PEPTIDOS VEGF Y SU USO Campo de la Invención Esta invención se relaciona a péptidos que son fragmentos de VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) y que tienen actividad de beneficio potencial en la terapia. Antecedentes de la Invención VEGF-A es un polipéptido secretado que es esencial para la formación del sistema vascular en la embriogénesis y desempeña una función principal en la angiogénesis en una variedad de estados de enfermedad. La expresión VEGF es regulada hacia arriba mediante la hipoxia y varias citoquinas en diversos tipos de células, y produce múltiples actividades biológicas in vivo e in vitro, incluyendo la diferenciación, proliferación, migración y supervivencia de las células endoteliales , permeabilidad vascular incrementada, migración de monocitos y producción endotelial incrementada de los factores vasodilatadores NO y prostaciclina . VEGF-A " humano existe en múltiples isoformas de 121, 145, 165, 189 y 206 aminoácidos, generadas por la división de mRNA alternativa, de las cuales VEGF12i, VEGFi45 y VEGF165 se conocen que son secretadas y biológicamente activas. Dos receptores distintos de la proteina de tirosina quinasa para VEGF se han identificado, es decir, Flt-1 (VEGFR1) y KDR/Flk-1 (VEGFR2). KDR/flk-1 se cree que es el receptor que principalmente media los efectos mitogénicos del VEGF en las células endoteliales y la angiogénesis in vivo; la función de Flt-1 es las células endoteliales es desconocida. Una proteina de transmembrana que no es de tirosina quinasa, neuropilina-1 (NP-1) , se ha identificado como un receptor adicional para VEGF, que específicamente enlaza a VEGF165. VEGF promueve la supervivencia de las células morales que expresan NP-1, incluyendo algunas células de carcinoma de pecho (Bachelder y colaboradores, Cáncer Res 61: 5736-5740, 2001) . La función de NP-1 en mediar los efectos biológicos del VEGF es todavía ampliamente desconocida. NP-1 es un receptor para una familia de moléculas llamadas semaforinas o colapsinas que desempeñan una función clave en la guia · de los axones neuronales durante el desarrollo del mamífero. En particular, NP-1 se conoce que media el colapso del cono en crecimiento y la actividad quimiorrepulsiva de la semaforina 3. Soker y colaboradores, J. Biol. Chem. 271(19): 5761-5767 (1996), describe que una proteina de fusión de GST que contiene los 44 aminoácidos codificados por el exón 7 de VEGF enlaza a NP-1. Soker y colaboradores, J. Biol. Chem. 272(10): 31582-31588 (1997), describe que una región del - exón 7 es necesaria para la inhibición del enlace de VEGF a las HUVECs. El péptido activo más corto (SEQ ID NO. 1) es CSCKNTDSRCKARQLELNERTCRC es decir, VEGF (137-160), o los aminoácidos 22-44 del exón 7 y el aminoácido 1 del exón 8. El residuo de cisteina terminal (C137 en VEGF) es aparentemente esencial para la actividad y la estructura 3D de la molécula. Se sugiere que puede haber enlace de intradisulfuro dentro del monómero VEGF. Breve Descripción de la Invención De manera sorprendente, se ha encontrado que ciertos péptidos tienen actividad antagonista de NP-1. Un péptido novedoso de acuerdo con la presente invención, tiene la SEQ ID' NO. 2, es decir la secuencia de aminoácidos SCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR o un .fragmento de la misma, que sustancialmente retiene la actividad antagonista de NP-1, en forma cíclica. La secuencia dada corresponde a los aminoácidos 138 a 165 dentro de VEGF, es decir, incluyendo parte de por lo menos el exón 8. De manera sorprendente, la actividad- se ha encontrado en péptidos que carecen del residuo Cys indicado por Soker y colaboradores, que es esencial. La invención también comprende variantes de la secuencia dada, en las cuales- la actividad novedosa, es decir, el antagonismo de NP-1, es retenido sin variación estructural inesperada. Así, la secuencia dada puede incluir reemplazos isostéricos u homólogos o derivaciones que hacen ai péptido relativamente estable.
