CN107207568A - 免疫调节剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新颖大环肽，其抑制PD‑1/PD‑L1和PD‑L1/CD80蛋白质/蛋白质相互作用，且因此适用于改善各种疾病，包括癌症和感染性疾病。

Description

免疫调节剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年2月4日提交的美国临时专利申请第62/111,900号的优先权，通过引用的方式将其整体并入本文。
技术领域
本发明提供新颖大环肽，其抑制PD-1/PD-L1和CD80/PD-L1蛋白质/蛋白质相互作用，且因此可用于改善各种疾病，包括癌症和感染性疾病。
背景技术
程序性死亡蛋白1(PD-1)为受体CD28家族的抑制成员，其还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1表达于活化B细胞、T细胞和骨髓细胞上(Agata等人,见上文；Okazaki等人,Curr.Opin.Immunol.,14:779-782(2002)；Bennett等人,J.Immunol.,170:711-718(2003))。
PD-1蛋白为作为Ig基因超家族的一部分的55kDa I型跨膜蛋白质(Agata等人,Int.Immunol.,8:765-772(1996))。PD-1含有膜近端免疫受体酪氨酸抑制模序(ITIM)和膜远端基于酪氨酸的切换模序(ITSM)(Thomas,M.L.,J.Exp.Med.,181:1953-1956(1995)；Vivier,E.等人,Immunol.Today,18:286-291(1997))。虽然结构上与CTLA-4类似，但PD-1缺乏对CD80CD86(B7-2)结合至关重要的MYPPY模序。已鉴别PD-1的两种配体，PD-L1(B7-H1)和PD-L2(b7-DC)。已展示在与表达PD-L1或PD-L2的细胞相互作用后，表达PD-1的T细胞的活化下调(Freeman等人,J.Exp.Med.,192:1027-1034(2000)；Latchman等人,Nat.Immunol.,2:261-268(2001)；Carter等人,Eur.J.Immunol.,32:634-643(2002))。PD-L1和PD-L2均为B7蛋白家族成员，其结合至PD-1，但不结合至其它CD28家族成员。PD-L1配体在多种人类癌症中为充足的(Dong等人,Nat.Med.,8:787-789(2002))。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润性淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少和癌细胞免疫逃避(Dong等人,J.Mol.Med.,81:281-287(2003)；Blank等人,Cancer Immunol.Immunother.,54:307-314(2005)；Konishi等人,Clin.Cancer Res.,10:5094-5100(2004))。免疫抑制可通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用而逆转，且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时，效应相加(Iwai等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:12293-12297(2002)；Brown等人,J.Immunol.,170:1257-1266(2003))。
还已展示PD-L1与CD80相互作用(Butte MJ等人,Immunity；27:111-122(2007))。已展示PD-L1/CD80对表达免疫细胞的相互作用为抑制性相互作用。已展示阻断该相互作用即消除该抑制性相互作用(Paterson AM等人,J Immunol.,187:1097-1105(2011)；Yang J等人,J Immunol.Aug 1；187(3):1113-9(2011))。
当表达PD-1的T细胞接触表达其配体的细胞时，响应于抗原性刺激的功能活性(包括增殖、细胞因子分泌和细胞毒性)减少。PD-1/PD-L1或PD-L2相互作用在感染或肿瘤消退(resolution)期间或在发展自身耐受性期间下调免疫应答(Keir,M.E.等人,Annu.Rev.Immunol.,26:Epub(2008))。慢性抗原刺激，诸如在肿瘤疾病或慢性感染期间出现的慢性抗原刺激，导致表达升高水平的PD-1且在针对慢性抗原的活性方面功能异常的T细胞(综述于Kim等人,Curr.Opin.Imm.(2010)中)。此称为“T细胞耗竭(T cellexhaustion)”。B细胞也呈现PD-1/PD-配体抑制和“耗竭”。
已展示使用针对PD-L1的抗体阻断PD-1/PD-L1接合(ligation)恢复且强化许多系统中的T细胞活化。患有晚期癌症的患者受益于使用针对PD-L1的单克隆抗体的疗法(Brahmer等人,New Engl.J.Med.(2012))。肿瘤和慢性感染的临床前动物模型已展示通过单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1途径可增强免疫应答且引起肿瘤排斥反应或控制感染。经由PD-1/PD-L1阻断的抗肿瘤免疫疗法可强化针对许多组织学相异肿瘤的治疗性免疫应答(Dong,H.等人,"B7-H1pathway and its role in the evasion of tumor immunity",J.Mol.Med.,81(5):281-287(2003)；Dong,H.等人,"Tumor-associated B7-H1 promotesT-cell apoptosis:a potential mechanism of immune evasion",Nat.Med.,8(8):793-800(2002))。
干扰PD-1/PD-L1相互作用使得具有慢性感染的系统中的T细胞活性增强。阻断PD-L1使得具有慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染的小鼠改善病毒清除且恢复免疫力(Barber,D.L.等人,"Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronicviral infection",Nature,439(7077):682-687(2006))。感染HIV-1的人源化小鼠展示CD4+T细胞针对病毒血症的保护和病毒消耗增强(Palmer等人,J.Immunol.(2013))。经由针对PD-L1的单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1可恢复HIV患者(Day,Nature(2006)；Petrovas,J.Exp.Med.(2006)；Trautman,Nature Med.(2006)；D'Souza,J.Immunol.(2007)；Zhang,Blood(2007)；Kaufmann,Nature Imm.(2007)；Kasu,J.Immunol.(2010)；Porichis,Blood(2011))、HCV患者(Golden-Mason,J.Virol.(2007)；Jeung,J.Leuk.Biol.(2007)；Urbani,J.Hepatol.(2008)；Nakamoto,PLoS Path.(2009)；Nakamoto,Gastroenterology(2008))和HBV患者(Boni,J.Virol.(2007)；Fisicaro,Gastro.(2010)；Fisicaro等人,Gastroenterology(2012)；Boni等人,Gastro.(2012)；Penna等人,J.Hep.(2012)；Raziorrough,Hepatology(2009)；Liang,World J.Gastro.(2010)；Zhang,Gastro.(2008))的T细胞的体外抗原特异性功能。
还已展示阻断PD-L1/CD80相互作用刺激免疫力(Yang J.等人,J Immunol.Aug 1；187(3):1113-9(2011))。已展示由PD-L1/CD80相互作用的阻断产生的免疫刺激经由与另外PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2相互作用的阻断组合而增强。
假设免疫细胞表型改变为败血性休克的重要因素(Hotchkiss等人,Nat RevImmunol(2013))。这些改变包括PD-1和PD-L1的水平增加(Guignant等人,Crit.Care(2011))，PD-1和PD-L1的水平增加的败血性休克患者的细胞展现T细胞凋亡水平增加。针对PD-L1的抗体可降低免疫细胞凋亡的水平(Zhang等人,Crit.Care(2011))。此外，缺少PD-1表达的小鼠与野生型小鼠相比对败血性休克症状更具抗性(Yang J.等人,JImmunol.Aug1；187(3):1113-9(2011))。研究已揭示使用抗体阻断PD-L1相互作用可抑制不当免疫应答且改善病征。
除增强对慢性抗原的免疫应答以外，还已展示阻断PD-1/PD-L1途径增强对疫苗接种(包括在慢性感染的情形下的治疗性疫苗接种)的应答(Ha,S.J.等人,"Enhancingtherapeutic vaccination by blocking PD-1-mediated inhibitory signals duringchronic infection",J.Exp.Med.,205(3):543-555(2008)；Finnefrock,A.C.等人,"PD-1blockade in rhesus macaques:impact on chronic infection and prophylacticvaccination",J.Immunol.,182(2):980-987(2009)；Song,M.-Y.等人,"Enhancement ofvaccine-induced primary and memory CD8+t-cell responses by soluble PD-1",J.Immunother.,34(3):297-306(2011))。
本文所述的分子在生物化学和基于细胞的实验系统中证明阻断PD-L1与PD-1的相互作用的能力。这些结果与治疗性施用增强癌症或慢性感染的免疫力的潜能(包括治疗性疫苗)相符。
发明内容
本文所述的大环肽能够抑制PD-L1与PD-1及与CD80的相互作用。这些化合物已证明高度有效结合至PD-L1、阻断PD-L1与PD-1或CD80的相互作用且能够促进增强T细胞功能活性，因此使其成为肠胃外、口服、经肺、经鼻、含服和持续释放制剂的候选物。
在一方面中，本发明提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐
其中：
A选自键、
其中：
表示与羰基的连接点且表示与氮原子的连接点；
z为0、1或2；
w为1或2；
n为0或1；
m’为0或1；
p为0、1或2；
Rx选自氢、氨基、羟基和甲基；
R14和R15独立选自氢和甲基；且
Rz选自氢和-C(O)NHR16；其中R16选自氢、-CHR17C(O)NH2、-CHR17C(O)NHCHR18C(O)NH2和-CHR17C(O)NHCHR18C(O)NHCH2C(O)NH2；其中R17选自氢和-CH2OH且其中R18选自氢和甲基；
Rv为氢或天然氨基酸侧链；
Q选自
其中Rb定义于下文；和含有一个、两个或三个双键且任选含有一个、两个或三个独立选自氮、氧和硫的杂原子的5-或6员环，其中所述环任选经一个、两个、三个或四个独立选自以下的取代基取代：C1-C6烷氧基羰基、C1-C3烷基、氨基、C1-C3烷基氨基、羧基、C1-C3二烷基氨基、卤素和卤代C1-C3烷基；
U选自
其中Rk定义于下文；和含有一个、两个或三个双键且任选含有一个、两个或三个独立选自氮、氧和硫的杂原子的5-或6员环，其中所述环任选经一个、两个、三个或四个独立选自以下的取代基取代：C1-C6烷氧基羰基、C1-C3烷基、氨基、C1-C3烷基氨基、羧基、C1-C3二烷基氨基、卤素和卤代C1-C3烷基；
条件是Q和U中的至少一个为含有一个、两个或三个双键且含有一个、两个或三个独立选自氮、氧和硫的杂原子的5-或6员环；
Rc、Rf、Rh、Ri、Rm和Rn为氢；
Ra、Re、Rj和Rk各自独立选自氢和甲基；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13独立选自天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链或与如下文所述的相应邻位R基团形成环；
Re和Rk可各自与相应邻位R基团及其所连接的原子形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中各环任选经一至四个独立选自氨基、氰基、甲基、卤素和羟基的基团取代；
Rb为甲基，或Rb和R2与其所连接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中各环任选经一至四个独立选自氨基、氰基、甲基、卤素和羟基的基团取代；
Rd为氢或甲基，或Rd和R4与其所连接的原子一起可形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中各环任选经一至四个独立选自氨基、氰基、甲基、卤素、羟基和苯基的基团取代；
Rg为氢或甲基，或Rg和R7与其所连接的原子一起可形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中各环任选经一至四个独立选自以下的基团取代：氨基、任选经卤素取代的苄基、苄基氧基、氰基、环己基、甲基、卤素、羟基、任选经甲氧基取代的异喹啉基氧基、任选经卤素取代的喹啉基氧基，和四唑基；且其中所述吡咯烷环和哌啶环任选稠合至环己基、苯基或吲哚基团；且
Rl为甲基，或Rl和R12与其所连接的原子一起形成选自氮杂环丁烷和吡咯烷的环，其中各环任选经一至四个独立选自氨基、氰基、甲基、卤素和羟基的基团取代。
在第一方面的第一实施方案中，本发明提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其中：
Q选自和含有一或两个双键且含有一个、两个、三个或四个氮原子的5员环；且
U选自和含有一或两个双键且含有一个、两个、三个或四个氮原子的5员环。在第二实施方案中，A为
在第三实施方案中：
z和w各自为1；
R14和R15为氢；且
Rz为-C(O)NHR16；其中R16为-CHR17C(O)NH2。
在第四实施方案中，R1为苯基C1-C3烷基，其中所述苯基任选经羟基取代；
R2为C1-C7烷基，或Rb和R2与其所连接的原子一起形成吗啉环或哌啶环；
R3选自-CH2CO2H和-CH2C(O)NH2；
R4和Rd与其所连接的原子一起形成吡咯烷环；
R5选自-CH2NH2和-CH2(咪唑基)；
R6选自C1-C7烷基、-CH2CH2C(O)NH2、-CH2CH2CH2CH2NH2和-CH2CH2CO2H；
R7为氢，或R7和Rg与其所连接的原子一起形成任选经羟基取代的吡咯烷环；
R8为-(CH2)吲哚基；
R9选自氨基甲基、羟基甲基、-CH2CH2NH2和CH2CH2CH2CH2NH2；
R10选自-(CH2)吲哚基、-(CH2)萘基和-(CH2)苯并噻吩基，其各自任选经-CH2CO2H取代；
R11为C1-C7烷基；且
R12为C1-C7烷基。
在第二方面中，本发明提供式(II)化合物或其药学上可接受的盐
其中：
A选自键、
其中：
表示与羰基的连接点且表示与氮原子的连接点；
n为0或1；
R14和R15独立选自氢和甲基；且
R16选自氢、-CHR17C(O)NH2、-CHR17C(O)NHCHR18C(O)NH2和-CHR17C(O)NHCHR18C(O)NHCH2C(O)NH2；
其中R17选自氢和-CH2OH且其中R18选自氢和甲基；
Q为含有一个、两个或三个双键且任选含有一个、两个或三个独立选自氮、氧和硫的杂原子的5-或6员环，其中所述环任选经一个、两个、三个或四个独立选自C1-C6烷氧基羰基、C1-C3烷基、氨基、C1-C3烷基氨基、羧基、C1-C3二烷基氨基、卤素和卤代C1-C3烷基的取代基取代；
Ra、Rf、Rj、Rk、Rl和Rm为氢；
Rb和Rc为甲基；
Rg选自氢和甲基；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R9、R10、R11和R12独立选自天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链或与如下文所述的相应邻位R基团形成环；
R20为氢；
R8选自天然氨基酸侧链、非天然氨基酸链，或可与如下文所述的相应邻位R基团形成环，或R8可与R20形成3-至6员碳环；
Rd选自氢和甲基，或Rd和R4与其所连接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中各环任选经一至四个独立选自氨基、氰基、甲基、卤素、卤甲基和羟基的基团取代；
Re选自氢和甲基，或Re和R5与其所连接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中各环任选经一至四个独立选自氨基、氰基、甲基、卤素、卤甲基和羟基的基团取代；且
Rh选自氢和甲基，或Rh和R8与其所连接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中各环任选经一至四个独立选自氨基、氰基、甲基、卤素、卤甲基和羟基的基团取代。
在第二方面的第一实施方案中，本发明提供式(II)化合物或其药学上可接受的盐，其中Q为含有一或两个双键且含有一个、两个、三个或四个氮原子的5员环。在第二实施方案中，A为
在第三实施方案中：
R1和R2为苯基C1-C3烷基；
R3为C1-C7烷基；
R4为氢；
R5为羧基甲基；
R6为C1-C7烷基；
R7为苯基C1-C3烷基；
R8为苯基C1-C3烷基，其中所述苯基经羟基取代，或R8和R20形成6员碳环；
R9为氢；
R10为-(CH2)吲哚基；
R11为经羟基取代的苯基C1-C3烷基；且
R12为C1-C7烷基。
在另一实施方案中，本发明提供一种增强、刺激和/或增加有此需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或其治疗学上可接受的盐。在另一实施方案中，所述方法还包括在式(I)化合物或其治疗学上可接受的盐之前、之后或与其同时施用额外药剂。在另一实施方案中，所述额外药剂为抗微生物剂、抗病毒剂、细胞毒性剂和/或免疫应答调节剂。在另一实施方案中，所述额外药剂为HDAC抑制剂。在另一实施方案中，所述额外药剂为TLR7和/或TLR8激动剂。
在另一实施方案中，本发明提供一种抑制有此需要的受试者的癌细胞生长、增殖或转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或其治疗学上可接受的盐。应理解，所述抑制可为直接或间接的。在另一实施方案中，所述癌症选自黑素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结肠直肠癌、去势抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌及乳腺癌和血液科恶性病。
在另一实施方案中，本发明提供一种治疗有此需要的受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或其治疗学上可接受的盐。在另一实施方案中，所述感染性疾病由病毒引起。在另一实施方案中，所述病毒选自HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒和流感病毒。
在另一实施方案中，本发明提供一种治疗有此需要的受试者的败血性休克的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的一或多种大环肽。
在另一实施方案中，本发明提供一种阻断受试者的PD-L1与PD-1和/或CD80的相互作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的至少一种大环肽。
在R侧链为经甲基取代的环的一部分的式(I)化合物中，应理解，所述甲基可在环中任何可取代的碳原子上，包括作为大环母体结构的一部分的碳。在本发明的化合物中，存在至少一个在具有四个非氢取代基且非式(II)的α-甲基取代环的环的主链上的碳
其中A为如权利要求书中所述的环且其中指示与大环结构的其余部分的连接点。
在式(I)化合物中，优选的R1侧链为：苯丙氨酸、酪氨酸、3-噻吩-2-基、4-甲基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、异色氨酸、3-甲基苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、3,4-二氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、3,4-二甲氧基苯丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸、4-二氟甲基苯丙氨酸、2-甲基苯丙氨酸、2-萘基丙氨酸、色氨酸、4-吡啶基、4-溴苯丙氨酸、3-吡啶基、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、联苯丙氨酸和3-氯苯丙氨酸；及2,4-二氨基丁烷。
在R2并非环的一部分的式(I)化合物中，优选的R2侧链为：丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸。
在式(I)化合物中，优选的R3侧链为：天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、丙氨酸、2,3-二氨基丙烷和2,4-二氨基丁烷。
在R4并非环的一部分的式(I)化合物中，优选的R4侧链为：缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸和甘氨酸。
在式(I)化合物中，优选的R5侧链为：氨基甲烷、组氨酸、天冬酰胺、2,3-二氨基丙烷、丝氨酸、甘氨酸、2,4-二氨基丁烷、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和3-噻唑基丙氨酸。
在式(I)化合物中，优选的R6侧链为：亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、赖氨酸、3-环己烷、苏氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁烷、丙氨酸、精氨酸和鸟氨酸(COCH3)。
在R7并非环的一部分的式(I)化合物中，优选的R7侧链为：甘氨酸、2,4-二氨基丁烷、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸和2,4-二氨基丁烷(C(O)环丁烷)。
在式(I)化合物中，优选的R8侧链为色氨酸和1,2-苯并异噻唑啉基丙氨酸。
在式(I)化合物中，优选的R9侧链为：丝氨酸、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、2,4-二丁胺、苏氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸、2,3-二氨基丙烷、精氨酸、天冬氨酸和酪氨酸。
在式(I)化合物中，优选的R10侧链为：任选经取代的色氨酸、苯并异噻唑基丙氨酸、1-萘基丙氨酸和甲硫氨酸。
在式(I)化合物中，优选的R11侧链为：正亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、甲硫氨酸、乙氧基甲烷、丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯基丙烷、谷氨酸、己烷和庚烷。
在R12并非环的一部分的式(I)化合物中，优选的R12侧链为：正亮氨酸、丙氨酸、乙氧基甲烷、甲硫氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、甲氧基乙烷、亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、己烷、庚烷和甘氨酸。
在式(I)化合物中，优选的R13侧链：精氨酸、鸟氨酸、丙氨酸、2,4-二氨基丁烷、2,3-二氨基丙烷、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、环丙基甲烷、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和2-氨基丁烷。
根据本发明，我们已发现特异性结合至PD-L1且能够抑制PD-L1与PD-1及CD80的相互作用的肽。这些大环肽展现体外免疫调节功效，因此使其成为用于治疗包括癌症和感染性疾病的各种疾病的治疗性候选物。
术语“特异性结合(specific binding或specifically bind)”是指蛋白质与结合分子(诸如化合物或配体)之间的相互作用。相互作用取决于由结合分子识别的蛋白质的具体结构(即，酶结合位点、抗原决定簇或表位)的存在。举例而言，若化合物特异性结合蛋白质结合位点"A"，则在含有包含结合位点A的蛋白质和特异性结合至蛋白质结合位点A的经标记肽的反应物中存在所述化合物将减小结合至所述蛋白质的经标记肽的量。相比之下，化合物对蛋白质的非特异性结合并不导致经标记肽自蛋白质的浓度依赖性置换。
本发明意欲包括本发明化合物中出现的原子的所有同位素。同位素包括原子数相同、但质量数不同的那些原子。通过一般实例但非限制性地，氢的同位素包括氘和氚。碳的同位素包括13C和14C。本发明的同位素标记化合物一般可通过本领域技术人员已知的常规技术或通过类似于本文所述的方法，使用适当同位素标记试剂代替原来使用的未标记试剂来制备。此类化合物可具有多种潜在用途，例如在确定生物学活性时用作标准物和试剂。在稳定同位素的情况下，此类化合物可具有有利地调节生物学、药理学或药物动力学性质的潜能。
本文所述的主题的另一方面为所披露的肽作为放射性标记配体用于配体结合测定的显影或用于监测体内吸收、代谢、分布、受体结合或占据或化合物配置(disposition)的用途。举例而言，本文所述的大环肽可使用放射性同位素125I制备，且所得放射性标记肽可用于显影结合测定或用于代谢研究。可选择地且出于相同目的，本文所述的大环肽可通过使用本领域技术人员已知的方法的催化性氚化转化成放射性标记形式。
本发明的大环肽还可通过使用本领域技术人员已知的方法添加放射性示踪剂而用作PET成像剂。
优选的肽包括本文所提供的大环肽中的至少一种且这些肽可包括于药物组合物和组合产品(combination)中。
具体实施方式
除非在特定情形中另外限制，否则本文所提供的定义非限制性地适用于本说明书通篇所用的术语。
氨基酸和肽化学领域普通技术人员了解氨基酸包括由以下通式结构表示的化合物：
其中R和R'如本文中所论述。
除非另外指明，否则如本文中单独或作为另一基团的一部分使用的术语“氨基酸”包括，但不限于，连接至称为"α"碳的同一碳的氨基和羧基，其中R和/或R'可为天然或非天然侧链，包括氢。在"α"碳处的绝对"S"构型通常称为"L"或"天然"构型。在"R"和"R′"(撇)取代基等于氢的情况下，氨基酸为甘氨酸且不是手性的。
本文使用的术语“天然氨基酸侧链”和“天然存在的氨基酸侧链”是指通常呈S-构型的任何天然存在的氨基酸(即，L-氨基酸)(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、-组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)的侧链。
本文使用的术语“非天然氨基酸侧链”和“非天然存在的氨基酸侧链”是指通常呈R-构型的任何天然存在的氨基酸(即，D-氨基酸)的侧链或除呈R-或S-构型的天然存在的氨基酸侧链(即，分别为D-或L-氨基酸)以外的选自以下的基团：
C2-C7烯基、C1-C3烷氧基C1-C3烷基、C1-C6烷氧基羰基C1-C3烷基、C1-C7烷基、C1-C3烷基硫基C1-C3烷基、酰氨基C1-C3烷基、氨基C1-C3烷基、氮杂吲哚基C1-C3烷基、苯并噻唑基C1-C3烷基、苯并噻吩基C1-C3烷基、苄基氧基C1-C3烷基、羧基C1-C3烷基、C3-C14环烷基C1-C3烷基、二苯基甲基、呋喃基C1-C3烷基、咪唑基C1-C3烷基、萘基C1-C3烷基、吡啶基C1-C3烷基、噻唑基C1-C3烷基、噻吩基C1-C3烷基；
联苯C1-C3烷基，其中联苯任选经甲基取代；
杂环基，其任选经一个、两个、三个、四个或五个独立选自以下的基团取代：C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C1-C3烷基磺酰基氨基、酰氨基、氨基、氨基C1-C3烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、卤素、卤代C1-C3烷基、羟基、-NC(NH2)2、硝基和-OP(O)(OH)2；
吲哚基C1-C3烷基，其中吲哚基部分任选经一个选自C1-C3烷基、羧基C1-C3烷基、卤素、羟基和苯基的基团取代，其中苯基进一步任选经一个、两个或三个独立选自C1-C3烷氧基、C1-C3烷基和卤素的基团取代；
苯基，其任选经一个、两个、三个、四个或五个独立选自以下的基团取代：C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C1-C3烷基磺酰基氨基、酰氨基、氨基、氨基C1-C3烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、卤素、卤代C1-C3烷基、羟基、-NC(NH2)2、硝基和-OP(O)(OH)2；
NRa’Rb’(C1-C7烷基)，其中Ra’和Rb’独立选自氢、C2-C4烯基氧基羰基、C1-C3烷基、C1-C3烷基羰基、C3-C6环烷基羰基、呋喃基羰基和苯基羰基。在烷基连接基团(linker)含有一个以上碳时，其它NRa’Rb’基团可在链上。
NRc’Rd’羰基C1-C3烷基，其中Rc’和Rd’独立选自氢、C1-C3烷基和三苯基甲基；
苯基C1-C3烷基，其中苯基部分任选经一个、两个、三个、四个或五个独立选自以下的基团取代：C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C1-C3烷基磺酰基氨基、酰氨基、氨基、氨基C1-C3烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、卤素、卤代C1-C3烷基、羟基、-NC(NH2)2、硝基和-OP(O)(OH)2；和
苯氧基C1-C3烷基，其中苯基任选经C1-C3烷基取代。
本文使用的术语“C2-C4烯基”是指具有二至四个碳原子、含有至少一个碳-碳双键的直链或支链基团。
本文使用的术语“C2-C7烯基”是指具有二至七个碳原子、含有至少一个碳-碳双键的直链或支链基团。
本文使用的术语“C2-C4烯基氧基”是指经由氧原子连接至母体分子部分的C2-C4烯基。
本文使用的术语“C1-C3烷氧基”是指经由氧原子连接至母体分子部分的C1-C3烷基。
本文使用的术语“C1-C4烷氧基”是指经由氧原子连接至母体分子部分的C1-C4烷基。
本文使用的术语“C1-C6烷氧基”是指经由氧原子连接至母体分子部分的C1-C6烷基。
本文使用的术语“C1-C3烷氧基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的C1-C3烷氧基。
本文使用的术语“C1-C6烷氧基羰基”是指经由羰基连接至母体分子部分的C1-C6烷氧基。
本文使用的术语“C1-C6烷氧基羰基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的C1-C6烷氧基羰基。
本文使用的术语“C1-C3烷基”是指衍生自含有一至三个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。
本文使用的术语“C1-C4烷基”是指衍生自含有一至四个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。
本文使用的术语“C1-C6烷基”是指衍生自含有一至六个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。
本文使用的术语“C1-C3烷基羰基”是指经由羰基连接至母体分子部分的C1-C3烷基。
本文使用的术语“C1-C3烷基氨基”是指-NHR1，其中R1为C1-C3烷基。
本文使用的术语“C1-C3烷基硫基”是指经由硫原子连接至母体分子部分的C1-C3烷基。
本文使用的术语“C1-C3烷基硫基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的C1-C3烷基硫基。
本文使用的术语“C1-C3烷基磺酰基”是指经由磺酰基连接至母体分子部分的C1-C3烷基。
本文使用的术语“C1-C3烷基磺酰基氨基”是指经由氨基连接至母体分子部分的C1-C3烷基磺酰基。
本文使用的术语“酰氨基”是指-C(O)NH2。
本文使用的术语“酰氨基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的酰氨基。
本文使用的术语“氨基”是指-NH2。
本文使用的术语“氨基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的氨基。
本文使用的术语“氨基磺酰基”是指经由磺酰基连接至母体分子部分的氨基。
本文使用的术语“氮杂吲哚基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子的氮杂吲哚基。氮杂吲哚基可经由基团中任何可取代原子连接至烷基部分。
本文使用的术语“苯并噻唑基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子的苯并噻唑基。苯并噻唑基可经由基团中任何可取代原子连接至烷基部分。
本文使用的术语“苯并噻吩基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子的苯并噻吩基。苯并噻吩基可经由基团中任何可取代原子连接至烷基部分。
本文使用的术语“苄基氧基”是指经由氧原子连接至母体分子部分的苯甲基。
本文使用的术语“苄基氧基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的苄基氧基。
本文使用的术语“联苯C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的联苯基。联苯基可经由基团中任何可取代原子连接至烷基部分。
本文使用的术语“羰基”是指-C(O)-。
本文使用的术语“羧基”是指-CO2H。
本文使用的术语“羧基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的羧基。
本文使用的术语“氰基”是指-CN。
本文使用的术语“C3-C14环烷基”是指具有3至14个碳原子和0个杂原子的饱和单环、双环或三环烃环系统。双环和三环环可为稠合、螺环或桥接环。环烷基的代表性实例包含但不限于环丙基、环戊基、双环[3.1.1]庚基和金刚烷基。
本文使用的术语“C3-C14环烷基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的C3-C14环烷基。
本文使用的术语“C3-C14环烷基羰基”是指经由羰基连接至母体分子部分的C3-C14环烷基。
本文使用的术语“C1-C3二烷基氨基”是指-NR1R2，其中R1和R2各自为含有一至三个碳原子的烷基。所述基团可相同或不同。
本文使用的术语“呋喃基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的呋喃基。呋喃基可经由基团中的任一可取代原子连接至烷基部分。
本文使用的术语“呋喃基羰基”是指经由羰基连接至母体分子部分的呋喃基。
本文使用的术语“卤基”和“卤素”是指F、Cl、Br或I。
本文使用的术语“卤代C1-C3烷基”是指经一个、两个或三个卤素原子取代的C1-C3烷基。
本文使用的术语“卤甲基”是指经一个、两个或三个卤素原子取代的甲基。
本文使用的术语“杂环基”是指含有一个、两个或三个独立选自氮、氧和硫的杂原子的5-、6-或7员环。5员环具有0至2个双键，且6员和7员环具有0至3个双键。术语“杂环基”还包括杂环基环稠合至4-至6员芳族或非芳族碳环或另一单环杂环基的双环基团。本发明的杂环基经由基团中的碳原子连接至母体分子部分。杂环基的实例包括，但不限于，苯并噻吩基、呋喃基、咪唑基、吲哚啉基、吲哚基、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基、噁唑基、哌嗪基、哌啶基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、吡咯并吡啶基、吡咯基、噻唑基、噻吩基和硫吗啉基。
本文使用的术语“羟基”是指-OH。
本文使用的术语“咪唑基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的咪唑基。咪唑基可经由基团中的任一可取代原子连接至烷基部分。
本文使用的术语“吲哚基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的吲哚基。吲哚基可经由基团中的任一可取代原子连接至烷基部分。
本文使用的术语“萘基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的萘基。萘基可经由基团中的任一可取代原子连接至烷基部分。
本文使用的术语“硝基”是指-NO2。
本文使用的术语“NRa’Rb’”是指经由氮原子连接至母体分子部分的两个基团Ra’和Rb’。Ra’和Rb’独立选自氢、C2-C4烯基氧基羰基、C1-C3烷基羰基、C3-C6环烷基羰基、呋喃基羰基和苯基羰基。
本文使用的术语“NRa’Rb’(C1-C3)烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的NRa’Rb’基团。
本文使用的术语“NRc’Rd’”是指经由氮原子连接至母体分子部分的两个基团Rc’和Rd’。Rc’和Rd’独立选自氢、C1-C3烷基和三苯基甲基。
本文使用的术语“NRc’Rd’羰基”是指经由羰基连接至母体分子部分的NRc’Rd’基团。
本文使用的术语“NRc’Rd’羰基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的NRc’Rd’羰基。
本文使用的术语“苯氧基”是指经由氧原子连接至母体分子部分的苯基。
本文使用的术语“苯氧基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的苯氧基。
本文使用的术语“苯基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的苯基。
本文使用的术语“苯基羰基”是指经由羰基连接至母体分子部分的苯基。
本文使用的术语“吡啶基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的吡啶基。吡啶基可经由基团中的任一可取代原子连接至烷基部分。
本文使用的术语“硫基”是指-S-。
本文使用的术语“磺酰基”是指-SO2-。
本文使用的术语“噻唑基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的噻唑基。噻唑基可经由基团中的任一可取代原子连接至烷基部分。
本文使用的术语“噻吩基C1-C3烷基”是指经由C1-C3烷基连接至母体分子部分的噻吩基。噻吩基可经由基团中的任一可取代原子连接至烷基部分。
术语“治疗”是指：(i)预防可能易患疾病、病症和/或病状、但尚未诊断出患病的患者出现所述疾病、病症或病状；(ii)抑制所述疾病、病症或病状，即，遏制其发展；及(iii)缓解所述疾病、病症或病状，即，使得所述疾病、病症和/或病状和/或与所述疾病、病症和/或病状相关的症状消退。
大环肽与PD-L1的结合可例如通过诸如均相时间分辨荧光(HTRF)、表面等离子共振(SPR)、等温滴定量热法(ITC)、核磁共振光谱(NMR)等的方法测量。另外，大环肽与表达于细胞表面上的PD-L1的结合可如本文所述在细胞结合测定中测量。
施用本文所述的治疗剂包括，但不限于，施用治疗有效量的治疗剂。如本文所用，术语“治疗有效量”是指，但不限于，治疗或预防通过施用本文所述的PD-1/PD-L1结合抑制剂的组合物可治疗的病状的治疗剂的量。该量为足以展现可检测的治疗性或预防性或改善性效应的量。效应可包括例如，但不限于，本文中所列举的病状的治疗或预防。受试者的精确有效量将取决于受试者的体型及健康状况、欲治疗的病状的性质及程度、治疗医师的建议及选择用于施用的治疗剂或治疗剂组合。因此，事先规定精确有效量是不可用的。
