CN107428804B

CN107428804B - 免疫调节剂

Info

Publication number: CN107428804B
Application number: CN201680016376.9A
Authority: CN
Inventors: K·M·博伊; 孙力强; 赵倩; E·马尔; E·P·吉利斯; P·M·斯科拉
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2015-03-18
Filing date: 2016-03-16
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2036-03-16
Also published as: EA201791739A1; TW201702259A; JP6797130B2; EP3271373B1; SG11201707479YA; BR112017019591A2; CA2980147A1; KR102628640B1; ES2910657T3; AU2016233292A1; EA033739B1; AR103969A1; MX2017011960A; CN107428804A; EP3271373A1; US20160272680A1; IL254423A0; KR20170128489A; WO2016149351A1; US9809625B2

Abstract

本发明提供新颖大环肽，其抑制PD‑1/PD‑L1及PD‑L1/CD80蛋白质/蛋白质相互作用，且由此可用于改善包含癌症及感染性疾病的各种疾病。

Description

免疫调节剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年3月18日提交的美国临时专利申请第62/134,686号的优先权，在此引入本申请作为参考。

技术领域

本发明提供新颖大环肽，其抑制PD-1/PD-L1和CD80/PD-L1蛋白质/蛋白质相互作用，且因此可用于改善各种疾病，包括癌症和感染性疾病。

背景技术

程序性死亡蛋白1(PD-1)为受体CD28家族的抑制成员，其还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1表达于活化B细胞、T细胞和骨髓细胞上(Agata等人,见上文；Okazaki等人,Curr.Opin.Immunol.,14:779-782(2002)；Bennett等人,J.Immunol.,170:711-718(2003))。

PD-1蛋白为作为Ig基因超家族的一部分的55kDa I型跨膜蛋白质(Agata等人,Int.Immunol.,8:765-772(1996))。PD-1含有膜近端免疫受体酪氨酸抑制模序(ITIM)和膜远端基于酪氨酸的切换模序(ITSM)(Thomas,M.L.,J.Exp.Med.,181:1953-1956(1995)；Vivier,E.等人,Immunol.Today,18:286-291(1997))。虽然结构上与CTLA-4类似，但PD-1缺乏对CD80CD86(B7-2)结合至关重要的MYPPY模序。已鉴别PD-1的两种配体，PD-L1(B7-H1)和PD-L2(b7-DC)。已展示在与表达PD-L1或PD-L2的细胞相互作用后，表达PD-1的T细胞的活化下调(Freeman等人,J.Exp.Med.,192:1027-1034(2000)；Latchman等人,Nat.Immunol.,2:261-268(2001)；Carter等人,Eur.J.Immunol.,32:634-643(2002))。PD-L1和PD-L2均为B7蛋白家族成员，其结合至PD-1，但不结合至其他CD28家族成员。PD-L1配体在多种人类癌症中为充足的(Dong等人,Nat.Med.,8:787-789(2002))。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润性淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少和癌细胞免疫逃避(Dong等人,J.Mol.Med.,81:281-287(2003)；Blank等人,Cancer Immunol.Immunother.,54:307-314(2005)；Konishi等人,Clin.Cancer Res.,10:5094-5100(2004))。免疫抑制可通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用而逆转，且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时，效应相加(Iwai等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:12293-12297(2002)；Brown等人,J.Immunol.,170:1257-1266(2003))。

还已展示PD-L1与CD80相互作用(Butte MJ等人,Immunity；27:111-122(2007))。已展示PD-L1/CD80对表达免疫细胞的相互作用为抑制性相互作用。已展示阻断该相互作用即消除该抑制性相互作用(Paterson AM等人,J Immunol.,187:1097-1105(2011)；Yang J等人,J Immunol.Aug 1；187(3):1113-9(2011))。

当表达PD-1的T细胞接触表达其配体的细胞时，响应于抗原性刺激的功能活性(包括增殖、细胞因子分泌和细胞毒性)减少。PD-1/PD-L1或PD-L2相互作用在感染或肿瘤消退(resolution)期间或在发展自身耐受性期间下调免疫应答(Keir,M.E.等人,Annu.Rev.Immunol.,26:Epub(2008))。慢性抗原刺激，诸如在肿瘤疾病或慢性感染期间出现的慢性抗原刺激，导致表达升高水平的PD-1且在针对慢性抗原的活性方面功能异常的T细胞(综述于Kim等人,Curr.Opin.Imm.(2010)中)。此称为“T细胞耗竭(T cellexhaustion)”。B细胞也呈现PD-1/PD-配体抑制和“耗竭”。

已展示使用针对PD-L1的抗体阻断PD-1/PD-L1接合(ligation)恢复且强化许多系统中的T细胞活化。患有晚期癌症的患者受益于使用针对PD-L1的单克隆抗体的疗法(Brahmer等人,New Engl.J.Med.(2012))。肿瘤和慢性感染的临床前动物模型已展示通过单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1途径可增强免疫应答且引起肿瘤排斥反应或控制感染。经由PD-1/PD-L1阻断的抗肿瘤免疫疗法可强化针对许多组织学相异肿瘤的治疗性免疫应答(Dong,H.等人,"B7-H1pathway and its role in the evasion of tumor immunity",J.Mol.Med.,81(5):281-287(2003)；Dong,H.等人,"Tumor-associated B7-H1promotes T-cell apoptosis:a potential mechanism of immune evasion",Nat.Med.,8(8):793-800(2002))。

干扰PD-1/PD-L1相互作用使得具有慢性感染的系统中的T细胞活性增强。阻断PD-L1使得具有慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染的小鼠改善病毒清除且恢复免疫力(Barber,D.L.等人,"Restoring function in exhausted CD8T cells during chronicviral infection",Nature,439(7077):682-687(2006))。感染HIV-1的人源化小鼠展示CD4+T细胞针对病毒血症的保护和病毒消耗增强(Palmer等人,J.Immunol.(2013))。经由针对PD-L1的单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1可恢复HIV患者(Day,Nature(2006)；Petrovas,J.Exp.Med.(2006)；Trautman,Nature Med.(2006)；D'Souza,J.Immunol.(2007)；Zhang,Blood(2007)；Kaufmann,Nature Imm.(2007)；Kasu,J.Immunol.(2010)；Porichis,Blood(2011))、HCV患者(Golden-Mason,J.Virol.(2007)；Jeung,J.Leuk.Biol.(2007)；Urbani,J.Hepatol.(2008)；Nakamoto,PLoSPath.(2009)；Nakamoto,Gastroenterology(2008))和HBV患者(Boni,J.Virol.(2007)；Fisicaro,Gastro.(2010)；Fisicaro等人,Gastroenterology(2012)；Boni等人,Gastro.(2012)；Penna等人,J.Hep.(2012)；Raziorrough,Hepatology(2009)；Liang,World J.Gastro.(2010)；Zhang,Gastro.(2008))的T细胞的体外抗原特异性功能。

还已展示阻断PD-L1/CD80相互作用刺激免疫力(Yang J.等人,J Immunol.Aug 1；187(3):1113-9(2011))。已展示由PD-L1/CD80相互作用的阻断产生的免疫刺激经由与另外PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2相互作用的阻断组合而增强。

假设免疫细胞表型改变为败血性休克的重要因素(Hotchkiss等人,Nat RevImmunol(2013))。这些改变包括PD-1和PD-L1的水平增加(Guignant等人,Crit.Care(2011))，PD-1和PD-L1的水平增加的败血性休克患者的细胞展现T细胞凋亡水平增加。针对PD-L1的抗体可降低免疫细胞凋亡的水平(Zhang等人,Crit.Care(2011))。此外，缺少PD-1表达的小鼠与野生型小鼠相比对败血性休克症状更具抗性(Yang J.等人,J Immunol.Aug1；187(3):1113-9(2011))。研究已揭示使用抗体阻断PD-L1相互作用可抑制不当免疫应答且改善病征。

除增强对慢性抗原的免疫应答以外，还已展示阻断PD-1/PD-L1途径增强对疫苗接种(包括在慢性感染的情形下的治疗性疫苗接种)的应答(Ha,S.J.等人,"Enhancingtherapeutic vaccination by blocking PD-1-mediated inhibitory signals duringchronic infection",J.Exp.Med.,205(3):543-555(2008)；Finnefrock,A.C.等人,"PD-1blockade in rhesus macaques:impact on chronic infection and prophylacticvaccination",J.Immunol.,182(2):980-987(2009)；Song,M.-Y.等人,"Enhancement ofvaccine-induced primary and memory CD8+t-cell responses by soluble PD-1",J.Immunother.,34(3):297-306(2011))。

本申请所述的分子在生物化学和基于细胞的实验系统中证明阻断PD-L1与PD-1的相互作用的能力。这些结果与治疗性施用增强癌症或慢性感染的免疫力的潜能(包括治疗性疫苗)相符。

发明内容

本申请所述的大环肽能够抑制PD-L1与PD-1及与CD80的相互作用。这些化合物已证明高度有效结合至PD-L1、阻断PD-L1与PD-1或CD80的相互作用且能够促进增强T细胞功能活性，因此使其成为肠胃外、口服、经肺、经鼻、含服和持续释放制剂的候选物。

在一个方面中，本发明提供一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐，

或其药学上可接受的盐，其中：

A选自

其中：

表示连接至羰基的连接点且

表示连接至氮原子的连接点；

n为0或1；

m为1或2；

w为0、1或2；

R¹⁴及R¹⁵独立地选自氢及甲基；

R^16a选自氢及C₁-C₆烷基；

R¹⁶选自

-(C(R^17a)₂)-C(O)-NR⁵⁰R⁵¹；

其中：

每一R^17a独立地选自氢及C₁-C₆烷基；

R⁵⁰及R⁵¹中的一个选自氢及C₁-C₆烷基且另一个选自-(CH₂)_n’X、C₁-C₆烷基、C₃-C₇环烷基、杂环基及苯基，其中环烷基任选经一个、两个或三个独立地选自C_1-C₃烷氧基、C_1-C₃烷基、氨基、氰基及羟基的基团取代，或；

R⁵⁰及R⁵¹与它们所连接的氮原子一起形成任选含有一或两个独立地选自氮、氧及硫的额外杂原子的4-、5-、6-或7元饱和或不饱和环；其中所述环任选经一个、两个或三个选自C₁-C₆烷氧基、C₁-C₃烷基、氰基、卤素、卤代C₁-C₃烷基、羟基、羟基(C₁-C₃烷基)、-NR⁷⁰R⁷¹、氧代及苯基的基团取代；其中苯基另外任选经一个、两个或三个独立地选自C₁-C₃烷氧基、氰基及卤素的基团取代；

n’为1至5；

X选自

C₂-C₆烷氧基甲基、C₁-C₆烷氧基羰基甲基、C₁-C₆烷基硫基甲基、C₁-C₆烷基磺酰基甲基、叠氮基甲基、叔丁氧基甲基、C₃-C₇环烷基、卤代烷氧基甲基、卤代甲基、杂环基、羟甲基、异丙氧基甲基、(NR⁷⁰R⁷¹)甲基、苯基、苯氧基甲基、苯基硫基甲基，

R⁷⁰及R⁷¹中的一个选自氢、C₁-C₆烷基及羟基C₂-C₆烷基且另一个选自C₁-C₆烷氧基羰基、C₁-C₆烷基羰基、C₁-C₆烷基磺酰基及羟基C₂-C₆烷基；

表示连接至羰基的连接点且

表示连接至氮原子的连接点；

R^c、R^f、R^h、Rⁱ、R^m及Rⁿ为氢；

R^a、R^e、R^j及R^k各自独立地选自氢及甲基；

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²及R¹³独立地选自天然氨基酸侧链及非天然氨基酸侧链或与如下所述的相应邻位R基团形成的环；

R^e及R^k可各自与相应邻位R基团及它们所连接的原子形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪及四氢噻唑的环；其中每一环任选经一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤素及羟基的基团取代；

R^b为甲基，或R^b及R²与它们所连接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪及四氢噻唑的环；其中每一环任选经一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤素及羟基的基团取代；

R^d为氢或甲基，或R^d及R⁴与它们所连接的原子一起可形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪及四氢噻唑的环；其中每一环任选经一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤素、羟基及苯基的基团取代；

R^g为氢或甲基或R^g及R⁷与它们所连接的原子一起可形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪及四氢噻唑的环；其中每一环任选经一至四个独立地选自以下的基团取代：氨基、任选经卤素取代的苄基、苄基氧基、氰基、环己基、甲基、卤素、羟基、任选经甲氧基取代的异喹啉基氧基、任选经卤素取代的喹啉基氧基及四唑基；且其中吡咯烷及哌啶环任选稠合至环己基、苯基或吲哚基团；且

R^l为甲基，或R^l及R¹²与它们所连接的原子一起形成选自氮杂环丁烷及吡咯烷的环，其中每一环任选经一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤素及羟基的基团取代。

在第一方面的第一实施方案中，本发明提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其中：

R^d及R⁴与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环；

R^g及R⁷与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环，其中所述环任选经一个羟基取代；且

R^k为甲基。

在第一方面的第二实施方案中，本发明提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其中：

R^d及R⁴与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环；

R^g及R⁷与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环，其中所述环任选经一个羟基取代；

R^k为甲基；

R^a、R^e及R^j为氢；

R^b、R^k及R^l为甲基；

Rⁿ为氢；

R¹系苯基甲基，其中苯基经羟基取代；

R²为甲基；

R³选自-CH₂C(O)NH₂及-CH₂CO₂H；

R⁵选自-CH₂NH₂、-CH₂OH及-CH₂C(O)NH₂；

R⁶选自-CH₂CH(CH₃)₂、-(CH₂)₂CO₂H及(CH₂)₂C(O)NH₂；

R⁸及R¹⁰为-CH₂(吲哚基)，其中吲哚基任选经-CH₂CO₂H取代；

R⁹选自氢、-(CH₂)₂NH₂、CH₂OH及-CH₂C(O)NH₂；

R¹¹及R¹²为-(CH₂)₃CH₃；且

R¹³选自甲基、-CH₂CH(CH₃)₂及-(CH₂)₂CO₂H。

在其它实施方案中，本发明提供一种增强、刺激和/或增加有此需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或其治疗学上可接受的盐。在其它实施方案中，所述方法还包括在式(I)化合物或其治疗学上可接受的盐之前、之后或与其同时施用额外药剂。在其它实施方案中，所述额外药剂为抗微生物剂、抗病毒剂、细胞毒性剂和/或免疫应答调节剂。在其它实施方案中，所述额外药剂为HDAC抑制剂。在其它实施方案中，所述额外药剂为TLR7和/或TLR8激动剂。

在其它实施方案中，本发明提供一种抑制有此需要的受试者的癌细胞生长、增殖或转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或其治疗学上可接受的盐。应理解，所述抑制可为直接或间接的。在其它实施方案中，所述癌症选自黑素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结肠直肠癌、去势抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌及乳腺癌和血液科恶性病。

在其它实施方案中，本发明提供一种治疗有此需要的受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或其治疗学上可接受的盐。在其它实施方案中，所述感染性疾病由病毒引起。在其它实施方案中，所述病毒选自HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒和流感病毒。

在其它实施方案中，本发明提供一种治疗有此需要的受试者的败血性休克的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本申请所述的一或多种大环肽。

在其它实施方案中，本发明提供一种阻断受试者的PD-L1与PD-1和/或CD80的相互作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本申请所述的至少一种大环肽。

在R侧链为经甲基取代的环的一部分的式(I)化合物中，应理解，所述甲基可在环中任何可取代的碳原子上，包括作为大环母体结构的一部分的碳。

在式(I)化合物中，优选的R¹侧链为：苯丙氨酸、酪氨酸、3-噻吩-2-基、4-甲基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、异色氨酸、3-甲基苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、3,4-二氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、3,4-二甲氧基苯丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸、4-二氟甲基苯丙氨酸、2-甲基苯丙氨酸、2-萘基丙氨酸、色氨酸、4-吡啶基、4-溴苯丙氨酸、3-吡啶基、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、联苯丙氨酸和3-氯苯丙氨酸；及2,4-二氨基丁烷。

在R²并非环的一部分的式(I)化合物中，优选的R²侧链为：丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸。

在式(I)化合物中，优选的R³侧链为：天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、丙氨酸、2,3-二氨基丙烷和2,4-二氨基丁烷。

在R⁴并非环的一部分的式(I)化合物中，优选的R⁴侧链为：缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸和甘氨酸。

