JP2004515471A - 合成赤血球産生刺激タンパク質 - Google Patents
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Abstract
合成赤血球産生刺激タンパク質が提供される。このタンパク質の合成方法も提供される。本発明はさらに、定義されたやり方でポリマー修飾されるそのような合成赤血球産生刺激タンパク質の誘導体に関する。そのようなタンパク質および誘導タンパク質の利用方法も提供される。
Description
【0001】
(技術分野)
本発明は、定義された方法でポリマー修飾される合成赤血球産生刺激タンパク質、ならびに製造方法および使用方法に関する。
【0002】
(関連出願への相互参照)
本出願は、米国特許出願第60/231,330号(2000年9月8日出願)および同第60/236,377号(2000年9月29日出願)の一部継続出願であり、そのどちらも参照により本明細書に全体が組み入れられる。
【0003】
(背景技術)
赤血球産生は、赤血球の代謝回転および損失を調節するために生じる赤血球産生のためのプロセスである。エリスロポエチン(EPO)は、赤血球産生を刺激するタンパク質ホルモンである。自然発生ヒトEPOは、主として腎臓中で作られて血流中へ分泌される165個のアミノ酸を含む糖タンパク質であり、骨髄中の前駆細胞からの赤血球産生を刺激する。ヒトEPOをコード化している遺伝子は、166個のアミノ酸残基を有する分子を予測するけれども、カルボキシ末端アルギニンは、その成熟形における翻訳後修飾において除去される。
【0004】
グリコシル化ヒトEPOは、位置24、38、および83に付着した(attached)3つのN結合糖鎖を有している。これは、位置126に存在するO結合糖部分も有している。グリコシル化の影響は複雑である。非グリコシル化EPOは、インビトロで活性がある。しかしながら、インビボでの完全活性についてはグリコシル化が必要であることが研究により明らかになっている。可変グリコシル化パターンが可変的効果を示すことも研究により明らかになっている。例えば、脱シアル酸化EPOは、インビトロ活性の増加とインビボ活性減少の両方を示し、これは肝細胞によって、認識、結合および除去されるガラクトース残基の露出に帰される効果である。完全シアル酸化されたEPOの分岐パターンも、生物活性に違いを作り出すことが明らかにされている。主に四本触覚型の分岐EPOは、「標準」EPOと同等の活性示し、それに対して主に二本触覚型の分岐EPOはインビトロでは3倍の活性を示すが、インビボでは正常活性の15%を示すにすぎない。さらに、EPO機能においては、O結合型ではなくN結合型糖類が重要であることが様々な研究により示されている。
【0005】
組換えにより作られたグリコシル化EPOを含有するいくつかの薬剤が利用可能である。しかしながら、現在利用可能なEPO製剤は、それらの血漿半減期が短いことおよびプロテアーゼ分解に対する感受性により制限される。それらは、各N結合グリコシル化部位および部位間で生じる分岐およびシアル酸含有量における高度の不均一性に起因する種々のグリコフォームの複雑な混合物も含んでいる。これらの欠点により、これらの製剤が最大の臨床効力を達成することが妨げられてきた。
【0006】
そのようなEPOタンパク質の循環半減期およびその他の特性を改善するため、PEG(ポリエチレングリコール)のような水溶性ポリマーが付着されてきたが、制御されたやり方でかつユーザー定義された精密さでポリマーを付着させることが困難であることを考えると、結果はまちまちであった。例えば、PEGのようなポリマー部分および関連ポリマーを、タンパク質上に見出される反応基へ付着させるために各種の方法が用いられてきた(米国特許第4,179,337号(Davis et al.)、および米国特許第4,002,531号(Royer)参照)。概説については、「薬としての酵素」(J. S. Holcerberg and J. Roberts, eds. pp. 367−383(1981))のAbuchowski et al.およびZalipsky, S.(Bioconjugate Chemistry(1995)6:150−165)を参照されたい。タンパク質を修飾するためにPEGおよびその他のポリマーを使用することも、Cheng, T.−L. et al., Bioconjugate Chem.(1999)10: 520−528; Belcheva, N. et al., Bioconjugate Chem.(1999)10: 932−937; Bettinger, T. et al., Bioconjugate Chem.(1998)9:842−846; Huang, S.−Y. et al., Bioconjugate Chem.(1998)9:612−617; Xu, B. et al. Langmuir(1997)13:2447−2456; Schwarz, J. B. et al., J. Amer. Chem. Soc.(1999)121:2662−2673; Reuter, J. D. et al., Bioconjugate Chem.(1999)10:271−278; Chan, T.−H. et al., J. Org. Chem.(1997)62:3500−3504により論じられている。タンパク質中の典型的な付着部位として、リジン残基上またはN末端におけるような第一アミノ基、システイン側鎖上におけるようなチオール基、およびグルタミン酸またはアスパラギン酸残基上またはC末端におけるようなカルボキシル基が含まれる。最も一般的な付着部位のいくつかは、糖タンパク質の糖残基、システインまたは標的タンパク質のN末端およびリジンである。
【0007】
EPOへのポリマーのコンジュゲーション(接合)について多くの様々な方法が記載されてきたが、コンジュゲーションプロセスには、厄介な問題が無いわけではない。コンジュゲーション反応により引き起こされる生物活性損失を制限するように注意しなければならない。例えば、付着部位数を最小限にするため、折りたたみまたは再生されたタンパク質が一般的に用いられる。しかしながら、活性化されたポリマーのあまりに多くが標的タンパク質またはポリペプチドに付着すると、生物活性はひどく減少したり失われたりすることがある。同様に、ポリマーをタンパク質に結合する不適切なリンカーが用いられるか、または不十分な量のポリマーが標的に付着されると、結果として生じるコンジュゲートの治療効果が限定されることがあり、さらにその生物活性における損失を補うのに十分な循環寿命の増加を示さないことがある。修飾ポリマーによりタンパク質の活性部位が遮断される結果としても問題が生じ得る。ポリマーとタンパク質は、一般に溶液ベースの反応で結合されるので、この問題は回避困難なことがある。ピリドキサールリン酸のような物質で活性部位をプレブロックすることが提案されてきたが、結果は矛盾したものであった(米国特許第4,179,337号(Daviset al.)参照)。これらの問題は、より低分子量のタンパク質およびペプチドの場合に特に深刻であり、これらは生物活性と関連しない付着部位をしばしばほとんど持たない。
【0008】
例えば、一般的な技法は、水溶性ポリマーを標的タンパク質中の第1アミンに付着させるというものであった(例えば、リジンのN末端アミノ基およびε−アミノ基)。チオール反応性ポリマーコンジュゲートも、ポリマーをシステインのチオール側鎖に付着させるために用いられてきた。ほとんどのタンパク質が、タンパク質の活性、折りたたみ、再生および安定性を定義する場合に重要な役割を果たすポリペプチド主鎖の様々な領域上に展開されたそのような反応性基の多数のコピーを含んでいるので、両方の方法とも重大な問題がある。従って、広範に用いられてはいるが、そのような方法には、タンパク質の生物活性における多少とも不完全または望ましくない減少があること、ならびに分離および特徴付けが困難な通常は複雑な混合物である、という問題がある(Delgada et al., Pharmaceutical Sciences(1997)3:59−66)。
【0009】
ランダムな付着を減らす試みにおいて、ポリマー付着の所望部位にリジンを付加すると共に天然リジンを除去したタンパク質が作られた(米国特許第4,904,584号)。例えば、G−CSFおよびIL−2がこの方法で修飾された。ランダムな付着を回避する他の試みは、ポリマー付着の所望部位に天然システインを付加すると共にシステインを除去するか、あるいはもし存在したとても天然システインを除去せずにシステインを付加したタンパク質を作ることであった(EP0668353号)。例えば、EPOはこの方法で作られた。そのようなシステインまたはリジン変異体により部位特定的ポリマー付着が理論上可能になるのに対し、すべての選ばれた部位が制御されたやり方で修飾できるという保証は依然として皆無である。
【0010】
多数のアミノ酸を含むタンパク質を、同じまたは類似した反応性官能基を持つ側鎖で部位特異的に修飾することができないので、最近の試みはタンパク質のアミノまたはカルボキシ末端の修飾に向けられてきた。アミノまたはカルボキシ末端の修飾は、これらの部位を一意的に修飾するいくつかの化学的コンジュゲーション手法の能力に依存してきた(WO90/02136号およびWO90/02135号)。例えば、この手法は、G−CSFおよびケモカインIL−8のN末端残基へのPEG鎖の付着に利用された(Gaertner et al., Bioconjug. Chem.(1996)7(1):38−44、およびWO96/41813号)。しかしながら、NまたはC末端の修飾により、タンパク質の活性は一般的に減少する(例えば、G−CSFのN末端およびリジン側鎖へのPEGの付着を論じている米国特許第5,985,265号参照)。水溶性ポリマーによるタンパク質修飾に伴う欠点にもかかわらず、PEG化および他の水溶性ポリマーのタンパク質への付着が追求され続けている。例えば、エリスロポエチン(EPO)の糖鎖およびリジンのような内部アミノ酸(EP0605963号およびWO00/32772号)、ならびにN末端(米国特許第6,077,939号およびWO00/32772号)へのPEGの付着も記載されている。あいにく、そのようなPEG化EPOは、分離および特徴付けが困難な複雑な混合物という結果になる。
【0011】
別の問題は、上記のポリマーが高度に非均質であり、これによりポリマー修飾タンパク質混合物の分析的キャラクタリゼーションおよび精製が困難になることである(Delgada et al., Pharmaceutical Sciences(1997)3:59−66)。例えば、PEGまたはPEGベースの鎖を調製するために用いられる手法は、それが3400程度のかなり低い相対分子量のものであっても、制御が不十分な重合段階を伴い、これにより調製品は平均値の回りに広がる鎖長を有することになる。すなわち、それらの手法は、nが離散的な値ではなく、むしろ平均値付近の範囲にある値を有する(CH2CH2O)nのポリマー調製品を伴う。結果として得られる誘導タンパク質の異質性は、しばしば、同定ましてや分離が容易にできない特性の範囲を伴う。
【0012】
しかしながら、あいにくなことに、適切なポリマーを同定し使用することの問題は、治療的用途に現在用いられるすべてのEPOタンパク質が組換えDNA技術から誘導されるという事実によって悪化する。組換えDNA技術の使用により、性能強化部分と組換えにより産生されたEPOタンパク質との間に形成され得る結合のタイプおよび特異性に厳しい制限が課される。これは、第一に、結合に適した官能基の数がごく限られているからであり、第二に、修飾されているタンパク質中に一般に反応性官能基のコピーがいくつかあり、従って、修飾のどのような特異性も不可能にるからである。例えば、超酸化ジスムターゼとPEGとの非選択的コンジュゲーションの場合には、修飾された酵素のいくつかのフラクションが完全に不活性であった(P. McGoff et al., Chem. Pharm. Bull.(1988)36:3079−3091)。また、もし異なる数のそのような部分がランダムに付着されれば、治療的タンパク質の薬物動態学は正確に予測できず、投薬は大きい問題になるであろう。付着を制御できないことにより、さらに、(a)効力の減少、(b)誘導体の膨大な混合物を分離するための手の込んだ精製の必要および(c)修飾部分のことによると不安定な付着という結果につながる。また、トレシルクロイドベース結合のような、技術的に既知のいくつかの結合が免疫原性であることも知られている。
【0013】
従って、循環半減期を改善し、タンパク質分解および免疫原性を減少させ、さらに生物学的に産生されたタンパク質の他の特性を改善するため、PEGのような水溶性ポリマーを付着させ得るが、それらを制御された方法でかつユーザー定義された精度で付着させることが困難であることを考えれば、結果はまちまちである。また、正確なユーザー定義された部位でのポリマー付着は成果が限られているので、タンパク質に一般に適用可能である好適な付着部位についてはほとんど知られていない。さらに、付着の確率性、およびそのような目的のために現在使用されているPEGおよび他の水溶性ポリマーのヘテロ分散的性質により、PEG−タンパク質コンジュゲートの精製および分析的特徴付けは困難であった。従って、再現可能な付着制御が不十分ということとポリマーの不均一性とが組み合された問題により、治療法としてのポリマー修飾タンパク質のルーチン的な承認は厳しく妨げられてきた(1970年代初期に導入されたにもかかわらず、治療的使用について承認されたものは現在までのところごくわずかである)。
【0014】
従って、組換えDNA技術ならびに天然および組換えにより産生されたEPOを修飾するために用いられるポリマー技術とは異なる生物活性赤血球産生刺激タンパク質を製造する方法に対するニーズが存在する。臨床特性を改善した赤血球産生刺激タンパク質も必要とされる。本発明はこれらおよびその他のニーズを満たすものである。
【0015】
(発明の開示)
本発明は、合成赤血球産生刺激タンパク質、それらの製造方法および使用方法に関する。特に、本発明は、1つ以上の水溶性ポリマーが付着させられた合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられる。本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質を含む製剤組成物も提供される。
【0016】
本発明はさらに、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質で哺乳動物を治療する方法にも向けられる。1つの実施態様においては、哺乳動物のヘマトクリット値を増加させるための方法が提供される。別の実施態様においては、哺乳動物における赤血球産生を増加させるための方法が提供される。別の実施態様は、哺乳動物のヘモグロビンを増加させる方法に向けられる。さらなる実施態様は、哺乳動物における網状赤血球数を増加させるための方法に向けられる。これらの方法は、所望の効果を達成するために本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を哺乳動物に有効量投与することを含む。
【0017】
好ましいポリマー修飾形態および中間体を含む、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質の製造方法も提供される。この方法は、合成赤血球産生刺激タンパク質のポリペプチド鎖の非重複アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合することを含み、それにより合成赤血球産生刺激タンパク質を含むポリペプチド鎖が産生される。
【0018】
(発明を実施するための最良の形態)
本発明は、合成赤血球産生刺激タンパク質、生産方法および使用方法に関する。
【0019】
I.本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質
好ましい実施形態において、本発明は、1つ以上の水溶性ポリマーを付着して有する合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられる。「赤血球産生刺激タンパク質」は、エリスロポエチン依存性細胞株の成長を促進するインビトロ生物活性を有するタンパク質を意味する。好ましい実施形態においては、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、赤血球産生を促進するインビボ生物学活性を有する。タンパク質の赤血球産生刺激活性は、インビボ投与後に赤血球産生を追う、EPO依存性細胞株の増殖を仲介するタンパク質の能力をアッセイする等、の各種の手段のいずれかにより決定できる。
【0020】
「水溶性ポリマー」は、水に可溶性の実質的に非抗原性ポリマーを意味している。
【0021】
本明細書中で用いられているように、タンパク質は、そのアミノ酸残基のいくつか、最も好ましくはそのすべてを重合させるために非組換え技術が使用されていれば「合成」であると言われる。用語「非組換え技術」は、有機化学および他の合成重合方法を伴う技術を、インビボあるいはインビトロにおいてタンパク質中へのRNAの翻訳を伴う技術から区別することを意図している。合成タンパク質は、完全合成および半合成タンパク質を含んでいる。完全合成タンパク質は、すべてのライゲーション成分が、化学合成すなわちリボソーム不使用(ribosomal−free)合成による人工的なものである場合に生産される。半合成タンパク質は、ライゲーション成分の少なくとも一部が、生物学的合成、すなわち細胞翻訳系または細胞不使用(cell−free)翻訳系中でリボソームによって作られ、別の部分は化学合成により作られて生産される。
【0022】
好ましい実施形態においては、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、リボソーム特定(ribosomally specified)エリスロポエチンのアミノ酸配列、および1つ以上の化学的ライゲーション部位により共有結合的に結合された1つ以上の非重複ペプチドセグメントを有するポリペプチド鎖を含む。最も好ましくは、エリスロポエチンは哺乳動物のものであり、より好ましくはヒトのものまたはそれらの誘導体である。例えば、多くのエリスロポエチンのアミノ酸配列が知られており、ヒトエリスロポエチンについては、その多くの活性変異体が作られており(例えば、米国特許第5,856,298号、第5,955,422号、第8,888,772号、第5,858,347号、第5,614,184号、第5,457,089号、第6,077,939号、およびWO00/32772号参照)、従って、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、そのようなアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含み得る。
【0023】
好ましい実施形態においては、リボソーム特定エリスロポエチン(ribosomally specified erythropoietin)は、1つ以上のグリコシル化部位を含み、水溶性ポリマーは、リボソーム特定エリスロポエチンの1つ以上のグリコシル化部位に対応する1つ以上の部位において合成赤血球産生刺激タンパク質のポリペプチド鎖に付着させられる。より好ましい実施形態においては、水溶性ポリマーは、1つ以上のそのようなグリコシル化部位に対応する1つ以上の部位でポリペプチド鎖に排他的に付着させられる。本発明のこの観点は、リボソーム特定エリスロポエチンが組換えにより作られる合成赤血球産生刺激タンパク質を含んでいる。従って、リボソーム特定エリスロポエチンは、天然エリスロポエチンまたは非天然エリスロポエチンとすることができ、後者は1つ以上の非天然グリコシル化部位をさらに含み得る。
【0024】
「グリコシル化部位」は、タンパク質の一つのアミノ酸配列を意味し、この配列は、そのタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基の側鎖へのオリゴ糖(炭水化物)鎖の酵素的付着をコード化するものであり、N結合またはO結合グリコシル化部位がよい例である。ポリマー修飾のための残基部位が位置的に同じなので、1つ以上のそのようなグリコシル化部位を除去するために変異されたエリスロポエチンが「グリコシル化部位」の定義に含まれることが理解されるであろう。「自然発生グリコシル化部位」は、自然状態で見い出されるエリスロポエチン糖タンパク質のグリコシル化部位を意味する。「非自然発生グリコシル化部位」は、エリスロポエチン中に設計されたグリコシル化部位を意味する。例えば、組換えヒトEPOがこの方法で設計されている(例えば、米国特許第5,856,298号参照)。
【0025】
本発明のこの実施形態は、ヒトエリスロポエチンのポリペプチド鎖を有する合成赤血球産生刺激タンパク質がその1つ以上のグリコシル化部位において本明細書中に記載されるような水溶性ポリマーで修飾される場合に、その水溶性ポリマーは、相当する自然発生エリスロポエチン糖タンパク質中の当該位置に通常見出される糖鎖に帰される生物学的効果の1つ以上を活用するために利用できるという知見に部分的に基づいている。そのような生物学的効果には、プロテアーゼ耐性、免疫原性、レセプター特異性、比活性、効力および薬物動態学の調節が含まれる。しかしながら、糖鎖の存在を排除し、これを本発明の好ましい水溶性ポリマーと置き換えることにより、糖鎖のペンダントシアル酸残基が除去された場合のような酵素分解およびクリアランス、不安定性、限定された循環半減期、分布、低いハンドリング特性等の回避が含まれる大きな利益がもたらされる。重要なことには、本発明のそのようなポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、未修飾の対応する合成タンパク質と比較した場合に、生物活性の損失が実質的にないのでそのような有利な生物学的特性を保持し、合成タンパク質のモノマー分子量が25kDa以上である場合でさえも生物活性が増加することも見出されている。
【0026】
従って、別の好ましい実施形態においては、本発明は、リボソーム特定エリスロポエチンのアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を含む合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられ、そこでは、ポリペプチド鎖は、それに付着させられた1つ以上の水溶性ポリマーを有しかつモノマー分子量が25kDa以上であり、さらに合成赤血球産生刺激タンパク質は、前記水溶性ポリマーを欠いたポリペプチド鎖を有する対応する合成タンパク質と同等か上回る生物活性を備える。生物活性は、インビトロ、インビボまたはその両方であり得る。好ましい実施形態においては、生物活性はインビボである。別の好ましい実施形態においては、本発明は、リボソーム特定エリスロポエチンのアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を含む合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられ、そこでは、ポリペプチド鎖は、そ1つ以上の水溶性ポリマーを付着して有しかつモノマー分子量が25kDa以上であり、さらに合成赤血球産生刺激タンパク質は、リボソーム特定エリスロポエチンと同等か上回る生物活性を備える。ここでも、生物活性は、インビトロ、インビボまたはその両方であり得る。好ましい実施形態においては、生物活性はインビボである。最も好ましくは、そのようなポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、それに付着させられた不連続な数の水溶性ポリマーを有するであろう。
【0027】
「化学的ライゲーション部位」は、第1のペプチドまたはポリペプチドのN末端アミノ酸および第2のペプチドまたはポリペプチドのC末端アミノ酸を意味し、これらは、化学的ライゲーションにより、その間で非可逆的共有結合を形成するか形成する能力がある。本明細書中で用いられているように、「化学的ライゲーション」は、2つの化学的部分の共有結合を伴う化学選択的反応を言い、それぞれの部分は、他方と非可逆的共有結合を一意的に形成する相互に反応性の官能基を有する。化学的ライゲーションは、(1)一意的な反応性C末端基を有する第1のペプチドまたはポリペプチドと、(2)一意的な反応性N末端基を有する第2のペプチドまたはポリペプチドとの共有結合的ライゲーションを含み、そこでは、C末端およびN末端反応基がその間で非可逆的共有結合を形成する。特に、化学的ライゲーションには、未保護ペプチドセグメントのライゲーションに適用し得る任意の化学選択的反応化学が含まれる。
【0028】
水溶性ポリマーについては、好ましい水溶性ポリマーは、以下の式により表すことができる。
Un−s1−B−s2−ポリマー−s3−J*
【0029】
Uは、合成赤血球産生刺激タンパク質のポリペプチド鎖に共有結合された唯一の官能基の残基である。特に、U基は、合成赤血球産生刺激タンパク質の1つ以上の非重複ペプチドセグメントの1つ以上のアミノ酸の側鎖nの相互に反応性の唯一の官能基と結合されており、そこではnは1〜6の整数である。より好ましくは、側鎖nは1〜4の整数であり、最も好ましくは1〜2である。本明細書中で使われているように、用語「アミノ酸」は、遺学伝的にコード化された20個のアミノ酸、天然に見出される稀なまたは異常なアミノ酸、および時々、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に関連する場合にアミノ酸残基と呼ばれることもある不規則アミノ酸のような任意の非天然的に生じるアミノ酸を意味する。Uおよび側鎖nの好ましい実施形態は、一意的な相互に反応性の基から形成された共有結合であり、そこではそのような結合は、オキシム、アミド、アミン、ウレタン、エーテル、チオエーテル、エステル、ヒドラジド、オキサゾリジン、チアゾリジン、チオエーテル、エーテル、およびエステルから選ばれる。最も好ましいUおよびn結合は、Uが、アミド、オキシム、チオエステル、ヒドラゾン、チアゾリジン、オキサゾリジンからなる群から選ばれる化学的ライゲーションにより形成された結合を介して側鎖nと共有結合しているものである。
【0030】
Bは、同じまたは異なる3つ以上のアームを有する分岐核であり、存在していても存在していなくてもよい。最も好ましくは、Bは存在しかつ3つ以上のアーム、さらに好ましくは4つ以上のアームを有する。特に、Bの1つのアームがUに(任意にスペーサーまたはリンカーs1を介して)結合されており、Bの第2のアームがポリマーに(任意にスペーサーまたはリンカーs2を介して)結合される。好ましいポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、Bの分岐アームの少なくとも1つが、オキシム、アミド、アミン、ウレタン、チオエーテル、エステル、ヒドラジド、オキサゾリジン、およびチアゾリジンからなる群から選ばれる結合の残基を含むものである。本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質の好ましい分岐核Bは、アミノ、カルボキシレートおよび混合アミノ−カルボキシレートからなる群から選ばれた分岐核を含む。好ましいアミノ分岐核はリジンを含み、好ましいカルボキシレート分岐核はグルタミン酸またはアスパラギン酸を含み、さらに混合アミノ−カルボキシレート分岐核はγ−グルタミン酸またはその誘導体を含む。
【0031】
「ポリマー」成分は、実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり、Bが存在する場合にはBと同じか異なることができる。「水溶性ポリマー」は、水に可溶性で、原子分子量が約1000ダルトン以上の実質的に非抗原性のポリマーを意味する。「ポリマー」は、好ましくは、有効流体力学的分子量が10,000Da以上であり、より好ましくは約20,000〜500,000Da、および最も好ましくは約40,000〜300,000Daである。「有効流体力学的分子量」は、水ベースのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により決定されるようなポリマー鎖の有効水−溶媒和サイズを意味する。水溶性ポリマーが、エチレンオキサイド反復単位のようなポリアルキレンオキシド反復単位を有するポリマー鎖を含んでいる場合、各鎖の原子分子量が、約200〜約80,000Da、好ましくは約1,500〜約42,000Da、最も好ましくは2,000〜約20,000Daであることが好適である。具体的に言及されているのでなければ、分子量は、原子分子量を指すことを意図している。
【0032】
「ポリマー」成分は、広範囲の分子量およびポリマーサブユニットを持つことができる。これらのサブユニットは、生物学的ポリマー、合成ポリマーまたはそれらの組み合わせを含み得る。そのような水溶性ポリマーの例としては、デキストランならびに硫酸デキストラン、P−アミノ架橋デキストリン、およびカルボキシメチルデキストリンを含むデキストラン誘導体、セルロースならびにメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含むセルロース誘導体、デンプンおよびデキストリン類、ならびにデンプンの誘導体および加水分解物、ポリエチレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーを含むポリアルキレングリコールならびにそれらの誘導体が含まれ、そこでは、前記ホモポリマーおよびコポリマーは、未置換または一端がアルキル基、ヘパリンおよびヘパリンのフラグメント、ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル、ポリビニルピロリドン、アスパルトアミド、およびポリオキシエチエレン化ポリオール、デキストランおよびデキストラン誘導体、デキストリンおよびデキストリン誘導体で置換されている。具体的に列挙した水溶性ポリマーの様々な誘導体も考えられることが理解されるであろう。
【0033】
上記で説明した水溶性ポリマー、とりわけポリエチレングリコール「PEG」のようなポリアルキレンオキシドベースのポリマーは周知である(例えば、”Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applicatons”, J. M. Harris, Ed., Plenum Press, New York, NY (1992); ”Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications”, J. M. Harris and S. Zalipsky, Eds., ACS (1997); 国際特許出願WO90/13540号、WO92/00748号、WO92/16555号、WO94/04193号、WO94/14758号、WO94/17039号、WO94/18247号、WO94/28937号、WO95/11924号、WO96/00080号、WO96/23794号、WO98/07713号、WO98/41562号、WO98/48837号、WO99/30727号、WO99/32134号、WO99/33483号、WO99/53951号、WO01/26692号、WO95/13312号、WO96/21469号、WO97/03106号、WO99/45964号、および米国特許第4,179,337号;第5,075,046号;第5,089,261号;第5,100,992号;第5,134,192号;第5,166,309号;第5,171,264号;第5,213,891号;第5,219,564号;第5,275,838号;第5,281,698号;第5,298,643号;第5,312,808号;第5,321,095号;第5,324,844号;第5,349,001号;第5,352,756号;第5,405,877号;第5,455,027号;第5,446,090号;第5,470,829号;第5,478,805号;第5,567,422号;第5,605,976号;第5,612,460号;第5,614,549号;第5,618,528号;第5,672,662号;第5,637,749号;第5,643,575号;第5,650,388号;第5,681,567号;第5,686,110号;第5,730,990号;第5,739,208号;第5,756,593号;第5,808,096号;第5,824,778号;第5,824,784号;第5,840,900号;第5,874,500号;第5,880,131号;第5,900,461号;第5,902,588号;第5,919,442号;第5,919,455号;第5,932,462号;第5,965,119号;第5,965,566号;第5,985,263号;第5,990,237号;第6,011,042号;第6,013,283号;第6,077,939号;第6,113,906号;第6,127,355号;第6,177,087号;第6,180,095号;第6,194,580号;第6,214,966号参照)。
【0034】
より好ましい「ポリマー」成分は、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシド、またはそれらの誘導体を含む。より好ましいポリアルキレンオキシドおよびポリアミドアルキレンオキシドは、式−(CH2−CH2−O)−のエチレンオキシド反復単位を含む。よりいっそう好ましい「ポリマー」成分は、式−[C(O)−X−C(O)−NH−Y−NH]n−または−[NH−Y−NH−C(O)−X−C(O)]n−の分子量約1000ダルトン以上のポリアミドであり、そこでは、XおよびYは、同じかまたは異なり、分岐状または直鎖状である二価のラジカルであり、nは、2〜100、より好ましくは2〜50の整数であり、XおよびYのいずれかまたは両方は、直鎖状または分岐状の生体適合性で実質的に非抗原性の水溶性反復単位を含む。その最も好ましい水溶性反復単位は、式−(CH2−CH2−O)−または−(CH2−CH2−O)−のエチレンオキシドを含む。そのような水溶性反復単位の数は大きく変わり得るが、そのような反復単位のより好ましい数は、2〜500、2〜400、2〜300、2〜200、2〜100、最も好ましくは、2〜50である。より好ましい実施形態の例は、XおよびYの一方または両方が、−((CH2)n1−(CH2−CH2−O)n2−(CH2)n1−)−または−((CH2)n1−(O−CH2−CH2)n2−(CH2)n1−)から選ばれるものであり、ここでn1は、1〜6、1〜5、1〜4、最も好ましくは1〜3であり、n2は、2〜50、2〜25、2〜15、2〜10、2〜8、最も好ましくは2〜5である。非常に好ましい実施形態の例は、Xが−(CH2−CH2)−であり、Yが−(CH2−(CH2−CH2−O)3−CH2−CH2−CH2)−または−(CH2−CH2−CH2−(O−CH2−CH2)3−CH2)−である。
【0035】
「ポリマー」成分あるいは1つ以上のスペーサーまたはリンカーは、存在する場合には、生物安定性または生物分解性であるポリマー鎖または単位を含み得る。例えば、反復結合を有するポリマーは、結合不安定性に応じて生理学的条件下での安定性の程度が変わる。そのような結合を有するポリマーは、低分子量の類似体の既知の加水分解速度に基づいて、生理学的条件下でのそれらの相対的な加水分解速度により分類され、例えば、より不安定なものからより安定なものについて、ポリカーボネート(−O−C(O)−O−)>ポリエステル(−C(O)−O−)>ポリウレタン(−NH−C(O)−O−)>ポリオルトエステル(−O−C((OR)(R’))−O−)>ポリアミド(−C(O)−NH−)である。同様に、水溶性ポリマーを標的分子に付着させる結合システムは、生体安定性または生体分解性とすることができ、例えば、より安定なものからより不安定なものついて、カーボネート(−O−C(O)−O−)>エステル(−C(O)−O−)>ウレタン(−NH−C(O)−O−)>オルトエステル(−O−C((OR)(R’))−O−)>アミド(−C(O)−NH−)である。これらの結合は例として示されるものであり、本発明の水溶性ポリマーのポリマー鎖または結合システムにおいて用い得る結合のタイプを限定することを意図するものではない。
【0036】
成分J*は、負、正および中性からなる群から選ばれ、生理学的条件下で実効電荷を有するペンダント基の残基である。これは、置換または未置換のアルキル基、アリール基、ヘテロアルキル基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、アシル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基、アミド、アミノ基,カルボニル基等、ならびにそれらの塩を含む。好ましくは、中性基はアルキル基またはアルコキシ基であり、1〜18個の炭素を含有する部分を含み得るが、それに限定されず、さらに直鎖状または分岐状とすることができる。帯電した基として提供される場合には、J*はイオン性官能基を含む。官能基の例としては、カルボン酸、エステル、アミド、ニトリル、チオール、およびヒドロキシル基が含まれるが、これらに限定されない。そのようなJ*基は、アミノ酸、核酸、脂肪酸、炭水化物、およびそれらの誘導体、ならびにキチン、キトサン、ヘパリン、硫酸ヘパラン、コンドロイチン、硫酸コンドロイチン、デルマタンおよび硫酸デルマタン、シクロデキストリン、デキストラン、ヒアルロン酸、リン脂質、シアル酸等のような成分とすることができる。J*は、好ましくは、カルボキシル、アミノ、チオール、ヒドロキシル、ホスホリル、グアニジウム、イミダゾールおよびそれらの塩から選ばれたイオン性部分を含む。最も好ましいのは、J*がイオン性カルボキシレート部分を含み、生理学的条件下で負の実効電荷を有する場合である。例えば、本発明の好ましいポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、3〜7の等電点を有し、従って、負の電荷を持つJ*基により、plの微調整に利用できる。
【0037】
成分s1、s2およびs3は、同じまたは異なってもよいスペーサーまたはリンカー部分であり、個々に存在しても存在しなくてもよい。好ましいスペーサーまたはリンカーとしては、水溶性ポリマー中に用いられる1つ以上の反復単位、ジアミノおよびまたは二酸単位、天然または非天然アミノ酸もしくはそれらの塩、ならびに好ましくは18個までの炭素原子または付加的なポリマー鎖さえも含むアルキル基、アリール基、ヘテロアルキル基、ヘテロアリール基、アルコキシ基等を含む脂肪族部分を含む直鎖または分岐状部分を含む。最も好ましくは、スペーサーまたはリンカーは、ポリマー鎖を含む。
【0038】
代わりに、上記の式Un−s1−B−s2−ポリマー−s3−J*は、「Un−B−ポリマー−J*」としてあらわすことができ、ここではs1、s2およびs3基は存在しても存在しなくてもよい。
【0039】
より好ましい「ポリマー」成分は、水溶性ポリマーU−s1−B−s2−ポリマー−s3−J*が全体として段階的合成により製造されるものである。これにより、正確な分子量および定義された構造を有するポリマーの構成が可能になる。対照的に、標準的ポリマー合成は重合プロセスであって、鎖長が異なる混合物が得られ、従って、分子量およびサイズが分布し、この分離は不可能ではないとしても困難である。分子の純度を制御する能力は、水溶性ポリマーが付着されかつ単分散である合成タンパク質を構成できるという点で、有利である。このことは、異質な化合物の結果として得られる特性が変化するということを回避し、かつ最も好ましい特性を持つ化合物だけを比較的容易に調製および単離できるという点で、大いに有利である。
【0040】
別の好ましい実施形態においては、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、1つ以上の不規則アミノ酸を含む。ここで使われているように、「不規則アミノ酸」は、非遺学伝的にコード化された側鎖、非遺学伝的にコード化されたバックボーン、非遺学伝的にコード化された置換されたNαまたはαC(O)部分、あるいはそれらの組み合わせを有するアミノ酸、すなわちリボソームによって組み込まれた20個の遺学伝的にコード化されたアミノ酸以外のものを指す。好ましい不規則アミノ酸の例としては、遺学伝的にコード化された官能基以外の一意的な官能基を持つ側鎖を有するアミノ酸、ならびに擬アミノ酸および様々なアミノ酸誘導体が含まれる。この点について、本発明により、合成赤血球産生刺激タンパク質の設計および/または構造における幅広い選択性および柔軟性が可能になる。発明品により用い得る非リボソーム的に組み込まれたアミノ酸の例として以下のものが含まれるが、これらに限定されるものではない。すなわち、D−アミノ酸、β−アミノ酸、擬似グルタミン酸塩、γ−アミノブチレート、オルニチン、ホモシステイン、N置換アミノ酸(R. Simon et at., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1992)89:9367−71、WO91/19735号(Bartlett et at.)、米国特許第5,646,285号(Baindur))、α−アミノメチレンオキシ酢酸(アミノ酸−Glyジペプチド等配体)、α−アミノオキシ酸ならびに非遺学伝的に非コード化された側鎖官能基を有する他のアミノ酸および誘導体等である。チオアミド、ビニル型アミド、ヒドラジノ、メチレンオキシ、チオメチレン、ホスホンアミド、オキシアミド、ヒドロキシエチレン、還元アミドおよび置換還元アミド等配体ならびにβ−スルホンアミドが使用できる。「擬似アミノ酸」は、遺学伝的にコード化されたアミノ酸として同一のバックボーン構造および側鎖基を持つが、側鎖原子の原子組成が異なるアミノ酸を意味する。
【0041】
好ましい実施形態においては、そのポリペプチド鎖の不規則アミノ酸に水溶性ポリマーが付着させられた合成赤血球産生刺激タンパク質が提供される。水溶性ポリマー付着のためにより好ましい不規則アミノ酸は、遺学伝的にコード化された官能基の存在下でこれと反応することなく用い得る化学選択的ライゲーション化学を使用する。
【0042】
上記で言及したように、全体が段階的集合により作られる水溶性ポリマーは、単分散(monodisperse)、例えば本発明の好ましいポリアミドエチレンオキシドとして作り得る。従って、別の好ましい実施形態は、水溶性ポリマーが単分散であるものである(すなわち、単一かつ構造的に定義された意図する分子種を含む分子的に均質な組成物)。また、合成赤血球産生刺激タンパク質は全体を化学合成により作り得るので、これらは単分散とすることもできる。そのような化合物には非常に純粋であるという利点があり、ヘテロ分散ポリマーを使用する場合のような精製および分析的特徴付けの問題が回避される。そのような化合物は、再現性のある投薬等の点に関しても有利である(例えば、糖タンパク質とPEG化組換え生産タンパク質との典型的な混合物とは対照的な単一分子種)。
【0043】
上記で言及したように、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、25kDa以上のモノマー分子量を持つことができる。本発明の目的のため、そのような分子量決定は、変性SDSポリアクリルアミド電気泳動法によりなされるべきである。用語「モノマー分子量」は、タンパク質またはポリペプチドの複数のコピーを持つことがある合成タンパク質とは区別されるモノマー合成タンパク質の分子量を指すことを意図している。用語「モノマーポリペプチド分子量」は、そこに付着させられたポリマーおよび/またはタンパク質またはポリペプチドの複数のコピーを持つことがある合成タンパク質とは区別されるモノマーポリペプチドの分子量を指すことを意図している。より好ましくは、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質のモノマー分子量は、40kDa以上、より好ましくは50kDa以上であり、最も好ましくは60以上〜70kDaである。例えば、SEP−1−B51と呼ばれる本発明の好ましい合成赤血球産生刺激タンパク質のモノマー分子量は、約73kDaである。しかしながら、さらに大きい構成物は本発明の範囲内に十分あるものと見なされる。
【0044】
別の実施形態においては、本発明は、タンパク質のライゲーション部位に擬似アミノ酸を含み、任意にタンパク質に付着させた水溶性ポリマーを含む合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられる。これらの化合物は、システインのような化学選択的反応性官能基を含むN末端アミノ酸を有する第1のペプチドまたはポリペプチドを、α−カルボキシチオエステルのような化学的ライゲーション適合性C末端官能基を有する第2のペプチドまたはポリペプチドに結合し、さらに擬似グルタメートアミノ酸を形成するシステインチオール側鎖のカルボキシメチル化のようなライゲーション部位の未保護側鎖官能基を擬似アミノ酸に化学的に変換することにより、ライゲーション部位における未保護側鎖官能基を有するライゲーション産物を形成することにより製造される。天然型化学的ライゲーション部位のシステインの変換により形成された擬似アミノ酸は、本明細書中では「擬似天然型化学的ライゲーション」と呼ばれ、以下で詳細に説明される。
【0045】
タンパク質のライゲーション部位におけるアミノ酸の側鎖に付着させられた水溶性ポリマーを含む合成赤血球産生刺激タンパク質も提供される。これらの化合物は、システインのような化学選択的反応性官能基を含むN末端アミノ酸を有する第1のペプチドまたはポリペプチドを、α−カルボキシチオエステルのようなライゲーション適合性C末端官能基を有する第2のペプチドまたはポリペプチドに結合し、ライゲーション部位における未保護側鎖官能基に水溶性ポリマーを付着させることにより、ライゲーション部位において未保護側鎖官能基を有するライゲーション産物を形成することにより合成される。
【0046】
擬似アミノ酸化学的ライゲーションの利用および本発明の化学的ライゲーション部位ポリマー修飾方法により、従来技術に対する利点が提供され、その利点としては、別の方法では適切なライゲーション部位を欠く多様な範囲の赤血球産生刺激タンパク質の活発な合成、日常的な費用効率の高い方法で部位特定的ポリマー修飾が活用できる部位の拡張(および付着化学)、ならびにとりわけかなり大きい分子量の合成赤血球産生刺激タンパク質の合成が含まれる。それらは、水溶性ポリマー付着のための個々または複数の部位のスキャニングを含む、所望の生物学的特性を微調整するための高処理能力のアナログ化に特に適している。
【0047】
上記で言及したように、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質の生物学的特性は、ポリマー付着の部位と結合化学を正確に調整すると共に水溶性ポリマーの分子量、ポリマー組成、構造(例えば、直鎖状か分岐状かあるいはその混合)、およびペンダント基(例えば、帯電か未帯電かあるいはその混合)を正確に調整することによって修正できる。特に、半減期、および分岐等を改善するためにタンパク質の分子量を増加させることに加えて、タンパク質に付着させられた水溶性ポリマーは、合成赤血球産生刺激タンパク質のアミノ酸配列が基づく対応する生物学的に生産されたタンパク質の荷電にほぼ等しい等電点により測定されるような正確な電荷を合成赤血球産生刺激タンパク質が持つようにできる。これには、対応するリボソーム特定タンパク質の自然状態の荷電を模倣できるという利点がある。従って、本発明の好ましい実施形態は、上記の特徴ならびにそのために利用される水溶性ポリマー、特に事前に選択された位置に付着させ得る構造的に定義されたポリマー付加物を組み合わせる合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられる。
【0048】
特に、本発明の好ましい合成赤血球産生刺激タンパク質(「SEP」)は、好ましくはヒト尿EPOのポリマー修飾合成類似体である。好ましい実施形態においては、これらは、チオエーテル、オキシム、アミドまたはその他の結合を介して1つ以上のペプチド残基に付着させられた1つ以上の水溶性ポリマーを含んでいる。非常に好ましい実施形態においては、そのような結合は、ヒト尿EPOにおいて天然にグリコシル化された1つ以上の位置(すなわち、位置24、38、83および126)にあるであろう。最も好ましくは、SEP分子は、2つ以上のそのような位置にポリマー部分を有するであろう。他の実施形態においては、他のタンパク質残基はポリマー部分によって修飾できる。本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質のための修飾位置は、タンパク質の無秩序なループ、領域またはドメイン、あるいは潜在的なプロテアーゼ切断部位またはその近くに位置する残基を含む。例えば、ポリマー修飾は、EPOの9、69および/または125の1つ以上の位置に導入し得る。さらに、もし1つ以上の天然グリコシル化部位がポリマーで修飾されずに残った場合には、それらの領域中の1つ以上のアミノ酸を希望により他の残基に変換することができる、例えば、もし正の電荷が必要であれば、リジンに変換でき、負の電荷が必要な場合であれば、アスパラギン酸もしくグルタミン酸、あるいはアラニン等に変換し得る。本発明のSEP分子の総分子量は、約25〜約150kDa、より好ましくは、約30〜約80kDaである。分子量は、任意の類似体の修飾に利用される水溶性ポリマーの数および構造を増大または減少させることによって制御できる。
【0049】
例えば、オキシム結合ポリマーSEP類似体は、好ましくは、アミノオキシ、ケトンまたはアルデヒド官能化した水溶性ポリマーをSEPタンパク質に、側鎖アミノオキシ、ケトンまたはアルデヒド官能性を持つ非天然的にコード化されたアミノ酸において付着させることにより構成される。例えば、SEP−0およびSEP−1の位置89および117は、擬似グルタメート(式−CHα−CH2−S−COOHの側鎖を有する非天然的にコード化されたアミノ酸(グルタメート側鎖−CHα−CH2−CH2−COOHと比較して))を含む。チオエーテル結合を利用しているSEP類似体は、好ましくは、システインまたはチオールを有する非天然アミノ酸により提供されるチオール官能性を含むように構成される。図10は、好ましい合成赤血球産生刺激タンパク質の1つのタイプの基本構造を示す。
【0050】
他の実施形態においては、本発明のSEP分子は、EPOの天然のアミノおよびカルボキシ末端が再配置されている「円形に並べ替えられた」EPO類似体を含み得る。最も好ましくは、そのような再配置により、アミノおよびカルボキシ末端が、無秩序ループ等のような、構造的拘束が小さい位置へ移動される。位置125および126周囲の無秩序ループ(天然のEPO残基ナンバリングシステムに関して)は、そのような再配置部位の例である。最も好ましくは、そのようなSEPは、ジスルフィドフリーであり、事前選択された残基においてポリマー部分に含むように化学的に修飾される。
【0051】
あるいは、SEP分子は、自然発生グリコシル化部位、または位置126および125のようなグリコシル化を受けやすい他の部位へ再配置されたアミノおよびカルボキシ末端を持つことができる。SEP分子は、電荷を除去または修正するためにアミノおよびカルボキシ末端の(カルボキシアミド化等によるような)修飾も含み得る。そのような円形に並べ替えられた分子の好ましい例において、新規なNおよびC末端が位置126および125によりそれぞれ提供される。位置7、29、33および161の天然のジスルフィド形成システインは、好ましくは、ジスルフィドブリッジを形成できない非天然的にコード化されたアミノ酸、L−α−N−酪酸(Aba)、で置換される。残基R166、E37およびV82は、好ましくは、生産を改善するため、アラニンで置換される。また、付加的システインは、好ましくは、以下で「0」として番号付けられる天然EPO番号方式に関して位置1と166との間に挿入される。結果として得られる分子は、4つのシステインを位置126、0、38および83に(N末端からC末端への方向に読んで)含み、これらは、(1)ライゲーション部位および(2)チオエーテル形成pPEG付着部位として利用される。任意に、付加的なpPEG付着部位を提供するために、システインはA125に取って代わることができる。
【0052】
本発明のそのようなSEP分子の総分子量は、約25〜約150kDa、より好ましくは約30〜約80kDaである。この分子量は、任意の類似体の修飾に利用される(pPEGのような)ポリマーの数および構造を増減することによって制御できる。より大きい構成物についてのpPEG仲介流体力学的MWは、100kDa以上である。任意のpPEG付着部位は、位置125、9、および24(N末端からC末端への方向に読んで)に位置する。付加的SEP類似体設計は、上記の無秩序ループ領域の代替的NおよびC末端を有し、および/または新しいNおよび/またはC末端から残基を切り取る。好ましい円形に並べ替えられた分子の基本構造を図11に示す。図12には、好ましい水溶性ポリマーの構造、ならびに種々の直鎖状および分岐状構成物を示す。
【0053】
例えば、本明細書中の実施例に記載される特定のSEP構成物に加え、ヒトEPOの天然配列を円形に並べ替えることによって配列を以下のやり方で設計した。すなわち、天然N末端Ala1およびC末端Arg166は、別のCys残基により結合され、従って、167アミノ酸のポリペプチドが得られ、新しいNおよびC末端が、天然配列の残基125−126において鎖を分離させることによって作り出され、すべての天然Cys残基は、L−α−アミノ−n−酪酸残基で置換され、さらに、以下の置換を行った。すなわち、Glu37Ala、Asn38Cys、Val82Ala、Asn83Cys、Ser126Cys、Arg166Ala(すべての残基番号は、ヒトEPOの天然配列に基づく)である。同時に、これらの設計要素の結果、示されるようなSEP−5のアミノ酸配列が得られる。SEP−5−L28タンパク質は、Cys残基126、0、24、38、および83(ヒトEPO配列に基づく番号付け)において、マイケル付加反応によって、マレイミド修飾直鎖(TTD−Succ)6カルボキシレートポリマー構成物によってポリマー修飾された。これらの変更は、SEP−5−L28タンパク質の合成および取り扱いを改善するために設計された。設計された配列は、それぞれがN末端Cys残基を持つ4つのペプチドセグメントから作られた。化学的ライゲーション部位は、Cys0、Cys38、Cys83であった。C末端ペプチドがα−カルボキシレートであるペプチドが合成され、他の3つのペプチドはα−チオエステルであり、このようにして、N末端Cys残基は、側鎖Acm保護された。Cys24は側鎖未保護であった。セグメントは、C末端の2つのセグメントで始め、天然型化学的ライゲーションにより逐次結合された。ライゲーション後、ライゲーション部位のフリーなCys側鎖は、マイケル付加反応により、マレイミド修飾直鎖状(TTD−Succ)6カルボキシレートポリマー構成物と反応し、次にCys側鎖Acm保護基が除去され、次のセグメントのライゲーションとポリマー修飾が同様に実行された。Acm基の除去後、次の(第4の)セグメントのライゲーションが実行され、最後のAcm基が除去されポリマー修飾が同様に実行されて、上記で説明し図30に示した、円形に並べ替えられたポリマー修飾SEP構成物が得られた。
【0054】
II.本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質の生産
ポリマー修飾赤血球産生刺激タンパク質は以前から記載されているが、本発明はそのような従来の試みとは顕著に異なる。例えば、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、全体的または部分的に化学合成される。さらに、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、1つ以上の特定のユーザー選択およびユーザー定義された部位で水溶性ポリマーにより修飾されている。
【0055】
さらに、本発明における赤血球産生刺激タンパク質の合成的生産により、調製品中の全分子のユーザー選択およびユーザー定義された部位のそれぞれにそのような修飾が確実に存在するようにできる。合成のそのような均一性および制御により、本発明は先行技術の方法の使用に許されたランダム修飾から顕著に区別される。重要なことに、本発明により、どのような重要でない残基もポリマー付加物を含むように誘導体化し得る合成赤血球産生刺激タンパク質を設計できるようになる。さらに、そのようなユーザー選択およびユーザー定義された部位の各々について、ユーザーは、それを介してそのような付加物がポリペプチドまたはタンパク質バックボーンに結合される正確な結合(アミド、チオエステル、チオエーテル、オキシム等)を定義できる。加えて、特定部位に存在してほしい特定のポリマー付加物は変更および制御することができ、その結果、存在するすべてのタンパク質またはポリペプチドが正確に同じ誘導体化部位に正確に同じ誘導体化付加物を含む最終調製品が得られる。従って、本発明により、ポリマー修飾赤血球産生刺激ポリペプチドおよびタンパク質の均質調製品の形成が可能になる。
【0056】
水溶性ポリマーを結合し得る付着部位の位置および数を変えるための手段の提供に加え、本発明により、結合ポリマーの性質を変えることが可能になる。どのような特定のユーザー選択およびユーザー定義された部位にも組み込み得るポリマー付加物は、任意の定義された長さとし得る。同様に、本発明の方法に従って、種々の部位において種々の長さのポリマーを使用することが可能である。従って、1つの実施形態において、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、水溶性ポリマー付加物でモノ修飾またはポリ修飾し得る。1つ以上のポリマー付加物が特定のポリペプチドまたはタンパク質中に導入される場合、使用されるポリマーは、「単種分化」、「多種分化」、「均一種分化」、または「多様に種分化」されたものとし得る。本明細書中で用いられているように、用語「単種分化された」は、単一種のポリマーにより修飾されたタンパク質またはポリペプチドを意味する。対照的に、用語「多種分化された」は、2つ以上のポリマー種により修飾されたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。そのような多種分化されたポリペプチドまたはタンパク質は、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾された各部位において、同じ単一のポリマー種が存在すれば「均一種分化された」と呼ばれる。対照的に、多種分化されたポリペプチドまたはタンパク質は、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾された部位が異なるポリマー種で修飾されていれば、「多様に種分された」と呼ばれる。
【0057】
さらに、ユーザー選択およびユーザー定義された各部位におけるポリマー付加物の直鎖性または分岐性の程度を変えることが可能である。従って、ポリマー付加物は、直鎖状、分岐状、または均一分岐状とし得る。用語「均一分岐状」は、特定部位におけるポリマーのすべての分岐が同じ構造および長さを有することを意味する。理解されるように、本発明により、任意の個々の分岐の長さならびにそのような分岐点に存在するポリマー構造の両方を独立して変えることが可能になる。
【0058】
要約すると、本発明により、ポリペプチドまたはタンパク質バックボーン中のポリマー修飾され、ユーザー選択およびユーザー定義された部位の(1)位置および(2)頻度を定義すること、ならびにそのような部位の各々に存在する分岐の(3)長さ、(4)種、および(5)程度を制御することが可能になる。加えて、複数のポリマー修飾を有するポリペプチドおよびタンパク質に関して、上記で確認した5つの変数の各々を各部位について独立して定義することが本発明により可能になる。さらに、分岐ポリマー修飾を有する合成赤血球産生刺激ポリペプチドおよびタンパク質に関して、上記で確認した5つの変数の各々を各分岐点について独立して定義することが本発明により可能になる。これは、存在しかつ不要なポリマー付着により妨害されずにいる20個の遺学伝的にコード化されたアミノ酸側鎖のいずれかまたはすべての多重コピーを有する正確にポリマー修飾された合成赤血球産生刺激タンパク質の均質組成物の合成を考慮している。
【0059】
従って、本発明により、ポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質の設計、合成および使用における大きな柔軟性がもたらされる。例えば、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質のアミノ酸配列は、それが基づく遺学伝的にコード化されたタンパク質のアミノ酸配列に関する1つ以上の欠失、挿入または置換を含み得る。アミノ酸配列は、擬似アミノ酸または不自然な側鎖等を持つ他のアミノ酸、例えば水溶性ポリマーをそれに付着させるための一意的な化学選択的官能基を持つように修飾されたもの、などの1つ以上の不規則なアミノ酸で置換できる。従って、水溶性ポリマーは、不規則アミノ酸、または遺学伝的にコード化されたアミノ酸を介して付着させ得る。水溶性ポリマーは直鎖状または分岐状とすることができ、カルボン酸、脂肪族、アミドまたはアミンのような化学的部分を含む末端基を有し得る。さらに、水溶性ポリマーは単分散とすることができ、すなわち、正確に定義された構造および組成の単一分子種を含むように作り得る。従って、水溶性ポリマーは、それで修飾された標的タンパク質の半減期、免疫原性、効力、貯蔵安定性、投与量、デリバー可能性等を正確に調整する特徴を含むように設計できる。
【0060】
特に、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質の生産は、以下の段階を有するものとして想定できる。すなわち、設計、ペプチド合成、ペプチドライゲーション、タンパク質生成のための完全長ライゲーション産物の折りたたみ、およびタンパク質の生物活性評価である。ポリマー修飾は、ペプチド合成、ライゲーションまたは折りたたまれた産物の段階の1つ以上で実行できることを本発明者らは見出した。しかしながら、ポリマーを、ペプチドまたは折りたたみ前のライゲーション産物に付着させることが好ましい。このようにして生産された所望の生物活性を示すタンパク質は、選択されて、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質となる。
【0061】
好ましい方法においては、合成赤血球産生刺激タンパク質を構成するポリペプチド鎖は、合成赤血球産生刺激タンパク質の非重複アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合して作られる。特に、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質分子は、当該合成赤血球産生刺激タンパク質分子のポリペプチド鎖の非重複アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合して作られ、そこではライゲーションに用いられる1つ以上のペプチドセグメントは、ユーザー定義および事前選択された部位において水溶性ポリマーが付着されている。次に、ポリマー修飾ポリペプチド鎖は折りたたまれて、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を生産することができる。
【0062】
本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質を生産する別の好ましい方法は、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質のポリペプチド鎖の非重複アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合する段階と、その1つ以上の化学的ライゲーション部位におけるアミノ酸の側鎖に1つ以上の水溶性ポリマーを付着させる段階とを含む。次に、ポリマー修飾ポリペプチド鎖は折りたたまれ、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を生産する。
【0063】
それほど好ましくはないが、合成赤血球産生刺激タンパク質は、(1)合成赤血球産生刺激タンパク質のポリペプチド鎖の非重複アミノ酸配列を含むペプチドセグメントと化学的に結合して、合成赤血球産生刺激タンパク質に対応する完全長ポリペプチド鎖を形成し、少なくとも1つのペプチドセグメントが、第1の化学選択性官能基を有する不規則アミノ酸を含み、(2)ポリペプチド鎖を折りたたみ、(3)第1の化学選択性基と一意的かつ相互に反応する第2の化学選択性基を含む水溶性ポリマーをそれに付着させることにより作ることができる。
【0064】
特に、本発明において具体化され、かつ実施例において例証されるこれらの多様なプロセスは、図面において合成赤血球産生刺激タンパク質について一般に示されるように例示され得る。例えば、図1A〜図1Eには、ライゲーションの前もしくは後またはそれらの組み合わせにおける、部分的または完全に未保護のペプチドセグメント
【化1】
への水溶性ポリマー(本明細書中で定義されるU−B−ポリマー−J*)の付着を伴うライゲーションの図式が示してある。図1A〜図1Dにおいては、Yaaは、一意的な化学選択性部分(例えば、α−カルボキシルチオエステルを持つアミノ酸)を持つ第1のペプチドセグメント上のC末端アミノ酸で、前記部分は、Yaaとの化学選択的化学的ライゲーションが可能な一意的かつ相互に反応性のN末端アミノ酸Xaa(例えば、アミノ末端システイン)部分を持つ第2のペプチドセグメントへの化学的ライゲーションのための部分である。YaaとXaaとの間の化学選択的反応により、それらの間に共有結合的結合が生成する(例えば、アミド結合)。従って、YaaおよびXaaは、化学選択的ライゲーション対を形成する。Un−は、図に示されるように、アミノ酸の側鎖上の正確なユーザー定義部位に組み込まれ、さらに水溶性ポリマーU−B−ポリマー−J*の基U−に対し化学選択的かつ相互に反応性の第2の一意的な化学選択的部分を表す。例えば、Unがケトン基を持つように修飾された側鎖である場合、水溶性ポリマーU−ポリマー−J*は、ケトンと反応する化学選択的な基、例えば、その間にオキシム結合を作り出すアミノオキシ基である。Un−の添字「n」はアミノ酸の数を表し、それらの側鎖は、化学選択的基Uを持つように設計されており、例えば、2つの特定的かつユーザー定義部位がポリマー修飾される場合にはn=2であり、これはU2またはUn=2と表すこともできる。すべての場合において、nは設計により正確に制御される正の整数である。従って、UnおよびUは、XaaおよびYaaの化学選択的基と両立できかつこれと非反応性の第2の化学選択的ライゲーション対を表す。図1Aおよび図1Bは、2つの異なる可能な反応を例示するものである。図示された第1の反応において、Un官能性を持つポリペプチド鎖は第2のポリペプチドに結合され、次に、ポリマー修飾ポリペプチドを得るために、U−B−ポリマー−J*部分と反応させられる。描かれた第2の反応において、ポリマー修飾ポリペプチドを得るために、Un官能性を持つポリペプチド鎖はU−B−ポリマー−J*部分と反応させられ、次に、より大きいポリマー修飾ポリペプチドを得るために、第2のポリペプチドに結合される。これらの図は、図1Aにおいては、Xaa残基を持つポリペプチドがポリマー修飾を受け、それに対して、図1Bにおいては、Yaa残基を持つポリペプチドがポリマー修飾を受けるという点で異なる。図1Cは、より大きいポリペプチドを形成するため、複数のポリペプチド鎖をそのライゲーションの前もしくは後に修飾する本発明の能力を例示するものである。図1Dにおいては、PGおよびPG’は保護基を表しており、そこでは、PG’は直交保護基を示し、すなわち、PGおよびPG’は異なる条件下で除去可能であり、かつ異なる水溶性ポリマーが同じ化学を介してUn基に付着させられている場合、あるいはUn基が、ポリマー修飾したくない側鎖官能基である場合(例えば、水溶性ポリマーのU基が第1アミノまたは側鎖チオールともっぱら反応するように設計されている場合の反応性の−NH2または−SHを持つ側鎖)に有用である。図1Dは、本発明の方法に従って結合されているポリペプチドの所望の側鎖を保護するために保護基が使用できることを示している。
【0065】
図1Eは、図1A〜図1Dによるライゲーションおよびポリマー修飾において用いられるペプチドセグメント中に存在するかまたは存在しない基の多様性を例示するものである。
【0066】
図2A〜図2Cは、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質を調製するためのプロセスの付加的な概略図を示す。特に、図2A〜図2Bは、ライゲーション部位(例えば、システインの側鎖チオール)におけるアミノ末端基Xaaの側鎖への水溶性ポリマーU−B−ポリマー−J*の付着を伴うライゲーションの図式を示す。図2Cは、図2A〜図2Bによるライゲーションおよびポリマー修飾において用いられるペプチドセグメント中に存在するかまたは存在しない基の多様性を例示するものである。
【0067】
図3A〜図3Bは、3つ以上の非重複ペプチドセグメントの化学的ライゲーションを伴うマルチセグメントライゲーションを達成するためのプロセスの付加的な図式を示す。すなわち、少なくとも一つのセグメントは、最終的な完全長ライゲーション産物に対応する中央セグメントである。このようにして調製されたペプチドは、例えば図1A〜図1E、図2A〜図2C、および図4A〜図4Cに示されるような別のライゲーション反応に関与するペプチドセグメントを調製するために用い得る。一般に、マルチセグメントライゲーションについては、中央セグメントは、使用されるライゲーション化学に応じて、そのペプチドの環化または鎖状体形成を回避するために、保護されたXaa基または保護されたYaa基を有している。逐次または連続ライゲーションについては、中央セグメントのXaa基が保護されている(例えば、Cys(Acm))のに対して、Yaa基は未保護である(例えば、Yaa−COSR。ここでCOSRは、α−カルボキシルチオエステルである)。ここでは、Yaa基は、未保護Xaa基を持つ第2のペプチドと自由に反応し、そこでは第2のペプチドはフリーなYaa基を欠いている。ライゲーションに続き、次のライゲーション反応用にXaa基を再生するために保護基が除去される。このプロセスは必要なだけ続けることができ、それにより、伸長されたポリペプチド鎖が生成される。Yaa基の保護は、4つ以上のセグメントで構成される最終的なライゲーション産物の生産を伴う収束的化学的ライゲーションの場合に特に有用である。例えば、4セグメントライゲーションから生成されたタンパク質標的(すなわち、3つのライゲーション反応)の場合、タンパク質の一端に対応する2つのセグメントと、タンパク質の他端に対応する2つのセグメントは、逐次的とは対照的に並行して結合でき、2つの端部は最終的ライゲーション反応において接合される。そのような収束的化学的ライゲーション方式も、直交ライゲーション化学を用いることができる。ここで再び、そのようなペプチドセグメント中に存在するかまたは存在しない基の多様性を図1E、図2Cおよび図4Cに例示する。
【0068】
図4A〜図4Cは、本発明の原理に従って、結果として得られる側鎖チオールの天然型化学的ライゲーションおよび化学修飾がどのように達成し得るかを例示するものである。特に、図4A〜図4Bは、チオアルキル化およびチオエーテル結合を含む化学的に修飾された側鎖(Ψで表される)を介しての「擬似アミノ酸」(ΨXaaで表される)を形成するために、ライゲーション部位における結果として得られるシステイン側鎖チオールの天然型化学的ライゲーションおよび化学修飾を示している。図示してない別の実施形態においては、側鎖チオールは脱硫反応においてアラニンに変換できる(Liang et al, J. Amer. Chem. Soc. (2001) 123(4):526−533)。両方の反応にとって重要な観点は、変換または修飾したくない他のどのような側鎖チオールも、適切な保護基(PG)により保護され、あるいはマルチセグメントライゲーションの場合には直交保護基(PG’)で保護され、そこではカルボキシ末端Yaa基を持つセグメントは保護されたアミノ末端Xaa基、すなわちPG−Xaa−ペプチドを含み、これは一例として図4Bに示してある。図4Cには、図1A〜図1E、図2A〜図2C、および図3A〜図3Bだけでなく、図4A〜図4Bによるライゲーションおよびポリマー修飾において用いられるペプチドセグメント中に存在するかまたは存在しない基の多様性が示してある。
【0069】
設計と併せて、ポリペプチドバックボーンの合成に利用されるペプチドまたはポリペプチドセグメントが構成される。これは、様々なポリペプチドバックボーンセグメントを集合させるために選択されたライゲーション化学、所与の標的タンパク質のために選択されたポリマー付着化学、および特定のポリマー付着部位に基づいて選ばれる適切なライゲーション部位の選択を伴う。天然型化学的ライゲーションが使用される場合、システインライゲーション部位は、適切な自然発生システイン残基について標的ポリペプチドバックボーンのアミノ酸配列をスキャニングすることにより決定される。本明細書中に記載されるように、拡張天然型化学的ライゲーションが使用される場合、スキャニングライゲーション部位は、Xaa−Gly部位のような強いライゲーションを可能にする適切な自然発生ライゲーション部位接合部について標的ポリペプチドバックボーンアミノ酸配列をスキャニングすることにより選択し得る。拡張天然型化学的ライゲーションは、システイン残基におけるライゲーションに限定されないので、任意の数の残基がライゲーション部位接合部となり得る。いくつかの例では、天然型および拡張天然型化学的ライゲーションの組み合わせを設計の一部とし得る。
【0070】
好ましい実施形態において、天然型化学的ライゲーションは、完全長ポリペプチド鎖の一部または全部の生成に用いられる。合成赤血球産生刺激タンパク質の基になる自然発生タンパク質中に存在するシステインは、化学的ライゲーション部位として用い得る。しかしながら、好ましいライゲーション接合部が適切なシステインを欠いている場合には、その位置の非システインアミノ酸は、その部位での天然型化学的ライゲーションを可能にするため、システインと置き換えることができる。もし必要であれば、新規に導入されたシステインは、本明細書中に記載されるように、その位置でオリジナルのアミノ酸に対応する擬似アミノ酸残基に変換できる。あるいは、ポリマー修飾のためにシステインがある部位に導入される場合、標的ポリペプチド中の修飾したくない他のすべてのシステインが保護されていれば、側鎖チオールは、チオール反応性水溶性ポリマー構成物の付着に利用できる。
【0071】
別の好ましい実施形態においては、拡張天然型化学的ライゲーションは、ここに記載されるように、完全長ポリペプチドの一部またはすべてを生成するために利用できる。この方法のため、N末端のNα置換された2ないし3つの炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸が用い得る。そのような残基(ライゲーションに用いられるペプチドまたはポリペプチドセグメントのN末端に存在する場合)は、本明細書中に記載の拡張天然型化学的ライゲーションの方法に従って、C末端α−カルボキシチオエステル部分を有するポリペプチドへ当該ポリペプチドを結合するのに有利に使用できる。
【0072】
一般的には、ペプチド合成には、標準的な自動ペプチド合成器を用いる段階的標準Bocおよび/またはFmoc固相ペプチド合成が用いられ、または標準プロトコルに従って手作業で行うか、あるいは商業ベンダーから注文および購入される。(”Synthetic Peptides, A User’s Guide,”G. A. Grant, Ed., W. H. Freeman & Company, New York, NY, 1992 ; ”Priciples of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky, Ed., Springer−Verlag, 1993; ”The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer−Verlag, 1994; and ”Protecting Groups,” P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994 ; ”Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach, Eds. W. C. Chan and P. D. White, Oxford University Press, 2000)。天然型化学的ライゲーションのためのようなチオエステル仲介ライゲーションに利用されるペプチドについては、標準的プロトコルに従って同様に作ることができる。(例えば、Dawson et al., Science (1994) 266: 776−779; Canne et al. Tetrahedron Lett. (1995) 36: 1217−1220; Kent, et al., WO96/34878号; Kent, et al., WO98/28434号; Ingenito et al., JACS (1999) 121 (49): 11369−11374; およびHackeng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1999) 96: 10068−10073); 上記のAmiato et al.参照)。
【0073】
水溶性ポリマーのライゲーションおよび部位特定的付着については、不要な付着を作り出す副反応を回避するため、化学的直交戦略がペプチド合成(例えば、図1〜図4および実施例を参照)に用いられる。例えば、ライゲーション設計およびポリマー付着方法に応じて、種々の直交合成戦略が利用できる。特に、付着させるべき水溶性ポリマーの性質、および特にこれをポリペプチドに結合するための官能基が、例えば本発明の好ましいグリコ模倣(glyco−mimetic)ポリマーについて下記で論じるように、考慮される。
【0074】
特に、水溶性ポリマーは、ライゲーションに用いられる標的ペプチド、完全長物質または折りたたまれたポリペプチド上の一意的官能基と選択的に反応性の一意的官能基Uを含むようにされる。化学合成が用いられる時、ペプチドは、相互に反応性の化学選択的基を、正確なユーザー定義部位に含むようにされる。本発明のこの観点は、ペプチド合成(保護基戦略)および化学的ライゲーション(部分的または無保護基戦略)の原理を具体化する。保護基戦略については、水溶性ポリマー上の所望の官能基を除くすべての潜在的な反応性官能基および標的分子上に存在するその相互に反応性の官能基が、適切な保護基によりブロックされる。多くの保護基が周知であり、この目的に適している(例えば、”Protecting Groups in Organic Synthesis”, 3rd Edition, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; ”Synthetic Peptides, A User’s Guide,” G. A. Grant, Ed., W. H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; ”Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry,” W. D.. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes, and H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998 ; ”Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky, Ed., Springer−Verlag, 1993; ”The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer−Verlag, 1994;および”Protecting Groups,” P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994参照)。
【0075】
従って、水溶性ポリマーは、上記に記載されるような広範囲の官能基を有するように作り得る。部分的保護基戦略または無保護基戦略については、ポリマー上の官能基および標的ペプチドまたはポリペプチド上に存在するその相互に反応性の官能基は、他の官能基が反応系中に存在し得るが非反応性である化学選択的反応対を用いる。これには、アミン捕獲戦略(例えば、ヘミアミナール形成、イミン形成、およびマイケル付加によるライゲーション)、チオール捕獲戦略(例えば、メルカプチド形成、ジスルフィド交換によるライゲーション)、天然型化学的ライゲーション戦略(例えば、システインまたは側鎖アミノ酸誘導体含有チオールのチオエステル交換によるライゲーション)、および直交ライゲーションカップリング戦略(例えば、チアゾリジン形成、チオエステル交換、チオエステル形成、ジスルフィド形成、およびアミド形成によるライゲーション)ができる基が含まれる(例えば、Coltart, DM., Tetrahedron (2000) 56:3449−3491参照)。
【0076】
この実施形態に好ましい化学選択的U基は、天然型化学的ライゲーション(Dawson et al., Science (1994) 266:766−779; Kent, et al., WO96/3487866号)、拡張一般化学的ライゲーション(Kent, et al., WO98/28434号)、オキシム形成化学的ライゲーション(Rose, et al., J. Amer. Chem. Soc. (1994) 116:30−33)、チオエステル形成ライゲーション(Schnolzer, et al, Science (1992) 256:221−225)、チオエーテル形成ライゲーション(Englebretsen et al., Tet. Lett. (1995) 36(48):8871−8874)、ヒドラゾン形成ライゲーション(Gaertner, et al., Bioconj. Chem. (1994) 5(4):333−338)、チアゾリジン形成ライゲーションおよびオキサゾリジン形成ライゲーション(Zhang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1998) 95(16):9184−9189; Tam, et al.,WO95/00846号)または他の方法(Yan, L. Z. and Dawson, P. E., ”Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization,” J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 526−533, 参照により本明細書に組み込まれる; Gieselnan et al., Org. Lett. 2001 3 (9): 1331−1334; Saxon, E. et al.,”Traceless” Staudinger Ligation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds. Org. Lett. 2000, 2, 2141−2143)のような水性両立ライゲーション化学で用いられる一意的官能基の残基を含む。
【0077】
上記で記載される種々の付着化学を考えると、水溶性ポリマーと標的ペプチドまたはポリペプチドとの間で形成された結合は、カーボネート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、アミン、オキシム、イミド、尿素、チオ尿素、チオエーテル、チオウレタン、チオエステル、エーテル、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキサゾリジン等から選ばれた結合の残基を含み得る。最も好ましい結合は、オキシムおよびアミド結合である。
