CN110997698B - 充当pd-1拮抗剂的免疫调节剂 - Google Patents

充当pd-1拮抗剂的免疫调节剂 Download PDF

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CN110997698B CN201880052406.0A CN201880052406A CN110997698B CN 110997698 B CN110997698 B CN 110997698B CN 201880052406 A CN201880052406 A CN 201880052406A CN 110997698 B CN110997698 B CN 110997698B
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Abstract

本公开文本提供了新型大环肽，其抑制PD‑1/PD‑L1和PD‑L1/CD80蛋白/蛋白相互作用，并且因此可用于改善各种疾病，包括癌症和感染性疾病。

Description

充当PD-1拮抗剂的免疫调节剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年6月23日提交的美国临时专利申请USSN 62/523,903的优先权，将其通过引用以其整体特此并入。
本公开文本提供了大环肽，其抑制PD-1/PD-L1和CD80/PD-L1蛋白/蛋白相互作用的，并且因此可用于改善各种疾病，包括癌症和感染性疾病。
程序性死亡蛋白1(PD-1)是还包括CD28、CTLA-4、ICOS、和BTLA的CD28受体家族的抑制性成员。PD-1在激活的B细胞、T细胞和骨髓细胞上表达(Agata等人,同上；Okazaki等人,Curr.Opin.Immunol.,14:779-782(2002)；Bennett等人,J.Immunol.,170:711-718(2003))。
PD-1蛋白是55kDa的I型跨膜蛋白，其是Ig基因超家族的一部分(Agata等人,Int.Immunol.,8:765-772(1996))。PD-1含有膜近端免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和膜远端基于酪氨酸的开关基序(ITSM)(Thomas,M.L.,J.Exp.Med.,181:1953-1956(1995)；Vivier,E.等人,Immunol.Today,18:286-291(1997))。虽然PD-1在结构上与CTLA-4类似，但它缺少MYPPY基序，所述基序对于CD80 CD86(B7-2)结合至关重要。已经鉴定出PD-1的两个配体，PD-L1(B7-H1)和PD-L2(b7-DC)。已经显示表达PD-1的T细胞的激活在与表达PD-L1或PD-L2的细胞相互作用时被下调(Freeman等人,J.Exp.Med.,192:1027-1034(2000)；Latchman等人,Nat.Immunol.,2:261-268(2001)；Carter等人,Eur.J.Immunol.,32:634-643(2002))。PD-L1和PD-L2二者均是与PD-1结合但不与其他CD28家族成员结合的B7蛋白家族成员。PD-L1配体在多种人癌症中是丰富的(Dong等人,Nat.Med.,8:787-789(2002))。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少以及癌细胞的免疫逃避(Dong等人,J.Mol.Med.,81:281-287(2003)；Blank等人,CancerImmunol.Immunother.,54:307-314(2005)；Konishi等人,Clin.Cancer Res.,10:5094-5100(2004))。可以通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用来逆转免疫抑制作用，并且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时，这种作用是加和的(Iwai等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:12293-12297(2002)；Brown等人,J.Immunol.,170:1257-1266(2003))。
还已经显示PD-L1与CD80相互作用(Butte MJ等人,Immunity；27:111-122(2007))。已经显示表达免疫细胞上PD-L1/CD80的相互作用是一种抑制性相互作用。已经显示阻断这种相互作用消除了这种抑制性相互作用(Paterson AM等人,J Immunol.,187:1097-1105(2011)；Yang J等人J Immunol.8月1日；187(3):1113-9(2011))。
当表达PD-1的T细胞接触表达其配体的细胞时，响应于抗原刺激的功能活性(包括增殖、细胞因子分泌和细胞毒性)降低。PD-1/PD-L1或PD-L2相互作用在感染或肿瘤的消退过程中或自我耐受形成过程中下调免疫应答(Keir,M.E.等人,Annu.Rev.Immunol.,26:Epub(2008))。慢性抗原刺激(如在肿瘤疾病或慢性感染期间发生的慢性抗原刺激)产生这样的T细胞，其表达升高水平的PD-1并且在对慢性抗原的活性方面是功能失调的(综述于Kim等人,Curr.Opin.Imm.(2010)中)。这被称为“T细胞消耗”。B细胞也展现出PD-1/PD配体抑制和“消耗”。
已经显示使用针对PD-L1的抗体阻断PD-1/PD-L1连接在许多系统中恢复和增强T细胞激活。患有晚期癌症的患者受益于用针对PD-L1的单克隆抗体的疗法(Brahmer等人NewEngl.J.Med.(2012))。肿瘤和慢性感染的临床前动物模型已经显示，单克隆抗体对PD-1/PD-L1途径的阻断可以增强免疫应答并导致肿瘤排斥或感染的控制。经由PD-1/PD-L1阻断的抗肿瘤免疫疗法可以增强对多种组织学上不同的肿瘤的治疗性免疫应答(Dong,H.等人,“B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity”,J.Mol.Med.,81(5):281-287(2003)；Dong,H.等人,“Tumor-associated B7-H1 promotes T-cellapoptosis:a potential mechanism of immune evasion”,Nat.Med.,8(8):793-800(2002))。
在患有慢性感染的系统中，对PD-1/PD-L1相互作用的干扰导致T细胞活性增强。PD-L1的阻断在患有染色体性淋巴细胞性绒毛膜脑膜炎病毒感染的小鼠中引起改善的病毒清除率和恢复的免疫(Barber,D.L.等人,“Restoring function in exhausted CD8 Tcells during chronic viral infection”,Nature,439(7077):682-687(2006))。感染HIV-1的人源化小鼠显示出针对病毒血症和CD4+T细胞的病毒性耗尽的增强的保护作用(Palmer等人J.Immunol.(2013))。通过针对PD-L1的单克隆抗体对PD-1/PD-L1的阻断可以恢复对来自HIV患者(Day,Nature(2006)；Petrovas,J.Exp.Med.(2006)；Trautman,NatureMed.(2006)；D'Souza,J.Immunol.(2007)；Zhang,Blood(2007)；Kaufmann,Nature Imm.(2007)；Kasu,J.Immunol.(2010)；Porichis,Blood(2011))、HCV患者(Golden-Mason,J.Virol.(2007)；Jeung,J.Leuk.Biol.(2007)；Urbani,J.Hepatol.(2008)；Nakamoto,PLoSPath.(2009)；Nakamoto,Gastroenterology(2008))和HBV患者(Boni,J.Virol.(2007)；Fisicaro,Gastro.(2010)；Fisicaro等人,Gastroenterology(2012)；Boni等人,Gastro.(2012)；Penna等人,J.Hep.(2012)；Raziorrough,Hepatology(2009)；Liang,WorldJ.Gastro.(2010)；Zhang,Gastro.(2008))的T细胞的体外抗原特异性功能。
还已经显示阻断PD-L1/CD80相互作用刺激免疫(Yang J.等人,J Immunol.Aug 1；187(3):1113-9(2011))。由阻断PD-L1/CD80相互作用所产生的免疫刺激已经显示通过与阻断进一步的PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2相互作用组合而增强。
假设免疫细胞表型的改变是脓毒性休克的一个重要因素(Hotchkiss等人,NatRev Immunol(2013))。这些包括升高水平的PD-1和PD-L1(Guignant等人,Crit.Care(2011))。PD-1和PD-L1水平升高的脓毒性休克患者的细胞展现出升高的T细胞凋亡水平。针对PD-L1的抗体可以降低免疫细胞凋亡的水平(Zhang等人,Crit.Care(2011))。此外，与野生型小鼠相比，缺乏PD-1表达的小鼠对脓毒性休克症状更具抵抗力。Yang J.等人.JImmunol.Aug1；187(3):1113-9(2011))。研究已经揭示，使用抗体阻断PD-L1的相互作用可以抑制不适当的免疫应答并改善疾病体征。
除了增强对慢性抗原的免疫学应答之外，PD-1/PD-L1途径的阻断还显示出增强对疫苗接种(包括在慢性感染的情况下的治疗性疫苗接种)的应答(Ha,S.J.等人,“Enhancingtherapeutic vaccination by blocking PD-1-mediated inhibitory signals duringchronic infection”,J.Exp.Med.,205(3):543-555(2008)；Finnefrock,A.C.等人,“PD-1blockade in rhesus macaques:impact on chronic infection and prophylacticvaccination”,J.Immunol.,182(2):980-987(2009)；Song,M.-Y.等人,“Enhancement ofvaccine-induced primary and memory CD8+t-cell responses by soluble PD-1”,J.Immunother.,34(3):297-306(2011))。
在生物化学和基于细胞的实验系统二者中，本文所述的分子均展现出阻断PD-L1与PD-1相互作用的能力。这些结果与治疗性给予(包括治疗性疫苗)增强癌症或慢性感染的免疫的潜力一致。
本文所述的大环肽能够抑制PD-L1与PD-1和与CD80的相互作用。这些化合物已展现出与PD-L1的高效结合，阻断PD-L1与PD-1或CD80的相互作用，并且能够促进增强的T细胞功能活性，因此使其成为肠胃外、口服、肺、鼻、颊和持续释放配制品的候选物。
在第一方面，本公开文本提供了式(I)的化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
A选自
其中：
表示与羰基的连接点，并且/>表示与氮原子的连接点；
n是0或1；
m是1或2；
m'是0或1；
w是0、1或2；
Rx选自氢、氨基、羟基和甲基；
R14和R15独立地选自氢和甲基；
R16a选自氢和C1-C6烷基；
R16选自
-(C(R17a)2)2-X-R30、
-C(R17a)2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X'-R31、
-C(R17a)2[C(O)N(R16a)C(R17a)2]w'-X-R31、
-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)n'-H；和
-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)m'-C(R17a)(R17)-CO2H；
其中：
w'是2或3；
n'是1-6；
m'是0-5；
X是在1与172个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链可以含有选自-NHC(O)NH-和-C(O)NH-的一个、两个、三个或四个嵌入其中的基团；并且其中所述链任选地被独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-(CH2)CO2H的一至六个基团取代；
X'是在1与172个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链可以含有选自-NHC(O)NH-和-C(O)NH-的一个、两个、三个或四个嵌入其中的基团；并且其中所述链任选地被独立地选自-CO2H、-C(O)NH2和-CH2CO2H的一至六个基团取代，前提条件是X'不是未取代的PEG；
R30选自-CO2H、-C(O)NRwRx和-CH3，其中Rw和Rx独立地选自氢和C1-C6烷基，前提条件是当X均为碳时，R30不是-CH3；
R31是-CO2H、-C(O)NRwRx、-CH3、alexa-5-SDP和生物素；
每个R17a独立地选自氢、C1-C6烷基、-CH2OH、-CH2CO2H、-(CH2)2CO2H，
每个R17独立地选自氢、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、-(CH2)zCO2H、-CH2OH、CH2C＝CH和-(CH2)z-三唑基-X-R35，其中z是1-6，并且R35选自-CO2H、-C(O)NRwRx、CH3、生物素、-2-氟吡啶、-C(O)-(CH2)2-C(O)O-维生素E、-C(O)O-维生素E；并且
前提条件是至少一个R17不是氢、-CH3或-CH2OH；
Rc、Rf、Rh、Ri、Rm和Rn是氢；
Ra和Rj各自独立地选自氢和甲基；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11、R12和R13独立地选自天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链或如下所述与对应的邻位R基团形成环；
R10是吲哚基C1-C3烷基，其中吲哚基部分任选地被选自以下的一个基团取代：C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基羰基、C1-C6烷氧基羰基C1-C3烷基、(C1-C6烷基)S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、芳基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、芳基C1-C3烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、C3-C6环烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、C3-C6环烷基C1-C3烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、氰基、卤代C1-C3烷氧基、卤代C1-C3烷基、杂芳基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、杂芳基C1-C3烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、-NRpRq、(NRpRq)C1-C3烷基和四唑基C1-C3烷基，或被选自以下的两个基团取代：C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基羰基、C1-C6烷氧基羰基C1-C3烷基、C1-C3烷基、(C1-C6烷基)S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、芳基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、芳基C1-C3烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、羧基、羧基C1-C3烷基、氰基、C3-C6环烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、C3-C6环烷基C1-C3烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、卤素、卤代C1-C3烷氧基、卤代C1-C3烷基、杂芳基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、杂芳基C1-C3烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、羟基、-NRpRq、(NRpRq)C1-C3烷基、四唑基、四唑基C1-C3烷基和苯基，其中所述苯基进一步任选地被独立地选自C1-C3烷氧基、C1-C3烷基和卤素的一个、两个或三个基团取代；或者
R10是氮杂吲哚基C1-C3烷基，其中氮杂吲哚基C1-C3烷基的氮杂吲哚基部分被独立地选自以下的一个或两个其他基团取代：C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基羰基、C1-C6烷氧基羰基C1-C3烷基、C1-C3烷基、(C1-C6烷基)S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、芳基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、芳基C1-C3烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、羧基、羧基C1-C3烷基、氰基、C3-C6环烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、C3-C6环烷基C1-C3烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、卤素、卤代C1-C3烷氧基、卤代C1-C3烷基、杂芳基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、杂芳基C1-C3烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、羟基、-NRpRq、(NRpRq)C1-C3烷基、四唑基、四唑基C1-C3烷基和苯基，其中所述苯基进一步任选地被独立地选自C1-C3烷氧基、C1-C3烷基和卤素的一个、两个或三个基团取代；或者
R10是-(CH2)nQ'，其中n是1-3，并且Q'是含有一个、两个、三个或四个氮原子的5,6-稠合的饱和或不饱和环体系，其中所述环体系任选地被选自以下的一个、两个或三个基团取代：C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基羰基、C1-C6烷氧基羰基C1-C3烷基、C1-C3烷基、(C1-C6烷基)S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、芳基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、芳基C1-C3烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、羧基、羧基C1-C3烷基、氰基、C3-C6环烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、C3-C6环烷基C1-C3烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、卤素、卤代C1-C3烷氧基、卤代C1-C3烷基、杂芳基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、杂芳基C1-C3烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、羟基、-NRpRq、(NRpRq)C1-C3烷基、四唑基、四唑基C1-C3烷基和苯基，其中所述苯基进一步任选地被独立地选自C1-C3烷氧基、C1-C3烷基和卤素的一个、两个或三个基团取代；前提条件是Q'不是氮杂吲哚基或吲哚基；或者
R10是-(CH2)nZ'，其中n是1-3并且Z'是含有一个、两个、三个或四个氮原子的6,6-稠合的饱和或不饱和环体系，其中所述环体系任选地被选自以下的一个、两个或三个基团取代：C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基羰基、C1-C6烷氧基羰基C1-C3烷基、C1-C3烷基、(C1-C6烷基)S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、芳基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、芳基C1-C3烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、羧基、羧基C1-C3烷基、氰基、C3-C6环烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、C3-C6环烷基C1-C3烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、卤素、卤代C1-C3烷氧基、卤代C1-C3烷基、杂芳基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、杂芳基C1-C3烷基S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、羟基、-NRpRq、(NRpRq)C1-C3烷基、四唑基、四唑基C1-C3烷基和苯基，其中所述苯基进一步任选地被独立地选自C1-C3烷氧基、C1-C3烷基和卤素的一个、两个或三个基团取代；
Rb是甲基，或者Rb和R2与它们所连接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被独立地选自氨基、氰基、甲基、卤素和羟基的一至四个基团取代；
Rd是氢或甲基，或者Rd和R4与它们所连接的原子一起可以形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被独立地选自氨基、氰基、甲基、卤素、羟基和苯基的一至四个基团取代；
Re是氢或甲基，或者Re和R5与它们所连接的原子一起可以形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被独立地选自氨基、氰基、甲基、卤素和羟基的一至四个基团取代；
Rg是氢或甲基，或者Rg和R7与它们所连接的原子一起可以形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被独立地选自以下的一至四个基团取代：氨基、任选地被卤素基团取代的苄基、苄氧基、氰基、环己基、甲基、卤素、羟基、任选地被甲氧基取代的异喹啉基氧基、任选地被卤素基团取代的喹啉基氧基，以及四唑基；并且其中吡咯烷和哌啶环任选地与环己基、苯基或吲哚基团稠合；
Rk是氢或甲基，或者Rk和R11与它们所连接的原子一起可以形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被独立地选自氨基、氰基、甲基、卤素和羟基的一至四个基团取代；并且
Rl是甲基，或者Rl和R12与它们所连接的原子一起形成选自氮杂环丁烷和吡咯烷的环；其中每个环任选地被独立地选自氨基、氰基的一至四个基团取代，在第一方面的第一个实施方案中，本公开文本提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中A是
在第一方面的第二个实施方案中：
m是1；
w是0；
R16a是氢；并且
R16选自
-C(R17a)2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X'-R31和
-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)m'-C(R17a)(R17)-CO2H。
在第一方面的第三个实施方案中：
Rb是甲基；
Rg和R7与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环，其中所述环任选地被一个羟基取代；并且
Rk是甲基。
在第一方面的第四个实施方案中：
Ra、Re和Rj是氢；
RL是甲基；
Rn是氢；
R1是苯基甲基，其中所述苯基任选地被一个羟基取代；
R2是甲基；
R3是-CH2C(O)NH2；
R4是氢，或者R4和Rd与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环；
R5是-CH2NH2；
R6是-CH2CH(CH3)2；
R8是-CH2(吲哚基)；
R9是-(CH2)2NH2；
R11和R12是-(CH2)3CH3；并且
R13是-CH2CH(CH3)2。
在第一方面的第五个实施方案中，R10选自
在第二方面，本公开文本提供了增强、刺激和/或增加有需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的式(I)的化合物或其治疗上可接受的盐。在第二方面的第一个实施方案中，所述方法进一步包括在式(I)的化合物或其治疗上可接受的盐之前、之后或与其同时给予另外的药剂。在第二方面的第二个实施方案中，所述另外的药剂是抗微生物剂、抗病毒剂、细胞毒性剂和/或免疫应答调节剂。在第二方面的第三个实施方案中，所述另外的药剂是HDAC抑制剂。在第二方面的第四个实施方案中，所述另外的药剂是TLR7和/或TLR8激动剂。
在第三方面，本公开文本提供了抑制有需要的受试者的癌细胞的生长、增殖或转移的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的式(I)的化合物或其治疗上可接受的盐。在第三方面的第一个实施方案中，所述癌症选自黑色素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、去势抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌和乳腺癌以及血液恶性肿瘤。
