DE60313444T2

DE60313444T2 - Vegf-peptide und deren verwendung

Info

Publication number: DE60313444T2
Application number: DE60313444T
Authority: DE
Inventors: D. Wolfson Inst Selwood; M. Wolfson Inst Löhr; I. Wolfson Inst Zachary
Original assignee: Ark Therapeutics Ltd
Current assignee: Ark Therapeutics Ltd
Priority date: 2002-04-02
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2023-03-29
Also published as: EP1490401B1; GB0207644D0; ATE360644T1; AU2003226515B2; WO2003082918A1; US20060166868A1; CN1642979A; IL163799A0; NO20044105L; JP2005531527A; KR20040099356A; KR100641535B1; ZA200406922B; CA2481253A1; DE60313444D1; ES2283799T3; MXPA04009479A; PL371546A1; AU2003226515A1; EP1490401A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Peptide, die Fragmente von VEGF (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor) sind und die eine Aktivität mit potentiellem Nutzen im Rahmen einer Therapie aufweisen.
Hintergrund der Erfindung
VEGF-A ist ein sekretiertes Polypeptid, das für die Bildung des Gefäßsystems im Rahmen der Embryogenese essentiell ist und eine Hauptrolle bei der Angiogenese bei verschiedenen Krankheitszuständen spielt: Die VEGF-Expression wird in mehreren Zellarten durch Hypoxie und mehrere Zytokine hinauf reguliert und löst in vivo und in vitro eine Mehrzahl von biologischen Aktivitäten aus, einschließlich der Differenzierung, der Proliferation, der Migration und des Überlebens von Endothelzellen, erhöhte Gefäßpermeabilität, Monozyten-Migration und erhöhte endotheliale Produktion der vasodilatatorischen Faktoren NO und Prostacyclin.
Humaner VEGF-A kommt in einer Mehrzahl von Isoformen von 121, 145, 165, 189 und 206 Aminosäuren vor, die durch alternatives mRNA-Spleißen erzeugt werden, von denen VEGF₁₂₁, VEGF₁₄₅ und VEGF₁₆₅ bekanntermaßen sekretiert werden und biologisch aktiv sind. Es sind zwei unterschiedliche Proteintyrosinkinaserezeptoren für VEGF identifiziert worden, d.h. Flt-1 (VEGFR1) und KDR/Flk-1 (VEGFR2). Es wird angenommen, dass KDR/flk-1 der Rezeptor ist, der primär die mitogenen Wirkungen von VEGF in Endothelzellen und Angiogenese in vivo vermittelt; die Funktion von Flt-1 in Endothelzellen ist unbekannt. Es ist ein nicht-Tyrosinkinase-Transmembranprotein, Neuropilin-1 (NP-1), als ein zusätzlicher Rezeptor für VEGF, der spezifisch VEGF₁₆₅ bindet, identifiziert worden. VEGF fördert das Überleben von Tumorzellen, welche NP-1 exprimieren, einschließlich einiger Brustkarzinomzellen (Bachelder et al., Cancer Res 61: 5736–5740, 2001). Die Rolle von NP-1 beim Vermitteln von biologischen Wirkungen von VEGF ist nach wie vor in großem Umfang unbekannt.
NP-1 ist ein Rezeptor für eine Familie von Molekülen, die als Semaphorine oder Collapsine bezeichnet werden, die eine Schlüsselrolle beim Lenken von neuronalen Axonen während der Säugetierentwicklung spielen. Insbesondere ist bekannt, dass NP-1 die den Wachstumskonus kollabieren lassende und chemorepulsive Aktivität von Semaphorin 3 vermittelt.
Soker et al., J. Biol. Chem. 271 (10): 5761–5767 (1996) offenbaren, dass ein GST-Fusionsprotein, welches die durch das Exon 7 von VEGF codierten 44 Aminosäuren enthält, an NP-1 bindet.
