ES2937286T3 - Inmunomoduladores - Google Patents

Abstract

La presente divulgación proporciona nuevos péptidos macrocíclicos que inhiben la interacción proteína/proteína PD-1/PD-L1 y PD-L1/CD80 y, por lo tanto, son útiles para la mejora de diversas enfermedades, incluido el cáncer y las enfermedades infecciosas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunomoduladores

La presente descripción proporciona péptidos macrocíclicos novedosos que inhiben las interacciones proteína/proteína PD-1/PD-L1 y CD80/PD-L1, y por ende, son útiles para la mejora de varias enfermedades, que incluyen el cáncer y las enfermedades infecciosas.

La proteína de Muerte Programada 1 (PD-1) es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28, que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD-1 se expresa en linfocitos B activados, linfocitos T y células mieloides (Agata et al., supra; Okazaki et al., Curr. Opin. Immunol., 14:779-782 (2002); Bennett et al., J. Immunol., 170:711-718 (2003)).

La proteína PD-1 es una proteína de transmembrana tipo I 55 kDa que es parte de la superfamilia del gen Ig (Agata et al., Int. Immunol., 8:765-772 (1996)). La PD-1 contiene un motivo de inhibición del inmunorreceptor de tirosina (ITIM) próximo a la membrana y un motivo de cambio basado en tirosina (ITSM) distal a la membrana (Thomas, M. L., J. Exp. Med., 181:1953-1956 (1995); Vivier, E. et al., Immunol. Today, 18:286-291 (1997)). Si bien su estructura es similar a la de CTLA-4, PD-1 carece del motivo MYPPY que es fundamental para la fijación de CD80 y CD86 (B7-2). Se han identificado dos ligandos de PD-1; PD-L1 (B7-H1) y PD-L2 (b7-DC). Se ha demostrado que la activación de los linfocitos T que expresan PD-1 se regula de manera descendente cuando se produce la interacción con linfocitos que expresan p D-L1 o PD-L2 (Freeman et al., J. Exp. Med., 192:1027-1034 (2000); Latchman et al., Nat. Immunol., 2:261-268 (2001); Carter et al., Eur. J. Immunol., 32:634-643 (2002)). Tanto PD-L1 como PD-L2 son miembros de la familia de la proteína B7 que se fijan a PD-1, pero no se fijan a otros miembros de la familia de CD28. El ligando PD-L1 con frecuencia se presenta en diversos tipos de cáncer en seres humanos (Dong et al., Nat. Med., 8:787-789 (2002)). La interacción entre PD-1 y PD-L1 da como resultado una disminución en los linfocitos que infiltran los tumores, una disminución en la proliferación mediada por el receptor de linfocitos T y una evasión inmunitaria por parte de células cancerosas (Dong et al., J. Mol. Med., 81:281-287 (2003); Blank et al., Cancer Immunol. Immunother., 54:307-314 (2005); Konishi et al., Clin. Cancer Res., 10:5094-5100 (2004)). La inmunodepresión se puede revertir mediante la inhibición de la interacción local de PD-1 con PD-L1, y el efecto es aditivo cuando también se bloquea la interacción de PD-1 con PD-L2 (Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:12293-12297 (2002); Brown et al., J. Immunol., 170:1257-1266 (2003)).

También se demostró que PD-L1 interactúa con CD80 (Butte MJ et al, Immunity; 27:111-122 (2007)). Se demostró que la interacción de células inmunitarias que expresan PD-L1/CD80 es inhibidora. El bloqueo de esta interacción demostró la inactivación de esta interacción inhibidora (Paterson AM, et al., J Immunol., 187:1097-1105 (2011); Yang J, et al. J Immunol. Aug 1;187(3):1113-9 (2011)).

Cuando los linfocitos T que expresan PD-1 entran en contacto con células que expresan sus ligandos, se reducen las actividades funcionales en respuesta a los estímulos antigénicos, incluida la proliferación, la secreción de citocina y la citotoxicidad. Las interacciones PD-1/PD-L1 o PD-L2 regulan de manera descendente las respuestas inmunitarias durante la resolución de una infección o tumor, o durante el desarrollo de la tolerancia inmunológica (Keir, M. E. et al., Annu. Rev. Immunol., 26:Epub (2008)). La estimulación crónica de antígenos, tal como la que ocurre durante la enfermedad tumoral o las infecciones crónicas, da como resultado linfocitos T que expresan niveles elevados de PD-1 y son disfuncionales con respecto a la actividad hacia el antígeno crónico (reseña en Kim et al., Curr. Opin. Imm. (2010)). Esto se denomina "agotamiento de linfocitos T". Los linfocitos B también muestran inhibición y "agotamiento" de PD-1/PD-ligando.

El bloqueo de la ligadura PD-1/PD-L1 por medio del uso de anticuerpos dirigidos a PD-L1 demostró la restauración y el aumento de la activación de linfocitos T en muchos sistemas. Los pacientes que presentan cáncer avanzado se benefician del tratamiento con un anticuerpo monoclonal dirigido a PD-L1 (Brahmer et al., NewEngl. J. Med. (2012)). Los modelos preclínicos de animales de tumores e infecciones crónicas dieron cuenta de que el bloqueo de la vía PD-1/PD-L1 por parte de anticuerpos monoclonales puede mejorar la respuesta inmunitaria y dar como resultado el rechazo del tumor o el control de la infección. La inmunoterapia antitumoral mediante el bloqueo de PD-1/PD-L1 puede aumentar la respuesta inmunitaria terapéutica a diversos tumores histológicamente diferentes (Dong, H. et al., "B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity", J. Mol. Med., 81(5):281-287 (2003); Dong, H. et al., "Tumorassociated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion", Nat. Med., 8(8):793-800 (2002)).

La interferencia con la interacción PD-1/PD-L1 provoca una actividad mejorada de linfocitos T en sistemas con infección crónica. El bloqueo de PD-L1 provocó una mejora de la depuración viral y un restablecimiento de la inmunidad en ratones con infección por el virus de la coriomeningitis linfocítica (Barber, D. L. et al., "Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection", Nature, 439(7077):682-687 (2006)). Los ratones humanizados infectados por VIH-1 mostraron una mejora de la protección contra la viremia y una disminución viral de linfocitos T CD4+ (Palmer et al., J. Immunol. (2013)). El bloqueo de PD-1/PD-L1 a través de anticuerpos monoclonales dirigidos a PD-L1 puede restaurar la funcionalidad específica del antígeno in vitro a los linfocitos T de pacientes con VIH (Day, Nature (2006); Petrovas, J. Exp. Med. (2006); Trautman, Nature Med. (2006); D'Souza, J. Immunol. (2007); Zhang, Blood (2007); Kaufmann, Nature Imm. (2007); Kasu, J. Immunol. (2010); Porichis, Blood (2011)), pacientes con HCV (Golden-Mason, J. Vi rol. (2007); Jeung, J. Leuk. Biol. (2007); Urbani, J. Hepatol. (2008); Nakamoto, PLoS Path. (2009); Nakamoto, Gastroenterology (2008)) y pacientes con HBV (Boni, J. Virol. (2007); Fisicaro, Gastro. (2010); Fisicaro et al., Gastroenterology (2012); Boni et al., Gastro. (2012); Penna et al., J. Hep. (2012); Raziorrough, Hepatology(2009); Liang, World J. Gastro. (2010); Zhang, Gastro. (2008)).

El bloqueo de la interacción PD-L1/CD80 también demostró que estimula la inmunidad (Yang J., et al., J Immunol. Aug 1 ;187(3):1113-9 (2011)). Se demostró la mejora de la estimulación inmunitaria que resulta del bloqueo de la interacción PD-L1/CD80 a través de la combinación con el bloqueo de otras interacciones PD-1/PD-L1 o PD-1/PD-L2.

Se supone que las alteraciones en los fenotipos de células inmunitarias son un factor importante en el choque séptico (Hotchkiss, et al., Nat Rev Immunol (2013)). Estos incluyen niveles aumentados de PD-1 y PD-L1 (Guignant, et al, Crit. Care (2011)), Las células de pacientes que presentan choque séptico con niveles aumentados de PD-1 y PD-L1 muestran un mayor nivel de apoptosis de linfocitos T. Los anticuerpos dirigidos a PD-L1 pueden reducir el nivel de apoptosis de células inmunitarias (Zhang et al, Crit Care (2011)). Además, los ratones que carecen de expresión de PD-1 son más resistentes a los síntomas de choque séptico que los ratones de tipo silvestre. Yang J., et al. . J Immunol. Aug 1; 187(3):1113-9 (2011)). Los estudios revelaron que el bloqueo de las interacciones de PD-L1 por medio de anticuerpos puede deprimir respuestas inmunitarias inadecuadas y mejorar los signos de la enfermedad.

Además de mejorar las respuestas inmunitarias a los antígenos crónicos, el bloqueo de la vía de PD-1/PD-L1 también demostró la mejora de las respuestas a la vacunación, incluida la vacunación terapéutica en el contexto de infección crónica (Ha, S. J. et al., "Enhancing therapeutic vaccination by blocking PD-1-mediated inhibitory signals during chronic infection", J. Exp. Med., 205(3):543-555 (2008); Finnefrock, A. C. et al., "PD-1 blockade in rhesus macaques: impact on chronic infection and prophylactic vaccination", J. Immunol., 182(2):980-987 (2009); Song, M. -Y. et al., "Enhancement of vaccine-induced primary and memory CD8+ t-cell responses by soluble PD-1", J. Immunother., 34(3):297-306 (2011)).

El documento WO 2014/151634 desvela inhibidores macrocíclicos de la interacción proteína/proteína PD-1/PD-L1 y CD80/PD-L1 que puede usarse contra el cáncer y las enfermedades infecciosas.

Las referencias a los métodos de tratamiento en los posteriores párrafos de esta descripción han de interpretarse como referencias a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

Las moléculas descritas en la presente demuestran la capacidad de bloquear la interacción de PD-L1 con PD-1, en sistemas experimentales bioquímicos y celulares. Estos resultados son coherentes con la posibilidad de que la administración terapéutica mejore la inmunidad en el cáncer o en infecciones crónicas, incluida la vacunación terapéutica.

Los péptidos macrocíclicos descritos en la presente son capaces de inhibir la interacción de PD-L1 con PD-1 y con CD80. Estos compuestos han demostrado una fijación altamente eficaz a PD-L1, el bloqueo de la interacción de PD-L1 con PD-1 o CD80, y son capaces de promover una mejora de la actividad funcional de linfocitos T, lo que los convierte en candidatos para formulaciones parenterales, orales, pulmonares, nasales, bucales o de liberación sostenida.

El alcance de la invención está definido por el conjunto de reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto, la presente descripción proporciona un compuesto de la Fórmula (I) que se selecciona de:

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o una sal de este aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

En otra forma de realización, la presente descripción proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal de este terapéuticamente aceptable para su uso en terapia. En otra forma de realización, el compuesto para su uso también comprende administrar un agente adicional antes, durante o después de la administración del compuesto de la Fórmula (I), o una sal de este terapéuticamente aceptable. En otra forma de realización, el agente adicional es un agente antimicrobiano, un agente antiviral, un agente citotóxico y/o un modificador de la respuesta inmunitaria. En otra forma de realización, el agente adicional es un inhibidor de HDAC. En otra forma de realización, el agente adicional es un agonista de TLR7 y/o TLR8.

En otra forma de realización, la presente descripción proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la Fórmula (I) o una sal de este terapéuticamente aceptable para su uso en inhibir el crecimiento, la proliferación o la metástasis de células cancerosas en un sujeto que lo necesita. Se debe comprender que la inhibición puede ser directa o indirecta. En otra forma de realización, el tipo de cáncer se selecciona de melanoma, carcinoma de células renales, cáncer pulmonar de células no pequeñas escamosas (NSCLC), NSCLC de células no escamosas, cáncer colorrectal, cáncer de próstata resistente a la castración, cáncer de ovario, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, carcinoma pancreático, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinomas de esófago, tubo gastrointestinal y mama, y cáncer hematológico.

En otra forma de realización, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula (I) o una sal de este terapéuticamente aceptable para su uso en tratar una enfermedad infecciosa en un sujeto que lo requiera. En otra forma de realización, la enfermedad infecciosa es causada por un virus. En otra forma de realización, el virus se selecciona de VIH, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, virus del herpes e influenza.

En otra forma de realización, la presente invención proporciona uno o más péptidos macrocíclicos descritos en la presente para su uso en tratar el choque séptico en un sujeto que lo necesita.

De acuerdo con la presente descripción, se descubrieron péptidos que se fijan específicamente a PD-L1 y son capaces de inhibir la interacción de PD-L1 con PD-1 y CD80. Estos péptidos macrocíclicos muestran una eficacia inmunomoduladora in vitro, lo que implica que sean candidatos terapéuticos para el tratamiento de varias enfermedades, incluido el cáncer y enfermedades infecciosas.

Las expresiones "fijación específica" o "que se fija específicamente" se refieren a la interacción entre una proteína y una molécula de fijación, tal como un compuesto o ligando. La interacción depende de la presencia de una estructura particular (es decir, un sitio de fijación a la enzima, un epítopo o un determinante antigénico) de la proteína reconocida por la molécula de fijación. Por ejemplo, si un compuesto tiene fijación específica al sitio de fijación a la proteína "A", la presencia del compuesto en una reacción que contiene una proteína que incluye el sitio de fijación A y de un péptido etiquetado que se fija específicamente al sitio de fijación a la proteína A producirán la reducción de la cantidad de péptido etiquetado fijado a la proteína. Por el contrario, la fijación no específica de un compuesto a la proteína no da como resultado un desplazamiento dependiente de la concentración del péptido etiquetado de la proteína.

Se pretende que la presente descripción incluya todos los isótopos de átomos que ocurren en los presentes compuestos. Los isótopos incluyen los átomos que tienen el mismo número atómico, pero diferentes números másicos. A fin de brindar ejemplos generales y sin limitación, los isótopos de hidrógeno incluyen deuterio y tritio. Los isótopos de carbono incluyen 13C y 14C. Por lo general, los compuestos de la invención etiquetados de manera isotópica se pueden preparar mediante técnicas convencionales conocidas por las personas del oficio de nivel medio o mediante procesos análogos a los que se describen en la presente, usando un reactivo adecuado etiquetado de manera isotópica en lugar de un reactivo no etiquetado. Los compuestos pueden tener varios usos posibles, por ejemplo, como estándares y reactivos para determinar la actividad biológica. En el caso de isótopos estables, es posible que estos compuestos tengan el potencial de modificar favorablemente propiedades biológicas, farmacológicas o farmacocinéticas.

Un aspecto adicional del objeto descrito en la presente se refiere al uso de los péptidos descritos como ligandos radioetiquetados para el desarrollo de ensayos de fijación a ligando o para controlar la adsorción, el metabolismo, la distribución, la fijación al receptor o su ocupación in vivo, o la disposición del compuesto. Por ejemplo, un péptido macrocíclico descrito en la presente se puede preparar usando el isótopo radiactivo 125I, y el péptido radioetiquetado resultante se puede usar para desarrollar un ensayo de fijación o para estudios de metabolismo. De manera alternativa, y para el mismo fin, un péptido macrocíclico descrito en la presente se puede convertir en una forma radioetiquetada mediante titulación catalítica usando métodos conocidos por las personas del oficio de nivel medio.

Los péptidos macrocíclicos de la presente descripción también se pueden usar como agentes para las imágenes PET agregando un marcador radiactivo mediante métodos conocidos por las personas del oficio de nivel medio.

Los péptidos preferidos incluyen al menos uno de los péptidos macrocíclicos provistos en la presente, y estos péptidos se pueden incluir en composiciones y combinaciones farmacéuticas.

Las definiciones provistas en la presente se aplican, sin limitación, a los términos usados en la presente memoria descriptiva, a menos que se limite de otra manera en casos específicos.

Las personas del oficio de nivel medio de la química de aminoácidos y péptidos están al tanto de que un aminoácido incluye un compuesto representado por la estructura general:

L o S-a-aminoácido D o R-a-aminoácido

(si R=H) (si R=H)

en donde R y R' son como se analizan en la presente.

A menos que se indique lo contrario, el término "aminoácido", como se usa en la presente, solo o como parte de otro grupo, incluye, sin limitación, un grupo amino y un grupo carboxilo ligado al mismo carbono, denominado carbono "a", en donde R y/o R' pueden ser una cadena lateral natural o no natural, que incluye hidrógeno. La configuración "S" absoluta en el carbono "a" con frecuencia se denomina configuración "L" o "natural". En caso de que ambos sustituyentes "R" y "R'"(principal) sean iguales a hidrógeno, el aminoácido es glicina y no es quiral.

La expresión “cadena lateral de aminoácido natural”, como se usa en la presente, se refiere a la cadena lateral de cualquier aminoácido natural (es decir, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina,-histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina), por lo general, en la configuración S (es decir, el aminoácido L).

El término "tratar" se refiere a: (i) prevenir una enfermedad, un trastorno o una afección en un paciente que puede tener predisposición a la enfermedad, el trastorno y/o la afección, pero que aún no se le ha diagnosticado; (ii) inhibir la enfermedad, el trastorno o la afección, es decir, detener su desarrollo; y (iii) aliviar la enfermedad, el trastorno o la afección, es decir, causar la regresión de la enfermedad, del trastorno y/o de la afección, y/o los síntomas asociados a la enfermedad, el trastorno y/o la afección.

La fijación de los péptidos macrocíclicos a PD-L1 se puede medir, por ejemplo, mediante métodos, tales como fluorescencia homogénea de resolución temporal (HTRF), resonancia de plasmones superficiales (SPR), calorimetría de titulación isotérmica (ITC), espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR) y similares. Además, la fijación de los péptidos macrocíclicos a PD-L1 expresado en la superficie de las células se puede medir como se describió en la presente, en ensayos de fijación celular.

La administración de un agente terapéutico descrito en la presente incluye, entre otros, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de agente terapéutico. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en la presente, se refiere, entre otros, a una cantidad de un agente terapéutico para tratar o prevenir una afección que se puede tratar mediante la administración de una composición de los inhibidores de fijación a PD-1/PD-L1 descritos en la presente. Dicha cantidad es la cantidad suficiente para demostrar un efecto detectable terapéutico, preventivo o que produce una mejora. El efecto puede incluir, por ejemplo, entre otros, el tratamiento o la prevención de las afecciones enumeradas en la presente. La cantidad eficaz precisa para un sujeto dependerá del tamaño y de la salud del sujeto, la naturaleza y el alcance de la afección que se trata, las recomendaciones del médico y el tratamiento o la combinación de tratamientos seleccionada para la administración. Por lo tanto, no es útil especificar una cantidad eficaz exacta por adelantado.

En otro aspecto, la descripción se refiere los péptidos macrocíclicos de la presente descripción para su uso en inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto usando. Como se demuestra en la presente, los péptidos macrocíclicos de la presente descripción son capaces de fijarse a PD-L1, alterar la interacción entre PD-L1 y PD-1, competir con la fijación de PD-L1 a anticuerpos monoclonales anti-PD-1 que se sabe bloquean la interacción con PD-1, mejorar la secreción de IFNy por parte de linfocitos T específicos de CMV, y mejorar la secreción de IFNg por parte de linfocitos T específicos de VIH. En consecuencia, los péptidos macrocíclicos de la presente descripción son útiles para modificar una respuesta inmunitaria, tratar enfermedades, tales como el cáncer o enfermedades infecciosas, estimular una respuesta autoinmunitaria protectora o estimular respuestas inmunitarias específicas de antígenos (por ejemplo, mediante la coadministración de péptidos bloqueadores de PD-L1 con un antígeno de interés).

A fin de comprender mejor la presente descripción, primero se definen ciertos términos. Las definiciones adicionales se indican a lo largo de la descripción detallada.

Las expresiones "ligando de muerte programada 1", "ligando de muerte celular programada 1", "Proteína PD-L1", "PD-L1", "Pd L1", "PDCDL1", "hPD-L1", "hPD-LI", "CD274" y "B7-H1" se usan indistintamente, e incluyen variantes, isoformas, homólogos de especies de PD-L1 humano, y análogos que tienen al menos un epítopo común con PD-L1. La secuencia de PD-L1 completa se puede encontrar en GENBANK®, N. ° de acceso NP_054862.

Las expresiones "muerte programada 1", "muerte celular programada 1", "proteína PD-1", "PD-1", "PD1", "PDCD1", "hPD-1" y "hPD-I" se usan indistintamente e incluyen variantes, isoformas, homólogos de especies de PD-1 humano, y análogos que tienen al menos un epítopo común con PD-1. La secuencia de PD-1 completa se puede encontrar en GENBANK®, N. ° de acceso U64863.

Las expresiones “antígeno asociado al linfocito T citotóxico-4”, “CTLA-4”, “CTLA4”, “antígeno CTLA-4” y “CD152” (véase, por ejemplo, Murata, Am. J. Pathol., 155:453-460 (1999)) se usan indistintamente e incluyen variantes, isoformas, homólogos de especies de CTLA-4 humano y análogos que tienen al menos un epítopo común con CTLA-4 (véase, por ejemplo, Balzano, Int. J. Cáncer Suppl., 7:28-32 (1992)). La secuencia de ácidos nucleicos CTLA-4 completa se puede encontrar en GENBANK®, N. ° de acceso L15006.

La expresión "respuesta inmunitaria" se refiere a la acción, por ejemplo, de linfocitos, células presentadoras de antígenos, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluso péptidos macrocíclicos, citocinas y complemento) que da como resultado el daño selectivo, la destrucción o la eliminación del cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados por patógenos, células cancerosas o, en el caso de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.

Un "evento adverso" (AE), como se usa en la presente, se refiere a cualquier signo (incluido un hallazgo anormal en el laboratorio), síntoma o enfermedad desfavorable o, en general, involuntario, incluso no deseable, asociado al uso de un tratamiento médico. Por ejemplo, un evento adverso puede estar asociado a la activación del sistema inmunitario o a la expansión de las células del sistema inmunitario (por ejemplo, linfocitos T) en respuesta a un tratamiento. Un tratamiento médico puede tener uno o más AE asociados, y cada AE puede tener el mismo nivel de gravedad, o no. La referencia a los métodos capaces de "alterar eventos adversos" implica un régimen de tratamiento que disminuye la incidencia y/o la gravedad de uno o más AE asociados al uso de un régimen de tratamiento diferente.

Como se usa en la presente, “enfermedad hiperproliferativa” se refiere a afecciones en donde el crecimiento celular supera niveles normales. Por ejemplo, las enfermedades o los trastornos hiperproliferativos incluyen el cáncer (por ejemplo, cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer biliar) y enfermedades que no son malignas (por ejemplo, ateroesclerosis, hiperplasia benigna e hipertrofia prostática benigna).

Como se usan en la presente, “alrededor de” o “que comprende esencialmente” significan, dentro de un margen de error aceptable del valor particular determinado por una persona del oficio de nivel medio, que dependerá en parte de cómo se mide o determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, “alrededor de” o “que comprende esencialmente" puede significar dentro de uno o más de una desviación estándar de acuerdo con la práctica en el estado de la técnica. De manera alternativa, “alrededor de” o “que comprende esencialmente” puede referirse a un rango de hasta 20 %. Además, en particular, con respecto a sistemas o procesos biológicos, los términos pueden referirse a hasta un orden de magnitud o hasta 5 veces un valor. Cuando se brindan valores particulares en la solicitud y las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, se supone que el significado de “alrededor de" o "que comprende esencialmente" se encuentra dentro de un margen de error aceptable para dicho valor particular.

Como se describe en la presente, cualquier rango de concentración, rango de porcentaje, rango de proporción o rango de entero incluye el valor de cualquier entero dentro del rango mencionado y, cuando sea adecuado, sus fracciones (tal como un décimo o un centésimo de un entero), a menos que se indique lo contrario.

Ensayos de competencia

La presente descripción también se refiere a péptidos macrocíclicos que son capaces de competir con la fijación de un anticuerpo anti-PD-L1 de referencia (MDX-1105) en al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90% y al menos alrededor de 100%. Dichos péptidos macrocíclicos pueden compartir homología estructural con uno o más péptidos macrocíclicos descritos en la presente, que incluyen las formas mutantes, de sustitución conservadora, de sustitución funcional y de eliminación, siempre que se fijen específicamente a PD-L1. Por ejemplo, si un péptido macrocíclico se fija considerablemente a la misma región de PD-L1 que un anticuerpo anti-PD-L1 de referencia, el péptido macrocíclico se debe fijar a un epítopo de PD-L1 que al menos se superpone con el epítopo PD-L1 al que se fija el anticuerpo monoclonal anti-PD-L1. La región de superposición puede variar de un residuo de aminoácido a varios cientos de residuos de aminoácido. El péptido macrocíclico luego debe competir con la fijación del anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 a PD-L1 y/o bloquearla y, de esa manera, disminuir la fijación del anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 a PD-L1, preferentemente, en al menos alrededor de 50 % en un ensayo de competencia.

Los anticuerpos anti-PD-L1 que se pueden usar como anticuerpos de referencia para los ensayos de competencia se conocen en el estado de la técnica. Por ejemplo, se pueden usar los siguientes anticuerpos anti-PD-L1 representativos: MDX-1105 (BMS); L01X-C (Serono), L1X3 (Serono), MSB-0010718C (Serono) y PD-L1 Probody (CytomX) y los anticuerpos PD-L1 descritos en WO 2007/005874 de titularidad conjunta.

Los anticuerpos anti-PD-1 que se pueden usar como anticuerpos de referencia para los ensayos de competencia se conocen en el estado de la técnica. Por ejemplo, se pueden usar los siguientes anticuerpos anti-PD-1 representativos: nivolumab (BMS); 17D8, 2D3, 4H1,4A11,7D3 y 5F4, cada uno de los cuales se describe en la patente estadounidense de titularidad conjunta N. ° 8,008,449 (BMS), MK-3475 (Merck, descrito en la patente estadounidense N. ° 8,168,757) y los anticuerpos descritos en la patente estadounidense N. ° 7,488,802.

Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, la presente descripción proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene un péptido macrocíclico o una combinación de péptidos macrocíclicos de la presente descripción, formulados junto con un portador aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Dichas composiciones pueden incluir un péptido macrocíclico o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la presente descripción, o una combinación de estos (por ejemplo, dos o más diferentes). Por ejemplo, una composición farmacéutica de la descripción puede comprender una combinación de péptidos macrocíclicos (o inmunoconjugados o biespecíficos) que se fijan a diferentes epítopos en el antígeno diana o que tienen actividades complementarias.

Las composiciones farmacéuticas de la descripción también se pueden administrar en un tratamiento conjunto, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, el tratamiento conjunto puede incluir un péptido macrocíclico combinado con al menos un agente antiinflamatorio o inmunodepresor. Los ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en el tratamiento conjunto se describen con mayor detalle más adelante en la sección de usos de los péptidos macrocíclicos de la descripción.

Como se usa en la presente, un “portador aceptable desde el punto de vista farmacéutico” incluye todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes demoradores de la absorción e isotónicos, y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el portador es adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión). En función de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, un péptido macrocíclico, un inmunoconjugado o una molécula biespecífica, se puede recubrir con un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Los compuestos farmacéuticos de la descripción pueden incluir una o más sales aceptables desde el punto de vista farmacéutico. Una “sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico” o “sal terapéuticamente aceptable” se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto de origen y no produce ningún efecto toxicológico no deseado (véase, por ejemplo, Berge, S. M. et al., J. Pharm. Sci., 66:1-19 (1977)). Los ejemplos de estas sales incluyen sales de adición ácida y sales de adición básica. Las sales de adición ácida incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, y también de ácidos orgánicos no tóxicos, tales como ácidos monocarboxílicos y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos aromáticos y alifáticos, y similares. Las sales de adición básica incluyen aquellas derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, y de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Una composición farmacéutica de la presente descripción también puede incluir un antioxidante aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Los ejemplos de antioxidantes aceptables desde el punto de vista farmacéutico incluyen: (1) antioxidantes hidrosolubles, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamintetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que se pueden usar en las composiciones farmacéuticas de la descripción incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de estos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La correcta fluidez se puede mantener, por ejemplo, usando materiales de recubrimiento, tales como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y usando tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, emulgentes y dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede garantizar mediante procedimientos de esterilización, como se indicó anteriormente, y mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede lograr mediante la inclusión de agentes que demoran la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Los portadores aceptables desde el punto de vista farmacéutico incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en el estado de la técnica. Excepto en el caso de que un medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas de la descripción. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios en las composiciones.

Con frecuencia, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para obtener una concentración farmacológica alta. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de estos. La correcta fluidez se puede mantener, por ejemplo, usando un recubrimiento, tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y usando tensioactivos. En muchos casos, puede ser preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede obtener incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad necesaria en un solvente adecuado con uno de los ingredientes mencionados anteriormente o una combinación de estos, según sea necesario, seguido de la microfiltración para su esterilización. En general, las dispersiones se prepararon mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básica y los otros ingredientes requeridos que se enumeraron anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo, más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente esterilizada por filtración de aquel.

