KR101467453B1 - 에프지에프２ 결합 펩타이드 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PTX3, 특히 PTX3(82-110) 부위에 걸쳐있는 PTX3의 N-말단 부위로부터 출발하도록 고안된 FGF2-결합 펩타이드를 개시한다. 상기 서열과 관련된 합성 펩타이드는 FGF2에 결합할 수 있고 선천적인 면역성에 예상되는 영향 없이 시험관 내 및 생체 내에서 그의 혈관형성 전 활성을 억제할 수 있다.
PTX3, 혈관형성 전 활성 억제

Description

에프지에프２ 결합 펩타이드 및 그의 용도{FGF2-BINDING PEPTIDES AND USES THEREOF}
본 발명은 FGF2에 결합할 수 있고 선천적인 면역성에 예상되는 영향 없이 시험관 내 및 생체 내에서 혈관형성 전 활성을 억제할 수 있는 섬유아세포 성장 인자-2 (FGF2)-결합 펩타이드에 관한 것이다.
펜트락신은 오량체 구조를 특징으로 하는 단백질의 상과이다1. 전통적인 짧은-펜트락신 C-반응성 단백질(CRP) 및 혈청 아밀로이드 P 성분(SAP)은 각각 인간 및 마우스에서 염증 매개체에 반응하여 간에서 생성되는 급성기 단백질이다2 ,3. 펜트락신은 다양한 리간드에 결합하며 세균에 대한 선천적인 내성 및 세포 찌꺼기 및 세포 외 기질 성분들의 제거에 연루된다1 ,4-6.
긴-펜트락신은 펜트락신 유사 C-말단 도메인에 커플링된 관련되지 않은 N-말단 도메인을 특징으로 한다7. 원형 긴-펜트락신 PTX3은 10 내지 20 머 다량체로 주로 조립되는 45 kD 글리코실화된 단백질이다10. PTX3은 주요 염증 신호에 반응하여, 상이한 세포 유형들에 의해, 특히 단핵성 식세포, 수지상 세포 및 내피 세포에 의해 국소적으로 생성되고 방출된다11. ptx3-/- 마우스에서의 연구는 상기 분자가 히아루론산-풍부 세포 외 기질의 조립에서부터 여성 불임 및 다양한 미생물에 대한 선천적인 면역성에 이르는 범위의, 중복되지 않은 복잡한 생체 내 기능들을 수행함을 입증하였다12 ,13. 이는 적어도 부분적으로, 고 친화성 보체 성분 C1q, 세포 외 기질 단백질 TSG6 및 선택된 미생물과 결합하여 보체 활성화를 활성화시키고 대식세포 및 수지상 세포에 의한 병원체 인식을 촉진시키는 PTX3의 능력과 관련이 있다1,14. 따라서, PTX3은 다양한 병태생리학 상태에서 독특한 중복되지 않은 기능들을 갖는 용해성 패턴 인식 수용체이다1 ,14.
섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2)는 고 친화성 타이로신-키나제 수용체(FGFR)와의 상호작용에 의해, 배양된 내피세포에서 세포 증식, 주화성 및 프로테아제 생산을 유도하는 헤파린-결합 성장 인자이다15. FGF2는 생체 내에서 혈관형성을 유도하며 상처 치유, 염증, 동맥경화증, 및 종양 성장 중의 혈관신생을 조절한다16. 여러 분자들이 세포 외 환경에서 FGF2를 격리시키며, 따라서 내피 세포 FGFR과의 상호작용을 방지하고 그의 혈관형성 활성을 억제한다(16에서 고찰됨). 이들 억제제 중 다수는 국소적으로 및/또는 전신적으로 생성/방출되며, 따라서 이는 상기 혈관형성 과정의 복잡한 조율에 기초가 된다.
긴 PTX3은 FGF2에 고도의 친화성 및 특이성으로 결합한다. 따라서, 긴 PTX3 은 시험관 내 FGF2-의존성 내피 세포 증식 및 생체 내 혈관형성을 억제한다17. 또한, 전체 PTX3은 FGF2-의존성 평활근 세포 활성화 및 동맥 손상 후 초기 후박화를 억제한다1 8. 따라서, PTX3은 상기 두 단백질의 공 발현을 특징으로 하는 상이한 병리 환경, 예를 들어 염증, 상처 치유, 동맥경화증 및 종양에서 FGF2 활성의 조절에 기여한다. 그러나 상기와 같은 큰 분자를 사용하지 않고 상기 단백질의 다른 활성들을 사용하지 않는 상기 단백질의 치료 용도는 개시되어 있지 않다. 실제로, PTX3은 C-말단 펜트락신 도메인을 통해 C1q에 결합한다10.
현재, 상기 PTX3 N-말단에 기인한다고 생각되는 생물학적 작용들은 없었다. 이를 토대로, 저자들은 FGF2와 상호작용하는 PTX3 N-말단의 능력을 조사하였다.
상기 PTX3N-말단 단편(1-178)을 과발현하는 레트로바이러스 유전자도입된 내피세포가 FGF2에 반응하여 감소된 분열촉진 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 정제된 재조합 PTX3(1-178)은 FGF2와 결합하고 PTX3/FGF2 상호작용을 방지한다. 또한, PTX3(87-99) 에피토프를 인식하는 단클론 항체 mAb-MNB4는 FGF2/PTX3 상호작용을 방지하고 PTX3의 FGF2 길항물질 활성을 완전히 파괴한다. 놀랍게도 저자들은 매우 짧은 펩타이드들이 상기와 같은 활성을 유지하고 치료 약물로서 유용함을 발견하였다. 일관되게, 합성 펩타이드 PTX3(82-110), PTX3(97-110), PTX3(97-107) 및 PTX3(100-104)은 FGF2와 결합하며 FGF2와, BIA코어 센서칩에 고정화된 전체 긴 PTX3과의 상호작용, FGF2-의존성 내피 세포 증식 및 생체 내 혈관형성을 억제한다. 따라서, 상기 데이터는 PTX3(97-110) 부위에 걸쳐있는 PTX3의 N-말단 연장부 중의 매우 짧은 FGF2-결합 도메인을 동정할 수 있게 한다. 상기 서열과 관련된 합성 펩타이드는 FGF2와 결합하고 선천적인 면역성에 예상된 영향 없이 시험관 내 및 생체 내에서 그의 혈관형성 전 활성을 억제할 수 있다.
따라서 본 발명의 주목적은 하기 화학식 I의 FGF2-결합 펩타이드; 그의 작용성 유도체, 전구체 또는 약학적으로 허용 가능한 염이다:
R1-Ala-X1-Pro-X2-Ala-R2
상기 식에서,
X1은 Arg 및 Lys 중에서 선택된 아미노산이고;
X2는 Cys 및 Thr 중에서 선택된 아미노산이고;
R1은 존재하지 않거나 서열식별번호:1 및 서열식별번호: 3 중에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;
R2는 존재하지 않거나 서열식별번호:2 및 서열식별번호: 4 중에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;
R1이 존재하지 않을 때, 또한 R2도 존재하지 않고; R1이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열일 때, R2는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열이고; R1이 서열식별번호: 3의 아미노산 서열일 때, R2는 서열식별번호: 2 및 서열식별번호: 4 중에서 선 택된 아미노산 서열이다.
바람직하게는, X1은 Arg이다. 보다 바람직하게는 X2는 Cys이다. 훨씬 더 바람직하게는 상기 펩타이드는 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7 및 서열식별번호: 10 중에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 추가의 목적은 화학식 I의 펩타이드 또는 그의 작용성 유도체를 포함하는 접합된 키메릭 펩타이드이다.
"펩타이드"란 용어는 통상적으로 4 내지 100 개 이상의 연속적인 아미노산, 대개는 5 내지 20 개의 연속적인 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드 쇄에 적용된다.
"작용성"이란 용어는 FGF2의 생물 활성을 크게 감소시킬 수 있는 FGF2-결합 성질을 나타내는 펩타이드를 정의한다. FGF2의 생물 활성은 분열촉진 및 혈관형성 효과를 포함한다. 특히, 본 발명의 펩타이드는 내피 세포 또는 평활근 세포의 FGF2-유도된 증식을 억제할 수 있다.
"전구체"는 세포 또는 신체에 투여 전 또는 투여 후에 대사 및 효소 과정에 의해 본 발명의 화합물로 전환될 수 있는 화합물이다.
본 발명에서 "염"이란 용어는 본 발명의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 그의 동족체의 카복실 그룹의 염 및 아미노 그룹의 산 부가염 모두를 지칭한다. 카복실 그룹의 염은 당해 분야에 공지된 수단에 의해 형성될 수 있으며, 무기염, 예를 들어 나트륨, 칼슘, 암모늄, 철 또는 아연 염 등, 및 유기 염기와의 염, 예를 들어 아민, 예를 들어 트라이에탄올아민, 아르기닌 또는 리신, 피페리딘, 프로카인 등에 의해 형성된 염을 포함한다. 산 부가염은 예를 들어 무기산, 예를 들어 염산 또는 황산과의 염, 및 유기산, 예를 들어 아세트산 또는 옥살산과의 염을 포함한다. 상기와 같은 염들 중 임의의 염은 본 발명의 펩타이드 및 폴리펩타이드, 또는 이들의 동족체와 실질적으로 유사한 활성을 가져야 한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "유도체"란 용어는 공지된 방법에 따라 상기 아미노산 부분의 측쇄 또는 N-/또는 C-말단 그룹상에 존재하는 작용성 그룹들로부터 제조될 수 있는 유도체를 지칭한다. 상기와 같은 유도체는 예를 들어 카복실 그룹의 에스터 또는 지방족 아미드 및 유리 아미노 그룹의 N-아실 유도체 또는 유리 하이드록실-그룹의 O-아실 유도체를 포함하고 아실-그룹, 예를 들어 알카노일- 또는 아로일-그룹과 형성된다. 본 발명은 또한 이미 개시한 펩타이드의 펩타이드 유사물질을 포함하며, 이때 상기 펩타이드의 성질은 아미노산 쇄, 아미노산 키랄성 및/또는 펩타이드 주쇄의 수준에서 화학적으로 개질되었다. 이러한 변경은 유사한(개선되지 않은 경우) 치료, 진단 및/또는 약동학 성질을 갖는 FGF2-결합제를 제공하고자 한다.