在第四方面，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的式(I)的化合物或其治疗上可接受的盐。在第四方面的第一个实施方案中，所述感染性疾病由病毒引起。在第四方面的第二个实施方案中，所述病毒选自HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒和流感病毒。
在第五方面，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的脓毒性休克的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的式(I)的化合物或其治疗上可接受的盐。
在第六方面，本公开文本提供了阻断受试者的PD-L1与PD-1和/或CD80的相互作用的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的式(I)的化合物或其治疗上可接受的盐。
在其中R侧链是被甲基取代的环的一部分的式(I)的化合物中，应理解的是，甲基可以在环中的任何可取代的碳原子上，包括作为大环母结构的一部分的碳。
在式(I)的化合物中，优选的R1侧链是：苯丙氨酸、酪氨酸、3-噻吩-2-基、4-甲基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-甲氧基苯基丙氨酰、异色氨酸、3-甲基苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、3,4-二氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、3,4-二甲氧基苯丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸、4-二氟甲基苯丙氨酸、2-甲基苯丙氨酸、2-萘基丙氨酸、色氨酸、4-吡啶基、4-溴苯丙氨酸、3-吡啶基、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、联苯丙氨酸和3-氯苯丙氨酸；和2,4-二氨基丁烷。
在其中R2不为环的一部分的式(I)的化合物中，优选的R2侧链是：丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R3侧链是：天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、丙氨酸、2,3-二氨基丙烷和2,4-二氨基丁烷。
在其中R4不为环的一部分的式(I)的化合物中，优选的R4侧链是：缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸和甘氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R5侧链是：氨基甲烷、谷氨酸、组氨酸、天冬酰胺、2,3-二氨基丙烷、丝氨酸、甘氨酸、2,4-二氨基丁烷、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和3-噻唑基丙氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R6侧链是：亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、赖氨酸、3-环己烷、苏氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁烷、丙氨酸、精氨酸和鸟氨酸(COCH3)。
在其中R7不为环的一部分的式(I)的化合物中，优选的R7侧链是：甘氨酸、2,4-二氨基丁烷、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸和2,4-二氨基丁烷(C(O)环丁烷)。
在式(I)的化合物中，优选的R8侧链是色氨酸和1,2-苯并异噻唑啉基丙氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R9侧链是：丝氨酸、氨基乙烷、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、2,4-二丁胺、苏氨酸、甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸、2,3-二氨基丙烷、精氨酸、天冬氨酸和酪氨酸。
在式(I)的化合物中，R10中的杂环基可以在环中任何可取代的碳或氮原子处连接至亚甲基接头。
在式(I)的化合物中，优选的R11侧链是：正亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、甲硫氨酸、乙氧基甲烷、丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯丙烷、谷氨酸、己烷和庚烷。
在其中R12不为环的一部分的式(I)的化合物中，优选的R12侧链是：正亮氨酸、丙氨酸、乙氧基甲烷、蛋氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、甲氧基乙烷、亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、己烷、庚烷和甘氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R13侧链是：精氨酸、鸟氨酸、丙氨酸、2,4-二氨基丁烷、2,3-二氨基丙烷、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、环丙基甲烷、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和2-氨基丁烷。
根据本公开文本，我们已经发现了与PD-L1特异地结合并能够抑制PD-L1与PD-1和CD80相互作用的肽。这些大环肽展现出体外免疫调节功效，从而使它们成为治疗各种疾病(包括癌症和感染性疾病)的治疗候选物。
术语“特异性结合”或“特异地结合”是指蛋白质与结合分子(如化合物或配体)之间的相互作用。相互作用取决于由结合分子识别的蛋白质的特定结构(即酶结合位点、抗原决定簇或表位)的存在。例如，如果化合物对蛋白质结合位点“A”具有特异性结合，则在含有包括结合位点A的蛋白质和与蛋白质结合位点A特异性结合的标记肽的反应中，所述化合物的存在将减少与蛋白质结合的标记肽的量。相反，化合物与蛋白质的非特异性结合不会导致标记肽从蛋白质中的浓度依赖性置换。
本公开文本旨在包括本发明化合物中出现的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子序数但质量数不同的那些原子。作为一般例子而非限制，氢的同位素包括氘和氚。碳的同位素包括13C和14C。本发明的同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与本文所述那些类似的方法，使用适当的同位素标记的试剂代替原本采用的未经标记的试剂来制备。此类化合物可以具有很多潜在的用途，例如在测定生物活性时作为标准和试剂。在稳定同位素的情况下，此类化合物可以具有有利地改变生物学、药理学或药物动力学特性的潜力。
本文所述主题的另一个方面是所公开的肽作为放射性标记的配体的用途，其用于开发配体结合测定或用于监测体内吸附、代谢、分布、受体结合或占据或化合物处置。例如，本文所述的大环肽可以使用放射性同位素125I制备，并且所得放射性标记的肽可以用于开发结合测定或用于代谢研究。可替代地，并且出于同样的目的，本文所述的大环肽可以通过使用本领域技术人员已知的方法进行催化氚化而转化为放射性标记的形式。
通过使用本领域技术人员已知的方法添加放射性示踪剂，本公开文本的大环肽还可以用作PET显像剂。
优选的肽包括本文提供的大环肽中的至少一种，并且这些肽可以包含在药物组合物和组合中。
除非在特定情况下另有限制，否则本文提供的定义适用于但不限于如在整个说明书中使用的术语。
氨基酸和肽化学领域的普通技术人员知道氨基酸包括由以下通用结构表示的化合物：
其中R和R′是如本文所讨论的。
除非另有说明，否则如本文所用术语“氨基酸”，单独或作为另一基团的一部分，包括但不限于连接到同一个碳(称为“α”碳)的氨基和羧基，其中R和/或R'可以是天然或非天然侧链，包括氢。“α”碳处的绝对“S”构型通常被称为“L”或“自然”构型。在“R”和“R′”(')取代基二者都等于氢的情况下，氨基酸是甘氨酸并且不是手性的。
如本文所用，术语“天然氨基酸侧链”和“天然存在的氨基酸侧链”是指通常处于S构型(即，L-氨基酸)的任何天然存在的氨基酸(即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)的侧链。
如本文所用，术语“非天然氨基酸侧链”和“非天然存在的氨基酸侧链”是指通常处于R构型(即，D-氨基酸)的任何天然存在的氨基酸的侧链或除了处于R或S构型(即，分别为D-或L-氨基酸)的天然存在的氨基酸侧链之外的基团，所述基团选自：
C2-C7烯基、C1-C3烷氧基C1-C3烷基、C1-C6烷氧基羰基C1-C3烷基、C1-C7烷基、C1-C3烷基硫烷基C1-C3烷基、酰胺基C1-C3烷基、氨基C1-C3烷基、苯并噻唑基C1-C3烷基、苯并噻吩基C1-C3烷基、苄氧基C1-C3烷基、羧基C1-C3烷基、C3-C14环烷基C1-C3烷基、C3-C6环烷基C1-C3烷基、二苯基甲基、呋喃基C1-C3烷基、咪唑基C1-C3烷基、萘基C1-C3烷基、吡啶基C1-C3烷基、噻唑基C1-C3烷基、噻吩基C1-C3烷基；
氮杂吲哚基C1-C3烷基，其中所述氮杂吲哚基C1-C3烷基的氮杂吲哚基部分任选地被独立地选自以下的一个或两个取代基取代：C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、(C1-C6烷基)S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、羧基、羧基C1-C3烷基、氰基、卤素、羟基、四唑基、四唑基C1-C3烷基和苯基，其中所述苯基进一步任选地被独立地选自C1-C3烷氧基、C1-C3烷基和卤素的一个、两个或三个基团取代；
联苯C1-C3烷基，其中所述联苯任选地被甲基取代；
-(CH2)nQ'，其中n是1-3，并且Q'是含有两个、三个或四个氮原子的5,6-稠合的饱和或不饱和环体系，其中所述环体系任选地被选自以下的一个、两个或三个基团取代：C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、(C1-C6烷基)S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、(C1-6烷基)磺酰胺基C1-C3烷基、羧基、羧基C1-C3烷基、氰基、卤素、羟基、四唑基、四唑基C1-C3烷基和苯基，其中所述苯基进一步任选地被独立地选自C1-C3烷氧基、C1-C3烷基和卤素的一个、两个或三个基团取代；前提条件是Q'不是氮杂吲哚基或吲哚基；或者
-(CH2)nZ'，其中n是1-3，并且Z'是含有一个、两个、三个或四个氮原子的6,6-稠合的饱和或不饱和环体系，其中所述环体系任选地被选自以下的一个、两个或三个基团取代：C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、(C1-C6烷基)S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、羧基、羧基C1-C3烷基、氰基、卤素、羟基、四唑基、四唑基C1-C3烷基和苯基，其中所述苯基进一步任选地被独立地选自以下的一个、两个或三个基团取代：C1-C3烷氧基、C1-C3烷基和卤素；
任选地被独立地选自以下的一个、两个、三个、四个或五个基团取代的杂环烷基：C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C1-C3烷基磺酰基氨基、酰胺基、氨基、氨基C1-C3烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、卤素、卤代C1-C3烷基、羟基、-NC(NH2)2、硝基和-OP(O)(OH)2；
吲哚基C1-C3烷基，其中吲哚基部分任选地被选自以下的一个或两个基团取代：(C1-6烷基)S(O)2NHC(O)C1-C3烷基、C1-C6烷氧基、C1-C3烷基、羧基、羧基C1-C3烷基、氰基、卤素、羟基、四唑基、四唑基C1-C3烷基和苯基，其中所述苯基进一步任选地被独立地选自C1-C3烷氧基、C1-C3烷基和卤素的一个、两个或三个基团取代；
任选地被独立地选自以下的一个、两个、三个、四个或五个基团取代的苯基：C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C1-C3烷基磺酰基氨基、酰胺基、氨基、氨基C1-C3烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、卤素、卤代C1-C3烷基、羟基、-NC(NH2)2、硝基和-OP(O)(OH)2；
NRaRb(C1-C7烷基)，其中Ra和Rb独立地选自氢、C2-C4烯氧基羰基、C1-C3烷基、C1-C3烷基羰基、C3-C6环烷基羰基、呋喃基羰基和苯基羰基。当烷基接头含有多于一个碳时，链上可以有一个另外的NRaRb基团。
NRcRd羰基C1-C3烷基，其中Rc和Rd独立地选自氢、C1-C3烷基和三苯甲基；
苯基C1-C3烷基，其中所述苯基部分任选地被独立地选自以下的一个、两个、三个、四个或五个基团取代：C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C1-C3烷基磺酰基氨基、酰胺基、氨基、氨基C1-C3烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、卤素、卤代C1-C3烷基、羟基、-NC(NH2)2、硝基和-OP(O)(OH)2；以及
苯氧基C1-C3烷基，其中所述苯基任选地被C1-C3烷基取代。
如本文所用，术语“C2-C4烯基”是指含有至少一个碳-碳双键的二至四个碳原子的直链或支链基团。
如本文所用，术语“C2-C7烯基”是指含有至少一个碳-碳双键的二至七个碳原子的直链或支链基团。
如本文所用，术语“C2-C4烯氧基”是指通过氧原子连接至母体分子部分的C2-C4烯基。
如本文所用，术语“C1-C3烷氧基”是指通过氧原子连接至母体分子部分的C1-C3烷基。
如本文所用，术语“C1-C4烷氧基”是指通过氧原子连接至母体分子部分的C1-C4烷基。
如本文所用，术语“C1-C6烷氧基”是指通过氧原子连接至母体分子部分的C1-C6烷基。
如本文所用，术语“C1-C3烷氧基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的C1-C3烷氧基。
如本文所用，术语“C1-C6烷氧基羰基”是指通过羰基连接至母体分子部分的C1-C6烷氧基。
如本文所用，术语“C1-C6烷氧基羰基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的C1-C6烷氧基羰基。
如本文所用，术语“C1-C3烷基”是指衍生自含有一至三个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。
如本文所用，术语“C1-C4烷基”是指衍生自含有一至四个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。
如本文所用，术语“C1-C6烷基”是指衍生自含有一至六个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。
如本文所用，术语“C1-C3烷基羰基”是指通过羰基连接至母体分子部分的C1-C3烷基。
如本文所用，术语“(C1-C6烷基)S(O)2NHC(O)C1-C3烷基”是指：
其中R是C1-C6烷基，R*是C1-C3烷基，并且指示与母体分子部分的连接点。
如本文所用，术语“C1-C3烷基硫烷基”是指通过硫原子连接至母体分子部分的C1-C3烷基。
如本文所用，术语“C1-C3烷基硫烷基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的C1-C3烷基硫烷基。
如本文所用，术语“C1-C3烷基磺酰基”是指通过磺酰基连接至母体分子部分的C1-C3烷基。
如本文所用，术语“C1-C3烷基磺酰基氨基”是指通过氨基连接至母体分子部分的C1-C3烷基磺酰基。
如本文所用，术语“酰胺基”是指-C(O)NH2。
如本文所用，术语“酰胺基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的酰胺基。
如本文所用，术语“氨基”是指-NH2。
如本文所用，术语“氨基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的氨基。
如本文所用，术语“氨基磺酰基”是指通过磺酰基连接至母体分子部分的氨基。
如本文所用，术语“氮杂吲哚基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子的氮杂吲哚基。氮杂吲哚基可以通过所述基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本文所用，术语“苯并噻唑基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子的苯并噻唑基。苯并噻唑基可以通过所述基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本文所用，术语“苯并噻吩基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子的苯并噻吩基。苯并噻吩基可以通过所述基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本文所用，术语“苄氧基”是指通过氧原子连接至母体分子部分的苄基。
如本文所用，术语“苄氧基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的苄氧基。
如本文所用，术语“联苯C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的联苯基。联苯基可以通过所述基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本文所用，术语“羰基”是指-C(O)-。
如本文所用，术语“羧基”是指-CO2H。
如本文所用，术语“羧基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的羧基。
如本文所用，术语“氰基”是指-CN。
如本文所用，术语“C3-C14环烷基”是指具有三至十四个碳原子和零个杂原子的饱和单环、双环或三环烃环体系。双环和三环可以是稠合的、螺环的或桥连的。环烷基的代表性例子包括但不限于环丙基、环戊基和双环[3.1.1]庚基和金刚烷基。
如本文所用，术语“C3-C14环烷基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的C3-C14环烷基。
如本文所用，术语“C3-C14环烷基羰基”是指通过羰基连接至母体分子部分的C3-C14环烷基。
如本文所用，术语“C3-C6环烷基”是指具有三至六个碳原子和零个杂原子的饱和单环烃环体系。
如本文所用，术语“C3-C6环烷基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的C3-C6环烷基。
如本文所用，术语“C3-C6环烷基羰基”是指通过羰基连接至母体分子部分的C3-C6环烷基。
如本文所用，术语“呋喃基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的呋喃基。呋喃基可以通过所述基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本文所用，术语“呋喃基羰基”是指通过羰基连接至母体分子部分的呋喃基。
如本文所用，术语“卤素”(“halo”和“halogen”)是指F、Cl、Br或I。
如本文所用，术语“卤代C1-C3烷基”是指被一、二或三个卤素原子取代的C1-C3烷基。
如本文所用，术语“卤甲基”是指被一、二或三个卤素原子取代的甲基。
如本文所用，术语“杂环基”是指含有独立地选自氮、氧和硫的一、二或三个杂原子的五元、六元或七元环。五元环具有零至两个双键，并且六元环和七元环具有零至三个双键。术语“杂环基”还包括双环基团，其中杂环基环与四至六元芳族或非芳族碳环或另一个单环杂环基稠合。本公开文本的杂环基通过所述基团中的碳原子连接至母体分子部分。杂环基的例子包括但不限于苯并噻吩基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基、噁唑基、哌嗪基、哌啶基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、吡咯并吡啶基、吡咯基、噻唑基、噻吩基和硫代吗啉基。
如本文所用，术语“羟基”是指-OH。
如本文所用，术语“咪唑基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的咪唑基。咪唑基可以通过所述基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本文所用，术语“吲哚基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的吲哚基。吲哚基可以通过所述基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本文所用，术语“萘基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的萘基。萘基可以通过所述基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本文所用，术语“硝基”是指-NO2。
如本文所用，术语“NRaRb”是指通过氮原子连接至母体分子部分的两个基团，Ra和Rb。Ra和Rb独立地选自氢、C2-C4烯氧基羰基、C1-C3烷基羰基、C3-C6环烷基羰基、呋喃基羰基和苯基羰基。
如本文所用，术语“NRaRb(C1-C3)烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的NRaRb基团。
如本文所用，术语“NRcRd”是指通过氮原子连接至母体分子部分的两个基团，Rc和Rd。Rc和Rd独立地选自氢、C1-C3烷基和三苯甲基。
如本文所用，术语“NRcRd羰基”是指通过羰基连接至母体分子部分的NRcRd基团。
如本文所用，术语“NRcRd羰基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的NRcRd羰基。
如本文所用，术语“苯氧基”是指通过氧原子连接至母体分子部分的苯基。
如本文所用，术语“苯氧基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的苯氧基。
如本文所用，术语“苯基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的苯基。
如本文所用，术语“苯基羰基”是指通过羰基连接至母体分子部分的苯基。
如本文所用，术语“吡啶基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的吡啶基。吡啶基可以通过所述基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本文所用，术语“硫烷基”是指-S-。
如本文所用，术语“磺酰基”是指-SO2-。
如本文所用，术语“四唑基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的四唑基。噻唑基可以通过所述基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本文所用，术语“噻唑基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的噻唑基。噻唑基可以通过所述基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
如本文所用，术语“噻吩基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基连接至母体分子部分的噻吩基。噻吩基可以通过所述基团中的任何可取代原子连接至烷基部分。
术语“治疗”是指：(i)预防可能易患有疾病、障碍和/或病症但尚未被诊断出患有所述疾病、障碍和/或病症的患者中所述疾病、障碍或病症的发生；(ii)抑制所述疾病、障碍或病症，即，遏制其发展；以及(iii)缓解所述疾病、障碍或病症，即引起所述疾病、障碍和/或病症和/或与所述疾病、障碍和/或病症相关的症状消退。
大环肽与PD-L1的结合可以例如通过如均相时间分辨荧光(HTRF)、表面等离子体共振(SPR)、等温滴定量热法(ITC)、核磁共振波谱法(NMR)等方法来测量。此外，大环肽与在细胞表面上表达的PD-L1的结合可以如本文所述在细胞结合测定中进行测量。
本文所述治疗剂的给予包括但不限于治疗有效量的治疗剂的给予。如本文所用的术语“治疗有效量”指但不限于治疗或预防通过给予本文所述的PD-1/PD-L1结合抑制剂组合物可治疗的病症的治疗剂的量。所述量是足以展现出可检测的治疗或预防或改善效果的量。所述效果可以包括，例如但不限于治疗或预防本文列出的病症。对于受试者的精确有效量将取决于受试者的体型和健康状况、所治疗的病症的性质和程度、治疗医师的建议以及选择用于给予的治疗剂或治疗剂组合。因此，预先指定确切的有效量是没有用的。
在另一方面，本公开文本涉及使用本公开文本的大环肽抑制受试者的肿瘤细胞生长的方法。如本文所示，本公开文本的大环肽能够与PD-L1结合、破坏PD-L1与PD-1之间的相互作用、与已知可阻断与PD-1相互作用的抗PD-1单克隆抗体竞争与PD-L1的结合、增强CMV特异性T细胞IFNγ分泌，以及增强HIV特异性T细胞IFNg分泌。因此，本公开文本的大环肽可用于改变免疫应答、治疗疾病如癌症或感染性疾病、刺激保护性自身免疫应答或刺激抗原特异性免疫应答(例如，通过与目的抗原共给予PD-L1阻断肽)。
为了更容易理解本公开文本，首先定义某些术语。另外的定义贯穿详细说明而阐述。