La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una forma de dosis única variará según el sujeto que se trate y el modo de administración particular. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una forma de dosis única será, generalmente, la cantidad de composición que produzca un efecto terapéutico. Por lo general, de un total de 100 %, esta cantidad varía de alrededor de 0,01 % a alrededor de 99 % de ingrediente activo, preferentemente, de alrededor de 0,1 % a alrededor de 70 %, con máxima preferencia, de alrededor de 1 % a alrededor de 30 % de ingrediente activo en combinación con un portador aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

Los regímenes de dosificación se ajustan para brindar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas con el tiempo, o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente, según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. En especial, resulta ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. Como se usa en la presente, la forma de dosis unitaria se refiere a unidades físicamente diferenciadas útiles como dosis unitarias para los sujetos que se tratan; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado junto con el portador farmacéutico requerido. La especificación de las formas de dosis unitaria de la descripción depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se desea obtener, y (b) las limitaciones inherentes en el estado de la técnica de obtener dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en seres humanos.

Para la administración del péptido macrocíclico, las dosis varían de alrededor de 0,0001 a 100 mg/kg y, con mayor frecuencia, de 0,01 a 5 mg/kg del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del rango de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento de ejemplo implica la administración una vez por día, dos veces por día, dos veces por semana, tres veces por semana, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez por mes, una vez cada tres meses o una vez cada tres a seis meses. Los regímenes de dosificación preferidos de un péptido macrocíclico de la invención incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal para la administración intravenosa, para el macrociclo que se administra, y se usa uno de los siguientes cronograma de dosificación: (i) cada cuatro semanas para seis dosificaciones, luego cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez y luego 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.

En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más péptidos macrocíclicos con diferentes especificidades de fijación, en cuyo caso, la dosificación de cada compuesto administrado se encuentra dentro de los rangos indicados. Por lo general, los compuestos se administran en numerosas ocasiones. Los intervalos entre dosis únicas pueden ser, por ejemplo, semanales, mensuales, trimestrales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, según se indique mediante la medición de los niveles en sangre del péptido macrocíclico dirigido al antígeno diana en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para alcanzar una concentración plasmática de alrededor de 1-1000 .mu.g/ml y, en algunos métodos, alrededor de 25-300 .mu.g/ml.

De manera alternativa, el péptido macrocíclico se puede administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso es necesaria una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar en función de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En el caso de aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente poco frecuentes durante un período prolongado. Algunos pacientes reciben el tratamiento de por vida. En el caso de aplicaciones terapéuticas, en ocasiones, es necesaria una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que se reduzca o se concluya la progresión de la enfermedad y, preferentemente, hasta que el paciente muestre una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. A partir de ahí, el paciente puede recibir un régimen profiláctico.

Los niveles de dosis reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden modificarse, a fin de obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición y un modo de administración particulares sin que sean tóxicos para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de varios factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares que se usan en la presente descripción, o del éster, la sal o la amida de aquel, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se use, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares que se usen, la edad, el sexo, el peso, la afección, la salud en general y los antecedentes médicos del paciente que está en tratamiento y factores similares conocidos en el campo de la medicina.

Una “dosis terapéuticamente eficaz” de un péptido macrocíclico de la invención da como resultado, preferentemente, una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento de la frecuencia y duración de los períodos asintomáticos de la enfermedad, o la prevención de disfunciones o incapacidades causadas por la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores, una “dosis terapéuticamente eficaz” inhibe, preferentemente, el crecimiento celular o tumoral en al menos alrededor de 20 %, con mayor preferencia, al menos alrededor de 40 %, aun con mayor preferencia, al menos alrededor de 60 % y, aun con mayor preferencia, al menos alrededor de 80 % con respecto a los sujetos sin tratar. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral y/o el VIH se puede evaluar en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia en tumores humanos o de la eficacia viral. De manera alternativa, esta propiedad de una composición se puede evaluar analizando la capacidad del compuesto de producir inhibición, tal como inhibición in vitro, mediante ensayos conocidos por las personas del oficio de nivel medio. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño tumoral, disminuir la carga viral o mejorar los síntomas en un sujeto. Una persona del oficio de nivel medio podrá determinar dichas cantidades en función de factores, tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto y la composición o vía de administración particulares seleccionadas.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un kit farmacéutico de partes que comprende un péptido macrocíclico y otro inmunomodulador, como se describe en la presente. El kit también puede comprender instrucciones para el uso en el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer, como se describe en la presente) y/o una enfermedad viral.

Una composición de la presente descripción se puede administrar a través de una o más vías de administración usando uno o más métodos conocidos en el estado de la técnica. La persona del oficio de nivel medio considerará que la vía de administración y/o el modo de administración variarán en función de los resultados deseados. Las vías de administración preferidas de los péptidos macrocíclicos de la descripción incluyen las siguientes: intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenterales, por ejemplo, inyección o infusión. La expresión “administración parenteral”, como se usa en la presente, significa modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, por lo general, mediante inyección, e incluye, entre otras, la infusión y la inyección intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intraesternal.

De manera alternativa, un péptido macrocíclico de la descripción se puede administrar a través de una vía no parenteral, tal como la vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.

Los compuestos activos se pueden preparar con portadores que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulada. Se pueden usar polímeros biodegradables biocompatibles, tales como etileno vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos de los métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o, en general, son conocidos por las personas del oficio de nivel medio. Véase, por ejemplo, Robinson, J. R., ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1978).

Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, en una forma de realización preferida, una composición terapéutica de la descripción se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las patentes estadounidenses N. os 5.399.163, 5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824 o 4.596.556. Los ejemplos de implantes y módulos conocidos y útiles en la presente descripción incluyen los siguientes: la patente estadounidense N.° 4.487.603, que describe una bomba de microinfusión implantable para administrar medicamentos a una velocidad controlada; la patente estadounidense N.° 4.486.194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la patente estadounidense N.° 4.447.233, que describe una bomba de infusión de medicamentos para administrar medicamentos a una velocidad de infusión precisa; la patente estadounidense N.° 4.447.224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármacos; la patente estadounidense N.° 4.439.196, que describe un sistema de administración de fármacos osmótico, que tiene compartimientos multicámara; y la patente estadounidense N.° 4.475.196, que describe un sistema de administración de fármacos osmótico. Existen numerosos implantes, sistemas de administración y módulos conocidos por las personas del oficio de nivel medio.

En algunas formas de realización, los péptidos macrocíclicos de la descripción se pueden formular a fin de garantizar la distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye numerosos compuestos altamente hidrófilos. A fin de garantizar que los compuestos terapéuticos de la descripción atraviesen la BBB (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para obtener información sobre métodos de fabricación de liposomas, véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses N.os 4.522.811, 5.374.548 y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender una o más porciones que se transportan selectivamente a células u órganos específicos y, por lo tanto, se mejora la administración dirigida del fármaco (véase, por ejemplo, Ranade, V. V., J. Clin. Pharmacol, 29:685 (1989)). Los ejemplos de porciones de direccionamiento incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, la patente estadounidense N. ° 5.416.016 de Low et al.); manósidos (Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun, 153:1038 (1988)); péptidos macrocíclicos (Bloeman, P. G. et al., FEBS Lett., 357:140 (1995); Owais, M. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 39:180 (1995)); receptor de la proteína tensioactiva A (Briscoe et al., Am. J. Physiol., 1233:134 (1995)); p120 (Schreier et al., J. Biol. Chem., 269:9090 (1994)); véanse también Keinanen, K. et al., FEBS Lett., 346:123 (1994); Killion, J. J. et al., Immunomethods 4:273 (1994).

Usos y métodos de la descripción

Los péptidos macrocíclicos, las composiciones y los métodos de la presente descripción presentan numerosos usos in vitro e in vivo que implican, por ejemplo, la detección de PD-L1 o la mejora de la respuesta inmunitaria mediante el bloqueo de PD-L1. Por ejemplo, tales moléculas se pueden administrar a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para mejorar la inmunidad en diversas situaciones. En consecuencia, se desvela en ella un método para modificar una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende administrar al sujeto el péptido macrocíclico de la descripción de manera que se modifique la respuesta inmunitaria en el sujeto. Preferentemente, la respuesta se mejora, se estimula o se regula en forma ascendente. En otros casos, el péptido macrocíclico puede presentar actividad terapéutica y de fijación anti-Macaca fascicularis, anti-ratón y/o anti-marmotas.

Como se usa en la presente, el término "sujeto" incluye animales humanos y no humanos. La expresión "animales no humanos" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, gallinas, marmotas, anfibios y reptiles, aunque se prefieren los mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas y caballos. Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que necesitan la mejora de una respuesta inmunitaria. Los métodos son particularmente adecuados para tratar pacientes humanos que presentan un trastorno que se puede tratar aumentando la respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T. En una forma de realización particular, los métodos son particularmente adecuados para el tratamiento de células cancerosas in vivo. A fin de lograr la mejora de la inmunidad específica del antígeno, los péptidos macrocíclicos se pueden administrar junto con un antígeno de interés. Cuando los péptidos macrocíclicos a PD-L1 se administran junto con otro agente, ambos pueden administrarse en cualquier orden o de manera simultánea.

La descripción también proporciona métodos para detectar la presencia de antígeno PD-L1 humano, de marmota, de Macaca fascicularis y/o ratón en una muestra, o para medir la cantidad de antígeno PD-L1 humano, de marmota, de Macaca fascicularis y/o de ratón, que comprenden poner en contacto la muestra, y una muestra de control, con un péptido macrocíclico de referencia, o una porción de fijación al antígeno de este, que se fija específicamente a PD-L1 humano, de marmota, de Macaca fascicularis y/o ratón, en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el macrociclo y PD-L1 humano, de marmota, de Macaca fascicularis y/o ratón. Luego se detecta la formación de un complejo, en donde la formación de un complejo diferente entre la muestra en comparación con la muestra de control indica la presencia del antígeno PD-L1 humano, de marmota, de Macaca fascicularis y/o ratón en la muestra.

Dada la fijación específica de los péptidos macrocíclicos de la descripción a PD-L1, en comparación con CD28, ICOS y CTLA-4, los péptidos macrocíclicos de la descripción se pueden usar para detectar específicamente la expresión de PD-L1 en la superficie de células y, además, se pueden usar para purificar PD-L1 mediante la purificación de inmunoafinidad.

Cáncer

El bloqueo de PD-1 por parte de los péptidos macrocíclicos puede mejorar la respuesta inmunitaria a las células cancerosas en el paciente. El ligando de PD-1, PD-L1, no se expresa en células humanas normales, pero es abundante en diversos tipos de cáncer humanos (Dong et al., Nat. Med., 8:787-789 (2002)). La interacción entre PD-1 y PD-L1 da como resultado una disminución en los linfocitos que infiltran los tumores, una disminución en la proliferación mediada por el receptor de linfocitos T y una evasión inmunitaria por parte de células cancerosas (Dong et al., J. Mol. Med., 81:281-287 (2003); Blank et al., Cancer Immunol. Immunother., 54:307-314 (2005); Konishi et al., Clin. Cancer Res., 10:5094-5100 (2004)). La inmunodepresión se puede revertir mediante la inhibición de la interacción local de PD-1 con PD-L1, y el efecto es aditivo cuando también se bloquea la interacción de PD-1 con PD-L2 (Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 99:12293-12297 (2002); Brown et al., J. Immunol., 170:1257-1266 (2003)). Si bien estudios anteriores mostraron que la proliferación de linfocitos T se puede recuperar inhibiendo la interacción de PD-1 con PD-L1, no se reportaron efectos directos sobre el crecimiento de tumores cancerosos in vivo mediante el bloqueo de la interacción PD-1/PD-L1. En un aspecto, la presente invención se refiere a un péptido macrocíclico de acuerdo con la invención para su uso in vivo de manera que se inhiba el crecimiento de los tumores cancerosos. Se puede usar un péptido macrocíclico solo para inhibir el crecimiento de tumores cancerosos. De manera alternativa, un péptido macrocíclico se puede usar junto con otros agentes inmunógenos, tratamientos contra el cáncer estándares u otros péptidos macrocíclicos, como se describe a continuación.

En consecuencia, en una forma de realización, la invención provee un péptido macrocíclico de acuerdo con la invención para su uso en inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto.

Los tipos de cáncer preferidos cuyo crecimiento se puede inhibir usando los péptidos macrocíclicos de la descripción incluyen los tipos de cáncer que generalmente son sensibles a la inmunoterapia. Los ejemplos de tipos de cáncer preferidos para el tratamiento incluyen melanoma (por ejemplo, melanoma maligno metastásico), carcinoma de células renales (por ejemplo, carcinoma de células claras), cáncer de próstata (por ejemplo, adenocarcinoma de próstata resistente al tratamiento hormonal y cáncer de próstata resistente a la castración), cáncer de mama, cáncer colorrectal y cáncer pulmonar (por ejemplo, cáncer pulmonar de células no pequeñas escamosas y no escamosas). Además, la descripción incluye tumores malignos recidivantes o resistentes al tratamiento, cuyo crecimiento puede inhibirse usando los péptidos macrocíclicos de la descripción.

Los ejemplos de otros tipos de cáncer que se pueden tratar usando los métodos de la descripción incluyen cáncer óseo, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago/cáncer gástrico, cáncer de testículo, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endócrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de las glándulas suprarrenales, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, leucemias crónicas o agudas, que incluyen leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o de uretra, carcinoma de pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), linfoma del SNC primario, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de linfocitos T, tipos de cáncer provocados por el entorno, que incluyen los provocados por el amianto, y combinaciones de estos tipos de cáncer. La presente descripción también es útil para el tratamiento de tipos de cáncer metastásicos, en especial, tipos de cáncer metastásicos que expresan PD-L1 (Iwai et al., Int. Immunol., 17:133-144 (2005)).

De manera opcional, los péptidos macrocíclicos a PD-L1 se pueden combinar con un agente inmunógeno, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (que incluyen proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células y células transfectadas con genes que codifican citocinas estimulantes del sistema inmunitario (He et al., J. Immunol., 173:4919-4928 (2004)). Los ejemplos de vacunas antitumorales que se pueden usar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citocina GM-CSF (analizada más adelante).

En los seres humanos, algunos tumores demostraron ser inmunógenos, tales como los melanomas. Se prevé que mediante el aumento del umbral de activación de linfocitos T a través del bloqueo de PD-L1, se activen las respuestas tumorales en el huésped.

Es probable que el bloqueo de PD-L1 sea más eficaz en combinación con un protocolo de vacunación. Se trazaron diversas estrategias experimentales para la vacunación contra los tumores (véanse Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000); Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring: 300­ 302 (2000); Khayat, D., ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000); Foon, K., ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000); véase también Restifo, N. et al., Cancer Vaccines, Capítulo 61, pp. 3023-3043, in DeVita, V. et al., eds., Cancer: Principies and Practice of Oncology, quinta edición (1997)). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna en la que se usan células tumorales autólogas o alogénicas. Estas vacunas celulares demostraron ser más eficaces cuando las células tumorales se transducen para expresar GM-CSF. GM-CSF demostró ser un activador potente de la presentación de antígenos para la vacunación contra los tumores (Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3539-3543 (1993)).

El estudio de los patrones de expresión génica y de expresión génica a gran escala en diversos tumores produjo la definición de los denominados antígenos específicos de tumores (Rosenberg, S. A., Immunity, 10:281-287 (1999)). En varios casos, estos antígenos específicos de tumores son antígenos diferenciados que se expresan en los tumores y en la célula donde se produjo el tumor, por ejemplo, antígenos melanocitos gp100, antígenos MAGE y Trp-2. Lo que es más importante, se puede demostrar que muchos de estos antígenos son las dianas de linfocitos T específicos del tumor en el huésped. El bloqueo de PD-L1 se puede usar en combinación con un conjunto de proteínas recombinantes y/o péptidos expresados en un tumor, a fin de generar una respuesta inmunitaria a estas proteínas. En general, el sistema inmunitario considera estas proteínas como autoantígenos y, por lo tanto, son tolerantes a ellos. El antígeno tumoral también puede incluir la proteína telomerasa, que es necesaria para la síntesis de telómeros de cromosomas y que se expresa en más del 85 % de los tipos de cáncer en seres humanos y solo en una cantidad limitada de tejidos somáticos (Kim, N et al., Science, 266:2011-2013 (1994)). (Estos tejidos somáticos pueden protegerse del ataque inmunitario de varias maneras). El antígeno tumoral también puede ser un "neoantígeno" expresado en células cancerosas debido a las mutaciones somáticas que alteran la secuencia proteica o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (es decir, bcr-abl en el cromosoma Philadelphia), o idiotipo de tumores de linfocitos B.

Otras vacunas antitumorales pueden incluir las proteínas de virus implicados en ciertos tipos de cáncer humano, tales como el virus del papiloma humano (HPV), el virus de la hepatitis (HBV y HCV) y el virus herpes asociado al sarcoma de Kaposi (KHSV). Otra forma de antígeno específico de tumores que se puede usar junto con el bloqueo de PD-L1 son las proteínas de choque térmico (HSP) purificadas aisladas del tejido tumoral en sí mismo. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales, y estas HSP son altamente eficaces para el suministro a las células que presentan antígenos, a fin de provocar inmunidad tumoral (Suot, R. et al., Science, 269:1585-1588 (1995); Tamura, Y. et al., Science, 278:117-120 (1997)).

Las células dendríticas (DC) son células que presentan antígenos potentes que se pueden usar para cebar respuestas específicas del antígeno. Las DC se pueden producir ex vivo y se pueden cargar con varios antígenos de proteínas y péptidos, así como extractos de células tumorales (Nestle, F. et al., Nat. Med., 4:328-332 (1998)). Asimismo, las DC se pueden transducir por medios genéticos para que también expresen estos antígenos tumorales. Las DC también se fusionaron directamente a las células tumorales, a fin de lograr la inmunización (Kugler, A. et al., Nat. Med., 6:332-336 (2000)). Como método de vacunación, la inmunización de DC se puede combinar de manera eficaz con el bloqueo de PD-L1 para activar respuestas antitumorales más potentes.

El bloqueo de PD-L1 también se puede combinar con tratamientos oncológicos estándares. El bloqueo de PD-L1 se puede combinar de manera eficaz con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, es posible reducir la dosis del reactivo quimioterapéutico administrado (Mokyr, M. et al., Cancer Res., 58:5301-5304 (1998)). Un ejemplo de tal combinación es un péptido macrocíclico en combinación con decarbazina para el tratamiento del melanoma. Otro ejemplo de tal combinación es un péptido macrocíclico en combinación con interleucina-2 (IL-2) para el tratamiento del melanoma. La razón científica del uso combinado del bloqueo de PD-L1 y la quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debería provocar el aumento de los niveles de antígenos tumorales en la vía de presentación de antígenos. Otros tratamientos conjuntos que pueden dar como resultado la sinergia con el bloqueo de PD-L1 mediante la muerte celular son la radiación, la cirugía y la privación hormonal. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el huésped. Los inhibidores de la angiogénesis también se pueden combinar con el bloqueo de PD-L1. La inhibición de la angiogenia produce la muerte de células tumorales que podrían alimentar el antígeno tumoral en las vías de presentación del antígeno del huésped.

También se pueden usar péptidos macrocíclicos que bloquean PD-L1 en combinación con péptidos macrocíclicos biespecíficos que dirigen células efectoras que expresan el receptor Fc alfa o Fc gamma a células tumorales (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses N.os 5.922.845 y 5.837.243). Se pueden usar péptidos macrocíclicos biespecíficos para dirigirse a dos antígenos separados. Por ejemplo, se usaron péptidos macrocíclicos biespecíficos del receptor anti-Fc/antígeno antitumoral (por ejemplo, Her-2/neu) para dirigir los macrófagos a los sitios tumorales. Este direccionamiento puede activar de manera más eficaz las repuestas específicas tumorales. El brazo de los linfocitos T de estas respuestas se podría aumentar mediante el uso del bloqueo de PD-L1. De manera alternativa, el antígeno se puede administrar directamente a las DC usando péptidos macrocíclicos biespecíficos que se fijan al antígeno tumoral y un marcador de superficie celular específico de células dendríticas.

Los tumores evaden la vigilancia inmunitaria del huésped mediante una gran variedad de mecanismos. Varios de estos mecanismos se pueden lograr mediante la inactivación de proteínas expresadas por los tumores y que son inmunodepresoras. Estos incluyen, entre otros, TGF-beta (Kehrl, J. et al., J. Exp. Med., 163:1037-1050 (1986)), IL-10 (Howard, M. et al., Immunology Today, 13:198-200 (1992)) y el ligando Fas (Hahne, M. et al., Science, 274:1363-1365 (1996)). Los péptidos macrocíclicos de cada una de estas entidades se pueden usar en combinación con anti-PD-L1 para contrarrestar los efectos del agente inmunodepresor y favorecer las respuestas inmunitarias tumorales por parte del huésped.

Otros péptidos macrocíclicos que se pueden usar para activar la respuesta inmunitaria del huésped se pueden usar en combinación con anti-PD-L1. Estos incluyen moléculas en la superficie de células dendríticas, que activan la función de DC y la presentación de antígenos. Los péptidos macrocíclicos anti-CD40 permiten sustituir eficazmente la actividad de los linfocitos T colaboradores (Ridge, J. et al., Nature, 393:474-478 (1998)) y se pueden usar junto con anticuerpos PD-1 (Ito, N. et al., Immunobiology, 201(5):527-540 (2000)). Los péptidos macrocíclicos de activación que se dirigen a moléculas coestimulantes de linfocitos T, tales como CTLA-4 (por ejemplo, la patente estadounidense N. ° 5.811.097), OX-40 (Weinberg, A. et al., Immunol., 164:2160-2169 (2000)), 4-1BB (Melero, I. et al., Nat. Med., 3:682-685 (1997) e ICOS (Hutloff, A. et al., Nature, 397:262-266 (1999)) también pueden proporcionar mayores niveles de activación de linfocitos T.

El trasplante de médula ósea se usa actualmente para tratar varios tumores de origen hematopoyético. Si bien la enfermedad del injerto contra el huésped es una consecuencia de este tratamiento, se puede obtener un beneficio terapéutico de las respuestas del injerto contra el tumor. El bloqueo de PD-L1 se puede usar para aumentar la eficacia de los linfocitos T específicos de tumor injertados en el donante.

También hay varios protocolos de tratamiento experimental que incluyen la activación y expansión ex vivo de linfocitos T específicos del antígeno y la transferencia adoptiva de estas células a receptores, a fin de estimular los linfocitos T específicos del antígeno contra los tumores (Greenberg, R. et al., Science, 285:546-551 (1999)). Estos métodos también se pueden usar para activar las respuestas de los linfocitos T a los agentes infecciosos, tales como CMV. Se prevé que la activación ex vivo en presencia de péptidos macrocíclicos aumente la frecuencia y actividad de los linfocitos T transferidos de manera adoptiva.

Enfermedades infecciosas

Se usan otros métodos de la descripción para tratar pacientes que estuvieron expuestos a toxinas o patógenos particulares. En consecuencia, otro aspecto de la invención provee un péptido macrocíclico de acuerdo con la presente invención para su uso en tratar una enfermedad infecciosa en un sujeto.

De manera similar a su aplicación a tumores como se analizó anteriormente, el bloqueo de PD-L1 se puede usar solo, o como adyuvante, en combinación con vacunas para estimular la respuesta inmunitaria a patógenos, toxinas y autoantígenos. Los ejemplos de patógenos para los que este enfoque terapéutico puede ser particularmente útil incluyen patógenos para los que no hay en la actualidad una vacuna eficaz o patógenos para los cuales las vacunas convencionales no son totalmente eficaces. Estos incluyen, entre otros, VIH, hepatitis (A, B y C), influenza, herpes, giardia, malaria (Butler, N. S. et al., Nature Immunology 13, 188-195 (2012); Hafalla, J. C. R., et al. PLOS Pathogens; 2 de febrero de 2012)), leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas Aeruginosa. El bloqueo de PD-L1 es particularmente útil contra infecciones establecidas por agentes, tales como el VIH, que presentan antígenos alterados durante el curso de las infecciones. Estos nuevos epítopos se reconocen como extraños al momento de la administración de PD-L1 antihumano y, por lo tanto, provocan una fuerte respuesta de los linfocitos T que no disminuye por las señales negativas a través de PD-L1.

Algunos ejemplos de virus patógenos que causan infecciones que se pueden tratar mediante los métodos de la descripción incluyen VIH, hepatitis (A, B o C), virus del herpes (por ejemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II y CMV, virus de Epstein Barr), adenovirus, virus de la influenza, flavivirus, virus ECHO, rinovirus, virus de Coxsackie, cornovirus, virus respiratorio sinsicial, virus de la parotiditis, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubéola, parvovirus, viruela vacunoide, virus de HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus del molusco contagioso, poliovirus, virus de la rabia, virus de John Cunningham y encefalitis causada por arbovirus.

Algunos ejemplos de bacterias patógenas que causan infecciones que se pueden tratar mediante los métodos de la descripción incluyen clamidia, bacterias rickettsias, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumonococos, meningococos y conococci, Klebsiella, próteo, Serratia, seudomonas, legionela, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, antrax, peste, leptospirosis y bacterias de la enfermedad de Lyme.

Algunos ejemplos de hongos patógenos que causan infecciones que se pueden tratar mediante los métodos de la descripción incluyen Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), género Mucorales (Mucor, Absidia, Rhizophus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.

Algunos ejemplos de parásitos patógenos que causen infecciones que se pueden tratar mediante los métodos de la descripción incluyen Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruz', Leishmania donovani, Toxoplasma gondi y Nippostrongylus brasiliensis.

En todos los métodos antes mencionados, el bloqueo de PD-L1 se puede combinar con otras formas de inmunoterapia, tales como el tratamiento de citocinas (por ejemplo, interferones, agentes que dirigen la actividad de VEGF o receptores de VEGF, GM-CSF, G-CSF, IL-2) o terapia de anticuerpos biespecíficos, que proporciona una presentación mejorada de antígenos tumorales (véase, por ejemplo, Holliger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993); Poljak, Structure, 2:1121-1123 (1994)).

Reacciones autoinmunitarias

Los péptidos macrocíclicos pueden provocar y ampliar las respuestas autoinmunitarias. De hecho, la inducción de respuestas antitumorales mediante el uso de vacunas de péptidos y células tumorales revela que muchas respuestas antitumorales implican reactividad autoinmunitaria (despigmentación observada en melanoma B 16 modificado por anti-CTLA-4+GM-CSF en van Elsas et al. más atrás; despigmentación en ratones vacunados con Trp-2 (Overwijk, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:2982-2987 (1999)); prostatitis autoinmunitaria provocada por vacunas de células tumorales TRAMP (Hurwitz, A., supra (2000)), vacuna de antígenos peptídicos de melanoma y vitiligo observadas en ensayos clínicos en seres humanos (Rosenberg, S. A. et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol., 19(1 ):81-84 (1996)).

Por lo tanto, es posible considerar el uso del bloqueo de anti-PD-L1 junto con varias autoproteínas, a fin de elaborar protocolos de vacunación para generar eficazmente respuestas inmunitarias contra estas autoproteínas para el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer implica una acumulación inadecuada del péptido A.beta. en depósitos amiloides en el cerebro; las respuestas de anticuerpos contra el amiloide permiten aclarar estos depósitos de amiloides (Schenk et al., Nature, 400:173-177 (1999)).

También se pueden usar como dianas otras autoproteínas, tales como IgE, para el tratamiento de la alergia y el asma, y TNF.alfa para la artritis reumatoide. Finalmente, las respuestas del anticuerpo a distintas hormonas se pueden inducir mediante el uso de los macrociclos descritos en la presente. Las respuestas de los anticuerpos neutralizantes a las hormonas reproductoras se pueden usar para la anticoncepción. Las respuestas de los anticuerpos neutralizantes a las hormonas y otros factores solubles necesarios para el crecimiento de tumores particulares también se pueden considerar como posibles dianas de vacunación.

Los métodos análogos a los descritos anteriormente para el uso de macrociclos anti-PD-L1 se pueden usar para la inducción de respuestas autoinmunitarias terapéuticas en el tratamiento de pacientes que tienen una acumulación inadecuada de otros autoantígenos, tales como depósitos de amiloide, incluidos A.beta. en la enfermedad de Alzheimer, citocinas, tales como TNF.alfa., e IgE.

