JP2002525102A - Ｎｃａｍ結合化合物 - Google Patents

Ｎｃａｍ結合化合物

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ホー． イエンセン，ペーテル
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、神経細胞接着分子（NCAM）提示細胞の増殖および／またはそれらからの神経突起のアウトグロースを刺激することができる新規な化合物を提供する。さらに、本発明は、正常の、変性したおよび損傷したNCAM提示細胞を処置する医薬組成物、薬剤および方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、中枢神経系および末梢神経系の疾患および症状の処置、筋肉の疾患
および症状の処置、および種々の器官の疾患および症状の処置に関する。特に、
本発明は、神経細胞接着分子（NCAM）提示細胞、例えば、ニューロン、の増殖お
よび／またはそれらからの神経突起のアウトグロース（outgrowth）を刺激する
ことができる新規な化合物を提供する。それ以上の面において、本発明は、正常
の、変性したおよび損傷したNCAM提示細胞を処置する組成物および薬剤ならびに
方法を提供する。
【０００２】 発明の背景 最近の十年の間に、脳、こうして神経細胞およびそれらの機能は科学研究の主
題となった。疑いなく、この複雑な適切な機能は身体および精神の適切な機能に
ついて極めて重要である。身体的および精神的機能障害は、なかでも、神経伝達
物質を包含するシグナリング化合物のレベルの異常に関係づけることができる。
いくつかの機能障害は神経細胞（ニューロン）、神経細胞の間の接続および筋肉
細胞と神経細胞との間の接続の崩壊に関係づけることができる。これは、例えば
、神経変性性疾患、例えば、神経細胞の死が老化に導くアルツハイマー病の場合
である。
【０００３】 脳の発生の間に、神経細胞（ニューロン）の接続が形成する。このような接続
は、ニューロン間の連絡が起こり、個々のニューロンが全体として一緒に機能で
きるために必要である。成熟した脳において、ニューロン間の接続は終始一貫し
て改造されて、変化する環境からの新しい要求を受け入れる。神経接続を改造す
る能力は、学習および記憶、および再生、例えば、脳に対する損傷または神経変
性疾患においてきわめて重要である。
【０００４】 神経接触の形成をコントロールするメカニズムは発生および成熟において一般
に類似する。細胞接着を包含するニューロン間の接触の形成、神経細胞の伸長（
神経突起）の形成、線維束性収縮（個々の神経突起の束形成）および接触点（シ
ナプス）の形成に、いくつかのメカニズムが関係する。
【０００５】 細胞接着分子（CAMs）は細胞間のタンパク質仲介接着のグループを構成する。
CAMsの主要なグループは、免疫グロブリンドメインの存在により特徴づけられる
、免疫グロブリン（Ig）のスーパーファミリーに属する。神経細胞接着分子（NC
AM）は、神経系において特に豊富であるIgスーパーファミリーの接着分子である
。NCAMは神経細胞の外膜において発現される。
【０００６】 1つのNCAM分子が他の分子上の他のNCAM分子に結合するとき、2つの細胞間の結
合が強化される。NCAMはNCAMに結合するばかりでなく、かつまた神経細胞上にま
たは脳の細胞外物質（細胞外基質）中に見出される他のタンパク質に結合する。
神経細胞間または神経細胞と細胞外基質との間の接着を仲介することによって、
NCAMは細胞の移動、神経突起の伸長、神経突起の線維束性収縮およびシナプスの
形成に影響を及ぼす。
【０００７】 NCAMの発現は形態形成事象に相関し、NCAMは発生の間において重要であること
を示唆する（Edelman 90）。こうして、NCAMは神経系（Daston他、1996）およ
び種々の器官、例えば、腎臓（Lackie他、1990）、肝臓（Knittel他、1996）、
腸（Romanska他、1996）、心臓（Gaardsvoll他、1993）、生殖腺（Moller他、19
91）、膵臓（Moller他、1992）、および筋肉（Landmesser他、1990）の発生にと
って重要であると考えられる。したがって、NCAM機能に影響を及ぼすことができ
るリガンドは、ターゲット細胞の適当な分化を誘導することによって、これらの
器官の障害された機能において潜在的に有益である（Walsh他、1990）。
【０００８】 脳において、NCAMの役割は臭覚系、海馬、小脳および網膜を包含する、ある種
の脳領域の発生を変更したノックアウトマウスにより支持された（Cremer他、19
94）。これらの組織において、NCAM発現の欠如は細胞の移動（Ono他、1994）お
よび神経突起のアウトグロースおよび線維束性収縮（Cremer他、1997）を障害し
、これは引き続いてシナプス発生を変更し、形態および機能を変化させる。NCAM
遺伝子が変化して可溶性NCAM型のみを産生するトランスジェニックマウスは出生
前に死亡し、NCAM機能が発生を妨害する、大きい潜在性を有することを示す（Ra
binowitz他、1996）。
【０００９】 成熟神経系において、NCAMは再生、学習および記憶に関連する神経接続の柔軟
性にとって重要であることが示された（Fields他、1996）。末梢神経系において
、病変（Nieke他、1985）および卒中（Jucker他、1995）を包含する損傷後の再
生における神経線維のアウトグロースおよび神経−筋肉の接続の形成にとって、
NCAMは必要であると考えられる。
【００１０】 そのうえ、末梢神経および神経−筋肉の接続を再生する能力（Olsen他、1995
）ならびに多数の変性的筋肉疾患（Walsh他、1985）において、NCAMは老化に関
係する障害に多分関係する。NCAMが神経突起のアウトグロース、線維束性収縮、
分岐および多分再生に関連するターゲット認識に重要であると考えられる、中枢
神経系において、NCAMの同様な役割が観測された（Daniloff他、1989）。さらに
、ニューロン機能にきわめて重要である神経線維の髄鞘形成にNCAMがまた必要で
あることを、NCAM−MAGダブルノックアウトマウスは示した。学習において、ニ
ューロン接続の微妙な改造は記憶痕跡の安定化に必要であり、そしてNCAM発現が
このような変化と付随的に変化することが示された（Doyle他、1992）。
【００１１】 そのうえ、抗体によるか、あるいはノックアウトマウスにおいてNCAM機能の妨
害は学習能力を障害する（Luthi他、1994；Ronn他、1995；Scholey他、1993）。
ノックアウトマウスから、NCAMがまた他の行動現象に関係することが明らかにな
った。こうして、NCAMノックアウトマウスはサーカディアンリズムを変更し（Sh
en他、1997）そして雄は攻撃性を増加させた（Shen他、1997）。ヒトにおいて、
可溶性NCAM型のレベルの増加は精神分裂病（van Kammen他、1998）および硬化
症（Massaro他、1987）において示され、NCAMがこれらの疾患にとって重要であ
りうることを示唆した。
【００１２】 NCAMは3つの主要な型で見出され、それらのうちの2つはトランスメンブラン型
であるが、第3型は脂質アンカーにより膜に結合されている（第1図参照）。すべ
ての3つの型は、5つの免疫グロブリンドメイン（Igドメイン）および2つのフィ
ブロネクチン様ドメイン（FnIIIドメイン）から細胞外的に成る同一構造を有す
る。NCAMの前駆体型はシグナル配列を含有する。ヒトNCAMの140Kdのイソ型前駆
体のアミノ酸配列を第17図に示す。IgドメインはN−末端から1から5、すなわち
、IgG1〜Ig5、に番号がつけられている。
【００１３】 フィブロネクチンドメインは同様にFnIII1およびFnIII2と呼ばれる。仲介する
細胞接着に加えて、NCAMは細胞におけるシグナルトランスダクションに影響を与
える（Schuch他、1989）。細胞表面におけるNCAM分子が他の細胞に結合するとき
、シグナルは細胞の内部に伝達される（トランスメンブランシグナリング）。細
胞内において、シグナリングカスケードが達成され、これは引き続いて細胞の挙
動に影響を及ぼす。NCAM結合により開始されたシグナリングは神経突起の伸長を
刺激できることが示された（Doherty他、1996）。
【００１４】 どのNCAMドメインが細胞接着およびシグナルトランスダクションを仲介するか
は不明瞭である。一般的に受け入れられた仮定は、同種親和性NCAM接着が2つの
対向するNCAM分子のIg3ドメイン間のトランスレシプロカル（transreciprocal）
相互作用により仲介されることを予測する。かなりの証拠はこの見解を支持し、
そして推定上の結合部位が同定された（Rao他、1992；Rao他、1994；Sandig他、
1994）。また、Ig3ドメインに影響を与えるリガンドは、NCAM仲介細胞接着を阻
害することが示された。
【００１５】 最近の仮定は、Ig3ばかりでなく、かつまたすべての5つのIgドメインが同種親
和性NCAM結合を仲介することを予測する（Ranheim 96）。この仮定に従い、1つ
のNCAM分子のIg1は他のNCAM分子のIg5に結合し、Ig2はIg4に結合し、そしてIg3
はIg3に結合する。こうして、これらのNCAM結合の2つの理論は部分的にオーバー
ラップしている。最近、本発明者らおよび同僚は、2つの対向するNCAM分子のIg1
およびIg2ドメイン間の二重レシプロカル（reciprocal）相互作用が同種親和性N
CAM結合を仲介することができることを提案した（Thomsen他（1996）、Kiselyov
他（1997）、Ronn：1997）。
【００１６】 以前にNCAM Ig1ドメインに結合することができるとして同定された、小さい
ペプチドを添加したとき、海馬細胞の培養においてニューロンの凝集は阻害され
ることをRonnは観測した。神経突起のアウトグロースの追加の刺激がまた見られ
た。Ronnはペプチド研究の配列を開示せず、また医学的処置における彼の観測の
利用を示唆しなかった。結論において、同種親和性NCAM結合のメカニズムは熟慮
すべき問題であるが、この分野における大部分の研究者らは2つの対向するNCAM
分子のすべての5つのIgドメインまたは少なくともIg3ドメイン間のレシプロカル
相互作用の仮定を好む。
【００１７】 NCAM、精製されたNCAMタンパク質および組換えNCAMドメインに対する抗体は、
ある種の細胞においてシグナルトランスダクションを誘導することが示された。
高い濃度のNCAM抗体は、一時的カルシウム増加ならびにすべてはないが、あるニ
ューロン細胞におけるpH変化を誘導することができる（Schuch他、1989）。組換
えNCAMドメインIg1およびIg2および組合わせされたドメインIg1〜Ig5は、同様な
一時的カルシウム増加およびある種の細胞におけるpH変化を誘導することができ
る（Frei他、1992）。
【００１８】 基質として使用されるか、あるいは細胞の単層により発現されるとき、NCAMタ
ンパク質は神経突起の伸長を刺激することができる。応答はNCAMのFnIIIドメイ
ンと繊維芽細胞成長因子−レセプターとの相互作用に依存する（Doherty他、199
6）。さらに、NCAMの細胞質部分とチロシンキナーゼfynとの相互作用は神経突起
のアウトグロースにとって重要である（Beggs他、1997）。 この相互作用はRas−MAP−キナーゼ経路を活性化すると考えられる（Schmid、
R−S他、1999）。
【００１９】 また、下層に固定化された組換えNCAMドメインは、神経突起の伸長、神経突起
の分岐または神経突起の線維束性収縮を刺激することができる。こうして、NCAM
のFnIIIドメインは、下層として使用するとき、神経突起の分岐を増加すること
ができる（Stahlhut他、1997、Kasper他、1996）。そのうえ、FnIIIドメインは
、細胞の拡大および神経突起のアウトグロースに影響を及ぼすために最も効力が
あるNCAMドメインであると報告された。また、Ig1〜Ig5はこれらのプロセスに影
響を及ぼしたが、FnIIIドメインよりも効力が低かった（Frei他、1992）。
【００２０】 対照的に、この研究においてIg1およびIg2は細胞接着および細胞移動を最も有
効に促進した（Frei他、1992）。Frei他は、また、単離されたNCAMドメインIg3
、Ig4、Ig5、FnIII、1およびFnIII、2による神経突起のアウトグロースの刺激を
観測したが、Ig1およびIg2による刺激を観測しなかった。Ig5とFnIII、1ドメイ
ンとの間に位置する配列は神経突起の線維束性収縮にとって重要であることが示
された（Pollerberg他、1993）。NCAMのIg5ドメインは、このドメイン上に糖鎖
ポリシアル酸（PSA）の存在または非存在のために、神経突起のアウトグロース
にとって主として重要である（Rutishauser他、1996）。同様に、レーン4ドメイ
ンは交互にスプライスされたドメインVASEの存在または非存在のために重要であ
る（Doherty他、1992）。
【００２１】 VASE配列に対応する合成ペプチドは、NCAM刺激された神経突起のアウトグロー
スを妨害することが示された（Lahrtz他、1997）。そのうえ、NCAM Ig4ドメイ
ンは他の接着分子、L1、に結合し、これにより神経突起のアウトグロースに影響
を及ぼすと推定される（Horstkorte他、1993）。固定化された試薬の作用と対照
的に、NCAM抗体または組換えドメインは、溶液中に添加したとき、神経突起のア
ウトグロースを阻害する。Ig3中の推定された同種親和性結合部位に対応するペ
プチドまたはIg3中のこの配列における突然変異は、NCAMにより刺激された神経
突起のアウトグロースを阻害することが示された（Sandig他、1994）。
【００２２】 しかしながら、最近、NCAMに対する抗体は神経突起のアウトグロースを刺激す
ることが示された（米国特許第5,667,978号）。この抗体はNCAMのIg3ドメインを
認識する。すべてのNCAMドメインは膠細胞、神経芽細胞および繊維芽細胞の増殖
に影響を及ぼすことが示され、Ig3ドメインは最も効力があった。この機能はMAP
キナーゼ活性との相互作用を必要とすることが示された（Krushel、1988）。Ig3
ドメイン配列の一部分に対応する小さいペプチドを包含する、NCAM Ig3ドメイ
ンの種々の阻害リガンドは膠細胞の増殖を阻害できることが示された（WO 96／
18103）。
【００２３】 これらのデータが示唆するように、NCAMタンパク質またはNCAMリガンドは神経
系および他の組織の機能に潜在的に影響を及ぼすことができるであろう。膠細胞
増殖の阻害は変性条件において有益であろう（WO 96／18103、米国特許第5,625
,040号、米国特許第5,667,978号）。したがって、NCAM機能、特に神経突起のア
ウトグロースの機能を刺激できる場合、脳に対する有益な作用は可能であろう。
ある種のin vitro NCAM機能の刺激はNCAM Ig3に対する抗体について記載され
た（米国特許第5,667,978号）。
【００２４】 しかしながら、NCAM機能に対して有意な刺激作用を有するNCAMの小さいリガン
ドは記載されてきていない。そのうえ、このようなリガンドがどのNCAMドメイン
をターゲットするかは明らかではない。大部分の証拠は同種親和性結合について
きわめて重要なドメインとしてNCAM Ig3ドメインに指摘しているが、FnIIIドメ
インと一緒にNCAMの細胞質部分はシグナリング分子との相互作用にとって最も重
要であると推定される。
【００２５】 博士論文「NCAMおよび神経の柔軟性」（Ronn、1997）において、神経の柔軟性
におけるNCAMの役割が研究された。神経細胞の凝集、神経突起の伸長および長期
間の増強（LTP）を包含する、異なるアッセイ（試験系）を使用して、NCAMの役
割または作用がNCAM抗体、NCAM融合タンパク質および他のNCAMリガンドによりに
影響を受ける方法を研究した。ランダムペプチドライブラリーから選択される推
定されたNCAMリガンドを研究した。
【００２６】 ペプチドはIg1に結合できることが見出された。1つの特異的ペプチドは、博士
論文においてそれ以上の特性決定されておらず、神経細胞の凝集を阻害し、神経
突起のアウトグロースを刺激することが示された。このようなリガンドは、発生
する神経系ならびにシナプスの柔軟性におけるNCAMの役割を明瞭する連続する試
みにおいて価値あるツールであることが結論された。研究されたペプチドの可能
な医学的使用は博士論文の目的でなく、またその中で示唆されていない。さらに
、博士論文は研究したペプチドの配列を開示していない。
【００２７】 米国特許第5,625,040号は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ホスファ
カン（Phosphacan））およびNCAMへの結合による神経再生の増強におけるその使
用に関する。ホスファカン配列は1616アミノ酸残基長さである。適当なベクター
中でコード遺伝子をクローニングすることによって、組換えホスファカンは得ら
れた。ホスファカンのいくつかのタンパク質分解フラグメントの同定されたアミ
