色固体状的粗肽。
环化方法A
除非另外指出，否则手动进行所有操作。“环化方法A”的程序描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模通过结合至用于生成肽的树脂的Sieber连接基团的量来确定。此规模不基于程序中所用肽的数量的直接测定。程序可通过规模的倍量来调整所述体积，以便按比例放大超过0.100mmol规模。将粗肽固体溶解于乙腈:8M胍/50mM TRIS水溶液(1:3)(pH 8.6)(7mL:18mL或类似比率)的溶液中，且随后若需要，使用NaOH水溶液(1.0M)调节溶液至pH＝8.5-9.0。溶液接着使用震荡器混合12至18小时。浓缩反应溶液且随后将残余物溶解于乙腈:水中。对此溶液进行反相HPLC纯化，得到所需环状肽。
环化方法C：
除非另外指出，否则手动进行所有操作。“环化方法C”的程序描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模通过结合至用于生成肽的树脂的Sieber连接基团的量来确定。此规模不基于程序中所用肽的数量的直接测定。程序可通过规模的倍量来调整所述体积，以便按比例放大超过0.100mmol规模。将粗肽固体溶解于乙腈:0.1M碳酸氢铵水性缓冲液(11mL:24mL或类似比率)的溶液中，且随后使用NaOH水溶液(1.0M)将溶液小心地调节至pH＝8.5-9.0。溶液接着使用震荡器混合12至18小时。浓缩反应溶液且随后将残余物溶解于乙腈:水中。对此溶液进行反相HPLC纯化，得到所需环状肽。
环化方法D：
除非另外指出，否则手动进行所有操作。“环化方法D”的程序描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模通过结合至用于生成肽的树脂的Sieber连接基团的量来确定。此规模不基于程序中所用肽的数量的直接测定。程序可通过规模的倍量来调整所述体积，以便按比例放大超过0.100mmol规模。将粗肽固体溶解于乙腈:0.1M碳酸氢铵水性缓冲液(11mL:24mL)的溶液中，且随后使用NaOH水溶液(1.0M)将溶液小心地调节至pH＝8.5-9.0。溶液随后在搅拌下混合12至18小时。浓缩反应溶液且随后将残余物溶解于乙腈:水中。对此溶液进行反相HPLC纯化，得到所需环状肽。
环化方法E：
除非另外指出，否则手动进行所有操作。“环化方法E”的程序描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模通过结合至用于生成肽的树脂的Sieber连接基团的量来确定。此规模不基于程序中所用肽的数量的直接测定。程序可通过规模的倍量来调整所述体积，以便按比例放大超过0.100mmol规模。将粗肽固体溶解于6M胍HCl水性缓冲溶液(15mL)中，溶液随后在搅拌下混合12至18小时。浓缩反应溶液且将15mL DMSO添加至残余物中，得到浆料，将其过滤。对此过滤溶液进行反相HPLC纯化，得到所需环状肽。手动偶合操作A：
向先前步骤的含有树脂的Bio-Rad反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。周期性震荡混合物5分钟且随后经由玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤五次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且震荡所得混合物60秒，随后经由玻璃料排出溶液。向反应容器中通常添加氨基酸(1.2-10当量)(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)，随后通常添加HATU(1.210当量)(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)，且最后通常添加DIPEA(2.4-20当量)(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。混合物震荡60分钟至18小时，随后经由玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤四次：对于每次洗涤，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且震荡所得混合物60秒，随后经由玻璃料排出溶液。
微裂解A：
向＜10mg的小树脂样品中添加2滴TIS及1mL三氟乙酸，在室温下震荡。在1小时之后，移出小等分试样且用0.5mL乙腈稀释，过滤并获得HPLC MS追踪。
环闭合复分解(Ring-Closing Metathesis)操作
向配备有磁力搅拌器的5mL微波管中的50mmol树脂中添加30mg固体HGII，添加3mL1,2二氯乙烷，用N2冒泡2分钟。将微波小瓶转移到Biotage微波中，并在100℃加热1小时。使用Bio-Rad管分离树脂。经3x 5ml DMF和5x 5ml DCM依次洗涤。按原样使用树脂进行切割。
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)壬-8-烯酸
Figure BDA0002391600630000731
向在20mL小管中的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)壬-8-烯酸(360mg,0.915mmol)添加甲苯(12ml)和作为固体的多聚甲醛(165mg,5.49mmol)和对-甲苯磺酸(17.40mg,0.091mmol)。在20mL小管中添加10分子筛。将小瓶加盖并加热至110℃6小时，然后冷却至室温。通过硅藻土塞
Figure BDA0002391600630000742
过滤除去分子筛，用二氯甲烷洗涤。真空除去溶剂得到浅黄色油状物。
用CHCl3(4.80ml)、TFA(4.80ml)和三乙基硅烷(0.438ml,2.74mmol)处理粗制4-(庚-6-烯-1-基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(S)-(9H-芴-9-基)甲基酯。在室温搅拌2小时然后除去溶剂，得到黄色油状物。
将该粗制油状物溶于20mL THF和10mL水，使用反相色谱在Luna C1830x 100柱上提纯，使用15min梯度0至100％含0.1％TFA的水至0.1％TFA的乙腈溶液，15x 2mL注射。合并所需的级分，冷冻并冻干，得到0.67克。LCMS条件D：保留时间1.79min，408.5M+1。
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)庚-6-烯酸
Figure BDA0002391600630000741
向在20mL小管中的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)庚-6-烯酸(2.5g,6.84mmol)添加甲苯(30mL)随后添加多聚甲醛(1.233g,41.0mmol)和对-甲苯磺酸(0.130g,0.684mmol)。向混合物中添加5分子筛。然后将反应加热至110℃6小时并冷却至室温。通过硅藻土塞
Figure BDA0002391600630000743
过滤除去分子筛，且该垫用30mL二氯甲烷洗涤。真空除去溶剂，得到黄色油状物。
将粗制黄色油状物5-氧代-4-(戊-4-烯-1-基)噁唑烷-3-羧酸(S)-(9H-芴-9-基)甲基酯用CHCl3(12.00ml)、TFA(12.00ml)和三乙基硅烷(3.28ml,20.52mmol)处理。将混合物在室温搅拌2小时，并除去溶剂，得到油状物。将该粗制油状物溶于30mL四氢呋喃和12mL水，并通过22x 2mL注射在30x 100C18Luna柱上提纯，经15分钟从0至100的含0.1％TFA的水至含0.1％TFA的乙腈。合并所需的级分，冷冻并冻干，得到固体1.843克。LCMS条件D：保留时间1.07min，380.4(M+1)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.76(br.s.,1H),7.97-7.77(m,2H),7.73-7.53(m,2H),7.49-7.25(m,4H),5.84-5.71(m,1H),5.06-4.90(m,2H),4.51(dd,J＝11.1,4.6Hz,1H),4.44-4.24(m,4H),2.78-2.64(m,3H),2.09-1.92(m,3H),1.87-1.63(m,3H),1.62-1.54(m,1H),1.26(quin,J＝7.5Hz,2H),1.20-0.94(m,1H)。
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)己-5-烯酸
Figure BDA0002391600630000751
向在20mL小管中的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)己-5-烯酸(1500mg,4.27mmol)添加甲苯(24mL)随后添加多聚甲醛(769mg,25.6mmol)和对-甲苯磺酸(81mg,0.427mmol)。向混合物中添加10分子筛。将反应加热6小时至110℃，然后冷却至室温。通过硅藻土塞
Figure BDA0002391600630000753
过滤除去分子筛，将该垫用30mL二氯甲烷洗涤。除去溶剂，得到浅黄色油状物。
用TFA(9.60mL)和三乙基硅烷(2.045ml,12.81mmol)处理在CHCl3(9.60mL)中的粗制黄色油状物4-(丁-3-烯-1-基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(S)-(9H-芴-9-基)甲基酯。在室温搅拌2小时并真空除去溶剂，得到油状物。