Soker et al., J. Biol. Chem. 272 (10): 31582–31588 (1997) offenbaren, dass eine Region von Exon 7 für die Inhibition der Bindung von VEGF an HUVECs erforderlich ist. Das kürzeste aktive Peptid (SEQ ID Nr. 1) ist
CSCKNTDSRCKARQLELNERTCRC,
d.h. VEGF (137–160) oder die Aminosäuren 22–44 von Exon 7 und Aminosäure 1 von Exon 8. Der terminale Cysteinrest (C¹³⁷ in VEGF) ist offensichtlich für die Aktivität und die dreidimensionale Struktur des Moleküls essentiell. Es wird vermutet, dass es innerhalb des VEGF-Monomers Intradisulfid-Bindungen geben könnte.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist überraschenderweise festgestellt worden, dass bestimmte Peptide eine NP-1-Antagonistenaktivität aufweisen. Ein neues Peptid gemäß der Erfindung weist die SEQ ID Nr. 2 auf, d.h. die Aminosäuresequenz
SCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR,
oder ein Fragment desselben, welches im Wesentlichen eine NP-1-Antagonistenaktivität beibehält, in cyclischer Form.
Die angegebene Sequenz entspricht den Aminosäuren 138 bis 165 innerhalb von VEGF, d.h. einschließlich zumindest eines Teils von Exon 8. Überraschenderweise ist Aktivität gefunden worden bei Peptiden, denen der Cys-Rest fehlt, bezüglich welchem von Soker et al. angegeben worden ist, dass er essentiell sei.
Die Erfindung umfasst auch Varianten der angegebenen Sequenz, in denen die neue Aktivität, d.h. der NP-1-Antagonismus, beibehalten wird, ohne unerwartete strukturelle Variationen. Dementsprechend kann die angegebene Sequenz isosterische oder homologe Ersetzungen oder Derivatisierungen, die das Peptid relativ stabil machen, umfassen.
Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
Peptide der Erfindung können durch bekannte Verfahren synthetisiert werden. Nachfolgend werden Beispiele angegeben. Insbesondere kann ein lineares Peptid durch automatisierte Peptidsynthese, gefolgt von einer Cyclisierung, hergestellt werden. Bekannte Cyclisierungsprozeduren umfassen jene, die von Tam et al., JACS 113:6657-62 (1991) beschrieben worden sind. Andere Cyclisierungen, z.B. Mitsunobu- oder Olefin-Metathese-Ringschluss, können ebenfalls verwendet werden.
Ein Peptid dieser Erfindung weist vorzugsweise 4 Cys-Reste auf. Es ist vorzugsweise bicyclisch.
Wie oben angegeben, können Peptide der Erfindung Modifikationen der angegebenen Sequenz umfassen. Solche Modifikationen sind den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt. Isosterische Ersetzungen umfassen Abu für Cys (dies kann wünschenswert sein, wenn das Peptid eine gerade Anzahl von Cys-Resten für eine Cyclisierung beibehalten sollte), Phe für Tyr und verschiedene Alkyl/Aryl-Substituenten. Das Verschieben von Substituenten innerhalb eines Aminosäurerests von einem C-Atom zu einem N-Atom, um Peptoide, die eine höhere Beständigkeit gegenüber einer Proteolyse aufweisen, herzustellen, und andere Modifikationen sind bekannt und sind innerhalb des Umfangs dieser Erfindung mit enthalten. Ein spezielles Peptid, über welches hier berichtet wird, ist N-acetyliert; den Fachleuten auf diesem Gebiet werden auch andere terminale Modifikationen bekannt sein. Solche modifizierten Peptide können als Prodrugs wirken und/oder modifizierte Immunogenität aufweisen.
Die NP-1-Antagonisteneigenschaften eines Peptids dieser Erfindung können durch die nachfolgend beschriebene Vorgehensweise bestimmt werden. Das Aktivitätsausmaß ist vorzugsweise mindestens 25% oder 50% so hoch wie jenes für das bicyclische 28-mer, das synthetisiert worden ist.
