KR20070092706A - 조혈을 촉진하는 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 EPO 의태 펩티드 및 다가 및/또는 초상가 펩티드를 제조하기 위한 특별한 합성 방법에 관한 것이다.

Description

조혈을 촉진하는 분자{MOLECULES WHICH PROMOTE HEMATOPOIESIS}
본 발명은 에리트로포이에틴 수용체에 대한 결합 분자로서의 펩티드, 이의 제조 방법, 이러한 펩티드를 함유하는 약제, 및 선택된 징후, 바람직하게는 다양한 형태의 빈혈 및 뇌졸중을 치료하기 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
호르몬 에리트로포이에틴(EPO)은 165개의 아미노산으로 구성되고 네 개의 글리코실화 부위를 지니는 당단백질이다. 네 개의 복잡한 탄수화물 측쇄는 약 35 kD의 전체 분자량의 40%를 구성한다. EPO는 신장에서 형성되고 여기에서 비장 및 골수로 이동하여, 적혈구의 생성을 자극한다. 만성 신장병에서, 감소된 EPO 생성은 적혈구감소 빈혈을 초래한다. 유전공학에 의해 제조된 재조합 EPO를 이용하여, 빈혈은 효과적으로 치료될 수 있다. EPO는 투석 환자의 삶의 질을 높인다. 신장 빈혈 뿐 아니라 미숙아, 염증 및 종양-관련 빈혈에서의 빈혈 또한 재조합 EPO에 의해 개선될 수 있다. EPO를 이용하여, 종양 환자에서 고 용량 화학요법이 보다 성공적으로 수행될 수 있다. 유사하게, EPO는 방사선 치료의 범위내에서 투여되는 경우 암 환자의 회복을 증진시킨다.
EPO를 이용한 치료에서, 단백질이 신체에서 비교적 빠르게 분해되기 때문에, 요구되는 용량 섭생이 잦거나 연속적인 정맥내 또는 피하 적용에 기초한다는 점에 문제가 있다. 따라서, 재조합 EPO-유래된 분자의 개발은 예를 들어 추가의 글리코실화 또는 페길화에 의해 안정성을 증가시킴으로써 생물학적 반감기를 증가시키기 위한 당단백질의 선택적인 개질에 도움이 된다.
재조합 EPO를 이용한 치료와 관련된 또 다른 중요한 논제는 환자가 치료 동안 재조합 EPO에 대한 항체를 조성하는데 대한 위험성이다. 이것은, 재조합 EPO가 내인성 EPO와 완전히 동일하지 않다는 사실에 기인한다. 일단 항체 형성이 유도되면, 이것은 또한 내인성 에리트로포이에틴의 활성을 손상시키는 항체를 야기할 수 있다. 이것은 종종 치료에 요구되는 재조합 EPO의 용량을 증가시킨다. 특히 그러한 항체가 내인성 EPO의 활성을 손상시키는 경우, 이러한 효과는 치료-유도된 자가면역 질병으로서 해석될 수 있다. 예컨대, 투석 환자가 EPO-치료한 지 수 개월 또는 수 년 후에 신장 이식을 받는 경우에 이것은 특히 바람직하지 않다. 이후, 항체는 이식에 의해 생성된 내인성 EPO의 활성을 손상시킬 수 있으므로 이식된 기관의 에리트로포이에틴 활성을 손상시킨다. 현재, 생물학적 반감기을 증가시키기 위해 재조합 EPO로 도입된 개질이 이러한 문제를 악화시키는지 개선시키는지에 대한 의문은 여전히 남아 있다. 일반적으로, 광범위한 개질 및 더 긴 반감기는 이러한 문제의 특성을 악화시킬 것으로 예상된다.
대안적인 방법은 에리트로포이에틴과 서열 상동성 또는 구조적 관련성을 공유하지 않는 아미노산으로부터의 합성 펩티드를 제조하는 것이다. 에리트로포이에틴 보다 상당히 소형인, EPO의 서열과 관련이 없는 펩티드는 효능제로서 작용할 수 있는 것으로 나타났다 (Wrighton 등, 1996). 동일한 저자는 이러한 펩티드가 10개 의 아미노산 길이를 지닌 여전히 활성인 최소 펩티드로 절단될 수 있다고 보고하였다.
EPO의 활성을 흉내내는 합성 펩티드가 국제 공개 WO96/40749호의 주제였다. 여기에는 위치 10 및 17로서 일반적으로 언급되는 위치 (이 중 하나는 필수적인 것으로 고려됨)에 두 프롤린을 함유하는 것이 바람직한 별개의 컨센서스의 10 내지 40개 아미노산의 의태 펩티드가 기술되어 있다.
따라서, 지금까지, EPO 수용체의 모든 소형 펩티드-기재 효능제는 하나 이상의 프롤린을 함유하고, 매우 활성인 에리트로포이에틴-의태 펩티드 EMP1에서의 이들의 위치와 관련하여, 일반적으로 위치 10 및 17로서 매겨진 정의된 위치에 종종 두 프롤린 잔기를 함유하는 구조를 지녔다 (국제 공개 WO96/40749; Wrighton 등, 1996, Johnson 등, 1997):
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG.
상기 프롤린은 펩티드의 효능에 필수불가결한 것으로 고려된다. 위치 17의 프롤린의 경우, 이것은 수용체와의 상호작용에 의해 성립되었으나, 위치 10의 프롤린은 분자의 올바른 폴딩에 필수적인 것으로 여겨진다 (참조 Wrighton 등, 1996, 1997). 프롤린의 특이적 입체화학적 특성에 의해 뒷받침되는 올바른 폴딩은 일반적으로 생물학적 활성의 필수적인 전제조건이다. 일반적으로, 프롤린은 종종 -본 경우에- 헤어핀 구조 및 베타 회전의 형성에 수반되는 구조-형성용 아미노산이다. 이러한 특성으로 인해, 이것은 특히 프롤린-함유 펩티드/단백질을 파괴하는 후-프롤린-특이적 엔도펩티다제에 대한 빈번한 공격점이 된다. 수많은 내인성 펩티드 호르몬 (앤지오텐신 I 및 II, 유로텐신, 티레올리베린, 다른 리베린 등)이 이러한 "단일-적중(singe-hit)" 후-프롤린 절단에 의해 비활성화된다. 따라서, 프롤린-함유 EPO-의태 펩티드의 반감기는 이러한 빈번한 활성 효소의 활성에 의해 단축된다.
상기 펩티드는 화학적으로 생성될 수 있고 재조합 생성을 요구하지 않는데, 규정된 품질 및 주체성을 지닌 생성물을 조절 및 수득하기가 훨씬 더 어렵다. 상기 소형 크기의 펩티드의 화학적 생성은 또한 생성 비용의 측면에서 경쟁할 수 있다. 더욱이, 화학적 생성은 글리코실화, 페길화 또는 임의의 다른 규정된 개질과 같은 분자 변형의 한정된 도입을 허용하며, 이는 생물학적 반감기를 증가시키는 공지된 잠재력을 지닐 수 있다. 그러나, 지금까지 현존하는 EPO 의태 펩티드를 이용한 임의의 치료가 승인된 바 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 원시 EPO의 생물학적 활성의 적어도 필수적인 부분을 나타내는 대안적인 합성 펩티드를 제공하여, 치료 방법, 특히 빈혈 또는 뇌졸중의 치료에 효과적인 대안 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따라서, EPO 수용체에 결합하며 효능제 활성을 포함할 수 있는 적어도 10개의 아미노산 길이의 펩티드가 제공된다. 따라서, 이러한 펩티드는 EPO 의태 특성을 나타낸다. 본 발명에 따른 EPO 의태 펩티드는 일반적으로 EPO 의태 펩티드의 위치 10으로 언급되는 위치에 프롤린을 포함하지 않으나, 양으로 하전된 아미노산을 지닌다 (넘버링에 대해서는 EMP1의 조상 서열을 기술하고 있는 예컨대 Johnson 등, 1997을 참조한다).
위치 10의 상기 프롤린은 특정 폴딩 구조에 특징적인 아미노산 모티프, 즉 베타-회전 모티프에 정위된다 (참조 Johnson, 1997). 상기 베타-회전 구조는 수용체 결합 위에 형성된다. 본 발명에 따른 EPO 의태 펩티드는 따라서 위치 10에서 베타-회전 모티프에 프롤린을 포함하지 않으나 양으로 하전된 아미노산을 지닌다. 예로는 K, R, H 또는 호모아르기닌과 같은 각각의 비천연 아미노산이 있다.
추가로, 하기 서열의 아미노산을 포함하는 펩티드가 제공된다:
X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15
상기에서, 각 아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산으로부터 선택되고
X6은 C, A, E, α-아미노-γ-브로모부티르산 또는 호모시스테인(hoc)이고;
X7은 R, H, L, W 또는 Y 또는 S이고;
X8은 M, F, I, 호모세린메틸에테르(hsm) 또는 노르이소류신이고;
X9는 G 또는 G의 보존적 교환이며;
X10은 프롤린의 비보존적 교환이거나;
X9 및 X10은 단일 아미노산에 의해 치환되고;
X11은 독립적으로 임의의 아미노산으로부터 선택되고;
X12는 T 또는 A이고;
X13은 W, 1-nal, 2-nal, A 또는 F이고;
X14는 D, E, I, L 또는 V이고;
X15는 C, A, K, α-아미노-γ-브로모부티르산 또는 호모시스테인(hoc)이고
단 X6 또는 X15는 C 또는 hoc이다.
기술된 펩티드 컨센서스의 길이는 10개 내지 40개 또는 50개 또는 60개의 아미노산인 것이 바람직하다. 60개를 넘는 아미노산 길이의 펩티드는 기술적으로 적합할지라도, 펩티드 길이의 증가에 따라 일반적으로 합성이 보다 복잡해지고 비용이 많이 들기 때문에 반드시 바람직한 것은 아니다. 바람직한 구체예에서, 펩티드 컨센서스는 적어도 10개, 15개, 18개 또는 20개 길이의 아미노산을 지닌다. 물론 이들은 더 긴 펩티드에 의해 각각 포함되도록 묻힐 수 있다. 기술된 펩티드 서열은 EPO 수용체에 대한 결합 도메인으로서 파악될 수 있다. EPO 의태 펩티드로서, 이들은 EPO 수용체에 결합될 수 있다.
하나 또는 -몇몇 구체예에 따르면- 두 프롤린 모두가 다른 천연 또는 비천연 아미노산에 의해 교체될 수 있다고 하더라도, 본 발명의 펩티드가 EPO 의태 활성을 나타낸다는 것은 매우 놀라웠다. 실제로, 본 발명에 따른 펩티드는 프롤린-함유 펩티드에 필적하는 활성을 지닌다. 그러나, 프롤린 잔기를 대신하는 아미노산이 보존적 교환을 나타내지 않는 대신 비보존적 교환을 나타낸다는 것에 주목할 만하다. 바람직하게는, 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 K. R 및 H 및 특히 K와 같은 염기성 아미노산을 대신 이용한다. 치환에 이용된 비보존적 아미노산은 비천연 아미노산일 수도 있고, 바람직하게는 양으로 하전된 측쇄를 지니는 것이다. 또한 언급된 아미노산의 개별적인 유사체가 포함된다. 비천연 아미노산의 적합한 예로는 호모아르기닌이 있다. 일 구체예에 따르면, 펩티드가 천연 아미노산인 아르기닌을 제외하고 위치 10에 양으로 하전된 아미노산을 지니고 있다. 이 구체예에 따르면, 프롤린 10은 따라서 K. H 또는 양으로 하전된 비천연 아미노산, 예컨대 호모아르기닌으로부터 선택된 아미노산으로 치환된다. 펩티드는 위치 10에서 라이신 또는 호모아르기닌을 나타내는 것이 바람직하다. 상기 기술된 대로, 위치 17의 프롤린은 비보존적 아미노산에 의해 교체될 수도 있다. 이러한 경우에, 상기 비보존적 아미노산은 K. R, H 또는 각각의 비천연 아미노산, 예컨대 호모아르기닌과 같은 양으로 하전된 측쇄를 지니는 것이 또한 바람직하다. 상기 구체예의 부-구체예에 따르면, 펩티드는 천연 아미노산인 아르기닌을 제외하고 위치 17에 양으로 하전된 아미노산을 지니고 있다. 이 구체예에 따르면, 프롤린 17은 따라서 K. H 또는 양으로 하전된 비천연 아미노산, 예컨대 호모아르기닌으로부터 선택된 아미노산으로 치환된다. 펩티드는 위치 17에서 라이신 또는 호모아르기닌을 나타내는 것이 바람직하다.
더욱이, 서열은 N-말단 및/또는 C-말단 아세틸화 및 아미드화를 지닐 수 있다. 몇몇 아미노산은 인산화될 수도 있다.
본 발명에 따르면, 에리트로포이에틴 수용체와 결합하고 하기 아미노산의 서열을 포함하는 펩티드가 제공된다:
X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15
상기에서, 각 아미노산은 표준 문자 약어에 의해 표시되며
X6은 C이고;
X7은 R, H, L 또는 W이고;
X8은 M, F 또는 I이고;
X9는 G 또는 G의 보존적 교환이며;
X10은 프롤린의 비보존적 교환이고;
X11은 독립적으로 임의의 아미노산으로부터 선택되고;
X12는 T이고;
X13은 W이고;
X14는 D, E, I, L 또는 V이고;
X15는 C이다.
추가로, X7은 세린일 수 있고, X8은 hsm 또는 노르이소류신일 수 있으며 X13은 1-nal, 2-nal, A 또는 F일 수 있다. 펩티드 컨센서스의 길이는 10개 내지 40개, 50개 또는 60개의 아미노산인 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 펩티드 컨센서스는 적어도 10개, 15개, 18개 또는 20개의 아미노산을 포함한다.
본 발명에 따른 펩티드는 L-아미노산 또는 입체이성질 D-아미노산 이외에, 비천연/비통상적인 아미노산, 예컨대 알파, 알파-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산 또는 락트산, 예컨대 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 호모세린-메틸에테르, β-알라닌, 3-피리딜알라닌, 4-히드록시프롤린, O-포스포세린, N-메틸글리신 (사르코신), 호모아르기닌, N-아세틸세린, N-아세틸글리신, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시라이신, 노르-라이신, 5-아미노레불린산 또는 아미노발레르산을 포함할 수 있다. N-메틸글리신 (MeG) 및 N-아세틸글리신 (AcG)을 특히 말단 위치에 사용하는 것이 특히 바람직하다. 또한 정의된 펩티드의 레트로, 인버소 및 레트로/인버소 펩티드 및 오로지 D-아미노산으로만 구성된 펩티드가 본 발명의 범위내에 있다.
또한 본 발명은 메티오닌의 산화 생성물, 또는 탈아미드화된 글루타민, 아르기닌 및 C-말단 아미드와 같은 펩티드의 유도체에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 펩티드는 아미노산 잔기 X9 및 X10을 치환시키는 단일의 아미노산을 지닌다. 이 구체예에서, 두 잔기 모두는 하나의 비천연 아미노산, 예컨대 5-아미노불린산 또는 아미노발레르산에 의해 치환될 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 발명에 따른 펩티드는 하기 컨센서스 서열을 포함한다:
X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15
상기에서, X6 내지 X15는 상기의 의미를 지니며
X4는 Y이고;
X5는 독립적으로 임의의 아미노산으로부터 선택되며, 바람직하게는 A, H, K, L, M, S, T 또는 I이다.
본 발명에 따른 펩티드는 연장될 수 있고 하기 컨센서스 서열을 포함할 수 있다:
X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18
상기에서, X4 내지 X15는 상기의 의미를 지니며
X3은 독립적으로 임의의 아미노산으로 선택되고, 바람직하게는 D, E, L, N, S, T 또는 V이고;
X16는 독립적으로 임의의 아미노산으로부터 선택되고, 바람직하게는 G, K, L, Q, R, S 또는 T이며, 보다 바람직하게는 K, R, S 또는 T이고;
X17은 독립적으로 임의의 아미노산으로부터 선택되고, 바람직하게는 A, G, P, R, K, Y 또는 양으로 하전된 측쇄를 지니는 비천연 아미노산이며, 보다 바람직하게는 K 또는 Har이고;
X18은 독립적으로 임의의 아미노산으로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 상기 펩티드는 X6이 C, E, A 또는 hoc이고, 바람직하게는 C 이고/거나 X7이 R, H 또는 Y 또는 S 이고/거나 X8이 F 또는 M 이고/거나 X9가 G 또는 A이고, 바람직하게는 G 이고/거나 X10이 K 또는 Har 이고/거나 X11이 V, L, I, M, E, A, T 또는 노르이소류신이고/거나 X12가 T 이고/거나 X13이 W 이고/거나 X14가 D 또는 V 이고/거나 X15가 C 또는 hoc이고, 바람직하게는 C이고/거나 X17이 P, Y 또는 A이거나 염기성 천연 또는 비천연 아미노산이다. 그러나, X17이 K 거나 양으로 하전된 측쇄를 지니는 비천연 아미노산, 예컨대 호모아르기닌인 것이 또한 바람직하다.
도 19는 EPO 의태 활성을 나타내는 신규하고 적합한 펩티드 서열을 추가로 기술한다. 추가의 펩티드는 하기 서열을 나타낸다:
Figure 112007041692014-PCT00001
펩티드가 프롤린을 지니지 않는다는 특징을 지니고 호르몬 에리트로포이에틴의 수용체에 대한 결합 용량을 지니며 효능제 활성을 나타내는 펩티드가 기술된다. 상기 기술된 대로, 이러한 펩티드는 일반적으로 10 및 17로서 언급되는 위치에 프롤린을 포함하지 않는 것이 바람직하나 상이한 천연 아미노산 또는 5-아미노레불린산을 포함한다. 이들은 바람직하게 위치 17에 라이신을 지닌다. 또한 각각의 펩티드를 코딩하는 핵산이 기술된다.