该粗制油状物溶于20mL四氢呋喃和12mL水并用16x 2mL注射在30x100C18Luna柱上提纯，经15分钟从0至100含0.1％TFA的水至含0.1％TFA的乙腈。合并所需的级分，冷冻并再次冻干，得到固体(0.67克)。LCMS条件D：保留时间1.02min，366.3(M+1)；分析HPLC条件G：保留时间＝13.22min，91％；分析HPLC条件H：保留时间＝12.25min，88％；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.97-12.63(br,1H),7.99-7.81(m,2H),7.78-7.54(m,2H),7.52-7.24(m,4H),5.90-5.61(m,1H),5.13-4.84(m,2H),4.52-4.22(m,4H),2.83-2.63(m,3H),1.98-1.74(m,4H)。
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)辛-7-烯酸
Figure BDA0002391600630000752
向在20mL小管中的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)辛-7-烯酸(1.5g,3.95mmol)添加甲苯(8mL)随后添加多聚甲醛(0.712g,23.72mmol)、对-甲苯磺酸(0.075g,0.395mmol)和10分子筛。将小瓶加盖并将反应加热至110℃6小时并冷却至室温。通过硅藻土
Figure BDA0002391600630000762
塞过滤除去分子筛，用20mL二氯甲烷洗涤并除去溶剂，得到浅黄色油状物。
向该黄色油状物4-(己-5-烯-1-基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(S)-(9H-芴-9-基)甲基酯添加CHCl3(3.20ml)、TFA(3.20ml)和最后添加三乙基硅烷(1.894ml,11.86mmol)。将反应在室温搅拌2小时并除去溶剂，得到油状物。
将油状物溶于20mL四氢呋喃和12mL水，用于在30x 100C18Phenominex Luna上提纯，经15分钟从0至100％含0.1％TFA的乙腈在含0.1％TFA的水中作为改性剂，16x 2mL注射。收集所需的级分，冷冻并再次冻干，得到0.88克。LCMS条件D：保留时间1.10min，394.5(M+1)分析HPLC条件G：保留时间14.3min，90％；分析HPLC条件H：保留时间13.1min，90％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.98-12.47(Br,1H),8.04-7.76(m,2H),7.76-7.56(m,2H),7.56-7.34(m,4H),5.78(ddt,J＝17.0,10.3,6.6Hz,1H),5.10-4.83(m,2H),4.50(dd,J＝10.9,4.6Hz,1H),4.45-4.17(m,2H),2.84-2.63(m,2H),2.01(br.s.,3H),1.85-1.66(m,2H),1.64-1.55(m,1H),1.42-1.05(m,2H),1.25-1.06(m,2H)。
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-3-(4-(烯丙基氧基)苯基)丙酸
Figure BDA0002391600630000761
向40mL小瓶中的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-(烯丙基氧基)苯基)丙酸(1500mg,3.38mmol)添加甲苯(24mL)随后添加多聚甲醛(609mg,20.29mmol)和对-甲苯磺酸(64.3mg,0.338mmol)，以及10分子筛。封盖反应并加热至110℃6小时，冷却至室温，并通过硅藻土
Figure BDA0002391600630000763
过滤除去分子筛，用30mL二氯甲烷洗涤，并除去溶剂，得到油状物。
用氯仿(9.60ml)、TFA(9.60ml)和三乙基硅烷(1.621ml,10.15mmol)处理黄色油状物4-(4-(烯丙基氧基)苄基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(S)-(9H-芴-9-基)甲基酯。在室温搅拌2小时。除去溶剂，得到油状物，将其溶于30mL二氯甲烷并通过硅藻土
Figure BDA0002391600630000764
过滤。用20mL二氯甲烷洗涤该垫，并除去溶剂，得到粗产物，将其在120克的硅Isco(120克金柱)提纯，己烷至乙酸乙酯梯度，得到0.582克白色固体。LCMS条件D：保留时间1.10min，394.5(M+1)；分析HPLC条件G：保留时间14.3min，90％；分析HPLC条件H：保留时间13.1min，90％。
制备RCM开端A
Figure BDA0002391600630000771
向25mL聚丙烯固态反应容器中加入Sieber树脂(140mg,0.100mmol)，并将反应容器放置在Symphony肽合成仪上。然后依次执行以下操作：
进行“Symphony方法A：树脂溶胀操作”；
“Symphony方法A：标准偶合操作”用Fmoc-Gly-OH进行；
“Symphony方法A：标准偶合操作”用Fmoc-Cys(Trt)-OH进行；
“Symphony方法A：仲胺偶合操作”用Fmoc-Arg(Pbf)-OH；进行
“Symphony方法A：标准偶合操作”用(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)辛-7-烯酸进行；
“Symphony方法A：仲胺偶合操作”用(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)辛-7-烯酸进行；
“Symphony方法A：仲胺偶合操作”用Fmoc-Trp(Boc)-OH进行；
“Symphony方法A：标准偶合操作”用Fmoc-Ser(tBu)-OH进行；
“Symphony方法A：标准偶合操作”用Fmoc-Trp(Boc)-OH进行；
“Symphony方法A：标准偶合操作”用Fmoc-[N-Me]Gly-OH进行；
“Symphony方法A：仲胺偶合操作”用Fmoc-Leu-OH进行；
“Symphony方法A：标准偶合操作”用Fmoc-His(Trt)-OH进行；
“Symphony方法A：标准偶合操作”用Fmoc-Pro-OH进行；
“Symphony方法A：仲胺偶合操作”用Fmoc-Asn(Trt)-OH进行；
“Symphony方法A：标准偶合操作”用Fmoc-[N-Me]Ala-OH进行；
“Symphony方法A：仲胺偶合操作”用Fmoc-Phe-OH进行；
进行“氯乙酰氯偶合操作B”；
进行“整体脱保护方法C”；
进行“环化方法D”。
粗材料经制备型LC提纯，使用以下条件：柱：Phen Luna Axia C1830*250mm；流动相A：95％H2O/5％ACN/0.05％TFA；流动相B：95:5％H2O/95％ACN/0.05％TFA；梯度30分钟内10％--100％梯度，30ml每分钟。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。
产物的产率为15mg。
分析HPLC条件I：保留时间＝14.982min；ESI-MS(+)m/z 953.1(M+2H)
制备实施例1001
Figure BDA0002391600630000781
将实施例RCM开端A(12mg,6.30μmol)溶于DCE(8ml)。然后添加第二代HOVEYDA-GRUBBS催化剂(0.790mg,1.260μmol)的DCE(0.5mL)溶液。用氩气吹洗溶液5分钟并随后加热至72℃过夜，此时LC-MS显示完全转化。粗材料经制备型LC提纯，使用以下条件：柱：PhenLuna Axia C1830*250mm；流动相A：95％H2O/5％ACN/0.05％TFA；流动相B：95:5％H2O/95％ACN/0.05％TFA；梯度30分钟内10％--100％梯度，30ml每分钟。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为3.8mg。分析HPLC条件I：保留时间＝14.137min；ESI-MS(+)m/z 939.4(M+2H)。
制备实施例1002
Figure BDA0002391600630000791
按照针对制备RCM开端A所述的一般合成顺序，制备实施例1002，其由以下一般操作构成：“Symphony方法A：树脂溶胀操作”、“Symphony方法A：标准偶合操作”、“Symphony方法A：仲胺偶合操作”、“氯乙酸偶合操作B”、“整体脱保护方法C”和“环化方法D”。将所得化合物溶于DCE(8ml)。然后添加第二代HOVEYDA-GRUBBS催化剂(0.790mg,1.260μmol)的DEM(0.5mL)溶液。用氩气吹洗溶液5分钟并随后加热至72℃过夜，此时LC-MS显示完全转化。粗材料经制备型LC提纯，使用以下条件：柱：Phen Luna Axia C18 30*250mm；流动相A：95％H2O/5％ACN/0.05％TFA；流动相B：95:5％H2O/95％ACN/0.05％TFA；梯度30分钟内10％--100％梯度，30ml每分钟。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为0.7mg。
分析HPLC条件I：保留时间＝14.661min；ESI-MS(+)m/z 953.5(M+2H)
制备实施例1100
Figure BDA0002391600630000801
向50mL聚丙烯锥形管中加入Rink Amide树脂(166mg，0.06mmol)，并将反应容器放置在CEM肽合成仪上。然后依次执行以下操作：
