JP2020536091A - 免疫調節剤 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ１／ＣＤ８０タンパク質／タンパク質相互作用を阻害し、それによって、癌および感染症などの様々な疾患の改善に有用である、新規な大環状ペプチドを提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、米国第６２／５６７，３２３号（２０１７年１０月３日出願）の利益を主張し、その全体的な内容が援用される。
本開示は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１およびＣＤ８０／ＰＤ−Ｌ１タンパク質／タンパク質相互作用を阻害し、それによって、癌および感染症などの様々な疾患の改善に有用である、新規な大環状ペプチドを提供する。
タンパク質、プログラム死１（ＰＤ−１）は、受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーであり、これにはＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡもまた含まれる。ＰＤ−１は活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞、および骨髄細胞上に発現する（Agata et al., supra; Okazaki et al., Curr. Opin. Immunol., 14:779-782 (2002); Bennett et al., J. Immunol., 170:711-718 (2003)）。
ＰＤ−１タンパク質は、Ｉｇ遺伝子スーパーファミリーの一部である、５５ｋＤａ Ｉ型膜貫通タンパク質である（Agata et al., Int. Immunol., 8:765-772 (1996)）。ＰＤ−１は、膜近位免疫受容体チロシン阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）および膜遠位チロシンベースのスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む（Thomas, M.L., J. Exp. Med., 181:1953-1956 (1995); Vivier, E. et al., Immunol. Today, 18:286-291 (1997)）。ＣＴＬＡ−４と構造的に類似するが、ＰＤ−１は、ＣＤ８０ ＣＤ８６（Ｂ７−２）結合に重要なＭＹＰＰＹモチーフがない。ＰＤ−１の２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）およびＰＤ−Ｌ２（ｂ７−ＤＣ）が特定されている。ＰＤ−１を発現しているＴ細胞の活性化は、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現している細胞との相互作用によって下方制御されることが示されている（Freeman et al., J. Exp. Med., 192:1027-1034 (2000); Latchman et al., Nat. Immunol., 2:261-268 (2001); Carter et al., Eur. J. Immunol., 32:634-643 (2002)）。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方が、ＰＤ−１に結合するが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しない、Ｂ７タンパク質ファミリーメンバーである。ＰＤ−Ｌ１リガンドは、様々なヒトの癌に多い（Dong et al., Nat. Med., 8:787-789 (2002)）。ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の相互作用によって、腫瘍浸潤リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体介在性増殖の減少、および癌細胞による免疫回避が生じる(Dong et al., J. Mol. Med., 81:281-287 (2003); Blank et al., Cancer Immunol. Immunother., 54:307-314 (2005); Konishi et al., Clin. Cancer Res., 10:5094-5100 (2004))。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との局所的な相互作用を阻害することによって、免疫抑制を逆転させることができ、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との相互作用もまた阻害されている場合、効果は相加的である（Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:12293-12297 (2002); Brown et al., J. Immunol., 170:1257-1266 (2003)）。
ＰＤ−Ｌ１もまた、ＣＤ８０と相互作用することが示されている（Butte MJ et al, Immunity;27:111-122 (2007)）。免疫を示す細胞において、ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ８０の相互作用は、阻害性のものであることが示されている。この相互作用の遮断は、この阻害性相互作用を抑制することが示されている（Paterson AM, et al., J Immunol., 187:1097-1105 (2011); Yang J, et al. J Immunol. Aug 1;187(3):1113-9 (2011)）。
ＰＤ−１を発現しているＴ細胞が、そのリガンドを発現している細胞に接触した時、増殖、サイトカイン分泌、および細胞毒性などの抗原刺激に対する応答において、機能的活性が低下する。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２相互作用は、感染症または腫瘍の消散の間、または自己寛容の発達の間、免疫応答を下方制御する（Keir, M.E. et al., Annu. Rev. Immunol., 26:Epub (2008)）。腫瘍疾患または慢性感染症の間に生じるような、慢性抗原刺激は、上昇した量のＰＤ−１を発現し、慢性抗原に対する活性に関して機能不全であるＴ細胞を生じさせる（Kim et al., Curr. Opin. Imm. (2010)において総括される）。これは「Ｔ細胞の疲弊」と呼ばれる。Ｂ細胞もまた、ＰＤ−１／ＰＤ−リガンド抑制および「疲弊」を示す。
ＰＤ−Ｌ１に対する抗体を用いたＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合の遮断によって、多くの系においてＴ細胞の活性化を回復させ、増大させることが示されている。進行癌を有する患者は、ＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体を用いた治療で利益を得る（Brahmer et al., New Engl. J. Med. (2012)）。腫瘍および慢性感染症の前臨床動物モデルによって、モノクローナル抗体によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の遮断は、免疫応答を増強させ、腫瘍の拒絶または感染症の制御をもたらすことができることが示されている。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断による抗腫瘍免疫療法は、組織学的に異なる多数の腫瘍に対する治療的免疫応答を増強させる可能性がある（Dong, H. et al., 「B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity」, J. Mol. Med., 81(5):281-287 (2003); Dong, H. et al., 「Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion」, Nat. Med., 8(8):793-800 (2002)）。
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用による干渉は、慢性感染症による系において、Ｔ細胞活性化の増強を生じる。ＰＤ−Ｌ１の遮断は、慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス感染を有するマウスにおいて、向上したウイルスクリアランスおよび保存された免疫をもたらした（Barber, D.L. et al., 「Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection」, Nature, 439(7077):682-687 (2006)）。ＨＩＶ−１に感染したヒト化マウスは、ウイルス血症に対する防御の増強と、ウイルス性のＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇を示す（Palmer et al., J. Immunol. (2013)）。ＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体を介したＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断によって、ＨＩＶ患者（Day, Nature (2006); Petrovas, J. Exp. Med. (2006); Trautman, Nature Med. (2006); D'Souza, J. Immunol. (2007); Zhang, Blood (2007); Kaufmann, Nature Imm. (2007); Kasu, J. Immunol. (2010); Porichis, Blood (2011)）、ＨＣＶ患者(Golden-Mason, J. Virol. (2007); Jeung, J. Leuk. Biol. (2007); Urbani, J. Hepatol. (2008); Nakamoto, PLoS Path. (2009); Nakamoto, Gastroenterology (2008)）、およびＨＢＶ患者（Boni, J. Virol. (2007); Fisicaro, Gastro. (2010); Fisicaro et al., Gastroenterology (2012); Boni et al., Gastro. (2012); Penna et al., J. Hep. (2012); Raziorrough, Hepatology (2009); Liang, World J. Gastro. (2010); Zhang, Gastro. (2008)）からのＴ細胞に対するインビトでの抗原特異的機能を回復させることができる。
ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ８０相互作用の遮断もまた、免疫を刺激することが示されている（Yang J., et al., J Immunol. Aug 1;187(3):1113-9 (2011)）。ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ８０相互作用の阻害に起因する免疫刺激は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２相互作用のさらなる遮断との組み合わせによって増強されることが示されている。
免疫細胞の表現型における変化は、敗血症性ショックの重要な因子であると仮定されている（Hotchkiss, et al., Nat Rev Immunol (2013)）。これらとしては、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の上昇した量（Guignant, et al, Crit. Care (2011)）が挙げられ、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の上昇した量を有する敗血症性ショック患者からの細胞は、Ｔ細胞アポトーシスの上昇した量を示す。ＰＤ−Ｌ１に対する抗体は、免疫細胞アポトーシスの量を減少させることができる（Zhang et al, Crit. Care (2011)）。さらに、ＰＤ−１発現を欠いたマウスは、野生型マウスよりも敗血症性ショックに対して耐性がある（Yang J., et al.. J Immunol. Aug 1;187(3):1113-9 (2011)）。研究によって、抗体を用いたＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断が非適切な免疫応答を抑制し、疾患状態を改善することが明らかになっている。
慢性的な抗原に対する免疫応答の増強に加えて、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の遮断は、慢性感染症との関連での治療ワクチン接種などのワクチン接種に対する応答を高めることも示されている（Ha, S.J. et al., 「Enhancing therapeutic vaccination by blocking PD-1-mediated inhibitory signals during chronic infection」, J. Exp. Med., 205(3):543-555 (2008); Finnefrock, A.C. et al., 「PD-1 blockade in rhesus macaques: impact on chronic infection and prophylactic vaccination」, J. Immunol., 182(2):980-987 (2009); Song, M.-Y. et al., 「Enhancement of vaccine-induced primary and memory CD8+ t-cell responses by soluble PD-1」, J. Immunother., 34(3):297-306 (2011)）。
本明細書に記載される分子は、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１との相互作用を、生化学および細胞に基づく実験系の両方において、遮断する能力を示す。これらの結果は、治療ワクチンなどの、癌または慢性感染症における免疫を増強するための治療的投与に関する可能性と一致する。
本明細書に記載される大環状ペプチドは、ＰＤ−Ｌ１の、ＰＤ−１およびＣＤ８０との相互作用を阻害することができる。これらの化合物は、ＰＤ−Ｌ１への非常に効果的な結合を示し、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１またはＣＤ８０のいずれかとの相互作用を遮断することが示されており、向上したＴ細胞の機能的活性を促進することができ、それによって非経口、経口、肺、経鼻、バッカルおよび除放性製剤のための候補となる。
第一の局面において、本開示は式（Ｉ）：
Figure 2020536091
［式中、
Ａは結合、
Figure 2020536091
から選択され、
ここで、
Figure 2020536091
はカルボニル基の結合点を表し、
Figure 2020536091
は窒素原子の結合点を表し；
ｚは０、１、または２であり；
ｗは１または２であり；
ｎは０または１であり；
ｍは１または２であり；
ｍ’は０または１であり；
ｐは０、１、または２であり；
Ｒｘは水素、アミノ、ヒドロキシ、およびメチルから選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は独立して、水素およびメチルから選択され；
Ｒｚは水素および−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１６から選択され；ここでＲ１６は、水素、−ＣＨＲ１７Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＣＨＲ１７Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ１８Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、および−ＣＨＲ１７Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ１８Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２から選択され；ここで、Ｒ１７は水素および−ＣＨ２ＯＨから選択され、Ｒ１８は水素およびメチルから選択され；
Ｒｖは水素または天然アミノ酸の側鎖であり；
Ｒｃ、Ｒｆ、Ｒｈ、Ｒｉ、およびＲｍは水素であり；
ＲＬはメチルであり；
Ｒｎは水素またはメチルであるか、あるいは、ＲｖおよびＲｎはピロリジン環を形成し；
Ｒａ、Ｒｊ、およびＲｋはそれぞれ独立して、水素およびメチルから選択され；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１３は独立して、天然アミノ酸の側鎖および非天然アミノ酸の側鎖から選択され；
Ｑは適宜、１つの炭素−炭素二重結合またはフェノキシ基を含んでいてもよい、５〜１２員の炭素鎖であり；
Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ７は独立して、天然のアミノ酸側鎖および非天然のアミノ酸側鎖から選択されるか、あるいは、以下に記載されるジェミナルなＲ基を形成し；
Ｒｂはメチルであるか、あるいは、ＲｂおよびＲ２は、それらが結合する原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、およびテトラヒドロチアゾールから選択される環を形成し；ここで、それぞれの環は適宜、アミノ、シアノ、メチル、ハロ、およびヒドロキシから独立して選択される、１〜４個の基で置換されていてもよく；
Ｒｄは水素またはメチルであるか、あるいは、ＲｄおよびＲ４は、それらが結合する原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、およびテトラヒドロチアゾールから選択される環を形成することができ；ここで、それぞれの環は適宜、アミノ、シアノ、メチル、ハロ、ヒドロキシ、およびフェニルから独立して選択される、１〜４個の基で置換されていてもよく；
Ｒｅは水素またはメチルであるか、あるいは、ＲｅおよびＲ５は、それらが結合する原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、およびテトラヒドロチアゾールから選択される環を形成することができ；ここで、それぞれの環は適宜、アミノ、シアノ、メチル、ハロ、およびヒドロキシから独立して選択される、１〜４個の基で置換されていてもよく；
Ｒｇは水素またはメチルであるか、あるいは、ＲｇおよびＲ７はそれらが結合する原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、およびテトラヒドロチアゾールから選択される環を形成することができ；ここで、それぞれの環は適宜、アミノ、ハロ基で適宜置換されていてもよいベンジル、ベンジルオキシ、シアノ、シクロヘキシル、メチル、ハロ、ヒドロキシ、メトキシ基で適宜置換されていてもよいイソキノリニルオキシ、ハロ基で適宜置換されていてもよいキノリニルオキシ、およびテトラゾリルから独立して選択される、１〜４個の基で置換されていてもよく；ここで、ピロリジンおよびピペリジン環は適宜、シクロヘキシル、フェニル、またはインドール基に縮合している。］
の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
第一の局面の第一の実施態様において、本開示は、Ａが
Figure 2020536091
である、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を開示する。
第二の実施態様において、
ｚは０であり；
ｗは１であり；
Ｒ１４およびＲ１５は水素であり；
Ｒｚは−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１６であり；ここで、Ｒ１６は−ＣＨＲ１７Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である。
第三の実施態様において、
Ｒ１は、ヒドロキシで適宜置換されていてもよいベンジルであり；
Ｒ２はメチルであるか、あるいはＲｂと一緒になって、ピペリジン、ピペラジン、およびモルホリンから選択される環を形成し；
Ｒ３は−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２および−ＣＨ２ＣＯ２Ｈから選択され；
Ｒ４は、Ｒｄと一緒になって、ピロリジン環を形成し；
Ｒ５は−ＣＨ２（イミダゾリル）および−ＣＨ２ＮＨ２から選択され；
Ｒ６はイソブチル、−（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｈ、および−（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２から選択され；
Ｒ７は水素であるか、あるいは、Ｒｇと一緒になって、ヒドロキシで適宜置換されていてもよいピロリジン環を形成し；
Ｒ８は−（ＣＨ２）インドリルであり；
Ｒ９は−ＣＨ２ＯＨおよび−（ＣＨ２）２ＮＨ２から選択され；
Ｒ１０は−（ＣＨ２）インドリルおよび−（ＣＨ２）ベンゾチエニルから選択され、それぞれは適宜、−ＣＨ２ＣＯ２Ｈで置換されていてもよい、
請求項３に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
別の実施態様において、本開示は、必要な対象において、免疫応答を強化し、刺激し、および／または増加させる方法であって、治療上の有効量の式（Ｉ）に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を対象に投与することを含む、前記方法を提供する。別の実施態様において、当該方法はさらに、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩の前、後、または同時に、さらなる薬剤を投与することを含む。別の実施態様において、さらなる薬剤は、抗菌剤、抗ウイルス剤、細胞毒性剤、および／または免疫応答調節剤である。別の実施態様において、さらなる薬剤はＨＤＡＣ阻害剤である。別の実施態様において、さらなる薬剤はＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストである。
別の実施態様において、本開示は、必要な対象において、癌細胞の成長、増殖、または転移を阻害する方法であって、治療上の有効量の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を対象に投与することを含む前記方法を提供する。前記阻害は直接的または間接的であることが理解されるべきである。別の実施態様において、癌は、黒色腫、腎細胞癌、扁平上皮非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、大腸癌、去勢抵抗性前立腺癌、卵巣癌、胃癌、肝細胞癌、膵臓癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、食道、消化管および乳房の癌、および造血器腫瘍から選択される。
別の実施態様において、本開示は、必要な対象において感染性疾患を治療する方法であって、治療上の有効量の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を対象に投与することを含む前記方法を提供する。別の実施態様において、感染性疾患はウイルスによって引き起こされる。別の実施態様において、ウイルスはＨＩＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペスウイルス、およびインフルエンザから選択される。
別の実施態様において、本開示は、必要な対象において敗血症性ショックを治療する方法であって、治療上の有効量の本明細書に記載される１つ以上の大環状ペプチドを対象に投与することを含む方法を提供する。
別の実施態様において、本開示は、対象においてＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１および／またはＣＤ８０との相互作用を阻害する方法であって、治療上の有効量の本明細書に記載の少なくとも１つの大環状ペプチドを対象に投与することを含む、前記方法を提供する。
式（Ｉ）の化合物において、好ましいＲ１側鎖は、フェニルアラニン、チロシン、３−チエン−２−イル、４−メチルフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、３−メトキシフェニルアラニン、イソトリプトファン、３−メチルフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、３，４−ジフルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、３，４−ジメトキシフェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、４−ジフルオロメチルフェニルアラニン、２−メチルフェニルアラニン、２−ナフチルアラニン、トリプトファン、４−ピリジニル、４−ブロモフェニルアラニン、３−ピリジニル、４−トリフルオロメチルフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、４−メトキシフェニルアラニン、ビフェニルアラニン、および３−クロロフェニルアラニン；および２，４−ジアミノブタンである。
Ｒ２が環の一部ではない場合の式（Ｉ）の化合物において、好ましいＲ２側鎖は、アラニン、セリン、およびグリシンである。
式（Ｉ）の化合物において、好ましいＲ３側鎖は、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、セリン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、スレオニン、ロイシン、アラニン、２，３−ジアミノプロパン、および２，４−ジアミノブタンである。
Ｒ４が環の一部ではない場合の式（Ｉ）の化合物において、好ましいＲ４側鎖は、バリン、アラニン、イソロイシン、およびグリシンである。
式（Ｉ）の化合物において、好ましいＲ５側鎖は、アミノメタン、ヒスチジン、アスパラギン、２，３−ジアミノプロパン、セリン、グリシン、２，４−ジアミノブタン、スレオニン、アラニン、リシン、アスパラギン酸、アラニン、および３−チアゾリルアラニンである。
式（Ｉ）の化合物において、好ましいＲ６側鎖は、ロイシン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、リシン、３−シクロヘキサン、スレオニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン、アラニン、アルギニン、およびオルニチン（ＣＯＣＨ３）である。
Ｒ７が環の一部ではない場合の式（Ｉ）の化合物において、好ましいＲ７側鎖は、グリシン、２，４−ジアミノブタン、セリン、リシン、アルギニン、オルニチン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、アラニン、および２，４−ジアミノブタン（Ｃ（Ｏ）シクロブタン）である。
式（Ｉ）の化合物において、好ましいＲ８の側鎖は、トリプトファンおよび１，２−ベンズイソチアゾリニルアラニンである。
式（Ｉ）の化合物において、好ましいＲ９の側鎖は、セリン、ヒスチジン、リシン、オルニチン、２，４−ジブチルアミン、スレオニン、リシン、グリシン、グルタミン酸、バリン、２，３−ジアミノプロパン、アルギニン、アスパラギン酸、およびチロシンである。
式（Ｉ）の化合物において、好ましいＲ１０の側鎖は、適宜置換されていてよいトリプトファン、ベンズイソチアゾリルアラニン、１−ナフチルアラニン、およびメチオニンである。
式（Ｉ）の化合物において、好ましいＲ１１の側鎖は、ノルロイシン、ロイシン、アスパラギン、フェニルアラニン、メチオニン、エトキシメタン、アラニン、トリプトファン、イソロイシン、フェニルプロパン、グルタミン酸、ヘキサン、およびヘプタンである。
Ｒ１２が環の一部ではない場合の式（Ｉ）の化合物において、好ましいＲ１２の側鎖は、ノルロイシン、アラニン、エトキシメタン、メチオニン、セリン、フェニルアラニン、メトキシエタン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシン、グルタミン酸、ヘキサン、ヘプタン、およびグリシンである。
式（Ｉ）の化合物において、好ましいＲ１３の側鎖は、アルギニン、オルニチン、アラニン、２，４−ジアミノブタン、２，３−ジアミノプロパン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、リシン、スレオニン、シクロプロピルメタン、グリシン、バリン、イソロイシン、ヒスチジン、および２−アミノブタンである。
本開示に従って、我々は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１およびＣＤ８０との相互作用を阻害することができるペプチドを発見した。これらの大環状ペプチドは、インビトロで免疫調節効果を発揮し、それによって癌および感染症などの様々な疾患の治療のための治療候補となる。
用語「特異的な結合」または「特異的に結合する」は、タンパク質と、化合物またはリガンドなどの結合分子との相互作用をいう。相互作用は、結合分子によって認識される、タンパク質の特定の構造（すなわち、酵素結合部位、抗原決定基、またはエピトープ）の存在による。例えば、化合物がタンパク質結合部位「Ａ」に特異的な結合を有する場合、結合部位Ａを含むタンパク質、およびタンパク質結合部位Ａに特異的に結合する標識ペプチドを含む反応において、化合物の存在は、タンパク質に結合する標識ペプチドの量を減少させる。反対に、タンパク質に対する化合物の非特異的な結合は、タンパク質からの標識ペプチドの濃度依存的な置換は生じない。
本開示は、本化合物中に生じる原子の全ての同位体を含むことを意図する。同位体は同じ原子数を有するが、異なる質量数を有するこれらの原子を含む。一般的な例として、限定されないが、水素の同位体としては、重水素およびトリチウムが挙げられる。炭素の同位体としては、１３Ｃおよび１４Ｃが挙げられる。本発明の同位体標識した化合物は、一般に、当業者に既知の従来の技術によって、または本明細書に記載されるものと同様の方法によって、他の場合に用いられる非標識試薬の代わりに、適切に同位体標識した試薬を用いて合成することができる。そのような化合物は、例えば、生物学的活性を決定する際の標準および試薬として、様々な潜在的な用途を有しうる。安定な同位体の場合、そのような化合物は、生物学的、薬理学的、または薬物動態特性を有利に変更する可能性を有しうる。
本明細書に記載される主題のさらなる局面は、リガンド結合アッセイの開発のために、またはインビボ吸着、代謝、分布、受容体結合もしくは占有、もしくは化合物処分の追跡のために、放射性標識リガンドとしての本開示のペプチドの使用である。例えば、本明細書に記載の大環状ペプチドは、放射性同位体１２５Ｉを用いて合成される場合があり、得られた放射性標識ペプチドは、結合アッセイの開発または代謝研究のために使用されうる。あるいは、同様の目的のために、本明細書に記載される大環状ペプチドは、当業者に既知の方法を用いて、触媒トリチウム化によって放射性標識形態に変換されうる。
本開示の大環状ペプチドはまた、当業者に既知の方法を用いて、放射性トレーサーを加えることによって、ＰＥＴ造影剤として使用することができる。
好ましいペプチドとしては、本明細書に提示される大環状ペプチドの少なくとも１つが挙げられ、これらのペプチドは医薬組成物および組み合わせに含まれうる。
本明細書に提示される定義は、特定の場合に限定されない限り、本明細書全体で使用される用語に、限定されず、適用される。
アミノ酸およびペプチド化学の技術分野における当業者は、アミノ酸が一般的な構造：
Figure 2020536091
［式中、ＲおよびＲ’は本明細書で記載される通りである、］
によって表される化合物を含むことを知っている。
特に断らない限り、本明細書で用いられる用語「アミノ酸」は、単独で、または他の基の一部として、限定されないが、「α」炭素と呼ばれる、同一の炭素に結合したアミノ基およびカルボキシル基を含み、ここで、Ｒおよび／またはＲ’は、水素などの、天然または非天然側鎖でありうる。「α」炭素における、「Ｓ」絶対配置は一般に、「Ｌ」または「天然」配置として示される。「Ｒ」および「Ｒ’」（プライム）置換基の両方が水素である場合、アミノ酸はグリシンであり、キラルでない。
本明細書で用いられる用語「天然アミノ酸側鎖」および「天然に存在するアミノ酸側鎖」は、通常はＳ配置（すなわち、Ｌ−アミノ酸）の、天然に存在するアミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン，−ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）の任意の側鎖をいう。
本明細書で用いられる用語「非天然アミノ酸側鎖」および「非天然に存在するアミノ酸側鎖」は、通常Ｒ配置（すなわち、Ｄ−アミノ酸）の、任意の天然に存在するアミノ酸の側鎖、または以下：
Ｃ２−Ｃ７アルケニル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシＣ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニルＣ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ７アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルファニルＣ１−Ｃ３アルキル、アミドＣ１−Ｃ３アルキル、アミノＣ１−Ｃ３アルキル、アザインドリルＣ１−Ｃ３アルキル、ベンゾチアゾリルＣ１−Ｃ３アルキル、ベンゾチエニルＣ１−Ｃ３アルキル、ベンジルオキシＣ１−Ｃ３アルキル、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキル、Ｃ３−Ｃ１４シクロアルキルＣ１−Ｃ３アルキル、ジフェニルメチル、フラニルＣ１−Ｃ３アルキル、イミダゾリルＣ１−Ｃ３アルキル、ナフチルＣ１−Ｃ３アルキル、ピリジニルＣ１−Ｃ３アルキル、チアゾリルＣ１−Ｃ３アルキル、チエニルＣ１−Ｃ３アルキル；
ビフェニルＣ１−Ｃ３アルキル、ここで、ビフェニルは適宜メチル基で置換されていてもよい；
Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルアミノ、アミド、アミノ、アミノＣ１−Ｃ３アルキル、アミノスルホニル、カルボキシ、シアノ、ハロ、ハロＣ１−Ｃ３アルキル、ヒドロキシ、−ＮＣ（ＮＨ２）２、ニトロ、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２から独立して選択される、１、２、３、４、または５個の基で適宜置換されていてもよい、ヘテロシクリル；
インドリルＣ１−Ｃ３アルキル、ここで、インドリル部分は適宜、Ｃ１−Ｃ３アルキル、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキル、ハロ、ヒドロキシ、およびフェニルから選択される１つの基で置換されていてもよく、ここで、フェニルはさらに、適宜、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、およびハロから独立して選択される、１、２、または３つの基で置換されていてもよく；
ＮＲｙＲｙ’（Ｃ１−Ｃ７アルキル）、ここで、ＲｙおよびＲｙ’は独立して、水素、Ｃ２−Ｃ４アルケニルオキシカルボニル、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルカルボニル、Ｃ３−Ｃ１４シクロアルキルカルボニル、フラニルカルボニル、およびフェニルカルボニルから選択され、アルキルリンカーが１つ以上の炭素を含む場合、さらなるＮＲｙＲｙ’基が鎖に存在しうる；
ＮＲｑＲｔカルボニルＣ１−Ｃ３アルキル、ここで、ＲｑおよびＲｔは独立して、水素、Ｃ１−Ｃ３アルキル、およびトリフェニルメチルから選択される；
Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルアミノ、アミド、アミノ、アミノＣ１−Ｃ３アルキル、アミノスルホニル、カルボキシ、シアノ、ハロ、ハロＣ１−Ｃ３アルキル、ヒドロキシ、−ＮＣ（ＮＨ２）２、ニトロ、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２から独立して選択される、１、２、３、４、または５個の基で適宜置換されていてもよい、フェニル；
ＮＲａ’Ｒｂ’（Ｃ１−Ｃ７アルキル）、ここで、Ｒａ’およびＲｂ’は独立して、水素、Ｃ２−Ｃ４アルケニルオキシカルボニル、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルカルボニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルカルボニル、フラニルカルボニル、およびフェニルカルボニルから選択され、アルキルリンカーが１つより多い炭素を含む場合、さらなるＮＲａ’Ｒｂ’基が鎖に存在しうる；
ＮＲｃ’Ｒｄ’カルボニルＣ１−Ｃ３アルキル、ここで、Ｒｃ’およびＲｄ’は独立して、水素、Ｃ１−Ｃ３アルキル、およびトリフェニルメチルから選択され；
フェニルＣ１−Ｃ３アルキル、ここで、フェニル部分は適宜、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルアミノ、アミド、アミノ、アミノＣ１−Ｃ３アルキル、アミノスルホニル、カルボキシ、シアノ、ハロ、ハロＣ１−Ｃ３アルキル、ヒドロキシ、−ＮＣ（ＮＨ２）２、ニトロ、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２から独立して選択される、１、２、３、４、または５個の基で置換されていてもよく；
フェノキシＣ１−Ｃ３アルキル、ここで、フェニルは適宜、Ｃ１−Ｃ３アルキル基で置換されていてもよい
から選択される、Ｒ−またはＳ−配置（すなわち、それぞれＤ−またはＬ−アミノ酸）の天然に存在するアミノ酸側鎖以外の基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ２−Ｃ４アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、２〜４個の炭素原子の直鎖または分岐鎖基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ２−Ｃ７アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、２〜７個の炭素原子の直鎖または分岐鎖基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ２−Ｃ４アルケニルオキシ」は、酸素原子を介して親分子基に結合した、Ｃ２−Ｃ４アルケニル基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ１−Ｃ３アルコキシ」は、酸素原子を介して親分子基に結合した、Ｃ１−Ｃ３アルキル基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ１−Ｃ４アルコキシ」は、酸素原子を介して親分子基に結合した、Ｃ１−Ｃ４アルキル基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ１−Ｃ６アルコキシ」は、酸素原子を介して親分子基に結合した、Ｃ１−Ｃ６アルキル基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ１−Ｃ３アルコキシＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子基に結合した、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル」は、カルボニル基を介して親分子基に結合した、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニルＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子基に結合した、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ１−Ｃ３アルキル」は、１〜３個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖飽和炭化水素に由来する基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ１−Ｃ４アルキル」は、１〜４個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖飽和炭化水素に由来する基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ１−Ｃ６アルキル」は、１〜６個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖飽和炭化水素に由来する基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ１−Ｃ３アルキルカルボニル」は、カルボニル基を介して親分子基に結合した、Ｃ１−Ｃ３アルキル基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ１−Ｃ３アルキルスルファニル」は、硫黄原子を介して親分子基に結合した、Ｃ１−Ｃ３アルキル基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ１−Ｃ３アルキルスルファニルＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子に結合した、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルファニル基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニル」は、スルホニル基を介して親分子基に結合した、Ｃ１−Ｃ３アルキル基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルアミノ」は、アミノ基を介して親分子基に結合した、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニル基をいう。
