相關申請案之交叉參考 本申請案主張2016年3月4日申請之美國序號62/303,673的權益，其全部內容全文併入。 根據本發明，吾等已發現特異性結合至PD-L1且能夠抑制PD-L1與PD-1及CD80之相互作用的化合物。此等巨環化合物展現活體外免疫調節功效，因此使其成為用於治療包括癌症及感染性疾病之各種疾病的治療性候選物。 術語「特異性結合(specific binding或specifically bind)」係指蛋白質與結合分子(諸如化合物或配位體)之間的相互作用。相互作用取決於由結合分子識別之蛋白質的特別結構(亦即酶結合位點、抗原決定子或抗原決定基)的存在。舉例而言，若化合物特異性結合蛋白質結合位點「A」，則在含有包括結合位點A之蛋白質及特異性結合至蛋白質結合位點A之經標記化合物的反應物中存在該化合物將減小結合至該蛋白質之經標記化合物的量。相比之下，化合物對蛋白質之非特異性結合並不導致經標記化合物自蛋白質之濃度依賴性置換。 本發明意欲包括存在於本發明化合物中之原子的所有同位素。同位素包括原子數相同、但質量數不同之彼等原子。作為一般實例但非限制性地，氫之同位素包括氘及氚。碳之同位素包括
13
C及
14
C。本發明之同位素標記化合物一般可藉由熟習此項技術者已知之習知技術或藉由類似於本文所述之方法，使用適當同位素標記試劑代替原來使用之未標記試劑來製備。此類化合物可具有多種潛在用途，例如在測定生物活性時用作標準物及試劑。在穩定同位素之情況下，此類化合物可具有有利地調節生物學、藥理學或藥物動力學特性之潛能。 本文所述之標的物的另一態樣為所揭示之化合物作為放射性標記配位體用於配位體結合分析之顯影或用於監測活體內吸附、代謝、分佈、受體結合或佔有率或化合物處置之用途。舉例而言，本文所述之巨環化合物可使用放射性同位素
125
I製備，且所得放射性標記化合物可用於顯影結合分析或用於代謝研究。作為替代方案且出於相同目的，本文所述之巨環化合物可藉由使用熟習此項技術者已知之方法的催化性氚化轉化成放射性標記形式。 本發明之巨環化合物亦可藉由使用熟習此項技術者已知之方法添加放射性示蹤劑而用作PET成像劑。 較佳化合物包括本文所提供之巨環化合物中之至少一者且此等化合物可包括於醫藥組合物及組合中。 除非在特定情形中另外限制，否則本文所提供之定義非限制性地適用於本說明書通篇所用的術語。 一般熟習胺基酸及肽化學之技術者瞭解胺基酸包括由以下通式結構表示之化合物：
L-或S-α-胺基酸 D-或R-α-胺基酸 (若R=H) (若R=H) 其中R及R'如本文中所論述。 除非另外指明，否則如本文中單獨或作為另一基團之一部分使用之術語「胺基酸」包括(但不限於)連接至稱為「α」碳之同一碳的胺基及羧基，其中R及/或R'可為天然或非天然側鏈，包括氫。在「α」碳處之絕對「S」組態通常稱為「L」或「天然」組態。在「R」及「R'」(主要)取代基等於氫之情況下，胺基酸為甘胺酸且並非對掌性。 如本文所用，術語「天然胺基酸側鏈」及「天然存在之胺基酸側鏈」係指通常呈S-組態之任何天然存在之胺基酸(亦即L-胺基酸) (亦即丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、-組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸)側鏈。 如本文所用，術語「非天然胺基酸側鏈」及「非天然存在之胺基酸側鏈」係指通常呈R-組態之任何天然存在之胺基酸(亦即D-胺基酸)側鏈或除呈R-或S-組態之天然存在之胺基酸側鏈(亦即分別D-或L-胺基酸)以外之選自以下之基團： C
2
-C
7
烯基、C
1
-C
3
烷氧基C
1
-C
3
烷基、C
1
-C
6
烷氧基羰基C
1
-C
3
烷基、C
1
-C
7
烷基、C
1
-C
3
烷基硫基C
1
-C
3
烷基、醯胺基C
1
-C
3
烷基、胺基C
1
-C
3
烷基、氮雜吲哚基C
1
-C
3
烷基、苯并噻唑基C
1
-C
3
烷基、苯并噻吩基C
1
-C
3
烷基、苯甲氧基C
1
-C
3
烷基、羧基C
1
-C
3
烷基、C
3
-C
14
環烷基C
1
-C
3
烷基、二苯甲基、呋喃基C
1
-C
3
烷基、咪唑基C
1
-C
3
烷基、萘基C
1
-C
3
烷基、吡啶基C
1
-C
3
烷基、噻唑基C
1
-C
3
烷基、噻吩基C
1
-C
3
烷基； 聯苯C
1
-C
3
烷基，其中聯苯視情況經甲基取代； 雜環基，其視情況經一個、兩個、三個、四個或五個獨立地選自以下之基團取代：C
1
-C
4
烷氧基、C
1
-C
4
烷基、C
1
-C
3
烷基磺醯基胺基、醯胺基、胺基、胺基C
1
-C
3
烷基、胺基磺醯基、羧基、氰基、鹵基、鹵基C
1
-C
3
烷基、羥基、-NC(NH
2
)
2
、硝基及-OP(O)(OH)
2
； 吲哚基C
1
-C
3
烷基，其中該吲哚基部分視情況經一個選自C
1
-C
3
烷基、羧基C
1
-C
3
烷基、鹵基、羥基及苯基之基團取代，其中該苯基另外視情況經一個、兩個或三個獨立地選自C
1
-C
3
烷氧基、C
1
-C
3
烷基及鹵基之基團取代； 苯基，其視情況經一個、兩個、三個、四個或五個獨立地選自以下之基團取代：C
1
-C
4
烷氧基、C
1
-C
4
烷基、C
1
-C
3
烷基磺醯基胺基、醯胺基、胺基、胺基C
1
-C
3
烷基、胺基磺醯基、羧基、氰基、鹵基、鹵基C
1
-C
3
烷基、羥基、-NC(NH
2
)
2
、硝基及-OP(O)(OH)
2
； NR
a '
R
b '
(C
1
-C
7
烷基)，其中R
a '
及R
b '
獨立地選自氫、C
2
-C
4
烯氧基羰基、C
1
-C
3
烷基、C
1
-C
3
烷基羰基、C
3
-C
6
環烷基羰基、呋喃基羰基及苯基羰基。當烷基連接基團含有一個以上碳時，另一NR
a '
R
b '
基團可在鏈上。 NR
c '
R
d '
羰基C
1
-C
3
烷基，其中R
c '
及R
d '
獨立地選自氫、C
1
-C
3
烷基及三苯甲基； 苯基C
1
-C
3
烷基，其中該苯基部分視情況經一個、兩個、三個、四個或五個獨立地選自以下之基團取代：C
1
-C
4
烷氧基、C
1
-C
4
烷基、C
1
-C
3
烷基磺醯基胺基、醯胺基、胺基、胺基C
1
-C
3
烷基、胺基磺醯基、羧基、氰基、鹵基、鹵基C
1
-C
3
烷基、羥基、-NC(NH
2
)
2
、硝基及-OP(O)(OH)
2
；及 苯氧基C
1
-C
3
烷基，其中苯基視情況經C
1
-C
3
烷基取代。 如本文所用，術語「C
2
-C
4
烯基」係指具有二至四個碳原子、含有至少一個碳-碳雙鍵之直鏈或分支鏈基團。 如本文所用，術語「C
2
-C
7
烯基」係指具有二至七個碳原子、含有至少一個碳-碳雙鍵之直鏈或分支鏈基團。 如本文所用，術語「C
2
-C
4
烯氧基」係指經由氧原子連接至母分子部分之C
2
-C
4
烯基。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
烷氧基」係指經由氧原子連接至母分子部分之C
1
-C
3
烷基。 如本文所用，術語「C
1
-C
4
烷氧基」係指經由氧原子連接至母分子部分之C
1
-C
4
烷基。 如本文所用，術語「C
1
-C
6
烷氧基」係指經由氧原子連接至母分子部分之C
1
-C
6
烷基。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
烷氧基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之C
1
-C
3
烷氧基。 如本文所用，術語「C
1
-C
6
烷氧基羰基」係指經由羰基連接至母分子部分之C
1
-C
6
烷氧基。 如本文所用，術語「C
1
-C
6
烷氧基羰基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之C
1
-C
6
烷氧基羰基。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
烷基」係指衍生自含有一至三個碳原子之直鏈或分支鏈飽和烴之基團。 如本文所用，術語「C
1
-C
4
烷基」係指衍生自含有一至四個碳原子之直鏈或分支鏈飽和烴之基團。 如本文所用，術語「C
1
-C
6
烷基」係指衍生自含有一至六個碳原子之直鏈或分支鏈飽和烴之基團。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
烷基胺基」係指-NHR
1
，其中R
1
為C
1
-C
3
烷基。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
烷基羰基」係指經由羰基連接至母分子部分之C
1
-C
3
烷基。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
烷基硫基」係指經由硫原子連接至母分子部分之C
1
-C
3
烷基。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
烷基硫基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之C
1
-C
3
烷基硫基。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
烷基磺醯基」係指經由磺醯基連接至母分子部分之C
1
-C
3
烷基。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
烷基磺醯基胺基」係指經由胺基連接至母分子部分之C
1
-C
3
烷基磺醯基。 如本文所用，術語「醯胺基」係指-C(O)NH
2
。 如本文所用，術語「醯胺基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之醯胺基。 如本文所用，術語「胺基」係指-NH
2
。 如本文所用，術語「胺基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之胺基。 如本文所用，術語「胺基磺醯基」係指經由磺醯基連接至母分子部分之胺基。 如本文所用，術語「氮雜吲哚基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子之氮雜吲哚基。氮雜吲哚基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「苯并噻唑基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子之苯并噻唑基。苯并噻唑基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「苯并噻吩基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子之苯并噻吩基。苯并噻吩基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「苯甲氧基」係指經由氧原子連接至母分子部分之苯甲基。 如本文所用，術語「苯甲氧基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之苯甲氧基。 如本文所用，術語「聯苯C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之聯苯基。聯苯基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「羰基」係指-C(O)-。 如本文所用，術語「羧基」係指-CO
2
H。 如本文所用，術語「羧基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之羧基。 如本文所用，術語「氰基」係指-CN。 如本文所用，術語「C
3
-C
14
環烷基」係指具有三至十四個碳原子及零個雜原子之飽和單環、雙環或三環烴環系統。雙環及三環環可為稠合、螺環或橋接的。環烷基之代表性實例包括(但不限於)環丙基、環戊基、雙環[3.1.1]庚基及金剛烷基。 如本文所用，術語「C
3
-C
14
環烷基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之C
3
-C
14
環烷基。 如本文所用，術語「C
3
-C
14
環烷基羰基」係指經由羰基連接至母分子部分之C
3
-C
14
環烷基。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
二烷基胺基」係指-NR
1
R
2
，其中R
1
及R
2
各為含有一至三個碳原子之烷基。基團可相同或不同。 如本文所用，術語「呋喃基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之呋喃基。呋喃基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「呋喃基羰基」係指經由羰基連接至母分子部分之呋喃基。 如本文所用，術語「鹵基」及「鹵素」係指F、Cl、Br或I。 如本文所用，術語「鹵基C
1
-C
3
烷基」係指經一個、兩個或三個鹵素原子取代之C
1
-C
3
烷基。 如本文所用，術語「鹵甲基」係指經一個、兩個或三個鹵素原子取代之甲基。 如本文所用，術語「雜環基」係指含有一個、兩個或三個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的五員、六員或七員環。五員環具有零至兩個雙鍵且六員及七員環具有零至三個雙鍵。術語「雜環基」亦包括雙環基團，其中雜環基環與四員至六員芳族或非芳族碳環或另一單環雜環基稠合。本發明之雜環基經由基團中之碳原子連接至母分子部分。雜環基之實例包括(但不限於)苯并噻吩基、呋喃基、咪唑基、吲哚啉基、吲哚基、異噻唑基、異噁唑基、嗎啉基、噁唑基、哌嗪基、哌啶基、吡唑基、吡啶基、吡咯啶基、吡咯并吡啶基、吡咯基、噻唑基、噻吩基及硫代嗎啉基。 如本文所用，術語「羥基」係指-OH。 如本文所用，術語「咪唑基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之咪唑基。咪唑基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「吲哚基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之吲哚基。吲哚基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「萘基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之萘基。萘基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「硝基」係指-NO
2
。 如本文所用，術語「NR
a '
R
b '
」係指經由氮原子連接至母分子部分之兩個基團R
a '
及R
b '
。R
a '
及R
b '
獨立地選自氫、C
2
-C
4
烯氧基羰基、C
1
-C
3
烷基羰基、C
3
-C
6
環烷基羰基、呋喃基羰基及苯基羰基。 如本文所用，術語「NR
a '
R
b '
(C
1
-C
3
)烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之NR
a '
R
b '
基團。 如本文所用，術語「NR
c '
R
d '
」係指經由氮原子連接至母分子部分之兩個基團R
c '
及R
d '
。R
c '
及R
d '
獨立地選自氫、C
1
-C
3
烷基及三苯甲基。 如本文所用，術語「NR
c '
R
d '
羰基」係指經由羰基連接至母分子部分之NR
c '
R
d '
基團。 如本文所用，術語「NR
c '
R
d '
羰基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之NR
c '
R
d '
羰基。 如本文所用，術語「苯氧基」係指經由氧原子連接至母分子部分之苯基。 如本文所用，術語「苯氧基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之苯氧基。 如本文所用，術語「苯基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之苯基。 如本文所用，術語「苯基羰基」係指經由羰基連接至母分子部分之苯基。 如本文所用，術語「吡啶基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之吡啶基。吡啶基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「硫基」係指-S-。 如本文所用，術語「磺醯基」係指-SO
2
-。 如本文所用，術語「噻唑基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之噻唑基。噻唑基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「噻吩基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之噻吩基。噻吩基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 術語「治療」係指：(i)預防可能易患疾病、病症及/或病狀、但尚未診斷出患病的患者出現該疾病、病症或病狀；(ii)抑制該疾病、病症或病狀，亦即遏制其發展；及(iii)緩解該疾病、病症或病狀，亦即使得該疾病、病症及/或病狀及/或與該疾病、病症及/或病狀相關聯之症狀消退。 巨環化合物與PD-L1之結合可例如藉由諸如均相時差式螢光(HTRF)、表面電漿子共振(SPR)、等溫滴定量熱法(ITC)、核磁共振光譜(NMR)及其類似物之方法量測。另外，巨環化合物與表現於細胞表面上之PD-L1的結合可如本文所述在細胞結合分析中量測。 投與本文所述之治療劑包括(但不限於)投與治療有效量之治療劑。如本文所用，術語「治療有效量」係指(但不限於)治療或預防藉由投與本文所述之PD-1/PD-L1結合抑制劑之組合物可治療之病狀的治療劑的量。該量為足以展現可偵測之治療性或預防性或改善性效應之量。效應可包括例如(但不限於)本文中所列舉之病狀的治療或預防。個體之精確有效量將取決於個體之體型及健康狀況、欲治療之病狀的性質及程度、治療醫師之建議及選擇用於投與之治療劑或治療劑組合。因此，事先規定精確有效量為不適用的。 在另一個態樣中，本發明係關於使用本發明之巨環化合物抑制個體腫瘤細胞生長之方法。如本文所證實，本發明之巨環化合物能夠結合至PD-L1、妨礙PD-L1與PD-1之間的相互作用、與PD-L1與已知阻斷與PD-1之相互作用的抗PD-1單株抗體之結合競爭、增強CMV特異性T細胞IFNγ分泌及增強HIV特異性T細胞IFNg分泌。因此，本發明之巨環化合物適用於調節免疫反應、治療諸如癌症或感染性疾病之疾病、刺激保護性自體免疫反應或刺激抗原特異性免疫反應(例如藉由共投與PD-L1阻斷化合物與所關注之抗原)。 為了使本發明可更易於理解，首先定義某些術語。在整個實施方式中，闡述其他定義。 術語「漸進式死亡配位體1」、「漸進式細胞死亡配位體1」、「蛋白質PD-L1」、「PD-L1」、「PDL1」、「PDCDL1」、「hPD-L1」、「hPD-LI」、「CD274」及「B7-H1」可互換使用且包括人類PD-L1之變體、同功異型物、物種同源物及具有至少一個與PD-L1共同之抗原決定基的類似物。完整PD-L1序列可見於GENBANK®寄存編號NP_054862。 術語「漸進式死亡1」、「漸進式細胞死亡1」、「蛋白質PD-1」、「PD-1」、「PD1」、「PDCD1」、「hPD-1」及「hPD-I」可互換使用且包括人類PD-1之變體、同功異型物、物種同源物及具有至少一個與PD-1共同之抗原決定基的類似物。完整PD-1序列可見於GENBANK®寄存編號U64863。 術語「細胞毒性T淋巴球相關抗原-4」、「CTLA-4」、「CTLA4」、「CTLA-4抗原」及「CD152」(參見例如Murata,
Am. J. Pathol.
, 155:453-460 (1999))可互換使用且包括人類CTLA-4之變體、同功異型物、物種同源物及具有至少一個與CTLA-4共同之抗原決定基的類似物(參見例如Balzano,
Int. J. Cancer Suppl.
