MXPA03001451A - Ligacion quimica pseudo nativa. - Google Patents

Abstract

La presente invencion concierne a metodos y composiciones para extender la tecnica de la ligacion quimica nativa para permitir la ligacion de una variedad mas amplia de peptidos, polipeptidos, otros polimeros y otras moleculas por medio de un enlace amida. La invencion proporciona ademas metodos y usos para tales proteinas y proteinas derivadas. La invencion es particularmente apropiada para usarse en la sintesis de proteinas bioactivas sinteticas, opcionalmente modificadas por polimero, y de composiciones farmaceuticas que contienen tales proteinas.

Description

LIGACIÓN QUÍMICA PSEUDO NATIVA Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos y composiciones para extender la técnica de ligación química activa. Para permitir la ligación de un intervalo más amplio de péptidos, polipéptidos , otros polímeros y otras moléculas por medio de un enlace amida. La invención proporciona además métodos y usos de tales proteínas y proteínas derivadas.

Antecedentes de la Invención Durante los últimos 30 años, la atención médica ha ¦ girado crecientemente hacia la posibilidad de usar proteínas producidas naturalmente como fármacos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades . Las técnicas del ADN recombinante se han vuelto el método primario para la producción comercial de muchos polipéptidos y proteínas debido a las grandes cantidades que se pueden producir en bacterias y otras células hospedadoras . La producción recombinante de proteínas involucra la transfección o transformación de células hospedadoras con el ADN que codifica la proteína exógena deseada y hace crecer las células bajo condiciones que favorezcan la expresión de la proteína recombinante. La E. coli y las levaduras se favorecen como hospedadores debido a que se pueden hacer para Ref: 144207 producir proteínas recombinantes a concentraciones altas (ver patente de E.U.A. 5,756,672 (Builder et al.). Se han concedido diversas patentes de E.U.A. con respecto a la expresión general bacteriana de las proteínas codificas por ADN recombinante (ver por ejemplo, patentes de E.U.A. 4,565,785; 4,673,641; 4,738,921; 4,795,706; 4,710,473) . Desafortunadamente, el uso de técnicas de ADN recombinante no ha sido universalmente exitoso. Bajo algunas condiciones, ciertas proteínas heterólogas expresadas en grandes cantidades a partir de hospedadores bacterianos, se precipitan dentro de las células en agregados densos, reconocidos como puntos brillantes visibles dentro de la envolvente de las células bajo un microscopio de contraste de fases. Estos agregados de proteínas precipitadas se refieren como "cuerpos refráctales" y pueden constituir una porción importante de la proteína total de célula (Brems et al., Biochemistry (1985)24: 7662. La recuperación de la proteína de estos cuerpos ha presentado diversos problemas, tales como la forma de separar la proteína alojada dentro de la célula a partir del material celular y las proteínas que lo alojan, y la forma de recuperar la proteína de cuerpo de inclusión en una forma biológicamente activa. Para artículos de revisión general sobre cuerpos refráctiles, ver Marston, supra; Mtraki and King, Bio/Technology, 7: 690 (1989); Marston and Hartley, Methods in Enzymol . , 182: 264-276 (1990); Wetzel, "Protein Aggregation In Vivo: Bacterial Inclusión Bodies ' and Mammalian Amyloid," en Stability of Protein Pharmaceuticals; In Vivo Path ays of Degradation and Strategies for Protein Stabilization, Ahern and anning (eds.) (Plenum Press, 1991) y Wetzel, "En anced Folding and Stabilization of Proteins by Suppression of Aggregation In Vitro and In Vivo," in Protein Engineering—A Practical Approach, ess, A.R. et al. (eds.) (IRL Press at Oxford University Press, Oxford, 1991). Existe por lo tanto una necesidad para una forma alternativa de producción de proteínas bioactivas . Una alternativa para la producción recombinante de proteínas involucra el uso de los principios de la química orgánica para sintetizar proteínas. Los métodos existentes par la síntesis química de proteínas incluyen síntesis de fase sólida por etapas y condensación de fragmentos ya sea en solución o en fase sólida. La síntesis clásica de fase sólida por etapas de Merrifield, involucra el ligado covalente de un aminoácido que corresponde al aminoácido en la terminal carboxi, de la cadena de péptidos deseada a un soporte sólido, extender la cadena de polipéptidos hacia la terminal amino por un acoplamiento por etapas de derivados activados de aminoácidos que tienen los grupos carboxilo activados . Después de la terminación del ensamble de la cadena de péptidos enlazada a fase sólida completamente protegida, la colocación covalente de fase sólida del péptido se desdobla por química adecuada y los grupos protectores se separan para dar el polipéptido de producto. Existen desafortunadamente desventajas múltiples al método de síntesis de fase sólida por etapas, incluyendo la formación de subproductos enlazados en fase sólida, que resultan de la reacción incompleta en las etapas de acoplamiento y desprotección en cada ciclo. Entre más extensa sea la cadena de péptidos, más desafiante es obtener productos bien definidos de alta pureza. Las síntesis de proteínas y de grandes polipéptidos por esta vía es una tarea laboriosa y consumidora de tiempo. El enfoque de condensación de fragmentos en fase sólida (también conocido como condensación de segmentos) se diseñó para superar las dificultades en la obtención de polipéptidos largos por medio de un método de síntesis por etapa de fase sólida. El método de condensación de segmentos involucra la preparación de diversos segmentos de péptidos por el método de etapas en fase sólida, seguido por el desdoblamiento desde la fase sólida y la purificación de estos segmentos ampliamente protegidos. Los segmentos protegidos se condensan uno por uno con el primer segmento, que se enlaza a la fase sólida. Sin embargo a menudo, se encuentran dificultades técnicas en muchas de las etapas de la condensación de segmentos de fase sólida. Ver E. Atherton, et al., "Solid Phase Fragment Condensation -The Problems," en Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis 11-25 (R. Epton, et al. 1990) . Por ejemplo el uso de grupos protectores en los segmentos para bloquear las reacciones indeseables de ligación, puede resultar frecuentemente en los segmentos protegidos escasamente solubles, interfiriendo en la activación eficiente del grupo carboxilo. La solubilidad limitada de los segmentos protegidos también puede interferir con la purificación de los segmentos protegidos. Ver K. Akaji et al., Chem. Pharm. Bull . (Tokio) 33:184-102(1985). Los segmentos protegidos son difíciles de caracterizar con respecto a la pureza, estructura covalente, y no pueden ir a una EMER (espectrometría de masas por electrorociado) analítica de alta resolución (con base en la carga) . La racemización del residuo en la terminal C de cada segmento activado de péptido también es un problema, excepto si la ligación se lleva a cabo en los residuos de glicina. Además, el desdoblamiento del polipéptido enlazado en fase sólida, completamente ensamblado de la fase sólida, y la eliminación de los grupos protectores, puede requerir frecuentemente procedimientos químicos severos y tiempos de reacción prolongados que resultan en la degradación del polipéptido completamente ensamblado. La condensación de segmentos se puede hacer en solución más que en fase sólida. Ver H. Muramatsu et al., Biochem. And Biophys. Res. Commn. 203 (2) : 1131-1139 (1994). Sin embargo, la condensación del segmento en solución, requiere la purificación de los segmentos previo a la ligación, así como el uso de grupos- protectores en un rango de grupos funcionales de cadena lateral diferentes, para evitar reacciones laterales indeseables múltiples. Además, la ligación en solución no permite una purificación fácil y etapas de lavado que resulten de ligaciones de fase sólida. Además, se aumentan las limitaciones con respecto a la solubilidad de los segmentos de péptidos protegidos y los productos de reacción intermediarios de péptidos protegidos.

La ligación química de los segmentos de péptidos se ha explorado con objeto de superar los problemas de solubilidad que se encuentran f ecuentemente con péptidos máximamente protegidos. La ligación química involucra la formación de una ligadura covalente selectiva, entre un primer componente químico y un segundo componente químico. Los grupos funcionales mutuamente reactivos, únicos, presentes en el primero y segundo componentes, se pueden usar para hacer la reacción de ligación quimioselectiva . Por ejemplo, la ligación química de los péptidos y polipéptidos involucra la reacción quimioselectiva de segmentos de péptidos o polipéptidos que soportan residuos de aminoácidos en la terminal N y en la terminal C, mutuamente reactivos, únicos. Se han utilizado diversas químicas diferentes para este propósito, ejemplos de las cuales incluyen la ligación química nativa (Dawson, et al., Science (1994) 266:776-779; Kent, et al., WO 96/34878; Kent , et al., WO 98/28434), ligación química formadora de oximas (Rose, et al., J. Amer. Chem. Soc. (1994) 116:30-34), ligación formadora de tioéster (Schnólzer, et al., Science (1992) 256:221-225), ligación formadora de tioéter (Englebretsen, et al., Tet . Letts. (1995) 36 (48) : 8871-8874) , ligación formadora de hidrazona (Gaertner, et al., Bioconj . Chem. (1994) 5 (4) :333-338) , y ligación formadora de tiazolidina y ligación formadora de oxazolidina (Zhang, et al., Proc . Nati. Acad. Sci . (1998) 95 (16) : 9184-9189; Tam et al., WO 95/00846; Patente de E.U.A. No. 5,589,356) o por otros métodos (Yan, L.Z. and Dawson, P.E., "Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization, " J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 526-533, que se incorporan en la presente como referencia; Gieselnan et al., Org. Lett. 2001 3 (9) : 1331-133 ; Saxon, E. et al., "Traceless" Staudinger Ligation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds . Org. Lett. 2000, 2, 2141-2143). De estos métodos, solamente el enfoque de ligación química nativa produce un producto de ligación que tiene un enlace amida nativo (esto es, péptido) en el sitio de ligación. La metodología de ligación química nativa original (Dawson et al., supra; y WO 96/34878) ha probado una metodología robusta para la generación de un enlace amida nativo en el sitio de ligación. La ligación química nativa involucra una reacción quimioselectiva entre un primer segmento de péptido o polipeptido, que tienen una porción en la terminal C a-carboxitioéster, y un segundo péptido o polipéptido que tiene un residuo de cisteína en la terminal N. Una reacción de intercambio de tioles produce un intermediario inicial ligado al tioéster, que se reconfigura espontáneamente para dar un enlace amida nativo en el sitio de ligación mientras que se regenera el tiol de cadena lateral de la cisteina. El inconveniente principal del enfoque de ligación química nativo original, es que requiere una cisteína en la terminal N, esto es, solamente permite la unión de segmentos de p ptidos y polipéptidos que poseen una cisteína en la terminal N. A pesar de este inconveniente, se ha reportado la ligación química nativa de péptidos con aminoácidos en la terminal N diferentes a la cisteína (W098/28434) . En este enfoque, la ligación se lleva a cabo usando un primer segmento de péptido o polipéptido que tiene un a-carboxitioéster en la terminal C y un segundo segmento de péptido o polipéptido que tiene un grupo en la terminal N, N- (tiol-auxiliar substituido) representado por la fórmula HS-CH2-CH2-0-NH- [péptido] . Después de la ligación, el grupo N- [auxiliar substituido en tiol] se separa por el desdoblamiento del grupo auxiliar HS-CH2-CH2-0- para generar un enlace amida nativo en el sitio de ligación. Una limitación de este método es que el uso de un grupo mercaptoetoxi auxiliar, pueden conducir exitosamente a la formación de un enlace de amida solamente en el residuo de glicina. Esto produce un producto de ligación que con el desdoblamiento, genera un residuo de glicina en la posición del aminoácido N-substituido en el segundo segmento de péptido o polipéptido. Como tal, esta modalidad del método solamente es adecuada si se desea que el producto de ligación de la reacción contenga un residuo de glicina en esta posición, y en cualquier caso puede ser problemático con respecto a los rendimientos de ligación, estabilidad de los precursores y la capacidad de separar el grupo auxiliar ligado en O. Aunque se pueden usar otros grupos auxiliares, por ejemplo, HSCH2-CH2NH- [péptido] , sin limitar la reacción a la ligación en un residuo de glicina, tales grupos auxiliares no se pueden separar del producto ligado. De esta manera, lo que se necesita es un sistema de ligación química robusto y ampliamente aplicable, que extienda la ligación química nativa a una amplia variedad de residuos diferentes de aminoácidos, péptidos, polipéptidos, polímeros y otras moléculas por medio de un grupo auxiliar que contiene tiol que se separa fácilmente, efectivo y que une tales moléculas junto con un enlace amida nativo en el sitio de ligación. La presente invención atiende estas y otras necesidades .

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 ilustra las reacciones globales de la ligación química pseudo nativa. La figura 2 ilustra el proceso global de preparación de proteínas sintéticas bioactivas de la presente invención. La figura 3 detalla la estructura básica de un tipo preferido de proteínas estimuladoras de la eritropoyesis sintética. La figura 4 muestra la estructura general de análogos SEP permutados circularmente que no tienen una terminación amino o carboxi . Los sitios de colocación de pPEG ("PEG de precisión" como se describe en la presente) , se posicionan iguales con relación a los análogos SEP. Los análogos SEP se circularizan por una ligadura de oxima entre las nuevas posiciones en la terminal N/C tal como P126C y A125X. El peso molecular total de los análogos SEP está en el rango de alrededor de 50-80 kDa, dependiendo el pPEG utilizado para la modificación de un análogo dado, con el pPEG mediado por el P hidrodinámico que se estima que es superior a alrededor de 100 kDa. La figura 5 muestra la estructura básica de las proteínas sintéticas bioactivas de GCSF. En la figura, "J" designa un residuo no natural codificado que tiene una cadena de un lado hidrofóbico. La figura 6 muestra la estructura de los análogos sintéticos preferidos RA TES . En la figura, NNY = nonanoilo, X = un aminoácido no natural codificado que tiene- una cadena lateral hidrofóbica, pPEG y PA = ácido graso. La figura 7 detalla esquemáticamente la formación de un polímero pPEG'de cadena ramificada.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a métodos y composiciones para extender la técnica de ligación química nativa, para permitir la ligación de un rango más amplio de péptidos, polipéptidos , otros polímeros y otras moléculas por medio de un enlace amida. La invención proporciona además métodos y usos para tales proteínas y proteínas derivadas. La invención es particularmente adecuada para el uso en la síntesis de proteínas bioactivas sintéticas opcionalmente modificadas con polímero, y de composiciones farmacéuticas que contienen tales proteínas. En detalle, la invención proporciona una proteína sintética (especialmente una proteína que tiene un monómero de peso molecular superior a alrededor de 25 kDa) que contiene un residuo de pseudo aminoácidos cuya cadena lateral tiene la fórmula: -S- Raa, en donde Raa es una porción terminal opcionalmente substituida de una cadena lateral de aminoácido especificada en el ribosoma, o un análogo de la porción terminal de una cadena lateral de aminoácido especificada en el ribosoma. La invención proporciona particularmente la modalidad de tal proteína sintética, en donde la proteína tiene una actividad biológica poseída por una proteína bioactiva que se produce por ribosomas . La invención se refiere además a tales proteínas sintéticas en donde se enlazan una pluralidad de residuos de aminoácidos de la proteína a los residuos aminoácidos adyacentes por un enlace amida, y tales proteínas sintéticas en donde una pluralidad de residuos de aminoácidos en donde al menos uno de tales residuos de aminoácidos se enlaza a un residuo de aminoácido adyacente por un enlace que no es de amida (por ejemplo, un enlace de tioéster, un enlace de tioéter y un enlace de oxima) . La invención se refiere además a tales proteínas sintéticas en donde el residuo de pseudo aminoácido es un residuo de aminoácidos en la configuración D, o es un residuo de aminoácidos en la configuración L, o en donde tales proteínas sintéticas contienen ambos residuos de pseudo aminoácidos en la configuración D y residuos de pseudo aminoácidos en la configuración L. La invención se refiere además a tales proteínas sintéticas, en donde el residuo de pseudo aminoácido se selecciona del grupo que consiste de pseudo-arginina, pseudo-asparagina, pseudo-aspartato , pseudo-dopamina, pseudo-glutamato, pseudo-glutamina, pseudo-histidina, pseudo-isoleucina, pseudo-leucina, pseudo-lisina, pseudo-metionina, pseudo-fenialanina, pseudo-serina, pseudo-treonina, pseudo-triptofano, pseudo-tirosina y pseudo-valina. La invención se refiere además a tales proteínas sintéticas, en donde la proteína bioactiva especificada ribosomalmente es una proteína de mamífero (por ejemplo, un humano, simio, bovino, murino, porcino, ovino, o proteína de equino) . La invención se refiere además a tales proteínas sintéticas en donde la proteína tiene una bioactividad seleccionada de un receptor de proteína o fragmento del mismo, de un ligando receptor de proteína o fragmento del mismo, o de una citocina (especialmente en donde la citocina se selecciona del grupo que consiste de una interleucina, una linfocina, una proteína RANTES, una proteína estimuladora de la eritropoyesis , factor de necrosis de tumor (TNF) , un interferón, factores de crecimiento y una hormona de péptido sencilla) . La invención se refiere además a proteínas sintéticas SEP-0, SEP-1 y SEP-3. La invención se refiere además a todas las proteínas sintéticas tales, en donde uno o más de sus residuos de aminoácido se modifican por uno o más aductos de polímero, y particularmente en donde la proteína sintética comprende uno o más residuos de aminoácido que se modifican por uno o más aductos de polímero en los residuos de aminoácido, que corresponden a al menos uno de los sitios de la glicosilación de una proteína bioactiva codificada por ribosomas . La invención también proporciona una composición farmacéutica moleculármente homogénea, que comprende una proteína sintética, en donde la proteína posee una actividad biológica que imita una actividad biológica asociada con una proteína mamífera bioactiva especificada por ribosomas, y tiene un peso molecular de monómeros superior a alrededor de 25 kDa, y contiene un residuo de pseudo aminoácido cuya cadena lateral tiene la fórmula -S-Raa, en donde Raa se selecciona del grupo que consiste de una porción terminal opcionalmente sustituida de una cadena lateral de aminoácidos especificada por ribosoma o un análogo del mismo. La invención también proporciona un método de tratamiento de una enfermedad o condición humana, que comprende administrar a un individuo que necesita de tal tratamiento, una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende una o más composiciones farmacéuticas molecularmente homogéneas, cada una comprende una proteína sintética, en donde la proteína sintética tiene un peso molecular de monómeros superior a alrededor de 25 kDa, y contienen un residuo de pseudo aminoácido cuya cadena lateral tiene la fórmula -S-Raa, en donde Raa se selecciona del grupo que consiste de una porción terminal opcionalmente sustituida de una cadena lateral de aminoácido que se especifica por ribosomas, o un análogo del mismo; la proteína sintética posee una actividad biológica que imita una actividad biológica de un receptor de proteina humana bioactivo especificado por ribosomas o un fragmento del mismo, un ligando de un receptor de proteínas o un fragmento del mismo o una citocina. La invención también proporciona un método para la síntesis de un polipéptido deseado, y el polipéptido deseado hecho a través de tal método, en donde el polipéptido deseado tiene la fórmula: aa-NH2-Q~a ¾- y-W-a cooH en donde Q y W denotan cada uno la presencia opcional de uno o más residuos adicionales de aminoácidos, aa^^ denota el residuo de aminoácido en la terminal N del polipéptido; aax y aaY denotan residuos internos adyacentes de aminoácidos que tienen las cadenas laterales x e y respectivamente y aaCooH denota el residuo de aminoácido en la terminal C del polipéptido; el método comprende: (A) Ligar un primer péptido que tiene la fórmula: aa^-aax-C0SR, en donde R es cualquier grupo compatible con el grupo tioéster, incluyendo pero no limitado a los grupos arilo, bencilo, y alquilo, a un segundo péptido que tiene la fórmula: Cys-W-aaCooH con lo cual se forma el polipéptido: a NH2-Q- ax-Cys-W-aacooH; y (B) Incubar el polipéptido en presencia de un reactivo Raa-X/ en donde Raa es un grupo cuya estructura imita la porción terminal de la cadena lateral del residuo de aminoácido aay y X es un buen grupo de partida (especialmente un halógeno tal como F, I, o Br) ; la incubación está bajo condiciones suficientes para formar el polipéptido deseado. La invención proporciona además la modalidad de tal método y polipéptido en donde el residuo de aminoácido aaY se selecciona del grupo que consiste de pseudo-arginina; pseudo-aspáragina; pseudo-aspartato; pseudo-dopamina; pseudo-glutamato; pseudo-glutamina; pseudo-histidina, pseudo-isoleucina; pseudo-leucina; pseudo-lisina; pseudo-metionina; pseudo-fenialanina; pseudo-serina; pseudo-treonina; pseudo-triptofano; pseudo-tirosina; y pseudo-valina .

Descripción de las Modalidades Preferidas La presente invención se refiere a métodos y composiciones para extender la técnica de ligación química nativa para permitir la ligación de un rango más amplio de péptidos, polipéptidos , otros polímeros y otras moléculas por medio de un enlace amida, facilitando asi la síntesis química de tales moléculas. La invención proporciona además métodos y usos para tales proteínas y proteínas derivadas . La invención es particularmente adecuada para el uso en la síntesis de proteínas bioactivas sintéticas opcionalmente modificadas con polímero, que tienen preferiblemente un peso molecular de monómeros superior a alrededor de 25 kDa, y de composiciones farmacéuticas que contienen tales proteínas .

I . La Síntesis Química de Péptidos y Proteínas Bioactivos Típicamente la síntesis de proteínas y péptidos bioactivos emplea el protocolo de síntesis de péptidos de fase sólida por etapas de una química "Merrifield" desarrollada a principios de los años 1960, usando sintetizadores de péptidos automatizados estándar. Tal síntesis puede emplear estrategias de ligación en fase de solución o sólida. Aunque tal química se puede emplear fácilmente para producir muchos polipéptidos , es inadecuada para la producción de proteínas o grandes polipéptidos debido a pérdidas asociadas de rendimiento, producción de subproductos y reacciones incompletas. Para atender estas limitaciones, se han desarrollado técnicas de ligación química que permiten que se liguen juntos los fragmentos preformados de péptidos con objeto de alcanzar la síntesis de polipéptidos y proteínas superiores.

La ligación química involucra la formación de una ligadura covalente selectiva entre un primer componente químico y un segundo componente químico . Los grupos funcionales mutuamente reactivos, únicos, presentes en el primero y segundo componentes, se pueden usar para hacer que la reacción de ligación sea quimioselectiva . Por ejemplo, la ligación química de péptidos y polipéptidos , involucra la reacción quimioselectiva de segmentos de péptidos o polipéptidos que soportan residuos de aminoácidos en la terminal N y en la terminal C mutuamente reactivos, únicos. Se han utilizado diversas químicas para este propósito, ejemplos de las cuales incluyen la ligación química nativa (Dawson, et al., Science (1994) 266:776-779; Kent, et al., WO 96/34878; Kent, et al., WO 98/28434), ligación química con formación de oximas (Rose, et al., J. Amer. Chem. Soc . (1994) 116:30-34), ligación con formación de tioéster (Schnólzer, et al., Science (1992) 256:221-225), ligación con formación de tioéter (Englebretsen, et al., Tet . Letts. (1995) 36(48) :8871-8874), ligación con formación de hidrazona (Gaertner, et al., Bioconj . Chem. (1994) 5 (4 ) : 333 -338) , y ligación con formación de tiazolidina y ligación con formación de oxazolidina (Zhang, et al., Proc . Nati. Acad. Sci. (1998) 95 (16) :9184-9189; Tam, et al., WO 95/00846; Patente de E.U.A. No. 5,589,356) o por otros métodos (Yan, L.Z. and Dawson, P.E., "Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization, " J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 526-533, que se incorpora en la presente como referencia; Gieselnan et al., Org. Lett . 2001 3 (9) : 1331-133 ; Saxon, E. et al . , "Traceless" Staudinger Ligation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds . Org. Lett. 2000, 2, 2141-2143) . En donde la ligación involucra la unión de un polipeptido que posee un residuo de cisteína en la terminal N, el procedimiento de ligación química nativa se emplea preferiblemente (Dawson, et al., Science (1994) 266:776-779; Kent, et al., O 96/34878; Kent, et al., WO 98/28434; Solicitud de patente E.U.A. número de serie 09/097,094, todas se incorporan en la presente como referencia) . La ligación química nativa involucra una reacción quimioselectiva entre un primer péptido o segmento de polipéptido que tiene una porción ct-carboxitioéster en la terminal C y un segundo péptido o polipéptido que tiene un residuo de cisteína en la terminal N. Una reacción de intercambio de tiol produce un intermediario inicial ligado al tioéster, lo que reconfigura espontáneamente para dar un enlace amida nativo en el sitio de ligación, mientras se regenera el tiol de la cadena lateral de cisteína. En muchos casos, la secuencia de la proteína natural comprenderá residuos de cisteína colocados adecuadamente tales que los fragmentos de polipéptido que tienen un residuo de cisteína en la terminal N se puedan sintetizar y usar en una reacción de ligación química nativa.

