CN110267971B - 免疫调节剂 - Google Patents

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Abstract

本公开提供作为免疫调节剂，并从而可用于改善各种疾病(包括癌症和感染性疾病)的化合物。

Description

免疫调节剂
相关申请的交叉参考
本申请要求2016年11月7日提交的美国临时申请序列号62/418352的优先权，其通过参考结合至本文中。
本公开提供新的大环肽，其抑制PD-1/PD-L1和CD80/PD-L1蛋白/蛋白相互作用，并从而可用于改善各种疾病，包括癌症和感染性疾病。
蛋白程序性死亡1 (PD-1)为CD28受体家族的抑制成员，所述受体家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化B细胞、T细胞和骨髓细胞上表达(Agata et al.,supra; Okazaki et al., Curr. Opin. Immunol., 14:779-782 (2002); Bennett etal., J. Immunol., 170:711-718 (2003))。
PD-1蛋白为55 kDa的I型跨膜蛋白，其为Ig基因超家族的一部分(Agata et al.,Int. Immunol., 8:765-772 (1996))。PD-1含有膜近端免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和膜远端基于酪氨酸的转换基序(ITSM) (Thomas, M.L., J. Exp. Med., 181:1953-1956(1995); Vivier, E. et al., Immunol. Today, 18:286-291 (1997))。尽管结构上类似于CTLA-4，但PD-1缺乏对CD80 CD86 (B7-2)结合至关重要的MYPPY基序。已经鉴定了PD-1的两种配体，PD-L1 (B7-H1)和PD-L2 (b7-DC)。表达PD-1的T细胞的活化已显示在与表达PD-L1或PD-L2的细胞相互作用时下调(Freeman et al., J. Exp. Med., 192:1027-1034(2000); Latchman et al., Nat. Immunol., 2:261-268 (2001); Carter et al., Eur. J. Immunol., 32:634-643 (2002))。PD-L1和PD-L2两者均为与PD-1结合，但不与其他CD28家族成员结合的B7蛋白家族成员。PD-L1配体在多种人类癌症中丰富(Dong et al., Nat. Med.,8:787-789 (2002))。PD-1和PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少和癌细胞的免疫逃逸(Dong et al., J. Mol. Med., 81:281-287(2003); Blank et al., Cancer Immunol. Immunother., 54:307-314 (2005); Konishiet al., Clin. Cancer Res., 10:5094-5100 (2004))。通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用可逆转免疫抑制，并且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时，效果是相加的(Iwai etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:12293-12297 (2002); Brown et al., J. Immunol., 170:1257-1266 (2003))。
PD-L1已显示出也与CD80相互作用(Butte MJ et al, Immunity; 27:111-122(2007))。PD-L1/CD80在表达免疫细胞上的相互作用已显示出为抑制性的相互作用。已显示出阻断这种相互作用可消除这种抑制性的相互作用(Paterson AM, et al., J Immunol.,187:1097-1105 (2011); Yang J, et al. J Immunol. Aug 1;187(3):1113-9 (2011))。
当表达PD-1的T细胞接触表达其配体的细胞时，响应抗原刺激的功能活性(包括增殖、细胞因子分泌和细胞毒性)降低。PD-1/PD-L1或PD-L2相互作用在感染或肿瘤消退期间或在自身耐受性发展期间下调免疫反应(Keir, M.E. et al., Annu. Rev. Immunol.,26:Epub (2008))。慢性抗原刺激，比如在肿瘤疾病或慢性感染期间发生的慢性抗原刺激，导致表达升高水平的PD-1并且在针对慢性抗原的活性方面功能失调的T细胞(综述于Kimet al., Curr. Opin. Imm. (2010))。这称为“T细胞耗竭”。B细胞也显示出PD-1/PD-配体抑制和“耗竭”。
已经显示使用针对PD-L1的抗体阻断PD-1/PD-L1连接在许多系统中恢复和增强T细胞活化。患有晚期癌症的患者得益于针对PD-L1的单克隆抗体的疗法(Brahmer et al.,New Engl. J. Med. (2012))。肿瘤和慢性感染的临床前动物模型已显示出通过单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1途径可增强免疫反应并导致肿瘤排斥或控制感染。经PD-1/PD-L1阻断的抗肿瘤免疫疗法可增强对许多组织学不同肿瘤的治疗性免疫反应(Dong, H. et al., "B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity", J. Mol. Med.,81(5):281-287 (2003); Dong, H. et al., "Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion", Nat. Med., 8(8):793-800 (2002))。
干扰PD-1/PD-L1相互作用导致慢性感染系统中的T细胞活性增强。阻断PD-L1在嗜铬淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染的小鼠中导致病毒清除率提高，并恢复免疫力(Barber,D.L. et al., "Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronicviral infection", Nature, 439(7077):682-687 (2006))。感染有HIV-1的人源化小鼠显示出保护作用增强免受病毒血症和CD4+ T细胞的病毒耗竭(Palmer et al., J. Immunol. (2013))。通过针对PD-L1的单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1可恢复HIV患者(Day, Nature (2006); Petrovas, J. Exp. Med. (2006); Trautman, Nature Med. (2006); D'Souza,J. Immunol. (2007); Zhang, Blood (2007); Kaufmann, NatureImm. (2007); Kasu,J. Immunol. (2010); Porichis, Blood (2011))、HCV患者(Golden-Mason, J. Virol. (2007); Jeung, J. Leuk. Biol. (2007); Urbani, J. Hepatol. (2008); Nakamoto,PLoSPath. (2009); Nakamoto, Gastroenterology (2008))和HBV患者(Boni, J. Virol. (2007); Fisicaro, Gastro. (2010); Fisicaro et al., Gastroenterology (2012);Boni et al., Gastro. (2012); Penna et al., J. Hep.(2012); Raziorrough,Hepatology (2009); Liang, World J. Gastro. (2010); Zhang, Gastro. (2008))的T细胞的体外抗原特异性功能。
阻断PD-L1/CD80相互作用也显示出刺激免疫力(Yang J., et al., J Immunol. Aug 1;187(3):1113-9 (2011))。通过与阻断进一步的PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2相互作用组合，已显示出由阻断PD-L1/CD80相互作用产生的免疫刺激得到增强。
假设免疫细胞表型的改变为脓毒性休克的重要因素(Hotchkiss, et al., Nat Rev Immunol (2013))。这些包括PD-1和PD-L1水平升高(Guignant, et al, Crit. Care (2011))，来自PD-1和PD-L1水平升高的脓毒性休克患者的细胞呈现出T细胞凋亡水平升高。针对PD-L1的抗体可降低免疫细胞凋亡的水平(Zhang et al, Crit. Care (2011))。此外，缺乏PD-1表达的小鼠比野生型小鼠对脓毒性休克症状的抗性更强(Yang J., et al. J Immunol. Aug 1;187(3):1113-9 (2011))。研究表明，使用抗体阻断PD-L1的相互作用可抑制不适当的免疫反应并改善疾病体征。
除了增强针对慢性抗原的免疫反应之外，还显示出阻断PD-1/PD-L1途径可增强对疫苗接种，包括在慢性感染的情况下的治疗性疫苗接种的反应(Ha, S.J. et al., "Enhancing therapeutic vaccination by blocking PD-1-mediated inhibitorysignals during chronic infection", J. Exp. Med., 205(3):543-555(2008);Finnefrock, A.C. et al., "PD-1 blockade in rhesus macaques: impact on chronicinfection and prophylactic vaccination", J. Immunol., 182(2):980-987(2009);Song, M.-Y. et al.," Enhancement of vaccine-induced primary and memory CD8+t-cell responses by soluble PD-1", J. Immunother., 34(3):297-306 (2011))。
PD-1途径为源自慢性感染和肿瘤疾病期间的慢性抗原刺激的T细胞耗竭中的关键抑制分子。已显示出通过靶向PD-L1蛋白阻断PD-1/PD-L1相互作用在体外和体内恢复抗原特异性T细胞免疫功能，包括在肿瘤或慢性感染的环境下对疫苗接种的反应增强。因此，期望阻断PD-L1与PD-1或CD80的相互作用的药物。
申请人已发现具有作为PD-L1与PD-1和CD80相互作用的抑制剂的活性，并从而可用于治疗性给予以增强对癌症或感染(包括治疗性疫苗)的免疫力的有效化合物。提供这些化合物可用于治疗性给予以增强对癌症或感染(包括治疗性疫苗)的免疫力。提供这些化合物可用作具有对其可药性重要的期望的稳定性、生物利用度、治疗指数和毒性值的药物。
在其第一方面，本公开提供以下式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
A选自键、
；
其中：
表示与羰基的连接点和/>表示与氮原子的连接点；
z为0、1或2；
w为1或2；
n为0或1；
m为1或2；
m’为0或1；
p为0、1或2；
Rx选自氢、氨基、羟基和甲基；
R14和R15独立地选自氢和甲基；和
Rz选自氢和-C(O)NHR16；其中R16选自氢、-CHR17C(O)NH2、-CHR17C(O)NHCHR18C(O)NH2和-CHR17C(O)NHCHR18C(O)NHCH2C(O)NH2；其中R17选自氢和-CH2OH和其中R18选自氢和甲基；
Rv为氢或天然氨基酸侧链；
Rc、Rf、Rh、Ri和Rm为氢；
Rn为氢；
Ra、Re和Rj各自独立地选自氢和甲基；
Rk选自氢和甲基；
R3和R13独立地选自天然氨基酸侧链、非天然氨基酸侧链、-(C(R17a)2)2-X-R30、-C(R17a)2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X’-R31、-C(R17a)2[C(O)N(R16a)C(R17a)2]w’ -X-R31、-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)n’-H和-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)m’-C(R17a)(R17)-CO2H；
R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自天然氨基酸侧链、非天然氨基酸侧链，或如下所述与相应的邻位R基团形成环；
Re和Rk可各自与相应的邻位R基团和它们所连接的原子形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环，其中每个环任选地用1-4个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代和羟基的基团取代；
Rb为甲基，或者Rb和R2与它们所连接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环，其中每个环任选地用1-4个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代和羟基的基团取代；
Rd为氢或甲基，或者Rd和R4与它们所连接的原子一起可形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环，其中每个环任选地用1-4个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代、羟基和苯基的基团取代；
Rg为氢或甲基，或者Rg和R7与它们所连接的原子一起可形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环，其中每个环任选地用选自以下的基团取代，并且还任选地用1-3个独立地选自以下的另外的基团取代：氨基、任选地用卤代基团取代的苄基、苄氧基、氰基、环己基、甲基、卤代、羟基、任选地用甲氧基取代的异喹啉基氧基、任选地用卤代基团取代的喹啉基氧基、和四唑基，和其中吡咯烷和哌啶环任选地与环己基、苯基或吲哚基团稠合；和
R1为甲基，或者R 1和R12与它们所连接的原子一起形成选自氮杂环丁烷和吡咯烷的环，其中每个环任选地用1-4个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代和羟基的基团取代；
w’为2或3；
n’为1-6；
m’为0-5；
X为1-172个原子的链，其中原子选自碳和氧和其中链可含有1、2、3或4个嵌入其中的选自-NHC(O)NH-和-C(O)NH-的基团，和其中链任选地用1-6个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-(CH2)CO2H的基团取代；
X’为1-172个原子的链，其中原子选自碳和氧和其中链可含有1、2、3或4个嵌入其中的选自-NHC(O)NH-和-C(O)NH-的基团，和其中链任选地用1-6个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代，条件是X’不为未取代的PEG；
R30选自-CO2H、-C(O)NRwRx和-CH3，其中Rw和Rx独立地选自氢和C1-C6烷基，条件是当X全为碳时，R30不为-CH3；
R31为-CO2H、-C(O)NRwRx、-CH3、alexa-5-SDP和生物素；
每个R17a独立地选自氢、C1-C6烷基、-CH2OH、-CH2CO2H、-(CH2)2CO2H，
每个R17独立地选自氢、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、-(CH2)zCO2H，-CH2OH、CH2C≡CH和-(CH2)z-三唑基-X -R35，其中z为1-6和R35选自-CO2H、-C(O)NRwRx、CH3、生物素、-2-氟吡啶、-C(O)-(CH2)2-C(O)O-维生素E、-C(O)O-维生素E；和
条件是至少一个R17不为氢、-CH3或-CH2OH；和
条件是R3和R13中的至少一个选自-(C(R17a)2)2-X-R30、-C(R17a)2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X’-R31、-C(R17a)2[C(O)N(R16a)C(R17a)2]w’ -X-R31、-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)n’-H和-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)m’-C(R17a)(R17)-CO2H。
在第一方面的第一实施方案中，本公开提供式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中A为：
。
在第一方面的第二实施方案中，z和w各自为1，R14和R15各自为氢，和Rz为- C(O)NHR16，其中R16为CHR17C(O)NH2，和其中R17为氢。
在第一方面的第三实施方案中，本公开提供式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中A为：
R3为天然或非天然氨基酸侧链和R13选自-(C(R17a)2)2-X-R30、-C(R17a)2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X’-R31、-C(R17a)2[C(O)N(R16a)C(R17a)2]w’ -X-R31、-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)n’-H和-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)m’-C(R17a)(R17)-CO2H。在第四实施方案中，R13为-(C(R17a)2)2-X-R30。在第五实施方案中，每个R17a为氢，X为10-25个原子的链，其中链可含有一个嵌入其中的C(O)NH-和其中链中的其余原子为碳，并且R30为-CH3。
