KR100819780B1

KR100819780B1 - 먹장어 체조직으로부터 디형 아미노산을 지닌 신경성펩타이드 버그키닌 아이

Info

Publication number: KR100819780B1
Application number: KR1020060103295A
Authority: KR
Inventors: 박남규; 김찬희; 고혜진
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2006-10-24
Filing date: 2006-10-24
Publication date: 2008-04-07

Abstract

본 발명은 먹장어(Eptatretus burgeri) 체조직으로부터 D형 아미노산을 지닌 신경성 펩타이드에 관한 것으로, 이를 더욱 상세하게 설명하면, 먹장어(Eptatretus burgeri) 장관 평활근에 대한 수축활성을 지표로 삼아 먹장어 조직에 존재하는 평활근 수축활성을 나타내는 신경성 펩타이드(neuropeptide)의 정제와 이들의 생리할성과 D형 아미노산을 포함하는 여러 종류의 합성물을 통하여 일차구조를 가진 조성물로서 아미노산 서열이 Val-Gly-Gly-_D-Phe-Gly-Ser-Ser-_D-Ala -His-Trp-NH₂로 표시되는 것을 특징으로 하는 평활근 수축활성을 지닌 신경성 펩타이드에 관한 것이다.

먹장어, 신경성 펩타이드, 평활근 수축활성

Description

먹장어 체조직으로부터 디형 아미노산을 지닌 신경성 펩타이드 버그키닌 아이{Purification of neuropeptide with D-amino acid, burgerkinin I(:B I), from the body tissue of the hagfish, Eptatretus burgeri}

도 1은 활성펩타이드의 정제단계 (A)와 활성 피크의 질량분석(MALDI-TOF Mass) 결과 (B)도

도 2는 천연물 BⅠ-NH₂ (N)와 합성물 L-BⅠ-NH₂ (S)의 역상 HPLC 상에서의 용출시간

본 발명은 먹장어(Eptatretus burgeri) 체조직으로부터 D형 아미노산을 지닌 신경성 펩타이드에 관한 것으로, 이를 더욱 상세하게 설명하면, 먹장어(Eptatretus burgeri) 장관 평활근에 대한 수축활성을 지표로 삼아 먹장어 조직에 존재하는 평활근 수축활성을 나타내는 신경성 펩타이드(neuropeptide)의 정제와 이들의 생리할성과 D형 아미노산을 포함하는 여러 종류의 합성물을 통하여 일차구조를 가진 조성물로서 아미노산 서열이 Val-Gly-Gly-_D-Phe-Gly-Ser-Ser-_D-Ala-His-Trp-NH₂로 표시 되는 것을 특징으로 하는 평활근 수축활성을 지닌 신경성 펩타이드에 관한 것이다.

일반적으로 신경성 펩타이드의 기능에 있어 평활근 수축 및 이완운동 조절은 미오신 (myosina)과 액틴 (actin)의 결합에 의해 조절된다. 미오신라이트체인 카이네이즈(Myosin light-chain kinase)가 미오신 조절라이트체인(myosin regulatory light chain)을 인산화시켜 미오신 (myosin)이 액틴 (actin)과 결합되도록 하여 수축작용을 나타낸다. 구조적으로 가로무늬를 가지고 있지 않는 포유류 평활근은 내장의 여러 장기 및 순환기 계통의 관벽을 구성하며, 내용물의 수송, 분해, 배출 및 보존과 유지등의 기능에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이러한 신경성 펩타이드는 1962년 낙지의 타액선으로부터 엘레도이신(eledosin)이 발견된 이후, 무척추 하등동물에서부터 인간에 이르기까지 다양한 생물의 조직으로부터 신경성 펩타이드들 (neuropeptides)이 발견되어졌다. 신경성 펩타이드(Neuropeptide)는 일반적으로 생체 내에서 호르몬 혹은 비호르몬(non-hormone)으로서 신경성 조절물질(neuromodulator) 및 신경성 전달물질(neurotransmitter)의 역할을 담당하며, 다양한 기관 및 조직에 따라 장관평활근의 운동의 조절, 염증반응의 매개, 혈관의 수축 이완의 조절, 통증전달 및 혈압의 조절 등을 나타낸다.