在另一个方面中，本发明涉及使用本发明的大环肽抑制受试者肿瘤细胞生长的方法。如本文所证实，本发明的大环肽能够结合至PD-L1、妨碍PD-L1与PD-1之间的相互作用、与PD-L1与已知阻断与PD-1的相互作用的抗-PD-1单克隆抗体的结合竞争、增强CMV特异性T细胞IFNγ分泌和增强HIV特异性T细胞IFNg分泌。因此，本发明的大环肽可用于调节免疫应答、治疗诸如癌症或感染性疾病的疾病、刺激保护性自身免疫应答或刺激抗原特异性免疫应答(例如，通过共施用PD-L1阻断肽与感兴趣的抗原)。
为了使本发明可更易于理解，首先定义某些术语。在整个实施方式中，阐述其他定义。
术语“程序性死亡配体1”、“程序性细胞死亡配体1”、“PD-L1蛋白”、“PD-L1”、“PDL1”、“PDCDL1”、“hPD-L1”、“hPD-LI”、“CD274”和“B7-H1”可互换使用且包括人类PD-L1的变体、同工型、物种同源物和具有至少一个与PD-L1共同的表位的类似物。完整PD-L1序列可见于登记号NP_054862。
术语“程序性死亡1”、“程序性细胞死亡1”、“PD-1蛋白”、“PD-1”、“PD1”、“PDCD1”、“hPD-1”和“hPD-I”可互换使用且包括人类PD-1的变体、同工型、物种同源物和具有至少一个与PD-1共同的表位的类似物。完整PD-1序列可见于登记号U64863。
术语“细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4”、“CTLA-4”、“CTLA4”、“CTLA-4抗原”和“CD152”(参见例如Murata,Am.J.Pathol.,155:453-460(1999))可互换使用且包括人类CTLA-4的变体、同工型、物种同源物和具有至少一个与CTLA-4共同的表位的类似物(参见例如Balzano,Int.J.Cancer Suppl.,7:28-32(1992))。完整CTLA-4核酸序列可见于登记号L15006。
术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原递呈细胞、吞噬细胞、粒细胞和由以上细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括大环肽、细胞因子和补体)产生对侵入病原体、感染有病原体的细胞或组织、癌细胞或在自身免疫或病理性炎症的情况下正常人类细胞或组织的选择性损坏、破坏或自人体消除的作用。
如本文所用，“不良事件”(AE)为与医学治疗的使用相关的任何不利且一般不希望、甚至不当迹象(包括异常实验室研究结果)、症状或疾病。举例而言，不良事件可与响应于治疗的免疫系统的活化或免疫系统细胞(例如，T细胞)的扩展相关。医学治疗可具有一或多个相关AE且各AE可具有相同或不同水平的严重度。提及能够“改变不良事件”的方法意指降低与不同治疗方案的使用相关联的一或多个AE的发生率和/或严重度的治疗方案。
如本文所用，“过度增殖性疾病”是指细胞生长增加超过正常水平的病状。举例而言，过度增殖性疾病或病症包括恶性疾病(例如，食道癌、结肠癌、胆道癌)和非恶性疾病(例如，动脉粥样硬化、良性增殖和良性前列腺肥大)。
如本文所用，“约”或“基本上包含”意指在如由本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受的误差范围内，其将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。举例而言，“约”或“基本上包含”可意指根据本领域的实践在一个或一个以上标准差内。可选择地，“约”或“基本上包含”可意指至多20％的范围。此外，尤其在生物系统或方法方面，所述术语可意指值的至多一个数量级或至多5倍。当在本申请和权利要求书中提供具体值时，除非另外陈述，否则“约”或“基本上包含”的含义应假定为在该具体值的可接受的误差范围内。
如本文所述，除非另外指明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括在所列举范围内的任何整数值，以及在适当时，它们的分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。
竞争测定
本发明还涉及能够与参考抗-PD-L1抗体(MDX-1105)竞争结合达至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％和至少约100％的大环肽。此类大环肽可与一或多种本文所披露的大环肽共享结构同源性，包括突变体、保守取代、功能取代和缺失形式，前提为其特异性结合至PD-L1。举例而言，若大环肽结合至与参考抗-PD-L1抗体基本上相同的PD-L1区，则大环肽应结合至与抗-PD-L1单克隆抗体所结合的PD-L1表位至少重叠的PD-L1表位。重叠区可在一个氨基酸残基至数百个氨基酸残基的范围内变化。接着大环肽应在竞争测定中与抗-PD-L1单克隆抗体与PD-L1的结合竞争和/或阻断该结合，从而减少抗-PD-L1单克隆抗体与PD-L1的结合，优选达至少约50％。
出于竞争测定目的可用作参考抗体的抗-PD-L1抗体为本领域已知的。举例而言，可使用以下代表性抗-PD-L1抗体：MDX-1105(BMS)；L01X-C(Serono)、L1X3(Serono)、MSB-0010718C(Serono)和PD-L1Probody(CytomX)及共同拥有的WO 2007/005874中所披露的PD-L1抗体。
出于竞争测定目的可用作参考抗体的抗-PD-1抗体为本领域已知的。举例而言，可使用以下代表性抗-PD-1抗体：纳武单抗(nivolumab)(BMS)；共同拥有的美国专利第8,008,449号中所分别披露的17D8、2D3、4H1、4A11、7D3和5F4(BMS)、MK-3475(Merck，美国专利第8,168,757号中所披露)和美国专利第7,488,802号中所披露的抗体。
药物组合物
在另一个方面中，本发明提供一种组合物，例如，药物组合物，其含有与药学上可接受的载体一起调配的一种本发明的大环肽或本发明的大环肽的组合。此类组合物可包括一种本发明的大环肽或免疫缀合物或双特异性分子或(例如，两种或更多种不同的)本发明的大环肽或免疫缀合物或双特异性分子的组合。举例而言，本发明的药物组合物可包含结合至靶抗原上的不同表位或具有互补活性的大环肽(或免疫缀合物或双特异性物)的组合。
本发明的药物组合物还可在组合疗法中(即，与其他药剂组合)施用。举例而言，组合疗法可包括大环肽与至少一种其他抗炎剂或免疫抑制剂的组合。可用于组合疗法的治疗剂的实例更详细地描述于下文关于本发明的大环肽的用途的部分中。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何及全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓(spinal)或表皮施用(例如，通过注射或输注)。取决于使用途径，活性化合物(即，大环肽、免疫缀合物或双特异性分子)可包覆在材料中以保护所述化合物免受酸作用及可使所述化合物不活化的其他天然条件。
本发明的药物化合物可包括一或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”或“治疗学上可接受的盐”是指保留母体化合物的期望生物活性且未赋予任何不期望的毒理学效应的盐(参见例如Berge,S.M.等人,J.Pharm.Sci.,66:1-19(1977))。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸(诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)以及衍生自无毒有机酸(诸如脂族单羧酸和二羧酸、经苯基取代的烷酸、羟基烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等)的盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属(诸如钠、钾、镁、钙等)以及衍生自无毒有机胺(诸如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因(procaine)等)的盐。
本发明的药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；及(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本发明药物组合物中的合适水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。可例如通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、通过在分散液的情况下通过维持所需粒度及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。
这些组合物还可含有佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌操作(见上文)及通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)而确保防止微生物存在。还可能需要在组合物中包括等张剂，诸如糖、氯化钠等。另外，可注射药物形式的延长吸收可通过包括延迟吸收剂(诸如单硬脂酸铝和明胶)来达成。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌散剂。此类介质和药剂用于药学活性物质的用途为本领域已知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于本发明的药物组合物中。组合物中还可掺入补充性活性化合物。
治疗组合物通常必须在制造和储存条件下无菌且稳定。组合物可调配为溶液、微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情况下，组合物中将优选包括等张剂，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来达成。
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物与一种上列成分或成分组合一起掺入适当溶剂中，如果需要接着灭菌微过滤来制备。一般而言，分散液通过将活性化合物掺入含有碱性分散介质和所需上列其他成分的无菌媒介物中来制备。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法自其预先无菌过滤溶液产生活性成分粉末加任何额外期望成分。
可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的受试者、具体施用模式而变化。可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量一般为产生治疗性效应的组合物的量。一般而言，在100％中，该量将介于约0.01％至约99％的活性成分、优选约0.1％至约70％、最佳约1％至约30％的活性成分与药学上可接受的载体组合。
调节剂量方案以得到最佳期望响应(例如治疗响应)。举例而言，可施用单一药团(bolus)，可随时间施用若干分次剂量，或可如治疗情形的紧急程度所指示而按比例减少或增加剂量。就施用简便性和剂量均一性而言，将肠胃外组合物调配成单位剂型尤其有利。如本文所用的单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗的受试者的实体上离散单位；各单位含有与所需药物载体结合的经计算以产生期望治疗性效应的预定量活性化合物。本发明的单位剂型的规格通过以下情况指定且直接取决于以下情况：(a)活性化合物的独特特征和欲达成的具体治疗性效应，及(b)混配用于治疗个体敏感性的此类活性化合物的技术中的固有限制。
关于大环肽的施用，剂量范围介于宿主体重的约0.0001至100mg/kg且更通常0.01至5mg/kg。举例而言，剂量可为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。例示性治疗方案需要每天一次、每天两次、一周两次(bi-weekly)、一周三次(tri-weekly)、一周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、一月一次、每3个月一次或每3至6个月一次施用。本发明的大环肽的优选剂量方案包括经由静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，同时使用以下给药时间表的一种施用大环：(i)每四周六次剂量，接着每三个月；(ii)每三周；(iii)3mg/kg体重一次，接着每三周1mg/kg体重。
在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种大环肽，在此情况下，所施用的各化合物的剂量属于所指示的范围内。化合物通常在多个时刻施用。单次剂量之间的间隔可为例如每周、每月、每三个月或每年。间隔亦可为不规律的，通过测量患者中针对靶抗原的大环肽的血液水平所指示。在一些方法中，调节剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆浓度，且在一些方法中达到约25-300μg/ml。
可选择地，大环肽可以持续释放制剂形式施用，在此情况下不需要频繁施用。施用的剂量和频率可取决于治疗为预防性或治疗性而变化。在预防性应用中，在长时期内，以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对较短的间隔施用相对较高的剂量，直至疾病的进展降低或终止，且优选直至患者展示疾病的症状的部分或完全改善。此后，可向患者施用预防性方案。
可改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量，以便获得在对患者无毒性的情况下有效达成特定患者、组合物和施用模式的期望治疗响应的量的活性成分。所选剂量水平将取决于多种药物动力学因素，包括本发明所用具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性；施用途径；施用时间；所用具体化合物的排泄率；治疗持续时间；与所用具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质；所治疗患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况和先前病史；及医学领域公知的类似因素。
“治疗有效剂量”的本发明的大环肽优选使得疾病症状的严重度降低、无疾病症状期的频率或持续时间增加或预防疾病病痛所致的损伤或失能。举例而言，关于肿瘤治疗，“治疗有效剂量”优选相对于未经治疗的受试者抑制细胞生长或肿瘤生长达至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％且再更优选至少约80％。化合物抑制肿瘤生长和/或HIV的能力可在预测对人类肿瘤的功效或病毒功效的动物模型系统中评价。可选择地，组合物的该特性可通过利用本领域技术人员已知的测定检查化合物的抑制能力(诸如体外抑制)来评价。治疗有效量的治疗性化合物可在受试者体内减小肿瘤尺寸、减少病毒负荷或以其他方式改善症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者体型、受试者症状的严重度和所选特定组合物或施用途径的因素来确定此类量。
在另一个方面中，本发明提供一种分装部分的药物试剂盒，其如本文所述包含大环肽和另一种免疫调节剂。所述试剂盒还可另外包含治疗过度增殖性疾病(诸如，如本文所述的癌症)和/或抗病毒疾病的使用说明书。
本发明的组合物可经由一或多种施用途径、使用本领域已知的多种方法中的一或多者来施用。如本领域技术人员应了解，施用途径和/或模式将取决于期望结果而变化。本发明的大环肽的优选施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外通常通过注射进行的施用模式，且包括，但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内、硬膜外及胸骨内注射和输注。
可选择地，本发明的大环肽可经由非肠胃外途径施用，诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、经阴道、经直肠、舌下或局部。
活性化合物可与将保护化合物免于快速释放的载体一起制备，诸如控制释放制剂，包括植入物、经皮贴剂和微胶囊化递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法已获得专利或一般为本领域技术人员已知。参见例如Robinson,J.R.编,Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,Marcel Dekker,Inc.,NewYork(1978)。
治疗性组合物可用本领域已知的医疗装置施用。举例而言，在一个优选实施方案中，本发明的治疗性组合物可用无针皮下注射装置施用，诸如美国专利第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号或第4,596,556号中所披露的装置。适用于本发明的公知植入物和模组的实例包括：美国专利第4,487,603号，其披露一种以受控速率施配药物的可植入微输注泵；美国专利第4,486,194号，其披露一种经由皮肤施用药物的治疗性装置；美国专利第4,447,233号，其披露一种以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利第4,447,224号，其披露一种用于连续药物递送的可变流动可植入输注装置；美国专利第4,439,196号，其披露一种具有多腔隔室的渗透药物递送系统；及美国专利第4,475,196号，其披露一种渗透药物递送系统。这些专利以引用的方式并入本文中。许多其他此类植入物、递送系统和模组为本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，本发明的大环肽可经调配以确保恰当体内分布。举例而言，血脑屏障(BBB)排除多种高度亲水性化合物。为确保本发明的治疗性化合物穿过BBB(必要时)，它们可调配成例如脂质体。关于制造脂质体的方法，参见例如美国专利第4,522,811号、第5,374,548号和第5,399,331号。脂质体可包含选择性输送至特定细胞或器官中的一或多个部分，由此增强靶向药物递送(参见例如Ranade,V.V.,J.Clin.Pharmacol.,29:685(1989))。例示性靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如Low等人的美国专利第5,416,016号)；甘露糖(Umezawa等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,153:1038(1988))；大环肽(Bloeman,P.G.等人,FEBS Lett.,357:140(1995)；Owais,M.等人,Antimicrob.AgentsChemother.,39:180(1995))；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人,Am.J.Physiol.,1233:134(1995))；p120(Schreier等人,J.Biol.Chem.,269:9090(1994))；还参见Keinanen,K.等人,FEBS Lett.,346:123(1994)；Killion,J.J.等人,Immunomethods 4:273(1994)。
本发明的用途和方法
本发明的大环肽、组合物和方法具有许多体外和体内效用，涉及例如检测PD-L1或通过阻断PD-L1增强免疫应答。举例而言，这些分子可施用至体外或离体培养物中的细胞或施用至人类受试者(例如体内)以在多种情形中增强免疫力。因此，在一个方面中，本发明提供一种调节受试者的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用本发明的大环肽以便调节所述受试者的免疫应答。优选地，增强、刺激或上调反应。在其他方面中，大环肽可具有抗-猕猴、抗-小鼠和/或抗-土拨鼠结合和治疗活性。
如本文所用，术语“受试者”意欲包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人类灵长类动物、羊、犬、猫、牛、马、鸡、土拨鼠、两栖动物和爬行动物，但哺乳动物为优选，诸如非人类灵长类动物、羊、犬、猫、牛和马。优选受试者包括需要增强免疫应答的人类患者。所述方法尤其适用于治疗患有可通过强化T细胞介导的免疫应答治疗的病症的人类患者。在一个特定实施方案中，所述方法尤其适用于体内处理癌细胞。为实现抗原特异性免疫力增强，大环肽可连同感兴趣的抗原一起施用。当针对PD-L1的大环肽连同另一药剂一起施用时，两者可以任一次序或同时施用。
本发明另外提供用于检测样品中人类、土拨鼠、猕猴和/或小鼠PD-L1抗原的存在或测量人类、土拨鼠、猕猴和/或小鼠PD-L1抗原的量的方法，其包括使所述样品和对照样品与特异性结合至人类、土拨鼠、猕猴和/或小鼠PD-L1的参考大环肽在允许在所述大环与人类、土拨鼠、猕猴和/或小鼠PD-L1之间形成复合物的条件下接触。接着检测复合物的形成，其中样品与对照样品相比的差异复合物形成指示样品中存在人类、土拨鼠、猕猴和/或小鼠PD-L1抗原。
鉴于本发明的大环肽对于PD-L1与CD28、ICOS和CTLA-4相比的特异性结合，本发明的大环肽可用于特异性检测细胞表面上的PD-L1表达，且此外，可用于经由免疫亲和力纯化来纯化PD-L1。
癌症
通过大环肽阻断PD-1可增强患者针对癌细胞的免疫应答。PD-1的配体PD-L1并不表达在正常人类细胞中，但大量存在于多种人类癌症中(Dong等人,Nat.Med.,8:787-789(2002))。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润性淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少和癌细胞免疫逃避(Dong等人,J.Mol.Med.,81:281-287(2003)；Blank等人,CancerImmunol.Immunother.,54:307-314(2005)；Konishi等人,Clin.Cancer Res.,10:5094-5100(2004))。免疫抑制可通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用而逆转，且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时，效应相加(Iwai等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,99:12293-12297(2002)；Brown等人,J.Immunol.,170:1257-1266(2003))。虽然先前研究已展示T细胞增殖可通过抑制PD-1与PD-L1的相互作用而恢复，但尚未报道通过阻断PD-1/PD-L1相互作用对体内癌症肿瘤生长的直接效应。在一个方面中，本发明涉及使用大环肽体内治疗受试者，使得癌性肿瘤生长受到抑制。大环肽可单独用于抑制癌性肿瘤生长。可选择地，大环肽可如下所述与其他免疫原性剂、标准癌症治疗或其他大环肽结合使用。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种抑制受试者的肿瘤细胞生长的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的大环肽。
可使用本发明的大环肽抑制生长的优选癌症包括通常响应于免疫疗法的癌症。治疗的优选癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾细胞癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺癌和去势抗性前列腺癌)、乳腺癌、结肠直肠癌和肺癌(例如，鳞状和非鳞状非小细胞肺癌)。另外，本发明包括可使用本发明的大环肽抑制生长的难治性或复发性恶性病。
可使用本发明的方法治疗的其他癌症的实例包括骨癌；胰腺癌；皮肤癌；头颈癌；皮肤或眼内恶性黑素瘤；子宫癌；卵巢癌；结肠癌；直肠癌；肛门区癌；胃癌；睾丸癌；子宫癌；输卵管癌；子宫内膜癌；子宫颈癌；阴道癌；外阴癌；霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)；非霍奇金氏淋巴瘤；食道癌；小肠癌；内分泌系统癌；甲状腺癌；甲状旁腺癌；肾上腺癌；软组织肉瘤；尿道癌；阴茎癌；慢性或急性白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病；儿童实体肿瘤；淋巴细胞性淋巴瘤；膀胱癌；肾癌或输尿管癌；肾盂癌；中枢神经系统(CNS)赘瘤；原发性CNS淋巴瘤；肿瘤血管生成；脊轴肿瘤；脑干神经胶质瘤；垂体腺瘤；卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)；表皮样癌；鳞状细胞癌；T细胞淋巴瘤；环境诱发癌，包括由石棉诱发的癌症；及所述癌症的组合。本发明还可用于治疗转移性癌症，尤其表达PD-L1的转移性癌症(Iwai等人,Int.Immunol.,17:133-144(2005))。
任选地，针对PD-L1的大环肽可与以下免疫原性剂组合，诸如癌细胞、经纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白质、肽和碳水化合物分子)、细胞和转染有编码免疫刺激细胞因子的基因的细胞(He等人,J.Immunol.,173:4919-4928(2004))。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，诸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽，或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(下文进一步论述)。
在人类中，已展示一些肿瘤具有免疫原性，诸如黑素瘤。预期通过利用PD-L1阻断升高T细胞活化的阈值，我们可预计活化宿主中的肿瘤响应。
当与疫苗接种方案组合时，PD-L1阻断可能最有效。已设计出针对肿瘤的许多实验性疫苗接种策略(参见Rosenberg,S.,Development of Cancer Vaccines,ASCOEducational Book Spring:60-62(2000)；Logothetis,C.,ASCO Educational BookSpring:300-302(2000)；Khayat,D.,ASCO Educational Book Spring:414-428(2000)；Foon,K.,ASCO Educational Book Spring:730-738(2000)；还参见Restifo,N.等人,Cancer Vaccines,第61章,第3023-3043页,DeVita,V.等人编,Cancer:Principles andPractice of Oncology,第五版(1997))。在这些策略之一中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。已显示这些细胞疫苗在肿瘤细胞经转导以表达GM-CSF时最有效。已显示GM-CSF为用于肿瘤疫苗接种的抗原递呈的强活化剂(Dranoff等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:3539-3543(1993))。
各种肿瘤中基因表达和大规模基因表达模式的研究已产生所谓肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg,S.A.,Immunity,10:281-287(1999))。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原为肿瘤中及出现肿瘤的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可展示为宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。PD-L1阻断可用于与表达于肿瘤中的重组蛋白质和/或肽的集合结合使用以产生针对这些蛋白质的免疫应答。这些蛋白质通常被免疫系统视为自体抗原且因此对其具耐受性。肿瘤抗原还可包括蛋白质端粒酶，其为合成染色体的端粒所必需的且表达于超过85％的人类癌症中且仅表达于有限数目的体细胞组织中(Kim,N等人,Science,266:2011-2013(1994))。(可通过各种手段保护这些体细胞组织免受免疫攻击)。肿瘤抗原还可为由于改变蛋白质序列或在两个无关序列之间形成融合蛋白(即，费城染色体(Philadelphia chromosome)中的bcr-abl)的体细胞突变而在癌细胞中表达的“新抗原”或B细胞肿瘤的受试者基因型。
其他肿瘤疫苗可包括人类癌症中所牵涉的病毒的蛋白质，所述病毒诸如人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可与PD-L1阻断结合使用的肿瘤特异性抗原的另一形式为自肿瘤组织自身分离的经纯化热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有肿瘤细胞蛋白质的片段且这些HSP高效递送至抗原递呈细胞以引发肿瘤免疫力(Suot,R.等人,Science,269:1585-1588(1995)；Tamura,Y.等人,Science,278:117-120(1997))。
树突状细胞(DC)为可用于引发抗原特异性应答的强抗原递呈细胞。DC可离体产生且负载有各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle,F.等人,Nat.Med.,4:328-332(1998))。DC还可通过基因方法转导从而也表达这些肿瘤抗原。DC还已出于免疫目的而直接与肿瘤细胞融合(Kugler,A.等人,Nat.Med.,6:332-336(2000))。作为疫苗接种的方法，DC免疫作用可与PD-L1阻断有效组合以活化更强抗肿瘤响应。
PD-L1阻断还可与标准癌症治疗组合。PD-L1阻断可与化学治疗方案有效组合。在这些情形中，有可能减小所施用的化学治疗剂的剂量(Mokyr,M.等人,Cancer Res.,58:5301-5304(1998))。此类组合的一个实例为大环肽与达卡巴嗪(decarbazine)组合用于治疗黑素瘤。此类组合的另一个实例为大环肽与白介素-2(IL-2)组合用于治疗黑素瘤。支持PD-L1阻断与化学疗法组合使用的科学基本原理在于作为大部分化学治疗化合物的细胞毒性作用结果的细胞死亡应使得抗原递呈途径中肿瘤抗原的水平增加。可经由细胞死亡而与PD-L1阻断产生协同作用的其他组合疗法为辐射、手术和激素去除(hormonedeprivation)。这些方案中的每一种产生宿主中的肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂还可与PD-L1阻断组合。抑制血管生成导致肿瘤细胞死亡，其可将肿瘤抗原馈至宿主抗原递呈途径中。
PD-L1阻断大环肽还可与使表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性大环肽组合使用(参见例如，美国专利第5,922,845号和第5,837,243号)。双特异性大环肽可用于靶向两个单独抗原。举例而言，抗-Fc受体/抗肿瘤抗原(例如，Her-2/neu)双特异性大环肽已用于使巨噬细胞靶向肿瘤位点。该靶向可更有效地活化肿瘤特异性响应。这些响应的T细胞臂通过使用PD-L1阻断来强化。可选择地，可通过使用结合至肿瘤抗原和树突状细胞特异性细胞表面标记的双特异性大环肽将抗原直接递送至DC。
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。许多这些机制可通过使肿瘤所表达且具免疫抑制性的蛋白质不活化来克服。这些蛋白质尤其包括TGF-β(Kehrl,J.等人,J.Exp.Med.,163:1037-1050(1986))、IL-10(Howard,M.等人,Immunology Today,13:198-200(1992))和Fas配体(Hahne,M.等人,Science,274:1363-1365(1996))。针对这些实体中的每一种的大环肽可与抗-PD-L1组合使用，以抵消免疫抑制剂的效应且促进宿主的肿瘤免疫应答。
可用于活化宿主免疫应答的其他大环肽可与抗-PD-L1组合使用。这些大环肽包括树突状细胞表面上活化DC功能和抗原递呈的分子。抗-CD40大环肽能够有效替代辅助T细胞活性(Ridge,J.等人,Nature,393:474-478(1998))且可与PD-1抗体结合使用(Ito,N.等人,Immunobiology,201(5):527-540(2000))。活化针对以下T细胞协同刺激分子的大环肽还可使得T细胞活化水平增加，诸如CTLA-4(例如，美国专利第5,811,097号)、OX-40(Weinberg,A.等人,Immunol.,164:2160-2169(2000))、4-1BB(Melero,I.等人,Nat.Med.,3:682-685(1997)和ICOS(Hutloff,A.等人,Nature,397:262-266(1999))。
骨髓移植目前用于治疗多种造血来源的肿瘤。虽然移植物抗宿主病为该治疗的后果，但可自移植物抗肿瘤响应获得治疗效益。PD-L1阻断可用于增加供体移植的肿瘤特异性T细胞的有效性。
还存在涉及抗原特异性T细胞的离体活化和扩展及将这些细胞过继性转移至接受者中以便抗原特异性T细胞抗肿瘤的数个实验性治疗方案(Greenberg,R.等人,Science,285:546-551(1999))。这些方法还可用于活化针对诸如CMV的感染物的T细胞响应。在大环肽存在下的离体活化可预期增加过继性转移T细胞的频率和活性。
感染性疾病
本发明的其他方法用于治疗已暴露于特定毒素或病原体的患者。因此，本发明的另一个方面提供一种治疗受试者的感染性疾病的方法，其包括向所述受试者施用本发明的大环肽，以便治疗所述受试者的感染性疾病。
与其如上文所论述的针对肿瘤的应用类似，PD-L1阻断可单独使用或作为佐剂与疫苗组合使用以刺激针对病原体、毒素和自体抗原的免疫应答。该治疗方法可特别适用的病原体的实例包括当前无有效疫苗的病原体或常规疫苗不完全有效的病原体。这些病原体包括，但不限于，HIV、肝炎(甲型、乙型和丙型)病毒、流感病毒、疱疹病毒、梨形鞭毛虫属(Giardia)、疟疾(Butler,N.S.等人,Nature Immunology 13,188-195(2012)；Hafalla,J.C.R.等人,PLOS Pathogens；February 2,2012))、利什曼原虫属(Leishmania)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas Aeruginosa)。PD-L1阻断特别适用于抵抗由经感染过程递呈改变抗原的感染物(诸如HIV)所确立的感染。这些新颖表位在施用抗-人类PD-L1时识别为外来的，因此经由PD-L1引起通过阴性信号未抑制的强T细胞响应。
引起可通过本发明方法治疗的感染的病原性病毒的一些实例包括HIV、肝炎(甲型、乙型和丙型)病毒、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒(EpsteinBarr virus))、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、冠状病毒、呼吸道融合胞体病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒(molluscumvirus)、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒。
引起可通过本发明方法治疗的感染的病原菌的一些实例包括衣原体(chlamydia)、立克次体细菌(rickettsial bacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和淋球菌(conococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、军团菌(legionella)、白喉(diphtheria)、沙门氏菌(salmonella)、杆菌(bacilli)、霍乱(cholera)、破伤风(tetanus)、肉毒中毒(botulism)、炭疽病(anthrax)、瘟疫(plague)、钩端螺旋体病(leptospirosis)和莱姆病(Lymes disease)细菌。
引起可通过本发明方法治疗的感染的病原性真菌的一些实例包括念珠菌属(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克鲁斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲菌属(Aspergillus)(烟曲霉(fumigatus)、黑曲菌(niger)等)、毛霉目(Mucorales)属(毛霉菌属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉属(rhizophus))、申克氏胞丝菌(Sporothrixschenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可通过本发明方法治疗的感染的病原性寄生虫的一些实例包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、大肠纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴原虫(Naegleriafowleri)、棘阿米巴虫属(Acanthamoeba sp.)、兰比亚梨形鞭毛虫(Giardialambia)、隐胞子虫属(Cryptosporidium sp.)、肺炎肺囊虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫、微小巴倍虫、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondi)和巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
在所有以上方法中，PD-L1阻断可与以下其他形式的免疫疗法组合，从而提供增强的肿瘤抗原递呈，诸如细胞因子治疗(例如，干扰素、靶向VEGF活性或VEGF受体的药剂、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或双特异性抗体疗法(参见例如Holliger,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)；Poljak,Structure,2:1121-1123(1994))。
自身免疫反应
大环肽可引起且放大自身免疫应答。实际上，使用肿瘤细胞和肽疫苗诱发抗肿瘤相应揭示许多抗肿瘤响应涉及抗自体反应性(在抗-CTLA-4+GM-CSF调节的B 16黑素瘤中观测到去色素(van Elsas等人,见上文)；Trp-2疫苗接种小鼠中的去色素(Overwijk,W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:2982-2987(1999))；由TRAMP肿瘤细胞疫苗引起的自身免疫前列腺炎(Hurwitz,A.,见上文(2000))、在人类临床试验中观测到黑素瘤肽抗原疫苗接种和白癜风(Rosenberg,S.A.等人,J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.,19(1):81-84(1996))。
因此，可考虑抗-PD-L1阻断与各种自身蛋白质结合使用以便设计高效产生针对这些自身蛋白质的免疫应答用于疾病治疗的疫苗接种方案。举例而言，阿兹海默病涉及淀粉样沉积物的Aβ肽在脑中的不当积聚；针对淀粉样的抗体应答能够清除这些淀粉样沉积物(Schenk等人,Nature,400:173-177(1999))。
其他自身蛋白质也可用作靶标，诸如用于过敏症和哮喘治疗的IgE及用于类风湿性关节炎治疗的TNFα。最后，针对各种激素的抗体应答可通过使用本文所披露的大环化合物诱导。针对生殖激素的中和抗体应答可用于避孕。针对特定肿瘤生长所需的激素及其他可溶性因子的中和抗体应答还可视为可能的疫苗接种靶标。
如上所述使用抗-PD-L1大环化合物的类似方法可用于诱导治疗性自身免疫应答以治疗具有其他自身抗原(诸如淀粉样沉积物，包括阿兹海默病中的Aβ；细胞因子，诸如TNFα和IgE)不当积聚的患者。