하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 서열 내에서 수행할 수 있고, 여기서 치환은 비극성 측쇄를 지니는 아미노산, 극성 측쇄를 지니는 천연 또는 비천연 비하전된 D- 또는 L-아미노산, 방향족 측쇄를 지니는 아미노산, 양으로 하전된 천연 또는 비천연 D- 또는 L-아미노산, 음으로 하전된 천연 또는 비천연 D- 또는 L-아미노산 뿐만 아니라 유사한 크기 및 분자량의 임의의 아미노산 내에서 일어나며, 원래 아미노산의 분자량은 원래 아미노산의 분자량의 약 +/- 25%의 분자량을 초과하게 벗어나지 않아야 하고, 효능 효과를 지니는 호르몬 에리트로포이에틴의 수용체에 대한 결합 용량은 유지된다. 바람직하게는, 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산이 치환된다. 위치 10 및 17에 프롤린이 도입되지 않는 서열 변형이 바람직하다.
본원에 기술된 펩티드 서열은 EPO 수용체에 대한 결합 도메인을 구성하는 적합한 의태 펩티드 유닛으로서 사용될 수 있다. 이들은 EPO 수용체에 결합하므로 이들의 의태 형태로 사용될 수 있다. 본원에 기술된 대로, 이들은 이량체로서 사용되는 것이 바람직한데, 그 이유는 EPO 수용체의 이량체화 및 그에 따라 생물학적 활성을 유도하는 용량이 단량체 결합 유닛의 이량체화에 의해 향상되기 때문이다.
따라서, 많은 상이한 펩티드가 본 발명의 범위내에 있음이 명백하다. 그러나, 서열 Ac-VLPLYRCRMGRETWECMRAAGVTK-NH2은 확실한 불이익을 지니는 것으로 나타났기 때문에 본 발명에 바람직하지 않다.
기술된 개별적인 펩티드 서열의 시작(N 말단) 및 끝(C 말단)에서, 5개 이하의 아미노산이 제거되고/거나 첨가될 수 있다. 펩티드 기능이 보존되는 한 크기는 무관함이 자명하다. 추가로, 지나치게 짧아서 이량체화시 일반적으로 효능제로서 기능하는 단량체로서의 이들의 활성을 폴딩시키는 개별적인 펩티드 서열에 주목한다. 따라서, 상기 펩티드는 이들의 이량체 형태로서 사용되는 것이 바람직하다. 따라서 각각의 절단되고/거나 연장된 구체예가 본 발명의 정신에 포함된다.
본 발명에서, 대문자로서 하나의 문자 코드에 대한 약어는 비천연 아미노산의 첨가에 의해 연장된 표준 폴리펩티드 명명법에 의한 것들이다.
코드 아미노산
A V L I M F Y W H S T C N Q D E K R P G Ava, 5-Ava Als, 5-Als MeG AcG Hsm Har 1nal 2nal βAla hoc L-알라닌 L-발린 L-류신 L-이소류신 L-메티오닌 L-페닐알라닌 L-티로신 L-트립토판 L-히스티딘 L-세린 L-트레오닌 L-시스테인 L-아스파라긴 L-글루타민 L-아스파르트산 L-글루탐산 L-라이신 L-아르기닌 L-프롤린 글리신 5-아미노발레산 5-아미노레불린산 N-메틸글리신 N-아세틸글리신 호모세린 메틸에테르 호모아르기닌 1-나프틸알라닌 2-나프틸알라닌 베타-알라닌 호모시스테인
상기 기술된 대로, 본 발명은 또한 펩티드의 변형 및 단일 아미노산의 보존적 교환에 의해 규정된 펩티드 컨센서스를 포함한다. 이러한 교환은 결합 분자의 구조 및 기능을 대부분의 경우에 단지 약간 변경시킨다. 보존적 교환에서, 하나의 아미노산은 유사한 특성을 지니는 그룹내에서 또 다른 아미노산으로 교체된다.
상응한 그룹의 예로는:
- 비극성 측쇄를 지니는 아미노산: A, G, V, L, I, P, F, W, M
- 극성 측쇄를 지니는 비하전된 아미노산: S, T, G, C, Y, N, Q
- 방향족 측쇄를 지니는 아미노산: F, Y, W
- 양으로 하전된 아미노산: K, R, H
- 음으로 하전된 아미노산: D, E
- 유사한 크기 또는 분자량의 아미노산, 여기서 교체 아미노산의 분자량은 원래 아미노산의 분자량을 최대 +/- 25% (또는 +/- 20%, +/- 15%, +/- 10%)까지 벗어난다.
양으로 하전된 측쇄를 지니는 그룹의 경우에, 상기 그룹이 호모아르기닌과 같은 개별적인 측쇄 프로필을 지니는 비천연 아미노산을 포함함이 자명하다. 비천연 아미노산과 같은 10번 프롤린 치환 분자가 이들의 측쇄 특성을 특징으로 하는 상기 그룹 중 하나에 명백하게 할당될 수 없는 경우에, 이것은 일반적으로 본 발명에 따른 프롤린의 비보존적 치환으로서 인식되어야 한다. 이렇게 드문 아미노산을 분류하기 위해, 분자량에 따른 분류 보조법이 도움이 될 수 있다.
보다 구체적으로, Wrighton 등 (미국특허 5,773,569호 및 관련 특허)은 파지 디스플레이 기술을 이용하여 아미노산이 활성을 유지하면서 교체될 수 있는지를 조사하였다. 이들은 가능한 절단, 즉 주어진 EPO 의태 펩티드의 최소 길이를 연구하고 이에 대한 데이터를 공개하였다. 그러나, 중심의 Gly-잔기에 인접한 프롤린이 활성 펩티드를 수득하기 위한 유일한 가능성인 것처럼 보였다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 하기 서열번호 2, 4-9로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드가 제공된다. 특히 바람직한 것이 서열번호 2의 경우에서처럼 위치 10에 K 및 위치 17에 K를 지니는 펩티드이다.
Figure 112007041692014-PCT00002
Figure 112007041692014-PCT00003
일 구체예에 따르면, 펩티드 이량체 또는 다량체가 상기 제시된 서열번호 2 및 4-9 또는 이의 변형에 따른 단량체에 기초하여 형성된다. 본원에 기술된 펩티드는 예컨대 단일 아미노산의 보존적 교환에 의해 개질될 수도 있고, 여기서 바람직하게는 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산이 교환된다.
바람직하게는 이러한 펩티드가 N-말단에서 AcG 및 C-말단에서 MeG로서 개질된다.
상기 개요된 대로, 본 발명에 기술된 펩티드는 에리트로포이에틴 수용체의 결합 부위를 인식하는 단량체 결합 도메인으로서 간주될 수 있다. 그러나, Wrighton 등 (Wrighton 1997)이 지적한 대로, 이러한 결합 도메인 중 둘은 일반적으로 수용체를 동형이량체화하고 시그널 형질도입을 유도하기 위해 요구된다. 따라서, 단 하나의 분자에서 이러한 결합 도메인 중 둘의 조합이 활성을 현저하게 향상시키고, 결합 도메인 중 둘이 함께 훨씬 낮은 ED50 (효과 용량 50%, 활성의 측정)을 나타내면서 하나의 단일 결합 도메인을 지니는 펩티드가 동일한 정성적 활성 패턴을 나타내는 결과를 초래함은 별로 놀랍지 않았다. 두 결합 도메인을 포함하는 펩티드는 본 설명의 문맥내에서 이가 또는 이량체 펩티드로 지정되며 특히 바람직하다.
두 단량체 결합 도메인을 조합시키는 하나의 널리 공지된 기술적 해법은 이량체화이다. 지금까지 이러한 접근법에 따른 모든 해법은 하기를 특징으로 한다:
a) 결합 도메인이 일가 또는 단량체 펩티드로서 먼저 따로 합성되고, 단계 b에 대한 제조방법에서 예컨대 반응성 기의 부착에 의해 개질될 수 있다.
b) 제2 반응 단계에서, -대부분의 경우에 동일한- 두 결합 도메인을 별개의 이량체화 반응에서 함께 결합시키며, 이것은 두 이량체화된 도메인 사이에 일반적으로 개재된 링커 분자를 포함할 수도 있다.
이러한 이량체는 이가 펩티드의 예이며 필수적으로 단량체와 동일한 생물학적 기능을 나타낸다. 일반적으로, 이들은 EPO 의태 펩티드의 경우에 향상된 생물학적 활성을 나타낸다.
본 발명의 교시에 따라 적용될 수 있는 단량체를 이량체화 또는 올리고머화하기 위한 수 가지 기술이 당업자에게 공지되어 있다. 단량체는 예컨대 링커에 대한 공유 부착에 의해 이량체화될 수 있다. 링커는 본 발명의 폴리펩티드 유닛 사이에 공유 결합을 생성하는 결합 분자이다. 폴리펩티드 유닛은 EPO 수용체에 대한 결합이 개선되는 방식으로 링커를 통해 조합될 수 있다 (Johnson 등, 1997; Wrighton 등, 1997). 더욱이 비공유 상호작용에 의한 단량체 비오티닐화된 펩티드 및 단백질 담체 분자의 다량체화가 Wrighton 등(Wrighton, 1997)에 의해 기술되었다. 펩티드의 C-말단을 비오티닐화하고 비오티닐화된 펩티드를 스트렙타비딘과 함께 후속하여 인큐베이션하는 비오틴/스트렙타비딘 시스템을 이용할 수도 있다. 대안적으로, 디케토피페라진 구조를 형성함에 의해 이량체화를 달성하는 것이 공지되어 있다. 당업자에게 공지된 상기 방법은 예컨대 문헌[Cavelier 등 (in: Peptides: The wave of the Future; Michal Lebl and Richard A. Houghten (eds); American Peptide Society, 2001)]에 상세하게 개시되어 있다. 이량체화 및 비공유 다량체화에 대한 상기 문헌의 설명들은 본원에 참조로서 포함된다. 종래 기술로부터 공지된 펩티드 이량체를 수득하기 위한 또 다른 대안적인 방법은 더 뒤의 링커 분자의 반응성 전구체로서 활성화된 이작용기성 디카르복실산 유도체를 이용하는 것이고, 이것은 N-말단 아미노기와 반응하여 최종 이량체 펩티드를 형성한다 (Johnson 등, 1997). 단량체는 링커에 대한 공유 부착에 의해 이량체화될 수도 있다. 바람직하게는, 링커가 NH-R-NH를 포함하고, 여기서 R은 또 다른 분자 부분에 대한 결합을 가능하게 하는 카르복실기 또는 아미노기와 같은 작용기로 치환된 저급 알킬렌이다. 링커는 라이신 잔기 또는 라이신 아미드를 함유할 수 있다. 또한 PEG를 링커로서 이용할 수 있다. 링커는 두 카르복실산을 함유하는 분자일 수 있고 하나 이상의 PEG 분자에 결합될 수 있는 아민과 같은 작용기를 지니도록 하나 이상의 원자에서 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 결합 분자를 이용한 펩티드의 올리고머화 및 이량체화를 위한 가능한 단계에 대한 상세한 설명이 WO2004/101606호에 제시된다.
이량체화/다량체화에 관한 상기 문헌의 기술이 본원에 참조로서 포함된다.
펩티드 단량체 또는 이량체는 하나 이상의 스페이서 분자를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는 예컨대 PEG일 수 있는, 상기 스페이서가 단량체 또는 이량체의 링커를 수 가용성 중합체 분자 또는 보호기에 연결시킨다. PEG의 바람직한 분자량은 3 kD 이상이고, 바람직하게는 20 내지 60 kD이다. 스페이서는 -NH 결합 또는 COOH-기로 종결된 C1-12 부분일 수 있고 저급 알킬 치환기를 지니도록 하나 이상의 이용할 수 있는 탄소 원자에서 치환되거나 치환되지 않는다. 특히 바람직한 스페이서가 WO2004/100997호에 개시되어 있다. 모든 문헌 -WO2004/100997호 WO2004/101606호-이 본원에 참조로서 포함된다. 펩티드의 PEG 변형은 본원에 참조로서 포함된 WO2004/101600호에 개시되어 있다.
기능적으로 충분하여 본 발명의 교시에 따라 이용될 수 있다고 하더라고, 이량체 분자를 합성하는 종래의 접근법은 얼마간의 단점을 지닐 수 있었다.
하나의 잠재적인 약점은 연결되는 단량체가 우선 따로 합성되어야 한다는 데에서 인식될 수 있었다. 이러한 접근법으로는 각각의 다량체화 반응에서의 이량체화 동안 단량체 펩티드의 확률적인 페어링(pairing)으로 인해, 헤테로이량체 이가/다가 펩티드를 수득하기가 특히 어렵다 (선택적으로 및 고의로). 적어도 이것은 특수하게 의도된 헤테로이량체의 생성에서 상당한 손실한 초래할 것이다. 둘 이상의 약간 상이한 단량체 결합 도메인을 함유하는 이가 또는 다가 펩티드가 매우 바람직한데, 그 이유는 이들의 헤테로이량체 특성으로 인해, 최종 이가 펩티드에서 이들의 상호작용을 안정화시킬 수 있는 두 도메인 사이의 특별한 상호작용이 도입될 수 있기 때문이다. 그러나, 종래 기술 "확률적인 이량체화 반응"과 관련된 수율에서의 높은 손실로 인해, 이것은 일반적으로 경게적으로 매력적인 접근법은 아니다.
이량체화를 위해 종래 기술의 접근법을 적용시키는 것은 따라서 -비록 기술적으로 적합할지라도- 기술된 대로 이종성 결합 도메인을 지니는 이러한 펩티드를 제공하기 위한 다소의 경제적 단점을 지닌다. 그러나, 본 발명은 심지어 이종성 결합 도메인을 함유할 수 있는, 고도로 활성인 다가 또는 이가 펩티드를 수득하기 위해 훨씬 더 효과적인 방법을 바람직하게 교시한다.
이러한 방법의 핵심 개념은 이량체화 또는 다량체화 이전의 분리된 반응에서 다가 또는 이가 펩티드의 단량체 펩티드 형성부를 합성하는 것을 억제하고, 예컨대 단 하나의 고체상 반응으로 최종 이가 또는 다가 펩티드를 한 단계로 단일 펩티드로서 합성하는 것이다. 따라서, 분리된 이량체화 또는 다량체화 반응은 더 이상 필요하지 않다. 이러한 측면은 큰 이점을 제공하는데, 즉 최종 펩티드 유닛에서 각각의 서열 위치에 대한 완전하고 독립적인 조절에 있다. 상기 방법은 각각의 서열 위치에 대한 독립적인 조절로 인해 펩티드 유닛에서 적어도 두 상이한 수용체-특이적 결합 도메인을 용이하게 포함하도록 한다.
이러한 구체예에 따르면, 결합 도메인 ("링커 영역") 사이에 있는 최종 펩티드의 서열은 아미노산만으로 구성되므로 단 하나의 연속적인 이가 또는 다가 EPO 의태 펩티드를 야기한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 링커는 형태적 고 유연성을 가능하게 하는 천연 또는 비천연 아미노산으로 구성된다. 이와 관련하여, 꼬임의 관점에서 고 유연성이 공지되어 있는 글리신 잔기를 결합 아미노산으로서 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 알라닌 또는 베타-알라닌과 같은 다른 아미노산 또는 이의 혼합물이 사용될 수도 있다. 사용되는 아미노산의 수 및 선택은 개개의 입체적 사실에 의존적이다. 본 발명의 상기 구체예는 분자 모델에 의해 적합한 링커의 제작 고안을 가능하게 하여 생체활성 형태의 뒤틀림을 회피한다. 3 내지 5 아미노산으로 구성된 링커가 특히 바람직하다.
최종 이가 또는 다가 펩티드의 기능적 도메인 (또는 단량체 유닛) 사이에 있는 링커가 펩티드의 별개의 부분일 수 있거나 단량체 기능적 도메인의 일부인 아미노산으로 -전체 또는 일부가- 구성될 수 있다는 것에 주목할 만하다. 예를 들어, 아미노산 위치 1 및 2와 19및 20의 글리신 잔기는 링커의 일부를 형성할 수 있다. 예로서 서열번호 11 내지 14가 제공된다. 따라서, 아미노산이 링커의 일부 뿐만 아니라 단량체 서브유닛의 일부를 형성하므로, "링커"라는 용어는 구조적이라기 보다 기능적으로 정의된다.
상기 언급된 대로, 이가/다가 펩티드의 합성 동안 최종 펩티드내에 있는 서열 위치가 조절하에 있고 따라서 정확하게 결정될 수 있기 때문에, 링커를 포함하는 펩티드 또는 이의 특정 영역 또는 도메인을 관리 또는 제작할 수 있다. 이것은 요망되지 않는 분자내 상호작용으로 인한 최종 이가 펩티드의 생체활성 형태의 뒤틀림을 피할 수 있게 하므로 특히 이롭다. 뒤틀림의 위험은 분자 모델에 의한 합성 이전에 평가될 수 있다. 이것은 특히 단량체 도메인 사이에 있는 링커의 고안에 적용된다.
본 발명에 따른 연속적인 이가/다가 펩티드는 상응하는 단량체 펩티드에 비해 훨씬 높은 활성을 나타내므로 효능의 증가가 이가 펩티드 개념과 관련된다는, 다른 이량체 펩티드로부터 공지된 관찰을 확인시켜 준다.
단량체 및 이량체 펩티드와 관련하여, 연속적인 이가/다가 펩티드는 예컨대 아세틸화 또는 아미드화 또는 C-말단 또는 N-말단 위치에서 연장됨에 의해 개질될 수 있다. PEG, 전분 또는 덱스트란과 같은 가용성 분자의 부착을 포함하는 상기 언급된 단량체 펩티드(단량체)에 대한 종래의 개질이 또한 본 발명에 따른 다가 또는 이가 펩티드에 대해 적용될 수 있다.
모든 가능한 변형이 링커를 개질시키는데 적용된다. 특히, 가용성 부분을 PEG, 전분 또는 덱스트란과 같은 링커에 부착시키는 것이 이로울 수 있다.
본 발명에 따른 최종 다가 또는 이가 펩티드의 합성은 유리하게 각각의 결합 도메인 내에 두 후속적이고 독립적인 이황화 결합 또는 다른 세포내 결합의 형성을 포함할 수 있다. 따라서, 펩티드가 고리화될 수도 있다.
본 발명에 따른 이가 구조는 본원에 보고된 펩티드 단량체에 기초하여 유리하게 형성된다.
