CN110655583A

CN110655583A - 一类新的Bcl10聚合抑制剂及其应用

Info

Publication number: CN110655583A
Application number: CN201810694584.5A
Authority: CN
Inventors: 杨成华; 张亮; 孙晨霞; 鲍伟; 于浩澜
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2020-01-07
Also published as: WO2020001495A1; CN111094357A

Abstract

本发明涉及一类新的Bcl10聚合抑制剂及其应用。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。本发明多肽具有(i)抑制Bcl10聚合作用；(ii)抑制CBM复合物的活性；(iii)选择性的抑制B细胞淋巴瘤(如ABC‑DLBCL)的生长；和/或(iv)治疗CBM复合物介导的NF‑kB活化相关疾病活性。

Description

一类新的Bcl10聚合抑制剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及一类新的Bcl10聚合抑制剂及其应用。

背景技术

弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤，根据其基因表达图谱的不同可将其分为三个亚型：生发中心B细胞型(Germinal center B cell like DLBCL,GCB-DLBCL)、活化B细胞型(Activated B celllike DLBCL,ABC-DLBCL)和原发纵膈B细胞型(Primary mediastinal B cell lymphoma,PMBL)。其中ABC-DLBCL的恶性程度最高，对现有免疫化学疗法有强烈的耐药性，经典的R-CHOP治疗后，GCB-DLBCL的五年存活率能达到76％，而ABC-DLBCL的五年存活率只有30％左右。

因此，寻找能有效治疗ABC-DLBCL的药物和治疗方法是临床上急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效治疗ABC-DLBCL的药物和治疗方法。

本发明的另一目的是提供一种新型的抑制Bcl10聚合活性的药物，同时也提供了Bcl10抑制剂在ABC-DLBCL治疗中的应用，及其他CBM复合体介导的NF-κB依赖性疾病中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种式I所示的多肽，或其药学上可接受的盐，

Z0-Z1-Z2-Z3-Z4 (I)

Z0为无、N端的修饰基团或1-3个氨基酸的肽段；

Z1为穿膜肽元件；

Z2为无或连接肽；

Z3为Bcl10抑制肽元件，所述的Z3的长度为12-25aa，较佳地13-20aa，更佳地14-18aa；

Z4为无、C端的修饰基团或1-3个氨基酸的肽段；

“-”为肽键。

在另一优选例中，所述多肽的长度为30-50aa，较佳地32-40aa。

在另一优选例中，所述N端的修饰基团选自下组：乙酰基、苯甲氧基羰基C、氨基戊酸、棕榈酸、或其组合。

在另一优选例中，所述穿膜肽元件具有如SEQ ID NO.:1所示的序列。

在另一优选例中，所述穿膜肽元件的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述连接肽的长度为0-10aa，较佳地，0-6aa。

在另一优选例中，所述Z3具有式A1所示的基序(5'-3')或式A2所示的反向氨基酸基序(5'-3')：

R-X1-RA-X2-K-X3-L (A1)；或

L-X3-K-X2'-AR-X1'-R (A2)

式中，

X1为4-6个氨基酸的肽段；较佳地X1为HFDHL或TSSRK；

X2为无、或1-2个氨基酸的肽段；较佳地X2为K或G；

X3为1-2个氨基酸的肽段；较佳地，X3为I或L；

X1'为4-6个氨基酸的肽段；较佳地X1为KRSST或LHDFH；

X2'为无、或1-2个氨基酸的肽段；较佳地X2’为K或G。

在另一优选例中，所述Z3具有式A1所示的基序(5'-3')或式A2所示的反向D型氨基酸基序(5'-3')：

R-X1-RA-X2-K-X3-L (A1)；或

L-X3-K-X2'-AR-X1'-R (A2)

式中，

X1为4-6个氨基酸的肽段；较佳地X1为HFDHL或TSSRK；

X2为无、或1-2个氨基酸的肽段；较佳地X2为K或G；

X3为1-2个氨基酸的肽段；较佳地，X3为I或L；

X1'为4-6个D型氨基酸的肽段；较佳地X1为KRSST或LHDFH；

X2'为无、或1-2个D型氨基酸的肽段；较佳地X2’为K或G。

在另一优选例中，所述C端的修饰基团选自下组：酰胺化，乙醛化、或其组合。

在另一优选例中，Z3具有SEQ ID No.:2或3或15或16所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，Z3的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2或3或15或16所示。