疫苗
大环肽可通过抗-PD-1大环与感兴趣的抗原(例如，疫苗)的共施用而用于刺激抗原特异性免疫应答。因此，在另一个方面中，本发明提供一种增强受试者体内针对抗原的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用：(i)所述抗原；及(ii)抗-PD-1大环，使得受试者体内针对所述抗原的免疫应答得以增强。抗原可为例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。此类抗原的非限制性实例包括以上部分中所论述的抗原，诸如上文所论述的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)、或来自上文所述的病毒、细菌或其他病原体的抗原。
体内和体外施用本发明组合物(例如，大环肽、多特异性和双特异性分子及免疫缀合物)的合适途径为本领域公知，且可由普通技术人员选择。举例而言，组合物可通过注射(例如，静脉内或皮下)施用。所用分子的合适剂量将取决于受试者的年龄和体重以及组合物的浓度和/或制剂。
如先前所述，本发明的大环肽可与一或多种其他治疗剂(例如，细胞毒性剂、放射毒性剂或免疫抑制剂)共施用。肽可连接至药剂(以免疫复合物形式)或可与药剂分开施用。在后一情况(分开施用)中，肽可在药剂之前、之后或与其同时施用或可与其他已知疗法(例如抗癌疗法，例如辐射)共施用。此类治疗剂尤其包括抗赘生性剂，诸如多柔比星(doxorubicin)(阿德里亚霉素(adriamycin))、顺铂博来霉素硫酸盐(cisplatinbleomycin sulfate)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、达卡巴嗪和环磷酰胺羟基脲(cyclophosphamide hydroxyurea)，其本身仅在对患者具毒性或亚毒性的水平下有效。顺铂每四周以100mg/剂量静脉内施用一次，且阿德里亚霉素每21天以60-75mg/ml剂量静脉内施用一次。本发明的大环肽与化学治疗剂的共施用提供两种经由不同机制操作的抗癌剂，其产生针对人类肿瘤细胞的细胞毒性效应。此类共施用可解决因发展对药物的抗性或肿瘤细胞的抗原性改变而将使其不与肽起反应所致的问题。
包含本发明组合物(例如，大环肽、双特异性或多特异性分子或免疫缀合物)和使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。试剂盒可另外含有至少一种额外试剂或一或多种本发明的额外大环肽(例如，具有结合至PD-L1抗原中与大环不同的表位的互补活性的人类抗体)。试剂盒通常包括指示试剂盒内含物的预期用途的标签。术语“标签”包括在试剂盒上或与试剂盒一起供应或以其他方式伴随试剂盒的任何书写或记录材料。
组合疗法
本发明的大环肽与另一PD-L1拮抗剂和/或其他免疫调节剂的组合可用于增强针对过度增殖性疾病的免疫应答。举例而言，这些分子可施用至体外或离体培养物中的细胞或施用至人类受试者(例如体内)以在多种情形中增强免疫力。因此，在一个方面中，本发明提供一种调节受试者的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用本发明的大环肽以便调节所述受试者的免疫应答。优选地，增强、刺激或上调反应。在另一个实施方案中，本发明提供一种改变与用免疫刺激性治疗剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，其包括向受试者施用本发明的大环肽和亚治疗剂量的另一种免疫调节剂。
通过大环肽阻断PD-L1可增强患者针对癌细胞的免疫应答。可使用本发明的大环肽抑制生长的癌症包括通常响应于免疫疗法的癌症。用本发明的组合疗法治疗的癌症的代表性实例包括黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌。可使用本发明的方法治疗的其他癌症的实例包括骨癌；胰腺癌；皮肤癌；头颈癌；皮肤或眼内恶性黑素瘤；子宫癌；卵巢癌；直肠癌；肛门区癌；胃癌；睾丸癌；子宫癌；输卵管癌；子宫内膜癌；子宫颈癌；阴道癌；外阴癌；霍奇金氏病；非霍奇金氏淋巴瘤；食道癌；小肠癌；内分泌系统癌；甲状腺癌；甲状旁腺癌；肾上腺癌；软组织肉瘤；尿道癌；阴茎癌；慢性或急性白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病；儿童实体肿瘤；淋巴细胞性淋巴瘤；膀胱癌；肾癌或输尿管癌；肾盂癌；中枢神经系统(CNS)赘瘤；原发性CNS淋巴瘤；肿瘤血管生成；脊轴肿瘤；脑干神经胶质瘤；垂体腺瘤；卡波西肉瘤；表皮样癌；鳞状细胞癌；T细胞淋巴瘤；环境诱发癌，包括由石棉诱发的癌症；及所述癌症的组合。本发明还可用于治疗转移性癌症。
在某些实施方案中，含有至少一种本文中论述的大环肽的治疗剂组合可以在药学上可接受的载体中的单一组合物形式同时施用，或以各药剂可依次施用的分开组合物形式同时施用。举例而言，第二免疫调节剂和本发明的大环肽可依次施用，诸如首先施用第二免疫调节剂且其次施用大环肽，或首先施用大环肽且其次施用第二免疫调节剂。此外，若依次施用一次以上剂量的组合疗法，则依次施用的次序在每一施用时间点可颠倒或保持相同次序，依次施用可与同时施用组合或其任何组合。举例而言，第二免疫调节剂和大环肽的第一次施用可同时，第二次施用可依次，其中首先施用第二免疫调节剂且其次施用大环肽，且第三次施用可依次，其中首先施用大环肽且其次施用第二免疫调节剂等。另一代表性给药方案可涉及首先依次施用，其中首先施用大环肽且其次施用第二免疫调节剂，且后续施用可同时。
任选地，大环肽和第二免疫调节剂的组合可另外与以下免疫原性剂组合，诸如癌细胞、经纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白质、肽和碳水化合物分子)、细胞和转染有编码免疫刺激细胞因子的基因的细胞(He等人,J.Immunol.,173:4919-4928(2004))。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，诸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽，或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(下文进一步论述)。
经组合的PD-L1大环肽和第二免疫调节剂可另外与疫苗接种方案组合。已设计出针对肿瘤的许多实验性疫苗接种策略(参见Rosenberg,S.,Development of CancerVaccines,ASCO Educational Book Spring:60-62(2000)；Logothetis,C.,ASCOEducational Book Spring:300-302(2000)；Khayat,D.,ASCO Educational Book Spring:414-428(2000)；Foon,K.,ASCO Educational Book Spring:730-738(2000)；还参见Restifo等人,Cancer Vaccines,第61章,第3023-3043页,DeVita等人编,Cancer:Principles and Practice of Oncology,第五版(1997))。在这些策略之一中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。已显示这些细胞疫苗在肿瘤细胞经转导以表达GM-CSF时最有效。已显示GM-CSF为用于肿瘤疫苗接种的抗原递呈的强活化剂(Dranoff等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:3539-3543(1993))。
各种肿瘤中基因表达和大规模基因表达模式的研究已产生所谓肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg,Immunity,10:281-287(1999))。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原为肿瘤中及出现肿瘤的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可展示为宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。在某些实施方案中，经组合的PD-L1大环肽和第二免疫调节剂可用于与表达于肿瘤中的重组蛋白质和/或肽的集合结合使用以产生针对这些蛋白质的免疫应答。这些蛋白质通常被免疫系统视为自体抗原且因此对其具耐受性。肿瘤抗原还可包括蛋白质端粒酶，其为合成染色体的端粒所必需的且表达于超过85％的人类癌症中且仅表达于有限数目的体细胞组织中(Kim等人,Science,266:2011-2013(1994))。(可通过各种方法保护这些体细胞组织免受免疫攻击)。肿瘤抗原还可为由于改变蛋白质序列或在两个无关序列之间形成融合蛋白(即，费城染色体中的bcr-abl)的体细胞突变而在癌细胞中表达的“新抗原”或B细胞肿瘤的受试者基因型。
其他肿瘤疫苗可包括人类癌症中所牵涉的病毒的蛋白质，所述病毒诸如人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可与PD-L1大环肽阻断结合使用的肿瘤特异性抗原的另一形式为自肿瘤组织自身分离的经纯化热休克蛋白质(HSP)。这些热休克蛋白质含有肿瘤细胞蛋白质的片段且这些HSP高效递送至抗原递呈细胞以引发肿瘤免疫力(Suot等人,Science,269:1585-1588(1995)；Tamura等人,Science,278:117-120(1997))。
树突状细胞(DC)为可用于引发抗原特异性应答的强抗原递呈细胞。DC可离体产生且负载有各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle等人,Nat.Med.,4:328-332(1998))。DC还可通过基因方法转导从而也表达这些肿瘤抗原。DC还已出于免疫目的而直接与肿瘤细胞融合(Kugler等人,Nat.Med.,6:332-336(2000))。作为疫苗接种的方法，DC免疫作用可与经组合的抗-PD-L1大环肽和第二免疫调节剂进一步有效组合以活化更强抗肿瘤响应。
经组合的抗-PD-L1大环肽和额外免疫调节剂还可与标准癌症治疗进一步组合。举例而言，大环肽与第二免疫调节剂的组合可与化学治疗方案有效组合。在这些情形中，如在大环肽与第二免疫调节剂的组合下所观测，有可能减小与本发明的组合一起施用的其他化学治疗剂的剂量(Mokyr等人,Cancer Res.,58:5301-5304(1998))。此类组合的一个实例为大环肽与第二免疫调节剂的组合与达卡巴嗪进一步组合用于治疗黑素瘤。另一个实例为大环肽与第二免疫调节剂的组合与白介素-2(IL-2)进一步组合用于治疗黑素瘤。支持PD-L1大环肽和另一种免疫调节剂与化学疗法组合使用的科学基本原理在于作为大部分化学治疗化合物的细胞毒性作用结果的细胞死亡应使得抗原递呈途径中肿瘤抗原的水平增加。可经由细胞死亡而与经组合的抗-PD-L1大环肽和额外免疫调节剂产生协同作用的其他组合疗法包括辐射、手术和激素去除。这些方案中的每一种产生宿主中的肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂还可与经组合的PD-L1和第二免疫调节剂组合。抑制血管生成导致肿瘤细胞死亡，其还可为馈至宿主抗原递呈途径中的肿瘤抗原的来源。
PD-L1与另一种免疫调节剂的组合还可与使表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性大环肽组合使用(参见例如，美国专利第5,922,845号和第5,837,243号)。双特异性大环肽可用于靶向两个单独抗原。举例而言，抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如，Her-2/neu)双特异性大环肽已用于使巨噬细胞靶向肿瘤位点。该靶向可更有效地活化肿瘤特异性响应。这些响应的T细胞臂通过使用经组合的PD-L1和第二免疫调节剂来强化。可选择地，可通过使用结合至肿瘤抗原和树突状细胞特异性细胞表面标记的双特异性大环肽将抗原直接递送至DC。
在另一个实例中，大环肽与第二免疫调节剂的组合可与以下抗赘生性大环剂结合使用，诸如(利妥昔单抗(rituximab))、(曲妥珠单抗(trastuzumab))、(托西莫单抗(tositumomab))、(替依莫单抗(ibritumomab))、(阿仑单抗(alemtuzumab))、Lymphocide(依帕珠单抗(eprtuzumab))、(贝伐单抗(bevacizumab))和(厄洛替尼(erlotinib))等。举例而言，且不希望受理论束缚，用抗癌抗体或与毒素结合的抗癌抗体治疗可导致癌细胞死亡(例如，肿瘤细胞)，其将强化通过第二免疫调节剂靶标或PD-L1介导的免疫应答。在一个示例性实施方案中，过度增殖性疾病(例如，癌症肿瘤)的治疗可包括抗癌抗体与同时或依次或其任何组合施用的大环肽和第二免疫调节剂的组合，其可强化宿主的抗肿瘤免疫应答。
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。许多这些机制可通过使肿瘤所表达且具免疫抑制性的蛋白质不活化来克服。这些蛋白质尤其包括TGF-β(Kehrl,J.等人,J.Exp.Med.,163:1037-1050(1986))、IL-10(Howard,M.等人,Immunology Today,13:198-200(1992))和Fas配体(Hahne,M.等人,Science,274:1363-1365(1996))。在另一个实施例中，针对这些实体中的每一种的抗体可与大环肽和另一种免疫调节剂进一步组合，以抵消免疫抑制剂的效应且促进宿主的肿瘤免疫应答。
可用于活化宿主免疫应答性的其他药剂可与本发明的大环肽进一步组合使用。这些药剂包括树突状细胞表面上活化DC功能和抗原递呈的分子。抗-CD40大环肽能够有效替代辅助T细胞活性(Ridge,J.等人,Nature,393:474-478(1998))且可与单独或与抗-CTLA-4组合组合的本发明的大环肽结合使用(Ito,N.等人,Immunobiology,201(5):527-540(2000))。活化针对以下T细胞协同刺激分子的大环肽还可使得T细胞活化水平增加，诸如OX-40(Weinberg,A.等人,Immunol.,164:2160-2169(2000))、4-1BB(Melero,I.等人,Nat.Med.,3:682-685(1997)和ICOS(Hutloff,A.等人,Nature,397:262-266(1999))。
骨髓移植目前用于治疗多种造血来源的肿瘤。虽然移植物抗宿主病为该治疗的后果，但可自移植物抗肿瘤响应获得治疗效益。单独或与另一种免疫调节剂组合的本发明的大环肽可用于增加供体移植的肿瘤特异性T细胞的有效性。
还存在涉及抗原特异性T细胞的离体活化和扩展及将这些细胞过继性转移至受体中以便抗原特异性T细胞抗肿瘤的数个实验性治疗方案(Greenberg,R.等人,Science,285:546-551(1999))。这些方法还可用于活化针对诸如CMV的感染物的T细胞响应。在单独或与另一种免疫调节剂组合的本发明的大环肽存在下的离体活化可预期增加过继性转移T细胞的频率和活性。
在某些实施方案中，本发明提供一种改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，其包括向受试者施用本发明的大环肽与亚治疗剂量的另一种免疫调节剂的组合。举例而言，本发明的方法提供一种通过向患者施用不可吸收类固醇而降低免疫刺激性治疗抗体诱导的结肠炎或腹泻的发病率的方法。由于任何将接受免疫刺激性治疗抗体的患者处于罹患由此类治疗诱导的结肠炎或腹泻的风险下，故该整个患者群体适合于根据本发明方法的疗法。虽然已施用类固醇以治疗炎性肠病(IBD)和预防IBD的恶化，但其尚未用于在尚未诊断患有IBD的患者中预防IBD(降低IBD的发病率)。与类固醇(甚至不可吸收类固醇)相关的显著副作用已阻碍预防性使用。
在其他实施方案中，单独或与另一种免疫调节剂组合的本发明的大环肽可与任何不可吸收类固醇的使用进一步组合。如本文所用，“不可吸收类固醇”为展现广泛的首过代谢(first pass metabolism)的糖皮质激素，使得在肝脏中代谢后，类固醇的生物利用度低，即小于约20％。在本发明的一个实施方案中，所述不可吸收类固醇为布地奈德(budesonide)。布地奈德为局部起效的糖皮类固醇，其在口服施用后主要通过肝脏广泛代谢。EC(Astra-Zeneca)为经研发以使药物递送至回肠和贯穿结肠最佳化的布地奈德的pH和时间依赖性口服制剂。EC在美国核准用于治疗涉及回肠和/或升结肠的轻度至中度克罗恩病(Crohn's disease)。用于治疗克罗恩病的EC的常用口服剂量为6至9mg/天。EC在肠中释放，随后吸收且保留在肠道粘膜中。一旦其通过肠道粘膜目标组织，EC在肝脏中通过细胞色素P450系统广泛代谢成具有可忽略的糖皮质激素活性的代谢物。因此，生物利用度较低(约10％)。布地奈德的低生物利用度使得与具有较不广泛的首过代谢的其他糖皮质激素相比的治疗比率得以改善。布地奈德与全身起效的皮质类固醇相比产生较少不良作用，包括下丘脑-垂体抑制作用较小。然而，长期施用EC可导致全身性糖皮质激素效应，诸如肾上腺皮质机能亢进症和肾上腺抑制。参见Physicians'Desk ReferenceSupplement,第58版,608-610(2004)。
在其他实施方案中，PD-L1和另一种免疫调节剂与不可吸收类固醇结合的组合可与水杨酸类(salicylate)进一步组合。水杨酸类包括5-ASA剂，诸如：柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)(Pharmacia&Upjohn)；奥沙拉嗪(olsalazine)(Pharmacia&UpJohn)；巴柳氮(balsalazide)(SalixPharmaceuticals,Inc.)；和美沙拉嗪(mesalamine)(Procter&GamblePharmaceuticals；Shire US；Axcan Scandipharm,Inc.；Solvay)。
剂量和制剂
式I的合适肽或更具体而言本文所述的大环肽，可作为单独化合物或与可接受的载体混合以药物制剂形式施用至患者以治疗糖尿病及其他相关疾病。治疗糖尿病领域的技术人员可易于确定向需要此类治疗的哺乳动物(包括人类)施用化合物的剂量和途径。施用途径可包括，但不限于，口服、口内、经直肠、经皮、含服、鼻内、经肺、皮下、肌内、皮内、舌下、结肠内、眼内、静脉内或肠道施用。根据施用途径，基于可接受的药学实践调配化合物(Fingl等人,The Pharmacological Basis of Therapeutics,第1章,第1页(1975)；Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1990))。
本文所述的药学上可接受的肽组合物可以多种剂型施用，诸如片剂、胶囊(其各包括持续释放或定时释放制剂)、丸剂、散剂、颗粒、酏剂、原位凝胶、微球、晶体复合物、脂质体、微乳液、酊剂、悬浮液、糖浆、气溶胶喷雾剂和乳液。本文所述的组合物还可以口服、静脉内(推注或输注)、腹膜内、皮下、经皮或肌内形式施用，全部使用药学领域普通技术人员公知的剂型。组合物可单独施用，但通常将与基于所选施用途径和标准药学实践选择的药用载体一起施用。
本文所述的组合物的剂量方案将当然取决于已知因素而变化，诸如具体药剂的药效学特征及其施用模式和途径；接受者的物种、年龄、性别、健康状况、医学病状和体重；症状的性质和程度；同时发生的治疗的种类；治疗频率；施用途径、患者的肾功能和肝功能以及期望效应。医师或兽医可确定预防、对抗或遏止疾病状态的进程所需的有效量的药物且开具该有效量的药物的处方。
根据一般指导，活性成分在用于指定效应时的口服日剂量将介于每千克体重约0.001至约1000mg范围内，优选每天每千克体重约0.01至约100mg，且最优选每天每千克约0.6至约20mg。活性成分在用于指定效应时的静脉内日剂量将在恒定速率输注期间介于每千克体重每分钟0.001ng至100.0ng范围内。此类恒定静脉内输注可优选以每千克体重每分钟0.01ng至50ng且最优选每千克体重每分钟0.01ng至10.0mg的速率施用。本文所述的组合物可以单次日剂量施用，或每日总剂量可分成每日两次、三次或四次分次剂量施用。本文所述的组合物还可视需要通过将允许经数天/周/月的时段持续释放药物的贮库(depot)制剂施用。
本文所述的组合物可经由局部使用合适的鼻内媒介物以鼻内形成或使用经皮皮肤贴片经由经皮途径施用。当以经皮递送系统形式施用时，剂量施用将当然在整个剂量方案中为连续而非间断的。
组合物通常与根据预定施用形式(即，口服片剂、胶囊、酏剂、在抛射剂存在或不存在下生成的气溶胶喷雾剂和糖浆)适当选择且与常规药学实践相符的合适药用稀释剂、赋形剂或载体(在本文中统称为药用载体)混合施用。
举例而言，对于以片剂或胶囊形式口服施用，活性药物组分可与以下口服、无毒、药学上可接受的惰性载体组合，诸如，但不限于，乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇和山梨醇；对于以液体形式口服施用，口服药物组分可与以下任何口服、无毒、药学上可接受的惰性载体组合，诸如，但不限于，乙醇、丙三醇和水。此外，当需要或必要时，还可将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入混合物中。合适的粘合剂包括，但不限于，淀粉；明胶；天然糖，诸如，但不限于，葡萄糖或β-乳糖；玉米增甜剂；天然和合成胶，诸如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠；羧基甲基纤维素；聚乙二醇和蜡。用于这些剂型的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠。崩解剂包括，但不限于，淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土和黄原胶。
本文所述的组合物还可以混合微胞或脂质体递送系统形式施用，诸如单层小微脂粒(small unilamellar vesicles)、单层大微脂粒(large unilamellar vesicles)和多层微脂粒(multilamellar vesicles)。脂质体可由多种磷脂形成，诸如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱。可添加渗透增强剂以增强药物吸收。
由于已知前药增强许多期望的药物品质(即，溶解性、生物利用度、制备等)，故本文所述化合物可以前药形式递送。因此，本文所述的主题意欲涵盖本发明要求保护的化合物的前药、递送它们的方法及含有它们的组合物。
本文所述的组合物还可与作为靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。此类聚合物可包括聚乙烯-吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟基乙基天冬酰胺苯酚或经棕榈酰基残基取代的聚氧化乙烯-聚赖氨酸。此外，本文所述的组合物可与以下可用于实现药物控制释放的一类可生物降解聚合物组合，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸与聚乙醇酸的共聚物、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两性嵌段共聚物。
适于施用的剂型(药物组合物)可含有每剂量单位约0.01毫克至约500毫克活性成分。在这些药物组合物中，活性成分将通常以按所述组合物的总重量计约0.5-95重量％的量存在。
明胶胶囊可含有活性成分和粉末状载体，诸如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁和硬脂酸。类似的稀释剂可用于制备压制片剂。片剂和胶囊可制备为持续释放产物以提供药物经数小时时段的连续释放。压制片剂可经糖包覆或经膜包覆以掩盖任何令人不愉快的味道且保护片剂不受大气影响，或经肠溶包衣包覆以便在胃肠道中选择性崩解。
用于口服施用的液体剂型可含有着色剂和矫味剂以增加患者接受性。
一般而言，水、合适的油、生理盐水、右旋糖(葡萄糖)及相关糖溶液和二醇(诸如丙二醇或聚乙二醇)为用于肠胃外溶液的合适载体。用于肠胃外施用的溶液优选含有活性成分的水溶性盐、合适的稳定剂和(若需要)缓冲物质。单独或组合的抗氧化剂，诸如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸为合适的稳定剂。还使用柠檬酸及其盐和EDTA钠。另外，肠胃外溶液可含有防腐剂，诸如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。
合适的药用载体描述于本领域的标准参考书Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第十九版,Mack Publishing Company(1995)中。
可用于本文所述化合物施用的代表性药物剂型可说明如下：
胶囊
大多数单位胶囊可通过用100毫克粉末状活性成分、150毫克乳糖、50毫克纤维素和6毫克硬脂酸镁填充标准两件式(two-piece)硬明胶胶囊来制备。
软明胶胶囊
可制备活性成分于可消化油(诸如大豆油、棉籽油或橄榄油)中的混合物且借助于正排量泵注入明胶中以形成含有100毫克活性成分的软明胶胶囊。胶囊应当洗涤且干燥。
片剂
片剂可通过常规操作制备以使得剂量单位例如为100毫克活性成分、0.2毫克胶态二氧化硅、5毫克硬脂酸镁、275毫克微晶纤维素、11毫克淀粉和98.8毫克乳糖。可应用适当包衣以增加适口性或延迟吸收。
可注射剂
本文所述的肽组合物的可注射制剂可或可不需要使用赋形剂，诸如已被监管机构批准的赋形剂。这些赋形剂包括，但不限于，溶剂和共溶剂、增溶剂、乳化剂或增稠剂、螯合剂、抗氧化剂和还原剂、抗微生物防腐剂、缓冲剂和pH调节剂、填充剂、保护剂和张力调节剂及特殊添加剂。可注射制剂必须无菌、无热原且在溶液情况下，不含微粒物质。
适于通过注射施用的肠胃外组合物可通过将例如1.5重量％活性成分搅拌于可或可不含有共溶剂或其他赋形剂的药学上可接受的缓冲液中来制备。溶液应当用氯化钠等张且灭菌。
悬浮液
可制备用于口服和/或肠胃外施用的水性悬浮液，以使得例如各5mL含有100mg细粉状活性成分、20mg羧甲基纤维素钠、5mg苯甲酸钠、1.0g山梨醇溶液U.S.P.和0.025mL香草醛或其他适口性矫味剂。
可生物降解微粒
适于通过注射施用的持续释放肠胃外组合物可如下制备：例如通过将合适的可生物降解聚合物溶解于溶剂中，将欲掺入的活性剂添加至聚合物溶液且自基质移除溶剂，由此形成活性剂分布于整个基质中的聚合物基质。
肽合成
本文中本发明的说明应根据化学成键的定律和原则加以解释。应理解，本发明所涵盖的化合物是对于作为药剂使用适宜稳定的那些。本领域技术人员知晓何种化合物基于化学成键和稳定性的一般原理将稳定和不稳定。
本发明的大环肽的化学合成可使用多种本领域公认的方法进行，包括逐步固相合成、经由构象辅助的肽片段再接合的半合成、克隆或合成肽区段的酶促接合和化学接合。合成本文所述的大环肽及其类似物的优选方法为使用各种固相技术的化学合成，诸如描述于Chan,W.C.等人编,Fmoc Solid Phase Synthesis,Oxford University Press,Oxford(2000)；Barany,G.等人,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,第2卷:"SpecialMethods in Peptide Synthesis,Part A",第3-284页,Gross,E.等人编,Academic Press,New York(1980)；和Stewart,J.M.等人,Solid-Phase Peptide Synthesis,第2版,PierceChemical Co.,Rockford,IL(1984)中的固相技术。优选策略基于用于临时保护α-氨基的Fmoc(9-芴基甲基甲基-氧基羰基)基团以及用于临时保护氨基酸侧链的叔丁基(参见例如Atherton,E.等人,"The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group",ThePeptides:Analysis,Synthesis,Biology,第9卷:"Special Methods in PeptideSynthesis,Part C",第1-38页,Undenfriend,S.等人编,Academic Press,San Diego(1987)。
肽可以逐步方式在不溶性聚合物支持物(也称为“树脂”)上自肽的C-端开始合成。通过将肽的C-端氨基酸经由形成酰胺或酯连接(linkage)附接至树脂开始合成。此使得所得肽最终分别以C-端酰胺或羧酸形式释放。
用于合成的C-端氨基酸和所有其他氨基酸需要使其α-氨基和侧链官能基(若存在)有差异地受保护，使得α-氨基保护基可在合成期间选择性移除。氨基酸的偶联通过将其羧基活化为活性酯且使其与附接至树脂的N-端氨基酸未封端的α-氨基反应来进行。重复α-氨基脱保护和偶联的顺序，直至组装整个肽序列为止。接着肽自树脂释放，同时伴随侧链官能团的脱保护，通常在适当清除剂存在下进行以限制副反应。所得肽最终通过反相HPLC纯化。
作为最终肽的前体所需的肽基-树脂的合成利用市售交联聚苯乙烯聚合物树脂(Novabiochem,San Diego,CA；Applied Biosystems,Foster City,CA)。对于C-端甲酰胺，优选固体支持物为：4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基乙酰基-对甲基二苯甲胺树脂(Rink酰胺MBHA树脂)；9-Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基-Merrifield树脂(Sieber酰胺树脂)；4-(9-Fmoc)氨基甲基-3,5-二甲氧基苯氧基)戊酰基-氨基甲基-Merrifield树脂(PAL树脂)。第一和后续氨基酸的偶联可使用或分别由DIC/HOBt、HBTU/HOBt、BOP、PyBOP或由DIC/6-Cl-HOBt、HCTU、DIC/HOAt或HATU产生的HOBt、6-Cl-HOBt或HOAt活性酯实现。对于受保护的肽片段，优选固体支持物为：2-氯三苯甲基氯树脂及9-Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基-Merrifield树脂(Sieber酰胺树脂)。第一氨基酸装载于2-氯三苯甲基氯树脂上最好通过使受Fmoc保护的氨基酸与树脂在二氯甲烷和DIEA中反应来实现。若需要，可添加少量DMF以促进氨基酸溶解。
本文所述的肽类似物的合成可通过使用单通道或多通道肽合成仪来进行，诸如CEM Liberty Microwave合成仪或Protein Technologies,Inc.Prelude(6通道)或Symphony(12通道)或Symphony-X(12或24通道)合成仪。
相应肽的肽基-树脂前体可使用任何标准操作裂解且脱除保护基(参见例如，King,D.S.等人,Int.J.Peptide Protein Res.,36:255-266(1990))。期望方法为在水和作为清除剂的TIS存在下使用TFA。通常，肽基-树脂在室温于TFA/水/TIS(94:3:3，v:v:v；1mL/100mg肽基树脂)中搅拌2-6小时。接着滤出用过的树脂且浓缩TFA溶液或在减压下干燥。所得粗物质肽析出且用Et2O洗涤或直接再溶解于DMSO或50％乙酸水溶液中以便通过制备型HPLC纯化。
具有期望纯度的肽可通过例如在Waters型号4000或Shimadzu型号LC-8A液体色谱仪上使用制备型HPLC纯化来获得。将粗肽溶液注入YMC S5 ODS(20×100mm)柱中且用MeCN/水(均用0.1％TFA缓冲)的线性梯度使用14-20mL/min的流速洗脱，同时通过在220nm的UV吸光度监测流出物。经纯化肽的结构可通过电喷雾MS分析确认。
实施例
本申请中使用的缩写(具体包含在下文的示例性方案和实施例中)为本领域技术人员公知。所使用的一些缩写如下：min或mins表示分钟；h或hr或hrs表示小时；RT或rt表示室温或保留时间(取决于上下文)；sat.表示饱和；TFA表示三氟乙酸；DMF表示N,N-二甲基甲酰胺；DCM表示二氯甲烷；Fmoc表示9-芴基甲基氧基羰基；HATU表示(六氟磷酸1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物)；DIEA或DIPEA表示二异丙基乙胺；NMP表示N-甲基吡咯烷酮；EDC表示1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；DMSO表示二甲基亚砜；MeOH表示甲醇；EtOAc表示乙酸乙酯；Et3N表示三乙胺；MeCN或ACN表示乙腈；DIAD表示偶氮二甲酸二乙酯；且TMSI表示三甲基碘硅烷。
分析数据：
质谱：“ESI-MS(+)”表示以正离子模式进行的电喷雾电离质谱；“ESI-MS(-)”表示以负离子模式进行的电喷雾电离质谱；“ESI-HRMS(+)”表示以正离子模式进行的高分辨电喷雾电离质谱；“ESI-HRMS(-)”表示以负离子模式进行的高分辨电喷雾电离质谱。所检测的质量在“m/z”单位名称后报道。精确质量大于1000的化合物常检测为双电荷或三电荷离子。
分析LCMS条件A：
柱：BEH C18,2.1×50mm，1.7-μm颗粒；流动相A：水，含有0.05％TFA；流动相B：乙腈，含有0.05％TFA；温度：50℃；梯度：在2分钟内2％B至98％B，然后在98％B保持0.5分钟；流速：0.8mL/min；检测：UV,220nm。
分析LCMS条件B：
柱：BEH C18,2.1×50mm，1.7-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.05％TFA；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.05％TFA；温度：50℃；梯度：在3分钟内0-100％B，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1.11mL/min。
分析LCMS条件C：
柱：BEH C18,2.1×50mm，1.7-μm颗粒；流动相A：水，含有0.2％甲酸和0.01％TFA；流动相B：乙腈，含有0.2％甲酸和0.01％TFA；温度：50℃；梯度：在2分钟内2％B至80％B，在0.1分钟内80％B至98％B，然后在98％B保持0.5分钟；流速：0.8mL/min；检测：UV,220nm。
分析LCMS条件D：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1×50mm，1.7-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10mM乙酸铵；温度：50℃；梯度：在3分钟内0-100％B，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1.11mL/min；检测：UV,220nm。
分析LCMS条件E：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1×50mm，1.7-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；温度：50℃；梯度：在3分钟内0-100％B，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1.11mL/min；检测：UV,220nm。
分析LCMS条件F：
柱：Waters Xbridge C18,2.1×50mm；流动相A：5:95乙腈:水，含有10mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10mM乙酸铵；温度：35℃；梯度：在4分钟内0-100％B，然后在1分钟内保持于100％B；流速：4mL/min；检测：UV,220nm。
分析LCMS条件G：
Finnigan LTQ质谱仪；柱：Phenomenex Jupiter C4,1×50mm；流动相A：1％甲酸/水；流动相B：0.1％甲酸/乙腈；温度：30℃；梯度：在1％B保持1分钟；在3分钟内1-95％B，然后在95％B保持3-min.；流速：0.15mL/min。
分析LCMS条件H：
柱：Waters BEH C18,2.0×50mm，1.7-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10mM乙酸铵；温度：50℃；梯度：在3分钟内0-100％B，然后在100％B保持0.5分钟；流速：1.0mL/min；检测：UV,220nm。
分析LCMS条件I：
柱：Waters BEH C18,2.0×50mm，1.7-μm颗粒；流动相A：5:95甲醇:水，含有10mM乙酸铵；流动相B：95:5甲醇:水，含有10mM乙酸铵；温度：50℃；梯度：在3分钟内0-100％B，然后在100％B保持0.5分钟；流速：0.5mL/min；检测：UV,220nm。
分析HPLC条件A：
柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；流动相A：含有0.1％TFA的水；流动相B：含有0.1％TFA的乙腈；温度：60℃；梯度：在25分钟内35％B至80％B；流速：1mL/min；检测：UV,217nm。
分析HPLC条件B：
柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；流动相A：含有0.1％TFA的水；流动相B：含有0.1％TFA的乙腈；温度：60℃；梯度：在25分钟内25％B至75％B；流速：1mL/min；检测：UV,217nm。
分析HPLC条件C：
柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；流动相A：含有0.1％TFA的水；流动相B：含有0.1％TFA的乙腈；温度：60℃；梯度：在25分钟内20％B至70％B；流速：1mL/min；检测：UV,217nm。
分析HPLC条件D：
柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；流动相A：含有0.1％TFA的水；流动相B：含有0.1％TFA的乙腈；温度：60℃；梯度：在25分钟内15％B至65％B；流速：1mL/min；检测：UV,217nm。
分析HPLC条件E：
柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；流动相A：含有0.1％TFA的水；流动相B：含有0.1％TFA的乙腈；温度：60℃；梯度：在20分钟内25％B至60％B；流速：1.25mL/min；检测：UV,217nm。
分析HPLC条件F：
柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；流动相A：含有0.1％TFA的水；流动相B：含有0.1％TFA的乙腈；温度：60℃；梯度：在20分钟内25％B至65％B；流速：1.25mL/min；检测：UV,217nm。
分析HPLC条件G：
柱：Sunfire C18 3.5um,3.0×150mm；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.05％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.05％三氟乙酸；温度：50℃；梯度：在12分钟内10-100％B，然后在100％B保持3分钟；流速：1mL/min；检测：UV,220nm。
分析HPLC条件H：
柱：Xbridge Phenyl 3.5×150um，流动相A：5:95乙腈:水，含有0.05％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.05％三氟乙酸；温度：50℃；梯度：在12分钟内10-100％B，然后在100％B保持3分钟；流速：1mL/min；检测：UV,220nm。
分析HPLC条件I：
柱：Phenomenex Luna 5u C18(2)150×4.6mm；流动相A：含有0.1％三氟乙酸的水，流动相B：含有0.1％三氟乙酸的乙腈，梯度：在20min内5-100％B，然后在100％B保持5分钟；流速：1mL/min,检测：UV,220nm。
分析HPLC条件J：
柱：Phenomenex Luna 5u C18(2)150×4.6mm；流动相A：含有0.1％三氟乙酸的水，流动相B：含有0.1％三氟乙酸的乙腈，梯度：在20min内10-100％B，然后在100％B保持5分钟；流速：1mL/min，检测：UV,220nm。