【0078】
例えば図1〜図4に示されるようなペプチドライゲーション段階は、固相または液相ライゲーション戦略を用い得る。図8は、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質のライゲーションおよび生産に使用できるペプチドセグメントへの水溶性ポリマーの精密な付着のための別の経路を示すものである。第1ステップは固相ペプチド合成(「SPPS」)(例えば、FmocまたはBocSPPS)が用いられ、そこではポリマー付着の標的とされたアミノ酸側鎖は、直交保護基で保護される(例えば、FmocSPPSを用いるのであれば、ポリマー付着部位を保護するのにBoc基を用いることができ、BocSPPSを用いるのであれば、直交保護基としてFmoc基を用いることができる)。ペプチド合成に続いて、直交保護基が選択的に除去されるのに対して、ペプチドの残りは保護されたままである。これにより、次のステップである固相ポリマー合成のための単一付着部位がもたらされる。ひとたび直交保護基が除去されると、ポリマー鎖は前駆体として付着させられる。より好ましくは、ポリマー鎖は、図6A〜図6Dに示されるプロセスを用いたポリマー合成の連続的ラウンドで作られる。単一ポリマー付着部位が示してあるが、2つ以上が提供できる。図9は概括的な反応方式を示すものである。
【0079】
上記で述べたように、化学的ライゲーションは、第1の化学成分と第2の化学成分との間の選択的な共有結合的結合の形成を伴う。第1および第2の成分上に存在する一意的で相互に反応性の官能基は、ライゲーション反応を化学選択的にするために使用できる。例えば、ペプチドおよびポリペプチドの化学的ライゲーションは、適合できる一意的で相互に反応性のC末端およびN末端アミノ酸残基を持つペプチドまたはポリペプチドの化学選択的反応を伴う。この目的のためにいくつかの異なる化学反応が用いられており、その例としては、天然型化学的ライゲーション(Dawson, et al., Science (1994) 266:776−779; Kent, et al., WO96/34878号; Kent et al., WO98/28434号)、オキシム形成化学的ライゲーション(Rose, et al., Amer. Chem. Soc. (1994) 116:30−34)、チオエステル形成ライゲーション(Schnolzer, et al., Science (1992) 256:221−225)、チオエーテル形成ライゲーション(Englebretsen, et al., Tet. Lett. (1995) 36(48):8871−8874)、ヒドラゾン形成ライゲーション(Gaertner et al., Bioconj. Chem. (1994) 5(4):333−338)、チアゾリジン形成ライゲーションおよびオキサゾリジン形成ライゲーション(Zhang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1998) 95(16):9184−9189; Tam, et al., WO95/00846号; 米国特許第5,589,356号); Gieselman et al., Selenocysteine−mediated native chemical ligation (Org Lett. (2001) 3(9):1331−1334; and Staudinger amkde forming chemical ligation (Saxon et al., Org. Lett. (2000) 2:2141−2143)が含まれる。従って、理解されるように、そのような目的に適したどのような化学選択的反応化学も未保護ペプチドのライゲーションに適用可能である。
【0080】
任意のライゲーション化学のための反応条件は、ライゲーションに使用されるペプチドまたはポリペプチドセグメントの所望の相互作用を維持するように選択される。例えば、pHおよび温度、ライゲーションラベルの水溶性、第1のセグメントと第2のセグメントとの比、反応混合物の含水率および組成を改変してライゲーションを最適化できる。所望のライゲーション反応の特異性および速度を制御するため、すなわちペプチドまたはポリペプチドセグメントの可溶性を操作することによって反応性基の暴露および表出を制御するため、ライゲーションセグメントを種々の程度に可溶化する試薬の付加または除外をさらに用い得る。反応条件は、1つ以上の内部および/または外部対照と比較した所望の化学選択的反応生成物についてアッセイすることにより容易に決定される。
【0081】
N末端システイン残基を有するポリペプチドとの接合をライゲーションが伴う場合、好ましくは天然型化学的ライゲーションの手順が使用される(Dawson, et al., Science (1994) 266:776−779; Kent, et al., WO96/34878号; Kent, et al., WO98/28434号))。この方法論は、ライゲーション部位で天然アミド結合を生成するための確固たる方法論であることが判明した。天然型化学的ライゲーションは、C末端α−カルボキシチオエステル部分を有する第1のペプチドまたはポリペプチドセグメントと、N末端システイン残基を有する第2のペプチドまたはポリペプチドとの間の化学選択的反応を伴う。チオール交換反応は、最初のチオエステル結合された中間体を作り出し、これは自然に再配列して、ライゲーション部位で天然アミド結合を与え、そして一方でシステイン側鎖チオールを再生する。多くの例において、天然タンパク質の配列は、天然型化学的ライゲーション反応において、N末端システイン残基を有するポリペプチドフラグメントが合成および使われるように、適切に配置されたシステイン残基を含む。他の例においては、ペプチド合成は、システイン残基をこの目的のためのポリペプチドに導入するために実施できる。従って、その標準的形態において、天然型化学的ライゲーションは、標的ポリペプチド配列中のシステイン残基におけるチオエステル仲介された化学選択的反応を伴い、ペプチド結合がライゲーション部位で形成され、Cysの側鎖は天然形状に再生される。
【0082】
あるいは、本発明のタンパク質は、「擬似天然型化学的ライゲーション」または「拡張天然型化学的ライゲーション」を使用して合成し得る。擬似天然型化学的ライゲーションは、タンパク質合成に使用されるペプチド中の事前選択された位置における非天然的に生じる擬似アミノ酸残基の使用を伴う(例えば、図4参照)。そのような擬似アミノ酸の構造は、システインの構造および合成されているタンパク質中のそのような事前選択された位置に天然に見出されるアミノ酸の構造の両方を模倣する。従って、擬似天然型化学的ライゲーションは、ライゲーション部位において天然型化学的ライゲーションから生成されたシステイン側鎖のチオアルキル化に向けられる。好ましい態様は、システインライゲーション部位におけるチオアルキル化であり、そこでは少なくとも1つのペプチドは、チオール側鎖が適切な保護基で保護された天然システインを含んでいる。
【0083】
本発明の好ましい実施形態においては、システイン基のチオール部分は所望の側鎖、例えばリボソーム特定アミノ酸の側鎖、そのようなアミノ酸の類似体、または非リボソーム特定(non−ribosomally specified)アミノ酸へ修飾される。本明細書中で用いられるように、リボソーム特定アミノ酸は、タンパク質翻訳のプロセスにおいてリボソームにより認識され、リボソームによって作り出されたタンパク質中に組み入れられ得るアミノ酸である。システイン側鎖チオール部分の化学的修飾を記載した刊行物がかなり存在する(例えば、”Current Protocols in Protein Science,” Edited by: John E. Coligan et a/., John Wiley & Sons, NY (2000))。Kaiser,E.T.は、自然発生アミノ酸側鎖の化学特性を模倣するために、システイン残基側鎖の変換を記載している(例えば、Kaiser, E. T. et al., ”Chemical Mutation Of Enzyme Active Sites,” Science. 1984 Nov 2; 226 (4674): 505−11)。加えて、ラベルをペプチドまたはタンパク質中に導入するためのシステイン側鎖の使用が記載されている。システイン側鎖修飾は、「タンパク質結合および架橋の化学」(Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking), S. S. Wong, (1991, CRC Press)、「タンパク質の化学的修飾」(Chemical Modification of Proteins), Gary E. Means et a/., (1971, Holden−Day)、「タンパク質の化学的修飾:選択された方法および分析手順」(Chemical Modification of Proteins: Selected methods and analytical procedures), Glazer, A. N. et al. (1975, Elsevier)、「タンパク質修飾のための化学試薬」(Chemical Reagents for Protein Modification), RL Lundblad (1991, CRC Press)で概説されている。Tamら(Biopolymer (1998)46:319−327)は、非Cys天然型化学的ライゲーションのためのホモシステイン(−CH2−CH2−SH)の使用に続き、ホモシステイン側鎖を天然メチオニン側鎖(−CH2−CH2−S−CH3)に変換するためにメチルp−ニトロベンゼンスルホネート(メチル化試薬)を使用するチオアルキル化を開示している。本発明は、ホモシステインを擬似アミノ酸、すなわちメチオニン以外のアミノ酸に変換するためにも用い得る。しかしながら、本明細書中に記載されるシステインの変換と同様に、本発明に従って、変換したくない少なくとも1つの天然システインを含むペプチドのためのジスルフィドペアリングに関与する天然システインの破壊を避けるために保護基を用いる必要である。適切な保護基は以下に記載する。
【0084】
擬似天然型化学的ライゲーションの方法は、所定のリボソーム特定アミノ酸(例えば、グリシン、アラニン、バリン、およびプロリン)(ただし、アラニンの側鎖は、脱硫反応により形成し得る)(Liang, Z.Y. and Dawson, P.E., ”Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization,” J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 526−533、参照により本明細書に組み込まれる)の側鎖の模倣を容易にはしないのであるが、多くのリボソーム特定または非コード化アミノ酸を模倣する側鎖を形成するために用いることができる。本発明の擬似天然型化学的ライゲーション方法に従って産生されたアミノ酸はチオエーテル結合を含み、β分岐を全く持たない(それらすべてがβ位置にメチル基を含んでいる、すなわちaa−CH2−S−、という点で)。従って、β分岐アミノ酸、イソロイシンおよびトレオニンの擬似アミノ酸バージョンは、β幾何学およびそれに付随する制約を有することなく、ペンダント側鎖構造を持たせ得る。
【0085】
重要なことに、本発明の方法は、リボソーム特定アミノ酸の長さと同じ長さ、あるいはそのような長さよりも長いまたは短いアミノ酸側鎖の形成に用い得る。側鎖長さのそのような改変は、三次元コンホメーションを安定化(または不安定化)してタンパク質安定性を増大させる(またはタンパク質のコンホメーションを改変し、それによって自然発生タンパク質により受け入れられたそれらと関連する広範囲の基質、インヒビター、受容体、リガンド等を受け入れるタンパク質の能力を強化する)ために用い得る。例えば、Cys−CH2−SH+Br−CH2−COOHにより、Cys−CH2−S−CH2−COOH(そのような「擬似グルタミン酸」は1つの付加的側鎖原子、すなわち−S−基を有する。代わりに、アスパラギン酸の代わりに用いられれば、2つの付加的側鎖原子、すなわち−CH2−S−基を有する)が生じる。他の側鎖は、側鎖中に同数の原子を有しているが、チオエーテル結合(−S−)を含む点が異なる。例えば、Cys−CH2−SH + Br−CH2−CH2−NH−PGに続いて、PGを除去することにより、Cys−CH2−SH−CH2−CH2−NH2が生じる。結果として得られる構造は、側鎖中に付加的な原子を全く持っていないが、1つの−CH2−基が−S−で置き換えられる。メチオニンはここでは別の例であり、Cys−CH2−SH+I−CH2−CH3によりCys−CH2−S−CH2−CH3(Met−CH2−CH2−S−CH3の天然のmet構造に対して)が生じ、従って、チオエーテルが再配置される。アルギニンも同様である。すなわち、Cys−CH2−SH + Br−CH2−NH−CH((−NH2)(=NH2 +))により、Cys−CH2−S−CH2−NH−CH((−NH2)(=NH2 +))が生じる。好ましくは、反応性アミノ基の保護は、とりわけ構成擬似リジンについて、不要な副反応を回避するために用い得る。ひとたびチオアルキル化反応が実行されれば、保護基は除去し得る。
【0086】
一般に、自然発生タンパク質をできる限り綿密に模倣することが要望される場合、タンパク質のそのような位置に普通存在するリボソーム特定アミノ酸の長さと同じ長さである側鎖長さを有する擬似アミノ酸分子を使用することが最も好まれ、リボソーム特定アミノ酸の長さより1原子分長い側鎖長を有する擬似アミノ酸分子を用いることはあまり好まれず、さらに、リボソーム特定アミノ酸の長さより2原子分長い側鎖長を有する擬似アミノ酸分子を用いることはさらに好まれない。さらに、遺学伝的変化が機能を混乱させないと思われる、または関連したタンパク質中のその部位のアミノ酸が保存されているシステインライゲーション部位を選択することが好まれる。そのような部位は、アラニンスキャニング、相同性モデリングおよびその他の方法によって同定できる。
【0087】
擬似天然型化学的ライゲーションにおいて、アミノ末端システイン残基を含んでいるペプチドは、天然型化学的ライゲーションにおけるように、カルボキシ末端チオエステルを有するペプチドに結合される。次に、システインのチオール側鎖が、式Raa−X(Xは良好な離脱基であり、Raaはその構造がリボソーム特定または合成アミノ酸の側鎖の末端部分を模倣する基である)の化合物と反応させられる。
【0088】
重要なことには、擬似天然型化学的ライゲーションの反応は、システイン側鎖の天然のL−立体配置、またはD−立体配置で働く。D−立体配置の使用により、そのライゲーション部位におけるプロテアーゼ耐性を付与でき、従って、タンパク質分解に対する安定性を増大させることが求められる場合に使用できる。しかしながら、D−システインを使う場合には、その部位におけるバックボーン構造は改変されるであろう。そのような改変は、プロテアーゼ耐性に加え、生物活性を改変することが求められ得る。しかしながら、生物活性へのインパクトを最小限にするため、D−システインを、無秩序領域、結果として得られる折りたたまれた分子の表面に配置される無秩序ループあるいは分子の無秩序末端におけるような、高い可撓性の部位に配置するのが好ましい。望ましくは、擬似天然型化学的ライゲーションの反応は、合成された分子の表面に大きい帯電側鎖(例えば、Lys、Arg、AspまたはGluの側鎖)を配置するために用い得る。
【0089】
適切で良好な脱離基Xの例としては、ハロゲン、特にヨウ素および臭素が含まれる。Raa基の例としては、PO4基、COOH基、COO基、CONH2基、グアニジウム基、アミン基、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、イミダゾール基、アルキル化イミダゾール基、インドール基、またはアルキル化インドール基が含まれる。
【0090】
用いるRaaの選択は、特定位置に存在することが望まれるアミノ酸側鎖に依存するであろう。従って、例えば、所望のポリペプチドまたはタンパク質が以下のアミノ酸配列を有している:
aaNH2−Q−aax−aay−W−aaCOOH
式中、QおよびWはそれぞれ、付加的なアミノ酸残基の任意の存在または不在を示し、aaxおよびaayは内部隣接残基を示し(それぞれ、側鎖xおよびyを有する)、aaNH2およびaaCOOHはそれぞれ、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ(N−)末端残基およびカルボキシ(C−)末端残基を示し、以下の2つのペプチドを調製することにより合成される:
aaNH2−Q−aax−COSRおよびCys−W−aaCOOH
式中、Cysはシステインによるaayの置換を示し、Rはチオエステル基と適合する任意の基であり、アリール、ベンジル、およびアルキル基を含むがこれらに限定されない。Rの例としては、3−カルボキシ−4−ニトロフェニルチオエステル、ベンジルエステル、およびメルカプトプロピオン酸ロイシンエステルが含まれる(例えば、Dawson et a/., Science (1994) 266: 776−779; Canne et al. Tetrahedron Lett. (1995) 36:1217−1220; Kent, et al., WO/96/34878号; Kent, et al.,WO98/28434号; Ingenito et al., JACS (1999) 121 (49):11369−11374;およびHackeng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96:10068−10073参照)。他の例としては、ジチオスレイトール、あるいはアルキルまたはアリールチオエステルが含まれ、これらは周知のインテイン仲介生物学的手法により生産できる(例えば、Chong et al., Gene (1997) 192: 277−281; Chong et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26:5109−5115; Evans et a/., Protein Science (1998) 7:2256−2264;およびCotton et al., Chemistry & Biology (1999) 6 (9): 247−256参照);次いで、両フラグメントを結合し、aaNH2−Q−aax−Cys−W−aaCOOH
を形成する。
【0091】
次に、結合されたフラグメントはRy−Xと反応させられ、ここでRyはy側鎖の構造を模倣する側鎖である。この反応は、システインのチオール基を「擬似y」側鎖に変換するのに十分な条件下で実施される。例えば、もしRaaがCH2−COOHまたは(CH2)2−COOHとなるように選択されれば、反応は、アスパラギン酸(「擬似−Asp」)またはグルタミン酸(「擬似−Glu」)の構造と機能を模倣するアミノ酸残基の形成に至るであろう。理解されるように、上記の記載に鑑みて、より複雑な合成が、3つ以上のペプチドフラグメントを用いて実施できる。
【0092】
この方法の重要な特徴は、反応しているセグメント中で修飾したくないシステイン残基が、ライゲーション部位におけるもの以外のCys残基の化学的修飾を防ぐため、例えばCys(Acm)のように側鎖保護されること、あるいは反応しているセグメント中の他のどのCys残基も、ライゲーション後に化学的修飾反応による同一の「擬似アミノ酸」の同時形成を意図されるということである。
【0093】
本明細書中で使われているように、記号φはベンジル基を示し、IMはイミダゾール基を示し、INはインドール基を示し、PGは保護基を示す。以下は、本発明に従って擬似アミノ酸残基を含むペプチドを合成するために用い得るRaa側鎖の概要であり、式中Xはハロゲン(I、Br、Cl、F)であり、たいていの場合はBrおよびClが好ましく、Fはφ付着について好ましい。
塩基性アミノ酸:
Lys(余分な原子無し)
−CH2−SH + X−CH2−CH2−NH−PG、続いて脱保護することにより、−CH2−S−CH2−CH2−NH2が得られる。
Arg(余分な原子無し)
−CH2−SH + X−CH2−NH−C((NH2)(=NH2+))により
−CH2−S−CH2−NH−C((NH2)(=NH2 +))が得られる。
His(余分な原子2個)
−CH2−SH + X−CH2−IMにより−CH2−S−CH2−IMが得られる。
酸性アミノ酸:
Asp(余分な原子2個)
−CH2−SH + X−CH2−COOHにより−CH2−S−CH2−COOHが得られる。
Glu(余分な原子1個)
−CH2−SH + X−CH2−COOHにより−CH2−S−CH2−COOHが得られる。
非荷電極性アミノ酸:
Tyr(余分な原子無しまたは1個)
−CH2−SH + F−φ−pOHにより−CH2−S−φ−pOHが得られる(余分な原子無し、同じ幾何配置)。
−CH2−SH + Br/I−CH2−φ−pOHにより−CH2−S−CH2−φ−pOHが得られる(余分な原子1個)。
Gln(余分な原子1個)
−CH2−SH + X−CH2−C(O)(NH2)により−CH2−S−CH2−C(O)(NH2)が得られる。
Asn(余分な原子2個)
−CH2−SH + X−CH2−C(O)(NH2)により−CH2−S−CH2−C(O)(NH2)が得られる。
Ser(余分な原子2ないし3個)
−CH2−SH + X−CH2OHにより−CH2−S−CH2OHが得られる(余分な原子2個)
−CH2−SH+X−CH2−CH2OHにより−CH2−S−CH2−CH2OHが得られる(余分な原子3個)。
Thr(余分な原子2ないし3個、β分岐が無い)
−CH2−SH + X−CH((CH3)(O−PG))に続いてPGを除去することにより−CH2−S−CH((CH3)(OH))が得られる(余分な原子2個)。
−CH2−SH + X−CH2−CH((CH3)(O−PG))に続いてPGを除去することにより−CH2−S−CH2−CH((CH3)(OH))が得られる(余分な原子3個)。
非極性アミノ酸:
Leu(余分な原子1ないし2個)
−CH2−SH + X−CH((CH3)(CH3))により−CH2−S−CH((CH3)(CH3))が得られる(余分な原子1個)。
−CH2−SH + X−CH2−((CH3)(CH3))により−CH2−S−CH2−CH((CH3)(CH3))が得られる(余分な原子2個)。
Ile(余分な原子2ないし3個、β分岐無し)
−CH2−SH + X−CH(CH3)−CH2−CH3により−CH2−S−CH(CH3)−CH2−CH3が得られる(余分な原子2個)。
−CH2−SH + X−CH2−CH(CH3)−CH2−CH3により−CH2−S−CH2−CH(CH3)−CH2−CH3が得られる(余分な原子3個)。
Phe(余分な原子1ないし2個)
−CH2−SH + F−φにより−CH2−S−φが得られる(余分な原子1個)。
−CH2−SH + Br/I−CH2−φにより−CH2−S−CH2−φが得られる(余分な原子2個)。
Met(余分な原子無し)
−CH2−SH + I−CH2−CH3により−CH2−SH−CH2−CH3が得られる。
Trp(余分な原子1個)
−CH2−SH + F−INにより−CH2−S−INが得られる。
【0094】
しかしながら、ライゲーションに用いられるポリペプチドの所与のN末端にシステインまたはホモシステイン残基を導入するために、あるいはライゲーション部位において擬似アミノ酸を利用するために、タンパク質配列を修飾することが不便または望ましくない場合には、天然型化学的ライゲーションの方法は、N末端がN置換、好ましくはNα置換された2つないし3つの炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールを含むように修飾され、その結果天然型化学的ライゲーションの原理をシステイン残基を欠くポリペプチドと共に用いることを可能にするように拡張できる(米国特許出願番号第60/231,339号参照。参照により本明細書に組み込まれる)。
【0095】
「拡張天然型化学的ライゲーション」の方法は、カルボキシルチオエステル、より好ましくはα−カルボキシルチオエステルを含む第1の成分を、酸安定N置換、好ましくはNα置換された2つないし3つの炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールを含む第2の成分と結合させることを伴う。第1の成分のカルボキシチオエステルと、第2の成分のN置換された2つないし3つの炭素鎖アルキルまたはアリールチオールのチオールと間の化学選択的反応は、チオエステル結合された中間体を介して進み、初期のライゲーション産物に分解する。より具体的には、COSRチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間で生じるチオール交換により、チオエステル結合中間体ライゲーション産物が生成し、これは自発的再配列後に、アミノアルキルチオール成分が以下の式IまたはIIを有しているかによって、それぞれ5員環または6員環の中間体を介してアミド結合された第1のライゲーション産物を生成する。
式中、J1は、1つ以上の任意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドまたはポリペプチド、あるいはそのようなペプチドまたはポリペプチドの部分、ポリマー、色素、適切に官能化された表面、リンカーないし検出可能マーカー、または化学的ペプチド合成ないし拡張天然型化学的ライゲーションと両立できる任意の他の化学的部分であり、R1、R2およびR3は、独立的に、C1に結合されたHまたは電子供与基であり、ただし、R1、RおよびR3の少なくとも1つが、C1に結合された電子供与基を含み、さらに、J2は、1つ以上の任意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドまたはポリペプチド、あるいはそのようなペプチドまたはポリペプチドの部分、ポリマー、色素、適切に官能化された表面、リンカーないし検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成ないし拡張天然型化学的ライゲーションと両立できる任意の他の化学的部分である。
【0096】
ライゲーション部位における、N置換された2つないし3つの炭素鎖アルキルまたはアリールチオール[HS−C2−C1(R1)−]もしくは[HS−(C3(R3)−C2(R2)−C1(R1)−]は、ペプチド適合条件下で、生成物への損傷なく、除去することができ、その結果、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する、式IIIの最終的なライゲーション産物を生成できる。
式中、J1、J2、R1、R2およびR3は、上記で定義された通りである。
【0097】
R1、R2およびR3基は、ペプチド適合切断条件下でN−C1結合の切断を容易にするように選択される。例えば、電子供与基は、特にC1にコンジュゲートされると、切断を容易にするC1における共鳴安定化カチオンを形成するために用い得る。化学的ライゲーション反応は、好ましくは、賦形剤としてチオール触媒を含み、水性または混合有機−水性条件で中性pH近傍の条件で実行される。第1および第2の成分の化学的ライゲーションは、自発的再配列が生じる5〜6員環を経て進み、N置換アミド結合ライゲーション産物を作り出す。第1および第2の成分がペプチドまたはポリペプチドである場合、N置換アミド結合ライゲーション産物は式IVまたはVを有する:
式中、J1、J2およびR1、R2、R3およびZ2は、上記で定義された通りである。
【0098】
N置換アミド結合ライゲーション産物のコンジュゲートされた電子供与基R1、R2またはR3は、N−C1結合の切断およびN置換アミド結合ライゲーション産物からの2ないし3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの除去を容易にする。ペプチド適合性切断条件下でのNのアルキルまたはアリールチオール鎖の除去は、ライゲーション部位での天然アミド結合を有するライゲーション産物を生成する。第1および第2の成分がペプチドまたはポリペプチドである場合、ライゲーション産物は以下の式を有する:
式Iについての代表的なR1置換基を表Iに示す。
表I
【表1】
式IIについての代表的なR1、R2およにR3置換基を表IIに示す。
表II
【表2】
【0099】
N置換された2炭素鎖化合物の場合と同様、ライゲーションの後のNα−C1結合の強い切断に対応してC1炭素への電子コンジュゲーションを維持するためには、オルトまたはパラ位置におけるベンジルおよびピコリル電子供与置換基R1’、R3’およびR5’のポジショニングが必要である。しかしながら、R2およびR3がC2およびC3と共にベンジル基を形成する場合、R1’およびR3’の少なくとも1つは、強力な電子供与基を含み、そこではR1’またはR3’は、メトキシ基(−OCH3)、チオール基(−SH)、ヒドロキシル基(−OH)、およびチオメチル基(−SCH3)から選択される。R2およびR3が水素であるN置換された3炭素鎖チオールについては、R1はベンジルまたはピコリル基を含み、そこではR1’、R3’およびR5’は強いまたは中程度の電子供与基、あるいはそれらの組み合わせを含む。N置換された2炭素鎖アルキルまたはアリールチオールと同様、強い電子供与基は、ライゲーションに続く切断に対する3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの感受性を高める。従って、特定の電子供与基またはそれらの組み合わせがそれに応じて選ばれ得る。
【0100】
N置換された2炭素鎖化合物の場合と同様、本発明のN置換された3炭素鎖化合物は、対象となる構成物における置換に利用可能な場合にR1’およびR5’位置におけるR1の置換基としてのチオールを含み得る。ここで再び、電子供与チオール基はC1にコンジュゲートされ、これらの位置で導入されることにより、これらの化合物が6員環形成ライゲーションの際の2つの経路を持つことが可能になる。それは、α−カルボキシチオエステルと反応するための利用可能なチオールの局所濃度も増大させ、ライゲーションを改善できる構造的制約という意味で更なるコンホメーションを提供する。
【0101】
本発明のN末端N置換の2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸の合成は、本明細書中で、例えば、スキームIおよびスキームIIにおいて説明されたように、技術的に周知の標準的有機化学手法に従って実行し得る。例えば、”Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms, and Structure,” 4th Edition, J. March (Ed.), John Wiley & Sons, New York, NY, 1992; ”Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group Preparations,” R. Larock (Ed.), VCH Publishers, New York, NY, 1989を参照のこと。それらは、溶液中で、ポリマー坦持合成、またはその組み合わせにより合成できる。好ましい方法では、Nα保護Nアルキル化S保護アミノアルキル−またはアリール−チオールアミノ酸前駆体が用いられる。合成に利用される試薬は、どのような数の商業的ソースからでも入手できる。また、個々のアミノ酸誘導体のような、出発成分および種々の中間体が、キット等で供給されており、後に使用するために保存できることが理解されるであろう。
【0102】
本発明のN末端Nα置換2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸の調製においては、保護基戦略が用いられる。種々の合成戦略において一般に利用される好ましい保護基(PG)は、固相ペプチド合成(「SPPS」)と両立できる。いくつかの例では、種々の条件下で除去可能な直交保護基を利用することも必要である。多くのそのような保護基は周知であり、この目的に適している(例えば、”Protecting Groups in Organic Synthesis”, 3rd Edition, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; ”Synthetic Peptides, A User’s Guide,” G. A. Grant, Ed., W. H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; ”Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry,” W. D.. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes, and H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; ”Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky, Ed., Springer−Verlag, 1993; ”The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer−Verlag, 1994;および”Protecting Groups,” P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994参照)。例としては、ベンジルオキシカルボニル(Z)、Boc、Bpoc、Trt、Nps、FmocCl−Z、Br−Z;NSC;MSC、Dde等が含まれる。硫黄部分については、適切な保護基の例としては、ベンジル、4−メチルベンジル、4−メトキシベンジル、トリチル、ACM、TACAM、キサンチル、ジスルフィド誘導体、ピコリル、およびフェナシルが含まれるがこれらに限定されない。
【0103】
より具体的には、Nα置換された2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、スキームI(Nα置換された前駆体の固相調製)、スキームII(Nα置換された前駆体の液相調製)により調製される。スキームIにおいて、Nα置換された2または3炭素鎖アルキル基またはアリールチオールは、ポリマー坦持有機合成の標準的方法を使って固相上で直接的に組み立てられ、それに対してスキームIIのNα保護、Nアルキル化、S保護、アミノアルキルまたはアリールチオールアミノ酸前駆体は、標準的なカップリングプロトコルを使って樹脂にカップリングされる。ラセミまたはジアステレオマー生成物が生産される場合、拡張天然型化学的ライゲーションにおける使用前にこれらを標準的な方法で分離することが必要なことがある。
スキームI
【化2】
スキームII
【化3】
【0104】
α−カルボキシチオエステルは、実施例を含み本明細書中に記載されているような、技術的に周知の標準的な化学的または生物学的方法に従って生成できる。化学合成については、α−カルボキシチオエステルペプチドは、溶液中またはチオエステル生成樹脂から合成でき、これらの手法は周知である(例えば、Dawson et al., Science (1994) 266:776−779; Canne et al. Tetrahedron Lett. (1995) 36:1217−1220; Kent, et al.,WO96/34878号; Kent, et al.,WO98/28434号; Ingenito et al., JACS (1999) 121(49):11369−11374;およびHackeng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96:10068−10073); 上記Amiato et al.参照)。例えば、化学的に合成されたチオエステルペプチドは、対応するペプチドα−チオ酸から作ることができ、これが今度は、樹脂法が好まれるけれども、チオエステル−樹脂上または溶液中で合成できる。ペプチド−α−チオ酸は、対応する3−カルボキシ−4−ニトロフェニルチオエステル、対応するベンジルエステル、あるいは各種のアルキルチオエステルのいずれかに変換できる。これらのチオエステルはすべて、ライゲーション反応用に満足すべき残留基を提供し、3−カルボキシ−4−ニトロフェニルチオエステルは、対応するベンジルチオエステルよりも若干速い反応速度を示し、これが今度はアルキルチオエステルよりもより反応性になり得る。別の例としては、トリチル関連メルカプトプロピオン酸ロイシンチオエステル生成樹脂を、C末端チオエステルの構成に利用できる(上記Hackeng et al.)。C末端チオエステル合成も、3−カルボキシプロパンスルホンアミド安全キャッチリンカーを用い、ジアゾメタンまたはヨードアセトニトリルで活性化し続いて適切なチオールで置換することにより達成できる(上記Ingenito et al.; Bertozzi et al.)。
【0105】
C末端α−カルボキシチオエステルペプチドも、インテイン仲介生物学的手法のような生物学的プロセスを用いて作ることができる(例えば、Chong et al., Gene (1997) 192:277−281; Chong et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26:5109−5115; Evans et al., Protein Science (1998) 7:2256−2264;およびCotton et al., Chemistry & Biology (1999) 6 (9):247−256参照)。例えば、インテイン発現系は、アフィニティタグのようなラベルのあるまたはなしに、「インテイン」タンパク質スプライシング要素の誘導可能性自己切断活性を利用してC末端ジチオスレイトール(DTT)エステルのペプチドまたはポリペプチドセグメントを生成するために利用できる。特に、インテインは、DTT、b−メルカプトエタノールまたはシステインのようなチオールの存在下で特定の自己切断を受け、これにより、C末端チオエステルを持つペプチドセグメントが生成される。例えば、上記のChong et al.,(1997)、上記のChong et al., (1998)、上記のEvans et al.、および上記のCotton et al.参照。しかしながら、組換えにより生産されたセグメントを用いる場合、最終構成物の化学的に合成された部分は、含まれる場合には、一般にポリマー修飾を含む。
【0106】
本発明のN置換された2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオール成分と第1のカルボキシチオエステル成分とのライゲーションにより、ライゲーション部位にN置換アミド結合を有するライゲーション産物が生成する。反応のライゲーション条件は、N置換された2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオール部分でチオエステルの選択的反応性を維持するように選ばれる。好ましい実施形態において、ライゲーション反応は、pH6〜8、好ましくはpH6.5〜7.5の範囲を有するバッファー中で実行される。バッファー溶液は、水性、有機、またはそれらの混合物とすることができる。ライゲーション反応は、1つ以上の触媒および/または1つ以上の還元剤、脂質、界面活性剤、その他の変性剤または可溶化試薬等も含み得る。好ましい触媒の例は、チオフェノール、ベンジルメルカプタン、TCEPおよびアルキルホスフィンのようなチオールおよびホスフィン含有部分である。変性および/または可溶化剤の例としては、グアニジウム、尿素の水またはTFE、HFIP、DMF、NMPのような有機溶媒溶液、水とアセトニトリルの混合物、および尿素の水溶液が含まれる。ライゲーション反応の速度を調節するために温度も用いることができ、温度は通常5℃〜55℃であり、好ましい温度は15℃〜40℃である。一例として、ライゲーション反応は、pH6.8〜7.8で6Mグアニジウム中の2%チオフェノールを有する反応系中で良好に進行する。
【0107】
N置換された2炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの場合は、ライゲーションイベントは、COSRチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間で生じるチオール交換に起因する。この交換により、チオエステル連結中間ライゲーション産物が生成され、これは5員環中間体を経て自発的再配列の後に、除去可能なN置換された2炭素鎖アルキルまたはアリールチオール[HS−C2−C1(R1)−]をライゲーション部位に有する式J1−HN−CH(Z1)−C(O)−Nα(C1(R1)−C2−SH)−CH(Z2)−J2のライゲーション産物が生成され、そこでは置換基は上記で定義された通りである。ライゲーション部位におけるN置換された2炭素鎖アルキルまたはアリールチオール[HS−C2−C1(R1)−]は、ペプチド適合条件下で除去されて、ライゲーション部位で天然アミド結合を有する式J1−HN−CH(Z1)−C(O)−NH−CH(Z2)−CO−J2の最終ライゲーション産物を生成できる。
【0108】
N置換された3炭素鎖アリールまたはアルキルチオールの場合は、COSRチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間のチオール交換により、チオエステル連結中間ライゲーション産物が生成され、これは6員環中間体を介しての自発的再配列の後に、除去可能なN置換された3炭素鎖アルキルまたはアリールチオール[HS−C3(R3)−C2(R2)−C1(R1)−]をライゲーション部位に有する式J1−HN−CH(Z1)−C(O)−Nα(C1−C2(R2)−C3(R3)−SH)−CH(Z2)−J2の第一のライゲーション産物が生成される。ライゲーション部位におけるN置換された3炭素鎖アリールチオール[HS−C3(R3)−C2(R2)−C1(R1)−]は、ペプチド適合条件下で除去されて、ライゲーション部位で天然アミド結合を有する式J1−HN−CH(Z1)−CO−NH−CH(Z2)−CO−J2の最終のライゲーション産物を生成できる。
【0109】
N置換されたアルキルまたはアリールチオール基の除去は、N−C1結合の切断を容易にするため、好ましくは酸性条件で実行され、安定化された未置換のアミド結合がライゲーション部位で作り出される。「ペプチド適合切断条件」は、ペプチドと両立できかつライゲーション産物からのアルキルまたはアリールチオール部分の切断に適した物理化学的条件を意味する。一般にペプチド適合切断条件は、用いられるα−置換化合物に応じて選択され、これは日常的かつ周知の方法により用意に推論できる(例えば、”Protecting Groups in Organic Synthesis”, 3rd Edition, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; ”Synthetic Peptides, A User’s Guide,” G. A. Grant, Ed., W. H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; ”Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry,” W. D.. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes, and H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998 ;”Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.,”M. Bodanszky, Ed., Springer−Verlag, 1993; ”The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer−Verlag, 1994;および”Protecting Groups,” P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994参照)。
【0110】
例えば、R1、R2またはR3置換基がメトキシ、ヒドロキシル、チオールまたはチオメチル、メチル等を含む場合、より一般的な除去方法は、ペプチド合成化学に典型的な酸性の切断条件を伴う。これには、強い酸性条件下または水−酸性条件下で、還元剤および/またはスカベンジャー系(例えば、無水フッ化水素(HF)、トリフルオロ酢酸(TFA)、またはトリメチルスルホニルフルオロ酢酸(TMSFA)等の酸)が有りまたは無しでのN−C1結合の切断が含まれる。より具体的な酸性切断系は、所定の構成物についてアリールまたはアルキルチオール部分を除去するためにNα−C1結合の切断を最適化するように選ばれ得る。そのような条件は周知であり、ペプチドの完全性の維持と両立できる。特に、ペプチドまたはポリペプチド配列中にトリプトファンが存在する場合、トリプトファン側鎖と遊離アリールまたはアルキルチオール部分との反応を回避するため、チオールスカベンジャーを含ませ得る。チオールスカベンジャーの例として、エタンジオール、システイン、β−メルカプトエタノールおよびチオクレゾールが含まれる。
【0111】
他の特殊化された切断条件としては、ピコリル基が置換基である場合の光または還元的切断条件が含まれる。一例として、R1、またはR2およびR3置換基がピコリル部分を含む場合、光分解(例えば、紫外光)、亜鉛/酢酸または電解還元を、標準プロトコルに従って切断用に用い得る。N置換された2炭素鎖チオールのR1がR1にチオメタンを含む場合、水銀またはHF切断が用い得る。この切断システムは、第1または第2のライゲーション成分が他の保護基を含む場合に、固体支持体から同時切断用におよび/または脱保護試薬としても用い得る。
【0112】
本発明の1つの実施形態において、Nα−置換2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、合成赤血球産生刺激タンパク質を産生するために拡張化学的ライゲーション用の基質として用い得る適切にN末端誘導体化されたポリペプチドを産生するために、ペプチド合成ステップ(特に、自動化ペプチド合成、ならびに直交および収束的ライゲーション戦略)中で用いられる。そのような化合物は、完全に保護された、部分的に保護されたまたは完全に未保護の酸安定性Nα−置換2または3炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールを含み、これらは式が(PG1)S−C2−C1(R1)−Nα(PG2)−CH(Z2)−C(O)−J2または(PG1)S−C3(R3)−C2(R2)−C1(R1)−Nα(PG2)−CH(Z2)−C(O)−J2であり、以下で表IIIおよび表IVに図示してある。特に、R1、R2およびR3の内の2つ以上は、C1にコンジュゲートされた電子供与基を含み、これは、Nα−置換アミノアルキルまたはアリールチオールのNα−置換アミドアルキルまたはアリールチオールへの変換に続いて、ペプチド適合性切断条件下でNα−C1結合の切断を容易にするC1における共鳴安定化カチオンを形成できるものである。PG1およびPG2は、個別にまたは組み合わせて存在しまたは存在せず、または同じまたは異なる保護基であり、そこではZ2は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションと適合性がある任意の化学的部分であり、J2は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションと適合性がある任意の化学的部分である。PG1(またはX1)は、アミンを保護するための基である。PG2(またはX2)は、チオールを保護するための基である。多くのそのような保護基は周知であり、この目的に適している(例えば、”Protecting Groups in Organic Synthesis”, 3rd Edition, T. W. Greene and P.G.M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; ”Synthetic Peptides, A User’s Guide,” G.A. Grant, Ed., W.H, Freeman & Company, New York, NY, 1992; ”Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry,” W.D.. Bennet, J.W. Christensen, L.K. Hamaker, M.L. Peterson, M.R. Rhodes, and H.H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; ”Pricipies of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky, Ed., Springer−Verlag, 1993; ”The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer−Verlag, 1994; and ”Protecting Groups,” P.J. Kocienski, Ed., Georg ThiemeVerlag, Stuttgart, Germany, 1994)。
表III
【表3】
【0113】
PG1およびX1として好ましい保護基の例としては、[Boc(t−ブチルカルバメート)、Troc(2,2,2,−トリクロロエチルカルバメート)、Fmoc(9−フルオレニルメチルカルバメート)、Br−ZまたはCl−Z(Br−またはCl−ベンジルカルバメート)、Dde(4,4,−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキシル−イリデン)、MsZ(4−メチルスルフィニルベンジル−カルバメート)、Msc(2−メチルスルホエチルカルバメート)、Nsc(4−ニトロフェニルエチルスルホニル−エチルオキシカルボニル)が含まれるがこれらに限定されない。好ましいPG1およびX1保護基は、”Protective Groups in Organic Synthesis,”Green and Wuts, Third Edition, Wiley−lnterscience, (1999)から選ばれ、最も好ましいものはFmocおよびNscである。PG2として好ましい保護基の例としては、[Acm(アセトアミドメチル)、MeoBzlまたはMob(p−メトキシベンジル)、Meb(p−メチルベンジル)、Trt(トリチル)、Xan(キサンテニル)、tButhio(s−t−ブチル)、Mmt(p−メトキシトリチル)、2または4ピコリル(2または4ピリヂル))、Fm(9−フルオレニルメチル)、tbut(t−ブチル)、Tacam(トリメチルアセトアミドメチル)]が含まれるが、これらに限定されない。好ましい保護基PG2およびX2は、”Protective Groups in Organic Synthesis,”Green and Wuts, Third Edition, Wiley−lnterscience, (1999)から選ばれ、最も好ましいものはAcm、Mob、MeB、ピコリルである。表IV
【表4】
【0114】
本発明のNα−置換された2または3鎖アルキルまたはアリールチオールは、上記のスキームIおよ11におけるように調製し得る。
【0115】
本発明の化合物は、ハロゲン仲介アミノアルキル化、還元的アミノ化を含む各種の手段のいずれによっても、および固相アミノ酸合成方法と適合するNα−保護された、N−アルキル化された、S−保護された、アミノアルキル−およびアリール−チオールアミノ酸前駆体の調製により生産できる。必要な場合には、許容できるキラル純度の化合物を得るために産生されたラセミ化合物またはジアステレオマーの分割を標準的方法により実行できる。
【0116】
III.本発明の好ましい水溶性ポリマーの合成および製造
本明細書中で使われているように、「分子不均一性」は、タンパク質製剤の個々のタンパク質に付着させられたポリマー分子の数における変動を意味することを意図している。用語「分子多様性」は、(a)ポリマーにより修飾されるタンパク質の部位における変動、(b)同じタンパク質の異なる部位の、またはタンパク質製剤の異なるタンパク質の同じ部位のポリマー付加物の長さの変動、または(c)同じタンパク質の異なる部位の、またはタンパク質製剤の異なるタンパク質の同じ部位のポリマー付加物の任意の分岐の程度および/または性質の変動を意味することを意図している。本明細書中で使われているように、「分子的に均質」は、すべてのタンパク質分子がアミノ酸配列および同じ位置に同じポリマー修飾を含んでいるタンパク質製剤を意味することを意図している。2つ以上の「分子的に均質」なタンパク質製剤混合物は、本明細書中では、「分子的に定義された」製剤と呼ばれる。
【0117】
本発明のこの観点に従って、上記で特定したポリマー不均一性、多様性、および不適性の問題に対する解決策は、ポリペプチドの利点(正確な長さ、便利な合成)と「pPEG」(「精密PEG」の利点(可撓性両親媒性、非免疫原性で、プロテアーゼの影響を受けないポリマー))Rose, K. et al.(米国特許出願番号第09/379,297号、参照により本明細書に組み込まれる)の両方を組み合わせる新規な種類の生体適合性ポリマーの製造を伴う。この新規な種類の生体適合性ポリマーは、以下の式を有する:
−[CO−X−CO−NH−Y−NH]n−
nは整数であり、好ましくは1〜100、より好ましくは2〜100であり、XおよびYは、アミド結合により連結された正確な構造の生体適合性の反復要素である。XおよびYは、好ましくは、反応官能基を欠いているか存在しない2価の有機ラジカルであり、さらに同じまたは異なっており、各反復単位(n)と共に独立して変わり得る。好ましくは、n=2の場合には、XまたはYの少なくとも一方は、置換、未置換、分岐および直鎖状脂肪族ならびに芳香族基からなる群から選ばれる。より好ましくは、XまたはYの一方は、フェニル、C1−C10アルキレン部分、C1−C10アルキル基、ヘテロ原子含有フェニル、ヘテロ原子含有C1−C10アルキレン部分、ヘテロ原子含有C1−C10アルキル基、それらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0118】
特に、好ましいpPEG部分は以下の式を有する:
−{CO−(CH2)2−CO−NH−(CH2)3−(OCH2CH2)3−CH2−NH}n−
(式中、nは、好ましくは1〜100、より好ましくは2〜100)、または
−{CO−(CH2)2−CO−NH−(CH2)6−NH−CO−(CH2)2−CO−NH−(CH2)3−(OCH2CH2)3−CH2−NH}n−
(式中、nは、好ましくは1〜50、より好ましくは2〜50で変化する。)
【0119】
そのようなpPEG部分は、各種の方法のいずれによっても合成できる。しかしながら、そのような部分は好ましくは、重合プロセスというよりむしろ単位の固相段階的の組上げを用いて生成される。そのような組上げプロセスを用いることにより、製剤の部分が、それらの長さ、それらのXおよびY置換基の性質、(もしあれば)分岐点の位置、ならびに任意の分岐の長さ、Xおよび置換基、および位置に関して定義された均質な構造を有することが可能になる。
【0120】
好ましくは、そのような部分は以下のようなステップによって合成される:
(a)式Z−Q−支持体の化合物のアミノまたはヒドロキシル基を、式HOOC−X−COOHを有するモル過剰の二酸誘導体でアシル化するステップ(式中、ZはH2N−またはHO−、Qはリンカーまたは標的分子、支持体は固相のマトリクスまたは表面)、
(b)ステップ(a)の産物の遊離カルボキシル基を活性化するステップ、
(c)ステップ(b)の産物を、式NH2−Y−NH2を有するモル過剰のジアミンでアミノ分解するステップ、さらに
(d)HOOC−X−COOHおよびNH2−Y−NH2を用いてステップ(a)〜(c)を任意に反復するステップで、前記XおよびYは、2価の有機ラジカルであるか存在せず、さらに同じかまたは異なっており、前記任意に反復される単位と共に独立して変わることができ、前記のアシル化およびアミノ分解ステップのいずれかで用いられるXおよびY置換基と同じまたは異なる。
【0121】
好ましい実施形態において、上記反復単位の6−マー、12−マー、18−マーおよび32マーが用いられる。必要な場合には、反復単位は、例えば、リジンのアミノ基と共に用いて分岐pPEG構造を形成できる。pPEGは、チオエーテル、オキシムおよびアミド結合形成を含む各種の化学によって、本発明の合成タンパク質に付着させ得る。
【0122】
1つの実施形態においては、単位の固相段階的鎖集合は以下のステップを含む:
ステップ1:保護または未保護二酸を樹脂上のアミノにカップリングして結合部位にアミド結合を生成する(PGは、用いる二酸に応じて存在するかまたは存在しない保護基):
PG−OOC−X−COOH + NH2−Y−NH−樹脂
【0123】
ステップ2:もし存在するのであれば、樹脂上の保護基(PG)を除去する
HOOC−X−CO−NH−Y−NH−樹脂
【0124】
ステップ3:保護または未保護のジアミノを樹脂上のカルボキシにカップリングして結合部位にアミド結合を生成する(PGは、用いるジアミノに応じて存在するかまたは存在しない)
PG−NH−Y−NH + HOOC−X−CO−NH−Y−NH−樹脂
【0125】
ステップ4:もし存在するのであれば、樹脂上の保護基(PG)を除去する
−NH−Y−NH−OC−X−CO−NH−Y−NH−樹脂
【0126】
ステップ5:ステップ1〜4を「n」回反復して「n」個の単位を付加し、次いで樹脂から切断する
−[CO−X−CO−NH−Y−NH]−[CO−X−CO−NH−Y−NH]
−[CO−X−CO−NH−Y−NH]−[CO−X−CO−NH−Y−NH]
−
【0127】
論じたように、直鎖状および分岐状pPEG構成物は、本発明の合成赤血球産生刺激分子への付着について好ましい水溶性ポリマーである。用いられるpPEGは、生理学的条件下での中性または帯電したペンダント基を持ち、さらに用いるpPEGに応じて付着化学、長さ、分岐および溶解性を変えることができる。上で言及したように、本発明の好ましいpPEGは、反復単位−CO−X−CO−NH−Y−NH−を有する水溶性ポリアミドを含み、XおよびYの一方または両方は、水溶性反復単位、最も好ましくは「PEG」ベースの反復単位を含む。オリゴ尿素は原則として、アミノ樹脂NH2−樹脂、および対称的ジアミンNH2−Y−NH2のケースについて以下に示すような単純な2段階の固相手順を用いて入手できる。
【0128】
カルボニルジイミダゾールによる活性化→im−CO−NH−樹脂
ジアミンNH2−Y−NH2によるアミノ分解→NH2−Y−NH−CO−NH−樹脂
これら2つのステップを多数回繰り返して、−NH−Y−NH−CO−反復単位を有するオリゴ尿素を得ることができるが、この方法はあまり好まれない。これは、上記のステップの収率が、非常に大過剰の試薬と長い反応時間であってさえも、室温で非定量的なことがあるからである。従って、ポリアミドを形成するために、アミノ樹脂NH2−樹脂のケースについて下記に示される3ステップ固相手順を用いることがより好ましい。異性体産物を回避するため、試薬HO2C−X−CO2HおよびNH2−Y−NH2は対称的とすべきである。
【0129】
二酸HO2C−X−CO2Hを用いたアシル化→HO−CO−X−CO−NH−樹脂
カルボニルジイミダゾールを用いた活性化→im−CO−OCO−X−CO−NH−樹脂
ジアミンNH2−Y−NH2を用いたアミノ分解→NH2−Y−NH−CO−X−CO−NH−樹脂
これらの3つのステップは、反復単位−NH−Y−NH−CO−X−CO−を有するポリイミドを得るため、順次多数回繰り返すことができる。ポリマーは正確な数のモノマー単位を含み、XおよびYは各ステップにおいて独立的に変えることができ、末端基は自由に選ばれ得る。例えば、アシル化ステップに無水コハク酸(「Succ」)を用い、アミノ分解ステップに4,7,10−トリオキサ−1,13−トリデカンジアミン(「EDA」または「TTD」とも呼ばれる)を用いることにより、「PEG」ベースのポリアミドが形成され、そこではXは−CH2CH2−、Yは−NH−CH2CH2CH2−(OCH2CH2)3−CH2−NH−であり、反復単位は−NH−CH2CH2CH2−(OCH2CH2)3−CH2−NH−COCH2CH2CO−である。この手順が保護基の無い2価の試薬を伴うという事実にかかわらず、標準的な市販のペプチド合成樹脂を用いる場合には、分岐構成物を作るために分岐Lys核のケースについて以下で言及されることを除き、架橋は問題ではない(Rose et al.,(米国特許出願番号第09/379,297号)およびRose et al., J. Am. Chem. Soc. (1999)121:7034)。
【0130】
例えば、分岐pPEG構成物は、Rose et al.,(米国特許出願番号第09/379,297号)、Rose, K.およびVizzavona, J. (J. Am. Chem. Soc. (1999) 121:7034)に記載される「ケモボディー」構成物についてと同様にして作り得る。分岐pPEG構成物は、リジン分岐核のような分岐核を持つようにすることができ、これはオキシムリンカーを介して、−(COCH2CH2CO−NH−CH2CH2CH2−(OCH2CH2)3−CH2−NH)n−のような好ましい水溶性ポリアミドにカップリングされる。例えば、オキシム結合は、ポリアミドの他端におけるLys側鎖上のアミノオキシアセチル基と、リジン核、例えば四量体核(O=CHCO)4Lys2Lys−上のグリオキシリル基との間で容易に形成され得る。従って、各リジン分岐点から切り離されたオキシムリンカーを、−Lys(COCH2ON=CHCO−)アミド−の構造として作ることができる。別の構成では、好ましくはポリアミドのカップリング後に単保護されたジアミンと脱保護を用いて下記の4価の分岐構成物を生成して、ポリアミドとポリアミドの遊離ペンダント基との間にオキシム結合を配置することができる:
[O=CHCO−(NH−CH2CH2CH2−[OCH2CH2]3−CH2−NH−COCH2CH2CO−)n]4Lys2Lys−
【0131】
オキシム化学は、二量体および四量体の分岐構成物を作る際に用い得るだけでなく、八量体分岐構成物の集合にも適している(Rose, K., J. Am. Chem. Soc. (1994) 116: 30; Rose, K. et al., Bioconj. Chem. (1996) 7: 552)。当然、そのようなpPEGポリアミドを用いる場合にそのような目的のために他の化学を使うことが可能である(例えば、図13参照)。さらに、ポリアミド形成は、BocまたはFmoc化学を伴うペプチド合成の合成スキームに組み入れ得るが、そのようなスキームを作り上げる際に、アミノ分解ステップによりFmoc基が除去され、もしBoc化学が使われることになるのであればインドールのホルミル保護が除去されることに留意しなければならない。
【0132】
従って、そのようなpPEGは、好ましい結合(例えば、アミド、チオエーテル、オキシム等)を介して直鎖状水溶性ポリマー(例えば、−(Succ−TTD)n−等)に連結された種々の分岐核(例えば、リジン分岐核等)を持つようにすることができ、そこでは、各直鎖状水溶性ポリマーの自由端は各々所望のペンダント基(例えば、カルボキシレート、アミノ、アミド等)でキャッピングして所望の電荷をもたらすことができる。さらに、本発明の直鎖状および分岐状pPEGは、1つ以上の一意的で相互に反応性の官能基を持つ合成タンパク質への付着に対し一意的な官能基を含むようにすることができ、pPEGのペンダント基は、好ましくは非抗原性である(例えば、図13参照)。
【0133】
特に好ましい実施形態においては、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、以下の式の分子的に均質なグリコ模倣水溶性ポリマーで修飾される:
U−s1−B−s2−ポリマー−s3−J*
式中、Uは一意的な官能基の残基、Bは、同じでも異なってもよくさらに存在しても存在しなくてもよい3つ以上のアームを有する分岐核、「ポリマー」は、式が−[C(O)−X−C(O)−NH−Y−NH]n−または−[NH−Y−NH−C(O)−X−C(O)]n−で、分子量が約5,000Da以上のポリアミドであり、ここでXおよびYは、同じでも異なってもよく、さらに分岐状でも直鎖状でもよい2価ラジカルであり、nは2〜50の整数であり、さらにXおよびYの一方または両方は、直鎖状でも分岐状でもよい実質的に非抗原性の水溶性反復単位を含み、J*は、負、正、および中性からなる群から選ばれ、生理学的条件下で実効電荷を有する実質的に非抗原性ペンダント基であり、s1、s2およびs3は、同じでも異なってもよくさらに個別に存在しても存在しなくてもよいスペーサーまたはリンカー部分である。そのようなポリマーとしては、米国特許出願番号第60/236,377号に記載されるものが含まれ、本明細書にその全体が組み入れられる。式U−s1−B−s2−ポリマー−s3−J*は、式U−B−ポリマー−J*で表すこともでき、ここではスペーサーまたはリンカー基s1、s2、s3は存在していても、していなくてもよい。
【0134】
本発明の好ましいグリコ模倣ポリマーの好ましい形成プロセスは、図5〜図7に示してある。図5A〜図5Bは、分岐核(B)および本発明の水溶性ポリマーU−B−ポリマー−J*の一意的な化学選択性官能基(U)を生成するための固相プロセスを示す。示されるような固相法が好ましいが、このプロセスは溶液中で実行できる。特に、図5Aには、直交的に保護された反応性基
【化4】
を有するU−B前駆体部分が示してあり、そのような構成物の基本的幾何学構造は、結合により連結された点
【化5】
により表され、この基本的幾何学構造は、用いられる化学的結合または基のタイプを限定することを意図するのものでなく、本発明のU−B部分の生成に適した構造および化学的加工ポイントを作るための幾何学の相対的ポイントを単に例示するものである。直交的に保護されたU−B前駆体は、U−B前駆体への共有結合が可能な活性化に続いて、適切な切断可能リンカーおよび共反応性基
【化6】
を含むポリマー支持体/樹脂にカップリングされる:
【化7】
【0135】
この系は、ポリマー支持体された有機化学の原理を使用する。カップリングに続き、分岐核は、例示されるように加工され(第1の分岐点のみが示してあり、付加的な分岐点は存在しても存在しなくていもよい)実質的に非抗原性の水溶性直鎖状ポリマーのような所望のポリマー成分の引き続いての付着に適切な分岐核を生成する。U基も示してあり、これは、合成の最初に、直交的に保護されたU−B前駆体の一部として提供、または分岐核Bの加工の間または後に加工し得る。ポリマー成分の付着がオンレジンで、すなわち切断より前に達成できるのに対して、好ましい経路は、ポリマー成分の引き続いての付着のために精製し得るU−B核を生成するため、ポリマー支持体/樹脂からのU−B部分の切断である。
【0136】
例示されるように、核基Bのペンダント分岐点は官能基(Func)を含むように作られ、これは同じまたは異なるものとすることができ、可逆的に保護(PG、PG’、またはPG’’)または未保護にできる。個々のケースにおいて、ポリマー成分の付着のための最終ステップは、ペンダント分岐点における官能基(Func)の生成、および基Uの生成を伴う(図7参照)。図5Bは代替的プロセスを示し、そこでは保護されたU−B前駆体が、リンカーを持つポリマー支持体と共に用いられ、これは切断と同時に、所望の保護されたまたは未保護のU基を生成する。図5Bには、ポリマー支持体への事前集合された分岐核Bの付着、およびポリマー成分の引き続いての付着のためのU−B部分を作るためにU基生成樹脂の使用も示してある。
【0137】
図6A〜図6Dには、引き続いてのU−B核への付着のための本発明の好ましい実質的に非抗原性の水溶性ポリアミドポリマー−J*成分を生成するための固相プロセスが示してある。固相プロセスが例示されているが、これは好ましいプロセスであって、溶液相プロセスを適合させて同じ最終結果を達成するようにできる。図6Aおよび図6Bにおいては、二酸およびジアミノ単位が、固相有機化学の原理を使ってカップリングされる。任意に、保護されたアミノ−X’−酸および/またはアミノ−Y’−酸単位は、式−[NH−Y−NHCO−X−CO]−のポリアミド構造を有する最終切断産物中の基XおよびYの付加的多様性のために組み入れ得る。図6AはNからC末端方向への合成を示すのに対して、図6BはCからN末端方向への合成を示す。図6Cおよび図6Dにおいては、保護されたアミノ−X’−酸および/またはアミノ−Y’−酸単位が、固相有機化学の原理を使ってカップリングされる。図6CはNからC末端方向への合成を示すのに対して、図6DはCからN末端方向への合成を示す。図6A〜図6Dから明白なように、最終的ポリアミド産物の性質は正確に制御され、これは合成のために実施される多数のサイクルに依存する。さらに、ペンダント基J*は、事実上どのようなユーザー定義仕様にでも作ることができる。単分散反復単位X、Y、X’およびY’が用いられる場合、最終的ポリアミド産物の正確な分子構造が正確に制御できる。
【0138】
式U−Bポリマー−J*の本発明の好ましい合成ポリマー構成物を生成するためにU−B成分をポリマー−J*成分にカップリングするための好ましいプロセスが図7に示してある。例示されているように、種々の保護基を提供でき、それらは、所定の構成物の意図される最終用途に応じて任意である。所望のU−B−ポリマー−J*構成物を産生するための種々の経路も例示されており、固相方法および溶液相方法が含まれる。
【0139】
上記で言及されたように、好ましい水溶性反復単位は、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシド、またはそれらの誘導体を含む。最も好ましい水溶性反復単位は、式−(CH2−CH2−O)―または―(CH2−CH2−O)−のエチレンオキシドを含み得る。そのような水溶性反復単位の数は大きく変わり得るが、そのような単位のより好ましい数は、2〜500、2〜400、2〜300、2〜200、2〜100、2〜50であり、より好ましくは2〜32であり、3〜8が最も好ましい。より好ましい実施形態の例は、XおよびYの一方または両方が、−((CH2)n1−(CH2−CH2−O)n2−(CH2)n1−)−または−((CH2)n1−(O−CH2−CH2)n2−(CH2)n1−)から選ばれ、ここでn1は、1〜6、1〜5、1〜4であり、最も好ましくは1〜3であり、n2は、2〜50、2〜25、2〜15、2〜10、2〜6であり、最も好ましくは2〜5である。非常に好ましい実施形態の例は、Xが−(CH2−CH2)−で、Yが−(CH2−(CH2−CH2−O)3−CH2−CH2−CH2)−または−(CH2−CH2−CH2−(O−CH2−CH2)3−CH2)−である場合である。いっそう好ましくは、個々のnが整数である単分散混合物である。非常に好ましい実施形態においては、Xは−(CH2−CH2)−であり、Yは−(CH2−(CH2−CH2−O)3−CH2−CH2−CH2)n−または−(CH2−CH2−CH2−(O−CH2−CH2)3−CH2)n−であり、nは12〜36である。
【0140】
特に、「ポリマー」は好ましくは、エチレンオキシド反復単位のようなポリアルキレンオキシドを有するポリマー鎖を有する水溶性ポリマーを含み、各鎖の分子量は、約1500〜約42,000Daであり、約2,000〜約20,000Daが最も好ましい。
【0141】
好ましいU基は、化学的ライゲーション可能な部分を含む。好ましいポリマーは、基Bが3本以上のアームを含む場合に分岐する。好ましい成分J*は、生理学的条件下でイオン化可能性な基を、そして最も好ましくは負に帯電する基を含む。UおよびJのいずれかまたは両方は、構成物の完全性を損うことなく除去可能な保護基を含み得る。
【0142】
好ましいスペーサーまたはリンカーは、水溶性ポリマー中に用いられる1つ以上の反復単位、ジアミノおよびまたは二酸単位、天然または非天然アミノ酸もしくはそれらの誘導体を含む直鎖状または分岐状部分、ならびに好ましくは最大で18個の炭素原子さらには付加的ポリマー鎖までも含むアルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アルコキシ等を含む直鎖状または分岐部分を含む。
【0143】
上記で言及したように、成分Uは、ペプチド、ポリペプチド、または関心のある他の表面のような標的分子に付着できる可能性があるか、または付着されている官能基の残基である。Uが標的分子へのコンジュゲーションのための官能基の残基である場合、Uは求核基または求電子基を含み、標的分子は、相互に反応性の求電子基または求核基をそれぞれ含む。
【0144】
そのような相互に反応性の多くの官能基は周知であり、ペプチドおよびポリペプチドに共通の側鎖官能基への付着が可能である(Zalipsky et al., Bioconjugate Chemistry (1995) 6:150−165; ”Perspectives in Bioconjugate Chemistry”, C.F. Meares, Ed., ACS, 1993; ”Chemistry of Protein Conjugation and Cross−Linking”, S.S. Wong, Ed., CRC Press, Inc.(1993))。官能基の例としては、(a)p−ニトロフェニル、またはスクシンイミジルのようなカーボネート、(b)カルボニルイミダゾール、(c)アズラクトン、(d)環状イミドチオン、さらに(e)イソシアネートまたはイソチオシアネートのようなアミノ基と反応可能な基が含まれる。カルボン酸基および反応性カルボニル基と反応可能な官能基の例としては、(a)第1アミン、または(b)ヒドラジンおよびアシルヒドラジド、カルバゼート、セミカルバメート、チオカルバゼート、アミノオキシ等のヒドラジドが含まれる。メルカプトまたはスルフヒドリル基と反応可能な官能基としては、フェニルグリオキサール、マレイミド、およびハロゲンが含まれる。(カルボキシル)酸のようなヒドロキシル基と反応可能な官能基、または求電子中心と反応可能な他の求核試薬の例としては、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、チオール基、活性メチレン等が含まれる。
【0145】
例えば、上記のポリマーは、標的分子へ付着するための官能基として成分Uを持つように調製することができ、そこでは官能基は、アクリレート、アルデヒド、ケトン、アミノオキシ、アミン、カルボン酸、エステル、チオエステル、ハロゲン、チオール、シアノアセテート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エポキシド、ヒドラジド、アジド、イソシアネート、マレイミド、メタクリレート、ニトロフェニルカーボネート、オルトピリジルジスルフィド、シラン、スルフヒドリル、ビニルスルホン、スクシンイミジルグルタレート、スクシミジルスクシネート、コハク酸、トレシレート等である。Uは、活性化可能な形態、例えば、アミンのような求核試薬と反応可能な活性エステルに変換できるカルボキシル酸でも提供できる。
【0146】
好ましい実施形態においては、Uは、標的分子上の一意的官能基と選択的反応性である一意的官能基の残基である。本発明のこの観点は、セクションIIにおいて上で論じたようなペプチド合成の原理(保護基戦略)および化学的ライゲーション(部分的または無保護基戦略)の原理を具体化するものである。従って、Uは、上で記載したような広範囲の官能基の残基を表し得る。好ましいU基は、アミンキャプチャ戦略(例えば、ヘミアミナール形成、イミン形成、およびマイケル付加によるライゲーション)、チオールキャプチャ戦略(例えば、メルカプチド形成、ジスルフィド交換によるライゲーション)、天然型化学的ライゲーション戦略(例えば、システインまたはチオール含有側鎖アミノ酸誘導体を伴うチオエステル交換によるライゲーション)、および直交ライゲーションカップリング戦略(例えば、チアゾリジン形成、チオエステル交換、チオエステル形成、ジスルフィド交換、およびアミド形成によるライゲーション)(例えば、Coltart, DM., Tetrahedron (2000) 56:3449−3491参照)。特に好ましいUは、セクションIIにおいて上記で記載されたような水性適合化学的ライゲーション化学中で用いられる一意的官能基の残基を含む。従って、Uは、カーボネート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、アミン、オキシム、イミド、尿素、チオ尿素、チオエーテル、チオウレタン、チオエステル、エーテル、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキサゾリジン等からなる群から選ばれる結合を形成可能な官能基とし得る。好ましい結合は、オキシムおよびアミド結合である。
【0147】
上記で言及したように、Bは、3本以上のアームを有する分岐核部分であり、存在してもしなくてもよい。Bが存在する場合、1本のアームが、UあるいはUに付着させられたスペーサーまたはリンカーに結合され、他の各々のアームは、ポリマーあるいはポリマーに付着させられたスペーサーまたはリンカーと結合される。分岐核Bの例としては、アミノ、アミド、カルボキシル、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。これらは、リジン等のオリゴアミド、あるいはアルカンジアミンとアクリル酸とから調製されたオリゴマー(「ポリアミドアミン」)を含み、後者は分岐核中に実効正電荷をもたらす。(例えば、Zeng et al., J. Pept. Sci. (1996) 2:66−72; Rose et al., Bioconjugate Chem., (1996) 7(5):552−556; NovoBiochem Catalog and Peptide Synthesis Handbook, Laufelfingen, 2001; Wells et al., Biopolymers (1998) 47:381−396 ; Mahajan et al., (1999) 40:4909−49−12; Judson et al. (1998) 39:1299−1302; Swali et al., (1997) 62:4902−4903、米国特許第5,932,462号、第5,919,455号、第5,643,575号、第5,681,567号参照)。他の多種多様な分岐核は用いることができ、かつこの目的に適しており、置換ジアミン、置換二酸、グリセロールのようなアルキル酸、および3つ以上の感応基または活性化可能基を有する他の部分、多価アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、およびアルコキシ部分等、ならびにオリゴ糖が含まれる(例えば、Nierengarten et al., Tetrahedron Lett. (1999) 40:5681−5684; Matthews et al., Prog. Polym. Sci. (1998) 1−56; Suner et al., Macromolecules (2000) 33:253; Fischer et al., Angew. Chem. Int. Ed. (1999) 38:884; Sunder et al., Adv. Mater. (2000) 12:235; Mulders et al., Tetrahedron Lett. (1997) 38:631−634; Mulders et al., Tetrahedron Lett. (1997) 38:30−3088;およびTurnbull et al., Chembiocehm (2000) 1 (1):70−74)。ポリマー成分に結合された最も好ましい分岐核は、アミド結合により結合される。
【0148】
好ましい分岐核は、アミノ、カルボキシルまたは混合されたアミノおよびカルボキシル官能性から出る。好ましい分岐核の例としては、それぞれリジンアミノ核、アスパラギン酸またはグルタミン酸分岐核、およびγ−グルタミン酸分岐核である。さらに、好ましい分岐ポリマー構成物は、分岐がオリゴアミドまたはポリアミドアミン核のような単独の分岐核から出ているものである。しかしながら、ポリマーバックボーンに沿って分配された多数の分岐核の連続から分岐が出ているウォーム状構造のような他の部類の分岐構成物を用いることができる(Schluter et al., Chem. Int. Ed. (2000) 39: 864)。化学組成および/またはポリマーバックボーンおよび反復単位のかさ高性に応じて、結果として得られるウォーム状構造は、水溶性となるようにまたは液晶組織を生じさせ易くなるように設計でき(Ouali et al., Macromolecules (2000) 33:6185)、これは送達用途、安定性、および作用持続期間にとり有利になり得る。本発明の他の分岐ポリマー構成物と同様、ウォーム状構成物は、Uを含むペンダント官能基を含むように作られる。
【0149】
ポリマー成分、あるいは1つ以上のスペーサーまたはリンカーは、例えば上記のセクションIで論じたように、生体安定性または生体分解性のポリマー鎖あるいは空間を置いたリンカーまたは結合を含み得る。上記のセクションIで同様に言及されたように、成分J*は、負、正および中性からなる群から選ばれる生理学的条件下での実効電荷を有するペンダント基の残基である。最も好ましいのは、J*がイオン化可能カルボキシレート部分を含み、生理学的条件下で負の実効電荷を有する場合である。成分s1、s2、およびs3は、同じでも異なってもよいスペーサーまたはリンカー部分であり、セクションIにおいて論じたもののように、個々に存在しても存在しなくてもよい。最も好ましくは、スペーサーまたはリンカーはポリマー鎖を含み、その場合、スペーサーまたはリンカーは式−[CO−X−CO−NH−Y−NH]n−の1つ以上の反復単位を含む。
【0150】
IV.製剤:
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、疾病および症状の処置を行うために、薬剤として用いることができる。従って、別の実施形態においては、本発明は、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質または薬学的に許容できるその塩を含む製薬組成物に向けられる。そのような製薬組成物は1つ以上の賦形剤を含み得る。好ましい賦形剤は、バッファー、キャリアタンパク質、アミノ酸、界面活性剤、脂質、水溶性ポリマー、および保存剤からなる群から選ばれる。医薬製剤は、合成赤血球産生刺激タンパク質以外の、1つ以上の付加的な生物活性薬剤(例えば、小形有機分子、他のタンパク質治療剤等)のような1つ以上の付加的な活性医薬成分を組み合わせることもできる。そのような製薬組成物は、本発明の好ましい方法おいて使用できる。これらには、哺乳動物における赤血球産生、ヘマトクリット、ヘモグロビン、および網状赤血球数を増加させる方法が含まれる。これらの方法は、所望の効果を得るために本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質を有効量哺乳動物に投与することが含まれる。
【0151】
最も好ましくは、治療を必要としている患者または個人に投与される場合、そのような合成赤血球産生刺激タンパク質および/またはポリペプチドは、ドラッグデリバリーシステムを用いて投与される。そのようなシステムを使うことにより、患者が薬物を使用できかつ所望の生物活性の有効性を高めるように薬物を患者に提示することが可能になる。本発明の目的である好ましいドラッグデリバリーシステムは、ポリペプチドまたはタンパク質を、経口的、経鼻的、または吸引的経路で、あるいは筋肉内、皮下、経皮、静脈内、耳内または眼内への投与が可能なシステムを含む、
【0152】