, 7:28-32 (1992))。完整CTLA-4核酸序列可見於GENBANK®寄存編號L15006。 術語「免疫反應」係指例如淋巴球、抗原呈現細胞、吞噬細胞、粒細胞及由以上細胞或肝臟產生之可溶性大分子(包括巨環類、細胞激素及補體)產生對侵入病原體、感染有病原體之細胞或組織、癌細胞或在自體免疫或病理性炎症之情況下正常人類細胞或組織之選擇性損壞、破壞或自人體消除之作用。 如本文所用，「不良事件」(AE)為與醫藥治療之使用相關聯之任何不利且一般不希望、甚至不當跡象(包括異常實驗室研究結果)、症狀或疾病。舉例而言，不良事件可與響應於治療之免疫系統活化或免疫系統細胞(例如T細胞)擴增相關聯。醫藥治療可具有一或多個相關AE且各AE可具有相同或不同的嚴重程度。提及能夠「改變不良事件」之方法意指降低與不同治療方案之使用相關聯之一或多個AE的發生率及/或嚴重程度的治療方案。 如本文所用，「過度增生性疾病」係指細胞生長增加超過正常水準之病狀。舉例而言，過度增生性疾病或病症包括惡性疾病(例如食道癌、結腸癌、膽道癌)及非惡性疾病(例如動脈粥樣硬化、良性增生及良性前列腺肥大)。 如本文所用，「約」或「基本上包含」意指在如由一般熟習此項技術者所測定之特定值的可接受的誤差範圍內，其將部分取決於如何量測或測定該值，亦即量測系統之侷限性。舉例而言，「約」或「基本上包含」可意指根據此項技術中之實踐在一個或一個以上標準差內。或者，「約」或「基本上包含」可意指至多20%之範圍。此外，尤其在生物系統或方法方面，該等術語可意指值之至多一個數量級或至多5倍。當在本申請案及申請專利範圍中提供特定值時，除非另外陳述，否則「約」或「基本上包含」之含義應假定為在該特定值之可接受的誤差範圍內。 如本文所述，除非另外指明，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括在所列舉範圍內之任何整數值及(在適當時)其分數(諸如整數之十分之一及百分之一)。 競爭分析 本發明亦關於能夠與參考抗PD-L1抗體(MDX-1105)競爭結合達至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%及至少約100%之巨環化合物。此類巨環化合物可與一或多種本文所揭示之巨環化合物共有結構同源性，包括突變體、保守取代形式、功能取代形式及缺失形式，其限制條件為其特異性結合至PD-L1。舉例而言，若巨環化合物與參考抗PD-L1抗體實質上結合至相同PD-L1區，則巨環化合物應結合至與抗PD-L1單株抗體所結合之PD-L1抗原決定基至少重疊之PD-L1抗原決定基。重疊區可在一個胺基酸殘基至數百個胺基酸殘基之範圍內變化。巨環化合物應接著在競爭分析中與抗PD-L1單株抗體與PD-L1之結合競爭及/或阻斷該結合，且從而減少抗PD-L1單株抗體與PD-L1之結合，較佳達至少約50%。 出於競爭分析目的可用作參考抗體之抗PD-L1抗體為此項技術中已知的。舉例而言，可使用以下代表性抗PD-L1抗體：MDX-1105 (BMS)；L01X-C (Serono)、L1X3 (Serono)、MSB-0010718C (Serono)及PD-L1 Probody (CytomX)及共同擁有的WO 2007/005874中所揭示之PD-L1抗體。 出於競爭分析目的可用作參考抗體之抗PD-1抗體為此項技術中已知的。舉例而言，可使用以下代表性抗PD-1抗體：尼沃單抗(nivolumab，BMS)；共同擁有的美國專利第8,008,449號中所分別揭示之17D8、2D3、4H1、4A11、7D3及5F4 (BMS)、MK-3475 (Merck，美國專利第8,168,757號中所揭示)及美國專利第7,488,802號中所揭示之抗體。 醫藥組合物 在另一個態樣中，本發明提供一種組合物(例如醫藥組合物)，含有與醫藥學上可接受之載劑一起調配之一種本發明之巨環化合物或本發明之巨環化合物組合。此類組合物可包括一種本發明之巨環化合物或免疫結合物或雙特異性分子或(例如兩種或兩種以上不同的)本發明之巨環化合物或免疫結合物或雙特異性分子之組合。舉例而言，本發明之醫藥組合物可包含結合至靶抗原上之不同抗原決定基或具有互補活性的巨環化合物(或免疫結合物或雙特異性物)之組合。 本發明之醫藥組合物亦可在組合療法中(亦即與其他藥劑組合)投與。舉例而言，組合療法可包括巨環化合物與至少一種其他消炎劑或免疫抑制劑之組合。可用於組合療法之治療劑的實例更詳細地描述於下文關於本發明之巨環化合物之用途的部分中。 如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。較佳地，載劑適用於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊椎或表皮投與(例如藉由注射或輸注)。視投藥途徑而定，活性化合物(亦即巨環化合物、免疫結合物或雙特異性分子)可包覆在材料中以保護該化合物免受酸作用及可使該化合物不活化之其他天然條件。 本發明之醫藥化合物可包括一或多種醫藥學上可接受之鹽。「醫藥學上可接受之鹽」或「治療學上可接受之鹽」係指保留母化合物之所需生物活性且未賦予任何不合需要的毒理學效應之鹽(參見例如Berge, S.M.等人,
J. Pharm. Sci.
, 66:1-19 (1977))。此類鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括衍生自無毒無機酸(諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及其類似物)以及衍生自無毒有機酸(諸如脂族單羧酸及二羧酸、經苯基取代之烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸及其類似物)之鹽。鹼加成鹽包括衍生自鹼土金屬(諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物)以及衍生自無毒有機胺(諸如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因(procaine)及其類似物)之鹽。 本發明之醫藥組合物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化劑。醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及其類似物；(2)油溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基大茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及其類似物；及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及其類似物。 可用於本發明醫藥組合物中之適合水性及非水性載劑的實例包括水、乙醇、多元醇(諸如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。可例如藉由使用包衣材料(諸如卵磷脂)、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。 此等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。可藉由滅菌程序(見上文)及藉由包括各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸及其類似物)而確保防止微生物存在。亦可能需要在組合物中包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，可注射醫藥形式之延長吸收可藉由包括延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來達成。 醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。此類介質及藥劑用於醫藥活性物質之用途為此項技術中已知的。除非任何習知介質或藥劑與活性化合物不相容，否則考慮將其用於本發明之醫藥組合物中。組合物中亦可併入補充性活性化合物。 治療組合物通常必須在製造及儲存條件下無菌且穩定。組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或適合於高藥物濃度之其他有序結構。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物之溶劑或分散介質。可例如藉由使用包衣(諸如卵磷脂)、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。在許多情況下，組合物中將較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來達成。 無菌可注射溶液可藉由將所需量之活性化合物與一種上列成分或成分組合一起併入適當溶劑中，並視需要接著滅菌微過濾來製備。一般而言，分散液藉由將活性化合物併入含有鹼性分散介質及所需上列其他成分的無菌媒劑中來製備。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，該等方法自其預先無菌過濾溶液產生活性成分粉末加任何額外所需成分。 可與載劑物質組合以產生單一劑型的活性成分之量將視所治療之個體、特定投藥模式而變化。可與載劑物質組合以產生單一劑型的活性成分之量一般為產生治療性效應之組合物的量。一般而言，在100%中，此量將介於約0.01%至約99%之活性成分、較佳約0.1%至約70%、最佳約1%至約30%之活性成分與醫藥學上可接受之載劑組合。 調節劑量方案以得到最佳所需反應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單一藥團，可隨時間投與若干分次劑量，或可如治療情形之緊急程度所指示而按比例減少或增加劑量。就投藥簡便性及劑量均一性而言，將非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文所用之單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療之個體的實體上離散單位；各單位含有與所需醫藥載劑結合之經計算以產生所需治療性效應之預定量活性化合物。本發明之單位劑型之規格藉由以下情況指定且直接取決於以下情況：(a)活性化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療性效應，及(b)混配用於治療個體敏感性之此類活性化合物之技術中的固有限制。 關於巨環化合物之投與，劑量範圍介於宿主體重之約0.0001至100 mg/kg且更通常0.01至5 mg/kg。舉例而言，劑量可為0.3 mg/kg體重、1 mg/kg體重、3 mg/kg體重、5 mg/kg體重或10 mg/kg體重或在1-10 mg/kg範圍內。例示性治療方案需要每天一次、每天兩次、兩週一次、三週一次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、一月一次、每3個月一次或每3至6個月一次投與。本發明之巨環化合物的較佳劑量方案包括經由靜脈內投與1 mg/kg體重或3 mg/kg體重，同時使用以下給藥時程中之一者給與巨環：(i)每四週六次劑量，接著每三個月；(ii)每三週；(iii) 3 mg/kg體重一次，接著每三週1 mg/kg體重。 在一些方法中，同時投與具有不同結合特異性之兩種或兩種以上巨環化合物，在此情況下，所投與之各化合物之劑量屬於所指示的範圍內。化合物通常在多個時刻投與。單次劑量之間的間隔可為例如每週、每月、每三個月或每年。間隔亦可為不規律的，藉由量測患者中針對靶抗原之巨環化合物的血液含量所指示。在一些方法中，調節劑量以達到約1-1000 μg/ml之血漿濃度，且在一些方法中達到約25-300 μg/ml。 或者，巨環化合物可以持續釋放調配物形式投與，在此情況下不需要頻繁投與。投與之劑量及頻率可視治療為預防性或治療性而變化。在預防性應用中，在長時期內，以相對不頻繁之間隔投與相對較低之劑量。一些患者在其餘生中繼續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對較短之間隔投與相對較高之劑量，直至疾病之進展降低或終止，且較佳直至患者展示疾病之症狀之部分或完全改善。此後，可向患者投與預防性方案。 可改變本發明之醫藥組合物中之活性成分的實際劑量，以便獲得在對患者無毒性之情況下有效達成特定患者、組合物及投藥模式之所需治療反應的量的活性成分。所選劑量將視多種藥物動力學因素而定，包括本發明所用特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性；投藥途徑；投藥時間；所用特定化合物之排泄率；治療持續時間；與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質；所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史；及醫藥技術中熟知之類似因素。 「治療有效劑量」之本發明之巨環化合物較佳使得疾病症狀之嚴重程度降低、無疾病症狀期之頻率或持續時間增加或預防疾病病痛所致之損傷或失能。舉例而言，關於腫瘤治療，「治療有效劑量」較佳相對於未經治療之個體抑制細胞生長或腫瘤生長達至少約20%、更佳至少約40%、甚至更佳至少約60%且再更佳至少約80%。化合物抑制腫瘤生長及/或HIV之能力可在預測對人類腫瘤之功效或病毒功效之動物模型系統中評估。或者，組合物之此特性可藉由利用熟習此項技術者已知之分析檢查化合物之抑制能力(諸如活體外抑制)來評估。治療有效量之治療性化合物可在個體體內減小腫瘤尺寸、減少病毒負荷或以其他方式改善症狀。一般熟習此項技術者將能夠基於諸如個體體型、個體症狀之嚴重程度及所選特定組合物或投藥途徑之因素來確定該等量。 在另一個態樣中，本發明提供一種分裝部分之醫藥套組，其如本文所述包含巨環化合物及另一種免疫調節劑。該套組亦可另外包含治療過度增生性疾病(諸如，如本文所述之癌症)及/或抗病毒疾病之使用說明書。 本發明之組合物可經由一或多種投藥途徑、使用此項技術中已知之多種方法中之一或多者來投與。如熟習此項技術者應瞭解，投藥途徑及/或模式將視所需結果而變化。本發明之巨環化合物的較佳投藥途徑包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、脊椎或其他非經腸投藥途徑，例如藉由注射或輸注。如本文所用，片語「非經腸投與」意指除腸內及局部投與以外通常藉由注射進行之投藥模式，且包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。 或者，本發明之巨環化合物可經由非非經腸途徑投與，諸如局部、表皮或黏膜投藥途徑，例如鼻內、經口、經陰道、經直腸、舌下或局部。 活性化合物可與將保護化合物免於快速釋放之載劑一起製備，諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼劑及微膠囊化遞送系統。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之許多方法已獲得專利或一般為熟習此項技術者已知。參見例如Robinson, J.R.編,
Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems
, Marcel Dekker, Inc., New York (1978)。 治療性組合物可用此項技術中已知之醫療裝置投與。舉例而言，在一個較佳實施例中，本發明之治療性組合物可用無針皮下注射裝置投與，諸如美國專利第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號或第4,596,556號中所揭示之裝置。適用於本發明之熟知插入物及模組之實例包括：美國專利第4,487,603號，其揭示一種以受控速率施配藥物之可植入微輸注泵；美國專利第4,486,194號，其揭示一種經由皮膚投與藥物之治療性裝置；美國專利第4,447,233號，其揭示一種以精確輸注速率遞送藥物之藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，其揭示一種用於連續藥物遞送之可變流動可植入輸注裝置；美國專利第4,439,196號，其揭示一種具有多腔隔室之滲透藥物遞送系統；及美國專利第4,475,196號，其揭示一種滲透藥物遞送系統。此等專利以引用的方式併入本文中。許多其他此類插入物、遞送系統及模組為熟習此項技術者已知的。 在某些實施例中，本發明之巨環化合物可經調配以確保恰當活體內分佈。舉例而言，血腦障壁(BBB)排除多種高度親水性化合物。為確保本發明之治療性化合物穿過BBB (必要時)，其可調配成例如脂質體。關於製造脂質體之方法，參見例如美國專利第4,522,811號、第5,374,548號及第5,399,331號。脂質體可包含選擇性輸送至特定細胞或器官中之一或多個部分，由此增強靶向藥物遞送(參見例如Ranade, V.V.,
J. Clin. Pharmacol.
, 29:685 (1989))。例示性靶向部分包括葉酸或生物素(參見例如Low等人之美國專利第5,416,016號)；甘露糖(Umezawa等人,
Biochem. Biophys. Res. Commun.
, 153:1038 (1988))；巨環類(Bloeman, P.G.等人,
FEBS Lett.
, 357:140 (1995)；Owais, M.等人,
Antimicrob. Agents Chemother.
, 39:180 (1995))；界面活性劑蛋白質A受體(Briscoe等人,
Am. J. Physiol.
, 1233:134 (1995))；p120 (Schreier等人,
J. Biol. Chem.
, 269:9090 (1994))；亦參見Keinanen, K.等人,
FEBS Lett.
, 346:123 (1994)；Killion, J.J.等人,
Immunomethods
4:273 (1994)。 本發明之用途及方法 本發明之巨環化合物、組合物及方法具有許多活體外及活體內效用，涉及例如偵測PD-L1或藉由阻斷PD-L1增強免疫反應。舉例而言，此等分子可投與培養物中、活體外或離體之細胞或投與人類個體(例如活體內)以在多種情形中增強免疫力。因此，在一個態樣中，本發明提供一種調節個體之免疫反應的方法，其包含向該個體投與本發明之巨環化合物以便調節該個體之免疫反應。較佳地，增強、刺激或上調反應。在其他方面中，巨環化合物可具有抗獼猴、抗小鼠及/或抗土撥鼠結合及治療活性。 如本文所用，術語「個體」意欲包括人類及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、羊、犬、貓、牛、馬、雞、土撥鼠、兩棲動物及爬行動物，但哺乳動物為較佳，諸如非人類靈長類動物、羊、犬、貓、牛及馬。較佳個體包括需要增強免疫反應之人類患者。該等方法尤其適用於治療患有可藉由強化T細胞介導之免疫反應治療之病症的人類患者。在一個特定實施例中，該等方法尤其適用於活體內處理癌細胞。為實現抗原特異性免疫力增強，巨環化合物可連同所關注之抗原一起投與。當針對PD-L1之巨環化合物連同另一藥劑一起投與時，兩者可以任一次序或同時投與。 本發明另外提供用於偵測樣品中人類、土撥鼠、獼猴及/或小鼠PD-L1抗原之存在或量測人類、土撥鼠、獼猴及/或小鼠PD-L1抗原之量的方法，其包含使該樣品及對照樣品與特異性結合至人類、土撥鼠、獼猴及/或小鼠PD-L1之參考巨環化合物在允許在該巨環與人類、土撥鼠、獼猴及/或小鼠PD-L1之間形成複合物的條件下接觸。接著偵測複合物之形成，其中樣品與對照樣品相比之差異複合物形成指示樣品中存在人類、土撥鼠、獼猴及/或小鼠PD-L1抗原。 鑒於本發明之巨環化合物對於PD-L1與CD28、ICOS及CTLA-4相比之特異性結合，本發明之巨環化合物可用於特異性偵測細胞表面上之PD-L1表現，且此外，可用於經由免疫親和力純化來純化PD-L1。 癌症 藉由巨環化合物阻斷PD-1可增強患者針對癌細胞之免疫反應。PD-1之配位體PD-L1並不表現在正常人類細胞中，但大量存在於多種人類癌症中(Dong等人,
Nat. Med.
, 8:787-789 (2002))。PD-1與PD-L1之間的相互作用導致腫瘤浸潤性淋巴球減少、T細胞受體介導之增生減少及癌細胞免疫逃避(Dong等人,
J. Mol. Med.
, 81:281-287 (2003)；Blank等人,
Cancer Immunol. Immunother.
, 54:307-314 (2005)；Konishi等人,
Clin. Cancer Res.
, 10:5094-5100 (2004))。免疫抑制可藉由抑制PD-1與PD-L1之局部相互作用而逆轉，且當PD-1與PD-L2之相互作用亦阻斷時，效應相加(Iwai等人,
Proc. Natl. Acad. Sci.
, 99:12293-12297 (2002)；Brown等人,
J. Immunol.
, 170:1257-1266 (2003))。雖然先前研究已展示T細胞增生可藉由抑制PD-1與PD-L1之相互作用而恢復，但尚未報導藉由阻斷PD-1/PD-L1相互作用對活體內癌症腫瘤生長之直接效應。在一個態樣中，本發明係關於使用巨環化合物活體內治療個體，使得癌性腫瘤生長受到抑制。巨環化合物可單獨用於抑制癌性腫瘤生長。或者，巨環化合物可如下所述與其他免疫原性劑、標準癌症治療或其他巨環化合物結合使用。 因此，在一個實施例中，本發明提供一種抑制個體之腫瘤細胞生長的方法，其包含向該個體投與治療有效量之巨環化合物。 可使用本發明之巨環化合物抑制生長之較佳癌症包括通常響應於免疫療法之癌症。治療之較佳癌症之非限制性實例包括黑素瘤(例如轉移性惡性黑素瘤)、腎細胞癌(例如透明細胞癌)、前列腺癌(例如激素難治性前列腺癌及去勢療法無效之前列腺癌)、乳癌、結腸直腸癌及肺癌(例如鱗狀及非鱗狀非小細胞肺癌)。另外，本發明包括可使用本發明之巨環化合物抑制生長之難治性或復發性惡性病。 可使用本發明之方法治療之其他癌症的實例包括骨癌；胰臟癌；皮膚癌；頭頸癌；皮膚或眼內惡性黑素瘤；子宮癌；卵巢癌；結腸癌；直腸癌；肛門區癌；胃癌；睾丸癌；子宮癌；輸卵管癌；子宮內膜癌；子宮頸癌；陰道癌；外陰癌；霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)；非霍奇金氏淋巴瘤；食道癌；小腸癌；內分泌系統癌；甲狀腺癌；副甲狀腺癌；腎上腺癌；軟組織肉瘤；尿道癌；陰莖癌；慢性或急性白血病，包括急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴球性白血病；兒童實體腫瘤；淋巴球性淋巴瘤；膀胱癌；腎癌或輸尿管癌；腎盂癌；中樞神經系統(CNS)贅瘤；原發性CNS淋巴瘤；腫瘤血管生成；脊軸腫瘤；腦幹神經膠質瘤；垂體腺瘤；卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)；表皮樣癌；鱗狀細胞癌；T細胞淋巴瘤；環境誘發癌，包括由石棉誘發之癌症；及該等癌症之組合。本發明亦適用於治療轉移性癌症，尤其表現PD-L1之轉移性癌症(Iwai等人,
Int. Immunol.
, 17:133-144 (2005))。 視情況，針對PD-L1之巨環化合物可與以下免疫原性劑組合，諸如癌細胞、經純化之腫瘤抗原(包括重組蛋白質、化合物及碳水化合物分子)、細胞及轉染有編碼免疫刺激細胞激素之基因的細胞(He等人,
J. Immunol.
, 173:4919-4928 (2004))。可使用之腫瘤疫苗的非限制性實例包括黑素瘤抗原之肽，諸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1及/或酪胺酸酶之肽，或經轉染以表現細胞激素GM-CSF之腫瘤細胞(下文進一步論述)。 在人類中，已展示一些腫瘤具有免疫原性，諸如黑素瘤。預期藉由利用PD-L1阻斷升高T細胞活化之臨限值，吾等可預計活化宿主中之腫瘤反應。 當與疫苗接種方案組合時，PD-L1阻斷可能最有效。已設計出針對腫瘤之許多實驗性疫苗接種策略(參見Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000)；Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring: 300-302 (2000)；Khayat, D., ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000)；Foon, K., ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000)；亦參見Restifo, N.等人, Cancer Vaccines, 第61章, 第3023-3043頁, DeVita, V.等人編,
Cancer: Principles and Practice of Oncology
, 第五版(1997))。在此等策略中之一者中，使用自體或同種異體腫瘤細胞製備疫苗。已顯示此等細胞疫苗在腫瘤細胞經轉導以表現GM-CSF時最有效。已顯示GM-CSF為用於腫瘤疫苗接種之抗原呈現之強活化劑(Dranoff等人,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 90: 3539-3543 (1993))。 各種腫瘤中基因表現及大規模基因表現模式之研究已產生所謂腫瘤特異性抗原之定義(Rosenberg, S.A.,
Immunity
, 10:281-287 (1999))。在許多情況下，此等腫瘤特異性抗原為腫瘤中及出現腫瘤之細胞中表現的分化抗原，例如黑素細胞抗原gp100、MAGE抗原及Trp-2。更重要的是，許多此等抗原可展示為宿主中發現之腫瘤特異性T細胞的靶標。PD-L1阻斷可與表現於腫瘤中之重組蛋白質及/或肽之集合結合使用以產生針對此等蛋白質之免疫反應。此等蛋白質通常被免疫系統視為自體抗原且因此對其具耐受性。腫瘤抗原亦可包括蛋白質端粒酶，其為合成染色體之端粒所必需的且表現於超過85%之人類癌症中且僅表現於有限數目之體細胞組織中(Kim, N等人,
Science
, 266:2011-2013 (1994))。(可藉由各種方法保護此等體細胞組織免受免疫攻擊)。腫瘤抗原亦可為由於改變蛋白質序列或在兩個無關序列之間形成融合蛋白(亦即費城染色體(Philadelphia chromosome)中之bcr-abl)之體細胞突變而在癌細胞中表現之「新抗原」或B細胞腫瘤之個體基因型。 其他腫瘤疫苗可包括人類癌症中所牽涉之病毒的蛋白質，該等病毒諸如人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV及HCV)及卡堡氏疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可與PD-L1阻斷結合使用之腫瘤特異性抗原的另一形式為自腫瘤組織自身分離之經純化熱休克蛋白質(HSP)。此等熱休克蛋白質含有腫瘤細胞蛋白質之片段且此等HSP高效遞送至抗原呈現細胞以引發腫瘤免疫力(Suot, R.等人,
Science
, 269:1585-1588 (1995)；Tamura, Y.等人,
Science
, 278:117-120 (1997))。 樹突狀細胞(DC)為可用於引發抗原特異性反應之強抗原呈現細胞。DC可離體產生且負載有各種蛋白質及肽抗原以及腫瘤細胞提取物(Nestle, F.等人,
Nat. Med.