在另一优选例中，所述多肽具有SEQ ID NO.:4或5或8或9或13或14所示的序列。

在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4或5或8或9或13或14所示。

在另一优选例中，所述多肽是天然的或人工合成的。

在另一优选例中，所述多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:4或5或8或9或13或14所示氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:4或5或8或9或13或14所示氨基酸序列经过1-5个(较佳地1-3，更佳地1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制Bcl10的聚合作用的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的多肽是由SEQ ID NO.:4或5或8或9或13或14所示的多肽经过1-3个较佳地1-2个，更佳地1个氨基酸取代、缺失；和/或

经过1-5，较佳地1-4个，更佳地1-3个，最佳地1-2个氨基酸的添加形成的。

在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了≥70％的SEQ ID NO:4或5或8或9或13或14的所示多肽的抑制Bcl10的聚合作用的活性。

在另一优选例中，所述的衍生多肽与SEQ ID NO:4或5或8或9或13或14的相同性≥80％，较佳地≥90％；更佳地≥95％。

本发明还提供了抑制Bcl10的聚合作用的、式I化合物的二聚体和多聚体形式，且所述二聚体和多聚体形式具有抑制抑制Bcl10的聚合作用的活性。

本发明第二方面提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的多肽或其药学上可接受的盐。

本发明第三方面提供了一种药物组合物，包括：

(a)治疗有效量的权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐；和

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述的多肽保留了≥70％、75％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％、或200％的SEQ ID NO:1所示多肽的抑制Bcl10的聚合作用的活性。

在另一优选例中，所述组合物的剂型包括包括口服剂型、或胃肠外剂型，如外用或局部使用剂型。

在另一优选例中，所述组合物的剂型包括包括片剂、丸剂、微丸剂、缓释剂、乳剂、混悬剂、颗粒剂、胶囊、粉剂、口服液、冻干剂、糖浆、膏剂、霜剂、滴剂、含服剂、静脉注射剂、栓剂、喷雾剂、气雾剂、洗剂、含漱剂、贴剂、或滴眼剂。

在另一优选例中，所述药物组合物还含有其他可(i)抑制Bcl10聚合作用；(ii)抑制CBM复合物的活性；(iii)选择性的抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤(如ABC-DLBCL)的生长；和/或(iv)治疗CBM复合物诱导的NF-κB活化的相关疾病的药物。

在另一优选例中，所述其他可(i)抑制Bcl10聚合作用；(ii)抑制CBM复合物的活性；(iii)选择性的抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤(如ABC-DLBCL)的生长；和/或(iv)治疗CBM复合物诱导的NF-κB活化的相关疾病的药物选自下组：MI-2、Mepazine、或其组合。

在另一优选例中，在所述药物组合物中，所述多肽或其药学上可接受的盐含量为0.0001-99wt％，较佳地为0.001-90wt％，更佳地0.01-50wt％，按组合物的总重量计。

本发明第四方面提供了一种本发明第一方面所述的多肽或其药学上可接受的盐的用途，用于制备组合物或药物，所述组合物或药物用于(i)抑制Bcl10聚合作用；(ii)抑制CBM复合物的活性；(iii)选择性的抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤(如ABC-DLBCL)的生长；和/或(iv)治疗CBM复合物诱导的NF-κB活化的相关疾病。

在另一优选例中，所述CBM复合物的相关疾病选自下组：自身免疫性疾病、长期性炎症反应，过敏性疾病，NF-κB依赖性癌症、或其组合。

在另一优选例中，所述自身免疫性疾病选自下组：银屑病、红斑狼疮、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物或药物还用于治疗选自下组的一种或多种疾病：

哮喘、乳腺癌、非小细胞肺癌、黑丝素瘤、结直肠癌、T/B细胞性白血病、或其组合。

本发明第五方面提供了一种选择性的抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤的生长的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面所述的多肽或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述的对象是人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述多肽或其药学上可接受的盐的浓度为10-300mM，较佳地，30-160mM，更佳地，130-160mM。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。

在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。

在另一优选例中，所述弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞选自下组：ABC-DLBCL、GCB-DLBCL、或其组合。

在另一优选例中，所述弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞包括ABC-DLBCL。

本发明第六方面提供了一种体外非治疗性的抑制Bcl10的聚合作用的方法，包括步骤：

在本发明第一方面所述的多肽或其药学上可接受的盐存在的条件下，培养肿瘤细胞，从而抑制所述肿瘤细胞中Bcl10的聚合作用。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞选自下组：弥漫性大B细胞淋巴瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、结直肠癌、T/B细胞性白血病、或其组合。