ノ酸配列に従い選択されたプライマーを使用して、遺伝子を単離した。フラグメ
ントのいずれも生物学的作用それ自体を有することは示唆されなかった。
【００２８】 神経突起のエクステンション（伸長）についての可能性に対する刺激作用は、
神経細胞間の接続の柔軟性を必要とする神経系の機能において有益な作用を有す
ることを期待できる。このような機能は、学習および記憶および再生を包含する
。したがって、NCAM仲介シグナリングに影響を及ぼす能力を有する物質を同定す
ることはかなり興味深いことである。
【００２９】 発明の要約 本発明によれば、中枢神経系および末梢神経系において神経突起の伸長を促進
する、新規な化合物が提供される。 さらに詳しくは、本発明は、 （a） NCAM Ig1ドメインに結合し、および／または （b） NCAM Ig2ドメインに結合し、そして NCAM提示細胞からの神経突起のアウトグロース（outgrowth）および／またはNCA
M提示細胞の増殖を刺激または促進することができる化合物に関する。NCAM Ig1
ドメインおよびNCAM Ig2ドメインとは、NCAM Ig1ポリペプチドおよびNCAM Ig
2ポリペプチドであると理解すべきである。これらの化合物は、a) NCAM Ig2ペ
プチドおよびそのフラグメントおよび模擬物を含んでなるグループ、およびb) N
CAM Ig1ポリペプチドおよびそのフラグメントおよび模擬物を含んでなるグルー
プを包含する。
【００３０】 このような化合物は天然に存在するならびに合成のならびに、ペプチド核酸（
PNA）モノマーおよび／またはペプチド模倣物から構成されることができる。 本発明は、組合わせされた（統合された）（unified）Ig1およびIg2ドメイン
により構築されたNCAM分子中の同種親和性結合部位を開示し、このようなドメイ
ンの組合わせは以後においてNCAM Ig1−Ig2またはNCAM Ig1−Ig2ドメインとし
て表示される。
【００３１】 こうして、本発明は、NCAM Ig1ドメイン（上記（a）に対応する）またはNCAM
Ig2ドメイン（上記（b）に対応する）に結合する化合物を包含する。これらの
2つのは一緒になって本明細書において開示する同種親和性結合部位を形成する
。 本発明によれば、（a）および（b）範囲内の前記化合物は、それぞれ、神経突
起のアウトグロースを活性化することができる化合物の下記の3つのグループ（
化合物のグループI、IIおよびIII）に属する。
【００３２】 化合物のグループIに関すると、化合物は特に少なくとも2つの塩基性アミノ酸
残基、好ましくは10アミノ酸残基の配列内の少なくとも2つの塩基性アミノ酸残
基、より好ましくは3アミノ酸残基の配列内の少なくとも2つの塩基性アミノ酸残
基を含んでなる、結合モチーフを通してNCAMの第1ドメイン（NCAM Ig1）に結合
するペプチドであることができる。
【００３３】 重要なペプチドは、下記の配列を含んでなる： （Xaa+）m−（Xaa）p−（Xaa+）−（Xaa1）r−（Xaa+）−（Xaa）q−（Xaa+）n
ここで Xaa+は塩基性アミノ酸残基であり、 Xaa1は任意のアミノ酸残基であり、 Xaaは任意のアミノ酸残基であり、そして m、n、p、qおよびrは独立して0または1であり、そしてここで塩基性アミノ酸
残基は好ましくはリシンまたはアルギニンでありそしてrは好ましくは1である。
それらは任意のアミノ酸残基であることができる。しかしながら、Xaa1は好まし
くはプロリン（P）またはグルタミン酸（E）である。
【００３４】 なおさらに好ましいペプチドにおいてrは1であり、そしてmおよびnの少なくと
も1つは1である。 本発明の好ましいペプチドは配列（K／R）0-1−K／R−X−K／R）を含んでなり
、ここでXはXaa1と同一の意味、適当にはK／R−K／R−X−K／RまたはK／R−X−K
／R、より適当には配列K／R−P−K／R、K／R−K／R−P−K／R、K／R−K／R−E−
K／RまたはK／R−K／R−E−K／R、最も適当には配列K−P−K、K−K−P−K、K−K
−E−KまたはK−K−E−Rを有する。例は配列A−S−K−K−P−K−R−N−I−K−A
（配列番号1）、A−K−K−E−R−Q−R−K−D−T−Q（配列番号2）およびA−R−A
−L−N−W−G−A−K−P−K（配列番号3）である。
【００３５】 化合物のグループIIに関すると、化合物はIg1ドメインにより構築されたNCAM Ig1−Ig2の同種親和性結合部位の部分に結合するペプチドであることができる
。 結合モチーフは、少なくとも2つの塩基性アミノ酸残基および少なくとも1つの
無極性アミノ酸、好ましくは少なくとも2つの塩基性アミノ酸残基および12アミ
ノ酸残基の配列内の1つの無極性アミノ酸残基を含んでなる。より好ましくは、
結合モチーフは少なくとも2つの塩基性アミノ酸残基および8アミノ酸残基の配列
内の少なくとも1つの無極性アミノ酸を含んでなる。最も好ましくは、結合モチ
ーフは、1無極性アミノ酸残基に加えて3アミノ酸により分離された少なくとも2
つの塩基性アミノ酸残基を含んでなり、1つの隣接するアミノ酸は塩基性アミノ
酸残基の1つにより1アミノ酸だけ分離されている。
【００３６】 このようなペプチドは、下記の一般的配列を含んでなる： （Xaa+）−（Xaa）−（Xaa）−（Xaa）m−（Xaa+）−（Xaa）−（Xaa-）n− （Xaah）−（Xaa）o−（Xaah）p ここで Xaa+は塩基性アミノ酸残基であり、 Xaa-は酸性アミノ酸残基であり、 Xaahは無極性アミノ酸残基であり、 Xaaは任意のアミノ酸残基であり、そして m、n、oおよびpは独立して0または1であり、そして塩基性アミノ酸残基は好ま
しくはリシンまたはアルギニンであり、酸性アミノ酸は好ましくはグルタミン酸
またはアスパラギン酸であり、無極性アミノ酸は好ましくはロイシン、イソロイ
シン、バリンまたはフェニルアラニンであり、そしてrは好ましくは1である。
【００３７】 本発明の好ましいペプチドは配列（K／R）−X−X−X−（K／R）−X−（E／D）
−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）を含んでなり、ここでXは任意のアミノ酸
残基、適当には配列（K／R）−X−（E／D）−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F
）、（K／R）−X−X−X−（K／R）−X−（E／D）、（K／R）−X−X−（K／R）−
X−（E／D）または（K／R）−X−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）、より適
当には配列（K／R）−X−X−X−（K／R）−X−（E／D）−（L／I／V／F）、（K
／R）−X−X−（K／R）−X−（E／D）−（L／I／V／F）または（K／R）−X−X−
X−（K／R）−X−（L／I／V／F）、なおより適当には配列（K／R）−X−X−（K
／R）−X−（E／D）−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）、（K／R）−X−X−X
−（K／R）−X−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）または（K／R）−X−X−X
−（K／R）−X−（E／D）−（L／I／V／F）−（L／I／V／F）、最も適当には配
列GRILARGEINFK（配列番号23）である。
【００３８】 化合物のグループIIIに関すると、化合物はIg2ドメインにより構築されたNCAM
Ig1−Ig2の同種親和性結合部位の部分に結合するペプチドであることができる
。 結合モチーフは、少なくとも2つの塩基性アミノ酸残基および少なくとも1つの
無極性アミノ酸、好ましくは少なくとも2つの塩基性アミノ酸残基および10アミ
ノ酸残基の配列内の2つの無極性アミノ酸残基を含んでなる。より好ましくは、
結合モチーフは少なくとも2つの塩基性アミノ酸残基および9アミノ酸残基の配列
内の少なくとも1つの無極性アミノ酸を含んでなる。最も好ましくは、結合モチ
ーフは、4アミノ酸により分離された少なくとも2つの酸性アミノ酸残基を含んで
なり、酸性アミノ酸は塩基性アミノ酸残および2つの隣接する無極性アミノ酸残
から1アミノ酸だけ分離されている。
【００３９】 このようなペプチドは、下記の一般的配列を含んでなる： （Xaa-）−（Xaa）−（Xaa）−（Xaa）m−（Xaa）r−（Xaa-）−（Xaa）− （Xaa+）−（Xaah）−（Xaah）p ここで Xaa+は塩基性アミノ酸残基であり、 Xaa-は酸性アミノ酸残基であり、 Xaahは無極性アミノ酸残基であり、 Xaaは任意のアミノ酸残基であり、そして m、n、oおよびpは独立して0または1であり、そしてここで塩基性アミノ酸残基
は好ましくはリシンまたはアルギニンであり、酸性アミノ酸は好ましくはグルタ
ミン酸またはアスパラギン酸であり、無極性アミノ酸は好ましくはロイシン、イ
ソロイシン、バリンまたはフェニルアラニンであり、そしてrは好ましくは1であ
る。
【００４０】 本発明の好ましいペプチドは配列（E／D）−X−X−X−（E／D）−X−（K／R）
−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）を含んでなり、ここでXは任意のアミノ酸
残基、適当には配列（E／D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F
）、（E／D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）−（L／I／V／F）、（E／D）−X−
X−X−X−（E／D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）、（E／D）−X−X−X−（E／
D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）または（E／D）−X−X−（E／D）−X−（K／
R）−（L／I／V／F）、より適当には配列（E／D）−X−X−（E／D）−X−（K／R
）−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）または（E／D）−X−X−（E／D）−X−
（K／R）−X−（L／I／V／F）−（L／I／V／F）、なおより適当には配列（E／D
）−X−X−X−X−（E／D）−X−（L／I／V／F）−（L／I／V／F）、（E／D）−X
−X−X−（E／D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）、または
（E／D）−X−X−X−（E／D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）−（L／I／V／F）
、最も適当には配列GEJSVGESKFFL（配列番号26）である。
【００４１】 アミノ酸の略号は通常の3および1文字コードに従う：アラニン（Ala、A）、ア
ルギニン（Arg、R）、アスパラギン（Asn、N）、アスパラギン酸（Asp、D）、シ
ステイン（Cys、C）、グルタミン酸（Glu、E）、グルタミン（Gln、Q）、グリシ
ン（Gly、G）、ヒスチジン（His、H）、イソロイシン（Ile、I）、ロイシン（Le
u、L）、リシン（Lys、K）、メチオニン（Met、M）、フェニルアラニン（Phe、F
）、プロリン（Pro、P）、セリン（Ser、S）、スレオニン（Thr、T）、トリプト
ファン（Trp、W）、チロシン（Tyr、Y）、およびバリン（Val、V）。
【００４２】 本発明の関係において、用語「アミノ酸」は天然に存在するアミノ酸ならびに
天然に存在しないアミノ酸を含んでなることを意図する。天然に存在しないアミ
ノ酸は、なかでも、修飾された天然に存在するアミノ酸である。 ペプチドは、例えば、アシル化により修飾することができる。 本発明は、また、抗NCAM Ig1抗体に関する。この抗体はIg1ドメインへのNCAM
Ig2ドメインの結合を模擬する。このような非ペプチド分子は、例えば、PNAs
またはペプチド模倣物である。ペプチド模倣物の例は、Marshall、G. R.、Tetr
ahedron 49、3547−3558（1993）に記載されており、そしてオリゴ（N−置換グ
リシン）、オリゴカルバメート、オリゴスルホンおよびオリゴスルホキシドを包
含する。
【００４３】 本発明は、さらに、Ig1ドメインへのNCAM Ig2ドメインの結合を模擬する、非
ペプチド分子である化合物に関する。 なおさらに、本発明は、NCAM提示細胞からのアウトグロースおよび／またはNC
AM提示細胞の増殖を刺激することから成る、正常の、変性したまたは損傷したNC
AM提示細胞の処置において使用するためのNCAM Ig2ポリペプチド、そのフラグ
メントまたはその模擬物を含有する。 本発明は、中枢神経系および末梢神経系、筋肉または種々の器官の疾患および
症状の処置であることができる。処置は、また、学習および記憶の刺激であるこ
とができる。
【００４４】 本発明の関係において、用語「症状」は、必要性が損傷、疾患または期待され
た疾患に関係するか、あるいは正常の状態の刺激および／または改善に関係する
かにかかわらず、処置を必要とする任意の症状を包含する。 本発明は、また、正常の、変性したまたは損傷したNCAM提示細胞の処置におい
て使用する薬剤の製造における、NCAM Ig2ポリペプチド、そのフラグメントま
たはその模擬物の使用に関する。 本発明は、さらに、本発明による1またはそれ以上の化合物を含んでなる医薬
組成物に関する。 さらに、本発明は、有効量の本発明による1またはそれ以上の化合物を投与す
ることを含んでなる、正常の、変性したまたは損傷したNCAM提示細胞を処置する
方法に関する。
【００４５】 処置は中枢神経系または末梢神経系の疾患または症状、例えば、術後神経損傷
、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成の障害、虚血後の損傷、例えば、卒中か
ら生ずる損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、痴呆、例えば、多梗塞性痴
呆、硬化症、真性糖尿病に関連する神経変性、概日時計または神経−筋肉伝達に
影響を与える疾患、および精神分裂病の処置；神経−筋肉接続の機能障害を伴う
症状を包含する筋肉の疾患または症状、例えば、遺伝的または外傷的萎縮性筋肉
障害の処置；種々の器官の疾患または症状、例えば、生殖腺、膵臓の変性的症状
、例えば、I型またはII型の真性糖尿病、腎臓の変性的症状、例えば、ネフロー
ゼおよび心臓、肝臓および腸の変性的症状の処置である。 本発明は、また、1またはそれ以上の本発明による化合物を含んでなる、人工
神経ガイドに関する。
【００４６】 発明の詳細な説明 神経系において、神経細胞間の接続を改造する能力は再生およびまた学習にお
いて非常に重要である。したがって、このようなプロセスを促進する物質を同定
することはかなり重要である。in vitroにおいてニューロンの生き残りおよび
神経突起のアウトグロースを刺激する物質は、再生および学習を刺激する可能性
を有することが期待されるので、このような物質を同定することに多数の努力が
集中されてきている。神経細胞接着分子（NCAM）はニューロン接続の発生および
改造にとって重要であると考えられるので、NCAM機能を刺激することができるリ
ガンドを同定することは重要である。NCAMのIg3ドメインに対する抗体は神経突
起のアウトグロースを刺激できることが以前に示された。
【００４７】 本発明は、NCAM Ig2ドメインがNCAM提示細胞からの神経突起のアウトグロー
スを強く刺激するという、驚くべき発見に基づく。こうして、NCAM Ig2はNCAM
Ig1ドメインのリガンドであることが発見された。さらに、NCAM Ig2ドメイン
は特異的シグナルトランスダクション経路の活性化により神経突起のアウトグロ
ースを刺激することが発見された。 同様に、本発明は、NCAM Ig1ドメインを刺激するNCAM Ig2ドメインのリガン
ドとして、特異的シグナルトランスダクション経路の活性化することによってNC
AM提示細胞からの神経突起のアウトグロースを強く刺激することができるNCAM
Ig1ドメインを開示する。
【００４８】 本発明者らは、また、組合わせ化学的により、神経突起のアウトグロースを刺
激する小さいペプチド同定した。ペプチドライブラリーから選択された活性ペプ
チドが同定され、そして2またはそれ以上のアミノ酸残基を含んでなる推定上の
モチーフが同定された。これらのペプチドは、NCAM Ig2ドメインとして、同一
特異的シグナルトランスダクション経路を刺激することが示された。
【００４９】 結果が示すように、NCAM Ig1のリガンド、NCAM Ig2ドメインまたはその小さ
い機能的模擬物は、特異的シグナリング経路を活性化することができ、神経突起
のアウトグロースを促進することができ、これにより再生および学習において有
益である。NCAM Ig2ドメインの他の機能的模擬物、例えば、抗体および非ペプ
チド分子は同一の方法において有益であることがある。したがって、本発明は、
NCAM Ig1ドメインを認識する小さいペプチド、ポリペプチド、抗体および非ペ