, 4:328-332 (1998))。DC亦可藉由基因方法轉導以亦表現此等腫瘤抗原。DC亦已出於免疫目的而直接與腫瘤細胞融合(Kugler, A.等人,
Nat. Med.
, 6:332-336 (2000))。作為疫苗接種之方法，DC免疫作用可與PD-L1阻斷有效組合以活化更強抗腫瘤反應。 PD-L1阻斷亦可與標準癌症治療組合。PD-L1阻斷可與化學治療方案有效組合。在此等情形中，有可能減小所投與之化學治療劑的劑量(Mokyr, M.等人,
Cancer Res.
, 58:5301-5304 (1998))。此類組合之一個實例為巨環化合物與達卡巴嗪(decarbazine)組合用於治療黑素瘤。此類組合之另一個實例為巨環化合物與介白素-2 (IL-2)組合用於治療黑素瘤。支持PD-L1阻斷與化學療法組合使用之科學基本原理在於作為大部分化學治療化合物之細胞毒性作用結果的細胞死亡應使得抗原呈現路徑中腫瘤抗原之含量增加。可經由細胞死亡而與PD-L1阻斷產生協同作用的其他組合療法為輻射、手術及激素去除。此等方案中之每一者產生宿主中之腫瘤抗原之來源。血管生成抑制劑亦可與PD-L1阻斷組合。抑制血管生成導致腫瘤細胞死亡，其可將腫瘤抗原饋至宿主抗原呈現路徑中。 PD-L1阻斷巨環化合物亦可與使表現Fcα或Fcγ受體之效應細胞靶向腫瘤細胞之雙特異性巨環組合使用(參見例如美國專利第5,922,845號及第5,837,243號)。雙特異性巨環可用於靶向兩個單獨抗原。舉例而言，抗Fc受體/抗腫瘤抗原(例如Her-2/neu)雙特異性巨環已用於使巨噬細胞靶向腫瘤位點。此靶向可更有效地活化腫瘤特異性反應。此等反應之T細胞臂藉由使用PD-L1阻斷來強化。或者，可藉由使用結合至腫瘤抗原及樹突狀細胞特異性細胞表面標記之雙特異性巨環將抗原直接遞送至DC。 腫瘤藉由多種機制逃避宿主免疫監視。許多此等機制可藉由使腫瘤所表現且具免疫抑制性之蛋白質不活化來克服。此等蛋白質尤其包括TGF-β (Kehrl, J.等人,
J. Exp. Med.
, 163:1037-1050 (1986))、IL-10 (Howard, M.等人,
Immunology Today
, 13:198-200 (1992))及Fas配位體(Hahne, M.等人,
Science
, 274:1363-1365 (1996))。針對此等實體中之每一者的巨環化合物可與抗PD-L1組合使用，以抵消免疫抑制劑之效應且促進宿主的腫瘤免疫反應。 可用於活化宿主免疫反應之其他巨環化合物可與抗PD-L1組合使用。此等巨環化合物包括樹突狀細胞表面上之活化DC功能及抗原呈現的分子。抗CD40巨環化合物能夠有效替代輔助T細胞活性(Ridge, J.等人,
Nature
, 393:474-478 (1998))且可與PD-1抗體結合使用(Ito, N.等人,
Immunobiology
, 201(5):527-540 (2000))。活化針對以下T細胞協同刺激分子之巨環化合物亦可使得T細胞活化水準增加，諸如CTLA-4 (例如美國專利第5,811,097號)、OX-40 (Weinberg, A.等人,
Immunol.
, 164:2160-2169 (2000))、4-1BB (Melero, I.等人,
Nat. Med.
, 3:682-685 (1997)及ICOS (Hutloff, A.等人,
Nature
, 397:262-266 (1999))。 骨髓移植目前用於治療多種造血來源之腫瘤。雖然移植物抗宿主病為此治療之後果，但可自移植物抗腫瘤反應獲得治療效益。PD-L1阻斷可用於增加供體移植之腫瘤特異性T細胞的有效性。 亦存在涉及抗原特異性T細胞之離體活化及擴增及將此等細胞授受性轉移至受體中以便抗原特異性T細胞抗腫瘤之數個實驗性治療方案(Greenberg, R.等人,
Science
, 285:546-551 (1999))。此等方法亦可用於活化針對諸如CMV之感染物的T細胞反應。在巨環化合物存在下之離體活化可預期增加授受性轉移T細胞之頻率及活性。 感染性疾病 本發明之其他方法用於治療已暴露於特定毒素或病原體之患者。因此，本發明之另一個態樣提供一種治療個體之感染性疾病的方法，其包含向該個體投與本發明之巨環化合物，以便治療該個體之感染性疾病。 與其如上文所論述之針對腫瘤之應用類似，PD-L1阻斷可單獨使用或作為佐劑與疫苗組合使用以刺激針對病原體、毒素及自體抗原之免疫反應。此治療方法可特別適用之病原體之實例包括當前無有效疫苗之病原體或習知疫苗不完全有效之病原體。此等病原體包括(但不限於) HIV、肝炎(A、B及C)、流感、疱疹、梨形鞭毛蟲屬(Giardia)、瘧疾(Butler, N.S.等人,
Nature Immunology 13
, 188-195 (2012)；Hafalla, J.C.R.等人,
PLOS Pathogens
; February 2, 2012))、利什曼原蟲屬(Leishmania)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas Aeruginosa)。PD-L1阻斷特別適用於抵抗由經感染過程呈現改變抗原之感染物(諸如HIV)所確立之感染。此等新穎抗原決定基在投與抗人類PD-L1時識別為外來的，因此經由PD-L1引起藉由陰性信號未抑制之強T細胞反應。 引起可藉由本發明方法治療之感染之病原性病毒的一些實例包括HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II及CMV、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黃病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、科沙奇病毒(coxsackie virus)、冠狀病毒、呼吸道融合病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭狀瘤病毒、軟疣病毒(molluscum virus)、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒及蟲媒病毒性腦炎病毒。 引起可藉由本發明方法治療之感染之病原菌的一些實例包括衣原體(chlamydia)、立克次體細菌(rickettsial bacteria)、分枝桿菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)及淋球菌(conococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假單胞菌(pseudomonas)、軍團菌(legionella)、白喉(diphtheria)、沙門氏菌(salmonella)、桿菌(bacilli)、霍亂(cholera)、破傷風(tetanus)、肉毒中毒(botulism)、炭疽病(anthrax)、瘟疫(plague)、鉤端螺旋體病(leptospirosis)及萊姆病(Lymes disease)細菌。 引起可藉由本發明方法治療之感染之病原性真菌的一些實例包括念珠菌屬(Candida) (白色念珠菌(albicans)、克魯斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、麴菌屬(Aspergillus) (煙麯黴(fumigatus)、黑麴菌(niger)等)、毛黴目(Mucorales)屬(毛黴菌屬(mucor)、犁頭黴屬(absidia)、根黴屬(rhizophus))、申克氏胞絲菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)。 引起可藉由本發明方法治療之感染之病原性寄生蟲的一些實例包括溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)、大腸纖毛蟲(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴原蟲(Naegleriafowleri)、棘阿米巴蟲屬(Acanthamoeba sp.)、蘭比亞梨形鞭毛蟲(Giardia lambia)、隱胞子蟲屬(Cryptosporidium sp.)、肺炎肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲、微小巴倍蟲、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondi)及巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)。 在所有以上方法中，PD-L1阻斷可與以下其他形式之免疫療法組合，從而提供增強的腫瘤抗原呈現，諸如細胞激素治療(例如干擾素、靶向VEGF活性或VEGF受體之藥劑、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或雙特異性抗體療法(參見例如Holliger,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 90:6444-6448 (1993)；Poljak,
Structure
, 2:1121-1123 (1994))。 自體免疫反應 巨環化合物可引起且放大自體免疫反應。實際上，使用腫瘤細胞及肽疫苗誘發抗腫瘤反應揭示許多抗腫瘤反應涉及抗自體反應性(在抗CTLA-4+GM-CSF調節之B 16黑素瘤中觀測到去色素(van Elsas等人, 見上文)；Trp-2疫苗接種小鼠中之去色素(Overwijk, W.等人,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 96:2982-2987 (1999))；由TRAMP腫瘤細胞疫苗引起之自體免疫前列腺炎(Hurwitz, A., 見上文(2000))、在人類臨床試驗中觀測到黑素瘤肽抗原疫苗接種及白斑病(Rosenberg, S.A.等人,
J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol.
, 19(1):81-84 (1996))。 因此，可能考慮抗PD-L1阻斷與各種自身蛋白質結合使用以便設計高效產生針對此等自身蛋白質之免疫反應用於疾病治療的疫苗接種方案。舉例而言，阿茲海默氏病涉及類澱粉沈積物之β肽在腦中之不當積聚；針對類澱粉之抗體反應能夠清除此等類澱粉沈積物(Schenk等人,
Nature
, 400:173-177 (1999))。 其他自身蛋白質亦可用作靶標，諸如用於過敏症及哮喘治療之IgE及用於類風濕性關節炎治療之TNFα。最後，針對各種激素之抗體反應可藉由使用本文所揭示之巨環化合物誘發。針對生殖激素之中和抗體反應可用於避孕。針對特定腫瘤生長所需之激素及其他可溶性因子的中和抗體反應亦可視為可能的疫苗接種靶標。 如上所述使用抗PD-L1巨環化合物之類似方法可用於誘發治療性自體免疫反應以治療具有其他自身抗原(諸如類澱粉沈積物，包括阿茲海默氏病中之β；細胞激素，諸如TNFα及IgE)不當積聚之患者。 疫苗 巨環化合物可藉由抗PD-1巨環與所關注之抗原(例如疫苗)之共投與而用於刺激抗原特異性免疫反應。因此，在另一個態樣中，本發明提供一種增強個體體內針對抗原之免疫反應的方法，其包含向該個體投與：(i)該抗原；及(ii)抗PD-1巨環，使得個體體內針對該抗原之免疫反應得以增強。抗原可為例如腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或來自病原體之抗原。此類抗原之非限制性實例包括以上部分中所論述之抗原，諸如上文所論述之腫瘤抗原(或腫瘤疫苗)、或來自上文所述之病毒、細菌或其他病原體的抗原。 活體內及活體外投與本發明組合物(例如巨環化合物、多特異性及雙特異性分子及免疫結合物)之適合途徑為此項技術中所熟知，且可由一般技術者選擇。舉例而言，組合物可藉由注射(例如靜脈內或皮下)投與。所用分子之適合劑量將視個體之年齡及體重以及組合物之濃度及/或調配物而定。 如先前所述，本發明之巨環化合物可與一或多種其他治療劑(例如細胞毒性劑、放射毒性劑或免疫抑制劑)共投與。化合物可連接至藥劑(以免疫複合物形式)或可與藥劑分開投與。在後一情況(分開投與)中，化合物可在藥劑之前、之後或同時投與或可與其他已知療法(例如抗癌療法，例如輻射)共投與。此類治療劑尤其包括抗贅生性劑，諸如小紅莓(doxorubicin)(阿德力黴素(adriamycin))、順鉑博萊黴素硫酸鹽(cisplatin bleomycin sulfate)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、達卡巴嗪及環磷醯胺羥基脲(cyclophosphamide hydroxyurea)，其本身僅在對患者具毒性或亞毒性之含量下有效。順鉑每四週以100 mg/劑量靜脈內投與一次，且阿德力黴素每21天以60-75 mg/ml劑量靜脈內投與一次。本發明之巨環化合物與化學治療劑之共投與提供兩種經由不同機制操作之抗癌劑，其產生針對人類腫瘤細胞之細胞毒性效應。此類共投與可解決因耐藥性出現或腫瘤細胞之抗原性改變而將使其不與化合物起反應所致的問題。 包含本發明組合物(例如巨環化合物、雙特異性或多特異性分子或免疫結合物)及使用說明書之套組亦在本發明之範疇內。套組可另外含有至少一種額外試劑或一或多種本發明之額外巨環化合物(例如具有結合至PD-L1抗原中與巨環不同之抗原決定基的互補活性的人類抗體)。套組通常包括指示套組內含物之預期用途的標籤。術語標籤包括在套組上或與套組一起供應或以其他方式伴隨套組之任何書寫或記錄材料。 組合療法 本發明之巨環化合物與另一PD-L1拮抗劑及/或其他免疫調節劑之組合適用於增強針對過度增生性疾病之免疫反應。舉例而言，此等分子可投與培養物中、活體外或離體之細胞或投與人類個體(例如活體內)以在多種情形中增強免疫力。因此，在一個態樣中，本發明提供一種調節個體之免疫反應的方法，其包含向該個體投與本發明之巨環化合物以便調節該個體之免疫反應。較佳地，增強、刺激或上調反應。在另一個實施例中，本發明提供一種改變與用免疫刺激性治療劑治療過度增生性疾病相關聯之不良事件的方法，其包含向個體投與本發明之巨環化合物及低於治療劑量之另一種免疫調節劑。 藉由巨環化合物阻斷PD-L1可增強患者針對癌細胞之免疫反應。可使用本發明之巨環化合物抑制生長之癌症包括通常響應於免疫療法之癌症。用本發明之組合療法治療之癌症的代表性實例包括黑素瘤(例如轉移性惡性黑素瘤)、腎癌、前列腺癌、乳癌、結腸癌及肺癌。可使用本發明之方法治療之其他癌症的實例包括骨癌；胰臟癌；皮膚癌；頭頸癌；皮膚或眼內惡性黑素瘤；子宮癌；卵巢癌；直腸癌；肛門區癌；胃癌；睾丸癌；子宮癌；輸卵管癌；子宮內膜癌；子宮頸癌；陰道癌；外陰癌；霍奇金氏病；非霍奇金氏淋巴瘤；食道癌；小腸癌；內分泌系統癌；甲狀腺癌；副甲狀腺癌；腎上腺癌；軟組織肉瘤；尿道癌；陰莖癌；慢性或急性白血病，包括急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴球性白血病；兒童實體腫瘤；淋巴球性淋巴瘤；膀胱癌；腎癌或輸尿管癌；腎盂癌；中樞神經系統(CNS)贅瘤；原發性CNS淋巴瘤；腫瘤血管生成；脊軸腫瘤；腦幹神經膠質瘤；垂體腺瘤；卡堡氏肉瘤；表皮樣癌；鱗狀細胞癌；T細胞淋巴瘤；環境誘發癌，包括由石棉誘發之癌症；及該等癌症之組合。本發明亦適用於治療轉移性癌症。 在某些實施例中，含有至少一種本文中論述之巨環化合物的治療劑組合可以在醫藥學上可接受之載劑中之單一組合物形式同時投與，或以各藥劑可依次投與之分開組合物形式同時投與。舉例而言，第二免疫調節劑及本發明之巨環化合物可依次投與，諸如首先投與第二免疫調節劑且其次投與巨環化合物，或首先投與巨環化合物且其次投與第二免疫調節劑。此外，若依次投與一次以上劑量之組合療法，則依次投與之次序在每一投與時間點可顛倒或保持相同次序，依次投與可與同時投與組合或其任何組合。舉例而言，第二免疫調節劑及巨環化合物之第一次投與可同時，第二次投與可依次，其中首先投與第二免疫調節劑且其次投與巨環化合物，且第三次投與可依次，其中首先投與巨環化合物且其次投與第二免疫調節劑等。另一代表性給藥方案可涉及首先依次投與，其中首先投與巨環化合物且其次投與第二免疫調節劑，且後續投與可同時。 視情況，巨環化合物及第二免疫調節劑之組合可另外與免以下疫原性劑組合，諸如癌細胞、經純化之腫瘤抗原(包括重組蛋白質、肽及碳水化合物分子)、細胞及轉染有編碼免疫刺激細胞激素之基因的細胞(He等人,
J. Immunol.
, 173:4919-4928 (2004))。可使用之腫瘤疫苗的非限制性實例包括黑素瘤抗原之肽，諸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1及/或酪胺酸酶之肽，或經轉染以表現細胞激素GM-CSF之腫瘤細胞(下文進一步論述)。 經組合之PD-L1巨環化合物及第二免疫調節劑可另外與疫苗接種方案組合。已設計出針對腫瘤之許多實驗性疫苗接種策略(參見Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000)；Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring: 300-302 (2000)；Khayat, D., ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000)；Foon, K., ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000)；亦參見Restifo等人, Cancer Vaccines, 第61章, 第3023-3043頁, DeVita等人編,
Cancer: Principles and Practice of Oncology
, 第五版(1997))。在此等策略中之一者中，使用自體或同種異體腫瘤細胞製備疫苗。已顯示此等細胞疫苗在腫瘤細胞經轉導以表現GM-CSF時最有效。已顯示GM-CSF為用於腫瘤疫苗接種之抗原呈現之強活化劑(Dranoff等人,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 90:3539-3543 (1993))。 各種腫瘤中基因表現及大規模基因表現模式之研究已產生所謂腫瘤特異性抗原之定義(Rosenberg,
Immunity
, 10:281-287 (1999))。在許多情況下，此等腫瘤特異性抗原為腫瘤中及出現腫瘤之細胞中表現的分化抗原，例如黑素細胞抗原gp100、MAGE抗原及Trp-2。更重要的是，許多此等抗原可展示為宿主中發現之腫瘤特異性T細胞的靶標。在某些實施例中，經組合之PD-L1巨環化合物及第二免疫調節劑可與表現於腫瘤中之重組蛋白質及/或肽之集合結合使用以產生針對此等蛋白質之免疫反應。此等蛋白質通常被免疫系統視為自體抗原且因此對其具耐受性。腫瘤抗原亦可包括蛋白質端粒酶，其為合成染色體之端粒所必需的且表現於超過85%之人類癌症中且僅表現於有限數目之體細胞組織中(Kim等人,
Science
, 266:2011-2013 (1994))。(可藉由各種方法保護此等體細胞組織免受免疫攻擊)。腫瘤抗原亦可為由於改變蛋白質序列或在兩個無關序列之間形成融合蛋白(亦即費城染色體中之bcr-abl)之體細胞突變而在癌細胞中表現之「新抗原」或B細胞腫瘤之個體基因型。 其他腫瘤疫苗可包括人類癌症中所牽涉之病毒的蛋白質，該等病毒諸如人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV及HCV)及卡堡氏疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可與PD-L1巨環化合物阻斷結合使用之腫瘤特異性抗原的另一形式為自腫瘤組織自身分離之經純化熱休克蛋白質(HSP)。此等熱休克蛋白質含有腫瘤細胞蛋白質之片段且此等HSP高效遞送至抗原呈現細胞以引發腫瘤免疫力(Suot等人,
Science
, 269:1585-1588 (1995)；Tamura等人,
Science
, 278:117-120 (1997))。 樹突狀細胞(DC)為可用於引發抗原特異性反應之強抗原呈現細胞。DC可離體產生且負載有各種蛋白質及肽抗原以及腫瘤細胞提取物(Nestle等人,
Nat. Med.
, 4:328-332 (1998))。DC亦可藉由基因方法轉導以亦表現此等腫瘤抗原。DC亦已出於免疫目的而直接與腫瘤細胞融合(Kugler等人,
Nat. Med.
, 6:332-336 (2000))。作為疫苗接種之方法，DC免疫作用可與經組合之抗PD-L1巨環化合物及第二免疫調節劑進一步有效組合以活化更強抗腫瘤反應。 經組合之抗PD-L1巨環化合物及額外免疫調節劑亦可與標準癌症治療進一步組合。舉例而言，巨環化合物與第二免疫調節劑之組合可與化學治療方案有效組合。在此等情形中，如在巨環化合物與第二免疫調節劑之組合下所觀測，有可能減小與本發明之組合一起投與之其他化學治療劑的劑量(Mokyr等人,
Cancer Res.