Aunque esta metodología ha demostrado ser práctica, robusta y útil para la síntesis de polipéptidos y proteínas grandes, su requerimiento para un residuo de cisteína en el sitio de la ligación limita su aplicabilidad. La cisteína es uno de los aminoácidos menos comunes. Un dominio típico de proteína comprende de 150-200 aminoácidos; muchas proteínas contienen regiones de más de 60 aminoácidos en longitud que puede no contener residuos de cisteínas . Una solución a este problema involucra diseñar una proteína que no se presente naturalmente, en la cual uno o más de los residuos de aminoácidos que se presentan naturalmente de la proteína sean reemplazados con residuos de cisteína, permitiendo así que se emplee el método de ligación química nativa. Esta solución se complica a menudo por los efectos impredecibles que puede tener la introducción del residuo de cisteína en la estructura o función de la proteína. Se pueden usar tales residuos de cisteína para inmovilizar de forma covalente la proteína sintetizada. La presente invención proporciona dos soluciones alternativas a este problema, que se pueden emplear separadamente o en conjunto. La primera de tales soluciones (denominada en la presente "Ligación química pseudo nativa") involucra el uso de residuos de pseudo aminoácidos que no se presentan naturalmente, en posiciones preseleccionadas en los péptidos empleados en la síntesis de proteína. Las estructuras de tales pseudo aminoácidos imitan las estructuras de la cisteína y las estructuras de los aminoácidos que se encuentran naturalmente en tales posiciones preseleccionadas en la proteína a sintetizarse. La segunda de tales soluciones (denominada en la presente como "Ligación química nativa extendida")/ se describe en la solicitud de patente de E.U.A. número de serie 60/231,339 (Kent, et al., presentada: Septiembre 8, 2000) que se incorporan en la presente como referencia, e involucra ligar el primer componente que comprende un tioéster de carboxilo, y más preferiblemente un tioéster de cc-carboxilo, con un segundo componente que comprende un ácido estable N substituido y preferiblemente, Na-substituido, amino alquilo o arilo tiol de 2 ó 3 carbones en la cadena. Cada una de estas soluciones se discute en detalle a continuación.

A. Ligación Química Pseudo-Nativa La ligación química pseudo-nativa se dirige a la tioalquilación de las cadenas laterales de cisteínas, generadas en los sitios de ligación a partir de la ligación química nativa. Un aspecto preferido es la tioalquilación de los sitios de ligación de la cisteína, en donde al menos un péptido contiene, una cisteína nativa que tiene su cadena lateral de tiol protegida con un grupo protector apropiado. En una modalidad preferida de la invención, la porción de tiol del grupo de cisteína se modifica dentro de la cadena lateral deseada, por ejemplo, dentro de la cadena lateral de un aminoácido especificado ribosomalmente, un análogo de tal aminoácido, o dentro de un aminoácido que no se especifica por ribosomas . Como se usa en la presente, un aminoácido que se especifica ribosomalmente, es un aminoácido que se reconoce por los ribosomas en el proceso de traducción de proteínas, y se puede incorporar dentro de una proteína producida ribosomalmente. Existe considerable literatura publicada que describe las modificaciones químicas de la proción de tiol de la cadena lateral de cisteína (ver por ejemplo, "Current Protocols in Protein Science", editado por Johri E. Coligan et al., John Wiley & Sons, Y (2000). Kaiser. E.T. , ha descrito la conversión de las cadenas laterales del residuo de cisteína para imitar las propiedades químicas de la cadena lateral del aminoácido que se presenta naturalmente (ver por ejemplo, Kaiser, E.T., et al., "Chemical Mutation of Enzyme Active Sites", Science, 1984 Nov 2; 226 (4674) : 505-11) . Adicionalmente , se ha descrito el uso de una cadena lateral de cisteína para introducir una etiqueta en un péptido o proteína. Las modificaciones de la cadena lateral de cisteína, se revisan en Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, S.S. Wong, (1991, CRC Press); Chemical Modification of Proteins, Gary E. Means et al . , (1971, Holden-Day) , Chemical Modification of Proteins : Selected methods and analytical procedures, Glazer, ?.?. , et al., (1975, Elsevier); Chemical Reagents for Protein Modification, RL Lundblad (1991, CRC Press). Tam et al., (Biopolymers (1998) 46:319-327) han descrito el uso de la homocisteína (-CH2-CH2-SH) para una ligación química nativa que no es cis, seguido por la tioalquilación usando metil p-nitrobencensulfonato (recativo metilador) para convertir la cadena lateral de homocisteína a una cadena lateral de metionina nativa (-CH2-CH2-S-CH3) . La presente invención también se puede . usar para convertir homocisteínas a pseudo aminoácidos también, esto es, a aminoácidos diferentes a la metionina. Sin embargo, así como con la conversión de cisteína aquí descrita, de conformidad con la presente invención es necesario usar grupos protectores para evitar la destrucción de cisteínas nativas involucradas en el apareamiento de disulfuro para los péptidos que contienen al menos una cisteína nativa que no se desea convertir. Se describen a continuación los grupos protectores adecuados. Aunque el método de la ligación química pseudo nativa no facilita la imitación de las cadenas laterales de ciertos aminoácidos especificados ribosomalmente (por ejemplo, las cadenas laterales de glicina, alanina, valina y prolina) (la cadena lateral de alanina puede sin embargo formarse a través de una reacción de desulfuración (Yan, L.Z. y Dawson, P.E., "Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined ith Desulfurization, " J. Am. Chem. Soc . 2001, 123, 526-533, que se incorpora en la presente como referencia) , se puede usar para formar cadenas laterales que imitan muchos aminoácidos no codificados o especificados ribosomalmente . Los aminoácidos producidos de conformidad con el método de ligación química pseudo. nativa de la presente invención, contendrán una ligadura de tioéter, y no tendrán una ramificación beta (en aquella en que incluirán todos un grupo metilo en la posición beta, esto es, aa-pc¾-S- . Asi, las versiones de pseudo aminoácidos de los aminoácidos ramificados en beta, isoleucina y treonina se pueden hacer para tener la estructura de cadena lateral colgante, sin tener la geometría beta y sus restricciones anexas . Significativamente, los métodos de la presente invención se pueden usar para formar cadenas laterales de aminoácidos que son de la misma longitud que aquellas de los aminoácidos especificados ribosomalmente, o que son más largas o más cortas que tal longitud. Tal alteración en la longitud de la cadena lateral se puede usar para estabilizar (o desestabilizar) la conformación tridimensional para incrementar la estabilidad de la proteína (o para aumentar la capacidad de la proteína para alterar su conformación con lo cual se acepta un rango diferente de substratos, inhibidores, receptores, ligandos, etc., con relación a aquellos aceptados por la proteína que se presenta naturalmente. Por ejemplo, Cys-CH2-SH + Br-CH2-C00H produce Cys-CH2-S-CH2-COOH (tal "ácido pseudo glutámico" tiene un átomo adicional en la cadena lateral, nominalmente el grupo -S-; alternativamente, si se usa en lugar del ácido aspártico, posee 2 átomos de cadena lateral adicionales, nominalmente un grupo -CH2-S-) . Otras cadenas laterales tienen el mismo número de átomos en las unidades en la cadena lateral, pero- difieren por inclusión de la ligadura de tioéter (-S-) . Por ejemplo, Cys-CH2-SH + Br-CH2-CH2-NH-PG, seguido por la separación de PG produce Cys-CH2-S-CH2-CH2-NH2. La estructura resultante no tiene átomos adicionales en la cadena lateral, sino que un grupo -CH2- se reemplaza con -S- . La metionina es otro ejemplo en la presente, Cys-CH2-SH + I-CH2-CH3 produce Cys-CH2-S-CH2-CH3 (contra el nativo que satisface la estructura de Met-CH2-CH2-S-CH3) ; así se relocaliza el tioéter. La arginina también: Cys-C¾-SH + Br-CH2-NH-CH ( -NH2) (= H2+) ) produce Cys-CH2-S-CH2- H-CH( (-N¾) (=N¾+) ) . Preferiblemente, la protección de los grupos amino reactivos, particularmente para la construcción de pseudo lisina se puede emplear para evitar reacciones laterales indeseables . Una vez que se lleva a cabo la reacción de tioalquilación, se puede separar el grupo protector.

En general, cuando el deseo es imitar lo más cercano posible una proteína que se presenta naturalmente, es más preferido emplear una molécula de pseudo aminoácidos que tenga una longitud de cadena lateral que es de la misma longitud que aquella del aminoácido especificado ribosomalmente normalmente presente en tal posición en la proteína; es menos preferido emplear una molécula de pseudo aminoácido que tenga una longitud de cadena lateral que es de un átomo más extensa que aquella del aminoácido específico ribosomalmente, y todavía menos preferida para emplear una molécula de pseudo aminoácido que tienen una longitud de cadena lateral que es de dos átomos más larga que aquella del aminoácido especificado por ribosomas . Además, se prefiere seleccionar un sitio de ligación de cisterna que está en ubicación en donde los cambios genéticos no es probable que alteren la fusión o en donde los aminoácidos en ese sitio en las proteínas relacionadas se conservan. Tales sitios se pueden identificar por el barrido de alanina, modelación de homología y otros métodos . En una ligación química pseudo nativa, un péptido que contiene un residuo de cisterna en la terminal amino se liga a un péptido que tiene un tioéster en la .terminal carboxi como en la ligación química nativa. La cadena lateral de tiol de la cisterna reacciona después con un compuesto de la fórmula Raa-X, en donde X es un buen grupo de partida, y Raa es un grupo cuya estructura imita la porción terminal de la cadena lateral de un aminoácido sintético o especificado en el ribosoma. Significativamente las reacciones de la ligación química pseudo nativa trabajan con la configuración L natural de la cadena lateral de cisteína o la configuración D. El uso de la configuración D puede impartir resistencia a la proteasa en el sitio de ligación, y se puede desear así cuando la estabilidad creciente a la proteolisis se desea. Sin embargo, al usar la D-cisteína, la estructura de columna en ese lado se alterará. Tal alteración además de la resistencia a la proteasa se puede desear para alterar la bioactividad. Sin embargo, para minimizar el impacto en la bioactividad, se prefiere localizar la D-cisteína en un sitio de alta flexibilidad, tal como una región de trastorno, tal como el circuito desordenado que se localiza en la superficie de la molécula plegada resultante, sobre una terminación desordenada de la molécula. Deseablemente, se pueden usar las reacciones de ligación química pseudo nativa para colocar cadena laterales cargadas grandes (por ejemplo, las cadenas laterales de Lys, Arg, Asp o Glu) sobre la superficie de la molécula sintetizada. Ejemplos de buenos grupos de partida adecuados X, incluyen halógenos especialmente, yodo y bromo. Los ejemplos de los grupos aa incluyen P0 , COOH, C00, CONH2, guanidinio, amina, alquilo, alquilo substituido, arilo, arilo substituido, imidazol, imidazol alquilado, indol o grupos alquilados de indol. La selección de cuál Raa emplear dependerá de la cadena lateral de aminoácidos deseada para estar presente en una posición particular. Así, un polipéptido o proteína deseada que tiene la secuencia de aminoácido: a- NH2~ Q~aax~aay-W-a cooH en donde Q y W denotan cada uno la presencia o ausencia opcional de residuos adicionales de aminoácidos y aax y aaY denotan residuos adyacentes internos (que tienen cadenas laterales X e Y respectivamente) y aaN¾ y respectivamente denotan el residuo terminal de amino (N-) y el residuo terminal carboxi .(C-) del polipéptido o proteína y se sintetizan al preparar 2 fragmentos de péptidos : aaNH2-Q-aax-C0SR y Cys-W-aaCOoH en donde Cys denota el reemplazo de aaY con cisteína y R es cualquier grupo compatible con el grupo tioéster incluyendo pero no limitado a, arilo, bencilo y grupos alquilo. Los ejemplos de R incluyen tioesteres de 3-carboxi-4-nitrofenilo, esteres de bencilo y ésteres del leucina del ácido mercaptopropiónico (ver por ejemplo, Dawson et al., Science (1994) 266:776-779; Canne et al. Tetra edron Lett . (1995) 36: 1217-1220; Kent, et al., WO 96/34878; Kent, et al., WO 98/28434; Ingénito et al., JACS (1999) 121(49): 113699-11374; y Hackeng et al., Proc . Nati. Acad. Sci . U.S.A. (1999) 96: 10068-10073). Otros ejemplos incluyen ditiotreitol , o tioésteres de alquilo o arilo que se pueden producir por técnicas biológicas mediadas por la inteína que también son bien conocidas (Ver por ejemplo, Chong et al., Gene (1997) 192:277-281; Chong et al., Nucí. Acids Res. (1998) 26: 5109-5115; Evans et al., Protein Science (1998) 7: 2256-2264; y Cotton et al., Chemistry & Biology (1999) 6 (9) -.247-256) ; y después ligar los fragmentos juntos para formar: aaNH2-Q-aax-Cys-W-aaCooH- El fragmento ligado reacciona después con Ry-X, en donde Ry es un grupo lateral que imita la estructura de la cadena lateral y) . La reacción se lleva a cabo bajo condiciones suficientes para convertir el grupo tiol de la cisteína dentro de una cadena lateral "pseudo-y" . Por ejemplo, si Raa se selecciona para ser CH2-COOH o (CH2)2-C00H, entonces la reacción conducirá a la formación de un residuo de aminoácido que imita la estructura y función del ácido aspártico ( "pseudo-Asp" ) o ácido glutámico ( "pseudo-Glu" ) · Como se apreciará a la luz de la descripción anterior, se puede llevar a cabo una síntesis más complicada empleando más de 2 fragmentos de péptido. La ligación química nativa que involucra "pseudo aminoácidos" de conformidad con la presente invención, expande significativamente la aplicabilidad del método de ligación , químico nativo para la síntesis química de proteínas. La ligación química nativa que involucra "pseudo aminoácidos" usa la misma química en la etapa de ligación, formando un enlace péptido en el residuo Cys con una funcionalidad de cadena lateral que contiene un tiol nativo; en una segunda etapa particular, la cadena lateral nativa que contiene tiol del Cys en el sitio de ligación, se convierte por reacción quimioselectiva para producir una cadena lateral no nativa que contiene el mismo grupo funcional como un aminoácido codificado genéticamente pero una cadena lateral no nativa. Por ejemplo, la cisterna en el sitio de ligación se puede reaccionar con ácido bromoacético (u otro ácido haloacético) a un pH neutral en agua; solamente el tiol sin proteger del Cys en el sitio de ligación reacciona bajo estas condiciones para dar un polipéptido que contiene un residuo S-carboximetilado en el sitio de ligación, viz: Este aminoácido no nativo contiene una porción carboxilo en la cadena lateral, el mismo grupo funcional un ácido glutámico o un residuo de ácido aspártico. El Cys S-carboximetilado se refiere en la presente como "ácido pseudo glutámico" "pseudo-glutamato, " "pseudo-Glu" ) (en donde un átomo de cadena lateral adicional está presente y es el grupo -S- que forma una ligadura de tioéter) (también se puede referir como un "ácido pseudo-aspártico" , en donde 2 átomos adicionales de cadena lateral están presentes, uno de los cuales es el grupo S que forma una ligadura de tioéter) . Para muchas proteínas, la conservación simple de la cadena lateral de carboxilato cargada aun en este "pseudo aminoácido" será suficiente para conservar o impartir las propiedades deseadas a la proteína. Una diferencia clave es que funciona como un sitio de ligación química nativo en una posición desprovista de una cisteína adecuada. El uso de otros reactivos para modificar el tiol de cadena lateral en los residuos Cys en los sitios de ligación, puede dar otros residuos de "pseudo aminoácidos" . Por ejemplo, la reacción del tiol con una haloacetamida, por ejemplo, bromoacetamida, dará una "pseudo glutamina" en el sitio de ligación, viz: Similarmente la reacción con una haloalquilamina protegida por ejemplo. seguido por la separación del grupo protector amino, dará un residuo de "pseudo-lisina" , viz: La reacción de los residuos Cys en el sitio o sitios de ligación con un haloalcano adecuado, por ejemplo. producirá un aminoácido de pseudo leucina, viz Otros haluros adecuadamente escogidos que contienen arilo, en donde R puede ser H, OH, arilo, etc. por ejemplo. se pueden usar similarmente para generar pseudo aminoácidos que corresponden a los residuos Phe, Tyr, o Trp, viz: Un aspecto importante de este método es que los residuos de cisterna que no se desean modificar en los segmentos de reacción están protegidos en la cadena lateral, por ejemplo, como Cys (Acm) , para evitar la modificación química de los residuos Cys diferentes a aquellos en los sitios de ligación, o que cualesquiera otros residuos Cys en los segmentos de reacción se pretenden para la formación simultánea de pseudo aminoácidos idénticos por la reacción de modificación química después de la ligación. Se apreciará que los mismos principios aplican al uso de la homocisteína en el sitio de la ligación. También se apreciará que la selenocisteína se puede emplear en un sitio de ligación a través de la ligación química nativa mediada por selenocisteína, y convertirse por reacción similares de alquilación para generar pseudo aminoácidos de la invención, en donde un grupo de selenoéter reemplaza el grupo de tioéter. Como se usa en la presente, el símbolo cp denota un grupo bencilo? IM denota un grupo imidazol, y 1N denota un grupo indol; PG denota un grupo protector. A continuación está un resumen de los grupos laterales Raa que se pueden usar para sintetizar péptidos que contienen residuos de pseudo aminoácidos de conformidad con la presente invención (en donde X es un halógeno (I, Br, Cl, F) con I y Br preferidos para la mayoría y F preferido para la colocación de f) : Aminoácidos básicos: Lys (sin átomos adicionales) -CH2-SH + X-CH2-CH2-NH-PG, seguido por desprotección da - CH2-S-CH2-CH2-N¾ Arg (sin átomos adicionales) -CH2-SH + X-C¾-NH-C ( (NH2) (=NH2+) ) da -CH2-S-CH2-NH-C ( (N¾) (=NH2+) ) His (2 átomos adicionales) -CH2-SH + X-CH2-IM-PG, seguido por desprotección da -CH2- S-CH2-IM Aminoácidos ácidos: Asp (2 átomos adicionales) -CH2-SH + X-CH2-COOH da -CH2-S-CH2-COOH Glu (1 átomo adicional) -CH2-SH + X-CH2-C00H da -CH2-S-CH2-COOH Aminoácidos polares sin carga: Tyr (sin ó 1 átomo adicional) -CH2-SH + F-cp-Poh da -CH2-S-(p-pOH) (sin átomos extra, misma geometría -CH2-SH + Br/I-CH2-cp-pOH da -CH2-S-CH2-cp- pOH (1 átomo adicional) Gln (1 átomo adicional) -C¾-SH + X-CH2-C(0) (N¾) da -CH2-S-CH2-C (O) (NH2) Asn (2 átomos adicionales) -CH2-SH + X-CH2-C(0) (NH2) de -CH2-S-CH2-C (O) (N¾) Ser (2 ó 3 átomos adicionales) -CH2-SH + X-CH2OH) da -CH2-S-CH2OH (2 átomos adicionales) -CH2-SH + X-CH2-CH2OH) da -CH2-S-CH2-CH2OH (3 átomos adicionales) Thr (2 ó 3 átomos adicionales, falta de ramificación beta) -CH2-SH + X-CH((CH3) (O-PG) ) seguido por remoción de PG da -CH2-S-CH( (C¾) (OH)) (2 átomos adicionales) -CH2-SH + X-CH2-CH( (CH3) (O-PG) ) seguido por remoción de PG da -C¾-S-CH2-CH( (CH3) (OH)) (3 átomos adicionales) Aminoácidos no polares : Leu (1 ó 2 átomos adicionales) -CH2-SH + X-CH( (C¾) (CH3) ) da -CH2-S-CH ( (CH3) (CH3) ) (1 átomo adicional) -CH2-SH + X-C¾-CH( (CH3) (CH3) ) da -CH2-S-CH2- CH((CH3) (CH3) ) (2 átomos adicionales) lie (2 ó 3 átomos adicionales, falta de ramificación beta) -CH2-SH + X-CH (CH3) ~CH2-C¾ da -CH2-S-CH (CH3) -CH2-CH3 (2 átomos adicionales) -C¾-SH + X-C¾-CH (C¾) -CH2-C¾ da -CH2-S-CH2-CH (CH3) -CH2- CH3 (3 átomos adicionales) Phe (1 ó 2 átomos adicionales) -CH2-SH + F-f da -C¾-S-<p (1 átomo adicional) -CH2-SH + Br/l-CH2-cp da -CH2-S-CH2-cp (2 átomos adicionales) Met (sin átomos adicionales) -C¾-SH + I-C¾-CH3 da -CH2-S-CH2-CH3 Trp (1 átomo adicional) -CH2-SH + F-IN da -CH2-S-IN La reacción general de pseudo ligación química se ilustra en la figura 1. Los grupos preferidos Raa y X se pueden usar para formar los pseudo aminoácidos que se muestran en la tabla I. Los residuos se muestran sin cargar, sin embargo, se apreciará que grupos ionizables tales como N¾ o COOH pueden estar en su forma cargada o suministrarse como sales. Todas las reacciones excepto aquellas para formar pseudo lisina son acuosas y se llevan a cabo a un pH de 8-9, en donde la estequiometría y la optimización de las reacciones se pueden ajustar siguiendo los protocolos estándar. La pseudolisina se forma en una reacción acuosa conducida a un pH de 8-9, seguido por la reacción en piperidina/H20 (ácido trifluoro acético (TFA) ) .

TABLA 1 En una modalidad adicional de la presente invención, el grupo tiol del residuo de cistelna se puede oxidar (-SH S03) , o reemplazarse con oxígeno para formar la serina (-SH- OH) . Tal reemplazo se puede llevar a cabo al reaccionar la cistelna con cloruro de tosilo (Tos-Cl) con lo cual se convierte el grupo tiol, -SH, en un grupo -S-Tos. En presencia de una base fuerte, el OH reemplaza al substituyente Tos, con lo cual se forma el grupo -OH deseado.