プチド分子であるか、あるいはそれらを含んでなる化合物または組成物を提供す
る。NCAMを発現する細胞を含有する組織に適用するとき、これらの化合物および
組成物はNCAM機能を促進するであろう。これらの化合物および組成物は、神経系
、筋肉および種々の器官を包含する、任意の他のNCAM発現組織の機能を促進する
ために適用することができる。
【００５０】 その最も広い面において、本発明は、NCAM Ig1ドメインおよび／またはNCAM
Ig2ドメインに結合しかつNCAM提示細胞からの神経突起のアウトグロースおよ
び／またはNCAM提示細胞の増殖を刺激することができる化合物に関する。このよ
うな化合物は、NCAM Ig2ドメイン、そのフラグメントまたはその模擬物を構成
するペプチドまたはPNA配列であることができる。 また、このような化合物は、NCAM Ig1ドメイン、そのフラグメントまたはそ
の模擬物を構成するペプチドまたはPNA配列であることができる。
【００５１】 本発明の関係において、Ig2ドメインおよびNCAM Ig1ドメインの模擬物は、NC
AM Ig1ドメインまたはIg2ドメインに結合し、かつ前記結合を通してNCAM提示細
胞からの神経突起のアウトグロースおよび／またはNCAM提示細胞の増殖を刺激す
る化合物であると理解すべきである。模擬物はペプチド、ペプチド誘導体、抗体
および非ペプチド化合物、例えば、小さい有機化合物、糖および脂肪、ならびに
ペプチド模擬物であることができる。
【００５２】 本発明によれば、中枢神経系および末梢神経系における神経突起の伸長を促進
する新規な化合物が提供される。驚くべきことには、本発明の化合物はニューロ
ン接続の形成および柔軟性を促進することができることが発見された。 上記から明らかなように、本発明の化合物は、NCAM Ig1−Ig2ドメインに結合
し、これにより神経突起のアウトグロースを活性化することができる化合物の3
つの開示した成長（化合物のグループI、IIおよびIII）に属する。
【００５３】 さらに化合物のグループIIに関すると、組換え、標識化ニューロン接続接着化
合物Ig1（NCAM Ig1）にin vitroで結合できる22のペプチドがペプチドライブ
ラリーから同定された。 22の配列は次の通りである：ASKKPKRNIKA（配列番号１）、AKKERQRKDTQ（配列
番号２）、ARALNWGAKPK（配列番号３）、AGSAVKLKKKA（配列番号４）、AKYVLIPI
RIS（配列番号５）、ASTKRSMQGI（配列番号６）、ARRAILM(Q/T/N)-AL（配列番号
７）、AYYLIVRVNRI（配列番号８）、ATNKKTGRRPR（配列番号９）、AKRNGPLINRI
（配列番号10）、AKRSVQKLDGQ（配列番号11）、ARQKTMKPRRS（配列番号12）、AG
DYNPDLDR（配列番号13）、ARKTRERKSKD（配列番号14）、ASQAKRRKGPR（配列番号
15）、APKLDRMLTKK（配列番号16）、AKKEKPNKPND（配列番号17）、AQMGRQSIDRN
（配列番号18）、AEGGKKKKMRA（配列番号19）、AKKKEQKQRNA（配列番号20）、AK
SRKGNSSLM（配列番号21）、ARKSRDMTAIK（配列番号22）。
【００５４】 3つのペプチド、C3（配列番号1）、D3（配列番号2）およびD4（配列番号3）（
第4図）をプラスモン表面共鳴分析によりNCAM Ig1ドメインに結合する能力につ
いてさらに研究し、ニューロン凝集を阻害しかつ神経突起のアウトグロースを刺
激する能力に従い選択した。これらのペプチドおよび混合ペプチドの配列分析に
より、NCAM Ig1に対する結合モチーフを驚くべきことには同定することができ
た。このモチーフは比較的解放された配列順序、K／R（aa）0-8K／R；好ましく
はK／R（aa）0-1K／Rで正に帯電したアミノ酸を含む、ここでKおよびRはそれぞ
れリシンおよびアルギニンを表し、正に帯電したアミノ酸は8アミノ酸（aa）残
基までにより分離されている。しかしながら、好ましくは、正に帯電したアミノ
酸は隣接するか、あるいはただ1つのアミノ酸残基により分離されている。
【００５５】 ペプチドライブラリーから単離された活性ペプチドの分析は、モチーフが2よ
り多い正に帯電したアミノ酸、例えば、3または4つの塩基性アミノ酸を含んでな
ることができる。 好ましいペプチドは、下記の配列を含んでなる： （Xaa+）m−（Xaa）p−（Xaa+）−（Xaa1）r−（Xaa+）−（Xaa）q（Xaa+）n ここで Xaa+は塩基性アミノ酸残基であり、 Xaa1は任意のアミノ酸残基であり、 Xaaは任意のアミノ酸残基であり、そして m、n、p、qおよびrは独立して0または1であり、そしてここで塩基性アミノ酸
残基は好ましくはリシンまたはアルギニンでありそしてrは好ましくは1である。
【００５６】 アミノ酸残基XaaおよびXaa1の特質は重要であるように思われない。それらは
任意のアミノ酸残基であることができるように見える。しかしながら、Xaa1は好
ましくはプロリン（P）またはグルタミン酸（E）である。 なおさらに好ましいペプチドにおいてrは1であり、そしてmおよびnの少なくと
も1つは1である。
【００５７】 本発明の好ましいペプチドは配列（K／R）0-1−K／R−X−K／R）を含んでなり
、ここでXはXaa1と同一の意味、適当にはK／R−K／R−X−K／RまたはK／R−X−K
／R、より適当には配列K／R−P−K／R、K／R−K／R−P−K／R、K／R−K／R−E−
K／RまたはK／R−K／R−E−K／R、最も適当には配列K−P−K、K−K−P−K、K−K
−E−KまたはK−K−E−Rを有する。例は配列A−S−K−K−P−K−R−N−I−K−A
（配列番号1）、A−K−K−E−R−Q−R−K−D−T−Q（配列番号2）およびA−R−A
−L−N−W−G−A−K−P−K（配列番号3）である。
【００５８】 本発明によれば、上記配列を含んでなるペプチドはNCAM Ig2ドメインの部分
（以後においてフラグメントと呼ぶ）またはNCAM Ig2ドメインの模擬物である
ことができる／さらに、ペプチドはIg1ドメインのIg2結合部位に結合するか、あ
るいはIg1ドメイン上の異なる結合部位に結合することができる。結合部位が「
正常」でない場合、結合は正常結合部位を模擬し、同一の方法において神経突起
のアウトグロースおよび／またはNCAM提示細胞の増殖を生ずるであろう。
【００５９】 本発明のペプチドは合成ペプチドライブラリーから同定されかつ選択されたデ
カペプチドに限定されないことが明らかである。これらのペプチドは、NCAM Ig
1ドメインに結合することが期待されるペプチドリガンド中でモチーフを同定す
るツールとしてのみ働いた。
【００６０】 本発明は、さらに、IG2−Pと呼ぶ、小さい合成ペプチドを開示し、そして、こ
れは神経突起のアウトグロースを刺激することが驚くべきことには示された（第
20図〜第21図参照）。核磁気共鳴（NMR）（第18図参照）により、NCAM Ig2ドメ
インに結合することができるNCAM Ig1ドメインと同様に、NCAM Ig2ドメインは
Igドメイン（ref）のIセットに属することが示された。個々のアミノ酸残基の化
学シフトを解析することによって、Ig1ドメインとIg2ドメインとの間の独特な相
互作用が驚くべきことには発見された。
【００６１】 顕著には、全相互作用部位はNCAMのIg1ドメインおよびIg2ドメインの両方から
の残基から成ることが発見された。こうして、これらの2つのドメインの一部分
は一緒になって独特な相互作用部位を形成した。Ig2ドメインにおいて、アミノ
酸Arg−192、Arg−196、Glu−198、Ile−199およびPhe−201は化学シフトおよび
示されたモデルに従い結合にとって特に重要であった。同様に、Ig1ドメインに
おいて、アミノ酸Glu−30、Glu−35およびLys−37、Phe−38およびPhe−39は結
合にとって重要であるように見えた（第18図参照）。
【００６２】 アミノ酸Arg−192、Arg−196、Glu−198、Glu−30、Glu−35およびLys−37の
突然変異を使用する研究は、これらの突然変異がNCAM Ig2ドメインの結合機能
を阻害することを示した。NMRにより解明されたIgG2およびIgG1の構造の研究か
ら、本発明者らは2つのペプチドを構築し、そして全ドメインの三次元構造にお
ける2つの特定の領域は特に、驚くべきほどに重要であることが明らかにされた
。
【００６３】 その後、NCAMの全Ig2ドメイン（残基191〜202）の二次元のアミノ酸配列から
の12アミノ酸の推定的に対応する配列（第17図参照）およびIg1ドメイン（残基2
9〜40）からの12アミノ酸の配列が同定された。次いで、これらの短い配列に対
応する2つのペプチドを合成し、そしてこれらのペプチドは細胞培養物中のニュ
ーロンからの神経突起のアウトグロースを促進し、これによりNCAMを発現する細
胞および組織の再生および構造的柔軟性の他の型を促進する可能性を有すること
が示された。
【００６４】 IG2−Pと呼ぶ、同定されたIg2−ペプチドは、配列GRILARGEINFK（配列番号23
）を有し、こうして全NCAM配列に由来するか、あるいはNCAM分子に結合すること
が発見された他のニューリトジェニック（neuritogenic）ペプチドに対する類似
性を共有しないことが証明された。さらに、対照の目的で、本発明は、Ig2−p配
列に由来し、神経突起のアウトグロースを促進しない、2つのペプチド配列（配
列番号24および配列番号25）を提供する。対照の目的でこれらのポリペプチドを
使用することは、実施例5においていっそう詳細に説明される。
【００６５】 IGI−Pと呼ぶ、Ig1−ペプチドは、既知のニューリトジェニック因子に対する
相同性を共有する配列GEISVGESKFFL（配列番号26）を有する。発見された4つの
配列は、次の通りであった： GRILARGEINFK（配列番号23） GSILASGESNFK（配列番号24） GRILARGSSNFK（配列番号25） GEISVGESKFFL（配列番号26）
【００６６】 こうして、本発明は、IGI−P−ペプチドおよび／またはIG2−P−ペプチドまた
はそれらの誘導体、例えば、ペプチド−アナローグ、ペプチド−フラグメント、
IGI−P−配列またはIG2−P−配列またはそれらのアナローグを含んでなるポリペ
プチド、本明細書において提示したIGI−P−ペプチドおよびIG2−P−ペプチドか
ら誘導された非ペプチド分子を含んでなる化合物または組成物を提供し、これら
はニューロン、ニューロン細胞系統または組織からの神経突起のアウトグロース
刺激することができる。 これらの前述の化合物および組成物は、末梢神経系または中枢神経系、筋肉お
よびNCAMを発現する他の組織に影響を与える変性的症状、ならびにNCAM機能の刺
激が有益である他の症状を処置するために使用することができる。
【００６７】 本発明は、また、神経突起のアウトグロースの特異的シグナルトランスダクシ
ョン経路は、NCAM Ig2ドメインおよびそれらのフラグメントおよび模擬物、さ
らにNCAM Ig1ドメインおよびそれらのフラグメントおよび模擬物、および3また
はそれ以上の塩基性アミノ酸残基を含んでなる小さいペプチドにより刺激される
ように見えるという、上記開示に対する追加の、驚くべき発見を包含する。こう
して、特異的シグナルトランスダクション経路は、また、前述のIg2−ペプチド
、Ig2−pにより刺激されることが発見された。
【００６８】 こうして、本発明者らは、NCAMドメインIg1およびIg2が寄与するNCAM中の同種
親和性結合部位を同定した。さらに、NCAM Ig1−Ig2ドメイン、例えば、NCAM
Ig2配列に由来するIg2−ペプチド、NCAM Ig2配列に由来するIg2−p−ペプチド
、NCAM Ig1配列に由来するIg1−p−ペプチドおよびC3ペプチドおよび組合わせ
ペプチドライブラリーから同定された関係するペプチドにより構築された結合部
位に結合する4つのリガンドのすべては神経突起のアウトグロースを促進する。
すべての4つのNCAM Ig1−Ig2リガンドは、NCAM Ig1−Ig2ドメインに結合し、
これにより神経突起のアウトグロースに導くシグナルトランスダクションを活性
化することができる、化合物の同一の新しいクラスに属する。
【００６９】 一般に、本発明は、中枢神経系および末梢神経系内のNCAM提示細胞からの神経
突起のアウトグロースおよび／またはNCAM提示細胞の増殖を刺激しかつ促進する
ことができる、新規な化合物を開示する。上記から明らかなように、本発明の化
合物は化合物の3つの開示された群（化合物のグループI、IIおよびIII）に属す
ることが、本発明者らにより、明らかにされ、そして化合物のグループIが詳述
された後、化合物のグループIIを後述する。
【００７０】 化合物のグループIIは、Ig1ドメインにより構築されたNCAM Ig1−Ig2の同種
親和性結合部位の部分に結合するペプチドであることができる化合物を含有する
。このようなペプチドは、それらの任意の機能的誘導体を包含する、次のような
、一般的配列を有するように見える： （Xaa+）−（Xaa）−（Xaa）−（Xaa）m−（Xaa+）−（Xaa）−（Xaa-）n− （Xaah）−（Xaa）o−（Xaah）p ここで
【００７１】 Xaa+は塩基性アミノ酸残基であり、 Xaa-は酸性アミノ酸残基であり、 Xaahは無極性アミノ酸残基であり、 Xaaは任意のアミノ酸残基であり、そして m、n、oおよびpは独立して0または1であり、そして塩基性アミノ酸残基は好ま
しくはリシンまたはアルギニンであり、酸性アミノ酸は好ましくはグルタミン酸
またはアスパラギン酸であり、無極性アミノ酸は好ましくはロイシン、イソロイ
シン、バリンまたはフェニルアラニンであり、そしてrは好ましくは1である。
【００７２】 グループIIに従うペプチドは配列（K／R）−X−X−X−（K／R）−X−（E／D）
−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）を含んでなり、ここでXは任意のアミノ酸
残基、適当には配列（K／R）−X−（E／D）−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F
）、（K／R）−X−X−X−（K／R）−X−（E／D）、（K／R）−X−X−（K／R）−
X−（E／D）または（K／R）−X−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）、より適
当には配列（K／R）−X−X−X−（K／R）−X−（E／D）−（L／I／V／F）、（K
／R）−X−X−（K／R）−X−（E／D）−（L／I／V／F）または（K／R）−X−X−
X−（K／R）−X−（L／I／V／F）、なおより適当には配列（K／R）−X−X−（K
／R）−X−（E／D）−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）、（K／R）−X−X−X
−（K／R）−X−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）または（K／R）−X−X−X
−（K／R）−X−（E／D）−（L／I／V／F）−（L／I／V／F）、最も適当には配
列GRILARGEINFK（配列番号23）である。
【００７３】 化合物のグループIIIに関すると、本発明の化合物は、同様に、Ig2ドメインに
より構築されたNCAM Ig1−Ig2の同種親和性結合部位の部分に結合するペプチド
であることができる。このようなペプチドは、それらの任意の機能的誘導体を包
含する、次のような、一般的配列を有するように見える： （Xaa-）−（Xaa）−（Xaa）−（Xaa）m−（Xaa+）n−（Xaa-）−（Xaa）− （Xaa+）−（Xaah）−（Xaah）p
【００７４】 ここで Xaa+は塩基性アミノ酸残基であり、 Xaa-は酸性アミノ酸残基であり、 Xaahは無極性アミノ酸残基であり、 Xaaは任意のアミノ酸残基であり、そして m、n、oおよびpは独立して0または1であり、そしてここで塩基性アミノ酸残基
は好ましくはリシンまたはアルギニンであり、酸性アミノ酸は好ましくはグルタ
ミン酸またはアスパラギン酸であり、無極性アミノ酸は好ましくはロイシン、イ
ソロイシン、バリンまたはフェニルアラニンであり、そしてrは好ましくは1であ
る。
【００７５】 グループIIIの範囲内のペプチドは配列（E／D）−X−X−X−（E／D）−X−（K
／R）−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）を含んでなり、ここでXは任意のア
ミノ酸残基、適当には配列（E／D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）−X−（L／I
／V／F）、（E／D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）−（L／I／V／F）、（E／D
）−X−X−X−X−（E／D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）、（E／D）−X−X−X