本明細書で用いられる用語「アミド」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２をいう。
本明細書で用いられる用語「アミドＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子基に結合した、アミド基をいう。
本明細書で用いられる用語「アミノ」は、−ＮＨ２をいう。
本明細書で用いられる用語「アミノＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子に結合したアミノ基をいう。
本明細書で用いられる用語「アミノスルホニル」は、スルホニル基を介して親分子基に結合したアミノ基をいう。
本明細書で用いられる用語「アザインドリルＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子に結合した、アザインドリル基をいう。アザインドリル基は、基中の任意の置換可能な原子を介して、アルキル基に結合しうる。
本明細書で用いられる用語「ベンゾチアゾリルＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子に結合した、ベンゾチアゾリル基をいう。ベンゾチアゾリル基は、基中の任意の置換可能な原子を介して、アルキル基に結合しうる。
本明細書で用いられる用語「ベンゾチエニルＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子に結合した、ベンゾチエニル基をいう。ベンゾチエニル基は、基中の任意の置換可能な原子を介して、アルキル基に結合しうる。
本明細書で用いられる用語「ベンジルオキシ」は、酸素原子を介して親分子に結合した、ベンジル基をいう。
本明細書で用いられる用語「ベンジルオキシＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子に結合した、ベンジルオキシ基をいう。
本明細書で用いられる用語「ビフェニルＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子に結合した、ビフェニル基をいう。ビフェニル基は、基中の任意の置換可能な原子を介して、アルキル基に結合しうる。
本明細書で用いられる用語「カルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）−をいう。
本明細書で用いられる用語「カルボキシ」は、−ＣＯ２Ｈをいう。
本明細書で用いられる用語「カルボキシＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子に結合した、カルボキシ基をいう。
本明細書で用いられる用語「シアノ」は、−ＣＮをいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ３−Ｃ１４シクロアルキル」は、３〜１４個の炭素原子および０個のヘテロ原子を有する、飽和単環式、二環式、または三環式炭化水素環系をいう。二環式および三環式環は、縮合、スピロ環、または架橋でありうる。シクロアルキル基の代表的な例としては、限定されないが、シクロプロピル、シクロペンチル、ビシクロ［３．１．１］ヘプチル、およびアダマンチルが挙げられる。
本明細書で用いられる用語「Ｃ３−Ｃ１４シクロアルキルＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子に結合したＣ３−Ｃ１４シクロアルキル基をいう。
本明細書で用いられる用語「Ｃ３−Ｃ１４シクロアルキルカルボニル」は、カルボニル基を介して親分子に結合した、Ｃ３−Ｃ１４シクロアルキル基をいう。
本明細書で用いられる用語「フラニルＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子に結合した、フラニル基をいう。フラニル基は、基中の任意の置換可能な原子を介してアルキル基に結合しうる。
本明細書で用いられる用語「フラニルカルボニル」は、カルボニル基を介して親分子に結合したフラニル基をいう。
本明細書で用いられる用語「ハロ」および「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩをいう。
本明細書で用いられる用語「ハロＣ１−Ｃ３アルキル」は、１、２、または３個のハロゲン原子で置換された、Ｃ１−Ｃ３アルキル基をいう。
本明細書で用いられる用語「ハロメチル」は、１、２、または３個のハロゲン原子で置換された、メチル基をいう。
本明細書で用いられる用語「ヘテロシクリル」は、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される、１、２、または３個のヘテロ原子を含む、５、６、または７員環をいう。５員環は０〜２個の二重結合を有し、６および７員環は０〜３個の二重結合を有する。用語「ヘテロシクリル」はまた、ヘテロシクリル環が４〜６員の芳香族または非芳香族炭素環に縮合している二環式基、または他の単環式ヘテロシクリル基を含む。本開示のヘテロシクリル基は、基中の炭素原子を介して親分子に結合する。ヘテロシクリル基の例としては、限定されないが、ベンゾチエニル、フリル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、モルホリニル、オキサゾリル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラゾリル、ピリジニル、ピロリジニル、ピロロピリジニル、ピロリル、チアゾリル、チエニル、およびチオモルホリニルが挙げられる。
本明細書で用いられる用語「ヒドロキシ」は、−ＯＨをいう。
本明細書で用いられる用語「イミダゾリルＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子に結合したイミダゾリル基をいう。イミダゾリル基は、基中の任意の置換可能な原子を介してアルキル基に結合しうる。
本明細書で用いられる用語「インドリルＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子基に結合した、インドリル基をいう。インドリル基は、基中の任意の置換可能な原子を介して、アルキル基に結合しうる。
本明細書で用いられる用語「ナフチルＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子基に結合した、ナフチル基をいう。ナフチル基は、基中の任意の置換可能な原子を介して、アルキル基に結合しうる。
本明細書で用いられる用語「ニトロ」は、−ＮＯ２をいう。
本明細書で用いられる用語「ＮＲａ’Ｒｂ’」は、窒素原子を介して親分子に結合した２つの基、Ｒａ’およびＲｂ’をいう。Ｒａ’およびＲｂ’は独立して、水素、Ｃ２−Ｃ４アルケニルオキシカルボニル、Ｃ１−Ｃ３アルキルカルボニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルカルボニル、フラニルカルボニル、およびフェニルカルボニルから選択される。
本明細書で用いられる用語「ＮＲａ’Ｒｂ’（Ｃ１−Ｃ３）アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子に結合した、ＮＲａ’Ｒｂ’基をいう。
本明細書で用いられる用語「ＮＲｃ’Ｒｄ’」は、窒素原子を介して親分子基に結合した２つの基、Ｒｃ’およびＲｄ’をいう。Ｒｃ’およびＲｄ’は独立して、水素、Ｃ１−Ｃ３アルキル、およびトリフェニルメチルから選択される。
本明細書で用いられる用語「ＮＲｃ’Ｒｄ’カルボニル」は、カルボニル基を介して親分子に結合した、ＮＲｃ’Ｒｄ’基をいう。
本明細書で用いられる用語「ＮＲｃ’Ｒｄ’カルボニルＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子に結合した、ＮＲｃ’Ｒｄ’カルボニル基をいう。
本明細書で用いられる用語「フェノキシ」は、酸素原子を介して親分子基に結合した、フェニル基をいう。
本明細書で用いられる用語「フェノキシＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子基に結合した、フェノキシ基をいう。
本明細書で用いられる用語「フェニルＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子基に結合した、フェニル基をいう。
本明細書で用いられる用語「フェニルカルボニル」は、カルボニル基を介して親分子基に結合した、フェニル基をいう。
本明細書で用いられる用語「ピリジニルＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子基に結合した、ピリジニル基をいう。ピリジニル基は、基中の任意の置換可能な原子を介して、アルキル基に結合しうる。
本明細書で用いられる用語「スルファニル」は、−Ｓ−をいう。
本明細書で用いられる用語「スルホニル」は、−ＳＯ２−をいう。
本明細書で用いられる用語「チアゾリルＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子基に結合した、チアゾリル基をいう。チアゾリル基は、基中の任意の置換可能な原子を介して、アルキル基に結合しうる。
本明細書で用いられる用語「チエニルＣ１−Ｃ３アルキル」は、Ｃ１−Ｃ３アルキル基を介して親分子基に結合した、チエニル基をいう。チエニル基は、基中の任意の置換可能な原子を介して、アルキル基に結合しうる。
用語「治療する」は、（ｉ）疾患、障害、および／または病状の素因を有しうるが、それを有するとは未だ診断されていない患者において、疾患、障害、または病状の発生を予防すること；（ｉｉ）疾患、障害、または病状を抑制すること、すなわち、その進行を停止させること；並びに（ｉｉｉ）疾患、障害、または病状を緩和すること、すなわち疾患、障害、および／もしくは病状、および／または疾患、障害、および／もしくは症状に関連する症状の退縮を引き起こすことをいう。
大環状ペプチドのＰＤ−Ｌ１への結合は、例えば、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）、核磁気共鳴スペクトロスコピー（ＮＭＲ）などの方法によって測定することができる。さらに、細胞表面に発現するＰＤ−Ｌ１への大環状ペプチドの結合は、細胞結合アッセイにおいて、本明細書に記載されるように測定することができる。
本明細書に記載される治療剤の投与としては、限定されないが、治療上の有効量の治療剤の投が挙げられる。本明細書で用いられる用語「治療上の有効量」は、限定されないが、本明細書に記載されるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合阻害剤の組成物の投与によって治療可能な病状の、治療または予防のための治療剤の分量をいう。その量は、検出可能な治療的、予防的、または回復的効果を発揮するのに十分な分量である。当該効果としては、例えば、限定されないが、本明細書に列挙される病状の治療または予防が挙げられる。対象についての正確な有効量は、対象の大きさおよび健康状態、治療される病状の性質および程度、治療する医師の推奨、並びに投与のために選択される治療法または治療法の組み合わせに依存する。そのため、事前に正確な有効量を特定することは有用ではない。
別の局面において、本開示は、本開示の大環状ペプチドを用いた、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法に関する。本明細書において示されるように、本開示の大環状ペプチドは、ＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との相互作用を阻害し、ＰＤ−１との相互作用を阻害することが知られている抗ＰＤ−１モノクローナル抗体とのＰＤ−Ｌ１の結合と競合し、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞ＩＦＮγ分泌を増強させ、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞ＩＦＮｇ分泌を増強させることができる。その結果、本開示の大環状ペプチドは、（例えば、ＰＤ−Ｌ１阻害ペプチドと対象の抗原との共投与によって）免疫応答を修正し、癌または感染性疾患などの疾患を治療し、防御的自己免疫応答を刺激するか、または抗原特異的免疫応答を刺激するのに有用である。
本開示が容易に理解され得るために、いくつかの用語を最初に定義する。さらなる定義が、詳細な説明にわたって記載される。
用語「プログラム死リガンド１」、「プログラム細胞死リガンド１」、「タンパク質ＰＤ−Ｌ１」、「ＰＤ−Ｌ１」、「ＰＤＬ１」、「ＰＤＣＤＬ１」、「ｈＰＤ−Ｌ１」、「ｈＰＤ−ＬＩ」、「ＣＤ２７４」および「Ｂ７−Ｈ１」は、同義で用いられ、ヒトＰＤ−Ｌ１のバリアント、アイソフォーム、種ホモログ、およびＰＤ−Ｌ１と少なくとも１つの共通するエピトープを有する類似体を含む。完全なＰＤ−Ｌ１配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アセッション番号ＮＰ＿０５４８６２で見つけることができる。
用語「プログラム死１」、「プログラム細胞死１」、「タンパク質ＰＤ−１」、「ＰＤ−１」、「ＰＤ１」、「ＰＤＣＤ１」、「ｈＰＤ−１」および「ｈＰＤ−Ｉ」は、同義で用いられ、ヒトＰＤ−１のバリアント、アイソフォーム、種ホモログ、およびＰＤ−１と少なくとも１つの共通するエピトープを有する類似体を含む。完全なＰＤ−１配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アセッション番号Ｕ６４８６３で見つけることができる。
用語「細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４」、「ＣＴＬＡ−４」、「ＣＴＬＡ４」、「ＣＴＬＡ−４抗原」および「ＣＤ１５２」（例えば、Murata, Am. J. Pathol., 155:453-460 (1999)を参照されたい）は、同義で用いられ、ヒトＣＴＬＡ−４のバリアント、アイソフォーム、種ホモログ、およびＣＴＬＡ−４と少なくとも１つの共通するエピトープを有する類似体を含む（例えば、Balzano, Int. J. Cancer Suppl., 7:28-32 (1992)を参照されたい）。完全なＣＴＬＡ−４核酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アセッション番号Ｌ１５００６で見つけることができる。
用語「免疫応答」は、例えば、侵入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または自己免疫もしくは病理学的炎症の場合には、通常のヒト細胞もしくは組織の選択的損傷、破壊、またはヒトの体からの排除を生じる、リンパ球、抗原提示細胞、貪食作用、顆粒球、および上記細胞または肝臓によって生産される可溶性高分子（大環状ペプチド、サイトカイン、および補体など）の作用をいう。
本明細書で用いられる「有害事象（ＡＥ）」は、医学的治療の使用に関連する、任意の好ましくない、一般に意図されない、さらに望ましくない、徴候（異常な検査所見など）、症状、または疾患である。例えば、有害事象は、治療に対する応答における、免疫系の活性化、または免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）の増殖に関連しうる。医学的治療は、１つ以上の関連するＡＥを有する場合があり、それぞれのＡＥは、同じまたは異なる重症度を有する場合がある。「有害事象を変化させる」ことができる方法に関する言及は、異なる治療レジメンの使用に関連する、１つ以上のＡＥの発生率および／または重症度を減少させる、治療レジメンを意味する。
本明細書で用いられる「過増殖性疾患」は、細胞増殖が正常なレベルを超えて増加する状態をいう。例えば、過増殖性疾患または障害としては、悪性疾患（例えば、食道癌、大腸癌、胆道癌）、および非悪性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、良性過形成、および良性前立腺肥大化）が挙げられる。
本明細書で用いられる「約」または「本質的に〜を含む」は、当業者によって決定される、特定の値について許容誤差範囲内であることを意味し、これは値の測定または決定方法、すなわち、測定系の限界に部分的に依存するであろう。例えば、「約」または「本質的に〜を含む」は、当技術分野における実施ごとに、１つ以上のある標準偏差の範囲内であることを意味しうる。あるいは、「約」または「本質的に〜を含む」は、最大２０％の範囲を意味しうる。さらに、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、当該用語は、最大で１０倍または最大で５倍の値を意味しうる。特定の値が本出願および特許請求の範囲において提供される場合、特に言及されない限り、「約」または「本質的に〜を含む」の意味は、その特定の値の許容誤差範囲内であると推定されるべきである。
本明細書で記載される、任意の濃度範囲、百分率範囲、比率範囲、または整数範囲は、特に言及されない限り、記載される範囲内の任意の整数値、および適切な場合、その分数（整数の１／１０および１／１００など）を含むと理解されるべきである。
競合アッセイ
本開示はまた、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、および少なくとも約１００％、参照抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＭＤＸ−１１０５）の結合と競合することができる、大環状ペプチドに関する。そのような大環状ペプチドは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する限り、変異体、保存的置換、機能的置換、および欠失の形態など、本明細書に開示される１つ以上の大環状ペプチドと構造的相同性を共有しうる。例えば、大環状ペプチドが、参照抗ＰＤ−Ｌ１抗体と同じＰＤ−Ｌ１の領域に実質的に結合する場合、大環状ペプチドは、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体が結合するＰＤ−Ｌ１エピトープと、少なくとも重なるＰＤ−Ｌ１のエピトープに結合するはずである。重複する領域は、１つのアミノ酸残基から数百個のアミノ酸残基の範囲でありうる。大環状ペプチドは次いで、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体のＰＤ−Ｌ１への結合と競合する、および／または結合を阻害し、それによって抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体のＰＤ−Ｌ１への結合は、競合アッセイにおいて、好ましくは少なくとも約５０％減少するはずである。
競合アッセイの目的で参照抗体として用いられうる抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、当技術分野において既知である。例えば、以下の代表的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体が用いられうる：ＭＤＸ−１１０５（ＢＭＳ）；Ｌ０１Ｘ−Ｃ（Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｌ１Ｘ３（Ｓｅｒｏｎｏ）、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ（Ｓｅｒｏｎｏ）、およびＰＤ−Ｌ１プロボディ（ＣｙｔｏｍＸ）、および共有されるＷＯ２００７／００５８７４において開示されるＰＤ−Ｌ１抗体。
競合アッセイの目的のために、参照抗体として用いられうる抗ＰＤ−１抗体は、当技術分野において既知である。例えば、以下の代表的な抗ＰＤ−１抗体が用いられうる：ニボルマブ（ＢＭＳ）；それぞれ共有される米国特許第８，００８，４４９号（ＢＭＳ）で開示される、１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４、ＭＫ−３４７５（Ｍｅｒｃｋ、米国特許第８，１６８，７５７号において開示される）、および米国特許第７，４８８，８０２号において開示される抗体。
医薬組成物
別の局面において、本開示は、１または組み合わせの、本開示の大環状ペプチドを含む、薬学的に許容可能な担体と共に製剤化された、組成物、例えば、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、１または組み合わせの（例えば、２つ以上の異なる）、本開示の大環状ペプチド、または免疫複合体、または二重特異性分子を含みうる。例えば、本開示の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的活性を有する、大環状ペプチド（または免疫複合体もしくは二重特異性）の組み合わせを含むことができる。
本開示の医薬組成物はまた、組み合わせ療法において、すなわち他の薬剤との組み合わせで、投与することができる。例えば、組み合わせ療法は、大環状ペプチドを、少なくとも１つの他の抗炎症性剤または免疫抑制剤との組み合わせで含むことができる。組み合わせ療法において用いることができる治療剤の例は、本開示の大環状ペプチドの使用に関するセクションで、以下にさらに詳細に記載される。
本明細書で用いられる「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的に許容可能な、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延化剤などが挙げられる。好ましくは、担体は、（例えば、注射または点滴による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与に適切である。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち大環状ペプチド、免疫複合体、または二重特異性分子は、酸の作用、および化合物を不活性化しうる他の自然条件から、化合物を保護するための物質でコーティングされうる。
本開示の医薬化合物は、１つ以上の薬学的に許容可能な塩を含みうる。「薬学的に許容可能な塩」または「治療上許容可能な塩」は、親化合物の目的の生物学的活性を維持し、任意の望ましくない毒性作用を生じない塩をいう（例えば、Berge, S.M. et al., J. Pharm. Sci., 66:1-19 (1977)を参照されたい）。そのような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸などの、非毒性の無機酸に由来するもの、並びに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカノン酸、ヒドロキシアルカノン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性の有機酸に由来するものが挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属に由来するもの、並びにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの、非毒性有機アミンに由来するものが挙げられる。
本開示の医薬組成物はまた、薬学的に許容可能な抗酸化剤を含みうる。薬学的に許容可能な抗酸化剤の例としては、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの、水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの、油溶性抗酸化剤；および（３）クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの、金属キレート剤が挙げられる。
本開示の医薬組成物において用いられうる、適切な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合は、必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含みうる。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順によって、および様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール ソルビン酸などを含有することの両方によって、確実にされうる。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含むこともまた、望ましくありうる。さらに、注入可能な医薬形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延される試薬を含有することによってもたらされうる。
薬学的に許容可能な担体としては、無菌水溶液または分散液、および無菌注入可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌散剤が挙げられる。薬学的に活性な物質についてのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において既知である。従来の任意の媒体および薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本開示の医薬組成物におけるそれらの使用は考慮される。補助的な活性化合物もまた、組成物に含まれうる。
治療組成物は一般に、製造および保管の条件下において、無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度の適切な、他の秩序のある構造として製剤化されうる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む、溶媒または分散媒でありうる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散液の場合は、必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを、組成物中に含むことが好ましいであろう。注入可能な医薬形態の持続的吸収は、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンなどの、吸収を遅延される試薬を組成物中に含有することによってもたらされうる。
無菌注入可能な溶液は、必要量の活性化合物を、１または組み合わせの前記に列挙された成分と共に、適切な溶媒中に組み込み、次いで、必要に応じて、滅菌精密濾過をすることによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒および前記に列挙されたもののうち必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに組み込むことによって、調製される。無菌注入可能な溶液の調製のための無菌散剤の場合、調製の好ましい方法は、予め無菌濾過されたその溶液からの、任意のさらなる望ましい成分に加えて、活性成分の粉末を生じる、真空乾燥、凍結乾燥（凍結乾燥）である。
担体物質と組み合わせて、単一の剤形を生じることができる活性成分の分量は、治療される対象、および特定の投与形態に応じて変化するであろう。担体物質と組み合わせて、単一の剤形を生じることができる活性成分の分量は、一般に治療効果を生じる組成物の分量であるだろう。一般に、１００分率で、この分量は、薬学的に許容可能な担体との組み合わせで、約０．０１パーセントから約９９％の活性成分、好ましくは、約０．１パーセントから約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセントから約３０パーセントの活性成分の範囲であるだろう。
用量レジメンは、最適な目的の応答（例えば、治療的応答）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、あるいは用量は、治療状態の緊急性によって必要とされるように、比例的に減少または増加させてもよい。投与の容易さおよび用量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形に製剤化することが特に有利である。本明細書で用いられる単位剤形は、治療される対象についての単位用量として適した、物理的に別個の単位をいい；それぞれの単位は、必要な医薬担体に関連する、目的の治療効果を生じるように計算された、活性化合物の所定の用量を含む。本開示の単位剤形についての仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特性、および達成される特定の治療効果、および（ｂ）そのような活性化合物を、個々の治療感度について配合することの、当技術分野における固有の制限によって決定され、直接的に依存する。
大環状ペプチドの投与のために、用量は約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、およびさらに通常は、０．０１から５ｍｇ／宿主体重ｋｇの範囲でありうる。例えば、用量は０．３ｍｇ／体重ｋｇ、１ｍｇ／体重ｋｇ、３ｍｇ／体重ｋｇ、５ｍｇ／体重ｋｇ、または１０ｍｇ／体重ｋｇ、または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内でありうる。例示的な治療レジメンは、１日１回、１日２回、週２回、週３回、毎週、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、月１回、３月ごとに１回、３〜６月ごとに１回の投与を伴う。本開示の大環状ペプチドについての好ましい用量レジメンとしては、静脈内投与によって１ｍｇ／体重ｋｇまたは３ｍｇ／体重ｋｇが挙げられ、大環状分子は、以下の用量スケジュールの１つを用いて投与される：（ｉ）４週間ごとに６回の用量、次いで３ヶ月ごと；（ｉｉ）３週間ごと；（ｉｉｉ）３ｍｇ／体重ｋｇを１回、次いで３週間ごとに１ｍｇ／体重ｋｇ。
いくつかの実施態様において、異なる結合特異性を有する２つ以上の大環状ペプチドは同時に投与され、その場合、投与されるそれぞれの化合物の用量は、示された範囲内に属する。化合物は通常、複数回投与される。単回投与の間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３月ごと、または毎年でありうる。間隔はまた、患者の標的抗原に対する大環状ペプチドの血中濃度を測定することによって示されるように、不規則でありうる。いくつかの方法において、用量は約１−１０００．ｍｕ．ｇ／ｍｌの血漿濃度に達するように調整され、いくつかの方法においては、約２５−３００．ｍｕ．ｇ／ｍｌである。
あるいは、大環状ペプチドは除放性製剤として投与することができ、その場合、より少ない頻度の投与が必要である。投与量および頻度は、治療が予防的であるか、治療的であるかによって異なりうる。予防的応用において、比較的低い用量が、長期間にわたって、比較的まれな間隔で投与される。一部の患者は、一生涯治療を受け続ける。治療的応用において、疾患の進行が軽減または終了するまで、および好ましくは、患者が疾患症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短期間における、比較的高い用量が時に必要とされる。その後、患者は予防的レジメンを投与されうる。
本開示の医薬組成物における活性成分の実際の用量は、患者に対する毒性がなく、特定の患者、組成物、および投与方法について、目的の治療的応答を達成するのに有効である活性成分の用量が得られるように変化しうる。選択される用量は、用いられる本開示の特定の組成物、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排出率、治療時間、用いられる特定の組成物と組み合わせで用いられる他の薬物、化合物、および／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、病状、健康状態、および既往歴、並びに医薬分野において周知の因子などの、様々な薬物動態的因子に依存する。
本開示の大環状ペプチドの「治療的に有効な用量」は好ましくは、疾患症状の重症度の減少、疾患無症状期間の頻度および期間の増加、または疾患の苦痛による機能障害または身体障害の予防をもたらす。例えば、腫瘍の治療について、「治療的に有効な用量」は好ましくは、細胞増殖または腫瘍増殖を、未治療の対象と比較して、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約８０％阻害する。腫瘍増殖および／またはＨＩＶを阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性またはウイルス有効性を予測する動物モデル系において評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、当業者に既知のアッセイによるインビトロ阻害など、化合物の阻害能力を試験することによって評価することができる。治療上の有効量の治療化合物は、腫瘍の大きさを減少させ、ウイルス負荷を減少させ、あるいは対象における症状を寛解させることができる。当業者は、対象の大きさ、対象の症状の重症度、および選択される特定の組成物もしくは投与経路などの因子に基づいて、そのような用量を決定することができるだろう。
別の局面において、本開示は、本明細書に記載されるように、大環状ペプチドおよび他の免疫調節剤を含む部品の医薬キットを提供する。当該キットはまた、過増殖性疾患（本明細書に記載される癌など）および／または抗ウイルス疾患の治療において用いるための、説明書をさらに含みうる。
本開示の組成物は、当技術分野において既知の様々な方法のうちの１つ以上を用いて、１つ以上の投与経路によって投与することができる。当業者によって理解されるように、投与経路および／または投与方法は、目的の結果に応じて変化するであろう。本開示の大環状ペプチドについての好ましい投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄投与経路または他の非経口投与経路、例えば注射または点滴が挙げられる。本明細書で用いられる用語「非経口投与」は、経腸および局所投与以外の、通常注射による投与方法を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内注射および点滴が挙げられる。
あるいは、本開示の大環状ペプチドは、局所、上皮、または粘膜投与経路など、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所投与などの経口経路（non-parenteral route）によって投与することができる。
活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムなどの、制御放出製剤などの急速な放出から化合物を保護する担体と共に製剤化されうる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤を製造するための多くの方法は特許を取得され、一般に当業者に既知である。例えば、Robinson, J.R., ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York (1978)を参照されたい。
治療組成物は、当技術分野において既知の医療デバイスを用いて投与することができる。例えば、好ましい実施態様において、本開示の治療組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、５，３８３，８５１号、５，３１２，３３５号、５，０６４，４１３号、４，９４１，８８０号、４，７９０，８２４号、または４，５９６，５５６号において開示されるデバイスなどの、無針皮下注射デバイスによって投与することができる。本開示において有用な、周知のインプラントおよびモジュールの例としては、米国特許第４，４８７，６０３号、これは制御された速度において薬物を分配するための、埋め込み可能なマイクロ注入ポンプを開示する；米国特許第４，４８６，１９４号、これは皮膚を通して薬物を投与するための治療デバイスを開示する；米国特許第４，４４７，２３３号、これは正確な注入速度において薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示する；米国特許第４，４４７，２２４号、これは連続的な薬物送達のための可変流量埋め込み可能型注入装置を開示する；米国特許第４，４３９，１９６号、これはマルチチャンバーコンパートメントを有する、浸透圧性薬物送達システムを開示する；および米国特許第４，４７５，１９６号、これは浸透圧性薬物送達システムを開示する、が挙げられる。これらの特許は引用により本明細書に援用される。他の多くのそのようなインプラント、送達システム、およびモジュールなどは、当業者に既知である。
いくつかの実施態様において、本開示の大環状ペプチドは、インビボで適切な分布を確実にするように製剤化されうる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、親水性の高い多くの化合物を排除する。（必要であれば）本開示の治療化合物がＢＢＢを通過することを確実にするために、それらは例えば、リポソーム中に製剤化されうる。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１、５，３７４，５４８、および５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送され、そのため標的の薬物送達を向上させる、１つ以上の部位を含みうる（例えば、Ranade, V.V., J. Clin. Pharmacol., 29:685 (1989)を参照されたい）。例示的な標的化部位としては、葉酸またはビオチン（例えば、米国特許第5,416,016号、Low et al.を参照されたい）；マンノシド（Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 153:1038 (1988)）；大環状ペプチド（Bloeman, P.G. et al., FEBS Lett., 357:140 (1995); Owais, M. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 39:180 (1995)）；界面活性剤タンパク質Ａ受容体（Briscoe et al., Am. J. Physiol., 1233:134 (1995)）；ｐ１２０（Schreier et al., J. Biol. Chem., 269:9090 (1994)）が挙げられる；Keinanen, K. et al., FEBS Lett., 346:123 (1994); Killion, J.J. et al., Immunomethods 4:273 (1994)もまた参照されたい。
本開示の使用および方法
本開示の大環状ペプチド、組成物、および方法は、例えば、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ１の阻害による免疫応答の増強の検出に関する、多くのインビトロおよびインビボでの有用性を有する。例えば、これらの分子は、様々な状況において免疫を増強させるために、インビトロまたはエクスビボで培養中の細胞に、または例えばインビボでのヒト対象に投与されうる。そのため、ある局面において、本開示は、対象における免疫応答が改変されるように、対象に本開示の大環状ペプチドを投与することを含む、対象における免疫応答を改変する方法を提供する。好ましくは、応答は増強され、刺激され、または上方制御される。別の点において、大環状ペプチドは、抗カニクイザル、抗マウス、および／または抗ウッドチャック結合性および治療活性を有しうる。