예를 들어, 상기 펩타이드가 환자에의 주입에 이어 펩티다제에 의해 절단되는 경향이 있는 경우, 비-절단성 펩타이드 유사물질에 의한 특히 민감한 펩타이드 결합의 치환은 보다 안정하고 따라서 치료제로서 보다 작용성인 펩타이드를 제공할 수 있다. 유사하게, L-아미노산 잔기의 치환은 상기 펩타이드를 단백질 분해에 덜 민감하게 하고 최종적으로 펩타이드 이외의 유기 화합물과 보다 유사하게 만드는 표준 방식이다. 또한 아미노-말단 차단 그룹, 예를 들어 t-부틸옥시카보닐, 아세틸, 숙시닐, 메톡시숙시닐, 수베릴, 아디필, 아젤라일, 단실, 벤질옥시카보닐, 플루오레닐메톡시카보닐, 메톡시아젤라일, 메톡시아디필, 메톡시수베릴 및 2,4-다이나이트로페닐이 유용하다. 증가된 효능, 연장된 활성, 정제의 용이성 및/또는 증가된 반감기를 제공하는 다수의 다른 개질들이 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명 펩타이드의 성질을 돌연변이 펩타이드에서 유지시키거나 심지어 강화시킬 수 있다. 돌연변이 펩타이드는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적으로 치환되었으나, 당해 분야에 공지되거나 하기 실시예에 개시된 수단에 의해 측정 시, 동등하거나 또는 훨씬 더 높은 수준에서 본 발명을 특성화하는 동일한 생물 활성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따라, 상기 돌연변이 펩타이드에서 바람직한 변화는 "보존적" 또는 "안전성" 치환으로서 통상적으로 공지된다. 보존적 아미노산 치환은 상기 분자의 구조 및 생물학적 작용을 보존하기 위해서 충분히 유사한 화학적 성질들을 갖는 아미노산에 의한 치환이다. 상기 문헌은 보존적 아미노산 치환의 선택을 천연 단백질의 서열 및/또는 구조에 대한 통계학적 및 물리화학적 연구를 토대로 수행할 수 있는 다수의 모델들을 제공한다.
돌연변이 펩타이드는 DNA를 암호화하는 통상적인 부위 지향성 돌연변이 기법, DNA 서열의 암호화(예를 들어 DNA 셔플링, 파지 디스플레이/선별) 또는 아미노산 수준의 조합 기술, 컴퓨터 지원된 디자인 연구, 또는 그의 적합한 임의의 다른 공지된 기법으로부터 생성될 수 있으며, 상기 기법들은 종래 기술 및 본 특허 출원 의 실시예에 제공된 교시를 사용하여 당해 분야의 통상적인 숙견가에 의해 통상적으로 수득되고 시험될 수 있는 실질적으로 상응하는 돌연변이된 펩타이드의 한정된 세트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 화학식 I의 펩타이드 또는 그의 작용성 유도체를 포함하는 융합된 키메릭 펩타이드이다. 융합되는 FGF2-결합 펩타이드 및/또는 키메릭 펩타이드는 화학식 I의 펩타이드 또는 상기 정의한 바와 같은 그의 돌연변이체/유도체 중 어느 하나의 아미노산 서열, 및 PTX3 이외의 단백질 서열에 속하는 아미노산 서열을 포함하여 FGF2-결합 활성의 상당한 손상 없이 추가적인 성질들을 제공한다.
융합 및/또는 키메릭 단백질 중에 포함될 수 있는 추가의 단백질 서열을 막-결합된 서열, 막-결합된 단백질의 세포 외 부위, 면역글로불린 불변 부위, 다량체화 도메인, 세포 외 단백질, 신호 펩타이드 함유 단백질, 방출 신호 함유 단백질 중에서 선택할 수 있다.
상기 융합 및/또는 키메릭 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 의해 나타나는 추가의 성질들은 보다 용이한 정제 능력, 보다 오래 지속되는 체액 중 반감기, 또는 세포 외 국소화이다. 상기 후자의 특징은 상기가 본 발명의 펩타이드를, 상기 펩타이드의 단리 및 정제를 용이하게 할 뿐만 아니라 또한 PTX3 및 FGF2가 천연적으로 상호작용하는 공간에 국소화되게 하므로 상기 정의에 포함된 융합 또는 키메릭 단백질의 특정 그룹을 한정하는데 특히 중요하다.
상기 FGF2-결합 펩타이드에 융합되는 서열들 중 하나 이상의 선택은 상기 펩 타이드의 특정 용도에 따라 변한다.
일반적인 과정으로서, 융합 단백질을 통상적인 유전자 공학 기법을 사용하여 상기 단백질을 암호화하는 핵산 단편을 생성시키고 에피솜 또는 불/일치되게 통합된 벡터뿐만 아니라 형질전환-, 감염-, 또는 형질감염-토대 기술을 사용하여 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포를 개질시키는데 사용되는 바이러스 또는 플라스미드 기원의 복제성 벡터에 클로닝시킴으로써 생성시킬 수 있다. 이들 벡터는 상기 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 구성적으로 활성이거나 유도성인 것으로 선택되는 상기 세포 자신의 전사 초기화/종결 조절 서열의 조절 하에 상기 세포 중에 FGF2-결합제를 포함하는 융합 단백질의 발현을 허용해야 한다. 이어서 세포주를 단리하여 안정한 세포주를 제공할 수 있다. 특히, 본 발명의 FGF2-결합제를 발현하도록 개질된 세포를 직접 사용하거나 투여할 때마다, 바람직한 세포는 통상적으로 PTX3을 발현하는 인간 세포이다. 세포외, 방출 신호, 또는 신호-펩타이드 함유 단백질의 서열의 경우에서와 같이 상기 추가적인 단백질 서열이 상기 FGF2-결합 도메인을 상기 세포 외 공간 중에 분비되게 하는 경우, 상기 작용제를 추가의 처리에 비추어 배양된 세포로부터 보다 용이하게 수집하고 정제시킬 수 있거나, 또는 한편으로 상기 세포를 직접 사용하거나 투여할 수 있다.
상기 추가의 단백질이 막-결합된 단백질의 서열의 경우에서와 같이, 상기 세포의 표면상에 상기 FGF2-결합제의 고정화를 허용하는 경우, 상기 작용제는 추가의 처리에 비추어 상기 배양된 세포로부터 덜 용이하게 수거되고 정제될 수 있으나, 상기 작용제가 천연 PTX3의 하나에 상응하는 형태로 제공되어, 가능하게는 그의 성 질을 개선시킬 수 있는 한, 상기 세포를 직접 사용하거나 투여할 수 있다.
본 발명의 FGF2-결합 펩타이드를 또한 본 발명의 펩타이드, 또는 상기 정의한 바와 같은 상응하는 활성 돌연변이의 구조 및/또는 서열을 사용할 수 있게 하는 컴퓨터 지원된 약물 디자인의 방법에 의해 동정할 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 사용하여, 컴퓨터 모델 기술을 사용하여 보다 큰 효능으로, PTX3와 FGF2 간의 상호작용을 연구할 수 있다. 상기와 같은 컴퓨터 지원된 분석을 사용하여 합성 유기 분자 또는 펩타이드(예를 들어 4 내지 20 아미노산 길이)의 형태로 개선된 펩타이드 또는 비 펩타이드 유사 약물을 개발할 수 있다. 일단 상기 화합물을 선별하고 상기가 FGF2와 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌으면, 이어서 세포 또는 동물 모델을 사용하여 그의 용도를 평가할 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 활성 접합체 또는 이종 부분과의 복합체의 형태로 존재할 수 있으며, 상기 부분은 직접 또는 커플링제 또는 링커의 사용을 통해, 공유 결합되거나 결합되지 않은 세포독성제, 표지(예를 들어 비오틴, 형광 표지), 약물 또는 다른 치료제 중에서 선택될 수 있다. 유용한 접합체 또는 복합체를 당해 분야에 공지된 분자 및 방법(방사능 또는 형광 표지, 비오틴, 세포독성제, 약물 또는 다른 치료제)을 사용하여 생성시킬 수 있다. 세포독성제는 화학요법제, 독소(예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소(즉 방사성접합체)를 포함한다. 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 유동 단백질, 다이안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센이 있다. 다양한 방사성핵종들을 방사성접합된 단백질의 제조에 이용할 수 있다. 예로서 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re가 있다.
유용한 접합체 또는 복합체를 또한 약물 전달 효능의 면에서 상기 작용제의 개선을 위해 생성시킬 수 있다. 이를 위해서, 본 발명의 펩타이드는 폴리에틸렌 글리콜 및 다른 천연 또는 합성 중합체와 같은 분자와의 활성 접합체 또는 복합체의 형태로 존재할 수 있다(Harris JM and Chess RB, Nat Rev Drug Discov.(2003), 2(3):214-21; Greenwald RB et al., Adv Drug Deliv Rev.(2003), 55(2):217-50; Pillai O and Panchagnula R, Curr Opin Chem Biol.(2001), 5(4):447-51). 이점에 관해서, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은 화학적으로 개질된 펩타이드(이때 상기 펩타이드는 중합체와 결합된다)를 고려한다. 전형적으로, 상기 중합체는 상기 접합체가 수성 환경, 예를 들어 생리적 환경에서 침전되지 않도록 수용성이다. 치료에 사용되는 접합체는 약학적으로 허용 가능한 수용성 중합체 부분을 포함할 수 있다. 적합한 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 모노메톡시-PEG, 모노-(C1-C10)알콕시-PEG, 아릴옥시-PEG, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)PEG, 트레실 모노메톡시 PEG, PEG 프로피온알데하이드, 비스-숙신이미딜 카보네이트 PEG, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 된 폴리올(예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 덱스트란, 셀룰로스, 또는 다른 탄수화물 기재 중합체를 포함한다. 적합한 PEG는 약 600 내지 약 60,000, 예를 들어 5,000, 12,000, 20,000 및 25,000의 분자량을 가질 수 있다. 접합체는 또한 상기와 같은 수용성 중합체의 혼합물을 포함할 수 있다.