在第一方面的第六实施方案中，本公开提供式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中A为：
R1为苯基C1-C3烷基，其中苯基部分任选地用一个选自C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C1-C3烷基磺酰基氨基、酰氨基、氨基、氨基C1-C3烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、卤代、卤代C1-C3烷基、羟基和硝基的基团取代；
R2为C1-C7烷基；
R3为羧基C1-C3烷基；
R4和Rd与它们所连接的原子一起可形成任选地用一个选自氨基、氰基、甲基、卤代、羟基和苯基的基团取代的吡咯烷环；
R5为咪唑基C1-C3烷基；
R6为C1-C7烷基；
R7和Rg与它们所连接的原子一起可形成任选地用一个选自氨基、氰基、甲基、卤代、羟基和苯基的基团取代的吡咯烷环；
R8为吲哚基C1-C3烷基，其中吲哚基部分任选地用一个选自C1-C3烷基、羧基C1-C3烷基、卤代、羟基和苯基的基团取代；
R9为羟甲基；
R10为吲哚基C1-C3烷基，其中吲哚基部分任选地用一个选自C1-C3烷基、羧基C1-C3烷基、卤代、羟基和苯基的基团取代；
R11为C1-C7烷基；和
R12为C1-C7烷基。
在第一方面的第七实施方案中，本公开提供式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中A为：
其中
z和w各自为1，R14和R15各自为氢，和Rz为-C(O)NHR16，其中R16为CHR17C(O)NH2，和其中R17为氢；
R13为-(C(R17a)2)2-X-R30，其中每个R17a为氢，X为10-25个原子的链，其中链可含有一个嵌入其中的C(O)NH-和其中链中的其余原子为碳，并且R30为-CH3；
R1为苯基C1-C3烷基，其中苯基部分任选地用一个选自C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C1-C3烷基磺酰基氨基、酰氨基、氨基、氨基C1-C3烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、卤代、卤代C1-C3烷基、羟基和硝基的基团取代；
R2为C1-C7烷基；
R3为羧基C1-C3烷基；
R4和Rd与它们所连接的原子一起可形成任选地用一个选自氨基、氰基、甲基、卤代、羟基和苯基的基团取代的吡咯烷环；
R5为咪唑基C1-C3烷基；
R6为C1-C7烷基；
R7和Rg与它们所连接的原子一起可形成任选地用一个选自氨基、氰基、甲基、卤代、羟基和苯基的基团取代的吡咯烷环；
R8为吲哚基C1-C3烷基，其中吲哚基部分任选地用一个选自C1-C3烷基、羧基C1-C3烷基、卤代、羟基和苯基的基团取代；
R9为羟甲基；
R10为吲哚基C1-C3烷基，其中吲哚基部分任选地用一个选自C1-C3烷基、羧基C1-C3烷基、卤代、羟基和苯基的基团取代；
R11为C1-C7烷基；和
R12为C1-C7烷基。
在第二方面，本公开提供一种在需要它的受试者中增强、刺激和/或增加免疫反应的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的式(I)的化合物或其治疗上可接受的盐。在第二方面的第一实施方案中，方法进一步包括在式(I)化合物或其治疗上可接受的盐之前、之后或同时给予另外的药物。在第二实施方案中，另外的药物选自抗微生物剂、抗病毒剂、细胞毒剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、HDAC抑制剂和免疫反应调节剂。
在第三方面，本公开提供一种在需要它的受试者中抑制癌细胞的生长、增殖或转移的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的式(I)的化合物或其治疗上可接受的盐。在第三方面的第一实施方案中，癌症选自黑素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、去势抵抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌和乳腺癌以及血液恶性肿瘤。
在第四方面，本公开提供一种在需要它的受试者中治疗感染性疾病的方法，方法包括给予受试者治疗有效量的式(I)的化合物或其治疗上可接受的盐。在第四方面的第一实施方案中，感染性疾病由病毒引起。在第二实施方案中，病毒选自HIV、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、疱疹病毒和流感。
在第五方面，本公开提供一种在需要它的受试者中治疗脓毒性休克的方法，方法包括给予受试者治疗有效量的式(I)的化合物或其治疗上可接受的盐。
在第六方面，本公开提供一种在受试者中阻断PD-L1与PD-1和/或CD80的相互作用的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的权利要求1的化合物或其治疗上可接受的盐。
在每个R位置以下基团为优选。氨基酸可为D-或L-立体化学，并且可如本公开中别处所述进行取代。
在式(I)的化合物中，优选的R1侧链为：苯丙氨酸、酪氨酸、3-噻吩-2-基、4-甲基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、异色氨酸、3-甲基苯丙氨酸、1-萘丙氨酸、3,4-二氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、3,4-二甲氧基苯丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸、4-二氟甲基苯丙氨酸、2-甲基苯丙氨酸、2-萘丙氨酸、色氨酸、4-吡啶基、4-溴苯丙氨酸、3-吡啶基、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、联苯丙氨酸和3-氯苯丙氨酸以及2,4-二氨基丁烷。
在其中R2不为环的一部分的式(I)化合物中，优选的R2侧链为：丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R3侧链为：天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、丙氨酸、2,3-二氨基丙烷和2,4-二氨基丁烷。
在其中R4不为环的一部分的式(I)化合物中，优选的R4侧链为：缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸和甘氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R5侧链为：氨基甲烷、组氨酸、天冬酰胺、2,3-二氨基丙烷、丝氨酸、甘氨酸、2,4-二氨基丁烷、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和3-噻唑基丙氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R6侧链为：亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、赖氨酸、3-环己烷、苏氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁烷、丙氨酸、精氨酸和鸟氨酸(COCH3)。
在其中R7不为环的一部分的式(I)化合物中，优选的R7侧链为：甘氨酸、2,4-二氨基丁烷、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸和2,4-二氨基丁烷(C(O)环丁烷)。
在式(I)的化合物中，优选的R8侧链为：色氨酸和1,2-苯并异噻唑啉基丙氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R9侧链为：丝氨酸、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、2,4-二丁胺、苏氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸、2,3-二氨基丙烷、精氨酸、天冬氨酸和酪氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R10侧链为：任选取代的色氨酸、苯并异噻唑基丙氨酸、1-萘丙氨酸、甲硫氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R11侧链为：正亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、甲硫氨酸、乙氧基甲烷、丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯丙烷、谷氨酸、己烷和庚烷。
在其中R12不为环的一部分的式(I)化合物中，优选的R12侧链为：正亮氨酸、丙氨酸、乙氧基甲烷、甲硫氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、甲氧基乙烷、亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、己烷、庚烷和甘氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R13侧链为：精氨酸、鸟氨酸、丙氨酸、2,4-二氨基丁烷、2,3-二氨基丙烷、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、环丙基甲烷、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和2-氨基丁烷。
根据本公开，我们发现了与PD-L1特异性结合并且能够抑制PD-L1与PD-1和CD80的相互作用的肽。这些大环肽呈现出体外免疫调节效力，从而使其成为用于治疗各种疾病(包括癌症和感染性疾病)的治疗候选物。
术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指蛋白和结合分子(比如化合物或配体)之间的相互作用。相互作用取决于结合分子识别的蛋白质的特定结构(即酶结合位点、抗原决定簇或表位)的存在。例如，如果化合物对蛋白结合位点“A”具有特异性结合，则化合物存在于含有包含结合位点A的蛋白和与蛋白结合位点A特异性结合的标记肽的反应中将减少与蛋白结合的标记肽的量。相比之下，化合物与蛋白的非特异性结合不会导致标记肽从蛋白中的浓度依赖性置换。
本公开旨在包括本公开化合物中存在的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子序数但质量数不同的那些原子。作为一般实例而非限制，氢的同位素包括氘和氚。碳的同位素包括13C和14C。本发明的同位素标记的化合物通常可通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与本文所述的那些类似的方法，使用适当同位素标记的试剂代替否则使用的非标记的试剂来制备。这种化合物可具有多种潜在用途，例如作为确定生物活性的标准和试剂。在稳定同位素的情况下，这种化合物可具有有利地修改生物学、药理学或药代动力学性质的潜力。
本文所述主题的另一方面为所公开的肽作为放射性标记的配体用于开发配体结合测定或用于监测体内吸收、代谢、分布、受体结合或占据或化合物处置的用途。例如，可使用放射性同位素125I制备本文所述的大环肽，并且生成的放射性标记的肽可用于开发结合测定或用于代谢研究。或者，并且出于相同的目的，可使用本领域技术人员已知的方法通过催化氚化将本文所述的大环肽转化为放射性标记的形式。
也可使用本领域技术人员已知的方法通过添加放射性示踪剂将本公开的大环肽用作PET显像剂。
优选的肽包括至少一种本文提供的大环肽，并且这些肽可包含在药用组合物和组合中。
除非在特定情况下另外限定，否则本文提供的定义适用于(但不限于)整个本说明书中使用的术语。
氨基酸和肽化学领域的普通技术人员意识到氨基酸包括由以下通式结构表示的化合物：
其中R和R’如本文所讨论的那样。
除非另外指明，本文使用的术语“氨基酸”(单独或作为另一基团的一部分)包含(但不限于)氨基和与相同碳(称为“α”碳)连接的羧基，其中R和/或R’可为天然或非天然的侧链(包括氢)。“α”碳处的绝对“S”构型通常称为“L”或“天然”构型。在其中“R”和“R’”两者(主要)取代基均与氢相等的情况下，氨基酸为甘氨酸并且不是手性的。
本文使用的术语“天然氨基酸侧链”和“天然存在的氨基酸侧链”是指通常以S-构型(即L-氨基酸)存在的任何天然存在的氨基酸(即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)的侧链。
本文使用的术语“非天然氨基酸侧链”和“非天然存在的氨基酸侧链”是指通常以R-构型存在(即D-氨基酸)的任何天然存在的氨基酸的侧链或选自以下的以R-或S-构型存在(即分别为D-或L-氨基酸)的天然存在的氨基酸侧链以外的基团：
C2-C7链稀基、C1-C3烷氧基C1-C3烷基、C1-C6烷氧基羰基C1-C3烷基、C1-C7烷基、C1-C3烷基硫烷基C1-C3烷基、酰氨基C1-C3烷基、氨基C1-C3烷基、氮杂吲哚基C1-C3烷基、苯并噻唑基C1-C3烷基、苯并噻吩基C1-C3烷基、苄氧基C1-C3烷基、羧基C1-C3烷基、C3-C14环烷基C1-C3烷基、二苯甲基、呋喃基C1-C3烷基、咪唑基C1-C3烷基、萘基C1-C3烷基、吡啶基C1-C3烷基、噻唑基C1-C3烷基、噻吩基C1-C3烷基；
联苯基C1-C3烷基，其中联苯基任选地用甲基取代；
任选地用1、2、3、4或5个独立地选自C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C1-C3烷基磺酰基氨基、酰氨基、氨基、氨基C1-C3烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、卤代、卤代C1-C3烷基、羟基、-NC(NH2)2、硝基和-OP(O)(OH)2的基团取代的杂环基；
吲哚基C1-C3烷基，其中吲哚基部分任选地用一个选自C1-C3烷基、羧基C1-C3烷基、卤代、羟基和苯基的基团取代，其中苯基进一步任选地用1、2或3个独立地选自C1-C3烷氧基、C1-C3烷基和卤代的基团取代；
NRxRy(C1-C7烷基)，其中Rx和Ry独立地选自氢、C2-C4链烯氧基羰基、C1-C3烷基、C1-C3烷基羰基、C3-C14环烷基羰基、呋喃基羰基和苯基羰基。当烷基接头含有多于一个碳时，链上可存在另外的NRxRy基团。
NRuRv羰基C1-C3烷基，其中Ru和Rv独立地选自氢、C1-C3烷基和三苯基甲基；
任选地用1、2、3、4或5个独立地选自C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C1-C3烷基磺酰基氨基、酰氨基、氨基、氨基C1-C3烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、卤代、卤代C1-C3烷基、羟基、-NC(NH2)2、硝基和-OP(O)(OH)2的基团取代的苯基；
苯基C1-C3烷基，其中苯基部分任选地用1、2、3、4或5个独立地选自C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C1-C3烷基磺酰基氨基、酰氨基、氨基、氨基C1-C3烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、卤代、卤代C1-C3烷基、羟基、-NC(NH2)2、硝基和-OP(O)(OH)2的基团取代；和
苯氧基C1-C3烷基，其中苯基任选地用C1-C3烷基取代。
本文使用的术语“alexa-5-SDP”是指
其中W为O或NH。
本文使用的术语“C2-C4链烯基”是指含有至少一个碳-碳双键的2-4个碳原子的直链或支链基团。
本文使用的术语“C2-C7链烯基”是指含有至少一个碳-碳双键的2-7个碳原子的直链或支链基团。
本文使用的术语“C2-C4链烯氧基”是指通过氧原子与母体分子部分连接的C2-C4链烯基。
本文使用的术语“C1-C3烷氧基”是指通过氧原子与母体分子部分连接的C1-C3烷基。
本文使用的术语“C1-C4烷氧基”是指通过氧原子与母体分子部分连接的C1-C4烷基。
本文使用的术语“C1-C6烷氧基”是指通过氧原子与母体分子部分连接的C1-C6烷基。
本文使用的术语“C1-C3烷氧基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的C1-C3烷氧基。
本文使用的术语“C1-C6烷氧基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的C1-C6烷氧基。
本文使用的术语“C1-C6烷氧基羰基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的C1-C6烷氧基羰基。
本文使用的术语“C1-C3烷基”是指衍生自含有1-3个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。
本文使用的术语“C1-C4烷基”是指衍生自含有1-4个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。
本文使用的术语“C1-C6烷基”是指衍生自含有1-6个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。
本文使用的术语“C1-C3烷基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的C1-C3烷基。
本文使用的术语“C1-C3烷基硫烷基”是指通过硫原子与母体分子部分连接的C1-C3烷基。
本文使用的术语“C1-C3烷基硫烷基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的C1-C3烷基硫烷基。
本文使用的术语“C1-C3烷基磺酰基”是指通过磺酰基与母体分子部分连接的C1-C3烷基。
本文使用的术语“C1-C3烷基磺酰基氨基”是指通过氨基与母体分子部分连接的C1-C3烷基磺酰基。
本文使用的术语“酰氨基”是指-C(O)NH2。
本文使用的术语“酰氨基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的酰氨基。