在式(I)化合物中，优选的R⁵侧链为：氨基甲烷、组氨酸、天冬酰胺、2,3-二氨基丙烷、丝氨酸、甘氨酸、2,4-二氨基丁烷、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和3-噻唑基丙氨酸。

在式(I)化合物中，优选的R⁶侧链为：亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、赖氨酸、3-环己烷、苏氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁烷、丙氨酸、精氨酸和鸟氨酸(COCH₃)。

在R⁷并非环的一部分的式(I)化合物中，优选的R⁷侧链为：甘氨酸、2,4-二氨基丁烷、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸和2,4-二氨基丁烷(C(O)环丁烷)。

在式(I)化合物中，优选的R⁸侧链为色氨酸和1,2-苯并异噻唑啉基丙氨酸。

在式(I)化合物中，优选的R⁹侧链为：丝氨酸、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、2,4-二丁胺、苏氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸、2,3-二氨基丙烷、精氨酸、天冬氨酸和酪氨酸。

在式(I)化合物中，优选的R¹⁰侧链为：任选经取代的色氨酸、苯并异噻唑基丙氨酸、1-萘基丙氨酸和甲硫氨酸。

在式(I)化合物中，优选的R¹¹侧链为：正亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、甲硫氨酸、乙氧基甲烷、丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯基丙烷、谷氨酸、己烷和庚烷。

在R¹²并非环的一部分的式(I)化合物中，优选的R¹²侧链为：正亮氨酸、丙氨酸、乙氧基甲烷、甲硫氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、甲氧基乙烷、亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、己烷、庚烷和甘氨酸。

在式(I)化合物中，优选的R¹³侧链：精氨酸、鸟氨酸、丙氨酸、2,4-二氨基丁烷、2,3-二氨基丙烷、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、环丙基甲烷、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和2-氨基丁烷。

根据本发明，我们已发现特异性结合至PD-L1且能够抑制PD-L1与PD-1及CD80的相互作用的肽。这些大环肽展现体外免疫调节功效，因此使其成为用于治疗包括癌症和感染性疾病的各种疾病的治疗性候选物。

术语“特异性结合(specific binding或specifically bind)”是指蛋白质与结合分子(诸如化合物或配体)之间的相互作用。相互作用取决于由结合分子识别的蛋白质的具体结构(即，酶结合位点、抗原决定簇或表位)的存在。举例而言，若化合物特异性结合蛋白质结合位点"A"，则在含有包含结合位点A的蛋白质和特异性结合至蛋白质结合位点A的经标记肽的反应物中存在所述化合物将减小结合至所述蛋白质的经标记肽的量。相比之下，化合物对蛋白质的非特异性结合并不导致经标记肽自蛋白质的浓度依赖性置换。

本发明意欲包括本发明化合物中出现的原子的所有同位素。同位素包括原子数相同、但质量数不同的那些原子。通过一般实例但非限制性地，氢的同位素包括氘和氚。碳的同位素包括¹³C和¹⁴C。本发明的同位素标记化合物一般可通过本领域技术人员已知的常规技术或通过类似于本申请所述的方法，使用适当同位素标记试剂代替原来使用的未标记试剂来制备。此类化合物可具有多种潜在用途，例如在确定生物学活性时用作标准物和试剂。在稳定同位素的情况下，此类化合物可具有有利地调节生物学、药理学或药物动力学性质的潜能。

本申请所述的主题的另一方面为所披露的肽作为放射性标记配体用于配体结合测定的显影或用于监测体内吸收、代谢、分布、受体结合或占据或化合物配置(disposition)的用途。举例而言，本申请所述的大环肽可使用放射性同位素¹²⁵I制备，且所得放射性标记肽可用于显影结合测定或用于代谢研究。可选择地且出于相同目的，本申请所述的大环肽可通过使用本领域技术人员已知的方法的催化性氚化转化成放射性标记形式。

本发明的大环肽还可通过使用本领域技术人员已知的方法添加放射性示踪剂而用作PET成像剂。

优选的肽包括本申请所提供的大环肽中的至少一种且这些肽可包括于药物组合物和组合产品(combination)中。

具体实施方式

除非在特定情形中另外限制，否则本申请所提供的定义非限制性地适用于本说明书通篇所用的术语。

氨基酸和肽化学领域普通技术人员了解氨基酸包括由以下通式结构表示的化合物：

其中R和R'如本申请中所论述。

除非另外指明，否则如本申请中单独或作为另一基团的一部分使用的术语“氨基酸”包括，但不限于，连接至称为"α"碳的同一碳的氨基和羧基，其中R和/或R'可为天然或非天然侧链，包括氢。在"α"碳处的绝对"S"构型通常称为"L"或"天然"构型。在"R"和"R′"(撇)取代基等于氢的情况下，氨基酸为甘氨酸且不是手性的。

如本申请所用，术语“天然氨基酸侧链”和“天然存在的氨基酸侧链”是指通常呈S-构型的任何天然存在的氨基酸(即，L-氨基酸)(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、-组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)的侧链。

如本申请所用，术语“非天然氨基酸侧链”和“非天然存在的氨基酸侧链”是指通常呈R-构型的任何天然存在的氨基酸(即，D-氨基酸)的侧链或除呈R-或S-构型的天然存在的氨基酸侧链(即，分别为D-或L-氨基酸)以外的选自以下的基团：

C₂-C₇烯基、C₁-C₃烷氧基C₁-C₃烷基、C₁-C₆烷氧基羰基C₁-C₃烷基、C₁-C₇烷基、C₁-C₃烷基硫基C₁-C₃烷基、酰氨基C₁-C₃烷基、氨基C₁-C₃烷基、氮杂吲哚基C₁-C₃烷基、苯并噻唑基C₁-C₃烷基、苯并噻吩基C₁-C₃烷基、苄基氧基C₁-C₃烷基、羧基C₁-C₃烷基、C₃-C₁₄环烷基C₁-C₃烷基、二苯基甲基、呋喃基C₁-C₃烷基、咪唑基C₁-C₃烷基、萘基C₁-C₃烷基、吡啶基C₁-C₃烷基、噻唑基C₁-C₃烷基、噻吩基C₁-C₃烷基；

联苯C₁-C₃烷基，其中联苯任选经甲基取代；

杂环基，其任选经一个、两个、三个、四个或五个独立地选自以下的基团取代：C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷基、C₁-C₃烷基磺酰基氨基、酰氨基、氨基、氨基C₁-C₃烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、卤素、卤代C₁-C₃烷基、羟基、-NC(NH₂)₂、硝基及-OP(O)(OH)₂；

吲哚基C₁-C₃烷基，其中吲哚基部分任选经一个选自C₁-C₃烷基、羧基C₁-C₃烷基、卤素、羟基及苯基的基团取代，其中苯基进一步任选经一个、两个或三个独立地选自C₁-C₃烷氧基、C₁-C₃烷基及卤素的基团取代；

苯基，其任选经一个、两个、三个、四个或五个独立地选自以下的基团取代：C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷基、C₁-C₃烷基磺酰基氨基、酰氨基、氨基、氨基C₁-C₃烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、卤素、卤代C₁-C₃烷基、羟基、-NC(NH₂)₂、硝基及-OP(O)(OH)₂；

NR^aR^b(C₁-C₇烷基)，其中R^a及R^b独立地选自氢、C₂-C₄烯基氧基羰基、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷基羰基、C₃-C₆环烷基羰基、呋喃基羰基及苯基羰基。在烷基连接体含有一个以上碳时，其它NR^aR^b基团可位于该链上。

NR^cR^d羰基C₁-C₃烷基，其中R^c及R^d独立地选自氢、C₁-C₃烷基及三苯基甲基；

苯基C₁-C₃烷基，其中苯基部分任选经一个、两个、三个、四个或五个独立地选自以下的基团取代：C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷基、C₁-C₃烷基磺酰基氨基、酰氨基、氨基、氨基C₁-C₃烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、卤素、卤代C₁-C₃烷基、羟基、-NC(NH₂)₂、硝基及-OP(O)(OH)₂；及

苯氧基C₁-C₃烷基，其中苯基任选经C₁-C₃烷基取代。

如本申请所用，术语“C₂-C₄烯基”是指具有二至四个碳原子、含有至少一个碳-碳双键的直链或支链基团。

如本申请所用，术语“C₂-C₇烯基”是指具有二至七个碳原子、含有至少一个碳-碳双键的直链或支链基团。

如本申请所用，术语“C₂-C₄烯基氧基”是指经由氧原子连接至母体分子部分的C₂-C₄烯基。

如本申请所用，术语“C₁-C₃烷氧基”是指经由氧原子连接至母体分子部分的C₁-C₃烷基。

如本申请所用，术语“C₁-C₄烷氧基”是指经由氧原子连接至母体分子部分的C₁-C₄烷基。

如本申请所用，术语“C₁-C₆烷氧基”是指经由氧原子连接至母体分子部分的C₁-C₆烷基。

如本申请所用，术语“C₁-C₃烷氧基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的C₁-C₃烷氧基。

如本申请所用，术语“C₁-C₆烷氧基羰基”是指经由羰基连接至母体分子部分的C₁-C₆烷氧基。

如本申请所用，术语“C₁-C₆烷氧基羰基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的C₁-C₆烷氧基羰基。

如本申请所用，术语“C₁-C₃烷基”是指衍生自含有一至三个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。

如本申请所用，术语“C₁-C₄烷基”是指衍生自含有一至四个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。

如本申请所用，术语“C₁-C₆烷基”是指衍生自含有一至六个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。

如本申请所用，术语“C₁-C₃烷基羰基”是指经由羰基连接至母体分子部分的C₁-C₃烷基。

如本申请所用，术语“C₁-C₃烷基硫基”是指经由硫原子连接至母体分子部分的C₁-C₃烷基。

如本申请所用，术语“C₁-C₃烷基硫基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的C₁-C₃烷基硫基。

如本申请所用，术语“C₁-C₃烷基磺酰基”是指经由磺酰基连接至母体分子部分的C₁-C₃烷基。

如本申请所用，术语“C₁-C₃烷基磺酰基氨基”是指经由氨基连接至母体分子部分的C₁-C₃烷基磺酰基。

如本申请所用，术语“酰氨基”是指-C(O)NH₂。

如本申请所用，术语“酰氨基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的酰氨基。

如本申请所用，术语“氨基”是指-NH₂。

如本申请所用，术语“氨基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的氨基。

如本申请所用，术语“氨基磺酰基”是指经由磺酰基连接至母体分子部分的氨基。

如本申请所用，术语“氮杂吲哚基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子的氮杂吲哚基。氮杂吲哚基可经由基团中任何可取代原子连接至烷基部分。

如本申请所用，术语“苯并噻唑基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子的苯并噻唑基。苯并噻唑基可经由基团中任何可取代原子连接至烷基部分。

如本申请所用，术语“苯并噻吩基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子的苯并噻吩基。苯并噻吩基可经由基团中任何可取代原子连接至烷基部分。

如本申请所用，术语“苄基氧基”是指经由氧原子连接至母体分子部分的苯甲基。

如本申请所用，术语“苄基氧基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的苄基氧基。

如本申请所用，术语“联苯C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的联苯基。联苯基可经由基团中任何可取代原子连接至烷基部分。

如本申请所用，术语“羰基”是指-C(O)-。

如本申请所用，术语“羧基”是指-CO₂H。

如本申请所用，术语“羧基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的羧基。

如本申请所用，术语“氰基”是指-CN。

如本申请所用，术语“C₃-C₁₄环烷基”是指具有3至14个碳原子及0个杂原子的饱和单环、双环或三环烃环系统。双环及三环环可为稠合、螺环或桥接环。环烷基的代表性实例包含但不限于环丙基、环戊基、二环[3.1.1]庚基和金刚烷基。

如本申请所用，术语“C₃-C₁₄环烷基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基附接至母体分子部分的C₃-C₁₄环烷基。

如本申请所用，术语“C₃-C₁₄环烷基羰基”是指经由羰基附接至母体分子部分的C₃-C₁₄环烷基。

如本申请所用，术语“C₃-C₆环烷基”是指具有三至六个碳原子和零个杂原子的饱和单环烃环系统。

如本申请所用，术语“C₃-C₆环烷基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的C₃-C₆环烷基。

如本申请所用，术语“C₃-C₆环烷基羰基”是指经由羰基连接至母体分子部分的C₃-C₆环烷基。

如本申请所用，术语“呋喃基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的呋喃基。呋喃基可经由基团中任何可取代原子连接至烷基部分。

如本申请所用，术语“呋喃基羰基”是指经由羰基连接至母体分子部分的呋喃基。

如本申请所用，术语“卤素”和“卤素”是指F、Cl、Br或I。

如本申请所用，术语“卤代C₁-C₃烷基”是指经一个、两个或三个卤素原子取代的C₁-C₃烷基。

如本申请所用，术语“卤甲基”是指经一个、两个或三个卤素原子取代的甲基。

如本申请所用，术语“杂环基”是指含有一个、两个或三个独立地选自氮、氧及硫的杂原子的5-、6-或7元环。五元环具有0至2个双键，且六元及七元环具有0至3个双键。术语“杂环基”亦包含杂环基环稠合至4-至6元芳香族或非芳香族碳环环或另一单环杂环基的二环基团。本发明杂环基经由基团中的碳原子连接至母体分子部分。杂环基的实例包含但不限于苯并噻吩基、呋喃基、咪唑基、吲哚啉基、吲哚基、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基、噁唑基、哌嗪基、哌啶基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、吡咯并吡啶基、吡咯基、噻唑基、噻吩基和硫代吗啉基。

如本申请所用，术语“羟基”是指-OH。

如本申请所用，术语“咪唑基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的咪唑基。咪唑基可经由基团中任何可取代原子连接至烷基部分。

如本申请所用，术语“吲哚基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的吲哚基。吲哚基可经由基团中任何可取代原子连接至烷基部分。

如本申请所用，术语“萘基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的萘基。萘基可经由基团中任何可取代原子连接至烷基部分。

如本申请所用，术语“硝基”是指-NO₂。

如本申请所用，术语“NR^aR^b”是指经由氮原子连接至母体分子部分的两个基团R^a和R^b。R^a和R^b独立地选自氢、C₂-C₄烯基氧基羰基、C₁-C₃烷基羰基、C₃-C₆环烷基羰基、呋喃基羰基和苯基羰基。

如本申请所用，术语“NR^aR^b(C₁-C₃)烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的NR^aR^b基团。

如本申请所用，术语“NR^cR^d”是指经由氮原子连接至母体分子部分的两个基团R^c和R^d。R^c和R^d独立地选自氢、C₁-C₃烷基和三苯基甲基。

如本申请所用，术语“NR^cR^d羰基”是指经由羰基连接至母体分子部分的NR^cR^d基团。

如本申请所用，术语“NR^cR^d羰基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的NR^cR^d羰基。

如本申请所用，术语“苯氧基”是指经由氧原子连接至母体分子部分的苯基。

如本申请所用，术语“苯氧基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的苯氧基。

如本申请所用，术语“苯基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的苯基。

如本申请所用，术语“苯基羰基”是指经由羰基连接至母体分子部分的苯基。

如本申请所用，术语“吡啶基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的吡啶基。吡啶基可经由基团中任何可取代原子连接至烷基部分。

如本申请所用，术语“硫基”是指-S-。

如本申请所用，术语“磺酰基”是指-SO₂-。

如本申请所用，术语“噻唑基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的噻唑基。噻唑基可经由基团中任何可取代原子连接至烷基部分。

如本申请所用，术语“噻吩基C₁-C₃烷基”是指经由C₁-C₃烷基连接至母体分子部分的噻吩基。噻吩基可经由基团中任何可取代原子连接至烷基部分。

术语“治疗”是指：(i)预防可能易患疾病、病症和/或病状、但尚未诊断出患病的患者出现所述疾病、病症或病状；(ii)抑制所述疾病、病症或病状，即，遏制其发展；及(iii)缓解所述疾病、病症或病状，即，使得所述疾病、病症和/或病状和/或与所述疾病、病症和/或病状相关的症状消退。

大环肽与PD-L1的结合可例如通过诸如均相时间分辨荧光(HTRF)、表面等离子共振(SPR)、等温滴定量热法(ITC)、核磁共振光谱(NMR)等的方法测量。另外，大环肽与表达于细胞表面上的PD-L1的结合可如本申请所述在细胞结合测定中测量。