そのようなドラッグデリバリーシステムは、部位特定的放出をもたらしたり、腸粘膜の保護を強化したりする処方を含み得る。適切な処方としては、ドライパウダー処方、ウイルス粒子カプセル封入によるデリバリー、リポソームカプセル封入、経皮パッチ、電気的支援移送(エレクトロポレーション療法)およびポリマー/niazoneコンジュゲーションが含まれる。
【0153】
好ましい実施形態において、そのようなドラッグデリバリー装置は生物学的環境にける変化に応答して、この変化に基づいて薬物を送達、または送達を停止する。薬物および他の活性薬剤の放出を制御するために広範囲の物質が用いられてきた。すなわち、ポリ(ウレタン)、ポリ(シロキサン)、ポリ(メチルメタクリレート)、親水性および強度のためのポリ(ビニルアルコール)、ポリ(エチレン)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(n−ビニルピロリドン)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(アクリル酸)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレン−コ−ビニルアセテート)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(メタクリル酸)等である。さらに好ましい実施形態においては、生分解性ポリマーが、ドラッグデリバリーを容易にするため使用される。そのようなポリマーとしては、ポリラクチド(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(ラクチド−コ−グリコーリド)(PLGA)、ポリ酸水化合物、およびポリオルソエステルが含まれる。ドラッグデリバリー機器およびそれらの使用方法は、以下の米国特許に記載されている。米国特許第6,072,041号;第6,041,253号;第6,018,678号;第6,017,318号;第6,002,961号;第5,879,712号;第5,849,331号;第5,792,451号;第5,783,212号;第5,766,633号;第5,759,566号;第5,690,954号;第5,681,811号;第5,654,000号;第5,641,511号;第5,438,040号;第4,810,499号;および第4,659,558号。
【0154】
従って、本発明の別の観点は、製薬組成物および、それを必要としている哺乳動物を、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質または薬学的に許容できるその塩を含む化合物を治療的に有効な量投与して治療する方法に関する。「薬学的に許容できる塩」は、本発明のポリペプチドの生物学的有効性および特性を保持し、かつ生物学的にまたは他の点で好ましくないものではない塩を意味するものである。塩は、酸または塩基から誘導し得る。酸性付加塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸(硫酸塩および重硫酸塩を与える)、硝酸、燐酸等の無機酸、ならびに酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、サルチル酸、p−トルエンスルホン酸等の有機酸から導かれる。塩基性付加塩は無機塩基から導かれ、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩等を含み得る。有機塩基から導かれる塩としては、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、2−ジメチルアミノエタノール, トロメタミン, リジン, アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、N−アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、N−エチルピペリジン等を含む、第1、第2および第3アミン、自然生成置換アミンを含む置換アミンおよび環状アミンから導かれる塩が含まれる。好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、ピペリジン、トロメタミン、およびコリンである。
【0155】
本明細書中で用いられる用語「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾病および状況(例えば、貧血)の任意の処置をカバーし、(i)疾病に罹患しやすくなっている可能性があるが、その疾病を有しているとまだ診断されていない被検者において、疾病または状況の発生を防止すること、(ii)疾病または状況を抑制、すなわち、その進行を停止すること、または(iii)疾病または状況を軽減、すなわち、その症状の後退または改善を引き起こすことを含む。
【0156】
本明細書中で用いられる用語「赤血球産生刺激タンパク質を用いた処置により防止または軽減される哺乳動物における疾病状態」は、一般に赤血球産生刺激タンパク質で有効に処置されると一般に認識されているすべての疾病状態をカバーすることを意図するものであり、それらの疾病状態は、本発明の特定の化合物により有効に防止または軽減されることが見出されている。これらの疾病状態には、貧血、β地中海貧血、悪性貧血、鎌状赤血球症、慢性細菌性心内膜炎、骨髄炎、若年性間接リウマチ、リウマチ熱、クローン病、潰瘍性大腸炎等が例として含まれるがこれらに限定されない。
【0157】
本明細書中で用いられる用語「治療上有効な量」は、ポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を、それを必要とする哺乳動物に、例えば赤血球産生誘発剤、抗貧血薬等として投与した場合に、(上記で定義されたような)処置を行うのに十分な量を指す。「治療上有効な量」となる量は、タンパク質誘導体、状態または疾病およびその重篤度、ならびに処置される哺乳動物、その体重、年齢等に応じて変わるであろうが、現代の知識および本開示に関して通常の機能を有する者により日常的に決定し得る。本明細書中で用いられるるように、用語「q.s.」は、定められた機能を達成するのに十分な量を付加、例えば、溶液を所望の容積(例えば、100mL)にすることを意味する。
【0158】
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質およびそれらの薬学的に許容できる塩、すなわち活性成分は、治療上有効な投薬量、すなわち上記に記載されるように、それを必要としている哺乳動物に投与した場合に、有効な処置を行うのに十分な量、で投与される。本明細書中に記載される合成赤血球産生刺激タンパク質の投与は、同様の用途に使われる薬剤の一般に認められた投与法のいずれかによることができる。本明細書中で使われるように、用語「本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質」、「本発明のポリペプチドの[薬学的に許容できる塩]」および「活性成分」は互換的に使われる。
【0159】
処方中のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質のレベルは、当業者により用いられる全範囲内で変わり得る。例えば、全体処方に基づいて約0.01重量パーセント(%w)〜約99.99%wのタンパク質アンタゴニストまたはアゴニストおよび約0.01%w〜約99.99%wの賦形剤である。より一般的には、ポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、約0.5%w〜約80%wのレベルで存在する。
【0160】
ヒト投薬レベルを本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質について最適化する必要がまだある一方で、一般的に、投与される化合物の量は当然、予防または軽減を標的とする被検者および疾病状態、苦痛の性質および重篤度、投与方法およびスケジュールならびに処方医師の判断に依存するであろう。そのような使用最適化は、技術的に通常のスキルを有する当業者の範囲内に十分ある。
【0161】
投与は、任意の許容された全身または局所経路とすることができ、例えば、非経口、経口(特に乳幼児用処方)、静脈内、経鼻、気管支吸入(すなわち、エアゾール処方)、経皮的または局所経路を介して、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、液体、溶液、エマルション、注射剤、懸濁液、座剤、エアゾール等の、固体、半固体もしくは液体またはエアゾールの投薬形態とすることができる。本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、所定レートでのポリペプチドの、好ましくは正確な用量の単一投与に適した単位服用形態での長期間投与の場合には、蓄積注射、浸透圧ポンプ、丸剤、経皮(電気輸送を含む)パッチ等を含む徐放性または制御放出投薬形態で投与することができる。これらの組成物は、従来の製薬担体または賦形剤および本発明のタンパク質アンタゴニストまたはアゴニストを含み、加えて、他の薬剤、製薬薬剤、担体、アジュバント等を含み得る。担体は種々の油剤から選択され、これには石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等である。水、食塩水、水性デキストロース、およびグリコール類は、特に注射可能溶液の場合に、特に好ましい液体担体である。適切な製薬担体としては、デンプン、セルロース、タルク、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、テアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレングリコール、水、エタノール等が含まれる。他の適切な製薬担体およびそれらの処方は、E. W. Martinによる”Remington’s Pharmaceutical Sciences”に記載されている。
【0162】
必要であれば、投与される製薬組成物は、湿潤または乳化剤、例えば酢酸ナトリウム塩のようなpH緩衝剤、ソルビタンモノステアレート、オレイン酸トリエタノールアミン等のような少量の非毒性補助物質も含み得る。
【0163】
活性成分がより多く必要とされることがあるが、便利な1日用量計画を用いて本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を送達するために、経口投与を用いることができ、用量計画は、所望の予防の程度に従って、または苦痛の緩和において調節できる。そのような経口投与のために、薬剤学的に許容可能で、非毒性組成物が、例えば調剤グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ポビドン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、クロスカーメロースナトリウム、ブドウ糖、ゼラチン、ショ糖、炭酸マグネシウム等のような、通常用いられる賦形剤のいずれかを混合することにより形成される。そのような組成物は、溶液、懸濁液、分散性錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、徐放性処方等の形態を取る。経口処方は、胃腸疾患の治療に特に適している。一般的な全身的目的のための経口バイオアベイラビリティは、アセチル化アミノ酸を含む処方のような全身的循環への取込みを改善する賦形剤を利用することによって調節できる。例えば、米国特許第US5,935,601号および米国特許第US5,629,020号を参照。
【0164】
これらの組成物は、カプセル、丸剤または錠剤の形態を取ることができ、従って、組成物は、活性成分に加えて、乳糖、ショ糖、リン酸二カルシウム等のような希釈剤、クロスカーメロールナトリウム、デンプンまたはその誘導体のような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、デンプン、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、ゼラチン、セルロースおよびその誘導体等のバインダーを含む。
【0165】
液状の薬剤学的に投与可能な組成物は、例えば、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質(約0.5%〜約20%)および調剤補助薬を、例えば水、食塩水、水性デキストロース、グリセリン、グリコール類、エタノール、保存料等のような担体中に溶解、分散等することにより調製でき、それにより溶液または懸濁液を形成することができる。必要であれば、投与される製薬組成物は、湿潤剤、懸濁剤、乳化剤、または可溶化剤、例えば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムといったpH緩衝剤等、シクロデキストリン誘導体、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートまたはステアレート等の少量の非毒性補助薬剤を含むこともできる。そのような投薬形態を調製する実際の方法は公知、または当業者にとり明白であろう。例えば、Remington’s Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniを参照。投与される組成物すなわち処方は、いずれにせよ、処置されている被検者の症状を予防または軽減するのに有効な量の活性成分を含む。乳幼児への経口投与の場合は、(シロップまたは懸濁液のような)液状処方が好まれる。
【0166】
液体を含む固形剤形の場合は、例えばプロピレンカーボネート、植物油トリグリセリド中の溶液または懸濁液は、好ましくはゼラチンカプセル中に被抱される。液状の剤形の場合は、例えばポリエチレングリコール中の溶液は、投与用に容易に計量されるように、十分な量の薬学的に許容できる液状の担体、例えば水で希釈できる。
【0167】
代わりに、液状または半固形の経口処方は、活性成分を、植物油、グリコール類、トリグリセリド類、プロピレングリコールエステル類(例えば、プロピレンカーボネート)等の中に溶解し、これらの溶液または懸濁液を硬質または軟質ゼラチンカプセルシェル内に被抱することによって調製できる。
【0168】
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を上記条件の処置に適用する際には、本明細書中に記載される活性成分の投与は、好ましくは非経口的に投与される。非経口投与は一般に、皮下、筋肉内または静脈内の注射を特徴とし、皮内または腹腔内注射、ならびに胸骨内注射または注入を含み得る。注射剤は、液状の溶液または懸濁液、注射前の液体中の溶液または懸濁液に適した固体形態として、エマルションまたは生体適合性ポリマーベースの微小球として従来の形態で調製できる(例えば、リポソーム、ポリエチレングリコール誘導体、ポリ(D,C)ラクチド等)。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール等である。加えて、必要であれば、投与される調剤組成物は、例えば、酢酸ナトリウム、ポリエキシエチレン、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、シクロデキストリン、血清アルブミン等のような、湿潤または乳化剤、pH緩衝剤、溶解性促進剤、タンパク質担体等の少量の非毒性補助物質も含み得る。
【0169】
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、例えば、ケモカイン受容体モジュレーターを(水または食塩水のような)適切な溶媒中に溶解またはリポソーム処方中に組み込み、続いて許容できる注入流体中へ分散することによって、非経口的に投与できる。本発明のポリペプチドの典型的な1日用量は、1回の注入で、または周期的な間隔を置いての一連の注入により投与できる。非経口投与については、水溶性形態、例えば水溶性塩の形態、または増粘物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストラン、そして必要であれば安定剤、を含む水性注射懸濁液という形態の活性成分の特に適切な水溶液がある。活性成分は、任意に賦形剤と共に、凍結乾燥物の形態とすることもでき、さらに非経口投与の前に適切な溶媒を加えることにより溶液にすることができる。
【0170】
非経口投与用により最近考案されたアプローチでは、一定の投薬レベルが維持されるように、遅延放出または徐放出システムの埋め込みが用いられる。例えば、参照により組み込まれる米国特許第3,710,795号、米国特許第5,714,166号および米国特許第5,041,292号を参照。
【0171】
そのような親組成物中に含まれている活性成分の百分率は、ポリペプチドの活性および被検者のニーズだけでなく、組成物の特定の性質にも大いに依存する。しかしながら、溶液中で0.01%〜10%の活性成分の百分率を用いることができ、もし組成物がその後上記の百分率にまで希釈される固体であれば、より高くなる。好ましくは、組成物は、溶液中に活性成分を0.02〜8%含む。
【0172】
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を投与する別の方法では、静脈内ボーラス注射および連続注入が用いられる。
【0173】
エアゾール投与は、本発明のタンパク質を気道へ直接送達するための効果的な手段である。この方法の利点のいくつかは下記の通りである。すなわち、1)酵素的分解、胃腸管からの低い吸収、または肝臓の初回通過効果による薬剤損失の影響を回避し、2)分子サイズ、電荷または肺外部位への親和性のために、他の方法では気道中の標的部位に到着できないであろう活性成分を投与する、3)肺胞を介した体内への速やかに吸収できるようにする、4)他の器官系が活性成分に曝されないようにし、これは暴露により望ましくない副作用が引き起こされることがある場合には重要である。これらの理由により、エアゾール投与は、喘息、肺局部感染、ならびに肺および気道の他の疾患および疾患状態の処置にとり特に有利である。
【0174】
3タイプの医薬用吸入装置、すなわちネブライザ吸入器、定量吸入器およびドライパウダー吸入器がある。ネブライザ吸入器は、高速の空気流を作り出し、これにより(液状形態に処方された)タンパク質誘導体が患者の気道内に運ばれるミストとして噴霧される。定量吸入器は一般に、圧縮ガスと共に包装された処方を有しており、作動と同時に、圧縮ガスにより定量のポリペプチドを放出し、このようにして所定量薬剤の信頼できる投与方法を提供する。ドライパウダー吸入器は、自由流動粉体の形でポリペプチドを投与し、この粉体は、この装置による呼吸中に患者の気流中に分散できる。自由流動流粉体を得るため、ケモカイン誘導体は、乳糖のような賦形剤と共に処方される。定量のタンパク質誘導体は、カプセル形態で貯蔵され、作動ごとに患者に分配される。上記の方法のすべては、本発明の投与に用い得る。
【0175】
リポソームに基づく製剤処方も、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質と共に使用するのに適している。例えば、米国特許第5,631,018号、同第5,723,147号、および同第5,766,627号を参照。リポソームの利点は、薬のリポソーム取込みに起因するインビボ分布および薬物動態学的パラメーターにおける有利な変化に関係していると信じられており、当業者により本発明のポリペプチドに適用し得る。注射または経口投与のための制御された放出リポソーム液体調剤処方も用い得る。
【0176】
座剤による全身投与については、伝統的なバインダーおよび担体として、例えば、ポリエチレングリコール類またはトリグリセリド類、例えばPEG1000(96%)およびPEG4000(4%)が含まれる。そのような座剤は、活性成分を約0.5w/w%〜約10w/w%、好ましくは約1w/w%〜約2w/w%の範囲で含む混合物から形成できる。
【0177】
本明細書中で言及したすべての刊行物および特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別的に示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。今や本発明の概要を説明したのであるから、例示のために提供されかつ特に明記してあるものを除き本発明を限定することを意図しない以下の以下の実施例を参照して、本発明はより容易に理解されるであろう。
【0178】
(実施例)
略語
Acm=アセトアミドメチルチオール保護基[すなわち、−CH2NHCOCH3]
AoA=アミノオキシアセチル
Arg(Tos)=L−アルギニン(側鎖NGトルエンスルホニル−保護)
ART=絶対網状赤血球数
Asp(cHex)=L−アスパラギン酸(側鎖シクロヘキシルエステル保護)
AUC=曲線下面積
Boc=ter−ブトキシカルボニル
CD=円偏光二色性
CDI=カルボニルジイミダゾール
CHO=チャイニーズハムスター卵巣
CL=クリアランス(mL/hr/kg)
Cmax=最大濃度
Cys(4MeBzll)=L−システイン(側鎖(4−メチル)ベンジル−保護)
Cys(Acm)=L−システイン(側鎖アセトアミドメチル[すなわち、−CH2NHCOCH3]−保護)
DCM=ジクロロメタン
DIC=ジイソプロピルカルボジイミド
DIEA=ジイソプロピルエチルアミン
DMF=ジメチルホルムアミド
DMSO=ジメチルジメチルスルホキシド
DPC=ドデシルホスホコリン
Dpr=L−1,2ジアミノプロピオン酸
ED50=50%最大効果に達するために必要な有効量
EDA=(4,7,10)−トリオキサトリデカン−1,13ジアミン
ELISA=酵素結合イムノアッセイ
EPO=エリスロポエチン
ES−MS=エレクトロスプレーイオン化質量分析
FBS=ウシ胎仔血清
Glu(cHex)=L−グルタミン酸(側鎖シクロヘキシルエステル保護)
GM−CSF=顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
HATU(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルアンモニウムヘキサフルオロフォスフェート
HCT=ヘマトクリット
HGB=ヘモグロビン
His(Dnp)=L−ヒスチジン(側鎖NImジニトロフェニル保護)
HOBT=N−ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC=高圧液体クロマトグラフィー
IMDM=イスコフ改変ダルベッコ培地
IPA=イソプロパノール
Lev=レブリン酸
Lys(CIZ)=L−リジン(側鎖2−クロロベンジルオキシカルボニル)−保護
MBHA=4−メチルベンズヒドリルアミン
MRT=平均滞留時間
MTT=4−メチルトリチル
MTT=チアゾリルブルー
NHS=N−ヒドロキシスクシンイミド
−OCH2−Pam−樹脂=−O−CH2−Bz−CH2CONHCH2(コポリスチレンジビニルベンゼン)−樹脂
Pbo=4−(CH3S(O)−)ベンジル
PBS=リン酸緩衝生理食塩水
PCV=赤血球沈層容積
RBC=赤血球
RET=網状赤血球
rhEPO=組換えヒトEPO
RSA=ラット血清アルブミン
SDS=ドデシル硫酸ナトリウム
SDS−PAGE=SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
SEP=合成赤血球産生タンパク質
Ser(Bzl)=L−セリン(側鎖ベンジル−保護)
【0179】
実施例1
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−0の合成
合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP)を合成した。完全長合成タンパク質(「SEP−0(1−166)」と表される)の配列は以下の通りである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LVKSSQPWΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKΨAIS
PPDAASAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR(配列番号:1)
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を示す。SEP−0タンパク質を、以下の4つのポリペプチドセグメントから溶液中で合成した:
セグメントSEP−0:1(GRFN1711;配列番号:1の残基1−32により構成)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH−チオエステル
セグメントSEP−0:2(GRFN1712、配列番号:1の残基33−88により構成)
CSLNEKITVP DTKVNFYAWK RMEVGQQAVE VWQGLALLSE
AVLRGQALLV KSSQPW−チオエステル(Cys33はAcm保護されている)
セグメントSEP−0:3(GRFN1713、配列番号:1の残基89−116により構成)
CPLQLHVDKA VSGLRSLTTL LRALGAQK−チオエステル(Cys89はAcm保護されている)
セグメントSEP−0:4(GRFN1714、配列番号:1の残基117−166により構成)
CAISPPDAAS AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY
TGEACRTGDR−カルボキシレート(C末端システイン(Cys161)はピコリル(pico)保護基を持っている)
【0180】
ペプチドSEP−0:1およびSEP−0:2およびSEP−0:3を、チオエステル生成樹脂上で、Boc(ter−ブトキシカルボニル)化学用in situ中和プロトコルおよび段階的固相ペプチド合成(SPPS)により、確立されているSPPS、側鎖保護およびチオエステル樹脂戦略(Hackeng, et al., PNAS (1999) 96: 10068−10073; and Schnolzer, et al., Int. J. Pept. Prot. Res., (1992) 40: 180−193))を用いてAB1433A自動ペプチド合成装置でまたは手作業での鎖集合により合成し、あるいは商業ベンダーへ注文して入手した。例えば、BocSPPS保護基の標準キットを用いた。すなわち、Arg(Tos);Asp(cHex);Cys(4MeBzl)&Cys(Acm);Glu(cHex);His(DNP);Lys(CIZ);Ser(Bzl);Thr(Bzl);Trp(formyl);Tyr(BrZ);Met、Asn、Gluは、側鎖未保護であった。セグメントSEP−0:4を、−OCH2−Pam−樹脂上で相似的に合成した。ペプチドを脱保護し、同時に、標準的Boc化学手順に従って、樹脂支持体からHF/p−クレゾールを用いて切断した。しかしながら、HF/p−クレゾール中で除去されない保護基を含むペプチドについては、保護基は保持された。ペプチドは、調製用C4逆相高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)で精製した。純粋なペプチドを含んでいるフラクションは、ES−MS(エレクトロスプレーイオン化質量分析)を使って同定し、その後のライゲーション用にプールし凍結乾燥した。
【0181】
ステップ1:ライゲーション#1 セグメントSEP−0:4およびセグメントSEP−0:3を、15mMの濃度でTFEに溶解した。6M塩化グアニジウムおよび1%チオフェノールを含む飽和リン酸塩バッファー(pH7.9)を加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。ライゲーション後、ライゲーションミックスを、TFE(トリフルオロエタノール)2ml、6M塩化グアニジウム6ml、25%β−メルカプトエタノール含有100mMリン酸塩の溶液に加え、20分間インキュベートした。この溶液を、15mg/ml TCEP(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン.HCl)氷酢酸溶液で酸性化し、調製用C4逆相HPLCカラム(直径1インチ)にロードした。次に、ペプチドを、調製用グラジエント逆相HPLCで精製した。所望のライゲーション産物SEP−0:Acm+SEP−0:3+SEP−0:4を含むフラクションをES−MSで同定し、プールした。
【0182】
ステップ2:Acm−除去#1 Acm除去のため、プールしておいたSEP−0:Acm+SEP−0:3+SEP−0:4のフラクションを含むアセトニトリル水溶液を、HPLCグレード水で1×希釈し、固体尿素を最終的に2モル濃度となるように加えた。3%酢酸水溶液中の30mg/ml Hg(酢酸塩)2溶液を(予期される総システイン濃度に関して)3倍モル過剰加え、溶液を1時間攪拌する。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中で20%とし、半調製用逆相HPLCカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望の産物SEP−0:3+SEP−0:4を含むフラクションを、ES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0183】
ステップ3:ライゲーション#2 等量のSEP−0:3+SEP−0:4およびSEP−0:2を共に、純TFE中に15mMの濃度で溶解した。6M塩化グアニジウムおよび1%チオフェノールを含むリン酸塩バッファー(pH7.5)250mMを加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。1日ライゲーションした後、ライゲーションミックスを、TFE10ml、β−メルカプトエタノール10ml、ピペリジン10m、および6M塩化グアニジウム20mlのpH4の溶液に加え、どのような残留保護基も除去されるように20分間インキュベートした。この溶液を、20%酢酸水溶液中の15mg/ml TCEPで酸性化し、調製用逆相HPLCカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のライゲーション産物SEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4を含むフラクションをES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0184】
ステップ4:カルボキシメチル化 SEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4を、TFE中に15mMの濃度で溶解した。6M塩化グアニジウムを含む2倍過剰(v/v)の200mMリン酸塩バッファー(pH7.9)を加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。最小量のメタノール中に溶解した25倍過剰のブロモ酢酸を加え、溶液を2時間反応させた。この溶液は、20%酢酸水溶液中の15mg/ml TCEPで酸性化し、調製用逆相HPLCカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のカルボキシメチル化産物SEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+Etを含むフラクションをES−MSで同定し、プールした。
【0185】
ステップ5:ピコリル除去 亜鉛末を2M HCl中で30分間活性化した。ペプチドSEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+Etを、生のTFE中に約10mg/ml濃度で溶解した。この溶液を、(新たに添加された)35mg/ml L−メチオニンおよび35mg/mlドデシルサルコシン(すなわち、ナトリウムN−ドデカノイルサルコシン)を含む4x(v/vTFEに関して)6M塩化グアニジウム、100mM酢酸塩、pH4、で希釈した。この反応は、〜1時間間隔でモニターし、5時間で完了した。完了後、上澄みを除去し、残留Zn末を、6M塩化グアニジウム、pH4、35mg/ml L−メチオニン含有100mM酢酸塩および20%TFE含有35mg/mlドデシルサルコシンで5分間2回洗い、20%β−メルカプトエタノールを含む同じ溶液でさらに1回洗う。結合産物を、20%酢酸水溶液中の15mg/ml TCEPの溶液で酸性化し、調製用逆相HPLCカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望の修飾産物SEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+Et−Picoを含むフラクションをES−MSで同定し、プールした。
【0186】
ステップ6:Acm除去#2 プールしておいたSEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+Et−Picoの溶液を、HPLCグレード水で3×希釈し、固体尿素を最終的に2モル濃度となるように加えた。3%酢酸水溶液中の30mg/ml Hg(酢酸塩)2溶液を(予期される全システイン濃度に対して)3倍モル過剰加え、溶液を1時間攪拌する。次に、溶液をβ−メルカプトエタノール中に20%とし、半調製用逆相HPLCカラムにロードし、ステップグラジエントで精製した。所望の産物SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+Et−Picoを含むフラクションをES−MSで同定し、2×(w/wペプチド質量に関して)DPC(ドデシルホスホコリン)を含む水で2×(v/v)希釈し、一晩凍結乾燥した。
【0187】
ステップ7:ライゲーション#3 等量のSEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+Et−PicoおよびSEP−0:1を共に、純TFE中に15mMの濃度で溶解し、6M塩化グアニジウム含むリン酸塩バッファー(pH7.5)250のmMを加える。この溶液に1%チオフェノールを加えた。1日ライゲーションした後、ライゲーションミックスをTFE10ml、β−メルカプトエタノール10ml、ピペリジン10m、および6M塩化グアニジウム20mlのpH4の溶液に加え、どのような残留保護基も除去されるように20分間インキュベートした。この溶液を、20%酢酸水溶液中の15mg/ml TCEPで酸性化し、調製用逆相HPLCカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のライゲーション産物SEP−0(1−166):(配列番号:1)を含むフラクションをエレクトロスプレーイオン化質量分析で同定し、により、2×(w/wペプチド質量に関して)ドデシルサルコシンを含む水で2×(v/v)希釈し、凍結乾燥した。
【0188】
ステップ8:折りたたみ 完全長結合されたペプチドSEP−0(1−166)を、6M塩化グアニジウム、20%TFEおよび10倍モル過剰(タンパク質のCys残基に関して)のシステインを含む200mM Trisバッファー(pH8.7)中に溶解した。この溶液を、3M塩化グアニジウムを含む200mM Trisバッファー(pH8.7)溶液に対して、室温で一晩透析した。次に、この溶液を、1M塩化グアニジウムを含む200mM Trisバッファー(pH8.7)の溶液に対して室温で4時間4℃で、そして最終的に10mMリン酸塩バッファー(pH7.0)に対して4時間4℃で透析して最終的な折りたたまれた産物を得た。折りたたみは、エレクトロスプレーES−MSおよびCD(円偏光二色性)分光分析により検証した。
【0189】
ステップ9:精製 折りたたまれたポリペプチドを、セントリコン・コンセントレーター・バイアル中で5×濃縮し、10mMリン酸塩、pH7.0で平衡化したリソースS陽イオン交換カラムにロードした。折りたたまれたタンパク質を、10分間リニア塩グラジエントで500mM NaCl中に溶離した。所望の折りたたまれた産物SEP−0(1−166)を含むフラクションを、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)で同定し、凍結し、−80℃で保存した。CDスペクトルだけでなく折りたたまれたタンパク質産物の分析逆相HPLCクロマトグラムおよびES−MSスペクトルによっても、折りたたまれたタンパク質の存在が証明された。
【0190】
実施例2
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−L30の合成
オキシム形成基をSEP−0の位置24および126に含むように、第2の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−1−L30と呼ぶ)を合成した。次に、これらの基を用いてSEP−1−L30を形成し、そこでは直鎖状の(EDA−Succ−)18カルボキシレート(EDA=(4,7,10)−トリオキサトリデカン−1,13ジアミン(TTDとも呼ばれる);Succ=−CO−CH2CH2CO−)ポリマーがタンパク質バックボーンに結合されている。完全長SEP−1(1−166)の配列は下記の通りである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LVKSSQPΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKΨAIS
PPDAAKoxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR(配列番号:2)
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を表し、Koxは、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合を介してカップリングされたオキシムリンカー基によってε−アミノ基において化学的に修飾された非天然リジンを表す。SEP−1−L30の構造も図15に示してある。
【0191】
以下で説明されるSEP−1−L30の化学合成を例示する概略図を図14に示す。簡潔に言えば、図14Aおよび図14Bにおいて、水溶性ポリマーGRFN32(GP32)は、オキシム結合形成化学的ライゲーション反応を介してペプチドSEP−1:1およびSEP−1:4に付着させられる。示されるように、ペプチドSEP−1:1は、その後の天然型化学的ライゲーションのためのヒスチジンα−カルボキシルチオエステルを含むC末端Yaa基を位置32に、および位置24(天然ヒトEPOのグリコシル化部位)に非天然リジン残基を持ち、後者の側鎖は、アミノオキシアシル部分を含むUn=1基を持つように化学的に修飾されている。最終的な完全長産物の位置1に対応するN末端アラニンを参照用に示してある。ペプチドSEP−1:4は、位置117にシステインを含む未保護N末端Xaa基を、位置126(天然ヒトEPOのグリコシル化部位)にアミノオキシアシル修飾リジンを含むUn=1基を、そして位置161(ジスルフィド形成システイン)に側鎖チオールがピコリル基で保護されたシステインを有する。Cys161は、天然型化学的ライゲーション部位のために導入されたシステインのその後の変換におけるそのチオアルキル化を防止するために保護されており(図14D参照)、また、ピコリル保護基が使われており、これはその除去が、最初の天然型化学的ライゲーション反応(図14C参照)においてAcm(アセトアミドメチル)保護システインを除去するために必要な条件に直交するからである。位置24および126におけるGP32ポリマー構成物の部位特定かつ排他的付着は、精密ポリマー修飾ペプチドSEP−1:1+GP32およびSEP−1:4+GP32を作り出すオキシム形成化学的ライゲーションにより達成される。図14Cは、SEP−1:4+GP32の中間ペプチドSEP−1:3への天然型化学的ライゲーションおよびSEP−1:3+SEP−1:4+GP32の生成を示すもので、後者のライゲーション部位は、Lys116およびCys117である。示されるように、ペプチドSEP−1:3は、位置89にAcm保護システインを含むN末端Xaa基を、位置116にリジンα−カルボキシルチオエステルを含むC末端Yaa基を含む。天然型化学的ライゲーションに続いて、Acm保護基は、次のライゲーション反応のためのこのライゲーション産物を調製するために除去される。図14Dは、SEP−1:3+SEP−1:4+GP32の中間ペプチドSEP−1:2への天然型化学的ライゲーションおよびSEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP32の生成を示すもので、後者のライゲーション部位は、Trp88およびCys89である。示されるように、ペプチドSEP−1:2は、位置33にAcmシステインを含むN末端Xaa基を、位置89にトリプトファンα−カルボキシルチオエステルを含むC末端Yaa基を含む。天然型化学的ライゲーションに続いて、ライゲーション産物は、ライゲーション部位システイン89および117の側鎖チオールのカルボキシメチル化のためにブロモ酢酸にさらされ、このようにして擬似グルタミン酸へ変換される。カルボキシメチル化に続いて、Acmおよびピコリル保護基は、次のライゲーション反応のために、この未保護のポリマー修飾ライゲーション産物を調製するために除去される。図14EはSEP−1:3+SEP−1:4+GP32のペプチドセグメントSEP−1:1+GP32(完全長産物のN末端セグメントに対応)への天然型化学的ライゲーションおよび完全長SEP−1−L30産物SEP−1:1+GP32+SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP32の生成を示すもので、その最終的なライゲーション部位はHis32およびCys33である。示されるように、完全長SEP−1−L30産物は、ユーザー定義された部位、すなわち天然ヒトEPOの位置24および位置126に対応するグリコシル化部位、において排他的に付着させられた2つの水溶性ポリマー(G32)を含む。合成の詳細を以下に説明する。
【0192】
A.FNP32によるGRFN1776およびGRFN1711GRのオキシム化
オキシム形成は、アミノオキシアセチル基を持つ水溶性ポリマーを、ケトンカルボニル基を持つペプチドに付着させるために実行した。これを達成するため、以下のペプチドセグメントを合成した:
セグメントSEP−1:4(GRFN1776;配列番号:2の残基117−166により構成)
CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY
TGEACRTGDR−カルボキシレート(Lys126は、ε−アミノ基においてレブリン酸残基で修飾されており、Cys117は、Acm保護されている)
セグメントSEP−1:1(GRFN1711、配列番号:2の残基1−32により構成)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH−チオエステル(Lys24は、レブリン酸残基で修飾されている)
【0193】
実施例1と同様に、セグメントSEP−1:1(GRFN1711)をチオエステル生成樹脂上で、セグメントSEP−1:4(GRFN1776)を−OCH2−Pam−樹脂上で合成した。これら2つのペプチドセグメントのリジン24および126は、当初ε−アミノ基においてFmoc基で保護した。鎖集合の完了後、Fmoc保有アミノ基を、標準的Fmoc脱保護手順に従って脱保護し、各ペプチド樹脂へレブリン酸を付着することによりそれぞれ修飾した。次に、これらのペプチドを脱保護し、実施例1に記載されるように、樹脂支持体から同時に切断した。ペプチドは、調製用C4逆相HPLCにより精製した。純粋なペプチドを含んでいるフラクションを、ES−MSを使って同定し、プールし、その後のライゲーション用に凍結乾燥した。GRFNP32[−(EDA−Succ)18カルボキシレート]を、標準的プロトコルに従ってSasrinカルボキシル生成樹脂上で集合させた(Rose, K. et al., 米国特許出願番号第09/379,297号;Rose, et al., J Am Chem Soc. (1999) 121:7034)。アミノオキシアセチル(AoA)部分を、5倍過剰の活性化Bocアミノオキシ酢酸をカップリングすることによってポリマーのN末端アミノ基に付着させた。ポリマー鎖は、古典的なFmoc化学手順を用いて樹脂支持体から切断した。ポリマー鎖は、調製用C4逆相HPLCにより精製した。純粋なポリマーを含んでいるフラクションを、ES−MSを使って同定し、プールし、その後のライゲーション用に凍結乾燥した。
【0194】
セグメントSEP−1:4およびGRFNP32を共に、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。次に、この溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントC4逆相HPLCで未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物SEP−1:4+GP32を含むフラクションを、ES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0195】
セグメントSEP−1:1およびGRFNP32を共に、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。次に、この溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントC4逆相HPLCで未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物SEP−1:1+GP32を含むフラクションを、ES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0196】
B.合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−L30の合成
SEP−1−L30を、溶液中で以下の4つのポリペプチドセグメントから合成した:
セグメントSEP−1:1+GP32(GRFN1711+GRFNP32、配列番号:2の残基1−32に対応)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EH−チオエステル(Lys24は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル)(Lev−AoA)オキシム結合(Koxと表される)を介してGRFNP32にカップリングされている)
セグメントSEP−1:2(GRFN1712、配列番号:2の残基33−88に対応)
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW−チオエステル(Cys33は、Acm保護されている)
セグメントSEP−1:3(GRFN1713、配列番号:2の残基89−116に対応)
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK−チオエステル(Cys89は、Acm保護されている)
セグメントSEP:1:4+GP32(GRFN1776+GRFNP32、配列番号:2の残基117−166に対応)
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR−カルボキシレート(Lys126は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル)(Lev−AoA)オキシム結合(Koxと表される)を介してGRFNP32にカップリングされており、C末端システインは、ピコリル(pico)保護基を有する)
【0197】
付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、基除去反応、折りたたみおよび精製は、実施例1に記載されるように実行し、完全長の折りたたまれたSEP−1−L30を得た。CDスペクトルだけでなく折りたたまれたタンパク質産物の分析用逆相HPLCクロマトグラムおよびES−MSスペクトルにより、折りたたまれたタンパク質産物の存在が証明された。
【0198】
実施例3
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−L26の合成
オキシム形成基をSEP−0の位置24および126に含むように、第3の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−1−L26と表される)を合成した。次に、これらの基を用いてSEP−1−L26を形成し、そこでは位置24および126でそれにおいて直鎖状ポリマー(EDA−Succ)18カルボキシレートおよび(EDA−Succ)6−アミドが、オキシム結合を介してタンパク質バックボーンにそれぞれ結合されている。完全長SEP−1(1−166)の配列は下記の通りである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LVKSSQPWΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKΨAIS
PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR(配列番号:2)
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を表し、Koxは、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合を介してカップリングされたオキシムリンカー基によってε−アミノ基において化学的に修飾された非天然リジンを表す。
【0199】
SEP−1−L30とは対照的に、SEP−1−L26構成物は、位置126において付着させられたより小さく未帯電の水溶性ポリマーを持つように設計した。位置24において付着させられたポリマーは、SEP−1−L30におけるものと同じであった。完全長産物の集合は、実施例2に記載した通りであった。SEP−1−L26の構造を図16に示す。
【0200】
A.GRFNP6によるGRFN1776のオキシム化およびGRFNP32によるGRFN1711のオキシム化
オキシム形成は、アミノオキシアセチル基を持つ水溶性ポリマーを、ケトンカルボニル基を持つペプチドに付着させるために実行した。これを達成するため、以下のペプチドセグメントを合成した:
セグメントSEP−1:4(GRFN1776;配列番号:2の残基117−166により構成)
CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY
TGEACRTGDR−カルボキシレート(Lys126は、ε−アミノ基においてレブリン酸残基で修飾されており、Cys117は、Acm保護されている)
セグメントSEP−1:1(GRFN1711、配列番号:2の残基1−32により構成)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH−チオエステル(Lys24は、レブリン酸残基で修飾されている)
【0201】
実施例1と同様に、セグメントSEP−1:1(GRFN1711)をチオエステル生成樹脂上で、セグメントSEP−1:4(GRFN1776)を−OCH2−Pam−樹脂上で合成した。これら2つのペプチドセグメントのリジン24および126は、当初ε−アミノ基においてFmoc基で保護した。鎖集合の完了後、Fmoc保有アミノ基を、標準的Fmoc脱保護手順に従って脱保護し、各ペプチド樹脂へレブリン酸を付着することによりそれぞれ標準的カップリング手順に従って修飾した。次に、これらのペプチドを脱保護し、実施例1に記載されるように、標準的Boc−化学手順に従って、樹脂支持体から同時に切断した。ペプチドは、調製用C4逆相HPLCにより別個に精製した。各ペプチドについて、純粋なペプチドを含んでいるフラクションを、ES−MSを使って同定し、プールし、その後のライゲーション用に凍結乾燥した。
【0202】
水溶性ポリマー(EDA−Succ)18カルボキシレート(GRFNP32)を、標準的プロトコルに従ってSasrinカルボキシル生成樹脂上で集合させた(Rose, K. et al., 米国特許出願番号第09/379,297号;Rose, et al., J Am Chem Soc. (1999) 121:7034)。水溶性ポリマー(EDA−Succ)6−アミド(GRFNP32)を、標準的プロトコルに従ってSieberアミド生成樹脂上で集合させた(Rose, K. et al., 米国特許出願番号第09/379,297号;Rose, et al., J Am Chem Soc. (1999) 121:7034)。アミノオキシアセチル(AoA)部分を、5倍過剰の活性化Bocアミノオキシ酢酸をカップリングすることによって各樹脂結合ポリマーのN末端アミノ基に付着させた。2つのポリマー鎖は、古典的なFmoc化学手順を用いてそれぞれの樹脂支持体から別個に切断した。各ポリマー鎖は、調製用C4逆相HPLCにより精製した。各ポリマーについて、純粋なポリマーを含んでいるフラクションを、ES−MSを使って同定し、プールし、その後のライゲーション用に凍結乾燥した。
【0203】
セグメントSEP−1:4およびGRFNP6を共に、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。次に、この溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントC4逆相HPLCで未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物SEP−1:4+GP6を含むフラクションを、ES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0204】
セグメントSEP−1:1およびGRFNP32を共に、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。次に、この溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントC4逆相HPLCで未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物SEP−1:1+GP32を含むフラクションを、ES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0205】
B.合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−L26の合成
SEP−1−L26は、溶液中で以下の4つのポリペプチドセグメントから合成した:
セグメントSEP:1:1+GP32(GRFN1711+GRFNP32、配列番号:2の残基1−32に対応)
セグメントSEP:11+GP32(GRFN1711+GRFNP32配列番号の残基1−32に対応:2)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EH−チオエステル(Lys24は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル)(Lev−AoA)オキシム結合(Koxと表される)を介してGRFNP32にカップリングされている)
セグメントSEP−1:2(GRFN1712、配列番号:2の残基33−88に対応)
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW−チオエステル(Cys33は、Acm保護されている)
セグメントSEP−1:3(GRFN1713、配列番号:2の残基89−116に対応)
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK−チオエステル(Cys89は、Acm保護されている)
セグメントSEP:1:4+GP6(GRFN1776+GRFNP6、配列番号:2の残基117−166に対応)
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR−カルボキシレート(Lys126は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル)(Lev−AoA)オキシム結合(Koxと表される)を介してGRFNP32にカップリングされており、C末端システイン[すなわち、Cys161]は、ピコリル(pico)保護基を有する)
【0206】
付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、基除去反応、折りたたみおよび精製は、実施例1および2に記載されるように実行し、完全長の折りたたまれたSEP−1−L26を得た。CDスペクトルだけでなく折りたたまれたタンパク質産物の分析用逆相HPLCクロマトグラムおよびES−MSスペクトルにより、折りたたまれたタンパク質産物の存在が証明された。
【0207】
実施例4
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−B50の合成
第4の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−1−B50と表される)を合成した。完全長SEP−1−B50のアミノ酸配列は、SEP−1−L30の配列と同じである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LVKSSQPΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKΨAIS
PPDAAKoxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR(配列番号:2)
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を表し、Koxは、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合を介してカップリングされたオキシムリンカー基によってε−アミノ基において化学的に修飾された非天然リジンを表す。
【0208】
しかしながら、このタンパク質は、SEP−1−L30の直鎖状(Succ−EDA)18ポリマーではなく、4つの直鎖状(Succ−EDA)12部分を有する分岐ポリマー構成物で誘導体化した。誘導体化はオキシム結合を介して達成した。
【0209】
図17は、以下で詳細に説明されるようにオキシム形成ライゲーションを介してSEP−1−B50に結合された分岐水溶性ポリマーGRFNP29(GP29)の化学合成を例示する概略図である。図17に示されるように、U基としてアミノオキシアシルを持ち、さらにGP29と呼ばれコハク酸残基により提供されたペンダントカルボキシレートを持つ直鎖状水溶性ポリアミドエチレンオキシド構成物へのチオエーテル結合を介したその後のカップリングのための4つのペンダントチオール基を持つ3×リジン分岐核Bを有するU−B成分GRFN17(GP17)を生成するために、直交的に保護されたリジンU−B前駆体を使用した。完全長産物の集合は、実施例2で記載される通りであった。SEP−1−B50の構造を図18に示す。
【0210】
A.複数のチオール基を持つ鋳型GRFNP17の合成
鋳型GRFNP17を、アミド生成(4−メチル)ベンズヒドリルアミン(MBHA)−樹脂上で0.4mmolスケールで手動で合成した。Fmoc−Lys(Boc)−OHを、標準的カップリングプロトコルを用いてカップリングした(Schnolzer, M., Int J Pept Protein Res.(1992)40:180−93)。2.1mmolアミノ酸、3.8ml 0.5M HBTU中の10%DIEA、すなわち、アミノ酸の5倍過剰を用いた。Fmoc保護基の除去後、Fmoc−Lys(Fmoc)−OHを、標準的アミノ酸カップリングプロトコルを用いてカップリングした(2.1mmolアミノ酸、3.8ml 0.5M HBTU中の10%DIEA、すなわち、アミノ酸の5倍過剰を用いた)。第2のFmoc除去ステップ後、Fmoc−Lys(Fmoc)−OHを、標準的アミノ酸カップリングプロトコルを用いてカップリングした(4.2mmolアミノ酸、7.6ml 0.5M HBTU中の10%DIEA、すなわち、遊離アミンに対して5倍過剰のアミノ酸)。最終的Fmoc脱保護ステップ後、DMF中のS−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステル(SAMA−oPfp)の5倍過剰(遊離アミンに対して)を30分間カップリングした。C末端リジル残基の側鎖のBoc保護基を、純TFAによる1分間の洗浄2回し、続いてDMF中の10%DIEAで洗って樹脂を中和して除去した。2mmol Boc−アミノオキシ酢酸および2mmol N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を3ml DMF中に溶解した。2mmol DIC(ジイソプロピルカルボジイミド)の添加後、酸を30〜60分間活性化した。この溶液を、中和された樹脂に加え、1時間カップリングさせ。最終的に、S−結合アセチル基を、DMF中の20%ピペリジンで30分間かけて除去した。鋳型を脱保護し、同時に遊離アルデヒドのスカベンジャーとしてのシステインの存在で標準的Boc−化学手順に従ってHF/p−クレゾールを用いて樹脂支持体から切断した(Schnolzer, M., Int J Pept Res. (1992) 40:180−93)。50%B[すなわち、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液](アルデヒドフリー)中の再生ポリアミドを凍結し、凍結乾燥した。精製のため、鋳型粗製産物を、2ml 50%B中に溶解し、100ml 100%A[すなわち、水中の0.1%TFA]を加えて試料を希釈した(アルデヒドの付加が保証されているので、塩化または酢酸グアニジウムの添加を回避する)。鋳型を、T=40℃および3%Bで平衡化したC4調製用逆相HPLCカラムにロードした。塩をイソクラティック溶離し、所望の鋳型、GRFNP17をリニアグラジエントで精製した。所望の産物を含むフラクションを、ES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0211】
B.分岐水溶性ポリマーGRFNP29の合成
分子量15kDaの分岐(EDA−Succ)12ポリマーであるGRFNP29を、精製チオール含有鋳型GRFNP17および直鎖状ポリマーGRFNP31、Br−アセチル−12(EDA−Succ)カルボキシレートのチオエーテル生成ライゲーションにより合成し、ここでGRFNP31は標準的プロトコルに従ってSasrinカルボキシ−生成樹脂上で合成した(Rose, K. et al., 米国特許出願番号第09/379,297号; Rose, et al., J Am Chem Soc. (1999) 121: 7034)。
【0212】
1.3倍モル過剰(全チオールに対して)の精製GRFNP31、Br−アセチル化(EDA−Succ)12、および精製チオール含有鋳型GRFNP17を共に、0.1M Tris−HCl/6M塩化グアニジウム、pH8.7に、〜10mM濃度で溶解した。溶解後、溶液を0.1M Tris−HCl、pH8.7バッファーで3倍(v/v)希釈した。ライゲーションミックスを室温で攪拌し、反応を逆相HPLCおよびES−MSにより監視した。付加的なGRFNP31反応物を、所望の反応産物が主産物になるまで必要なだけ付加した。ワークアップのため、3×(v/vライゲーションミックスに対して)0.1M酢酸塩/6M塩化グアニジウム、pH4を添加し、溶液を調製用C4逆相HPLCカラムにロードし、リニアグラジエントにより精製した。純粋なGRFNP29構成物を含むフラクションを、ES−MSを用いて同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0213】
C.GRFNP29によるGRFN1776およびGRFN1711のオキシム化
セグメントSEP−1:4およびセグメントSEP−1:1を実施例2に記載されるように合成した。セグメントSEP−1:4およびGRFNP29を共に、0.1%TFA含有50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。この溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を、調製用逆相HPLCカラム(1インチ直径)にロードした。ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントC4逆相HPLCで未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物SEP:1:4+GP29を含むフラクションを、ES−MSにより同定し、プールした。
【0214】
セグメントSEP−1:1およびGRFNP29を共に、0.1%TFA含有50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。この溶液を凍結し、凍結乾燥した。乾燥粉末を、0.1%TFA含有50%アセトニトリル水溶液中に溶解し、調製用GPC(ゲル浸透クロマトグラフィー)カラム(1インチ直径)ロードした。ポリマー修飾ペプチドを、イソクラティック溶離により未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物SEP−1を含むフラクション:1+GP29を、ES−MSにより同定し、プールした。
【0215】
D.合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−B50の合成
SEP−1−B50(配列番号:2)は、溶液中で以下の4つのポリペプチドセグメントから合成した:
セグメントSEP−1:1+GP29(GRFN1711+GRFNP29、配列番号2の残基1−32に対応)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EH−チオエステル(Lys24は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル)(Lev−AoA)オキシム結合(Koxと表される)を介してGRFNP29にカップリングされている)
セグメントSEP−1:2(GRFN1712、配列番号:2の残基33−88に対応)
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW−チオエステル(Cys33は、Acm保護されている)
セグメントSEP−1:3(GRFN1713、配列番号:2の残基89−116に対応)
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK−チオエステル(Cys89は、Acm保護されている)
セグメントSEP:1:4+GP29(GRFN1776+GRFNP29、配列番号:2の残基117−166に対応)
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR−カルボキシレート(Lys126は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル)(Lev−AoA)オキシム結合(Koxと表される)を介してGRFNP29にカップリングされており、C末端システインは、ピコリル(pico)保護基を有する)
【0216】
付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、基除去反応、折りたたみおよび精製は、精製がリソースQカラム上であったこと以外は、実施例1および2に記載されるように実行し、完全長の折りたたまれたSEP−1−B50(配列番号:2)を得た。CDスペクトルだけでなく折りたたまれたタンパク質産物SEP−1−B50の分析用C4逆相HPLCクロマトグラムおよびES−MSスペクトルにより、折りたたまれたタンパク質産物の存在が証明された。
【0217】
実施例5
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−3−L42の合成
第5の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−3−L42と呼ぶ)を合成した。完全長SEP−3タンパク質のアミノ酸配列は下記の通りである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNECIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LACSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS
PPDAACAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR(配列番号:3)
【0218】
位置24、38、83、および126のシステイン残基を、マレイミド官能化した(EDA−Succ)18(GRFNP32)ポリマー単位(マイケル付加反応を介して)で修飾してSEP−3−L42を形成した。SEP−3−L42の構造を図20に示す。
【0219】
以下で説明されるSEP−3−L42の化学合成を例示する概略図を図19に示す。簡潔に言えば、図19Aおよび図19Bは、4つのSEP−3−L42ペプチドセグメント、SEP−3:1〜SEP−3:4の天然型化学的ライゲーションを示し、これによりヒトEPOにおける4つ全ての天然グリコシル化部位に対応するライゲーション部位でシステインが生成する。特に、図19Bは、すべてのジスルフィド形成システインが保護された完全長ポリペプチドを示し、これによりシステインライゲーション部位において4つの帯電直鎖状水溶性ポリマー(GRFN32−マレイミド(GP32マレイミド)と呼ぶ)のマイケル付加反応を介した部位特定的付着が可能になる。図19Bも、ジスルフィド形成システインの最終的脱保護ステップ、および完全長のポリマー修飾産物の生成を示す。
【0220】
詳細には、SEP−3は溶液中で以下の4つのポリペプチドセグメントから合成した:
セグメントSEP−3:1(GRFN1747、配列番号:3の残基1−37に対応)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNE−チオエステル(Cys7、Cys29、およびCys33はAcm保護されている)
セグメントSEP−3:2(GRFN1774、配列番号:3の残基38−82に対応)
CIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LA−チオエステル(Cys38は、Acm基により保護された側鎖)
セグメントSEP−3:3(GRFN1749、配列番号:3の残基83−125に対応)
CSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS
PPDAA−チオエステル(Cys83は、Acm基により保護された側鎖)
セグメントSEP−3:4(GRFN1750、配列番号:3の残基126−166に対応)
CAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR−カルボキシレート(Cys161は、Pbo[すなわち、4−(CH3S(O)−)ベンジル−]保護されている)
【0221】
ペプチド合成。ペプチドSEP−3:1、SEP−3:2、およびSEP−3:3を、実施例1に記載されるような確立された側鎖保護戦略を用い、上記の特定のペプチドにおいて言及したような保護基戦略を変えて、Boc化学SPPSのためのin situ中和プロトコルにより、チオエステル生成樹脂上で合成した。セグメントSEP−3:4を、−OCH2−Pam−樹脂上で相似的に合成した。ペプチドを脱保護し、実施例1に記載されるように、樹脂支持体から同時に切断した。結果として得られた上記のペプチドを、調製用RP−HPLCにより精製した。純粋なペプチドを含むフラクションを、ES−MSを用いて同定し、ブールし、その後のライゲーション用に凍結乾燥した。
【0222】
ステップ1:ライゲーション#1 セグメントSEP−3:4およびセグメントSEP−3:3を、15mMの濃度でTFEに溶解した。6M塩化グアニジウムおよび1%チオフェノールを含む飽和リン酸塩バッファー(pH7.5)を加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。ライゲーション後、ライゲーションミックス(1容積と定義する)を、{TFE2ml、6M塩化グアニジウム6ml、25%β−メルカプトエタノール含有100mMリン酸塩の溶液}2容積に加え、20分間インキュベートした。この溶液を、15mg/ml TCEPの氷酢酸溶液で酸性化し、調製用C4逆相HPLCカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のライゲーション産物SEP−3:Acm+SEP−3:3+SEP−3:4を含むフラクションをES−MSで同定し、プールした。
【0223】
ステップ2:Acm除去#1 Acm除去のため、プールしておいたSEP−3:Acm+SEP−3:3+SEP−3:4のフラクションを含むアセトニトリル水溶液を、HPLCグレード水で1×希釈し、固体尿素を最終的に2モル濃度となるように加えた。3%酢酸水溶液中の30mg/ml Hg(酢酸塩)2溶液を3倍モル過剰加え、溶液を1時間攪拌した。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中で20%とし、半調製用C4逆相HPLCカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望の産物SEP−3:3+SEP−3:4を含むフラクションをES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0224】
ステップ3:ライゲーション#2 等量のSEP−3:3+SEP−3:4およびSEP−3.2を共に、純TFE中に15mMの濃度で溶解した。6M塩化グアニジウムおよび1%チオフェノールを含むリン酸塩バッファー(pH7.5)250mMを加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。1日ライゲーションした後、ライゲーションミックス(1容積と定義する)を、TFE10ml、β−メルカプトエタノール10ml、ピペリジン10m、および6M塩化グアニジウム20mlのpH4の溶液2容積に加え、どのような残留保護基も除去されるように20分間インキュベートした。この溶液を、20%酢酸水溶液中の15mg/ml TCEPで酸性化し、調製用C4逆相HPLCカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のライゲーション産物SEP−3:Acm+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4を含むフラクションをES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0225】
ステップ4:Acm除去 Acm除去のため、プールしておいたSEP−3:Acm+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4のフラクションを含むアセトニトリル水溶液を、HPLCグレード水で1×希釈し、固体尿素を最終的に2モル濃度となるように加えた。3%酢酸水溶液中の30mg/ml Hg(酢酸塩)2溶液を3倍モル過剰(予想される総システイン濃度に対して)加え、溶液を1時間攪拌した。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中で20%とし、C4半調製用逆相HPLCカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望の産物SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4を含むフラクションをES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0226】
ステップ5:ライゲーション#3 等量のSEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4およびSEP−:3:1を共に、純TFE中に15mMの濃度で溶解した。6M塩化グアニジウムおよび1%チオフェノールを含むリン酸塩バッファー(pH7.5)250mMを加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。1日ライゲーションした後、ライゲーションミックス(1容積と定義する)を、TFE10ml、β−メルカプトエタノール10ml、ピペリジン10mおよび6M塩化グアニジウム20mlのpH4の溶液2容積に加え、どのような残留保護基も除去されるように20分間インキュベートした。この溶液を、20%酢酸水溶液中の15mg/ml TCEPで酸性化し、調製用C4逆相HPLCカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のライゲーション産物SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4を含むフラクションをES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0227】
ステップ6:ポリマーGRFNP32の付着 GRFNP32−マレイミドと呼ばれるマレイミド官能化直鎖状(EDA−Succ)18ポリマーを、マレイミド官能化(EDA−Succ)18ポリマー[すなわち、マレイミド−(EDA−Succ)18]を形成するためのメーカーのプロトコルに従い、GRFNP32をBMPS(3−マレイミドプロピオン酸NHSエステル、Pierce、USA)で官能化することにより調製した。SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4を、必要最小量のTFE中に溶解した。3倍過剰のGRFNP32−マレイミドを、6M塩化グアニジウム、100mMリン酸塩、pH7.5、中に溶解し、TFE溶液に加えた。マイケル付加反応の進行は、分析用逆相HPLCで追った。反応完了後、この溶液を、調製用C4逆相HPLCカラムにロードし、リニアグラジエントにより精製した。所望のポリマー修飾産物SEP−3:Acm+SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4+pPEG[すなわち、Cys24、Cys38、Cys83およびCys126の側鎖チオールに付着させられたGRFNP32の4つのコピーを持つ結合された完全長166残基ポリペプチド鎖、従ってSEP−3:Acm+SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4+GP32とも呼ばれる]を含むフラクションをES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0228】
ステップ7:Pbo除去 Pbo還元のため、SEP−3:Acm+SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4+GP32の凍結乾燥粉末を、5%エタンジチオールを含む純TFA中に溶解した。次に、Pbo基を、30分間かけて10%チオアニソールおよび15%ブロモトリメチルシランを加えることにより切断した。溶液をロータリーエバポレーター中で乾燥し、0.1%TFAを含むアセトニトリル水溶液に取り込んだ。結果として得られた溶液を、半調製用逆相HPLCカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望のCys161−脱保護産物SEP−3:Acm+SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4+GP32−Pboを含むフラクションをES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0229】
ステップ8:Acm除去 Cys7、Cys29、およびCys33の側鎖から最終的にAcmを除去するため、SEP−3:Acm+SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4+GP32−Pboのプールしておいたフラクションを含むアセトニトリル水溶液を、HPLCグレード水で1x希釈し、固体尿素を最終的に2モル濃度となるように加えた。3%酢酸水溶液中の30mg/ml Hg(酢酸塩)2溶液を(予期される全システイン濃度に関して)3倍モル過剰加え、溶液を1時間攪拌した。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中で20%とし、半調製用C4逆相HPLCカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望の結合されたポリマー修飾産物SEP−3(1−166)を含むフラクションを、ES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0230】
ステップ9:折りたたみ 完全長結合されたポリマー修飾ペプチドSEP−3(1−166)を、6M塩化グアニジウム、20%TFEおよび10倍モル過剰(SEP−3中のCys残基に関して)のシステインを含む200mM Trisバッファー(pH8.7)中に溶解した。この溶液を、3M塩化グアニジウムを含む200mM Trisバッファー(pH8.7)溶液に対して、室温で一晩透析した。次に、この溶液を、1M塩化グアニジウムを含む200mM Trisバッファー(pH8.7)の溶液に対して室温で4時間4℃で、そして最終的に10mMリン酸塩バッファー(pH7.0)に対して4時間4℃で透析して最終的な折りたたまれた産物を得た。折りたたみは、エレクトロスプレーES−MSおよびCD分光分析により検証した。
【0231】
ステップ10:精製 折りたたまれたポリペプチドを、セントリコン・コンセントレーター・バイアル中で5×濃縮し、10mMリン酸塩、pH7.0で平衡化したリソースS陽イオン交換カラムにロードした。折りたたまれたタンパク質を、10分間リニア塩グラジエントで500mM NaCl中に溶離した。所望の折りたたまれた産物SEP−3−L42を含むフラクションを、SDS−PAGEで同定し、凍結し、−80℃で保存した。
【0232】
実施例6
合成赤血球産生刺激タンパク質の生物活性アッセイ
折りたたまれた合成赤血球産生刺激タンパク質、SEP−0、SEP−1−L26、SEP−1−L30、SEP−1−B50、およびSEP−3−L42の生物活性を、UT/7および32D103197細胞系を用い、対照標準として市販の組換えエリスロポエチンを用いた因子依存性細胞系増殖アッセイにおいて決定した。UT−7は、成長および生存についてインターロイキン−3、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、またはエリスロポエチン(EPO)の1つに絶対的に依存するヒト巨核芽球白血病細胞系である(Miura Y, et al., Acta Haematol (1998) 99:180−184) ; Komatsu N, et al., Cancer Res. (1991) 51:341−8)。32D103197は、マウス造血細胞系である(Metcalf, D. Int J Cell Cloning (1992) 10:116−25)。
【0233】