术语“程序性死亡配体1”、“程序性细胞死亡配体1”、“蛋白质PD-L1”、“PD-L1”、“PDL1”、“PDCDL1”、“hPD-L1”、“hPD-LI”、“CD274”和“B7-H1”可互换使用，并且包括人PD-L1的变体、同种型、物种同源物以及与PD-L1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-L1序列可以在登录号NP_054862下找到。
术语“程序性死亡1”、“程序性细胞死亡1”、“蛋白质PD-1”、“PD-1”、“PD1”、“PDCD1”、“hPD-1”和“hPD-I”可互换使用，并且包括人PD-1的变体、同种型、物种同源物以及与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-1序列可以在登录号U64863下找到。
术语“细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4”、“CTLA-4”、“CTLA4”、“CTLA-4抗原”和“CD152”(参见例如Murata,Am.J.Pathol.,155:453-460(1999))可互换使用，并且包括人CTLA-4的变体、同种型、物种同源物以及与CTLA-4具有至少一个共同表位的类似物(参见例如Balzano,Int.J.Cancer Suppl.,7:28-32(1992))。完整的CTLA-4核酸序列可以在登录号L15006下找到。
术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括大环肽、细胞因子和补体)的作用，其导致对人体的选择性损伤、破坏或从人体消除入侵的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或者在自身免疫或病理炎症的情况下，消除正常的人细胞或组织。
如本文所用的“不良事件(AE)”是与医学治疗的使用相关的任何不利的并且通常是无意的、甚至是不希望的体征(包括异常的实验室发现)、症状或疾病。例如，不良事件可能与响应于治疗的免疫系统的激活或免疫系统细胞(例如T细胞)的扩增相关。医学治疗可能具有一种或多种相关的AE，并且每种AE可能具有相同或不同级别的严重程度。对能够“改变不良事件”的方法的提及意指降低与不同治疗方案的使用相关的一种或多种AE的发生率和/或严重程度的治疗方案。
如本文所用，“过度增殖性疾病”是指其中细胞生长超过正常水平的病症。例如，过度增殖性疾病或障碍包括恶性疾病(例如食道癌、结肠癌、胆管癌)和非恶性疾病(例如动脉粥样硬化、良性增生和良性前列腺肥大)。
如本文所用，“约”或“基本上包含……”意指在由本领域普通技术人员测定的具体值的可接受的误差范围内，这将部分取决于如何测量或测定值，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上包含……”可以意指在一个或多于一个标准偏差内。可替代地，“约”或“基本上包含……”可以意指高达20％的范围。此外，特别是关于生物系统或方法，所述术语可以意指高达值的一个数量级或高达值的5倍。当在本申请和权利要求中提供特定值时，除非另有说明，否则应当假定“约”或“基本上包含……”的含义在所述特定值的可接受误差范围内。
如本文所述，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。
竞争测定
本公开文本还涉及这样的大环肽，其能够与参考抗PD-L1抗体(MDX-1105)竞争至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％和至少约100％的结合。此类大环肽可以与本文公开的一种或多种大环肽(包括突变体、保守取代、功能取代和缺失形式)具有结构同源性，前提条件是它们与PD-L1特异性地结合。例如，如果大环肽与参考抗PD-L1抗体基本上结合PD-L1的相同区域，则所述大环肽应当与PD-L1的如下表位结合，所述表位至少与所述抗PD-L1单克隆抗体所结合的PD-L1表位重叠。重叠区域的范围可以为一个氨基酸残基至几百个氨基酸残基。那么大环肽应当与抗PD-L1单克隆抗体竞争和/或阻断其与PD-L1的结合，并且从而使抗PD-L1单克隆抗体与PD-L1的结合在竞争测定中降低、优选地降低至少约50％。
可以用作竞争测定目的的参考抗体的抗PD-L1抗体在本领域中是已知的。例如，可以使用以下代表性的抗PD-L1抗体：MDX-1105(BMS)；L01X-C(Serono)、L1X3(Serono)、MSB-0010718C(Serono)和PD-L1 Probody(CytomX)，以及在共同拥有的WO 2007/005874中披露的PD-L1抗体。
可以用作竞争测定目的的参考抗体的抗PD-1抗体在本领域中是已知的。例如，可以使用以下代表性的抗PD-1抗体：nivolumab(BMS)；各自在共同拥有的美国专利号8,008,449(BMS)中披露的17D8、2D3、4H1、4A11、7D3和5F4；MK-3475(Merck，在美国专利号8,168,757中披露)；以及在美国专利号7,488,802中披露的抗体。
药物组合物
在另一方面，本公开文本提供了含有与药学上可接受的载体一起配制的一种本公开文本的大环肽或本公开文本的大环肽组合的组合物，例如药物组合物。此类组合物可以包含一种本公开文本的大环肽或免疫缀合物或双特异性分子或者本公开文本的大环肽或免疫缀合物或双特异性分子的组合(例如两种或更多种不同的本公开文本的大环肽或免疫缀合物或双特异性分子)。例如，本公开文本的药物组合物可以包含与靶抗原上的不同表位结合或具有互补活性的大环肽(或免疫缀合物或双特异性分子)的组合。
本公开文本的药物组合物也可以在组合疗法中给予，即与其他药剂组合给予。例如，组合疗法可以包括与至少一种其他抗炎剂或免疫抑制剂组合的大环肽。可以在组合疗法中使用的治疗剂的例子在下文关于本公开文本的大环肽的用途的部分中更详细地进行了描述。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上可相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮给予(例如，通过注射或输注)。根据给予的途径，可以将活性化合物(即大环肽、免疫缀合物或双特异性分子)包被在材料中以保护化合物免受酸和可能使化合物失活的其他自然条件的作用。
本公开文本的药物化合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”或“治疗上可接受的盐”是指保留母体化合物的所希望生物活性并且不赋予任何不希望的毒理作用的盐(参见例如Berge,S.M.等人,J.Pharm.Sci.,66:1-19(1977))。此类盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸(如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)以及衍生自无毒有机酸(如脂肪族单羧酸和脂肪族二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等)的那些。碱加成盐包括衍生自碱土金属(如钠、钾、镁、钙等)以及衍生自无毒有机胺(如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的那些。
本公开文本的药物组合物还可以包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可以用于本公开文本的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。可以例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度、以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。
这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述灭菌程序以及通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚山梨酸等)两种方法来确保防止微生物的存在。还可能令人希望的是在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，可通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射药物形式的延迟吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和药剂用于药物活性材料的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑其用于本公开文本的药物组合物中。补充性活性化合物也可掺入到组合物中。
在制造和储存条件下，治疗性组合物通常必须是无菌且稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或适合高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合的混合物。例如，通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。通过在所述组合物中包含延迟吸收的药剂例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
可以通过将活性化合物以所需的量掺入适当的溶剂中，随后微过滤灭菌来制备无菌可注射溶液，所述溶剂根据需要具有以上列举的一种成分或多种成分的组合。通常，通过将所述活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有碱性分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述真空干燥和冷冻干燥由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据正在被治疗的受试者和特定的给予模式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，从百分比来说，该量范围在约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％、最优选约1％至约30％的活性成分内，所述活性成分与药学上可接受的载体相组合。
可以调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以给予单次推注，可以随时间给予几个分开的剂量，或者可以如根据治疗情况的紧急程度指示的按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物是尤其有利的，以便于给予和剂量的均匀。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算与所需的药物载体联合可产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本公开文本的剂量单位形式的规格取决于或直接依赖于：(a)活性化合物的独特特征和所要实现的特定治疗效果，和(b)在合成用于治疗个体敏感性的这种活性化合物的领域中固有的限制。
对于大环肽的给予，剂量在约0.0001至100mg/kg宿主体重且更通常在0.01至5mg/kg宿主体重的范围内。例如剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或者在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每天给予一次、每天给予两次、每周给予两次、每周给予三次、每周给予一次、每两周给予一次、每三周给予一次、每四周给予一次、每月给予一次、每3个月给予一次或每三至6个月给予一次。本公开文本的大环肽的优选剂量方案包括经由静脉内给予1mg/kg体重或3mg/kg体重，其中使用以下给药时间表中的一种给予所述大环：(i)每四周，持续六个剂量，随后每三个月；(ii)每三周；(iii)一次3mg/kg体重，然后每三周1mg/kg体重。
在一些方法中，同时给予具有不同结合特异性的两种或更多种大环肽，在这种情况下，所给予的每种化合物的剂量都在所示范围内。通常在多个场合给予所述化合物。单次剂量之间的间隔可以是例如每周、每月、每三个月或每年。如通过测量患者中针对靶抗原的大环肽的血液水平所指示，间隔也可以是不规则的。在一些方法中，调整剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆浓度，并且在一些方法中达到约25-300μg/ml。
可替代地，大环肽可以作为持续释放制剂给予，在这种情况下需要较不频繁的给予。给予的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，以相对不频繁的间隔长时间给予相对低的剂量。一些患者在其余生持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要间隔相对短的相对高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，并且优选直到患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可以向患者给予预防性方案。
本公开文本的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变以便获得对于特定患者、组合物和给予模式有效实现所希望治疗反应而不会对患者造成毒性的量的活性成分。所选剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用本公开文本的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给予途径，给予时间，所采用特定化合物的排泄速率，治疗持续时间，与所采用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和既往病史，以及医学领域中熟知的类似因素。
本公开文本的大环肽的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重程度的降低、无疾病症状时期的频率和持续时间的增加、或由于疾病困扰引起的损伤或残疾的预防。例如，对于肿瘤的治疗，相对于未治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选地抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％、以及还更优选至少约80％。可以在预测人肿瘤中的功效或病毒功效的动物模型系统中评价化合物抑制肿瘤生长和/或HIV的能力。可替代地，可以通过检查由熟练的技术人员已知的测定所测的化合物抑制、这种体外抑制的能力来评价组合物的这种特性。治疗性化合物的治疗有效量可以减小肿瘤大小、减小病毒载量或以其他方式改善受试者中的症状。本领域普通技术人员将能够基于此类因素(如受试者的体型、受试者症状的严重程度以及所选择的给予的特定组合物或途径)来确定此类量。
在另一方面，本公开文本提供了药物试剂盒，其具有包含大环肽和另一种免疫调节剂的部件，如本文所述。所述试剂盒还可以进一步包括用于治疗过度增殖性疾病(如本文所述的癌症)和/或抗病毒疾病的说明书。
可以使用本领域中已知的多种方法中的一种或多种，通过一种或多种给予途径来给予本公开文本的组合物。如技术人员所理解的，给予途径和/或方式将根据所希望的结果而变化。本公开文本的大环肽的优选给予途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给予途径，例如通过注射或输注。如本文所用的短语“肠胃外给予”意指除了肠给予和局部给予之外，通常通过注射的给予方式，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。
可替代地，本公开文本的大环肽可以经由非肠胃外途径给予，如局部、表皮或粘膜给予途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部给予。
可以将活性化合物与保护化合物免于快速释放的载体(如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊递送系统)一起制备。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多用于制备此类配制品的方法是获得专利权的或是本领域的技术人员通常已知的。参见例如Robinson,J.R.编,Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems,Marcel Dekker,Inc.,New York(1978)。
可以将治疗性组合物用本领域已知的医疗装置给予。例如，在优选的实施方案中，可以将本公开文本的治疗性组合物用无针皮下注射装置，如在美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中披露的装置给予。可用于本公开文本的熟知的植入物和模块的例子包括：美国专利号4,487,603，其披露了一种用于以受控制的速率分配药物的可植入的微输注泵；美国专利号4,486,194，其披露了用于通过皮肤给予药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其披露了用于以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其披露了用于连续药物递送的可变流量可植入输注设备；美国专利号4,439,196，其披露了具有多室区室的渗透性药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其披露了渗透性药物递送系统。将这些专利通过引用并入本文。许多其他此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，可以配制本公开文本的大环肽以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排斥许多高度亲水性化合物。为了确保本公开文本的治疗性化合物穿过BBB(如果需要的话)，可以将其配制在例如脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见例如美国专利号4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂质体可以包含选择性地转移到特定细胞或器官中从而增强靶向药物递送的一个或多个部分(参见例如Ranade,V.V.,J.Clin.Pharmacol.,29:685(1989))。示例性靶向部分包含叶酸或生物素(参见例如Low等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,153:1038(1988))；大环肽(Bloeman,P.G.等人,FEBS Lett.,357:140(1995)；Owais,M.等人,Antimicrob.AgentsChemother.,39:180(1995))；表面活性蛋白A受体(Briscoe等人,Am.J.Physiol.,1233:134(1995))；p120(Schreier等人,J.Biol.Chem.,269:9090(1994))；还参见Keinanen,K.等人,FEBS Lett.,346:123(1994)；Killion,J.J.等人,Immunomethods 4:273(1994)。
本公开文本的用途和方法
本公开文本的大环肽、组合物和方法具有许多体外和体内实用性，包括例如检测PD-L1或通过阻断PD-L1增强免疫应答。例如，这些分子可以在体外或离体给予至培养物中的细胞，或者例如在体内给予至人受试者以在各种情况下增强免疫。因此，在一个方面，本公开文本提供了改变受试者中免疫应答的方法，其包括向受试者给予本公开文本的大环肽从而改变受试者中的免疫应答。优选地，所述应答被增强、刺激或上调。在其他方面，大环肽可以具有抗食蟹猴、抗小鼠和/或抗土拨鼠结合和治疗活性。
如本文所用，术语“受试者”旨在包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、土拨鼠、两栖动物和爬行动物，但优选哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛和马。优选的受试者包括需要增强免疫应答的人患者。所述方法特别适用于治疗患有可以通过增加T细胞介导的免疫应答来治疗的障碍的人患者。在特定的实施方案中，所述方法特别适用于在体内治疗癌细胞。为了实现免疫的抗原特异性增强，大环肽可以与目的抗原一起给予。当针对PD-L1的大环肽与另一种药剂一起给予时，两者可以顺序或同时给予。
本公开文本进一步提供了用于检测样品中人、土拨鼠、食蟹猴和/或小鼠PD-L1抗原的存在，或测量人、土拨鼠、食蟹猴和/或小鼠PD-L1抗原的量的方法，其包括在允许在大环与人、土拨鼠、食蟹猴和/或小鼠PD-L1之间形成复合物的条件下，将所述样品和对照样品与特异地结合人、土拨鼠、食蟹猴和/或小鼠PD-L1的参考大环肽接触。然后检测复合物的形成，其中样品相比于对照样品之间的差异复合物形成指示样品中存在人、土拨鼠、食蟹猴和/或小鼠PD-L1抗原。
鉴于本公开文本的大环肽与CD28、ICOS和CTLA-4相比对PD-L1的特异性结合，本公开文本的大环肽可以用于特异性地检测细胞表面上的PD-L1表达，并且此外，可以用于经由免疫亲和纯化来纯化PD-L1。
癌症
大环肽对PD-1的阻断可以增强对患者癌细胞的免疫应答。PD-1的配体PD-L1在正常人细胞中不表达，但在多种人癌症中是丰富的(Dong等人,Nat.Med.,8:787-789(2002))。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少以及癌细胞的免疫逃避(Dong等人,J.Mol.Med.,81:281-287(2003)；Blank等人,CancerImmunol.Immunother.,54:307-314(2005)；Konishi等人,Clin.Cancer Res.,10:5094-5100(2004))。可以通过抑制PD-1对PD-L1的局部相互作用来逆转免疫抑制作用，并且当PD-1对PD-L2的相互作用也被阻断时，这种作用是加和的(Iwai等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,99:12293-12297(2002)；Brown等人,J.Immunol.,170:1257-1266(2003))。虽然先前的研究已经显示可以通过抑制PD-1对PD-L1的相互作用来恢复T细胞增殖，但还没有报道通过阻断PD-1/PD-L1相互作用对体内癌症肿瘤生长的直接影响。在一个方面，本公开文本涉及使用大环肽在体内治疗受试者，使得抑制癌性肿瘤的生长。大环肽可以单独用于抑制癌性肿瘤的生长。可替代地，如下所述，大环肽可以与其他免疫原性药剂、标准癌症治疗或其他大环肽结合使用。
因此，在一个实施方案中，本公开文本提供了抑制受试者的肿瘤细胞生长的方法，其包括向所述受试者给予治疗有效量的大环肽。
使用本公开文本的大环肽可以抑制其生长的优选癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症。用于治疗的优选癌症的非限制性例子包括黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、肾细胞癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌和去势抗性前列腺癌)、乳腺癌、结直肠癌和肺癌(例如鳞状和非鳞状非小细胞肺癌)。另外，本公开文本包括可以使用本公开文本的大环肽抑制其生长的难治性或复发性恶性肿瘤。
可以使用本公开文本的方法治疗的其他癌症的例子包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛区癌、胃(stomach/gastric)癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱导的那些)以及所述癌症的组合。本公开文本还可用于治疗转移性癌症，尤其是表达PD-L1的转移性癌症(Iwai等人,Int.Immunol.,17:133-144(2005))。
任选地，针对PD-L1的大环肽可以与免疫原性药剂组合，所述免疫原性药剂是如癌性细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞(He等人,J.Immunol.,173:4919-4928(2004))。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性例子包括黑色素瘤抗原的肽(如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽)或转染以表达细胞因子GM-CSF(下文进一步所讨论)的肿瘤细胞。
在人中，已经显示一些肿瘤(如黑色素瘤)具有免疫原性。预计通过PD-L1阻断提高T细胞激活的阈值，我们可以预期激活宿主中的肿瘤应答。
当与疫苗接种方案组合时，PD-L1阻断可能是最有效的。已经设计了许多用于针对肿瘤的疫苗接种的实验策略(参见Rosenberg,S.,Development of Cancer Vaccines,ASCOEducational Book Spring:60-62(2000)；Logothetis,C.,ASCO Educational BookSpring:300-302(2000)；Khayat,D.,ASCO Educational Book Spring:414-428(2000)；Foon,K.,ASCO Educational Book Spring:730-738(2000)；还参见Restifo,N等人,CancerVaccines,第61章,第3023-3043页,在DeVita,V.等人编,Cancer:Principles andPractice of Oncology,第五版(1997)中)。在这些策略之一中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。已经显示，当肿瘤细胞被转导以表达GM-CSF时，这些细胞疫苗是最有效的。已经显示GM-CSF是用于肿瘤疫苗接种的抗原呈递的有效力的激活剂(Dranoff等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:3539-3543(1993))。
