KR100641535B1

KR100641535B1 - 브이이지에프 펩티드 및 그 용도

Info

Publication number: KR100641535B1
Application number: KR1020047015025A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 셀우드; 마리안느 로어; 이안 재커리
Original assignee: 아크 테라퓨틱스 리미티드
Priority date: 2002-04-02
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2006-10-31
Also published as: GB0207644D0; PL371546A1; ATE360644T1; CN1642979A; IL163799A0; ZA200406922B; US20060166868A1; AU2003226515B2; JP2005531527A; DE60313444T2; KR20040099356A; CA2481253A1; NO20044105L; EP1490401A1; WO2003082918A1; MXPA04009479A; DE60313444D1; ES2283799T3; EP1490401B1; AU2003226515A1

Abstract

본 발명에서는 고리 형태인, 아미노산 서열 SCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR 또는 실질적으로 NP-1 길항제 활성을 보유하는 이의 단편을 갖는 신규한 펩티드를 치료용으로 사용하는 것이 제안된다.

Description

브이이지에프 펩티드 및 그 용도{VEGF PEPTIDES AND THEIR USE}

본 발명은 VEGF(혈관 내피 성장 인자)의 단편이고 치료용법에서 잠재적인 이익의 활성을 가진 펩티드에 관한 것이다.

VEGF-A는 다양한 질병 상태에서 배아형성에서의 혈관 체계의 형성에 대하여 핵심적이고 혈관형성의 중요한 역할을 한다. VEGF 발현은 다양한 세포 형태에서 저산소증 및 여러 개의 시토킨에 의해 상향조절되고, 그리고 내피 세포의 분화, 증식, 이동 및 생존, 혈관이완(vasodilatory) 인자 NO 및 프로스타시클린(prostacyclin)의 증가된 혈관 투과성, 단핵세포 이동 및 증가된 내피 생산을 포함하여, 생체 내에서 및 생체 외에서 다중의 생물학적인 활성을 이끌어낸다.

인간 VEGF-A는 대안적 mRNA 접합(splicing)에 의해 발생된, 121, 145, 165, 189 및 206 아미노산의 다중 이형질체(isoform)에서 존재한다. VEGF₁₂₁, VEGF₁₄₅ 및 VEGF₁₆₅은 생물학적으로 활성이고 분비되는 것으로 알려져 있다. VEGF에 대한 두 개의 독특한 단백질 티로신 키나제 수용체, 즉 Flt-1(VEGFR1) 및 KDR/Flk-1(VEGF2)는 동정화되고 있다. KDR/flk-1은 생체 내에서 내피 세포 및 혈관형성에서의 VEGF의 분열촉진 효과를 주로 조정하는 수용체라고 생각되고; 내피 세포에서 Flt-1의 기능은 알려져 있지 않다. 비-티로신 키나제 막단백질, 뉴로필린(neuropilin)-1(NP-1)은 VEGF에 대한 추가적인 수용체로서 동정화되고 있고, VEGF₁₆₅에 특이적으로 반응한다. VEGF는 NP-1을 발현하는 종양 세포의 생존을 촉진하고, 어떤 유방암 세포를 포함한다(Bachelder et al, Cancer Res 61:5736-5740, 2001). VEGF의 생물학적인 효과를 중재하는 데 있어서의 NP-1의 역할은 아직 대부분 알려져 있지 않다.

NP-1는 세마포린(semaphorin) 또는 콜랍신(collapsin)이라고 불리는 분자의 군(family)에 대한 수용체이고 포유동물 성장 중 신경의 액손 유도에서 핵심 역할을 한다. 특히, NP-1은 세마포린 3의 성장 원추체(cone)-붕괴 및 화학반발적인 활성을 중재하는 것으로 알려져 있다.

Soker et al, J. Biol. Chem. 271(10): 5761-5767 (1996)은 VEGF 액손 7에 의해 암호화된 44 아미노산을 함유하는 GST 융합 단백질이 NP-1에 결합한다는 것을 개시한다.