本文使用的术语“氨基”是指-NH2。
本文使用的术语“氨基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的氨基。
本文使用的术语“氨基磺酰基”是指通过磺酰基与母体分子部分连接的氨基。
本文使用的术语“氮杂吲哚基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子连接的氮杂吲哚基。氮杂吲哚基可通过基团中任何可取代的原子与烷基部分连接。
本文使用的术语“苯并噻唑基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子连接的苯并噻唑基。苯并噻唑基可通过基团中任何可取代的原子与烷基部分连接。
本文使用的术语“苯并噻吩基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子连接的苯并噻吩基。苯并噻吩基可通过基团中任何可取代的原子与烷基部分连接。
本文使用的术语“苄氧基”是指通过氧原子与母体分子部分连接的苄基。
本文使用的术语“苄氧基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的苄氧基。
如本文使用的术语“生物素”是指：
其中W为O或NH。
本文使用的术语“联苯C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的联苯基。联苯基可通过基团中任何可取代的原子与烷基部分连接。
本文使用的术语“羰基”是指- C(O)-。
本文使用的术语“羧基”是指-CO2H。
本文使用的术语“羧基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的羧基。
本文使用的术语“氰基”是指-CN。
本文使用的术语“C3-C14环烷基”是指具有3-14个碳原子和0个杂原子的饱和单环、双环或三环烃环系统。双环和三环可为稠合的、螺环的或桥接的。环烷基的代表性实例包括(但不限于)环丙基、环戊基、双环[3.1.1]庚基和金刚烷基。
本文使用的术语“C3-C14环烷基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的C3-C14环烷基。
本文使用的术语“C3-C14环烷基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的C3-C14环烷基。
本文使用的术语“呋喃基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的呋喃基。呋喃基可通过基团中任何可取代的原子与烷基部分连接。
本文使用的术语“呋喃基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的呋喃基。
本文使用的术语“卤代”和“卤素”是指F、Cl、Br或I。
本文使用的术语“卤代C1-C3烷基”是指用1、2或3个卤素原子取代的C1-C3烷基。
本文使用的术语“卤代甲基”是指用1、2或3个卤素原子取代的甲基。
本文使用的术语“杂环基”是指含有1、2或3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5、6或7元环。5元环具有0-2个双键，和6和7元环具有0-3个双键。术语“杂环基”还包括双环基团，其中杂环基环与4至6元芳族或非芳族碳环或另一单环杂环基稠合。本公开的杂环基通过基团中的碳原子与母体分子部分连接。杂环基的实例包括(但不限于)苯并噻吩基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基、噁唑基、哌嗪基、哌啶基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、吡咯并吡啶基、吡咯基、噻唑基、噻吩基和硫代吗啉基。
本文使用的术语“羟基”是指-OH。
本文使用的术语“咪唑基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的咪唑基。咪唑基可通过基团中任何可取代的原子与烷基部分连接。
本文使用的术语“吲哚基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的吲哚基。吲哚基可通过基团中任何可取代的原子与烷基部分连接。
本文使用的术语“萘基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的萘基。萘基可通过基团中任何可取代的原子与烷基部分连接。
本文使用的术语“硝基”是指-NO2。
本文使用的术语“NRxRy”是指两个基团Ra和Rb，其通过氮原子与母体分子部分连接。Ra和Rb独立地选自氢、C2-C4链烯氧基羰基、C1-C3烷基羰基、C3-C14环烷基羰基、呋喃基羰基和苯基羰基。
本文使用的术语“NRxRy(C1-C3)烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的NRxRy基团。
本文使用的术语“NRuRv”是指两个基团Ru和Rv，其通过氮原子与母体分子部分连接。Ru和Rv独立地选自氢、C1-C3烷基和三苯基甲基。
本文使用的术语“NRuRv羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的NRuRv基团。
本文使用的术语“NRuRv羰基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的NRuRv羰基。
本文使用的术语“PEG”是指聚乙二醇，一种由式表示的环氧乙烷的聚合物，其中n在1-57之间。应当理解，PEG基团可通过氧原子或碳原子与母体分子部分连接。
本文使用的术语“苯氧基”是指通过氧原子与母体分子部分连接的苯基。
本文使用的术语“苯氧基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的苯氧基。
本文使用的术语“苯基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的苯基。
本文使用的术语“苯基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的苯基。
本文使用的术语“吡啶基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的吡啶基。吡啶基可通过基团中任何可取代的原子与烷基部分连接。
本文使用的术语“硫烷基”是指-S-。
本文使用的术语“磺酰基”是指-SO2-。
本文使用的术语“噻唑基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的噻唑基。噻唑基可通过基团中任何可取代的原子与烷基部分连接。
本文使用的术语“噻吩基C1-C3烷基”是指通过C1-C3烷基与母体分子部分连接的噻吩基。噻吩基可通过基团中任何可取代的原子与烷基部分连接。
术语“治疗”是指：(i) 在可能易患疾病、障碍和/或病症但尚未诊断为患有的患者预防疾病、障碍或病症的发生；(ii) 抑制疾病、障碍或病症，即阻止其发展；和(iii) 减轻疾病、障碍或病症，即引起疾病、障碍和/或病症和/或与疾病、障碍和/或病症相关的症状的消退。
本文使用的术语“维生素E”是指：
。
大环肽与PD-L1的结合可通过例如均相时间分辨荧光(HTRF)、表面等离子体共振(SPR)、等温滴定量热法(ITC)、核磁共振光谱(NMR)等方法测量。进一步地，大环肽与细胞表面上表达的PD-L1的结合可如本文所述以细胞结合测定测量。
给予本文所述的治疗剂包括(但不限于)给予治疗有效量的治疗剂。本文使用的术语“治疗有效量”是指(但不限于)治疗或预防可通过给予本文所述的PD-1/PD-L1结合抑制剂的组合物治疗的病症的治疗剂的量。该量为足以呈现出可检测的治疗或预防或改善作用的量。该作用可包括例如(并且不限于)治疗或预防本文所列的病症。用于受试者的准确有效量将取决于受试者的体型大小和健康状况、所治疗病症的性质和程度、治疗医师的建议以及选择用于给予的治疗剂或治疗剂组合。因此，事先规定精确的有效量是没有用的。
另一方面，本公开涉及使用本公开的大环肽在受试者中抑制肿瘤细胞生长的方法。如本文所证实的那样，本公开的大环肽能够与PD-L1结合，破坏PD-L1和PD-1之间的相互作用，与已知阻断与PD-1相互作用的抗PD-1单克隆抗体竞争结合PD-L1，增强CMV特异性T细胞IFNγ分泌以及增强HIV特异性T细胞IFNg分泌。因此，本公开的大环肽可用于改变免疫反应、治疗疾病比如癌症或感染性疾病、刺激保护性自身免疫反应或刺激抗原特异性免疫反应(例如通过共同给予PD-L1阻断肽与感兴趣的抗原)。
为了可更易于理解本公开，首先定义某些术语。在整个详述中阐述了另外的定义。
术语“程序性死亡配体1”、“程序性细胞死亡配体1”、“蛋白PD-L1”、“PD-L1”、“PDL1”、“PDCDL1”、“hPD-L1”、“hPD-LI”、“CD274”和“B7-H1”可互换使用，并且包括人PD-L1的变体、同种型、物种同系物以及与PD-L1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-L1序列可以在GENBANK®登录号NP_054862下找到。
术语“程序性死亡1”、“程序性细胞死亡1”、“蛋白PD-1”、“PD-1”、“PD1”、“PDCD1”、“hPD-1”和“hPD-I”可互换使用，并且包括人PD-1的变体、同种型、物种同系物以及与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-1序列可以在GENBANK®登录号U64863下找到。
术语“细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4”、“CTLA-4”、“CTLA4”、“CTLA-4抗原”和“CD152”(参见例如Murata, Am. J. Pathol., 155:453-460 (1999))可互换使用，并且包括人CTLA-4的变体、同种型、物种同系物以及与CTLA-4具有至少一个共同表位的类似物(参见例如Balzano, Int. J. Cancer Suppl.,7:28-32 (1992))。完整的CTLA-4核酸序列可以在GENBANK®登录号L15006下找到。
术语“免疫反应”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括大环肽、细胞因子和补体)的作用，这种作用导致入侵病原体、感染有病原体的细胞或组织、癌细胞或者在自身免疫或病理性炎症的情况下正常人细胞或组织的选择性损伤、破坏或从人体消除。
本文使用的“不良事件”(AE)为与使用医学治疗相关的任何不利和通常无意的，甚至不期望的体征(包括异常实验室发现)、症状或疾病。例如，不良事件可能与响应治疗的免疫系统的激活或免疫系统细胞(例如T细胞)的扩增有关。医学治疗可能具有一种或多种相关的AE，并且每种AE可具有相同或不同水平的严重程度。提及能够“改变不良事件”的方法意指降低与使用不同治疗方案相关的一种或多种AE的发生率和/或严重程度的治疗方案。
本文使用的“过度增殖性疾病”是指其中细胞生长增加超过正常水平的病症。例如，过度增殖性疾病或障碍包括恶性疾病(例如食道癌、结肠癌、胆管癌)和非恶性疾病(例如动脉粥样硬化、良性增生和良性前列腺肥大)。
本文使用的“约”或“基本上包含”意指对本领域的普通技术人员测定的特定值在可接受的误差范围内，这将部分取决于如何测量或测定该值，即测量系统的限度。例如，“约”或“基本上包含”可意指根据本领域的实践在一个或多于一个标准偏差内。或者，“约”或“基本上包含”可意指至多20%的范围。此外，特别是关于生物系统或过程，该术语可意指至多一个数量级或至多5倍的值。当在申请和权利要求中提供特定值时，除非另外说明，否则应假定“约”或“基本上包含”的含义在该特定值的可接受误差范围内。
如本文所述，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时，包括其分数(比如整数的十分之一和百分之一)，除非另外指明。
竞争性测定
本公开还涉及能够与参考抗PD-L1抗体(MDX-1105)的结合竞争至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%和至少约100%的大环肽。这种大环肽可与本文公开的一种或多种大环肽共具结构同源性，包括突变体、保守性置换、功能性置换和缺失形式，条件是它们与PD-L1特异性结合。例如，如果大环肽基本上与同参考抗PD-L1抗体相同的PD-L1区域结合，则大环肽应与PD-L1的表位结合，该表位至少与抗PD-L1单克隆抗体结合的PD-L1表位重叠。重叠区域可在一个氨基酸残基至几百个氨基酸残基的范围内。然后，大环肽应与抗PD-L1单克隆抗体同PD-L1的结合竞争和/或阻断这种结合，并且在竞争性测定中降低抗PD-L1单克隆抗体同PD-L1的结合优选地至少约50%。
可用作竞争性测定目的的参考抗体的抗PD-L1抗体为本领域已知的。例如，可使用以下代表性的抗PD-L1抗体：MDX-1105 (BMS)、L01X-C (Serono)、L1X3 (Serono)、MSB-0010718C (Serono)和PD-L1 Probody (CytomX)以及共同拥有的WO2007/005874中公开的PD-L1抗体。
可用作竞争性测定目的的参考抗体的抗PD-1抗体为本领域已知的。例如，可使用以下代表性的抗PD-L抗体：纳武单抗(BMS)；17D8、2D3、4H1、4A11、7D3和5F4 (各自在共同拥有的美国专利第8008449号中公开) (BMS)、MK-3475 (Merck, 在美国专利第8168757号中公开)及在美国专利第7488802号中公开的抗体。
药用组合物
另一方面，本公开提供一种组合物，例如药用组合物，其含有与药学上可接受的载体一起配制的本公开的大环肽的一种或组合。这种组合物可包含本公开的(例如两种或多种不同的)大环肽或免疫缀合物或双特异性分子中的一种或组合。例如，本公开的药用组合物可包含与靶抗原上的不同表位结合或具有互补活性的大环肽(或免疫缀合物或双特异性肽)的组合。
本公开的药用组合物还可以组合疗法给予，即与其他药物组合给予。例如，组合疗法可包括大环肽与至少一种其他抗炎或免疫抑制剂的组合。可用于组合疗法的治疗剂的实例在以下关于本公开的大环肽的用途的部分中更详细地描述。
本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适合于静脉内、肌内、皮下、非肠道、脊柱或表皮给予(例如通过注射或输注)。取决于给予途径，可将活性化合物(即大环肽、免疫缀合物或双特异性分子)包被于材料中，以保护化合物免受酸和其他可能使化合物失活的天然条件的作用。
本公开的药用化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”或“治疗上可接受的盐”是指保留母体化合物的期望的生物活性并且不产生任何不期望的毒理作用的盐(参见例如Berge, S.M. et al., J. Pharm. Sci.,66:1-19 (1977))。这种盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自非毒性无机酸比如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等以及衍生自非毒性有机酸比如脂肪族单-和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂肪族和芳族磺酸等的那些盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属比如钠、钾、镁、钙等以及衍生自非毒性有机胺比如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的那些盐。
本公开的药用组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1) 水溶性抗氧化剂，比如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2) 油溶性抗氧化剂，比如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3) 金属螯合剂，比如枸橼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本公开的药用组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(比如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油比如橄榄油和可注射的有机酯比如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料比如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可保持适当的流动性。
这些组合物还可含有辅剂比如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过上文的灭菌程序和通过包含各种抗细菌和抗真菌剂例如尼泊金、氯丁醇、苯酚山梨酸等，可确保预防微生物的存在。还可能期望在组合物中包含等渗剂，比如糖类、氯化钠等。另外，通过包含延迟吸收的试剂比如单硬脂酸铝和明胶可实现延长可注射药用形式的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌粉末。这种介质和试剂用于药用活性物质的用途为本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于本公开的药用组合物中。补充的活性化合物也可掺入组合物中。
治疗组合物一般地必须在制备和储存条件下为无菌和稳定的。组合物可配制成溶液剂、微乳剂、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如通过使用包衣比如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可保持适当的流动性。在许多情况下，优选的是在组合物中包含等渗剂，例如糖类、多元醇比如甘露醇、山梨醇或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶可实现延长可注射组合物的吸收。
无菌可注射溶液剂可通过将所需量的活性化合物与以上列举的成分中的一种或组合(根据需要)一起掺入适当的溶剂中，随后进行灭菌微滤来制备。通常，通过将活性化合物掺入含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分的粉末加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外期望的成分。
