KR20030057529A - 합성 적혈구생성 자극 단백질 - Google Patents

Abstract

합성 적혈구생성 자극 단백질이 제공된다. 또한 단백질을 합성하기 위한 방법들도 제공된다. 본 발명은 더 나아가 정의된 방식으로 중합체 변형되는 그러한 합성 적혈구생성 자극 단백질의 유도체에 관한 것이다. 또한 그러한 단백질과 유도된 단백질에 대한 방법들과 용도가 제공된다.

Description

합성 적혈구생성 자극 단백질{SYNTHETIC ERYTHROPOIESIS STIMULATING PROTEINS}

적혈구 발생은 적혈구의 교체 및 손실을 조절하기 위해 일어나는 적혈구의 제조 과정이다. 에리스로포이에틴(EPO)는 적혈구 발생을 자극하는 단백질 호르몬이다. 자연적으로 발생하는 사람 EPO는 신장에서 주로 생산되고, 혈류로 분비되는 165 아미노산을 함유하는 당단백질이고, 골수에서 선구체 세포로부터 적혈구의 생산을 자극한다. 유전자 인코딩 사람 EPO가 166 아미노 산 잔기를 갖는 분자를 예측하지만, 카르복시 말단 아르기닌은 그것의 만기 형태에서 번역후 변형에서 제거된다.

글리코실화 사람 EPO는 위치 24, 38 및 83에서 부착된 3개의 N-연결 탄수화물 사슬을 가진다. 그것은 또한 위치 126에 존재하는 하나의 O-연결 탄화수소 부분을 가진다. 글리코실화의 효과는 복잡하다. 비-글리코실화 EPO는 시험관내에서 활성이다. 그러나, 연구는 글리코실화가 생체내에서 완전한 활성을 위해서 필요하다는 것을 보여주었다. 연구는 또한 변화하기 쉬운 글리코실화 패턴이 변하기 쉬운 효과를 나타내는 것을 보여주었다. 예를 들어, 데시알리화(desialyated) EPO는 시험관내에서 강화되고 생체내에서 감소된 활성으로 모두 간세포에 의해 인식되고 결합되고, 제거되는 갈락토스 잔기의 노출에 공헌하는 효과를 나타낸다. 완전히 시알리화 EPO의 분지 패턴은 또한 생물학적 활성에서 차이를 만드는 것으로 나타났다. 지배적으로 테트라-안터너리(anternnary) 분지상 EPO는 "표준" EPO와 동등한 활성을 보여주는 반면, 지배적으로 바이-안터너리 분지상 EPO는 시험관내에서 3배 더 활성을 보이지만, 생체내에서는 정상 활성의 오직 15%만 나타난다. 게다가, 다양한 연구들은 오직 N-연결된 당만이 EPO 기능화에서 중요하다는 것을 보여주었다.

몇가지 약학적 제품은 재조합적으로 생산된 글리코실화 EPO가 이용가능하다. 그러나, 현재 이용가능한 EPO 약학적 제품은 그들의 짧은 플라즈마 반감기 및 프로테아제 저하에 대한 감수성에 의해 제한된다. 그들은 또한 각각의 N-연결된 글리코실화 부위 및 부위사이에서 일어나는 분지 및 살리실산 함량에서의 높은 정도의 이종성의 다른 글리코형태의 복합 혼합물을 함유한다. 이들 단점은 그들이 최대 임상 효능을 얻지 못하도록 방해하였다.

이러한 EPO 단백질의 반감기 및 다른 특성들을 개선하기 위해, PEG(폴리에틸렌 글리콜)과 같은 수용성 중합체가 부착되었지만, 주어진 혼합된 결과는 제어된방식으로 사용자가 정의한 정확성으로 그들을 부착시키기 어렵다. 예를 들어, PEG와 같은 폴리머 부분 및 단백질에서 발견된 반응성 기에 대한 관련된 중합체를 부착하는데 다양한 수단이 사용되어 왔다.(참조 U. S. Patent 4,179,337 (Davis et al.), 및 U. S. Patent 4,002,531 (Royer). 검토를 위해, Abuchowski et al., in "Enzymes as Drugs," (J. S. Holcerberg 및 J. Roberts, eds. pp. 367-383 (1981) 및 Zalipsky, S. (Bioconjugate chemistry (1995) 6: 150-165을 참고하라. 또한 단백질을 변형하기 위한 PEG 및 다른 중합체의 사용이 Cheng, T.-L. et al., Bioconjugate Chem. (1999) 10: 520-528; Belcheva, N. et al., Bioconjugate Chem. (1999) 10: 932-937; Bettinger, T. et al., Bioconjugate Chem. (1998) 9: 842-846 ; Huang, S.-Y. et al., Bioconjugate Chem. (1998) 9: 612-617; Xu, B. et al. Langmuir (1997) 13: 2447-2456; Schwarz, J. B. et al., J. Amer. Chem. Soc. (1999) 121: 2662-2673; Reuter, J. D. et al., Bioconjugate Chem. (1999) 10: 271-278; Chan, T.-H. et al., J. Org. Chem. (1997) 62: 3500-3504에 의해 논의된다. 단백질에서 전형적인 부착 부위는 리신 잔기 위 또는 N-말단에서의 것들과 같은 1차 아미노 기, 시스테인 측쇄위의 것들과 같은 티올 기, 및 글루타메이트 또는 아스파르테이트 잔기위 또는 C-말단에의 것들과 같은 카르복실기를 포함한다. 가장 일반적인 부착 부위의 일부는 당단백질, 시스테인의 당 잔기 또는 N-말단 및 타겟 단백질의 리신이다.

많은 다른 접근이 EPO에 대한 중합체의 결합에 대해 기술되었지만, 결합 과정은 복잡하지 않은 것은 아니다. 결합 반응에 의해 유발되는 생물학적 활성을 제한하는데 주의를 해야 한다. 예를 들어, 접힌 또는 다시접힌 단백질은 부착 부위의 수를 줄이는데 전형적으로 사용된다. 그러나, 너무 많은 활성화 중합체가 타겟 단백질 또는 폴리펩티드에 부착되면, 생물학적 활성화는 심하게 감소되거나 잃어버릴 수 있다. 게다가, 만일 단백질에 중합체를 결합시키는 잘못된 링커가 사용되거나 불충분한 양의 중합체가 타겟에 부착된다면, 발생되는 콘쥬게이트의 치료 량은 제한될 수 있고, 생물활성에서의 손실을 보상하기 위한 순환 수명에서의 충분한 증가를 나타내지 않을 수 있다. 문제들은 또한 중합체를 변형함으로써 단백질의 활성 부위의 억제 때문에 초래될 수 있다. 이 문제점은 중합체와 단백질이 전형적으로 용액 기반 반응에서 결합되기 때문에 피하는 것이 어려울 수 있다. 피리독살 포스페이트와 같은 물질로 활성 부위를 미리봉쇄하는 것은 제안되었지만, 그 결과는 일관성이 없다(참고, U. S. Patent 4,179,337 (Davis et al.) ). 이들 문제점들은 특히 더 낮은 분자량 단백질과 펩티드에 심각하고, 종종 생물활성와 연관되지 않은 부착 부위는 거의 없다.

예를 들어, 일반적인 기술은 타겟 단백질에서 1차 아민에 수용성 중합체의 부착에 있었다(예를 들어, N-말단 아미노 기와 리신의 엡실론 아미노 기). 티올 반응성 중합체 콘쥬게이트는 또한 중합체를 시스테인의 티올 측쇄에 부착하는데 사용되었다. 두가지 접근 모두 상당한 문제들을 나타낸다. 대부분의 단백질이 그러한 반응성 기의 다중 복사물을 함유하기 때문에 단백질의 활성, 접힘, 다시접힘 및 안정성을 정의하는데 중요한 역할을 하는 다양한 영역의 폴리펩티드 백본에 걸쳐 퍼진다. 따라서 널리 사용되지만, 그러한 접근은 다소 불완전하거나 원치않는 단백질의 생물활성에서의 환원 및, 보통 분리하고 특성화하기 어려운 복잡한 혼합물때문에 고통받는다(Delgada et al., Pharmaceutical Sciences (1997) 3: 59-66).

무작위 부착을 줄이기 위한 시도에 있어서, 리신을 중합체 부착의 원하는 부위에 첨가하는것과 함께 천연 리신이 제거되는 단백질이 만들어졌다. 예를 들어 G-CSF 및 IL-2 은 이러한 식으로 변경되었다. 무작위 부착을 피하기 위한 다른 시도는 중합체 부착의 원하는 부위에 시스테인을 첨가하는 것과 함께 천연 리신이 제거되거나, 또는 만일 존재한다면 천연 시스테인을 제거하지 않고 시스테인이 첨가되는 단백질을 만들어왔다. 예를 들어, EPO는 이런 식으로 만들어져왔다. 그러한 시스테인 또는 리신 변체는 이론적으로 부위 특이성 중합체 부착을 허용하지만, 모든 선택된 부위가 제어된 방식으로 변경될 수 있다는 것은 여전히 보장이 없다.

부위 특이적으로 동일한 또는 유사한 반응성 작용기를 갖는 측쇄를 갖는 다중 아미노산을 함유하는 단백질을 변경하는 무능력이 주어지므로, 최근의 노력은 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단의 변형에 초점을 맞췄다. 아미노 또는 카르복시 말단의 변형은 유일하게 이들 부위를 변경하는 일부 화학적 콘쥬게이트 기술에 의존하였다 (WO 90/02136 및 WO 90/02135). 그러나, N- 또는 C-말단의 변경은 전형적으로 단백질의 활성을 감소한다.(참고 예를 들어, PEG의 N-말단 및 리신 측쇄의 G-CSF에 대한 부착을 논의하는 U. S. Patent 5,985,265). 수용성 중합체와 단백질의 변경을 갖는 결함에도 불구하고, PEGyl화 및 다른 수용성 중합체의 단백질에 대한 부착은 계속해서 추구되었다. 예를 들어, 에리스로포이에틴 (EPO)의 당 사슬 및 리신과 같은 내부 아미노산(EP 0 605 963 및 WO 00/32772), 및 N-말단 (U.S. Patent 6,077,939 및 WO 00/32772)에 대한 PEG의 부착은 또한 기술되어 있다. 불행하게도, 그러한 PEGyl화 EPO는 분리시키고 특성화하기 어려운 복잡한 혼합물을 초래한다.

다른 문제는 상기 논의된 중합체가 모두 매우 불균일해서 중합체-변형 단백질의 혼합물의 분석적 특성화 및 정제를 어렵게 만든다는 것이다(Delgada 등, Pharmaceutical Sciences (1997) 3:59-66). 예를 들어, PEG 또는 PEG-기초 사슬을 제조하는데 사용된 기술은, 심지어 3400과 같이 꽤 적은 상대 분자 질량을 가진 것들 조차도, 평균값 근처의 사슬 길이의 분포를 갖는 제조물을 가져오는 불량하게 제어된 중합 단계를 포함하는데, 즉 그것들은 (CH₂CH₂O)_n의 중합체 제조물을 포함하며, 여기에서 n은 불연속적인 값을 갖는 것이 아니라, 오히려 평균 근처의 값의 범위를 가진다. 유도된 단백질의 결과의 이종성은 흔히, 훨씬 덜 개별적인 쉽게 확인할 수 없는 특성 범위에 관련된다. 폴리펩티드 애덕트의 사용이 원칙적으로 가능한 해결책을 제공하기 위해 고려될 수 있지만, 폴리펩티드의 사용은, 그것들이 단백질 가수분해 절단에 민감하고, 유도된 단백질을 면역원성으로 만들 수 있기 때문에 유리하지 않다.

그러나, 불행하게도, 적절한 중합체를 확인하고 사용하는 문제는 치료 용도로 현재 채택된 모든 EPO 단백질이 재조합 DNA 기술로부터 유도된다는 사실에 의해 악화된다. 재조합 DNA 기술은 성능-강화 부분과 재조합적으로 제조된 EPO 단백질 사이에 형성될 수 있는 연결의 타입과 특이성에 대한 엄격한 제한을 놓는다. 이것은 첫째로 연결에 적합한 오직 작은 제한된 수의 작용기가 있기 때문이고, 둘째로는 일반적으로 단백질에서 반응성 작용기의 몇가지 복사물이 있을 것이고, 따라서 어떠한 변형의 특이성을 방해하기 때문이다. 예를 들어, 과산화물 디스뮤타제의 PEG와의 비선택적인 콘쥬게이트의 경우에, 변형된 효소의 몇가지 부분은 완전히 비활성이었다(P. McGoff et al., Chem. Pharm. Bull. (1988) 36: 3079-3091). 또한, 다른 수의 그러한 부분들이 무작위로 부착되면, 투약을 큰 문제로 만들면서, 치료 단백질의 약물 생체 반응학은 정확하게 예측가능할 수 없다. 부착의 제어의 부족은 더욱이 (a) 감소된 효능 (b) 유도체의 막대한 혼합물을 분리하기 위한 정교한 정화 계획에 대한 필요성 및 (c)변경하는 부분의 가능하게 안정적이지 않은 부착을 초래할 수 있다. 당업계에 잘 알려진 트레실클로라이드-기반의 연결과 같은 몇가지 연결은 또한 면역성으로 알려져있다.

따라서 순환 반감기를 개선하고, 단백분해와 면역성을 감소시키고, 생물학적으로 제조된 단백질의 다른 특성들을 개선하기 위해, PEG와 같은 수용성 중합체가 부착될 수 있지만, 그들을 제어된 방식으로 부착하는 어려움으로 주어지는 혼합된 결과와 사용자 정의된 정확성과 함께이다. 또한, 정확한 사용자-정의된 부위에서 중합체를 부착하는데의 제한된 성공때문에, 일반적으로 단백질에 적용가능했던 바람직한 부착 부위에 대해서 거의 알려진 바가 없다. 게다가, 부착의 확률적인 성질 및 현재 그러한 목적을 위해 채택된 PEG와 다른 수용성 중합체의 헤테로-전파 성질 때문에, 정화 및 PEG-단백질 콘쥬게이트의 분석적 특성화가 어려웠다. 따라서 복제가능한 부착에 대한 불량한 제어 및 중합체 이종성의 병합된 문제점은 치료법으로서 중합체 변형 단백질의 일상적인 승인을 심하게 방해하였다(1970 초반에 그것의 도입되었음에도 불구하고 오직 몇개만이 치료 용도를 위해 승인되었다.).

따라서, 재조합 DNA 기술과 중합체 기술과 전혀 다른 생물활성 적혈구생성을 형성하는 방법에 대한 필요성이 존재한다. 또한 임상적인 특성을 개선한 적혈구생성 자극 단백질이 필요하다. 본 발명은 이들 및 다른 필요성을 만족시킨다.

본 발명은 한정된 방식으로 중합체-변형되는 합성 자극 단백질과 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

관련된 출원의 상호참조

본 출원은 미국 특허 출원 제 60/231,339 호 (2000년 9월 8일 제출) 및 제 60/236,377 호 (2000년 9월 29일 제출)의 일부계속이고, 두 출원은 모두 참고문헌으로서 여기에 전문이 수록된다.

도 1A-1E는 본 발명의 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질 제조 프로세스의 개략도이다.

도 2A-2C는 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질 제조 프로세스의 개략도이다.

도 3A-3B는 3개 이상의 비-중복 펩티드 세그먼트들의 화학 라이게이션을 포함하는 다수-세그먼트 라이게이션 프로세스의 개략도이며, 즉 적어도 1개 세그먼트는 최종 전길이 라이게이션 생성물에 해당하는 중간 세그먼트이다.

도 4A-4C는 결과의 측쇄 티올의 천연 화학 라이게이션 및 화학적 변형을 예시한다.

도 5A-5B는 본 발명의 수용성 중합체 U-B-중합체-J*의 분기 중심(B) 및 유일한 화학선택성 작용기(U)를 생성하기 위한 고체상 프로세스이다.

도 6A-6D는 U-B 중심에의 후속 부착을 위한, 본 발명의 바람직한 실질적으로 비-항원성인 수용성 폴리아미드 중합체-J* 성분을 생성하기 위한 고체상 프로세스이다.

도 7은 U-B 성분과 중합체-J* 성분을 커플링하여 식 U-B-중합체-J*의 본 발명의 바람직한 합성 중합체 구성물을 생성하는 프로세스이다.

도 8은 라이게이션 및 본 발명의 적혈구생성 자극 합성 단백질의 생성에 이용할 수 있는 펩티드 세그먼트에 수용성 중합체를 정확히 부착하기 위한 다른 경로를 나타낸다.

도 9는 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질을 제조하는 전체적인 프로세스를 예시한다.

도 10은 바람직한 형태의 합성 적혈구생성 자극 단백질의 기본 구조를 나타낸다. pPEG = "정확한 PEG"

도 11은 재배치된 아미노 및 카르복시 말단을 갖는 순환식 변경된 SEP 유사체의 일반 구조를 나타낸다.

도 12는 바람직한 수용성 중합체, 및 그것의 다양한 선형 및 분기 구성물의 구조를 나타낸다.

도 13는 분기-사슬 pPEG 중합체의 형성을 도식적으로 나타낸다.

도 14은 실시예 2에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-L30으로 표시된 합성 사이토카인의 합성을 나타낸다.

도 15은 실시예 2에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-L30으로 표시된 합성 사이토카인을 나타낸다.

도 16은 실시예 3에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-L26으로 표시된 합성 사이토카인을 나타낸다.

도 17는 실시예 4에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-B50으로 표시된 합성 사이토카인에 부착되는 바람직한 분기-사슬 수용성 중합체의 형성을 도식적으로 나타낸다.

도 18은 실시예 4에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-B50으로 표시된 합성 사이토카인을 나타낸다.

도 19은 실시예 5에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP3-L42로 표시된 합성 사이토카인의 합성을 나타낸다.

도 20는 실시예 5에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP3-L42로 표시된 합성 사이토카인을 나타낸다.

도 21은 실시예 7에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-B51로 표시된 합성 사이토카인에 부착하기 위한 바람직한 수용성 중합체의 합성을 나타낸다.

도 22는 실시예 7에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-B51로 표시된 합성 사이토카인을 나타낸다.

도 23는 실시예 8에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-B52로 표시된 합성 사이토카인에 부착하기 위한 바람직한 수용성 중합체의 합성을 나타낸다.

도 24은 실시예 8에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체인, SEP1-B52로 표시된 합성 사이토카인을 나타낸다.

도 25은 실시예 2 내지 5 및 7 내지 8에 설명된 대로 제조된 사람 EPO의 정확한 중합체-변형 합성 유사체에 대한 대표적인 분석 데이타를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 대표적인 등전 포커싱 겔(IEF) 및 비-환원성 SDS-PAGE 겔은 접힌 정제된 SEP1-B51의 상대적 분자량을 나타낸다.

도 26은 SEP 화합물들인 SEP0, SEP1-L26, SEP1-L30, SEP1-B50, SEP1-B51 및 SEP3-L42의 인자-의존성 셀라인의 시험관내 활성을 나타낸다.

도 27는 수시간 내의 시간에 대한 SEP3-L42 및 SEP1-B50의 혈장 농도(ng/ml)를 비교하는 대표적인 약물동태학 프로파일을 나타낸다.

도 28은 SEP1-B51 및 저산소 래트 모델의 CHO-세포에서 생성된 재조합 당화된 사람 에리트로포에틴("rhEPO")에 대한 적혈구(RBC)-⁵⁹Fe 흡수(용량 %로서)인, 72시간까지 측정된 생체내 활성의 선형 회귀 분석을 나타낸다.

도 29은 각 화합물에 대해 5㎍/kg의 단일 정맥내 용량 후, 수시간 내의 시간에 대한 SEP1-B51 및 rhEPO의 혈장 농도(ng/ml)를 비교하는, 래트에서의 청소에 대한 대표적인 약물동태학 프로파일을 나타낸다.

도 30은 순환식 변경된 중합체-변형 SEP 구성물을 나타낸다.

바람직한 구체예의 설명

본 발명은 합성 적혈구생성 자극 단백질, 제조 방법 및 사용에 관한 것이다.

I. 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질

바람직한 구체예에서, 본 발명은 거기에 부착된 하나 이상의 가용성 중합체를 갖는 합성 적혈구생성 자극 단백질을 지시한다. "적혈구생성 자극 단백질"에 의해 에리스로포이에틴-의존 세포계의 성장을 촉진하는 인비트로 생물학적 활성을 가지는 단백질이 의도된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 합성 적혈구생성 자극단백질은 적혈구의 제조를 촉진하는 생체내 생물학적 활성을 가진다. 단백질의 적혈구생성 자극 활성은 의존 세포계 등의 증식을 성립시키는 단백질의 능력을 평가함으로써, 생체내 투여 후에 하기의 적혈구생성와 같은 어떠한 다양한 수단에 의해 결정될 수 있다.

"가용성 중합체"는 실질적으로 물에 녹을수 있는 비항원성 중합체를 의도한다.

여기서 사용된 바와같이, 재조합 기술이 그것의 아미노산 잔기의 일부를 대부분 바람직하게 모든 잔기를 중합하는데 사용되었다면, 단백질은 "합성" 이라고 부른다. 용어 "비-재조합 기술"은 생체내 또는 시험관내에서 RNA를 단백질로 전환하는 것을 수반하는 기술로부터 유기 화학 및 다른 합성 중합 접근을 수반하는 기술들을 구별하기 위한 목적이다. 합성 단백질은 전체적으로 합성 및 절반 합성 단백질을 포함한다. 완전히 합성 단백질은 제조된다. 모든 라이게이션 성분은 화학 합성, 즉, 무-리보솜 합성에 의해 사람이 만든다. 반-합성 단백질은 제조되는데, 여기서 적어도 생물학적 합성에 의해 즉, 세포 또는 무-세포 전환 시스템에서 리보솜으로 만들어지고, 또다른 부분은 화학적 합성에 의해 만들어진다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질은 리보솜으로 지정되는 에리스로포이에틴의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 사슬 및 하나 이상의 화학적 라이게이션 부위에 의해 공유결합적으로 결합된 하나 이상의 중복되지 않는 펩티드 단편들을 포함한다. 가장 바람직하게는 에리스로포이에틴이 포유 동물이고, 보다 바람직하게는 사람 또는 그것의 유도체이다. 예를 들어, 많은 에리스로포이에틴의 아미노산 서열은 공지되고, 사람 에리스로포이에틴에 대해 그것의 많은 활성 변체들이 만들어졌고,(참조, 예를 들어, U. S Patent Nos. 5,856,298; 5, 955, 422; 8,888,772; 5,858,347; 5,614,184; 5,457,089; 및 6,077,939; 및 WOO/32772), 따라서, 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질은 그러한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 리보솜으로 지정된 에리스로포이에틴은 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하고, 가용성 중합체는 리보솜으로 지정된 에리스로포이에틴의 하나 이상의 글리코실화 부위에 해당하는 하나 이상의 부위에 합성 적혈구생성 자극 단백질의 폴리펩티드 사슬에 부착된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 가용성 중합체는 하나 이상의 그러한 글리코실화 부위에 해당하는 하나 이상의 부위에 독점적으로 폴리펩티드 사슬에 부착된다. 본 발명의 이러한 양태는 리보솜으로 지정된 에리스로포이에틴이 재조합적으로 제조되는 합성 적혈구생성 자극 단백질을 포함한다. 따라서, 리보솜으로 지정된 에리스로포이에틴이 천연 에리스로포이에틴 또는 비천연 에리스로포이에틴이 될 수 있고, 그것의 후자는 하나 이상의 비천연 글리코실화 부위를 더욱 포함할 수 있다.

"글리코실화 부위"는 N-연결 및 O-연결된 글리코실화 부위에 의해 예증화된, 단백질의 아미노산 서열의 아미노산 잔기의 측쇄에 올리고사카리드(카르보히드레이트) 사슬의 효소의 부착을 위해 인코딩하는 단백질의 아미노산 서열을 의도한다. 중합체 변형을 위한 잔여 부위가 위치적으로 동일할 것이므로, 하나 이상의 그러한 글리코실화 부위를 제거하기 위해 변화시킨 에리스로포이에틴이 구체화된다는 것이이해될 것이다. "천연적으로 일어나는 글리코실화 부위"는 천연에서 발견되는 에리스로포이에틴 당단백질의 글리코실화 부위를 의도한다. "비천연적으로 발생하는 글리코실화 부위"는 에리스로포이에틴으로 조종된 글리코실화 부위를 의도한다(참조 예를 들어, U. S. Patent No. U. S. Patent No. 5,856,298).

본 발명의 구체예는 부분적으로, 사람 에리스로포이에틴의 폴리펩티드 사슬을 갖는 합성 적혈구생성 자극 단백질이 여기서 기술된 중합체와 같은 가용성 중합체로 그들의 하나 이상의 글리코실화 부위에서 변경될 때, 자연적으로 가용성 중합체는 하나 이상의 생물학적 효과를 이용하기 위해 이용될 수 있다는 발견에 기반한다. 그러한 생물학적 효과는 프로테아제 저항의 조절, 복사물 면역성, 리셉터-특이성, 특이적 활성, 효능 및 약물 생체 반응학을 포함한다. 그러나, 카르보히드레이트 사슬의 존재를 제거함으로써, 그리고 그것을 본 발명의 바람직한 수용성 중합체로 대체함으로써, 당 사슬의 펜던트 살리실산 잔기가 제거될 때, 불안정한 상태, 제한된 순환 반감기, 분포, 불량한 취급 특성 등과 같이 효소적 저하 및 제거를 포함하여 중요한 이점이 얻어진다. 중요하게는, 그것은 또한 본 발명의 그러한 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질은 합성 단백질의 모노머 분자량은 25 kDa 보다 더 클때조차, 변경되지 않은 복사물 합성 단백질과 비교할때, 증가된 생물활성을 포함하여, 생물학적 활성의 손실의 상당한 존재에서 그러한 이점의 생물학적 특성을 보유한다는 것이 발견되었다.

따라서, 또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 리보솜으로 지정된 에리스로포이에틴의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함하는 합성 적혈구생성 자극 단백질을 지시한다. 폴리펩티드 사슬은 여기에 부착된 하나 이상의 수용성 중합체와 25 kDa보다 더 큰 모노머 분자량을 가지고, 여기서 합성 적혈구생성 자극 단백질은 상기 수용성 중합체가 없는 폴리펩티드 사슬을 갖는 대응하는 합성 단백질보다 더 크거나 동일한 생물활성을 포함한다. 생물활성은 시험관내 생체내 생체내 또는 둘다가 될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 생물활성은 생체내이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 리보솜으로 지정된 에리스로포이에틴의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함하는 합성 적혈구생성 자극 단백질을 지시하는데, 여기서 폴리펩티드 사슬은 거기에 부착된 하나 이상의 수용성 중합체와 25 kD보다 더 큰 모노머 분자량을 가지고 리보솜으로 지정된 에리스로포이에틴보다 더 크거나 동일한 생물활성을 포함한다. 여기 다시, 생물활성은 시험관내 생체내 또는 둘다가 될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 생물활성이 생체내이다. 가장 바람직하게는, 그러한 중합체 변형 합성 적혈구생성은 분리된 수의 수용성 중합체를 가질 것이다.

"화학적 라이게이션 부위"는 첫번째 펩티드 또는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 및 화학적 라이게이션에 의해 그안에 사이에서 비가역성 공유 결합을 형성하거나 형성할 수 있는 두번째 펩티드 또는 폴리펩티드의 C-말단 아미노 산을 의도한다. 여기서 사용된 바와 같이, "화학적 라이게이션"은 두개의 화학적 부분들의 공유 결합을 수반하는 화학선택적 반응을 말하고, 그것의 각각 부분은 다른 하나와 비가역적 공유 결합을 유일하게 형성할 수 있는 상호적으로 반응성 작용기를 갖는다. 화학적 라이게이션은 공유 라이게이션의 (1) 유일하게 반응성 C-말단 기를 갖는 첫번째 펩티드 또는 폴리펩티드와 (2)유일하게 반응성 N-말단 기를 갖는 두번째 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 C-말단과 N-말단 반응성 기는 그안에서 사이에 비가역성 공유 결합을 형성한다. 특히, 화학적 라이게이션은 보호되지 않은 펩티드 단편의 라이게이션에 도포될 수 있는 어떠한 화학선택적 반응을 포함한다.

수용성 중합체에 대해, 바람직한 수용성 중합체는 다음 식으로 표시될 수 있다:

Un-s1-B-s2-중합체-s3-J ^*

U는 합성 적혈구생성 자극 단백질의 폴리펩티드 사슬에 결합된 유일한 작용기의 잔기이다. 특히, U 기는 합성 적혈구생성 자극 단백질의 하나 이상의 중복되지 않은 펩티드 단편의 하나 이상의 아미노산의 측쇄 n의 상호적으로 반응성인 유일한 작용기에 결합되고, 여기서 n은 1 내지 6의 분리된 정수이다. 보다 바람직하게는 측쇄 n은 1 내지 4의 분리된 정수이고, 가장 바람직하게는 1 내지 2이다. 여기서 사용된 바와 같이 용어 "아미노산"은 20 유전적으로 코드된 아미노산, 천연에서 발견되는 드문 또는 예외적인 아미노산 및 불규칙적인 아미노산과 같은, 비천연적으로 발생하는 아미노산의 어떤 것을 포함하도록 의도된다; 때때로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 문맥에 있을때, 아미노산 잔기라고 언급된다. U와 측쇄 n의 바람직한 구체예는 유일한 상호적으로 반응성 기로부터 형성된 공유 결합이고, 그러한 결합은 옥심, 아미드,아민, 우레탄, 에테르, 티오에트르, 에스테르, 히드라지드, 옥사졸리딘, 타이졸리딘, 티오에테르, 에테르, 및 에스테르로부터 선택된다. 가장 바람직한 U와 n 결합은 U가 아미드, 옥심, 티오에스테르, 히드라존, 타이졸리딘, 옥사졸리딘으로 구성되는 군으로부터 선택된 화학적 라이게이션에 의해 형성된 결합을 통해 측쇄 n에 공유결합으로 결합되는 것이다.

B는 동일하거나 다를 수 있고 있을 수도 있고 없을 수도 있는 3 이상의 팔을 갖는 분지상 코어이다. 가장 바람직하게는 B는 존재하고 3 이상의 팔, 보다 바람직하게는 4 이상의 팔을 포함한다. 특히, B의 하나의 팔은 (선택적으로 스페이서 또는 링커 s1을 통해) U에 결합되고, B의 두번째 팔은 (선택적으로 스페이서 또는 링커 s2을 통해) 중합체에 결합된다. 선호되는 중합체-변형된 합성 적혈구생성 자극 단백질은 부분 B의 하나 이상의 분지상 팔은 옥심, 아미드,아민, 우레탄, 티오에테르, 에스테르, 히드라지드, 옥사졸리딘,및 타이졸리딘으로 구성되는 군으로부터 선택된 결합의 잔기를 포함한다. 본 발명의 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질의 바람직한 분기기 B는 아미노, 카르복실레이트 및 혼성 아미노-카르복실레이트로 구성된 군으로부터 선택된 분기 중심을 포함한다. 바람직한 아미노 분기 중심은 리신을 포함하고, 바람직한 카르복실레이트 분기 중심은 글루탐산 또는 아스파르트산을 포함하고, 바람직한 혼성 아미노-카르복실레이트 분기 중심은 감마-글루탐산, 또는 그것의 유도체를 포함한다.

중합체 성분은 실질적으로 비-항원성인 수용성 중합체로, B가 존재하는 경우 동일하거나 또는 상이할 수 있다. "수용성 중합체"는 실질적으로 비-항원성인 중합체를 의미하며, 물에서 가용성이고 약 1,000 달톤 이상의 원자 분자량을 가진다.중합체는 바람직하게 10,000Da 이상, 더 바람직하게 약 20,000 내지 500,000 Da, 가장 바람직하게 약 40,000 내지 300,000Da의 유효 유체역학 분자량을 가진다. "유효 유체역학 분자량"은 수성-기초 크기배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 측정된 중합체 사슬의 효과적인 수-용매화 크기를 의미한다. 수용성 중합체가 에틸렌 옥시드 반복 단위와 같은 폴리알킬렌 옥시드 반복 단위를 갖는 중합체 사슬을 함유할 때, 각 사슬은 약 200 내지 약 80,000Da, 바람직하게 약 1,500 내지 약 42,000Da의 원자 분자량을 갖는 것이 바람직하며, 2,000 내지 약 20,000Da가 가장 바람직하다. 구체적으로 언급되지 않는다면, 분자량은 원자 분자량으로 간주된다.

중합체 성분은 넓은 범위의 분자량, 및 중합체 서브유닛을 가진다. 이들 서브유닛은 생물학적 중합체, 합성 중합체, 또는 그것들의 조합을 포함할 수 있다. 그러한 수용성 중합체의 예는, 덱스트란 술페이트, P-아미노 교차결합 덱스트린, 및 카르복시메틸 덱스트린을 포함한 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 메틸셀룰로스 및 카르복시메틸셀룰로스를 포함한 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 녹말 및 덱스트린, 및 녹말 유도체 및 가수분해물, 폴리에틸렌 글리콜, 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 글리콜 동종중합체, 및 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(여기에서, 상기 동종중합체 및 공중합체는 치환되지 않거나 또는 한 단부에서 알킬기로 치환될 수 있다)를 포함한 폴리알킬렌 글리콜 및 그것의 유도체, 헤파린 및 헤파린 단편, 폴리비닐 알콜 및 폴리비닐 에틸 에테르, 폴리비닐피롤리돈, 아스파르타미드, 및 데스트란 및 덱스트란 유도체, 덱스트린 및 덱스트린 유도체로 폴리옥시에틸화된 폴리올을 포함한다. 또한, 구체적으로 기술된 수용성 중합체의 다양한 유도체가 고려된다는 것이 인정될 것이다.

상술된 것들과 같은 수용성 중합체는 잘 알려져 있으며, 특히 폴리에틸렌 글리콜인 "PEG"와 같은 폴리알킬렌 옥시드-기재 중합체가 잘 알려져 있다(예를 들어, "폴리(에틸렌 글리콜) 화학: 생물기술 및 생물의학 응용", J. M. Harris 편저, 플레넘 프레스, 뉴욕 (1992); 및 "폴리(에틸렌 글리콜) 화학 및 생물학적 응용", J. M. Harris 및 S. Zalipsky 편저, ACS (1997); 및 국제 특허 출원: WO 90/13540, WO 92/00748, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28937, WO 95/11924, WO 96/00080, WO 96/23794, WO 98/07713, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/30727, WO 99/32134, WO 99/33483, WO 99/53951, WO 01/26692, WO 95/13312, WO 96/21469, WO 97/03106, WO 99/45964, 및 미국 특허 번호 4,179,337; 5,075,046; 5,089,261; 5,100,992; 5,134,192; 5,166,309; 5,171,264; 5,213,891; 5,219,564; 5,275,838; 5,281,698; 5,298,643; 5,312,808; 5,321,095; 5,324,844; 5,349,001; 5,352,756; 5,405,877; 5,455027; 5,446,090; 5,470,829; 5,478,805; 5,567,422; 5,605,976; 5,612,460; 5,614549; 5, 618,528; 5,672,662; 5,637,749; 5,643,575; 5,650,388; 5,681,567; 5,686,110; 5,730,990; 5,739,208; 5,756,593; 5,808,096; 5,824,778; 5,824,784; 5,840,900; 5,874,500; 5,880,131; 5,900,461; 5,902,588; 5,919,442; 5,919,455; 5,932,462; 5,965,119; 5,965,566; 5,985,263; 5,990,237; 6,011,042; 6,013,283; 6,077,939; 6,113,906; 6,127355; 6,177,087; 6,180,095; 6,194,580; 6,214,966 참조).

더 바람직한 중합체 성분은 폴리알킬렌 옥시드, 폴리아미드 알킬렌 옥시드,또는 그것의 유도체를 포함한다. 보다 선호되는 폴리알킬렌 옥사이드 및 폴리아미드 알킬렌 옥사이드는 식 -(CH2-CH2-O)-의 에틸렌 옥사이드 반복 단위를 포함한다. 더욱 더 바람직한 중합체 성분은 식 -[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]_n- 또는 -[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]_n-의 약 1,000 달톤 이상의 분자량을 갖는 폴리아미드이며, 여기에서 X 및 Y는 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 분기되거나 또는 선형일 수 있는 2가 라디칼이고, n은 2 내지 100의 불연속 정수이며, X 및 Y 중 어느 1개 또는 모두는 선형이거나 또는 분기될 수 있는 생체적합성이며 실질적으로 비-항원성인 수용성 반복 단위를 포함한다. 가장 바람직한 수용성 반복 단위는 식 -(CH₂-CH₂-O)- 또는 -(CH₂-CH₂-O)-의 에틸렌 옥시드를 포함한다. 그러한 수용성 반복 단위의 수는 유의하게 변할 수 있지만, 더 바람직하게 그러한 단위의 수는 2 내지 500, 2 내지 400, 2 내지 300, 2 내지 200, 2 내지 100이고, 가장 바람직하게는 2 내지 50이다. 더 바람직한 구체예의 예는, X 및 Y 중 어느 1개 또는 모두가 -((CH₂)_n1-(CH₂-CH₂-O)_n2-(CH₂)_n1-)- 또는 -((CH₂)_n1-(O-CH₂-CH₂)_n2-(CH₂)_n1-)-으로부터 선택되는 경우이며, 여기에서 n1은 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 가장 바람직하게 1 내지 3이고, n2는 2 내지 50, 2 내지 25, 2 내지 15, 2 내지 10, 2 내지 8, 가장 바람직하게 2 내지 5이다. 매우 바람직한 구체예의 예는, X가 -(CH₂-CH₂)-이고 Y가 -(CH₂-(CH₂-CH₂-0)₃-CH₂-CH₂-CH₂)- 또는 -(CH₂-CH₂-CH₂-(O-CH₂-CH₂)₃-CH₂) -인 경우이다.

중합체 성분 또는 1개 이상의 스페이서 또는 링커가 존재할 때, 이것은 생물안정성 또는 생분해성인 중합체 사슬 또는 단위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 반복 결합을 갖는 중합체는 결합 불안정성에 따라 생리학적 조건하에서 안정성의 정도가 변화한다. 그러한 결합을 갖는 중합체는 생리학적 조건하에서의 상대 가수분해 속도에 의해 분류될 수 있는데, 이것은 저분자량 유사체의 공지된 가수분해 속도를 기준으로 하며, 예를 들어 덜 안정한 것에서부터 더 안정한 순서로, 폴리카르보네이트(-O-C(O)-O-) > 폴리에스테르(-C(O)-O-) > 폴리우레탄(-NH-C(O)-O-) > 폴리오르쏘에스테르(-O-C((OR)(R'))-O-) > 폴리아미드(-C(O)-NH-)이다. 유사하게, 표적 분자에 수용성 중합체를 부착시키는 결합 시스템도 생물안정성 또는 생분해성일 수 있는데, 예를 들어 덜 안정한 것에서부터 더 안정한 순서로, 카르보네이트(-O-C(O)-O-) > 에스테르(-C(O)-O-) > 우레탄(-NH-C(O)-O-) > 오르쏘에스테르(-O-C((OR)(R'))-O-) > 아미드(-C(O)NH-)이다. 이들 결합은 단지 예일 뿐이며, 본 발명 수용성 중합체의 중합체 사슬 또는 결합 시스템에 사용할 수 있는 결합의 종류를 제한하지 않는다.

성분 J*는 생리학적 조건하에서 음, 양 및 중성으로 구성된 군으로부터 선택된 순전하를 갖는 펜던트 기의 잔기이다. 이것은 치환되거나 또는 치환되지 않은 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 아릴알킬, 아실, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 아미드, 아미노, 카르보닐기 등 뿐만 아니라, 그것들의 염을 포함한다. 중성기는 바람직하게 알킬 또는 알콕시기이며, 제한은 없지만 1 내지 18개의 탄소를 함유하는 부분을 포함할 수 있고, 선형이거나 또는 분기될 수 있다. J*가 하전된 기로서 제공될 때, 이것은 이온화 가능한 작용기를 포함한다. 작용기의 예는 카르복실산,에스테르, 아미드, 니트릴, 티올 및 히드록실을 포함하지만 제한은 없다. 그러한 J* 기는 아미노산, 핵산, 지방산, 탄수화물, 및 그것들의 유도체, 및 키틴, 키토산, 헤파린, 헤파란 술페이트, 콘트로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 및 데르마탄 술페이트, 시클로덱스트린, 덱스트란, 히알루론산, 인지질, 시알산 등과 같은 부분의 성분일 수 있다. 바람직하게, J*는 카르복실, 아미노, 티올, 히드록실, 포스포릴, 구아니디늄, 이미다졸 및 그것들의 염으로부터 선택된 이온화 가능한 부분을 포함한다. J*가 이온화 가능한 카르복실레이트 부분을 포함하고, 생리학적 조건하에서 순 음전하를 갖는 경우가 가장 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질은 3과 7 사이의 정전점을 가지고, 따라서 음 전하를 갖는 J*기에 의해 pl을 미세 튜닝하는데 이용될 수 있다.

성분 s1, s2, 및 s3은 스페이서 또는 링커 부분으로, 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 개별적으로 존재하거나 또는 부재할 수 있다. 바람직한 스페이서 또는 링커는 수용성 중합체에 사용된 1개 이상의 반복 단위를 포함하는 선형 또는 분기 부분, 디아미노 및/또는 2산 단위, 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그것의 유도체 뿐만 아니라, 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 알콕시 등을 포함한 지방족 부분을 포함하며, 바람직하게는 18개 이하의 탄소 원자나 심지어 추가의 중합체 사슬을 함유한다.

또는 달리, 상기 식 "Un-s1-B-s2-중합체-s3-J*"는 "Un-B-중합체-J*"로 표시될 수 있으며, 여기에서 s1, s2, 및 s3 기는 존재할 수도 또는 부재할 수도 있다.