−（E／D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）または（E／D）−X−X−（E／D）−X
−（K／R）−（L／I／V／F）、より適当には配列（E／D）−X−X−（E／D）−X
−（K／R）−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）または（E／D）−X−X−（E／
D）−X−（K／R）−X−（L／I／V／F）−（L／I／V／F）、なおより適当には配
列（E／D）−X−X−X−X−（E／D）−X−（L／I／V／F）−（L／I／V／F）、（E
／D）−X−X−X−（E／D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）
、または（E／D）−X−X−X−（E／D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）−（L／I
／V／F）、最も適当には配列GEJSVGESKFFL（配列番号26）である。
【００７６】 本発明において提供される化合物は、また、NCAM Ig1ドメインに結合しかつ
神経突起のアウトグロースを刺激するペプチドを含んでなる。 ペプチドは、例えば、アミノ酸残基の1またはそれ以上を置換することによっ
て、修飾することができる。L−アミノ酸およびD−アミノ酸の両方を使用するこ
とができる。他の修飾は誘導体、例えば、エステル、糖、およびその他を含んで
なることができる。例はメチルエステルおよびアセチルエステルである。重合、
例えば、反復配列またはこの分野においてよく知られている種々の担体、例えば
、リシンバックボーンまたはタンパク質部分、例えば、ウシ血清アルブミン（BS
A）への結合もまた本発明の1つの面である。
【００７７】 本発明は、また、NCAM Ig2ドメインの非ペプチド模擬物または上に定義した
ペプチドに関する。本発明の関係において、このような模擬物は、NCAM Ig1ド
メインおよび／またはNCAM Ig2ドメインに結合するか、あるいは他の方法でそ
れらと相互作用し、これによりNCAM提示細胞からの神経突起のアウトグロースお
よび／またはNCAM提示細胞の増殖を刺激する化合物であると理解すべきである。 本発明のそれ以上の面において、本発明は、抗NCAM Ig1抗体、または本明細
書に開示するNCAM Ig1−Ig2結合部位に寄与するIg2の部分を認識する抗体であ
る化合物に関する。
【００７８】 抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであることができる。また、組換
え抗体、例えば、キメラおよび／またはヒト化抗体は本発明の一部分である。 本発明のそれ以上の面において、本発明は、正常の、変性したまたは損傷した
NCAM提示細胞の処置において使用するためのNCAM Ig2ポリペプチド、そのフラ
グメントまたは模擬物に関する。処置は中枢神経系または末梢神経系、筋肉また
は種々の器官の疾患または症状の処置である。NCAM提示細胞のみがこのような処
置に対して応答することができる。
【００７９】 本発明は、また、上に定義した化合物の1またはそれ以上を含んでなる医薬組
成物および薬物に関する。 なおそれ以上の面において、in vitroまたはin vivoにおいて正常の、変性
したまたは損傷したNCAM提示細胞を処置する方法に関し、この方法は有効量の上
に定義した化合物の1またはそれ以上を投与することを包含する。
【００８０】 処置は中枢神経系または末梢神経系の疾患または症状、例えば、術後神経損傷
、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成の障害、虚血後の損傷、例えば、卒中か
ら生ずる損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、痴呆、例えば、多梗塞性痴
呆、硬化症、真性糖尿病に関連する神経変性、概日時計または神経−筋肉伝達に
影響を与える疾患、および精神分裂病の処置；神経−筋肉接続の機能障害を伴う
症状を包含する筋肉の疾患および症状、例えば、遺伝的または外傷的萎縮性筋肉
障害の処置；種々の器官の疾患および症状、例えば、生殖腺、膵臓の、例えば、
I型またはII型の真性糖尿病、腎臓の変性的疾患、例えば、ネフローゼおよび心
臓、肝臓および腸の変性的症状の処置である。
【００８１】 本発明の他の面は、人工神経ガイドと組合わせた本発明による化合物の使用で
ある。 本発明のなお他の面は、学習および／または記憶する能力の刺激における本発
明の化合物の使用である。
【００８２】 NCAM機能をシミュレートすることができる候補のリガンドを同定できるように
するために、種々のリガンドの作用を定量的に評価できる、簡単な培養系（凝集
培養物）を確立した。海馬細胞はラット胚から得た。細胞を規定された培地中で
成長させ、解離した細胞をマイクロタイタープレートに播種した。24時間後、凝
集の量を計数する。マイクロウェル中に細胞を播種する直前に、細胞懸濁液に試
験すべき化合物を添加する。細胞が凝集する間にNCAM Ig1結合性リガンドが存
在するとき、細胞の播種後24時間に定量したとき、小さいが、多数の細胞凝集物
が見られる。リガンドの阻害作用によりNCAMの接着性質がブロックされるので、
多数の小さい凝集物からの大きい凝集物の形成がブロックされる。こうして、活
性リガンドの存在下に、小さいが、多数の細胞凝集物が見られる。
【００８３】 細胞が凝集する間にNCAM Ig1−Ig2ドメインの異なるリガンドが存在するとき
、このような作用が観測される。こうして、全組換えIg2、およびIg2配列（Ig2
−p）（配列番号23）またはIg1配列（Ig1−p）（配列番号26）から誘導された合
成ペプチド、および合成ペプチド（配列番号1、配列番号2および配列番号3）の
ライブラリーから同定されたNCAM Ig1のペプチドリガンドは、記載した細胞培
養合成において凝集を阻害した。
【００８４】 この系は細胞接着、細胞移動および多分神経突起のアウトグロースに導く処理
された細胞におけるプロセスの形成の検査を可能とする。後者をさらに研究する
ために、単一ニューロンからの神経突起の伸長を研究することができる。凝集の
研究におけるように細胞を調製し、プラスチックまたはフィブロネクチンの支持
体上に播種する。
【００８５】 次いで細胞を適当な時間の間維持し、次いで例えば、コンピューター援用影像
解析プログラムにより、神経突起の伸長を測定することによって、神経突起のア
ウトグロースを分析する。10μMより長い神経突起について、各細胞の最長の神
経突起の平均長さを測定した（第2図参照）。さらに、神経突起当たりの分岐点
の平均数および細胞当たりの神経突起の平均数を決定した。試験すべきNCAM Ig
1−Ig2リガンドを細胞播種直前に添加する。（配列番号1、2、3、23、26）。
【００８６】 同様に、NCAM Ig1−Ig2中の結合部位から誘導されたペプチドを細胞播種直前
に添加した。 ニューリトジーン（neuritogene）作用のメカニズムを研究するために、NCAM
従属シグナリングを阻害することが知られている、種々の化合物と組み合わせて
、リガンドの1つ、C3（配列番号1）を添加した。
【００８７】 下記の化合物が神経突起の伸長に対するC3の刺激作用を阻害することが見出さ
れた：ベラパミル（L型電圧従属カルシウムチャンネルの「ve」インヒビター）
、オメガ−コノトキシンGVIA（N型電圧従属カルシウムチャンネルの「co」イン
ヒビター）、百日咳トキシン（Pertussis toxin）（ある種のGタンパク質の「p
ertus」インヒビター）、エルブスタチンアナローグ（「erb」；ある種のチロシ
ンキナーゼのインヒビター）、繊維芽細胞成長因子のレセプター（FGF−Rs）中
のアシッドボックス（acidbox）エピトープに対する抗体）（NCAM−FGF−R結合
およびシグナリングのインヒビター）、いわゆるCAM相同ドメイン（CHD）に対応
するペプチド（NCAM−FGF−R結合およびシグナリングのインヒビター）。
【００８８】 さらに、C3のニューリトジェニック（neuritogenic）作用は溶液中のNCAM Ig
1により完全に阻害された。これらの結果が示すように、リガンド、例えば、C3
はNCAM Ig1ドメインに結合し、これにより前述のインヒビター化合物に対して
感受性であるニューロンにおけるシグナリング経路を活性化することによって、
神経突起のアウトグロースを刺激する。
【００８９】 フィブロネクチン支持体上で維持した一次海馬ニューロンからの神経突起のア
ウトグロースに対する作用について、NCAM Ig1の内因的リガンド、NCAM Ig2を
試験した。細胞播種直前に、培養ウェルにNCAM Ig2を添加した。NCAM Ig2はC3
ペプチドと同様に神経突起のアウトグロースを刺激することが見出された。C3ペ
プチドがその最大ニューリトジェニック作用を有したのと同一濃度において、NC
AM Ig2の最大ニューリトジェニック作用が見出された。
【００９０】 C3について前述したようにNCAM従属シグナリングを阻害することが知られてい
る化合物と組み合わせて、NCAM Ig2ドメインを試験したとき、ニューリトジェ
ニック作用が同一の方法において阻害された。こうして、内因的リガンドNCAM
Ig2および人工的リガンドC3の両方はNCAM Ig1に結合し、そしてNCAM Ig2およ
びC3の両方は神経突起の伸長を刺激するように見え、これは同一シグナルトラン
スダクション経路が活性化されるためであると考えられる。
【００９１】 NCAM Ig1またはNCAM Ig2の結合部位から誘導された合成ペプチドを細胞培養
物に添加したとき、神経突起のアウトグロースが刺激された。こうして、Ig2の
作用はNCAM Ig1−Ig2配列のフラグメントを構築する、小さい合成ペプチドによ
り模擬されることができる。それゆえ、神経突起のアウトグロースはまず組換え
ポリペプチドの形態の無傷のIg2ドメインにより促進され、第2にNCAM Ig1およ
びNCAM Ig2ドメインのフラグメントにより促進され、第3に配列から誘導可能な
ペプチドと無関係のNCAM Ig1結合性ペプチドにより促進されるように見えた。
したがって、同種親和性NCAM結合に関係づけられる、NCAM Ig1ドメインおよび
／またはNCAM Ig1−Ig2の一部分に結合する化合物により、神経突起のアウトグ
ロースは促進されうるという、新規な、驚くべき原理を本発明者らは証明した。
【００９２】 Ig2−ペプチド（Ig2−p）の特異性をコントロールするために、2つの対照ペプ
チド、P2−3SおよびP2−4Sを合成し、それらはニューリトジェニック作用をもた
ないことが見出された。実施例5参照）。P2−3Sペプチドの配列、GSILARGESNFK
（配列番号24）はIg2−p配列に対応し、ここでArg−2、Arg−6およびIle−9はセ
リンにより置換されている。P2−4Sペプチドの配列、GSILARGSSNFK（配列番号25
）はIg2−p配列に対応し、ここでArg−2、Arg−6およびIle−9はセリンにより置
換されており、突然変異したアミノ酸残基がIg2−pペプチドのニューリトジェニ
ック作用にとって重要であることを示す。
【００９３】 NCAM Ig2およびC3を、また、組合わせて添加したとき、神経突起のアウトグ
ロースに対する作用について試験した。作用は非加法的であることが見出された
。さらに、これらの結果が示すように、NCAM Ig2およびC3は同一メカニズムに
より神経突起の伸長を刺激する。それらの両方はNCAM Ig1ドメインに結合し、
これにより同一シグナリング経路を活性化して神経突起のアウトグロースに導く
。
【００９４】 ペプチドまたは非ペプチドのライブラリーから、推定上の人工的リガンドを選
択し、同定することができる。任意のライブラリーを使用することができる。合
成ペプチドライブラリーならびに天然に存在するタンパク質のフラグメントを含
有するライブラリーを、有用なペプチドの検索において使用することができる。
非ペプチド化合物を含んでなる、任意の種類のライブラリーを同様に使用するこ
とができる。
【００９５】 ペプチドは線状配列のアミノ酸から成る短い分子である。アミノ酸は、アミノ
酸の長い折りたたまれた鎖から成る、天然に存在するタンパク質の構築ブロック
である。こうして、アミノ酸のある種の配列により特徴づけられるペプチドは、
タンパク質のある領域を模擬することができる。天然に存在するタンパク質はL
−アミノ酸残基から成る。しかしながら、人工的ペプチドはまたD−アミノ酸残
基から成るか、あるいはそれらを含んでなることができる。組合わせ化学により
、等しい長さのペプチドを担持するビーズの混合物を構築することができ、ここ
で各ビーズはユニーク配列のペプチドを担持する（Lam他、1991）。このような
ビーズ上のペプチド混合物をペプチドライブラリーと呼ぶ。
【００９６】 本発明において、精製された組換えNCAM Ig1とともに樹脂結合デカペプチド
を含んでなる、合成ランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることに
よって、ペプチドを同定した分配、スクランブル手法を使用して、樹脂結合1ビ
ーズ1ペプチドライブラリーの合成を実施した（Furka、A.、Sebestyyen、F.、As
gedom、M.およびDibo、G.（1991）Int. J. Pep. Pro. Res. 37、487−493
）。合成を通じてポリエチレンを反応器として使用した。樹脂をビオチニル化NC
AM Ig1とインキュベートすることによって、スクリーニングを実施した。引き
続いて、樹脂をアビジン−アルカリ性ホスファターゼとインキュベートした。基
質BCIP／NET（Sigma）をLam他（1992）が記載する手法により添加し、染色した
ビーズをミクロ配列決定のために取出した。
【００９７】 最も強く染色されたビーズを立体顕微鏡下に選択し、ABI 120A HPLCを装備
したABI 470Aにより配列決定した。22のNCAM Ig1結合性ペプチド配列が同定さ
れた（第4図（A）；配列番号1〜配列番号22）。 興味あるペプチドの同定および選択のために選択した方法は、推定上のモチー
フの同定に決定的ではないことを理解すべきである。 得られた配列を整列し、推定上のモチーフを明らかにする反復パターンについ
てこれらを検査することによって、合成すべきペプチド配列を選択した（第4図
（B）〜（D））。
【００９８】 C3、D3およびD4と呼ぶ3つのペプチド（第4図（B）〜（D））を合成し、そして
NCAM Ig1ドメインに対するそれらの結合をプラスモン表面共鳴解析により評価
した。センサーチップ上に固定化したとき、ペプチドデンドリマー（リシンバッ
クボーンに結合した4つのペプチド（第2図（C））を使用して、溶液中で少なく
とも1つのペプチドをNCAM Ig1への結合のために確実に暴露させた。すべての3
つのペプチドは溶液中でNCAM Ig1に結合した。3つのペプチドを神経突起のアウ
トグロースに対する作用についてさらに試験した。すべての3つのペプチドは神
経突起のアウトグロースを強く刺激した。そのうえ、ペプチドは細胞の凝集を開
始した。
【００９９】 ペプチドのどの性質が作用にとって重要であるかを研究するために、C3配列の
種々の対照ペプチドを構築し、試験した。 C3配列中の個々の残基の役割を研究するために、C3と同一残基を含んでなるが
、配列が異なる、いわゆるスクランブルドペプチド構築した（121、114およびC3
scr、第7図）。同様に、D3およびD4配列中の残基に対応するスクランブルドペプ
チドを構築した（スクランブルドD3およびスクランブルドD4、第7図）。
【０１００】 さらに、塩基性アミノ酸（KsおよびRs）がアラニンで置換されているC3配列を
含有するペプチドを構築して（116〜119、第7図）これらの特定のアミノ酸の役
割を調査した。同様に、プロリンは一般にペプチドの構造にとって重要であると
考えられるので、プロリン残基（Xaa1）がアラニンで置換されているC3配列に対
応するペプチドを構築した。プロリンをアラニンで置換しても、作用は変化しな
い。同様に、作用を変化させないで、1つの塩基性アミノ酸は置換されたアラニ
ンであることができる。
【０１０１】 対照的に、塩基性残基の2〜4つのアラニン置換を有するペプチドは凝集に対す
る作用をもたず、これらの残基はC3の作用にとって重要であることが示される。
C3における塩基性アミノ酸残基の役割をさらに研究するために、塩基性アミノ酸
がアシル化により修飾されたC3配列を含有するペプチドを構築した。アシル化は
これらの残基から電荷を除去するが、水素結合を形成する能力を保存する。4つ
の塩基性アミノ酸がアシル化により修飾されているペプチド（C3dacetyl、K（12
0）、第7図）はC3として凝集を阻害し、塩基性アミノ酸の電荷ばかりでなく、か
つまた他の性質、例えば、水素結合を形成する能力がC3の作用にとって重要であ
るに違いないことが示される。
【０１０２】 同様に凝集培養物をC3の存在下にモノマー、デンドリマー（C3d）として、ま
たはBSA結合20マーとして調製した。C3ペプチドの異なる形態を試験した。C3の
モノマー、デンドリマーおよびBSA結合の形態は凝集に対して同様な作用を有す