进行“CEM方法A：树脂溶胀操作”；
“CEM方法A：单偶合操作”用Fmoc-Gly-OH进行；
“CEM方法A：单偶合操作”用Fmoc-Cys(Trt)-OH进行；
“CEM方法A：双偶合操作”用Fmoc-Arg(Pbf)-OH进行；
“CEM方法A：单偶合操作用(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)辛-7-烯酸进行；
“CEM方法A：双偶合操作”用(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)辛-7-烯酸进行；
“CEM方法A：双偶合操作”用Fmoc-Trp(Boc)-OH进行；
“CEM方法A：单偶合操作”用Fmoc-Ser(tBu)-OH进行；
“CEM方法A：单偶合操作”用Fmoc-Trp(Boc)-OH进行；
“CEM方法A：单偶合操作”用Fmoc-[N-Me]Gly-OH进行；
“CEM方法A：双偶合操作”用Fmoc-Leu-OH进行；
“CEM方法A：单偶合操作”用Fmoc-His(Trt)-OH进行；
“CEM方法A：单偶合操作”用Fmoc-Pro-OH进行；
“CEM方法A：双偶合操作”用Fmoc-Asn(Trt)-OH进行；
“CEM方法A：双偶合操作”用Fmoc-[N-Me]Ala-OH进行；
“CEM方法A：双偶合操作”用Fmoc-Phe-OH进行；
进行“氯乙酰氯偶合操作B”；
进行“环闭合复分解操作”；
进行“整体脱保护方法C”；
进行“环化方法D”。
该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟50-90％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为1.3mg，且其LCMS分析所估算的纯度为99％。分析LCMS条件H：保留时间＝1.94min.；ESI-MS(+)m/z 938.9(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝3.02min.；ESI-MS(+)m/z 939.6(M+2H)。
制备实施例RCM开端B
Figure BDA0002391600630000811
按照针对制备RCM开端A所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例RCM开端B，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈：含10mM乙酸铵的水；梯度：经25分钟10-60％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为1.8mg，且其LCMS分析所估算的纯度为100％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.33min；ESI-MS(+)m/z 981.8(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.29min；ESI-MS(+)m/z 982.2(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：981.4776(M+2H)测量值：981.4764(M+2H)。
制备实施例RCM开端C
Figure BDA0002391600630000821
按照针对制备RCM开端A所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例RCM开端C，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；梯度：经25分钟15-65％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为0.9mg，且其LCMS分析所估算的纯度为97％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.64min；ESI-MS(+)m/z 981.9(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.58min；ESI-MS(+)m/z 982.1(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：981.4958(M+2H)测量值：981.4942(M+2H)。
制备实施例RCM开端D
Figure BDA0002391600630000831
按照针对制备RCM开端A所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备RCM开端D，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；梯度：经25分钟15-65％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为4.8mg，且其LCMS分析所估算的纯度为95％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.50min；ESI-MS(+)m/z 967.9(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.44min；ESI-MS(+)m/z 968.0(M+2H)。
制备实施例RCM开端E
Figure BDA0002391600630000841
按照针对制备RCM开端A所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例RCM开端E，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈：含10mM乙酸铵的水；梯度：经25分钟10-65％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为6.2mg，且其LCMS分析所估算的纯度为100％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.38min；ESI-MS(+)m/z 953.9(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.32min；ESI-MS(+)m/z 953.7(M+2H)。
制备实施例1101
Figure BDA0002391600630000851
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1101，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟35-75％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为2.6mg，且其LCMS分析所估算的纯度为96％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.35min.；ESI-MS(+)m/z 955.8(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝1.60min.；ESI-MS(-)m/z 952.6(M+2H)。
制备实施例1102
Figure BDA0002391600630000861
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1102，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟25-70％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为5.0mg，且其LCMS分析所估算的纯度为96％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.26min.；ESI-MS(+)m/z 939.9(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.56min.；ESI-MS(+)m/z 939.9(M+2H)。
制备实施例1103
Figure BDA0002391600630000871
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1103，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：Waters XBridge C18,19x 250mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈：有0.1％三氟乙酸的水；梯度：经25分钟0-50％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为2.8mg，且其LCMS分析所估算的纯度为98％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.23min；ESI-MS(+)m/z 872.1(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.23min；ESI-MS(+)m/z 871.9(M+2H)。
制备实施例1104
Figure BDA0002391600630000881