, 58:5301-5304 (1998))。此類組合之一個實例為巨環化合物與第二免疫調節劑之組合與達卡巴嗪進一步組合用於治療黑素瘤。另一個實例為巨環化合物與第二免疫調節劑之組合與介白素-2 (IL-2)進一步組合用於治療黑素瘤。支持PD-L1巨環化合物及另一種免疫調節劑與化學療法組合使用之科學基本原理在於作為大部分化學治療化合物之細胞毒性作用結果的細胞死亡應使得抗原呈現路徑中腫瘤抗原之含量增加。可經由細胞死亡而與經組合之抗PD-L1巨環化合物及額外免疫調節劑產生協同作用的其他組合療法包括輻射、手術及激素去除。此等方案中之每一者產生宿主中之腫瘤抗原之來源。血管生成抑制劑亦可與經組合之PD-L1及第二免疫調節劑組合。抑制血管生成導致腫瘤細胞死亡，其亦可為饋至宿主抗原呈現路徑中之腫瘤抗原之來源。 PD-L1與另一種免疫調節劑之組合亦可與使表現Fcα或Fcγ受體之效應細胞靶向腫瘤細胞之雙特異性巨環組合使用(參見例如美國專利第5,922,845號及第5,837,243號)。雙特異性巨環可用於靶向兩個單獨抗原。舉例而言，抗Fc受體/抗腫瘤抗原(例如Her-2/neu)雙特異性巨環已用於使巨噬細胞靶向腫瘤位點。此靶向可更有效地活化腫瘤特異性反應。此等反應之T細胞臂藉由使用經組合之PD-L1及第二免疫調節劑來強化。或者，可藉由使用結合至腫瘤抗原及樹突狀細胞特異性細胞表面標記之雙特異性巨環將抗原直接遞送至DC。 在另一個實例中，巨環化合物與第二免疫調節劑之組合可與以下抗贅生性巨環劑結合使用，諸如RITUXAN® (利妥昔單抗(rituximab))、HERCEPTIN® (曲妥珠單抗(trastuzumab))、BEXXAR® (托西莫單抗(tositumomab))、ZEVALIN® (布突默單抗(ibritumomab))、CAMPATH® (阿侖單抗(alemtuzumab))、Lymphocide (依帕珠單抗(eprtuzumab))、AVASTIN® (貝伐單抗(bevacizumab))及TARCEVA® (埃羅替尼(erlotinib))及其類似物。舉例而言且不希望受理論束縛，用抗癌抗體或與毒素結合之抗癌抗體治療可導致癌細胞死亡(例如腫瘤細胞)，其將強化藉由第二免疫調節劑靶標或PD-L1介導之免疫反應。在一個示例性實施例中，過度增生性疾病(例如癌症腫瘤)之治療可包括抗癌抗體與同時或依次或其任何組合投與之巨環化合物及第二免疫調節劑之組合，其可強化宿主之抗腫瘤免疫反應。 腫瘤藉由多種機制逃避宿主免疫監視。許多此等機制可藉由使腫瘤所表現且具免疫抑制性之蛋白質不活化來克服。此等蛋白質尤其包括TGF-β (Kehrl, J.等人,
J. Exp. Med.
, 163:1037-1050 (1986))、IL-10 (Howard, M.等人,
Immunology Today
, 13:198-200 (1992))及Fas配位體(Hahne, M.等人,
Science
, 274:1363-1365 (1996))。在另一個實例中，針對此等實體中之每一者的抗體可與巨環化合物及另一種免疫調節劑進一步組合，以抵消免疫抑制劑之效應且促進宿主的腫瘤免疫反應。 可用於活化宿主免疫反應性之其他藥劑可與本發明之巨環化合物進一步組合使用。此等藥劑包括樹突狀細胞表面上之活化DC功能及抗原呈現的分子。抗CD40巨環肽能夠有效替代輔助T細胞活性(Ridge, J.等人,
Nature
, 393:474-478 (1998))且可與單獨或與抗CTLA-4組合組合之本發明之巨環化合物結合使用(Ito, N.等人,
Immunobiology
, 201(5):527-540 (2000))。活化針對以下T細胞協同刺激分子之巨環化合物亦可使得T細胞活化水準增加，諸如OX-40 (Weinberg, A.等人,
Immunol.
, 164:2160-2169 (2000))、4-1BB (Melero, I.等人,
Nat. Med.
, 3:682-685 (1997)及ICOS (Hutloff, A.等人,
Nature
, 397:262-266 (1999))。 骨髓移植目前用於治療多種造血來源之腫瘤。雖然移植物抗宿主病為此治療之後果，但可自移植物抗腫瘤反應獲得治療效益。單獨或與另一種免疫調節劑組合之本發明之巨環化合物可用於增加供體移植之腫瘤特異性T細胞的有效性。 亦存在涉及抗原特異性T細胞之離體活化及擴增及將此等細胞授受性轉移至受體中以便抗原特異性T細胞抗腫瘤之數個實驗性治療方案(Greenberg, R.等人,
Science
, 285:546-551 (1999))。此等方法亦可用於活化針對諸如CMV之感染物的T細胞反應。在單獨或與另一種免疫調節劑組合之本發明之巨環化合物存在下之離體活化可預期增加授受性轉移T細胞之頻率及活性。 在某些實施例中，本發明提供一種改變與用免疫刺激劑治療過度增生性疾病相關聯之不良事件的方法，其包含向個體投與本發明之巨環化合物與低於治療劑量之另一種免疫調節劑之組合。舉例而言，本發明之方法提供一種藉由向患者投與不可吸收類固醇而降低免疫刺激性治療抗體誘發之結腸炎或腹瀉之發病率的方法。由於任何將接受免疫刺激性治療抗體之患者處於罹患由此類治療誘發之結腸炎或腹瀉的風險下，故此整個患者群體適合於根據本發明方法之療法。雖然已投與類固醇以治療發炎性腸病(IBD)及預防IBD惡化，但其尚未用於尚未診斷患有IBD之患者預防(降低發病率) IBD。與類固醇(甚至不可吸收類固醇)相關聯之顯著副作用已阻礙預防性使用。 在其他實施例中，單獨或與另一種免疫調節劑組合之本發明之巨環化合物可與任何不可吸收類固醇之使用進一步組合。如本文所用，「不可吸收類固醇」為展現深入首次代謝的糖皮質激素，使得在肝臟中代謝後，類固醇之生物利用率低，亦即小於約20%。在本發明之一個實施例中，不可吸收類固醇為布地奈德(budesonide)。布地奈德為局部起效的糖皮類固醇，其在經口投與後主要藉由肝臟深入代謝。ENTOCORT® EC (Astra-Zeneca)為經研發以使藥物遞送至迴腸及貫穿結腸最佳化之布地奈德的pH及時間依賴性經口調配物。ENTOCORT® EC在美國核准用於治療涉及迴腸及/或升結腸之輕度至中度克羅恩氏病(Crohn's disease)。用於治療克羅恩氏病之ENTOCORT® EC的常用口服劑量為6至9毫克/天。ENTOCORT® EC在腸中釋放，隨後吸收且保留在腸道黏膜中。一次其通過腸道黏膜目標組織，ENTOCORT® EC在肝臟中藉由細胞色素P450系統深入代謝成具有可忽略的糖皮質激素活性的代謝物。因此，生物利用率較低(約10%)。布地奈德之低生物利用率使得與具有較不深入之首次代謝的其他糖皮質激素相比的治療比率得以改善。布地奈德與全身起效的皮質類固醇相比產生較少不良作用，包括下丘腦-垂體抑制作用較小。然而，長期投與ENTOCORT® EC可導致全身性糖皮質激素效應，諸如腎上腺皮質機能亢進症及腎上腺抑制。參見
Physicians' Desk Reference Supplement
, 第58版, 608-610 (2004)。 在其他實施例中，PD-L1及另一種免疫調節劑與不可吸收類固醇結合之組合可與水楊酸進一步組合。水楊酸包括5-ASA劑，諸如：柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine) (AZULFIDINE®, Pharmacia & Upjohn)；奧沙拉嗪(olsalazine) (DIPENTUM®, Pharmacia & UpJohn)；巴柳氮(balsalazide) (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.)；及美沙拉嗪(mesalamine) (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals；PENTASA®, Shire US；CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.；ROWASA®, Solvay)。 劑量及調配物 式I之適合化合物或更特定言之本文所述之巨環化合物可作為單獨化合物及或與可接受之載劑混合以醫藥調配物形式投與患者以治療糖尿病及其他相關疾病。熟習治療糖尿病之技術者可易於確定向需要此類治療之哺乳動物(包括人類)投與化合物之劑量及途徑。投藥途徑可包括(但不限於)經口、口內、經直腸、經皮、經頰、鼻內、經肺、皮下、肌肉內、皮內、舌下、結腸內、眼內、靜脈內或腸道投與。根據投藥途徑，基於可接受之藥學實踐調配化合物(Fingl等人,
The Pharmacological Basis of Therapeutics
, 第1章, 第1頁 (1975)；
Remington's Pharmaceutical Sciences
, 第18版, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990))。 本文所述之醫藥學上可接受之化合物組合物可以多種劑型投與，諸如錠劑、膠囊(其各包括持續釋放或定時釋放調配物)、丸劑、散劑、顆粒、酏劑、原位凝膠、微球體、晶體複合物、脂質體、微乳液、酊劑、懸浮液、糖漿、氣溶膠噴霧劑及乳液。本文所述之組合物亦可以經口、靜脈內(快速注射或輸注)、腹膜內、皮下、經皮或肌肉內形式投與，全部使用一般熟習醫藥技術者熟知的劑型。組合物可單獨投與，但一般將與基於所選投藥途徑及標準醫藥實踐選擇的醫藥載劑一起投與。 本文所述之組合物的給藥方案將當然視已知因素而變化，諸如特定藥劑之藥力學特徵及其投藥模式及途徑；接受者之物種、年齡、性別、健康狀況、醫學病狀及體重；症狀之性質及程度；同時發生的治療的種類；治療頻率；投藥途徑、患者之腎功能及肝功能以及所需效應。醫師或獸醫可確定預防、對抗或遏止疾病狀態之進程所需之有效量之藥物且開具該有效量之藥物的處方。 根據一般指導，活性成分在用於指定效應時之口服日劑量將介於每公斤體重約0.001至約1000 mg範圍內，較佳每天每公斤體重約0.01至約100 mg，且最佳每天每公斤約0.6至約20 mg。活性成分在用於指定效應時之靜脈內日劑量將在恆定速率輸注期間介於每公斤體重每分鐘0.001 ng至100.0 ng範圍內。此類恆定靜脈內輸注可較佳以每公斤體重每分鐘0.01 ng至50 ng且最佳每公斤體重每分鐘0.01 ng至10.0 mg之速率投與。本文所述之組合物可以單次日劑量投與，或每日總劑量可分成每日兩次、三次或四次分次給藥投與。本文所述之組合物亦可視需要藉由將允許經數天/週/月之時段持續釋放藥物之儲槽式調配物投與。 本文所述之組合物可經由局部使用適合之鼻內媒劑以鼻內形成或使用經皮皮膚貼片經由經皮途徑投與。當以經皮遞送系統形式投與時，劑量投與將當然在整個給藥方案中為連續而非間斷的。 組合物通常與根據預定投藥形式(亦即口服錠劑、膠囊、酏劑、在推進劑存在或不存在下生成之氣溶膠噴霧劑及糖漿)適當選擇且與習知醫藥實踐相符之適合醫藥稀釋劑、賦形劑或載劑(在本文中統稱為醫藥載劑)混合投與。 舉例而言，對於以錠劑或膠囊形式經口投與，活性藥物組分可與以下經口、無毒、醫藥學上可接受之惰性載劑組合，諸如(但不限於)乳糖、澱粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、磷酸二鈣、硫酸鈣、甘露醇及山梨醇；對於以液體形式經口投與，經口藥物組分可與以下任何經口、無毒、醫藥學上可接受之惰性載劑組合，諸如(但不限於)乙醇、丙三醇及水。此外，當需要或必要時，亦可將適合之黏合劑、潤滑劑、崩解劑及著色劑併入混合物中。適合之黏合劑包括(但不限於)澱粉；明膠；天然糖，諸如(但不限於)葡萄糖或β-乳糖；玉米甜味劑；天然及合成膠，諸如阿拉伯膠、黃蓍膠或海藻酸鈉；羧基甲基纖維素；聚乙二醇及蠟。用於此等劑型之潤滑劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉及氯化鈉。崩解劑包括(但不限於)澱粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土及三仙膠。 本文所述之組合物亦可以混合微胞或脂質體遞送系統形式投與，諸如單層小微脂粒、單層大微脂粒及多層微脂粒。脂質體可由多種磷脂形成，諸如膽固醇、硬脂胺或磷脂醯膽鹼。可添加滲透增強劑以增強藥物吸收。 由於已知前藥增強許多所需醫藥品質(亦即溶解性、生物可用性、製造等)，故本文所述化合物可以前藥形式遞送。因此，本文所述之標的物意欲涵蓋本發明所主張之化合物的前藥、遞送其之方法及含有其之組合物。 本文所述之組合物亦可與作為靶向藥物載劑之可溶性聚合物偶合。此類聚合物可包括聚乙烯-吡咯啶酮、哌喃共聚物、聚羥丙基-甲基丙烯醯胺-苯酚、聚羥乙基天冬醯胺苯酚或經軟脂醯基殘基取代之聚氧化乙烯-聚離胺酸。此外，本文所述之組合物可與以下適用於實現藥物控制釋放之一類可生物降解聚合物組合，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸與聚乙醇酸之共聚物、聚ε己內酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫哌喃、聚氰基丙烯酸酯及水凝膠之交聯或兩性嵌段共聚物。 適於投與之劑型(醫藥組合物)可含有每劑量單位約0.01毫克至約500毫克活性成分。在此等醫藥組合物中，活性成分將通常以按該組合物之總重量計約0.5-95重量%之量存在。 明膠膠囊可含有活性成分及粉末狀載劑，諸如乳糖、澱粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂及硬脂酸。類似稀釋劑可用於製造壓製錠劑。錠劑及膠囊可製造為持續釋放產物以提供藥物經數小時時段之連續釋放。壓製錠劑可經糖包覆或經膜包覆以掩蓋任何令人不愉快的味道且保護錠劑不受大氣影響，或經腸溶包衣包覆以便在胃腸道中選擇性崩解。 用於經口投與之液體劑型可含有著色劑及調味劑以增加患者接受性。 一般而言，水、適合之油、生理鹽水、右旋糖(葡萄糖)及相關糖水溶液及二醇(諸如丙二醇或聚乙二醇)為適用於非經腸溶液之載劑。用於非經腸投與之溶液較佳含有活性成分之水溶性鹽、適合之穩定劑及(若需要)緩衝物質。單獨或合併之抗氧化劑，諸如亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸為適合之穩定劑。亦使用檸檬酸及其鹽及EDTA鈉。另外，非經腸溶液可含有防腐劑，諸如氯化苯甲烴銨、對羥基苯甲酸甲酯或丙酯及氯丁醇。 適合之醫藥載劑描述於本領域之標準參考本文
Remington: The Science and Practice of Pharmacy
, 第十九版, Mack Publishing Company (1995)中。 適用於本文所述化合物投與之代表性醫藥劑型可說明如下： 膠囊 大多數單位膠囊可藉由用100毫克粉末狀活性成分、150毫克乳糖、50毫克纖維素及6毫克硬脂酸鎂填充標準分半硬明膠膠囊來製備。 軟明膠膠囊 可製備活性成分於可消化油(諸如大豆油、棉籽油或橄欖油)中之混合物且藉助於正排量泵注入明膠中以形成含有100毫克活性成分之軟明膠膠囊。膠囊應洗滌且乾燥。 錠劑 錠劑可藉由習知程序製備以使得劑量單位例如為100毫克活性成分、0.2毫克膠態二氧化矽、5毫克硬脂酸鎂、275毫克微晶纖維素、11毫克澱粉及98.8毫克乳糖。可施用適當包衣以增加可口性或延遲吸收。 可注射劑 本文所述之化合物組合物的可注射調配物可或可不需要使用賦形劑，諸如已經監管機構核准之賦形劑。此等賦形劑包括(但不限於)溶劑及共溶劑、增溶劑、乳化劑或增稠劑、螯合劑、抗氧化劑及還原劑、抗微生物防腐劑、緩衝劑及pH調節劑、增積劑、保護劑及張力調節劑及專門添加劑。可注射調配物必須無菌、無熱原質且在溶液情況下，不含微粒物質。 適於藉由注射投與之非經腸組合物可藉由將例如1.5重量%活性成分攪拌於可或可不含有共溶劑或其他賦形劑之醫藥學上可接受之緩衝液中來製備。溶液應用氯化鈉等張且滅菌。 懸浮液 可製備用於經口及/或非經腸投與之水性懸浮液，以使得例如各5 mL含有100 mg細粉狀活性成分、20 mg羧甲基纖維素鈉、5 mg苯甲酸鈉、1.0 g山梨醇溶液U.S.P.及0.025 mL香草精或其他可口調味劑。 可生物降解微粒 適於藉由注射投與之持續釋放非經腸組合物可例如藉由將適合之可生物降解聚合物溶解於溶劑中，將欲併入之活性劑添加至聚合物溶液且自基質移除溶劑，由此形成活性劑分佈於整個基質中之聚合物基質來製備。 化合物合成 本文中之本發明的描述應視為與化學鍵結之定律及原理一致。應理解，本發明涵蓋之化合物為適當穩定地用作藥劑之彼等化合物。基於化學鍵結及穩定性之一般原理，熟習此項技術者將知曉何等化合物將穩定及將不穩定。 本發明之巨環化合物的化學合成可使用多種此項技術公認之方法進行，包括逐步固相合成、經由構形輔助之肽片段再接合的半合成、選殖或合成肽區段之酶促接合及化學接合。合成本文所述之巨環化合物及其類似物之較佳方法為使用各種固相技術之化學合成，諸如描述於Chan, W.C.等人編,
Fmoc Solid Phase Synthesis
, Oxford University Press, Oxford (2000)；Barany, G.等人,
The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology
, 第2卷: 「Special Methods in Peptide Synthesis, Part A」, 第3-284頁, Gross, E.等人編, Academic Press, New York (1980)；及Stewart, J.M.等人,
Solid-Phase Peptide Synthesis
, 第2版, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)中之固相技術。較佳策略係基於用於臨時保護α-胺基之Fmoc (9-茀基甲基甲基-氧基羰基)基團與用於臨時保護胺基酸側鏈之第三丁基組合(參見例如Atherton, E.等人, 「The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group」,
The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology
, 第9卷: 「Special Methods in Peptide Synthesis, Part C」, 第1-38頁, Undenfriend, S.等人編, Academic Press, San Diego (1987)。 化合物可以逐步方式在不溶性聚合物負載物(亦稱為「樹脂」)上自化合物之C端開始合成。藉由將化合物之C端胺基酸經由形成醯胺或酯鍵附接至樹脂開始合成。此使得所得化合物最終分別以C端醯胺或羧酸形式釋放。 用於合成之C端胺基酸及所有其他胺基酸需要使其α-胺基及側鏈官能基(若存在)有差異地受保護，使得α-胺基保護基可在合成期間選擇性移除。胺基酸之偶合藉由將其羧基活化為活性酯且使其與附接至樹脂之N端胺基酸未封端之α-胺基反應來進行。重複α-胺基脫除保護基及偶合之順序，直至組裝整個化合物序列為止。化合物接著自樹脂釋放，同時伴隨側鏈官能基脫除保護基，通常在適當清除劑存在下進行以限制副反應。所得化合物最終藉由逆相HPLC純化。 作為最終化合物之前驅物所需之肽基-樹脂的合成利用市售交聯聚苯乙烯聚合物樹脂(Novabiochem, San Diego, CA; Applied Biosystems, Foster City, CA)。C端甲醯胺之較佳固體負載物為：4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-胺基甲基)-苯氧基乙醯基-對甲基二苯甲胺樹脂(Rink醯胺MBHA樹脂)；9-Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基-Merrifield樹脂(Sieber醯胺樹脂)；4-(9-Fmoc)胺基甲基-3,5-二甲氧基苯氧基)戊醯基-胺基甲基-Merrifield樹脂(PAL樹脂)。第一及後續胺基酸之偶合可使用HOBt、6-Cl-HOBt或分別由DIC/HOBt、HBTU/HOBt、BOP、PyBOP生產或由DIC/6-Cl-HOBt、HCTU、DIC/HOAt或HATU生產之HOAt活性酯實現。受保護之化合物片段的較佳固體負載物為：2-氯三苯甲基氯樹脂及9-Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基-Merrifield樹脂(Sieber醯胺樹脂)。第一胺基酸裝載於2-氯三苯甲基氯樹脂上最佳藉由使受Fmoc保護之胺基酸與樹脂在二氯甲烷及DIEA中反應來實現。若需要，可添加少量DMF以促進胺基酸溶解。 本文所述之化合物類似物的合成可藉由使用單通道或多通道肽合成器來進行，諸如CEM Liberty Microwave合成器或Protein Technologies, Inc. Prelude (6通道)、Symphony (12通道)或Symphony-X (12或24通道)合成器。 肽基-樹脂前驅物可使用任何標準程序裂解且脫除保護基(參見例如King, D.S.等人,
Int. J. Peptide Protein Res.