SEP構成物の原液を、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、10%FBS(ウシ胎仔血清)、グルタミンおよびPenstrep中で作り、これらの現役の連続した2×希釈をマルチウェルプレートに加え、これにヒトUT/7EPO細胞を5000cells/50μlの濃度で加えた。プレートは、37℃で5%O2存在下でインキュベートし、成長を毎日モニターした。4日後、PBS(リン酸塩緩衝食塩水)中の2.5mg/ml MTT(メチルチアゾールテトラゾリウム)20μlを加え、プレートを4時間インキュベートした。IPA150μlを加え、各ウェルの吸光度を562nmで読んだ。SEP化合物についてED50(最大効果の50%に達するための有効用量)値を決定しCHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞産生rhEPO(組換えヒトエリスロポエチン)の値と比較した。これらの実験の結果により、合成赤血球産生刺激タンパク質のすべてが生物活性を示すことが実証された。SEP−0、SEP−1−L26、SEP−1−L30、およびSEP−1−B50についてのED50結果を表VIに示す。
表VI
【表5】
【0234】
ポリマー修飾SEP−1−L30の場合の吸光度によりタンパク質濃度を計算するために吸光係数を用いるだけでペプチド含有量について基準化した場合のこれらの実験からの付加的結果は、SEP−0、SEP−1−L26、SEP−1−L30、SEP−1−B50およびSEP−3−L42について表VIIおよび図26に示してある(SEP−1−B51化合物の合成は以下の実施例7に記載)。一括して、これらのインビトロアッセイは、インビトロ生物活性に対するポリマー構造および付着部位を変えることの差動効果を実証するものであり、そこでは、これらの化合物の相対的な効力の序列は、(1)ヒトEPO受容体活性について試験した場合には、(最も強力なのものから最も弱いものへ)SEP−1−L26(SEP−1−L30>SEP−1−B50(SEP−1−B51>SEP−3−L42>SEP−0であり、(2)マウスEPO受容体活性について試験した場合には、(最も強力なのものから最も弱いものへ)SEP−1−L−26>SEP−1−L30>SEP−0>SEP−3−L42>SEP−1−B50(SEP−1−B51である。
表VII
【表6】
【0235】
表VIIおよび図26の結果は、非ポリマー修飾構成物SEP−0と比較したポリマー修飾SEP構成物についての受容体優先性において有意な差も示している。特に、SEP−1−L26は、対応するヒトEPOグリコシル化部位位置24(この部位に付着させられたペンダント負電荷を持つ5.5kDa直鎖状ポリマー)および位置126(この部位に付着させられたペンダント中性電荷を持つ1.8kDa直鎖状ポリマー)に付着させられた異なる直鎖状ポリマーで修飾されており、この構成物はヒト受容体およびマウス受容体両方に対して同様な活性を有していた。SEP−1−L30は、対応するヒトEPOグリコシル化部位位置24および126にペンダント負電荷を有する5.5kDa直鎖状ポリマーで修飾されており、この構成物はマウス受容体と比較してヒト受容体に対して約5倍活性であった。SEP−3−L42は、対応するヒトEPOグリコシル化部位位置24、38、83および126にペンダント負電荷を有する5.5kDa直鎖状ポリマーで修飾されており、マウス受容体と比較してヒト受容体に対して約10倍活性であった。最大の差は、SEP−1−B50およびSEP−1−B51について観察され、これらは、対応するヒトEPOグリコシル化部位位置24および126に付着させられた分岐状の負帯電の15kDaポリマーで修飾されており、plが約5(ヒトEPOと同様)であり、マウス受容体と比較してこれらの2つの構成物はヒト受容体に対して〜60倍活性であった。
【0236】
マウスEPOは、ヒトEPO位置126に対応する位置にグリコシル化部位を欠いているので(マウスEPOは、ヒトEPOに見られるO−グリコシル化セリンの代わりに非グリコシル化プロリンを有している)、改変された受容体活性は、ある程度この違い、従って対応する位置126にO−結合グリコシル化を欠いているEPOについてのマウス受容体の優先性に起因し得る。これは、SEP−1−L26およびSEP−1−L30とSEP−1−B50およびSEP−1−B52との比較に一致している。例えば、SEP−1−L26は、1.8kDa未帯電ポリマーを位置126に有するのに対して、SEP−1−L30は、5.5kDa負帯電ポリマーを位置126に有している。ヒトEPO受容体に対して同等な活性が観察されたけれども、マウスEPO受容体に対しては4倍の違いが見られた。最大の差は、対応するヒトEPOグリコシル化部位位置126に負帯電15kDaポリマーが付着させられたSEP−1−B50およびSEP−1−B51構成物の場合に観察された。ヒトEPOにおける4つの天然グリコシル化位置すべて、すなわち24、38、83および126、に対応する部位における5.5kDa負帯電ポリマーの付加は、SEP−3−L42構成物と同様に、マウスについての優先性をなおいっそう減少させたが、SEP−1−B50およびSEP−1−B51構成物よりは少なかった。これらの結果は、生物学的に産生され、グリコシル化されたタンパク質におけるグリコシル化部位に対応する部位の精密修飾によって、およびポリマーのサイズ、分岐の性質および電荷を調節することによって受容体特異性を調整できることを立証している。
【0237】
実施例7
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−B51の合成
A.SEP−1−B51の組成
第6の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−1−B51と呼ぶ)を合成した。完全長SEP−1−B51のアミノ酸配列は、SEP−1−B50の配列と同じである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LVKSSQPWΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKΨAIS
PPDAAKoxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR(配列番号:2)
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を表し、Koxは、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合を介してカップリングされたオキシムリンカー基によってε−アミノ基において化学的に修飾された非天然リジンを表す。
【0238】
しかしながら、SEP−1−B50とは対照的に、タンパク質は、アミド結合を介してリジン分岐核に結合された4つの直鎖状(Succ−TTD)12−Succ−アラニン−OH[すなわち、(Succ−TTD)12−Succ−Ala−OH、あるいは(Succ−TTD)12Succ−Ala]ポリマーを有する分岐状ポリマー構成物で誘導体化されている。アミド結合を介した分岐核への直鎖状ポリマーのカップリングは、安定性を向上するように設計された。4つの直鎖状ポリマーも、アラニン部分およびペンダント負電荷を持つように設計され、負電荷がシアル酸を模倣し、アラニンが糖鎖のペンダント糖部分に類似の疎水性を模倣する。分岐ポリマーも、分岐核鋳型の合成および取り扱い特性を改善するために、さらにタンパク質バックボーンへの糖付着部位と糖質の第1の分岐点との間の天然糖質鎖に見られるスページングを模倣するために、分岐核とタンパク質バックボーン付着部位との間に水溶性スペーサーを持つように設計された。
【0239】
図21は、以下で説明されるようにオキシム形成ライゲーションを介してSEP−1−B51に結合された分岐水溶性ポリマーGRFNP41(GP41)の化学合成を例示する概略図である。完全長産物の集合は、実施例2に記載の通りであった。SEP−1−B51の構造は図22に示してある。
【0240】
B.分岐鋳型(GRFNP40)にカップリングするための(Succ−TTD)12Succ−AlaOtBu(GRFNP39)の合成
直鎖状ポリマー(Succ−TTD)12Succ−AlaOtBu(GRFNP39)を、0.5mmolスケールで、Sasrin酸不安定な、カルボン酸生成樹脂上で合成した。0.5mmol(〜0.5グラム)Sasrin酸不安定な、カルボン酸生成ポリスチレン樹脂(ヒドロキシル置換1.02mmol/g)を、DMF中で15分間膨潤させ、次いで排液した。このヒドロキシル−官能化された樹脂に、DIEA(ジイソプロピルエチルアミン)500マイクロリットル(3.9mmol)を含むDMF8ml中に溶解した無水コハク酸450mg(4.5mmol)および4−(ジメチルアミノ)ピリジン488mg(4mmol)を加え、渦撹拌により30分間反応させ、排液した。カップリングを反復し、過剰反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。HOOC−CH2CH2CO−O−樹脂(0.5mmol)を、新たに用意したDMF中の1.0M(8mmol)CDI(カルボニルジイミダゾール)溶液8mlを加えて活性化し、40分間反応させ、次いで排液した。過剰反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。DMF中の0.5M(2mmol)HOTB溶液4ml中に溶解した(4,7,10)−トリオキサトリデカン−1,13ジアミン(TTD)4ml(4グラム、18.2mmol)を加え、渦流攪拌により30分間反応させ、次いで排液した。過剰反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。DIEAを500マイクロリットル(3.9mmol)含む0.5M(4mmol)HOBT(N−ヒドロキシベンゾトリアゾール)溶液8ml中に溶解した無水コハク酸(450mg、4.5mmol)を樹脂に加え、15分間渦流攪拌して反応させ、次いで排液した。3つのステップ(CDI活性化、TTDカップリング、無水コハク酸反応)を11回[すなわち、合計12回]反復した。過剰反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。HOOC−CH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂(0.5mmol)を、新たに用意したDMF中の1.0M(8mmol)CDI溶液8mlで活性化し、40分間反応させ、次いで排液した。過剰反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。H−AlaOtBu・HCL2.5mmolを、DIEA150マイクロリットル(111mg、0.825mmol)を含むDMF中の0.5M(2.375mmol)HOBT溶液4.75ml中に溶解し、さらにCDI−活性化HOOCCH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂(0.5mmol)と渦撹拌により1時間反応させ、次いで排液した。過剰反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。生成物tertBuOOC−CH(CH3)−NH−OC−CH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂を、DCM(ジクロルメタン)で徹底的に洗浄し、排液し、次いで、樹脂を真空下で一定重量になるまで乾燥した。生成物−樹脂の典型的な重量は約2グラムであった。
【0241】
直鎖状(Succ−TTD)12Succ−AlaOtBuポリマーを、DCM中の4%TFAを用いる標準的Fmoc−化学手順に従って樹脂支持体から切断した。沈降した粗生成物を、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥ポリマーを、0.1%TFAを含む少量の50%アセトニトリル水溶液中に溶解し、有機物濃度を1%未満まで減少させるために希釈した。粗生成物を、T=40℃において3%Bで平衡化したC4調製用逆相カラムにロードした。塩類をイソクラティック溶離し、所望の鋳型を、20−35%バッファーB(0.1%TFA含有アセトニトリル)対0.1%TFA水溶液の60分間にわたるリニアグラジエントにより精製した。所望の(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu物質(GRFNP39)を含むフラクションを、ES−MSで同定し、凍らせ、凍結乾燥した。
【0242】
C.分岐のための複数のアミン基およびタンパク質(GRFNP40)への(後の)付着のための保護されたアミノオキシ基を持つ鋳型の合成
鋳型GRFNP40を、Sieberアミド生成樹脂上で0.4mmolスケールで手作業で合成した。すべてのカップリング、脱保護および活性化ステップの間にDMFによる1分間のフロー洗浄ステップがあった。Nα−Fmoc−Nβ−(Boc−アミノオキシアセチル)−L−ジアミノプロピオン酸2mmolを、1時間、DCM/DMF(ジメチルホルムアミド)中のDIC 2mmolおよびNHS 2mmolを用いた30分間のNHS−エステル事前活性化を用いて樹脂に結合させた。Fmoc保護基の除去(DMF中の20%v/vピペリジン2×3分間)および洗浄後、DIEA 2.2mmolを含む0.5M HOBT(N−ヒドロキシベンゾトリアゾール)溶液8ml中に無水コハク酸4mmolを溶解し、10分間樹脂にカップリングさせた。このステップの後、カルボキシル基を、新たに調製したDMF中の0.5M(4mmol)CDI溶液8mlで活性化した。TTD 4ml(18.2mmol)を、DMF中の0.5mHOBT溶液4mlに加え、30分間カップリングさせた。
【0243】
Fmoc−Lys(Fmoc)−OH(2mmol)を、結果として得られるアミノ−TTD−Succ−Dpr(BocAoA)−樹脂(Dpr=ジアミノプロピオン酸)に、DMF中のDIC 2mmolおよびをNHS 2mmolによる30分間の事前活性化を用いて1時間カップリングさせた。このカップリングを1度繰り返した。Fmoc除去ステップ(DMF中の20%v/vピペリジンで2×3分間)後、Fmoc−Lys(Fmoc)−OH 4mmolを上述の通りに再カップリングを含むカップリングをさせた。最終的なFmoc保護ステップ(DMF中の20%v/vピペリジンで2×3分間)後、鋳型を、DCM中の4%TFAを用いる標準的Fmoc−化学手順に従って樹脂支持体から切断した。沈降した生成物を、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥した粗生成物を、0.1%TFAを含む少量の50アセトニトリル水溶液中に溶解し、有機物濃度が1%未満となるように希釈した。鋳型を、T=40℃で3%バッファーB(アセトニトリル中の0.1%TFA)で平衡化したC4調製用逆相HPLCカラムにロードした。塩類および他の非アミド物質をイソクラティック溶離し、所望の鋳型を、5−12%バッファーB(0.1%TFA含有アセトニトリル)対0.1%TFA水溶液の60分間にわたるリニアグラジエントにより精製した。所望のLys−Lys(Lys)−TTD−Succ−Dpr(BocAoA)アミド物質(GRFNP40)を含むフラクションをES−MSでついて同定し、凍らせて凍結乾燥した。
【0244】
D.アミドカップリングされた分岐ポリマー(GRFNP41)の集合および脱保護
分子量16kDaの分岐(TTD−Succ)49−ポリマーであるGRFNP41を、GRFNP39[(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu]を精製鋳型GRFNP40にカップリングすることにより合成した。60℃でDMSO(ジメチルスルホキシド)中に20mg/mlの濃度で溶解した精製(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu(GRFNP39)(1.0mmol)を、DMSO中で濃度10mg/mlのHATU{O−(7−アザベンドトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート}0.95モルで、20倍(モル)過剰DIEA存在下で活性化した。DMSO中に濃度3.9mg/mlで溶解した精製鋳型GRFNP40(0.24モル)を直ちに加えた。反応の進行は、C4分析用逆相HPLCおよびES−MSにより監視した。典型的には、カップリングは数分以内で完了した。ワークアップのため、4容積(ライゲーションミックスに対して)の0.1M酢酸ナトリウム/6M塩化グアニジウム、pH4を加え、溶液を調製用(C4)逆相HPLCカラムにロードした。塩類および他の非アミド含有物質をイソクラティック溶離し、所望の分岐ポリマー産物を、20−35%バッファーB(0.1%TFA含有アセトニトリル)対0.1%TFA水溶液のリニアグラジエントにより80分間にわたり精製した。所望の物質を含むフラクションを、ES−MSで同定し、凍らせて凍結乾燥した。
【0245】
結果として得られる精製ポリマーを、純TFA中に1mg/mlの濃度で1時間かけて溶解し、Boc基をアミノオキシアセチル部分から除去し、tert−ブチルエステル基を−Ala−OtBu部分から除去した。溶液をロータリーエバポレーター中で乾燥するまで回転させ、乾燥ポリマーを、50%バッファーB(0.1%TFA含有アセトニトリル)中に溶解させた。付加物形成不純物を捕捉するため、アミノオキシ酢酸(a.k.a「カルボキシメトキシルアミン」)を最終濃度0.5Mまで加えた。20分後、溶液を3.3容積バッファーA(0.1%TFA水溶液)で希釈し、調製用C4逆相HPLCカラムにロードし、すべてのアミノオキシ酢酸が除去されるまで10%バッファーBでポンプ送液し、次いでポリマーを、15%から45%のバッファーB対0.1%TFA水溶液のステップグラジエントで80分間にわたり精製した。所望の分岐ポリマー物質(GRFNP41)を含むプールされたフラクションを凍らせ、凍結乾燥した。
【0246】
E.分岐ポリマーGRFNP41によるペプチドセグメントGRFN1776およびGRFN1711のオキシム形成ライゲーション(オキシム化)
セグメントSEP−1:4(GRFN1776、配列番号:2の残基117−166で構成される)およびセグメントSEP−1:1(GRFN1711、配列番号:2の残基1−32で構成される)を、実施例1に記載されるように、標準的in situ中和Boc化学SPPSを用いて合成した。ペプチドGRFN1776を、同様に上記で記載されるように、標準的プロトコルに従って−OCH2−Pam−樹脂上で合成した。ペプチドGRFN1711を、上記で記載されるように、標準的プロトコルに従ってチオエステル−生成樹脂上で合成した。Lys126にレブリンアシル部分を含むセグメントGRFN1776およびAoA含有GRFNP41を共に、0.1%TFA含有50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。溶液を凍結乾燥した。乾燥した粉末粗製産物を、0.1%TFA含有50%アセトニトリル水溶液中に再溶解し、調製用逆相(C4)HPLCカラムにロードした。ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエント逆相HPLCによって未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム結合(オキシム化)産物SEP−1:4+GP41を含むフラクションをES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0247】
Lys24にレブリンアシル部分を含むセグメントGRFN1711およびAoA含有GRFNP41を共に、0.1%TFA含有50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。溶液を凍らせ、凍結乾燥した。乾燥粉末を、0.1%TFA含有50%アセトニトリル水溶液中に再溶解し、調製用C4逆相HPLCカラムにロードした。ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントC4逆相HPLCによって未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム結合(オキシム化)産物SEP−1:4+GP41を含むフラクションをES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0248】
F.合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1B51の合成
(配列番号:2)を有するSEP−1−B51を、溶液中で以下の4つのポリペプチドセグメントから合成した:
セグメントSEP−1:1+GP41(GRFN1711+GRFNP41、配列番号:2の残基1−32に対応)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EH−チオエステル(Lys24は、Koxにより示されるように、分岐ポリマーGRFNP41にオキシム結合されたレブリンアシルペンダント部分を有し、His32はDnp保護されている)
セグメントSEP−1:2(GRFN1712、配列番号:2の残基33−88に対応)
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLAL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW−チオエステル(Cys33はAcm保護されており、3つのTrp残基はホルミル保護されている)
セグメントSEP−1:3(GRFN1713、配列番号:2の残基89−116に対応)
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK−チオエステル(Cys89はAcm保護されており、His94はDnp保護されている)
セグメントSEP−1:4+GP41(GRFN1776+GRFNP41、配列番号:2の残基117−166に対応)
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR
GKLKLYTGEA CRTGDR−カルボキシレート(C末端システイン(すなわち、Cys161)はピコリル(pico)保護基を有し、Lys126はKoxにより示されるように、分岐ポリマーGRFNP41にオキシム結合されたレブリンアシルペンダント部分を有する)
【0249】
完全長の折りたたまれたSEP−1−B51(配列番号:2)を産するため、付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、折りたたみおよび精製を、以下の変更を伴って、実施例1−4に記載されるように実行した:
【0250】
ステップ1:ライゲーション#1 セグメントSEP−1:4+GP41を、3mMの濃度でTFE(1容積)に溶解した。セグメントSEP−1:3を、6M塩化グアニジウムを含む2容積の300mM Naリン酸塩バッファー(pH7.9)中に2.25mMの濃度まで溶解した。2つの溶液を混合して、最終的なセグメント濃度を1mM SEP−1:4+GP41および1.5mM SEP−1:3とし、1%チオフェノールを加え、pH6.8〜7.2でペプチドセグメント溶液(「3容積」)を得た。反応を室温で一晩進行させた。ライゲーション後、β−メルカプトエタノール(3容積)をライゲーションミックスに加え、続いて3容積の6M塩化グアニジウム300mM Naリン酸塩pH7.9バッファー、そしてTCEPを加え(ペプチドセグメントの全重量の0.25重量比)、溶液を20分間攪拌した。この溶液を、0.6容積の氷酢酸でpH4.0+/−0.1に酸性化して清澄な溶液とし、これに6M塩化グアニジウムを含むpH4.0、100mM Na酢酸塩希釈バッファーを30容積加えた。結果として得られる溶液を、調製用逆相(C4)HPLCカラムに送液した。すべての非ペプチド物質がカラムから溶離されるまで、バッファーを5%B[従って、残りは95%バッファーA(0.1%TFA水溶液)]で送液し、次いでライゲーション産物を25−45%バッファーBのグラジエントにより80分間にわたって精製した。所望のライゲーション産物(Cys89(Acm)){SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}を含むフラクションをエレクトロスプレー質量分析により同定し、プールした。
【0251】
ステップ2:Acm−除去#1 Acm除去のため、(Cys89(Acm)){SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}のプールされたフラクションを含むアセトニトリル水溶液を、HPLCグレード水で1×希釈し、固体尿素を最終的に2モル濃度となるように加えた。3%酢酸水溶液中の30mg/ml Hg(酢酸塩)2溶液を(総システイン濃度に関して)3倍モル過剰加え、溶液を1時間攪拌した。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中で20%とし、半調製用逆相HPLCカラムにロードし、すべての非ペプチド物質が溶離されるまで25%バッファーBで送液し、次いで産物を、50%バッファーBへのステップグラジエントにより精製した。所望のライゲーション産物{SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}を含むフラクションをはエレクトロスプレー質量分析により同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0252】
ステップ3:ライゲーション#2 ステップ2からの{SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}産物、[すなわち、1713−1776−GP41]を、TFE(1容積)中に濃度3mMで溶解した。セグメントSEP−1:2(セグメントGRFN1712)を、6M塩化グアニジウム含有300mM Naリン酸塩バッファー(pH7.9)2容積中に2.25mMの濃度まで溶解した。2つの溶液を混合して、最終的なセグメント濃度を1mM {SEP−1:3+SEP−1:4−GP41}および1.5mM SEP−1:2とし、1%チオフェノールを加え、pH6.8〜7.2でペプチドセグメント溶液(「3容積」)を得た。反応を室温で一晩進行させた。次いで、ライゲーションミックスを、3容積(すなわち、上記で用いたTFEの容積に対して)の希釈バッファー、すなわち6M塩化グアニジウム含有100mM酢酸ナトリウムpH4.0で希釈し、次に、TFE3容積、β−メルカプトエタノール3容積、ピペリジン3容積および6M塩化グアニジウム6容積、100mM Na酢酸塩pH4.0から成り4℃に冷却した溶液に加え、どのような残留保護基も除去するために、室温で20分間攪拌した。この溶液を1.8容積の凍結氷酢酸で酸性化して清澄な溶液とし、これにTCEP(ペプチドセグメントの総重量に対して0.25の比率)を加え、溶液を20分間インキュベートした。次に、6M塩化グアニジウムを含むpH4.0、100mM Na酢酸塩希釈バッファーを30容積加え、溶液を混合した。結果として得られる溶液を、調製用逆相(C4)HPLCカラムに送液した。すべての非ペプチド物質がカラムから溶離されるまで、バッファーを30%C[バッファーC:イソプロパノール60%/アセトニトリル30%/水10%中の0.1%TFA]で送液し、次いでライゲーション産物を37−57%バッファーCのグラジエントにより80分間にわたって精製した。所望のライゲーション産物(Cys33(Acm)){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}を含むフラクションをES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0253】
ステップ4:残基Cys89およびCys117のカルボキシメチル化 (Cys33(Acm)){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}[すなわち、(Cys33(Acm))−1712−1713−1776−GP41]を、TFE中に1mMの濃度で溶解した。6M塩化グアニジウムを含む300mM Naリン酸塩バッファー(pH7.9)10容積を加えた。メタノール中に75mg/mlで溶解した25倍過剰(スルフヒドリル基について)のブロモ酢酸を加え、溶液を室温で2時間攪拌しつつ反応させた。次に、この反応混合物を100mM Na酢酸塩、pH4.0、6M塩化グアニジウム溶液11容積で希釈し、調製用逆相(C4)HPLC カラムにロードし、すべての非ペプチド成分が溶離されるまで20%バッファーCで送液し、次いでライゲーション産物を、55%バッファーCへのステップグラジエントで精製した。所望の修飾産物(Cys33(Acm);Ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}を含むフラクションを、ES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0254】
ステップ5:ピコリル除去 亜鉛末(ペプチド1ミリグラムあたり71ミリグラム)を2M HCl中で5分間活性化させ、この活性化をもう1度繰り返し、次いで、過剰な酸を除去するため、(新たに加えた)L−メチオニン35mgおよび35mg/ml Naドデカノイルサルコシンならびに10%v/vTFEを含む6M塩化グアニジウム、50mMグリシンpH2.2で10分間洗った。洗浄をもう1度繰り返した。Cys161(Pico)含有ペプチド(Cys33(Acm);Ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}を、純TFE中に約30mg/mlの濃度で溶解した。この溶液を、(新たに加えた)L−メチオニン35mgおよび35mg/ml Naドデカノイルサルコシンならびに10%v/vTFEを含む6M塩化グアニジウム、50mMグリシンpH2.2、4容積(TFEに対して)で希釈した。この溶液を活性化亜鉛末に加え、室温で50分間攪拌した。反応は、アリコット(等量のβ−メルカプトエタノールおよび数粒のTCEPで処理し、次いで分析用に2容積の6M塩化グアニジウム、100mM Na酢酸塩pH4.0で希釈)の分析用C4逆相HPLCで、〜1時間間隔で監視し、2〜5時間後に完了した。分析用HPLCピーク(すなわち、92Da質量の損失)のES−MS分析により示されるようなピコリル基除去の完了後、上澄みをろ過により除去し、残ったZn末を、L−メチオニン35mgおよび35mg/mlドデシルサルコシンならびに20%v/vTFEを含む6M塩化グアニジウム、pH4、100mM酢酸塩で3度洗った。BioRadSM−2ビーズ(溶液容積の約3分の1)を、上澄みと洗液とを合わせたものに加え、室温で30分間攪拌し、次いでろ過した。β−メルカプトエタノールを10%v/vになるまで加え、次に、0.25×(ペプチドの総合重量)のTCEPを加え、溶液を室温で5分間攪拌した。この溶液を、等量の100mM Na酢酸塩pH4.0、6M塩化グアニジウムで1:1希釈し、調製用(C4)逆相HPLCカラムにロードし、すべての非ペプチド物質が溶離されるまで、35%バッファーCを送液し、所望の産物を55%バッファーCへのステップグラジエントにより精製した。所望のCys161脱保護産物(Cys33(Acm);Ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41−Pico}をエレクトロスプレー質量分析で同定し、プールした。
【0255】
ステップ6:Acm除去#2 プールしておいた(Cys33(Acm);Ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41−Pico}[すなわち、(Cys33(Acm);Ψ89,117−1712−1713−1776−GP41]の溶液を、HPLCグレード水で3×希釈し、固体尿素を最終的に2モル濃度となるように加えた。3%酢酸水溶液中の30mg/ml Hg(酢酸塩)2溶液を(全システイン濃度に対して)3倍モル比率で加え、溶液を室温で1時間攪拌した。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中に20%とし、半調製用(C4)逆相HPLCカラムにロードした。すべての非ペプチド物質が溶離されるまで、バッファーC(20%)を送液し、次に、所望の産物を、55%バッファーCへのステップグラジエントにより精製した。所望の産物(Cys33;Ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41−Pico}を含むフラクションをES−MSで同定し、2×(w/w、ペプチド質量に対して)DPC(ドデシルホスホコリン)を含む水で2×(v/v)希釈し、一晩凍結乾燥した。
【0256】
ステップ7:ライゲーション#3 (Cys33;Ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41−Pico}[すなわち、(Cys33;Ψ89,117)−1712−1713−1776−GP41]を、純TFE(1容積)中に3mM濃度で溶解した。SEP−1:1[すなわち、1711−GP41]を、6M塩化グアニジウムを含む300mM Naリン酸塩バッファー(pH7.9)2容積中に溶解した。これらの溶液を合わせ、1%v/vチオフェノールを加えた。ライゲーションミックスを室温で一晩攪拌した。この溶液に、β−メルカプトエタノール(上記のTFE容積に対して)3容積、およびライゲーションバッファー(6M塩化グアニジウムを含む300mM Naリン酸塩バッファー。pH7.9)9容積を加えた。この溶液に、0.25×(ペプチドの総合重量)TCEPを加え、溶液をは20分間室温で攪拌した。氷酢酸(0.6容積)を加えて溶液をpH4.0に酸性化し、次にこの溶液を、30容積の6M塩化グアニジウム含有100mM Na酢酸塩pH4.0で希釈し、調製用(C4)逆相HPLCカラムにロードした。すべての非ペプチド物質が溶離されるまでバッファーC(25%)を送液し、次にライゲーション産物を、35−55%のバッファーCのリニアグラジエントによって80分間にわたって精製した。所望のライゲーション産物SEP−1(1−166)(Ψ89,117){SEP−1:1(+GP41)+SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}(配列番号:2)を含むフラクションをエレクトロスプレー質量分析により同定し、プールした。
【0257】
ステップ8:折り返し 完全長の結合されたペプチドSEP−1(1−166)(Ψ89,117){SEP−1:1(+GP41)+SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}[すなわち、1711(GP41)−1712−1713−1776−GP41]を含む組み合わせたフラクションに、固体塩化グアニジウム、1M Trisバッファー(pH8.7)および蒸留水を加え、最終的な溶液を、結合されたペプチドSEP−1(1−166)0.1ミリグラム/ml、6M塩化グアニジウム、100mM Trisあたり0.1ミリグラムとした。この結合されたペプチド(「タンパク質」)溶液を、15ml透析カセット中にロードし、3M塩化グアニジウム、5マイクロモルのシステインおよび2マイクロモルのシスチンを含む100mM Trisバッファー(pH8.5)溶液に対して4℃で一晩透析した。次に、このタンパク質溶液を、1M塩化グアニジウムを含む100mM Trisバッファー(pH8.5)溶液に対して4℃で8時間透析し、最終的に10mM Trisバッファー(pH7.0)に対して4℃で14時間透析して折りたたまれた産物を産生した。透析カセットからの折りたたまれたタンパク質を含む溶液を合わせた。折りたたみは、ES−MS、分析用RP−HPLCおよびCD分光測定法により立証された。
【0258】
ステップ9:精製 折りたたまれたタンパク質を含む溶液を、10mM Tris、pH7.0で平衡化したQ−Sepharaoseイオン交換カラムにロードした。折りたたまれたタンパク質を、125mM NaClへのリニア塩グラジエントを用いて溶離した。所望の折りたたまれた産物SEP−1−B51を含むフラクションを、非還元性SDS−PAGEで同定し、プールした。合わせたフラクションを限外ろ過により濃縮し、約2ミリグラム/1ミリリットルの濃度にし、次に、このタンパク質溶液を2.6×100cmS−300ゲルろ過カラムにロードした。精製されたSEP−1−B51を、10mM TrispH7.0、137mM塩化ナトリウムにより溶離した。高純度SEP−1−B51を含むフラクションを、非還元性SDS−PAGEにより同定し、プールし、凍結し、−80℃で保存した。最終的な精製された折りたたまれたタンパク質SEP−1−B51を、分析用(C4)逆相HPLC、ES−MS、非還元性SDS−PAGE、およびCD分光測定によりキャラクタリゼーションした。図25には、折りたたまれた精製SEP−1−B51の相対分子量を示す代表的な等電電気泳動ゲル(IEF)および非還元性SDS−PAGEゲルを示してある。同じゲル上で走らせた分子量標準を、比較用に示してある。示されるように、非還元性SDS−PAGEにより決定されたSEP−1−B51の相対分子量は73kDaである。相対plは約5.0である。折りたたまれた精製されたSEP−1−B51産物、代表的なRP−HPLCクロマトグラムも示してある。これは、本発明の精密ポリマー修飾タンパク質の純度および増大した相対分子量を例示している。
【0259】
実施例8
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−B52の合成
A.SEP−1−B52の組成
第7の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−1−B52と呼ばれる)を合成した。完全長SEP−1−B52のアミノ酸配列は、SEP−1−B51の配列と同じである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LVKSSQPWΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKΨAIS
PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR(配列番号:2)
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を表し、Koxは、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合を介してカップリングされたオキシムリンカー基によってε−アミノ基において化学的に修飾された非天然リジンを表す。
【0260】
SEP−1−B52タンパク質は、残基24および126において、SEP−1−B51と同様な分岐(Succ−TTD)12−Succ−Alaポリマー構成物で誘導体化したが、この類似体については、ポリマーはピルビン酸とアミノオキシ酢酸との間のオキシム結合を介して付着させた。さらに、リジン残基24および126のε−アミノ基は、レブリンアシル部分の代わりにアミノオキシアセチル官能基を持つように修飾し、分岐(Succ−TTD)12−Succ−Alaポリマー構成物は、ペンダントピルビンアシル部分を持つようにした。これらの変化は、合成および取り扱いを改善し、オキシム結合の安定性をさらに増大させるために設計した。
【0261】
図23は、以下で記載されるようなオキシム形成ライゲーションによってSEP−1−B52に結合される分岐水溶性ポリマーGRFNP43(GP43)の化学合成を例示する概略図である。完全長産物の集合は、実施例2において説明した。SEP−1−B52の構造は図24に示してある。
【0262】
B.分岐鋳型(GRFNP42)へのカップリングのための(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu(GRFNP39)の合成
(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu(GRFNP39)を、0.5mmolスケールで合成した。0.5mmol(−0.5グラム)Sasrin酸不安定性、カルボン酸生成ポリスチレン樹脂(ヒドロキシル置換1.02mmol/g)を、DMF中で15分間膨潤させ、次に排液した。このヒドロキシル官能化樹脂に、DIEA(ジイソプロピルエチルアミン)を500マイクロリットル(3.9mmol)含むDMF8ml中に溶解させた無水コハク酸450mg(4.5mmol)および4−(ジメチルアミノ)ピリジン488mg(4mmol)を加え、30分間渦撹拌により反応させ、次いで排液した。このカップリングを繰り返し、過剰な反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)による1分間の渦洗浄で除去し、排液した。HOOC−CH2CH2CO−O−樹脂(0.5mmol)を、DMF中の新規な1.0M(8mmol)CDI溶液8mlを加えて活性化し、40分間反応させ、次いで排液した。過剰な反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄によって除去し、排液した。は、DMF中の0.5m(2mmol)HOBT溶液4ml中に溶解させたTTD4ml(4グラム、18.2mmol)を加え、30分間渦攪拌によって反応させ、排液した。過剰な反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄によって除去し、排液した。DIEA500マイクロリットル(3.9mmol)を含む8mlの0.5M(4mmol)HOBT(N−ヒドロキシベンゾトリアゾール)溶液中に溶解させた無水コハク酸(450mg、4.5mmol)を樹脂に加え、渦攪拌によって15分間反応させ、次に排液した。これらの3ステップ(CDI活性化、TTDカップリング、無水コハク酸反応)を11回[すなわち、合計12回]繰り返した。過剰な反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、排液した。HOOC−CH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂(0.5mmol)を、DMF中の新規な1.0M(8mmol)CDI溶液8mlで活性化し、40分間反応させ、排液した。過剰な反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、排液した。H−AlaOtBu・HCl 2.5mmolを、DIEA 150マイクロリットル(111mg、0.825mmol)を含むDMF中の0.5M(2.375mmol)HOBT4.75ml中に溶解させ、CDI−活性化されたHOOC−CH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂(0.5mmol)と渦撹拌して1時間反応させ、次に排液した。過剰な反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、次に排液した。産物tertBuOOC−CH(CH3)−NH−OC−CH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂をDCMで徹底的に洗い、排液し、次に樹脂を真空下で一定重量になるまで乾燥した。産物樹脂の典型的な重量は約2グラムであった。
【0263】
直鎖状GRFNP39を、標準的Fmoc−化学手順に従って、DCM中の4%TFAを用いて樹脂支持体から切断した。沈降した粗製産物を、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥されたポリマーを、0.1%TFAを含む少量の50%アセトニトリル水溶液中に溶解し、有機物濃度を1%未満になるまで希釈した。粗製産物を、T=40℃において3%Bで平衡化したC4調製用逆相HPLCカラムにロードした。塩類をイソクラティック溶離し、所望の鋳型を、20−35%バッファーB(0.1%TFA含有アセトニトリル)対0.1%TFA水溶液のリニアグラジエントにより60分以上かけて精製した。所望の(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu物質(GRFNP39)を含むフラクションをES−MSで同定し、凍らせて、凍結乾燥した。
【0264】
C.分岐のための複数のアミン基およびタンパク質(GRFNP42)への(後の)付着のためのペンダントピルビナシル部分を持つ鋳型の合成
鋳型を、Boc−Leu−OCH2−Pam−樹脂上で0.4mmolスケールで手作業により合成した。DMFによる1分間のフロー洗浄ステップを、すべてのカップリング、脱保護および活性化ステップの間で用いた。Boc基を、純(すなわち、100%)TFAで処理して除去した。DMF洗浄後、Fmoc−(Rink−リンカー)−OH 2mmolを、DIEA 1mlを含むDMF 3.8ml中のHBTU 1.8mmolによる活性化後、樹脂にカップリングさせた。Fmoc保護基除去(2×3分間DMF中の20%ピペリジン)後、Fmoc−Lys(MTT)−OH[MTT=4−メチルトリチル]2mmolを、DMF中のDIC 2mmolおよびNHS 2mmolによるNHS−エステル活性化を用いて樹脂にカップリングした。Fmoc基除去(2×1分間DMF中の0.5%DBU)後に、8mlのDIEA 2.2mmolを含む0.5M HOBT溶液中に溶解させた無水コハク酸4mmolを、10分間樹脂にカップリングした。このステップの後、樹脂結合カルボキシル基を、DMF中の新たな0.5M CDI溶液8mlで活性化した。TTD 4mlを、0.5M HOBT溶液4mlに加え、30分間カップリングした。
【0265】
Fmoc−Lys(Fmoc)−OH 2mmolを、DMF中のDIC 2mmolおよびNHS 2mmolによるNHS−エステル活性化を用いて樹脂にカップリングした。Fmoc除去ステップ(2×1分間DMF中の0.5%DBU)後、Boc−Lys(Boc)−NHS 4mmolをDMF 3ml中でカップリングした。
【0266】
MTT保護基はDCM中の2%TFAによる複数回の洗浄により除去した。上澄みがその黄色を失うと脱保護は完了する。樹脂を、DMF中の10%DIEAにより1分間中和した。DMF中のDIC 2mmolおよびNHS 2mmolによるNHS−エステル活性化を用いて、ピルビン酸2mmolを45分間かけて樹脂にカップリングした。鋳型を脱保護し、水5%を含む純TFAを用いて樹脂支持体から切断した。切断溶液を、ロータリーエバポレーター中で乾燥するまで蒸発させた。残基を、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥した鋳型を、0.1%TFAを含む少量の50%アセトニトリル水溶液中に溶解し、有機物濃度が1%未満になるまで希釈した。ピルビン酸塩含有鋳型を、T=40℃において0%バッファーB[すなわち、100%バッファーA=0.1%TFA水溶液]で平衡化したC4調製用カラムにロードした。塩類を、イソクラティック溶離し、所望の鋳型を、5−12%バッファーB対0.1%TFA水溶液のリニアグラジエントにより60分間で精製した。所望の物質(GRFNP42)を含むフラクションを、ESI−MSにより同定し、凍らせて凍結乾燥した。
【0267】
D.アミドカップリングされた分岐ポリマー(GRFNP43)の集合および脱保護
分子量16kDaの分岐(TTD−Succ)49−ポリマーであるGRFNP43を、GRFNP39を精製鋳型GRFNP42にカップリングすることにより合成した。DMSO中に60℃で10mg/mlの濃度で溶解させた精製(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu(GRFNP39)(1.0mmol)を、20倍(モル)過剰のDIEA存在下において、DMSO中の濃度20mg/mlのHATU 0.95molにより活性化した。DMSO中に3.9mg/mlの濃度で溶解させた精製鋳型(0.24mol)GRFNP42を直ちに加えた。反応の進行を、分析用C4逆相HPLCおよびES−MSにより監視した。典型的には、カップリングは数分以内で完了した。ワークアップのため、4容積(ライゲーションミックスに対して)の0.1M酢酸塩/6M塩化グアニジウム、pH4を加え、溶液を調製用(C4)逆相HPLCカラムにロードした。塩類および他の非アミド含有物質をイソクラティック溶離し、所望の分岐ポリマー産物を、20−35%バッファーB(0.1%TFA含有アセトニトリル)対0.1%TFA水溶液のリニアグラジエントにより80分間にわたり精製した。所望の物質を含むフラクションを、ES−MSで同定し、凍らせて凍結乾燥した。
【0268】
結果として得られる精製分岐ポリマー構成物GRFNP43を、純TFA中に1mg/mlの濃度で1時間かけて溶解し、Ala−OtBitertブチルエステル保護を除去した。溶液をロータリーエバポレーター中で乾燥するまで蒸発させ、乾燥ポリマーを、50%バッファーB(0.1%TFA含有アセトニトリル)中に溶解させた。ポリマーを、調製用逆相HPLC上で15%から45%バッファーB対0.1%TFA水溶液のステップグラジエントを用いて80分間で脱塩した。所望の物質(GRFNP43)を含むプールしたフラクションを凍らせて凍結乾燥し、乾燥粉体をオキシム化形成ライゲーションステップに用いた。
【0269】
E.分岐ポリマーGRFNP43によるGRFN1776およびGRFN1711のオキシム形成ライゲーション(オキシム化)
セグメントSEP−1:4およびセグメントSEP−1:1を、実施例2、3、4、および7において上記に記載されるように合成し、ただしレブリン酸の代わりにアミノオキシアセチル(AoA)部分をそれぞれのペプチドセグメント中のLys24およびLys126に、標準的カップリングプロトコルに従って付加した。従って、ペプチド−樹脂の集合後、側鎖Fmoc基が個々のペプチド樹脂から除去され、Bocアミノオキシ酢酸2mmolを、DMF中のDIC 2mmolおよびNHS 2mmolによるNHSエステル活性化を用いて樹脂に付加した。2つのペプチドを、HFを用いて脱保護および樹脂から切断し、C4逆相HPLCにより精製した。カルボニル化合物への暴露を回避するため、適切な予防策を取った。セグメントSEP−1:4およびGRFNP43を共に等モル比率で、0.1%TFA(トリフルオロ酢酸)を含む50%アセトニトリル水溶液中に溶解させた。溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に再溶解させ、調製用C4逆相HPLCカラムにロードした。ポリマー修飾ペプチドを、未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから、調製用グラジエント逆相HPLCにより分離した。所望のオキシム化産物SEP−1:4+GP43を含むフラクションを、ES−MSで同定し、プールした。
【0270】
SEP−1:1およびGRFNP43を共に、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解させた。溶液を凍らせて凍結乾燥した。乾燥粉末を、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に溶解させ、調製用グラジエントC4逆相HPLCカラムにロードした。ポリマー修飾ペプチドを、未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから、調製用逆相グラジエント溶離により分離した。所望のオキシム化産物SEP−1:1+GP43を含むフラクションを、ES−MSにより同定し、プールした。
【0271】
F.合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−B52の合成
SEP−1−B52(配列番号:2)を、以下の4つのポリペプチドセグメントから溶液中で合成した:
セグメントSEP:1:1+GP43(GRFN1711+GRFNP43、配列番号:2の残基1−32に対応)
APPRLICDSR VLERYILEAK EAEKOXITTGCA EH−チオエステル(Lys24は、(KOXにより示されるような)分岐ポリマーGRFNP43にオキシム結合されたAoAペンダント部分を有し、His32はDnp保護されている)
セグメントSEP−1:2(GRFN1712、配列番号:2の残基33−88に対応)
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW−チオエステル(Cys33はAcm保護されており、3つのTrp残基はホルミル保護されている)
セグメントSEP−1:3(GRFN1713、配列番号:2の残基89−116に対応)
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK−チオエステル(Cys89はAcm保護されており、His94はDnp保護されている)
セグメントSEP−1:4+GP43(GRFN1776+GRFNP43、配列番号:2の残基117−166に対応)
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR
GKLKLYTGEA CRTGDR−カルボキシレート(C末端システイン(すなわち、Cys161)は、ピコリル(pico)保護基を有し、Lysq126は、(KOXにより示されるような)分岐ポリマーGRFNP43にオキシム結合されたAoAペンダント部分を有している)
【0272】
付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、折りたたみおよび精製を、実施例1、2、3、4、および7において上記で記載されるように実施して完全長の折りたたまれたSEP−1−B52(配列番号:2)を作り、これを分析用(C4)逆相HPLC、ES−MS、および非還元性SDS−PAGEによりキャラクタリゼーションした。バイオアッセイを、他のSEP構成物について記載されるように実行した。
【0273】
実施例9
SEP−3−L42の効力研究
シトレート・バッファー(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)プラス0.25%ラット血清アルブミン(RSA)中でSEP−3−L42を再処方化し、正常な雄ラット(1群あたりラット5匹)に対し、0、1、5、または10μg/kgの用量で、週3回(tiw)1、3、および6日目に静脈内投与した。最後の注入の4日後(9日目)に血液試料を採取し、血液学的パラメーターについて分析した。これらの用量でのSEP−3−L42の最後の注入の4日後における赤血球(RBC)、ヘモグロビン(HGB)、ヘマトクリット(HCT)、および網状赤血球数(RET)の値には、対照群の値と比較した場合に、統計的に有意な差は全くなかった。
【0274】
実施例10
SEP−3−L42の薬物動態学的研究
シトレート・バッファー(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)プラス0.25%RSA、pH6.9、においてSEP−3−L42を再処方化し、正常な雄ラットに対し、5μg/kgの用量レベルで単一用量として静脈内投与した。投薬から0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144、168時間後に血液試料を採取した。血漿中SEP−3−L42濃度を、メーカーの指示に従い、抗EPO ELISAキット(R & D Systems, Human Erythiropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit #DEP00)により決定した。結果を図27に示する。
【0275】
図27に例示されるように、SEP−3−L42と比較して、SEP−1−B50は若干遅いクリアランスを示す。その循環半減期にもかかわらず、SEP−3−L42は、試験した用量での赤血球産生促進における統計的に有意な差を示さなかった。対照的に、SEP−1−B50は、同じ用量で赤血球産生を刺激した。このことは、薬物動態学的挙動および効力を含むインビボ生物学特性の微調整に、ポリマー構造を利用できることを例示している。
【0276】
実施例11
SEP−1−L30の効力研究
シトレート・バッファー(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)プラス0.25%RSA中でSEP−1−L30を再処方化し、正常な雄ラット(1群あたりラット5匹)に対し、0、1、5、25、または50μg/kgの用量で、週3回(tiw)1、3、および5日目に静脈内投与した。最後の注入の4および8日後(9および13日目)に血液試料を採取し、血液学的パラメーターについて分析した。対照群の値と比較した場合に、SEP−1−L30による処置後のどのような間隔においても、RBC、HGB、およびHCTの値に、統計的に有意な差は全くなかった。網状赤血球数は、25および50μsg/kgで処置したラットの場合に最後の注入から4日後(9日目)には、より高かった(対照群の値と比較した場合に、統計的に有意な差)。SEP−1−L30で処理したどの動物についても、血液学的パラメーターの他の差は、9日目または13日目には全く観察されなかった。[データは示してない]
【0277】
実施例12
SEP−1−L30の薬物動態学的研究
シトレート・バッファー(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)プラス0.25%RSA、pH6.9、においてSEP−1−L30を再処方化し、正常な雄ラットに対し、5または25μg/kgの用量レベルで単一用量として静脈内投与した。投薬から0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144、および168時間後に血液試料を採取した。SEP−3−L42の血漿中濃度を、メーカーの指示に従い、ELISAキット(R & D Systems, Human Erythiropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit #DEP00)により決定した。所定用量におけるどの時点においてもSEP−1−L30は全く検出できなかった。
【0278】
実施例13
SEP−1−B50の効力研究
無菌PBS(リン酸塩緩衝食塩水)プラス0.25%RSA中でSEP−1−B−50を再処方化し、正常な雄ラット(1群あたりラット5匹)に対し、0、1、5、25、または125μg/kgの用量で、週3回(tiw)1、3、および6日目に静脈内投与した。最後の注入の4、9および14日後(10、15および20日目)に血液試料を採取し、血液学的パラメーターについて分析した。データを表VIIIに示す。5、25および125μg/kgのSEP−1−B50を投与した動物については、最後の注入から4日後(10日目)に、増加したRBC、HGB、HCT、およびRETに用量関連応答が観察された(対照群の値と比較した場合に、統計的に有意な差)。これらの動物のRBC、HGB、およびHCTは、15日目の対照値よりも高いままであり、125μg/kgで処置した動物の場合に20日目(最後の注入から14日後)まで対照群の値と比較した場合に若干高く継続した。RET産生は、10日後には減少し、25および125μg/kg動物の場合に15および20日目は有意に低い値を示す。表VIII
SEP−1−B50の多重用量後の血液学所見
【表7】
【0279】
実施例14
SEP−1−B50の薬物動態学的研究
シトレート・バッファー(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)プラス0.25%RSA、pH6.9、においてSEP−1−B50を再処方化し、正常な雄ラットに対し、5または25μg/kgの用量レベルで単一用量として静脈内投与した。投薬から0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144、168時間後に血液試料を採取した。SEP−1−B50の血漿中濃度を、メーカーの指示に従い、ELISAキット(R & D Systems, Human Erythiropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit #DEP00)により決定した。排出半減期は、5および25μg/kg用量について、それぞれ9.7および9.9時間であると決定された。観察されたMRT(平均滞留時間)は、5および25μg/kg用量について、それぞれ13.9および14.4時間であった。SEP−1−B50の代表的な薬物動態学的側面を図27に示す。
【0280】
実施例15
SEP−1−B51の効力研究
SEP−1−B51を、2つの実験において正常な雄ラットに静脈内投与した。
【0281】
実験1:シトレート・バッファー(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)プラス0.25%RSA中でSEP−1−B51を再処方化し、正常な雄ラット(1群あたりラット5匹)に対し、0、1、5、または25μg/kgの用量で、週3回(tiw)1、3、および6日目に静脈内投与し、最後の注入の4、9および14日後(10、15および20日目)に血液学的パラメーター分析用に血液試料を採取した。データを下記の表IXに示す。SEP−1−B51の3回目にして最後の静脈内注入の4日後(10日目)、対照群の値と比較して、RBC、HGB、HCT、および絶対網状赤血球数(ART)における統計的に有意な増加が、25μg/kg SEP−1−B51を投与した動物について観察された。これらの動物についてのRBC値は、15日目には対照値より高いままであり、20日目には対照値と同程度であった。網状赤血球産生は、10日後に減少し、15日目には5および25μg/kg動物について有意により低い値が観察された。
表IX
SEP−1−B51の多重用量後の血液学所見
【表8】
【0282】
実験2:シトレート・バッファー(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)プラス0.25%ヒト血清アルブミン中でSEP−1−B51を再処方化し、雄ラット(1群あたりラット5匹)に対し、0、1、5、または25μg/kgの用量で、週3回(tiw)1、3、および5日目に静脈内投与し、最後の注入の2、4および6日後(7、9および11日目)に血液学的パラメーター分析用に血液試料を採取した。さらに、ヘマトクリットのみの測定用[充填赤血球量(PCV)として]の血液試料を残りの研究日(2、3、4、5、6、8、10、12、および13日目)に毎日採取した。データを表Xに示す。HCT(PCVまたは計算された)値は、5および25μg/kgを投与した動物の場合に、最初の注入から2日後(3日目)から有意に増加し、3回目にして最後の注入の6日後(11日目)まで継続した。RBCおよびHGBも、5および25μg/kgを投与した動物の場合に、測定した日(最初の投与の2、4、および6日後、7、9、および11日目)に有意に増加した。ARTは、25μg/kgの群の場合にのみ、最後の投与の2日および4日後(7および9日目)に有意に増加した。
表X
SEP−1−B51の多重用量後の血液学所見
【表9】
【0283】
追加のラット群を、SEP−1−B51の25μg/kgでの単一静脈内用量で処置し、血液学的パラメーターの分析のために、注入の48時間後に血液試料を採取した。ヘマトクリットのみの測定用(充填赤血球量として)の血液試料を、注射後、8、24、および72時間後、ならびに7日後(1、2、4、および8日目)に採取した。SEP−1−B51で静脈内的に処置したラットの場合のHCT、HGB、およびARTの値は、3日目(注入の2日後)に対照動物の値よりも高く(統計的に有意)、HCTも、これらの動物において4日目に有意に増加した。
【0284】
実施例16
SEP−1−B51についての赤血球増加および低酸素モデルにおける効力研究 それぞれ10匹の正常なマウスの群(媒介物対照、4つの用量レベルでCHO−細胞(「rhEPO」)中で産生した組換えグリコシル化ヒトエリスロポエチン、および4つの用量レベル、すなわち100mU/ngを想定した0.32、1、5、25μg/kg/用量、SEP−1−B51)を、模擬高高度室内で20日間、506.5mbに保った大気空気に1日あたり18時間曝した。シトレート・バッファープラス0.25%ヒト血清アルブミン中で処方化したrhEPOまたはSEP−1−B51を200μL−容積、低酸素後4日目に静脈注射(IV)した。2日後、各マウスに0.2μCiの59Feを腹腔内注射(i.p..)した。RBC−放射性鉄取込みは、3日後、心臓穿刺により採取した血液500μL中に存在する放射能量を測定することによって評価した。
【0285】
SEP−1−B51およびrhEPOの場合の72時間RBC−59Fe取込み(用量の%)により、5μg/kgまでの用量の増加に伴って増加した59Fe取込みにおける明確な用量関連応答が示され、前記用量以上で応答は頭打ちになる(25μg/kg)。従って、3つの最低用量レベルを、線形回帰を計算するために用いた。SEP−1−B51およびrhEPOの線形回帰分析を図28に示す。SEP−1−B51およびrhEPOの応答は本質的に同じであった。SEP−1−B51のrhEPOに対する「効力比」は、1.0035(0.6947〜1.4498の95%信頼区間)であり、このアッセイにおいて決定されたSEP−1−B51の効力は、100mU/ngであった(69〜145の95%信頼区間)。
【0286】
SEP−1−B51は、rhEPOのインビボ活性と同様の活性を示し、用量依存的に作用し、このモデルにおけるrhEPOの場合に典型的なネガティブフィードバック機構の誘発に起因するより高用量におけるプラトー応答が含まれる。このことは、SEP−1−B51分子の精密なユーザー定義グリコシル化部位に付着させられたポリマー構造が、rhEPOの糖鎖により付与されるインビボ活性を模倣することを例示している。
【0287】
実施例17
SEP−1−B51の薬物動態学的研究
シトレート・バッファープラス0.25%ヒト血清アルブミン、あるいはrhEPO(500U/kgに等価)中で処方化したSEP−1−B51を5μg/kgの単一用量で正常な雄ラット群に静脈内投薬し、この群を、投薬から5、30、60分、2、4、8、および24時間、さらに2、3、4、5、6、および7日後に採血した。血漿試料中のSEP−1−B51またはrhEPOの濃度を、メーカーの指示に従って、R&Dシステム部抗EPOELISAキット(R & D Systems, Human Erythropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit #DEP00)を用いたアッセイにより決定した。
【0288】
濃度の対数の最小二乗法分析を実行し、以下の表XIに記載の薬物動態学的パラメーターを得た。5μg/kgの単一静脈内投薬を受けた雄ラットにおけるSEP−1−B51の血漿中濃度における経時的変化は、半減期が10.5±0.5時間の単一指数薬物動態学的性質関数により説明できた。SEP−1−B51についての中央区画の分布容積(Vc)は、32.5±2.0mL/kgであった。クリアランス(CL)は2.15mL/時/kgで、平均滞留時間(MRT)15.1±0.7時間であった。比較すると、5μg/kgの静脈内投薬を受けた雄ラットにおけるrhEPOの血漿中濃度における変化は、α半減期が1.24±0.22時間でβ半減期が5.51±0.40時間の両側指数薬物動態学的性質関数を使って最もうまく説明された。rhEPOについてのVcは57.0±3.2mL/kgであった。CLは、16.0±0.5mL/時/kgで、SEP−1−B51の値より約8倍大きい。rhEPOの平均滞留時間(MRT)は、5.73±0.17時間で、SEP−1−B51の値より約3倍短い。
表XI
rhEPOと比較したSEP−1−B51の薬物動態学的パラメーター
【表10】
【0289】
SEP−1−B51およびrhEPOの血漿クリアランスは図29に示してある。これらのデ−タにより、グリコシル化組換えヒトEPOと比較してSEP−1−B51の循環半減期が有意に増加すること、さらに、この増加は、分子中の精密なユーザー定義部位に付着させられたポリマー構造に起因していることが示される。
【0290】
本発明は、その特定の実施形態に関して説明を行ってきたが、本発明はさらなる変形が可能であること、および本願は、本発明のどのような変更例、利用または改変をも対象として含み、さらに本発明が関連する技術内において公知の、または通例の実施方法の範囲に入るような、また上述の本質的特徴に適応し得るような本開示からの逸脱を含むことが理解されるであろう。
【0291】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1A】
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を調製するためのプロセスの概要を示す。
【図1B】
図1Aと同様な図である。
【図1C】
図1Aと同様な図である。
【図1D】
図1Aと同様な図である。
【図1E】
図1Aと同様な図である。
【図2A】
本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質を調製するためのプロセスの概要を示す。
【図2B】
図2Aと同様な図である。
【図2C】
図2Aと同様な図である。
【図3A】
3つ以上の非重複ペプチドセグメント、すなわち少なくとも1つのセグメントが最終的な完全長化学的ライゲーション産物に対応する中間セグメントである、化学的ライゲーションを伴うマルチセグメントライゲーションのためのプロセスの概要を示す。
【図3B】
図3Aと同様な図である。
【図4A】
天然型化学的ライゲーションおよび結果として得られる側鎖チオールの化学修飾を例示する。
【図4B】
図4Aと同様な図である。
【図4C】
図4Aと同様な図である。
【図5A】
本発明の水溶性ポリマーU−B−ポリマー−J*の分岐核(B)および一意的化学選択的官能基(U)を生成させるための固相プロセスを示す。
【図5B】
図5Aと同様な図である。
【図6A】
U−B核へのその後の付着のための本発明の好ましい実質的に非抗原性水溶性ポリアミドポリマー−J*成分を生成するための固相プロセスを示す。
【図6B】
図6Aと同様な図である。
【図6C】
図6Aと同様な図である。
【図6D】
図6Aと同様な図である。
【図7】
U−B成分をポリマー−J*成分にカップリングして式U−B−ポリマー−J*の本発明の好ましい合成ポリマー構成物を生成するためのプロセスを示す。
【図8】
本発明の赤血球産生刺激合成タンパク質のライゲーションおよび産生に使用可能なペプチドセグメントへの水溶性ポリマーの精密付着のための代替経路を示す。
【図9】
本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質調製の全体的プロセスを例示する。
【図10】
好ましいタイプの合成赤血球産生刺激タンパク質の基本構造を示す。pPEG=「精密PEG」
【図11】
再配置されたアミノおよびカルボキシ末端を有する円形に並べ替えられたSEP類似体の一般構造を示す。
【図12A】
好ましい水溶性ポリマー、およびその種々の直鎖および分岐構成物の構造を示す。
【図12B】
図12Aと同様な図である。
【図12C】
図12Aと同様な図である。
【図12D】
図12Aと同様な図である。
【図13】
分岐鎖pPEGポリマーの形成を概略的に示す。
【図14A】
SEP−1−L30と呼ばれる合成サイトカインの合成を示し、これは実施例2において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図14B】
図14Aと同様な図である。
【図14C】
図14Aと同様な図である。
【図14D】
図14Aと同様な図である。
【図14E】
図14Aと同様な図である。
【図15】
SEP−1−L30と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例2において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図16】
SEP−1−L26と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例3において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図17A】
SEP−1−B50と呼ばれる合成サイトカインに付着させられる好ましい分岐鎖水溶性ポリマーの形成を概略的に示し、これは実施例4において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図17B】
図17Aと同様な図である。
【図18】
SEP−1−B50と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例4において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図19A】
SEP−3−L42と呼ばれる合成サイトカインの合成を示し、これは実施例5において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図19B】
図19Aと同様な図である。
【図20】
SEP−3−L42と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例5において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図21A】
実施例7において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体であるSEP−1−B51と呼ばれる合成サイトカインに付着させるための好ましい水溶性ポリマーの合成を示す。
【図21B】
図21Aと同様な図である。
【図22】
SEP−1−B51と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例7において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図23A】
実施例8において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体であるSEP−1−B52と呼ばれる合成サイトカインに付着させるための好ましい水溶性ポリマーの合成を示す。
【図23B】
図23Aと同様な図である。
【図24】
SEP−1−B52と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例8において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図25】
実施例2〜5および7〜8において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体についての代表的分析データを示す。示されるように、代表的な等電点ゲル(IEF)および非還元SDS−PAGEゲルは、折りたたまれ精製されたSEP−1−B51の相対的なモノマー分子量を明示する。
【図26】
SEP化合物SEP−0、SEP−1−L26、SEP−1−L30、SEP−1−B50、SEP−1−B51およびSEP−3−L42の因子依存性細胞系のインビトロ活性を示す。
【図27】
SEP−3−L42およびSEP−1−B50のナノグラム/ミリリットル(ng/ml)で表した血漿中濃度を時間(hours)で表した期間と比較したときの代表的な薬物動態学的側面を示す。
【図28】
SEP−1−B51および低酸素ラットモデルにおけるCHO−細胞(「rhEPO」)中で作られた組換えグリコシル化ヒトエリスロポエチンについて、72時間赤血球(RBC)−59Fe取込み(投与量の%としての)により測定したインビボ活性の線形回帰分析を示す。
【図29】
各化合物について5μg/kgの単一IV投与量に続いて、SEP−1−B51およびrhEPOのng/mlで表した血漿中濃度を時間(hours)で表した期間と比較したときのラットにおけるクリアランスについての代表的な薬物動態学的側面を示す。
【図30】
円形に並べ替えられたポリマー修飾SEP構成物を示す。
(技術分野)
本発明は、定義された方法でポリマー修飾される合成赤血球産生刺激タンパク質、ならびに製造方法および使用方法に関する。
【0002】
(関連出願への相互参照)
本出願は、米国特許出願第60/231,330号(2000年9月8日出願)および同第60/236,377号(2000年9月29日出願)の一部継続出願であり、そのどちらも参照により本明細書に全体が組み入れられる。
【0003】
(背景技術)
赤血球産生は、赤血球の代謝回転および損失を調節するために生じる赤血球産生のためのプロセスである。エリスロポエチン(EPO)は、赤血球産生を刺激するタンパク質ホルモンである。自然発生ヒトEPOは、主として腎臓中で作られて血流中へ分泌される165個のアミノ酸を含む糖タンパク質であり、骨髄中の前駆細胞からの赤血球産生を刺激する。ヒトEPOをコード化している遺伝子は、166個のアミノ酸残基を有する分子を予測するけれども、カルボキシ末端アルギニンは、その成熟形における翻訳後修飾において除去される。
【0004】
グリコシル化ヒトEPOは、位置24、38、および83に付着した(attached)3つのN結合糖鎖を有している。これは、位置126に存在するO結合糖部分も有している。グリコシル化の影響は複雑である。非グリコシル化EPOは、インビトロで活性がある。しかしながら、インビボでの完全活性についてはグリコシル化が必要であることが研究により明らかになっている。可変グリコシル化パターンが可変的効果を示すことも研究により明らかになっている。例えば、脱シアル酸化EPOは、インビトロ活性の増加とインビボ活性減少の両方を示し、これは肝細胞によって、認識、結合および除去されるガラクトース残基の露出に帰される効果である。完全シアル酸化されたEPOの分岐パターンも、生物活性に違いを作り出すことが明らかにされている。主に四本触覚型の分岐EPOは、「標準」EPOと同等の活性示し、それに対して主に二本触覚型の分岐EPOはインビトロでは3倍の活性を示すが、インビボでは正常活性の15%を示すにすぎない。さらに、EPO機能においては、O結合型ではなくN結合型糖類が重要であることが様々な研究により示されている。
【0005】
組換えにより作られたグリコシル化EPOを含有するいくつかの薬剤が利用可能である。しかしながら、現在利用可能なEPO製剤は、それらの血漿半減期が短いことおよびプロテアーゼ分解に対する感受性により制限される。それらは、各N結合グリコシル化部位および部位間で生じる分岐およびシアル酸含有量における高度の不均一性に起因する種々のグリコフォームの複雑な混合物も含んでいる。これらの欠点により、これらの製剤が最大の臨床効力を達成することが妨げられてきた。
【0006】
そのようなEPOタンパク質の循環半減期およびその他の特性を改善するため、PEG(ポリエチレングリコール)のような水溶性ポリマーが付着されてきたが、制御されたやり方でかつユーザー定義された精密さでポリマーを付着させることが困難であることを考えると、結果はまちまちであった。例えば、PEGのようなポリマー部分および関連ポリマーを、タンパク質上に見出される反応基へ付着させるために各種の方法が用いられてきた(米国特許第4,179,337号(Davis et al.)、および米国特許第4,002,531号(Royer)参照)。概説については、「薬としての酵素」(J. S. Holcerberg and J. Roberts, eds. pp. 367−383(1981))のAbuchowski et al.およびZalipsky, S.(Bioconjugate Chemistry(1995)6:150−165)を参照されたい。タンパク質を修飾するためにPEGおよびその他のポリマーを使用することも、Cheng, T.−L. et al., Bioconjugate Chem.(1999)10: 520−528; Belcheva, N. et al., Bioconjugate Chem.(1999)10: 932−937; Bettinger, T. et al., Bioconjugate Chem.(1998)9:842−846; Huang, S.−Y. et al., Bioconjugate Chem.(1998)9:612−617; Xu, B. et al. Langmuir(1997)13:2447−2456; Schwarz, J. B. et al., J. Amer. Chem. Soc.(1999)121:2662−2673; Reuter, J. D. et al., Bioconjugate Chem.(1999)10:271−278; Chan, T.−H. et al., J. Org. Chem.(1997)62:3500−3504により論じられている。タンパク質中の典型的な付着部位として、リジン残基上またはN末端におけるような第一アミノ基、システイン側鎖上におけるようなチオール基、およびグルタミン酸またはアスパラギン酸残基上またはC末端におけるようなカルボキシル基が含まれる。最も一般的な付着部位のいくつかは、糖タンパク質の糖残基、システインまたは標的タンパク質のN末端およびリジンである。
【0007】
EPOへのポリマーのコンジュゲーション(接合)について多くの様々な方法が記載されてきたが、コンジュゲーションプロセスには、厄介な問題が無いわけではない。コンジュゲーション反応により引き起こされる生物活性損失を制限するように注意しなければならない。例えば、付着部位数を最小限にするため、折りたたみまたは再生されたタンパク質が一般的に用いられる。しかしながら、活性化されたポリマーのあまりに多くが標的タンパク質またはポリペプチドに付着すると、生物活性はひどく減少したり失われたりすることがある。同様に、ポリマーをタンパク質に結合する不適切なリンカーが用いられるか、または不十分な量のポリマーが標的に付着されると、結果として生じるコンジュゲートの治療効果が限定されることがあり、さらにその生物活性における損失を補うのに十分な循環寿命の増加を示さないことがある。修飾ポリマーによりタンパク質の活性部位が遮断される結果としても問題が生じ得る。ポリマーとタンパク質は、一般に溶液ベースの反応で結合されるので、この問題は回避困難なことがある。ピリドキサールリン酸のような物質で活性部位をプレブロックすることが提案されてきたが、結果は矛盾したものであった(米国特許第4,179,337号(Daviset al.)参照)。これらの問題は、より低分子量のタンパク質およびペプチドの場合に特に深刻であり、これらは生物活性と関連しない付着部位をしばしばほとんど持たない。
【0008】
例えば、一般的な技法は、水溶性ポリマーを標的タンパク質中の第1アミンに付着させるというものであった(例えば、リジンのN末端アミノ基およびε−アミノ基)。チオール反応性ポリマーコンジュゲートも、ポリマーをシステインのチオール側鎖に付着させるために用いられてきた。ほとんどのタンパク質が、タンパク質の活性、折りたたみ、再生および安定性を定義する場合に重要な役割を果たすポリペプチド主鎖の様々な領域上に展開されたそのような反応性基の多数のコピーを含んでいるので、両方の方法とも重大な問題がある。従って、広範に用いられてはいるが、そのような方法には、タンパク質の生物活性における多少とも不完全または望ましくない減少があること、ならびに分離および特徴付けが困難な通常は複雑な混合物である、という問題がある(Delgada et al., Pharmaceutical Sciences(1997)3:59−66)。
【0009】