Soker et al, J. Biol. Chem. 272(10): 31582-31588 (1997)은 액손 7의 영역이 HUVEC에 결합하는 VEGF의 억제에 필수적이다라는 것을 개시한다. 가장 짧은 활성 펩티드(SEQ IN NO. 1)은 CSCKNTDSRCKARQLELNERTCRC, 즉 VEGF(137-160), 또는 액손 7의 아미노산 22-44 및 액손 8의 아미노산 1이다. 말단의 시스테인 잔기(VEGF에서 C¹³⁷)은 분명하게 분자의 3D 구조 및 활성에 핵심적이다. VEGF 단량체 안에서 인트라술파이드 결합일 것이라는 것을 제안한다.

발명의 요약

놀랍게도, 특정 펩티드가 NP-1 길항제(antagonist) 활성을 갖는 것이 밝혀졌다. 본 발명에 따른 신규한 펩티드는 고리(cyclic) 형태인, SEQ ID NO.2, 즉 아미노산 서열 SCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR 또는 NP-1 길항제 활성을 실질적으로 보유하는 그의 단편이다.

주어진 서열은 VEGF 내의 아미노산 138 내지 165, 최소한 엑손 8의 부분을 포함하는 아미노산에 상응한다. 놀랍게도, 활성은 Soker et al에 의해 필수적이라고 지적된 Cys 잔기가 결핍된 펩티드에서 발현되었다.

또한, 본 발명은 신규한 활성, 즉 NP-1 길항작용이 예상밖으로 구조적 변형 없이 유지되는, 주어진 서열의 변형(variant)을 포함한다. 그러므로, 주어진 서열은 펩티드를 상대적으로 안정하게 만드는 등입체성의(isosteric) 또는 동종성 치환(replacement) 또는 유도체화(derivatization)를 포함할 수 있다.

본 발명의 펩티드는 알려진 방법에 의해 합성될 수 있다. 실시예는 하기에 나타내었다. 특히, 선형 펩티드는 자동화된 펩티드 합성에 의해 생산되고 고리화(cyclization)될 수 있다. 알려진 고리화 공정은 Tam et al, JACS 113:6657-62 (1991)에 의해 기재된 것을 포함한다. 다른 고리화, 예를 들어 미츠노부(Mitsunobu) 또는 올레핀 복분해(metathesis) 고리 폐쇄도 사용될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 펩티드는 4개의 Cys 잔기를 가진다. 바람직하게는 두 고리성(bicyclic)이다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 주어진 서열의 변경(modification)을 포함할 수 있다. 이러한 변경은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 등입체성 치환은 Cys에 대한 Abu(펩티드가 고리화를 위한 짝수의 Cys 잔기를 보유하는 것이 바람직할 것이다), Tyr 및 다른 알킬/아릴 치환기에 대한 Phe를 포함한다. 단백질 분해 및 다른 변경에 더 큰 저항성을 가진 펩토이드(peptoid)를 생산하기 위하여, C 원자에서 N원자까지, 아미노산 잔기 안에서의 치환기의 변위(shifting)는 알려져 있고, 본 발명의 범위에 포함된다. 여기서 개시된 특이 펩티드는 N-아세틸화된다; 다른 말단의 변경 또한 당업자들에게 잘 알려질 것이다. 이러한 변경 펩티드는 전구약물(prodrug)로서 작용하고/하거나 변경된 면역원성을 가질 수 있다.

본 발명의 펩티드의 NP-1 길항제 특성은 하기와 같은 공정에 의해 결정될 수 있다. 활성의 수준은 바람직하게는 25% 이상이거나, 또는 합성되어진 두 고리성 28-mer에 대한 것만큼 큰, 50%일 수도 있다.

본 발명의 펩티드의 활성은 그들이 NP-1가 병리학에서 현저한 역할을 가질 수 있는 질병의 치료에서 유용할 것이다. 치료적인 용도의 경우에서, 본 발명의 펩티드는 당업자들에게 알려진, 구성성분을 사용하여, 공정에 의해 제형화되고 투여될 것이다. 펩티드의 적절한 투여량은 환자의 상태, 화합물의 효능, 투여경로 등의 일반적인 인자를 고려하여 당업자들에게 선택될 것이다. 투여의 적절한 경로는 근육내, 비강내 및 피부내 투여를 포함할 것이다.