보다 바람직한 중합체 성분은 수용성 중합체 U-s1-B-s2-중합체-s3-J*가 단계적 합성에 의해 전체로서 생산되는 경우이다. 이것은 이들 중합체가 정확한 분자량 및 규정된 구조를 가질 것이라는 의미이다. 반대로, 중합 과정인 보통의 중합체 합성은 상이한 길이를 갖는 사슬들의 혼합물을 가져오며, 그래서 비록 분리하는 것이 불가능하지 않다 해도, 그것을 어렵게 하는 분자량 및 크기의 분포가 있게 된다. 분자 순도를 제어하는 능력은, 그것에 부착된 수용성 중합체를 가지며 단일-분산된 합성 단백질이 구성될 수 있다는 점에서 유리하다. 이것은 이종성 화합물로 인한 가변적인 특성들을 피할 수 있고, 단지 가장 바람직한 특성을 갖는 화합물들 만이 제조되며, 비교적 용이하게 분리될 수 있다는 점에서 상당한 이점을 나타낸다.

또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질은 하나 이상의 변칙 아미노산을 포함할 것이다. 본원에 사용된 "변칙 아미노산"은 비-유전적으로 코드된 측쇄, 비-유전적으로 코드된 백본, 비-유전적으로 코드된 치환 Nα 또는 αC(O) 부분, 또는 그것들의 조합을 갖는 아미노산, 즉 리보솜적으로 인스톨된 20개의 유전적으로 코드된 아미노산에 속한 것 이외의 다른 아미노산으로 간주한다. 바람직한 변칙 아미노산의 예는 유전적으로 코드된 작용기 이외의 다른 유일한 작용기를 지닌 측쇄를 갖는 아미노산, 뿐만 아니라 위아미노산 및 다양한 아미노산 변이체를 포함한다. 이 점에 있어서, 본 발명은 합성 적혈구생성 자극 단백질의 디자인 및/또는 구성에 있어 폭넓은 선택성 및 융통성을 허락한다. 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 비-리보솜적으로 인스톨된 아미노산의 예는, D-아미노산, β-아미노산, 위-글루타메이트, γ-아미노부티레이트, 오르니틴, 호모시스테인, N-치환 아미노산(R. Simon 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89:9367-71; WO 91/19735(Bartlett 등), 미국 특허 5,646,285 (Baindur)), α-아미노메틸렌옥시 아세트산(아미노산-Gly-디펩티드 동배체) 및 α-아미노옥시 산, 및 비-유전적으로 비-코드된 측쇄 작용기를 갖는 다른 아미노산 유도체 등을 포함하지만 제한은 없다. 티오아미드, 비닐성 아미드, 히드라지노, 메틸렌옥시, 티오메틸렌, 포스폰아미드, 옥시아미드, 히드록시에틸렌, 환원 아미드 및 치환 환원 아민드 동배체, 및 β-술폰아미드(들)를 함유하는 펩티드 유사체가 사용될 수 있다. "위아미노산"은 유전적으로 코드된 아미노산과 동일한 백본 구조 및 측쇄기를 가지지만, 측쇄 원자의 원자 조성에 차이가 있는 아미노산을 의미한다.

바람직한 구체예에서, 폴리펩티드 사슬의 변칙 아미노산에 부착된 수용성 중합체를 갖는 합성 적혈구생성 자극 단백질이 제공된다. 그것에 수용성 중합체의 부착을 위한 가장 바람직한 변칙 아미노산은 유전적으로 코드된 작용기의 존재하에서 이것들과의 반응 없이 사용될 수 있는 화학선택성 라이게이션 화학을 사용한다.

위에서 주목한 바와 같이, 단계적 회합에 의해 전부 만들어진 수용성 중합체는 단일 분산으로서 예를 들어, 본 발명의 바람직한 폴리아미드 에틸렌 옥사이드로서 만들어질 수 있다. 따라서 또다른 바람직한 구체예는 수용성 중합체가 단일 분산인 것이다. (즉, 단일 및 균일한 조성물 관심의 대상인 단일 및 구조적으로 정의된 분자 종을 함유하는 분자적으로 균일한 조성물) 또한, 합성 적혈구생성 자극 단백질이 전부 만들어질 수 있기 때문에, 그들은 또한 단일 분산으로 만들어질 수 있다. 그러한 화합물은 여기에 분산가능한 중합체가 채택될때 매우 순수한 이점이 있고 정제 및 분석적인 특성화의 문제들을 피한다. 그러한 화합물은 복제가능 투여량 등의 관점에서 이점이 있다(예를 들어, 당단백질 및 PEGyl화 재조합적으로 생산된 단백질의 전형적인 단백질에 반대되는 단일 분자 종).

상기한 바와 같이, 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질은 25 kDa보다 더 큰 모노머 분자량을 가질 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 분자량의 그러한 결정은 SDS 폴리아크릴아미드 전기이동을 출발시킴으로써 이루어진다. 용어 "모노머 분자량"은 거기에 부착된 중합체 및/또는 단백질 또는 폴리펩티드의 다중 복사물을 가질수 있는 합성 단백질과 구별되는 바와 같이, 모노머 폴리펩티드의 분자량을 언급하도록 의도된다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질은 60 내지 70 이상의 모노머 분자량과 함께, 40 kDa, 보다 바람직하게는 50 kDa 이상의 모노머 분자량을 가질 것이다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 합성 적혈구생성 자극 단백질은, 지정된 SEP1-B51은 약 73kDa의 모노머 분자량을 가진다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 단백질의 라이게이션 부위에 가 아미노산을 포함하는 합성 적혈구생성 자극 단백질, 및 선택적으로, 단백질에 부착된 수용성 중합체를 지시한다. 이들 화합물은 시스테인과 같은, 화학선택적 반응성 작용기를 포함하는 N-말단 아미노산을 갖는 첫번째 펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 α-카르복시 티오에스테르와 같은 화학적 라이게이션 호환가능 C-말단 작용기를 갖는 두번째 펩티드 또는 폴리펩티드에 라이게이팅하고, 가 글루타메이트 아미노산을 형성하는 시스테인 티올 측쇄의 카르복시메틸화처럼, 탈보호된 측쇄 작용기를 라이게이션 부위에서 화학적으로 변환함으로써, 라이게이션 부위에서 탈보호 측쇄 작용기를 갖는 라이게이션을 형성함으로써 제조된다. 천연의 화학적 라이게이션 부위에서 시스테인의 변환에 의해 형성된 위 아미노산은 여기서 "위 천연 화학적 라이게이션"이라고 언급되며, 하기에 상세히 기술된다.

또한 단백질의 라이게이션 부위에서 아미노산의 측쇄에 부착된 수용성 중합체를 포함하는 합성 적혈구생성 자극 단백질이 제공된다. 이들 화합물은 시스테인과 같은 화학선택성 반응성 작용기를 포함하는 N-말단 아미노산을 갖는 첫번째 펩티드 또는 폴리펩티드 단편을, α-카르복시 티오에스테르와 같은 화학적 라이게이션 호환가능 C-말단 작용기를 갖는 두번째 펩티드 또는 폴리펩티드에 라이게이팅하고, 수용성 중합체를 라이게이션 부위에서 탈보호된 측쇄 작용기에 부착함으로써, 탈보호된 측쇄 작용기를 갖는 라이게이션 생성물을 형성함으로써 합성된다.

본 발명의 가 아미노산 화학적 라이게이션 및 화학적 라이게이션 부위 중합체 변경의 이용은 다른 것들 중에서, 실질적인 분자량의 합성 적혈구생성 자극 단백질의 합성은 물론이고, 그렇지 않으면 적절한 라이게이션 부위가 없는 다양한 범위의 적혈구생성 자극 단백질의 힘드는 합성, 부위 특정 중합체 변경이 일상적이고 비용에 효율적인 방식으로 이용될 수 있는 부위의 팽창(및 부착 화학)을 포함하여, 종래 업계에 대해 몇가지 이점을 제공한다. 그들은 또한 수용성 중합체 부착을 위한 개별적인 또는 다중 부위를 스캔하는 것을 포함하여, 특히 원하는 생물학적 특성들의 미세 튜닝을 위한 아날로깅을 하는 높은 효율에 적합하다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질의 생물학적 특성들은 수용성 중합체의 분자량, 중합체 조성, 구조(예를 들어, 선형대 분지상, 또는 그들의 혼합물) 및 펜던트 기(예를 들어, 하전된 대 하전되지 않은, 또는 그들의 혼합물)의 정확한 조절과 합동으로 중합체 부착의 부위와 연결 화학을 정확하게 조절함으로써 변경될 수 있다. 특히, 반감기를 증가시키는 단백질의 분자량을 증가시키는 것에 더하여, 분지 등에서, 거기에 부착된 수용성 중합체는 대응하는 생물학적으로 제조된 단백질의 전하와 대략 동일한 등전점에 의해 측정된 바와 같이, 합성 적혈구생성 자극 단백질이 정확한 전하를 갖도록 만들 수 있다. 이는 대응하는 리보솜적으로 지정된 단백질의 자연적인 전하를 흉내내는 이점을 가진다. 본 발명의 바람직한 구체예는 따라서 그것에 사용되는 수용성 중합체 특히, 미리선택된 위치에 부착될 수 있는 구조적으로 정의된 중합체 애덕트는 물론이고, 상기 특징들을 조합하는 합성 적혈구생성 자극 단백질을 지정한다.

특히, 본 발명의 바람직한 합성 적혈구생성 자극 단백질("SEPs")은 바람직하게는 사람 비뇨기 EPO의 중합체-변형 합성 유사체이다. 바람직한 구체예에서, 그들은 티오에테르, 옥심, 아미드 또는 다른 연결을 통해 하나 이상의 펩티드 잔기(들)에 부착된 하나 이상의 수용성 중합체를 함유한다. 매우 바람직한 구체예에서, 그러한 연결은 사람 비뇨기 EPO에서(즉, 위치 24, 38, 83, 및 126) 자연적으로 글리코실화되는 하나 이상의 위치에 있을 것이다. 가장 바람직하게는, SEP 분자는 둘 이상의 그러한 위치에서 중합체 부분을 가질 것이다. 대안의 구체예에서, 다른 단백질 잔기는 중합체 부분에 의해 변경될 수 있다. 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질 변경의 위치는 단백질의 무질서한 루프, 영역 또는 도메인에 위치한, 또는 잠재적인 프로테아제 절단의 부위에서 또는 근처에서의 잔기를 포함한다. 예를들어, 중합체 변경은 EPO의 하나 이상의 9, 69 및/또는 125위치에서 도입될 수 있다. 게다가, 만일 하나 이상의 자연 글리코실화 부위가 중합체로 변경되지 않고 남아있으면, 그들 영역에서 하나 이상의 아미노산은 원한다면, 다른 잔기로 예를 들어 양 전하를 원한다면, 리신 , 또는 음 전하를 원할때 아스파르트산 또는 글루탐산 또는 아날린 등으로 변환될 수 있다. 본 발명의 SEP 분자의 전체 분자량은 약 25 내지 150 kDa, 보다 바람직하게는 약 30 내지 80 kDa에서 변할 수 있다. 분자량은 주어진 유사체의 변경을 위해 사용되는 수용성 중합체의 수와 구조를 증가시키거나 감소시킴으로써 제어될 수 있다.

예를 들어, 옥심-연결된 중합체 SEP 유사체는 바람직하게 아미노옥시, 케톤 또는 알데히드 작용화된 수용성 중합체를 사슬 아미노옥시, 케톤 또는 알데히드를 갖는 비천연적으로 인코딩된 아미노산 사이드에서 SEP 단백질에 부착시킴으로써 구성된다. 예를 들어, SEP-0 과 1의 위치 89 와 117은 가 글루타메이트(식 CHα-CH₂-S-COOH(글루타메이트 측쇄-CHα-CH₂-CH₂-COOH와 비교됨)의 측쇄를 갖는 비천연적으로 인코딩된 아미노산)를 함유한다. 티오에테르 연결을 이용하는 SEP 유사체는 바람직하게는 티올을 갖는 측쇄와 함께 시스테인 또는 비천연 아미노산에 의해 제공되는 티올 작용성을 함유하도록 구성된다. 도 10은 한가지 타입의 바람직한 합성 적혈구생성 자극 단백질의 기초적인 구조를 나타낸다.

대안적인 구체예에서, 본 발명의 SEP 분자는 천연 아미노산 및 EPO의 카르복시 말단이 재배치되었던 "순환하여 치환된" EPO 유사체를 포함할 수 있다. 가장바람직하게는, 그러한 재배치는 아미노 및 카르복시 말단을 불규칙적인 루프 등과 같은, 낮은 구조상 제약으로 이동할 것이다. (고유한 EPO 잔기 넘버링 시스템에 비례하는) 위치 125 및 126 주변의 불규칙적인 루프는 그러한 재배치 부위의 예이다. 가장 바람직하게는, 그러한 EPO는 디술피드가 없을 것이고, 미리선택된 잔기에서 중합체 부분을 함유하도록 화학적으로 변경될 것이다.

대안으로서는, SEP 분자는 자연적으로 발생하는 글리코실화 부위로, 또는 위치 126 및 125와 같이, 글리코실화에 잘 따르는 다른 부위로 재배치된 아미노산 및 카르복시 말단들을 가질 수 있다. SEP 분자는 또한 (카르복시 아미드화 등에 의해) 전하를 제거하거나 변경하는 아미노 및 카르복시 말단의 변경을 포미할 수 있다. 그러한 순환하여 치환된 분자의 바람직한 예에서, 새로운 N- 및 C-말단은 각각 위치 126 및 125에 의해 제공된다. 위치 7,29,33 및 161에서 천연 디술피드 형성 시트세인은 바람직하게는 비천연적으로 인코딩된 아미노산, L-α-N-부티르산 (Aba)에 의해 대체되고, 이는 디술피드 다리를 형성할 수 없다. 잔기 R166, E37 및 V82은 제조를 향상시키는 아날린으로 바람직하게는 대체된다. 또한, 추가적인 시스테인은 고유의 EPO 숫자 계획에 비례하여 위치 1과 166 사이에 바람직하게는 삽입되고, 이는 '0' 이하로 숫자가 매겨진다. 발생되는 분자는 4개의 시스테인을 함유하고(위치 126, 0, 38, 및 83에서(N- 내지 C-말단 방향에 판독된 바와 같이)), 그것은 (1)라이게이선 부위 및 (2)티오에테르 형성 pPEG 부착 부위로 이용된다. 선택적으로, 시스테인은 추가적인 pPEG 부착 부위를 제공하도록 A125를 대체될 수 있다.

본 발명의 그러한 SEP 분자의 총 분자량은 약 25 내지 약 150 kDa, 보다 바람직하게는 약 30 내지 약 80 kDa 에서 변할 수 있다. 분자량은 주어진 유사체의 변경을 위해 사용된 (pPEG와 같은)중합체의 수와 구조를 증가시키거나 감소시킴으로써 제어될 수 있다. 더 많은 구조를 위한 pPEG 매개된 유체역학의 MW는 100kDa보다 더 크다. 선택적인 pPEG 부착 부위는 125, 9, 및 24의 위치에서 위치한다. (N- 내지 C-말단 방향으로 판독된 바와 같다) 추가적인 SEP 유사체 설계는 불규칙적인 루프 영역에서 대체의 N- 및 C-말단을 가지고, 새로운 N- 및/또는 C-말단으로부터 잔기를 절단한다. 바람직한 순환 치환된 수용성 중합체의 기본 구조가 도 11에 나와있다. 도 12는 바람직한 수용성 중합체의 구조 및 다양한 선형 및 분지상 구조를 나타낸다.

예를 들어, 여기서 실시예에 기술된 특정 SEP 구조에 더하여, 서열은 하기의 방식으로사람 EPO의 고유의 서열을 순환하여 치환함으로써 설계된다 : 천연 N-말단 Ala¹및 C-말단 Arg¹³⁶은 추가적인 Cys 잔기에 의해 결합되고, 따라서 167 아미노산의 폴리펩티드을 얻는다; 새로운 N-및 C-말단은 고유 서열의 잔기 125-126에서 사슬을 분리시킴으로써 발생되었다 ; 모든 고유 Cys 잔기는 L-^α아미노-n부티르산 로 치환되었고; 하기의 치환이 이루어졌다: Glu37Ala ; Asn38Cys; Val82AIa ; Asn83Cys; Ser126Cys ; Arg166Ala (모든 잔기 숫자는 사람 EPO의 고유 서열에 기반한다). 함께, 이들 설계 원소들은 나타낸 바와 같은 SEP-5 아미노산 서열을 초래한다. SEP-5-L28 단백질은 Michael 첨가 반응에 의해, 말레이미드-변경된 선형 (TTD-Succ)₆카르복실레이트 중합체 구조와 함께 Cys 잔기 126,0,24,38, 및 83에서(사람 EPO 서열에 기반하는 넘버링) 중합체-변경되었다. 이들 변화는 SEP-5-L28 단백질의 합성 및 취급을 개선하도록 설계되었다. 설계된 서열은 각각 N-말단 Cys 잔기를 갖는, 4개의 펩티드 단편으로부터 이루어졌다. 화학적 라이게이션 부위는 Cys⁰, Cys³⁸, Cys⁸³였다. 펩티드는 합성되었고 여기서 C-말단 펩티드가 α-카르복실레이트 ; 다른 세개의 펩티드는 α-티오에스테르, 및 N-말단 Cys 잔기는 따라서 측쇄 Acm 보호되었다. Cys²⁴는 측쇄 보호되었다. 단편은 C-말단 2 단편들로 시작하여, 천연 화학 라이게이션에 의해, 연속적으로 결합되었다. 라이게이션 후에, 라이게이션 부위에서 자유 Cys 측쇄는 Michael 첨가 반응에 의해, 말레이미드 변형된 선형 (TTD-Succ)₆카르복실레이트 폴리머 구조물과 반응하였고, 그후 Cys 측쇄 Acm 보호기는 제거되었고, 다음 단편의 라이게이션 및 중합체 변경은 비슷한 양상으로 수행되었다. Acm 기의 제거 후에, 다음 (4번째) 단편의 라이게이션이 수행되었고, 최종 Acm 기를 제거하였고 중합체 변경을 비슷한 양상으로 수행하여, 도 30에 나타낸 바와 같이 순환하여-치환된, 중합체 변형 SEP 구조를 얻었다.

II. 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질의 제조

중합체-변형 적혈구생성 자극 단백질이 이전에 설명되었지만, 본 발명은 그러한 종래 노력과는 두드러지게 다르다. 예를 들어, 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질은 전부 또는 부분적으로 화학적으로 합성되었다. 게다가, 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질은 하나 이상의 특정, 사용자 선택된 및 사용자 정의된 부위에서 수용성 중합체로 변경되었다.

게다가, 본 발명에서 적혈구생성 자극 단백질의 합성 제조는 그러한 변경이 제조에 있어서 사용자-선택되고 사용자 정의된 각각의 부위에 존재하도록 확실하게 해준다. 그러한 합성의 균일성 및 제어는 본 발명을 이전 업계의 방법의 사용이 허용된 무작위 변경으로부터 현저하게 구별한다. 상당하게, 본 발명은 어떠한 중대하지 않은 잔기가 중합체 애덕트를 함유하도록 유도될 수 있는 합성 적혈구생성 자극 단백질을 설계하도록 허용한다. 게다가, 각각의 그러한 사용자-선택된 그리고 사용자 정의된 부위를 위해, 사용자는 그러한 애덕트가 폴리펩티드 또는 단백질 백본에 결합될 정확한 연결(아미드, 티오에스테르, 티오에테르, 옥심 등)을 정의할 수 있다. 추가적으로, 특정 부위에 존재하길 원하는 특정 중합체 애덕트는 변화되고 제어될 수 있고, 그래서 존재하는 모든 단백질 또는 폴리펩티드가 정확하게 동일한 유도된 부위에서 정확하게 동일한 유도된 애덕트를 함유하는 최종 제조가 얻어지도록 한다. 따라서, 본 발명은 중합체-변형 적혈구생성 자극 폴리펩티드 및 단백질의 균일한 제조의 형성을 허용한다.

수용성 중합체가 결합될 수 있는 부착의 위치와 수를 변화하기 위한 수단을 제공하는 것에 더하여, 본 발명은 결합 중합체의 성질을 변화하도록 허용한다. 어떠한 특정 사용자-선택된 및 사용자-정의된 부위안으로 포함될 수 있는 중합체 애덕트는 어떠한 정의된 길이가 될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 방법과 일치하여, 다른 부위에서 다른 길이의 중합체를 채택하는 것이 가능하다. 따라서, 한가지 구체예에서, 본 발명의 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질은 수용성 중합체 애덕트와 함께, 모노-변경되고 또는 폴리 변경될 수 있다. 하나 이상의 중합체 애덕트가 특정 폴리펩티드 또는 단백질 안으로 도입될때, 채택된 중합체는 "모노-전문화된" "폴리-전문화된" "균일하게 전문화된" 또는 다양하게 전문화될 수 있다. 여기서 사용된 바와 같이, 용어 "모노-전문화된"은 중합체의 단일 종에 의해 변경된 폴리펩티드 또는 단백질을 언급하도록 의도된다. 대조적으로, 폴리 전문화된 폴리펩티드 또는 단백질은 만일 폴리펩티드 또는 단백질의 변경된 부위가 다른 종의 중합체로 변경된다면, "다양하게 전문화된"으로 언급된다.

게다가, 사용자 정의된 부위에서 사용자 선택된 각각에서 중합체 애덕트의 선형성 또는 분지성의 범위를 변화시키는 것이 가능하다. 따라서 중합체 애덕트는 선형, 분지상 또는 균일하게 분지상이 될 수 있다. 용어 "균일하게 분지된"은 특정 부위에서 모든 분지의 중합체가 동일한 구조와 길이를 가지는 것을 의미한다. 우리가 이해하는 바와 같이, 본 발명은 독립적으로 어떠한 개별적인 분지의 길이 와 그러한 분지 포인트에서 존재하는 중합체의 구조 모두를 변화하도록 허용한다.

요컨대, 본 발명은 폴리펩티드 또는 단백질 백본에서 중합체-변형, 사용자-선택되고 사용자-정의된 부위의 (1) 위치 및 (2) 빈도를 정의하는 것은 물론이고, 각각의 그러한 부위에서 존재하는 분지의 (3)길이, (4)종 및 (5)정도를 제어하는 것을 허용한다. 추가적으로, 다중 중합체 변경을 갖는 폴리펩티드 및 단백질에 관해서, 본 발명은 각각의 부위에 대한 상기 확인된 5개 변수를 독립적으로 정의하는 것을 허용한다. 게다가, 분지상 중합체 변경을 갖는 합성 적혈구생성 자극 폴리펩티드 및 단백질에 대해, 본 발명은 각각의 분지 포인트에 대한 상기 확인된 5개 변수의 각각을 독립적으로 정의하도록 허용한다. 이는 원치않는 중합체 부착에 의해존재하고 방해되지 않고 남겨진 20개 유전적으로 인코딩된 아미노산 측쇄의 어떤 것 또는 전부의 다중 복사물을 갖는 정확성 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질의 균일한 조성물의 합성을 허용한다.

따라서 본 발명은 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질의 설계, 합성 및 사용에 있어서 상당한 유용성을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질의 아미노산 서열은 그것이 기초로하는 유전적으로 인코딩된 단백질의 아미노산 서열에 비례하여 하나 이상의 결손, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 비천연 측쇄 등을 갖는 위 아미노 산 또는 다른 아미노산과 같은, 예를 들어, 거기에 수용성 중합체 애덕트를 부착하기 위한 유일한 화학선택적 작용기를 갖도록 변형되는 것과 같이, 하나 이상의 불규칙적인 아미노산으로 치환될 수 있다. 따라서, 수용성 중합체는 불규칙 아미노산, 또는 유전적으로 인코딩된 아미노산을 통해 부착될 수 있다. 수용성 폴러미는 선형 또는 분지상이 될 수 잇고, 그것은 카르복실산, 지방족, 아미드 또는 아민과 같은 화학적 부분을 포함하는 말단 기를 가질 수 있다. 게다가, 수용성 중합체는 단일분산이 될 수 있다. 즉, 그것은 정확하게 정의된 구조 및 조성의 단일 분자 종을 포함하도록 만들어 질 수 있다. 따라서, 수용성 중합체는 그것으로 변형된 타겟 단백질의 반감기, 면역성, 효능, 저장 안정성, 투여량, 운반성 등을 미세하게 조정하는 특징들을 함유하도록 설계될 수 있다.

특히, 중합체 변형된 합성 적혈구생성 자극 단백질의 제조는 하기의 단계들:즉, 설계, 펩티드 합성, 펩티드 라이게이션, 단백질을 발생하는 전체 길이 라이게이션 생성물의 접힘, 및 단백질의 바이오활성의 평가를 갖는 것으로 생각될 수 있다. 본 발명자들은 중합체 변형이 하나 이상의 펩티드 합성, 라이게이션 또는 접힌 생성물 단계에서 수행될 수 있다는 것을 발견하였다. 그러나, 중합체를 펩티드 또는 접힘에 앞서 라이게이션 생성물에 부착시키는것이 바람직하다. 이러한 식으로 원하는 바이오활성을 나타내는 제조된 단백질이 선택되고 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질을 나타낸다.

바람직한 방법에서, 합성 적혈구생성 자극 단백질을 포함하는 폴리펩티드 사슬은 합성 적혈구생성 자극 단백질의 비-중복 단백질을 포함하는 화학적으로 라이게이트하는 펩티드 단편으로 만들어진다. 특히, 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질 분자는 관심의 합성 적혈구생성 자극 단백질의 폴리펩티드 사슬의 비중복 아미노산 서열을 포함하는 화학적으로 라이게이팅 펩티드 단편에 의해 만들어지고, 여기서 라이게이션을 위해 사용된 하나 이상의 펩티드 단편은 사용자 정의되고 미리선택된 부위에서 거기에 부착된 수용성 중합체를 가진다. 중합체 변형된 폴리펩티드 사슬은 그후 접혀서 본 발명의 중합체 변형된 합성 적혈구생성 자극 단백질을 제조할 수 있다.

발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질을 제조하기 위한 또다른 바람직한 방법은 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 중합체 변형 단백질의 폴리펩티드 사슬의 비중복 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편들을 화학적으로 라이게이팅하고, 하나 이상의 수용성 중합체를 그들의 하나 이상의 화학적 라이게이션 부위의 아미노산의 측쇄에 부착시키는 것을 포함한다. 중합체 변형 폴리펩티드 사슬은 그후 본 발명의 중합체 변형 합성 적혈구생성 자극 단백질을 제조하기 위해 접힐 수 있다.

덜 바람직하긴 하지만, 합성 적혈구생성 자극 단백질은 (1)합성 적혈구생성 자극 단백질의 폴리펩티드 서열의 비-중복 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편을 화학적으로 라이게이팅하여 합성 적혈구생성 자극 단백질에 대응하는 전체 길이 폴리펩티드 사슬을 형성하고, (2) 폴리펩티드 사슬을 접힘하고, (3)유일하게 그리고 상호간에 첫번째 화학선택적 기와 반응성인 두번째 화학선택적 기를 포함하는 수용성 중합체를 거기에 부착시킴으로써 만들어질 수 있다.

특히 구체적으로, 본 발명에 포함되고, 실시예에 예시된 이들 다양한 프로세스는, 일반적으로 합성 적혈구생성 자극 단백질에 대해 도면에 나타낸 바와 같이 설명될 수 있다. 예를 들어, 도 1A 내지 1E는 라이게이션 전 또는 후에 부분적으로 또는 완전히 보호되지 않은 펩티드 세그먼트들에 수용성 중합체(본원에 정의된 U-B-Polymer-J*)의 부착을 포함하는 라이게이션 계획, 또는 그것들의 조합을 묘사한다. 도 1A 내지 1D에서, Yaa는 Yaa와 화학선택성 화학 라이게이션할 수 있는 유일한 상호 반응성 N-말단 아미노산 Xaa(예를 들어, 아미노 말단 시스테인) 부분을 지니는 제 2 펩티드 세그먼트와의 화학 라이게이션을 위한 유일한 화학선택성 부분(예를 들어, 알파-카르복실 티오에스테르를 지닌 아미노산)을 지니는 제 1 펩티드 세그먼트 상의 C-말단 아미노산을 표시한다. Yaa와 Xaa 사이의 화학선택성 반응은 그 사이에 공유 결합을 생성한다(예를 들어, 아미노 결합). 따라서, Yaa 및 Xaa는 화학선택성 라이게이션 쌍을 형성한다. 도면에 나타낸 U_n-은 아미노산 측쇄 상의 정확한 사용자-규정된 부위에 결합된 제 2의 유일한 화학선택성 부분을 표시하며, 수용성 중합체 U-B-Polymer-J*의 U- 기에 대해 화학선택성이고 상호 반응성이다. 예를 들어, U_n이 케톤기를 지니도록 변형된 측쇄일 때, 수용성 중합체 U-Polymer-J*의 U-는 케톤과의 반응을 위한 화학선택성 기, 예를 들어 그 사이에서 옥심 결합을 생성하는 아미노옥시기이다. U_n-의 하첨자 "u"는 화학선택성 기 U를 지니도록 디자인된 아미노산 및 그것의 측쇄의 수를 표시하며, 예를 들어 2개의 특이적인 사용자-규정된 부위가 중합체 변형되는 경우 n=2이며, 이것은 또한 U₂또는 U_n=2로 표시될 수 있다. 모든 경우에서 n은 디자인에 의해 정확하게 제어되는 양의 정수이다. 따라서, U_n및 U는 Xaa 및 Yaa의 화학선택성 기와 양립할 수 있으며 비반응성인 제 2의 화학선택성 라이게이션 쌍을 표시한다. 도 1A 및 1B는 2가지의 상이한 가능한 반응을 예시한다. 처음에 묘사된 반응에서는, U_n작용기를 지닌 폴리펩티드 사슬이 제 2 폴리펩티드와 라이게이션된 후, U-B-Polymer-J* 부분과 반응되어 중합체-변형 폴리펩티드를 얻는다. 두번째 묘사된 반응에서는, U_n작용기를 지닌 폴리펩티드 사슬이 U-B-Polymer-J*와 반응되어 중합체-변형 폴리펩티드를 얻은 후, 제 2 폴리펩티드와 라이게이션되어 더 큰 중합체-변형 폴리펩티드를 얻는다. 이 도면들은, 도 1A에서는 Xaa 잔기를 지닌 폴리펩티드가 중합체 변형을 수용하는 반면, 도 1B에서는 Yaa 잔기를 지닌 폴리펩티드가 중합체 변형을 수용한다는 점에서 다르다. 도 1C는 다수 폴리펩티드 사슬을 그것들의 라이게이션 전 또는 후에 변형시켜서 더 큰 폴리펩티드를 형성하는 본 발명의 능력을 예시한다. 도 1D에서,PG및PG'는 보호기를 표시하며, 여기에서PG'는 직교하는 보호기를 나타내는데, 즉PG및PG'는 상이한 조건하에서 제거할 수 있으며, 상이한 수용성 중합체가 동일한 화학에 의해 U_n기들에 부착되는 경우, 또는 U_n기가 중합체로 변형시키고 싶지 않은 측쇄 작용기(예를 들어, 반응성 -NH₂또는 -SH를 지닌 측쇄, 이 경우 수용성 중합체의 U 기는 1차 아미노 또는 측쇄 티올에 배타적으로 반응하도록 디자인된다)를 표시하는 경우에 유용하다. 도 1D는 보호기가 본 발명의 방법에 따라서 라이게이션되는 폴리펩티드의 원하는 측쇄를 보호하기 위해서 사용될 수 있다는 것을 보여준다.

도 1E는 도 1A 내지 1D에 따르는 라이게이션 및 중합체 변형에 사용된 펩티드 세그먼트에 존재할 수도 또는 부재할 수도 있는 기들의 다양성을 예시한다.

도 2A 내지 2C는 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질을 제조하기 위한 프로세스의 추가 계획을 묘사한다. 구체적으로, 도 2A 내지 2B는 라이게이션 부위에 있는 아미노 말단기 Xaa의 측쇄(예를 들어, 시스테인의 측쇄 티올)에 수용성 중합체 U-B-Polymer-J*의 부착을 포함하는 라이게이션 계획을 묘사한다. 도 2C는 도 2A 내지 2B에 따르는 라이게이션 및 중합체 변형에 사용된 펩티드 세그먼트에 존재할 수도 또는 부재할 수도 있는 기들의 다양성을 예시한다.

도 3A 내지 3B는 3개 이상의 비-중복 펩티드 세그먼트의 화학 라이게이션을 포함하는 멀티-세그먼트 라이게이션을 달성하기 위한 프로세스의 추가 계획을 묘사하는데, 즉 적어도 1개 세그먼트는 최종 전길이 라이게이션 생성물에 상응하는 중간 세그먼트이다. 이 방식으로 제조된 펩티드는, 예를 들어 도 1A 내지 1E, 도 2A 내지 2C, 및 도 4A 내지 4C에 나타낸 다른 라이게이션 반응에 포함된 펩티드 세그먼트들을 제조하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 멀티-세그먼트 라이게이션에 대해서, 중간 세그먼트(들)은 사용된 라이게이션 화학에 따라서 그 펩티드의 고리화 또는 연쇄체 형성을 피하기 위해 보호된 Xaa 기 또는 보호된 Yaa 기를 가진다. 연속 또는 일련의 라이게이션에 대해서, 중간 세그먼트의 Xaa 기는 보호되는(예를 들어, Cys(Acm)) 반면, Yaa 기는 보호되지 않는다(예를 들어, Yaa-COSR, 여기에서 -COSR은 알파-카르복실 티오에스테르이다). 여기서, Yaa 기는 보호되지 않은 Xaa 기를 지닌 제 2 펩티드와 반응하는 것이 자유로우며, 이 경우 제 2 펩티드는 자유로운 Yaa 기가 없는 상태이다. 라이게이션 후, 보호기가 제거되어 다음 라이게이션 반응을 위해 Xaa 기를 재생성한다. 이 프로세스는 필요에 따라 계속될 수 있으며, 이로써 연장된 폴리펩티드 사슬을 생성한다. Yaa 기의 보호는 4개 이상의 세그먼트로 이루어진 최종 라이게이션 생성물의 생성을 포함하는 수렴 화학 라이게이션에 특히 유용하다. 예를 들어, 4-세그먼트 라이게이션(즉, 3회 라이게이션 반응)으로부터 생성된 단백질 표적에 대해서, 단백질의 한 단부에 상응하는 2개 세그먼트 및 단백질의 나머지 단부에 상응하는 2개 세그먼트는 연속 라이게이션에 대립하는 것으로서 병행하여 라이게이션될 수 있고, 이 두 단부는 최종 라이게이션 생성물에서 연결된다. 또한, 그러한 수렴 화학 라이게이션 계획은 직교 라이게이션 화학을 사용할 수 있다. 여기서 다시, 그러한 펩티드 세그먼트에 존재할 수도 또는 부재할 수도 있는 기들의 다양성이 도 1E, 2C 및 4C에 예시된다.

도 4A 내지 4C는 결과의 측쇄 티올의 천연 화학 라이게이션 및 화학적 변형이 어떻게 본 발명의 원리에 따라서 달성될 수 있는지를 예시한다. 구체적으로, 도 4A 내지 4B는 티오알킬화에 의해 "위아미노산"(ψXaa로 표시)을 형성하기 위한 라이게이션 부위(들)에 있는 결과의 시스테인 측쇄 티올의 천연 화학 라이게이션 및 화학적 변형, 및 티오에테르 결합을 포함하는 화학적으로 변형된 측쇄(ψ로 표시)의 생성을 묘사한다. 나타내지 않은 다른 구체예에서 측쇄 티올은 탈황 반응에서 알라닌으로 전환될 수 있다(Liang 등, J. Amer. Chem. Soc. (2001) 123(4):526-533). 두 반응의 중요한 측면은, 전환 또는 변형하고 싶지 않은 어떤 다른 측쇄 티올이 적합한 보호기(PG)로 보호된다는 점, 또는 멀티-세그먼트 라이게이션을 위해서는 직교하는 보호기(PG')로 보호되며, 이 경우에는 카르복시 말단 Yaa 기를 지닌 세그먼트가 도 4B에 예시된 방식에 의해 제공된 보호된 아미노 말단 Xaa 기, 즉PG-Xaa-펩티드를 포함한다는 점이다. 도 4C는 도 4A 내지 4B 뿐만 아니라, 도 1A 내지 도 1E, 도 2A 내지 2C, 및 도 3A 내지 3B에 따르는 라이게이션 및 중합체 변형에 사용된 펩티드 세그먼트에 존재할 수도 또는 부재할 수도 있는 기들의 다양성을 예시한다.

디자인과 함께, 폴리펩티드 백본을 합성하는데 이용된 펩티드 또는 폴리펩티드 세그먼트들이 구성된다. 이것은 다양한 폴리펩티드 백본 세그먼트들을 회합시키기 위해 선택된 라이게이션 화학, 주어진 표적 단백질에 대해 선택된 중합체 부착 화학, 및 특정한 중합체 부착 부위를 기초로 하여 선택되는 적합한 라이게이션부위의 선택을 포함한다. 천연 화학 라이게이션이 사용될 때, 시스테인 라이게이션 부위는 적합한 천연 발생 시스테인 잔기에 대해 표적 폴리펩티드 백본 아미노산 서열을 스캐닝함으로써 결정된다. 본원에 설명된 "확장된 천연 화학 라이게이션"이 사용될 때, 라이게이션 부위는Xaa-Gly 부위와 같은 확실한 라이게이션을 허락하는 적합한 천연 발생 라이게이션 부위 접합부에 대해 표적 폴리펩티드 백본 아미노산 서열을 스캐닝함으로써 선택될 수 있다. 확장된 천연 화학 라이게이션이 시스테인 잔기에서의 라이게이션으로 제한되지 않기 때문에, 많은 잔기가 라이게이션 부위 접합부로서 사용될 수 있다. 어떤 경우에, 천연 및 확장된 천연 화학 라이게이션의 조합이 디자인의 일부일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 전길이 폴리펩티드 사슬의 일부 또는 전부를 생성하기 위해서 천연 화학 라이게이션이 사용된다. 합성 적혈구생성 자극 단백질이 기초하는 천연 발생 단백질에 존재하는 시스테인이 화학 라이게이션 부위로 사용될 수 있다. 그러나, 바람직한 라이게이션 접합부가 적합한 시스테인을 갖지 않은 경우, 그 위치에 있는 비-시스테인 아미노산이 시스테인으로 대체되어, 그 위치에서의 천연 화학 라이게이션이 허락될 수 있다. 원한다면, 본원에 설명된 대로, 새로 도입된 시스테인이 그 위치에 있는 원래 아미노산에 상응하는 위아미노산 잔기로 전환된 수 있다. 또는 달리, 시스테인이 중합체 변형을 위한 부위에 도입될 때는, 측쇄 티올이 티올-반응성 수용성 중합체 구성물의 부착을 위해 활용될 수 있으며, 단 표적 폴리펩티드에 있는 변형하고 싶지 않은 모든 다른 시스테인은 보호된다.

다른 바람직한 구체예에서, 본원에 설명된 확장된 천연 화학 라이게이션이전길이 폴리펩티드의 일부 또는 전부를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 이 방법을 위해서, N-말단 Nα-치환 2 또는 3개 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 아미노산이 사용될 수 있다. 그러한 잔기(라이게이션을 위해 사용된 펩티드 또는 폴리펩티드의 N-말단에 존재하는 경우)는, 본원에 설명된 확장된 천연 화학 라이게이션 방법에 따라서, 그 폴리펩티드와 C-말단 α-카르복시 티오에스테르 부분을 갖는 폴리펩티드를 라이게이션하는데 유리하게 사용될 수 있다.

전형적으로, 펩티드 합성은, 표준 자동화 펩티드 합성기를 사용하는 단계적 표준 Boc 및/또는 Fmoc 고체상 펩티드 합성을 사용하거나, 또는 표준 프로토콜에 따라 수동으로 합성되거나, 또는 상업적 판매자로부터 주문 및 구입된다("합성 펩티드, 사용자 가이드", G. A. Grant, 편저, W. H. Freeman & Company, 뉴욕, 1992; "펩티드 합성 원리, 2판", M. Bodanszky, 편저, Springer-Verlag, 1993; "펩티드 합성 연습, 2판", M. Bodanszky 및 A. Bodanszky, 편저, Springer-Verlag, 1994; 및 "보호기", P. J. Kocienski, 편저, Georg Thieme Verlag, 독일 스투트가르트, 1994; "Fmoc 고체상 펩티드 합성, 실용 접근법", 편저 W. C. Chan 및 P. D. White, 옥스포드 대학 출판부, 2000). 천연 화학 라이게이션에서와 같이, 티오에스테르-매개 라이게이션에 이용된 펩티드에 대해서, 그것들은 또한 표준 프로토콜에 따라서 만들어질 수 있다(예를 들어, Dawson 등, Sciecne (1994) 266:776-779; Canne 등, Tetrahedron Lett. (1995) 36:1217-1220; Kent 등, WO 96/34878; Kent 등, WO 98/28434; Ingenito 등, JACS (1999) 121(49):11369-11374; 및 Hackeng 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96:10068-10073); Amiato 등, 상동 참조).

수용성 중합체의 라이게이션 및 부위-특이적 부착에 대해서, 원치 않는 부착을 가져오는 부반응을 피하기 위해서 화학적 직교 접근법이 펩티드 합성에 사용된다(예를 들어, 도 1 내지 4, 및 실시예 참조). 예를 들어, 라이게이션 디자인 및 중합체 부착 접근법에 따라서, 여러 가지의 직교 합성 전략이 활용될 수 있다. 구체적으로, 예를 들어 본 발명의 바람직한 당-의태성 중합체에 대해 하기 논의된 바와 같이, 부착될 수용성 중합체의 성질, 특히 그것을 폴리펩티드에 연결하기 위한 작용기가 고려된다.