Die Aktivität von Peptiden der Erfindung bedeutet, dass sie bei der Behandlung von Erkrankungen, bei denen NP-1 möglicherweise eine signifikante Rolle bei der Pathologie spielt, nützlich sein können. Für eine therapeutische Verwendung können Peptide der Erfindung formuliert und verabreicht werden durch Vorgehensweisen und unter Verwendung von Komponenten, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind. Die geeignete Dosierung des Peptids kann durch den Fachmann ausgewählt werden unter Berücksichtigung der üblichen Faktoren, wie des Zustands des zu behandelnden Subjekts, der Wirkkraft der Verbindung, der Verabreichungsroute u.s.w. Geeignete Verabreichungsrouten umfassen intramuskulär, intranasal und subkutan.
Ein NP-1-Antagonist kann mit Semaphorin 3 hinsichtlich der Bindung an NP-1 kompetitieren und dadurch Wirkungen von Semaphorin 3 auf den Auswuchs von Axonen und die Migration in Nervenzellen antagonisieren. Potentielle Anwendungen davon bestehen bei der Förderung des Auswuchses von Neuriten, bei der Stimulation der Nervenreparatur oder der Behandlung von Neurodegeneration. Ferner kann ein NP-1-Antagonist das Überleben von auf Semaphorin 3 ansprechenden Neuronen fördern, eine Wirkung, die dessen Nützlichkeit bei den oben angegebenen Anwendungen bestätigen oder verstärken würde, und könnte diese Anwendungen erweitern, z.B. um den Tod von Nervenzellen, der durch Episoden von Ischämie, wie bei Schlaganfall und verschiedenen Augenerkrankungen, hervorgerufen wird, zu behandeln.
NP-1 spielt eine wichtige Rolle bei der Angiogenese und kann für eine VEGF-induzierte Angiogenese bei Krebs, Augenerkrankungen, rheumatoider Arthritis und anderen Erkrankungen essentiell sein. Dementsprechend haben NP-1-Antagonisten Anwendungen bei der Hemmung einer VEGF-abhängigen Angiogenese im Krankheitszustand.
NP-1-Antagonisten können auch eine Rolle bei der Immunsuppression spielen. Dementsprechend kann es hilfreich sein, ein Peptid der Erfindung vor, während oder nach einer Transplantation zu verabreichen.
Zusätzlich kann ein NP-1-Antagonist mit VEGF hinsichtlich der Bindung an NP-1 in Tumorzellen kompetitieren und den Zelltod bei NP-1 exprimierenden Tumorzellen fördern. Potentielle Anwendungen davon liegen in der Antikrebstherapie.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Abkürzungen
MBHA, Methylbenzhydrylamin; Fmoc, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl; Ala, Alanin; Arg, Arginin; Asn, Asparagin; Asp, Asparaginsäure; Abu, Aminobuttersäure; Cys, Cystein; Gln, Glutamin; Glu, Glutaminsäure; Gly, Glycin; His, Histidin; Ile, Isoleucin; Leu, Leucin; Lys, Lysin; Met, Methionin; Phe, Phenylalanin; Pro, Prolin; Ser, Serin; Thr, Threonin; Trp, Tryptophan; Tyr, Tyrosin; Va, Valin; Pbf, 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl; Pmc, 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-8-sulfonyl; Trt, Trityl; tBu, tert.-Butyl; Boc, Butoxycarbonyl; Pybob, Benzotriazol-1-yloxytrispyrrolidino-phosphoniumhexafluorphosphat; NMM, N-Methylmorpholin; DCM, Dichlormethan; DMF, Dimethylformamid; TBME, tert.-Butylmethylether; TFA, Trifluoressigsäure; HPLC, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; LC-MS, Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie; Å, Angström; AAA, Aminosäureanalyse; DMSO, Dimethylsulfoxid; VEGF, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor.