Adicionalmente , el grupo tiol de la cisteína se puede modificar a través de una reacción de adición de Michael como se muestra a continuación: en donde R es H, alquilo, arilo, alquil arilo, amino, o es una molécula de polímero que puede ser ramificada o no ramificada, aleatoria o ' de bloque. Un aspecto adicional de la presente invención, se dirige al uso de un fragmento de péptido cuyo residuo de cisteína en la terminal amino se ha modificado para contener una porción de alquil amino (y preferiblemente un metilamino) : Al proteger, el grupo amino de la porción alquil amino, se puede ligar el péptido A con un segundo péptido que tiene la fórmula general: péptidos B-ocCOSR. Con la separación del grupo protector, se puede ligar un péptido adicional que tiene la fórmula general péptido C-ccCOSR, con los péptidos ligados previamente para formar un complejo de péptido ramificado: Ya que la proteína ramificada todavía contiene el grupo tiol de la cisteína, reaccionará con una molécula Raa~X en la forma antes descrita con lo que se permiten modificaciones adicionales de la cadena lateral. En particular, al usar una alquil amida como el substituyente R, se puede introducir un grupo amino adicional dentro de la molécula, con lo cual se permite una ramificación adicional o reacciones adicionales de ligación: En una modalidad adicional de la presente invención, se puede usar la modificación de la cadena lateral de cisteína para introducir cualquiera de una diversidad de etiquetas o moléculas de enlace. Por ejemplo, las etiquetas detectables por resonancia de giro de electrones, fluorescencia (por ejemplo, amonio 4-cloro-7-sulfobenzo-furazan (SBF) Pierce Chemical Co . ) o se puede emplear formación de imágenes magnéticas. Tal etiquetado es útil en el diagnóstico de enfermedades y condiciones, así como en el análisis de interacciones de enlaces moleculares (por ejemplo, para medir distancias en proteínas de membrana integral) . La metodología de la presente invención tiene diversas ventajas sobresalientes con respecto al uso de etiquetas y moléculas de enlace. Tales substituyentes se pueden incorporar en una forma no aleatoria específica del sitio. Adicionalmente, la porción de etiqueta solamente necesita estar estable con las ¦ etapas posteriores de ligación química (si hay alguna) . Tales reacciones se llevan a cabo generalmente bajo condiciones muy moderadas (tales como aquellas empleadas en la ligación química nativa; separación de Acm u otros grupos protectores que se pueden usar opcionalmente para proteger los grupos tiol de otros residuos de cisteina (como con Hg (C¾COOH) 2) ; y purificación CLAR de fase inversa) . La protección de tales grupos tiol adicionales evita la polimerización oxidante de los péptidos que contienen Cis y facilita así su purificación y manej o .

B. Ligación Química JSTativa Extendida. Como se indica arriba, en donde la secuencia de una proteína natural no contiene un residuo adecuado de cisteina, y es inconveniente o indeseable modificar una secuencia natural de proteína de manera de introducir un residuo de cisteina en la terminación N de un polipéptido, se puede usar el método de la "Ligación Química Nativa Extendida" para ligar polipéptidos cuya terminación N se haya modificado para contener un aminoalquil o aril tiol de 2 .6 3 carbones en la cadena, N-substituido y preferiblemente ? -substituido, con lo cual se permiten los principios de la ligación química nativa emplearse con los polipéptidos que carecen de residuos de cisteina (ver solicitud de patente de E.U.A. número de serie 60/231,339, que se incorpora en la presente como referencia) . El método de la Ligación Química Nativa Extendida, involucra ligar un primer componente que comprende un tioéster de carboxilo y más preferiblemente, un tioéster de oc-carboxilo con un segundo componente que comprende un aminoalquil o aril tiol de 2 ó 3 carbones en la cadena N-substituido y preferiblemente, Na-substituido . La reacción quimioselectiva entre el carboxitioéster del primer componente y el tiol del alquil o aril' tiol de 2 ó 3 carbones en la cadena N-substituido, del segundo componente, avanza a través de un intermediario ligado al tioéster, y lo resuelve en un producto inicial de ligación. Más específicamente, el intercambio de tiol sucede entre el componente de tioéster COSR y el componente de amino alquil tiol que genera un producto de ligación intermediario ligado en el tioéster, que después de una reconfiguración espontánea genera un primer producto de ligación ligado a amida a través de un intermediario de 5 ó 6 miembros en el anillo dependiendo de si el componente de amino alquil tiol tiene la fórmula I o II respectivamente : Jl-C (.0) -N(C1 (Rl) -C2-SH) -J2 I Jl-C (O) - [Cl (Rl) -C2 (R2) -C3 (R3) -SH) -J2 II en donde Jl es un péptido o polipéptido que tiene una o más cadenas laterales de aminoácido opcionalmente protegidas, o una porción de tal péptido o polipéptido, un polímero, un colorante, una superficie adecuadamente funcionalizada, un marcador detectable o ligador, o cualquier otra porción química compatible con la síntesis química de péptidos o ligación química nativa extendida, Rl , R2 , y R3 son independientemente H o un grupo donador de electrones conjugado con Cl; con la condición de que al menos uno de Rl, R2 , y R3 comprenda un grupo donador de electrones conjugado con Cl; y J2 es un péptido o un polipéptido que tiene una o más cadenas laterales de aminoácidos opcionalmente protegidas, o una porción de tal péptido o polipéptido, un polímero, un colorante, una superficie adecuadamente funcionalizada, un ligador o un marcador detectable, o cualquier otra porción química compatible con la síntesis química de péptidos o la ligación química nativa extendida. El alquil o aril tiol de 2 ó 3 carbones en la cadena N-substituido [HS-C2-C1 (Rl) -] o [HS- (C3 (R3) -C2 (R2) -Cl (Rl) -] , en el sitio de ligación, se puede eliminar, bajo condiciones compatibles de péptidos sin daño al producto, para generar un producto final de ligación de fórmula III que tiene un enlace nativo de amida en el sitio de ligación: Jl-C (O) -H -J2 III en donde Jl, J2 , Rl , R2 , y R3 son como se definieron anteriormente. Los grupos Rl, R2 , y R3 se seleccionan para facilitar el desdoblamiento del enlace N-Cl bajo condiciones de desdoblamiento compatibles con los péptidos. Por ejemplo, los grupos donadores de electrones particularmente si se conjugan con Cl se pueden usar para formar un catión de resonancia estabilizado en Cl que facilita el desdoblamiento. La reacción química de ligación incluye preferiblemente como un excipiente a un catalizador de tiol, y se lleva a cabo alrededor de condiciones de pH neutral en condiciones acuosas o mezcladas acuosa-orgánica . La ligación química del primero y segundo componentes puede avanzar a través de un anillo de cinco o seis miembros que se somete a un reconfiguración espontánea para producir un producto de ligación ligado a una amida N-substituida. En donde el primero y segundo componente son péptidos o polipéptidos, el producto de ligación ligado a amida N-substituido tiene la fórmula IV o V: Jl-C (O) -Ncc(Cl (Rl) -C2-HS) -CH(Z2) -C (O) -J2 IV Jl-C (O) -Na(Cl (Rl) -C2 (R2) -C3 (R3) -HS) -CH(Z2) -C(0) -J2 V en donde Jl , J2 y Rl, R2 , R3 son como se definen arriba y Z2 es una cadena lateral de aminoácido o un derivado de tal cadena lateral. Los grupos donadores de electrones conjugados Rl, R2 o R3 del producto de ligación enlazado a amida N-substituida, facilita el desdoblamiento del enlace N-Cl y la separación de un alquil o aril tiol de 2 ó 3 carbones en la cadena del producto de ligación ligado a amida N-substituido . La eliminación de la cadena de alquil o .aril tiol del N bajo condiciones de desdoblamiento compatibles con los péptidos, genera un producto de ligación que tiene un enlace de amida nativo en el sitio de ligación. En donde el primero y segundo componentes son péptidos o polipéptidos , el producto de ligación tendrá la fórmula: Jl-CONaH-CH (Z2) -C (0) -J2 X Los substituyentes ejemplares^ Rl para la fórmula 1 se detallan en la tabla II .

TABLA II. Fórmula I Grupos Substituyentes Rl para la fórmula I (CI incluido como referencia) Los substituyentes ejemplares Rl, R2 , y R3 para la fórmula II se detallan en la Tabla >III.

TABLA III .

Fórmula II Rl , R2 , y R3 Substituyentes (Cl incluido para referencia) .

Como con los compuestos N- substituidos de 2 carbones en la cadena, el posicionamiento de los substituyentes donadores de electrones de bencilo y picolilo Rl', R3 ' , y R5' en las posiciones orto o para, es necesario para mantener la conjugación electrónica al carbono Cl para un desdoblamiento firme del enlace ?a-Cl que sigue a la ligación. Sin embargo, cuando R2 y R3 forman un grupo de bencílo con C2 y C3 , al menos uno de Rl ' y R3 ' comprenden un grupo donador fuerte de electrones, en donde Rl' o R3 ' se seleccionan de metoxi (-0CH3), tiol (-SH) , hidroxilo (-0H), y tiometilo (-SCH3). Para los tioles de 3 carbones en lá cadena N-substituidos en los cuales R2 y R3 son hidrógenos, Rl comprende un grupo de bencilo o picolilo en el cual Rl ' , R3 ' , y R5 ' incluyen grupos donadores de electrones moderados o fuertes o una combinación de los mismos. Como con el · alquil o aril tioles de 2 carbones en la cadena N-substituidos, los grupos donadores de electrones fuertes, aumentan la sensibilidad del alquil o aril tiol de 3 carbones en la cadena para el desdoblamiento que sigue a la ligación. Así, se puede seleccionar de esta manera un grupo particular donador de electrones o una combinación de los' mismos. De manera similar a los compuestos N-substituidos de 2 carbones en la cadena, los compuestos N-substituidos de 3 carbones en la cadena de la presente invención, pueden incluir un tiol como un substituyente de Rl en las posiciones Rl' y R5' cuando está disponible para la substitución en un constructo de interés. Aquí nuevamente, el grupo tiol donador de electrones se conjuga con Cl y su introducción en estas ubicaciones permite que los compuestos tengan dos rutas para el evento de ligación formador del anillo de 6 miembros. También incrementa la concentración local de los tioles disponibles para reaccionar con el tioéster a-carboxi, y suministra las conformaciones adicionales en términos de las restricciones estructurales que pueden mejorar la ligación. La síntesis de los aminoácidos del alquil o aril tiol de 2 ó 3 carbones en la cadena N-substituidos en la terminal N de la invención, se puede llevar a cabo como se describe en la presente por ejemplo, en el esquema de reacción I y esquema de reacción II, y de conformidad ¦ con las técnicas estándar de química orgánica conocidas en el arte. Ver por ejemplo, "Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms, and Structure," 4a. Ediciónn, J. March (Ed.), John Wiley & Sons, ¦ New York, NY, 1992; "Comprehensive' Organic Transformations , A Guide to Functional Group Preparations , ?1 R. Larock (Ed.), VCH Publishers, New York, NY, 1989. Se pueden sintetizar en solución, por síntesis o portada en polímeros o una combinación de la misma. El enfoque preferido emplea precursores de aminoácidos de alquil o aril tiol protegidos en amino S, alquilados en N, protegidos en N alfa. Los reactivos utilizados para la síntesis se pueden obtener a partir de cualquier número de fuentes comerciales. También, se entenderá bien que los componentes de partida y diversos intermediarios tales como los derivados individuales de aminoácidos se pueden almacenar para un uso posterior suministrados en kit(s) similares. En la preparación de los aminoácidos de alquil o aril • tiol de 2 ó 3 carbones en la cadena Na-substituidos en la terminal N de la invención, se emplean estrategias de grupos protectores. Los grupos protectores preferidos (PG) utilizados en las diversas estrategias de síntesis en general, son compatibles con las síntesis de péptidos en fase sólida ("SPPS") . En algunos casos, también es necesario utilizar grupos protectores ortogonales que se separan bajo condiciones diferentes . Muchos de tales grupos protectores se conocen y son adecuados para este propósito (ver por ejemplo, "Protecting Groups in Organic Synthesis" , 3a. Edición, T. . Greene and P.G.M. Wuts, Eds . , John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catálogo 2000; "Synthetic Peptides, ? User' s Guide, " G.A. Grant , Ed. , W.H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry," W.D.. - Bennet, J.W. Christensen, L.K. Hamaker, M.L.- Peterson, M.R.Rhodes, and H.H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Priciples of. Peptide Synthesis, 2a ed.," M. Bodanszky, Ed., Springer- Verlag 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2a ed.," M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; y "Protecting Groups",, P.J. Kocienski, Ed. , Georg -Thieme Verlag, . Stuttgart, Alemania, 1994). Los ejemplos incluyen benciloxicarbonilo, (Z) , Boc, Bpoc, Trt, Nps, FmocCl-Z, Br-Z; NSC; MSC, Dde, etc. Para las porciones de azufre, .los ejemplos de grupos protectores adecuados incluyen pero no se limitan a bencilo, 4-metilbencilo, 4-metoxibencilo, tritilo, ACM, TACAM, xantilo; derivados de disulfuro, picolilo, y fenacilo. Más particularmente, se pueden preparar los alquil aril tioles de 2 ó 3 carbones en la cadena Na- substituidos de conformidad con el esquema de reacción I (preparación en fase sólida del precursor ?a-substitutido) , esquema de reacción II (preparación en fase de solución del precursor Na-substituido) . En el esquema de reacción I, los alquil o aril tioles de 2 ó 3 carbones en la cadena ?a-substituidos , se ensamblan directamente en la fase sólida usando métodos estándar de síntesis orgánica soportada en polímeros, mientras que el precursor de aminoácidos de amino alquilo o aril tiol ?a-protegido, N-alquilado, S-protegido, del esquema II se acopla a la resina usando protocolos estándar de acoplamiento. En donde se producen productos rácemicos o diasteroméricos , puede ser necesario separar estos por métodos estándar antes de usarlos en una ligación química nativa extendida. Esquema de Reacción I. Síntesis en Fase Sólida de Moléculas Derivadas Auxiliares de ECL.

X = halógeno Esquema de Reacción II .

Los a-carboxitioésteres se pueden generar por métodos químicos o biológicos siguiendo las técnicas estándar conocidas en el arte, tales como aquellas aqui descritas incluyendo los ejemplos. Para la síntesis química, los péptidos de -carboxitioéster se pueden sintetizar en solución o a partir de resinas generadoras de tioéster, cuyas técnicas son bien conocidas (ver por ejemplo, Dawson et al., supra; Canne et al., supra; Hackeng et al., supra, Aimoto et al.). Por ejemplo, los péptidos de tioéster químicamente sintetizados se pueden hacer a partir de los -tioácidos de péptidos correspondientes, que a su vez se pueden sintetizar sobre una resina de tioéster o en solución, aunque se prefiere el método de la resina. Los péptido-oc-tioácidos se pueden convertir a los tioésteres correspondientes de 3-carboxi-4-nítrofenilo, al éster de bencilo correspondiente o a cualquiera de una diversidad de alquil tioésteres. Todos estos tioésteres proporcionan grupos de partida satisfactorios para la reacciones de ligación, con los tioésteres de 3-carboxi-4-nitrofenilo demostrando una velocidad de reacción de alguna manera más rápida que los tioésteres correspondientes de bencilo, que a su vez -pueden ser más reactivos que los tioésteres de alquilo. Como otro ejemplo, una resina generadora del tioéster de leucina del ácido mercaptopropiónico asociado con tritilo, se puede utilizar para construir tioésteres en la terminal C (Hackeng et al., supra) . La síntesis del tioéster en la terminal C también se puede alcanzar usando un ligador que atrapa la seguridad de 3 carboxipropansulfonamida, por activación con diazometano o yodoacetonitrilo seguido por el desplazamiento con un tiol adecuado (Ingénito et al., supra Bertozzi et al . ) . La ligación de los componentes de alquil o aril tiol de 2 ó 3 carbones en la cadena N-substituidos de la invención con el primer componente de carboxitioéster, genera un producto de ligación que tiene un enlace de amida N-substituido en el sitio de ligación. Las condiciones de ligación de la reacción se escogen para mantener la reactividad selectiva del tioéster con una porción de alquil o aril tiol de 2 ó 3 carbones en la cadena N-substituidos . En una modalidad preferida, la reacción de ligación se lleva a cabo en una solución amortiguadora que tiene un pH de 6-8, con un rango preferido de pH que es de 6.5-7.5. La solución amortiguadora puede ser acuosa orgánica o una mezcla de la misma. La reacción de ligación también puede incluir uno o más catalizadores y/o uno o más agentes reductores, lípidos, detergentes, otros desnaturalizantes o reactivos de solubilización y similares. Los ejemplos de los catalizadores preferidos son porciones que contienen tiol y fosfina, tales como tiofenol, benzilmercaptano , TCEP y alquil fosfina. Los ejemplos de los agentes desnaturalizantes y/o solubilizantes incluyendo guanidinio, urea en agua o solventes orgánicos tales como TFE, HFIP, DMF, NMP, acetonitrilo mezclado con agua o con guanidinio y urea en agua. Se puede también utilizar la temperatura para regular la tasa de la reacción de ligación que está usualmente entre 5°C y 55°C, con la temperatura preferida estando entre 15 °C y 40°C. Como un ejemplo, las reacciones de ligación proceden bien en un sistema de reacción que tiene 2% de tiofenol en guanidinio 6M a un pH entre 6.8 y 7.8. Para los alquil o aril tioles de 2 carbones en la cadena N-substituidos , el evento de ligación resulta de un intercambio de tiol que sucede entre el componente de tioéster COSR y el componente de amino alquil tiol. El intercambio genera un producto de ligación del intermediario ligado al tioéster, que después de una reconfiguración espontánea a través de un intermediario de 5 miembros en el anillo, genera un primer producto de ligación de la fórmula Jl-HN-CH(Zl) -C (O) -N (Cl (Rl) -C2SH) -CH (Z2-J2 que tiene un alquil o aril tiol de 2 carbones en la cadena N- substituido (HS-C2C1 (Rl) -] en el sitio de ligación, en donde los substituyentes son como se definieron arriba. El alquil o aril tiol [HS-C2-G1 (Rl) -] de 2 carbones en la cadena N-substituido, en el sitio de ligación, se puede eliminar bajo, condiciones compatibles con péptidos, para generar un producto final de ligación de la fórmula Jl-HN-CH (Zl) -CO-NH-CH(Z2)-CO-J2 que tiene un enlace de amida nativo en el sitio de ligación. Para los aril o alquiltioles de 3 carbones en la cadena N-substituidos, el intercambio de tiol entre el componente de tioéster COSR y el componente de aminoalquil tiol, genera un producto de ligación intermedio ligado al tioéster, que después de una reconfiguración espontánea a través de un intermediario de un anillo de 6 miembros, genera un primer producto de ligación de la fórmula Jl-HN-CH (Zl) -C (O) -N (Cl-C2 (R2) -C3 (R3) -SH) -CH (Z2) -J2 que . tiene un alquil o aril tiol de 3 carbones en la cadena N-substituido removible [HS-C3 (R3) -C2 (R2) -Cl (Rl) -] en el sitio de ligación. El aril tiol de 3 carbones en la cadena N-substituido [HS-C3 (R3) -C2 (R2) -C1(R1)-] en el sitio de ligación, puede removerse bajo condiciones compatibles con péptidos para generar un producto final de ligación de la fórmula Jl-HN-CH (Zl) -CO-NH-CH (Z2) -CO-J2 que tiene un enlace nativo de amida en el sitio de ligación . La separación del grupo alquil o aril tiol N-substituido se lleva a cabo preferiblemente en condiciones ácidas para facilitar el desdoblamiento del enlace N-Cl, produciendo un enlace de amida estabilizado no substituido en el sitio de ligación. Por "condiciones de desdoblamiento compatibles con los péptidos" se pretenden condiciones fisicoquímicas compatibles con los péptidos y adecuadas para el desdoblamiento de la porción de alquil o aril tiol a partir del producto de ligación. Las condiciones de desdoblamiento compatibles con péptidos en general, se seleccionan dependiendo del compuesto a-substituido empleado, que se puede deducir fácilmente a través de métodos de rutina y bien conocidos (ver por ejemplo, "Protecting Groups in Organic Synthesis", 3a' Edition, T. . Greene and P.G.M. Wuts, Eds . , John Wiley & Sons, Inc., 1999; MovaBiochem Catalog 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide," G.A. Grant, Ed. , W.H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry," W.D. Bennet, J.W. Christensen, L.K. Hamaker, .L. Peterson, M.R.Rhodes, and H.H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principies of Peptide Synthesis, 2a ed.," M. Bodanszky, Ed. , Springer-Verl g, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2a ed.," M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; y "Protecting Groups," P.J. ocienski , Ed. , Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1994) . Por ejemplo, en donde los substituyentes Rl, R2 , o R3 comprenden un metoxi, hidroxilo, tiol o tiometilo, metilo y similares, el método más universal para la eliminación, involucra condiciones ácidas de desdoblamiento típicas para las químicas de síntesis de péptidos. Esto incluye el desdoblamiento del enlace N-Cl bajo fuertes condiciones ácidas o condiciones de agua- cidas con o sin reactivos reductores y/o sistemas secuestrantes (por ejemplo, un ácido tal como el fluoruro de hidrógeno anhidro (HF) , ácido trifluoroacético, (TFA) , o ácido trimetilsulfonil trifluoroacético (TMSFA) y sus similares) . Se pueden escoger sistemas de desdoblamiento ácidos más específicos para optimizar el desdoblamiento del enlace ?a-Cl para separar la porción de aril o alquil tiol para un constructo dado. Tales condiciones son bien conocidas y compatibles con el mantenimiento de la integridad de los péptidos. Se puede incluir un secuestrante de tioles, particularmente en donde están presentes los triptofanos en una secuencia de péptidos o polipéptidos para evitar la reacción de la cadena lateral de triptofano con la porción liberada de arilo d alquil tiol . Los ejemplos de los secuestrantes de tiol incluyen etanodiol, cisteína, beta-mercaptoetanol y tiocresol. Otras condiciones especializadas de desdoblamiento incluyen condiciones de desdoblamiento reductor o ligero en donde el grupo picolilo es el substituyente . Como un ejemplo, cuando los substituyentes Rl , o R2 y R3 comprenden una porción de picolilo, se puede usar la fotolisis (por ejemplo, luz ultravioleta) , ácido acético/zinc o reducción electrolítica para el desdoblamiento que sigue protocolos estándar. En donde el Rl del tiol de 2 carbones N-substituido comprende un tiometano a Rl, se puede usar el mercurio o desdoblamientos HF. El sistema de desdoblamiento también se puede usar para- el desdoblamiento simultáneo a partir de un soporte sólido y/o como un reactivo de desprotección cuando el primero o el segundo componentes de ligación comprenden otros grupos' protectores . En una modalidad de la presente invención, los alquilo o aril tioles de 2 ó 3 cadenas Na-substituidos se emplean en la etapa de síntesis de péptidos (particularmente en la síntesis de péptidos automatizada y en estrategias de ligación convergentes y ortogonales) para producir polipéptidos derivados adecuadamente en la terminal N, que se pueden usar como substratos para una ligación química extendida para producir proteínas bioactivas sintéticas. Tales compuestos comprenden un amino alquil o aril tiol de 3 carbones en la cadena o de 2 , ?a-substituido estable al ácido completamente sin proteger o parcialmente protegido, completamente protegido, de la fórmula (PG1) S-C2-C1 (Rl) -Na (PG2 ) -CH (Z2) -C(0)-J2 o (PG1) S-C3 (R3) -C2 (R2) -Cl (Rl) -Na(PG2) -CH(Z2) -C(O) -J2 , que se detallan a continuación en las tablas IV y V. En particular uno o más del Rl, R2 y R3 comprenden un grupo donador de electrones conjugado a Cl que siguiendo la conversión del amino alquil o aril tiol Na-substituido a una amida alquil o aril tiol Na-substituido, puede formar un catión estabilizado por resonancia en Cl, que facilita el desdoblamiento del enlace ?a-Cl bajo condiciones de desdoblamiento compatibles con péptidos. PG1 y PG2 son grupos protectores que están presentes individualmente o en combinación, o están ausentes y pueden ser iguales o diferentes, en donde Z2 es cualquier porción química compatible con la síntesis química de péptidos, o la ligación química nativa extendida, y en donde J2 es cualquier porción química compatible con la síntesis química de péptidos o la ligación química nativa extendida. PG1 (o XI) es un grupo para la protección de amina. PG2 (o X2) es un grupo para la protección del tiol . Muchos de tales grupos protectores se conocen y son adecuados para este propósito (ver por ejemplo, "Protecting Groups in Organic Synthesis", 3a' Edición, T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Eds . , Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide" , G.A. Grant, Ed. , W.H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Co binatorial & Solid Phase Organic Chemistry." , W.D. Bennet, J.W. Christensen, L.K. Hamaker, M.L. Peterson, M.R.Rhodes, and H.H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Priciples of Peptide Synthesis, 2nd ed.," M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "ThePractice of Peptide Synthesis, 2nd ed.," M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; and "Protecting Groups", P.J. Kocienski, Ed. , Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1994) .