通用操作：
Prelude方法A：
所有操作(manipulation)均在Prelude肽合成仪(Protein Technologies)上自动进行。除非有所描述，否则所有操作(procedure)均在装配有底部玻料的10或45mL聚丙烯管中进行。该管经由管的底部和顶部连结至Prelude肽合成仪。可经由管顶部添加DMF和DCM，其均匀洗涤管侧面。剩余试剂为经由管底部添加且穿过玻料以接触树脂。经由管底部去除所有溶液。“周期性搅动”描述N2气体穿过底部玻料的简单脉冲；该脉冲持续大约5秒且每30秒发生一次。一般不使用制备超过三周的氨基酸溶液。DMF＝二甲基甲酰胺；DIC＝N,N’-二异丙基碳二亚胺；HOAt＝1-羟基7-氮杂苯并三唑；Sieber＝Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述与聚苯乙烯树脂的连结性(connectivity)的位置和类型。所用树脂为具有Sieber连接基团(在氮处经Fmoc保护)的Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g载量。常用氨基酸列于下文中，其中侧链保护基团指示于括号中。
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。
“Prelude方法A”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中所述规模根据结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。该规模对应于大约140mg上文所述的Sieber-Merrifield树脂。可通过调整所述体积规模的倍数，将所有操作按比例放大至超过0.100mmol规模。在氨基酸偶联之前，使用树脂溶胀操作(在下文中描述为“树脂溶胀操作”)来开始所有肽合成序列。氨基酸至伯胺N-末端的偶联使用下文所述的“单一偶联操作”。Fmoc-N-甲基氨基酸的偶联且偶联至仲胺N-末端使用下文所述的“仲胺偶联操作”。通过下文所详述的“氯乙酰氯偶联操作”或“氯乙酸偶联操作”来描述氯乙酰基至肽的N-末端的偶联。
树脂溶胀操作：
向40mL聚丙烯固相反应容器中添加Merrifield:Sieber树脂(140mg,0.100mmol)。如下所述将树脂洗涤三次：向反应容器中添加DMF(5.0mL)和DCM(5.0mL)，此时伴随N2鼓泡自反应容器底部将混合物周期性搅动10分钟，然后排出溶剂。
单一偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动60秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸和HOAt(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)的溶液，然后添加DIC(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)。将混合物周期性搅动60min，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
仲胺偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动60秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸和HOAt(0.2M于DMF中，5.0mL，5当量)的溶液，然后添加DIC(0.2M于DMF中，5.0mL，5当量)。将混合物周期性搅动300min，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
氯乙酰氯偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加3.0mL存于DMF中的DIPEA(4.0mmol,0.699mL，40当量)和氯乙酰氯(2.0mmol,0.160mL，20当量)的溶液。将混合物周期性搅动12至18小时，然后排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：对于每一洗涤而言，将DMF(4.0mL)添加至容器顶部且将所得混合物周期性搅动90秒，然后排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，将DCM(4.0mL)添加至容器顶部且将所得混合物周期性搅动90秒，然后排出溶液。
Prelude方法B：
所有操作均在Prelude肽合成仪(Protein Technologies)上自动进行。所有操作均在装配有底部玻料的10或45mL聚丙烯管中进行。可经由管顶部添加DMF和DCM，其均匀洗涤管侧面。剩余试剂为经由管底部添加且穿过玻料以接触树脂。经由管底部去除所有溶液。“周期性搅动”描述N2气体穿过底部玻料的简单脉冲；该脉冲持续大约5秒且每30秒发生一次。一般不使用制备超过三周的氨基酸溶液。DMF＝二甲基甲酰胺；HCTU＝2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；DIPEA＝二异丙基乙胺；Sieber＝Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述与聚苯乙烯树脂的连结性的位置和类型。所用树脂为具有Sieber连接基团(在氮处经Fmoc保护)的Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g载量。常用氨基酸列于下文中，其中侧链保护基团指示于括号中。
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。
“Prelude方法B”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中所述规模根据结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。该规模对应于大约140mg上文所述的Sieber-Merrifield树脂。可通过调整所述体积规模的倍数，将所有操作按比例放大至超过0.100mmol规模。在氨基酸偶联之前，使用树脂溶胀操作(在下文中描述为“树脂溶胀操作”)来开始所有肽合成序列。氨基酸至伯胺N-末端的偶联使用下文所述的“单一偶联操作”。氨基酸至仲胺N-末端的偶联使用下文所述的“仲胺偶联操作”。通过下文所详述的“氯乙酰氯偶联操作”或“氯乙酸偶联操作”来描述氯乙酰基至肽的N-末端的偶联。
树脂溶胀操作：
向40mL聚丙烯固相反应容器中添加Merrifield:Sieber树脂(140mg,0.100mmol)。如下所述将树脂洗涤(溶胀)三次：向反应容器中添加DMF(5.0mL)和DCM(5.0mL)，此时伴随N2鼓泡自反应容器底部将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出溶剂。
单一偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动60秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)，然后添加HCTU(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)，且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，2.5mL，20当量)。将混合物周期性搅动30分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
双偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动60秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)，然后添加HCTU(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)，且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，2.5mL，20当量)。将混合物周期性搅动15分钟，然后经由玻料排出反应溶液。经由容器顶部使用DMF(4.0mL)将树脂连续洗涤3次且将所得混合物周期性搅动60秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)，然后添加HCTU(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)，且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，2.5mL，20当量)。将混合物周期性搅动15分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
仲胺偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，2.5mL，10当量)，然后添加HCTU(0.2M于DMF中，2.5mL，10当量)，且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.5mL，12当量)。将混合物周期性搅动12小时，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
氯乙酰氯偶联操作A：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加3.0mL存于DMF中的DIPEA(4.0mmol,0.699mL，40当量)和氯乙酰氯(2.0mmol,0.160mL，20当量)的溶液。将混合物周期性搅动12至18小时，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：对于每一洗涤而言，向容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，向容器顶部添加CH2Cl2(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。
氯乙酸偶联操作B：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加DMF(2.0mL)、氯乙酸(1.2mmol,113mg，12当量)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(1.2mmol,0.187mL，12当量)。将混合物周期性搅动12至18小时，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：对于每一洗涤而言，向容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，向容器顶部添加CH2Cl2(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。
Prelude方法C：
所有操作均在Prelude肽合成仪(Protein Technologies)上自动进行。除非有所描述，否则所有操作均在装配有底部玻料的10或45mL聚丙烯管中进行。该管经由管的底部和顶部连结至Prelude肽合成仪。可经由管顶部添加DMF和DCM，其均匀洗涤管侧面。剩余试剂为经由管底部添加且穿过玻料以接触树脂。经由管底部去除所有溶液。“周期性搅动”描述N2气体穿过底部玻料的简单脉冲；该脉冲持续大约5秒且每30秒发生一次。一般不使用制备超过三周的氨基酸溶液。HATU溶液在制备5天内使用。DMF＝二甲基甲酰胺；HCTU＝2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；HATU＝六氟磷酸1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物；DIPEA＝二异丙基乙胺；Sieber＝Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述与聚苯乙烯树脂的连结性的位置和类型。所用树脂为具有Sieber连接基团(在氮处经Fmoc保护)的Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g载量。常用氨基酸列于下文中，其中侧链保护基团指示于括号中。
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。
“Prelude方法C”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中所述规模根据结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。该规模对应于大约140mg上文所述的Sieber-Merrifield树脂。可通过调整所述体积规模的倍数，将所有操作按比例放大至超过0.100mmol规模。在氨基酸偶联之前，使用树脂溶胀操作(在下文中描述为“树脂溶胀操作”)来开始所有肽合成序列。氨基酸至伯胺N-末端的偶联使用下文所述的“单一偶联操作”。氨基酸至仲胺N-末端的偶联使用下文所述的“仲胺偶联操作”。树脂的最终洗涤使用下文所述的“最终洗涤操作”。
树脂溶胀操作：
向40mL聚丙烯固相反应容器中添加Merrifield:Sieber树脂(140mg,0.100mmol)。如下所述将树脂洗涤(溶胀)三次：向反应容器中添加DMF(5.0mL)和DCM(5.0mL)，此时伴随N2鼓泡自反应容器底部将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出溶剂。
单一偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动60秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，5.0mL，10当量)，且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，2.5mL，20当量)。将混合物周期性搅动60分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
仲胺偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)，且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，1.5mL，12当量)。将混合物周期性搅动300分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂洗涤两次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)，且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，1.5mL，12当量)。将混合物周期性搅动300分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂洗涤两次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
定制(custom)氨基酸偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，0.5至2.5mL，1至5当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，0.5至2.5mL，1至5当量)，且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，0.5至1.5mL，4至12当量)。将混合物周期性搅动60分钟至600分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂洗涤两次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
最终洗涤操作：
如下所述将树脂连续洗涤两次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DCM(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
氯乙酸偶联操作：
注意手动步骤。向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物在室温振动5分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且搅动所得混合物，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加DMF(2.0mL)、氯乙酸(1.2mmol,113mg，12当量)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(1.2mmol,0.187mL，12当量)。将混合物在室温振动12至18小时，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：对于每一洗涤而言，向容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，向容器顶部添加CH2Cl2(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。
Prelude方法D：
所有操作均在Prelude肽合成仪(Protein Technologies)上自动进行。除非有所描述，否则所有操作均在装配有底部玻料的10或45mL聚丙烯管中进行。该管经由管的底部和顶部连结至Prelude肽合成仪。可经由管顶部添加DMF和DCM，其均匀洗涤管侧面。剩余试剂为经由管底部添加且穿过玻料以接触树脂。经由管底部去除所有溶液。“周期性搅动”描述N2气体穿过底部玻料的简单脉冲；该脉冲持续大约5秒且每30秒发生一次。一般不使用制备超过三周的氨基酸溶液。HATU溶液在制备5天内使用。DMF＝二甲基甲酰胺；HCTU＝2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；HATU＝六氟磷酸1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物；DIPEA＝二异丙基乙胺；Sieber＝Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述与聚苯乙烯树脂的连结性的位置和类型。所用树脂为具有Sieber连接基团(在氮处经Fmoc保护)的Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g载量。常用氨基酸列于下文中，其中侧链保护基团指示于括号中。
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。
“Prelude方法D”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中所述规模根据结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。该规模对应于大约140mg上文所述的Sieber-Merrifield树脂。可通过调整所述体积规模的倍数，将所有操作按比例放大至超过0.100mmol规模。在氨基酸偶联之前，使用树脂溶胀操作(在下文中描述为“树脂溶胀操作”)来开始所有肽合成序列。氨基酸至伯胺N-末端的偶联使用下文所述的“单一偶联操作”。氨基酸至仲胺N-末端的偶联使用下文所述的“仲胺偶联操作”。树脂的最终洗涤使用下文所述的“最终洗涤操作”。
树脂溶胀操作：
向40mL聚丙烯固相反应容器中添加Merrifield:Sieber树脂(140mg,0.100mmol)。如下所述将树脂洗涤(溶胀)三次：向反应容器中添加DMF(5.0mL)和DCM(5.0mL)，此时伴随N2鼓泡自反应容器底部将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出溶剂。
单一偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动60秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，2.5当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，2.5当量)，且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，0.75mL，5当量)。将混合物周期性搅动30分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动15分钟，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
仲胺偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，2.5当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，2.5当量)，且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，0.75mL，5当量)。将混合物周期性搅动30分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂洗涤两次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，2.5当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，2.5当量)，且最后添加DIPEA(0.8M于DMF中，0.75mL，5当量)。将混合物周期性搅动30分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂洗涤两次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动15分钟，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂洗涤两次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动15分钟，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
最终洗涤操作：
如下所述将树脂连续洗涤两次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DCM(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
氯乙酸偶联操作：
注意手动步骤。向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物在室温振动5分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且搅动所得混合物，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加DMF(2.0mL)、氯乙酸(1.2mmol,113mg，12当量)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(1.2mmol,0.187mL，12当量)。将混合物在室温振动12至18小时，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：对于每一洗涤而言，向容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，向容器顶部添加CH2Cl2(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。
CEM方法A：
所有操作均在CEM Liberty微波肽合成仪(CEM公司)上自动进行。除非有所描述，否则所有操作均在装配有底部玻料且通向CEM Discovery微波单元的30或125mL聚丙烯管中进行。该管经由管的底部和顶部连结至CEM Liberty合成仪。可经由管的顶部和底部添加DMF和DCM，其均匀洗涤管侧面。经由管底部去除所有溶液，只是同时自顶部转移树脂。“周期性鼓泡”描述N2气体穿过底部玻料的简单鼓泡。一般不使用制备超过三周的氨基酸溶液。HATU溶液在制备5天内使用。DMF＝二甲基甲酰胺；HCTU＝2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；HATU＝六氟磷酸1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物；DIPEA＝二异丙基乙胺；Sieber＝Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述与聚苯乙烯树脂的连结性的位置和类型。所用树脂为具有Sieber连接基团(在氮处经Fmoc保护)的Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g载量。其它常用树脂(例如Rink、氯三苯甲基(ChloroTrityl)或其它酸敏感性连接基团)可用于合成中，除非在具体实施例中另有所述，否则使用Seiber酰胺树脂。常用氨基酸列于下文中，其中侧链保护基团指示于括号中。
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Orn(Boc)-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。
“CEM方法A”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中所述规模根据结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。该规模对应于大约140mg上文所述的Sieber-Merrifield树脂。可通过调整所述体积规模的倍数，将所有操作按比例放大至超过0.100mmol规模。在氨基酸偶联之前，使用树脂溶胀操作(在下文中描述为“树脂溶胀操作”)来开始所有肽合成序列。氨基酸至伯胺N-末端的偶联使用下文所述的“单一偶联操作”。氨基酸至仲胺N-末端的偶联使用下文所述的“仲胺偶联操作”。通过上文详述的“氯乙酰氯偶联操作”或“氯乙酸偶联操作”描述氯乙酰基至肽的N-末端的偶联。
树脂溶胀操作：
向50mL聚丙烯圆锥形管中添加Merrifield:Sieber树脂(140mg,0.100mmol)。然后向管中添加DMF(7mL)，随后添加DCM(7mL)。然后将树脂自容器顶部转移至反应容器中。将该操作再重复两次。添加DMF(7mL)，随后添加DCM(7mL)。伴随N2鼓泡自反应容器底部使树脂溶胀15分钟，然后经由玻料排出溶剂。
标准偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)、HATU(0.5M于DMF中，1.0mL，5当量)和DIPEA(2M于NMP中，0.5mL，10当量)。通过在75℃N2鼓泡5分钟来混合混合物(对于所有氨基酸，只是Fmoc-Cys(Trt)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH在50℃进行偶联)，经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v,5.0mL)的溶液。将混合物在65℃周期性鼓泡2分钟，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。所得树脂直接用于下一步骤中。
双偶合(Double-couple)偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)、HATU(0.5M于DMF中，1.0mL，5当量)和DIPEA(2M于NMP中，0.5mL，10当量)。通过在75℃N2鼓泡5分钟来混合混合物(对于所有氨基酸，只是Fmoc-Cys(Trt)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH在50℃进行偶联)，经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)、HATU(0.5M于DMF中，1.0mL，5当量)和DIPEA(2M于NMP中，0.5mL，10当量)。通过在75℃N2鼓泡5分钟来混合混合物(对于所有氨基酸，只是Fmoc-Cys(Trt)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH在50℃进行偶联)，经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v,5.0mL)的溶液。将混合物在65℃周期性鼓泡2分钟，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。所得树脂直接用于下一步骤中。
仲胺偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加存于DMF(7mL)中的5％哌嗪和0.1MHOBt的溶液。将混合物在75℃周期性搅动3分钟且然后排出溶液。将该操作再重复一次。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)、HCTU(0.5M于DMF中，1.0mL，5当量)和DIPEA(2M于NMP中，0.5mL，10当量)。通过在75℃N2鼓泡5分钟来混合混合物(对于所有氨基酸，只是Fmoc-Cys(Trt)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH在50℃进行偶联)，随后未经加热进行6小时。在排出之后，如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v,5.0mL)的溶液。将混合物在65℃周期性鼓泡2分钟，然后排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。所得树脂直接用于下一步骤中。
定制氨基酸偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加含有HATU(2.5当量至10当量)的氨基酸溶液(1.25mL至5mL，2.5当量至10当量)，且最后添加DIPEA(2M于NMP中，0.5mL至1mL，20当量)。通过在25℃至75℃N2鼓泡5分钟至2小时来混合混合物，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v,5.0mL)的溶液。将混合物在65℃周期性鼓泡2分钟，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。所得树脂直接用于下一步骤中。
Symphony方法A：
所有操作均在Symphony肽合成仪(Protein Technologies)上自动进行。除非有所描述，否则所有操作均在装配有底部玻料的Symphony聚丙烯管中进行。该管经由管的底部和顶部连结至Symphony肽合成仪。所有溶剂、DMF、DCM、氨基酸和试剂均为经由管底部添加且通过玻料以接触树脂。经由管的底部去除所有溶液。“周期性搅动”描述N2气体穿过底部玻料的简单脉冲；该脉冲持续大约5秒且每15秒发生一次。一般不使用制备超过三周的氨基酸溶液。HATU溶液在制备5天内使用。DMF＝二甲基甲酰胺；HCTU＝2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；HATU＝六氟磷酸1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物；NMM＝n-甲基吗啉；DIPEA＝二异丙基乙胺；Sieber＝Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述与聚苯乙烯树脂的连结性的位置和类型。所用树脂为具有Sieber连接基团(在氮处经Fmoc保护)的Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g载量。其它常用酸敏感性树脂也可用于合成中，例如Rink或官能化氯三苯甲基树脂。常用氨基酸列于下文中，其中侧链保护基团指示于括号中。
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。
“Symphony方法A”的操作描述以0.050mmol规模进行的实验，其中该规模以结合至树脂的Sieber连接基团的量测定。该规模对应于大约70mg上文所述的Sieber-Merrifield树脂。可通过调整所述体积规模的倍数，将所有操作按比例放大超过0.050mmol规模。在氨基酸偶联之前，以树脂溶胀程序(在下文中描述为“溶胀程序”)来开始所有肽合成序列。氨基酸偶联至一级胺N端使用下文所述的“标准偶联操作”。氨基酸偶联至仲胺N端使用“双偶合(Double-coupling)”，定制氨基酸(custom amino acids)为经由手动空白添加(Blankaddition)氨基酸进行偶联(下文所述的“空白偶联(Blank coupling)”)。
溶胀操作：
向Symphony聚丙烯固相反应容器中添加Merrifield:Sieber树脂(70mg,0.050mmol)。如下所述将树脂洗(溶胀)三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，此时使用N2自反应容器底部鼓泡将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,2.5mL)。将混合物周期性搅动2.5分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗六次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出反应溶液。使用经由容器底部添加的DMF(6.25mL)洗树脂且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂洗三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，此时伴随N2鼓泡自反应容器底部将混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶剂。所得树脂直接用于下一步骤中。
标准偶联操作：
如下所述将树脂洗涤三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，此时伴随N2鼓泡自反应容器底部将混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,2.5mL)。将混合物周期性搅动2.5分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂洗涤6次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出反应溶液。使用经由容器底部添加的DMF(6.25mL)洗涤树脂且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
仲胺偶联操作：
如下所述将树脂洗涤三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，此时伴随N2鼓泡自反应容器底部将混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,2.5mL)。将混合物周期性搅动2.5分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂洗涤6次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。将混合物周期性搅动300分钟，然后经由玻料排出反应溶液。使用经由容器底部添加的DMF(6.25mL)洗涤树脂且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。将混合物周期性搅动300分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
定制氨基酸偶联操作：
如下所述将树脂洗涤三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，此时伴随N2鼓泡自反应容器底部将混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,2.5mL)。将混合物周期性搅动2.5分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂洗涤6次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。通过Symphony软件中止合成以向反应容器中手动添加定制氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，然后重新开始自动化：添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。将混合物周期性搅动300分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂洗涤6次：经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加Ac2O/DIPEA/DMF(v/v/v 1:1:3 2.5mL)，将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
Symphony方法B：
所有操作均在Symphony肽合成仪(Protein Technologies)上自动进行。除非有所描述，否则所有操作均在装配有底部玻料的Symphony聚丙烯管中进行。该管经由管的底部和顶部连结至Symphony肽合成仪。所有溶剂、DMF、DCM、氨基酸和试剂均为经由管底部添加且通过玻料以接触树脂。经由管底部去除所有溶液。“周期性搅动”描述N2气体穿过底部玻料的简单脉冲；该脉冲持续大约5秒且每15秒发生一次。一般不使用制备超过三周的氨基酸溶液。HATU溶液在制备5天内使用。DMF＝二甲基甲酰胺；HCTU＝2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；HATU＝六氟磷酸1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物；NMM＝n-甲基吗啉；DIPEA＝二异丙基乙胺；Sieber＝Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述与聚苯乙烯树脂的连结性的位置和类型。所用树脂为具有Sieber连接基团(在氮处经Fmoc保护)的Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g载量。其它常用酸敏感性树脂也可用于合成中，例如Rink或官能化氯三苯甲基树脂。常用氨基酸列于下文中，其中侧链保护基团指示于括号中。
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。
“Symphony方法B”的操作描述以0.050mmol规模进行的实验，其中所述规模根据结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。该规模对应于大约70mg上文所述的Sieber-Merrifield树脂。可通过调整所述体积规模的倍数，将所有程序按比例放大至超过0.050mmol规模。在氨基酸偶联之前，使用树脂溶胀程序(在下文中描述为“溶胀程序”)来开始所有肽合成序列。氨基酸至一级胺N-末端的偶联使用下文所述的“标准偶联操作”。氨基酸至仲胺N-末端的偶联使用“仲胺偶联操作B”，定制氨基酸为经由手动空白添加氨基酸进行偶联(下文所述的“定制氨基酸偶联操作”)，且使用下文所述的“最终封端操作”将氯乙酰基酸酐添加至序列的最终位置。
溶胀操作：