ランダムな付着を減らす試みにおいて、ポリマー付着の所望部位にリジンを付加すると共に天然リジンを除去したタンパク質が作られた(米国特許第4,904,584号)。例えば、G−CSFおよびIL−2がこの方法で修飾された。ランダムな付着を回避する他の試みは、ポリマー付着の所望部位に天然システインを付加すると共にシステインを除去するか、あるいはもし存在したとても天然システインを除去せずにシステインを付加したタンパク質を作ることであった(EP0668353号)。例えば、EPOはこの方法で作られた。そのようなシステインまたはリジン変異体により部位特定的ポリマー付着が理論上可能になるのに対し、すべての選ばれた部位が制御されたやり方で修飾できるという保証は依然として皆無である。
【0010】
多数のアミノ酸を含むタンパク質を、同じまたは類似した反応性官能基を持つ側鎖で部位特異的に修飾することができないので、最近の試みはタンパク質のアミノまたはカルボキシ末端の修飾に向けられてきた。アミノまたはカルボキシ末端の修飾は、これらの部位を一意的に修飾するいくつかの化学的コンジュゲーション手法の能力に依存してきた(WO90/02136号およびWO90/02135号)。例えば、この手法は、G−CSFおよびケモカインIL−8のN末端残基へのPEG鎖の付着に利用された(Gaertner et al., Bioconjug. Chem.(1996)7(1):38−44、およびWO96/41813号)。しかしながら、NまたはC末端の修飾により、タンパク質の活性は一般的に減少する(例えば、G−CSFのN末端およびリジン側鎖へのPEGの付着を論じている米国特許第5,985,265号参照)。水溶性ポリマーによるタンパク質修飾に伴う欠点にもかかわらず、PEG化および他の水溶性ポリマーのタンパク質への付着が追求され続けている。例えば、エリスロポエチン(EPO)の糖鎖およびリジンのような内部アミノ酸(EP0605963号およびWO00/32772号)、ならびにN末端(米国特許第6,077,939号およびWO00/32772号)へのPEGの付着も記載されている。あいにく、そのようなPEG化EPOは、分離および特徴付けが困難な複雑な混合物という結果になる。
【0011】
別の問題は、上記のポリマーが高度に非均質であり、これによりポリマー修飾タンパク質混合物の分析的キャラクタリゼーションおよび精製が困難になることである(Delgada et al., Pharmaceutical Sciences(1997)3:59−66)。例えば、PEGまたはPEGベースの鎖を調製するために用いられる手法は、それが3400程度のかなり低い相対分子量のものであっても、制御が不十分な重合段階を伴い、これにより調製品は平均値の回りに広がる鎖長を有することになる。すなわち、それらの手法は、nが離散的な値ではなく、むしろ平均値付近の範囲にある値を有する(CH2CH2O)nのポリマー調製品を伴う。結果として得られる誘導タンパク質の異質性は、しばしば、同定ましてや分離が容易にできない特性の範囲を伴う。
【0012】
しかしながら、あいにくなことに、適切なポリマーを同定し使用することの問題は、治療的用途に現在用いられるすべてのEPOタンパク質が組換えDNA技術から誘導されるという事実によって悪化する。組換えDNA技術の使用により、性能強化部分と組換えにより産生されたEPOタンパク質との間に形成され得る結合のタイプおよび特異性に厳しい制限が課される。これは、第一に、結合に適した官能基の数がごく限られているからであり、第二に、修飾されているタンパク質中に一般に反応性官能基のコピーがいくつかあり、従って、修飾のどのような特異性も不可能にるからである。例えば、超酸化ジスムターゼとPEGとの非選択的コンジュゲーションの場合には、修飾された酵素のいくつかのフラクションが完全に不活性であった(P. McGoff et al., Chem. Pharm. Bull.(1988)36:3079−3091)。また、もし異なる数のそのような部分がランダムに付着されれば、治療的タンパク質の薬物動態学は正確に予測できず、投薬は大きい問題になるであろう。付着を制御できないことにより、さらに、(a)効力の減少、(b)誘導体の膨大な混合物を分離するための手の込んだ精製の必要および(c)修飾部分のことによると不安定な付着という結果につながる。また、トレシルクロイドベース結合のような、技術的に既知のいくつかの結合が免疫原性であることも知られている。
【0013】
従って、循環半減期を改善し、タンパク質分解および免疫原性を減少させ、さらに生物学的に産生されたタンパク質の他の特性を改善するため、PEGのような水溶性ポリマーを付着させ得るが、それらを制御された方法でかつユーザー定義された精度で付着させることが困難であることを考えれば、結果はまちまちである。また、正確なユーザー定義された部位でのポリマー付着は成果が限られているので、タンパク質に一般に適用可能である好適な付着部位についてはほとんど知られていない。さらに、付着の確率性、およびそのような目的のために現在使用されているPEGおよび他の水溶性ポリマーのヘテロ分散的性質により、PEG−タンパク質コンジュゲートの精製および分析的特徴付けは困難であった。従って、再現可能な付着制御が不十分ということとポリマーの不均一性とが組み合された問題により、治療法としてのポリマー修飾タンパク質のルーチン的な承認は厳しく妨げられてきた(1970年代初期に導入されたにもかかわらず、治療的使用について承認されたものは現在までのところごくわずかである)。
【0014】
従って、組換えDNA技術ならびに天然および組換えにより産生されたEPOを修飾するために用いられるポリマー技術とは異なる生物活性赤血球産生刺激タンパク質を製造する方法に対するニーズが存在する。臨床特性を改善した赤血球産生刺激タンパク質も必要とされる。本発明はこれらおよびその他のニーズを満たすものである。
【0015】
(発明の開示)
本発明は、合成赤血球産生刺激タンパク質、それらの製造方法および使用方法に関する。特に、本発明は、1つ以上の水溶性ポリマーが付着させられた合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられる。本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質を含む製剤組成物も提供される。
【0016】
本発明はさらに、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質で哺乳動物を治療する方法にも向けられる。1つの実施態様においては、哺乳動物のヘマトクリット値を増加させるための方法が提供される。別の実施態様においては、哺乳動物における赤血球産生を増加させるための方法が提供される。別の実施態様は、哺乳動物のヘモグロビンを増加させる方法に向けられる。さらなる実施態様は、哺乳動物における網状赤血球数を増加させるための方法に向けられる。これらの方法は、所望の効果を達成するために本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を哺乳動物に有効量投与することを含む。
【0017】
好ましいポリマー修飾形態および中間体を含む、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質の製造方法も提供される。この方法は、合成赤血球産生刺激タンパク質のポリペプチド鎖の非重複アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合することを含み、それにより合成赤血球産生刺激タンパク質を含むポリペプチド鎖が産生される。
【0018】
(発明を実施するための最良の形態)
本発明は、合成赤血球産生刺激タンパク質、生産方法および使用方法に関する。
【0019】
I.本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質
好ましい実施形態において、本発明は、1つ以上の水溶性ポリマーを付着して有する合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられる。「赤血球産生刺激タンパク質」は、エリスロポエチン依存性細胞株の成長を促進するインビトロ生物活性を有するタンパク質を意味する。好ましい実施形態においては、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、赤血球産生を促進するインビボ生物学活性を有する。タンパク質の赤血球産生刺激活性は、インビボ投与後に赤血球産生を追う、EPO依存性細胞株の増殖を仲介するタンパク質の能力をアッセイする等、の各種の手段のいずれかにより決定できる。
【0020】
「水溶性ポリマー」は、水に可溶性の実質的に非抗原性ポリマーを意味している。
【0021】
本明細書中で用いられているように、タンパク質は、そのアミノ酸残基のいくつか、最も好ましくはそのすべてを重合させるために非組換え技術が使用されていれば「合成」であると言われる。用語「非組換え技術」は、有機化学および他の合成重合方法を伴う技術を、インビボあるいはインビトロにおいてタンパク質中へのRNAの翻訳を伴う技術から区別することを意図している。合成タンパク質は、完全合成および半合成タンパク質を含んでいる。完全合成タンパク質は、すべてのライゲーション成分が、化学合成すなわちリボソーム不使用(ribosomal−free)合成による人工的なものである場合に生産される。半合成タンパク質は、ライゲーション成分の少なくとも一部が、生物学的合成、すなわち細胞翻訳系または細胞不使用(cell−free)翻訳系中でリボソームによって作られ、別の部分は化学合成により作られて生産される。
【0022】
好ましい実施形態においては、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、リボソーム特定(ribosomally specified)エリスロポエチンのアミノ酸配列、および1つ以上の化学的ライゲーション部位により共有結合的に結合された1つ以上の非重複ペプチドセグメントを有するポリペプチド鎖を含む。最も好ましくは、エリスロポエチンは哺乳動物のものであり、より好ましくはヒトのものまたはそれらの誘導体である。例えば、多くのエリスロポエチンのアミノ酸配列が知られており、ヒトエリスロポエチンについては、その多くの活性変異体が作られており(例えば、米国特許第5,856,298号、第5,955,422号、第8,888,772号、第5,858,347号、第5,614,184号、第5,457,089号、第6,077,939号、およびWO00/32772号参照)、従って、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、そのようなアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含み得る。
【0023】
好ましい実施形態においては、リボソーム特定エリスロポエチン(ribosomally specified erythropoietin)は、1つ以上のグリコシル化部位を含み、水溶性ポリマーは、リボソーム特定エリスロポエチンの1つ以上のグリコシル化部位に対応する1つ以上の部位において合成赤血球産生刺激タンパク質のポリペプチド鎖に付着させられる。より好ましい実施形態においては、水溶性ポリマーは、1つ以上のそのようなグリコシル化部位に対応する1つ以上の部位でポリペプチド鎖に排他的に付着させられる。本発明のこの観点は、リボソーム特定エリスロポエチンが組換えにより作られる合成赤血球産生刺激タンパク質を含んでいる。従って、リボソーム特定エリスロポエチンは、天然エリスロポエチンまたは非天然エリスロポエチンとすることができ、後者は1つ以上の非天然グリコシル化部位をさらに含み得る。
【0024】
「グリコシル化部位」は、タンパク質の一つのアミノ酸配列を意味し、この配列は、そのタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基の側鎖へのオリゴ糖(炭水化物)鎖の酵素的付着をコード化するものであり、N結合またはO結合グリコシル化部位がよい例である。ポリマー修飾のための残基部位が位置的に同じなので、1つ以上のそのようなグリコシル化部位を除去するために変異されたエリスロポエチンが「グリコシル化部位」の定義に含まれることが理解されるであろう。「自然発生グリコシル化部位」は、自然状態で見い出されるエリスロポエチン糖タンパク質のグリコシル化部位を意味する。「非自然発生グリコシル化部位」は、エリスロポエチン中に設計されたグリコシル化部位を意味する。例えば、組換えヒトEPOがこの方法で設計されている(例えば、米国特許第5,856,298号参照)。
【0025】
本発明のこの実施形態は、ヒトエリスロポエチンのポリペプチド鎖を有する合成赤血球産生刺激タンパク質がその1つ以上のグリコシル化部位において本明細書中に記載されるような水溶性ポリマーで修飾される場合に、その水溶性ポリマーは、相当する自然発生エリスロポエチン糖タンパク質中の当該位置に通常見出される糖鎖に帰される生物学的効果の1つ以上を活用するために利用できるという知見に部分的に基づいている。そのような生物学的効果には、プロテアーゼ耐性、免疫原性、レセプター特異性、比活性、効力および薬物動態学の調節が含まれる。しかしながら、糖鎖の存在を排除し、これを本発明の好ましい水溶性ポリマーと置き換えることにより、糖鎖のペンダントシアル酸残基が除去された場合のような酵素分解およびクリアランス、不安定性、限定された循環半減期、分布、低いハンドリング特性等の回避が含まれる大きな利益がもたらされる。重要なことには、本発明のそのようなポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、未修飾の対応する合成タンパク質と比較した場合に、生物活性の損失が実質的にないのでそのような有利な生物学的特性を保持し、合成タンパク質のモノマー分子量が25kDa以上である場合でさえも生物活性が増加することも見出されている。
【0026】
従って、別の好ましい実施形態においては、本発明は、リボソーム特定エリスロポエチンのアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を含む合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられ、そこでは、ポリペプチド鎖は、それに付着させられた1つ以上の水溶性ポリマーを有しかつモノマー分子量が25kDa以上であり、さらに合成赤血球産生刺激タンパク質は、前記水溶性ポリマーを欠いたポリペプチド鎖を有する対応する合成タンパク質と同等か上回る生物活性を備える。生物活性は、インビトロ、インビボまたはその両方であり得る。好ましい実施形態においては、生物活性はインビボである。別の好ましい実施形態においては、本発明は、リボソーム特定エリスロポエチンのアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を含む合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられ、そこでは、ポリペプチド鎖は、そ1つ以上の水溶性ポリマーを付着して有しかつモノマー分子量が25kDa以上であり、さらに合成赤血球産生刺激タンパク質は、リボソーム特定エリスロポエチンと同等か上回る生物活性を備える。ここでも、生物活性は、インビトロ、インビボまたはその両方であり得る。好ましい実施形態においては、生物活性はインビボである。最も好ましくは、そのようなポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、それに付着させられた不連続な数の水溶性ポリマーを有するであろう。
【0027】
「化学的ライゲーション部位」は、第1のペプチドまたはポリペプチドのN末端アミノ酸および第2のペプチドまたはポリペプチドのC末端アミノ酸を意味し、これらは、化学的ライゲーションにより、その間で非可逆的共有結合を形成するか形成する能力がある。本明細書中で用いられているように、「化学的ライゲーション」は、2つの化学的部分の共有結合を伴う化学選択的反応を言い、それぞれの部分は、他方と非可逆的共有結合を一意的に形成する相互に反応性の官能基を有する。化学的ライゲーションは、(1)一意的な反応性C末端基を有する第1のペプチドまたはポリペプチドと、(2)一意的な反応性N末端基を有する第2のペプチドまたはポリペプチドとの共有結合的ライゲーションを含み、そこでは、C末端およびN末端反応基がその間で非可逆的共有結合を形成する。特に、化学的ライゲーションには、未保護ペプチドセグメントのライゲーションに適用し得る任意の化学選択的反応化学が含まれる。
【0028】
水溶性ポリマーについては、好ましい水溶性ポリマーは、以下の式により表すことができる。
Un−s1−B−s2−ポリマー−s3−J*
【0029】
Uは、合成赤血球産生刺激タンパク質のポリペプチド鎖に共有結合された唯一の官能基の残基である。特に、U基は、合成赤血球産生刺激タンパク質の1つ以上の非重複ペプチドセグメントの1つ以上のアミノ酸の側鎖nの相互に反応性の唯一の官能基と結合されており、そこではnは1〜6の整数である。より好ましくは、側鎖nは1〜4の整数であり、最も好ましくは1〜2である。本明細書中で使われているように、用語「アミノ酸」は、遺学伝的にコード化された20個のアミノ酸、天然に見出される稀なまたは異常なアミノ酸、および時々、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に関連する場合にアミノ酸残基と呼ばれることもある不規則アミノ酸のような任意の非天然的に生じるアミノ酸を意味する。Uおよび側鎖nの好ましい実施形態は、一意的な相互に反応性の基から形成された共有結合であり、そこではそのような結合は、オキシム、アミド、アミン、ウレタン、エーテル、チオエーテル、エステル、ヒドラジド、オキサゾリジン、チアゾリジン、チオエーテル、エーテル、およびエステルから選ばれる。最も好ましいUおよびn結合は、Uが、アミド、オキシム、チオエステル、ヒドラゾン、チアゾリジン、オキサゾリジンからなる群から選ばれる化学的ライゲーションにより形成された結合を介して側鎖nと共有結合しているものである。
【0030】
Bは、同じまたは異なる3つ以上のアームを有する分岐核であり、存在していても存在していなくてもよい。最も好ましくは、Bは存在しかつ3つ以上のアーム、さらに好ましくは4つ以上のアームを有する。特に、Bの1つのアームがUに(任意にスペーサーまたはリンカーs1を介して)結合されており、Bの第2のアームがポリマーに(任意にスペーサーまたはリンカーs2を介して)結合される。好ましいポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、Bの分岐アームの少なくとも1つが、オキシム、アミド、アミン、ウレタン、チオエーテル、エステル、ヒドラジド、オキサゾリジン、およびチアゾリジンからなる群から選ばれる結合の残基を含むものである。本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質の好ましい分岐核Bは、アミノ、カルボキシレートおよび混合アミノ−カルボキシレートからなる群から選ばれた分岐核を含む。好ましいアミノ分岐核はリジンを含み、好ましいカルボキシレート分岐核はグルタミン酸またはアスパラギン酸を含み、さらに混合アミノ−カルボキシレート分岐核はγ−グルタミン酸またはその誘導体を含む。
【0031】
「ポリマー」成分は、実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり、Bが存在する場合にはBと同じか異なることができる。「水溶性ポリマー」は、水に可溶性で、原子分子量が約1000ダルトン以上の実質的に非抗原性のポリマーを意味する。「ポリマー」は、好ましくは、有効流体力学的分子量が10,000Da以上であり、より好ましくは約20,000〜500,000Da、および最も好ましくは約40,000〜300,000Daである。「有効流体力学的分子量」は、水ベースのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により決定されるようなポリマー鎖の有効水−溶媒和サイズを意味する。水溶性ポリマーが、エチレンオキサイド反復単位のようなポリアルキレンオキシド反復単位を有するポリマー鎖を含んでいる場合、各鎖の原子分子量が、約200〜約80,000Da、好ましくは約1,500〜約42,000Da、最も好ましくは2,000〜約20,000Daであることが好適である。具体的に言及されているのでなければ、分子量は、原子分子量を指すことを意図している。
【0032】
「ポリマー」成分は、広範囲の分子量およびポリマーサブユニットを持つことができる。これらのサブユニットは、生物学的ポリマー、合成ポリマーまたはそれらの組み合わせを含み得る。そのような水溶性ポリマーの例としては、デキストランならびに硫酸デキストラン、P−アミノ架橋デキストリン、およびカルボキシメチルデキストリンを含むデキストラン誘導体、セルロースならびにメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含むセルロース誘導体、デンプンおよびデキストリン類、ならびにデンプンの誘導体および加水分解物、ポリエチレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーを含むポリアルキレングリコールならびにそれらの誘導体が含まれ、そこでは、前記ホモポリマーおよびコポリマーは、未置換または一端がアルキル基、ヘパリンおよびヘパリンのフラグメント、ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル、ポリビニルピロリドン、アスパルトアミド、およびポリオキシエチエレン化ポリオール、デキストランおよびデキストラン誘導体、デキストリンおよびデキストリン誘導体で置換されている。具体的に列挙した水溶性ポリマーの様々な誘導体も考えられることが理解されるであろう。
【0033】
上記で説明した水溶性ポリマー、とりわけポリエチレングリコール「PEG」のようなポリアルキレンオキシドベースのポリマーは周知である(例えば、”Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applicatons”, J. M. Harris, Ed., Plenum Press, New York, NY (1992); ”Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications”, J. M. Harris and S. Zalipsky, Eds., ACS (1997); 国際特許出願WO90/13540号、WO92/00748号、WO92/16555号、WO94/04193号、WO94/14758号、WO94/17039号、WO94/18247号、WO94/28937号、WO95/11924号、WO96/00080号、WO96/23794号、WO98/07713号、WO98/41562号、WO98/48837号、WO99/30727号、WO99/32134号、WO99/33483号、WO99/53951号、WO01/26692号、WO95/13312号、WO96/21469号、WO97/03106号、WO99/45964号、および米国特許第4,179,337号;第5,075,046号;第5,089,261号;第5,100,992号;第5,134,192号;第5,166,309号;第5,171,264号;第5,213,891号;第5,219,564号;第5,275,838号;第5,281,698号;第5,298,643号;第5,312,808号;第5,321,095号;第5,324,844号;第5,349,001号;第5,352,756号;第5,405,877号;第5,455,027号;第5,446,090号;第5,470,829号;第5,478,805号;第5,567,422号;第5,605,976号;第5,612,460号;第5,614,549号;第5,618,528号;第5,672,662号;第5,637,749号;第5,643,575号;第5,650,388号;第5,681,567号;第5,686,110号;第5,730,990号;第5,739,208号;第5,756,593号;第5,808,096号;第5,824,778号;第5,824,784号;第5,840,900号;第5,874,500号;第5,880,131号;第5,900,461号;第5,902,588号;第5,919,442号;第5,919,455号;第5,932,462号;第5,965,119号;第5,965,566号;第5,985,263号;第5,990,237号;第6,011,042号;第6,013,283号;第6,077,939号;第6,113,906号;第6,127,355号;第6,177,087号;第6,180,095号;第6,194,580号;第6,214,966号参照)。
【0034】
より好ましい「ポリマー」成分は、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシド、またはそれらの誘導体を含む。より好ましいポリアルキレンオキシドおよびポリアミドアルキレンオキシドは、式−(CH2−CH2−O)−のエチレンオキシド反復単位を含む。よりいっそう好ましい「ポリマー」成分は、式−[C(O)−X−C(O)−NH−Y−NH]n−または−[NH−Y−NH−C(O)−X−C(O)]n−の分子量約1000ダルトン以上のポリアミドであり、そこでは、XおよびYは、同じかまたは異なり、分岐状または直鎖状である二価のラジカルであり、nは、2〜100、より好ましくは2〜50の整数であり、XおよびYのいずれかまたは両方は、直鎖状または分岐状の生体適合性で実質的に非抗原性の水溶性反復単位を含む。その最も好ましい水溶性反復単位は、式−(CH2−CH2−O)−または−(CH2−CH2−O)−のエチレンオキシドを含む。そのような水溶性反復単位の数は大きく変わり得るが、そのような反復単位のより好ましい数は、2〜500、2〜400、2〜300、2〜200、2〜100、最も好ましくは、2〜50である。より好ましい実施形態の例は、XおよびYの一方または両方が、−((CH2)n1−(CH2−CH2−O)n2−(CH2)n1−)−または−((CH2)n1−(O−CH2−CH2)n2−(CH2)n1−)から選ばれるものであり、ここでn1は、1〜6、1〜5、1〜4、最も好ましくは1〜3であり、n2は、2〜50、2〜25、2〜15、2〜10、2〜8、最も好ましくは2〜5である。非常に好ましい実施形態の例は、Xが−(CH2−CH2)−であり、Yが−(CH2−(CH2−CH2−O)3−CH2−CH2−CH2)−または−(CH2−CH2−CH2−(O−CH2−CH2)3−CH2)−である。
【0035】
「ポリマー」成分あるいは1つ以上のスペーサーまたはリンカーは、存在する場合には、生物安定性または生物分解性であるポリマー鎖または単位を含み得る。例えば、反復結合を有するポリマーは、結合不安定性に応じて生理学的条件下での安定性の程度が変わる。そのような結合を有するポリマーは、低分子量の類似体の既知の加水分解速度に基づいて、生理学的条件下でのそれらの相対的な加水分解速度により分類され、例えば、より不安定なものからより安定なものについて、ポリカーボネート(−O−C(O)−O−)>ポリエステル(−C(O)−O−)>ポリウレタン(−NH−C(O)−O−)>ポリオルトエステル(−O−C((OR)(R’))−O−)>ポリアミド(−C(O)−NH−)である。同様に、水溶性ポリマーを標的分子に付着させる結合システムは、生体安定性または生体分解性とすることができ、例えば、より安定なものからより不安定なものついて、カーボネート(−O−C(O)−O−)>エステル(−C(O)−O−)>ウレタン(−NH−C(O)−O−)>オルトエステル(−O−C((OR)(R’))−O−)>アミド(−C(O)−NH−)である。これらの結合は例として示されるものであり、本発明の水溶性ポリマーのポリマー鎖または結合システムにおいて用い得る結合のタイプを限定することを意図するものではない。
【0036】
成分J*は、負、正および中性からなる群から選ばれ、生理学的条件下で実効電荷を有するペンダント基の残基である。これは、置換または未置換のアルキル基、アリール基、ヘテロアルキル基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、アシル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基、アミド、アミノ基,カルボニル基等、ならびにそれらの塩を含む。好ましくは、中性基はアルキル基またはアルコキシ基であり、1〜18個の炭素を含有する部分を含み得るが、それに限定されず、さらに直鎖状または分岐状とすることができる。帯電した基として提供される場合には、J*はイオン性官能基を含む。官能基の例としては、カルボン酸、エステル、アミド、ニトリル、チオール、およびヒドロキシル基が含まれるが、これらに限定されない。そのようなJ*基は、アミノ酸、核酸、脂肪酸、炭水化物、およびそれらの誘導体、ならびにキチン、キトサン、ヘパリン、硫酸ヘパラン、コンドロイチン、硫酸コンドロイチン、デルマタンおよび硫酸デルマタン、シクロデキストリン、デキストラン、ヒアルロン酸、リン脂質、シアル酸等のような成分とすることができる。J*は、好ましくは、カルボキシル、アミノ、チオール、ヒドロキシル、ホスホリル、グアニジウム、イミダゾールおよびそれらの塩から選ばれたイオン性部分を含む。最も好ましいのは、J*がイオン性カルボキシレート部分を含み、生理学的条件下で負の実効電荷を有する場合である。例えば、本発明の好ましいポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、3〜7の等電点を有し、従って、負の電荷を持つJ*基により、plの微調整に利用できる。
【0037】
成分s1、s2およびs3は、同じまたは異なってもよいスペーサーまたはリンカー部分であり、個々に存在しても存在しなくてもよい。好ましいスペーサーまたはリンカーとしては、水溶性ポリマー中に用いられる1つ以上の反復単位、ジアミノおよびまたは二酸単位、天然または非天然アミノ酸もしくはそれらの塩、ならびに好ましくは18個までの炭素原子または付加的なポリマー鎖さえも含むアルキル基、アリール基、ヘテロアルキル基、ヘテロアリール基、アルコキシ基等を含む脂肪族部分を含む直鎖または分岐状部分を含む。最も好ましくは、スペーサーまたはリンカーは、ポリマー鎖を含む。
【0038】
代わりに、上記の式Un−s1−B−s2−ポリマー−s3−J*は、「Un−B−ポリマー−J*」としてあらわすことができ、ここではs1、s2およびs3基は存在しても存在しなくてもよい。
【0039】
より好ましい「ポリマー」成分は、水溶性ポリマーU−s1−B−s2−ポリマー−s3−J*が全体として段階的合成により製造されるものである。これにより、正確な分子量および定義された構造を有するポリマーの構成が可能になる。対照的に、標準的ポリマー合成は重合プロセスであって、鎖長が異なる混合物が得られ、従って、分子量およびサイズが分布し、この分離は不可能ではないとしても困難である。分子の純度を制御する能力は、水溶性ポリマーが付着されかつ単分散である合成タンパク質を構成できるという点で、有利である。このことは、異質な化合物の結果として得られる特性が変化するということを回避し、かつ最も好ましい特性を持つ化合物だけを比較的容易に調製および単離できるという点で、大いに有利である。
【0040】
別の好ましい実施形態においては、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、1つ以上の不規則アミノ酸を含む。ここで使われているように、「不規則アミノ酸」は、非遺学伝的にコード化された側鎖、非遺学伝的にコード化されたバックボーン、非遺学伝的にコード化された置換されたNαまたはαC(O)部分、あるいはそれらの組み合わせを有するアミノ酸、すなわちリボソームによって組み込まれた20個の遺学伝的にコード化されたアミノ酸以外のものを指す。好ましい不規則アミノ酸の例としては、遺学伝的にコード化された官能基以外の一意的な官能基を持つ側鎖を有するアミノ酸、ならびに擬アミノ酸および様々なアミノ酸誘導体が含まれる。この点について、本発明により、合成赤血球産生刺激タンパク質の設計および/または構造における幅広い選択性および柔軟性が可能になる。発明品により用い得る非リボソーム的に組み込まれたアミノ酸の例として以下のものが含まれるが、これらに限定されるものではない。すなわち、D−アミノ酸、β−アミノ酸、擬似グルタミン酸塩、γ−アミノブチレート、オルニチン、ホモシステイン、N置換アミノ酸(R. Simon et at., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1992)89:9367−71、WO91/19735号(Bartlett et at.)、米国特許第5,646,285号(Baindur))、α−アミノメチレンオキシ酢酸(アミノ酸−Glyジペプチド等配体)、α−アミノオキシ酸ならびに非遺学伝的に非コード化された側鎖官能基を有する他のアミノ酸および誘導体等である。チオアミド、ビニル型アミド、ヒドラジノ、メチレンオキシ、チオメチレン、ホスホンアミド、オキシアミド、ヒドロキシエチレン、還元アミドおよび置換還元アミド等配体ならびにβ−スルホンアミドが使用できる。「擬似アミノ酸」は、遺学伝的にコード化されたアミノ酸として同一のバックボーン構造および側鎖基を持つが、側鎖原子の原子組成が異なるアミノ酸を意味する。
【0041】
好ましい実施形態においては、そのポリペプチド鎖の不規則アミノ酸に水溶性ポリマーが付着させられた合成赤血球産生刺激タンパク質が提供される。水溶性ポリマー付着のためにより好ましい不規則アミノ酸は、遺学伝的にコード化された官能基の存在下でこれと反応することなく用い得る化学選択的ライゲーション化学を使用する。
【0042】
上記で言及したように、全体が段階的集合により作られる水溶性ポリマーは、単分散(monodisperse)、例えば本発明の好ましいポリアミドエチレンオキシドとして作り得る。従って、別の好ましい実施形態は、水溶性ポリマーが単分散であるものである(すなわち、単一かつ構造的に定義された意図する分子種を含む分子的に均質な組成物)。また、合成赤血球産生刺激タンパク質は全体を化学合成により作り得るので、これらは単分散とすることもできる。そのような化合物には非常に純粋であるという利点があり、ヘテロ分散ポリマーを使用する場合のような精製および分析的特徴付けの問題が回避される。そのような化合物は、再現性のある投薬等の点に関しても有利である(例えば、糖タンパク質とPEG化組換え生産タンパク質との典型的な混合物とは対照的な単一分子種)。
【0043】
上記で言及したように、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、25kDa以上のモノマー分子量を持つことができる。本発明の目的のため、そのような分子量決定は、変性SDSポリアクリルアミド電気泳動法によりなされるべきである。用語「モノマー分子量」は、タンパク質またはポリペプチドの複数のコピーを持つことがある合成タンパク質とは区別されるモノマー合成タンパク質の分子量を指すことを意図している。用語「モノマーポリペプチド分子量」は、そこに付着させられたポリマーおよび/またはタンパク質またはポリペプチドの複数のコピーを持つことがある合成タンパク質とは区別されるモノマーポリペプチドの分子量を指すことを意図している。より好ましくは、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質のモノマー分子量は、40kDa以上、より好ましくは50kDa以上であり、最も好ましくは60以上〜70kDaである。例えば、SEP−1−B51と呼ばれる本発明の好ましい合成赤血球産生刺激タンパク質のモノマー分子量は、約73kDaである。しかしながら、さらに大きい構成物は本発明の範囲内に十分あるものと見なされる。
【0044】
別の実施形態においては、本発明は、タンパク質のライゲーション部位に擬似アミノ酸を含み、任意にタンパク質に付着させた水溶性ポリマーを含む合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられる。これらの化合物は、システインのような化学選択的反応性官能基を含むN末端アミノ酸を有する第1のペプチドまたはポリペプチドを、α−カルボキシチオエステルのような化学的ライゲーション適合性C末端官能基を有する第2のペプチドまたはポリペプチドに結合し、さらに擬似グルタメートアミノ酸を形成するシステインチオール側鎖のカルボキシメチル化のようなライゲーション部位の未保護側鎖官能基を擬似アミノ酸に化学的に変換することにより、ライゲーション部位における未保護側鎖官能基を有するライゲーション産物を形成することにより製造される。天然型化学的ライゲーション部位のシステインの変換により形成された擬似アミノ酸は、本明細書中では「擬似天然型化学的ライゲーション」と呼ばれ、以下で詳細に説明される。
【0045】
タンパク質のライゲーション部位におけるアミノ酸の側鎖に付着させられた水溶性ポリマーを含む合成赤血球産生刺激タンパク質も提供される。これらの化合物は、システインのような化学選択的反応性官能基を含むN末端アミノ酸を有する第1のペプチドまたはポリペプチドを、α−カルボキシチオエステルのようなライゲーション適合性C末端官能基を有する第2のペプチドまたはポリペプチドに結合し、ライゲーション部位における未保護側鎖官能基に水溶性ポリマーを付着させることにより、ライゲーション部位において未保護側鎖官能基を有するライゲーション産物を形成することにより合成される。
【0046】
擬似アミノ酸化学的ライゲーションの利用および本発明の化学的ライゲーション部位ポリマー修飾方法により、従来技術に対する利点が提供され、その利点としては、別の方法では適切なライゲーション部位を欠く多様な範囲の赤血球産生刺激タンパク質の活発な合成、日常的な費用効率の高い方法で部位特定的ポリマー修飾が活用できる部位の拡張(および付着化学)、ならびにとりわけかなり大きい分子量の合成赤血球産生刺激タンパク質の合成が含まれる。それらは、水溶性ポリマー付着のための個々または複数の部位のスキャニングを含む、所望の生物学的特性を微調整するための高処理能力のアナログ化に特に適している。
【0047】
上記で言及したように、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質の生物学的特性は、ポリマー付着の部位と結合化学を正確に調整すると共に水溶性ポリマーの分子量、ポリマー組成、構造(例えば、直鎖状か分岐状かあるいはその混合)、およびペンダント基(例えば、帯電か未帯電かあるいはその混合)を正確に調整することによって修正できる。特に、半減期、および分岐等を改善するためにタンパク質の分子量を増加させることに加えて、タンパク質に付着させられた水溶性ポリマーは、合成赤血球産生刺激タンパク質のアミノ酸配列が基づく対応する生物学的に生産されたタンパク質の荷電にほぼ等しい等電点により測定されるような正確な電荷を合成赤血球産生刺激タンパク質が持つようにできる。これには、対応するリボソーム特定タンパク質の自然状態の荷電を模倣できるという利点がある。従って、本発明の好ましい実施形態は、上記の特徴ならびにそのために利用される水溶性ポリマー、特に事前に選択された位置に付着させ得る構造的に定義されたポリマー付加物を組み合わせる合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられる。
【0048】
特に、本発明の好ましい合成赤血球産生刺激タンパク質(「SEP」)は、好ましくはヒト尿EPOのポリマー修飾合成類似体である。好ましい実施形態においては、これらは、チオエーテル、オキシム、アミドまたはその他の結合を介して1つ以上のペプチド残基に付着させられた1つ以上の水溶性ポリマーを含んでいる。非常に好ましい実施形態においては、そのような結合は、ヒト尿EPOにおいて天然にグリコシル化された1つ以上の位置(すなわち、位置24、38、83および126)にあるであろう。最も好ましくは、SEP分子は、2つ以上のそのような位置にポリマー部分を有するであろう。他の実施形態においては、他のタンパク質残基はポリマー部分によって修飾できる。本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質のための修飾位置は、タンパク質の無秩序なループ、領域またはドメイン、あるいは潜在的なプロテアーゼ切断部位またはその近くに位置する残基を含む。例えば、ポリマー修飾は、EPOの9、69および/または125の1つ以上の位置に導入し得る。さらに、もし1つ以上の天然グリコシル化部位がポリマーで修飾されずに残った場合には、それらの領域中の1つ以上のアミノ酸を希望により他の残基に変換することができる、例えば、もし正の電荷が必要であれば、リジンに変換でき、負の電荷が必要な場合であれば、アスパラギン酸もしくグルタミン酸、あるいはアラニン等に変換し得る。本発明のSEP分子の総分子量は、約25〜約150kDa、より好ましくは、約30〜約80kDaである。分子量は、任意の類似体の修飾に利用される水溶性ポリマーの数および構造を増大または減少させることによって制御できる。
【0049】
例えば、オキシム結合ポリマーSEP類似体は、好ましくは、アミノオキシ、ケトンまたはアルデヒド官能化した水溶性ポリマーをSEPタンパク質に、側鎖アミノオキシ、ケトンまたはアルデヒド官能性を持つ非天然的にコード化されたアミノ酸において付着させることにより構成される。例えば、SEP−0およびSEP−1の位置89および117は、擬似グルタメート(式−CHα−CH2−S−COOHの側鎖を有する非天然的にコード化されたアミノ酸(グルタメート側鎖−CHα−CH2−CH2−COOHと比較して))を含む。チオエーテル結合を利用しているSEP類似体は、好ましくは、システインまたはチオールを有する非天然アミノ酸により提供されるチオール官能性を含むように構成される。図10は、好ましい合成赤血球産生刺激タンパク質の1つのタイプの基本構造を示す。
【0050】
他の実施形態においては、本発明のSEP分子は、EPOの天然のアミノおよびカルボキシ末端が再配置されている「円形に並べ替えられた」EPO類似体を含み得る。最も好ましくは、そのような再配置により、アミノおよびカルボキシ末端が、無秩序ループ等のような、構造的拘束が小さい位置へ移動される。位置125および126周囲の無秩序ループ(天然のEPO残基ナンバリングシステムに関して)は、そのような再配置部位の例である。最も好ましくは、そのようなSEPは、ジスルフィドフリーであり、事前選択された残基においてポリマー部分に含むように化学的に修飾される。
【0051】
あるいは、SEP分子は、自然発生グリコシル化部位、または位置126および125のようなグリコシル化を受けやすい他の部位へ再配置されたアミノおよびカルボキシ末端を持つことができる。SEP分子は、電荷を除去または修正するためにアミノおよびカルボキシ末端の(カルボキシアミド化等によるような)修飾も含み得る。そのような円形に並べ替えられた分子の好ましい例において、新規なNおよびC末端が位置126および125によりそれぞれ提供される。位置7、29、33および161の天然のジスルフィド形成システインは、好ましくは、ジスルフィドブリッジを形成できない非天然的にコード化されたアミノ酸、L−α−N−酪酸(Aba)、で置換される。残基R166、E37およびV82は、好ましくは、生産を改善するため、アラニンで置換される。また、付加的システインは、好ましくは、以下で「0」として番号付けられる天然EPO番号方式に関して位置1と166との間に挿入される。結果として得られる分子は、4つのシステインを位置126、0、38および83に(N末端からC末端への方向に読んで)含み、これらは、(1)ライゲーション部位および(2)チオエーテル形成pPEG付着部位として利用される。任意に、付加的なpPEG付着部位を提供するために、システインはA125に取って代わることができる。
【0052】
本発明のそのようなSEP分子の総分子量は、約25〜約150kDa、より好ましくは約30〜約80kDaである。この分子量は、任意の類似体の修飾に利用される(pPEGのような)ポリマーの数および構造を増減することによって制御できる。より大きい構成物についてのpPEG仲介流体力学的MWは、100kDa以上である。任意のpPEG付着部位は、位置125、9、および24(N末端からC末端への方向に読んで)に位置する。付加的SEP類似体設計は、上記の無秩序ループ領域の代替的NおよびC末端を有し、および/または新しいNおよび/またはC末端から残基を切り取る。好ましい円形に並べ替えられた分子の基本構造を図11に示す。図12には、好ましい水溶性ポリマーの構造、ならびに種々の直鎖状および分岐状構成物を示す。
【0053】
例えば、本明細書中の実施例に記載される特定のSEP構成物に加え、ヒトEPOの天然配列を円形に並べ替えることによって配列を以下のやり方で設計した。すなわち、天然N末端Ala1およびC末端Arg166は、別のCys残基により結合され、従って、167アミノ酸のポリペプチドが得られ、新しいNおよびC末端が、天然配列の残基125−126において鎖を分離させることによって作り出され、すべての天然Cys残基は、L−α−アミノ−n−酪酸残基で置換され、さらに、以下の置換を行った。すなわち、Glu37Ala、Asn38Cys、Val82Ala、Asn83Cys、Ser126Cys、Arg166Ala(すべての残基番号は、ヒトEPOの天然配列に基づく)である。同時に、これらの設計要素の結果、示されるようなSEP−5のアミノ酸配列が得られる。SEP−5−L28タンパク質は、Cys残基126、0、24、38、および83(ヒトEPO配列に基づく番号付け)において、マイケル付加反応によって、マレイミド修飾直鎖(TTD−Succ)6カルボキシレートポリマー構成物によってポリマー修飾された。これらの変更は、SEP−5−L28タンパク質の合成および取り扱いを改善するために設計された。設計された配列は、それぞれがN末端Cys残基を持つ4つのペプチドセグメントから作られた。化学的ライゲーション部位は、Cys0、Cys38、Cys83であった。C末端ペプチドがα−カルボキシレートであるペプチドが合成され、他の3つのペプチドはα−チオエステルであり、このようにして、N末端Cys残基は、側鎖Acm保護された。Cys24は側鎖未保護であった。セグメントは、C末端の2つのセグメントで始め、天然型化学的ライゲーションにより逐次結合された。ライゲーション後、ライゲーション部位のフリーなCys側鎖は、マイケル付加反応により、マレイミド修飾直鎖状(TTD−Succ)6カルボキシレートポリマー構成物と反応し、次にCys側鎖Acm保護基が除去され、次のセグメントのライゲーションとポリマー修飾が同様に実行された。Acm基の除去後、次の(第4の)セグメントのライゲーションが実行され、最後のAcm基が除去されポリマー修飾が同様に実行されて、上記で説明し図30に示した、円形に並べ替えられたポリマー修飾SEP構成物が得られた。
【0054】
II.本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質の生産
ポリマー修飾赤血球産生刺激タンパク質は以前から記載されているが、本発明はそのような従来の試みとは顕著に異なる。例えば、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、全体的または部分的に化学合成される。さらに、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、1つ以上の特定のユーザー選択およびユーザー定義された部位で水溶性ポリマーにより修飾されている。
【0055】
さらに、本発明における赤血球産生刺激タンパク質の合成的生産により、調製品中の全分子のユーザー選択およびユーザー定義された部位のそれぞれにそのような修飾が確実に存在するようにできる。合成のそのような均一性および制御により、本発明は先行技術の方法の使用に許されたランダム修飾から顕著に区別される。重要なことに、本発明により、どのような重要でない残基もポリマー付加物を含むように誘導体化し得る合成赤血球産生刺激タンパク質を設計できるようになる。さらに、そのようなユーザー選択およびユーザー定義された部位の各々について、ユーザーは、それを介してそのような付加物がポリペプチドまたはタンパク質バックボーンに結合される正確な結合(アミド、チオエステル、チオエーテル、オキシム等)を定義できる。加えて、特定部位に存在してほしい特定のポリマー付加物は変更および制御することができ、その結果、存在するすべてのタンパク質またはポリペプチドが正確に同じ誘導体化部位に正確に同じ誘導体化付加物を含む最終調製品が得られる。従って、本発明により、ポリマー修飾赤血球産生刺激ポリペプチドおよびタンパク質の均質調製品の形成が可能になる。
【0056】
水溶性ポリマーを結合し得る付着部位の位置および数を変えるための手段の提供に加え、本発明により、結合ポリマーの性質を変えることが可能になる。どのような特定のユーザー選択およびユーザー定義された部位にも組み込み得るポリマー付加物は、任意の定義された長さとし得る。同様に、本発明の方法に従って、種々の部位において種々の長さのポリマーを使用することが可能である。従って、1つの実施形態において、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、水溶性ポリマー付加物でモノ修飾またはポリ修飾し得る。1つ以上のポリマー付加物が特定のポリペプチドまたはタンパク質中に導入される場合、使用されるポリマーは、「単種分化」、「多種分化」、「均一種分化」、または「多様に種分化」されたものとし得る。本明細書中で用いられているように、用語「単種分化された」は、単一種のポリマーにより修飾されたタンパク質またはポリペプチドを意味する。対照的に、用語「多種分化された」は、2つ以上のポリマー種により修飾されたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。そのような多種分化されたポリペプチドまたはタンパク質は、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾された各部位において、同じ単一のポリマー種が存在すれば「均一種分化された」と呼ばれる。対照的に、多種分化されたポリペプチドまたはタンパク質は、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾された部位が異なるポリマー種で修飾されていれば、「多様に種分された」と呼ばれる。
【0057】
さらに、ユーザー選択およびユーザー定義された各部位におけるポリマー付加物の直鎖性または分岐性の程度を変えることが可能である。従って、ポリマー付加物は、直鎖状、分岐状、または均一分岐状とし得る。用語「均一分岐状」は、特定部位におけるポリマーのすべての分岐が同じ構造および長さを有することを意味する。理解されるように、本発明により、任意の個々の分岐の長さならびにそのような分岐点に存在するポリマー構造の両方を独立して変えることが可能になる。
【0058】
要約すると、本発明により、ポリペプチドまたはタンパク質バックボーン中のポリマー修飾され、ユーザー選択およびユーザー定義された部位の(1)位置および(2)頻度を定義すること、ならびにそのような部位の各々に存在する分岐の(3)長さ、(4)種、および(5)程度を制御することが可能になる。加えて、複数のポリマー修飾を有するポリペプチドおよびタンパク質に関して、上記で確認した5つの変数の各々を各部位について独立して定義することが本発明により可能になる。さらに、分岐ポリマー修飾を有する合成赤血球産生刺激ポリペプチドおよびタンパク質に関して、上記で確認した5つの変数の各々を各分岐点について独立して定義することが本発明により可能になる。これは、存在しかつ不要なポリマー付着により妨害されずにいる20個の遺学伝的にコード化されたアミノ酸側鎖のいずれかまたはすべての多重コピーを有する正確にポリマー修飾された合成赤血球産生刺激タンパク質の均質組成物の合成を考慮している。
【0059】
従って、本発明により、ポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質の設計、合成および使用における大きな柔軟性がもたらされる。例えば、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質のアミノ酸配列は、それが基づく遺学伝的にコード化されたタンパク質のアミノ酸配列に関する1つ以上の欠失、挿入または置換を含み得る。アミノ酸配列は、擬似アミノ酸または不自然な側鎖等を持つ他のアミノ酸、例えば水溶性ポリマーをそれに付着させるための一意的な化学選択的官能基を持つように修飾されたもの、などの1つ以上の不規則なアミノ酸で置換できる。従って、水溶性ポリマーは、不規則アミノ酸、または遺学伝的にコード化されたアミノ酸を介して付着させ得る。水溶性ポリマーは直鎖状または分岐状とすることができ、カルボン酸、脂肪族、アミドまたはアミンのような化学的部分を含む末端基を有し得る。さらに、水溶性ポリマーは単分散とすることができ、すなわち、正確に定義された構造および組成の単一分子種を含むように作り得る。従って、水溶性ポリマーは、それで修飾された標的タンパク質の半減期、免疫原性、効力、貯蔵安定性、投与量、デリバー可能性等を正確に調整する特徴を含むように設計できる。
【0060】
特に、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質の生産は、以下の段階を有するものとして想定できる。すなわち、設計、ペプチド合成、ペプチドライゲーション、タンパク質生成のための完全長ライゲーション産物の折りたたみ、およびタンパク質の生物活性評価である。ポリマー修飾は、ペプチド合成、ライゲーションまたは折りたたまれた産物の段階の1つ以上で実行できることを本発明者らは見出した。しかしながら、ポリマーを、ペプチドまたは折りたたみ前のライゲーション産物に付着させることが好ましい。このようにして生産された所望の生物活性を示すタンパク質は、選択されて、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質となる。
【0061】
好ましい方法においては、合成赤血球産生刺激タンパク質を構成するポリペプチド鎖は、合成赤血球産生刺激タンパク質の非重複アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合して作られる。特に、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質分子は、当該合成赤血球産生刺激タンパク質分子のポリペプチド鎖の非重複アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合して作られ、そこではライゲーションに用いられる1つ以上のペプチドセグメントは、ユーザー定義および事前選択された部位において水溶性ポリマーが付着されている。次に、ポリマー修飾ポリペプチド鎖は折りたたまれて、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を生産することができる。
【0062】
本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質を生産する別の好ましい方法は、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質のポリペプチド鎖の非重複アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合する段階と、その1つ以上の化学的ライゲーション部位におけるアミノ酸の側鎖に1つ以上の水溶性ポリマーを付着させる段階とを含む。次に、ポリマー修飾ポリペプチド鎖は折りたたまれ、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を生産する。
【0063】
それほど好ましくはないが、合成赤血球産生刺激タンパク質は、(1)合成赤血球産生刺激タンパク質のポリペプチド鎖の非重複アミノ酸配列を含むペプチドセグメントと化学的に結合して、合成赤血球産生刺激タンパク質に対応する完全長ポリペプチド鎖を形成し、少なくとも1つのペプチドセグメントが、第1の化学選択性官能基を有する不規則アミノ酸を含み、(2)ポリペプチド鎖を折りたたみ、(3)第1の化学選択性基と一意的かつ相互に反応する第2の化学選択性基を含む水溶性ポリマーをそれに付着させることにより作ることができる。
【0064】
特に、本発明において具体化され、かつ実施例において例証されるこれらの多様なプロセスは、図面において合成赤血球産生刺激タンパク質について一般に示されるように例示され得る。例えば、図1A〜図1Eには、ライゲーションの前もしくは後またはそれらの組み合わせにおける、部分的または完全に未保護のペプチドセグメント
【化1】
への水溶性ポリマー(本明細書中で定義されるU−B−ポリマー−J*)の付着を伴うライゲーションの図式が示してある。図1A〜図1Dにおいては、Yaaは、一意的な化学選択性部分(例えば、α−カルボキシルチオエステルを持つアミノ酸)を持つ第1のペプチドセグメント上のC末端アミノ酸で、前記部分は、Yaaとの化学選択的化学的ライゲーションが可能な一意的かつ相互に反応性のN末端アミノ酸Xaa(例えば、アミノ末端システイン)部分を持つ第2のペプチドセグメントへの化学的ライゲーションのための部分である。YaaとXaaとの間の化学選択的反応により、それらの間に共有結合的結合が生成する(例えば、アミド結合)。従って、YaaおよびXaaは、化学選択的ライゲーション対を形成する。Un−は、図に示されるように、アミノ酸の側鎖上の正確なユーザー定義部位に組み込まれ、さらに水溶性ポリマーU−B−ポリマー−J*の基U−に対し化学選択的かつ相互に反応性の第2の一意的な化学選択的部分を表す。例えば、Unがケトン基を持つように修飾された側鎖である場合、水溶性ポリマーU−ポリマー−J*は、ケトンと反応する化学選択的な基、例えば、その間にオキシム結合を作り出すアミノオキシ基である。Un−の添字「n」はアミノ酸の数を表し、それらの側鎖は、化学選択的基Uを持つように設計されており、例えば、2つの特定的かつユーザー定義部位がポリマー修飾される場合にはn=2であり、これはU2またはUn=2と表すこともできる。すべての場合において、nは設計により正確に制御される正の整数である。従って、UnおよびUは、XaaおよびYaaの化学選択的基と両立できかつこれと非反応性の第2の化学選択的ライゲーション対を表す。図1Aおよび図1Bは、2つの異なる可能な反応を例示するものである。図示された第1の反応において、Un官能性を持つポリペプチド鎖は第2のポリペプチドに結合され、次に、ポリマー修飾ポリペプチドを得るために、U−B−ポリマー−J*部分と反応させられる。描かれた第2の反応において、ポリマー修飾ポリペプチドを得るために、Un官能性を持つポリペプチド鎖はU−B−ポリマー−J*部分と反応させられ、次に、より大きいポリマー修飾ポリペプチドを得るために、第2のポリペプチドに結合される。これらの図は、図1Aにおいては、Xaa残基を持つポリペプチドがポリマー修飾を受け、それに対して、図1Bにおいては、Yaa残基を持つポリペプチドがポリマー修飾を受けるという点で異なる。図1Cは、より大きいポリペプチドを形成するため、複数のポリペプチド鎖をそのライゲーションの前もしくは後に修飾する本発明の能力を例示するものである。図1Dにおいては、PGおよびPG’は保護基を表しており、そこでは、PG’は直交保護基を示し、すなわち、PGおよびPG’は異なる条件下で除去可能であり、かつ異なる水溶性ポリマーが同じ化学を介してUn基に付着させられている場合、あるいはUn基が、ポリマー修飾したくない側鎖官能基である場合(例えば、水溶性ポリマーのU基が第1アミノまたは側鎖チオールともっぱら反応するように設計されている場合の反応性の−NH2または−SHを持つ側鎖)に有用である。図1Dは、本発明の方法に従って結合されているポリペプチドの所望の側鎖を保護するために保護基が使用できることを示している。
【0065】
図1Eは、図1A〜図1Dによるライゲーションおよびポリマー修飾において用いられるペプチドセグメント中に存在するかまたは存在しない基の多様性を例示するものである。
【0066】
図2A〜図2Cは、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質を調製するためのプロセスの付加的な概略図を示す。特に、図2A〜図2Bは、ライゲーション部位(例えば、システインの側鎖チオール)におけるアミノ末端基Xaaの側鎖への水溶性ポリマーU−B−ポリマー−J*の付着を伴うライゲーションの図式を示す。図2Cは、図2A〜図2Bによるライゲーションおよびポリマー修飾において用いられるペプチドセグメント中に存在するかまたは存在しない基の多様性を例示するものである。
【0067】
図3A〜図3Bは、3つ以上の非重複ペプチドセグメントの化学的ライゲーションを伴うマルチセグメントライゲーションを達成するためのプロセスの付加的な図式を示す。すなわち、少なくとも一つのセグメントは、最終的な完全長ライゲーション産物に対応する中央セグメントである。このようにして調製されたペプチドは、例えば図1A〜図1E、図2A〜図2C、および図4A〜図4Cに示されるような別のライゲーション反応に関与するペプチドセグメントを調製するために用い得る。一般に、マルチセグメントライゲーションについては、中央セグメントは、使用されるライゲーション化学に応じて、そのペプチドの環化または鎖状体形成を回避するために、保護されたXaa基または保護されたYaa基を有している。逐次または連続ライゲーションについては、中央セグメントのXaa基が保護されている(例えば、Cys(Acm))のに対して、Yaa基は未保護である(例えば、Yaa−COSR。ここでCOSRは、α−カルボキシルチオエステルである)。ここでは、Yaa基は、未保護Xaa基を持つ第2のペプチドと自由に反応し、そこでは第2のペプチドはフリーなYaa基を欠いている。ライゲーションに続き、次のライゲーション反応用にXaa基を再生するために保護基が除去される。このプロセスは必要なだけ続けることができ、それにより、伸長されたポリペプチド鎖が生成される。Yaa基の保護は、4つ以上のセグメントで構成される最終的なライゲーション産物の生産を伴う収束的化学的ライゲーションの場合に特に有用である。例えば、4セグメントライゲーションから生成されたタンパク質標的(すなわち、3つのライゲーション反応)の場合、タンパク質の一端に対応する2つのセグメントと、タンパク質の他端に対応する2つのセグメントは、逐次的とは対照的に並行して結合でき、2つの端部は最終的ライゲーション反応において接合される。そのような収束的化学的ライゲーション方式も、直交ライゲーション化学を用いることができる。ここで再び、そのようなペプチドセグメント中に存在するかまたは存在しない基の多様性を図1E、図2Cおよび図4Cに例示する。
【0068】
図4A〜図4Cは、本発明の原理に従って、結果として得られる側鎖チオールの天然型化学的ライゲーションおよび化学修飾がどのように達成し得るかを例示するものである。特に、図4A〜図4Bは、チオアルキル化およびチオエーテル結合を含む化学的に修飾された側鎖(Ψで表される)を介しての「擬似アミノ酸」(ΨXaaで表される)を形成するために、ライゲーション部位における結果として得られるシステイン側鎖チオールの天然型化学的ライゲーションおよび化学修飾を示している。図示してない別の実施形態においては、側鎖チオールは脱硫反応においてアラニンに変換できる(Liang et al, J. Amer. Chem. Soc. (2001) 123(4):526−533)。両方の反応にとって重要な観点は、変換または修飾したくない他のどのような側鎖チオールも、適切な保護基(PG)により保護され、あるいはマルチセグメントライゲーションの場合には直交保護基(PG’)で保護され、そこではカルボキシ末端Yaa基を持つセグメントは保護されたアミノ末端Xaa基、すなわちPG−Xaa−ペプチドを含み、これは一例として図4Bに示してある。図4Cには、図1A〜図1E、図2A〜図2C、および図3A〜図3Bだけでなく、図4A〜図4Bによるライゲーションおよびポリマー修飾において用いられるペプチドセグメント中に存在するかまたは存在しない基の多様性が示してある。
【0069】
設計と併せて、ポリペプチドバックボーンの合成に利用されるペプチドまたはポリペプチドセグメントが構成される。これは、様々なポリペプチドバックボーンセグメントを集合させるために選択されたライゲーション化学、所与の標的タンパク質のために選択されたポリマー付着化学、および特定のポリマー付着部位に基づいて選ばれる適切なライゲーション部位の選択を伴う。天然型化学的ライゲーションが使用される場合、システインライゲーション部位は、適切な自然発生システイン残基について標的ポリペプチドバックボーンのアミノ酸配列をスキャニングすることにより決定される。本明細書中に記載されるように、拡張天然型化学的ライゲーションが使用される場合、スキャニングライゲーション部位は、Xaa−Gly部位のような強いライゲーションを可能にする適切な自然発生ライゲーション部位接合部について標的ポリペプチドバックボーンアミノ酸配列をスキャニングすることにより選択し得る。拡張天然型化学的ライゲーションは、システイン残基におけるライゲーションに限定されないので、任意の数の残基がライゲーション部位接合部となり得る。いくつかの例では、天然型および拡張天然型化学的ライゲーションの組み合わせを設計の一部とし得る。
【0070】
好ましい実施形態において、天然型化学的ライゲーションは、完全長ポリペプチド鎖の一部または全部の生成に用いられる。合成赤血球産生刺激タンパク質の基になる自然発生タンパク質中に存在するシステインは、化学的ライゲーション部位として用い得る。しかしながら、好ましいライゲーション接合部が適切なシステインを欠いている場合には、その位置の非システインアミノ酸は、その部位での天然型化学的ライゲーションを可能にするため、システインと置き換えることができる。もし必要であれば、新規に導入されたシステインは、本明細書中に記載されるように、その位置でオリジナルのアミノ酸に対応する擬似アミノ酸残基に変換できる。あるいは、ポリマー修飾のためにシステインがある部位に導入される場合、標的ポリペプチド中の修飾したくない他のすべてのシステインが保護されていれば、側鎖チオールは、チオール反応性水溶性ポリマー構成物の付着に利用できる。
【0071】
別の好ましい実施形態においては、拡張天然型化学的ライゲーションは、ここに記載されるように、完全長ポリペプチドの一部またはすべてを生成するために利用できる。この方法のため、N末端のNα置換された2ないし3つの炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸が用い得る。そのような残基(ライゲーションに用いられるペプチドまたはポリペプチドセグメントのN末端に存在する場合)は、本明細書中に記載の拡張天然型化学的ライゲーションの方法に従って、C末端α−カルボキシチオエステル部分を有するポリペプチドへ当該ポリペプチドを結合するのに有利に使用できる。
【0072】
一般的には、ペプチド合成には、標準的な自動ペプチド合成器を用いる段階的標準Bocおよび/またはFmoc固相ペプチド合成が用いられ、または標準プロトコルに従って手作業で行うか、あるいは商業ベンダーから注文および購入される。(”Synthetic Peptides, A User’s Guide,”G. A. Grant, Ed., W. H. Freeman & Company, New York, NY, 1992 ; ”Priciples of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky, Ed., Springer−Verlag, 1993; ”The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer−Verlag, 1994; and ”Protecting Groups,” P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994 ; ”Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach, Eds. W. C. Chan and P. D. White, Oxford University Press, 2000)。天然型化学的ライゲーションのためのようなチオエステル仲介ライゲーションに利用されるペプチドについては、標準的プロトコルに従って同様に作ることができる。(例えば、Dawson et al., Science (1994) 266: 776−779; Canne et al. Tetrahedron Lett. (1995) 36: 1217−1220; Kent, et al., WO96/34878号; Kent, et al., WO98/28434号; Ingenito et al., JACS (1999) 121 (49): 11369−11374; およびHackeng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1999) 96: 10068−10073); 上記のAmiato et al.参照)。
【0073】
水溶性ポリマーのライゲーションおよび部位特定的付着については、不要な付着を作り出す副反応を回避するため、化学的直交戦略がペプチド合成(例えば、図1〜図4および実施例を参照)に用いられる。例えば、ライゲーション設計およびポリマー付着方法に応じて、種々の直交合成戦略が利用できる。特に、付着させるべき水溶性ポリマーの性質、および特にこれをポリペプチドに結合するための官能基が、例えば本発明の好ましいグリコ模倣(glyco−mimetic)ポリマーについて下記で論じるように、考慮される。
【0074】
特に、水溶性ポリマーは、ライゲーションに用いられる標的ペプチド、完全長物質または折りたたまれたポリペプチド上の一意的官能基と選択的に反応性の一意的官能基Uを含むようにされる。化学合成が用いられる時、ペプチドは、相互に反応性の化学選択的基を、正確なユーザー定義部位に含むようにされる。本発明のこの観点は、ペプチド合成(保護基戦略)および化学的ライゲーション(部分的または無保護基戦略)の原理を具体化する。保護基戦略については、水溶性ポリマー上の所望の官能基を除くすべての潜在的な反応性官能基および標的分子上に存在するその相互に反応性の官能基が、適切な保護基によりブロックされる。多くの保護基が周知であり、この目的に適している(例えば、”Protecting Groups in Organic Synthesis”, 3rd Edition, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; ”Synthetic Peptides, A User’s Guide,” G. A. Grant, Ed., W. H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; ”Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry,” W. D.. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes, and H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998 ; ”Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky, Ed., Springer−Verlag, 1993; ”The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer−Verlag, 1994;および”Protecting Groups,” P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994参照)。
【0075】
従って、水溶性ポリマーは、上記に記載されるような広範囲の官能基を有するように作り得る。部分的保護基戦略または無保護基戦略については、ポリマー上の官能基および標的ペプチドまたはポリペプチド上に存在するその相互に反応性の官能基は、他の官能基が反応系中に存在し得るが非反応性である化学選択的反応対を用いる。これには、アミン捕獲戦略(例えば、ヘミアミナール形成、イミン形成、およびマイケル付加によるライゲーション)、チオール捕獲戦略(例えば、メルカプチド形成、ジスルフィド交換によるライゲーション)、天然型化学的ライゲーション戦略(例えば、システインまたは側鎖アミノ酸誘導体含有チオールのチオエステル交換によるライゲーション)、および直交ライゲーションカップリング戦略(例えば、チアゾリジン形成、チオエステル交換、チオエステル形成、ジスルフィド形成、およびアミド形成によるライゲーション)ができる基が含まれる(例えば、Coltart, DM., Tetrahedron (2000) 56:3449−3491参照)。
【0076】
この実施形態に好ましい化学選択的U基は、天然型化学的ライゲーション(Dawson et al., Science (1994) 266:766−779; Kent, et al., WO96/3487866号)、拡張一般化学的ライゲーション(Kent, et al., WO98/28434号)、オキシム形成化学的ライゲーション(Rose, et al., J. Amer. Chem. Soc. (1994) 116:30−33)、チオエステル形成ライゲーション(Schnolzer, et al, Science (1992) 256:221−225)、チオエーテル形成ライゲーション(Englebretsen et al., Tet. Lett. (1995) 36(48):8871−8874)、ヒドラゾン形成ライゲーション(Gaertner, et al., Bioconj. Chem. (1994) 5(4):333−338)、チアゾリジン形成ライゲーションおよびオキサゾリジン形成ライゲーション(Zhang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1998) 95(16):9184−9189; Tam, et al.,WO95/00846号)または他の方法(Yan, L. Z. and Dawson, P. E., ”Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization,” J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 526−533, 参照により本明細書に組み込まれる; Gieselnan et al., Org. Lett. 2001 3 (9): 1331−1334; Saxon, E. et al.,”Traceless” Staudinger Ligation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds. Org. Lett. 2000, 2, 2141−2143)のような水性両立ライゲーション化学で用いられる一意的官能基の残基を含む。
【0077】
上記で記載される種々の付着化学を考えると、水溶性ポリマーと標的ペプチドまたはポリペプチドとの間で形成された結合は、カーボネート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、アミン、オキシム、イミド、尿素、チオ尿素、チオエーテル、チオウレタン、チオエステル、エーテル、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキサゾリジン等から選ばれた結合の残基を含み得る。最も好ましい結合は、オキシムおよびアミド結合である。
【0078】
例えば図1〜図4に示されるようなペプチドライゲーション段階は、固相または液相ライゲーション戦略を用い得る。図8は、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質のライゲーションおよび生産に使用できるペプチドセグメントへの水溶性ポリマーの精密な付着のための別の経路を示すものである。第1ステップは固相ペプチド合成(「SPPS」)(例えば、FmocまたはBocSPPS)が用いられ、そこではポリマー付着の標的とされたアミノ酸側鎖は、直交保護基で保護される(例えば、FmocSPPSを用いるのであれば、ポリマー付着部位を保護するのにBoc基を用いることができ、BocSPPSを用いるのであれば、直交保護基としてFmoc基を用いることができる)。ペプチド合成に続いて、直交保護基が選択的に除去されるのに対して、ペプチドの残りは保護されたままである。これにより、次のステップである固相ポリマー合成のための単一付着部位がもたらされる。ひとたび直交保護基が除去されると、ポリマー鎖は前駆体として付着させられる。より好ましくは、ポリマー鎖は、図6A〜図6Dに示されるプロセスを用いたポリマー合成の連続的ラウンドで作られる。単一ポリマー付着部位が示してあるが、2つ以上が提供できる。図9は概括的な反応方式を示すものである。
【0079】
上記で述べたように、化学的ライゲーションは、第1の化学成分と第2の化学成分との間の選択的な共有結合的結合の形成を伴う。第1および第2の成分上に存在する一意的で相互に反応性の官能基は、ライゲーション反応を化学選択的にするために使用できる。例えば、ペプチドおよびポリペプチドの化学的ライゲーションは、適合できる一意的で相互に反応性のC末端およびN末端アミノ酸残基を持つペプチドまたはポリペプチドの化学選択的反応を伴う。この目的のためにいくつかの異なる化学反応が用いられており、その例としては、天然型化学的ライゲーション(Dawson, et al., Science (1994) 266:776−779; Kent, et al., WO96/34878号; Kent et al., WO98/28434号)、オキシム形成化学的ライゲーション(Rose, et al., Amer. Chem. Soc. (1994) 116:30−34)、チオエステル形成ライゲーション(Schnolzer, et al., Science (1992) 256:221−225)、チオエーテル形成ライゲーション(Englebretsen, et al., Tet. Lett. (1995) 36(48):8871−8874)、ヒドラゾン形成ライゲーション(Gaertner et al., Bioconj. Chem. (1994) 5(4):333−338)、チアゾリジン形成ライゲーションおよびオキサゾリジン形成ライゲーション(Zhang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1998) 95(16):9184−9189; Tam, et al., WO95/00846号; 米国特許第5,589,356号); Gieselman et al., Selenocysteine−mediated native chemical ligation (Org Lett. (2001) 3(9):1331−1334; and Staudinger amkde forming chemical ligation (Saxon et al., Org. Lett. (2000) 2:2141−2143)が含まれる。従って、理解されるように、そのような目的に適したどのような化学選択的反応化学も未保護ペプチドのライゲーションに適用可能である。
【0080】
任意のライゲーション化学のための反応条件は、ライゲーションに使用されるペプチドまたはポリペプチドセグメントの所望の相互作用を維持するように選択される。例えば、pHおよび温度、ライゲーションラベルの水溶性、第1のセグメントと第2のセグメントとの比、反応混合物の含水率および組成を改変してライゲーションを最適化できる。所望のライゲーション反応の特異性および速度を制御するため、すなわちペプチドまたはポリペプチドセグメントの可溶性を操作することによって反応性基の暴露および表出を制御するため、ライゲーションセグメントを種々の程度に可溶化する試薬の付加または除外をさらに用い得る。反応条件は、1つ以上の内部および/または外部対照と比較した所望の化学選択的反応生成物についてアッセイすることにより容易に決定される。
【0081】
N末端システイン残基を有するポリペプチドとの接合をライゲーションが伴う場合、好ましくは天然型化学的ライゲーションの手順が使用される(Dawson, et al., Science (1994) 266:776−779; Kent, et al., WO96/34878号; Kent, et al., WO98/28434号))。この方法論は、ライゲーション部位で天然アミド結合を生成するための確固たる方法論であることが判明した。天然型化学的ライゲーションは、C末端α−カルボキシチオエステル部分を有する第1のペプチドまたはポリペプチドセグメントと、N末端システイン残基を有する第2のペプチドまたはポリペプチドとの間の化学選択的反応を伴う。チオール交換反応は、最初のチオエステル結合された中間体を作り出し、これは自然に再配列して、ライゲーション部位で天然アミド結合を与え、そして一方でシステイン側鎖チオールを再生する。多くの例において、天然タンパク質の配列は、天然型化学的ライゲーション反応において、N末端システイン残基を有するポリペプチドフラグメントが合成および使われるように、適切に配置されたシステイン残基を含む。他の例においては、ペプチド合成は、システイン残基をこの目的のためのポリペプチドに導入するために実施できる。従って、その標準的形態において、天然型化学的ライゲーションは、標的ポリペプチド配列中のシステイン残基におけるチオエステル仲介された化学選択的反応を伴い、ペプチド結合がライゲーション部位で形成され、Cysの側鎖は天然形状に再生される。
【0082】
あるいは、本発明のタンパク質は、「擬似天然型化学的ライゲーション」または「拡張天然型化学的ライゲーション」を使用して合成し得る。擬似天然型化学的ライゲーションは、タンパク質合成に使用されるペプチド中の事前選択された位置における非天然的に生じる擬似アミノ酸残基の使用を伴う(例えば、図4参照)。そのような擬似アミノ酸の構造は、システインの構造および合成されているタンパク質中のそのような事前選択された位置に天然に見出されるアミノ酸の構造の両方を模倣する。従って、擬似天然型化学的ライゲーションは、ライゲーション部位において天然型化学的ライゲーションから生成されたシステイン側鎖のチオアルキル化に向けられる。好ましい態様は、システインライゲーション部位におけるチオアルキル化であり、そこでは少なくとも1つのペプチドは、チオール側鎖が適切な保護基で保護された天然システインを含んでいる。
【0083】