구체적으로, 수용성 중합체는 라이게이션에 사용된 표적 펩티드, 전길이 물질 또는 심지어 접힌 폴리펩티드 상의 유일한 작용기와 선택적으로 반응하는 유일한 작용기 U를 포함하도록 만들어진다. 화학적 합성이 사용될 때, 펩티드는 정확한 사용자-규정된 부위에 상호 반응성인 화학선택성 기를 함유하도록 만들어진다. 본 발명의 이런 측면은 펩티드 합성(보호기 전략) 및 화학 라이게이션(부분적 보호기 또는 비보호기 전략)의 원리를 포함한다. 보호기 전략에 대해서, 수용성 중합체 상의 원하는 작용기를 제외한 모든 잠재적 반응성 작용기 및 표적 분자 상에 존재하는 그것의 상호 반응성 작용기가 적합한 보호기로 차단된다. 많은 보호기가 공지되어 있으며, 이 목적에 적합하다(예를 들어, "유기 합성에서의 보호기", 3판, T. W. Greene 및 P. G. M. Wuts, 편저, John Wiley & Sons, Inc., 1999; 노바바이오켐 카탈로그 2000; "합성 펩티드, 사용자 가이드", G. A. Grant, 편저, W. H. Freeman & Company, 뉴욕, 1992; "어드밴스드 캠테크 조합 & 고체상 유기 화학 핸드북", W. D. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R.Rhodes, 및 H. H. Saneii, 편저, 어드밴스드 캠테크, 1998; "펩티드 합성 원리, 2판", M. Bodanszky, 편저, Springer-Verlag, 1993; "펩티드 합성 연습, 2판", M. Bodanszky 및 A. Bodanszky, 편저, Springer-Verlag, 1994; 및 "보호기", P. J. Kocienski, 편저, Georg Thieme Verlag, 독일 스투트가르트, 1994 참조).

따라서, 수용성 중합체는 상술된 것들과 같은 광범위한 작용기를 가지도록 만들어진다고 말할 수 있다. 부분적 보호기 또는 비보호기 전략에 대해서, 중합체 상의 작용기 및 표적 펩티드 또는 폴리펩티드 상에 존재하는 그것의 상호 반응성 작용기가 화학선택성 반응쌍으로 사용되며, 여기에서 이 반응 시스템에는 비반응성인 다른 작용기도 존재할 수 있다. 이것은 아민 포착 전략(예를 들어, 헤미아미날 형성, 이민 형성, 및 미카엘 부가에 의한 라이게이션), 티올 포착 전략(예를 들어, 메르캅타이드 형성, 2황화물 교환에 의한 라이게이션), 천연 화학 라이게이션 전략(예를 들어, 시스테인 또는 티올 함유 측쇄 아미노산 유도체를 포함하는 티오에스테르 교환에 의한 라이게이션), 및 직교 라이게이션 커플링 전략(예를 들어, 타이졸리딘 형성, 티오에스테르 교환, 티오에스테르 형성, 2황화물 교환, 및 아미드 형성에 의한 라이게이션)에 따르는 기들을 포함한다(예를 들어, Coltart D. M., Tetrahedron (2000) 56:3449-3491).

이 구체예에 바람직한 화학선택성 U 기는, 천연 화학 라이게이션(Dawson 등, Science (1994) 266:776-779; Kent 등, WO 96/34878), 확장된 일반적 화학 라이게이션(Kent 등, WO 98/28434), 옥심 형성 화학 라이게이션(Rose 등, J. Amer. Chem. Soc. (1994) 116:30-33), 티오에스테르 형성 라이게이션(Schnolzer 등, Science(1992) 256:221-225), 티오에테르 형성 라이게이션(Englebretsen 등, Tet. Letts. (1995) 36(48):8871-8874), 히드라존 형성 라이게이션(Gaertner 등 Bioconj. Chem. (1994) 5(4):333-338), 및 타이졸리딘 형성 라이게이션 및 옥사졸리딘 형성 라이게이션(Zhang, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. (1998) 95(16):9184-9189; Tam 등, WO 95/00846)과 같은, 또는 다른 방법(Yan, L. Z. 및 Dawson, P. E., "탈황 반응과 조합된 천연 화학 라이게이션에 의한 시스테인 잔기를 사용하지 않는 펩티드 및 단백질의 합성", J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 526-533, 본원에 참고자료로 수록됨; Gieselnan 등, Org. Lett. 2001 3(9):1331-1334; Saxon, E. 등, 아미드 결합의 화학선택성 합성을 위한 "무추적자" 스타우딘저 라이게이션. Org. Lett. 2000, 2, 2141-2143)에 의한, 수양립성 라이게이션 화학에 사용되는 유일한 작용기의 잔기를 포함할 것이다.

상술된 다양한 부착 화학이 주어진다면, 수용성 중합체와 표적 펩티드 또는 폴리펩티드 사이에 형성된 결합은 카르보네이트, 에스테르, 우레탄, 오르쏘에스테르, 아미드, 아민, 옥심, 이미드, 우레아, 티오우레아, 티오에테르, 티오우레탄, 티오에스테르, 에테르, 타이졸리딘, 히드라존, 옥사졸리딘 등으로부터 선택된 결합의 잔기를 포함할 수 있다. 가장 바람직한 결합은 옥심 및 아미드 결합이다.

예를 들어, 도 1 내지 4에 나타낸 바와 같은, 펩티드 라이게이션 단계는 고체 또는 용액상 라이게이션 전략을 사용할 수 있다. 도 8은 본 발명의 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질의 라이게이션 및 생산에 사용할 수 있는 펩티드 세그먼트에 수용성 중합체를 정확히 부착하는 다른 경로를 묘사한다. 제 1 단계는고체상 펩티드 합성("SPPS")(예를 들어, Fmoc 또는 Boc SPPS)을 사용하며, 여기에서 중합체 부착에 대해 표적화된 아미노산 측쇄가 직교하는 보호기로 보호된다(예를 들어, Fmoc SPPS를 사용한다면 Boc 기가 중합체 부착 부위를 보호하기 위해 사용될 수 있고, 또는 Boc SPPS를 사용한다면 Fmoc 기가 직교하는 보호기로서 사용될 수 있다). 펩티드 합성 후, 직교하는 보호기는 나머지 펩티드가 보호된 채로 있는 동안 선택적으로 제거된다. 이것은 다음 단계 - 고체상 중합체 합성을 위한 단일 부착 부위를 제공한다. 일단 직교 보호기가 제거되면, 중합체 사슬이 선구물질로서 부착된다. 더 바람직하게는, 중합체 사슬이 도 6A 내지 6D에 묘사된 프로세스를 사용한 중합체 합성의 연속 라운드를 통해 구성된다. 단일 중합체 부착 부위를 나타내지만, 1개 이상이 제공될 수도 있다. 도 9는 일반적인 반응도를 보여준다.

상기 주지된 바와 같이, 화학 라이게이션은 제 1 화학 성분과 제 2 화학 성분 사이의 선택적 공유 결합의 형성을 포함한다. 제 1 및 제 2 성분 상에 존재하는 유일한 상호 반응성인 작용기는 라이게이션 반응을 화학선택성으로 만들기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩티드와 폴리펩티드의 화학 라이게이션은 양립 가능한 유일한 상호 반응성 C-말단 및 N-말단 아미노산 잔기를 지니는 펩티드 또는 폴리펩티드 세그먼트들의 화학선택성 반응을 포함한다. 몇가지 상이한 화학이 이 목적에 이용되었는데, 이것의 예는 천연 화학 라이게이션(Dawson 등, Science (1994) 266:776-779; Kent 등, WO 96/34878; Kent 등, WO 98/28434), 옥심 형성 화학 라이게이션(Rose 등, J. Amer. Chem. Soc. (1994) 116:30-33), 티오에스테르 형성 라이게이션(Schnolzer 등, Science (1992) 256:221-225), 티오에테르 형성 라이게이션(Englebretsen 등, Tet. Letts. (1995) 36(48):8871-8874), 히드라존 형성 라이게이션(Gaertner 등 Bioconj. Chem. (1994) 5(4):333-338), 및 타이졸리딘 형성 라이게이션 및 옥사졸리딘 형성 라이게이션(Zhang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. (1998) 95(16):9184-9189; Tam 등, WO 95/00846; 미국 특허 번호 5,589,356); Gieselman 등, 셀레노시스테인-매개 천연 화학 라이게이션(Org Lett (2001) 3(9):1331-1334); 및 스타우딘저 아미드 형성 화학 라이게이션(Saxon 등, Org Lett (2000) 2:2141-2143)을 포함한다. 따라서, 인정되는 바와 같이, 그러한 목적을 위한 어떤 화학선택성 반응 화학이 보호되지 않은 펩티드 세그먼트들의 라이게이션에 적용될 수 있다.

주어진 라이게이션 화학의 반응 조건은 라이게이션에 사용된 펩티드 또는 폴리펩티드 세그먼트들의 원하는 상호작용을 유지하도록 선택된다. 예를 들어, pH와 온도, 라이게이션 표지의 수용해성, 제 1 세그먼트 대 제 2 세그먼트의 비, 물함량, 및 반응 혼합물의 조성이 라이게이션의 최적화를 위해 변화될 수 있다. 더 나아가서, 상이한 정도로 라이게이션 세그먼트들을 용해시키는 시약의 첨가 또는 배제가, 원하는 라이게이션 반응의 특이성 및 속도를 제어하기 위해, 즉 펩티드 또는 폴리펩티드 세그먼트들의 용해성을 조종함으로써 반응성 기의 노출 및 표출을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 반응 조건은 1개 이상의 내부 및/또는 외부 대조표준과 비교하여 원하는 화학선택성 반응 생성물을 분석함으로써 쉽게 결정된다.

라이게이션이 N-말단 시스테인 잔기를 갖는 폴리펩티드의 연결을 포함하는 경우, 바람직하게 천연 화학 라이게이션 과정이 사용된다(Kent 등, WO 96/34878;Kent 등, WO 98/28434; Dawson 등, Science (1994) 266:776-779). 이 방법은 라이게이션 부위에서 천연 아미드 결합을 생성하는 확실한 방법으로 판명되었다. 천연 화학 라이게이션은 C-말단 α-카르복시티오에스테르 부분을 갖는 제 1 펩티드 또는 폴리펩티드 세그먼트와 N-말단 시스테인 잔기를 갖는 제 2 펩티드 또는 폴리펩티드 사이의 화학선택성 반응을 포함한다. 티올 교환 반응이 초기 티오에스테르-연결 중간체를 제공하며, 이것은 자발적으로 재배열되어 라이게이션 부위에 천연 아미드 결합을 제공함과 동시에 시스테인 측쇄 티올을 다시 생성한다. 많은 예에서, 천연 단백질의 서열은, N-말단 시스테인 잔기를 갖는 폴리펩티드 단편이 합성되어 천연 화학 라이게이션 반응에 사용될 수 있도록 적합하게 위치된 시스테인 잔기를 포함할 것이다. 다른 예에서, 펩티드 합성은 이런 목적으로 폴리펩티드에 시스테인 잔기를 도입하기 위해 수행될 수 있다. 따라서, 그것의 표준형에서, 천연 화학 라이게이션은 표적 폴리펩티드 서열에 있는 시스테인 잔기에서의 티오에스테르-매개 화학선택성 반응을 포함하며, 펩티드 결합이 라이게이션 부위에 형성되고, Cys 측쇄가 천연 형태에서 다시 생성된다.

또는 달리, 본 발명의 단백질은 "위-천연 화학 라이게이션" 또는 "확장된 천연 화학 라이게이션"의 사용을 통해 합성될 수 있다. 위-천연 화학 라이게이션은 단백질 합성에 사용된 펩티드의 미리 선택된 위치에 있는 비천연 발생 위-아미노산 잔기의 사용을 포함한다(예를 들어, 도 4 참조). 그러한 위-아미노산의 구조는 시스테인의 구조 및 합성될 단백질의 그러한 미리 선택된 위치에서 천연적으로 발견되는 아미노산의 구조를 모두 의태한다. 따라서, 위-천연 화학 라이게이션은 천연화학 라이게이션으로부터의 라이게이션 부위에서 생성된 시스테인 측쇄의 티오알킬화에 관련된다. 바람직한 양태는 시스테인 라이게이션 부위의 티오알킬화이며, 여기에서 적어도 1개 펩티드는 적합한 보호기로 보호된 티올 측쇄를 갖는 천연 시스테인을 함유한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 시스테인기의 티올 부분은 원하는 측쇄, 예를 들어 리보솜적으로 특이화된 아미노산, 그러한 아미노산의 유사체, 또는 비-리보솜적으로 특이화된 아미노산의 측쇄로 변형된다. 본원에 사용된 리보솜적으로 특이화된 아미노산은 단백질 번역 과정에서 리보솜에 의해 인식되는 아미노산이며, 리보솜적으로 생산된 단백질에 결합될 수 있다. 많은 공개된 문헌이 시스테인 측쇄 티올 부분의 화학적 변형을 설명하고 있다(예를 들어, "단백질 과학에서의 현행 프로토콜", John E. Coligan 등 편저, John Wiley & Sons, 뉴욕 (2000)). Kaiser E. T.는 천연 발생 아미노산 특쇄의 화학적 특성을 의태시키기 위한 시스테인 잔기 측쇄의 전환을 설명했다(예를 들어, Kaiser E. T. 등, "효소 활성 부위의 화학적 돌연변이", Science. 1984. 2. 11;226(4674):505-11). 추가하여, 펩티드 또는 단백질에 표지를 도입하기 위한 시스테인 측쇄의 사용이 설명되었다. 시스테인 측쇄 변형이 단백질 콘쥬게이션 및 교차결합 화학, S. S. Wong(1991, CRC Press); 단백질의 화학적 변형, Gary E. Means 등(1971, Holden-Day), 단백질의 화학적 변형: 선택적 방법 및 분석 과정, Glazer, A. N. 등(1975, Elsevier); 단백질 변형을 위한 화학 시약, R. L. Lundblad(1991, CRC Press)에서 검토된다. Tam 등(Biopolym-ers (1998) 46:319-327)은 비-cys 천연 화학 라이게이션을 위한 호모시스테인(-CH₂-CH₂-SH)의 사용 후, 메틸 p-니트로벤젠술포네이트(메틸화 시약)를 사용한 티오알킬화에 의해, 이 호모시스테인 측쇄를 천연 메티오닌 측쇄(-CH₂-CH₂-S-CH₃)로 전환시키는 것을 개시했다. 또한, 본 발명은 호모시스테인을 위아미노산, 즉 메티오닌 이외의 다른 아미노산으로 전환시키는데 사용될 수 있다. 그러나, 본원에 설명된 시스테인의 전환에 관해서, 본 발명에 따르면, 전환시키고 싶지 않은 적어도 1개의 천연 시스테인을 함유하는 펩티드에 대해서, 2황화물쌍에 포함된 천연 시스테인의 파괴를 피하기 위해 보호기를 사용할 필요가 있다. 적합한 보호기가 아래 설명된다.

위-천연 화학 라이게이션의 방법은 어떤 리보솜적으로 특이화된 아미노산의 측쇄(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 및 프롤린의 측쇄)의 의태를 용이하게 하지는 않지만(그러나, 알라닌의 측쇄는 탈황 반응을 통해 형성될 수 있다, Liang Z. Y. 및 Dawson P. E. "탈황 반응과 조합된 천연 화학 라이게이션에 의한 시스테인 잔기를 사용하지 않는 펩티드 및 단백질의 합성", J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 526-533, 본원에 참고자료로 수록됨), 그것은 많은 리보솜적으로 특이화된 또는 비-코드된 아미노산을 의태하는 측쇄를 형성하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 위-천연 화학 라이게이션 방법에 따라서 생산된 아미노산은 티오에테르 결합을 함유할 것이며, 베타-분기를 갖지 않을 것이다(그것들이 모두 베타 위치에 메틸기를 포함할 것이라는 점에서, 즉 aa-CH₂-S-). 따라서, 베타-분기 아미노산의 위-아미노산 버전인 이소로이신 및 트레오닌이, 베타 기하구조 및 그것의 부수적인 콘스트레인트를 갖지 않으면서, 펜던트 측쇄 구조를 가지도록 만들어질 것이다.

중요하게도, 본 발명의 방법은 리보솜-지정 아미노산의 측쇄와 동일한, 또는 이러한 길이보다 더 길거나 짧은 아미노산 측쇄를 형성하는데 이용될 수 있다. 측쇄 길이에서의 이러한 변경은 3차원적 형태를 안정화 (또는 불안정화)하여 단백질 안정성을 증가시키도록 (또는 단백질의 형태를 변경하여 상이한 범위의 기질, 저해제, 수용체, 리간드 등을 받아들이는 단백질의 능력을 자연적으로 생겨나는 단백질에 비해 향상시키도록) 이용될 수 있다. 예를 들어, Cys-CH₂-SH + Br-CH₂-COOH는 Cys-CH₂-S-CH₂-COOH를 산출한다 (이러한 "위-글루탐산"은 하나의 추가적인 측쇄 원자, 다시 말해 -S-기를 갖는다; 대안으로, 만약 아스파라트산의 위치에 사용되면, 이것은 두개의 추가적인 측쇄 원자, 다시 말해 -CH₂-S-기를 가질 것이다). 다른 측쇄는 측쇄에 동일한 수의 원자를 갖되, 티오에테르 연결 (-S-)의 포함에 의해 상이하다. 예를 들어, Cys-CH₂-SH + Br-CH₂-CH₂-NH-PG후,PG의 제거는 Cys-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH₂를 산출한다. 결과적 구조는 측쇄에 추가적인 원자를 갖지 않지만, 한 -CH₂-기는 -S-로 대치된다. 메티오닌은 여기서 또 다른 예로서, Cys-CH₂-SH + I-CH₂-CH₃은 Cys-CH₂-S-CH₂-CH₃(천연 메트 구조인 Met-CH₂-CH₂-S-CH₃과 비교)을 산출한다; 그러므로 티오에테르가 재배치된다. 아르기닌 또한: Cys-CH₂-SH + Br-CH₂-NH-CH((-NH₂)(=NH₂ ⁺))는 Cys-CH₂-S-CH₂-NH-CH((-NH₂) (=NH₂ ⁺))를 산출한다. 바람직하게는, 반응 아미노기의 보호, 특히 위 리신을 구성하기 위한 보호가 원치 않는 부반응을 회피하는데 채택될 수 있다. 일단 티오알킬화 반응이 수행되면, 보호기는 제거될 수 있다.

일반적으로, 가능한 한 근접하게 자연적으로 생겨나는 단백질을 모방하는 것이 요구된다면, 단백질 내의 이러한 위치에 통상적으로 존재하는 리보솜-지정 아미노산의 측쇄 길이와 동일한 측쇄 길이를 갖는 위 아미노산 분자를 채택하는 것이 가장 바람직하고; 리보솜-지정 아미노산의 측쇄보다 한 원자 더 긴 측쇄 길이를 갖는 위 아미노산 분자를 채택하는 것은 덜 바람직하며, 리보솜-지정 아미노산의 측쇄보다 두 원자 더 긴 측쇄 길이를 갖는 위 아미노산 분자를 채택하는 것은 더욱 덜 바람직하다. 게다가, 한 위치에 있는 시스테인 라이게이션 지점을 선택하는 것이 바람직한데, 이 지점은 유전적 변화가 기능을 방해할 것으로 생각되지 않거나 관련된 단백질 내의 이 지점에서 아미노산이 보존되는 지점이다. 이러한 지점은 알라닌 스캐닝, 상동성 모델링 및 다른 방법에 의해 식별될 수 있다.

위-천연 화학적 라이게이션에서, 아미노 말단 시스테인 잔기를 함유한 펩티드는, 천연 화학적 라이게이션과 같이, 카르복시 말단 티오에스테르를 갖는 펩티드와 라이게이션 된다. 시스테인의 티올 측쇄는 그 다음 화학식 R_aa-X의 화합물과 반응하는데, 여기에서 X는 양호한 이탈기이고, R_aa는 그 구조가 리보솜-지정 또는 합성 아미노산의 측쇄의 말단 부분을 모방한 기이다.

중요하게도, 위-천연 화학적 라이게이션의 반응은 시스테인 측쇄의 자연적인 L-배열, 또는 D-배열로 작용한다. C-배열의 사용은 이 라이게이션 지점에서 프로테아제 내성을 부여하므로, 단백질 가수분해에 대한 증가된 안정성이 요구될 때 바람직할 수 있다. 그러나, D-시스테인의 사용에 있어서, 이 지점에서 백본 구조는 변경될 것이다. 이러한 변경은, 프로테아제 내성 외에, 생물활성을 변경하는데 바람직할 수 있다. 그러나, 생물활성 상에서 충격을 최소화하기 위해, (분자의 혼란된 말단 상에서, 결과적 접힌 분자의 표면에 위치할 혼란된 루프와 같은) 혼란된 영역과 같은, 높은 유연성의 지점에 D-시스테인을 위치시키는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 위-천연 화학적 라이게이션의 반응이 합성된 분자의 표면 상에 거대하고, 하전된 측쇄 (예를 들어, Lys, Arg, Asp 또는 Glu의 측쇄)를 위치시키도록 이용될 수 있다.

적당한 양호 이탈기인, X의 예는 할로겐, 특히 요오드 및 브롬을 포함한다. R_aa기의 예는 PO₄, COOH, COO, CONH₂, 구아니디늄, 아민, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 이미다졸, 알킬화된 이미다졸, 인돌, 또는 알킬화된 인돌기를 포함한다.

어떤 R_aa를 채택하는가에 대한 선택은 특정 위치에서 존재하기를 원하는 아미노산 측쇄에 의존할 수 있다. 그러므로, 예를 들어 다음의 아미노산 서열을 갖는 원하는 폴리펩티드 또는 단백질은:

aa_NH2-Q-aa_x-aa_y- W-aa_COOH

(상기 식에서 Q 및 W는 각각 추가적인 아미노산 잔기의 임의적 존재 또는 부재를 표시하고, aa_x및 aa_y는 (각각 측쇄 x 및 y를 가진) 내부 인접 잔기를 나타내며, aa_NH2및 aa_COOH는 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노 (N-) 말단 잔기 및 카르복시 (C-) 말단 잔기를 각각 표시) 다음의 두 펩티드 절편을 제조함으로써 합성될 수 있다.

aa_NH2-Q-aa_x-COSR 및 Cys-W-aa_COOH

상기 식에서 Cys는 시스테인으로 aa_y의 대치를 표시하고, R은 티오에스테르기와 융합성인 어떤 기인데, 아릴, 벤질, 및 알킬기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. R의 예는 3-카르복시-4-니트로페닐 티오에스테르, 벤질 에스테르, 및 머캅토프로프리온산 류신 에스테르를 포함한다 (Dawsonet al., Science (1994) 266: 776-779; Canneet al., Tetrahedron Lett. (1995) 36: 1217-1220; Kent,et al., WO 96/34878; Kent,et al., WO 98/28434; Ingenitoet al., JACS (1999) 121(49): 11369-11374; 및 Hackenget al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96: 10068-10073 참조). 다른 예는 디티오트레이톨 또는, 알킬 또는 아릴 티오에스테르를 포함하는데, 이는 또한 주지된 인테인-중재 생물학적 기술 (Chonget al., Gene (1997) 192:277-281; Chonget al., Nucl. Acids Res. (1998) 26:5109-5115; Evanset al., Protein Science (1998) 7: 2256-2264; 및 Cottonet al., Chemistry & Biology (1999) 6(9): 247-256 참조)로 생산될 수 있고; 그 후 절편을 함께 라이게이션하여 다음을 형성한다:

aa_NH2-Q-aa_x-Cys-W-aa_COOH.

라이게이션된 절편은 그 다음 R_y-X와 반응하는데, 여기에서 R_y는 y 측쇄의 구조를 모방하는 측기이다. 반응은 시스테인의 티올기가 "위-y" 측쇄로 전환되기 충분한 조건 하에서 수행된다. 예를 들어, R_aa가 CH₂-COOH 또는 (CH₂)₂-COOH로 되도록 선택된다면, 반응은 아스파르트산 또는 글루탐산의 기능 및 구조를 모방하는 아미노산 잔기 (각각 "위-Asp", "위-Glu")의 형성을 일으킬 것이다. 위의 설명의 관점에서 인정될 것이기 때문에, 더욱 복잡한 합성은 둘 이상의 펩티드 절편을 채택하도록 수행될 수 있다.

이러한 접근법의 중요한 특징은 변경되지 말아야 할 시스테인 잔기가 반응하는 단편 내에서 Cys(Acm)과 같이 측쇄 보호되어, 라이게이션 지점(군) 외의 Cys 잔기의 화학적 변경을 막거나, 또는 반응하는 단편 내의 어떤 다른 Cys 잔기가 라이게이션 후 화학적 변경 반응에 의해 동일한 '위 아미노산'의 동시 형성에 의도된다는 것이다. 동일한 원칙이 라이게이션 지점에서 호모시스테인의 사용에 적용된다는 것이 인정될 것이다. 또한 셀레노시스테인이 셀로노시스테인-중재 천연 화학적 라이게이션을 통하여 라이게이션 지점에서 채택될 수 있고, 유사한 알킬화 반응에 의해 전환되어 본 발명의 위 아미노산을 생성할 수 있으며, 여기에서 셀레노에테르기는 티오에테르기를 치환한다는 것이 인정될 것이다.

여기서 사용될 때, 상징 φ는 벤질기를 표시하고;IM은 이미다졸기를 표시하고,IN은 인돌기를 표시하고;PG는 보호기를 표시한다. 아래는 본 발명에 따른 위-아미노산 잔기를 포함한 펩티드를 합성하는데 사용될 수 있는 Raa 측기의 요약이다 (여기에서 X 는 활로겐이다 (대부분에 있어서 I 및 Br을 갖는 I, Br, Cl, F가 바람직하고, φ부착에 대하여 F가 바람직하다)):

염기성 아미노산

Lys (잉여 원자 없음)

-CH₂-SH + X-CH₂-CH₂-NH-PG후, 탈보호는 -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH₂를 부여

Arg (잉여 원자 없음)

-CH₂-SH +X-CH₂-NH-C((NH₂)(=NG₂+))는 -CH₂-S-CH₂-NH-C((NH₂)(=NH₂+)를 부여

His (2개의 잉여 원자)

-CH₂-SH + X-CH₂-IM-PG후, 탈보호는 -CH₂-S-CH₂-IM을 부여

산성 아미노산

Asp (2개의 잉여 원자)

-CH₂-SH + X-CH₂-COOH는 -CH₂-S-CH₂-COOH를 부여

Glu (1개의 잉여 원자)

-CH₂-SH + X-CH₂-COOH는 -CH₂-S-CH₂-COOH를 부여

비하전된 극성 아미노산

Tyr (잉여 원자 없음 또는 1개)

-CH₂-SH + F-φ-pOH는 -CH₂-S-φ-pOH를 부여(잉여 원자 없음, 동일한 기하 구조)

-CH₂-SH + Br/I-CH₂-φpOH는 -CH₂-S-CH₂-φpOH를 부여 (1개의 잉여 원자)

Gln (1개의 잉여 원자)

-CH₂-SH + X-CH₂-C(O)(NH₂)는 -CH₂-S-CH₂-C(O)(NH₂)를 부여

Asn (2개의 잉여 원자)

-CH₂-SH + X-CH₂-C(O)(NH₂)는 -CH₂-S-CH₂-C(O)(NH₂)를 부여

Ser (2 또는 3개의 잉여 원자)

-CH₂-SH + X-CH₂OH는 -CH₂-S-CH₂-OH를 부여 (2개의 잉여 원자)

-CH₂-SH + X-CH₂CH₂OH는 -CH₂-S-CH₂-CH₂OH를 부여 (3개의 잉여 원자)

Thr (2 또는 3개의 잉여 원자, 베타 분지 결손)

-CH₂-SH + X-CH((CH₃)(O-PG)) 후PG의 제거는 -CH₂-S-CH((CH₃)(OH))를 부여 (2개의 잉여 원자)

-CH₂-SH + X-CH₂-CH((CH₃)(O-PG)) 후PG의 제거는 -CH₂-S-CH₂-CH((CH₃)(OH))를 부여 (3개의 잉여 원자)

비-극성 아미노산

Leu (1 또는 2개의 잉여 원자)

-CH₂-SH + X-CH((CH₃)(CH₃))는 -CH₂-S-CH((CH₃)(CH₃))를 부여 (1개의 잉여 원자)

-CH₂-SH + X-CH₂-CH((CH₃)(CH₃))는 -CH₂-S-CH₂-CH((CH₃)(CH₃))를 부여 (2개의 잉여 원자)

Ile (2 또는 3개의 잉여 원자, 베타 분지 결손)

-CH₂-SH + X-CH(CH₃)-CH₂-CH₃은 -CH₂-S-CH(CH₃)-CH₂-CH₃을 부여 (2개의 잉여 원자)

-CH₂-SH + X-CH₂-CH(CH₃)-CH₂-CH₃은 -CH₂-S-CH₂-CH(CH₃)-CH₂-CH₃을 부여 (3개의 잉여 원자)

Phe (1 또는 2개의 잉여 원자)

-CH₂-SH + F-φ는 -CH₂-S-φ를 부여 (1개의 잉여 원자)

-CH₂-SH + Br/I-CH₂-φ는 -CH₂-S-CH₂-φ를 부여 (2개의 잉여 원자)

Met (잉여 원자 없음)

-CH₂-SH + I-CH₂-CH₃은 -CH₂-S-CH₂-CH₃을 부여

Trp (1개의 잉여 원자)

-CH₂-SH + F-IN은 -CH₂-S-IN을 부여

그러나, 위에 지적한 것과 같이, 적당한 시스테인 잔기를 함유하지 않은 자연 단백질의 서열, 및 폴리펩티드의 N-말단에 시스테인 잔기를 도입하도록 자연 단백질 서열을 변경하는데 알맞지 않거나 또는 바람직하지 않은 서열에서, 천연 화학적 라이게이션의 방법은 N-말단이 N-치환된, 바람직하게는 Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 함유하도록 변환된 폴리펩티드를 라이게이션하는데 이용됨으로써, 천연 화학적 라이게이션의 원칙을 시스테인 잔기가 결여된 폴리펩티드로 채택되도록 허용할 수 있다 (참고문헌으로 여기 수록된, 미국 특허 출원 제 60/231,339 참조).

"확장된 천연 화학적 라이게이션"의 방법은 카르복실 티오에스테르, 더욱 바람직하게는 α-카르복실 티오에스테르를 포함한 제 1 성분을, 산에 안정한 N-치환된, 바람직하게는 Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 포함한 제 2 성분에 라이게이션 시키는 것을 포함한다. 제 1 성분의 카르복시티오에스테르와 제 2 성분의 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 티올 간의 화학선택적 반응은 티오에스테르-연결된 중간물을 통해 진행되고, 초기 라이게이션 생성물로 분해된다. 보다 명확하게 말하자면, COSR 티오에스테르 성분 및 아미노 알킬 티올 성분 간에 발생하는 티올 교환은 티오에스테르-연결된 중간물 라이게이션 생성물을 생성하는데, 이 생성물은 자발적인 재배열 후 아미노 알킬 티올 성분이 화학식 I 또는 II 중 어떤 것을 갖느냐에 의존하여 5-원 또는 6-원 고리 중간물을 통해 아미드-연결된 제 1 라이게이션 생성물을 생성한다:

J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 I

J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2 II

상기 식에서 J1은 하나 이상의 임의적으로 보호되는 아미노산 측쇄를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이거나, 또는 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드의 부분, 중합체, 염료, 적당히 기능화된 표면, 링커 또는 검출가능한 마커이거나, 또는 화학적펩티드 합성 또는 확장된 천연 화학적 라이게이션에 융화적인 어떠한 다른 화학적 부분이고; R1, R2 및 R3은 독립적으로 H이거나 또는 C1에 접합된 전자 공여기이고; 단, R1, R2 및 R3 중 적어도 하나는 C1에 접합된 전자 공여기를 포함하고; J2는 하나 이상의 임의적으로 보호되는 아미노산 측쇄를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이거나, 또는 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드, 중합체, 염료, 적당히 기능화된 표면, 링커 또는 검출가능한 마커이거나; 또는 화학적 펩티드 합성 또는 확장된 천연 화학적 라이게이션에 융화적인 어떠한 다른 화학적 부분이다.

라이게이션 지점에 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C2-C1(R1)-] 또는 [HS-(C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]은 펩티드-융화성 조건 하에서, 생성물의 손상 없이 제거되어, 라이게이션 지점에 천연 아미드 결합을 갖는, 화학식 III의 최종 라이게이션 생성물을 생성할 수 있다:

J1-C(O)-HN-J2 III

여기에서 J1, J2, R1, R2 및 R3은 위에 정의된 것과 같다.

R1, R2 및 R3 기는 펩티드 융화성 절단 조건 하에서 N-C1 결합의 절단을 용이하게 하도록 선택된다. 예를 들어, 전자 공여군은, 특히 C1에 접합되어 있다면, 절단을 용이하게 하는 C1에서 공명 안정화된 양이온을 형성하는데 이용될 수 있다. 화학적 라이게이션 반응은 바람직하게 첨가제로서 티올 촉매를 포함하고, 수성 또는 혼합된 유기-수성 조건의 대략 중성 pH 조건에서 수행된다. 제 1 및 제 2 성분의 화학적 라이게이션은 자발적으로 재배열이 일어나 N-치환된 아미노 연결된 라이게이션 생성물을 산출하는 5 또는 6 원 고리를 통해 진행될 수 있다. 제 1 및 제 2성분이 펩티드 또는 폴리펩티드이면, N-치환된 아미드 연결 라이게이션 생성물은 화학식 IV 또는 V를 가진다:

J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 IV

J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 V

상기 식에서 J1, J2 및 R1, R2, R3은 위에 정의된 것과 같고 Z2는 아미노산 측쇄 또는 이러한 측쇄의 유도체이다.

N-치환된 아미드 결합 라이게이션 생성물의, 접합된 전자 공여기 R1, R2 또는 R3은 N-C1 결합의 절단 및 N-치환된 아미드-연결 라이게이션 생성물로부터 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 제거를 용이하게 한다. 펩티드 융화성 절단 조건 하에서 N의 알킬 또는 아릴 티올 사슬의 제거는 라이게이션 지점에 천연 아미드 결합을 갖는 라이게이션 생성물을 생성한다. 제 1 및 제 2 성분이 펩티드 또는 폴리펩티드이면, 라이게이션 생성물은 다음의 화학식을 가질 것이다:

J1-CONαH-CH(Z2)-C(O)-J2 X

화학식 I에 대하여 대표적인 R1 치환기는표 2에 묘사된다.

화학식 II에 대하여 대표적인 R1, R2 및 R3 치환기는표 2에 묘사된다.

N-치환된 2 탄소 사슬 화합물에 관하여, 오르쏘 또는 파라 위치에서 벤질 및피콜릴 전자-공여 치환기 R1', R3' 및 R5'의 위치결정은 라이게이션 후 Nα-결합의 확고한 절단을 위해 C1 탄소로의 전자적 접합을 유지시킬 필요가 있다. 그러나, R2 및 R3가 C2 및 C3과 벤질기를 형성할 때, R1' 및 R3' 중 적어도 하나는 강력한 전자 공여기를 포함하는데, 여기에서 R1' 또는 R3'은 메톡시 (-OCH3), 티올 (-SH), 히드록시 (-OH), 및 티오메틸 (-SCH3)로부터 선택된다. R2 및 R3이 수소인 N-치환된 3 탄소 사슬 티올에 대하여, R1은 R1', R3' 및 R5'가 강력한 또는 중간의 전자-공여기, 또는 그들의 조합을 포함하는 벤질 또는 피콜릴기를 포함한다. N-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올에 관하여, 강력한 전자-공여기는 라이게이션 후 절단에 대한 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 민감성을 향상시킨다. 그러므로 특별한 전자-공여기 또는 그것의 조합은 그에 따라 선택될 수 있다.

N-치환된 2 탄소 사슬 화합물과 유사하게, 본 발명의 N-치환된 3 탄소 사슬 화합물은 흥미있는 구성체에서 치환에 대하여 이용가능할 때 R1' 및 R5' 위치에서 R1'의 치환기로서 티올을 포함한다. 여기서 다시, 전자-공여 티올기는 C1에 접합되고 이 위치에서 그것의 도입은 화합물이 라이게이션 사건을 형성하는 6-원 고리에 대한 두 개의 경로를 갖게 할 수 있다. 이는 또한 이용가능한 티올의 국소 농도를 α-카르복시 티오에스테르와 반응하도록 증가시키고, 라이게이션을 개선할 수 있는 구조적 구속에 의한 추가적인 형태에 제공한다.

본 발명의 N-말단 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 아미노산의 합성은, 여기 설명된 것과 같이 수행될 수 있고 (예를 들어개요도 I및개요도 II), 업계에 공지된 표준 유기 화학 기술에 따라서 수행될 수도 있다. 예를 들어, "Advanced Organic Chemistry Mechanisms, and Structure", 4th Edition, J. March (Ed.), John Wiley & Sons, New York, NY, 1992; "Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group Prepa래트ions", R. Larock (Ed.), VCH Publishers, New York, NY, 1989를 참조한다. 이 아미노산은 용액에서, 중합체-지지 합성에 의해, 또는 그들의 조합으로 합성될 수 있다. 바람직한 접근법은 N 알파 보호 N 알킬화 S-보호된 아미노 알킬- 또는 아릴- 티올 아미노산 전구체를 채택한다. 합성에 이용되는 시약은 다수의 제조사로부터 얻을 수 있다. 또한, 시작 성분 및 개개의 아미노산 유도체와 같은, 다양한 중간물이 차후 사용을 위해 저장될 수 있고, 키트 등으로 제공될 수 있다는 것이 잘 이해될 것이다.

본 발명의 N-말단 Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 아미노산의 제조에, 보호기 전략이 채택된다. 일반적으로 다양한 합성 전략에 사용되는 바람직한 보호기 (PG)는 고체상 펩티드 합성 (Solid Phase 펩티드 Synthesis, "SPPS")과 융화적이다. 몇몇 예에서, 상이한 조건 하에서 제거 가능한 직교성 보호기를 사용하는 것이 또한 필요하다. 많은 이러한 보호기는 공지되고 본 목적에 적당하다 (예를 들어, "보호 Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition, T. W. Greene and P.G.M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide", G.A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry", W.D. Bennet, J.W. Christensen, L.K. Hamaker, M.L. Peterson, M.R. Rhodes, and H.H. Saneii, Eds.,Advanced Chemtech, 1998; "Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; 및 "Protection Groups", P.J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994 참조). 예는 벤질옥시카르보닐 (Z), Boc, Bpoc, Trt, Nps, FmocCl-Z, Br-Z; NSC; MSC, Dde 등을 포함한다. 황 부분에 대하여, 적당한 보호기의 예는 벤질, 4-메틸벤질, 4-메톡시벤질, 트리틸, ACM, TACAM, 크산틸, 디설피드 유도체, 피콜릴, 및 페나실을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

더욱 특별하게, Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올은개요도 I(Nα-치환된 전구체의 고체-상 제조),개요도 II(Nα-치환된 전구체의 용액-상 제조)에 따라서 제조될 수 있다.개요도 I에서, Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올은 중합체-지지 유기 합성의 표준 방법을 이용하여 고체 상에 직접 회합하고, 반면개요도 II의 Nα-보호된, N-알킬화된, S-보호된, 아미노알킬 또는 아릴티올 아미노산 전구체는 표준 커플링 프로토콜을 이용하여 수지에 커플링 된다. 라세미체 또는 부분입체 이성질체 생성물이 생산되면, 확장된 천연 화학적 라이게이션에 사용하기에 앞서 표준 방법에 의해 이들을 분리할 필요가 있다.

α-카르복시티오에스테르는, 실시예를 포함하여 여기 설명된 것과 같은, 업계에 공지된 표준 기술 후 화학적 또는 생물학적 방법에 의해서 생성될 수 있다.화학적 합성을 위하여, α-카르복시티오에스테르 펩티드는 용액내 또는 티오에스테르-생성 수지으로부터 합성될 수 있는데, 이 기술은 주지된다 (예를 들어, Dawsonet al.,상기; Canneet al.,상기; Hackenget al.,상기, Aimotoet al.참조).예를 들어, 화학적으로 합성되는 티오에스테르 펩티드는 상응하는 펩티드 α-티오산으로부터 만들어질 수 있는데, 이는 차례로 티오에스테르-수지 상에서 또는 용액 내에서 합성될 수 있지만, 수지 접근법이 바람직하다. 펩티드-α-티오산은 상응하는 3-카르복시-4-니트로페닐 티오에스테르, 상응하는 벤질 에스테르, 또는 다양한 알킬 티오에스테르의 어떤 것으로 전환될 수 있다. 이 모든 티오에스테르는, 상응하는 벤질 티오에스테르보다 어느 정도 더 빠른 반능 속도를 예증하는 3-카르복시-4-니트로페닐 티오에스테르를 가지고 한, 라이게이션 반응에 만족스러운 이탈기를 제공하는데, 이는 차례로 알킬 티오에스테르보다 더 반응적일 수 있다. 또 다른 예로서, 트리틸-결합 머캅토프로프리온산 류신 티오에스테르-생성 수지는 C-말단 티오에스테르를 구성하는데 사용될 수 있다 (Hackenget al., 상기). C-말단 티오에스테르 합성은 또한 3-카르복시프로판설폰아미드 안전-장치 링커를 이용하여 디아조메탄 또는 요오드아세토니트릴로 활성화시킨 후 적당한 티올로 대치함으로써 성취될 수 있다 (Ingenitoet al.,상기; Bertozziet al.).