TABLA IV.

HNa CH C- PG, Na CH C- O PG, HS— c; PG, Na CH O PG, S c; R1 Los ejemplos de los grupos protectores preferidos para PGl y XI incluyen pero no se limitan ha [Boc (t-Butilcarbamato) , Troc (2 , 2 , 2 , -Tricloroetilcarbamato) , Fmoc(9-Fluorenilmetilcarbamato) , Br-Z o Cl-Z (Br- o Cl-Bencilcarbamato) , Dde (4 , 4 , -dimetil-2-6-dioxocicloexl-ilideno) , MsZ (4-Metilsulfonilbencilcarbamato) , Msc(2- Metilsulfoetilcarbamato) Nsc (4 -nitrofeniletilsulfonil-etiloxi-carbonil] . Se prefieren los grupos protectores PGl ' y XI que se seleccionan de "Protective Groups in Organic Synthesis," Grenn and uts, Tercera Edición, Wiley-Interscience, (1999) siendo el más preferido Fmoc y Nsc. Los ejemplos de los grupos protectores preferidos para PG2 incluyen pero no se limitan a [Acm (acetamidometil) , MeoBzl o Mob (p-Metoxibencilo) , Meb (p-Metilbencilo) , Tr (Tritilo) , Xan (Xantenilo) , tButio (s-t-butilo) , , Mmt (p- etoxitritilo) , 2 ó 4 Picolilo(2 o 4 piridilo) ) , Fm(9-Fluorofenilo-metil) , tbut (tButilo) , Tacam (Trimetilacetamidometil) ] . Los grupos protectores preferidos PG2 y X2 se seleccionan de "Protective Groups in Organic Synthesis" , Green and Wuts, Tercera Edición, Wiley-Interscience , (1999) , siendo los más preferidos Acm, Mob, MeB, Picolilo.

TABLA V .

Las formas protegidas para los alquil o aril tioles de 2 ó 3 cadenas Na-substituidos de la invención, se pueden preparar como en los esquemas de reacción I y II anteriores.

Los compuestos de la presente invención se pueden producir por cualquiera de una diversidad de medios, incluyendo amino alquilación mediada por halógeno, aminación reductora, y por la preparación de precursores de aminoácidos amino alquil o aril tiol protegidos en S, N-alquilados , Ncc-protegidos, compatibles con métodos de síntesis de aminoácidos en fase sólida. Cuando se desea, la resolución de los racematos o los diasterómeros producidos para dar los compuestos de pureza quiral aceptable, se puede llevar a cabo por métodos estándar.

II. Los Péptidos y Proteínas Bioactivos de la Presente Invención. A. Proteínas Sintéticas Bioactivas. Los métodos antes descritos se pueden usar para sintetizar péptidos y proteínas bioactivas sintéticas. Como se usa en la presente, una proteína bioactiva se dice que es sintética si se ha empleado tecnología no recombinante para polimerizar algunos y más preferiblemente todos sus residuos de aminoácidos. El término "tecnología no recombinante" se pretende para distinguir tecnologías que involucran química orgánica y otros métodos de polimerización sintética a partir de tecnologías que involucran la traducción del AR en proteína ya sea in vivo o in vitro. Más preferiblemente, las proteínas sintéticas bioactivas de la presente invención, serán producidas in vitro usando los principios de la química orgánica, y en particular los métodos de "ligación química nativa" y "ligación química nativa extendida" como se discute en la presente. Tales síntesis químicas se efectuarán preferiblemente usando un método sintético convergente en el cual se sintetizarán los fragmentos de polipéptidos y después se ligarán uno con el otro para formar la proteína bioactiva sintética. Alternativamente, Las proteínas bioactivas sintéticas de la presente invención se pueden sintetizar en una síntesis sencilla no convergente. Como se indica anteriormente, las proteínas bioactivas sintéticas de la presente invención tienen un peso molecular substancial, preferiblemente que es superior alrededor de 25 kDa. Para los propósitos de la presente invención, tales detérminaciones de peso molecular se harán por una electroforesis desnaturalizante de SDS poliacrilamida . El término "peso molecular del monómero" se pretende para referirse al peso molecular de una proteína sintética de monómero, como se diferencia de las proteínas sintéticas que pueden poseer copias múltiples de una proteína o polipéptido.

Como se usa en la presente, se dice que una proteína sintética tiene "actividad biológica" si posee una bioactividad diferenciable que depende de la estructura de la proteína sintética o la secuencia de aminoácidos, tal que la variación en tal estructura o secuencia aumente, modifique o atenúe la bioactividad de la proteína. Sin limitación, tal actividad biológica incluye la capacidad de la proteína para mediar una señalización catalítica o inducir la reacción. Como se usa en la presente, una proteína se dice que "media una reacción catalítica" al convertir un substrato en un producto sin consumirse en sí misma o modificarse permanente. Se dice que una proteína "media una señalización o induce una reacción" si su presencia provoca un organismo, sus tejidos o células, que inicien, continúen, aumenten, modifiquen o atenúen la expresión de genes, diferenciación celular o proliferación celular. Los ejemplos de tales reacciones de señalización o inducción incluyen la inducción de la expresión de citocinas o una respuesta para la expresión de citocinas, incluyendo eritropoyesis , inducción o atenuación de la inflamación y/o un proceso inflamatorio, inicio de la angiogénesis o vascularización, inducción de la apoptosis, afectación del ciclo celular etc. La bioactividad de las proteínas bioactivas sintéticas de la presente invención, también incluyen la capacidad de la proteína para enlazarse específicamente a un receptor, ligando o anticuerpo. Como se usa en la presente, el término enlace específico, se pretende para referirse a una interacción de enlace basada estructuralmente, tal como aquella que existe entre una hormona y su receptor, o un anticuerpo o un epítope antigénico como se diferencia del enlace no específico basado en la carga, solubilidad hidrofobicidad etc. Las proteínas sintéticas bioactivas de la presente invención, se sintetizan preferiblemente por la condensación de los residuos de aminoácidos. Tales residuos de aminoácidos pueden ser los aminoácidos instalados por ribosomas, codificados por ácidos nucleicos: alanina, arginina, asparagina, aspartato, cisteína, glutamato, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, y valina. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos seleccionada para una proteína bioactiva sintética particular deseada, sería la secuencia nativa o natural de esa proteína. En una modalidad alternativa, la secuencia seleccionada de aminoácidos estará compuesta de todos los construidos de fragmentos de polipéptidos que pueden contener un residuo de cisteína en la terminal N en lugar de los residuos de aminoácidos presentes en la secuencia nativa o natural de esa proteína. La inclusión de tal residuo permite que se ligue el polipéptido con otro polipéptido (modificado para contener un grupo carboxitioéster) usando los principios de ligación química nativa aquí descritos y como tal, facilita el uso de la síntesis convergente para producir proteínas bioactivas sintéticas . En una modalidad adicional, las proteínas bioactivas sintéticas de la presente invención, pueden contener residuos de aminoácidos "irregulares" . Como se usa en la presente, el término "residuos de aminoácidos irregulares" se pretende para referirse a aminoácidos que no se codifican por el ARN y que no se instalan por ribosomas. A este respecto, la presente invención permite una amplia selección y flexibilidad en el diseño y/o construcción de proteínas bioactivas sintéticas. Los ejemplos de los aminoácidos que no se instalan por ribosomas que se pueden usar de conformidad con la presente invención incluyen D-aminoácidos, ß-amino cidos, pseudo glut mato, ?-aminobutirato , ornitina, homocisteína , aminoácidos N-substituidos (R. Simón et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89:9367-71; W091/19735 (Bartlett et al.), patente U.S. 5,646,285 (Baindur) , ácidos aminometilenoxi acéticos a (un isóstero de dipéptido aminoácido-Gly) , y aminooxiácido.s-a ' etc. Los análogos de péptidos que contienen tioamida, amida viniloga, hidrazino, metilenoxi, tiometileno, fosfonamidas , oxiamida, hidroxietileno, amida reducida, isoésteres substituidos de amida reducida, y ß-sulfonamidas se pueden emplear. En particular, el uso de pseudoglutamato es ventajoso ya que la modificación en la cadena R permite la colocación de aductos de polímero con la proteína sintetizada. Similarmente, se pueden emplear aminoácidos de alquil o aril tiol de 2 ó 3 carbones en la cadena Na-substituidos en la terminal N. Se pueden usar ventajosamente tales residuos (en donde estén presentes en la terminación final o polipéptidos) para ligar ese polipéptido con un polipéptido que tenga una porción carboxi tioéster, de conformidad con los métodos de ligación química nativa extendida aquí descritos. En una modalidad, todos los residuos de aminoácidos de la proteína bioactiva sintética se pueden unir juntos por un enlace péptido (esto es un enlace amida) . Alternativamente, se pueden ligar dos residuos de aminoácidos (o los residuos en la terminal C y en la terminal N de los dos polipéptidos) uno con el otro por un enlace no amida (tal como un enlace de tioéster de oxima, un enlace de tioéter, un enlace de disulfuro dirigido, un enlace de tiozolidinina etc.) (Schnólzer, M. y Kent , S.B.H., Science (1992) 256:221-225; Rosé, K. , J. Amer. Chem Soc . (1994) 116:30-33; Englebretsen, D.R. et al., Tetrahedron Lett . 36:8871-8874; Baca, M. et al., J. Amer. Chem Soc. (1995) 117:1881-1887; Liu, C.F. et al., J. Amer. Chem Soc. (1994) 116:4149-4153; Liu, C.F. et al., J. Amer. Chem Soc. (1996) 118:307-312; Dawson, P.E. et al. (1994) Science 266:776-779). La invención permite así una diversidad de modificaciones en el enlace de péptidos, substitutos y reemplazos isoestéricos á explotarse en la preparación de proteínas bioactivas. Las proteínas bioactivas sintéticas de la presente invención, se pueden diseñar para poseer una bioactividad que imita una bioactividad asociada con un mamífero (incluyendo humanos), simios, bovinos, murinos, porcinos, ovinos, equinos etc.), aves o proteínas de peces. Como se usa en la presente, se dice que una primera proteína imita a una segunda proteína, si la primera proteína posee una bioactividad que se modifica, aumenta o atenúa con respecto a la bioactividad de la segunda proteína. Se dice que una bioactividad está asociada con la proteína, si su presencia es directa o indirectamente dependiente de la secuencia de aminoácidos de la proteína. En una modalidad alternativa, las proteínas bioactivas de la presente invención, se pueden preparar completa o parcialmente por ingeniería, sin referencia a alguna contraparte bioactiva natural correspondiente. Las proteínas bioactivas sintéticas preferidas de la presente invención, incluyen receptores, ligandos del receptor de proteínas. Los ejemplos de tales proteínas incluyen el receptor de la hormona adrenocorticotropica y sus fragmentos bioactivos, receptor de la angiotensina, receptor natriurético atrial, receptor de la bradicinina, receptor de la hormona del crecimiento, receptor quimiotáctico, receptor de la dinorfina, receptor de la endorfina, el receptor para la ß-lipotropina y sus fragmentos bioactivos, receptor de la encefalina, receptores del inhibidor de enzimas, el- receptor de la fibronectina, y sus fragmentos bioactivos, receptores de péptidos liberadores de la hormona del crecimiento y gastrointestinal, el receptor para el péptido liberador de la hormona luteinizante , el receptor para la hormona estimuladora de melanocitos, receptor de la neurotensina, receptor opioide, receptor de la oxitocina, receptor de la vasopresina, receptor de la vasotocina, el receptor de la hormona paratiroides y fragmentos, receptor de la proteina cinasa, receptor de la somatostatina, receptor de la substancia P. Las proteínas bioactivas sintéticas de la' presente invención también incluyen enzimas y moléculas estructurales tales como la quitina o colágeno etc. En una modalidad adicional, las proteínas bioactivas sintéticas de la presente invención incluyen citocinas. Las citocinas son protexnas pequeñas o factores biológicos (en el rango de 5-20 kDa) que se liberan por las células y median los efectos específicos en la interacción célula-célula, comunicación y sobre el comportamiento de otras células. Como se usa en la presente, el término citocina pretende incluir interleucinas ("IL) (tal como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, etc.); linfocinas y moléculas de señalización tales como proteínas estimuladoras de la eritropoyesis (por ejemplo, eritropoyetina (EPO) ) , factor de necrosis de tumor (TNF) , interferones , etc., factores de crecimiento tal como el factor de crecimiento de transformación, factor de crecimiento de los nervios, factor de crecimiento derivado del cerebro, neurotrofina-3 , neurotrofina-4 , factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento de células T (TGF, TGF-ß?, TGF- 2, TGF- 3, etc.), factores estimuladores de las colonias (G-CSF, G -CSF, M-CSF etc.), factor de crecimiento epidermal (EGF, LIF KGF, OSM, PDGF, IGF-I, etc.), factor de crecimiento de fibroblastos (ccFGF, ß???, etc.), y hormonas, particularmente hormonas sencillas de péptidos tales como la hormona del crecimiento. Las citocinas y particularmente las citocinas quimiotácticas , también comprenden ejemplos particularmente preferidos de proteínas cuya secuencia de aminoácidos se puede usar para ayudar en el diseño de proteínas sintéticas bioactivas dentro del ámbito de la presente invención. Las citocinas participan en respuestas inmunes adquiridas e innatas directa o indirectamente mediando el reclutamiento de leucocitos, o al servir como señales importantes en la activación de leucocitos que se han acumulado en sitios específicos de la invasión microbiana. Las citocinas pro-inflamatorias, interleucina-1 ß (IL-1 ß) e interleucina-6 , (IL-6) y los mediadores reflejan el reclutamiento y activación de neutrófilos, incluyendo la molécula de adhesión intercelular soluble, interleucina-8 (IL-8) (Kotecha S., European Journal of Pediatrics (1996) 155 Suppl 2:S14-17). La interleucina 6 es una citocina multifuncional involucrada principalmente en la respuesta de fase aguda, diferenciación de células ß y producción de anticuerpos (Akira S, et al: Interleukin-6 in biology and medicine. Adv Immunol (1993) 54:1-78) . Esta citocina se sintetiza y secreta por muchas células diferentes incluyendo monocitos, macrófagos, células T y B, células endoteliales y fibroblastos. La IL-6 se induce a menudo con las citocinas pre inflamatorias TNF alfa y IL-1 en muchas condiciones de alarma, y la IL-6 en circulación juega un papel importante en la inducción de reacción en fase aguda (Xing Z, et al., J. Clin. Invest . (1998) 101(2) :311-20) . Las citocinas que tienen influencia directa o indirectamente en el reclutamiento y activación de leucocitos incluyen TNF-alfa, factores estimuladores de la colonia de granulocitos (G-CSF) , factor estimulador de la colonia de macrófagos granulocitos (GM-CSF9, y miembros de la familia de quimiocina. Las citocinas que regulan predominantemente el estado de la activación de leucocitos incluyen gamma interferón (IFN-gamma) , interleucina-10 (IL-10) , e interleucina-12 (IL-12) . Las citocinas también pueden tener influencia n la depuración microbiana al inducir o regular la expresión de otras moléculas' efectoras, lo cual puede suceder en una forma autocrina o paracrina. Los factores estimuladores de las colonias son citocinas producidas por una diversidad de células mielo y estromales, que se requieren para la proliferación y maduración de células madre hematopoyéticas . Adicionalmente , los estudios muestran que estos factores aumentan las actividades de las células efectoras de las poblaciones de leucocitos maduros. Específicamente el G-CSF, prolonga la supervivencia in vitro de los neutrófilos, aumenta la actividad fagocítica de los neutrófilos y aumenta el choque respiratorio de los neutrófilos (Standiford TJ, Et al., J. Invest. Med. (19097) 45:335-345). En contraste, el GM-CSF promueve la proliferación y maduración de neutrófilos y macrofagos; las. propiedades activadoras de esta citocina se dirigen principalmente hacia poblaciones maduras de macrofagos (Chen GH, et al, J Immuno (1994) 152:724-734). Se han caracterizado ahora 6 subfamilias cercanamente relacionadas de citocinas quimiotácticas referidas como quimiocinas . De estas, los' miembros de al menos dos subfamilias contribuyen a la defensa del hospedador antimicrobiano pulmonar (Mandujano J, et al., Amer. J. Respir. Crit. Care Med. (1995) 151:1233-1238); Baggiolini M, et al., Ann. Rev. Immunol . (1997) 15:675-705). Los miembros de la familia de quimiocinas C-X-C que incluyen IL-8, MIP (proteína inflamatoria de macrofagos) -2 , KC, ENA-78, y NAP-2, tienen actividades estimuladoras y quimiotácticas de neutrófilos predominantes, mientras que la familia C-C que incluye MCP (proteína quimioatrayente del monocito)-!, MCP-2, MCP-3, RA TES , MIP-1 alfa, Y MIP-1 beta, ejerce efectos predominantes guimiotácticos y/o activantes en macrófagos, linfocitos, y eosinófilos . (Huffnagle GB, et al., The Role Of Chemokines In Pneumonía, in Koch A, Strieter R, eds . Chemokines in Disease. Texas: R.G. Landis Co; 1996:151-168).

El gama interferón es una citocina producida por células T (células T alfa, beta y gama delta) y células NK que son instrumentales en la inmunidad mediada por células contra un amplio espectro de patógenos pulmonares. Esta citocina activa diversas funciones de las células efectoras del macrófago, incluyendo la estimulación del choque respiratorio, la capacidad de presentar antígenos, el cebado de la liberación de TNF derivada de macrófagos, y la actividad antimicrobiana de macrófagos aumentada in vitro contra organismos bacterianos, fúngales y micobacterianos . La interleucina-12 es una citocina que promueve las respuestas inmunes del tipo Thl, mientras inhiben las respuestas inmunes del tipo Th2. Específicamente, la IL-12 estimula el desarrollo de células Thl y células NK, e incrementa la actividad citolítica de las células CD8+ y las células NK. De manera más importante, la IL-12 sirve como el inductor principal del IFN-gamma a partir de células T y células NK. En contraste con IL-12, la IL-10 promueve el desarrollo de las respuestas inmunes del tipo Th2 mientras inhibe la inmunidad mediada por células (tipo Thl) (Howard M, et al, J. Clin. Immunol . (1992) 12:239-247). Esta citocina se ha mostrado que ejerce propiedades anti-inflamatorias potentes, en parte al desactivar directamente neutrófilos y macrófagos, y al subregular la expresión del TNF, IFN-gamma y miembros de las familias de quimiocinas C-X-C y C-C. La IL-10 es instrumental en atenuar la producción indeseable de citocinas proinflamatorias en estados de activación celular inmune sistémica. La EPO es un ejemplo particularmente preferido de una proteina, cuya secuencia de aminoácidos se puede usar para ayudar en el diseño de una proteína sintética bioactiva que tiene una actividad estimuladora de la eritropoyesis . La EPO es el factor principal responsable de la regulación de la producción de células de glóbulos rojos durante condiciones de régimen permanente, y para acelerar la recuperación de la masa de células de glóbulos rojos después de la hemorragia (Jelkmann, W. (1992) Physiol. Revie s 72:449; Krantz, S.B. (1991) Blood 77:419; Porter, D.L. and M.A. Goldberg (1993) Exp. Hematol. 21:399; Nissenson, A.R. (1994) Blood Purif .12:6) . La forma en circulación de la EPO humana es una glicoproteína de 165 aminoácidos (aa) con un peso molecular de aproximadamente de 30, 000 (Sawyer, S.T. et al. (1994) Hematol. Oncol . Clinics NA 8:895; Jacobs, .J. et al. Nature (1985) 3133:806; Lin, F-K. et al. Proc . Nati. Acad. Sci . USA (1985) 82:7580). Aunque el ADNc para la EPO predice una molécula con 166 residuos de aminoácidos, se separa la arginina en la terminal carboxi en una modificación post traduccional (12) . Existen tres sitios potenciales para la glicosilación ligada en N y todos se llenan. También está presente una porción de carbohidrato, ligada en O (13) . Los efectos de la glicosilación son complejos. Aunque la EPO derivada de E.coli no glicosilada muestra una actividad biológica completa in vitro, la glicosilación es aparentemente necesaria para actividad completa in vivo, Así, la EPO naturalmente derivada desglicosilada y producida por E.coli, muestra muy baja actividad en estudios animales (Krantz, S.B. (1991) Blood 77:419; Sasaki, H. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:12059; Lowy, P.H. et al. (1960) Nature 185:102; Wojcho ski, D.M. et al. Biochem. Biophys . Acta 910:224; Dordal , M.S. et al. (1985) Endocrinology 116:2293).

Consistente con lo anterior, los patrones variables de glicosilación muestran efectos variables. Por ejemplo, la EPO desialilada muestra una actividad in vitro aumentada y disminuida in vivo, un efecto atribuido a la exposición de los residuos de galactosa que se reconocen, enlazan y depuran por los hepatocitos (Spivak, J.L. and B.B. Hogans (1989) Blood 73v:90; Goldwasser, E. et al. (1974) J. Biol. Chem. 249:4202). El patrón de ramificación de la- EPO completamente sialada también hace una diferencia en la actividad biológica. Predominantemente la EPO ramificada tetra antenaria muestra una actividad equivalente con la EPO estándar, mientras que la EPO ramificada predominantemente bi-antenaria muestra tres veces más actividad in vitro pero solamente un 15% de la actividad normal in vivo (Takeuchi, M. et al. (1989) Proc . Nati. Acad. Sci . USA 86:7819). Los estudios han indicado que solamente los azúcares ligados en N y no los ligados en 0 son importantes en el funcionamiento de la EPO (Higuchi, . et al. (1992) J. Biol . Chem. 267:770319). Los factores estimuladores de la colonia y los RANTES también comprenden ejemplos particularmente preferidos de proteínas cuya secuencia de aminoácidos se puede usar para ayudar en el diseño de una proteína sintética bioactiva dentro del ámbito de la presente invención.