Peptidsynthesen in kleinem Maßstab
Die in 1 gezeigten Peptide wurden an einem automatisierten AMS 422 Multiple Peptide Synthesiser unter Verwendung des Festphasen-Ansatzes synthetisiert. Es wurden das Rink Amide MBHA-Harz (0,59 und 0,68 mmol/g Beladung) und die N-Fmoc-Strategie mit orthogonalem Schutz (Acm, t-Bu) der Cys-Seitenketten von zu cyclisierenden Derivaten angewendet. Das gewünschte Peptid wurde im 25 μM-Maßstab synthetisiert und einmal mit einer Basiskopplungszeit von 30 min gekoppelt. Das Harz und die Aminosäurederivate Fmoc-Ala-OH.H₂O, Fmoc-Arg(Pbf/Pmc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro.H₂O, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH und Fmoc-Val-OH wurden von Calbiochem-Novabiochem UK Ltd. (Nottingham, Vereinigtes Königreich) oder Alexis (Nottingham, Vereinigtes Königreich) erworben.
Jede Aminosäure wurde nacheinander über die aktiver Ester-Methode an die von dem C- zu dem N-Terminus wachsende Peptidkette gekoppelt, wobei Pybop (Calbiochem-Novabiochem) und NMM (Rathburn Chemicals, Walkerburn, Vereinigtes Königreich) als Kopplungsreagenzien angewendet wurden. Die Entfernung der N-Fmoc-Schutzgruppe erfolgte mit 20% Piperidin in DMF (Rathburn Chemicals, Walkerburn, Schottland), gefolgt von aufeinanderfolgenden Wäschen mit DMF und DCM. Nach der Synthese von jedem Peptid wurde eine automatische Acetylierung mit einem 4-fachen Überschuss von Essigsäure (0,7 molar, Rathburn Chemicals, Winterburn, Schottland) basierend auf der Substitution des Rink-Amide-MBNA-Harzes ausgeführt. Das Kopplungsreagens Pybop, NMM und alle Aminosäurederivate wurden in DMF (0,7 M, 4-facher Überschuss bezogen auf die Substitution des Rink-Amide-MBHA-Harzes) gelöst mit Ausnahme der Aminosäuren Fmoc-His(Trt)-OH und Fmoc-Phe-OH. Diese geschützten Aminosäurederivate wurden in N-Methylpyrrolidon gelöst. Alle verwendeten Lösemittel waren von HPLC-Qualität. Die Peptide wurden von dem Harz unter gleichzeitiger Schutzgruppenentfernung unter Verwendung von 90% TFA bei Raumtemperatur für 3 h in Gegenwart von 5% Thioanisol, 2,5% Wasser und 2,5% Ethandithiol als Fänger für erzeugte reaktive Kationen abgespalten. Die Abspaltungsmischung wurde filtriert und in eiskaltem TBME ausgefällt. Das zurückbleibende Harz wurde einmal mit dem Abspaltungsreagens gewaschen, es wurde filtriert und mit den vorangegangenen Fraktionen vereinigt. Die Präzipitate wurden nach Zentrifugation gesammelt, dreimal mit eiskaltem TBME gewaschen und über Nacht bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Die rohen Peptide wurden in 15%-iger wässriger Essigsäure gelöst und 2 Tage lyophilisiert (–40°C, 6 mbar).