C-말단 α-카르복시티오에스테르 펩티드는 또한 인테인-매개 생물학적 기술과같은, 생물학적 프로세스를 사용하여 만들어 질 수 있다(예를 들어, Chong et al., Gene (1997) 192: 277-281; Chong et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26: 5109-5115; Evans et al., Protein Science (1998) 7: 2256-2264; and Cotton etal., Chemistry & Biology (1999) 6 (9): 247-256를 참고하라). 예를 들어, 친화력 태그와 같은 라벨을 갖거나 갖지않는 인테인 발현 시스템이 C-말단 디티오트레이톨 (DTT) 에스테르 펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 생성하는 '인테인' 단백질-가닥잇기 원소의 유도가능 스스로 절단 기능을 이용하는데 사용될 수 있다. 특히, 인테인은 DTT, b-메르캅토에탄올 또는 시스테인와 같은 티올의 존재하에서 특정 스스로 절단을 겪고, 그것은 C-말단 티오에스테르를 갖는 펩티드 단편을 생성한다. 예를 들어, Chong et al., (1997) 상기; Chong et al., (1998) 상기; Evans et al., 상기; and Cotton et al., 상기를 참조하라. 그러나, 재조합적으로 제조된 단편을 사용할때, 최종 구조물의 화학적으로 합성된 부분은 전형적으로 포함된 중합체 변형을 함유할 것이다.

제 1 카르복시티오에스테르 성분을 갖는 본 발명의 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 성분의 라이게이션은, 라이게이션 지점에 N-치환된 아미드 결합을 갖는 라이게이션 생성물을 생성한다. 반응의 라이게이션 조건은 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 부분을 갖는 티오에스테르의 선택적인 반응성을 유지하도록 선택된다. 바람직한 구체예에서, 라이게이션 반응은 pH 6 내지 8, 바람직한 pH범위는 6.5 내지 7.5인 완충용액에서 수행한다. 완충용액은 수성, 유기성 또는 그들의 혼합물이 될 수 있다. 라이게이션 반응은 또한 하나 이상의 촉매 및/또는 하나 이상의 환원제, 지질, 세제, 다른 변성제 또는 용해제 등을 포함할 수 있다. 바람직한 촉매의 예는 티올 및 포스핀으로, 이는 티오페놀, 벤질머캅탄, TCEP 및 알킬 포스핀과 같은, 부분을 함유한다. 변성 및/또는 용해제의 예는 구아니디늄, 물 또는 TFE, HFIP, DMF, NMP와 같은 유기 용매 중 유레아, 물과 혼합한 아세토니트릴, 또는 구아니디늄과 혼합한 아세토니트릴 및 물 중 유레아를 포함한다. 온도는 또한 라이게이션 반응의 속도를 조절하는데 이용될 수 있는데, 이는 보통 5℃에서 55℃ 사이이고, 바람직한 온도는 15℃에서 40℃ 사이이다. 한 예에서, 라이게이션 반응은 6.8 내지 7.8 사이의 pH에서 6M 구아니디늄 중 2% 티오페놀을 갖는 반응 시스템에서 양호하게 진행한다.

N-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올에 대하여, 라이게이션 사건은 COSR 티오에스테르 성분 및 아미노 알킬 티올 성분 사이에서 발생하는 티올 교환으로부터 일어난다. 교환은, 5-원 고리 중간물을 통한 자발적인 재배열 후 화학식 J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-J2의 제 1 라이게이션 생성물을 생성하는 티오에스테르-연결 중간 라이게이션 생성물을 생성하는데, 이 화학식은 라이게이션 지점에 제거 가능한 N-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C2-C1(R1)-]을 가지며 치환기는 위에 정의된 것과 같다. 라이게이션 지점에 N-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C2-C1(R1)-]은, 펩티드-융화성 조건 하에서, 제거되어 라이게이션 지점에 천연 아미드 결합을 갖는 화학식 J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2의 최종 라이게이션 생성물을 생성할 수 있다.

N-치환된 3 탄소 사슬 아릴 또는 알킬 티올에 대하여, COSR 티오에스테르 성분 및 아미노 알킬 티올 성분 간의 티올 교환은 6-원 고리 중간물을 통한 자발적인 재배열 후 화학식 J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1-C2(R1)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-J2의 제 1 라이게이션 생성물을 생성하는 티올에스테르-연결 중간 라이게이션 생성물을 생성하는데, 이 화학식은 라이게이션 지점에 제거 가능한 N-치환된 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]을 갖는다. 라이게이션 지점에 N-치환된 3 탄소 사슬 아릴 티올 [HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]은, 펩티드-융화성 조건 하에서, 제거되어 라이게이션 지점에 천연 아미드 결합을 갖는 화학식 J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2의 최종 라이게이션 생성물을 생성할 수 있다.

N-치환된 알킬 또는 아릴 티올기의 제거는 바람직하게 N-C1 결합의 절단을 용이하게 하기 위해 산성 조건에서 수행되어, 라이게이션 지점에 안정화되고, 치환되지 않은 아미드 결합을 산출한다. "펩티드-융화성 절단 조건"에 의하여, 펩티드와 융화적이고 라이게이션 생성물로부터 알킬 또는 아릴 티올 부분의 절단에 적당한 물리-화학적 조건이 의도된다. 일반적으로 펩티드-융화적 절단 조건은 채택되는 α-치환된 화합물에 의존하여 선택되는데, 이 조건은 일상적이고 주지된 접근법을 통해 손쉽게 추론될 수 있다 (예를 들어, "보호 Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition, T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide", G.A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry", W.D. Bennet, J.W. Christensen, L.K. Hamaker, M.L. Peterson, M.R. Rhodes, and H.H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; 및 "보호 Groups", P.J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994 참조).

예를 들어, R1, R2 또는 R3 치환기가 메톡시, 히드록시, 티올 또는 티오메틸, 메틸 등을 포함할 때, 제거를 위한 더욱 보편적인 방법은 펩티드 합성 화학법에 대하여 전형적인 산성 절단 조건을 포함한다. 이것은 강한 산성 조건 또는 물-산성 조건 하에서, 환원제 및/또는 스캐빈져 시스템 (예를 들어, 무수 플루오르화 수소 (HF), 트리플루오로아세트산 (TFA), 또는 트리메틸술포닐 플루오르아세트산 (TMSFA)등과 같은 산)을 갖거나 갖지 않고, N-C1 결합의 절단을 포함한다. 더욱 특유한 산성 절단 시스템은 주어진 구조에 대한 아릴 또는 알킬 티오 부분을 제거하기 위해 Nα-C1 결합을 최적화하도록 선택될 수 있다. 이러한 조건은 주지되고 펩티드 본래 모습의 유지에 융화적이다. 특히 유리 아릴 또는 알킬 티올 부분과 트립토판 측쇄의 반응을 회피하기 위해 트립토판이 펩티드 또는 폴리펩티드 서열에 존재할 때, 티올 스캐빈져가 포함될 수 있다. 티올 스캐빈져의 예는 에탄디올, 시스테인, 베타-머캅토에탄올 및 티오크레졸을 포함한다.

다른 전문화된 절단 조건은 피콜릴기가 치환기일 때 광 또는 환원-절단 조건을 포함한다. 예로서, R1, R2 및 R3 치환기가 피콜릴 부분을 포함할 때, 광분해 (예를 들어, 자외선광), 아연/아세트산 또는 전자분해 환원이 표준 프로토콜 후 절단에 이용될 수 있다. N-치환된 2 탄소 사슬 티올의 R1이 R1에 티오메탄을 포함하면, 수은 또는 HF 절단이 이용될 수 있다. 절단 시스템은 또한 제 1 또는 제 2 라이게이션 성분이 다른 보호기를 포함할 때 고체 지지물로부터의 동시 절단 및/또는탈보호제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서 Nα-치환된 2 또는 3 사슬 알킬 또는 아릴 티올이 펩티드 합성 단계 (특히 자동 펩티드 합성 및, 직교성 및 수렴성 라이게이션 전략)에 채택되어, 합성 생물활성 단백질을 산출하기 위한 확장된 화학적 라이게이션에 기질로서 사용될 수 있는 적당히 N-말단으로 유래된 폴리펩티드를 산출한다. 이러한 화합물은 화학식 (PG1)S-C2-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2 또는 (PG1)S-C3 (R3)-C2(R2)-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2의 완전히 보호된, 부분적으로 보호된 또는 완전히 보호되지 않은 산에 안정한 Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 포함하는데, 이는 아래표 III및표 IV에 묘사된다. 특히, 하나 이상의 R1, R2 및 R3은, Nα-치환된 아미드 알킬 또는 아릴 티올로 Nα-치환된 아미노 알킬 또는 아릴 티올의 전환 후, 펩티드 융화성 절단 조건 하에서 Nα-C1 결합의 절단을 용이하게 하는 공명 안정화된 양이온을 C1에서 형성할 수 있는, C1에 접합된 전자 공여기를 포함한다. PG1 및 PG2는 개별적으로 또는 조합으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있고 동일하거나 상이할 수 있는 결합기인데, 여기에서 Z2는 화학적 펩티드 합성 또는 확장된 천연 화학적 라이게이션과 융화성인 어떠한 화학적 부분이고, J2는 화학적 펩티드 합성 또는 확장된 천연 화학적 라이게이션에 융화적인 어떠한 화학적 부부분이다. PG1 (또는 X1)은 아민을 보호하기 위한 기이다. PG2 (또는 X2)는 티올을 보호하기 위한 기이다. 많은 이러한 보호기가 공지되고 본 목적에 적당하다 (예를 들어, "Protecing Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition, T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc.,1999; NovaBiochem Catalog 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide", G.A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry", W.D. Bennet, J.W. Christensen, L.K. Hamaker, M.L. Peterson, M.R. Rhodes, and H.H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; 및 "보호 Groups", P.J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994 참조).

PG1 및 X1에 대한 바람직한 보호기의 예는 [Boc(t-부틸카르바메이트), Troc (2,2,2,-트리클로로에틸카르바메이트), Fmoc(9-플루오르에닐메틸카르바메이트), Br-Z 또는 Cl-Z(Br- 또는 Cl-벤질카르바메이트), Dde(4,4,-디메틸-2,6-디옥소시클로에틸-일리덴), MsZ(4-메틸설피닐벤질카르바메이트), Msc(2-메틸설포에틸카르바메이트), Nsc(4-니트로페닐에틸설포닐-에틸옥시-카르보닐)]을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 PG1 및 X1 보호기는 "보호 Groups in Organic Synthesis" (Greene and Wuts, Third Edition, Wiley-Interscience, (1999))로부터 선택되고 Fmoc 및 Nsc가 가장 바람직하다. PG2에 대한 바람직한 보호기의 예는 [Acm(아세트아미도메틸), MeoBzl 또는 Mob(p-메톡시벤질), Meb(p-메틸벤질), Trt(트리틸), Xan(크산테닐), tButhio(s-t-부틸), Mmt(p-메톡시트리틸), 2 또는 4 피콜릴(2 또는 4 피리딜), Fm(9-플루오르에닐-메틸), tbut(t-부틸), Tacam(트리메틸아세트아미도메틸)]을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 보호기 PG2 및 X2는 "Protective Groups in Organic Synthesis"(Green and Wuts, Third Edition, Wiley-Interscience, (1999))로부터 선택되고, Acm, Mob, MeB, 피콜릴이 가장 바람직하다.

본 발명의 Nα-치환된 2 또는 3 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 보호 형태는 위의 개요도 I 및 II에서와 같이 제조될 수 있다.

본 발명의 화합물은, 할로겐-중재 아미노 알킬화, 환원성 아민화를 포함하는 어떠한 다양한 수단 및, 고체상 아미노산 합성 방법과 융화적인 Nα-보호된, N-알킬화된, S-보호된, 아미노 알킬- 또는 아릴-티올 아미노산 전구체에 의해서 생산될 수 있다. 바람직하다면, 허용되는 키랄 순도의 화합물을 부여하기 위해 생산된 라세미체 또는 부분입체 이성질체의 분해는, 표준 방법에 의해 수행될 수 있다.

III. 본 발명의 바람직한 수용성 중합체의 합성과 제조

여기서 사용된 바와 같이, 용어 "분자 이종성" 은 단백질 제조의 각각의 단백질에 부착된 중합체 분자의 수의 변화를 언급하도록 의도된다. 용어 "분자 다양성"은 (a) 중합체에 의해 병형되는 단백질의 부위(들)에서 변화, (b)동일한 단백질의 다른 부위의 또는 단백질 조제의 다른 단백질에서의 동일한 부위(들)의 중합체 애덕트의 길이에서의 변화, 또는 (c)동일한 단백질의 다른 부위, 또는 단백질 조제의 다른 단백질에서의 동일한 부위(들)의 중합체 애덕트의 어떠한 분지의 범위 및/또는 성질에서의 변화를 언급하도록 의도된다. 여기서 사용된 바와 같이, 용어 "분자적으로 규일한"은 단백질의 제조를 언급하도록 의도된다. 모든 단백질은 동일한 위치에서 아미노산 서열 및 동일한 중합체 변형을 함유한다. 두가지 이상의"분자적으로 균일한" 단백질 조제의 혼합물은 여기서 "분자적으로 정의된" 조제를 언급한다.

본 발명의 이러한 양태에 따라서, 중합체 이질성, 다양성, 및 부적당성의 상기-규명된 문제에 대한 해결책은 폴리펩티드 (정확한 길이, 편리한 합성) 및"pPEG" ("정밀 PEG"; 유동성, 양친매성, 비-면역원성인, 프로테아제를 허용하지 않는 중합체: Rose, K.et al., 미국 특허 출원 제 09/379,297 호, 참고문헌으로서 여기 수록)의 장점을 조합한 새로운 분류의 생체교합성 중합체의 생산을 포함한다. 이 새로운 분류의 생체교합성 중합체는 다음의 화학식을 갖는다:

-[CO-X-CO-NH-Y-NH]_n-

n은 바람직하게 1 내지 100 및 더욱 바람직하게는 2 내지 100인 정수이고, 상기 식에서, X 및 Y는 아미드 결합에 의해 연결된 정확한 구조의 생체교합성 반복 요소이다. 바람직하게는, X 및 Y가 반응성 작용기가 결여된 2가의 유기 라디칼이거나 없을 수 있고 동일하거나 상이할 수 있으며, 각 반복 유닛으로 독립적으로 변화할 수 있다. 바람직하게는, n=2일 때, X 또는 Y 중 적어도 하나가 치환, 비치환, 분지 및 직쇄상의 지방기 및 방향족으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 2가 유기 라디칼인 X 또는 Y 중 적어도 하나가 페놀, C₁-C₁₀알킬렌 부분, C₁-C₁₀알킬기, 헤테로원자-함유 페놀, 헤테로원자-함유 C₁-C₁₀알킬렌 부분, 헤테로원자-함유 C₁-C₁₀알킬기, 및 그것의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

특히 바람직한 pPEG 부분은 다음의 화학식을 갖는다:

-{CO-(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)₆-NH-CO-(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH-}_n-

(상기 식에서 n은 바람직하게 1 내지 100, 더욱 바람직하게는 2 내지 100까지 다양하다); 또는

-{CO-(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)₆-NH-CO-(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH-}_n-

(상기 식에서 n은 바람직하게 1 내지 50, 더욱 바람직하게는 2 내지 50까지 다양하다).

이러한 pPEG 부분은 어떠한 다양한 방식으로 합성될 수 있다. 그러나, 이러한 부분은 바람직하게, 중합체형성 과정보다는 유닛의 고체상 순차적 연쇄 회합을 이용하여 생산된다. 이러한 회합 과정의 이용은 제조물의 부분이, 부분의 길이, X 및 Y 치환기의 특성, (만약 있다면) 분지점의 위치, 및 길이에 관하여, 정의되고 상동한 구조, X 및 Y 치환기 및 어떤 분지의 위치를 갖는 것을 허용한다.

바람직하게는, 이러한 부분이 다음과 같은 단계에 의해서 합성될 것이다:

(a) 화학식 HOOC-X-COOH를 갖는 이산 유도체의 몰 초과량으로 화학식 Z-Q-지지체 화합물의 아미노 또는 히드록시 기를 아실화하는 단계 (여기에서 Z는 H₂N- 또는 HO-이고; Q는 링커 또는 표적 분자이고; 지지체는 고체상, 매트릭스 또는 표면이다);

(b) 단계 (a) 산물의 유리 카르복시기를 활성화하는 단계;

(c) 화학식 NH₂-Y-NH₂를 갖는 디아민의 몰 초과량으로 단계 (b)의 산물을 아미노분해하는 단계; 및

(d) HOOC-X-COOH 및 NH₂-Y-NH₂를 이용하여 단계 (a) 내지 (c)를 임의적으로 반복하는 단계 (여기에서, 상기 X 및 Y는 2가 유기 라디칼이거나 없을 수도 있고동일하거나 상이하며, 각각의 상기 임의적으로 반복되는 유닛으로 독립적으로 다양할 수 있고, 선행하는 아실화 및 아미노분해 단계에서 사용된 X 및 Y 치환기와 동일 또는 상이하다).

바람직한 구체예에서, 상기 반복 유닛의 6-원소체, 12-원소체, 18-원소체 및 32-원소체가 채택된다. 원한다면, 분지된 pPEG 구조를 형성하기 위해 리신의 아미노기와의 접합에 반복 유닛을 사용할 수 있다. pPEG는 티오에테르, 옥심 및 아미드 연결 형성을 포함하는 다양한 화학법에 의해, 본 발명의 합성 단백질에 부착될 수 있다.

한 구체예에서, 유닛의 고체상 순차적 연쇄 회합은 다음의 단계를 포함한다.

단계 1: 보호 또는 보호되지 않은 이산을 수지 상의 아미노에 커플링하여 연결 지점에 아미드 결합을 발생 (여기에서PG는 채택된 이산에 의존하여 존재 또는 부재하는 보호기이다):

PG-OOC-X-COOH + NH₂-Y-NH-수지

단계 2: 만약 존재한다면, 수지 상의 보호기 (PG)를 제거

HOOC-X-CO-NH-Y-NH-수지

단계 3: 보호 또는 보호되지 않은 이산을 수지 상의 카르복시에 커플링하여 연결 지점에 아미드 결합을 발생 (여기에서PG는 채택된 이산에 의존하여 존재 또는 부재하는 보호기이다):

PG-NH-Y-NH + HOOC-X-CO-NH-Y-NH-수지

단계 4: 만약 존재한다면, 수지 상의 보호기 (PG)를 제거

-NH-Y-NH-OC-X-CO-NH-Y-NH-수지

단계 5: 'n'개의 유닛을 첨가하여 단계 1 내지 4를 'n'회 반복한 후 수지으로부터 절단

-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-

고찰된 것과 같이, 직쇄상 및 분지상 pPEG 구성체는 바람직하게 본 발명의 합성 생물활성 분자에 부착되기 위한 수용성 중합체이다. 채택된 pPEG는 생리학적 조건 하에서 하전되거나 또는 중성인 펜던트기를 갖고, 실험자가 채택한 pPEG 구조에 의존하여 부착 화학법, 길이, 분지 및 용해도에서 다양하게 만들 수 있다. 위에 언급한 것과 같이, 본 발명의 바람직한 pPEG는 반복 유닛 -CO-X-CO-NH-Y-NH-를 갖는 수용성 폴리아미드를 포함하는데, 여기에서 X 및 Y 중 하나 또는 둘 모두는 수용성 반복 유닛, 가장 바람직하게는 'PEG'-기초 반복 유닛을 포함한다. 올리고유레아가 단순 2-단계 고체상 방법을 이용하여 원칙적으로 사용될 수 있음에도 불구하고, 아미노 수지, NH₂-수지, 및 대칭성 디아민 NH₂-Y-NH₂의 경우에 대해 아래 나타난 것과 같이:

카르보닐디이미다졸로 활성화 → im-CO-NH-수지

NH₂-Y-NH₂디아민으로 아미노분해 → NH₂-Y-NH-CO-NH-수지

(여기에서 이 2 단계를 수차례 반복하여 반복 유닛 -NH-Y-NH-CO-를 갖는 올리고유레아를 얻을 수 있다), 이 접근법은 덜 바람직하다. 이것은 상기 단계의 수율이, 매우 많은 양의 시약 및 긴 반응 시간을 가지고도, 상온에서 비-양적일 수 있기 때문이다. 따라서, 아미노 수지, NH₂-수지의 경우에 대하여 아래 나타난, 3-단계 고체상 방법을 이용하여 폴리아미드를 형성하는 것이 바람직하다. 시약 HO₂C-X-CO₂H 및 NH₂-Y-NH₂는 이소형 산물을 회피하기 위해 대칭성이 되어야 한다.

이산 HO₂C-X-CO₂H 로 아실화 → HO-CO-X-CO-NH-수지

카르보닐디이미다졸로 활성화 → im-CO-OCO-X-CO-NH-수지

디아민 NH₂-Y-NH₂로 아미노분해 → NH2-Y-NH-CO-X-CO-NH-수지

이 세 단계를 차례대로 수차례 반복하여 반복 유닛 -NH-Y-NH-CO-X-CO-를 갖는 폴리아미드를 얻을 수 있다. 중합체는 정확한 수의 모노머 유닛을 함유하고, X 및 Y는 각 단계에서 독립적으로 변화될 수 있으며, 말단-기는 임의대로 선택될 수 있다. 예를 들어, 아실화 단계를 위한 숙신 안히드리드 ("Succ") 및 아미노분해 단계를 위한 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데카네디아민 ("EDA" 또는 "TTD"로도 지칭됨)의 사용에 의해, X가 -CH₂CH₂-이고, Y가 -NH-CH₂CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH-이고, 반복 유닛이 -NH-CH₂CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH-COCH₂CH₂CO-인 "PEG"-기초 폴리아미드를 형성한다. 방법이 보호기를 갖지 않는 2가 시약을 포함한다는 사실에도 불구하고, 아래에 언급된, 분지된 구성체를 만들기 위한 분지된 Lys 코어의 경우를 제외하고는, 표준 시중 합성 수지를 사용하면 교차-결합은 문제되지 않는다 (Roseet al.,(미국 특허 출원 제 09/379,297 호); 및 Roseet al.,J. Am. Chem. Soc.(1999) 121:7034).

예를 들어, 분지된 pPEG 구성체는 Roseet al.,(미국 특허 출원 제 09/379,297호) 및 Rose, K. 및 Vizzavona, J. (J. Am. Chem. Soc.(1999) 121: 7034)에 설명된 "케모바디 (chemobody)"와 유사한 수단으로 만들어 질 수 있다. 그러므로, 분지된 pPEG 구성체는 리신 분지형성 코어와 같은 분지형성 코어를 갖도록 만들어 질 수 있는데, 이 리신 코어는 옥심 링커를 통해 -(COCH₂CH₂CO-NH-CH₂CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH)_n-과 같은 바람직한 수용성 폴리아미드에 커플링된다. 예를 들어, 옥심 결합은 폴리아미드의 다른 말단에 있는 Lys 측쇄상의 아미노옥시아세틸기와, 테트라머 코어인 (O=CHCO)₄Lys₂Lys-과 같은, 리신 코어상의 글리옥실일기 사이에서 손쉽게 형성된다. 그러므로 각 리신 분지점으로부터 나온 옥심 링커는 구조 -Lys(COCH₂ON=CHCO-)아미드- 로서 제조될 수 있다. 대안적 구성물은, 바람직하게 단일보호 디아민 및 폴리아미드 커플링 후 탈보호를 이용하여, 폴리아미드 및 폴리아미드의 유리 펜던트기 사이에 옥심 결합을 위치시켜서, 아래에 묘사된 4가의 분지된 구성체를 발생할 수 있다:

[O=CHCO-(NH-CH₂CH₂CH₂-[OCH₂CH₂]₃-CH₂-NH-COCH₂CH₂CO-)_n]₄Lys₂Lys-

옥심 화학법은 이중합 및 사중합의 분지된 구성체를 제작하는데에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 팔중합의 분지된 구성체의 회합에도 적당하다 (Rose, K., J. Am. Chem. Soc. (1994) 116:30; Rose, K.et al., Bioconj. Chem. (1996) 7:552).이러한 pPEG 폴리아미드를 사용할 때, 이러한 목적을 위해 다른 화학법을 이용하는 것도 물론 가능하다 (도 13참조). 더욱이, 폴리아미드 형성은 Bco 또는 Fmoc 화학법을 포함하는 펩티드 합성을 위한 합성 개요도 내로 통합될 수 있으나, 이러한 개요도를 고안할 때에 아미노분해 단계가 Fmoc기를 제거할 수 있고, 만약 Bco 화학법을 사용하려 한다면 이 단계가 인돌의 포르밀 보호를 제거할 수 있어야 한다는 것을 명심하여야 한다.

따라서, 이러한 pPEG는 정선한 결합 (예를 들어, 아미드, 키오에테르, 옥심 등)을 통해 직쇄 수용성 폴리아미드 (예를 들어, -(Succ-TTD)_n- 등)에 연결된 다양한 분지형성 코어 (예를 들어, 리신 분지형성 코어 등)을 갖도록 만들어질 수 있는데, 여기에서 각 직쇄 수용성 폴리아미드의 유리 말단은 원하는 변화를 제공하도록 원하는 펜던트기 (예를 들어, 카르복실레이트, 아미노, 아미드 등)로 각각 캡핑될 수 있다. 더욱이 본 발명의 직쇄 및 분지된 pPEG는, 하나 이상의 유일하고 서로 반응성인 작용기를 갖는 합성 단백질에 부착하기 위한 유일한 작용기를 포함하도록 만들어질 수 있고, pPEG의 펜던트기는 바람직하게 비-면역원성일 것이다 (예로서도 13참조).

특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질은 하기식의 분자적으로 균일한 글리코-의태 수용성 중합체로 변형된다:

U-s1-B-s2-중합체-s3-J ^*

여기서 U는 유일한 작용기의 잔기이고, B는 동일하거나 다를 수 있고 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 3 이상의 팔을 갖는 분지 코어이다.

중합체는 약 5,000 Da이상의 분쟈량을 갖는 식-[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n- 또는 -[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-의 폴리아미드이고, 여기서 X 와 Y는 분지상 또는 선형이 될 수 있는 동일하거나 다를 수 있는 2가 라디칼이고, 여기서 X 와 Y 모두 또는 둘 중 하나는 선형 또는 분지상일 수 있는 실질적으로 비-면역원성 수용성 반복 단위를 포함하고, J^*는 순 전하 음, 양 및 중성으로 구성되는 군으로부터 선택되는 물리적인 조건하에서, 실질적으로 비면역성인 펜던트 기의 잔기이고, 여기서 s1, s2, 및 s3 는 동일하거나 다를 수 있는 스페이서 또는 링커이고, 개별적으로 존재할 수도 있고 없을 수도 있다. 그러한 중합체는 여기에 전체가 참고문헌으로 포함된 US. Patent Application Serial No. 60/236,377에 기술된 것들을 포함한다. , 식 U-s1-B-s2-중합체-s3-J* 은 또한 식 U-B-중합체-J*으로 나타낼 수 있고, 여기서 스페이서 또는 링커 군 s1, s2, s3 은 있을 수도 있고 없을 수도 있다.

본 발명의 바람직한 글리코미메틱(glycomimetic) 중합체를 형성하는 바람직한 과정은 도 5-7에 나와있다. 도 5A-5B는 분지 코어(B) 및 본 발명의 수용성 중합체 U-B-중합체-J^*의 유일한 화학선택적 작용기(U)를 발생하기 위한 고체 상 과정을 나타낸다. 나타낸 바와 같은 고체 상 접근이 바람직하긴 하지만, 과정은 용액에서 수행될 수도 있다. 특히 도 5A는 을 나타낸다. 반응기를 갖는 직교하여 보호된 U-B 선구물질 부분 및 그러한 구조체의 기본 기하학 구조가 결합으로 연결된 도트에 의해 표현되는 것을 보여준다; 이 기본 기하학 구조는 사용된 화학적 연결 또는 기들의 타입을 제한하는 것으로 의도되지 않지만, 본 발명의 U-B 부분의 발생에 적합한 구조 및 화학 동화 포인트를 만들기위한 기하학의 상대적인 포인트의 단순한 예이다. 직교하여 보호된 U-B 선구물질은 U-B 선구물질에 공유 연결할 수 있는 활성화를 잇는 적절한 절단가능 링커 및 공-반응성 기를 포함하는 중합체 지지체/수지에 커플링된다.

이 시스템은 중합체-지지된 유기 화학의 원리를 이용한다. 원하는 중합체 성분의 이어지는 부착에 적합한 분지 코어를 발생하는 것으로 설명된 바와 같이, 분지 코어를 커플링하는 것은 정밀하게 구성된다(오직 처음 분지 포인트를 나타내고, 추가 분지 포인트는 존재하거나 존재하지 않을 수 있다). 또한, U 기를 볼 수 있는데, 이는 합성의 최초에 직교하여 보호된 U-B 선구물질의 부분으로서 제공되거나, 분지 코어 B의 동화 도중이나 후에 동화될 수 있다. 화중합체 성분의 부착이 수지에서 즉, 절단하기 전에, 달성될 수 있지만, 바람직한 경로는 중합체 성분을 이어서 부착하기 위해 정제될 수 있는 U-B 코어를 발생하도록, 중합체 지지체/수지로부터의 U-B 부분의 절단이다.

그림으로 설명된 바와 같이, 코어 기 B의 펜던트 분지 포인트는 작용기(Func)를 포함하도록 만들어지고, 이는 동일하거나 다를 수 있고, 가역적으로 보호되거나(PG,PG' 또는 PG'') 보호되지 않을 수 있다. 이러한 경우에, 중합체 성분의 부착을 위한 최종 단계는 펜던트 분지 포인트에서 작용기(Func)의 발생, 및기 U의 발생을 수반한다(도 7 참조). 도 5B는 링커를 갖는 중합체 지지체와 조합으로 보호된 U-B 선구물질이 이용되는 대안 방법을 나타낸다. 도 5B는 도한 미리 회합된 분지 코어 B의 부착, 및 중합체 성분의 이어지는 부착을 위한 U-B 부분을 만드는 U-기 발생 수지의 사용을 나타낸다.

도 6A-6D 는 U-B 코어에 이어서 부착을 위한 본 발명의 바람직한 실질적으로 비면역원성 수용성 폴리아미드 중합체-J^*성분을 발생하기 위한 고체 상 과정을 나타낸다. 고체 상 과정이 예증되었지만, 그것은 바람직한 방법이고, 용액 상 과정도 동일한 최종 결과를 달성하기 위해 채택할 수 있다. 도 6A 와 6B에서, 이산성 및 이아미노 단위는 고체 상 유기 화학의 원리를 사용하여 커플링된다. 선택적으로, 식- [NH-Y-NHCO-X-CO]-의 폴리아미드 구조를 갖는 최종 절단 생성물에서 기 X 와 Y의 추가적인 다양성을 위해, 보호된 아미노-X'-산 및/또는 아미노-Y'-산 단위가 포함될 수 있다. 도 6A는 N-내지 C-말단 방향에서의 합성을 나타내고, 반면에 도 6B는 C-내지 N-말단 방향에서의 합성을 나타낸다. 도 6C 및 6D에서, 보호된 아미노-X'-산 및/또는 아미노-Y'-산 단위는 고체 상 유기 화학의 원리를 사용하여 커플링된다. 도 6C는 N-내지 C-말단 방향에서 합성을 나타내고, 반면에 도 6D 는 C-내지 N 말단 방향에서의 합성을 나타낸다. 도 6A-6D로부터 명백하듯이, 최종 폴리아미드 생성물의 성질은 정확하게 조절될 수 있고, 그것은 합성을 위해 수행하는 사이클의 수에 의존한다. 게다가, 펜던트 기 J* 는 사실상 어떠한 사용자 정의된 명세사항으로 만들어질 수 있다. 단일 분산 반복 단위 X, Y, X' 및 Y'가 사용될때,최종 폴리아미드 생성물의 정확한 분자 구조는 정확하게 제어될 수 있다.

식 U-B-중합체-J*의 본 발명의 바람직한 합성 중합체 구조물을 생성하기 위한 중합체-J* 성분으로 U-B 성분을 커플링하기 위한 바람직한 과정은 도 7에 나타나있다. 나타낸바와 같이, 다양한 보호기가 제공될 수 있고, 선택적으로 주어진 구조물의 의도된 최종 사용에 의존하고 있다. 또한 고체 상 접근 및 용액 상 접근을 포함하여, 원하는 U-B-중합체-J* 구조물을 제조하기 위한 다른 경로가 예증된다.

위에서 주목한 바와 같이, 바람직한 수용성 반복 단위는 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리아미드 알킬렌 옥사이드, 또는 그것의 유도체를 포함한다. 가장 바람직한 수용성 반복 단위는 에틸렌 옥사이드를 포함한다. 식 -(CH₂-CH₂-O)-또한-(CH₂-CH₂-0)-. 그러한 수용성 반복 단위의 수는 매우 의미있게 변할 수 있지만, 그러한 단위의 더욱 바람직한 수는 2 내지 500, 2 내지 400, 2 내지 300, 2 내지 200, 2 내지 100, 2 내지 50, 및 보다 바람직하게는 2 내지 32이고, 3 내지 8 이 가장 바람직하다. 보다 바람직한 구체예의 예는 X 와 Y중 하나 또는 둘다가 :-((CH₂)_n1-(CH₂-CH₂-O)_n2-(CH₂)_n1-)-또는-((CH₂)_n1-(O-CH₂-CH₂)_n2-(CH₂)_n1-)인 것이고, 여기서 n1은 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4 및 가장 바람직하게는 1 내지 3, 여기서 n2 는 2 내지 50, 2 내지 25, 2 내지 15, 2 내지 10, 2 내지 8, 및 가장 바람직하게는 2 내지 5이다. 매우 바람직한 구체예는 X가 -(CH₂-CH₂)-이고, Y는 -(CH₂-(CH₂-CH₂-0)₃-CH₂-CH₂CH₂)- 또는 -(CH₂-CH₂-CH₂-(O-CH₂-CH₂)₃-CH₂)-이다. 더욱 바람직하게는 각각의 n이분리된 정수인 단일-분산 조성물이다. 매우 바람직한 구체예에서, X는 -(CH₂-CH₂)- 이고 Y 는 -(CH₂-(CH₂-CH₂-0)₃-CH₂-CH₂-CH₂)n- 또는 -(CH₂-CH₂-CH₂-(O-CH₂-CH₂)₃-CH₂)-n 여기서 n은 12 내지 36이다.

특히, 중합체는 바람직하게 가질 것이다. 수용성 중합체가 에틸렌 옥사이드 반복 단위와 같은 폴리알킬렌 옥사이드 반복 단위를 갖는 중합체 사슬을 함유할때, 각각의 사슬은 약 1500과 약 42,000 Da 사이의 분자량을 가지는 것이 바람직하고, 바람직하게는 약 2,000 내지 약 20,000 Da 사이가 가장 바람직하다.

바람직한 U 기는 화학적 라이게이션을 할수 있는 부분을 포함한다. 바람직한 중합체는 기 B가 3 이상의 팔을 포함할때 분지된다. 바람직한 성분 J^*는 생리학적인 조건하에서 이온화가능한 기를 포함하고, 가장 바람직하게는 음으로 하전된 것이다. U와 J 중 하나 또는 모두는 구조물의 무결성을 손상하지 않고 제거될 수 있는 보호기를 포함할 수 있다.

바람직한 스페이서 또는 링커는 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 알콕시 등을 포함하여, 지방족 부분들은 물론이고, 수용성 중합체, 다이아몬드 및 이산성 단위에 사용되는 하나 이상의 반복 단위를 포함하는 선형 또는 분지상 부분들을 포함하고 바람직하게는 18 이하의 탄소 원자 또는 추가적인 중합체 사슬을 함유한다.

주목한 바와 같이, 성분 U는 펩티드 또는 폴리펩티드와 같은, 타겟 분자 또는 관심의 다른 표면에 부착되어 있거나 부착될 수 있는 작용기의 잔기이다. U는타겟 분자에 결합하기 위한 잔기일때, U는 친핵성 기 또는 친전기 기를 포함하고, 타겟 분자는 각각 상호간에 반응성 친핵성 기 또는 친전기 기를 포함한다.

많은 그러한 상호간에 반응성인 작용기는 공지되어 있고 펩티드 및 폴리펩티드에 일반적인 측쇄 작용기, 또는 유도된 측쇄 작용기에 부착이 가능하다 (Zalipsky et al., Bioconjugate chemistry (1995) 6: 150-165;"Perspectives in Bioconjugate 화학", C. F. Meares, Ed., ACS, 1993; "chemistry of protein Conjugation 및 Cross-Linking", S. S. Wong, Ed., CRC Press, Inc. (1993)). 작용기의 예는 다음과 같은 아미노기와 반응할 수 있는 기를 포함한다: (a) p-니트로페닐, 또는 숙시니미딜과 같은 카보네이트; (b) 카르보닐 이미다졸; (c) 아즐락톤; (d) 고리 이미드 티온; 및 (e) 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트. 카르복실산 기 및 반응성 카르보닐 기와 반응할 수 있는 작용기의 예는 (a) 1차 아민; 또는 (b) 아실 히드라지드, 카르바제이트, 세미카르바메이트, 티오카르바제이트, 아미노옥시와 같은 히드라진 및 히드라지드 작용기 등을 포함한다. 메르캅토 또는 술프히드릴 기와 반응할 수 있는 작용기는 페닐 글리옥살, 말레이미드 및 할로겐을 포함한다. (카르복실) 산과 같은 히드록실기와 반응할 수 있는 작용기 또는 친전자성 중심과 반응할 수 있는 다른 친핵성물질의 예는 히드록실, 아미노, 카르복실, 티올 기, 활성 메틸렌 등을 포함한다.

예를 들어, 상기 중합체는 타겟 분자에 부착하기 위한 작용기로서 성분 U를 수행하기 위해 제조될 수 있고, 여기서 작용기는 아크릴레이트, 알데히드, 케톤, 아미노옥시, 아민, 카르복실산, 에스테르, 티오에스테르, 할로겐, 티올, 시아노아세테이트, 디팔미토일 소스파티딜에탄올아민, 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, 에폭시드, 히드라지드, 아지드, 이소시아네이트, 말레이미드, 메타크릴레이트, 니트로페닐 카보네이트, 오르쏘피리딜 디술피드, 실란, 술프히드릴, 비닐 술폰, 숙시니미딜 글루타레이트, 숙시미딜 숙시네이트, 숙신산, 트레실레이트 등이다. U는 또한 활동가능 형태, 예를 들어, 아민과 같은 뉴클레오필레와 반응할 수 있는 그들의 활성 에스테르로 변환될 수 있는 카르복실산의 형태로 제공될 수 있다.

바람직한 구체예에서, U는 타겟 분자에서 유일한 작용기와 선택적으로 반응하는 유일한 작용기의 잔기이다. 본 발명의 이러한 양태는 섹션 II에서 상기 논의된 바와 같이, 펩티드 합성(보호 기 전략) 및 화학적 라이게이션(부분적 또는 보호기 없는 전략)의 원리를 구체화한다. 따라서, U는 상기한 것들과 같은, 넓은 범위의 작용기의 잔기를 나타낼 수 있다. 바람직한 U 기는 아민 포획 전략(예를 들어, 헤미아미날(hemiaminal) 형성에 의해, 이민 형성에 의해, Michael 첨가에 의한 라이게이션), 티올 포획 전략들(예를 들어, 메르캅티드 형성, 디술피드 교환에 의한 라이게이션), 천연 화학 라이게이션 전략(예를 들어, 시스테인 또는 티올을 수반하는 티오에스테르 교환에 의한 라이게이션은 측쇄 아미노산 유도체를 함유한다) 및 직교 라이게이션 커플링 전략(예를 들어, 타이졸리딘 형성에 의한, 티오에스테르 교환에 의한, 디술피드 교환에 의한, 아미드 형성에 의한 라이게이션)에 잘 따른다. (예를 들어, Coltart, DM., Tetrahedron (2000) 56: 3449-3491 참고). 특히 바람직한 U는 상기 섹션 II에 기술된 바와 같은 수성 상용성 화학적 라이게이션 화학에 사용되는 유일한 작용기의 잔기를 포함한다. 따라서, U는 카보네이트, 에스테르, 우레탄, 오르쏘에스테르, 아미드, 아민, 옥심, 이미드, 유레아, 티오유레아, 티오에테르, 티오우레탄, 티오에스테르, 에테르, 타이졸리딘, 히드라존, 옥사졸리딘 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 결합을 형성할 수 있는 작용기가 될 수 있다. 바람직한 결합은 옥심과 아미드 결합이다.

위에서 주목한 바와 같이, B는 3 이상의 원자를 갖는 분지 코어 부분이고, 존재할 수도 있고 없을 수도 있다. B가 존재할때, 하나의 팔은 U 또는 에 결합되거나 스페이서나 링커가 U에 부착되고, 각각의 다른 팔은 중합체에 결합되거나 스페이서나 링커가 중합체에 부착된다. 분지 코어 B의 예는 이것으로 제한되지는 않지만, 아미노, 아미드, 카르복실 및 그들의 조합을 포함한다. 이들은 리신 등의 올리고아미드, 또는 알칸디아민과 아크릴산 ("폴리아미도아민")으로부터 제조된 올리고머를 포함하고, 후자는 분지 코어에서 순 양 전하를 제공한다. (예를 들어, Zeng et al., J. Pept. Sci. (1996) 2: 66-72; Rose et al., Bioconjugate Chem., (1996) 7 (5): 552-556; NovoBiochem Catalog 및 펩티드 Synthesis Handbook,Laufelfingen, 2001; Wells et al., Biopolymers (1998) 47: 381-396 ; Mahajan et al., (1999) 40: 4909-49-12; Judson et al. (1998) 39: 1299-1302; Swali et a/., (1997) 62: 4902-4903;US Patent Nos. 5,932,462,5,919,455,5,643,575,5,681,567 참고). 많은 다른 분지 코어가 사용될 수 있고 이러한 목적에 적합하며, 치환된 디아민, 치환된 이산, 글리세롤 및 다가 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴을 포함하여, 3 이상의 작용 또는 활성가능 기를 갖는 다른 부분 및 알콕시 부분과 같은 알킬산 및 올리고사카리드을 포함한다(예를 들어,Nierengarten et al., Tetrahedron Lett. (1999) 40: 5681-5684; Matthews et al., Prog. Polym. Sci. (1998) 1-56; Suner et a/., Macromolecules (2000) 33: 253; Fischer et a/., Angew. Chem. Int. Ed. (1999) 38: 884; Sunder et al., Adv. Mater. (2000) 12: 235; Mulders et al., Tetrahedron Lett. (1997) 38: 631-634; Mulders et al., Tetrahedron Lett. (1997) 38: 30-3088; 및 Turnbull et al., Chembiocehm (2000) 1 (1) : 70-74). 중합체 성분에 연결된 가장 바람직한 분지 코어는 아미드 결합에 의해 결합된다.