ることが見出された。C3配列のデンドリマーは、多分レセプタードメインのいく
つかに結合する能力を有するために、最も効力がある形態である。
【０１０３】 レセプターが実際にはNCAM Ig1ドメインであることを確認するために、実施
例1に記載するように溶液中でピキア・パストリス（Pichia pastoris）の存在
下に調製した、このドメインと細胞をインキュベートした。NCAM Ig1ドメイン
の存在はC3の作用を阻害し、C3のNCAM仲介細胞接着を妨害することを証明した。
これらの実験が示すように、ここで同定されたNCAM Ig1結合性質はNCAM仲介細
胞接着に影響を及ぼし、これにより高い密度で成長した一次ニューロンの培養に
おいて形成した細胞凝集物の数およびニューロンのプロセスを増加する。
【０１０４】 C3ペプチド配列中の2つの塩基性アミノ酸のみの置換がニューリトジェニック
作用を完全に壊滅させた。こうして、配列中の2〜4つのリシンおよびアルギニン
をアラニンで置換したとき、神経突起刺激作用は完全に阻害された。これが示す
ように、C3配列中の塩基性アミノ酸はその作用にとってきわめて重要である。驚
くべきことには、同一アミノ酸がアシル化により修飾されたペプチドは細胞接着
および神経突起のアウトグロースに対して多少の作用を有するが、その程度は無
傷のC3ペプチドと同一ではなく、塩基性アミノ酸の電荷ばかりでなく、かつまた
他の性質、例えば、水素結合を形成する能力がC3の作用にとって重要であるに違
いないことが示される。さらに、無傷のペプチドの作用を溶液中の等モル濃度の
NCAM Ig1ドメインによりブロックすることができる。これが示すように、ペプ
チドはニューロンにより発現されたNCAM Ig1ドメインに結合することによって
働く。
【０１０５】 増殖および細胞成長に対するリガンドの作用をまた試験した。C3ペプチドは最
初に増殖および細胞成長を刺激することが発見された。この増殖の初期の促進後
、ペプチドは神経突起のアウトグロースを増加すると同時に増殖を抑制すること
によって分化を刺激する。こうして、増殖に対する作用は細胞の成長状態に依存
する。増殖に対する作用は、海馬細胞からの一次細胞培養物およびラットクロム
親和性細胞腫細胞系統PC12細胞の培養物について示された。したがって、リガン
ドはNCAM提示細胞からの神経突起のアウトグロースおよび／またはNCAM提示細胞
の増殖を刺激する。
【０１０６】 本発明の化合物の3つのグループ、グループI、IIおよびIIIについて明らかに
前述したように、本発明のグループIの化合物は、少なくとも2つの塩基性アミノ
酸残基を含んでなる結合モチーフを通して、NCAM Ig1ドメインに結合するペプ
チドであることができる。10アミノ酸残基配列の範囲内、適当には3アミノ酸残
基配列の範囲内の少なくとも2つの塩基性アミノ酸残基を含んでなるペプチドは
、本発明の目的のために非常に重要な化合物であると考えられる。
【０１０７】 単離されたペプチドリガンドを分析すると、リガンドは好都合には2より多い
塩基性アミノ酸を含んでなることができることが明らかにされた。 それによれば、グループIの範囲内の重要なペプチドは、下記の配列を含んで
なる： （Xaa+）m−（Xaa）p−（Xaa+）−（Xaa1）r−（Xaa+）−（Xaa）q−（Xaa+）n
ここで Xaa+は塩基性アミノ酸残基であり、 Xaa1は任意のアミノ酸残基であり、 Xaaは任意のアミノ酸残基であり、そして m、n、p、qおよびrは独立して0または1である。 塩基性アミノ酸残基は好ましくはリシン（K）またはアルギニン（R）でありそ
してrは好ましくは1である。
【０１０８】 アミノ酸残基XaaおよびXaa1の特質は重要であるように思われない。それらは
任意のアミノ酸残基であることができるように見える。しかしながら、Xaa1は好
ましくはプロリン（P）またはグルタミン酸（E）である。 なおさらに好ましいペプチドにおいて、rは1でありそしてmおよびnの少なくと
も1つは1である。
【０１０９】 本発明の好ましいペプチドは配列（K／R）0-1−K／R−X−K／R）を含んでなり
、ここでXはXaa1の意味、適当にはK／R−K／R−X−K／RまたはK／R−X−K／R、
より適当には配列K／R−P−K／R、K／R−K／R−P−K／R、K／R−K／R−E−K／R
またはK／R−K／R−E−K／R、最も適当には配列K−P−K、K−K−P−K、K−K−E
−KまたはK−K−E−Rを有する。例は配列A−S−K−K−P−K−R−N−I−K−A（配
列番号1）、A−K−K−E−R−Q−R−K−D−T−Q（配列番号2）およびA−R−A−L
−N−W−G−A−K−P−K（配列番号3）である。
【０１１０】 塩基性アミノ酸残基間の距離が推定されたモチーフにおいて可変因子である理
由は、リガンドの重要な性質の1つがアミノ酸残基のクラスター、すなわち、塩
基性アミノ酸残基を含んでなるエピトープ、の暴露であることができるというこ
とであると推測される。このようなクラスターは、密接に連鎖されたアミノ酸に
よりつくるか、あるいは交互にペプチド／タンパク質のフォルディングを通して
つくることができる。好都合には、アミノ酸残基を担体表面上に暴露することが
できる。特に、マルチマーのペプチド、例えば、デンドリマーは、多数の柔軟性
ペプチドモノマーの存在のために、コンフォメーションの決定因子またはクラス
ターを形成することができる。
【０１１１】 前述したように、ペプチドライブラリーから単離された活性ペプチドの分析が
示唆するように、2より多い電荷したアミノ酸、例えば、3または4つの塩基性ア
ミノ酸を含んでなることができる。結合の強さおよび生ずる下流のシグナルの強
さは、多分、可変機能的強さのクラスターを生ずる、ペプチド中の塩基性アミノ
酸の数および／または位置に依存する。ペプチド中の他のアミノ酸の位置は、特
にペプチドのフォルディングの場合において、重要であることがある。クラスタ
ーの可変強さは可変結合定数を生じ、こうして、シグナリングにおいて可変強さ
を生ずることがある。
【０１１２】 いかなる特定の理論にも拘束されたくないが、NCAM Ig1および／またはNCAM
Ig2ドメインに対する活性リガンドはNCAM Ig1ドメインおよび／またはNCAM
Ig2ドメインに結合し、こうしてドメインのコンフォメーションの変化を誘発し
、開始されるシグナリングカスケードを生じ、前記シグナリングは細胞の増殖お
よび／または神経突起のアウトグロースに影響を及ぼすと考えられる。こうして
、適当なリガンドはNCAM Ig1ドメインおよびNCAM Ig2ドメインのコンフォメー
ション変化を誘発し、下流のシグナリングを生ずることができる、任意の化合物
であることができる。
【０１１３】 非常に重要なペプチドは、NCAM Ig2ドメインの一部分に対応し、NCAM Ig2ド
メインの模擬物またはフラグメントであるペプチドである。 ペプチドはNCAM Ig1ドメイン上のIg2結合部位に結合するか、あるいはNCAM
Ig2結合部位と異なる結合部位に結合することができる。リガンドC3、D3およびD
4はNCAM Ig2ドメインまたはそのフラグメントの結合部位と異なる部位に結合す
る。
【０１１４】 Ig1ドメインのリガンドに加えて同様に特に重要であるリガンドは、Ig2ドメイ
ンにより構築されたIg1−Ig2結合部位の部分のリガンドを包含するIg2ドメイン
のリガンドである。 本発明の目的に対して重要である他の化合物は、NCAM Ig1、NCAM Ig2ドメイ
ンまたは人工的リガンドの結合を模擬する非ペプチド分子である。このような他
の化合物は小さい有機化合物、糖および脂質、ならびにペプチド模擬物、ペプト
イドおよびペプトマーから選択することができる。
【０１１５】 小さい有機化合物のライブラリーをスクリーニングして、NCAM Ig1ドメイン
、NCAM Ig2ドメインの人工的リガンド、およびNCAM Ig1およびIg2ドメインに
より構築されたIg1−Ig2結合部位の人工的リガンドを同定することができ、これ
らのリガンドはNCAM活性を刺激する。このようなライブラリーおよびそれらの構
築は普通に知られており、有用なリガンドのスクリーニングはこの明細書に開示
されている方法またはこの分野において知られている方法により実施することが
できる。
【０１１６】 このような他の化合物は、また、抗NCAM Ig1抗体、抗NCAM Ig2抗体（モノク
ローナル、ポリクローナルまたは組換え）または、NCAM Ig1およびIg2ドメイン
により構築された、結合部位の中またはその付近のエピトープを認識する他の抗
体であることができ、これらの抗体はさらにキメラであるか、あるいはヒト化さ
れていることができる。ポリクローナルならびにa) モノクローナル抗NCAM Ig1
抗体および／またはb) 抗NCAM Ig2抗体は、普通に知られている手法に従い製造
することができる。
【０１１７】 マウスまたはウサギは一次免疫化フォルムとして働くことができ、ここでNCAM
Ig1に対する抗体またはNCAM Ig2に対する抗体を発生させる。精製されたポリ
クローナル抗体をそれ以上の処理しないで使用することができる。あるいは、モ
ノクローナル抗体を産生することができる。モノクローナル抗体を産生する方法
はこの分野において知られている。組換え抗体、例えば、キメラおよびヒト化抗
体をまたこの分野において知られている方法により得ることができる。次いで、
前述の方法または同様な方法に従い、適切な活性抗体をスクリーニングする。
【０１１８】 神経突起のアウトグロースならびに神経細胞、例えば、ある種の内因的向性因
子の生存および増殖を促進する可能性を有する物質は、ニューロン再生およびニ
ューロンの柔軟性の他の型を促進する化合物についての検索における主要なター
ゲットである（FuおよびGordon、1997）。末梢神経は、種々の損傷後、それらの
ターゲットとの機能的接続を再生しかつ再確立する可能性を有する。しかしなが
ら、機能的回復はめったに完結せず、末梢神経の損傷は重要な問題となっている
。ある種の神経系において、再生の可能性は非常に制限されている。したがって
、末梢神経系および中枢神経系における機能的再生を促進する能力を有する物質
の同定は非常に重要である。
【０１１９】 再生を促進する物質の可能性を評価するために、神経突起のアウトグロースお
よび神経細胞の増殖および生存を刺激する能力を研究することができる。本発明
のNCAM Ig1またはNCAM Ig2結合性化合物は、神経突起のアウトグロースを促進
しかつニューロン増殖に影響を与えることが示され、したがって、損傷後のニュ
ーロン接続の再生および機能的回復のプロモーターならびにこのような影響を必
要とする他の症状におけるニューロン機能のプロモーターとして最もすぐれてい
るように思われる。
【０１２０】 したがって、本発明は、正常の、変性したまたは損傷したNCAM提示細胞の処置
において使用するためのNCAM Ig1ドメイン、NCAM Ig2ドメインおよびそれらの
フラグメントまたは模擬物に関する。NCAM Ig1ドメインのフラグメントの1例は
、NCAM Ig1−Ig2結合部位に関係するNCAM Ig1ドメインの部分である。特に、
本発明は、正常の、変性したまたは損傷したNCAM提示細胞の処置において使用す
るためのNCAM Ig2ドメイン、そのフラグメントまたは模擬物に関し、ここで処
置はNCAM提示細胞からのアウトグロースおよび／またはNCAM提示細胞の増殖を刺
激することから成る。
【０１２１】 処置は適当には中枢神経系または末梢神経系の疾患または症状、筋肉または種
々の器官の疾患および症状の処置、中枢神経系または末梢神経系の疾患または症
状、例えば、術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成の障害、虚血
後の損傷、例えば、卒中から生ずる損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、
痴呆、例えば、多梗塞性痴呆、硬化症、真性糖尿病に関連する神経変性、概日時
計または神経−筋肉伝達に影響を与える疾患、および精神分裂病；神経−筋肉接
続の機能障害を伴う症状を包含する筋肉の疾患または症状、例えば、遺伝的また
は外傷的萎縮性筋肉障害；種々の器官の疾患または症状、例えば、生殖腺、膵臓
の変性的症状、例えば、I型またはII型の真性糖尿病、腎臓の変性的症状、例え
ば、ネフローゼおよび心臓、肝臓および腸の変性的症状；のin vivo処置；およ
び学習および／または記憶の能力の処置または刺激である。
【０１２２】 本発明は、また、正常の、変性したまたは損傷したNCAM提示細胞を処置する薬
剤の製造における、NCAM Ig1−Ig2ドメインの使用および／またはNCAM Ig1−I
g2結合部位に関係するNCAM Ig1の部分、またはその模擬物のフラグメントの使
用に関する。こうして、本発明は、NCAM提示細胞からの神経突起のアウトグロー
スおよび／またはNCAM提示細胞の増殖を刺激するためにNCAM提示細胞を処置する
薬剤の製造における、NCAM Ig2ドメイン、またはその模擬物のフラグメントの
使用に関する。
【０１２３】 特に、NCAM提示細胞を処置する薬剤の製造における、NCAM Ig2ドメイン、ま
たはその模擬物のフラグメントの使用において、薬剤は中枢神経系または末梢神
経系の疾患または症状、例えば、術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄
鞘形成の障害、虚血後の損傷、例えば、卒中から生ずる損傷、パーキンソン病、
アルツハイマー病、痴呆、例えば、多梗塞性痴呆、硬化症、真性糖尿病に関連す
る神経変性、概日時計または神経−筋肉伝達に影響を与える疾患、および精神分
裂病の処置のため；神経−筋肉接続の機能障害を伴う症状を包含する筋肉の疾患
または症状、例えば、遺伝的または外傷的萎縮性筋肉障害の処置のため；種々の
器官の疾患または症状、例えば、生殖腺、膵臓の変性的症状、例えば、I型また
はII型の真性糖尿病、腎臓の変性的症状、例えば、ネフローゼおよび心臓、肝臓
および腸の変性的症状の処置ため、または学習および／または記憶の能力を刺激
する薬剤である。
【０１２４】 本発明は、また、上に定義した1またはそれ以上の化合物を含んでなる医薬組
成物に関する。特に、本発明の組成物は、NCAM Ig2ペプチドまたはそのフラグ
メントまたはペプチド模擬物である化合物を含んでなる。好ましい態様において
、ペプチドをマルティマーとして、例えば、担体に結合させて、処方される。ペ
プチドは適当にはデンドリマー、例えば、リシンに連鎖したまたはタンパク質担
体、例えば、BSAにカップリングした4つのペプチドとして処方することができる
。このような処方物は当業者によく知られている。
【０１２５】 本発明は、また、有効量の前述の1またはそれ以上の化合物または前述の医薬
組成物をin vitroまたはin vivoで投与して、NCAM提示細胞からの神経突起の
アウトグロースおよび／またはNCAM提示細胞の増殖を刺激することを包含する、
正常の、変性されたまたは損傷したNCAM提示細胞をin vitroまたはin vivoで
処置する方法に関する。
【０１２６】 本発明の方法において、処置は好ましくは中枢神経系または末梢神経系の疾患
または症状、例えば、術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成の障
害、虚血後の損傷、例えば、卒中から生ずる損傷、パーキンソン病、アルツハイ
マー病、痴呆、例えば、多梗塞性痴呆、硬化症、真性糖尿病に関連する神経変性
、概日時計または神経−筋肉伝達に影響を与える疾患、および精神分裂病；神経
−筋肉接続の機能障害を伴う症状を包含する筋肉の疾患、例えば、遺伝的または
外傷的萎縮性筋肉障害または症状；器官の疾患または症状、例えば、生殖腺、膵
臓の変性的症状、例えば、I型またはII型の真性糖尿病、腎臓の変性的症状、例
えば、ネフローゼおよび心臓の変性的症状；のin vivo処置である。
【０１２７】 本発明は、処置を必要とする患者の中枢神経系または末梢神経系を処置する方
法に関し、ここでこの方法は上に定義した1またはそれ以上の化合物または上に
定義した組成物を患者に投与することを特徴とする。 さらに、本発明の方法は、また、処置が神経の再生に導く方法である。化合物
を人工装置、例えば、人工神経ガイドと組合わせて使用する。こうして、それ以
上の面において、本発明は、上に定義した1またはそれ以上の化合物または上に
定義した組成物を含んでなることを特徴とする、人工神経ガイドに関する。人工
神経ガイドはこの分野において知られている。
【０１２８】 それ以上の面において、本発明は、上に定義した1またはそれ以上の化合物ま
たは成物を被検体に投与することを特徴とする、被検体における学習および／ま
たは記憶の能力を刺激する方法に関する。 本発明は、さらに、有効量の上に定義した1またはそれ以上の化合物または組
成物と、薬学上許容される添加剤とを含んでなる、中枢神経系または末梢神経系
、筋肉または種々の器官の疾患および症状を処置するための薬剤に関する。この
ような薬剤は、適当には、経口的、経皮的、筋肉内、頭蓋内、鼻内または肺内に
投与するように処方することができる。
【０１２９】 なお他の態様において、本発明は、有効量の上に定義した1またはそれ以上の
化合物または上に定義した組成物と、1またはそれ以上の薬学上許容される添加