Reinigung und Charakterisierung
Die rohen Peptide wurden durch analytische LC-MS an einem Quattro LC Mass Spectrometer von Micromass mit einem HPLC-Instrument, Modell 1100, von Hewlett-Packard unter Verwendung von analytischen Umkehrphasen-Säulen (Säule Alltech Hypersil PEP-Umkehrphasensäule, 100 Å, C₈, 5 μ (250 × 4,6 mm) 0% → 50% Acetonitril in 20 min), analysiert. Die Trennungen wurden bei einer Wellenlänge von 215 nm für die Amidbindungs-Absorption mit einer Flussrate von 1 ml/min überwacht. Die rohen Peptide wurden durch präparative Umkehrphasen-HPLC (Gilson) gereinigt, bei 215 nm überwacht und mit einer Flussrate von 20 ml/min eluiert. Es wurde die gleiche mobile Phase, wie sie für die LC-MS-Analyse der rohen Peptide angegeben wurde, verwendet. Die rohen Peptide wurden unter Verwendung einer Alltech Hypersil PEP-Umkehrphasensäule, 100 Å, C₈, 8 μ (250 × 22 mm) gereinigt. Sie wurden mit 0% → 50% Acetonitril in 20 min eluiert. Die Analoga waren bei Verwendung einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (LC-MS) zu mehr als 95% rein und wiesen die erwartete Aminosäureanalyse auf.
Es wurden verschiedene unterschiedliche Gradienten für die Elution der Peptide, die bei 215 nm überwacht wurde, angewendet. Die organische Phase, Acetonitril, und die wässrige Phase enthalten beide 0,1% TFA und 3% 1-Propanol. Die Gradienten und Flussraten sind nachfolgend aufgelistet. Der Prozentsatz gibt den Anteil der organischen Phase an. 0% → 50% Acetonitril in 20 min, Flussrate 1 ml/min.
Synthese von linearer SEQ ID Nr. 2 in größerem Maßstab
SEQ ID Nr. 2 wurde durch einen automatisierten Einzel-Festphasen-Ansatz (Applied Biosystems 433A Peptide Synthesiser) unter Verwendung des Fmoc-Arg(Pbf)-p-alkoxybenzylalkohol-Harzes (0,59 mmol/g Beladung) synthetisiert. Aminosäuren wurden durch die Fmoc-Strategie in einem 0,25 mmol-Maßstab unter Verwendung von Fastmoc^TM-Chemie mit einer einzelnen Kopplungszeit von 21 min angeheftet. Das Harz und die Aminosäurederivate, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH (Positionen 9 und 23), Fmoc-Cys(Acm)-OH (Positionen 2 und 21), Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH und Fmoc-Tyr(tBu)-OH wurden von der Bachem AG, Bubendorf, Schweiz, erworben. Jede Aminosäure wurde nacheinander zu der vom C- zum N-Terminus wachsenden Peptidkette hinzugefügt unter Anwendung von 0,45 M 2-(1N-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU)/1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) in DMF (Applied Biosystems, Warrington, Vereinigtes Königreich) und N,N-Diisopropylethylamin (DIEA, Fisher Chemicals, Loughborough, Vereinigtes Königreich) als Kopplungsreagenzien. Die Entfernung der N-Fmoc-Schutzgruppe erfolgte mit 20% Piperidin (Romil, Cambridge, Vereinigtes Königreich) in N-Methylpyrrolidon (NMP, M56 Chemicals, Runcorn, Vereinigtes Königreich), gefolgt von aufeinanderfolgenden Wäschen mit NMP. Das Kopplungsreagens, HBTU/HOBt, liegt in 3,6-fachem Überschuss (0,9 mmol) und alle Aminosäurederivate in 4-fachem Überschuss (1,0 mmol) vor. Alle verwendeten Lösemittel waren von HPLC-Qualität.