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1104，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法F”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟45-85％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为7.6mg，且其LCMS分析所估算的纯度为100％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.23min.；ESI-MS(+)m/z 907.2(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.51min.；ESI-MS(+)m/z 907.2(M+2H)。
制备实施例1105
Figure BDA0002391600630000891
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1105，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法F”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟40-80％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为6.7mg，且其LCMS分析所估算的纯度为97％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.35min.；ESI-MS(+)m/z 926.2(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.43min.；ESI-MS(+)m/z 925.2(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：924.9300(M+2H)测量值：924.9290(M+2H)。
制备实施例1106
Figure BDA0002391600630000901
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1106，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法F”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇:含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟35-75％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。该材料经制备型LC/MS进一步提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5甲醇：含0.1％三氟乙酸的水；梯度：经30分钟40-85％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为2.3mg，且其LCMS分析所估算的纯度为97％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.45min.；ESI-MS(+)m/z 885.8(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.86min.；ESI-MS(+)m/z 885.9(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：885.4270(M+2H)；测量值：885.4264(M+2H)。
制备实施例1107
Figure BDA0002391600630000911
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1107，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法F”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟45-85％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为1.0mg，且其LCMS分析所估算的纯度为100％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.55min.；ESI-MS(+)m/z 914.8(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.57min.；ESI-MS(+)m/z 915.2(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：913.4640(M+2H)；测量值：913.4623(M+2H)。
制备实施例1108
Figure BDA0002391600630000921
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1108，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法F”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟40-80％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为1.9mg，且其LCMS分析所估算的纯度为100％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.55min.；ESI-MS(+)m/z 909.2(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.48min.；ESI-MS(+)m/z 909.3(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：908.4060(M+2H)；测量值：908.4044(M+2H)
制备实施例1109
Figure BDA0002391600630000931
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1109，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟45-85％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为3.7mg，且其LCMS分析所估算的纯度为100％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.47min.；ESI-MS(+)m/z 942.3(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.83min.；ESI-MS(+)m/z 942.3(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：941.9747(M+2H)；测量值：941.9728(M+2H)
制备实施例1110
Figure BDA0002391600630000941
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1110，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟45-85％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。该材料经制备型LC/MS进一步提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟5-45％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为2.3mg，且其LCMS分析所估算的纯度为100％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.46min.；ESI-MS(+)m/z 924.9(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.91min.；ESI-MS(+)m/z 925.2(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：924.9300(M+2H)；测量值：924.9273(M+2H)
制备实施例1111
Figure BDA0002391600630000951
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1111，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟40-80％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。该材料经制备型LC/MS进一步提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈：含0.1％三氟乙酸的水；梯度：经30分钟10-50％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为2.6mg，且其LCMS分析所估算的纯度为97％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.66min.；ESI-MS(+)m/z 942.0(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.80min.；ESI-MS(+)m/z 943.6(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：936.9154(M+2H)；测量值：936.9167(M+2H)