剤とを含んでなる、被検体における学習および／または記憶の刺激において使用
するための組成物に関する。このような組成物は、適当には、経口的、経皮的、
筋肉内、頭蓋内、鼻内または肺内に投与するように処方することができる。
【０１３０】 上記から明らかなように、柔軟性の増加は神経系、例えば、学習および再生お
よび変性NCAM機能を包含する神経系の外側の他の症状において有益であると考え
られる。本発明のペプチドの作用を、再生、すなわち、単離された上頸神経節か
らの軸索のアウトグロースに関して研究した。上に同定されたモチーフのペプチ
ドは対照ペプチドに比較してアウトグロースを刺激することが見出された。観測
された作用が投与量により大きく影響を受ける場合、これは多分NCAM Ig1結合
性化合物によりシグナルトランスダクション経路が活性化され、神経突起のアウ
トグロースについてベル形投与量−応答曲線を生ずるためである（第8図および
第11図）。
【０１３１】 こうして、ニューロン再生に対するNCAM Ig1結合性化合物の作用およびNCAM
仲介シグナルトランスダクション経路の活性化に依存する柔軟性の他の型につい
て、同様なベル形投与量−応答曲線が期待されるであろう。齧歯類または他の動
物における化合物の心室内注入および引き続く種々の投与量のNCAM Ig1結合性
化合物の注射後における動物の学習能力の検査により、学習に対するNCAM Ig1
結合性化合物の作用をin vivoにおいて研究することができた。このような注射
をトレーニング後5〜8時間に実施したとき、学習のある種の型に対するNCAM抗体
の阻害作用が証明されたので、注射はトレーニング前にまたはトレーニング後の
種々の時点に実施すべきである（Scholey他、1993）。
【０１３２】 学習に対するNCAM Ig1結合性化合物の作用を評価する有用な学習モデルは、
齧歯類またはニワトリにおいて受動的回避および水迷路の学習を包含する。NCAM
抗体について実施されたように、NCAM Ig1結合性化合物の適用後に長期間の増
強の誘導または維持を測定することによって、学習に関連するシナプスの柔軟性
に対するNCAM Ig1結合性化合物の作用をin vitroまたはin vivoにおいて研究
することができるであろう（Ronn他、1995）。
【０１３３】 驚くべきことには、上に示したようにモチーフの特性を表示するNCAM Ig2ド
メインおよびNCAM Ig1結合性ペプチドのリガンドは、NCAM仲介シグナリングを
刺激することが見出された。特に、C3ペプチド、Ig1−pおよびIg2−ペプチド、I
g2−pは、NCAM Ig1ドメインと相互作用し、これによりシグナルトランスダクシ
ョンを誘導することによって、神経突起の伸長を包含するNCAM機能を刺激する。 したがって、本発明の化合物は症状において有益な作用を有すると考えられ、
ここでNCAM機能は重要であることが示された。
【０１３４】 前述したように、NCAMはいくつかの組織および器官において発現されることが
見出された。こうして、NCAMトランスメンブランシグナリングを妨害することは
、下記のような疾患および障害において有益な影響を有することがある： 1） 再生およびシナプスの柔軟性に対する可能性の増加が望ましい、中枢神
経系および末梢神経系の疾患および症状、例えば、術後神経損傷；外傷性神経損
傷；神経線維の髄鞘形成により特徴づけられる障害；虚血後の損傷、例えば、卒
中から生ずる損傷；パーキンソン病；アルツハイマー病；多梗塞性痴呆を包含す
る痴呆；硬化症；真性糖尿病に関連する神経変性；概日時計に影響を与える疾患
；神経−筋肉伝達に影響を与える疾患；および精神分裂病； 2） 神経−筋肉接続の機能障害を伴う症状を包含する筋肉の疾患、例えば、
遺伝的萎縮性筋肉障害；および外傷的萎縮性筋肉障害； 3） 種々の器官の変性的症状、例えば、生殖腺の変性的症状；β−細胞を包
含する障害を包含する膵臓の変性的症状；I型またはII型の真性糖尿病；腎臓の
変性的症状、例えば、ネフローゼ；および心臓、肝臓および腸の変性的症状。
【０１３５】 前述したように、本発明は、また、薬物および組成物に関する。本発明の化合
物に基づく薬物および組成物の処方物を開発する方法は、一般に、他のタンパク
質に基づく薬剤産物を処方する方法に対応する。潜在的問題およびこれらの問題
を克服するために必要な手引きは、いくつかの文献、例えば、下記の文献に記載
されている：″Theapeutic Peptides and Protein Formulation．Processin
g and Delivery Systems″、A. K. Bangs編、Technomic Publishing AG
、Basel、1995。
【０１３６】 注射可能な調製物は、液状溶液または懸濁液、注射前に液体中に溶解または懸
濁させるために適当な固体の形態として調製される。また、調製物を乳化するこ
とができる。活性成分を薬学上許容されかつ活性成分と適合性である賦形剤とし
ばしば混合される。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース
、グリセロール、エタノールまたはその他、およびそれらの組合わせである。さ
らに、所望ならば、調製物は少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、pH
緩衝化剤、または調製物の有効性または輸送を増強する物質を含有することがで
きる。 本発明の化合物の処方物は当業者に知られている技術により製造することがで
きる。処方物は薬学上許容される担体および賦形剤、例えば、微小球、リポソー
ム、マイクロカプセル、ナノ粒子またはその他を含有することができる。
【０１３７】 調製物は適当には注射により、必要に応じて、活性成分がその作用を発揮する
部位に、投与することができる。他の投与モードに適当な追加の処方物は、坐剤
、経鼻、肺および、ある場合において、経口処方物を包含する。坐剤について、
伝統的結合剤および担体はポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを包
含する。このような坐剤は1またはそれ以上の活性成分を0.5％〜10％、好ましく
は1〜2％の範囲において含有する混合物から形成することができる。
【０１３８】 経口処方物は、このような通常使用される賦形剤、例えば、薬学的等級のマン
ニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリ
ン、セルロース、炭酸マグネシウム、およびその他を包含する。これらの組成物
は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出性処方物または粉末の形
態を取り、一般に10〜95％、好ましくは25〜70％の1またはそれ以上の活性成分
を含有する。
【０１３９】 他の処方物は経鼻および肺の投与、例えば、吸入器およびエーロゾルに適当で
ある。 活性化合物は中性または塩の形態で処方することができる。薬学上許容される
細胞は酸付加塩（ペプチド化合物の遊離アミノ酸基と形成した）および無機酸、
例えば、塩酸またはリン酸、または有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、
マンデル酸、およびその他と形成した塩を包含する。遊離カルボキシル基と形成
した塩は、また、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸
化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄、および有機塩基、例
えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、2−エチルアミノエタノール、
ヒスチジン、プロカイン、およびその他から誘導することができる。
【０１４０】 調製物は投与形態と適合する方法で、療法的に有効な量で投与される。投与す
べき量は、治療すべき被検体、被検体の体重および年齢、治療すべき疾患および
疾患の段階に依存する。適当な投与量範囲は、数100μgの活性成分／投与、好ま
しくは約0.1μg〜1000μgの範囲、例えば、約1μg〜300μgの範囲、特に約10μg
〜50μgの範囲である。投与は1回実施可能であるか、あるいは引き続いて投与す
ることができる。また、投与量は投与経路に依存し、そして治療すべき被検体の
年齢および体重とともに変化するであろう。
【０１４１】 本発明の化合物のあるものは十分に活性であるが、他のものについて、調製物
が薬学上許容される添加剤および／または担体をさらに含んでなる場合、作用は
増強されるであろう。このような添加剤および担体はこの分野において知られて
いる。そのターゲットへの活性物質の送出を促進する化合物を含むことは有利で
あろう。
【０１４２】 多くの場合において、処方物を多数回投与することが必要であろう。投与は連
続的注入、例えば、心室内注入またはより多くの投与量の投与、例えば、1日当
たり多い回数、毎日、1週当たり多い回数、毎週、およびその他であることがで
きる。神経ガイドに関すると、投与は連続的であるか、あるいは1またはそれ以
上の活性化合物の調節放出に基づいて小さい部分でであることができる。さらに
、前駆体を使用して放出速度および／または放出部位をコントロールすることが
できる。他の種類の移植片および経口投与は同様に調節放出および／または前駆
体の使用に基づくことができる。
【０１４３】 処置は必ずしも診断された疾患の処置である必要はなく、一般に被検体の予防
的処置であるか、あるいは前述の疾患の1つに対して高い危険性を有することが
知られている被検体の予防的処置であることができる。
【０１４４】 下記の非限定的実施例により、本発明をさらに例示する。 実施例 実施例1．NCAMのレセプターIgドメイン1の製造 NCAMのIg1ドメインをピキア・パストリス（Pichia pastoris）中で組換えタ
ンパク質として製造した。ラットNCAMのアミノ酸1〜97をコードするcDNAフラグ
メントをPCRにより合成し、そして増幅されたcDNAをpHIL−S1プラスミド（Invit
rogen Corporation、San Diego、USA）のXhoI／BamHI部位の中にサブクローニ
ングした。大腸菌（E. coli）Top 10F'株（Invitrogen Corporation、San D
iego、USA）を形質転換のために使用した。組換えプラスミドをNsiIで線状化し
、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）His 4 GS−115株（Invitrogen C
orporation、San Diego、USA）を形質転換のために使用した。
【０１４５】 ピキア（Pichia）発現キットマニュアル（製造業者により供給された）に従い
、形質転換および選択を実施した。組換えタンパク質をIg1 PP（Ig様ドメイン1
、P. pastoris中の産生された）として設計した。アミノ酸の配列決定および11
kDの期待される分子量を確証するMALDI−MSにより、Ig1 PPの確実性は保証され
た。本質的にピキア発現キットマニュアルに従い、細胞を成長させた。成長する
細胞からの誘導上清を0.21mmのフィルターを通して濾過した後、限外濾過により
濃縮し、セファデックス（Sephadex）G−50（Pharmacia Bitech AB、Sweden）
を使用してゲル濾過により精製した。
【０１４６】 実施例2．NCAMのIgドメイン2の製造 残基100〜191に対応するPCRにより、NCAMのIg2ドメインをコードするcDNAを合
成した。ラットNCAM−120cDNAを鋳型として使用した。増幅されたcDNAフラグメ
ントをpぴ9プラスミド（Invitrogen）SnaBI／AvrII部位の中にサブクローニング
した。組換えプラスミドをSacIで線状化し、製造業者により供給されたプロトコ
ルに従い、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）His 4 GS−115株（Invit
rogen）の形質転換のために使用した。
【０１４７】 2リットルの発酵槽（NBR Mini Bioreactor、NBR Bioreactor AG）中で誘
導後、NCAMの組換えIg2ドメインが発現された。Ig2ドメインをセファデックス（
Sephadex）G25（Pharmacia）によるゲル濾過により、次いで5mlのHiTrap SPカ
ラムを使用するイオン交換クロマトグラフィーにより精製して、10〜15mg／リッ
トルの発現媒質を得た。アミノ酸の配列決定および質量分析により、NCAM Ig2
ドメインの確実性は保証された。N−末端において、クローニング部位を考察す
ると、もとの残基Lys−1およびLeu−2がTyr−1およびVal−2で置換された。
【０１４８】 NCAMの最初の2つのドメインの二量化の開示されたモデルは、次のようにして
グループ突然変異アプローチを使用して実験的に証明された。 下記の3つの突然変異をつくり、突然変異したNCAM（20−208）ドメインが組換
えタンパク質として産生された：ドメイン1中に3つの突然変異E30A、E35A、K37A
をもつNCAM（20−208）、ドメイン2中に3つの突然変異R192A、R196A、E198Aをも
つNCAM（20−208）およびドメイン−1中に3つの突然変異E30A、E35A、K37Aおよ
びドメイン−2中に3つの突然変異R192A、R196A、E198AをもつNCAM（20−208）。
【０１４９】 突然変異を含有する75bp長さの5'および72bp長さの3'プライマーを使用するPC
Rにより、問題の2つの部位中の突然変異を導入した（5' CTG CAG GTA GAT ATT G
TT CCC AGC CAA GGA GCC ATC AGC GTT GGA GCC TCC GCC TTC TTC CTG TGT CAA G
TG GCA 3' 及び 5' ATT CAC AAT GAC CTG AAT GTC CTT GAA GTT GAT GGC CCC GG
C GGC CAG GAT GGC GCC CTC ACA GCG GTA AGT 3'）。
【０１５０】 NCAM（20−208）の3つの突然変異が産生された。第1突然変異体において、ド
メイン−1の同種親和性結合部位からの残基Glu−30、Glu−35およびLys−37がAl
aで置換された。第2突然変異体において、ドメイン2の同種親和性結合部位から
の残基Arg−192、Arg−196およびGlu−198がAlaで置換された。第3突然変異体は
、Alaで置換された6つの残基Glu−30、Glu−35、Lys−37、Arg−192、Arg−196
およびGlu−198を有した。
【０１５１】 制限分析およびDNA配列決定により突然変異の存在を確証した後、非突然変異N
CAM（20−208）と比較して、突然変異について発現レベルおよび精製パターンに
おいて有意な変動は存在しないことが確認された。ゲル濾過クロマトグラフィー
を使用して、NCAM（20−208）は約46kDaにおいて二量体として溶離することが明
らかにされた。この発見は、突然変異したタンパク質が約23kDaにおいてモノマ
ーとして溶離ように思われるという発見と比較したとき、同種親和性結合部位に
おける突然変異により引き起こされる効果をモニターする容易な、信頼性ある方
法を提供する。
【０１５２】 こうして、突然変異は二量体の形成を壊滅させることが証明された。これは6
つの突然変異した残基の1つまたはいくつかの対が二量体の形成に関係すること
を明らかに示唆する。 3つの突然変異したタンパク質の各々の1H NMRスペクトルにより、突然変異し
た二重ドメインのドメイン−1およびドメイン−2が非突然変異タンパク質におけ
る折りたたみに非常に類似して折りたたまれることが示された。
【０１５３】 実施例3．樹脂結合デカペプチドライブラリーの合成およびスクリーニング 分配、混合手法を使用して、樹脂結合、1ビーズ1ペプチドライブラリーの合成
を実施した（Furka、A. 他、（1991）Int. J. Pep. Prot. Res. 37、487−
493）。合成および最後のTFA−脱保護を通じて、ポリエチレン注射器を反応器と
して使用した。TentaGel（Rapp Polymere、Tubingen、Germany）を18のアリコ
ートに分割し、システインおよびヒスチジンを除外してタンパク質L−アミノ酸
を使用した。
【０１５４】 下記の保護基で側鎖を保護した：Asp（tBu）、Glu（tBu）、Tyr（tBu）、Ser
（tBu）、Thr（tBu）、Asn（trt）、Gln（trt）、Lys（Boc）、Arg（pmc）。5当
量のDICおよび5当量のHOBtを使用して、Fmoc保護されたアミノ酸（5当量；Milli
genまたはNovabiochem）を一夜カップリングさせた。DMF中の25％のピペリジン
を20分間使用して、Fmoc基を除去した。82.5％のTFA、5％のアニソール、5％のH 2 O、5％のEDT、2.5％のチオアニソールを室温において2.5時間を使用して側鎖保
護基を除去し、次いでテトラヒドロフランおよび1％のHOAcで洗浄し、引き続く