本明細書で用いられる用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことが意図される。非ヒト動物としては、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、ウッドチャック、両生類、および爬虫類などの、全ての脊椎動物が挙げられるが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、およびウマなどの哺乳動物が好ましい。好ましい対象としては、免疫応答の増強を必要とするヒト患者が挙げられる。この方法は特に、Ｔ細胞介在免疫応答を増強することによって治療することができる障害を有する、ヒト患者の治療に適切である。特定の実施態様において、当該方法は特に、インビボでの癌細胞の治療に適切である。免疫の抗原特異性増強を達成するために、大環状ペプチドを対象の抗原と共に投与することができる。ＰＤ−Ｌ１への大環状ペプチドを別の薬剤と共に投与する場合、２つは、順にまたは同時にのいずれかで投与することができる。
本開示はさらに、サンプルおよび対照サンプルを、ヒト、ウッドチャック、カニクイザル、および／またはマウスＰＤ−Ｌ１と特異的に結合する参照大環状ペプチドと、大環状分子と、ヒト、ウッドチャック、カニクイザル、および／またはマウスＰＤ−Ｌ１との複合体形成が可能な条件下で接触させることを含む、サンプル中のヒト、ウッドチャック、カニクイザル、および／またはマウスＰＤ−Ｌ１抗原の存在を検出する方法、またはヒト、ウッドチャック、カニクイザル、および／またはマウスＰＤ−Ｌ１抗原の量を測定する方法を提供する。次いで、複合体形成を検出し、ここで、対照サンプルと比較して、サンプル間での異なる複合体形成は、サンプル中のヒト、ウッドチャック、カニクイザル、および／またはマウスＰＤ−Ｌ１抗原の存在を示す。
ＣＤ２８、ＩＣＯＳおよびＣＴＬＡ−４と比較して、ＰＤ−Ｌ１についての本開示の大環状ペプチドの特異的な結合を考慮すると、本開示の大環状ペプチドは、細胞表面におけるＰＤ−Ｌ１発現を特異的に検出するために使用することができ、さらに、免疫親和性精製によってＰＤ−Ｌ１を精製するために使用することができる。
癌
大環状ペプチドによるＰＤ−１の阻害は、患者における癌細胞に対する免疫応答を向上させることができる。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１についてのリガンドは、通常のヒト細胞において発現されていないが、様々なヒトの癌において豊富に含まれる（Dong et al., Nat. Med., 8:787-789 (2002)）。ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の相互作用によって、腫瘍浸潤リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体介在性増殖の減少、および癌細胞による免疫回避が生じる（Dong et al., J. Mol. Med., 81:281-287 (2003); Blank et al., Cancer Immunol. Immunother., 54:307-314 (2005); Konishi et al., Clin. Cancer Res., 10:5094-5100 (2004)）。免疫抑制は、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への局所的な相互作用を阻害することによって、逆転させることができ、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ２との相互作用も同様に遮断される場合、その効果は付加的である（Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 99:12293-12297 (2002); Brown et al., J. Immunol., 170:1257-1266 (2003)）。以前の研究では、Ｔ細胞増殖は、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への相互作用を阻害することによって、回復することができることが示されていたが、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を阻害することによる、インビボでの癌腫瘍増殖の直接的な効果の報告は存在していなかった。ある局面において、本開示は、癌腫瘍の増殖が阻害されるような、大環状ペプチドを用いたインビボでの対象の治療に関する。大環状ペプチドを単独で使用して、癌腫瘍の増殖が阻害されうる。あるいは、大環状ペプチドは、以下に記載されるように、他の免疫原性剤、標準的な癌治療、または他の大環状ペプチドと組み合わせて用いられうる。
あるいは、ある実施態様において、本開示は、対象に治療上の有効量の大環状ペプチドを投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
増殖が本開示の大環状ペプチドを用いて阻害されうる、好ましい癌としては、一般に免疫療法に応答する癌が挙げられる。治療のための好ましい癌の限定されない例としては、黒色腫（例えば、転移悪性黒色腫）、腎細胞癌（例えば、淡明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン難治性前立腺癌および去勢抵抗性前立腺癌）、乳癌、大腸癌、および肺癌（例えば、扁平上皮および非扁平上皮非小細胞性肺癌）が挙げられる。さらに、本開示は、本開示の大環状ペプチドを用いて、その増殖が阻害されうる、難治性または再発性の悪性腫瘍を含む。
本開示の方法を用いて治療されうる他の癌の例としては、骨腫瘍、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、大腸癌、直腸癌、肛門部癌、胃／胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、頸部癌、膣癌、外陰癌、ホジキン疾患、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄白血病、慢性骨髄白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病などの慢性または急性白血病、小児固形腫瘍、リンパ性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されるものなどの環境誘発性癌、および前記癌の組み合わせが挙げられる。本開示はまた、転移癌、特にＰＤ−Ｌ１を発現する転移癌の治療に有用である（Iwai et al., Int. Immunol., 17:133-144 (2005)）。
適宜、ＰＤ−Ｌ１に対する大環状ペプチドは、癌細胞、精製された腫瘍抗原（組み換えタンパク質、ペプチド、および炭水化物分子など）、細胞、および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子を遺伝子導入した細胞などの、免疫原性剤と組み合わせることができる（He et al., J. Immunol., 173:4919-4928 (2004)）。用いることができる腫瘍ワクチンの限定されない例としては、ｇｐ１００のペプチドなどの黒色腫抗原のペプチド、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼ、またはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝子導入した腫瘍細胞（以下でさらに記載される）が挙げられる。
ヒトにおいて、いくつかの腫瘍は、黒色腫などの免疫原性であることが示されている。ＰＤ−Ｌ１遮断によってＴ細胞活性化の閾値を上げることによって、宿主における腫瘍応答が活性化されることが期待できると予想される。
ＰＤ−Ｌ１遮断は、ワクチン接種プロトコルと組み合わせた場合、最も有効である可能性がある。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験的戦略が考案されている（Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000); Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring: 300-302 (2000); Khayat, D., ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000); Foon, K., ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000)を参照されたい；Restifo, N. et al., Cancer Vaccines, Chapter 61, pp. 3023-3043, in DeVita, V. et al., eds., Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition (1997)もまた参照されたい）。これらの戦略の１つにおいて、ワクチンは自己または異種腫瘍細胞を用いて調製される。これらの細胞ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質転換された場合に、最も有効であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種についての抗原提示の強力な活性化因子であることが示されている（Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3539-3543 (1993)）。
様々な腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義が導かれた（Rosenberg, S.A., Immunity, 10:281-287 (1999)）。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍および腫瘍が発生した細胞において発現される、分化した抗原、例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、およびＴｒｐ−２である。さらに重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主において発見された腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることが示されている。ＰＤ−Ｌ１遮断は、これらのタンパク質に対する免疫応答を生じさせるために、腫瘍において発現する組み換えタンパク質および／またはペプチドのコレクションと組み合わせて用いられる。これらのタンパク質は、免疫系によって、通常自己抗原として見なされるため、これらに対して耐性がある。腫瘍抗原はまた、染色体のテロメアの合成に必要であり、ヒトの癌の８５％より多くにおいて、および限られた数の体細胞組織においてのみ発現する、タンパク質テロメラーゼを含みうる（Kim, N et al., Science, 266:2011-2013 (1994)）。（これらの体細胞組織は、様々な方法によって、免疫攻撃から保護されうる。）腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を変化させる、または２つの無関係の配列（すなわち、フィラデルフィア染色体のｂｃｒ−ａｂｌ）間の融合タンパク質を生じる体細胞突然変異により、癌細胞において発現する「ネオアンチゲン」、またはＢ細胞腫瘍からのイディオタイプでもありうる。
他の腫瘍ワクチンとしては、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）およびカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）などの、ヒトの癌に関連するウイルスからのタンパク質が挙げられうる。ＰＤ−Ｌ１遮断と並行して用いられうる、腫瘍特異的抗原の別の形態は、腫瘍組織そのものから単離した、精製した熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞からのタンパク質のフラグメントを含み、これらのＨＳＰは腫瘍免疫を誘発するために、抗原提示細胞に高効率で送達される（Suot, R. et al., Science, 269:1585-1588 (1995); Tamura, Y. et al., Science, 278:117-120 (1997)）。
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答を予備刺激するために用いることのできる、強力な抗原提示細胞である。ＤＣはエクスビボで生産され、様々なタンパク質およびペプチド抗原、並びに腫瘍細胞抽出物と共に導入されうる（Nestle, F. et al., Nat. Med., 4:328-332 (1998)）。ＤＣはまた、遺伝的手段によって導入されてもよく、これらの腫瘍抗原もまた発現される。ＤＣはまた、免疫付与のため、腫瘍細胞に直接融合される（Kugler, A. et al., Nat. Med., 6:332-336 (2000)）。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫化をＰＤ−Ｌ１遮断と効率的に組み合わせて、さらに強力な抗腫瘍応答を活性化することができる。
ＰＤ−Ｌ１遮断はまた、標準的な癌治療と組み合わせてもよい。ＰＤ−Ｌ１遮断は、化学療法レジメンと効率的に組み合わされうる。これらの例において、投与される化学療法剤の用量を減少させることが可能でありうる（Mokyr, M. et al., Cancer Res., 58:5301-5304 (1998)）。これらの組み合わせの例としては、大環状ぺプチドと、黒色腫の治療のためのダカルバジンとの組み合わせが挙げられる。このような組み合わせの別の例としては、大環状ぺプチドと、黒色腫の治療のためのインターロイキン−２（ＩＬ−２）との組み合わせが挙げられる。ＰＤ−Ｌ１遮断および化学療法の組み合わせ使用の背後にある科学的な根拠は、大半の化学療法化合物の細胞毒性効果によってもたらされる細胞死によって、抗原提示経路における腫瘍抗原の量を増加しうることである。細胞死によるＰＤ−Ｌ１遮断と相乗しうる他の組み合わせ療法は、放射線、外科手術、およびホルモン遮断である。これらのプロトコルのそれぞれは、宿主中で腫瘍抗原源を生じる。血管形成阻害剤はまた、ＰＤ−Ｌ１遮断と組み合わされうる。血管形成の阻害によって、腫瘍抗原を宿主の抗原提示経路に供給しうる、腫瘍細胞死が生じる。
ＰＤ−Ｌ１阻害性大環状ぺプチドはまた、腫瘍細胞に対するＦｃアルファまたはＦｃガンマ受容体発現エフェクター細胞を標的にする二重特異性大環状ぺプチドと組み合わせて用いることができる（例えば、米国特許第５，９２２，８４５号および５，８３７，２４３号を参照されたい）。二重特異性大環状ぺプチドは、２つの別の抗原を標的にするために用いることができる。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）二重特異性大環状ぺプチドは、腫瘍部位にマクロファージを標的化するために用いられている。この標的化は腫瘍特異応答をより効率的に活性化しうる。これらの応答のＴ細胞の武装は、ＰＤ−Ｌ１遮断の使用によって増強されるであろう。あるいは、抗原は、腫瘍抗原および樹状細胞特異的な細胞表面マーカーに結合する二重特異性大環状ぺプチドを使用することによって、ＤＣに直接送達されうる。
腫瘍は、様々なメカニズムによって宿主の免疫監視を回避する。これらのメカニズムの多くは、腫瘍によって発現される、免疫抑制性のタンパク質の不活性化によって克服されうる。これらの例としては、他のＴＧＦ−ベータ（Kehrl, J. et al., J. Exp. Med., 163:1037-1050 (1986)）、ＩＬ−１０（Howard, M. et al., Immunology Today, 13:198-200 (1992)）、およびＦａｓリガンド（Hahne, M. et al., Science, 274:1363-1365 (1996)）の範疇のものが挙げられる。これらの物質のそれぞれに対する大環状ぺプチドは、免疫抑制剤の効果を打ち消し、宿主による腫瘍免疫応答を促進するために、抗ＰＤ−Ｌ１と組み合わせで用いられうる。
宿主の免疫応答を活性化するために用いられ得る他の大環状ペプチドは、ＰＤ−Ｌ１遮断と組み合わせて用いることができる。これらとしては、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞表面上の分子が挙げられる。抗ＣＤ４０大環状ぺプチドは、ヘルパーＴ細胞活性を効果的に置換することができ（Ridge, J. et al., Nature, 393:474-478 (1998)）、ＰＤ１抗体と併用して用いることができる（Ito, N. et al., Immunobiology, 201(5):527-540 (2000)）。ＣＴＬＡ−４（例えば、米国特許第５，８１１，０９７号）、ＯＸ−４０（Weinberg, A. et al., Immunol., 164:2160-2169 (2000)）、４−１ＢＢ（Melero, I. et al., Nat. Med., 3:682-685 (1997)）、およびＩＣＯＳ（Hutloff, A. et al., Nature, 397:262-266 (1999)）などの、Ｔ細胞共刺激分子に対する活性化大環状ぺプチドはまた、Ｔ細胞活性化の程度の上昇をもたらしうる。
骨髄移植は現在、様々な造血系起源の腫瘍の治療に用いられる。移植片対宿主病はこの治療の結果であるが、移植片対腫瘍反応から治療上の便益が得られうる。ＰＤ−Ｌ１遮断は、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を高めるために使用することができる。
腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を得るために、抗原特異性Ｔ細胞のエクスビボ活性化および拡大、並びにこれらの細胞の移植患者への養子細胞移植に関する、いくつかの実験的治療プロトコルもまた存在する（Greenberg, R. et al., Science, 285:546-551 (1999)）。これらの方法は、ＣＭＶなどの感染性薬剤に対する、Ｔ細胞応答を活性化させるためにも用いられうる。大環状ぺプチドの存在下でのエクスビボ活性化は、養子細胞移植されたＴ細胞の発生頻度および活性を増加させることが期待されうる。
感染性疾患
本開示の他の方法は、特定の毒素または病原体に曝された患者を治療するために用いられる。したがって、本開示の別の局面は、対象を感染性疾患について治療するように、本開示の大環状ぺプチドを対象に投与することを含む、対象における感染性疾患の治療方法を提示する。
前記の腫瘍への適用と同様に、ＰＤ−Ｌ１遮断を単体で、またはワクチンとの組み合わせにおけるアジュバントとして、病原体、毒素、および自己抗原に対する免疫応答を刺激するために用いることができる。この治療方法が特に有用でありうる病原体の例としては、現在有効なワクチンが存在しない病原体、または従来のワクチンが完全に有効とはいえない病原体が挙げられる。これらとしては、限定はされないが、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、およびＣ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア（Butler, N.S. et al., Nature Immunology 13, 188-195 (2012); Hafalla, J.C.R., et al. PLOS Pathogens; February 2, 2012)）、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、緑膿菌が挙げられる。ＰＤ−Ｌ１遮断は、感染の過程で変化した抗原を提示するＨＩＶなどの、薬剤によって確立された感染症に対して特に有効である。これらの新規エピトープは、抗ヒトＰＤ−Ｌ１の投与時に異物として認識され、そのためＰＤ−Ｌ１を介した負のシグナルに弱められない強力なＴ細胞応答を引き起こす。
本開示の方法によって治療可能な感染を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例としては、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、またはＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、およびＣＭＶ、エプスタイン・バールウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクチニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、ラブドウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス性脳炎ウイルスが挙げられる。
本開示の方法によって治療可能な感染を引き起こす病原性細菌のいくつかの例としては、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブトウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌およびコノコッキ（conococci）、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ、およびライム病菌が挙げられる。
本開示の方法によって治療可能な感染を引き起こす病原性真菌のいくつかの例としては、カンジタ（アルビカンス、クルセイ、グラブラータ、トロピカリス、など）、クリプトコッカス・ネオファルマンス、アスペルギルス（フミガーツス、ニジェール、など）、ケカビ属（ムコール、アブシジア、リゾプス）、スポロトリックス・シェンキイ、ブラストミセス・デルマチチジス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、コクシジオイデス・イミチスおよびヒストプラズマ・カプスラーツムが挙げられる。
本開示の方法によって治療可能な感染を引き起こす病原性寄生虫のいくつかの例としては、赤痢アメーバ、大腸バランチジウム、ネグレリア・フォーレリ、アカントアメーバ種、ジアルジア、クリプトスポリジウム種、ニューモシスチス・カリニ、３日熱マラリア病原虫、バベシア・ミクロチ、トリパノソーマ・ブルーセイ、トリパノソーマ・クルーズ、リーシュマニア・ドノバン、トキソプラズマ・ゴンディイ、およびニッポストロンジラス・ブラジリエンシスが挙げられる。
前記の方法の全てにおいて、ＰＤ−Ｌ１遮断は、サイトカイン療法（例えば、インターフェロン、ＶＥＧＦ活性またはＶＥＧＦ受容体を標的にする薬剤、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２）、または腫瘍抗原の提示を促進するために用いられる二重特異性抗体療法（例えば、Holliger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993); Poljak, Structure, 2:1121-1123 (1994)を参照されたい）などの、他の免疫療法の形態と組み合わせることができる。
自己免疫反応
大環状ぺプチドは、自己免疫性応答を誘発し、増大させうる。実際に、腫瘍細胞およびペプチドワクチンを用いた抗腫瘍応答の誘導によって、多くの抗腫瘍応答が、抗自己反応（前記のElsas et al.における、抗ＣＴＬＡ−４＋ＧＭ−ＣＳＦ修飾Ｂ１６黒色腫において観察された色素脱失）；Ｔｒｐ−２ワクチン接種マウスにおける色素脱失（Overwijk, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:2982-2987 (1999)）；ＴＲＡＭＰ腫瘍細胞ワクチンによって引き起こされる自己免疫性前立腺炎（前記のHurwitz, A., (2000)）、黒色腫ペプチド抗原ワクチンおよびヒト臨床試験において観測される白斑（Rosenberg, S.A. et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol., 19(1):81-84 (1996)）に関連していることが明らかになった。
そのため、疾患治療のためのこれらの自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に生じさせるためのワクチン接種プロトコルを考案するために、様々な自己タンパク質と組み合わせて抗ＰＤ−Ｌ１遮断を用いることを考えることができる。例えば、アルツハイマー病は、脳におけるアミロイド沈着物中のＡ．ベータ．ペプチドの不適切な蓄積に関連し；アミロイドに対する抗体応答は、これらのアミロイド沈着物を除去することができる（Schenk et al., Nature, 400:173-177 (1999)）。
他の自己タンパク質はまた、アレルギーおよび喘息、並びにリウマチ性関節炎についてのＴＮＦ．アルファの治療のためのＩｇＥなどの標的として用いられうる。最終的に、様々なホルモンに対する抗体応答は、本明細書に開示される大環状分子の使用によって誘導されうる。生殖ホルモンに対する中和抗体応答は、避妊のために用いられうる。特定の腫瘍の増殖に必要な、ホルモンおよび他の可溶性因子に対する中和抗体応答はまた、可能なワクチンの標的として考えられうる。
抗ＰＤ−Ｌ１大環状分子の使用についての前記の類似の方法は、治療上の自己免疫性応答の誘発に用いられ、アルツハイマー病におけるＡ．ベータなどの、アミロイド沈着物、ＴＮＦアルファなどのサイトカイン、およびＩｇＥなどの他の自己抗原の不適切な蓄積を有する患者を治療することができる。
ワクチン
大環状ぺプチドは、抗ＰＤ−１大環状分子を、対象の抗原（例えばワクチン）と共投与することによって、抗原特異的な免疫応答を刺激するために用いられうる。従って、別の局面において、本開示は、対象において抗原に対する免疫応答を増強させるような（ｉ）抗原；および（ｉｉ）抗ＰＤ−１大環状分子を、対象に投与することを含む、対象において抗原に対する免疫応答を増強させる方法を提供する。抗原は、例えば腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、または病原体からの抗原でありうる。そのような抗原の限定されない例としては、前記の腫瘍抗原（または腫瘍ワクチン）、または前記のウイルス、細菌または他の病原体からの抗原などの前記の節で記述されたものが挙げられる。
本開示の組成物（例えば、大環状ぺプチド、多重特異性および二重特異性分子および免疫結合体）のインビボおよびインビトロの適切な投与経路は、当技術分野において周知であり、当業者によって選択することができる。例えば、組成物は注射（例えば、静脈内または皮下）によって投与することができる。用いられる分子の適切な用量は、対象の年齢および体重、並びに組成物の濃度および／または処方に依存するであろう。
前記のように、本開示の大環状ぺプチドは、１つ以上の他の治療剤、例えば細胞毒性剤、放射毒性剤、または免疫抑制剤と共に併用投与されうる。ぺプチドは、（免疫複合体として）薬剤に結合することができ、あるいは、薬剤と別個に投与することができる。後者（別個の投与）の場合、ぺプチドは薬剤の前、後または同時に投与されてもよく、あるいは他の既知の治療、例えば抗癌療法、例えば放射線療法と併用されてもよい。そのような治療剤としては、とりわけ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン ブレオマイシン サルフェート、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジンおよびシクロホスファミド ヒドロキシ尿素などの、それ自体が患者に対して毒性または準毒性であるレベルでのみ有効である抗腫瘍剤などが挙げられる。シスプラチンは４週間に１回、１００ｍｇ／用量として静脈内投与され、アドリアマイシンは２１日に１回、６０−７５ｍｇ／ｍｌで静脈内投与される。本開示の大環状ぺプチドを、化学療法剤と共投与することによって、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性効果をもたらす異なる機構を介して作用する２つの抗癌剤が提供される。そのような共投与によって、薬物に対する耐性の発達、またはぺプチドによって不活性化されうる腫瘍細胞の抗原性の変化による問題を解決することができる。
また、本開示の範囲内には、本開示の組成物（例えば、大環状ぺプチド、二重特異性、または多重特異性分子、または免疫結合体）、および使用説明書を含むキットがある。キットはさらに、少なくとも１つの追加の試薬、または本開示の１つ以上のさらなる大環状ぺプチド（例えば、大環状分子とは異なるＰＤ−Ｌ１抗原のエピトープに結合する、相補的活性を有するヒト抗体）を含みうる。キットは一般に、キットの内容物の意図する使用を示すラベルを含む。用語、ラベルは、キットにおいて、またはキットと共に提供される、またはキットに添付されている、任意の書面または記録を含む。
組み合わせ治療
本開示の大環状ペプチドと、他のＰＤ−Ｌ１アゴニストおよび／または他の免疫調節剤との組み合わせは、過剰増殖性疾患に対する免疫応答の増強に有用である。例えば、これらの分子は、インビトロまたはエクスビボで培養細胞に、または例えばインビボでヒト対象に投与されて、様々な状況において免疫を向上させることができる。そのため、ある局面において、本開示は、対象の免疫応答を調整するように、本開示の大環状ペプチドを対象に投与することを含む、対象における免疫応答を調整する方法を提供する。好ましくは、応答は向上され、刺激され、上方制御される。別の実施態様において、本開示は、本開示の大環状ペプチドおよび治療量以下の用量の他の免疫調整剤を対象に投与することを含む、免疫賦活性治療剤による、過増殖性疾患の治療に関連する有害事象を変化させる方法を提供する。
大環状ペプチドによるＰＤ−Ｌ１の遮断は、患者における癌細胞に対する免疫応答を向上させることができる。本開示の大環状ペプチドを用いて、増殖が阻害されうる癌としては、一般的に免疫療法に応答性の癌が挙げられる。本開示の組み合わせ治療による治療のための癌の代表的な例としては、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎癌、前立腺癌、乳癌、大腸癌、および肺癌が挙げられる。本開示の方法を用いて治療されうる他の癌の例としては、骨腫瘍、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、頸部癌、膣癌、外陰癌、ホジキン疾患、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄白血病、慢性骨髄白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病などの慢性または急性白血病、小児固形腫瘍、リンパ性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されるものなどの環境誘発性癌、および前記癌の組み合わせが挙げられる。本開示はまた、転移癌の治療に有用である。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される少なくとも１つの大環状ペプチドを含む治療剤の組み合わせは、薬学的に許容可能な担体中の単一の組成物として同時に、またはそれぞれの薬剤が順に投与されうる、別個の組成物として同時に投与されうる。例えば、第二免疫調節剤および本開示の大環状ペプチドは、最初に第二免疫調節剤、次に大環状ペプチドを投与する、あるいは最初に大環状ペプチド、次に第二免疫調節剤を投与するなどのように、順次投与することができる。さらに、組み合わせ治療の複数用量が順次投与される場合、順次投与の順は、それぞれの投与時において、逆転または同じ順で保たれてもよく、順次投与は、同時投与、またはそれらの任意の組み合わせと組み合わせてもよい。例えば、最初の第二免疫調節剤および大環状ペプチドの投与は同時であってもよく、第二の投与は、最初に第二免疫調節剤、次に大環状ペプチドの順であってもよく、第三の投与は、最初に大環状ペプチド、次に第二免疫調節剤の順などであってもよい。別の代表的な投与スキームは、最初の投与が最初に大環状ペプチド、次に第二免疫調節剤の順であり、次の投与が同時であってもよい。
適宜、大環状ペプチドおよび第二免疫調節剤の組み合わせはさらに、癌細胞、精製された腫瘍抗原（組み換えタンパク質、ペプチド、および炭水化物分子など）、細胞、および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子を遺伝子導入した細胞などの、免疫原性剤と組み合わせることができる（He et al., J. Immunol., 173:4919-4928 (2004)）。用いることができる腫瘍ワクチンの限定されない例としては、ｇｐ１００のペプチドなどの黒色腫抗原のペプチド、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼ、またはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝子導入した腫瘍細胞（以下でさらに記載される）が挙げられる。
ＰＤ−Ｌ１大環状ペプチドおよび第二免疫調節剤の組み合わせは、さらにワクチン接種プロトコルと組み合わせることができる。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験的戦略が考案されている（Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000); Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring: 300-302 (2000); Khayat, D., ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000); Foon, K., ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000)を参照されたい；Restifo et al., Cancer Vaccines, Chapter 61, pp. 3023-3043, in DeVita et al., eds., Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition (1997)もまた参照されたい）。これらの戦略の１つにおいて、ワクチンを自己または異種腫瘍細胞を用いて調製する。これらの細胞ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質転換された場合に、最も有効であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種についての抗原提示の強力な活性化因子であることが示されている（Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3539-3543 (1993)）。
様々な腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義が導かれた（Rosenberg, Immunity, 10:281-287 (1999)）。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍および腫瘍が発生した細胞において発現される、分化した抗原、例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、およびＴｒｐ−２である。さらに重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主において発見された腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることが示されている。いくつかの実施態様において、ＰＤ−Ｌ１大環状ペプチドと第二免疫調節剤の組み合わせは、これらのタンパク質に対する免疫応答を生じさせるために、腫瘍において発現する組み換えタンパク質および／またはペプチドのコレクションと組み合わせて用いられうる。これらのタンパク質は、免疫系によって、通常自己抗原として見なされるため、これらに対して耐性がある。腫瘍抗原はまた、染色体のテロメアの合成に必要であり、ヒトの癌の８５％より多くにおいて、および限られた数の体細胞組織においてのみ発現する、タンパク質テロメラーゼを含みうる（Kim, et al., Science, 266:2011-2013 (1994)）。（これらの体細胞組織は、様々な方法によって、免疫攻撃から保護されうる。）腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を変化させる、または２つの無関係の配列（すなわち、フィラデルフィア染色体のｂｃｒ−ａｂｌ）間の融合タンパク質を生じる体細胞突然変異により、癌細胞において発現する「ネオアンチゲン」、またはＢ細胞腫瘍からのイディオタイプでもありうる。
他の腫瘍ワクチンとしては、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）およびカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）などの、ヒトの癌に関連するウイルスからのタンパク質が挙げられうる。ＰＤ−Ｌ１大環状ペプチド遮断と並行して用いられうる、腫瘍特異的抗原の別の形態は、腫瘍組織そのものから単離した、精製した熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞からのタンパク質のフラグメントを含み、これらのＨＳＰは腫瘍免疫を誘発するために、抗原提示細胞に高効率で送達される（Suot, et al., Science, 269:1585-1588 (1995); Tamura, et al., Science, 278:117-120 (1997)）。
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答を予備刺激するために用いることのできる、強力な抗原提示細胞である。ＤＣはエクスビボで生産され、様々なタンパク質およびペプチド抗原、並びに腫瘍細胞抽出物と共に導入されうる（Nestle, et al., Nat. Med., 4:328-332 (1998)）。ＤＣはまた、遺伝的手段によって導入されてもよく、これらの腫瘍抗原もまた発現される。ＤＣはまた、免疫付与のため、腫瘍細胞に直接融合される（Kugler, et al., Nat. Med., 6:332-336 (2000)）。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫化を、抗ＰＤ−Ｌ１大環状ペプチドと第二免疫調節剤との組み合わせと、効率的にさらに組み合わせて、さらに強力な抗腫瘍応答を活性化することができる。
抗ＰＤ−Ｌ１大環状ぺプチドとさらなる免疫調節剤との組み合わせは、標準的ながん治療とさらに組み合わせられうる。例えば、大環状ぺプチドと第二免疫調節剤との組み合わせは、化学療法レジメンと効率的に組み合わされうる。これらの例において、大環状ぺプチドと第二免疫調節剤との組み合わせにおいて観察されるように、本開示の組み合わせと共に投与される他の化学療法剤の用量を減少させることが可能でありうる（Mokyr, M. et al., Cancer Res., 58:5301-5304 (1998)）。これらの組み合わせの例としては、黒色腫の治療のためのダカルバジンとのさらなる組み合わせにおける、大環状ペプチドと第二免疫調節剤との組み合わせが挙げられる。別の例としては、黒色腫の治療のためのインターロイキン−２（ＩＬ−２）とのさらなる組み合わせにおける、大環状ペプチドと第二免疫調節剤との組み合わせが挙げられる。ＰＤ−Ｌ１大環状ぺプチドおよび他の免疫調節剤と、化学療法との組み合わせ使用の背後にある科学的な根拠は、大半の化学療法化合物の細胞毒性効果によってもたらされる細胞死によって、抗原提示経路における腫瘍抗原の量の増加が生じるはずであることである。細胞死によって、抗ＰＤ−Ｌ１大環状ぺプチドおよびさらなる免疫調節剤との組み合わせと相乗しうる他の組み合わせ療法は、放射線、外科手術、およびホルモン遮断である。これらのプロトコルのそれぞれは、宿主中で腫瘍抗原源を生じる。血管形成阻害剤はまた、ＰＤ−Ｌ１および第二免疫調節剤の組み合わせと組み合わされうる。血管形成の阻害によって、腫瘍抗原源を宿主の抗原提示経路に供給しうる、腫瘍細胞死が生じる。
ＰＤ−Ｌ１および他の免疫調節剤の組み合わせはまた、主要細胞に対するＦｃアルファまたはＦｃガンマ受容体発現エフェクター細胞を標的にする二重特異性大環状ぺプチドと組み合わせて用いることができる（例えば、米国特許第５，９２２，８４５号および５，８３７，２４３号を参照されたい）。二重特異性大環状ぺプチドは、２つの別の抗原を標的にするために用いることができる。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）二重特異性大環状ぺプチドは、腫瘍部位にマクロファージを標的化するために用いられている。この標的化は、腫瘍特異的応答をより効率的に活性化しうる。これらの応答のＴ細胞の武装は、ＰＤ−Ｌ１遮断および第二免疫調節剤の組み合わせの使用によって増強されるであろう。あるいは、抗原は、腫瘍抗原および樹状細胞特異的な細胞表面マーカーに結合する二重特異性大環状ぺプチドを使用することによって、ＤＣに直接送達されうる。