Synthese von linearer Ac-SEQ ID Nr. 2
Ac-SEQ ID Nr. 2 wurde durch einen automatisierten Mehrfach-Festphasen-Ansatz (Rainin Symphony multiple peptide synthesiser) unter Verwendung des Fmoc-Arg(Pbf)-p-alkoxybenzylalkohol-Harzes (0,59 mmol/g Beladung) synthetisiert. Aminosäuren wurden durch die Fmoc-Strategie in einem 0,2 mmol-Maßstab (Peptide 3) unter Verwendung von Fmoc-Chemie mit einer einzelnen Kopplungszeit von 20 min angeheftet. Das Harz und die Aminosäurederivate, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH (Peptid 3, Positionen 9 und 23), Fmoc-Cys(Acm) (Peptid 3, Positionen 2 und 21), Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH und Fmoc-Tyr(tBu)-OH wurden von der Bachem AG, Bubendorf, Schweiz, erworben. Jede Aminosäure wurde nacheinander zu der vom C- zum N-Terminus wachsenden Peptidkette hinzugefügt unter Anwendung von 2-(1N-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorborat (TBTU, Severn Biotech Ltd., Kidderminster, Vereinigtes Königreich) und N,N-Diisopropylethylamin (DIEA, Fisher Chemicals, Loughborough, Vereinigtes Königreich) als Kopplungsreagenzien. Die Entfernung der N-Fmoc-Schutzgruppe erfolgte mit 20% Piperidin (Romil, Cambridge, Vereinigtes Königreich) in N-Methylpyrrolidon (NMP, M56 Chemicals, Runcorn, Vereinigtes Königreich), gefolgt von aufeinanderfolgenden Wäschen mit NMP. Das Kopplungsreagens TBTU (4-facher Überschuss) wurde in DMF (Apollo Scientific, Stockport, Vereinigtes Königreich) und alle Aminosäurederivate (4-facher Überschuss) und DIEA (8-facher Überschuss) in NMP gelöst. Nach der Synthese (Peptide 3) wurde eine automatische N-terminale Acetylierung unter Verwendung eines Überschusses einer Capping-Mischung von Essigsäureanhydrid/Lutidin/DMF/DCM (2:1:9:8) ausgeführt. Alle verwendeten Lösemittel waren von HPLC-Qualität.
Synthese von linearer Ac-SEQ ID Nr. 2-NH₂
Ac-SEQ ID Nr. 2-NH₂ wurde unter Verwendung eines halbautomatisierten Festphasen-Ansatzes (Labortec AG SP4000 Peptide Synthesiser) unter Verwendung des tricyclischen Amid-Linker-Harzes (0,63 mmol/g Beladung) synthetisiert. Aminosäuren wurden durch eine Fmoc-Strategie in einem 4 mmol-Maßstab unter Verwendung von Fmoc-Chemie mit einer einzelnen Kopplungszeit von 60 min angeheftet. Der vollständige Ablauf jedes Kopplungsschritts wurde unter Verwendung des Kaiser-Farbtests überwacht. Es wurden erneute Kopplungen ausgeführt, bis ein negativer Farbtest erhalten wurde. Das Harz und die Aminosäurederivate, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH (Positionen 9 und 23), Fmoc-Cys(Acm)-OH (Positionen 2 und 21), Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH und Fmoc-Tyr(tBu)-OH wurden von der Bachem AG, Bubendorf, Schweiz, erworben. Jede Aminosäure wurde nacheinander zu der vom C- zum N-Terminus wachsenden Peptidkette hinzugefügt unter Anwendung von 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorborat (TBTU, Severn Biotech Ltd., Kidderminster, Vereinigtes Königreich) und N,N-Diisopropylethylamin (DIEA, Fisher Chemicals, Loughborough, Vereinigtes Königreich) als Kopplungsreagenzien. Die Entfernung der N-Fmoc-Schutzgruppe erfolgte mit 20% Piperidin (Romil, Cambridge, Vereinigtes Königreich) in DMF, gefolgt von aufeinanderfolgenden Wäschen mit DMF und Propan-2-ol. Das Kopplungsreagens TBTU, alle Aminosäurederivate (3-facher Überschuss) und DIEA (6-facher Überschuss) wurden in DMF gelöst. Nach der Synthese wurde eine N-terminale Acetylierung unter Verwendung eines Überschusses einer Capping-Mischung von Essigsäureanhydrid/Lutidin/DMF/DCM (2:1:9:8) ausgeführt. Alle verwendeten Lösemittel waren von HPLC-Qualität.