EPO 수용체를 이량체화하기 위한 적합한 펩티드 유닛의 몇몇 예가 하기에 나열된다. 결합 도메인에 걸친 바는 임의적이나 바람직한 분자내 이황화 다리를 나타낸다:
서열번호 10(서열번호 2에 기초함):
Figure 112007041692014-PCT00004
서열번호 11
Figure 112007041692014-PCT00005
상기 이가 구조 중의 링커는 생체활성 형태의 뒤틀림을 막기 위해 분자 모델에 의해 제작된다 (도 1)
서열번호 12
링커 서열은 하나의 글리신 잔기에 의해 짧아질 수 있다. 이러한 서열은 또한 결합 도메인의 동일한 시간부에 형성된 글리신 잔기에 의해 구성된 링커에 대한 예이다 (서열번호 2 참조).
Figure 112007041692014-PCT00006
결합 도메인은 단량체 서열로서 사용될 수도 있다 (서열번호 13).
Figure 112007041692014-PCT00007
서열번호 14:
Figure 112007041692014-PCT00008
상기 서열은 약간 상이한(이종성) 두 결합 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 연속적인 이가 펩티드를 제공한다. 이러한 이가 펩티드는 종래의 이량체화 접근법 (상기 참조)과 관련된 경제적인 영향을 받지 않을 것이다. 또한 이러한 결합 도메인은 서열번호 15로서 단량체로서 적용될 수 있다.
서열번호 15:
Figure 112007041692014-PCT00009
서열번호 15a:
Figure 112007041692014-PCT00010
추가의 예로는
Figure 112007041692014-PCT00011
이 있다.
추가의 구체예에 따르면, 펩티드가 임의로 추가의 아미노산을 지니며, 바람직하게는 하기 서열에서와 같이 N-말단에 시스테인과 같은 반응성 측쇄를 지니는 것이 있다.
Figure 112007041692014-PCT00012
추가로, 펩티드의 예는 하기 아미노산 서열을 나타낸다:
Figure 112007041692014-PCT00013
첫번째 서열은 위치 X7에 세린을 지닌다. 상기 서열이 이량체에 혼입될 때 히드록실기의 도입을 통해 새로운 수소 다리가 생성됨이 발견되었다. 위치 X7의 세린의 효용은 이량체에 특히 유리한데, 이는 생체활성 형태가 안정화되기 때문이다.
비천연 아미노산 호모아르기닌을 나타내고 있는 두번째 서열은 수의적 목적으로 약제학적 조성물에 이용하기에 특히 적합하다. 위치 10 및/또는 17에 호모아르기닌과 같은 양으로 하전된 긴 측쇄를 지니는 아미노산을 지니고 있는 펩티드 서열이 마우스/개 수용체와 같은 EPO 수용체에 강한 결합 용량을 지님이 일반적으로 발견되었다. 따라서, 이들은 수의적 생성물에서의 사용에 특히 적합하나, 이들의 용도가 이에 한정되는 것은 아니다.
반응성 측쇄는 예컨대 추가의 변형에 대한 결합 끈으로서 기능할 수 있다. 더욱이 펩티드는 제1 및 제2 및/또는 제3 및 제4 시스테인 사이에 분자내 이황화 다리를 포함하거나 포함하지 않는다.
서열번호 2, 4-9 및 12, 13 및 15, 15a로 예시된 단량체 펩티드가 본 발명에 따른 연속적인 이가 펩티드와 유리하게 조합됨을 주목하는 것이 중요하다. 그러나, 이러한 단량체의 이량체화를 위한 종래 방법이 적용될 수도 있다. 본 발명의 범위내에 있는 (이로 제한되는 것은 아님) 단량체 펩티드에 적용되는 상기 종래 접근법의 예는 하기를 포함한다:
1. C-말단에서 C-말단으로의 연결을 통한 이량체화, 여기서 상기 단량체 펩티드 중 하나의 C-말단은 다른 펩티드의 C-말단에 공유적으로 결합된다. 단량체 사이의 링커/스페이서는 디케토피페라진 유닛을 함유할 수 있다. 바람직한 Gly-Gly 디케토피페라진 골격이 C-말단 글리신 단량체를 활성화시킴에 의해 달성될 수 있다. 상기 원리는 C-말단 이량체화를 형성하는 데에도 사용될 수 있다.
하기 식 및 예는 분자 모델링에 의해 최적화된 네 개의 제작된 예를 나타낸다:
(a) 서열번호 2에 기초한 이량체 (이량체 형태는 도 2에 도시된다):
Figure 112007041692014-PCT00014
(b) 서열번호 2에 기초하며 하나의 글리신에 의해 짧아진 링커를 지니는 이량체; 형태는 도 3에 도시된다.
Figure 112007041692014-PCT00015
(c) 서열번호 2에 기초하며 베타-알라닌에 의해 치환된 글리신을 지니는 이량체 (도 4). 단량체(서열번호 16)는 EPO 의태 펩티드로서 적용될 수도 있다.
Figure 112007041692014-PCT00016
(d) 서열번호 2에 기초하며 베타-알라닌에 의해 치환된 대안적인 글리신을 지니는 이량체 (도 5). 단량체(서열번호 17)는 EPO 의태 펩티드로서 적용될 수도 있다.
Figure 112007041692014-PCT00017
2. N-말단에서 N-말단으로의 연결을 통한 이량체화, 여기서 상기 단량체 펩티드 중 하나의 N-말단은 다른 펩티드의 N-말단에 공유적으로 결합됨으로써, 스페이서 유닛이 바람직하게 디카르복실산 빌딩 블록을 함유한다.
(a) 일 구체예에서, 하나의 글리신 잔기에 의해 N-말단에서 연장된 서열번호 2에 기초하여 생성된 이량체 (서열번호 18)는 링커/스페이서로서 헥산디오일 유닛을 함유한다 (도 6).
Figure 112007041692014-PCT00018
(b) 대안적인 구체예에서, 이량체화는 링커/스페이서로서 옥탄디오일 유닛을 이용하여 달성될 수 있다 (도 7):
Figure 112007041692014-PCT00019
3. 측쇄를 통한 이량체화, 여기서 상기 단량체 펩티드 중 하나의 아미노산 측쇄는 두 펩티드 단량체를 연결시키는 적합한 스페이서 분자를 포함시켜 다른 펩티드의 아미노산 측쇄에 공유적으로 결합된다. 이것은 하기를 포함할 수 있다:
(a) 아미드 결합을 통한 연결:
Figure 112007041692014-PCT00020
(b) 또는 이황화 다리를 통한 연결:
Figure 112007041692014-PCT00021
X는 개개 결합의 형성에 관여하는 각 아미노산의 백본 코어를 나타낸다.
상기 기술된 각각의 어셈블리 방법은 다량체의 제조에도 이용될 수 있다.
본원에 개시된 모든 결합 도메인 각각의 펩티드는 단독으로 또는 이가/다가 펩티드의 일부로서 단량체 형태로 이용될 수 있고/거나 하나 이상의 다른 동일하거나 상이한 펩티드 도메인과 조합될 수 있어서 개개의 동종 또는 이종성 이가 또는 다가 펩티드를 형성함에 주목한다.
펩티드는 예컨대 아세틸화 또는 아미드화에 의해 개질되거나 C-말단 또는 N-말단 위치에서 연장될 수 있다. 두 말단 중 하나에서 하나 이상의 아미노산을 이용한 연장, 예컨대 중합체에 대한 부착 부위의 제조는 종종 연속적인 펩티드로서 가장 잘 제조될 수 있는 헤테로이량체 이가 펩티드를 야기한다.
본 발명의 화합물은 사람 및/또는 수의적 약제학적 조성물을 제조하기 위해 바람직하게 이용될 수 있다. 이들은 EPO 의태물로서, 에리트로포이에틴과 기본적으로 동일한 정성적 활성 패턴을 나타낸다. 따라서, 이들은 일반적으로 에리트로포이에틴과 동일한 징후에 적합하다.
에리트로포이에틴은 시토킨 슈퍼패밀리의 일원이다. 도입부에 기술된 자극 효과 이외에, 에리트로포이에틴은 줄기 세포를 자극함이 또한 발견되었다. 따라서 본원에 기술된 EPO 의태물은 줄기 세포 관련 효과에 의해 야기되는 모든 징후에 적합하다. 비제한적인 예로서 신경계와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료가 있다. 신경학적인 손상, 질병 또는 질환의 예로는 예컨대 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤 무도병, 다발성 경화증, 근육위축가쪽경화증, 가우쳐병, 테이-사크병, 신경병증, 말초신경 손상, 뇌종양, 뇌 손상, 척수 손상 또는 뇌졸중 손상이 있다. 본 발명에 따른 EPO 의태 펩티드는 심장부전이거나 그럴 위험이 있는 환자의 예방 및/또는 치료적 처치에 사용될 수도 있다. 예로는 심근경색증, 심장동맥 질병, 심근염, 화학요법 치료, 알코올중독, 심근병증, 고혈압, 송모판폐쇄기능부족 또는 대동맥협착증을 포함하는 판막 심장병, 및 갑상샘 만성 및/또는 급성 심장 증후군의 질환이 있다.
또한, EPO 의태물은 내피 전구 세포의 생리적 가동, 증식 및 분화의 자극, 내피 전구 세포의 기능부전과 관련된 질환의 치료 및 상기 질병을 치료하기 위한 약제학적 조성물 및 내피 전구 세포의 자극에 적합한 상기 펩티드 및 다른 작용제를 포함하는 약제학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 질병의 예로는 고콜레스테롤혈증, 당뇨병, 내피-매개된 만성 염증 질환, 그물-내피증을 포함하는 내피증, 죽상경화증, 심장 질병, 심근허혈, 협심증, 연령-관련 심혈관 질병, 레이노드 질병, 임신성 과다근육긴장증, 만성 또는 급성 신장 기능상실, 심장 기능상실, 상처 치료 및 이차 질병이 있다.
더욱이, 본 발명에 따른 펩티드는 혈뇌벽을 가로질러 작용제를 운반하기에 적합한 담체이며 개별적인 용도 및/또는 혈뇌벽을 통과할 수 있는 개별적인 치료적 컨주게이션 작용제의 생성에 사용될 수 있다.
본원에 기술된 펩티드는 특히 에리트로포이에틴의 결핍 또는 낮거나 불완전한 적혈구 개체군을 특징으로 하는 질환의 치료 및 특히 임의의 유형의 빈혈 또는 뇌졸중의 치료에 적합하다. 펩티드는 또한 포유동물에서 헤마토크릿을 증가시키고/거나 유지하는데 적합하다. 이러한 약제학적 조성물은 의도된 투여 절차에 조성물이 적합하도록 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 적합한 운반 방법 및 담체 및 첨가제가 예를 들어 WO2004/101611호 및 WO2004/100997호에 기술되어 있다.
상기 개요된 대로, 이량체 또는 심지어 다량체에 대한 단량체 펩티드의 이량체화는 일반적으로 개개의 단량체 펩티드에 비해 EPO 의태 효능 활성을 향상시킨다. 그러나, 활성을 추가로 향상시키는 것이 바람직하다. 예를 들어. 이량체 EPO 의태 펩티드 조차도 세포 메커니즘의 활성화에 대해 EPO 보다 덜 유효하다.
펩티드의 활성을 증가시키기 위한 수 개의 접근법이 종래에 만들어졌고, 예를 들어 보다 유효한 후보를 동정하기 위한 아미노산 서열의 변형이 있다. 그러나, 지금까지도 펩티드, 특히 EPO의 활성을 추가로 향상시켜 생물학적 활성을 개선시키는 것이 여전히 요망된다.
본 발명의 추가의 구체예는 상기 문제에 대한 해법을 제공한다. 이에 표적 분자와 결합하며 하기를 포함하는 화합물이 제공된다:
i) 둘 이상의 펩티드 유닛, 여기서 각 펩티드 유닛은 표적에 대한 결합 용량을 지니는 둘 이상의 도메인을 포함함;
ii) 하나 이상의 고분자 담체 유닛;
여기서, 상기 펩티드 유닛은 상기 고분자 담체 유닛에 결합된다.
놀랍게도, 고분자 지지체 상에서 본 발명에 따른 둘 이상의 이가 또는 다가 펩티드의 조합은 결합 수용체에 대한 이가 (또는 심지어 다가) 펩티드의 효능을 부가적으로, 한층 더 부가적으로 크게 증가시킨다. 따라서, 상승적인 효과가 관찰된다.
본 발명의 목적을 위해 사용된 "이가"라는 용어는 표적, 여기에서는 EPO 수용체에 대한 결합 용량을 지니는 두 도메인을 포함하는 펩티드로서 정의된다. 따라서, "다가" 또는 "다량체" EPO 의태 펩티드는 EPO 수용체에 대해 수 개의 각각의 결합 도메인을 지닌다. "펩티드" 및 "펩티드 유닛"이라는 용어가 크기와 관련된 임의의 제한을 포함하지 않으며 올리고- 및 폴리펩티드 뿐만 아니라 단백질을 포함함이 자명하다.
고분자 담체 유닛에 부착된 둘 이상의 이가 또는 다가 펩티드 유닛을 포함하는 화합물을 본 구체예의 문맥에서 "초상가(supravalent)"로서 명명한다. 이러한 초상가 분자는 해당 분야에 공지된 이량체 또는 다량체 분자와 매우 상이하다. 해당 분야는 단순히 단량체 EPO 의태 펩티드를 조합시켜 이량체를 생성한다. 대조적으로 초상가 분자는 이미 (적어도) 이가의 펩티드 유닛을 고분자 담체 유닛에 연결시켜 초상가 분자를 산출함에 의해 생성된다 (실시예가 도 13 내지 15에 제시된다). 이에 의해, 펩티드의 전체 활성 및 효능이 크게 향상되고 따라서 EC50 용량이 감소된다.
해당 분야에 공지된 분자에 비해 초상가 분자의 큰 효능의 이유가 지금까지 완전히 이해되어 있지 않다. 이것은 해당 분야에 공지된 이량체 분자가 이량체 당 하나의 표적 각각에 대한 수용체 결합 부위만을 제공한다는 사실 때문이다. 따라서, 단 하나의 수용체 복합체가 이량체 화합물의 결합시 생성되므로 단 하나의 형질도입 과정을 유도한다. 예컨대, 두 단량체 EPO 의태 펩티드를 PEG를 통해 연결시켜 펩티드 이량체를 형성하고, 이로써 시그널 형질도입에 필요한 수용체 단량체의 이량체화를 촉진한다 (Johnson 등, 1997). 대조적으로, 본 발명에 따른 초상가 화합물은 수 개의 이미 이량체 또는 다량체인 개별적인 수용체 결합 유닛을 포함한다. 이것은 하나의 화합물 분자에 대해 수 개의 수용체 복합체를 세포 표면상에 생성할 수 있을 것이므로 펩티드 유닛의 활성을 한층 더 부가적으로 효능화한다. 초상가 화합물의 결합은 세포표면상에 수용체 복합체의 밀집화를 초래할 수 있다.
상기 구체예에 사용된 EPO 의태 펩티드 유닛은 동종- 또는 이종성일 수 있는데, 이는 동일하거나 상이한 펩티드 유닛이 사용됨을 의미한다. 동종- 또는 이종성일 수 있는 펩티드 유닛의 결합 도메인 (상기 기술된 단량체 펩티드)에도 동일하게 적용된다. 담체 유닛에 결합된 이가 또는 다가 펩티드 유닛은 동일한 수용체 표적에 결합된다.
그러나, 물론 이들의 아미노산 서열이 여전히 상이할 수 있다. 이가 또는 다가 펩티드 유닛의 단량체 결합 도메인은 선형 또는 고리형일 수 있다. 고리형 분자는 예를 들어 세포내 시스테인 다리 (상기 참조)의 형성에 의해 생성될 수 있다.
고분자 담체 유닛은 하나 이상의 천연 또는 합성의 분지, 선형 또는 수지상 중합체를 포함한다. 고분자 담체 유닛은 물 및 체액에 가용성인 것이 바람직하고, 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 중합체이다. 수가용성 중합체 분자는 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 유도체를 포함하고, PEG, PEG 동종중합체, mPEG, 폴리프로필렌글리콜 동종중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체 (여기서 상기 동종중합체 및 공중합체는 치환되지 않거나, 한 말단에서 예컨대 아실기에 의해 치환됨); 폴리글리세린 또는 폴리시알린산; 메틸셀룰로오스 및 카르복시메틸셀룰로오스를 포함하는 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체; 전분(예컨대 히드록시알킬 전분(HAS). 특히 히드록시에틸 전분(HES) 및 덱스트린, 이들의 유도체; 덱스트란설패트, 가교된 덱스트린 및 폴리비닐 에틸 에테르를 포함하는 덱스트란 및 덱스트란 유도체; 폴리비닐피롤리딘; a,b-폴리[(2-히드록시에틸)-DL-아스파르태트아미드; 폴리옥시에틸화된 폴리올을 포함한다. 물론 모든 생물학적으로 비활성인 수가용성 중합체를 이용할 수도 있다. 그럼에도 불구하고 단순히 적합한 담체 유닛의 바람직한 예로는 호모이작용기성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (비스-말레이미드, 비스카르복시, 비스아미노 등)이 있다.
고분자 담체 유닛은 본 발명에 적합한 상이한 중합체의 상이한 특성으로 인해 넓은 범위의 분자량을 지닐 수 있다. 따라서, 크기 제한이 없다. 그러나, 분자량이 3 kD 이상, 바람직하게는 10 kD 이상 및 대략 20 내지 500 kD 및 보다 바람직하게는 약 30 내지 150 또는 약 60 또는 80 kD인 것이 바람직하다. 담체 유닛의 크기는 선택된 중합체에 의존적이고 따라서 다양할 수 있다. 예를 들어, 히드록시에틸전분과 같은 전분을 사용하는 경우, 분자량은 상당히 더 높을 수 있다. 이 때 평균 분자량은 약 100 내지 4.000 kD 또는 심지어 그보다 더 높게 배열될 수 있다. 담체 유닛의 크기는 각 펩티드 유닛이 이들 각각의 수용체 분자를 결합시키기에 최적으로 배열될 수 있도록 바람직하게 선택된다. 이를 촉진하기 위해, 본 발명의 일 구체예는 분지 유닛을 포함하는 담체 유닛을 이용한다. 상기 구체예에 따르면, PEG와 같은 중합체가 분지 유닛에 부착되어 수많은 펩티드 유닛의 혼입을 가능하게 하는 큰 담체 분자를 야기한다. 적합한 분지 유닛의 예로는 글리세롤 또는 폴리글리세롤이 있다. 또한 본원에 참조로서 포함된 Haag 2000에 교시된 대로 수지상 분지 유닛을 이용할 수 있다.