樹脂を凍結乾燥した。
【０１５５】 0.1％のゼラチン（Sigma）を含有するTris／HCl緩衝液（Tris／HCl 0.025M、
pH7.2、0.25M NaCl、0.1％（w／v）Tween 20）中で2mlの樹脂（約106ビーズに
等しい）をビオチニル化レセプターと60分間インキュベートすることによって、
スクリーニングを実施した。引き続いて、樹脂をTris／HCl緩衝液中で洗浄し、
アビジン−アルカリ性ホスファターゼ（1：20000に希釈した）と30分間インキュ
ベートした。Lam他（1992）により記載されている手法に従い、基質BCIP／NBT（
Sigma）を添加し、染色されたビーズをミクロ配列決定のために取出した。ライ
ブラリーをレセプターNCAM Ig1−PP（10mg／ml）でスクリーニングした。
【０１５６】 実施例4．ビーズの配列決定および合成すべきペプチドの選択 最も強く染色されたビーズを立体顕微鏡下で選択し、ABI 120A HPLCを装備
したABI 470Aにより配列決定した。得られた22のペプチド配列（配列番号1〜配
列番号22）を第4図Aに示す。顕著な発見は、これらの同定されたNCAM Ig1結合
性配列中の塩基性アミノ酸リシン（K）およびアルギニン（R）の高い存在率であ
った。
【０１５７】 得られた配列を整列させ、推定上のモチーフを明らかにする反復パターンにつ
いてこれらを検査することによって、合成し、それ以上の研究において使用すべ
きペプチド配列を選択した。3つの明らかなモチーフがペプチド内で同定された
。第1モチーフは配列K／R−K／R−P−K／R−N／Sであり、これは第4図Bに示すよ
うにC3ペプチドを包含するペプチドのグループの中に部分的に保存された。第2
モチーフはK／R−K／R−E−K／R−X−K／R−K／Rであり、これはD3を包含する3
つのペプチドの中に部分的に保存されることが見出された（第4図C）。第3モチ
ーフ、G−X−K／R−P−K／R、は、D4を包含する2つのペプチドの中に見出された
（第4図D）。
【０１５８】 実施例5．ペプチドの合成 NCAM Ig1の配列から誘導された1つのペプチドIg1−p（配列番号26）を後述す
るようにして合成した。さらに、NCAM Ig2の配列から誘導された1つのペプチド
Ig2−p（配列番号23）を後述するようにして合成した。組合わせライブラリーか
ら、22のNCAM Ig1結合性配列（配列番号1〜22）が同定された。
【０１５９】 3つのペプチド、C3（配列番号1）、D3（配列番号2）およびD4（配列番号3）を
それ以上の分析のために選択し、TentaGel樹脂上でRinkアミドリンカー（p−（
（R，S）−α−（1−（9H−フルオレン−9−イル）−メトキシホルムアミド）−
2，4−ジメトキシベンジル）−フェノキシ酢酸（Novabiochem）およびFmoc保護
アミノ酸（3当量）を使用して合成した。マニュアルマルチカラム装置においてT
BTU（3当量）、HOBt（3当量）およびDIEA（4.5当量）を使用して、カップリング
を60分間実施した。FmocをDMF中において20％のピペリジンで10分間脱保護した
。
【０１６０】 Fmoc−Lys（Fmoc）−OH（Novabiochem）をリンカー樹脂にカップリングし、次
いでFmoc基をFmoc脱保護し、さらにFmoc−Lys（Fmoc）−OH（Novabiochem）をカ
ップリングすることによって、ペプチドデンドリマーを合成した。Fmoc脱保護後
、モノマーのペプチドについて前述したようにペプチドの合成を実施した。ペプ
チジル樹脂を90％のTFA、5％のH2O、3％のEDT、2％のチオアニソールで脱保護し
、ジエチルエーテル中で沈降させ、ジエチルエーテル中で3回洗浄し、5％のAcOH
中で可溶化し、凍結乾燥した。
【０１６１】 ウォーターズ（Waters）picotagおよびWISP 712に接続されたウォーターズ50
1ポンプを使用して、アミノ酸分析を実施した。C18カラム上の分析用および調製
用HPLC（Delta−Pak 100Å 15μm、Millipore）のために、ウォーターズ996フ
ォトダイオードアレイ検出器を装備したウォーターズ600Eを使用した。VG TOF
Spec E（Fisions Instrument）上で、MALDI−MSを実施した。HPLCにより推定
すると、ペプチドは少なくとも95％の純度であった。
【０１６２】 Ig2−ペプチド、Ig2−p、の重要な残基の役割を研究するために、配列GSILASG
ESNFK（P2−3S）およびGSILASGSSNFK（P2−4S）の、それぞれ、P2−3SおよびP2
−4Sと呼ぶ、2つの対照ペプチドを構築した。P2−3S（配列番号24）において、N
CAM Ig2ドメインの残基Arg−192、Arg−196およびIle−199の突然変異に対応す
るセリンで残基Arg−2、Arg−6およびIle−9を置換した。P2−4S（配列番号25）
において、NCAM Ig2ドメインの残基Arg−192、Arg−196、Glu−198およびIle−
199の突然変異に対応するセリンで残基Arg−2、Arg−6、Glu−8およびIle−9を
置換した。
【０１６３】 C3配列中の個々の残基の役割を研究するために、C3と同一残基を含んでなるが
、配列が異なる、いわゆるスクランブルドペプチドを同一方法で構築した（121
、114およびC3scr、第7図）。同様に、D3およびD4中の残基に対応するスクラン
ブルドペプチドを構築した（スクランブルドD3およびスクランブルドD4、第7図
）。さらに、塩基性アミノ酸（KsおよびRs）がセリンで置換されているC3配列を
含有するペプチドを構築して（116〜119、第7図）、これらの特定のアミノ酸の
役割を調査した。同様に、プロリン残基（Xaa1）がアラニンで置換されているC3
配列に対応するペプチドを構築した。C3中の塩基性アミノ酸残基の役割をさらに
研究するために、塩基性アミノ酸がアセチル化により修飾されたC3配列を含有す
るペプチドを構築した（C3dacetyl、K（120）、第7図）。
【０１６４】 実施例6．プラスモン表面共鳴解析 BIAlite計器（Pharmacia Biosennsor AB、Sweden）を使用して、実時間生体
分子相互作用分析を実施した。25℃においてHepes緩衝化生理食塩水（HBS：10mM
のHepes pH7.4、150mMのHCl、3.4mMのEDTA、0.005％v／v界面活性剤P20（Pharm
acia Biosennsor AB、Sweden）を展開緩衝液として使用して、すべての実験を
実施した。
【０１６５】 デンドリマーペプチドC3、D3およびD4（3つのリシンから成るバックボーンに
カップリングした4ペプチド−モノマー）を、下記の手順に従い、センサーチッ
プCM5（Pharmacia Biosennsor AB、Sweden）上に固定化した：チップを10mlの
0.05で維持したN−ヒドロキシスクシンイミド、0.2MのN−エチル−N'−（ジメチ
ルアミノプロピル）カーボジイミドにより活性化した；35mlのHBS中のペプチド
溶液を60μg／mlの濃度でを使用して、ペプチドを固定化した；最後にチップを3
5μlの1Mのエタノールアミン塩酸塩pH8.5によりブロックした。デンドリマーペ
プチドへのIg1の結合：50mlのIg1またはIg1Iを示した濃度において適用した。チ
ップを5mMのNaOHの2つの5mlのパルスにより再生した。2回の独立の実験を実施し
た。結果により、C3、C3およびD4はNCAM Ig1ドメインに結合することが確証さ
れた。
【０１６６】 実施例7．凝集および神経突起のアウトグロース 1） NCAMに対するNCAM Ig1結合性化合物の影響は細胞接着を仲介した。在胎
17〜19日のラット胚から海馬細胞を調製した。生後47日のマウスから小脳細胞を
調製した。N2（Gibco，BRL）を補充したDMEM／F12（Gibco，BRL）またはB27（Gi
bco，BRL）を補充したNeurobassalから成る規定培地（両方の場合において、20m
MのHEPES（Gibco，BRL）、0.4％w／vのウシ血清アルブミン（Sigma）および100i
U／mlのペニシリン−ストレプトアビジンを補充した）中で、細胞を成長させた
。
【０１６７】 本質的に記載されたようにして（Maar他、1995）、解離した細胞を60ウェルの
マイクロタイタープレートの中に播種した（15ml中の50,000／ウェル）。マイク
ロウェルの中へ細胞を播種する直前に、試験すべきペプチドを細胞懸濁液に添加
した。NCAM Ig1結合性ペプチド、C3、D3およびD4が細胞凝集の間に存在したと
き、細胞播種後24時間に定量したとき、より大きい細胞凝集物が生じた。示した
濃度（ペプチド−デンドリマー上に存在するペプチドモノマーの量に関して計算
した濃度、μM）のC3dの存在下に細胞を播種した後24時間に、測定された凝集物
の数を第5図に示す。
【０１６８】 そのうえ、ペプチドは形成したニューロンプロセスの数を増加させた（第6図
）。同様に、D3−およびD4−デンドリマーは、24時間後、形成した凝集物の数を
増加させた。C3配列に基づくスクランブルドペプチドは、また、凝集を阻害した
。試験した種々のペプチドの作用を第7図に示す。C3−ペプチドの活性残基を定
位するために、アラニン置換を実施した。アラニンによるプロリンの置換は作用
を変化させなかった。同様に、作用を変化させないで、こうしてこのようなペプ
チドを変化させないで、1つの塩基性アミノ酸を置換することができる。
【０１６９】 対照的に、塩基性残基の2〜4つのアラニン置換を有するペプチドは凝集に対す
る作用をもたず、これらの塩基性残基がC3の作用にとって重要であることが示さ
れた。モノマー、デンドリマーとしてまたはBSA結合20マーとしてC3の存在下に
、同様な凝集培養物を調製した。C3ペプチドの異なる形態を試験した。C3のモノ
マー、デンドリマーおよびBSA結合の形態は凝集に対して同様な作用を有するこ
とが見出された。しかしながら、C3配列のデンドリマーは、多分いくつかのレセ
プタードメインに結合する能力のために、最も効力がある形態であった。
【０１７０】 レセプターがNCAM Ig1ドメイン上に位置することを確認するために、実施例1
に記載するように溶液中の5.4または54μg／mlの濃度でピキア・パストリス（Pi
chia pastoris）中で調製した、このドメインと細胞をインキュベートした。NC
AM Ig1ドメインの存在はC3の作用を阻害し、C3のNCAM仲介細胞接着の阻害を証
明した。これらの実験において、ここにおいて同定されたNCAM Ig1結合性ペプ
チドはNCAM仲介細胞接着に影響を及ぼし、これにより高い密度で成長した一次ニ
ューロンの培養物中で形成した細胞凝集物およびニューロンプロセスの数を増加
させることが示される。
【０１７１】 前述したように製造した海馬凝集物培養物において、NCAM Ig2ドメインおよ
びペプチドIg2−p（配列番号23）およびIg1−p（配列番号26）の作用を試験した
。培養物を種々の濃度のIgドメイン2で処理したとき、細胞凝集物の数は投与量
従属的方法で増加したことを理解することができる。処理した培養物において、
対照培養物と比較したとき、凝集物はより小さく、Igドメイン2は細胞間接着を
減少させることが示される。Ig2−ペプチドは、また、細胞凝集を阻害した。Ig
ドメイン2およびIg2−ペプチドの作用を比較することによって、両方の化合物は
濃度従属的方法で凝集を強く阻害したことを理解することができる。
【０１７２】 Ig2−ペプチドによる海馬ニューロンの凝集の阻害が特異的であるかどうかを
試験するために、Igドメイン1へのIgドメイン2の結合に関係するいくつかの残基
がSerで置換されているペプチドを試験した。Arg−2、Arg−6およびIle−9がSer
で置換された、ペプチドP2−3S（配列番号24）は阻害作用をもたなかった。さら
にGlu−8がSerで置換された、ペプチドP2−4S（配列番号25）は海馬細胞の凝集
に対してわずかの阻害作用のみを有した。
【０１７３】 これらの結果が示すように、Igドメイン1へのその結合に関係するIg2ドメイン
中のアミノ酸残基はNCAM仲介細胞間接着にとって重要である。我々は、また、記
載するように凝集培養物中のIg1−Pペプチドｎｏ作用を試験した。また、このペ
プチドは細胞の凝集を阻害し、NCAM Ig1−Ig2ドメイン中の結合部位に寄与する
NCAM Ig2ドメインの部分がNCAM仲介細胞間接着にとって重要である。
【０１７４】 2） NCAM Ig1結合性化合物は神経突起のアウトグロースを促進する。海馬細
胞を在胎18日のラット胚から調製した。パーマノックス（Permanox）プラスチッ
ク（NUNC A／S、Denmark）またはフィブロネクチン（同時培養物）の成長表面
を有する8ウェルのLabTek組織培養チャンバースライドの中に、ほぼ4000細胞／c
m2に対応する、5000細胞／ウェルを播種し、実施例7（1）に記載するように20時
間維持した。
【０１７５】 同時培養物について、NCAM−Bを発現するか、あるいは発現しないL−細胞また
は3T3細胞、繊維芽細胞の単層上にニューロンを播種した。成長関連タンパク質4
3kD（GAP43）についての免疫組織化学的染色により、ニューロンを可視化した。
簡単に述べると、リン酸塩緩衝液（PBS）中の4％のパラホルムアルデヒド中で細
胞を30分間固定した。一次抗体は、室温において1時間または4℃において一夜、
1％の胎仔ウシ血清（FBS）、0.1％のウシ血清アルブミン（BSA）、50mMのグリシ
ン、0.02％のNaN3、2％のサポニンを含むPBS中で1:100に希釈したウサギ抗GAP43
であった。
【０１７６】 第2抗体は、室温において1時間、1％のBSAを含むPBS中で1:100に希釈した、ビ
オチニル化ブタ抗ウサギ免疫グロブリンであった。層間で、1％のBSAを含むPBS
中で3×20分間洗浄を実施した。生きているまたは染色されたニューロンの影像
を捕捉し、タンパク質実験室（Protein Laboratory）においてつくられた影像
解析プログラム・ライン・レングス（Line Length）により解析した。推定上の
軸索は各細胞の最長の神経突起として同定された。10μmより長い神経突起のみ
を考察した。
【０１７７】 NCAM−140を安定に発現する繊維芽細胞の単層（LBN）またはNCAMを発現しない
繊維芽細胞の単層（LVN）に対する、一次海馬ニューロンの同時培養物に添加し
たC3の作用を第8図に示す。このモデルにおいて、トランスフェクトされた繊維
芽細胞により発現されたNCAMは、ニューロンからの神経突起のアウトグロースの
増加を誘導する。NCAMを発現する繊維芽細胞上の神経突起の平均長さは、NCAMを
発現しない繊維芽細胞上の神経突起の平均長さより長かった。
【０１７８】 C3の存在下に、NCAMを発現するか、あるいは発現しない繊維芽細胞上の神経突
起の長さの間に差は存在せず、C3は小脳ニューロンおよび海馬ニューロンの両方
中のNCAM（0.54または5.4μM）に結合することが示された。ニューロンがNCAMを
発現しない繊維芽細胞上で維持されたとき、C3の非存在下に維持された対照と比
較したとき、同様な濃度のC3により神経突起の伸長は刺激された。これが示すよ
うに、C3は神経突起のアウトグロースを刺激する。
【０１７９】 神経突起の伸長に対する刺激作用を研究するために、細胞を前述したように調
製し、プラスチックまたはフィブロネクチンの支持体上に播種した。次いで細胞
を21時間維持し、そしてプログラム・ラインレングスを使用するコンピュータ援
用影像解析により、神経突起のアウトグロースを解析した。10μmより長い神経
突起について、各細胞の最長の神経突起の平均長さを測定した。さらに、分岐点
の平均数／神経突起および神経突起の平均数／細胞を決定した。細胞の播種直前
に、NCAM Ig1結合性ペプチドC3、D3およびD4を添加した。
【０１８０】 これは神経突起のアウトグロースを増加させた。細胞当たりの最長の神経突起
の測定結果を第9図および第10図に示す。これらの図面において、濃度はμMで与
えられている。神経突起の数／細胞および神経突起の分岐を測定したとき、同様
に投与量−応答の関係が見出された。同様なアミノ酸組成を有するが、配列が変
更された、スクランブルドペプチドは、C3、D3およびD4と同様な作用を有した。
試験したNCAM Ig1結合性ペプチドおよび種々の対照ペプチドの神経突起のアウ
トグロースに対する作用を、第7図に示す。
【０１８１】 NCAM Ig1結合性ペプチドのどの性質が観測されたニューリトジェニック作用
にとって重要であるかを研究するために、C3配列に対応するが、塩基性アミノ酸
が単独で置換されたペプチドを、神経突起のアウトグロースに対する、それらの
作用について試験した（第11図）。最長の神経突起の長さ、神経突起の数／細胞
および神経突起の分岐はC3ペプチド（0.54μM）により強く刺激された。塩基性
アミノ酸の1アラニン置換を除外して同様な配列を有するペプチドは、同様な作
用を有した。対照的に、3または4つのアラニン置換を有するペプチドは作用をも
たなかった。この作用のみをメカニズムを研究するために、NCAM従属シグナリン
グを阻害することが知られている種々の化合物と組み合わせて、C3ペプチド（0.