可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的受试者和具体的给予方式而变化。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常为产生治疗作用的组合物的量。通常，在100%的情况下，与药学上可接受的载体组合的该量在活性成分的约0.01%-约99%，优选地在约0.1%-约70%，最优选地在活性成分的约1%-约30%的范围内。
调整剂量方案以提供最佳的期望的反应(例如治疗反应)。例如，可给予单次推注，可随时间的推移给予几个分开的剂量，或者可根据治疗情况的急迫性所示按比例减少或增加剂量。尤其有利的是以剂量单位形式配制非肠道组合物以便于给予和剂量均匀性。本文使用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗受试者的单位剂量的物理离散单位，每个单位含有预定量的经计算可与所需的药用载体一起产生期望的治疗作用的活性化合物。本公开的剂量单位形式的规格直接根据以下来规定：(a) 活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗作用，和(b) 复合这种活性化合物用于治疗个体敏感性的技术中固有的局限性。
对于大环肽的给予，剂量在约0.0001-100 mg/kg，和更通常地在0.01-5 mg/kg宿主体重的范围内。例如，剂量可为0.3 mg/kg体重、1 mg/kg体重、3 mg/kg体重、5 mg/kg体重或10 mg/kg体重或在1-10 mg/kg的范围内。示例性的治疗方案需要给予每天一次、每天两次、每周两次、每周三次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每三到六个月一次。本公开的大环肽的优选剂量方案包括经静脉给予1 mg/kg体重或3 mg/kg体重，其中使用以下给药方案之一给予大环：(i) 每四周六个剂量，然后每三个月一次；(ii) 每三周一次；(iii) 3 mg/kg体重一次，随后每三周1 mg/kg体重。
在一些方法中，同时给予两种或多种具有不同结合特异性的大环肽，在这种情况下，给予的每种化合物的剂量落在所示的范围内。这些化合物通常多次给予。单次剂量之间的间隔可为例如每周一次、每月一次、每三个月一次或每年一次。如通过在患者测量针对靶抗原的大环肽的血液水平所示的，间隔也可不规则。在一些方法中，调整剂量以达到约1-1000 μg/ml的血浆浓度，并且在一些方法中为约25-300 μg/ml。
或者，大环肽可作为持续释放制剂给予，在这种情况下需要较低频率的给予。给予的剂量和频率可根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，相对较低的剂量以相对频繁的间隔经长时间段给予。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔给予相对高的剂量直至疾病的发展减少或终止，并且优选地直至患者显示出疾病症状的部分或完全改善。之后，可给予患者预防性方案。
可改变本公开的药用组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得对特定患者、组合物和给予方式有效实现期望的治疗反应且对患者没有毒性的活性成分的量。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所使用的本公开特定组成或其酯、盐或酰胺的活性，所使用的具体化合物的给予途径、给予时间、排泄速率、治疗的持续时间、与所使用的特定组成组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和既往病史等医学领域众所周知的因素。
本公开的大环肽的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重程度降低、疾病无症状期的频率和持续时间增加或者由于感病性造成的损伤或致残的预防。例如，对于肿瘤的治疗，“治疗有效剂量”优选地相对于未治疗的受试者抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20%，更优选地至少约40%，甚至更优选地至少约60%，和仍然更优选地至少约80%。化合物抑制肿瘤生长和/或HIV的能力可以预测人类肿瘤效力或病毒效力的动物模型系统进行评估。或者，组合物的这种性质可通过检查化合物抑制的能力来评估，这种抑制在体外通过熟练从业者已知的测定进行。治疗有效量的治疗化合物可减少肿瘤大小、降低病毒载量或者改善受试者的症状。本领域的普通技术人员将能够基于比如受试者的体型大小、受试者症状的严重程度和所选择的特定组成或给予途径等因素来确定这种量。
另一方面，本公开提供一种包含大环肽和另一种免疫调节剂的药用试剂盒，如本文所述。试剂盒还可进一步包含用于治疗过度增殖性疾病(比如本文所述的癌症)和/或抗病毒疾病的说明书。
本公开的组合物可使用本领域已知的多种方法中的一种或多种经一种或多种给予途径给予。如技术人员所意识到的，给予途径和/或方式将根据期望的结果而变化。本公开的大环肽的优选给予途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他非肠道给予途径(例如通过注射或输注)。本文使用的短语“非肠道给予”意指除肠内和局部给予以外的给予方式，通常通过注射，并且包括(但不限于)静脉内、肌内、动脉内，鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
或者，本公开的大环肽可经非肠道途径给予，比如局部、表皮或粘膜给予途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部给予。
活性化合物可用将保护化合物免于快速释放的载体制备，比如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化传递系统。可使用可生物降解的、生物相容性聚合物，比如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种制剂的许多方法为获得专利权的或本领域技术人员通常已知的。参见例如Robinson, J.R., ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., NewYork(1978)。
治疗组合物可与本领域已知的医疗装置一起给予。例如，在一个优选的实施方案中，本公开的治疗组合物可与无针皮下注射装置，比如美国专利第5399163、5383851、5312335、5064413、4941880、4790824或4596556号中公开的装置一起给予。可用于本公开的众所周知的植入物和模块的实例包括：美国专利第4487603号，其公开了一种用于以受控速率分配药物的可植入微量输液泵；美国专利第4486194号，其公开了一种用于通过皮肤给予药物的治疗装置；美国专利第4447233号，其公开了一种用于以准确输注速率传递药物的药物输注泵；美国专利第4447224号，其公开了一种用于连续药物传递的可变流动植入式输注装置；美国专利第4439196号，其公开了一种具有多室隔室的渗透性药物传递系统；和美国专利第4475196号，其公开了一种渗透性药物传递系统。这些专利通过参考结合到本文中。许多其他这种植入物、传递系统和模块为本领域的技术人员已知的。
在某些实施方案中，可配制本公开的大环肽以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高度亲水性化合物。为了确保本公开的治疗性化合物穿过BBB (如果需要)，可将其例如以脂质体配制。对于制备脂质体的方法，参见例如美国专利第4522811、5374548和5399331号。脂质体可包含一个或多个部分，其选择性地转运至特定细胞或器官中，从而增强靶向药物传递(参见例如Ranade, V.V., J. Clin. Pharmacol., 29:685(1989))。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如Low等的美国专利第5416016号)、甘露糖苷(Umezawa et al., Biochem. Biophys.Res. Commun.,153:1038 (1988))、大环肽(Bloeman, P.G. et al., FEBS Lett., 357:140 (1995); Owais, M. et al.,Antimicrob. Agents Chemother., 39:180 (1995))、表面活性蛋白A受体(Briscoe etal., Am. J. Physiol.,1233:134 (1995))、p120 (Schreier et al., J. Biol. Chem.,269:9090 (1994))，还可参见Keinanen, K. et al., FEBS Lett., 346:123 (1994);Killion, J.J. et al., Immunomethods 4:273 (1994)。
本公开的用途和方法
本公开的大环肽、组合物和方法具有许多体外和体内用途，包括例如通过阻断PD-L1检测PD-L1或增强免疫反应。例如，这些分子可体外或离体给予培养中的细胞，或者例如体内给予人类受试者，以在多种情况下增强免疫力。因此，在一个方面，本公开提供一种在受试者中修饰免疫反应的方法，其包括给予受试者本公开的大环肽，使得受试者的免疫反应被修饰。优选地，反应被增强、刺激或上调。在其他方面，大环肽可具有抗犬、抗小鼠和/或抗土拨鼠的结合和治疗活性。
本文使用的术语“受试者”旨在包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，比如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、土拨鼠、两栖动物和爬行动物，尽管哺乳动物为优选的，比如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛和马。优选的受试者包括需要增强免疫反应的人类患者。该方法特别适合于治疗患有可通过增强T细胞介导的免疫反应来治疗的障碍的人类患者。在一个具体实施方案中，该方法特别适合于治疗体内的癌细胞。为了实现免疫的抗原特异性增强，可将大环肽与感兴趣的抗原一起给予。当将针对PD-L1的大环肽与另一种药物一起给予时，这两者可按顺序或同时给予。
本公开进一步提供用于检测样品中人、土拨鼠、犬和/或小鼠PD-L1抗原的存在，或者测量人、土拨鼠、犬和/或小鼠PD-L1抗原的量的方法，方法包括在使得能够在大环和人、土拨鼠、犬和/或小鼠PD-L1之间形成复合物的条件下使样品和对照样品与同人、土拨鼠、犬和/或小鼠PD-L1特异性结合的参考大环肽接触。然后检测复合物的形成，其中样品与对照样品相比较形成的复合物差异表明样品中存在人、土拨鼠、犬和/或小鼠PD-L1抗原。
鉴于本公开的大环肽对PD-L1的特异性结合，与CD28、ICOS和CTLA-4相比较，本公开的大环肽可用于特异性地检测细胞表面上的PD-L1表达，而且可用于经免疫亲和纯化来纯化PD-L1。
癌症
通过大环肽阻断PD-1可增强对患者癌细胞的免疫反应。PD-1的配体PD-L1不在正常人体细胞中表达，但在多种人类癌症中丰富(Dong et al., Nat. Med., 8:787-789(2002))。PD-1和PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少和癌细胞的免疫逃逸(Dong et al., J. Mol. Med., 81:281-287 (2003); Blank etal., Cancer Immunol. Immunother., 54:307-314 (2005); Konishi et al., Clin. Cancer Res., 10:5094-5100 (2004))。通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用可逆转免疫抑制，并且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时，效果是相加的(Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:12293-12297 (2002); Brown et al., J. Immunol., 170:1257-1266 (2003))。尽管先前的研究表明通过抑制PD-1与PD-L1的相互作用可恢复T细胞增殖，但是没有通过阻断PD-1/PD-L1相互作用对体内癌症肿瘤生长的直接影响的报道。在一个方面，本公开涉及使用大环肽体内治疗受试者使得抑制癌性肿瘤的生长。可单独使用大环肽来抑制癌性肿瘤的生长。或者，大环肽可连同其他免疫原性药物、标准癌症治疗或其他大环肽一起使用，如下所述。
因此，在一个实施方案中，本公开提供一种在受试者中抑制肿瘤细胞生长的方法，方法包括给予受试者治疗有效量的大环肽。
可使用本公开的大环肽抑制其生长的优选癌症包括一般地对免疫疗法有反应的癌症。用于治疗的优选癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾细胞癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌和去势抗性前列腺癌)、乳腺癌、结直肠癌和肺癌(例如鳞状和非鳞状非小细胞肺癌)。另外，本公开包括其生长可使用本公开的大环肽来抑制的难治性或复发性恶性肿瘤。
可使用本公开的方法治疗的其他癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛门区域癌症、胃/胃部癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌症、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、儿童实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤)、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波济氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的癌症)和所述癌症的组合。本公开还可用于治疗转移性癌症，尤其是表达PD-L1的转移性癌症(Iwai et al., Int. Immunol.,17:133-144 (2005))。
任选地，针对PD-L1的大环肽可与免疫原性药物比如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞(He et al., J.Immunol., 173:4919-4928 (2004))组合。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，比如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽，或转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(以下进一步讨论)。
在人类已显示出一些肿瘤比如黑素瘤具有免疫原性。预计通过PD-L1阻断提高T细胞活化的阈值，我们可期望在宿主激活肿瘤反应。
当与疫苗接种方案组合时，PD-L1阻断可能是最有效的。已设计了许多用于针对肿瘤进行疫苗接种的实验策略(参见Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines,ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000); Logothetis, C., ASCO EducationalBook Spring:300-302 (2000); Khayat, D., ASCO Educational Book Spring:414-428(2000); Foon, K., ASCO Educational Book Spring:730-738 (2000); 还可参见Restifo, N. et al., Cancer Vaccines, Chapter 61, pp. 3023-3043, in DeVita, V.et al., eds., Cancer:Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition(1997))。在这些策略之一中，疫苗使用自体或同种异体肿瘤细胞进行制备。当肿瘤细胞被转导以表达GM-CSF时，这些细胞疫苗显示出最有效。GM-CSF显示出为用于肿瘤疫苗接种的抗原呈递的有效激活剂(Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:3539-3543(1993))。
对各种肿瘤中的基因表达和大规模基因表达模式的研究已经导致所谓的肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg, S.A., Immunity, 10:281-287 (1999))。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原为在肿瘤和肿瘤产生的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可显示为宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。PD-L1阻断可连同肿瘤中表达的重组蛋白和/或肽的集合一起使用，以产生对这些蛋白的免疫反应。这些蛋白通常被免疫系统视为自身抗原，并因此对它们具有耐受性。肿瘤抗原还可包括蛋白端粒酶，其为用于合成染色体端粒所需的，并且在超过85%的人类癌症和仅在有限数目的体细胞组织中表达(Kim, N et al., Science, 266:2011-2013(1994))。(可通过各种手段保护这些体细胞组织免受免疫攻击)。因为改变蛋白序列或在两个不相关的序列(即费城染色体中的bcr-abl)之间产生融合蛋白的体细胞突变，或者来自B细胞肿瘤的独特型，肿瘤抗原也可为癌细胞中表达的“新生抗原”。