本发明第七方面提供了一种治疗CBM复合物诱导的NF-κB活化的相关疾病的方法，包括步骤：向需要的对象施用治疗有效量的本发明第一方面所述的多肽、和/或本发明第三方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述的对象是人或非人哺乳动物。

本发明第八方面提供了一种筛选选择性抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤的生长的候选化合物的方法，包括步骤：

(a)将Bcl10蛋白与化合物库混合，测定化合物库中的化合物与所述Bcl10蛋白的结合情况；

其中，如果所述测试化合物库中的化合物与所述Bcl10蛋白有结合，则表明所述与Bcl10蛋白结合的化合物为候选化合物。

(b)将步骤(a)中所确定的候选化合物施用于弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞，测定其对弥漫性大B细胞淋巴瘤的影响。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。

本发明第九方面提供了一种筛选选择性抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤的生长的候选化合物的方法，包括步骤：

(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养表达Bcl10蛋白的肿瘤细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中所述Bcl10蛋白的表达情况E1；

并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中所述Bcl10蛋白的表达情况E2；

(b)如果所述测试组中的所述Bcl10蛋白的表达情况E1显著低于所述对照组中的所述Bcl10蛋白的表达情况E2，则表示所述测试化合物是候选化合物。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤(c)：将步骤(b)中所确定的候选化合物施用于哺乳动物模型，测定其对哺乳动物的影响。

在另一优选例中，所述哺乳动物为患有弥漫性大B细胞淋巴瘤的哺乳动物。

在另一优选例中，所述“显著低于”指E1/E2≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了MBP-Bcl10的凝胶过滤层析峰形图及峰产物SDS-PAGE胶结果图。

图2显示了根据CB复合体的结构模型设计了1个对照小分子肽和5个Bcl10小分子肽抑制剂。

图3显示了Bcl10小分子肽抑制剂对Bcl10纤维结构形成的影响。

图4显示了Bcl10小分子肽抑制剂对ABC-DLBCL细胞系(HBL-1和TMD8)和GCB-DLBCL细胞系(OCL-LY1)的生长的影响。

图5显示了Bcl10小分子肽抑制剂修饰肽对ABC-DLBCL细胞系(HBL-1和TMD8)和GCB-DLBCL细胞系(OCL-LY1)的生长的影响。

图6显示了Bcl10小分子肽抑制剂对ABC-DLBCL肿瘤在NCG小鼠体内生长的影响。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一类具有抑制Bcl10聚合作用的，分子量小于5KD(如仅约2.3-4.4kD)的小分子多肽。具体而言，本发明设计了数个候选序列，采用固相法将其合成，分离纯化获得高纯度的小肽Bcl10-P2、Bcl10-P4及其修饰形式，并运用HPLC及MS对之进行鉴定，再经过大量筛选，获得了一类新型的、具有(i)抑制Bcl10聚合作用；(ii)抑制CBM复合物的活性；(iii)选择性的抑制B细胞淋巴瘤(如ABC-DLBCL)的生长；和/或(iv)治疗CBM复合物诱导的NF-κB活化的相关疾病活性的小分子多肽。在此基础上，本发明人完成了本发明。

活性多肽

在本发明中，术语“本发明多肽”、“Bcl10聚合抑制剂”可互换使用，都指具有(i)抑制Bcl10聚合作用；(ii)抑制CBM复合物的活性；(iii)选择性的抑制B细胞淋巴瘤(如ABC-DLBCL)的生长；和/或(iv)治疗CBM复合物诱导的NF-κB活化的相关疾病活性的具有SEQ IDNO.:4或5或8或9或13或14所示的氨基酸序列的蛋白或多肽。此外，所述术语还包括具有抑制(i)抑制Bcl10聚合作用；(ii)抑制CBM复合物的活性；(iii)选择性的抑制B细胞淋巴瘤(如ABC-DLBCL)的生长；和/或(iv)治疗CBM复合物诱导的NF-κB活化的相关疾病活性的、SEQID NO：4或5或8或9或13或14所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-5个(通常为1-4个，较佳地1-3个，更佳地1-2个，最佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明还包括本发明多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持(i)抑制Bcl10聚合作用；(ii)抑制CBM复合物的活性；(iii)选择性的抑制B细胞淋巴瘤(如ABC-DLBCL)的生长；和/或(iv)治疗CBM复合物诱导的NF-κB活化的相关疾病活性的的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)本发明的多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

