EA015339B1 - Связывающие fgf2 пептиды и их применение - Google Patents

Abstract

В настоящей заявке описаны связывающие FGF2 пептиды, которые были сконструированы, начиная с N-концевого участка РТХ3, в частности включающие участок РТХ3(82-110). Синтетические пептиды, родственные этой последовательности, способны связывать FGF2 и ингибировать его проангиогенную активность in vitro и in vivo при отсутствии ожидаемого влияния на врожденный иммунитет.

Description

Настоящее изобретение относится к пептидам, связывающим фактор роста фибробластов-2 (РОР2), которые способны связывать РОР2 и ингибировать его проангиогенную активность ίη νίίτο и ίη νίνο в отсутствие ожидаемого влияния на врожденный иммунитет.

Уровень техники

Пентраксины представляют собой суперсемейство белков, характеризующихся пентамерной структурой¹. Классические короткие пентраксины, С-реактивный белок (СЕР) и компонент сывороточного амилоида Р (8ЛР) представляют собой белки острой фазы у человека и мыши соответственно, продуцируемые в печени в ответ на медиаторы воспаления^2,3. Пентраксины связывают различные лиганды и вовлечены во врожденную устойчивость к микробам и в удаление продуктов распада клеток и компонентов внеклеточного матрикса^1,4-6.

Длинные пентраксины характеризуются неродственным Ν-концевым доменом, связанным с пентраксинподобным С-концевым доменом⁷. Являющийся прототипом длинный пентраксин РТХ3^8,9 представляет собой гликозилированный белок 45 кДа, собранный преимущественно в виде мультимеров из 10-20 мультимеров¹⁰. РТХ3 продуцируется местно и высвобождается клетками различных типов, в частности мононуклеарными фагоцитами, дендритными клетками и эндотелиальными клетками, в ответ на первичные воспалительные сигналы¹¹. В исследованиях на мышах ρΐχ3^-/- было показано, что эта молекула ίη νίνο выполняет сложные неизбыточные функции, простирающиеся от сборки богатого гиалуроновой кислотой внеклеточного матрикса до способности к оплодотворению у женщин и до врожденного иммунитета против различных микроорганизмов^12,13. По меньшей мере, частично это связано со способностью РТХ3 связывать с высокой аффинностью компонент комплемента С1с.|. белок внеклеточного матрикса Т8С6 и выбранные микроорганизмы, запуская активацию комплемента и способствуя распознаванию патогена макрофагами и дендритными клетками^1,14. Таким образом, РТХ3 представляет собой растворимый рецептор распознавания структур, обладающий уникальными неизбыточными функциями в различных патофизиологических условиях^1,14.

Фактор роста фибробластов-2 (РОР2) представляет собой связывающий гепарин фактор роста, который индуцирует пролиферацию клеток, хемотаксис и продукцию протеаз в культивируемых эндотелиальных клетках посредством высокоаффинного взаимодействия с рецепторами тирозинкиназ (РОРК)¹⁵. РОР2 индуцирует ангиогенез ίη νίνο и регулирует образование новых сосудов в процессе заживления ран, воспаления, атеросклероза и роста опухоли¹⁶. Ряд молекул блокирует РОР2 во внеклеточном пространстве, тем самым предотвращая его взаимодействие с РОРК эндотелиальных клеток и ингибируя его ангиогенную активность (обзор в¹⁶). Многие из этих ингибиторов продуцируются/высвобождаются местно и/или системно, образуя тем самым основу для сложной регуляции процесса ангиогенеза.

Длинный РТХ3 связывает РОР2 с высокой аффинностью и специфичностью. Соответственно, длинный РТХ3 ингибирует зависимую от РОР2 пролиферацию эндотелиальных клеток ίη νίίτο и ангиогенез ίη νίνο¹⁷. Кроме того, полноразмерный РТХ3 ингибирует зависимую от РОР2 активацию гладкомышечных клеток и утолщение интимы после повреждения артерий¹⁸. Таким образом, РТХ3 теоретически может вносить вклад в регуляцию активности РОР2 в различных патологических условиях, характеризующихся совместной экспрессией двух белков, в том числе при воспалении, заживлении ран, атеросклерозе и неоплазии. Однако учитывая практическую невозможность использовать такую большую молекулу и другие виды активности белка, не описано ни одного варианта терапевтического применения белка. Фактически, РТХ3 связывает С1с.| посредством С-концевого домена пентраксина¹⁰.

До настоящего времени Ν-концевому участку РТХ3 не были приписаны никакие биологические функции. Исходя из этого, авторами изобретения была исследована способность Ν-концевого участка РТХ3 взаимодействовать с РОР2.

Описание изобретения

Было обнаружено, что трансдуцированные ретровирусом клетки эндотелия, сверхэкспрессирующие РТХ3№концевой фрагмент (1-178), обладают сниженной митогенной активностью в ответ на РОР2. Очищенный рекомбинантный РТХ3 (1-178) связывает РОР2 и предотвращает взаимодействие РТХ3/РОР2. Кроме того, моноклональное антитело тАЬ-М№4, распознающее эпитоп РТХ3(87-99), предотвращает взаимодействие РОР2/РТХ3 и устраняет активность РТХ3 как антагониста РОР2. Неожиданно авторами изобретения было обнаружено, что очень короткие пептиды сохраняют такую активность и являются эффективными в качестве терапевтических лекарственных средств. Соответственно, синтетические пептиды РТХ3(82-110), РТХ3(97-110), РТХ3(97-107) и РТХ3(100-104) связывают РОР2 и ингибируют взаимодействие РОР2 с полноразмерным длинным РТХ3, иммобилизованным на сенсорном чипе ΒΙΑοοιό, зависимую от РОР2 пролиферацию эндотелиальных клеток и ангиогенез ίη νίνο. Таким образом, данные позволяют идентифицировать очень короткий, связывающий РОР2 домен в Ν-концевом удлиняющем участке РТХ3, охватывающем область РТХ3(97-110). Синтетические пептиды, родственные этой последовательности, способны связывать РОР2 и ингибировать его проангиогенную активность ίη νίίτο и ίη νίνο в отсутствие ожидаемого влияния на врожденный иммунитет.

Таким образом, главной целью настоящего изобретения является связывающий РОР2 пептид формулы I

- 1 015339

Ρχ-ΆΙΰ-Χ^Ρχο-Χ'-ΆΙΰ-Η, (I) где Х₁ представляет собой аминокислоту, выбранную из Агд и Ьук;

Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную из Сук и Тйг;

Κι отсутствует или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из 8ЕС ΙΌ N0: 1 и δΙΤ) ΙΌ N0: 3;

К₂ отсутствует или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из 8ЕС ΙΌ N0: 2 и 8Е0 ΙΌ N0: 4, при следующих условиях:

когда Κ₁ отсутствует, К₂ также отсутствует; когда Κ_ι представляет собой аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 1, К₂ представляет собой аминокислотную последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 2;

когда Κ₁ представляет собой аминокислотную последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 3, К₂ представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕС ΙΌ N0: 2 и 8Е0 ΙΌ N0: 4;

функциональное производное, предшественник или фармацевтически приемлемая соль пептида.

Предпочтительно Х₁ представляет собой Агд. Более предпочтительно Х₂ представляет собой Сук. Еще более предпочтительно пептид состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из 8ЕС ΙΌ N0: 5, δΙΤ) ΙΌ N0: 6, 8Ер ΙΌ N0: 7 и 8Ер ΙΌ N0: 10.

Еще одной целью изобретения является конъюгированный химерный пептид, содержащий пептид формулы Ι или его функциональные производные.

Как правило, термин пептид используют в отношении полипептидной цепи, содержащей от 4 до 100 или более последовательных аминокислот, обычно от 5 до 20 последовательных аминокислот.

Термин функциональный обозначает пептид, обладающий связывающими ЕСЕ2 свойствами, способный значительно снижать биологическую активность ЕСЕ2. Биологическая активность ЕСЕ2 включает митогенный и ангиогенный эффекты. В частности, пептиды согласно изобретению способны ингибировать индуцируемую ЕСЕ2 пролиферацию эндотелиальных клеток или гладкомышечных клеток.

Предшественники представляют собой соединения, которые могут быть преобразованы в соединения согласно настоящему изобретению посредством метаболической и ферментативной обработки до или после введения в клетки или организм.

В рамках настоящей заявки термин соли относится к солям, получаемым по карбоксильным группам, и к получаемым при добавлении кислот солям по аминогруппам пептидов, полипептидов или их аналогов согласно настоящему изобретению. Соли по карбоксильной группе можно получать известными в данной области способами, и они включают неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и т.п., а также соли с органическими основаниями, такие как соли, получаемые, например, с аминами, например триэтаноламином, аргинином или лизином, пиперидином, прокаином и т.п. Получаемые при добавлении кислот соли включают, например, соли с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная кислота или серная кислота, и соли с органическими кислотами, такими как, например, уксусная кислота или щавелевая кислота. Любая из таких солей должна обладать практически такой же активностью, как пептиды и полипептиды согласно изобретению или их аналоги.

В рамках настоящей заявки термин производные относится к производным, которые могут быть получены известными способами из функциональных групп, присутствующих на боковых цепях молекул аминокислот или на №/или С-концевых группах. Например, такие производные включают сложные эфиры или алифатические амиды карбоксильных групп, а также ^ацильные производные свободных аминогрупп или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп, и их получают с использованием ацильных групп, таких как, например, алканоильные или ароильные группы. Также настоящее изобретение включает пептидомиметики уже описанных пептидов, в которых природа пептидов была химически модифицирована на уровне боковых цепей аминокислот, хиральности аминокислот и/или пептидного каркаса. Эти изменения предназначены для получения связывающих ЕСЕ2 средств со сходными (если не улучшенными) терапевтическими, диагностическими и/или фармакокинетическими свойствами.

Например, если пептид подвержен расщеплению пептидазами после введения субъекту, то замена конкретной восприимчивой к воздействию пептидной связи на нерасщепляемый пептидный миметик может обеспечить более стабильный пептид и, соответственно, более функциональный в качестве терапевтического средства. Сходным образом, замена остатка Ь-аминокислоты является общепринятым способом, чтобы сделать пептид менее чувствительным к протеолизу и, в итоге, более сходным с органическими соединениями, отличными от пептидов. Также эффективными являются аминоконцевые блокирующие группы, такие как трет-бутилоксикарбонильная, ацетильная, сукцинильная, метоксисукцинильная, суберильная, адипильная, азелаильная, дансильная, бензилоксикарбонильная, флуоренилметоксикарбонильная, метоксиазелаильная, метоксиадипильная, метоксисуберильная и 2,4-динитрофенильная группы. В данной области известно множество других модификаций, обеспечивающих повышенную эффективность, пролонгированную активность, легкость очистки и/или увеличенное время полужизни.

Свойства пептидов согласно изобретению можно поддерживать или даже усиливать в мутантных пептидах. Мутантные пептиды содержат аминокислотные последовательности, в которых были осущест

- 2 015339 влены консервативные замены одного или нескольких аминокислотных остатков при условии, что они обладают той же характеризующей настоящее изобретение биологической активностью на эквивалентном или даже более высоком уровнях, как определено известными в данной области способами или описано в представленных ниже примерах.

Согласно настоящему изобретению предпочтительные изменения в мутантных пептидах общеизвестны как консервативные или безопасные замены. Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены на аминокислоты с химическими свойствами, в достаточной степени сходными для сохранения структуры и биологической функции молекулы. В литературе представлены многочисленные модели, с использованием которых можно проводить выбор консервативных аминокислотных замен на основе статистических и физико-химических исследований последовательности и/или структуры природного белка.

Мутантные пептиды можно получать посредством общепринятого способа сайт-направленного мутагенеза кодирующей ДНК, посредством комбинаторных способов на уровне кодирующей последовательности ДНК (такими как перестановка ДНК, фаговый дисплей/отбор) или аминокислот, посредством исследований на основе компьютерного конструирования или любым другим известным, эффективным для этого способом, обеспечивающим конечный набор практически аналогичных мутированных пептидов, которые специалист в данной области может обычным способом получать и тестировать, используя указания, имеющиеся в предшествующем уровне техники и в примерах настоящей патентной заявки.