其他肿瘤疫苗可包括来自与人类癌症有关的病毒的蛋白，比如人类乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KHSV)。可连同PD-L1阻断一起使用的另一种形式的肿瘤特异性抗原为从肿瘤组织本身分离的纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白片段，并且这些HSP在传递至抗原呈递细胞以引发肿瘤免疫时是高效的(Suot, R. et al., Science, 269:1585-1588 (1995); Tamura, Y.et al., Science, 278:117-120 (1997))。
树突状细胞(DC)为有效的抗原呈递细胞，可用于引发抗原特异性反应。DC可离体产生并载有各种蛋白和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle, F. et al., Nat. Med.,4:328-332 (1998))。DC也可通过遗传手段转导以表达这些肿瘤抗原。出于免疫的目的，DC也已直接与肿瘤细胞融合(Kugler, A. et al., Nat. Med., 6:332-336 (2000))。作为疫苗接种的方法，DC免疫可与PD-L1阻断有效组合，以激活更有效的抗肿瘤反应。
PD-L1阻断也可与标准癌症治疗组合。PD-L1阻断可有效地与化疗方案组合。在这些情况下，可减少给予的化学治疗剂的剂量(Mokyr, M. et al., Cancer Res., 58:5301-5304 (1998))。这种组合的一个实例为大环肽与氮烯咪胺组合用于治疗黑素瘤。这种组合的另一个实例为大环肽与白细胞介素-2 (IL-2)组合用于治疗黑素瘤。组合使用PD-L1阻断和化学疗法背后的科学原理为，细胞死亡是大多数化学治疗性化合物的细胞毒作用的结果，应导致抗原呈递途径中肿瘤抗原水平的增加。可通过细胞死亡导致与PD-L1阻断协同作用的其他组合疗法为放射疗法、手术和激素剥夺。这些方案中的每一种在宿主产生肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂也可与PD-L1阻断组合。抑制可将肿瘤抗原供给宿主抗原呈递途径的血管生成导致肿瘤细胞死亡。
阻断PD-L1的大环肽也可与双特异性大环肽组合使用，双特异性大环肽使表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞(参见例如美国专利第5922845和5837243号)。双特异性大环肽可用于靶向两种单独的抗原。例如，已使用抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如Her-2/neu)双特异性大环肽使巨噬细胞靶向肿瘤部位。该靶向可更有效地激活肿瘤特异性反应。这些反应的T细胞臂将通过使用PD-L1阻断来增强。或者，可通过使用与肿瘤抗原和树突状细胞特异性细胞表面标志物结合的双特异性大环肽将抗原直接传递至DC。
肿瘤通过各种机制逃逸宿主免疫监视。许多这些机制可通过由肿瘤表达并且免疫抑制的蛋白的失活来克服。这些其中包括TGF-β (Kehrl, J. et al., J. Exp. Med.,163:1037-1050 (1986))、IL-10 (Howard, M. et al., Immunology Today, 13:198-200(1992))和Fas配体(Hahne, M. et al., Science, 274:1363-1365 (1996))。针对这些实体中每一个的大环肽可与抗PD-L1组合使用以抵消免疫抑制剂的作用和有利于宿主的肿瘤免疫反应。
可用于活化宿主免疫反应性的其他大环肽可与抗PD-L1组合使用。这些包括树突状细胞表面上的分子，其活化DC功能和抗原呈递。抗CD40大环肽能够有效地替代T细胞辅助活动(Ridge, J. et al., Nature, 393:474-478 (1998))并可连同PD-1抗体一起使用(Ito, N. et al., Immunobiology, 201(5):527-540 (2000))。将大环肽活化至T细胞共刺激分子比如CTLA-4 (例如美国专利第5811097号)、OX-40 (Weinberg, A. et al.,Immunol., 164:2160-2169 (2000))、4-1BB (Melero, I. et al., Nat. Med., 3:682-685 (1997)和ICOS (Hutloff, A. et al., Nature, 397:262-266 (1999))也可提供增加水平的T细胞活化。
骨髓移植目前正用于治疗多种造血来源的肿瘤。尽管移植物抗宿主病为该治疗的结果，但是可通过移植物抗肿瘤反应获得治疗益处。PD-L1阻断可用于增加供体移植的肿瘤特异性T细胞的有效性。
还有一些实验性治疗方案涉及抗原特异性T细胞的离体活化和扩增以及这些细胞过继转移至接受者以抗原特异性T细胞对抗肿瘤(Greenberg, R. et al., Science, 285:546-551 (1999))。这些方法也可用于活化T细胞对感染因子比如CMV的反应。预期在存在大环肽的情况下进行离体活化可增加过继转移的T细胞的频率和活性。
感染性疾病
本公开的其他方法用于治疗已经暴露于特定毒素或病原体的患者。因此，本公开的另一方面提供一种在受试者中治疗感染性疾病的方法，方法包括给予受试者本公开的大环肽，使得受试者针对感染性疾病进行治疗。
类似于如上所讨论的其对肿瘤的应用，PD-L1阻断可单独使用，或作为辅剂与疫苗组合使用，以刺激对病原体、毒素和自身抗原的免疫反应。该治疗方法可能特别有用的病原体的实例包括目前没有有效疫苗的病原体或常规疫苗不完全有效的病原体。这些包括(但不限于) HIV、肝炎(甲、乙和丙型)、流感、疱疹、贾第鞭毛虫、疟疾(Butler, N.S. et al.,Nature Immunology13, 188-195 (2012); Hafalla, J.C.R., et al. PLOS Pathogens;February 2, 2012))、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。PD-L1阻断对于在感染过程中呈现改变的抗原的因子比如HIV建立的感染特别有用。这些新的表位在抗人PD-L1给予时被识别为外来的，从而引起强烈的T细胞反应，其不会被PD-L1的负信号抑制。
引起可通过本公开的方法治疗的感染的致病病毒的一些实例包括HIV、肝炎(甲、乙和丙型)、疱疹病毒(herpes virus) (例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒(adenovirus)、流感病毒(influenza virus)、黄病毒(influenza virus)、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、冠状病毒属(coronavirus)、呼吸道合胞病毒(espiratory syncytial virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、轮状病毒(rotavirus)、麻疹病毒(measles virus)、风疹病毒(rubella virus)、细小病毒(parvovirus)、痘苗病毒(vaccinia virus)、HTLV病毒、登革病毒(dengue virus)、乳头瘤病毒(papillomavirus)、软疣病毒(molluscum virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、狂犬病毒(rabies virus)、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒(arboviral encephalitis virus)。
引起可通过本公开的方法治疗的感染的致病性细菌的一些实例包括衣原体(chlamydia)、立克次氏体细菌(rickettsial bacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和淋球菌(conococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、军团菌(legionella)、白喉(diphtheria)、沙门氏菌(salmonella)、杆菌(bacilli)、霍乱(cholera)、破伤风(tetanus)、肉毒中毒(botulism)、炭疽(anthrax)、鼠疫(plague)、钩端螺旋体病(leptospirosis)和莱姆病(Lyme disease)细菌。
引起可通过本公开的方法治疗的感染的致病性真菌的一些实例包括念珠菌(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克鲁斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉菌(Aspergillus) (烟曲霉菌(fumigatus)、黑曲霉菌(niger)等)、毛霉属(Genus Mucorales)(毛霉菌(mucor)、梨头霉(absidia)、根霉菌(rhizophus))、申克氏胞丝菌(Sporothrixschenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可通过本公开的方法治疗的感染的致病性寄生虫的一些实例包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋绦虫(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴原虫(Naegleria fowleri)、棘阿米巴属(Acanthamoeba sp.)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialambia) 、隐孢子虫属(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、果氏巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、冈氏弓形虫(Toxoplasma gondi)和巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
在所有以上方法中，PD-L1阻断可与其他形式的免疫疗法组合，比如细胞因子治疗(例如干扰素、靶向VEGF活性或VEGF受体的药物、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或双特异性抗体疗法，其提供增强的肿瘤抗原呈递(参见例如Holliger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993); Poljak, Structure, 2:1121-1123 (1994))。
自身免疫反应
大环肽可引发和放大自身免疫反应。确实，使用肿瘤细胞和肽疫苗诱导抗肿瘤反应表明许多抗肿瘤反应涉及抗自身反应性(在van Elsas等人的上文中抗CTLA-4 + GM-CSF-修饰的B16黑素瘤中观察到的脱色、在Trp-2疫苗接种小鼠中的脱色(Overwijk, W. etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:2982-2987 (1999))、TRAMP肿瘤细胞疫苗诱发的自身免疫性前列腺炎(Hurwitz, A., supra (2000))、黑素瘤肽抗原接种疫苗和在人临床试验中观察到的白癫风(Rosenberg, S.A. et al., J. Immunother.Emphasis Tumor Immunol., 19(1):81-84 (1996))。
因此，可考虑连同各种自身蛋白一起使用抗PD-L1阻断，以设计疫苗接种方案以有效地产生针对这些自身蛋白的免疫反应用于疾病治疗。例如，阿尔茨海默病涉及大脑中淀粉样沉积物中的Aβ肽的不适当累积，针对淀粉样沉积物的抗体反应能够清除这些淀粉样沉积物(Schenk et al., Nature, 400:173-177 (1999))。
其他自身蛋白也可用作靶标，比如用于治疗变态反应和哮喘的IgE以及用于治疗类风湿性关节炎的TNFα。最后，可通过使用本文公开的大环来诱导针对各种激素的抗体反应。中和性抗体对生殖激素的反应可用于避孕。中和性抗体对特定肿瘤生长所需的激素和其他可溶性因子的反应也可认为是可能的疫苗接种目标。
如上所述的用于抗PD-L1大环化合物的类似方法可用于诱导治疗性自身免疫反应，以治疗具有不适当累积的其他自身抗原比如淀粉样沉积物(包括阿尔茨海默病中的Aβ)、细胞因子比如TNFα和IgE的患者。
疫苗
通过共同给予抗PD-1大环化合物与感兴趣的抗原(例如疫苗)，大环肽可用于刺激抗原特异性免疫反应。因此，另一方面，本公开提供一种在受试者中增强对抗原的免疫反应的方法，方法包括给予受试者：(i) 抗原；和(ii) 抗PD-1大环化合物，使得在受试者中增强对抗原的免疫反应。抗原可为例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。这种抗原的非限制性实例包括以上部分中讨论的那些，比如以上讨论的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)或者来自上述病毒、细菌或其他病原体的抗原。
体内和体外给予本公开的组合物(例如大环肽、多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)的合适途径为本领域熟知的，并且可由普通技术人员进行选择。例如，组合物可通过注射(例如静脉或皮下)给予。所用分子的合适剂量取决于受试者的年龄和体重以及组合物的浓度和/或制剂。
如前所述，本公开的大环肽可与一种或其他多种治疗剂共同给予，例如细胞毒剂、放射性毒剂或免疫抑制剂。肽可与药物连接(作为免疫复合物)，或者可与药物分开给予。在后者情况下(单独给予)，肽可在药物之前、之后或与药物同时给予，或者可与其他已知疗法例如抗癌疗法(例如放射疗法)共同给予。这种治疗剂其中包括抗肿瘤剂，比如多柔比星(阿霉素)、顺铂硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、氮烯咪胺和环磷酰胺羟基脲，它们本身仅在对患者毒性或亚毒性的水平下有效。顺铂每四周一次作为100 mg/剂静脉给予，和阿霉素每21天一次作为60-75 mg/ml剂量静脉给予。本公开的大环肽与化学治疗剂的共同给予提供两种抗癌剂，其经不同的机制起作用，对人体肿瘤细胞产生细胞毒性作用。这种共同给予可解决由于对药物出现耐药性或肿瘤细胞的抗原性变化而使其与肽不反应的问题。
包含本公开的组成(例如大环肽、双特异性或多特异性分子或免疫缀合物)和使用说明书的试剂盒也在本公开的范围内。试剂盒可进一步含有至少一种另外的试剂，或者一种或多种另外的本公开的大环肽(例如具有互补活性的人源抗体，其与不同于大环化合物的PD-L1抗原中的表位结合)。试剂盒一般地包含表明试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的，或者试剂盒附带的任何书写或记录材料。
组合疗法
本公开的大环肽与另一种PD-L1拮抗剂和/或其他免疫调节剂的组合可用于增强针对过度增殖性疾病的免疫反应。例如，这些分子可体外或离体给予培养中的细胞，或者例如体内给予人类受试者，以在多种情况下增强免疫力。因此，在一个方面，本公开提供一种在受试者中修饰免疫反应的方法，方法包括给予受试者本公开的大环肽，使得受试者的免疫反应被修饰。优选地，反应被增强、刺激或上调。在另一个实施方案中，本公开提供一种改变与用免疫刺激性治疗剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，方法包括给予受试者本公开的大环肽和亚治疗剂量的另一种免疫调节剂。
通过大环肽阻断PD-L1可增强对患者癌细胞的免疫反应。可使用本公开的大环肽抑制其生长的癌症包括一般地对免疫疗法有反应的癌症。用本公开的组合疗法治疗的癌症的代表性实例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌和肺癌。可使用本公开的方法治疗的其他癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌症、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、儿童实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤)、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波济氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的癌症)和所述癌症的组合。本公开还可用于治疗转移性癌症。
在某些实施方案中，含有至少一种本文讨论的大环肽的治疗剂的组合可作为药学上可接受的载体中的单一组合物同时给予，或者作为单独的组合物同时给予，其中每种药物可依序给予。例如，本公开的第二免疫调节剂和大环肽可依序给予，比如首先给予第二免疫调节剂和其次给予大环肽，或者首先给予大环肽和其次给予第二免疫调节剂。此外，如果依序给予多于一剂的组合疗法，则依序给予的顺序可在每个给予时间点颠倒或保持相同的顺序，依序给予可与同时给予或其任何组合组合。例如，第二免疫调节剂和大环肽的第一次给予可同时进行，第二次给予可依序进行首先给予第二免疫调节剂和其次给予大环肽，和第三次给予可依序进行首先给予大环肽和其次给予第二免疫调节剂等。另一个代表性的给药方案可能涉及第一次给予，其依序进行首先给予大环肽和其次给予第二免疫调节剂，并且随后给予可同时进行。
任选地，大环肽和第二免疫调节剂的组合可进一步与免疫原性药物组合，比如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞(He et al., J. Immunol., 173:4919-4928 (2004))。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，比如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽，或者转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(以下进一步讨论)。