本発明の好ましい実施形態においては、システイン基のチオール部分は所望の側鎖、例えばリボソーム特定アミノ酸の側鎖、そのようなアミノ酸の類似体、または非リボソーム特定(non−ribosomally specified)アミノ酸へ修飾される。本明細書中で用いられるように、リボソーム特定アミノ酸は、タンパク質翻訳のプロセスにおいてリボソームにより認識され、リボソームによって作り出されたタンパク質中に組み入れられ得るアミノ酸である。システイン側鎖チオール部分の化学的修飾を記載した刊行物がかなり存在する(例えば、”Current Protocols in Protein Science,” Edited by: John E. Coligan et a/., John Wiley & Sons, NY (2000))。Kaiser,E.T.は、自然発生アミノ酸側鎖の化学特性を模倣するために、システイン残基側鎖の変換を記載している(例えば、Kaiser, E. T. et al., ”Chemical Mutation Of Enzyme Active Sites,” Science. 1984 Nov 2; 226 (4674): 505−11)。加えて、ラベルをペプチドまたはタンパク質中に導入するためのシステイン側鎖の使用が記載されている。システイン側鎖修飾は、「タンパク質結合および架橋の化学」(Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking), S. S. Wong, (1991, CRC Press)、「タンパク質の化学的修飾」(Chemical Modification of Proteins), Gary E. Means et a/., (1971, Holden−Day)、「タンパク質の化学的修飾:選択された方法および分析手順」(Chemical Modification of Proteins: Selected methods and analytical procedures), Glazer, A. N. et al. (1975, Elsevier)、「タンパク質修飾のための化学試薬」(Chemical Reagents for Protein Modification), RL Lundblad (1991, CRC Press)で概説されている。Tamら(Biopolymer (1998)46:319−327)は、非Cys天然型化学的ライゲーションのためのホモシステイン(−CH2−CH2−SH)の使用に続き、ホモシステイン側鎖を天然メチオニン側鎖(−CH2−CH2−S−CH3)に変換するためにメチルp−ニトロベンゼンスルホネート(メチル化試薬)を使用するチオアルキル化を開示している。本発明は、ホモシステインを擬似アミノ酸、すなわちメチオニン以外のアミノ酸に変換するためにも用い得る。しかしながら、本明細書中に記載されるシステインの変換と同様に、本発明に従って、変換したくない少なくとも1つの天然システインを含むペプチドのためのジスルフィドペアリングに関与する天然システインの破壊を避けるために保護基を用いる必要である。適切な保護基は以下に記載する。
【0084】
擬似天然型化学的ライゲーションの方法は、所定のリボソーム特定アミノ酸(例えば、グリシン、アラニン、バリン、およびプロリン)(ただし、アラニンの側鎖は、脱硫反応により形成し得る)(Liang, Z.Y. and Dawson, P.E., ”Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization,” J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 526−533、参照により本明細書に組み込まれる)の側鎖の模倣を容易にはしないのであるが、多くのリボソーム特定または非コード化アミノ酸を模倣する側鎖を形成するために用いることができる。本発明の擬似天然型化学的ライゲーション方法に従って産生されたアミノ酸はチオエーテル結合を含み、β分岐を全く持たない(それらすべてがβ位置にメチル基を含んでいる、すなわちaa−CH2−S−、という点で)。従って、β分岐アミノ酸、イソロイシンおよびトレオニンの擬似アミノ酸バージョンは、β幾何学およびそれに付随する制約を有することなく、ペンダント側鎖構造を持たせ得る。
【0085】
重要なことに、本発明の方法は、リボソーム特定アミノ酸の長さと同じ長さ、あるいはそのような長さよりも長いまたは短いアミノ酸側鎖の形成に用い得る。側鎖長さのそのような改変は、三次元コンホメーションを安定化(または不安定化)してタンパク質安定性を増大させる(またはタンパク質のコンホメーションを改変し、それによって自然発生タンパク質により受け入れられたそれらと関連する広範囲の基質、インヒビター、受容体、リガンド等を受け入れるタンパク質の能力を強化する)ために用い得る。例えば、Cys−CH2−SH+Br−CH2−COOHにより、Cys−CH2−S−CH2−COOH(そのような「擬似グルタミン酸」は1つの付加的側鎖原子、すなわち−S−基を有する。代わりに、アスパラギン酸の代わりに用いられれば、2つの付加的側鎖原子、すなわち−CH2−S−基を有する)が生じる。他の側鎖は、側鎖中に同数の原子を有しているが、チオエーテル結合(−S−)を含む点が異なる。例えば、Cys−CH2−SH + Br−CH2−CH2−NH−PGに続いて、PGを除去することにより、Cys−CH2−SH−CH2−CH2−NH2が生じる。結果として得られる構造は、側鎖中に付加的な原子を全く持っていないが、1つの−CH2−基が−S−で置き換えられる。メチオニンはここでは別の例であり、Cys−CH2−SH+I−CH2−CH3によりCys−CH2−S−CH2−CH3(Met−CH2−CH2−S−CH3の天然のmet構造に対して)が生じ、従って、チオエーテルが再配置される。アルギニンも同様である。すなわち、Cys−CH2−SH + Br−CH2−NH−CH((−NH2)(=NH2 +))により、Cys−CH2−S−CH2−NH−CH((−NH2)(=NH2 +))が生じる。好ましくは、反応性アミノ基の保護は、とりわけ構成擬似リジンについて、不要な副反応を回避するために用い得る。ひとたびチオアルキル化反応が実行されれば、保護基は除去し得る。
【0086】
一般に、自然発生タンパク質をできる限り綿密に模倣することが要望される場合、タンパク質のそのような位置に普通存在するリボソーム特定アミノ酸の長さと同じ長さである側鎖長さを有する擬似アミノ酸分子を使用することが最も好まれ、リボソーム特定アミノ酸の長さより1原子分長い側鎖長を有する擬似アミノ酸分子を用いることはあまり好まれず、さらに、リボソーム特定アミノ酸の長さより2原子分長い側鎖長を有する擬似アミノ酸分子を用いることはさらに好まれない。さらに、遺学伝的変化が機能を混乱させないと思われる、または関連したタンパク質中のその部位のアミノ酸が保存されているシステインライゲーション部位を選択することが好まれる。そのような部位は、アラニンスキャニング、相同性モデリングおよびその他の方法によって同定できる。
【0087】
擬似天然型化学的ライゲーションにおいて、アミノ末端システイン残基を含んでいるペプチドは、天然型化学的ライゲーションにおけるように、カルボキシ末端チオエステルを有するペプチドに結合される。次に、システインのチオール側鎖が、式Raa−X(Xは良好な離脱基であり、Raaはその構造がリボソーム特定または合成アミノ酸の側鎖の末端部分を模倣する基である)の化合物と反応させられる。
【0088】
重要なことには、擬似天然型化学的ライゲーションの反応は、システイン側鎖の天然のL−立体配置、またはD−立体配置で働く。D−立体配置の使用により、そのライゲーション部位におけるプロテアーゼ耐性を付与でき、従って、タンパク質分解に対する安定性を増大させることが求められる場合に使用できる。しかしながら、D−システインを使う場合には、その部位におけるバックボーン構造は改変されるであろう。そのような改変は、プロテアーゼ耐性に加え、生物活性を改変することが求められ得る。しかしながら、生物活性へのインパクトを最小限にするため、D−システインを、無秩序領域、結果として得られる折りたたまれた分子の表面に配置される無秩序ループあるいは分子の無秩序末端におけるような、高い可撓性の部位に配置するのが好ましい。望ましくは、擬似天然型化学的ライゲーションの反応は、合成された分子の表面に大きい帯電側鎖(例えば、Lys、Arg、AspまたはGluの側鎖)を配置するために用い得る。
【0089】
適切で良好な脱離基Xの例としては、ハロゲン、特にヨウ素および臭素が含まれる。Raa基の例としては、PO4基、COOH基、COO基、CONH2基、グアニジウム基、アミン基、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、イミダゾール基、アルキル化イミダゾール基、インドール基、またはアルキル化インドール基が含まれる。
【0090】
用いるRaaの選択は、特定位置に存在することが望まれるアミノ酸側鎖に依存するであろう。従って、例えば、所望のポリペプチドまたはタンパク質が以下のアミノ酸配列を有している:
aaNH2−Q−aax−aay−W−aaCOOH
式中、QおよびWはそれぞれ、付加的なアミノ酸残基の任意の存在または不在を示し、aaxおよびaayは内部隣接残基を示し(それぞれ、側鎖xおよびyを有する)、aaNH2およびaaCOOHはそれぞれ、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ(N−)末端残基およびカルボキシ(C−)末端残基を示し、以下の2つのペプチドを調製することにより合成される:
aaNH2−Q−aax−COSRおよびCys−W−aaCOOH
式中、Cysはシステインによるaayの置換を示し、Rはチオエステル基と適合する任意の基であり、アリール、ベンジル、およびアルキル基を含むがこれらに限定されない。Rの例としては、3−カルボキシ−4−ニトロフェニルチオエステル、ベンジルエステル、およびメルカプトプロピオン酸ロイシンエステルが含まれる(例えば、Dawson et a/., Science (1994) 266: 776−779; Canne et al. Tetrahedron Lett. (1995) 36:1217−1220; Kent, et al., WO/96/34878号; Kent, et al.,WO98/28434号; Ingenito et al., JACS (1999) 121 (49):11369−11374;およびHackeng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96:10068−10073参照)。他の例としては、ジチオスレイトール、あるいはアルキルまたはアリールチオエステルが含まれ、これらは周知のインテイン仲介生物学的手法により生産できる(例えば、Chong et al., Gene (1997) 192: 277−281; Chong et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26:5109−5115; Evans et a/., Protein Science (1998) 7:2256−2264;およびCotton et al., Chemistry & Biology (1999) 6 (9): 247−256参照);次いで、両フラグメントを結合し、aaNH2−Q−aax−Cys−W−aaCOOH
を形成する。
【0091】
次に、結合されたフラグメントはRy−Xと反応させられ、ここでRyはy側鎖の構造を模倣する側鎖である。この反応は、システインのチオール基を「擬似y」側鎖に変換するのに十分な条件下で実施される。例えば、もしRaaがCH2−COOHまたは(CH2)2−COOHとなるように選択されれば、反応は、アスパラギン酸(「擬似−Asp」)またはグルタミン酸(「擬似−Glu」)の構造と機能を模倣するアミノ酸残基の形成に至るであろう。理解されるように、上記の記載に鑑みて、より複雑な合成が、3つ以上のペプチドフラグメントを用いて実施できる。
【0092】
この方法の重要な特徴は、反応しているセグメント中で修飾したくないシステイン残基が、ライゲーション部位におけるもの以外のCys残基の化学的修飾を防ぐため、例えばCys(Acm)のように側鎖保護されること、あるいは反応しているセグメント中の他のどのCys残基も、ライゲーション後に化学的修飾反応による同一の「擬似アミノ酸」の同時形成を意図されるということである。
【0093】
本明細書中で使われているように、記号φはベンジル基を示し、IMはイミダゾール基を示し、INはインドール基を示し、PGは保護基を示す。以下は、本発明に従って擬似アミノ酸残基を含むペプチドを合成するために用い得るRaa側鎖の概要であり、式中Xはハロゲン(I、Br、Cl、F)であり、たいていの場合はBrおよびClが好ましく、Fはφ付着について好ましい。
塩基性アミノ酸:
Lys(余分な原子無し)
−CH2−SH + X−CH2−CH2−NH−PG、続いて脱保護することにより、−CH2−S−CH2−CH2−NH2が得られる。
Arg(余分な原子無し)
−CH2−SH + X−CH2−NH−C((NH2)(=NH2+))により
−CH2−S−CH2−NH−C((NH2)(=NH2 +))が得られる。
His(余分な原子2個)
−CH2−SH + X−CH2−IMにより−CH2−S−CH2−IMが得られる。
酸性アミノ酸:
Asp(余分な原子2個)
−CH2−SH + X−CH2−COOHにより−CH2−S−CH2−COOHが得られる。
Glu(余分な原子1個)
−CH2−SH + X−CH2−COOHにより−CH2−S−CH2−COOHが得られる。
非荷電極性アミノ酸:
Tyr(余分な原子無しまたは1個)
−CH2−SH + F−φ−pOHにより−CH2−S−φ−pOHが得られる(余分な原子無し、同じ幾何配置)。
−CH2−SH + Br/I−CH2−φ−pOHにより−CH2−S−CH2−φ−pOHが得られる(余分な原子1個)。
Gln(余分な原子1個)
−CH2−SH + X−CH2−C(O)(NH2)により−CH2−S−CH2−C(O)(NH2)が得られる。
Asn(余分な原子2個)
−CH2−SH + X−CH2−C(O)(NH2)により−CH2−S−CH2−C(O)(NH2)が得られる。
Ser(余分な原子2ないし3個)
−CH2−SH + X−CH2OHにより−CH2−S−CH2OHが得られる(余分な原子2個)
−CH2−SH+X−CH2−CH2OHにより−CH2−S−CH2−CH2OHが得られる(余分な原子3個)。
Thr(余分な原子2ないし3個、β分岐が無い)
−CH2−SH + X−CH((CH3)(O−PG))に続いてPGを除去することにより−CH2−S−CH((CH3)(OH))が得られる(余分な原子2個)。
−CH2−SH + X−CH2−CH((CH3)(O−PG))に続いてPGを除去することにより−CH2−S−CH2−CH((CH3)(OH))が得られる(余分な原子3個)。
非極性アミノ酸:
Leu(余分な原子1ないし2個)
−CH2−SH + X−CH((CH3)(CH3))により−CH2−S−CH((CH3)(CH3))が得られる(余分な原子1個)。
−CH2−SH + X−CH2−((CH3)(CH3))により−CH2−S−CH2−CH((CH3)(CH3))が得られる(余分な原子2個)。
Ile(余分な原子2ないし3個、β分岐無し)
−CH2−SH + X−CH(CH3)−CH2−CH3により−CH2−S−CH(CH3)−CH2−CH3が得られる(余分な原子2個)。
−CH2−SH + X−CH2−CH(CH3)−CH2−CH3により−CH2−S−CH2−CH(CH3)−CH2−CH3が得られる(余分な原子3個)。
Phe(余分な原子1ないし2個)
−CH2−SH + F−φにより−CH2−S−φが得られる(余分な原子1個)。
−CH2−SH + Br/I−CH2−φにより−CH2−S−CH2−φが得られる(余分な原子2個)。
Met(余分な原子無し)
−CH2−SH + I−CH2−CH3により−CH2−SH−CH2−CH3が得られる。
Trp(余分な原子1個)
−CH2−SH + F−INにより−CH2−S−INが得られる。
【0094】
しかしながら、ライゲーションに用いられるポリペプチドの所与のN末端にシステインまたはホモシステイン残基を導入するために、あるいはライゲーション部位において擬似アミノ酸を利用するために、タンパク質配列を修飾することが不便または望ましくない場合には、天然型化学的ライゲーションの方法は、N末端がN置換、好ましくはNα置換された2つないし3つの炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールを含むように修飾され、その結果天然型化学的ライゲーションの原理をシステイン残基を欠くポリペプチドと共に用いることを可能にするように拡張できる(米国特許出願番号第60/231,339号参照。参照により本明細書に組み込まれる)。
【0095】
「拡張天然型化学的ライゲーション」の方法は、カルボキシルチオエステル、より好ましくはα−カルボキシルチオエステルを含む第1の成分を、酸安定N置換、好ましくはNα置換された2つないし3つの炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールを含む第2の成分と結合させることを伴う。第1の成分のカルボキシチオエステルと、第2の成分のN置換された2つないし3つの炭素鎖アルキルまたはアリールチオールのチオールと間の化学選択的反応は、チオエステル結合された中間体を介して進み、初期のライゲーション産物に分解する。より具体的には、COSRチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間で生じるチオール交換により、チオエステル結合中間体ライゲーション産物が生成し、これは自発的再配列後に、アミノアルキルチオール成分が以下の式IまたはIIを有しているかによって、それぞれ5員環または6員環の中間体を介してアミド結合された第1のライゲーション産物を生成する。
式中、J1は、1つ以上の任意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドまたはポリペプチド、あるいはそのようなペプチドまたはポリペプチドの部分、ポリマー、色素、適切に官能化された表面、リンカーないし検出可能マーカー、または化学的ペプチド合成ないし拡張天然型化学的ライゲーションと両立できる任意の他の化学的部分であり、R1、R2およびR3は、独立的に、C1に結合されたHまたは電子供与基であり、ただし、R1、RおよびR3の少なくとも1つが、C1に結合された電子供与基を含み、さらに、J2は、1つ以上の任意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドまたはポリペプチド、あるいはそのようなペプチドまたはポリペプチドの部分、ポリマー、色素、適切に官能化された表面、リンカーないし検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成ないし拡張天然型化学的ライゲーションと両立できる任意の他の化学的部分である。
【0096】
ライゲーション部位における、N置換された2つないし3つの炭素鎖アルキルまたはアリールチオール[HS−C2−C1(R1)−]もしくは[HS−(C3(R3)−C2(R2)−C1(R1)−]は、ペプチド適合条件下で、生成物への損傷なく、除去することができ、その結果、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する、式IIIの最終的なライゲーション産物を生成できる。
式中、J1、J2、R1、R2およびR3は、上記で定義された通りである。
【0097】
R1、R2およびR3基は、ペプチド適合切断条件下でN−C1結合の切断を容易にするように選択される。例えば、電子供与基は、特にC1にコンジュゲートされると、切断を容易にするC1における共鳴安定化カチオンを形成するために用い得る。化学的ライゲーション反応は、好ましくは、賦形剤としてチオール触媒を含み、水性または混合有機−水性条件で中性pH近傍の条件で実行される。第1および第2の成分の化学的ライゲーションは、自発的再配列が生じる5〜6員環を経て進み、N置換アミド結合ライゲーション産物を作り出す。第1および第2の成分がペプチドまたはポリペプチドである場合、N置換アミド結合ライゲーション産物は式IVまたはVを有する:
式中、J1、J2およびR1、R2、R3およびZ2は、上記で定義された通りである。
【0098】
N置換アミド結合ライゲーション産物のコンジュゲートされた電子供与基R1、R2またはR3は、N−C1結合の切断およびN置換アミド結合ライゲーション産物からの2ないし3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの除去を容易にする。ペプチド適合性切断条件下でのNのアルキルまたはアリールチオール鎖の除去は、ライゲーション部位での天然アミド結合を有するライゲーション産物を生成する。第1および第2の成分がペプチドまたはポリペプチドである場合、ライゲーション産物は以下の式を有する:
式Iについての代表的なR1置換基を表Iに示す。
表I
【表1】
式IIについての代表的なR1、R2およにR3置換基を表IIに示す。
表II
【表2】
【0099】
N置換された2炭素鎖化合物の場合と同様、ライゲーションの後のNα−C1結合の強い切断に対応してC1炭素への電子コンジュゲーションを維持するためには、オルトまたはパラ位置におけるベンジルおよびピコリル電子供与置換基R1’、R3’およびR5’のポジショニングが必要である。しかしながら、R2およびR3がC2およびC3と共にベンジル基を形成する場合、R1’およびR3’の少なくとも1つは、強力な電子供与基を含み、そこではR1’またはR3’は、メトキシ基(−OCH3)、チオール基(−SH)、ヒドロキシル基(−OH)、およびチオメチル基(−SCH3)から選択される。R2およびR3が水素であるN置換された3炭素鎖チオールについては、R1はベンジルまたはピコリル基を含み、そこではR1’、R3’およびR5’は強いまたは中程度の電子供与基、あるいはそれらの組み合わせを含む。N置換された2炭素鎖アルキルまたはアリールチオールと同様、強い電子供与基は、ライゲーションに続く切断に対する3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの感受性を高める。従って、特定の電子供与基またはそれらの組み合わせがそれに応じて選ばれ得る。
【0100】
N置換された2炭素鎖化合物の場合と同様、本発明のN置換された3炭素鎖化合物は、対象となる構成物における置換に利用可能な場合にR1’およびR5’位置におけるR1の置換基としてのチオールを含み得る。ここで再び、電子供与チオール基はC1にコンジュゲートされ、これらの位置で導入されることにより、これらの化合物が6員環形成ライゲーションの際の2つの経路を持つことが可能になる。それは、α−カルボキシチオエステルと反応するための利用可能なチオールの局所濃度も増大させ、ライゲーションを改善できる構造的制約という意味で更なるコンホメーションを提供する。
【0101】
本発明のN末端N置換の2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸の合成は、本明細書中で、例えば、スキームIおよびスキームIIにおいて説明されたように、技術的に周知の標準的有機化学手法に従って実行し得る。例えば、”Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms, and Structure,” 4th Edition, J. March (Ed.), John Wiley & Sons, New York, NY, 1992; ”Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group Preparations,” R. Larock (Ed.), VCH Publishers, New York, NY, 1989を参照のこと。それらは、溶液中で、ポリマー坦持合成、またはその組み合わせにより合成できる。好ましい方法では、Nα保護Nアルキル化S保護アミノアルキル−またはアリール−チオールアミノ酸前駆体が用いられる。合成に利用される試薬は、どのような数の商業的ソースからでも入手できる。また、個々のアミノ酸誘導体のような、出発成分および種々の中間体が、キット等で供給されており、後に使用するために保存できることが理解されるであろう。
【0102】
本発明のN末端Nα置換2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸の調製においては、保護基戦略が用いられる。種々の合成戦略において一般に利用される好ましい保護基(PG)は、固相ペプチド合成(「SPPS」)と両立できる。いくつかの例では、種々の条件下で除去可能な直交保護基を利用することも必要である。多くのそのような保護基は周知であり、この目的に適している(例えば、”Protecting Groups in Organic Synthesis”, 3rd Edition, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; ”Synthetic Peptides, A User’s Guide,” G. A. Grant, Ed., W. H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; ”Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry,” W. D.. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes, and H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; ”Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky, Ed., Springer−Verlag, 1993; ”The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer−Verlag, 1994;および”Protecting Groups,” P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994参照)。例としては、ベンジルオキシカルボニル(Z)、Boc、Bpoc、Trt、Nps、FmocCl−Z、Br−Z;NSC;MSC、Dde等が含まれる。硫黄部分については、適切な保護基の例としては、ベンジル、4−メチルベンジル、4−メトキシベンジル、トリチル、ACM、TACAM、キサンチル、ジスルフィド誘導体、ピコリル、およびフェナシルが含まれるがこれらに限定されない。
【0103】
より具体的には、Nα置換された2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、スキームI(Nα置換された前駆体の固相調製)、スキームII(Nα置換された前駆体の液相調製)により調製される。スキームIにおいて、Nα置換された2または3炭素鎖アルキル基またはアリールチオールは、ポリマー坦持有機合成の標準的方法を使って固相上で直接的に組み立てられ、それに対してスキームIIのNα保護、Nアルキル化、S保護、アミノアルキルまたはアリールチオールアミノ酸前駆体は、標準的なカップリングプロトコルを使って樹脂にカップリングされる。ラセミまたはジアステレオマー生成物が生産される場合、拡張天然型化学的ライゲーションにおける使用前にこれらを標準的な方法で分離することが必要なことがある。
スキームI
【化2】
スキームII
【化3】
【0104】
α−カルボキシチオエステルは、実施例を含み本明細書中に記載されているような、技術的に周知の標準的な化学的または生物学的方法に従って生成できる。化学合成については、α−カルボキシチオエステルペプチドは、溶液中またはチオエステル生成樹脂から合成でき、これらの手法は周知である(例えば、Dawson et al., Science (1994) 266:776−779; Canne et al. Tetrahedron Lett. (1995) 36:1217−1220; Kent, et al.,WO96/34878号; Kent, et al.,WO98/28434号; Ingenito et al., JACS (1999) 121(49):11369−11374;およびHackeng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96:10068−10073); 上記Amiato et al.参照)。例えば、化学的に合成されたチオエステルペプチドは、対応するペプチドα−チオ酸から作ることができ、これが今度は、樹脂法が好まれるけれども、チオエステル−樹脂上または溶液中で合成できる。ペプチド−α−チオ酸は、対応する3−カルボキシ−4−ニトロフェニルチオエステル、対応するベンジルエステル、あるいは各種のアルキルチオエステルのいずれかに変換できる。これらのチオエステルはすべて、ライゲーション反応用に満足すべき残留基を提供し、3−カルボキシ−4−ニトロフェニルチオエステルは、対応するベンジルチオエステルよりも若干速い反応速度を示し、これが今度はアルキルチオエステルよりもより反応性になり得る。別の例としては、トリチル関連メルカプトプロピオン酸ロイシンチオエステル生成樹脂を、C末端チオエステルの構成に利用できる(上記Hackeng et al.)。C末端チオエステル合成も、3−カルボキシプロパンスルホンアミド安全キャッチリンカーを用い、ジアゾメタンまたはヨードアセトニトリルで活性化し続いて適切なチオールで置換することにより達成できる(上記Ingenito et al.; Bertozzi et al.)。
【0105】
C末端α−カルボキシチオエステルペプチドも、インテイン仲介生物学的手法のような生物学的プロセスを用いて作ることができる(例えば、Chong et al., Gene (1997) 192:277−281; Chong et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26:5109−5115; Evans et al., Protein Science (1998) 7:2256−2264;およびCotton et al., Chemistry & Biology (1999) 6 (9):247−256参照)。例えば、インテイン発現系は、アフィニティタグのようなラベルのあるまたはなしに、「インテイン」タンパク質スプライシング要素の誘導可能性自己切断活性を利用してC末端ジチオスレイトール(DTT)エステルのペプチドまたはポリペプチドセグメントを生成するために利用できる。特に、インテインは、DTT、b−メルカプトエタノールまたはシステインのようなチオールの存在下で特定の自己切断を受け、これにより、C末端チオエステルを持つペプチドセグメントが生成される。例えば、上記のChong et al.,(1997)、上記のChong et al., (1998)、上記のEvans et al.、および上記のCotton et al.参照。しかしながら、組換えにより生産されたセグメントを用いる場合、最終構成物の化学的に合成された部分は、含まれる場合には、一般にポリマー修飾を含む。
【0106】
本発明のN置換された2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオール成分と第1のカルボキシチオエステル成分とのライゲーションにより、ライゲーション部位にN置換アミド結合を有するライゲーション産物が生成する。反応のライゲーション条件は、N置換された2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオール部分でチオエステルの選択的反応性を維持するように選ばれる。好ましい実施形態において、ライゲーション反応は、pH6〜8、好ましくはpH6.5〜7.5の範囲を有するバッファー中で実行される。バッファー溶液は、水性、有機、またはそれらの混合物とすることができる。ライゲーション反応は、1つ以上の触媒および/または1つ以上の還元剤、脂質、界面活性剤、その他の変性剤または可溶化試薬等も含み得る。好ましい触媒の例は、チオフェノール、ベンジルメルカプタン、TCEPおよびアルキルホスフィンのようなチオールおよびホスフィン含有部分である。変性および/または可溶化剤の例としては、グアニジウム、尿素の水またはTFE、HFIP、DMF、NMPのような有機溶媒溶液、水とアセトニトリルの混合物、および尿素の水溶液が含まれる。ライゲーション反応の速度を調節するために温度も用いることができ、温度は通常5℃〜55℃であり、好ましい温度は15℃〜40℃である。一例として、ライゲーション反応は、pH6.8〜7.8で6Mグアニジウム中の2%チオフェノールを有する反応系中で良好に進行する。
【0107】
N置換された2炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの場合は、ライゲーションイベントは、COSRチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間で生じるチオール交換に起因する。この交換により、チオエステル連結中間ライゲーション産物が生成され、これは5員環中間体を経て自発的再配列の後に、除去可能なN置換された2炭素鎖アルキルまたはアリールチオール[HS−C2−C1(R1)−]をライゲーション部位に有する式J1−HN−CH(Z1)−C(O)−Nα(C1(R1)−C2−SH)−CH(Z2)−J2のライゲーション産物が生成され、そこでは置換基は上記で定義された通りである。ライゲーション部位におけるN置換された2炭素鎖アルキルまたはアリールチオール[HS−C2−C1(R1)−]は、ペプチド適合条件下で除去されて、ライゲーション部位で天然アミド結合を有する式J1−HN−CH(Z1)−C(O)−NH−CH(Z2)−CO−J2の最終ライゲーション産物を生成できる。
【0108】
N置換された3炭素鎖アリールまたはアルキルチオールの場合は、COSRチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間のチオール交換により、チオエステル連結中間ライゲーション産物が生成され、これは6員環中間体を介しての自発的再配列の後に、除去可能なN置換された3炭素鎖アルキルまたはアリールチオール[HS−C3(R3)−C2(R2)−C1(R1)−]をライゲーション部位に有する式J1−HN−CH(Z1)−C(O)−Nα(C1−C2(R2)−C3(R3)−SH)−CH(Z2)−J2の第一のライゲーション産物が生成される。ライゲーション部位におけるN置換された3炭素鎖アリールチオール[HS−C3(R3)−C2(R2)−C1(R1)−]は、ペプチド適合条件下で除去されて、ライゲーション部位で天然アミド結合を有する式J1−HN−CH(Z1)−CO−NH−CH(Z2)−CO−J2の最終のライゲーション産物を生成できる。
【0109】
N置換されたアルキルまたはアリールチオール基の除去は、N−C1結合の切断を容易にするため、好ましくは酸性条件で実行され、安定化された未置換のアミド結合がライゲーション部位で作り出される。「ペプチド適合切断条件」は、ペプチドと両立できかつライゲーション産物からのアルキルまたはアリールチオール部分の切断に適した物理化学的条件を意味する。一般にペプチド適合切断条件は、用いられるα−置換化合物に応じて選択され、これは日常的かつ周知の方法により用意に推論できる(例えば、”Protecting Groups in Organic Synthesis”, 3rd Edition, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; ”Synthetic Peptides, A User’s Guide,” G. A. Grant, Ed., W. H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; ”Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry,” W. D.. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes, and H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998 ;”Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.,”M. Bodanszky, Ed., Springer−Verlag, 1993; ”The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer−Verlag, 1994;および”Protecting Groups,” P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994参照)。
【0110】
例えば、R1、R2またはR3置換基がメトキシ、ヒドロキシル、チオールまたはチオメチル、メチル等を含む場合、より一般的な除去方法は、ペプチド合成化学に典型的な酸性の切断条件を伴う。これには、強い酸性条件下または水−酸性条件下で、還元剤および/またはスカベンジャー系(例えば、無水フッ化水素(HF)、トリフルオロ酢酸(TFA)、またはトリメチルスルホニルフルオロ酢酸(TMSFA)等の酸)が有りまたは無しでのN−C1結合の切断が含まれる。より具体的な酸性切断系は、所定の構成物についてアリールまたはアルキルチオール部分を除去するためにNα−C1結合の切断を最適化するように選ばれ得る。そのような条件は周知であり、ペプチドの完全性の維持と両立できる。特に、ペプチドまたはポリペプチド配列中にトリプトファンが存在する場合、トリプトファン側鎖と遊離アリールまたはアルキルチオール部分との反応を回避するため、チオールスカベンジャーを含ませ得る。チオールスカベンジャーの例として、エタンジオール、システイン、β−メルカプトエタノールおよびチオクレゾールが含まれる。
【0111】
他の特殊化された切断条件としては、ピコリル基が置換基である場合の光または還元的切断条件が含まれる。一例として、R1、またはR2およびR3置換基がピコリル部分を含む場合、光分解(例えば、紫外光)、亜鉛/酢酸または電解還元を、標準プロトコルに従って切断用に用い得る。N置換された2炭素鎖チオールのR1がR1にチオメタンを含む場合、水銀またはHF切断が用い得る。この切断システムは、第1または第2のライゲーション成分が他の保護基を含む場合に、固体支持体から同時切断用におよび/または脱保護試薬としても用い得る。
【0112】
本発明の1つの実施形態において、Nα−置換2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、合成赤血球産生刺激タンパク質を産生するために拡張化学的ライゲーション用の基質として用い得る適切にN末端誘導体化されたポリペプチドを産生するために、ペプチド合成ステップ(特に、自動化ペプチド合成、ならびに直交および収束的ライゲーション戦略)中で用いられる。そのような化合物は、完全に保護された、部分的に保護されたまたは完全に未保護の酸安定性Nα−置換2または3炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールを含み、これらは式が(PG1)S−C2−C1(R1)−Nα(PG2)−CH(Z2)−C(O)−J2または(PG1)S−C3(R3)−C2(R2)−C1(R1)−Nα(PG2)−CH(Z2)−C(O)−J2であり、以下で表IIIおよび表IVに図示してある。特に、R1、R2およびR3の内の2つ以上は、C1にコンジュゲートされた電子供与基を含み、これは、Nα−置換アミノアルキルまたはアリールチオールのNα−置換アミドアルキルまたはアリールチオールへの変換に続いて、ペプチド適合性切断条件下でNα−C1結合の切断を容易にするC1における共鳴安定化カチオンを形成できるものである。PG1およびPG2は、個別にまたは組み合わせて存在しまたは存在せず、または同じまたは異なる保護基であり、そこではZ2は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションと適合性がある任意の化学的部分であり、J2は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションと適合性がある任意の化学的部分である。PG1(またはX1)は、アミンを保護するための基である。PG2(またはX2)は、チオールを保護するための基である。多くのそのような保護基は周知であり、この目的に適している(例えば、”Protecting Groups in Organic Synthesis”, 3rd Edition, T. W. Greene and P.G.M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; ”Synthetic Peptides, A User’s Guide,” G.A. Grant, Ed., W.H, Freeman & Company, New York, NY, 1992; ”Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry,” W.D.. Bennet, J.W. Christensen, L.K. Hamaker, M.L. Peterson, M.R. Rhodes, and H.H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; ”Pricipies of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky, Ed., Springer−Verlag, 1993; ”The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.,” M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer−Verlag, 1994; and ”Protecting Groups,” P.J. Kocienski, Ed., Georg ThiemeVerlag, Stuttgart, Germany, 1994)。
表III
【表3】
【0113】
PG1およびX1として好ましい保護基の例としては、[Boc(t−ブチルカルバメート)、Troc(2,2,2,−トリクロロエチルカルバメート)、Fmoc(9−フルオレニルメチルカルバメート)、Br−ZまたはCl−Z(Br−またはCl−ベンジルカルバメート)、Dde(4,4,−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキシル−イリデン)、MsZ(4−メチルスルフィニルベンジル−カルバメート)、Msc(2−メチルスルホエチルカルバメート)、Nsc(4−ニトロフェニルエチルスルホニル−エチルオキシカルボニル)が含まれるがこれらに限定されない。好ましいPG1およびX1保護基は、”Protective Groups in Organic Synthesis,”Green and Wuts, Third Edition, Wiley−lnterscience, (1999)から選ばれ、最も好ましいものはFmocおよびNscである。PG2として好ましい保護基の例としては、[Acm(アセトアミドメチル)、MeoBzlまたはMob(p−メトキシベンジル)、Meb(p−メチルベンジル)、Trt(トリチル)、Xan(キサンテニル)、tButhio(s−t−ブチル)、Mmt(p−メトキシトリチル)、2または4ピコリル(2または4ピリヂル))、Fm(9−フルオレニルメチル)、tbut(t−ブチル)、Tacam(トリメチルアセトアミドメチル)]が含まれるが、これらに限定されない。好ましい保護基PG2およびX2は、”Protective Groups in Organic Synthesis,”Green and Wuts, Third Edition, Wiley−lnterscience, (1999)から選ばれ、最も好ましいものはAcm、Mob、MeB、ピコリルである。表IV
【表4】
【0114】
本発明のNα−置換された2または3鎖アルキルまたはアリールチオールは、上記のスキームIおよ11におけるように調製し得る。
【0115】
本発明の化合物は、ハロゲン仲介アミノアルキル化、還元的アミノ化を含む各種の手段のいずれによっても、および固相アミノ酸合成方法と適合するNα−保護された、N−アルキル化された、S−保護された、アミノアルキル−およびアリール−チオールアミノ酸前駆体の調製により生産できる。必要な場合には、許容できるキラル純度の化合物を得るために産生されたラセミ化合物またはジアステレオマーの分割を標準的方法により実行できる。
【0116】
III.本発明の好ましい水溶性ポリマーの合成および製造
本明細書中で使われているように、「分子不均一性」は、タンパク質製剤の個々のタンパク質に付着させられたポリマー分子の数における変動を意味することを意図している。用語「分子多様性」は、(a)ポリマーにより修飾されるタンパク質の部位における変動、(b)同じタンパク質の異なる部位の、またはタンパク質製剤の異なるタンパク質の同じ部位のポリマー付加物の長さの変動、または(c)同じタンパク質の異なる部位の、またはタンパク質製剤の異なるタンパク質の同じ部位のポリマー付加物の任意の分岐の程度および/または性質の変動を意味することを意図している。本明細書中で使われているように、「分子的に均質」は、すべてのタンパク質分子がアミノ酸配列および同じ位置に同じポリマー修飾を含んでいるタンパク質製剤を意味することを意図している。2つ以上の「分子的に均質」なタンパク質製剤混合物は、本明細書中では、「分子的に定義された」製剤と呼ばれる。
【0117】
本発明のこの観点に従って、上記で特定したポリマー不均一性、多様性、および不適性の問題に対する解決策は、ポリペプチドの利点(正確な長さ、便利な合成)と「pPEG」(「精密PEG」の利点(可撓性両親媒性、非免疫原性で、プロテアーゼの影響を受けないポリマー))Rose, K. et al.(米国特許出願番号第09/379,297号、参照により本明細書に組み込まれる)の両方を組み合わせる新規な種類の生体適合性ポリマーの製造を伴う。この新規な種類の生体適合性ポリマーは、以下の式を有する:
−[CO−X−CO−NH−Y−NH]n−
nは整数であり、好ましくは1〜100、より好ましくは2〜100であり、XおよびYは、アミド結合により連結された正確な構造の生体適合性の反復要素である。XおよびYは、好ましくは、反応官能基を欠いているか存在しない2価の有機ラジカルであり、さらに同じまたは異なっており、各反復単位(n)と共に独立して変わり得る。好ましくは、n=2の場合には、XまたはYの少なくとも一方は、置換、未置換、分岐および直鎖状脂肪族ならびに芳香族基からなる群から選ばれる。より好ましくは、XまたはYの一方は、フェニル、C1−C10アルキレン部分、C1−C10アルキル基、ヘテロ原子含有フェニル、ヘテロ原子含有C1−C10アルキレン部分、ヘテロ原子含有C1−C10アルキル基、それらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0118】
特に、好ましいpPEG部分は以下の式を有する:
−{CO−(CH2)2−CO−NH−(CH2)3−(OCH2CH2)3−CH2−NH}n−
(式中、nは、好ましくは1〜100、より好ましくは2〜100)、または
−{CO−(CH2)2−CO−NH−(CH2)6−NH−CO−(CH2)2−CO−NH−(CH2)3−(OCH2CH2)3−CH2−NH}n−
(式中、nは、好ましくは1〜50、より好ましくは2〜50で変化する。)
【0119】
そのようなpPEG部分は、各種の方法のいずれによっても合成できる。しかしながら、そのような部分は好ましくは、重合プロセスというよりむしろ単位の固相段階的の組上げを用いて生成される。そのような組上げプロセスを用いることにより、製剤の部分が、それらの長さ、それらのXおよびY置換基の性質、(もしあれば)分岐点の位置、ならびに任意の分岐の長さ、Xおよび置換基、および位置に関して定義された均質な構造を有することが可能になる。
【0120】
好ましくは、そのような部分は以下のようなステップによって合成される:
(a)式Z−Q−支持体の化合物のアミノまたはヒドロキシル基を、式HOOC−X−COOHを有するモル過剰の二酸誘導体でアシル化するステップ(式中、ZはH2N−またはHO−、Qはリンカーまたは標的分子、支持体は固相のマトリクスまたは表面)、
(b)ステップ(a)の産物の遊離カルボキシル基を活性化するステップ、
(c)ステップ(b)の産物を、式NH2−Y−NH2を有するモル過剰のジアミンでアミノ分解するステップ、さらに
(d)HOOC−X−COOHおよびNH2−Y−NH2を用いてステップ(a)〜(c)を任意に反復するステップで、前記XおよびYは、2価の有機ラジカルであるか存在せず、さらに同じかまたは異なっており、前記任意に反復される単位と共に独立して変わることができ、前記のアシル化およびアミノ分解ステップのいずれかで用いられるXおよびY置換基と同じまたは異なる。
【0121】
好ましい実施形態において、上記反復単位の6−マー、12−マー、18−マーおよび32マーが用いられる。必要な場合には、反復単位は、例えば、リジンのアミノ基と共に用いて分岐pPEG構造を形成できる。pPEGは、チオエーテル、オキシムおよびアミド結合形成を含む各種の化学によって、本発明の合成タンパク質に付着させ得る。
【0122】
1つの実施形態においては、単位の固相段階的鎖集合は以下のステップを含む:
ステップ1:保護または未保護二酸を樹脂上のアミノにカップリングして結合部位にアミド結合を生成する(PGは、用いる二酸に応じて存在するかまたは存在しない保護基):
PG−OOC−X−COOH + NH2−Y−NH−樹脂
【0123】
ステップ2:もし存在するのであれば、樹脂上の保護基(PG)を除去する
HOOC−X−CO−NH−Y−NH−樹脂
【0124】
ステップ3:保護または未保護のジアミノを樹脂上のカルボキシにカップリングして結合部位にアミド結合を生成する(PGは、用いるジアミノに応じて存在するかまたは存在しない)
PG−NH−Y−NH + HOOC−X−CO−NH−Y−NH−樹脂
【0125】
ステップ4:もし存在するのであれば、樹脂上の保護基(PG)を除去する
−NH−Y−NH−OC−X−CO−NH−Y−NH−樹脂
【0126】
ステップ5:ステップ1〜4を「n」回反復して「n」個の単位を付加し、次いで樹脂から切断する
−[CO−X−CO−NH−Y−NH]−[CO−X−CO−NH−Y−NH]
−[CO−X−CO−NH−Y−NH]−[CO−X−CO−NH−Y−NH]
−
【0127】
論じたように、直鎖状および分岐状pPEG構成物は、本発明の合成赤血球産生刺激分子への付着について好ましい水溶性ポリマーである。用いられるpPEGは、生理学的条件下での中性または帯電したペンダント基を持ち、さらに用いるpPEGに応じて付着化学、長さ、分岐および溶解性を変えることができる。上で言及したように、本発明の好ましいpPEGは、反復単位−CO−X−CO−NH−Y−NH−を有する水溶性ポリアミドを含み、XおよびYの一方または両方は、水溶性反復単位、最も好ましくは「PEG」ベースの反復単位を含む。オリゴ尿素は原則として、アミノ樹脂NH2−樹脂、および対称的ジアミンNH2−Y−NH2のケースについて以下に示すような単純な2段階の固相手順を用いて入手できる。
【0128】
カルボニルジイミダゾールによる活性化→im−CO−NH−樹脂
ジアミンNH2−Y−NH2によるアミノ分解→NH2−Y−NH−CO−NH−樹脂
これら2つのステップを多数回繰り返して、−NH−Y−NH−CO−反復単位を有するオリゴ尿素を得ることができるが、この方法はあまり好まれない。これは、上記のステップの収率が、非常に大過剰の試薬と長い反応時間であってさえも、室温で非定量的なことがあるからである。従って、ポリアミドを形成するために、アミノ樹脂NH2−樹脂のケースについて下記に示される3ステップ固相手順を用いることがより好ましい。異性体産物を回避するため、試薬HO2C−X−CO2HおよびNH2−Y−NH2は対称的とすべきである。
【0129】
二酸HO2C−X−CO2Hを用いたアシル化→HO−CO−X−CO−NH−樹脂
カルボニルジイミダゾールを用いた活性化→im−CO−OCO−X−CO−NH−樹脂
ジアミンNH2−Y−NH2を用いたアミノ分解→NH2−Y−NH−CO−X−CO−NH−樹脂
これらの3つのステップは、反復単位−NH−Y−NH−CO−X−CO−を有するポリイミドを得るため、順次多数回繰り返すことができる。ポリマーは正確な数のモノマー単位を含み、XおよびYは各ステップにおいて独立的に変えることができ、末端基は自由に選ばれ得る。例えば、アシル化ステップに無水コハク酸(「Succ」)を用い、アミノ分解ステップに4,7,10−トリオキサ−1,13−トリデカンジアミン(「EDA」または「TTD」とも呼ばれる)を用いることにより、「PEG」ベースのポリアミドが形成され、そこではXは−CH2CH2−、Yは−NH−CH2CH2CH2−(OCH2CH2)3−CH2−NH−であり、反復単位は−NH−CH2CH2CH2−(OCH2CH2)3−CH2−NH−COCH2CH2CO−である。この手順が保護基の無い2価の試薬を伴うという事実にかかわらず、標準的な市販のペプチド合成樹脂を用いる場合には、分岐構成物を作るために分岐Lys核のケースについて以下で言及されることを除き、架橋は問題ではない(Rose et al.,(米国特許出願番号第09/379,297号)およびRose et al., J. Am. Chem. Soc. (1999)121:7034)。
【0130】
例えば、分岐pPEG構成物は、Rose et al.,(米国特許出願番号第09/379,297号)、Rose, K.およびVizzavona, J. (J. Am. Chem. Soc. (1999) 121:7034)に記載される「ケモボディー」構成物についてと同様にして作り得る。分岐pPEG構成物は、リジン分岐核のような分岐核を持つようにすることができ、これはオキシムリンカーを介して、−(COCH2CH2CO−NH−CH2CH2CH2−(OCH2CH2)3−CH2−NH)n−のような好ましい水溶性ポリアミドにカップリングされる。例えば、オキシム結合は、ポリアミドの他端におけるLys側鎖上のアミノオキシアセチル基と、リジン核、例えば四量体核(O=CHCO)4Lys2Lys−上のグリオキシリル基との間で容易に形成され得る。従って、各リジン分岐点から切り離されたオキシムリンカーを、−Lys(COCH2ON=CHCO−)アミド−の構造として作ることができる。別の構成では、好ましくはポリアミドのカップリング後に単保護されたジアミンと脱保護を用いて下記の4価の分岐構成物を生成して、ポリアミドとポリアミドの遊離ペンダント基との間にオキシム結合を配置することができる:
[O=CHCO−(NH−CH2CH2CH2−[OCH2CH2]3−CH2−NH−COCH2CH2CO−)n]4Lys2Lys−
【0131】
オキシム化学は、二量体および四量体の分岐構成物を作る際に用い得るだけでなく、八量体分岐構成物の集合にも適している(Rose, K., J. Am. Chem. Soc. (1994) 116: 30; Rose, K. et al., Bioconj. Chem. (1996) 7: 552)。当然、そのようなpPEGポリアミドを用いる場合にそのような目的のために他の化学を使うことが可能である(例えば、図13参照)。さらに、ポリアミド形成は、BocまたはFmoc化学を伴うペプチド合成の合成スキームに組み入れ得るが、そのようなスキームを作り上げる際に、アミノ分解ステップによりFmoc基が除去され、もしBoc化学が使われることになるのであればインドールのホルミル保護が除去されることに留意しなければならない。
【0132】
従って、そのようなpPEGは、好ましい結合(例えば、アミド、チオエーテル、オキシム等)を介して直鎖状水溶性ポリマー(例えば、−(Succ−TTD)n−等)に連結された種々の分岐核(例えば、リジン分岐核等)を持つようにすることができ、そこでは、各直鎖状水溶性ポリマーの自由端は各々所望のペンダント基(例えば、カルボキシレート、アミノ、アミド等)でキャッピングして所望の電荷をもたらすことができる。さらに、本発明の直鎖状および分岐状pPEGは、1つ以上の一意的で相互に反応性の官能基を持つ合成タンパク質への付着に対し一意的な官能基を含むようにすることができ、pPEGのペンダント基は、好ましくは非抗原性である(例えば、図13参照)。
【0133】
特に好ましい実施形態においては、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、以下の式の分子的に均質なグリコ模倣水溶性ポリマーで修飾される:
U−s1−B−s2−ポリマー−s3−J*
式中、Uは一意的な官能基の残基、Bは、同じでも異なってもよくさらに存在しても存在しなくてもよい3つ以上のアームを有する分岐核、「ポリマー」は、式が−[C(O)−X−C(O)−NH−Y−NH]n−または−[NH−Y−NH−C(O)−X−C(O)]n−で、分子量が約5,000Da以上のポリアミドであり、ここでXおよびYは、同じでも異なってもよく、さらに分岐状でも直鎖状でもよい2価ラジカルであり、nは2〜50の整数であり、さらにXおよびYの一方または両方は、直鎖状でも分岐状でもよい実質的に非抗原性の水溶性反復単位を含み、J*は、負、正、および中性からなる群から選ばれ、生理学的条件下で実効電荷を有する実質的に非抗原性ペンダント基であり、s1、s2およびs3は、同じでも異なってもよくさらに個別に存在しても存在しなくてもよいスペーサーまたはリンカー部分である。そのようなポリマーとしては、米国特許出願番号第60/236,377号に記載されるものが含まれ、本明細書にその全体が組み入れられる。式U−s1−B−s2−ポリマー−s3−J*は、式U−B−ポリマー−J*で表すこともでき、ここではスペーサーまたはリンカー基s1、s2、s3は存在していても、していなくてもよい。
【0134】
本発明の好ましいグリコ模倣ポリマーの好ましい形成プロセスは、図5〜図7に示してある。図5A〜図5Bは、分岐核(B)および本発明の水溶性ポリマーU−B−ポリマー−J*の一意的な化学選択性官能基(U)を生成するための固相プロセスを示す。示されるような固相法が好ましいが、このプロセスは溶液中で実行できる。特に、図5Aには、直交的に保護された反応性基
【化4】
を有するU−B前駆体部分が示してあり、そのような構成物の基本的幾何学構造は、結合により連結された点
【化5】
により表され、この基本的幾何学構造は、用いられる化学的結合または基のタイプを限定することを意図するのものでなく、本発明のU−B部分の生成に適した構造および化学的加工ポイントを作るための幾何学の相対的ポイントを単に例示するものである。直交的に保護されたU−B前駆体は、U−B前駆体への共有結合が可能な活性化に続いて、適切な切断可能リンカーおよび共反応性基
【化6】
を含むポリマー支持体/樹脂にカップリングされる:
【化7】
【0135】
この系は、ポリマー支持体された有機化学の原理を使用する。カップリングに続き、分岐核は、例示されるように加工され(第1の分岐点のみが示してあり、付加的な分岐点は存在しても存在しなくていもよい)実質的に非抗原性の水溶性直鎖状ポリマーのような所望のポリマー成分の引き続いての付着に適切な分岐核を生成する。U基も示してあり、これは、合成の最初に、直交的に保護されたU−B前駆体の一部として提供、または分岐核Bの加工の間または後に加工し得る。ポリマー成分の付着がオンレジンで、すなわち切断より前に達成できるのに対して、好ましい経路は、ポリマー成分の引き続いての付着のために精製し得るU−B核を生成するため、ポリマー支持体/樹脂からのU−B部分の切断である。
【0136】
例示されるように、核基Bのペンダント分岐点は官能基(Func)を含むように作られ、これは同じまたは異なるものとすることができ、可逆的に保護(PG、PG’、またはPG’’)または未保護にできる。個々のケースにおいて、ポリマー成分の付着のための最終ステップは、ペンダント分岐点における官能基(Func)の生成、および基Uの生成を伴う(図7参照)。図5Bは代替的プロセスを示し、そこでは保護されたU−B前駆体が、リンカーを持つポリマー支持体と共に用いられ、これは切断と同時に、所望の保護されたまたは未保護のU基を生成する。図5Bには、ポリマー支持体への事前集合された分岐核Bの付着、およびポリマー成分の引き続いての付着のためのU−B部分を作るためにU基生成樹脂の使用も示してある。
【0137】
図6A〜図6Dには、引き続いてのU−B核への付着のための本発明の好ましい実質的に非抗原性の水溶性ポリアミドポリマー−J*成分を生成するための固相プロセスが示してある。固相プロセスが例示されているが、これは好ましいプロセスであって、溶液相プロセスを適合させて同じ最終結果を達成するようにできる。図6Aおよび図6Bにおいては、二酸およびジアミノ単位が、固相有機化学の原理を使ってカップリングされる。任意に、保護されたアミノ−X’−酸および/またはアミノ−Y’−酸単位は、式−[NH−Y−NHCO−X−CO]−のポリアミド構造を有する最終切断産物中の基XおよびYの付加的多様性のために組み入れ得る。図6AはNからC末端方向への合成を示すのに対して、図6BはCからN末端方向への合成を示す。図6Cおよび図6Dにおいては、保護されたアミノ−X’−酸および/またはアミノ−Y’−酸単位が、固相有機化学の原理を使ってカップリングされる。図6CはNからC末端方向への合成を示すのに対して、図6DはCからN末端方向への合成を示す。図6A〜図6Dから明白なように、最終的ポリアミド産物の性質は正確に制御され、これは合成のために実施される多数のサイクルに依存する。さらに、ペンダント基J*は、事実上どのようなユーザー定義仕様にでも作ることができる。単分散反復単位X、Y、X’およびY’が用いられる場合、最終的ポリアミド産物の正確な分子構造が正確に制御できる。
【0138】
式U−Bポリマー−J*の本発明の好ましい合成ポリマー構成物を生成するためにU−B成分をポリマー−J*成分にカップリングするための好ましいプロセスが図7に示してある。例示されているように、種々の保護基を提供でき、それらは、所定の構成物の意図される最終用途に応じて任意である。所望のU−B−ポリマー−J*構成物を産生するための種々の経路も例示されており、固相方法および溶液相方法が含まれる。
【0139】
上記で言及されたように、好ましい水溶性反復単位は、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシド、またはそれらの誘導体を含む。最も好ましい水溶性反復単位は、式−(CH2−CH2−O)―または―(CH2−CH2−O)−のエチレンオキシドを含み得る。そのような水溶性反復単位の数は大きく変わり得るが、そのような単位のより好ましい数は、2〜500、2〜400、2〜300、2〜200、2〜100、2〜50であり、より好ましくは2〜32であり、3〜8が最も好ましい。より好ましい実施形態の例は、XおよびYの一方または両方が、−((CH2)n1−(CH2−CH2−O)n2−(CH2)n1−)−または−((CH2)n1−(O−CH2−CH2)n2−(CH2)n1−)から選ばれ、ここでn1は、1〜6、1〜5、1〜4であり、最も好ましくは1〜3であり、n2は、2〜50、2〜25、2〜15、2〜10、2〜6であり、最も好ましくは2〜5である。非常に好ましい実施形態の例は、Xが−(CH2−CH2)−で、Yが−(CH2−(CH2−CH2−O)3−CH2−CH2−CH2)−または−(CH2−CH2−CH2−(O−CH2−CH2)3−CH2)−である場合である。いっそう好ましくは、個々のnが整数である単分散混合物である。非常に好ましい実施形態においては、Xは−(CH2−CH2)−であり、Yは−(CH2−(CH2−CH2−O)3−CH2−CH2−CH2)n−または−(CH2−CH2−CH2−(O−CH2−CH2)3−CH2)n−であり、nは12〜36である。
【0140】
特に、「ポリマー」は好ましくは、エチレンオキシド反復単位のようなポリアルキレンオキシドを有するポリマー鎖を有する水溶性ポリマーを含み、各鎖の分子量は、約1500〜約42,000Daであり、約2,000〜約20,000Daが最も好ましい。
【0141】
好ましいU基は、化学的ライゲーション可能な部分を含む。好ましいポリマーは、基Bが3本以上のアームを含む場合に分岐する。好ましい成分J*は、生理学的条件下でイオン化可能性な基を、そして最も好ましくは負に帯電する基を含む。UおよびJのいずれかまたは両方は、構成物の完全性を損うことなく除去可能な保護基を含み得る。
【0142】
好ましいスペーサーまたはリンカーは、水溶性ポリマー中に用いられる1つ以上の反復単位、ジアミノおよびまたは二酸単位、天然または非天然アミノ酸もしくはそれらの誘導体を含む直鎖状または分岐状部分、ならびに好ましくは最大で18個の炭素原子さらには付加的ポリマー鎖までも含むアルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アルコキシ等を含む直鎖状または分岐部分を含む。
【0143】
上記で言及したように、成分Uは、ペプチド、ポリペプチド、または関心のある他の表面のような標的分子に付着できる可能性があるか、または付着されている官能基の残基である。Uが標的分子へのコンジュゲーションのための官能基の残基である場合、Uは求核基または求電子基を含み、標的分子は、相互に反応性の求電子基または求核基をそれぞれ含む。
【0144】
そのような相互に反応性の多くの官能基は周知であり、ペプチドおよびポリペプチドに共通の側鎖官能基への付着が可能である(Zalipsky et al., Bioconjugate Chemistry (1995) 6:150−165; ”Perspectives in Bioconjugate Chemistry”, C.F. Meares, Ed., ACS, 1993; ”Chemistry of Protein Conjugation and Cross−Linking”, S.S. Wong, Ed., CRC Press, Inc.(1993))。官能基の例としては、(a)p−ニトロフェニル、またはスクシンイミジルのようなカーボネート、(b)カルボニルイミダゾール、(c)アズラクトン、(d)環状イミドチオン、さらに(e)イソシアネートまたはイソチオシアネートのようなアミノ基と反応可能な基が含まれる。カルボン酸基および反応性カルボニル基と反応可能な官能基の例としては、(a)第1アミン、または(b)ヒドラジンおよびアシルヒドラジド、カルバゼート、セミカルバメート、チオカルバゼート、アミノオキシ等のヒドラジドが含まれる。メルカプトまたはスルフヒドリル基と反応可能な官能基としては、フェニルグリオキサール、マレイミド、およびハロゲンが含まれる。(カルボキシル)酸のようなヒドロキシル基と反応可能な官能基、または求電子中心と反応可能な他の求核試薬の例としては、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、チオール基、活性メチレン等が含まれる。
【0145】
例えば、上記のポリマーは、標的分子へ付着するための官能基として成分Uを持つように調製することができ、そこでは官能基は、アクリレート、アルデヒド、ケトン、アミノオキシ、アミン、カルボン酸、エステル、チオエステル、ハロゲン、チオール、シアノアセテート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エポキシド、ヒドラジド、アジド、イソシアネート、マレイミド、メタクリレート、ニトロフェニルカーボネート、オルトピリジルジスルフィド、シラン、スルフヒドリル、ビニルスルホン、スクシンイミジルグルタレート、スクシミジルスクシネート、コハク酸、トレシレート等である。Uは、活性化可能な形態、例えば、アミンのような求核試薬と反応可能な活性エステルに変換できるカルボキシル酸でも提供できる。
【0146】
好ましい実施形態においては、Uは、標的分子上の一意的官能基と選択的反応性である一意的官能基の残基である。本発明のこの観点は、セクションIIにおいて上で論じたようなペプチド合成の原理(保護基戦略)および化学的ライゲーション(部分的または無保護基戦略)の原理を具体化するものである。従って、Uは、上で記載したような広範囲の官能基の残基を表し得る。好ましいU基は、アミンキャプチャ戦略(例えば、ヘミアミナール形成、イミン形成、およびマイケル付加によるライゲーション)、チオールキャプチャ戦略(例えば、メルカプチド形成、ジスルフィド交換によるライゲーション)、天然型化学的ライゲーション戦略(例えば、システインまたはチオール含有側鎖アミノ酸誘導体を伴うチオエステル交換によるライゲーション)、および直交ライゲーションカップリング戦略(例えば、チアゾリジン形成、チオエステル交換、チオエステル形成、ジスルフィド交換、およびアミド形成によるライゲーション)(例えば、Coltart, DM., Tetrahedron (2000) 56:3449−3491参照)。特に好ましいUは、セクションIIにおいて上記で記載されたような水性適合化学的ライゲーション化学中で用いられる一意的官能基の残基を含む。従って、Uは、カーボネート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、アミン、オキシム、イミド、尿素、チオ尿素、チオエーテル、チオウレタン、チオエステル、エーテル、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキサゾリジン等からなる群から選ばれる結合を形成可能な官能基とし得る。好ましい結合は、オキシムおよびアミド結合である。
【0147】
上記で言及したように、Bは、3本以上のアームを有する分岐核部分であり、存在してもしなくてもよい。Bが存在する場合、1本のアームが、UあるいはUに付着させられたスペーサーまたはリンカーに結合され、他の各々のアームは、ポリマーあるいはポリマーに付着させられたスペーサーまたはリンカーと結合される。分岐核Bの例としては、アミノ、アミド、カルボキシル、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。これらは、リジン等のオリゴアミド、あるいはアルカンジアミンとアクリル酸とから調製されたオリゴマー(「ポリアミドアミン」)を含み、後者は分岐核中に実効正電荷をもたらす。(例えば、Zeng et al., J. Pept. Sci. (1996) 2:66−72; Rose et al., Bioconjugate Chem., (1996) 7(5):552−556; NovoBiochem Catalog and Peptide Synthesis Handbook, Laufelfingen, 2001; Wells et al., Biopolymers (1998) 47:381−396 ; Mahajan et al., (1999) 40:4909−49−12; Judson et al. (1998) 39:1299−1302; Swali et al., (1997) 62:4902−4903、米国特許第5,932,462号、第5,919,455号、第5,643,575号、第5,681,567号参照)。他の多種多様な分岐核は用いることができ、かつこの目的に適しており、置換ジアミン、置換二酸、グリセロールのようなアルキル酸、および3つ以上の感応基または活性化可能基を有する他の部分、多価アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、およびアルコキシ部分等、ならびにオリゴ糖が含まれる(例えば、Nierengarten et al., Tetrahedron Lett. (1999) 40:5681−5684; Matthews et al., Prog. Polym. Sci. (1998) 1−56; Suner et al., Macromolecules (2000) 33:253; Fischer et al., Angew. Chem. Int. Ed. (1999) 38:884; Sunder et al., Adv. Mater. (2000) 12:235; Mulders et al., Tetrahedron Lett. (1997) 38:631−634; Mulders et al., Tetrahedron Lett. (1997) 38:30−3088;およびTurnbull et al., Chembiocehm (2000) 1 (1):70−74)。ポリマー成分に結合された最も好ましい分岐核は、アミド結合により結合される。
【0148】
好ましい分岐核は、アミノ、カルボキシルまたは混合されたアミノおよびカルボキシル官能性から出る。好ましい分岐核の例としては、それぞれリジンアミノ核、アスパラギン酸またはグルタミン酸分岐核、およびγ−グルタミン酸分岐核である。さらに、好ましい分岐ポリマー構成物は、分岐がオリゴアミドまたはポリアミドアミン核のような単独の分岐核から出ているものである。しかしながら、ポリマーバックボーンに沿って分配された多数の分岐核の連続から分岐が出ているウォーム状構造のような他の部類の分岐構成物を用いることができる(Schluter et al., Chem. Int. Ed. (2000) 39: 864)。化学組成および/またはポリマーバックボーンおよび反復単位のかさ高性に応じて、結果として得られるウォーム状構造は、水溶性となるようにまたは液晶組織を生じさせ易くなるように設計でき(Ouali et al., Macromolecules (2000) 33:6185)、これは送達用途、安定性、および作用持続期間にとり有利になり得る。本発明の他の分岐ポリマー構成物と同様、ウォーム状構成物は、Uを含むペンダント官能基を含むように作られる。
【0149】
ポリマー成分、あるいは1つ以上のスペーサーまたはリンカーは、例えば上記のセクションIで論じたように、生体安定性または生体分解性のポリマー鎖あるいは空間を置いたリンカーまたは結合を含み得る。上記のセクションIで同様に言及されたように、成分J*は、負、正および中性からなる群から選ばれる生理学的条件下での実効電荷を有するペンダント基の残基である。最も好ましいのは、J*がイオン化可能カルボキシレート部分を含み、生理学的条件下で負の実効電荷を有する場合である。成分s1、s2、およびs3は、同じでも異なってもよいスペーサーまたはリンカー部分であり、セクションIにおいて論じたもののように、個々に存在しても存在しなくてもよい。最も好ましくは、スペーサーまたはリンカーはポリマー鎖を含み、その場合、スペーサーまたはリンカーは式−[CO−X−CO−NH−Y−NH]n−の1つ以上の反復単位を含む。
【0150】
IV.製剤:
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、疾病および症状の処置を行うために、薬剤として用いることができる。従って、別の実施形態においては、本発明は、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質または薬学的に許容できるその塩を含む製薬組成物に向けられる。そのような製薬組成物は1つ以上の賦形剤を含み得る。好ましい賦形剤は、バッファー、キャリアタンパク質、アミノ酸、界面活性剤、脂質、水溶性ポリマー、および保存剤からなる群から選ばれる。医薬製剤は、合成赤血球産生刺激タンパク質以外の、1つ以上の付加的な生物活性薬剤(例えば、小形有機分子、他のタンパク質治療剤等)のような1つ以上の付加的な活性医薬成分を組み合わせることもできる。そのような製薬組成物は、本発明の好ましい方法おいて使用できる。これらには、哺乳動物における赤血球産生、ヘマトクリット、ヘモグロビン、および網状赤血球数を増加させる方法が含まれる。これらの方法は、所望の効果を得るために本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質を有効量哺乳動物に投与することが含まれる。
【0151】
最も好ましくは、治療を必要としている患者または個人に投与される場合、そのような合成赤血球産生刺激タンパク質および/またはポリペプチドは、ドラッグデリバリーシステムを用いて投与される。そのようなシステムを使うことにより、患者が薬物を使用できかつ所望の生物活性の有効性を高めるように薬物を患者に提示することが可能になる。本発明の目的である好ましいドラッグデリバリーシステムは、ポリペプチドまたはタンパク質を、経口的、経鼻的、または吸引的経路で、あるいは筋肉内、皮下、経皮、静脈内、耳内または眼内への投与が可能なシステムを含む、
【0152】
そのようなドラッグデリバリーシステムは、部位特定的放出をもたらしたり、腸粘膜の保護を強化したりする処方を含み得る。適切な処方としては、ドライパウダー処方、ウイルス粒子カプセル封入によるデリバリー、リポソームカプセル封入、経皮パッチ、電気的支援移送(エレクトロポレーション療法)およびポリマー/niazoneコンジュゲーションが含まれる。
【0153】
好ましい実施形態において、そのようなドラッグデリバリー装置は生物学的環境にける変化に応答して、この変化に基づいて薬物を送達、または送達を停止する。薬物および他の活性薬剤の放出を制御するために広範囲の物質が用いられてきた。すなわち、ポリ(ウレタン)、ポリ(シロキサン)、ポリ(メチルメタクリレート)、親水性および強度のためのポリ(ビニルアルコール)、ポリ(エチレン)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(n−ビニルピロリドン)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(アクリル酸)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレン−コ−ビニルアセテート)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(メタクリル酸)等である。さらに好ましい実施形態においては、生分解性ポリマーが、ドラッグデリバリーを容易にするため使用される。そのようなポリマーとしては、ポリラクチド(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(ラクチド−コ−グリコーリド)(PLGA)、ポリ酸水化合物、およびポリオルソエステルが含まれる。ドラッグデリバリー機器およびそれらの使用方法は、以下の米国特許に記載されている。米国特許第6,072,041号;第6,041,253号;第6,018,678号;第6,017,318号;第6,002,961号;第5,879,712号;第5,849,331号;第5,792,451号;第5,783,212号;第5,766,633号;第5,759,566号;第5,690,954号;第5,681,811号;第5,654,000号;第5,641,511号;第5,438,040号;第4,810,499号;および第4,659,558号。
【0154】
従って、本発明の別の観点は、製薬組成物および、それを必要としている哺乳動物を、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質または薬学的に許容できるその塩を含む化合物を治療的に有効な量投与して治療する方法に関する。「薬学的に許容できる塩」は、本発明のポリペプチドの生物学的有効性および特性を保持し、かつ生物学的にまたは他の点で好ましくないものではない塩を意味するものである。塩は、酸または塩基から誘導し得る。酸性付加塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸(硫酸塩および重硫酸塩を与える)、硝酸、燐酸等の無機酸、ならびに酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、サルチル酸、p−トルエンスルホン酸等の有機酸から導かれる。塩基性付加塩は無機塩基から導かれ、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩等を含み得る。有機塩基から導かれる塩としては、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、2−ジメチルアミノエタノール, トロメタミン, リジン, アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、N−アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、N−エチルピペリジン等を含む、第1、第2および第3アミン、自然生成置換アミンを含む置換アミンおよび環状アミンから導かれる塩が含まれる。好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、ピペリジン、トロメタミン、およびコリンである。
【0155】
本明細書中で用いられる用語「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾病および状況(例えば、貧血)の任意の処置をカバーし、(i)疾病に罹患しやすくなっている可能性があるが、その疾病を有しているとまだ診断されていない被検者において、疾病または状況の発生を防止すること、(ii)疾病または状況を抑制、すなわち、その進行を停止すること、または(iii)疾病または状況を軽減、すなわち、その症状の後退または改善を引き起こすことを含む。
【0156】
本明細書中で用いられる用語「赤血球産生刺激タンパク質を用いた処置により防止または軽減される哺乳動物における疾病状態」は、一般に赤血球産生刺激タンパク質で有効に処置されると一般に認識されているすべての疾病状態をカバーすることを意図するものであり、それらの疾病状態は、本発明の特定の化合物により有効に防止または軽減されることが見出されている。これらの疾病状態には、貧血、β地中海貧血、悪性貧血、鎌状赤血球症、慢性細菌性心内膜炎、骨髄炎、若年性間接リウマチ、リウマチ熱、クローン病、潰瘍性大腸炎等が例として含まれるがこれらに限定されない。
【0157】
本明細書中で用いられる用語「治療上有効な量」は、ポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を、それを必要とする哺乳動物に、例えば赤血球産生誘発剤、抗貧血薬等として投与した場合に、(上記で定義されたような)処置を行うのに十分な量を指す。「治療上有効な量」となる量は、タンパク質誘導体、状態または疾病およびその重篤度、ならびに処置される哺乳動物、その体重、年齢等に応じて変わるであろうが、現代の知識および本開示に関して通常の機能を有する者により日常的に決定し得る。本明細書中で用いられるるように、用語「q.s.」は、定められた機能を達成するのに十分な量を付加、例えば、溶液を所望の容積(例えば、100mL)にすることを意味する。
【0158】
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質およびそれらの薬学的に許容できる塩、すなわち活性成分は、治療上有効な投薬量、すなわち上記に記載されるように、それを必要としている哺乳動物に投与した場合に、有効な処置を行うのに十分な量、で投与される。本明細書中に記載される合成赤血球産生刺激タンパク質の投与は、同様の用途に使われる薬剤の一般に認められた投与法のいずれかによることができる。本明細書中で使われるように、用語「本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質」、「本発明のポリペプチドの[薬学的に許容できる塩]」および「活性成分」は互換的に使われる。
【0159】
処方中のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質のレベルは、当業者により用いられる全範囲内で変わり得る。例えば、全体処方に基づいて約0.01重量パーセント(%w)〜約99.99%wのタンパク質アンタゴニストまたはアゴニストおよび約0.01%w〜約99.99%wの賦形剤である。より一般的には、ポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、約0.5%w〜約80%wのレベルで存在する。
【0160】
ヒト投薬レベルを本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質について最適化する必要がまだある一方で、一般的に、投与される化合物の量は当然、予防または軽減を標的とする被検者および疾病状態、苦痛の性質および重篤度、投与方法およびスケジュールならびに処方医師の判断に依存するであろう。そのような使用最適化は、技術的に通常のスキルを有する当業者の範囲内に十分ある。