접합체의 예는 본 발명의 펩타이드 및 상기 폴리펩타이드 부분의 N-말단에 결합된 폴리아실 옥사이드 부분을 포함한다. PEG가 하나의 적합한 폴리알킬 옥사이드이다. 예시로서, 본 발명의 펩타이드를 PEG로 개질시킬 수 있다("PEG화"로서 공지된 방법). PEG화를 당해 분야에 공지된 PEG화 반응 중 어느 하나에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어, PEG화를 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행할 수 있다. 또 다른 접근법에서, 접합체를 활성화된 PEG(이때 PEG의 말단 하이드록시 또는 아미노 그룹을 활성화된 링커로 치환시켰다)의 축합에 의해 형성시킨다.
본 발명의 또 다른 목적을, 본 발명의 FGF2-결합 펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기 핵산과 하이브리드화하는 핵산, 변성된 서열을 갖는 핵산으로 나타낸다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 및 발현 벡터로 형질전환된 원핵 또는 진핵 숙주 세포 및 상기로부터 유래된 안정한 세포 주의 발현을 허용하여, 상기 FGF2-결합제(막 표면상에 분비되거나 상기 표면상에서 발현될 수 있다)를 발현하는 상기 바이러스 또는 플라스미드 기원의 발현 벡터를 포함한다. 예로서 인간 B 세포가 있다.
본 발명의 FGF2-결합 펩타이드를, 상기 개시된 숙주 세포를 적합한 배양 배 지에서 배양시키고 상기 FGF2-결합제를 수거하는 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 적합한 벡터 내에 삽입하고 연결시킬 수 있다. 일단 형성되었으면, 상기 발현 벡터를 적합한 숙주 세포 내로 도입시키며, 이어서 상기 세포는 상기 펩타이드를 발현한다.
본 발명에 언급한 바와 같은 본 발명의 임의의 재조합 펩타이드의 발현을 적합한 발현 벡터를 사용하여 진핵 세포(예를 들어 효모, 곤충 또는 포유동물 세포) 또는 원핵 세포에서 수행할 수 있다. 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다.
목적하는 단백질을 발현할 수 있기 위해서, 발현 벡터는 또한 유전자 발현 및 상기 단백질의 생산을 허용하는 방식으로 상기 단백질을 암호화하는 DNA에 결합된 전사 및 번역 조절 정보를 함유하는 특정한 뉴클레오타이드 서열을 포함해야 한다. 먼저, 상기 유전자를 전사하기 위해서, RNA 폴리머라제에 의해 인식될 수 있는 프로모터가 선행되어야 하며, 여기에 상기 폴리머라제가 결합되고 따라서 전사 과정이 개시된다.
상이한 효율로 작용하는, 사용 중인 다양한 상기와 같은 프로모터들(강 및 약 프로모터)이 존재한다.
진핵 숙주의 경우, 상기 숙주의 성질에 따라 상이한 전사 및 번역 조절 서열들을 사용할 수 있다. 상기 숙주는 바이러스 공급원, 예를 들어 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스, 유인원 바이러스 등으로부터 유래할 수 있으며, 이때 조절 신호들은 높은 수준의 발현을 갖는 특정 유전자와 관련이 있다. 예로는 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터, SV40 초기 프로모터, 효모 gal4 유전자 프로모터 등이 있다. 억제 및 활성화를 허용하고, 따라서 상기 유전자의 발현을 조절할 수 있는 전사 개시 조절 신호를 선택할 수 있다.
본 발명의 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 작용적으로 연결된 전사 및 번역 조절 신호(목적하는 유전자 서열을 상기 숙주 세포에 통합시킬 수 있다)를 갖는 벡터(들)내에 삽입시킨다.
상기 도입된 DNA에 의해 안정하게 형질전환된 세포를 또한 상기 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 마커를 도입시킴으로써 선택할 수 있다. 상기 마커는 또한 영양요구성 숙주에 포토트로피, 살생물제 내성, 예를 들어 항생제, 또는 중금속, 예를 들어 구리 등을 제공할 수 있다. 상기 선택성 마커 유전자를, 발현시킬 DNA 유전자 서열에 직접 결합시키거나, 또는 공-형질감염에 의해 동일 세포 내에 도입시킬 수 있다.
상기 벡터의 추가적인 요소들, 즉 상기 벡터를 함유하는 수용 세포를 인식할 수 있고 상기 벡터를 함유하지 않는 수용 세포들로부터 선택할 수 있는 용이성; 특정 숙주에서 목적하는 상기 벡터의 사본 수; 및 상이한 종들의 숙주 세포들 사이에서 상기 벡터가 "왕복"할 수 있는 것이 바람직한 지의 여부는 또한 본 발명의 단백질의 최적 생산을 획득하는데, 특히 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 함유하는 특정 세포를 선택하는데 유용할 수 있다.
일단 상기 구조물(들)을 함유하는 벡터(들) 또는 DNA 서열이 발현을 위해 제조되었으면, 상기 DNA 구조물을 임의의 다양한 적합한 수단들, 즉 형질전환, 형질 감염, 접합, 원형질체 융합, 일렉트로포레이션, 칼슘 포스페이트-침전, 직접적인 미세주입 등에 의해 적합한 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있다.
숙주 세포는 원핵 또는 진핵일 수 있다. 진핵 숙주, 예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 인간, 원숭이, 마우스 및 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포가 바람직한데, 그 이유는 이들이 정확한 부위에 정확한 폴딩 또는 글리코실화를 포함하여 단백질 분자에 번역 후 변경을 제공하기 때문이다. 또한 효모 세포는 글리코실화를 포함한 번역 후 펩타이드 변경을 수행할 수 있다. 강한 프로모터 서열을 사용하고 효모에서 목적하는 단백질의 생산을 위해 사용될 수 있는 높은 사본 수의 플라스미드를 사용하는 다수의 재조합 DNA 전략들이 존재한다. 효모는 클로닝된 포유동물 유전자 산물 상의 리더 서열을 인식하고 리더 서열(즉 예비-펩타이드)을 갖는 펩타이드를 분비한다.
상기 벡터(들)의 도입 후에, 상기 숙주 세포를, 벡터 함유 세포의 성장을 선별하는 선택성 배지에서 증식시킨다. 상기 클로닝된 유전자 서열(들)이 발현된 결과 목적하는 단백질들이 생성된다.
다수의 평론 및 문헌들, 예를 들어 문헌["A Practical Approach" published by Oxford University Press, "DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001]은 벡터 및 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 사용하여 재조합 단백질을 클로닝 및 생성시키는 방법에 대한 교시를 제공한다.
본 발명의 FGF2-결합제(펩타이드 또는 펩타이드 유사물의 형태일 때)를 제조 하는데 보다 많이 지시되는 화학 합성 기술의 예는 고상 합성 및 액상 합성이다. 고상 합성으로서, 예를 들어 합성할 펩타이드의 C-말단에 상응하는 아미노산을 유기 용매에 불용성인 지지체에 결합시키고, 반응들의 교번 반복에 의해, 적합한 보호 그룹으로 보호된 측쇄 작용기 및 아미노 그룹을 갖는 아미노산들을 C-말단에서부터 N-말단으로의 순서로 하나씩 축합시키는 것과, 상기 펩타이드의 아미노 그룹의 보호 그룹 또는 수지에 결합된 아미노산을 방출시키는 것이 있으며, 따라서 상기 펩타이드 쇄가 상기 방식으로 연장된다.
고상 합성 방법은 사용되는 보호 그룹의 유형에 따라 크게 tBoc 방법과 Fmoc 방법으로 분류된다. 전형적으로 사용되는 보호 그룹은 아미노 그룹의 경우, tBoc(t-부톡시카보닐), Cl-Z(2-클로로벤질옥시카보닐), Br-Z(2-브로모벤질옥시카보닐), Bzl(벤질), Fmoc(9-플루오레닐메톡시카보닐), Mbh(4,4'-다이메톡시다이벤즈하이드릴), Mtr(4-메톡시-2,3,6-트라이메틸벤젠설포닐), Trt(트리틸), Tos(토실), Z(벤질옥시카보닐) 및 Cl2-Bzl(2,6-다이클로로벤질); 구아니디노 그룹의 경우 NO2(나이트로) 및 Pmc(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐); 및 하이드록실 그룹의 경우 tBu(t-부틸)를 포함한다. 목적하는 펩타이드의 합성 후에, 상기에 탈보호 반응을 가하고 상기 고체 지지체로부터 절단시킨다. 상기와 같은 펩타이드 절단 반응은 Boc 방법의 경우 수소 플루오라이드 또는 트라이-플루오로메탄 설폰산을 사용하여 수행하고, Fmoc 방법의 경우 TFA를 사용하여 수행할 수 있다.
재조합 DNA 또는 화학 합성 기술에 의해 수득된 FGF2-결합제에 최종적으로 하나 이상의 정제 단계를 가한다. 정제를 상기 목적에 대해 공지된 방법들 중 임의의 한 방법, 즉 추출, 침전, 크로마토그래피, 전기영동 등을 포함한 임의의 통상적인 과정에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어, HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)를 사용할 수 있다. 용출을 단백질 정제에 통상적으로 사용되는 수-아세토나이트릴-기재 용매를 사용하여 수행할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 FGF2-결합제의 정제된 제제를 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 정제된 제제는 본 발명 화합물의 1 건조중량% 이상, 바람직하게는 5 건조중량% 이상인 제제를 지칭한다.
상술한 본 발명의 화합물(단백질, 펩타이드, 유기 화합물)을 약제로서, 바람직하게는 변경된 혈관형성에 의해 발생한 질병의 억제제로서 사용할 수 있다. 질병억제가 발생하였다. 보다 특히 상기 변경된 혈관형성은 성장 인자 FGF2의 변경된 활성화에 의해 유발된다. 훨씬 더 바람직하게는 상기 질병은 관절염 질병, 종양 전이, 당뇨성 망막병증, 건선, 만성 염증, 동맥경화증 및 종양으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 바람직하게는 상기 종양은 육종, 암종, 악성종양, 골 종양 및 신경내분비 종양의 그룹 중에서 선택된다.
상술한 본 발명의 화합물(단백질, 펩타이드, 유기 화합물)을 섬유아세포 또는 평활근세포의 조절되지 않은 FGF2-의존성 증식, 과도한 섬유아세포 반응에 관련된 반흔형성, 및 혈관성형술 후 재협착과 관련된 질병의 억제제로서 사용할 수 있다.