制备实施例1112
Figure BDA0002391600630000961
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1112，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟45-85％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。该材料经制备型LC/MS进一步提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈：含10mM乙酸铵的水；梯度：经20分钟10-50％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为9.0mg，且其LCMS分析所估算的纯度为100％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.54min.；ESI-MS(+)m/z 908.3(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.65min.；ESI-MS(+)m/z 908.3(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：907.4220(M+2H)；测量值：907.4199(M+2H)
制备实施例1113
Figure BDA0002391600630000971
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1113，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经20分钟40-80％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。该材料经制备型LC/MS进一步提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟10-50％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为2.5mg，且其LCMS分析所估算的纯度为100％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.54min.；ESI-MS(+)m/z 933.4(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝3.01min.；ESI-MS(+)m/z 933.4(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：932.9274(M+2H)；测量值：932.9261(M+2H)
制备实施例1114
Figure BDA0002391600630000981
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1114，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经20分钟40-80％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。该材料经制备型LC/MS进一步提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟10-50％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为5.4mg，且其LCMS分析所估算的纯度为100％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.56min.；ESI-MS(+)m/z 933.4(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝3.03min.；ESI-MS(+)m/z 933.4(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：932.9274(M+2H)；测量值：932.9263(M+2H)
制备实施例1115
Figure BDA0002391600630000991
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1115，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟5-45％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为8.3mg，且其LCMS分析所估算的纯度为98％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.41min.；ESI-MS(+)m/z 947.3(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.59min.；ESI-MS(+)m/z 947.3(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：946.4329(M+2H)；测量值：946.4296(M+2H)
制备实施例1116
Figure BDA0002391600630001001
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1116，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟25-70％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为10.6mg，且其LCMS分析所估算的纯度为100％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.46min.；ESI-MS(+)m/z 930.1(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.84min.；ESI-MS(+)m/z 930.3(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：929.9097(M+2H)；测量值：929.9097(M+2H)
制备实施例1117
Figure BDA0002391600630001011
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1117，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟35-75％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。该材料经制备型LC/MS进一步提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟0-40％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为5.5mg，且其LCMS分析所估算的纯度为98％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.46min.；ESI-MS(+)m/z 966.5(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.84min.；ESI-MS(+)m/z 966.6(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：965.9195(M+2H)；测量值：965.9173(M+2H)
制备实施例1118
Figure BDA0002391600630001021
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1118，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟10-50％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。该材料经制备型LC/MS进一步提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈：含0.1％三氟乙酸的水；梯度：经30分钟15-55％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。该材料经制备型LC/MS进一步提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈：含0.1％三氟乙酸的水；梯度：经30分钟15-55％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为4.4mg，且其LCMS分析所估算的纯度为100％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.69min.；ESI-MS(+)m/z 924.0(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝3.31min.；ESI-MS(+)m/z 924.4(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：923.9000(M+2H)；测量值：923.8970(M+2H)