Peptid-Abspaltung
Die Peptide wurden von dem Harz mit gleichzeitiger Entfernung der Schutzgruppen unter Verwendung von 82,5% TFA bei Raumtemperatur für 3 h in Gegenwart von 5% Thioanisol, 5% Wasser, 2,5% Ethandithiol und 6% (Gew./Vol.) Phenol abgespalten. Die Abspaltungsmischung wurde filtriert und in eiskaltem Diethylether ausgefällt. Das zurückbleibende Harz wurde einmal mit TFA gewaschen, es wurde filtriert und mit den vorangegangenen Fraktionen vereinigt. Die Präzipitate wurden bei 4°C über Nacht aufbewahrt und wurden durch Filtration gesammelt, mit eiskaltem Diethylether gewaschen und bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Die rohen Peptide wurden in TFA/Acetonitril/Wasser gelöst und über Nacht lyophilisiert (–50°C, 6 mbar).
Charakterisierung von rohen Peptiden
Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC (Gilson) unter Verwendung einer analytischen C-18-Säule (Vydac 218TP54, 250 × 4,6 mm, Teilchengröße 5 μm und Porengröße 300 Å) und eines linearen AB-Gradienten von 0–100% B über 40 min bei einer Flussrate von 1 ml/min, wobei Eluent A 0,1% TFA/Wasser war und Eluent B 0,1% TFA in 60% CH₃CN/Wasser war, charakterisiert. Die Masse wurde unter Verwendung von MALDI-MS bestätigt und der Ellman's Farbtest bestätigte das Vorhandensein von freien Sulfhydrylgruppen, wo anwendbar.
Herstellung von bicyclischen Peptiden
Die rohen linearen Vorstufen wurden in der minimalen Menge TFA gelöst und mit Wasser auf 2 l/0,25 mmol verdünnt. Die erste Disulfidbrücke wurde zwischen ungeschützten Cys-Resten unter Verwendung von K₃Fe(CN)₆ gebildet. Die Peptidlösung wurde mit wässrigem Ammoniumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Zu dieser Lösung wurde 0,01 M K₃Fe(CN)₆ tropfenweise bis zum Überschuss zugegeben, bis eine leicht gelbe Farbe bestehen blieb. Der vollständige Ablauf der Reaktion wurde durch HPLC-Analysenprobennahme nach Ansäuern bestätigt. Der pH der Lösung wurde unter Verwendung von 50%-iger wässriger Essigsäure auf 4 eingestellt. Die rohe Reaktionsmischung wurde mit schwachem Bio-Rex 70-Kationenaustauscherharz (BioRad, CA) über Nacht gerührt und in eine Glassäule gepackt. Nach sorgfältigem Waschen mit Wasser wurde das Peptid unter Verwendung von 50%-iger wässriger Essigsäure eluiert und durch DSC unter Verwendung von Ninhydrin detektiert. Ninhydrin-positive Fraktionen wurden gepoolt und lyophilisiert. Rohes Material wurde über präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die gereinigten Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt und lyophilisiert. Die zweite Disulfidbrücke wurde über I₂-Oxidation zwischen Cys(Acm)-geschützten Resten gebildet. Eine Lösung des Peptids (5 mg/ml) in 10%-iger wässriger TFA wurde kräftig mit 8 Äquivalenten Iod gemischt. Der Verlauf der Reaktion wurde unter Verwendung von HPLC-Analysenprobennahme verfolgt. Bei vollständigem Ablauf der Reaktion (üblicherweise nach 0,5 h) wurde das überschüssige Iod unter Verwendung von 1 M Ascorbinsäure gequencht. Die Reaktionsmischung wurde zweifach mit Eluent A verdünnt, durch einen 0,45 μm-Einwegfilter filtriert und direkt über präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die relevanten Fraktionen wurden gesammelt, eingedampft, lyophilisiert und bei 4°C aufbewahrt.