, 36:255-266 (1990))。所需方法為在水及作為清除劑之TIS存在下使用TFA。通常，肽基-樹脂在室溫下於TFA/水/TIS (94:3:3，v:v:v；1 mL/100 mg肽基樹脂)中攪拌2-6小時。接著濾出已用樹脂且濃縮TFA溶液或在減壓下乾燥。所得粗物質化合物沈澱且用Et
2
O洗滌或直接再溶解於DMSO或50%乙酸水溶液中以便藉由製備型HPLC純化。 具有所需純度之化合物可藉由例如在Waters型號4000或Shimadzu型號LC-8A液體層析儀上使用製備型HPLC純化來獲得。將粗物質化合物溶液注入YMC S5 ODS (20×100 mm)管柱中且用MeCN/水(均用0.1% TFA緩衝)之線性梯度使用14-20 mL/min之流動速率溶離，同時藉由在220 nm下之UV吸光度監測流出物。經純化化合物之結構可藉由電噴霧MS分析確認。
實例
本申請案中所用(具體包括在以下說明性流程及實例中)的縮寫為熟習此項技術者所熟知。一些所用縮寫如下：min或mins表示分鐘；h或hr表示小時；RT或rt表示室溫或滯留時間(上下文將指示)；sat.表示飽和；TFA表示三氟乙酸；DMF表示N,N-二甲基甲醯胺；DCM表示二氯甲烷；Fmoc表示9-茀基甲氧基羰基；HATU表示(1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽)；DIEA或DIPEA表示二異丙基乙胺；NMP表示N-甲基吡咯啶酮；EDC表示1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺；DMSO表示二甲亞碸；MeOH表示甲醇；EtOAc表示乙酸乙酯；Et
3
N表示三乙胺；MeCN或ACN表示乙腈；DIAD表示偶氮二甲酸二乙酯；及TMSI表示三甲基矽烷基碘。
分析資料：
質譜分析：「ESI-MS(+)」表示在陽離子模式中進行之電噴霧電離質譜分析；「ESI-MS(-)」表示在陰離子模式中進行之電噴霧電離質譜分析；「ESI-HRMS(+)」表示在陽離子模式中進行之高解析度電噴霧電離質譜分析；「ESI-HRMS(-)」表示在陰離子模式中進行之高解析度電噴霧電離質譜分析。所偵測之質量在「
m/z
」單位名稱後報導。精確質量大於1000之化合物常常偵測為雙電荷或三電荷離子。 以下分析方案及合成方法適用於實例1400-1508。
分析資料：
質譜分析：「ESI-MS(+)」表示在陽離子模式中進行之電噴霧電離質譜分析；「ESI-MS(-)」表示在陰離子模式中進行之電噴霧電離質譜分析；「ESI-HRMS(+)」表示在陽離子模式中進行之高解析度電噴霧電離質譜分析；「ESI-HRMS(-)」表示在陰離子模式中進行之高解析度電噴霧電離質譜分析。所偵測之質量在「
m/z
」單位名稱後報導。精確質量大於1000之化合物常常偵測為雙電荷或三電荷離子。
分析 LCMS 條件 A ：
管柱：BEH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：水 + 0.05% TFA；移動相B：乙腈 + 0.05% TFA；溫度：50℃；梯度：經2分鐘2% B至98% B，接著在98% B下保持0.5分鐘；流速：0.8 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 B ：
管柱：BEH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.05% TFA；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.05% TFA；溫度：50℃；梯度：經3分鐘0-100% B，接著在100% B下保持0.75分鐘；流速：1.11 mL/min。
分析 LCMS 條件 C ：
管柱：BEH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：水 + 0.2%甲酸及0.01% TFA；移動相B：乙腈 + 0.2%甲酸0.01% TFA；溫度：50℃；梯度：經2分鐘2% B至80% B，經0.1分鐘80% B至98% B，接著在98% B下保持0.5分鐘；流速：0.8 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 D ：
管柱：Waters Acquity UPLC BEH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：50℃；梯度：經3分鐘0-100% B，接著在100% B下保持0.75分鐘；流速：1.11 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 E ：
管柱：Waters Acquity UPLC BEH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；溫度：50℃；梯度：經3分鐘0-100% B，接著在100% B下保持0.75分鐘；流速：1.11 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 F ：
管柱：Waters Xbridge C18, 2.1 × 50 mm；移動相A：5:95乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：35℃；梯度：經4分鐘0-100% B，接著在100% B下保持1分鐘；流速：4 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 G ：
Finnigan LTQ質譜儀；管柱：Phenomenex Jupiter C4, 1 × 50 mm；移動相A：1%甲酸/水；移動相B：0.1%甲酸/乙腈；溫度：30℃；梯度：1% B，保持1分鐘；經3分鐘1-95% B，接著在95% B下保持3分鐘；流速：0.15 mL/min。
分析 LCMS 條件 H ：
管柱：Waters BEH C18, 2.0 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：50℃；梯度：經3分鐘0−100% B，接著在100% B下保持0.5分鐘；流速：1.0 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 I ：
管柱：Waters BEH C18, 2.0 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：50℃；梯度：經3分鐘0-100% B，接著在100% B下保持0.5分鐘；流速：0.5 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 HPLC 條件 A ：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；移動相A：水 + 0.1% TFA；移動相B：乙腈 + 0.1% TFA；溫度：60℃；梯度：經25分鐘35% B至80% B；流速：1 mL/min；偵測：UV，217 nm。
分析 HPLC 條件 B ：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；移動相A：水 + 0.1% TFA；移動相B：乙腈 + 0.1% TFA；溫度：60℃；梯度：經25分鐘25% B至75% B；流速：1 mL/min；偵測：UV，217 nm。
分析 HPLC 條件 C ：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；移動相A：水 + 0.1% TFA；移動相B：乙腈 + 0.1% TFA；溫度：60℃；梯度：經25分鐘20% B至70% B；流速：1 mL/min；偵測：UV，217 nm。
分析 HPLC 條件 D ：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；移動相A：水 + 0.1% TFA；移動相B：乙腈 + 0.1% TFA；溫度：60℃；梯度：經25分鐘15% B至65% B；流速：1 mL/min；偵測：UV，217 nm。
分析 HPLC 條件 E ：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；移動相A：水 + 0.1% TFA；移動相B：乙腈 + 0.1% TFA；溫度：60℃；梯度：經20分鐘25% B至60% B；流速：1.25 mL/min；偵測：UV，217 nm。
分析 HPLC 條件 F ：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；移動相A：水 + 0.1% TFA；移動相B：乙腈 + 0.1% TFA；溫度：60℃；梯度：經20分鐘25% B至65% B；流速：1.25 mL/min；偵測：UV，217 nm。
分析 HPLC 條件 G ：
管柱：Sunfire C18 3.5um, 3.0×150mm；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.05%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.05%三氟乙酸；溫度：50℃；梯度：經12分鐘10-100% B，接著在100% B下保持3分鐘；流速：1 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 HPLC 條件 H ：
管柱：Xbridge Phenyl 3.5×150um，移動相A：5:95乙腈:水 + 0.05%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.05%三氟乙酸；溫度：50℃；梯度：經12分鐘10-100% B，接著在100% B下保持3分鐘；流速：1 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 HPLC 條件 I ：
管柱：Phenomenex Luna 5u C18(2) 150 × 4.6 mm；移動相A：水 + 0.1%三氟乙酸，移動相B：乙腈 + 0.1%三氟乙酸，梯度：經20分鐘5-100% B，接著在100% B下保持5分鐘；流速：1 mL/min，偵測：UV，220
分析 HPLC 條件 J ：
管柱：Phenomenex Luna 5u C18(2) 150 × 4.6 mm；移動相A：水 + 0.1%三氟乙酸，移動相B：乙腈 + 0.1%三氟乙酸，梯度：經20分鐘10-100% B，接著在100% B下保持5分鐘；流速：1 mL/min，偵測：UV，220
通用程序 ： Prelude 方法 A ：
所有操作在Prelude肽合成器(Protein Technologies)上自動進行。除非另外指出，否則所有程序在裝配有底部玻璃料之10或45 mL聚丙烯管中進行。該管經由該管之底部及頂部連接至Prelude肽合成器。DMF及DCM可經由管頂部添加，其向下同等洗滌管側。其餘試劑經由管底部添加且向上穿過玻璃料以接觸樹脂。所有溶液經由管底部移除。「週期性攪動」描述經由底部玻璃料之短暫N
2
氣脈衝；脈衝持續約5秒且每隔30秒出現。一般不使用製備超過三週之胺基酸溶液。Sieber = Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中「3-基氧基」描述與聚苯乙烯樹脂連接之位置及類型。所用樹脂為具有Sieber連接基團(在氮處受Fmoc保護)之Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1% DVB，0.71 mmol/g裝載量。常用胺基酸列於以下，其中側鏈保護基在括弧內指出。Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。 「Prelude方法A」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。此規模相當於大致140 mg上文所述之Sieber-Merrifield樹脂。所有程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。在胺基酸偶合之前，所有化合物合成順序始於樹脂溶脹程序，下文描述為「樹脂溶脹程序」。將胺基酸偶合至一級胺N端使用下文所述之「單偶合程序」。Fmoc-N-甲基胺基酸之偶合及偶合至二級胺N端使用下文所述之「二級胺偶合程序」。將氯乙醯基偶合至化合物之N端藉由下文詳述之「氯乙醯氯偶合程序」或「氯乙酸偶合程序」描述。
樹脂溶脹程序 ：
向40 mL聚丙烯固相反應容器中添加Merrifield:Sieber樹脂(140 mg，0.100 mmol)。樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (5.0 mL)及DCM (5.0 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物10分鐘，隨後排出溶劑。
單偶合程序 ：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸及HOAt之溶液(0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)，接著添加DIC (0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)。週期性攪動混合物60分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
二級胺偶合程序 ：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸及HOAt之溶液(0.2M於DMF中，5.0 mL，5 eq)，接著添加DIC (0.2M於DMF中，5.0 mL，5 eq)。週期性攪動混合物300分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
氯乙醯氯偶合程序
： 向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加3.0 mL DIPEA (4.0 mmol，0.699 mL，40 eq)及氯乙醯氯(2.0 mmol，0.160 mL，20 eq)於DMF中之溶液。週期性攪動混合物12至18小時，接著排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，將DMF (4.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，將DCM (4.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後排出溶液。
Prelude 方法 B ：
所有操作在Prelude肽合成器(Protein Technologies)上自動進行。所有程序在裝配有底部玻璃料之10或45 mL聚丙烯管中進行。DMF及DCM可經由管頂部添加，其向下同等洗滌管側。其餘試劑經由管底部添加且向上穿過玻璃料以接觸樹脂。所有溶液經由管底部移除。「週期性攪動」描述經由底部玻璃料之短暫N
2
氣脈衝；脈衝持續約5秒且每隔30秒出現。一般不使用製備超過三週之胺基酸溶液。Sieber = Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中「3-基氧基」描述與聚苯乙烯樹脂連接之位置及類型。所用樹脂為具有Sieber連接基團(在氮處受Fmoc保護)之Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1% DVB，0.71 mmol/g裝載量。常用胺基酸列於以下，其中側鏈保護基在括弧內指出。Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。 「Prelude方法B」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。此規模相當於大致140 mg上文所述之Sieber-Merrifield樹脂。所有程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。在胺基酸偶合之前，所有化合物合成順序始於樹脂溶脹程序，下文描述為「樹脂溶脹程序」。將胺基酸偶合至一級胺N端使用下文所述之「單偶合程序」。將胺基酸偶合至二級胺N端使用下文所述之「二級胺偶合程序」。將氯乙醯基偶合至化合物之N端藉由下文詳述之「氯乙醯氯偶合程序」或「氯乙酸偶合程序」描述。
樹脂溶脹程序：
向40 mL聚丙烯固相反應容器中添加Merrifield:Sieber樹脂(140 mg，0.100 mmol)。樹脂如下洗滌(溶脹)三次：向反應容器中添加DMF (5.0 mL)及DCM (5.0 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶劑。
單偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)，接著添加HCTU (0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，2.5 mL，20 eq)。週期性攪動混合物30分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
雙偶合程序 ：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)，接著添加HCTU (0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，2.5 mL，20 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂用經由容器頂部之DMF (4.0 mL)連續洗滌3次且週期性攪動所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)，接著添加HCTU (0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，2.5 mL，20 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
二級胺偶合程序 ：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，2.5 mL，10 eq)，接著添加HCTU (0.2M於DMF中，2.5 mL，10 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.5 mL，12 eq)。週期性攪動混合物12小時，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
氯乙醯氯偶合程序 A ：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加3.0 mL DIPEA (4.0 mmol，0.699 mL，40 eq)及氯乙醯氯(2.0 mmol，0.160 mL，20 eq)於DMF中之溶液。週期性攪動混合物12至18小時，接著經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，將DMF (4.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，將CH
2
Cl
2
(2.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。
氯乙酸偶合程序 B
： 向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加DMF (2.0 mL)、氯乙酸(1.2 mmol，113 mg，12 eq)及N,N'-二異丙基碳化二亞胺(1.2 mmol，0.187 mL，12 eq)。週期性攪動混合物12至18小時，接著經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，將DMF (4.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，將CH
2
Cl
2
(2.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。
Prelude 方法 C ：
所有操作在Prelude肽合成器(Protein Technologies)上自動進行。除非另外指出，否則所有程序在裝配有底部玻璃料之10或45 mL聚丙烯管中進行。該管經由該管之底部及頂部連接至Prelude肽合成器。DMF及DCM可經由管頂部添加，其向下同等洗滌管側。其餘試劑經由管底部添加且向上穿過玻璃料以接觸樹脂。所有溶液經由管底部移除。「週期性攪動」描述經由底部玻璃料之短暫N
2
氣脈衝；脈衝持續約5秒且每隔30秒出現。一般不使用製備超過三週之胺基酸溶液。HATU溶液在製備5天內使用。Sieber=Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中「3-基氧基」描述與聚苯乙烯樹脂連接之位置及類型。所用樹脂為具有Sieber連接基團(在氮處受Fmoc保護)之Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1% DVB，0.71 mmol/g裝載量。常用胺基酸列於以下，其中側鏈保護基在括弧內指出。Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。 「Prelude方法C」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。此規模相當於大致140 mg上文所述之Sieber-Merrifield樹脂。所有程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。在胺基酸偶合之前，所有化合物合成順序始於樹脂溶脹程序，下文描述為「樹脂溶脹程序」。將胺基酸偶合至一級胺N端使用下文所述之「單偶合程序」。將胺基酸偶合至二級胺N端使用下文所述之「二級胺偶合程序」。樹脂之最終洗滌使用下文所述之「
最終洗滌程序
」。
樹脂溶脹程序 ：
向40 mL聚丙烯固相反應容器中添加Merrifield:Sieber樹脂(140 mg，0.100 mmol)。樹脂如下洗滌(溶脹)三次：向反應容器中添加DMF (5.0 mL)及DCM (5.0 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶劑。
單偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，2.5 mL，20 eq)。週期性攪動混合物60分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
二級胺偶合程序 ：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，1.5 mL，12 eq)。週期性攪動混合物300分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，1.5 mL，12 eq)。週期性攪動混合物300分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
常規胺基酸偶合程序 ：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，0.5至2.5 mL，1至5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，0.5至2.5 mL，1至5 eq)，且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，0.5至1.5 mL，4至12 eq)。週期性攪動混合物60分鐘至600分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
最終洗滌程序 ：
樹脂如下連續洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DCM (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
氯乙酸偶合程序
： 注意手動步驟。向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。混合物在室溫下震盪5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且攪動所得混合物，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加DMF (2.0 mL)、氯乙酸(1.2 mmol，113 mg，12 eq)及N,N'-二異丙基碳化二亞胺(1.2 mmol，0.187 mL，12 eq)。混合物在室溫下震盪12至18小時，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，將DMF (4.0 mL)添加至容器頂部且攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，將CH
2
Cl
2
(4.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。
Prelude 方法 D ：
所有操作在Prelude肽合成器(Protein Technologies)上自動進行。除非另外指出，否則所有程序在裝配有底部玻璃料之10或45 mL聚丙烯管中進行。該管經由該管之底部及頂部連接至Prelude肽合成器。DMF及DCM可經由管頂部添加，其向下同等洗滌管側。其餘試劑經由管底部添加且向上穿過玻璃料以接觸樹脂。所有溶液經由管底部移除。「週期性攪動」描述經由底部玻璃料之短暫N
2
氣脈衝；脈衝持續約5秒且每隔30秒出現。一般不使用製備超過三週之胺基酸溶液。HATU溶液在製備5天內使用。Sieber=Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中「3-基氧基」描述與聚苯乙烯樹脂連接之位置及類型。所用樹脂為具有Sieber連接基團(在氮處受Fmoc保護)之Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1% DVB，0.71 mmol/g裝載量。常用胺基酸列於以下，其中側鏈保護基在括弧內指出。Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。 「Prelude方法D」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。此規模相當於大致140 mg上文所述之Sieber-Merrifield樹脂。所有程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。在胺基酸偶合之前，所有化合物合成順序始於樹脂溶脹程序，下文描述為「樹脂溶脹程序」。將胺基酸偶合至一級胺N端使用下文所述之「單偶合程序」。將胺基酸偶合至二級胺N端使用下文所述之「二級胺偶合程序」。樹脂之最終洗滌使用下文所述之「
最終洗滌程序
」。
樹脂溶脹程序 ：
向40 mL聚丙烯固相反應容器中添加Merrifield:Sieber樹脂(140 mg，0.100 mmol)。樹脂如下洗滌(溶脹)三次：向反應容器中添加DMF (5.0 mL)及DCM (5.0 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶劑。
單偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，2.5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，2.5 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，0.75 mL，5 eq)。週期性攪動混合物30分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
二級胺偶合程序 ：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，2.5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，2.5 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，0.75 mL，5 eq)。週期性攪動混合物30分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，2.5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，2.5 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，0.75 mL，5 eq)。週期性攪動混合物30分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
最終洗滌程序：
樹脂如下連續洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DCM (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
氯乙酸偶合程序
： 注意手動步驟。向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。混合物在室溫下震盪5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且攪動所得混合物，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加DMF (2.0 mL)、氯乙酸(1.2 mmol，113 mg，12 eq)及N,N'-二異丙基碳化二亞胺(1.2 mmol，0.187 mL，12 eq)。混合物在室溫下震盪12至18小時，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，將DMF (4.0 mL)添加至容器頂部且攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，將CH