바람직한 분지 코어는 아미노, 카르복실 또는 혼합된 아미도 및 카르복실 작용기로부터 나온다. 바람직한 분지 코어의 예는 각각 리신 아미노 코어, 아스파르트 또는 글루탐산 분지 코어, 및 감마-글루탐산 분지 코어이다. 게다가, 분지가 중합체 백본을 따라 분포된 다중 분지 코어의 서열로부터 나오는 웜-같은 구조처럼, 다른 부류의 분지된 구조물이 사용될 수 있다(Schluter et a/., Chem. Int. Ed. (2000) 39: 864). 화학적 조성물 및/또는 중합체 백본의 부피감에 의존하여, 생성되는 웜-같은 구조는 수용성이거나 또는 액체 결정 조직을 유발하는 경향이 있도록 설계될 수 있고, (Ouali et al., Macromolecules (2000) 33: 6185), 그것은 운반 용도, 안정성 및 작동의 지속에 이점이 될 수 있다. 본 발명의 다른 분지상 중합체 구조물에 대해, U를 포함하는 펜던트 작용기를 함유하도록 웜-같은 구조물이 만들어진다.

중합체 성분, 또는 하나 이상의 스페이서 또는 링커는 예를 들어, 섹션 I에서 상기 논의한 바와 같이, 생안정성 또는 생화학분해가능한 중합체 사슬 또는 사이공간을 차지하는 링커 또는 결합을 포함할 수 있다. 또한,섹션 I에서 주목한 바와 같이, 음, 양 및 중성으로 구성되는 군으로부터 선택되는 생리학적 조건하에서 성분 J^*는 순 전하를 갖는 펜던트 기의 잔기이다. 가장 바람직하게는 J^*는 이온화가능한 카르복실레이트 부분을 포함하고 생리학적 조건하에서 순 음 전하를 갖는다. 성분 s1, s2 및 s3는섹션 I에서 논의한 것들과 같이, 동일하거나 다를 수도 있는 스페이서나 링커이고, 개별적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 가장 바람직하게는 스페이서 또는 링커는 중합체 사슬을 포함하고, 여기서 스페이서나 링커는 식 -[CO-NH-X-NH]n-의 하나 이상의 반복 단위를 포함한다.

IV. 약학:

본 발명의 중합체 번형된 합성 적혈구생성 자극 단백질은 질병 및 상태의 치료에 작용하도록 약학 약제로서 사용될 수 있다. 따라서, 또다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질, 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학적 조성물을 끌어낸다. 그러한 약학적 조성물은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 바람직한 부형제는 완충제, 담체 단백질, 아미노산, 청정제, 지질, 수용성 중합체 및 방부제로 구성되는 군으로부터 선택된다. 약학적 제제는 또한 합성 적혈구생성 자극 단백질 외에, 하나 이상의 추가적인 생물활성 약제와 같은, 하나 이상의 첨가 활성 약학 성분들(예를 들어, 작은 유기 분자, 다른 단백질 치료제 등)을 결합시킬 수 있다. 그러한 약학적 조성물은 본 발명의 바람직한 방법에서 채택될 수 있다. 이들은 포유 동물, 적혈구 헤마토크릿, 헤모글로빈및 망상 적혈구 카운트에서의 제조를 증가시키는 방법을 포함한다. 이들 방법은 원하는 효과를 관찰하기 위해 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질의 유효량을 포유 동물로 투여하는 것을 포함한다.

가장 바람직하게는, 치료가 필요한 환자 또는 개인에게 투여할때, 그러한 합성 적혈구생성 자극 폴리펩티드 및/또는 단백질은 약물 수송 시스템을 사용하여 투여될 것이다. 그러한 시스템 용도는 그들이 수용가능하도록 하고 원하는 생물활성의 효과를 강화하는 방식으로 환자에게 약물이 투여되도록 해준다. 본 발명의목적은, 바람직한 약물 수송 시스템은 폴리펩티드 또는 단백질 바이아웃을 경구, 경비 또는 흡입 경로 또는 근육내로, 피하로, 경피로, 정맥내, 인트라우랄 또는 안내로 투여할 수 있는 시스템을 포함한다.

그러한 약물 수송 시스템은 부위 특이성 방출을 제공하거나, 장 점막에 대한 보호를 강화하는 제제를 포함할 수 있다. 적절한 제제는:건조 분말 제제, 바이러스 입자 캡슐화를 통한 운반, 리포솜 캡슐화, 경피 패치, 전기적으로 보도된 운송(전기충격 요법) 및 중합체/니아존 결합을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 그러한 약물 수송 장치는 생물학적 환경에서 변화에 반응할 것이고 이들 변화에 기반한 약물을 운반하고-또는 운반을 멈추고-운반할 것이다. 재료의 범위는 약물 및 다른 활성 약제의 방출을 조절하도록 채택되어왔다: 친수성 및 강도를 위한 폴리 (우레탄), 폴리 (실옥산), 폴리 (메틸 메타크릴레이트), 폴리 (비닐 알코올), 폴리 (에틸렌), 폴리 (비닐 피롤리돈), 폴리 (2-히드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리 (n-비닐 피롤리돈), 폴리 (메틸 메타크릴레이트),폴리 (비닐 알코올), 폴리 (아크릴산), 폴리아크릴아미드, 폴리 (에틸렌-co-비닐 아세테이트), 폴리 (에틸렌 클리콜), 폴리 (메타크릴산), 등. 더욱 바람직한 구체예에서, 생물분해성 중합체는 약물 수송을 촉진하기 위해 채택될 것이다. 그러한 중합체는 폴리락티드 (PLA), 폴리클리콜리드 (PGA), 폴리 (락티드-co-클리콜리드) (PLGA), 폴리안히드리드, 및 폴리오르쏘에스테르를 포함한다. 약물 수송 장치 및 그들의 사용 방법은 미국 특허; 6,072,041; 6,041,253; 6,018,678; 6,017,318; 6,002,961; 5,879,712; 5,849,331; 5,792,451; 5,783,212; 5,766,633; 5,759,566; 5,690,954; 5,681,811; 5,654,000; 5,641,511; 5,438,040; 4,810,499; 및 4,659,558에 기술되어 있다.

따라서, 본 발명의 또다른 양태는 치료에 유효한 양의 본 발명의 중합체 변형 합성 적혈구생성 자극 단백질, 또는 약학적으로 허용되는 그것의 염을 포함하는 화합물을 투여함으로써, 그것을 필요로하는 포유 동물을 치료하는 약학적 조성물 및 방법에 관한 것이다. "약학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 효과 및 특성들을 지니고 생물학적이지 않거나 그렇지 않으면 바람직하지 않은 염을 의미하도록 의도된다. 염은 산이나 염기로부터 유도될 수 있다. 산 부가 염은 염화수소산, 브롬화수소산, 황산 (페이트 및 비술페이트 염을 내줌), 질산, 인산 등과 같은 무기 산 및 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 살리실산, p-톨루엔술폰산, 등과 같은 유기산으로부터 유도된다. 염기 부가 염은 무기 염기로부터 유도될 수 있고, 나트륨,칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘 염 등을 포함한다. 유기 염기로부터 유도된 염은 1차, 2차 및 3차 아민, 자연적으로 발생하는 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 트로메타민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 히드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, N-알킬글루카민, 테오브로민, 푸린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘 등을 포함하여, 고리식 아민으로부터 형성된 것들을 포함한다. 바람직한 유기 염기는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 피페리딘, 트로메타민 및 콜린이다.

여기서 사용된 바와 같이 용어 "치료"는 포유 동물 특히 사람에서의 질병 또는 상태(예를 들어,빈혈)의 어떠한 치료를 다루고, (i)질병의 상태가 되기 쉬울 수 있지만, 아직 병을 가진것으로 진단되지는 않은 피험자에서 질병 또는 상태가 발생하는 것을 막는것 (ii)질병이나 상태를 억제하는 것, 즉 그것의 발전을 저지하는 것 또는 (iii) 질병 또는 상태를 경감시키는 것 즉, 그것의 증상의 경감 또는 개선을 유발하는 것을 포함한다.

여기서 사용된 바와 같이 용어 "적혈구생성 자극 단백질로 치료함으로써 예방하거나 완화되는 포유 동물에서 질병 상태"는 일반적으로 적혈구생성 자극 단백질로 보통 치료되는 것으로 당업계에 통상적으로 알려져있는 모든 질병 상태를 커버하도록 의도되며, 그러한 질병 상태는 본 발명의 특정 화합물로 치료함으로써 유용하게 예방되거나 경감되는 것으로 밝혀진 상태이다. 이들은 제한이 아닌 예증에 의해, 빈혈, 베타 탈라세미아, 악성빈혈, 겸상 적혈구성 병증, 만성 세균성 심내막염, 골수염, 아동 류머티즘성 관절염, 류마티스열, 크론 병, 궤양성 대장염 등을 포함한다.

여기서 사용된 바와 같이, 용어 "치료에 유효한 양"은 그것을 필요로하는 포유 동물에게 투여될때, 예를 들어, 적혈구 제조의 유도 효소, 항 빈혈제 등과 같이 치료에 작용하는데 충분한 중합체 변형 합성 적혈구생성 자극 단백질의 양을 말한다. "치료에 효과적인 양"을 구성하는 양은 단백질 유도체, 상태 또는 질병 및 그것의 심각도, 그리고 치료되는 포유 동물, 그것의 중량, 나이 등에 의존하여 변할 것이다. 여기서 사용된 바와 같이, 용어 "q.s"는 상태 함수를 달성하는데 충분한 양을 첨가하는 것, 예를 들어, 원하는 부피로 (예를 들어, 100mL) 용액을 가져가는 것을 의미한다.

본 발명의 중합체 변형 합성 적혈구생성 자극 단백질 및 약학적으로 허용가능한 염, 즉, 활성 성분이 치료에 효과적인 투약량으로 투여되고, 즉, 그 양은, 상기한 바와 같이, 그것을 필요로하는 포유 동물에 투여될때, 치료 작용을 하기에 충분한 것이다. 여기서 설명된 합성 적혈구생성 자극 단백질의 투여는 유사한 유용성으로 작용하는 약제를 위한 어떠한 허용되는 모드를 통해 가능하다. 여기서 사용된 바와 같이, 용어 "본 발명의 중합체 변형 합성 적혈구생성 자극 단백질" "본 발명의 폴리펩티드의 약학적으로 허용가능한 염" 및 "활성 성분" 이 상호교환하여 사용된다.

제제에서 중합체-변형 합성 적혈구 생성 자극 단백질의 수준은 당업자들에 의해 채택된 모든 범위내에서 예를 들어, 약 0.01 퍼센트 중량(%w) 내지 약99.99%w의 총 제제에 기반하는 단백질 길항제 또는 작용제 및 약 0.01 %w 내지 99.99%w 부형제에서 변할 수 있다. 보다 전형적으로는, 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질은 약 0.5%w 내지 약 80%w의 수준에서 존재할 것이다.

사람 투약량 수준이 아직 본 발명의 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질에 대해 최적화되지 않았지만, 일반적으로, 투여되는 화합물의 양은 물론, 예방 또는 경감을 위해 표적화된 피험자와 질병 상태, 고통의 성질 또는 심각성, 투여의 방식과 스케줄 및 처방하는 의사의 판단에 의존할 것이다. 그러한 용도 최적화는 당업자들의 지식의 범위내에 잘 있다.

투여는 어떤 허용된 전신 또는 국부 경로에 의해, 예를 들어 비경구, 경구(특히 유아용 조제물에 대해), 정맥내, 비강, 기관지 흡입(즉, 에어로졸 조제물), 경피 또는 국소적 경로에 의해, 고체, 반고체 또는 액체 형태, 또는 에어로졸 투약 형태로, 예를 들어 정제, 알약, 캡슐, 분말, 액체, 용액, 에멀젼, 주사가능 물질, 현탁액, 좌약, 에어로졸 등으로 행해질 수 있다. 또한, 본 발명의 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질은, 정해진 속도의 연장된 폴리펩티드의 투여를 위해서 저장 주사, 삼투 펌프, 알약, 경피(전기수송을 포함) 패치 등을 포함한, 지속- 또는 제어-방출 투약 형태로, 바람직하게는 정확한 투약의 단일 투여에 적합한 단위 투약 형태로 투여될 수 있다. 조성물은 종래의 제약학적 담체 또는 부형제, 및 본 발명의 단백질 길항제 또는 작용제를 포함할 것이며, 여기에 더하여 다른 의약 제제, 제약학적 제제, 담체, 보조제 등을 포함할 수 있다. 담체는 석유, 동물, 야체 또는 합성 기원의 기름을 포함하는 여러 가지 기름, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 미네랄오닐, 참깨유 등으로부터 선택될 수 있다. 물, 살린, 수성 덱스트로스, 및 글리세롤이 주사가능한 용액에 특히 바람직한 액체 담체이다. 적합한 제약학적 담체는 녹말, 셀룰로스, 활석, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 호분, 실리카겔, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화나트륨, 건조 탈지우유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 다른 적합한 제약학적 담체 및 그것들의 조제물은 E. W. Martin의 "레밍턴 제약 과학"에 설명된다.

원한다면, 투여될 제약학적 조성물은 또한 소량의 비독성 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등, 예를 들어 나트륨 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 포함할 수 있다.

더 이상의 활성 성분이 필요할 수 있지만, 경구 투여가 편리한 일일 투약 섭생을 사용하여 본 발명의 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질을 전달하기 위해 사용될 수 있으며, 이것은 원하는 예방의 정도 또는 고통의 완화에 따라서 조정될 수 있다. 그러한 경구 투여에 대해서, 제약학적으로 허용되는 비독성 조성물은 보통 사용되는 부형제, 예를 들어 제약학적 등급의 만니톨, 락토스, 녹말, 포비돈, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로스, 크로스카멜로스 나트륨, 글루코스, 젤라틴, 수크로스, 마그네슘 카르보네이트 등 중 어느 것의 혼합에 의해 형성된다. 그러한 조성물은 용액, 현탁액, 분산성 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속-방출 조제물 등의 형태를 취한다. 경구 조제물은 위장 질환의 치료에 특히 적합하다. 일반적인 전신 목적을 위한 경구 생체이용율은, 아세틸화 아미노산을 포함하는 조제물과 같은, 전신 순환에서 흡수를 개선하는 부형제를 이용함으로써 조정될 수 있다. 예를 들어, US 5,935,601 및 US 5,629,020 참조.

조성물은 캡슐, 알약 또는 정제의 형태를 취할 수 있으며, 따라서 조성물은 활성 성분과 함께, 락토스, 수크로스, 디칼슘 포스페이트 등과 같은 희석제; 크로스카멜로스 나트륨, 녹말 또는 그것의 유도체와 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 등과 같은 윤활제; 녹말, 폴리비닐피롤리돈, 검 아카시아, 젤라틴, 셀룰로스 및 그것의 유도체 등과 같은 바인더를 함유할 것이다.

제약학적으로 투여가능한 액체 조성물은, 예를 들어 본 발명의 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질(약 0.5% 내지 약 20%) 및 선택적으로 제약학적 애쥬번트를, 예를 들어 물, 살린, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 글리콜, 에탄올, 보존제 등과 같은 담체에 용해, 분산 등을 행하여, 용액 또는 현탁액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 원한다면, 투여될 제약학적 조성물은 또한, 습윤제, 현탁제, 유화제 또는 용해제, pH 완충제 등과 같은 비독성 보조 물질, 예를 들어 나트륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트, 시클로덱스트린 유도체, 폴리옥시에틸렌, 소르비탄 모노라우레이트 또는 스테아레이트 등을 소량 함유할 수 있다. 그러한 투약 형태를 제조하는 실제 방법은 공지되어 있거나, 또는 당업자에게 분명할 것이다. 예를 들어, 레밍턴 제약 과학(Mack Publishing Company, 펜실베니아 이스톤) 참조. 어쨌든 투여될 조성물 또는 조제물은 치료될 피험자의 증상을 예방 또는 완화하는데 효과적인 양으로 활성 성분을 함유한다. 유아에게 경구 투여하기 위해서는 액체 조제물(시럽 또는 현탁액과 같은)이 바람직하다.

액체를 함유하는 고체 투약 형태에 대해서, 예를 들어 프로필렌 카르보네이트, 식물유 또는 트리글리세라이드 중의 용액 또는 현탁액이 바람직하게 젤라틴 캡슐에 넣어진다. 액체 투약 형태에 대해서, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 중의 용액이 투여를 위해서 쉽게 측정되는 충분한 양의 제약학적으로 허용되는 액체 담체, 예를 들어 물과 함께 희석될 수 있다.

또는 달리, 액체 또는 반고체 경구 조제물이 활성 성분을 식물유, 글리콜, 트리글리세라이드, 프로필렌 글리콜 에스테르(예를 들어, 프로필렌 카르보네이트) 등에 용해 또는 분산시키고, 이들 용액 또는 현탁액을 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐 껍질에 넣음으로써 제조될 수 있다.

상기 상태의 치료에 본 발명의 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질을 적용하는데 있어서, 본원에 설명된 활성 성분의 투여는 바람직하게 비경구적으로 투여된다. 비경구 투여는 일반적으로 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의해 특징지어지며, 피내 또는 복강내 주사 뿐만 아니라, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함할 수 있다. 주사가능 물질은 종래의 형태로서, 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전에 액체에 용해하여 용액 또는 현탁액을 만들기에 적합한 고체 형태, 에멀전 또는 생체적합성 중합체-기재 미세구(예를 들어, 리포솜, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 폴리(D, C) 락타이드 등)로 제조될 수 있다. 적합한 부형제는, 예를 들어 물, 살린, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 여기에 더하여, 원한다면 투여될 제학학적 조성물은 또한, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 용해성 증진제, 단백질 캐리어 등, 예를 들어 나트륨 아세테이트, 폴리옥시에틸렌, 소르비탄 모노라우레이트,트리에탄올아민 올레에이트, 시클로덱스트린, 혈청 알부민 등과 같은 비독성 보조 물질을 소량 함유할 수 있다.

본 발명의 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질은, 예를 들어 화합물을 적합한 용매(물 또는 살린과 같은)에 용해시키거나, 또는 리포솜 조제물에 혼합한 후 허용되는 주입 유체로 분산시킴에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 전형적인 일일 용량은 1회 주입, 또는 주기적인 간격에 걸쳐 사이를 둔 일련의 주입에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투여에 대해서, 수용성 형태, 예를 들어 수용성 염의 형태인 활성 성분의 수용액, 또는 점도-증가 물질, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란, 및 원한다면 안정제를 함유하는 수성 주사 현탁액이 특히 적합하다. 또한, 활성 성분은 선택적으로 부형제와 함께 동결건조물의 형태일 수 있으며, 적합한 용매를 첨가함으로써 비경구 투여 전에 용액으로 만들어질 수 있다.

비경구 투여에 대한 더욱 최근에 고안된 접근법은 느린-방출 또는 지속-방출 시스템의 이식을 사용하며, 이로써 일정한 투약 수준이 유지된다. 예를 들어, 본원에 참고자료로 수록된 US 3,710,795, US 5,714,166 및 US 5,041,292를 참조한다.

그러한 비경구 조성물에 함유된 활성 성분의 퍼센트는, 그것의 특이적 성질 뿐만 아니라, 폴리펩티드의 활성 및 피험자의 필요에 매우 좌우된다. 그러나, 용액 중에서 0.01% 내지 10%의 활성 성분 퍼센트가 사용 가능하며, 만일 조성물이 이후에 상기 퍼센트로 희석될 고체라면 퍼센트는 더 높을 것이다. 바람직하게, 조성물은 용액 중에 0.02% 내지 8%의 활성 성분을 포함할 것이다.

본 발명의 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질을 투여하는 다른 방법은 거환 주사 및 연속 주입을 이용한다.

에어로졸 투여가 본 발명의 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질을 기도로 직접 전달하는 효과적인 수단이다. 이 방법의 일부 이점은 1) 효소 분해의 효과, 위장관에서의 불량한 흡수, 또는 간 일차-통과 효과로 인한 치료제의 손실을 피하고; 2) 활성 성분의 분자 크기, 전하 또는 폐-외 부위에 대한 친화성으로 인해 다른 식으로는 기도에 있는 그것들의 표적 부위에 도달할 수 없는 활성 성분을 투여하고; 3) 허파꽈리를 통해 신체로의 빠른 흡수를 제공하고; 4) 노출이 바람직하지 않은 부작용을 일으킬 수 있는 경우 중요한, 활성 성분에 다른 기관계통이 노출되는 것을 피한다는 점이다. 이들 이유 때문에, 에어로졸 투여는 천식, 폐의 국부 감염, 및 폐 및 기도의 다른 질환 또는 질환 상태의 치료에 특히 유리하다.

3가지 종류의 제약학적 흡입 장치가 있는데, 분무 흡입기, 계량 흡입기 및 건조 분말 흡입기이다. 분무기 장치는 고속의 공기 흐름을 야기하며, 이로써 단백질 유도체(이것은 액체 형태로 조제되었다)가 안개로서 분무되어 환자의 기도로 운반되게 된다. 계량 흡입기는 전형적으로 압축 기체와 함께 패키지된 조제물을 가지며, 작동시 압축 기체에 의해 측정된 양의 폴리펩티드를 배출함으로써, 한 세트의 제제의 양을 투여하는 믿을 수 있는 방법을 제공한다. 건조 분말 흡입기는 이 장치에 의해 숨쉬는 동안 환자의 공기-흐름 내로 분산될 수 있는 자유롭게 흐르는 분말의 형태로 폴리펩티드를 투여한다. 자유롭게 흐르는 분말을 달성하기 위해서, 단백질 유도체는 락토스와 같은 부형제와 함께 조제된다. 측정된 양의 단백질 유도체는 캡슐 형태로 저장되고, 각 작동에 대해 환자에게 분배된다. 상기 방법은 모두 본 발명을 투여하는데 사용될 수 있다.

또한, 리포솜에 기초한 제약학적 조제물이 본 발명의 중합체-변형 합성 적혈구생성 자극 단백질과 함께 사용하는데 적합하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,631,018, US 5,723,147, 및 5,766,627 참조. 리포솜의 이익은 약물의 리포솜 포착으로 인한 조직 분포 및 약물동태학 파라미터에서의 유리한 변화와 관련된다고 여겨지며, 당업자에 의해 본 발명의 폴리펩티드에 적용될 수 있다. 또한, 주사 또는 경구 투여용의 제어-방출 리포솜 액체 제약학적 조제물이 사용될 수 있다.

좌약에 의한 전신 투여에 대해서, 통상의 바인더 및 캐리어는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 또는 트리글리세라이드, 예를 들어 PEG 1000(96%)과 PEG 4000(4%)를 포함한다. 그러한 좌약은 약 0.5w/w% 내지 약 10w/w%, 바람직하게 약 1w/w% 내지 약 2w/w% 범위의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.

본 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허 출원은, 개개의 공보 또는 특허 출원이 참고문헌으로서 수록되도록 구체적이고도 개별적으로 지시되었던 것과 동일한 규모로 본원에 참고자료로서 수록된다. 본 발명의 배경에 대한 논의가 본 발명의 배경을 설명하기 위해 본원에 포함된다. 이것이 언급된 물질 중 어느 것이 공개되거나, 공지되거나, 또는 청구항 중 어느 것의 우선일을 가지는 전세계 어느 곳에서든지의 선행기술 또는 통상의 일반적 지식의 일부라는 것을 승인하는 것은 아니다. 이제 본 발명을 일반적으로 설명하였으며, 그것이 다음에 실시예를 참고하여 더 쉽게 이해될 것이다. 실시예는 예로서 제공되며, 명시되지 않는다면 본 발명을 제한하지 않는다.

발명의 개요

본 발명은 합성 적혈구생성 자극 단백질, 그들의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 여기에 부착된 하나 이상의 수용성 중합체를 갖는 합성 적혈구생성 자극 단백질을 지시한다. 또한 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명은 본 발명의 중합체 변형된 적혈구생성 합성 포유 동물을 치료하는 방법을 더욱 지시한다. 한가지 구체예에서, 헤마토크릿을 증가시키기 위해 방법이 제공된다. 또다른 구체예에서, 방법은 포유 동물에서 적혈구의 제조를 증가시키기 위한 방법이 제공된다. 또다른 구체예는 포유 동물에서 헤모글로빈을 증가시키기 위한 방법을 지시한다. 더 나아간 구체예는 포유 동물에서 망상적혈구 수를 증가시키기 위한 방법을 지시한다. 이들 방법은 원하는 효과를 달성하기 위해 본 발명의 중합체 변형된 합성 적혈구생성 자극 단백질의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.

바람직한 중합체 변형된 형태, 및 중간체를 포함하여, 본 발명의 합성 적혈구생성 자극 단백질의 제조 방법이 또한 제공된다. 방법은 중복되지 않는 아미노산 서열을 포함하는 화학적으로 펩티드 단편을 라이게이션하는 것을 포함하고, 그로써 합성 적혈구생성 자극 단백질을 포함하는 폴리펩티드 사슬이 제조된다.

약어

Acm = 아세트아미도메틸 티올-보호 기 [즉,-CH₂NHCOCH₃]

AoA = 아미노옥시아세틸

Arg (Tos) = L-아르기닌 (측쇄 N^G톨루엔술포닐-보호됨)

ART = 절대 망상적혈구 수

Asp (cHex) = L-아스파르트산 (측쇄 시클로헥실 에스테르-보호됨)

AUC = 곡선 아래 면적

Boc = tert. 부톡시카르보닐

CD = 원형 이색성

CDI 카르보닐디이미디아졸

CHO = 중국 햄스터 난소

CL = 제거 (mL/hr/kg)

Cmax = 최대 농도

Cys (4MeBzl) = L-시스테인 (측쇄 (4-메틸) 벤질-보호됨)

Cys (Acm) = L-시스테인 (측쇄 아세트아미도메틸 [즉,-CH₂NHCOCH₃]-보호됨)

DCM = 디클로로메탄

DIC = 디이소프로필카르보디이미드

DIEA = 디이소프로필에틸아민

DMF = 디메틸포름아미드

DMSO = 디메틸술폭시드

DPC = 도데실포스포콜린

Dpr = L-1,2디아미노프로피온산

ED50 = 50% 최대 효과에 도달하는데 필요한 효과적인 투여량

EDA = (4,7,10)-트리옥사트리데칸-1,13디아민

ELISA = 효소-연결된 면역분석

EPO = 에리스로포이에틴

ES-MS = 전자스프레이 이온화 질량 분석

FBS = 태아 소과 혈청

Glu (cHex) = L-글루탐산 (측쇄 시클로헥실 에스테르-보호됨)

GM-CSF = 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자

HATU = 0-(7-아자벤조트리아졸-1-yl)-1,1,3,3-테트라메틸암모늄 헥사플루오로포스페이트

HCT = 헤마토크릿

HGB = 헤모글로빈

His (Dnp) = L-히스티딘 (측쇄 N^lm디니트로페닐-보호됨)

HOBT = N-히드록시벤조트리아졸

HPLC = 높은 압력 액체 크로마토그래피

IMDM = Iscove의 변형된 Dulbecco의 매질

IPA = 이소프로판올

Lev = 레불린 산

Lys (CIZ) = L-리신 (측쇄 2-클로로벤질옥시카르보닐)-보호됨

MBHA = 4-메틸벤즈히드릴아민

MRT = 평균 잔류 시간

MTT = 4-메틸트리틸

MTT = 티아졸일 블루

NHS = N-히드록시숙시니미드

-OCH2-Pam-수지 =-O-CH₂-Bz-CH₂CONHCH₂(코폴리스티렌 디비닐벤젠)-수지

Pbo = 4-(CH₃S(O)-)벤질

PBS = 포스페이트 완충처리된 살린

PCV = 압축된 세포 체적

RBC = 적혈구

RET = 망상적혈구

rhEPO = 재조합 사람 EPO

RSA = 래트 혈청 알부민

SDS = 나트륨 도데실 술페이트

SDS-PAGE = SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기이동

SEP = 합성 전기이동 단백질

Ser (Bzl) = L-세린 (측쇄 벤질-보호됨)

실시예 1

합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-0의 합성

합성 적혈구생성 자극 단백질(SEP)을 합성하였다. 전-길이 합성된 단백질의 서열(SEP-0(1-166)으로 표시)은 다음과 같다:

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EHCSLNEKIT

VPETKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL

LVKSSQPWψP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAIS

PPDAASAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR (SEQ ID NO:1)

여기에서 ψ는 술프히드릴기에서 카르복시메틸화된 시스테인으로 구성된 비-천연 아미노산 잔기를 나타낸다. SEP-0 단백질은 다음의 네 폴리펩티드 단편으로부터 용액내에서 합성하였다:

단편 SEP-0:1 (GRFN 1711; SEQ ID NO:1의 잔기 1 내지 32로 구성됨)

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-티오에스테르

단편 SEP-0:2 (GRFN 1712, SEQ ID NO:1의 잔기 33 내지 38로 구성됨)

CSLNEKITVP DTKVNFYAWK RMEVGQQAVE VWQGLALLSE

AVLRGQALLV KSSQPW-티오에스테르 (여기에서 Cys³³은 Acm 보호된다)

단편 SEP-0:3 (GRFN 1713, SEQ ID NO:1의 잔기 89 내지 116으로 구성됨)

CPLQLHVDKA VSGLRSLTTL LRALGAQK-티오에스테르 (여기에서 Cys⁸⁹는 Acm 보호된다)

단편 SEP-0:4 (GRFN 1714, SEQ ID NO:1의 잔기 117 내지 166으로 구성됨)

CAISPPDAAS AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY

TGEACRTGDR-카르복실레이트 (여기에서 C-말단 시스테인 (Cys¹⁶¹)은 피콜릴 (피코) 보호기를 지닌다)

펩티드 SEP-0:1 및 SEP-0:2 및 SEP-0:3은, ABI433A 자동 펩티드 합성기에서 티오에스테르-생성 수지에 결합하여 Boc (tert-부톡시카르보닐) 화학법 및 확립된 SPPS, 측쇄 보호 및 티오에스테르-수지 전략 (Hackeng,et al., PNAS (1999) 96: 10068-10073; Schnolzer,et al., Int. J. Pept. Prot. Res., (1992) 40: 180-193))을 이용한 순차적 고체상 펩티드 합성 (SPPS)을 위한 제자리 (in situ) 중성화 프로토콜로써, 또는 수동 연쇄 회합로 합성하거나, 시중 공급체로부터 주문 공급받았다. 예를 들어, Boc SPPS 보호기의 표준 세트를 사용하였다: 즉, Arg(Tos); Asp(cHex); Cys(4MeBzl) & Cys(Acm); Glu(cHex); His(DNP); Lys(ClZ); Ser(Bzl); Thr(Bzl); Trp(포르밀); Try(BrZ); Met, Asn, Gln을 측쇄 비보호하였다. 단편 SEP-0:4는 -OCH₂-Pam-수지 상에서 유사하게 합성하였다. 표준 Boc 화학 방법에 따라서HF/p-크레졸을 이용하여 펩티드를 탈보호화하고 수지 지지체로부터 동시에 절단하였다; 그러나, HF/p-크레졸에서 제거되지 않은 보호기를 함유한 펩티드를 위해, 보호기를 유지하였다. 예비 C4 역상-고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 펩티드를 정제하였다. ES-MS (전자분무 이온화 질량 분석법)을 이용하여 순수한 펩티드를 함유한 부분을 식별한 후, 이후의 라이게이션을 위해 모아서 동결건조하였다.

단계 1: 라이게이션 #1단편 SEP-0:4 및 단편 SEP-0:3을 15 mM 농도로 TFE에 용해하였다. 6 M 구아니디늄 클로라이드 및 1% 티오페놀을 함유한 표준 인산 완충용액 (pH 7.9)를 첨가하고, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻었다. 라이게이션 후, 라이게이션 혼합물을 2ml TFE (트리플루오로에탄올), 6 ml 6M 구아니디늄 클로라이드, 25% β-머캅토에탄올을 함유한 100 mM 인산의 용액에 첨가하고 20분 동안 인큐베이션 하였다. 빙초산 중 15mg/ml TCEP (트리(2-카르복시에틸)포스핀.HCl)의 용액으로 용액을 산성화하고 예비 C4 역상 HPLC 컬럼 (지름 1인치) 상에 로딩하였다. 그 다음 예비 구배 역상 HPLC로 펩티드를 정제하였다. 원하는 라이게이션 산물인 SEP-0:Acm+SEP-0:3+SEP-0:4를 함유한 부분을 ES-MS로써 식별한 후 모았다.

단계 2: Acm-제거 #1Acm 제거를 위하여, SEP-0:Acm+SEP-0:3+SEP-0:4의 모아진 부분을 함유한 액체 아세토니트릴 용액을 HPLC 등급수로 1x로 희석하고, 최종 농도 2 몰이 되도록 고체 유레아를 첨가하였다. 3% 수성 아세트산 중 (총 기대되는 시스테인 농도에 대해) 세 배 몰 초과량의 30 mg/ml Hg(아세테이트)₂용액을 첨가하고 1시간 동안 용액을 교반하였다. 그 다음 β-머캅토에탄올에서 용액을 20%로 만든 후, 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하여 단계 구배로 정제하였다. 원하는 산물인 SEP-0:3+SEP-0:4를 함유한 부분을 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.

단계 3: 라이게이션 #2순 TFE에 같은 양의 SEP-0:3+SEP-0:4 및 SEP-0:2를 15 mM 농도에서 공동으로 용해하였다. 6 M 구아니디늄 클로라이드 및 1% 티오페놀을 함유한 250 mM 인산 완충용액 (pH 7.5)을 첨가하여, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻는다. 하루동안의 라이게이션 후, 10 ml TFE, 10 ml β-머캅토에탄올, 10 ml 피페리딘 및 20 ml 6M 구아니디늄 클로라이드의 pH 4 용액에 라이게이션 혼합물을 첨가하고, 남아있는 보호기를 제거하기 위해 20분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 20% 수성 아세트산 중 15 mg/ml TCEP의 용액으로 산성화한 후, 예비 역상 HPLC 컬럼 상으로 로딩하고 직선 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 산물인 SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4를 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.

단계 4: 카르복시메틸화SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4를 15 mM 농도에서 TFE에 용해하였다. 6 M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 두 배 초과량 (v/v)의 200 mM 인산 완충용액 (pH 7.9)을 첨가하고, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻었다. 최소량의 메탄올에 용해된 25배 초과량의 브로모-아세트산을 첨가하고, 용액을 2시간 동안 반응하게 하였다. 20% 수성 아세트산 중 15 mg/ml TCEP의 용액으로 용액을 산성화한 후, 예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 단계 구배로 정제하였다. 원하는 카르복시메틸화된 산물인 SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et를 ES-MS로 식별하고 모았다.

단계 5: 피콜릴 제거아연 가루를 2M HCl에서 30분동안 활성화하였다. 펩티드 SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et를 약 10 mg/ml 농도에서 순 TFE에 용해하였다. (새로이 첨가된) 35 mg/ml L-메티오닌 및 35 mg/ml 도데실사르코신 (즉, 소듐 N-도데시카노일사르코신)을 함유한, 4x (v/v; TFE에 대해) 6M 구아니디늄 클로라이드, pH 4의 100 mM 아세테이트로 용액을 희석하였다. 용액을 활성화된 Zn 분말에 첨가하였다. 1시간 간격으로 반응을 모니터링하고 5시간 후 완료하였다. 완료 후, 상청액을 제거하고 남아있는 Zn 분말은 20% TFE 중 35 mg/ml L-메티오닌 및 35 mg/ml 도데실사르코신을 함유한 6M 구아니디늄 클로라이드, pH 4, 100 mM 아세테이트로 5분동안 2회 세척하고 20% β-머캅토에탄올을 함유한 동일한 용액으로 1회 세척하였다. 결합된 산물은 20% 수성 아세트산 중 15 mg/ml TCEP의 용액으로 산성화한 후, 예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 단계 구배로 정제하였다. 원하는 변경된 산물인 SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et-피코를 함유한 부분은 ES-MS로 식별하고 모았다.

단계 6: Acm-제거 #2SEP-0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et-피코의 모아진 용액은 HPLC 등급수로써 3x로 희석하고, 고체 유레아를 첨가하여 최종 농도를 2 몰로 하였다. 3% 수성 아세트산 중 (총 기대되는 시스테인 농도에 대해) 세 배 몰 초과량의 30 mg/ml Hg(아세테이트)₂용액을 첨가하고 1시간 동안 용액을 교반하였다. 그 다음 β-머캅토에탄올에서 용액을 20%로 만든 후, 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하여 단계 구배로 정제하였다. 원하는 산물인 SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et-피코를 함유한 부분을 ES-MS로 식별한 후, 2x (w/w; 펩티드 양에 대해) DPC (도데실포스포콜린)를 함유한 물로 2x (v/v) 희석하고 하루밤동안 동결건조하였다.

단계 7: 라이게이션 #3순 TFE에 같은 양의 SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et-피코 및 SEP-0:1을 15 mM 농도에서 공동으로 용해하고 6 M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 250 mM 인산 완충용액 (pH 7.5)을 첨가한다. 이 용액에 1% 티오페놀을 첨가하였다. 하루동안의 라이게이션 후, 10 ml TFE, 10 ml β-머캅토에탄올, 10 ml 피페리딘 및 20 ml 6M 구아니디늄 클로라이드의 pH 4 용액에 라이게이션 혼합물을 첨가하고, 남아있는 보호기를 제거하기 위해 20분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 20% 수성 아세트산 중 15 mg/ml TCEP의 용액으로 산성화한 후, 예비 역상 HPLC 컬럼 상으로 로딩하고 직선 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 산물인 SEP-0 (1-166):(SEQ ID NO:1)을 함유한 부분을 전자분무 질량 분석법으로 식별한 후, 2x (w/w; 펩티드 양에 대해) 도데실사르코신을 함유한 물로 2x (v/v) 희석하고 동결건조하였다.

단계 8 접힘:전체길이 라이게이션된 펩티드 SEP-0(1-166)은 6 M 구아니디늄 클로라이드 및 20% TFE 및 10배 초과량 (단백질 내 Cys 잔기에 대해)의 시스테인을 함유한 200 mM Tris 완충용액 (pH 8.7)에 용해시켰다. 3 M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 200 mM Tris 완충용액 (pH 8.7)에 대하여 이 용액을 실온에서 하루밤동안 투석하였다. 그 다음 1M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 200 mM Tris 완충용액 (pH 8.7)에 대하여 용액을 4℃에서 4시간동안 투석하고 최종적으로 10 mM 인산 완충용액 (pH 7.0)에 대하여 4℃에서 4시간동안 투석하여 최종 접힌 산물을 수득하였다. 전자 분무 ES-MS 및 CD (원편광 2색성) 분석법으로 확인하였다.

단계 9 정제:접힌 폴리펩티드를 센트리콘 농축기 바이알에서 5x로 농축하고 10mM 인산, pH 7.0로 평형화된 Resource S 양이온 교환 컬럼 상에 로딩하였다. 접힌 단백질을 직선 염 구배에서 500 mM NaCl로 10분 동안 용리하였다. 원하는 접힌 산물인 SEP-0 (1-166)을 함유한 부분을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)로 식별한 후, 냉동하여 -80℃에 저장하였다. 접힌 단백질 산물의 분석적 역상 HPLC 크로마토그램 및 ES-MS 분석법은 물론이고 CD 스펙트로미트리법 역시 접힌 단백질의 존재를 예증하였다.

실시예 2

합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-L30의 합성

두번째 합성 적혈구생성 자극 단백질 (SEP-1-L30으로 표시)은 SEP-0의 위치 24 및 126에 옥심-형성기를 함유하도록 합성하였다. 그 다음 이 기는 SEP-1-L30을 형성하는데 사용하였는데, 여기에서 직선(EDA-Succ)₁₈카르복실레이트 (EDA = (4,7,10)-트리옥사츠리데칸-1,3디아민(TTD라고도 함); Succ = -CO-CH₂-CH₂CO-) 중합체는 단백질 백본에 결합되어 있다. 전체길이 SEP-1 (1-166)의 서열은 다음과 같다:

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK ^OXITTGCA EHCSLNEKIT

VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL

LVKSSQPWψP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAIS

PPDAAK ^OXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR (SEQ ID NO:2)

여기에서 ψ는 술프히드릴기에서 카르복실메틸화된 시스테인으로 구성된 비-천연 아미노산 잔기를 표시하고, K^OX는 옥심 결합을 통해 지정된 수용성 중합체와 커플링된 옥심 링커기로 ε-아미노기에서 화학적으로 변경된 비-천연 리신을 표시한다.