실제로, 본 발명의 FGF2-결합 펩타이드는 일단 FGF2에 결합되었으면, FGF2의 억제제로서 작용한다. 실제로 상기 펩타이드는 내피 세포 또는 평활근 세포의 FGF2-유도된 증식을 억제할 수 있다. 따라서, 상기와 같은 분자의 치료 가능성은 FGF2의 억제가 유리한 질병의 예방 및/또는 치료이다. 상기 후자의 효과를 또한 FGF2를 발현하는 세포 집단의 감소에 사용할 수 있다.
본 발명의 FGF2-결합 펩타이드를 변경된 혈관형성에 의해 발생한 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물 중에 활성 성분으로서 사용할 수 있으며, 이때 상기 변경된 혈관형성은 FGF2의 변경된 활성화에 의해 유발된다. 상기 질병의 예로는 관절염 질병, 종양 전이, 당뇨성 망막병증, 건선, 만성 염증, 동맥경화증 또는 종양이며, 이때 상기 종양은 육종, 암종, 악성종양, 골 종양 또는 신경내분비 종양이다.
본 발명의 FGF2-결합제를 또한 섬유아세포 또는 평활근 세포의 조절되지 않은 FGF2-의존성 증식, 예를 들어 과도한 섬유아세포 반응에 관련된 반흔형성, 및 혈관성형술 후 재협착증과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물 중의 활성 성분으로서 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 화학식 I의 펩타이드 또는 그의 작용성 유도체 및 적합한 희석제 및/또는 부형제 및/또는 항원보강제, 상기 언급한 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물을 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 안정제 또는 희석제와 함께 제형화할 수 있다. 상기 작용제의 성질에 따라, 상기 약학 조성물은 CD4+ T 세포와 관련된 질병, 예를 들어 자가면역 질병, 염증 또는 감염에 유용할 수 있다.
본 발명의 FGF2-결합 펩타이드를 포함하는 약학 조성물은 상기 화합물이 치 료 유효량, 즉 처리된 동물에서 의학적으로 바람직한 결과를 성취하는데 유효한 양으로 함유된 모든 조성물을 포함한다. 상기 약학 조성물은 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체, 동물에게 투여하기에 적합하고(예를 들어 생리 식염수) 최후에 약제로 사용될 수 있는 상기 활성 화합물의 제제로의 가공을 촉진하는 보조제(부형제, 안정제 또는 희석제와 같은)를 포함하기에 적합한 생물학적으로 상용성인 비히클을 함유할 수 있다.
상기 약학 조성물을 투여 방식의 필요성을 만족시키는데 허용 가능한 임의의 방식으로 제형화할 수 있다. 약물 전달을 위한 생물물질 및 다른 중합체뿐만 아니라 특정한 투여 방식을 유효하게 하기 위한 상이한 기법 및 모델의 사용이 문헌에 개시되어 있다. 혈액-뇌 장벽의 침투를 개선시키기 위한 본 발명 화합물의 변경이 또한 유용할 것이다.
임의의 허용되는 투여 방식을 사용할 수 있으며 이를 당해 분야의 숙련가들에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어 투여는 다양한 비 경구 경로, 예를 들어 피하, 정맥 내, 피 내, 근육 내, 복강 내, 비 내, 경피, 경구, 또는 구강 경로에 의할 수 있다. 비 경구 투여는 일시 주사 또는 시간에 따른 점진적인 관류에 의할 수 있다. 비 경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 유화액을 포함하며, 이들은 당해 분야에 공지된 보조제 또는 부형제를 함유할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 적합한 유성 주사 현탁액으로서 상기 활성 화합물의 현탁액을 투여할 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스터, 예를 들어 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스터, 에를 들어 에틸올리에이트 또는 트라이글리세라이드를 포함한다.
상기 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있는 수성 주사 현탁액은 예를 들어 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨 및/또는 덱스트란을 포함한다. 임의로, 상기 현탁액은 또한 안정제를 함유할 수 있다. 약학 조성물은 주사에 의한 투여에 적합한 용액을 포함하며, 부형제와 함께 약 0.01 내지 99%, 바람직하게는 약 20 내지 75%의 활성 화합물을 함유한다. 직장으로 투여할 수 있는 조성물은 좌약을 포함한다.
투여되는 투여량이 수용자의 연령, 성별, 건강, 및 체중, 동반 치료(존재하는 경우)의 종류, 치료 회수 및 목적하는 효과의 성질에 따라 변할 것임은 물론이다. 투여량을 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되고 결정될 수 있는 바와 같이, 개인 환자에게 맞출 것이다. 각각의 치료에 필요한 전체 용량을 수회 용량 또는 단일 용량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 단독으로 또는 상기 병에 대해 지시되거나 또는 상기 병의 다른 증상에 대해 지시된 다른 치료제와 함께 투여할 수 있다. 대개 활성 성분의 1일 투여량은 체중 킬로그램 당 0.01 내지 100 ㎎이다.
본 발명의 화합물을 상기 환자에게 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어 생리 식염수 중에서 정맥 내로 투여할 수 있다. 펩타이드의 세포 내 전달을 위한 표준 방법, 예를 들어 리포솜을 통한 전달을 사용할 수 있다. 상기와 같은 방법은 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 본 발명의 제형은 비 경 구 투여, 예를 들어 정맥 내, 피하, 근육 내 및 복강 내 투여에 유용하다.
의료 분야에 널리 공지된 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 다수의 인자들, 예를 들어 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동반 투여되는 다른 약물에 따라 변한다.
본 발명에 인용된 모든 참고문헌들은 상기 인용된 참고문헌들에 제공된 모든 데이터, 표, 도면 및 내용을 포함하여, 전체가 본 발명에 참고로 인용된다. 또한, 본 발명에 인용된 참고문헌 내에 인용된 참고문헌들의 전체 내용도 또한 전체가 참고로 인용된다. 공지된 방법 단계, 통상적인 방법 단계, 공지된 방법 또는 통상적인 방법에 대한 참고는 본 발명의 임의의 태양, 설명 또는 실시태양이 관련 분야에 개시되거나, 교시되거나 제시되어 있음을 어떠한 식으로도 승인하는 것이 아니다.
일단 본 출원에 개시된 방법 및 생성물의 특징을 이해했으면, 추가적인 단계들의 필요성 및 종류를 종래 기술의 고찰뿐만 아니라 본 발명의 기본적인 세부사항 및 일부 용도를 기술하는 하기의 비 제한적인 도면 및 실시예들에 의해 쉽게 추론할 수 있다.
도 1은 레트로바이러스 형질도입된 Nterm-PTX3에 의한 FGF2 분열촉진 활성의 억제를 나타낸다. (A) EGFP, 인간 완전 길이 PTX3, sCterm-PTX, 또는 Nterm-PTX3 레트로바이러스로 감염된 쥐 대동맥 내피(MAE) 세포의 처리된 배지의 웨스턴 블럿 분석. sCterm-PTX3 레인 중에 존재하는 2 개의 면역반응성 밴드는 상기 재조합 단백질 의 글리코실화 및 비 글리코실화된 형태에 상응한다10. (B) 레트로바이러스 감염된 MAE 세포를 FGF2(0.55 nM)로 자극하였다. 48 시간 후에, 세포를 트립신 처리하고 카운트하였다. 데이터를 모의-감염된 FGF2-처리된 세포에서 관찰된 증식 퍼센트로서 나타낸다(0.8 세포 집단 배가). (C) GM7373 세포를 감염된 MAE 세포로부터의 처리된 배지를 사용하여 배양시키고 0.55 nM FGF2로 즉시 처리하였다. 24 시간 후에, 세포를 트립신 처리하고 카운트하였다. 데이터를 새로운 배지 + FGF2(1.0 세포 집단 배가)에서 배양시킨 GM7373 세포에서 관찰된 증식 퍼센트로서 나타낸다. B 및 C에서, 데이터는 3 회 중복된 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SD이다.
도 2는 재조합 Nterm-PTX3에 의한 FGF2/PTX3 상호작용의 억제를 나타낸다. (A) 재조합 6xHis-표지된 Nterm-PTX3 및 Cterm-PTX3을 발현시키고 형질전환된 이 콜라이 세포로부터 정제시켰다(삽입물은 상기 정제된 단백질이 부하된 SDS-PAGE 젤의 은 염색을 나타낸다). 이어서, FGF2-코팅된 웰을 37 ℃에서 30분간 완전 길이 PTX3, Cterm-PTX, 또는 Nterm-PTX3(모두 44 nM)와 함께 배양하였다. 고정화된 FGF2에 결합된 단백질의 상대 량을 물질 및 방법에 개시된 바와 같이 토끼 다클론 항-PTX3 항체와의 배양에 의해 면역검출하였다. (B) FGF2-코팅된 웰을 10 배 몰 과잉의 완전 길이 PTX3, Cterm-PTX, 또는 Nterm-PTX3의 부재 또는 존재 하에서 비오틴화된 PTX3(bPTX3, 22 nM)와 배양하였다. 이어서 고정화된 FGF2에 결합된 bPTX3의 양을 측정하고 데이터를 임의의 경쟁자의 부재 하에서 측정한 결합 퍼센트로서 나타내었 다. 모든 데이터는 3 회 중복된 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SD이다.
도 3은 PTX3 에피토프 지도화를 나타낸다. (A) 완전 길이 PTX3, Cterm-PTX3, 또는 Nterm-PTX3(200 ng/레인)을 단클론 항체 mAb-MNB4 및 mAb-16B5를 사용하여 웨스턴 블럿팅에 의해 분석하였다. (B) 전체 인간 PTX3 서열에 걸쳐 있는 128 개 중복 13-머 펩타이드를 SPOT-합성 기법에 의해 셀룰로스 멤브레인 상에 배열하였다. 이어서 멤브레인을 mAb-MNB4(흑색 막대) 및 mAb-16B5(회색 막대) 항체로 탐침하고 면역복합체를 상기 멤브레인의 농도측정 분석에 의해 정량화하였다. 상기 두 항체에 의해 인식된 PTX3 펩타이드의 아미노산 서열을 단일 문자 코드로 밑줄그은 이탤릭체로 나타낸다.