2
Cl
2
(4.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。
CEM 方法 A ：
所有操作在CEM Liberty微波肽合成器(CEM Corporation)上自動進行。除非另外指出，否則所有程序在裝配有底部玻璃料至CEM Discovery微波單元之30或125 mL聚丙烯管中進行。該管經由該管之底部及頂部連接至CEM Liberty合成器。DMF及DCM可經由管頂部及底部添加，其向下同等洗滌管側。除了自頂部轉移樹脂時，所有溶液經由管底部移出。「週期性鼓泡」描述經由底部玻璃料之短暫N
2
氣鼓泡。一般不使用製備超過三週之胺基酸溶液。HATU溶液在製備5天內使用。DMF = 二甲基甲醯胺；HCTU = 2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲
；HATU = 1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽；DIPEA = 二異丙基乙胺；Sieber = Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中「3-基氧基」描述與聚苯乙烯樹脂連接之位置及類型。所用樹脂為具有Sieber連接基團(在氮處受Fmoc保護)之Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1% DVB，0.71 mmol/g裝載量。可在合成中採用其他常見樹脂(諸如Rink、ChloroTrityl)或其他酸敏感性連接基團，除非另外指出，否則在特定實例中使用Seiber醯胺樹脂。常用胺基酸列於以下，其中側鏈保護基在括弧內指出。Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Orn(Boc)-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。 「CEM方法A」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。此規模相當於大致140 mg上文所述之Sieber-Merrifield樹脂。所有程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。在胺基酸偶合之前，所有化合物合成順序始於樹脂溶脹程序，下文描述為「樹脂溶脹程序」。將胺基酸偶合至一級胺N端使用下文所述之「單偶合程序」。將胺基酸偶合至二級胺N端使用下文所述之「二級胺偶合程序」。將氯乙醯基偶合至化合物之N端藉由上文詳述之「氯乙醯氯偶合程序」或「氯乙酸偶合程序」描述。
樹脂溶脹程序 ：
向50 mL聚丙烯錐形管中添加Merrifield:Sieber樹脂(140 mg，0.100 mmol)。隨後將DMF (7 mL)添加至管中，接著添加DCM (7 mL)。樹脂接著自容器頂部轉移至反應容器。再重複程序兩次。添加DMF (7 mL)，接著添加DCM (7 mL)。藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡使樹脂溶脹15分鐘，隨後經由玻璃料排出溶劑。
標準偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)、HATU (0.5M於DMF中，1.0 mL，5 eq)及DIPEA (2M於NMP中，0.5 mL，10 eq)。除了在50℃下偶合的Fmoc-Cys(Trt)-OH及Fmoc-His(Trt)-OH之外，所有胺基酸之混合物在75℃下藉由N2鼓泡5分鐘來混合，經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。混合物在65℃下週期性鼓泡2分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。所得樹脂直接用於下一步驟。
雙偶合偶合程序 ：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)、HATU (0.5M於DMF中，1.0 mL，5 eq)及DIPEA (2M於NMP中，0.5 mL，10 eq)。除了在50℃下偶合的Fmoc-Cys(Trt)-OH及Fmoc-His(Trt)-OH之外，所有胺基酸之混合物在75℃下藉由N
2
鼓泡5分鐘來混合，經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)、HATU (0.5M於DMF中，1.0 mL，5 eq)及DIPEA (2M於NMP中，0.5 mL，10 eq)。除了在50℃下偶合的Fmoc-Cys(Trt)-OH及Fmoc-His(Trt)-OH之外，所有胺基酸之混合物在75℃下藉由N
2
鼓泡5分鐘來混合，經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。混合物在65℃下週期性鼓泡2分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。所得樹脂直接用於下一步驟。
二級胺偶合程序 ：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加5%哌嗪及0.1 M HOBt於DMF (7 mL)中之溶液。混合物在75℃下週期性攪動3分鐘且隨後排出溶液。再重複此程序一次。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)、HCTU (0.5M於DMF中，1.0 mL，5 eq)及DIPEA (2M於NMP中，0.5 mL，10 eq)。所有胺基酸(對於Fmoc-Cys(Trt)-OH及Fmoc-His(Trt)-OH，50℃)之混合物在75℃下藉由N
2
鼓泡5分鐘來混合，接著在不加熱的情況下混合6小時。在排出後，樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。混合物在65℃下週期性鼓泡2分鐘，隨後排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。所得樹脂直接用於下一步驟。
常規胺基酸偶合程序 ：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加含有HATU (2.5 eq至10 eq)之胺基酸溶液(1.25 mL至5 mL，2.5 eq至10 eq)，且最後添加DIPEA (2M於NMP中，0.5 mL至1 mL，20 eq)。混合物在25℃至75℃下藉由N
2
鼓泡5分鐘至2小時來混合，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。混合物在65℃下週期性鼓泡2分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。所得樹脂直接用於下一步驟。
Symphony 方法 A ：
所有操作在Symphony肽合成器(Protein Technologies)上自動進行。除非另外指出，否則所有程序在裝配有底部玻璃料之Symphony聚丙烯管中進行。該管經由該管之底部及頂部連接至Symphony肽合成器。所有溶劑、DMF、DCM、胺基酸及試劑經由管底部添加且向上穿過玻璃料以接觸樹脂。所有溶液經由管底部移除。「週期性攪動」描述經由底部玻璃料之短暫N
2
氣脈衝；脈衝持續約5秒且每隔15秒出現。一般不使用製備超過三週之胺基酸溶液。HATU溶液在製備5天內使用。DMF = 二甲基甲醯胺；HCTU = 2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲
；HATU = 1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽；NMM = n-甲基嗎啉；DIPEA = 二異丙基乙胺；Sieber = Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中「3-基氧基」描述與聚苯乙烯樹脂連接之位置及類型。所用樹脂為具有Sieber連接基團(在氮處受Fmoc保護)之Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1% DVB，0.71 mmol/g裝載量。其他常見酸敏感性樹脂亦可用於合成，諸如Rink或官能化氯三苯甲基樹脂。常用胺基酸列於以下，其中側鏈保護基在括弧內指出。Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。 「Symphony方法A」之程序描述以0.050 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。此規模相當於大致70 mg上文所述之Sieber-Merrifield樹脂。所有程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.050 mmol規模。在胺基酸偶合之前，所有化合物合成順序始於樹脂溶脹程序，下文描述為「溶脹程序」。將胺基酸偶合至一級胺N端使用下文所述之「標準偶合程序」。將胺基酸偶合至二級胺N端使用「雙偶合」，常規胺基酸經由手動空白添加胺基酸，亦即下文所述之「空白偶合」來偶合。
溶脹程序 ：
向Symphony聚丙烯固相反應容器中添加Merrifield:Sieber樹脂(70 mg，0.050 mmol)。樹脂如下洗滌(溶脹)三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂用經由容器底部添加之DMF (6.25 mL)洗滌且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。所得樹脂直接用於下一步驟。
標準偶合程序 ：
樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下洗滌6次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂用經由容器底部添加之DMF (6.25 mL)洗滌且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
二級胺偶合程序 ：
樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下洗滌6次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物300分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂用經由容器底部添加之DMF (6.25 mL)洗滌且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物300分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
常規胺基酸偶合程序 ：
樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下洗滌6次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。由Symphony軟體暫停合成以將常規胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)手動添加至反應容器中，隨後重啟自動化：以添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物300分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌六次：經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加Ac
2
O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2.5 mL)，週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
Symphony 方法 B ：
所有操作在Symphony肽合成器(Protein Technologies)上自動進行。除非另外指出，否則所有程序在裝配有底部玻璃料之Symphony聚丙烯管中進行。該管經由該管之底部及頂部連接至Symphony肽合成器。所有溶劑、DMF、DCM、胺基酸及試劑經由管底部添加且向上穿過玻璃料以接觸樹脂。所有溶液經由管底部移除。「週期性攪動」描述經由底部玻璃料之短暫N
2
氣脈衝；脈衝持續約5秒且每隔15秒出現。一般不使用製備超過三週之胺基酸溶液。HATU溶液在製備5天內使用。DMF = 二甲基甲醯胺；HCTU = 2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲
；HATU = 1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽；NMM = n-甲基嗎啉；DIPEA = 二異丙基乙胺；Sieber = Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中「3-基氧基」描述與聚苯乙烯樹脂連接之位置及類型。所用樹脂為具有Sieber連接基團(在氮處受Fmoc保護)之Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1% DVB，0.71 mmol/g裝載量。其他常見酸敏感性樹脂亦可用於合成，諸如Rink或官能化氯三苯甲基樹脂。常用胺基酸列於以下，其中側鏈保護基在括弧內指出。 Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。「Symphony方法B」之程序描述以0.050 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。此規模相當於大致70 mg上文所述之Sieber-Merrifield樹脂。所有程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.050 mmol規模。在胺基酸偶合之前，所有化合物合成順序始於樹脂溶脹程序，下文描述為「溶脹程序」。將胺基酸偶合至一級胺N端使用下文所述之「標準偶合程序」。將胺基酸偶合至二級胺N端使用「
二級胺偶合程序 B
」，常規胺基酸經由手動空白添加胺基酸，亦即下文所述之「
常規胺基酸偶合程序
」偶合，且氯乙醯酸酐使用下文所述之「最終封端程序」添加至序列之最終位置。
溶脹程序 ：
向Symphony聚丙烯固相反應容器中添加Merrifield:Sieber樹脂(70 mg，0.050 mmol)。樹脂如下洗滌(溶脹)三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂用經由容器底部添加之DMF (6.25 mL)洗滌且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。所得樹脂直接用於下一步驟。
標準偶合程序 ：
樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下洗滌6次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌6次：經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加Ac
2
O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2.5 mL)，週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
二級胺偶合程序 ：
樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下洗滌6次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂用經由容器底部添加之DMF (6.25 mL)洗滌且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加Ac
2
O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2.5 mL)，週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
常規胺基酸偶合程序：
樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下洗滌6次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。由系統暫停系統以將常規胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)手動添加至反應容器中，隨後重啟自動化以向反應容器中添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌6次：經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加Ac
2
O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2.5 mL)，週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
最終封端程序 ：
樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下洗滌6次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)，接著添加氯乙酸酐(0.4M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂用經由容器底部添加之DMF (6.25 mL)洗滌且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)，接著添加氯乙酸酐(0.4M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌6次：經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加Ac
2
O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2.5 mL)，週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DCM (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂隨後用氮氣流乾燥10分鐘。
整體脫除保護基方法 A ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「整體脫除保護基方法A」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。使用三氟乙酸:水:三異丙基矽烷:二硫蘇糖醇(92.5:2.5:2.5:2.5 v:v:v:w)製備「脫除保護基溶液」。樹脂自反應容器移出且轉移至裝備有玻璃料的25 mL注射器中。向注射器中添加「脫除保護基溶液」(5.0 mL)。混合物在震盪器中混合85分鐘。將溶液過濾，濃縮且稀釋於乙醚(30 mL)中。將沈澱固體離心3分鐘。傾析清液層溶液且將固體再懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且將其餘固體懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且其餘固體在高真空下乾燥。獲得呈白色至灰白色固體狀之粗化合物。
整體脫除保護基方法 B ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「整體脫除保護基方法B」之程序描述以0.04 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.04 mmol規模。使用三氟乙酸:三異丙基矽烷(96:4; v:v)製備「脫除保護基溶液」。樹脂自反應容器移出且轉移至裝備有玻璃料的10 mL注射器中。向注射器中添加「脫除保護基溶液」(2.0-3.0 mL)。混合物在震盪器中混合1小時或1.5小時。將溶液過濾，用脫除保護基溶液(0.5 mL)洗滌，濃縮且稀釋於乙醚(30 mL)中。將沈澱固體離心3分鐘。傾析清液層溶液且將固體再懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且將其餘固體懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且其餘固體在高真空下乾燥。獲得呈白色至灰白色固體狀之粗化合物。
整體脫除保護基方法 C ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「整體脫除保護基方法C」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。使用三氟乙酸:三異丙基矽烷:二硫蘇糖醇(95:2.5:2.5 v:v:w)製備「脫除保護基溶液」。樹脂自反應容器移出且轉移至Bio-Rad管中。向Bio-Rad管中添加「脫除保護基溶液」(4.0 mL)。混合物在震盪器中混合60分鐘。將溶液過濾且稀釋於乙醚(30 mL)中。將沈澱固體離心3分鐘。傾析清液層溶液且將固體再懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且將其餘固體懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且其餘固體在高真空下乾燥。獲得呈白色至灰白色固體狀之粗化合物。
整體脫除保護基方法 D ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「整體脫除保護基方法B」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。使用三氟乙酸:三異丙基矽烷:二硫蘇糖醇(94:3:3 v:v:w)製備「脫除保護基溶液」。樹脂自反應容器移出且轉移至裝備有玻璃料的25 mL注射器中。向注射器中添加「脫除保護基溶液」(5.0 mL)。混合物在震盪器中混合5分鐘。將溶液過濾且稀釋於乙醚(30 mL)中。將沈澱固體離心3分鐘。傾析清液層溶液且將固體再懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且將其餘固體懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且其餘固體在高真空下乾燥。獲得呈白色至灰白色固體狀之粗化合物。
整體脫除保護基方法 E ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「整體脫除保護基方法E」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Fmoc Gly-ClTrt連接基團的量來確定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。使用三氟乙酸:三異丙基矽烷:二硫蘇糖醇(95:2.5:2.5 v:v:w)製備「脫除保護基溶液」。樹脂自反應容器移出且轉移至Bio-Rad管中。向Bio-Rad管中添加「脫除保護基溶液」(2.0 mL)。混合物在震盪器中混合3分鐘。將溶液過濾且收集於離心管中。向Bio-Rad管中添加「脫除保護基溶液」(2.0 mL)。混合物在震盪器中混合3分鐘。將溶液過濾且收集於離心管中。向Bio-Rad管中添加「脫除保護基溶液」(2.0 mL)。混合物在震盪器中混合3分鐘。將溶液過濾且收集於離心管中。使離心管中之溶液靜置60分鐘。隨後用乙醚(30 mL)稀釋所收集之溶液且形成沈澱物。將沈澱固體離心3分鐘。傾析清液層溶液且將固體再懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且將其餘固體懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且其餘固體在高真空下乾燥。獲得呈白色至灰白色固體狀之粗化合物。
整體脫除保護基方法 F ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「整體脫除保護基方法F」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Rink連接基團的量來確定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。使用三氟乙酸:三異丙基矽烷:二硫蘇糖醇(95:2.5:2.5 v:v:w)製備「脫除保護基溶液」。樹脂自反應容器移出且轉移至6 ml Bio-Rad管中。向Bio-Rad中添加「脫除保護基溶液」(4.0 mL)。混合物在震盪器中混合90分鐘。將溶液過濾且稀釋於乙醚(30 mL)中。將沈澱固體離心3分鐘。傾析清液層溶液且將固體再懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且將其餘固體懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且其餘固體在高真空下乾燥。獲得呈白色至灰白色固體狀之粗化合物。
環化方法 A
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「環化方法A」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至用於生成化合物之樹脂的Sieber連接基團的量來確定。此規模不基於程序中所用化合物之數量的直接測定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。將粗化合物固體溶解於乙腈:8M胍/50mM TRIS水溶液(1:3) (pH 8.6) (7 mL:18 mL或類似比率)之溶液中，且隨後若需要，使用NaOH水溶液(1.0M)調節溶液至pH = 8.5-9.0。溶液接著使用震盪器混合12至18小時。濃縮反應溶液且隨後將殘餘物溶解於乙腈:水中。對此溶液進行逆相HPLC純化，得到所需環狀化合物。
環化方法 C ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「環化方法C」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至用於生成化合物之樹脂的Sieber連接基團的量來確定。此規模不基於程序中所用化合物之數量的直接測定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。將粗化合物固體溶解於乙腈:0.1M碳酸氫銨水性緩衝液(11 mL:24 mL或類似比率)之溶液中，且隨後使用NaOH水溶液(1.0M)將溶液小心地調節至pH = 8.5-9.0。溶液接著使用震盪器混合12至18小時。濃縮反應溶液且隨後將殘餘物溶解於乙腈:水中。對此溶液進行逆相HPLC純化，得到所需環狀化合物。
環化方法 D ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「環化方法D」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至用於生成化合物之樹脂的Sieber連接基團的量來確定。此規模不基於程序中所用化合物之數量的直接測定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。將粗化合物固體溶解於乙腈:0.1M碳酸氫銨水性緩衝液(11 mL:24 mL)之溶液中，且隨後使用NaOH水溶液(1.0M)將溶液小心地調節至pH = 8.5-9.0。溶液隨後在攪拌下混合12至18小時。濃縮反應溶液且隨後將殘餘物溶解於乙腈:水中。對此溶液進行逆相HPLC純化，得到所需環狀化合物。
環化方法 E ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「環化方法E」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至用於生成化合物之樹脂的Sieber連接基團的量來確定。此規模不基於程序中所用化合物之數量的直接測定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。將粗化合物固體溶解於6M胍HCl水性緩衝溶液(15 mL)中，溶液隨後在攪拌下混合12至18小時。濃縮反應溶液且將15 mL DMSO添加至殘餘物中，得到漿料，將其過濾。對此過濾溶液進行逆相HPLC純化，得到所需環狀化合物。
手動偶合程序 A ：
向先前步驟之含有樹脂的Bio-Rad反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性震盪混合物5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且震盪所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(1.2-10當量)典型(0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)，隨後添加HATU (1.210當量)典型(0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)，且最後添加DIPEA (2.4-20當量)典型(0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。混合物震盪60分鐘至18小時，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且震盪所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。
樹脂上 N- 甲基化方法 A .
(Turner, R. A.; Hauksson, N. E.; Gipe, J. H.; Lokey, R. S.