아래에 설명된 SEP1-L30의 화학적 합성을 설명하는 개략도가 도 14에 나와있다. 간단히, 도 14(A) 및 14(B)에서 수용성 중합체 GRFN32(GP32)는 옥심 결합-형성 화학 라이게이션 반응을 통해 펩티드 SEP-1:1 및 SEP-1:4에 부착된다. 나타낸 바와 같이, 펩티드 SEP-1:1는 위치 32에서 후속 천연 화학 라이게이션에 대한 히스티딘 알파-카르복실 티오에스테르를 포함하는 C-말단 Yaa 기 및, 그것의 측쇄가 화학적으로 변형되어 아미노옥시 아실 부분을 포함하는 U_n=1을 갖는, 위치 24(천연 사람 EPO의 글리코실화 부위)에서 비-천연 리신 잔기를 갖는다. 최종 전길이 생성물의 위치 1에 대응하는 N-말단 아날닌은 참고를 위해 나타낸다. 펩티드 SEP-1:4는 위치 117에서 시스테인을 포함하는 비보호 N-말단 Xaa 기, 위치 126(천연 사람 EPO의 글리코실화 부위)에서 아미노옥시 아실 변형된 리신을 포함하는 U_{n=1 기,}위치 161(디술피드 형성 시스테인)에서 피콜일 기로 보호된 그것의 측쇄 티올을 갖는 시스테인을 가진다. Cys¹⁶¹은 천연 화학 라이게이션 부위를 위해 도입된 시스테인의후속 변환에서 그것의 티오알킬화를 예방하도록 보호된다(도 14(D)를 참조); 또한, 피콜일 보호 기는 그것의 제거가 제 1 천연 화학 라이게이션 반응에서 Acm (아세트아미도메틸) 보호된 시스테인을 제거하는데 필요한 조건에 직교하기 때문에 사용된다(도 14(C)참조). 위치 24 및 126에서 GP32 중합체 구조물의 부위-특이적이고 독점적인 부착은 정확한 중합체 변형된 펩티드 SEP-1:1+GP32 및 SEP-1:4+GP32를 제조하기위한 옥심 형성 화학 라이게이션을 통해 달성된다.도 14(C)는 중간 펩티드 단편 SEP-1:3에 SEP-1:4+GP32의 천연 화학 라이게이션 및 SEP-1:3-SEP+1:4+GP32의 발생을 나타내고, 그것의 라이게이션 부위는 Lys¹¹⁶과 Lys¹¹⁷이다. 나타낸 바와 같이 펩티드 SEP-1:3는 Acm 보호된 시스테인을 포함하는 위치 89에서 N-말단 Xaa 기, 및 리신 알파-카르복실 티오에스테르를 포함하는 위치 116에서 C-말단 Yaa 기를 포함한다. 천연 화학 라이게이션에 뒤어어, Acm 보호 기는 제거되어, 다음 라이게이션 반응을 위한 이러한 라이게이션 생성물을 제조한다.도 14(D)는 SEP-1:3-SEP+1:4+GP32의 중간 펩티드 단편 SEP-1:2으로의 천연 화학 라이게이션 및 SEP-1:2-1:3+SEP-1:4+GP32의 발생을 보여주고, 그것의 라이게이션 부위는 Trp⁸⁸및 Cys⁸⁹이다. 나타낸 바와 같이 펩티드 SEP-1:2는 Acm 시스테인을 포함하는 위치 33에서 N-말단 Xaa 기 및, 트립토판 알파-카르복시 티오에스테르를 포함하는 위치 89에서 C-말단 Yaa 기를 포함한다. 천연 화학 라이게이션 후에, 라이게이션 생성물을 라이게이션 부위 시스테인 89 및 117의 측쇄 티올의 카르복시메틸화를 위해 브로모아세트산으로 노출시키고, 따라서 그들이 위 글로탐산으로 변환된다. 카르복시메틸화 후에, Acm 및 피콜일 보호 기는 제거되어 다음 라이게이션 반응을 위해 이러한 비보호, 중합체-변형 라이게이션 생성물을 제조한다.도 14(E)는 SEP-1:3-1:4+SEP-1:4+GP32의 펩티드 단편 SEP-1:1+GP32으로의 천연 화학 라이게이션(전 길이 생성물의 N-말단 단편에 대응됨) 및 전길이 SEP-1-L30 생성물 SEP-1:1+GP32+SEP-1:2+SEP-1:3+SEP-1:4+GP32의 생성을 보여주고, 그것의 최종 라이게이션 부위는 His³²및 Cys³³이다. 나타낸 바와 같이, 전길이 SEP-1-L30 생성물은 사용자 정의된 부위, 즉, 자연.사람 EPO의 위치 24 및 위치 126에 해당하는 글리코실화 부위에 배타적으로 부착된 2 수용성 중합체(G32)를 포함한다. 합성의 상세한 사항은 하기에 설명된다.

A. GRFNP32로 GRFN1776 및 GRFN1711의 옥심화

옥심 형성은 케톤 카르보닐기를 갖는 펩티드에 아미노옥시아세틸기를 갖는 수용성 중합체가 부착하도록 수행하였다. 이를 성취하기 위해, 다음의 펩티드 단편을 합성하였다:

단편 SEP-1:4 (GRFN 1776;SEQ ID NO:2의 잔기 117 내지 166으로 구성됨)

CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY

TGEACRTGDR-카르복실레이트 (여기에서 Lys¹²⁶은 ε-아미노기에서 레불린산으로 변경되고, 여기에서 Cys117은 Acm 보호됨)

단편 SEP-1:1 (GRFN 1711,SEQ ID NO:2의 잔기 1 내지 32로 구성됨)

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-티오에스테르

(여기에서 Lys²⁴는 레불린산 잔기로 변경됨)

실시예 1에서와 같이 단편 SEP-1:1 (GRFN 1711)은 티오에스테르-생성 수지 상에서, 단편 SEP-1:4 (GRFN 1776)는 -OCH₂-Pam-수지 상에서 합성하였다. 이들 두 펩티드 단편의 리신 24 및 126은 ε-아미노기 지점에서 Fmoc기로 처음에 보호하였다. 연쇄 회합의 완료 후, 표준 Fmoc 탈보호 방법에 따라 Fmoc-보유 아미노기를 탈보호하고 각 펩티드 수지에 레불린산을 각각 부착함으로써 변경하였다. 그 다음 실시예 1에서 설명한 것과 같이 펩티드를 탈보호하고 동시에 수지 지지체로부터 절단하였다. 예비 C4 역상 HPLC로 펩티드를 정제하였다. 순수한 펩티드를 함유한 부분은 ES-MS를 이용하여 식별한 후, 이후의 라이게이션을 위해 모아서 동결건조하였다. GRFNP32[-(EDA-Succ)₁₈카르복실레이트]는 표준 프로토콜 (Rose, K.et al.,미국 특허 출원 제 09/379,297; Rose,et al., J Am Chem Soc.(1999) 121:7034)에 따라 Sasrin 카르복실-생성 수지 상에서 회합하였다. 아미노옥시아세틸 (AoA) 부분은 5배 초과량의 활성화된 Boc-아미노옥시아세트산을 커플링함으로써 중합체의 N-말단 아미노기에 부착하였다. 전통적 Fmoc-화학 방법을 이용하여 수지 지지체로부터 중합체 사슬을 절단하였다. 중합체 사슬은 예비 C4 역상 HPLC로 정제하였다. 순수한 중합체를 함유한 부분은 ES-MS를 이용하여 식별한 후, 이후의 라이게이션을 위하여 모아서 동결건조하였다.

0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 단편 SEP-1:4 및 GRFNP32를 동분자 비율로 공동으로 용해하였다. 그 다음 용액을 동결건조하였다. 건조된 분말을용해시키고 예비 구배 C4 역상 HPLC로써 비변경된 펩티드 및 비반응된 중합체로부터 중합체-변형 펩티드를 분리하였다. 원하는 옥심화된 산물 SEP-1:4+GP32를 함유한 부분을 ES-MS로 식별한 후 모아서 동결건조하였다.

0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 단편 SEP-1:1 및 GRFNP32를 동분자 비율로 공동으로 용해하였다. 그 다음 용액을 동결건조하였다. 건조된 분말을 용해시키고 예비 구배 C4 역상 HPLC로써 비반응된 중합체로부터 중합체-변형 펩티드를 분리하였다. 원하는 옥심화된 산물 SEP-1:1+GP32를 함유한 부분을 ES-MS로 식별한 후 모아서 동결건조하였다.

B. 합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-L30의 합성

SEP-1-L30은 용액 내에서 다음 네 개의 폴리펩티드 단편으로 합성하였다:

단편 SEP-1:1+GP32 (GRFN 1711 + GRFNP32,SEQ ID NO:2의 잔기 1-32에 상응):

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK ^OXITTGCA EH-티오에스테르

(여기에서 Lys²⁴는 K^OX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸 (Lev-AoA)옥심 결합을 통해 GRFNP32에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변경된다)

단편 SEP-1:2 (GRFN 1712,SEQ ID NO:2의 잔기 33-88에 상응):

CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL

SEAVLRGQAL LVKSSQPW-티오에스테르 (여기에서 Cys³³은 Acm 보호됨)

단편 SEP-1:3 (GRFN 1713,SEQ ID NO:2의 잔기 89-116에 상응):

CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-티오에스테르 (여기에서 Cys⁸⁹는 Acm 보호됨)

단편 SEP-1:4+GP32 (GRFN 1776 + GRFNP32,SEQ ID NO:2의 잔기 117-166에 상응):

CAIS PPDAAK ^OXAAPL RTIRADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR-카르복실레이트 (여기에서 Lys¹²⁶은 K^OX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸 (Lev-AoA)옥심 결합을 통해 GRFNP32에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변경되고, C-말단 시스테인은 피콜릴 (피코) 보호기를 갖는다)

추가적인 펩티드의 합성, 라이게이션 반응, 카르복시메틸화, 보호기 제거 반응, 접힘 및 정제는실시예 1에서 설명된 것과 같이 수행하여 전체길이의, 접힌 SEP-1-L30을 수득하였다. 접힌 단백질 산물의 분석적 역상 HPLC 크로마토그램 및 ES-MS 분석법은 물론이고 CD 스펙트로미트리법 역시 접힌 단백질의 존재를 예증하였다.

실시예 3

합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-L26의 합성

제 3의 합성 적혈구생성 자극 단백질 (SEP-1-L26으로 나타냄)은 SEP-0의 위치 24 및 126에 옥심-형성기를 함유하도록 합성하였다. 이 기는 SEP-1-L26을 형성하는데 사용하였는데, 여기에서 여기에서 직선 중합체 (EDA-Succ)₁₈카르복실레이트 및 (EDA-Succ)₆-아미드는 옥심 연결을 통해 각각 위치 24 및 126에서 단백질 백본에 결합되어 있다. 전체길이 SEP-1 (1-166)의 서열은 다음과 같다:

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK ^OXITTGCA EHCSLNEKIT

VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL

LVKSSQPWψP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAIS

PPDAAK ^OXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR (SEQ ID NO:2)

여기에서 ψ는 술프히드릴기에서 카르복실메틸화된 시스테인으로 구성된 비-천연 아미노산 잔기를 표시하고, K^OX는 옥심 결합을 통해 지정된 수용성 중합체와 커플링된 옥심 링커기로 ε-아미노기에서 화학적으로 변경된 비-천연 리신을 표시한다.

SEP-1-L30과는 반대로, SEP-1-L26 구성체는 위치 126에 부착된 더 작고 비하전된 수용성 중합체를 갖도록 디자인한다. 위치 24에 부착된 중합체는 SEP-1L30에서와 동일하다. 전체길이 산물의 회합은실시예 2에 설명된 것과 같다.

A. GRFNP6으로 GRFN1776의 옥심화 및 GRFNP32로 GRFN1711의 옥심화

옥심 형성은 케톤 카르보닐기를 갖는 펩티드에 아미노옥시아세틸기를 갖는 수용성 중합체가 부착하도록 수행하였다. 이를 성취하기 위해, 다음의 펩티드 단편을 합성하였다:

단편 SEP-1:4 (GRFN 1776;SEQ ID NO:2의 잔기 117 내지 166으로 구성됨)

CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY

TGEACRTGDR-카르복실레이트 (여기에서 Lys¹²⁶은 ε-아미노기에서 레불린산으로 변경되고, 여기에서 Cys117은 Acm 보호됨)

단편 SEP-1:1 (GRFN 1711,SEQ ID NO:2의 잔기 1 내지 32로 구성됨)

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-티오에스테르

(여기에서 Lys²⁴는 레불린산 잔기로 변경됨)

실시예 1에서와 같이 단편 SEP-1:1 (GRFN 1711)은 티오에스테르-생성 수지 상에서, 단편 SEP-1:4 (GRFN 1776)는 -OCH₂-Pam-수지 상에서 합성하였다. 이들 두 펩티드 단편의 리신 24 및 126은 ε-아미노기 지점에서 Fmoc기로 처음에 보호하였다. 연쇄 회합의 완료 후, 표준 Fmoc 탈보호 방법에 따라 Fmoc-보유 아미노기를 탈보호하고, 표준 커플링 프로토콜에 따라 각 펩티드 수지에 레불린산을 각각 부착함으로써 변경하였다. 그 다음실시예 1에서 설명한 것과 같이 Boc-화학 방법에 따라 펩티드를 탈보호하고 동시에 수지 지지체로부터 절단하였다. 예비 C4 역상 HPLC로 펩티드를 정제하였다. 각 펩티드에 대하여, 순수한 펩티드를 함유한 부분은 ES-MS를 이용하여 식별한 후, 이후의 라이게이션을 위해 모아서 동결건조하였다.

수용성 중합체 (EDA-Succ)₁₈카르복실레이트 (GRFNP32)는 Sasrin 카르복시-생성 수지 상에서 표준 프로토콜 (Rose, K.et al.,미국 특허 출원 제 09/379,297 ; Rose,et al., J Am Chem Soc.(1999) 121:7034) 에 따라 회합하였다. 수용성 중합체 (EDA-Succ)₆-아미드 (GRFNP6)는 Sieber 아미드-생성 수지 상에서 표준 프로토콜(Rose, K.et al.,미국 특허 출원 제 09/379,297; Rose,et al., J Am Chem Soc.(1999) 121:7034) 에 따라 회합하였다. 아미노옥시아세틸 (AoA)부분은 5배 초과량의 활성화된 Boc-아미노옥시아세트산을 커플링함으로써 각 수지-결합 중합체의 N-말단 아미노기에 부착하였다. 두 중합체 사슬은 전통적 Fmoc-화학 방법을 이용하여 각 수지 지지체로부터 분리되도록 절단하였다. 각 중합체 사슬은 예비 역상 HPLC로 정제하였다. 각 중합체에 대하여, 순수한 중합체를 함유한 부분은 ES-MS를 이용하여 식별한 후, 이후의 라이게이션을 위해 모아서 동결건조하였다.

0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 단편 SEP-1:4 및 GRFNP6을 동분자 비율로 공동으로 용해하였다. 그 다음 용액을 동결건조하였다. 건조된 분말을 용해시키고 예비 구배 C4 역상 HPLC로써 비변경된 펩티드 및 비반응된 중합체로부터 중합체-변형 펩티드를 분리하였다. 원하는 옥심화된 산물 SEP-1:4+GP6을 함유한 부분을 ES-MS로 식별한 후 모아서 동결건조하였다.

0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 단편 SEP-1:1 및 GRFNP32를 동분자 비율로 공동으로 용해하였다. 그 다음 용액을 동결건조하였다. 건조된 분말을 용해시키고 예비 구배 C4 역상 HPLC로써 비반응된 중합체로부터 중합체-변형 펩티드를 분리하였다. 원하는 옥심화된 산물 SEP-1:1+GP32를 함유한 부분을 ES-MS로 식별한 후 모아서 동결건조하였다.

B. 합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-L26의 합성

SEP-1-L26은 용액 내에서 다음 네 개의 폴리펩티드 단편으로 합성하였다:

단편 SEP-1:1+GP32 (GRFN 1711 + GRFNP32,SEQ ID NO:2의 잔기 1-32에상응):

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK ^OXITTGCA EH-티오에스테르

(여기에서 Lys²⁴는 K^OX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸 (Lev-AoA)옥심 결합을 통해 GRFNP32에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변경된다)

단편 SEP-1:2 (GRFN 1712,SEQ ID NO:2의 잔기 33-88에 상응):

CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL

SEAVLRGQAL LVKSSQPW-티오에스테르 (여기에서 Cys³³은 Acm 보호됨)

단편 SEP-1:3 (GRFN 1713,SEQ ID NO:2의 잔기 89-116에 상응):

CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-티오에스테르 (여기에서 Cys⁸⁹는 Acm 보호됨)

단편 SEP-1:4+GP32 (GRFN 1776 + GRFNP32,SEQ ID NO:2의 잔기 117-166에 상응):

CAIS PPDAAK ^OXAAPL RTIRADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR-카르복실레이트 (여기에서 Lys¹²⁶은 K^OX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸 (Lev-AoA)옥심 결합을 통해 GRFNP32에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변경되고, C-말단 시스테인은 피콜릴 (피코) 보호기를 갖는다)

추가적인 펩티드의 합성, 라이게이션 반응, 카르복시메틸화, 보호기 제거 반응, 접힘 및 정제는실시예 1에서 설명된 것과 같이 수행하여 전체길이의, 접힌 SEP-1-L26을 수득하였다. 접힌 단백질 산물의 분석적 역상 HPLC 크로마토그램 및 ES-MS 분석법은 물론이고 CD 스펙트로미트리법 역시 접힌 단백질의 존재를 예증하였다.

실시예 4

합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-B50의 합성

제 4의 합성 적혈구생성 자극 단백질 (SEP-1-B50으로 나타냄)을 합성하였따. 전체길이 SEP-1-B50의 아미노산 서열은 SEP-1-L50의 그것과 동일하다:

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK ^OXITTGCA EHCSLNEKIT

VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL

LVKSSQPWψP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAIS

PPDAAK ^OXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR (SEQ ID NO:2)

여기에서 ψ는 술프히드릴기에서 카르복실메틸화된 시스테인으로 구성된 비-천연 아미노산 잔기를 표시하고, K^OX는 옥심 결합을 통해 지정된 수용성 중합체와 커플링된 옥심 링커기로 ε-아미노기에서 화학적으로 변경된 비-천연 리신을 표시한다.

그러나, SEP-1-L30의 직선 (Succ-EDA)₁₈중합체를 갖기 보다는 네 개의 직선(Succ-EDA)₁₂부분을 갖는 분지된 중합체 구성체로 단백질을 유도하였다. 옥심 연결을 통해 유도를 성취하였다. 전체길이 산물의 회합은실시예 2에서 설명된 것과 같다.

도 17은 하기에 설명한 바와 같이 옥심 형성 라이게이션을 통해 SEP-1-B50에 결합된 분지된 수용성 중합체 GRFNP29의 화학적 합성을 나타내는 개략도이다. 도 17에서 나타낸 바와 같이, 직각으로 보호된 리신 U-B 선구물질을 사용하여, U 기로서 아미노옥시 아실을 가지고, 3X 리신 분지 코어 B를 갖는 GP29로 지정된 선형 수용성 폴리아미드 에틸렌 옥사이드 구조물에 대한 티오에테르 연결을 통해 이어지는 커플링을 위한 4개 펜던트 티올 기를 갖는 U-B 성분 GRFN17(GP17)을 생성하였고, 그것은 숙신산 잔기에 의해 기증된 펜던트 카르복실레이트를 가진다. 전체-길이 생성물의 회합은 실시예 2에서 기술되었다. SEP-1-B50의 구조가 도 18에 나와있다.

A. 다수의 티올기를 갖는 주형 GRFNP17의 합성

주형 GRFNP17은 0.4 mmol 스캐일로 아미드 생성 (4-메틸)벤즈히드릴아민 (MBHA)-수지 상에서 수공으로 합성하였다. Fmoc-Lys(Boc)-OH는 표준 커플링 프로토콜 (Schnolzer, M.,Int J Pept 단백질 Res.(1992) 40:180-93)을 이용하여 커플링하였다. 2.1mmol 아미노산; 즉, 5배 초과량의 아미노산, 3.8 ml 0.5M HBTU 중 10% DIEA를 사용하였다. Fmoc 보호기의 제거 후, Fmoc-Lys(Fmoc)-OH는 표준 아미노산 커플링 프로토콜을 이용하여 커플링하였다 (2.1 mmol 아미노산; 즉, 5배 초과량의 아미노산, 3.8 ml 0.5M HBTU 중 10% DIEA). 제 2 Fmoc 제거 단계 후, Fmoc-Lys(Fmoc)-OH는 표준 아미노산 커플링 프로토콜을 이용하여 커플링하였다 (4.2 mmol 아미노산; 즉, 유리 아민에 대해 5배 초과량의 아미노산, 3.8 ml 0.5M HBTU 중 10% DIEA). 최종 Fmoc 탈보호 단계 후, DMF 중 (유리 아민에 대해) 5배 초과량의 S-아세틸 티오글리콜산 펜타플루오로페닐 에스테르 (SAMA-oPfp)를 30분 동안 커플링하였다. 순 TFA로 1분간 2회 세척하여 C-말단 리실 잔기 측쇄의 Boc 보호기를 제거한 다음, DMF 중 10% DIEA로 세척하여 수지를 중성화하였다. 2 mmol Boc-아미노옥시아세트산 및 2 mmol N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 3 ml DMF에 용해하였다. 2 mmol DIC (디이소프로필카르보디이미드)의 첨가 후, 30 내지 60분동안 산을 활성화하였다. 중성화된 수지에 용액을 첨가하고 1 시간동안 커플링하였다. 최종적으로, S-연결 아세틸기는 DMF 중 20% 피페리딘으로 30분동안 제거하였다. 유리 알데히드에 대한 스캐빈져로서 시스테인이 존재하는 표준 Boc-화학 방법에 따른 HF/p-크레졸을 이용하여 주형을 탈보호하고 동시에 수지 지지체로부터 절단하였다 (Schnolzer, M.,Int J Pept 단백질 Res.(1992) 40:180-93). 50% B[즉, 0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴] 중 회복된 폴리아미드 (무 알데히드)를 냉동시키고 동결건조하였다. 정제를 위하여, 주형 조 산물을 2ml 50% B에 용해하고, 100 ml 100% A[즉, 물 중 0.1% TFA]를 첨가하여 샘플을 희석하였다 (알데히드의 첨가가 보증되기 때문에, 구아니디늄 클로라이드 및 아세테이트의 첨가는 회피한다). 주형은 T=40℃, 3% B에서 평형화된 C4 예비 역상 HPLC 컬럼 상으로 로딩하였다. 염을 등용매로 용리하고 원하는 주형인, GRFNP17을 직선 구배에서 정제하였다. 원하는 산물을 함유한 부분은 ES-MS로 식별한 후, 모아서 동결건조하였다.

B. 분지된 수용성 중합체 GRFNP29의 합성

15 kDa 분자량의 분지된 (EDA-Succ)₁₂중합체인, GRFNP29는 정제된 티올-함유 주형인 GRFNP17 및 직선 중합체 GRFNP31, Br-아세틸-(EDA-Succ)₁₂의 티오에스테르-생성 라이게이션으로써 합성하였다 (Rose, K.et al.,미국 특허 출원 제 09/379,297; Rose,et al., J Am Chem Soc.(1999) 121:7034).

(총 티올의) 1.3x 몰 초과량의 정제된 GRFNP31, Br-아세틸화 (EDA-Succ)₁₂, 및 정제된 티올-함유 주형 GRFNP17을 ~10 mM 농도에서 pH8.7의 0.1 M Tris-HCl/6M 구아니디늄 클로라이드에 공동으로 용해시켰다. 용해 후, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.7 완충용액으로 세 배(v/v) 희석하였다. 실온에서 라이게이션 혼합물을 교반하고 역상 HPLC 및 ES-MS로 반응을 모니터링 하였다. 원하는 반응 산물이 주된 산물일 때까지 추가적인 GRFNP31 반응물을 필요 기준만큼 첨가하였다. 정밀검사를 위해, pH 4인 3x (v/v, 라이게이션 혼합물에 대해) 0.1M 아세테이트 / 6M 구아니디늄 클로라이드를 첨가하고, 용액을 예비 C4 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고, 직선 구배로 정제하였다. 순수한 GRFNP29 구성체를 함유한 부분은 ES-MS를 이용하여 식별한 후, 모아서 동결건조하였다.

C. GRFNP29로 GRFN1776 및 GRFN1711의 옥심화

단편 SEP-1:4 및 단편 SEP-1:1은실시예 2에서 설명된 것과 같이 합성하였다. 단편 SEP-1:4 및 GRFNP29는 0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 동분자 비율로 공동으로 용해시켰다. 용액을 동결건조하였다. 건조된 분말은 예비 역상HPLC 컬럼 (지름 1 인치)상에 로딩하였다. 중합체-변경 펩티드는 예비 구배 C4 역상 HPLC로써 비변경된 펩티드 및 비반응 중합체로부터 분리하였다. 원하는 옥심화된 산물 SEP-1:4+GP29를 함유한 부분은 ES-MS로 식별하여 모았다.

단편 SEP-1:1 및 GRFNP29는 0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 동분자 비율로 공동으로 용해하였다. 용액을 냉동하고 동결건조하였다. 건조된 분말을 0.1% TFA를 함유한 50% 수성 아세토니트릴에 용해시키고 예비 GPC (겔 침투 크로마토그래피) 컬럼 (지름 1인치)상에 로딩하였다. 등용매 용리로서 비변경된 펩티드 및 비반응된 중합체로부터 중합체-변경 펩티드를 분리하였다. 원하는 옥심화된 산물 SEP-1:1+GP29를 함유한 부분은 ES-MS로 식별하여 모았다.

D. 합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-B50의 합성

SEP-1-B50 (SEQ ID NO:2)은 다음 네 개의 폴리펩티드 단편으로 용액 내에서 합성하였다.

단편 SEP-1:1+GP29 (GRFN 1711 + GRFNP29,SEQ ID NO:2의 잔기 1-32에 상응):

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK ^OXITTGCA EH-티오에스테르

(여기에서 Lys²⁴는 K^OX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸 (Lev-AoA)옥심 결합을 통해 GRFNP29에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변경된다)

단편 SEP-1:2 (GRFN 1712,SEQ ID NO:2의 잔기 33-88에 상응):

CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL

SEAVLRGQAL LVKSSQPW-티오에스테르 (여기에서 Cys³³은 Acm 보호됨)

단편 SEP-1:3 (GRFN 1713,SEQ ID NO:2의 잔기 89-116에 상응):

CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-티오에스테르 (여기에서 Cys⁸⁹는 Acm 보호됨)

단편 SEP-1:4+GP29 (GRFN 1776 + GRFNP29,SEQ ID NO:2의 잔기 117-166에 상응):

CAIS PPDAAK ^OXAAPL RTIRADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR-카르복실레이트 (여기에서 Lys¹²⁶은 K^OX로 표시된 레불린-아미노옥시아세틸 (Lev-AoA)옥심 결합을 통해 GRFNP29에 커플링된 레불린 옥심 링커기로ε-아미노기에서 변경되고, C-말단 시스테인은 피콜릴 (피코) 보호기를 갖는다)

추가적인 펩티드의 합성, 라이게이션 반응, 카르복시메틸화, 보호기 제거 반응, 접힘 및 정제는, 정제를 Resource Q 컬럼상에서 한 것을 제외하고는,실시예 1 및 2에서 설명된 것과 같이 수행하여 전체길이의, 접힌 SEP-1-B50 (SEQ ID NO:2)을 수득하였다. 접힌 단백질 산물 SEP-1-B50의 분석적 역상 HPLC 크로마토그램 및 ES-MS 분석법은 물론이고 CD 스펙트로미트리법 역시 접힌 단백질의 존재를 예증하였다.

실시예 5

합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-3-L42의 합성

제 5 합성 적혈구생성 자극 단백질 (SEP-3-L42로 표시)을 합성하였다. 전체길이 SEP-3 단백질의 아미노산 서열은 다음과 같다:

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNECIT

VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL

LACSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS

PPDAACAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR (SEQ ID NO:3)

위치: 24, 38, 83 및 126에 있는 시스테인 잔기는 SEP-3-L42를 형성하도록 (Michael 첨가 반응을 통하여) 말레이미드-기능화된 (EDA-Succ)₁₈(GRFNP32) 중합체 유닛으로써 변경하였다. SEP-3-L42의 구조는 도 20에 나타난다.

하기에 설명된 SEP-3-L42의 화학 합성을 설명하는 개략도는 도 19에 나와있다. 간단히, 도 19(A) 및 도 19(B)는 SEP-3:4을 통해 4개의 SEP-30-L42 펩티드 단편 SEP-3:1의 천연 화학 라이게이션을 보여주고, 사람 EPO에서 모든 4개의 고유 글리코실화 부위에 해당하는 라이게이션 부위에서 시스테인을 생성한다. 특히, 도 19(B)는 Michael 첨가 반응을 통해 시스테인 라이게이션 부위에서 4개의 하전된 선형 수용성 중합체(지정된 GRFN32-말레이미드 (GP32-말레이미드)의 부위 특이성 부착을 허용하는, 보호된 모든 디술피드-형성 시스테인을 갖는 전체길이 폴리펩티드를 보여준다. 도 19(B)는 또한 디술피드-형성 시스테인의 최종 탈보호 단계, 및 전체길이, 중합체 변형된 생성물의 생성을 나타낸다.

상세하게는, SEP-3은 4개의 폴리펩티드 단편들로부터 용액에서 합성되었다:

단편 SEP-3:1 (GRFN 1747,SEQ ID NO:3의 잔기 1-37에 상응)

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNE-티오에스테르

(여기에서 Cys⁷, Cys²⁹및 Cys³³은 Acm 보호됨)

단편 SEP-3:2 (GRFN 1774,SEQ ID NO:3의 잔기 38-82에 상응)

CIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL

SEAVLRGQAL LA-티오에스테르 (여기에서 Cys³⁸은 Acm기로 보호된 측쇄임)

단편 SEP-3:3 (GRFN 1749,SEQ ID NO:3의 잔기 83-125에 상응)

CSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS

PPDAA-티오에스테르 (여기에서 Cys⁸³은 Acm기로 보호된 측쇄임)

단편 SEP-3:4 (GRFN 1750,SEQ ID NO:3의 잔기 126-166에 상응)

CAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDT-카르복실레이트 (여기에서 Cys¹⁶¹은 Pbo [즉, 4-(CH₃S(O)-)벤질-] 보호됨)

펩티드 합성.펩티드 SEP-3:1 및 SEP-3:2 및 SEP-3:3은, 실시예 1에서 설명된 것과 같이 확립된 측쇄 보호 전략을 이용하여, 위의 특정 펩티드에서 언급된 것과 같이 보호기에 변화를 주어, Boc 화학법 SPPS를 위한 제자리 중성화 프로토콜로써 티오에스테르-생성 수지 상에서 합성하였다. 단편 SEP-3:4는 -OCH2-Pam-수지 상에서 유사하게 합성하였다. 실시예 1에서 설명된 것과 같이 펩티드를 탈보호하고 동시에 수지 지지체로부터 절단하였다. 위에 설명된 결과적 펩티드는 예비 RP-HPLC로 정제하였다. 순수한 펩티드를 함유한 부분은 ES-MS를 사용하여 식별한 후, 이후의 라이게이션을 위하여 모아서 동결건조하였다.

단계 1: 라이게이션 #1단편 SEP-3:4 및 단편 SEP-3:3을 15 mM 농도로 TFE에 용해하였다. 6 M 구아니디늄 클로라이드 및 1% 티오페놀을 함유한 표준 인산 완충용액 (pH 7.5)을 첨가하고, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻었다. 라이게이션 후, 라이게이션 혼합물 (1 부피로 정의)을 {2ml TFE, 6 ml 6M 구아니디늄 클로라이드 및 25% β-머캅토에탄올을 함유한 100 mM 인산}의 용액 2 부피에 첨가하고 20분 동안 인큐베이션 하였다. 빙초산 중 15mg/ml TCEP의 용액으로 용액을 산성화한 후, 예비 C4 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 직선 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 산물인 SEP-3:Acm+SEP-3:3+SEP-3:4를 함유한 부분을 ES-MS로써 식별한 후 모았다.

단계 2: Acm-제거 #1Acm 제거를 위하여, SEP-3:Acm+SEP-3:3+SEP-3:4의 모아진 부분을 함유한 액체 아세토니트릴 용액을 HPLC 등급수로 1x로 희석하고, 최종 농도 2 몰이 되도록 고체 유레아를 첨가하였다. 3% 수성 아세트산 중 (총 기대되는 시스테인 농도에 대해) 세 배 몰 초과량의 30 mg/ml Hg(아세테이트)₂용액을 첨가하고 1시간 동안 용액을 교반하였다. 그 다음 β-머캅토에탄올에서 용액을 20%로 만든 후, 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하여 단계 구배로 정제하였다. 원하는 산물인 SEP-3:3+SEP-3:4를 함유한 부분을 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.

단계 3: 라이게이션 #2순 TFE에 같은 양의 SEP-3:3+SEP-3:4 및 SEP-3:2를 15 mM 농도에서 공동으로 용해하였다. 6 M 구아니디늄 클로라이드 및 1% 티오페놀을 함유한 250 mM 인산 완충용액 (pH 7.5)을 첨가하여, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻는다. 하루동안의 라이게이션 후, 라이게이션 혼합물 (1 부피로 정의)을 10 ml TFE, 10 ml β-머캅토에탄올, 10 ml 피페리딘 및 20 ml 6M 구아니디늄의 pH 4 용액 2 부피에 첨가하고, 남아있는 보호기를 제거하기 위해 20분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 20% 수성 아세트산 중 15 mg/ml TCEP의 용액으로 산성화한 후, 예비 C4 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 직선 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 산물인 SEP-3:Acm+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4를 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.

단계 4: Acm 제거Acm 제거를 위하여, SEP-3:Acm+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4의 모아진 부분을 함유한 수성 아세토니트릴 용액은 HPLC 등급수로써 1x로 희석하고, 고체 유레아를 첨가하여 최종 농도를 2 몰로 하였다. 3% 수성 아세트산 중 (총 기대되는 시스테인 농도에 대해) 세 배 몰 초과량의 30 mg/ml Hg(아세테이트)₂용액을 첨가하고 1시간 동안 용액을 교반하였다. 그 다음 β-머캅토에탄올에서 용액을 20%로 만든 후, 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하여 단계 구배로 정제하였다. 원하는 산물인 SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4+Et-피코를 함유한 부분을 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.

단계 5: 라이게이션 #3순 TFE에 같은 양의 SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4 및 SEP-0:1을 15 mM 농도에서 공동으로 용해하였다. 6 M 구아니디늄 클로라이드 및 1% 티오페놀을 함유한 250 mM 인산 완충용액 (pH 7.5)을 첨가하고, 펩티드 단편의 투명한 용액을 얻는다. 하루동안의 라이게이션 후, 라이게이션 혼합물 (1 부피로 정의)을 10 ml TFE, 10 ml β-머캅토에탄올, 10 ml 피페리딘 및 20 ml 6M 구아니디늄 클로라이드의 pH 4 용액 2 부피에 첨가하고, 남아있는 보호기를 제거하기 위해 20분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 20% 수성 아세트산 중 15 mg/ml TCEP의 용액으로 산성화한 후, 예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 직선 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션 산물인 SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4 을 함유한 부분을 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.

단계 6: 중합체 GRFNP32의 부착.GRFNP32-말레이미드라 불리우는 말레이미드-기능화된 직쇄 (EDA-Succ)₁₈중합체는 제조사 프로토콜에 따라 BMPS (3-말레이미도 프로피온산 NHS 에스테르, Pierce, USA)로 GRFNP32를 기능화시킴으로써 말레이미드-기능화된 (EDA-Succ)₁₈중합체 (즉, 말레이미드-(EDA-Succ)₁₈]를 형성하도록 제조하였다. SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4는 필요한 TFE의 최소량에 용해하였다. 세 배 초과량의 GRFNP32-말레이미드를 6M 구아니디늄 클로라이드, 100 mM 인산, pH 7.5에 용해시키고 TFE 용액에 첨가하였다. Michael 첨가 반응의 과정 후 분석적 역상 HPLC를 행하였다. 반응을 완료한 후, 용액을 예비 C4 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 직선 구배로 정제하였다. 원하는 중합체-변경 산물인 SEP-3:Acm+SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+pPEG [즉 Cys²⁴, Cys³⁸, Cys⁸³및 Cys¹²⁶의 측쇄 티올에 부착된 GRFNP32의 4개의 카피를 갖는 라이게이션된 전체길이 166 잔기 폴리펩티드 사슬, 그러므로 SEP-3:Acm+SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+GP32라고도 함]를 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.

단계 7: Pbo 제거Pbo 제거를 위하여, SEP-3:Acm+SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+GP32의 동결건조된 분말을 5% 에탄디티올을 함유한 순 TFA에 용해하였다. 그 다음 Pbo기는 30분 동안 10% 티오아니졸 및 15% 브로모트리메틸실레인을 첨가함으로써 절단하였다. 용액을 회전-증발기에서 건조시키고 0.1% TFA를 함유한 수성 아세토니트릴에 녹였따. 결과 용액은 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고 단계 구배로 정제하였다. 원하는 Cys161-탈보호 산물인 SEP-3:Acm+SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+GP32-Pbo를 함유한 부분은 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.

단계 8: Acm 제거Cys7, Cys29 및 Cys33의 측쇄로부터 최종 Acm 제거를 위하여, SEP-3:Acm+SEP-3:1+SEP-3:2+SEP-3:3+SEP-3:4+GP32의 모아진 부분을 함유한 수성 아세토니트릴 용액을 HPLC 등급수로써 1x로 희석하고, 고체 유레아를 첨가하여 최종 농도가 2 몰이 되게 하였다. 3% 수성 아세트산 중 (총 기대되는 시스테인 농도에 대해) 세 배 몰 초과량의 30 mg/ml Hg(아세테이트)₂용액을 첨가하고 1시간 동안 용액을 교반하였다. 그 다음 β-머캅토에탄올에서 용액을 20%로 만든 후, 반-예비 역상 HPLC 컬럼 상에 로딩하여 단계 구배로 정제하였다. 원하는 라이게이션된, 중합체-변경 산물인 SEP-3(1-166)을 함유한 부분을 ES-MS로 식별하고 하루밤동안 동결건조하였다.

단계 9 접힘:전체길이 라이게이션된, 중합체-변경 펩티드 SEP-3(1-166)은 6 M 구아니디늄 클로라이드 및 20% TFE 및 10배 초과량 (SEP-3 내 Cys 잔기에 대해)의 시스테인을 함유한 200 mM Tris 완충용액 (pH 8.7)에 용해시켰다. 3 M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 200 mM Tris 완충용액 (pH 8.7)에 대하여 이 용액을 실온에서 하루밤동안 투석하였다. 그 다음 1M 구아니디늄 클로라이드를 함유한 200 mM Tris 완충용액 (pH 8.7)에 대하여 용액을 4℃에서 4시간동안 투석하고 최종적으로 10 mM 인산 완충용액 (pH 7.0)에 대하여 4℃에서 4시간동안 투석하여 최종 접힌 산물을 수득하였다. 전자 분무 ES-MS 및 CD 스펙트로미트리법으로 확인하였다.

단계 9 정제:접힌 폴리펩티드를 센트리콘 농축기 바이알에서 5x로 농축하고 10mM 인산, pH 7.0로 평형화된 Resource S 양이온 교환 컬럼 상에 로딩하였다. 접힌 단백질을 직선 염 구배에서 500 mM NaCl로 10분 동안 용리하였다. 원하는 접힌 산물인 SEP-3-L42 (1-166)를 함유한 부분을 SDS-PAGE)로 식별한 후, 냉동하여 -80℃에 저장하였다.

실시예 6

합성 적혈구생성 자극 단백질의 생물활성 검정

접힌 합성 적혈구생성 자극 단백질, SEP-0, SEP-1-L26, SEP-1-L30, SEP-1-B50, 및 SEP-3-L42의 생물활성은 대조군 표준으로서 시중 재조합 에리스로포이에틴을 사용한 인자-의존 세포주 증식 검정에서, UT/7 및 32D 103197 세포주를 이용하여 측정하였다. UT/7은 성장 및 생존을 위해 인터류킨-3, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 또는 에리스로포이에틴에 절대적인 의존성을 갖는 사람 거대핵모세포성 백혈병 세포주이다 (Miura Y, et al., Acta Haematol (1998) 99:180-184; Komatsu N, et al., Cancer Res. (1991) 51:341-8). 32D 103197는 쥐의 조혈 세포주이다 (Metcalf, D. Int J Cell Cloning (1992) 10:116-25).

SEP 구성체의 원액은 Iscove's 변형된 Dulbecco's Medium (IMDM), 10% FBS (소태아혈청), 글루타민 및 Penstrep으로 제조하였고, 이 원액의 연속된 2x 희석액을 사람 UT/7 EPO 세포가 5000 세포/50㎕의 농도로 첨가된 멀티-웰 플레이트에 첨가하였다. 5% CO₂존재하에 37℃에서 플레이트를 인큐베이션하고 성장에 대해 매일 모니터링 하였다. 4일 후, PBS (인산 완충 식염수) 중 20㎕ 2.5 mg/ml MTT (메틸티아졸 테트라졸륨)을 첨가하고 4시간 동안 플레이트를 인큐베이션 하였다. 150㎕ IPA를 첨가하고 562 nm에서 각 웰의 흡광도를 판독하였다. SEP 화합물에 대한 ED50 (최대 효과의 50%에 도달하기 위한 효과량)수치를 측정하고 CHO (중국산 햄스터 난소)-세포 생산된 rhEPO (재조합 사람 에리스로포이에틴)의 그것과 비교하였다. 이 실험으로부터 나온 결과는 모든 합성 적혈구생성 자극 단백질이 생물활성을 나타낸다는 것을 예시하였다. SEP-0, SEP-1-L26, SEP-1-L30 및 SEP-1-B50에 대한 ED50 결과는 표 VI에 나타난다.

중합체-변형 SEP-1-L30에 대한 흡수에 의한 단백질 농도를 계산하기 위한 소멸 계수만을 사용하는 펩티드 함량에 대해 정상화(표준화)될때, 이들 실험으로부터의 추가적인 결과가 표 VII 및 SEP-0, SEP1-L26, SEP-1-L30, SEP-1-B50, SEP-3-L42, 및 SEP-1-B51 (SEP-1 B51 화합물의 합성은 하기 실시예 7에 기술되어 있다)에 대한 도 26에 나와있다. 회합적으로, 시험관내 분석에서 이들은 시험관내 생물활성에서 중합체 구조와 부착의 위치를 바꾸는 차별적인 효과를 나타내고, 여기서 이들 화합물은 하기의 효능의 상대 순서를 가진다: (1) 사람 EPO 리셉터 활성(가장 유력한것에서부터 가장 적게 유력한것까지)에 대해 실험할때 : SEP-1-L26 SEP-1-L30 > SEP-1-B50SEP-1-B51 > SEP-3-L42 > SEP-0; 및 (2) 마우스 EPO 리셉터 활성(가장 유력한것에서부터 가장 적게 유력한것까지)에 대해서는: SEP-1-L26 > SEP-1-L30 > SEP-0 > SEP-3-L42 > SEP-1-B50SEP-1-B51.