먹장어 (Eptatretus burgeri)는 칠성장어(lampreys)와 함께, 원구류(Cyclostomata) 부류에 속하는 원시적인 하등 척추동물이다. 현재 먹장어에 관한 연구는 헤모글로빈(hemoglobin)의 특성, 구조와 유전적 계통발생학적 분류 등이 진행되어 왔다. 또한 cDNA 및 면역활성(immunoreactive) 연구에 의해 먹장어에는 엔도텔린(endothelin), 칼시토닌성물질(Calcitonin-like substance), 바소토 신(vasotocin), FMRF 아마이드(FMRF amide), 뉴로피신계(neurophisin-), 아르기닌-바소프레신(Arg- vasopressin), 옥시토신성 펩타이드(oxytocin-like peptide), 신경성 펩타이드(natriuretic peptide) 등이 존재한다고 되었다. 한편 같은 속에 속하는 먹장어(Eptatretus stouti)에서도 오피오이드 펩타이드(Opioid peptide)인 메티오닌-엔케팔린(Met-enkephalin)과 루이신-엔케팔린(Leu- enkephalin)이 뇌에 존재함이 보고되어 졌으며, 이후 cDNA연구를 통하여 오피오이드펩타이드 수용체 유전자(opioid peptide receptor gene)가 존재함이 밝혀져 왔으나, 아직까지 먹장어에 존재하는 신경성 펩타이드의 정제에 관한 연구는 미비한 실정이다.

따라서 본 발명의 목적은 상기와 같은 종래의 여러 가지 문제점을 개선시키기 위하여 안출한 것으로, 먹장어(Eptatretus burgeri) 장관 평활근에 대한 수축활성을 지표로 삼아 먹장어 조직에 존재하는 평활근 수축활성을 나타내는 신경성 펩타이드 (neuropeptide)의 정제와 이들의 생리활성과 D형 아미노산을 포함하는 여러 종류의 합성물을 통하여 일차구조를 가진 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리 펩타이드를 제공한다.

이하, 본 발명의 구성에 대해 더욱 상세히 설명하면, 본 발명에 있어, 정제되어진 신경성 펩타이드는 실시예1에 구체적으로 기재된 바와 같이, 원구류인 먹장 어 (Eptatretus burgeri)로부터 초산 추출물을 얻고, 상기의 추출물을 Sep-Pak C₁₈ cartridge로 조정제한 후, HPLC로 분리하였다.

상기 분리된 펩타이드는 수축활성을 갖는 새로운 신경성 펩타이드로 상기의 HPLC 시스템을 거친 후, 질량분석기 ‘MALDI-TOF mass spectrometer (Voyager-DE^TM STR spectrometer, Perseptive Biosystems, U.S.A)’ 및 자동단백질구조분석기 ‘automated protein sequencer PPSQ-21A (Shimadzu, Ltd., Japan)’를 통해 아미노산 서열이 결정되어진다.

이하, 본 발명의 구성에 대하여 아래 실시에를 통하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명의 권리범위가 아래 실시예에 만 한정되어지는 것은 아니며, 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능하다.

[ 실시예 1] 먹장어로부터 장관수축활성 펩타이드의 분리

실험에 사용한 먹장어 (Eptatretus burgeri, 500마리, 체장 30 ～ 50 cm)는 2006년 8월에 부산광역시 중구 자갈치 시장에서 구입하였으며, 살아있는 상태의 먹장어로부터 체조직을 분리 한 후, 액체질소로 급속 동결시켜서 실험에 사용하기 전 까지 -75 ℃에 보관하였다.

1. 먹장어 체조직으로부터 장관 수축성 펩타이드의 추출

동결 보관된 먹장어 체조직(500 마리)을 끓는 물에 10~15 분간 끓여서 식힌 후, 5% 초산을 넣고 조직을 파쇄하였다. 파쇄한 시료는 4 ℃에서 30 분 동안 7,000 x g 으로 원심분리를 하였으며, 침전물은 다시 한번 5 % 초산용액을 넣고 호모게네 이저(homogenizer)로 추출하여 상기와 같은 7,000 x g의 조건으로 원심분리 하였다. 상층액은 농축시킨 후, 시료 : 에탄올 = 2 : 3 (v/v)의 비율로 에탄올을 첨가하여 -20 ℃의 냉장고에 3시간 보관 후, 4 ℃에서 30 분간 10,000 x g로 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 그리고 상층액은 다시 농축하여 메탄올 및 NaCl을 시료 (1ℓ): 메탄올 (1ℓ) : NaCl (15 g)의 비율로 첨가한 후, 4 ℃에서 30 분 동안 10,000 x g로 원심분리를 행하였으며, 얻어진 상층액은 농축하였다. 농축한 상층액에 총 농도가 0.1 N HCl이 되도록 1 N HCl을 첨가하고, 4 ℃로 30 분간 20,000 x g로 원심분리를 행하였다.

원심분리한 상층액은 부분적으로 물질을 분리하기 위해 Sep-Pak C₁₈ cartridge에 주입하였다. 우선 Sep-Pak C₁₈ cartridge를 0.1 % TFA가 포함된 100 %메탄올로 활성화시킨 후, 0.1 % TFA가 포함된 물(H₂O)로 충분히 평형화하였다. 충분히 평형화가 된 다음 시료를 주입하여 0.1 % TFA가 포함된 물(H₂O), 10 % 메탄올 (retained materials; RM10) 및 60 % 메탄올(RM60)과 100 % 메탄올(RM100)로 물질들을 각각 용출시켜 실험동물의 장관평활근 수축활성 측정에 사용하였다.