组合的PD-L1大环肽和第二免疫调节剂可进一步与疫苗接种方案组合。已设计许多用于针对肿瘤的疫苗接种的实验策略(参见Rosenberg, S., Development of CancerVaccines, ASCO Educational Book Spring:60-62 (2000); Logothetis, C., ASCOEducational Book Spring:300-302 (2000); Khayat, D., ASCO Educational BookSpring: 414-428 (2000); Foon, K., ASCO Educational Book Spring:730-738(2000); see also Restifo et al., Cancer Vaccines, Chapter 61, pp. 3023-3043in DeVita et al., eds., Cancer:Principles and Practice of Oncology, FifthEdition (1997))。在这些策略之一中，疫苗使用自体或同种异体肿瘤细胞制备。当肿瘤细胞被转导以表达GM-CSF时，这些细胞疫苗显示出最有效。GM-CSF显示出为用于肿瘤疫苗接种的抗原呈递的有效活化剂(Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:3539-3543 (1993))。
对各种肿瘤中的基因表达和大规模基因表达模式的研究已经导致所谓的肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg, Immunity, 10:281-287 (1999))。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原为在肿瘤和肿瘤产生的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可显示为宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。在某些实施方案中，组合的PD-L1大环肽和第二免疫调节剂可连同肿瘤中表达的重组蛋白和/或肽的集合一起使用，以产生对这些蛋白的免疫反应。这些蛋白通常被免疫系统视为自身抗原，并因此对它们具有耐受性。肿瘤抗原还可包括蛋白端粒酶，其为用于合成染色体端粒所需的，并且在超过85%的人类癌症和仅在有限数目的体细胞组织中表达(Kim et al.,Science, 266:2011-2013 (1994))。(可通过各种手段保护这些体细胞组织免受免疫攻击)。因为改变蛋白序列或在两个不相关的序列(即费城染色体中的bcr-abl)之间产生融合蛋白的体细胞突变，或者来自B细胞肿瘤的独特型，肿瘤抗原也可为癌细胞中表达的“新生抗原”。
其他肿瘤疫苗可包括来自与人类癌症有关的病毒的蛋白，比如人类乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KHSV)。可连同PD-L1大环肽阻断一起使用的另一种形式的肿瘤特异性抗原为从肿瘤组织本身分离的纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白片段，并且这些HSP在传递至抗原呈递细胞以引发肿瘤免疫时是高效的(Suot, R. et al., Science, 269:1585-1588 (1995);Tamura et al., Science, 278:117-120 (1997))。
树突状细胞(DC)为有效的抗原呈递细胞，可用于引发抗原特异性反应。DC可离体产生并载有各种蛋白和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle, F. et al., Nat. Med., 4:328-332 (1998))。DC也可通过遗传手段转导以表达这些肿瘤抗原。出于免疫的目的，DC也已直接与肿瘤细胞融合(Kugler, A. et al., Nat. Med., 6:332-336 (2000))。作为疫苗接种的方法，DC免疫可有效地进一步与组合的抗PD-L1大环肽和第二免疫调节剂组合，以激活更有效的抗肿瘤反应。
组合的抗PD-L1大环肽和另外的免疫调节剂也可进一步与标准癌症治疗组合。例如，大环肽和第二免疫调节剂的组合可有效地与化疗方案组合。在这些情况下，如对大环肽和第二免疫调节剂的组合观察到的那样，可减少用本公开的组合给予的其他化学治疗剂的剂量(Mokyr et al., Cancer Res., 58:5301-5304 (1998))。这种组合的一个实例为大环肽和第二免疫调节剂的组合，其进一步与氮烯咪胺组合用于治疗黑素瘤。另一个实例为大环肽和第二免疫调节剂的组合，其进一步与白细胞介素-2 (IL-2)组合用于治疗黑素瘤。组合使用PD-L1大环肽和另一种免疫调节剂与化学治疗背后的科学原理为，细胞死亡是大多数化学治疗性化合物的细胞毒作用的结果，应导致抗原呈递途径中肿瘤抗原水平的增加。可通过细胞死亡导致与组合的抗PD-L1大环肽和另外的免疫调节剂协同作用的其他组合疗法包括放射疗法、手术或激素剥夺。这些方案中的每一种在宿主产生肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂也可与组合的PD-L1和第二免疫调节剂组合。血管生成的抑制导致肿瘤细胞死亡，其也可为供给宿主抗原呈递途径的肿瘤抗原的来源。
PD-L1和另一种免疫调节剂的组合也可与双特异性大环肽组合使用，双特异性大环肽使表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞(参见例如美国专利第5922845和5837243号)。双特异性大环肽可用于靶向两种单独的抗原。例如，已使用抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如Her-2/neu)双特异性大环肽使巨噬细胞靶向肿瘤部位。该靶向可更有效地激活肿瘤特异性反应。这些反应的T细胞臂将通过使用组合的PD-L1和第二免疫调节剂来增强。或者，可通过使用与肿瘤抗原和树突状细胞特异性细胞表面标志物结合的双特异性大环肽将抗原直接传递至DC。
在另一个实例中，大环肽和第二免疫调节剂的组合可连同以下抗肿瘤大环药物一起使用，比如RITUXAN® (利妥昔单抗)、HERCEPTIN® (曲妥珠单抗)、BEXXAR® (托西莫单抗)、ZEVALIN® (替伊莫单抗)、CAMPATH® (阿仑单抗)、Lymphocide (依帕珠单抗)、AVASTIN® (贝伐单抗)和TARCEVA® (厄洛替尼)等。作为实例并且不希望受到理论的束缚，用抗癌抗体或与毒素缀合的抗癌抗体进行治疗可导致癌细胞死亡(例如肿瘤细胞)，其将增强由第二免疫调节剂或靶标或PD-L1介导的免疫反应。在一个示例性实施方案中，过度增殖性疾病(例如癌症肿瘤)的治疗可包括与大环肽和第二免疫调节剂同时或依序组合的抗癌抗体或其任何组合，其可增强宿主的抗肿瘤免疫反应。
肿瘤通过各种机制逃逸宿主免疫监视。许多这些机制可通过由肿瘤表达并且免疫抑制的蛋白的失活来克服。这些其中包括TGF-β (Kehrl, J. et al., J. Exp. Med.,163:1037-1050 (1986))、IL-10 (Howard, M. et al., Immunology Today, 13:198-200(1992))和Fas配体(Hahne, M. et al., Science, 274:1363-1365 (1996))。在另一个实例中，针对这些实体中每一个的抗体可进一步与大环肽和另一种免疫抑制剂组合以抵消免疫抑制剂的作用和有利于宿主的抗肿瘤免疫反应。
可用于活化宿主免疫反应性的其他药物可进一步与本公开的大环肽组合使用。这些包括树突状细胞表面上的分子，其活化DC功能和抗原呈递。抗CD40大环肽能够有效地替代T细胞辅助活动(Ridge, J. et al., Nature, 393:474-478 (1998))并可连同本公开的大环肽(单独或与抗CTLA-4组合)一起使用(Ito, N. et al., Immunobiology, 201(5):527-540 (2000))。将大环肽活化至T细胞共刺激分子比如OX-40 (Weinberg, A. et al.,Immunol., 164:2160-2169 (2000))、4-1BB (Melero, I. et al., Nat. Med., 3:682-685 (1997)和ICOS (Hutloff, A. et al., Nature, 397:262-266 (1999))也可提供增加水平的T细胞活化。
骨髓移植目前正用于治疗多种造血来源的肿瘤。尽管移植物抗宿主病为该治疗的结果，但是可从移植物抗肿瘤反应获得治疗益处。本公开的大环肽，单独或与另一种免疫调节剂组合，可用于增加供体移植的肿瘤特异性T细胞的有效性。
还有一些实验性治疗方案涉及抗原特异性T细胞的离体活化和扩增以及这些细胞过继转移至接受者以抗原特异性T细胞对抗肿瘤(Greenberg, R. et al., Science, 285:546-551 (1999))。这些方法也可用于活化T细胞对感染因子比如CMV的反应。预期在存在本公开的大环肽的情况下，单独或与另一种免疫调节剂组合进行离体活化可增加过继转移的T细胞的频率和活性。
在某些实施方案中，本公开提供一种改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，方法包括将本公开的大环肽与亚治疗剂量的另一种免疫调节剂组合给与受试者。例如，本公开的方法提供一种通过给予患者不可吸收的类固醇来降低免疫刺激性治疗性抗体诱发的结肠炎或腹泻的发生率的方法。因为任何接受免疫刺激性治疗性抗体的患者均处于出现由这种治疗诱发的结肠炎或腹泻的风险下，所以整个患者人群适合于本公开的方法的治疗。尽管已经给予类固醇来治疗炎症性肠病(IBD)和预防IBD的恶化，但其尚未用于预防尚未诊断患有IBD的患者的IBD (降低其发病率)。与类固醇(甚至是不可吸收的类固醇)相关的显著副作用阻碍了预防性使用。
在进一步的实施方案中，本公开的大环肽(单独或与另一种免疫调节剂组合)可进一步与任何不可吸收的类固醇的使用组合。本文使用的“不可吸收的类固醇”为糖皮质激素，其呈现出广泛的首过代谢，使得在肝脏代谢后，类固醇的生物利用度低，即低于约20%。在本公开的一个实施方案中，不可吸收的类固醇为布地奈德。布地奈德为局部作用的糖皮质类固醇，其在口服给予后主要通过肝脏广泛代谢。ENTOCORT®EC (Astra-Zeneca)为一种pH和时间依赖性的布地奈德口服制剂，其被开发以优化向回肠和整个结肠的药物传递。ENTOCORT®EC在美国被批准用于治疗涉及回肠和/或升结肠的轻度至中度克罗恩病。用于治疗克罗恩病的ENTOCORT®EC的常用口服剂量为6-9 mg/天。ENTOCORT®EC在被吸收并保留在肠粘膜中之前在肠内释放。一旦其通过肠粘膜靶组织，ENTOCORT®EC被肝脏中的细胞色素P450系统广泛代谢，代谢产物具有可忽略的糖皮质激素活性。因此，生物利用度低(约10%)。与其他糖皮质激素相比较，布地奈德的生物利用度低导致治疗比率提高，首过代谢不太广泛。与全身作用的皮质类固醇相比较，布地奈德导致不良反应较少，包括下丘脑-垂体抑制较少。然而，长期给予ENTOCORT®EC可导致全身性糖皮质激素效应，比如肾上腺功能亢进和肾上腺抑制。参见Physicians' Desk Reference Supplement, 58th Edition, 608-610 (2004)。
在更进一步的实施方案中，PD-L1和另一种免疫调节剂连同不可吸收的类固醇一起的组合可进一步与水杨酸盐组合。水杨酸盐包括5-ASA药物，比如：柳氮磺胺吡啶(AZULFIDINE®, Pharmacia & Upjohn)、奥沙拉秦(DIPENTUM®, Pharmacia & UpJohn)、巴沙拉秦(COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.)和美沙拉嗪(ASACOL®, Procter& Gamble Pharmaceuticals; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm,Inc.; ROWASA®, Solvay)。
剂量和制剂
合适的式I的肽，或者更具体地讲本文所述的大环肽，可作为单独的化合物和/或以药用制剂的形式与可接受的载体混合给予患者以治疗糖尿病和其他相关疾病。治疗糖尿病领域的技术人员可易于确定化合物给予需要这种治疗的哺乳动物(包括人)的剂量和给予途径。给予途径可包括(但不限于)口服、口内、直肠、经皮、颊、鼻内、肺、皮下、肌内、皮内、舌下、结肠内、眼内、静脉内或肠内给予。化合物基于可接受的药学实践，根据给予途径进行配制(Fingl et al., in The Pharmacological Basis of Therapeutics, Chapter1, p.1 (1975); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack PublishingCo., Easton, PA (1990))。
本文所述的药学上可接受的肽组合物可以多剂量形式给予，比如片剂、胶囊剂(其每种包括持续释放或定时释放制剂)、丸剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、原位凝胶剂、微球、晶体复合物、脂质体、微乳剂、酊剂、混悬剂、糖浆剂、气溶胶喷雾剂和乳剂。本文所述的组合物还可以口服、静脉内(推注或输注)、腹膜内、皮下、经皮或肌内形式给予，所有这些均使用制药领域的普通技术人员熟知的剂型。组合物可单独给予，但通常与基于所选给予途径和标准制药实践选择的药用载体一起给予。
当然，本文所述组合物的剂量方案将根据已知因素而变化，比如特定药物的药效学特征及其给予方式和途径；接受者的物种、年龄、性别、健康状况、医学状况和体重；症状的性质和程度；同时治疗的种类；治疗频率；给予途径、患者的肾和肝功能以及期望的效果。医师或兽医可确定并开具预防、抵抗或阻止疾病状态的发展所需的药物有效量。
作为一般指导原则，当用于所示效果时，活性成分的每日口服剂量在约0.001-1000 mg/kg体重之间，优选地在约0.01-100 mg/kg体重/天之间，和最优选低在约0.6-20mg/kg/天之间的范围内。当用于所示效果时，活性成分在恒速输注期间的静脉内每日剂量将在0.001 ng-100.0 ng/min/Kg体重的范围内。这种恒定的静脉输注可优选地以0.01 ng-50 ng/min/Kg体重，和最优选地以0.01 ng-10.0 mg/min/Kg体重的速率给予。本文所述的组合物可以单一每日剂量给予，或者总每日剂量可以每日2、3或4次的分开剂量给予。本文所述的组合物还可通过长效制剂给予，使得药物能够经数天/数周/数月的时间段根据需要持续释放。
本文所述的组合物可经局部使用合适的鼻内媒介物以鼻内形式给予，或使用经皮贴剂经经皮途径给予。当以经皮传递系统的形式给予时，剂量给予当然在整个剂量方案中为连续的而不是间歇的。
组合物一般地以与根据预期的给予形式(即口服片剂、胶囊剂、酏剂、用或不用推进剂产生的气溶胶喷雾剂和糖浆剂)适当选择并与常规制药实践一致的合适的药用稀释剂、赋形剂或载体(本文中统称为药用载体)的混合物给予。
例如，对于以片剂或胶囊剂形式的口服给予，活性药物组分可与口服，非毒性，药学上可接受的惰性载体比如(但不限于)乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇和山梨糖醇组合；对于以液体形式的口服给予，口服药物组分可与任何口服，非毒性，药学上可接受的惰性载体比如(但不限于)乙醇、甘油和水组合。此外，当期望或必要时，也可将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入到混合物中。合适的粘合剂包括(但不限于)淀粉、明胶、天然糖类(比如(但不限于)葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味剂、天然和合成树胶(比如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠)、羧甲基纤维素、聚乙二醇和蜡。用于这些剂型的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠。崩解剂包括(但不限于)淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土和黄原胶。
本文所述的组合物还可以混合的胶束或脂质体传递系统比如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡的形式给予。脂质体可由多种磷脂比如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。可添加渗透增强剂以增强药物吸收。
由于已知前药可增强药物的许多期望的品质(即溶解度、生物利用度、制备等)，因此本文所述的化合物可以前药形式传递。因此，本文所述的主题旨在涵盖本发明要求保护的化合物的前药、传递所述化合物的方法以及含有所述化合物的组合物。
本文所述的组合物还可与作为可靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。这些聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或用棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷-聚赖氨酸。此外，本文所述的组合物可与一类可用于实现药物控制释放的可生物降解的聚合物组合，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。
适合于给予的剂型(药用组合物)每剂量单位可含有约0.01毫克-约500毫克的活性成分。在这些药用组合物中，活性成分通常以基于组合物的总重量按重量计约0.5-95%的量存在。
明胶胶囊可含有活性成分和粉末状载体，比如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁和硬脂酸。类似的稀释剂可用于制备压制片剂。片剂和胶囊剂两者均可制成持续释放产品，以经数小时的时间段提供药物的连续释放。压制片剂可为糖包衣或薄膜包衣的，以掩盖任何令人不愉快的味道并保护片剂免受大气影响，或者为肠溶包衣的以在胃肠道中选择性崩解。
用于口服给予的液体剂型可含有着色剂和矫味剂以增加患者的接受度。
通常，水、合适的油、盐水、右旋糖(葡萄糖)水溶液和相关的糖溶液和二醇类比如丙二醇或聚乙二醇为非肠道溶液剂的合适载体。用于非肠道给予的溶液剂优选地含有活性成分的水溶性盐、合适的稳定剂，并且如果必要的话还含有缓冲物质。单独或组合的抗氧化剂比如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸为合适的稳定剂。还使用枸橼酸及其盐和EDTA钠。另外，非肠道溶液剂可含有防腐剂，比如苯扎氯铵、尼泊金甲酯或丙酯和氯丁醇。
合适的药用载体描述于Remington: The Science and Practice of Pharmacy,Nineteenth Edition, Mack Publishing Company (1995) (该领域的标准参考文本)中。