別の実施例において、大環状ぺプチドと第二免疫調節剤との組み合わせは、リツキサン（登録商標）（リツキシマブ）、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、ベキサール（登録商標）（トシツモマブ）、ゼヴァリン（登録商標）（イブリツモマブ）、キャンパス（登録商標）（アレムツズマブ）、リンフォシド（エプラツズマブ）、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）、およびタルセバ（登録商標）（エルロチニブ）などの、抗腫瘍大環状薬剤との組み合わせで用いることができる。例として、理論に限定されたくないが、抗癌性抗体または毒素に結合した抗癌性抗体による治療によって、第二免疫調節剤の標的またはＰＤ−Ｌ１によって介在される、免疫応答が増強されうる、癌細胞死（例えば、腫瘍細胞）が生じうる。ある例示的な実施態様において、過増殖性疾患（例えば、癌腫瘍）の治療としては、大環状ぺプチドと第二免疫調節との、同時、または順次の組み合わせ、またはそれらの任意の組み合わせにおける、抗癌性抗体が挙げられ、これは宿主による抗腫瘍免疫応答を増強しうる。
腫瘍は、様々なメカニズムによって宿主の免疫監視を回避する。これらのメカニズムの多くは、腫瘍によって発現する、および免疫抑制性のタンパク質の不活性化によって克服されうる。これらの例としては、他のＴＧＦ−ベータ（Kehrl, J. et al., J. Exp. Med., 163:1037-1050 (1986)）、ＩＬ−１０（Howard, M. et al., Immunology Today, 13:198-200 (1992)）、およびＦａｓリガンド（Hahne, M. et al., Science, 274:1363-1365 (1996)）の範疇のものが挙げられる。別の例において、これらの物質のそれぞれに対する抗体は、免疫抑制剤の効果を打ち消し、宿主による抗腫瘍免疫応答を促進させるために、大環状ペプチドおよび他の免疫調節剤とさらに組み合わせられうる。
宿主の免疫応答を活性化するために用いられうる、他の大環状ぺプチドは、本開示の大環状ペプチドとの組み合わせで、さらに用いることができる。これらとしては、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する、樹状細胞表面上の分子が挙げられる。抗ＣＤ４０大環状ぺプチドは、ヘルパーＴ細胞活性を効果的に置換することができ（Ridge, J. et al., Nature, 393:474-478 (1998)）、本開示の大環状ペプチドの単体、または抗ＣＴＬＡ−４の組み合わせとの組み合わせにおいて、用いることができる（Ito, N. et al., Immunobiology, 201(5):527-540 (2000)）。ＯＸ−４０（Weinberg, A. et al., Immunol., 164:2160-2169 (2000)）、４−１ＢＢ（Melero, I. et al., Nat. Med., 3:682-685 (1997)）、およびＩＣＯＳ（Hutloff, A. et al., Nature, 397:262-266 (1999)）などの、Ｔ細胞共刺激分子に対する活性化大環状ぺプチドはまた、Ｔ細胞活性化の程度の上昇をもたらしうる。
骨髄移植は現在、様々な造血系起源の腫瘍の治療に用いられる。移植片対宿主病はこの治療の結果であるが、移植片対腫瘍反応から治療上の便益が得られうる。本開示の大環状ペプチドは、単体で、または他の免疫調節剤との組み合わせで、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を高めるために使用することができる。
腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を得るために、抗原特異性Ｔ細胞のエクスビボ活性化および拡大、並びにこれらの細胞の移植患者への養子細胞移植に関する、いくつかの実験的治療プロトコルもまた存在する（Greenberg, R. et al., Science, 285:546-551 (1999)）。これらの方法は、ＣＭＶなどの感染性薬剤に対する、Ｔ細胞応答を活性化させるためにも用いられうる。本開示の大環状ぺプチドの存在下でのエクスビボ活性化は、単独で、または別の免疫調節剤との組み合わせで、養子細胞移植されたＴ細胞の発生頻度および活性を増加させることが期待されうる。
いくつかの実施態様において、本開示は、本開示の大環状ペプチドを、治療量以下の用量の他の免疫調節剤との組み合わせで対象に投与することを含む、免疫賦活剤を用いた過増殖性疾患の治療に関連する有害事象を変化させる方法を提供する。例えば、本開示の方法は、非吸収性のステロイドを患者に投与することによって、免疫賦活性治療抗体誘発性大腸炎または下痢の発生を軽減する方法を提供する。免疫賦活性治療抗体を受ける任意の患者は、そのような治療に誘発される大腸炎または下痢を発症するリスクがあるため、この患者集団全体が本開示の方法による治療に適している。ステロイドは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療し、ＩＢＤの憎悪を防止するために投与されているが、これらはＩＢＤを有すると診断されていない患者におけるＩＢＤの予防（発生率の低下）のためには用いられていない。ステロイドに関連する重要な副作用は、非吸収性ステロイドであっても、予防的使用を思いとどまらせてきた。
さらなる実施態様において、本開示の大環状ペプチドは、単体で、または他の免疫調節剤との組み合わせのいずれかで、任意の非吸収性ステロイドの使用とさらに組み合わせることができる。本明細書で使用される「非吸収性ステロイド」は、肝臓での代謝後、ステロイドのバイオアベイラビリティが低い、すなわち約２０％未満であるような、広範囲の初回通過代謝を示す糖質コルチコイドである。本開示のある実施態様において、非吸収性ステロイドはブデソニドである。ブデソニドは、局所的に作用する糖質コルチコステロイドであり、これは経口投与後に主に肝臓によって広範囲に代謝される。エントコート（登録商標）ＥＣ（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ）は、回腸および大腸全体への薬物送達を最適化するように開発された、ブデソニドのｐＨおよび時間依存性経口製剤である。エントコート（登録商標）ＥＣは、米国において、回腸および／またはその上の大腸に関する、軽度から中程度のクローン病の治療について承認されている。クローン病の治療のための、エントコート（登録商標）ＥＣの通常の経口用量は、６から９ｍｇ／日である。エントコート（登録商標）ＥＣは、腸において放出され、その後腸粘膜に吸収され保持される。腸粘膜の標的組織を通過すると、エントコート（登録商標）ＥＣは、肝臓のシトクロムＰ４５０系によって、ごくわずかな糖質コルチコイド活性を有する代謝物に、広範囲に代謝される。そのため、バイオアベイラビリティは低い（約１０％）。ブデソニドの低いバイオアベイラビリティによって、それほど広範囲でない初回通過代謝を有する他の糖質コルチコイドと比較して、治療比率が改善される。ブデソニドは、全身に作用するコルチコステロイドよりも視床下部−下垂体抑制が少ないなど、副作用が少なくなる。しかしながら、エントコート（登録商標）ＥＣの慢性投与は、副腎皮質機能亢進症および副腎抑制などの、全身性糖質コルチコイド作用をもたらしうる。Physicians’Desk Reference Supplement、58th Edition、608-610 (2004)を参照されたい。
さらなる実施態様において、ＰＤ−Ｌ１および他の免疫調整剤の組み合わせと、非吸収性ステロイドとの組み合わせはさらに、サリチレートと組み合わせることができる。サリチレートとしては、例えば、スルファサラジン（アザルフィジン（登録商標）, Pharmacia & Upjohn)；オルサラジン（ディペンタム（登録商標）, Pharmacia & UpJohn)；バルサラジド（コラザール（登録商標）, Salix Pharmaceuticals, Inc.)；およびメサラミン（アサコール（登録商標）, Procter & Gamble Pharmaceuticals；ペンタサ（登録商標）, Shire US；カナサ（登録商標）, Axcan Scandipharm, Inc.；ロワサ（登録商標）, Solvay）などの５−ＡＳＡ剤が挙げられる。
用量および製剤
本明細書に記載される、式Ｉの適切なペプチドおよびさらに具体的な大環状ペプチドは、糖尿病および他の関連する疾患を治療するために、化合物単体で、および／または許容可能な単体との組み合わせで、医薬製剤の形態において、患者に投与することができる。糖尿病の治療の分野における当業者は、そのような治療が必要な、ヒトなどの哺乳動物に対する化合物の用量および投与経路を、容易に決定することができる。投与経路としては、限定されないが、経口、口腔内、直腸、経皮、バッカル、鼻腔内、肺、皮下、筋肉内、皮内、舌下、結腸内、眼内、静脈内、または腸投与が挙げられる。化合物は、許容可能な薬務に基づいて、投与経路に従って製剤化される（Fingl et al., in The Pharmacological Basis of Therapeutics, Chapter 1, p. 1 (1975); Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)）。
本明細書に記載される、薬学的に許容可能なペプチド組成物は、錠剤、カプセル（それぞれ、除放性または時限放出性製剤を含む）、丸剤、散剤、顆粒、エリキシル、インサイチュゲル、マイクロスフェア、結晶複合体、リポソーム、マイクロエマルジョン、チンキ、懸濁液、シロップ、エアロゾルスプレー、およびエマルジョンなどの、多くの剤形において投与することができる。本明細書に記載される組成物はまた、全て薬学分野における当業者に周知の剤形を用いて、経口、静脈内（ボーラスまたは点滴）、腹腔内、皮下、経皮、または筋肉内の形態において投与することができる。組成物は単体で投与されてもよいが、一般に、選択された投与経路および標準的な薬務に基づいて選択された医薬担体と共に投与される。
本明細書に記載の組成物についての投与レジメンは、当然のことながら、特定の試薬、および投与形態および投与経路の薬力学的特性；受容者の種、年齢、性別、健康、健康状態、および体重；症状の性質および程度；併用療法の種類；治療の頻度；投与経路、患者の腎臓および肝臓の機能、並びに目的の効果などの既知の因子に応じて変化する。医師または獣医師は、疾患状態を予防し、対抗し、または進行を停止させるのに必要な薬物の有効量を決定し、処方することができる。
一般的なガイダンスとして、所定の効果について使用される場合、活性成分の毎日の経口用量は、約０．００１から１０００ｍｇ／体重ｋｇの間、好ましくは約０．０１から１００ｍｇ／体重ｋｇ／日の間、および最も好ましくは約０．６から２０ｍｇ／ｋｇ／日の間の範囲である。静脈内では、所定の効果について使用される場合、活性成分の毎日の用量は、一定速度の点滴の間、０．００１ｎｇから１００．０ｎｇ／分／体重ｋｇの間である。そのような一定の静脈内点滴は、好ましくは、０．０１ｎｇから５０ｎｇ／分／体重ｋｇ、および最も好ましくは０．０１ｎｇから１０．０ｍｇ／分／体重ｋｇの速度で投与することができる。本明細書に記載される組成物は、単回一日用量で投与されてもよく、あるいは、１日用量の総量は、１日２回、３回、または４回の分割用量で投与されてもよい。本明細書に記載される組成物はまた、必要に応じて、数日／数週間／数ヶ月の期間にわたって、薬物の持続放出を可能にするデポー製剤によって投与されてもよい。
本明細書に記載される組成物は、適切な鼻腔内ビヒクルの局所的使用を介した鼻腔内形態において、または経皮皮膚パッチを用いた経皮経路によって、投与することができる。経皮送達システムの形態において投与される場合、当然のことながら、用量投与は、用量レジメンにわたって、間欠的ではなく連続的である。
組成物は一般に、意図される投与形態、すなわち経口錠剤、カプセル、エリキシル、噴射剤を含む、または含まないエアロゾルスプレー、およびシロップに関して適切に選択され、従来の薬務と一致する、適切な薬学的な希釈剤、賦形剤、または担体（合わせて、本明細書において薬学的担体と称する）との混合物において投与される。
例えば、錠剤またはカプセルの形態における経口投与について、活性な薬学的成分は、限定されないが、ラクトース、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、およびソルビトールなどの、経口、非毒性、薬学的に許容可能な不活性担体と組み合わせることができ；液体形態における経口投与について、経口薬物成分は、限定されないが、エタノール、グリセロール、および水などの任意の経口、非毒性、薬学的に許容可能な不活性担体と組み合わせることができる。さらに、望ましい場合または必要な場合、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、および着色剤はまた、混合物に組み込むことができる。適切な結合剤としては、限定されないが、デンプン、ゼラチン、限定されないが、グルコースまたはベータ−ラクトース、コーン甘味剤などの天然糖、アカシア、トラガカント、またはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、および蝋などの天然および合成ゴムが挙げられる。これらの剤形において用いられる滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、および塩化ナトリウムが挙げられる。崩壊剤としては、限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、およびキサンタンガムが挙げられる。
本明細書に記載される組成物はまた、小さな単一ラメラ小胞、大きな単一ラメラ小胞、および多層ラメラ小胞などの、ミセルまたはリポソーム送達システムの混合された形態において投与されうる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンなどの様々なリン脂質から形成することができる。薬物吸収を高めるために、浸透促進剤を加えてもよい。
プロドラッグは、医薬品の多くの望ましい品質（すなわち、溶解度、バイオアベイラビリティ、製造など）を向上されることが知られているため、本明細書に記載される化合物は、プロドラッグの形態において送達されうる。そのため、本明細書に記載される主題は、本明細書において請求される化合物のプロドラッグ、それを送達する方法、およびそれを含む組成物を含むことが意図される。
本明細書において記載される組成物はまた、標的可能な薬物担体としての可溶性ポリマーと組み合わせられうる。そのようなポリマーとしては、ポリビニル−ピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル基で置換されたポリエチレンオキシド−ポリリシンが挙げられる。さらに、本明細書に記載される組成物は、薬物の制御放出を達成するのに有用な、生分解性ポリマーの種類、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳とポリグリコール酸との共重合体、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアシレート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロック共重合体と組み合わせられうる。
投与に適切な剤形（医薬組成物）は、単位剤形あたり、約０．０１ミリグラムから約５００ミリグラムの活性成分を含みうる。これらの医薬組成物において、活性成分は通常、組成物の総重量に基づいて、約０．５−９５重量％の分量で存在する。
ゼラチンカプセルは、活性成分、並びにラクトース、デンプン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、およびステアリン酸などの粉末担体を含みうる。同様の希釈剤を用いて、圧縮錠剤を製造することができる。錠剤およびカプセルの両方は、除放性製品として製造され、数時間にわたる薬物の継続的な放出を提供することができる。圧縮製剤は、不快な味を隠し、錠剤を大気から保護するために、糖コーティングまたはフィルムコーティングされうるか、あるいは消化管における選択的な崩壊のために腸溶性コーティングされうる。
経口投与のための液体剤形は、患者の許容性を高めるために、着色剤および香料を含むことができる。
一般的に、水、適切な油、食塩水、デキストロース（グルコース）水溶液、および関連する糖溶液、およびプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールは、非経口溶液のための適切な担体である。非経口投与のための溶液は、好ましくは、活性成分の水溶性の塩、適切な安定化剤、および必要に応じて、緩衝物質を含む。亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、またはアスコルビン酸などの抗酸化剤は、単体または組み合わせのいずれかで、適切な安定化剤である。また、クエン酸およびその塩、およびＥＤＴＡナトリウムが用いられる。さらに、非経口溶液は、塩化ベンザルコニウム、メチル−またはプロピル−パラベン、およびクロロブタノールなどの防腐剤を含むことができる。
適切な薬学的な単体は、本分野における標準的な参照テキストである、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Edition, Mack Publishing Company (1995)において記載される。
本明細書に記載される化合物の投与のための、代表的な有用な薬学的な剤形は、以下に例示することができる：
カプセル
標準的な２ピースの硬ゼラチンカプセルに、１００ミリグラムの粉末活性成分、１５０ミリグラムのラクトース、５０ミリグラムのセルロース、およびお６ミリグラムのステアリン酸マグネシウムを充填することによって、多数の単位カプセルを製造することができる。
軟ゼラチンカプセル
ダイズ油、綿実油、またはオリーブ油などの可消化油中の活性成分の混合物を調製し、容積式ポンプを用いてゼラチンに注入して、１００ミリグラムの活性成分を含む軟ゼラチンカプセルを形成することができる。カプセルは洗浄し、乾燥するべきである。
錠剤
錠剤は、剤形が、例えば、１００ミリグラムの活性成分、０．２ミリグラムのコロイド状二酸化ケイ素、５ミリグラムのステアリン酸マグネシウム、２７５ミリグラムの微結晶セルロース、１１ミリグラムのデンプン、および９８．８ミリグラムのラクトースであるように、従来の方法によって製造されうる。嗜好性を向上させるため、または吸収を遅延させるために、適切なコーティングが適用されうる。
注入可能
本明細書に記載されるペプチド組成物の注入可能な製剤は、規制機関によって承認されているものなどの賦形剤の使用を必要とする場合、または必要としない場合がある。これらの賦形剤としては、限定されないが、溶媒および共溶媒、可溶化剤、乳化剤、または濃化剤、キレート剤、抗酸化剤、および還元剤、抗菌防腐剤、緩衝剤、およびｐＨ調整剤、、充填剤、保護剤、および張性調節剤、および特別な添加物が挙げられる。注入可能な製剤は、無菌で、発熱物質を含まず、溶液の場合、粒子状物質を含まない必要がある。
注射による投与に適した非経口組成物は、例えば、共溶媒または他の賦形剤を含んでもよく、含まなくてもよい、薬学的に許容可能な緩衝液中で、例えば、１．５重量％の活性成分を攪拌することによって製造されうる。溶液は、塩化ナトリウムで等張にし、滅菌される必要がある。
懸濁液
水性懸濁液は、例えば、各５ｍＬが、１００ｍｇの細かく分割された活性成分、２０ｍｇのナトリウムカルボキシメチルセルロース、５ｍｇの安息香酸ナトリウム、１．０ｇのソルビトール溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および０．０２５ｍＬのバニリン、または他の口当たりの良い香料を含むように、経口および／または非経口投与のために製造することができる。
生分解性微粒子
注射による投与に適切な、除放性の非経口組成物は、例えば、適切な生分解性ポリマーを溶媒に溶解させ、ポリマー溶液に活性成分を添加して合わせて、マトリックスから溶媒を除去し、それによってマトリックス全体に分散した活性成分を有するポリマーのマトリクスを形成することによって製造されうる。
ペプチド合成
本明細書に開示される記載は、化学結合の法則および原理に適合して解釈されるべきである。本開示に包含される化合物は、医薬品としての使用に適切に安定なものであることが理解されるべきである。当業者は、化学結合および安定性の一般原理に基づいて、どの化合物が安定であるか、または安定でないかを知るであろう。
本開示の大環状ペプチドの化学合成は、段階的固相合成、立体構造的に補助されたペプチド断片の再連結による半合成、クローン化または合成ペプチド断片の酵素的連結、および化学的連結などの、当技術分野において認識されている様々な方法を用いて実施することができる。本明細書に記載される大環状ペプチドおよびその類似体の合成に好ましい方法は、Chan, W.C. et al., eds., Fmoc Solid Phase Synthesis, Oxford University Press, Oxford (2000); Barany, G. et al., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 2: 「Special Methods in Peptide Synthesis, Part A」, pp. 3-284, Gross, E. et al., eds., Academic Press, New York (1980); および Stewart, J.M. et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)に記載されるものなどの、様々な固相技術を用いた化学合成である。好ましい戦略は、α−アミノ基の一時的な保護のためのＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチル メチル−オキシカルボニル）基と、アミノ酸側鎖の一時的な保護のためのｔｅｒｔ−ブチル基との組み合わせに基づく（例えば、Atherton, E. et al., 「The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group」, in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 9: 「Special Methods in Peptide Synthesis, Part C」, pp. 1-38, Undenfriend, S. et al., eds., Academic Press, San Diego (1987)を参照されたい）。
ペプチドは、ペプチドのＣ末端から開始する不溶性ポリマー担体（「樹脂」とも称される）上で、段階的に合成することができる。アミドまたはエステル結合の形成によって、ペプチドのＣ末端アミノ酸を樹脂に付加することによって、合成が開始される。これにより、生じたペプチドは、それぞれＣ末端アミドまたはカルボン酸として、最終的に解離される。
Ｃ末端アミノ酸および合成において用いられる全ての他のアミノ酸は、α−アミノ保護基が合成中に選択的に除去されうるように、α−アミノ基および側鎖官能基（存在する場合）を区別して保護することが必要である。アミノ酸のカップリングは、活性エステルとしてのカルボキシル基の活性化、およびそれを、樹脂に付加されたＮ末端アミノ酸の保護されていないα−アミノ酸と反応させることによって行われる。α−アミノ基の脱保護とカップリングの手順は、全体のペプチド配列が組み立てられるまで繰り返される。次いで、ペプチドは、通常は副反応を制限するための適切なスカベンジャーの存在下で、側鎖の官能基の脱保護を伴って、樹脂から解離される。得られたペプチドを最終的に逆相ＨＰＬＣで精製する。
最終的なペプチドの前駆体として必要なペプチジル樹脂の合成は、市販の架橋ポリスチレンポリマー樹脂を利用する（Novabiochem, San Diego, CA; Applied Biosystems, Foster City, CA）。Ｃ末端カルボキサミドについて、好ましい固相担体は：４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシアセチル−ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂）；９−Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ−メリフィールド樹脂（シーバーアミド樹脂）；４−（９−Ｆｍｏｃ）アミノメチル−３，５−ジメトキシフェノキシ）バレリル−アミノメチル−メリフィールド樹脂（ＰＡＬ樹脂）である。最初およびその後のアミノ酸のカップリングは、それぞれ、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰから、またはＤＩＣ／６−Ｃｌ−ＨＯＢｔ、ＨＣＴＵ、ＤＩＣ／ＨＯＡｔもしくはＨＡＴＵから生成した、ＨＯＢｔ、６−Ｃｌ−ＨＯＢｔまたはＨＯＡｔ活性化エステルを用いて行うことができる。好ましい固相担体は、保護されたペプチド断片のための、２−クロロトリチルクロライド樹脂および９−Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ−メリフィールド樹脂（シーバーアミド樹脂）である。最初のアミノ酸を、２−クロロトリチルクロライド樹脂にロードするのには、ジクロロメタンおよびＤＩＥＡ中で、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を樹脂と反応させることによって最も良く達成される。必要に応じて、少量のＤＭＦを加えて、アミノ酸の溶解を促進することができる。
本明細書に記載されるペプチド類似体の合成は、ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ超音波合成器、または Protein Technologies, Inc. プレリュード（６チャンネル）またはシンフォニー（１２チャンネル）合成器などの、単一または複数チャンネルのペプチド合成器を用いて行うことができる。
これらのそれぞれのペプチドのペプチジル樹脂前駆体は、任意の標準的な手順を用いて、切り出しおよび脱保護されうる（例えば、King, D.S. et al., Int. J. Peptide Protein Res., 36:255-266 (1990)を参照されたい）。望ましい方法は、水およびスカベンジャーとしてのＴＩＳの存在下で、ＴＦＡを用いることである。一般に、ペプチジル樹脂は、室温で２〜６時間にわたり、ＴＦＡ／水／ＴＩＳ（９４：３：３、ｖ：ｖ：ｖ；１ｍＬ／１００ｍｇのペプチジル樹脂）中で攪拌される。次いで、使用した樹脂を濾別し、ＴＦＡ溶液を濃縮するか、真空で乾燥させた。得られた粗製ペプチドは、Ｅｔ２Ｏで沈殿させ洗浄するか、あるいは、分取ＨＰＬＣによる精製のために、ＤＭＳＯまたは５０％酢酸水溶液中に直接再溶解させる。
所定の純度を有するペプチドは、例えば、Ｗａｔｅｒｓモデル４０００またはＳｈｉｍａｄｚｕモデルＬＣ−８Ａ液体クロマトグラフにおいて、分取ＨＰＬＣを用いた精製によって、得ることができる。粗製ペプチドの溶液をＹＭＣ Ｓ５ ＯＤＳ（２０Ｘ１００ｍｍ）カラムに注入し、流速１４−２０ｍＬ／分を用いて、いずれも０．１％ＴＦＡで緩衝させた、ＭｅＣＮ／水の直線的勾配によって溶出し、溶出液を２２０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって追跡する。精製されたペプチドの構造は、エレクトロスプレーＭＳ分析で確認することができる。
本開示、特に例示的なスキームおよびその後の実施例などにおいて用いられる略語は、当業者に周知である。用いられる略語のいくつかは、以下の通りである：ＨＯＢｔは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＨＯＡｔは１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール；ＤＩＣはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド；ＨＢＴＵはＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート；ＢＯＰはベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート；ＰｙＢＯＰは（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート）；ＨＣＴＵはＯ−（６−Ｃｌ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；ＨＡＴＵは（１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム ３−オキシド ヘキサフルオロホスフェート）；Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニル；ＤＩＥＡまたはＤＩＰＥＡはジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＴＦＡはトリフルオロ酢酸；ＴＩＳはトリイソプロピルシラン；Ｅｔ２Ｏはジエチルエーテル；ＤＭＳＯはジメチルスルホキシド；ＤＣＭは１，１−ジクロロメタン；ＮＭＭはＮ−メチルモルホリン；ＮＭＰはＮ−メチルピロリドン；Ａｃはアセチル；ｍｉｎおよびｍｉｎｓは分；ｈおよびｈｒおよびｈｒｓは時間；ＲＴは保持時間または室温（文脈により決定される）；ＡＣＮまたはＭｅＣＮはアセトニトリル；ＴＥＳはトリエチルシラン；ｐＴｓＯＨはパラ−トリルスルホン酸；ＤＥＭはジエトキシメタン；ＤＣＥはジクロロエタン；およびＥｔはエチル。
分析データ：
マススペクトロメトリー：「ＥＳＩ−ＭＳ（＋）」は、陽イオンモードで行われるエレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリーを表す；「ＥＳＩ−ＭＳ（−）」は、陰イオンモードで行われるエレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリーを表す；「ＥＳＩ−ＨＲＭＳ（＋）」は、陽イオンモードで行われる、高分解能エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリーを表す；「ＥＳＩ−ＨＲＭＳ（−）」は、陰イオンモードで行われる、高分解能エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリーを表す。検出された分子量は、「ｍ／ｚ」単位表示に従って報告される。１０００より大きい精密質量を有する化合物はしばしば、２価または３価イオンとして検出された。
分析データ：
マススペクトロメトリー：「ＥＳＩ−ＭＳ（＋）」は、陽イオンモードで行われるエレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリーを表す；「ＥＳＩ−ＭＳ（−）」は、陰イオンモードで行われるエレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリーを表す；「ＥＳＩ−ＨＲＭＳ（＋）」は、陽イオンモードで行われる、高分解能エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリーを表す；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ（−）」は、陰イオンモードで行われる、高分解能エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリーを表す。検出された分子量は、「ｍ／ｚ」単位表示に従って報告される。１０００より大きい精密質量を有する化合物はしばしば、２価または３価イオンとして検出された。
分析ＬＣＭＳ条件Ａ：
カラム：ＢＥＨ Ｃ１８、２．１ｘ５０ｍｍ、１．７μｍ粒子；移動相Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む水；移動相Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリル；温度：５０℃；勾配：２分にわたり、２％Ｂから９８％Ｂ、次いで９８％Ｂで０．５分間保持；流速：０．８ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍにおけるＵＶ。
分析ＬＣＭＳ条件Ｂ：
カラム：ＢＥＨ Ｃ１８、２．１ｘ５０ｍｍ、１．７μｍ粒子；移動相Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含む、９５：５ アセトニトリル：水；温度：５０℃；勾配：３分にわたり、０−１００％Ｂ、次いで０．７５分間、１００％Ｂで保持；流速：１．１１ｍＬ／分。
分析ＬＣＭＳ条件Ｃ：
カラム：ＢＥＨ Ｃ１８、２．１ｘ５０ｍｍ、１．７μｍ粒子；移動相Ａ：０．２％ギ酸および０．０１％ＴＦＡを含む、水；移動相Ｂ：０．２％ギ酸および０．０１％ＴＦＡを含む、アセトニトリル；温度：５０℃；勾配：２分にわたり、２％Ｂから８０％Ｂ、０．１分にわたり、８０％Ｂから９８％Ｂ、次いで９８％Ｂで０．５分間保持；流速：０．８ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍにおけるＵＶ。
分析ＬＣＭＳ条件Ｄ：
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８、２．１ｘ５０ｍｍ、１．７μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む、９５：５ アセトニトリル：水；温度：５０℃；勾配：３分にわたり、０−１００％Ｂ、次いで０．７５分間、１００％Ｂで保持；流速：１．１１ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍにおけるＵＶ。
分析ＬＣＭＳ条件Ｅ：
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８、２．１ｘ５０ｍｍ、１．７μｍ粒子；移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、９５：５ アセトニトリル：水；温度：５０℃；勾配：３分にわたり、０−１００％Ｂ、次いで０．７５分間、１００％Ｂで保持；流速：１．１１ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍにおけるＵＶ。
分析ＬＣＭＳ条件Ｆ：
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８、２．１ｘ５０ｍｍ；移動相Ａ：１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む、９５：５ アセトニトリル：水；温度：３５℃；勾配：４分にわたり、０−１００％Ｂ、次いで１分間、１００％Ｂで保持；流速：４ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍにおけるＵＶ。
分析ＬＣＭＳ条件Ｇ：
Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱ マススペクトロメーター；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４、１ｘ５０ｍｍ；移動相Ａ：水中の１％ギ酸；移動相Ｂ：アセトニトリル中の０．１％ギ酸；温度：３０℃；勾配：１％Ｂ、１分間保持；３分にわたり、１−９５％Ｂ、次いで３分間、９５％Ｂで保持；流速：０．１５ｍＬ／分。
分析ＨＰＬＣ条件Ａ：
カラム：ＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ ３ｕｍ １５０ｘ４．６ｍｍ 移動相Ａ：０．１％ＴＦＡを含む、水；移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡを含む、アセトニトリル；温度：６０℃；勾配：２５分にわたり、３５％Ｂから８０％Ｂ；流速：１ｍＬ／分；検出：２１７ｎｍにおけるＵＶ。
分析ＨＰＬＣ条件Ｂ：
カラム：ＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ ３ｕｍ １５０ｘ４．６ｍｍ 移動相Ａ：０．１％ＴＦＡを含む、水；移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡを含む、アセトニトリル；温度：６０℃；勾配：２５分にわたり、２５％Ｂから７５％Ｂ；流速：１ｍＬ／分；検出：２１７ｎｍにおけるＵＶ。
分析ＨＰＬＣ条件Ｃ：
カラム：ＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ ３ｕｍ １５０ｘ４．６ｍｍ 移動相Ａ：０．１％ＴＦＡを含む、水；移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡを含む、アセトニトリル；温度：６０℃；勾配：２５分にわたり、２０％Ｂから７０％Ｂ；流速：１ｍＬ／分；検出：２１７ｎｍにおけるＵＶ。
分析ＨＰＬＣ条件Ｄ：
カラム：ＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ ３ｕｍ １５０ｘ４．６ｍｍ 移動相Ａ：０．１％ＴＦＡを含む、水；移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡを含む、アセトニトリル；温度：６０℃；勾配：２５分にわたり、１５％Ｂから６５％Ｂ；流速：１ｍＬ／分；検出：２１７ｎｍにおけるＵＶ。
分析ＨＰＬＣ条件Ｅ：
カラム：ＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ ３ｕｍ １５０ｘ４．６ｍｍ 移動相Ａ：０．１％ＴＦＡを含む、水；移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡを含む、アセトニトリル；温度：６０℃；勾配：２０分にわたり、２５％Ｂから６０％Ｂ；流速：１．２５ｍＬ／分；検出：２１７ｎｍにおけるＵＶ。
分析ＨＰＬＣ条件Ｆ：
カラム：ＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ ３ｕｍ １５０ｘ４．６ｍｍ 移動相Ａ：０．１％ＴＦＡを含む、水；移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡを含む、アセトニトリル；温度：６０℃；勾配：２０分にわたり、２５％Ｂから６５％Ｂ；流速：１．２５ｍＬ／分；検出：２１７ｎｍにおけるＵＶ。
分析ＨＰＬＣ条件Ｇ：
カラム：Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３．５ｕｍ、３．０ｘ１５０ｍｍ；移動相Ａ：０．０５％トリフルオロ酢酸を含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：０．０５％トリフルオロ酢酸を含む、９５：５ アセトニトリル：水；温度：５０℃；勾配：１２分にわたり、１０−１００％Ｂ、次いで３分間、１００％Ｂで保持；流速：１ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍにおけるＵＶ。
分析ＨＰＬＣ条件Ｈ：
カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ フェニル ３．５ｘ１５０ｕｍ、移動相Ａ：０．０５％トリフルオロ酢酸を含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：０．０５％トリフルオロ酢酸を含む、９５：５ アセトニトリル：水；温度：５０℃；勾配：１２分にわたり、１０−１００％Ｂ、次いで３分間、１００％Ｂで保持；流速：１ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍにおけるＵＶ。
分析ＨＰＬＣ条件Ｉ：
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５ｕ Ｃ１８（２） １５０ｘ４．６ｍｍ；移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、水、移動相Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、アセトニトリル、勾配：２０分にわたり、５−１００％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：１ｍＬ／分、検出：２２０におけるＵＶ
分析ＨＰＬＣ条件Ｊ：
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５ｕ Ｃ１８（２） １５０ｘ４．６ｍｍ；移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、水、移動相Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、アセトニトリル、勾配：２０分にわたり、１０−１００％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：１ｍＬ／分、検出：２２０におけるＵＶ