그 결과 체조직 추출물 중 60 % 메탄올이 포함된 RM60에서 가장 강한 수축활성을 나타냈으며, 물(D.W.)층에서 RM60보다 약한 수축활성을 나타내었다. 따라서 먹장어 장관에 대해 가장 강한 수축활성을 나타낸 RM60을 사용하여 정제하였다.

2. 신경성 펩타이드의 분리 및 정제

체조직으로부터 추출한 RM60은 서로 다른 분리특성을 지닌 6단계[(크기배 제(Size exclusion), 역상 (reversed-phase), 양이온교환(cation-exchange), 음이온교환(anion-exchange), 친화력(affinity)]의 교대 반복적인 정제과정을 거쳤고, 각각의 단계에서 얻어진 분획들은 먹장어 장관 평활근에 대하여 수축활성을 측정하였다.

먹장어 체조직으로부터 추출된 장관평활근에 활성을 나타낸 RM60(60 % 메탄올추출물)은 처음으로 Vydac 218TP510 Protein & peptide C₁₈ (9.2 × 250 mm) 칼럼(column)으로 B용매 농도경사(gradient), 0 → 60 %에서 120분간, 유속은 2.0 ㎖/min로 수행하였다.

첫 단계의 분리에서 20 % CH₃CN의 농도에 해당하는 분획 22번에서 활성을 나타내었으며, 활성분획은 TSK-gel Heparin-5PW (7.5 × 75 mm) 칼럼(column)을 사용하여 정제하였으며, 분리조건은 다음과 같으며, A 용매는 10 mM의 Tris-HCl buffer(pH 6.0)와 B 용매는 1.0 M NaCl을 포함하는 10 mM의 Tris-HCl buffer (pH 6.0)이며 B 용매의 농도경사(gradient)는 0 → 0.5 M (100 min)에서 유속은 1.0 mL/min, 온도 40 ℃에서 친화성 HPLC 분리를 수행한 후, 칼럼(column)에 결합하지 않은 성질을 지닌 분획 2, 3에서 수축활성을 나타내는 분획을 얻었으며, 칼럼(column)에 결합한 활성을 띄지 않은 대부분의 불순물을 제거하였다.

친화성 HPLC에서 얻은 활성분획을 농축한 후, 효과적인 정제를 위하여 첫 단계와 성질이 다른 역상 칼럼(column)인 μ-Bondapak C₁₈ (3.9 × 300 mm) 칼럼(column)을 이용하여 0 → 60 %의 B용매 농도경사(gradient)로 120분간, 1.0 mL/min의 유속으로 40 ℃ 조건에서 수행하였으며, 2 %의 CH₃CN에 해당되는 분획 2, 3에서 활성분획을 얻었다.

활성을 나타낸 분획은 네 번째 HPLC 정제단계로 음이온 교환 칼럼(column) (TSK-gel DEAE-5PW, 7.5 × 75 mm)을 사용하여 다음과 같은 분리조건으로 정제하였으며, A 용매는 10 mM Tris-HCl의 PBS (pH 9.2)와 B 용매는 1.0 M NaCl을 포함하는 10 mM의 Tris-HCl (pH 9.2)로, B 용매의 농도경사(gradient)를 0 → 0.5 M (100 min)에서 유속, 0.5 mL/min, 온도 40 ℃에서 친화성 칼럼(column)과 마찬가지로 이 단계에서도 에 결합하지 않는 부분에서 수축반응을 보였다. 이러한 결과는 활성 펩타이드 내에 극성 아미노산을 포함하지 않는다는 것을 의미한다.

활성분획은 다시 다섯번째 역상 HPLC 칼럼(column) (Nova-Pak C₁₈, 3.9 × 300 mm)으로 B용매의 농도경사(gradient)를 13 → 23 %로 50분 동안 0.5 ml/min의 유속으로 40 ℃에서 행하였다.

다섯 번째 단계의 역상 HPLC를 통하여 약 20 % CH₃CN에서 용출된 수축활성을 나타낸 분획은 Superdex Peptide HR 10/30 칼럼(column) (10 × 300 mm)을 이용하여 크기배제(size exclusion) HPLC를 행하였고, 얻어진 활성 peak는 다시 최종적으로 Hypersil BDS C18 (2×125 mm) 칼럼(column)으로 20 % CH₃CN의 isocratic 조건으로 40 ℃에서 분리를 행하여22.166분의 머무름 시간에 해당되는 하나의 순수한 물질로 정제하였다 (도 1A).