Org. Lett. 2013
,
15
(19), 5012-5015)： 除非另外指出，否則手動進行所有操作。「樹脂上N-甲基化方法A」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至用於生成化合物之樹脂的Sieber連接基團的量來確定。此規模不基於程序中所用化合物之數量的直接測定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。 將樹脂轉移至25 mL燒結注射器中。向樹脂中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。震盪混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂用DMF (4.0 mL)洗滌3次。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，4.0 mL)。震盪混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂用DMF (4.0 mL)連續洗滌三次且用DCM (4.0 mL)洗滌三次。將樹脂懸浮於DMF (2.0 mL)及三氟乙酸乙酯(0.119 ml，1.00 mmol)、1,8-二氮雜二環[5.4.0]十一-7-烯(0.181 ml，1.20 mmol)中。將混合物置於震盪器上60分鐘。經由玻璃料排出溶液。樹脂用DMF (4.0 mL)連續洗滌三次且用DCM (4.0 mL)洗滌三次。 樹脂用無水THF (2.0 mL)洗滌三次以移除任何殘餘水。在烘箱乾燥之4.0 mL小瓶中添加THF (1.0 mL)及乾燥4 Å分子篩(20 mg)上之三苯基膦(131 mg，0.500 mmol)。將溶液轉移至樹脂且緩慢添加偶氮二甲酸二異丙酯(0.097 mL，0.5 mmol)。攪拌樹脂15分鐘。經由玻璃料排出溶液且用無水THF (2.0 mL)洗滌樹脂三次以移除任何殘餘水。在烘箱乾燥之4.0 mL小瓶中添加THF (1.0 mL)、乾燥4 Å分子篩(20 mg)上之三苯基膦(131 mg，0.500 mmol)。將溶液轉移至樹脂且緩慢添加偶氮二甲酸二異丙酯(0.097 mL，0.5 mmol)。攪拌樹脂15分鐘。經由玻璃料排出溶液。樹脂用DMF (4.0 mL)連續洗滌三次且用DCM (4.0 mL)洗滌三次。將樹脂懸浮於乙醇(1.0 mL)及THF (1.0 mL)中，且添加硼氫化鈉(37.8 mg，1.000 mmol)。將混合物攪拌30分鐘且排出。樹脂用DMF (4.0 mL)連續洗滌三次且用DCM (4.0 mL)洗滌三次。
內醯胺形成 A ：
向自「環化方法D」獲得之粗化合物中添加無水二甲基甲醯胺(7.5 mL)，接著添加1.5 eq HATU、3 eq
N
-甲基嗎啉。在室溫下攪拌反應物3小時至隔夜。添加冰乙酸(3滴)且在Genevac EZ2中蒸發移除溶劑。將化合物溶解於DMF (2 mL)中，經由0.2 um針筒過濾器過濾且進行逆相純化。
內醯胺形成 B ：
向自純化獲得之化合物中添加無水二甲基甲醯胺(1 mL)，接著添加在DMF中新鮮製備之儲備液(0.1M)形式的1.5 eq HATU及在DMF中新鮮製備之儲備液0.3M形式的3 eq
N
-甲基嗎啉。反應混合物在室溫下攪拌隔夜，經由0.2 um過濾器過濾且進行逆相純化。
微裂解 A ：
向＜10 mg之小樹脂樣品中添加2滴TIS及1 mL三氟乙酸，在室溫下震盪。在1小時之後，移出小等分試樣且用0.5 mL乙腈稀釋，過濾且藉由LC-MS獲得分析。
通用合成順序：
「通用合成順序」描述用於得到本文所述之環狀化合物之程序的通用順序。該順序由上文所述之通用方法構成。該順序始於樹脂溶脹程序。隨後依序進行一系列胺基酸偶合，若樹脂結合之化合物的N端為一級胺，則使用單偶合程序；或若樹脂結合之化合物的N端為二級胺，則使用雙偶合程序。在按順序偶合所有胺基酸之後，按以下給定次序進行額外程序：最終洗滌、氯乙酸偶合、整體脫除保護基、環化及最終內醯胺形成。
製備實例
1400
實例1400係按照上文所述由以下通用程序構成之「通用合成順序」來製備：「Prelude方法C：
樹脂溶脹程序
」、「Prelude方法C：
單偶合程序
」、「Prelude方法C：
二級胺偶合程序
」、「Prelude方法C：
最終洗滌程序
」、
氯乙酸偶合程序 B
「
整體脫除保護基方法 C
」、「
環化方法 D
」及「
內醯胺形成 A
」 粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：Waters XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經25分鐘10-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為0.5 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為99%。
分析 LCMS 條件 D ：滯留時間
= 1.44 min; ESI-MS(+)
m/z
914.7 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 E ：滯留時間
= 1.46 min; ESI-MS(+)
m/z
914.6 (M+2H)。
製備實例 1401 實例1401係按照上文所述由以下通用程序構成之「通用合成順序」來製備：「Prelude方法C：
樹脂溶脹程序
」、「Prelude方法C：
單偶合程序
」、「Prelude方法C：
二級胺偶合程序
」、「Prelude方法C：
最終洗滌程序
」、
氯乙酸偶合程序 B
「
整體脫除保護基方法 C
」、「
環化方法 D
」 粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：Waters XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經25分鐘10-60% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經25分鐘15-60% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為3.7 mg。 遵循「
內醯胺形成 B
」。 粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：Waters XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經25分鐘15-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為1.2 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為91%。
分析 LCMS 條件 D ：滯留時間
= 1.54 min; ESI-MS(+)
m/z
954.3 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 E ：滯留時間
= 1.52 min; ESI-MS(+)
m/z
954.1 (M+2H)。
製備實例 1402 實例1402係按照上文所述由以下通用程序構成之「通用合成順序」來製備：「Prelude方法C：
樹脂溶脹程序
」、「Prelude方法C：
單偶合程序
」、「Prelude方法C：
二級胺偶合程序
」、「Prelude方法C：
最終洗滌程序
」、
氯乙酸偶合程序 B
「
整體脫除保護基方法 C
」、「
環化方法 D
」及「
內醯胺形成 A
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：Waters XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經25分鐘10-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為4.6 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為99%。
分析 LCMS 條件 D ：滯留時間
= 1.44 min; ESI-MS(+)
m/z
921.7 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 E
：滯留時間 = 1.46 min; ESI-MS(+)
m/z
921.7 (M+2H)。
製備實例 1403 實例1403係按照上文所述由以下通用程序構成之「通用合成順序」來製備：「Prelude方法C：
樹脂溶脹程序
」、「Prelude方法C：
單偶合程序
」、「Prelude方法C：
二級胺偶合程序
」、「Prelude方法C：
最終洗滌程序
」、
氯乙酸偶合程序 B
「
整體脫除保護基方法 C
」、「
環化方法 D
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：Waters XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經25分鐘10-61% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為19.2 mg。 遵循「
內醯胺形成 B
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：Waters XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經25分鐘10-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為3.5 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為91%。
分析 LCMS 條件 D ：滯留時間
= 1.39 min; ESI-MS(+)
m/z
961.3 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 E
：滯留時間 = 1.41 min; ESI-MS(+)
m/z
961.2 (M+2H)。
製備實例 1404 實例1404係按照上文所述由以下通用程序構成之「通用合成順序」來製備：「Prelude方法C：
樹脂溶脹程序
」、「Prelude方法C：
單偶合程序
」、「Prelude方法C：
二級胺偶合程序
」、「Prelude方法C：
最終洗滌程序
」、
氯乙酸偶合程序 B
「
整體脫除保護基方法 C
」、「
環化方法 D
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：Waters XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經25分鐘10-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經25分鐘15-60% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為12.8 mg。 遵循「
內醯胺形成 B
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：Waters XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經25分鐘10-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為1.1 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為92%。
分析 LCMS 條件 D ：滯留時間
= 1.49 min; ESI-MS(+)
m/z
961.2 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 E ：滯留時間
= 1.51 min; ESI-MS(+)
m/z
961.3 (M+2H)。
製備實例 1405 實例1405係按照上文所述由以下通用程序構成之「通用合成順序」來製備：「Prelude方法C：
樹脂溶脹程序
」、「Prelude方法C：
單偶合程序
」、「Prelude方法C：
二級胺偶合程序
」、「Prelude方法C：
最終洗滌程序
」、
氯乙酸偶合程序 B
「
整體脫除保護基方法 C
」、「
環化方法 D
」及「
內醯胺形成 A
」 粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經25分鐘15-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為2.4 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為94%。
分析 LCMS 條件 D ：滯留時間
= 1.55 min; ESI-MS(+)
m/z
905.4 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 E ：滯留時間
= 1.55 min; ESI-MS(+)
m/z
905.6 (M+2H)。
製備實例 1500 實例1500係按照上文所述由以下通用程序構成之「通用合成順序」來製備：「Prelude方法C：
樹脂溶脹程序
」、「Prelude方法C：
單偶合程序
」、「Prelude方法C：
二級胺偶合程序
」、「Prelude方法C：
最終洗滌程序
」、
氯乙酸偶合程序 B
「
整體脫除保護基方法 C
」、「
環化方法 D
」及「
內醯胺形成 A
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：Waters XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經25分鐘10-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經25分鐘20-60% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為1.3 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為99%。
分析 LCMS 條件 D ：滯留時間
= 1.50 min; ESI-MS(+)
m/z
898.5 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 E ：滯留時間
= 1.44 min; ESI-MS(+)
m/z
898.2 (M+2H)。
製備實例 1501 實例1501係按照上文所述由以下通用程序構成之「通用合成順序」來製備：「Prelude方法C：
樹脂溶脹程序
」、「Prelude方法C：
單偶合程序
」、「Prelude方法C：
二級胺偶合程序
」、「Prelude方法C：
最終洗滌程序
」、
氯乙酸偶合程序 B
「
整體脫除保護基方法 C
」、「
環化方法 D
」及「
內醯胺形成 A
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：Waters XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經25分鐘10-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經25分鐘15-60% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為4.8 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為99%。
分析 LCMS 條件 D ：滯留時間
= 1.45 min; ESI-MS(+)
m/z
905.3 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 E ：滯留時間
= 1.41 min; ESI-MS(+)
m/z
905.4 (M+2H)。 ESI-HRMS(+)
m/z:
計算值：904.9325 (M+2H); 實驗值：904.9305 (M+2H)
製備實例 1502 實例1502係按照上文所述由以下通用程序構成之「通用合成順序」來製備：「Prelude方法C：
樹脂溶脹程序
」、「Prelude方法C：
單偶合程序
」、「Prelude方法C：
二級胺偶合程序
」、「Prelude方法C：
最終洗滌程序
」、
氯乙酸偶合程序 B
「
整體脫除保護基方法 E
」、「
環化方法 D
」及「
內醯胺形成 A
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：Waters XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經25分鐘10-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經25分鐘20-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經25分鐘20-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為9.8 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為97%。
分析 LCMS 條件 D ：滯留時間
= 1.60 min; ESI-MS(+)
m/z
898.5 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 E ：滯留時間
= 1.56 min; ESI-MS(+)
m/z
898.4 (M+2H)。
製備實例 1503 實例1503係按照上文所述由以下通用程序構成之「通用合成順序」來製備：「Prelude方法C：
樹脂溶脹程序
」、「Prelude方法C：
單偶合程序
」、「Prelude方法C：
二級胺偶合程序
」、「Prelude方法C：
最終洗滌程序
」、
氯乙酸偶合程序 B
「
整體脫除保護基方法 E
」、「
環化方法 D
」及「
內醯胺形成 A
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：Waters XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經25分鐘15-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經25分鐘25-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為3.7 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為96%。
分析 LCMS 條件 D ：滯留時間
= 1.63 min; ESI-MS(+)
m/z
891.7 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 E ：滯留時間
= 1.60 min; ESI-MS(+)
m/z
891.2 (M+2H)。
製備實例 1504 實例1504係按照上文所述由以下通用程序構成之「通用合成順序」來製備：「Prelude方法C：
樹脂溶脹程序
」、「Prelude方法C：
單偶合程序
」、「Prelude方法C：
二級胺偶合程序
」、「Prelude方法C：
最終洗滌程序
」、
氯乙酸偶合程序 B
「
整體脫除保護基方法 F
」、「
環化方法 D
」及「
內醯胺形成 A
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：Waters XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經25分鐘10-60% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經25分鐘10-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為2.4 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。
分析 LCMS 條件 D ：滯留時間
= 1.43 min; ESI-MS(+)
m/z
905.4 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 E ：滯留時間
= 1.40 min; ESI-MS(+)
m/z
905.3 (M+2H)。
製備實例 1505 實例1505係按照上文所述由以下通用程序構成之「通用合成順序」來製備：「Prelude方法C：
樹脂溶脹程序
」、「Prelude方法C：
單偶合程序
」、「Prelude方法C：
二級胺偶合程序
」、「Prelude方法C：
最終洗滌程序
」、
氯乙酸偶合程序 B
「
整體脫除保護基方法 F
」、「
環化方法 D
」及「
內醯胺形成 A
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：Waters XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經25分鐘10-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經25分鐘15-60% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為3.7 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。
分析 LCMS 條件 D ：滯留時間
= 1.50 min; ESI-MS(+)
m/z
912.2 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 E ：滯留時間
= 1.42 min; ESI-MS(+)
m/z
912.4 (M+2H)。
製備實例 1506 實例1506係按照上文所述由以下通用程序構成之「通用合成順序」來製備：「Prelude方法C：
樹脂溶脹程序
」、「Prelude方法C：
單偶合程序
」、「Prelude方法C：
二級胺偶合程序
」、「Prelude方法C：
最終洗滌程序
」、
氯乙酸偶合程序 B
「
整體脫除保護基方法 E
」、「
環化方法 D
」及「
內醯胺形成 A
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘40-80% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為1.2 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為96%。
分析 LCMS 條件 H ：滯留時間
= 1.49 min.; ESI-MS(+)
m/z
912.6 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 I ：滯留時間
= 2.60 min.; ESI-MS(+)
m/z
912.7 (M+2H)。 ESI-HRMS(+)
m/z:
計算值：911.9403(M+2H); 實驗值：911.9391 (M+2H)。
製備實例 1507 實例1507係按照上文所述由以下通用程序構成之「通用合成順序」來製備：「Prelude方法C：
樹脂溶脹程序
」、「Prelude方法C：
單偶合程序
」、「Prelude方法C：
二級胺偶合程序
」、「Prelude方法C：
最終洗滌程序
」、
氯乙酸偶合程序 B
「
整體脫除保護基方法 E
」、「
環化方法 D
」及「
內醯胺形成 A
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘40-80% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘15-55% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為4.5 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為98%。
分析 LCMS 條件 H ：滯留時間
= 1.54 min.; ESI-MS(+)
m/z
913.2 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 I ：滯留時間
= 2.67 min.; ESI-MS(+)
m/z
912.9 (M+2H)。 ESI-HRMS(+)
m/z:
計算值：911.9385 (M+2H); 實驗值：911.9403 (M+2H)。
製備實例 1508 實例1508係按照上文所述由以下通用程序構成之「通用合成順序」來製備：「Prelude方法C：
樹脂溶脹程序
」、「Prelude方法C：
單偶合程序
」、「Prelude方法C：
二級胺偶合程序
」、「Prelude方法C：
最終洗滌程序
」、
氯乙酸偶合程序 B
「
整體脫除保護基方法 E
」、「
環化方法 D
」及「
內醯胺形成 A
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經30分鐘15-55% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘40-80% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為6.7 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。
分析 LCMS 條件 H ：滯留時間
= 1.55 min.; ESI-MS(-)
m/z
904.7 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 I ：滯留時間
= 3.11 min.; ESI-MS(+)
m/z
905.1 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z:
計算值：904.9302 (M+2H)
;
實驗值：904.9325 (M+2H)
以下程序用於實例 5001-5008 ： 分析資料：
質譜分析：「ESI-MS(+)」表示在陽離子模式中進行之電噴霧電離質譜分析；「ESI-MS(-)」表示在陰離子模式中進行之電噴霧電離質譜分析；「ESI-HRMS(+)」表示在陽離子模式中進行之高解析度電噴霧電離質譜分析；「ESI-HRMS(-)」表示在陰離子模式中進行之高解析度電噴霧電離質譜分析。所偵測之質量在「
m/z
」單位名稱後報導。精確質量大於1000之化合物常常偵測為雙電荷或三電荷離子。
分析條件 A ：
管柱：Waters BEH C18, 2.0 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：50℃；梯度：0% B，經3分鐘0−100% B，接著在100% B下保持0.5分鐘；流速：1 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析條件 B ：
管柱：Waters BEH C18, 2.0 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：50℃；梯度：0% B，經3分鐘0-100% B，接著在100% B下保持0.5分鐘；流速：0.5 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析條件 C ：
管柱：Phenomenex Luna C18 2.0 × 30 mm 3.0 μm粒子；移動相A：乙腈:水(10:90) + 0.1% TFA；移動相B：乙腈:水(90:10) + 0.1% TFA；溫度：40℃；梯度：0% B，經2分鐘0-100% B，隨後在100% B下保持1.0分鐘；流速：0.8 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析條件 D ：
管柱：Waters Aquity BEH C18 2.1 × 50 mm 1.7 μm粒子；移動相A：水 + 0.05% TFA；移動相B：乙腈 + 0.05% TFA；溫度：40℃；梯度：0% B，經1.5分鐘0-100% B，隨後在100% B下保持0.5分鐘；流速：0.8 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析條件 E ：
管柱：Waters Aquity BEH C18 2.1 × 50 mm 1.7 μm粒子；移動相A：水 + 0.05% TFA；移動相B：乙腈 + 0.05% TFA；溫度：40℃；梯度：0% B，經3分鐘0-100% B，隨後在100% B下保持0.5分鐘；流速：0.8 mL/min；偵測：UV，220 nm。
通用程序： Prelude 方法 A ：
所有操作在Prelude肽合成器(Protein Technologies)上自動進行。除非另外指出，否則所有程序在裝配有底部玻璃料之10 mL聚丙烯管中進行；若反應物之規模超過0.100 mmol，則使用裝配有底部玻璃料之40 mL聚丙烯管。該管經由該管之底部及頂部連接至Prelude肽合成器。DMF及DCM可經由管頂部添加，其向下同等洗滌管側。其餘試劑經由管底部添加且向上穿過玻璃料以接觸樹脂。所有溶液經由管底部移除。「週期性攪動」描述經由底部玻璃料之短暫N
2
氣脈衝；脈衝持續約5秒且每隔30秒出現。氯乙醯氯於DMF中之溶液在製備24小時內使用。一般不使用製備超過三週之胺基酸溶液。HATU溶液在製備5天內使用。DMF = 二甲基甲醯胺；HATU = 1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽；DIPEA = 二異丙基乙胺；Rink = (2,4-二甲氧基苯基)(4-烷氧基苯基)甲胺，其中「4-烷氧基」描述與聚苯乙烯樹脂連接之位置及類型。所用樹脂為具有Rink連接基團(在氮處受Fmoc保護)之Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1% DVB，0.56 mmol/g裝載量。常用胺基酸列於以下，其中側鏈保護基在括弧內指出。Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。 「Prelude方法A」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Rink連接基團的量來確定。此規模相當於大致178 mg上文所述之Rink-Merrifield樹脂。所有程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。在胺基酸偶合之前，所有化合物合成順序始於樹脂溶脹程序，下文描述為「樹脂溶脹程序」。將胺基酸偶合至一級胺N端使用下文所述之「單偶合程序」。將胺基酸偶合至二級胺N端使用下文所述之「雙偶合程序」。將氯乙醯氯偶合至化合物之N端藉由下文詳述之「氯乙醯氯偶合程序」描述。
樹脂溶脹程序：
向10 mL聚丙烯固相反應容器中添加Merrifield:Rink樹脂(178 mg，0.100 mmol)。樹脂如下洗滌(溶脹)三次：向反應容器中添加DMF (2.0 mL)，接著週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶劑。
單偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.0 mL，2 eq)，隨後添加HATU (0.2M於DMF中，1.0 mL，2 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，0.5 mL，4 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐(2.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
雙偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.0 mL，2 eq)，隨後添加HATU (0.2M於DMF中，1.0 mL，2 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，0.5 mL，4 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.0 mL，2 eq)，隨後添加HATU (0.2M於DMF中，1.0 mL，2 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，0.5 mL，4 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐(2.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
氯乙醯氯偶合程序
： 向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加DIPEA (0.8 M於DMF中，3.0 mL，24 eq)，接著添加氯乙醯氯(0.8 M於DMF中，1.65 mL，13.2 eq)。週期性攪動混合物30分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，將DMF (2.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，將CH
2
Cl
2
(2.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。將所得樹脂置於N
2
流下15分鐘。
Symphony 方法 A ：
除如所指出之外，此採集程序與「Prelude方法A」相同。對於所有程序，使用Symphony X肽合成器(Protein Technologies)代替Prelude肽合成器且所有試劑經由反應容器頂部添加。
樹脂溶脹程序：
此程序與「Prelude方法A：樹脂溶脹程序」相同。
單偶合程序 ：
除DIPEA溶液之濃度為0.4 M且將1.0 mL此溶液遞送至反應物以外，此程序與「Prelude方法A：單偶合程序」相同。
雙偶合程序：
除DIPEA溶液之濃度為0.4 M且將1.0 mL此溶液遞送至反應物以外，此程序與「Prelude方法A：雙偶合程序」相同。
氯乙醯氯偶合程序
： 此程序與「Prelude方法A：氯乙醯氯偶合程序」相同。