B. Protexnas y Polipeptidos Modificados con Polímeros.

Un segundo atributo de la presente invención, se refiere a la capacidad de modificar una proteína o polipéptido para contener uno o más aductos de polímeros estructuralmente definidos en posiciones preseleccionadas . Aunque se han descrito previamente las proteínas modificadas con polímeros, la naturaleza y forma de las modificaciones posibles de polímeros de la presente invención, difieren marcadamente de tales esfuerzos previos. Ya que las proteínas sintéticas bioactivas de la presente invención se sintetizan químicamente, completas o en parte, es posible sintetizar tales proteínas en una forma que permitirá que se enlacen covalentemente polímeros (tales como polímeros o azúcar, polietilenglicol , glicoles, ácido hialurónico etc.), a uno o más sitios particulares definidos por el usuario y seleccionados por el usuario en un polipéptido de una estructura de proteínas. Además, la producción sintética de las proteínas en la presente invención, permite asegurar que tales modificaciones estén presentes en cada uno de los sitios definidos por el usuario y seleccionados por el usuario de cada molécula en preparación. Tal uniformidad y control de la síntesis hace diferente notablemente a la presente invención de las modificaciones aleatorias permitidas para el uso de los métodos del arte previo. Significativamente, la presente invención permite diseñar una proteína sintética en la cual se puede derivar algún residuo no crítico para que contenga un aducto de polímero. Además, para cada sitio definido por el usuario y seleccionado por el usuario, el usuario puede definir la ligadura precisa (amida, tioéster, tioéter, oxima, etc.) a través de la cual se enlazarán tales aductos al polipéptido o a la estructura de proteínas. Adicionalmente, los aductos particulares del polímero deseado para estar presente en un sitio particular se pueden variar y controlar, tal que se obtenga una preparación final en la cual cada proteína o polipéptido presente contenga precisamente los mismos aductos derivados en los sitios iguales derivados precisamente. Así, la presente invención permite la formación de preparaciones homogéneas de polipéptidos modificados con polímeros y proteínas. Además de suministrar un medio para variar la posición y número de los sitios de colocación a los cuales se puede enlazar un polímero, la presente invención permite variar la naturaleza del polímero enlazado. Los aductos de polímero que se pueden incorporar dentro de algún sitio particular definido por el usuario y seleccionado por el usuario pueden ser de cualquier longitud definida. Similarmente , consistente con los métodos de la presente invención, es posible emplear polímeros de longitudes diferentes en sitios diferentes. Así en una modalidad, las proteínas bioactivas sintéticas de la presente invención se pueden mono-modificar o poli-modificar con un aducto de polímeros. En donde se introduce más de un aducto de polímero en un polipéptido o proteína particular, los polímeros empleados pueden ser mono-especiados, poli-especiados o uniformemente especiados o diversamente especiados. Como se usa en la presente, el término mono-especiado pretende referirse a un polipéptido o proteína que sea modificado por una especie sencilla de polímeros. En contraste, el término poli-especiado pretende referirse a un polipéptido o proteína que sea modificado por más de una especie sencilla de polímero. Tal polipeptido o proteína poli-especiado se dice que está uniformemente especiado si, en cada sitio modificado del polipéptido o proteína, está presente la misma especie sencilla del polímero. En contraste, un polipéptido o proteína poli-especiado se dice que está diversamente especiado si los sitios modificados del polipéptido o protelna se modifican con especies diferentes del polímero. Además, es posible variar el grado de la línealidad de ramificación del aducto del polímero en cada uno de los sitios definidos por el usuario y seleccionados por el usuario. Así los aductos de polímero pueden ser lineales ramificados o uniformemente ramificados. El término "uniformemente ramificado" pretende significar que todas las ramificaciones de un polímero en un sitio particular tienen la misma estructura y longitud. Como se apreciará, la presente invención permite variar independientemente la longitud de una ramificación individual así como la estructura del polímero presente en tal punto de ramificación. En suma, la presente invención permite definir (1) la ubicación y (2) la frecuencia de los sitios definidos por el usuario y seleccionados por el usuario, modificados con polímero en una estructura de polipéptido o de proteína así como controlar (3) la longitud, (4) especie, y (5) grado de ramificación presente en cada uno de tales sitios. Adicionalmente , con respecto al polipéptido y a las proteínas que tienen modificaciones múltiples del polímero, la presente invención permite definir independientemente cada una de las cinco variables antes identificadas para cada sitio. Además, con respecto a los polipéptidos y proteínas que tienen modificaciones de polímeros ramificados, la presente invención permite definir independientemente cada una de las cinco variables antes identificadas para cada punto de ramificación. Así, la presente invención proporciona una flexibilidad substancial de modificación de polímero.

C. Suministro de Proteínas y de Péptidos. Los polipéptidos y proteínas bioactivos sintéticos modificados con polímero opcionalmente de la presente invención, se pueden emplear como agentes farmacéuticos para efectuar el tratamiento de enfermedades y condiciones. Más preferiblemente, cuando se administran a un paciente o individuo que necesita de terapia, tales polipéptidos y/o proteínas bioactivas sintéticas · se administrarán usando un sistema de suministro de fármacos. Los usos de tal sistema permiten que un fármaco se presente al paciente en una forma que lo haga aceptable para ellos y permita la efectividad de la bioactividad deseada. Los propósitos de la presente invención, sistemas de suministros de fármacos preferidos, incluyen sistemas capaces de administrar polipéptidos o proteínas por vías oral, nasal, o de inhalación, intramuscularmente, subcutáneamente, transdermalmente, intravenosamente, intrauralmente, o intraocularmente . Tales sistemas de suministros de fármacos pueden incluir formulaciones que suministran una liberación específica del sitio, o que aumentan la protección para la mucosa intestinal. Las formulaciones adecuadas incluyen formulaciones de polvo seco, encapsulacion de partículas virales por medio de suministro, encapsulacion de liposomas, parches transdermales, transporte eléctricamente ayudado (terapia de electroporación) y conjugación de polímero/niazona . · En una modalidad preferida, tales dispositivos de suministro de fármacos responderán a cambios en el entorno biológico y suministrarán o cesarán de suministrar-fármacos basados en estos cambios. Se han empleado un rango de materiales para controlar lá liberación de fármacos y otros agentes activos: poliuretanos, poli-siloxanos , poli (metilmetacrilato) , alcohol de polivinilo, para capacidad hidrofílica y resistencia, polietileno, polivinilpirrolidona, poli (2-hidroxi etilmetacrilato) , poli (n-vinilpirrolidona, poli-metilmetacrilato, alcohol de polivinilo, ácido poliacrilico, poliacrilamida, poli (etileno-co-acetato de vinilo) , polietilenglicol , poli-ácidometacrílico etc.. En una modalidad adicional preferida, se emplearán polímeros biodegradables para facilitar el suministro del fármaco. Tales polímeros incluyen polilacturos (PLA) , poliglicólidos (PGA) , polilacturo-co-glicólidos (PLGA) , poli -anhídridos y poliortoésteres . Los dispositivos y métodos de suministro de fármacos para su uso se describen en la patentes de E.U.A. 6,072,041; 6,041,253; 6,018,678; 6,017,318; 6,002,961; 5,879,712; 5,849,331; 5,792,451; 5,783,212; 5,766,633; 5,759,566; 5,690,954; 5,681,811; 5,654,000; 5,641,511; 5,438,040; 4,810,499; y 4,659,558.

III. Producción de Proteínas Bioactivas Sintéticas. La producción de las proteínas sintéticas bioactivas de la presente invención, se pueden vislumbrar por tener las siguiente etapas o componentes: diseño, síntesis, ligación de péptidos, plegado de proteínas, evaluación de la bioactívidad, modificación del polímero de la estructura de polipéptido (figura 2) .

A. Diseño de las Proteínas Bioactivas Sintéticas Preferidas . ¦ En una modalidad particularmente preferida, las proteínas bioactivas sintéticas de la presente invención, serán una proteína estimuladora de la eritropoyesis . Como se usa en la presente, una proteína estimuladora de la eritropoyesis , es una proteína que media la producción de células de glóbulos rojos. La bioactividad estimuladora de la eritripoyesis de una proteina se puede determinar por cualquiera de diversos medios tal como por la siguiente eritropoyesis después de una administración in vivo, al ensayar la capacidad de la proteina para mediar la proliferación de líneas celulares dependientes de la EPO etc.

Una proteína estimuladora de la eritropoyesis preferida es mamífera, más preferiblemente humana, EPO y sus análogos. La eritropoyetina se sintetiza predominantemente y se secreta por las células intersticiales, y endoteliales , capilares, tubulares, y yuxtatubulares del riñon. La enfermedad crónica del riñon provoca la destrucción de células productoras de EPO en el riñon., La carencia resultante de EPO frecuentemente induce a anemias. El uso clínico principal de la EPO es por lo tanto el tratamiento de pacientes con insuficiencia severa del riñon (hematocrito debajo de 0.3) que reciben usualmente transfusiones así como el tratamiento de pacientes anémicos después de la quimioterapia. Típicamente, la EPO se sintetiza de forma recombinante en célula de ovario de hámster para su uso clínico. La EPO es una proteína ácida estable relativamente al calor y al pH (pl=4.5) de residuos de 165 aminoácidos en su forma madura. La EPO transforma su actividad a través del receptor de EPO. Aproximadamente el 40% de la masa molecular de la EPO se debe a su glicosilación . La glicosilación es un factor importante que determina el comportamiento fármacocinético de la EPO en vivo. La EPO no glicosilada tiene una vida media biológica extremadamente corta. Se enlaza todavía a su receptor y puede tener aún una actividad específica superior in vitro. Sin embargo, los experimentos recientes han demostrado que la PEGilación de la EPO aumenta significativamente su tiempo de vida, pero disminuye significativamente la actividad EPO en un sistema de ensayo basado en células. Las proteínas sintéticas estimuladoras de la eritropoyesis ("SEP") de la presente invención,' son preferiblemente análogos sintéticos químicamente modificados de la EPO urinaria humana. En una modalidad preferida, contienen una o más porciones de polímero (más preferiblemente porciones pPEG) colocadas a uno o más residuos de péptidos a través de un tioéter, oxima, amida . u otra ligadura. En una modalidad altamente preferida, tales ligaduras estarán en una o más de las posiciones que se glicosilan naturalmente en la EPO urinaria humana (esto es posiciones 24, 38, y 126). Más preferiblemente, las moléculas SEP tendrán porciones de pPEG en dos o más de tales posiciones. En, una modalidad alternativa, se pueden modificar otros residuos de proteína por porciones de polímeros. Las posiciones de modificación para las proteínas bioactivas sintéticas de la presente invención incluyen residuos localizados en un circuito, región, o dominio desordenado de la proteína, o en o cerca de los sitios del desdoblamiento potencial de las proteasas . Por ejemplo se pueden introducir modificaciones del polímero en una o más de las posiciones de la EPO. El peso molecular total de las moléculas SEP de la presente invención puede variar desde alrededor de 25 hasta alrededor de 150 kDa y más preferiblemente de alrededor de 30 hasta alrededor de 80 kDa. Se puede controlar el peso molecular al incrementar o disminuir el número y estructura del polímero (tal como pPEG) utilizado para la modificación de un análogo dado. El PM hidrodinámico mediado por pPEG para los constructops más grandes es superior a alrededor de 100 kDA. Los ensayos in vitro en células que expresan el receptor humano de EPO, indican que los SEP de la presente invención tienen un ED50 que es equivalente a aquél de la EPO humana glicosilada producida de forma recombinante . Los análogos pPEG ligados a oximas se construyen preferiblemente al colocar un pPEG funcionalizado con aminoxicetona o aldehido a la proteína SEP en un aminoácido codificado no naturalmente ¦ que soporta una f ncionalidad cetona o aldehido con aminooxi de cadena lateral. Por ejemplo las posiciones 89 y 117 de SEP-0 y 1, contienen pseudo glutamatos (un aminoácido codificado no naturalmente que soporta una cadena lateral de la fórmula -CHcc-CH2-S-COOH (en comparación con la cadena lateral de glutamato -CHa-CH2-CH2-COOH) ) . Los análogos SEP que utilizan ligaduras de tioéter se construyen preferiblemente para contener una funcionalidad de tiol suministrada por una cisteína o un aminoácido no natural con una cadena lateral que soporta el tiol. La Figura 3 detalla la estructura básica de un tipo de proteínas sintéticas estimuladoras de la eritropoyesis preferidas. En una modalidad alternativa, las moléculas SEP de la presente invención pueden comprender análogos de EPO "permutado circuíármente" en los cuales las terminaciones amino y carboxi naturales del EPO se han re-localizado. Más preferiblemente, tal re-localización moverá las terminaciones amino y carboxi a las posiciones de baja restricción estructural tal como circuitos desordenados etc. El circuito desordenado alrededor de las posiciones 125 y 126 (con relación al sistema de numeración de residuos EPO nativos) es un ejemplo de tal sitio de re-localización. Más preferiblemente, tal SEP estará libre de bisulfuro, y se modificará químicamente para contener porciones de polímero en los residuos pre-seleccionados . Alternativamente, las moléculas SEP pueden tener terminaciones amino y carboxi re-localizadas a un sitio de glicosilacion que se presenta naturalmente, o a otros sitios posibles de glicosilacion tal como la posición 125 y 126. Las moléculas SEP también pueden incluir modificaciones de las terminaciones amino y carboxi para eliminar o modificar la carga (tal como por amidación carboxi etc) . En un ejemplo preferido de tales moléculas permutadas circuíármente, se suministran nuevas terminaciones N y C por las posiciones 125 y 126 respectivamente. La cisteínas naturales formadoras de bisulfuro en las posiciones 7, 29, 32 y 161, se reemplazan preferiblemente por el aminoácido que no codifica naturalmente al ácido L-a-N-butxrico (Aba) , que no puede formar puentes de bisulfuros.. Los residuos R166, E37 y V82 se reemplazan preferiblemente con alaninas para mejorar la producción. También se inserta preferiblemente una cisteína adicional entre las posiciones 1 166 con relación al esquema EPO nativo, que se numera debajo como "0". La molécula resultante contiene cuatro cisteínas (en las posiciones 126, 0, 38, y 83 (como se lee en la dirección de la terminal N a la C) , que se utilizan como (1) sitios de ligación y (2) sitios de colocación de pPEG formadores de tioéter. Opcionalmente , una cisteína puede reemplazar el A125 para proporcionar un sitio de colocación adicional de pPEG. El peso molecular total de tales moléculas SEP de la presente invención, puede variar desde alrededor de 25 hasta alrededor de 150 kDa, y más preferiblemente desde alrededor de 30 hasta alrededor de 80 kDa. El peso molecular se puede controlar al incrementar o disminuir el número y estructura del polímero (tal como pPEG) utilizado para la modificación de un análogo dado. El PM hidrodinámico mediado por pPEG para los constructos más grandes es superior a 100 kDa. Los sitios de colocación opcionales de pPEG se localizan en las posiciones 125, 9, y 24 (como se lee en la dirección de la terminal N a la C) . Los diseños análogos adicionales de SEP tienen terminaciones alternativas N y C en la región desordenada de circuito y/o en los residuos truncados de las nuevas terminaciones N y/o C. La estructura básica de las moléculas permutadas preferidas circularmente se muestra en la Figura 4. En una modalidad alternativa, las proteínas sintéticas bioactivas de la presente invención, son un mamífero, más preferiblemente C-GSF humano. El G-CSF induce la proliferación rápida y liberación de granulocitos neutrofílieos al torrente sanguíneo, con lo cual se suministra un efecto terapéutico al combatir la infección. La proteína humana G-CSF tiene 174 aminoácidos de longitud (patente EP 0459630 (Cambie, R. et al.), y variantes de su secuencia se han aislado. La proteína tiene cuatro residuos de cisteína y un sitio de O-glicosilación en la posición de treonina 133. En una modalidad de tales moléculas sintéticas GCSF, la secuencia de aminoácidos de la molécula se alterará con relación a la secuencia del GCSF nativo de manera de contener residuos hidrofóbicos naturales, o más preferiblemente no naturalmente codificados, en una o más de las posiciones 1, 2, ó 3. Opcionalmente , tales moléculas se modificarán además para contener unos residuos hidrofóbicos adicionales naturales, o más preferiblemente no naturales codificados en la posición 5 de GCSF o en las posiciones 173 y/o 174. En una modalidad adicional preferida, las moléculas sintéticas GCSF serán modificadas con polímero (preferiblemente pPEG) en una o más de las posiciones 63, 64 y/o · 133 y/o en una o más de las posiciones 1 y 174. Los polímeros pPEG pueden ser lineales o ramificados, cargados, sin carga o mezclados, y pueden tener un intervalo de peso molecular desde alrededor de 5 alrededor de 80 kDa, y más preferiblemente de alrededor de 40 alrededor de 70 kDa de PM total de pPEG en contribución dependiendo del número y estructura de los pPEG utilizados para modificación. El radio hidrodinámico muestra un efecto superior de PM in vivo (por ejemplo, un pPEG ramificado de 10 kDa muestra un PM efectivo de alrededor de 55 kDa) . El PM hidrodinámico estimado mediado por pPEG es superior a 100 kDa. Para los análogos que utilizan la ligadura de oxima, el pEPG se coloca preferiblemente a los residuos codificados no naturalmente que soportan una funcionalidad de cadena lateral aminoxi , cetona o aldehido. Para los análogos que utilizan la ligadura de tioéter, el pPEG se coloca preferiblemente a un aminoácido de cisteína o no natural con una cadena lateral que soporta un tiol . Para los análogos que utilizan la ligadura de amida, el pPEG se coloca a un aminoácido natural o no natural que soporta una amida de cadena lateral reactiva . La estructura básica de las proteínas sintéticas bio-activas de GCSF se muestra en la Figura 5. En la Figura "J" designa un residuo no codificado naturalmente que tiene una cadena lateral hidrofóbica. La bio-actividad de tales proteínas sintéticas bio-activas GCSF se puede ensayar por medios convencionales, tales como por el ensayo de su capacidad para mediar la proliferación de una línea celular humana o de ratón dependiente del factor (por ejemplo línea celular NFS60) , o al medir la estimulación de neutrófilos, vida media e inmunogenicidad in vivo, ya sea con o sin un sistema de entrega dirigido a una vida media/liberación de más de 20 días) . En una modalidad alternativa, las proteínas sintéticas bio-activas de la presente invención son de un mamífero, más preferiblemente quimiocina humana, RANTES. La RANTES bloquea la entrada de las cepas de VIH M-trópicas a través del receptor primario CCR5 , y también sub-modula las trayectorias de inflamación involucradas en el asma, rechazo de transplante y cicatrización de heridas (Kalinkovich A, et al., Immunol Lett . (1999) 68:281-287). Las moléculas RANTES sintéticas de la presente invención, difieren preferiblemente de la quimiocina RANTES en estar químicamente modificada de manera tal que: (1) la serina N terminal encontrada en la posición 1 de RANTES 1-68 se substituye con un grupo n-nonanoilo ( "NNY" ) , Y (2) la tirosina en la posición 3 se substituye con un aminoácido no codificado naturalmente que tiene una cadena lateral hidrofóbica. Se ha encontrado que tales compuestos son extremadamente potentes, que poseen un ED50 en el rango de pM, comparado con el rango de mM para el "Met -RANTES 1-68" recombinante . Los análogos potentes de RANTES se han creado para tener uno o más cambios adicionales a . aquellos antes observados, tales como el reemplazo de la prolina en la posición 2 con un aminoácido que no se codifica naturalmente que tiene una cadena lateral hidrofóbica, y por la colocación de un ácido graso a la terminación C de la molécula. Se ha mejorado la especificidad del receptor en combinación con la potencia por modificaciones a la región del circuito N que corresponde a los residuos RANTES 12-20. En una modalidad adicional preferida, las moléculas sintéticas RANTES de la invención incorporan una porción de- polímeros (tal como pPEG, o nonanoilo ("NNY") o Y3X en su terminación N o C para mejorar inter alia la vida media in vivo. La porción de pPEG se coloca preferiblemente a través de una ligadura de oxima a un aminoácido que no se codifica naturalmente, que se introduce en la posición 66, 67, 68 o un ligador en la posición 68, con preferencia a la posición 67. El ácido graso se coloca preferiblemente a través de una ligadura de oxima (preferiblemente a través de un ligador) al residuo 68 tal como un ligador de di o tri péptido de amino-oxi modificado con aminoácido. Se pueden emplear alternativamente otras químicas de colocación. El peso molecular de los constructos más grandes de tales análogos RANTES sintéticos es desde alrededor de 25 kDa hasta alrededor de 45 kDa dependiendo de la naturaleza y estructura de la colocación del pPEG, y para los constructos más grandes tiene un PM hidrodinámico mediado de pPEG de más de 60 kDa. La estructura de los análogos RANTES sintéticos preferidos se muestra en la Figura 6.