分析ＨＰＬＣ条件Ｋ：
カラム−Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃ１８ ５０Ｘ２．１ｍｍ−２．７μｍ；移動相Ａ：水中の０．１％ＨＣＯＯＨ、移動相Ｂ：アセトニトリル、勾配：１．７分にわたり、０−１００％Ｂ、次いで１．５５分間、１００％Ｂで保持；流速：１ｍＬ／分、検出：２５４におけるＵＶ
一般的な方法：
プレリュード方法Ａ：
全ての操作は、プレリュードペプチド合成器（Protein Technologies）における自動化のもとで行った。特に記載されない限り、全ての操作は、下部フリットが取り付けられた、１０または４５ｍＬポリプロピレンチューブにおいて行った。チューブは、チューブの下部および上部の両方を介して、プレリュードペプチド合成器と結合する。ＤＭＦおよびＤＣＭを、チューブの上部を介して加えることができ、これによってチューブの両側が均等に洗い流される。残りの試薬は、チューブの下部から加えられ、フリットを通過して樹脂と接触する。全ての溶液をチューブの下部から除去する。「周期的攪拌」は、下部フリットを介した、Ｎ２ガスの短いパルスを表し；このパルスは約５秒間継続し、３０秒ごとに生じる。アミノ酸溶液は一般に、準備から３週間を超えて使用しなかった。ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＤＩＣ＝Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド；ＨＯＡｔ＝１−ヒドロキシ ７−アザベンゾトリアゾール；シーバー（シーバー）＝Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ、ここで、「３−イルオキシ」はポリスチレン樹脂の位置および結合の種類を表す。用いられる樹脂は、シーバーリンカー（窒素においてＦｍｏｃ保護）を有する、メリフィールドポリマー（ポリスチレン）である；１００−２００メッシュ、１％ＤＶＢ、０．７１ｍｍｏｌ／ｇロード。用いられる一般的なアミノ酸は、括弧内に示される側鎖保護基と共に、以下に列挙される。
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｂｚｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ。
「プレリュード方法Ａ」の手順は、０．１００ｍｍｏｌスケールで行われた実験をいい、ここで、スケールは樹脂に結合したシーバーリンカーの量によって決定される。このスケールは、前記のシーバー−メリフィールド樹脂の約１４０ｍｇに相当する。全ての手順は、スケールの倍数で、記載された体積を調整することによって、０．１００ｍｍｏｌスケールを超えて拡大することができる。アミノ酸カップリングの前に、全てのペプチド合成手順は、以下で「樹脂膨潤手順」と記載される、樹脂膨潤手順から開始した。アミノ酸を、一級アミンＮ末端にカップリングするには、以下に記載される「シングルカップリング手順」を用いた。Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチルアミノ酸のカップリング、および二級アミンＮ末端へのカップリングには、以下に記載される「二級アミンカップリング手順」を用いた。ペプチドのＮ末端へのクロロアセチル基のカップリングは、以下に記載される「クロロアセチル クロライドカップリング手順」または「クロロ酢酸カップリング手順」によって説明される。
樹脂膨潤手順：
４０ｍＬポリプロピレン固相反応容器に、メリフィールド：シーバー樹脂（１４０ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を加えた。樹脂を以下のように３回洗浄した：反応容器にＤＭＦ（５．０ｍＬ）およびＤＣＭ（５．０ｍＬ）を加え、その後混合物を、反応容器の底からのＮ２バブリングによって周期的に１０分間攪拌し、その後溶媒を排出した。
シングルカップリング手順：
前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。反応容器にピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を、以下のように連続して５回洗浄した；それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を６０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器にアミノ酸およびＨＯＡｔ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、５．０ｍＬ、１０当量）の溶液を加え、次いでＤＩＣ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、５．０ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を６０分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように、連続して４回洗浄した；それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、酢酸無水物：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ（１０：１：８９ ｖ／ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を１０分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
二級アミンカップリング方法；
前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間、周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。反応容器にピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して５回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を６０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器にアミノ酸およびＨＯＡｔ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、５．０ｍＬ、５当量）の溶液、次いでＤＩＣ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、５．０ｍＬ、５当量）を加えた。混合物を３００分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した： それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に酢酸無水物：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ（１０：１：８９ ｖ／ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を１０分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
クロロアセチルクロライドカップリング手順：
前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。反応容器にピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して５回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、ＤＩＰＥＡ（４．０ｍｍｏｌ、０．６９９ｍＬ、４０当量）、およびクロロアセチルクロライド（２．０ｍｍｏｌ、０．１６０ｍＬ、２０当量）のＤＭＦ中の溶液を３．０ｍＬ加えた。混合物を１２から１８時間周期的に攪拌し、次いで溶液を排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液を排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＣＭ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液を排出した。
プレリュード方法Ｂ：
全ての操作はプレリュードペプチド合成器（Protein Technologies）において自動化のもとで行った。全ての手順は、下部フリットが取り付けられた、１０または４５ｍＬポリプロピレンチューブにおいて行った。ＤＭＦおよびＤＣＭは、チューブの上部を介して加えることができ、これによってチューブの両側が均等に洗い流される。残りの試薬は、チューブの下部から加えられ、フリットを通過して樹脂と接触する。全ての溶液をチューブの下部から除去する。「周期的攪拌」は、下部フリットを介した、Ｎ２ガスの短いパルスを表し；このパルスは約５秒間継続し、３０秒ごとに生じる。アミノ酸溶液は一般に、準備から３週間を超えて使用しなかった。ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＨＣＴＵ＝２−（６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム；ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン；シーバー＝Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ、ここで、「３−イルオキシ」はポリスチレン樹脂の位置および結合の種類を表す。用いた樹脂は、シーバーリンカー（窒素においてＦｍｏｃ保護）を有するメリフィールドポリマー（ポリスチレン）である；１００−２００メッシュ、１％ＤＶＢ、０．７１ｍｍｏｌ／ｇロード。用いられる一般的なアミノ酸は、括弧内に示される側鎖保護基と共に、以下に列挙される：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｂｚｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ。
「プレリュード方法Ｂ」の手順は、０．１００ｍｍｏｌスケールで行われた実験をいい、ここで、スケールは樹脂に結合したシーバーリンカーの量によって決定される。このスケールは、前記のシーバー−メリフィールド樹脂の約１４０ｍｇに相当する。全ての手順は、スケールの倍数で、記載された体積を調整することによって、０．１００ｍｍｏｌスケールを超えて拡大することができる。アミノ酸カップリングの前に、全てのペプチド合成手順は、以下で「樹脂膨潤手順」と記載される、樹脂膨潤手順から開始した。アミノ酸を、一級アミンＮ末端にカップリングするには、以下に記載される「シングルカップリング手順」を用いた。二級アミンＮ末端へのアミノ酸のカップリングには、以下に記載される「二級アミンカップリング」を用いた。ペプチドのＮ末端へのクロロアセチル基のカップリングは、以下に記載される「クロロアセチル クロライドカップリング手順」または「クロロ酢酸カップリング手順」によって説明される。
樹脂膨潤手順：
４０ｍＬポリプロピレン固相反応容器に、メリフィールド：シーバー樹脂（１４０ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を加えた。樹脂を以下のように３回洗浄（膨潤）した：反応容器に、ＤＭＦ（５．０ｍＬ）およびＤＣＭ（５．０ｍＬ）を加え、その後混合物を、反応容器の下部からのＮ２バブリングによって１０分間周期的に攪拌し、その後溶媒をフリットから排出した。
シングルカップリング手順：
前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。反応容器にピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して５回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を６０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器にアミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、５．０ｍＬ、１０当量）、次いでＨＣＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、５．０ｍＬ、１０当量）、最後にＤＩＰＥＡ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、２．５ｍＬ、２０当量）を加えた。混合物を３０分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、酢酸無水物：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ（１０：１：８９ ｖ／ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を１０分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
ダブルカップリング手順：
前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して５回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え得られた混合物を６０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、５．０ｍＬ、１０当量）、次いでＨＣＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、５．０ｍＬ、１０当量）、最後にＤＩＰＥＡ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、２．５ｍＬ、２０当量）を加えた。混合物を１５分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を容器の上部からＤＭＦ（４．０ｍＬ）で連続して３回洗浄し、得られた混合物を６０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器にアミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、５．０ｍＬ、１０当量）、次いでＨＣＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、５．０ｍＬ、１０当量）、最後にＤＩＰＥＡ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、２．５ｍＬ、２０当量）を加えた。混合物を１５分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
二級アミンカップリング手順：
前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して５回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、２．５ｍＬ、１０当量）、次いでＨＣＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、２．５ｍＬ、１０当量）、最後にＮＭＭ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．５ｍＬ、１２当量）を加えた。混合物を１２時間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ：
前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して５回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、ＤＩＰＥＡ（４．０ｍｍｏｌ、０．６９９ｍＬ、４０当量）、およびクロロアセチルクロライド（２．０ｍｍｏｌ、０．１６０ｍＬ、２０当量）のＤＭＦ中の溶液を３．０ｍＬ加えた。混合物を１２から１８時間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＣＨ２Ｃｌ２（２．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。
クロロ酢酸カップリング手順Ｂ：
前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して５回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、ＤＭＦ（２．０ｍＬ）、クロロ酢酸（１．２ｍｍｏｌ、１１３ｍｇ、１２当量）、およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（１．２ｍｍｏｌ、０．１８７ｍＬ、１２当量）を加えた。混合物を１２〜１８時間にわたり周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＣＨ２Ｃｌ２（２．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。
プレリュード方法Ｃ：
全ての操作は、プレリュードペプチド合成器（Protein Technologies）において自動化のもとで行った。特に記載されない限り、全ての手順は、下部フリットが取り付けられた、１０または４５ｍＬポリプロピレンチューブにおいて行った。チューブは、チューブの下部および上部の両方を介して、プレリュードペプチド合成器に結合する。ＤＭＦおよびＤＣＭは、チューブの上部を介して加えることができ、これによってチューブの両側が均等に洗い流される。残りの試薬は、チューブの下部から加えられ、フリットを通過して樹脂と接触する。全ての溶液をチューブの下部から除去する。「周期的攪拌」は、下部フリットを介した、Ｎ２ガスの短いパルスを表し；このパルスは約５秒間継続し、３０秒ごとに生じる。アミノ酸溶液は一般に、準備から３週間を超えて使用しなかった。ＨＡＴＵ溶液は、準備から５日以内に使用した。ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＨＣＴＵ＝２−（６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム；ＨＡＴＵ＝１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム ３−オキシド ヘキサフルオロホスフェート；ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン；シーバー＝Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ、ここで、「３−イルオキシ」は、ポリスチレン樹脂の位置および結合の種類を表す。用いる樹脂はシーバーリンカー（窒素においてＦｍｏｃ保護）を有するメリフィールドポリマー（ポリスチレン）であり；１００−２００メッシュ、１％ＤＶＢ、０．７１ｍｍｏｌ／ｇロード。用いられる一般的なアミノ酸は、括弧内に示される側鎖保護基と共に、以下に列挙される：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｂｚｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ。
「プレリュード方法Ｃ」の手順は、０．１００ｍｍｏｌスケールで行われた実験をいい、ここで、スケールは樹脂に結合したシーバーリンカーの量によって決定される。このスケールは、前記のシーバー−メリフィールド樹脂の約１４０ｍｇに相当する。全ての手順は、スケールの倍数で、記載された体積を調整することによって、０．１００ｍｍｏｌスケールを超えて拡大することができる。アミノ酸カップリングの前に、全てのペプチド合成手順は、以下で「樹脂膨潤手順」と記載される、樹脂膨潤手順によって開始した。一級アミンＮ末端へのアミノ酸のカップリングには、以下に記載される「シングルカップリング手順」を用いた。二級アミンＮ末端へのアミノ酸のカップリングには、以下に記載される「二級アミンカップリング手順」を用いた。樹脂の最終的な洗浄には、以下に記載される「最終洗浄手順」を用いた。
樹脂膨潤手順：
４０ｍＬポリプロピレン固相反応容器に、メリフィールド：シーバー樹脂（１４０ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を加えた。樹脂を以下のように３回洗浄（膨潤）した：反応容器にＤＭＦ（５．０ｍＬ）およびＤＣＭ（５．０ｍＬ）を加え、その後混合物を、反応容器の下部からのＮ２バブリングによって、１０分間周期的に攪拌し、その後溶媒をフリットから排出した。
シングルカップリング手順：
前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。反応容器にピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して５回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え得られた混合物を６０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、５．０ｍＬ、１０当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、５．０ｍＬ、１０当量）、最後にＤＩＰＥＡ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、２．５ｍＬ、２０当量）を加えた。混合物を６０分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、酢酸無水物：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ（１０：１：８９ ｖ／ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を１０分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
二級アミンカップリング手順：
前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。反応容器にピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して５回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、２．５ｍＬ、５当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、２．５ｍＬ、５当量）、最後にＤＩＰＥＡ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．５ｍＬ、１２当量）を加えた。混合物を３００分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように２回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、２．５ｍＬ、５当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、２．５ｍＬ、５当量）、最後にＤＩＰＥＡ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．５ｍＬ、１２当量）を加えた。混合物を３００分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように２回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に酢酸無水物：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ（１０：１：８９ ｖ／ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を１０分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
カスタムアミノ酸カップリング手順：
前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。反応容器にピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して５回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、０．５から２．５ｍＬ、１から５当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、０．５から２．５ｍＬ、１から５当量）、最後にＤＩＰＥＡ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、０．５から１．５ｍＬ、４から１２当量）を加えた。混合物を６０分から６００分間にわたり周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように２回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（２．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に酢酸無水物：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ（１０：１：８９ ｖ／ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を１０分間にわたり周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
最終的な洗浄手順：
樹脂を以下のように連続して２回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＣＭ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間にわたり周期的に確認し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
クロロ酢酸カップリング手順:
手動ステップに注意されたい。前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を室温で５分間振盪させ、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して５回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を攪拌し、その後その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、ＤＭＦ（２．０ｍＬ）、クロロ酢酸（１．２ｍｍｏｌ、１１３ｍｇ、１２当量）、およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（１．２ｍｍｏｌ、０．１８７ｍＬ、１２当量）を加えた。混合物を１２から１８時間、室温で振盪させ、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＣＨ２Ｃｌ２（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。
プレリュード方法Ｄ：
全ての操作は、プレリュードペプチド合成器（Protein Technologies）において、自動化のもとで行った。特に記載されない限り、全ての操作は、下部フリットが取り付けられた、１０または４５ｍＬポリプロピレンチューブにおいて行った。チューブは、チューブの下部および上部の両方を介して、プレリュードペプチド合成器に結合する。ＤＭＦおよびＤＣＭは、チューブの上部を介して加えることができ、これによってチューブの両側が均等に洗い流される。残りの試薬は、チューブの下部から加えられ、フリットを通過して樹脂と接触する。全ての養液をチューブの下部から除去する。「周期的攪拌」は、下部フリットを介した、Ｎ２ガスの短いパルスを表し；このパルスは約５秒間継続し、３０秒ごとに生じる。アミノ酸溶液は一般に、準備から３週間を超えて使用しなかった。ＨＡＴＵ溶液は、準備から５日以内に使用した。ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＨＣＴＵ＝２−（６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム；ＨＡＴＵ＝１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム ３−オキシド ヘキサフルオロホスフェート；ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン；シーバー＝Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ、ここで、「３−イルオキシ」は、ポリスチレン樹脂の位置および結合の種類を表す。用いる樹脂は、シーバーリンカー（窒素においてＦｍｏｃ保護）を有する、メリフィールドポリマー（ポリスチレン）である；１００−２００メッシュ、１％ＤＶＢ、０．７１ｍｍｏｌ／ｇロード。用いられる一般的なアミノ酸は、括弧内に示される側鎖保護基と共に、以下に列挙される：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｂｚｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ。
「プレリュード方法Ｄ」の手順は、０．１００ｍｍｏｌスケールで行われた実験をいい、ここで、スケールは樹脂に結合したシーバーリンカーの量によって決定される。このスケールは、前記のシーバー−メリフィールド樹脂の約１４０ｍｇに相当する。全ての手順は、スケールの倍数で、記載された体積を調整することによって、０．１００ｍｍｏｌスケールを超えて拡大することができる。アミノ酸カップリングの前に、全てのペプチド合成手順は、以下で「樹脂膨潤手順」と記載される、樹脂膨潤手順によって開始した。一級アミンＮ末端へのアミノ酸のカップリングには、以下に記載される「シングルカップリング手順」を用いた。二級アミンＮ末端へのアミノ酸のカップリングには、以下に記載される「二級アミンカップリング手順」を用いた。樹脂の最終的な洗浄には、以下に記載される「最終洗浄手順」を用いた。
樹脂膨潤手順：
４０ｍＬポリプロピレン固相反応容器に、メリフィールド：シーバー樹脂（１４０ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を加えた。樹脂を以下のように３回洗浄（膨潤）した：反応容器に、ＤＭＦ（５．０ｍＬ）およびＤＣＭ（５．０ｍＬ）を加え、その後混合物を、反応容器の下部からのＮ２バブリングによって、１０分間周期的に攪拌し、その後溶媒をフリットから排出した。
シングルカップリング手順：
前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。反応容器にピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して５回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え得られた混合物を６０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器にアミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、２．５当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、２．５当量）、最後にＤＩＰＥＡ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、０．７５ｍＬ、５当量）を加えた。混合物を３０分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、酢酸無水物：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ（１０：１：８９ ｖ／ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を１５分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した： それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
二級アミンカップリング手順：
前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。反応容器にピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して５回洗浄した： それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器にアミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、２．５当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、２．５当量）、最後にＤＩＰＥＡ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、０．７５ｍＬ、５当量）を加えた。混合物を３０分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように２回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、２．５当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、２．５当量）、最後にＤＩＰＥＡ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、０．７５ｍＬ、５当量）を加えた。混合物を３０分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように２回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に酢酸無水物：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ（１０：１：８９ ｖ／ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を１５分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように２回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、酢酸無水物：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ（１０：１：８９ ｖ／ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を１５分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
最終的な洗浄手順：
樹脂を以下のように連続して２回洗浄した： それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した： それぞれの洗浄について、ＤＣＭ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
クロロ酢酸 カップリング手順:
手動ステップに注意されたい。前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を室温で５分間振盪させ、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して５回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、ＤＭＦ（２．０ｍＬ）、クロロ酢酸（１．２ｍｍｏｌ、１１３ｍｇ、１２当量）、およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（１．２ｍｍｏｌ、０．１８７ｍＬ、１２当量）を加えた。混合物を室温で１２から１８時間振盪し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＣＨ２Ｃｌ２（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。
ＣＥＭ方法Ａ：
全ての操作は、ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙマイクロ波ペプチド合成器（CEM Corporation）において、自動化のものとで行った。特に記載されない限り、全ての操作は、下部フリットがＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙマイクロ波ユニットに取り付けられた、３０または１２５ｍＬポリプロピレンチューブにおいて行った。チューブは、チューブの下部および上部の両方を介して、ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ合成器に結合する。ＤＭＦおよびＤＣＭは、チューブの上部および下部から加えることができ、これによってチューブの側面を均等に洗い流す。樹脂を上部から移す場合を除き、すべての溶液はチューブの下部から除去する。「周期的なバブリング」は、下部フリットを介した、Ｎ２ガスの短いバブリングを表す。アミノ酸溶液は一般に、準備から３週間を超えて使用しなかった。ＨＡＴＵ溶液は、準備から５日以内に使用した。ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＨＣＴＵ＝２−（６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム；ＨＡＴＵ＝１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム ３−オキシド ヘキサフルオロホスフェート；ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン；シーバー＝Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ、ここで、「３−イルオキシ」は、ポリスチレン樹脂の位置および結合の種類を表す。用いた樹脂は、シーバーリンカー（窒素においてＦｍｏｃ保護）を有するメリフィールドポリマー（ポリスチレン）である；１００−２００メッシュ、１％ＤＶＢ、０．７１ｍｍｏｌ／ｇロード。クロロトリチル、または他の酸感受性リンカーなどの、他の一般的な樹脂を合成に用いることができ、特に言及されない限り、シーバーアミド樹脂が特定の実施例において用いられる。用いられる一般的なアミノ酸は、括弧内に示される側鎖保護基と共に、以下に列挙される：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｂｚｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ。
「ＣＥＭ方法Ａ」の手順は、０．１００ｍｍｏｌスケールで行われた実験をいい、ここで、スケールは樹脂に結合したシーバーリンカーの量によって決定される。このスケールは、前記のシーバー−メリフィールド樹脂の約１４０ｍｇに相当する。全ての手順は、スケールの倍数で、記載された体積を調整することによって、０．１００ｍｍｏｌスケールを超えて拡大することができる。アミノ酸カップリングの前に、全てのペプチド合成手順は、以下で「樹脂膨潤手順」と記載される、樹脂膨潤手順によって開始した。一級アミンＮ末端へのアミノ酸のカップリングには、以下に記載される「シングルカップリング手順」を用いた。二級アミンＮ末端へのアミノ酸のカップリングには、以下に記載される「二級アミンカップリング手順」を用いた。クロロアセチル基のペプチドのＮ末端へのカップリングは、以下に記載される「クロロアセチルクロライドカップリング手順」または「クロロ酢酸カップリング手順」によって説明される。
樹脂膨潤手順：
５０ｍＬポリプロピレンコニカルチューブに、メリフィールド：シーバー樹脂（１４０ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、ＤＭＦ（７ｍＬ）をチューブに加え、次いでＤＣＭ（７ｍＬ）を加えた。樹脂を次いで、容器の上部から反応容器」に移した。この手順をさらに２回繰り返す。ＤＭＦ（７ｍＬ）を加え、次いでＤＣＭ（７ｍＬ）を加えた。反応容器の下部から、１５分間Ｎ２バブリングによって、樹脂を膨潤させ、その後溶媒をフリットから排出した。
標準的なカップリング手順：