Vacunas

Los péptidos macrocíclicos se pueden usar para estimular respuestas inmunitarias específicas de antígenos mediante la coadministración de un macrociclo anti-PD-1 con un antígeno de interés (por ejemplo, una vacuna). En consecuencia, en otro aspecto, la descripción provee un método para mejorar una respuesta inmunitaria a un antígeno en un sujeto, que comprende administrar al sujeto: (i) el antígeno; y (ii) un macrociclo anti-PD-1, de modo que se mejora la respuesta inmunitaria al antígeno en el sujeto. El antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno tumoral, un antígeno viral, un antígeno bacteriano o un antígeno de un patógeno. Los ejemplos no limitantes de esos antígenos incluyen los que se analizan en las secciones anteriores, tales como los antígenos tumorales (o vacunas contra tumores) analizados anteriormente, o los antígenos de virus, bacterias u otros patógenos descritos anteriormente.

Las vías de administración adecuadas de las composiciones (por ejemplo, péptidos macrocíclicos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas, e inmunoconjugados) de la descripción in vivo e in vitro son conocidas en el estado de la técnica, y las pueden seleccionar las personas del oficio de nivel medio. Por ejemplo, las composiciones pueden administrarse mediante inyección (por ejemplo, intravenosa o subcutánea). Las dosis adecuadas de las moléculas usadas dependerán de la edad y el peso del sujeto y de la concentración y/o la formulación de la composición.

Como se describió anteriormente, los péptidos macrocíclicos de la descripción se pueden coadministrar con uno o más agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunodepresor. El péptido se puede fijar al agente (como un inmunocomplejo) o se puede administrar de manera separada del agente. En el último caso (administración por separado), el péptido se puede administrar antes o después del agente, o de manera simultánea con este, o se puede coadministrar con otros tratamientos conocidos, por ejemplo, un tratamiento contra el cáncer, por ejemplo, radiación. Los agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos, como doxorrubicina (adriamicina), cisplatino, sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucil, decarbazina y ciclofosfamida hidroxiurea que, por sí solos, son eficaces únicamente a niveles que son tóxicos o subtóxicos para un paciente. El cisplatino se administra de manera intravenosa en dosis de 100 mg una vez cada cuatro semanas, y la adriamicina se administra de manera intravenosa en una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La coadministración de los péptidos macrocíclicos de la presente descripción con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes antineoplásicos que funcionan mediante diferentes mecanismos que producen un efecto citotóxico en las células tumorales humanas. La coadministración puede solucionar problemas debidos al desarrollo de resistencia a los fármacos o a un cambio en la antigenicidad de las células tumorales, lo cual las volvería no reactivas con los péptidos.

Dentro del alcance de la presente descripción también se encuentran kits que comprenden las composiciones de la descripción (por ejemplo, péptidos macrocíclicos, moléculas biespecíficas o multiespecíficas, o inmunoconjugados) e instrucciones de uso. El kit también puede contener al menos un reactivo adicional, o uno o más péptidos macrocíclicos adicionales de la descripción (por ejemplo, un anticuerpo humano que tiene una actividad complementaria que se fija a un epítopo en el antígeno PD-L1 diferente del macrociclo). En general, los kits incluyen una etiqueta que indica el uso previsto del contenido del kit. El término "etiqueta" incluye cualquier leyenda o material grabado suministrado sobre el kit o junto con él, o que acompaña de otro modo al kit.

Terapia de combinación

La combinación de los péptidos macrocíclicos de la presente descripción con otro antagonista de PD-L1 y/u otro inmunomodulador es útil para la mejora de una respuesta inmunitaria contra una enfermedad hiperproliferativa. Por ejemplo, tales moléculas se pueden administrar a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para mejorar la inmunidad en diversas situaciones. En consecuencia, se desvela en esta provee un método para modificar una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un péptido macrocíclico de la descripción de manera que se modifique la respuesta inmunitaria en el sujeto. Preferentemente, la respuesta se mejora, se estimula o se regula en forma ascendente. En otra forma de realización, la presente descripción proporciona un método para alterar eventos adversos asociados al tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente terapéutico inmunoestimulador, que comprende administrar un péptido macrocíclico de la presente descripción y una dosis subterapéutica de otro inmunomodulador a un sujeto.

El bloqueo de PD-L1 por parte de los péptidos macrocíclicos puede mejorar la respuesta inmunitaria a las células cancerosas en el paciente. Los tipos de cáncer cuyo crecimiento se puede inhibir usando los péptidos macrocíclicos de la presente descripción incluyen los tipos de cáncer que responden a la inmunoterapia. Los ejemplos representativos de tipos de cáncer para el tratamiento con el tratamiento conjunto de la presente descripción incluyen melanoma (por ejemplo, melanoma maligno metastásico), cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de pulmón. Los ejemplos de otros tipos de cáncer que se pueden tratar usando los métodos de la presente descripción incluyen cáncer óseo, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endócrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de las glándulas suprarrenales, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, leucemias crónicas o agudas, que incluyen leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o de uretra, carcinoma de pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), linfoma del SNC primario, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de linfocitos T, tipos de cáncer provocados por el entorno, que incluyen los provocados por el amianto, y combinaciones de estos tipos de cáncer. La presente descripción también es útil para el tratamiento de tipos de cáncer metastásicos.

En algunas formas de realización, la combinación de agentes terapéuticos que contienen al menos un péptido macrocíclico analizado en la presente se puede administrar de manera simultánea como una sola composición en un portador aceptable desde el punto de vista farmacéutico, o de manera simultánea como composiciones separadas, en donde cada agente se puede administrar de manera secuencial. Por ejemplo, un segundo inmunomodulador y un péptido macrocíclico de la presente descripción se pueden administrar secuencialmente, por ejemplo, en primer lugar, se administra el segundo inmunomodulador y, en segundo lugar, se administra el péptido macrocíclico, o el péptido macrocíclico se administra en primer lugar y el segundo inmunomodulador en segundo lugar. Asimismo, si se administra en forma secuencial más de una dosis del tratamiento conjunto, el orden de la administración secuencial se puede invertir o mantener en el mismo orden en cada punto temporal de administración, las administraciones secuenciales se pueden combinar con administraciones simultáneas, o cualquier combinación de estas. Por ejemplo, la primera administración de un segundo inmunomodulador y el péptido macrocíclico puede ser simultánea; la segunda administración puede ser secuencial, con el segundo inmunomodulador en primer lugar y el péptido macrocíclico en segundo lugar; y la tercera administración puede ser secuencial con el péptido macrocíclico en primer lugar y el segundo inmunomodulador en segundo lugar, etc. Otro esquema de dosificación representativo puede implicar una primera administración que sea secuencial con el péptido macrocíclico en primer lugar y el segundo inmunomodulador en segundo lugar, y las administraciones posteriores pueden ser simultáneas.

De manera opcional, la combinación del péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador se puede combinar a su vez con un agente inmunógeno, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (que incluyen proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células y células transfectadas con genes que codifican citocinas estimulantes del sistema inmunitario (He et al., J. Immunol., 173:4919-4928 (2004)). Los ejemplos de vacunas antitumorales que se pueden usar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citocina GM-CSF (analizada más adelante).

Un péptido macrocíclico PD-L1 y un segundo inmunomodulador combinados se pueden combinar, a su vez, con un protocolo de vacunación. Se trazaron diversas estrategias experimentales para la vacunación contra los tumores (véanse Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000); Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring: 300-302 (2000); Khayat, D., ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000); Foon, K., ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000); véase también Restifo et al., Cancer Vaccines, Capítulo 61, pp. 3023-3043 in DeVita et al., eds., Cancer: Principies and Practice of Oncology, quinta edición (1997)). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna en la que se usan células tumorales autólogas o alogénicas. Estas vacunas celulares demostraron ser más eficaces cuando las células tumorales se transducen para expresar GM-CSF. GM-CSF demostró ser un activador potente de la presentación de antígenos para la vacunación contra los tumores (Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:3539-3543 (1993)).

El estudio de los patrones de expresión génica y de expresión génica a gran escala en diversos tumores produjo la definición de los denominados antígenos específicos de tumores (Rosenberg, Immunity, 10:281-287 (1999)). En varios casos, estos antígenos específicos de tumores son antígenos de diferenciación que se expresan en los tumores y en la célula donde se produjo el tumor, por ejemplo, antígenos melanocitos gp100, antígenos MAGE y Trp-2. Lo que es más importante, se puede demostrar que muchos de estos antígenos son las dianas de linfocitos T específicos del tumor en el huésped. En ciertas formas de realización, un péptido macrocíclico PD-L1 y un segundo inmunomodulador combinados se pueden usar junto con un conjunto de proteínas y/o péptidos recombinantes expresados en un tumor, a fin de generar una respuesta inmunitaria a estas proteínas. En general, el sistema inmunitario considera estas proteínas como autoantígenos y, por lo tanto, son tolerantes a ellos. El antígeno tumoral también puede incluir la proteína telomerasa, que es necesaria para la síntesis de telómeros de cromosomas y que se expresa en más del 85 % de los tipos de cáncer en seres humanos y solo en una cantidad limitada de tejidos somáticos (Kim et al., Science, 266:2011-2013 (1994)). (Estos tejidos somáticos pueden protegerse del ataque inmunitario de varias maneras). El antígeno tumoral también puede ser un "neoantígeno" expresado en células cancerosas debido a las mutaciones somáticas que alteran la secuencia proteica o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (es decir, bcr-abl en el cromosoma Philadelphia), o idiotipo de tumores de linfocitos B.

Otras vacunas antitumorales pueden incluir las proteínas de virus implicados en ciertos tipos de cáncer humano, tales como el virus del papiloma humano (HPV), el virus de la hepatitis (HBV y HCV) y el virus herpes asociado al sarcoma de Kaposi (KHSV). Otra forma de antígeno específico de tumores que se puede usar junto con el bloqueo del péptido macrocíclico PD-L1 son las proteínas de choque térmico (HSP) purificadas aisladas del tejido tumoral en sí mismo. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales, y estas HSP son altamente eficaces para el suministro a las células que presentan antígenos, a fin de provocar inmunidad tumoral (Suot et al., Science, 269:1585-1588 (1995); Tamura et al., Science, 278:117-120 (1997)).

Las células dendríticas (DC) son células que presentan antígenos potentes que se pueden usar para cebar respuestas específicas del antígeno. Las DC se pueden producir ex vivo y se pueden cargar con varios antígenos de proteínas y péptidos, así como extractos de células tumorales (Nestle et al., Nat. Med., 4:328-332 (1998)). Asimismo, las DC se pueden transducir por medios genéticos para que también expresen estos antígenos tumorales. Las DC también se fusionaron directamente a las células tumorales, a fin de lograr la inmunización (Kugler et al., Nat. Med., 6:332-336 (2000)). Como método de vacunación, la inmunización de DC se puede combinar eficazmente con el péptido macrocíclico anti-PD-L1 y un segundo inmunomodulador combinados, a fin de activar respuestas antitumorales más potentes.

Un péptido macrocíclico anti-PD-L1 y un inmunomodulador adicional combinados también se pueden combinar con tratamientos oncológicos estándares. Por ejemplo, una combinación de un péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador se puede combinar eficazmente con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, como se observa en la combinación de un péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador, es posible reducir la dosis de otro reactivo quimioterapéutico administrado con la combinación de la presente descripción (Mokyr et al., Cáncer Res., 58:5301-5304 (1998)). Un ejemplo es la combinación de un péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador a su vez combinados con decarbazina para el tratamiento del melanoma. Otro ejemplo es la combinación de un péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador a su vez combinados con interleucina-2 (IL-2) para el tratamiento del melanoma. Las razones científicas del uso combinado del péptido macrocíclico PD-L1 y otro inmunomodulador con la quimioterapia consisten en que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debería provocar el aumento de los niveles de antígenos tumorales en la vía de presentación de antígenos. Otros tratamientos conjuntos que pueden ocasionar sinergia con un péptido macrocíclico anti-PD-L1 y un inmunomodulador adicional combinados mediante la muerte celular incluyen radiación, cirugía o privación hormonal. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el huésped. Los inhibidores de la angiogenia también se pueden combinar con PD-L1 y un segundo inmunomodulador combinados. La inhibición de la angiogénesis provoca la muerte de las células tumorales, lo cual también puede ser una fuente de antígenos tumorales que se alimentan en las vías de presentación de antígenos del huésped.

También se puede usar una combinación de PD-L1 y otro inmunomodulador en combinación con péptidos macrocíclicos biespecíficos que dirigen las células efectoras que expresan el receptor de Fc.alfa. o Fc. gamma. a las células tumorales (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses N.os 5.922.845 y 5.837.243). Se pueden usar péptidos macrocíclicos biespecíficos para dirigirse a dos antígenos separados. Por ejemplo, se usaron péptidos macrocíclicos biespecíficos del receptor anti-Fc/antígeno antitumoral (por ejemplo, Her-2/neu) para dirigir los macrófagos a los sitios tumorales. Este direccionamiento puede activar de manera más eficaz las repuestas específicas tumorales. El grupo de linfocitos T de estas respuestas se podría aumentar mediante el uso de PD-L1 y un segundo inmunomodulador combinados. De manera alternativa, el antígeno se puede administrar directamente a las DC usando péptidos macrocíclicos biespecíficos que se fijan al antígeno tumoral y un marcador de superficie celular específico de células dendríticas.

En otro ejemplo, se puede usar una combinación de un péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador junto con agentes macrocíclicos antineoplásicos, tales como RITUXAN® (rituximab), HERCEPTIN® (trastuzumab), BEXXAR® (tositumomab), ZEVALⁱN® (ibritumomab), CAMPATH® (alemtuzumab), Lymphocide (eprtuzumab), AVASTIN® (bevacizumab), TARCEVA® (erlotinib) y similares. A modo de ejemplo y sin pretender limitarse a ninguna teoría, el tratamiento con un anticuerpo antineoplásico o un anticuerpo antineoplásico conjugado con una toxina puede provocar la muerte de células cancerosas (por ejemplo, células tumorales) que podrían potenciar una respuesta inmunitaria mediada por la diana del segundo inmunomodulador o PD-L1. En una forma de realización de ejemplo, un tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, un tumor canceroso) puede incluir un anticuerpo antineoplásico en combinación con un péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador, de manera simultánea o secuencial, o cualquier combinación de estas, lo cual puede potenciar una respuesta inmunitaria antitumoral por parte del huésped.

Los tumores evaden la vigilancia inmunitaria del huésped mediante una gran variedad de mecanismos. Varios de estos mecanismos pueden lograrse mediante la inactivación de las proteínas, que son expresadas por los tumores y que son inmunodepresoras. Estas incluyen, entre otros, TGF-.beta. (Kehrl, J. et al., J. Exp. Med., 163:1037-1050 (1986)), IL-10 (Howard, M. et al., Immunology Today, 13:198-200 (1992)) y el ligando Fas (Hahne, M. et al., Science, 274:1363-1365 (1996)). En otro ejemplo, los anticuerpos dirigidos a cada una de estas entidades también se pueden combinar con un péptido macrocíclico y otro inmunomodulador para contrarrestar los efectos de los agentes inmunodepresores y favorecer las respuestas inmunitarias antitumorales por parte del huésped.

Otros agentes que se pueden usar para activar la respuesta inmunitaria del huésped también se pueden usar en combinación con un péptido macrocíclico de la presente descripción. Estos incluyen moléculas en la superficie de células dendríticas, que activan la función de DC y la presentación de antígenos. Los péptidos macrocíclicos anti-CD40 son capaces de sustituir eficazmente la actividad de los linfocitos T colaboradores (Ridge, J. et al., Nature, 393:474-478 (1998)) y se pueden usar junto con los péptidos macrocíclicos de la presente descripción, solos o combinados con una combinación de anti-CTLA-4 (Ito, N. et al., Immunobiology, 201(5):527-540 (2000)). Los péptidos macrocíclicos de activación que se dirigen a las moléculas coestimulantes de linfocitos T, tales como OX-40 (Weinberg, A. et al., Immunol, 164:2160-2169 (2000)), 4-1BB (Melero, I. et al., Nat. Med., 3:682-685 (1997) e ICOS (Hutloff, A. et al., Nature, 397:262-266 (1999)) también pueden proporcionar mayores niveles de activación de los linfocitos T.

El trasplante de médula ósea se usa actualmente para tratar varios tumores de origen hematopoyético. Si bien la enfermedad del injerto contra el huésped es una consecuencia de este tratamiento, se puede obtener un beneficio terapéutico de las respuestas del injerto contra el tumor. Se puede usar un péptido macrocíclico de la presente descripción, ya sea solo o en combinación con otro inmunomodulador, para aumentar la eficacia de los linfocitos T específicos de tumores injertados en el donante.

También hay varios protocolos de tratamiento experimental que incluyen la activación y expansión ex vivo de linfocitos T específicos del antígeno y la transferencia adoptiva de estas células a receptores, a fin de estimular los linfocitos T específicos del antígeno contra los tumores (Greenberg, R. et al., Science, 285:546-551 (1999)). Estos métodos también se pueden usar para activar las respuestas de los linfocitos T a los agentes infecciosos, tales como CMV. Se puede esperar que la activación ex vivo en presencia de un péptido macrocíclico de la presente descripción, ya sea solo o en combinación con otro inmunomodulador, aumente la frecuencia y la actividad de los linfocitos T transferidos de manera adoptiva.

En ciertas formas de realización, la presente descripción proporciona un método para alterar un evento adverso asociado al tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, que comprende administrar a un sujeto un péptido macrocíclico de la presente descripción en combinación con una dosis subterapéutica de otro inmunomodulador. Por ejemplo, los métodos de la presente descripción proveen un método para reducir la incidencia de diarrea o colitis inducida por anticuerpos terapéuticos inmunoestimuladores mediante la administración de un esteroide no absorbible al paciente. Debido a que cualquier paciente que reciba un anticuerpo terapéutico inmunoestimulador se encuentra en riesgo de desarrollar colitis o diarrea inducidas por dicho tratamiento, la totalidad de esta población de pacientes es adecuada para la terapia de acuerdo con los métodos de la presente descripción. Si bien se administraron esteroides para tratar la enfermedad intestinal inflamatoria (IBD) y prevenir exacerbaciones de IBD, no se usaron para prevenir (reducir la incidencia de) IBD en pacientes que no recibieron un diagnóstico de IBD. Los efectos secundarios significativos asociados a los esteroides, incluso los esteroides no absorbibles, desalentaron el uso profiláctico.

En otras formas de realización, un péptido macrocíclico de la presente descripción, ya sea solo o en combinación con otro inmunomodulador, también se puede combinar con el uso de cualquier esteroide no absorbible. Como se usa en la presente, un "esteroide no absorbible" es un glucocorticoide que muestra un metabolismo amplio en la primera pasada, de modo que después del metabolismo en el hígado, la biodisponibilidad del esteroide sea baja, es decir, de menos de alrededor de 20 %. En una forma de realización de la descripción, el esteroide no absorbible es budesónida. La budesónida es un glucocorticoesteroide de acción local, que es metabolizado en forma amplia, principalmente por el hígado, después de la administración oral. ENTOCORT® EC (Astra-Zeneca) es una formulación oral de budesónida dependiente del pH y del tiempo, desarrollada para optimizar la administración del fármaco al íleo y en el colon. ENTOCORT® EC está aprobado en los EE. UU. para el tratamiento de la enfermedad de Crohn de leve a moderada que afecta el íleo y/o el colon ascendente. La dosis oral habitual de ENTOCORT® EC para el tratamiento de la enfermedad de Crohn es de 6 a 9 mg/día. ENTOCORT® EC se libera en los intestinos antes de ser absorbido y retenido en la mucosa intestinal. Una vez que pasa a través del tejido diana de la mucosa intestinal, ENTOCORT® EC es ampliamente metabolizado por el sistema de citocromo P450 en el hígado con metabolitos que tienen una actividad de glucocorticoides insignificante. Por lo tanto, la biodisponibilidad es baja (de alrededor de 10 %). La baja biodisponibilidad de budesónida da como resultado una relación terapéutica mejorada en comparación con otros glucocorticoides que tienen metabolismo de primera pasada menos amplio. La budesónida da como resultado menos cantidad de efectos adversos, incluso una menor inhibición hipotalámica-hipofisaria, que los corticoesteroides de acción sistemática. Sin embargo, la administración crónica de ENTOCORT® EC puede dar como resultado efectos glucocorticoides sistémicos, tales como hipercorticismo e inhibición suprarrenal. Véase Physicians' Desk Reference Supplement, 58.a edición, 608-610 (2004).

Aun en otras formas de realización, una combinación de PD-L1 y otro inmunomodulador junto con un esteroide no absorbible se puede combinar, a su vez, con un salicilato. Los salicilatos incluyen agentes 5-ASA, tales como: sulfasalazine (Az ULFIDINE®, Pharmacia & Upjohn); olsalazine (DIPENTUM®, Pharmacia & UpJohn); balsalazide (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.); y mesalamine (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; r Ow ASA®, Solvay).

Dosis y formulación

Un péptido adecuado de la Fórmula I, o más específicamente un péptido macrocíclico descrito en la presente, se puede administrar a pacientes para tratar la diabetes y otras enfermedades relacionadas como un compuesto solo o mezclado con un portador aceptable en forma de formulaciones farmacéuticas. Las personas del oficio de nivel medio del tratamiento de la diabetes pueden determinar fácilmente la dosis y la vía de administración del compuesto a mamíferos, incluidos los seres humanos, que necesitan dicho tratamiento. La vía de administración puede incluir, por ejemplo, la administración oral, intraoral, rectal, transdérmica, bucal, intranasal, pulmonar, subcutánea, intramuscular, intradérmica, sublingual, intracolónica, intraocular, intravenosa o intestinal. El compuesto se formula de acuerdo con la vía de administración en función de la práctica farmacéutica aceptable (Fingl et al., en The Pharmacological Basis of Therapeutics, capítulo 1, p. 1 (1975); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. a edición, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)).

Las composiciones peptídicas aceptables desde el punto de vista farmacéutico descritas en la presente se pueden administrar en múltiples formas de dosificación, tales como comprimidos, cápsulas (cada una de las cuales incluye formulaciones de liberación retardada o sostenida), píldoras, polvos, gránulos, elíxires, geles in situ, microesferas, complejos cristalinos, liposomas, microemulsiones, tinturas, suspensiones, jarabes, atomizadores en aerosol y emulsiones. Las composiciones descritas en la presente también se pueden administrar en forma oral, intravenosa (bolo o infusión), intraperitoneal, subcutánea, transdérmica o intramuscular, todas las cuales implican formas de dosificación conocidas por las personas del oficio de nivel medio del campo farmacéutico. Las composiciones se pueden administrar solas, pero generalmente se administran con un portador farmacéutico seleccionado en función de la vía de administración elegida y la práctica farmacéutica estándar.

El régimen de dosificación de las composiciones descritas en la presente variará, naturalmente, según ciertos factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del agente particular y su modo y vía de administración; la especie, la edad, el sexo, la salud, la afección médica y el peso del receptor; la naturaleza y el alcance de los síntomas; el tipo de tratamiento simultáneo; la frecuencia del tratamiento; la vía de administración, la función renal y hepática del paciente, y el efecto deseado. Un médico o veterinario puede determinar y recetar la cantidad eficaz del fármaco necesaria para prevenir, contrarrestar o detener el avance de la enfermedad.

A modo orientativo, la dosis oral diaria del ingrediente activo, cuando se usa para los efectos indicados, variará de alrededor de 0,001 a 1000 mg/kg de peso corporal, preferentemente, de alrededor de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal por día y, con máxima preferencia, de alrededor de 0,6 a 20 mg/kg/día. Si la administración es intravenosa, la dosis diaria del ingrediente activo cuando se usa para los efectos indicados variará de 0,001 ng a 100,0 ng por min/kg de peso corporal durante una infusión a velocidad constante. Dicha infusión intravenosa constante se puede administrar preferentemente a una velocidad de 0,01 ng a 50 ng por min/kg de peso corporal y, con máxima preferencia, de 0,01 ng a 10,0 mg por min/kg de peso corporal. Las composiciones descritas en la presente se pueden administrar en una sola dosis diaria, o la dosis diaria total se puede administrar en dosis divididas de dos, tres o cuatros veces por día. Las composiciones descritas en la presente también se pueden administrar mediante una formulación de absorción retardada que permitirá la liberación sostenida del fármaco durante un período de días/semanas/meses, según se desee.

Las composiciones descritas en la presente se pueden administrar de manera intranasal mediante el uso tópico de vehículos intranasales adecuados o mediante vías transdérmicas, usando parches transdérmicos para la piel. Cuando se administra en forma de un sistema de administración transdérmico, la administración de las dosis será, por supuesto, continua en lugar de intermitente durante todo el régimen de dosificación.

En general, las combinaciones se administran en una mezcla con diluyentes, excipientes o portadores farmacéuticos adecuados (que se denominan conjuntamente en la presente "portadores farmacéuticos") seleccionados de manera adecuada con respecto a la forma de administración pretendida, es decir, comprimidos orales, cápsulas, elíxires, atomizadores de aerosol generados con o sin propulsores y jarabes, y de acuerdo con las prácticas farmacéuticas convencionales.

Por ejemplo, para la administración oral en forma de comprimido o cápsula, el componente farmacológico activo se puede combinar con un portador inerte oral, no tóxico, aceptable desde el punto de vista farmacéutico, tal como lactosa, almidón, sacarosa, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, fosfato de dicalcio, sulfato de calcio, manitol y sorbitol; para la administración oral en forma líquida, los componentes farmacológicos orales se pueden combinar con cualquier portador inerte oral, no tóxico, aceptable desde el punto de vista farmacéutico, tal como etanol, glicerol y agua. Además, cuando se desee o sea necesario, también se pueden incorporar en la mezcla aglutinantes, lubricantes, agentes de desintegración y colorantes adecuados. Los aglutinantes adecuados incluyen, entre otros, almidón, gelatina, azúcares naturales, tales como glucosa o beta-lactosa, endulzantes del maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol y ceras. Los lubricantes usados en estas formas de dosificación incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio y cloruro de sodio. Los desintegrantes incluyen, por ejemplo, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita y goma xantana.

Las composiciones descritas en la presente también se pueden administrar en forma de sistemas de administración de micelas o liposomas mezclados, tales como vesículas unilaminares pequeñas, vesículas unilaminares grandes y vesículas multilaminares. Los liposomas se pueden formar de varios fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas. Se pueden agregar mejoradores de la penetración para mejorar la absorción del fármaco.

Debido a que se sabe que los profármacos mejoran múltiples cualidades beneficiosas de los productos farmacéuticos (por ejemplo, solubilidad, biodisponibilidad, fabricación, etc.), los compuestos descritos en la presente se pueden suministrar en forma de profármacos. Por ello, el objetivo descrito en la presente pretende incluir profármacos de los compuestos reivindicados en la presente, métodos para suministrarlos y composiciones que los contienen.

Las composiciones descritas en la presente también se pueden acoplar a polímeros solubles como portadores farmacológicos direccionables. Estos polímeros pueden incluir polivinil-pirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropil- metacrilamida-fenol, polihidroxietilaspartamidafenol u óxido de polietileno-polilisina sustituida con residuos de palmitoílo. Asimismo, las composiciones descritas en la presente se pueden combinar con una clase de polímeros biodegradables útiles para lograr la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico y poliglicólico, caprolactona de poliépsilon, ácido polihidroxibutírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacilatos y copolímeros en bloque reticulados o anfipáticos de hidrogeles.

Las formas de dosificación (composiciones farmacéuticas) adecuadas para la administración pueden contener de alrededor de 0,01 miligramo a alrededor de 500 miligramos de ingrediente activo por unidad de dosificación.

Generalmente, en estas composiciones farmacéuticas, el ingrediente activo está presente en una cantidad de alrededor de 0,5-95 % en peso en función del peso total de la composición.

Las cápsulas de gelatina pueden contener el ingrediente activo y portadores en polvo, tales como lactosa, almidón, derivados de celulosa, estearato de magnesio y ácido esteárico. Se pueden usar diluyentes similares para fabricar comprimidos. Tanto los comprimidos como las cápsulas se pueden fabricar como productos de liberación sostenida para proporcionar una liberación continua del medicamento durante un período de horas. Los comprimidos pueden estar recubiertos con azúcar o con una película para disimular el sabor desagradable y protegerlo de la atmósfera, o pueden estar recubiertos de manera entérica para la desintegración selectiva en el tubo gastrointestinal.

Las formas de dosificación líquidas para la administración oral pueden contener colorantes y saborizantes, a fin de aumentar la aceptación por parte del paciente.

En general, el agua, un aceite adecuado, la solución salina, la dextrosa acuosa (glucosa) y las soluciones de azúcares relacionadas, y los glicoles, tales como propilenglicol o polietilenglicoles son portadores adecuados para soluciones parenterales. La solución para la administración parenteral contiene, preferentemente, una sal hidrosoluble del ingrediente activo, agentes estabilizantes adecuados y, de ser necesario, sustancias amortiguadoras. Los agentes antioxidantes, tales como bisulfito de sodio, sulfito de sodio o ácido ascórbico, ya sean solos o en combinación, son agentes estabilizantes adecuados. También se usan el ácido cítrico y sus sales, y EDTA de sodio. Asimismo, las soluciones parenterales pueden contener conservantes, tales como cloruro de benzalconio, metilparabeno o propilparabeno y clorobutanol.

Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19.a edición, Mack Publishing Company (1995), un texto de referencia estándar en este campo.

Las formas de dosificación farmacéuticas útiles y representativas para la administración de los compuestos descritos en la presente se pueden ilustrar de la siguiente manera:

Cápsulas

Se puede preparar una gran cantidad de unidades de cápsulas llenando cápsulas de gelatina dura de dos piezas estándares con 100 miligramos de ingrediente activo en polvo, 150 miligramos de lactosa, 50 miligramos de celulosa y 6 miligramos de estearato de magnesio.

Cápsulas de gelatina blandas

Una mezcla de ingrediente activo en un aceite que se puede digerir, tal como aceite de soja, aceite de semillas de algodón o aceite de oliva, se puede preparar e inyectar por medio de una bomba de desplazamiento positivo en gelatina para formar cápsulas de gelatina blandas que contienen 100 miligramos del ingrediente activo. Las cápsulas deben lavarse y secarse.

Comprimidos

Los comprimidos se pueden preparar mediante procedimientos convencionales, de modo que la unidad de dosificación sea, por ejemplo, de 100 miligramos de ingrediente activo, 0,2 miligramos de dióxido de silicio coloidal, 5 miligramos de estearato de magnesio, 275 miligramos de celulosa microcristalina, 11 miligramos de almidón y 98,8 miligramos de lactosa. Los recubrimientos adecuados se pueden aplicar para aumentar la palatabilidad o retrasar la absorción.

Inyectable

Una formulación inyectable de una composición peptídica descrita en la presente puede requerir o no el uso de excipientes, tales como los aprobados por entidades reguladoras. Estos excipientes incluyen, por ejemplo, solventes y cosolventes, solubilizantes, emulgentes o espesantes, agentes quelantes, antioxidantes y agentes reductores, conservantes antimicrobianos, amortiguadores y agentes de ajuste del pH, agentes volumétricos, protectores y de ajuste de la tonicidad, y aditivos especiales. Una formulación inyectable tiene que ser estéril, libre de pirógeno y, en el caso de soluciones, libre de material particulado.

Una composición parenteral adecuada para la administración mediante inyección se puede preparar agitando, por ejemplo, 1,5 % en peso de ingrediente activo en un amortiguador aceptable desde el punto de vista farmacéutico que puede contener o no un cosolvente u otro excipiente. La solución debería transformarse en isotónica con cloruro de sodio y debería esterilizarse.

Suspensión

Se puede preparar una suspensión acuosa para administración oral y/o parenteral, de modo que, por ejemplo, cada 5 ml contenga 100 mg de ingrediente activo finamente dividido, 20 mg de carboximetilcelulosa de sodio, 5 mg de benzoato de sodio, 1,0 g de solución de sorbitol, U. S. P. y 0,025 ml de vanilina u otro saborizante agradable al paladar.

Micropartículas biodegradables

Una composición parenteral de liberación sostenida adecuada para la administración mediante inyección se puede preparar, por ejemplo, disolviendo un polímero biodegradable adecuado en un solvente, agregando a la solución polimérica el agente activo que se desea incorporar y retirando el solvente de la matriz, para así formar la matriz del polímero con el agente activo distribuido a lo largo de la matriz.

Síntesis de péptidos

La descripción de la presente invención se debe interpretar de acuerdo con las leyes y los principios de la fijación química. Se debe entender que los compuestos abarcados por la presente descripción son aquellos adecuadamente estables para ser usados como agente farmacéutico. La persona del oficio de nivel medio sabrá qué compuestos serían estables o no en función de los principios generales de la fijación química y la estabilidad.

La síntesis química de un péptido macrocíclico de la presente descripción se puede llevar a cabo usando varios métodos reconocidos en el estado de la técnica, que incluyen la síntesis gradual en fase sólida, la semisíntesis mediante la religadura de fragmentos peptídicos asistida en forma conformacional, la ligadura enzimática de segmentos peptídicos clonados o sintéticos, y la ligadura química. Un método preferido para sintetizar los péptidos macrocíclicos y sus análogos descritos en la presente es la síntesis química en la que se emplean varias técnicas en fase sólida, tales como las descritas en Chan, W. C. et al., eds., Fmoc Solid Phase Synthesis, Oxford University Press, Oxford (2000); Barany, G. et al., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 2: "Special Methods in Peptide Synthesis, Part A", pp. 3-284, Gross, E. et al., eds., Academic Press, Nueva York (1980); y en Stewart, J. M. et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, 2.a edición, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984). La estrategia preferida se basa en el grupo Fmoc (9-fluorenilmetilmetil-oxicarbonilo) para la protección temporal del grupo a-amino, en combinación con el grupo ter-butilo para la protección temporal de las cadenas laterales de aminoácidos (véase, por ejemplo, Atherton, E. et al., "The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group", en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 9: "Special Methods in Peptide Synthesis, Part C", pp. 1-38, Undenfriend, S. et al., eds., Academic Press, San Diego (1987).

Los péptidos se pueden sintetizar en etapas en un soporte polimérico insoluble (también denominado “resina”) desde el terminal C del péptido. Una síntesis comienza al agregar el aminoácido del terminal C del péptido a la resina mediante la formación de una ligadura amida o éster. Esto permite la liberación final del péptido resultante como amida del terminal C o ácido carboxílico, respectivamente.

El aminoácido del terminal C y todos los otros aminoácidos que se usan en la síntesis deben tener sus grupos a-amino y funcionalidades de cadena lateral (de estar presentes) protegidas de manera diferencial, de manera que el grupo protector a-amino se puede retirar de manera selectiva durante la síntesis. El acoplamiento de un aminoácido se realiza mediante la activación de su grupo carboxilo como un éster activo y una reacción de éste con un grupo a-amino no bloqueado del aminoácido del terminal N unido a la resina. La secuencia de desprotección y acoplamiento del grupo a-amino se repite hasta que se ensambla la secuencia peptídica completa. Luego se libera el péptido de la resina con la desprotección concomitante de las funcionalidades de la cadena lateral, usualmente en presencia de secuestrantes adecuados para limitar las cadenas laterales. El péptido resultante se purifica finalmente mediante HPLC de fase inversa.

En la síntesis de las resinas de peptidilo necesarias como precursores de los péptidos finales se emplean resinas poliméricas de poliestireno reticulado disponibles en el comercio (Novabiochem, San Diego, CA; Applied Biosystems, Foster City, CA). Los soportes sólidos preferidos son los siguientes: Resina 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)-fenoxiacetil-p-metil bencidrilamina (resina MBHA de amida Rink); 9-Fmoc-amino-xanten-3-iloxi-resina Merrifield (resina de amida Sieber); 4-(9-Fmoc)aminometil-3,5-dimetoxifenoxi)valeril-aminometil-resina Merrifield (resina PAL), para carboxamidas del terminal C. El acoplamiento del primer aminoácido con los aminoácidos posteriores se puede lograr mediante el uso de ésteres activos HOBt, 6-Cl-HOBt o HOAt producidos de DIC/HOBt, HBTU/HOBt, BOP, PyBOP, o de DIC/6-Cl-HOBt, HCTU, DIC/HOAt o HATU, respectivamente. Los soportes sólidos preferidos son los siguientes: resina de cloruro de 2-clorotritilo y 9-Fmoc-amino-xanten-3-iloxi-resina Merrifield (resina de amida Sieber) para los fragmentos peptídicos protegidos. La carga del primer aminoácido en la resina de cloruro de 2-clorotritilo se logra mejor haciendo reaccionar el aminoácido protegido por Fmoc con la resina en diclorometano y DIEA. Si fuese necesario, se puede agregar una pequeña cantidad de DMF para facilitar la disolución del aminoácido.

Las síntesis de los análogos peptídicos descritos en la presente se pueden realizar usando un sintetizador peptídico de un solo canal o de múltiples canales, tal como un sintetizador de microondas CEM Liberty, o un sintetizador Prelude (6 canales), Symphony (12 canales) o Symphony-X (12 o 24 canales) de Protein Technologies, Inc.

Los precursores de la resina de peptidilo para sus péptidos respectivos se pueden escindir y desproteger usando cualquier procedimiento estándar (véase, por ejemplo, King, D. S. et al., Int. J. Peptide Protein Res., 36:255-266 (1990)). Un método deseado es el uso de TFA en presencia de agua y TIS como secuestrantes. En general, la resina de peptidilo se agita en TFA/agua/TIS (94:3:3, v:v:v; 1 ml/100 mg de resina de peptidilo) durante 2-6 h a temperatura ambiente. Luego, la resina gastada se filtra, y la solución de TFA se concentra o se seca a presión reducida. El péptido crudo resultante se precipita y se lava con Et²O o se vuelve a disolver directamente en ^d M^s O o ácido acético acuoso al 50 % para la purificación mediante HPLC preparativa.

Se pueden obtener péptidos con la pureza deseada mediante purificación con HPLC preparativa, por ejemplo, en un cromatógrafo de líquidos Waters modelo 4000 o Shimadzu modelo LC-8A. La solución de péptidos crudos se inyecta en una columna YMC S5 ODS (20 x 100 mm) y se eluyó con un gradiente lineal de MeCN en agua, ambos amortiguados con 0,1 % de TFA, con una velocidad de flujo de 14-20 ml/min con monitoreo de efluente por absorbancia de UV a 220 nm. Las estructuras de los péptidos purificados se pueden confirmar mediante análisis MS de electrospray.

Ejemplos

Las abreviaturas que se usan en la presente solicitud, que incluyen, en particular, los siguientes esquemas y ejemplos ilustrativos, son conocidas por las personas del oficio de nivel medio. Algunas de las abreviaturas que se usan son las siguientes: min para minutos; h para horas; RT o rt para tiempo de retención; sat. para saturado; TFA para ácido trifluoroacético; DMF para N,N-dimetilformamida; DCM para diclorometano; Fmoc para 9-fluorenilmetiloxicarbonilo; HATU para (hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido); DIEA o DIPEA para diisopropiletilamina; NMP para N-metilpirrolidona; EDC para 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida; DMSO para dimetilsulfóxido; MeOH para metanol; EtOAc para acetato de etilo; Et3N para trietilamina; MeCN o ACN para acetonitrilo; DIAD para azodicarboxilato de dietilo; y TMSI para yoduro de trimetilsililo.

Datos analíticos:

Espectrometría de masa: “ESI-MS(+)” significa ionización por electrospray-espectrometría de masa realizadas en modo de ion positivo; “ESI-MS(-)” significa ionización por electrospray-espectrometría de masa realizadas en modo de ion negativo; “ESI-HRMS(+)” significa ionización por electrospray-espectrometría de masa de alto rendimiento realizadas en modo de ion positivo; “ESI-HRMS(-)” significa ionización por electrospray-espectrometría de masa de alto rendimiento realizadas en modo de ion negativo. Las masas detectadas se informan de acuerdo con la designación de unidad “m/z". En general, los compuestos con masas exactas mayores de 1000 se detectaron como iones de doble carga o de triple carga.

Condición A del análisis de LCMS:

Columna: BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm; fase móvil A: agua con 0,05 % de TFA; fase móvil B: acetonitrilo con 0,05 % de TFA; temperatura: 50 °C; gradiente: 2% de B a 98% de B durante 2 minutos, luego una retención de 0,5 minutos a 98% de B; flujo: 0,8 ml/min; detección: UV a 220 nm.

Condición B del análisis de LCMS:

Columna: BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con 0,05% de TFA; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,05% de TFA; temperatura: 50 °C; gradiente: 0-100% de B durante 3 minutos, luego un mantenimiento de 0,75 minutos a 100 % de B; flujo: 1,11 ml/min.

Condición C del análisis de LCMS:

Columna: BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm; fase móvil A: agua con 0,2% de ácido fórmico y 0,01% de TFA; fase móvil B: acetonitrilo con 0,2% de ácido fórmico y 0,01% de TFA; temperatura: 50 °C; gradiente: 2% de B a 80% de B durante 2 minutos, de 80% de B a 98% B durante 0,1 minuto, luego una retención de 0,5 minutos a 98% de B; flujo: 0,8 ml/min; detección: UV a 220 nm.

Condición D del análisis de LCMS:

Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; temperatura: 50 °C; gradiente: 0-100% de B durante 3 minutos, luego un mantenimiento de 0,75 minutos a 100 % de B; flujo: 1,11 ml/min; detección: UV a 220 nm.

Condición E del análisis de LCMS:

Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; temperatura: 50 °C; gradiente: 0-100% de B durante 3 minutos, luego un mantenimiento de 0,75 minutos a 100 % de B; flujo: 1,11 ml/min; detección: UV a 220 nm.

Condición F del análisis de LCMS:

Columna: Waters Xbridge C18, 2,1 x 50 mm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; temperatura: 35 °C; gradiente: 0-100% de B durante 4 minutos, luego un mantenimiento de 1 minutos a 100 % de B; flujo: 4 ml/min; detección: UV a 220 nm. Condición G del análisis de LCMS:

Espectrómetro de masa Finnigan LTQ; columna: Phenomenex Jupiter C4, 1 x 50 mm; fase móvil A: 1% de ácido fórmico en agua; fase móvil B: 0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo; temperatura: 30 °C; gradiente: 1% de B, una retención de 1 min; 1-95% de B durante 3 minutos, luego una retención de 3 minutos a 95% de B; flujo: 0,15 ml/min. Condición H del análisis de LCMS:

Columna: Waters BEH C18, 2,0 x 50 mm, partículas de 1,7 |jm; fase móvil A: 5:95

acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; temperatura:

50 °C; gradiente: 0-100% de B durante 3 minutos, luego un mantenimiento de 0,5 minutos a 100 % de B; flujo: 1,0 ml/min; detección: UV a 220 nm.

Condición I del análisis de LCMS:

Columna: Waters BEH C18, 2,0 x 50 mm, partículas de 1,7 jm ; fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con 10 mM de acetato de

de amonio; fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; temperatura: 50 °C; gradiente: 0­ 100 % de B durante 3 minutos,

luego 0,5 minutos de retención a 100 % de B; flujo: 0,5 ml/min; detección: UV a 220 nm.

Condición A del análisis de HPLC:

Columna: YMC Pack ODS-AQ 3 um 150 x 4,6 mm; fase móvil A: agua con 0,1 % de TFA; fase móvil B: acetonitrilo con 0,1% de TFA; temperatura: 60 °C; gradiente: de 35% de B a 80% de B durante 25 min; flujo: 1 ml/min; detección: UV a 217 nm.

Condición B del análisis de HPLC:

Columna: YMC Pack ODS-AQ 3 um 150 x 4,6 mm; fase móvil A: agua con 0,1 % de TFA; fase móvil B: acetonitrilo con 0,1% de TFA; temperatura: 60 °C; gradiente: de 25% de B a 75% de B durante 25 min; flujo: 1 ml/min; detección: UV a 217 nm.

Condición C del análisis de HPLC:

Columna: YMC Pack ODS-AQ 3 um 150 x 4,6 mm; fase móvil A: agua con 0,1 % de TFA; fase móvil B: acetonitrilo con 0,1% de TFA; temperatura: 60 °C; gradiente: de 20% de B a 70% de B durante 25 min; flujo: 1 ml/min; detección: UV a 217 nm.

Condición D del análisis de HPLC:

Columna: YMC Pack ODS-AQ 3 um 150 x 4,6 mm; fase móvil A: agua con 0,1 % de TFA; fase móvil B: acetonitrilo con 0,1% de TFA; temperatura: 60 °C; gradiente: de 15% de B a 65% de B durante 25 min; flujo: 1 ml/min; detección: UV a 217 nm.

Condición E del análisis de HPLC:

Columna: YMC Pack ODS-AQ 3 um 150 x 4,6 mm; fase móvil A: agua con 0,1 % de TFA; fase móvil B: acetonitrilo con 0,1% de TFA; temperatura: 60 °C; gradiente: de 25% de B a 60% de B durante 20 min; flujo: 1,25 ml/min; detección: UV a 217 nm.

Condición F del análisis de HPLC:

Columna: YMC Pack ODS-AQ 3 um 150 x 4,6 mm; fase móvil A: agua con 0,1 % de TFA; fase móvil B: acetonitrilo con 0,1% de TFA; temperatura: 60 °C; gradiente: de 25% de B a 65% de B durante 20 min; flujo: 1,25 ml/min; detección: UV a 217 nm.

Condición G del análisis de HPLC:

Columna: Sunfire C18 3,5 um, 3,0 x 150 mm; fase móvil A: 5:95 de acetonitr¡lo:agua con 0,05% de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,05% de ácido trifluoroacético; temperatura: 50 °C; gradiente: 10-100% de B durante 12 minutos, luego un mantenimiento de 3 minutos a 100 % de B; flujo: 1 ml/min; detección: UV a 220 nm.

Condición H del análisis de HPLC:

Columna: Xbridge Phenyl 3,5 x 150 um; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,05% de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,05% de ácido trifluoroacético; temperatura: 50 °C; gradiente: 10-100% de B durante 12 minutos, luego un mantenimiento de 3 minutos a 100 % de B; flujo: 1 ml/min; detección: UV a 220 nm.

Condición I del análisis de HPLC:

Columna: Phenomenex Luna 5 u C18(2) 150 x 4,6 mm; fase móvil A: agua con 0,1% de ácido trifluoroacético; fase móvil B: acetonitrilo con 0,1% de ácido trifluoroacético; gradiente: 5-100% de B durante 20 min, luego una retención de 5 minutos a 100% de B; flujo 1 ml/min, detección: UV a 220.

Condición J del análisis de HPLC:

Columna: Phenomenex Luna 10 u C18(2) 150 x 4,6 mm; fase móvil A: agua con 0,1% de ácido trifluoroacético; fase móvil B: acetonitrilo con 0,1% de ácido trifluoroacético; gradiente: 5-100% de B durante 20 min, luego una retención de 5 minutos a 100% de B; flujo 1 ml/min, detección: UV a 220.

Procedimientos generales:

Método A de Prelude:

Todas las manipulaciones se realizaron mediante automatización en un sintetizador de péptidos Prelude (Protein Technologies). A menos que se indique lo contrario, todos los procedimientos se realizaron en un tubo de polipropileno de 10 o 45 ml equipado con una frita en la parte inferior. El tubo se conecta con el sintetizador de péptidos Prelude a través de la parte inferior y superior del tubo. Se pueden agregar DMF y DCM a través de la parte superior del tubo, lo que produce el lavado parejo de los laterales del tubo. Los reactivos restantes se agregan a través de la parte inferior del tubo y se hacen pasar a través de la frita para entrar en contacto con la resina. Todas las soluciones se retiran a través de la parte inferior del tubo. La “agitación periódica” describe un impulso breve de gas de N² a través de la frita de la parte inferior; el impulso dura aproximadamente 5 segundos y se produce cada 30 segundos. En general, no se usaron soluciones de aminoácidos de más de tres semanas desde de la preparación. DMF = dimetilformamida; DIC = N,N'-diisopropilcarbodiimida; HOAt = 1-hidroxi 7-azabenzotriazol; Sieber = Fmoc-amino-xanten-3-iloxi, en donde “3-iloxi” describe la posición y el tipo de conectividad con la resina de poliestireno. La resina usada es polímero Merrifield (poliestireno) con un ligador Sieber (protegido por Fmoc en el nitrógeno); malla de 100-200, 1% de DVB, 0,71 mmol/g de carga. Los aminoácidos comunes usados se enumeran a continuación con grupos protectores de cadenas laterales que se indican entre paréntesis. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

Los procedimientos del “Método A de Prelude” describen un experimento realizado a una escala 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina. Esta escala corresponde aproximadamente a 140 mg de la resina Sieber-Merrifield descrita anteriormente. Todos los procedimientos se pueden realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Antes del acoplamiento de los aminoácidos, todas las secuencias de síntesis de péptidos comenzaron con un procedimiento de expansión de resina, descrito a continuación como “procedimiento de expansión de resina”. En el acoplamiento de los aminoácidos al terminal N de la amina primaria, se usó el “procedimiento de acoplamiento simple” descrito a continuación. En el acoplamiento de los aminoácidos Fmoc-N-metilo y el acoplamiento a un terminal N de la amina secundaria, se usó el “procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria” descrito a continuación. El acoplamiento del grupo cloroacetilo al terminal N del péptido se describe mediante el “Procedimiento de acoplamiento de cloruro de cloroacetilo” o “Procedimiento de acoplamiento de ácido cloroacético” que se detallan a continuación.

Procedimiento de expansión de resina:

A un recipiente de reacción de polipropileno en fase sólida de 40 ml, se agregó resina Merrifield:Sieber (140 mg, 0,100 mmol). La resina se lavó tres veces de la siguiente manera: al recipiente de reacción, se agregaron DMF (5,0 ml) y DCM (5,0 ml), después de lo cual la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N2 de la parte inferior del recipiente de reacción durante 10 minutos antes de que el solvente drenara.

Procedimiento de acoplamiento simple:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 mi). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 60 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó una solución del aminoácido y HOAt (0,2 M en DMF, 5,0 ml, 10 eq.), luego DIC (0,2 M en DMF, 5,0 ml, 10 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 60 min, luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 60 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó una solución del aminoácido y HOAt (0,2 M en DMF, 5,0 ml, 5 eq.), luego DIC (0,2 M en DMF, 5,0 ml, 5 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 300 min, luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento de cloruro de cloroacetilo:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregaron 3,0 ml de una solución de DIPEA (4,0 mmol, 0,699 ml, 40 eq.) y cloruro de cloroacetilo (2,0 mmol, 0,160 ml, 20 eq.) en DMF. La mezcla se agitó periódicamente durante 12 a 18 horas, y luego la solución drenó. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DCM (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara.

Método B de Prelude:

Todas las manipulaciones se realizaron mediante automatización en un sintetizador de péptidos Prelude (Protein Technologies). Todos los procedimientos se realizaron en un tubo de polipropileno de 10 o 45 ml equipado con una frita en la parte inferior. Se pueden agregar DMF y DCM a través de la parte superior del tubo, lo que produce el lavado parejo de los laterales del tubo. Los reactivos restantes se agregan a través de la parte inferior del tubo y se hacen pasar a través de la frita para entrar en contacto con la resina. Todas las soluciones se retiran a través de la parte inferior del tubo. La “agitación periódica” describe un impulso breve de gas de N² a través de la frita de la parte inferior; el impulso dura aproximadamente 5 segundos y se produce cada 30 segundos. En general, no se usaron soluciones de aminoácidos de más de tres semanas desde de la preparación. DMF = dimetilformamida; HCTU = 2-(6-cloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; DIPEA = diisopropiletilamina; Sieber = Fmoc-amino-xanten-3-iloxi, en donde “3-iloxi” describe la posición y el tipo de conectividad con la resina de poliestireno. La resina usada es polímero Merrifield (poliestireno) con un ligador Sieber (protegido por Fmoc en el nitrógeno); malla de 100-200, 1% de DVB, 0,71 mmol/g de carga. Los aminoácidos comunes usados se enumeran a continuación con grupos protectores de cadenas laterales que se indican entre paréntesis.

Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

Los procedimientos del “Método B de Prelude” describen un experimento realizado a una escala 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina. Esta escala corresponde aproximadamente a 140 mg de la resina Sieber-Merrifield descrita anteriormente. Todos los procedimientos se pueden realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Antes del acoplamiento de los aminoácidos, todas las secuencias de síntesis de péptidos comenzaron con un procedimiento de expansión de resina, descrito a continuación como “procedimiento de expansión de resina”. En el acoplamiento de los aminoácidos al terminal N de la amina primaria, se usó el “procedimiento de acoplamiento simple” descrito a continuación. En el acoplamiento de los aminoácidos al terminal N de la amina secundaria, se usó el “Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria” descrito a continuación. El acoplamiento del grupo cloroacetilo al terminal N del péptido se describe mediante el “Procedimiento de acoplamiento de cloruro de cloroacetilo” o “Procedimiento de acoplamiento de ácido cloroacético” que se detallan a continuación.

Procedimiento de expansión de resina:

A un recipiente de reacción de polipropileno en fase sólida de 40 ml, se agregó resina Merrifield:Sieber (140 mg, 0,100 mmol). La resina se lavó (expandió) tres veces de la siguiente manera: al recipiente de reacción, se agregaron DMF (5,0 ml) y DCM (5,0 ml), después de lo cual la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N2 de la parte inferior del recipiente de reacción durante 10 minutos antes de que el solvente drenara a través de la frita.

Procedimiento de acoplamiento simple:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 60 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 5,0 ml, 10 eq.), luego HCTU (0,2 M en DMF, 5,0 ml, 10 eq.) y finalmente DIPEA (0,8 M en DMF, 2,5 ml, 20 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 30 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento doble:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 60 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 5,0 ml, 10 eq.), luego HCTU (0,2 M en DMF, 5,0 ml, 10 eq.) y finalmente DIPEA (0,8 M en DMF, 2,5 ml, 20 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente 3 veces con DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 60 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 5,0 ml, 10 eq.), luego HCTU (0,2 M en DMF, 5,0 ml, 10 eq.) y finalmente DIPEA (0,8 M en DMF, 2,5 ml, 20 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 mi). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 10 eq.), luego HCTU (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 10 eq.) y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 1,5 ml, 12 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 12 h, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento A de acoplamiento de cloruro de cloroacetilo:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregaron 3,0 ml de una solución de DIPEA (4,0 mmol, 0,699 ml, 40 eq.) y cloruro de cloroacetilo (2,0 mmol, 0,160 ml, 20 eq.) en DMF. La mezcla se agitó periódicamente durante 12 a 18 h, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó CH²Cl² (2,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita.

Procedimiento B de acoplamiento de ácido cloroacético:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregaron DMF (2,0 ml), ácido cloroacético (1,2 mmol, 113 mg, 12 eq.) y N,N'-diisopropilcarbodiimida (1,2 mmol, 0,187 ml, 12 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 12 a 18 h, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó CH²Cl² (2,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita.

Método C de Prelude:

Todas las manipulaciones se realizaron mediante automatización en un sintetizador de péptidos Prelude (Protein Technologies). A menos que se indique lo contrario, todos los procedimientos se realizaron en un tubo de polipropileno de 10 o 45 ml equipado con una frita en la parte inferior. El tubo se conecta con el sintetizador de péptidos Prelude a través de la parte inferior y superior del tubo. Se pueden agregar DMF y DCM a través de la parte superior del tubo, lo que produce el lavado parejo de los laterales del tubo. Los reactivos restantes se agregan a través de la parte inferior del tubo y se hacen pasar a través de la frita para entrar en contacto con la resina. Todas las soluciones se retiran a través de la parte inferior del tubo. La “agitación periódica” describe un impulso breve de gas de N² a través de la frita de la parte inferior; el impulso dura aproximadamente 5 segundos y se produce cada 30 segundos. En general, no se usaron soluciones de aminoácidos de más de tres semanas desde de la preparación. Se usó solución HATU dentro de los 5 días de preparación. DMF = dimetilformamida; HCTU = 2-(6-cloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; HATU = hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido; DIPEA = diisopropiletilamina; Sieber = Fmoc-amino-xanten-3-iloxi, en donde “3-iloxi” describe la posición y el tipo de conectividad con la resina de poliestireno. La resina usada es polímero Merrifield (poliestireno) con un ligador Sieber (protegido por Fmoc en el nitrógeno); malla de 100-200, 1% de DVB, 0,71 mmol/g de carga. Los aminoácidos comunes usados se enumeran a continuación con grupos protectores de cadenas laterales que se indican entre paréntesis.

Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

Los procedimientos del “Método C de Prelude” describen un experimento realizado a una escala 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina. Esta escala corresponde aproximadamente a 140 mg de la resina Sieber-Merrifield descrita anteriormente. Todos los procedimientos se pueden realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Antes del acoplamiento de los aminoácidos, todas las secuencias de síntesis de péptidos comenzaron con un procedimiento de expansión de resina, descrito a continuación como “procedimiento de expansión de resina”. En el acoplamiento de los aminoácidos al terminal N de la amina primaria, se usó el “procedimiento de acoplamiento simple” descrito a continuación. En el acoplamiento de los aminoácidos al terminal N de la amina secundaria, se usó el “Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria” descrito a continuación. En el lavado final de la resina, se usó el “procedimiento de lavado final” descrito a continuación.

Procedimiento de expansión de resina:

A un recipiente de reacción de polipropileno en fase sólida de 40 ml, se agregó resina Merrifield:Sieber (140 mg, 0,100 mmol). La resina se lavó (expandió) tres veces de la siguiente manera: al recipiente de reacción, se agregaron DMF (5,0 ml) y DCM (5,0 ml), después de lo cual la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N² de la parte inferior del recipiente de reacción durante 10 minutos antes de que el solvente drenara a través de la frita.