바람직하게는, 펩티드 유닛이 단량체를 조합시킴에 의해 (헤드 투 헤드, 헤드 투 테일, 또는 테일 투 테일) 생성된 후에, 고분자 담체 유닛을 펩티드 유닛에 연결시킨다. 고분자 담체 유닛은 공유 또는 비공유(예컨대 배위) 결합을 통해 펩티드 유닛에 연결된다. 그러나, 공유 결합을 이용하는 것이 바람직하다. 부착은 라이신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아르파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 티로신 또는 N-말단 아미노가 및 C-말단 카르복실산과 같은 펩티드 유닛의 반응성 아미노산을 통해 발생할 수 있다.
고분자 담체 유닛이 적합한 커플링 그룹을 소유하지 않는 경우에, 수 개의 커플링 물질을 이용하여 중합체를 적합하게 개질시킴으로써 이것이 펩티드 유닛상에서 하나 이상의 반응성 기와 반응할 수 있다. 중합체를 개질시키기 위해 사용될 수 있는 적합한 화학적 기로는 예컨대 하기와 같은 것들이 있다:
단백질의 아미노기와 반응하는 아실화기, 예를 들어 산 무수물기, N-아실이미다졸기, 아지드기, N-카르복시 무수물기, 디케톤기, 디알킬 피로카르보네이트기, 이미도에스테르기 및 카르보디이미드-활성화된 카르복실기. 상기 모든 기는 단백질/펩티드 상의 아미노기와 반응하여 아실 또는 유사한 결합을 포함하는 공유 결합을 형성하는 것으로 공지되어 있다;
펩티드 유닛상의 설프히드릴(메르캅토), 티오메틸, 이미다조 또는 아미노기와 반응하는 알킬화기, 예컨대 할로-카르복실기, 말레이미드기, 활성화된 비닐기, 에틸렌이민기, 아실 할라이드기, 2-히드록시, 5-니트로-벤질 브로마이드기; 및 펩티드의 아미노기와 반응하는 환원제를 함께 지니는 지방족 알데히드 및 케톤기;
단백질의 카르복실기와 반응하는 에스테르 및 아미드 형성기, 예컨대 디아조카르복실레이트기, 및 아민기와 함께 카르보디이미드;
단백질상의 설프히드릴기와 반응하는 이황화 형성기, 예컨대 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조에이트)기 및 알킬메르캅탄기 (요오드와 같은 산화제의 존재하에 단백질의 설프히드릴기와 반응함);
디카르보닐기, 예컨대 시클로헥산디온기, 및 펩티드의 구아니딘 부분과 반응하는 다른 1,2-디케톤기;
펩티드 상의 페놀기와 반응하는 디아조기;
펩티드 상의 아미노기와 반응하는 시아노겐 브로마이드와 다당류와의 반응으로부터의 반응성기.
따라서, 요약해 보면, 본 발명에 따른 화합물은 먼저 중합체를 화학적으로 개질시켜 펩티드 유닛상에 이용할 수 있거나 도입된 화학적 기와 반응할 수 있는 하나 이상의 화학적 기를 지니는 중합체를 제공하고, 이후 -임의로- 개질된 중합체 및 펩티드 유닛을 함께 반응시켜 -필요하다면- 개질된 중합체의 화학적 기를 이용하여 공유적으로 결합된 이의 복합체를 형성함에 의해 제조될 수 있다.
커플링이 펩티드 (예컨대 시스테인 기)의 유리 SH-기를 통해 발생하는 경우, 중합체의 말레이미드기를 이용하는 것이 바람직하다.
규정된 분자를 생성하기 위해, 펩티드 유닛을 고분자 담체 유닛에 부착시키기 위한 표적화된 접근법을 이용하는 것이 바람직하다. 적합한 아미노산이 요망되는 부착 부위에 존재하지 않는 경우, 적합한 아미노산을 이량체 EPO 의태 펩티드 유닛에 혼입시킬 수 있다. 수 개의 상이한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 개체군을 포함하는 이종성 혼합물을 야기하는 펩티드를 통털어 조절되지 않는 커플링 반응을 회피하기 위해서는, 부위 특이적 중합체 부착에 대해, 펩티드 유닛의 말단에 유일한 반응성 기, 예컨대 특이적 아미노산이 바람직하다.
PEG 또는 HES와 같은 고분자 담체 유닛에 대한 펩티드 유닛의 커플링은 주요하게 당업자에게 공지된 반응을 이용하여 수행된다. 예컨대 당업자가 이용할 수 있는 다수의 PEG 및 HES 부착 방법이 있다 (참조, 예를 들어 WO 2004-100997호는 추가의 참고문헌, Roberts 등, 2002; 미국특허 4,064,118호; EP 1 398 322호; EP 1 398 327호; EP 1 398 328호; WO2004/024761호을 제공하며, 이들 모두는 본원에 참조로서 포함된다).
본원에 개시된 초상가 개념이 PEG화 또는 HES화의 공지된 개념과 상이한 것임을 이해하는 것이 중요한다. 해당 분야에서, 예컨대 PEG화는 단지 펩티드 이량체를 생성하거나 약물동력학적 파라미터를 개선시키기 위해 사용된다. 그러나, 상기 개요된 대로, 적어도 둘 이상의 이가 펩티드 유닛을 고분자 담체 유닛인 예컨대 PEG에 부착시키는 것이 효능을 상당히 향상시킨다 (따라서, EC50 용량이 감소됨). 따라서 본 발명의 개념은 당 분야에 공지된 PEG화 개념에 해당되는 경우인 약물동력학적 파라미터 뿐만 아니라 약력학적 파라미터에도 강한 효과를 지닌다. 그러나, 물론 고분자 담체 유닛으로서 PEG의 혼입이 약물동력학에 대해 공지된 이점을 지닌다.
PEG화는 일반적으로 펩티드의 생체약제학적 특성을 개선시키기 위해 수행된다. PEG 컨주게이션에 따른 단백질 분자의 가장 적절한 변경은 크기 확대, 단백질 표면 및 글리코실화 기능 차폐, 전하 변형 및 에피토프 차폐이다. 특히, 크기 확대는 신장 초여과를 늦추며 수동적 향상 투과 및 체류 메커니즘에 의해 투과가능한 조직으로의 축적을 촉진시킨다. 단백질 차폐는 단백질분해 및 면역계 인식을 감소시키는데, 이것은 중요한 제거 경로이다. 단백질 생리화학적 및 생물학적 특성에 대한 PEG화의 특이적 효과는 단백질 및 중합체 특성 뿐만 아니라 적용된 PEG화 방법에 의해 엄격하게 결정된다.
그러나, PEG 또는 다른 비분해가능한 중합체의 초상가 분자에 대한 지지체 유닛으로서의 사용은 새로운 문제를 야기할 수 있다.
생체내 적용 동안에, 임상적 설정에서의 복용 간격은 약물 효과의 손실을 일으킨다. 통상적인 복용 및 복용 간격은 효과가 복용 간격 동안 손실되지 않도록 조절된다. 비분해가능한 큰 중합체 유닛(예컨대, PEG-부분)에 부착된 펩티드가 지지체 분자 보다 빠르게 분해되어 인체로부터 제거될 수 있다는 사실로 인해, 담체 유닛이 축적될 위험이 발생할 수 있다. 이러한 축적 위험은 항상 약물의 효과-반감기가 약물 자체 또는 이의 성분/대사산물 중 하나의 제거-반감기 보다 짧기 때문에 일어난다. 따라서, 담체 분자의 축적은 펩티드가 일반적으로 매우 큰 PEG-부분 (~20-40kD)으로 PEG화되고 따라서 느린 신장 제거를 나타내기 때문에 회피되어야 한다. 펩티드 부분 자체는 효소적 분해를 수행하며 심지어 부분적인 절단이 펩티드를 탈활성화시키는데 충분할 수 있다.
이러한 문제의 해법을 찾기 위하여, 본 발명의 일 구체예는 둘 이상의 서브유닛으로 구성된 고분자 담체 유닛의 사용을 교시한다. 고분자 서브유닛은 생체분해가능한 공유 링커 구조를 통해 연결된다. 이 구체예에 따르면, 큰 (예를 들어 40 kD) 분자량의 담체 분자는 생체분해가능한 링커를 통해 연결된 여러 개의 소형 또는 중간 크기의 서브유닛(예를 들어, 각 서브유닛이 5 내지 10 kD의 분자량을 지님)에 의해 생성된다. 이에 의해 모듈라 분자량의 서브유닛은 요망되는 분자량의 담체 분자를 생성하는 것으로 이해된다. 그러나, 생체분해가능한 링커 구조는 인체에서 파과될 수 있으므로 더 작은 담체 서브유닛(예컨대 5 내지 10 kD)을 방출시킨다. 소형 담체 서브유닛은 일반적인 분자량 (예컨대 40 kD)를 지니는 중합체 분자 보다 양호한 신장 제거를 나타낸다. 예가 도 16에 제시된다.
링커 구조는 공지된 분해 특성 및 체액에서의 분해 시간 규모에 따라서 선택된다. 파괴가능한 구조는 예를 들어 가수분해에 의해 절단될 수 있는 아미드/펩티드 결합 또는 에스테르와 같은 카르복실산 유도체 등의 절단가능한 기를 함유할 수 있다 (참조, 예컨대 Roberts, 2002, 본원에 참조로서 포함됨). PEG 숙신이미딜 에스테르가 생리학적 pH에서 분해 속도를 조절하기 위해 PEG 백본에서의 다양한 에스테르 결합을 이용하여 합성될 수도 있다 (Zhao, 1997, 본원에 참조로서 포함됨). 벤질 우레탄의 디설파이드와 같은 다른 파괴가능한 구조가 예컨대 세포의 엔도솜 구획(Zalipsky, 1999)에서 온화한 환원 조건하에 절단될 수 있으므로 또한 적합하다. 적합한 링커를 선택하기 위한 다른 기준은 신속한 (종종 효소적인) 분해 또는 느린 (종종 비효소적인 분해) 분해의 선택에 있다. 체액에서 이러한 두 메커니즘의 조합이 또한 적합하다. 이렇게 매우 유리한 개념이 본원에 기술되거나 언급된 특정 펩티드에 제한되지 않으며 동일한 축적 문제가 발생하는 PEG 분자와 같은 큰 중합체 유닛에 부착되는 다른 약제학적 분자에도 적용됨이 명백하다.
일 구체예에 따르면, 히드록시알킬전분 및 바람직하게는 HES가 고분자 담체 유닛으로서 사용된다. HES는 여러 가지의 중요한 이점을 지닌다. 먼저, HES는 생체분해가능하다. 더욱이 HES의 생체분해성은 에틸기의 비율에 의해 조절될 수 있으므로 이에 좌우될 수 있다. 30 내지 50%의 에틸기가 본 발명의 목적에 매우 적합하다. 생체분해성으로 인해, 상기 PEG와 관련하여 기술된 축적 문제가 일반적으로 일어나지 않는다. 더욱이 HES는 예컨대 혈장 증량제의 형태로 의학적 치료에 장기간 사용되어 왔다. 따라서, 이의 무해성 사용이 승인된다.
또한, HES의 가수분해 생성물의 유도체가 가스 크로마토그래피에 의해 검출될 수 있다. HES-펩티드 컨주게이트는 펩티드 유닛이 여전히 안정한 조건하에 가수분해될 수 있다. 이것은 분해 생성물의 정량 및 모니터링을 가능하게 하고, 활성 펩티드의 평가 및 표준화를 가능하게 한다.
추가의 구체예에 따르면, 제1 유형의 고분자 담체 유닛을 사용하여 펩티드 유닛으로 로딩시킨다. 제1 담체는 예컨대 HES와 같이 용이하게 생체분해될 수 있는 것이 바람직하다. 그러나, 제1 담체의 모든 부착 스폿이 펩티드 유닛으로 점유되는 것은 아니며 예컨대 약 20 내지 50%만이 점유된다. 사용된 중합체의 크기에 따라서, 수 백개의 펩티드 유닛을 담체 분자와 커플링시킬 수 있다. 제1 담체의 나머지 부착 스폿은 제1 담체보다 낮은 분자량을 지니는 소형 PEG 유닛과 같은 상이한 담체에 의해 점유된다. 상기 구체예는 초상가 조성물이 바람직하게는 3 내지 5 또는 10 kD의 PEG 유닛에 의해 구성된 제2 담체의 존재로 인해 매우 내구력이 있는 제1 담체에 기인하여 생성된다는 이점을 지닌다. 그러나, 제1 담체 (예컨대 HES) 및 펩티드 유닛은 생체분해가능하고 제2 담체, 예컨대 PEG는 충분히 작아서 인체로부터 용이하게 제거될 수 있으므로, 모든 실체는 매우 잘 분해될 수 있다
펩티드 유닛의 결합 도메인을 구성하는 단량체는 호모이량체 에리트로포이에틴 수용체를 인식한다. 호모이량체 수용체의 나중의 특성은 많은 다른 시토킨 수용체로부터 EPO-수용체를 구별한다. 상기 기술된 둘 이상의 EPO 의태 단량체 결합 도메인을 포함하는 펩티드 유닛은 EPO 수용체와 결합되고 바람직하게는 이들의 표적을 이량체화 또는 다량체화시킬 수 있고/거나 이를 안정화시켜 복합체를 도입하는 시그널 형질도입을 생성시킬 수 있다.
본 발명은 또한 개개 화합물의 생성 방법을 포함하고, 여기서 펩티드 유닛은 각각의 담체 유닛에 연결된다. 더욱이 본 발명은 펩티드 유닛이 각각의 고분자 담체 유닛에 연결되는 개개 화합물의 생성 방법을 포함한다. 본 발명의 화합물은 사람용 및/또는 수의용 약제학적 조성물의 제조에 바람직하게 이용될 수 있다. 이들은 에리트로포이에틴의 결핍 또는 낮거나 불충분한 적혈구 개체군을 특징으로 하는 질병의 치료 및 특히 임의의 유형의 빈혈 및 뇌졸중의 치료에 특히 적합하다. 또한 이들은 상기 기술된 모든 징후에 이용될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 조성물이 의도된 투여 절차에 적합해지도록 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 적합한 전달 방법 및 담체 및 첨가제는 예를 들어 본원에 참조로서 포함된 WO2004/100997호 및 WO2004/101611호에 개시되어 있다.
초상가 분자의 개념은 실시예에 의해 설명될 수 있다. 도 13은 본 발명에 따른 간단한 초상가 분자의 예를 도시한다. 두 연속적인 이가 EPO 의태 펩티드를 N-말단에서 말레이미드기를 지니는 이작용기성 PEG 부분에 의해 연결시킨다. 시스테인은 PEG 담체 유닛에 대한 반응성 부착 부위로서 선택되었다.
그러나, 초상가 분자는 둘을 초과하는 이가 또는 다가 펩티드 유닛을 포함할 수 있다. 도 14는 분지 유닛으로서 중심 글리세롤 유닛을 지니는 담체 유닛에 기초한 실시예를 제시한다. 시스테인은 다시 부착을 위해 이용되었다. 도 20은 고분자 담체 유닛으로서 HES를 이용하는 실시예를 도시한다. HES는 펩티드 유닛의 SH기와 반응하는 말레이미드기를 지니도록 개질되었다. 실시예에 따라서, 모든 부착 부위가 펩티드 유닛에 결합된다. 그러나, 소형 PEG 유닛(예컨대, 3 내지 10 kD)이 부착 부위의 적어도 일부를 점유할 수 있었다.
상기 설명된 대로, 초상가 개념은 다가 수지상 중합체로 확대될 수 있으며, 여기서, 수지상 및/또는 중합체 담체 유닛은 매우 다수의 연속적인 이가 펩티드에 연결된다. 예를 들어, 수지상 분지 유닛은 폴리글리세롤에 기초할 수 있다 (본원에 참조로서 포함된 Haag 2000 참조).
6개의 연속적인 이가 펩티드를 함유하는 수지상 분지 유닛을 지니는 담체 유닛에 기초한 초상가 분자에 대한 실시예가 도 15에 도시된다.
초상가 분자의 다른 예는 전분 또는 덱스트란을 지니는 담체 유닛을 포함하고, 이들은 매우 많은 수의 알데히드 작용기를 포함하는 예컨대 과요오드산을 이용하여 산화된다. 제2 단계에서, 많은 이가 펩티드가 담체 유닛에 부착되어 함께 최 종 분자를 형성한다. 심지어 수 백개의 (예컨대 50 내지 1000, 바람직하게는 150 내지 800, 보다 바람직하게는 250 내지 700) 펩티드 유닛이 담체 분자, 예컨대 HES에 커플링될 수 있음을 주목한다.
도 16은 생체분해가능한 단순한 초상가 분자의 개념을 입증한다. 두 연속적인 이가 EPO 의태 펩티드를 N-말단에서 중간 절단 위치를 지니는 생체분해가능한 링커를 통해 연결되는 두 이작용기성 PEG 분자에 의해 연결한다. 상기 링커는 서브유닛에서 큰 PEG 유닛의 파괴를 허용하므로 신장 제거를 촉진시킨다.