표 VIl 및 도 26 에서의 결과는 또한 비중합체 변형 구조 SEP-0와 비교하여 중합체-변형 SEP 구조에 대한 리셉터 선호에 있어서, 상당한 차이를 나타낸다. 특히, SEP-1-L26은 대응하는 사람 EPO 글리코실화 부위 위치 24 (이 부위에 부착된 펜던트 음 전하를 갖는 5.5 kDa 선형 중합체) 및 위치 126 (이 부위에 부착된 펜던트 중성 전하를 갖는 1.8 kDa 선형 중합체)에 부착된 다른 선형 중합체로 변경된다 ; 이 구조는 사람과 마우스 리셉터 모두에 대해 유사한 활성을 가졌다. SEP-1-L30는 대응하는 사람 EPO 글리코실화 부위 위치 24와 126에서 펜던트 음 전하를 갖는 5.5 kDa 선형 중합체로 변경된다; 이들 구조는 사람 리셉터에 대해 마우스 리셉터와 비교하여 약 5X 보다 활성이었다. 대응하는 사람 EPO 글리코실화 부위 위치 24,38,83 및 126에서 펜던트 음 전하를 갖는 5.5 kDa 선형 중합체로 변경된 SEP-3-L42는 마우스 리셉터와 비교하여 사람 리셉터에 대해 약 10X 더 활성이다. 가장 큰 차이는 SEP-1-B50 및 SEP-1-B51에서 관찰되었고, 그것은 대응하는 사람 EPO 글리코실화 부위 위치 24 및 126에 부착된 분지상, 음으로 하전된 15 kDa 중합체로 변경되고, 대략 5 (사람 EPO에 유사)의 pl을 가진다; 이들 두 구조는 마우스 리셉터에 비하여 사람 리셉터에 대해 ~60X 보다 활성이었다.

마우스 EPO가 사람 EPO 위치 126에 대응하는 위치에서 글리코실화 부위를 잃고있기 때문에(마우스 EPO는 사람 EPO에서 발견된 O-글리코실화 세린을 대신하여 비-글리코실화 프롤린을 가진다), 변경된 리셉터 활성은 부분적으로 이 차이때문일 수 있고, 따라서 EPO에 대한 마우스 리셉터의 선호는 대응하는 위치 126에서 O-결합된 글리코실화를 잃고있다. 이것은 SEP-1-L26 및 SEP-1-L30을 SEP-1-B50 및 SEP-1-B52에 비교하는 것과 함께 일치한다. 예를 들어, SEP-1-L30는 위치 126에서 5.5 kDa 음으로 하전된 중합체를 가지는 반면, SEP-1-L26는 위치 126에서 1.8 kDa 하전되지 않은 중합체를 가진다. 비록 등가의 활성이 사람 EPO 리셉터에 대해 관찰되었지만, 마우스 EPO 리셉터에 대해 4-배 차이가 발견되었다. 가장 큰 차이가 대응하는 사람 EPO 글리코실화 부위 위치 126에 부착된 음으로 하전된 15 kDa 중합체와 함께, SEP-1-B50 및 SEP-1-B51 구조에 대해 발견되었다. 사람 EPO에서 모든 4개 음 글리코실화 위치에 대응하는 5.5 kDa 음으로 하전된 중합체의 첨가는, 즉, SEP-3-L42 구조를 갖는 24,38,83 및 126에서와 같이 마우스에 대한 감소된 선호를 보다 더욱 감소시켰지만, SEP-1-B50 및 SEP-1 B51 구조 미만이었다. 이들 결과는 리셉터-특이성이 생물학적으로 제조된 글리코실화 부위에 대응하는 부위의 정확한 변경, 글리코실화 단백질에 의해 그리고 크기, 분지의 성질 및 중합체의 전하에 의해 조절될 수 있다.

실시예 7

적혈구생성 자극 단백질 SEP-1 B51의 합성

A. SEP-1-B51의 조성물.

6번째 합성 적혈구생성 자극 단백질(SEP-1-B51 명시)이 합성되었다. 전체길이 SEP-1-B51의 아미노산 서열이 SEP-1-B50 의 것과 동일하다:

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^oxXITTGCA EHCSLNEKIT

VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL

LVKSSQPWΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKΨAIS

PPDAAK^oxXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR (SEQ ID NO : 2)

여기서 ψ는 술프히드릴 기에서 카르복실메틸화 되는 시스테인으로 구성되는 비천연 아미노산 잔기를 나타내고, 여기서 K^ox는 옥심 결합을 통해 지정된 가용성 중합체에 결합된 옥심 링커 기로 ε-아미노 기에서 화학적으로 변형되는 비천연 리신을 나타낸다.

그러나, SEP-1-B50에 대조적으로, 단백질은 리신 분지 코어에 대한 아미드 결합을 통해 커플링된, 단백질을 4개 선형 (Succ-TTD) 12-Succ-알라닌-OH [즉, (Succ-TTD) 12- Succ-Ala-OH, 또는 (Succ-TTD) 12Succ-Ala] 중합체를 갖는 분지상 중합체 구조로 유도되었다. 아미노 결합을 통한 분지 코어로 선형 중합체의 커플링은 안정성을 향상하도록 설계되었다. 4개의 선형 중합체는 또한 살리실산을 흉내내는 음 전하 및 아닐린과 카르보히드레이트 사슬의 펜던트 당 부분과 유사한 소수성 특성과 함께, 아닐린 부분 및 펜던트 음 전하를 운반하도록 설계된다. 분지상 중합체는 또한 분지 코어 주형의 합성 및 취급 특성을 개선하기 위해 그리고 단백질 백본에 대한 당 부착 부위와 카르보히드레이트의 첫번째 분기 포인트 사이에 천연의 카르보히드레이트 사슬에서 발견된 스페이스를 흉내내기 위해, 분지 코어와 단백질 백본 부착 부위 사이에 가용성 스페이서를 갖도록 설계되었다.

도 21은 하기한 바와 같이 SEP-1-B51에 결합되었던 화학적 합성의 분지 수용성 중합체 GRFNP41 (GP41)의 화학적 합성을 나타내는 도식이다. 전체 길이 생성물의 회합은 실시예 2에서 기술한 바와 같았다. SEP-1-B51의 구조는 도 22에 나와있다.

B. 분지 주형(GRFNP40)에 결합하기 위한 (Succ-TTD) ₁₂ Succ-AlaOtBu(GRFNP39)의 합성

선형 중합체 (Succ-TTD)₁₂Succ-AlaOtBu(GRFNP39)는 Sasrin 산 라빌레, 카르복실산-발생 수지에서 0.5 mol 스케일에서 합성되었다. 0.5mmole(~0.5 그램) Sasrin 산 불안정, 카르복실산-발생 폴리스티렌 수지 (히드록실 치환 1.02 mmole/g;)을 15 분동안 DMF에서 팽창시켰고, 그후 배출시켰다. 이 히드록실-기능화 수지에, 500 마이크로리터 (3.9 mmole) DIEA (디이소프로필에틸아민)를 함유하는 8 ml의 DMF에 용해된 450 mg (4.5 mmole) 숙신 안히드리드 및 488 mg (4 mmole) 4-(디메틸아미노)피리딘을 첨가하고 소용돌이 교반으로 30분동안 반응시키고, 배출시켰다. 커플링은 반복되었고 과도한 반응물과 용해가능 공 생성물을 DMF (~50ml)으로 1 분 소용돌이 흐름 세척으로 제거하였고, 그후 배출시켰다. HOOC-CH₂CH₂CO-O-수지 0.5 mmole)는 DMF중의 8 ml의 신선한 1.0 M (8 mmole) CDI (카르보닐디이미다졸) 용액을 첨가함으로써 활성화되었고 40분 동안 반응시켰고, 그후 배출되었다. 과도한 반응물 및 용해가능 공생성물을 DMF (~50ml)으로 1 분 소용돌이 흐름 세척으로 제거하고, 그후 배출하였다. DMF중의 4 ml 0.5M (2 mmole) HOBT 용액에 용해된 4 ml (4 그램, 18.2 mmole) (4,7,10)-트리옥사트리데칸-1,13디아민 (TTD)을 첨가하고 30분동안 소용돌이 교반으로 반응시키고, 그후 배출하였다. DMF (-50ml)으로 1 분 소용돌이 흐름 세척에 의해 과도한 반응물 및 용해가능 공생성물을 제거하고, 그후 배출하였다. 500 마이크로리터 (3.9 mmole) DIEA를 함유하는 8 ml의 0.5M(4 mmole) HOBT (N-히드록시벤조트리아졸) 용액에 용해된 숙신 안히드리드(450 mg, 4.5 mmole)를 수지에 첨가하고 15분동안 소용돌이 교반으로 반응시키고, 그후 배출하였다. 3 단계는 (CDI 활성화 ; TTD 커플링 ; 숙신 안히드리드 반응) 11 번 반복되었다. [즉, 총 12회]. 과도한 반응물 및 용해가능 공생성물을 DMF (-50ml)으로 1 분 소용돌이 흐름 세척에 의해 제거하였고, 배출하였다. HOOC-CH₂CH₂CO (TTD-숙시닐)₁₂-O-수지 (0.5 mmole)을 DMF중의 8ml의 신선한 1.0 M (8 mmole) CDI 용액으로 활성화시키고 40분동안 반응시켰고, 그후 배출하였다. 과도한 반응물 및 용해가능 공생성물은 DMF (-50ml)으로 1분의 소용돌이 흐름 세척에 의해 제거되었고, 그후 배출시켰다. 2.5 mmole H-AlaOtBu. HCI을 150 마이크로리터 (111 mg, 0.825 mmole) DIEA를 함유하는 DMF중의 4.75 ml 0.5 M (2.375 mmole) HOBT 에 용해시키고, 1소용돌이 교반으로 시간동안 CDI-활성화된 HOOCCH₂CH₂CO (TTD-숙시닐) 12-0-수지 (0.5 mmole)로 반응시키고, 그후 배출하였다. 과도한 반응물 및 용해가능 공생성물을 DMF (-50ml)으로 1-분 소용돌이 흐름 세척에 의해 제거하고, 그후 배출하였다. 생성물 tertBuOOC- CH (CH₃)-NH-OC-CH₂CH₂CO (TTD-숙시닐) 12-O-수지를 DCM (디클로르메탄)로 광범위하게 세척하고, 배출시키고 그후 수지를 진공하에서 일정한 중량으로 건조시켰다. 전형적인 생성물-수지의 중량은 약 2 그램이었다.

선형 (Succ-TTD)₁₂Succ-AlaOtBu 중합체는 DCM 중에 4% TFA를 사용하여 Fmoc-화학 과정에 따라 수지 지지체로부터 절단되었다. 침전된 미정제 생성물은 50% 수성 아세토니트릴중에 용해되었다. 동결건조된 중합체는 0.1% TFA를 함유하는 소량의 50% 수성 아세토니트릴에 용해되었고 희석시켜 유기의 농도를 1% 미만으로 낮췄다. 미정제 생성물은 3% B에서 T = 40°C에서 평형화된 C4 예비 역상 칼럼위로 로딩하였다. 염은 등용매적으로 용출되었고 원하는 주형은 60분에 걸쳐서 20-35 % 완충액 B (0.1% TFA을 함유하는 아세토니트릴) 대 0.1% 수성 TFA의 선형 구배로 정제하였다. 원하는 (Succ-TTD)₁₂-Succ-AlaOtBu 재료 (GRFNP39)를 함유하는 분율은 ES-MS에 의해 확인되었고, 동결되고 동결건조되었다.

C. 분지화를 위한 다중 아민 기를 운반하는 주형과 합성 단백질(GRFNP40)에 (나중) 부착을 위한 보호된 아미노옥시 기의 합성

주형 GRFNP40을 상호적으로 0.4 mmol 스케일로 Sieber 아미드-발생 수지에서 합성하였다. 모든 커플링 사이에 DMF로 1분 흐름 세척 단계, 탈보호 및 활성화 단계가 있었다. 2 mmol N^α-Fmoc- N^β(Boc-아미노옥시아세틸)-L-디아미노프로피온산을 30 분 NHS-에스테르 전-활성화를 사용하여, DCM/DMF(디메틸포름아미드)중의 2mmol DIC 및 2 mmol NHS로 1 시간동안 수지에 커플링시켰다. Fmoc 보호기의 제거 (2 x 3 분 DMF중의 20% v/v 피페리딘)와 세척후에, 2.2 mmol DlEA 를 함유하는 8ml의 0.5M HOBT (N-히드록시벤조트리아졸) 용액에 용해된 4 mmol 숙신 안히드리드를 수지에 10 분동안 커플링시켰다. 이 단계후에, 카르복실기는 DMF중의 8 ml의 신선한 0.5 M (4 mmole) CDI 용액으로 활성화하였다. 4ml (18. 2 mmole) TTD 를 DMF중의 4 ml 0.5M HOBT 용액에 첨가하고 30 분동안 커플링하였다.

Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (2 mmol)를 발생되는 아미노-TTD-Succ Dpr (BocAoA)-수지 (여기서 Dpr = 디아미노프로피온산)에 2 mmol DIC 및 2 mmol NHS in DMF로 30 분의 전-활성화 및 1시간동안의 커플링을 사용하여 커플링하였다. 이러한 커플링은 한번 반복되었다. Fmoc 제거 단계후에 (2 x 3 분 20% v/v DMF중에 피페리딘), 4 mmol Fmoc-Lys (Fmoc)-OH를 상기한 바와 같이 재커플링을 포함하여, 커플링하였다. 최종 Fmoc 보호 단계 후에 (2 x 3 분 20% v/v DMF중의 피페리딘), 주형을 DCM 중의 4% TFA를 사용하여 표준 Fmoc-화학 과정에 따라 수지 지지체로부터 절단하였다. 침전된 생성물을 0.1% TFA을 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에 용해시키고 동결건조시켰다. 동결건조된 미정제 제품은 0.1% TFA를 함유하는 소량의 50% 수성 아세토니트릴에 용해시키고 희석시켜 유기의 농도를 1% 미만으로 낮췄다. 주형은 3% B에서(아세토니트릴중의 0.1% TFA) T = 40°C에서 평형화된 C4 예비 역상 칼럼위로 로딩하였다. 염과 다른 비아미드 재료는 등용매로 용출되었고, 원하는 주형은 60분에 걸쳐서 5-12 % 완충액 B (0.1% TFA을 함유하는 아세토니트릴) 대 0.1% 수성 TFA의 선형 구배로 정제하였다. 원하는 Lys-Lys(Lys)-TTD-Succ-Dpr(BocAOA).아미드재료(GRFNP40)를 함유하는 분율은 ES-MS에 의해 확인되었고, 동결되고 동결건조되었다.

D. 아미드-커플링된 분지상 중합체(GRFNP41)의 회합 및 탈보호

GRFNP41, 분지된 (TTD-Succ)₄₉-16kD 분자량의 중합체는 GRFNP39 [(Succ-TTD)₁₂-Succ-AlaOtBu]를 정제된 주형 GRFNP40에 커플링함으로써 합성되었다. 60 ℃에서 20 mg/ml의 농도로 DMSO (디메틸술폭시드)중에 용해된 정제된 (Succ-TTD) 12-Succ-AlaOtBu (GRFNP39) (1.0mmole)는 20배 (몰) 초과량의 DIEA의 존재하에서 0.95mole의 DMSO중의 HATU {0-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트}로 10 mg/ml의 농도에서 활성화되었다. 3.9 mg/ml의 농도에서 DMSO에 용해시킨 정제된 주형 GRFNP40(0.24mole)을 즉시 첨가하였다. 반응의 과정은 C4 분석 역상 HPLC 및 ES-MS에 의해 모니터링되었다. 전형적으로, 커플링은 몇분내에 완전하였다. 마무리를 위해, 4 볼륨(라이게이션 혼합에 비례하여) 0.1 M 나트륨 아세테이트/6 M 구아니디늄 클로라이드, pH 4를 첨가하고, 용액을 예비 (C4) 역상 HPLC 칼럼위에 로딩하였다. 염과 다른 비아미드 함유 재료는 등용매로 용출되었고 원하는 분지상 중합체 생성물은 80분안에 20-35 % 완충액 B (0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴) 대 0.1% 수성 TFA의 선형 구배로 정제하였다. 원하는 재료를 함유하는 부분은 ES-MS에 의해 확인되고, 냉동 및 동결건조되었다.

발생되는 정제된 중합체는 TFA 1 mg/ml의 농도에서 1 시간동안 스트레이트에 용해되어 아미노옥시아세틸 부분으로부터 Boc 기를 제거하고 -Ala-OtBu 부분으로부터 tertButyl 에스테르 기를 제거하였다. 용액을 회전 증발기에서 회전시켜 건조하고 건조한 중합체를 50% 완충액 B에 용해하였다(0.1% TFA을 함유하는 아세토니트릴). 아미노옥시아세트산 (a.k.a. '카르복시메톡실아민')을 0.5M의 최종 농도에 첨가하여 애덕트-형성 불순물을 소기하였다. 20분후에, 용액을 3.3 볼륨의 완충액 A (0.1% TFA in 물)으로 희석하고, 예비 C4 역상 HPLC 칼럼위로 로딩하고 모든 아미노옥시아세트산이 제거될 때까지 10% 완충액 B에서 펌핑하였고, 그후 중합체는 80분에 걸쳐 15% 내지 45% 완충액 B 대 0.1% 수성 TFA의 단계 구배로 정제되었다. 원하는 분지된 중합체 재료(GRFNP41)를 함유하는 모아진 부분은 냉동되고 동결건조되었다.

E. 분지된 중합체 GRFNP41으로 펩티드 단편 GRFN1776 및 GRFN1711의 옥심 형성 라이게이션(옥심화)

실시예 1에서 상기한 바와 같이 표준 인시투 중화 Boc 화학 SPPS를 사용하여 단편s SEP-1: 4 (GRFN1776, SEQ ID NO : 2의 잔기 117-166 와 단편 SEP-1: 1 으로 구성됨 (SEQ ID NO : 2의 잔기 1-32로 구성된 GRFN1711을 합성하였다. 펩티드 GRFN1776를 또한 상기한 바와 같은 표준 프로토콜을 따라 OCH2-Pam-수지 에서 합성하였다. 펩티드 GRFN1711를 상기한 바와 같은 표준 프로토콜을 따라 티오에스테르-gene래트ing 수지에서 합성하였다. Lys126에서 레불린(레불린) 아실 부분을 함유하는 단편 GRFN1776 및 AoAcontaining GRFNP41 는 0.1 % TFA를 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에서 같은 분자 비율로 함께 용해되었다. 용액은 동결건조하였다. 건조된 분말 미정제 생성물은 0.1 % TFA를 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에서 재용해시키고 예비 역상 (C4) HPLC 칼럼에서 로딩하였다. 중합체-변형 펩티드는 예비 구배 역상 HPLC에 의해 변경되지 않은 펩티드와 반응하지 않은 중합체로부터 분리되었다. 원하는 옥심-연결된 (옥심화) 생성물 SEP-1: 4+GP41을 함유하는 부분은 ES-MS에 의해 확인되고 모아지고 동결건조하였다.

Lys²⁴에서 레불린 아실 부분을 함유하는 단편 GRFN1711 및 AoA-함유 GRFNP41를 0.1% TFA를 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에 함께 동일한 몰비율로 용해하였다. 용액을 냉동시키고 동결건조시켰다. 건조된 분말을 0.1 % TFA를 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에서 재용해시키고 C4 예비 역상 HPLC 칼럼위로 로딩하였다. 중합체-변형 펩티드는 예비 구배 역상 HPLC에 의해 변경되지 않은 펩티드와 반응하지 않은 중합체로부터 분리되었다. 원하는 옥심-연결된 (옥심화) 생성물 SEP-1: 4+GP41을 함유하는 부분은 ES-MS에 의해 확인되고 모아지고 동결건조하였다.

F. 합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1 B51의 합성

(SEQ ID NO : 2)을 갖는 SEP-1-B51를 4 폴리펩티드 단편으로부터 용액에서합성하였다:

단편 SEP-1: 1+GP41 (GRFN 1711+GRFNP41; 잔기 1-32의 SEQ ID NO : 2)에 해당함:

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^oxITTGCA EH-티오에스테르

(여기서 K^ox로 나타내 바와 같이, Lys²⁴은 레불린 아실 펜던트 부분 옥심-중합체 GRFNP41에 연결되고; 및 여기서 His³²은 Dnp 보호된다)

단편 SEP-1: 2 (GRFN 1712;SEQ ID NO : 2의 잔기 33-88에 해당됨):

CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL

SEAVLRGQAL LVKSSQPW-티오에스테르 (여기서 Cys³³은 Acm 보호됨; 여기서 3 Trp 잔기는 포름일 보호된다)

단편 SEP-1: 3 (GRFN 1713, 잔기 89-116 ofSEQ ID NO : 2에 해당됨 ):

CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-티오에스테르 (여기서 Cys⁸⁹는 Acm 보호됨; 여기서 His94은 Dnp 보호됨)

단편 SEP-1: 4+GP41 (GRFN 1776+GRFNP41, 잔기 117-166 의SEQ ID NO : 2에 해당됨).

CAIS PPDAAK^oxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR

GKLKLYTGEA CRTGDR-카르복실레이트 (여기서 C-말단 시스테인(즉 Cys'61) 피콜일(피코)는 보호 기를 운반한다, 여기서 Kob에 의해 나타낸 바와 같이, Lys¹²⁶은 분지된 중합체 GRFNP41에 연결된-레불린 아실 펜던트 부분 옥심을 가진다)

하기의 변경과 함께, 실시예 1-4에서 기술된 바와 같이, 추가 펩티드의 합성, 라이게이션 반응, 카르복시메틸화, 보호기 제거 반응, 접힘 및 전체 길이, 접힌 SEP-1-B51 (SEQ NO : 2)를 산출하는 정제가 수행되었다:

단계 1: 라이게이션 #

단편 SEP-1: 4+GP41를 3 mM 농도로 TFE (1 체적)에 용해하였다. 단편 SEP-1: 3을 6 M 구아니디늄 클로라이드를 함유하는 2 볼륨의 300mM Na 포스페이트 완충액(pH 7.9)에 2.25 mM의 농도로 용해하였다. 2개의 용액을 혼합하여, 1mM 의 최종 단편 농도의 SEP-1: 4+GP41 및 1.5mM SEP-1: 3를 얻었고, 1% 티오페놀을 첨가하였고, 6.8-7.2의 pH에서 펩티드 단편의 용액을 발생하였다('3 체적'). 반응을 실온에서 밤새 진행시켰다. 라이게이션후에, 교반 혼합물에 β-메르캅토에탄올 (3 체적)을 첨가하고, 이어서 3 체적의 6 M 구아니디늄 클로라이드 300 mM Na 포스페이트 pH7트 완충액, 및 TCEP을 첨가하고 (펩티드 단편의 총 중량의 0.25 중량), 용액을 20분동안 교반하였다. 용액을 0.6 체적의 얼음의 아세트산으로 pH4.0+/-0.1까지 산화시켜 깨끗한 용액을 얻었고, 거기에 구아니디늄 클로라이드중의 6M, 30 체적의 pH 4.0,100mM Na 아세테이트 희석 완충액을 첨가하였다. 발생되는 용액을 예비 역상(C4) HPLC 칼럼위에 펌핑하였다. 완충액은 5% B [따라서 남은 부분은 물중의 95% 완충액 A (물중의 0.1% TFA)이다]에서 모든 비-펩티드 재료가 칼럼으로부터 용출할때까지 펌핑하였고, 그후 라이게이션 생성물을 80분에 걸쳐 25-45% 완충액 B의 구배에 의해 정제하였다. 원하는 라이게이트 생성물을 함유하는 부분은 (Cys89 (Acm)) {SEP1 : 3+SEP-1: 4+GP41} 일렉트로스프레이 질량 분석에 의해 확인되고 모아졌다.

단계 2: Acm-제거 #1

Acm 제거를 위해, (Cys⁸⁹(Acm)){SEP-1: 3+SEP-1: 4+GP41}의 모아진 부분을 함유하는 수성 아세토니트릴 용액을 HPLC 등급 물로 1x 희석하였고, 고체 요소를 2 M의 최종 농도에 대해 첨가하였다. 3배 몰농도 초과량 (총 시스테인 농도에 비례하여)의 3% 수성 아세트산 중의 30 mg/ml Hg (아세테이트) 용액을 첨가하고 용액을 1시간동안 교반하였다. 용액을 그후 3-메르캅토에탄올중의 20% 로 만들고, 반-에비 역-상 HPLC 칼럼 위로 로딩하고 모든 비-펩티드 재료가 용출할때까지 25% 완충액 B에서 펌핑하고, 생성물을 그후 50% 완충액 B로의 단계 구배로 정제하였다. . 원하는 라이게이트 생성물{SEP-1: 3+SEP1: 4+GP41}을 함유하는 부분은 전자스프레이 질량 분석에 의해 확인되었고, 모아지고 동결건조되었다.

단계 3: 라이게이션 #2

단계 2로부터의 {SEP-1: 3+SEP-1: 4+GP41} 생성물[즉, 1713-1776GP41]을 3 mM 농도에서 TFE (1 체적)에 용해하였다. 단편 SEP-1: 2 (단편 GRFN1712) 를 6 M 구아니디늄 클로라이드를 함유하는 2 체적의 300mM Na 포스페이트 완충액 (pH 7.9)에 2.25 mM의 농도로 용해하였다. 두가지 용액을 혼합하여, 최종 단편 농도의 1mM {SEP-1: 3+SEP1: 4+GP41} 및 1. 5mM SEP-1: 2을 얻고, 1% 티오페놀을 첨가하였고, 6.8-7.2의 pH에서 펩티드 단편의 용액('3 체적')을 얻었다. 반응을 밤새 실온에서 진행시켰다. 그후 라이게이션 혼합물을 6M 구아니디늄 클로라이드을 함유하는 희석 완충액: 100mM 나트륨 아세테이트 pH4.0의 3 체적 (즉, 위에서 사용된 TFE의 체적에 비례함)으로 희석하고, 그후 4℃로 냉각되고, 3 체적 TFE, 3 체적 (3-메르캅토에탄올, 3 체적 피페리딘 및 6 체적의 6M 구아니디늄 클로라이드, 100mM Na 아세테이트 pH 4.0으로 구성된 용액에 첨가하고 20분동안 실온에서 교반하여 어떠한 남은보호기를 제거하였다. 용액을 1.8 체적의 냉동 얼음의 아세트산으로 산성화하여 깨끗한 용액을 얻고 TCEP (펩티드 단편의 총 중량의 중량에 의 해 0.25)를 첨가하고, 용액을 20분동안 배양하였다. 그후 30 체적의 구아니디늄 클로라이드중의 pH4.0, 100mM Na 아세테이트 희석 완충액, 6m를 첨가하고 용액을 혼합하였다. 발생되는 용액을 예비역상 (C4) HPLC 칼럼 위로 펌핑하였다. 완충액을 모든 비-펩티드 재료가 칼럼으로부터 용출할때까지, 30% C (완충액 C: 0.1% TFA in 60% 이소프로판올/30% 아세토니트릴/10% 물)에서 펌핑하고, 그후 라이게이션 생성물을 80분에 걸쳐 37-57%% 완충액 C의 구배에 의해 정제하였다. (Cys33 (Acm)) {SEP-1: 2+SEP-1: 3+SEP-1: 4+GP41}을 함유하는 부분은 ES-MS에 의해 확인되고 모아지고 동결건조되었다.

단계 4: 잔기 Cys⁸⁹및 Cys¹¹⁷의 카르복시메틸화

(Cys³³(Acm)){SEP-1: 2+SEP-1: 3+SEP-1: 4+GP41} [즉, (Cys33 (Acm))-1712-1713-1776-GP41}을 1 mM 농도에서 TFE에 용해하였다. 6 M 구아니디늄 클로라이드 를 함유하는 10 체적의f 300 mM Na 포스페이트 완충액 (pH 7.9) 을 첨가하였다. 메탄올에 용해된 브로모아세트산의 25-배 초과량 (술프히드릴 기보다)을 75mg/ml 에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 그후 11 체적의 100mM Na 아세테이트 pH4.0,6M 구아니디늄 클로라이드으로 희석하고, 예비 역상 (C4) HPLC 칼럼 위로 로딩하고 모든 비-펩티드 성분이 용출할때까지, 20% 완충액 C에서 펌핑하고, 그후 라이게이션 생성물을 55% 완충액 C로의 단계 구배로 정제하였다. 원하는 변경된 생성물을 함유하는 부분(Cys33 (Acm); Ψ^89,1l7) {SEP-1 : 2+SEP1: 3+SEP-1: 4+GP41}은 ES-MS에 의해 확인되었고 모아지고 동결건조되었다.

단계 5: 피콜일 제거

5분동안 2M HCl에서 Zinc 더스트(펩티드의 밀리그램당 71 밀리그램)를 활성화하였고, 활성화는 한번 반복되었고, 그후 아연은 10분동안 6M 구아니디늄 클로라이드, 35 mg/ml L-메티오닌 및 35 mg/ml Na 도데카노일사르코신을 함유하는 50mM 글리신 pH2.2 (새롭게 추가된) 및 10% v/v TFE으로 세척하여 과도한 산을 제거하였다. 세척은 한번 반복하였다. Cys161 (피코) 함유하는 펩티드 (Cys³³(Acm); Ψ^89,117) {SEP-1: 2+SEP-1: 3+SEP-1: 4+GP41}을 스트레이트 TFE에 용해하였다. 용액을 4 볼륨(TFE에 비례하여) 6M 구아니디늄 클로라이드, (새롭게 추가된) 35 mg/ml L-메티오닌 및 35 mg/ml Na 도데카노이사르코신을 함유하는 50mM 글리신 pH2.2 및 10% v/v TFE으로 희석하였다. 용액을 활성화된 아연 분말에 첨가하고 실온에서 50 분동안 교반하였다. 반응을 분석 C4 역상 HPLC의 알리콧(동일한 부피의 3-메르캅토에탄올 및 약간의 그레인의 TCEP으로 처리하고, 그후 분석을 위해 2 체적의 6M 구아니디늄 클로라이드, 100mM Na 아세테이트 pH4.0 으로 희석하였다)에 의해 1시간 간격으로 모니터하고 2 내지 5 시간후에 완료되었다. 피콜일 기 제거 가 완료된 후에, 분석 HPLC 피크의 ES-MS 분석 (즉, 91 Da 질량의 손실)에 의해 나타낸 바와 같이, 상청액을 여과에 의해 제거하고 남아있는 Zn 분말을 6M 구아니디늄 클로라이드, pH 4, 35 mg/ml L-메티오닌을 함유하는 100 mM 아세테이트 및 20% TFE을함유하는 35 mg/ml 도데실사르코신으로 3회 세척하였다. BioRad SM-2 비드(용액 부피의 대략 1/3)를 조합된 상청액과 워시에 첨가하고 실온에서 30분동안 교반하고, 그후 여과하였다. p-메르캅토에탄올을 10% v/v에 첨가하고,그후 0.25x (펩티드의 조합된 중량)의 TCEP를 첨가하고 용액을 실온에서 5분동안 교반하였다. 용액은 동일한 부피의 100mM Na 아세테이트 pH4.0,6M 구아니디늄 클로라이드로 1: 1 희석하였고 예비 (C4) 역상 HPLC 칼럼위로 로딩하였고, 모든 비-펩티드 재료가 용출될 때까지 35% 완충액 C를 펌핑하고, 원하는 생성물을 55% 완충액 C까지의 단계.구배로 정제하였다. 원하는 Cys¹⁶¹-탈보호된 생성물 (Cys³³(Acm); Ψ^89,117) {SEP-1: 2+SEP-1: 3+SEP-1: 4+GP41-피코}을 함유하는 부분을 전자스프레이 질량 분석에 의해 확인하고 모았다.

단계 6 : Acm-제거 #2

(Cys³³(Acm); Ψ^89,117) {SEP- 1: 2+SEP-1: 3+SEP-1: 4+GP41-피코} [즉, (Cys³³(Acm); Ψ^89,117)-1712-1713-1776-GP41]의 모아진 용액을 HPLC 등급 물로 3x 희석하였고, 최종 농도의 2M를 위해 고체 요소를 첨가하였다. 3% 수성 아세트산중의 3배 몰비(총 시스테인 농도에 비례하여)의 30 mg/ml Hg (아세테이트) 2 용액 을 첨가하고 용액을 1시간동안 실온에서 교반하였다. 용액을 그후 β-메르캅토에탄올 중에 20%로 만들고, 반-예비 (C4) 역상 HPLC 칼럼위로 로딩하였다. 완충액 C (20%)를 모든 비-아미드 재료가 용출될 때까지, 펌핑하였고, 그후 원하는 생성물을 55% 완충액 C로의 단계 구배로 정제하였다. (Cys33 ; T89s117) {SEP-1 : 2+SEP-1: 3+SEP1:4+GP41-피코} 을 ES-MS에 의해 확인하고, 2x (w/w 펩티드 질량에 비례함) DPC (도데실포스포콜린)를 함유하는 물로 2x (v/v) 희석하고 밤새 동결건조시켰다.

단계 7: 라이게이션 #3

(Cys33 ; Ψ^89,117) {SEP-1: 2+SEP-1: 3+SEP-1: 4+GP41-피코} [즉,(Cys³³; Ψ^89,117)-1712-1713-1776-GP41] 을 스트레이트 TFE (1 체적)에서 3 mM 농도로 용해하였다. SEP-1: 1 [즉, 1711-GP41]를 6 M 구아니디늄 클로라이드를 함유하는 2 체적 300 mM Na 포스페이트에 (pH 7.9) 용해시켰다. 용액을 조합하고, 1% v/v 티오페놀을 첨가했다. 라이게이션 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용액에 3 체적 (상기 TFE 체적에 비례)의 -메르캅토에탄올, 및 9 체적의 라이게이션 완충액 (300 mM Na 포스페이트 완충액 pH 7.9, 6 M 구아니디늄 클로라이드를 함유)를 첨가하였다. 용액에 0.25x (펩티드의 조합된 중량) TCEP을 첨가하고 용액을 실온에서 20분간 교반하였다. 얼음의 아세트산 (0.6 체적)을 첨가하여 용액을 pH4.0로 산성화하고, 용액을 그후 6M 구아니디늄 클로라이드을 함유하는 30 체적의 100mM Na 아세테이트 pH4.0 로 희석하고, 예비 (C4) 역상 HPLC 칼럼 위로 로딩하였다. 모든 비-아미드 재료가 용출될때까지, 완충액 C (25%)를 펌핑하고, 그후 교반 생성물을 80분에 걸쳐 35-55%으로부터의 선형 구배의 완충액 C로 정제하였다. 원하는 라이게이트 생성물 SEP-1 (1166) (Ψ^89,117) {SEP-1: 1 (+GP41) +SEP-1: 2+SEP-1: 3+SEP-1: 4+GP41} : (SEQ ID NO : 2)을 전자스프레이 질량 분석에 의해 확인하고, 모았다.

단계 8 접힘 :

전체 길이 라이게이트 펩티드를 함유하는 SEP-1 (1-166) (Ψ^89,117) {SEP-1 : 1 (+GP41) +SEP-1 : 2+SEP-1 : 3+SEP-1: 4+GP41} [즉, 1711 (GP41)-1712-1713-1776-GP41]에 고체 구아니디늄 클로라이드, 1M Tris 완충액 (pH 8.7) 및 증류수를 첨가하여 최종 용액을 ml 라이게이트 펩티드 SEP-1 (1-166), 6M 구아니디늄 클로라이드, 100mM Tris 당 0.1 밀리그램으로 만들고, 이러한 라이게이트 펩티드 ('단백질') 용액을 15ml 투석 카세트 위로 로딩하고 밤새 4℃에서 3 M 구아니디늄 클로라이드, 5마이크로몰 시스테인 및 2 마이크로몰 시스테인을 함유하는 100 mM Tris 완충액 (pH 8.5) 용액에 대해 투석시켰다. 단백질 용액은 그후 1 M 구아니디늄 클로라이드을 함유하는 100 mM Tris 완충액 (pH 8.5)의 용액에 대해 8시간동안 4℃에서 투석시키고 마지막으로 4℃에서 14시간동안 10 mM Tris 완충액 (pH 7.0)에 대해 투석시켜 최종 접힌 생성물을 얻었다. 투석 카세트로부터 접힌 단백질-함유 용액을 조합하였다. 접힘을 ES-MS, 분석 RP-HPLC, 및 CD 스펙트로미트리에 의해 확인하였다.

단계 9 정제 : 접힘한 단백질-함유 용액을 10 mM Tris, pH 7. 0로 평형시킨 Q-Sepharaose 이온 교환 칼럼위에 로딩하였다. 125 mM NaCI로의 선형 염 구배를 사용하여 접힌 단백질을 용출시켰다. 원하는 접힌 생성물 SEP-1-B51을 함유하는 부분은 비-환원 SDS-PAGE에 의해 확인되고, 모아졌다. 조합된 부분은 울트라여과에 의해 대략 밀리리터당 2 밀리그램의 농도로 농축되고, 그후 단백질 용액을 2.6x100cm S-300 겔 여과 칼럼위에 로딩하였다. 정제된 SEP-1-B51을 10mM Tris pH7.0,137 mM나트륨 클로라이드으로 용출시켰다. 고순도 SEP-1-B51를 함유하는 부분을 비환원 SDS-PAGE에 의해 확인하고, 모으고, 동결시키고 -80℃에서 저장하였다. 최종, 정제된 접힌 단백질 SEP-1-B51은 분석 (C4) 역상 HPLC, ES-MS, 비환원 SDS-PAGE, 및 CD 스펙트로미트리에 의해, 특징지어진다.

도 25는 접힌, 정제된 SEP1-B51의 상대적인 분자량을 나타내는 대표적인 등전 집중화 겔 (IEF) 및 비환원 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 동일한 겔에서 작동되는 분자량 표준이 비교를 위해 나와있다. 나타낸 바와 같이, 비 환원 SDS PAGE에 의해 결정됨으로써 SEP1-B51의 상대 분자량은 약 73kDa이다. 상대 pl은 대략 5.0이다. 또한 접힌, 정제된 SEP-1-B51 생성물의 대표 RP-HPLC 크로마토그램이 나와있다. 이것은 본 발명의 정확한 중합체-변형 단백질의 순도 및 증가된 상대 분자량을 예증한다.

실시예 8

합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-B52의 합성

A. SEP-1-B52의 조성물. 7번째 합성 적혈구생성 자극 단백질(SEP-1-B52으로 지정됨)을 합성하였다. 전체길이 SEP-1-B52의 아미노산 서열은 SEP-1-B51의 것과 동일하다:

APPRLICDSR VLERYLLAK EAEK^oxITTGCA EHCSLNEKIT

VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL

LVKSSQPWΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKvAIS

PPDAAK^oxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR (SEQ ID NO : 2)

여기서 Ψ는 술프히드릴 기에서 카르보메틸화된 시스테인으로 구성되는 비-천연 아미노 산 잔기를 나타내고, 여기서 K^ox는 옥심 결합을 통해 지정된 수용성 중합체에 커플링된 옥심 링커와 함께 ε-아미노 기에서 화학적으로 변경된 비천연 리신을 나타낸다.

SEP-1-B52 단백질은 SEP-1-B5와 유사한 분지상 (Succ-TTD)₁₂-Succ-Ala 중합체 구조를 갖는 잔기 24와 126에서 유도되었지만, 이러한 유사체에 대한 중합체는 피루브산 및 아미노옥시아세트산 사이의 옥심 결합을 통해 부착되었다. 게다가, 리신 잔기 24와 126의 ε-아미노 기는 레불린 아실 부분을 대신하여 아미노옥시아세틸 작용기를 갖도록 변경되었다. 분지상 (Succ-TTD) 12-Succ-Ala 중합체 구조는 펜던트 피루브 아실 부분을 갖도록 만들어졌다. 이들 전하는 합성과 취급을 향상시키고, 옥심 결합의 안정성을 더욱 증가시키도록 설계되었다.

도 23은 옥심-형성 라이게이션을 통해 SEP-1-B52에 결합된 분지상 수용성 GRFNP43 (GP43)의 화학적, 합성을 설명하는 도식이다. 전체 길이 생성물의 회합은 실시예 2에서 기술된 바와 같았다. SEP-1-B52 의 구조는 도 24에 나타난다.