B. Modificación de polímero específica y definida de las proteínas y péptidos sintéticos bio-activos. Un aspecto adicional de la presente invención, se refiere a porciones químicas y polímeros, en particular polímeros solubles en agua, y su uso para modificar proteínas de manera de producir fármacos de proteínas con propiedades mejoradas con relación a la proteína no modificada. Los efectos benéficos anticipados de tal modificación incluyen pero no se limitan a (a) una potencia mejorada (b) un tiempo de vida más extendido del fármaco de proteína en circulación, debido a una estabilidad proteolítica creciente y tasas reducidas de depuración, (c) inmunogenicidad reducida y (d) posiblemente un direccionamiento diferencial comparado con la molécula no modificada. Como se discutió anteriormente, aunque se ha empleado el polietilenglicol para modificar proteínas (ver por ejemplo, patente E.U.A 6,027,720, Kuga et al., que se relaciona con la modificación de residuos de lisina de G-CSF para permitir la colocación de moléculas de polietilenglicol por medio de grupos amina reactivos) , tales modificaciones se asocian con la heterogeneidad molecular y la diversidad molecular. Como se usa en la presente, el término heterogeneidad molecular pretende referirse a una variación en el número de moléculas de polímero colocadas a cada proteína de una preparación de proteínas. El término diversidad molecular pretende referirse a (a) una variación en los sitios de la proteína que se modifican por el polímero, (b) una variación en la longitud de los aductos de polímero de sitios diferentes de la misma proteína, o de los mismos sitios en proteínas diferentes de una preparación de proteínas o (c) una variación en el grado y/o naturaleza de cualquier ramificación de los aductos de polímero de sitios diferentes de la misma proteína, o de los mismos sitios en proteínas diferentes de una preparación de proteínas. Como se usa en la presente, el término "molecularmente homogéneo" pretende referirse a una preparación de una proteína en la cual todas las moléculas de proteína contienen la secuencia de aminoácidos y las mismas modificaciones de polímero en las mismas posiciones . Una mezcla de dos o más preparaciones de proteína "moleculármente homogéneas" se refiere en la presente como una preparación "molecularmente definida" . De conformidad con este aspecto de la invención, una solución a los problemas antes identificados de heterogeneidad de polímero, diversidad e inadecuabilidad involucra la producción de una nueva clase de polímeros biocompatibles que combinan las ventajas de ambos polipéptidos (longitud precisa, síntesis conveniente) y "pPEG" ( "PEG de precisión"), un polímero no in unogénico, anfifílico, flexible no susceptible a las proteasas) Rose, K. et al., (solicitud de patente E.U.A número de serie 09/379,297, que se incorpora en la presente como referencia). Esta nueva clase de polímero bxocompatible tiene la fórmula: - [CO-X-CO-NH-Y-NH] n-n es un entero, preferiblemente de 1-100 y más preferiblemente 2-100, en donde X e Y son elementos de repetición biocompatibles de la estructura precisa ligada por un enlace amida. Preferiblemente, X e Y serán radicales orgánicos bivalentes que carecen de grupos funcionales reactivos o están ausentes y son iguales o diferentes, y pueden variar independientemente en cada unidad de repetición (n) . Preferiblemente, cuando n es igual a 2, al menos uno de X o Y se seleccionaran del grupo que consiste de un grupo aromático y alifático lineal y ramificado substituido, no substituido. Más preferiblemente, al menos uno de X o Y, los radicales orgánicos divalentes, se seleccionarán del grupo que consiste de fenilo, una porción de alquileno QL-CIO, un grupo alquilo C1-C10, un fenilo que contiene un heteroátomo, una porción de alquileno Ci-C10 que contiene un heteroátomo, un grupo alquilo C^-Cio que contiene un heteroátomo y una combinación del mismo. Las porciones pPEG particularmente preferidas tienen las fórmulas: - {C0- (CH2) 2-C0- NH- (CH2) 3- (0CH2CH2) 3-CH2-NH}n- en donde n varía preferiblemente de 1-100 y más preferiblemente de 2-100; o -{CO (CH2) 2-CO-NH- (CH2) s-NH-C0- (CH2) 2-C0- H- (CH2) 3- (OCH2CH2) 3-CH2- NH-}n-, en donde n varía preferiblemente de 1-50 y más preferiblemente de 2-50. Tales porciones de pPEG se pueden sintetizar en cualquiera de una diversidad de formas. Tales porciones se producen preferiblemente sin embargo, usando un ensamble de unidades en fase sólida de cadena por etapa más que un proceso de polimerización. El uso de tal proceso de ensamble permite que las porciones de una preparación tengan una estructura definida y homogénea en cuanto a su longitud, la naturaleza de su substituyente X e Y', las posiciones de los puntos de ramificación (si hay algunos) y la longitud, substituyentes X e Y y las posiciones de cualquiera ramificaciones . Preferiblemente, tales porciones se sintetizarán por etapas tales como: (a) acilar el grupo amino o hidroxilo de un compuesto de la fórmula Z-Q- soporte con un exceso molar de un derivado de un diácido que tiene la fórmula, H00C-X- COOH, donde Z es ¾N- o HO- ; Q es un ligador o una molécula objetivo; y el soporte es una matriz o superficie en fase sólida; (b) activar el grupo carboxilo libre del producto de la etapa (a) ; (c) aminolisar el producto de la etapa (b) con un exceso molar de una diamina que tiene la fórmula NH2-Y-NH2; (d) repetir opcionalmente las etapas (a) - (c) usando HOOC- X-COOH y NH2-Y-NH2, en donde X e Y son radicales orgánicos divalentes o están ausentes, o son iguales o diferentes y pueden variar independientemente con cada una de las unidades opcionalmente repetidas, y son iguales o diferentes de los substituyentes X e Y usados en cualquiera de las etapas previas de acilación y aminolización . En las modalidades preferidas, se emplean 6-meros, 12-meros, 18-meros y 32-meros de las unidades de repetición anteriores. En donde se desea, la unidad de repetición se puede usar por ejemplo en conjunto con el grupo amino de la lisina para formar estructuras ramificadas de pPEG. El pPEG se puede colocar a las proteínas sintéticas de la presente invención por una diversidad de químicas incluyendo tioéter, formación de ligaduras, oxima y amida. En una modalidad, el ensamble de cadena por etapas de fase sólida de las unidades comprende: Etapa 1 : Un diácido de acoplamiento protegido o . no protegido para el amino en la resina, para generar un enlace amida en el sitio de la ligadura (en donde PG es un grupo protector que está presente o ausente dependiendo del diácido empleado) : PG-OOC-X-COOH + NH2-Y-NH-Resina Etapa 2 : Separar el grupo protector (PG) de la resina si está presente HOOC-X-CO-NH-Y-NH-Resina Etapa 3 : Diamino de acoplamiento protegido o sin proteger al carboxi en la resina para generar un enlace amida en el sitio de ligación (en donde PG está presente o ausente dependiendo del amino empleado) PG-NH-Y-NH + HOOC-X-CO-NH-Y-NH-Resina Etapa 4: Remover el grupo protector PG en las resinas si está presente -NH-Y-NH-OC-X-CO-NH-Y-NH-Resina Etapa 5: Repetir las etapas 1-4 *n' veces para agregar ln' unidades y después desdoblar de la resina - [CO-X-CO-NH-Y-NH] - [CO-X-CO-NH-Y-NH] - [CO-X-CO- H-Y-NH] - [CO-X- CO- H-Y-NH] - Como se discutió, los constructos lineales y ramificados de pPEG son polímeros solubles en agua preferidos para la colocación a moléculas bioactivas sintéticas de la invención. Los pPEG empleados soportan grupos colgantes que se cargan o son neutros bajo condiciones fisiológicas , y se pueden hacer para variar en la química de colocación, longitud, ramificación y solubilidad dependiendo de la estructura pPEG que se emplee. Como se observa arriba, los pPEG preferidos de la invención comprenden una poliamida soluble en agua que tiene la unidad de repetición -CO-X-CO-NH-Y-NH-, en donde uno de ambos de X e Y comprenden una unidad de repetición soluble en agua, y más preferiblemente una unidad de repetición basada en PEG. Aunque las oligoureas son en principio accesibles usando un procedimiento de fase sólida simple de dos etapas como se muestra debajo para el caso de la resina amino, NH2-Resina y una diamina simétrica NH2-Y-NH2: Activación con carbonildiimidazol ? im-CO-NH-Resina Aminólisis con la diamina NH2-Y-NH2 ? N¾-Y-NH-C0-NH- Resina en donde estas dos etapas se pueden repetir diversas veces para dar una oligourea con una unidad de repetición -NH-Y-NH-CO-, este método es el menos preferido. Esto se debe a que los rendimientos de las etapas anteriores pueden no ser cuantitativos a temperatura ambiente, aun con excesos muy grandes de reactivos y tiempos de reacción largo. De esta manera, es preferible usar un procedimientos de tres etapas en fase sólida, que se muestra a continuación para el caso de una resina amino NH2-Resina, para formar una poliamida. Los reactivos H02C-X-C02H y NH2-Y-NH2 deben ser simétricos con objeto de evitar productos isoméricos. Acilación con el diácido H02-C-X-C02H ? H0-CO-X-C0-NH- Resina Activación con carbonildiimidazol ? im-CO-OCO-X-CO- H- Resina Aminólisis con diamina N¾-Y-NH2 ? NH2-Y-NH-C0-X-C0-NH- Resina Estas tres etapas se pueden repetir en secuencia varias veces para dar una poliamida con la unidad de repetición - H-Y-NH-CO-X-CO- . El polímero contiene un número preciso de unidades de monómero, X e Y se pueden variar independientemente en cada etapa, y se pueden escoger a voluntad los grupos finales. Por ejemplo, al usar el anhídrido succínico ("Succ") para la etapa de acilación y 4 , 7 , 10-trioxa-l , 13-tridecanodiamina (también referido como "EDA" o "TTD" ) para la etapa de aminólisis, se forman polaimidas de base PEG en donde X es -CH2CH2-, Y es -NH-CH2CH2CH2- (OCH2CH2) 3-CH2- H- y la unidad de repetición es -NH-CH2CH2CH2- (OCH2CH2) 3-CH2-NH-COCH2CH2CO- . A pesar de que el hecho de que el procedimiento involucre reactivos divalentes sin grupos protectores, el reticulado no es un problema cuando se usan enzimas de síntesis de péptidos comerciales estándar (Rose et al., (solicitud de patente E.U.A No. 09/379,297); y Rose et al., J. Am. Chem. Soc . (1999) 121:7034), excepto como se observa a continuación para el caso de núcleos ramificados de Lys para hacer constructos ramificados. Por ejemplo, los constructos ramificados de pPEG se pueden hacer de una forma similar como para los constructos del "quimiocuerpo" descritos en Rose et al., (solicitud de patente de E.U.A No. De serie 09/379,297) y Rose, K. y Vizzavona, J. (J. Am. Chem. Soc. (1999) 121:7034). Así, se pueden hacer constructos ramificados de pPEG para tener un núcleo de ramificación tal como un grupo de ramificación de lisina, que se acopla a través de los ligadores de oxima a una poliamida preferida soluble en agua tal como - (C0CH2CH2C0-NH-C¾CH2CH2- (OCH2CH2)3-CH2-NH) n- . Por ejemplo, se pueden formar fácilmente enlaces de oxima entre un grupo aminooxiacetilo sobre una cadena lateral Lys en la otra extremidad de la poliamida, y grupos glioxililo en un núcleo de lisina, por ejemplo el núcleo tetramérico (0=CHCO) 4Lys2Lys- . Así, un ligador de oxima fuera de cada punto de ramificación de lisina se puede preparar como la estructura Lys (COCH2ON=CHCO- ) amida- . Una construcción alterna puede colocar el enlace de oxiraa entre la poliamida y el grupo colgante libre de la poliamida, usando preferiblemente una diamina mono-protegida y una desprotección después del acoplamiento de la poliamida, para generar un constructo ramificado tetravalente detallado a continuación: [0=GHC0- (NH-CH2CH2CH2- [0CH2CH2] 3-CH2-NH-COCH2CH2CO- ) n] 4Lys2Lys- Se puede usar la química de oxima para hacer no solamente constructos ramificados diméricos y tetraméricos , sino también adecuada para ensamblar constructos octaméricos ramificados (Rose K. , J. Am. Chem. Soc . (1994) 116:30; Rose, K. et al., Bioconj . Chem. (1996)7:552). Es por supuesto posible usar otras químicas para tales propósitos cuando se usan tales poliamidas pPEG (ver por ejemplo, Figura 7) . Además, se puede incorporar la formación de poliamidas dentro de un esquema sintético para la síntesis de péptidos que involucran química Boc o Fmoc, pero cuando se elaboran tales esquemas se debe tener en mente que la etapa de aminólisis removerá el grupo Fmoc y removerá la protección de formilo del indol si se va a usar la química Boc. De esta manera, tal pPEG se puede hacer para que tenga diversos núcleos de ramificación (por ejemplo, núcleo de ramificación de lisina etc.) ligado a través de un enlace de elección (por ejemplo, amida, tioéter, oxima, etc.) a una poliamida soluble en agua lineal (por ejemplo, - (Succ-TTD) n- , etc.), en donde el extremo libre de cada poliamida lineal soluble en agua se puede cerrar con un grupo colgante deseado (por ejemplo, carboxilato, amino, amida, etc.) para suministrar una carga deseada. Además, los pPEG lineales y ramificados de la presente invención se pueden hacer para comprender un grupo funcional único para la colocación de una proteína sintética que soporta uno o más grupos funcionales mutuamente reactivos y únicos, y los grupos colgantes de los pPEG serán preferiblemente no antígenos (ver por ejemplo Figura 7) . Todas las publicaciones o solicitudes de patente mencionadas en esta especificación, se incorporan en la presente como referencia al mismo grado, como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera específica e individualmente indicada para incorporarse como referencia. La discusión de los antecedentes de la invención en la presente se incluyen para explicar el contexto de la invención. Esto no se debe tomar como una admisión de que cualquier material referido se publicó, conoce, o es parte del arte previo o de un conocimiento general común en cualquier parte en el mundo a partir de la fecha de prioridad de cualquiera de las reivindicaciones . Habiendo descrito ahora generalmente la invención, se entenderá la misma más fácilmente a través de la referencia a los siguientes ejemplos que se suministran a manera de ilustración y que no se pretende que limiten la presente invención a menos que se especifique . Ejemplo 1 Síntesis de la proteína sintética SEP-0 estimuladora de la eritropoyesis . Se sintetizó una protelna sintética estimuladora de la eritropoyesis (SEP) . La secuencia de la protelna sintetizada de longitud completa (designada "SEP-0 (1-66) " es: APP LICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EHCSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LV SSQPW^ LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK AIS PPDAASAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR (SEQ ID NO: 1) en donde ? denota un residuo de aminoácido no nativo que consiste de una cisterna que está carboximetilada en el grupo sulfihidrilo . La proteína SEP-0 se sintetizó en solución a partir de cuatro segmentos de polipéptido: Segmento SEP-0 : 1 (GRFN 1711; compuesto de los residuos 1-32 de SEQ ID NO: 1) : APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-tioéster Segmento SEP-0 :2 (GRFN 1712, compuesto de los residuos 33-88 de SEQ ID NO : 1) : CSLNEKITVP DTKVNFYA K RMEVGQQAVE VWQGLALLSE AVLRGQALLV KSSQPW-tioéster (donde Cys33 está protegido por Acm) Segmento SEP-0 : 3 (G FN 1713, compuesto de los residuos 89-116 de SEQ ID NO: 1) : CPLKLHVDKA VSGLRSLTTL LRALGAQK-tioéter (donde Cys89 esta protegido por Acm) Segmento SEP-0 :4 (GRFN 1714, compuesto de los residuos 117-166 de SEQ ID NO: 1) : CAISPPDAAS AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY TGEACRTGDR-CARBOXILATO (donde la cisteína en la terminal C (Cys161) lleva un grupo protector picolilo (pico) ) Los péptidos SEP-0 :1 y SEP-0: 2 y SEP-0: 3 se sintetizaron en una resina generadora de tioéster por el protocolo de neutralización in situ para la química de Boc (tert-butoxicarbonilo) y por etapas en la síntesis de péptidos de fase sólida (SPPS) usando el SPPS, establecido, estrategias de resina tioéster y de protección de cadena lateral (Hackeng, et al., PNAS (1999) 96: 10068-10073 ; y Schnolzer, et al., Int. J. Pept. Prot. Res., (1992) 40: 180-193)) sobre un sintetizador de péptidos automatizado ???433? o por ensamble manual de cadenas, u ordenado y adquirido de vendedores comerciales. Por ejemplo, un conjunto estándar de los grupos protectores Boc SPPS se uso, nominalmente : Arg(Tos); Asp(cHex); Cys (4MeBzl) & Cys (Acm; Glu(cHex); His (DNP) ; Lys(ClZ); Ser(Bzl); Thr(Bzl); Trp(formil); Tyr(BrZ); Met, Asn, Gln estaban sin proteger en la cadena lateral. El segmento SEP-0:4 se sintetizó de forma análoga en un -0CH2-Pam-resina. Se desprotegieron los péptidos y se desdoblaron simultáneamente a partir del soporte de resina usando HF/p-cresol según el procedimiento de química estándar de Boc; sin embargo, para aquellos péptidos que contienen grupos protectores no separados en HF/p-cresol, se retuvieron los grupos protectores. Se purificaron los péptidos por cromatografía líquida de alta presión de fase inversa C4 preparativa (CLAR) . Las fracciones que contenían péptidos puros se identificaron usando EM-ER (espectrometría de masa por ionización y electrorociado) , se acumularon y liofilizaron para la ligación posterior. Etapa 1: Ligación #1. El segmento SEP-0:4 y el segmento SEP-0:3 se disolvieron en TFE a una concentración 15 mM. Se agregó solución amortiguadora de fosfato saturada (pH 7.9) que contenía cloruro de guanidinio 6 M y tiofenol al 1%, resultando en una solución transparente de los segmentos de péptidos. Después de la ligación, se agregó la mezcla de ligación a una solución de 2 mi de TFE (trifluoroetanol) , 6 mi de cloruro de guanidinio 6 M, 100 mM de fosfato que contenía 25% de ß-mercaptoetanol y se incubó por 20 minutos. La solución se acidificó con una solución de 15 mg/ml TCEP (clorohidrato de tris (2 -carboxietil ) fosfina) en ácido acético glacial, y se cargó sobre una columna CLAR de fase inversa C4 preparativa de 1 pulgada (2.54 cm) de diámetro) . Se purificaron después los péptidos por CLAR de fase inversa de gradiente preparativo. Las fracciones que contienen el producto ligado deseado SEP-OAcm+SEP-0 : 3+SEP- 0 : 4 se identificaron por EM-ER y se acumularon. Etapa 2: eliminación de Acm #1. Para la eliminación de Acm la solución acuosa de acetonitrilo que contiene las fracciones acumuladas SEP-0 :Acm+SEP-0 : 3+SEP-O : 4 se diluyó lx con agua grado CLAR, y urea sólida se agregó hasta una concentración molar de 2. Se agregó un exceso molar de tres veces (con relación a la concentración total esperada de cisteína) , de una solución de 30 mg/ml de Hg (acetato) 2 en ácido acético o acuoso al 3% y se agitó la solución por 1 hora. La solución se hizo después al 20% en ß-percaptoetanol , se cargó en una columna CLAR de fase inversa semipreparativa y se purificó con un gradiente de etapa. Las fracciones que contienen el producto deseado SEP-0 : 3+SEP-O : se identificaron por EM-ER y se liofilizaron- durante la noche. Etapa 3: Ligación #2. Se disolvieron en conjunto cantidades iguales de SEP- 0 : 3+SEP- 0 : 4 y SEP-0 :2 en TFE puro a una concentración de 15 mM. Se agregó solución amortiguadora de fosfato 250 mM (pH 7.5) que contenía cloruro de guanidino 6 M y tiofenol al 1%, resultando en una solución transparente de los segmentos de péptidos. Después de un día de ligación, se agregó la mezcla de ligación a una solución de 10 mL de TFE, 10 mi de ß-mercaptoetanol , 10 mi de piperidina y 20 mi de cloruro de guanidinio 6M, pH 4, y se incubó por 20 minutos para separar cualquiera grupos protectores restantes. Se acidificó la solución con una solución de 15 mg/ml TCEP en ácido acético acuoso al 20%, cargado sobre una columna CLAR preparativa de fase inversa y purificada con un gradiente lineal . Las fracciones que contienen el producto ligado SEP-0 :Acm+SEP-0 : 2+SEP-O :3+SEP-0 :4 se identificaron por EM-ER y se liofilizaron durante la noche. Etapa 4 Carboximetilación . SEP-0 :Acm+SEP-0 : 2+SEP-0:3+SEP-0:4 se disolvió en TFE a una concentración 15 mM. Un exceso de dos veces (v/v) de solución amortiguadora de fosfato 200 mM (que contiene cloruro de guanidino 6 se agregó, resultando en una solución transparente del segmento de péptidos. Un exceso de 25 veces de ácido bromoacético disuelto en una cantidad mínima de metano! se agregó, y se dejó que la solución reaccionara por 2 horas. La solución se acidificó con una solución de 15 mg/ml TCEP de ácido acético acuoso al 20%, cargado sobre una columna CLAR preparativa de fase inversa y purificado con un gradiente de etapa. Las fracciones que contienen el producto deseado carboximetilado SEP-0 :Acm+SEP-0 : 2+SEP-O :3+SEP-0 : 4+Et se identificaron por EM-ER y se acumularon. Etapa 5: Separación del picolilo. Se activó el polvo de zinc en HCl 2M por 30 minutos. El péptido SEP-0 :Acm+SEP-0 : 2+SEP-O :3+SEP-0 : 4+Et se disolvió en TFE puro alrededor de una concentración de 10 mg/ml. La solución se diluyó con 4x (p/p con relación a TFE) , de cloruro de guanidinio 6M, acetato 100 mM, pH 4, que contenía (recientemente agregado) 35 mg/ml de L-metionina y 35 mg/ml de dodecilsarcosina (esto es N-dodecanoilsarcosina de sodio) . Se agregó la solución al polvo activado de Zn. Se observó la reacción a intervalos de alrededor de 1 hora y está completa después de 5 horas. Después de la terminación se separó el sobrenadante y el polvo remanente de zinc se lavó dos veces por 5 minutos con cloruro de guanidinio 6M pH 4, acetato 100 mM que contenía 35 mg/ml de L-metionina y 35 mg/ml de dodecilsarcosina que contiene 20% de TFE así como una vez con la misma solución que contiene 20% de ß-mercaptoetanol . Se acidificó el producto combinado con una solución de 15 mg/ml TCEP en ácido acético acuoso al 20%, cargado sobre una columna CLAR de fase inversa preparativa y purificado por un gradiente de etapa. Las fracciones que contienen el producto deseado modificado SEP-0 :Acm+SEP~0 : 2+SEP-O : 3+SEP-O : 4+Et-pico se identificaron por E -ER y se acumularon. Etapa. 6: Eliminación del Acm #2. La solución acumulada de SEP-0 :Acm+SEP- 0 : 2+SEP- 0 : 3+SEP- 0 : 4+Et-pico se diluyó 3x con agua grado CLAR, y se agregó urea sólida para una concentración final 2 molar. Se agregó un exceso molar de 3 veces (con relación a la concentración total esperada de cisteína) de 30 mg/ml Hg (acetato) 2 en solución, en ácido acético acuoso al 3%, y la solución se agitó por 1 hora. La solución después se hizo al 20% en ß-mercaptoetanol , se cargó sobre una columna CLAR semipreparativa de fase inversa y se purificó con un gradiente de etapa. Las fracciones que contienen el producto deseado SEP-0 : 2+SEP-O : 3+SEP-O :4+Et-pico se identificaron por EM-ER se diluyeron 2x (v/v) con agua que contenía 2x (p/p con relación a la masa del péptido) DPC (dodecilfosfocolina) y se liofilizaron durante la noche. Etapa 7: Ligación #3. Se disolvieron conjuntamente cantidades iguales de SEP- 0 : 2+SEP- 0 : 3+SEP- 0 : 4+Et-pico y SEP-0:1 en TFE puro a una concentración 15 mM y una solución amortiguadora de fosfato 250 mM (pH 7.5) que contenía cloruro de guanidinio 6M se agregó. Se agregó a la solución tiofenol al 1%. Un día después de la ligación, se agregó la mezcla de ligación a una solución de 10 mi de TFE, 10 mi de ß-mercaptoetanol , 10 mi de piperídina y 20 mi de cloruro de guanidinio 6M pH 4 , y se incubaron por 20 minutos para separar algunos grupos protectores remanentes. Se acidificó la solución con una solución de 15 mg/ml TCEP en ácido acético acuoso al 20%, cargado sobre una columna CLAR preparativa de fase inversa y se purificó con un gradiente lineal . Las fracciones que contienen el producto ligado deseado SEP-0 (1-66) : (SEQ ID NO: 1) se identificaron por espectrometría de masas por electrorociado, se diluyeron 2x (v/v) con agua que contenía 2x (p/p con relación a la masa del péptido) de dodecilsarcosina y se liofilizó. Etapa 8 Plegado: El SEP-0 (1-66) péptido ligado de longitud completa, se disolvió en solución amortiguadora Tris 200 mM (pH 8.7) que contenía cloruro de guanidinio 6 y TFE al 20% y un exceso molar de diez veces (con relación a los residuos Cys en la proteína) de cisterna. Esta solución se dializó durante la noche contra una solución de solución amortiguadora Tris 200 mM (pH 8.7) que contenía cloruro de guanidinio 3M a temperatura ambiente. La solución se dializó después contra una solución de solución amortiguadora Tris 200 mM (pH 8.7) que contiene cloruro de guanidinio 1 M a temperatura ambiente por 4 horas a 4°C, y finalmente contra una solución amortiguadora de fosfato 10 mM (pH 7.0) por 4 horas a 4°C para resultar el producto final plegado. El plegado se verificó por EM-ER de electrorociado y espectrometría CD (dicroismo circular) . Etapa 9 Purificación-. Se concentró el polipéptido plegado 5x en viales de un concentrador centricon y se cargó en una columna de intercambio de cationes Resource S equilibrada con fosfato 10 mM pH 7.0. Se eluyó la proteína plegada en un gradiente de sal lineal hasta NaCl 500 mM en 10 minutos. Las fracciones que contenían el producto plegado deseado SEP-0 (1-66) se identificaron por electroforesis de gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) y se congelaron y almacenaron a -80°C. Un cromatograma CLAR de fase inversa analítica y un espectro EM-ER del producto de la proteína plegada, así como un espectro CD, demostraron la presencia de la proteína plegada.

Ejemplo 2 Síntesis de la proteína sintética estimuladora de la eritropoyesis SEP-1-L30 Se sintetizó una segunda proteína sintética estimuladora de la eritropoyesis (designada SEP-1-L30) que contenía grupos formadores de oxima en las posiciones 24 y 126 de SEP-0. Estos grupos se usaron después para formar SEP-1-L30, en el cual el (EDA-Succ- ) 18 carboxilato lineal (EDA = (4,7,10)-trioxatridecano-1 , 13 diamina, también denominado TTD; Succ = -CO-CH2CH2CO- ) polímeros han sido unidos a la estructura de la proteína. La estructura de la SEP-l(l-66) de longitud completa es : APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK0XITTGCA EHCSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEV QGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW P LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK AIS PPDAAK0XAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR (SEQ ID NO: 2) donde ? denota un residuo no nativo de aminoácido que consiste de una cisteína que está carboximetilada en el grupo sulfhidrilo, y en donde Ko denota una lisina no nativa que está químicamente modificada en el grupo e-amino con un grupo ligador de oxima acoplado al polímero designado soluble en agua a través de un enlace oxima.