对各种肿瘤中的基因表达和大规模基因表达模式的研究已经产生了所谓的肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg,S.A.,Immunity,10:281-287(1999))。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤和从其产生肿瘤的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可以显示为宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。PD-L1阻断可以与肿瘤中表达的重组蛋白和/或肽的集合结合使用，以便产生针对这些蛋白质的免疫应答。这些蛋白质通常被免疫系统视为自身抗原，并且因此免疫系统可容忍它们。肿瘤抗原还可以包括蛋白质端粒酶，其是合成染色体端粒所需的并且在超过85％的人癌症和仅有限数量的体细胞组织中表达(Kim,N等人,Science,266:2011-2013(1994))。(可以通过各种手段保护这些体细胞组织免受免疫攻击)。肿瘤抗原也可以是因为改变蛋白质序列或产生两个不相关序列之间的融合蛋白(即费城染色体中的bcr-abl)的体细胞突变或者来自B细胞肿瘤的独特型而在癌细胞中表达的“新抗原”。
其他肿瘤疫苗可以包括来自人癌症中所涉及的病毒的蛋白质，所述病毒是如人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可以与PD-L1阻断结合使用的另一种形式的肿瘤特异性抗原是从肿瘤组织本身分离的纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白质片段，并且这些HSP在递送至抗原呈递细胞时高效引发肿瘤免疫(Suot,R.等人,Science,269:1585-1588(1995)；Tamura,Y.等人,Science,278:117-120(1997))。
树突细胞(DC)是有效力的抗原呈递细胞，其可以用于引发抗原特异性应答。DC可以离体产生并加载各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle,F.等人,Nat.Med.,4:328-332(1998))。DC还可以通过遗传手段转导以也表达这些肿瘤抗原。出于免疫目的，DC还已经直接与肿瘤细胞融合(Kugler,A.等人,Nat.Med.,6:332-336(2000))。作为一种疫苗接种方法，DC免疫可以与PD-L1阻断有效组合以激活更有效力的抗肿瘤反应。
PD-L1阻断还可以与标准癌症治疗组合。PD-L1阻断可以与化学治疗方案有效组合。在这些情况下，可以减少给予的化学治疗剂的剂量(Mokyr,M.等人,Cancer Res.,58:5301-5304(1998))。这种组合的例子是大环肽与达卡巴嗪组合用于治疗黑色素瘤。这种组合的另一个例子是大环肽与白细胞介素-2(IL-2)组合用于治疗黑色素瘤。组合使用PD-L1阻断和化学疗法背后的科学原理是，作为大多数化学治疗化合物的细胞毒作用的结果的细胞死亡应导致抗原呈递途径中肿瘤抗原水平的升高。可能通过细胞死亡导致与PD-L1阻断协同作用的其他组合疗法是放射、手术和激素剥夺。这些方案中的每一种都在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂也可以与PD-L1阻断剂组合。抑制血管生成导致肿瘤细胞死亡，其可以将肿瘤抗原供给宿主抗原呈递途径。
PD-L1阻断性大环肽还可以与将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性大环肽组合使用(参见例如美国专利号5,922,845和5,837,243)。双特异性大环肽可以用于靶向两种单独的抗原。例如，已经使用抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如，Her-2/neu)双特异性大环肽将巨噬细胞靶向肿瘤部位。这种靶向可以更有效地激活肿瘤特异性应答。这些应答的T细胞臂将通过使用PD-L1阻断来增强。可替代地，可以通过使用与肿瘤抗原和树突细胞特异性细胞表面标记物结合的双特异性大环肽将抗原直接递送至DC。
肿瘤通过各种各样的机制逃避宿主免疫监视。许多这些机制可以通过由肿瘤表达并且具免疫抑制性的蛋白质的失活来克服。这些尤其包括TGF-β(Kehrl,J.等人,J.Exp.Med.,163:1037-1050(1986))、IL-10(Howard,M.等人,Immunology Today,13:198-200(1992))和Fas配体(Hahne,M.等人,Science,274:1363-1365(1996))。针对这些实体中的每一种的大环肽可以与抗PD-L1组合使用，以抵消免疫抑制剂的作用并且有利于宿主的肿瘤免疫应答。
可以用于激活宿主免疫应答的其他大环肽可以与抗PD-L1组合使用。这些包括树突细胞表面上的分子，其激活DC功能和抗原呈递。抗CD40大环肽能够有效地替代T细胞辅助活性(Ridge,J.等人,Nature,393:474-478(1998))并且可以与PD-1抗体结合使用(Ito,N.等人,Immunobiology,201(5):527-540(2000))。将大环肽激活为T细胞共刺激分子如CTLA-4(例如，美国专利号5,811,097)、OX-40(Weinberg,A.等人,Immunol.,164:2160-2169(2000))、4-1BB(Melero,I.等人,Nat.Med.,3:682-685(1997))和ICOS(Hutloff,A.等人,Nature,397:262-266(1999))也可以提供升高水平的T细胞激活。
骨髓移植目前用于治疗多种造血来源的肿瘤。虽然移植物抗宿主病是这种治疗的结果，但是可以从移植物抗肿瘤应答获得治疗益处。PD-L1阻断可以用于增加供体移植的肿瘤特异性T细胞的有效性。
还存在几种实验性治疗方案，其包括抗原特异性T细胞的离体激活和扩增，以及将这些细胞过继转移到受体中，以便使抗原特异性T细胞对抗肿瘤(Greenberg,R.等人,Science,285:546-551(1999))。这些方法也可以用于激活T细胞对感染因子(如CMV)的应答。预期在大环肽存在下的离体激活可以增加过继转移的T细胞的频率和活性。
感染性疾病
使用本公开文本的其他方法治疗已经暴露于特定毒素或病原体的患者。因此，本公开文本的另一个方面提供了治疗受试者中感染性疾病的方法，其包括向受试者给予本公开文本的大环肽，从而治疗所述受试者的感染性疾病。
类似于如上文讨论的其对肿瘤的应用，PD-L1阻断可以单独使用，或作为佐剂与疫苗组合使用，以刺激针对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。这种治疗方法可能特别有用的病原体的例子包括目前没有有效疫苗的病原体或常规疫苗不完全有效的病原体。这些疾病包括但不限于HIV、肝炎(甲型、乙型和丙型)、流感、疱疹、贾第鞭毛虫、疟疾(Butler,N.S.等人,Nature Immunology 13,188-195(2012)；Hafalla,J.C.R.等人PLOS Pathogens；February 2,2012))；利什曼原虫、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。PD-L1阻断对于在感染过程中呈现改变的抗原的诸如HIV等药剂的确定感染特别有用。这些新型表位在抗人PD-L1给予时被识别为外源，因此引起强烈的T细胞应答，其不会被PD-L1的负信号抑制。
引起可通过本公开文本的方法治疗的感染的致病病毒的一些例子包括HIV、肝炎病毒(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒(cornovirus)、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒。
引起可通过本公开文本的方法治疗的感染的致病细菌的一些例子包括衣原体(chlamydia)、立克次体细菌(rickettsial bacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和淋球菌(conococci)、克雷伯菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙雷菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、军团菌(legionella)、白喉、沙门氏菌(salmonella)、杆菌(bacilli)、霍乱、破伤风、肉毒杆菌、炭疽、鼠疫、钩端螺旋体病和莱姆病细菌。
引起可通过本公开文本的方法治疗的感染的致病真菌的一些例子包括念珠菌(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉(Aspergillus)(烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、属毛霉目(Genus Mucorales)(毛霉菌属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉属(rhizophus))、申克孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可通过本公开文本的方法治疗的感染的致病寄生虫的一些例子包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴(Naegleriafowleri)、棘阿米巴属物种(Acanthamoeba sp.)、蓝氏贾第虫(Giardialambia)、隐孢子虫属物种(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystiscarinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、微小巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondi)和巴西日圆线虫(Nippostrongylusbrasiliensis)。
在所有上述方法中，PD-L1阻断可以与其他形式的免疫疗法(如细胞因子治疗(例如，干扰素、靶向VEGF活性或VEGF受体的药剂、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或双特异性抗体疗法)组合，这提供了肿瘤抗原的增强的呈递(参见例如Holliger,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)；Poljak,Structure,2:1121-1123(1994))。
自身免疫反应
所述大环肽可以引起和放大自身免疫应答。事实上，使用肿瘤细胞和肽疫苗诱导抗肿瘤应答揭示许多抗肿瘤应答包括抗自身反应性(在上述van Elsas等人中的抗CTLA-4+GM-CSF修饰的B16黑色素瘤中观察到的脱色；Trp-2疫苗接种小鼠中的脱色(Overwijk,W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:2982-2987(1999))；由TRAMP肿瘤细胞疫苗诱发的自身免疫性前列腺炎(Hurwitz,A.,同上(2000)))、黑色素瘤肽抗原疫苗接种和在人临床试验中观察到的白癜风(Rosenberg,S.A.等人,J.Immunother.EmphasisTumor Immunol.,19(1):81-84(1996))。
因此，可以考虑将抗PD-L1阻断与各种自身蛋白结合使用，以便设计疫苗接种方案以有效地产生针对这些自身蛋白的免疫应答用于疾病治疗。例如，阿尔茨海默病涉及Aβ肽以淀粉样沉积物在大脑中的不适当积累；针对淀粉样蛋白的抗体应答能够清除这些淀粉样沉积物(Schenk等人,Nature,400:173-177(1999))。
其他自身蛋白也可以用作靶标，如用于治疗过敏和哮喘的IgE以及用于类风湿性关节炎的TNFα。最后，可以通过使用本文公开的大环诱导针对各种激素的抗体应答。针对生殖激素的中和抗体应答可以用于避孕。针对特定肿瘤生长所需的激素和其他可溶性因子的中和抗体应答也可以被认为是可能的疫苗接种靶标。
如上文针对使用抗PD-L1大环描述的类似方法可以用于诱导治疗性自身免疫应答，以治疗具有其他自身抗原的不适当积累的患者，所述其他自身抗原是如淀粉样沉积物(包括在阿尔茨海默病中的Aβ)、细胞因子(如TNFα)和IgE。
疫苗
所述大环肽可以用于通过共给予抗PD-1大环与目的抗原(例如，疫苗)来刺激抗原特异性免疫应答。因此，在另一个方面，本公开文本提供了增强受试者针对抗原的免疫应答的方法，其包括向所述受试者给予：(i)抗原；和(ii)抗PD-1大环，使得所述受试者针对所述抗原的免疫应答得以增强。所述抗原可以是例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。此类抗原的非限制性例子包括在以上部分中讨论的那些，如上文讨论的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)或来自上述病毒、细菌或其他病原体的抗原。
体内和体外给予本公开文本的组合物(例如大环肽、多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)的合适途径是本领域熟知的，并且可以由普通技术人员选择。例如，所述组合物可以通过注射(例如静脉内或皮下)给予。使用的分子的合适剂量将取决于受试者的年龄和体重以及所述组合物的浓度和/或配制品。
如先前所述，本公开文本的大环肽可以与一种或多种其他治疗剂(例如，细胞毒性剂、放射性毒剂或免疫抑制剂)共给予。所述肽可以与所述药剂连接(作为免疫复合物)，或者可以与所述药剂单独给予。在后一种情况(单独给予)下，所述肽可以在其他药剂之前、之后或与其同时给予，或者可以与其他已知疗法(例如抗癌疗法，例如放射)共给予。此类治疗剂尤其包括抗肿瘤剂，如多柔比星(阿霉素)、顺铂硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、达卡巴嗪(decarbazin)和环磷酰胺羟基脲，它们本身仅在对患者有毒或亚毒的水平下有效。顺铂以100mg/剂每四周一次静脉内给予，并且阿霉素以60-75mg/ml的剂量每21天一次静脉内给予。本公开文本的大环肽与化学治疗剂的共给予提供了两种抗癌剂，它们通过不同的机制起作用，这对人肿瘤细胞产生细胞毒性作用。这种共给予可以解决由于药物抗性的发展或肿瘤细胞的抗原性变化而导致它们与所述肽不反应的问题。
包含本公开文本的组合物(例如大环肽、双特异性或多特异性分子或免疫缀合物)和使用说明书的试剂盒也在本公开文本的范围内。所述试剂盒可以进一步含有至少一种另外的试剂，或一种或多种本公开文本的另外的大环肽(例如，具有互补活性的人抗体，其与PD-L1抗原中的不同于所述大环的表位结合)。试剂盒通常包括指示试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供或者以其他方式伴随试剂盒的任何书写或记录材料。
组合疗法
本公开文本的大环肽与另一种PD-L1拮抗剂和/或其他免疫调节剂的组合可用于增强针对过度增殖性疾病的免疫应答。例如，这些分子可以在体外或离体给予至培养物中的细胞，或者例如在体内给予至人受试者以在各种情况下增强免疫。因此，在一个方面，本公开文本提供了改变受试者中免疫应答的方法，其包括向受试者给予本公开文本的大环肽从而改变受试者中的免疫应答。优选地，所述应答被增强、刺激或上调。在另一个实施方案中，本公开文本提供了改变与用免疫刺激性治疗剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，其包括向受试者给予本公开文本的大环肽和亚治疗剂量的另一种免疫调节剂。
大环肽对PD-L1的阻断可以增强对患者癌细胞的免疫应答。使用本公开文本的大环肽可以抑制其生长的癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症。用本公开文本的组合疗法治疗的癌症的代表性例子包括黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤)、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌。可以使用本公开文本的方法治疗的其他癌症的例子包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱导的那些)以及所述癌症的组合。本公开文本还可用于治疗转移性癌症。
在某些实施方案中，含有至少一种本文讨论的大环肽的治疗剂组合可以作为单一组合物在药学上可接受的载体中同时给予，或者作为单独的组合物同时给予，其中每种药剂可以依次给予。例如，本公开文本的第二免疫调节剂和大环肽可以依次给予，如首先给予第二免疫调节剂且其次给予大环肽，或者首先给予大环肽且其次给予免疫调节剂。此外，如果依次给予多于一个剂量的组合疗法，则在每个给予时间点，依次给予的顺序可以颠倒或保持相同的顺序，依次给予可以与同时给予组合，或其任何组合。例如，第二免疫调节剂和大环肽的第一次给予可以同时进行，第二次给予可以依次进行，其中首先为第二免疫调节剂且其次为大环肽，以及第三次给予可以依次进行，其中首先为大环肽且其次为第二免疫调节剂，等等。另一个代表性的给药方案可以包括依次进行的第一次给予，其中首先为大环肽且其次为第二免疫调节剂，并且随后的给予可以同时进行。
任选地，大环肽和第二免疫调节剂的组合可以进一步与免疫原性药剂组合，所述免疫原性药剂是如癌性细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞(He等人,J.Immunol.,173:4919-4928(2004))。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性例子包括黑色素瘤抗原的肽(如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽)或转染以表达细胞因子GM-CSF(下文进一步所讨论)的肿瘤细胞。
组合的PD-L1大环肽和第二免疫调节剂可以进一步与疫苗接种方案组合。已经设计了许多用于针对肿瘤的疫苗接种的实验策略(参见Rosenberg,S.,Development ofCancer Vaccines,ASCO Educational Book Spring:60-62(2000)；Logothetis,C.,ASCOEducational Book Spring:300-302(2000)；Khayat,D.,ASCO Educational Book Spring:414-428(2000)；Foon,K.,ASCO Educational Book Spring:730-738(2000)；还参见Restifo等人,Cancer Vaccines,第61章,第3023-3043页,在DeVita等人编,Cancer:Principles and Practice of Oncology,第五版(1997)中)。在这些策略之一中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。已经显示，当肿瘤细胞被转导以表达GM-CSF时，这些细胞疫苗是最有效的。已经显示GM-CSF是用于肿瘤疫苗接种的抗原呈递的有效力的激活剂(Dranoff等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:3539-3543(1993))。
对各种肿瘤中的基因表达和大规模基因表达模式的研究已经产生了所谓的肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg,Immunity,10:281-287(1999))。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤和从其产生肿瘤的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可以显示为宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。在某些实施方案中，组合的PD-L1大环肽和第二免疫调节剂可以与肿瘤中表达的重组蛋白和/或肽的集合结合使用，以便产生针对这些蛋白质的免疫应答。这些蛋白质通常被免疫系统视为自身抗原，并且因此免疫系统可容忍它们。肿瘤抗原还可以包括蛋白质端粒酶，其是合成染色体端粒所需的并且在超过85％的人癌症和仅有限数量的体细胞组织中表达(Kim等人,Science,266:2011-2013(1994))。(可以通过各种手段保护这些体细胞组织免受免疫攻击)。肿瘤抗原也可以是因为改变蛋白质序列或产生两个不相关序列之间的融合蛋白(即费城染色体中的bcr-abl)的体细胞突变或者来自B细胞肿瘤的独特型而在癌细胞中表达的“新抗原”。
其他肿瘤疫苗可以包括来自人癌症中所涉及的病毒的蛋白质，所述病毒是如人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可以与PD-L1大环肽阻断结合使用的另一种形式的肿瘤特异性抗原是从肿瘤组织本身分离的纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白质片段，并且这些HSP在递送至抗原呈递细胞时高效引发肿瘤免疫(Suot等人,Science,269:1585-1588(1995)；Tamura等人,Science,278:117-120(1997))。
树突细胞(DC)是有效力的抗原呈递细胞，其可以用于引发抗原特异性应答。DC可以离体产生并加载各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle等人,Nat.Med.,4:328-332(1998))。DC还可以通过遗传手段转导以也表达这些肿瘤抗原。出于免疫目的，DC还已经直接与肿瘤细胞融合(Kugler等人,Nat.Med.,6:332-336(2000))。作为一种疫苗接种方法，DC免疫可以有效地进一步与组合的抗PD-L1大环肽和第二免疫调节剂组合以激活更有效力的抗肿瘤应答。
组合的抗PD-L1大环肽和另外的免疫调节剂也可以进一步与标准的癌症治疗组合。例如，大环肽和第二免疫调节剂的组合可以与化学治疗方案有效组合。在这些情况下，如用大环肽和第二免疫调节剂的组合所观察到的，有可能减少与本公开文本的组合一起给予的其他化学治疗剂的剂量(Mokyr等人,Cancer Res.,58:5301-5304(1998))。这种组合的例子是进一步与用于治疗黑色素瘤的达卡巴嗪组合的大环肽和第二免疫调节剂的组合。另一个例子是进一步与用于治疗黑色素瘤的白细胞介素-2(IL-2)组合的大环肽和第二免疫调节剂的组合。组合使用PD-L1大环肽和另一种免疫调节剂与化学疗法背后的科学原理是，作为大多数化学治疗化合物的细胞毒作用的结果的细胞死亡应导致抗原呈递途径中肿瘤抗原水平的升高。可能通过细胞死亡导致与组合的抗PD-L1大环肽和另外的免疫调节剂协同作用的其他组合疗法包括放射、手术或激素剥夺。这些方案中的每一种都在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂也可以与组合的PD-L1和第二免疫调节剂组合。抑制血管生成导致肿瘤细胞死亡，这也可能是待送入宿主抗原呈递途径的肿瘤抗原的来源。
PD-L1和另一种免疫调节剂的组合还可以与将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性大环肽组合使用(参见例如美国专利号5,922,845和5,837,243)。双特异性大环肽可以用于靶向两种单独的抗原。例如，已经使用抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如，Her-2/neu)双特异性大环肽将巨噬细胞靶向肿瘤部位。这种靶向可以更有效地激活肿瘤特异性应答。这些应答的T细胞臂将通过使用组合的PD-L1和第二免疫调节剂来增强。可替代地，可以通过使用与肿瘤抗原和树突细胞特异性细胞表面标记物结合的双特异性大环肽将抗原直接递送至DC。
在另一个例子中，大环肽和第二免疫调节剂的组合可以与抗肿瘤大环药剂结合使用，所述抗肿瘤大环药剂是如(利妥昔单抗)、/>(曲妥珠单抗)、/>(托西莫单抗)、/>(替伊莫单抗)、/>(阿伦单抗)、Lymphocide(依帕珠单抗)、/>(贝伐单抗)和/>(埃罗替尼)等。以举例的方式并且不希望受理论的束缚，用抗癌抗体或与毒素缀合的抗癌抗体进行治疗可以导致癌细胞(例如，肿瘤细胞)死亡，这将增强由第二免疫调节剂靶标或PD-L1介导的免疫应答。在示例性实施方案中，过度增殖性疾病(例如癌症肿瘤)的治疗可以包括抗癌抗体与大环肽和第二免疫调节剂的组合同时或依次给予或其任何组合，这可以增强宿主的抗肿瘤免疫应答。
肿瘤通过各种各样的机制逃避宿主免疫监视。许多这些机制可以通过由肿瘤表达并且具免疫抑制性的蛋白质的失活来克服。这些尤其包括TGF-β(Kehrl,J.等人,J.Exp.Med.,163:1037-1050(1986))、IL-10(Howard,M.等人,Immunology Today,13:198-200(1992))和Fas配体(Hahne,M.等人,Science,274:1363-1365(1996))。在另一个例子中，针对这些实体中的每一种的抗体可以进一步与大环肽和另一种免疫调节剂组合，以抵消免疫抑制剂的作用，并有利于宿主的抗肿瘤免疫应答。
可以用于激活宿主免疫应答的其他药剂可以进一步与本公开文本的大环肽组合使用。这些包括树突细胞表面上的分子，其激活DC功能和抗原呈递。抗CD40大环肽能够有效地替代T细胞辅助活性(Ridge,J.等人,Nature,393:474-478(1998))并且可以与本公开文本的大环肽(单独或与抗CTLA-4组合组合)结合使用(Ito,N.等人,Immunobiology,201(5):527-540(2000))。将大环肽激活为T细胞共刺激分子如OX-40(Weinberg,A.等人,Immunol.,164:2160-2169(2000))、4-1BB(Melero,I.等人,Nat.Med.,3:682-685(1997))和ICOS(Hutloff,A.等人,Nature,397:262-266(1999))也可以提供增加水平的T细胞激活。
骨髓移植目前用于治疗多种造血来源的肿瘤。虽然移植物抗宿主病是这种治疗的结果，但是可以从移植物抗肿瘤应答获得治疗益处。本公开文本的大环肽(单独或与另一种免疫调节剂组合)可以用于增加供体植入的肿瘤特异性T细胞的有效性。
还存在几种实验性治疗方案，其包括抗原特异性T细胞的离体激活和扩增，以及将这些细胞过继转移到受体中，以便使抗原特异性T细胞对抗肿瘤(Greenberg,R.等人,Science,285:546-551(1999))。这些方法也可以用于激活T细胞对感染因子(如CMV)的应答。预期在存在本公开文本的大环肽(单独或与另一种免疫调节剂组合)的情况下的离体激活可以增加过继转移的T细胞的频率和活性。