3. 천연 펩타이드의 분자량 측정 및 아미노산 서열 결정

먹장어로부터 정제된 장관 수축활성을 지닌 신경성 펩타이드의 분자량은 MALDI-TOF mass spectrometer (Voyager-DE^TM STR spectrometer, Perseptive Biosystems, U.S.A)를 사용하여 측정하였다. 그리고, 아미노산 서열을 결정하기 위해서 자동 단백질 구조분석기인 Automated-protein sequencer PPSQ-21A (Shimadzu, Ltd., Japan)와 Applied Biosystem gas-phase sequencer (Model Procise 476A, Foster city, CA, USA)를 사용하여 애드만 (Edman) 분해법으로 분석하였다.

최종 정제한 펩타이드의 분자량은 각각 10개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로 밝혀졌으며 분자량은 각각 1003.97 (M+H)⁺ Da이었다 (도 1B). 본 연구에서는 편의상 먹장어 (Eptatretus burgeri)의 종명을 따서 먹장어 체조직으로부터 분리된 장관수축성 펩타이드를 버그키닌Ⅰ(burgerkinin Ⅰ, 이하 BⅠ) 명명하였다.

B I은 3개의 Gly, 2개의 Ser, 방향족 아미노산인 Trp과 Phe, 그 외의 3개의 중성 아미노산을 포함한 총 10개의 아미노산으로 구성되어 있는 데카 펩타이드(decapeptide)로 아미노산 서열분석 및 분자량측정 결과를 일치시켜보면 일차구조는 C말단이 amide화된 Val-Gly-Gly-Phe-Gly-Ser-Ser-Ala-His-Trp-amide이었다.

본 연구에서 정제한 BⅠ과 지금까지 알려진 모든 수축활성 펩타이드들과의 상동성 (homology)을 조사하기 위해 NCBI(National Center for Biotechnology Information, U.S.A.) protein-protein network BLAST Data Bank를 이용하여 검색하였다.

그 결과, BⅠ은 전혀 상동성이 없는 새로운 평활근 수축성 펩타이드이며, 지 금까지 보고된 장관평활근 수축활성 펩타이드와는 전혀 상동성이 없는 새로운 펩타이드로 판명되었다.

[ 실시예 2] 펩타이드의 합성 및 정제

1. 펩타이드의 합성

Fmoc-법을 사용하여 고상법으로 펩타이드를 합성하였다 ((Park, N. G., J-K. Seo, H-J. Ku, S. Lee, G. Sugihara, K-H. Kim, J-S. Park and S-W. Kang. 1997. Conformation and biological activity of mastoparan B and its analogs Ⅰ. Bull. Korean Chem. Soc., 18, 50~56).

C-말단에 아마이드(amide)화된 형태의 펩타이드를 합성하기 위해 Fmoc-NH- PAL-resin을, C-말단이 프리(free)한 경우는 Fmoc-_D-Trp-Wang-resin, Fmoc-Trp -Wang-resin을 사용하였다.

2. 펩타이드 -수지의 절단과 탈보호

합성 펩타이드에 연결되어 있는 수지와 측쇄(side chain)의 보호기를 제거하기 위해서 절단시약 [TFA (5ml) : m-cresol (0.6 ml) : thioanisole (1.7 ml) : EDT (0.9 ml)]을 사용하여 실온에서 90 분간 반응을 시켰다. 반응 후, 수지를 여과한 다음 펩타이드 용액을 진공농축하였다. 계속해서 농축액에 차가운 에테르를 첨가하여 펩타이드를 결정화 및 절단시약을 제거 시킨 후 5 % 초산 용액으로 녹여 농축 후 동결건조 시켰다.

3. 합성 펩타이드의 정제

동결 건조한 몇 종류의 조합성 펩타이드들은 역상 HPLC로 부분정제를 행하였다. 먹장어 체조직 유래의 합성 펩타이드는 다음의 분리조건으로 부분 정제하였다: 칼럼(column), Vydac 218TP510 Protein & peptide C₁₈ (9.2 × 250 mm); B용매의 농도경사(gradient)는 15 → 21 % (18 min)에서 유속을 4.0 mL/min로 부분정제된 합성 펩타이드는 계속해서 같은 칼럼(칼럼(column))을 사용하여 17 % CH₃CN의 아이소크래틱(isocratic)조건으로 정제하였다.

4.합성 펩타이드

1) L형 아미노산으로 구성된 합성펩타이드

먹장어의 체조직으로부터 정제되어 일차구조가 밝혀진 펩타이드는 모두 L형 아미노산으로 가장 먼저 합성하였다. C말단이 -amide화 되어있는 펩타이드인 L-burgerkinin Ⅰ-NH₂ (L-BⅠ-NH₂)을 합성하였다. 또한 C말단이 프리(free)한 OH 형태인 L-burgerkinin Ⅰ-OH (L-BⅠ-OH)를 합성하여 먹장어 장관에 대한 수축활성을 측정하였다.