A. Oximación de GRFN1776 y GRFN1711 con GRFNP32 Se llevó a cabo la formación de' oximas para colocar polímeros solubles en agua que soportan un grupo amino oxiacetilo a los péptidos que llevan un grupo cetona carbonilo. Para lograr esto, se sintetizaron los siguientes segmentos de péptidos : Segmento SEP-1:4 (GRFN 1776; compuesto de los residuos 117-166 de SEQ ID NO: 2) : CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY TGEACRTGDR-carboxilato (en donde Lys126 se modifica con un residuo ácido levulínico en el grupo e-amino, y en donde Cys117 está protegido por Acm) Segmento SEP-1:1 (GRFN 1711; compuesto de los residuos 1-32 de SEQ ID NO : 2 ) : APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-tioéster (donde Lys24 está modificado con un residuo de ácido levulínico) Se sintetizó el segmento SEP-1:1 (GRFN 1711) en una resina generadora de tioéster y el segmento SEP-1:4 (GRFN 1776) en una resina -0C¾-Pam como en el ejemplo 1. Las lisinas 24 y 126 de estos dos segmentos de péptidos se protegieron inicialmente con un grupo Fmoc en el grupo e-amino. Después de la terminación del ensamble de la cadena, los grupos amino que soportan Fmoc se desprotegieron siguiendo los procedimientos estándar de desprotección Fmoc y se modificaron por la colocación del ácido levulínico a cada resina de péptido respectivamente. Los péptidos se desprotegieron después y se desdoblaron simultáneamente del soporte de la resina como se describe en el ejemplo 1. Se puri-ficaron- los péptidos por CLAR preparativa C4 de fase inversa. Las fracciones que contienen péptidos puros se identificaron usando EM-ER, acumulado y liofilizado para una ligación posterior. GRFNP32 [- (EDA-Succ) 18 carboxilato] se ensambló en una resina generadora de carboxilo Sasrin siguiendo los protocolos estándar (Rose, K. et al., solicitud de patente de E.U.A numero de serie 09/379,297; Rose, et al., J. Am Chem Soc . (19S9) 121: 7034) . Se colocó una porción de aminooxiacetilo (AoA) al grupo amino en la terminal N del polímero por acoplamiento de un exceso de 5 veces de ácido Boc-aminoxiacético activado. La cadena de polímeros se desdobla desde el soporte de resina usando procedimientos de química clásica de Fmoc. Se purificó la cadena de polímero por CLAR de fase inversa C4 preparativa. Las fracciones que contienen el polímero puro se identificaron usando EM-ER, se acumularon y liofilizaron para la ligación posterior. El segmento SEP-1:4 y GRFNP32 se disolvieron conjuntamente a una relación equimolar en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1%. La solución se liofilizó después. El polvo seco se disolvió y el péptido modificado con polímero se separó del péptido sin modificar y el polímero sin reaccionar por CLAR de fase inversa C4 de gradiente preparativa. Las fracciones que contienen el SEP-1:4+GP32 del producto oximado deseado se identificaron por EM-ER y se acumularon y liofilizaron . El segmento SEP-1:1 y GRFNP32 se disolvieron conjuntamente en una relación equimolar de acetonitrilo acuoso al 50% que contiene 0.1% TFA. La solución se liofilizó después. El polvo seco se disolvió y el péptido modificado con polímero se separó del polímero sin reaccionar por CLAR de fase inversa C4 de gradiente preparativo. Las fracciones que contienen el producto oximado deseado SEP-1:1 + GP32 se identificaron por EM-ER y se acumularon y liofilizaron.

B. Síntesis de la proteína sintética estimuladora de la eritropoyesis SEP-1-L30 La SEP-1-L30 se sintetizó en solución de cuatro segmentos de polipéptidos : El segmento S3P-1 : 1+GP32 (GRFN 1711 + GRFNP32, que corresponde a los residuos 1-32 de SEQ ID NO : 2) : APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK°XITTGCA EH-tioéster (donde Lys24 se modifica en el grupo e-amino con un grupo ligador de oxima levulínico que se acopla a GRFNP32 a través del enlace de oxima (Lev-AoA) de aminooxiacetilo levulinico denotado como KOx) El segmento SEP-1:2 (GRFN 1712, que corresponde a los residuos 33-88 de SEQ ID NO: 2) : CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VE WQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW-tioéster (donde Cys33 esta protegida por Acm) El segmento SEP-l: 3 (GRFN 1713, que corresponde a los residuos 89-116 de SEQ ID NO: 2) : CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-tioéster (donde Cys89 esta protegido por Acm) El segmento SEP-l :4+GP32 (GRFN 1776 + GRFNP32, que corresponde a los residuos 117-166 de SEQ ID NO: 2) : CAIS PPDAAK0XAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR-carboxilato (donde Lys12S se modifica en el grupo e-amino con un grupo ligador de oxima levulínico que se acopla a GRFNP32 a través del enlace de oxima (Lev-AoA) levulínico-aminooxiacetilo denotado Kox, y en donde la cisteína en la terminal C lleva un grupo protector picolilo (pico) ) La síntesis de los péptidos adicionales, reacciones de ligación, carboximetilación, reacciones de separación del grupo protector, pliegue y purificación se llevaron a cabo como se describe en el ejemplo 1, para producir SEP-1-L30 plegado de longitud completa. Un cromatograma CLAR de fase inversa analítica y un espectro EM-ER del producto de la proteína plegada así como un espectro CD demostraron la presencia de la proteína plegada.

Ejemplo 3 Síntesis de la proteína sintética estimuladora de la eritropoyesis SEP-1-L26 Una tercera proteína sintética estimuladora de la eritropoyesis (designada como SEP-1-L26) se sintetizó para contener grupos formadores de oxima en las posiciones 24 y 126 de SEP-0. Estos grupos se usaron después para formar SEP-1-L26 en los cuales los polímeros lineales (EDA-Succ)i8 carboxilato y (EDA-Succ) 6-amida se habían unido a la estructura de la proteína a través de ligaduras de oxima en las posiciones 24 y 126, respectivamente. La secuencia de la SEP-1 (1-166) de longitud completa es: APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK0XITTGCA EHCSLNEKIT VPDT VNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW P LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR LGAQK AIS PPDAAK0XAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR (SEQ ID NO : 2 ) donde ? denota un residuo no nativo de aminoácido que consiste de una cisteína que está carboximetilada en el grupo sulfhidrilo, y en donde Kox denota una lisina no nativa que está químicamente modificada en el grupo e-amino con un grupo ligador de oxima acoplado al polímero designado soluble en agua a través de un enlace oxima. En contraste con SEP-1-L30, el constructo SEP-1-L26 se diseña para soportar un polímero soluble en agua más pequeño y soluble en agua y sin carga colocado en la posición 126. El polímero colocado en la posición 24 fue el mismo que en SEP-1-L30. El ensamble del producto de longitud completa fue como se describe en el ejemplo 2.

A. Oximación de GRFN1776 con GRFNP6 y oximación de GRFN1711 con GRFNP32 Se llevó a cabo la formación de oximas para colocar polímeros solubles en agua que soportan un grupo amino oxiacetilo a los péptidos que llevan un grupo cetona carbonilo. Para lograr esto, se sintetizaron los siguientes segmentos de péptidos: Segmento SEP-1:4 (GRFN 1776; compuesto de los residuos 117-166 de SEQ ID NO: 2) : CAISPPDAA AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY TGEACRTGDR-carboxilato (en donde Lys126 se modifica con un residuo ácido levulínico en el grupo e-amino, y en donde Cys117 está protegido por Acm) Segmento SEP-1:1 (GRFN 1711; compuesto de los residuos 1-32 de SEQ ID NO: 2) : APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-tioéster (donde Lys24 está modificado con un residuo de ácido levulínico) Se sintetizó el segmento SEP-1:1 (GRFN 1711) en una resina generadora de tioéster y el segmento SEP-1:4 (GRFN 1776) en una resina -OCH2-Pam como en el ejemplo 1. Las lisinas 24 y 126 de estos dos segmentos de péptidos se protegieron inicialmente con un grupo Fmoc en el grupo e-amino. Después de la terminación del ensamble de la cadena, los grupos amino que soportan Fmoc se desprotegieron siguiendo los procedimientos estándar de despxotección Fmoc ? se modificaron por la colocación del ácido levulínico a cada resina de péptido respectivamente. Los péptidos se desprotegieron después y se desdoblaron simultáneamente del soporte de la resina como se describe en el ejemplo 1. Los péptidos se purificaron separadamente por CLAR de fase inversa C4 preparativa. Para cada péptido, las fracciones que contienen péptidos puros se identificaron usando EM-ER, se acumularon y liofilizaron para la ligación posterior. El polímero soluble en agua (EDA-Succ) 18 carboxilato (GRFNP32) se ensambló en una resina generadora de carboxi Sasrin siguiendo protocolos estándar (Rose, K. et al., solicitud de patente E.U.A número de serie 09/379,297; Rose, et al., J Am Chem Soc . (1999) 121: 7034) . El polímero soluble en agua (EDA-Succ) 6-amida (GRFNP6) se ensambló en una resina generadora de amida Sieber siguiendo los protocolos estándar (Rose, K. et al., solicitud de patente de E.U.A número de serie 09/379,297; Rose, et al., J Am Chem Soc.(1999) 121:7034). Una porción de aminooxiacetilo (AoA) se colocó al grupo amino en la terminal N de cada polímero enlazado a la resina por acoplamiento de un exceso de cinco veces de ácido Boc-aminooxiacético activado. Las dos cadenas de polímeros se desdoblaron separadamente de los soportes respectivos de resina usando procedimientos de química clásica Fmoc . Cada cadena de polímeros se purificó por CLAR preparativa de fase inversa. Para cada polímero, las fracciones que contienen el polímero puro se identificaron usando EM-ER, se acumularon y liofilizaron para la ligación posterior. El segmento SEP-1:4 y GRFNP6 se disolvieron conjuntamente a una relación equimolar en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1%. La solución se liofilizó después. El polvo seco se disolvió y el péptido modificado con polímero se separó del péptido sin modificar y el polímero sin reaccionar por CLAR de fase inversa C4 de gradiente preparativa. Las fracciones que contienen el SEP-1:4+GP6 del producto oximado deseado se identificaron por EM-ER y se acumularon y liofilizaron. El segmento SEP- 1:1 y GRFNP32 se disolvieron con untamente en una relación equimolar de acetonitrilo acuoso al 50% que contiene 0.1% TFA. La solución se liofilizó después. El polvo seco se disolvió y el péptido modificado con polímero se separó del polímero sin reaccionar por CLAR de fase inversa C4 de gradiente preparativo . Las fracciones que contienen el producto oximado deseado SEP-1:1 + GP32 se identificaron por EM-ER y se acumularon y liofilizaron.

B. Síntesis de la proteína sintética estimuladora de la eritropoyesis SEP-1-L26 La SEP-1-L26 se sintetizó en solución de cuatro segmentos de polipéptidos : El- segmento SEP-1:1+GP32 (GRFN 1711 + GRFNP32, que corresponde a los residuos 1-32 de SEQ ID NO: 2) : APPRLICDSR VLERYLLEAK EAE 0XITTGCA EH-tioéster (donde Lys24 se modifica en el grupo e-amino con un grupo ligador de oxima levulínico que se acopla a GRFNP32 a través del enlace de oxima (Lev-AoA) de aminooxiacetilo levulínico denotado como Kox) El segmento SEP-1:2 (GRFN 1712, que corresponde a los residuos 33-88 de SEQ ID NO: 2) : CSLNEKIT VPDTKVNFYA KRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW-tioéster (donde Cys33 está protegida por Acm) El segmento SEP-1-.3 (GRFN 1713, que corresponde a los residuos 89-116 de SEQ ID NO: 2) : CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-tioéster (donde Cys89 está protegido por Acm) El segmento SEP-1:4+GP6 (GRFN 1776 + GRFNP6, que corresponde a los residuos 117-166 de ' SEQ ID NO: 2) : CAIS PPDAAK0XAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR-carboxilato (donde Lys126 se modifica en el grupo e-amino con un grupo ligador de oxima levulínico que se acopla a GRFNP32 a través del enlace de oxima (Lev-AoA) levulínico-aminooxiacetilo denotado Kox, y en donde la cisteína en la terminal C lleva un grupo protector picolilo (pico) ) La síntesis de los péptidos adicionales, reacciones de ligación, carboximetilación, reacciones de separación del grupo protector, pliegue y purificación se llevaron a cabo como se describe en el ejemplo 1, para producir SEP-1-L30 plegado de longitud completa. Un cromatograma CLAR de fase inversa analítica y un espectro E -ER del producto de la proteína plegada así como un espectro CD demostraron la presencia de la proteína plegada.

Ejemplo 4 Síntesis de la proteína sintética estimuladora de la eritropoyesis SEP-1-B50 Una cuarta proteína sintética estimuladora de eritropoyesis (designada SEP-1-B50) se sintetizó. La secuencia de aminoácidos del SEP-1-B50 de longitud completa es la misma que la de SEP-1-L30: APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK ITTGCA EHCSLNEKIT VPDTKVNFYA W RMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW P LQLHV AVS GLRSLTTLLR LG QK?AIS PPDAAK AAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR (SEQ ID NO: 2) donde ? denota un residuo no nativo de aminoácido que consiste de una cisteína que está carboximetilada en el grupo sulfhidrilo, y en donde Kox denota una lisina no nativa que está químicamente modificada en el grupo e-amino con un grupo ligador de oxima acoplado al polímero designado soluble en agua a través de un enlace oxima. Sin embargo, la proteína se derivó con un constructo de polímero ramificado que tiene cuatro porciones lineales (Succ-EDA)X2 más que el polímero lineal (Succ-EDA) i8 de SEP-1-L30. La derivación se logró por medio de ligaduras de oximas . El ensamble del producto de longitud completa fue como se describe en el ejemplo 2.

A. Síntesis del GRFNP17 de plantilla que lleva grupos múltiples de tiol Se sintetizó la plantilla GRFNP17 manualmente en una resina de (4-metil) benzhidrilamina (MBHA) generadora de amida en una escala de 0.4 mmol . Se acopló el Fmoc-Lys (Boc) -OH usando protocolos de acoplamiento estándar (Schnólzer, M. , Int J Pept Protein Res. (1992) 40:180-93). Se usó aminoácido 2.1mmol, 10% DIEA en 3.8 mi 0.5M HBTU, esto es un exceso de 5 veces del aminoácido. Después de la separación del grupo protector Fmoc, se acopló el Fmoc-Lys (Fmoc) -OH usando protocolos de acoplamiento de aminoácidos estándar (2.1 mmol de aminoácido, 10% DIEA en 3.8 mi 0.5M HBTU; esto es un exceso de 5 veces de aminoácidos) . Después de una segunda etapa de separación de Fmoc, se acopló el Fmoc-Lys (Fmoc) -OH usando protocolos de acoplamiento estándar de aminoácidos (4.2 mmol de aminoácidos, 10% de DIEA en 7.6 mi 0.5M HBTU; esto es, un exceso de 5 veces del aminoácido con relación a la amina libre) . Después de una etapa final de desprotección de Fmoc, se acopló por 30 minutos un exceso de 5 veces (con relación a las aminas libres) del éster de pentafluorofenilo del ácido S-acetil tioglicólico (SAMA-oPfp) en DMF por 30 minutos. El grupo protector Boc de la cadena lateral del residuo de lisilo en la terminal C se separó por 2 veces en lavados intermitentes de un minuto con TFA puro, seguido por la neutralización de la resina por lavado con 10% DIEA en DMF. 2 mmol de ácido Boc-aminooxiacético y 2 mmol de N-hidroxisuccinimida (NHS) se disolvieron en DMF en 3 mi. Después de la adición de 2 mmol de DIC (diisopropilcarbodiimida) , se activó el ácido por 30-60 minutos. Se agregó la solución a la resina neutralizada y se acopló 1 hora. Finalmente, se separaron los grupos acetilo ligados en S con piperidina al 20% en DMF por 30 minutos. Se desprotegió la plantilla y se desdobló simultáneamente del soporte de la resina usando HF/p-cresol según los procedimientos estándar de química de Boc en presencia de cisterna como un secuestrante para el aldehido libre (Schnólzer, M. , Int J Pept Protein Res. (1992) 40:180-93) . La poliamída recuperada en 50% de B [esto es acetonitrilo acuoso al 50% que contiene 0.1% TFA] (libre de aldehidos) se congeló y liofilizó. Para la purificación, se disolvió el producto crudo de plantilla en 2 mi de B al 50% y 100 mi de A al 100% [esto es TFA al 0.1% en agua] se agregó para diluir la muestra (evitar el cloruro de guanidinio o la adición de acetato, ya que la adición de aldehidos se garantiza) . Se cargó la plantilla sobre una columna CLAR de fase inversa preparativa C4 equilibrada a T = 40°C a un 3% de B. Las sales se eluyeron de forma isocrática y la plantilla deseada, GRFNP17 se purificó en un gradiente lineal. Las fracciones que contienen el producto deseado se identificaron por EM-ER se acumularon y liofilizaron .

B. Síntesis del polímero GRFNP29 soluble en agua ramificado El GRFMP29, un polímero ramificado de (EDA-Succ) 12 de un peso molecular de 15kDa, se sintetizó por una ligación generadora de tioéter de una plantilla que contiene tiol purificada de GRFNP17 y un polímero lineal GRFNP31, Br-acetil- (EDA-Succ) i2 carboxilato, en donde GRFNP31 se .sintetizó sobre una resina generadora de carboxi Sasrin siguiendo los protocolos estándar (Rose, K. et al., solicitud de patente de E.U.A. número de serie 09/379,297; Rose, et al., J Am Chem SOC. (1999) 121 : 7034) . Un exceso molar de 1.3x (sobre los tioles totales) de GRFNP31 purificado, Br-acetilado (EDA-Succ) 12 , y la plantilla que ¦ contiene tiol purificada GRFNP17, se disolvieron de manera conjunta con Tris-HCl 0.1 M/cloruro de guanidino 6M, pH 8.7 a una concentración de -10 mM. Después de la disolución, la solución se diluyó tres veces (v/v) con Tris-HCl 0.1 M, solución amortiguadora pH 8.7. La mezcla de ligadura se agitó a temperatura ambiente y la reacción se monitoreó por CLAR de fase inversa y EM/ER, se agregó reactivo GRFNP31 adicional en una base como fuera necesario hasta que el producto de reacción deseado fue el producto mayor. Para la preparación, se agregó 3x (v/v a la mezcla de ligado) de acetato O.lM/cloruro de guanidino 6M, pH , y la solución se cargó en una columna CLAR " de fase inversa C4 preparativa, y se purificó con un gradiente lineal. Las fracciones que contienen el constructo GRFNP29 puro se identificaron usando EM-ER, se agruparon y liofilizaron.

C. Oximación de GRFN1776 y GRFN1711 con GRFNP29. Se sintetizaron los Segmentos SEP-1:4, y el Segmento SEP-1:1 como se describe en el Ejemplo 2. El segmento SEP-1:4 y GRFNP29 se disolvieron de manera conjunta a una relación equimolar en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1%. La solución se liofilizó. El polvo seco se cargó en una columna CLAR de fase inversa preparativa (diámetro de 1 pulgada (2.54 cm) ) . El péptido modificado por polímero se separó del péptido no modificado y el polímero no reactivo por CLAR de fase inversa de gradiente C4 preparativa. Las fracciones que contienen el producto oximado deseado SEP:1:4+GP29 se identifica por EM-ER y se agrupa. El segmento SEP-1:1 y GRFNP29 se disuelven de manera conjunta a una relación equimolar en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1%. La solución se congeló y se liofilizó. El polvo seco se disolvió en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1% y se cargó en una columna de GPC - (cromatografía de permeación en gel) preparativa (diámetro de 1 pulgada (2.54 cm) ) . El péptido modificado en polímero se separó del péptido no modificado y del polímero que no reaccionó por elución isocrática. Las fracciones que contienen el producto oximado deseado SEP-1:1+GP29 se identificaron por EM-ER y se agruparon.

D. Síntesis de Proteína SEP-1-B50 Estimulada en Eritropoyesis Sintética. Se sintetizó la SEP-1-B50 (SEQ ID N0:2) en una solución a partir de cuatro segmentos de polipéptido. El segmento SEP-1:1+GP29 (GRFN 1711 + GRFNP29, correspondiente a los residuos 1-32 de la SEQ ID NO: 2) ·. APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK0XITTGCA EH-tioéster (donde Lys24 está modificado en el grupo e con el grupo de enlace oxima levulínico que se acopla al GRFNP29 a través de un enlace oxima levulínico-aminooxiacetilo (Lev-AoA) que denota ox) . El segmento SEP-1:2 (GRFN 1712, correspondiente a los residuos 33-88 de la SEQ ID NO: 2) : CSLNEKIT VPDTKVNFYA W RMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW-tioéster (donde Cys33 está protegido por Acm) . El segmento SEP-1:3 (GRFN 1713, correspondiente a los residuos 89-116 de la SEQ ID NO:2) : CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-tioéster (donde Cys89 está protegido por Acm) . El segmento SEP11:4+GP29 (GRFN 1776 + GRFNP29, correspondiente a los residuos 117-166 de la SEQ ID NO:2): CAIS PPDAAKoxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR-carboxilato (donde Lysl26 se modifica en el grupo e-amino con un grupo de enlace oxima levulínico que se acopla a GRFNP29 a través del enlace oxima (Lev-AoA) levulínico-aminooxiacetilo denota Kox y donde la cisteína C-terminal porta un grupo protector pxcolilo (pico) ) .

Se realizó la síntesis de péptidos adicionales, reacciones de ligación, carboximetilación, reacciones de remoción del grupo protector, plegado y la purificación como se describe en los Ejemplos 1 y 2, excepto que la purificación fue en una columna Resource Q, para proporcionar el SEP-1-B50 plegado, de longitud completa (SEQ ID N0.-2) . Un cromatograma de CLAR de fase inversa C4 analítico y un espectro EM-ER del producto de proteína plegada SEP-1-B50, así como un espectro CD demuestran la presencia de proteína plegada.