【0161】
投与は、任意の許容された全身または局所経路とすることができ、例えば、非経口、経口(特に乳幼児用処方)、静脈内、経鼻、気管支吸入(すなわち、エアゾール処方)、経皮的または局所経路を介して、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、液体、溶液、エマルション、注射剤、懸濁液、座剤、エアゾール等の、固体、半固体もしくは液体またはエアゾールの投薬形態とすることができる。本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、所定レートでのポリペプチドの、好ましくは正確な用量の単一投与に適した単位服用形態での長期間投与の場合には、蓄積注射、浸透圧ポンプ、丸剤、経皮(電気輸送を含む)パッチ等を含む徐放性または制御放出投薬形態で投与することができる。これらの組成物は、従来の製薬担体または賦形剤および本発明のタンパク質アンタゴニストまたはアゴニストを含み、加えて、他の薬剤、製薬薬剤、担体、アジュバント等を含み得る。担体は種々の油剤から選択され、これには石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等である。水、食塩水、水性デキストロース、およびグリコール類は、特に注射可能溶液の場合に、特に好ましい液体担体である。適切な製薬担体としては、デンプン、セルロース、タルク、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、テアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレングリコール、水、エタノール等が含まれる。他の適切な製薬担体およびそれらの処方は、E. W. Martinによる”Remington’s Pharmaceutical Sciences”に記載されている。
【0162】
必要であれば、投与される製薬組成物は、湿潤または乳化剤、例えば酢酸ナトリウム塩のようなpH緩衝剤、ソルビタンモノステアレート、オレイン酸トリエタノールアミン等のような少量の非毒性補助物質も含み得る。
【0163】
活性成分がより多く必要とされることがあるが、便利な1日用量計画を用いて本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を送達するために、経口投与を用いることができ、用量計画は、所望の予防の程度に従って、または苦痛の緩和において調節できる。そのような経口投与のために、薬剤学的に許容可能で、非毒性組成物が、例えば調剤グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ポビドン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、クロスカーメロースナトリウム、ブドウ糖、ゼラチン、ショ糖、炭酸マグネシウム等のような、通常用いられる賦形剤のいずれかを混合することにより形成される。そのような組成物は、溶液、懸濁液、分散性錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、徐放性処方等の形態を取る。経口処方は、胃腸疾患の治療に特に適している。一般的な全身的目的のための経口バイオアベイラビリティは、アセチル化アミノ酸を含む処方のような全身的循環への取込みを改善する賦形剤を利用することによって調節できる。例えば、米国特許第US5,935,601号および米国特許第US5,629,020号を参照。
【0164】
これらの組成物は、カプセル、丸剤または錠剤の形態を取ることができ、従って、組成物は、活性成分に加えて、乳糖、ショ糖、リン酸二カルシウム等のような希釈剤、クロスカーメロールナトリウム、デンプンまたはその誘導体のような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、デンプン、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、ゼラチン、セルロースおよびその誘導体等のバインダーを含む。
【0165】
液状の薬剤学的に投与可能な組成物は、例えば、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質(約0.5%〜約20%)および調剤補助薬を、例えば水、食塩水、水性デキストロース、グリセリン、グリコール類、エタノール、保存料等のような担体中に溶解、分散等することにより調製でき、それにより溶液または懸濁液を形成することができる。必要であれば、投与される製薬組成物は、湿潤剤、懸濁剤、乳化剤、または可溶化剤、例えば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムといったpH緩衝剤等、シクロデキストリン誘導体、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートまたはステアレート等の少量の非毒性補助薬剤を含むこともできる。そのような投薬形態を調製する実際の方法は公知、または当業者にとり明白であろう。例えば、Remington’s Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniを参照。投与される組成物すなわち処方は、いずれにせよ、処置されている被検者の症状を予防または軽減するのに有効な量の活性成分を含む。乳幼児への経口投与の場合は、(シロップまたは懸濁液のような)液状処方が好まれる。
【0166】
液体を含む固形剤形の場合は、例えばプロピレンカーボネート、植物油トリグリセリド中の溶液または懸濁液は、好ましくはゼラチンカプセル中に被抱される。液状の剤形の場合は、例えばポリエチレングリコール中の溶液は、投与用に容易に計量されるように、十分な量の薬学的に許容できる液状の担体、例えば水で希釈できる。
【0167】
代わりに、液状または半固形の経口処方は、活性成分を、植物油、グリコール類、トリグリセリド類、プロピレングリコールエステル類(例えば、プロピレンカーボネート)等の中に溶解し、これらの溶液または懸濁液を硬質または軟質ゼラチンカプセルシェル内に被抱することによって調製できる。
【0168】
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を上記条件の処置に適用する際には、本明細書中に記載される活性成分の投与は、好ましくは非経口的に投与される。非経口投与は一般に、皮下、筋肉内または静脈内の注射を特徴とし、皮内または腹腔内注射、ならびに胸骨内注射または注入を含み得る。注射剤は、液状の溶液または懸濁液、注射前の液体中の溶液または懸濁液に適した固体形態として、エマルションまたは生体適合性ポリマーベースの微小球として従来の形態で調製できる(例えば、リポソーム、ポリエチレングリコール誘導体、ポリ(D,C)ラクチド等)。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール等である。加えて、必要であれば、投与される調剤組成物は、例えば、酢酸ナトリウム、ポリエキシエチレン、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、シクロデキストリン、血清アルブミン等のような、湿潤または乳化剤、pH緩衝剤、溶解性促進剤、タンパク質担体等の少量の非毒性補助物質も含み得る。
【0169】
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、例えば、ケモカイン受容体モジュレーターを(水または食塩水のような)適切な溶媒中に溶解またはリポソーム処方中に組み込み、続いて許容できる注入流体中へ分散することによって、非経口的に投与できる。本発明のポリペプチドの典型的な1日用量は、1回の注入で、または周期的な間隔を置いての一連の注入により投与できる。非経口投与については、水溶性形態、例えば水溶性塩の形態、または増粘物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストラン、そして必要であれば安定剤、を含む水性注射懸濁液という形態の活性成分の特に適切な水溶液がある。活性成分は、任意に賦形剤と共に、凍結乾燥物の形態とすることもでき、さらに非経口投与の前に適切な溶媒を加えることにより溶液にすることができる。
【0170】
非経口投与用により最近考案されたアプローチでは、一定の投薬レベルが維持されるように、遅延放出または徐放出システムの埋め込みが用いられる。例えば、参照により組み込まれる米国特許第3,710,795号、米国特許第5,714,166号および米国特許第5,041,292号を参照。
【0171】
そのような親組成物中に含まれている活性成分の百分率は、ポリペプチドの活性および被検者のニーズだけでなく、組成物の特定の性質にも大いに依存する。しかしながら、溶液中で0.01%〜10%の活性成分の百分率を用いることができ、もし組成物がその後上記の百分率にまで希釈される固体であれば、より高くなる。好ましくは、組成物は、溶液中に活性成分を0.02〜8%含む。
【0172】
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を投与する別の方法では、静脈内ボーラス注射および連続注入が用いられる。
【0173】
エアゾール投与は、本発明のタンパク質を気道へ直接送達するための効果的な手段である。この方法の利点のいくつかは下記の通りである。すなわち、1)酵素的分解、胃腸管からの低い吸収、または肝臓の初回通過効果による薬剤損失の影響を回避し、2)分子サイズ、電荷または肺外部位への親和性のために、他の方法では気道中の標的部位に到着できないであろう活性成分を投与する、3)肺胞を介した体内への速やかに吸収できるようにする、4)他の器官系が活性成分に曝されないようにし、これは暴露により望ましくない副作用が引き起こされることがある場合には重要である。これらの理由により、エアゾール投与は、喘息、肺局部感染、ならびに肺および気道の他の疾患および疾患状態の処置にとり特に有利である。
【0174】
3タイプの医薬用吸入装置、すなわちネブライザ吸入器、定量吸入器およびドライパウダー吸入器がある。ネブライザ吸入器は、高速の空気流を作り出し、これにより(液状形態に処方された)タンパク質誘導体が患者の気道内に運ばれるミストとして噴霧される。定量吸入器は一般に、圧縮ガスと共に包装された処方を有しており、作動と同時に、圧縮ガスにより定量のポリペプチドを放出し、このようにして所定量薬剤の信頼できる投与方法を提供する。ドライパウダー吸入器は、自由流動粉体の形でポリペプチドを投与し、この粉体は、この装置による呼吸中に患者の気流中に分散できる。自由流動流粉体を得るため、ケモカイン誘導体は、乳糖のような賦形剤と共に処方される。定量のタンパク質誘導体は、カプセル形態で貯蔵され、作動ごとに患者に分配される。上記の方法のすべては、本発明の投与に用い得る。
【0175】
リポソームに基づく製剤処方も、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質と共に使用するのに適している。例えば、米国特許第5,631,018号、同第5,723,147号、および同第5,766,627号を参照。リポソームの利点は、薬のリポソーム取込みに起因するインビボ分布および薬物動態学的パラメーターにおける有利な変化に関係していると信じられており、当業者により本発明のポリペプチドに適用し得る。注射または経口投与のための制御された放出リポソーム液体調剤処方も用い得る。
【0176】
座剤による全身投与については、伝統的なバインダーおよび担体として、例えば、ポリエチレングリコール類またはトリグリセリド類、例えばPEG1000(96%)およびPEG4000(4%)が含まれる。そのような座剤は、活性成分を約0.5w/w%〜約10w/w%、好ましくは約1w/w%〜約2w/w%の範囲で含む混合物から形成できる。
【0177】
本明細書中で言及したすべての刊行物および特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別的に示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。今や本発明の概要を説明したのであるから、例示のために提供されかつ特に明記してあるものを除き本発明を限定することを意図しない以下の以下の実施例を参照して、本発明はより容易に理解されるであろう。
【0178】
(実施例)
略語
Acm=アセトアミドメチルチオール保護基[すなわち、−CH2NHCOCH3]
AoA=アミノオキシアセチル
Arg(Tos)=L−アルギニン(側鎖NGトルエンスルホニル−保護)
ART=絶対網状赤血球数
Asp(cHex)=L−アスパラギン酸(側鎖シクロヘキシルエステル保護)
AUC=曲線下面積
Boc=ter−ブトキシカルボニル
CD=円偏光二色性
CDI=カルボニルジイミダゾール
CHO=チャイニーズハムスター卵巣
CL=クリアランス(mL/hr/kg)
Cmax=最大濃度
Cys(4MeBzll)=L−システイン(側鎖(4−メチル)ベンジル−保護)
Cys(Acm)=L−システイン(側鎖アセトアミドメチル[すなわち、−CH2NHCOCH3]−保護)
DCM=ジクロロメタン
DIC=ジイソプロピルカルボジイミド
DIEA=ジイソプロピルエチルアミン
DMF=ジメチルホルムアミド
DMSO=ジメチルジメチルスルホキシド
DPC=ドデシルホスホコリン
Dpr=L−1,2ジアミノプロピオン酸
ED50=50%最大効果に達するために必要な有効量
EDA=(4,7,10)−トリオキサトリデカン−1,13ジアミン
ELISA=酵素結合イムノアッセイ
EPO=エリスロポエチン
ES−MS=エレクトロスプレーイオン化質量分析
FBS=ウシ胎仔血清
Glu(cHex)=L−グルタミン酸(側鎖シクロヘキシルエステル保護)
GM−CSF=顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
HATU(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルアンモニウムヘキサフルオロフォスフェート
HCT=ヘマトクリット
HGB=ヘモグロビン
His(Dnp)=L−ヒスチジン(側鎖NImジニトロフェニル保護)
HOBT=N−ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC=高圧液体クロマトグラフィー
IMDM=イスコフ改変ダルベッコ培地
IPA=イソプロパノール
Lev=レブリン酸
Lys(CIZ)=L−リジン(側鎖2−クロロベンジルオキシカルボニル)−保護
MBHA=4−メチルベンズヒドリルアミン
MRT=平均滞留時間
MTT=4−メチルトリチル
MTT=チアゾリルブルー
NHS=N−ヒドロキシスクシンイミド
−OCH2−Pam−樹脂=−O−CH2−Bz−CH2CONHCH2(コポリスチレンジビニルベンゼン)−樹脂
Pbo=4−(CH3S(O)−)ベンジル
PBS=リン酸緩衝生理食塩水
PCV=赤血球沈層容積
RBC=赤血球
RET=網状赤血球
rhEPO=組換えヒトEPO
RSA=ラット血清アルブミン
SDS=ドデシル硫酸ナトリウム
SDS−PAGE=SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
SEP=合成赤血球産生タンパク質
Ser(Bzl)=L−セリン(側鎖ベンジル−保護)
【0179】
実施例1
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−0の合成
合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP)を合成した。完全長合成タンパク質(「SEP−0(1−166)」と表される)の配列は以下の通りである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LVKSSQPWΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKΨAIS
PPDAASAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR(配列番号:1)
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を示す。SEP−0タンパク質を、以下の4つのポリペプチドセグメントから溶液中で合成した:
セグメントSEP−0:1(GRFN1711;配列番号:1の残基1−32により構成)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH−チオエステル
セグメントSEP−0:2(GRFN1712、配列番号:1の残基33−88により構成)
CSLNEKITVP DTKVNFYAWK RMEVGQQAVE VWQGLALLSE
AVLRGQALLV KSSQPW−チオエステル(Cys33はAcm保護されている)
セグメントSEP−0:3(GRFN1713、配列番号:1の残基89−116により構成)
CPLQLHVDKA VSGLRSLTTL LRALGAQK−チオエステル(Cys89はAcm保護されている)
セグメントSEP−0:4(GRFN1714、配列番号:1の残基117−166により構成)
CAISPPDAAS AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY
TGEACRTGDR−カルボキシレート(C末端システイン(Cys161)はピコリル(pico)保護基を持っている)
【0180】
ペプチドSEP−0:1およびSEP−0:2およびSEP−0:3を、チオエステル生成樹脂上で、Boc(ter−ブトキシカルボニル)化学用in situ中和プロトコルおよび段階的固相ペプチド合成(SPPS)により、確立されているSPPS、側鎖保護およびチオエステル樹脂戦略(Hackeng, et al., PNAS (1999) 96: 10068−10073; and Schnolzer, et al., Int. J. Pept. Prot. Res., (1992) 40: 180−193))を用いてAB1433A自動ペプチド合成装置でまたは手作業での鎖集合により合成し、あるいは商業ベンダーへ注文して入手した。例えば、BocSPPS保護基の標準キットを用いた。すなわち、Arg(Tos);Asp(cHex);Cys(4MeBzl)&Cys(Acm);Glu(cHex);His(DNP);Lys(CIZ);Ser(Bzl);Thr(Bzl);Trp(formyl);Tyr(BrZ);Met、Asn、Gluは、側鎖未保護であった。セグメントSEP−0:4を、−OCH2−Pam−樹脂上で相似的に合成した。ペプチドを脱保護し、同時に、標準的Boc化学手順に従って、樹脂支持体からHF/p−クレゾールを用いて切断した。しかしながら、HF/p−クレゾール中で除去されない保護基を含むペプチドについては、保護基は保持された。ペプチドは、調製用C4逆相高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)で精製した。純粋なペプチドを含んでいるフラクションは、ES−MS(エレクトロスプレーイオン化質量分析)を使って同定し、その後のライゲーション用にプールし凍結乾燥した。
【0181】
ステップ1:ライゲーション#1 セグメントSEP−0:4およびセグメントSEP−0:3を、15mMの濃度でTFEに溶解した。6M塩化グアニジウムおよび1%チオフェノールを含む飽和リン酸塩バッファー(pH7.9)を加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。ライゲーション後、ライゲーションミックスを、TFE(トリフルオロエタノール)2ml、6M塩化グアニジウム6ml、25%β−メルカプトエタノール含有100mMリン酸塩の溶液に加え、20分間インキュベートした。この溶液を、15mg/ml TCEP(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン.HCl)氷酢酸溶液で酸性化し、調製用C4逆相HPLCカラム(直径1インチ)にロードした。次に、ペプチドを、調製用グラジエント逆相HPLCで精製した。所望のライゲーション産物SEP−0:Acm+SEP−0:3+SEP−0:4を含むフラクションをES−MSで同定し、プールした。
【0182】
ステップ2:Acm−除去#1 Acm除去のため、プールしておいたSEP−0:Acm+SEP−0:3+SEP−0:4のフラクションを含むアセトニトリル水溶液を、HPLCグレード水で1×希釈し、固体尿素を最終的に2モル濃度となるように加えた。3%酢酸水溶液中の30mg/ml Hg(酢酸塩)2溶液を(予期される総システイン濃度に関して)3倍モル過剰加え、溶液を1時間攪拌する。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中で20%とし、半調製用逆相HPLCカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望の産物SEP−0:3+SEP−0:4を含むフラクションを、ES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0183】
ステップ3:ライゲーション#2 等量のSEP−0:3+SEP−0:4およびSEP−0:2を共に、純TFE中に15mMの濃度で溶解した。6M塩化グアニジウムおよび1%チオフェノールを含むリン酸塩バッファー(pH7.5)250mMを加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。1日ライゲーションした後、ライゲーションミックスを、TFE10ml、β−メルカプトエタノール10ml、ピペリジン10m、および6M塩化グアニジウム20mlのpH4の溶液に加え、どのような残留保護基も除去されるように20分間インキュベートした。この溶液を、20%酢酸水溶液中の15mg/ml TCEPで酸性化し、調製用逆相HPLCカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のライゲーション産物SEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4を含むフラクションをES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0184】
ステップ4:カルボキシメチル化 SEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4を、TFE中に15mMの濃度で溶解した。6M塩化グアニジウムを含む2倍過剰(v/v)の200mMリン酸塩バッファー(pH7.9)を加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。最小量のメタノール中に溶解した25倍過剰のブロモ酢酸を加え、溶液を2時間反応させた。この溶液は、20%酢酸水溶液中の15mg/ml TCEPで酸性化し、調製用逆相HPLCカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のカルボキシメチル化産物SEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+Etを含むフラクションをES−MSで同定し、プールした。
【0185】
ステップ5:ピコリル除去 亜鉛末を2M HCl中で30分間活性化した。ペプチドSEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+Etを、生のTFE中に約10mg/ml濃度で溶解した。この溶液を、(新たに添加された)35mg/ml L−メチオニンおよび35mg/mlドデシルサルコシン(すなわち、ナトリウムN−ドデカノイルサルコシン)を含む4x(v/vTFEに関して)6M塩化グアニジウム、100mM酢酸塩、pH4、で希釈した。この反応は、〜1時間間隔でモニターし、5時間で完了した。完了後、上澄みを除去し、残留Zn末を、6M塩化グアニジウム、pH4、35mg/ml L−メチオニン含有100mM酢酸塩および20%TFE含有35mg/mlドデシルサルコシンで5分間2回洗い、20%β−メルカプトエタノールを含む同じ溶液でさらに1回洗う。結合産物を、20%酢酸水溶液中の15mg/ml TCEPの溶液で酸性化し、調製用逆相HPLCカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望の修飾産物SEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+Et−Picoを含むフラクションをES−MSで同定し、プールした。
【0186】
ステップ6:Acm除去#2 プールしておいたSEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+Et−Picoの溶液を、HPLCグレード水で3×希釈し、固体尿素を最終的に2モル濃度となるように加えた。3%酢酸水溶液中の30mg/ml Hg(酢酸塩)2溶液を(予期される全システイン濃度に対して)3倍モル過剰加え、溶液を1時間攪拌する。次に、溶液をβ−メルカプトエタノール中に20%とし、半調製用逆相HPLCカラムにロードし、ステップグラジエントで精製した。所望の産物SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+Et−Picoを含むフラクションをES−MSで同定し、2×(w/wペプチド質量に関して)DPC(ドデシルホスホコリン)を含む水で2×(v/v)希釈し、一晩凍結乾燥した。
【0187】
ステップ7:ライゲーション#3 等量のSEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+Et−PicoおよびSEP−0:1を共に、純TFE中に15mMの濃度で溶解し、6M塩化グアニジウム含むリン酸塩バッファー(pH7.5)250のmMを加える。この溶液に1%チオフェノールを加えた。1日ライゲーションした後、ライゲーションミックスをTFE10ml、β−メルカプトエタノール10ml、ピペリジン10m、および6M塩化グアニジウム20mlのpH4の溶液に加え、どのような残留保護基も除去されるように20分間インキュベートした。この溶液を、20%酢酸水溶液中の15mg/ml TCEPで酸性化し、調製用逆相HPLCカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のライゲーション産物SEP−0(1−166):(配列番号:1)を含むフラクションをエレクトロスプレーイオン化質量分析で同定し、により、2×(w/wペプチド質量に関して)ドデシルサルコシンを含む水で2×(v/v)希釈し、凍結乾燥した。
【0188】
ステップ8:折りたたみ 完全長結合されたペプチドSEP−0(1−166)を、6M塩化グアニジウム、20%TFEおよび10倍モル過剰(タンパク質のCys残基に関して)のシステインを含む200mM Trisバッファー(pH8.7)中に溶解した。この溶液を、3M塩化グアニジウムを含む200mM Trisバッファー(pH8.7)溶液に対して、室温で一晩透析した。次に、この溶液を、1M塩化グアニジウムを含む200mM Trisバッファー(pH8.7)の溶液に対して室温で4時間4℃で、そして最終的に10mMリン酸塩バッファー(pH7.0)に対して4時間4℃で透析して最終的な折りたたまれた産物を得た。折りたたみは、エレクトロスプレーES−MSおよびCD(円偏光二色性)分光分析により検証した。
【0189】
ステップ9:精製 折りたたまれたポリペプチドを、セントリコン・コンセントレーター・バイアル中で5×濃縮し、10mMリン酸塩、pH7.0で平衡化したリソースS陽イオン交換カラムにロードした。折りたたまれたタンパク質を、10分間リニア塩グラジエントで500mM NaCl中に溶離した。所望の折りたたまれた産物SEP−0(1−166)を含むフラクションを、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)で同定し、凍結し、−80℃で保存した。CDスペクトルだけでなく折りたたまれたタンパク質産物の分析逆相HPLCクロマトグラムおよびES−MSスペクトルによっても、折りたたまれたタンパク質の存在が証明された。
【0190】
実施例2
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−L30の合成
オキシム形成基をSEP−0の位置24および126に含むように、第2の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−1−L30と呼ぶ)を合成した。次に、これらの基を用いてSEP−1−L30を形成し、そこでは直鎖状の(EDA−Succ−)18カルボキシレート(EDA=(4,7,10)−トリオキサトリデカン−1,13ジアミン(TTDとも呼ばれる);Succ=−CO−CH2CH2CO−)ポリマーがタンパク質バックボーンに結合されている。完全長SEP−1(1−166)の配列は下記の通りである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LVKSSQPΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKΨAIS
PPDAAKoxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR(配列番号:2)
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を表し、Koxは、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合を介してカップリングされたオキシムリンカー基によってε−アミノ基において化学的に修飾された非天然リジンを表す。SEP−1−L30の構造も図15に示してある。
【0191】
以下で説明されるSEP−1−L30の化学合成を例示する概略図を図14に示す。簡潔に言えば、図14Aおよび図14Bにおいて、水溶性ポリマーGRFN32(GP32)は、オキシム結合形成化学的ライゲーション反応を介してペプチドSEP−1:1およびSEP−1:4に付着させられる。示されるように、ペプチドSEP−1:1は、その後の天然型化学的ライゲーションのためのヒスチジンα−カルボキシルチオエステルを含むC末端Yaa基を位置32に、および位置24(天然ヒトEPOのグリコシル化部位)に非天然リジン残基を持ち、後者の側鎖は、アミノオキシアシル部分を含むUn=1基を持つように化学的に修飾されている。最終的な完全長産物の位置1に対応するN末端アラニンを参照用に示してある。ペプチドSEP−1:4は、位置117にシステインを含む未保護N末端Xaa基を、位置126(天然ヒトEPOのグリコシル化部位)にアミノオキシアシル修飾リジンを含むUn=1基を、そして位置161(ジスルフィド形成システイン)に側鎖チオールがピコリル基で保護されたシステインを有する。Cys161は、天然型化学的ライゲーション部位のために導入されたシステインのその後の変換におけるそのチオアルキル化を防止するために保護されており(図14D参照)、また、ピコリル保護基が使われており、これはその除去が、最初の天然型化学的ライゲーション反応(図14C参照)においてAcm(アセトアミドメチル)保護システインを除去するために必要な条件に直交するからである。位置24および126におけるGP32ポリマー構成物の部位特定かつ排他的付着は、精密ポリマー修飾ペプチドSEP−1:1+GP32およびSEP−1:4+GP32を作り出すオキシム形成化学的ライゲーションにより達成される。図14Cは、SEP−1:4+GP32の中間ペプチドSEP−1:3への天然型化学的ライゲーションおよびSEP−1:3+SEP−1:4+GP32の生成を示すもので、後者のライゲーション部位は、Lys116およびCys117である。示されるように、ペプチドSEP−1:3は、位置89にAcm保護システインを含むN末端Xaa基を、位置116にリジンα−カルボキシルチオエステルを含むC末端Yaa基を含む。天然型化学的ライゲーションに続いて、Acm保護基は、次のライゲーション反応のためのこのライゲーション産物を調製するために除去される。図14Dは、SEP−1:3+SEP−1:4+GP32の中間ペプチドSEP−1:2への天然型化学的ライゲーションおよびSEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP32の生成を示すもので、後者のライゲーション部位は、Trp88およびCys89である。示されるように、ペプチドSEP−1:2は、位置33にAcmシステインを含むN末端Xaa基を、位置89にトリプトファンα−カルボキシルチオエステルを含むC末端Yaa基を含む。天然型化学的ライゲーションに続いて、ライゲーション産物は、ライゲーション部位システイン89および117の側鎖チオールのカルボキシメチル化のためにブロモ酢酸にさらされ、このようにして擬似グルタミン酸へ変換される。カルボキシメチル化に続いて、Acmおよびピコリル保護基は、次のライゲーション反応のために、この未保護のポリマー修飾ライゲーション産物を調製するために除去される。図14EはSEP−1:3+SEP−1:4+GP32のペプチドセグメントSEP−1:1+GP32(完全長産物のN末端セグメントに対応)への天然型化学的ライゲーションおよび完全長SEP−1−L30産物SEP−1:1+GP32+SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP32の生成を示すもので、その最終的なライゲーション部位はHis32およびCys33である。示されるように、完全長SEP−1−L30産物は、ユーザー定義された部位、すなわち天然ヒトEPOの位置24および位置126に対応するグリコシル化部位、において排他的に付着させられた2つの水溶性ポリマー(G32)を含む。合成の詳細を以下に説明する。
【0192】
A.FNP32によるGRFN1776およびGRFN1711GRのオキシム化
オキシム形成は、アミノオキシアセチル基を持つ水溶性ポリマーを、ケトンカルボニル基を持つペプチドに付着させるために実行した。これを達成するため、以下のペプチドセグメントを合成した:
セグメントSEP−1:4(GRFN1776;配列番号:2の残基117−166により構成)
CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY
TGEACRTGDR−カルボキシレート(Lys126は、ε−アミノ基においてレブリン酸残基で修飾されており、Cys117は、Acm保護されている)
セグメントSEP−1:1(GRFN1711、配列番号:2の残基1−32により構成)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH−チオエステル(Lys24は、レブリン酸残基で修飾されている)
【0193】
実施例1と同様に、セグメントSEP−1:1(GRFN1711)をチオエステル生成樹脂上で、セグメントSEP−1:4(GRFN1776)を−OCH2−Pam−樹脂上で合成した。これら2つのペプチドセグメントのリジン24および126は、当初ε−アミノ基においてFmoc基で保護した。鎖集合の完了後、Fmoc保有アミノ基を、標準的Fmoc脱保護手順に従って脱保護し、各ペプチド樹脂へレブリン酸を付着することによりそれぞれ修飾した。次に、これらのペプチドを脱保護し、実施例1に記載されるように、樹脂支持体から同時に切断した。ペプチドは、調製用C4逆相HPLCにより精製した。純粋なペプチドを含んでいるフラクションを、ES−MSを使って同定し、プールし、その後のライゲーション用に凍結乾燥した。GRFNP32[−(EDA−Succ)18カルボキシレート]を、標準的プロトコルに従ってSasrinカルボキシル生成樹脂上で集合させた(Rose, K. et al., 米国特許出願番号第09/379,297号;Rose, et al., J Am Chem Soc. (1999) 121:7034)。アミノオキシアセチル(AoA)部分を、5倍過剰の活性化Bocアミノオキシ酢酸をカップリングすることによってポリマーのN末端アミノ基に付着させた。ポリマー鎖は、古典的なFmoc化学手順を用いて樹脂支持体から切断した。ポリマー鎖は、調製用C4逆相HPLCにより精製した。純粋なポリマーを含んでいるフラクションを、ES−MSを使って同定し、プールし、その後のライゲーション用に凍結乾燥した。
【0194】
セグメントSEP−1:4およびGRFNP32を共に、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。次に、この溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントC4逆相HPLCで未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物SEP−1:4+GP32を含むフラクションを、ES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0195】
セグメントSEP−1:1およびGRFNP32を共に、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。次に、この溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントC4逆相HPLCで未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物SEP−1:1+GP32を含むフラクションを、ES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0196】
B.合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−L30の合成
SEP−1−L30を、溶液中で以下の4つのポリペプチドセグメントから合成した:
セグメントSEP−1:1+GP32(GRFN1711+GRFNP32、配列番号:2の残基1−32に対応)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EH−チオエステル(Lys24は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル)(Lev−AoA)オキシム結合(Koxと表される)を介してGRFNP32にカップリングされている)
セグメントSEP−1:2(GRFN1712、配列番号:2の残基33−88に対応)
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW−チオエステル(Cys33は、Acm保護されている)
セグメントSEP−1:3(GRFN1713、配列番号:2の残基89−116に対応)
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK−チオエステル(Cys89は、Acm保護されている)
セグメントSEP:1:4+GP32(GRFN1776+GRFNP32、配列番号:2の残基117−166に対応)
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR−カルボキシレート(Lys126は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル)(Lev−AoA)オキシム結合(Koxと表される)を介してGRFNP32にカップリングされており、C末端システインは、ピコリル(pico)保護基を有する)
【0197】
付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、基除去反応、折りたたみおよび精製は、実施例1に記載されるように実行し、完全長の折りたたまれたSEP−1−L30を得た。CDスペクトルだけでなく折りたたまれたタンパク質産物の分析用逆相HPLCクロマトグラムおよびES−MSスペクトルにより、折りたたまれたタンパク質産物の存在が証明された。
【0198】
実施例3
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−L26の合成
オキシム形成基をSEP−0の位置24および126に含むように、第3の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−1−L26と表される)を合成した。次に、これらの基を用いてSEP−1−L26を形成し、そこでは位置24および126でそれにおいて直鎖状ポリマー(EDA−Succ)18カルボキシレートおよび(EDA−Succ)6−アミドが、オキシム結合を介してタンパク質バックボーンにそれぞれ結合されている。完全長SEP−1(1−166)の配列は下記の通りである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LVKSSQPWΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKΨAIS
PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR(配列番号:2)
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を表し、Koxは、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合を介してカップリングされたオキシムリンカー基によってε−アミノ基において化学的に修飾された非天然リジンを表す。
【0199】
SEP−1−L30とは対照的に、SEP−1−L26構成物は、位置126において付着させられたより小さく未帯電の水溶性ポリマーを持つように設計した。位置24において付着させられたポリマーは、SEP−1−L30におけるものと同じであった。完全長産物の集合は、実施例2に記載した通りであった。SEP−1−L26の構造を図16に示す。
【0200】
A.GRFNP6によるGRFN1776のオキシム化およびGRFNP32によるGRFN1711のオキシム化
オキシム形成は、アミノオキシアセチル基を持つ水溶性ポリマーを、ケトンカルボニル基を持つペプチドに付着させるために実行した。これを達成するため、以下のペプチドセグメントを合成した:
セグメントSEP−1:4(GRFN1776;配列番号:2の残基117−166により構成)
CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY
TGEACRTGDR−カルボキシレート(Lys126は、ε−アミノ基においてレブリン酸残基で修飾されており、Cys117は、Acm保護されている)
セグメントSEP−1:1(GRFN1711、配列番号:2の残基1−32により構成)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH−チオエステル(Lys24は、レブリン酸残基で修飾されている)
【0201】
実施例1と同様に、セグメントSEP−1:1(GRFN1711)をチオエステル生成樹脂上で、セグメントSEP−1:4(GRFN1776)を−OCH2−Pam−樹脂上で合成した。これら2つのペプチドセグメントのリジン24および126は、当初ε−アミノ基においてFmoc基で保護した。鎖集合の完了後、Fmoc保有アミノ基を、標準的Fmoc脱保護手順に従って脱保護し、各ペプチド樹脂へレブリン酸を付着することによりそれぞれ標準的カップリング手順に従って修飾した。次に、これらのペプチドを脱保護し、実施例1に記載されるように、標準的Boc−化学手順に従って、樹脂支持体から同時に切断した。ペプチドは、調製用C4逆相HPLCにより別個に精製した。各ペプチドについて、純粋なペプチドを含んでいるフラクションを、ES−MSを使って同定し、プールし、その後のライゲーション用に凍結乾燥した。
【0202】
水溶性ポリマー(EDA−Succ)18カルボキシレート(GRFNP32)を、標準的プロトコルに従ってSasrinカルボキシル生成樹脂上で集合させた(Rose, K. et al., 米国特許出願番号第09/379,297号;Rose, et al., J Am Chem Soc. (1999) 121:7034)。水溶性ポリマー(EDA−Succ)6−アミド(GRFNP32)を、標準的プロトコルに従ってSieberアミド生成樹脂上で集合させた(Rose, K. et al., 米国特許出願番号第09/379,297号;Rose, et al., J Am Chem Soc. (1999) 121:7034)。アミノオキシアセチル(AoA)部分を、5倍過剰の活性化Bocアミノオキシ酢酸をカップリングすることによって各樹脂結合ポリマーのN末端アミノ基に付着させた。2つのポリマー鎖は、古典的なFmoc化学手順を用いてそれぞれの樹脂支持体から別個に切断した。各ポリマー鎖は、調製用C4逆相HPLCにより精製した。各ポリマーについて、純粋なポリマーを含んでいるフラクションを、ES−MSを使って同定し、プールし、その後のライゲーション用に凍結乾燥した。
【0203】
セグメントSEP−1:4およびGRFNP6を共に、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。次に、この溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントC4逆相HPLCで未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物SEP−1:4+GP6を含むフラクションを、ES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0204】
セグメントSEP−1:1およびGRFNP32を共に、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。次に、この溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントC4逆相HPLCで未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物SEP−1:1+GP32を含むフラクションを、ES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0205】
B.合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−L26の合成
SEP−1−L26は、溶液中で以下の4つのポリペプチドセグメントから合成した:
セグメントSEP:1:1+GP32(GRFN1711+GRFNP32、配列番号:2の残基1−32に対応)
セグメントSEP:11+GP32(GRFN1711+GRFNP32配列番号の残基1−32に対応:2)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EH−チオエステル(Lys24は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル)(Lev−AoA)オキシム結合(Koxと表される)を介してGRFNP32にカップリングされている)
セグメントSEP−1:2(GRFN1712、配列番号:2の残基33−88に対応)
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW−チオエステル(Cys33は、Acm保護されている)
セグメントSEP−1:3(GRFN1713、配列番号:2の残基89−116に対応)
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK−チオエステル(Cys89は、Acm保護されている)
セグメントSEP:1:4+GP6(GRFN1776+GRFNP6、配列番号:2の残基117−166に対応)
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR−カルボキシレート(Lys126は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル)(Lev−AoA)オキシム結合(Koxと表される)を介してGRFNP32にカップリングされており、C末端システイン[すなわち、Cys161]は、ピコリル(pico)保護基を有する)
【0206】
付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、基除去反応、折りたたみおよび精製は、実施例1および2に記載されるように実行し、完全長の折りたたまれたSEP−1−L26を得た。CDスペクトルだけでなく折りたたまれたタンパク質産物の分析用逆相HPLCクロマトグラムおよびES−MSスペクトルにより、折りたたまれたタンパク質産物の存在が証明された。
【0207】
実施例4
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−B50の合成
第4の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−1−B50と表される)を合成した。完全長SEP−1−B50のアミノ酸配列は、SEP−1−L30の配列と同じである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LVKSSQPΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKΨAIS
PPDAAKoxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR(配列番号:2)
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を表し、Koxは、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合を介してカップリングされたオキシムリンカー基によってε−アミノ基において化学的に修飾された非天然リジンを表す。
【0208】
しかしながら、このタンパク質は、SEP−1−L30の直鎖状(Succ−EDA)18ポリマーではなく、4つの直鎖状(Succ−EDA)12部分を有する分岐ポリマー構成物で誘導体化した。誘導体化はオキシム結合を介して達成した。
【0209】
図17は、以下で詳細に説明されるようにオキシム形成ライゲーションを介してSEP−1−B50に結合された分岐水溶性ポリマーGRFNP29(GP29)の化学合成を例示する概略図である。図17に示されるように、U基としてアミノオキシアシルを持ち、さらにGP29と呼ばれコハク酸残基により提供されたペンダントカルボキシレートを持つ直鎖状水溶性ポリアミドエチレンオキシド構成物へのチオエーテル結合を介したその後のカップリングのための4つのペンダントチオール基を持つ3×リジン分岐核Bを有するU−B成分GRFN17(GP17)を生成するために、直交的に保護されたリジンU−B前駆体を使用した。完全長産物の集合は、実施例2で記載される通りであった。SEP−1−B50の構造を図18に示す。
【0210】
A.複数のチオール基を持つ鋳型GRFNP17の合成
鋳型GRFNP17を、アミド生成(4−メチル)ベンズヒドリルアミン(MBHA)−樹脂上で0.4mmolスケールで手動で合成した。Fmoc−Lys(Boc)−OHを、標準的カップリングプロトコルを用いてカップリングした(Schnolzer, M., Int J Pept Protein Res.(1992)40:180−93)。2.1mmolアミノ酸、3.8ml 0.5M HBTU中の10%DIEA、すなわち、アミノ酸の5倍過剰を用いた。Fmoc保護基の除去後、Fmoc−Lys(Fmoc)−OHを、標準的アミノ酸カップリングプロトコルを用いてカップリングした(2.1mmolアミノ酸、3.8ml 0.5M HBTU中の10%DIEA、すなわち、アミノ酸の5倍過剰を用いた)。第2のFmoc除去ステップ後、Fmoc−Lys(Fmoc)−OHを、標準的アミノ酸カップリングプロトコルを用いてカップリングした(4.2mmolアミノ酸、7.6ml 0.5M HBTU中の10%DIEA、すなわち、遊離アミンに対して5倍過剰のアミノ酸)。最終的Fmoc脱保護ステップ後、DMF中のS−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステル(SAMA−oPfp)の5倍過剰(遊離アミンに対して)を30分間カップリングした。C末端リジル残基の側鎖のBoc保護基を、純TFAによる1分間の洗浄2回し、続いてDMF中の10%DIEAで洗って樹脂を中和して除去した。2mmol Boc−アミノオキシ酢酸および2mmol N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を3ml DMF中に溶解した。2mmol DIC(ジイソプロピルカルボジイミド)の添加後、酸を30〜60分間活性化した。この溶液を、中和された樹脂に加え、1時間カップリングさせ。最終的に、S−結合アセチル基を、DMF中の20%ピペリジンで30分間かけて除去した。鋳型を脱保護し、同時に遊離アルデヒドのスカベンジャーとしてのシステインの存在で標準的Boc−化学手順に従ってHF/p−クレゾールを用いて樹脂支持体から切断した(Schnolzer, M., Int J Pept Res. (1992) 40:180−93)。50%B[すなわち、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液](アルデヒドフリー)中の再生ポリアミドを凍結し、凍結乾燥した。精製のため、鋳型粗製産物を、2ml 50%B中に溶解し、100ml 100%A[すなわち、水中の0.1%TFA]を加えて試料を希釈した(アルデヒドの付加が保証されているので、塩化または酢酸グアニジウムの添加を回避する)。鋳型を、T=40℃および3%Bで平衡化したC4調製用逆相HPLCカラムにロードした。塩をイソクラティック溶離し、所望の鋳型、GRFNP17をリニアグラジエントで精製した。所望の産物を含むフラクションを、ES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0211】
B.分岐水溶性ポリマーGRFNP29の合成
分子量15kDaの分岐(EDA−Succ)12ポリマーであるGRFNP29を、精製チオール含有鋳型GRFNP17および直鎖状ポリマーGRFNP31、Br−アセチル−12(EDA−Succ)カルボキシレートのチオエーテル生成ライゲーションにより合成し、ここでGRFNP31は標準的プロトコルに従ってSasrinカルボキシ−生成樹脂上で合成した(Rose, K. et al., 米国特許出願番号第09/379,297号; Rose, et al., J Am Chem Soc. (1999) 121: 7034)。
【0212】
1.3倍モル過剰(全チオールに対して)の精製GRFNP31、Br−アセチル化(EDA−Succ)12、および精製チオール含有鋳型GRFNP17を共に、0.1M Tris−HCl/6M塩化グアニジウム、pH8.7に、〜10mM濃度で溶解した。溶解後、溶液を0.1M Tris−HCl、pH8.7バッファーで3倍(v/v)希釈した。ライゲーションミックスを室温で攪拌し、反応を逆相HPLCおよびES−MSにより監視した。付加的なGRFNP31反応物を、所望の反応産物が主産物になるまで必要なだけ付加した。ワークアップのため、3×(v/vライゲーションミックスに対して)0.1M酢酸塩/6M塩化グアニジウム、pH4を添加し、溶液を調製用C4逆相HPLCカラムにロードし、リニアグラジエントにより精製した。純粋なGRFNP29構成物を含むフラクションを、ES−MSを用いて同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0213】
C.GRFNP29によるGRFN1776およびGRFN1711のオキシム化
セグメントSEP−1:4およびセグメントSEP−1:1を実施例2に記載されるように合成した。セグメントSEP−1:4およびGRFNP29を共に、0.1%TFA含有50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。この溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を、調製用逆相HPLCカラム(1インチ直径)にロードした。ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントC4逆相HPLCで未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物SEP:1:4+GP29を含むフラクションを、ES−MSにより同定し、プールした。
【0214】
セグメントSEP−1:1およびGRFNP29を共に、0.1%TFA含有50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。この溶液を凍結し、凍結乾燥した。乾燥粉末を、0.1%TFA含有50%アセトニトリル水溶液中に溶解し、調製用GPC(ゲル浸透クロマトグラフィー)カラム(1インチ直径)ロードした。ポリマー修飾ペプチドを、イソクラティック溶離により未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物SEP−1を含むフラクション:1+GP29を、ES−MSにより同定し、プールした。
【0215】
D.合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−B50の合成
SEP−1−B50(配列番号:2)は、溶液中で以下の4つのポリペプチドセグメントから合成した:
セグメントSEP−1:1+GP29(GRFN1711+GRFNP29、配列番号2の残基1−32に対応)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EH−チオエステル(Lys24は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル)(Lev−AoA)オキシム結合(Koxと表される)を介してGRFNP29にカップリングされている)
セグメントSEP−1:2(GRFN1712、配列番号:2の残基33−88に対応)
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW−チオエステル(Cys33は、Acm保護されている)
セグメントSEP−1:3(GRFN1713、配列番号:2の残基89−116に対応)
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK−チオエステル(Cys89は、Acm保護されている)
セグメントSEP:1:4+GP29(GRFN1776+GRFNP29、配列番号:2の残基117−166に対応)
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR−カルボキシレート(Lys126は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル)(Lev−AoA)オキシム結合(Koxと表される)を介してGRFNP29にカップリングされており、C末端システインは、ピコリル(pico)保護基を有する)
【0216】
付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、基除去反応、折りたたみおよび精製は、精製がリソースQカラム上であったこと以外は、実施例1および2に記載されるように実行し、完全長の折りたたまれたSEP−1−B50(配列番号:2)を得た。CDスペクトルだけでなく折りたたまれたタンパク質産物SEP−1−B50の分析用C4逆相HPLCクロマトグラムおよびES−MSスペクトルにより、折りたたまれたタンパク質産物の存在が証明された。
【0217】
実施例5
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−3−L42の合成
第5の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−3−L42と呼ぶ)を合成した。完全長SEP−3タンパク質のアミノ酸配列は下記の通りである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNECIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LACSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS
PPDAACAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR(配列番号:3)
【0218】
位置24、38、83、および126のシステイン残基を、マレイミド官能化した(EDA−Succ)18(GRFNP32)ポリマー単位(マイケル付加反応を介して)で修飾してSEP−3−L42を形成した。SEP−3−L42の構造を図20に示す。
【0219】
以下で説明されるSEP−3−L42の化学合成を例示する概略図を図19に示す。簡潔に言えば、図19Aおよび図19Bは、4つのSEP−3−L42ペプチドセグメント、SEP−3:1〜SEP−3:4の天然型化学的ライゲーションを示し、これによりヒトEPOにおける4つ全ての天然グリコシル化部位に対応するライゲーション部位でシステインが生成する。特に、図19Bは、すべてのジスルフィド形成システインが保護された完全長ポリペプチドを示し、これによりシステインライゲーション部位において4つの帯電直鎖状水溶性ポリマー(GRFN32−マレイミド(GP32マレイミド)と呼ぶ)のマイケル付加反応を介した部位特定的付着が可能になる。図19Bも、ジスルフィド形成システインの最終的脱保護ステップ、および完全長のポリマー修飾産物の生成を示す。
【0220】
詳細には、SEP−3は溶液中で以下の4つのポリペプチドセグメントから合成した:
セグメントSEP−3:1(GRFN1747、配列番号:3の残基1−37に対応)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNE−チオエステル(Cys7、Cys29、およびCys33はAcm保護されている)
セグメントSEP−3:2(GRFN1774、配列番号:3の残基38−82に対応)
CIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LA−チオエステル(Cys38は、Acm基により保護された側鎖)
セグメントSEP−3:3(GRFN1749、配列番号:3の残基83−125に対応)
CSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS
PPDAA−チオエステル(Cys83は、Acm基により保護された側鎖)
セグメントSEP−3:4(GRFN1750、配列番号:3の残基126−166に対応)
CAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR−カルボキシレート(Cys161は、Pbo[すなわち、4−(CH3S(O)−)ベンジル−]保護されている)
【0221】
ペプチド合成。ペプチドSEP−3:1、SEP−3:2、およびSEP−3:3を、実施例1に記載されるような確立された側鎖保護戦略を用い、上記の特定のペプチドにおいて言及したような保護基戦略を変えて、Boc化学SPPSのためのin situ中和プロトコルにより、チオエステル生成樹脂上で合成した。セグメントSEP−3:4を、−OCH2−Pam−樹脂上で相似的に合成した。ペプチドを脱保護し、実施例1に記載されるように、樹脂支持体から同時に切断した。結果として得られた上記のペプチドを、調製用RP−HPLCにより精製した。純粋なペプチドを含むフラクションを、ES−MSを用いて同定し、ブールし、その後のライゲーション用に凍結乾燥した。
【0222】
ステップ1:ライゲーション#1 セグメントSEP−3:4およびセグメントSEP−3:3を、15mMの濃度でTFEに溶解した。6M塩化グアニジウムおよび1%チオフェノールを含む飽和リン酸塩バッファー(pH7.5)を加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。ライゲーション後、ライゲーションミックス(1容積と定義する)を、{TFE2ml、6M塩化グアニジウム6ml、25%β−メルカプトエタノール含有100mMリン酸塩の溶液}2容積に加え、20分間インキュベートした。この溶液を、15mg/ml TCEPの氷酢酸溶液で酸性化し、調製用C4逆相HPLCカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のライゲーション産物SEP−3:Acm+SEP−3:3+SEP−3:4を含むフラクションをES−MSで同定し、プールした。
【0223】
ステップ2:Acm除去#1 Acm除去のため、プールしておいたSEP−3:Acm+SEP−3:3+SEP−3:4のフラクションを含むアセトニトリル水溶液を、HPLCグレード水で1×希釈し、固体尿素を最終的に2モル濃度となるように加えた。3%酢酸水溶液中の30mg/ml Hg(酢酸塩)2溶液を3倍モル過剰加え、溶液を1時間攪拌した。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中で20%とし、半調製用C4逆相HPLCカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望の産物SEP−3:3+SEP−3:4を含むフラクションをES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0224】
ステップ3:ライゲーション#2 等量のSEP−3:3+SEP−3:4およびSEP−3.2を共に、純TFE中に15mMの濃度で溶解した。6M塩化グアニジウムおよび1%チオフェノールを含むリン酸塩バッファー(pH7.5)250mMを加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。1日ライゲーションした後、ライゲーションミックス(1容積と定義する)を、TFE10ml、β−メルカプトエタノール10ml、ピペリジン10m、および6M塩化グアニジウム20mlのpH4の溶液2容積に加え、どのような残留保護基も除去されるように20分間インキュベートした。この溶液を、20%酢酸水溶液中の15mg/ml TCEPで酸性化し、調製用C4逆相HPLCカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のライゲーション産物SEP−3:Acm+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4を含むフラクションをES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0225】
ステップ4:Acm除去 Acm除去のため、プールしておいたSEP−3:Acm+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4のフラクションを含むアセトニトリル水溶液を、HPLCグレード水で1×希釈し、固体尿素を最終的に2モル濃度となるように加えた。3%酢酸水溶液中の30mg/ml Hg(酢酸塩)2溶液を3倍モル過剰(予想される総システイン濃度に対して)加え、溶液を1時間攪拌した。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中で20%とし、C4半調製用逆相HPLCカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望の産物SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4を含むフラクションをES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0226】
ステップ5:ライゲーション#3 等量のSEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4およびSEP−:3:1を共に、純TFE中に15mMの濃度で溶解した。6M塩化グアニジウムおよび1%チオフェノールを含むリン酸塩バッファー(pH7.5)250mMを加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。1日ライゲーションした後、ライゲーションミックス(1容積と定義する)を、TFE10ml、β−メルカプトエタノール10ml、ピペリジン10mおよび6M塩化グアニジウム20mlのpH4の溶液2容積に加え、どのような残留保護基も除去されるように20分間インキュベートした。この溶液を、20%酢酸水溶液中の15mg/ml TCEPで酸性化し、調製用C4逆相HPLCカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のライゲーション産物SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4を含むフラクションをES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0227】
ステップ6:ポリマーGRFNP32の付着 GRFNP32−マレイミドと呼ばれるマレイミド官能化直鎖状(EDA−Succ)18ポリマーを、マレイミド官能化(EDA−Succ)18ポリマー[すなわち、マレイミド−(EDA−Succ)18]を形成するためのメーカーのプロトコルに従い、GRFNP32をBMPS(3−マレイミドプロピオン酸NHSエステル、Pierce、USA)で官能化することにより調製した。SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4を、必要最小量のTFE中に溶解した。3倍過剰のGRFNP32−マレイミドを、6M塩化グアニジウム、100mMリン酸塩、pH7.5、中に溶解し、TFE溶液に加えた。マイケル付加反応の進行は、分析用逆相HPLCで追った。反応完了後、この溶液を、調製用C4逆相HPLCカラムにロードし、リニアグラジエントにより精製した。所望のポリマー修飾産物SEP−3:Acm+SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4+pPEG[すなわち、Cys24、Cys38、Cys83およびCys126の側鎖チオールに付着させられたGRFNP32の4つのコピーを持つ結合された完全長166残基ポリペプチド鎖、従ってSEP−3:Acm+SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4+GP32とも呼ばれる]を含むフラクションをES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0228】
ステップ7:Pbo除去 Pbo還元のため、SEP−3:Acm+SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4+GP32の凍結乾燥粉末を、5%エタンジチオールを含む純TFA中に溶解した。次に、Pbo基を、30分間かけて10%チオアニソールおよび15%ブロモトリメチルシランを加えることにより切断した。溶液をロータリーエバポレーター中で乾燥し、0.1%TFAを含むアセトニトリル水溶液に取り込んだ。結果として得られた溶液を、半調製用逆相HPLCカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望のCys161−脱保護産物SEP−3:Acm+SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4+GP32−Pboを含むフラクションをES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0229】
ステップ8:Acm除去 Cys7、Cys29、およびCys33の側鎖から最終的にAcmを除去するため、SEP−3:Acm+SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4+GP32−Pboのプールしておいたフラクションを含むアセトニトリル水溶液を、HPLCグレード水で1x希釈し、固体尿素を最終的に2モル濃度となるように加えた。3%酢酸水溶液中の30mg/ml Hg(酢酸塩)2溶液を(予期される全システイン濃度に関して)3倍モル過剰加え、溶液を1時間攪拌した。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中で20%とし、半調製用C4逆相HPLCカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望の結合されたポリマー修飾産物SEP−3(1−166)を含むフラクションを、ES−MSで同定し、一晩凍結乾燥した。
【0230】
ステップ9:折りたたみ 完全長結合されたポリマー修飾ペプチドSEP−3(1−166)を、6M塩化グアニジウム、20%TFEおよび10倍モル過剰(SEP−3中のCys残基に関して)のシステインを含む200mM Trisバッファー(pH8.7)中に溶解した。この溶液を、3M塩化グアニジウムを含む200mM Trisバッファー(pH8.7)溶液に対して、室温で一晩透析した。次に、この溶液を、1M塩化グアニジウムを含む200mM Trisバッファー(pH8.7)の溶液に対して室温で4時間4℃で、そして最終的に10mMリン酸塩バッファー(pH7.0)に対して4時間4℃で透析して最終的な折りたたまれた産物を得た。折りたたみは、エレクトロスプレーES−MSおよびCD分光分析により検証した。
【0231】
ステップ10:精製 折りたたまれたポリペプチドを、セントリコン・コンセントレーター・バイアル中で5×濃縮し、10mMリン酸塩、pH7.0で平衡化したリソースS陽イオン交換カラムにロードした。折りたたまれたタンパク質を、10分間リニア塩グラジエントで500mM NaCl中に溶離した。所望の折りたたまれた産物SEP−3−L42を含むフラクションを、SDS−PAGEで同定し、凍結し、−80℃で保存した。
【0232】
実施例6
合成赤血球産生刺激タンパク質の生物活性アッセイ
折りたたまれた合成赤血球産生刺激タンパク質、SEP−0、SEP−1−L26、SEP−1−L30、SEP−1−B50、およびSEP−3−L42の生物活性を、UT/7および32D103197細胞系を用い、対照標準として市販の組換えエリスロポエチンを用いた因子依存性細胞系増殖アッセイにおいて決定した。UT−7は、成長および生存についてインターロイキン−3、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、またはエリスロポエチン(EPO)の1つに絶対的に依存するヒト巨核芽球白血病細胞系である(Miura Y, et al., Acta Haematol (1998) 99:180−184) ; Komatsu N, et al., Cancer Res. (1991) 51:341−8)。32D103197は、マウス造血細胞系である(Metcalf, D. Int J Cell Cloning (1992) 10:116−25)。
【0233】
SEP構成物の原液を、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、10%FBS(ウシ胎仔血清)、グルタミンおよびPenstrep中で作り、これらの現役の連続した2×希釈をマルチウェルプレートに加え、これにヒトUT/7EPO細胞を5000cells/50μlの濃度で加えた。プレートは、37℃で5%O2存在下でインキュベートし、成長を毎日モニターした。4日後、PBS(リン酸塩緩衝食塩水)中の2.5mg/ml MTT(メチルチアゾールテトラゾリウム)20μlを加え、プレートを4時間インキュベートした。IPA150μlを加え、各ウェルの吸光度を562nmで読んだ。SEP化合物についてED50(最大効果の50%に達するための有効用量)値を決定しCHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞産生rhEPO(組換えヒトエリスロポエチン)の値と比較した。これらの実験の結果により、合成赤血球産生刺激タンパク質のすべてが生物活性を示すことが実証された。SEP−0、SEP−1−L26、SEP−1−L30、およびSEP−1−B50についてのED50結果を表VIに示す。
表VI
【表5】
【0234】
ポリマー修飾SEP−1−L30の場合の吸光度によりタンパク質濃度を計算するために吸光係数を用いるだけでペプチド含有量について基準化した場合のこれらの実験からの付加的結果は、SEP−0、SEP−1−L26、SEP−1−L30、SEP−1−B50およびSEP−3−L42について表VIIおよび図26に示してある(SEP−1−B51化合物の合成は以下の実施例7に記載)。一括して、これらのインビトロアッセイは、インビトロ生物活性に対するポリマー構造および付着部位を変えることの差動効果を実証するものであり、そこでは、これらの化合物の相対的な効力の序列は、(1)ヒトEPO受容体活性について試験した場合には、(最も強力なのものから最も弱いものへ)SEP−1−L26(SEP−1−L30>SEP−1−B50(SEP−1−B51>SEP−3−L42>SEP−0であり、(2)マウスEPO受容体活性について試験した場合には、(最も強力なのものから最も弱いものへ)SEP−1−L−26>SEP−1−L30>SEP−0>SEP−3−L42>SEP−1−B50(SEP−1−B51である。
表VII
【表6】
【0235】
表VIIおよび図26の結果は、非ポリマー修飾構成物SEP−0と比較したポリマー修飾SEP構成物についての受容体優先性において有意な差も示している。特に、SEP−1−L26は、対応するヒトEPOグリコシル化部位位置24(この部位に付着させられたペンダント負電荷を持つ5.5kDa直鎖状ポリマー)および位置126(この部位に付着させられたペンダント中性電荷を持つ1.8kDa直鎖状ポリマー)に付着させられた異なる直鎖状ポリマーで修飾されており、この構成物はヒト受容体およびマウス受容体両方に対して同様な活性を有していた。SEP−1−L30は、対応するヒトEPOグリコシル化部位位置24および126にペンダント負電荷を有する5.5kDa直鎖状ポリマーで修飾されており、この構成物はマウス受容体と比較してヒト受容体に対して約5倍活性であった。SEP−3−L42は、対応するヒトEPOグリコシル化部位位置24、38、83および126にペンダント負電荷を有する5.5kDa直鎖状ポリマーで修飾されており、マウス受容体と比較してヒト受容体に対して約10倍活性であった。最大の差は、SEP−1−B50およびSEP−1−B51について観察され、これらは、対応するヒトEPOグリコシル化部位位置24および126に付着させられた分岐状の負帯電の15kDaポリマーで修飾されており、plが約5(ヒトEPOと同様)であり、マウス受容体と比較してこれらの2つの構成物はヒト受容体に対して〜60倍活性であった。
【0236】
マウスEPOは、ヒトEPO位置126に対応する位置にグリコシル化部位を欠いているので(マウスEPOは、ヒトEPOに見られるO−グリコシル化セリンの代わりに非グリコシル化プロリンを有している)、改変された受容体活性は、ある程度この違い、従って対応する位置126にO−結合グリコシル化を欠いているEPOについてのマウス受容体の優先性に起因し得る。これは、SEP−1−L26およびSEP−1−L30とSEP−1−B50およびSEP−1−B52との比較に一致している。例えば、SEP−1−L26は、1.8kDa未帯電ポリマーを位置126に有するのに対して、SEP−1−L30は、5.5kDa負帯電ポリマーを位置126に有している。ヒトEPO受容体に対して同等な活性が観察されたけれども、マウスEPO受容体に対しては4倍の違いが見られた。最大の差は、対応するヒトEPOグリコシル化部位位置126に負帯電15kDaポリマーが付着させられたSEP−1−B50およびSEP−1−B51構成物の場合に観察された。ヒトEPOにおける4つの天然グリコシル化位置すべて、すなわち24、38、83および126、に対応する部位における5.5kDa負帯電ポリマーの付加は、SEP−3−L42構成物と同様に、マウスについての優先性をなおいっそう減少させたが、SEP−1−B50およびSEP−1−B51構成物よりは少なかった。これらの結果は、生物学的に産生され、グリコシル化されたタンパク質におけるグリコシル化部位に対応する部位の精密修飾によって、およびポリマーのサイズ、分岐の性質および電荷を調節することによって受容体特異性を調整できることを立証している。
【0237】
実施例7
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−B51の合成
A.SEP−1−B51の組成
第6の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−1−B51と呼ぶ)を合成した。完全長SEP−1−B51のアミノ酸配列は、SEP−1−B50の配列と同じである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LVKSSQPWΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKΨAIS
PPDAAKoxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR(配列番号:2)
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を表し、Koxは、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合を介してカップリングされたオキシムリンカー基によってε−アミノ基において化学的に修飾された非天然リジンを表す。
【0238】
しかしながら、SEP−1−B50とは対照的に、タンパク質は、アミド結合を介してリジン分岐核に結合された4つの直鎖状(Succ−TTD)12−Succ−アラニン−OH[すなわち、(Succ−TTD)12−Succ−Ala−OH、あるいは(Succ−TTD)12Succ−Ala]ポリマーを有する分岐状ポリマー構成物で誘導体化されている。アミド結合を介した分岐核への直鎖状ポリマーのカップリングは、安定性を向上するように設計された。4つの直鎖状ポリマーも、アラニン部分およびペンダント負電荷を持つように設計され、負電荷がシアル酸を模倣し、アラニンが糖鎖のペンダント糖部分に類似の疎水性を模倣する。分岐ポリマーも、分岐核鋳型の合成および取り扱い特性を改善するために、さらにタンパク質バックボーンへの糖付着部位と糖質の第1の分岐点との間の天然糖質鎖に見られるスページングを模倣するために、分岐核とタンパク質バックボーン付着部位との間に水溶性スペーサーを持つように設計された。
【0239】
図21は、以下で説明されるようにオキシム形成ライゲーションを介してSEP−1−B51に結合された分岐水溶性ポリマーGRFNP41(GP41)の化学合成を例示する概略図である。完全長産物の集合は、実施例2に記載の通りであった。SEP−1−B51の構造は図22に示してある。
【0240】