1. 단량체의 펩티드 합성
수동 합성
PL-링크-아미드-수지 (치환 비율 0.4mmol/g) 또는 미리 로딩된 0.4mmol 규모의 Wang-수지를 사용한 디스커버 마이크로파 시스템(CEM)을 이용하여 합성을 수행하였다. 30ml 피페리딘/DMF(1:3)를 첨가하고 100W로 3x30초 동안 조사하여 Fmoc-기의 제거를 달성하였다. DMF PyBOP/HOBT/DIPEA 중 5배 과량의 아미노산을 커플링 첨가제로서 첨가하고 50W로 5x30초 동안 조사하여 아미노산의 커플링을 달성하였다. 모든 조사 싸이클 사이에, 용액을 빙조의 도움으로 수동적으로 냉각한다. 탈보호 및 커플링 이후에, 수지를 30ml의 DMF로 6회 세척한다. 마지막 아미노산의 탈보호 이후에, 몇몇 펩티드를 1.268ml의 캡핑 용액(100ml의 DMSO 중 4.73ml의 아세트산 무수물 및 8.73ml의 DIEA)과 함께 5분 동안 인큐베이션시켜 아세틸화한다. 절단 이전에, 수지를 30ml DMF로 6회 및 30ml DCM으로 6회 세척한다. 불활성 대기 하에 5ml의 TFA/TIS/EDT/H2O (94/1/2.5/2.5)로 120분 동안 처리하여 미정제 펩티드의 절단을 달성한다. 상기 용액을 40ml의 찬 에테르로 여과시킨다. 침전물을 아세토니트릴/물(1/1)에 용해시키고 펩티드를 RP-HPLC (Kromasil 100 C18 10㎛, 250x4.6mm)에 의해 정제한다.
자동 합성
PL-링크-아미드-수지 (치환 비율 0.4mmol/g) 또는 미리 로딩된 0.25mmol 규모의 Wang-수지를 사용한 오딧세이 마이크로파 시스템(CEM)을 이용하여 합성을 수행한다. 10ml 피페리딘/DMF(1:3)를 첨가하고 100W로 10x10초 동안 조사하여 Fmoc-기의 제거를 달성하였다. DMF PyBOP/HOBT/DIPEA 중 5배 과량의 아미노산을 커플링 첨가제로서 첨가하고 50W로 5x30초 동안 조사하여 아미노산의 커플링을 달성하였다. 모든 조사 싸이클 사이에, 용액을 반응 혼합물을 통해 질소를 버블링함으로써 냉각한다. 탈보호 및 커플링 이후에, 수지를 10ml의 DMF로 6회 세척한다. 마지막 아미노산의 탈보호 이후에, 몇몇 펩티드를 0.793ml의 캡핑 용액(100ml의 DMSO 중 4.73ml의 아세트산 무수물 및 8.73ml의 DIEA)과 함께 인큐베이션시켜 아세틸화한다. 절단 이전에, 수지를 10ml DMF로 6회 및 10ml DCM으로 6회 세척한다. 불활성 대기하에 5ml의 TFA/TIS/EDT/H2O (94/1/2.5/2.5)로 120분 동안 처리하여 미정제 펩티드의 절단을 달성한다. 상기 용액을 40ml의 찬 에테르로 여과하고, 침전물을 아세토니트릴/물(1/1)에 용해시키고 펩티드를 RP-HPLC (Kromasil 100 C18 10㎛, 250x4.6mm)에 의해 정제한다.
정제
모든 펩티드를 네불라-LCMS-시스템(Gilson)을 이용하여 정제하였다. 모든 펩티드의 미정제 물질을 아세토니트릴/물(1/1)에 용해시키고, 펩티드를 RP-HPLC (Kromasil 100 C18 10㎛, 250x4.6mm)에 의해 정제하였다. 유속은 20ml/분이었고 LCMS 스플리트 비율은 1/1000이었다.
II. 분자내 이황화 다리의 형성
K3[(FeCN6)]을 이용한 고리화
용액1: 10mg의 펩티드를 0.1% TFA/아세토니트릴에 용해시키고 0.5mg/ml의 농도에 도달할 때까지 물로 희석시켰다. 고체 중탄산암모늄을 첨가시켜 pH가 약 8이 되었다.
용액2: 두 번째 바이알에서 10ml의 0.1% TFA/아세토니트릴을 10ml의 물로 희석시킨다. 고체 중탄산암모늄을 pH가 8에 도달할 때까지 첨가하고 1 방울의 0.1M K3[(FeCN6)]을 첨가한다.
용액1 및 2를 3시간에 걸쳐 아세토니트릴/물 (1/1; pH = 8)의 혼합물에 적가한다. 혼합물을 실온에서 밤새 인큐베이션하고, 혼합물을 농축시키고 LCMS에 의해 정제시켰다.
CLEAR-OX™-수지를 이용한 고리화
100ml의 아세토니트릴/물 (1/1; 0.1% TFA)에 고체 중탄산암모늄을 pH가 8에 도달할 때까지 첨가한다. 30분 동안 아르곤을 버블링시켜 상기 용액을 탈기시킨 다. 여기서 100mg의 CLEAR-OX™-수지를 첨가한다. 10분 후, 10mg의 펩티드를 고체로서 첨가한다. 2시간의 인큐베이션 후, 용액을 여과하고, 농축시키고, LCMS에 의해 정제한다.
시클릭 펩티드의 정제
모든 펩티드를 네불라-LCMS-시스템(Gilson)을 이용하여 정제시켰다. 모든 펩티드의 미정제 물질을 아세토니트릴/물 (1/1) 또는 DMSO에 용해시키고, 펩티드를 RP-HPLC (Kromasil 100 C18 10㎛, 250x4.6mm)에 의해 정제하였다. 유속은 20ml/분이었고 LCMS 스플리트 비율은 1/1000이었다.
III. 단량체를 이용한 시험관내 검정
TF-1 세포를 이용한 BrdU 혼입에 의한 증식 검정
대수증식기의 TF-1 세포(~2.105 - 1.106 세포/ml; RPMI 배지; 20% 우태아 혈청; 페니실린, 스트렙토마이신, L-글루타민; 0.5ng/ml 인터루킨 3이 보충됨)를 세척하고 (원심분리 5분. 1500 rpm 및 IL3가 없는 RPMI 완전물에 500,000세포/ml로 재현탁) 미리 배양시킨 다음 IL-3 없이 24시간 동안 검정을 개시하였다. 다음 날, 세포를 24- 또는 96-웰 플레이트에 일반적으로 6 이상의 농도를 사용하여 그리고 시험되는 작용제 당 적어도 10.000세포/웰을 함유하는 농도 당 4 웰로 시딩한다. 각 실험은 재조합 EPO를 포함하는 대조군을 포지티브 대조 작용제로서 및 시토킨이 첨가되지 않은 웰을 네거티브 대조 작용제로서 포함한다. 펩티드 및 EPO 대조군은 배지에서 요망되는 농도로 미리 희석되고 세포에 첨가되며, 표준 배양 조건(37℃, 기체상 중 5% 이산화탄소, 물로 포화된 대기)하에 3일의 배양기간이 개시된다. 농도는 항상 3일의 배양 기간 중 웰에서의 작용제의 최종 농도를 언급한다. 상기 배양 기간의 종료시에, FdU를 최종 농도가 8ng/ml인 배양 배지에 첨가하고 배양을 6시간 동안 지속시킨다. 이후, BrdU (브로모데옥시우리딘) 및 dCd (2-데옥시시티딘)을 이들의 최종 농도로 첨가하고 (10ng/ml BrdU; 8ng/ml dCD; 배양 배지 중의 최종 농도) 추가로 2시간 동안 배양을 지속시킨다.
상기 인큐베이션 및 배양 기간의 종료시에, 세포를 1.5% BSA를 함유하는 인산염 완충된 염수로 1회 세척하고 최소량의 액체에 재현탁시킨다. 이 현탁액으로부터, 세포를 70% 에탄올에 -20℃에서 적가한다. 이로부터의 세포를 얼음상에서 10분 동안 인큐베이션시킨 다음 직접 분석하거나 분석 전에 4℃에서 저장할 수 있다.
분석에 앞서, 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 상청액을 폐기하고 세포를 최소량의 남아 있는 유체에 재현탁시켰다. 이후 세포를 현탁시키고 10분 동안 0.5ml 2M HCl/0.5% 트리톤 X-100에서 인큐베이션한다. 이후, 이들을 다시 펠릿화하고 최소량의 남아 있는 유체에 재현탁시키고, 이것을 0.5ml의 0.1N Na2B4O7에 pH 8.5으로 희석시킨 직후에 세포를 재펠릿화한다. 마지막으로, 세포를 40㎕의 인산염 완충된 염수(1.5% BSA)에 재현탁하고, 각각 20㎕의 세포 현탁액을 함유하는 두 반응 튜브로 나누었다. 2㎕의 항-BrdU-FITC (DAKO, 클론 Bu20a)를 하나의 튜브에 첨가하고 2㎕의 대조 mlgG1-FITC (Sigma)를 두번 째 튜브에 첨가하고 실온에서 30 분의 인큐베이션을 개시하였다. 이후, 0.4ml의 인산염 완충된 염수 및 10㎍/ml의 요오드화프로피듐 (최종 농도)을 첨가하였다. 흐름 세포측정기에서의 분석은 4C 세포 또는 보다 높은 배수성을 지니는 세포의 분획 및 BrdU-포지티브 세포의 분획을 나타내었고, 따라서 세포 주기의 적절한 단계에서 세포의 분획을 결정하였다.
TF-1 세포를 이용한 MTT에 의한 증식 검정
대수증식기의 TF-1 세포(~2.105 - 1.106 세포/ml; RPMI 배지; 20% 우태아 혈청; 페니실린, 스트렙토마이신, L-글루타민; 0.5ng/ml 인터루킨 3이 보충됨)를 세척하고 (원심분리 5분. 1500 rpm 및 IL3가 없는 RPMI 완전물에 500.000세포/ml로 재현탁) 미리 배양시킨 다음 IL-3 없이 24시간 동안 검정을 개시하였다. 다음 날, 세포를 24- 또는 96-웰 플레이트에 일반적으로 6 이상의 농도를 사용하여 그리고 시험되는 작용제 당 적어도 10.000세포/웰을 함유하는 농도 당 4 웰로 시딩한다. 각 실험은 재조합 EPO를 포함하는 대조군을 포지티브 대조 작용제로서 및 시토킨이 첨가되지 않은 웰을 네거티브 대조 작용제로서 포함한다. 펩티드 및 EPO 대조군은 배지에서 요망되는 농도로 미리 희석되고 세포에 첨가되며, 표준 배양 조건(37℃, 기체상 중 5% 이산화탄소, 물로 포화된 대기)하에 3일의 배양기간이 개시된다. 농도는 항상 4일의 배양 기간 중 웰에서의 작용제의 최종 농도를 언급한다.
4일 째에, 분석을 개시하기 전에, 연속 희석된 공지된 수의 TF-1 세포를 웰의 수대로 (100㎕ 배지 중 0/2500/5000/10000/20000/50000세포/웰) 제조한다. 이러한 웰을 시험 웰과 동일한 방식으로 처리하고 이후 세포 수가 결정될 수 있는 눈 금 곡선을 제공한다. 이러한 참조 웰이 설정되면, MTT 증식 키트 (Promega, CellTiter 96 Aqueous non-radioactive cell proliferation assay)로부터의 MTS 및 PMS를 37℃ 수조에서 해동시키고, 100㎕의 PMS 용액을 2ml의 MTS 용액에 첨가한다. 20㎕의 상기 혼합물을 검정 플레이트의 각 웰에 첨가하고 37℃에서 3-4시간 동안 인큐베이션한다. 물 중 25㎕의 10% 나트륨 도데실설페이트를 각 웰에 첨가하고 ELISA 리더에서 E492를 측정한다.
프로그램 그래프패드를 이용한 용량-반응 관계의 산출에 기초하여 도 17 및 18에 도시된 그래프 값을 이용하여, MTT-검정 데이터에 기초한 하기 EC50 값을 결정하였다:
하기 표는 예시적인 몇몇 펩티드의 EC50 값을 나타낸다:
Figure 112007041692014-PCT00022
Figure 112007041692014-PCT00023
IV. 이가 EPO 의태 펩티드의 합성
선형 서열번호 11 (AGEM 11)의 자동 합성
0.25mmol 규모의 링크-아미드-수지 (치환 비율 0.19mmol/g)을 사용한 리버티 마이크로파 시스템(CEM)을 이용하여 합성을 수행한다. 10ml 피페리딘/DMF(1:3)를 이용한 이중 처리 및 50W로 10x10초 동안 조사하여 Fmoc-기의 제거를 달성하였다. DMF PyBOP/HOBT/DIPEA 중 4배 과량의 아미노산을 커플링 첨가제로서 이용하여 이중 처리하고 50W로 5x30초 동안 조사하여 아미노산의 커플링을 달성하였다. 모든 조사 싸이클 사이에, 용액을 반응 혼합물을 통해 질소를 버블링함으로써 냉각한다. 탈보호 및 커플링 이후에, 수지를 10ml의 DMF로 6회 세척한다. 이중 커플링 싸이클 이후에, 모든 미처리된 아미노기를 10배 과량의 N-(2-클로로벤질옥시카르보닐옥시)숙신이미드 (DMF 중 0.2M 용액)로 처리하고 50W로 3x30초 동안 조사하여 차단시킨다. 마지막 아미노산의 탈보호 이후에, 펩티드를 0.793ml의 캡핑 용액(100ml의 DMSO 중 4.73ml의 아세트산 무수물 및 8.73ml의 DIEA)과 함께 인큐베이션시켜 아세틸화한다. 절단 이전에, 수지를 10ml DMF로 6회 및 10ml DCM으로 6회 세척한다. 불활성 대기하에 5ml의 TFA/TIS/EDT/H2O (94/1/2.5/2.5)로 120분 동안 처리하여 미정제 펩티드의 절단을 달성한다. 상기 용액을 40ml의 찬 에테르로 여과하고, 침전물을 아세토니트릴/물(1/1)에 용해시키고 펩티드를 RP-HPLC (Kromasil 100 C18 10㎛, 250x4.6mm)에 의해 정제한다.
선형 AGEM11의 정제 계획, Kromasil 100 C18 10㎛, 250x4.6mm 및 그에 따라 사용된 50분 후 5% 내지 50% 아세토니트릴 (0.1% TFA)의 구배가 도 8 및 9에 도시 된다.
선형 AGEM11의 고리화
Figure 112007041692014-PCT00024
30mg의 선형 펩티드를 60ml의 용액 A에 용해시켰다. 상기 용액 및 60ml DMSO를 60ml의 용액 A에 첨가하였다 (총 첨가 시간: 3시간). 48시간 후, 용매를 증발에 의해 제거하고 남아 있는 잔류물을 30ml의 DMSO/물 (1/1)에 용해시켰다. 30ml의 아세트산 및 17mg의 요오드 (DMSO/물 (1/1)에 용해됨)를 첨가하고 용액을 90분 동안 실온에서 혼합한다. 이후 20mg의 아스코르브산을 첨가하고 용매를 증발에 의해 제거한다. 미정제 혼합물을 아세토니트릴/물 (2/1)에 용해하고 펩티드를 RP-HPLC (Kromasil 100 C18 10㎛, 250x4.6mm)에 의해 정제한다.
용액 A: 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴/물 (1/1). 중탄산암모늄을 첨가시켜 pH를 8.0으로 조정한다.
시클릭 AGEM11에 대한 정제 파라미터가 도 10 및 11에 제시된다 (계획: 시클릭 AGEM11의 정제 계획, Kromasil 100 C18 10㎛, 250x4.6mm, 50분 후 5% 내지 35% 아세토니트릴 (0.1% TFA)의 구배).
V. EPO 활성을 측정하기 위한 시험관내 증식 검정
대수증식기의 TF1 세포 (20% 우태아 혈청(FCS) 및 0.5ng/ml IL-3을 지니는 RPMI에서 성장한 2.105 - 1.106세포/ml)를 계수하고, 검정을 수행하는데 요구되는 수의 세포를 원심분리하고 (5분, 1500rpm) IL-3이 없는 5% FCS를 지니는 RPMI에서 300 000세포/ml로 재현탁시켰다. 세포를 IL-3이 없는 상기 (기아) 배지에서 48시간 동안 미리 배양하였다. 검정을 개시하기 전에, 세포를 다시 계수하였다.
검정을 개시하기 직전에, 펩티드 및 EPO의 원액을 제조하였다. 펩티드를 칭량하고 5% FCS를 지니는 RPMI에 1mM, 467μM 또는 200 μM 이하의 농도로 용해시켰다. EPO 원액은 10 nM 또는 20 nM이었다. 292㎕의 상기 원액을 96 웰 배양 플레이트의 하나의 웰로 피펫팅하였다 - 시험된 각 물질에 대해 하나의 플레이트가 선택됨. 5% FCS를 지니는 200㎕의 RPMI을 각 플레이트에서 17개의 다른 웰로 피펫팅하였다. 92㎕의 원액을 200㎕의 배지를 함유하는 웰로 피펫팅하였다. 내용물을 혼합하고, 이 웰로부터의 92㎕를 다음 등으로 옮겼다. 이러한 방식으로 연속 희석된 (18 희석) 각 물질을 제조하였고, 각 연속적인 웰에서 농도는 이전 웰 농도의 1:√10 이었다. 각 웰로부터, 3x50㎕를 세 개의 빈 웰로 옮겼다. 이러한 방식으로 각 물질의 농도를 네 번 반복하여 측정하였다. 각 플레이트의 웰의 최상 및 최하 라인은 빈 채로 두었음을 주목한다.
미리 처리된 (기아된) 세포를 원심분리하고 (5분, 1500 rpm) 5% FCS를 지니는 RPMI에 200 000세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 50㎕의 세포 현탁액 (10 000개 세포)을 각 웰에 첨가하였다. 세포의 첨가로 인해, 웰 중 물질의 최종 농도가 원래 희석 범위의 반이 되었음을 주목한다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2하에 72시간 동안 인큐베이션하였다.
평가를 개시하기 전에, 웰로의 공지된 양의 희석 범위의 TF-1 세포를 제조하 였다: 0/2500/5000/10000/20000/50000세포/ml를 네 번씩 피펫팅하였다 (100㎕ RPMI + 5% FCS).
웰 당 살아 있는 세포의 수를 측정하기 위해, 이미 만들어져 있는 MTT 시약 (Promega, CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay)를 37℃의 수조에서 해동시켰다. 웰 당 20㎕의 MTT 시약을 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 5% CO2하에 추가로 1-2시간 동안 인큐베이션시켰다. 25㎕의 10% SDS 용액을 첨가하고, 플레이트를 ELISA 리더(Genios, Tecan)에서 평가하였다. 데이터를 스프레드시트 (엑셀)로 처리하고 그래프패드에서 플롯팅하였다.