도 4는 mAb-MNB4가 FGF2/PTX3 상호작용을 방해함을 나타낸다. (A) FGF2-코팅된 웰을 완전 길이 PTX3, mAb-MNB4, 또는 mAb-16B5(모두 220 nM)의 존재 또는 부재 하에서 22 nM bPTX3와 배양하였다. 이어서 고정화된 FGF2에 결합된 bPTX3의 양을 측정하고 데이터를 임의의 경쟁자의 부재 하에서 측정된 결합 퍼센트로 나타내었다. (B) GM7373 세포를 mAb-MNB4 또는 mAb-16B5(모두 2.2 μM)의 존재 또는 부재 하에서 FGF2(0.55 nM) + PTX3(220 nM)와 함께 배양하였다. 24 시간 후에, 세포들을 트립신처리하고 카운트하였다. 데이터를 단지 FGF2와 배양시킨 GM7373 세포에서 관찰된 증식 퍼센트로서 나타낸다. 모든 데이터는 3 회 중복한 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SD이다.
도 5는 합성 PTX3 펩타이드에 의한 FGF2/PTX3 상호작용의 억제를 나타낸다. (A) 인간 PTX3 N-말단 및 관련된 합성 PTX3 펩타이드의 도식적 표현이다. (B) 지시된 PTX3 펩타이드(200 ㎍/웰)로 코팅한 웰에 FGF2(80 nM)를 가하고 결합된 FGF2의 양을 평가하였다. PTX3-코팅된 웰에 결합된 FGF2의 양의 퍼센트로서 나타낸 데이터는 3 회 중복한 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SD이다. (C) 상부 패널: FGF2(0.8 μM)를 PTX-코팅되거나 젤라틴 코팅된 BIA코어 센서칩 상에 주입하였다. 하부 패널: 고정화된 PTX3에 대한 증가하는 양의 FGF2(0.1, 0.5, 0.8 및 1.1 μM)의 결합을 나타내는 센소그램 오버레이. 반응(RU, Resonance Units에서)을 시간의 함수로서 기록하였다. D) FGF2(0.8 μM)를 증가하는 농도의 완전 길이 PTX3(■) 또는 합성 펩타이드 PTX3(82-110)(●), 스크램블된 PTX3(○) 또는 PTX3(57-85)(□)의 존재 하에서 PTX3-코팅된 BIA코어 센서칩 상에 주입하였다. 상기 반응을 주입의 끝에서 기록하고 길항물질 농도의 함수로서 플롯팅하였다. 각각의 펩타이드에 대해서, 2 내지 3 개의 독립적인 실험에서 유사한 결과를 획득하였다. (E) GM7373 세포를 PTX3(220 nM) 또는 지시된 PTX3 펩타이드(모두 66 μM)의 부재 또는 존재 하에서 FGF2(0.55 nM)와 함께 배양하였다. 단지 FGF2와 배양시킨 GM7373 세포에서 관찰된 증식 퍼센트로서 나타낸 데이터는 3 회 중복한 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SD이다.
도 6은 FGF2 길항물질로서 PTX3(97-110) 펩타이드를 나타낸다. (A) 펩타이드에 걸쳐있는 PTX3(82-110)의 도식적 표현이다. (B) 지시된 PTX3 펩타이드(200 ㎍/웰)로 코팅한 웰에서 FGF2(80 nM)를 배양하고 결합된 FGF2의 양을 평가하였다. PTX3-코팅된 웰에 결합된 FGF2의 양의 퍼센트로서 나타낸 데이터는 3 회 중복한 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SD이다. (C) FGF2(0.8 μM)를 증가하는 농도의 PTX3(82-110)(●), PTX3(97-110)(○), PTX3(82-101)(■) 또는 PTX3(82-96)(▲)의 존재 하에서 PTX3-코팅된 BIA코어 센서칩 상에 주입하였다. 상기 반응을 주입의 끝에서 기록하고 길항물질 농도의 함수로서 플롯팅하였다. 각각의 펩타이드에 대해서, 2 내지 3 개의 독립적인 실험에서 유사한 결과를 획득하였다. (D) GM7373 세포를 지시된 PTX3 펩타이드(모두 66 μM)의 부재 또는 존재 하에서 FGF2(0.55 nM)와 함께 배양하였다. 단지 FGF2와 배양시킨 GM7373 세포에서 관찰된 증식 퍼센트로서 나타낸 데이터는 3 회 중복한 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SD이다. (E) FGF2(0.8 μM)를 증가하는 농도의 PTX3(97-110)(●), PTX3(100-110)(●), TPX3(97-104)(▲), 또는 PTX3(97-107)(▼), PTX3(104-113)(◆), PTX3(100-113)(▲), PTX3(100-104)(■)의 존재 하에서 PTX3-코팅된 BIA코어 센서칩 상에 주입하였다. 상기 반응을 주입의 끝에서 기록하고 길항물질 농도의 함수로서 플롯팅하였다. 각각의 펩타이드에 대해서, 2 내지 3 개의 독립적인 실험에서 유사한 결과를 획득하였다.
도 7은 PTX3(82-110) 펩타이드의 혈관형성 억제 활성을 나타낸다. 3 nmol의 PTX3(82-110)의 부재(b) 또는 존재(c) 하에 비히클(a) 또는 16 pmol FGF2를 함유하는 알기네이트 비드와 함께 11일째에 이식한 병아리 태아 융모요낭막(CAM)을 14일째에 사진촬영하였다. 원래 배율, x 5.
실시예 1
물질 및 방법
화학물질
인간 재조합 FGF2(수탁 번호 09038) 및 PTX3(수탁 번호 swiss-prot P26022)를 각각 이 콜라이 및 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 발현시키고 개시된 바와 같이 정제시켰다10 ,19. 합성 인간 PTX3(31-60), PTX3(57-85) 및 PTX3(107-132) 펩타이드는 프림(Primm, Milan, Italy)에 의해 제공되었으며, 다른 펩타이드들은 모두 테크노젠(Tecnogen, Piana di Monteverna, Caserta, Italy)에 의해 제공되었다(HPLC 순도 ≥95%). 모든 펩타이드들에 대해서, 아미노산 서열을 PTX3 리더서열 중의 1 번 위치의 메티오닌 잔기로부터 단일 문자 코드 및 넘버링 별표로 표 1에 나타낸다.
[표 1]
인간 PTX3 N-말단에 걸쳐 있는 합성 펩타이드
Figure 112008060008219-pct00001
Figure 112008060008219-pct00002
정제된 인간 PTX3에 대한 래트 단클론 항체는 이미 개시되었다10 ,20(MNB1 목록 번호 ALX-804-463, MNB4 목록 번호 ALX-804-464, Alexis Biochemicals).
세포 배양물
소 태아 대동맥 내피 GM7373 세포21를 10% 송아지 태아 혈청(FCS)을 함유하는 이글스 MEM에서 증식시켰다. 인간 태아 신장(EcoPack2-293) 패키징 세 포(Clontech, CA, USA)를 10% FCS를 함유하는 DMEM(Life Technologies, Gaithersburg, MD)에서 증식시켰다. Balb/c 쥐 대동맥 내피 22106 세포(MAE 세포)를 알 아우어바흐(R. Auerbach)(University of Wisconsin, Madison, WI)로부터 수득하고 10% FCS를 첨가한 DMEM에서 증식시켰다.
레트로바이러스 감염
인간 PTX3 및 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 암호화하는 cDNA를 개시된 바와 같이 수득하였다17. N-말단 단편 PTX3(1-178)(Nterm-PTX3) 및 PTX3(1-17) 분비를 위해 리더 서열에 융합된 C-말단 단편 PTX3(179-381)(sCterm-PTX3)을 암호화하는 cDNA를 PCR 및 표준 클로닝 기법에 의해 pLX-PTX317로부터 생성시켰다. 모든 cDNA를 pBABE 레트로바이러스 벡터에서 클로닝하고 따라서 pBABE-PTX3, pBABE-Nterm-PTX3, pBABE-sCterm-PTX3 및 pBABE-EGFP를 생성시키고 이들을 사용하여 리포펙타민17의 존재 하에서 상기 EcoPack2-293 패키징 세포를 형질감염시켰다. 형질도입된 세포를 퓨로마이신(1 ㎍/㎖, Sigma)으로 2 주간 선별하였다. 106 cfu/㎖ 초과의 바이러스 역가를 갖는 클론들을 추가의 실험을 위해 사용하였다. 이어서 MAE 세포의 융합 배양물을 24 시간 동안 폴리브렌(8 ㎍/㎖, Sigma)의 존재 하에서 pBABE-PTX3, pBABE-Nterm-PTX3, pBABE-sCterm-PTX3 또는 pBABE-EGFP 패키징 세포로부터 처리된 배지와 함께 배양시켰다. 감염된 세포 집단을 7일간 퓨로마이신으로 선별하였 다. 에피형광 현미경검사(Axiovert S100 현미경, x10/0.25; Zeiss, Gottingen, Germany)에 의한 EGFP-감염된 세포의 관찰은 레트로바이러스 감염 효율이 80%를 초과하였음을 보였다. 트랜스유전자 단백질 발현의 수준 및 감염된 세포에 의한 방출을 평가하기 위해서 세포 배양물을 무 혈청 조건 하에서 2 일간 증식시켰다. 이어서 처리된 배지를 수거하고, 원심분리에 의해 등명화하고, 센트리콘 YM-10 필터(Millipore)를 사용하여 10 배 농축시키고, 100 ㎕ 분액을 웨스턴 블럿 분석에 의해 탐침하였다.
세포 증식 분석
내피 세포 상에서의 세포 증식 분석을 개시된 바와 같이 수행하였다22. 간단히, GM7373 또는 MAE 세포를 96-웰 디쉬에서 각각 75,000 세포/㎠ 또는 25,000 세포/㎠로 시딩하였다. 16 시간 후에, 세포를 상이한 길항물질의 부재 또는 존재 하에서 0.4% FCS + FGF2(0.55 nM)를 함유하는 새로운 배지에서 배양시켰다. 각각 24 또는 48 시간 후에, 세포들을 트립신처리하고 부르커 챔버에서 카운트하였다.