前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、次いで下部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、最後に上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、２．５ｍＬ、５当量）、ＨＡＴＵ（０．５Ｍ／ＤＭＦ、１．０ｍＬ、５当量）、およびＤＩＰＥＡ（２Ｍ／ＮＭＰ、０．５ｍＬ、１０当量）を加えた。５０℃でカップリングさせたＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ以外の全てのアミノ酸について、混合物を７５℃で５分間、Ｎ２バブリングによって混合させ、反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、次いで下部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、最後に上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄。反応容器に、酢酸無水物：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ（１０：１：８９ ｖ／ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を６５℃で２分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、次いで下部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、最後に上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
ダブルカップリング手順：
前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、次いで下部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、最後に上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、２．５ｍＬ、５当量）、ＨＡＴＵ（０．５Ｍ／ＤＭＦ、１．０ｍＬ、５当量）、およびＤＩＰＥＡ（２Ｍ／ＮＭＰ、０．５ｍＬ、１０当量）を加えた。５０℃でカップリングさせたＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ以外の全てのアミノ酸について、混合物を７５℃で５分間、Ｎ２バブリングによって混合させ、反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、次いで下部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、最後に上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、２．５ｍＬ、５当量）、ＨＡＴＵ（０．５Ｍ／ＤＭＦ、１．０ｍＬ、５当量）、およびＤＩＰＥＡ（２Ｍ／ＮＭＰ、０．５ｍＬ、１０当量）を加えた。５０℃でカップリングさせたＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ以外の全てのアミノ酸について、混合物を７５℃で５分間、Ｎ２バブリングによって混合させ、反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した： 上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、次いで下部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、最後に上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄。反応容器に、酢酸無水物：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ（１０：１：８９ ｖ／ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を６５℃で２分間周期的にバブリングし、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した： 上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、次いで下部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、最後に上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
二級アミンカップリング手順：
前のステップからの樹脂を含む反応容器に、５％ピペラジンおよび０．１Ｍ ＨＯＢｔのＤＭＦ（７ｍＬ）中の溶液を加えた。混合物を７５℃で３分間周期的に攪拌し、次いで溶液を排出した。この手順をさらにもう一回繰り返した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した： 上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、次いで下部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、最後に上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、２．５ｍＬ、５当量）、ＨＣＴＵ（０．５Ｍ／ＤＭＦ、１．０ｍＬ、５当量）、およびＤＩＰＥＡ（２Ｍ／ＮＭＰ、０．５ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を全てのアミノ酸について、７５℃で５分間Ｎ２バブリングによって混合し（Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨについては５０℃）、次いで６時間加熱なしで行った。排出した後、樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、次いで下部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、最後に上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄。反応容器に、酢酸無水物：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ（１０：１：８９ ｖ／ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を６５℃で２分間、周期的に攪拌し、次いで溶液を排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、次いで下部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、最後に上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
カスタムアミノ酸カップリング手順：
前のステップからの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を３分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、次いで下部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、最後に上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄。反応容器に、ＨＡＴＵ（２．５当量から１０当量）を含むアミノ酸溶液（１．２５ｍＬから５ｍＬ、２．５当量から１０当量）、および最後にＤＩＰＥＡ（２Ｍ／ＮＭＰ、０．５ｍＬから１ｍＬ、２０当量）を加えた。混合物を２５℃から７５℃で５分から２時間、Ｎ２バブリングによって混合し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、次いで下部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、最後に上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄。反応容器に、酢酸無水物：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ（１０：１：８９ ｖ／ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）の溶液を加えた。混合物を６５℃で２分間周期的にバブリングし、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、次いで下部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄、最後に上部からのＤＭＦ（７ｍＬ）洗浄。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
シンフォニー方法Ａ：
全ての操作は、シンフォニーペプチド合成器（Protein Technologies）において、自動化のもとで行った。特に言及されない限り、全ての手順は、下部フリットに取り付けたシンフォニーポリプロピレンチューブにおいて行った。チューブは、チューブの下部および上部の両方を介して、シンフォニーペプチド合成器に結合する。全ての溶媒、ＤＭＦ、ＤＣＭ、アミノ酸、および試薬は、チューブの下部から加えられ、フリットを通過して樹脂と接触する。全ての溶液は、チューブの下部から除去する。「周期的な攪拌」は、下部フリットを介したＮ２ガスの短いパルスをいい；パルスは約５秒間継続し、１５秒ごとに生じる。アミノ酸溶液は一般に、準備から３週間を超えて使用しなかった。ＨＡＴＵ溶液は、準備から５日以内に使用した。ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＨＣＴＵ＝２−（６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム；ＨＡＴＵ＝１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム ３−オキシド ヘキサフルオロホスフェート；ＮＭＭ＝ｎ−メチルモルホリン；ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン；シーバー＝Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ、ここで、「３−イルオキシ」は、ポリスチレン樹脂の位置および結合の種類を表す。用いる樹脂は、シーバーリンカー（窒素においてＦｍｏｃ保護）を有するメリフィールドポリマー（ポリスチレン）である；１００−２００メッシュ、１％ＤＶＢ、０．７１ｍｍｏｌ／ｇロード。Ｒｉｎｋまたは機能化クロロトリチル樹脂などの、他の一般的な酸感受性樹脂もまた、合成に用いることができる。用いられる一般的なアミノ酸は、括弧内に示される側鎖保護基と共に、以下に列挙される：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｂｚｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ。
「シンフォニー方法Ａ」の手順は、０．０５０ｍｍｏｌスケールで行われた実験をいい、ここで、スケールは樹脂に結合したシーバーリンカーの量によって決定される。このスケールは、前記のシーバー−メリフィールド樹脂の約７０ｍｇに相当する。全ての手順は、スケールの倍数で、記載された体積を調整することによって、０．０５０ｍｍｏｌスケールを超えて拡大することができる。アミノ酸カップリングの前に、全てのペプチド合成手順は、以下で「樹脂膨潤手順」と記載される、樹脂膨潤手順によって開始した。一級アミンＮ末端へのアミノ酸のカップリングには、以下に記載される「標準的なカップリング手順」を用いた。二級アミンＮ末端へのアミノ酸のカップリングには、「二級アミンカップリング手順」を用い、カスタムアミノ酸は、以下に記載されるアミノ酸の「ブランクカップリング」の、手動のブランク負荷によってカップリングする。
膨潤手順：
シンフォニーポリプロピレン固相反応容器に、メリフィールド：シーバー樹脂（７０ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）を加えた。樹脂を以下のように３回洗浄（膨潤）した：反応容器にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、その後混合物を、反応容器の下部からのＮ２バブリングによって周期的に攪拌し、その後溶媒をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、２．５ｍＬ）を加えた。混合物を２．５分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して６回洗浄した：それぞれの洗浄について、容器の底からＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、最後にＮＭＭ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を１０分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を、容器の下部から加えたＤＭＦ（６．２５ｍＬ）によって洗浄し、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、および最後にＮＭＭ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を１０分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように３回洗浄した：反応容器にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、その後混合物を、反応容器の底からのＮ２バブリングによって、３０秒間周期的に攪拌し、その後溶媒をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
標準的なカップリング手順：
樹脂を以下のように３回洗浄した：反応容器にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、その後混合物を、反応容器の底からのＮ２バブリングによって、３０秒間周期的に攪拌し、その後溶媒をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、２．５ｍＬ）を加えた。混合物を２．５分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように６回洗浄した：それぞれの洗浄について、容器の底からＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、最後にＮＭＭ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を１０分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を、容器の下部から加えたＤＭＦ（６．２５ｍＬ）で洗浄し、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、最後にＮＭＭ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を１０分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：それぞれの洗浄について、容器の底からＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
二級アミンカップリング手順：
樹脂を以下のように３回洗浄した：反応容器にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、その後混合物を、反応容器の底からのＮ２バブリングによって、３０秒間周期的に攪拌し、その後溶媒をフリットから排出した。反応容器にピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、２．５ｍＬ）を加えた。混合物を２．５分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように６回洗浄した：それぞれの洗浄について、容器の底からＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、最後にＮＭＭ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を３００分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を、容器の下部から加えたＤＭＦ（６．２５ｍＬ）で洗浄し、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、最後にＮＭＭ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を３００分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：それぞれの洗浄について、容器の底からＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
カスタムアミノ酸カップリング手順：
樹脂を以下のように３回洗浄した：反応容器にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、その後混合物を、反応容器の底からのＮ２バブリングによって、３０秒間周期的に攪拌し、その後溶媒をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、２．５ｍＬ）を加えた。混合物を２．５分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように６回洗浄した： それぞれの洗浄について、容器の底からＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。手動で反応容器にカスタムアミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）を加えるために、シンフォニーソフトウェアによって合成を停止させ、次いで自動化を再度開始し、ＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、および最後にＮＭＭ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を３００分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を、容器の下部から加えたＤＭＦ（２．５ｍＬ）によって、以下のように６回洗浄し、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、Ａｃ２Ｏ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ（ｖ／ｖ／ｖ １：１：３ ２．５ｍＬ）を加えた。混合物を１０分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：それぞれの洗浄について、容器の底からＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
シンフォニー方法Ｂ：
特に言及されない限り、全ての手順は、下部フリットに取り付けたシンフォニーポリプロピレンチューブにおいて行った。チューブは、チューブの下部および上部の両方を介して、シンフォニーペプチド合成器に結合する。全ての溶媒、ＤＭＦ、ＤＣＭ、アミノ酸、および試薬は、チューブの下部から加えられ、フリットを通過して樹脂と接触する。全ての溶液は、チューブの下部から除去する。「周期的な攪拌」は、下部フリットを介したＮ２ガスの短いパルスをいい；パルスは約５秒間継続し、１５秒ごとに生じる。アミノ酸溶液は一般に、準備から３週間を超えて使用しなかった。ＨＡＴＵ溶液は、準備から５日以内に使用した。ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＨＣＴＵ＝２−（６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム；ＨＡＴＵ＝１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム ３−オキシド ヘキサフルオロホスフェート；ＮＭＭ＝ｎ−メチルモルホリン；ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン；シーバー＝Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ、ここで、「３−イルオキシ」は、ポリスチレン樹脂の位置および結合の種類を表す。用いる樹脂は、シーバーリンカー（窒素においてＦｍｏｃ保護）を有するメリフィールドポリマー（ポリスチレン）である；１００−２００メッシュ、１％ＤＶＢ、０．７１ｍｍｏｌ／ｇロード。Ｒｉｎｋまたは機能化クロロトリチル樹脂などの、他の一般的な酸感受性樹脂もまた用いることができる。用いられる一般的なアミノ酸は、括弧内に示される側鎖保護基と共に、以下に列挙される：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｂｚｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ。
「シンフォニー方法Ｂ」の手順は、０．０５０ｍｍｏｌスケールで行われた実験をいい、ここで、スケールは樹脂に結合したシーバーリンカーの量によって決定される。このスケールは、前記のシーバー−メリフィールド樹脂の約７０ｍｇに相当する。全ての手順は、スケールの倍数で、記載された体積を調整することによって、０．０５０ｍｍｏｌスケールを超えて拡大することができる。アミノ酸カップリングの前に、全てのペプチド合成手順は、以下で「樹脂膨潤手順」と記載される、樹脂膨潤手順によって開始した。一級アミンＮ末端へのアミノ酸のカップリングには、以下に記載される「標準的なカップリング手順」を用いた。二級アミンＮ末端へのアミノ酸のカップリングには、「二級アミンカップリング手順Ｂ」を用い、カスタムアミノ酸は、以下に記載されるアミノ酸の「カスタムアミノ酸カップリング手順」の手動ブランク付加によってカップリングし、クロロアセチル無水物は、以下に記載される「最終的なキャップ手順」を用いて、最後の位置に加える。
膨潤手順：
シンフォニーポリプロピレン固相反応容器に、メリフィールド：シーバー樹脂（７０ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）を加えた。樹脂を以下のように３回洗浄（膨潤）した：反応容器にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、その後反応容器の下部からのＮ２バブリングによって、混合物を１０分間周期的に攪拌し、その後溶媒をフリットから排出した。反応容器にピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、２．５ｍＬ）を加えた。混合物を２．５分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して６回洗浄した：それぞれの洗浄について、容器の底からＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、最後にＮＭＭ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を１０分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を、容器の下部から加えたＤＭＦ（６．２５ｍＬ）によって洗浄し、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、最後にＮＭＭ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を１０分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように３回洗浄した：反応容器にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、その後混合物を、反応容器の底からのＮ２バブリングによって、３０秒間周期的に攪拌し、その後溶媒をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
標準的なカップリング手順：
樹脂を以下のように３回洗浄した：反応容器にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、その後混合物を、反応容器の底からのＮ２バブリングによって、３０秒間周期的に攪拌し、その後溶媒をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、２．５ｍＬ）を加えた。混合物を２．５分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように６回洗浄した：それぞれの洗浄について、容器の底からＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、最後にＮＭＭ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を１５分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように６回洗浄した：ＤＭＦ（２．５ｍＬ）を容器の下部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、Ａｃ２Ｏ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ（ｖ／ｖ／ｖ １：１：３ ２．５ｍＬ）を加えた。混合物を１０分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して６回洗浄した： それぞれの洗浄について、容器の底からＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、得られた混合ｂ通を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
二級アミンカップリング方法：
樹脂を以下のように３回洗浄した：反応容器にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、その後混合物を、反応容器の底からのＮ２バブリングによって、３０秒間周期的に攪拌し、その後溶媒をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、２．５ｍＬ）を加えた。混合物を２．５分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように６回洗浄した：それぞれの洗浄について、容器の底からＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、最後にＮＭＭ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を１５分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を、容器の下部から加えたＤＭＦ（６．２５ｍＬ）で洗浄し、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、次いでＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、最後にＮＭＭ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を１５分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して３回洗浄した：それぞれの洗浄について、容器の底からＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器にＡｃ２Ｏ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ（ｖ／ｖ／ｖ １：１：３ ２．５ｍＬ）を加えた。混合物を１０分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して６回洗浄した：それぞれの洗浄について、容器の底からＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
カスタムアミノ酸カップリング手順：
樹脂を以下のように３回洗浄した：反応容器にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、その後混合物を、反応容器の底からのＮ２バブリングによって、３０秒間周期的に攪拌し、その後溶媒をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、２．５ｍＬ）を加えた。混合物を２．５分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように６回洗浄した：それぞれの洗浄について、容器の底からＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。カスタムアミノ酸を反応容器に手動で加えるために、システムをシステムによって停止させ、次いで自動化を再開して、反応ベシクルにＨＡＴＵ（０．２Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、５当量）、および最後にＮＭＭ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を１５分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように６回洗浄した：ＤＭＦ（２．５ｍＬ）を容器の下部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器にＡｃ２Ｏ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ（ｖ／ｖ／ｖ １：１：３ ２．５ｍＬ）を加えた。混合物を１０分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して６回洗浄した： それぞれの洗浄について、容器の底からＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、得られた混合物を９０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次のステップに用いた。
最終的なキャップ手順:
樹脂を以下のように３回洗浄した：反応容器にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、その後混合物を、反応容器の底からのＮ２バブリングによって、３０秒間周期的に攪拌し、その後溶媒をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、２．５ｍＬ）を加えた。混合物を２．５分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように６回洗浄した：それぞれの洗浄について、容器の底からＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、ＮＭＭ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加え、次いでクロロ酢酸無水物（０．４Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を１５分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を、容器の下部から加えたＤＭＦ（６．２５ｍＬ）で洗浄し、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、ＮＭＭ（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加え、次いでクロロ酢酸無水物（０．４Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を１５分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように６回洗浄した：ＤＭＦ（２．５ｍＬ）を容器の下部から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、Ａｃ２Ｏ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ（ｖ／ｖ／ｖ １：１：３ ２．５ｍＬ）を加えた。混合物を１０分間周期的に攪拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して６回洗浄した：それぞれの洗浄について、容器の底からＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＣＭ（２．５ｍＬ）を容器の底から加え、得られた混合物を３０秒間周期的に攪拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を次いで、窒素気流によって１０分間乾燥させた。
一般的な脱保護方法Ａ：
全ての操作は、特に記載されない限り、手動で行った。「一般的な脱保護方法Ａ」の手順は、０．１００ｍｍｏｌスケールで行われた実験をいい、ここで、スケールは樹脂に結合したシーバーリンカーの量によって決定される。全ての手順は、スケールの倍数で、記載された体積を調整することによって、０．１００ｍｍｏｌスケールを超えて拡大することができる。「脱保護溶液」は、トリフルオロ酢酸：水：トリイソプロピルシラン：ジチオスレイトール（９２．５：２．５：２．５：２．５ ｖ：ｖ：ｖ：ｗ）を用いて調製した。樹脂を反応容器から除去し、フリットを取り付けた２５ｍＬシリンジに移した。シリンジに、「脱保護溶液」（５．０ｍＬ）を加えた。混合物を振盪器で８５分間混合した。溶液を濾過し、濃縮し、ジエチルエーテル（３０ｍＬ）で希釈した。沈殿した固形物を３分間遠心分離した。上清溶液をデカントし、固形物をジエチルエーテル（２５ｍＬ）に再懸濁させた。懸濁液を３分間遠心分離した。上清をデカントし、残った固形物をジエチルエーテル（２５ｍＬ）に懸濁した。懸濁液を３分間遠心分離した。上清をデカントし、残った固形物を高真空で乾燥させた。粗製ペプチドを、白色から灰白色の固形物として得た。
一般的な脱保護方法Ｂ：
全ての操作は、特に記載されない限り、手動で行った。「一般的な脱保護方法Ｂ」の手順は、０．０４ｍｍｏｌスケールで行われた実験をいい、ここで、スケールは樹脂に結合したシーバーリンカーの量によって決定される。手順は、スケールの倍数で、記載された体積を調整することによって、０．０４ｍｍｏｌスケールを超えて拡大することができる。「脱保護溶液」は、トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン（９６：４；ｖ：ｖ）を用いて調製した。樹脂を反応容器から除去し、フリットを取り付けた１０ｍＬシリンジに移した。シリンジに、「脱保護溶液」（２．０−３．０ｍＬ）を加えた。混合物を振盪器で１時間または１．５時間混合した。溶液を濾過し、脱保護溶液（０．５ｍＬ）で洗浄し、濃縮し、ジエチルエーテル（３０ｍＬ）で希釈した。沈殿した固形物を３分間遠心分離した。上清溶液をデカントし、固形物をジエチルエーテル（２５ｍＬ）に再懸濁した。懸濁液を３分間遠心分離した。上清をデカントし、残った固形物をジエチルエーテル（２５ｍＬ）に懸濁した。懸濁液を３分間遠心分離した。上清をデカントし、残った固形物を高真空で乾燥させた。粗製ペプチドを、白色から灰白色の固形物として得た。
一般的な脱保護方法Ｃ：
全ての操作は、特に記載されない限り、手動で行った。「一般的な脱保護方法Ｃ」の手順は、０．１００ｍｍｏｌスケールで行われた実験をいい、ここで、スケールは樹脂に結合したシーバーリンカーの量によって決定される。全ての手順は、スケールの倍数で、記載された体積を調整することによって、０．１００ｍｍｏｌスケールを超えて拡大することができる。「脱保護溶液」は、トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：ジチオスレイトール（９５：２．５：２．５ ｖ：ｖ：ｗ）を用いて調製した。樹脂を反応容器から除去し、Ｂｉｏ−Ｒａｄチューブに移した。Ｂｉｏ−Ｒａｄに、「脱保護溶液」（４．０ｍＬ）を加えた。混合物を振盪器で６０分間混合した。溶液を濾過し、ジエチルエーテル（３０ｍＬ）で希釈した。沈殿した固形物を３分間遠心分離した。上清溶液をデカントし、固形物をジエチルエーテル（２５ｍＬ）に再懸濁した。懸濁液を３分間遠心分離した。上清をデカントし、残った固形物をジエチルエーテル（２５ｍＬ）に懸濁した。懸濁液を３分間遠心分離した。上清をデカントし、残った固形物を高真空で乾燥させた。粗製ペプチドを、白色から灰白色の固形物として得た。
一般的な脱保護方法Ｄ：
全ての操作は、特に記載されない限り、手動で行った。「一般的な脱保護方法Ｂ」の手順は、０．１００ｍｍｏｌスケールで行われた実験をいい、ここで、スケールは樹脂に結合したシーバーリンカーの量によって決定される。全ての手順は、スケールの倍数で、記載された体積を調整することによって、０．１００ｍｍｏｌスケールを超えて拡大することができる。「脱保護溶液」は、トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：ジチオスレイトール（９４：３：３ ｖ：ｖ：ｗ）を用いて調製した。樹脂を反応容器から除去し、フリットを取り付けた２５ｍＬシリンジに移した。シリンジに「脱保護溶液」（５．０ｍＬ）を加えた。混合物を５分間振盪器で混合した。溶液を濾過し、ジエチルエーテル（３０ｍＬ）で希釈した。沈殿した固形物を３分間遠心分離した。上清溶液をデカントし、固形物をジエチルエーテル（２５ｍＬ）に再懸濁した。懸濁液を３分間遠心分離した。上清をデカントし、残った固形物をジエチルエーテル（２５ｍＬ）に懸濁した。懸濁液を３分間遠心分離した。上清をデカントし、残った固形物を高真空で乾燥させた。粗製ペプチドを、白色から灰白色の固形物として得た。
一般的な脱保護方法Ｅ：
全ての操作は、特に言及されない限り、手動で行った。「一般的な脱保護方法Ｅ」の手順は、０．１００ｍｍｏｌスケールで行われた実験をいい、ここで、スケールは、樹脂に結合したＦｍｏｃ Ｇｌｙ−ＣｌＴｒｔリンカーの量によって決定される。全ての手順は、スケールの倍数で、記載された体積を調整することによって、０．１００ｍｍｏｌスケールを超えて拡大することができる。「脱保護溶液」は、トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：ジチオスレイトール（９５：２．５：２．５ ｖ：ｖ：ｗ）を用いて調製した。樹脂を反応容器から除去し、Ｂｉｏ−Ｒａｄチューブに移した。Ｂｉｏ−Ｒａｄチューブに、「脱保護溶液」（２．０ｍＬ）を加えた。混合物を振盪器で３分間混合した。溶液を濾過し、遠心チューブに回収した。Ｂｉｏ−Ｒａｄチューブに、「脱保護溶液」（２．０ｍＬ）を加えた。混合物を振盪器で３分間混合した。溶液を濾過し、遠心チューブに回収した。Ｂｉｏ−Ｒａｄチューブに、「脱保護溶液」（２．０ｍＬ）を加えた。混合物を振盪器で３分間混合した。溶液を濾過し、遠心チューブに回収した。遠心チューブ中で容器を６０分間静置した。回収した溶液を次いで、ジエチルエーテル（３０ｍＬ）で希釈し、沈殿が生成した。沈殿した固形物を３分間遠心分離した。上清溶液をデカントし、固形物をジエチルエーテル（２５ｍＬ）に再懸濁した。懸濁液を３分間遠心分離した。上清をデカントし、残った固形物をジエチルエーテル（２５ｍＬ）に懸濁した。懸濁液を３分間遠心分離した。上清をデカントし、残った固形物を高真空で乾燥させた。粗製ペプチドを、白色から灰白色の固形物として得た。
一般的な脱保護方法Ｆ：
全ての操作は、特に言及されない限り、手動で行った。「一般的な脱保護方法 F」の手順は、０．１００ｍｍｏｌスケールで行われた実験をいい、ここで、スケールは、樹脂に結合したＲｉｎｋリンカーの量によって決定される。全ての手順は、スケールの倍数で、記載された体積を調整することによって、０．１００ｍｍｏｌスケールを超えて拡大することができる。「脱保護溶液」は、トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：ジチオスレイトール（９５：２．５：２．５ ｖ：ｖ：ｗ）を用いて調製した。樹脂を反応容器から除去し、６ｍｌのＢｉｏ−Ｒａｄに移した。Ｂｉｏ−Ｒａｄに、「脱保護溶液」（４．０ｍＬ）を加えた。混合物を振盪器で９０分間混合した。溶液を濾過し、ジエチルエーテル（３０ｍＬ）で希釈した。沈殿した固形物を３分間遠心分離した。上清溶液をデカントし、固形物をジエチルエーテル（２５ｍＬ）に再懸濁した。懸濁液を３分間遠心分離した。上清をデカントし、残った固形物をジエチルエーテル（２５ｍＬ）に懸濁した。懸濁液を３分間遠心分離した。上清をデカントし、残った固形物を高真空で乾燥させた。粗製ペプチドを、白色から灰白色の固形物として得た。