NP-1 길항제는 NP-1에 대한 결합을 위하여 세마포린 3과 경쟁할 것이고, 그것으로 인하여, 신경세포에서 엑손의 성장 및 이동에서 세마포린 3의 효과를 상쇄한다. 이것의 잠재적인 응용은 신경돌기 성장을 촉진하는 것, 신경 복구를 촉진하거나 또는 신경퇴화를 치료하는 것이다. 추가로, NP-1 길항제는 세마포린 3-반응성 뉴런의 생존을 촉진할 것이다. 상기 응용에서 그것의 효용을 확인하거나 강화하는 영향을 촉진할 수 있고, 예를 들어, 발작 및 일부 안과 질병에서와 같이 허혈의 에피소드에 의해 야기된 뉴런성 사멸을 처리하기 위하여, 이들 응용을 확장할 수 있다. NP-1은 혈관형성에서 중요한 역할을 하고 암, 안과 질환, 류머티즘성 관절염 및 다른 질병에서 VEGF-유도 혈관형성에 핵심적일 수 있다. 그러므로, NP-1 길항제는 질병에서 VEGF-의존 혈관형성의 억제에서 응용될 수 있다.

NP-1 길항제는 또한 면역억제에서도 역할을 담당할 수 있다. 그러므로, 이식 전에, 중에 또는 후에 본 발명의 펩티드를 주는 것이 유용할 것이다.

게다가, NP-1 길항제는 종양 세포에서 NP-1에 결합하기 위하여 VEGF와 경쟁하고 NP-1-발현 종양 세포에서 세포의 사멸을 촉진할 것이다. 이것의 잠재적인 응용은 항암 치료법이다.

도 1은 PAE/NP1 세포에 결합하는 ¹²⁵I-VEGF₁₆₅에서 고리화된 VEGF Exon 7-유도된 펩티드(100μM)의 영향을 나타내는 도이다. 특히, 이것은 EG 3287에 의해 뉴로필린-1(NP-1)만을 발현하는 돼지 대동맥 내피세포(PAE)에 결합하는 VEGF 방사선표지된 리간드의 억제, 및 많은 다른 관련된 고리형 펩티드의 영향이 없음을 나타낸다. F9 및 F10은 동일한 펩티드 제조의 두 분획으로 간주한다.

도 2는 PAE/NP-1 세포에 결합하는 ¹²⁵I-VEGF₁₆₅의 특이적이고, 선별적인 억제를 나타내지만, KDR(PAE/KDR) 또는 Flt-1(PAE/Flt-1) 중 하나를 발현하는 세포, 다른 두 주요 VEGF 수용체에 결합하는 데에는 아무 영향을 나타내지 않는 것을 나타내는 도이다. EG 3287은 또한 NP-1, KDR 및 Flt-1를 발현하는 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)에 결합하는 방사선표지된 VEGF를 억제하고(도 2), VEGF-유도된 KDR 포스포릴화를 억제한다(도 3).

도 3은 EG 3287가 VEGF-유도된 KDR 포스포릴화를 억제하는 것을 나타낸 도이다.

도 4는 펩티드 EG 3287 또한 천연적으로 VEGF에 대한 NP-1 수용체만을 발현하는, 가슴 암종 세포주 MDA-MB-231에 방사선표지된 VEGF의 결합을 억제하는 것을 나타내는 도이다.

하기 실시예는 본 발명을 예증한다.

약자

MBHA, 메틸벤조히드릴아민; Fmoc, 9-플루오레닐메톡시-카르복닐; Ala, 알라닌; Arg, 알지닌; Asn, 아스파라긴; Asp, 아스파르트산; Abu, 아미노부티르산; Cys, 시스테인; Gln, 글루타민; Glu, 글루탐산; Gly, 글리신; His, 히스티딘; Ile, 이소루신; Leu, 루신; Lys, 라이신; Met, 메티오닌; Phe, 페닐알라닌; Pro, 프롤린; Ser, 세린; Thr, 트레오닌; Trp, 트립토판; Tyr, 티로신; Val, 발린; Pbf, 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조퓨란-5-술포닐; Pmc, 2,2,5,7,8-펜타메틸클로만-6-술포닐; Trt, 트리틸; tBu, tert-부틸; Boc, 부톡시카르보닐; Pybop, 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트; NMM, N-메틸모르폴린; DCM, 디클로로메탄; DMF, 디메틸포름알데히드; TBME, t-부틸 메틸 에테르; TFA, 트리플루오로아세트산; HPLC, 고성능 액체 크로마토그래피; LC-MS, 액체 크로마토그래피 질량 분광계; Å, 옹스트롬; AAA, 아미노산 분석; DMSO, 디메틸 술폭시드; VEGF, 혈관 내피 성장 인자.