施用本申请所述的治疗剂包括，但不限于，施用治疗有效量的治疗剂。如本申请所用，术语“治疗有效量”是指，但不限于，治疗或预防通过施用本申请所述的PD-1/PD-L1结合抑制剂的组合物可治疗的病状的治疗剂的量。该量为足以展现可检测的治疗性或预防性或改善性效应的量。效应可包括例如，但不限于，本申请中所列举的病状的治疗或预防。受试者的精确有效量将取决于受试者的体型及健康状况、欲治疗的病状的性质及程度、治疗医师的建议及选择用于施用的治疗剂或治疗剂组合。因此，事先规定精确有效量是不可用的。

在另一个方面中，本发明涉及使用本发明的大环肽抑制受试者肿瘤细胞生长的方法。如本申请所证实，本发明的大环肽能够结合至PD-L1、妨碍PD-L1与PD-1之间的相互作用、与PD-L1与已知阻断与PD-1的相互作用的抗-PD-1单克隆抗体的结合竞争、增强CMV特异性T细胞IFNγ分泌和增强HIV特异性T细胞IFNg分泌。因此，本发明的大环肽可用于调节免疫应答、治疗诸如癌症或感染性疾病的疾病、刺激保护性自身免疫应答或刺激抗原特异性免疫应答(例如，通过共施用PD-L1阻断肽与感兴趣的抗原)。

为了使本发明可更易于理解，首先定义某些术语。在整个实施方式中，阐述其他定义。

术语“程序性死亡配体1”、“程序性细胞死亡配体1”、“PD-L1蛋白”、“PD-L1”、“PDL1”、“PDCDL1”、“hPD-L1”、“hPD-LI”、“CD274”和“B7-H1”可互换使用且包括人类PD-L1的变体、同工型、物种同源物和具有至少一个与PD-L1共同的表位的类似物。完整PD-L1序列可见于

登记号NP_054862。

术语“程序性死亡1”、“程序性细胞死亡1”、“PD-1蛋白”、“PD-1”、“PD1”、“PDCD1”、“hPD-1”和“hPD-I”可互换使用且包括人类PD-1的变体、同工型、物种同源物和具有至少一个与PD-1共同的表位的类似物。完整PD-1序列可见于

登记号U64863。

术语“细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4”、“CTLA-4”、“CTLA4”、“CTLA-4抗原”和“CD152”(参见例如Murata,Am.J.Pathol.,155:453-460(1999))可互换使用且包括人类CTLA-4的变体、同工型、物种同源物和具有至少一个与CTLA-4共同的表位的类似物(参见例如Balzano,Int.J.Cancer Suppl.,7:28-32(1992))。完整CTLA-4核酸序列可见于

登记号L15006。

术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原递呈细胞、吞噬细胞、粒细胞和由以上细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括大环肽、细胞因子和补体)产生对侵入病原体、感染有病原体的细胞或组织、癌细胞或在自身免疫或病理性炎症的情况下正常人类细胞或组织的选择性损坏、破坏或自人体消除的作用。

如本申请所用，“不良事件”(AE)为与医学治疗的使用相关的任何不利且一般不希望、甚至不当迹象(包括异常实验室研究结果)、症状或疾病。举例而言，不良事件可与响应于治疗的免疫系统的活化或免疫系统细胞(例如，T细胞)的扩展相关。医学治疗可具有一或多个相关AE且各AE可具有相同或不同水平的严重度。提及能够“改变不良事件”的方法意指降低与不同治疗方案的使用相关联的一或多个AE的发生率和/或严重度的治疗方案。

如本申请所用，“过度增殖性疾病”是指细胞生长增加超过正常水平的病状。举例而言，过度增殖性疾病或病症包括恶性疾病(例如，食道癌、结肠癌、胆道癌)和非恶性疾病(例如，动脉粥样硬化、良性增殖和良性前列腺肥大)。

如本申请所用，“约”或“基本上包含”意指在如由本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受的误差范围内，其将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。举例而言，“约”或“基本上包含”可意指根据本领域的实践在一个或一个以上标准差内。可选择地，“约”或“基本上包含”可意指至多20％的范围。此外，尤其在生物系统或方法方面，所述术语可意指值的至多一个数量级或至多5倍。当在本申请和权利要求书中提供具体值时，除非另外陈述，否则“约”或“基本上包含”的含义应假定为在该具体值的可接受的误差范围内。

如本申请所述，除非另外指明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括在所列举范围内的任何整数值，以及在适当时，它们的分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。

竞争测定

本发明还涉及能够与参考抗-PD-L1抗体(MDX-1105)竞争结合达至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％和至少约100％的大环肽。此类大环肽可与一或多种本申请所披露的大环肽共享结构同源性，包括突变体、保守取代、功能取代和缺失形式，前提为其特异性结合至PD-L1。举例而言，若大环肽结合至与参考抗-PD-L1抗体基本上相同的PD-L1区，则大环肽应结合至与抗-PD-L1单克隆抗体所结合的PD-L1表位至少重叠的PD-L1表位。重叠区可在一个氨基酸残基至数百个氨基酸残基的范围内变化。接着大环肽应在竞争测定中与抗-PD-L1单克隆抗体与PD-L1的结合竞争和/或阻断该结合，从而减少抗-PD-L1单克隆抗体与PD-L1的结合，优选达至少约50％。

出于竞争测定目的可用作参考抗体的抗-PD-L1抗体为本领域已知的。举例而言，可使用以下代表性抗-PD-L1抗体：MDX-1105(BMS)；L01X-C(Serono)、L1X3(Serono)、MSB-0010718C(Serono)和PD-L1Probody(CytomX)及共同拥有的WO 2007/005874中所披露的PD-L1抗体。

出于竞争测定目的可用作参考抗体的抗-PD-1抗体为本领域已知的。举例而言，可使用以下代表性抗-PD-1抗体：纳武单抗(nivolumab)(BMS)；共同拥有的美国专利第8,008,449号中所分别披露的17D8、2D3、4H1、4A11、7D3和5F4(BMS)、MK-3475(Merck，美国专利第8,168,757号中所披露)及美国专利第7,488,802号中所披露的抗体。

药物组合物

在另一个方面中，本发明提供一种组合物，例如，药物组合物，其含有与药学上可接受的载体一起调配的一种本发明的大环肽或本发明的大环肽的组合。此类组合物可包括一种本发明的大环肽或免疫缀合物或双特异性分子或(例如，两种或更多种不同的)本发明的大环肽或免疫缀合物或双特异性分子的组合。举例而言，本发明的药物组合物可包含结合至靶抗原上的不同表位或具有互补活性的大环肽(或免疫缀合物或双特异性物)的组合。

本发明的药物组合物还可在组合疗法中(即，与其他药剂组合)施用。举例而言，组合疗法可包括大环肽与至少一种其他抗炎剂或免疫抑制剂的组合。可用于组合疗法的治疗剂的实例更详细地描述于下文关于本发明的大环肽的用途的部分中。

如本申请所用，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何及全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓(spinal)或表皮施用(例如，通过注射或输注)。取决于使用途径，活性化合物(即，大环肽、免疫缀合物或双特异性分子)可包覆在材料中以保护所述化合物免受酸作用及可使所述化合物不活化的其他天然条件。

本发明的药物化合物可包括一或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”或“治疗学上可接受的盐”是指保留母体化合物的期望生物活性且未赋予任何不期望的毒理学效应的盐(参见例如Berge,S.M.等人,J.Pharm.Sci.,66:1-19(1977))。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸(诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)以及衍生自无毒有机酸(诸如脂族单羧酸和二羧酸、经苯基取代的烷酸、羟基烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等)的盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属(诸如钠、钾、镁、钙等)以及衍生自无毒有机胺(诸如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因(procaine)等)的盐。

本发明的药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；及(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

可用于本发明药物组合物中的合适水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。可例如通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、通过在分散液的情况下通过维持所需粒度及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。

这些组合物还可含有佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌操作(见上文)及通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)而确保防止微生物存在。还可能需要在组合物中包括等张剂，诸如糖、氯化钠等。另外，可注射药物形式的延长吸收可通过包括延迟吸收剂(诸如单硬脂酸铝和明胶)来达成。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌散剂。此类介质和药剂用于药学活性物质的用途为本领域已知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于本发明的药物组合物中。组合物中还可掺入补充性活性化合物。

治疗组合物通常必须在制造和储存条件下无菌且稳定。组合物可调配为溶液、微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情况下，组合物中将优选包括等张剂，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来达成。

无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物与一种上列成分或成分组合一起掺入适当溶剂中，如果需要接着灭菌微过滤来制备。一般而言，分散液通过将活性化合物掺入含有碱性分散介质和所需上列其他成分的无菌媒介物中来制备。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法自其预先无菌过滤溶液产生活性成分粉末加任何额外期望成分。

可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的受试者、具体施用模式而变化。可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量一般为产生治疗性效应的组合物的量。一般而言，在100％中，该量将介于约0.01％至约99％的活性成分、优选约0.1％至约70％、最佳约1％至约30％的活性成分与药学上可接受的载体组合。

调节剂量方案以得到最佳期望响应(例如治疗响应)。举例而言，可施用单一药团(bolus)，可随时间施用若干分次剂量，或可如治疗情形的紧急程度所指示而按比例减少或增加剂量。就施用简便性和剂量均一性而言，将肠胃外组合物调配成单位剂型尤其有利。如本申请所用的单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗的受试者的实体上离散单位；各单位含有与所需药物载体结合的经计算以产生期望治疗性效应的预定量活性化合物。本发明的单位剂型的规格通过以下情况指定且直接取决于以下情况：(a)活性化合物的独特特征和欲达成的具体治疗性效应，及(b)混配用于治疗个体敏感性的此类活性化合物的技术中的固有限制。

关于大环肽的施用，剂量范围介于宿主体重的约0.0001至100mg/kg且更通常0.01至5mg/kg。举例而言，剂量可为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。例示性治疗方案需要每天一次、每天两次、一周两次(bi-weekly)、一周三次(tri-weekly)、一周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、一月一次、每3个月一次或每3至6个月一次施用。本发明的大环肽的优选剂量方案包括经由静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，同时使用以下给药时间表的一种施用大环：(i)每四周六次剂量，接着每三个月；(ii)每三周；(iii)3mg/kg体重一次，接着每三周1mg/kg体重。

在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种大环肽，在此情况下，所施用的各化合物的剂量属于所指示的范围内。化合物通常在多个时刻施用。单次剂量之间的间隔可为例如每周、每月、每三个月或每年。间隔亦可为不规律的，通过测量患者中针对靶抗原的大环肽的血液水平所指示。在一些方法中，调节剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆浓度，且在一些方法中达到约25-300μg/ml。

可选择地，大环肽可以持续释放制剂形式施用，在此情况下不需要频繁施用。施用的剂量和频率可取决于治疗为预防性或治疗性而变化。在预防性应用中，在长时期内，以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对较短的间隔施用相对较高的剂量，直至疾病的进展降低或终止，且优选直至患者展示疾病的症状的部分或完全改善。此后，可向患者施用预防性方案。

可改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量，以便获得在对患者无毒性的情况下有效达成特定患者、组合物和施用模式的期望治疗响应的量的活性成分。所选剂量水平将取决于多种药物动力学因素，包括本发明所用具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性；施用途径；施用时间；所用具体化合物的排泄率；治疗持续时间；与所用具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质；所治疗患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况和先前病史；及医学领域公知的类似因素。

“治疗有效剂量”的本发明的大环肽优选使得疾病症状的严重度降低、无疾病症状期的频率或持续时间增加或预防疾病病痛所致的损伤或失能。举例而言，关于肿瘤治疗，“治疗有效剂量”优选相对于未经治疗的受试者抑制细胞生长或肿瘤生长达至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％且再更优选至少约80％。化合物抑制肿瘤生长和/或HIV的能力可在预测对人类肿瘤的功效或病毒功效的动物模型系统中评价。可选择地，组合物的该特性可通过利用本领域技术人员已知的测定检查化合物的抑制能力(诸如体外抑制)来评价。治疗有效量的治疗性化合物可在受试者体内减小肿瘤尺寸、减少病毒负荷或以其他方式改善症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者体型、受试者症状的严重度和所选特定组合物或施用途径的因素来确定此类量。

在另一个方面中，本发明提供一种分装部分的药物试剂盒，其如本申请所述包含大环肽和另一种免疫调节剂。所述试剂盒还可另外包含治疗过度增殖性疾病(诸如，如本申请所述的癌症)和/或抗病毒疾病的使用说明书。

本发明的组合物可经由一或多种施用途径、使用本领域已知的多种方法中的一或多者来施用。如本领域技术人员应了解，施用途径和/或模式将取决于期望结果而变化。本发明的大环肽的优选施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本申请所用，短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外通常通过注射进行的施用模式，且包括，但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内、硬膜外及胸骨内注射和输注。

可选择地，本发明的大环肽可经由非肠胃外途径施用，诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、经阴道、经直肠、舌下或局部。

活性化合物可与将保护化合物免于快速释放的载体一起制备，诸如控制释放制剂，包括植入物、经皮贴剂和微胶囊化递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法已获得专利或一般为本领域技术人员已知。参见例如Robinson,J.R.编,Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,Marcel Dekker,Inc.,NewYork(1978)。

治疗性组合物可用本领域已知的医疗装置施用。举例而言，在一个优选实施方案中，本发明的治疗性组合物可用无针皮下注射装置施用，诸如美国专利第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号或第4,596,556号中所披露的装置。适用于本发明的公知植入物和模组的实例包括：美国专利第4,487,603号，其披露一种以受控速率施配药物的可植入微输注泵；美国专利第4,486,194号，其披露一种经由皮肤施用药物的治疗性装置；美国专利第4,447,233号，其披露一种以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利第4,447,224号，其披露一种用于连续药物递送的可变流动可植入输注装置；美国专利第4,439,196号，其披露一种具有多腔隔室的渗透药物递送系统；及美国专利第4,475,196号，其披露一种渗透药物递送系统。这些专利以引用的方式并入本申请中。许多其他此类植入物、递送系统和模组为本领域技术人员已知的。

在某些实施方案中，本发明的大环肽可经调配以确保恰当体内分布。举例而言，血脑屏障(BBB)排除多种高度亲水性化合物。为确保本发明的治疗性化合物穿过BBB(必要时)，它们可调配成例如脂质体。关于制造脂质体的方法，参见例如美国专利第4,522,811号、第5,374,548号和第5,399,331号。脂质体可包含选择性输送至特定细胞或器官中的一或多个部分，由此增强靶向药物递送(参见例如Ranade,V.V.,J.Clin.Pharmacol.,29:685(1989))。例示性靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如Low等人的美国专利第5,416,016号)；甘露糖(Umezawa等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,153:1038(1988))；大环肽(Bloeman,P.G.等人,FEBS Lett.,357:140(1995)；Owais,M.等人,Antimicrob.AgentsChemother.,39:180(1995))；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人,Am.J.Physiol.,1233:134(1995))；p120(Schreier等人,J.Biol.Chem.,269:9090(1994))；还参见Keinanen,K.等人,FEBS Lett.,346:123(1994)；Killion,J.J.等人,Immunomethods 4:273(1994)。

本发明的用途和方法

本发明的大环肽、组合物和方法具有许多体外和体内效用，涉及例如检测PD-L1或通过阻断PD-L1增强免疫应答。举例而言，这些分子可施用至体外或离体培养物中的细胞或施用至人类受试者(例如体内)以在多种情形中增强免疫力。因此，在一个方面中，本发明提供一种调节受试者的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用本发明的大环肽以便调节所述受试者的免疫应答。优选地，增强、刺激或上调反应。在其他方面中，大环肽可具有抗-猕猴、抗-小鼠和/或抗-土拨鼠结合和治疗活性。

如本申请所用，术语“受试者”意欲包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人类灵长类动物、羊、犬、猫、牛、马、鸡、土拨鼠、两栖动物和爬行动物，但哺乳动物为优选，诸如非人类灵长类动物、羊、犬、猫、牛和马。优选受试者包括需要增强免疫应答的人类患者。所述方法尤其适用于治疗患有可通过强化T细胞介导的免疫应答治疗的病症的人类患者。在一个特定实施方案中，所述方法尤其适用于体内处理癌细胞。为实现抗原特异性免疫力增强，大环肽可连同感兴趣的抗原一起施用。当针对PD-L1的大环肽连同另一药剂一起施用时，两者可以任一次序或同时施用。