制备实施例1119
Figure BDA0002391600630001031
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1119，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟40-80％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为1.5mg，且其LCMS分析所估算的纯度为88％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.73min.；ESI-MS(+)m/z 937.2(M+2H).
分析LCMS条件I：保留时间＝2.96min.；ESI-MS(+)m/z 937.3(M+2H).
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：936.4158(M+2H)；测量值：936.4139(M+2H)
制备实施例1120
Figure BDA0002391600630001041
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1120，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟5-45％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。该材料经制备型LC/MS进一步提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈：含0.1％三氟乙酸的水；梯度：经30分钟15-55％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为1.6mg，且其LCMS分析所估算的纯度为99％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.58min.；ESI-MS(+)m/z 946.4(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝3.08min.；ESI-MS(+)m/z 946.4(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：945.9352(M+2H)；测量值：945.9328(M+2H)
制备实施例1121
Figure BDA0002391600630001051
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1121，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。
该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟40-80％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。该材料经制备型LC/MS进一步提纯，使用以下条件：柱：XBridgeC18,19x200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟10-50％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为2.1mg，且其LCMS分析所估算的纯度为99％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.22min.；ESI-MS(+)m/z 1010.6(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.57min.；ESI-MS(+)m/z 1010.7(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1010.4327(M+2H)；测量值：1010.4290(M+2H)
制备实施例RCM开端F
Figure BDA0002391600630001061
按照针对制备RCM开端A所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例RCM开端F，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈：含0.1％三氟乙酸的水；梯度：经30分钟10-50％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。该材料经制备型LC/MS进一步提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇：含10mM乙酸铵的水；梯度：经15分钟45-85％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为0.8mg，且其LCMS分析所估算的纯度为100％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.42min.；ESI-MS(+)m/z 993.8(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.92min.；ESI-MS(+)m/z 993.7(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：993.4587(M+2H)；测量值：993.4552(M+2H)
制备实施例1122
Figure BDA0002391600630001071
按照针对制备实施例1100所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例1122，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“环闭合复分解操作”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈：含0.1％三氟乙酸的水；梯度：经30分钟15-55％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为1.7mg，且其LCMS分析所估算的纯度为99％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.28min.；ESI-MS(+)m/z 980.6(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.76min.；ESI-MS(+)m/z 979.9(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：979.4431(M+2H)；测量值：979.4406(M+2H)
制备实施例RCM开端G
Figure BDA0002391600630001081
按照针对制备RCM开端A所述的一般合成顺序，在Rink树脂上制备实施例RCM开端G，其由以下一般操作构成：“CEM方法A：树脂溶胀操作”、“CEM方法A：单偶合操作”、“CEM方法A：双偶合操作”、“氯乙酰氯偶合操作A”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。该粗材料经制备型LC/MS提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95甲醇：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5甲醇:含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟40-80％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。该材料经制备型LC/MS进一步提纯，使用以下条件：柱：XBridge C18,19x 200mm,5-μm粒子；流动相A：5:95乙腈：含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈：含10mM乙酸铵的水；梯度：经30分钟10-50％B，随后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。合并含所需产物的级分并通过离心蒸发干燥。产物的产率为1.9mg，且其LCMS分析所估算的纯度为99％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.37min.；ESI-MS(+)m/z 1024.8(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.82min.；ESI-MS(+)m/z 1024.8(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1024.4484(M+2H)；测量值：1024.4454(M+2H)
使用均相时间分辨荧光(HTRF)结合测定测试大环肽竞争PD-1与PD-L1结合的能力的方法
使用PD-1/PD-L1均相时间分辨荧光(HTRF)结合试验研究本公开的大环肽与PD-L1结合的能力。
方法