소규모 펩티드 합성

도 1에서 나타낸 펩티드는 고체상 접근법을 사용하는 자동화된 AMS 422 Multiple Peptide Synthesiser에서 합성하였다. 고리화하기 위하여 유도체의 Cys 곁사슬의 Rink Amide MBHA 수지 (0.59 및 0.68 m㏖/g 적재) 및 직교(orthogonal)의 보호(Acm, t-Bu)를 이용한 N-Fmoc 전략이 적용되었다. 원하는 펩티드는 25μM 규모로 합성하고 30분의 기초 결합 시간으로 한번에 결합하였다. 수지 및 아미노산 유도체, Fmoc-Ala-OH.H₂0, Fmoc-Arg(Pbf/Pmc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro.H₂O, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH 및 Fmoc-Val-OH는 Calbiochem-Novabiochem UK Ltd. (Nottingham, UK) 또는 Alexis (Nottingham, UK)에서 구입하였다.

각각의 아미노산은 활성 에스테르법을 통하여 결합제로서 Pybop(Calbiochem-Novabiochem) 및 NMM(Rathburn Chemicals, Walkerburn, UK)을 적용하여, C-말단에서 N-말단으로 펩티드 사슬이 성장하도록 순차적으로 결합된다. N-Fmoc 보호기는 DMF (Rathburn Chemicals, Waklkerburn, Scotland) 중 20% 피페리딘으로 제거된 다음, 순차적으로 DMF 및 DCM으로 세척하였다. 자동 아세틸화는 Rink-Amide-MBHA 수지의 치환(substitution)에 기초한 4배 과량의 아세트산(0.7몰, Rathburn Chemicals, Winterburn Scotland)으로 각 펩티드의 합성 후 수행된다. 결합제, Pybop, NMM 및 모든 아미노산 유도체는 아미노산 Fmoc-His(Trt)-OH 및 Fmoc-Phe-OH를 제외한 DMF(0.7M, Rink-Amide-MBHA-수지) 중에 용해하였다. 이들 보호된 아미노산 유도체는 N-메틸피롤리돈 중에 용해하였다. 사용된 모든 용매는 HPLC-등급의 품질이었다. 펩티드는 생성된 반응성 양이온의 제거제(scavenger)로서 5% 티오아니솔, 2.5% 물 및 2.5% 에탄디티올의 존재 하에서 실온에서 3시간 동안 90% TFA를 사용하여 동시적인 탈보호로 수지로부터 균열되었다. 상기 균열 혼합물은 여과되고 얼음-냉각된 TBME에서 침전된다. 잔류된 수지는 한번 균열제로 세척되고, 여과되고 이전의 분획(fraction)과 혼합되었다. 침전물은 원심분리후 수집되고, 얼음-냉각된 TBME로 세번 세척되고, 실온에서 하룻밤동안 건조되었다. 조(crude) 펩티드는 15% 수용성 아세트산에 용해되고 2일 동안 동결건조하였다(-4℃, 6mbar).