整體脫除保護基方法 A ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「整體脫除保護基方法A」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Rink連接基團的量來確定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。「脫除保護基溶液」係藉由將三氟乙酸(22 mL)、苯酚(1.325 g)、水(1.25 mL)及三異丙基矽烷(0.5 mL)合併於40 mL玻璃瓶中來製備。樹脂自反應容器移出且轉移至4 mL玻璃瓶。向小瓶中添加「脫除保護基溶液」(2.0 mL)。混合物在震盪器中劇烈混合(1000 RPM持續1分鐘，隨後500 RPM持續1-2小時)。混合物經由0.2微米針筒過濾器過濾且用「脫除保護基溶液」(1.0 mL)或TFA (1.0 mL)萃取固體。向裝有合併濾液之24 mL試管中添加Et
2
O (15 mL)。使混合物劇烈混合，接著沈澱大量白色固體。使混合物離心5分鐘，隨後傾析溶液與固體分離且棄去。將固體懸浮於Et
2
O (20 mL)中；隨後使混合物離心5分鐘；且傾析溶液與固體分離並棄去。對於最後一次，將固體懸浮於Et
2
O (20 mL)中；使混合物離心5分鐘；且傾析溶液與固體分離並棄去，得到呈白色至灰白色固體狀之粗化合物。
環化方法 A ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「環化方法A」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至用於生成化合物之樹脂的Rink連接基團的量來確定。此規模不基於程序中所用化合物之數量的直接測定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。將粗化合物固體溶解於MeCN:0.1M NH
4
OAc水溶液(1:1)中以達到60 mL之總體積，且隨後使用NaOH水溶液(1.0M)將溶液小心地調節至pH = 8.5-9.0。溶液隨後攪拌12-18小時。濃縮反應溶液且隨後將殘餘物溶解於DMSO:MeOH中。對此溶液進行逆相HPLC純化，得到所需環狀化合物。
環化方法 B ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「環化方法A」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至用於生成化合物之樹脂的Rink連接基團的量來確定。此規模不基於程序中所用化合物之數量的直接測定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。將粗化合物固體溶解於MeCN:0.1M NH
4
OAc水溶液(1:1)中以達到18-22 mL之總體積，且隨後使用NaOH水溶液(1.0M)將溶液小心地調節至pH = 8.5-9.0。隨後使溶液在不攪拌的情況下靜置12-18小時。濃縮反應溶液且隨後將殘餘物溶解於DMSO:MeOH中。對此溶液進行逆相HPLC純化，得到所需環狀化合物。
通用合成順序 A ：
「通用合成順序A」描述用於得到本文所述之環狀化合物之程序的通用順序。出於此通用程序的目的，「Symphony方法A」之程序與「Prelude方法A」之程序可互換。向10 mL聚丙烯固相反應容器中添加Rink-Merrifield樹脂(178 mg，0.100 mmol)，且將反應容器置於Prelude肽合成器上。遵循「Prelude方法A：樹脂溶脹程序」。接著，按照「Prelude方法A：單偶合程序」(若樹脂結合化合物之N端為一級胺)或「Prelude方法A：雙偶合程序」(若樹脂結合化合物之N端為二級胺)在Prelude上依序進行一系列胺基酸偶合。遵循「Prelude方法A：氯乙醯氯偶合程序」；隨後遵循「整體脫除保護基方法A」；隨後遵循「環化方法A」。
製備實例 5001 中間物5001係按照「通用合成順序A」以0.200 mmol規模來製備。粗物質經由製備型HPLC以如下條件純化：管柱：Luna C18, 30 × 100 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1% TFA；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1% TFA；梯度：經10分鐘0-60% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：42 mL/min。所需產物在9.32分鐘溶離。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為53.8 mg。分析條件D：滯留時間 = 1.106 min; ESI-MS(+) m/z 934.05 (M+2H)。 實例5001製備如下：向裝有含中間物5001 (53.8 mg，0.029 mmol)之DMF (3 mL)的2 mL小瓶中添加DIPEA (0.101 mL，0.577 mmol)及HATU (43.8 mg，0.115 mmol)。溶液在室溫下攪拌1小時。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經15分鐘50-90% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為11.2 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為99%。 分析條件A：滯留時間 = 1.96 min; ESI-MS(+) m/z 924.6 (M+2H) 分析條件B：滯留時間 = 3.13 min; ESI-MS(+) m/z 924.7 (M+2H)。
製備實例 5002 中間物5002係按照「通用合成順序A」以0.200 mmol規模來製備。粗物質經由製備型HPLC以如下條件純化：管柱：Luna C18, 30 × 100 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1% TFA；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1% TFA；梯度：經10分鐘10-60% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：42 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為50.0 mg。分析條件C：滯留時間 = 1.272 min; ESI-MS(+) m/z 933.75 (M+2H)。 實例5002製備如下：向裝有含中間物5002 (50 mg，0.024 mmol)之DMF (3 mL)的7 mL小瓶中添加DIPEA (0.083 mL，0.478 mmol)及HATU (36.3 mg，0.096 mmol)。溶液在室溫下攪拌30分鐘。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經15分鐘30-70% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為14.6 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件A：滯留時間 = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 924.8 (M+2H) 分析條件B：滯留時間 = 3.01 min; ESI-MS(+) m/z 923.3 (M-2H)。
製備實例 5003 中間物5003係按照「通用合成順序A」以0.200 mmol規模來製備。粗物質經由製備型HPLC以如下條件純化：管柱：Luna C18, 30 × 100 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1% TFA；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1% TFA；梯度：經10分鐘10-60% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：42 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為50.0 mg。分析條件C：滯留時間 = 1.300 min; ESI-MS(+) m/z 926.75 (M+2H)。 實例5003製備如下：向裝有含中間物5003 (50 mg，0.024 mmol)之DMF (3 mL)的7 mL小瓶中添加DIPEA (0.084 mL，0.481 mmol)及HATU (36.6 mg，0.096 mmol)。溶液在室溫下攪拌30分鐘。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經15分鐘25-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘50-90% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為12.5 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為98%。 分析條件A：滯留時間 = 1.94 min; ESI-MS(+) m/z 917.5 (M+2H) 分析條件B：滯留時間 = 3.03 min; ESI-MS(+) m/z 917.4 (M+2H)
製備實例 5004 中間物5004係按照「通用合成順序A」以0.200 mmol規模來製備。粗物質經由製備型HPLC以如下條件純化：管柱：Luna C18, 30 × 100 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1% TFA；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1% TFA；梯度：經10分鐘10-60% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：42 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為35.5 mg。分析條件D：滯留時間 = 1.557 min; ESI-MS(+) m/z 963.6 (M+2H) 實例5004製備如下：將中間物5004 (35.5 mg，0.018 mmol)溶解於DMF (2.0 mL)中。向溶液中添加DIPEA (0.075 mL，0.43 mmol)，隨後添加HATU (28 mg，0.074 mmol)。溶液在室溫下攪拌45分鐘。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經15分鐘35-75% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為4.9 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為95%。 分析條件A：滯留時間 = 2.14 min; ESI-MS(+) m/z 954.1 (M+2H) 分析條件B：滯留時間 = 2.93 min; ESI-MS(+) m/z 952.4 (M-2H)。
製備實例 5005 中間物5005係按照「通用合成順序A」，使用「環化方法B」代替「環化方法A」以0.600 mmol規模來製備。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經15分鐘15-55% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經40分鐘45-85% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。所得物質用HCl水溶液濕磨，隨後真空乾燥。產物產量為112.8 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為93%。 分析條件A：滯留時間 = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 971.2 (M+2H) 分析條件B：滯留時間 = 2.58 min; ESI-MS(+) m/z 971.3 (M+2H) 實例5005製備如下：向裝備有攪拌棒且裝有中間物5005 (26.0 mg，0.013 mmol)之15 mL小瓶中添加DMF (0.50 mL)，隨後添加DIPEA (0.023 mL，0.129 mmol)，隨後添加HATU (12.28 mg，0.032 mmol)。溶液在室溫下攪拌15分鐘。向反應物中添加乙醇胺(0.1 mL)。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘45-85% B，隨後在100% B下保持7分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為8.0 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件A：滯留時間 = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 952.8 (M+2H) 分析條件B：滯留時間 = 2.73 min; ESI-MS(+) m/z 953.2 (M+2H)。
製備實例 5006 中間物5006係按照「通用合成順序A」，使用「環化方法B」代替「環化方法A」以0.400 mmol規模來製備。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘10-50% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘40-80% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為54.7 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件A：滯留時間 = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 941.3 (M-2H) 分析條件B：滯留時間 = 2.62 min; ESI-MS(+) m/z 940.8 (M-2H) ESI-HRMS(+) m/z: 計算值：942.4485 實驗值：942.4475。 實例5006製備如下：向裝備有攪拌棒且裝有中間物5006 (40 mg mg，0.020 mmol)之1打蘭小瓶中添加NMP (1.00 mL)，隨後添加DIPEA (0.036 mL，0.20 mmol)，隨後添加HATU (19 mg，0.051 mmol)。溶液在室溫下攪拌4小時。向反應溶液中添加MeNH
3
Cl (5 mg)及HATU (10 mg)。反應物在室溫下攪拌30分鐘。向溶液中添加AcOH (3滴)。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘45-100% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘10-50% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為5.2 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件A：滯留時間 = 1.497 min; ESI-MS(+) m/z 933.45 (M+2H) 分析條件B：滯留時間 = 2.139 min; ESI-MS(+) m/z 933.70 (M+2H) ESI-HRMS(+) m/z: 計算值：933.4432 實驗值：933.4416。
製備實例 5007 中間物5007係按照「通用合成順序A」，使用「環化方法B」代替「環化方法A」以0.400 mmol規模來製備。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘10-50% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為75.1 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件A：滯留時間 = 1.408 min; ESI-MS(+) m/z 961.40 (M-2H) 分析條件B：滯留時間 = 2.912 min; ESI-MS(+) m/z 963.45 (M+2H) ESI-HRMS(+) m/z: 計算值：962.9618 實驗值：962.9592 實例5007製備如下：向裝備有攪拌棒且裝有中間物5007 (49 mg，0.025 mmol)之1打蘭小瓶中添加NMP (1.00 mL)，隨後添加DIPEA (0.043 mL，0.25 mmol)，隨後添加HATU (23 mg，0.062 mmol)。溶液在室溫下攪拌4小時。向反應溶液中添加MeNH
3
Cl (5 mg)及HATU (10 mg)。反應物在室溫下攪拌1小時。向溶液中添加AcOH (3滴)。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘15-55% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為3.3 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為97%。 分析條件A：滯留時間 = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 952.3 (M-2H) 分析條件B：滯留時間 = 2.68 min; ESI-MS(+) m/z 954.3 (M+2H) ESI-HRMS(+) m/z: 計算值：953.9565 實驗值：953.9542。
製備實例 5008 中間物5008係按照「通用合成順序A」，使用「環化方法B」代替「環化方法A」以0.400 mmol規模來製備。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘15-55% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為122.4 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為97%。 分析條件A：滯留時間 = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 957.5 (M+2H) 分析條件B：滯留時間 = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 954.5 (M-2H) ESI-HRMS(+) m/z: 計算值：955.9577 實驗值：955.9543 實例5008製備如下：向裝備有攪拌棒且裝有中間物5008 (46 mg，0.023 mmol)之1打蘭小瓶中添加NMP (1.00 mL)，隨後添加DIPEA (0.041 mL，0.23 mmol)，隨後添加HATU (22 mg，0.058 mmol)。溶液在室溫下攪拌4小時。向反應溶液中添加MeNH
3
Cl (5 mg)及HATU (10 mg)。溶液在室溫下攪拌1小時，隨後向溶液中添加AcOH (3滴)。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘20-60% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘50-100% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為1.7毫克，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件E：滯留時間 = 1.833 min; ESI-MS(+) m/z 948.15 (M+2H) 分析條件B：滯留時間 = 2.545 min; ESI-MS(+) m/z 946.55 (M+2H)。 製備實例7155
實例7155係藉由按照關於製備實例5001所述由以下通用程序構成之通用合成順序而以100 μmol × 4規模製備：「Prelude方法A：樹脂溶脹程序」、「Prelude方法A：單偶合程序」、「Prelude方法A：雙偶合程序」、「Prelude方法A：氯乙醯氯偶合程序」。 向微波小瓶中之所得樹脂結合化合物(100 μmol)中添加1 eq (100 μm，63 mg)荷維達-格拉布氏第二代催化劑(Hoveyda-Grubb's second generation catalyst)及17 mL二氯乙烷。將小瓶密封，且混合物用氮氣脫氣/吹掃並隨後在120℃下進行微波加熱1小時。重複反應4次，且所得樹脂合併於固相合成容器中，過濾，用DMF (4 × 20mL)、隨後用(DCM 5 × 20mL)洗滌並真空乾燥隔夜。將該物質分成四個100 μmol批次。 隨後採用「整體脫除保護基方法A」及「環化方法A」。 整體脫除保護基方法A：「整體脫除保護基方法A」之程序描述以100 μmol×4規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Rink連接基團的量來確定。「脫除保護基溶液」係藉由將三氟乙酸(22 mL)、苯酚(1.325 g)、水(1.25 mL)及三異丙基矽烷(0.5 mL)合併於40 mL玻璃瓶中來製備。向固相合成容器小瓶中所含之樹脂中添加「脫除保護基溶液」(8.0 mL)。混合物在定軌震盪器上混合(175RPM持續2小時)。過濾混合物，固體用額外「脫除保護基溶液」(4.0 mL)洗滌且收集於40 mL螺旋蓋小瓶中。向合併之濾液中添加Et
2
O (15 mL)。使混合物劇烈混合，接著沈澱大量白色固體。混合物在2000 RPM下離心3分鐘，傾析溶液與固體分離且棄去。重複該方法三次，隨後使固體靜置在實驗台上且風乾1-2小時，隨後得到呈灰白色固體狀之粗化合物。 環化方法A：「環化方法A」之程序描述以100 μmol × 4規模進行之實驗。將粗化合物固體溶解於MeCN:0.1M NH
4
OAc水溶液(60mL:60mL)中，且隨後使用NaOH水溶液(1.0M)將溶液小心地調節至pH = 9.0。將小瓶封蓋且隨後在定軌震盪器上以175RPM混合溶液隔夜(~18小時)。濃縮反應溶液且隨後將殘餘物溶解於MeOH中。 粗化合物經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 5μm, 19 × 200 mm，移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘15-55% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為3.0 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為84%。 分析條件A：滯留時間 = 1.63 min; ESI-MS(+)
m/z
= 909.5 (M + 2H) 分析條件B：滯留時間 = 2.70 min; ESI-MS(+)
m/z
= 909.5 (M + 2H)。 使用以下分析型LC/MS條件測定最終純度。 分析條件A：管柱：Waters BEH C18, 2.0 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：50℃；梯度：0% B，經3分鐘0−100% B，接著在100% B下保持0.5分鐘；流速：1 mL/min；偵測：UV，220 nm。 分析條件B：管柱：Waters BEH C18, 2.0 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：50℃；梯度：0% B，經3分鐘0-100% B，接著在100% B下保持0.5分鐘；流速：0.5 mL/min；偵測：UV，220 nm。 製備實例7156
向圓底燒瓶中添加3.0 mg實例7155 (1.65 μmol)及2 mL甲醇。將燒瓶密封且溶液用氮氣脫氣及吹掃。隨後向溶液中添加1 eq 10% Pd/C，燒瓶裝配有氫氣球且混合物在室溫下攪拌隔夜。所得產物過濾且經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 5μm, 19 × 200 mm，移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘45-85% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為1.7毫克，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件A：滯留時間 = 1.69 min; ESI-MS(+)
m/z
= 910.5 (M + 2H) 分析條件B：滯留時間 = 2.70 min; ESI-MS(+)
m/z
= 910.5 (M + 2H)。 使用以下分析型LC/MS條件測定最終純度。 分析條件A：管柱：Waters BEH C18, 2.0 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：50℃；梯度：0% B，經3分鐘0−100% B，接著在100% B下保持0.5分鐘；流速：1 mL/min；偵測：UV，220 nm。 分析條件B：管柱：Waters BEH C18, 2.0 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：50℃；梯度：0% B，經3分鐘0-100% B，接著在100% B下保持0.5分鐘；流速：0.5 mL/min；偵測：UV，220 nm。
製備中間物 10500 中間物10500係按照「通用合成順序A」，但使用「環化方法B」代替「環化方法A」來製備。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘40-80% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經40分鐘10-50% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為25.8 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為99%。 分析條件A：滯留時間 = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 908.4 (M+2H)。 分析條件B：滯留時間 = 2.81 min; ESI-MS(+) m/z 908.4 (M+2H)。
製備實例 10500 將中間物10500 (15 mg，8.26 µmol)溶解於DMF (1 mL)中，接著添加胡尼鹼(Hunig's Base) (7.22 µl，0.041 mmol)，隨後添加HATU (4.71 mg，0.012 mmol)。反應物攪拌1小時。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘30-70% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為1.2 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為99%。 分析條件A：滯留時間 = 1.85 min; ESI-MS(+) m/z 899.5 (M+2H)。 分析條件B：滯留時間 = 2.98 min; ESI-MS(+) m/z 899.7 (M+2H)。
製備中間物 10501 中間物10501係按照「通用合成順序A」來製備。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘15-55% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為34.0 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件A：滯留時間 = 1.64 min; ESI-MS(+)
m/z
929.4 (M+2H)。 分析條件B：滯留時間 = 2.82 min; ESI-MS(+)
m/z
929.8 (M+2H)。
製備實例 10501 實例10501係按照用於製備實例10500之方法來製備。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘25-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為6.5 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件A：滯留時間 = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 920.6 (M+2H)。 分析條件B：滯留時間 = 2.88 min; ESI-MS(+) m/z 920.6 (M+2H)。
製備中間物 10502 中間物10502係按照「通用合成順序A」來製備。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘15-55% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為34.0 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件A：滯留時間 = 1.68 min; ESI-MS(+)
m/z
922.5 (M+2H)。 分析條件B：滯留時間 = 2.83 min; ESI-MS(+)
m/z
922.8 (M+2H)。
製備實例 10502 實例10502係按照用於製備實例10500之方法來製備。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘25-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為3.1 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為98%。 分析條件A：滯留時間 = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 913.4 (M+2H)。 分析條件B：滯留時間 = 2.88 min; ESI-MS(+) m/z 913.7 (M+2H)。
製備中間物 10503 中間物10503係按照「通用合成順序A」來製備。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘15-55% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為23.4 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件A：滯留時間 = 1.65 min; ESI-MS(+)
m/z
915.8 (M+2H) 分析條件B：滯留時間 = 2.84 min; ESI-MS(+)
m/z
915.8 (M+2H)
製備實例 10503 實例10503係按照用於製備實例10500之方法來製備。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘25-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為1.8 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件A：滯留時間 = 1.78 min; ESI-MS(+) m/z 906.8 (M+2H)。 分析條件B：滯留時間 = 2.92 min; ESI-MS(+) m/z 906.7 (M+2H)。 使用均相時差式螢光(HTRF)結合分析測試巨環化合物與PD-1競爭結合至PD-L1之能力的方法 使用PD-1/PD-L1均相時差式螢光(HTRF)結合分析研究本發明之巨環化合物結合至PD-L1之能力。
方法
可溶性PD-1與可溶性PD-L1結合之均相時差式螢光(HTRF)分析。可溶性PD-1及可溶性PD-L1係指移除跨膜區且融合至異源序列(特定言之，人類免疫球蛋白G序列(Ig)之Fc部分或六聚組胺酸抗原決定基標籤(His))之羧基端截短的蛋白質。所有結合研究均在由dPBS組成的補充有0.1% (w/v)牛血清白蛋白及0.05% (v/v) Tween-20之HTRF分析緩衝液中進行。對於PD-1-Ig/PD-L1-His結合分析，抑制劑與PD-L1-His (10 nM最終)一起在4 µl分析緩衝液中預培育15分鐘，接著添加含PD-1-Ig (20 nM最終)之1 µl分析緩衝液並另外培育15分鐘。使用來自人類、短尾獼猴、小鼠或其他物種之PD-L1融合蛋白。使用經銪穴狀配位體標記之抗Ig單株抗體(1 nM最終)及經別藻藍蛋白(APC)標記之抗His單株抗體(20 nM最終)實現HTRF偵測。將抗體稀釋於HTRF偵測緩衝液中且將5 µl施配在結合反應頂部。使反應平衡30分鐘且使用EnVision螢光計獲得信號(665 nm/620 nm比率)。建立PD-1-Ig/PD-L2-His (分別為20及5 nM)、CD80-His/PD-L1-Ig (分別為100及10 nM)及CD80-His/CTLA4-Ig (分別為10及5 nM)之間的額外結合分析。在生物素標記之第71號化合物與人類PD-L1-His之間的結合/競爭研究進行如下。巨環化合物抑制劑與PD-L1-His (10 nM最終)一起在4 µl分析緩衝液中預培育60分鐘，接著添加含生物素標記之第71號化合物(0.5 nM最終)之1 µl分析緩衝液。使結合平衡30分鐘，接著添加含經銪穴狀配位體標記之抗生蛋白鏈菌素(2.5 pM最終)及經APC標記之抗His (20 nM最終)之5 µl HTRF緩衝液。使反應平衡30分鐘且使用EnVision螢光計獲得信號(665 nm/620 nm比率)。 重組蛋白質。在HEK293T細胞中表現具有C端人類Ig抗原決定基標籤[hPD-1 (25-167)-3S-IG]之羧基截短之人類PD-1 (胺基酸25-167)及具有C端His抗原決定基標籤[hPD-L1(19-239)-菸草葉脈斑點病毒蛋白酶裂解位點(TVMV)-His]之人類PD-L1 (胺基酸18-239)，且依次藉由重組蛋白質A親和層析及尺寸排阻層析純化。人類PD-L2-His (Sino Biologicals)、CD80-His (Sino Biologicals)、CTLA4-Ig (RnD Systems)均經由市售來源獲得。 重組人類PD-1-Ig之序列
(SEQ ID NO:1)
重組人類PD-L1-TVMV-His (PD-L1-His)之序列
(SEQ ID NO:2)
結果顯示於表1中。如所示，本發明之巨環化合物證實有效抑制PD-1-Ig對PD-L1-TVMV-His (PD-L1-His)之結合活性。範圍如下：A = 0.10-1 μM；B = 0.01-0.099 μM；C = 0.003 - 0.0099 μM。
表 1
熟習此項技術者應顯而易知本發明不限於前述說明性實例，且其可以其他不悖離本發明基本屬性之形式實施。因此，需要在所有方面將實例視為說明性而非限制性的，參考隨附申請專利範圍而非前述實例，且因此所有在申請專利範圍等效意義或範圍內的變化均意欲涵蓋於其中。