Другой целью изобретения является слитый химерный пептид, содержащий пептид формулы (I) или его функциональные производные. Связывающие ЕСЕ2 пептиды, являясь слитыми и/или химерными пептидами, содержат аминокислотную последовательность пептида формулы (I) или любое из их мутантов/производных, как описано выше, и аминокислотную последовательность, относящуюся к отличной от РТХ3 последовательности белка, обеспечивая дополнительные свойства без значительного нарушения ЕСЕ2-связывающей активности.

Дополнительные последовательности белков, которые можно включать в слитые и/или химерные белки, могут быть выбраны из мембраносвязанных последовательностей, внеклеточных участков мембраносвязанных белков, константных областей иммуноглобулинов, доменов мультимеризации, внеклеточных белков, белков, содержащих сигнальные пептиды, белков, содержащих сигнальные последовательности для выведения.

Дополнительные свойства, проявляемые слитыми и/или химерными полипептидами или пептидами, заключаются в способности к более легкой очистке, более продолжительном времени полужизни в жидкостях организма или во внеклеточной локализации. Это последнее свойство обладает особой важностью для определения конкретной группы слитых или химерных белков, включенных в представленное выше определение, поскольку оно позволяет помещать пептиды согласно изобретению в пространство, в котором не только облегчены выделение и очистка этих пептидов, но и в котором происходит природное взаимодействие РТХ3 и ЕСЕ2.

Выбор одной или нескольких последовательностей, подлежащих слиянию со связывающими ЕСЕ2 пептидами, зависит от конкретного варианта использования пептида.

В качестве общего способа слитые белки можно получать, конструируя кодирующие их участки нуклеиновых кислот с использованием общепринятых способов генной инженерии и клонируя в реплицируемые векторы вирусного или плазмидного происхождения, которые используют для модифицирования прокариотической или эукариотической клетки-хозяина с применением эписомальных или не/гомологично встраиваемых векторов, а также с применением способов на основе трансформации, инфекции или трансфекции. Эти векторы должны обеспечивать экспрессию слитого белка, включающего связывающее ЕСЕ2 средство, в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине под контролем их собственных регуляторных последовательностей для инициации/терминации транскрипции, которые выбраны таким образом, чтобы быть конститутивно активными или индуцибельными в указанной клетке. Затем можно выделять линию клеток для получения стабильной клеточной линии. В частности, если клетки, модифицированные для экспрессии связывающих ЕСЕ2 средств согласно изобретению, используют или вводят непосредственным образом, то, предпочтительно, клетки представляют собой клетки человека, обычно экспрессирующие РТХ3. Если дополнительная белковая последовательность, как в случае последовательности внеклеточных белков, белков, содержащих сигнальную последовательность для выведения, или белков, содержащих сигнальный пептид, обеспечивает секрецию связывающего ЕСЕ2 домена во внеклеточное пространство, то средство может быть более легко выделено и очищено из культивируемых клеток с учетом последующей обработки, или, альтернативно, клетки могут быть использованы или введены непосредственным образом.

Если дополнительный белок, как в случае последовательности мембраносвязанных белков, обеспечивает иммобилизацию связывающего ЕСЕ2 средства на поверхности клетки, то средство может быть менее легко выделено и очищено из культивируемых клеток с учетом последующей обработки, однако клетки могут быть использованы или введены непосредственным образом, обеспечивая средство в форме, соответствующей форме природного РТХ3, возможно, улучшая его свойства.

Связывающие ЕСЕ2 пептиды согласно изобретению могут быть также идентифицированы спосо- 3 015339 бами компьютерного конструирования лекарственных средств, в которых используют структуру и/или последовательность пептидов согласно изобретению или соответствующих мутантов, как описано выше. Пептиды согласно изобретению можно с более высокой эффективностью использовать для исследования взаимодействия РТХ3 и ЕОЕ2, используя способы компьютерного моделирования. Такой анализ с использованием компьютера можно применять для получения улучшенных пептидных или непептидных миметических лекарственных средств в виде синтетических органических молекул или пептидов (например, длиной 4-20 аминокислот). После отбора таких соединений и обнаружения, что они способны связывать ЕОЕ2, можно затем оценивать их использование с применением клеточных или животных моделей.

Полипептиды согласно изобретению могут находиться в виде активных конъюгатов или комплекса с гетерологичной молекулой, которую можно выбирать из цитотоксических средств, меток (например, биотина, флуоресцентных меток), лекарственных средств или других терапевтических средств, связанных ковалентно или несвязанных, непосредственно или посредством использования связывающих средств или линкеров. Эффективные конъюгаты или комплексы можно получать с использованием известных в данной области молекул и способов (радиоактивных или флуоресцентных меток, биотина, цитотоксических средств, лекарственных средств или других терапевтических средств). Цитотоксические средства включают химиотерапевтические средства, токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибного, растительного или животного происхождения или его фрагменты) или радиоактивный изотоп (т.е. радиоконъюгат). Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают цепь дифтерийного токсина А, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь экзотоксина А (из Ркеиботопак аетидшока), цепь рицина А, цепь абрина А, цепь модецина А, альфа-сарцин, белки Л1еитйе8 Готби, белки диантина, белки Рйу1о1аса атепсапа (РАР1, ΡΑΡΙΙ и РАР-8), ингибитор Мототбюа сйатаийа, курцин, кротин, ингибитор 8аропапа оГйсшаШ, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецины. Для получения радиоконъюгированных белков доступно множество радиоактивных изотопов. Примеры включают ²¹²Βί, ¹³¹Ι, ¹³¹Ιη, ⁹⁰Υ и ¹⁸⁶Ре.

Кроме того, эффективные конъюгаты или комплексы можно получать для улучшения средств в аспекте эффективности доставки лекарственного средства. С этой целью пептиды согласно изобретению могут находиться в виде активных конъюгатов или комплекса с такими молекулами, как полиэтиленгликоль и другие природные или синтетические полимеры (Наттщ ЕМ. апб Сйекк Р.В., №11 Реу Эгид ИЦсоу. (2003), 2(3):214-21; Отеепга1б Р.В. е1 а1., Α6ν Цгцд ЦеКу Реу. (2003), 55(2):217-50; Р111а1 О. апб Рапсйадпи1а К., Сигг Θρίη Сйет Вю1. (2001), 5(4):447-51). В этом отношении настоящее изобретение включает химически модифицированные пептиды, как описано в настоящей заявке, в которых пептид связан с полимером. Как правило, полимер является водорастворимым, вследствие чего конъюгат не осаждается в водной среде, такой как физиологическая среда. Используемые для лечения конъюгаты могут содержать фармацевтически приемлемые водорастворимые полимерные молекулы. Приемлемые водорастворимые полимеры включают полиэтиленгликоль (РЕО), монометокси-РЕО, моно(С₁-С₁₀)алкокси-РЕО, арилоксиРЕО, поли(№винилпирролидон)-РЕО, трезилмонометокси-РЕО, РЕО-пропиональдегид, бис-сукцинимидилкарбонат-РЕО, гомополимеры пропиленгликоля, сополимер полипропиленоксид/этиленоксид, полиоксиэтилированные многоатомные спирты (например, глицерин), поливиниловый спирт, декстран, целлюлозу или другие полимеры на основе углеводов. Приемлемые РЕО могут иметь молекулярную массу от приблизительно 600 до приблизительно 60000, в том числе, например, 5000, 12000, 20000 и 25000. Также конъюгат может содержать смесь таких водорастворимых полимеров.

Примеры конъюгатов включают пептиды согласно изобретению и группу полиалкилоксида, присоединенную к Ν-концевому участку указанной молекулы полипептида. Одним из приемлемых полиалкилоксидов является РЕО. В качестве иллюстрации, пептиды согласно настоящему изобретению можно модифицировать с использованием РЕО, применяя способ, известный как пегилирование. Пегилирование можно проводить с использованием любой из известных в данной области реакций пегилирования. Например, пегилирование можно осуществлять реакцией ацилирования или реакцией алкилирования с использованием реакционноспособной молекулы полиэтиленгликоля. В альтернативном способе конъюгаты получают конденсацией активированного РЕО, при которой концевую гидрокси- или аминогруппу в РЕО заменяют активированным линкером.

Другой целью изобретения являются нуклеиновые кислоты, которые кодируют связывающие ЕОЕ2 пептиды согласно изобретению, нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с указанными выше нуклеиновыми кислотами, нуклеиновые кислоты, которые имеют вырожденные последовательности.

Также изобретение относится к векторам экспрессии вирусного или плазмидного происхождения, обеспечивающим экспрессию нуклеиновой кислоты согласно изобретению, к прокариотическим или эукариотическим клеткам-хозяевам, трансформированным такими векторами, и к получаемым из них стабильным линиям клеток, экспрессирующим связывающее ЕОЕ2 средство, которое может секретироваться или экспрессироваться на поверхности мембран. Примерами являются В-клетки человека.

Связывающие ЕОЕ2 пептиды согласно изобретению можно получать способом, в котором описанные выше клетки-хозяева культивируют в соответствующих культуральных средах и получают связы

- 4 015339 вающее ЕСЕ2 средство.

Последовательность ДНК, кодирующую пептиды согласно изобретению, можно вставлять и лигировать в приемлемый вектор. После получения вектор экспрессии вводят в приемлемую клетку-хозяина, которая затем экспрессирует пептид.

Экспрессию любого из рекомбинантных пептидов согласно изобретению, как описано в настоящей заявке, можно осуществлять в эукариотических клетках (например, клетках дрожжей, насекомых или млекопитающих) или прокариотических клетках с использованием соответствующих векторов экспрессии. Можно использовать любой известный в данной области способ.

Для того чтобы быть способным экспрессировать желаемый белок, вектор экспрессии должен также содержать специфические нуклеотидные последовательности, которые включают информацию для регуляции транскрипции и трансляции, связанные с ДНК, кодирующей желаемый белок, таким образом, чтобы обеспечивать экспрессию гена и продукцию белка. Прежде всего, для того чтобы ген транскрибировался, ему должен предшествовать распознаваемый РНК-полимеразой промотор, с которым полимераза связывается и запускает тем самым процесс транскрипции.

Существует множество таких используемых промоторов, которые действуют с различной эффективностью (сильные и слабые промоторы).

В случае эукариотических организмов-хозяев, в зависимости от природы организма-хозяина, можно использовать различные регулирующие транскрипцию и трансляцию последовательности. Они могут быть получены из вирусных источников, таких как аденовирус, вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус обезьяны или т.п., где регуляторные сигнальные последовательности связаны с конкретным геном, экспрессирующимся на высоком уровне. Примеры представляют собой промотор ТК вируса герпеса, ранний промотор 8У40, дрожжевой промотор гена да14 и т.д. Можно выбирать такие регуляторные сигнальные последовательности для инициации транскрипции, которые обеспечивают репрессию и активацию таким образом, чтобы можно было регулировать экспрессию генов.

Молекулу ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок согласно изобретению, вставляют в вектор(ы), имеющий регуляторные сигнальные последовательности для транскрипции и трансляции, который способен встраивать желаемые последовательности генов в клеткухозяина.

Клетки, которые были стабильно трансформированы введенной ДНК, можно отбирать посредством дополнительного введения одного или нескольких маркеров, обеспечивающих селекцию клеток-хозяев, которые содержат вектор экспрессии. Кроме того, маркер может обеспечивать фототрофию для ауксотрофного организма-хозяина, устойчивость к биоцидам, например антибиотикам или тяжелым металлам, таким как медь, или т. п. Селектируемый ген-маркер можно непосредственно связывать с подлежащими экспрессии последовательностями ДНК для генов или вводить в ту же самую клетку посредством совместной трансфекции.

Дополнительные элементы векторов также могут быть эффективными для достижения оптимального получения белков согласно изобретению, в частности для отбора конкретной клетки, содержащей плазмидный или вирусный вектор: легкость, с которой содержащие вектор клетки-реципиенты могут быть распознаны и отделены от клеток-реципиентов, не содержащих вектор; количество копий вектора, которое желаемо в конкретном организме-хозяине; а также желательна ли способность вектора к челночным перемещениям между клетками-хозяевами различных видов.

После того как для экспрессии конструкции(ий) ДНК были получены содержащий конструкцию(ии) вектор(ы) или последовательность ДНК, их можно вводить в соответствующую клетку-хозяин любым из множества приемлемых способов: трансформацией, трансфекцией, конъюгацией, слиянием протопластов, электропорацией, осаждением посредством фосфата кальция, прямой микроинъекцией и т.д.

Клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими. Предпочтительными являются эукариотические организмы-хозяева, например клетки млекопитающих, такие как клетки человека, обезьяны, мыши и клетки яичника китайского хомячка (СНО), поскольку они обеспечивают посттрансляционные модификации белковых молекул, в том числе надлежащую укладку или гликозилирование надлежащих участков. Клетки дрожжей также могут осуществлять посттрансляционные модификации пептидов, в том числе гликозилирование. Существует множество способов рекомбинантной ДНК, в которых используют последовательности сильных промоторов и большое число копий плазмид, которые можно применять для получения желаемых белков в дрожжах. Дрожжи распознают лидерные последовательности в продуктах клонированных генов млекопитающих и секретируют пептиды, содержащие лидерные последовательности (т.е. препептиды).

После введения вектора(ов) клетки-хозяева выращивают в селективной среде, посредством которой проводят селекцию на предмет роста клеток, содержащих вектор. Экспрессия последовательности(ей) клонированного гена приводит к получению желаемых белков.

Во многих обзорах и книгах представлены указания относительно того, как клонировать и получать рекомбинантные белки с использованием векторов и прокариотических или эукариотических клетокхозяев, например в некоторых документах из серий А Ргасбса1 Арргоасй, опубликованных ОхГогй Ишуегзйу Ргекк (ΌΝΑ С1ошид 2: Ехргекщои Зубетк, 1995; ΌΝΑ С1ошид 4: МаттаПаи ЗуШетк, 1996;

- 5 015339

Рго1сш Ехргсккюп. 1999; Рго1сш РипПсаОоп Тсс11пк.|ис5. 2001).

Примеры способов химического синтеза. которые более всего показаны для получения связывающего ЕСЕ2 средства согласно изобретению. когда оно находится в виде пептида или пептидных миметиков. представляют собой твердофазный синтез и жидкофазный синтез. Например. в случае твердофазного синтеза аминокислоту. соответствующую С-концевому участку подлежащего синтезу пептида. связывают с носителем. который не растворим в органических растворителях. и посредством поочередного повтора реакций удлиняют таким образом пептид. где в ходе одной реакции аминокислоты вместе с их аминогруппами и функциональными группами боковых цепей. защищенные соответствующими защитными группами. конденсируют одну за другой в порядке от С-концевого участка к Ν-концевому участку. а в ходе другой реакции высвобождают связанные со смолой аминокислоты или защитную группу на аминогруппах пептидов.

В основном. способы твердофазного синтеза в зависимости от используемого типа защитной группы подразделяют на способ (Вос и способ Етос. Как правило. используемые защитные группы включают (Вос (трет-бутоксикарбонил). С.'1-Ζ (2-хлорбензилоксикарбонил). Вг-Ζ (2-бромбензилоксикарбонил). Βζΐ (бензил). Етос (9-флуоренилметоксикарбонил). МЫ1 (4.4'-диметоксидибензгидрил). М1г (4-метокси-2.3.6триметилбензолсульфонил). Тг1 (тритил). Ток (тозил). Ζ (бензилоксикарбонил) и СЕ-Βζΐ (2.6дихлорбензил) для аминогрупп; ΝΟ₂ (нитрогруппу) и Ртс (2.2.5.7.8-пентаметилхроман-6-сульфонил) для гуанидиногрупп и (Ви (трет-бутил) для гидроксильных групп). После синтеза желаемого пептида его подвергают реакции снятия защиты и отделяют от твердого носителя. Такую реакцию отделения пептида можно проводить с использованием фтороводородной кислоты или трифторметансульфоновой кислоты в случае способа Вос и с использованием ТФА в случае способа Етос.

В конечном итоге связывающие ЕСЕ2 средства. полученные способами рекомбинантной ДНК или химического синтеза. подвергают одной или нескольким стадиям очистки. Очистку можно проводить любым из известных для этой цели способов. т.е. любым общепринятым способом. в том числе экстракцией. осаждением. хроматографией. электрофорезом или т.п. Например. можно использовать ВЭЖХ (высокоэффективную жидкостную хроматографию). Элюцию можно проводить с использованием растворителя на основе вода-ацетонитрил. обычно применяемого для очистки белков. Изобретение относится к очищенным препаратам связывающих ЕОЕ2 средств согласно изобретению. В рамках настоящей заявки очищенные препараты относятся к препаратам. которые содержат по меньшей мере 1%. предпочтительно по меньшей мере 5% сухой массы соединений согласно изобретению.

Описанные выше соединения согласно изобретению (белки. пептиды. органические соединения) можно использовать в качестве лекарственного средства. предпочтительно в качестве средства против заболевания. обусловленного измененным ангиогенезом. Более предпочтительно измененный ангиогенез вызван измененной активацией фактора роста ЕОЕ2. Еще более предпочтительно заболевание выбирают из группы. состоящей из артрита. метастазирования опухоли. диабетической ретинопатии. псориаза. хронического воспаления. артериосклероза или опухоли. Предпочтительно опухоль выбирают из группы саркомы. карциномы. карциноидной опухоли. опухоли костной ткани или нейроэндокринной опухоли.

Описанные выше соединения согласно изобретению (белки. пептиды. органические соединения) можно использовать в качестве средств против заболеваний. связанных с неконтролируемой. зависимой от ЕОЕ2 пролиферацией фибробластов или гладкомышечных клеток. рубцевания. связанного с чрезмерной реакцией фибробластов. и рестеноза после ангиопластики.

Действительно. связывающие ЕОЕ2 пептиды согласно изобретению. связываясь с ЕОЕ2. действуют как ингибитор ЕОЕ2. В самом деле. пептиды способны ингибировать индуцируемую ЕОЕ2 пролиферацию эндотелиальных клеток или гладкомышечных клеток. Поэтому терапевтический потенциал такой молекулы заключается в профилактике и/или лечении заболеваний. при которых ингибирование ЕОЕ2 является благоприятным. Этот последний эффект также можно использовать для уменьшения популяции клеток. экспрессирующих ЕОЕ2.

Связывающие ЕОЕ2 пептиды согласно изобретению можно использовать в качестве активных ингредиентов в фармацевтических композициях для профилактики и/или лечения заболеваний. обусловленных измененным ангиогенезом. где измененный ангиогенез вызван измененной активацией ЕОЕ2. Примером указанных заболеваний является: артрит. метастазирование опухоли. диабетическая ретинопатия. псориаз. хроническое воспаление. артериосклероз или опухоль. где опухоль. например. представляет собой саркому. карциному. карциноидную опухоль. опухоль костной ткани или нейроэндокринную опухоль.

Связывающие ЕОЕ2 средства согласно изобретению можно также использовать в качестве активных ингредиентов в фармацевтических композициях для профилактики и/или лечения заболеваний. связанных с неконтролируемой. зависимой от ЕОЕ2 пролиферацией фибробластов или гладкомышечных клеток. например. рубцеванием. связанным с чрезмерной реакцией фибробластов. и рестеноза после ангиопластики.

Также настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции. содержащей терапевтически эффективное количество пептида формулы I или его функциональных производных. а также приемлемые разбавители и/или наполнители. и/или вспомогательные фармацевтические средства для про

- 6 015339 филактики и/или лечения указанных выше заболеваний. Эти фармацевтические композиции можно составлять в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями, стабилизаторами или разбавителями. В зависимости от свойств средства фармацевтическая композиция может быть эффективна при заболеваниях, связанных с Т-клетками СЛ4+. например при аутоиммунных заболеваниях, воспалениях или инфекциях.

Фармацевтические композиции, которые содержат связывающие РСР2 пептиды согласно настоящему изобретению, включают все композиции, где указанное соединение содержится в терапевтически эффективном количестве, т.е. количестве, эффективном для достижения желаемого медицинского эффекта у животного, которому проводят лечение. Фармацевтические композиции могут содержать эффективные фармацевтически приемлемые носители, биологически совместимые инертные вещества, приемлемые для введения животному (например, физиологический раствор), а также при соответствующих условиях композиции содержат вспомогательные средства (такие как наполнители, стабилизаторы или разбавители), способствующие преобразованию активных соединений в препараты, которые можно использовать в фармацевтических целях.

Фармацевтические композиции можно составлять любым приемлемым образом, удовлетворяющим требованиям конкретного способа введения. В литературе описано использование биоматериалов и других полимеров для доставки лекарственного средства, а также различные способы и модели для подтверждения правильного выбора конкретного способа введения. Также эффективны модификации соединений согласно изобретению для улучшения проникновения через гематоэнцефалический барьер.

Любой приемлемый способ введения может быть использован и определен специалистами в данной области. Например, введение можно осуществлять различными парентеральными способами, такими как подкожное, внутривенное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, интраназальное, трансдермальное, пероральное или буккальное введение. Парентеральное введение можно осуществлять болюсной инъекцией или постепенной перфузией в течение определенного времени. Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии, которые могут содержать известные в данной области вспомогательные средства или наполнители и могут быть получены общепринятыми способами. Кроме того, можно вводить суспензию активных соединений в виде соответствующих масляных суспензий для инъекции. Приемлемые липофильные растворители или носители включают жирные масла, например кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, например этилолеат или триглицериды.

Водные суспензии для инъекции, которые могут содержать вещества, повышающие вязкость суспензии, включают, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Необязательно, суспензия может также содержать стабилизаторы. Фармацевтические композиции включают растворы, приемлемые для введения инъекцией, и содержат от приблизительно 0,01 до 99%, предпочтительно от приблизительно 20 до 75% активного соединения вместе с наполнителем. Композиции, которые можно вводить ректально, включают суппозитории.

Понятно, что вводимая доза зависит от возраста, пола, состояния здоровья и массы реципиента, вида сопутствующего лечения, при наличии такого, частоты проведения лечения и природы желаемого эффекта. Дозу подбирают для конкретного субъекта, как понимает и определяет специалист в данной области. Суммарную дозу, необходимую для каждого лечения, можно вводить в виде многократных доз или в виде разовой дозы. Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно вводить отдельно или в сочетании с другими терапевтическими средствами, направленными против заболевания или направленными против других симптомов заболевания. Как правило, суточная доза активного ингредиента составляет от 0,01 до 100 мг на 1 кг массы организма.

Соединения согласно настоящему изобретению можно вводить пациенту внутривенно в фармацевтически приемлемом носителе, таком как физиологический раствор. Можно использовать общепринятые способы внутриклеточной доставки пептидов, например доставку посредством липосом. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Препараты согласно этому изобретению эффективны для парентерального введения, такого как внутривенное, подкожное, внутримышечное и внутрибрюшинное. Как хорошо известно в области медицины, дозы для любого пациента зависят от множества факторов, в том числе размера пациента, площади поверхности тела, возраста, конкретного соединения, подлежащего введению, пола, времени и способа введения, общего состояния здоровья и других параллельно вводимых лекарственных средств.

Все цитируемые в настоящей заявке ссылки включены сюда в качестве ссылки в полном объеме, включая все данные, таблицы, фигуры и текст, представленные в цитируемых ссылках. Кроме того, полное содержание ссылок, которые цитируются в цитируемых в настоящей заявке ссылках, также приведено здесь полностью в качестве ссылки. Ссылки на известные стадии способов, стадии общепринятых способов, известные способы или общепринятые способы никаким образом не являются признанием того, что какой-либо аспект, описание или вариант осуществления настоящего изобретения описан, указан или предположен в соответствующей области. Поняв особенности способов и продуктов, описанных в настоящей заявке, можно легко вывести необходимость и тип дополнительных стадий из обзора предшествующей области, а также из следующих ниже неограничивающих фигур и примеров, в которых

- 7 015339 описаны основные детали и некоторые варианты использования изобретения.