Descripción de Modalidades Preferidas Les péptidos de la invención se pueden sintetizar por métodos conocidos. Ejemplos se dan. después. En particular, un péptido lineal se puede producir mediante la síntesis de péptido automatizada, seguido por la ciclizacion. Los procedimientos de ciclizacion conocidos incluyen aquellos descritos por Tam y colaboradores, JACS 113:6657-62 (1991). Otras ciclizaciones, por ejemplo, el cierre de anillo de metátesis de, olefina o Mítsunobu, también pueden ser utilizadas . Un péptido de esta invención de preferencia tiene 4 residuos Cys. De preferencia es bicíclico. Como se indicó en lo anterior, los péptidos de la invención pueden incluir modificaciones de la secuencia dada. Tales modificaciones son bien conocidas para. aquellos expertos en la técnica. Los reemplazos isostéricos incluyen Abu por Cys (esto puede ser deseable donde el péptido debe retener un número par de residuos Cys para la ciclizacion) , Phe por Tyr y' diferentes sustituyentes de alquilo/arilo . El desplazamiento de los sustituyentes dentro de un residuo de aminoácido, desde un átomo C a un átomo N, para producir peptoides que contienen resistencia más grande a las proteólisis, y otras modificaciones, son conocidas y son incluidas dentro del alcance de esta invención. Un péptido específico reportado en la presente está N-acetilado; otras modificaciones terminales también serán conocidas para aquellos expertos ordinarios en la técnica. Tales péptidos modificados pueden actuar como profármacos, y/o tener inmunogenicidad modificada/í- Las propiedades antagonistas de NP-1 de un péptido de esta invención se pueden determinar mediante el procedimiento descrito enseguida. El nivel de actividad de preferencia es de por lo menos 25 o 50% tan grande como aquel para el 28-mer biciclico que se ha sintetizado. La actividad de los péptidos de la invención significa que puede ser útil en el tratamiento de enfermedades en las cuales NP-1 puede tener una función significante en la patología. Para uso terapéutico, los péptidos de la invención se pueden formular y administrar mediante procedimientos, y usando componentes, conocidos para aquellos expertos ordinarios en . la técnica. La dosificación apropiada del péptido puede ser elegida por la persona experta habiendo ' considerado los factores usuales tales como la condición del sujeto a ser tratado, la potencia del compuesto, la ruta de administración, etc. las rutas adecuadas de administración incluyen la administración intramuscular, intranasal y subcutánea. Un antagonista de NP-1 puede competir con la semaforina 3 para él enlace a NP-1, y de esta manera antagonizar los efectos de ía semaforina 3 en la excrecencia axonal y la migración en las células nerviosas. Las aplicaciones potenciales de esto, están en promover la excrecencia de neuritas, en la estimulación de la reparación del nervio o el tratamiento de la neurodegeñeración . Además, un antagonista de NP-1 puede promover la supervivencia de las neuronas responsivas a la semaforina 3, un