재조합 6 x His - 표지된 PTX3 단편의 이 콜라이 발현 및 정제
Nterm-PTX3 및 Cterm-PTX3 cDNA를 추가의 뉴클레오타이드를 함유하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 pLX-PTX3로부터 증폭시켰다:
PTX3-N:
(+) CACCGAGAACTCGGATGATTATGA 8(서열식별번호: 17);
(-) TTAACCTGCCGGCAGCCAGCTCC(서열식별번호 18);
PTX3-C:
(+) CACCTGTGAAACAGCTATTTTA(서열식별번호: 19);
(-) TTATGAAACATACTGAGCTCC(서열식별번호: 20).
이들 cDNA를 pENTR TOPO 벡터(pENTR Directional TOPO Cloning Kit, Invitrogen) 내에 클로닝하고 서열화하였다. 이어서 게이트웨이(Gateway) 테크놀로지(Invitrogen)를 사용하여, pENTR TOPO 벡터로부터 Nterm-PTX3 및 Cterm-PTX3 cDNA를 pDEST17 벡터에 클로닝하여 상기 재조합 단백질의 C-말단에서 6 x His-표지의 삽입을 허용하였다. 이어서 이 콜라이 BL21-Al 세포(Invitrogen)를 2 개의 재조합 플라스미드로 형질전환시키고 37 ℃에서 암피실린 100 ㎍/㎖을 함유하는 LB 배지에서 증식시켰다. 재조합 단백질 발현을 0.2% L-아라비노스의 존재 하에 30 ℃에서 밤새 배양에 의해 유도하였다. 유도 후에, 세포를 결합 완충액(20 mM 나트륨 포스페이트, 0.5M NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 7.4)에 재현탁하고 초음파에 의해 용해시켰다. 등명화된 상등액을 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하고 정제를 위해 니켈이 있는 3.0 ㎖ HiTrap 고정화된 금속 친화성 컬럼(IMAC)(Amersham Bioscience) 상에 부하하였다. 상기 컬럼을 결합 완충액 중의 100 mM 이미다졸로 세척하고 결합된 단백질을 제조사의 지시에 따라 300 mM 이미다졸로 용출시켰다. 분획들을 면역블럿팅에 의해 재조합 단백질의 존재에 대해 탐침하고 양성 분획들을 모으고 PBS 중에서 젤 여과 크로마토그래피(Sephadex G25 컬럼 PD10, Amersham)에 의해 탈염시켰다. 재조합 단백질의 순도는 SDS-PAGE에 이어 상기 젤의 은 염색에 의해 평가 시 90%를 초과하였다(도 2A, 삽입물 참조).
고상 결합 분석
ELISA 미세플레이트를 FGF2(270 nM)를 함유하는 100 mM NaHCO3(pH 9.6, 코팅 완충액) 100 ㎕/웰로 4 ℃에서 16 시간 동안 배양시켰다. 이어서 웰들을 실온에서 코팅 완충액 중의 5% 건조 밀크로 2 시간 동안 상부코팅하였다. 이어서, 완전 길이 PTX3, 재조합 Nterm-PTX3 또는 Cterm-PTX3(모두 44 nM)를 함유하는 100 ㎕의 PBS 분액을 FGF2-코팅된 웰 상에서 37 ℃에서 30 분간 배양시켰다. 이어서 웰들을 상기 2 개의 PTX3 단편을 모두 웨스턴 블럿 및 ELISA에서 유사한 효율로 인식하는 토끼 다클론 항-PTX3 항체(1:2000 희석), 항-토끼 비오틴화된 항체(1:2000), 및 100 ㎕의 스트렙트아비딘-양고추냉이 퍼옥시다제(1:5000, Amersham)와 함께 실온에서 1 시간 연속적으로 배양시켰다. 이어서 100 ㎕/웰의 크로모젠 기질 2,29-아지노비스(3-에틸벤즈티아졸린설폰산)을 가하였다. 흡광도 값을 자동 ELISA 판독기에서 405 ㎚에서 판독하였다. 일부 실험에서, 비오틴-표지된 PTX3(bPTX3)(22 nM)을 함유하는 PBS 100 ㎕ 분액을 경쟁자의 존재 또는 부재 하에 FGF2-코팅된 웰 상에서 37 ℃에서 30 분간 배양하였다. 이어서 웰들을 세척하고, 결합된 bPTX3의 양을 개시된 바와 같이 평가하였다17. 한편으로, 합성 PTX3 펩타이드를 상술한 바와 같이 ELISA 미세플레이트 웰(200 ㎍/웰) 상에 고정화시켰다. 이어서 FGF2(80 nM)를 가하고 고정화된 펩타이드에 결합된 FGF2를 37 ℃에서 토끼 다클론 항-FGF2 항체(1:7000)와 함께 1 시간 배양하여 평가한 다음 상술한 바와 같이 면역복합체 검 출을 수행하였다.
PTX3 에피토프 지도화
단클론 항-PTX3 항체에 결합하는 에피토프의 아미노산 서열을 확인하기 위해서, 128 개 펩타이드를 SPOT-합성 기술23에 의해 셀룰로스 멤브레인 상에 배열하였다. 상기 펩타이드들은 3-아미노산 프레임이동을 갖는 13-아미노산 길이였다. 멤브레인들을 4 ℃에서 16 시간 동안 트윈-TBS 중의 2% 우유(MBS)로 차단시켰다. 세척 후에, 상기 멤브레인들을 단클론 항체 mAb MNB4 또는 mAb 16B5(둘 다 MBS에서 1:1000 희석)와 함께 37 ℃에서 90 분간 배양하고 이어서 MBS 중의 토끼 알칼리성 포스파타제-접합된 항-래트 IgG(1:30,000, Sigma)와 함께 37 ℃에서 90 분간 배양하였다. 색상 반응을 개시한 바와 같이 전개시키고23 상기 신호의 강도를 상기 멤브레인의 농도측정 분석에 의해 평가하였다.
BIA 코어 결합 분석
BIA코어 X 장치(BIAcore Inc, Piscataway, NJ)를 사용하였다. 표면 플라스몬 공명을 사용하여 BIA코어 센서칩에 고정화된 PTX3에 결합하는 FGF2의 능력에 의해 유발된 굴절률 변화를 측정하였다. 이를 위해서, PTX3(2.2 μM)를 0.2M N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드 및 0.05M N-하이드록시숙신이미드의 혼합물 50 ㎕로 이미 활성화시킨 CM4 센서칩의 유동 세포와 반응시켰다. 이들 실험 조건은 대략 0.1 pmol의 PTX3에 해당하는, 5,000 공명 단위(RU)의 고정화를 허용하였다. 유사한 결과를 젤라틴(여기에서 음성 대조군으로 서 사용된다)의 고정화 및 블랭크 삭감에 대해 획득하였다. 이어서 증가하는 농도의 FGF2를 합성 PTX3 펩타이드의 존재 또는 부재 하에 희석 완충액(PBS + 0.005% 계면활성제 P20, 5.0 ㎍/㎖ CaCl2 및 MgCl2) 중에서 4 분간(고정화된 PTX3와의 회합을 허용하기 위해서) 상기 PTX3 표면 상에 주입하고 이어서 용해가 관찰될 때까지 세척하였다.
병아리 태아 융모요낭막 ( CAM ) 분석
비히클 또는 16 pmol의 FGF2를 함유하는 알기네이트 비드(5 ㎕)를 합성 PTX3 펩타이드의 존재 또는 부재 하에서 개시한 바와 같이 제조하고24 배양 11일째에 수정된 화이트 레그혼 계란(10 계란/실험 그룹)의 CAM 상부에 놓았다. 72 시간 후에, 상기 이식물로 수렴하는 혈관을 입체현미경(STEMI-SR, x2/0.12; Zeiss) 하에서 이중 맹검 방식으로 2 명의 관찰자에 의해 카운트하였다.
결과
PTX3 의 N-말단 부위가 FGF2 와 결합한다
PTX3 단백질은 전통적인 짧은 펜트락신 CRP 및 SAP와 상동성을 공유하는 C-말단 203 아미노산 도메인(Cterm-PTX3) 및 임의의 다른 공지된 단백질8과 어떠한 중요한 상동성도 나타내지 않는 N-말단 178-아미노산 연장부(Nterm-PTX3)를 특징으로 한다. 상기 혈관형성 억제성을 확인하고자, PTX3의 FGF2-결합 도메인(들), 2 개의 Cterm 또는 Nterm-PTX3 부분을 FGF2와 상호작용하는 그들의 능력에 대해 평가하였다.
선행의 관찰들은 완전 길이 PTX3의 과발현이 방출된 PTX3의 외부 성장 인자에의 결합 및 그의 세포 외 환경에서의 격리로 인해 내피 세포에서 FGF2-의존성 증식을 억제시킴을 보였다17. 이를 토대로, 쥐 대동맥 내피(MAE) 세포를 인간 완전 길이 PTX3, PTX3 N-말단 연장부 Nterm-PTX3, 또는 분비를 위한 PTX3 리더서열에 융합된 PTX3 C-말단(sCterm-PTX3)을 갖는 레트로바이러스로 감염시켰다. 대조용 세포를 EGFP-함유 레트로바이러스로 감염시켰다. 감염된 세포는 유사한 양으로 상응하는 단백질들을 과발현하고 방출시켰으며(도 1A) 기본 조건 하에서 유사한 성장률을 보였다. 그러나, Nterm-PTX3 과발현은 완전 길이 PTX3-과발현과 유사한, 외부 FGF2에 반응하여 증식하는 감염된 세포의 능력을 현저하게 감소시켰다(도 1B). 대신에 대조용 EGFP-감염된 세포와 비교할 때 sCterm-PTX3 과발현에 의해 발휘된 억제는 없었다.
FGF2-길항물질로서 작용하는 Nterm-PTX3의 능력을 추가로 평가하기 위해서, 감염된 MAE 세포의 처리된 배지를 내피 GM7373 세포의 FGF2-의존성 증식에 영향을 미치는 능력에 대해 평가하였다(도 1C). 예상된 바와 같이, Nterm-PTX3 감염된 또는 PTX3-감염된 MAE 세포의 처리된 배지의 존재 하에서 FGF2와 GM7373 세포와의 배양은 성장 인자의 분열촉진 활성을 현저하게 억제시킨 반면, sCterm-PTX3 감염된 및 EGFP-감염된 MAE 세포의 처리된 배지는 효과가 없었다(도 1C). 상기 처리된 배지 중 어느 것도 10% FCS에 의해 촉발된 GM7373 세포 증식의 현저한 억제를 유발하지 않았으며, 따라서 상기 효과의 특이성을 확인하였다.