用于给予本文所述化合物的代表性的有用药用剂型可说明如下：
胶囊剂
通过用100 mg粉末状活性成分、150 mg乳糖、50 mg纤维素和6 mg硬脂酸镁填充标准两片式硬明胶胶囊，可制备大量单位胶囊剂。
软明胶胶囊剂
可制备活性成分在可消化油比如大豆油、棉籽油或橄榄油中的混合物，并通过正排量泵注入明胶中以形成含有100 mg活性成分的软明胶胶囊剂。胶囊剂应洗涤和干燥。
片剂
片剂可通过常规程序制备，使得剂量单位例如为100 mg活性成分、0.2 mg胶体二氧化硅、5 mg硬脂酸镁、275 mg微晶纤维素、11 mg淀粉和98.8 mg乳糖。可应用适当的包衣以增加适口性或延迟吸收。
注射剂
本文所述的肽组合物的可注射制剂可需要或可不需要使用赋形剂，比如已由监管机构批准的那些赋形剂。这些赋形剂包括(但不限于)溶剂和共溶剂、增溶剂、乳化剂或增稠剂、螯合剂、抗氧化剂和还原剂、抗微生物防腐剂、缓冲剂和pH调节剂、填充剂、保护剂和张力调节剂及特殊添加剂。可注射制剂必须是无菌的，无热原的，并且在溶液剂的情况下不含颗粒物质。
适合于通过注射给予的非肠道组合物可通过在可含有或不含共溶剂或其他赋形剂的药学上可接受的缓冲液中搅拌例如按重量计1.5%的活性成分来制备。溶液剂应使得与氯化钠等渗并灭菌。
本申请中使用的缩写，特别是包括在以下说明性实施例中的缩写，为本领域的技术人员熟知的。所用的一些缩写如下：HOBt代表羟基苯并三唑；HOAt代表1-羟基-7-氮杂苯并三唑；DIC代表N,N’-二异丙基碳二亚胺；HBTU代表O-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐；BOP代表苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐；PyBOP代表(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐；TIS或TIPS代表三异丙基硅烷；DMSO代表二甲基亚砜；DCM代表二氯甲烷；min代表分钟；h代表小时；RT代表室温或保留时间(上下文决定)；FMOC代表9-芴基甲氧基羰基；TFA代表三氟乙酸；Et代表乙基；DIEA或DIPEA代表二异丙基乙胺；DMF代表N,N-二甲基甲酰胺；HCTU代表O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐；和HATU代表O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐。
混悬剂
可制备用于口服和/或非肠道给予的水性混悬剂，使得例如每5 mL含有100 mg细分的活性成分、20 mg羧甲基纤维素钠、5 mg苯甲酸钠、1.0 g山梨醇溶液(U.S.P.)和0.025mL香草醛或其他可口的矫味剂。
可生物降解的微粒
可制备适合于通过注射给予的持续释放非肠道组合物，例如通过使合适的可生物降解的聚合物溶解于溶剂中，向聚合物溶液中加入待掺入的活性剂，并从基质中去除溶剂，从而形成具有分布于整个基质中的活性剂的聚合物基质。
肽合成
应当理解，基团-C(O)NH-可以两种可能取向中的任何一种在接头X和X’内确定方向(例如作为-C(O)NH-或作为-NHC(O)-)，除非另外说明。
本文中对本公开的描述应当与化学键合的定律和原理一致地理解。应当理解，本公开所包括的化合物为适当稳定用作药物的那些化合物。例如，在式(I)的化合物中，X为1-172个原子的链，其中原子选自碳和氧和其中链可含有1、2、3或4个嵌入其中的选自-NHC(O)NH-和-C(O)NH-的基团，和其中链任选地用1-6个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-(CH2)CO2的基团取代，应该理解，这不包括其中多个杂原子彼此连接的化合物(即-O-O-或O-NHC(O)NH-)，因为这些不认为是稳定的分子。在另一个实例中，X不包括其中两个杂原子仅被一个碳分开的化合物，因为认为这也是不稳定的。基于化学键合和稳定性的一般原理，本领域的技术人员将会知道哪些化合物会稳定和哪些不稳定。
本公开的大环肽的化学合成可使用多种本领域公认的方法进行，包括逐步固相合成、通过肽片段的构象辅助重新连接的半合成、克隆或合成肽段的酶促连接和化学连接。合成本文所述的大环肽及其类似物的优选方法为使用各种固相技术的化学合成，比如Chan,W.C. et al., eds., Fmoc Solid Phase Synthesis, Oxford University Press,Oxford (2000); Barany, G. et al., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology,Vol. 2: "Special Methods in Peptide Synthesis, Part A", pp. 3-284, Gross, E.et al., eds., Academic Press, New York (1980); and in Stewart, J.M. et al.,Solid-Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL(1984)中描述的那些技术。优选的策略基于Fmoc (9-芴基甲基甲氧基羰基)基团用于临时保护α-氨基、与叔丁基组合用于临时保护氨基酸侧链(参见例如Atherton, E. et al., "The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group", in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 9: "Special Methods in Peptide Synthesis,Part C", pp. 1-38, Undenfriend, S. et al., eds., Academic Press, San Diego(1987)。
肽可从肽的C-末端开始以逐步方式在不溶性聚合物载体(也称为“树脂”)上合成。通过经形成酰胺或酯键将肽的C-末端氨基酸附着于树脂上开始合成。这使得能够最终分别作为C-末端酰胺或羧酸释放生成的肽。
合成中使用的C-末端氨基酸和所有其他氨基酸需要对其α-氨基和侧链官能团(如果存在的话)进行差异保护，使得在合成期间可选择性地去除α-氨基保护基。氨基酸的偶联通过活化其作为活性酯的羧基和其与附着于树脂上的N-末端氨基酸的未封闭的α-氨基的反应来进行。重复α-氨基脱保护和偶联序列，直至组装了完整的肽序列。然后通常在存在适当清除剂的情况下使肽从树脂释放出来，同时使侧链官能团脱保护，以限制副反应。最后通过反相HPLC纯化生成的肽。
作为最终肽的前体所需的肽基树脂的合成使用市售的交联聚苯乙烯聚合物树脂(Novabiochem, San Diego, CA; Applied Biosystems, Foster City, CA)。用于C-末端甲酰胺的优选的固相载体为：4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基乙酰基-对-甲基二苯甲基胺树脂(Rink酰胺MBHA树脂)、9-Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基- Merrifield树脂(Sieber酰胺树脂)、4-(9-Fmoc)氨基甲基-3,5-二甲氧基苯氧基)戊酰基-氨基甲基-Merrifield树脂(PAL树脂)。分别使用由DIC/HOBt、HBTU/HOBt、BOP、PyBOP或由DIC/6-Cl-HOBt、HCTU、DIC/HOAt或HATU产生的HOBt、6-Cl-HOBt或HOAt活性酯可实现首先和随后氨基酸的偶联。用于受保护的肽片段的优选的固相载体为：2-氯三苯甲基氯树脂和9-Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基- Merrifield树脂(Sieber酰胺树脂)。将第一个氨基酸加载至2-氯三苯甲基氯树脂上最好通过使Fmoc保护的氨基酸与树脂在二氯甲烷和DIEA中反应来实现。如果必要，可加入少量DMF以促进氨基酸的溶解。
本文所述的肽类似物的合成可通过使用单通道或多通道肽合成仪进行，比如CEMLiberty Microwave合成仪或Protein Technologies, Inc. Prelude (6通道)或Symphony(12通道)合成仪。
可使用任何标准程序使其相应肽的肽基树脂前体裂解和脱保护(参见例如King,D.S. et al., Int. J. Peptide Protein Res., 36:255-266 (1990))。期望的方法为在存在水和TIS作为清除剂的情况下使用TFA。一般地，将肽基树脂在TFA /水/ TIS (94:3:3,v:v:v; 1 mL/100 mg肽基树脂)中于室温下搅拌2-6小时。然后滤除废树脂，并浓缩TFA溶液或减压干燥。使生成的粗品肽沉淀并用Et2O洗涤或直接重新溶解于DMSO或50%乙酸水溶液中，用于通过制备型HPLC纯化。
具有所期望的纯度的肽可通过使用制备型HPLC，例如在Waters Model 4000或Shimadzu Model LC-8A液相色谱仪上纯化获得。将粗品肽的溶液注入YMC S5 ODS (20 X100 mm)柱中，并用线性梯度的在水中的MeCN洗脱，两者均用0.1% TFA缓冲，流速为14-20mL/min，流出物通过220 nm下的UV吸光度监测。纯化肽的结构可通过电喷雾MS分析确认。
分析数据：
质谱：“ESI-MS (+)”表示在正离子模式下进行的电喷雾电离质谱；“ESI-MS (-)”表示在负离子模式下进行的电喷雾电离质谱；“ESI-HRMS (+)”表示在正离子模式下进行的高分辨率电喷雾电离质谱；“ESI-HRMS (-)”表示在负离子模式下进行的高分辨率电喷雾电离质谱。根据“m/z”单位名称报告检测到的质量。精确质量大于1000的化合物通常被检测为双电荷或三电荷离子。
高分辨质谱(HRMS)分析在Fourier Transform Orbitrap质谱仪(Exactive,Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)上使用以25000分辨率(半高最大值，全宽，FWHM)操作的正或负电喷雾电离进行。仪器每天根据制造商的说明书进行校准，导致质量准确度误差<5 ppm。操作软件Xcalibur用于计算理论质荷比值并处理获得的数据。
在实施例11058和11059中使用以下分析方案和合成方法。
一般程序：
Symphony X方法A：
所有操作均在Symphony X肽合成仪(Protein Technologies)上自动化进行。所有程序均在装有底部玻璃料的10 mL聚丙烯管中进行。管通过管的底部和顶部两者连接至Symphony X肽合成仪。DMF和DCM可通过管的顶部添加，其均匀地向下冲洗管的侧面。剩余的试剂通过管的底部添加并向上通过玻璃料以接触树脂。所有溶液通过管的底部去除。“定期搅动”描述了通过底部玻璃料的短暂N2气体脉冲，脉冲持续约5秒，每30秒发生一次。在制备的24小时内使用DMF中的氯乙酰氯溶液。通常不使用从制备开始超过3周的氨基酸溶液。HATU溶液在制备5天内使用。DMF =二甲基甲酰胺；HATU = 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧化物六氟磷酸盐；DIPEA =二异丙基乙胺；Rink = (2,4-二甲氧基苯基) (4-烷氧基苯基)甲胺，其中“4-烷氧基”描述与聚苯乙烯树脂的连接位置和类型。使用的树脂为Merrifield聚合物(聚苯乙烯)，具有Rink接头(在氮气下Fmoc保护)，100-200目，1% DVB，0.56 mmol/g负载。使用的常见氨基酸列于以下，侧链保护基团标明于括号内。Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Asn (Trt)-OH、Fmoc-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-Bzt-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-Dab (Boc)-OH、Fmoc-Dap (Boc)-OH、Fmoc-Gln (Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His (Trt)-OH、Fmoc-Hyp (tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-[N-Me]Ala-OH、Fmoc-[N-Me]Nle-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Sar-OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH、Fmoc-Thr (tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH。
“Symphony X方法A”的程序描述了以0.100 mmol规模进行的实验，其中规模由与树脂结合的Rink接头的量确定。该规模对应于约178 mg的上述Rink-Merrifield树脂。通过将所述体积调整为规模的倍数，所有程序可按比例缩放超过0.100 mmol规模。在氨基酸偶联之前，所有肽合成序列均以树脂溶胀程序开始，以下描述为“树脂溶胀程序”。氨基酸与伯胺N-末端的偶联使用下述“单偶联程序”。氨基酸与仲胺N-末端的偶联使用下述“双偶联程序”。通过以下详述的“氯乙酰氯偶联程序”描述氯乙酰氯与肽的N-末端的偶联。
树脂溶胀程序A：
向10 mL聚丙烯固相反应容器中加入Merrifield: Rink树脂(178 mg, 0.100mmol)。树脂如下洗涤(溶胀) 3次：向反应容器中加入DMF (2.0 mL)，然后定期搅动混合物10分钟，之后通过玻璃料排出溶剂。
单偶联程序A：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中加入哌啶:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL)。定期搅动混合物3分钟，并然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中加入哌啶:DMF (20:80v/v, 2.0 mL)。定期搅动混合物3分钟，并然后通过玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤6次：对于每次洗涤，通过容器的顶部加入DMF (2.0 mL)，并将生成的混合物定期搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中加入氨基酸(在DMF中0.2M, 1.0 mL, 2 eq)，然后加入HATU (在DMF中0.2M, 1.0 mL, 2 eq)，和最后加入DIPEA (在DMF中0.4M, 1.0 mL, 4eq)。定期搅动混合物15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤4次：对于每次洗涤，通过容器的顶部加入DMF (2.0 mL)，并将生成的混合物定期搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中加入乙酸酐(2.0 mL)。将混合物定期搅动10分钟，然后通过玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤4次：对于每次洗涤，通过容器的顶部加入DMF (2.0mL)，并将生成的混合物定期搅动90秒，之后通过玻璃料排出溶液。生成的树脂直接用于下一步骤。
双偶联程序A：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中加入哌啶:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL)。定期搅动混合物3分钟，并然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中加入哌啶:DMF (20:80v/v, 2.0 mL)。定期搅动混合物3分钟，并然后通过玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤6次：对于每次洗涤，通过容器的顶部加入DMF (2.0 mL)，并将生成的混合物定期搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中加入氨基酸(在DMF中0.2M, 1.0 mL, 2 eq)，然后加入HATU (在DMF中0.2M, 1.0 mL, 2 eq)，和最后加入DIPEA (在DMF中0.4M, 1.0 mL, 4eq)。定期搅动混合物15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。树脂如下洗涤2次：对于每次洗涤，通过容器的顶部加入DMF (2.0 mL)，并将生成的混合物定期搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中加入氨基酸(在DMF中0.2M, 1.0 mL, 2 eq)，然后加入HATU (在DMF中0.2M, 1.0 mL, 2 eq)，和最后加入DIPEA (在DMF中0.4M, 1.0 mL, 4 eq)。定期搅动混合物15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。树脂如下洗涤2次：对于每次洗涤，通过容器的顶部加入DMF (2.0 mL)，并将生成的混合物定期搅动90秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中加入乙酸酐(2.0 mL)。将混合物定期搅动10分钟，然后通过玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤4次：对于每次洗涤，通过容器的顶部加入DMF (2.0 mL)，并将生成的混合物定期搅动90秒，之后通过玻璃料排出溶液。生成的树脂直接用于下一步骤。
Symphony氨基酸N-末端终止程序：
向10 mL聚丙烯固相反应容器中加入Merrifield: Rink树脂(178 mg, 0.100mmol)。树脂如下洗涤(溶胀) 3次：向反应容器中加入DMF (2.0 mL)，然后定期搅动混合物10分钟，之后通过玻璃料排出溶剂。