发明还提供本发明多肽的类似物。这些类似物与天然本发明多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

编码序列

本发明还涉及编码本发明多肽的多核苷酸。一种优选的编码序列如SEQ ID NO:6(Bcl10-P2)或7(Bcl10-P4)所示，它编码SEQ ID NO:4(Bcl10-P2)或5(Bcl10-P4)所示的多肽的氨基酸序列。

在一优选实施方式中，Bcl10-P2的核苷酸序列如下所示：

Bcl10-P2:

5’-GACCGCCAGATAAAGATTTGGTTCCAGAATCGGCGCATGAAGTGGAAGAAGAGACATTTTGATCATCTACGTGCAAAAAAAATACTCAGTAGA-3’(SEQ ID No.:6)

在一优选实施方式中，Bcl10-P4的核苷酸序列如下所示：

Bcl10-P4:

5’-GACCGCCAGATAAAGATTTGGTTCCAGAATCGGCGCATGAAGTGGAAGAAGCGAACATCAAGTAGAAAAAGGGCTGGAAAATTGTTAGACTACTTACAGGAA-3’(SEQ ID No.:7)

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:6或7所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，以SEQ ID NO:6或7为例，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ IDNO:4或5所示序列的多肽，但与SEQ ID NO:6或7中相应编码区序列有差别的核酸序列。

本发明的多肽的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或ZY多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

另一方面，本发明还包括对本发明多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。

在两个核酸或多肽的背景下，当进行最大相符性序列比较和比对时，术语“基本相同”是指两个或多个序列或亚序列，其具有至少约80％，例如至少约85％、约90％、约95％、约98％或约99％的核苷酸或氨基酸残基与特定的参考序列具有同一性，如使用以下序列比较方法和/或通过肉眼检查所测定。

在本发明中，所有的序列如下表所示。

制备方法

本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。

一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25％六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4％对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10％)的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80％乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛Sephadex G10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。

在一优选例中，本发明的多肽，按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。

另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸可用来表达或生产重组的本发明的多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码本发明多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

重组多肽可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得多聚体形式的表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。

药物组合物和施用方法

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有片剂、颗粒剂、胶囊、丸剂、注射剂、或口服液。

这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。

例如，配制可这样进行：将本发明的多肽或其药学上可接受的盐与基本物质一起溶解于无菌水(在无菌水中溶解有表面活性剂)中，调节渗透压和酸碱度至生理状态，并可任意地加入合适的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂和增粘剂，然后使其完全溶解。

本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，本发明的多肽或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。此外，本发明的多肽或其盐还可通过插入预先涂有药物的眼内透镜而得以应用。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的本发明的多肽或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。

穿膜肽元件

本发明的穿膜肽元件是果蝇的触角足突变基因(Antp)同源盒的一部分，可以进入到细胞核内并结合到HOX-1.3基因的启动子区域，促进神经细胞的分化。

在本发明一优选实施方式中，所述穿膜肽元件具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。

弥漫性大B细胞淋巴瘤

CBM介导的NF-κB的相关性疾病

不同的类型的细胞中，CBM复合体在介导NF-κB的活化中有重要作用，CBM复合体持续性活性可以导致多种细胞的NF-κB的持续性活化和相关疾病的产生。

在本发明中，CBM介导的NF-κB的相关性疾病包括(但不限于)：自身免疫性疾病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、黑丝素瘤、结直肠癌、或T/B细胞性白血病。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明多肽及其衍生多肽的分子量小，可透过组织屏障；

(b)本发明的多肽可有效抑制Bcl10聚合作用，从而抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤(尤其是活化B细胞型弥漫性大B细胞淋巴瘤)的生长。

(c)本发明的多肽可有效治疗CBM复合物的相关疾病(如自身免疫性疾病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、黑丝素瘤、结直肠癌、T/B细胞性白血病等)。

(d)本发明的多肽的安全性高，对生物组织毒副作用小。

(e)本发明的多肽可通过固相合成的方法制备，纯度高，产量大，成本低。

(f)本发明多肽的稳定性好。

(g)本发明多肽的特异性高，选择性好。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

如无特别说明，本发明实施例中所用的试剂或材料均为市售产品。

材料和方法

1.1MBP-Bcl10蛋白表达和纯化

Bcl10(1-233)的表达质粒构建在pDB-His-MBP的载体上，转化到BL21(DE3)细胞株中表达，通过Ni-NTA(Qiagen，Valencia，CA)亲和层析初步纯化，再通过凝胶过滤色谱柱Superdex 200HR 10/300(GE Healthcare，UK)进一步纯化，收集目的蛋白，最后蛋白储存在含20mM Tris(pH 7.5),150mM NaCl,和5mM DTT的缓冲液中。