정제 및 특성화

조 펩티드는 분석 역상 컬럼(컬럼 Alltech Hypersil PEP 역상 컬럼, 100Å, C8, 5μ(250×4.6㎜) 20분 중 0% →50% 아세트니트릴)을 사용하는 Hewlett-Packard HPLC 기기, 모델 1100과 함께 Micromass의 Quattro LC Mass Spectrometer에서 분석 LC-MS로 분석하였다. 분리는 1㎖/분의 유속으로 아미드 결합 흡수로서 215㎚의 파장에서 관측되었다. 조 펩티드는 제조용 역상 HPLC(Gilson)에 의해 정제되고, 215㎚에서 관측되고, 20㎖/분의 유속으로 용출되었다. 조 펩티드의 LC-MS 분석을 위한 지정된 바와 같은 동일한 이동상이 사용되었다. 조 펩티드는 Alltech Hypersil PEP 역상 컬럼, 100Å, C8, 8μ (250×22㎜)을 사용하여 정제하였다. 그것들은 20분 내에 0% →50% 아세트니트릴로 용출하였다. 유사물(analogue)는 고성능 액체 크로마토그래피(LC-MS)를 사용하여 95%이상의 순도를 갖고, 예상된 아미노산 분석되었다.

다양한 다른 농도구배는 215㎚에서 관측되는 펩티드의 용츨에 대하여 적용되었다. 유기상, 아세토니트릴 및 수성상은 모두 0.1% TFA 및 3% 1-프로판올을 함유한다. 농도구배 및 유속은 아래에 기재되었다. 상기 퍼센트는 유기상의 비율을 나타낸다. 20분내 0%→50%, 1㎖/분의 유속.

선형 SEQ ID NO.2의 대규모 합성

SEQ ID NO.2는 Fmoc-Arg(Pbf)-p-알콕시벤질 알콜 수지(0.59m㏖/g 적재)를 사용하여 자동화된 단일 고체상 접근법(Applied Biosystems 433A peptide Synthesiser)로 합성하였다. 아미노산은 21분의 단일 결합시간을 가진 Fastmoc™ chemistry를 사용하여 0.25m㏖ 스케일로 Fmoc 전략에 의해 첩부하였다. 수지 및 아미노산 유도체, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH (위치 9 및 23), Fmoc-Cys(Acm)-OH (위치 2 및 21), Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH 및 Fmoc-Tyr(tBu)-OH는 Bachem AG, Bubendorf, Switzerland에서 구입하였다. 각각의 아미노산은 결합제로서 DMF 중 0.45M 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU)/1-히드록시벤조트리아졸(HOBt) (Applied Biosystems, Warrington, UK) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA, Fisher Chemicals, Loughborough, UK)을 적용하여 C-말단에서 N-말단으로 성장하는 펩티드 사슬에 순차적으로 첨가되었다. N-Fmoc 보호기는 N-메틸피롤리돈 (NMP, M56 Chemicals, Runcorn, UK) 중 20% 피페리딘(Romil, Cambridge, UK)으로 제거하고, 이어서 NMP로 세척하였다. 결합제, HBTU/HOBt는 3.6배의 과량(0.9m㏖)이고 모든 아미노산은 4배의 과량(1.0m㏖)이었다. 사용된 모든 용매는 HPLC-등급의 품질이었다.

선형 Ac-SEQ ID NO.2의 합성

SEQ ID NO.2는 Fmoc-Arg(Pbf)-p-알콕시벤질 알콜 수지(0.59m㏖/g 적재)를 사용하여 자동화된 다중 고체상 접근법(Rainin Symphony multiple peptide synthesiser)으로 합성하였다. 아미노산은 20분의 단일 결합시간을 가진 Fmoc chemistry를 사용하여 0.2m㏖ 스케일로(펩티드 3) Fmoc 전략에 의하여 첩부하였다. 수지 및 아미노산 유도체, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH (펩티드 3 위치 9 및 23), Fmoc-Cys(Acm)-OH (펩티드 3 위치 2 및 21), Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH 및 Fmoc-Tyr(tBu)-OH는 Bachem AG, Bubendorf, Switzerland에서 구입하였다. 각각의 아미노산은 결합제로서 DMF 중 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU, Severn Biotech Ltd, Kidderminster, UK) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA, Fisher Chemicals, Loughborough, UK)을 적용하여 C-말단에서 N-말단으로 성장하는 펩티드 사슬에 순차적으로 첨가되었다. N-Fmoc 보호기는 N-메틸피롤리돈 (NMP, M56 Chemicals, Runcorn, UK) 중 20% 피페리딘(Romil, Cambridge, UK)으로 제거하고, 이어서 NMP로 세척하였다. 결합제, TBTU(4배의 과량)은 DMF(Apollo Scientific, Stockport UK)에 용해하고, 모든 아미노산 유도체(4배의 과량) 및 DIEA(8배의 과량)은 NMP에 용해하였다. 자동 N-말단 아세틸화는 과량의 아세트 무수물/루티딘/DMF/DCM (2:1:9:8)의 캡핑(capping) 혼합물을 사용하여 합성(펩티드 3) 후 수행하였다. 사용된 모든 용매는 HPLC-등급의 품질이었다.