Описание чертежей

Фиг. 1 - ингибирование митогенной аткивности ЕСЕ2 посредством трансдуцированных ретровирусом Ы_1егт-РТХ3. (А) Анализ посредством вестерн-блоттинга для кондиционированной среды из клеток эндотелия аорты мыши (МАЕ), инфицированных ЕСЕР, полноразмерным ретровирусом человека РТХ3, ретровирусами 5С,_егт-РТХ3 или Н_е|11|-РТХ3. Две иммунореактивные полосы, присутствующие на дорожке для 5С,_егт-РТХ3. соответствуют гликозилированной и негликозилированной формам рекомбинантного белка¹⁰. (В) Инфицированные ретровирусом клетки МАЕ стимулировали с использованием ЕСЕ2 (0,55 нМ). Через 48 ч клетки обрабатывали трипсином и подсчитывали. Данные выражают в виде процента пролиферации, наблюдаемой у псевдоинфицированных клеток, обрабатываемых ЕСЕ2 (0,8 удвоения клеточной популяции). (С) Клетки СМ7373 инкубировали с использованием кондиционированной среды от инфицированных клеток МАЕ и сразу обрабатывали посредством 0,55 нМ ЕСЕ2. Через 24 ч клетки обрабатывали трипсином и подсчитывали. Данные выражают в виде процента пролиферации, наблюдаемой у клеток СМ7373, инкубируемых в свежей среде вместе с ЕСЕ2 (1,0 удвоения клеточной популяции). В В и С данные представляют собой среднее значение ±8И для 3 независимых экспериментов в трех сериях.

Фиг. 2 - ингибирование взаимодействия ЕСЕ2/РТХ3 посредством рекомбинантного Н_е|11|-РТХ3. (А) Рекомбинантный 6/НЕ-меченный Ы_1егт-РТХ3 и С_1егт-РТХ3 экспрессировали и очищали из трансформированных клеток Е. со11 (во вставке представлено окрашивание серебром геля 8И8-РАСЕ, в который поместили очищенные белки). Затем покрытые посредством ЕСЕ2 лунки инкубировали вместе с полноразмерным РТХ3, Н_е|11|-РТХ3 или С_1егт-РТХ3 (все при концентрации 44 нМ) в течение 30 мин при 37°С. Относительное количество белка, связавшегося с иммобилизованным ЕСЕ2, регистрировали иммунологическим способом посредством инкубации с поликлональным антителом кролика против РТХ3, как описано в Веществах и способах. (В) Покрытые посредством ЕСЕ2 лунки инкубировали вместе с биотинилированным РТХ3 (ЬРТХ3, 22 нМ) в отсутствие или при наличии 10-кратного молярного избытка полноразмерного РТХ3, Ы_1егт-РТХ3 или С_1егт-РТХ3. Затем измеряли количество ЬРТХ3, связавшегося с иммобилизованным ЕСЕ2, а данные выражали в виде процента связывания, измеряемого в отсутствие какоголибо конкурентного вещества. Все данные представляют собой среднее значение ±8И для 3 независимых экспериментов в трех сериях.

Фиг. 3 - картирование эпитопа РТХ3. (А) Полноразмерный РТХ3, Н_е|11|-РТХ3 и С_1егт-РТХ3 (200 нг/дорожка) анализировали вестерн-блоттингом с использованием моноклональных антител тАЬ-МИБ4 и тАЬ-16В5. (В) 128 перекрывающихся пептидов, состоящих из 13 мономеров, покрывающих всю последовательность РТХ3 человека, группировали на целлюлозных мембранах посредством способа 8РОТсинтеза. Затем на мембраны воздействовали антителами тАЬ-МИБ4 (черные столбцы) и тАЬ-16В5 (серые столбцы) и количественно определяли иммунокомплексы денситометрическим анализом мембран. Аминокислотная последовательность пептидов РТХ3, распознаваемая двумя антителами, представлена в виде однобуквенного кода курсивным шрифтом с подчеркиванием.

Фиг. 4 - тАЬ-МИВ4 препятствует взаимодействию ЕСЕ2/РТХ3. (А) Покрытые посредством ЕСЕ2 лунки инкубировали вместе с 22 нМ ЬРТХ3 в отсутствие или в присутствии полноразмерного РТХ3, тАЬ-МИВ4 или тАЬ-16В5 (все в концентрации 220 нМ). Затем измеряли количество ЬРТХ3, связавшегося с иммобилизованным ЕСЕ2, а данные выражали в виде процента связывания, измеряемого в отсутствие какого-либо конкурентного вещества. (В) Клетки СМ7373 инкубировали вместе с ЕСЕ2 (0,55 нМ) вместе с РТХ3 (220 нМ) в отсутствие или в присутствии тАЬ-МХВ4 или тАЬ-16В5 (оба в концентрации 2,2 мкМ). Через 24 ч клетки обрабатывали трипсином и подсчитывали. Данные выражают в виде процента пролиферации, наблюдаемой у клеток СМ7373, которые инкубируют только с ЕСЕ2. Все данные представляют собой среднее значение ±8И для 3 независимых экспериментов в трех сериях.

Фиг. 5 - ингибирование взаимодействия ЕСЕ2/РТХ3 синтетическими пептидами РТХ3. (А) Схематическое представление Ν-концевого РТХ3 человека и родственных синтетических пептидов РТХ3. (В) В лунки, покрытые указанными пептидами РТХ3 (200 мкг/лунка), добавляли ЕСЕ2 (80 нМ) и оценивали количество связавшегося ЕСЕ2. Данные, выраженные в виде процента количества ЕСЕ2, связавшегося с покрытыми РТХ3 лунками, представляют собой среднее значение ±8И для 3 независимых экспериментов в трех сериях. (С) Верхняя панель: вспрыскивали ЕСЕ2 (0,8 мкМ) над покрытыми РТХ3 или покрытыми желатином сенсорными чипами В1Асоге. Нижняя панель: лист сенсограммы, на котором представлено связывание ЕСЕ2 (0,1, 0,5, 0,8 и 1,1 мкМ) в возрастающих количествах с иммобилизованным РТХ3. Реакцию (в КП, резонансных единицах) регистрировали как функцию времени. (И) впрыскивали ЕСЕ2 (0,8 мкМ) над покрытым РТХ3 сенсорном чипом В1Асоге в присутствии возрастающих концентраций полноразмерного РТХ3 () или синтетических пептидов РТХ3 (82-110) (·) смешанного РТХ3(82-110) (о) или РТХЗ(57-85) (□). Регистрировали ответную реакцию по окончании впрыскивания и наносили на график как функцию концентрации антагониста. Для каждого пептида получали сходные результаты в 2-3 независимых экспериментах. (Е) Клетки СМ7373 инкубировали вместе с ЕСЕ2 (0,55 нМ) в отсутствие или в присутствии РТХ3 (220 нМ) или указанных пептидов РТХ3 (все в концентрации 66 мкМ). Данные,

- 8 015339 выраженные в виде процента пролиферации, наблюдаемой у клеток ОМ7373, которые инкубируют только с ЕСЕ2, представляют собой среднее значение ±8Ό для 3 независимых экспериментов в трех сериях.

Фиг. 6 - пептид РТХ3(97-110) как антагонист РОР2. (А) Схематическое представление перекрывающих пептидов РТХ3(82-110). (В) Лунки, покрытые указанными пептидами РТХ3 (200 мкг/лунка), инкубировали вместе с РОР2 (80 нМ) и оценивали количество связавшегося РОР2. Данные, выраженные в виде процента количества ЕСЕ2, связавшегося с покрытыми РТХ3 лунками, представляют собой среднее значение ±8Ό для 3 независимых экспериментов в трех сериях. (С) Впрыскивали РОР2 (0,8 мкМ) над покрытым РТХ3 сенсорным чипом ΒΙΑοοιό в присутствии возрастающих концентраций РТХ3 (82-110) (•) РТХ3(97-110) (о), РТХ3 (82-101) () или РТХ3(82-96) (▲). Регистрировали ответную реакцию по окончании впрыскивания и наносили на график как функцию концентрации антагониста. Для каждого пептида получали сходные результаты в 2-3 независимых экспериментах. (Ό) Клетки ОМ7373 инкубировали вместе с РОР2 (0,55 нМ) в отсутствие или в присутствии указанных пептидов РТХ3 (все в концентрации 66 мкМ). Данные, выраженные в виде процента пролиферации, наблюдаемой у клеток ОМ7373, которые инкубируют только с РОР2, представляют собой среднее значение ±8Ό для 3 независимых экспериментов в трех сериях. (Е) Впрыскивали ЕСЕ2 (0,8 мкМ) над покрытым РТХ3 сенсорным чипом ΒΙΑοοΓβ в присутствии возрастающих концентраций РТХ3(97-110) (·), РТХ3(100-110) (•), РТХ3 (97-104) (▲) или РТХ3 (97-107) (▼), РТХ3(104-113) (♦), РТХ3(100-113) (▲), РТХ3(100-104) (). Регистрировали ответную реакцию по окончании впрыскивания и наносили на график как функцию концентрации антагониста. Для каждого пептида получали сходные результаты в 2-3 независимых экспериментах.

Фиг. 7 - антиангиогенная активность пептида РТХ3(82-110). Фотографировали на 14 сутки хорионаллантоисную мембрану эмбриона цыпленка (САМ), имплантированную на 11 сутки вместе с гранулами альгината, содержащими носитель (а) или 16 пмоль РОР2 в отсутствие (Ь) или в присутствии (с) 3 нмоль РТХ3(82-110). Исходное увеличение, х5.

Примеры

Пример 1. Вещества и способы.

Химические вещества.

Рекомбинантный ЕСЕ2 человека (уникальный идентификатор 09038) и РТХ3 (уникальный идентификатор 8\\'155-Рго1 Р26022) экспрессировали в Е. οοΐί и клетках яичника китайского хомячка соответственно и очищали, как описано в ^10,19. Синтетические пептиды РТХ3(31-60), РТХ3(57-85) и РТХ3(107-132) человека получали из Рптт (М11ап, 11а1у), все остальные пептиды получали из Тсаю^си (Р1аиа άί Μοη(суста, Са§ег1а, Иа1у) (степень чистоты ВЭЖХ>95%). Аминокислотная последовательность для всех пептидов представлена в табл. 1 в виде однобуквенного кода, а нумерация начинается с метионинового остатка в положении 1 в лидерной последовательности РТХ3.

Таблица 1

Синтетические пептиды, покрывающие Ν-концевой РТХ3 человека

Пептид	Аминокислотная последовательность	8Εζ) Ιϋ ΝΟ:
РТХЗ(31-60)	□ΝΕΙϋΝΟίΗΡΤΕΟΡΤΡΟΟΟΟΟΕΗδΕννΟΚίΡ	8
РТХЗ(57-85)	□ΚίΓΙΜΙΕΝδΟΜΗΕΗΜίΙΟΑΤΟΟνίΡΟΕΙ	9
РТХЗ(82-110)	РСЕЕОРШЕЕЕСШАЕЗЕАРРСАР САРАЕ	10
Смешанный РТХЗ(82-110)	Е6ЬК6ЕЬК65КЕАЕЬЬКОААКАРАСР1РЕ	11
РТХЗ(107-132)	АРАЕАРЬТЗАЮЕЫОАТЯОАСНКЬА	12
РТХЗ(82-96)	КбЕкаНЬКЕЕЬСКЬА	13
РТХЗ(82-101)	ΡΟΕΕΟΡίΡΕΕίβΡΙΑΕΟίΑΚ	14
РТХЗ(97-110)	Е51АРРСАРСАРАЕ	5
РТХЗ(97-104)	Е81АРРСА	15
РТХЗ(97-107)	ЕБЬАРРСАРСА	6
РТХЗ(100-104)	АРРСА	7
РТХЗ(100-110)	АКРСАРОАРАЕ	16
РТХЗ(82-99)	КеЕЮКЬКЕЕЬбКЬАЕЗЬ	1
РТХЗ(105-110)	Р6АРАЕ	2
РТХЗ(97-99)	Е8Ь	3
РТХЗ(105-107)	РОА	4

Ранее были описаны моноклональные антитела крысы, направленные против очищенного РТХ3 человека^10,20 (МК1В1, номер в каталоге АЬХ-804-463, МКВ4, номер в каталоге АЬХ-804-464, А1ехй ΒίοсйетюаН).

Культуры клеток.

Эндотелиальные клетки аорты бычьего эмбриона ОМ7373²¹ выращивали на МЕМ Игла, содержа

- 9 015339 щей 10% эмбриональную телячью сыворотку (ЕС8). Клетки-упаковщики эмбриональной почки человека (ЕсоРаск2-293) (С1оп1сс11. С.А., И8А) выращивали на ЭМЕМ (Ы£е Тсе11по1од1ск. СаккегкЬигд, Μ.Ό.), содержащей 10% ЕС8. Эндотелиальные клетки аорты мыши Ва1Ь/с 22106 (клетки МАЕ) получали от Κ. АиегЬасй (Ишуегкйу о£ Уксопкш, Майкоп, У.к) и выращивали на ЭМЕМ с добавкой 10% ЕС8.