1.2Bcl10小分子多肽合成

设计了多条小分子肽，经检验发现其中两条小分子肽能有效抑制Bcl10的聚合及纤维结构的形成。他们的序列分别是：DRQIKIWFQNRRMKWKKRTSSRKRAGKLLDYLQE(SEQ IDNo.:5)和DRQIKIWFQNRRMKWKKRHFDHLRAKKILSR(SEQ ID No.:4)。

①小分子肽合成顺序：从序列C端到N端，步骤如下：

a.称取n当量树脂放入反应器，加入DCM(二氯甲烷)溶胀半小时，然后抽掉DCM，加入序列中第一个氨基酸2n当量，加2n当量的DIEA，适量的DMF，DCM(适量是指以可使树脂充分鼓动起来为宜)，DIEA(二异丙基乙胺)、DMF(二甲基甲酰胺)、DCM，氮气鼓泡反应60min。然后加入约5n当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、MEOH洗净。

b.往反应器中加入序列中第二个氨基酸(也为2n当量)，2n当量HBTU(1-羟基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸盐)及DIEA，N2鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量的脱帽液去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，洗净，茚三酮检测。

c.依步骤b的方式依次加入序列中不同的氨基酸并进行各种修饰。

d.将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定量(切割液和树脂大约以10ml/克的比例)的切割液(组成是95％TFA，2％乙二硫醇，2％三异丙基硅烷，1％水)，震荡，滤掉树脂。

e.得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到序列的粗产物。

②多肽纯化：

开发新工艺用高效液相色谱将粗品提纯至要求纯度。

③多肽冻干：

纯化好的液体放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。

1.3透射电镜EM实验

纯化好的MBP-Bcl10与Bcl10小分子肽抑制剂以1:1或1:2的比例混合，加入TEV酶在室温下反应1小时后，将反应产物的5ul滴在含有薄层碳和塑料膜涂层的电镜铜网(中镜科仪cat：BZ10024a)上，一分钟后吸去液滴，风干后再用3％的乙酸铀酰负染一分钟，之后吸去液滴，风干后在上海生科院神经所电镜室的JEM-1230电镜下观察。

1.4细胞培养

ABC-DLBCL细胞株HBL-1和TMD8培养在含10％FBS，2mM谷氨酰胺、10mM Hepes缓冲液和青霉素链霉素的RPMI培养液中。GCB-DLBCL细胞株OCI-LY1培养在含20％胎牛血清和青霉素链霉素的IMEM培养液中。所有的细胞株均培养在含有5％ CO₂的37℃恒温湿润培养箱中。

1.5细胞生长抑制实验

对数生长期的DLBCL细胞株在含相应培养液的96孔板中培养过夜，第二天向细胞中加入各候选化合物，每个化合物按3.16倍的稀释比例设置浓度梯度。细胞增殖是通过荧光发光法定量检测细胞内ATP的含量来检测细胞数(CellTiter-Glo,Promega,Madison,WI)。DLBCL细胞株在化合物处理0小时和72小时后，用多功能酶标仪(SpectraMaxParadigm,Molecular Devices,USA)检测荧光信号。小分子肽抑制剂的生长抑制率的计算公式为：如果72小时荧光值(T72)大于0小时荧光值(T0)，生长抑制率＝(T72_cpd-T0)/(T72_DMSO-T0)*100；如果T72小于T0，生长抑制率＝(T72_cpd-T0)/T0*100。用GraphPad Prism5软件来绘制细胞生长抑制曲线图，并计算抑制50％细胞生长的小分子化合物浓度。每个实验设置3个复孔。

实施例1MBP-Bcl10的表达和纯化

Bcl10(1-233)的表达质粒构建在pDB-His-MBP的载体上，转化到BL21(DE3)细胞株中表达，通过Ni-NTA(Qiagen，Valencia，CA)亲和层析初步纯化，再通过凝胶过滤色谱柱Superdex 200HR 10/300(GE Healthcare，UK)进一步纯化，收集目的蛋白，最后蛋白储存在含20mM Tris(pH 7.5),150mM NaCl,and 5mM DTT的缓冲液中。

结果如图1所示，在12-14mL左右的位置开始出现目的蛋白峰，用SDS-PAGE胶验证此峰形下的蛋白确实是MBP-Bcl10蛋白，分子量为75kD，纯度为95％。