在某些实施方案中，本公开文本提供了用于改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，其包括向受试者给予本公开文本的大环肽与亚治疗剂量的另一种免疫调节剂的组合。例如，本公开文本的方法提供了通过向患者给予不可吸收的类固醇来降低免疫刺激性治疗抗体诱导的结肠炎或腹泻的发生率的方法。因为将接受免疫刺激治疗抗体的任何患者都有发展为由这种治疗诱导的结肠炎或腹泻的风险，所以这整个患者群体都适合于根据本公开文本的方法的疗法。虽然已经给予类固醇以治疗炎性肠病(IBD)和预防IBD恶化，但它们尚未被用于预防(降低)未被诊断为患有IBD的患者的IBD(IBD发病率)。与类固醇，甚至是不可吸收的类固醇相关的显著副作用阻碍了预防性使用。
在进一步的实施方案中，本公开文本的大环肽(单独或与另一种免疫调节剂组合)可以进一步与任何不可吸收的类固醇的使用组合。如本文所用，“不可吸收的类固醇”是一种糖皮质激素，其展现出广泛的首过代谢，使得在肝脏中代谢后，所述类固醇的生物利用度低，即小于约20％。在本公开文本的一个实施方案中，不可吸收的类固醇是布地奈德。布地奈德是一种局部作用的糖皮质激素，其在口服给予后主要由肝脏广泛代谢。EC(Astra-Zeneca)是开发用于优化药物向回肠和整个结肠的递送的布地奈德的pH和时间依赖性口服配制品。/>EC在美国被批准用于治疗涉及回肠和/或升结肠的轻度至中度克罗恩病。/>EC治疗克罗恩病的通常口服剂量是6至9mg/天。EC在被吸收并保留在肠粘膜中之前在肠内释放。一旦通过肠粘膜靶组织，EC被肝脏中的细胞色素P450系统广泛代谢为糖皮质激素活性可忽略不计的代谢物。因此，生物利用度低(约10％)。与首过代谢范围较小的其他糖皮质激素相比，布地奈德的低生物利用度导致治疗比率提高。与全身作用的皮质类固醇相比，布地奈德导致较少的副作用，包括较少的下丘脑-垂体抑制。然而，慢性给予/>EC可能导致全身糖皮质激素效应，如皮质醇增多症和肾上腺抑制。参见Physicians'Desk ReferenceSupplement,第58版,608-610(2004)。
在仍进一步的实施方案中，PD-L1和另一种免疫调节剂的组合与不可吸收的类固醇结合可以进一步与水杨酸盐组合。水杨酸盐包括5-ASA药剂，例如像：柳氮磺吡啶(Pharmacia&Upjohn)；奥沙拉嗪(/>Pharmacia&UpJohn)；巴柳氮(/>Salix Pharmaceuticals公司)；和美沙拉嗪(/>Procter&Gamble Pharmaceuticals；/>Shire US；/>Axcan Scandipharm公司；/>Solvay)。
剂量和配制品
合适的式I的肽，或更具体地说是本文所述的大环肽，可以作为单独的化合物和/或与呈药物配制品形式的可接受载体混合的化合物向患者给予以治疗糖尿病和其他相关疾病。糖尿病治疗领域的技术人员可以容易地确定所述化合物对于需要这种治疗的哺乳动物(包括人)的给予剂量和途径。给予途径可以包括但不限于口服、口内、直肠、透皮、口腔、鼻内、肺、皮下、肌内、皮内、舌下、结肠内、眼内、静脉内或肠道给予。所述化合物是根据基于可接受的药学实践的给予途径配制的(Fingl等人,in The Pharmacological Basis ofTherapeutics,第1章,第1页(1975)；Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1990))。
本文所述的药学上可接受的肽组合物可以如下多种剂型给予，如片剂、胶囊(其每一种包括持续释放或定时释放配制品)、丸剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、原位凝胶、微球、结晶复合物、脂质体、微乳剂、酊剂、混悬剂、糖浆、气溶胶喷雾剂和乳剂。还可以将本文所述的组合物以口服、静脉内(推注或输注)、腹膜内、皮下、经皮或肌内形式给予，所有这些都使用药学领域普通技术人员熟知的剂型。可以单独给予所述组合物，但通常将与基于选择的给予途径和标准制药实践所选择的药物载体一起给予。
当然，本文所述的组合物的给予方案将根据已知因素(如特定药剂的药效学特征及其给予方式和途径；接受者的物种、年龄、性别、健康、医疗状况和体重；症状的性质和程度；同时治疗的种类；治疗频率；给予途径、患者的肾和肝功能和所希望的效果)而变化。医师或兽医可以确定和规定预防、抵抗或阻止疾病状态进展所需的药物的有效量。
作为一般指导，活性成分的每日口服剂量，当用于指示的效果时，将在约0.001与1000mg/kg体重之间、优选地在每天约0.01与100mg/kg体重之间、并且最优选地在约0.6与20mg/kg/天之间的范围内。通过静脉注射，在恒速输注期间，用于所示效果的活性成分的每日剂量将在0.001ng与100.0ng/min/Kg体重之间的范围内。这种恒速静脉输注可以优选地以0.01ng至50ng/min/Kg体重，并且最优选0.01ng至10.0mg/min/Kg体重的速率给予。可以将本文所述的组合物以单次日剂量给予，或者可以将每日总剂量以每日两次、三次或四次的分剂量给予。还可以将本文所述的组合物通过贮库配制品给予，所述贮库配制品将允许根据需要在数天/数周/数月的时间内持续释放药物。
可以通过局部使用合适的鼻内媒介物以鼻内形式或使用透皮贴剂通过透皮途径来给予本文所述的组合物。当以透皮递送系统的形式给予时，剂量给予在整个剂量方案中当然是连续的而不是间歇的。
通常将所述组合物与针对预期给予形式适当选择的并且与常规制药实践一致的合适药物稀释剂、赋形剂或载体(在本文统称为药物载体)混合给予，预期给予形式是口服片剂、胶囊、酏剂、使用或不使用推进剂产生的气溶胶喷雾剂、以及糖浆。
例如，对于片剂或胶囊形式的口服给予，可以将活性药物组分与口服无毒药学上可接受的惰性载体(如但不限于乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸氢钙、硫酸钙、甘露醇和山梨醇组合；对于液体形式的口服给予，可以将口服药物组分与任何口服无毒药学上可接受的惰性载体(如但不限于乙醇、甘油和水)组合。此外，当需要或必要时，也可将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入混合物中。合适的粘合剂包括但不限于淀粉、明胶、天然糖(如但不限于葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味剂、天然和合成树胶(如阿拉伯树胶、黄芪胶)或海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇和蜡。这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土和黄原胶。
本文所述的组合物还可以混合的胶束或脂质体递送系统(如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡)的形式给予。脂质体可以由各种磷脂(如胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱)形成。可以添加渗透促进剂来增强药物吸收。
因为已知前药增强药物的许多希望品质(即，溶解度、生物利用度、制造等)，所以本文所述化合物可以以前药形式递送。因此，本文所述的主题旨在涵盖本发明要求保护的化合物的前药、递送所述前药的方法、以及含有所述前药的组合物。
本文所述的组合物还可以与作为可靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。此类聚合物可以包括聚乙烯-吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或被棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷-聚赖氨酸。此外，本文所述的组合物可以与可用于实现药物控制释放的一类可生物降解聚合物组合，这些可生物降解聚合物例如是聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯、以及交联或两亲性水凝胶嵌段共聚物。
适用于给予的剂型(药物组合物)的每剂量单位可以含有约0.01毫克至约500毫克的活性成分。在这些药物组合物中，活性成分通常按重量计以基于组合物总重量的约0.5％-95％的量存在。
明胶胶囊可以含有活性成分和粉末状载体，如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁和硬脂酸。类似的稀释物可用于制备压缩片剂。片剂和胶囊两者均可制成持续释放产品，以在数小时的时间内提供药物的连续释放。压缩片剂可以是糖衣或薄膜包衣的以掩盖任何令人不愉快的味道并保护片剂免受空气影响，或肠溶包衣的以在胃肠道中选择性地崩解。
用于口服给予的液体剂型可含有着色剂和调味剂以增加患者的接受度。
通常，水、合适的油、盐水、水性右旋糖(葡萄糖)和相关的糖溶液和二醇(如丙二醇或聚乙二醇)是肠胃外溶液的合适载体。用于肠胃外给予的溶液优选地含有活性成分的水溶性盐、合适的稳定剂以及缓冲物质(如果需要的话)。单独或组合的抗氧化剂如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸是合适的稳定剂。还使用了柠檬酸及其盐以及EDTA。此外，肠胃外溶液可含有防腐剂，如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、以及氯丁醇。
合适的药物载体描述于Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第十九版,Mack Publishing Company(1995)中，该文献是此领域中的标准参考。
用于给予本文所述化合物的代表性有用的药物剂型可以说明如下：
胶囊
可以通过填充标准的两片式硬明胶胶囊来制备大量的单元胶囊，所述胶囊具有100毫克粉末状活性成分、150毫克乳糖、50毫克纤维素和6毫克硬脂酸镁。
软明胶胶囊
可以制备活性成分于可消化油(如大豆油、棉籽油或橄榄油)中的混合物，并通过正排量泵将所述混合物注入明胶中以形成包含100毫克活性成分的软明胶胶囊。应洗涤和干燥胶囊。
片剂
片剂可以通过常规程序来制备，使得剂量单元例如为100毫克活性成分、0.2毫克胶体二氧化硅、5毫克硬脂酸镁、275毫克微晶纤维素、11毫克淀粉和98.8毫克乳糖。可以施加适当的包衣以增加适口性或延迟吸收。
可注射剂
本文所述肽组合物的可注射配制品可能需要或可能不需要使用赋形剂，如已经由监管机构批准的赋形剂。这些赋形剂包括但不限于溶剂和助溶剂、增溶剂、乳化剂或增稠剂、螯合剂、抗氧化剂和还原剂、抗微生物防腐剂、缓冲液和pH调节剂、填充剂、保护剂和张力调节剂、以及特殊添加剂。注射配制品必须无菌、无热原，并且在溶液的情况下，不含颗粒物质。
适用于通过注射给予的肠胃外组合物可以通过在药学上可接受的缓冲液中搅拌例如按重量计1.5％的活性成分来制备，所述缓冲液可以含有或不含有助溶剂或其他赋形剂。应使得溶液与氯化钠等渗并灭菌。
悬浮液
可以制备水性悬浮液以用于口服和/或肠胃外给予，使得例如每个5mL含有100mg细分的活性成分、20mg羧甲基纤维素钠、5mg苯甲酸钠、1.0g山梨醇溶液(U.S.P.)和0.025mL香草醛或其他可口的调味剂。
可生物降解微粒
适用于通过注射给予的持续释放肠胃外组合物可以例如通过以下方法来制备：将合适的可生物降解聚合物溶解在溶剂中，向聚合物溶液中添加待掺入的活性剂，并从基质去除溶剂，从而形成聚合物的基质，其中活性剂分布在整个基质中。
本申请中(特别包括下文的说明性实施例中)使用的缩写是本领域技术人员熟知的。使用的一些缩写如下：DCM代表二氯甲烷；TFA代表三氟乙酸；RT代表室温或保留时间(根据上下文指示)；h或hr或hrs代表小时；EDC代表1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；DMAP代表4-(N,N-二甲基氨基)吡啶；MeOH代表甲醇；EtOAc代表乙酸乙酯；DMF代表N,N-二甲基甲酰胺；Et代表乙基；DBU代表1,8-二氮杂双环[5.40]十一碳-7-烯；DMSO代表二甲基亚砜；以及THF代表四氢呋喃。
肽合成
本公开文本的大环肽的化学合成可以使用多种本领域公认的方法进行，所述方法包括逐步固相合成、通过肽片段的构象辅助再连接进行的半合成、克隆或合成肽段的酶连接以及化学连接。合成本文所述的大环肽及其类似物的优选方法是使用各种固相技术(如描述于Chan,W.C.等人,编,Fmoc Solid Phase Synthesis,Oxford University Press,Oxford(2000)；Barany,G.等人,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,第2卷:“Special Methods in Peptide Synthesis,Part A”,第3-284页,Gross,E.等人,编,Academic Press,New York(1980)；Stewart,J.M.等人,Solid-Phase Peptide Synthesis,第2版,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984)中的那些)的化学合成。优选的策略是基于α-氨基临时保护的Fmoc(9-芴基甲基甲基氧基羰基)基团与氨基酸侧链临时保护的叔丁基组合(参见例如Atherton,E.等人,“The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino ProtectingGroup”,in The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,第9卷:“Special Methods inPeptide Synthesis,Part C”,第1-38页,Undenfriend,S.等人,编,Academic Press,SanDiego(1987))。
所述肽可以从肽的C-末端开始，在不溶性聚合物支持物(也称为“树脂”)上以逐步方式合成。通过形成酰胺或酯键，将肽的C-末端氨基酸附加到树脂，开始合成。这使得所得肽最终分别作为C-末端酰胺或羧酸释放。
合成中使用的C-末端氨基酸和所有其他氨基酸需要使它们的α-氨基和侧链官能团(如果存在的话)被差异地保护，使得α-氨基保护基团可以在合成过程中选择性地去除。氨基酸的偶联是通过激活羧基为活性酯，并使其与附加到树脂的N-末端氨基酸的未封闭α-氨基反应来进行的。重复α-氨基去保护和偶联的序列，直到整个肽序列被组装。然后肽从树脂中释放出来，伴随着侧链官能团的去保护，这通常在存在适当的清除剂的情况下进行，以限制副反应。所得肽最终通过反相HPLC来纯化。
作为最终肽的前体所需的肽基树脂的合成利用了商业上可获得的交联聚苯乙烯聚合物树脂(Novabiochem,圣地亚哥，加利福尼亚州；Applied Biosystems,福斯特市，加利福尼亚州)。针对C-末端甲酰胺，优选的固体支持物是：4-(2′,4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧乙酰基-对-甲基二苯甲基胺树脂(Rink酰胺MBHA树脂)；9-Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基-Merrifield树脂(Sieber酰胺树脂)；4-(9-Fmoc)氨基甲基-3,5-二甲氧基苯氧基)戊酰基-氨基甲基-Merrifield树脂(PAL树脂)。第一个和随后的氨基酸的偶联可以分别使用由DIC/HOBt、HBTU/HOBt、BOP、PyBOP或由DIC/6-Cl-HOBt、HCTU、DIC/HOAt或HATU生产的HOBt、6-Cl-HOBt或HOAt活性酯来完成。针对保护的肽片段，优选的固体支持物是：2-氯三苯甲基氯树脂和9-Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基-Merrifield树脂(Sieber酰胺树脂)。通过使Fmoc保护的氨基酸与树脂在二氯甲烷和DIEA中反应，最佳地实现将第一个氨基酸加载到2-氯三苯甲基氯树脂上。如有必要，可以添加少量DMF以促进氨基酸的溶解。
本文所述肽类似物的合成可以通过使用单通道或多通道肽合成器(如CEMLiberty Microwave合成器，或Protein Technologies公司Prelude(6通道)或Symphony(12通道)合成器)来进行。
用于它们各自肽的肽基树脂前体可以使用任何标准程序进行切割和去保护(参见例如King,D.S.等人,Int.J.Peptide Protein Res.,36:255-266(1990))。希望的方法是在存在水和TIS的情况下使用TFA作为清除剂。通常，将肽基树脂在TFA/水/TIS(94:3:3，v:v:v；1mL/100mg肽基树脂)中在室温下搅拌2-6小时。然后将用过的树脂过滤掉，并将TFA溶液在减压下浓缩或干燥。所得粗肽或者沉淀并用Et2O洗涤，或者直接再溶解到DMSO或50％乙酸水溶液中，以用于通过制备型HPLC纯化。
分析数据：
质谱：“ESI-MS(+)”表示在正离子模式下执行的电喷雾电离质谱；“ESI-MS(-)”表示在负离子模式下执行的电喷雾电离质谱；“ESI-HRMS(+)”表示在正离子模式下执行的高分辨率电喷雾电离质谱；“ESI-HRMS(-)”表示在负离子模式下执行的高分辨率电喷雾电离质谱。检测到的质量按照“m/z”单位名称报告。精确质量大于1000的化合物通常被检测为双电荷或三电荷离子。
通用程序：
Symphony X方法A：
所有操作都是在Symphony X肽合成器(Protein Technologies)上自动化进行的。所有程序都在装有底部玻璃料的10mL聚丙烯管中进行。管通过管的底部和顶部二者连接到Symphony X肽合成器。DMF和DCM可以通过管的顶部添加，DMF和DCM均匀地向下冲洗管的侧面。剩余的试剂通过管的底部添加，并通过玻璃料向上接触树脂。所有溶液都通过管的底部取出。“周期性搅动”描述了N2气体穿过底部玻璃料的短暂脉冲；所述脉冲持续大约5秒，并且每30秒发生一次。在制备后24h内使用氯乙酰氯在DMF中的溶液。氨基酸溶液通常在制备后三周内不使用。HATU溶液在制备后5天内使用。DMF＝二甲基甲酰胺；HATU＝1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐；DIPEA＝二异丙基乙胺；Rink＝(2,4-二甲氧基苯基)(4-烷氧基苯基)甲胺，其中“4-烷氧基”描述了与聚苯乙烯树脂连接的位置和类型。使用的树脂是Merrifield聚合物(聚苯乙烯)，带有Rink接头(在氮气下Fmoc保护)；100-200目，1％DVB，0.56mmol/g载量。以下列出了常用的氨基酸，其中括号内指示了侧链保护基团。Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。
“Symphony X方法A”的程序描述了在0.100mmol规模上进行的实验，其中所述规模由结合到树脂的Rink接头的量决定。此规模对应于大约178mg上述Rink-Merrifield树脂。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所有程序的规模放大超过0.100mmol规模。在氨基酸偶联之前，所有肽合成序列都从树脂溶胀程序，下文称为“树脂溶胀程序”开始。氨基酸与伯胺N-末端的偶联使用以下描述的“单偶联程序”。氨基酸与仲胺N-末端的偶联使用以下描述的“双偶联程序”。氯乙酰氯与肽的N-末端的偶联通过以下详述的“氯乙酰氯偶联程序”进行描述。
树脂溶胀程序A：
向10mL聚丙烯固相反应容器中添加Merrifield:Rink树脂(178mg，0.100mmol)。如下将树脂洗涤(溶胀)三次：向反应容器中添加DMF(2.0mL)，在溶剂通过玻璃料排出之前，将混合物周期性地搅动10分钟。
单偶联程序A：
向含有来自前一步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性地搅动3分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性地搅动3分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(2.0mL)，并将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(在DMF中0.2M，1.0mL，2当量)，然后添加HATU(在DMF中0.2M，1.0mL，2当量)，并且最后添加DIPEA(在DMF中0.4M，1.0mL，4当量)。将混合物周期性地搅动15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤四次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(2.0mL)，并将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐(2.0mL)。将混合物周期性地搅动10分钟，然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤四次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(2.0mL)，并将所得混合物周期性地搅动90秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
双偶联程序A：
向含有来自前一步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性地搅动3分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性地搅动3分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(2.0mL)，并将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(在DMF中0.2M，1.0mL，2当量)，然后添加HATU(在DMF中0.2M，1.0mL，2当量)，并且最后添加DIPEA(在DMF中0.4M，1.0mL，4当量)。将混合物周期性地搅动15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂洗涤两次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(2.0mL)，并将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(在DMF中0.2M，1.0mL，2当量)，然后添加HATU(在DMF中0.2M，1.0mL，2当量)，并且最后添加DIPEA(在DMF中0.4M，1.0mL，4当量)。将混合物周期性地搅动15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂洗涤两次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(2.0mL)，并将所得混合物周期性地搅动90秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐(2.0mL)。将混合物周期性地搅动10分钟，然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤四次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(2.0mL)，并将所得混合物周期性地搅动90秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
Symphony氨基酸N-末端停止程序：
向10mL聚丙烯固相反应容器中添加Merrifield:Rink树脂(178mg，0.100mmol)。如下将树脂洗涤(溶胀)三次：向反应容器中添加DMF(2.0mL)，在溶剂通过玻璃料排出之前，将混合物周期性地搅动10分钟。
向含有来自前一步骤的Rink树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性地搅动3分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性地搅动3分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(2.0mL)，并将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氨基酸(在DMF中0.2M，1.0mL，2当量)，然后添加HATU(在DMF中0.2M，1.0mL，2当量)，并且最后添加DIPEA(在DMF中0.4M，1.0mL，4当量)。将混合物周期性地搅动15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤四次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(2.0mL)，并将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中添加乙酸酐(2.0mL)。将混合物周期性地搅动10分钟，然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤四次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(2.0mL)，并将所得混合物周期性地搅动90秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性地搅动3分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性地搅动3分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(2.0mL)，并将所得混合物周期性地搅动90秒，然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤三次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DCM(2.0mL)，并将所得混合物周期性地搅动90秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂在氮气流下放置15分钟。
氯乙酸偶联程序A：