可溶性PD-1与可溶性PD-L1结合的均相时间分辨荧光(HTRF)分析。可溶性PD-1及可溶性PD-L1是指移除跨膜区且融合至异源序列(特定言的，人类免疫球蛋白G序列(Ig)的Fc部分或六聚组氨酸抗原决定基标签(His))的羧基端截短的蛋白质。所有结合研究均在由dPBS组成的补充含0.1％(w/v)牛血清白蛋白及0.05％(v/v)Tween-20的HTRF分析缓冲液中进行。对于PD-1-Ig/PD-L1-His结合分析，抑制剂与PD-L1-His(10nM最终)一起在4μl分析缓冲液中预培育15分钟，接着添加含PD-1-Ig(20nM最终)的1μl分析缓冲液并另外培育15分钟。使用来自人类、短尾猕猴、小鼠或其它物种的PD-L1融合蛋白。使用经铕穴状配体标记的抗Ig单克隆抗体(1nM最终)及经别藻蓝蛋白(APC)标记的抗His单克隆抗体(20nM最终)实现HTRF检测。将抗体稀释于HTRF检测缓冲液中且将5μl施配在结合反应顶部。使反应平衡30分钟且使用EnVision荧光计获得信号(665nm/620nm比率)。建立PD-1-Ig/PD-L2-His(分别为20及5nM)、CD80-His/PD-L1-Ig(分别为100及10nM)及CD80-His/CTLA4-Ig(分别为10及5nM)之间的额外结合分析。在生物素标记的第71号化合物与人类PD-L1-His之间的结合/竞争研究进行如下。大环肽抑制剂与PD-L1-His(10nM最终)一起在4μl分析缓冲液中预培育60分钟，接着添加含生物素标记的第71号化合物(0.5nM最终)的1μl分析缓冲液。使结合平衡30分钟，接着添加含经铕穴状配体标记的抗生蛋白链菌素(2.5pM最终)及经APC标记的抗His(20nM最终)的5μl HTRF缓冲液。使反应平衡30分钟且使用EnVision荧光计获得信号(665nm/620nm比率)。
重组蛋白质。在HEK293T细胞中表达具有C端人类Ig抗原决定基标签[hPD-1(25-167)-3S-IG]的羧基截短的人类PD-1(氨基酸25-167)及具有C端His抗原决定基标签[hPD-L1(19-239)-烟草叶脉斑点病毒蛋白酶裂解位点(TVMV)-His]的人类PD-L1(氨基酸18-239)，且依次通过重组蛋白质A亲和色谱及尺寸排阻色谱纯化。人类PD-L2-His(SinoBiologicals)、CD80-His(Sino Biologicals)、CTLA4-Ig(RnD Systems)均经由市售来源获得。
重组人序列PD-1-Ig
hPD1(25-167)-3S-IG
Figure BDA0002391600630001101
(SEQ ID NO：1)
重组人序列PD-L1-TVMV-His(PD-L1-His)
hPDL1(19-239)-TVMV-His
Figure BDA0002391600630001102
(SEQ ID NO：2)
结果示于表1。如图所示，本公开的大环肽显示出对PD-1-Ig与PD-L1-TVMV-His(PD-L1-His)的结合活性的有效抑制。范围如下：A＝0.10-2μM；B＝0.01-0.099μM；C＝0.002-0.0099μM。
表1
Figure BDA0002391600630001103
Figure BDA0002391600630001111
本领域普通技术人员应显而易知本发明不限于前述说明性实施例，且其可以其它不悖离本发明基本属性的形式实施。因此，需要在所有方面将实施例视为说明性而非限制性的，参考随附申请专利范围而非前述实施例，且因此所有在申请专利范围等效意义或范围内的变化均意欲涵盖于其中。
序列表
<110> 百时美施贵宝公司
<120> 免疫调节剂
<130> 12956-WO-PCT
<150> US 62/567,323
<151> 2017-10-03
<160> 2
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 384
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
20 25 30
Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro
35 40 45
Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln
50 55 60
Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg
65 70 75 80
Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
100 105 110
Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro
115 120 125
Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Gly
130 135 140
Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Arg Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr
145 150 155 160
His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
180 185 190
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
195 200 205
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
210 215 220
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
225 230 235 240
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
245 250 255
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
260 265 270
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
275 280 285
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
290 295 300
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
305 310 315 320
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
325 330 335
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
340 345 350
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
355 360 365
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380
Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
20 25 30
Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro
35 40 45
Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln
50 55 60
Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg
65 70 75 80
Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
100 105 110
Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro
115 120 125
Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Gly
130 135 140
Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Arg Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr
145 150 155 160
His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
180 185 190
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
195 200 205
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
210 215 220
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
225 230 235 240
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
245 250 255
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
260 265 270
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
275 280 285
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
290 295 300
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