向Symphony聚丙烯固相反应容器中添加Merrifield:Sieber树脂(70mg,0.050mmol)。如下所述将树脂洗涤(溶胀)三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，此时伴随N2鼓泡自反应容器底部将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,2.5mL)。将混合物周期性搅动2.5分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤六次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出反应溶液。使用经由容器底部添加的DMF(6.25mL)洗涤树脂且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂洗涤三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，此时伴随N2鼓泡自反应容器底部将混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶剂。所得树脂直接用于下一步骤中。
标准偶联操作：
如下所述将树脂洗涤三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，此时伴随N2鼓泡自反应容器底部将混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,2.5mL)。将混合物周期性搅动2.5分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂洗涤6次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。将混合物周期性搅动15分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂洗涤6次：经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加Ac2O/DIPEA/DMF(v/v/v 1:1:3 2.5mL)，将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤六次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
仲胺偶联操作：
如下所述将树脂洗涤三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，此时伴随N2鼓泡自反应容器底部将混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,2.5mL)。将混合物周期性搅动2.5分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂洗涤6次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。将混合物周期性搅动15分钟，然后经由玻料排出反应溶液。使用经由容器底部添加的DMF(6.25mL)洗涤树脂且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，然后添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。将混合物周期性搅动15分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加Ac2O/DIPEA/DMF(v/v/v 1:1:3 2.5mL)，将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤六次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
定制氨基酸偶联操作：
如下所述将树脂洗涤三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，此时伴随N2鼓泡自反应容器底部将混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,2.5mL)。将混合物周期性搅动2.5分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂洗涤6次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。通过用于向反应容器中手动(manuel)添加定制氨基酸的系统(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)来中止系统，然后重新开始自动化，以向反应容器中添加HATU(0.2M于DMF中，1.25mL，5当量)，且最后添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。将混合物周期性搅动15分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂洗涤6次：经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加Ac2O/DIPEA/DMF(v/v/v 1:1:3 2.5mL)，将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤六次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。
最终封端操作：
如下所述将树脂洗涤三次：向反应容器中添加DMF(2.5mL)，此时伴随N2鼓泡自反应容器底部将混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶剂。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,2.5mL)。将混合物周期性搅动2.5分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂洗涤6次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)，随后添加氯乙酸酐(0.4M于DMF中，1.25mL，10当量)。将混合物周期性搅动15分钟，然后经由玻料排出反应溶液。使用经由容器底部添加的DMF(6.25mL)洗涤树脂且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加NMM(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)，随后添加氯乙酸酐(0.4M于DMF中，1.25mL，10当量)。将混合物周期性搅动15分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂洗涤6次：经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加Ac2O/DIPEA/DMF(v/v/v 1:1:32.5mL)，将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤六次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DMF(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器底部添加DCM(2.5mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。然后使用氮气将所得树脂干燥10min。
整体脱保护方法A：
除非另有所述，否则所有操作均手动进行。“整体脱保护方法A”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中所述规模根据结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。可通过调整所述体积规模的倍数，将操作按比例放大至超过0.100mmol规模。“脱保护溶液”使用三氟乙酸:水:三异丙基硅烷:二硫苏糖醇(92.5:2.5:2.5:2.5 v:v:v:w)制得。自反应容器取出树脂且转移至配备有玻料的25mL注射器中。向注射器中添加“脱保护溶液”(5.0mL)。将混合物在振动器中混合85min。过滤溶液，浓缩且在二乙醚(30mL)中稀释。将所析出的固体离心3分钟。倾析上清液溶液且将固体再悬浮于二乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析上清液且将剩余固体悬浮于二乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析上清液且在高真空下干燥剩余固体。获得白色至灰白色固体形式的粗制肽。
整体脱保护方法B：
除非另有所述，否则所有操作均手动进行。“整体脱保护方法B”的操作描述以0.04mmol规模进行的实验，其中所述规模根据结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。可通过调整所述体积规模的倍数，将操作按比例放大至超过0.04mmol规模。“脱保护溶液”使用三氟乙酸:三异丙基硅烷(96:4；v:v)制得。自反应容器取出树脂且转移至配备有玻料的10mL注射器中。向注射器中添加“脱保护溶液”(2.0-3.0mL)。将混合物在振动器中混合1h或1.5h。过滤溶液，使用脱保护溶液(0.5mL)洗涤，浓缩且在二乙醚(30mL)中稀释。将所析出的固体离心3分钟。倾析上清液溶液且将固体再悬浮于二乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析上清液且将剩余固体悬浮于二乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析上清液且在高真空下干燥剩余固体。获得白色至灰白色固体形式的粗制肽。
整体脱保护方法C：
除非有所描述，否则所有操作均手动进行。“整体脱保护方法C”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中所述规模根据结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。可通过调整所述体积规模的倍数，将操作按比例放大至超过0.100mmol规模。“脱保护溶液”使用三氟乙酸:三异丙基硅烷:二硫苏糖醇(95:2.5:2.5 v:v:w)制得。自反应容器取出树脂且转移至Bio-Rad管中。向Bio-Rad管中添加“脱保护溶液”(4.0mL)。将混合物在振动器中混合60分钟。过滤溶液且在二乙醚(30mL)中稀释。将所析出的固体离心3分钟。倾析上清液溶液且将固体再悬浮于二乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析上清液且将剩余固体悬浮于二乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析上清液且在高真空下干燥剩余固体。获得白色至灰白色固体形式的粗制肽。
整体脱保护方法D：
除非另有所述，否则所有操作均手动进行。“整体脱保护方法B”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中所述规模根据结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。可通过调整所述体积规模的倍数，将操作按比例放大至超过0.100mmol规模。“脱保护溶液”使用三氟乙酸:三异丙基硅烷:二硫苏糖醇(94:3:3 v:v:w)制得。自反应容器取出树脂且转移至配备有玻料的25mL注射器中。向注射器中添加“脱保护溶液”(5.0mL)。将混合物在振动器中混合5分钟。过滤溶液且在二乙醚(30mL)中稀释。将所析出的固体离心3分钟。倾析上清液溶液且将固体再悬浮于二乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析上清液且将剩余固体悬浮于二乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析上清液且在高真空下干燥剩余固体。获得白色至灰白色固体形式的粗制肽。
整体脱保护方法E：
除非有所描述，否则所有操作均手动进行。“整体脱保护方法E”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模根据结合至树脂的FmocGly-ClTrt连接基团的量所测定。可通过调整所述体积规模的倍数，将操作按比例放大至超过0.100mmol规模。“脱保护溶液”使用三氟乙酸:三异丙基硅烷:二硫苏糖醇(95:2.5:2.5 v:v:w)制得。自反应容器取出树脂且转移至Bio-Rad管中。向Bio-Rad管中添加“脱保护溶液”(2.0mL)。将混合物在振动器中混合3分钟。过滤溶液，且收集于离心管中。向Bio-Rad管中添加“脱保护溶液”(2.0mL)。将混合物在振动器中混合3分钟。过滤溶液，且收集于离心管中。向Bio-Rad管中添加“脱保护溶液”(2.0mL)。将混合物在振动器中混合3分钟。过滤溶液，且收集于离心管中。将离心管中的溶液静置60分钟。然后使用二乙醚(30mL)稀释所收集溶液，且形成析出物。将所析出的固体离心3分钟。倾析上清液溶液且将固体再悬浮于二乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析上清液且将剩余固体悬浮于二乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析上清液且在高真空下干燥剩余固体。获得白色至灰白色固体形式的粗制肽。
整体脱保护方法F：
除非有所描述，否则所有操作均手动进行。“整体脱保护方法F”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模根据结合至树脂的Rink连接基团的量所测定。可通过调整所述体积规模的倍数，将操作按比例放大至超过0.100mmol规模。“脱保护溶液”使用三氟乙酸:三异丙基硅烷:二硫苏糖醇(95:2.5:2.5 v:v:w)制得。自反应容器取出树脂且转移至6ml Bio-Rad管中。向Bio-Rad中添加“脱保护溶液”(4.0mL)。将混合物在振动器中混合90分钟。过滤溶液且在二乙醚(30mL)中稀释。将所析出的固体离心3分钟。倾析上清液溶液且将固体再悬浮于二乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析上清液且将剩余固体悬浮于二乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析上清液且在高真空下干燥剩余固体。获得白色至灰白色固体形式的粗制肽。
环化方法A
除非另有所述，否则所有操作均手动进行。“环化方法A”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模根据结合至用于生成肽的树脂的Sieber连接基团的量所测定。该规模并非基于操作中所使用肽的量的直接测定。可通过调整所述体积规模的倍数，将操作按比例放大至超过0.100mmol规模。将粗制肽固体溶于乙腈:水性8M胍/50mM TRIS(1:3)(pH 8.6)(7mL:18mL或类似比率)的溶液中，且然后视需要使用NaOH水溶液(1.0M)将溶液调节至pH＝8.5-9.0。然后使用振动器将溶液混合12至18小时。浓缩反应溶液且然后将残余物溶于乙腈:水中。对该溶液实施反相HPLC纯化以得到期望的环状肽。
环化方法C：
除非有所描述，否则所有操作均手动进行。“环化方法C”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模根据结合至用于生成肽的树脂的Sieber连接基团的量所测定。该规模并非基于操作中所使用肽的量的直接测定。可通过调整所述体积规模的倍数，将操作按比例放大至超过0.100mmol规模。将粗制肽固体溶于乙腈:水性0.1M碳酸氢铵缓冲剂(11mL:24mL或类似比率)的溶液中，且然后使用NaOH水溶液(1.0M)将溶液小心调节至pH＝8.5-9.0。然后使用振动器将溶液混合12至18小时。浓缩反应溶液且然后将残余物溶于乙腈:水中。对该溶液实施反相HPLC纯化以得到期望的环状肽。
环化方法D：
除非有所描述，否则所有操作均手动进行。“环化方法D”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模根据结合至用于生成肽的树脂的Sieber连接基团的量所测定。该规模并非基于操作中所使用肽的量的直接测定。可通过调整所述体积规模的倍数，将操作按比例放大至超过0.100mmol规模。将粗制肽固体溶于乙腈:水性0.1M碳酸氢铵缓冲剂(11mL:24mL)的溶液中，且然后使用NaOH水溶液(1.0M)将溶液小心调节至pH＝8.5-9.0。然后伴随搅拌将溶液混合12至18小时。浓缩反应溶液且然后将残余物溶于乙腈:水中。对该溶液实施反相HPLC纯化以得到期望的环状肽。
环化方法E：
除非有所描述，否则所有操作均手动进行。“环化方法E”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模根据结合至用于生成肽的树脂的Sieber连接基团的量所测定。该规模并非基于操作中所使用肽的量的直接测定。可通过调整所述体积规模的倍数，将操作按比例放大至超过0.100mmol规模。将粗制肽固体溶于6M胍HCl缓冲剂(15mL)的水溶液中，然后将溶液伴随搅拌混合12至18小时。浓缩反应溶液且向残余物中添加15mLDMSO以得到浆液，过滤浆液。对该经过滤的溶液实施反相HPLC纯化以得到期望的环状肽。
手动偶联操作A：
向含有来自先前步骤的树脂的Bio-Rad反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性振动5分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物振动60秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加典型氨基酸(1.2-10当量)(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)，然后添加典型HATU(1.2-10当量)(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)，且最后添加典型DIPEA(2.4-20当量)(0.8M于DMF中，1.25mL，10当量)。将混合物振动60分钟至18小时，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物振动60秒，然后经由玻料排出溶液。
N-甲基化树脂上方法A.(Turner,R.A.；Hauksson,N.E.；Gipe,J.H.；Lokey,R.S.Org.Lett.2013,15(19),5012-5015)：
除非有所描述，否则所有操作均手动进行。“N-甲基化树脂上方法A”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模根据结合至用于生成肽的树脂的Sieber连接基团的量所测定。该规模并非基于操作中所使用肽的量的直接测定。可通过调整所述体积规模的倍数，将操作按比例放大至超过0.100mmol规模。
将树脂转移至25mL熔块注射器中。向树脂中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物振动3min且然后经由玻料排出溶液。使用DMF(4.0mL)将树脂洗涤3次。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,4.0mL)。将混合物振动3min且然后经由玻料排出溶液。使用DMF(4.0mL)将树脂连续洗涤三次且使用DCM(4.0mL)连续洗涤三次。将树脂悬浮于DMF(2.0mL)和三氟乙酸乙酯(0.119ml,1.00mmol)、1,8-氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(0.181ml,1.20mmol)中。将混合物置于振动器上保持60min。经由玻料排出溶液。使用DMF(4.0mL)将树脂连续洗涤三次且使用DCM(4.0mL)连续洗涤三次。
使用无水THF(2.0mL)将树脂洗涤三次以去除任何残余水。在烘干的4.0mL小瓶中，添加THF(1.0mL)和位于干燥分子筛(20mg)上的三苯基膦(131mg,0.500mmol)。将溶液转移至树脂中且缓慢添加偶氮二甲酸二异丙基酯(0.097mL,0.5mmol)。将树脂搅拌15min。经由玻料排出溶液且使用无水THF(2.0mL)将树脂洗涤三次以去除任何残余水。在烘干的4.0mL小瓶中添加THF(1.0mL)、位于干燥分子筛(20mg)上的三苯基膦(131mg,0.500mmol)。将溶液转移至树脂中且缓慢添加偶氮二甲酸二异丙基酯(0.097mL,0.5mmol)。将树脂搅拌15min。经由玻料排出溶液。使用DMF(4.0mL)将树脂连续洗涤三次且使用DCM(4.0mL)连续洗涤三次。将树脂悬浮于乙醇(1.0mL)和THF(1.0mL)中，且添加硼氢化钠(37.8mg,1.000mmol)。将混合物搅拌30min且排出。使用DMF(4.0mL)将树脂连续洗涤三次且使用DCM(4.0mL)连续洗涤三次。
微裂解A：
向树脂的小(<10mg)试样中添加2滴TIS和1mL三氟乙酸，在室温振动。在1h之后，取出较小等分试样并使用0.5mL乙腈稀释，过滤，并通过LC-MS获得分析。
(S)-2-((S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-苯基丙酰氨基)丙酸甲酯
将(S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-苯基丙酸(500mg,1.670mmol)和HATU(699mg,1.837mmol)溶于CH2Cl2(10mL)和DMF(4mL)中。将混合物在室温搅拌10min，然后添加存于1mL DMF中的(S)-2-氨基丙酸甲酯HCl(245mg,1.754mmol)和许尼希碱(Hunig'sBase)(1.167mL,6.68mmol)。将混合物在室温搅拌2小时，此时LC-MS显示完成转化。使用3ml 1NHCl淬灭。倾倒至150mL EA中，使用10％LiCl洗涤两次。然后浓缩有机层。在50gGOLDC18柱上纯化粗制材料。10％--100％溶剂B梯度，22min。溶剂A：水/TFA；溶剂B：ACN/TFA。
合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥，得到标题化合物(600mg,86％)。
分析LCMS条件A：保留时间＝0.88min；ESI-MS(+)m/z 385.1(M+H)。
(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)-1H-四唑-1-基)丙酸甲酯
在N2下，向压力小瓶中装填存于THF(20ml)中的(S)-2-((S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-苯基丙酰氨基)丙酸甲酯(600mg,1.561mmol)和二苯基-2-吡啶基膦(1644mg,6.24mmol)。使用N2吹扫溶液，然后逐滴添加DIAD(1.214ml,6.24mmol)。然后缓慢添加二苯基磷酰基叠氮化物(1.682ml,7.80mmol)。将混合物加热至50℃并在50℃搅拌14小时，此时LC-MS显示期望的产物峰。冷却至室温且将混合物倾倒至80mL EtOAc中，使用冷1N HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤。然后浓缩有机层且通过以下RediSep柱纯化所获得的材料：Silica80g Gold；流速：60ml/min；梯度：在15min内0％--45％溶剂B；溶剂A1：己烷；溶剂B1：乙酸乙酯。
合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥，得到标题化合物(290mg)。
分析LCMS条件A：保留时间＝1.0min；ESI-MS(+)m/z 410.1(M+H)。
(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)-1H-四唑-1-基)丙酸
将(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)-1H-四唑-1-基)丙酸甲酯(290mg,0.425mmol)溶于THF(4mL)和MeOH(1mL)共溶剂中。向该溶液中分两份添加LiOH(1.275mL,2.55mmol)。LC-MS显示在室温搅拌2小时之后完成转化。使用1N HCl终止反应，将pH调节至1-2。使用EtOAc萃取两次。然后通过Na2SO4干燥有机层并浓缩，得到285mg粗制材料。未实施纯化。
分析LCMS条件A：保留时间＝0.83min；ESI-MS(+)m/z 396.3(M+H)。
(S)-2-(5-((S)-1-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)-1H-四唑-1-基)丙酸
在N2下，将(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)-1H-四唑-1-基)丙酸(285mg,0.721mmol)溶于MeOH(4ml)中。使用N2吹扫系统，然后添加Pd/C(77mg,0.072mmol)。将混合物在室温和H2气囊下搅拌过夜。使用硅藻土塞过滤出催化剂，使用甲醇洗涤且去除溶剂。
将上述残余物溶于乙腈(4mL)和水(2mL)中。冷却至0℃且向溶液中添加Na2CO3(1.802ml,3.60mmol)，随后添加存于1mL CH3CN中的碳酸(9H-芴-9-基)甲酯·(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(267mg,0.793mmol)。将反应混合物在2小时内升温至室温。使用1N HCl酸化至pH2并使用EtOAc萃取。然后通过Na2SO4干燥有机层并浓缩。在反相HPLC上纯化所获得的粗制材料。柱：Axia Luna C18 30*100mm；溶剂A：95％H2O/5％ACN/0.05％TFA；溶剂B：95％ACN/5％H2O/0.05％TFA；梯度：10％--100％溶剂B，在12min内。
合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥，得到标题化合物(90mg)。
分析LCMS条件A：保留时间＝0.97min；ESI-MS(+)m/z 484.0(M+H)。
(R)-2-((S)-3-(苯并[b]噻吩-3-基)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)丙酰氨基)己酸甲酯
在0℃，向存于DCM(30.2ml)中的(S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-(4-(叔丁氧基)苯基)丙酸(2.24g,6.03mmol)和(S)-2-氨基丙酸甲酯盐酸盐(0.850g,6.09mmol)的溶液中添加固体HATU(2.408g,6.33mmol)，在15min之后添加N-甲基吗啉(1.326ml,12.06mmol)，且升温至室温过夜。添加1N HCl 20ml并搅拌10min。倾倒至分液漏斗中，分离各层并使用DCM(30ml)将水相再萃取2次。通过Na2SO4干燥合并的有机层，过滤并剥离以得到油状物。
在硅胶上使用己烷-乙酸乙酯(0至100％)于Isco 80G柱上纯化材料，产生1.91克产物。
分析LCMS条件E：保留时间：1.05min，483.4(M+1)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm8.46(1H,d,J＝7.46Hz),7.96(2H,t,J＝8.62Hz),7.57(1H,d,J＝8.68Hz),7.19-7.49(6H,m),4.95(m,2H)4.38-4.57(1H,m),4.28(1H,td,J＝8.01,5.50Hz),3.53-3.76(3H,s),3.32(2H,s),3.12-3.24(1H,m),3.06(1H,dd,J＝14.67,10.15Hz),1.50-1.80(2H,m),1.29(3H,br.s.),0.75-0.98(3H,m)。
(2R)-2-(5-((S)-2-(苯并[b]噻吩-3-基)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)乙基)-4H-1，2，3-三唑-4-基)己酸甲酯
在N2下，向配备有氮气线和磁力搅拌器的单颈圆底烧瓶中装填(S)-2-((S)-3-(苯并[b]噻吩-3-基)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)丙酰氨基)己酸甲酯(1.91g,3.96mmol)和二苯基-2-吡啶基膦(3.13g,11.87mmol)，然后添加THF(25ml)。使用N2将溶液吹扫5min，然后逐滴添加DIAD(2.309ml,11.87mmol)。然后经由加料漏斗添加二苯基磷酰基叠氮化物(3.41ml,15.83mmol)。将反应液在室温和氮气气氛下搅拌18小时。去除THF以得到稠油状物，将稠油状物溶于100mL乙酸乙酯中并添加100mL 1N HCl。使用50mL乙酸乙酯将水相再萃取2次。通过Na2SO4干燥合并的有机物，过滤并剥离以得到油状物。
ISCO，220克二氧化硅；己烷至乙酸乙酯梯度；分离出0.556克期望材料。材料呈现为粗制混合物形式。
分析LCMS条件E：保留时间：1.1min，508.4(M+1)。
(S)-2-(5-((S)-2-(苯并[b]噻吩-3-基)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)乙基)-1H-四唑-1-基)己酸
向(S)-2-(5-((S)-2-(苯并[b]噻吩-3-基)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)乙基)-1H-四唑-1-基)己酸甲酯(0.566g,1.115mmol)中添加MeOH(2.79ml)和THF(2.79ml)。搅拌混合物直至呈溶液形式为止，然后添加氢氧化锂(1.673ml,3.35mmol)并在室温搅拌15min。添加1N HCl以达成弱酸性pH 6并使用25mL乙酸乙酯萃取3次。使用Na2SO4干燥合并的有机物，过滤，并去除溶剂以得到无色油状物，其未经纯化即使用。LCMS条件E：保留时间＝0.99min，494.4(M+1)。
(S)-2-(5-((S)-1-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-(苯并[b]噻吩-3-基)乙基)-1H-四唑-1-基)己酸
在0℃，向溶于乙腈(12ml)(在冰水浴中冷却)中的(S)-2-(5-((S)-2-(苯并[b]噻吩-3-基)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)乙基)-1H-四唑-1-基)己酸(0.55g,1.114mmol)中添加三甲基碘硅烷(0.465ml,3.34mmol)。在0℃搅拌1/2小时，然后升温至室温保持1/2小时。添加1N HCl并使用20mL乙酸乙酯萃取4次。通过Na2SO4干燥有机层，过滤，并剥离以得到黄褐色油状物。
在ISCO上使用80克Gold二氧化硅柱纯化，产生0.126克白色固体。
LCMS条件E：保留时间＝0.99min，582.5(M+1)
(S)-2-((S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-(4-(叔丁氧基)苯基)丙酰氨基)丙酸甲酯
在0℃，向存于DCM(30.2ml)中的(S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-(4-(叔丁氧基)苯基)丙酸(2.24g,6.03mmol)和(S)-2-氨基丙酸甲酯盐酸盐(0.850g,6.09mmol)的溶液中添加固体HATU(2.408g,6.33mmol)。在15min之后，添加N-甲基吗啉(1.326ml,12.06mmol)且将混合物升温至室温过夜。添加1N HCl 30ml并使用二氯甲烷(30mL)萃取3次，通过Na2SO4干燥合并的有机物，过滤，并剥离以得到蜡。经由正相色谱(ISCO，80克二氧化硅，己烷至乙酸乙酯梯度)纯化残余物，产生1.3克产物。
LCMS条件E：保留时间＝0.97min 457.5(M+1)；1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.40-7.31(m,5H),7.14-7.05(m,J＝8.1Hz,2H),6.97-6.84(m,2H),5.31(s,1H),5.11(s,2H),4.49(s,1H),3.72(s,3H),1.57(br.s.,2H),1.38-1.29(m,12H)。
(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-(4-(叔丁氧基)苯基)乙基)-1H-四唑-1-基)丙酸甲酯
在N2下，在配备有氮气线、磁力搅拌器且装填有(S)-2-((S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-(4-(叔丁氧基)苯基)丙酰氨基)丙酸甲酯(1.77g,3.88mmol)的单颈圆底烧瓶中添加存于THF(25ml)中的二苯基-2-吡啶基膦(3.05克，11.64mmol)。使用N2吹扫溶液，然后逐滴添加DIAD(2.261ml,11.63mmol)。然后缓慢添加二苯基磷酰基叠氮化物(3.34ml,15.51mmol)。将反应液在室温搅拌2.5小时。将混合物加热至55℃并在50℃搅拌20小时。冷却至室温并倾倒至40mL乙酸乙酯中，使用冷1N HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤。去除有机物以得到稠油状物。在ISCO 80克柱(存于己烷中的0至100％乙酸乙酯)上纯化残余物，产生2.24克混合物，其未经进一步纯化即使用。
LCMS条件D：保留时间＝1.01min，482.5。
(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-(4-(叔丁氧基)苯基)乙基)-1H-四唑-1-基)丙酸
向(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-(4-(叔丁氧基)苯基)乙基)-1H-四唑-1-基)丙酸甲酯(2.24g,4.65mmol)中添加MeOH(11.63ml)和THF(11.63ml)。搅拌混合物直至呈溶液形式为止，然后添加氢氧化锂(6.98ml,13.96mmol)。将混合物在室温搅拌15min。添加1N HCl以达成弱酸性pH 6并使用25mL乙酸乙酯萃取3次。使用Na2SO4干燥合并的有机物，过滤并去除溶剂，得到油状物，其未经纯化即用于下一步骤中。
LCMS条件D：保留时间＝0.93min，468.4。
(S)-2-(5-((S)-1-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-(4-(叔丁氧基)苯基)乙基)-1H-四唑-1-基)丙酸
在N2下，将(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-(4-(叔丁氧基)苯基)乙基)-1H-四唑-1-基)丙酸(3.4g,7.27mmol)溶于20mL MeOH中。向该溶液中添加Pd/C(500mg,0.470mmol)。将溶液脱气，然后改充H2气囊。将混合物在H2下搅拌4小时。LC-MS显示转化>95％。过滤出催化剂，去除溶剂，得到粗制材料。
将上述材料溶于THF(8mL)中，添加乙腈(6mL)和3mL水。在冰水浴中冷却至0℃，添加Na2CO3(2.312g,21.82mmol)，随后逐份添加碳酸(9H-芴-9-基)甲基酯·(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(2.70g,8.00mmol)。在室温搅拌过夜。添加1N HCl以达成弱酸性pH 5。使用25mL乙酸乙酯萃取4次。通过Na2SO4干燥合并的萃取物，过滤并去除溶剂，得到黄色油状物。通过ISCO220克柱(使用己烷至乙酸乙酯梯度)，得到0.403克产物。
LCMS条件D：保留时间＝1.2min，556.5
分析HPLC条件H：保留时间：11.34min，94％
分析HPLC条件G：保留时间：12.39min，93.9％
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.9-13.4(s,1H),8.33(d,J＝8.0Hz,1H),7.86(d,J＝7.5Hz,2H),7.71-7.59(m,1H),7.57(d,J＝7.5Hz,1H),7.47-7.34(m,2H),7.34-7.16(m,3H),6.92-6.75(m,2H),5.72-5.47(m,1H),5.3-5.05(m,1H),4.27-4.02(m,3H),3.25(dd,J＝13.8,10.3Hz,1H),3.10(dd,J＝14.1,4.5Hz,1H),1.99-1.71(m,2H),1.65(d,J＝7.0Hz,1H),1.29-1.11(m,9H)。
3-((S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-(((S)-1-甲氧基-1-氧代己烷-2-基)氨基)-3-氧代丙基)-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯
在室温，将HATU(30.0g,79mmol)添加至存于CH2Cl2(274ml)和DMF(132ml)中的(S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-(1-(叔丁氧基羰基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(28.8g,65.7mmol)的经搅拌溶液中。将反应混合器在室温搅拌10min。然后在室温添加存于2mL DMF中的(S)-2-氨基己酸甲酯盐酸盐(14.32g,79mmol)和DIPEA(40.2ml,230mmol)。将反应液在室温混合1 1/2h。使用1.5N HCl和10％LiCl溶液洗涤反应混合物并使用二氯甲烷萃取。通过Na2SO4干燥有机层经并浓缩。通过ISCO正相色谱纯化粗制材料。在20％乙酸乙酯/石油醚中洗脱化合物。
LCMS条件D：保留时间：2.23min，566.4(M+1)
分析HPLC条件G：保留时间：23.97min，97.9％。
3-((S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-(1-((S)-1-甲氧基-1-氧代己烷-2-基)-1H-四唑-5-基)乙基)-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯
在N2下，向于THF(80mL)中的3-((S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-(((S)-1-甲氧基-1-氧代己烷-2-基)氨基)-3-氧代丙基)-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯(10g,17.68mmol)和三苯基膦(13.91g,53.0mmol)的经搅拌溶液中。使用N2吹扫溶液，然后逐滴添加DIAD(10.31mL,53.0mmol)。然后缓慢添加叠氮化磷酸二苯基酯(13.33mL,61.9mmol)。在75℃加热反应混合物并在75℃搅拌24小时。将反应混合物冷却至室温并倾倒至500ml乙酸乙酯中，使用2N HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤。然后浓缩有机层并获得粗制材料。通过正相色谱纯化粗制材料，产生3-((S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-(1-((S)-1-甲氧基-1-氧代己烷-2-基)-1H-四唑-5-基)乙基)-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯(6g,9.65mmol，54.6％产率)
LCMS条件D：保留时间：2.54min，591.3(M+1)。
分析HPLC条件K：保留时间：2.58min，95.7％。
(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-(1-(叔丁氧基羰基)-1H-吲哚-3-基)乙基)-1H-四唑-1-基)己酸