本发明另外提供用于检测样品中人类、土拨鼠、猕猴和/或小鼠PD-L1抗原的存在或测量人类、土拨鼠、猕猴和/或小鼠PD-L1抗原的量的方法，其包括使所述样品和对照样品与特异性结合至人类、土拨鼠、猕猴和/或小鼠PD-L1的参考大环肽在允许在所述大环与人类、土拨鼠、猕猴和/或小鼠PD-L1之间形成复合物的条件下接触。接着检测复合物的形成，其中样品与对照样品相比的差异复合物形成指示样品中存在人类、土拨鼠、猕猴和/或小鼠PD-L1抗原。

鉴于本发明的大环肽对于PD-L1与CD28、ICOS和CTLA-4相比的特异性结合，本发明的大环肽可用于特异性检测细胞表面上的PD-L1表达，且此外，可用于经由免疫亲和力纯化来纯化PD-L1。

癌症

通过大环肽阻断PD-1可增强患者针对癌细胞的免疫应答。PD-1的配体PD-L1并不表达在正常人类细胞中，但大量存在于多种人类癌症中(Dong等人,Nat.Med.,8:787-789(2002))。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润性淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少和癌细胞免疫逃避(Dong等人,J.Mol.Med.,81:281-287(2003)；Blank等人,CancerImmunol.Immunother.,54:307-314(2005)；Konishi等人,Clin.Cancer Res.,10:5094-5100(2004))。免疫抑制可通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用而逆转，且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时，效应相加(Iwai等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,99:12293-12297(2002)；Brown等人,J.Immunol.,170:1257-1266(2003))。虽然先前研究已展示T细胞增殖可通过抑制PD-1与PD-L1的相互作用而恢复，但尚未报道通过阻断PD-1/PD-L1相互作用对体内癌症肿瘤生长的直接效应。在一个方面中，本发明涉及使用大环肽体内治疗受试者，使得癌性肿瘤生长受到抑制。大环肽可单独用于抑制癌性肿瘤生长。可选择地，大环肽可如下所述与其他免疫原性剂、标准癌症治疗或其他大环肽结合使用。

因此，在一个实施方案中，本发明提供一种抑制受试者的肿瘤细胞生长的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的大环肽。

可使用本发明的大环肽抑制生长的优选癌症包括通常响应于免疫疗法的癌症。治疗的优选癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾细胞癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺癌和去势抗性前列腺癌)、乳腺癌、结肠直肠癌和肺癌(例如，鳞状和非鳞状非小细胞肺癌)。另外，本发明包括可使用本发明的大环肽抑制生长的难治性或复发性恶性病。

可使用本发明的方法治疗的其他癌症的实例包括骨癌；胰腺癌；皮肤癌；头颈癌；皮肤或眼内恶性黑素瘤；子宫癌；卵巢癌；结肠癌；直肠癌；肛门区癌；胃癌；睾丸癌；子宫癌；输卵管癌；子宫内膜癌；子宫颈癌；阴道癌；外阴癌；霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)；非霍奇金氏淋巴瘤；食道癌；小肠癌；内分泌系统癌；甲状腺癌；甲状旁腺癌；肾上腺癌；软组织肉瘤；尿道癌；阴茎癌；慢性或急性白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病；儿童实体肿瘤；淋巴细胞性淋巴瘤；膀胱癌；肾癌或输尿管癌；肾盂癌；中枢神经系统(CNS)赘瘤；原发性CNS淋巴瘤；肿瘤血管生成；脊轴肿瘤；脑干神经胶质瘤；垂体腺瘤；卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)；表皮样癌；鳞状细胞癌；T细胞淋巴瘤；环境诱发癌，包括由石棉诱发的癌症；及所述癌症的组合。本发明还可用于治疗转移性癌症，尤其表达PD-L1的转移性癌症(Iwai等人,Int.Immunol.,17:133-144(2005))。

任选地，针对PD-L1的大环肽可与以下免疫原性剂组合，诸如癌细胞、经纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白质、肽和碳水化合物分子)、细胞和转染有编码免疫刺激细胞因子的基因的细胞(He等人,J.Immunol.,173:4919-4928(2004))。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，诸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽，或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(下文进一步论述)。

在人类中，已展示一些肿瘤具有免疫原性，诸如黑素瘤。预期通过利用PD-L1阻断升高T细胞活化的阈值，我们可预计活化宿主中的肿瘤响应。

当与疫苗接种方案组合时，PD-L1阻断可能最有效。已设计出针对肿瘤的许多实验性疫苗接种策略(参见Rosenberg,S.,Development of Cancer Vaccines,ASCOEducational Book Spring:60-62(2000)；Logothetis,C.,ASCO Educational BookSpring:300-302(2000)；Khayat,D.,ASCO Educational Book Spring:414-428(2000)；Foon,K.,ASCO Educational Book Spring:730-738(2000)；还参见Restifo,N.等人,Cancer Vaccines,第61章,第3023-3043页,DeVita,V.等人编,Cancer:Principles andPractice of Oncology,第五版(1997))。在这些策略之一中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。已显示这些细胞疫苗在肿瘤细胞经转导以表达GM-CSF时最有效。已显示GM-CSF为用于肿瘤疫苗接种的抗原递呈的强活化剂(Dranoff等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:3539-3543(1993))。

各种肿瘤中基因表达和大规模基因表达模式的研究已产生所谓肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg,S.A.,Immunity,10:281-287(1999))。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原为肿瘤中及出现肿瘤的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可展示为宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。PD-L1阻断可用于与表达于肿瘤中的重组蛋白质和/或肽的集合结合使用以产生针对这些蛋白质的免疫应答。这些蛋白质通常被免疫系统视为自体抗原且因此对其具耐受性。肿瘤抗原还可包括蛋白质端粒酶，其为合成染色体的端粒所必需的且表达于超过85％的人类癌症中且仅表达于有限数目的体细胞组织中(Kim,N等人,Science,266:2011-2013(1994))。(可通过各种手段保护这些体细胞组织免受免疫攻击)。肿瘤抗原还可为由于改变蛋白质序列或在两个无关序列之间形成融合蛋白(即，费城染色体(Philadelphia chromosome)中的bcr-abl)的体细胞突变而在癌细胞中表达的“新抗原”或B细胞肿瘤的受试者基因型。

其他肿瘤疫苗可包括人类癌症中所牵涉的病毒的蛋白质，所述病毒诸如人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可与PD-L1阻断结合使用的肿瘤特异性抗原的另一形式为自肿瘤组织自身分离的经纯化热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有肿瘤细胞蛋白质的片段且这些HSP高效递送至抗原递呈细胞以引发肿瘤免疫力(Suot,R.等人,Science,269:1585-1588(1995)；Tamura,Y.等人,Science,278:117-120(1997))。

树突状细胞(DC)为可用于引发抗原特异性应答的强抗原递呈细胞。DC可离体产生且负载有各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle,F.等人,Nat.Med.,4:328-332(1998))。DC还可通过基因方法转导从而也表达这些肿瘤抗原。DC还已出于免疫目的而直接与肿瘤细胞融合(Kugler,A.等人,Nat.Med.,6:332-336(2000))。作为疫苗接种的方法，DC免疫作用可与PD-L1阻断有效组合以活化更强抗肿瘤响应。

PD-L1阻断还可与标准癌症治疗组合。PD-L1阻断可与化学治疗方案有效组合。在这些情形中，有可能减小所施用的化学治疗剂的剂量(Mokyr,M.等人,Cancer Res.,58:5301-5304(1998))。此类组合的一个实例为大环肽与达卡巴嗪(decarbazine)组合用于治疗黑素瘤。此类组合的另一个实例为大环肽与白介素-2(IL-2)组合用于治疗黑素瘤。支持PD-L1阻断与化学疗法组合使用的科学基本原理在于作为大部分化学治疗化合物的细胞毒性作用结果的细胞死亡应使得抗原递呈途径中肿瘤抗原的水平增加。可经由细胞死亡而与PD-L1阻断产生协同作用的其他组合疗法为辐射、手术和激素去除(hormonedeprivation)。这些方案中的每一种产生宿主中的肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂还可与PD-L1阻断组合。抑制血管生成导致肿瘤细胞死亡，其可将肿瘤抗原馈至宿主抗原递呈途径中。

PD-L1阻断大环肽还可与使表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性大环肽组合使用(参见例如，美国专利第5,922,845号和第5,837,243号)。双特异性大环肽可用于靶向两个单独抗原。举例而言，抗-Fc受体/抗肿瘤抗原(例如，Her-2/neu)双特异性大环肽已用于使巨噬细胞靶向肿瘤位点。该靶向可更有效地活化肿瘤特异性响应。这些响应的T细胞臂通过使用PD-L1阻断来强化。可选择地，可通过使用结合至肿瘤抗原和树突状细胞特异性细胞表面标记的双特异性大环肽将抗原直接递送至DC。

肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。许多这些机制可通过使肿瘤所表达且具免疫抑制性的蛋白质不活化来克服。这些蛋白质尤其包括TGF-β(Kehrl,J.等人,J.Exp.Med.,163:1037-1050(1986))、IL-10(Howard,M.等人,Immunology Today,13:198-200(1992))和Fas配体(Hahne,M.等人,Science,274:1363-1365(1996))。针对这些实体中的每一种的大环肽可与抗-PD-L1组合使用，以抵消免疫抑制剂的效应且促进宿主的肿瘤免疫应答。

可用于活化宿主免疫应答的其他大环肽可与抗-PD-L1组合使用。这些大环肽包括树突状细胞表面上活化DC功能和抗原递呈的分子。抗-CD40大环肽能够有效替代辅助T细胞活性(Ridge,J.等人,Nature,393:474-478(1998))且可与PD-1抗体结合使用(Ito,N.等人,Immunobiology,201(5):527-540(2000))。活化针对以下T细胞协同刺激分子的大环肽还可使得T细胞活化水平增加，诸如CTLA-4(例如，美国专利第5,811,097号)、OX-40(Weinberg,A.等人,Immunol.,164:2160-2169(2000))、4-1BB(Melero,I.等人,Nat.Med.,3:682-685(1997)和ICOS(Hutloff,A.等人,Nature,397:262-266(1999))。

骨髓移植目前用于治疗多种造血来源的肿瘤。虽然移植物抗宿主病为该治疗的后果，但可自移植物抗肿瘤响应获得治疗效益。PD-L1阻断可用于增加供体移植的肿瘤特异性T细胞的有效性。

还存在涉及抗原特异性T细胞的离体活化和扩展及将这些细胞过继性转移至接受者中以便抗原特异性T细胞抗肿瘤的数个实验性治疗方案(Greenberg,R.等人,Science,285:546-551(1999))。这些方法还可用于活化针对诸如CMV的感染物的T细胞响应。在大环肽存在下的离体活化可预期增加过继性转移T细胞的频率和活性。

感染性疾病

本发明的其他方法用于治疗已暴露于特定毒素或病原体的患者。因此，本发明的另一个方面提供一种治疗受试者的感染性疾病的方法，其包括向所述受试者施用本发明的大环肽，以便治疗所述受试者的感染性疾病。

与其如上文所论述的针对肿瘤的应用类似，PD-L1阻断可单独使用或作为佐剂与疫苗组合使用以刺激针对病原体、毒素和自体抗原的免疫应答。该治疗方法可特别适用的病原体的实例包括当前无有效疫苗的病原体或常规疫苗不完全有效的病原体。这些病原体包括，但不限于，HIV、肝炎(甲型、乙型和丙型)病毒、流感病毒、疱疹病毒、梨形鞭毛虫属(Giardia)、疟疾(Butler,N.S.等人,Nature Immunology 13,188-195(2012)；Hafalla,J.C.R.等人,PLOS Pathogens；February 2,2012))、利什曼原虫属(Leishmania)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas Aeruginosa)。PD-L1阻断特别适用于抵抗由经感染过程递呈改变抗原的感染物(诸如HIV)所确立的感染。这些新颖表位在施用抗-人类PD-L1时识别为外来的，因此经由PD-L1引起通过阴性信号未抑制的强T细胞响应。

引起可通过本发明方法治疗的感染的病原性病毒的一些实例包括HIV、肝炎(甲型、乙型和丙型)病毒、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒(EpsteinBarr virus))、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、冠状病毒、呼吸道融合胞体病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒(molluscumvirus)、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒。

引起可通过本发明方法治疗的感染的病原菌的一些实例包括衣原体(chlamydia)、立克次体细菌(rickettsial bacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和淋球菌(conococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、军团菌(legionella)、白喉(diphtheria)、沙门氏菌(salmonella)、杆菌(bacilli)、霍乱(cholera)、破伤风(tetanus)、肉毒中毒(botulism)、炭疽病(anthrax)、瘟疫(plague)、钩端螺旋体病(leptospirosis)和莱姆病(Lymes disease)细菌。

引起可通过本发明方法治疗的感染的病原性真菌的一些实例包括念珠菌属(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克鲁斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、曲菌属(Aspergillus)(烟曲霉(fumigatus)、黑曲菌(niger)等)、毛霉目(Mucorales)属(毛霉菌属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉属(rhizophus))、申克氏胞丝菌(Sporothrixschenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。

引起可通过本发明方法治疗的感染的病原性寄生虫的一些实例包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、大肠纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴原虫(Naegleriafowleri)、棘阿米巴虫属(Acanthamoeba sp.)、兰比亚梨形鞭毛虫(Giardialambia)、隐胞子虫属(Cryptosporidium sp.)、肺炎肺囊虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫、微小巴倍虫、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondi)和巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。

在所有以上方法中，PD-L1阻断可与以下其他形式的免疫疗法组合，从而提供增强的肿瘤抗原递呈，诸如细胞因子治疗(例如，干扰素、靶向VEGF活性或VEGF受体的药剂、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或双特异性抗体疗法(参见例如Holliger,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)；Poljak,Structure,2:1121-1123(1994))。

自身免疫反应

大环肽可引起且放大自身免疫应答。实际上，使用肿瘤细胞和肽疫苗诱发抗肿瘤相应揭示许多抗肿瘤响应涉及抗自体反应性(在抗-CTLA-4+GM-CSF调节的B 16黑素瘤中观测到去色素(van Elsas等人,见上文)；Trp-2疫苗接种小鼠中的去色素(Overwijk,W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:2982-2987(1999))；由TRAMP肿瘤细胞疫苗引起的自身免疫前列腺炎(Hurwitz,A.,见上文(2000))、在人类临床试验中观测到黑素瘤肽抗原疫苗接种和白癜风(Rosenberg,S.A.等人,J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.,19(1):81-84(1996))。

因此，可考虑抗-PD-L1阻断与各种自身蛋白质结合使用以便设计高效产生针对这些自身蛋白质的免疫应答用于疾病治疗的疫苗接种方案。举例而言，阿兹海默病涉及淀粉样沉积物的Aβ肽在脑中的不当积聚；针对淀粉样的抗体应答能够清除这些淀粉样沉积物(Schenk等人,Nature,400:173-177(1999))。

其他自身蛋白质也可用作靶标，诸如用于过敏症和哮喘治疗的IgE及用于类风湿性关节炎治疗的TNFα。最后，针对各种激素的抗体应答可通过使用本申请所披露的大环化合物诱导。针对生殖激素的中和抗体应答可用于避孕。针对特定肿瘤生长所需的激素及其他可溶性因子的中和抗体应答还可视为可能的疫苗接种靶标。

如上所述使用抗-PD-L1大环化合物的类似方法可用于诱导治疗性自身免疫应答以治疗具有其他自身抗原(诸如淀粉样沉积物，包括阿兹海默病中的Aβ；细胞因子，诸如TNFα和IgE)不当积聚的患者。

疫苗

大环肽可通过抗-PD-1大环与感兴趣的抗原(例如，疫苗)的共施用而用于刺激抗原特异性免疫应答。因此，在另一个方面中，本发明提供一种增强受试者体内针对抗原的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用：(i)所述抗原；及(ii)抗-PD-1大环，使得受试者体内针对所述抗原的免疫应答得以增强。抗原可为例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。此类抗原的非限制性实例包括以上部分中所论述的抗原，诸如上文所论述的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)、或来自上文所述的病毒、细菌或其他病原体的抗原。

体内和体外施用本发明组合物(例如，大环肽、多特异性和双特异性分子及免疫缀合物)的合适途径为本领域公知，且可由普通技术人员选择。举例而言，组合物可通过注射(例如，静脉内或皮下)施用。所用分子的合适剂量将取决于受试者的年龄和体重以及组合物的浓度和/或制剂。