305 310 315 320
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
325 330 335
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
340 345 350
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
355 360 365
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380
<210> 2
<211> 237
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1 5 10 15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
20 25 30
Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln
35 40 45
Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg
50 55 60
Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
100 105 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115 120 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
130 135 140
Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys
145 150 155 160
Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr
165 170 175
Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr
180 185 190
Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile
195 200 205
Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Gly Ser Ser
210 215 220
Glu Thr Val Arg Phe Gln Gly His His His His His His
225 230 235

Claims (16)

1.式(I)的化合物
Figure FDA0002391600620000011
或其药学上可接受的盐，其中：
A选自键，
Figure FDA0002391600620000012
其中：
Figure FDA0002391600620000013
表示与羰基基团的连接点且
Figure FDA0002391600620000014
表示与氮原子的连接点；
z为0、1或2；
w为1或2；
n为0或1；
m为1或2；
m’为0或1；
p为0、1或2；
Rx选自氢、氨基、羟基和甲基；
R14和R15独立地选自氢和甲基；和
Rz选自氢和–C(O)NHR16；其中R16选自氢、-CHR17C(O)NH2、-CHR17C(O)NHCHR18C(O)NH2和-CHR17C(O)NHCHR18C(O)NHCH2C(O)NH2；其中R17选自氢和–CH2OH且其中R18选自氢和甲基；
Rv为氢或天然氨基酸侧链；
Rc、Rf、Rh、Ri和Rm为氢；
RL为甲基；
Rn为氢或甲基，或Rv和Rn形成吡咯烷环；
Ra、Rj和Rk各自独立地选自氢和甲基；
R1、R3、R6、R8、R9、R10和R13独立地选自天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链；
Q为5至12元碳链，其任选地含有一个碳-碳双键或苯氧基基团；
R2、R4、R5和R7独立地选自天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链，或与以下所述的偕偶R基团形成环；
Rb为甲基，或Rb和R2与它们所连接的原子一起形成环，所述环选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑；其中各个环任选地取代有1至4个基团，所述基团独立地选自氨基、氰基、甲基、卤素和羟基；
Rd为氢或甲基，或Rd和R4与它们所连接的原子一起可形成环，所述环选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑；其中各个环任选地取代有1至4个基团，所述基团独立地选自氨基、氰基、甲基、卤素、羟基和苯基；
Re为氢或甲基，或Re和R5与它们所连接的原子一起可形成环，所述环选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑；其中各个环任选地取代有1至4个基团，所述基团独立地选自氨基、氰基、甲基、卤素和羟基；和
Rg为氢或甲基，或Rg和R7与它们所连接的原子一起可形成环，所述环选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑；其中各个环任选地取代有1至4个基团，所述基团独立地选自氨基、经卤素基团任选取代的苄基、苄基氧基、氰基、环己基、甲基、卤素、羟基、经甲氧基基团任选取代的异喹啉基氧基、经卤素基团任选取代的喹啉基氧基、和四唑基；且其中所述吡咯烷和所述哌啶环任选地稠合至环己基、苯基或吲哚基团。
2.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中A为
Figure FDA0002391600620000031
3.根据权利要求2所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中
z为0；
w为1；
R14和R15为氢；和
Rz为–C(O)NHR16；其中R16为-CHR17C(O)NH2。
4.根据权利要求3所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中
R1为经羟基任选取代的苄基；
R2为甲基，或与Rb一起形成环，所述环选自哌啶、哌嗪和吗啉；
R3选自-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H；
R4与Rd一起形成吡咯烷环；
R5选自-CH2(咪唑基)和-CH2NH2；
R6选自异丁基、-(CH2)2CO2H和-(CH2)2CONH2；
R7为氢，或与Rg一起形成经羟基任选取代的吡咯烷环；
R8为–(CH2)吲哚基；
R9选自-CH2OH和-(CH2)2NH2；和
R10选自–(CH2)吲哚基和–(CH2)苯并噻吩基，其各自任选地取代有–CH2CO2H。
5.一种增强、刺激和/或增加有需要的受试者的免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的权利要求1所述的化合物或其治疗学上可接受的盐。
6.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括在权利要求1所述的化合物或其治疗学上可接受的盐之前、之后或同时给药额外药剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述额外药剂为抗微生物剂、抗病毒剂、细胞毒性剂和/或免疫反应调节剂。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述额外药剂为HDAC抑制剂。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述额外药剂为TLR7和/或TLR8激动剂。
10.一种抑制有需要的受试者的癌细胞生长、增生或转移的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的权利要求1所述的化合物或其治疗学上可接受的盐。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结肠直肠癌、去势抵抗性的前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰脏癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌及乳癌、及血液科恶性病。
12.一种治疗有需要的受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的权利要求1所述的化合物或其治疗学上可接受的盐。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述感染性疾病由病毒引起。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述病毒选自HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒及流感病毒。
15.一种治疗有需要的受试者的败血性休克的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的权利要求1所述的化合物或其治疗学上可接受的盐。
16.一种阻断受试者的PD-L1与PD-1和/或CD80的相互作用的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的权利要求1所述的化合物或其治疗学上可接受的盐。
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