Nterm-PTX3의 FGF2-길항물질 활성이 성장 인자와 직접 상호작용하는 그의 능력에 기인함을 확인하기 위해서, Nterm-PTX3을 재조합 6 x His-표지된 단백질로서 형질전환된 이 콜라이 세포로부터 발현 및 정제시켰으며; 정제된 재조합 6 x His-표지된 Cterm-PTX3을 대조용으로서 사용하였다(도 2A, 삽입물). FGF2 상호작용에 대해 평가 시, 완전 길이 PTX3 및 재조합 Nterm-PTX3 단편은 비 조직 배양 플라스틱에 고정화된 FGF2와 결합하는 능력을 나타내었다. 대신에 재조합 Cterm-PTX3에 의한 상호작용은 관찰되지 않았다(도 2A). 따라서, Cterm-PTX3는 아닌, 재조합 Nterm-PTX3 또는 완전 길이 PTX3의 10 배 몰 과잉은 비오틴화된 PTX3(bPTX3)의 고정화된 FGF2에의 결합을 방지하였다(도 2B).
이들 결과는 함께 FGF2 상호작용에 PTX3의 N-말단 부위를 관련시킨다.
단클론 항- N term - PTX3 항체에 의한 FGF2 / PTX3 상호작용의 억제
인간 완전 길이 PTX3에 대해 생성된 래트 단클론 항체 조합의 선별은 웨스턴 블럿에서 각각 재조합 Nterm-PTX3 및 Cterm-PTX3와 선택적으로 결합하는 항체 mAb-MNB420(MNB4 목록 번호 ALX-804-464, Alexis Biochemicals) 및 mAb-16B510(MNB1 목록 번호 ALX-804-463, Alexis Biochemicals)를 식별하였다(도 3A).
상기 두 항체에 의해 인식된 PTX3 에피토프를 지도화하기 위해서, 저자는 SPOT-합성 기법23의 이점을 취하였으며, 이 기법에 의해 전체 인간 PTX3 서열에 걸쳐있는 128 개 중복 13-머 펩타이드를 셀룰로스 멤브레인 상에 배열하였다. 상기 멤브레인을 상기 두 단클론 항체로 탐침한 경우, 면역복합체 검출은 mAb-MNB4가 PTX3의 N-말단 연장부에 존재하는 에피토프 PTX3(87-99)를 인식하는 반면 mAb-16B5는 PTX3의 C-말단 부위에 위치한 에피토프 PTX3(306-312)를 인식함을 밝혀냈다(도 3B).
FGF2/PTX3 상호작용에 영향을 미치는 능력에 대해 시험 시, mAb-MNB4(mAb-16B5는 아님)는 몰 과잉의 표지되지 않은 자유 PTX3와 유사하게, 고정화된 FGF2에 결합하는 bPTX3의 능력을 방지한다. 따라서, mAb-MNB4는 내피 GM7373 세포에서 FGF2에 의해 발휘되는 분열촉진 활성을 억제하는 완전 길이 PTX3의 능력을 완전히 파괴하는 반면, mAb-16B5는 효과가 없다(도 4B). 따라서, N-말단 PTX3(87-99) 에피토프를 인식하는 mAb-MNB4는 FGF2/PTX3 상호작용을 중화시킨다.
FGF2 길항물질로서 합성 N term - PTX3 -관련된 펩타이드
PTX3의 N-말단 연장부 중의 FGF2-결합 부위를 추가로 한정하기 위해서, 저자들은 3 개의 독특한 합성 펩타이드 PTX3(31-60), PTX3(57-85) 및 Nterm-PTX3 아미노산 서열에 부분적으로 걸쳐있는 PTX3(107-132)와 함께, 중화 mAb-MNB4(상기 참조)에 의해 인식된 PTX3(87-99) 에피토프를 함유하는 합성 펩타이드 PTX3(82-110)의 FGF2-길항물질 활성을 평가하였다.
첫 번째 실험 세트에서, 4 개의 합성 PTX3 단편을 고상 결합 분석에서 FGF2와 상호작용하는 그들의 능력에 대해 평가하였다. 도 5B에 나타낸 바와 같이, 자유 FGF2는 비 조직 배양 플라스틱에 고정화된 PTX3(82-110)에는 결합하지만 고정화된 PTX3(31-60) 또는 PTX3(57-85)에는 결합하지 않으며, 이는 고정화된 PTX3(107-132)와의 단지 제한된 상호작용을 나타낸다.
이어서, 표면 플라스몬 공명을 사용하여 FGF2/PTX3 상호작용에 영향을 미치는 4 개 펩타이드의 능력을 평가하였다. 결과는 FGF2(0.8 μ)가 BIA코어 센서칩에 고정화된 PTX3에, 높은 능력(주입 단계의 끝에서 결합된 350-400 RU)으로 결합함을 보인다(도 5C, 상부 패널). 상기 상호작용의 특이성은 젤라틴-코팅된 센서칩에 대한 결합의 결여에 의해 입증된다. 또한 증가하는 농도의 FGF2(0.1에서 1.1 μM, 도 5C, 하부 패널)를 FGF2/PTX3 상호작용의 역학적 매개변수를 평가하기 위해 PTX3 표면상에 주입하였다. 상기 결합 데이터는 상호작용이 6 x 10-5 s-1의 동역학적 해리 상수(koff) 및 0.2 x 103 s-1M-1의 동역학적 해리 상수(kon)로 발생하며, 따라서 0.3 x 10-6 M-1과 같은 Kd 값을 생성시킴을 나타낸다. 이를 토대로, 4 개의 합성 PTX3 펩타이드를, 이동상에서 FGF2를 격리시키고, 따라서 그의 PTX3 센서칩과의 상호작용을 방지하는 능력에 대해 평가하였다. 도 5D에 나타낸 바와 같이, PTX3(82-110)은 자유 완전 길이 PTX3에 의해 입증된 것보다 30 배 더 낮은 효능으로 용량 의존적인 방식으로 상기 PTX3 표면에 대한 FGF2의 결합을 억제한다(ID50은 자유 PTX3 및 PTX3(82-110) 펩타이드 각각에 대해 1.0 μM 및 30 μM과 같다). 대신에, 동일한 실험 조건 하에서, PTX3(31-60), PTX3(57-85) 및 PTX3(107-132) 펩타이드에 의해 발휘된 억제 효과는 없었다(도 5D 및 다른 수집된 데이터). 또한, PTX3(82-110)에 해당하는 아미노산 조성을 갖는 스크램블된 합성 펩타이드[sPTX(82-110), 표 1]는 제한된 억제 효과(ID50 > 3000 μM)를 나타내었으며(도 5D), 따라서 이는 PTX3(82-110) 중의 주요 아미노산 서열이 FGF2 상호작용에 중요함을 가리킨다.
FGF2와 결합하는 PTX3(82-110) 펩타이드의 능력은 저자들이 FGF2-길항물질로서 작용하는 그의 능력을 평가하도록 하였다. 내피 GM7373 세포에 대해 시험 시, 완전 길이 PTX3 및 PTX3(82-110) 모두 외부 FGF2에 의해 발휘되는 분열촉진 활성을 억제하는 반면, 스크램블된 PTX3(82-110), PTX3(31-60), PTX3(57-85) 및 PTX3(107-132) 펩타이드는 효과가 없었다(도 5E). 용량 반응 곡선은 상기 PTX3(82-110)의FGF2-길항물질 활성이 용량 의존성임을 입증하였다(ID50은 PTX3(82-110) 및 PTX3 각각에 대해 30 μM 및 30 nM과 같다).
PTX3 의 N-말단 연장부에서 최소의 선형 FGF2 -결합 서열의 확인
상기 데이터는 함께 PTX3의 N-말단 연장부 중의 선형 아미노산 서열 82-110이 FGF2 상호작용에 중요한 역할을 함을 가리킨다. 최소 선형 FGF2-결합 서열을 확인하고자, 전체 PTX3(82-110) 서열(도 6A 및 표 1)에 걸쳐있는 3 개의 중복 합성 펩타이드 PTX3(82-96), PTX3(82-101) 및 PTX3(97-110)을 고상 결합 분석에서 FGF2와 상호작용하는 능력에 대해 평가하였다. 동일한 실험 조건 하에서 자유 FGF2는 PTX3(82-96) 또는 PTX3(82-101)과의 상호작용 없이, 고정화된 PTX3(97-110)뿐만 아니라 모 PTX3(82-110) 및 완전 길이 PTX3에 결합한다(도 6B). 따라서, PTX3(97-110)은 이동 상에서 FGF2와 결합하며, 따라서 BIA코어 센서칩에 고정화된 PTX3와의 상호작용을 방지한다(도 6C). PTX3(97-110)의 억제 활성은 모 펩타이드 PTX3(82-110)에 의해 입증된 바와 유사한 반면, PTX3(82-96) 및 PTX3(82-101)은 효과가 없었다(도 6C). 이러한 관찰을 지켜볼 때, PTX3(82-96) 또는 PTX3(82-101)이 아닌, PTX3(97-110)은 내피 GM7373 세포에서 FGF2에 의해 발휘된 분열촉진 활성을 억제한다(도 6D).
펩타이드 PTX3(97-110)에 걸쳐있는 최소 선형 FGF2-결합 서열을 추가로 조사하기 위해서, 저자들은 BIA코어 센서칩에 고정화된 PTX3와의 상호작용을 측정함으로써 하기 보다 짧은 펩타이드들의 결합을 분석하였다: PTX3(97-107), PTX3(97-104), PTX3(100-104) 및 PTX3(100-110)(도 6E). 펩타이드 PTX3(97-107) 및 PTX3(100-104)은 FGF2에 대한 현저한 결합을 나타내었다. 대조적으로 펩타이드 PTX3(97-104) 및 PTX3(100-110)은 BIA코어 센서칩에 고정화된 PTX3에 대한 자유 FGF2의 결합을 방지하지 않았다(도 6E). 따라서, PTX3(100-104)은 PTX3의 N-말단 연장부 중의 최소 선형 FGF2-결합 아미노산 서열을 나타내는 것으로 보인다. 따라서, PTX3(100-104)는 FGF2-유도된 내피 세포 증식을 억제한다.