2) D형 아미노산을 포함하는 펩타이드

Burgerkinin Ⅰ (BⅠ)의 아미노산잔기가 D형 아미노산으로 치환된 다양한 형태의 펩타이드를의 방법으로 합성하여 먹장어 장관평활근에 대한 수축활성을 측정하였다.

BⅠ의 경우 광학적 이성질체가 존재하지 않는 Gly을 제외하고 펩타이드의 아미노산 중 1개의 잔기가 D형 아미노산으로 치환된 C말단이 아미드(-amide) 형태부 터 먼저 합성하였다. 1번위치의 _L-Val → _D-Val으로 치환된 D[Val¹]-BⅠ-NH₂, 4번위치의 _L-Phe → _D-Phe으로 치환된 D[Phe⁴]-BⅠ-NH₂, 6번위치의 _L-Ser → _D-Ser으로 치환된 D[Ser⁶]-BⅠ-NH₂, 7번위치의 _L-Ser → _D-Ser으로 치환된 D[Ser⁷]-BⅠ-NH₂, 8번위치의 _L-Ala → _D-Ala으로 치환된 D[Ala⁸]-BⅠ-NH₂, 9번위치의 _L-His → _D-His으로 치환된 D[His⁹]-BⅠ-NH₂ 및 10번위치의 _L-Trp → _D-Trp으로 치환된 D[Trp¹⁰]-BⅠ-NH₂인 7종류의 펩타이드를 합성하였다. 또한 D형 아미노산이 1개 치환된 형태 중 C말단이 free한 형태인 4번위치의 _L-Phe → _D-Phe이 치환된 D[Phe⁴]-BⅠ-OH 및 7번위치의 _L-Ala → _D-Ala으로 치환된 D[Ala⁷]-BⅠ-OH의 두 종류의 펩타이드를 합성하였다.

다음으로 D형 아미노산이 두 개 치환된 형태 중에서 C말단이 아미드(amide)화 되어 있는 형태인 4, 6번의 위치가 _D-Phe 및 _D-Ser으로 치환된 D[Phe⁴, Ser⁶]-BⅠ-NH₂, 4, 8번의 위치가 _D-Phe 및 _D-Ala으로 치환된 D[Phe⁴, Ala⁸]-BⅠ-NH₂, 4, 9번의 위치가 _D-Phe 및 _D-His로 치환된 D[Phe⁴, His⁹]-BⅠ-NH₂, 6, 7번의 위치가 _D-Ser으로 치환된 D[Ser⁶ ^,7]-BⅠ-NH₂, 6, 8번의 위치가 _D-Ser 및 _D-Ala으로 치환된 D[Ser⁶, Ala⁸]-BⅠ-NH₂ 및 8, 9번의 위치가 _D-Ala 및 _D-His으로 치환된 D[Ala⁴, His⁹]-BⅠ-NH₂의 7종류의 펩타이드를 합성하였으며, 이들 중에서 C말단이 free한 형태로 D[Phe⁴, Ala⁸]-BⅠ-OH 1종류를 합성하였다.

D형 아미노산을 3개 포함하며 C말단이 아미드(amide)화된 BⅠ으로 4, 6 및 7번의 위치가 _D-Phe 및 _D-Ser으로 치환된 D[Phe⁴, Ser⁶ ^,7]-BⅠ-NH₂, 4, 8 및 9번의 위치가 _D-Phe, _D-Ala 및 _D-His으로 치환된 D[Phe⁴, Ala⁸, His⁹]-BⅠ-NH₂, 6, 7 및 8번의 위치가 _D-Ser 및 _D-Ala으로 치환된 D[Ser⁶ ^,7, Ala⁸]-BⅠ-NH₂의 3종류의 펩타이드를 합성하였고, C말단이 free한 형태인 D[Phe⁴, Ser⁶, Ala⁸]-BⅠ-OH, D[Phe⁴, Ser⁶, His⁹]-BⅠ-OH, D[Phe⁴, Ser⁶, His⁹]-BⅠ-OH의 3종류의 펩타이드를 합성하였다.

D형 아미노산이 4개가 치환된 BⅠ중 4, 6, 7 및 8번의 위치가 _D-Phe, _D-Ser 및 _D-Ala으로 치환된 C말단이 -amide 및 free한 D[Phe⁴, Ser⁶ ^,7, Ala⁸]-BⅠ-NH₂와 D[Phe⁴, Ser⁶ ^,7, Ala⁸]-BⅠ-OH의 2 종류를 합성하였다. 그리고 4, 6, 7 및 9번 위치에 _D-Phe, _D-Ser 및 _D-His으로 치환된 D[Phe⁴, Ser⁶ ^,7, His⁹]-BⅠ-NH₂, 6, 7, 8 및 9번 위치가 _D-Ser, _D-Ala 및 _D-His으로 치환된 D[Ser⁶ ^,7, Ala⁸, His⁹]-BⅠ-NH₂는 C말단을 amide 형태로 합성하였다.