環化方法Ａ
全ての操作は、特に記載されない限り、手動で行った。「環化方法Ａ」の手順は、０．１００ｍｍｏｌスケールで行われた実験をいい、ここで、スケールはペプチドの生成に用いた樹脂のシーバーリンカーの量によって決定される。このスケールは、手順において用いたペプチドの量の直接的な決定には基づいていない。全ての手順は、スケールの倍数で、記載された体積を調整することによって、０．１００ｍｍｏｌスケールを超えて拡大することができる。粗製ペプチド固形物を、アセトニトリル：８Ｍ グアニジン／５０ｍＭ トリス水溶液（１：３）（ｐＨ８．６）（７ｍＬ：１８ｍＬ、または同様の比率）の溶液に溶解させ、溶液を必要に応じて、ＮａＯＨ水溶液（１．０Ｍ）を用いてｐＨ＝８．５−９．０に調整した。溶液を次いで、振盪器を用いて、１２から１８時間混合した。反応溶液を濃縮し、残留物を次いでアセトニトリル：水に溶解した。この溶液を逆相ＨＰＬＣに付し、目的の環状ペプチドを得た。
環化方法Ｃ：
全ての操作は、特に記載されない限り、手動で行った。「環化方法Ｃ」の手順は、０．１００ｍｍｏｌスケールで行われた実験をいい、ここで、スケールはペプチドの生成に用いた樹脂のシーバーリンカーの量によって決定される。このスケールは、手順において用いたペプチドの量の直接的な決定には基づいていない。全ての手順は、スケールの倍数で、記載された体積を調整することによって、０．１００ｍｍｏｌスケールを超えて拡大することができる。粗製ペプチド固形物をアセトニトリル：０．１Ｍ 重炭酸アンモニウムの緩衝水溶液（１１ｍＬ：２４ｍＬ、または同様の比率）に溶解させ、溶液を次いで、ＮａＯＨ水溶液（１．０Ｍ）を用いて、慎重にｐＨ＝８．５−９．０に調整した。溶液を、振盪器を用いて、１２から１８時間混合した。反応溶液を濃縮し、残留物を次いでアセトニトリル：水に溶解した。この溶液を逆相ＨＰＬＣに付し、目的の環状ペプチドを得た。
環化方法Ｄ：
全ての操作は、特に記載されない限り、手動で行った。「環化方法Ｄ」の手順は、０．１００ｍｍｏｌスケールで行われた実験をいい、ここで、スケールはペプチドの生成に用いた樹脂のシーバーリンカーの量によって決定される。このスケールは、手順において用いたペプチドの量の直接的な決定には基づいていない。全ての手順は、スケールの倍数で、記載された体積を調整することによって、０．１００ｍｍｏｌスケールを超えて拡大することができる。粗製ペプチド固形物を、アセトニトリル：０．１Ｍ 重炭酸アンモニウム緩衝水溶液（１１ｍＬ：２４ｍＬ）の溶液に溶解し、溶液を次いで、ＮａＯＨ水溶液（１．０Ｍ）を用いて、慎重にｐＨ＝８．５−９．０に調整した。溶液を次いで、１２から１８時間攪拌することによって混合した。反応溶液を濃縮し、残留物を次いでアセトニトリル：水に溶解した。この溶液を逆相ＨＰＬＣに付し、目的の環状ペプチドを得た。
環化方法Ｅ：
全ての操作は、特に記載されない限り、手動で行った。「環化方法Ｅ」の手順は、０．１００ｍｍｏｌスケールで行われた実験をいい、ここで、スケールはペプチドの生成に用いた樹脂のシーバーリンカーの量によって決定される。このスケールは、手順において用いたペプチドの量の直接的な決定には基づいていない。全ての手順は、スケールの倍数で、記載された体積を調整することによって、０．１００ｍｍｏｌスケールを超えて拡大することができる。粗製ペプチド固形物は、６Ｍ グアニジン ＨＣｌ緩衝水溶液（１５ｍＬ）に溶解させ、溶液を次いで、１２から１８時間にわたり攪拌によって混合した。反応溶液を濃縮し、１５ｍＬのＤＭＳＯを残留物に加え、生じたスラリーを濾過した。この濾過した溶液を逆相ＨＰＬＣに付し、目的の環状ペプチドを得た。
手動カップリング手順Ａ：
前のステップからの樹脂を含むＢｉｏ−Ｒａｄ反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）を加えた。混合物を５分間周期的に攪拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して５回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を６０秒間振盪し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸（１．２−１０当量）一般的に（０．２Ｍ／ＤＭＦ、２．５ｍＬ、５当量）、次いでＨＡＴＵ（１．２１０当量）一般的に（０．２Ｍ／ＤＭＦ、２．５ｍＬ、５当量）、最後にＤＩＰＥＡ（２．４−２０当量）一般的に（０．８Ｍ／ＤＭＦ、１．２５ｍＬ、１０当量）を加えた。混合物を６０分から１８時間振盪し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を以下のように連続して４回洗浄した：それぞれの洗浄について、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を容器の上部から加え、得られた混合物を６０秒間振盪し、その後溶液をフリットから排出した。
マイクロ切り出しＡ：
樹脂の少ない＜１０ｍｇのサンプルに、２滴のＴＩＳおよび１ｍｌのトリフルオロ酢酸を加え、室温で１時間振盪し、少量を除去し、０．５ｍＬのアセトニトリルで希釈し、濾過して、ＨＰＬＣ ＭＳトレースを得る。
閉環メタセシス手順
磁気攪拌子を備えた５ｍＬマイクロ波チューブにおいて、５０ｍｍｏｌの樹脂に、３０ｍｇのＨＧＩＩを固形物として加え、３ｍＬの１，２ジクロロエタンを加え、Ｎ２で２分間キャップスパージを行う。マイクロ波バイアルをＢｉｏｔａｇｅマイクロ波に移し、１００℃で１時間加熱する。Ｂｉｏ−Ｒａｄチューブを用いて、樹脂を単離する。３ｘ５ｍｌ ＤＭＦ、次いで５ｘ５ｍｌ ＤＣＭで洗浄する。樹脂を切り出しにそのまま用いる。
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）ノン−８−エン酸
Figure 2020536091
２０ｍＬバイアル中の（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）ノン−８−エン酸（３６０ｍｇ、０．９１５ｍｍｏｌ）に、トルエン（１２ｍｌ）を加え、固体のパラホルムアルデヒド（１６５ｍｇ、５．４９ｍｍｏｌ）、およびｐ−トルエンスルホン酸（１７．４０ｍｇ、０．０９１ｍｍｏｌ）を加えた。２０ｍＬのバイアルに、１０個のモレキュラー・シーブを加えた。バイアルに栓をして、１１０℃で６時間加熱し、次いで室温に冷却した。シーブを珪藻土（セライト（登録商標））のプラグを介した濾過によって除去し、ジクロロメタンで洗浄した。溶媒を真空で留去し、淡黄色の油状物を得た。
粗製の（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル ４−（ヘプト−６−エン−１−イル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボキシレートを、ＣＨＣｌ３（４．８０ｍｌ）、ＴＦＡ（４．８０ｍｌ）、およびトリエチルシラン（０．４３８ｍｌ、２．７４ｍｍｏｌ）で処理した。室温で２時間攪拌し、次いで溶媒を留去して、黄色の油状物を得た。
粗製の油状物を、２０ｍＬのＴＨＦおよび１０ｍＬの水に溶解させ、０．１％ＴＦＡを含む、０から１００％の水から、０．１％ＴＦＡを含む、アセトニトリル溶液の１５分の勾配、１５ｘ２ｍＬの注入を用いた、Ｌｕｎａ Ｃ１８ ３０ｘ１００カラムにおいて、逆相クロマトグラフィーを用いて精製した。目的の画分を合わせて、凍結させ、凍結乾燥させて、０．６７グラムを得た。LCMS条件D: 保持時間 1.79分 408.5 M+1。
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）ヘプト−６−エン酸
Figure 2020536091
２０ｍＬバイアル中の（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）ヘプト−６−エン酸（２．５ｇ、６．８４ｍｍｏｌ）に、トルエン（３０ｍＬ）、次いでパラホルムアルデヒド（１．２３３ｇ、４１．０ｍｍｏｌ）、およびｐ−トルエンスルホン酸（０．１３０ｇ、０．６８４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物に５個のモレキュラー・シーブを加えた。反応液を次いで６時間にわたり１１０℃に加熱し、室温に冷却した。シーブを珪藻土（セライト（登録商標））を介した濾過によって除去し、パッドを３０ｍＬジクロロメタンで洗浄した。溶媒を真空で流去し、黄色の油状物を得た。
粗製の黄色の油状物、（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル ５−オキソ−４−（ペント−４−エン−１−イル）オキサゾリジン−３−カルボキシレートを、ＣＨＣｌ３（１２．００ｍｌ）、ＴＦＡ（１２．００ｍｌ）、およびトリエチルシラン（３．２８ｍｌ、２０．５２ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を室温で２時間攪拌し、溶媒を留去して、油状物を得た。粗製の油状物を３０ｍＬテトラヒドロフランおよび１２ｍＬ水に溶解させ、３０ｘ１００ Ｃ１８ Ｌｕｎａ カラム １５分にわたり、０から１００の０．１％ＴＦＡを含む水から０．１％ＴＦＡを含む、アセトニトリルで、２２ｘ２ｍＬ注入によって精製した。目的の画分を合わせて、凍結し、凍結乾燥して、１．８４３グラムの固形物を得た。LCMS条件D: 保持時間 1.07分 380.4 (M+1); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 12.76 (br. s., 1H), 7.97 - 7.77 (m, 2H), 7.73 - 7.53 (m, 2H), 7.49 - 7.25 (m, 4H), 5.84 - 5.71 (m, 1H), 5.06 - 4.90 (m, 2H), 4.51 (dd, J=11.1, 4.6 Hz, 1H), 4.44 - 4.24 (m, 4H), 2.78 - 2.64 (m, 3H), 2.09 - 1.92 (m, 3H), 1.87 - 1.63 (m, 3H), 1.62 - 1.54 (m, 1H), 1.26 (quin, J=7.5 Hz, 2H), 1.20 - 0.94 (m, 1H)。
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）ヘキサ−５−エン酸
Figure 2020536091
２０ｍＬバイアル中の（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）ヘキサ−５−エン酸（１５００ｍｇ、４．２７ｍｍｏｌ）に、トルエン（２４ｍＬ）、次いでパラホルムアルデヒド（７６９ｍｇ、２５．６ｍｍｏｌ）、およびｐ−トルエンスルホン酸（８１ｍｇ、０．４２７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物に１０個のモレキュラー・シーブを加えた。反応液を６時間にわたり、１１０℃に加熱し、次いで室温に冷却した。シーブを、珪藻土（セライト（登録商標））を介した濾過によって除去し、パッドを３０ｍＬジクロロメタンで洗浄した。溶媒を除去し、淡黄色の油状物を得た。
ＣＨＣｌ３（９．６０ｍＬ）中の粗製の黄色の油状物、（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル ４−（ブト−３−エン−１−イル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボキシレートを、ＴＦＡ（９．６０ｍＬ）およびトリエチルシラン（２．０４５ｍｌ、１２．８１ｍｍｏｌ）で処理した。室温で２時間攪拌し、溶媒を真空で留去し、油状物を得た。
粗製の油状物を、２０ｍＬテトラヒドロフランおよび１２ｍＬ水中に溶解させ、３０ｘ１００ Ｃ１８ Ｌｕｎａ カラム １５分にわたり０から１００の０．１％ＴＦＡを含む水から０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルで、１６ｘ２ｍＬの注入によって精製した。目的の画分を合わせて、凍結させ、再び凍結乾燥して、固形物を得た（０．６７グラム）。LCMS条件D: 保持時間 1.02分 366.3 (M+1); 分析HPLC条件 G: 保持時間 = 13.22分 91%; 分析HPLC条件 H: 保持時間 = 12.25分 88%; 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 12.97-12.63 (br、1H), 7.99 - 7.81 (m, 2H), 7.78 - 7.54 (m, 2H), 7.52 - 7.24 (m, 4H), 5.90 - 5.61 (m, 1H), 5.13 - 4.84 (m, 2H), 4.52 - 4.22 (m, 4H), 2.83 - 2.63 (m, 3H), 1.98 - 1.74 (m, 4H)
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）オクト−７−エン酸
Figure 2020536091
２０ｍＬバイアル中の（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）オクト−７−エン酸（１．５ｇ、３．９５ｍｍｏｌ）に、トルエン（８ｍＬ）、次いでパラホルムアルデヒド（０．７１２ｇ、２３．７２ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸（０．０７５ｇ、０．３９５ｍｍｏｌ）、および１０個のモレキュラー・シーブを加えた。バイアルに栓をし、反応液を１１０℃で６時間加熱し、室温に冷却した。シーブを珪藻土（セライト（登録商標））のプラグを介した濾過によって除去し、２０ｍＬのジクロロメタンで洗浄し、溶媒を留去して、淡黄色の油状物を得た。
黄色の油状物、（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル ４−（ヘキサ−５−エン−１−イル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボキシレートに、ＣＨＣｌ３（３．２０ｍｌ）、ＴＦＡ（３．２０ｍｌ）、および最後にトリエチルシラン（１．８９４ｍｌ、１１．８６ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で２時間攪拌し、溶媒を留去して、油状物を得た。
油状物を２０ｍＬテトラヒドロフランおよび１２ｍＬ水に溶解させ、３０ｘ１００ Ｃ１８ Ｐｈｅｎｏｍｉｎｅｘ Ｌｕｎａ １５分にわたり、０から１００％の０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル／調節剤として０．１％ＴＦＡを含む水、１６ｘ２ｍＬ注入で精製した。目的の画分を回収し、凍結させ、凍結乾燥して、０．８８グラムを得た。LCMS条件D: 保持時間 1.10分 394.5 (M+1) 分析HPLC条件 G: 保持時間 14.3分 90%; 分析HPLC条件 H: 保持時間 13.1分 90%。 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 12.98-12.47 (Br, 1H), 8.04 - 7.76 (m, 2H), 7.76 - 7.56 (m, 2H), 7.56 - 7.34 (m, 4H), 5.78 (ddt, J=17.0、10.3, 6.6 Hz, 1H), 5.10 - 4.83 (m, 2H), 4.50 (dd, J=10.9, 4.6 Hz, 1H), 4.45 - 4.17 (m, 2H), 2.84 - 2.63 (m, 2H), 2.01 (br. s., 3H), 1.85 - 1.66 (m, 2H), 1.64 - 1.55 (m, 1H), 1.42 - 1.05 (m, 2H), 1.25 - 1.06 (m, 2H)。
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−（アリルオキシ）フェニル）プロパン酸
Figure 2020536091
４０ｍＬバイアル中の（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（アリルオキシ）フェニル）プロパン酸（１５００ｍｇ、３．３８ｍｍｏｌ）に、トルエン（２４ｍＬ）、次いでパラホルムアルデヒド（６０９ｍｇ、２０．２９ｍｍｏｌ）、およびｐ−トルエンスルホン酸（６４．３ｍｇ、０．３３８ｍｍｏｌ）、次いで１０個のモレキュラー・シーブを加えた。反応液に栓をして、１１０℃で６時間加熱し、室温に冷却し、シーブを珪藻土（セライト（登録商標））を介した濾過によって除去し、３０ｍＬジクロロメタンで洗浄し、溶媒を留去して、油状物を得た。
黄色の油状物、（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル ４−（４−（アリルオキシ）ベンジル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボキシレートを、クロロホルム（９．６０ｍｌ）、ＴＦＡ（９．６０ｍｌ）、およびトリエチルシラン（１．６２１ｍｌ、１０．１５ｍｍｏｌ）で処理した。溶媒を留去して、油状物を得て、これを３０ｍＬジクロロメタンに溶解させ、珪藻土（セライト（登録商標））を介して濾過した。ペード（pade）を２０ｍＬジクロロメタンで洗浄し、溶媒を留去して、粗生成物を得て、これを１２０グラムのシリカＩｓｃｏ（１２０グラムのゴールドカラム）、ヘキサンから酢酸エチルの勾配で精製して、０．５８２グラムの白色の固形物を得た。LCMS条件D: 保持時間 1.10分 394.5 (M+1); 分析HPLC条件 G: 保持時間 14.3分 90%; 分析HPLC条件 H: 保持時間 13.1分 90%
ＲＣＭオープンＡの合成
Figure 2020536091
２５ｍＬポリプロピレン固相反応容器に、シーバー樹脂（１４０ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌを加え、反応容器をシンフォニーペプチド合成器に設置した。以下の手順を次いで、順に行った：
「シンフォニー方法Ａ：樹脂膨潤手順」を行った；
「シンフォニー方法Ａ：標準的カップリング手順」をＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨで行った；
「シンフォニー方法Ａ：標準的カップリング手順」をＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨで行った；
「シンフォニー方法Ａ：二級アミンカップリング手順」をＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨで行った；
「シンフォニー方法Ａ：標準的カップリング手順」を（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）オクト−７−エン酸で行った；
「シンフォニー方法Ａ：二級アミンカップリング手順」を（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）オクト−７−エン酸で行った；
「シンフォニー方法Ａ：二級アミンカップリング手順」をＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨで行った；
「シンフォニー方法Ａ：標準的カップリング手順」をＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨで行った；
「シンフォニー方法Ａ：標準的カップリング手順」をＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨで行った；
「シンフォニー方法Ａ：標準的カップリング手順」をＦｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ｇｌｙ−ＯＨで行った；
「シンフォニー方法Ａ：二級アミンカップリング手順」をＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨで行った；
「シンフォニー方法Ａ：標準的カップリング手順」をＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨで行った；
「シンフォニー方法Ａ：標準的カップリング手順」をＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨで行った；
「シンフォニー方法Ａ：二級アミンカップリング手順」をＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨで行った；
「シンフォニー方法Ａ：標準的カップリング手順」をＦｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ａｌａ−ＯＨで行った；
「シンフォニー方法Ａ：二級アミンカップリング手順」をＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨで行った；
「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ｂ」を行った；
「一般的な脱保護方法Ｃ」を行った；
「環化方法Ｄ」を行った。
粗製物質は、以下の条件を用いて、分取ＬＣによって精製した：
カラム：Ｐｈｅｎ Ｌｕｎａ Ａｘｉａ Ｃ１８ ３０＊２５０ｍｍ；
移動相Ａ：９５％Ｈ２Ｏ／５％ＡＣＮ／０．０５％ＴＦＡ；移動相Ｂ：９５：５％Ｈ２Ｏ／９５％ＡＣＮ／０．０５％ＴＦＡ；勾配 ３０分で１０％−１００％の勾配、３０ｍｌ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。
生成物の収量は１５ｍｇであった。
分析HPLC条件 I: 保持時間 = 14.982 分; ESI-MS(+) m/z 953.1 (M+2H)
実施例１００１の合成
Figure 2020536091
実施例ＲＣＭオープンＡ（１２ｍｇ、６．３０μｍｏｌ）を、ＤＣＥ（８ｍｌ）に溶解させた。ホヴェイダ−グラブス触媒第二世代（０．７９０ｍｇ、１．２６０μｍｏｌ）のＤＣＥ（０．５ｍＬ）中の溶液を、次いで加えた。溶液をアルゴンで５分間パージし、次いで７２℃で一晩加熱し、この時ＬＣ−ＭＳによって完全な変換が示された。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣによって精製した：
カラム：Ｐｈｅｎ Ｌｕｎａ Ａｘｉａ Ｃ１８ ３０＊２５０ｍｍ；
移動相Ａ：９５％Ｈ２Ｏ／５％ＡＣＮ／０．０５％ＴＦＡ；移動相Ｂ：９５：５％Ｈ２Ｏ／９５％ＡＣＮ／０．０５％ＴＦＡ；勾配 ３０分で１０％−１００％の勾配、３０ｍｌ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は３．８ｍｇであった。
分析HPLC条件 I: 保持時間 = 14.137 分; ESI-MS(+) m/z 939.4 (M+2H)
実施例１００２の合成
Figure 2020536091
実施例１００２は、以下の一般的な手順から成る、ＲＣＭオープンＡの合成について記載された一般的な合成手順によって合成した：「シンフォニー方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「シンフォニー方法Ａ：標準的カップリング手順」、「シンフォニー方法Ａ：二級アミンカップリング手順」、「クロロ酢酸カップリング手順Ｂ」、「一般的な脱保護方法Ｃ」、および「環化方法Ｄ」。得られた化合物をＤＣＥ（８ｍｌ）に溶解した。ホヴェイダ−グラブス触媒第二世代（０．７９０ｍｇ、１．２６０μｍｏｌ）の、ＤＥＭ（０．５ｍＬ）中の溶液を次いで加えた。溶液を５分間アルゴンでパージし、次いで７２℃で一晩加熱し、その時ＬＣ−ＭＳによって完全な変換が示された。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣによって精製した：カラム：Ｐｈｅｎ Ｌｕｎａ Ａｘｉａ Ｃ１８ ３０＊２５０ｍｍ；移動相Ａ：９５％Ｈ２Ｏ／５％ＡＣＮ／０．０５％ＴＦＡ；移動相Ｂ：９５：５％Ｈ２Ｏ／９５％ＡＣＮ／０．０５％ＴＦＡ；勾配 ３０分にわたり１０％−１００％の勾配、３０ｍｌ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は０．７ｍｇであった。
分析HPLC条件 I: 保持時間 = 14.661 分; ESI-MS(+) m/z 953.5 (M+2H)
実施例１１００の合成
Figure 2020536091
５０ｍＬポリプロピレンコニカルチューブに、Ｒｉｎｋアミド樹脂（１６６ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を加え、反応容器をＣＥＭペプチド合成器に設置した。以下の手順を次いで、順に行った：
「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」を行った；
「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」をＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨで行った；
「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」をＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨで行った；
「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」をＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨを行った；
「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」を（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）オクト−７−エン酸で行った；
「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」を（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）オクト−７−エン酸で行った；
「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」をＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨで行った；
「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」をＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨで行った；
「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」をＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨで行った；
「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」をＦｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ｇｌｙ−ＯＨで行った；
「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」をＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨで行った；
「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順をＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨで行った；
「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」をＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨで行った；
「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」をＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨで行った；
「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」をＦｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ａｌａ−ＯＨで行った；
「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」をＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨで行った；
「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ｂ」を行った；
「閉環メタセシス手順」を行った；
「一般的な脱保護方法Ｃ」を行った；
「環化方法Ｄ」を行った。
粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：３０分にわたり５０−９０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は１．３ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は９９％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.94 分; ESI-MS(+) m/z 938.9 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 3.02 分; ESI-MS(+) m/z 939.6 (M+2H)。
実施例ＲＣＭオープンＢの合成
Figure 2020536091
実施例ＲＣＭオープンＢは、以下の一般的な手順から成る、ＲＣＭオープンＡの合成方法について記載される一般的な合成手順に従ってＲｉｎｋ樹脂で合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２５０ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：２５分にわたり１０−６０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。目的の収量は１．８ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は１００％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 D: 保持時間 = 1.33 分； ESI-MS(+) m/z 981.8 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 E: 保持時間 = 1.29 分； ESI-MS(+) m/z 982.2 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 981.4776(M+2H) 観測値: 981.4764(M+2H)
実施例ＲＣＭオープンＣの合成
Figure 2020536091
実施例ＲＣＭオープンＣは、以下の一般的な手順から成る、ＲＣＭオープンＡの合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２５０ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：２５分にわたり１５−６５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は０．９ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は９７％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 D: 保持時間 = 1.64 分； ESI-MS(+) m/z 981.9 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 E: 保持時間 = 1.58 分； ESI-MS(+) m/z 982.1 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 981.4958(M+2H) 観測値: 981.4942(M+2H)
実施例ＲＣＭオープンＤの合成
Figure 2020536091
実施例ＲＣＭオープンＤは、以下の一般的な手順から成る、ＲＣＭオープンＡの製造について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２５０ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：２５分にわたり１５−６５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は４．８ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は９５％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 D: 保持時間 = 1.50 分； ESI-MS(+) m/z 967.9 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 E: 保持時間 = 1.44 分； ESI-MS(+) m/z 968.0 (M+2H)。
実施例ＲＣＭオープンＥの合成
Figure 2020536091
実施例ＲＣＭオープンＥは、以下の一般的な手順から成る、ＲＣＭオープンＡの合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２５０ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：２５分にわたり１０−６５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は６．２ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は１００％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 D: 保持時間 = 1.38 分； ESI-MS(+) m/z 953.9 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 E: 保持時間 = 1.32 分； ESI-MS(+) m/z 953.7 (M+2H)。
実施例１１０１の合成
Figure 2020536091
実施例１１０１は、以下の一般的な手順から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：３０分にわたり３５−７５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は２．６ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は９６％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.35 分; ESI-MS(+) m/z 955.8 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 1.60 分; ESI-MS(-) m/z 952.6 (M+2H)。
実施例１１０２の合成
Figure 2020536091
実施例１１０２は、以下の一般的な手順から成る、実施例１１００の合成について気足された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：３０分にわたり、２５−７０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は５．０ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は９６％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.26 分; ESI-MS(+) m/z 939.9 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.56 分; ESI-MS(+) m/z 939.9 (M+2H)。
実施例１１０３の合成
Figure 2020536091
実施例１１０３は、以下の一般的な方法から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成方法に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２５０ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：２５分にわたり、０−５０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は2.8 mgであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は９８％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 D: 保持時間 = 1.23 分； ESI-MS(+) m/z 872.1 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 E: 保持時間 = 1.23 分； ESI-MS(+) m/z 871.9 (M+2H)。
実施例１１０４の合成
Figure 2020536091
実施例１１０４は、以下の一般的な合成方法から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｆ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：３０分にわたり、４５−８５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は７．６ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は１００％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.23 分; ESI-MS(+) m/z 907.2 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.51 分; ESI-MS(+) m/z 907.2 (M+2H)。
実施例１１０５の合成
Figure 2020536091
実施例１１０５は、以下の一般的な合成手順から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｆ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：３０分にわたり４０−８０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は６．７ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は９７％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.35 分; ESI-MS(+) m/z 926.2 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.43 分; ESI-MS(+) m/z 925.2 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 924.9300(M+2H) 観測値: 924.9290(M+2H)
実施例１１０６の合成
Figure 2020536091
実施例１１０６は、以下の一般的な手順から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｆ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：３０分にわたり、３５−７５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。物質をさらに、以下の条件を用いて、分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、９５：５ メタノール：水；勾配：３０分にわたり４０−８５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は２．３ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は９７％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.45 分; ESI-MS(+) m/z 885.8 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.86 分; ESI-MS(+) m/z 885.9 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z:計算値: 885.4270(M+2H); 観測値: 885.4264(M+2H)