使用LiOH(15.24ml,30.5mmol)处理存于THF(33.6ml)和MeOH(8.40ml)中的3-((S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-(1-((S)-1-甲氧基-1-氧代己烷-2-基)-1H-四唑-5-基)乙基)-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯(6g,10.16mmol)的经搅拌溶液并在室温搅拌3h。使用1NHCl酸化反应混合物并使用乙酸乙酯萃取。干燥有机层并浓缩以得到粗制物。通过combiflash纯化粗产物，产生(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-(1-(叔丁氧基羰基)-1H-吲哚-3-基)乙基)-1H-四唑-1-基)己酸(3.5g,5.89mmol，58.0％产率)
LCMS条件D：保留时间：2.41min，477.2(M+1)。
(S)-2-(5-((S)-1-氨基-2-(1-(叔丁氧基羰基)-1H-吲哚-3-基)乙基)-1H-四唑-1-基)己酸
在N2下，向存于MeOH(56.7ml)中的(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-(1-(叔丁氧基羰基)-1H-吲哚-3-基)乙基)-1H-四唑-1-基)己酸(3.5g,6.07mmol)的经搅拌溶液中添加Pd/C(1.292g,1.214mmol)。将溶液脱气，然后改充H2。将混合物在H2下在室温搅拌7小时。经由硅藻土过滤反应混合物并使用甲醇洗涤滤床，并浓缩，得到(S)-2-(5-((S)-1-氨基-2-(1-(叔丁氧基羰基)-1H-吲哚-3-基)乙基)-1H-四唑-1-基)己酸(1.8g,3.69mmol，42.6％产率)。
LCMS条件D：保留时间：2.13min，441.2(M+1)。
(S)-2-(5-((S)-1-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-(1-(叔丁氧基羰基)-1H-吲哚-3-基)乙基)-1H-四唑-1-基)己酸
向存于乙腈(24.88ml)和水(12.44ml)中且冷却至0℃的(S)-2-(5-((S)-1-氨基-2-(1-(叔丁氧基羰基)-1H-吲哚-3-基)乙基)-1H-四唑-1-基)己酸(1.8g,4.07mmol)的经搅拌溶液中添加Na2CO3(6.51ml,13.02mmol)，随后添加FMOC-OSU(1.647g,4.88mmol)并在室温搅拌4h。使用1N HCl将反应混合物淬灭并将pH调节至1-2。使用乙酸乙酯萃取并浓缩以得到粗制油状物。通过反相combi flash纯化粗制化合物，得到0.88克(S)-2-(5-((S)-1-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-(1-(叔丁氧基羰基)-1H-吲哚-3-基)乙基)-1H-四唑-1-基)己酸。
LCMS条件D：保留时间：2.25min，666.6(M+1)。
分析HPLC条件H：保留时间：16.2min，92％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.45(d,J＝8.0Hz,1H),8.02(d,J＝8.5Hz,1H),7.84(d,J＝7.0Hz,2H),7.76(d,J＝8.0Hz,1H),7.66(s,1H),7.60-7.49(m,2H),7.40-7.26(m,3H),7.26-7.14(m,2H),5.16(d,J＝10.5Hz,1H),4.18-4.04(m,2H),3.51-3.36(m,2H),3.17(s,2H),2.28(br.s.,1H),1.63-1.46(m,9H),1.19(d,J＝7.0Hz,2H),1.07(d,J＝8.0Hz,1H),0.75-0.63(m,2H)。
(S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-(萘-1-基)丙酸
在0℃，将氯甲酸苄基酯(1.081mL,7.67mmol)和NaOH(8.36mL,8.36mmol)同时滴加至存于THF(7mL)和7ml 1N NaOH中的(S)-2-氨基-3-(萘-1-基)丙酸(1.5g,6.97mmol)的经搅拌溶液中。将混合物在室温搅拌2小时，此时LC-MS显示期望的产物峰。使用1N HCl酸化并使用EtOAc萃取。去除EtOAc且通过RediSep柱(80g二氧化硅)纯化所获得的粗制材料。
流速：60ml/min
溶剂A：二氯甲烷；溶剂B：20％MeOH/80％DCM。
梯度：0％--50％溶剂B，在20min内。
合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥，得到标题化合物(2.21g,89％)。
分析LCMS条件A：保留时间＝0.98min；ESI-MS(+)m/z 350.08(M+H)。
(S)-2-((S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-(萘-1-基)丙酰氨基)己酸甲酯
将(S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-(萘-1-基)丙酸(2.1g,6.01mmol)和HATU(2.74g,7.21mmol)溶于CH2Cl2(25mL)和DMF(12mL)中。将混合物在室温搅拌10min，然后添加存于2ml DMF中的(S)-2-氨基己酸甲酯HCl(1.310g,7.21mmol)和许尼希碱(3.67mL,21.04mmol)。将混合物在室温搅拌2小时，此时LC-MS显示完成转化。使用10ml 1N HCl淬灭。将混合物倾倒至250ml EtOAc中，使用10％LiCl洗涤两次并使用盐水洗涤一次。然后通过Na2SO4干燥有机层并浓缩。通过RediSep柱(220g二氧化硅)纯化粗制材料。
流速：150ml/min
平衡体积：1.0CV
溶剂A1：己烷；溶剂B1：乙酸乙酯
梯度：0％--40％溶剂B，在15min内。
合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥，得到标题化合物(1.86g,65％)。
分析LCMS条件A：保留时间＝1.14min；ESI-MS(+)m/z 477.1(M+H)。
(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-(萘-1-基)乙基)-1H-四唑-1-基)己酸甲酯
在N2下，向压力小瓶中装填存于THF(35ml)中的(S)-2-((S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-(萘-1-基)丙酰氨基)己酸甲酯(1.8g,3.78mmol)和二苯基-2-吡啶基膦(2.98g,11.33mmol)，使用N2吹扫，然后逐滴添加DIAD(2.203ml,11.33mmol)。然后缓慢添加二苯基磷酰基叠氮化物(2.85ml,13.22mmol)。将混合物加热至55℃并在55℃搅拌18小时，此时LC-MS显示期望的产物峰。冷却至室温并倾倒至200ml EtOAc中，使用2N HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤。然后浓缩有机层且通过RediSep柱(Silica 330g Gold)纯化所获得的材料。
流速：200ml/min
平衡体积：3.0CV
溶剂A1：己烷；溶剂B1：乙酸乙酯
梯度：0％-40％溶剂B，在15min内。
合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥，得到标题化合物(533mg,28％)
分析LCMS条件A：保留时间＝1.18min；ESI-MS(+)m/z 502.2(M+H)。
(S)-2-(5-((S)-1-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-(萘-1-基)乙基)-1H-四唑-1-基)己酸
将(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-(萘-1-基)乙基)-1H-四唑-1-基)己酸甲酯(533mg,1.063mmol)溶于THF(8mL)和MeOH(2mL)共溶剂中。向该溶液中分两份添加LiOH(1.594mL,3.19mmol)。LC-MS显示在室温搅拌2小时之后完成转化。产物峰出现于0.99/2.0min。使用1N HCl淬灭反应，将pH调节至1-2。使用EtOAc萃取。然后通过Na2SO4干燥有机层并浓缩，得到粗制材料。
在N2下，将上述所获得的材料溶于10ml MeOH中。向该溶液中添加Pd/C(170mg,0.159mmol)。将溶液脱气，然后改充H2气囊。将混合物在H2下搅拌7小时，此时LC-MS显示转化>95％。过滤出催化剂并去除溶剂。将所获得的残余物溶于乙腈(6mL)和水(3ml)中。冷却至0℃，添加Na2CO3(1.594mL,3.19mmol)，随后添加碳酸(9H-芴-9-基)甲基酯·(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(394mg,1.169mmol)。将混合物在室温搅拌3小时，此时LC-MS显示完成转化。使用1N HCl淬灭，将pH调节至1--2并使用EtOAc萃取。然后在真空下浓缩有机层且通过RediSep柱(40g二氧化硅)纯化所获得的粗制材料。
流速：40ml/min
平衡体积：5.0CV
溶剂A：二氯甲烷
溶剂B：20％MeOH/DCM
梯度：0％--50％溶剂B，在15min内。
合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥，得到标题化合物(429mg,63％，3个步骤)。
分析LCMS条件A：保留时间＝1.18min；ESI-MS(+)m/z 576.2(M+H)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.15-13.65(s,1H),8.47(d,J＝8.5Hz,1H),8.05(s,1H),7.95-7.89(m,1H),7.89-7.76(m,3H),7.63-7.49(m,5H),7.43-7.32(m,3H),7.26(d,J＝6.5Hz,1H),7.23(d,J＝8.0Hz,1H),5.51-5.31(m,1H),5.31-5.18(m,1H),4.17-4.04(m,3H),3.81-3.71(m,2H),2.24(br.s.,2H),2.85-2.1(m,2H),1.23-1.08(m,2H),0.75-0.62(m,3H)。
(S)-(1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基甲酸苄基酯
向存于DCM(6mL)中的(S)-(1-羟基-3-苯基丙-2-基)氨基甲酸苄基酯(0.457g,1.6mmol)的混合物中添加戴斯-马丁高碘烷(Dess-Martin Periodinane)(0.814g,1.920mmol)。在2小时之后，LCMS显示在室温搅拌6小时之后完成转化。使用二氯甲烷稀释反应混合物并使用冷1N NaOH洗涤。使用MgSO4干燥有机层，过滤并浓缩。产物未经进一步纯化即用于下一步骤中。
分析LCMS条件A：保留时间＝0.85min；ESI-MS(+)m/z 284.0(M+H)。
(S)-(1-苯基丁-3-炔-2-基)氨基甲酸苄基酯
将起始材料(S)-(1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基甲酸苄基酯(400mg,1.412mmol)溶于无水MeOH(8mL)中。冷却至0℃且然后添加K2CO3(390mg,2.82mmol)，随后添加膦酸二甲基酯·(1-重氮-2-氧代丙基)酯(0.318mL,2.118mmol)。将混合物缓慢升温至室温并搅拌3小时。LC-MS显示部分转化。期望产物峰出现于0.97/2.0min。将反应液在室温搅拌过夜,，此时LC-MS显示完成转化。将混合物倾倒至0.5N HCl中，使用乙酸乙酯萃取。然后通过Na2SO4干燥有机层并浓缩。然后在24g ISCO柱上纯化粗制材料。
溶剂A：CH2Cl2；溶剂B：20％MeOH/CH2Cl2。梯度：0--50％溶剂B，在15min内。50％溶剂B，保持10min。
合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥，得到标题化合物(240mg,61％)。
分析LCMS条件A：保留时间＝0.96min；ESI-MS(+)m/z 280.1(M+H)。
(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙酸叔丁酯
将起始材料(S)-(1-苯基丁-3-炔-2-基)氨基甲酸苄基酯(85mg,0.304mmol)和(S)-2-叠氮基丙酸叔丁酯(208mg,1.217mmol)溶于甲苯(4mL)中。使用N2吹扫，然后添加Ru-催化剂[113860-07-4](16.54mg,0.015mmol)。将混合物在100℃搅拌16小时，此时LC-MS显示完成转化。去除溶剂。在反相HPLC柱(30*100mm Luna)上纯化所获得的残余物。
溶剂A：95％H2O/5％CH3CN/0.1％TFA；溶剂B：5％H2O/95％CH3CN/0.1％TFA
合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥，得到标题化合物(56mg,41％)。
分析LCMS条件A：保留时间＝1.01min；ESI-MS(+)m/z 451.1(M+H)。
(S)-2-(5-((S)-1-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙酸
将起始材料(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙酸叔丁酯(142mg,0.315mmol)在N2下溶于MeOH(4ml)中。使用N2吹扫系统，然后添加Pd/C(33.5mg,0.032mmol)。将混合物在室温和H2气囊下搅拌7小时，此时LC-MS显示完全转化成中间体(S)-2-(5-((S)-1-氨基-2-苯基乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙酸叔丁酯。过滤出催化剂并去除溶剂。将所获得的残余物溶于乙腈(4mL)和水(2mL)中。冷却至0℃且向溶液中添加N2CO3(0.788ml,1.576mmol)，随后添加存于1ml CH3CN中的碳酸(9H-芴-9-基)甲基酯●(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(117mg,0.347mmol)。将反应混合物在2小时内升温至室温。LC-MS显示起始材料已消耗。使用1N HCl酸化至pH2并使用乙酸乙酯萃取。然后通过Na2SO4干燥有机层并浓缩。然后使用存于CH2Cl2(5ml)中的20％TFA将所获得的材料在室温处理7小时。LC-MS显示完成转化。在反相HPLC上纯化所获得的粗制材料。
柱：30*100mm Luna
溶剂A：95％H2O/5％CH3CN/0.1％TFA；溶剂B：5％H2O/95％CH3CN/0.1％TFA
合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥，得到标题化合物(68mg,44％，3个步骤)。
分析LCMS条件A：保留时间＝0.95min；ESI-MS(+)m/z 483.1(M+H)。
中间体树脂A：((S)-1-(((S)-4-氨基-1-((S)-2-(((5R,8S,11S,14S,17S,20S,23S,29S,32S)-17,23-双((1H-吲哚-3-基)甲基)-1-氨基-11,14-二丁基-8-(3-胍基丙基)-20-(羟基甲基)-33-(1H-咪唑-5-基)-29-异丁基-5-(巯基甲基)-12,15,27-三甲基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十一氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氮杂三十三烷-32-基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-1,4-二氧代丁-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯Seiber酰胺树脂
向125mL反应容器中添加Sieber树脂(1410mg,1mmol)，且将容器置于CEM Liberty微波肽合成仪上。然后依次进行下列操作：
进行“CEM方法A：树脂溶胀程序”；
使用Fmoc-Gly-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作”；
使用Fmoc-Cys(Trt)-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作”；
使用Fmoc-Arg(Pbf)-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作；
使用Fmoc-[N-Me]Nle-OH进行“CEM方法A：双偶合偶联操作”；
使用Fmoc-[N-Me]Nle-OH进行“CEM方法A：双偶合偶联操作”；
使用Fmoc-Trp(Boc)-OH进行“CEM方法A：双偶合偶联操作”；
使用Fmoc-Ser(tBu)-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作”；
使用Fmoc-Trp-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作”；
使用Fmoc-Sar-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作”；
使用Fmoc-Leu-OH进行“CEM方法A：双偶合偶联操作”；
使用Fmoc-His(Trt)-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作”；
使用Fmoc-Pro-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作”；
使用Fmoc-Asn(tBu)-OH进行“CEM方法A：双偶合偶联操作”；
将所得树脂转移至配备有玻料的100mL聚丙烯管中并使用DCM(40mL×3)洗涤。最后，在真空下干燥树脂并用作合成中间体。
进行微裂解A。
分析LCMS条件A：保留时间＝1.0min,ESI-MS(+)m/z 966.6(M+2H+1CO2)。
实施例1001和实施例1002的制备
自中间体树脂A开始，使用依次进行的下列操作处理所得树脂：
针对(S)-2-(5-((S)-1-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)-1H-四唑-1-基)丙酸进行“手动偶联操作A”
“氯乙酸偶联操作B”
“整体脱保护方法C”
“环化方法D”
实施例1001，异构体1。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：WatersXBridge C18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；梯度：在25分钟内20-60％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为2.1mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为95％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.57min；ESI-MS(+)m/z 932.15(M+2H)
分析LCMS条件E：保留时间＝1.44min；ESI-MS(+)m/z 932.35(M+2H)。
实施例1002，异构体2。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：WatersXBridge C18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；梯度：在25分钟内20-60％B，然后在60％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为1.5mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为99％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.79min；ESI-MS(+)m/z 932.15(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.66min；ESI-MS(+)m/z 931.85(M+2H)。
实施例1003和实施例1004的制备
自中间体树脂A开始。使用依次进行的下列操作处理所得树脂：
针对(S)-2-(5-((S)-1-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙酸进行“手动偶联操作A”。
“氯乙酸偶联操作B”
“整体脱保护方法C”
“环化方法D”
然后进行一般合成序列“氯乙酸偶联操作B”、“整体脱保护方法C”和“环化方法D”。
实施例1003，异构体1。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：WatersXBridge C18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在25分钟内20-65％B，然后在65％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为0.9mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为100％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.54min；ESI-MS(+)m/z 931.85(M+2H)
分析LCMS条件E：保留时间＝1.41min；ESI-MS(+)m/z 931.90(M+2H)。
实施例1004，异构体2。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：WatersXBridge C18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在25分钟内20-60％B，然后在60％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为1.9mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为96％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.55min；ESI-MS(+)m/z 931.90(M+2H)
分析LCMS条件E：保留时间＝1.42min；ESI-MS(+)m/z 931.60(M+2H)。
实施例1005的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备四唑实施例1005：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联操作”、“Symphony方法A：仲胺偶联操作B”、“氯乙酸偶联操作B”、“整体脱保护方法C”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：Waters XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在25分钟内25-65％B，然后在10分钟内保持于65％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为3.6mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为98％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.83min；ESI-MS(+)m/z 937.9(M+2H)
分析LCMS条件E：保留时间＝1.76min；ESI-MS(+)m/z 938.0(M+2H)。
实施例1006的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备四唑实施例1006：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联操作”、“Symphony方法A：仲胺偶联操作B”、“氯乙酸偶联操作B”、“整体脱保护方法C”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：Waters XBridge C18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；梯度：在25分钟内15-65％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为3.1mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为96％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.69min；ESI-MS(+)m/z 959.3(M+2H)。
实施例1007的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备四唑实施例1007：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联操作”、“Symphony方法A：仲胺偶联操作B”、“氯乙酸偶联操作B”、“整体脱保护方法C”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：Waters XBridge C18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在25分钟内15-65％B，然后在10分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为1.4mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为100％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.71min；ESI-MS(+)m/z 943.4(M+2H)
分析LCMS条件E：保留时间＝1.69min；ESI-MS(+)m/z 943.8(M+2H)。
实施例1010的制备
在Rink树脂上遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1010：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联操作”、“Symphony方法A：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法A：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18 300,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；梯度：在25分钟内25-70％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。经由制备型LC/MS使用下列条件进一步纯化材料：柱：XBridge C18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在25分钟内25-70％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为1.9mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为98％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.73min；ESI-MS(+)m/z 954.0(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.67min；ESI-MS(+)m/z 954.2(M+2H)。
实施例1012的制备
在Rink树脂上遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1012：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联操作”、“Symphony方法A：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法A：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：Waters XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在25分钟内15-65％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为3.2mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为100％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.51min；ESI-MS(+)m/z 940.5(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.44min；ESI-MS(+)m/z 940.3(M+2H)。
实施例1013的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1013：“Prelude方法B：树脂溶胀程序”、“Prelude方法B：标准偶联操作”、“Prelude方法B：仲胺偶联操作”、“Prelude方法B：定制氨基酸偶联操作”、“Prelude方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：Waters XBridge C18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在25分钟内10-65％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。经由制备型LC/MS使用下列条件进一步纯化材料：柱：XBridge C18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；梯度：在25分钟内20-65％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为3.2mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为100％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.54min；ESI-MS(+)m/z 949.0(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.50min；ESI-MS(+)m/z 949.3(M+2H)。
实施例1014的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1014：“Prelude方法B：树脂溶胀程序”、“Prelude方法B：标准偶联操作”、“Prelude方法B：仲胺偶联操作”、“Prelude方法B：定制氨基酸偶联操作”、“Prelude方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：Waters XBridge C18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在25分钟内10-65％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。经由制备型LC/MS使用下列条件进一步纯化材料：柱：XBridge C18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；梯度：在25分钟内15-60％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为4.8mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为100％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.43min；ESI-MS(+)m/z 914.9(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.43min；ESI-MS(+)m/z 914.9(M+2H)。
实施例1050的制备
在Rink树脂上遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1050：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：Waters XBridge C18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；梯度：在25分钟内10-65％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为2.0mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为98％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.47min；ESI-MS(+)m/z 940.3(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.42min；ESI-MS(+)m/z 940.6(M+2H)。
实施例1051的制备
在Rink树脂上遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1051：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：Waters XBridge C18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在25分钟内10-65％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为1.9mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为95％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.43min；ESI-MS(+)m/z 914.8(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.44min；ESI-MS(+)m/z 915.2(M+2H)。
实施例1052的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1052：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：Waters XBridgeC18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；梯度：在25分钟内10-65％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为2.4mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为93％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.58min；ESI-MS(+)m/z 967.0(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.52min；ESI-MS(+)m/z 966.8(M+2H)。
实施例1053的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1053：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：Waters XBridgeC18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在25分钟内10-65％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为4.3mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为91％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.38min；ESI-MS(+)m/z 936.5(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.48min；ESI-MS(+)m/z 936.1(M+2H)。
实施例1054的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1054：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法D”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：Waters XBridgeC18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；梯度：在25分钟内10-65％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。经由制备型LC/MS使用下列条件进一步纯化材料：柱：XBridge C18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；梯度：在25分钟内15-60％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为2.2mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为100％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.44min；ESI-MS(+)m/z 929.0(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.39min；ESI-MS(+)m/z 929.0(M+2H)。
实施例1055的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1055：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法D”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：Waters XBridgeC18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在25分钟内15-65％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。经由制备型LC/MS使用下列条件进一步纯化材料：柱：XBridge C18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在25分钟内20-60％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为1.1mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为93％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.50min；ESI-MS(+)m/z 907.4(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.49min；ESI-MS(+)m/z 907.9(M+2H)。