实施例2Bcl10小分子肽抑制剂的设计

根据CB复合体的结构模型设计了1个对照小分子肽和5个Bcl10小分子肽抑制剂。其序列如表1及图2所示。

表1：Bcl10小分子肽抑制剂序列：

其中，横线部分为基序部分，序列分别为SEQ ID NO.:2(P2)或3(P4)。

实施例3Bcl10小分子抑制剂对Bcl10聚合作用的影响

为了检测Bcl10小分子抑制剂对Bcl10抑制剂作用的影响，将纯化好的MBP-Bcl10蛋白同Bcl10小分子肽抑制剂按照1:1或1:2的摩尔比例混合在室温孵育半小时，然后加入TEV酶在室温反应一小时。反应产物滴在EM的铜网上经乙酸铀酰负染后在电镜下观察Bcl10小分子肽抑制剂对Bcl10聚合作用的影响。

结果如图3可见，MBP-Bcl10能形成纤维状结构，而小分子肽抑制剂Bcl-P2和Bcl-P4能够有效地抑制Bcl10纤维结构的形成，而Bcl-P3则不能抑制Bcl10纤维结构的形成，说明Bcl-P2和Bcl-P4是有效的Bcl10聚合抑制剂。

实施例4Bcl10小分子肽抑制剂对ABC-DLBCL细胞系特异性地生长抑制作用

为了检验Bcl10小分子肽抑制剂对ABC-DLBCL和GCB-DLBCL细胞的增殖的影响，采用不同浓度梯度的小分子肽抑制剂，分别作用于两种ABC-DLBCL细胞株即HBL-1、TMD8和一种GCB-DLBCL细胞株OCI-LY1上，0h和72h后测定细胞数量。

结果表明，能够有效抑制Bcl10聚合的小分子肽Bcl-P2和BclP4能够特异性系抑制ABC-DLBCL细胞的生长(GI50：3～5μM)，而对GCB-DLBCL生长没有明显抑制作用(GI50>100μM)；而对Bcl10聚合作用没有影响的小分子肽抑制剂Bcl-P1、Bcl-P3和Bcl-P5则对ABC-DLBCL的生长没有抑制作用，说明Bcl10的聚合作用对ABC-DLBCL的生长有关键作用，而Bcl10也是抑制ABC-DLBCL的生长的有效靶点。

实施例5Bcl10小分子肽抑制剂修饰肽对ABC-DLBCL细胞系特异性地生长抑制作用

小分子肽抑制剂常常在细胞内有容易降解、不稳定的特点，而将小分子肽进行修饰是提高肽的稳定性及有效性的有效策略。将Bcl-P2和BclP4进行了N端乙酰化修饰(Ac-Bcl10-P2-NH2，Ac-Bcl10-P4-NH2)，以及反向D肽修饰(DRI-Bcl10-P2，DRI-Bcl10-P4)(具体序列见表2)，并测试了这些修饰在细胞内的作用，发现这些修饰肽也能选择性抑制ABC-DLBCL细胞的生长(图5)。

表2：修饰的Bcl10小分子肽抑制剂序列：

注释:小写字母代表D型氨基酸

横线部分为反向氨基酸基序，序列分别为SEQ ID NO.:15或16。

实施例6Bcl10小分子肽抑制剂有效抑制ABC-DLBCL肿瘤的生长

为了检测Bcl10小分子肽抑制剂能不能在小鼠体内抑制ABC-DLBCL的生长，将ABC-DLBCL细胞系TMD8细胞和GCB-DLBCL细胞OCL-LY1细胞植入NCG小鼠皮下成瘤，然后将Bcl-ctl和Bcl-P4经尾静脉每天给药，观察Bcl10小分子抑制肽对ABC-DLBCL肿瘤的生长抑制作用。如图6，结果表明，Bcl-P4能有效抑制ABC-DLBCL肿瘤在小鼠体内的生长，而没有明显的毒副作用。Bcl-P4对GCB-DLBCL肿瘤的生长抑制作用不明显。

讨论

ABC-DLBCL是目前恶性程度最高的淋巴瘤，对目前临床上常用的免疫化学R-CHOP疗法有强烈的耐药性。它的特点之一是具有促生长、抗凋亡作用的NF-κB信号通路的持续激活，因此，理论上来说，寻找靶向药物来阻碍ABC-DLBCL中的NF-κB信号是治疗ABC-DLBCL的有效方法。但是，由于NF-κB是具有广泛重要生物活性的转录因子，本身并不适合作为治疗靶点。