Procedimiento de acoplamiento simple:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 60 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 5,0 ml, 10 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 5,0 ml, 10 eq.) y finalmente DIPEA (0,8 M en DMF, 2,5 ml, 20 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 60 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq.) y finalmente DIPEA (0,8 M en DMF, 1,5 ml, 12 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 300 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó dos veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq.) y finalmente DIPEA (0,8 M en DMF, 1,5 ml, 12 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 300 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó dos veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 mi). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 0,5 a 2,5 ml, 1 a 5 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 0,5 a 2,5 ml, 1 a 5 eq.) y finalmente DIPEA (0,8 M en DMF, 0,5 a 1,5 ml, 4 a 12 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 60 minutos a 600 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó dos veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de lavado final:

La resina se lavó sucesivamente dos veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DCM (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento de ácido cloroacético:

Nota: etapa manual. Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregaron DMF (2,0 ml), ácido cloroacético (1,2 mmol, 113 mg, 12 eq.) y N,N'-diisopropilcarbodiimida (1,2 mmol, 0,187 ml, 12 eq.). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 12 a 18 horas, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó CH²Cl² (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita.

Método D de Prelude:

Todas las manipulaciones se realizaron mediante automatización en un sintetizador de péptidos Prelude (Protein Technologies). A menos que se indique lo contrario, todos los procedimientos se realizaron en un tubo de polipropileno de 10 o 45 ml equipado con una frita en la parte inferior. El tubo se conecta con el sintetizador de péptidos Prelude a través de la parte inferior y superior del tubo. Se pueden agregar DMF y DCM a través de la parte superior del tubo, lo que produce el lavado parejo de los laterales del tubo. Los reactivos restantes se agregan a través de la parte inferior del tubo y se hacen pasar a través de la frita para entrar en contacto con la resina. Todas las soluciones se retiran a través de la parte inferior del tubo. La “agitación periódica” describe un impulso breve de gas de N² a través de la frita de la parte inferior; el impulso dura aproximadamente 5 segundos y se produce cada 30 segundos. En general, no se usaron soluciones de aminoácidos de más de tres semanas desde de la preparación. Se usó solución HATU dentro de los 5 días de preparación. DMF = dimetilformamida; HCTU = 2-(6-cloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; HATU = hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido; DIPEA = diisopropiletilamina; Sieber = Fmoc-amino-xanten-3-iloxi, en donde “3-iloxi” describe la posición y el tipo de conectividad con la resina de poliestireno. La resina usada es polímero Merrifield (poliestireno) con un ligador Sieber (protegido por Fmoc en el nitrógeno); malla de 100-200, 1% de DVB, 0,71 mmol/g de carga. Los aminoácidos comunes usados se enumeran a continuación con grupos protectores de cadenas laterales que se indican entre paréntesis.

Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

Los procedimientos del “Método D de Prelude” describen un experimento realizado a una escala 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina. Esta escala corresponde aproximadamente a 140 mg de la resina Sieber-Merrifield descrita anteriormente. Todos los procedimientos se pueden realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Antes del acoplamiento de los aminoácidos, todas las secuencias de síntesis de péptidos comenzaron con un procedimiento de expansión de resina, descrito a continuación como “procedimiento de expansión de resina”. En el acoplamiento de los aminoácidos al terminal N de la amina primaria, se usó el “procedimiento de acoplamiento simple” descrito a continuación. En el acoplamiento de los aminoácidos al terminal N de la amina secundaria, se usó el “Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria” descrito a continuación. En el lavado final de la resina, se usó el “procedimiento de lavado final” descrito a continuación.

Procedimiento de expansión de resina:

A un recipiente de reacción de polipropileno en fase sólida de 40 ml, se agregó resina Merrifield:Sieber (140 mg, 0,100 mmol). La resina se lavó (expandió) tres veces de la siguiente manera: al recipiente de reacción, se agregaron DMF (5,0 ml) y DCM (5,0 ml), después de lo cual la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N2 de la parte inferior del recipiente de reacción durante 10 minutos antes de que el solvente drenara a través de la frita.

Procedimiento de acoplamiento simple:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 60 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 2,5 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 2,5 eq.) y finalmente DIPEA (0,8 M en DMF, 0,75 ml, 5 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 30 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 2,5 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 2,5 eq.) y finalmente DIPEA (0,8 M en DMF, 0,75 ml, 5 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 30 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó dos veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita.

Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 2,5 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 2,5 eq.) y finalmente DIPEA (0,8 M en DMF, 0,75 ml, 5 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 30 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó dos veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó dos veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita.

La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de lavado final;

La resina se lavó sucesivamente dos veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DCM (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento de ácido cloroacético:

Nota: etapa manual. Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregaron DMF (2,0 ml), ácido cloroacético (1,2 mmol, 113 mg, 12 eq.) y N,N'-diisopropilcarbodiimida (1,2 mmol, 0,187 ml, 12 eq.). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 12 a 18 horas, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó CH²Cl² (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita.

Método A de CEM;

Todas las manipulaciones se realizaron mediante automatización en un sintetizador de péptidos para microondas CEM Liberty (CEM Corporation). A menos que se indique lo contrario, todos los procedimientos se realizaron en un tubo de polipropileno de 30 o 125 ml equipado con una frita en la parte inferior a una unidad de microondas CEM Discovery. El tubo se conecta con un sintetizador CEM Liberty a través de la parte inferior y superior del tubo. Se pueden agregar DMF y DCM a través de la parte superior e inferior del tubo, lo que produce el lavado parejo de los laterales del tubo. Todas las soluciones se retiran a través de la parte inferior del tubo, excepto durante la transferencia de la resina desde la parte superior. El “burbujeo periódico” describe un breve burbujeo de gas de N² a través de la frita de la parte inferior. En general, no se usaron soluciones de aminoácidos de más de tres semanas desde de la preparación. Se usó solución HATU dentro de los 5 días de preparación. DMF = dimetilformamida; HCTU = 2-(6-cloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; HATU = hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido; DIPEA = diisopropiletilamina; Sieber = Fmoc-amino-xanten-3-iloxi, en donde “3-iloxi” describe la posición y el tipo de conectividad con la resina de poliestireno. La resina usada es polímero Merrifield (poliestireno) con un ligador Sieber (protegido por Fmoc en el nitrógeno); malla de 100-200, 1% de DVB, 0,71 mmol/g de carga. Otras resinas comunes tales como Rink, clorotritilo u otros ligadores sensibles a ácidos se pueden usar en la síntesis; se usa la resina de amida Seiber a menos que se indique lo contrario en los ejemplos específicos. Los aminoácidos comunes usados se enumeran a continuación con grupos protectores de cadenas laterales que se indican entre paréntesis.

Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Orn(Boc)-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

Los procedimientos del “Método A de CEM” describen un experimento realizado a una escala 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina. Esta escala corresponde aproximadamente a 140 mg de la resina Sieber-Merrifield descrita anteriormente. Todos los procedimientos se pueden realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Antes del acoplamiento de los aminoácidos, todas las secuencias de síntesis de péptidos comenzaron con un procedimiento de expansión de resina, descrito a continuación como “procedimiento de expansión de resina”. En el acoplamiento de los aminoácidos al terminal N de la amina primaria, se usó el “procedimiento de acoplamiento simple” descrito a continuación. En el acoplamiento de los aminoácidos al terminal N de la amina secundaria, se usó el “Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria” descrito a continuación. El acoplamiento del grupo cloroacetilo al terminal N del péptido se describe mediante el “procedimiento de acoplamiento de cloruro de cloroacetilo” o “procedimiento de acoplamiento de ácido cloroacético” descrito anteriormente.

Procedimiento de expansión de resina;

A un tubo cónico de polipropileno de 50 ml, se agregó resina Merrifield:Sieber (140 mg, 0,100 mmol). Luego, se agregó DMF (7 ml) al tubo seguida de DCM (7 ml). La resina luego se transfirió al recipiente de reacción de la parte superior del recipiente. El procedimiento se repitió dos veces más. Se agregó DMF (7 ml) y luego DCM (7 ml). La resina se expandió con burbujeo de N2 de la parte inferior del recipiente de reacción durante 15 minutos antes de que el solvente drenara a través de la frita.

Procedimiento de acoplamiento estándar:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó una solución de piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de piperdina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq.), luego hAt U (0,5 M en DMF, 1,0 ml, 5 eq.) y finalmente DIPEA (2 M en NMP, 0,5 ml, 10 eq.). La mezcla se mezcló mediante burbujeo de N2 durante 5 minutos a 75 °C para todos los aminoácidos, excepto Fmoc-Cys(Trt)-OH y Fmoc-His(Trt)-OH que se acoplan a 50 °C, la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se hizo burbujear periódicamente durante 2 minutos a 65 °C, luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento de doble acople:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó una solución de piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de piperdina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq.), luego hAt U (0,5 M en DMF, 1,0 ml, 5 eq.) y finalmente DIPEA (2 M en NMP, 0,5 ml, 10 eq.). La mezcla se mezcló mediante burbujeo de N2 durante 5 minutos a 75 °C para todos los aminoácidos, excepto Fmoc-Cys(Trt)-OH y Fmoc-His(Trt)-OH que se acoplan a 50 °C, la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq.), luego HATU (0,5 M en d Mf , 1,0 ml, 5 eq.) y finalmente DIPEA (2 M en NMP, 0,5 ml, 10 eq.). La mezcla se mezcló mediante burbujeo de N2 durante 5 minutos a 75 °C para todos los aminoácidos, excepto Fmoc-Cys(Trt)-OH y Fmoc-His(Trt)-OH que se acoplan a 50 °C, la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se hizo burbujear periódicamente durante 2 minutos a 65 °C, luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó una solución de piperazina al 5% y HOBt 0,1 M en DMF (20:0,1 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos a 75 °C, y luego la solución drenó. Este procedimiento se repitió una vez más. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq.), HCTU (0,5 M en DMF, 1,0 ml, 5 eq.) y DIPEA (2 M en NMP, 0,5 ml, 10 eq.). La mezcla se mezcló mediante burbujeo de N² durante 5 minutos a 75 °C para todos los aminoácidos (50 °C para Fmoc-Cys(Trt)-OH y Fmoc-His(Trt)-OH), seguido de 6 h sin calentamiento. Después del drenaje, la resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se hizo burbujear periódicamente durante 2 minutos a 65 °C, y luego la solución drenó. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó una solución de piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de piperdina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. Al recipiente de reacción, se agregó la solución de aminoácidos (1,25 ml a 5 ml, 2,5 eq. a 10 eq.) que contenía HATU (2,5 eq a 10 eq.), y finalmente DIPEA (2 M en NMP, 0,5 ml a 1 ml, 20 eq.). La mezcla se mezcló mediante burbujeo de N2 durante 5 minutos a 2 horas de 25 °C a 75 °C, luego la solución de reacción drenó a través de la frita.

La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se hizo burbujear periódicamente durante 2 minutos a 65 °C, luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Método A de Symphony:

Todas las manipulaciones se realizaron mediante automatización en un sintetizador de péptidos Symphony (Protein Technologies). A menos que se indique lo contrario, todos los procedimientos se realizaron en un tubo de polipropileno Symphony equipado con una frita en la parte inferior. El tubo se conecta con el sintetizador de péptidos Symphony a través de la parte inferior y superior del tubo. Todos los solventes, DMF, DCM, los aminoácidos y los reactivos se agregan a través de la parte inferior del tubo y se hacen pasar a través de la frita para entrar en contacto con la resina. Todas las soluciones se retiran a través de la parte inferior del tubo. La “agitación periódica” describe un impulso breve de gas de N² a través de la frita de la parte inferior; el impulso dura aproximadamente 5 segundos y se produce cada 15 segundos. En general, no se usaron soluciones de aminoácidos de más de tres semanas desde de la preparación. Se usó solución HATU dentro de los 5 días de preparación. DMF = dimetilformamida; HCTU = 2-(6-cloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; HATU = hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido; NMM= n-metilmorfolina; DIPEA = diisopropiletilamina; Sieber = Fmoc-amino-xanten-3-iloxi, en donde “3-iloxi” describe la posición y el tipo de conectividad con la resina de poliestireno. La resina usada es polímero Merrifield (poliestireno) con un ligador Sieber (protegido por Fmoc en el nitrógeno); malla de 100-200, 1% de DVB, 0,71 mmol/g de carga. También se pueden usar otras resinas sensibles a ácidos comunes en la síntesis, tales como la resina Rink o la resina de clorotritilo funcionalizada. Los aminoácidos comunes usados se enumeran a continuación con grupos protectores de cadenas laterales que se indican entre paréntesis.

Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

Los procedimientos de “Método A de Symphony” describen un experimento llevado a cabo a una escala de 0,050 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina. Esta escala corresponde aproximadamente a 70 mg de la resina Sieber-Merrifield descrita anteriormente. Todos los procedimientos se pueden realizar a una escala superior a 0,050 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Antes del acoplamiento de los aminoácidos, todas las secuencias de síntesis de péptidos comenzaron con un procedimiento de expansión de resina, descrito a continuación como “procedimiento de expansión”. En el acoplamiento de los aminoácidos al terminal N de la amina primaria, se usó el “Procedimiento de acoplamiento estándar” descrito a continuación. En el acoplamiento de los aminoácidos al terminal N de la amina secundaria, se usó un “acoplamiento doble”; los aminoácidos a medida se acoplan mediante la adición manual de Blank del aminoácido de “acoplamiento de Blank” descrito a continuación.

Procedimiento de expansión:

A un recipiente de reacción de polipropileno en fase sólida Symphony, se agregó resina Merrifield:Sieber (70 mg, 0,050 mmol). La resina se lavó (expandió) tres veces de la siguiente manera: al recipiente de reacción, se agregó DMF (2,5 ml), después de lo cual la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N2 de la parte inferior del recipiente de reacción durante 10 minutos antes de que el solvente drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,5 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 2,5 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.) y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 1,25 ml, 10 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó con DMF (6,25 ml) que se agregó a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.) y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 1,25 ml, 10 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó tres veces de la siguiente manera: al recipiente de reacción, se agregó DMF (2,5 ml), después de lo cual la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N2 de la parte inferior del recipiente de reacción durante 30 segundos antes de que el solvente drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento estándar:

La resina se lavó tres veces de la siguiente manera: al recipiente de reacción, se agregó DMF (2,5 ml), después de lo cual la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N² de la parte inferior del recipiente de reacción durante 30 segundos antes de que el solvente drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,5 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 2,5 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó seis veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.) y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 1,25 ml, 10 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó con DMF (6,25 ml) que se agregó a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.) y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 1,25 ml, 10 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria:

La resina se lavó tres veces de la siguiente manera: al recipiente de reacción, se agregó DMF (2,5 ml), después de lo cual la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N² de la parte inferior del recipiente de reacción durante 30 segundos antes de que el solvente drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,5 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 2,5 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó seis veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.) y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 1,25 ml, 10 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 300 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó con DMF (6,25 ml) que se agregó a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.) y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 1,25 ml, 10 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 300 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida:

La resina se lavó tres veces de la siguiente manera: al recipiente de reacción, se agregó DMF (2,5 ml), después de lo cual la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N² de la parte inferior del recipiente de reacción durante 30 segundos antes de que el solvente drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,5 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 2,5 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó seis veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La síntesis se pausó mediante el software Symphony para agregar al recipiente de reacción manualmente el aminoácido a medida (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.), luego se reinició la automatización para agregar HATU (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.) y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 1,25 ml, 10 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 300 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó seis veces como se indica a continuación con DMF (2,5 ml), que se agregó a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó Ac²O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2,5 ml), la mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Método B de Symphony:

Todas las manipulaciones se realizaron mediante automatización en un sintetizador de péptidos Symphony (Protein Technologies). A menos que se indique lo contrario, todos los procedimientos se realizaron en un tubo de polipropileno Symphony equipado con una frita en la parte inferior. El tubo se conecta con el sintetizador de péptidos Symphony a través de la parte inferior y superior del tubo. Todos los solventes, DMF, DCM, los aminoácidos y los reactivos se agregan a través de la parte inferior del tubo y se hacen pasar a través de la frita para entrar en contacto con la resina. Todas las soluciones se retiran a través de la parte inferior del tubo. La “agitación periódica” describe un impulso breve de gas de N² a través de la frita de la parte inferior; el impulso dura aproximadamente 5 segundos y se produce cada 15 segundos. En general, no se usaron soluciones de aminoácidos de más de tres semanas desde de la preparación. Se usó solución HATU dentro de los 5 días de preparación. DMF = dimetilformamida; HCTU = 2-(6-cloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; HATU = hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido; NMM= n-metilmorfolina; DIPEA = diisopropiletilamina; Sieber = Fmoc-amino-xanten-3-iloxi, en donde “3-iloxi” describe la posición y el tipo de conectividad con la resina de poliestireno. La resina usada es polímero Merrifield (poliestireno) con un ligador Sieber (protegido por Fmoc en el nitrógeno); malla de 100-200, 1% de DVB, 0,71 mmol/g de carga. También se pueden usar otras resinas sensibles a ácidos comunes en la síntesis, tales como la resina Rink o la resina de clorotritilo funcionalizada. Los aminoácidos comunes usados se enumeran a continuación con grupos protectores de cadenas laterales que se indican entre paréntesis.

Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

Los procedimientos de “Método B de Symphony” describen un experimento llevado a cabo a una escala 0,050 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina. Esta escala corresponde aproximadamente a 70 mg de la resina Sieber-Merrifield descrita anteriormente. Todos los procedimientos se pueden realizar a una escala superior a 0,050 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Antes del acoplamiento de los aminoácidos, todas las secuencias de síntesis de péptidos comenzaron con un procedimiento de expansión de resina, descrito a continuación como “procedimiento de expansión”. En el acoplamiento de los aminoácidos al terminal N de la amina primaria, se usó el “Procedimiento de acoplamiento estándar” descrito a continuación. En el acoplamiento de los aminoácidos al terminal N de la amina secundaria, se usó el “Procedimiento B de acoplamiento a la amina secundaria". Los aminoácidos a medida se acoplan mediante la adición manual de Blank del aminoácido del “Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida" descrito a continuación, y se agregó anhídrido de cloroacetilo a la posición final de la secuencia usando el “Procedimiento de recubrimiento final” descrito a continuación.

Procedimiento de expansión:

A un recipiente de reacción de polipropileno en fase sólida Symphony, se agregó resina Merrifield:Sieber (70 mg, 0,050 mmol). La resina se lavó (se expandió) tres veces de la siguiente manera: al recipiente de reacción, se agregó DMF (2,5 ml), después de lo cual la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N² de la parte inferior del recipiente de reacción durante 10 minutos antes de que el solvente drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,5 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 2,5 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.) y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 1,25 ml, 10 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó con DMF (6,25 ml) que se agregó a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.) y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 1,25 ml, 10 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó tres veces de la siguiente manera: al recipiente de reacción, se agregó DMF (2,5 ml), después de lo cual la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N2 de la parte inferior del recipiente de reacción durante 30 segundos antes de que el solvente drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento estándar:

La resina se lavó tres veces de la siguiente manera: al recipiente de reacción, se agregó DMF (2,5 ml), después de lo cual la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N² de la parte inferior del recipiente de reacción durante 30 segundos antes de que el solvente drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,5 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 2,5 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó seis veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.) y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 1,25 ml, 10 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó seis veces de la siguiente manera: se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó Ac2O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:32,5 ml), la mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria:

La resina se lavó tres veces de la siguiente manera: al recipiente de reacción, se agregó DMF (2,5 ml), después de lo cual la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N2 de la parte inferior del recipiente de reacción durante 30 segundos antes de que el solvente drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,5 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 2,5 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó seis veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.) y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 1,25 ml, 10 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó con DMF (6,25 ml) que se agregó a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.), luego HATU (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.) y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 1,25 ml, 10 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó Ac2O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:32,5 ml), la mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida:

La resina se lavó tres veces de la siguiente manera: al recipiente de reacción, se agregó DMF (2,5 ml), después de lo cual la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N² de la parte inferior del recipiente de reacción durante 30 segundos antes de que el solvente drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,5 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 2,5 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó seis veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. El sistema se pausó para la adición manual del aminoácido a medida al recipiente de reacción (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.), y luego se reinició la automatización para agregar HATU (0,2 M en DMF, 1,25 ml, 5 eq.) y finalmente NMM (0,8M en DMF, 1,25 ml, 10 eq.) al recipiente de reacción. La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó seis veces de la siguiente manera: se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó Ac2O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:32,5 ml), la mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de recubrimiento final:

La resina se lavó tres veces de la siguiente manera: al recipiente de reacción, se agregó DMF (2,5 ml), después de lo cual la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N² de la parte inferior del recipiente de reacción durante 30 segundos antes de que el solvente drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,5 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 2,5 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó seis veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó NMM (0,8 M en DMF, 1,25 ml, 10 eq.) y luego se agregó el anhídrido cloroacético (0,4 M en DMF, 1,25 ml, 10 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó con ^d M^f (6,25 ml) que se agregó a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó NMM (0,8 M en DMF, 1,25 ml, 10 eq.) y luego se agregó el anhídrido cloroacético (0,4 M en DMF, 1,25 ml, 10 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó seis veces de la siguiente manera: se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó Ac2O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:32,5 ml), la mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DCM (2,5 ml) a través de la parte inferior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina resultante se secó con un flujo de nitrógeno durante 10 min.

Método A de desprotección global:

Todas las manipulaciones se realizaron de manera manual, a menos que se indique lo contrario. El procedimiento del “Método A de desprotección global” describe un experimento realizado a una escala de 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina. El procedimiento se puede realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Se preparó una “solución de desprotección” usando ácido trifluoroacético:agua:triisopropilsilano:ditiotreitol (92,5:2,5:2,5:2,5 v:v:v:p). La resina se retiró del recipiente de reacción y se transfirió a una jeringa de 25 ml equipada con una frita. A la jeringa se agregó la “solución de desprotección” (5,0 ml). La mezcla se mezcló en un agitador durante 85 min. La solución se filtró, se concentró y se diluyó en dietiléter (30 ml). El sólido precipitado se centrifugó durante 3 minutos. La solución sobrenadante decantó, y el sólido se volvió a suspender en dietiléter (25 ml). La suspensión se centrifugó durante 3 minutos. El sobrenadante decantó, y el sólido restante se suspendió en dietiléter (25 ml). La suspensión se centrifugó durante 3 minutos. El sobrenadante decantó, y el sólido restante se secó en alto vacío. El péptido crudo se obtuvo como un sólido blanco a blancuzco.

Método B de desprotección global:

Todas las manipulaciones se realizaron de manera manual, a menos que se indique lo contrario. El procedimiento del “Método B de desprotección global” describe un experimento realizado a una escala de 0,04 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina. El procedimiento se puede realizar a una escala superior a 0,04 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Se preparó una “solución de desprotección” usando ácido trifluoroacético:triisopropilsilano (96:4; v:v). La resina se retiró del recipiente de reacción y se transfirió a una jeringa de 10 ml equipada con una frita. A la jeringa se agregó la “solución de desprotección” (2,0-3,0 ml). La mezcla se mezcló en un agitador durante 1 h o 1,5 h. La solución se filtró, se lavó con solución de desprotección (0,5 ml), se concentró y se diluyó en dietiléter (30 ml). El sólido precipitado se centrifugó durante 3 minutos. La solución sobrenadante decantó, y el sólido se volvió a suspender en dietiléter (25 ml). La suspensión se centrifugó durante 3 minutos. El sobrenadante decantó, y el sólido restante se suspendió en dietiléter (25 ml). La suspensión se centrifugó durante 3 minutos. El sobrenadante decantó, y el sólido restante se secó en alto vacío. El péptido crudo se obtuvo como un sólido blanco a blancuzco.

Método C de desprotección global:

Todas las manipulaciones se realizaron de manera manual, a menos que se indique lo contrario. El procedimiento del “Método C de desprotección global” describe un experimento realizado a una escala de 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina. El procedimiento se puede realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Se preparó una “solución de desprotección” usando ácido trifluoroacético:triisopropilsilano:ditiotreitol (95:2,5:2,5 v:v:p). La resina se retiró del recipiente de reacción y se transfirió a un tubo Bio-Rad. Al tubo Bio-Rad se agregó la “solución de desprotección” (4,0 ml). La mezcla se mezcló en un agitador durante 60 minutos. La solución se filtró y se diluyó en dietiléter (30 ml). El sólido precipitado se centrifugó durante 3 minutos. La solución sobrenadante decantó, y el sólido se volvió a suspender en dietiléter (25 ml). La suspensión se centrifugó durante 3 minutos. El sobrenadante decantó, y el sólido restante se suspendió en dietiléter (25 ml). La suspensión se centrifugó durante 3 minutos. El sobrenadante decantó, y el sólido restante se secó en alto vacío. El péptido crudo se obtuvo como un sólido blanco a blancuzco.

Método D de desprotección global:

Todas las manipulaciones se realizaron de manera manual, a menos que se indique lo contrario. El procedimiento del “Método B de desprotección global” describe un experimento realizado a una escala de 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina. El procedimiento se puede realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Se preparó una “solución de desprotección” usando ácido trifluoroacético:triisopropilsilano:ditiotreitol (94:3:3 v:v:p). La resina se retiró del recipiente de reacción y se transfirió a una jeringa de 25 ml equipada con una frita. A la jeringa se agregó la “solución de desprotección” (5,0 ml). La mezcla se mezcló en un agitador durante 5 minutos. La solución se filtró y se diluyó en dietiléter (30 ml). El sólido precipitado se centrifugó durante 3 minutos. La solución sobrenadante decantó, y el sólido se volvió a suspender en dietiléter (25 ml). La suspensión se centrifugó durante 3 minutos. El sobrenadante decantó, y el sólido restante se suspendió en dietiléter (25 ml). La suspensión se centrifugó durante 3 minutos. El sobrenadante decantó, y el sólido restante se secó en alto vacío. El péptido crudo se obtuvo como un sólido blanco a blancuzco.

Método E de desprotección global:

Todas las manipulaciones se realizaron de manera manual, a menos que se indique lo contrario. El procedimiento del “Método E de desprotección global” describe un experimento realizado a una escala de 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Fmoc Gly-ClTrt unido a la resina. El procedimiento se puede realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Se preparó una “solución de desprotección” usando ácido trifluoroacético:triisopropilsilano:ditiotreitol (95:2,5:2,5 v:v:p). La resina se retiró del recipiente de reacción y se transfirió a un tubo Bio-Rad. Al tubo Bio-Rad se agregó la “solución de desprotección” (2,0 ml). La mezcla se mezcló en un agitador durante 3 minutos. La solución se filtró y se recolectó en un tubo centrífugo. Al tubo Bio-Rad se agregó la “solución de desprotección” (2,0 ml). La mezcla se mezcló en un agitador durante 3 minutos. La solución se filtró y se recolectó en un tubo centrífugo. Al tubo Bio-Rad se agregó la “solución de desprotección” (2,0 ml). La mezcla se mezcló en un agitador durante 3 minutos. La solución se filtró y se recolectó en un tubo centrífugo. La solución en el tubo centrífugo se dejó reposar durante 60 minutos. Luego la solución recolectada se diluyó con dietiléter (30 ml), y se formó un precipitado. El sólido precipitado se centrifugó durante 3 minutos. La solución sobrenadante decantó, y el sólido se volvió a suspender en dietiléter (25 ml). La suspensión se centrifugó durante 3 minutos. El sobrenadante decantó, y el sólido restante se suspendió en dietiléter (25 ml). La suspensión se centrifugó durante 3 minutos. El sobrenadante decantó, y el sólido restante se secó en alto vacío. El péptido crudo se obtuvo como un sólido blanco a blancuzco.

Método F de desprotección global:

Todas las manipulaciones se realizaron de manera manual, a menos que se indique lo contrario. El procedimiento del “Método F de desprotección global” describe un experimento realizado a una escala de 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Rink unido a la resina. El procedimiento se puede realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Se preparó una “solución de desprotección” usando ácido trifluoroacético:triisopropilsilano:ditiotreitol (95:2,5:2,5 v:v:p). La resina se retiró del recipiente de reacción y se transfirió a un tubo Bio-Rad de 6 ml. Al tubo Bio-Rad se agregó la “solución de desprotección” (4,0 ml). La mezcla se mezcló en un agitador durante 90 minutos. La solución se filtró y se diluyó en dietiléter (30 ml). El sólido precipitado se centrifugó durante 3 minutos. La solución sobrenadante decantó, y el sólido se volvió a suspender en dietiléter (25 ml). La suspensión se centrifugó durante 3 minutos. El sobrenadante decantó, y el sólido restante se suspendió en dietiléter (25 ml). La suspensión se centrifugó durante 3 minutos. El sobrenadante decantó, y el sólido restante se secó en alto vacío. El péptido crudo se obtuvo como un sólido blanco a blancuzco.