마지막으로 C말단 및 N말단을 제외한 5개의 아미노산 모두가 D형으로 치환된 D[Phe⁴, Ser⁶ ^,7, Ala⁸, His⁹]-BⅠ-NH₂는 amide 형태만을 합성하였다.

5. 천연물과 합성물의 비교

정제한 천연물과 합성물의 동일성은 분자량 측정과 역상(reverse-phase) HPLC 칼럼(column)을 이용한 머무름시간(retention time, RT) 및 먹장어 장관에 대한 수축활성을 비교함으로써 확인하였다. 체조직으로부터 정제한 펩타이드는 Hypersil BDS C₁₈ (2 × 125 mm) 칼럼(column)을 사용하여 20 % CH₃CN의 아이소크레틱(isocratic) 조건으로 비교하였다.

천연물 BⅠ은 모두 L형의 아미노산으로 합성된 합성 L-BⅠ과의 동일성을 확인하기 위해서 분자량 측정, 역상 HPLC를 사용하여 머무름 시간을 비교하였다. 이들 펩타이드들의 분자량을 측정 한 결과, 4 종류의 합성물과 천연물의 분자량은 각각 이론값과 측정값이 일치하였다 (표 1).

합성한 L-BⅠ-NH₂를 역상 HPLC를 사용하여 천연물과 머무름 시간을 비교한 결과, L-BⅠ-NH₂의 경우 천연물은 22.12 분에서 용출된 반면 합성물은 21.03분에서 용출되어 머무름 시간이 일치하지 않았다 (도 2).

또한 합성 L-BⅠ-NH₂를 사용하여 먹장어 장관에 대한 수축활성을 농도별로 측정하였다.

L-BⅠ은 10^-5 M에서도 먹장어 장관에 대해 수축활성을 나타내지 않았다 (미 표시).

6. D- Amino acid 가 포함된 BⅠ

모두 L형의 아미노산으로 합성한 L-BⅠ은 천연물 BⅠ과 같은 분자량을 나타냈지만, 역상 HPLC상에서 머무름 시간이 달랐다. 또한 먹장어 장관에 대하여 L-BⅠ의 C 말단이 아마이드(amide)화 및 free한 형태 모두가 수축활성을 나타내지 않았다 (미 표시). 이러한 결과로 미루어 보아 천연물의 BⅠ내에 적어도 1개 이상의 D형 아미노산이 존재함을 의미한다. 따라서 천연물 BⅠ의 일차구조와 완전히 동일한 일차구조를 밝히기 위하여 D형 아미노산을 포함하는 다양한 펩타이드들을 합성하여, 천연물 BⅠ의 생리활성을 비교하는 방법을 사용하였다 (Heck, S.D., Siok, C.J., Krapcho, K.J., Kelbaugh, P.R., Thadeio, P.F., Welch, M.J., Williams, R.D., Ganong, A.H., Kelly, M.E., Lanzetti, A.J., Gray, W.R., and Volkmann, R.A. (1994) Science 266, 1065-1068.; Jimenez, E.C., Olivera, B.M., Gray, W.R., and Cruz, L.J. (1996) J. Biol . Chem . 271, 28002-28005.; Kreil, G., Barra, D., Simmaco, M., Erspamer, V., Erspermer, G.F., Negri, L., Severinin, C., Corsi, R., and Melchiorri, P. (1989) Eur . J. Pharmacol . 162, 123-128.).

[실시 예 3] 먹장어의 장관 평활근에 대한 수축활성

1. 장관 평활근에 대한 수축활성 측정

먹장어 체조직 및 내장조직으로부터 장관평활근 수축활성을 지니는 펩타이드를 정제하기 위해 먹장어의 장관을 사용하였다. 또한 합성한 펩타이드들도 먹장어 장관에 대한 수축활성을 측정하였다.

장관의 표본을 만들기 위해 배측부를 항문 쪽으로 절개하였다. 그 후 식도로부터 3 - 4 cm 떨어진 부위를 2 - 3 cm 길이로 재빨리 적출 하였다. 적출한 먹장어 장관은 글루코오스(glucose)가 포함된 인공해수(NaCl, 445; KCl, 10; CaCl₂2H₂O,10; MgCl₂6H₂O, 55; Glucose, 10; Tris-HCl buffer (pH 7.8), 10 mM)에 담근 후 면실로 5 - 10 mm정도의 길이 정도로 아래와 위를 면실로 묶었다. 준비된 장관은 아래쪽은 2 mL의 반응조에 고정시키고 위쪽은 생체반응측정기의 아이소메트릭 트랜스듀서(isometric transducer)에 연결하여 2.0 g의 장력을 주었다.