在B细胞中，抗原结合BCR后诱导Src家族激酶磷酸化CD79A和CD79B的ITAM结构域的酪氨酸，接着，酪氨酸激酶Syk通过结合到磷酸化的ITAM上被激活，从而引发了包括布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase，BTK)、磷酸酶Cγ(phospholipase Cγ)以及蛋白激酶Cβ(protein kinase Cβ，PKC-β)在内的信号级联反应。PKC-β使CARM1发生磷酸化，促使它招募BCL10和MALT1，形成CBM复合物，从而激活IκB激酶(IKK)，最后激发了NF-κB信号通路(21)。另一方面，激活的MALT1通过其酶活性切割灭活A20(22)、CYLD(23,24)等NF-κB负反馈抑制剂，进一步促进NF-κB信号通路的活化。在ABC-DLBCL的肿瘤细胞中常见以上信号通路分子的突变或是转位，例如CARMA1突变(25)、CD79A/B突变(26)、BCL10和MALT1基因的转位等，导致NF-κB信号通路的持续性活化。

由上可见，CBM复合体在介导NF-κB活化中有重要作用。而CBM复合体中唯一具有酶活性的MALT1蛋白是近年来开发治疗ABC-DLBCL的靶向药物的热门分子靶点：首先，抑制MALT1的活性可以有效抑制NF-κB的信号，从而选择性抑制甚至杀伤ABC-DLBCL细胞，说明靶向MALT1酶活的治疗有效性；其次，MALT1敲除的小鼠除了在T细胞和B细胞的激活方面表现出一部分缺陷，在其他方面都表型正常，提示靶向MALT1酶活来治疗ABC-DLBCL的副作用会比较小；第三，MALT1的类caspase结构域在人类基因中是唯一的，抑制MALT1不会产生由于抑制其他结构相似的蛋白等造成的广泛副作用。本发明人已经开发了MALT1小分子抑制剂，并证明了MALT1是治疗ABC-DLBCL的有效靶点。

Bcl10是CBM复合体纤维结构的核心，Bcl10的纤维结构为CBM复合体的活化以及NF-κB信号通路关键蛋白的招募和活化提供了中心支架平台，是NF-κB信号通路激活的关键。不能形成纤维结构的Bcl10的突变体对NF-κB信号通路的活化有显性负作用的抑制作用，因此，Bcl10可能是抑制NF-κB信号通路，治疗ABC-DLBCL的另一个有效靶点。本发明根据Bcl10的结构模型设计了抑制Bcl10的小分子肽抑制剂，其中Bcl-P2和Bcl-P4能够有效地抑制Bcl10的聚合作用和纤维结构的形成和NF-κB的活性，在细胞水平和小鼠异体移植瘤模型上都显示了对ABC-DLBCL有非常特异的杀伤作用，证明Bcl10是抑制NF-κB活性和ABC-DLBCL的有效靶点。

大量研究表明，异常的NF-κB信号通路的活化在乳腺癌、激素抵抗型前列腺癌、肺癌、甲状腺癌、结肠癌、淋巴瘤等多种癌症及自身免疫性疾病(如银屑病等)中都有着重要作用。近年来的研究显示CBM蛋白复合体及其家族蛋白在这些癌症组织中有广泛的表达，该复合体在除淋巴瘤之外的其它NF-κB相关癌症中也可能有关键作用。因此，Bcl10抑制剂也可能为治疗上述癌症及自身免疫性疾病提供有效的治疗方法。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 一类新的Bcl10聚合抑制剂及其应用

<130> P2018-1073

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys

1 5 10 15

Lys

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Arg His Phe Asp His Leu Arg Ala Lys Lys Ile Leu

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

Arg Thr Ser Ser Arg Lys Arg Ala Gly Lys Leu Leu

1 5 10

<210> 4

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys

1 5 10 15

Lys Arg His Phe Asp His Leu Arg Ala Lys Lys Ile Leu Ser Arg

20 25 30

<210> 5

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys

1 5 10 15

Lys Arg Thr Ser Ser Arg Lys Arg Ala Gly Lys Leu Leu Asp Tyr Leu

20 25 30

Gln Glu

<210> 6

<211> 93

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

Gly Ala Cys Cys Gly Cys Cys Ala Gly Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala

1 5 10 15

Thr Thr Thr Gly Gly Thr Thr Cys Cys Ala Gly Ala Ala Thr Cys Gly

20 25 30

Gly Cys Gly Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly

35 40 45

Ala Ala Gly Ala Gly Ala Cys Ala Thr Thr Thr Thr Gly Ala Thr Cys

50 55 60

Ala Thr Cys Thr Ala Cys Gly Thr Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala

65 70 75 80

Ala Ala Thr Ala Cys Thr Cys Ala Gly Thr Ala Gly Ala

85 90

<210> 7

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

gaccgccaga taaagatttg gttccagaat cggcgcatga agtggaagaa gcgaacatca 60

agtagaaaaa gggctggaaa attgttagac tacttacagg aa 102

<210> 8

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

Xaa Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys

1 5 10 15

Lys Arg His Phe Asp His Leu Arg Ala Lys Lys Ile Leu Ser Xaa

20 25 30

<210> 9

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

Xaa Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys

1 5 10 15

Lys Arg Thr Ser Ser Arg Lys Arg Ala Gly Lys Leu Leu Asp Tyr Leu

20 25 30

Gln Xaa

<210> 10

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys

1 5 10 15

Lys Glu Lys Ile Ile Ala Glu Arg His Phe

20 25

<210> 11

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys

1 5 10 15

Lys Arg Glu Asp Thr Glu Glu Ile Ser Cys Arg

20 25

<210> 12

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys

1 5 10 15

Lys Lys Gly Leu Asp Thr Leu Val Glu Ser Ile Arg Arg Glu Lys Thr

20 25 30

Gln

<210> 13

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys

1 5 10 15

Lys Arg Ser Leu Ile Lys Lys Ala Arg Leu His Asp Phe His Arg

20 25 30

<210> 14

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys

1 5 10 15

Lys Glu Gln Leu Tyr Asp Leu Leu Lys Gly Ala Arg Lys Arg Ser Ser

20 25 30

Thr Arg

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

Leu Ile Lys Lys Ala Arg Leu His Asp Phe His Arg

1 5 10

<210> 16

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

Leu Leu Lys Gly Ala Arg Lys Arg Ser Ser Thr Arg

1 5 10

Claims

1.一种式I所示的多肽，或其药学上可接受的盐，

Z0-Z1-Z2-Z3-Z4 (I)

Z0为无、N端的修饰基团或1-3个氨基酸的肽段；

Z1为穿膜肽元件；

Z2为无或连接肽；

Z4为无、C端的修饰基团或1-3个氨基酸的肽段；

“-”为肽键。

2.如权利要求1所述的式I所示的多肽，或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述多肽的长度为30-50aa，较佳地32-40aa。

3.如权利要求1所述的式I所示的多肽，或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述N端的修饰基团选自下组：乙酰基、苯甲氧基羰基C、氨基戊酸、棕榈酸、或其组合。

4.如权利要求1所述的式I所示的多肽，或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述Z3具有式A1所示的基序(5'-3')或式A2所示的反向氨基酸基序(5'-3')：

R-X1-RA-X2-K-X3-L (A1)；或

L-X3-K-X2'-AR-X1'-R (A2)

式中，

X1为4-6个氨基酸的肽段；较佳地X1为HFDHL或TSSRK；

X2为无、或1-2个氨基酸的肽段；较佳地X2为K或G；

X3为1-2个氨基酸的肽段；较佳地，X3为I或L；

X1'为4-6个氨基酸的肽段；较佳地X1为KRSST或LHDFH；

X2'为无、或1-2个氨基酸的肽段；较佳地X2’为K或G。

5.如权利要求1所述的式I所示的多肽，或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO.:4或5或8或9或13或14所示的序列。

6.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐。

7.一种药物组合物，其特征在于，包括：

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

8.一种权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备组合物或药物，所述组合物或药物用于(i)抑制Bcl10聚合作用；(ii)抑制CBM复合物的活性；(iii)选择性的抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤的生长；和/或(iv)治疗CBM复合物诱导的NF-κB活化的相关疾病。

9.一种选择性的抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤的生长的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐。

10.一种体外非治疗性的抑制Bcl10的聚合作用的方法，其特征在于，包括步骤：

在权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐存在的条件下，培养肿瘤细胞，从而抑制所述肿瘤细胞中Bcl10的聚合作用。

11.一种筛选选择性抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤的生长的候选化合物的方法，其特征在于，包括步骤：

12.一种筛选选择性抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤的生长的候选化合物的方法，其特征在于，包括步骤：