Método A de ciclización

Todas las manipulaciones se realizaron de manera manual, a menos que se indique lo contrario. El procedimiento del “Método A de ciclización” describe un experimento realizado a una escala de 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina que se usó para generar el péptido. Esta escala no se basa en una determinación directa de la cantidad de péptido usado en el procedimiento. El procedimiento se puede realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Los sólidos de péptidos crudos se disolvieron en una solución de acetonitrilo:guanidina acuosa 8 M/ 50 mM de TRIS (1:3) (pH 8,6) (7 ml:18 ml o una relación similar), y luego la solución se ajustó luego a pH = 8,5-9,0 usando NaOH acuoso (1,0 M), si era necesario. Luego la solución se mezcló usando un agitador durante 12 a 18 horas. La solución de reacción se concentró, y luego el residuo se disolvió en acetonitrilo:agua. Esta solución se sometió a purificación mediante HPLC de fase inversa para obtener el péptido cíclico deseado.

Método C de ciclización:

Todas las manipulaciones se realizaron de manera manual, a menos que se indique lo contrario. El procedimiento del “Método C de ciclización” describe un experimento realizado a una escala de 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina que se usó para generar el péptido. Esta escala no se basa en una determinación directa de la cantidad de péptido usado en el procedimiento. El procedimiento se puede realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Los sólidos de péptidos crudos se disolvieron en una solución de acetonitrilo:amortiguador de bicarbonato de amonio acuoso 0,1 M (11 ml:24 ml o una relación similar), y luego la solución se ajustó cuidadosamente a pH = 8,5-9,0 usando NaOH acuoso (1,0 M). Luego la solución se mezcló usando un agitador durante 12 a 18 horas. La solución de reacción se concentró, y luego el residuo se disolvió en acetonitrilo:agua. Esta solución se sometió a purificación mediante HPLC de fase inversa para obtener el péptido cíclico deseado.

Método D de ciclización:

Todas las manipulaciones se realizaron de manera manual, a menos que se indique lo contrario. El procedimiento del “Método D de cidización” describe un experimento realizado a una escala de 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina que se usó para generar el péptido. Esta escala no se basa en una determinación directa de la cantidad de péptido usado en el procedimiento. El procedimiento se puede realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Los sólidos de péptidos crudos se disolvieron en una solución de acetonitrilo:amortiguador de bicarbonato de amonio acuoso 0,1 M (11 ml:24 ml), y luego la solución se ajustó cuidadosamente a pH = 8,5-9,0 usando NaOH acuoso (1,0 M). La solución luego se mezcló agitándola durante 12 a 18 horas. La solución de reacción se concentró, y luego el residuo se disolvió en acetonitrilo:agua. Esta solución se sometió a purificación mediante HPLC de fase inversa para obtener el péptido cíclico deseado.

Método E de ciclización:

Todas las manipulaciones se realizaron de manera manual, a menos que se indique lo contrario. El procedimiento del “Método E de cidización” describe un experimento realizado a una escala de 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina que se usó para generar el péptido. Esta escala no se basa en una determinación directa de la cantidad de péptido usado en el procedimiento. El procedimiento se puede realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Los sólidos de péptidos crudos se disolvieron en una solución de amortiguador de HCI de guanidina acuosa 6 M (15 ml), y luego la solución se mezcló agitándola durante 12 a 18 horas. La solución de reacción se concentró, y se agregaron 15 ml de DMSO al residuo, con lo cual se obtuvo una suspensión que se filtró. Esta solución filtrada se sometió a purificación mediante HPLC de fase inversa para obtener el péptido cíclico deseado.

Procedimiento A de acoplamiento manual:

Al recipiente de reacción Bio-Rad que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 5 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó durante 60 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (1,2-10 equivalentes), generalmente (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq), luego HATU (1,210 equivalentes) generalmente (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq) y finalmente DIPEA (2,4- 20 equivalentes) generalmente (0,8 M en DMF, 1,25 ml, 10 eq). La mezcla se agitó durante 60 minutos a 18 horas, y luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó durante 60 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita.

Método A de N-metilación en resina. (Turner, R. A.; Hauksson, N. E.; Gipe, J. H.; Lokey, R. S. Org. Lett,2013, 15(19), 5012-5015):

Todas las manipulaciones se realizaron de manera manual, a menos que se indique lo contrario. El procedimiento del “Método A de N-metilación en resina” describe un experimento realizado a una escala de 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina que se usó para generar el péptido. Esta escala no se basa en una determinación directa de la cantidad de péptido usado en el procedimiento. El procedimiento se puede realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala.

La resina se transfirió a una jeringa fritada de 25 ml. A la resina se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó durante 3 min, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó tres veces con DMF (4,0 ml). Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 4,0 ml). La mezcla se agitó durante 3 min, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces con DMF (4,0 ml) y tres veces con DCM (4,0 ml). La resina se suspendió en DMF (2,0 ml) y trifluoroacetato de etilo (0,119 ml, 1,00 mmol), 1,8-diazabiciclo[5.4,0]undec-7-eno (0,181 ml, 1,20 mmol). La mezcla se colocó en un agitador durante 60 min. La solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces con DMF (4,0 ml) y tres veces con DCM (4,0 ml).

La resina se lavó tres veces con THF seco (2,0 ml) para eliminar el agua residual. A un vial de 4,0 ml secado en el horno, se agregaron THF (1,0 ml) y trifenilfosfina (131 mg, 0,500 mmol) en tamices moleculares 4 A secos (20 mg). La solución se transfirió a la resina, y se agregó lentamente azodicarboxilato de diisopropilo (0,097 ml, 0,5 mmol). La resina se agitó durante 15 min. La solución drenó a través de la frita, y la resina se lavó tres veces con THF seco (2,0 ml) para retirar el agua residual. A un vial de 4,0 ml secado en el horno, se agregaron THF (1,0 ml) y trifenilfosfina (131 mg, 0,500 mmol) en tamices moleculares 4 A secos (20 mg). La solución se transfirió a la resina, y se agregó lentamente azodicarboxilato de diisopropilo (0,097 ml, 0,5 mmol). La resina se agitó durante 15 min. La solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces con DMF (4,0 ml) y tres veces con DCM (4,0 ml). La resina se suspendió en etanol (1,0 ml) y THF (1,0 ml), y se agregó borohidruro de sodio (37,8 mg, 1,000 mmol). La mezcla se agitó durante 30 min y se drenó. La resina se lavó sucesivamente tres veces con DMF (4,0 ml) y tres veces con DCM (4,0 ml).

Microescisión A:

A una pequeña muestra de < 10 mg de resina, se agregaron 2 gotas de TIS y 1 ml de ácido triflouroacético, y se agitó a temperatura ambiente. Después de 1 h, se retiró una pequeña alícuota y se diluyó con 0,5 ml de acetonitrilo, se filtró y se obtuvo el análisis mediante LC-MS.

2-((S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-fenilpropanamido)propanoato de (S)-metilo

El ácido (S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-fenilpropanoico (500 mg, 1,670 mmol) y HATU (699 mg, 1,837 mmol) se disolvieron en CH²Cl² (10 ml) y DMF (4 ml). Las mezclas se agitaron a temperatura ambiente durante 10 min antes de que se agregaran 2-aminopropanoato de (S)-metilo, HCl (245 mg, 1,754 mmol) y base de Hunig (1,167 ml, 6,68 mmol) en 1 ml de DMF. Las mezclas se agitaron a temperatura ambiente durante 2 horas, en cuyo momento la LC-MS mostró conversión completa. Se inactivaron con 3 ml de HCl 1 N. Se vertieron en 150 ml de EA, se lavaron con 10 % de LiCl dos veces. Luego, la capa orgánica se concentró. Los materiales crudos se purificaron en columna GOLDC18 de 50 g, 10 %--100 % de gradiente de SolB durante 22 min. SolA: agua/TFA; SolB: ACN/TFA

Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga para obtener el compuesto del título (600 mg, 86 %). Condición A del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 0,88 min; ESI-MS(+) m/z 385,1 (M+H).

2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-feniletil)-1H-tetrazol-1-il)propanoato de (S)-metilo

Un vial de presión se cargó con 2-((S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-fenilpropanamido)propanoato de (S)-metilo (600 mg, 1,561 mmol) y difenil-2-piridilfosfina (1644 mg, 6,24 mmol) en THF (20 ml) en N². La solución se purgó con N² antes de que se agregara por goteo DIAD (1,214 ml, 6,24 mmol). Luego, se agregó lentamente difenilfosforil azida (1,682 ml, 7,80 mmol). Las mezclas se calentaron hasta 50 °C y se agitaron a 50 °C durante 14 horas, en cuyo momento la LC-MS mostró el pico del producto deseado. Las mezclas se enfriaron hasta temperatura ambiente y se vertieron en 80 ml de EtOAc, se lavaron con HCl 1 N frío, NaHCO3 saturado y salmuera. La capa orgánica luego se concentró, y el material obtenido se purificó mediante columna RediSep: 80 g de sílice Gold; velocidad de flujo: 60 ml/min; gradiente de 0 %--45 % de SolB durante 15 min; solvente: A1 hexano; solvente: B1 acetato de etilo.

Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga para obtener el compuesto del título (290 mg) Condición A del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,0 min; ESI-MS(+) m/z 410,1 (M+H).

Ácido (S)-2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-feniletil)-1H-tetrazol-1-il)propanoico

2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-feniletil)-1H-tetrazol-1-il)propanoato de (S)-metilo (290 mg, 0,425 mmol) se disolvió en cosolvente de THF (4 ml) y MeOH (1 ml). A esta solución se agregó LiOH (1,275 ml, 2,55 mmol) en dos porciones. La LC-MS mostró conversión completa después de agitarse a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se inactivó con HCl 1 N, el pH se ajustó a 1-2. Se extrajo con EtOAc dos veces. La capa orgánica luego se secó en Na2SO4 y se concentró para obtener 285 mg de materiales crudos. No se realizó purificación.

Condición A del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 0,83 min; ESI-MS(+) m/z 396,3 (M+H).

Ácido (S)-2-(5-((S)-1-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-2-feniletil)-1H-tetrazol-1-il)propanoico

El ácido (S)-2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-feniletil)-1H-tetrazol-1-il)propanoico (285 mg, 0,721 mmol) se disolvió en MeOH (4 ml) en N². El sistema se purgó con N² antes de que se agregara Pd/C (77 mg, 0,072 mmol). Las mezclas se agitaron a temperatura ambiente en un globo de H² durante la noche. El catalizador se filtró usando un tapón de tierra diatomácea (Celite®), se lavó con metanol, y el solvente se retiró.

Los residuos anteriores se disolvieron en acetonitrilo (4 ml) y agua (2 ml). Se enfriaron hasta 0 °C, y a la solución se agregó Na2CO3 (1,802 ml, 3,60 mmol) y luego carbonato de (9H-fluoren-9-il)metil (2,5-dioxopirrolidin-1-ilo) (267 mg, 0,793 mmol) en 1 ml de CH³CN. Las mezclas de reacción se calentaron hasta temperatura ambiente durante 2 horas. Se acidificaron con HCl 1 N hasta pH 2 y se extrajeron con EtOAc. La capa orgánica luego se secó en Na2SO4 y se concentró. Los materiales crudos obtenidos se purificaron en HPLC de fase inversa. Columna: Axia Luna C18 30*100mm; SolA: 95 % de H²O^{/ 5} % de ACN/0,05 % de TFA; SolB: 95 % de ACN/5 % de H2o/0,05 % de TFA; gradiente de 10 %--100 % de SolB durante 12 min.

Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga para obtener el compuesto del título (90 mg).

Condición A del análisis de L^c M^s : Tiempo de retención = 0,97 min; ESI-MS(+) m/z 484,0 (M+H).

2-((S)-3-(benzo[b]tiofen-3-il)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)propanamido)hexanoato de (R)-metilo

A una solución de ácido (S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-(4-(ter-butoxi)fenil)propanoico (2,24 g, 6,03 mmol) y 2-aminopropanoato de (S)-metilo, clorhidrato (0,850 g, 6,09 mmol) en DCM (30,2 ml) a 0 °C, se agregó HATU sólido (2,408 g, 6,33 mmol), después de 15 min, se agregó N-metilmorfolina (1,326 ml, 12,06 mmol) y se calentó a temperatura ambiente durante la noche. Se agregaron 20 ml de HCl 1 N, y se agitó durante 10 min. Se vertió en una ampolla de decantación, las capas se separaron, y la fase acuosa se extrajo 2x más con DCM (30 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron en Na2SO4, se filtraron y se despojaron hasta obtener un aceite.

El material purificado en gel de sílice usando 0 a 100 % de hexanos a acetato de etilo en una columna de 80 g Isco produjo 1,91 gramos.

Condición E del análisis de LCMS: tiempo de retención 1,05 min 483,4 (M+1); 1H NMR (400 MHz, D M S O d) 8 ppm 8,46 (1 H, d, J=7,46 Hz), 7,96 (2 H, t, J=8,62 Hz), 7,57 (1 H, d, J=8,68 Hz), 7,19 - 7,49 (6 H, m), 4,95 (m, 2H) 4,38 4,57 (1 H, m), 4,28 (1 H, td, J=8,01, 5,50 Hz), 3,53 - 3,76 (3 H, s), 3,32 (2 H, s), 3,12 - 3,24 (1 H, m), 3,06 (1 H, dd, J=14,67, 10,15 Hz), 1,50 - 1,80 (2 H, m), 1,29 (3 H, br. s.), 0,75 - 0,98 (3 H, m).

2-(5-((S)-2-(benzo[b]tiofen-3-il)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)etil)-4H-1,2, 3-triazol-4-il)hexanoato de (2R)-metilo

Un matraz de fondo redondo de cuello simple equipado con una línea de nitrógeno y un agitador magnético se cargó con 2-((S)-3-(benzo[b]tiofen-3-il)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)propanamido)hexanoato de (S)-metilo (1,91 g, 3,96 mmol) y difenil-2-piridilfosfina (3,13 g, 11,87 mmol), luego THF (25 ml) en N². La solución se purgó con N² durante 5 min, antes de que se agregara DIAD (2,309 ml, 11,87 mmol) por goteo. Luego, se agregó lentamente difenilfosforil azida (3,41 ml, 15,83 mmol) mediante una ampolla de adición. La reacción se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno durante 18 horas. El ^t H^f se retiró hasta obtener un aceite espeso, que se disolvió en 100 ml de acetato de etilo, y se agregaron 100 ml de HCl 1 N. Se extrajo la fase acuosa 2 veces más con 50 ml de acetato de etilo. Los orgánicos combinados se secaron en Na2SO4, se filtraron y se despojaron hasta obtener un aceite.

220 gramos de sílice ISCO; gradiente de hexanos a acetato de etilo; el material deseado se aisló en 0,556 gramos. El material se utilizó crudo como una mezcla.

Condición E del análisis de LCMS: tiempo de retención 1,1 min 508,4 (M+1).

Ácido (S)-2-(5-((S)-2-(benzo[b]tiofen-3-il)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)etil)-1H-tetrazol-1-il)hexanoico

A 2-(5-((S)-2-(benzo[b]tiofen-3-il)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)etil)-1H-tetrazol-1-il)hexanoato de (S)-metilo (0,566 g, 1,115 mmol), se agregaron MeOH (2,79 ml) y THF (2,79 ml). La mezcla se agitó hasta formar una solución, luego se agregó hidróxido de litio (1,673 ml, 3,35 mmol) y se agitó durante 15 min a temperatura ambiente. Se agregó HCl 1 N para obtener un pH 6 levemente ácido, y el resultado se extrajo 3x con 25 ml de acetato de etilo. Los orgánicos combinados se secaron en Na2SO4, se filtraron, y el solvente se retiró hasta obtener un aceite incoloro, que se usó sin purificación. Condición E de LCMS: tiempo de retención = 0,99 min 494,4 (M+1).

Ácido (S)-2-(5-((S)-1-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-2-(benzo[b]tiofen-3-il)etil)-1H-tetrazol-1-il)hexanoico

Al ácido (S)-2-(5-((S)-2-(benzo[b]tiofen-3-il)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)etil)-1H-tetrazol-1-il)hexanoico (0,55 g, 1,114 mmol) disuelto en acetonitrilo (12 ml) enfriado en un baño de agua helada, se agregó yodotrimetilsilano (0,465 ml, 3,34 mmol) a 0 °C. Se agitó durante 'A hora a 0 °C, luego se calentó hasta temperatura ambiente durante 'A hora. Se agregó HCl 1 N y se extrajo 4x con 20 ml de acetato de etilo. La capa orgánica se secó en Na2SO4, se filtró y se despojó hasta obtener un aceite marrón amarillento. La purificación en una columna ISCO con 80 gramos de sílice Gold produjo 0,126 gramos de sólido blanco.

Condición E de LCMS: tiempo de retención = 0,99 min 582,5 (M+1)

2-((S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-(4-(ter-butoxi)fenil)propanamido)propanoato de (S)-metilo

A una solución de ácido (S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-(4-(ter-butoxi)fenil)propanoico (2,24 g, 6,03 mmol) y 2-aminopropanoato de (S)-metilo, clorhidrato (0,850 g, 6,09 mmol) en DCM (30,2 ml) a 0 °C, se agregó HATU sólido (2,408 g, 6,33 mmol). Después de 15 min, se agregó N-metilmorfolina (1,326 ml, 12,06 mmol), y la mezcla se calentó hasta temperatura ambiente durante la noche. Se agregaron 30 ml de HCl 1 N y se extrajeron 3x con diclorometano (30 ml), los orgánicos combinados se secaron en Na2SO4, se filtraron y se despojaron hasta obtener una cera. El residuo se purificó mediante cromatografía de fase normal, ISCO con 80 gramos de sílice; el gradiente de hexanos a acetato de etilo produjo 1,3 gramos.

Condición E de LCMS: tiempo de retención = 0,97 min 457,5 (M+1); 1H NMR (400MHz, CLOROFORMO-d) 87,40 -7,31 (m, 5H), 7,14 - 7,05 (m, J=8,1 Hz, 2H), 6,97 - 6,84 (m, 2H), 5,31 (s, 1H), 5,11 (s, 2H), 4,49 (s, 1H), 3,72 (s, 3H), 1,57 (br. s., 2H), 1,38 - 1,29 (m, 12H).

2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-(4-(ter-butoxi)fenil)etil)-1H-tetrazol-1-il)propanoato de (S)-metilo

En un matraz de fondo redondo de cuello simple equipado con una línea de nitrógeno, un agitador magnético, y cargado con 2-((S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-(4-(ter-butoxi)fenil)propanamido)propanoato de (S)-metilo (1,77 g, 3,88 mmol), se agregó difenil-2-piridilfosfina (3,05 gramos, 11,64 mmol) en THF (25 ml), en N². La solución se purgó con N² antes de que se agregara por goteo DIAD (2,261 ml, 11,63 mmol). Luego, se agregó lentamente difenilfosforil azida (3,34 ml, 15,51 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 horas. La mezcla se calentó hasta 55 °C y se agitó a 50 °C durante 20 horas. Se enfrió hasta temperatura ambiente y se vertió en 40 ml de acetato de etilo, se lavó con HCl 1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. Los orgánicos se retiraron hasta obtener un aceite espeso. El residuo se purificó en una columna ISCO de 80 gramos; 0 a 100 % de acetato de etilo en hexanos produjo 2,24 gramos de una mezcla que se usó sin purificación adicional. Condición D de LCMS: tiempo de retención = 1,01 min 482,5.

Ácido (S)-2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-(4-(ter-butoxi)fenil)etil)-1H-tetrazol-1-il)propanoico

A 2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-(4-(ter-butoxi)fenil)etil)-1H-tetrazol-1-il)propanoato de (S)-metilo (2,24 g, 4,65 mmol), se agregaron MeOH (11,63 ml) y THF (11,63 ml). La mezcla se agitó hasta formar una solución, luego se agregó hidróxido de litio (6,98 ml, 13,96 mmol). La mezcla se agitó durante 15 min a temperatura ambiente. Se agregó HCl 1 N para obtener un pH 6 levemente ácido, y el resultado se extrajo 3x con 25 ml de acetato de etilo. Los orgánicos combinados se secaron en Na2SO4, se filtraron, y el solvente se retiró para obtener un aceite que se usó en la siguiente etapa sin purificación.

Condición D de LCMS: tiempo de retención = 0,93 min 468,4.

Ácido (S)-2-(5-((S)-1-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-2-(4-(ter-butoxi)fenil)etil)-1H-tetrazol-1-il)propanoico

El ácido (S)-2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-(4-(ter-butoxi)fenil)etil)-1H-tetrazol-1-il)propanoico (3,4 g, 7,27 mmol) se disolvió en 20 ml de MeOH en N². A esta solución se agregó Pd/C (500 mg, 0,470 mmol). La solución se desgasificó antes de cambiar a un globo de H². Las mezclas se agitaron en H² durante 4 horas. La LC-MS mostró >95% de conversión. El catalizador se filtró, el solvente se retiró para obtener el material crudo.

El material anterior se disolvió en THF (8 ml), acetonitrilo (6 ml), y se agregaron 3 ml de agua. Se enfrió hasta 0 °C en un baño de agua helada, se agregó Na2CO3 (2,312 g, 21,82 mmol), luego carbonato de (9H-fluoren-9-il)metil (2,5-dioxopirrolidin-1-ilo) (2,70 g, 8,00 mmol) en porciones. Se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se agregó HCl 1 N para obtener un pH 5 levemente ácido. El resultado se extrajo 4x con 25 ml de acetato de etilo. Los extractos combinados se secaron en Na2SO4, se filtraron, y el solvente se retiró para obtener un aceite amarillo. La columna ISCO de 220 gramos, con un gradiente de hexanos a acetato de etilo, produjo 0,403 gramos

Condición D de LCMS: tiempo de retención = 1,2 min 556,5

Condición H del análisis de HPLC: tiempo de retención 11,34 min 94 %

Condición G del análisis de HPLC: tiempo de retención 12,39 min 93,9%

1H NMR (400MHz, DMSO-d6) 813,9-13,4 (s, 1H), 8,33 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,86 (d, J=7,5 Hz, 2H), 7,71 - 7,59 (m, 1H), 7,57 (d, J=7,5 Hz, 1H), 7,47 - 7,34 (m, 2H), 7,34 - 7,16 (m, 3H), 6,92 - 6,75 (m, 2H), 5,72 - 5,47 (m, 1H), 5,3-5,05(m, 1H), 4,27 - 4,02 (m, 3H), 3,25 (dd, J=13,8, 10,3 Hz, 1H), 3,10 (dd, J=14,1,4,5 Hz, 1H), 1,99 - 1,71 (m, 2H), 1,65 (d, J=7,0 Hz, 1H), 1,29 - 1,11 (m, 9H).

3-((S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-(((S)-1-metoxi-1-oxohexan-2-il)amino)-3-oxopropil)-1H-indol-1-carboxilato de ter-butilo

Se agregó HATU (30,0 g, 79 mmol) a una solución agitada de ácido (S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-(1-(terbutoxicarbonil)-1H-indol-3-il)propanoico (28,8 g, 65,7 mmol) en CH²Cl² (274 ml) y DMF (132 ml) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 min. Luego, se agregó 2-aminohexanoato de (S)-metilo, clorhidrato (14,32 g, 79 mmol) y DIPEA (40,2 ml, 230 mmol) en 2 ml de DMF a temperatura ambiente. La reacción se mezcló a temperatura ambiente durante 1,5 h. La mezcla de reacción se lavó con HCl 1,5 N y solución de LiCl al 10 % y se extrajo con diclorometano. Las capas orgánicas se secaron en Na2SO4 y se concentraron. El material crudo se purificó mediante cromatografía de fase normal ISCO. El compuesto se eluyó en 20 % de acetato de etilo / éter de petróleo.

Condición D de LCMS: tiempo de retención 2,23 min 566,4 (M+1)

Condición G del análisis de HPLC: tiempo de retención 23,97 min 97,9 %.

3-((S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-(1-((S)-1-metoxi-1-oxohexan-2-il)-1H-tetrazol-5-il)etil)-1H-indol-1-carboxilato de ter-butilo

A una solución agitada de 3-((S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-(((S)-1-metoxi-1-oxohexan-2-il)amino)-3-oxopropil)-1H-indol-1-carboxilato de ter-butilo (10 g, 17,68 mmol) y trifenilfosfina (13,91 g, 53,0 mmol) en THF (80 ml) en N2 [omisión en el texto fuente]. La solución se purgó con n 2 antes de que se agregara DIAD (10,31 ml, 53,0 mmol) por goteo. Luego, se agregó lentamente fosforazidato de difenilo (13,33 ml, 61,9 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 75 °C y se agitó a 75 °C durante 24 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se vertió en 500 ml de acetato de etilo, se lavó con HCl 2 N, NaHCO3 saturado y salmuera. La capa orgánica luego se concentró, y se obtuvo el material crudo. El material crudo se purificó mediante cromatografía de fase normal para producir 3-((S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-(1-((S)-1-metoxi-1-oxohexan-2-il)-1H-tetrazol-5-il)etil)-1H-indol-1-carboxilato de ter-butilo (6 g, 9,65 mmol, 54,6 % de rendimiento)

Condición D de LCMS: tiempo de retención 2,54 min 591,3 (M+1).

Condición K del análisis de HPLC: tiempo de retención 2,58 min 95,7 %.

Ácido (S)-2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-(1-(ter-butoxicarbonil)-1H-indol-3-il)etil)-1H-tetrazol-1-il)hexanoico

Una solución agitada de 3-((S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-(1-((S)-1-metoxi-1-oxohexan-2-il)-1H-tetrazol-5-il)etil)-1H-indol-1-carboxilato de ter-butilo (6 g, 10,16 mmol) en THF (33,6 ml) y MeOH (8,40 ml) se trató con LiOH (15,24 ml, 30,5 mmol) y se agitó durante 3 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se acidificó con HCI 1 N y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se secó y se concentró para obtener el producto crudo. El producto crudo se purificó mediante combi flash para producir ácido (S)-2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-(1-(ter-butoxicarbonil)-1H-indol-3-il)etil)-1H-tetrazol-1-il)hexanoico (3,5 g, 5,89 mmol, 58,0 % de rendimiento)

Condición D de LCMS: tiempo de retención 2,41 min 477,2 (M+1).

Ácido (S)-2-(5-((S)-1-amino-2-(1-(ter-butoxicarbonil)-1H-indol-3-il)etil)-1H-tetrazol-1-il)hexanoico

A una solución agitada de ácido (S)-2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-(1-(ter-butoxicarbonil)-1H-indol-3-il)etil)-1H-tetrazol-1-il)hexanoico (3,5 g, 6,07 mmol) en MeOH (56,7 ml) en N2, se agregó Pd/C (1,292 g, 1,214 mmol). La solución se desgasificó antes de cambiar a H2 La mezcla se agitó en H2 durante 7 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtró a través de tierra diatomácea (Celite®), y se lavó en almohadilla con metanol y se concentró para obtener ácido (S)-2-(5-((S)-1-amino-2-(1-(ter-butoxicarbonil)-1H-indol-3-il)etil)-1H-tetrazol-1-il)hexanoico (1,8 g, 3,69 mmol, 42,6 % de rendimiento).

Condición D de LCMS: tiempo de retención 2,13 min 441,2 (M+1).

Ácido (S)-2-(5-((S)-1-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-2-(1-(ter-butoxicarbonil)-1H-indol-3-il)etil)-1H-tetrazol-1-il)hexanoico

A una solución agitada de ácido (S)-2-(5-((S)-1-amino-2-(1-(ter-butoxicarbonil)-1H-indol-3-il)etil)-1H-tetrazol-1-il)hexanoico (1,8 g, 4,07 mmol) en acetonitrilo (24,88 ml) y agua (12,44 ml) enfriada a 0 °C, se agregaron Na2CO3 (6,51 ml, 13,02 mmol) y luego FMOC-OSU (1,647 g, 4,88 mmol), y se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. La mezcla de reacción se inactivó con HCl 1 N, y el pH se ajustó a 1-2. Se extrajo con acetato de etilo y se concentró para obtener el aceite crudo. El compuesto crudo se purificó mediante combi flash de fase inversa para obtener 0,88 gramos de ácido (S)-2-(5-((S)-1-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-2-(1-(ter-butoxicarbonil)-1H-indol-3-il)etil)-1H-tetrazol-1-il)hexanoico.

Condición D de LCMS: tiempo de retención 2,25 min 666,6 (M+1).

Condición H del análisis de HPLC: tiempo de retención 16,2 min 92 %.