B.分岐鋳型(GRFNP40)にカップリングするための(Succ−TTD)12Succ−AlaOtBu(GRFNP39)の合成
直鎖状ポリマー(Succ−TTD)12Succ−AlaOtBu(GRFNP39)を、0.5mmolスケールで、Sasrin酸不安定な、カルボン酸生成樹脂上で合成した。0.5mmol(〜0.5グラム)Sasrin酸不安定な、カルボン酸生成ポリスチレン樹脂(ヒドロキシル置換1.02mmol/g)を、DMF中で15分間膨潤させ、次いで排液した。このヒドロキシル−官能化された樹脂に、DIEA(ジイソプロピルエチルアミン)500マイクロリットル(3.9mmol)を含むDMF8ml中に溶解した無水コハク酸450mg(4.5mmol)および4−(ジメチルアミノ)ピリジン488mg(4mmol)を加え、渦撹拌により30分間反応させ、排液した。カップリングを反復し、過剰反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。HOOC−CH2CH2CO−O−樹脂(0.5mmol)を、新たに用意したDMF中の1.0M(8mmol)CDI(カルボニルジイミダゾール)溶液8mlを加えて活性化し、40分間反応させ、次いで排液した。過剰反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。DMF中の0.5M(2mmol)HOTB溶液4ml中に溶解した(4,7,10)−トリオキサトリデカン−1,13ジアミン(TTD)4ml(4グラム、18.2mmol)を加え、渦流攪拌により30分間反応させ、次いで排液した。過剰反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。DIEAを500マイクロリットル(3.9mmol)含む0.5M(4mmol)HOBT(N−ヒドロキシベンゾトリアゾール)溶液8ml中に溶解した無水コハク酸(450mg、4.5mmol)を樹脂に加え、15分間渦流攪拌して反応させ、次いで排液した。3つのステップ(CDI活性化、TTDカップリング、無水コハク酸反応)を11回[すなわち、合計12回]反復した。過剰反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。HOOC−CH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂(0.5mmol)を、新たに用意したDMF中の1.0M(8mmol)CDI溶液8mlで活性化し、40分間反応させ、次いで排液した。過剰反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。H−AlaOtBu・HCL2.5mmolを、DIEA150マイクロリットル(111mg、0.825mmol)を含むDMF中の0.5M(2.375mmol)HOBT溶液4.75ml中に溶解し、さらにCDI−活性化HOOCCH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂(0.5mmol)と渦撹拌により1時間反応させ、次いで排液した。過剰反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。生成物tertBuOOC−CH(CH3)−NH−OC−CH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂を、DCM(ジクロルメタン)で徹底的に洗浄し、排液し、次いで、樹脂を真空下で一定重量になるまで乾燥した。生成物−樹脂の典型的な重量は約2グラムであった。
【0241】
直鎖状(Succ−TTD)12Succ−AlaOtBuポリマーを、DCM中の4%TFAを用いる標準的Fmoc−化学手順に従って樹脂支持体から切断した。沈降した粗生成物を、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥ポリマーを、0.1%TFAを含む少量の50%アセトニトリル水溶液中に溶解し、有機物濃度を1%未満まで減少させるために希釈した。粗生成物を、T=40℃において3%Bで平衡化したC4調製用逆相カラムにロードした。塩類をイソクラティック溶離し、所望の鋳型を、20−35%バッファーB(0.1%TFA含有アセトニトリル)対0.1%TFA水溶液の60分間にわたるリニアグラジエントにより精製した。所望の(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu物質(GRFNP39)を含むフラクションを、ES−MSで同定し、凍らせ、凍結乾燥した。
【0242】
C.分岐のための複数のアミン基およびタンパク質(GRFNP40)への(後の)付着のための保護されたアミノオキシ基を持つ鋳型の合成
鋳型GRFNP40を、Sieberアミド生成樹脂上で0.4mmolスケールで手作業で合成した。すべてのカップリング、脱保護および活性化ステップの間にDMFによる1分間のフロー洗浄ステップがあった。Nα−Fmoc−Nβ−(Boc−アミノオキシアセチル)−L−ジアミノプロピオン酸2mmolを、1時間、DCM/DMF(ジメチルホルムアミド)中のDIC 2mmolおよびNHS 2mmolを用いた30分間のNHS−エステル事前活性化を用いて樹脂に結合させた。Fmoc保護基の除去(DMF中の20%v/vピペリジン2×3分間)および洗浄後、DIEA 2.2mmolを含む0.5M HOBT(N−ヒドロキシベンゾトリアゾール)溶液8ml中に無水コハク酸4mmolを溶解し、10分間樹脂にカップリングさせた。このステップの後、カルボキシル基を、新たに調製したDMF中の0.5M(4mmol)CDI溶液8mlで活性化した。TTD 4ml(18.2mmol)を、DMF中の0.5mHOBT溶液4mlに加え、30分間カップリングさせた。
【0243】
Fmoc−Lys(Fmoc)−OH(2mmol)を、結果として得られるアミノ−TTD−Succ−Dpr(BocAoA)−樹脂(Dpr=ジアミノプロピオン酸)に、DMF中のDIC 2mmolおよびをNHS 2mmolによる30分間の事前活性化を用いて1時間カップリングさせた。このカップリングを1度繰り返した。Fmoc除去ステップ(DMF中の20%v/vピペリジンで2×3分間)後、Fmoc−Lys(Fmoc)−OH 4mmolを上述の通りに再カップリングを含むカップリングをさせた。最終的なFmoc保護ステップ(DMF中の20%v/vピペリジンで2×3分間)後、鋳型を、DCM中の4%TFAを用いる標準的Fmoc−化学手順に従って樹脂支持体から切断した。沈降した生成物を、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥した粗生成物を、0.1%TFAを含む少量の50アセトニトリル水溶液中に溶解し、有機物濃度が1%未満となるように希釈した。鋳型を、T=40℃で3%バッファーB(アセトニトリル中の0.1%TFA)で平衡化したC4調製用逆相HPLCカラムにロードした。塩類および他の非アミド物質をイソクラティック溶離し、所望の鋳型を、5−12%バッファーB(0.1%TFA含有アセトニトリル)対0.1%TFA水溶液の60分間にわたるリニアグラジエントにより精製した。所望のLys−Lys(Lys)−TTD−Succ−Dpr(BocAoA)アミド物質(GRFNP40)を含むフラクションをES−MSでついて同定し、凍らせて凍結乾燥した。
【0244】
D.アミドカップリングされた分岐ポリマー(GRFNP41)の集合および脱保護
分子量16kDaの分岐(TTD−Succ)49−ポリマーであるGRFNP41を、GRFNP39[(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu]を精製鋳型GRFNP40にカップリングすることにより合成した。60℃でDMSO(ジメチルスルホキシド)中に20mg/mlの濃度で溶解した精製(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu(GRFNP39)(1.0mmol)を、DMSO中で濃度10mg/mlのHATU{O−(7−アザベンドトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート}0.95モルで、20倍(モル)過剰DIEA存在下で活性化した。DMSO中に濃度3.9mg/mlで溶解した精製鋳型GRFNP40(0.24モル)を直ちに加えた。反応の進行は、C4分析用逆相HPLCおよびES−MSにより監視した。典型的には、カップリングは数分以内で完了した。ワークアップのため、4容積(ライゲーションミックスに対して)の0.1M酢酸ナトリウム/6M塩化グアニジウム、pH4を加え、溶液を調製用(C4)逆相HPLCカラムにロードした。塩類および他の非アミド含有物質をイソクラティック溶離し、所望の分岐ポリマー産物を、20−35%バッファーB(0.1%TFA含有アセトニトリル)対0.1%TFA水溶液のリニアグラジエントにより80分間にわたり精製した。所望の物質を含むフラクションを、ES−MSで同定し、凍らせて凍結乾燥した。
【0245】
結果として得られる精製ポリマーを、純TFA中に1mg/mlの濃度で1時間かけて溶解し、Boc基をアミノオキシアセチル部分から除去し、tert−ブチルエステル基を−Ala−OtBu部分から除去した。溶液をロータリーエバポレーター中で乾燥するまで回転させ、乾燥ポリマーを、50%バッファーB(0.1%TFA含有アセトニトリル)中に溶解させた。付加物形成不純物を捕捉するため、アミノオキシ酢酸(a.k.a「カルボキシメトキシルアミン」)を最終濃度0.5Mまで加えた。20分後、溶液を3.3容積バッファーA(0.1%TFA水溶液)で希釈し、調製用C4逆相HPLCカラムにロードし、すべてのアミノオキシ酢酸が除去されるまで10%バッファーBでポンプ送液し、次いでポリマーを、15%から45%のバッファーB対0.1%TFA水溶液のステップグラジエントで80分間にわたり精製した。所望の分岐ポリマー物質(GRFNP41)を含むプールされたフラクションを凍らせ、凍結乾燥した。
【0246】
E.分岐ポリマーGRFNP41によるペプチドセグメントGRFN1776およびGRFN1711のオキシム形成ライゲーション(オキシム化)
セグメントSEP−1:4(GRFN1776、配列番号:2の残基117−166で構成される)およびセグメントSEP−1:1(GRFN1711、配列番号:2の残基1−32で構成される)を、実施例1に記載されるように、標準的in situ中和Boc化学SPPSを用いて合成した。ペプチドGRFN1776を、同様に上記で記載されるように、標準的プロトコルに従って−OCH2−Pam−樹脂上で合成した。ペプチドGRFN1711を、上記で記載されるように、標準的プロトコルに従ってチオエステル−生成樹脂上で合成した。Lys126にレブリンアシル部分を含むセグメントGRFN1776およびAoA含有GRFNP41を共に、0.1%TFA含有50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。溶液を凍結乾燥した。乾燥した粉末粗製産物を、0.1%TFA含有50%アセトニトリル水溶液中に再溶解し、調製用逆相(C4)HPLCカラムにロードした。ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエント逆相HPLCによって未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム結合(オキシム化)産物SEP−1:4+GP41を含むフラクションをES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0247】
Lys24にレブリンアシル部分を含むセグメントGRFN1711およびAoA含有GRFNP41を共に、0.1%TFA含有50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。溶液を凍らせ、凍結乾燥した。乾燥粉末を、0.1%TFA含有50%アセトニトリル水溶液中に再溶解し、調製用C4逆相HPLCカラムにロードした。ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントC4逆相HPLCによって未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム結合(オキシム化)産物SEP−1:4+GP41を含むフラクションをES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0248】
F.合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1B51の合成
(配列番号:2)を有するSEP−1−B51を、溶液中で以下の4つのポリペプチドセグメントから合成した:
セグメントSEP−1:1+GP41(GRFN1711+GRFNP41、配列番号:2の残基1−32に対応)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EH−チオエステル(Lys24は、Koxにより示されるように、分岐ポリマーGRFNP41にオキシム結合されたレブリンアシルペンダント部分を有し、His32はDnp保護されている)
セグメントSEP−1:2(GRFN1712、配列番号:2の残基33−88に対応)
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLAL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW−チオエステル(Cys33はAcm保護されており、3つのTrp残基はホルミル保護されている)
セグメントSEP−1:3(GRFN1713、配列番号:2の残基89−116に対応)
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK−チオエステル(Cys89はAcm保護されており、His94はDnp保護されている)
セグメントSEP−1:4+GP41(GRFN1776+GRFNP41、配列番号:2の残基117−166に対応)
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR
GKLKLYTGEA CRTGDR−カルボキシレート(C末端システイン(すなわち、Cys161)はピコリル(pico)保護基を有し、Lys126はKoxにより示されるように、分岐ポリマーGRFNP41にオキシム結合されたレブリンアシルペンダント部分を有する)
【0249】
完全長の折りたたまれたSEP−1−B51(配列番号:2)を産するため、付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、折りたたみおよび精製を、以下の変更を伴って、実施例1−4に記載されるように実行した:
【0250】
ステップ1:ライゲーション#1 セグメントSEP−1:4+GP41を、3mMの濃度でTFE(1容積)に溶解した。セグメントSEP−1:3を、6M塩化グアニジウムを含む2容積の300mM Naリン酸塩バッファー(pH7.9)中に2.25mMの濃度まで溶解した。2つの溶液を混合して、最終的なセグメント濃度を1mM SEP−1:4+GP41および1.5mM SEP−1:3とし、1%チオフェノールを加え、pH6.8〜7.2でペプチドセグメント溶液(「3容積」)を得た。反応を室温で一晩進行させた。ライゲーション後、β−メルカプトエタノール(3容積)をライゲーションミックスに加え、続いて3容積の6M塩化グアニジウム300mM Naリン酸塩pH7.9バッファー、そしてTCEPを加え(ペプチドセグメントの全重量の0.25重量比)、溶液を20分間攪拌した。この溶液を、0.6容積の氷酢酸でpH4.0+/−0.1に酸性化して清澄な溶液とし、これに6M塩化グアニジウムを含むpH4.0、100mM Na酢酸塩希釈バッファーを30容積加えた。結果として得られる溶液を、調製用逆相(C4)HPLCカラムに送液した。すべての非ペプチド物質がカラムから溶離されるまで、バッファーを5%B[従って、残りは95%バッファーA(0.1%TFA水溶液)]で送液し、次いでライゲーション産物を25−45%バッファーBのグラジエントにより80分間にわたって精製した。所望のライゲーション産物(Cys89(Acm)){SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}を含むフラクションをエレクトロスプレー質量分析により同定し、プールした。
【0251】
ステップ2:Acm−除去#1 Acm除去のため、(Cys89(Acm)){SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}のプールされたフラクションを含むアセトニトリル水溶液を、HPLCグレード水で1×希釈し、固体尿素を最終的に2モル濃度となるように加えた。3%酢酸水溶液中の30mg/ml Hg(酢酸塩)2溶液を(総システイン濃度に関して)3倍モル過剰加え、溶液を1時間攪拌した。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中で20%とし、半調製用逆相HPLCカラムにロードし、すべての非ペプチド物質が溶離されるまで25%バッファーBで送液し、次いで産物を、50%バッファーBへのステップグラジエントにより精製した。所望のライゲーション産物{SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}を含むフラクションをはエレクトロスプレー質量分析により同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0252】
ステップ3:ライゲーション#2 ステップ2からの{SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}産物、[すなわち、1713−1776−GP41]を、TFE(1容積)中に濃度3mMで溶解した。セグメントSEP−1:2(セグメントGRFN1712)を、6M塩化グアニジウム含有300mM Naリン酸塩バッファー(pH7.9)2容積中に2.25mMの濃度まで溶解した。2つの溶液を混合して、最終的なセグメント濃度を1mM {SEP−1:3+SEP−1:4−GP41}および1.5mM SEP−1:2とし、1%チオフェノールを加え、pH6.8〜7.2でペプチドセグメント溶液(「3容積」)を得た。反応を室温で一晩進行させた。次いで、ライゲーションミックスを、3容積(すなわち、上記で用いたTFEの容積に対して)の希釈バッファー、すなわち6M塩化グアニジウム含有100mM酢酸ナトリウムpH4.0で希釈し、次に、TFE3容積、β−メルカプトエタノール3容積、ピペリジン3容積および6M塩化グアニジウム6容積、100mM Na酢酸塩pH4.0から成り4℃に冷却した溶液に加え、どのような残留保護基も除去するために、室温で20分間攪拌した。この溶液を1.8容積の凍結氷酢酸で酸性化して清澄な溶液とし、これにTCEP(ペプチドセグメントの総重量に対して0.25の比率)を加え、溶液を20分間インキュベートした。次に、6M塩化グアニジウムを含むpH4.0、100mM Na酢酸塩希釈バッファーを30容積加え、溶液を混合した。結果として得られる溶液を、調製用逆相(C4)HPLCカラムに送液した。すべての非ペプチド物質がカラムから溶離されるまで、バッファーを30%C[バッファーC:イソプロパノール60%/アセトニトリル30%/水10%中の0.1%TFA]で送液し、次いでライゲーション産物を37−57%バッファーCのグラジエントにより80分間にわたって精製した。所望のライゲーション産物(Cys33(Acm)){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}を含むフラクションをES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0253】
ステップ4:残基Cys89およびCys117のカルボキシメチル化 (Cys33(Acm)){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}[すなわち、(Cys33(Acm))−1712−1713−1776−GP41]を、TFE中に1mMの濃度で溶解した。6M塩化グアニジウムを含む300mM Naリン酸塩バッファー(pH7.9)10容積を加えた。メタノール中に75mg/mlで溶解した25倍過剰(スルフヒドリル基について)のブロモ酢酸を加え、溶液を室温で2時間攪拌しつつ反応させた。次に、この反応混合物を100mM Na酢酸塩、pH4.0、6M塩化グアニジウム溶液11容積で希釈し、調製用逆相(C4)HPLC カラムにロードし、すべての非ペプチド成分が溶離されるまで20%バッファーCで送液し、次いでライゲーション産物を、55%バッファーCへのステップグラジエントで精製した。所望の修飾産物(Cys33(Acm);Ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}を含むフラクションを、ES−MSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【0254】
ステップ5:ピコリル除去 亜鉛末(ペプチド1ミリグラムあたり71ミリグラム)を2M HCl中で5分間活性化させ、この活性化をもう1度繰り返し、次いで、過剰な酸を除去するため、(新たに加えた)L−メチオニン35mgおよび35mg/ml Naドデカノイルサルコシンならびに10%v/vTFEを含む6M塩化グアニジウム、50mMグリシンpH2.2で10分間洗った。洗浄をもう1度繰り返した。Cys161(Pico)含有ペプチド(Cys33(Acm);Ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}を、純TFE中に約30mg/mlの濃度で溶解した。この溶液を、(新たに加えた)L−メチオニン35mgおよび35mg/ml Naドデカノイルサルコシンならびに10%v/vTFEを含む6M塩化グアニジウム、50mMグリシンpH2.2、4容積(TFEに対して)で希釈した。この溶液を活性化亜鉛末に加え、室温で50分間攪拌した。反応は、アリコット(等量のβ−メルカプトエタノールおよび数粒のTCEPで処理し、次いで分析用に2容積の6M塩化グアニジウム、100mM Na酢酸塩pH4.0で希釈)の分析用C4逆相HPLCで、〜1時間間隔で監視し、2〜5時間後に完了した。分析用HPLCピーク(すなわち、92Da質量の損失)のES−MS分析により示されるようなピコリル基除去の完了後、上澄みをろ過により除去し、残ったZn末を、L−メチオニン35mgおよび35mg/mlドデシルサルコシンならびに20%v/vTFEを含む6M塩化グアニジウム、pH4、100mM酢酸塩で3度洗った。BioRadSM−2ビーズ(溶液容積の約3分の1)を、上澄みと洗液とを合わせたものに加え、室温で30分間攪拌し、次いでろ過した。β−メルカプトエタノールを10%v/vになるまで加え、次に、0.25×(ペプチドの総合重量)のTCEPを加え、溶液を室温で5分間攪拌した。この溶液を、等量の100mM Na酢酸塩pH4.0、6M塩化グアニジウムで1:1希釈し、調製用(C4)逆相HPLCカラムにロードし、すべての非ペプチド物質が溶離されるまで、35%バッファーCを送液し、所望の産物を55%バッファーCへのステップグラジエントにより精製した。所望のCys161脱保護産物(Cys33(Acm);Ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41−Pico}をエレクトロスプレー質量分析で同定し、プールした。
【0255】
ステップ6:Acm除去#2 プールしておいた(Cys33(Acm);Ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41−Pico}[すなわち、(Cys33(Acm);Ψ89,117−1712−1713−1776−GP41]の溶液を、HPLCグレード水で3×希釈し、固体尿素を最終的に2モル濃度となるように加えた。3%酢酸水溶液中の30mg/ml Hg(酢酸塩)2溶液を(全システイン濃度に対して)3倍モル比率で加え、溶液を室温で1時間攪拌した。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中に20%とし、半調製用(C4)逆相HPLCカラムにロードした。すべての非ペプチド物質が溶離されるまで、バッファーC(20%)を送液し、次に、所望の産物を、55%バッファーCへのステップグラジエントにより精製した。所望の産物(Cys33;Ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41−Pico}を含むフラクションをES−MSで同定し、2×(w/w、ペプチド質量に対して)DPC(ドデシルホスホコリン)を含む水で2×(v/v)希釈し、一晩凍結乾燥した。
【0256】
ステップ7:ライゲーション#3 (Cys33;Ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41−Pico}[すなわち、(Cys33;Ψ89,117)−1712−1713−1776−GP41]を、純TFE(1容積)中に3mM濃度で溶解した。SEP−1:1[すなわち、1711−GP41]を、6M塩化グアニジウムを含む300mM Naリン酸塩バッファー(pH7.9)2容積中に溶解した。これらの溶液を合わせ、1%v/vチオフェノールを加えた。ライゲーションミックスを室温で一晩攪拌した。この溶液に、β−メルカプトエタノール(上記のTFE容積に対して)3容積、およびライゲーションバッファー(6M塩化グアニジウムを含む300mM Naリン酸塩バッファー。pH7.9)9容積を加えた。この溶液に、0.25×(ペプチドの総合重量)TCEPを加え、溶液をは20分間室温で攪拌した。氷酢酸(0.6容積)を加えて溶液をpH4.0に酸性化し、次にこの溶液を、30容積の6M塩化グアニジウム含有100mM Na酢酸塩pH4.0で希釈し、調製用(C4)逆相HPLCカラムにロードした。すべての非ペプチド物質が溶離されるまでバッファーC(25%)を送液し、次にライゲーション産物を、35−55%のバッファーCのリニアグラジエントによって80分間にわたって精製した。所望のライゲーション産物SEP−1(1−166)(Ψ89,117){SEP−1:1(+GP41)+SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}(配列番号:2)を含むフラクションをエレクトロスプレー質量分析により同定し、プールした。
【0257】
ステップ8:折り返し 完全長の結合されたペプチドSEP−1(1−166)(Ψ89,117){SEP−1:1(+GP41)+SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}[すなわち、1711(GP41)−1712−1713−1776−GP41]を含む組み合わせたフラクションに、固体塩化グアニジウム、1M Trisバッファー(pH8.7)および蒸留水を加え、最終的な溶液を、結合されたペプチドSEP−1(1−166)0.1ミリグラム/ml、6M塩化グアニジウム、100mM Trisあたり0.1ミリグラムとした。この結合されたペプチド(「タンパク質」)溶液を、15ml透析カセット中にロードし、3M塩化グアニジウム、5マイクロモルのシステインおよび2マイクロモルのシスチンを含む100mM Trisバッファー(pH8.5)溶液に対して4℃で一晩透析した。次に、このタンパク質溶液を、1M塩化グアニジウムを含む100mM Trisバッファー(pH8.5)溶液に対して4℃で8時間透析し、最終的に10mM Trisバッファー(pH7.0)に対して4℃で14時間透析して折りたたまれた産物を産生した。透析カセットからの折りたたまれたタンパク質を含む溶液を合わせた。折りたたみは、ES−MS、分析用RP−HPLCおよびCD分光測定法により立証された。
【0258】
ステップ9:精製 折りたたまれたタンパク質を含む溶液を、10mM Tris、pH7.0で平衡化したQ−Sepharaoseイオン交換カラムにロードした。折りたたまれたタンパク質を、125mM NaClへのリニア塩グラジエントを用いて溶離した。所望の折りたたまれた産物SEP−1−B51を含むフラクションを、非還元性SDS−PAGEで同定し、プールした。合わせたフラクションを限外ろ過により濃縮し、約2ミリグラム/1ミリリットルの濃度にし、次に、このタンパク質溶液を2.6×100cmS−300ゲルろ過カラムにロードした。精製されたSEP−1−B51を、10mM TrispH7.0、137mM塩化ナトリウムにより溶離した。高純度SEP−1−B51を含むフラクションを、非還元性SDS−PAGEにより同定し、プールし、凍結し、−80℃で保存した。最終的な精製された折りたたまれたタンパク質SEP−1−B51を、分析用(C4)逆相HPLC、ES−MS、非還元性SDS−PAGE、およびCD分光測定によりキャラクタリゼーションした。図25には、折りたたまれた精製SEP−1−B51の相対分子量を示す代表的な等電電気泳動ゲル(IEF)および非還元性SDS−PAGEゲルを示してある。同じゲル上で走らせた分子量標準を、比較用に示してある。示されるように、非還元性SDS−PAGEにより決定されたSEP−1−B51の相対分子量は73kDaである。相対plは約5.0である。折りたたまれた精製されたSEP−1−B51産物、代表的なRP−HPLCクロマトグラムも示してある。これは、本発明の精密ポリマー修飾タンパク質の純度および増大した相対分子量を例示している。
【0259】
実施例8
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−B52の合成
A.SEP−1−B52の組成
第7の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−1−B52と呼ばれる)を合成した。完全長SEP−1−B52のアミノ酸配列は、SEP−1−B51の配列と同じである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EHCSLNEKIT
VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL
LVKSSQPWΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKΨAIS
PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA
CRTGDR(配列番号:2)
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を表し、Koxは、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合を介してカップリングされたオキシムリンカー基によってε−アミノ基において化学的に修飾された非天然リジンを表す。
【0260】
SEP−1−B52タンパク質は、残基24および126において、SEP−1−B51と同様な分岐(Succ−TTD)12−Succ−Alaポリマー構成物で誘導体化したが、この類似体については、ポリマーはピルビン酸とアミノオキシ酢酸との間のオキシム結合を介して付着させた。さらに、リジン残基24および126のε−アミノ基は、レブリンアシル部分の代わりにアミノオキシアセチル官能基を持つように修飾し、分岐(Succ−TTD)12−Succ−Alaポリマー構成物は、ペンダントピルビンアシル部分を持つようにした。これらの変化は、合成および取り扱いを改善し、オキシム結合の安定性をさらに増大させるために設計した。
【0261】
図23は、以下で記載されるようなオキシム形成ライゲーションによってSEP−1−B52に結合される分岐水溶性ポリマーGRFNP43(GP43)の化学合成を例示する概略図である。完全長産物の集合は、実施例2において説明した。SEP−1−B52の構造は図24に示してある。
【0262】
B.分岐鋳型(GRFNP42)へのカップリングのための(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu(GRFNP39)の合成
(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu(GRFNP39)を、0.5mmolスケールで合成した。0.5mmol(−0.5グラム)Sasrin酸不安定性、カルボン酸生成ポリスチレン樹脂(ヒドロキシル置換1.02mmol/g)を、DMF中で15分間膨潤させ、次に排液した。このヒドロキシル官能化樹脂に、DIEA(ジイソプロピルエチルアミン)を500マイクロリットル(3.9mmol)含むDMF8ml中に溶解させた無水コハク酸450mg(4.5mmol)および4−(ジメチルアミノ)ピリジン488mg(4mmol)を加え、30分間渦撹拌により反応させ、次いで排液した。このカップリングを繰り返し、過剰な反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)による1分間の渦洗浄で除去し、排液した。HOOC−CH2CH2CO−O−樹脂(0.5mmol)を、DMF中の新規な1.0M(8mmol)CDI溶液8mlを加えて活性化し、40分間反応させ、次いで排液した。過剰な反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄によって除去し、排液した。は、DMF中の0.5m(2mmol)HOBT溶液4ml中に溶解させたTTD4ml(4グラム、18.2mmol)を加え、30分間渦攪拌によって反応させ、排液した。過剰な反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄によって除去し、排液した。DIEA500マイクロリットル(3.9mmol)を含む8mlの0.5M(4mmol)HOBT(N−ヒドロキシベンゾトリアゾール)溶液中に溶解させた無水コハク酸(450mg、4.5mmol)を樹脂に加え、渦攪拌によって15分間反応させ、次に排液した。これらの3ステップ(CDI活性化、TTDカップリング、無水コハク酸反応)を11回[すなわち、合計12回]繰り返した。過剰な反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、排液した。HOOC−CH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂(0.5mmol)を、DMF中の新規な1.0M(8mmol)CDI溶液8mlで活性化し、40分間反応させ、排液した。過剰な反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、排液した。H−AlaOtBu・HCl 2.5mmolを、DIEA 150マイクロリットル(111mg、0.825mmol)を含むDMF中の0.5M(2.375mmol)HOBT4.75ml中に溶解させ、CDI−活性化されたHOOC−CH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂(0.5mmol)と渦撹拌して1時間反応させ、次に排液した。過剰な反応物および可溶性副産物を、DMF(〜50ml)を用いた1分間の渦流洗浄により除去し、次に排液した。産物tertBuOOC−CH(CH3)−NH−OC−CH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂をDCMで徹底的に洗い、排液し、次に樹脂を真空下で一定重量になるまで乾燥した。産物樹脂の典型的な重量は約2グラムであった。
【0263】
直鎖状GRFNP39を、標準的Fmoc−化学手順に従って、DCM中の4%TFAを用いて樹脂支持体から切断した。沈降した粗製産物を、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥されたポリマーを、0.1%TFAを含む少量の50%アセトニトリル水溶液中に溶解し、有機物濃度を1%未満になるまで希釈した。粗製産物を、T=40℃において3%Bで平衡化したC4調製用逆相HPLCカラムにロードした。塩類をイソクラティック溶離し、所望の鋳型を、20−35%バッファーB(0.1%TFA含有アセトニトリル)対0.1%TFA水溶液のリニアグラジエントにより60分以上かけて精製した。所望の(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu物質(GRFNP39)を含むフラクションをES−MSで同定し、凍らせて、凍結乾燥した。
【0264】
C.分岐のための複数のアミン基およびタンパク質(GRFNP42)への(後の)付着のためのペンダントピルビナシル部分を持つ鋳型の合成
鋳型を、Boc−Leu−OCH2−Pam−樹脂上で0.4mmolスケールで手作業により合成した。DMFによる1分間のフロー洗浄ステップを、すべてのカップリング、脱保護および活性化ステップの間で用いた。Boc基を、純(すなわち、100%)TFAで処理して除去した。DMF洗浄後、Fmoc−(Rink−リンカー)−OH 2mmolを、DIEA 1mlを含むDMF 3.8ml中のHBTU 1.8mmolによる活性化後、樹脂にカップリングさせた。Fmoc保護基除去(2×3分間DMF中の20%ピペリジン)後、Fmoc−Lys(MTT)−OH[MTT=4−メチルトリチル]2mmolを、DMF中のDIC 2mmolおよびNHS 2mmolによるNHS−エステル活性化を用いて樹脂にカップリングした。Fmoc基除去(2×1分間DMF中の0.5%DBU)後に、8mlのDIEA 2.2mmolを含む0.5M HOBT溶液中に溶解させた無水コハク酸4mmolを、10分間樹脂にカップリングした。このステップの後、樹脂結合カルボキシル基を、DMF中の新たな0.5M CDI溶液8mlで活性化した。TTD 4mlを、0.5M HOBT溶液4mlに加え、30分間カップリングした。
【0265】
Fmoc−Lys(Fmoc)−OH 2mmolを、DMF中のDIC 2mmolおよびNHS 2mmolによるNHS−エステル活性化を用いて樹脂にカップリングした。Fmoc除去ステップ(2×1分間DMF中の0.5%DBU)後、Boc−Lys(Boc)−NHS 4mmolをDMF 3ml中でカップリングした。
【0266】
MTT保護基はDCM中の2%TFAによる複数回の洗浄により除去した。上澄みがその黄色を失うと脱保護は完了する。樹脂を、DMF中の10%DIEAにより1分間中和した。DMF中のDIC 2mmolおよびNHS 2mmolによるNHS−エステル活性化を用いて、ピルビン酸2mmolを45分間かけて樹脂にカップリングした。鋳型を脱保護し、水5%を含む純TFAを用いて樹脂支持体から切断した。切断溶液を、ロータリーエバポレーター中で乾燥するまで蒸発させた。残基を、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥した鋳型を、0.1%TFAを含む少量の50%アセトニトリル水溶液中に溶解し、有機物濃度が1%未満になるまで希釈した。ピルビン酸塩含有鋳型を、T=40℃において0%バッファーB[すなわち、100%バッファーA=0.1%TFA水溶液]で平衡化したC4調製用カラムにロードした。塩類を、イソクラティック溶離し、所望の鋳型を、5−12%バッファーB対0.1%TFA水溶液のリニアグラジエントにより60分間で精製した。所望の物質(GRFNP42)を含むフラクションを、ESI−MSにより同定し、凍らせて凍結乾燥した。
【0267】
D.アミドカップリングされた分岐ポリマー(GRFNP43)の集合および脱保護
分子量16kDaの分岐(TTD−Succ)49−ポリマーであるGRFNP43を、GRFNP39を精製鋳型GRFNP42にカップリングすることにより合成した。DMSO中に60℃で10mg/mlの濃度で溶解させた精製(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu(GRFNP39)(1.0mmol)を、20倍(モル)過剰のDIEA存在下において、DMSO中の濃度20mg/mlのHATU 0.95molにより活性化した。DMSO中に3.9mg/mlの濃度で溶解させた精製鋳型(0.24mol)GRFNP42を直ちに加えた。反応の進行を、分析用C4逆相HPLCおよびES−MSにより監視した。典型的には、カップリングは数分以内で完了した。ワークアップのため、4容積(ライゲーションミックスに対して)の0.1M酢酸塩/6M塩化グアニジウム、pH4を加え、溶液を調製用(C4)逆相HPLCカラムにロードした。塩類および他の非アミド含有物質をイソクラティック溶離し、所望の分岐ポリマー産物を、20−35%バッファーB(0.1%TFA含有アセトニトリル)対0.1%TFA水溶液のリニアグラジエントにより80分間にわたり精製した。所望の物質を含むフラクションを、ES−MSで同定し、凍らせて凍結乾燥した。
【0268】
結果として得られる精製分岐ポリマー構成物GRFNP43を、純TFA中に1mg/mlの濃度で1時間かけて溶解し、Ala−OtBitertブチルエステル保護を除去した。溶液をロータリーエバポレーター中で乾燥するまで蒸発させ、乾燥ポリマーを、50%バッファーB(0.1%TFA含有アセトニトリル)中に溶解させた。ポリマーを、調製用逆相HPLC上で15%から45%バッファーB対0.1%TFA水溶液のステップグラジエントを用いて80分間で脱塩した。所望の物質(GRFNP43)を含むプールしたフラクションを凍らせて凍結乾燥し、乾燥粉体をオキシム化形成ライゲーションステップに用いた。
【0269】
E.分岐ポリマーGRFNP43によるGRFN1776およびGRFN1711のオキシム形成ライゲーション(オキシム化)
セグメントSEP−1:4およびセグメントSEP−1:1を、実施例2、3、4、および7において上記に記載されるように合成し、ただしレブリン酸の代わりにアミノオキシアセチル(AoA)部分をそれぞれのペプチドセグメント中のLys24およびLys126に、標準的カップリングプロトコルに従って付加した。従って、ペプチド−樹脂の集合後、側鎖Fmoc基が個々のペプチド樹脂から除去され、Bocアミノオキシ酢酸2mmolを、DMF中のDIC 2mmolおよびNHS 2mmolによるNHSエステル活性化を用いて樹脂に付加した。2つのペプチドを、HFを用いて脱保護および樹脂から切断し、C4逆相HPLCにより精製した。カルボニル化合物への暴露を回避するため、適切な予防策を取った。セグメントSEP−1:4およびGRFNP43を共に等モル比率で、0.1%TFA(トリフルオロ酢酸)を含む50%アセトニトリル水溶液中に溶解させた。溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に再溶解させ、調製用C4逆相HPLCカラムにロードした。ポリマー修飾ペプチドを、未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから、調製用グラジエント逆相HPLCにより分離した。所望のオキシム化産物SEP−1:4+GP43を含むフラクションを、ES−MSで同定し、プールした。
【0270】
SEP−1:1およびGRFNP43を共に、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解させた。溶液を凍らせて凍結乾燥した。乾燥粉末を、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液中に溶解させ、調製用グラジエントC4逆相HPLCカラムにロードした。ポリマー修飾ペプチドを、未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから、調製用逆相グラジエント溶離により分離した。所望のオキシム化産物SEP−1:1+GP43を含むフラクションを、ES−MSにより同定し、プールした。
【0271】
F.合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−B52の合成
SEP−1−B52(配列番号:2)を、以下の4つのポリペプチドセグメントから溶液中で合成した:
セグメントSEP:1:1+GP43(GRFN1711+GRFNP43、配列番号:2の残基1−32に対応)
APPRLICDSR VLERYILEAK EAEKOXITTGCA EH−チオエステル(Lys24は、(KOXにより示されるような)分岐ポリマーGRFNP43にオキシム結合されたAoAペンダント部分を有し、His32はDnp保護されている)
セグメントSEP−1:2(GRFN1712、配列番号:2の残基33−88に対応)
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW−チオエステル(Cys33はAcm保護されており、3つのTrp残基はホルミル保護されている)
セグメントSEP−1:3(GRFN1713、配列番号:2の残基89−116に対応)
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK−チオエステル(Cys89はAcm保護されており、His94はDnp保護されている)
セグメントSEP−1:4+GP43(GRFN1776+GRFNP43、配列番号:2の残基117−166に対応)
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR
GKLKLYTGEA CRTGDR−カルボキシレート(C末端システイン(すなわち、Cys161)は、ピコリル(pico)保護基を有し、Lysq126は、(KOXにより示されるような)分岐ポリマーGRFNP43にオキシム結合されたAoAペンダント部分を有している)
【0272】
付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、折りたたみおよび精製を、実施例1、2、3、4、および7において上記で記載されるように実施して完全長の折りたたまれたSEP−1−B52(配列番号:2)を作り、これを分析用(C4)逆相HPLC、ES−MS、および非還元性SDS−PAGEによりキャラクタリゼーションした。バイオアッセイを、他のSEP構成物について記載されるように実行した。
【0273】
実施例9
SEP−3−L42の効力研究
シトレート・バッファー(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)プラス0.25%ラット血清アルブミン(RSA)中でSEP−3−L42を再処方化し、正常な雄ラット(1群あたりラット5匹)に対し、0、1、5、または10μg/kgの用量で、週3回(tiw)1、3、および6日目に静脈内投与した。最後の注入の4日後(9日目)に血液試料を採取し、血液学的パラメーターについて分析した。これらの用量でのSEP−3−L42の最後の注入の4日後における赤血球(RBC)、ヘモグロビン(HGB)、ヘマトクリット(HCT)、および網状赤血球数(RET)の値には、対照群の値と比較した場合に、統計的に有意な差は全くなかった。
【0274】
実施例10
SEP−3−L42の薬物動態学的研究
シトレート・バッファー(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)プラス0.25%RSA、pH6.9、においてSEP−3−L42を再処方化し、正常な雄ラットに対し、5μg/kgの用量レベルで単一用量として静脈内投与した。投薬から0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144、168時間後に血液試料を採取した。血漿中SEP−3−L42濃度を、メーカーの指示に従い、抗EPO ELISAキット(R & D Systems, Human Erythiropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit #DEP00)により決定した。結果を図27に示する。
【0275】
図27に例示されるように、SEP−3−L42と比較して、SEP−1−B50は若干遅いクリアランスを示す。その循環半減期にもかかわらず、SEP−3−L42は、試験した用量での赤血球産生促進における統計的に有意な差を示さなかった。対照的に、SEP−1−B50は、同じ用量で赤血球産生を刺激した。このことは、薬物動態学的挙動および効力を含むインビボ生物学特性の微調整に、ポリマー構造を利用できることを例示している。
【0276】
実施例11
SEP−1−L30の効力研究
シトレート・バッファー(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)プラス0.25%RSA中でSEP−1−L30を再処方化し、正常な雄ラット(1群あたりラット5匹)に対し、0、1、5、25、または50μg/kgの用量で、週3回(tiw)1、3、および5日目に静脈内投与した。最後の注入の4および8日後(9および13日目)に血液試料を採取し、血液学的パラメーターについて分析した。対照群の値と比較した場合に、SEP−1−L30による処置後のどのような間隔においても、RBC、HGB、およびHCTの値に、統計的に有意な差は全くなかった。網状赤血球数は、25および50μsg/kgで処置したラットの場合に最後の注入から4日後(9日目)には、より高かった(対照群の値と比較した場合に、統計的に有意な差)。SEP−1−L30で処理したどの動物についても、血液学的パラメーターの他の差は、9日目または13日目には全く観察されなかった。[データは示してない]
【0277】
実施例12
SEP−1−L30の薬物動態学的研究
シトレート・バッファー(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)プラス0.25%RSA、pH6.9、においてSEP−1−L30を再処方化し、正常な雄ラットに対し、5または25μg/kgの用量レベルで単一用量として静脈内投与した。投薬から0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144、および168時間後に血液試料を採取した。SEP−3−L42の血漿中濃度を、メーカーの指示に従い、ELISAキット(R & D Systems, Human Erythiropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit #DEP00)により決定した。所定用量におけるどの時点においてもSEP−1−L30は全く検出できなかった。
【0278】
実施例13
SEP−1−B50の効力研究
無菌PBS(リン酸塩緩衝食塩水)プラス0.25%RSA中でSEP−1−B−50を再処方化し、正常な雄ラット(1群あたりラット5匹)に対し、0、1、5、25、または125μg/kgの用量で、週3回(tiw)1、3、および6日目に静脈内投与した。最後の注入の4、9および14日後(10、15および20日目)に血液試料を採取し、血液学的パラメーターについて分析した。データを表VIIIに示す。5、25および125μg/kgのSEP−1−B50を投与した動物については、最後の注入から4日後(10日目)に、増加したRBC、HGB、HCT、およびRETに用量関連応答が観察された(対照群の値と比較した場合に、統計的に有意な差)。これらの動物のRBC、HGB、およびHCTは、15日目の対照値よりも高いままであり、125μg/kgで処置した動物の場合に20日目(最後の注入から14日後)まで対照群の値と比較した場合に若干高く継続した。RET産生は、10日後には減少し、25および125μg/kg動物の場合に15および20日目は有意に低い値を示す。表VIII
SEP−1−B50の多重用量後の血液学所見
【表7】
【0279】
実施例14
SEP−1−B50の薬物動態学的研究
シトレート・バッファー(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)プラス0.25%RSA、pH6.9、においてSEP−1−B50を再処方化し、正常な雄ラットに対し、5または25μg/kgの用量レベルで単一用量として静脈内投与した。投薬から0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144、168時間後に血液試料を採取した。SEP−1−B50の血漿中濃度を、メーカーの指示に従い、ELISAキット(R & D Systems, Human Erythiropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit #DEP00)により決定した。排出半減期は、5および25μg/kg用量について、それぞれ9.7および9.9時間であると決定された。観察されたMRT(平均滞留時間)は、5および25μg/kg用量について、それぞれ13.9および14.4時間であった。SEP−1−B50の代表的な薬物動態学的側面を図27に示す。
【0280】
実施例15
SEP−1−B51の効力研究
SEP−1−B51を、2つの実験において正常な雄ラットに静脈内投与した。
【0281】
実験1:シトレート・バッファー(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)プラス0.25%RSA中でSEP−1−B51を再処方化し、正常な雄ラット(1群あたりラット5匹)に対し、0、1、5、または25μg/kgの用量で、週3回(tiw)1、3、および6日目に静脈内投与し、最後の注入の4、9および14日後(10、15および20日目)に血液学的パラメーター分析用に血液試料を採取した。データを下記の表IXに示す。SEP−1−B51の3回目にして最後の静脈内注入の4日後(10日目)、対照群の値と比較して、RBC、HGB、HCT、および絶対網状赤血球数(ART)における統計的に有意な増加が、25μg/kg SEP−1−B51を投与した動物について観察された。これらの動物についてのRBC値は、15日目には対照値より高いままであり、20日目には対照値と同程度であった。網状赤血球産生は、10日後に減少し、15日目には5および25μg/kg動物について有意により低い値が観察された。
表IX
SEP−1−B51の多重用量後の血液学所見
【表8】
【0282】
実験2:シトレート・バッファー(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)プラス0.25%ヒト血清アルブミン中でSEP−1−B51を再処方化し、雄ラット(1群あたりラット5匹)に対し、0、1、5、または25μg/kgの用量で、週3回(tiw)1、3、および5日目に静脈内投与し、最後の注入の2、4および6日後(7、9および11日目)に血液学的パラメーター分析用に血液試料を採取した。さらに、ヘマトクリットのみの測定用[充填赤血球量(PCV)として]の血液試料を残りの研究日(2、3、4、5、6、8、10、12、および13日目)に毎日採取した。データを表Xに示す。HCT(PCVまたは計算された)値は、5および25μg/kgを投与した動物の場合に、最初の注入から2日後(3日目)から有意に増加し、3回目にして最後の注入の6日後(11日目)まで継続した。RBCおよびHGBも、5および25μg/kgを投与した動物の場合に、測定した日(最初の投与の2、4、および6日後、7、9、および11日目)に有意に増加した。ARTは、25μg/kgの群の場合にのみ、最後の投与の2日および4日後(7および9日目)に有意に増加した。
表X
SEP−1−B51の多重用量後の血液学所見
【表9】
【0283】
追加のラット群を、SEP−1−B51の25μg/kgでの単一静脈内用量で処置し、血液学的パラメーターの分析のために、注入の48時間後に血液試料を採取した。ヘマトクリットのみの測定用(充填赤血球量として)の血液試料を、注射後、8、24、および72時間後、ならびに7日後(1、2、4、および8日目)に採取した。SEP−1−B51で静脈内的に処置したラットの場合のHCT、HGB、およびARTの値は、3日目(注入の2日後)に対照動物の値よりも高く(統計的に有意)、HCTも、これらの動物において4日目に有意に増加した。
【0284】
実施例16
SEP−1−B51についての赤血球増加および低酸素モデルにおける効力研究 それぞれ10匹の正常なマウスの群(媒介物対照、4つの用量レベルでCHO−細胞(「rhEPO」)中で産生した組換えグリコシル化ヒトエリスロポエチン、および4つの用量レベル、すなわち100mU/ngを想定した0.32、1、5、25μg/kg/用量、SEP−1−B51)を、模擬高高度室内で20日間、506.5mbに保った大気空気に1日あたり18時間曝した。シトレート・バッファープラス0.25%ヒト血清アルブミン中で処方化したrhEPOまたはSEP−1−B51を200μL−容積、低酸素後4日目に静脈注射(IV)した。2日後、各マウスに0.2μCiの59Feを腹腔内注射(i.p..)した。RBC−放射性鉄取込みは、3日後、心臓穿刺により採取した血液500μL中に存在する放射能量を測定することによって評価した。
【0285】
SEP−1−B51およびrhEPOの場合の72時間RBC−59Fe取込み(用量の%)により、5μg/kgまでの用量の増加に伴って増加した59Fe取込みにおける明確な用量関連応答が示され、前記用量以上で応答は頭打ちになる(25μg/kg)。従って、3つの最低用量レベルを、線形回帰を計算するために用いた。SEP−1−B51およびrhEPOの線形回帰分析を図28に示す。SEP−1−B51およびrhEPOの応答は本質的に同じであった。SEP−1−B51のrhEPOに対する「効力比」は、1.0035(0.6947〜1.4498の95%信頼区間)であり、このアッセイにおいて決定されたSEP−1−B51の効力は、100mU/ngであった(69〜145の95%信頼区間)。
【0286】
SEP−1−B51は、rhEPOのインビボ活性と同様の活性を示し、用量依存的に作用し、このモデルにおけるrhEPOの場合に典型的なネガティブフィードバック機構の誘発に起因するより高用量におけるプラトー応答が含まれる。このことは、SEP−1−B51分子の精密なユーザー定義グリコシル化部位に付着させられたポリマー構造が、rhEPOの糖鎖により付与されるインビボ活性を模倣することを例示している。
【0287】
実施例17
SEP−1−B51の薬物動態学的研究
シトレート・バッファープラス0.25%ヒト血清アルブミン、あるいはrhEPO(500U/kgに等価)中で処方化したSEP−1−B51を5μg/kgの単一用量で正常な雄ラット群に静脈内投薬し、この群を、投薬から5、30、60分、2、4、8、および24時間、さらに2、3、4、5、6、および7日後に採血した。血漿試料中のSEP−1−B51またはrhEPOの濃度を、メーカーの指示に従って、R&Dシステム部抗EPOELISAキット(R & D Systems, Human Erythropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit #DEP00)を用いたアッセイにより決定した。
【0288】
濃度の対数の最小二乗法分析を実行し、以下の表XIに記載の薬物動態学的パラメーターを得た。5μg/kgの単一静脈内投薬を受けた雄ラットにおけるSEP−1−B51の血漿中濃度における経時的変化は、半減期が10.5±0.5時間の単一指数薬物動態学的性質関数により説明できた。SEP−1−B51についての中央区画の分布容積(Vc)は、32.5±2.0mL/kgであった。クリアランス(CL)は2.15mL/時/kgで、平均滞留時間(MRT)15.1±0.7時間であった。比較すると、5μg/kgの静脈内投薬を受けた雄ラットにおけるrhEPOの血漿中濃度における変化は、α半減期が1.24±0.22時間でβ半減期が5.51±0.40時間の両側指数薬物動態学的性質関数を使って最もうまく説明された。rhEPOについてのVcは57.0±3.2mL/kgであった。CLは、16.0±0.5mL/時/kgで、SEP−1−B51の値より約8倍大きい。rhEPOの平均滞留時間(MRT)は、5.73±0.17時間で、SEP−1−B51の値より約3倍短い。
表XI
rhEPOと比較したSEP−1−B51の薬物動態学的パラメーター
【表10】
【0289】
SEP−1−B51およびrhEPOの血漿クリアランスは図29に示してある。これらのデ−タにより、グリコシル化組換えヒトEPOと比較してSEP−1−B51の循環半減期が有意に増加すること、さらに、この増加は、分子中の精密なユーザー定義部位に付着させられたポリマー構造に起因していることが示される。
【0290】
本発明は、その特定の実施形態に関して説明を行ってきたが、本発明はさらなる変形が可能であること、および本願は、本発明のどのような変更例、利用または改変をも対象として含み、さらに本発明が関連する技術内において公知の、または通例の実施方法の範囲に入るような、また上述の本質的特徴に適応し得るような本開示からの逸脱を含むことが理解されるであろう。
【0291】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1A】
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を調製するためのプロセスの概要を示す。
【図1B】
図1Aと同様な図である。
【図1C】
図1Aと同様な図である。
【図1D】
図1Aと同様な図である。
【図1E】
図1Aと同様な図である。
【図2A】
本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質を調製するためのプロセスの概要を示す。
【図2B】
図2Aと同様な図である。
【図2C】
図2Aと同様な図である。
【図3A】
3つ以上の非重複ペプチドセグメント、すなわち少なくとも1つのセグメントが最終的な完全長化学的ライゲーション産物に対応する中間セグメントである、化学的ライゲーションを伴うマルチセグメントライゲーションのためのプロセスの概要を示す。
【図3B】
図3Aと同様な図である。
【図4A】
天然型化学的ライゲーションおよび結果として得られる側鎖チオールの化学修飾を例示する。
【図4B】
図4Aと同様な図である。
【図4C】
図4Aと同様な図である。
【図5A】
本発明の水溶性ポリマーU−B−ポリマー−J*の分岐核(B)および一意的化学選択的官能基(U)を生成させるための固相プロセスを示す。
【図5B】
図5Aと同様な図である。
【図6A】
U−B核へのその後の付着のための本発明の好ましい実質的に非抗原性水溶性ポリアミドポリマー−J*成分を生成するための固相プロセスを示す。
【図6B】
図6Aと同様な図である。
【図6C】
図6Aと同様な図である。
【図6D】
図6Aと同様な図である。
【図7】
U−B成分をポリマー−J*成分にカップリングして式U−B−ポリマー−J*の本発明の好ましい合成ポリマー構成物を生成するためのプロセスを示す。
【図8】
本発明の赤血球産生刺激合成タンパク質のライゲーションおよび産生に使用可能なペプチドセグメントへの水溶性ポリマーの精密付着のための代替経路を示す。
【図9】
本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質調製の全体的プロセスを例示する。
【図10】
好ましいタイプの合成赤血球産生刺激タンパク質の基本構造を示す。pPEG=「精密PEG」
【図11】
再配置されたアミノおよびカルボキシ末端を有する円形に並べ替えられたSEP類似体の一般構造を示す。
【図12A】
好ましい水溶性ポリマー、およびその種々の直鎖および分岐構成物の構造を示す。
【図12B】
図12Aと同様な図である。
【図12C】
図12Aと同様な図である。
【図12D】
図12Aと同様な図である。
【図13】
分岐鎖pPEGポリマーの形成を概略的に示す。
【図14A】
SEP−1−L30と呼ばれる合成サイトカインの合成を示し、これは実施例2において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図14B】
図14Aと同様な図である。
【図14C】
図14Aと同様な図である。
【図14D】
図14Aと同様な図である。
【図14E】
図14Aと同様な図である。
【図15】
SEP−1−L30と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例2において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図16】
SEP−1−L26と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例3において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図17A】
SEP−1−B50と呼ばれる合成サイトカインに付着させられる好ましい分岐鎖水溶性ポリマーの形成を概略的に示し、これは実施例4において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図17B】
図17Aと同様な図である。
【図18】
SEP−1−B50と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例4において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図19A】
SEP−3−L42と呼ばれる合成サイトカインの合成を示し、これは実施例5において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図19B】
図19Aと同様な図である。
【図20】
SEP−3−L42と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例5において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図21A】
実施例7において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体であるSEP−1−B51と呼ばれる合成サイトカインに付着させるための好ましい水溶性ポリマーの合成を示す。
【図21B】
図21Aと同様な図である。
【図22】
SEP−1−B51と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例7において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図23A】
実施例8において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体であるSEP−1−B52と呼ばれる合成サイトカインに付着させるための好ましい水溶性ポリマーの合成を示す。
【図23B】
図23Aと同様な図である。
【図24】
SEP−1−B52と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例8において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図25】
実施例2〜5および7〜8において説明されるように調製されたヒトEPOの精密ポリマー修飾合成類似体についての代表的分析データを示す。示されるように、代表的な等電点ゲル(IEF)および非還元SDS−PAGEゲルは、折りたたまれ精製されたSEP−1−B51の相対的なモノマー分子量を明示する。
【図26】
SEP化合物SEP−0、SEP−1−L26、SEP−1−L30、SEP−1−B50、SEP−1−B51およびSEP−3−L42の因子依存性細胞系のインビトロ活性を示す。
【図27】
SEP−3−L42およびSEP−1−B50のナノグラム/ミリリットル(ng/ml)で表した血漿中濃度を時間(hours)で表した期間と比較したときの代表的な薬物動態学的側面を示す。
【図28】
SEP−1−B51および低酸素ラットモデルにおけるCHO−細胞(「rhEPO」)中で作られた組換えグリコシル化ヒトエリスロポエチンについて、72時間赤血球(RBC)−59Fe取込み(投与量の%としての)により測定したインビボ活性の線形回帰分析を示す。
【図29】
各化合物について5μg/kgの単一IV投与量に続いて、SEP−1−B51およびrhEPOのng/mlで表した血漿中濃度を時間(hours)で表した期間と比較したときのラットにおけるクリアランスについての代表的な薬物動態学的側面を示す。
【図30】
円形に並べ替えられたポリマー修飾SEP構成物を示す。
Claims (77)
- 1つ以上の水溶性ポリマーが付着している合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 赤血球産生を増加するインビボ生物活性を有する、請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記タンパク質が、リボソーム特定(ribosomally specified)エリスロポエチンのアミノ酸配列および1つ以上の化学的ライゲーション部位により共有結合された1つ以上の非重複ペプチドセグメントを有するポリペプチド鎖を含む、請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 1つ以上の前記水溶性ポリマーが、前記リボソーム特定エリスロポエチンのグリコシル化部位に対応する部位において前記ポリペプチド鎖に付着している、請求項3に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記リボソーム特定エリスロポエチンが、ヒト型である、請求項3に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記リボソーム特定エリスロポエチン糖タンパク質が、非天然である、請求項3に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 非天然の、前記リボソーム特定エリスロポエチンが、1つ以上の非天然グリコシル化部位を有する、請求項6に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記水溶性ポリマーが、前記リボソーム特定エリスロポエチンのグリコシル化部位に対応する1つ以上の部位において、前記ポリペプチド鎖に排他的に付着している、請求項2に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 1つ以上の前記水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシドまたはそれらの誘導体を含む反復単位を含む、請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記ポリアルキレンオキシドおよびポリアミドアルキレンオキシドが、式−(CH2−CH2−O)−のエチレンオキシド反復単位を含む、請求項9に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 1つ以上の前記水溶性ポリマーが、分岐状である、請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 1つ以上の前記水溶性ポリマーが、生理学的条件下で負の実効電荷を有する、請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、3〜7に等電点を有する、請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記水溶性ポリマーが、単分散である、請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、単分散である、請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、25kDa以上のモノマー分子量を有する、請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、40kDa以上のモノマー分子量を有する、請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、50kDa以上のモノマー分子量を有する、請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、60kDa以上のモノマー分子量を有する、請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、70kDa以上のモノマー分子量を有する、請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記ポリペプチド鎖が、1つ以上の不規則アミノ酸を含む、請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記不規則アミノ酸、は非天然側鎖を含む、請求項21に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記不規則アミノ酸が、擬似アミノ酸を含む、請求項21に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記擬似アミノ酸が、擬似グルタミン酸塩である、請求項23に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記非天然側鎖が、水溶性ポリマーに共有結合している、請求項22に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質・
- 前記水溶性ポリマーが、化学的ライゲーションにより形成される結合を介して前記側鎖に共有結合している、請求項25に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 化学的ライゲーションにより形成される前記結合が、アミド、オキシム、ヒドラゾン、チアゾリジン、オキサゾリジンおよびチオエステルからなる群から選ばれる、請求項26に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 1つ以上の前記化学的ライゲーション部位が、アミド結合を含む、請求項3に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記水溶性ポリマーが、前記ポリペプチド鎖の化学的ライゲーション部位におけるアミノ酸の側鎖を介して前記ポリペプチド鎖に付着している、請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- SEP−1およびSEP−3からなる群から選ばれる合成赤血球産生刺激タンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- SEP−0、SEP−1およびSEP−3、ならびにそれらの類似体からなる群から選ばれる合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 前記類似体が、SEP−1−L26、SEP−1−L30、SEP−1−B50、SEP−1−B51、およびSEP−1−B52からなる群から選ばれる、請求項31に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
- 請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質または薬学的に許容できるその塩を含む薬剤組成物。
- バッファー、キャリアタンパク質、アミノ酸、界面活性剤、脂質、水溶性ポリマーおよび保存剤からなる群から選ばれる1つ以上の賦形剤を含む、請求項33に記載の薬剤組成物。
- 前記合成赤血球産生刺激タンパク質以外の1つ以上の別の生物活性薬剤を含む、請求項33に記載の薬剤組成物。
- 哺乳動物のヘマトクリットを増加させる方法であって、前記哺乳動物に有効量の請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質を投与し、それにより前記哺乳動物におけるヘマトクリットを増加させる方法。
- 哺乳動物における赤血球産生を増加させる方法であって、前記哺乳動物に有効量の請求項1に記載のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を投与し、それにより前記哺乳動物における赤血球産生を増加させる方法。
- 哺乳動物におけるヘモグロビン産生を増加させる方法であって、前記哺乳動物に有効量の請求項1に記載のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を投与し、それにより前記哺乳動物におけるヘモグロビン産生を増加させる方法。
- 哺乳動物における網状赤血球数を増加させる方法であって、前記哺乳動物に有効量の請求項1に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質を投与し、それにより前記哺乳動物における網状赤血球数を増加させる、方法。
- 合成赤血球産生刺激タンパク質を含むポリペプチド鎖を産生する方法であって、前記合成赤血球産生刺激タンパク質のポリペプチド鎖の非重複アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合し、それにより前記合成赤血球産生刺激タンパク質を含むポリペプチド鎖を産生する方法。
- 前記ポリペプチド鎖を折りたたみ、それにより生物活性のある合成赤血球産生刺激タンパク質を産生する、請求項40に記載の方法。
- 1つ以上の前記ペプチドセグメントが、部分的に保護されている、前記請求項40に記載の方法。
- 1つ以上の前記ペプチドセグメントが、未保護である、請求項40に記載の方法。
- 1つ以上の前記ペプチドセグメントが、それに付着している水溶性ポリマーを含む、請求項40に記載の方法。
- 前記化学的ライゲーションが、天然型化学的ライゲーション、拡張天然型化学的ライゲーション、擬似天然型化学的ライゲーション、オキシム形成化学的ライゲーション、ヒドラゾン形成化学的ライゲーション、オキサゾリジン形成化学的ライゲーション、チアゾリジン形成化学的ライゲーションおよびチオエステル形成化学的ライゲーションから選ばれる化学選択的ライゲーション化学を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記ポリペプチド鎖が、それに付着している1つ以上の水溶性ポリマーを含む、請求項40に記載の方法。
- 前記ポリペプチド鎖が、リボソーム特定エリスロポエチンのアミノ酸配列を含む、請求項40に記載の方法。
- 1つ以上の前記水溶性ポリマーが、前記リボソーム特定エリスロポエチンのグリコシル化部位に対応する部位において前記ポリペプチド鎖に付着している、請求項46に記載の方法。
- 前記リボソーム特定エリスロポエチン糖タンパク質が、組換えにより産生される、請求項48に記載の方法。
- 前記リボソーム特定エリスロポエチン糖タンパク質が、非天然である、請求項48に記載の方法。
- 前記非天然のリボソーム特定エリスロポエチン糖タンパク質が、1つ以上の非天然グリコシル化部位を有する、請求項50に記載の方法。
- 前記リボソーム特定エリスロポエチンが、ヒト型である、前記請求項47に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーが、前記リボソーム特定エリスロポエチンのグリコシル化部位に対応する部位において前記ポリペプチド鎖に排他的に付着している、請求項48に記載の方法。
- 1つ以上の前記水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシドまたはそれらの誘導体を含む反復単位を含む、請求項46に記載の方法。
- 前記ポリアルキレンオキシドおよびポリアミドアルキレンオキシドが、式−(CH2−CH2−O)−のエチレンオキシド反復単位を含む、請求項54に記載の方法。
- 1つ以上の前記水溶性ポリマーが、分岐状である、請求項46に記載の方法。
- 1つ以上の前記水溶性ポリマーが、生理学的条件下で負の実効電荷を有する、請求項46に記載の方法。
- 前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、3〜7に等電点を有する、請求項41に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーが、単分散(mono−disperse)である、請求項46に記載の方法。
- 前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、単分散である、前記請求項40に記載の方法。
- 前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、25kDa以上のモノマー分子量を有する、請求項46に記載の方法。
- 前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、40kDa以上のモノマー分子量を有する、請求項46に記載の方法。
- 前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、50kDa以上のモノマー分子量を有する、前記請求項46に記載の方法。
- 前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、60kDa以上のモノマー分子量を有する、請求項46に記載の方法。
- 前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、70kDa以上のモノマー分子量を有する、請求項46に記載の方法。
- 前記ポリペプチド鎖が、1つ以上の不規則(irregular)アミノ酸を含む、前記請求項40に記載の方法。
- 前記不規則アミノ酸が、非天然側鎖を含む、前記請求項66に記載の方法。
- 前記不規則アミノ酸が、擬似アミノ酸を含む、請求項67に記載の方法。
- 前記ポリペプチド鎖が、アミド、オキシム、ヒドラゾン、チアゾリジン、オキサゾリジンおよびチオエステルからなる群から選ばれる結合を有する化学的ライゲーション部位を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーが、非天然側鎖を有する前記ポリペプチド鎖のアミノ酸に付着している、請求項46に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーが、化学的ライゲーショにより形成される結合を介して前記側鎖に共有結合している、請求項46の方法。
- 化学的ライゲーションにより形成される前記結合が、アミド、オキシム、ヒドラゾン、チアゾリジン、オキサゾリジンおよびチオエステルからなる群から選ばれる、前記請求項71に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーが、前記ポリペプチド鎖の化学的ライゲーション部位におけるアミノ酸の側鎖を介して前記ポリペプチド鎖に付着している、請求項46に記載の方法。
- 前記生物活性合成赤血球産生刺激タンパク質が、赤血球産生を増加するインビボ生物活性を有する、請求項41に記載の方法。
- 前記ポリペプチド鎖が、SEP−1およびSEP−3からなる群から選ばれる合成赤血球産生刺激タンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項に記載40の方法。
- 合成赤血球産生刺激タンパク質が、SEP−0、SEP−1およびSEP−3ならびにそれらの類似体からなる群から選ばれる、請求項40に記載の方法。
- 前記類似体が、SEP−1−L26、SEP−1−L30、SEP−1−B50、SEP−1−B51、およびSEP−1−B52からなる群から選ばれる、前記請求項76に記載の方法。
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