如先前所述，本发明的大环肽可与一或多种其他治疗剂(例如，细胞毒性剂、放射毒性剂或免疫抑制剂)共施用。肽可连接至药剂(以免疫复合物形式)或可与药剂分开施用。在后一情况(分开施用)中，肽可在药剂之前、之后或与其同时施用或可与其他已知疗法(例如抗癌疗法，例如辐射)共施用。此类治疗剂尤其包括抗赘生性剂，诸如多柔比星(doxorubicin)(阿德里亚霉素(adriamycin))、顺铂博来霉素硫酸盐(cisplatinbleomycin sulfate)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、达卡巴嗪和环磷酰胺羟基脲(cyclophosphamide hydroxyurea)，其本身仅在对患者具毒性或亚毒性的水平下有效。顺铂每四周以100mg/剂量静脉内施用一次，且阿德里亚霉素每21天以60-75mg/ml剂量静脉内施用一次。本发明的大环肽与化学治疗剂的共施用提供两种经由不同机制操作的抗癌剂，其产生针对人类肿瘤细胞的细胞毒性效应。此类共施用可解决因发展对药物的抗性或肿瘤细胞的抗原性改变而将使其不与肽起反应所致的问题。

包含本发明组合物(例如，大环肽、双特异性或多特异性分子或免疫缀合物)和使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。试剂盒可另外含有至少一种额外试剂或一或多种本发明的额外大环肽(例如，具有结合至PD-L1抗原中与大环不同的表位的互补活性的人类抗体)。试剂盒通常包括指示试剂盒内含物的预期用途的标签。术语“标签”包括在试剂盒上或与试剂盒一起供应或以其他方式伴随试剂盒的任何书写或记录材料。

组合疗法

本发明的大环肽与另一PD-L1拮抗剂和/或其他免疫调节剂的组合可用于增强针对过度增殖性疾病的免疫应答。举例而言，这些分子可施用至体外或离体培养物中的细胞或施用至人类受试者(例如体内)以在多种情形中增强免疫力。因此，在一个方面中，本发明提供一种调节受试者的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用本发明的大环肽以便调节所述受试者的免疫应答。优选地，增强、刺激或上调反应。在另一个实施方案中，本发明提供一种改变与用免疫刺激性治疗剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，其包括向受试者施用本发明的大环肽和亚治疗剂量的另一种免疫调节剂。

通过大环肽阻断PD-L1可增强患者针对癌细胞的免疫应答。可使用本发明的大环肽抑制生长的癌症包括通常响应于免疫疗法的癌症。用本发明的组合疗法治疗的癌症的代表性实例包括黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌。可使用本发明的方法治疗的其他癌症的实例包括骨癌；胰腺癌；皮肤癌；头颈癌；皮肤或眼内恶性黑素瘤；子宫癌；卵巢癌；直肠癌；肛门区癌；胃癌；睾丸癌；子宫癌；输卵管癌；子宫内膜癌；子宫颈癌；阴道癌；外阴癌；霍奇金氏病；非霍奇金氏淋巴瘤；食道癌；小肠癌；内分泌系统癌；甲状腺癌；甲状旁腺癌；肾上腺癌；软组织肉瘤；尿道癌；阴茎癌；慢性或急性白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病；儿童实体肿瘤；淋巴细胞性淋巴瘤；膀胱癌；肾癌或输尿管癌；肾盂癌；中枢神经系统(CNS)赘瘤；原发性CNS淋巴瘤；肿瘤血管生成；脊轴肿瘤；脑干神经胶质瘤；垂体腺瘤；卡波西肉瘤；表皮样癌；鳞状细胞癌；T细胞淋巴瘤；环境诱发癌，包括由石棉诱发的癌症；及所述癌症的组合。本发明还可用于治疗转移性癌症。

在某些实施方案中，含有至少一种本申请中论述的大环肽的治疗剂组合可以在药学上可接受的载体中的单一组合物形式同时施用，或以各药剂可依次施用的分开组合物形式同时施用。举例而言，第二免疫调节剂和本发明的大环肽可依次施用，诸如首先施用第二免疫调节剂且其次施用大环肽，或首先施用大环肽且其次施用第二免疫调节剂。此外，若依次施用一次以上剂量的组合疗法，则依次施用的次序在每一施用时间点可颠倒或保持相同次序，依次施用可与同时施用组合或其任何组合。举例而言，第二免疫调节剂和大环肽的第一次施用可同时，第二次施用可依次，其中首先施用第二免疫调节剂且其次施用大环肽，且第三次施用可依次，其中首先施用大环肽且其次施用第二免疫调节剂等。另一代表性给药方案可涉及首先依次施用，其中首先施用大环肽且其次施用第二免疫调节剂，且后续施用可同时。

任选地，大环肽和第二免疫调节剂的组合可另外与以下免疫原性剂组合，诸如癌细胞、经纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白质、肽和碳水化合物分子)、细胞和转染有编码免疫刺激细胞因子的基因的细胞(He等人,J.Immunol.,173:4919-4928(2004))。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，诸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽，或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(下文进一步论述)。

经组合的PD-L1大环肽和第二免疫调节剂可另外与疫苗接种方案组合。已设计出针对肿瘤的许多实验性疫苗接种策略(参见Rosenberg,S.,Development of CancerVaccines,ASCO Educational Book Spring:60-62(2000)；Logothetis,C.,ASCOEducational Book Spring:300-302(2000)；Khayat,D.,ASCO Educational Book Spring:414-428(2000)；Foon,K.,ASCO Educational Book Spring:730-738(2000)；还参见Restifo等人,Cancer Vaccines,第61章,第3023-3043页,DeVita等人编,Cancer:Principles and Practice of Oncology,第五版(1997))。在这些策略之一中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。已显示这些细胞疫苗在肿瘤细胞经转导以表达GM-CSF时最有效。已显示GM-CSF为用于肿瘤疫苗接种的抗原递呈的强活化剂(Dranoff等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:3539-3543(1993))。

各种肿瘤中基因表达和大规模基因表达模式的研究已产生所谓肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg,Immunity,10:281-287(1999))。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原为肿瘤中及出现肿瘤的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可展示为宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。在某些实施方案中，经组合的PD-L1大环肽和第二免疫调节剂可用于与表达于肿瘤中的重组蛋白质和/或肽的集合结合使用以产生针对这些蛋白质的免疫应答。这些蛋白质通常被免疫系统视为自体抗原且因此对其具耐受性。肿瘤抗原还可包括蛋白质端粒酶，其为合成染色体的端粒所必需的且表达于超过85％的人类癌症中且仅表达于有限数目的体细胞组织中(Kim等人,Science,266:2011-2013(1994))。(可通过各种方法保护这些体细胞组织免受免疫攻击)。肿瘤抗原还可为由于改变蛋白质序列或在两个无关序列之间形成融合蛋白(即，费城染色体中的bcr-abl)的体细胞突变而在癌细胞中表达的“新抗原”或B细胞肿瘤的受试者基因型。

其他肿瘤疫苗可包括人类癌症中所牵涉的病毒的蛋白质，所述病毒诸如人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可与PD-L1大环肽阻断结合使用的肿瘤特异性抗原的另一形式为自肿瘤组织自身分离的经纯化热休克蛋白质(HSP)。这些热休克蛋白质含有肿瘤细胞蛋白质的片段且这些HSP高效递送至抗原递呈细胞以引发肿瘤免疫力(Suot等人,Science,269:1585-1588(1995)；Tamura等人,Science,278:117-120(1997))。

树突状细胞(DC)为可用于引发抗原特异性应答的强抗原递呈细胞。DC可离体产生且负载有各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle等人,Nat.Med.,4:328-332(1998))。DC还可通过基因方法转导从而也表达这些肿瘤抗原。DC还已出于免疫目的而直接与肿瘤细胞融合(Kugler等人,Nat.Med.,6:332-336(2000))。作为疫苗接种的方法，DC免疫作用可与经组合的抗-PD-L1大环肽和第二免疫调节剂进一步有效组合以活化更强抗肿瘤响应。

经组合的抗-PD-L1大环肽和额外免疫调节剂还可与标准癌症治疗进一步组合。举例而言，大环肽与第二免疫调节剂的组合可与化学治疗方案有效组合。在这些情形中，如在大环肽与第二免疫调节剂的组合下所观测，有可能减小与本发明的组合一起施用的其他化学治疗剂的剂量(Mokyr等人,Cancer Res.,58:5301-5304(1998))。此类组合的一个实例为大环肽与第二免疫调节剂的组合与达卡巴嗪进一步组合用于治疗黑素瘤。另一个实例为大环肽与第二免疫调节剂的组合与白介素-2(IL-2)进一步组合用于治疗黑素瘤。支持PD-L1大环肽和另一种免疫调节剂与化学疗法组合使用的科学基本原理在于作为大部分化学治疗化合物的细胞毒性作用结果的细胞死亡应使得抗原递呈途径中肿瘤抗原的水平增加。可经由细胞死亡而与经组合的抗-PD-L1大环肽和额外免疫调节剂产生协同作用的其他组合疗法包括辐射、手术和激素去除。这些方案中的每一种产生宿主中的肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂还可与经组合的PD-L1和第二免疫调节剂组合。抑制血管生成导致肿瘤细胞死亡，其还可为馈至宿主抗原递呈途径中的肿瘤抗原的来源。

PD-L1与另一种免疫调节剂的组合还可与使表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性大环肽组合使用(参见例如，美国专利第5,922,845号和第5,837,243号)。双特异性大环肽可用于靶向两个单独抗原。举例而言，抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如，Her-2/neu)双特异性大环肽已用于使巨噬细胞靶向肿瘤位点。该靶向可更有效地活化肿瘤特异性响应。这些响应的T细胞臂通过使用经组合的PD-L1和第二免疫调节剂来强化。可选择地，可通过使用结合至肿瘤抗原和树突状细胞特异性细胞表面标记的双特异性大环肽将抗原直接递送至DC。

在另一个实例中，大环肽与第二免疫调节剂的组合可与以下抗赘生性大环剂结合使用，诸如

(利妥昔单抗(rituximab))、

(曲妥珠单抗(trastuzumab))、

(托西莫单抗(tositumomab))、

(替依莫单抗(ibritumomab))、

(阿仑单抗(alemtuzumab))、Lymphocide(依帕珠单抗(eprtuzumab))、

(贝伐单抗(bevacizumab))和

(厄洛替尼(erlotinib))等。举例而言，且不希望受理论束缚，用抗癌抗体或与毒素结合的抗癌抗体治疗可导致癌细胞死亡(例如，肿瘤细胞)，其将强化通过第二免疫调节剂靶标或PD-L1介导的免疫应答。在一个示例性实施方案中，过度增殖性疾病(例如，癌症肿瘤)的治疗可包括抗癌抗体与同时或依次或其任何组合施用的大环肽和第二免疫调节剂的组合，其可强化宿主的抗肿瘤免疫应答。

肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。许多这些机制可通过使肿瘤所表达且具免疫抑制性的蛋白质不活化来克服。这些蛋白质尤其包括TGF-β(Kehrl,J.等人,J.Exp.Med.,163:1037-1050(1986))、IL-10(Howard,M.等人,Immunology Today,13:198-200(1992))和Fas配体(Hahne,M.等人,Science,274:1363-1365(1996))。在另一个实施例中，针对这些实体中的每一种的抗体可与大环肽和另一种免疫调节剂进一步组合，以抵消免疫抑制剂的效应且促进宿主的肿瘤免疫应答。

可用于活化宿主免疫应答性的其他药剂可与本发明的大环肽进一步组合使用。这些药剂包括树突状细胞表面上活化DC功能和抗原递呈的分子。抗-CD40大环肽能够有效替代辅助T细胞活性(Ridge,J.等人,Nature,393:474-478(1998))且可与单独或与抗-CTLA-4组合组合的本发明的大环肽结合使用(Ito,N.等人,Immunobiology,201(5):527-540(2000))。活化针对以下T细胞协同刺激分子的大环肽还可使得T细胞活化水平增加，诸如OX-40(Weinberg,A.等人,Immunol.,164:2160-2169(2000))、4-1BB(Melero,I.等人,Nat.Med.,3:682-685(1997)和ICOS(Hutloff,A.等人,Nature,397:262-266(1999))。

骨髓移植目前用于治疗多种造血来源的肿瘤。虽然移植物抗宿主病为该治疗的后果，但可自移植物抗肿瘤响应获得治疗效益。单独或与另一种免疫调节剂组合的本发明的大环肽可用于增加供体移植的肿瘤特异性T细胞的有效性。

还存在涉及抗原特异性T细胞的离体活化和扩展及将这些细胞过继性转移至受体中以便抗原特异性T细胞抗肿瘤的数个实验性治疗方案(Greenberg,R.等人,Science,285:546-551(1999))。这些方法还可用于活化针对诸如CMV的感染物的T细胞响应。在单独或与另一种免疫调节剂组合的本发明的大环肽存在下的离体活化可预期增加过继性转移T细胞的频率和活性。

在某些实施方案中，本发明提供一种改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，其包括向受试者施用本发明的大环肽与亚治疗剂量的另一种免疫调节剂的组合。举例而言，本发明的方法提供一种通过向患者施用不可吸收类固醇而降低免疫刺激性治疗抗体诱导的结肠炎或腹泻的发病率的方法。由于任何将接受免疫刺激性治疗抗体的患者处于罹患由此类治疗诱导的结肠炎或腹泻的风险下，故该整个患者群体适合于根据本发明方法的疗法。虽然已施用类固醇以治疗炎性肠病(IBD)和预防IBD的恶化，但其尚未用于在尚未诊断患有IBD的患者中预防IBD(降低IBD的发病率)。与类固醇(甚至不可吸收类固醇)相关的显著副作用已阻碍预防性使用。

在其他实施方案中，单独或与另一种免疫调节剂组合的本发明的大环肽可与任何不可吸收类固醇的使用进一步组合。如本申请所用，“不可吸收类固醇”为展现广泛的首过代谢(first pass metabolism)的糖皮质激素，使得在肝脏中代谢后，类固醇的生物利用度低，即小于约20％。在本发明的一个实施方案中，所述不可吸收类固醇为布地奈德(budesonide)。布地奈德为局部起效的糖皮类固醇，其在口服施用后主要通过肝脏广泛代谢。

EC(Astra-Zeneca)为经研发以使药物递送至回肠和贯穿结肠最佳化的布地奈德的pH和时间依赖性口服制剂。

EC在美国核准用于治疗涉及回肠和/或升结肠的轻度至中度克罗恩病(Crohn's disease)。用于治疗克罗恩病的

EC的常用口服剂量为6至9mg/天。

EC在肠中释放，随后吸收且保留在肠道粘膜中。一旦其通过肠道粘膜目标组织，

EC在肝脏中通过细胞色素P450系统广泛代谢成具有可忽略的糖皮质激素活性的代谢物。因此，生物利用度较低(约10％)。布地奈德的低生物利用度使得与具有较不广泛的首过代谢的其他糖皮质激素相比的治疗比率得以改善。布地奈德与全身起效的皮质类固醇相比产生较少不良作用，包括下丘脑-垂体抑制作用较小。然而，长期施用

EC可导致全身性糖皮质激素效应，诸如肾上腺皮质机能亢进症和肾上腺抑制。参见Physicians'Desk ReferenceSupplement,第58版,608-610(2004)。

在其他实施方案中，PD-L1和另一种免疫调节剂与不可吸收类固醇结合的组合可与水杨酸类(salicylate)进一步组合。水杨酸类包括5-ASA剂，诸如：柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)(

Pharmacia&Upjohn)；奥沙拉嗪(olsalazine)(

Pharmacia&UpJohn)；巴柳氮(balsalazide)(

SalixPharmaceuticals,Inc.)；和美沙拉嗪(mesalamine)(

Procter&GamblePharmaceuticals；

Shire US；

Axcan Scandipharm,Inc.；

Solvay)。

剂量和制剂

式I的合适肽或更具体而言本申请所述的大环肽，可作为单独化合物或与可接受的载体混合以药物制剂形式施用至患者以治疗糖尿病及其他相关疾病。治疗糖尿病领域的技术人员可易于确定向需要此类治疗的哺乳动物(包括人类)施用化合物的剂量和途径。施用途径可包括，但不限于，口服、口内、经直肠、经皮、含服、鼻内、经肺、皮下、肌内、皮内、舌下、结肠内、眼内、静脉内或肠道施用。根据施用途径，基于可接受的药学实践调配化合物(Fingl等人,The Pharmacological Basis of Therapeutics,第1章,第1页(1975)；Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1990))。