Ретровирусная инфекция.

кДНК, кодирующие РТХ3 человека и улучшенный зеленый флуоресцентный белок (ЕСЕР) получали, как описано в ¹⁷. кДНК, кодирующие ^концевой фрагмент РТХ3 (1-178) (Не|11|-РТХ3) и С-концевой фрагмент РТХ3(179-381), слитые с лидерной последовательностью для секреции РТХ3 (1-17) (кС1егтРТХ3), получали из рЬХ-РТХ3¹⁷ с использованием ПЦР общепринятых способов клонирования. Все кДНК клонировали в ретровирусный вектор рВАВЕ, получая таким образом рВАВЕ-РТХ3, рВАВЕ-Не|11|РТХ3, рВАВЕ-кС_1егт-РТХ3 и рВАВЕ-ЕСЕР, которые использовали для трансфицирования клетокупаковщиков ЕсоРаск2-293 в присутствии липофектамина¹⁷. Трансдуцированные клетки отбирали в течение 2 недель с использованием пуромицина (1 мкг/мл, 81дта). Для дальнейших экспериментов использовали клоны с титром вирусов, превышающим 10⁶ колониеобразующих ед./мл. Затем достигшие смыкания монослоя культуры клеток МАЕ инкубировали в течение 24 ч вместе с кондиционированной средой от рВАВЕ-РТХ3, рВАВЕ-Н_1егт-РТХ3, рВАВЕ-кС_1егт-РТХ3 или клеток-упаковщиков рВАВЕ-ЕСЕР в присутствии полибрена (8 мкг/мл, 81дта). Популяции инфицированных клеток отбирали в течение 7 суток с использованием пуромицина. При наблюдении инфицированных ЕСЕР клеток посредством эпифлуоресцентной микроскопии (микроскоп Ахюуей 8100, х 10/0,25; 2ек§, Сойшдеп, Сегтапу) было выявлено, что эффективность ретровирусной инфекции превышала 80%. Для оценки уровней экспрессии и высвобождения трансгенного белка инфицированными клетками выращивали в течение 2 суток клеточные культуры в не содержащих сыворотку условиях. Затем кондиционированные среды собирали, очищали центрифугированием, 10-кратно концентрировали с использованием фильтров СеШпсоп УМ-10 (М1Шроге) и анализировали аликвоты 100 мкл посредством анализа вестерн-блоттингом.

Анализ пролиферации клеток.

Анализ клеточной пролиферации для эндотелиальных клеток проводили, как описано в ²². Вкратце, клетки СМ7373 или МАЕ высевали в 96-луночные планшеты при 75000 клеток/см² или 25000 клеток/см² соответственно. Через 16 ч клетки инкубировали в свежей среде, содержащей 0,4% ЕС8 вместе с ЕСЕ2 (0,55 нМ), в отсутствие или в присутствии различных антагонистов. Через 24 или 48 ч соответственно клетки обрабатывали трипсином и подсчитывали в камере Бюркера.

Экспрессия и очистка фрагментов рекомбинантного 6хНк-меченного РТХ3 из Е. Со11.

Амплифицировали кДНК К_егт-РТХ3 и С’1егт-РТХ3 из рЬХ-РТХ3 посредством ПЦР с использованием праймеров, содержащих дополнительные нуклеотиды

РТХ3-Ы:

(+) САСССАСААСТСОСАТСАТТАТОА 8 (ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 17);

(-) ТТААССТССССССАСССАССТСС (5Εβ Ю ΝΟ: 18);

РТХ3-С:

( + ) САССТОТОАААСАССТАТТТТА (ЗЕ<2 Ю ΝΟ: 19);

(-) ТТАТСАААСАТАСТОАССТСС (ЗЕ<2 Ю ΝΟ; 20) .

Эти кДНК клонировали в вектор рЕКТВ Т0Р0 (набор для клонирования рЕХТВ Ойес1юпа1 Т0Р0, Шуйгодеп) и проводили секвенирование. Затем с использованием способа Са1е^ау© (ЗпуЦгодеп) кДНК Н_епп-РТХ3 и С_1егт-РТХ3 из вектора рЕХТВ Т0Р0 клонировали в вектор рОЕ8Т17, обеспечивая вставку 6хНк-метки в С-концевой участок рекомбинантных белков. Затем клетки Е. со11 ВИ21 -А! ([пуЦгодеп) трансформировали посредством двух рекомбинантных плазмид и выращивали при 37°С в среде ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Экспрессию рекомбинантного белка индуцировали посредством инкубации в течение ночи при 30°С в присутствии 0,2% Ь-арабинозы. После индукции клетки ресуспендировали в буфере для связывания (20 мМ фосфата натрия, 0,5М №С1, 10 мМ имидазола, рН 7,4) и лизировали воздействием ультразвука. Очищенные супернатанты фильтровали через фильтр 0,45 мкм и помещали для очистки в аффинную колонку с иммобилизованным металлом (ГМАС) Н1Тгар, с никелем, объемом 3,0 мл (Атегкйат Вюкаепсек). Колонку промывали 100 мМ имидазола в буфере для связывания и элюировали связавшиеся белки с использованием 300 мМ имидазола в соответствии с указаниями производителя. Фракции анализировали на предмет наличия рекомбинантного белка посредством иммуноблоттинга, а положительные фракции собирали и обессоливали гельфильтрационной хроматографией (колонка сефадекс С25 РОК), Атегкйат) в РВ8. Степень чистоты рекомбинантных белков превышала 90%, как оценивали посредством 8П8-РАСЕ с последующим окрашиванием геля серебром (см. вставку в фиг. 2А).

Твердофазный анализ связывания.

Микропланшеты для ЕЫБА инкубировали в течение 16 ч при 4°С вместе с 100 мкл/лунка 100 мМ NаНС0з, рН 9,6 (буфер для нанесения покрытия), содержащим ЕСЕ2 (270 нМ). Затем лунки в течение 2 ч при комнатной температуре покрывали 5% сухим молоком в буфере для нанесения покрытия. После этого аликвоты РВ8 100 мкл, содержащие полноразмерный РТХ3, рекомбинантный Н;_егт-РТХ3 или С_1е1т

- 10 015339

РТХ3 (все в концентрации 44 нМ), инкубировали в течение 30 мин при 37°С в лунках, покрытых ЕСЕ2. Затем лунки последовательно инкубировали в течение 1 ч при 37°С вместе с поликлональным антителом кролика против РТХ3 (разведение 1:2000), распознающим оба фрагмента РТХ3 с одинаковой эффективностью в вестерн-блоттинге и ЕБ18А, биотинилированным антителом против кролика (1:2000) и 100 мкл стрептавидин-пероксидазы хрена (1:5000, Атегкбат) в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого добавляли 100 мкл/лунка хромогенного субстрата в виде 2,29-азин-бис(3этилбензтиазолинсульфоновой кислоты). Величины поглощения регистрировали при 405 нм на автоматическом считывающем устройстве для ЕЫ8А. В некоторых экспериментах аликвоты РВ8 100 мкл, содержащие меченный биотином РТХ3 (ЬРТХ3) (22 нМ), инкубировали в течение 30 мин при 37°С в покрытых ЕСЕ2 лунках в присутствии или отсутствие конкурирующих веществ. Затем лунки промывали и оценивали количество связавшегося ЬРТХ3, как описано в ¹⁷. Альтернативно, фиксировали синтетические пептиды РТХ3 в лунках микропланшета для ЕЫ8А (200 мкг/лунка), как описано выше. После этого добавляли ЕСЕ2 (80 нМ) и оценивали количество ЕСЕ2, связавшегося с иммобилизованными пептидами, посредством инкубации в течение 1 ч при 37°С вместе с поликлональным антителом кролика против ЕСЕ2 (1:7000) с последующей регистрацией иммунокомплекса, как описано выше.

Картирование эпитопа РТХ3.

Для выявления аминокислотной последовательности эпитопов, связывающихся с моноклональными антителами против РТХ3, группировали 128 пептидов на целлюлозных мембранах с использованием способа 8РОТ-синтеза²³. Длина пептидов составляла 13 аминокислот при 3-аминокислотном сдвиге рамки считывания. Мембраны блокировали 2% молоком в Т\уееп-ТВ8 (МВ8) в течение 16 ч при 4°С. После промывки мембраны инкубировали в течение 90 мин при 37°С вместе с моноклональными антителами тАЬ ΜΝΒ4 или тАЬ 16В5 (оба при разведении 1:1000 в МВ8), а затем инкубировали в течение 90 мин при 37°С вместе с конъюгированным со щелочной фосфатазой 1§С кролика против крысы (1:30000, 81дта) в МВ8. Получали реакцию окрашивания, как описано в ²³, и оценивали интенсивность сигнала денситометрическим анализом мембраны.

Анализ связывания В1Асоге.

Использовали устройство В1Асоге X (В1Асоге 1пс, Ркса1а\уау. Νί). Для измерения изменений показателя преломления, которые обусловлены способностью ЕСЕ2 связываться с РТХ3, иммобилизованным на сенсорном чипе В1Асоге, использовали поверхностный плазмонный резонанс. С этой целью позволяли РТХ3 (2,2 мкМ) взаимодействовать с проточной ячейкой в сенсорном чипе СМ4, которая была предварительно активирована посредством 50 мкл смеси 0,2М гидрохлорида №этил-Ы'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и 0,05 М Ν-гидроксисукцинимида. Эти экспериментальные условия обеспечивали иммобилизацию 5000 резонансных единиц (КИ), соответствующих приблизительно 0,1 пмоль РТХ3. Сходные результаты получали для иммобилизации желатина, используемого в настоящей заявке в качестве отрицательного контроля, и для вычитания фоновых значений. Затем ЕСЕ2 в возрастающих концентрациях в присутствии или отсутствие синтетических пептидов РТХ3 в буфере для разведения (РВ8 вместе с 0,005% поверхностно-активным веществом Р20, 5,0 мкг/мл СаС1₂ и МдС1₂) впрыскивали в течение 4 мин над поверхностью РТХ3 (для обеспечения их связывания с иммобилизованным РТХ3), а после этого промывали до тех пор, пока не наблюдали диссоциации.

Анализ с использованием хорионаллантоисной мембраны эмбриона цыпленка (САМ).

Альгинатные гранулы (5 мкл), содержащие носитель или 16 пмоль ЕСЕ2 в присутствии или отсутствии синтетических пептидов РТХ3, получали, как описано в ²⁴, и помещали на верхнюю поверхность САМ из оплодотворенных яиц цыплят породы белый леггорн после 11 суток инкубации (10 яиц на экспериментальную группу). Через 72 ч подсчитывали количество сходящихся к имплантату кровеносных сосудов посредством двух наблюдений двойным слепым способом с использованием стереомикроскопа (8ТЕМ1-8К, х2/0,12; гекз).

Результаты.

Ν-Концевой участок РТХ3 связывает ЕСЕ2.

Белок РТХ3 характеризуется С-концевым доменом из 203 аминокислот (С_1епт-РТХ3), обладающим гомологией с классическими короткими пентраксинами СКР и 8АР, и Ν-концевым удлиняющим участком из 178 аминокислот (И_1е1т-РТХ3), для которого не показано какой-либо значительной гомологии с каким-либо известным белком⁸. При попытке выявить антиангиогенный, связывающий ЕСЕ2 домен(ы) РТХ3 оценивали два участка С_1егт или Н_егт-РТХ3 на предмет их способности взаимодействовать с ЕСЕ2.

В ходе предшествующих наблюдений было показано, что сверхэкспрессия полноразмерного РТХ3 приводит к ингибированию зависящей от ЕСЕ2 пролиферации клеток эндотелия, что обусловлено связыванием высвобождаемого РТХ3 с экзогенным фактором роста и его блокированием во внеклеточной среде¹⁷. Исходя из этого, эндотелиальные клетки аорты мыши (МАЕ) инфицировали ретровирусами, содержащими полноразмерный РТХ3 человека, Ν-концевой удлиняющий участок РТХ3 Н_егт-РТХ3 или Сконцевой участок РТХ3, слитые с лидерной последовательностью РТХ3 для секреции (§С_|егт-РТХ3). Контрольные клетки инфицировали посредством ретровируса, содержащего ЕСЕР. Инфицированные клетки сверхэкспрессировали и высвобождали соответствующие белки в сходных количествах (фиг. 1А), и для них наблюдали сходную скорость роста в основных условиях. Однако сверхэкспрессия Н_егт-РТХ3 вы

- 11 015339 звала значительное снижение способности инфицированных клеток к пролиферации в ответ на экзогенный РСР2, что является сходным со сверхэкспрессией полноразмерного РТХ3 (фиг. 1В). В отличие от этого, сверхэкспрессия 5С_1е|т-РТХ3 не вызывала ингибирования в сравнении с контрольными клетками, инфицированными посредством ЕСРР.