向含有来自前一步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性地搅动3分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中添加哌啶:DMF(20:80v/v，2.0mL)。将混合物周期性地搅动3分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(2.0mL)，并将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中添加氯乙酸(在DMF中0.2M，1.0mL)，然后添加HATU(在DMF中0.2M，1.0mL，2当量)，并且最后添加DIPEA(在DMF中0.4M，1.0mL，4当量)。将混合物周期性地搅动15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤三次：对于每次洗涤，向容器顶部添加DMF(2.0mL)，并将所得混合物周期性地搅动90秒，然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤四次：对于每次洗涤，向容器顶部添加CH2Cl2(2.0mL)，并将所得混合物周期性地搅动90秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂在N2流下放置15分钟。
全局去保护方法A：
除非另有说明，否则所有操作都是手动进行的。“全局去保护方法A”的程序描述了在0.100mmol规模上进行的实验，其中所述规模由结合到树脂的Rink接头的量决定。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所述程序的规模放大超过0.100mmol规模。通过在40mL玻璃小瓶中混合三氟乙酸(22mL)、苯酚(1.325g)、水(1.25mL)和三异丙基硅烷(0.5mL)来制备“去保护溶液”。从反应容器中取出树脂，并转移到4mL玻璃小瓶中。向小瓶中添加“去保护溶液”(2.0mL)。将混合物在振荡器中剧烈混合(1000RPM持续1分钟，然后500RPM持续90分钟)。将混合物通过装有底部玻璃料的10mL聚丙烯管过滤，允许滴加到含有15mL乙醚的24mL试管中，从而产生白色沉淀。将管中的固体(树脂)用“去保护溶液”(1.0mL)萃取一次，允许滴加到乙醚中。将混合物离心7分钟，然后将溶液从固体中倒出并丢弃。将固体悬浮在Et2O(20mL)中，然后将混合物离心5分钟；并且将溶液从固体中倒出并丢弃。最后一次，将固体悬浮在Et2O(20mL)中；将混合物离心5分钟；并且将溶液从固体中倒出并丢弃，以得到呈白色至灰白色固体的粗肽。
环化方法A：
除非另有说明，否则所有操作都是手动进行的。“环化方法A”的程序描述了在0.100mmol规模上进行的实验，其中所述规模由结合到用于产生所述肽的树脂的Rink接头的量决定。此规模不是基于对所述程序中使用的肽量的直接测定。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所述程序的规模放大超过0.100mmol规模。将粗肽固体溶解在甲醇(10mL)中，并且然后使用N,N-二异丙胺小心地将溶液调节至pH＝9.0-11。然后将溶液搅拌18-24h。浓缩反应溶液并且然后将残余物溶解于MeOH中。对此溶液进行反相HPLC纯化，以得到所需的环肽。
分析LCMS条件A：
柱：BEH C18，2.1x 50mm，1.7-μm颗粒；流动相A：含0.05％TFA的水；流动相B：含0.05％TFA的乙腈；温度：50℃；梯度：经2分钟2％B至98％B，然后在98％B下保持0.5分钟；流速：0.8mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析LCMS条件B：
柱：BEH C18，2.1x 50mm，1.7-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.05％TFA的水；流动相B：95:5乙腈:含0.05％TFA的水；温度：50℃；梯度：经3分钟0％-100％B，然后在100％B下保持0.75分钟；流速：1.11mL/min。
分析条件C：
柱：X-Bridge C18，2.0x 50mm，3.5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；温度：40℃；梯度：0％B，经8分钟0％-100％B，然后在100％B下保持1.0分钟；流速：0.8mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析条件D：
柱：X-Bridge C18，2.0x 50mm，3.5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；温度：40℃；梯度：0％B，经4分钟0％-100％B，然后在100％B下保持1.0分钟；流速：0.8mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析条件E：
柱：Waters XBridge C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；温度：70℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持2min；流速：0.75mL/min；检测：MS和UV(220nm)。
分析条件F：
柱：Waters CSH C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；温度：70℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持2min；流速：0.75mL/min；检测：MS和UV(220nm)。
改性氯三苯甲基树脂1
改性氯三苯甲基树脂2
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(甲磺酰胺基)-2-氧乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸的制备
步骤1：
向(S)-苄基2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸酯(1.2g，2.2mmol)溶解在DCM(10mL)中的溶液中添加TFA(10mL)。将反应在RT下搅拌1小时。将反应挥发物蒸发并在高真空下放置过夜，以得到产物(S)-2-(3-(3-(苄氧基)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-氧丙基)-1H-吲哚-1-基)乙酸(1.0g，2.1mmol，93％产率)。分析条件A：保留时间＝1.25min；ESI-MS(+)m/z 509.2(M+Na)。
步骤2：
向(S)-2-(3-(3-(苄氧基)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-氧丙基)-1H-吲哚-1-基)乙酸(1.01g，2.076mmol)溶解在干DCM(20mL)的溶液中添加甲磺酰胺(0.197g，2.076mmol)、EDC(0.438g，2.284mmol)和DMAP(0.279g，2.284mmol)。将反应在RT下搅拌4天。将溶液用HCl水溶液(1M)洗涤，然后用盐水洗涤；收集；经MgSO4干燥，过滤并在减压下蒸发，以得到粗材料(S)-苄基2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(甲磺酰胺基)-2-氧乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸酯(900mg，1.6mmol，77％产率)。分析条件A：保留时间＝1.79min；ESI-MS(+)m/z 586.1(M+Na)。
步骤3：
将H2鼓泡通过(S)-苄基2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(甲磺酰胺基)-2-氧乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸酯(896mg，1.590mmol)和Pd-C(169mg，0.159mmol)在MeOH(20mL)中的溶液5分钟。然后将反应在H2的正压下放置2小时。将反应用N2鼓泡，并且然后通过尼龙玻璃料过滤器过滤。在减压下蒸发挥发物，以得到呈粘稠油状物的产物(S)-2-氨基-3-(1-(2-(甲磺酰胺基)-2-氧乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(424mg，1.25mmol，79％产率)。分析条件A：保留时间＝0.87min；ESI-MS(+)m/z 340(M+H)。
步骤4：
向(S)-2-氨基-3-(1-(2-(甲磺酰胺基)-2-氧乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(424mg，1.249mmol)和碳酸氢钠(525mg，6.25mmol)在丙酮(8.00mL)和水(8mL)中的溶液中添加(9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧吡咯烷-1-基)碳酸酯(421mg，1.249mmol)。将反应搅拌18小时。在剧烈搅拌下，用HCl水溶液(1M)将反应缓慢酸化至pH 5。将水层用25ml EtOAc分离。将有机层用水，然后用盐水洗涤。将有机层收集，经MgSO4干燥，并且在减压下蒸发挥发物。将粗材料经由反相色谱(流动相A：5％乙腈，95％水，10mM乙酸铵。流动相B：95％乙腈，5％水，10mM乙酸铵。经20个柱体积10％B-50％B)纯化，以得到呈灰白色固体的产物(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(甲磺酰胺基)-2-氧乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(330mg，0.59mmol，47％产率)。分析条件B：保留时间＝1.14min；ESI-MS(+)m/z 561.9(M+H)。
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吲唑-3-基)丙酸的制备
方案：
步骤1：
向1H-吲唑-3-甲醛(3g，20.53mmol)和碳酸铯(7.36g，22.58mmol)在DMF(82ml)中的0℃溶液中添加2-溴乙酸叔丁酯(3.29ml，22.58mmol)，并通过从冰浴中取出而升温至RT。将反应搅拌2h。将反应倒在水(500mL)上并添加Et2O(200mL)。将产物萃取在Et2O层中。分离各层并用Et2O(100mL)第二次萃取水相。将合并的Et2O层用水，然后用盐水洗涤2次。将有机层收集，经硫酸钠干燥并在真空下浓缩。使用0％-30％EtOAc/己烷的梯度，通过快速硅胶色谱法纯化粗材料。收集产物级分，并在真空下去除溶剂，以得到2-(3-甲酰基-1H-吲唑-1-基)乙酸叔丁酯，5.23(98％)。ESI-MS(+)m/z 205.1(M+1-tBu)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ10.28(s,1H),8.35(d,J＝8.1Hz,1H),7.56-7.49(m,1H),7.45-7.36(m,2H),5.18(s,2H),1.48(s,9H)。
步骤2：
将(±)-甲基2-苄氧羰基氨基-2-(二甲氧基膦基)乙酸酯(7.32g，22.10mmol)溶解在CH2Cl2(50mL)中，并在氮气下搅拌。向此溶液中添加DBU(3.33mL，22.10mmol)，并将混合物搅拌10min，然后在15-20min内滴加2-(3-甲酰基-1H-吲唑-1-基)乙酸叔丁酯(5.23g，20.09mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液。在室温下，使搅拌继续16h。将反应混合物在真空下浓缩。将残余物用EtOAc稀释并用5％柠檬酸水溶液，然后用盐水洗涤，接着经无水Na2SO4干燥，过滤并蒸发。使用0％-50％EtOAc/己烷的梯度，通过快速硅胶色谱法纯化粗材料。收集产物级分，并在真空下去除溶剂，以得到(E)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吲唑-3-基)丙烯酸甲酯，7.4g(79％)。ESI-MS(+)m/z 466.0(M+1)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ9.21(s,1H),7.82(d,J＝8.3Hz,1H),7.52-7.23(m,8H),6.90(s,1H),5.23(s,2H),5.08(s,2H),3.86(s,3H),1.44(s,9H)
步骤3：
将(Z)-甲基2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吲唑-3-基)丙烯酸酯(7.4g，15.90mmol)溶解在parr瓶中的MeOH(80mL)和苯(80mL)中。将N2气体鼓泡通过所述溶液15min，然后添加(+)-1,2-双((2S,5S)-2,5-二乙基磷杂环戊烷基)苯(环辛二烯)铑(I)三氟甲磺酸酯(0.115g，0.159mmol)，并置于氢气气氛(60psi)下3天。将反应通过硅藻土过滤，并在真空下浓缩。使用0％-50％EtOAc/己烷的梯度，通过快速硅胶色谱法纯化粗材料。收集产物级分，并在真空下去除溶剂，以得到(S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吲唑-3-基)丙酸甲酯，7.43g，(100％)。ESI-MS(+)m/z 468.0(M+1)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.64(d,J＝8.1Hz,1H),7.44-7.26(m,7H),7.15(t,J＝7.5Hz,1H),5.87(d,J＝7.8Hz,1H),5.13(s,2H),4.99(s,2H),4.90-4.80(m,1H),3.66(s,3H),3.63-3.55(m,1H),3.46(dd,J＝14.8,4.8Hz,1H),1.42(s,9H)。
步骤4：
将氢氧化锂(1.142g，47.7mmol)在水(39.7ml)中的溶液添加到(S)-甲基2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吲唑-3-基)丙酸酯(7.43g，15.89mmol)在THF(39.7ml)中的溶液中。将反应在RT下搅拌30min。向反应中添加EtOAc，并用1N HCl使pH呈酸性。将有机相收集，经硫酸钠干燥并在真空下浓缩。使用0％-10％MeOH/DCM w/0.1％AcOH，通过快速色谱纯化粗材料。收集产物级分，并在真空下去除溶剂，以得到(S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吲唑-3-基)丙酸，3.9g(54％)。ESI-MS(+)m/z 454.0(M+1)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.73(br.s.,1H),7.77(d,J＝8.3Hz,1H),7.56-7.50(m,2H),7.40-7.24(m,5H),7.14-7.08(m,1H),5.15(s,2H),5.00-4.89(m,2H),4.42(td,J＝8.6,5.1Hz,1H),3.39-3.24(m,2H),1.37(s,9H)。
步骤5：
将(S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吲唑-3-基)丙酸(3.88g，8.56mmol)溶解在MeOH(80ml)/苯(20mL)中，并置于N2气氛下。在剧烈搅拌下向溶液中添加Pd-C(0.455g，0.428mmol)。将反应置于H2气体气氛下，并搅拌16h。将反应通过硅藻土过滤，并在真空下浓缩，以得到(S)-2-氨基-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吲唑-3-基)丙酸，2.74g(100％)，其原样用于步骤6。ESI-MS(+)m/z 320.1(M+H)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.78(d,J＝8.0Hz,1H),7.54(d,J＝8.5Hz,1H),7.38(ddd,J＝8.3,7.0,1.0Hz,1H),7.13(t,J＝7.2Hz,1H),5.23-5.10(m,2H),3.58(dd,J＝9.0,4.0Hz,1H),3.49(dd,J＝15.6,4.0Hz,1H),3.28(br.s.,2H),3.17(dd,J＝15.7,8.9Hz,1H),1.41(s,9H)。/>
步骤6：
将(S)-2-氨基-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吲唑-3-基)丙酸(2.74g，8.58mmol)溶解在THF(34.3ml)中，然后添加水(34.3ml)。随后添加碳酸氢钠(1.442g，17.16mmol)，然后添加(9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧吡咯烷-1-基)碳酸酯(2.89g，8.58mmol)。将反应搅拌2h。在真空下去除大部分THF，然后添加EtOAc。将混合物用1N HCl酸化至pH 7，并用EtOAc萃取。将有机层收集，经硫酸钠干燥，并在真空下浓缩，以得到(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吲唑-3-基)丙酸(4.9g，105％)，其按原样使用。ESI-MS(+)m/z 542.1(M+H)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.87(d,J＝7.5Hz,2H),7.82(d,J＝8.0Hz,1H),7.70(d,J＝8.3Hz,1H),7.64(t,J＝8.2Hz,2H),7.52(d,J＝8.3Hz,1H),7.43-7.34(m,3H),7.32-7.23(m,2H),7.10(t,J＝7.4Hz,1H),5.15(s,2H),4.42(td,J＝8.8,5.0Hz,1H),4.20-4.11(m,3H),3.42-3.25(m,2H),1.36(s,9H)。
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-基)丙酸的制备
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-基)丙酸是通过与(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吲唑-3-基)丙酸相同的方法制备的，但具有以下修改：步骤1中1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-甲醛代替1H-吲唑-3-甲醛用作起始材料。步骤4中甲酯的水解在0℃下进行20min，而不是在室温下进行30min。ESI-MS(+)m/z 542.2(M+H)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.34(dd,J＝4.8,1.3Hz,1H),8.23(d,J＝7.5Hz,1H),7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.81(dd,J＝8.5,1.3Hz,1H),7.65(t,J＝8.4Hz,2H),7.46(s,1H),7.44-7.37(m,2H),7.29(dtd,J＝10.9,7.4,0.9Hz,2H),7.19(dd,J＝8.3,4.5Hz,1H),5.06-4.92(m,2H),4.37-4.30(m,1H),4.23-4.14(m,3H),3.28(dd,J＝14.7,4.1Hz,1H),3.09(dd,J＝14.6,9.0Hz,1H),1.38(s,9H)。
2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吲唑-1-基)丙酸的制备
步骤1：
向2-(5-溴-1H-吲唑-3-基)乙酸叔丁酯(500mg，1.6mmol)和2-{双[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙-2-烯酸苄酯(640mg，1.7mmol)在乙腈(10mL)中的溶液中添加碳酸钾(1.3g，9.6mmol)。将反应在RT下搅拌18小时。将反应用EtOAc稀释并且用水洗涤。将有机层用盐水洗涤；收集；经MgSO4干燥；过滤并蒸发挥发物，以得到粗产物。将粗产物经由反相色谱法(55g柱，5％-100％CH3CN:含01.％TFA的水)纯化，以得到呈白色固体的2-(双(((2-甲基-2-丙烷基)氧基)羰基)氨基)-3-(5-溴-3-(2-((2-甲基-2-丙烷基)氧基)-2-氧乙基)-1H-吲唑-1-基)丙酸苄酯(1.12g，1.626mmol，101％产率)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.98-7.90(m,1H),7.49(dd,J＝8.9,1.8Hz,1H),7.43-7.33(m,6H),5.49(t,J＝7.2Hz,1H),5.26(d,J＝2.7Hz,2H),5.04(d,J＝7.1Hz,2H),3.93-3.82(m,2H),1.48-1.45(m,9H),1.31-1.27(m,18H)。分析条件A：保留时间＝1.84min；ESI-MS(+)m/z 712.2(M+Na)。
步骤2：
将H2鼓泡通过2-(双(((2-甲基-2-丙烷基)氧基)羰基)氨基)-3-(5-溴-3-(2-((2-甲基-2-丙烷基)氧基)-2-氧乙基)-1H-吲唑-1-基)丙酸苄酯(1.0g，1.5mmol)和Pd-C(0.16g，0.15mmol)在MeOH(20mL)中的溶液5分钟。然后在搅拌下将反应在H2的正压下放置2小时。将反应用N2鼓泡，并且然后将浆料通过尼龙玻璃料过滤器过滤。在减压下蒸发挥发物，以得到呈粘稠油状物的2-(双(((2-甲基-2-丙烷基)氧基)羰基)氨基)-3-(3-(2-((2-甲基-2-丙烷基)氧基)-2-氧乙基)-1H-吲唑-1-基)丙酸(0.76g，1.5mmol，100％产率)。分析条件A：保留时间＝1.63min；ESI-MS(+)m/z 542.2(M+Na)。
步骤3：
将在二噁烷中的HCl(5.0ml，4.0M)添加到2-(双(((2-甲基-2-丙烷基)氧基)羰基)氨基)-3-(3-(2-((2-甲基-2-丙烷基)氧基)-2-氧乙基)-1H-吲唑-1-基)丙酸(781mg，1.503mmol)中，并在0℃下搅拌30分钟，然后升温至RT并搅拌30min。在减压、不加热的条件下蒸发反应挥发物，以得到呈白色固体的HCl盐形式的2-氨基-3-(3-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吲哚-1-基)丙酸(540mg，1.5mmol，100％产率)。分析条件A：保留时间＝1.18min；ESI-MS(+)m/z 320(M+H)。
步骤4：
向HCl盐形式的2-氨基-3-(3-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吲哚-1-基)丙酸(540mg，1.5mmol)和碳酸氢钠(630mg，7.5mmol)在丙酮(10mL)和水(10mL)中的溶液中添加(9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧吡咯烷-1-基)碳酸酯(510mg，1.5mmol)。将反应在RT下搅拌18小时。在剧烈搅拌下，用HCl水溶液(1.0M)将反应缓慢酸化至pH 5。将水层用25ml EtOAc分离。将有机层用水，然后用盐水洗涤。收集有机层，经MgSO4干燥，并且在减压下蒸发挥发物，以得到粗产物。将粗材料通过制备型HPLC(10％-100％CH3CN:含0.1％TFA的水)纯化，以得到呈灰白色固体的纯产物2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吲唑-1-基)丙酸(131mg，0.242mmol，16.1％产率)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.79(d,J＝7.4Hz,2H),7.71(d,J＝8.2Hz,1H),7.58-7.50(m,3H),7.41-7.34(m,3H),7.26(q,J＝7.4Hz,2H),7.13(t,J＝7.5Hz,1H),4.85-4.81(m,2H),4.79-4.68(m,1H),4.17(dd,J＝7.3,1.7Hz,2H),4.08(d,J＝7.3Hz,1H),3.92(s,2H),1.46-1.39(m,9H)。分析条件A：保留时间＝1.75min；ESI-MS(+)m/z 542.1(M+H)。
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙酸的制备
方案：
步骤1：
向5-甲氧基-1H-吲哚-3-甲醛(1.5g，8.56mmol)和碳酸铯(3.07g，9.42mmol)在DMF(34.2ml)中的0℃溶液中添加2-溴乙酸叔丁酯(1.373ml，9.42mmol)，并通过从冰浴中取出而升温至RT。将反应搅拌2h。将反应倾倒在水上并添加Et2O。将产物萃取在Et2O层中。分离各层并用Et2O第二次萃取水相。将合并的Et2O层用水，然后用盐水洗涤两次。将有机层收集，经硫酸钠干燥并在真空下浓缩，以得到2-(3-甲酰基-5-甲氧基-1H-吲哚-1-基)乙酸叔丁酯，2.1g(85％)，其原样用于下一步。ESI-MS(+)m/z 290.1(M+H)。
步骤2：
将2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-(二甲氧基磷酰基)乙酸苄酯(1.55g，3.8mmol)溶解在DCM(11.52mL)中，并在氮气下搅拌。向此溶液中添加DBU(0.573mL，3.80mmol)，并将混合物搅拌10min，然后在15-20min内滴加2-(3-甲酰基-5-甲氧基-1H-吲哚-1-基)乙酸叔丁酯(1.0g，3.46mmol)在DCM(11.52mL)中的溶液。在室温下，使搅拌继续16h。将反应混合物在真空下浓缩。将残余物用EtOAc稀释并用5％柠檬酸水溶液，然后用盐水洗涤，接着经无水Na2SO4干燥，过滤并蒸发。使用20％-70％EtOAc/己烷的梯度，通过快速色谱法纯化粗材料。收集产物级分，并在真空下去除溶剂，以得到(E)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙烯酸苄酯，1.6g，80％。ESI-MS(+)m/z571.2(M+H)。