本申请所述的药学上可接受的肽组合物可以多种剂型施用，诸如片剂、胶囊(其各包括持续释放或定时释放制剂)、丸剂、散剂、颗粒、酏剂、原位凝胶、微球、晶体复合物、脂质体、微乳液、酊剂、悬浮液、糖浆、气溶胶喷雾剂和乳液。本申请所述的组合物还可以口服、静脉内(推注或输注)、腹膜内、皮下、经皮或肌内形式施用，全部使用药学领域普通技术人员公知的剂型。组合物可单独施用，但通常将与基于所选施用途径和标准药学实践选择的药用载体一起施用。

本申请所述的组合物的剂量方案将当然取决于已知因素而变化，诸如具体药剂的药效学特征及其施用模式和途径；接受者的物种、年龄、性别、健康状况、医学病状和体重；症状的性质和程度；同时发生的治疗的种类；治疗频率；施用途径、患者的肾功能和肝功能以及期望效应。医师或兽医可确定预防、对抗或遏止疾病状态的进程所需的有效量的药物且开具该有效量的药物的处方。

根据一般指导，活性成分在用于指定效应时的口服日剂量将介于每千克体重约0.001至约1000mg范围内，优选每天每千克体重约0.01至约100mg，且最优选每天每千克约0.6至约20mg。活性成分在用于指定效应时的静脉内日剂量将在恒定速率输注期间介于每千克体重每分钟0.001ng至100.0ng范围内。此类恒定静脉内输注可优选以每千克体重每分钟0.01ng至50ng且最优选每千克体重每分钟0.01ng至10.0mg的速率施用。本申请所述的组合物可以单次日剂量施用，或每日总剂量可分成每日两次、三次或四次分次剂量施用。本申请所述的组合物还可视需要通过将允许经数天/周/月的时段持续释放药物的贮库(depot)制剂施用。

本申请所述的组合物可经由局部使用合适的鼻内媒介物以鼻内形成或使用经皮皮肤贴片经由经皮途径施用。当以经皮递送系统形式施用时，剂量施用将当然在整个剂量方案中为连续而非间断的。

组合物通常与根据预定施用形式(即，口服片剂、胶囊、酏剂、在抛射剂存在或不存在下生成的气溶胶喷雾剂和糖浆)适当选择且与常规药学实践相符的合适药用稀释剂、赋形剂或载体(在本申请中统称为药用载体)混合施用。

举例而言，对于以片剂或胶囊形式口服施用，活性药物组分可与以下口服、无毒、药学上可接受的惰性载体组合，诸如，但不限于，乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇和山梨醇；对于以液体形式口服施用，口服药物组分可与以下任何口服、无毒、药学上可接受的惰性载体组合，诸如，但不限于，乙醇、丙三醇和水。此外，当需要或必要时，还可将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入混合物中。合适的粘合剂包括，但不限于，淀粉；明胶；天然糖，诸如，但不限于，葡萄糖或β-乳糖；玉米增甜剂；天然和合成胶，诸如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠；羧基甲基纤维素；聚乙二醇和蜡。用于这些剂型的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠。崩解剂包括，但不限于，淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土和黄原胶。

本申请所述的组合物还可以混合微胞或脂质体递送系统形式施用，诸如单层小微脂粒(small unilamellar vesicles)、单层大微脂粒(large unilamellar vesicles)和多层微脂粒(multilamellar vesicles)。脂质体可由多种磷脂形成，诸如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱。可添加渗透增强剂以增强药物吸收。

由于已知前药增强许多期望的药物品质(即，溶解性、生物利用度、制备等)，故本申请所述化合物可以前药形式递送。因此，本申请所述的主题意欲涵盖本发明要求保护的化合物的前药、递送它们的方法及含有它们的组合物。

本申请所述的组合物还可与作为靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。此类聚合物可包括聚乙烯-吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟基乙基天冬酰胺苯酚或经棕榈酰基残基取代的聚氧化乙烯-聚赖氨酸。此外，本申请所述的组合物可与以下可用于实现药物控制释放的一类可生物降解聚合物组合，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸与聚乙醇酸的共聚物、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两性嵌段共聚物。

适于施用的剂型(药物组合物)可含有每剂量单位约0.01毫克至约500毫克活性成分。在这些药物组合物中，活性成分将通常以按所述组合物的总重量计约0.5-95重量％的量存在。

明胶胶囊可含有活性成分和粉末状载体，诸如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁和硬脂酸。类似的稀释剂可用于制备压制片剂。片剂和胶囊可制备为持续释放产物以提供药物经数小时时段的连续释放。压制片剂可经糖包覆或经膜包覆以掩盖任何令人不愉快的味道且保护片剂不受大气影响，或经肠溶包衣包覆以便在胃肠道中选择性崩解。

用于口服施用的液体剂型可含有着色剂和矫味剂以增加患者接受性。

一般而言，水、合适的油、生理盐水、右旋糖(葡萄糖)及相关糖溶液和二醇(诸如丙二醇或聚乙二醇)为用于肠胃外溶液的合适载体。用于肠胃外施用的溶液优选含有活性成分的水溶性盐、合适的稳定剂和(若需要)缓冲物质。单独或组合的抗氧化剂，诸如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸为合适的稳定剂。还使用柠檬酸及其盐和EDTA钠。另外，肠胃外溶液可含有防腐剂，诸如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。

合适的药用载体描述于本领域的标准参考书Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第十九版,Mack Publishing Company(1995)中。

可用于本申请所述化合物施用的代表性药物剂型可说明如下：

胶囊

大多数单位胶囊可通过用100毫克粉末状活性成分、150毫克乳糖、50毫克纤维素和6毫克硬脂酸镁填充标准两件式(two-piece)硬明胶胶囊来制备。

软明胶胶囊

可制备活性成分于可消化油(诸如大豆油、棉籽油或橄榄油)中的混合物且借助于正排量泵注入明胶中以形成含有100毫克活性成分的软明胶胶囊。胶囊应当洗涤且干燥。

片剂

片剂可通过常规操作制备以使得剂量单位例如为100毫克活性成分、0.2毫克胶态二氧化硅、5毫克硬脂酸镁、275毫克微晶纤维素、11毫克淀粉和98.8毫克乳糖。可应用适当包衣以增加适口性或延迟吸收。

可注射剂

本申请所述的肽组合物的可注射制剂可或可不需要使用赋形剂，诸如已被监管机构批准的赋形剂。这些赋形剂包括，但不限于，溶剂和共溶剂、增溶剂、乳化剂或增稠剂、螯合剂、抗氧化剂和还原剂、抗微生物防腐剂、缓冲剂和pH调节剂、填充剂、保护剂和张力调节剂及特殊添加剂。可注射制剂必须无菌、无热原且在溶液情况下，不含微粒物质。

适于通过注射施用的肠胃外组合物可通过将例如1.5重量％活性成分搅拌于可或可不含有共溶剂或其他赋形剂的药学上可接受的缓冲液中来制备。溶液应当用氯化钠等张且灭菌。

悬浮液

可制备用于口服和/或肠胃外施用的水性悬浮液，以使得例如各5mL含有100mg细粉状活性成分、20mg羧甲基纤维素钠、5mg苯甲酸钠、1.0g山梨醇溶液U.S.P.和0.025mL香草醛或其他适口性矫味剂。

可生物降解微粒

适于通过注射施用的持续释放肠胃外组合物可如下制备：例如通过将合适的可生物降解聚合物溶解于溶剂中，将欲掺入的活性剂添加至聚合物溶液且自基质移除溶剂，由此形成活性剂分布于整个基质中的聚合物基质。

本申请案中(包含尤其在下列阐释性实施例中)所使用的缩写已为本领域技术人员所已知。所用的一些缩写如下：HOBt为羟基苯并三唑；HOAt为1-羟基-7-氮杂苯并三唑；DIC为N,N’-二异丙基碳化二亚胺；BOP为六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基参(二甲基氨基)鏻；PyBOP为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻；HCTU为1H-苯并三唑鎓1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5氯-,六氟磷酸盐(1-),3-氧化物；HATU为六氟磷酸1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物；TFA为三氟乙酸；TIS为三异丙基硅烷；DMSO为二甲亚砜；MeCN或ACN或AcCN为乙腈；DMF为N,N-二甲基甲酰胺；DCM为二氯甲烷；DIPEA或DIEA为二异丙基乙胺；Et₂O为二乙醚；MeOH为甲醇；rt为室温；h为小时；min为分钟；且iPr为异丙基。

肽合成

本申请中本发明的说明应根据化学键合的原理和规则加以解释。应理解，本发明所涵盖的化合物为对于作为药物的合适稳定性的那些。本领域技术人员知晓何种化合物基于化学键合及稳定性的一般原理将是稳定的及不稳定的。

可使用各种本领域认可的方法(包含逐步固相合成、经由肽片段的构象辅助性连接的半合成、克隆或合成肽区段的酶连接及化学连接)来实施本发明大环肽的化学合成。合成本申请所表示的大环肽及其类似物的优选方法使用各种固相技术的化学合成，这些固相技术为(例如)表示于以下文献中的那些：Chan,W.C.等人编辑，Fmoc Solid PhaseSynthesis,Oxford University Press,Oxford(2000)；Barany,G.等人，The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology，第2卷：“Special Methods in Peptide Synthesis，PartA”，第3-284页，Gross,E.等人编辑，Academic Press,New York(1980)；及Stewart,J.M.等人，Solid-Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984)。优选策略基于Fmoc(9-茀基甲基甲基-氧基羰基)(用于暂时保护α-氨基)与叔丁基(用于暂时保护氨基酸侧链)的组合(例如参见Atherton,E.等人，“The FluorenylmethoxycarbonylAmino Protecting Group”,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biolog，第9卷：“SpecialMethods in Peptide Synthesis,Part C”，第1-38页，Undenfriend,S.等人编辑，AcademicPress,San Diego(1987)。

可以逐步方式在不溶性聚合物载体(亦称为“树脂”)上自肽的C端开始来合成肽。通过经由形成酰胺或酯链接将肽的C端氨基酸连接至树脂上来开始合成。此使得最终分别以C端酰胺或羧酸形式释放所得肽。

合成中所使用的C端氨基酸及所有其它氨基酸需要具有分别经保护以便α-氨基保护基团可在合成期间选择性去除的α-氨基及侧链官能基(若存在)。通过以下方式来实施氨基酸的偶合：将其羧基活化为活性酯且使与连接至树脂的N端氨基酸的其未阻断α-氨基进行反应。重复α-氨基去保护及偶合的序列直至已组装整个肽序列为止。然后自树脂释放肽，同时对侧链官能基实施去保护，此通常系在适当清除剂存在下进行以限制副反应。最后，通过反相HPLC纯化所得肽。

需要作为最终肽的前体的肽基-树脂的合成利用市售交联聚苯乙烯聚合物树脂(Novabiochem,San Diego,CA；Applied Biosystems,Foster City,CA)。优选固体载体系：4-(2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基乙酰基-对-甲基二苯甲基胺树脂(Rink酰胺MBHA树脂)；9-Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基-Merrifield树脂(Sieber酰胺树脂)；4-(9-Fmoc)氨基甲基-3,5-二甲氧基苯氧基)戊酰基-氨基甲基-Merrifield树脂(PAL树脂)，其为用于C端甲酰胺。可分别使用自DIC/HOBt、HBTU/HOBt、BOP、PyBOP或自DIC/6-Cl-HOBt、HCTU、DIC/HOAt或HATU产生的HOBt、6-Cl-HOBt或HOAt活性酯来达成第一及后续氨基酸的偶合。优选固体载体系：用于经保护肽片段的2-氯三苯甲基氯树脂及9-Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基-Merrifield树脂(Sieber酰胺树脂)。通过使Fmoc保护的氨基酸与树脂在二氯甲烷及DIEA中进行反应来最佳地将第一氨基酸载于2-氯三苯甲基氯化物树脂上若需要，则可添加少量DMF以促进氨基酸的溶解。

可通过使用单-或多通道肽合成器(例如CEM Liberty微波合成器或ProteinTechnologies,Inc.Prelude(6信道)或Symphony(12通道)合成器)来合成本申请所表示的肽类似物。

可裂解用于各别肽的肽基-树脂前体且使用任一标准操作实施去保护(例如参见King,D.S.等人，Int.J.Peptide Protein Res.,36:255-266(1990))。期望方法系在水及TIS(作为清除剂)存在下使用TFA。通常，将肽基-树脂在室温下于TFA/水/TIS(94:3:3,v:v:v；1mL/100mg肽基树脂)中搅拌2-6hr。然后过滤掉已消耗树脂且在减压下浓缩或干燥TFA溶液。使所得粗制肽沉淀并使用Et₂O洗涤或直接再溶于DMSO或50％乙酸水溶液中以用于通过制备型HPLC进行纯化。

可通过使用制备型HPLC(例如在Waters模型4000或Shimadzu模型LC-8A液相层析)上纯化来获得具有期望纯度的肽。将粗制肽的溶液注入YMC S5ODS(20×100mm)管柱并利用存于水中的MeCN(皆使用0.1％TFA缓冲)的线性梯度使用14-20mL/min的流速洗脱，其中通过220nm下的UV吸亮度监测流出物。可通过电喷雾MS分析证实纯化肽的结构。

分析数据:

质谱：“ESI-MS(+)”表示以正离子模式进行的电喷雾离子化质谱；“ESI-MS(-)”表示以负离子模式进行的电喷雾离子化质谱；“ESI-HRMS(+)”表示以正离子模式进行的高分辨率电喷雾离子化质谱；“ESI-HRMS(-)”表示以负离子模式进行的高分辨率电喷雾离子化质谱。遵循“m/z”单位分配来报告所检测质量。确切质量大于1000的化合物通常检测为双电荷或三电荷离子。

分析条件A：

管柱：Waters BEH C18，2.0×50mm，1.7-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10mM乙酸铵；温度：50℃；梯度：0％B，在3分钟内0-100％B，然后在0.5分钟内保持于100％B；流速：1mL/min；检测：220nm下的UV。

分析条件B：

管柱：Waters BEH C18，2.0×50mm，1.7-μm颗粒；移动相A：5:95甲醇:水，含有10mM乙酸铵；移动相B：95:5甲醇:水，含有10mM乙酸铵；温度：50℃；梯度：0％B，在3分钟内0-100％B，然后在0.5分钟内保持于100％B；流速：0.5mL/min；检测：220nm下的UV。

分析条件C：

管柱：Waters BEH C18，2.1×50mm，1.7-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10mM乙酸铵；温度：70℃；梯度：0％B，在3分钟内0-100％B，然后在2.0分钟内保持于100％B；流速：0.75mL/min；检测：220nm下的UV。

分析条件D：

管柱：Waters CSH C18，2.1×50mm，1.7-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有三氟乙酸；移动相B：95:5乙腈:水，含有三氟乙酸；温度：70℃；梯度：0％B，在3分钟内0-100％B，然后在2.0分钟内保持于100％B；流速：0.75mL/min；检测：220nm下的UV。

用于实施例及中间体的一般操作

所有操作均在Symphony-X肽合成器(Protein Technologies)上自动进行。除非另有描述，否则所有操作均在装配有底部玻璃料的的10mL聚丙烯管中进行。该管经由管的底部及顶部连结至Prelude肽合成器。可经由管顶部添加DMF及DCM，其均匀洗涤管侧面。剩余试剂系经由管底部添加且穿过玻璃料以接触树脂。经由管底部去除所有溶液。“周期性搅动”表示N₂气体穿过底部玻璃料的简单脉冲；该脉冲持续大约5秒且每30秒发生一次。在制备24h内使用存于DMF中的氯乙酰基氯溶液。氨基酸溶液通常自制备开始使用不超过三周。HATU溶液系在制备5天内使用。DMF＝二甲基甲酰胺；HATU＝六氟磷酸1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物；DIPEA＝二异丙基乙胺；Rink＝(2,4-二甲氧基苯基)(4-烷氧基苯基)甲胺，其中“4-烷氧基”表示连接至聚苯乙烯树脂的位置及类型。所用树脂系具有Rink连接体(在氮处经Fmoc保护)的Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1％DVB，0.56mmol/g载量。常用氨基酸列示于下文中，其中侧链保护基团指示于括号中。

Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。

对于酰胺产物而言，该操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中所述规模根据结合至树脂的Rink连接体的量所测定。此规模对应于大约178mg上文所表示的Rink-Merrifield树脂。在氨基酸偶合之前，使用树脂溶胀操作(在下文中表示为“树脂溶胀操作”)来开始所有肽合成序列。氨基酸与伯胺N端的偶合使用下文所描述的“单一偶合操作”。氨基酸与仲胺N端的偶合使用下文所描述的“双偶合操作”。通过下文所详述的“氯乙酰基氯偶合操作”来描述氯乙酰基氯与肽N端的偶合。