선형 Ac-SEQ ID NO.2-NH ₂ 의 합성

SEQ ID NO.2-NH₂는 트리시클릭 아미드 연결체(linker) 수지(0.63m㏖/g 적재)를 사용하여 반-자동화된 단일 고체상 접근법(Labortec AG SP4000 peptide Synthesiser)로 합성하였다. 아미노산은 60분의 단일 결합시간을 가진 Fmoc chemistry를 사용하여 4m㏖ 스케일로 Fmoc 전략에 의하여 첩부하였다. 각 결합 단계의 완료는 Kaiser colour test를 사용하여 관측하였다. 수지 및 아미노산 유도체, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH (위치 9 및 23), Fmoc-Cys(Acm)-OH (위치 2 및 21), Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH 및 Fmoc-Tyr(tBu)-OH는 Bachem AG, Bubendorf, Switzerland에서 구입하였다. 각각의 아미노산은 결합제로서 DMF 중 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU, Severn Biotech Ltd, Kidderminster, UK) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA, Fisher Chemicals, Loughborough, UK)을 적용하여 C-말단에서 N-말단으로 성장하는 펩티드 사슬에 순차적으로 첨가되었다. N-Fmoc 보호기는 DMF 중 20% 피페리딘(Romil, Cambridge, UK)으로 제거하고, 이어서 DMF 및 프로판-2-올로 세척하였다. 결합제, TBTU, 모든 아미노산 유도체(3배의 과량) 및 DIEA(6배의 과량)은 DMF에 용해하였다. N-말단 아세틸화는 과량의 아세트 무수물/루티딘/DMF/DCM (2:1:9:8)의 캡핑(capping) 혼합물을 사용하여 합성(펩티드 3) 후 수행하였다. 사용된 모든 용매는 HPLC-등급의 품질이었다.

펩티드 절단

펩티드는 5% 티오아니솔, 5% 물, 2.5% 에탄디티올 및 6%(w/v) 페놀의 존재 하에서 실온에서 3시간 동안 82.5% TFA를 사용하는 동시 탈보호화로 수지로부터 절단시켰다. 절단 혼합물은 여과시키고 얼음-냉각된 디에틸 에테르에서 침천시켰다. 남은 수지는 TFA로 한번 세척하고, 여과하고, 이전의 분획과 혼합하였다. 침전물은 4℃에서 하룻밤 동안 저장하고, 여과하여 수집하고, 얼음-냉각된 디에틸 에테르로 세척하고, 실온에서 건조하였다. 조 펩티드는 TFA/아세트니트릴/물에 용해시키고, 하룻밤 동안 동결건조시켰다(-50℃, 6mbar).

조 펩티드의 특성화

펩티드는 분석용 C-18 컬럼 (Vydac 218TP54, 250×4.6㎜, 5㎛ 입자크기 및 300Å 기공 크기) 및 1㎖/분의 유속에서 40분이상 B에 대한 0-100%의 선형 AB 농도구배를 사용하여 역상 HPLC(Gilson)으로 특성화하였고, 여기서 용출액 A는 60% CH₃CN/물 중 0.1% TFA/물 및 용출액 B은 0.1% TFA이었다. 질량은 MALDI-MS를 사용하여 확인하고, Ellman's colour test는 응용가능한 자유 술피드릴기의 존재를 확인하였다.