데이터는 도 12에 요약되어 있다.
ED50 (nM):
EPO 0.0158
BB48 (단량체, 서열번호 2) 4113
AGEM11 (이가) 36.73
VI. 확대된 펩티드 검정
확대된 검정에서, 약 200개의 펩티드 서열은 이들의 EPO 의태 활성에 대해 시험하였다.
LIPS-Vario 합성 시스템 상에서 펩티드를 펩티드 아미드로서 합성하였다. 특별한 MTP-합성 플레이트에서 합성을 수행하였고, 규모는 펩티드 당 2μmol이었다. 합성은 활성화 시약으로서 HOBT를 이용하는 표준 Fmoc-프로토콜에 따랐다. 커플링 단계를 4회 커플링으로서 수행하였다. 각 커플링 단계는 25분이 소요되며 단계 당 과 아미노산은 2.8 이었다. 펩티드의 절단 및 탈보호를 90% TFA, 5% TIPS, 2.5% H2O 및 2.5% DDT를 함유하는 절단 용액으로 수행하였다. 수지에 부착된 완성된 펩티드를 함유하는 합성 플레이트를 96 딥 웰 플레이트의 상부에 저장하였다. 50㎕의 절단 용액을 각 웰에 첨가하고 10분 동안 절단을 수행하였으며, 이 절차는 3회 반복되었다. 절단된 펩티드를 중력 흐름에 의해 200㎕의 절단 용액을 이용하여 딥 웰 플레이트로 용리시켰다. 측쇄 작용기의 탈보호를 딥 웰 플레이트내에서 추가로 2.5시간 동안 수행하였다. 이후 빙냉 에테르/헥산으로 펩티드를 침전시키고 원심분리하였다. 펩티드를 중성 수용액에 용해시키고 밤새 4℃에서 인큐베이션시켜 고리화를 수행하였다. 펩티드를 동결건조시켰다.
도 19는 합성 및 시험된 펩티드 단량체에 대한 개요를 제공한다.
펩티드를 시험관내 증식 검정으로 이들의 EPO 의태 활성에 대해 시험하였다. V.에 기술된 대로 검정을 수행하였다. 각 검정일에, 40 마이크로역가 플레이트를 제조하여 1의 참조 실시예인 38개 시험 펩티드의 시험관내 활성과 동시에 EPO에 대해 측정하였다. EPO 원액은 20nM이었다.
결과를 도 19에 도시한다. 결과로부터 알 수 있듯이, 본 발명의 컨센서를 충족하지 않는 시험된 펩티드는 EPO 의태 활성을 나타내지 않았다.
VII. 펩티드 HES-컨주게이트의 합성
원칙적인 반응 계획을 도 21에 도시한다.
기술된 방법의 목적은 상기 실시예에 따른 전분 유도체, HES의 생성이며, 이것은 온화하고 수성인 반응 조건하에 티올기와 선택적으로 반응한다. 이러한 선택성은 말레이미드기를 가지고 도달된다.
HES 먼저 아미노기로 이작용기화되고 이후 각각의 말레이미드 유도체로 전환된다. 반응 배치에는 초 막을 통해 저분자 시약이 존재하지 않았다. 생성물, 중간체, 생성물 및 유리체가 모두 다분산된다.
아미노-HES(AHES)의 합성
히드록시에틸전분 (볼루벤®)을 저분자 물질 제거(diafiltration) 및 후속적인 동결건조에 의해 수득한다. 평균 몰 중량은 40%의 치환 등급을 지니며 약 130 kDa 이었다.
본원에 참조로서 포함된 문헌[Jacob Piehler, "Modifizierung von Oberflachen fur die thermodynamische und kinetische Charakterisierung biomolejularer Erkennung mit optischen Transducern", 1997]의 연구 보고에서 아미노 덱스트란에 대해 기술된 합성법에 따라 합성을 수행하였다. HES를 디올 히드록실기의 부분선택적인 산화에 의해 문헌[Floor 등 (1989)]에 기술된 과요오드화 나트륨을 지니는 알데히드기로 활성화시켰다. 알데히드기를 암모니아의 존재하에 나트륨 시아노보르히드라이드 (NaCNBH3)와의 환원성 아민화를 통해 아미노기로 전환시켰다 (Yalpani and Brooks, 1995).
과요오드화물 개방: 사용된 과요오드화물의 양은 20%의 글루코오스 빌딩 블 록 수를 나타낸다 (180g/ml의 글루코오스 빌딩 블록 질량 적용, DS = 0,4). 초 여과 및 동결건조를 통해 작업을 수행하였다.
NH4Cl/Na[BH3CN] (과량)을 이용한 환원성 아민화
생성물의 침전 및 저분자 물질 제거에 의해 작업.
분석
정성: 닌히드린 반응 (카이저-시험)
정량: 아미노 덱스트란과 비교하여 2,4,6-트리니트로벤졸 설폰산 (TNBS) 이용.
달성된 치환 등급은 약 2.8% 이었다. 이는 약 6400g/몰의 하나의 아미노기를 지니는 하나의 빌딩 블록의 몰 질량을 초래한다.
말레이미도프로피오닐-아미노-히드록시에틸전분("MalPA-HES")의 합성
합성
3-말레이미도프로피온산-N-히드록시숙신이미드에스테르 (MalPA-OSu)를 과량으로 (10배)(50mM 인산염 완충액, pH 7, 20% DMF, 밤새) 사용하여 초 여과 및 동결건조에 의해 작업하였다.
분석
아미노기의 반응을 닌히드린 및 TNBS로 확인하였다.
도입된 말레이미드기의 수는 글루타티온(GSH)의 반응 및 엘만스(Ellmans) 시약(DNTB)을 이용한 과도한 티올기의 검출에 의해 700 MHz-1H-NMR-분광계를 통해 입 증된다.
달성된 치환 등급은 약 2% 이었고, 이는 말레이미드 빌딩 블록 당 8500g/몰에 상응한다 (180g/몰의 글루코오스 빌딩 블록 질량, DS = 0,4).
펩티드-히드록시에틸전분-컨주게이트 (Pep-AHES)
합성
유리 (Pep-IA) 또는 비오티닐화된 (Pep-IB) N-말단을 지니는 시스테인 함유 펩티드를 이용하였다. Pep-IA/B의 4:1 혼합물을 밤새 과량으로 전환시켰고 (인산염 완충액 중 약 6 당량의 MalPA-HES, 50mM, pH 6.5/DMF 80:20; 초 여과 및 동결건조로 작업하였다.
분석
UV 흡수를 280nm에서 측정하고, 남아 있는 말레이미드기의 함량을 GSH/DNTB로 측정하였다.
펩티드 수율은 대부분 정량적인 것이다. 유리 말레이미드기가 거의 검출되지 않았다.
VIII. 항체-교차 반응성 검정
본 출원의 도입부에 기술된 대로, 환자들은 종종 rhuEPO에 대한 항체를 발생시킨다. 이것은 도입부에 개시된 힘든 결과를 초래한다.
본 발명에 따른 펩티드의 특성을 추가로 연구하기 위해, 펩티드가 실체로 항-EPO 항체와 교차 반응하는지를 분석하였다.
항-EPO 항체를 함유하는 토끼 및 사람 혈청을 시험에 이용하였다. 이러한 혈청은 EPO 또는 하기 EPO 의태 펩티드로 미리 처리되었다:
Figure 112007041692014-PCT00025
Ac = 아세틸화된 N-말단
Am = 아미드화된 C-말단
1nal = 1-나프틸알라닌
상이한 농도의 에리트로포이에틴 및 EPO 의태 펩티드를 분석에 이용하였다. 혈청을 시험 물질로 미리 처리하여 혈청에 존재하는 항-EPO 항체를 흡수시킨 후에, 혈청을 방사성 표지된 에리트로포이에틴으로 처리하였다. 예비 흡수 단계 이후에 혈청에 남아 있는 항체가 에리트로포이에틴에 의해 결합되고 다시 면역침전되었다. 본 시험에 이용된 프로토콜은 본원에 참조로서 포함된 Tacey 등, 2003에 기술되어 있다.
본 발명에 따라 EPO 또는 EPO 의태 펩티드를 이용하여 혈청을 함유하는 항-EPO 항체의 예비-흡수를 수행한 결과가 도 22에 개시된다.
혈청이 EPO 의태 펩티드로 미리 처리되는 경우, 혈청은 방사성 표지된 에리트로포이에틴과 접촉시 포지티브로 시험되었다. 따라서, 항-EPO 항체는 예비 처리에도 불구하고 혈청에서 검출된다. 이것은 EPO 의태 펩티드가 예비 처리 동안 항-EPO 항체에 결합할 수 없음을 의미한다. 결합 활성의 부재하에, 항-EPO 항체는 EPO 의태 펩티드와 함께 혈청으로부터 제거되지 않으므로 혈청에 남게 된다. 항-EPO 항체는 인식될 수 없으므로 EPO 의태 펩티드에 결합한다.
재조합 사람 EPO (rhuEPO)를 대조군으로서 이용하였다. 혈청이 에리트로포이에틴으로 미리 처리되는 경우, 방사성 표지된 에리트로포이에틴을 혼입시키는 후속적인 검정에서 상당히 많은 항체가 검출될 수 없었는데, 그 이유는 항체가 이미 결합되었거나 에리트로포이에틴의 예비 처리에 의해 제거되었기 때문이다.
도 22에 도시된 숫자는 IP에 이용된 총 계수의 % cpm을 나타낸다. % cpm 값이 > 0.9일 때 혈청은 포지티브인 것으로 측정된다. 100% cpm은 사용된 전체 계수(방사성 트레이서)의 양, 여기서 방사성 표지된 EPO를 나타낸다
상기 검정은 본 발명에 따른 EPO 의태 펩티드가 항-EPO 항체와 바람직하게 교차 반응하지 않음을 입증한다. 본원에 기술된 EPO 의태 펩티드는 따라서 rhuEPO에 대해 항체를 발생시키는 환자에서 조차 치료적 효과를 나타낼 것이다. 더욱이, EPO 의태 펩티드에 대한 항체가 에리트로포이에틴과 결합하지 않을 것으로 예상된다. 따라서 본 발명에 따른 EPO 의태 펩티드는 이들이 항-EPO 항체와 현저한 교차 반응성을 나타내지 않는다는 점에서 또한 바람직하다.
참조문헌:
Figure 112007041692014-PCT00026
SEQUENCE LISTING <110> AplaGen GmbH <120> Molecules which promote Hematopoiesis <130> 46 883 K <140> PCT/EP2005/012075 <141> 2005-11-10 <150> DE 10 2004 054 422 <151> 2004-11-10 <150> EP 04 029 536.2 <151> 2004-12-14 <150> US 11/041,207 <151> 2005-01-25 <150> EP 05 002 113.8 <151> 2005-02-02 <150> EP 05 012 637.4 <151> 2005-06-13 <150> EP 05 013 594.6 <151> 2005-06-23 <150> EP 05 020 035.1 <151> 2005-09-14 <160> 234 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 1st general formula <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> C, A, E, alpha-amino-gamma-bromobutyric acid or homocysteine (hoc) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> R, H, L, W, Y or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> M, F, I, homoserine methyl ether (hsm) or norisoleucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> G or conservative exchange of G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(5) <223> alternatively, the amino acids X9 and X10 (at positions 4 and 5) are substituted by a single amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> non-conservative exchange of proline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> independently selected from any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> T or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> W, 1-nal, 2-nal, A or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> D, E, I, L or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> C, A, K, alpha-amino-gamma-bromobutyric acid or homocysteine (hoc) provided that either X6 or X15 is C or hoc <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 2nd general formula <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> R, H, L or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> M, F or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> G or conservative exchange of G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> non-conservative exchange of proline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> independently selected from any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> D, E, I, L or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> C <400> 2 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 3rd general formula <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> independently selected from any amino acid, preferably A, H, K, L, M, S, T or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> C, A, E, alpha-amino-gamma-bromobutyric acid or homocysteine (hoc); or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> R, H, L, W, Y or S; or R, H, L or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> M, F, I, homoserine methyl ether (hsm) or norisoleucine; or M, F or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> G or conservative exchange of G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> non-conservative exchange of P; alternatively, the amino acids named X9 and X10 (position 6 and 7) are substituted by a single amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> independently selected from any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> T or A; or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> W, 1-nal, 2-nal, A or F; or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> D, E, I, L or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> C, A, K, alpha-amino-gamma-bromobutyric acid or homocysteine (hoc), provided that either X6 or X15 is C or hoc; or C <400> 3 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 4th general formula <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> independently selected from any amino acid, preferably D, E, L, N, S, T or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> independently selected from any amino acid, preferably A, H, K, L, M, S, T or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> C, A, E, alpha-amino-gamma-bromobutyric acid or homocysteine (hoc); or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> R, H, L, W, Y or S; or R, H, L or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> M, F, I, homoserine methyl ether (hsm) or norisoleucine; or M, F or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> G or conservative exchange of G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> non-conservative exchange of proline; alternatively, the amino acid positions named X9 and X10 (positions 7 and 8) are substituted by a single amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> independently selected from any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> T or A; T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> W, 1-nal, 2-nal, A or F; or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> D, E, I, L or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> C, A, K, alpha-amino-gamma-bromobutyric acid or homocysteine (hoc) provided that either X6 or X15 is C or hoc; or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> independently selected from any amino acid, preferably G, K, L, Q, R, S, or T, more preferred K, R, S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> independently selected from any amino acid, preferably A, G, P, R, K, Y or a non-natural amino acid with a positively charged side chain, more preferred K or Har <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> independently selected from any amino acid <400> 4 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 5 Gly Gly Thr Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 6 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-napthylalanine <400> 7 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-napthylalanine <400> 8 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 9 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Ile Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-napthylalanine <400> 10 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Glu Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 11 Gly Gly Thr Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 12 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Asn Gly Gly 20 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-napthylalanine <400> 13 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 14 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 15 Gly Gly Thr Tyr Leu Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 16 Gly Gly Thr Leu Ser Cys Glu Phe Gly Lys Leu Thr Glu Val Cys Asp 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 17 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 17 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 18 Gly Gly Thr Tyr His Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 19 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 20 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 21 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 21 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 22 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 22 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 23 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 23 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 24 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 24 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 25 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 25 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 26 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 26 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 27 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 27 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Leu Thr Xaa Asp Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 28 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 29 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 30 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Ser 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 31 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 31 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 32 Gly Gly Asp Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 33 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 33 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 34 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 34 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 35 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 35 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Gly 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 36 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-napthylalanine <400> 36 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 37 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 37 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 38 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 38 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 39 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 39 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 40 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 40 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 41 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 41 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 42 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 42 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Asp Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 43 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 43 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Ala Gly Gly 20 <210> 44 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 44 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Ile Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 45 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 45 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Leu 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 46 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 46 Gly Gly Val Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 47 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 47 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 48 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 48 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 49 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 49 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 50 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 50 Gly Gly Thr Leu Ser Cys Asp Phe Gly Gly Leu Thr Trp Val Cys Glu 1 5 10 15 Lys Gln Glu Gly 20 <210> 51 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 51 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 52 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 52 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 53 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 53 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Asp Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 54 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 54 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Leu Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 55 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 55 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 56 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Asp Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 57 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 57 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 58 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 58 Gly Gly Thr Tyr Ala Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 59 Gly Gly Thr Gly Ser Cys Glu Phe Gly Gly Leu Ala Lys Val Cys Glu 1 5 10 15 Lys Gln Glu Gly 20 <210> 60 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 60 Gly Gly Met Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 61 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 61 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 62 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 62 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 63 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 63 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 64 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 64 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 65 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 65 Gly Gly Thr Leu Ser Cys Asp Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Glu 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 66 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 66 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 67 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 67 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 68 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 68 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Gly Gly Leu Phe Trp Val Cys Glu 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 69 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 69 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Leu Arg Gly 20 <210> 70 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 70 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 71 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 71 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 72 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 72 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 73 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 73 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Met Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 74 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 74 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 75 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 75 Gly Gly Thr Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 76 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 76 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 77 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 77 Gly Gly Thr Gly Ser Cys Glu Ala Gly Lys Leu Thr Asp Val Cys Glu 1 5 10 15 Lys Gln Asp Gly 20 <210> 78 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 78 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 79 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 79 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 80 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 80 Gly Gly Thr Leu Ser Cys Asp Phe Gly Lys Leu Gly Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 81 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 81 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys His 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 82 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 82 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 83 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 83 Gly Gly Thr Gly Ser Cys Glu Phe Gly Lys Leu Thr Glu Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 84 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 84 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Ala Gly 20 <210> 85 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 85 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 86 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 86 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 87 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 87 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Asp Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 88 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 88 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Leu Cys Lys 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 89 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 89 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 90 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 90 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Glu Cys Lys 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 91 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 91 Gly Gly Thr Gly Ser Cys Asp Phe Gly Lys Leu Ala Trp Val Cys Asp 1 5 10 15 Lys Gln Glu Gly 20 <210> 92 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> homoserine metyl ether <400> 92 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Xaa Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 93 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 93 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 94 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 94 Gly Gly Thr Gly Ser Cys Asp Ala Gly Lys Leu Thr Asp Val Cys Asp 1 5 10 15 Lys Gln Asp Gly 20 <210> 95 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 95 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Ile Thr Trp Leu Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 96 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> homoserine methyl ether <400> 96 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Xaa Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 97 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 97 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 98 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 98 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 99 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 99 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Ala Gly 20 <210> 100 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 100 Gly Gly Thr Gly Ser Cys Asp Phe Gly Lys Leu Thr Asp Val Cys Ala 1 5 10 15 Lys Gln Glu Gly 20 <210> 101 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 101 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys Arg Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 102 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 102 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 103 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 103 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys Glu Gly Gly Lys Leu Gly Lys Val Cys Glu 1 5 10 15 Lys Gln Glu Gly 20 <210> 104 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 104 Gly Gly Thr Leu Ser Cys Asp Ala Gly Gly Leu Thr Lys Val Cys Asp 1 5 10 15 Lys Gln Asp Gly 20 <210> 105 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 105 Gly Gly Thr Leu Ser Cys His Pro Gly Lys Leu Thr Lys Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Asp Gly 20 <210> 106 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 106 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 107 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 107 Gly Gly Thr Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 108 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 108 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 109 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 109 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Ile Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 110 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 110 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 111 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 111 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Leu Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 112 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 112 Gly Gly Thr Leu Ser Cys Glu Phe Gly Lys Leu Phe Lys Val Cys Glu 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 113 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 113 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Ala Gly 20 <210> 114 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 114 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 115 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 115 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 116 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 116 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 117 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 117 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 118 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 118 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Ala 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 119 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 119 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 120 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 120 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 121 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 121 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Ile Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 122 