efecto que confirmaría o incrementaría su utilidad en las aplicaciones dadas en lo anterior, y puede extender estas aplicaciones, por ejemplo, al tratamiento de la muerte neuronal ocasionada por episodios de isquemia como en el ataque apopléjico y algunas enfermedades oculares. NP-1 desempeña una función importante en la angiogénesis y puede ser esencial para la . angiogénesis inducida por VEGF en el cáncer, enfermedad ocular, artritis reumatoide y otras enfermedades. Por lo tanto, los antagonistas de NP-1 pueden tener . aplicaciones en la inhibición de la angiogénesis dependiente de VEGF en la enfermedad. • Los antagonistas de NP-1 también pueden desempeñar una función en la inmunosupresión . Por lo tanto, puede ser útil proporcionar un péptido de la invención antes, durante o después de un transplante. Además, un antagonista de NP-1 puede competir con VEGF para el enlace a NP-1 en células tumorales y promover la muerte celular en ^células tumorales que expresan NP-1. Las aplicaciones potenciales de esto, están en . la terapia anti-cáncer. Los siguientes . E emplos ilustran la invención. Abreviaciones MBHA, metilbenzhidrilamina; Fmoc, 9-fÍuorenil-metoxi-carbonilo; Ala, alanina; Arg, arginina; Asn, asparagina; Asp, ácido aspártico; Abu, ácido aminobutírico; Cys, cisteína; Gln, · glutamina; Glu, ácido glutámico; Gly, glicina; His, histidina; lie, isoleucina; Leu, leucina; Lys, lisina; Met,. metionina; Phe, fenilalanina; Pro,, prolina; Ser, serina; Thr, treonina; Trp, triptofano; Tyr, tirosina; Val, valina; Pbf, 2, 2, 4, 6, 7-pentametildihidrdbenzofuran-5-sulfonilo; Pmc, 2 , 2 , 5 , 7 , 8-pentametilcroman-6-sulfonilo; Trt, tritilo; tBu, ter-butilo; Boc, butoxicarbonilo; Pybop, hexafluorofosfEito de benzotriazol-l-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio; NMMM, N-metil morfolina; DCM, diclorometano ; DMF, dimetilformamida; TB E, éter t-butil metílico; TFA, ácido trifluoroacético; HPLG, cromatografía líquida de alto desempeño; LC-MS, c-romatografía líquida espectrometría de masas; Á, Angstrom; AAA; análisis de aminoácido; DMSO, sulfóxido de dimetilo; VEGF, factor de crecimiento endotelial vascular. Síntesis de Péptido a Pequeña Escala Los péptidos mostrados en la Fig. 1 se sintetizaron en un Sintetizador de Péptidos Múltiples AMS 422 usando el procedimiento en fase sólida. Se aplicaron la resina Rink Amide MBHA (carga' 0.59 y 0.68 mmol/g) y la estrategia de N-Fmoc con protección ortogonal (Acm, t-Bu) de la cadenas laterales Cys de derivados a ser ciclizados. El péptido deseado se sintetizó en una escala de 25 µ? y se acopló una vez con un tiempo de acoplamiento base de 30 minutos. La resina y los derivados de aminoácidos, Fmoc-Ala-OH. H20, Fmoc-Arg (Pbf/Pmc) -OH, Fmoc-Asn (Trt ) -OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln (Trt ) -OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fraoc-His (Trt) -OH, Fmoc-Ile-OH, . Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro . H20, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Trp (Boc) -OH,. Fmoc-Tyr(tBu)-OH y Fmoc-Val-OH se adquirieron de Calbiochem-Novabiochem UK Ltd.. (Nottingham, UK) o Alexis (Nottingham, UK) . Cada aminoácido se acopló secuencialmente a la cadena de péptido en crecimiento a partir del C- al N-terminal, aplicando Pybop (Calbiochem-Novabiochem) y NMM (Rathburn Chemicals, alkerburn, UK) como reactivos de acoplamiento por medio del método de éster activo. La remoción del grupo protector N-Fmoc se llevó a cabo con piperidina al 20% en DMF (Rathburn Chemicals, Walkerburn, Escocia) seguido por lavados secuenciales con DMF y DCM. La acetilación automática se llevó a. cabo después de la síntesis de cada péptido con un exceso de 4 veces de ácido acético (0.7 molar, Rathburn Chemicals, Walkerburn, Escocia) basado en la sustitución de la resina Rink-Amide-MBHA. El reactivo de acoplamiento, Pybop, NMM y todos los derivados de aminoácidos se disolvieron en DMF (0.7 M, exceso de 4 veces basado en la sustitución de la resina Rink-Amide-MBHA) excepto para los aminoácidos Fmoc-His (Trt ) -OH y Fmoc-Phe-OH. Estos derivados de aminoácidos protegidos se disolvieron en N-metilpirrolidona . Todos los solventes utilizados fueron de calidad de grado HPLC. Los. péptidos se segmentaron de la resina con desprotección significante usando 90% de TFA,a temperatura ambiente durante 3 horas en la presencia de 5% de tioanisol, 2.5% de agua y 2.5% de etanoditiol como un depurador de cationes reactivos generados. La mezcla de segmentación se filtró y se precipitó en TBME enfriado con hielo. La resina restante se lavó una vez con el reactivo de segmentación, se filtró y se combinó con las fracciones previas. Los precipitados se colectaron después . de .la-centrifugación, se lavaron tres veces con TBME enfriado con hielo y se dejaron secar durante la noche a temperatura ambiente. Los péptidos crudos se disolvieron en ácido acético acuoso al 15% y se liofilizaron durante 2 dias (-40°C, 6 mbar) . Purificación y Caracterización Los péptidos. crudos se analizaron mediante la LC-MS analítica sobre un Espectrómetro de Masas Quattro LC de Micromass con un instrumento de HPLC de Hewlett-Packard, modelo 1100 usando columnas de fase inversa analíticas (columna de fase inversa de · PEP Alltech Hypersil, 100 Á, C8, 5 µ (250 x 4.5 mm) ) 0% ? 50% de acetonitrilo en 20 minutos. Las separaciones se inspeccionaron a una longitud de onda de 215 nm para la absorbencia de enlace de amida con un gasto de flujo de 1 mL/min. Los péptidos crudos se' purificaron mediante la , HPLC de fase inversa preparativa (Gilson) , se inspeccionaron a 215 nm y se eluyeron a un gasto de flujo de 20 mL/min. Se usó la misma fase móvil como se estableció para el análisis de LC-MS de los péptidos crudos.' Los péptidos crudos se purificaron usando una columna de fase inversa de PEP Alltech . Hypersil, 100 Á, C8, 8 µ (250 x 22 mm) . Ellos se eluyeron con 0% ? 50% de acetonitrilo en 20 minutos. Los análogos fueron mayores que 95% puros usando la cromatografía líquida de alto desempeño (LC-MS) y tuvieron el análisis de aminoácidos esperado. ¦Varios gradientes diferentes se aplicaron para la elución de los péptidos que se inspeccionaron en 215 nm. La fase orgánica, acetonitrilo, y la fase acuosa ambas contienen TFA al 0.1% y 1-propanol al 3%. Los gradientes y gastos de flujo se listan enseguida. El porcentaje indica la. proporción de la fase orgánica. 0% ? 50% en 20 minutos, gasto de flujo de 1 mL/min.
Síntesis a Escala más Grande de la SEQ ID NO. 2 Lineal La SEQ ID NO. 2 se sintetizó mediante un procedimiento en fase sólida individual automatizado (sintetizador de' péptidos Applied Biosystems 433A) usando la resina de alcohol Fmoc-Arg ( Pbf) -p-alcoxibencílico (carga 0.59 mmol/g) . Los aminoácidos se unieron mediante la estrategia de Fmoc en una escala de 0.25 mmol usando , la química FastmocMR con un tiempo de acoplamiento individual de 21 minutos. La resina y los derivados de aminoácidos Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn (Trt ) -OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH (posiciones 9 y 23), Fmoc-Cys (Acm) -OH (posiciones 2 y 21), Fmoo-Gln (Trt).