Для дополнительной оценки способности Н_е|т|-РТХ3 действовать в качестве антагониста РСР2 оценивали кондиционированные среды от инфицированных клеток МАЕ на предмет способности воздействовать на зависящую от РСР2 пролиферацию эндотелиальных клеток СМ7373 (фиг. 1С). Как и предполагали, инкубация клеток СМ7373 вместе с РСР2 в присутствии кондиционированной среды от клеток МАЕ, инфицированных посредством Н_е|т|-РТХ3 или РТХ3, вызывала значительное ингибирование митогенной активности фактора роста, тогда как кондиционированные среды от клеток МАЕ, инфицированных посредством 5С_1е|т|-РТХ3 и ЕСРР, были неэффективными (фиг. 1С). Ни одна из кондиционированных сред не вызывала значительного ингибирования пролиферации клеток СМ7373, запускаемой посредством 10% РС8, что тем самым подтверждает специфичность эффекта.

Для подтверждения того, что активность Ы_1егт-РТХ3 как антагониста РСР2 была обусловлена его способностью непосредственно взаимодействовать с фактором роста, Ы_1егт-РТХ3 экспрессировали и очищали из трансформированных клеток Е. со11 в виде рекомбинантного 6хН18-меченного белка; в качестве контроля использовали очищенный рекомбинантный 6хНк-меченный С_1егт-РТХ3 (фиг. 2А, вставка). При оценке взаимодействия РСР2 у полноразмерного РТХ3 и фрагмента рекомбинантного Ы_1егт-РТХ3 наблюдали способность связываться с РСР2, иммобилизованным на пластмассе для нетканевых культур. В отличие от этого, для рекомбинантного С_1егт-РТХ3 взаимодействия не наблюдали (фиг. 2А). Соответственно, 10-кратный молярный избыток рекомбинантного Ы_1егт-РТХ3 или полноразмерного РТХ3, но не С_|егт-РТХ3, предотвращал связывание биотинилированного РТХ3 (ЬРТХ3) с иммобилизованным РСР2 (фиг. 2В).

Взятые вместе эти результаты означают, что за связывание с РСР2 ответственен Ν-концевой участок РТХ3.

Ингибирование взаимодействия РСР2/РТХ3 моноклональным антителом против Н_егт-РТХ3.

При скрининге набора моноклональных антител крысы, получаемых против полноразмерного РТХ3 человека, были выявлены антитела тЛЬ-М№4²⁰ (ΜΝΒ4, номер в каталоге ЛЬХ-804-464, А1ехк Вюсйетъ сак) и тАЬ-16В5¹⁰ (ΜΝΒ1, номер в каталоге ЛЬХ-804-463, А1ехк Вюсйетюак), которые при вестернблоттинге избирательно связывают рекомбинантный ЭД_ет-РТХ3 и С_|егт-РТХ3, соответственно (фиг. 3А).

Для картирования эпитопов РТХ3, распознаваемых двумя антителами, авторы изобретения использовали преимущество способа 8РОТ-синтеза²³, посредством которого на целлюлозной мембране группировали 128 перекрывающихся, состоящих из 13 мономеров пептидов, охватывающих всю последовательность РТХ3 человека. В случае воздействия на мембрану двумя моноклональными антителами при регистрации иммунокомплекса было выявлено, что тАЬ-МЫВ4 распознает эпитоп РТХ3(87-99), представленный на Ν-концевом удлиняющем участке РТХ3, тогда как тАЬ-16В5 распознает эпитоп РТХ3(306-312), расположенный на С-концевом участке РТХ3 (фиг. 3В).

При тестировании способности воздействовать на взаимодействие РСР2/РТХ3 тАЬ-М№4, но не тАЬ-16В5, препятствует способности ЬРТХ3 связывать зафиксированный РСР2, что сходно со случаем молярного избытка свободного немеченого РТХ3 (фиг. 4А). Соответственно, тАЬ-М№4 устраняет способность полноразмерного РТХ3 ингибировать митогенную активность, вызываемую РСР2 у эндотелиальных клеток СМ7373, тогда как тАЬ-16В5 является неэффективным (фиг. 4В). Таким образом, тАЬΜNΒ4, распознающее Ν-концевой эпитоп РТХ3(87-99), нейтрализует взаимодействие РСР2/РТХ3.

Синтетические Н_е|т|-РТХ3-родственные пептиды как антагонисты РСР2.

Для дальнейшего определения связывающего РСР2 участка в Ν-концевом удлиняющем участке РТХ3 авторы изобретения оценивали активность синтетического пептида РТХ3(82-110) как антагониста РСР2, где пептид содержит эпитоп РТХ3(87-99), распознаваемый нейтрализующим тАЬ-МХВ4 (см. выше), вместе с тремя отдельными синтетическими пептидами РТХ3(31-60), РТХ3(57-85) и РТХ3(107-132), частично покрывающих аминокислотную последовательность ЭД_ет-РТХ3 (фиг. 5А).

В первом наборе экспериментов четыре синтетических фрагмента РТХ3 оценивали на предмет их способности взаимодействовать с РСР2 в твердофазном анализе связывания. Как представлено на фиг. 5В, свободный РСР2 связывается с РТХ3(82-110), иммобилизованным на пластмассе для нетканевых культур, но не с иммобилизованным РТХ3(31-60) или РТХ3(57-85), проявляя лишь ограниченное взаимодействие с иммобилизованным РТХ3(107-132).

Затем использовали поверхностный плазмонный резонанс для оценки способности четырех пептидов воздействовать на взаимодействие РСР2/РТХ3. Результаты показывают, что РСР2 (0,8 мкМ) с высокой эффективностью связывается с РТХ3, иммобилизованным на сенсорном чипе В1Асоге, (350-400 резонансных единиц, связавшихся по окончании стадии впрыскивания) (фиг. 5С, верхняя панель). Специфичность взаимодействия показывают посредством отсутствия связывания с сенсорным чипом, покрытым желатином. Кроме того, для оценки кинетических параметров взаимодействия РСР2/РТХ3 на поверхность РТХ3 впрыскивали РСР2 в возрастающих концентрациях (от 0,1 до 1,1 мкМ, фиг .5 С, нижняя

- 12 015339 панель). Данные по связыванию показывают, что взаимодействие происходит с кинетической константой диссоциации (к_дис), составляющей 6х10^-5 с^-1, и кинетической константой ассоциации (кас), составляющей 0,2х10³ с^-1-М^-1, тем самым приводя к величине Кд, равной 0,3х10’⁶ М^-1. Исходя из этого, четыре синтетических пептида РТХ3 оценивали на предмет их способности блокировать ЕОЕ2 в подвижной фазе, предотвращая тем самым его взаимодействие с сенсорным чипом РТХ3. Как представлено на фиг. 5Ό, РТХ3(82-110) ингибирует связывание ЕОЕ2 с поверхностью РТХ3 зависящим от дозы образом при эффективности в 30 раз ниже, чем эффективность, наблюдаемая для свободного полноразмерного РТХ3 (ГО50 равно 1,0 мкМ и 30 мкМ для свободного РТХ3 и пептида РТХ3(82-110) соответственно). В отличие от этого, в тех же самых экспериментальных условиях не наблюдали ингибирующего эффекта, вызываемого пептидами РТХ3(31-60), РТХ3 (57-85) и РТХ3(107-132) (фиг. 5Ό и другие полученные данные). Кроме того, для смешанного синтетического пептида с аминокислотным составом, совпадающим с РТХ3(82-110) [§РТХ3(82-110), табл. 1], наблюдали ограниченный ингибирующий эффект (ГО₅₀>3000 мкМ) (фиг. 5Ό), что тем самым указывает на важность первичной аминокислотной последовательности в РТХ3(82-110) для взаимодействия с ЕОЕ2.

Способность пептида РТХ3(82-110) связывать РСР2 побудила авторов изобретения оценить его способность действовать в качестве антагониста РСР2. При тестировании на эндотелиальных клетках СМ7373 и полноразмерный РТХ3, и РТХ3(82-110) ингибируют митогенную активность, вызываемую экзогенным РСР2, тогда как смешанный пептид РТХ3(82-110), пептиды РТХ3(31-60), РТХ3(57-85) и РТХ3(107-132) были неэффективны (фиг. 5Е). Кривые доза-эффект подтверждали, что активность РТХ3(82-110) как антагониста ЕСЕ2 являлась зависящей от дозы (ГО₅₀ равно 30 мкМ и 30 нМ для РТХ3 (82-110) и РТХ3 соответственно).

Выявление минимальной линейной связывающей ЕСЕ2 последовательности в Ν-концевом удлиняющем участке РТХ3.

Взятые вместе представленные выше данные указывают на то, что линейная последовательность аминокислот 82-110 в Ν-концевом удлиняющем участке РТХ3 играет важную роль во взаимодействии с ЕСЕ2. При попытке выявить минимальную линейную связывающую ЕСЕ2 последовательность три перекрывающихся синтетических пептида РТХ3(82-96), РТХ3(82-101) и РТХ3(97-110), охватывающих всю последовательность РТХ3(82-110) (фиг. 6А и табл. 1), оценивали на предмет способности взаимодействовать с ЕСЕ2 в твердофазном анализе связывания. В одних и тех же экспериментальных условиях свободный ЕСЕ2 связывается с иммобилизованным РТХ3(97-110), а также с родительским РТХ3(82-110) и полноразмерным РТХ3 при отсутствии взаимодействия с РТХ3(82-96) или РТХ3(82-101) (фиг. 6В). Соответственно, РТХ3(97-110) связывает ЕСЕ2 в подвижной фазе, предотвращая тем самым его взаимодействие с РТХ3, иммобилизованным на сенсорном чипе В1Асоге (фиг. 6С). Ингибирующая активность РТХ3(97-110) была сходной с активностью, наблюдаемой для родительского пептида РТХ3(82-110), тогда как РТХ3(82-96) и РТХ3(82-101) были неэффективны (фиг. 6С). В соответствии с этими наблюдениями РТХ3(97-110), но не РТХ3(82-96) или РТХ3(82-101), ингибирует митогенную активность, вызываемую ЕСЕ2 у эндотелиальных клеток СМ7373 (фиг. 6Ό).

Для дальнейшего исследования минимальной линейной связывающей ЕСЕ2 последовательности, охватывающей пептид РТХ3(97-110), авторы изобретения анализировали связывание представленных ниже более коротких пептидов с ЕСЕ2 посредством измерения их взаимодействия с РТХ3, иммобилизованным на сенсорном чипе В1Асоге: РТХ3(97-107), РТХ3(97-104), РТХ3(100-104) и РТХ3(100-110) (фиг. 6Е). Для пептидов РТХ3(97-107) и РТХ3(100-104) наблюдали значительное связывание с ЕСЕ2. В отличие от этого пептиды РТХ3(97-104) и РТХ3(100-110) не предотвращали связывание свободного ЕСЕ2 с РТХ3, иммобилизованным на сенсорном чипе В1Асоге (фиг. 6Е). Таким образом, по-видимому, РТХ3(100-104) представляет собой минимальную линейную связывающую ЕСЕ2 последовательность аминокислот в Ν-концевом удлиняющем участке РТХ3. Соответственно, РТХ3(100-104) ингибирует индуцируемую ЕСЕ2 пролиферацию эндотелиальных клеток.

Синтетические Н_е|11|-РТХ3-родственные пептиды ингибируют ангиогенную активность ЕСЕ2.