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 122 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 123 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 123 Gly Gly Thr Gly Ser Cys Glu Pro Gly Lys Leu Thr Asp Val Cys Glu 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 124 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 124 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 125 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 125 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 126 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 126 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 127 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 127 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 128 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 128 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Glu Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 129 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 129 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 130 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 130 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 131 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 131 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 132 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 132 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 133 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 133 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys Glu Ala Gly Lys Leu Thr Lys Val Cys Glu 1 5 10 15 Lys Gln Glu Gly 20 <210> 134 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 134 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 135 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken fro Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 135 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 136 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 136 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 137 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 137 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 138 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 138 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Val Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 139 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 139 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Met Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 140 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 140 Gly Gly Asn Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 141 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 141 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 142 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 142 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 143 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> homoserine methyl ether <400> 143 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Xaa Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 144 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 144 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 145 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 145 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 146 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 146 Gly Gly Ala Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 147 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 147 Gly Gly Ser Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 148 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 148 Gly Gly Thr Leu Ser Cys Asp Phe Gly Lys Leu Gly Trp Val Cys Asp 1 5 10 15 Lys Gln Glu Gly 20 <210> 149 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 149 Gly Gly Thr Tyr Lys Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 150 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from fig. 19 <400> 150 Gly Gly Thr Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 151 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 151 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 152 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 152 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 153 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 153 Gly Gly Thr Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 154 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 154 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 155 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 155 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Thr 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 156 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 156 Gly Gly Thr Tyr Met Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 157 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 157 Gly Gly Thr Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 158 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 158 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys Trp Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 159 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 159 Gly Gly Thr Leu Ser Cys Asp Phe Gly Gly Leu Gly Trp Val Cys Asp 1 5 10 15 Lys Gln Glu Gly 20 <210> 160 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 160 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 161 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 161 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 162 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 162 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Leu Thr Xaa Glu Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 163 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 163 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 164 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 164 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 165 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 165 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 166 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 166 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 167 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 167 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 168 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 168 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 169 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 169 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Glu Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 170 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 170 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 171 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 171 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 172 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 172 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 173 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> homoserine methyl ether <400> 173 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Xaa Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 174 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 174 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 175 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 175 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 176 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 176 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 177 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 177 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Met Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 178 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 178 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 179 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 179 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 180 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 180 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 181 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> homoserine methyl ether <400> 181 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Xaa Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 182 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 182 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Met Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 183 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 183 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ile Thr Trp Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 184 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 184 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 185 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 185 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 186 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 2-naphtylalanine <400> 186 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 187 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 187 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Leu Gly Gly 20 <210> 188 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 188 Gly Gly Thr Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 189 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 189 Gly Gly Glu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 190 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 190 Gly Gly Leu Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Gln 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 191 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 191 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 192 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 192 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Ala Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 193 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 193 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Ile Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 194 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 194 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Thr Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 195 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 195 Gly Gly Thr Gly Ser Cys Glu Phe Gly Gly Leu Gly Trp Val Cys Asp 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 196 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 196 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 197 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 197 Gly Gly Thr Tyr Thr Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 198 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> taken from Fig. 19 <400> 198 Gly Gly Thr Gly Ser Cys Glu Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Asp 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 199 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> supplemental for Fig. 19 on page 8 <400> 199 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Ala Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 200 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> supplemental for Fig. 19 on page 8 <400> 200 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 201 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> supplemental for Fig. 19 on page 8 <400> 201 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 202 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> supplemental for Fig. 19 on page 8 <400> 202 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Pro Gln Gly Gly 20 <210> 203 <211> 19 <212> PRT <213> artificial <220> <223> supplemental for Fig. 19 on page 8 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> 5-aminolevulinic acid <400> 203 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Xaa Leu Thr Trp Val Cys Lys Pro 1 5 10 15 Gln Gly Gly <210> 204 <211> 19 <212> PRT <213> artificial <220> <223> supplemental for Fig. 19 on page 8 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> 5-aminolevulinic acid <400> 204 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Xaa Leu Thr Trp Val Cys Lys Lys 1 5 10 15 Gln Gly Gly <210> 205 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> initially cited as SEQ ID NO 2 <400> 205 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 206 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> initially cited as SEQ ID NO 4 <400> 206 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Pro Gln Gly Gly 20 <210> 207 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> initially cited as SEQ ID NO 5 <400> 207 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Arg Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Pro Gln Gly Gly 20 <210> 208 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> initially cited as SEQ ID NO 6 <400> 208 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Arg Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 209 <211> 19 <212> PRT <213> artificial <220> <223> initially cited as SEQ ID NO 7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> 5-aminolevulinic acid <400> 209 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Xaa Leu Thr Trp Val Cys Lys Pro 1 5 10 15 Gln Gly Gly <210> 210 <211> 19 <212> PRT <213> artificial <220> <223> initially cited as SEQ ID NO 8 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> 5-aminolevulinic acid <400> 210 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Xaa Leu Thr Trp Val Cys Lys Lys 1 5 10 15 Gln Gly Gly <210> 211 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> initially cited as SEQ ID NO 9 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <400> 211 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 212 <211> 40 <212> PRT <213> artificial <220> <223> initially cited as SEQ ID NO 10 <220> <221> DISULFID <222> (6)..(15) <220> <221> DISULFID <222> (26)..(35) <400> 212 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr 20 25 30 Trp Val Cys Lys Lys Gln Gly Gly 35 40 <210> 213 <211> 40 <212> PRT <213> artificial <220> <223> initially cited as SEQ ID NO 11 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> DISULFID <222> (6)..(15) <220> <221> DISULFID <222> (26)..(35) <220> <221> MOD_RES <222> (40)..(40) <223> AMIDATION <400> 213 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr 20 25 30 Trp Val Cys Lys Lys Gln Gly Gly 35 40 <210> 214 <211> 39 <212> PRT <213> artificial <220> <223> initially cited as SEQ ID NO 12 <220> <221> DISULFID <222> (6)..(15) <220> <221> DISULFID <222> (25)..(34) <400> 214 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp 20 25 30 Val Cys Lys Lys Gln Gly Gly 35 <210> 215 <211> 19 <212> PRT <213> artificial <220> <223> initially cited as SEQ ID NO 13 <400> 215 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly <210> 216 <211> 40 <212> PRT <213> artificial <220> <223> initially cited as SEQ ID 14 <220> <221> DISULFID <222> (6)..(15) <220> <221> DISULFID <222> (26)..(35) <400> 216 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr 20 25 30 Trp Val Cys Lys Lys Asp Gly Gly 35 40 <210> 217 <211> 21 <212> PRT <213> artificial <220> <223> initially cited as SEQ ID NO 15 <400> 217 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Gly Gly 20 <210> 218 <211> 21 <212> PRT <213> artificial <220> <223> initially cited as SEQ ID NO 15a <400> 218 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Asp Gly Gly 20 <210> 219 <211> 40 <212> PRT <213> artificial <220> <223> not initially cited using a SEQ ID number <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> 1-naphtylalanine <400> 219 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr 20 25 30 Xaa Val Cys Lys Lys Gln Arg Gly 35 40 <210> 220 <211> 41 <212> PRT <213> artificial <220> <223> not cited initially using a SEQ ID number <400> 220 Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys 1 5 10 15 Lys Lys Gln Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu 20 25 30 Thr Trp Val Cys Lys Lys Gln Gly Gly 35 40 <210> 221 <211> 41 <212> PRT <213> artificial <220> <223> not cited initially using a SEQ ID number <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> 1-napthylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> 1-napthylalanine <400> 221 Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys 1 5 10 15 Lys Lys Gln Arg Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu 20 25 30 Thr Xaa Val Cys Lys Lys Gln Arg Gly 35 40 <210> 222 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> not cited before using a SEQ ID number <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> homoarginine <400> 222 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys Ser Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Xaa Gln Gly Gly 20 <210> 223 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> not previuosly cited using a SEQ ID number <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> homoarginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> homoarginine <400> 223 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Xaa Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Xaa Gln Gly Gly 20 <210> 224 <211> 22 <212> PRT <213> artficial <220> <221> DISULFID <222> (6)..(15) <400> 224 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly Gly Gly 20 <210> 225 <211> 21 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EPO mimetic peptide <220> <221> DISULFID <222> (6)..(15) <400> 225 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly Gly 20 <210> 226 <211> 21 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EPO mimetic peptide <220> <221> DISULFID <222> (6)..(15) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> beta-alanine <400> 226 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Xaa Gly 20 <210> 227 <211> 21 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EPO mimetic peptide <220> <221> DISULFID <222> (6)..(15) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> beta-alanine <400> 227 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Xaa Gly Gly 20 <210> 228 <211> 21 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EPO mimetic peptide <400> 228 Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cys 1 5 10 15 Lys Lys Gln Gly Gly 20 <210> 229 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> reference sequence <400> 229 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 230 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EPO mimetic peptide <400> 230 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Ala Lys Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Gly Gly 20 <210> 231 <211> 20 <212> PRT <213> artifical <400> 231 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Gly Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Pro Gln Gly Gly 20 <210> 232 <211> 41 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EPO mimetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> 1-naphthylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> 1-naphthylalanine <220> <221> MOD_RES <222> (40)..(40) <223> AMIDATION <400> 232 Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys 1 5 10 15 Lys Lys Gln Arg Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu 20 25 30 Thr Xaa Val Cys Lys Lys Gln Arg Gly 35 40 <210> 233 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EPO mimetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 1-naphtylalanine <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> AMIDATION <400> 233 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Arg Gly 20 <210> 234 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EPO mimetic consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> R, H, L or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> M, F, I or hsm <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> G or a conservative exchange of G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> non-conservative exchange of proline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> is independendly selected from any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> D, E, I, L or V, 1-naphthylalanine or 2-naphthylalanine <400> 234 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Trp Xaa Cys 1 5 10

Claims (55)

  1. EPO 의태 펩티드가 EPO 의태 펩티드의 위치 10으로서 언급되는 위치에 프롤린을 포함하지 않으나 양으로 하전된 아미노산을 포함함을 특징으로 하는, EPO 수용체와 결합할 수 있고 효능 활성을 포함하는 10개 이상의 아미노산 길이의 펩티드.
  2. 제 1항에 있어서, EPO 의태 펩티드가 폴딩 구조에 특징적인 아미노산 모티프 (베타-회전 모티프)를 지니며, 상기 펩티드가 베타-회전 모티프의 위치 10에 프롤린을 포함하지 않으나, 양으로 하전된 아미노산, 바람직하게는 K를 포함함을 특징으로 하는 펩티드.
  3. 제 1항에 있어서, 위치 9 및 10이 하기 5-아미노레불린산 (5-Als)에 의해 점유됨을 특징으로 하는 펩티드:
    Figure 112007041692014-PCT00027
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 양으로 하전된 아미노산, 바람직하게는 K 또는 Har을 위치 17에 지님을 특징으로 하는 펩티드.
  5. 하기 아미노산 서열을 포함하는 특히 EPO 수용체와 결합할 수 있는 펩티드:
    X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15
    상기에서, 각 아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산으로부터 선택되고
    X6은 C, A, E, α-아미노-γ-브로모부티르산 또는 호모시스테인(hoc)이고;
    X7은 R, H, L, W 또는 Y 또는 S이고;
    X8은 M, F, I, 호모세린메틸에테르 또는 노르이소류신이고;
    X9는 G 또는 G의 보존적 교환이며;
    X10은 프롤린의 비보존적 교환이거나;
    X9 및 X10은 단일 아미노산에 의해 치환되고;
    X11은 임의의 아미노산으로부터 선택되고;
    X12는 T 또는 A이고;
    X13은 W, 1-nal, 2-nal, A 또는 F이고;
    X14는 D, E, I, L 또는 V이고;
    X15는 C, A, K, α-아미노-γ-브로모부티르산 또는 호모시스테인(hoc)이고
    단 X6 또는 X15는 C 또는 hoc이다.
  6. 제 5항에 있어서, 하기 아미노산 서열을 특징으로 하거나:
    X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15
    상기에서, 각 아미노산은 표준 문자 약어에 의해 표시되며
    X6은 C이고;
    X7은 R, H, L 또는 W이고;
    X8은 M, F 또는 I이고;
    X9는 G 또는 G의 보존적 교환이며;
    X10은 프롤린의 비보존적 교환이고;
    X11은 독립적으로 임의의 아미노산으로부터 선택되고;
    X12는 T이고;
    X13은 W이고;
    X14는 D, E, I, L 또는 V이고;
    X15는 C이거나;
    X9 및 X10은 단일 아미노산에 의해 치환되고,
    하기 아미노산 서열을 특징으로 하는 펩티드:
    X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15
    상기에서, X6은 C이고;
    X7은 R, H, L 또는 W이고;
    X8은 M, F, I 또는 hsm (호모세린 메틸에테르)이고;
    X9는 G 또는 G의 보존적 교환이며;
    X10은 프롤린의 비보존적 교환이고;
    X11은 독립적으로 임의의 아미노산으로부터 선택되고;
    X12는 T이고;
    X13은 W이고;
    X14는 D, E, I, L 또는 V, 1-nal (1-나프틸알라닌) 또는 2-nal (2-나프틸알라닌)이고;
    X15는 C이다.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, X10이 양으로 하전된 측쇄를 지니는 아미노산이고, 바람직하게는 R. K 또는 개개의 비천연 아미노산이고, 바람직하게는 Har이거나, X9 및 X10이 단일 아미노산, 바람직하게는 5-아미노레불린산 (Als) 또는 아미노 발레르산에 의해 치환됨을 특징으로 하는 펩티드.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 펩티드:
    X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15
    상기에서, X6 내지 X15는 상기의 의미를 지니며
    X4는 Y이고;
    X5는 독립적으로 임의의 아미노산으로부터 선택되며, 바람직하게는 A, H, K, L, M, S, T 또는 I이다.
  9. 제 8항에 있어서, 하기 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 펩티드:
    X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18
    상기에서, X4 내지 X15는 상기의 의미를 지니며
    X3은 독립적으로 임의의 아미노산으로 선택되고, 바람직하게는 D, E, L, N, S, T 또는 V이고;
    X16는 독립적으로 임의의 아미노산으로부터 선택되고, 바람직하게는 G, K, L, Q, R, S 또는 T이며;
    X17은 독립적으로 임의의 아미노산으로부터 선택되고, 바람직하게는 A, G, P, R, K, Y 또는 양으로 하전된 측쇄를 지니는 비천연 아미노산이며, 바람직하게는 호모아르기닌이고;
    X18은 독립적으로 임의의 아미노산으로부터 선택된다.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, X6이 C, E, A 또는 hoc이고, 바람직하게는 C 이고/거나 X7이 R, S, H 또는 Y 이고/거나 X8이 F 또는 M 이고/거나 X9가 G 또는 A이고, 바람직하게는 G 이고/거나 X10이 K 또는 Har 이고/거나 X11이 V, L, I, M, E, A, T 또는 노르이소류신이고/거나 X12가 T 이고/거나 X13이 W 이고/거나 X14가 D 또는 V 이고/거나 X15가 C 또는 hoc이고, 바람직하게는 C 이고/거나 X17이 P, Y, A 또는 K 또는 Har임을 특징으로 하는 펩티드.
  11. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 펩티드:
    Figure 112007041692014-PCT00028
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 펩티드:
    Figure 112007041692014-PCT00029
    Figure 112007041692014-PCT00030
    상기에서, X는 1-나프틸알라닌이고 U는 2-나프틸알라닌이다.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 단일 아미노산의 보 존적 교환에 의해 개질되고, 바람직하게는 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산이 교환됨을 특징으로 하는 펩티드
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 항-EPO 항체와 교차 반응하지 않음을 특징으로 하는 펩티드.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 개질되고, 상기 개질이 바람직하게 N-말단 및/또는 C-말단 아세틸화 (Ac) 및/또는 아미드화 (Am), 바람직하게는 세포내 이황화 다리에 의한 세포내 고리화 및/또는 인산화로 구성된 군으로부터 선택되며, N-메틸글리신 (meG)으로서의 C-말단 글리신 개질 및 N-아세틸글리신 (AcG)으로서의 N-말단 글리신 개질이 특히 바람직하고/거나 펩티드가 고분자 부분에 부착되고, 여기서 상기 부분이 바람직하게 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란 및 전분으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 펩티드
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 상기 정의된 펩티드 서열의 단량체, 이량체 또는 다량체를 형성함을 특징으로 하는 펩티드.
  17. 제 16항에 있어서, 이량체 또는 다량체가 분지되거나 분지되지 않은 구조를 지니는 호모- 또는 헤테로머이고, 단량체 펩티드 유닛이 N-말단에서 N-말단으로, C-말단에서 C-말단으로 또는 N-말단에서 C-말단으로 서로 결합됨을 특징으로 하는 펩티드.
  18. 제 15항 또는 제 17항에 있어서, 펩티드가 링커 및/또는 스페이서 유닛을 포함함을 특징으로 하는 펩티드.
  19. 수용체에 대해 결합 용량을 지니는 둘 이상의 도메인을 포함하고, 상기 도메인이 제 1항 내지 제 14항 및 제 55항 중 어느 한 항에 정의된 아미노산 서열을 포함하는, 연속적인 펩티드 사슬을 지니는 합성 펩티드.
  20. 제 19항에 있어서, 둘 이상의 이종성 결합 도메인을 포함함을 특징으로 하는 합성 펩티드.
  21. 제 19항 또는 제 20항에 있어서, 천연 또는 비천연 아미노산 잔기의 결합 부분 (링커)을 포함함을 특징으로 하는 합성 펩티드.
  22. 제 19항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 부분이 3 내지 5 글리신 및/또는 알라닌 잔기 또는 이들의 유도체를 포함함을 특징으로 하는 합성 펩티드.