-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH y Fmoc-Tyr (tBu) -OH, se adquirieron de Baechem AG, Bubendorf, Süiza. Cada aminoácido se adicionó secuencialmente a la cadena de péptido en crecimiento del C- al N-terminal aplicando hexafluorofosfato de 2- (lH-benzotriazol-l-il) -1, 1, 3, 3-tetrametiluronio (HBTU) 0.45M/l-hidroxibenzotriazol (HOBt) en DMF (Applied Biosystems, Warrington, UK) y N,N-diisopropiletilamina (DIEA, Fisher Chemicals, Loughborough, UK) como reactivos de acoplamiento. La remoción del grupo protector N-Fmoc se llevó a cabo con piperidina al 20% (Romil, Cambridge, UK) en N-metilpirrolidona (NMP, 56 Chemicals, Runcorn, UK);i seguido por lavados secuenciales con NMP. El reactivo de acoplamiento, HBTU/HOBt está en exceso de 3.6 veces (0.9 mmol) y tocios los derivados de aminoácidos en exceso de 4 veces (1.0 mmol). Todos los solventes utilizados fueron de calidad de grado HPLC. Síntesis de Ac-SEQ ID NO. 2 Lineal Ac-SEQ ID NO. 2 se sintetizó mediante un procedimiento en fase sólida múltiple automatizado (sintetizador de péptidos múltiple Rainin Symphony) usando la resina de alcohol Fmoc-Arg ( Pbf) -p-alcoxibencílico (carga de 0.59 irunol/g) . Los aminoácidos se unieron mediante la estrategia de Fmoc en una escala de 0.2 mmol (péptidos 3) usando la química . Fmoc con un tiempo de acoplamiento individual de 20 minutos. La resina y los derivados de aminoácidos Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, Fmoc-As (OtBu) -OH, Fmoc-Cys (Trt) -OH (péptido 3 posiciones 9 y 23), Fmoc-Cys (Acm) -OH (péptido 3 posiciones 2 y 21), Fmoc-Gln (Trt ) -OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH,-Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH y Fmoc-Tyr (tBu) -OH, se adquirieron de Baechem AG, Bubendorf, Suiza. Cada aminoácido se adicionó secuencialmente a la cadena de péptido en crecimiento del C- al N-terminal- aplicando tetrafluoroborato de 2-(lH-benzotriazol-l-il) -1, 1, 3, 3-tetrametilurónio (HBTU, Severn Biotech Ltd. Kidderminster, U ) y N, N-diisopropiletilamina (DIEA, Fisher Chemicals, Loughborough, UK) como reactivos de acoplamiento. La remoción del grupo protector N-Fmoc se llevó a cabo con - piperidina al 20% (Romil, Cambridge, UK) en N-metiipirroli dona (NMP, M56 Chemicals, . Runcorn, UK) seguido por lavados secuenciales con NMP. El reactivo de acoplamiento, TBTU (exceso de 4 veces) se disolvió en DMF (Apollo Scientific, Stockport UK) y todos los derivados de aminoácidos (exceso de 4 veces) y DIEA (exceso de 8 veces) en NMP. La acetilación N-terminal automática se llevó a cabo después de la síntesis (péptidos 3) usando un exceso de una mezcla de coronación de anhídrido acético/lutidina/DMF/DCM (2:1:9:8). Todos los solventes utilizados fueron de calidad de grado HPLC. Síntesis de Ac-SEQ ID No. 2-NH2 Lineal La Ac-SEQ ID NO. 2-NH2 se sintetizó usando un procedimiento e fase sólida automatizado (sintetizador de péptidos Labortec AG SP4000) usando la resina enlazadora de amida tricíclica (carga 0.63 mmol/g) . Los aminoácidos se unieron mediante la estrategia- de Fmoc en una escala de 4 mmol usando la química Fmoc con un tiempo de acoplamiento individual de 60 minutos. La . terminación de cada etapa de acoplamiento se inspeccionó usando la prueba de color Kaiser. Los reacoplamientos se realizaron hasta que se obtuvo una prueba de color negativa. La resina y los derivados de