Es wurden drei Peptide der Erfindung erhalten. Wie werden nachfolgend als EG 3287 (bicyclische Form von SEQ ID Nr. 2), EG3307 (bicyclische Form von Ac-SEQ ID Nr. 2) und EG3315 (bicyclische Form von Ac-SEQ ID Nr. 2-NH₂) bezeichnet.
An sämtlichem gereinigten Material wurde eine vollständige Qualitätskontrolle durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass Peptide anhand von HPLC in zwei Puffersystemen (TFA und TEAP) zu mehr als 95% rein waren. Eine Aminosäureanalyse (Beckman 6300), welche einer sauren Hydrolyse folgte, bestätigte die Aminosäurezusammensetzung. MALDI-MS (Kratos Kompact Probe) zeigte das erwartete Molekülion. Ellman's Farbtest wurde verwendet, um das Fehlen von freien Sulfhydrylgruppen in monocyclischen und bicyclischen Peptiden zu bestätigen.
KDR-Phosphorylierungsassay
Zellen wurden mit Peptid in einer Konzentration von 10, 30 und 100 mM 15 min vorbehandelt, gefolgt von einer Behandlung mit 25 ng/ml VEGF für 10 min, und Zellen wurden unverzüglich durch Lysepuffer (64 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,2 mM Na₃VO₄, 2% SDS, 10% Glycerol, 0,1 mM AEBSF, 5 mg/ml Leupeptin) extrahiert. Die KDR-Phosphorylierung wurde bestimmt, indem Zellextrakte mit Antikörpern, die entweder an den Tyrosinen 1054 und 1059 phosphorylierten KDR erkennen (erworben von Oncogene Research Products Inc.) oder gesamten KDR erkennen (erworben von Santa Cruz Inc.), immungeblottet wurden. Immunreaktive Banden wurden durch Chemolumineszenz unter Verwendung von Meerrettich- Peroxidase-konjugiertem anti-Kaninchen-IgG und ECL-Reagens sichtbar gemacht.
Es kann auf die begleitenden Zeichnungen Bezug genommen werden. Kurz zusammengefasst, zeigt 1 Wirkungen von cyclisierten, von Exon 7 von VEGF abgeleiteten Peptiden (100 μM) auf die ¹²⁵I-VEGF₁₆₅-Bindung an PAE/NP1-Zellen. Sie zeigt insbesondere die Hemmung der Bindung von radioaktiv markiertem VEGF-Ligand an Schweineaorta-Endothelzellen (PEA), welche nur Neuropilin-1 (NP1) exprimieren, durch EG3287 und keine Wirkung einer Anzahl von anderen verwandten cyclischen Peptiden. F9 und F10 beziehen sich auf zwei Fraktionen der gleichen Peptidpräparation.
2 zeigt eine spezifische selektive Hemmung der ¹²⁵I-VEGF₁₆₅-Bindung an PAE/NP-1-Zellen, aber keine Wirkung auf das Binden an Zellen, welche entweder nur KDR (PAE/KDR) oder Flt-1 (PAE/Flt-1), die anderen beiden hauptsächlichen VEGF-Rezeptoren, exprimieren. EG3287 hemmte auch die Bindung von radioaktiv markiertem VEGF an humane Umbilikalvenen-Endothelzellen (HUVEC), die NP-1, KDR und Flt-1 exprimieren (2), und hemmte eine VEGF-induzierte KDR-Phosphorylierung (3).
4 zeigt, dass das Peptid EG3287 auch die Bindung von radioaktiv markiertem VEGF an die Brustkarzinomzelllinie MDA-MB-231, die von Natur aus nur NP1-Rezeptoren für VEGF exprimiert, hemmte.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptid mit der Aminosäuresequenz SCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR oder ein Fragment desselben, welches im Wesentlichen eine NP-1-Antagonistenaktivität beibehält, in cyclischer Form.
Peptid nach Anspruch 1, das die gegebene Sequenz aufweist, in bicyclischer Form.
Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 zur therapeutischen Verwendung.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung der Nervenreparatur.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Neurodegeneration.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Antikrebstherapie.