Для оценки способности Н_ег|1|-РТХ3-родственных пептидов воздействовать на индуцируемое ЕСЕ2 образование новых сосудов ίη νίνο на верхнюю поверхность САМ эмбриона цыпленка в возрасте 11 суток имплантировали желатиновые губки с адсорбированным ЕСЕ2 в отдельности или с добавкой пептидов РТХ3. Как представлено на фиг. 7, альгинатные гранулы с адсорбированным ЕСЕ2 (16 пмоль/эмбрион) вызывают сильную ангиогенную реакцию при сравнении с гранулами, на которых адсорбирован носитель (число макроскопических сосудов, сходящихся по направлению к имплантату, равно 44±7 и 11±5 сосудов/эмбрион для двух экспериментальных групп соответственно). В соответствии с наблюдениями ίη νίίτο зависящая от ЕСЕ2 ангиогенная реакция ίη νίνο была значимо снижена (28±5 сосудов/эмбрион, р<0,05 при ΑΝΟνΑ) в результате добавления 3,0 нмоль пептида РТХ3(82-110) к имплантатам ЕСЕ2 (фиг. 7). Соответственно, 80 нмоль РТХ3(97-110) вызывали 50% ингибирование ангиогенной реакции, вызываемой посредством ЕСЕ2; в отличие от этого РТХ3(82-96) эффекта не оказывал.

Обсуждение.

Авторами изобретения показано, что взаимодействие с ЕОЕ2 опосредуется Ν-концевым удлиняю

- 13 015339 щим участком в РТХ3. Кроме того. в экспериментах. проведенных с использованием нейтрализующих моноклональных антител и синтетических. родственных РТХ3 пептидов. выявлена линейная последовательность аминокислот РТХ3(97-110) как ответственная за это взаимодействие. Эти выводы основаны на следующих экспериментальных данных: ί) короткие пентраксины СКР и 8АР являются неэффективными связывающими ЕСЕ2 веществами¹⁷. несмотря на гомологию их последовательностей с С-концевым участком РТХ3⁷; ίί) ретровирусная трансдукция Ν-концевого фрагмента РТХ3(1-178) (Н_сгт-РТХ3). но не кС_!сгт-РТХ3. ингибирует митогенную активность. вызываемую экзогенным ЕСЕ2 у эндотелиальных клеток; ίίί) рекомбинантный Х_вгт-РТХ3. но не С_1сгт-РТХ3. связывается с иммобилизованным ЕСЕ2 и ингибирует взаимодействие РТХ3/ЕСЕ2; ίν) моноклональное антитело ιηΛό-ΜΝΒ4. посредством которого картировали линейный эпитоп РТХ3(87-99). предотвращает взаимодействие ЕСЕ2/РТХ3 и устраняет активность РТХ3 как антагониста ЕСЕ2 у эндотелиальных клеток; ν) синтетический пептид РТХ3(82-110) и более короткие пептиды РТХ3(97-110). РТХ3(97-107) и РТХ3(100-104). но не другие пептиды на основе различных областей Ν-концевого участка РТХ3. предотвращают взаимодействие ЕСЕ2/РТХ3 посредством связывания ЕСЕ2. ингибируя тем самым зависящую от ЕСЕ2 пролиферацию эндотелиальных клеток ίη ν^(^о и ангиогенез ίη угуо.

РТХ3 продуцируется макрофагами²⁷. фибробластами⁹. миобластами²⁸. микроглией²⁹ и эндотелиальными клетками⁸. что указывает на то. что РТХ3 может обладать паракринной и аутокринной функциями в отношении эндотелия. Сходным образом. различные стимулирующие сигналы. в том числе медиаторы воспаления 1Ь-1 и оксид азота³⁰.³¹. индуцируют экспрессию ЕСЕ2 в эндотелиальных клетках. вовлеченных в аутокринную петлю стимуляции. Таким образом. эндотелиальные клетки и клетки других типов могут экспрессировать и РТХ3. и ЕСЕ2. Соответственно. РТХ3. продуцируемый воспалительными клетками или самими эндотелиальными клетками. может воздействовать на аутокринное и паракринное действие. оказываемое ЕСЕ2 на эндотелий ίη ν^(^о и ίη угуо. Это должно обеспечивать точную регуляцию образования новых сосудов посредством продукции и ингибиторов и стимуляторов ангиогенеза.

ЕСЕ2 представляет собой плейотропный фактор роста. стимулирующий различные типы клеток энтодермального и мезодермального происхождения³². Соответственно. роль. которую играет ЕСЕ2 при различных патофизиологических состояниях. не ограничена его ангиогенной активностью. Например. ЕСЕ2 стимулирует миграцию и пролиферацию фибробластов в ходе заживления ран. а также гладкомышечных клеток в ходе атеросклероза^33.34 и рестеноза³⁵. Кроме того. он способствует выживанию нейронов и пролиферации глиальных клеток в поврежденной центральной нервной системе³⁶. При всех этих состояниях сопутствующая продукция РТХ3³⁷.³⁸ регулирует действие. оказываемое ЕСЕ2 на такие клетки. Действительно. РТХ3 ингибирует зависящую от ЕСЕ2 активацию гладкомышечных клеток ίη уйго и утолщение интимы после повреждения артерий ίη νί\Ό¹⁸.

В заключение. авторами изобретения впервые показано. что Ν-концевой участок РТХ3 вовлечен во взаимодействие с ЕСЕ2. РТХ3 представляет собой полифункциональный растворимый рецептор распознавания структур на пересечении врожденного иммунитета. воспаления. отложения матрикса и способности к оплодотворению у женщин. Он проявляет свою полифункциональную активность посредством взаимодействия с множеством лигандов с различными молекулярными свойствами.

Ссылки

1. Саг1апба С.. ВоШ^1 В.. ВакЮпс Α.. Мап!оуап А. РсгИгахтк а! 1Нс сгоккгоабк Ьс!уссп шиа!с 1ттипйу. тПаттабоп. та!пх бсрокйюп. апб Гста1с £сгй1йу. Аппи Ксу Iттиηо1. 2005; 23:337-366.

2. 8!сс1 Ό.Μ.. ^кйсксаб А.8. Ткс та)ог аси!с ркакс гсас1ап1к: С-гсасбус рго!ст. ксгит ату1о1б Р сотропсп! апб ксгит ату1о1б А рго!ст. Iттиηо1 Тобау. 1994; 15:81-88.

3. Рсрук М.В.. Βη11ζ М.Ь. Аси!с ркакс рго!стк \\ЙН крсс1а1 гсГсгспсс !о С-гсасбус рго!ст апб гс1а!сб рго!стк (рсп1ахтк) апб ксгит ату1о1б А рго!ст. Абу 1ттипо1. 1983; 34:141-212.

4. Эи С1ок Т.^. Ткс т!сгас!юп оГ С-гсас!гус рго!ст апб ксгит ату1о1б Р сотропсп! уйк пис1саг ап!1дспк. Мо1 Вю1 Кср. 1996; 23:253-260.

5. Ссуиге Η.. ΖΗηη§ Х.Н.. Ьт! Т.Е. 8!гис!игс апб Гппсбоп оГ 111с рспбахтк. Сигг Ορίη 1ттипо1. 1995; 7:54-64.

6. №ш1а А.1. ЭаНа М.К.. уап Коо!сп С.. Коок А. Кссодпйюп апб с1сагапсс оГ арор!о!ю сс11к: а го1с Гог сотр1стсп! апб рспйахтк. Тгспбк 1ттипо1. 2003; 24:148-154.

7. Сообтап А.К.. Са^боζо Т.. АЬадуап К.. А1!тсусг А.. \У1кшсукк1 Н.С.. У11сск ί. Ьопд рсгИгахтк: ап стсгдтд дгоир оГ рго!стк уйк бгусгкс Гипсбопк. Су!октс Сго\\1к Еас!ог Ксу. 1996; 7:191-202.

8. Вгсу1апо Е.. б'Ашс11о Е.М.. Со1ау 1.. Рсп С.. Βо!ίаζζ^ В.. Вакоск А.. 8ассопс 8.. Магас11а К.. Ргс63ζζι V.. Косск М.. с! а1. 1п!сг1сикт-1-тбис1Ь1с дспск ίη спбо!кс11а1 сс11к. С1ошпд оГ а псу дспс гс1а!сб !о Сгсасйус рго!ст апб ксгит ату1о1б Р сотропсп!. 1. Вю1. Скст. 1992; 267:22190-22197.

9. Ьсс С.\У.. Ьсс Т.Н.. ^1сск ί. Т8С-14. а !итог пссгобк ГасЮг- апб 1Е-1-тбис1Ь1с рго!ст. ίκ а поус1 тстЬсг оГ !кс рсп!ахт Гатбу оГаси!с ркакс рго!стк. ί. 1ттипо1. 1993; 150:1804-1812.

10. Во1б^1 В.. Vои^с!-С^аν^а^^ V.. Вак!опс А.. Ос Сю1а Ь.. Майсисс1 С.. Рсп С.. 8ргсаПсо Е.. Райка М.. О'ЕИоггс С.. С^аηаζζа Е.. ТадкаЬис А.. 8а1топа М.. Тсбсксо Е.. 1п1гопа М.. Мап!оуат А. МиШтсг Гогта!юп апб кдапб гссодпйюп Ьу !кс 1опд рспбахт РТХ3. 81тйагйюк апб бйЕсгспсск уйк !кс кког! рспйахтк С-гсасбус рго!ст апб ксгит ату1о1б Р сотропсп!. 1. Вю1. Скст. 1997; 272:32817-32823.

- 14 015339

11. Ваб1е А., 81са А., б'Аше11о Е., Вгеу1апо Е., Сагпбо 6., СакГе11апо Μ., ΜαηΙοναηί А., 1пГгопа М. С11агас1сп/а11оп оГ (Не рготоГег Гог (Не Нитап 1опд репбахт РТХ3. Во1е о! ΝΕ-карраВ ίη (итог песго515 Гас(ог-а1рНа апб 1п(ег1еик1п-1 Ье(а геди1абоп. 1. Вю1. СНет. 1997, 272:8172-8178.

12. 8а1икГг1 А., 6аг1апба С., НбксН Е., Эе Асебк М., Массадпо А., Во(Ь^1 В., Иош А., ВакГопе А., МапГоташ 6., Веск Рессои Р., 8а1та(оп 6., МаНопеу Ό.Ι., Иау А.к, 81гасика 6., Воташ Ь., МапГоташ А. РТХ3 р1аук а кеу го1е ш (Не огдашхаНоп оГ (Не сити1ик оорНогик ехГгасе11и1аг таГбх апб ш ш у|уо Гег(|Нхабоп. Оете1ортеп(. 2004; 131:1577-1586.

13. 6аг1апба С., НбксН Е., Вохха 8., 8а1ик(п А., Эе Асебк М., №(а В., Массадпо А., В1уа Е., Во((ахх1 В., Реб 6., Иош А., Уадо Ь., Вобо М., Эе 8апбк В., Сагтшаб Р., 8пасика 6., АНгиба Е., УессН А., Воташ Ь., МапГоташ А. №п-гебипбап( го1е о Г (Не 1опд репбахт РТХ3 ш ап(1-Гппда1 1ппаГе 1ттипе гекропке. №Гиге. 2002, 420:182-186.

14. МапГоташ А., 6аг1апба С., Во((ахх1 В. Репбахт 3, а поп-гебипбап( ко1иЫе раГГегп гесодшбоп гесер(ог бггокеб ш 1ппаГе 1ттипйу. Уассше. 2003; 21 8ирр1 2:843-47.

15. 6егушк Р., 8ко1бепЬегд Е., Оаеккоп-\Уе1кН Ь. Еипсбоп оГ бЬгоЫакГ дго\т(Н ГасГогк апб уакси1аг епбо(НеНа1 дго\т(Н ГасГогк апб (Не1г гесерГогк ш аидюдепебк. СбГ Вет. Опсо1. НетаГо1. 2000; 34:185-194.

16. Ргек1а М., Ие11'Ега Р., Мйо1а 8., Могош Е., Вопса В., Викпаб М. Е1ЬгоЬ1акГ дго\т(Н ГасГог/йЬгоЫакГ дго\т(Н ГасГог гесерГог кукГет ш аидюдепебк. СуГокше Сго\т(Н ЕасГог Вет. 2005; 16:159-178.

17. Викпаб М., Сато/ζί М., Могош Е., Во((ахх1 В., Реб 6., 1пбгассо1о 8., Атабоб А., МапГоташ А., Ргек1а М. 8е1ес(1те гесодшбоп оГ йЬгоЫакГ дго\т(Н ГасГог-2 Ьу (Не 1опд репбахт РТХ3 шЫЬйк апдюдепебк. В1ооб. 2004; 104:92-99.