수축활성측정은 실온에서 반응조 내에 공기를 주입시켜 주면서 안정화시킨 후 1 x 10^-5 M 아세틸콜린(acetylcholine, Ach)을 15분 간격으로 3회 투여하여 활성화시켰다. 이후 준비된 각 HPLC 정제단계에서 얻은 분획들과 펩타이드(peptide)성 약물을 누적투여방법으로 투여하였다. 시료들은 주입 한 후 수축활성을 측정하여 생리활성측정기(physiograph)상에 기록하였다.

농도-의존적으로 수축활성의 측정은 행하였으며, 포유류 유래 BK (mammalian BK) 및 먹장어 BK (hagfish BK)의 수축활성 측정은 5 × 10^-7 M 카바콜 (cabachol) 로, 합성 버그키닌 (burgerkinin)Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ들의 수축활성 측정은 10^-5 M Ach의 최대수축에 대한 상대적인 수축 %로 나타내었다. 모든 약리활성은 ED₅₀ (최고 수축의 50 %를 나타낼 때의 농도) 및 Emax (최고 수축 %)로써 비교하였다. ED₅₀ 값은 최소자승법으로 계산하였으며, 통계적 처리는 student’s t-test로서 하였다. 모든 반응은 means±S. E.로 표시하였다.

1) BⅠ의 수축활성

각각의 BⅠ-NH₂에 D형 아미노산이 하나씩 치환된 치환체의 농도별 수축반응을 나타내며, 표 1는 역치반응의 농도를 나타낸다. D[Phe⁴]-BⅠ-NH₂는 10^-7M에서 가장 낮은 농도로 수축활성이 나타나기 시작하였으며, 최고수축반응 (E_max)은 115.9 ± 7.98 %로 가장 크게 나타났다. 또한, 수용체와의 친화도를 나타내는 ED₅₀ 의 값은 7.0 × 10^-7 M로 나타났다. 그러나 C말단이 free한 D[Phe⁴]-BⅠ-OH는 활성을 나타내지 않았다. D[Ala⁸]-BⅠ-NH₂는 D[Phe⁴]-BⅠ-NH₂보다 10배 높은 농도인 10^-6 M에서 수축활성이 나타나기 시작하였으며, E_max값 또한 63.73 ± 24.5 %로 역시 D[Phe⁸]-BⅠ-NH₂보다 낮았다. D[Phe⁴]-BⅠ-OH와는 달리 D[Ala⁸]-BⅠ-OH는 D[Ala⁸]-BⅠ-NH₂와 유사한 활성을 나타내었다. D[Ser⁶]-BⅠ-NH₂ 및 D[His⁹]-BⅠ-NH₂도 고농도인 10^-5M에서 수축활성이 나타나기 시작하지만 나머지 다른 아미노산 잔기를 D형으로 치환한 합성물들에 대해서는 장관수축활성을 나타내지 않았다.

이러한 결과들을 토대로 하여 D[Phe⁸]-BⅠ-NH₂와 D[Ala⁸]-BⅠ-NH₂를 포함하는 펩타이드를 기준으로 D형 아미노산을 2 - 5개를 포함하는 펩타이드들을 합성하였다.

D형 아미노산이 2개씩 치환된 D[Phe⁴, Ala⁸]-BⅠ-NH₂는 10^-8M에서 가장 낮은 농도로 수축활성을 나타내기 시작했으며, E_max는 117.9 ± 11.37 % 및 ED₅₀은 4.2 × 10^-7M로 나타났다. 흥미롭게도 [_D-Phe⁴, Ala⁸]-BⅠ-OH는 고농도인 10^-5 M에서 조차도 수축활성을 나타내지 않았다. 다른 합성물 중에서 D[Ser⁶ ^,7]-BⅠ-NH₂와 D[Ala⁸,His⁹]-BⅠ-NH₂는 10^-6M에서 D[Phe⁴,His⁹]-BⅠ-NH₂는 10^-5M에서 수축활성이 나타나기 시작하였다. 그러나 D[Phe⁴,Ser⁶]-BⅠ-NH₂와 D[Ser⁶,Ala⁸]-BⅠ-NH₂는 수축활성을 보이지 않았다.