1H NMR (400MHz, DMSO-d6) 88,45 (d, J=8,0 Hz, 1H), 8,02 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,84 (d, J=7,0 Hz, 2H), 7,76 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,60 - 7,49 (m, 2H), 7,40 - 7,26 (m, 3H), 7,26 - 7,14 (m, 2H), 5,16 (d, J=10,5 Hz, 1H), 4,18 - 4,04 (m, 2H), 3,51 - 3,36 (m, 2H), 3,17 (s, 2H), 2,28 (br. s., 1H), 1,63 - 1,46 (m, 9H), 1,19 (d, J=7,0 Hz, 2H), 1,07 (d, J=8,0 Hz, 1H), 0,75 - 0,63 (m, 2H).

Ácido (S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-(naftalen-1-il)propanoico

Se agregaron carbonocloridato de bencilo (1,081 ml, 7,67 mmol) y NaOH (8,36 ml, 8,36 mmol) al mismo tiempo a una solución agitada de ácido (S)-2-amino-3-(naftalen-1-il)propanoico (1,5 g, 6,97 mmol) en THF (7 ml) y 7 ml de NaOH 1 N a 0 °C. Las mezclas se agitaron a temperatura ambiente durante 2 horas, en cuyo momento la LC-MS mostró el pico del producto deseado. Se acidificó con HCl 1 N y se extrajo con EtOAc. Se retiró el EtOAc, y los materiales crudos obtenidos se purificaron mediante columna RediSep: 80 g de sílice

Velocidad de flujo: 60 ml/min.

Solvente: A diclorometano; solvente: B 20 % de MeOH/80 % de DCM.

Gradiente 0 %--50 % de SolB durante 20 min.

Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga para obtener el compuesto del título (2,21 g, 89 %).

Condición A del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 0,98 min; ESI-MS(+) m/z 350,08 (M+H).

2-((S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-(naftalen-1-il)propanamido)hexanoato de (S)-metilo

Se disolvieron ácido (S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-(naftalen-1-il)propanoico (2,1 g, 6,01 mmol) y HATU (2,74 g, 7,21 mmol) en CH²Cl² (25 ml) y DMF (12 ml). Las mezclas se agitaron a temperatura ambiente durante 10 min antes de que se agregaran 2-aminohexanoato de (S)-metilo, HCl (1,310 g, 7,21 mmol) y base de Hunig (3,67 ml, 21,04 mmol) en 2 ml de DMF. Las mezclas se agitaron a temperatura ambiente durante 2 horas, en cuyo momento la LC­ MS mostró conversión completa. Se inactivaron con 10 ml de HCl 1 N. Las mezclas se vertieron en 250 ml de EtOAc, se lavaron dos veces con 10 % de LiCl, una vez con salmuera. La capa orgánica luego se secó en Na2SO4 y se concentró. Los materiales crudos se purificaron mediante columna RediSep: 220 g de sílice

Velocidad de flujo: 150 ml/min

Volumen de equilibrio: 1,0 CV

Solvente: A1 hexano; solvente: B1 acetato de etilo

Gradiente 0 %--40 % de Sol B durante 15 min.

Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga para obtener el compuesto del título (1,86 g, 65 %).

Condición A del análisis de L^c M^s : Tiempo de retención = 1,14 min; ESI-MS(+) m/z 477,1 (M+H).

2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-(naftalen-1-il)etil)-1H-tetrazol-1-il)hexanoato de (S)-metilo

Un vial de presión se cargó con 2-((S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-(naftalen-1-il)propanamido)hexanoato de (S)-metilo (1,8 g, 3,78 mmol), y difenil-2-piridilfosfina (2,98 g, 11,33 mmol) en THF (35 ml), en N² se purgó con N² antes de que se agregara DIAD (2,203 ml, 11,33 mmol) por goteo. Luego, se agregó lentamente difenilfosforil azida (2,85 ml, 13,22 mmol). Las mezclas se calentaron hasta 55°C y se agitaron a 55°C durante 18 horas, en cuyo momento la LC-MS mostró el pico del producto deseado. Se enfriaron hasta temperatura ambiente y se vertieron en 200 ml de EtOAc, se lavaron con HCl 2 N, NaHCO3 saturado y salmuera. La capa orgánica luego se concentró, y el material obtenido se purificó mediante columna RediSep: 330 g de sílice Gold

Velocidad de flujo: 200 ml/min

Volumen de equilibrio: 3,0 CV

Solvente: A1 hexano; solvente: B1 acetato de etilo

Gradiente 0 %-40 % de SolB durante 15 min.

Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga para obtener el compuesto del título (533 mg, 28 %).

Condición A del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,18 min; ESI-MS(+) m/z 502,2 (M+H).

Ácido (S)-2-(5-((S)-1-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-2-(naftalen-1-il)etil)-1H-tetrazol-1-il)hexanoico

2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-(naftalen-1-il)etil)-1H-tetrazol-1-il)hexanoato de (S)-metilo (533 mg, 1,063 mmol) se disolvió en cosolvente de THF (8 ml) y MeOH (2 ml). A esta solución se agregó LiOH (1,594 ml, 3,19 mmol) en dos porciones. La LC-MS mostró conversión completa después de agitarse a temperatura ambiente durante 2 horas. El pico del producto se obtuvo a 0,99/2,0 min. La reacción se inactivó con HCl 1 N, el pH se ajustó a 1-2. Se extrajo con EtOAc. La capa orgánica luego se secó en Na2SO4 y se concentró para obtener materiales crudos.

Los materiales obtenidos anteriormente se disolvieron en 10 ml de MeOH en N². A esta solución se agregó Pd/C (170 mg, 0,159 mmol). La solución se desgasificó antes de cambiar a un globo de H². Las mezclas se agitaron en H² durante 7 horas, en cuyo momento la LC-MS mostró >95 % de conversión. El catalizador se filtró, y el solvente se retiró. Los residuos obtenidos se disolvieron en acetonitrilo (6 ml) y agua (3ml). Se enfriaron hasta 0 °C, se agregó Na2CO3 (1,594 ml, 3,19 mmol) y luego carbonato de (9H-fluoren-9-il)metil (2,5-dioxopirrolidin-1-ilo) (394 mg, 1,169 mmol). Las mezclas se agitaron a temperatura ambiente durante 3 horas, en cuyo momento la LC-MS mostró conversión completa. Se inactivaron con HCl 1 N, se ajustaron a pH 1--2 y se extrajeron con EtOAc. La capa orgánica luego se concentró al vacío, y los materiales crudos obtenidos se purificaron mediante columna RediSep: 40g de sílice

Velocidad de flujo: 40 ml/min

Volumen de equilibrio: 5,0 CV

Solvente: A diclorometano

Solvente: B 20 % de MeOH/DCM

Gradiente 0 %--50 % de SolB durante 15 min.

Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga para obtener el compuesto del título (429 mg, 63 %, 3 etapas).

Condición A del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,18 min; ESI-MS(+) m/z 576,2 (M+H).

1H NMR (400MHz, DMSO-de) □ 14,15-13,65(s, 1H), 8,47 (d, J=8,5 Hz, 1H), 8,05 (s, 1H), 7,95 - 7,89 (m, 1H), 7,89 - 7,76 (m, 3H), 7,63 - 7,49 (m, 5H), 7,43 - 7,32 (m, 3H), 7,26 (d, J=6,5 Hz, 1H), 7,23 (d, J=8,0 Hz, 1H), 5,51 - 5,31 (m, 1H), 5,31 - 5,18 (m, 1H), 4,17 - 4,04 (m, 3H), 3,81 - 3,71 (m, 2H), 2,24 (br. s., 2H), 2,85-2,1(m, 2H), 1,23 - 1,08 (m, 2H), 0,75 - 0,62 (m, 3H).

(1-oxo-3-fenilpropan-2-il)carbamato de (S)-bencilo

A una mezcla de (1-hidroxi-3-fenilpropan-2-il)carbamato de (S)-bencilo (0,457 g, 1,6 mmol) en DCM ^{( 6} ml), se agregó periodinano de Dess-Martin (0,814 g, 1,920 mmol). Después de 2 horas, la LCMS mostró conversión completa después de agitarse a temperatura ambiente durante ⁶ horas. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano y se lavó con NaOH 1 N frío. La capa orgánica se secó en MgSO⁴ , se filtró y se concentró. Se usó en la siguiente etapa, sin purificación adicional.

Condición A del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 0,85 min; ESI-MS(+) m/z 284,0 (M+H).

(1-fenilbut-3-in-2-il)carbamato de (S)-bencilo

Los materiales de inicio, (1-oxo-3-fenilpropan-2-il)carbamato de (S)-bencilo (400 mg, 1,412 mmol) se disolvieron en MeOH seco ^{( 8} ml). Se enfriaron hasta 0 °C, y luego se agregó K²CO³ (390 mg, 2,82 mmol), seguido de (1-diazo-2-oxopropil)fosfonato de dimetilo (0,318 ml, 2,118 mmol). Las mezclas se calentaron lentamente hasta temperatura ambiente y se agitaron durante 3 horas. La LC-MS mostró conversión parcial. El pico del producto deseado fue a 0,97/2,0 min. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche, en cuyo momento la LC-MS mostró conversión completa. Las mezclas se vertieron en HCl 0,5 N, se extrajeron con acetato de etilo. La capa orgánica luego se secó en Na2SO4 y se concentró. Los materiales crudos luego se purificaron en columna ISCO de 24 g.

SolA: CH²Cb; SolB: 20 % de MeOH/CH²Cl². gradiente 0--50 % de SolB durante 15 min, 50 % de SolB, retención de ¹⁰ min.

Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga para obtener el compuesto del título (240 mg, 61 %).

Condición A del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 0,96 min; ESI-MS(+) m/z 280,1 (M+H).

2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-feniletil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)propanoato de (S)-ter-butilo

Los materiales de inicio, (1-fenilbut-3-in-2-il)carbamato de (S)-bencilo (85 mg, 0,304 mmol) y 2-azidopropanoato de (S)-ter-butilo (208 mg, 1,217 mmol) se disolvieron en tolueno (4 ml). Se purgaron con N² antes de que se agregara catalizador de Ru [113860-07-4] (16,54 mg, 0,015 mmol). Las mezclas se agitaron a 100 °C durante ¹⁶ horas, en cuyo momento la LC-MS mostró conversión completa. El solvente se retiró. Los residuos obtenidos se purificaron en columna de HPLC de fase inversa: Luna 30*100mm

SolA: 95 % de H²O^{/ 5} % de CH3CN/0,1 % de TFA; SolB: 5 % de H²O^{/ 9 5} % de CH3CN/0,1 % de TFA

Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga para obtener el compuesto del título (56 mg, 41%).

Condición A del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,01 min; ESI-MS(+) m/z 451,1 (M+H)

Ácido (S)-2-(5-((S)-1-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-2-feniletil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)propanoico

Los materiales de inicio, 2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-feniletil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)propanoato de (S)-terbutilo (142 mg, 0,315 mmol) se disolvieron en MeOH (4 ml), en N². El sistema se purgó con N² antes de que se agregara Pd/C (33,5 mg, 0,032 mmol). Las mezclas se agitaron a temperatura ambiente en un globo de H² durante 7 horas, en cuyo momento la LC-MS mostró conversión completa al intermediario 2-(5-((S)-1-amino-2-feniletil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)propanoato de (S)-ter-butilo. El catalizador se filtró, y el solvente se retiró. Los residuos obtenidos se disolvieron en acetonitrilo (4 ml) y agua (2 ml). Se enfriaron hasta 0 °C, y a la solución se agregó N ²CO³ (0,788 ml, 1,576 mmol), luego carbonato de (9H-fluoren-9-il)metil (2,5-dioxopirrolidin-1-ilo) (117 mg, 0,347 mmol) en 1 ml de CH³CN. Las mezclas de reacción se calentaron hasta temperatura ambiente durante 2 horas. La LC-MS mostró que los materiales de inicio se consumieron. Se acidificaron con HCl 1 N hasta pH 2 y se extrajeron con acetato de etilo. La capa orgánica luego se secó en Na2SO4 y se concentró. Los materiales obtenidos luego se trataron con 20 % de TFA en CH²Cl² (5ml) a temperatura ambiente durante 7 horas. La LC-MS mostró conversión completa. Los materiales crudos obtenidos se purificaron en HPLC de fase inversa.

Columna: Luna 30*100mm

SolA: 95 % de H²O^{/ 5} % de CH3CN/0,1 % de TFA; SolB: 5 % de H²O^{/ 9 5} % de CH3CN/0,1 % de TFA

Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga para obtener el compuesto del título (68 mg, 44 %, 3 etapas).

Condición A del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 0,95 min; ESI-MS(+) m/z 483,1 (M+H).

Intermediario de resina A: . ((S)-1-(((S)-4-amino-1-((S)-2-(((5R,8S,11S,14S,17S,20S,23S,29S,32S)-17,23-bis((1H-indol-3-il)metil)-1 -amino-11,14-dibutil-8-(3-guanidinopropil)-20-(hidroximetil)-33-(1 H-imidazol-5-il)-29-isobutil-5-(mercaptometil)-12,15,27-trimetil-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecaoxo-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-decaazatritriacontan-32-il)carbamoil)pirrolidin-1-il)-1,4-dioxobutan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)(metil)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metilo, resina de amida Seiber

A un reactor de 125 ml, se agregó resina Sieber (1410 mg, 1 mmol), y el recipiente se colocó en el sintetizador de péptidos para microondas CEM Liberty. Luego, los siguientes procedimientos se realizaron de manera secuencial:

Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de expansión de resina"; Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar" con Fmoc-Gly-OH; Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar’ con Fmoc-Cys(Trt)-OH; Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar’ con Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento de doble acople" con Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento de doble acople" con Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento de doble acople" con Fmoc-Trp(Boc)-OH; Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar’ con Fmoc-Ser(tBu)-OH;

Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar’ con Fmoc-Trp-OH;

Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar’ con Fmoc-Sar-OH;

Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento de doble acople" con Fmoc-Leu-OH;

Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar’ con Fmoc-His(Trt)-OH;

^{Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estánda} r ’ ^{con Fmoc-Pro-OH;}

Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento de doble acople" con Fmoc-Asn(tBu)-OH;

La resina resultante se transfirió a un tubo de polipropileno de 100 ml equipado con una frita y se lavó con DCM (40 ml x 3). Por último, la resina se secó al vacío y se usó como intermediario para la síntesis.

Se siguió la microescisión A.

Condición A del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,0 min, ESI-MS(+) m/z 966,6 (M+2H ¹ CO²).

Preparación del Ejemplo 1001 y el Ejemplo 1002

Comenzando con el Intermediario de resina A, la resina resultante se trató con los siguientes procedimientos que se realizaron secuencialmente:

Se siguió el “procedimiento A de acoplamiento manual” para el ácido (S)-2-(5-((S)-1-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-2-feniletil)-1H-tetrazol-1-il)propanoico

"Procedimiento B de acoplamiento de ácido cloroacético"

“Método C de desprotección global’’

“Método D de ciclización”

Ejemplo 1001, Isómero 1. El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 |jm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 20-60% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 2,1 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 95%.

Condición D del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,57 min; ESI-MS(+) m/z 932,15 (M+2H) Condición E del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,44 min; ESI-MS(+) m/z 932,35 (M+2H).

Ejemplo 1002, Isómero 2. El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 20-60% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 60% de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 1,5 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 99%.

Condición D del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,79 min; ESI-MS(+) m/z 932,15 (M+2H).

Condición E del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,66 min; ESI-MS(+) m/z 931,85 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1003 y el Ejemplo 1004

Comenzó con el Intermediario de resina A. La resina resultante se trató con los siguientes procedimientos que se realizaron secuencialmente:

Se siguió el “procedimiento A de acoplamiento manual” para el ácido (S)-2-(5-((S)-1-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-2-feniletil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)propanoico

"Procedimiento B de acoplamiento de ácido cloroacético"

“Método C de desprotección global"

“Método C de ciclización"

Luego se siguieron las secuencias de síntesis generales “Procedimiento B de acoplamiento de ácido cloroacético", “Método C de desprotección global" y ‘‘Método D de ciclización".

Ejemplo 1003, Isómero. El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 20-65% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 65% de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 0,9 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de ^{10 0} %.

Condición D del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,54 min; ESI-MS(+) m/z 931,85 (M+2H) Condición E del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,41 min; ESI-MS(+) m/z 931,90 (M+2H).

Ejemplo 1004, Isómero 2. El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 20-60% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 60% de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 1,9 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 96%.

Condición D del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,55 min; ESI-MS(+) m/z 931,90 (M+2H) Condición E del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,42 min; ESI-MS(+) m/z 931,60 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1005

El tetrazol del Ejemplo 1005 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: "Método A de Symphony: procedimiento de expansión de resina", “Método A de Symphony: procedimiento de acoplamiento estándar", “Método A de Symphony: Procedimiento B de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento B de acoplamiento de ácido cloroacético", “Método C de desprotección global" y “Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 25-65% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 10 minutos a 65% de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 3,6 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 98%.

Condición D del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,83 min; ESI-MS(+) m/z 937,9 (M+2H)

Condición E del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,76 min; ESI-MS(+) m/z 938,0 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1006

El tetrazol del Ejemplo 1006 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: "Método A de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método A de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar”, “Método A de Symphony: Procedimiento B de acoplamiento a la amina secundaria”, “Procedimiento B de acoplamiento de ácido cloroacético”, “Método C de desprotección global” y “Método D de ciclización”. El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 15-65% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 3,1 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 96%.

Condición D del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,69 min; ESI-MS(+) m/z 959,3 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1007

El tetrazol del Ejemplo 1007 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: "Método A de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método A de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar”, “Método A de Symphony: Procedimiento B de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento B de acoplamiento de ácido doroacético", “Método C de desprotección global" y “Método D de ciclización”. El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 15-65% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 10 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 1,4 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de ^{10 0} %.

Condición D del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,71 min; ESI-MS(+) m/z 943,4 (M+2H) Condición E del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,69 min; ESI-MS(+) m/z 943,8 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1010

El Ejemplo 1010 se preparó en resina Rink de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: "Método A de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método A de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar” , “Método A de Symphony: Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método A de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, ‘‘Método F de desprotección global" y ‘‘Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18300, 19 x 250 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 25-70% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El material se volvió a purificar mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 25-70% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 1,9 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 98%. Condición D del análisis de ^l C^m S: Tiempo de retención = 1,73 min; ESI-MS(+) m/z 954,0 (M+2H).

Condición E del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,67 min; ESI-MS(+) m/z 954,2 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1012

El Ejemplo 1012 se preparó en resina Rink de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: "Método A de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método A de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar’, “Método A de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método A de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final", ‘‘Método F de desprotección global" y ‘‘Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 15-65% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 3,2 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 100 %.

Condición D del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,51 min; ESI-MS(+) m/z 940,5 (M+2H).

Condición E del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,44 min; ESI-MS(+) m/z 940,3 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1013

El Ejemplo 1013 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: "Método B de Prelude: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Prelude: Procedimiento de acoplamiento estándar”, “Método B de Prelude; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Método B de Prelude: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida”, “Método B de Prelude: Procedimiento de recubrimiento final", “Método F de desprotección global" y “Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 10-65% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El material se volvió a purificar mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 gm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 20-65% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 3,2 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 100 %. Condición D del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,54 min; ESI-MS(+) m/z 949,0 (M+2H). Condición E del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,50 min; ESI-MS(+) m/z 949,3 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1014

El Ejemplo 1014 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: "Método B de Prelude: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Prelude: Procedimiento de acoplamiento estándar", “Método B de Prelude: Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Método B de Prelude: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida", “Método B de Prelude: Procedimiento de recubrimiento final’, ‘‘Método F de desprotección global" y ‘‘Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 gm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 10-65% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El material se volvió a purificar mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 gm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 15-60% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 4,8 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 100 %. Condición D del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,43 min; ESI-MS(+) m/z 914,9 (M+2H). Condición E del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,43 min; ESI-MS(+) m/z 914,9 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1050

El Ejemplo 1050 se preparó en resina Rink de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar” , “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, ‘‘Método F de desprotección global" y ‘‘Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 10-65% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 2,0 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 98%. Condición D del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,47 min; ESI-MS(+) m/z 940,3 (M+2H).

Condición E del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,42 min; ESI-MS(+) m/z 940,6 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1051

El Ejemplo 1051 se preparó en resina Rink de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar", “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, ‘‘Método F de desprotección global" y “Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de ac etato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 10-65% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 1,9 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 95%. Condición D del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,43 min; ESI-MS(+) m/z 914,8 (M+2H).

Condición E del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,44 min; ESI-MS(+) m/z 915,2 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1052

El Ejemplo 1052 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar”, “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, ‘‘Método F de desprotección global’ y ‘‘Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 10-65% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 2,4 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 93%.

Condición D del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,58 min; ESI-MS(+) m/z 967,0 (M+2H).

Condición E del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,52 min; ESI-MS(+) m/z 966,8 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1053

El Ejemplo 1053 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, “Método F de desprotección global’ y “Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con 10 mM de

acetato de amonio; Gradiente: 10-65% de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 4,3 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 91%.

Condición D del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,38 min; ESI-MS(+) m/z 936,5 (M+2H).

Condición E del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,48 min; ESI-MS(+) m/z 936,1 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1054

El Ejemplo 1054 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar”, “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final", ‘‘Método D de desprotección global" y ‘‘Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 gm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 10-65 % de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El material se volvió a purificar mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 gm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 15-60 % de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 2,2 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 100 %.

Condición D del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,44 min; ESI-MS(+) m/z 929,0 (M+2H).

Condición E del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,39 min; ESI-MS(+) m/z 929,0 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1055

El Ejemplo 1055 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar”, “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final", ‘‘Método D de desprotección global" y ‘‘Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 15-65 % de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El material se volvió a purificar mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 20-60 % de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 1,1 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 93 %.

Condición D del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,50 min; ESI-MS(+) m/z 907,4 (M+2H).

Condición E del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,49 min; ESI-MS(+) m/z 907,9 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1056

El Ejemplo 1056 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar", “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final", ‘‘Método F de desprotección global’’ y “Método D de ciclización’’. El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 40-80 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 10,8 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 100 %.

Condición H del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,41 min; ESI-MS(+) m/z 937,4 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 2,03 min; ESI-MS(+) m/z 936,6 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1057

El Ejemplo 1057 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida", “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final’’, “Método F de desprotección global’’ y “Método D de ciclización”. El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 45-85 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El material se volvió a purificar mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 5-45 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 3,3 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 97 %.

Condición H del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,68 min; ESI-MS(+) m/z 634,4 (M 3H) Condición I del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 2,35 min; ESI-MS(+) m/z 947,0 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1058

El Ejemplo 1058 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar", “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida", “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, ‘‘Método F de desprotección global" y “Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 50-90 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 5,7 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 97 %.

Condición H del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,81 min; ESI-MS(+) m/z 986,9 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 2,50 min; ESI-MS(+) m/z 986,8 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1059

El Ejemplo 1059 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar", “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida", “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, ‘‘Método F de desprotección global" y “Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 |jm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 15-55 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 3,6 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 94 %.

Condición H del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,61 min; ESI-MS(+) m/z 934,4 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 3,01 min; ESI-MS(+) m/z 934,3 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1060

El Ejemplo 1060 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida", “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, ‘‘Método F de desprotección global" y “Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 jm ; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 10-50 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El material se volvió a purificar mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 jm ; fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 40-80 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 1,1 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 97 %.

Condición H del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,52 min; ESI-MS(+) m/z 960,9 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 2,81 min; ESI-MS(+) m/z 960,7 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1061

El Ejemplo 1061 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar", “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida", “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, ‘‘Método F de desprotección global" y “Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 50-100 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El material se volvió a purificar mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 20-60 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 14,4 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 96 %.

Condición H del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,54 min; ESI-MS(+) m/z 956,3 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 2,84 min; ESI-MS(+) m/z 956,8 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1100

El Ejemplo 1100 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar", “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final’’, ‘‘Método F de desprotección global’ y ‘‘Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 15-65 % de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 5,9 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 99 %.

Condición D del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,53 min; ESI-MS(+) m/z 893,2 (M+2H).

Condición E del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,51 min; ESI-MS(+) m/z 893,3 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1101

El Ejemplo 1101 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar”, “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final’’, “Método F de desprotección global’ y “Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 35-75 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 3,2 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 98 %.

Condición H del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,404 min; ESI-MS(+) m/z 930,85 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 2,715 min; ESI-MS(+) m/z 930,90 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1102

El Ejemplo 1102 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar”, “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, ‘‘Método F de desprotección global’ y ‘‘Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 35-75 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 19,0 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 98 %.

Condición H del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,796 min; ESI-MS(+) m/z 941,20 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 2,389 min; ESI-MS(+) m/z 940,95 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1103

El Ejemplo 1103 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar”, “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, “Método F de desprotección global’ y “Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de

amonio; gradiente 15-55 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 1,3 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 98 %.

Condición H del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,60 min; ESI-MS(+) m/z 932,1 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 2,70 min; ESI-MS(+) m/z 932,8 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1104

El Ejemplo 1104 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar”, “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, ‘‘Método F de desprotección global" y ‘‘Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 35-75 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 1,8 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 95 %.

Condición H del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,537 min; ESI-MS(+) m/z 961,65 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 2,988 min; ESI-MS(+) m/z 961,10 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1105

El Ejemplo 1105 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar”, “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, ‘‘Método F de desprotección global" y ‘‘Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 40-80 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El material se volvió a purificar mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 10-55 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 3,9 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 92 %.

Condición H del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,622 min; ESI-MS(+) m/z 935,80 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 3,125 min; ESI-MS(+) m/z 935,25 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1106

Peso molecular: 1927,13

El Ejemplo 1106 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar", “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, “Método F de desprotección global’ y “Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 40-80 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El material se volvió a purificar mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 15-55 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 6,5 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 97 %.

Condición H del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,419 min; ESI-MS(+) m/z 964,80 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 2,875 min; ESI-MS(+) m/z 946,95 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1107

El Ejemplo 1107 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar”, “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, ‘‘Método F de desprotección global’ y ‘‘Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 15-55 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El material se volvió a purificar mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 40-80 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 0,8 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 100 %.

Condición H del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,624 min; ESI-MS(+) m/z 939,80 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 3,090 min; ESI-MS(+) m/z 939,85 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1108

El Ejemplo 1108 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina’’, “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar", “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria’’, “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final’’, “Método F de desprotección global’ y “Método D de ciclización”. El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 15-55 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 1,0 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 100 %.

Condición H del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,702 min; ESI-MS(+) m/z 942,90 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 3,245 min; ESI-MS(+) m/z 942,95 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1109

El Ejemplo 1109 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina’’, “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar", “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria’’, “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final’’, “Método F de desprotección global’ y “Método D de ciclización”. El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 15-55 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 2,5 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 100 %.

Condición I del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 2,73 min; ESI-MS(-) m/z 913,6 (M-2H).

Preparación del Ejemplo 1110

El Ejemplo 1110 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar”, “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, ‘‘Método F de desprotección global" y ‘‘Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 40-80 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 4,4 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 94 %.

Condición H del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,494 min; ESI-MS(+) m/z 936,15 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 2,966 min; ESI-MS(+) m/z 935,80 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1111 (no de acuerdo con la invención)

El Ejemplo 1111 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar”, “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, “Método F de desprotección global’ y “Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con 10 mM de acetato de

amonio; gradiente 45-85 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 19,8 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 99 %.

Condición H del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,56 min; ESI-MS(+) m/z 933,4 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 2,71 min; ESI-MS(+) m/z 933,4 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1113 (no de acuerdo con la invención)

El Ejemplo 1113 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar”, “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, ‘‘Método F de desprotección global’ y ‘‘Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 45-85 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El material se volvió a purificar mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 10-50 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 4,2 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 98 %.

Condición H del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,53 min; ESI-MS(+) m/z 926,1 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 2,61 min; ESI-MS(+) m/z 925,8 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1114 (no de acuerdo con la invención)

El Ejemplo 1114 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, de los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar"’, “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, ‘‘Método F de desprotección global" y ‘‘Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 45-85 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El material se volvió a purificar mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de

acetato de amonio; gradiente: 15-55 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 11,0 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 98 %.

Condición H del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,57 min; ESI-MS(+) m/z 925,9 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 2,65 min; ESI-MS(+) m/z 925,8 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 1115

El Ejemplo 1115 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 1001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: “Método B de Symphony: Procedimiento de expansión de resina", “Método B de Symphony: Procedimiento de acoplamiento estándar”, “Método B de Symphony; Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria", “Procedimiento A de acoplamiento manual”, “Método B de Symphony: Procedimiento de recubrimiento final”, “Método F de desprotección global’ y “Método D de ciclización". El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con 10 mM de acetato de amonio; gradiente: 45-90 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El material se volvió a purificar mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 10-50 % de B durante 30 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 1,2 mg, y la pureza calculada mediante el análisis de LCMS fue de 100 %.

Condición H del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 1,60 min; ESI-MS(+) m/z 938,3 (M+2H).