18. Сатοζζ^ М., 2асс1идпа 8., Викпаб М., СоНиш Ό., Ват^^еζ-Сο^^еа 6., Во(й^1 В., МапГоташ А., 61асса М., РгекГа М. Репбахт 3 1пН1Ь1(к бЬгоЫакГ дго\т(Н ГасГог 2- берепбепГ асГшабоп оГ ктоо(Н тикс1е се11к ш уйго апб пеошбта Гогтабоп ш νί\Ό. Абебокс1ег ТНготЬ Уаке Вю1. 2005; 25:1837-1842.

19. ГкассН А., 8ГаГиГо М., Опека В., Вегдоыот Ь., Викпаб М., 8агт1епГок Р., ВадпоГб 6., РгекГа М. А бх-атшо ас1б бе1ебоп ш Ьабс Г1ЬгоЬ1акГ дго\т(Н ГасГог б1ккос1аГек йк тйодешс ас(^ν^(у Ггот йк р1актшодеп ас(1та(ог-б1бистд сарасйу. Ргос. N(1. Асаб. 8сГ И8А. 1991; 88:2628-2632.

20. Реб 6., ГпГгопа М., Соггаб1 Ό., Гасийб 6., 81дпобш 8., Атаыбп Е., Р^ζζе((^ Е., Маддюш А.Р., МоссеГб Т., Ме(га М., Сак Ь.И., 6Неζζ^ Р., 81ре Ι.Ό., Ве 6., ОНте((1 6., МапГоташ А., Ьабш В. РТХ3, А ргоГо(ур1са1 1опд репбахт, 1к ап еаг1у шбюаГог оГ асиГе туосагб1а1 шГагсбоп ш Нитапк. Спси1абоп. 2000; 102:636-641.

21. 6бпкрап 1.В., Мие11ег 8.Ν., бетбю Е.М. Вот те епбо(НеНа1 се11к (гапкГогтеб ш тИго Ьу Ьеыо(а)ругепе. 1. Се11. РНубо1. 1983; 114:328-338.

22. РгекГа М., Ма1ег 1.А., Викпаб М., ВадпоГб 6. Вабс Г1ЬгоЬ1акГ дгоу(Н ГасГог: ргобисбоп, тйодешс гекропке, апб рокГ-гесерГог бдпа1 баикбисбоп ш сиЙигеб погта1 апб (гапкГогтеб Ге(а1 Ьотте аоб1с епбо(Не11а1 се11к. 1. Се11. Рйубо1. 1989; 141:517-526.

23. Егапк В., Отегуб1 Н. 8РОТ куп(Небк. Ерйоре апа1убк \\ЙН аггаук оГ куп(Не(1с рерббек ргерагеб оп се11и1оке тетЬгапек. Ме(Нобк Мо1 Вю1. 1996; 66:149-169.

24. Кпо11 А., 8сНппб( 8., СНартап М., \УПеу Ό., Ви1дбп 1., В1апк 1., КйсНпег Ь. А сотрапкоп оГ (уо соп(го11еб-ге1еаке беНтегу кукГетк Гог (Не беНтегу оГ атбоббе Го соп(го1 аидюдепебк. Мюготакс Век. 1999; 58:1-9.

25. Етк1еу 1., УН Не Н.Е., О'Нага В.Р., О11та 6., 8бпгтакап Ν., Т1ск1е I.!, В1ипбе11 Т.Ь., Рерук М.В., Уооб 8.Р. 8бисГиге оГ репГатебс Нитап кегит ату1о1б Р сотропепГ. №1(иге. 1994; 367:338-345.

26. Епкккоп А.Е., Соикепк Й.8., Уеатег Ь.Н., Ма((Неук В.У. ТНгее-б1тепбопа1 к(гис(иге оГ Нитап Ьабс ПЬгоЬ1ак( дгоу(Н ГасГог. Ргос. №1(1. Асаб. 86. И.8.А. 1991; 88:3441-3445.

27. УоигеГ-Сгабаб У., Майеисш С., Реп 6, Роб 6., 1п(гопа М., МапГоташ А. Ехргекбоп оГ а 1опд репбахт, РТХ3, Ьу топосуГек ехрокеб Го (Не тусоЬасГеба1 се11 уа11 сотропепГ ИроагаЬшотаппап. ГпГесГ Гттип. 1997; 65:1345-1350.

28. ГпГгопа М., А11ек У., СакГе11апо М., Р1сагб1 6., Эе 6ю1а Ь., ВοГГаζζа^ В., Реп 6., Вгет1ало Е., 8а1топа М., Эе 6гедобо Ь., Игадат Т.А., 8бпгтакап Ν., В1ипбе11 Т.Ь., НатбГоп Т.А., МапГоташ А. С1ошпд оГ тоике р(х3, а пеу тетЬег оГ (Не репбахт депе ГатНу ехргеккеб аГ ехбаНерабс бГек. В1ооб. 1996; 87:18621872.

29. Ро1епГагиГб Ν., Во(й^1 В., Όί 8апГо Е., В1аб Е., Адпе11о Ό., Οκζζί Р., ГпГгопа М., Ваг(.Га1 Т., В1сНагбк 6., МапГоташ А. 1пбис1Ь1е ехргекбоп оГ (Не 1опд репбахт РТХ3 ш (Не сеп(га1 пегтоик кукГет. 1 №иго1ттипо1., 2000; 106:87-94.

30. 8аташедо Е., МагкНат Р.И., 6епбе1тап В., 6а11о В.С., Епкоб В. ГпЙаттаГогу суГокшек шбисе епбо(НеНа1 се11к Го ргобисе апб ге1еаке Ьабс ПЬгоЬ1ак( дгоу(Н ГасГог апб Го рготоГе Кароб'к кагсота-бке 1ебопк ш пибе тке. 1. 1ттипо1. 1997; 158:1887-1894.

31. Ζχ№ М., РагепП А., Ьебба Е., Ие11'Ега Р., 6гапдег Н.1., Мадд1 С.А., РгекГа М. №1(г1с ох1бе рготоГек рго11ГегаГ1оп апб р1актшодеп асГшаГог ргобисбоп Ьу согопагу тепи1аг епбо(НеНит (НгоидН епбодепоик ЬЕ6Е. С1гс Век. 1997; 80:845-852.

32. ВГкш И.В., МоксаГеШ Ό. ВесепГ бете1ортепГк ш (Не се11 Ью1оду оГ Ьабс ГЬгоЫакГ дгоу(Н ГасГог. 1. Се11. Вю1. 1989; 109:1-6.

- 15 015339

33. В1о1шск 8., Реор1ез С.Е., Ргеетап М.К., ЕЬег1еш Т.Г. К1адзЬгип Μ. Т 1утр1юсу1ез 5уп111С51/с апб ехрой йерапп-Ьтбшд ер1бегта1 дго\\Й1 ГасЮг-Кке дго\\1Н Гас1ог апб Ьазк йЬгоЫай дго\\Й1 ГасЮг, тйодепз Гог уазси1аг се11з апб ГЬгоЫазГз: б1£Гегепба1 ргобисйоп апб ге1еазе Ьу СЭ4+ апб СЭ8+ Т се11з. Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А. 1994; 91:2890-2894.

34. Реор1ез С.Е., В 1о1п1ск 8., ТакайазЫ К., Ргеетап М.К.. К1адзЬгип М., ЕЬег1еш Т.1. Т 1утрНосу1ез На! 1пййга1е 1итогз апб аГкегозс1егойс р1ас|иез ргобисе Нерапп- Ьшбшд ер1бегта1 дго\\Й1 Гас1ог-Нке дго\\Й1 ГасЮг апб Ьазю ГЬгоЫазГ дго\\Й1 ГасЮг: а роГепйа1 ра1ко1од1с го1е. Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А. 1995; 92:65476551.

35. Ке1бу М.А., Ршдег1е 1., Ыпбпег V. РасГогз сопйоШпд 1ке беуе1ортеп1 оГ айепа1 1езюпз айег шщгу. Сйси1аГюп. 1992; 86:11143-46.

36. Ьодап А., Веггу М. ТгапзГогтшд дго\\Й1 ГасЮг-Ье1а 1 апб Ьазю ПЬгоЬ1аз1 дго\\Й1 ГасЮг ш Не щигеб СЫ8. Тгепбз Ркагтасо1 8ск 1993; 14:337-342.

37. Κ·ινίζζη Т., МопеГа Ό., ВоИа/ζί В., Реп С., Саг1апба С., Н|гзсН Е., Вгскагбз С.1., МапГоуаш А., Vеζхаш А. Эупат1с шбисГюп оГ 1ке 1опд репГгахш РТХ3 ш 1ке СЫ8 айег БтЫс ί^ίζιιΐΌδ: еу1бепсе Гог а ргоГесбуе го1е ш зе^ζи^е-^ηбисеб пеигобедепегабоп. №игозс1епсе. 2001; 105:43-53.

38. Ко1рН М.8., 21ттег 8., Вοйаζζ^ В., Саг1апба С., МапГоуаш А., Напззоп С.К. Ргобисйоп оГ Не 1опд репГгахш РТХ3 ш абуапсеб аГкегозс1егобс р1ас.|иез. Айегюзс1ег ТНготЬ νη^ Вю1. 2002/22:е10-14.

Claims (17)

1. Связывающий РСР2 пептид формулы I

К1-А1а-Х1-Рго-Х₂-А1а-Р₂ (I) где Х₁ представляет собой аминокислоту, выбранную из Агд и Ьуз;

Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную из Суз и ТНг;

Κι отсутствует или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из 8Еф ΙΌ N0: 1 и 8ЕО ΙΌ N0: 3;

К₂ отсутствует или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из 8Еф ΙΌ N0: 2 и 8Еф ΙΌ N0: 4, при следующих условиях:

когда К отсутствует, К₂ также отсутствует; когда Κι представляет собой аминокислотную последовательность 8Еф ΙΌ N0: 1, К₂ представляет собой аминокислотную последовательность 8Еф ΙΌ N0: 2;

когда К представляет собой аминокислотную последовательность 8Еф ΙΌ N0: 3, К₂ представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из 8Еф ΙΌ N0: 2 и 8Еф ΙΌ N0: 4;

или фармацевтически приемлемая соль.

2. Пептид по п.1, в котором Х₁ представляет собой Агд.

3. Пептид по п.1 или 2, в котором Х₂ представляет собой Суз.

4. Пептид по любому из предшествующих пунктов, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из 8ЕО ΙΌ N0: 5, 8ЕО ΙΌ N0: 6, 8ЕО ΙΌ N0: 7 и 8ЕО ΙΌ N0: 10.

5. Слитый химерный пептид, содержащий пептид по любому из предшествующих пунктов, где слитая аминокислотная последовательность относится к отличной от РТХ3 человека последовательности белка, выбранной из группы мембраносвязанных белков, внеклеточных участков мембраносвязанных белков, константных областей иммуноглобулинов, доменов мультимеризации, внеклеточных белков, белков, содержащих сигнальные пептиды, белков, содержащих сигнальные последовательности для выведения.

6. Конъюгированный химерный пептид, содержащий пептид или его функциональные производные по любому из предшествующих пунктов.

7. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид по любому из предшествующих пунктов, или гибридизующаяся с указанной выше нуклеиновой кислотой, или включающая ее вырожденную последовательность.

8. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.7.

9. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии по п.8.

10. Клетка-хозяин по п.9, где пептид секретируется или экспрессируется на поверхности мембраны клетки.

11. Применение пептида по пп.1-6 в качестве лекарственного средства.

12. Применение по п.11, где лекарственное средство представляет собой средство против заболевания, обусловленного измененным ангиогенезом.

13. Применение по п.12, где измененный ангиогенез обусловлен измененной активацией фактора роста РСР2.

14. Применение по п.12 или 13, где заболевание выбрано из группы, состоящей из артрита, метастазирования опухоли, диабетической ретинопатии, псориаза, хронического воспаления, артериосклероза или опухоли.

15. Применение по п.14, где опухоль выбрана из группы саркомы, карциномы, карциноидной опу

- 16 015339 холи, опухоли костной ткани или нейроэндокринной опухоли.

16. Применение по п.11, где лекарственное средство представляет собой средство против заболевания, связанного с неконтролируемой, зависимой от РОР2 пролиферацией фибробластов или гладкомышечных клеток, рубцевания, связанного с чрезмерной реакцией фибробластов, и рестеноза после ангиопластики.

17. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество пептида по любому из пп.1-6, а также приемлемые разбавители, и/или наполнители, и/или адъюванты.