Ejemplo 5. Síntesis de Proteína Sintética SEP-3 -L42 que Estimula la Eritropoyesis . La quinta proteína estimulante de la eritropoyesis sintética (designada SEP-3-L42) se sintetizó. La secuencia de aminoácido de la proteína SEP-3 de longitud completa es: APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNECIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LACSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS PPDAACAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR (SEQ ID NO: 3) . Los residuos de cisterna en las posiciones: 24, 38, 83, y 126 se modificaron con unidades de polímero (EDA-Succ) i8 (GRFNP32 ) funcionalizada en maleimida (por medio de una reacción de adición Michael) para formar la SEP-3-L42. En detalle, la SEP-3 se sintetiza en una solución desde cuatro segmentos de polipéptido: Segmento SEP-3 : 1 (GRFN 1747, correspondiente a los residuos 1-37 de la SEQ ID N0:3) : APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNE-tioéster (donde Cys7, Cys29, y Cys33 están protegidas por Acra) . Segmento SEP-3 : 2 (GRFN 1774, correspondiente a los residuos 38-82 de la SEQ ID NO: 3) : CIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LA-tioéster (donde Cys38 es una cadena lateral protegida con el grupo Acm) . Segmento SEP-3 :3 (GRFN 1749, correspondiente a los residuos 83-125 de la SEQ ID NO : 3 ) : CSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK3AIS PPDAA-tioéster (donde Cys83 es cadena lateral protegida con el grupo Acm) . Segmento SEP-3 : 4 (GRFN 1750, correspondiente a los residuos 126-166 de la SEQ ID NO : 3 ) : CAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR-carboxilato (donde Cys161 es Pbo [esto es, protegido por 4- (C¾S (O) - ) bencilo] ) . Síntesis de Péptidos. Los péptidos SEP-3 :1 y SEP-3: 2 y SEP-3: 3 se sintetizan en una resina generada en tioéster por el protocolo de neutralización in situ para SPPS de química Boc, usando estrategias de protección de cadena lateral establecidas como se describe en el Ejemplo 1, con cambios en la estrategia del grupo protector como se nota en los péptidos específicos de arriba. El segmento SEP-3:4 se sintetizó análogamente en una resina -OCH2-Pam- . Los péptidos se desprotegen y desdoblan simultáneamente de la resina soportada como se describe en el Ejemplo 1. Los péptidos resultantes descritos arriba se purifican por CLAR-RP preparativa. Las fracciones que contienen el péptido puro se identifican usando EM-ER, agrupadas y liofilizadas para ligación posterior. Etapa 1: Ligación #2. El segmento SEP-3:4 y el segmento SEP-3:3 se disuelven en TFE a una concentración de 15 mM. Se agrega solución amortiguadora de fosfato saturada (pH 7.5) que contiene cloruro de guanidino 6 y tiofenol al 1%, resultando en una solución clara de los segmentos de péptido. Después de la ligación, la mezcla de ligación (definida como 1 volumen) se agrega a 2 volúmenes de la solución de {2 mi de TFE, 6 mi de cloruro de guanidino 6 , fosfato 100 mM que contiene ß-mercaptoetanol al 25%} y se. incuba durante 20 minutos. La solución se hizo acida con una solución de 15 mg/ml de TCEP en ácido acético glacial, cargada en una columna CLAR de fase inversa C4 preparativa, y purificada con un gradiente lineal. Las fracciones que contienen el producto ligado deseado SEP-3 :Acm+SEP-3 : 3+SEP3 : 4 se identifican por EM-E y se agrupan. Etapa 2: Remoción del Acm #1. Para remover el Acm, se diluyó lx la solución de acetonitrilo acuosa que contienen las fracciones agrupadas de SEP-3 : Acm+SEP-3 : 3+SEP-3 : 4 con agua grado CLAR, y se agregó urea sólida para una concentración final de 2 molar. Se agregó un exceso molar de tres veces (con relación a la concentración de cisteína esperada total) de una solución 30 mg/ml de Hg (acetato) 2 en ácido acético acuoso al 3%, y la solución se agitó durante una hora. La solución se hizo al 20% en ß-mercaptoetanol , se cargó en una columna CLAR de fase inversa C4 semi-preparativa, y se purificó con un gradiente de etapa. Las fracciones que contienen el producto ligado deseado SEP-3: 3+SEP-3:4 se identificaron por EM-ER y se liofilizaron durante la noche. Etapa 3: Ligación #2. Se disolvieron de manera conjunta cantidades iguales de SEP-3 : 3+SEP-3 ·.4 y SEP-3.2 en trifluoroetanol TFE puro a una concentración de 15 mM. Se agregó solución amortiguadora de fosfato 250 mM (pH 7.5) que contiene guanidino 6 M y tiofenol al 1%, resultando en una solución clara de los segmentos de péptido. Después de un día de ligación, la mezcla de ligación (definida como 1 volumen) , se agregó a 2 volúmenes de la solución de 10 mL de TFE, 10 mi de ß-mercaptoetanol , 10 mi de piperidina y 20 mi de guanidino 6M, pH 4, y se incubó durante 20 minutos para remover los grupos protectores restantes. La solución se acidificó con una solución de 15 mg/ml de TCEP en ácido acético acuoso al 20%, se cargó en una columna CLAR de . fase inversa C4 preparativa y se purificó con un gradiente lineal. Las fracciones que contienen el producto ligado deseado SEP-3 :Acm+SEP-3 :2+SEP-3 :3+SEP-3 :4 se identifican por EM-ER y se liofilizan durante la noche. Etapa 4 Remoción de Acm. Para remover el Acm, la solución de acetonitrilo acuosa que contienen las fracciones agrupadas de SEP-3 :Acm+SEP-3 : 2+SEP-3 : 3+SEP-3 : 4 se diluye Ix con agua grado CLAR, y se agrega urea sólida para una concentración final de 2 molar. Se agrega un exceso molar de tres veces (con relación a la concentración de cisteína esperada total) de una solución 30 mg/ml de Hg (acetato) 2 en ácido acético acuoso al 3% y la solución se agitó durante una hora.' La solución se hace entonces al 20% en ß-mercaptoetanol, cargada en una columna CLAR de fase inversa semi-preparativa C4 y purificada con un gradiente de etapa. Las fracciones que contienen el producto ligado deseado SEP-3 :2+SEP-3 :'3+SEP~3 :4 se identifican por EM-ER y se liofilizan durante la noche . Etapa 5: Ligación #3. Se disolvieron de manera conjunta cantidades iguales de SEP-3 : 2+SEP-3 : 3+SEP-3 : 4 y SEP:3:1 en TFE puro a una concentración de 15 mM. Se agregaron solución amortiguadora de fosfato 250 mM (pH 7.5) que contiene guanidino 6 M y tiofenol al 1%, resultando en una solución clara de segmentos de péptido. Después de un día de ligación, la mezcla de ligación (definida como 1 volumen) se agregó a 2 volúmenes de una solución de 10 mi de TFE, 10 mi de ß-mercaptoetanol , 10 mi de piridiria y 20 mi de guanidino 6 M, pH, y se incubó durante 20 minutos para remover cualquier resto de grupos protectores. La solución se hizo ácida con una solución de 15 mg/ml de TCEP en ácido acético acuoso al 20%, cargada en una columna CLAR de fase inversa C4 preparativa, y se purificó con un gradiente lineal. Las fracciones que contienen el producto ligado deseado SEP-3 :l+SEP-3 :2+SEP-3 :3+SEP-3 :4 se identificaron por EM-ER y se liofilizaron durante la noche. Etapa 6: Enlace del Polímero GRFNP32. El polímero (EDA-Succ)i8 lineal funcionalizado en maleimida llamado GRFNP32-maleimida, se preparó al funcionalizar el GRFNP32 con BMPS (éster NHS del ácido 3-maleimido propiónico, Pierce, EU7A) siguiendo los protocolos de los fabricantes para formar el polímero (EDA-Succ)18 funcionalizado en maleimida [esto es, maleimida- (EDA-Succ) 18] . Se' disolvió SEP-3 : l+SEP-3 : 2+SEP-3: 3+SEP-3:4 en la cantidad mínima de TFE requerida. Se disolvió tres veces el exceso de GRFNP32 -maleimida en cloruro de guanidino 6M, fosfato 100 mM, pH 7.5 y se agregó a la solución de TFE. El progreso de la reacción de adición Michael se siguió por CLAR de fase inversa analítica. Después de que la reacción se completó, la solución se cargó en una columna CLAR de fase inversa C4 preparativa. Las fracciones contienen el producto modificado por polímero deseado SEP3 :Acm+SEP-3 : l+SEP-3 : 2+SEP-3 : 3+pPEG [esto es, la cadena de polipéptido de 166 residuos de longitud completa ligada con cuatro copias de GRFNP32 enlazadas a los tioles de cadena lateral de Cys24, Cys38, Cys83 y Cys126, y de esta manera también llamado SEP3 :Acm+SEP-3 : l+SEP-3 : 2+SEP-3 : 3+SEP- 3:4+GP32], se identifican por EM-ER y se liofilizan durante la noche. Etapa 7: Remoción de Pbo. Para la reducción de Pbo, el polvo liofilizado de SEP3 :Acm+SEP-3 : l+SEP-3 : 2+SEP-3 : 3+SEP-3:4+GP32 se disolvió en TFA puro que contiene etanditiol al 5%. El grupo Pbo se desdobla entonces por la adición de tioanisol al 10% y bromotrimetilsilano al 15% durante 30 minutos . La solución se secó en un evaporador rotatorio y se tomó en acetonitrilo acuoso que contiene TFA al 0.1%. La solución resultante se cargó en una columna CLAR de fase inversa semi-preparativa y se purificó con un gradiente de paso. Las fracciones que contienen el producto desprotegido Cys161 deseado SEP3 : cm+SEP-3 : l+SEP-3 : 2+SEP-3 : 3+SEP-3 : 4+GP32-Pbo, se identifican por EM-ER y se liofilizaron durante la noche . Etapa 8: Remoción de Ac . Para la remoción final de Acm de las cadenas laterales de Cys7, Cys29, y Cys33, la solución de acetonitrilo acuosa que contienen las fracciones agrupadas de SEP3 :Acm+SEP-3 : l+SEP-3 : 2+SEP-3 : 3+SEP-3 : +GP32-Pbo se diluyó lx con agua grado CLAR, y se agregó urea sólida para una concentración final de 2 molar. Un exceso molar de tres veces (con relación a la concentración de cisteína esperada total) de una solución 30 mg/ml de Hg (acetato) 2 en ácido acético acuoso al 3%, se agregó y la solución se agitó durante una hora. La solución se hizo entonces al 20% en ß-mercaptoetanol , se cargó en una columna CLAR de fase inversa C4 semi-preparativa y se purificó con un gradiente de etapa. Las fracciones que contienen el producto modificado por polímero, ligado deseado SEP-3 (1-166) , se identificaron por EM-ER y se liofilizaron durante la noche. Etapa 9 Plegado: El péptido SEP-3 modificado en polímero, ligado de longitud completa (1-166) se disolvió en solución amortiguadora Tris 200 mM (pH 8.7) que contiene cloruro de guanidino y TFE al 20% y un exceso molar de diez veces (con relación a los residuos Cys en SEP-3) de cisteína. Esta solución se dializó durante la noche contra una solución de solución amortiguadora Tris 200 mM (pH 8.7) que contiene cloruro de guanidino 3M a temperatura ambiente. La solución se dializó entonces contra una solución de solución amortiguadora Tris 200 mM (pH 8.7) que contiene cloruro de guanidino 1M durante 4 horas a 4°C y finalmente contra solución amortiguadora de fosfato 10 mM (pH 7.0) durante 4 horas a 4°C para producir el producto plegado f nal . El pliegue se verificó por electroatomizado EM-ER y espectrometría CD. Etapa 10 Purificación: El péptido plegado se concentró 5x en viales concentradores centricon y se cargó en una columna de intercambio de cationes Resource S equilibrada a fosfato 10 mM, H 7.0. La proteína plegada se eluyó en un gradiente de sal lineal a NaCl 500 mM en 10 minutos. Las fracciones que contienen el producto plegado deseado SEP-3-L42, se identificaron por SDS-PAGE, y se congelaron y almacenaron a -80°C.

Ej emplo 6 Ensayo de Bioactividad de las Proteínas Sintéticas que Estimulan la Eritropoyesis . La bioactividad de las proteínas sintéticas que estimulan la eritropoyesis, SEP-0, SEP-1-L26, SEP-1-L30, SEP-1-B50, y SEP-3-L42, se determinó usando líneas de célula UT/7 y 32D 103197, en ensayos de proliferación de línea celular dependientes del factor usando eritropoyesis recombinante comercial como un estándar de control. La UT-7 es una línea de célula de leucemia megacarioblástica humana con dependencia absoluta en un factor estimulante de la colonia granulocito-macrófago, interleucina-3 (GM-CSF) , o eritropoyetina (EPO) para crecimiento y supervivencia (Miura Y, et al., Acta Haematol (1998) 99:180-184); Komatsu N, et al., Cáncer Res (19941) 51:341-8). La 32D 103197 es una línea de célula hematopoyética de murina (Metcalf, D. Int J Cell Cloning (1992) 10:116-25). Las soluciones de reserva de los constructos SEP se hacen en medio Dulbecco modificado de Iscove (I DM) , FBS al 10% (suero de bovino fetal) , glutamina y Penstrep, y se agregan series de diluciones 2x de estas soluciones de reserva a las placas de pozos múltiples a los cuales se le agregan las células UT/7 EPO humanas a una concentración de 5000 ??1??33/50µ1. Las placas se incuban a 37°C en presencia de C02 al 5% y se observan diariamente para el crecimiento. Después de cuatro días, se agregaron 20 µ? de 2.5 mg/ml de MTT (metiltiazol tetrazolio) en PBS (solución salina amortiguada en fosfato) y las placas se incubaron durante cuatro horas. Se agregaron 150 µ? de IPA y la absorbancia de cada pozo se leyó a 562 nm. Los valores ED50 (dosis efectiva para alcanzar el 50% de efecto máximo) para los compuestos SEP se determinó y comparó a la de células CHO (ovario de hámster chino) que producen rhEPO (eritropoyetina humana recombinante) . Los resultados de estos experimentos demuestran que todas las proteínas que estimulan la eritropoyesis sintética exhiben bioactividad . Los resultados ED50 para SEP-0, SEP-1-L26, SEP-1-L30, Y SEP-1-B50 se muestran en la Tabla VI .

Tabla VI.

Aunque la invención se ha descrito en conexión con modalidades específicas de la misma, se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales y esta solicitud se pretende que cubra cualesquiera de las variaciones, usos, o adaptaciones de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo tales salidas de la presente descripción cuando están dentro de la práctica conocida o regular dentro de la técnica a la cual pertenece la invención y cuando puede aplicarse a las características esenciales anteriormente establecidas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (62)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 5 1. Una proteina sintética, caracterizada porque contiene un residuo de pseudo aminoácido cuya cadena lateral tiene la fórmula: —S—Raa, donde Raa es una porción terminal opcionalmente substituida de una cadena lateral de aminoácido ribosomalmente específica, o un análogo de la porción G terminal de una cadena lateral de aminoácido ribosomalmente específica.
2. 2. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la cadena lateral —S— Raa tiene la misma longitud de cadena como la cadena lateral 5 del aminoácido ribosomalmente específico.
3. 3. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la cadena lateral —S— Raa tiene una longitud de cadena mayor que la cadena lateral del aminoácido ribosomalmente específico. 0
4. 4. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína tiene una actividad biológica poseída por la proteína bioactiva ribosomalmente específica.
5. 5. La proteína sintética de conformidad con la 5 reivindicación 4, caracterizada porque la cadena lateral —S—Raa del residuo de pseudo aminoácido, imita la estructura o función de un aminoácido ribosomalmente específico en la posición correspondiente en la proteína bioactiva.
6. 6. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la cadena lateral —S— Raa del residuo de pseudo aminoácido altera la estructura o función de un aminoácido ribosomalmente específico en una posición correspondiente en la proteína bioactiva.
7. 7. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la proteína 'sintética tiene un peso molecular de monómero mayor a alrededor de 25 kDa.
8. 8. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la proteína bioactiva producida ribosomalmente contiene un residuo de cisteína.
9. 9. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el residuo de pseudo aminoácido está en una posición diferente a una correspondiente a la posición del residuo de cisteína en la proteína bioactiva producida ribosomalmente.
10. 10. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la pluralidad de residuos de aminoácido de la proteína se enlazan a los residuos de aminoácido adyacentes por un enlace amida.
11. 11. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque cada residuo de aminoácido se enlaza a sus residuos de aminoácido adyacentes por enlaces amida.
12. 12. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteina se compone de una pluralidad de residuos de aminoácido en donde al menos uno de tales residuos de aminoácido se enlaza a un residuo de aminoácido adyacente por un enlace que no es de amida.
13. 13. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el enlace que no es de amida se selecciona del grupo que consiste de un enlace tioéster, un enlace tioéter y un enlace oxima .
14. 14. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el residuo de pseudo aminoácido es un residuo de aminoácido de configuración D.
15. 15. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el residuo de pseudo aminoácido es un residuo de aminoácido en configuración L.
16. 16. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el residuo de pseudo aminoácido se selecciona del grupo que consiste de una pseudo arginina,- una pseudo asparagina; un pseudo aspartato; una pseudo dopamina; un pseudo glut mato; una pseudo glutamina; una pseudo histidina; una pseudo ísoleucina; una pseudo leucina; una pseudo lisina; una pseudo metionina; una pseudo fenilalaniña; una pseudo serina; una pseudo treonina; un pseudo triptofano ; una pseudo tirosina; y una pseudo valina.
17. 17. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el residuo de pseudo aminoácido es un pseudo glutamato.
18. 18. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la proteína bioactiva ribosomalmente producida es una proteína de mamífero.
19. 19. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la proteína de mamífero se selecciona del grupo que consiste de una proteína de humano, simio, bovino, murino, porcino, ovino, y equino.
20. 20. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la proteína de mamífero es una proteína de humano.
21. 21. La proteína sintética de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 19-20, caracterizada porque la proteína tiene una bioactividad seleccionada de un receptor de proteína o fragmento del mismo, de un ligando del receptor de proteína o fragmento del mismo, o de una citocina .
22. 22. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la proteína sintética bioactiva tiene una bioactividad de una citocina.
23. 23. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la citocina se selecciona del grupo que consiste de una interleucina, una linfocina, una proteína RA TES, una proteína que estimula la eritropoyesis , factor de necrosis de tumor (TNF) , un interferón, factores de crecimiento y una hormona de péptido sencilla.
24. 24. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la citocina es una proteína que estimula la eritropoyesis.
25. 25. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la proteína que estimula la eritropoyesis es eritropoyetina .
26. 26. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la proteína bioactiva sintética se selecciona del grupo que consiste de SEP-0, SEP-1, y SEP-3.
27. 27. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la citocina es una proteína RANTES .
28. 28. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la citocina es un factor del crecimiento.
29. 29. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque el factor de crecimiento es G-CSF.
30. 30. La protelna sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína sintética comprende uno o más residuos de aminoácido que se modifican por uno o más aductos de polímero.
31. 31. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la proteína bioactiva producida ribosomalmente se glicosila en uno o más sitios de glicosilación.
32. 32. La proteína sintética de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la proteína sintética comprende uno o más residuos de aminoácido que se modifican por uno o más aductos de polímero en los residuos de aminoácido, que corresponden a al menos uno de los sitios de glicosilación de la proteína bioactiva producida ribosomalmente . '
33. 33. Una composición farmacéutica moleculármente homogénea, caracterizada porque comprende la proteína sintética, en donde la proteína posee la actividad biológica que imita la actividad biológica asociada con la proteína de mamífero bioactiva ribosomalmente específica, y tiene un peso molecular de monómero mayor a alrededor de 25 kDa, y contiene un residuo de pseudo aminoácido cuya cadena lateral tiene la fórmula: —S—Raa, donde Raa se selecciona del grupo que consiste de una porción terminal opcionalmente substituida de la cadena lateral de aminoácido ribosomalmente específica, o un análogo del mismo.
34. 34. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la composición comprende una mezcla de al menos dos de las composiciones farmacéuticas moleculármente homogéneas.
35. 35. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la proteina de mamífero bioactiva ribosomalmente específica se selecciona del grupo que consiste de proteína de humano, simio, bovino, murino, porcino, ovino, y equino.
36. 36. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la proteína de mamífero bioactiva ribosomalmente especifica es una proteína de humano .
37. 37. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la proteína sintética tiene la actividad biológica de un receptor de proteína o fragmento del mismo, de un ligando del receptor de proteína o fragmento del mismo, o de una citocina.
38. 38. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque la proteína sintética tiene una actividad biológica de una citocina.
39. 39. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la citocina se selecciona del grupo que consiste de una interleucina, una proteína RANTES, una linfocina, una proteína que estimula la eritropoyesis, factor de necrosis de tumor (TNF) , un interferón, factor de crecimiento y una hormona de péptido sencilla .
40. 40. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la citocina es una proteína que estimula la eritropoyesis.
41. 41. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque la proteína que estimula la eritropoyesis es eritropoyetina .
42. 42. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la proteína sintética se selecciona del grupo que consiste de SEP-0, SEP-1, y SEP-3.
43. 43. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la citocina es una proteína RANTES.
44. 44. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la citocina es un factor del crecimiento.
45. 45. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque el factor de crecimiento es G-CSF.
46. 46. Un método de tratamiento de una enfermedad o condición humana, caracterizado porque comprende administrar a un individuo que necesita de tal tratamiento, una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende una o más composiciones farmacéuticas moleculármente homogéneas, cada una comprende una proteína sintética, en donde la proteína sintética tiene un peso molecular de monómero mayor a alrededor de 25 kDa, y contiene un residuo de pseudo aminoácido cuya cadena lateral tiene la fórmula: —S—Raa, donde Raa se selecciona del grupo que consiste de una porción terminal opcionalmente substituida de la cadena lateral de aminoácido ribosomalmente específica, o un análogo del mismo; la proteína sintética posee una actividad biológica que imita la actividad biológica del receptor de la proteína humana bioactiva ribosomalmente específica o fragmento del mismo, ligando del receptor de la proteína o fragmento del mismo, o una citocina.
47. 47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la proteína sintética tiene la actividad biológica de la citocina.
48. 48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la citocina se selecciona del grupo que consiste de una interleucina, una linfocina, una proteína RANTES, una proteína que estimula la eritropoyesis , factor de necrosis de tumor (TNF) , un interferón, un factor de crecimiento y una hormona de péptido sencilla.
49. 49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la citocina es una proteína que estimula la eritropoyesis .
50. 50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la proteína que estimula la eritropoyesis es eritropoyetina .
51. 51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la proteína bioactiva sintética se selecciona del grupo que consiste de SEP-0, SEP-1, y SEP-3.
52. 52. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la citocina es una proteína RA TES . "
53. 53. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la citocina es un factor de crecimiento.
54. 54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el factor de crecimiento es G-CSF.
55. 55. Un método para sintetizar un polipéptido deseado de la fórmula: a. NH2-Qaaz-aay-W-aacooH donde Q y cada uno denotan la presencia opcional de uno o más residuos de aminoácido adicionales, aa^ denota el residuo de aminoácido N terminal del polipéptido; aax y aay denotan residuos de aminoácido adyacentes internos, que tienen cadenas laterales x e y, respectivamente, y aaCooH denota el residuo aminoácido C terminal del polipéptido: el método caracterizado porque comprende: (A) ligar un primer péptido que tiene la fórmula: aauH2"Q~ aax-COSR, en donde R es cualquier grupo compatible con el grupo tioéster, incluyendo, pero no limitado a, grupos arilo, bencilo, y alquilo, a un segundo péptido que tiene la fórmula: Cys-W-aaCOoH para por ello formar el polipéptido: aanHz-Q-aax-Cys-W-aacooH; y (B) incubar el polipéptido en presencia de un reactivo Raa-X, donde Raa es un grupo cuya estructura imita la porción - terminal de la cadena lateral del residuo de aminoácido aay; y X es un buen grupo de partida; la incubación se da bajo condiciones suficientes para formar el polipéptido deseado.
56. 56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque X es un halógeno.
57. 57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el halógeno es F, l o Br.
58. 58. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el residuo aay de aminoácido se selecciona del grupo que consiste de una pseudo arginina; una pseudo asparagina,- un pseudo aspartato; una pseudo dopamina; un pseudo glutamato; una pseudo glutamina; una pseudo histidina; una pseudo isoleucina; una pseudo leucina; una pseudo lisina; una pseudo metionina; una pseudo fenilalanina; una pseudo serina; una pseudo treonina; un pseudo triptofano; una pseudo tirosina; y una pseudo valina.
59. 59. Un polipéptido de la fórmula: aa H2~Qsa-z~aay-W-aacooH donde Q y W cada uno denotan la presencia opcional de uno o más residuos de aminoácido adicionales, aaffi2 denota el residuo de aminoácido N terminal del polipéptido; aax y aay denotan residuos de aminoácido adyacentes internos, que tienen cadenas laterales x e y, respectivamente, y aa80H denota el residuo aminoácido C terminal del polipéptido: caracterizado porque el polipéptido se produce por el método que comprende : (A) ligar un primer péptido que tiene la fórmula: aa^-Q- - aax-COSR, en donde R es cualquier grupo compatible con el grupo tioéster, incluyendo, pero no limitado a, grupos arilo, bencilo, y alquilo, a un segundo péptido que tiene la fórmula: Cys-W-aaCOoH para por ello formar el polipéptido: aauHj-Q-aax-C s-W-aacooH,- Y (B) incubar el polipéptido en presencia de un reactivo Raa-X, donde Raa es un grupo cuya estructura imita la porción terminal de la cadena lateral del residuo de aminoácido aay; y X es un buen grupo de partida; la incubación se da bajo condiciones suficientes para formar el polipéptido deseado.
60. 60. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque X es un halógeno.
61. 61. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el halógeno es F, I o Br.
62. 62. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el residuo de aminoácido aay se selecciona del grupo que consiste de una pseudo arginina; una pseudo asparagina; un pseudo aspartato; una pseudo dopamina; un pseudo glutamato; una pseudo glutamina; una pseudo histidina; una pseudo isoleucina; una pseudo leucina; una pseudo lisina; una pseudo metionina; una pseudo fenilalanina; una pseudo serina; una pseudo treonina; un pseudo triptofano; una pseudo tirosina; y una pseudo valina.