또한 D형 아미노산이 3-5개가 각각 D형 아미노산으로 치환된 펩타이드의 경 우, D[Phe⁴,Ala⁸, His⁹]-BⅠ-NH₂, D[Phe⁴,Ser⁶ ^,7Ala⁸]-BⅠ-NH₂들은 10^-6 M에서 D[Phe⁴,Ser^6,7]-BⅠ-NH₂, D[Ser⁶,Ser⁷, Ala⁸]-BⅠ-NH₂, D[Ser⁶ ^,7,Ala⁸, His⁹]-BⅠ-NH₂,D[Phe⁴,Ser⁶ ^,7, Ala⁸ _,His⁹]-BⅠ-NH₂들은 10^-5 M에서 수축활성을 나타내기 시작하였지만, 나머지 치환물들은 수축활성을 나타내지 않았다. 또한 C말단이 free한 D[Phe⁴,Ser^6,7, Ala⁸]-BⅠ-OH은 10^-6 M에서, D[Phe⁴,Ser⁶, Ala⁸]-BⅠ-OH은 10^-5 M에서 수축활성을 나타내기 시작하였으며, D[Phe⁴,Ser⁶, His⁹]-BⅠ-OH, D[Phe⁴,Ala⁸, His⁹]-BⅠ-OH는 수축활성을 나타내지 않았다.

따라서, 다양한 종류의 합성물과 그들을 이용한 평활근 수축활성측정 결과를 종합하여 수축활성을 나타내는 3종류의 활성세기를 살펴보면 다음과 같다; D[Ala⁸]-BⅠ-NH₂《 D[Phe⁴]-BⅠ-NH₂ 〈 D[Phe⁴, Ala⁸]-BⅠ-NH₂.

다시 말해서 D[Phe⁴, Ala⁸]-BⅠ-NH₂가 먹장어 장관에 수축활성을 나타내기 위해서 평활근 내에 존재하는 수용체와 결합하기 위한 가장 적합한 구조를 취함을 의미한다.

D[Phe⁴, Ala⁸]-BⅠ-NH₂와 D[Phe⁴, Ala⁸]-BⅠ-OH를 비교하여 보면 C말단이 free 한 OH의 형태는 수축활성이 나타나지 않음을 알 수 있으며, 다른 C말단에 OH의 형태를 지닌 치환체에서도 마찬가지로 활성이 소멸되거나 낮아짐을 알 수 있다. 이러한 것은 C말단의 amide가 수축활성을 위한 중요한 역할을 하고 있다는 것을 나타낸다.

또한, D[Phe⁴, Ala⁸]-BⅠ-NH₂에 또 다른 D형의 아미노산이 첨가된 치환체의 경우를 살펴보면 수축활성이 현저히 감소하거나 소멸됨을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 D[Phe⁴, Ala⁸]-BⅠ-NH₂에 첨가된 또 다른 D형의 아미노산은 수용체와 결합에 있어서 구조적 장애를 유도할 것이라 생각된다.

끝으로 D[Phe⁴, Ala⁸]-BⅠ-NH₂를 L-BⅠ-NH₂와 비교하여 보면 역치반응의 농도가 약 10,000배 이상 차이가 나며, 이는 이전의 보고(Iwakoshi, E., Hisada, M., and Minakata, H. (2000) Peptides 21, 623-630.; Morishita, F., Nakanishi, Y., Kaku, S., Furukawa, Y., Ohta, S., Hirata, T., Ohtani, M., Fujisawa, Y., Muneoka, Y., and Matsushima, O.(1997)Biochem . Biophys . Res . Commun . 240, 354-358)와 유사하였다. 그러므로 이러한 결과들을 종합하여 보면 _D-Phe⁴, _D-Ala⁸ 및 C말단의 amide는 BⅠ의 장관평활근 수축활성을 나타냄에 중요한 역할을 하는 요소이며, BI의 완전한 일차구조는 Val-Gly-Gly-_D-Phe-Gly-Ser-Ser-_D-Ala- His-Trp-amide이다.

이상에서와 같이 본 발명은 비록 상기의 실시예에 한하여 설명하였지만 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다.

이상에서 보여준 바와 같이 본 발명은 먹장어(Eptatretus burgeri)의 체조직으로부터 분리되었고, 먹장어 장관평활근에 대한 수축활성 지닌 Val-Gly-Gly- _D-Phe-Gly-Ser-Ser-_D-Ala-His-Trp-NH₂함유 펩타이드를 제공함으로써 의약 및 생물산업에 있어 신약 개발의 선도 물질 및 후보물질로서 유용한 효과를 나타낸다.

Claims

먹장어(Eptatretus burgeri) 체조직으로부터 추출 정제된 D형 아미노산을 포함하는 신경성 펩타이드는 일차구조를 가진 것으로, 아미노산서열이 Val-Gly-Gly-_D-Phe-Gly-Ser-Ser-_D-Ala-His-Trp-NH₂으로 표시되는 것을 특징으로 하는 평활근 수축활성을 지닌 신경성 펩타이드.
제 1항에 있어서, 신경성 펩타이드는 평활근 수축활성을 지닌 것을 특징으로 하는 신경성 펩타이드.