树脂溶胀操作：

向10mL聚丙烯固相反应器中添加Merrifield:Rink树脂(178mg，0.100mmol)。如下所述将树脂洗涤(溶胀)三次：向反应器中添加DMF(2.0mL)，随后将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻璃料排出溶剂。

单一偶合操作：

向含有来自先前步骤的树脂的反应器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻璃料排出溶液。向反应器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻璃料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤六次：对于每一洗涤而言，向反应器顶部(并非经由底部玻璃料)添加DMF(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻璃料排出溶液。向反应器中添加氨基酸(0.2M，于DMF中，1.0mL，2当量)，然后添加HATU(0.2M，于DMF中，1.0mL，2当量)，且最后添加DIPEA(0.4M，于DMF中，1.0mL，4当量)。将混合物周期性搅动15分钟，然后经由玻璃料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，向反应器顶部(并非经由底部玻璃料)添加DMF(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻璃料排出溶液。向反应器中添加乙酸酐(2.0mL)。将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻璃料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，向反应器顶部(并非经由底部玻璃料)添加DMF(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。

用于-(S)-2-氨基-3-(1-(羧基甲基)-1H-吲哚-3-基)丙酸的单一偶合：

如上所述进行偶合，但仅使用30分钟搅动时间。

双偶合操作：

向含有来自先前步骤的树脂的反应器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻璃料排出溶液。向反应器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻璃料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤六次：对于每一洗涤而言，向反应器顶部(并非经由底部玻璃料)添加DMF(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻璃料排出溶液。向反应器中添加氨基酸(0.2M，于DMF中，1.0mL，2当量)，然后添加HATU(0.2M，于DMF中，1.0mL，2当量)，且最后添加DIPEA(0.4M，于DMF中，1.0mL，4当量)。将混合物周期性搅动15分钟，然后经由玻璃料排出反应溶液。如下所述将树脂洗涤两次：对于每一洗涤而言，向反应器顶部(并非经由底部玻璃料)添加DMF(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻璃料排出溶液。向反应器中添加氨基酸(0.2M，于DMF中，1.0mL，2当量)，然后添加HATU(0.2M，于DMF中，1.0mL，2当量)，且最后添加DIPEA(0.4M，于DMF中，1.0mL，4当量)。将混合物周期性搅动15分钟，然后经由玻璃料排出反应溶液。如下所述将树脂洗涤两次：对于每一洗涤而言，向反应器顶部(并非经由底部玻璃料)添加DMF(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻璃料排出溶液。向反应器中添加乙酸酐(2.0mL).将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻璃料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，向反应器顶部(并非经由底部玻璃料)添加DMF(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。

氯乙酰基氯偶合操作：

向含有来自先前步骤的树脂的反应器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻璃料排出溶液。向反应器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻璃料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤六次：对于每一洗涤而言，向反应器顶部(并非经由底部玻璃料)添加DMF(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻璃料排出溶液。向反应器中添加DIPEA(0.4M，于DMF中，3.0mL，24当量)，然后添加氯乙酰基氯(0.8M，于DMF中，1.5mL，13.2当量)。将混合物周期性搅动30分钟，然后经由玻璃料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤三次：对于每一洗涤而言，向反应器顶部(并非经由底部玻璃料)添加DMF(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻璃料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，向反应器顶部(并非经由底部玻璃料)添加CH₂Cl₂(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻璃料排出溶液。将所得树脂置于N₂流下15分钟，随后树脂变得僵硬且易于处置。

对于羧酸C端产物而言：该操作描述以0.100mmol规模进行的实验，其中所述规模根据结合至树脂的2-氯三苯甲基连接体的量所测定。通常以0.92meq/g载量来使用市售Fmoc-Gly-2-氯三苯甲基树脂。此规模对应于大约109mg上文所表示的我Fmoc-Gly-2-氯三苯甲基树脂。在氨基酸偶合之前，使用树脂溶胀操作(在下文中表示为“树脂溶胀操作”)来开始所有肽合成序列。氨基酸至伯胺N端的偶合使用下文所描述的“单一偶合操作”。氨基酸至仲胺N端的偶合使用下文所描述的“双偶合操作”。通过下文所详述的“氯乙酰基氯偶合操作”来描述氯乙酰基氯至肽N端的偶合。

树脂溶胀操作：

单一偶合操作：

向含有来自先前步骤的树脂的反应器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻璃料排出溶液。向反应器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻璃料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤六次：对于每一洗涤而言，向反应器顶部(并非经由底部玻璃料)添加DMF(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻璃料排出溶液。向反应器中添加氨基酸(0.2M，于DMF中，1.0mL，2当量)，然后添加HATU(0.2M，于DMF中，1.0mL，2当量)，且最后添加DIPEA(0.4M，于DMF中，1.0mL，4当量)。将混合物周期性搅动15分钟，然后经由玻璃料排出反应溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，向反应器顶部(并非经由底部玻璃料)添加DMF(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻璃料排出溶液。向反应器中添加DIPEA(0.4M，于DMF中，1.0mL，4当量)，然后添加乙酸酐(2.0mL)。将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻璃料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，向反应器顶部(并非经由底部玻璃料)添加DMF(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。

如上所述进行偶合，但仅使用30min搅动时间。

双偶合操作：

向含有来自先前步骤的树脂的反应器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻璃料排出溶液。向反应器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性搅动3分钟且然后经由玻璃料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤六次：对于每一洗涤而言，向反应器顶部(并非经由底部玻璃料)添加DMF(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻璃料排出溶液。向反应器中添加氨基酸(0.2M，于DMF中，1.0mL，2当量)，然后添加HATU(0.2M，于DMF中，1.0mL，2当量)，且最后添加DIPEA(0.4M，于DMF中，1.0mL，4当量)。将混合物周期性搅动15分钟，然后经由玻璃料排出反应溶液。如下所述将树脂洗涤两次：对于每一洗涤而言，向反应器顶部(并非经由底部玻璃料)添加DMF(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻璃料排出溶液。向反应器中添加氨基酸(0.2M，于DMF中，1.0mL，2当量)，然后添加HATU(0.2M，于DMF中，1.0mL，2当量)，且最后添加DIPEA(0.4M，于DMF中，1.0mL，4当量)。将混合物周期性搅动15分钟，然后经由玻璃料排出反应溶液。如下所述将树脂洗涤两次：对于每一洗涤而言，向反应器顶部(并非经由底部玻璃料)添加DMF(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动30秒，然后经由玻璃料排出溶液。向反应器中添加DIPEA(0.4M，于DMF中，1.0mL，4当量)，然后添加乙酸酐(2.0mL).将混合物周期性搅动10分钟，然后经由玻璃料排出溶液。如下所述将树脂连续洗涤四次：对于每一洗涤而言，向反应器顶部(并非经由底部玻璃料)添加DMF(2.0mL)且将所得混合物周期性搅动90秒，然后经由玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一步骤中。

氯乙酰基氯偶合操作：

整体去保护操作：

通过在40mL玻璃器皿中组合三氟乙酸(22mL)、苯酚(1.325g)、水(1.25mL)及三异丙基硅烷(0.5mL)来制备“去保护溶液”。自反应器取出树脂且转移至4mL玻璃小瓶中。向小瓶中添加“去保护溶液”(2.0mL)。将混合物在振荡器(在1000RPM下1分钟，然后在500RPM下1.5h)中剧烈混合。经由0.2微米注射器过滤器将混合物过滤至18×150mm测试管中，且使用第二部分的“去保护溶液”(1.0mL)萃取固体。使用Et₂O(15mL)稀释18×150mm测试管中的所合并的滤液，随后大量白色固体发生沉淀。将混合物离心2分钟，然后倾析溶液。将固体悬浮于Et₂O(20mL)中；将混合物离心5分钟；且倾析溶液。最后，将固体悬浮于Et₂O(20mL)中；将混合物离心5分钟，且倾析溶液。

环化操作：

将固体溶于20mL MeOH中，且使用许尼希碱将溶液调节至pH＝11。然后将溶液静置(无需搅拌)过夜(大约18h)。在旋转蒸发下去除溶剂以提供粗产物。

INT-1300Z的制备

以0.4mmol规模根据上述操作来合成下列肽。加下划线的步骤采用双偶合操作，且使用30min单一偶合来偶合斜体残基。ClAc-Tyr-[N-Me]Ala-Asn-Pro-Dap-Leu-Hyp-Trp-Dab-[(S)-2-氨基-3-(1-(羧基甲基)-1H-吲哚-3-基)丙酸]-[N-Me]Nle-[N-Me]Nle-Leu-Cys-Gly；其中将Gly加入2-氯三苯甲基树脂上。通过以下方式来达成自树脂的裂解：将树脂在20％六氟异丙醇/DCM中振荡5min，随后过滤。在真空中浓缩滤液以提供期望产物。HPLCRT＝2.21min，管柱：Waters Aquity UPLC BEH C18 2.1×50mm 1.7-μm颗粒；移动相A：含有0.05％TFA的乙腈；移动相B：含有0.05％TFA水；梯度：在1.5分钟内2-98％B，然后在1.55分钟内保持于98％B；流速：0.8mL/min。

INT-130AA的制备

以0.8mmol规模根据上述操作来合成下列肽。加下划线的步骤采用双偶合操作。

ClAc-Tyr-[N-Me]Ala-Asn-Pro-Ser-Gln-Hyp-Trp-Ser-Trp-[N-Me]Nle-[N-Me]Nle-Leu-Cys-Gly；其中将Gly加入2-氯三苯甲基树脂上。在根据上述操作去保护且环化之后，如下所述来纯化化合物：经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：watersCSH c-18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内40-80％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为29.3mg，且通过LCMS分析估计其纯度为97％。

分析条件C：保留时间＝1.59min；ESI-MS(+)m/z 917.4(M+2H)。

分析条件D：保留时间＝1.84min；ESI-MS(+)m/z 917.4(M+2H)

ESI-HRMS(+)m/z:计算值：916.9374(M+2H)实验值：916.9371(M+2H)。

INT-130AB的制备

通过随附一般方法以1.400mmol规模(.1mmol)来实施合成。在遇到N端处的仲胺(使用加下划线的残基表示)时，使用双偶合(操作B)。序列如下：

ClAc-Tyr-mAla-Asn-Pro-Dap-Leu-Hyp-Trp-Gly-Trp-mNle-mNle-Leu-Cys-[Gly]。在上文所表示醚操作中的TFA/苯酚/水/iPr3SiH混合剂及沉淀/洗涤后，该肽自树脂裂解。通过将材料吸收于MeOH(约20mL)中并添加4-6滴许尼希碱(pH～11)来将所得材料环化。在室温搅拌过夜之后，通过经由旋转蒸发去除溶剂来获得粗制材料。材料未经纯化即用于实施例13082-13089及13091-13117中。

实施例13080的制备

步骤1：向于DMF(537μl)中的中间体1300Z(61.8mg，0.021mmol)的溶液中添加HATU(12.25mg，0.032mmol)，随后添加许尼希碱(11.25μl，0.064mmol)。最后，添加苄基胺(3.52μl，0.032mmol)，且在室温搅拌所得溶液。在3h内，产物已形成，如通过LC/MS所展示。添加水，且过滤所得混合物以提供固体3-((7R,10S,13S,16S,19S,22S,25S)-25-((2S,4R)-4-(叔丁氧基)-1-((S)-2-((S)-2-((S)-1-((S)-2-((S)-2-((S)-3-(4-(叔丁氧基)苯基)-2-(2-氯乙酰氨基)-N-甲基丙酰氨基)丙酰氨基)-4-氧代-4-(三苯甲基氨基)丁酰基)吡咯烷-2-甲酰氨基)-3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酰氨基)-4-甲基戊酰基)吡咯烷-2-甲酰氨基)-19-((1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1H-吲哚-3-基)甲基)-22-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)-13,16-二丁基-10-异丁基-14,17-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧代-1-苯基-7-((三苯甲基硫基)甲基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氮杂二十六烷-26-基)-1H-吲哚-1-甲酸叔丁基酯(38.1mg，0.013mmol，产率为59.8％)。原样使用该材料。

步骤2：向固体3-((7R,10S,13S,16S,19S,22S,25S)-25-((2S,4R)-4-(叔丁氧基)-1-((S)-2-((S)-2-((S)-1-((S)-2-((S)-2-((S)-3-(4-(叔丁氧基)苯基)-2-(2-氯乙酰氨基)-N-甲基丙酰氨基)丙酰氨基)-4-氧代-4-(三苯甲基氨基)丁酰基)吡咯烷-2-甲酰氨基)-3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酰氨基)-4-甲基戊酰基)吡咯烷-2-甲酰氨基)-19-((1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1H-吲哚-3-基)甲基)-22-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)-13,16-二丁基-10-异丁基-14,17-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧代-1-苯基-7-((三苯甲基硫基)甲基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氮杂二十六烷-26-基)-1H-吲哚-1-甲酸叔丁基酯(38.1mg，0.013mmol)中添加裂解混合剂(2mL TFA、120.4mg苯酚、45.4μLEt3SiH及113.6μL水)。将所得黄色溶液在室温下保持45min，然后使用约20mL乙醚稀释。将所得固体在离心器上旋转成团粒，且通过倾析去除乙醚。在额外乙醚洗涤循环之后，将固体溶于1:1AcCN:乙酸铵(20mL)中，且使用1M NaOH将pH调节至约9。将溶液在室温下静置过夜。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为6.6mg，且通过LCMS分析估计其纯度为100％。

分析条件C：保留时间＝1.88min；ESI-MS(+)m/z 989.4(M+2H)。

分析条件D：保留时间＝1.64min；ESI-MS(+)m/z 989.7(M+2H)

ESI-HRMS(+)m/z:计算值：989.0082(M+2H)实验值：989.0073(M+2H)。

实施例13081的制备

向于DMF(289μl)中的2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)-30,36-双((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-(2-氨基-2-氧代乙基)-44-(3-氨基-3-氧代丙基)-24,27-二丁基-40-羟基-12-(4-羟基苄基)-33,47-双(羟甲基)-21-异丁基-9,10,25,28-四甲基-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-十四氧代四十八氢二吡咯并[2,1-g₁:2',1'-x][1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]硫杂十四氮杂环戊四十烷-18-甲酰氨基)乙酸(21.2mg，0.012mmol)的溶液中添加HATU(5.72mg，0.015mmol)，然后添加存于DMF中的许尼希碱(8.08μl，0.046mmol)及5-叠氮基戊烷-1-胺(14.82mg，0.116mmol)的混合物。在室温搅拌混合物。在约1h之后，看到少量产物，且大部分SM得以保留。再过一小时之后，LC/MS并不改变多少。依序添加额外的HATU及胺混合物，且将黄色溶液在室温搅拌过夜。LC/MS展示起始材料已消耗且形成期望材料。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内60-100％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为8.1mg，且通过LCMS分析估计其纯度为99％。

分析条件C：保留时间＝2.01min；

分析条件D：保留时间＝2.02min；

ESI-HRMS(+)m/z:计算值：971.9853(M+2H)实验值：971.9856(M+2H)。

实施例13082的制备

向于DMF(298μl)中的粗制中间体130AB(16.0mg，8.95μmol)的溶液中依序添加许尼希碱(9.38μl，0.054mmol)及2-甲氧基乙胺(15.42μl，0.179mmol)。然后添加HATU(10.21mg，0.027mmol)。在室温搅拌混合物。LC/MS指示SM及产物的混合物，该产物并不随时间进一步生长。添加额外HATU并将混合物搅拌过夜，然后LC/MS指示起始材料已消耗。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内50-90％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为3.4mg，且通过LCMS分析估计其纯度为96％。

分析条件C：保留时间＝1.92min；ESI-MS(+)m/z 922.8(M+2H)。

分析条件D：保留时间＝1.76min；ESI-MS(+)m/z 922.9(M+2H)

ESI-HRMS(+)m/z:计算值：922.4818(M+2H)实验值：922.4807(M+2H)。

实施例13083的制备

向于DMF(548μl)中的粗制中间体130AB(49mg，0.027mmol)的溶液中依序添加许尼希碱(28.7μl，0.165mmol)及哌啶-4-醇(55.5mg，0.548mmol)。然后添加HATU(11.47mg，0.030mmol)。在室温搅拌混合物。LC/MS展示SM及产物峰重叠，其中主质量峰之比率约为1:1。添加额外0.5当量HATU，且使反应再进行一小时。期望质量然后系主要组份，但可看到一些SM以及胍加合物峰。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内50-90％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为2.6mg，且通过LCMS分析估计其纯度为95％。