aminoácidos Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg ( Pbf) -OH, Fmoc-Asn (Trt ) -OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Cys (Trt ) -OH (posiciones 9 y 23), Fmoc-Cys (Acm) -OH (posiciones 2 y 21) , Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -0H, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH y Fmoc-Tyr- ( tBu) -OH, se adquirieron de Bachem AG , Bubendorf, Suiza. Cada aminoácido se adicionó secuencialmente a la cadena de péptido en crecimiento del C- al Nf-terminal aplicando tetrafluoroborato de 2- (lH-benzotriazol-l-.il) -1, 1, 3, 3-tetrametilurónio (TBTü, Severn Biotech Ltd. Kidderminster, UK). y N,N-diisopropiletilamina (DIEA, Fisher Chemicals, Loughborough, UK) como reactivos de acoplamiento. La remoción del grupo protector N-Fmoc se llevó a cabo con piperidina al 20% (Romil, . Cambridge, UK) en DMF, . seguido por lavados secuenciales con DMF y propan-2-ol. El reactivo de acoplamiento, TBTU, ' todos los derivados de aminoácidos (exceso de 3 veces) y DIEA (exceso de 6 veces) se disolvieron en DMF. La acetilación N-terminal se llevó a cabo después de la síntesis usando un exceso de una mezcla de coronación de anhídrido acético/lutidina/DMF/DCM (2:1:9:8). Todos los solventes utilizados fueron de calidad de grado HPLC. Segmentación de Péptido Los péptidos se segmentaron de ' la resina con la desprotección simultánea usando' 82.5% de TFA a temperatura ambiente durante 3 horas en la presencia de 5% de tionisol, 5% de agua, 2.5% de etanoditiol y 6% (p/v) de fenol. La mezcla de segmentación se filtró y se precipitó e éter dietílico enfriado con hielo. La resina restante se lavó una vez con FA, se' filtró y se combinó con las f ac previas. Los precipitados se almacenaron a 4°c duran noche y se colectaron por filtración', se lavaron con dietilico enfriado con hielo y se dejaron secar a tempe] ambiente. Los péptidos crudos se disolvieron TFA/acetonitrilo/agua y se liofilizaron durante la (-50°C, 6 nabar) . Caracterización de Péptidos Crudos Los péptidos se caracterizaron mediante la HE fase inversa (Gilson) usando una columna C-18 ana! (Vydac 218TP54, '250 x 4.6mm, tamaño de partícula 5 tamaño de poro 300 Á) y un gradiente AB lineal de 0-100' B durante 40 min a un gasto de flujó de 1 mL/min, en dor eluyente A fue TFA al 0.1%/agua el eluyente B fue T 0.1% en CH3CN al 60% /agua. La masa se confirmó usando t> MS y la prueba de color de Ellman confirmó la presenc. grupos sulfhidrilo libres donde es aplicable. Producción de Péptidos Biciclicos - Los precursores lineales crudos se disolvier el TFA mínimo y se diluyeron a 2 L/0.25 mmol con agü primer puente de disulfuro se formó entre los residuos C protegidos usando K3Fe(CN)6. La solución de péptido se i a un pH de 7.5 con hidróxido de amonio acuoso. A solución, se adicionó gota a gota en exceso K3 e(C )s' C hasta que permaneció un ligero color amarillo. La termir de la reacción se confirmó mediante el muestreo de HPLC después de la acidificación. El pH de la solución se ajustó a 4 usando ácido acético acuoso al 50%. La mezcla de reacción cruda se agitó con la resina de intercambio catiónico débil Bio-Rex 70 (BioRad, CA) durante la noche y se empacó en una columna de vidrio. Después del lavado completo con agua, el péptido s.e eluyó con ácido acético acuoso al 50% y se detectó mediante TLC usando ninhidrina. Las fracciones positivas de ninhidrina se acumularon y. se .liofilizaron . El material crudo se purificó por medio de la HPLC de fase inversa preparativa. Las