步骤3：
将(Z)-苄基2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙烯酸酯(700mg，1.227mmol)溶解在用(+)-1,2-双((2S,5S)-2,5-二乙基磷杂环戊烷基)苯(环辛二烯)铑(I)三氟甲磺酸酯(8.86mg，0.012mmol)处理的MeOH(12ml)中，并置于氢气气氛(60psi)下3天。将反应通过硅藻土过滤，在真空下浓缩，以得到(S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙酸苄酯，702mg(100％)，其原样用于下一步。ESI-MS(+)m/z 573.2(M+H)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.87(d,J＝7.8Hz,1H),7.38-7.13(m,11H),7.10-7.02(m,2H),6.77(dd,J＝8.8,2.3Hz,1H),5.13-5.04(m,2H),5.04-4.94(m,2H),4.86(s,2H),4.32(td,J＝8.3,5.8Hz,1H),3.72(s,3H),1.39(s,9H)。
步骤4：
将(S)-苄基2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙酸酯(700mg，1.222mmol)溶解在MeOH(12ml)中，并置于N2气氛下。在剧烈搅拌下向溶液中添加Pd-C(65.0mg，0.061mmol)。将反应置于H2气氛下，并搅拌16h。将反应通过硅藻土过滤，并在真空下浓缩，以得到(S)-2-氨基-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙酸，426mg(100％)，其原样用于步骤5。ESI-MS(+)m/z 349.1(M+H)。
步骤5：
将(S)-2-氨基-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙酸(426mg，1.223mmol)溶解在THF(5ml)中，然后添加水(5.00ml)。随后添加碳酸氢钠(205mg，2.446mmol)，然后添加(9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧吡咯烷-1-基)碳酸酯(412mg，1.223mmol)。将反应搅拌2h。在真空下去除大部分THF，然后添加Et2O。丢弃有机层，并用Et2O再次洗涤水层。将水相收集，用1N HCl酸化，并用EtOAc萃取。将有机层收集，经硫酸钠干燥，并在真空下浓缩，以得到未经进一步纯化的粗产物。获得LC/MS和NMR确认。ESI-MS(+)m/z571.1(M+H)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.71(br.s.,1H),7.88(d,J＝7.5Hz,2H),7.72(d,J＝8.3Hz,1H),7.66(t,J＝8.3Hz,2H),7.40(td,J＝7.1,4.1Hz,2H),7.33-7.23(m,2H),7.17(d,J＝8.8Hz,1H),7.13-7.08(m,2H),6.76(dd,J＝8.8,2.3Hz,1H),4.85(s,2H),4.24-4.14(m,3H),3.76(s,3H),3.14(dd,J＝14.4,4.4Hz,1H),2.99(dd,J＝14.8,9.8Hz,1H),1.38(s,9H)。
2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)丙酸的制备
方案：
步骤1：
向1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲醛(1.5g，10.26mmol)和碳酸铯(3.68g，11.29mmol)在DMF(41.1ml)中的0℃溶液中添加2-溴乙酸叔丁酯(1.646ml，11.29mmol)，并通过从冰浴中取出而升温至RT。将反应搅拌2h。将反应倾倒在水上并添加Et2O。将产物萃取在Et2O层中。分离各层并用Et2O第二次萃取水相。将合并的Et2O层用水，然后用盐水洗涤2次。将有机层收集，经硫酸钠干燥并在真空下浓缩，以得到2-(3-甲酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-1-基)乙酸叔丁酯，2.3g(86％)，其原样用于下一步。ESI-MS(+)m/z 205.1(M+1-tBu)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ10.02(s,1H),8.58(dd,J＝7.8,1.5Hz,1H),8.42(dd,J＝4.8,1.5Hz,1H),7.95(s,1H),7.31-7.28(m,1H),5.05(s,2H),1.49(s,9H)。
步骤2：
将2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-(二甲氧基磷酰基)乙酸苄酯(2.348g，5.76mmol)溶解在DCM(12mL)中，并在氮气下搅拌。向此溶液中添加DBU(0.637ml，4.23mmol)，并将混合物搅拌10min，然后滴加2-(3-甲酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-1-基)乙酸叔丁酯(1g，3.84mmol)在DCM(12mL)中的溶液。在室温下，使搅拌继续16h。将反应混合物在真空下浓缩。将残余物用EtOAc稀释并用5％柠檬酸水溶液和盐水洗涤，然后经无水Na2SO4干燥，过滤并蒸发。使用0％-10％MeOH/DCM的梯度，通过快速色谱法纯化粗材料。收集产物级分，并在真空下去除溶剂，以得到(E)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)丙烯酸苄酯，1.54g(74％)。
实施例1的制备
按照以下通用程序制备实施例1：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂1用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟10％-70％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为14mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为95.3％。
分析LCMS条件C：保留时间＝4.081min；ESI-MS(+)m/z 1354.98(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1354.2099(M+2H)；实测值：1354.2063(M+2H)。
实施例2的制备
按照以下通用程序制备实施例2：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂1用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟10％-70％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为16mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为96.6％。分析LCMS条件C：保留时间＝4.081min；ESI-MS(+)m/z 1341.98(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1341.2021(M+2H)；实测值：1341.1982(M+2H)。
实施例3的制备
按照以下通用程序制备实施例3：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂1用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟10％-70％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为15mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为95.9％。分析LCMS条件C：保留时间＝4.416min；ESI-MS(+)m/z 1297.49(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1296.6964(M+2H)；实测值：1296.6934(M+2H)。
实施例4的制备
按照以下通用程序制备实施例4：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂1用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟10％-70％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为7mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为92.1％。分析LCMS条件C：保留时间＝4.371min；ESI-MS(+)m/z 1281.50(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1283.6886(M+2H)；实测值：1283.6855(M+2H)。
实施例5的制备
按照以下通用程序制备实施例5：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂1用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟20％-55％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为23.1mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为98％。分析LCMS条件D：保留时间＝2.56min；ESI-MS(+)m/z 1317.06(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1303.2029(M+2H)；实测值：1303.1973(M+2H)。
实施例6的制备
按照以下通用程序制备实施例6：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂1用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟20％-55％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为18.7mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为98％。分析LCMS条件D：保留时间＝2.55min；ESI-MS(+)m/z 1304.10(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1303.2029(M+2H)；实测值：1303.1973(M+2H)。
实施例7的制备
按照以下通用程序制备实施例7：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂1用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟20％-55％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为6.7mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为97％。分析LCMS条件D：保留时间＝2.53min；ESI-MS(+)m/z 1317.05(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1316.2108(M+2H)；实测值：1316.2050(M+2H)。
实施例8的制备
按照以下通用程序制备实施例8：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂1用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟20％-55％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为9.7mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为98％。分析LCMS条件D：保留时间＝2.43min；ESI-MS(+)m/z 1303.99(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1303.2029(M+2H)；实测值：1303.1968(M+2H)。
实施例9的制备
按照以下通用程序制备实施例9：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂1用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟20％-55％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为19.7mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为96％。分析LCMS条件D：保留时间＝2.82min；ESI-MS(+)m/z 1323.60(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1322.7210(M+2H)；实测值：1322.7145(M+2H)。
实施例10的制备
按照以下通用程序制备实施例10：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂1用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟20％-55％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为12.8mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为95％。分析LCMS条件D：保留时间＝2.81min；ESI-MS(+)m/z 1310.55(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1309.7131(M+2H)；实测值：1309.7081(M+2H)。
实施例11的制备
按照以下通用程序制备实施例11：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂1用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟20％-55％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为11.7mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为98％。分析LCMS条件D：保留时间＝2.51min；ESI-MS(+)m/z 1317.09(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1316.2108(M+2H)；实测值：1316.2050(M+2H)。
实施例12的制备
按照以下通用程序制备实施例12：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂1用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟15％-65％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为19.3mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为98％。分析LCMS条件D：保留时间＝2.49min；ESI-MS(+)m/z 1331.69(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1330.7189(M+2H)；实测值：1330.7160(M+2H)。
实施例13的制备
按照以下通用程序制备实施例13：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂1用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟15％-65％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为9.7mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为96％。
分析LCMS条件D：保留时间＝2.48min；ESI-MS(+)m/z 1317.17(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1316.2108(M+2H)；实测值：1316.2100(M+2H)。
实施例14的制备
按照以下通用程序制备实施例14：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂1用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟15％-65％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为10.3mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为95％。分析LCMS条件D：保留时间＝2.54min；ESI-MS(+)m/z 1317.19(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1316.2108(M+2H)；实测值：1316.2100(M+2H)。
实施例15的制备
按照以下通用程序制备实施例15：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂2用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟20％-65％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为28.5mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为98％。分析LCMS条件D：保留时间＝2.31min；ESI-MS(+)m/z 1341.14(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1340.1943(M+2H)；实测值：1340.1930(M+2H)。
实施例16的制备
按照以下通用程序制备实施例16：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂2用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟20％-65％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为7.8mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为98％。分析LCMS条件D：保留时间＝2.65min；ESI-MS(+)m/z 1309.71(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1308.7053(M+2H)；实测值：1308.7050(M+2H)。
实施例17的制备
按照以下通用程序制备实施例17：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂2用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟20％-65％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为32.5mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为96％。分析LCMS条件D：保留时间＝2.39min；ESI-MS(+)m/z 1303.10(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1302.1951(M+2H)；实测值：1302.1940(M+2H)。
实施例18的制备
按照以下通用程序制备实施例18：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂2用于此合成。用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗材料：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟15％-65％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为15.5mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为97％。分析LCMS条件D：保留时间＝2.35min；ESI-MS(+)m/z 1303.09(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1302.1951(M+2H)；实测值：1302.1940(M+2H)。
实施例19的制备
按照以下通用程序制备实施例19：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂2用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟10％-60％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为5.70mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为96％。分析LCMS条件D：保留时间＝2.34min；ESI-MS(+)m/z 1303.15(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1302.1951(M+2H)；实测值：1302.1940(M+2H)。
实施例20的制备
按照以下通用程序制备实施例20：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂2用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟10％-60％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为5.70mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为96％。分析LCMS条件D：保留时间＝2.35min；ESI-MS(+)m/z 1303.15(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1302.1951(M+2H)；实测值：1302.1940(M+2H)。
实施例21的制备
按照以下通用程序制备实施例21：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂2用于此合成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进行纯化：柱：XSelect CSH Prep C18，5-μm OBD，30mm x250mm。流动相A：10:90乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：90:10乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：经25分钟15％-65％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：40mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为25.7mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为94％。分析LCMS条件D：保留时间＝2.35min；ESI-MS(+)m/z 1317.73(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1316.7028(M+2H)；实测值：1316.7020(M+2H)。
实施例22的制备
按照以下通用程序制备实施例22：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂3用于此合成。用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗材料：柱：XBridge C18，19x 200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10-mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10-mM乙酸铵的水；梯度：经25分钟25％-65％B，然后在100％B下保持4分钟；流速：20mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。用以下条件通过制备型LC/MS进一步纯化材料：柱：Waters CSH C18，19x200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；梯度：经25分钟25％-65％B，然后在100％B下保持4分钟；流速：20mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为25.2mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为91％。分析LCMS条件E：保留时间＝1.85min；ESI-MS(+)m/z 1462.1(M+2H)；分析LCMS条件F：保留时间＝1.98min；ESI-MS(+)m/z 1462.4(M+2H)；SI-HRMS(+)m/z：计算值：1461.7979(M+2H)；实测值：1461.7950(M+2H)。