  23. 제 19항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 결합 도메인의 일부 를 형성하는 아미노산에 의해 제공됨을 특징으로 하는 합성 펩티드.
  24. 제 19항에 있어서, 펩티드가 하기로부터 선택된 펩티드 서열 또는 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 정의된 펩티드 서열 중 하나를 포함하며,
    Figure 112007041692014-PCT00031
    상기 펩티드는 바람직하게는 시스테인과 같이 N-말단에 반응성 측쇄를 지니는 것인 추가의 아미노산을 지니거나 지니지 않으며, 펩티드는 개개 서열에 존재하는 경우 제1 및 제2 및/또는 제3 및 제4 시스테인 사이에 세포내 이황화 다리를 포함하거나 포함하지 않음을 특징으로 하는 펩티드.
  25. a. 제1 펩티드
    b. 제2 펩티드 및
    c. 바람직하게는 제1 및 제2 펩티드를 연결시키는 결합 부분(링커)을 적어도 포함하며, 상기 펩티드 중 하나 이상은 제 1항 내지 제 14항, 제 24항 또는 제 55항 중 어느 한 항에 정의된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 유닛을 포함하는, 펩티드 이량체 또는 다량체.
  26. 제 25항에 있어서, 제1 펩티드의 C-말단이 제2 펩티드의 N-말단에 공유적으로 결합되거나, 상기 펩티드의 C-말단이 제2 펩티드의 C-말단에 공유적으로 결합되 거나, 제1 펩티드의 N-말단이 제2 펩티드의 N-말단에 공유적으로 결합됨을 특징으로 하는 펩티드 이량체 또는 다량체.
  27. 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 링커가 천연 및/또는 비천연 아미노산, 바람직하게는 글리신, 알라닌 또는 이들의 유도체의 서열을 포함함을 특징으로 하는 펩티드 이량체 또는 다량체.
  28. 제 25항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 링커/스페이서 유닛이 디케토피페라진 유닛을 함유함을 특징으로 하는 펩티드 이량체 또는 다량체.
  29. 제 26항에 있어서, 링커가 이가 디아실 빌딩 블록이고, 바람직하게는 지방족 디카르복실산으로부터 유래된 디아실 빌딩 블록임을 특징으로 하는 펩티드 이량체 또는 다량체.
  30. 제 25항에 있어서, 제1 펩티드의 아미노산 측쇄가 제2 펩티드의 아미노산 측쇄에 공유적으로 결합됨을 특징으로 하는 펩티드 이량체 또는 다량체.
  31. 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드에 공유적으로 결합된 수 가용성 중합체, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란 또는 전분으로 구성된 군으로부터 선택된 수 가용성 중합체를 추가로 포함함을 특징으로 하는 펩 티드.
  32. 제 31항에 있어서, 수 가용성 부분이 바람직하게는 10 kD 이상의 분자량을 지니고, 가장 바람직하게는 20 내지 60 kD의 분자량을 지니는 PEG임을 특징으로 하는 펩티드.
  33. (i) 각 펩티드 유닛이 표적에 대해 결합 용량을 지니는 둘 이상의 도메인을 포함하고, 결합 도메인이 제 1항 내지 제 14항 또는 제 55항 중 어느 한 항에 정의된 아미노산 서열을 포함하는, 둘 이상의 펩티드 유닛;
    (ii) 하나 이상의 고분자 담체 유닛을 포함하며,
    상기 펩티드 유닛이 상기 고분자 담체에 부착되는, 표적 분자에 결합하는 화합물.
  34. 제 33항에 있어서, 담체 유닛이 하나 이상의 천연 또는 합성의 분지, 수지상 또는 선형 중합체이거나 이들을 포함하고, 바람직하게는 폴리글리세린, 폴리시알린산, 덱스트란, 전분 또는 폴리에틸렌 글리콜로 구성된 군 또는 다른 생물학적으로 비활성인 수 가용성 중합체로부터 선택됨을 특징으로 하는 화합물.
  35. 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 담체 유닛이 분지 유닛을 포함함을 특징으로 하는 화합물.
  36. 제 35항에 있어서, 분지 유닛이 글리세롤 또는 폴리글리세롤을 포함함을 특징으로 하는 화합물.
  37. 제 33항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 분자의 분자량이 5 kD 이상이고, 바람직하게는 20 내지 200 또는 4000 kD이고 폴리에틸렌 글리콜과 같은 소형 담체가 사용되는 경우에 20 내지 80 kD임을 특징으로 하는 화합물.
  38. 제 33항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 유닛이 둘 이상의 고분자 서브유닛을 포함하고, 고분자 서브유닛이 하나 이상의 생체분해가능한 공유 링커 구조에 의해 서로 연결됨을 특징으로 하는 화합물.
  39. 제 33항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생체분해가능한 담체 유닛을 포함하고, 펩티드 유닛 및 제2 고분자 담체 유닛이 상기 제1 고분자 담체 유닛에 부착됨을 특징으로 하는 화합물.
  40. 제 39항에 있어서, 제2 담체 유닛이 제1 담체 유닛에 비해 낮은 분자량을 지니고, 바람직하게는 HES와 같은 히드록시알킬전분인 제1 담체 유닛의 부착 부위의 20 내지 50%가 분자량이 약 3 내지 10 kD인 폴리에틸렌 글리콜인 것이 바람직한 제2 담체 유닛에 의해 점유됨을 특징으로 하는 화합물.
  41. 제 33항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 개질된 고분자 담체 유닛이 사용됨을 특징으로 하는 화합물.
  42. 제 41항에 있어서, 펩티드 유닛이 공유 결합에 의해 고분자 담체 유닛에 부착되고, 부착이 펩티드 유닛의 반응성 아미노산, N-말단 아미노기 및/또는 C-말단 카르복실산에 의해 일어나며, 여기서 반응성 아미노산은 라이신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌 및 티로신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고,
    중합체가 적합한 반응성 커플링기를 소유하지 않는 경우에, 커플링 물질은 고분자 담체 유닛을 개질시키기 위해 이용되며,
    커플링 물질은 펩티드 유닛의 아미노기와 반응하는 아실화기, 펩티드 유닛 상의 설프히드릴(메르캅토), 티오메틸, 이미다조 또는 아미노기와 반응하는 알킬화기, 가장 바람직하게는 말레이미드기, 펩티드 유닛의 카르복실기와 반응하는 에스테르 및 아미드 형성기, 펩티드 유닛상의 설프히드릴기와 반응하는 이황화 형성기, 예컨대 5,5'-디티오비스 (2-니트로벤조에이트)기 및 알킬메르캅탄기, 디카르보닐기, 예컨대 시클로헥산디온기, 및 펩티드 유닛의 구아니딘 부분과 반응하는 다른 1,2-디케톤기; 펩티드의 페놀기와 반응하는 디아조기; 펩티드 유닛의 아미노기와 반응하는, 시아노겐 브로마이드와 중합체의 반응으로부터의 반응성 기로 구성된 군으로부터 바람직하게 선택됨을 특징으로 하는 화합물.
  43. 제 42항에 있어서, 반응성 아미노산이 시스테인이고 커플링기가 말레이미드임을 특징으로 하는 화합물.
  44. 제 33항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 유닛의 결합 도메인이 링커 구조를 통해 내부적으로 연결됨을 특징으로 하는 화합물.
  45. 제 44항에 있어서, 링커가 연속적인 펩티드 링커임을 특징으로 하는 화합물.
  46. 제 1항 내지 제 45항 또는 제 55항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 및/또는 화합물의 약제학적 조성물을 제조하기 위한 용도.
  47. 제 1항 내지 제 45항 또는 제 55항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 및/또는 화합물의 에리트로포이에틴 결핍 또는 느리거나 불충분한 적혈구 개체군을 특징으로 하거나 에리트로포이에틴을 투여하여 치료될 수 있는 질병을 예방하거나 치료하고 특히 임의의 유형의 빈혈 또는 뇌졸중을 치료하기 위한 약제 조성물을 제조하기 위한 용도.
  48. 제 1항 내지 제 45항 또는 제 55항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 및/또는 화합물의 에리트로포이에틴 결핍 또는 느리거나 불충분한 적혈구 개체군을 특징으로 하거나 에리트로포이에틴을 투여하여 치료될 수 있는 질병을 예방하거나 치료하고 특히 임의의 유형의 빈혈 또는 뇌졸중을 치료하기 위한 용도.
  49. 제 1항 내지 제 45항 또는 제 55항 중 어느 한 항에 따른 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 임의로 포함하는 약제학적 조성물.
  50. 제 49항에 있어서, 에리트로포이에틴 결핍 또는 느리거나 불충분한 적혈구 개체군을 특징으로 하거나 에리트로포이에틴을 투여하여 치료될 수 있는 질병을 예방하거나 치료하고 특히 임의의 유형의 빈혈 또는 뇌졸중을 치료하기 위한 것임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  51. (i) 각 펩티드 유닛이 수용체에 대해 결합 용량을 지니는 둘 이상의 도메인을 포함하는 둘 이상의 펩티드 유닛을 생성시키는 단계;
    (ii) 하나 이상의 고분자 담체 유닛을 생성시키는 단계;
    (iii) 펩티드 유닛을 고분자 담체 유닛에 부착시키는 단계를 포함하여, 제 33항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 제조하는 방법.
  52. 제 51항에 있어서, 펩티드 유닛이 연속적인 펩티드 사슬로서 합성됨을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 51항 또는 제 52항에 있어서, 펩티드 유닛상의 이용가능한 화학적 기와 반응할 수 있는 하나 이상의 화학적 기를 지니는 고분자 담체 유닛을 이용하고, 이후 반응성 고분자 담체 유닛 및 펩티드 유닛을 함께 반응시켜 고분자 담체 유닛의 화학적 기를 이용하여 이의 공유적으로 결합된 복합체를 형성함을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 1항 내지 제 14항 및 제 16항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 엔코딩하는 핵산.
  55. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 인버소 및/또는 레트로/인버소 펩티드이거나 D-아미노산으로만 구성된 개개 펩티드임을 특징으로 하는 펩티드.
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Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7589063B2 (en) 2004-12-14 2009-09-15 Aplagen Gmbh Molecules which promote hematopoiesis
US7919461B2 (en) * 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
EA200800109A1 (ru) * 2005-06-23 2008-06-30 Аплаген Гмбх Суправалентные соединения
MX2008011389A (es) * 2006-03-09 2009-01-26 Aplagen Gmbh Moleculas modificadas las cuales promueven hematopoyesis.
EP2018835B1 (de) 2007-07-09 2014-03-05 Augustinus Bader Wirkstoff abgebendes Pflaster
ES2750254T3 (es) 2007-09-27 2020-03-25 Amgen Inc Formulaciones farmacéuticas
WO2009055014A2 (en) 2007-10-23 2009-04-30 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydroxyapatite-targeting multiarm polymers and conjugates made therefrom
EP3381445B1 (en) 2007-11-15 2023-10-25 Amgen Inc. Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration
US9175078B2 (en) 2008-01-25 2015-11-03 Amgen Inc. Ferroportin antibodies and methods of use
JP2009191056A (ja) * 2008-02-15 2009-08-27 Affymax Inc 合成ペプチドをベースとするｅｐｏレセプターアゴニストを用いた抗エリスロポエチン抗体に媒介された障害の治療
AU2009234373B2 (en) 2008-04-09 2015-09-24 Cornell University Coferons and methods of making and using them
MX2010011717A (es) 2008-05-01 2010-11-30 Amgen Inc Anticuerpos anti-hepcidina y metodos de uso.
AU2009313902B9 (en) 2008-11-13 2014-03-27 The General Hospital Corporation Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation of BMP-6
WO2011012306A2 (en) 2009-07-30 2011-02-03 Aplagen Gmbh Use of emps for antagonising epo-stimulatory effects on epo-responsive tumors while maintaining erythropoiesis
US9771345B2 (en) 2009-10-07 2017-09-26 Cornell University Coferons and methods of making and using them
MX344382B (es) 2009-10-23 2016-12-14 Amgen Inc * Adaptador de vial y sistema.
WO2011098095A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Aplagen Gmbh Peptides binding the tpo receptor
ES2545411T5 (es) 2010-06-07 2024-04-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármaco
EP2590666B1 (en) 2010-07-06 2017-04-26 Augustinus Bader Topical application of erythropoietin for use in the treatment of injuries of the cornea
US9480624B2 (en) 2011-03-31 2016-11-01 Amgen Inc. Vial adapter and system
LT2699293T (lt) 2011-04-20 2019-04-25 Amgen Inc. Automatinio purškimo prietaisas
KR102084171B1 (ko) 2011-10-14 2020-04-14 암젠 인크 주사기 및 어셈블리 방법
SI3081249T1 (sl) 2012-11-21 2021-03-31 Amgen Inc. Naprava za dajanje zdravila
TWI639449B (zh) 2013-03-15 2018-11-01 美商安美基公司 用於注射器之匣盒
CN110041427B (zh) 2013-03-15 2023-05-23 本质生命科学有限公司 抗铁调素抗体及其用途
CA2904725C (en) 2013-03-15 2022-04-12 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
WO2014149357A1 (en) 2013-03-22 2014-09-25 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US11097055B2 (en) 2013-10-24 2021-08-24 Amgen Inc. Injector and method of assembly
AU2014340174B2 (en) 2013-10-24 2019-09-12 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
CN106413779B (zh) 2014-05-07 2020-06-05 安姆根有限公司 具有减震元件的自助注射器
JP6822843B2 (ja) 2014-06-03 2021-01-27 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達装置によって収集されたデータを遠隔で処理するためのシステム及び方法
AU2015321462B2 (en) 2014-09-22 2020-04-30 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
EP3943135A3 (en) 2014-10-14 2022-06-29 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audible indicators
ES2785311T3 (es) 2014-12-19 2020-10-06 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con botón móvil o campo de interfaz de usuario
US10799630B2 (en) 2014-12-19 2020-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
EP3258988B1 (en) 2015-02-17 2019-08-28 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
US11806509B2 (en) 2015-02-27 2023-11-07 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a turnable threshold of resistance to needle guard movement
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
EP3386573B1 (en) 2015-12-09 2019-10-02 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
EP4035711A1 (en) 2016-03-15 2022-08-03 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
US11541168B2 (en) 2016-04-29 2023-01-03 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
US10988284B2 (en) 2016-05-13 2021-04-27 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
EP3532127A1 (en) 2016-10-25 2019-09-04 Amgen Inc. On-body injector
EP3570917A1 (en) 2017-01-17 2019-11-27 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
CA3048520A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
WO2018152073A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
CA3050927A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Brian Stonecipher Drug delivery device with activation prevention feature
KR102627069B1 (ko) 2017-03-07 2024-01-18 암겐 인코포레이티드 과압에 의한 바늘 삽입
IL268386B2 (en) 2017-03-09 2023-11-01 Amgen Inc Insertion mechanism for a drug delivery device
EP3570871B1 (en) 2017-03-20 2020-11-18 H. Hoffnabb-La Roche Ag Method for in vitro glycoengineering of an erythropoiesis stimulating protein
EP4241807A3 (en) 2017-03-28 2023-10-11 Amgen Inc. Plunger rod and syringe assembly system and method
JP7200134B2 (ja) 2017-06-08 2023-01-06 アムジエン・インコーポレーテツド トルク駆動式薬物送達デバイス
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
MX2019015472A (es) 2017-06-22 2020-02-19 Amgen Inc Reduccion del impacto/choque de la activacion del mecanismo.
AU2018290302B2 (en) 2017-06-23 2024-02-29 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
WO2019014014A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Amgen Inc. NEEDLE INSERTION-RETRACTING SYSTEM HAVING DOUBLE TORSION SPRING SYSTEM
WO2019018169A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Amgen Inc. PERMEABLE GAS SEALING ELEMENT FOR MEDICINE CONTAINER AND METHODS OF ASSEMBLY
US11484648B2 (en) 2017-07-25 2022-11-01 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
EP4085942A1 (en) 2017-07-25 2022-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
EP3691717B1 (en) 2017-10-04 2023-02-08 Amgen Inc. Flow adapter for drug delivery device
EP4257164A3 (en) 2017-10-06 2024-01-17 Amgen Inc. Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly
IL273323B1 (en) 2017-10-09 2024-06-01 Amgen Inc Drug delivery device with drive assembly and related assembly method
EP3703778A1 (en) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
EP3706830A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
CN111225696B (zh) 2017-11-10 2023-07-18 安进公司 用于药物递送装置的柱塞
AU2018368340B2 (en) 2017-11-16 2024-03-07 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
AU2018368338A1 (en) 2017-11-16 2020-04-09 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
EP3826701A1 (en) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
US20210128844A1 (en) 2018-07-24 2021-05-06 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
MA53320A (fr) 2018-07-31 2021-11-03 Amgen Inc Ensemble de trajet de fluide pour dispositif d'administration de médicament
WO2020068623A1 (en) 2018-09-24 2020-04-02 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
EP3856283A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
AU2019352616A1 (en) 2018-10-02 2021-03-18 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
TW202408605A (zh) 2018-10-05 2024-03-01 美商安進公司 具有劑量指示器之藥物遞送裝置
US20210346596A1 (en) 2018-10-15 2021-11-11 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
CN117138169A (zh) 2018-10-15 2023-12-01 安进公司 药物递送装置
MA54057A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament à rétraction partielle d'élément d'administration de médicament
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
WO2020091956A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
US20220160972A1 (en) 2019-04-24 2022-05-26 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
WO2021041067A2 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
KR20240011135A (ko) 2021-05-21 2024-01-25 암젠 인크 약물 용기를 위한 충전 레시피를 최적화하는 방법
WO2024094457A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing glycoprotein compositions

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3924746A1 (de) * 1989-07-26 1991-01-31 Behringwerke Ag Erythropoietin (epo)-peptide und dagegen gerichtete antikoerper
JP4050314B2 (ja) * 1995-06-07 2008-02-20 オーソ ファーマシューティカル コーポレイション エリトロポエチン受容体に結合する化合物およびペプチド
WO2004002424A2 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Centocor, Inc. Mammalian epo mimetic ch1 deleted mimetibodies, compositions, methods and uses

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CA2586915A1 (en) 2006-05-18
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