합성 N term - PTX3 -관련된 펩타이드는 FGF2 의 혈관형성 활성을 억제한다
생체 내에서 FGF2-유도된 혈관신생에 영향을 미치는 Nterm-PTX3-관련된 펩타 이드의 능력을 평가하기 위해서, FGF2 단독 또는 PTX3 펩타이드가 첨가된 FGF2에 의해 흡착된 젤라틴 스펀지를 11일 된 병아리 태아 CAM의 상부에 이식하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, FGF2(16 pmol/태아)가 흡착된 알기네이트 비드는 비히클이 흡착된 비드에 비해 효능 있는 혈관형성 반응을 발휘한다(상기 이식물에 수렴하는 거시적인 혈관은 2 개의 실험 그룹 각각에 대해 44 ± 7 및 11 ± 5 혈관/태아와 같다). 상기 시험관 내 관찰을 지켜볼 때, 생체 내 FGF2-의존성 혈관형성 반응은 상기 FGF2 이식물에 3.0 nmol의 PTX3(97-110) 펩타이드의 첨가에 의해 현저하게 감소되었다(28 ± 5 혈관/태아, ANOVA에 의해 p<0.05)(도 7). 따라서, 80 nmol의 PTX3(97-110)은 FGF2에 의해 촉발된 혈관형성 반응을 50% 억제시켰으며; 대신에 PTX3(82-96)에 의해서는 효과가 발휘되지 않았다.
논의
저자들은 FGF2 상호작용이 PTX3 상의 N-말단 연장부에 의해 매개됨을 보인다. 또한, 중화 단클론 항체 및 합성 PTX3-관련된 펩타이드를 사용하여 수행한 실험들은 상기 상호작용에 대한 원인으로서 아미노산 선형 서열 PTX3(97-110)을 확인한다. 이러한 결론은 하기의 실험적인 증거들을 바탕으로 한다: i) 짧은-펜트락신 CRP 및 SAP는 PTX3 C-말단7과의 서열 상동성에도 불구하고 비효율적인 FGF2 결합제17이고; ii) N-말단 단편 PTX3(1-178)(Nterm-PTX3)(sCterm-PTX3은 아님)의 레트로바이러스 형질도입은 내피 세포에서 외부 FGF2에 의해 발휘되는 분열촉진 활성을 억제 하며; iii) 재조합 Nterm-PTX3(Cterm-PTX3은 아님)은 고정화된 FGF2에 결합하고 PTX3/FGF2 상호작용을 억제하고; iv) 단클론 항체 mAb-MNB4(선형 에피토프 PTX3(87-99)을 지도화한다)는 FGF2/PTX3 상호작용을 방지하고 내피 세포에서 PTX3의 FGF2 길항물질 활성을 파괴하며; v) 합성 펩타이드 PTX3(82-110) 및 보다 짧은 펩타이드 PTX3(97-110), PTX3(97-107) 및 PTX3(100-104)(PTX3 N-말단의 상이한 부위들을 기본으로 하는 다른 펩타이드들은 아님)은 FGF2 결합에 의해 FGF2/PTX3 상호작용을 방지하여, 시험관 내 FGF2-의존성 내피 세포 증식 및 생체 내 혈관형성을 억제한다.
PTX3은 대식세포27, 섬유아세포9, 근아세포28, 미세아교세포29 및 내피 세포8에 의해 생성되며, 이는 상기가 내피세포층 상에서 이웃분비 및 자가분비 작용을 발휘할 수 있음을 가리킨다. 유사하게, 염증 매개체 IL-1 및 산화 질소30 , 31를 포함한 다양한 자극인자들은 자극의 자가분비 고리를 경험하는 내피 세포에서 FGF2 발현을 유도한다. 따라서, 내피 세포 및 다른 세포 유형들은 PTX3와 FGF2 모두를 발현할 수 있다. 따라서, 염증 세포 또는 내피 세포 자신에 의해 생성되는 PTX3은 시험관 내 및 생체 내에서 내피세포층 상에서 FGF2에 의해 발휘된 자가분비 및 이웃분비 활성에 영향을 비칠 수 있다. 이는 혈관형성 억제제 및 자극제 모두의 생산을 통해 혈관신생의 미세한 조율을 허용할 것이다.
FGF2는 내배엽 및 중배엽 기원의 다양한 세포 유형들을 자극하는 다면적인 성장 인자이다32. 따라서, 다양한 병태생리학적 상태에서 FGF2에 의해 발휘되는 역할은 그의 혈관형성 활성으로 제한되지 않는다. 예를 들어, FGF2는 상처 치유 기간 동안 섬유아세포의 이동 및 증식, 및 동맥경화증33 ,34 및 재협착증35 중 평활근 세포의 이동 및 증식을 자극한다. 또한, 상기는 손상된 중추 신경계에서 신경 세포 생존 및 신경교 세포 증식에 유리할 수 있다36. 모든 이러한 조건에서, PTX3의 동반 생산37 ,38은 상기 세포에 대해 FGF2에 의해 발휘되는 활성을 조정한다. 실제로, PTX3은 시험관 내에서 FGF2-의존성 평활근 세포 활성화 및 생체 내에서 동맥 손상 후 초기 후박화를 억제한다18.
결론적으로, 저자들은 처음으로 PTX3 N-말단이 FGF2 상호작용에 연관됨을 입증한다. PTX3은 선천적인 면역성, 염증, 기질 침착 및 여성 생식 간의 기로에 서있는 다작용성 수용성 패턴 인식 수용체이다. 상기는 독특한 분자 성질을 갖는 다수의 리간드와의 상호작용에 의해 그의 다작용성 활성을 발휘한다.
참고문헌
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SEQUENCE LISTING <110> Tecnogen S.C.p.a. <120> FGF2-Binding PTX3 Fragments <130> 524 <160> 16 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Gly Glu Leu Gln Arg Leu Arg Glu Glu Leu Gly Arg Leu Ala Glu 1 5 10 15 Ser Leu <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Pro Gly Ala Pro Ala Glu 1 5 <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Ser Leu 1 <210> 4 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Gly Ala 1 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Ser Leu Ala Arg Pro Cys Ala Pro Gly Ala Pro Ala Glu 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Ser Leu Ala Arg Pro Cys Ala Pro Gly Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Arg Pro Cys Ala 1 5 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Asn Glu Ile Asp Asn Gly Leu His Pro Thr Glu Asp Pro Thr Pro 1 5 10 15 Cys Asp Cys Gly Gln Glu His Ser Glu Trp Asp Lys Leu Phe 20 25 30 <210> 9 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Lys Leu Phe Ile Met Leu Glu Asn Ser Gln Met Arg Glu Arg Met 1 5 10 15 Leu Leu Gln Ala Thr Asp Asp Val Leu Arg Gly Glu Leu 20 25 <210> 10 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Arg Gly Glu Leu Gln Arg Leu Arg Glu Glu Leu Gly Arg Leu Ala Glu 1 5 10 15 Ser Leu Ala Arg Pro Cys Ala Pro Gly Ala Pro Ala Glu 20 25 <210> 11 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Glu Gly Leu Arg Gly Glu Leu Arg Gly Ser Arg Glu Ala Glu Leu Leu 1 5 10 15 Arg Gln Ala Ala Arg Ala Pro Ala Cys Pro Leu Pro Glu 20 25 <210> 12 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Pro Ala Glu Ala Arg Leu Thr Ser Ala Leu Asp Glu Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ala Thr Arg Asp Ala Gly Arg Arg Leu Ala 20 25 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Arg Gly Glu Leu Gln Arg Leu Arg Glu Glu Leu Gly Arg Leu Ala 1 5 10 15 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Arg Gly Glu Leu Gln Arg Leu Arg Glu Glu Leu Gly Arg Leu Ala Glu 1 5 10 15 Ser Leu Ala Arg 20 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Glu Ser Leu Ala Arg Pro Cys Ala 1 5 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ala Arg Pro Cys Ala Pro Gly Ala Pro Ala Glu 1 5 10 3

Claims (18)

  1. 하기 화학식 I의 FGF2-결합 펩타이드 또는 약학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I
    R1-Ala-X1-Pro-X2-Ala-R2
    상기 식에서,
    X1은 Arg이고;
    X2는 Cys이고;
    R1은 존재하지 않거나 서열식별번호:1 및 서열식별번호: 3 중에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;
    R2는 존재하지 않거나 서열식별번호:2 및 서열식별번호: 4 중에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;
    R1이 존재하지 않을 때, 또한 R2도 존재하지 않고; R1이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열일 때, R2는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열이고; R1이 서열식별번호: 3의 아미노산 서열일 때, R2는 서열식별번호: 2 및 서열식별번호: 4 중에서 선택된 아미노산 서열이다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7 및 서열식별번호: 10 중에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 약학적으로 허용 가능한 염.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항 또는 제 4 항에 따른 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
  9. 제 8 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  10. 제 9 항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 펩타이드가 상기 세포의 막 표면상에 분비되거나 상기 표면상에서 발현되는 숙주 세포.
  12. 삭제
  13. 제 1 항 또는 제 4 항에 따른 펩타이드 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 혈관신생이 성장 인자 FGF2의 변경된 활성화에 의해 유발되는 약제학적 조성물.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 관절염 질병, 종양 전이, 당뇨성 망막병증, 건선, 만성 염증, 동맥경화증 및 종양으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 질환에 사용되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 종양이 육종, 암종, 악성종양, 골 종양 및 신경내분비 종양의 그룹 중에서 선택되는 약제학적 조성물.
  17. 제 1 항 또는 제 4 항에 따른 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 섬유아세포 또는 평활근세포의 조절되지 않은 FGF2-의존성 증식, 과도한 섬유아세포 반응에 관련된 반흔형성, 또는 혈관성형술 후 재협착 억제용 약제학적 조성물.
  18. 삭제
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