fracciones purificadas se colectaron, se . combinaron y se liofilizaron . El . segundo puente de disulfuro se formó mediante la I2-oxidación entre los residuos protegidos Cys (Acm) . Una solución del péptido (5 mg/ml) en TFA acuoso al 10% se mezcló vigorosamente con 8 equivalentes de yodo. El curso de la reacción fue seguido usando el muestreo de HPLC. En la terminación de la reacción (usualmente después de 0.5 h) , el yodo en exceso se suprimió usando ácido ascórbico 1M. La mezcla de reacción se diluyó x 2 con eluyente A, se filtró a través de un filtro desechable de 0.45 µp? y se purificó directamente mediante la HPLC de fase inversa preparativa. Las fracciones relevantes se colectaron, se evaporaron, se liofilizaron y se almacenaron á 4°C. Tres péptidos de la invención se obtuvieron. Ellos son referidos enseguida como EG 3287 (forma biciclica de la SEQ ID NO. 2), EG3307 (forma bicíclica de la Ac-SEQ ID No. 2) y EG3315 (forma biciclica de la Ac-SEQ ID No. 2-NH2). El control de calidad completo se realizó en todo el material purificado. Los péptidos se mostraron que son mayores que 95% puros mediante la HPLC en dos sistemas requladores (TFA y TEAP) . El análisis de aminoácido (Beckman 6300) después de la hidrólisis ácida confirmó la composición de aminoácido. MALDI-MS (Kratos Kompact Probé) mostró -el ión molecular esperado. La prueba de color de Ellman se usó para confirmar la ausencia de grupos sulfhidrilo libres en los péptidos monociclicos y biciclicos. Ensayo de Fosforilización KDR Células se pretrataron con el péptido en 10, 30 y 100 mM durante 15 minutos seguido por . el tratamiento con 25 ng/ml de VEGF durante 10 minutos, y las células se extrajeron inmediatamente mediante la solución reguladora de lisis (Tris-HCl 64 mM, pH 6.8, Na3V04 0.2 mM, SDS al 2%, glicerol al 10%, AEBSF 0.1 mM, leupeptina 5 mg/ml) . La fosforilación KDR se determinó al inmunomanchar extractos de células con anticuerpos que reconocen ya sea KDR fosforilado en las Tirosinas 1054 y 1059 (adquirido de Oncogene Research Products Inc.) o KDR total (adquirido de Santa Cruz Inc.). Bandas inmunoreactivas se . visualizaron mediante quimioluminiscencia usando IgG anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante y reactivo ECL.
La referencia se puede hacer a los dibujos acompañantes. Brevemente, la Fig. 1 muestra los efectos de los péptidos ' derivados del Exón 7 de VEGF ciclizado (100 µp?) en 125I-VGEF1 65 que enlaza a las células PAE/NP1. En particular, esto muestra la inhibición del enlace de ligando radiomarcado de VGEF a las células endoteliales aórticas porcinas (PAE) -.que expresan solamente Neuropilina-1 (NP-1) mediante EG 3287, y no afectan a un número de otros péptidos cíclicos relacionados. F9 y FIO se refieren, a dos . fracciones de la misma preparación de péptido. La Fig. 2 muestra la inhibición selectiva, específica de 125I-VGEFi65 que enlaza a las células PAE/NP-l, pero no. el efecto en el enlace a las células que expresan ya sea solamente KDR (PAE/KDR.) . o Flt-1 . (PAE/Flt-1) , los otros dos receptores de VGEF principales. EG3287 también inhibió el enlace de VEGF radiomarcado a las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) que expresan NP-1, KDR y Flt-1
(Fig. 2) , e inhibió la fosforilación KDR inducida por VEGF
(Fig. 3) . La Fig. 4 muestra que el péptido EG3287 también inhibió el enlace de VEGF radiomarcado a la línea de células de carcinoma de pecho MDA-MB-231, que naturalmente expresa solamente los receptores de NP-1 para VEGF.