实施例1056的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1056：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：定制氨基酸偶联操作”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内40-80％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为10.8mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为100％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.41min.；ESI-MS(+)m/z 937.4(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.03min.；ESI-MS(+)m/z 936.6(M+2H)。
实施例1057的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1057：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“Symphony方法B：定制氨基酸偶联操作”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内45-85％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。经由制备型LC/MS使用下列条件进一步纯化材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内5-45％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为3.3mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为97％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.68min.；ESI-MS(+)m/z 634.4(M+3H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.35min.；ESI-MS(+)m/z 947.0(M+2H)。
实施例1058的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1058：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“Symphony方法B：定制氨基酸偶联操作”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内50-90％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为5.7mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为97％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.81min.；ESI-MS(+)m/z 986.9(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.50min.；ESI-MS(+)m/z 986.8(M+2H)。
实施例1059的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1059：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“Symphony方法B：定制氨基酸偶联操作”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为3.6mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为94％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.61min.；ESI-MS(+)m/z 934.4(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝3.01min.；ESI-MS(+)m/z 934.3(M+2H)。
实施例1060的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1060：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“Symphony方法B：定制氨基酸偶联操作”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内10-50％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。经由制备型LC/MS使用下列条件进一步纯化材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内40-80％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为1.1mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为97％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.52min.；ESI-MS(+)m/z 960.9(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.81min.；ESI-MS(+)m/z 960.7(M+2H)。
实施例1061的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1061：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“Symphony方法B：定制氨基酸偶联操作”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内50-100％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。经由制备型LC/MS使用下列条件进一步纯化材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；梯度：在30分钟内20-60％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为14.4mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为96％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.54min.；ESI-MS(+)m/z 956.3(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.84min.；ESI-MS(+)m/z 956.8(M+2H)。
实施例1100的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1100：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：Waters XBridgeC18,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在25分钟内15-65％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为5.9mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为99％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.53min；ESI-MS(+)m/z 893.2(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.51min；ESI-MS(+)m/z 893.3(M+2H)。
实施例1101的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1101：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内35-75％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为3.2mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为98％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.404min；ESI-MS(+)m/z 930.85(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.715min；ESI-MS(+)m/z 930.90(M+2H)。
实施例1102的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1102：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内35-75％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为19.0mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为98％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.796min；ESI-MS(+)m/z 941.20(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.389min；ESI-MS(+)m/z 940.95(M+2H)。
实施例1103的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1103：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为1.3mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为98％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.60min；ESI-MS(+)m/z 932.1(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.70min；ESI-MS(+)m/z 932.8(M+2H)。
实施例1104的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1104：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内35-75％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为1.8mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为95％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.537min；ESI-MS(+)m/z 961.65(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.988min；ESI-MS(+)m/z 961.10(M+2H)。
实施例1105的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1105：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：Waters XBridgeC18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：含有0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5甲醇:水，含有0.1％三氟乙酸；梯度：在30分钟内40-80％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。经由制备型LC/MS使用下列条件进一步纯化材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内10-55％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为3.9mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为92％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.622min；ESI-MS(+)m/z 935.80(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝3.125min；ESI-MS(+)m/z 935.25(M+2H)。
实施例1106的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1106：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内40-80％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。经由制备型LC/MS使用下列条件进一步纯化材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为6.5mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为97％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.419min；ESI-MS(+)m/z 964.80(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.875min；ESI-MS(+)m/z 946.95(M+2H)。
实施例1107的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1107：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。经由制备型LC/MS使用下列条件进一步纯化材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内40-80％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为0.8mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为100％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.624min；ESI-MS(+)m/z 939.80(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝3.090min；ESI-MS(+)m/z 939.85(M+2H)。
实施例1108的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1108：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为1.0mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为100％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.702min；ESI-MS(+)m/z 942.90(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝3.245min；ESI-MS(+)m/z 942.95(M+2H)。
实施例1109的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1109：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为2.5mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为100％。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.73min；ESI-MS(-)m/z 913.6(M-2H)。
实施例1110的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1110：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内40-80％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为4.4mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为94％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.494min；ESI-MS(+)m/z 936.15(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.966min；ESI-MS(+)m/z 935.80(M+2H)。
实施例1111的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1111：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内45-85％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为19.8mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为99％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.56min；ESI-MS(+)m/z 933.4(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.71min；ESI-MS(+)m/z 933.4(M+2H)。
实施例1113的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1113：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内45-85％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。经由制备型LC/MS使用下列条件进一步纯化材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内10-50％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为4.2mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为98％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.53min；ESI-MS(+)m/z 926.1(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.61min；ESI-MS(+)m/z 925.8(M+2H)。
实施例1114的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1114：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内45-85％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。经由制备型LC/MS使用下列条件进一步纯化材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为11.0mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为98％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.57min；ESI-MS(+)m/z 925.9(M+2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.65min；ESI-MS(+)m/z 925.8(M+2H)。
实施例1115的制备
遵循针对实施例1001的制备所述由下列一般操作构成的一般合成序列来制备实施例1115：“Symphony方法B：树脂溶胀程序”、“Symphony方法B：标准偶联操作”、“Symphony方法B：仲胺偶联操作”、“手动偶联操作A”、“Symphony方法B：最终封端程序”、“整体脱保护方法F”和“环化方法D”。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；流动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内45-90％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。经由制备型LC/MS使用下列条件进一步纯化材料：柱：XBridge C18,19×200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；梯度：在30分钟内10-50％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。产物的产量为1.2mg，且其通过LCMS分析的估计纯度为100％。
分析LCMS条件H：保留时间＝1.60min；ESI-MS(+)m/z 938.3(M-2H)。
分析LCMS条件I：保留时间＝2.80min；ESI-MS(+)m/z 940.3(M+2H)。
分析数据:
质谱：“ESI-MS(+)”表示以正离子模式进行的电喷雾电离质谱；“ESI-MS(-)”表示以负离子模式进行的电喷雾电离质谱；“ESI-HRMS(+)”表示以正离子模式进行的高分辨电喷雾电离质谱；“ESI-HRMS(-)”表示以负离子模式进行的高分辨电喷雾电离质谱。所检测的质量在“m/z”单位名称后报道。精确质量大于1000的化合物常检测为双电荷或三电荷离子。
在Fourier Transform Orbitrap质谱仪(Exactive,Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)上使用以25,000分辨率(半高最大全宽，FWHM)操作的正或负电喷雾电离实施高分辨质谱(HRMS)分析。每天根据制造商说明书来校准仪器，从而使得质量精度误差<5ppm。使用操作软件Xcalibur计算理论质量-电荷值且处理所获得的数据。
分析LCMS条件A：
柱：BEH C18,2.1×50mm，1.7-μm颗粒；流动相A：水，含有0.05％TFA；流动相B：乙腈，含有0.05％TFA；温度：50℃；梯度：在1分钟内2％B至98％B，然后在98％B保持0.5分钟；流速：0.8mL/min；检测：UV,220nm。
分析LCMS条件D：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1×50mm，1.7-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有10mM乙酸铵；流动相B：95:5乙腈:水，含有10mM乙酸铵；温度：50℃；梯度：在3分钟内0-100％B，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1.11mL/min；检测：UV,220nm。
分析LCMS条件E：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,2.1×50mm，1.7-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；温度：50℃；梯度：在3分钟内0-100％B，然后在100％B保持0.75分钟；流速：1.11mL/min；检测：UV,220nm。
通用操作：
CEM方法A：
所有操作均在CEM Liberty微波肽合成仪(CEM公司)上自动进行。除非有所描述，否则所有操作均在装配有底部玻料且通向CEM Discovery微波单元的30或125mL聚丙烯管中进行。该管经由管的底部和顶部连结至CEM Liberty合成仪。可经由管的顶部和底部添加DMF和DCM，其均匀洗涤管侧面。经由管底部去除所有溶液，只是同时自顶部转移树脂。“周期性鼓泡”描述N2气体穿过底部玻料的简单鼓泡。一般不使用制备超过三周的氨基酸溶液。HATU溶液在制备5天内使用。DMF＝二甲基甲酰胺；HCTU＝2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；HATU＝六氟磷酸1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物；DIPEA＝二异丙基乙胺；Sieber＝Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述与聚苯乙烯树脂的连结性的位置和类型。所用树脂为具有Sieber连接基团(在氮处经Fmoc保护)的Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g载量。常用氨基酸列于下文中，其中侧链保护基团指示于括号中。
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。
“CEM方法A”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中所述规模根据结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。该规模对应于大约140mg上文所述的Sieber-Merrifield树脂。可通过调整所述体积规模的倍数，将所有操作按比例放大至超过0.100mmol规模。在氨基酸偶联之前，使用树脂溶胀操作(在下文中描述为“树脂溶胀操作”)来开始所有肽合成序列。氨基酸至伯胺N-末端的偶联使用下文所述的“单一偶联操作”。氨基酸至仲胺N-末端的偶联使用下文所述的“仲胺偶联操作”。通过上文详述的“氯乙酰氯偶联操作”或“氯乙酸偶联操作”描述氯乙酰基至肽的N-末端的偶联。
树脂溶胀操作：
向50mL聚丙烯圆锥形管中添加Merrifield:Sieber树脂(140mg,0.100mmol)。然后向管中添加DMF(7mL)，随后添加DCM(7mL)。然后将树脂自容器顶部转移至反应容器中。将该操作再重复两次。添加DMF(7mL)，随后添加DCM(7mL)。伴随N2鼓泡自反应容器底部使树脂溶胀15分钟，然后经由玻料排出溶剂。
标准偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)、HATU(0.5M于DMF中，1.0mL，5当量)和DIPEA(2M于NMP中，0.5mL，10当量)。通过在75℃N2鼓泡5分钟来混合混合物(对于所有氨基酸，只是Fmoc-Cys(Trt)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH在50℃进行偶联)，经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v,5.0mL)的溶液。将混合物在65℃周期性鼓泡2分钟，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。所得树脂直接用于下一步骤中。
双偶合偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)、HATU(0.5M于DMF中，1.0mL，5当量)和DIPEA(2M于NMP中，0.5mL，10当量)。通过在75℃N2鼓泡5分钟来混合混合物(对于所有氨基酸，只是Fmoc-Cys(Trt)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH在50℃进行偶联)，经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加氨基酸(0.2M于DMF中，2.5mL，5当量)、HATU(0.5M于DMF中，1.0mL，5当量)和DIPEA(2M于NMP中，0.5mL，10当量)。通过在75℃N2鼓泡5分钟来混合混合物(对于所有氨基酸，只是Fmoc-Cys(Trt)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH在50℃进行偶联)，经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v,5.0mL)的溶液。将混合物在65℃周期性鼓泡2分钟，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。所得树脂直接用于下一步骤中。
定制氨基酸偶联操作：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)的溶液。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加含有HATU(2.5当量至10当量)的氨基酸溶液(1.25mL至5mL，2.5当量至10当量)，且最后添加DIPEA(2M于NMP中，0.5mL至1mL，20当量)。通过在25℃至75℃N2鼓泡5分钟至2小时来混合混合物，然后经由玻料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。向反应容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v,5.0mL)的溶液。将混合物在65℃周期性鼓泡2分钟，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：使用DMF(7mL)自顶部洗涤，随后使用DMF(7mL)自底部洗涤且最后使用DMF(7mL)自顶部洗涤。所得树脂直接用于下一步骤中。
氯乙酰氯偶联操作A：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加3.0mL存于DMF中的DIPEA(4.0mmol,0.699mL，40当量)和氯乙酰氯(2.0mmol,0.160mL，20当量)的溶液。将混合物周期性搅动12至18小时，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：对于每一洗涤而言，向容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，向容器顶部添加CH2Cl2(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。
氯乙酸偶联操作A：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v,5.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤五次：对于每一洗涤而言，经由容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻料排出溶液。向反应容器中添加DMF(2.0mL)、氯乙酸(1.2mmol,113mg，12当量)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(1.2mmol,0.187mL，12当量)。将混合物周期性搅动12至18小时，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：对于每一洗涤而言，向容器顶部添加DMF(4.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，向容器顶部添加CH2Cl2(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻料排出溶液。
整体脱保护方法B：
除非有所描述，否则所有操作均手动进行。“整体脱保护方法B”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中所述规模根据结合至树脂的Sieber连接基团的量来确定。可通过调整所述体积规模的倍数，将操作按比例放大至超过0.100mmol规模。“脱保护溶液”使用三氟乙酸:三异丙基硅烷:二硫苏糖醇(94:3:3 v:v:w)制得。自反应容器取出树脂且转移至配备有玻料的25mL注射器中。向注射器中添加“脱保护溶液”(5.0mL)。将混合物在振动器中混合5分钟。过滤溶液且在二乙醚(30mL)中稀释。将所析出的固体离心3分钟。倾析上清液溶液且将固体再悬浮于二乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析上清液且将剩余固体悬浮于二乙醚(25mL)中。将悬浮液离心3分钟。倾析上清液且在高真空下干燥剩余固体。获得白色至灰白色固体形式的粗制肽。
环化方法C：
除非有所描述，否则所有操作均手动进行。“环化方法C”的操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中该规模根据结合至用于生成肽的树脂的Sieber连接基团的量所测定。该规模并非基于操作中所使用肽的量的直接测定。可通过调整所述体积规模的倍数，将操作按比例放大至超过0.100mmol规模。将粗制肽固体溶于乙腈:水性0.1M碳酸氢铵缓冲剂(11mL:24mL)的溶液中，且然后使用NaOH水溶液(1.0M)将溶液小心调节至pH＝8.5-9.0。然后使用振动器将溶液混合12至18小时。浓缩反应溶液且然后将残余物溶于乙腈:水中。对该溶液实施反相HPLC纯化，得到期望的环状肽。
(S)-2-(5-((S)-1-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)-1H-四唑-1-基)-3-苯基丙酸[Fmoc-Pheψ[CN4]-L-Phe-OH]的制备。
方案：
步骤1：
使用1-羟基-7-氮杂苯并三唑(1.120g,8.23mmol)和EDC(1.577g,8.23mmol)处理L-苯丙胺酸苄基酯盐酸盐(2g,6.85mmol)、Z-Phe-OH(2.257g,7.54mmol)、DIPEA(2.99mL,17.14mmol)和DCM(100mL)的溶液并在室温搅拌15h。使用饱和NaHCO3(2×100mL)、1M HCl(2×50mL)和盐水(50mL)洗涤混合物，干燥(Na2SO4)并在减压下浓缩，得到白色固体形式的(S)-2-((S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-苯基丙酰氨基)-3-苯基丙酸苄基酯(3.2g,5.96mmol，87％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.42-7.11(m,21H),4.96(d,J＝2.0Hz,4H),4.63-4.45(m,1H),4.06-3.91(m,2H),3.34-2.96(m,3H),2.85(br.s.,4H)。
步骤2(Schroeder,G.M.；Marshall,S.；Wan,H.；Purandare,A.V.TetrahedronLett.2010,51,1404-1406.)：
在N2下，向压力小瓶中装填存于THF(9.32ml)中的(S)-2-((S)-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-苯基丙酰氨基)-3-苯基丙酸苄基酯(1.0g,1.864mmol)和二苯基-2-吡啶基膦(3.17g,7.45mmol)。使用N2吹扫溶液，然后逐滴添加DIAD(1.449ml,7.45mmol)。将反应液搅拌5min。然后经30min逐滴添加二苯基磷酰基叠氮化物(1.606ml,7.45mmol)。在完成添加且不再有氮形成之后，封闭密封管且将反应液在55℃搅拌4小时。
将反应液冷却至室温并倾倒至乙酸乙酯(200mL)中，使用冷1N HCl(100mL)、饱和NaHCO3(100mL)和盐水(100mL)洗涤。通过无水硫酸钠干燥有机层，过滤并浓缩以得到橙色油状物。通过使用100％己烷至60％乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂硅胶色谱进行纯化，得到660mg低纯度(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)-1H-四唑-1-基)-3-苯基丙酸苄基酯。通过制备型HPLC使用下列条件实施第二次纯化：柱：Phenomenex Luna5u C18(2)100A 250×21.2mm，填充AXIA(10-100mg)520551-2号。流动相A：0.1TFA/水；流动相B：0.1％TFA/乙腈；梯度：在20分钟内50-80％B，然后在10分钟内95％B梯度；流速：15mL/min；检测：UV,220nm。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发干燥。获得米色吸湿性固体形式的(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)-1H-四唑-1-基)-3-苯基丙酸苄基酯(通过LC/MS分析，产量为60.0mg，纯度为70％)。分析条件A：保留时间＝1.82min；ESI-MS(+)m/z 562.5(M+H)。
步骤3：
在10％碳载钯(22.74mg,0.021mmol)上使用来自乳胶气囊的氢对存于MeOH(534μl)中的(S)-2-(5-((S)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)-1H-四唑-1-基)-3-苯基丙酸苄基酯(60mg,0.107mmol)的溶液进行氢化2h。通过过滤去除催化剂且在减压下浓缩滤液，得到白色胶状固体。将产物溶于MeCN(2mL)和水(2mL)及Et3N(100μL)中并使用FMOC-OSu(36.0mg,0.107mmol)处理。将混合物在室温搅拌15h。使用EtOAc(50mL)稀释反应混合物，使用1M HCl(2×20mL)和盐水(20mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并在减压下浓缩，得到黄色固体形式的Fmoc-Pheψ[CN4]-L-Phe-OH[(S)-2-(5-((S)-1-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)-1H-四唑-1-基)-3-苯基丙酸](42mg,0.075mmol，70％产率)。通过LC/MS分析估计产物纯度为64％。
分析LCMS条件A：保留时间＝1.70min；ESI-MS(+)m/z 560.5(M+H)。
2-(5-(1-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)环己基)-1H-四唑-1-基)乙酸[Fmoc-Acc6ψ[CN4]-Gly-OH的制备。
方案：
步骤1.