実施例１１０７の合成
Figure 2020536091
実施例１１０７は、以下の一般的な手順から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成方法に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｆ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：３０分にわたり４５−８５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は１．０ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は１００％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.55 分; ESI-MS(+) m/z 914.8 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.57 分; ESI-MS(+) m/z 915.2 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 913.4640(M+2H); 観測値: 913.4623(M+2H)
実施例１１０８の合成
Figure 2020536091
実施例１１０８は、以下の一般的な手順から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｆ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：３０分にわたり、４０−８０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は１．９ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は１００％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.55 分; ESI-MS(+) m/z 909.2 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.48 分; ESI-MS(+) m/z 909.3 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 908.4060(M+2H); 観測値: 908.4044(M+2H)
実施例１１０９の合成
Figure 2020536091
実施例１１０９は、以下の一般的な方法から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：３０分にわたり４５−８５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は３．７ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は１００％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.47 分; ESI-MS(+) m/z 942.3 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.83 分; ESI-MS(+) m/z 942.3 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 941.9747(M+2H); 観測値: 941.9728(M+2H)
実施例１１１０の合成
Figure 2020536091
実施例１１１０は、以下の一般的な手順から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：３０分にわたり４５−８５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。物質をさらに、以下の条件を用いて、分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：３０分にわたり５−４５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は２．３ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は１００％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.46 分; ESI-MS(+) m/z 924.9 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.91 分; ESI-MS(+) m/z 925.2 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 924.9300(M+2H); 観測値: 924.9273(M+2H)
実施例１１１１の合成
Figure 2020536091
実施例１１１１は、以下の一般的な手順から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：２０分にわたり４０−８０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。物質をさらに、以下の条件によって、分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：３０分にわたり１０−５０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は２．６ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は９７％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.66 分; ESI-MS(+) m/z 942.0 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.80 分; ESI-MS(+) m/z 943.6 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 936.9154(M+2H); 観測値: 936.9167(M+2H)
実施例１１１２の合成
Figure 2020536091
実施例１１１２は、以下の一般的な手順から成る、実施例１１００の合成について記載された、一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：３０分にわたり４５−８５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。物質をさらに、以下の条件を用いて、分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：２０分にわたり１０−５０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は９．０ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は１００％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.54 分; ESI-MS(+) m/z 908.3 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.65 分; ESI-MS(+) m/z 908.3 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 907.4220(M+2H); 観測値: 907.4199(M+2H)
実施例１１１３の合成
Figure 2020536091
実施例１１１３は、以下の一般的な合成手順から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：２０分にわたり、４０−８０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。物質をさらに、以下の条件を用いて、分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：３０分にわたり、１０−５０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は２．５ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は１００％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.54 分; ESI-MS(+) m/z 933.4 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 3.01 分; ESI-MS(+) m/z 933.4 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 932.9274(M+2H); 観測値: 932.9261(M+2H)
実施例１１１４の合成
Figure 2020536091
実施例１１１４は、以下の一般的な手順から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：２０分にわたり４０−８０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。物質をさらに、以下の条件を用いて、分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：３０分にわたり１０−５０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は５．４ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は１００％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.56 分; ESI-MS(+) m/z 933.4 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 3.03 分; ESI-MS(+) m/z 933.4 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 932.9274(M+2H); 観測値: 932.9263(M+2H)
実施例１１１５の合成
Figure 2020536091
実施例１１１５は、以下の一般的な手順から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：３０分にわたり５−４５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は８．３ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度はは９８％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.41 分; ESI-MS(+) m/z 947.3 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.59 分; ESI-MS(+) m/z 947.3 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 946.4329(M+2H); 観測値: 946.4296(M+2H)
実施例１１１６の合成
Figure 2020536091
実施例１１１６は、以下の一般的な手順から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：３０分にわたり２５−７０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥した。生成物の収量は１０．６ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は１００％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.46 分; ESI-MS(+) m/z 930.1 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.84 分; ESI-MS(+) m/z 930.3 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 929.9097(M+2H); 観測値: 929.9097(M+2H)
実施例１１１７の合成
Figure 2020536091
実施例１１１７は、以下の一般的な手順から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：３０分にわたり３５−７５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。物質をさらに、以下の条件を用いて、分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：３０分にわたり０−４０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は５．５ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は９８％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.46 分; ESI-MS(+) m/z 966.5 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.84 分; ESI-MS(+) m/z 966.6 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 965.9195(M+2H); 観測値: 965.9173(M+2H)
実施例１１１８
Figure 2020536091
実施例１１１８は、以下の一般的な手順から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成方法に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：３０分にわたり１０−５０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。物質をさらに、以下の条件を用いて、分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：３０分にわたり１５−５５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。物質をさらに、以下の条件を用いて、分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：３０分にわたり１５−５５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は４．４ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は１００％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.69 分; ESI-MS(+) m/z 924.0 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 3.31 分; ESI-MS(+) m/z 924.4 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 923.9000(M+2H); 観測値: 923.8970(M+2H)
実施例１１１９の合成
Figure 2020536091
実施例１１１９は、以下の一般的な手順から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：３０分にわたり４０−８０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は１．５ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は８８％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.73 分; ESI-MS(+) m/z 937.2 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.96 分; ESI-MS(+) m/z 937.3 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 936.4158(M+2H); 観測値: 936.4139(M+2H)
実施例１１２０の合成
Figure 2020536091
実施例１１２０は、以下の一般的な手順から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：３０分にわたり５−４５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。物質をさらに、以下の条件を用いて、分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：３０分にわたり１５−５５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は１．６ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は９９％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.58 分; ESI-MS(+) m/z 946.4 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 3.08 分; ESI-MS(+) m/z 946.4 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 945.9352(M+2H); 観測値: 945.9328(M+2H)
実施例１１２１の合成
Figure 2020536091
実施例１１２１は、以下の一般的な手順から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「閉環メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。
粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：３０分にわたり４０−８０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。物質をさらに、以下の条件を用いて、分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：３０分にわたり１０−５０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は２．１ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は９９％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.22 分; ESI-MS(+) m/z 1010.6 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.57 分; ESI-MS(+) m/z 1010.7 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 1010.4327(M+2H); 観測値: 1010.4290(M+2H)
実施例ＲＣＭオープンＦの合成
Figure 2020536091
実施例ＲＣＭオープンＦは、以下の一般的な合成手順から成る、ＲＣＭオープンＡの合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：３０分にわたり１０−５０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。物質をさらに、以下の条件を用いて、分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ メタノール：水；勾配：１５分にわたり４５−８５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は０．８ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は１００％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.42 分; ESI-MS(+) m/z 993.8 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.92 分; ESI-MS(+) m/z 993.7 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 993.4587(M+2H); 観測値: 993.4552(M+2H)
実施例１１２２の合成
Figure 2020536091
実施例１１２２は、以下の一般的な合成手順から成る、実施例１１００の合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「平版メタセシス手順」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：３０分にわたり１５−５５％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は１．７ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は９９％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.28 分; ESI-MS(+) m/z 980.6 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.76 分; ESI-MS(+) m/z 979.9 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 979.4431(M+2H); 観測値: 979.4406(M+2H)
実施例ＲＣＭオープンＧの合成
Figure 2020536091
実施例ＲＣＭオープンGは、以下の一般的な手順から成る、ＲＣＭオープンAの合成について記載された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂において合成した：「ＣＭＥ方法Ａ：樹脂膨潤手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：シングルカップリング手順」、「ＣＭＥ方法Ａ：ダブルカップリング手順」、「クロロアセチルクロライドカップリング手順Ａ」、「一般的な脱保護方法Ｂ」、および「環化方法Ｃ」。 粗製物質を以下の条件で分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ メタノール：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウム；９５：５ メタノール：水；勾配：３０分にわたり４０−８０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。物質をさらに、以下の条件を用いて、分取ＬＣ／ＭＳによって精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、１９ｘ２００ｍｍ、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、５：９５ アセトニトリル：水；移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、９５：５ アセトニトリル：水；勾配：３０分にわたり、１０−５０％Ｂ、次いで５分間、１００％Ｂで保持；流速：２０ｍＬ／分。目的の生成物を含む画分を合わせて、遠心蒸発によって乾燥させた。生成物の収量は１．９ｍｇであり、ＬＣＭＳ解析によって推定した純度は９９％であった。
分析ＬＣＭＳ条件 H: 保持時間 = 1.37 分; ESI-MS(+) m/z 1024.8 (M+2H)。
分析ＬＣＭＳ条件 I: 保持時間 = 2.82 分; ESI-MS(+) m/z 1024.8 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z: 計算値: 1024.4484(M+2H); 観測値: 1024.4454(M+2H)
均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）結合アッセイを用いた、ＰＤ−Ｌ１に対するＰＤ−１の結合と競合する、大環状ペプチドの能力の試験方法
本開示の大環状ペプチドの、ＰＤ−Ｌ１に結合する能力を、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）結合アッセイを用いて調査した。
方法
可溶性ＰＤ−１の可溶性ＰＤ−Ｌ１に対する結合の均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイ。可溶性ＰＤ−１および可溶性ＰＤ−Ｌ１は、膜貫通領域を除去し、異種配列、具体的には、ヒト免疫グロブリンＧ配列（Ｉｇ）のＦｃ部位またはヘキサヒスチジンエピトープタグ（Ｈｉｓ）を融合させた、カルボキシル末端切断を有するタンパク質をいう。全ての結合試験は、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンおよび０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を添加した、ｄＰＢＳから成るＨＴＲＦアッセイ緩衝液において行った。ＰＤ−１−Ｉｇ／ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ結合アッセイについて、阻害剤は４μｌのアッセイ緩衝液中のＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ（１０ｎＭ最終）と、１５分間予めインキュベートし、次いで１μｌのアッセイ緩衝液中のＰＤ−１−Ｉｇ（２０ｎＭ最終）を添加し、さらに１５分間インキュベートした。ヒト、カニクイザル、マウス、または他の種からのＰＤ−Ｌ１融合タンパク質を用いた。ＨＴＲＦ検出は、ユーロピウム クリプテート標識抗Ｉｇモノクローナル抗体（１ｎＭ最終）およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（２０ｎＭ最終）を用いて行った。抗体をＨＴＲＦ検出緩衝液中で希釈し、５μｌを結合反応の上部に分注した。反応を３０分間平衡化させ、シグナル（６６５ｎｍ／６２０ｎｍ比）を、ＥｎＶｉｓｉｏｎフルオロメーターを用いて得た。さらなる結合アッセイは、ＰＤ−１−Ｉｇ／ＰＤ−Ｌ２−Ｈｉｓ（それぞれ、２０および５ｎＭ）、ＣＤ８０−Ｈｉｓ／ＰＤ−Ｌ１−Ｉｇ（それぞれ、１００および１０ｎＭ）およびＣＤ８０−Ｈｉｓ／ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（それぞれ、１０および５ｎＭ）間において確立した。ビオチニル化化合物第７１番およびヒトＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ間の結合／競合試験は、以下のように行った。大環状ペプチド阻害剤を、４μｌのアッセイ緩衝液中のＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ（１０ｎＭ最終）で、６０分間予めインキュベートし、次いで１μｌのアッセイ緩衝液中でビオチニル化化合物第７１番（０．５ｎＭ最終）を加えた。結合を３０分間平衡化させ、次いで５μｌのＨＴＲＦ緩衝液中のユーロピウム クリプテート標識ストレプトアビジン（２．５ｐＭ最終）およびＡＰＣ標識抗Ｈｉｓ（２０ｎＭ最終）を加えた。反応を３０分間平衡化させ、シグナル（６６５ｎｍ／６２０ｎｍ比率）を、ＥｎＶｉｓｉｏｎフルオロメーターを用いて得た。
組み換えタンパク質。Ｃ末端ヒトＩｇエピトープタグ［ｈＰＤ−１（２５−１６７）−３Ｓ−ＩＧ］を有するカルボキシル切断ヒトＰＤ−１（アミノ酸２５−１６７）、およびＣ末端Ｈｉｓエピトープタグ［ｈＰＤ−Ｌ１（１９−２３９）−タバコ静脈斑点ウイルスプロテアーゼ切断部位（ＴＶＭＶ）−Ｈｉｓ］を有するヒトＰＤ−Ｌ１（アミノ酸１８−２３９）を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に発現させ、組み換えタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって順次精製した。ヒトＰＤ−Ｌ２−Ｈｉｓ(Sino Biologicals)、ＣＤ８０−Ｈｉｓ(Sino Biologicals)、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ(RnD Systems)は全て、市販源から入手した。
Figure 2020536091
Figure 2020536091
結果を表１に示す。示されるように、本開示の大環状ペプチドは、ＰＤ−Ｌ１−ＴＶＭＶ−Ｈｉｓ（ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ）に対するＰＤ−１−Ｉｇの結合活性の強力な阻害を示した。範囲は以下の通りである：Ａ＝０．１０−２μＭ；Ｂ＝０．０１−０．０９９μＭ；Ｃ＝０．００２−０．００９９μＭ。
Figure 2020536091
Figure 2020536091
本開示は、前記の例示的な実施例に限定されず、その本質的な特性から逸脱することなく、他の特定の形式で実施することができることが当業者に明らかであろう。したがって、実施例はあらゆる点において例示的であり、限定的でないと見なされることが望ましく、前記の実施例ではなく付属の特許請求の範囲についての言及、特許請求の範囲と均等な意味および範囲内の全ての変更は、そのため、そこに含まれることが意図される。

Claims (16)

  1. 式（Ｉ）：
    Figure 2020536091
    ［式中、
    Ａは結合、
    Figure 2020536091
    から選択され；
    ここで、
    Figure 2020536091
    はカルボニル基の結合点を表し、
    Figure 2020536091
    は窒素原子の結合点を表し；
    ｚは０、１、または２であり；
    ｗは１または２であり；
    ｎは０または１であり；
    ｍは１または２であり；
    ｍ’は０または１であり；
    ｐは０、１、または２であり；
    Ｒｘは水素、アミノ、ヒドロキシ、およびメチルから選択され；
    Ｒ１４およびＲ１５は独立して、水素およびメチルから選択され；
    Ｒｚは水素および−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１６から選択され；ここで、Ｒ１６は水素、−ＣＨＲ１７Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＣＨＲ１７Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ１８Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、および−ＣＨＲ１７Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ１８Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２から選択され；Ｒ１７は水素および−ＣＨ２ＯＨから選択され；Ｒ１８は水素およびメチルから選択され；
    Ｒｖは水素または天然アミノ酸の側鎖であり；
    Ｒｃ、Ｒｆ、Ｒｈ、Ｒｉ、およびＲｍは水素であり；
    ＲＬはメチルであり；
    Ｒｎは水素またはメチルであるか、あるいは、ＲｖおよびＲｎはピロリジン環を形成し；
    Ｒａ、Ｒｊ、およびＲｋはそれぞれ独立して、水素およびメチルから選択され；
    Ｒ１、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１３は独立して、天然アミノ酸の側鎖および非天然アミノ酸の側鎖から選択され；
    Ｑは適宜、１つの炭素−炭素二重結合を含んでいてもよい５〜１２員の炭素鎖またはフェノキシ基であり；
    Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ７は独立して、天然アミノ酸の側鎖および非天然アミノ酸の側鎖から選択されるか、あるいは以下に記載されるジェミナルなＲ基と共に環を形成し；
    Ｒｂはメチルであるか、あるいはＲｂおよびＲ２は、それらが結合する原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、およびテトラヒドロチアゾールから選択される環を形成し；ここで、それぞれの環は適宜、アミノ、シアノ、メチル、ハロ、およびヒドロキシから独立して選択される、１〜４個の基で置換されていてもよく；
    Ｒｄは水素またはメチルであるか、あるいはＲｄおよびＲ４は、それらが結合する原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、およびテトラヒドロチアゾールから選択される環を形成することができ；ここで、それぞれの環は適宜、アミノ、シアノ、メチル、ハロ、ヒドロキシ、およびフェニルから独立して選択される、１〜４個の基で置換されていてもよく；
    Ｒｅは水素またはメチルであるか、あるいは、ＲｅおよびＲ５は、それらが結合する原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、およびテトラヒドロチアゾールから選択される環を形成することができ；ここで、それぞれの環は適宜、アミノ、シアノ、メチル、ハロ、およびヒドロキシから独立して選択される１〜４個の基で置換されていてもよく；
    Ｒｇは水素またはメチルであるか、あるいは、ＲｇおよびＲ７は、それらが結合する原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、およびテトラヒドロチアゾールから選択される環を形成することができ；ここで、それぞれの環は適宜、アミノ、ハロ基で適宜置換されていてもよいベンジル、ベンジルオキシ、シアノ、シクロヘキシル、メチル、ハロ、ヒドロキシ、メトキシ基で適宜置換されていてもよいイソキノリニルオキシ、ハロ基で適宜置換されていてもよいキノリニルオキシ、およびテトラゾリルから独立して選択される、１〜４個の基で置換されていてもよく；ピロリジンおよびピペリジン環は適宜、シクロヘキシル、フェニル、またはインドール基に縮合していてもよい。］
    で示される化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
  2. Ａが
    Figure 2020536091
    である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
  3. ｚが０であり；
    ｗが１であり；
    Ｒ１４およびＲ１５が水素であり；
    Ｒｚが−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１６であり；ここで、Ｒ１６が−ＣＨＲ１７Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である、
    請求項２に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
  4. Ｒ１がヒドロキシで適宜置換されていてもよいベンジルであり；
    Ｒ２がメチルであるか、あるいは、Ｒｂと一緒になって、ピペリジン、ピペラジン、およびモルホリンから選択される環を形成し；
    Ｒ３が−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２および−ＣＨ２ＣＯ２Ｈから選択され；
    Ｒ４が、Ｒｄと一緒になって、ピロリジン環を形成し；
    Ｒ５が−ＣＨ２（イミダゾリル）および−ＣＨ２ＮＨ２から選択され；
    Ｒ６がイソブチル、−（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｈ、および−（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２から選択され；
    Ｒ７が水素であるか、あるいは、Ｒｇと一緒になって、ヒドロキシで適宜置換されていてもよいピロリジン環を形成し；
    Ｒ８が−（ＣＨ２）インドリルであり；
    Ｒ９が−ＣＨ２ＯＨおよび−（ＣＨ２）２ＮＨ２から選択され；
    Ｒ１０が−（ＣＨ２）インドリルおよび−（ＣＨ２）ベンゾチエニルから選択され、それぞれは適宜、−ＣＨ２ＣＯ２Ｈで置換されていてもよい、
    請求項３に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
  5. 必要な対象において、免疫応答を強化し、刺激し、および／または増加させる方法であって、治療上の有効量の請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を対象に投与することを含む、方法。
  6. 請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩の前、後、または同時に、さらなる薬剤を投与することをさらに特徴とする、請求項５に記載の方法。
  7. さらなる薬剤が抗菌剤、抗ウイルス剤、細胞毒性剤、および／または免疫応答調節剤である、請求項６に記載の方法。
  8. さらなる薬剤がＨＤＡＣ阻害剤である、請求項６に記載の方法。
  9. さらなる薬剤がＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストである、請求項６に記載の方法。
  10. 必要な対象において、癌細胞の成長、増殖、または転移を抑制する方法であって、治療上の有効量の請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を対象に投与することを含む、方法。
  11. 癌が黒色腫、腎細胞癌、扁平上皮非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、大腸癌、去勢抵抗性前立腺癌、卵巣癌、胃癌、肝細胞癌、膵臓癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、食道、消化管および乳房の癌、および造血器腫瘍から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 必要な対象において感染性疾患を治療する方法であって、治療上の有効量の請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を対象に投与することを含む、方法。
  13. 感染性疾患がウイルスによって引き起こされる、請求項１２に記載の方法。
  14. ウイルスが、ＨＩＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペスウイルス、およびインフルエンザから選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 必要な対象において、敗血症性ショックを治療する方法であって、治療上の有効量の請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を対象に投与することを含む、方法。
  16. 対象において、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１および／またはＣＤ８０との相互作用を阻害する方法であって、治療上の有効量の請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を対象に投与することを含む、方法。
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