向含有来自先前步骤的Rink树脂的反应容器中加入哌啶:DMF (20:80 v/v, 2.0mL)。定期搅动混合物3分钟，并然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中加入哌啶:DMF(20:80 v/v, 2.0 mL)。定期搅动混合物3分钟，并然后通过玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤6次：对于每次洗涤，通过容器的顶部加入DMF (2.0 mL)，并将生成的混合物定期搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中加入氨基酸(在DMF中0.2M, 1.0 mL, 2eq)，然后加入HATU (在DMF中0.2M, 1.0 mL, 2 eq)，和最后加入DIPEA (在DMF中0.4M,1.0 mL, 4 eq)。定期搅动混合物15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤4次：对于每次洗涤，通过容器的顶部加入DMF (2.0 mL)，并将生成的混合物定期搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中加入乙酸酐(2.0 mL)。将混合物定期搅动10分钟，然后通过玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤4次：对于每次洗涤，通过容器的顶部加入DMF (2.0 mL)，并将生成的混合物定期搅动90秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中加入哌啶:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL)。定期搅动混合物3分钟，并然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中加入哌啶:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL)。定期搅动混合物3分钟，并然后通过玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤5次：对于每次洗涤，通过容器的顶部加入DMF (2.0mL)，并将生成的混合物定期搅动90秒，之后通过玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤3次：对于每次洗涤，通过容器的顶部加入DCM (2.0 mL)，并将生成的混合物定期搅动90秒，之后通过玻璃料排出溶液。将生成的树脂置于氮气流下15分钟。
氯乙酰氯偶联程序A：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中加入哌啶:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL)。定期搅动混合物3分钟，并然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中加入哌啶:DMF (20:80v/v, 2.0 mL)。定期搅动混合物3分钟，并然后通过玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤6次：对于每次洗涤，通过容器的顶部加入DMF (2.0 mL)，并将生成的混合物定期搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中加入DIPEA (在DMF中0.4M, 4.0 mL, 16 eq)，然后加入氯乙酰氯(在DMF中0.8M, 1.5 mL)。定期搅动混合物30分钟，然后通过玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤3次：对于每次洗涤，向容器的顶部加入DMF (2.0 mL)，并将生成的混合物定期搅动90秒，之后通过玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤4次：对于每次洗涤，向容器的顶部加入CH2Cl2 (2.0 mL)，并将生成的混合物定期搅动90秒，之后通过玻璃料排出溶液。将生成的树脂置于N2流下15分钟。
氯乙酸偶联程序A：
向含有来自先前步骤的树脂的反应容器中加入哌啶:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL)。定期搅动混合物3分钟，并然后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中加入哌啶:DMF (20:80v/v, 2.0 mL)。定期搅动混合物3分钟，并然后通过玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤4次：对于每次洗涤，通过容器的顶部加入DMF (2.0 mL)，并将生成的混合物定期搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应容器中加入氯乙酸(在DMF中0.2M, 1.0 mL, 2 eq)，然后加入HATU (在DMF中0.2M, 1.0 mL, 2 eq)，和最后加入DIPEA (在DMF中0.4M, 1.0 mL, 4eq)。定期搅动混合物15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。树脂如下连续洗涤3次：对于每次洗涤，通过容器的顶部加入DMF (2.0 mL)，并将生成的混合物定期搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。树脂如下连续洗涤4次：对于每次洗涤，通过容器的顶部加入CH2Cl2 (2.0mL)，并将生成的混合物定期搅动90秒，之后通过玻璃料排出溶液。将生成的树脂干燥5分钟。
全面脱保护方法A：
所有操作均手动进行，除非另外说明。“全面脱保护方法A”的程序描述了以0.100mmol规模进行的实验，其中规模由与树脂结合的Rink接头的量确定。通过将所述体积调整为规模的倍数，程序可按比例缩放超过0.100 mmol规模。通过在40 mL玻璃小瓶中合并三氟乙酸(22 mL)、苯酚(1.325 g)、水(1.25 mL)和三异丙基硅烷(0.5 mL)制备“脱保护溶液”。从反应容器中取出树脂并转移至4 mL玻璃小瓶中。向小瓶中加入“脱保护溶液”(2.0 mL)。将混合物在摇动器中剧烈混合(1000 RPM 1分钟，然后500 RPM 90分钟)。将混合物通过装有底部玻璃料的10 mL聚丙烯管过滤，使得滴加至含有15 mL乙醚的24 mL试管中，得到白色沉淀。管中的固体(树脂)用“脱保护溶液”(1.0 mL)提取一次，使得滴加至醚中。将混合物离心7分钟，然后从固体中倾掉溶液并弃去。使固体悬浮于Et2O (20 mL)中，然后将混合物离心5分钟，并从固体中倾掉溶液且弃去。最后一次，使固体悬浮于Et2O (20 mL)中，将混合物离心5分钟，并从固体中倾掉溶液且弃去，得到为白色至灰白色固体的粗品肽。
环合方法A：
所有操作均手动进行，除非另外说明。“环合方法A”的程序描述了以0.100 mmol规模进行的实验，其中规模由与用于产生肽的树脂结合的Rink接头的量确定。该规模不是基于直接测定该程序中使用的肽的量。通过将所述体积调整为规模的倍数，程序可按比例缩放超过0.100 mmol规模。将粗品肽固体溶解于甲醇(10 mL)中，并然后使用N,N-二异丙胺将溶液小心地调节至pH = 9.0-11。然后将溶液搅拌18-24小时。浓缩反应溶液，并然后使残余物溶解于MeOH中。使该溶液经受反相HPLC纯化，得到期望的环肽。
分析条件A：
柱：X-Bridge C18，2.0 x 50 mm，3.5 μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含有10 mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含有10 mM乙酸铵)；温度：40°C；梯度：0% B，0-100% B经8分钟，然后在100% B保持1.0分钟；流速：0.8 mL/min；检测：220 nm的UV。
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-十四烷酰氨基己酸的制备
向装有(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-氨基己酸(3.0 g, 8.14mmol)、肉豆蔻酰氯(2.435 ml, 8.96 mmol)和二氯甲烷(41 ml)的圆底烧瓶中加入N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(4.25 ml, 24.43 mmol)。初始混悬液立即变黄并然后澄明。10分钟之后固体开始沉淀。将反应物在室温下搅拌20小时。将反应混合物用20 ml二氯甲烷稀释，并倾入到饱和氯化铵溶液中。分离各层，并用20%甲醇/氯仿溶液洗涤水层。将合并的有机物用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩，得到粘性的黄色固体。使生成的残余物经受硅胶色谱(0-5%甲醇/二氯甲烷梯度)，得到为黄色泡沫的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-十四烷酰氨基己酸(2.87 g, 4.97 mmol, 产率61%)。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ7.88 (dd, J=7.2, 4.1 Hz, 2H), 7.77-7.69 (m, 2H), 7.44-7.37 (m, 2H), 7.35-7.28(m, 2H), 4.29-4.17 (m, 2H), 3.95-3.84 (m, 1H), 3.63-3.52 (m, 1H), 3.10 (q, J=7.4 Hz, 1H), 3.05-2.94 (m, 2H), 2.01 (t, J=7.4 Hz, 2H), 1.46 (d, J=6.8 Hz,3H), 1.34 (dd, J=13.1, 5.0 Hz, 3H), 1.24-1.20 (m, 22H), 0.86-0.82 (m, 3H)。
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-棕榈酰氨基己酸可市售得到。
实施例11058的制备
按照以下概述的3步骤程序制备实施例11058：
步骤A：
序列：Cys-Gly-[Rink树脂]
在由以下程序组成的一般合成序列后制备实施例11058：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”和“Symphony氨基酸N-末端终止程序”。
步骤B：
向含有来自步骤1的树脂的20 ml小瓶中加入5 ml DMF以溶胀树脂。10分钟之后，加入(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-棕榈酰氨基己酸(0.116 g, 0.2mmol)、在DMF中的0.2M 2-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-1,1,3,3-四甲基异脲六氟磷酸盐(V) (1.0 ml, 0.20 mmol)和在DMF中的0.4M N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(1.0 ml,0.40 mmol)。将小瓶在小型摇动器上摇动过夜。
通过将小瓶的内容物转移至10 ml聚丙烯反应管中并通过真空过滤进行过滤来分离树脂。用20 ml DMF、20 ml二氯甲烷和5 ml乙醚洗涤树脂。将生成的树脂真空干燥，并以0.56 mmol/g载量使用。
步骤C：
在由以下程序组成的一般合成序列后，以步骤C完成实施例11058：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序B”、“氯乙酸偶联程序A”、“全面脱保护方法A”和“环合方法A”。
经制备型LC/MS纯化粗品物质，条件如下：柱：Waters XBridge C18, 30 x 100mm，5 μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含有10 mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含有10mM乙酸铵)；梯度：15-100% B经25分钟，然后在100% B保持5分钟；流速：30 mL/min。合并含有期望的产物的级分并经离心蒸发干燥。产物的产量为7.6 mg，并且其通过LCMS分析估计的纯度为98%。分析LCMS条件A：保留时间= 6.42分钟；ESI-MS (+) m/z 1061.8 (M+2H)；ESI-HRMS (+) m/z: 理论值: 1061.0839 (M+2H) 实测值: 1061.0833 (M+2H)。
实施例11059的制备
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实施例11059按照对实施例11058的制备所述的一般合成序列制备，由以下一般程序组成：“Symphony方法A：树脂溶胀程序”、“Symphony方法A：标准偶联程序”、“Symphony方法A：仲胺偶联程序A”、“定制氨基酸偶联程序”、“Symphony氨基酸N-末端终止程序”、“氯乙酸偶联程序A”、“全面脱保护方法A”和“环合方法A”。
经制备型LC/MS纯化粗品物质，条件如下：柱：Waters XBridge C18, 30 x 100mm，5 μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含有10 mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含有10mM乙酸铵)；梯度：15-100% B经25分钟，然后在100% B保持5分钟；流速：30 mL/min。合并含有期望的产物的级分并经离心蒸发干燥。产物的产量为6.4 mg，并且其通过LCMS分析估计的纯度为98%。分析LCMS条件A：保留时间= 5.74分钟；ESI-MS (+) m/z 1048.0 (M+2H)。
使用均相时间分辨荧光(HTRF)结合测定测试大环肽竞争PD-1与PD-L1结合的能力的方法
使用PD-1/PD-L1均相时间分辨荧光(HTRF)结合测定研究了本公开的大环肽与PD-L1结合的能力。
方法
可溶性PD-1与可溶性PD-L1的结合的均相时间分辨荧光(HTRF)测定。可溶性PD-1和可溶性PD-L1是指具有羧基末端截短的蛋白，其去除跨膜区并与异源序列融合，具体地讲是人免疫球蛋白G序列(Ig)或6组氨酸表位标签(His)的Fc部分。所有结合研究在HTRF测定缓冲液中进行，缓冲液由补充有0.1% (w/v)牛血清白蛋白和0.05% (v/v) Tween-20的dPBS组成。对于PD-1-Ig/PD-L1-His结合测定，将抑制剂与PD-L1-His (最终10 nM)在4 μl测定缓冲液中预温育15分钟，随后加入在1 μl测定缓冲液中的PD-1-Ig (最终20 nM)并进一步温育15分钟。使用来自人、食蟹猴、小鼠或其他物种的PD-L1融合蛋白。使用铕穴醚配位化合物标记的抗Ig单克隆抗体(最终1 nM)和别藻蓝蛋白(APC)标记的抗His单克隆抗体(最终20nM)实现HTRF检测。将抗体以HTRF检测缓冲液稀释，并在结合反应的顶部分配5 μl。使得反应平衡30分钟，并使用EnVision荧光计获得信号(665 nm/620 nm比率)。在PD-1-Ig/PD-L2-His (分别为20和5 nM)、CD80-His/PD-L1-Ig (分别为100和10 nM)和CD80-His/CTLA4-Ig(分别为10和5 nM)之间建立另外的结合测定。如下进行生物素化的化合物71号和人PD-L1-His之间的结合/竞争研究。将大环肽抑制剂与PD-L1-His (最终10 nM)在4 μl测定缓冲液中预温育60分钟，随后加入在1 μl测定缓冲液中的生物素化的化合物71号(最终0.5 nM)。使结合平衡30分钟，随后加入在5 μl HTRF缓冲液中的铕穴醚配位化合物标记的链霉亲和素(最终2.5 pM)和APC标记的抗His (最终20 nM)。使得反应平衡30分钟，并使用EnVision荧光计获得信号(665 nm/620 nm比率)。
重组蛋白。具有C-末端人Ig表位标签的羧基截短的人PD-1 (氨基酸25-167)[hPD-1 (25-167)-3S-IG]和具有C-末端His表位标签的人PD-L1 (氨基酸18-239) [hPD-L1(19-239)-烟草脉斑驳病毒蛋白酶切割位点(TVMV)-His]在HEK293T细胞中表达，并依序通过重组蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法纯化。人PD-L2-His (Sino Biologicals)、CD80-His (Sino Biologicals)、CTLA4-Ig (RnD Systems)均通过商业来源获得。
重组人PD-1-Ig的序列
(SEQIDNO:1)
重组人PD-L1-TVMV-His (PD-L1-His)的序列
(SEQIDNO:2)
结果如表1所示。如表所示，本公开的大环肽显示出对PD-L1-TVMV-His (PD-L1-His)的PD-1-Ig结合活性的有效抑制。
表1
实施例编号 HTRF IC50 (μM)
11058 1.93
11059 0.69
对于本领域技术人员显而易见的是，本公开不限于前述说明性实施例，并且可在不背离其基本属性的情况下以其他具体形式实施。因此，期望在所有方面均认为是说明性而非限制性的实施例、对所附权利要求而不是前述实施例的提及和在权利要求的含义和等同范围内的所有变化因此均旨在包括在其中。

Claims (6)

1.选自以下的化合物或其药学上可接受的盐：
2.权利要求1的化合物或其治疗上可接受的盐在制备用于在需要它的受试者中增强、刺激和/或增加免疫反应的药物中的用途。
3.权利要求1的化合物或其治疗上可接受的盐在制备用于在需要它的受试者中抑制癌细胞的生长、增殖或转移的药物中的用途。
4.权利要求1的化合物或其治疗上可接受的盐在制备用于在需要它的受试者中治疗感染性疾病的药物中的用途。
5.权利要求4的用途，其中所述感染性疾病由病毒引起。
6.权利要求1的化合物或其治疗上可接受的盐在制备用于在需要它的受试者中治疗脓毒性休克的药物中的用途。
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