在10％碳载钯(0.675g,0.634mmol)上使用来自乳胶气囊的氢对存于MeOH(7.48ml)中的2-(5-(1-(苄基氨基)环己基)-1H-四唑-1-基)乙酸(Chembridge；CAS编号：915920-47-7)(0.500g,1.585mmol)的溶液进行氢化16h。通过在硅藻土上过滤来去除催化剂并使用DCM洗涤且在减压下浓缩所得溶液。
步骤2.
向存于乙腈(3.74ml)、水(3.74ml)和三乙胺(0.221ml,1.585mmol)中且冷却至0℃的来自步骤1的粗制氨基酸的溶液中添加碳酸(9H-芴-9-基)甲基酯·(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(0.535g,1.585mmol)且将反应混合物在0℃搅拌4h。在EtOAc中稀释溶液，使用1NHCl和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并在减压下浓缩成黄色油状物。通过快速色谱使用0-100％EtOAc/己烷梯度纯化该黄色油状物。使用30％MeOH/DCM冲洗柱以完全洗脱产物。汇集含有期望产物的级分并在减压下浓缩，得到116mg(16％总产率)褐色固体形式的期望产物。通过LC/MS分析估计产物纯度接近100％。
分析LCMS条件A：保留时间＝1.45min；ESI-MS(+)m/z 448.0(M+H)。
实施例3001和3002的制备
遵循下文所述的通用合成序列制备实施例3001和3002。
向50mL聚丙烯管中添加Sieber树脂(140mg,0.100mmol)，且将管置于CEM Liberty微波肽合成仪上。然后依次实施下列操作：
进行“CEM方法A：树脂溶胀程序”；
使用Fmoc-Gly-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作”；
使用Fmoc-Cys(Trt)-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作”；
使用Fmoc-Leu-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作”；
使用Fmoc-Tyr(tBu)-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作”；
使用Fmoc-Tyr(tBu)-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作”；
使用Fmoc-Sar-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作”；
使用Fmoc-Tyr(tBu)-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作”；
使用Fmoc-[N-Me]Phe-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作”；
使用10当量Fmoc-Val-OH在75℃进行“CEM方法A：定制氨基酸偶联操作”2小时；
使用Fmoc-Asp(OtBu)-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作”；
使用Fmoc-Sar-OH进行“CEM方法A：标准偶联操作”；
使用5当量Fmoc-[N-Me]Nle-OH进行“CEM方法A：定制氨基酸偶联操作”10min；
使用5当量Fmoc-Pheψ[CN4]-L-Phe-OH进行“CEM方法A：定制氨基酸偶联操作”10min；进行“氯乙酰氯偶联操作A”，进行“整体脱保护方法B”且进行“环化方法C”。
实施例3001，异构体1。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：Phenomenex Luna 5u C18(2)250×21.2AXIA,100A系列号：520221-1；流动相A：0.1％TFA/水；流动相B：0.1％TFA/乙腈；梯度：在50分钟内35-75％B，然后在5分钟内达到最高95％B的梯度；流速：15mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发和冻干进行干燥。实施例3001异构体1的产量为1.5mg，且其通过HPLC分析估计的纯度为82.0％，使用下列条件：柱：Phenom Kinetex 2.6u C18(2)2.1×50mm系列号：515561-57；流动相A：0.025％乙酸铵/5％甲醇/水；流动相B：乙腈/水(4:1)；梯度：在20分钟内30-95％B，60℃；流速：1mL/min。检测UV：217nm。
分析LCMS条件A：保留时间＝1.50min；ESI-MS(+)m/z 904.5(M+2H)。
自上述制备型LC/MS条件分离第二异构体(异构体2)。实施例3002异构体2的产量为1.6mg，且通过HPLC分析估计其纯度为89.6％，使用下列条件：柱：Phenom Kinetex 2.6uC18(2)2.1×50mm系列号：515561-57；流动相A：0.025％乙酸铵/5％甲醇/水；流动相B：乙腈/水(4:1)；梯度：在20分钟内30-95％B，60℃；流速：1mL/min。UV检测：217nm。
分析LCMS条件A：保留时间＝1.52min；ESI-MS(+)m/z 904.5(M+2H)。
实施例3003的制备
遵循针对实施例3001的制备所述由下列通用操作构成的通用合成序列来制备实施例3003：“CEM方法A：树脂溶胀程序”、“CEM方法A：标准偶联操作”、“CEM方法A：定制氨基酸偶联操作”、“氯乙酸偶联操作A”、“整体脱保护方法B”和“环化方法C”。在Trp残基之后使用”CEM方法A：定制氨基酸偶联操作”来偶联Fmoc-[2-(5-(1-氨基环己基)-1H-四唑-1-基)]-OH[Fmoc-Acc6ψ[CN4]-Gly-OH。
经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：柱：XBridge C18 300,19×250mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；流动相B：95:5乙腈:水，含有0.1％三氟乙酸；梯度：在25分钟内30-70％B，然后在100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分并经由离心蒸发进行干燥。产物的产量为0.37mg，且其通过LCMS分析使用“分析LCMS条件D和E”估计的纯度为82％。
分析LCMS条件D：保留时间＝1.66min；ESI-MS(+)m/z 885.5(M+2H)。
分析LCMS条件E：保留时间＝1.87min；ESI-MS(+)m/z 885.4(M+2H)。
ESI-HRMS(+)m/z:
计算值：884.9371(M+2H)
实验值：884.9343(M+2H)
使用均相时间分辨荧光(HTRF)结合测定测试大环肽与PD-1结合至PD-L1竞争的能力的方法
使用PD-1/PD-L1均相时间分辨荧光(HTRF)结合测定研究本发明的大环肽结合至PD-L1的能力。
方法
可溶性PD-1与可溶性PD-L1结合的均相时间分辨荧光(HTRF)测定。可溶性PD-1和可溶性PD-L1是指移除跨膜区(transmembrane-spanning region)且融合至异源序列(具体而言，人类免疫球蛋白G序列(Ig)的Fc部分或六聚组氨酸表位标签(His))的羧基端截短的蛋白质。所有结合研究均在由dPBS组成的补充有0.1％(w/v)牛血清白蛋白和0.05％(v/v)Tween-20的HTRF测定缓冲液中进行。对于PD-1-Ig/PD-L1-His结合测定，抑制剂与PD-L1-His(10nM最终)一起在4μl测定缓冲液中预培育15分钟，接着添加含PD-1-Ig(20nM最终)的1μl测定缓冲液并另外培育15分钟。使用来自人类、短尾猕猴、小鼠或其他物种的PD-L1融合蛋白。使用经铕穴状配体标记的抗Ig单克隆抗体(1nM最终)和经别藻蓝蛋白(APC)标记的抗His单克隆抗体(20nM最终)实现HTRF检测。将抗体稀释于HTRF检测缓冲液中且将5μl施配在结合反应顶部。使反应平衡30分钟且使用EnVision荧光计获得信号(665nm/620nm比率)。建立PD-1-Ig/PD-L2-His(分别为20和5nM)、CD80-His/PD-L1-Ig(分别为100和10nM)和CD80-His/CTLA4-Ig(分别为10和5nM)之间的额外结合测定。在生物素标记的第71号化合物与人类PD-L1-His之间的结合/竞争研究如下进行。大环肽抑制剂与PD-L1-His(10nM最终)一起在4μl测定缓冲液中预培育60分钟，接着添加含生物素标记的第71号化合物(0.5nM最终)的1μl测定缓冲液。使结合平衡30分钟，接着添加含经铕穴状配体标记的链霉亲和素(2.5pM最终)和经APC标记的抗His(20nM最终)的5μl HTRF缓冲液。使反应平衡30分钟且使用EnVision荧光计获得信号(665nm/620nm比率)。
重组蛋白质。在HEK293T细胞中表达具有C-端人类Ig表位标签[hPD-1(25-167)-3S-IG]的羧基截短的人类PD-1(氨基酸25-167)和具有C-端His表位标签[hPD-L1(19-239)-烟草叶脉斑点病毒蛋白酶裂解位点(TVMV)-His]的人类PD-L1(氨基酸18-239)，且依次通过重组蛋白质A亲和色谱和尺寸排阻色谱纯化。人类PD-L2-His(Sino Biologicals)、CD80-His(Sino Biologicals)、CTLA4-Ig(RnD Systems)均经由市售来源获得。
重组人类PD-1-Ig的序列
hPD1(25-167)-3S-IG
(SEQ ID No：1)
重组人类PD-L1-TVMV-His(PD-L1-His)的序列
hPDL1(19-239)-TVMV-His
(SEQ ID No：2)
结果显示于表1中。如所示，证明本发明的大环肽有效抑制PD-1-Ig对PD-L1-TVMV-His(PD-L1-His)的结合活性。范围如下：A＝0.10-10μM；B＝0.01-0.099μM；C＝0.005-0.0099μM。
表1
对于本领域技术人员显而易见的是，本发明不限于前述说明性实施例，且其可以其它不偏离本发明基本属性的形式实施。因此，需要在所有方面将实施例视为说明性而非限制性的，参考随附权利要求书而非前述实施例，且因此本发明意欲涵盖权利要求书的等效内容的含义和范围内的所有变化。
序列表
<110> 百时美施贵宝公司
<120> 免疫调节剂
<130> 12409-WO-PCT
<150> US 62/111,900
<151> 2015-02-04
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 384
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
20 25 30
Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro
35 40 45
Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln
50 55 60
Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg
65 70 75 80
Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
100 105 110
Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro
115 120 125
Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Gly
130 135 140
Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Arg Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr
145 150 155 160
His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
180 185 190
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
195 200 205
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
210 215 220
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
225 230 235 240
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
245 250 255
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
260 265 270
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
275 280 285
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
290 295 300
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
305 310 315 320
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
325 330 335
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
340 345 350
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
355 360 365
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380
<210> 2
<211> 237
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1 5 10 15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
20 25 30
Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln
35 40 45
Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg
50 55 60
Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
100 105 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115 120 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
130 135 140
Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys
145 150 155 160
Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr
165 170 175
Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr
180 185 190
Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile
195 200 205
Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Gly Ser Ser
210 215 220
Glu Thr Val Arg Phe Gln Gly His His His His His His
225 230 235

Claims (23)

1.一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐，
其中：
A选自键、
其中：
表示与羰基的连接点且表示与氮原子的连接点；
z为0、1或2；
w为1或2；
n为0或1；
m为1或2；
m’为0或1；
p为0、1或2；
Rx选自氢、氨基、羟基和甲基；
R14和R15独立选自氢和甲基；且
Rz选自氢和-C(O)NHR16；其中R16选自氢、-CHR17C(O)NH2、-CHR17C(O)NHCHR18C(O)NH2和-CHR17C(O)NHCHR18C(O)NHCH2C(O)NH2；其中R17选自氢和-CH2OH且其中R18选自氢和甲基；
Rv为氢或天然氨基酸侧链；
Q选自
其中Rb定义于下文；和含有一个、两个或三个双键且任选含有一个、两个或三个独立选自氮、氧和硫的杂原子的5-或6员环，其中所述环任选经一个、两个、三个或四个独立选自以下的取代基取代：C1-C6烷氧基羰基、C1-C3烷基、氨基、C1-C3烷基氨基、羧基、C1-C3二烷基氨基、卤素和卤代C1-C3烷基；
U选自
其中Rk定义于下文；和含有一个、两个或三个双键且任选含有一个、两个或三个独立选自氮、氧和硫的杂原子的5-或6员环，其中所述环任选经一个、两个、三个或四个独立选自以下的取代基取代：C1-C6烷氧基羰基、C1-C3烷基、氨基、C1-C3烷基氨基、羧基、C1-C3二烷基氨基、卤素和卤代C1-C3烷基；
条件是Q和U中的至少一个为含有一个、两个或三个双键且含有一个、两个或三个独立选自氮、氧和硫的杂原子的5-或6员环；
Rc、Rf、Rh、Ri、Rm和Rn为氢；
Ra、Re、Rj和Rk各独立选自氢和甲基；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13独立选自天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链或与如下文所述的相应邻位R基团形成环；
Re和Rk可各自与相应邻位R基团及其所连接的原子形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中各环任选经一至四个独立选自氨基、氰基、甲基、卤素和羟基的基团取代；
Rb为甲基，或Rb和R2与其所连接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中各环任选经一至四个独立选自氨基、氰基、甲基、卤素和羟基的基团取代；
Rd为氢或甲基，或Rd和R4与其所连接的原子一起可形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中各环任选经一至四个独立选自氨基、氰基、甲基、卤素、羟基和苯基的基团取代；
Rg为氢或甲基，或Rg和R7与其所连接的原子一起可形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中各环任选经一至四个独立选自以下的基团取代：氨基、任选经卤素取代的苄基、苄基氧基、氰基、环己基、甲基、卤素、羟基、任选经甲氧基取代的异喹啉基氧基、任选经卤素取代的喹啉基氧基，和四唑基；且其中所述吡咯烷环和哌啶环任选稠合至环己基、苯基或吲哚基团；且
Rl为甲基，或Rl和R12与其所连接的原子一起形成选自氮杂环丁烷和吡咯烷的环，其中各环任选经一至四个独立选自氨基、氰基、甲基、卤素和羟基的基团取代。
2.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
Q选自和含有一或两个双键且含有一个、两个、三个或四个氮原子的5员环；且
U选自和含有一或两个双键且含有一个、两个、三个或四个氮原子的5员环。
3.权利要求2的化合物或其药学上可接受的盐，其中A为
4.权利要求3的化合物或其药学上可接受的盐，其中
z和w各为1；
R14和R15为氢；且
Rz为-C(O)NHR16；其中R16为-CHR17C(O)NH2。
5.权利要求4的化合物，其中
R1为苯基C1-C3烷基，其中所述苯基任选经羟基取代；
R2为C1-C7烷基，或Rb和R2与其所连接的原子一起形成吗啉环或哌啶环；
R3选自-CH2CO2H和-CH2C(O)NH2；
R4和Rd与其所连接的原子一起形成吡咯烷环；
R5选自-CH2NH2和-CH2(咪唑基)；
R6选自C1-C7烷基、-CH2CH2C(O)NH2、-CH2CH2CH2CH2NH2和-CH2CH2CO2H；
R7为氢，或R7和Rg与其所连接的原子一起形成任选经羟基取代的吡咯烷环；
R8为-(CH2)吲哚基；
R9选自氨基甲基、羟基甲基、-CH2CH2NH2和CH2CH2CH2CH2NH2；
R10选自-(CH2)吲哚基、-(CH2)萘基和-(CH2)苯并噻吩基，其各自任选经-CH2CO2H取代；
R11为C1-C7烷基；且
R12为C1-C7烷基。
6.一种式(II)化合物或其药学上可接受的盐，
其中：
A选自键、
其中：
表示与羰基的连接点且表示与氮原子的连接点；
n为0或1；
R14和R15独立选自氢和甲基；且
R16选自氢、-CHR17C(O)NH2、-CHR17C(O)NHCHR18C(O)NH2和-CHR17C(O)NHCHR18C(O)NHCH2C(O)NH2；
其中R17选自氢和-CH2OH且其中R18选自氢和甲基；
Q为含有一个、两个或三个双键且任选含有一个、两个或三个独立选自氮、氧和硫的杂原子的5-或6员环，其中所述环任选经一个、两个、三个或四个独立选自C1-C6烷氧基羰基、C1-C3烷基、氨基、C1-C3烷基氨基、羧基、C1-C3二烷基氨基、卤素和卤代C1-C3烷基的取代基取代；
Ra、Rf、Rj、Rk、Rl和Rm为氢；
Rb和Rc为甲基；
Rg选自氢和甲基；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R9、R10、R11和R12独立选自天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链或与如下文所述的相应邻位R基团形成环；
R20为氢；
R8选自天然氨基酸侧链、非天然氨基酸链，或可与如下文所述的相应邻位R基团形成环，或R8可与R20形成3-至6员碳环；
Rd选自氢和甲基，或Rd和R4与其所连接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中各环任选经一至四个独立选自氨基、氰基、甲基、卤素、卤甲基和羟基的基团取代；
Re选自氢和甲基，或Re和R5与其所连接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中各环任选经一至四个独立选自氨基、氰基、甲基、卤素、卤甲基和羟基的基团取代；且
Rh选自氢和甲基，或Rh和R8与其所连接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中各环任选经一至四个独立选自氨基、氰基、甲基、卤素、卤甲基和羟基的基团取代。
7.权利要求6的化合物或其药学上可接受的盐，其中Q为含有一或两个双键且含有一个、两个、三个或四个氮原子的5员环。
8.权利要求7的化合物或其药学上可接受的盐，其中A为
9.权利要求8的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1和R2为苯基C1-C3烷基；
R3为C1-C7烷基；
R4为氢；
R5为羧基甲基；
R6为C1-C7烷基；
R7为苯基C1-C3烷基；
R8为苯基C1-C3烷基，其中所述苯基经羟基取代，或R8和R20形成6员碳环；
R9为氢；
R10为-(CH2)吲哚基；
R11为经羟基取代的苯基C1-C3烷基；且
R12为C1-C7烷基。
10.一种化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物选自：
实施例1001；实施例1002；实施例1003；实施例1004；实施例1005；实施例1006；实施例1007；实施例1010；实施例1012；实施例1013；实施例1014；实施例1050；实施例1051；实施例1052；实施例1053；实施例1054；实施例1055；实施例1056；实施例1057；实施例1058；实施例1059；实施例1060；实施例1061；实施例1100；实施例1101；实施例1102；实施例1103；实施例1104；实施例1105；实施例1106；实施例1107；实施例1108；实施例1109；实施例1110；实施例1111；实施例1113；实施例1114；实施例3001；实施例3002；实施例3003。
11.一种化合物，其为实施例1115。
12.一种增强、刺激和/或提高有此需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1的化合物或其治疗学上可接受的盐。
13.权利要求12的方法，其还包括在权利要求1的化合物或其治疗学上可接受的盐之前、之后或与其同时施用额外药剂。
14.权利要求13的方法，其中所述额外药剂为抗微生物剂、抗病毒剂、细胞毒性剂和/或免疫应答调节剂。
15.权利要求13的方法，其中所述额外药剂为HDAC抑制剂。
16.权利要求13的方法，其中所述额外药剂为TLR7和/或TLR8激动剂。
17.一种抑制有此需要的受试者的癌细胞生长、增殖或转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1的化合物或其治疗学上可接受的盐。
18.权利要求17的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结肠直肠癌、去势抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌及乳腺癌和血液科恶性病。
19.一种治疗有此需要的受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1的化合物或其治疗学上可接受的盐。
20.权利要求19的方法，其中所述感染性疾病由病毒引起。
21.权利要求20的方法，其中所述病毒选自HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒和流感病毒。
22.一种治疗有此需要的受试者的败血性休克的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1的化合物或其治疗学上可接受的盐。
23.一种阻断受试者的PD-L1与PD-1和/或CD80的相互作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1的化合物或其治疗学上可接受的盐。
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