分析条件C：保留时间＝1.85min；

分析条件D：保留时间＝1.76min；ESI-MS(+)m/z 936.2(M+2H)

ESI-HRMS(+)m/z:计算值：935.4896(M+2H)实验值：935.4882(M+2H)。

实施例13084的制备

向于DMF(933μl)中的粗制中间体130AB(50mg，0.028mmol)的溶液中依序添加许尼希碱(29.3μl，0.168mmol)及N-甲基丙烷-1-胺(40.9mg，0.560mmol)。然后添加HATU(11.70mg，0.031mmol)。在室温搅拌混合物。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内50-90％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为2.9mg，且通过LCMS分析估计其纯度为100％。

分析条件B：保留时间＝2.89min；ESI-MS(+)m/z 921.8(M+2H)。

分析条件C：保留时间＝1.90min；ESI-MS(+)m/z 922.0(M+2H)。

ESI-HRMS(+)m/z:计算值：921.4922(M+2H)实验值：921.4910(M+2H)。

实施例13085的制备

向于DMF(933μl)中的粗制中间体130AB(50mg，0.028mmol)的溶液中依序添加许尼希碱(29.3μl，0.168mmol)及吡咯烷(39.8mg，0.560mmol)。然后添加HATU(11.70mg，0.031mmol)。在室温搅拌混合物。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内50-90％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为2.2mg，且通过LCMS分析估计其纯度为96％。

分析条件B：保留时间＝2.81min；ESI-MS(+)m/z 921.1(M+2H)。

分析条件C：保留时间＝1.76min；ESI-MS(+)m/z 920.8(M+2H)。

ESI-HRMS(+)m/z:计算值：920.4844(M+2H)实验值：920.4833(M+2H)。

实施例13086的制备

向于DMF(933μl)中的粗制中间体130AB(50mg，0.028mmol)的溶液中依序添加许尼希碱(29.3μl，0.168mmol)及哌啶(47.6mg，0.560mmol)。然后添加HATU(11.70mg，0.031mmol)。在室温搅拌混合物。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内50-90％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为2.9mg，且通过LCMS分析估计其纯度为100％。

分析条件C：保留时间＝2.01min；ESI-MS(+)m/z 928.0(M+2H)。

分析条件D：保留时间＝1.72min；ESI-MS(+)m/z 927.9(M+2H)

ESI-HRMS(+)m/z:计算值：927.4922(M+2H)实验值：927.4905(M+2H)。

实施例13087的制备

向于DMF(933μl)中的粗制中间体130AB(50mg，0.028mmol)的溶液中依序添加许尼希碱(29.3μl，0.168mmol)及吗啉(48.7mg，0.560mmol)。然后添加HATU(11.70mg，0.031mmol)。在室温搅拌混合物。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内50-90％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为5.3mg，且通过LCMS分析估计其纯度为95％。

分析条件C：保留时间＝1.81min；ESI-MS(+)m/z 929.3(M+2H)。

分析条件D：保留时间＝1.66min；ESI-MS(+)m/z 929.3(M+2H)

ESI-HRMS(+)m/z:计算值：928.4818(M+2H)实验值：928.4807(M+2H)。

实施例13088的制备

向于DMF(933μl)中的粗制中间体130AB(50mg，0.028mmol)的溶液中依序添加许尼希碱(29.3μl，0.168mmol)及4-苯基哌啶(90mg，0.560mmol)。然后添加HATU(11.70mg，0.031mmol)。在室温搅拌混合物。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内55-95％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为3.1mg，且通过LCMS分析估计其纯度为100％。

分析条件C：保留时间＝2.14min；ESI-MS(+)m/z 966.1(M+2H)。

分析条件D：保留时间＝1.89min；ESI-MS(+)m/z 966.0(M+2H)

ESI-HRMS(+)m/z:计算值：965.5078(M+2H)实验值：965.5070(M+2H)。

实施例13089的制备

向于DMF(933μl)中的粗制中间体130AB(50mg，0.028mmol)的溶液中依序添加许尼希碱(29.3μl，0.168mmol)及甲基哌嗪(56mg，0.560mmol)。然后添加HATU(11.70mg，0.031mmol)。在室温搅拌混合物。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内50-90％B，然后在4分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为4.9mg，且通过LCMS分析估计其纯度为96％。

分析条件C：保留时间＝1.79min；ESI-MS(+)m/z 935.6(M+2H)。

分析条件D：保留时间＝1.38min；ESI-MS(+)m/z 935.6(M+2H)

ESI-HRMS(+)m/z:计算值：934.9976(M+2H)实验值：934.9962(M+2H)。

实施例13090的制备

通过随附一般方法以0.20mmol规模(2×0.1mmol)来实施合成。在遇到N端处的仲胺(使用加下划线的残基表示)时，使用双偶合(操作B)。序列如下：ClAc-Tyr-mAla-Asn-Pro-Dap-Leu-Hyp-Trp-Gly-Trp-mNle-mNle-Leu-Cys-Sarc。在上文所表示醚操作中的TFA/苯酚/水/iPr3SiH混合剂及沉淀/洗涤后，该肽自Rink树脂裂解。通过将材料吸收于MeOH(约20mL)中并添加4-6滴许尼希碱(pH～11)来将所得材料环化。在室温搅拌过夜之后，通过经由旋转蒸发去除溶剂来获得粗制材料。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内50-90％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。

产物产量为36.4mg，且通过LCMS分析估计其纯度为95％。

分析条件C：保留时间＝1.69min；ESI-MS(+)m/z 900.6(M+2H)。

分析条件D：保留时间＝1.54min；ESI-MS(+)m/z 900.9(M+2H)。

实施例13091-13118的制备

将存于DMF(9.25mL)中的中间体130AB(1.1gm，592μmol)及DIPEA(629μL，3.6mmol)的溶液在室温下振荡15分钟。亦制备存于DMF(9.25mL)中的HATU(248mg，651μmol)的溶液。向每一称重至16×48mm螺纹小瓶中的胺(15当量)中添加250μL中间体130AB/DIPEA溶液及250μL HATU溶液。将小瓶加盖并在室温下振荡。在过夜之后，LC/MS指示反应不完全，且再添加HATU溶液的250uL等分试样。再经一天之后，添加HATU溶液的最终等分试样。

13091的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内20-60％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为0.7mg，且通过LCMS分析估计其纯度为96％。

实施例13092的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内20-60％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为1.7mg，且通过LCMS分析估计其纯度为95％。

实施例13093的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。经由制备型LC/MS使用下列条件进一步纯化材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内20-60％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为0.2mg，且通过LCMS分析估计其纯度为94％。

实施例13094的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内20-60％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为1.8mg，且通过LCMS分析估计其纯度为100％。

实施例13095的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内10-50％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为0.5mg，且通过LCMS分析估计其纯度为91％。

实施例13096的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内20-60％B，然后在3分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为2.1mg，且通过LCMS分析估计其纯度为96％。

实施例13097的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在3分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为2.3mg，且通过LCMS分析估计其纯度为96％。

实施例13098的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为0.7mg，且通过LCMS分析估计其纯度为100％。

实施例13099的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在3分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为1.4mg，且通过LCMS分析估计其纯度为94％。

实施例13100的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为1.1mg，且通过LCMS分析估计其纯度为92％。

实施例13101的纯化:

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为2.0mg，且通过LCMS分析估计其纯度为100％。

实施例13102的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。经由制备型LC/MS使用下列条件进一步纯化材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内50-90％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为0.1mg，且通过LCMS分析估计其纯度为94％。

实施例13103的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内50-90％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。经由制备型LC/MS使用下列条件进一步纯化材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内10-50％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为1.1mg，且通过LCMS分析估计其纯度为100％。

实施例13104的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内20-60％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为1.4mg，且通过LCMS分析估计其纯度为100％。

实施例13105的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内50-90％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为1.9mg，且通过LCMS分析估计其纯度为92％。

实施例13106的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内20-100％B，然后在3分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为1.7mg，且通过LCMS分析估计其纯度为90％。

实施例13107的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内10-50％B，然后在4分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为0.6mg，且通过LCMS分析估计其纯度为100％。

实施例13108的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内25-65％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为1.9mg，且通过LCMS分析估计其纯度为92％。

实施例13109的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内25-65％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为2.0mg，且通过LCMS分析估计其纯度为92％。

实施例13110的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为0.7mg，且通过LCMS分析估计其纯度为90％。

实施例13111的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内10-50％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为1.6mg，且通过LCMS分析估计其纯度为96％。

实施例13112的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在4分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为0.6mg，且通过LCMS分析估计其纯度为100％。

实施例13113的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内25-65％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为2.8mg，且通过LCMS分析估计其纯度为92％。

实施例13114的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为0.8mg，且通过LCMS分析估计其纯度为92％。

实施例13115的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内25-65％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为0.5mg，且通过LCMS分析估计其纯度为96％。

实施例13116的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内10-50％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为2.6mg，且通过LCMS分析估计其纯度为92％。

实施例13117的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内15-55％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为2.0mg，且通过LCMS分析估计其纯度为96％。

实施例13118的纯化：

经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridge C18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5乙腈:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内20-60％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为4.3mg，且通过LCMS分析估计其纯度为100％。

实施例13091-13118的分析条件、保留时间及ESI-MS(+)m/z(M+2H)：

实施例13119的制备

通过随附一般方法使用0.2mmol Rink树脂来实施合成。在遇到N端处的仲胺(使用加下划线的残基表示)时，使用双偶合(操作B)。序列如下：ClAc-Tyr-mAla-Asn-Pro-Dap-Leu-Hyp-Trp-Gly-Trp-mNle-mNle-Leu-Cys-Sar。在上文所表示醚操作中的TFA/苯酚/水/iPr₃SiH混合剂及沉淀/洗涤后，该肽自树脂裂解。通过将材料吸收于MeOH(约20mL)中并添加4-6滴许尼希碱(pH～11)来将所得材料环化。在室温搅拌过夜之后，通过经由旋转蒸发去除溶剂来获得粗制材料。经由制备型LC/MS使用下列条件纯化粗制材料：管柱：XBridgeC18，19×200mm，5-μm颗粒；移动相A：5:95甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；移动相B：95:5甲醇:水，含有10-mM乙酸铵；梯度：在30分钟内50-90％B，然后在5分钟内保持于100％B；流速：20mL/min。合并含有期望产物的部分并经由离心蒸发干燥。产物产量为36.4mg，且通过LCMS分析估计其纯度为95％。

分析条件C：保留时间＝1.69min；ESI-MS(+)m/z 900.6(M+2H)。

分析条件D：保留时间＝1.54min；ESI-MS(+)m/z 900.9(M+2H)

ESI-HRMS(+)m/z:计算值：900.4687(M+2H)实验值：900.4671(M+2H).

使用均相时间解析荧光(HTRF)结合分析测试大环肽竞争使PD-1结合至PD-L1的能力的方法

使用PD-1/PD-L1均相时间解析荧光(HTRF)结合分析探究本发明的大环肽结合至PD-L1的能力。

方法

可溶性PD-1至可溶性PD-L1的结合的均相时间解析荧光(HTRF)分析。可溶性PD-1及可溶性PD-L1是指具有去除跨膜区的羧基端截短且融合至异源序列，具体而言人类免疫球蛋白G序列(Ig)的Fc部分或六组胺酸表位标识(His)的蛋白质。所有结合研究均在HTRF分析缓冲剂(由补充有0.1％(w/v)牛血清白蛋白及0.05％(v/v)Tween-20的dPBS组成)中进行。对于PD-1-Ig/PD-L1-His结合分析而言，将抑制剂与PD-L1-His(最终10nM)一起在4μl分析缓冲剂中预培育15m，随后添加存于1μl分析缓冲剂中的PD-1-Ig(20nM最终)且进一步培育15m。使用来自人类、食蟹猴、小鼠或其它物种的PD-L1融合蛋白。使用铕穴状化合物标记的抗Ig单株抗体(最终1nM)及别藻蓝蛋白(APC)标记的抗His单株抗体(最终20nM)达成HTRF检测。在HTRF检测缓冲剂中稀释抗体且将5μl分配于结合反应的顶部。将反应平衡30分钟且使用EnVision荧光仪获得信号(665nm/620nm比率)。在PD-1-Ig/PD-L2-His(分别为20nM及5nM,、CD80-His/PD-L1-Ig(分别为100nM及10nM)及CD80-His/CTLA4-Ig(分别为10nM及5nM)之间确立其它结合分析。如下所述实施71号生物素化化合物与人类PD-L1-His之间的结合/竞争研究。将大环肽抑制剂与PD-L1-His(最终10nM)一起在4μl分析缓冲剂中预培育60分钟，随后添加存于1μl分析缓冲剂中的71号生物素化化合物(最终0.5nM)。将结合平衡30分钟，随后添加存于5μl HTRF缓冲剂中的铕穴状化合物标记的链霉抗生物素蛋白(Streptavidin)(最终2.5pM)及APC-标记的抗His(最终20nM)。将反应平衡30m且使用EnVision荧光仪获得信号(665nm/620nm比率)。

重组蛋白。在HEK293T细胞中表现具有C端人类Ig表位标签[hPD-1(25-167)-3S-IG]的羧基截短的人类PD-1(氨基酸25-167)及具有C端His表位标识[hPD-L1(19-239)-烟草脉斑驳病毒蛋白酶裂解位点(TVMV)-His]的人类PD-L1(氨基酸18-239)且通过重组蛋白A亲和层析及粒径筛析层析依序纯化。人类PD-L2-His(Sino Biologicals)、CD80-His(SinoBiologicals)、CTLA4-Ig(RnD Systems)均经由商业来源获得。

重组人类PD-1-Ig的序列

(SEQ ID No:1)

重组人类PD-L1-TVMV-His(PD-L1-His)的序列

(SEQ ID No:2)

结果展示于表1中。如所展示，本发明大环肽显示对PD-L1-TVMV-His(PD-L1-His)的PD-1-Ig结合活性的强力抑制。范围如下：A＝0.01-0.06μM；B＝0.004-0.0099μM。

表1

本领域技术人员应显而易知本发明不限于前述说明性实施例，且其可以其他不偏离本发明基本属性的形式实施。因此，需要在所有方面将实施例视为说明性而非限制性的，参考随附权利要求书而非前述实施例，且因此所有在权利要求的等效意义或范围内的变化均意欲涵盖于其中。

序列表

<110> 百时美施贵宝公司

<120> 免疫调节剂

<130> PCK03724A

<150> US 62/134,686

<151> 2015-03-18

<160> 2

<170> PatentIn 版本号3.5

<210> 1

<211> 384

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala

1 5 10 15

Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe

20 25 30

Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro

35 40 45

Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln

50 55 60

Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg

65 70 75 80

Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr

85 90 95

Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu

100 105 110

Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro

115 120 125

Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Gly

130 135 140

Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Arg Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr

145 150 155 160

His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser

165 170 175

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

180 185 190

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

195 200 205

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

210 215 220

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

225 230 235 240

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

245 250 255

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

260 265 270

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

275 280 285

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

290 295 300

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

305 310 315 320

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

325 330 335

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

340 345 350

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

355 360 365

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375 380

<210> 2

<211> 237

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser

1 5 10 15

Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu

20 25 30

Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln

35 40 45

Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg

50 55 60

Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala

65 70 75 80

Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys

85 90 95

Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val

100 105 110

Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro

115 120 125

Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys

130 135 140

Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys

145 150 155 160

Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr

165 170 175

Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr

180 185 190

Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile

195 200 205

Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Gly Ser Ser

210 215 220

Glu Thr Val Arg Phe Gln Gly His His His His His His

225 230 235

Claims

1.一种化合物，其选自：

及

或其药学上可接受的盐。

2.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于抑制通过PD-L1与PD-1的相互作用介导的癌症的药物中的用途。

3.权利要求2的用途，其中所述癌症选自黑素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌、非鳞状NSCLC、结肠直肠癌、去势抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、乳腺癌和血液科恶性病。

4.权利要求2的用途，其中所述癌症为胃肠道癌。

5.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗通过PD-L1与PD-1的相互作用介导的感染性疾病的药物中的用途。

6.权利要求5的用途，其中所述感染性疾病由病毒引起。

7.权利要求6的用途，其中所述病毒选自HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒和流感病毒。

8.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗通过PD-L1与PD-1的相互作用介导的败血性休克的药物中的用途。