Condición I del análisis de LCMS; Tiempo de retención = 2,80 min; ESI-MS(+) m/z 940,3 (M+2H).

Datos analíticos;

Espectrometría de masa: “ESI-MS(+)” significa ionización por electrospray-espectrometría de masa realizadas en modo de ion positivo; “ESI-MS(-)” significa ionización por electrospray-espectrometría de masa realizadas en modo de ion negativo; “ESI-HRMS(+)” significa ionización por electrospray-espectrometría de masa de alto rendimiento realizadas en modo de ion positivo; “ESI-HRMS(-)” significa ionización por electrospray-espectrometría de masa de alto rendimiento realizadas en modo de ion negativo. Las masas detectadas se informan de acuerdo con la designación de unidad “m/z". En general, los compuestos con masas exactas mayores de 1000 se detectaron como iones de doble carga o de triple carga.

Los análisis de espectrometría de masa de alta resolución (HRMS) se realizaron en un espectrómetro de masa Orbitrap mediante transformada de Fourier (Exactive, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) usando ionización de electrospray positiva o negativa que operaba a una resolución de 25,000 (anchura a media altura, FWHM). El instrumento se calibró diariamente de acuerdo con las especificaciones del fabricante, lo cual produjo errores de precisión de masa < 5 ppm. El software operativo, Xcalibur, se usó para calcular los valores teóricos de la masa con respecto a la carga y para procesar los datos obtenidos.

Condición A del análisis de LCMS:

Columna: BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm; fase móvil A: agua con 0,05 % de TFA; fase móvil B: acetonitrilo con 0,05 % de TFA; temperatura: 50 °C; gradiente: 2 % de B a 98 % de B durante 1 minuto, luego una retención de 0,5 minutos a 98 % de B; flujo: 0,8 ml/min; detección: UV a 220 nm.

Condición D del análisis de LCMS:

Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 10 mM de acetato de amonio; temperatura: 50 °C; gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, luego un mantenimiento de 0,75 minutos a 100 % de B; flujo: 1,11 ml/min; detección: UV a 220 nm.

Condición E del análisis de LCMS:

Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; temperatura: 50 °C; gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, luego un mantenimiento de 0,75 minutos a 100 % de B; flujo: 1,11 ml/min; detección: UV a 220 nm.

Procedimientos generales:

Método A de CEM:

Todas las manipulaciones se realizaron mediante automatización en un sintetizador de péptidos para microondas CEM Liberty (CEM Corporation). A menos que se indique lo contrario, todos los procedimientos se realizaron en un tubo de polipropileno de 30 o 125 ml equipado con una frita en la parte inferior a una unidad de microondas CEM Discovery. El tubo se conecta con un sintetizador CEM Liberty a través de la parte inferior y superior del tubo. Se pueden agregar DMF y DCM a través de la parte superior e inferior del tubo, lo que produce el lavado parejo de los laterales del tubo. Todas las soluciones se retiran a través de la parte inferior del tubo, excepto durante la transferencia de la resina desde la parte superior. El “burbujeo periódico” describe un breve burbujeo de gas de N² a través de la frita de la parte inferior. En general, no se usaron soluciones de aminoácidos de más de tres semanas desde de la preparación. Se usó solución HATU dentro de los 5 días de preparación. DMF = dimetilformamida; HCTU = 2-(6-cloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; HATU = hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido; DIPEA = diisopropiletilamina; Sieber = Fmoc-amino-xanten-3-iloxi, en donde “3-iloxi” describe la posición y el tipo de conectividad con la resina de poliestireno. La resina usada es polímero Merrifield (poliestireno) con un ligador Sieber (protegido por Fmoc en el nitrógeno); malla de 100-200, 1% de DVB, 0,71 mmol/g de carga. Los aminoácidos comunes usados se enumeran a continuación con grupos protectores de cadenas laterales que se indican entre paréntesis.

Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

Los procedimientos del “Método A de CEM” describen un experimento realizado a una escala 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina. Esta escala corresponde aproximadamente a 140 mg de la resina Sieber-Merrifield descrita anteriormente. Todos los procedimientos se pueden realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Antes del acoplamiento de los aminoácidos, todas las secuencias de síntesis de péptidos comenzaron con un procedimiento de expansión de resina, descrito a continuación como “procedimiento de expansión de resina”. En el acoplamiento de los aminoácidos al terminal N de la amina primaria, se usó el “procedimiento de acoplamiento simple” descrito a continuación. En el acoplamiento de los aminoácidos al terminal N de la amina secundaria, se usó el “Procedimiento de acoplamiento a la amina secundaria” descrito a continuación. El acoplamiento del grupo cloroacetilo al terminal N del péptido se describe mediante el “procedimiento de acoplamiento de cloruro de cloroacetilo” o “procedimiento de acoplamiento de ácido cloroacético” descrito anteriormente.

Procedimiento de expansión de resina:

A un tubo cónico de polipropileno de 50 ml, se agregó resina Merrifield:Sieber (140 mg, 0,100 mmol). Luego, se agregó DMF (7 ml) al tubo seguida de DCM (7 ml). La resina luego se transfirió al recipiente de reacción de la parte superior del recipiente. El procedimiento se repitió dos veces más. Se agregó DMF (7 ml) y luego DCM (7 ml). La resina se expandió con burbujeo de N² de la parte inferior del recipiente de reacción durante 15 minutos antes de que el solvente drenara a través de la frita.

Procedimiento de acoplamiento estándar:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó una solución de piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de piperdina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq.), luego ^hA^t U (0,5 M en DMF, 1,0 ml, 5 eq.) y finalmente DIPEA (2 M en NMP, 0,5 ml, 10 eq.). La mezcla se mezcló mediante burbujeo de N² durante 5 minutos a 75 °C para todos los aminoácidos, excepto Fmoc-Cys(Trt)-OH y Fmoc-His(Trt)-OH que se acoplan a 50 °C, la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se hizo burbujear periódicamente durante 2 minutos a 65 °C, luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento de doble acople:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó una solución de piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de piperdina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq.), luego ^hA^t U (0,5 M en DMF, 1,0 ml, 5 eq.) y finalmente DIPEA (2 M en NMP, 0,5 ml, 10 eq.). La mezcla se mezcló mediante burbujeo de N² durante 5 minutos a 75 °C para todos los aminoácidos, excepto Fmoc-Cys(Trt)-OH y Fmoc-His(Trt)-OH que se acoplan a 50 °C, la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. Al recipiente de reacción, se agregó el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq.), luego HATU (0,5 M en ^d M^f , 1,0 ml, 5 eq.) y finalmente DIPEA (2 M en NMP, 0,5 ml, 10 eq.). La mezcla se mezcló mediante burbujeo de N² durante 5 minutos a 75 °C para todos los aminoácidos, excepto Fmoc-Cys(Trt)-OH y Fmoc-His(Trt)-OH que se acoplan a 50 °C, la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se hizo burbujear periódicamente durante 2 minutos a 65 °C, luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó una solución de piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de piperdina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. Al recipiente de reacción, se agregó la solución de aminoácidos (1,25 ml a 5 ml, 2,5 eq. a 10 eq.) que contenía HATU (2,5 eq a 10 eq.), y finalmente DIPEA (2 M en NMP, 0,5 ml a 1 ml, 20 eq.). La mezcla se mezcló mediante burbujeo de N2 durante 5 minutos a 2 horas de 25 °C a 75 °C, luego la solución de reacción drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. Al recipiente de reacción, se agregó una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se hizo burbujear periódicamente durante 2 minutos a 65 °C, luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: lavado con DMF (7 ml) de la parte superior, seguido de lavado con DMF (7 ml) de la parte inferior y, finalmente, lavado con DMF (7 ml) de la parte superior. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento A de acoplamiento de cloruro de cloroacetilo:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregaron 3,0 ml de una solución de DIPEA (4,0 mmol, 0,699 ml, 40 eq.) y cloruro de cloroacetilo (2,0 mmol, 0,160 ml, 20 eq.) en DMF. La mezcla se agitó periódicamente durante 12 a 18 h, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó CH²Cl² (2,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita.

Procedimiento A de acoplamiento de ácido cloroacético:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregó piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. Al recipiente de reacción, se agregaron DMF (2,0 ml), ácido cloroacético (1,2 mmol, 113 mg, 12 eq.) y N,N'-diisopropilcarbodiimida (1,2 mmol, 0,187 ml, 12 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 12 a 18 h, y luego la solución drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces de la siguiente manera: para cada lavado, se agregó CH²Cl² (2,0 ml) a través de la parte superior del recipiente, y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de que la solución drenara a través de la frita.

Método B de desprotección global:

Todas las manipulaciones se realizaron de manera manual, a menos que se indique lo contrario. El procedimiento del “Método B de desprotección global” describe un experimento realizado a una escala de 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina. El procedimiento se puede realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Se preparó una “solución de desprotección” usando ácido trifluoroacético:triisopropilsilano:ditiotreitol (94:3:3 v:v:p). La resina se retiró del recipiente de reacción y se transfirió a una jeringa de 25 ml equipada con una frita. A la jeringa se agregó la “solución de desprotección” (5,0 ml). La mezcla se mezcló en un agitador durante 5 minutos. La solución se filtró y se diluyó en dietiléter (30 ml). El sólido precipitado se centrifugó durante 3 minutos. La solución sobrenadante decantó, y el sólido se volvió a suspender en dietiléter (25 ml). La suspensión se centrifugó durante 3 minutos. El sobrenadante decantó, y el sólido restante se suspendió en dietiléter (25 ml). La suspensión se centrifugó durante 3 minutos. El sobrenadante decantó, y el sólido restante se secó en alto vacío. El péptido crudo se obtuvo como un sólido blanco a blancuzco.

Método C de ciclización:

Todas las manipulaciones se realizaron de manera manual, a menos que se indique lo contrario. El procedimiento del “Método C de ciclización” describe un experimento realizado a una escala de 0,100 mmol, en donde la escala se determina de acuerdo con la cantidad de ligador Sieber unido a la resina que se usó para generar el péptido. Esta escala no se basa en una determinación directa de la cantidad de péptido usado en el procedimiento. El procedimiento se puede realizar a una escala superior a 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Los sólidos de péptidos crudos se disolvieron en una solución de acetonitrilo:amortiguador de bicarbonato de amonio acuoso 0,1 M (11 ml:24 ml), y luego la solución se ajustó cuidadosamente a pH = 8,5-9,0 usando NaOH acuoso (1,0 M). Luego la solución se mezcló usando un agitador durante 12 a 18 horas. La solución de reacción se concentró, y luego el residuo se disolvió en acetonitrilo:agua. Esta solución se sometió a purificación mediante HPLC de fase inversa para obtener el péptido cíclico deseado.

Preparación de ácido (S)-2-(5-((S)-1-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-2-feniletil)-1H-tetrazol-1-il)-3-fenilpropanoico [Fmoc-Phey[CN4]-L-Phe-OH].

Esquema:

Etapa 1:

Una solución de benciléster de L-fenilalanina, clorhidrato (2 g, 6,85 mmol), Z-Phe-OH (2,257 g, 7,54 mmol), DIPEA (2,99 ml, 17,14 mmol) y DCM (100 ml) se trató con 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (1,120 g, 8,23 mmol) y EDC (1,577 g, 8,23 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 15 h. La mezcla se lavó con NaHCO3 saturado (2 x 100 ml), HCl 1 M (2 x 50 ml) y salmuera (50 ml), se secó (Na2SO4) y se concentró a presión reducida para obtener 2-((S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-fenilpropanamido)-3-fenilpropanoato de (S)-bencilo (3,2 g, 5,96 mmol, 87 % de rendimiento) como un sólido blanco,1H NMR (400MHz, DMSO-d6) 87,42 - 7,11 (m, 21H), 4,96 (d, J=2,0 Hz, 4H), 4,63 - 4,45 (m, 1H), 4,06 - 3,91 (m, 2H), 3,34 - 2,96 (m, 3H), 2,85 (br. s., 4H).

Etapa 2 (Schroeder, G. M.; Marshall, S.; Wan, H.; Purandare, A. V. Tetrahedron Lett, 2010, 51, 1404-1406.):

Un vial de presión se cargó con 2-((S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-fenilpropanamido)-3-fenilpropanoato de (S)-bencilo (1,0 g, 1,864 mmol) y difenil-2-piridilfosfina (3,17 g, 7,45 mmol) en THF (9,32 ml), en N². La solución se purgó con N² antes de agregar DIA^d (1,449 ml, 7,45 mmol) por goteo. La reacción se agitó durante 5 min. Luego se agregó difenilfosforil azida (1,606 ml, 7,45 mmol) por goteo durante 30 min. Después de que se completó la adición, no hubo más formación de nitrógeno, el tubo sellado se cerró, y la reacción se agitó a 55 °C durante 4 horas.

La reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se vertió en acetato de etilo (200 ml), se lavó con HCl 1 N (100 ml), NaHCO3 saturado (100 ml) y salmuera (100 ml). La capa orgánica se secó en sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró para obtener un aceite naranja. La purificación mediante cromatografía de gel de sílice usando 100 % de hexanos a 60 % de acetato de etilo como eluyente produjo 660 mg de 2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-feniletil)-1H-tetrazol-1-il)-3-fenilpropanoato de (S)-bencilo con baja pureza. Segunda purificación mediante HPLC preparativa usando las siguientes condiciones: Columna: Phenomenex Luna 5u C18(2) 100A 250 x 21,2 mm AXIA packed (10-100 mg) #520551-2. Fase móvil A: 0,1 % de TFA en agua; fase móvil B: 0,1 % de TFA en acetonitrilo; gradiente: 50-80 % de B durante 20 minutos, luego un gradiente de 95 % de B durante 10 minutos; flujo: 15 ml/min; detección: UV a 220 nm. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. 2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-feniletil)-1H-tetrazol-1-il)-3-fenilpropanoato de (S)-bencilo se obtuvo como un sólido higroscópico beige en 60,0 mg de rendimiento en 70 % de pureza según análisis mediante LC/MS. Condición A de análisis: Tiempo de retención = 1,82 min; ESI-MS(+) m/z 562,5 (M+H).

Etapa 3:

Una solución de 2-(5-((S)-1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-feniletil)-1H-tetrazol-1-il)-3-fenilpropanoato de (S)-bencilo (60 mg, 0,107 mmol) en MeoH (534 pl) se hidrogenó en 10 % de paladio sobre carbón (22,74 mg, 0,021 mmol) usando hidrógeno de un globo de látex durante 2 h. El catalizador se retiró mediante filtración, y el filtrado se concentró a presión reducida para obtener un sólido gomoso blanco. El producto se disolvió en MeCN (2 ml) y agua (2 ml) y Et3N (100 pl) y se trató con FMOC-OSu (36,0 mg, 0,107 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 h. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (50 ml), se lavó con HCl 1 M (2 x 20 ml) y salmuera (20 ml), se secó (Na2SO4) y se concentró a presión reducida para obtener Fmoc-Phey[CN4]-L-Phe-OH [ácido (S)-2-(5-((S)-1-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-2-feniletil)-1H-tetrazol-1-il)-3-fenilpropanoico] (42 mg, 0,075 mmol, 70 % de rendimiento) como un sólido amarillo. Se calculó, según el análisis mediante LC/MS, que la pureza del producto fue de 64 %.

Condición A del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,70 min; ESI-MS(+) m/z 560,5 (M+H).

Preparación de ácido 2-(5-(1-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)ciclohexil)-1H-tetrazol-1-il)acético [Fmoc-Accey[CN4]-Gly-OH.

Esquema:

Etapa 1.

Una solución de ácido 2-(5-(1-(bencilamino)ciclohexil)-1H-tetrazol-1-il)acético (Chembridge; CAS N. ° 915920-47-7) (0,500 g, 1,585 mmol) en MeOH (7,48 ml) se hidrogenó en 10 % de paladio sobre carbón (0,675 g, 0,634 mmol) usando hidrógeno de un globo de látex durante 16 h. El catalizador se retiró mediante filtración en tierra diatomácea (Celite®) con lavado en DCM, y la solución resultante se concentró a presión reducida.

Etapa 2.

A una solución del aminoácido crudo de la etapa 1 en acetonitrilo (3,74 ml), agua (3,74 ml) y trietilamina (0,221 ml, 1,585 mmol), enfriada a 0 °C, se agregó carbonato de (9H-fluoren-9-il)metil (2,5-dioxopirrolidin-1-ilo) (0,535 g, 1,585 mmol), y la mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 4 h. La solución se diluyó en EtOAc, se lavó con HCl 1 N y salmuera, se secó en Na2SO4 anhidro y se concentró hasta obtener un aceite amarillo a presión reducida. Este se purificó mediante cromatografía flash usando un gradiente de 0-100 % de EtOAc en hexanos. La columna se purgó con 30 % de MeOH/DCM para eluir completamente el producto. Las fracciones que contenían el producto deseado se agruparon y se concentraron a presión reducida para obtener 116 mg (16 % de rendimiento total) del producto deseado como un sólido marrón. Se calculó, según el análisis mediante LC/MS, que la pureza del producto fue cercana al 100 %.

Condición A del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,45 min; ESI-MS(+) m/z 448,0 (M+H).

Preparación de los Ejemplos 3001 y 3002

Los Ejemplos 3001 y 3002 se prepararon de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita a continuación. A un tubo de polipropileno de 50 ml, se agregó resina Sieber (140 mg, 0,100 mmol), y el tubo se colocó en el sintetizador de péptidos para microondas CEM Liberty. Luego, los siguientes procedimientos se realizaron de manera secuencial:

Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de expansión de resina” Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar” con Fmoc-Gly-OH Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar” con Fmoc-Cys(Trt)-OH Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar” con Fmoc-Leu-OH Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar” con Fmoc-Tyr(tBu)-OH Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar” con Fmoc-Tyr(tBu)-OH Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar” con Fmoc-Sar-OH Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar” con Fmoc-Tyr(tBu)-OH Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar” con Fmoc-[N-Me]Phe-OH Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida’’ con Fmoc-Val-OH usando 10 eq durante 2 horas a 75 °C Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar” con Fmoc-Asp(OtBu)-OH Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar” con Fmoc-Sar-OH Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida’’ con Fmoc-[N-Me]Nle-OH usando 5 eq durante 10 minutos; Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida’’ con Fmoc-Phey[CN4]-L-Phe-OH usando 5 eq durante 10 min; se siguió el “procedimiento A de acoplamiento de cloruro de cloroacetilo”, “Método B de desprotección global” y “Método C de ciclización”.

Ejemplo 3001, Isómero 1. El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa en las siguientes condiciones: Columna: Phenomenex Luna 5u C18(2) 250 x 21,2 AXIA, 100A Ser. #520221-1; fase móvil A: 0,1 % de TFA en agua; fase móvil B: 0,1 % de TFA en acetonitrilo; gradiente: 35-75 % de B durante 50 minutos, luego, un gradiente de 5 minutos hasta 95 % de B; flujo: 15 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga y liofilización. El rendimiento del Ejemplo 3001, Isómero 1 fue de 1,5 mg, y su pureza calculada mediante análisis de HPLC fue de 82,0 % usando las siguientes condiciones: Columna: Phenom Kinetex 2,6u C18(2) 2,1 x 50 mm Ser. #515561-57; fase móvil A: 0,025 % de acetato de amonio en 5 % de metanol/agua; fase móvil B: acetonitrilo/agua (4:1); gradiente: 30-95 % de B durante 20 minutos a 60 °C; flujo: 1 ml/min. Detección UV: 217 nm.

Condición A del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,50 min; ESI-MS(+) m/z 904,5 (M+2H).

Un segundo isómero, Isómero 2, se aisló de las condiciones anteriores de LC/MS preparativa. El rendimiento del Ejemplo 3002, Isómero 2 fue de 1,6 mg, y su pureza calculada mediante análisis de HPLC fue de 89,6 % usando las siguientes condiciones: Columna: Phenom Kinetex 2,6u C18(2) 2,1 x 50 mm Ser. #515561-57; fase móvil A: 0,025 % de acetato de amonio en 5 % de metanol/agua; fase móvil B: acetonitrilo/agua (4:1); gradiente: 30-95 % de B durante 20 minutos a 60 °C; flujo: 1 ml/min. Detección UV: 217 nm.

Condición A del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,52 min; ESI-MS(+) m/z 904,5 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3003

El Ejemplo 3003 se preparó de acuerdo con la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del Ejemplo 3001, compuesta por los siguientes procedimientos generales: Se siguió el “Método A de CEM: procedimiento de expansión de resina”, “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento estándar”, “Método A de CEM: procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida’’, “Procedimiento A de acoplamiento de ácido cloroacético’’, “Método B de desprotección global” y “Método C de ciclización”. Fmoc-[2-(5-(1-aminociclohexil)-1H-tetrazol-1-il)]-OH [Fmoc-Acc6y[CN4]-Gly-OH se acopló después del residuo de Trp usando un “Método A de CEM: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos a medida”.

El material crudo se purificó mediante LC/MS preparativa usando las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18 300, 19 x 250 mm, partículas de 5 pm; fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 30-70 % de B durante 25 minutos, luego un mantenimiento de 5 minutos a 100 % de B; flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. El rendimiento del producto fue de 0,37 mg, y la pureza calculada mediante análisis de LCMS fue de 82 % usando “condiciones D y E del análisis de LCMS”.

Condición D del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,66 min; ESI-MS(+) m/z 885,5 (M+2H).

Condición E del análisis de LCMS: Tiempo de retención = 1,87 min; ESI-MS(+) m/z 885,4 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z:

Calculado: 884,9371 (M+2H)

Encontrado: 884,9343 (M+2H)

MÉTODOS PARA EVALUAR LA CAPACIDAD DE PÉPTIDOS MACROCÍCLICOS PARA COMPETIR POR LA FIJACIÓN DE PD-1 A PD-L1 MEDIANTE ENSAYOS DE FIJACIÓN DE FLUORESCENCIA HOMOGÉNEA DE RESOLUCIÓN TEMPORAL (HTRF)

La capacidad de los péptidos macrocíclicos de la presente descripción para fijarse a PD-L1 se investigó mediante un ensayo de fijación de fluorescencia homogénea de resolución temporal (HTRF) PD-1/PD-L1.

Métodos

Ensayos de fluorescencia homogénea de resolución temporal (HTRF) de fijación de PD-1 soluble a PD-L1 soluble. PD-1 soluble y PD-L1 soluble se refieren a proteínas con truncamientos de extremo de carboxilo que eliminan las regiones que abarcan transmembrana y se fusionan con secuencias heterólogas, específicamente la porción Fc de la secuencia de inmunoglobulina humana G (Ig) o la etiqueta del epítopo de hexahistidina (His). Todos los estudios de fijación se realizaron en un amortiguador de ensayo HTRF que consistía en dPBS enriquecido con 0,1 % (p/v) de albúmina de suero bovino y 0,05 % (v/v) de Tween-20. Para el ensayo de fijación de PD-1-Ig/PD-L1-His, los inhibidores se incubaron previamente con PD-L1-His (10 nM final) durante 15 m en 4 pl de amortiguador de ensayo, y luego se agregó PD-1 -Ig (20 nM final) en 1 pl de amortiguador de ensayo, y se continuó la incubación durante 15 m. Se usaron proteínas de fusión PD-L1 de ser humano, Macaca fascicularis, ratón u otras especies. La detección mediante HTRF se logró usando anticuerpo monoclonal anti-Ig etiquetado con criptato de europio (1 nM final) y anticuerpo monoclonal anti-His etiquetado con aloficocianina (APC) (20 nM final). Los anticuerpos se diluyeron en amortiguador de detección de HTRF, y se colocaron 5 pl encima de la reacción de fijación. La reacción se equilibró durante 30 minutos, y se obtuvo la señal (relación 665nm/620nm) usando un fluorómetro EnVision. Se establecieron ensayos de fijación adicionales entre PD-1-Ig/PD-L2-His (20 y 5 nM, respectivamente), CD80-His/PD-L1-Ig (100 y 10 nM, respectivamente) y CD80-His/CTLA4-Ig (10 y 5 nM, respectivamente). Se realizaron estudios de competencia entre el Compuesto biotinilado N. ° 71 y PD-L1-His humana de la siguiente manera. Se incubaron previamente inhibidores del péptido macrocíclico con PD-L1-His (10 nM final) durante 60 minutos en 4 pl de amortiguador de ensayo, y luego se agregó Compuesto biotinilado N. ° 71 (0,5 nM final) en 1 pl de amortiguador de ensayo. Se dejó que la fijación se equilibrara durante 30 minutos, y luego se agregó estreptadivina etiquetada con criptato de europio (2,5 pM final) y anti-His etiquetado con APC (20 nM final) en 5 pl de amortiguador de HTRF. Se dejó que la reacción se equilibrara durante 30 m, y se obtuvo la señal (relación 665 nm/620 nm) usando un fluorómetro EnVision.

Proteínas recombinantes. PD-1 humano truncado con carboxilo (aminoácidos 25-167) con una etiqueta del epítopo de Ig humana del terminal C [hPD-1 (25-167)-3S-IG] y PD-L1 humana (aminoácidos 18-239) con una etiqueta del epítopo His del terminal C [hPD-L1(19-239)-sitio de escisión del Virus del moteado de las nerviaciones del tabaco (TVMV)-His] se expresaron en células HEK293T y se purificaron secuencialmente mediante cromatografía de afinidad de proteína A recombinante y cromatografía de exclusión por tamaño. Se obtuvieron PD-L2-His (Sino Biologicals), CD80-His (Sino Biologicals), CTLA4-Ig (RnD Systems) de ser humano a través de fuentes comerciales.

Secuencia de PD-1 -Ig humana recombinante

hPD1(25-167)-3S-IG

1 LDSPDRPWNP PTFSPALLW TEGDNATFTC SFSNTSESFV LNWYRMSPSN

51 QTDKLAAFPE DRSQPGQDCR FRVTQLPNGR DFHMSWRAR RNDSGTYLCG

101 AISLAPKAQI KESLRAELRV TERRAEVPTA HPSPSPRPAG QFQGSPGGGG

151 GREPKSSDKT HTSPPSPAPE LLGGSSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW

201 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW

251 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV

301 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD

351 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK

(SEQ ID NO:1)

Secuencia de PD-L1-TVMV-His humana recombinante (PD-L1-His)

hPDI1(19-239)-TVMV-His

1 FTVTVPKDLY WEYGSNMTI ECKFPVEKQL DLAALIVYWE MEDKNIIQFV 51 HGEEDLKVQH SSYRQRARLL KDQLSLGNAA LQITDVKLQD AGVYRCMISY 101 GGADYKRITV KVNAPYNKIN QRILWDPVT SEHELTCQAE GYPKAEVIWT 151 SSDHQVLSGK TTTTNSKREE KLFNVTSTLR INTTTNEIFY CTFRRLDPEE 201 NHTAELVIPE LPLAHPPNER TGSSETVRFQ GHHHHHH

(SEQ ID NO:2)

Los resultados se muestran en la Tabla 1. Como puede apreciarse, los péptidos macrocíclicos de la presente descripción demostraron una inhibición potente de la actividad de fijación de PD-1-Ig a PD-L1-TVMV-His (PD-L1-His). Los rangos son los siguientes: A = 0,10-10 pM; B = 0,01-0,099 pM; C = 0,005 - 0,0099 pM.

Tabla 1

(continuación)

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto seleccionado de:

o una sal del mismo aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que es

3. Un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 o una sal del mismo terapéuticamente aceptable para su uso en terapia en un sujeto que lo necesita.

4. El compuesto o la sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 3 que también comprende administrar un agente adicional antes, durante o después de la administración del compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal del mismo terapéuticamente aceptable.

5. El compuesto o la sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 4 en donde el agente adicional es un agente antimicrobiano, un agente antiviral, un agente citotóxico y/o un modificador de la respuesta inmunitaria.

6. El compuesto o la sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 4 en donde el agente adicional es un inhibidor de HDAC.

7. El compuesto o la sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 4 en donde el agente adicional es un agonista de TLR7 y/o de TLR8.

8. Un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso en inhibir el crecimiento, la proliferación o la metástasis de células cancerosas en un sujeto que lo necesita.

9. El compuesto o la sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 8 en donde el cáncer se selecciona de melanoma, carcinoma de células renales, cáncer pulmonar de células no pequeñas escamosas (NSCLC), NSCLC de células no escamosas, cáncer colorrectal, cáncer de próstata resistente a la castración, cáncer de ovario, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, carcinoma pancreático, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinomas de esófago, tubo gastrointestinal y mama, y cáncer hematológico.

10. Un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso en tratar una enfermedad infecciosa en un sujeto que lo necesita.

11. El compuesto o la sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 10 en donde la enfermedad infecciosa está causada por un virus.

12. El compuesto o la sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 en donde el virus se selecciona de VIH, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, virus del herpes e influenza.

13. Un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 o una sal del mismo terapéuticamente aceptable para su uso en tratar el choque séptico en un sujeto que lo necesita.