두 고리성 펩티드의 생산

조 선형 전구체는 최소한의 TFA에 용해되고, 물로 2ℓ/0.25m㏖이 되도록 희석되었다. 첫 번째 이황화 결합은 K₃Fe(CN)₆을 사용하여 비보호된 Cys 잔기 사이에서 형성되었다. 펩티드 용액은 수성 암모늄 히드록시드로 pH 7.5로 조정하였다. 이 용액에, 엷은 노란색이 남을 때까지, 0.01M K₃Fe(CN)₆을 한 방울씩 적가하였다. 반응은 완료는 산성화 후 HPLC 표본화로 확인하였다. 용액의 pH는 50% 수용성 아세트산을 사용하여 4가 되도록 조정하였다. 조 반응 혼합물은 Bio-Rex 70 약한 음이온-교환 수지(BioRad, CA)로 하룻밤 동안 교반하고 유리 컬럼으로 충전하였다. 물로 철처하게 세척한 후, 펩티드는 50% 수용성 아세트산으로 용출되고 닌히드린을 사용하여 TLC로 탐지하였다. 닌히드린 양성 분획을 합하여 동결건조하였다. 조 재료는 제조용 역상 HPLC를 통해 정제된다. 두 번째 이황화 결합은 Cys(Acm) 보호기 사이의 I₂-산화를 통해 형성된다. 10% 수용성 TFA에서 펩티드 용액(5㎎/㎖)은 8당량의 요오드(iodine)와 격렬하게 혼합된다. 반응 코스는 HPLC 표본화를 사용하여 이어진다. 반응의 완료에서(일반적으로 0.5시간 후), 과량의 요오드는 1M 아스코르브산을 사용하여 종결한다. 반응 혼합물은 용출액 A로 2배 희석되고, 0.45㎛ 일회용 여과기로 여과하고 제조용 역상 HPLC로 직접적으로 정제하였다. 적절한 분획을 수집하고, 증발시키고, 동결건조시키고, 4℃에서 유지시켰다.

본 발명의 세 개의 펩티드를 얻었다. 그것들은 하기 EG 3287(SEQ ID NO.2의 두 고리 형태), EG 3307(Ac-SEQ ID NO.2의 두 고리 형태) 및 EG 3315(Ac-SEQ ID NO.2-NH2의 두 고리 형태)로 간주된다.

전체 품질 조절은 모든 정제된 재료에서 수행하였다. 펩티드는 두 개의 완충용액 시스템(TFA 및 TEAP)에서 HPLC로 95%이상의 순도를 보인다. 산 가수분해 후의 아미노산 분석(Beckman 6300)은 아미노산 조성을 확인한다. MALDI-MS(Kratos Kompat Probe)은 예상된 분자 이온을 나타냈다. Ellman's colour test는 단고리 또는 두 고리 펩티드에서 자유 술피드릴기의 부재를 확인하는 데 사용되었다.

KDR 포스포릴화 검사

세포는 10, 30 및 100mM에서 15분 동안 펩티드로 예비처리하고, 10분 동안 25ng/㎖ VEGF로 처리하고, 세포는 용해 완충용액(64mM Tris-HCl, pH 6.8, 0.2mM Na₃VO₄, 2% SDS, 10% 글리세롤, 0.1mM AEBSF, 5㎎/㎖ 류펩틴)으로 즉시 추출된다. KDR 포스포릴화는 Tyrosine 1054 및 1059(Oncogene Research products Inc.에서 구 입한)에서 포스포릴화된 KDR 또는 총 KDR(Santa Cruz Inc.에서 구입한) 중 하나를 인식하는 항체로 세포 추출물을 이뮤노블라팅(immunoblotting)하는 것으로 결정된다. 면역반응성 띠(band)는 호스레디쉬 퍼옥시아제-연계 항-토끼 IgG 및 ECL 시약을 사용하여 화학냉광으로 시각화된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

두 고리 형태의, 아미노산 서열 SCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR 또는 실질적으로 NP-1 길항제 활성을 보유하는 이의 단편을 갖는 펩티드.
삭제
제 1항에 있어서, 치료적인 용도의 펩티드.
제 1항에 따른 펩티드를 포함하는 신경 회복 자극용 약제.
제 1항에 따른 펩티드를 포함하는 신경퇴화 치료용 약제.
제 1항에 따른 펩티드를 포함하는 항암 치료용 약제.