B. 분지 주형 (GRFNP42)에 커플링하기 위한 (Succ-TTD) 12-Succ-AlaOtBu (GRFNP39)의 합성

(Succ-TTD)₁₂-Succ-AlaOtBu(GRFNP39)을 0.5 mmol 스케일에서 합성하였다. 0. 5mmole(~0.5 그램) Sasrin 산 불안정, 카르복실산-발생 폴리스티렌 수지(히드록실 치환 1.02 mmole/g;)을 15분동안 DMF에 팽창시키고 그후 배출하였다. 이 히드록실-기능화 수지에 500 마이크로리터 (3.9 mmole) DIEA (디이소프로필에틸아민)을 함유하는 8 ml의 DMF에 용해된 450 mg (4.5 mmole) 숙신산 무수물 및 488 mg (4 mmole) 4-(디메틸아미노) 피리딘을 첨가하고 소용돌이 교반과 함께 30분동안 반응시키고, 그후 배출시켰다. 커플링을 반복하고 초과량의 반응물과 용해가능 공생성물을 DMF (~50mol)으로 1분 소용돌이 흐름 세척에 의해 제거하고, 그후 배출하였다. HOOC-CH₂CH₂CO-O-수지 (0.5 mmole)을 DMF중의 8ml의 신선한 1.0 M (8 mmole) CDI 용액을 첨가함으로써 활성화하고 40분동안 반응시키고, 배출하였다. 과도한 반응물과 용해가능 공생성물은 DMF (~50ml)으로 1 분 소용돌이 흐름 세척함으로써 제거되었고, 배출되었다. DMF중의 4 ml 0.5M (2 mmole) HOBT 용액에 용해된 4 ml (4 그램, 18.2 mmole) TTD을 첨가하고 30분동안 소용돌이 교반으로 반응시키고 배출시켰다. 과도한 반응물과 용해가능 공생성물을 DMF (~50mol)으로 1 분 소용돌이 흐름 세척 에 의해 제거하고 배출하였다. 500 마이크로리터 (3.9 mmole) DIEA을 함유하는 8 ml의 0.5M (4 mmole) HOBT (N-히드록시벤조트리아졸) 용액에 용해된 숙신산 무수물 (450 mg, 4.5 mmole)를 수지에 첨가하고 15분동안 소용돌이 교반으로 반응시키고, 그후 배출하였다. 3 단계 (GDI 활성화; TTD 커플링; 숙신산 무수물 반응)를 11번 반복하였다.[즉, 총 12회]. 과도한 반응물과 용해가능 공생성물을 DMF (-50ml)으로1분 소용돌이치는 흐름 세척에 의해 제거하였고, 배출하였다. The HOOC-CH₂CH₂CO (TTD-숙시닐)₁₂-O-수지 (0.5 mmole)를 활성화하였다. DMF중의 8ml의 신선한 1.0 M (8 mmole) CDI 용액으로 활성화하고, 40분 동안 반응시키고, 배출시켰다. 과도한 반응물과 용해가능 공생성물을 DMF (-50ml)으로 1-분 소용돌이 흐름 세척에 의해 제거하고, 배출하였다. 2.5 mmole HAlaOtBu. HCI을 150 마이크로리터 (111 mg, 0.825 mmole) DIEA을 함유하는 DMF중의 4.75 ml 0.5 M (2.375 mmole) HOBT에 용해시키고, CDI-활성화 HOOC-CH₂CH₂CO (TTD-숙시닐)₁₂-O-수지 (0.5 mmole)으로 1시간동안 소용돌이 교반으로 반응시키고, 그후 배출시켰다. 과도한 반응물 및 용해가능 공생성물을 DMF (~50ml)으로 1-분 소용돌이 흐름 세척에 의해 제거하고, 그후 배출시켰다. 생성물 tertBuOOC-CH(CH₃)-NH-OC-CH₂CH₂CO (TTD-숙시닐) 12-O-수지를 DCM로 광범위하게 세척하고, 배출시키고 그후 수지를 일정한 중량으로 진공하에서 건조시켰다. 생성물-수지의 전형적인 중량은 약 2 그램이었다.

DCM중의 4% TFA를 사용하여 표준 Fmoc-화학 과정에 따라 수지 지지체로부터 선형 GRFNP39를 절단하였다. 침전된 미정제 생성물은 0.1 % TFA 를 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에 용해시키고 동결건조하였다. 동결건조한 중합체를 0.1 % TFA 를 함유하는 소량의 50% 수성 아세토니트릴에 용해시키고 희석시켜서 유기 농도를 1% 미만으로 줄였다. 미정제 생성물을 3% B에서 T=40℃에 눈금보정된 C4 예비 역상 HPLC 칼럼위에 로딩하였다. 염을 등용매로 용출하고 60분에 걸쳐 원하는 주형을 20-35% 완충액 B (0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴) 대 0.1% 수성 TFA 의 선형 구배로 정제하였다. 원하는 (Succ-TTD)₁₂-Succ-AlaOtBu 재료(GRFNP39)를 함유하는 부분을 ES-MS에 의해 확인하고, 냉동하고 동결건조시켰다.

C. 분지를 위한 다중 아민기를 운반하는 주형 및 단백질에 대한 (이후의) 부착을 위한 펜던트 피루브 아실 부분의 합성

주형은 0.4 mmol 스케일에서 Boc-Leu-OCH2-Pam-수지에서 수동식으로 합성되었다. DMF로 1분 흐름-세척 단계를 모든 커플링, 탈보호 및 활성화 단계 사이에 사용하였다. Boc 기를 스트레이트 (즉 100%) TFA로 처리함으로써 제거하였다. DMF 세척후에, 1 ml DIEA를 함유하는 3.8 ml DMF중의 1.8 mmol HBTU 으로 활성화한후에, 2 mmol Fmoc-(Rink-링커)-OH를 수지에 커플링하였다. Fmoc 보호기 (2 x 3 분 20% DMF중의 피페리딘)를 제거한 후에, DMF중의 2 mmol DIC 및 2 mmol NHS으로 NHS-에스테르 활성화를 사용하여, 2 mmol Fmoc-Lys (MTT)-OH [MTT = 4-메틸트리틸]를 수지에 커플링하였다. Fmoc 보호기 (2 x 1 분 DMF중의 0.5% DBU)의 제거 후에, 2.2 mmol DIEA를 함유하는 8ml의 0. 5M HOBT 용액 중에 용해된 4 mmol 숙신산 무수물을 수지에 10분동안 커플링하였다. 이 단계 후에, 수지-결합된 카르복실 기는 DMF중의 8 ml의 신선한 0.5 M CDI 용액으로 활성화시켰다. 4 ml TTD를 4 ml 0.5M HOBT 용액에 첨가하고 30분동안 커플링하였다.

DMF중의 2 mmol DIC 및 2 mmol NHS으로 NHS-에스테르 활성화를 사용하여 2 mmol Fmoc-Lys (Fmoc)-OH를 수지에 커플링하였다. Fmoc 제거 단계 (2 x 1 분 0.5% DBU in DMF)후에, 4 mmol Boc-Lys (Boc)-NHS는 3 ml DMF 중에 커플링한다.

MTT 보호 기는 DCM 중의 2% TFA으로 다중 세척에 의해 제거되었다. 탈보호는 상청액이 그것의 황색이 없어질때까지 완료되었다. 수지를 DMF중의 10% DIEA으로 1분 동안 중화하였다. 45분동안 DMF 중의 2 mmol DIC 및 2 mmol NHS로 NHS-에스테르 활성화함으로써 2 mmol 피루브산을 수지에 커플링하였다. 주형을 탈보호시키고 5% 물을 함유하는 스트레이트 TFA를 사용하여 수지 지지체로부터 절단하였다. 분할 용액은 회전 증발기에서 건조하게 증발시켰다. 잔기를 0.1% TFA을 함유하는 50% 수성 아세토니트릴중에 용해시키고 동결건조시켰다. 동결건조된 주형을 0.1% TFA을 함유하는 소량의 50% 수성 아세토니트릴에 용해시키고 희석시켜 유기의 농도를 1% 미만으로 줄였다. 피루베이트-함유 주형을 0 % 완충액 B에서 T = 40℃에서 평형을 이룬 C4 Prep 칼럼 위로 로딩하였다[즉 물중의 100% 완충액 A = 0.1 % TFA]. 염을 등용매로 용출시키고 원하는 주형을 60 분에서 5-12 %의 완충액 B 대 0.1% 수성 TFA의 선형 구배로 정제하였다. 원하는 재료(GRFNP42)를 함유하는 부분은 ESI-MS에 의해 확인되고, 냉동되고 동결건조되었다.

D. 아미드-커플링된 분기된 중합체 (GRFNP43)의 회합 및 탈보호

GRFNP43, 분기된 (TTD-Succ)₄₉-16kDa 분자량의 중합체는 GRFNP39를 정제된 주형 GRFNP42에 커플링함으로써 합성되었다. 60℃에서 20 mg/ml의 농도로 DMSO에 용해된 정제된 (Succ TTD)₁₂-Succ-AlaOtBu (GRFNP39) (1.O mmole)은 12배 (몰) 초과량의 DIEA의 존재하에서 10 mg/ml의 농도에서 DMSO중의 0.95mole의 HATU으로 활성화되었다. 3.9 mg/ml의 농도로 DMSO중에 용해된 정제된 주형 (0.24mole) GRFNP42을즉시 첨가하였다. 반응의 과정을 분석 C4 역상 HPLC 및 ES-MS에 의해 모니터링하였다. 전형적으로, 커플링을 몇분안에 완료되었다. 마무리를 위해, 4 체적 (라이게이션 혼합물에 비례하여) 0. 1 M 아세테이트/6 M 구아니디늄 클로라이드, pH 4를 첨가하고, 용액을 예비 (C4) 역상 HPLC 칼럼위로 로딩하였다. 재료를 함유하는 염과 다른 비-아미드를 등용매로 용출하였고 원하는 생성물 분지된 중합체는 80 분에 걸쳐서 20-35 % 완충액 B (0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴) 대 0.1% 수성 TFA의 선형 구배로 정제되었다. 원하는 재료를 함유하는 부분을 ES MS에 의해 확인하고, 냉동시키고 동결건조시켰다.

생성되는 정제된 분지상 중합체 구조 GRFNP43를 1시간 동안 1 mg/ml의 농도로 스트레이트 TFA에 용해시켰다. Ala-OtBu tertButyl 에스테르 보호를 제거하였다. 용액을 회전 증발기에서 건조 상태로 증발시켰다. 건조시킨 중합체를 TFA 80분에서 15% 내지 45% 완충액 B 대 0.1% 수성 TFA의 단계 구배로 예비 역상 HLPC 위에서 염분제거하였다. 원하는 재료(GRFNP43)를 함유하는 모아진 분율은 냉동되고 동결건조되고, 옥심 형성 라이게이션 단계를 위해 사용된 분말을 건조시켰다.

E. 분지된 중합체 GRFNP43로 GRFN1776 및 GRFN1711의 옥심-형성 라이게이션(옥심화)

상기 실시예 2,3,4 및 7에서 기술된 바와 같이 단편 SEP-1:4, 및 단편 SEP-1:1를 합성하였다. 오직 레불린 산을 대신하여 아미노옥시아세틸 (AoA) 부분을 표준 커플링 프로토콜을 따라 각각의 펩티드 단편에서 Lys²⁴및 Lys¹²⁶에 추가되었다.따라서, 펩티드 수지의 회합 후에, 측쇄 Fmoc 기를 각각의 펩티드-수지로부터 제거하였다. DMF중의 2 mmol DIC 및 2 mmol NHS 로 NHS-에스테르 활성화를 사용하여 2 mmol Boc아미노옥시아세트산을 수지에 첨가하였다. 2개의 펩티드는 탈보호되고, HF으로 수지로부터 절단하고 C4 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 예방 조치를 취해 카르보닐 화합물에 노출되는 것을 피했다. 단편 SEP-1: 4 및 GRFNP43을 공동으로 동일몰 비에서 0.1% TFA (트리플루오로아세트산)을 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에서 용해시켰다. 용액을 동결건조시켰다. 건조된 분말을 0.1% TFA를 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에 재용해하였고 예비 C4 역상 HPLC 칼럼위에 로딩하였다. 중합체 변형 펩티드는 변경되지 않은 펩티드 및 반응하지 않은 중합체로부터 예비 구배 역상 HPLC으로부터 분리시켰다. 원하는 옥심화 생성물 SEP-1: 4+GP43을 함유하는 부분은 ES-MS에 의해 확인되고 모아졌다.

단편 SEP-1: 1 및 GRFNP43을 0.1 % TFA를 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에서 동일 몰비에서 함께 용해하였다. 용액을 냉동시키고 동결건조하였다. 건조된 분말을 0.1% TFA를 함유하는 50% 수성 아세토니트릴에 용해시키고 예비 구배 C4 역상 HPLC 칼럼위에 로딩하였다. 중합체-변형 펩티드는 예비 역상 구배에 의해 변경되지 않은 펩티드와 반응하지 않은 중합체로부터 분리되었다. 원하는 옥심화 생성물 SEP-1: 1+GP43 을 함유하는 부분은 ES-MS에 의해 확인되고 모아졌다.

F. 합성 적혈구생성 자극 단백질 SEP-1-B52의 합성

SEP-1-B52 (SEQ ID NO : 2)는 다음과 같은 4개의 폴리펩티드 단편으로부터 용액에 합성되었다:

단편 SEP : 1 : 1+GP43 (GRFN 1711+GRFNP43; 잔기 1-32 의SEQ ID NO : 2에 해당함):

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^oxITTGCA EH-티오에스테르 (여기서K ^ox에 의해 나타낸 바와 같이, Lys²⁴은 분지상 중합체 GRFNP43에 옥심-연결된 AoA 펜던트 부분을 가지고; 여기서 His³²는 Dnp 보호된다)

단편 SEP-1 : 2 (GRFN 1712; 잔기 33-88 의 SEQ ID NO : 2에 해당함):

CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL

SEAVLRGQAL LVKSSQPW-티오에스테르 (여기서 Cys³³는 Acm 보호된다; 여기서 3개 Trp 잔기는 포름일 보호된다)

단편 SEP-1: 3 (GRFN 1713, 잔기 89-116의 SEQ ID NO : 2에 해당됨):

CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-티오에스테르 (여기서 Cys³⁹는 Acm 보호되고; 여기서 His⁹⁴는 Dnp 보호된다)

단편 SEP-1: 4+GP43 (GRFN 1776+GRFNP43, 잔기 117-166의SEQ ID NO : 2에 해당됨):

CAIS PPDAAK ^oxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR

GKLKLYTGEA CRTGDR-카르복실레이트 (여기서 C-말단 시스테인(즉, Cys¹⁶¹)은피콜일 (피코) 보호 기를 운반하고, 여기서 K^ox에 의해 나타낸 바와 같이, Lysq¹²⁶은 분지상 중합체 GRFNP43에 옥심-연결된 AoA 펜던트 부분을 가진다).

추가적인 펩티드, 라이게이션 반응, 카르복시메틸화, 보호기 제거 반응, 접힘 및 정제가 상기 실시예 1,2,3.4 및 7에서 기술된 바와 같이 수행되어 전체 길이, 접힌 SEP-1-B52 (SEQ ID NO : 2)를 수득하고, 그것은 분석 (C4) 역상 HPLC, ES-MS, 및 비환원 SDS-PAGE에 의해 특성화되었다. 다른 SEP 구조에 대해 설명된 바와 같이 생물검정을 수행한다.

실시예 9

SEP-3-L42에 대한 유효성 연구

SEP-3-L42를 Citrate 완충액(20mM 나트륨 시트레이트 + 100mM 나트륨 클로라이드) 플러스 0.25% 래트 혈청 알부민(RSA)에서 다시 조제하고, 0,1,5, 또는 10 μg/kg, tiw의 투여량으로 (그룹당 5 래트) 1,3, 및 6일째에 정상 수컷 래트에게 정맥내 투여되었다. 혈액 샘플을 마지막 투여 후에 (9일째) 4일 수집하였고 혈액학적 파라미터에 대해 분석하였다. 대조군의 것들과 비교했을때, 이들 투여량에서 SEP-3-L42 으로 마지막 주사한 후에 4일째에 적혈구(RBC), 헤모글로빈(HGB), 헤마토크릿(HCT), 및 망상적혈구 수(RET) 값에서의 통계학적으로 중요한 어떠한 차이가 없었다.

실시예 10

SEP-3-L42에 대한 약물생체 반응학 연구

SEP-3-L42를 Citrate 완충액(20mM 나트륨 시트레이트 + 100mM 나트륨 클로라이드) 플러스 0.25% RSA, pH6.9에서 다시 조제되고, 5ug/kg의 투여 수준에서 단일 투여량으로 정상 수컷 래트에게 정맥내 투여되었다. 혈액 샘플을 투여 후에 0,1,2,4,6,12,24,48,72,96,120,144 및 168 시간에서 수집하였다. 제조업체 지시에 따라 안티-EPO ELISA 키트 (R & D Systems, 사람 에리스로포이에틴 Quantikine IVD 면역분석 Kit #DEP00)에 의해 SEP-3-L42 농도를 결정하였다. 결과는 도 27에 나타나있다.

도 27에 나타낸 바와 같이, SEP-1-B50는 SEP3-L42에 비해 약간 더 낮은 제거를 나타내었다. 그것의 순환 반감기에도 불구하고, SEP3-L42는 통계학적으로 유의한 차이를 나타내는데 실패하였다. 대조적으로, SEP-1-B50는 실험한 투여량에서 적혈구 제조를 촉진하였다. 이것은 중합체 구조가 약물생체 반응학 거동 및 효능을 포함하는, 생체내 생물학적 특성에서 미세-튜닝에 이용될 수 있다는 것을 예증한다.

실시예 11

SEP-1-L30에 대한 유효성 연구

SEP-1-L30을 Citrate 완충액(20mM 나트륨 시트레이트 + 100mM 나트륨 클로라이드) 플러스 0.25% RSA에서 다시 조제하고, 0,1,5,25 또는 50μg/kg, tiw의 투여량으로 (그룹당 5 래트) 1,3, 및 5일째에 정상 수컷 래트에게 정맥내 투여하였다. 혈액 샘플을 마지막 투여 후에 (9일과 13일째) 4일과 8일에 수집하였고 혈액학적 파라미터에 대해 분석하였다. 대조군의 것들과 비교했을때, SEP-1-L30으로 치료한후에 어떠한 간격에서 RBC, HGB, 및 HCT 값에서의 통계학적으로 중요한 어떠한 차이는 없었다. 망상적혈구 수는 25 및 50μg/kg로 처리된 래트에 대해서 마지막 투여 후(9일째) 4일째에 더 높았다(대조군의 것들과 비교했을때 통계학적으로 유의적인 차이). 혈액학 파라미터에서의 어떠한 다른 차이는 SEP-1-L30로 처리된 어떤 동물에 대해 9일 또는 13일에 관찰되지 않았다. [데이타 나타내지 않음]

실시예 12

SEP-1-L30에 대한 약물 생체 반응학 연구

SEP-1-L30을 Citrate 완충액(20mM 나트륨 시트레이트 + 100mM 나트륨 클로라이드) 플러스 0.25% RSA, pH6.9에서 다시 조제하고, 5 또는 25ug/kg의 투여 수준에서 단일 투여량으로 정상 수컷 래트에게 정맥내 투여되었다. 혈액 샘플을 투여 후에 0,1,2,4,6,12,24,48,72,96,120,144 및 168 시간에서 수집하였다. 제조업체 지시에 따라 SEP-1-L30 플라즈마 농도는 ELISA 키트(R & D Systems, 사람 에리스로포이에틴 Quantikine IVD 면역분석 Kit #DEP00)에 의해 결정되었다. 어떠한 SEP-1-L30은 주어진 투여량에서 어떠한 시점에서 검출되지 않았다.

실시예 13

SEP-1-B50에 대한 유효성 연구

SEP-1-B50을 무균 PBS (포스페이트 완충처리한 살린) 플러스 0.25% RSA에서 다시 조제하고, 1, 3 및 6일째에 정상 수컷 래트(그룹당 5 래트)에게 0,1,5,25 또는 125 μg/kg, tiw의 투여량으로 정맥내 투여하였다. 혈액 샘플을 마지막 투여후 4,9 및 14일에 수집하고(10,15 및 20일째) 혈액학 파라미터에 대해 분석하였다. 데이타는 하기 표 VIII에 나타나있다. 5, 25 및 125μg/kg SEP-1-B50을 수용하는 동물에 대해 마지막 투여후 4일째(10일째)에서 증가된 RBC, HGB, HCT, 및 RET에 있어서의 투여량 관련 반응이 관찰되었다(대조군의 값과 비교할때 통계학적으로 유의적 차이). 이들 동물에 대한 RBC, HGB, 및 HCT은 15일째에 대조 값보다 더 높게 남아있었고 125 μg/kg에서 처리된 동물에 대해 20일(마지막 투여후 14일)동안 내내 계속 대조 값보다 상당히 더 높았다. 25 및 125 μg/kg 동물에 대해, 15일과 20일째에 상당히 더낮은 카운트수와 함께, 10일째후에는 RET 제조가 감소되었다.

실시예 14

SEP-1-B50에 대한 약물 생체 반응학적 연구

SEP-1-B50을 Citrate 완충액 (20mM 나트륨 시트레이트 + 100mM 나트륨 클로라이드) 플러스 0.25% RSA, pH6.9에서 다시 조제하고, 단일 투여량으로서 5 또는 25 ug/kg의 투여 수준으로 정상 수컷 래트에게 정맥내 투여하였다. 투여후 0,1,2,4,6,12,24,48,72,96,120,144,168 시간에 혈액 샘플을 수집하였다. SEP-1-B50의 플라즈마 농도는 제조업체 지시에 따라 ELISA kit (R & D Systems, 사람 에리스로포이에틴 Quantikine IVD 면역분석 Kit#DEP00)에 의해 결정되었다. 제거 반감기를 5 및 25 ug/kg 투여량에 대해, 각각 9.7 및 9.9 시간으로 결정하였다. 관찰된 MRT (평균 잔류 시간)은 5 및 25 ug/kg 투여량에 대해 각각, 13.9 및 14.4 시간이었다. SEP-1-B50에 대한 대표적인 약물 생체 반응학 프로파일은 도 27에 나타난다.

실시예 15

SEP-1-B51을 위한 유효성 연구

SEP-1-B51은 2가지 실험에서 정상 수컷 래트로 정맥내 투여되었다.

실험 1:SEP-1-B50을 Citrate 완충액 (20mM 나트륨 시트레이트 + 100mM 나트륨 클로라이드) 플러스 0.25% RSA에서 다시 조제하고, 0,1,5 또는 25μg/kg, tiw의 투여량으로 (그룹당 5 래트) 1, 3 및 6 일째에 정상 수컷 래트에게 정맥내 투여되었고 혈액 샘플을 혈액학적 파라미터의 분석을 위해 마지막 투여 후에 (10일,15일 및 20일) 4, 9 및 14일에 수집하였다. 데이타는 표 IX에 나와있다. SEP-1-B51 으로 세번째 및 마지막 정맥내 투여 4일후에(10일째), 대조군의 값과 비교할때, RBC, HGB, HCT 및 절대적인 망상 적혈구 카운트 (ART)에서의 통계학적으로 상당한 증가가 25 μg/kg SEP-1-B51을 수용하는 동물에 대해 관찰되었다. 이들 동물들에 대한 RBC 값은 15일째에 대조값보다 더 높게 남아있었고 20일째에 대조값과 비교할만 하였다. 15일째에 5 및 25 μg/kg 동물들에 대해 관찰된, 상당히 더 낮은 카운트수와 함께, 10일째 후에 망상 적혈구 제조가 감소되었다.

실험 2.

SEP-1-B51을 Citrate 완충액 (20mM 나트륨 시트레이트 + 100mM 나트륨 클로라이드) 플러스 0.25% 사람 혈청 알부민에서 다시 조제하고, 1,3 및 5일째에 0,1,5또는 25 μg/kg, tiw의 투여량에서 수컷 래트에게(그룹당 5마리 래트) 정맥내 투여하고, 혈액학 파라미터의 분석을 위해 혈액 샘플을 마지막 투여후에 (7,9, 및 11일째) 2,4,및 6 일째에 수집하였다. 게다가, 오직 헤마토크릿만의 측정을 위한 혈액 샘플은 [밀집된 세포 볼륨(PCV)으로서] 남아있는 연구 일수에 날마다 수집되었다(2,3,4,5,6,8,10,12,및 13일째). 데이타는 하기 표 X에 나타낸다. HCT (PCV 또는 계산된) 값은 첫번째 투여후(3일째) 2일에 시작하여 5 및 25 pg/kg을 수용하는 동물들에 대해 상당히 증가되었고 3번째와 마지막 주사 후 6일 동안내내 계속되었다(11일째). RBC 및 HGB은 또한 5 및 25 μg/kg을 수용하는 동물에 대해 그들이 측정된 날(마지막 투여 후 2, 4 및 6일; 7, 9 및 11일째)에 상당히 증가되었다. ART는 마지막 투여 후 2 및 4일에(7일과 9일째) 오직 25 μg/kg 군에 대해서만 상당히 증가되었다.

래트의 추가 그룹을 25 μg/kg에서 SEP-1 B51의 단일 정맥내 투여로 처리하였고, 헤마토크릿 만의 측정을 위한 혈액 샘플을 투여후 8, 24 및 72 시간과 7일 (1, 2, 4 및 8일째)에 수집하였다. SEP-1-B51으로 정맥내 처리된 래트에 대한 HCT, HGB, 및 ART 값은 3일째에 (주사후 2일) 대조 동물의 값보다 더 높았고(통계학적으로 유의적으로), HCT은 또한 이들 동물에 있어서 4일째에 상당히 증가되었다.

실시예 16

SEP-1-B51에 대한 폴리시테믹 및 저산소증 Model에서의 유효성 연구

4 투여량에서 10 각각의 정상 마우스의 그룹 (매개물 제어, 4 투여 레벨에서CHO-세포("rhEPO")에서 제조된 재조합 글리코실화 사람 에리스로포이에틴, 및 4 투여 레벨에서 SEP-1-B51 : 100 mU/ng을 가정하는 0.32,1,5,25 ug/kg/투여량)은 20일동안 시뮬레이티드 높은 고도 챔버에서 506.5 mb로 유지된 대기 공기로 하루에 18 시간 노출되었다. Citrate 완충액 플러스 0.25% 사람 혈정 알부민에 다시 조제된, rhEPO 또는 SEP-1-B51을 4일째 후-저산소증 일수에서 200 μL-부피에서 정맥내(IV) 주사하였다. 2일 후에, 각각의 마우스는 0.2 μCi의⁵⁹Fe로 복강내(i. p.) 주입하였다. RBC-방사성철 흡수는 심장 천자에 의해 흡수된 500μL의 혈액에 존재하는 방사능의 양을 측정함으로써 3일 후에 추정되었다.

SEP-1-B51 및 rhEPO에 대한 72-시간 RBC-⁵⁹Fe 흡수(투여량의 %)는 반응 접시 (25 μg/kg) 위에, 투여량을 5 μg/kg 까지 증가하면서, 증가된⁵⁹Fe 흡수에서의 정확한 투여량 관련 반응을 나타내었다. 3개 가장 낮은 투여량 수준은 따라서 선형 후퇴를 계산하는데 사용되었다. SEP-1-B51 및 rhEPO의 선형 후퇴 분석이 도 28에 나타난다. SEP-1-B51 및 rhEPO의 반응은 본질적으로 동일하였다. rhEPO에 대한 SEP-1-B51의 "효능 비"가 1.0035 였고(0.6947 내지 1.4498의 95% 신뢰 간격) 이 평가에서 결정된 SEP-1-B51의 효능이 100 mU/ng 였다(69-145의 95% 신뢰 간격).

SEP-1-B51은 rhEPO의 것과 유사한 생체내 활성을 나타내고, 이 모델에서 rhEPO에 대해 전형적인 음 피드백 메카니즘의 유도로 인한 더 높은 투여량에서의 반응 접시를 포함하여, 투여량 의존 방식으로 작용한다. 이것은 SEP-1-B51 분자에서 정확한 사용자-정의된 글리코실화 부위에 부착된 중합체 구조는 rhEPO의 당 사슬에 의해 공헌된 생체내 활성을 흉내낸다.

실시예 17

SEP-1-B51의 약물 생체 반응학적 연구

정상 수컷 래트의 그룹은 Citrate 완충액 플러스 0.25% 사람 혈청 알부민, 또는 rhEPO (500 U/kg와 등가임)에서 조제된, 5 ug/kg SEP-1-B51의 단일 투여량으로 정맥내 투여되고, 투여후 5,30,60분, 2,4,8 및 24시간, 2,3,4,5,6,및 7일째에 출혈하였다. 플라즈마 샘플에서 SEP-1-B51 또는 rhEPO 농도는 제조업체의 지시에 따라 R & D Systems 안티-EPO ELISA 키트 (R & D Systems, 사람 에리스로포이에틴 Quantikine IVD 면역분석 Kit#DEPOO)를 사용하여 ELISA 분석에 의해 결정되었다.

농도의 로가리즘의 최소의 스퀘어 분석이 수행되었고, 하기 표 XI에 나열된 약물 생체 반응학 파라미터를 산출해냈다. 플라즈마 농도의 변화는 5μg/kg의 단일 정맥내 투여량을 수용하는 수컷 래트에서 시간에 따른 SEP-1-B51의 플라즈마 농도에서의 변화는 10.5 ±0.5 시간의 반감기를 갖는 모노-지수 약물 생체 반응학 성질 기능에 의해 설명될 수 있다. 중앙 구획 (Vc)의 분포의 부피는 32.5±2.0 mL/kg였다. 제거(CL)는 15.1 ±0.7 시간의 평균 잔류 시간과 함께, 2.15 mL/hr/kg이었다. 비교에 의해, 5 μg/kg의 정맥내 투여량을 수용하는 수컷 래트에서의 rhEPO의 플라즈마 농도에서의 변화는 1.24 ±0.22 시간의 α반감기 및 5.51±0.40 시간의 β반감기를 갖는, 이-지수 약물 생체 반응 성질 기능에 의해 가장 잘 설명되었다. rhEPO에 대한 Vc는 57.0 ± 3.2 mL/kg였다. CL은 16.0 ± 0.5 mL/hr/kg였고, SEP-1-B51의 그것보다 약 8배 더 크다. rhEPO의 평균 잔류 시간(MRT)은 5.73± 0.17시간이었고, SEP-1-B51의 것보다 약 3 배 더 짧다.

SEP-1-B51 및 rhEPO 플라즈마 제거를 그래픽으로 나타낸 것이 도 29에 나와있다. 이들 데이타는 글리코실화 재조합 사람 EPO을 넘는 SEP-1B51에 대한 순환 반감기에서의 상당한 증가를 설명하며, 이러한 증가는 분자에서 정확한 사용자-정의된 부위에 부착된 중합체 구조때문이다.

그들의 특정 구체예와 연결하여 본 발명이 설명되었긴 하지만, 더욱 변형이 있을 수 있고, 이 출원은 일반적으로, 본 발명의 원리를 따르고, 관련하는 업계내에서의 공지된 또는 관습적인 실행내에 있고 앞서 설명한 필수 특징들에 적용될 수 있는 본 개시로부터 출발을 포함하면서, 어떠한 변형, 용도 또는 하기 발명의 적합을 커버하도록 의도된다.

Claims (77)

1. 거기에 부착된 하나 이상의 수용성 중합체를 갖는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
2. 제 1항에 있어서, 적혈구의 제조를 증가시키는 생체내 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
3. 제 1항에 있어서, 상기 단백질은 리보솜 지정된 에리스로포이에틴의 아미노산 서열 및 하나 이상의 화학적 라이게이션 부위에 의해 공유결합으로 결합된 하나 이상의 비중복 펩티드 단편들을 갖는 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
4. 제 3항에 있어서, 하나 이상의 상기 수용성 합성 적혈구생성 자극 단백질이 상기 리보솜 지정된 에리스로포이에틴의 글리코실화 부위에 해당하는 부위에서 상기 폴리펩티드 사슬에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
5. 제 3항에 있어서, 상기 리보솜 지정된 에리스로포이에틴이 사람인 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
6. 제 3항에 있어서, 상기 리보솜 지정된 에리스로포이에틴 당단백질이 비천연인 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
7. 제 6항에 있어서, 상기 천연 리보솜 지정된 에리스로포이에틴이 하나 이상의 비천연 글리코실화 부위를 가지는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
8. 제 2항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 상기 리보솜 지정된 에리스로포이에틴의 글리코실화 부위에 해당하는 하나 이상의 부위에서 독점적으로 상기 폴리펩티드 사슬에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
9. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 상기 수용성 중합체는 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리아미드 알킬렌 옥사이드, 또는 그것의 유도체를 포함하는 반복 단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
10. 제 9항에 있어서, 상기 폴리알킬렌 옥사이드 및 폴리아미드 알킬렌 옥사이드는 식 -(CH2-CH2-O)-의 에틸렌 옥사이드 반복 단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
11. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 상기 수용성 중합체가 분지되는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
12. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 상기 수용성 중합체가 음의 값인 생리학적 조건하에서 순 전하를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
13. 제 1항에 있어서, 상기 합성 적혈구생성 자극 단백질이 3과 7 사이의 등전점을 가지는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
14. 제 1항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 단일 분산인 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
15. 제 1항에 있어서, 상기 합성 적혈구생성 자극 단백질이 단일 분산인 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
16. 제 1항에 있어서, 상기 합성 적혈구생성 자극 단백질이 25 kDa이상의 모노머 분자량을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
17. 제 1항에 있어서, 상기 합성 적혈구생성 자극 단백질이 40 kDa이상의 모노머 분자량을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
18. 제 1항에 있어서, 상기 합성 적혈구생성 자극 단백질이 50 kDa이상의 모노머 분자량을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
19. 제 1항에 있어서, 상기 합성 적혈구생성 자극 단백질이 60 kDa이상의 모노머 분자량을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
20. 제 1항에 있어서, 상기 합성 적혈구생성 자극 단백질이 70 kDa이상의 모노머 분자량을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
21. 제 1항에 있어서, 상기 폴리펩티드 사슬이 하나 이상의 불규칙 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
22. 제 21항에 있어서, 상기 불규칙 아미노산이 비천연 측쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
23. 제 21항에 있어서, 상기 불규칙 아미노산이 위 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
24. 제 23항에 있어서, 상기 위 아미노산은 위 글루타메이트인 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
25. 제 22항에 있어서, 상기 비천연 측쇄가 공유결합으로 수용성 중합체에 결합되는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
26. 제 25항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 화학적 라이게이션에 의해 형성된 결합을 통해 상기 측쇄에 공유결합으로 결합되는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
27. 제 26항에 있어서, 화학적 라이게이션에 의해 형성된 상기 결합은 아미드, 옥심, 히드라존, 타이졸리딘, 옥사졸리딘 및 티오에스테르로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
28. 제 3항에 있어서, 하나 이상의 상기 화학적 라이게이션 부위가 아미드 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
29. 제 1항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 상기 폴리펩티드 사슬의 화학적 라이게이션 부위에서 아미노산의 측쇄를 통해 상기 폴리펩티드 사슬에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
30. 제 1항에 있어서, SEP-1과 SEP-3으로 구성되는 군으로부터 선택된 합성 적혈구생성 자극 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
31. SEP-0, SEP-1 및 SEP-3 및 그것의 유사체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
32. 제 31항에 있어서, 상기 유사체는 SEP-1-L26, SEP-1-L30, SEP-1-B50, SEP-1-B51 및 SEP-1-B52으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 적혈구생성 자극 단백질.
33. 제 1항에 따르는 합성 적혈구생성 자극 단백질 또는 약학적으로 허용되는 그것의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
34. 제 33항에 있어서, 완충제, 담체 단백질, 아미노산, 청정제, 지질, 수용성 중합체 및 방부제로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
35. 제 33항에 있어서, 상기 합성 적혈구생성 자극 단백질 이외에 한가지 이상의 추가 생물활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
36. 포유 동물에서 헤마토크릿을 증가시키는 방법으로서, 상기 포유 동물에게 제 1항에 따르는 합성 적혈구생성 자극 단백질의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 그것에 의해 상기 포유 동물에서의 헤마토크릿이 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 포유 동물에서 적혈구의 제조를 증가시키는 방법으로서, 상기 포유 동물에게 제 1항에 따르는 중합체 변형된 합성 적혈구생성 자극 단백질의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 그것에 의해 상기 포유 동물에서의 적혈구의 제조가 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
38. 포유 동물에서 헤모글로빈의 제조를 증가시키는 방법으로서, 상기 포유 동물에게 제 1항에 따르는 중합체 변형된 합성 적혈구생성 자극 단백질의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 그것에 의해 상기 포유 동물에서의 헤모글로빈의 제조가 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
39. 포유 동물에서 망상 적혈구 수를 증가시키는 방법으로서, 상기 포유 동물에게 제 1항에 따르는 합성 적혈구생성 자극 단백질의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 그것에 의해 상기 포유 동물에서의 망상 적혈구 수가 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
40. 합성 적혈구생성 자극 단백질을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 제조하는 방법으로서, 상기 합성 적혈구생성 자극 단백질의 폴리펩티드 사슬의 비중복 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편들을 화학적으로 라이게이션하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
41. 제 40항에 있어서, 상기 폴리펩티드 사슬을 접음으로써, 생물활성 합성 적혈구생성 자극 단백질이 제조되는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
42. 제 40항에 있어서, 한가지 이상의 상기 펩티드 단편들이 부분적으로 보호되는 것을 특징으로 하는 방법.
43. 제 40항에 있어서, 한가지 이상의 상기 펩티드 단편들이 보호되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
44. 제 40항에 있어서, 한가지 이상의 상기 펩티드 단편들이 거기에 부착된 수용성 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
45. 제 40항에 있어서, 상기 화학적 라이게이션은 천연 화학 라이게이션, 연장된 천연 화학 라이게이션, 위 천연 화학 라이게이션, 옥심 형성 화학 라이게이션, 히드라존 형성 화학 라이게이션, 옥사졸리딘 형성 화학 라이게이션, 타이졸리딘 형성화학 라이게이션 및 티오에스테르 형성 화학 라이게이션으로부터 선택되는 화학선택성 라이게이션 화학을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
46. 제 40항에 있어서, 상기 폴리펩티드 사슬은 거기에 부착된 하나 이상의 수용성 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
47. 제 40항에 있어서, 상기 폴리펩티드 사슬은 리보솜 지정된 에리스로포이에틴의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
48. 제 46항에 있어서, 하나 이상의 상기 수용성 중합체는 상기 리보솜 지정된 에리스로포이에틴의 글리코실화 부위에 해당하는 부위에서 상기 폴리펩티드 사슬에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
49. 제 48항에 있어서, 상기 리보솜 지정된 에리스로포이에틴 당단백질이 재조합적으로 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
50. 제 48항에 있어서, 상기 리보솜 지정된 에리스로포이에틴 당단백질이 비천연인 것을 특징으로 하는 방법.
51. 제 50항에 있어서, 상기 비자연 리보솜 지정된 에리스로포이에틴 당단백질이하나 이상의 비자연 글리코실화 부위를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
52. 제 47항에 있어서, 상기 리보솜 지정된 에리스로포이에틴이 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
53. 제 48항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 상기 리보솜 지정된 에리스로포이에틴의 글리코실화 부위에 해당하는 부위에서 상기 폴리펩티드 사슬에 독점적으로 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
54. 제 46항에 있어서, 하나 이상의 상기 수용성 중합체는 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리아미드 알킬렌 옥사이드, 또는 그것의 유도체를 포함하는 반복 단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
55. 제 54항에 있어서, 상기 폴리알킬렌 옥사이드 및 폴리아미드 알킬렌 옥사이드는 식 -(CH2-CH2-O)-의 에틸렌 옥사이드 반복 단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
56. 제 46항에 있어서, 하나 이상의 상기 수용성 중합체가 분지된 것을 특징으로 하는 방법.
57. 제 46항에 있어서, 하나 이상의 상기 수용성 중합체가 음의 값인 생리학적 조건하에서 순 전하를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
58. 제 41항에 있어서, 상기 합성 적혈구생성 자극 단백질이 3과 7 사이의 등전점을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
59. 제 46항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 단일 분산인 것을 특징으로 하는 방법.
60. 제 40항에 있어서, 상기 합성 적혈구생성 자극 단백질이 단일 분산인 것을 특징으로 하는 방법.
61. 제 46항에 있어서, 상기 합성 적혈구생성 자극 단백질이 25 kDa이상의 모노머 분자량을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
62. 제 46항에 있어서, 상기 합성 적혈구생성 자극 단백질이 40 kDa이상의 모노머 분자량을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
63. 제 46항에 있어서, 상기 합성 적혈구생성 자극 단백질이 50 kDa이상의 모노머 분자량을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
64. 제 46항에 있어서, 상기 합성 적혈구생성 자극 단백질이 60 kDa이상의 모노머 분자량을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
65. 제 46항에 있어서, 상기 합성 적혈구생성 자극 단백질이 70 kDa이상의 모노머 분자량을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
66. 제 40항에 있어서, 상기 폴리펩티드 사슬이 하나 이상의 불규칙 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
67. 제 66항에 있어서, 상기 불규칙 아미노산이 비자연 측쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
68. 제 67항에 있어서, 상기 불규칙 아미노산이 위 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
69. 제 40항에 있어서, 상기 폴리펩티드 사슬은 아미드, 옥심, 히드라존, 타이졸리딘, 옥사졸리딘 및 티오에스테르로 구성되는 군으로부터 선택되는 결합을 갖는 화학 라이게이션 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
70. 제 46항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 비자연 측쇄를 갖는 상기 폴리펩티드 사슬의 아미노산에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
71. 제 46항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 화학적 라이게이션에 의해 형성된 결합을 통해 상기 측쇄에 공유결합으로 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
72. 제 71항에 있어서, 화학적 라이게이션에 의해 형성된 상기 결합은 아미드, 옥심, 히드라존, 타이졸리딘, 옥사졸리딘 및 티오에스테르로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
73. 제 46항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 상기 폴리펩티드 사슬의 화학 라이게이션 부위에서 아미노산의 측쇄를 통해 상기 폴리펩티드 사슬에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
74. 제 41항에 있어서, 상기 생물활성 합성 적혈구생성 자극 단백질이 적혈구의 제조를 증가시키는 생체내 생물학적 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
75. 제 40항에 있어서, 상기 폴리펩티드 사슬은 SEP-1 및 SEP-3으로 구성되는 군으로부터 선택되는 합성 적혈구생성 자극 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것을 것을 특징으로 하는 방법.
76. 제 40항에 있어서, 합성 적혈구생성 자극 단백질이 SEP-0, SEP-1, 및 SEP-3, 및 그것의 유사체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
77. 제 76항에 있어서, 상기 유사체는 SEP-1-L26, SEP-1-L30, SEP-1-B50, SEP-1-B51, 및 SEP-1-B52로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.