实施例23的制备
按照以下通用程序制备实施例23：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂3用于此合成。用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗材料：柱：XBridge C18，19x 200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10-mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10-mM乙酸铵的水；梯度：经20分钟28％-68％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为11.1mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为98％。分析LCMS条件F：保留时间＝2.23min；ESI-MS(+)m/z 1497.2(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1496.8158(M+2H)；实测值：1496.8170(M+2H)。
实施例24的制备
按照以下通用程序制备实施例24：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂3用于此合成。用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗材料：柱：XBridge C18，19x 200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10-mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10-mM乙酸铵的水；梯度：经25分钟20％-60％B，然后在100％B下保持6分钟；流速：20mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。用以下条件通过制备型LC/MS进一步纯化材料：柱：XBridge C18，19x200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；梯度：经25分钟26％-66％B，然后在100％B下保持6分钟；流速：20mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为22.0mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为94％。分析LCMS条件E：保留时间＝1.86min；ESI-MS(+)m/z 1475.3(M+2H)；分析LCMS条件F：保留时间＝1.99min；ESI-MS(+)m/z 1475.3(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1476.3025(M+2H)；实测值：1476.3020(M+2H)。
实施例25的制备
按照以下通用程序制备实施例25：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂3用于此合成。用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗材料：柱：XBridge C18，19x 200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；梯度：经26分钟12％-65％B，然后在100％B下保持4分钟；流速：20mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为30.8mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为100％。分析LCMS条件F：保留时间＝1.98min；ESI-MS(+)m/z 975.25(M+3H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1461.7949(M+2H)；实测值：1461.7930(M+2H)。
实施例26的制备
按照以下通用程序制备实施例26：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂3用于此合成。用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗材料：柱：XBridge C18，19x 200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10-mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10-mM乙酸铵的水；梯度：经20分钟15％-55％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。用以下条件通过制备型LC/MS进一步纯化材料：柱：Waters CSH C18，19x200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；梯度：经22分钟22％-62％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为7.5mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为98％。分析LCMS条件E：保留时间＝1.78min；ESI-MS(+)m/z 1475.3(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1461.7949(M+2H)；实测值：1461.7950(M+2H)。
实施例27的制备
按照以下通用程序制备实施例27：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂3用于此合成。用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗材料：柱：XBridge C18，19x 200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；梯度：经20分钟27％-67％B，然后在100％B下保持8分钟；流速：20mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为27.1mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为95％。分析LCMS条件E：保留时间＝1.94min；ESI-MS(+)m/z 1504.2(M+2H)；分析LCMS条件F：保留时间＝1.91min；ESI-MS(+)m/z 1404.0(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1504.8133(M+2H)；实测值：1504.8070(M+2H)。
实施例28的制备
按照以下通用程序制备实施例28：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂3用于此合成。用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗材料：柱：XBridge C18，19x 200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；梯度：经20分钟23％-63％B，然后在100％B下保持6分钟；流速：20mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为21.7mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为96％。分析LCMS条件F：保留时间＝1.86min；ESI-MS(+)m/z 1489.8(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1490.3056(M+2H)；实测值：1490.3000(M+2H)。
实施例29的制备
按照以下通用程序制备实施例29：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂3用于此合成。用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗材料：柱：XBridge C18，19x 200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；梯度：经20分钟27％-62％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为32.9mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为98％。分析LCMS条件E：保留时间＝1.90min；ESI-MS(+)m/z 1489.4(M+2H)；分析LCMS条件F：保留时间＝1.95min；ESI-MS(+)m/z 1490.0(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1490.3056(M+2H)；实测值：1490.2990(M+2H)。
实施例30的制备
按照以下通用程序制备实施例30：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂3用于此合成。用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗材料：柱：XBridge C18，19x 200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10-mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10-mM乙酸铵的水；梯度：经25分钟20％-60％B，然后在100％B下保持6分钟；流速：20mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为23.1mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为90％。分析LCMS条件E：保留时间＝1.80min；ESI-MS(+)m/z 1019.1(M+3H)；分析LCMS条件F：保留时间＝1.93min；ESI-MS(+)m/z 1019.1(M+3H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1528.3047(M+2H)；实测值：1528.3000(M+2H)。
实施例31的制备
按照以下通用程序制备实施例31：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“氯乙酸偶联程序”、“全局去保护方法A”和“环化方法A”。将改性氯三苯甲基树脂3用于此合成。用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗材料：柱：XBridge C18，19x 200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10-mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10-mM乙酸铵的水；梯度：经25分钟25％-60％B，然后在100％B下保持6分钟；流速：20mL/min。将含有所需产物的级分合并并经由离心蒸发干燥。产物的产率为16.8mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为100％。分析LCMS条件F：保留时间＝1.91min；ESI-MS(+)m/z 1491.1(M+2H)；ESI-HRMS(+)m/z：计算值：1490.3056(M+2H)；实测值：1490.2990(M+2H)。
用于使用均相时间分辨荧光(HTRF)结合测定测试大环肽竞争PD-1与PD-L1结合的能力的方法
使用PD-1/PD-L1均相时间分辨荧光(HTRF)结合测定研究本公开文本的大环肽与PD-L1结合的能力。
方法
可溶性PD-1与可溶性PD-L1结合的均相时间分辨荧光(HTRF)测定。可溶性PD-1和可溶性PD-L1是指具有羧基端截短的蛋白质，其去除跨膜区域(transmembrane-spanningregions)并与异源序列、特别是人免疫球蛋白G序列(Ig)的Fc部分或六组氨酸表位标记(His)融合。所有结合研究都在HTRF测定缓冲液中进行，所述缓冲液由补充有0.1％(w/v)牛血清白蛋白和0.05％(v/v)Tween-20的dPBS组成。对于PD-1-Ig/PD-L1-His结合测定，将抑制剂与PD-L1-His(最终10nM)在4μl测定缓冲液中预孵育15分钟，然后添加在1μl测定缓冲液中的PD-1-Ig(最终20nM)并且再孵育15分钟。使用来自人、食蟹猴、小鼠或其他物种的PD-L1融合蛋白。使用铕窝穴体(crypate)标记的抗Ig单克隆抗体(最终1nM)和别藻蓝蛋白(APC)标记的抗His单克隆抗体(最终20nM)实现HTRF检测。将抗体在HTRF检测缓冲液中稀释，并且在结合反应之上分配5μl。允许反应平衡30分钟，并且使用EnVision荧光计获得信号(665nm/620nm比率)。在PD-1-Ig/PD-L2-His(分别为20和5nM)、CD80-His/PD-L1-Ig(分别为100和10nM)和CD80-His/CTLA4-Ig(分别为10和5nM)之间建立了另外的结合测定。生物素化的化合物号71与人PD-L1-His之间的结合/竞争研究如下进行。将大环肽抑制剂在4μl测定缓冲液中与PD-L1-His(最终10nM)预孵育60分钟，然后添加在1μl测定缓冲液中的生物素化的化合物号71(最终0.5nM)。允许结合平衡30分钟，然后添加在5μl HTRF缓冲液中的铕窝穴体标记的链霉亲和素(最终2.5pM)和APC标记的抗His(最终20nM)。允许反应平衡30分钟，并且使用EnVision荧光计获得信号(665nm/620nm比率)。
重组蛋白。将具有C-末端人Ig表位标记的羧基截短的人PD-1(氨基酸25-167)[hPD-1(25-167)-3S-IG]和具有C-末端His表位标记的人PD-L1(氨基酸18-239)[hPD-L1(19-239)-烟草静脉斑驳病毒蛋白酶切割位点(TVMV)-His]在HEK293T细胞中表达，并且通过重组蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法依次纯化。人PD-L2-His(Sino Biologicals)、CD80-His(Sino Biologicals)、CTLA4-Ig(RnD Systems)均通过商业来源获得。
重组人PD-1-Ig的序列
hPD1(25-167)-3S-IG
(SEQ ID NO：1)
重组人PD-L1-TVMV-His(PD-L1-His)的序列
hPDL1(19-239)-TVMV-His
(SEQ ID NO：2)
结果在表1中示出。如表所示，本公开文本的大环肽展现了对PD-1-Ig与PD-L1-TVMV-His(PD-L1-His)结合活性的有效抑制。范围如下：A＝0.010-0.060μM；B＝0.0011-0.009μM；C＝0.0003-0.0010μM。
表1
/>
对于本领域技术人员来说应清楚的是，本公开文本并不限于前述说明性实施例，并且其可以在不背离本公开文本的基本属性的情况下体现为其他具体形式。因此，希望所述实施例在所有方面都被视为说明性的而非限制性的，参考所附的权利要求而不是前述实施例，并且因此落入权利要求的等同内容的含义和范围内的所有变化均旨在包含在其中。
序列表
<110> 百时美施贵宝公司
<120> 充当PD-1拮抗剂的免疫调节剂
<130> 12879-WO-PCT
<150> US 62/523,903
<151> 2017-06-23
<160> 2
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 384
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
20 25 30
Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro
35 40 45
Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln
50 55 60
Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg
65 70 75 80
Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
100 105 110
Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro
115 120 125
Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Gly
130 135 140
Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Arg Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr
145 150 155 160
His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
180 185 190
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
195 200 205
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
210 215 220
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
225 230 235 240
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
245 250 255
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
260 265 270
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
275 280 285
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
290 295 300
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
305 310 315 320
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
325 330 335
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
340 345 350
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
355 360 365
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380
<210> 2
<211> 237
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1 5 10 15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
20 25 30
Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln
35 40 45
Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg
50 55 60
Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
100 105 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115 120 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
130 135 140
Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys
145 150 155 160
Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr
165 170 175
Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr
180 185 190
Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile
195 200 205
Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Gly Ser Ser
210 215 220
Glu Thr Val Arg Phe Gln Gly His His His His His His
225 230 235

Claims (8)

1.一种式(I)的化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
A是
其中：
表示与羰基的连接点，并且/>表示与氮原子的连接点；
m是1；
w是0；
R14和R15独立地选自氢和甲基；
R16a是氢；
R16选自-C(R17a)2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X'-R31和-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)m'-C(R17a)(R17)-CO2H；
其中：
m'是0-5；
X'是在1与172个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链可以含有选自-NHC(O)NH-和-C(O)NH-的一个、两个、三个或四个嵌入其中的基团；并且其中所述链任选地被独立地选自-CO2H、-C(O)NH2和-CH2CO2H的一至六个基团取代，前提条件是X'不是未取代的PEG；
R31是-CO2H、-C(O)NRwRx、-CH3、alexa-5-SDP和生物素；
每个R17a独立地选自氢、C1-C6烷基、-CH2OH、-CH2CO2H、-(CH2)2CO2H，每个R17独立地选自氢、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、-(CH2)zCO2H、-CH2OH、CH2C＝CH和-(CH2)z-三唑基-X-R35，其中z是1-6，并且R35选自-CO2H、-C(O)NRwRx、CH3、生物素、-2-氟吡啶、-C(O)-(CH2)2-C(O)O-维生素E和-C(O)O-维生素E；
其中Rw和Rx独立地选自氢和C1-C6烷基；
前提条件是至少一个R17不是氢、-CH3或-CH2OH；
Rc、Rf、Rh、Ri、Rm和Rn是氢；
Ra、Re和Rj各自是氢；
R1是苯基甲基，其中所述苯基任选地被一个羟基取代；
R2是甲基；
R3是-CH2C(O)NH2；
R4是氢并且Rd是氢或甲基，或者R4和Rd与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环；
R5是-CH2NH2；
R6是-CH2CH(CH3)2；
R8是-CH2(吲哚基)；
R9是-(CH2)2NH2；
R11和R12是-(CH2)3CH3；
R13是-CH2CH(CH3)2；
R10选自
Rb是甲基；
Rg和R7与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环，其任选地被一个羟基取代；
Rk是甲基；并且
Rl是甲基。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于增强、刺激和/或增加免疫应答的药物中的用途。
3.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于抑制癌细胞的生长、增殖或转移的药物中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述癌症选自黑色素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、去势抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌和乳腺癌以及血液恶性肿瘤。
5.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗感染性疾病的药物中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述感染性疾病由病毒引起。
7.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗脓毒性休克的药物中的用途。
8.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于阻断PD-L1与PD-1和/或CD80的相互作用的药物中的用途。
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