54μM）を添加した（第12図および第13図）。
【０１８２】 下記の化合物は神経突起の伸長に対するC3の刺激作用を阻害することが見出さ
れた：10μMのベラパミル（L−型電圧従属カルシウムチャンネルの「ve」インヒ
ビター）、0.27μMのオメガ−コノトキシンGVIA（N−型電圧従属カルシウムチャ
ンネルの「co」インヒビター）、1μg／mlの百日咳トキシン（Pertussis toxin
）（ある種のGタンパク質の「pertus」インヒビター）、エルブスタチンアナロ
ーグ（「erb」0.2μM、ある種のチロシンキナーゼのインヒビター）、繊維芽細
胞成長因子レセプター中のアシドボックス（acidbox）エピトープに対する抗体
（FGF−Rs）（NCAM−FGF−R結合およびシグナリングの1：200インヒビター）、
いわゆるCAM相同ドメイン（CHD）に対応するペプチド（175μM、NCAM−FGF−R結
合およびシグナリングのインヒビター）。
【０１８３】 さらに、C3のニューリトジェニック作用は、溶液中の、実施例1に記載するよ
うに調製した、NCAM Ig1ドメインにより完全に阻害された。これらの結果が示
すように、C3はNCAM Ig1ドメインに結合し、これにより上に定義したインヒビ
ター化合物に対して感受性であるニューロン中のシグナリング経路を活性化する
ことによって、神経突起のアウトグロースを刺激する。
【０１８４】 NCAM Ig1の内因的リガンドを研究するために、NCAM Ig2ドメインをピキア・
パストリス（Pichia pastoris）中で調製し（実施例2参照）、フィブロネクチ
ン支持体上で維持した一次海馬ニューロンからの神経突起のアウトグロースに対
する、その作用について試験した。細胞播種の直前に、このドメインを含んでな
るポリペプチドを培養ウェルに添加した。示した濃度のNCAM Ig2ポリペプチド
（「pLoop2」）の存在下に一次海馬ニューロンの播種後に測定した、最長の神経
突起の平均長さを第14図に示す。それが示すように、NCAM Ig2はC3ペプチドの
それに類似するベル形投与量−応答関係で神経突起のアウトグロースを刺激する
。
【０１８５】 このドメインの0.5μMに対応する5.4μg／mlの濃度において、NCAM Ig2の最
大ニューリトジェニック作用が見出された。これは、C3ペプチドが最大のニュー
リトジェニック作用を有した濃度である。次いでC3について前述したように、NC
AM従属シグナリングを阻害することが知られている化合物と組み合わせてNCAM
Ig2ドメインを試験した。また、これらの化合物はNCAM Ig2のニューリトジェニ
ック作用を阻害した。こうして、NCAM Ig2およびC3の両方はNCAM Ig1に結合し
、同一シグナルトランスダクション経路を活性化することによって神経突起の伸
長を刺激する。
【０１８６】 したがって、NCAM Ig2およびC3を組合わせて添加したとき、神経突起のアウ
トグロースに対するそれらの作用について試験した。NCAM Ig2の作用はC3のそ
れに対して非加法的であることが見出された（第15図）。これらの結果が示すよ
うに、NCAM Ig2およびC3は同一メカニズムにより神経突起の伸長を刺激する。
それらの両方はNCAM Ig1ドメインに結合し、これにより同一シグナリング経路
を活性化して神経突起のアウトグロースに導く。 Ig1ドメイン2およびIg1ドメ
イン2の残基191−202を包含するペプチドは、神経突起のアウトグロースに対し
て直接的作用を有することが示された。
【０１８７】 前述したように、海馬細胞を低い密度で成長させ、種々の濃度の化合物で処理
した。海馬ニューロンからの神経突起のアウトグロースを測定するために、立体
解析学的原理に基づく簡単な手順を使用した。簡単に述べると、ソフトウェアパ
ッケージ″ProcessLength″（Protein Laboratory、University of Copenhag
en）により、ある数の試験ラインを有する格子を含有する不偏計数フレームを細
胞培養物の影像上に重ねた。試験ラインとの細胞プロセスの交点の数を計数し、
細胞本体の数にに関係づけ、これにより全神経突起長さ／細胞の定量を可能とし
た。
【０１８８】 Igドメイン2およびIg−ペプチドの両方は、投与量従属的方法で海馬ニューロ
ンからの神経突起のアウトグロースを強く刺激した。前述したようにIg2−p中の
3または4つの残基をSerで画分すると、神経突起のアウトグロースを刺激するIg2
−ペプチドの能力は阻害された。Ig2−ペプチドの潜在能力を増加するために、
リシンバックボーンにカップリングされた4つのモノマーから構成されたデンド
リマー（Ig2−p）を合成した。デンドリマーは、Igドメイン2の刺激作用につい
て見出された濃度範囲と同一濃度範囲内においてベル形投与量−応答関係で、強
いニューリトジェニック作用を有した。
【０１８９】 最適濃度3.6μMにおいてデンドリマーで処理した海馬培養物において、ニュー
ロンは対照よりも非常に高い程度の形態学的分化を示したことが観測された。こ
うして、強いニューリトジェニック活性を有するNCAM由来ペプチドリガンドが同
定された。Igドメイン1へのIgドメイン2の結合に関係する残基に対応する、いく
つかの残基がSerで置換されたペプチドを試験した。
【０１９０】 Arg−2、Arg−6およびIle−9がSerで置換された、ペプチドP2−3Sは、刺激作
用をもたなかった。追加的にGlu−8がSerで置換された、Ig2−ペプチド、P2−4S
は、同様に、海馬細胞からの神経突起のアウトグロースに対して刺激作用をもた
なかった。こうして、これらの残基はIg2−pペプチドのニューリトジェニック作
用にとって重要である。したがって、残基Arg−192、Arg−196、Glu−198および
Ile−199はNCAM Ig2ドメインのニューリトジェニック作用にとって重要である
と考えることができる。
【０１９１】 そのうえ、海馬細胞培養物をIg2−pペプチドおよび第1Igドメインの存在下に
成長させた。Igドメイン1の添加すると、Ig2−ペプチドのニューリトジェニック
活性が減少することがことが見られた。さらに、FGFRに対する抗体、レセプター
のCAM相同ドメイン（CHD）およびホスホリパーゼC−γ（PLCγ）の特異的インヒ
ビターは、Ig2−pペプチドにより誘導された神経突起のアウトグロースを阻害す
ることが証明された。事実、Ig2−pペプチド誘導神経突起のアウトグロースを、
抗FGFRおよびCHDは阻害したが、U−73122、PLCγの阻害は完全に阻害した。これ
らのデータが示すように、Ig2−ペプチドはNCAM−FGFRシグナリング経路を通し
て神経突起のアウトグロースを刺激する。
【０１９２】 Ig1−pペプチドは、前述したように調製した海馬細胞培養物における神経突起
のアウトグロースを促進することがさらに示された。これが示すように、NCAM
Ig1結合に関係するIg1ドメインの部分に対応する配列は神経突起のアウトグロー
スを直接刺激することができる。
【０１９３】 これらの残基中の突然変異は神経突起のアウトグロースに関するIgドメイン1
−2の活性を変化させるかどうかを、さらに試験した。正常のIgドメイン1−2（I
g1−2）は、神経突起のアウトグロースに対する作用をもつとしても、わずかで
あることが見られた。二量体において、すべての潜在的結合部位はブロックされ
ているので、これは驚くべきことではない。突然変異した二重ドメインの存在下
に、海馬細胞からの神経突起の伸長は投与量従属的方法で阻害された。したがっ
て、最初の2つのIgドメイン間の結合に潜在的に関係する残基はNCAM仲介神経突
起のアウトグロースにとって重要であると、我々は結論する。
【０１９４】 実施例8．増殖 製造業者の手法に従い細胞増殖ELISA系（Amersham Life Science）において
、5−ブロモ−2'−デオキシウリジンの組込により、細胞増殖を決定した。一次
海馬ニューロンをマイクロタイタープレートの中に33000細胞／ウェルの密度で
播種した。0.8μMの濃度においてC3dの存在下に、BrdUの組込みの増加が観測さ
れ、ニューロン増殖の刺激が示された。投与量−応答曲線がベル形であり（第16
図）、こうしてより高い濃度において、C3は増殖を阻害した。
【０１９５】 また、C3は神経芽細胞腫細胞の増殖を促進した。しかしながら、増殖に対する
正味の作用は細胞の成長状態に依存する。それゆえPC12細胞において、神経突起
のアウトグロースの増加と付随的に増殖に対する阻害作用が観測され、ペプチド
はこれらの細胞の分化を刺激した。これらの結果が示すように、NCAM Ig1結合
性化合物はニューロン増殖に影響を及ぼすことがある。正味の作用は細胞の成長
状態に依存するが、適切な条件下に、増殖の刺激が生ずるであろう。
【０１９６】 実施例9．細胞の成長 細胞の成長は細胞の増殖をモニターする他の方法である。前述したように、規
定培地中で20,000〜40,000／ウェルの密度で96ウェルのマイクロタイタープレー
ト（Nunc A／S）の中に細胞を播種した。細胞を48時間成長させ、遠心して培地
を除去し、PBS中の3.7％のホルムアルデヒド中で15分間固定し、20％のメタノー
ル中の0.5％のクリスタルバイオレットで15分間染色した。染色した細胞をMilli
Q 精製水で洗浄し、次いで残留色素を50％のエタノール中の0.5Mのクエン酸
ナトリウムpH4.2で可溶化し、550nmにおいて吸収を測定した。細胞の播種直前に
0.8μMで添加したとき、C3は細胞の成長を増加することが示された。
【０１９７】 実施例10．NCAM Ig1−Ig2結合部位の構造の決定 NCAMの2つのドメインのNMRスペクトルおよびそれらの既知の三次元構造により
、2つのドメインの表面上に結合部位を形成する残基を捜し出すことが可能であ
る。15N標識化タンパク質の15N−HSQCスペクトルにおいて、ペプチドの窒素およ
びプロトンの両方を有する各アミノ酸残基についての信号を観測することができ
る。
【０１９８】 したがって、信号の化学シフトの変化の決定は、例えば、他の分子の結合によ
り、混乱されるタンパク質中の部位を捜し出す方法である。NCAMのドメイン−1
の15N標識化試料に、非標識化ドメイン−2を添加してドメイン−2中の1に対して
2の過剰にした。NCAMの15N標識化ドメイン−2を使用して、相当する実験を実施
した。各残基についての1Hおよび15Nの化学シフトの記録された変化は、それぞ
れ混乱した1Hおよび15Nの化学シフトについて、それぞれ0.04ppmおよび0.2ppmに
おけるカットオフを使用して、ドメイン−1およびドメイン−2の構造上にマッピ
ングされた。
【０１９９】 ドメイン−1において高い化学シフトの混乱を経験する残基は、Gly−12、Gly
−17、Glu−18、Ser−19、Lys−20、Phe−22、Cys−24、Arg−51、Leu−64、Ile
−66、Tyr−67、Ala−69、Ile−71、Asn−94およびLys−96であり、そしてドメ
イン−2において、残基は、Thr−131、Ile−132、Glu−173、Gly−174、Ile−17
6、Leu−177、Ala−178、Gly−180、Glu−181、Ile−182、Asn−183およびPhe−
184である。2つのドメイン中のこれらの残基についてのペプチドバックボーンの
NMR信号の化学シフトは、他のNCAMドメインの存在がこれらの部位における化学
的環境を変化することを報告し、他のNCAMドメインがこれらの付近において結合
されていることを示唆する。
【０２００】 他のドメインの添加により混乱された残基のマッピングは、これらの残基がド
メイン表面の各々上の1つの適切に定められた、密着したパッチの中に位置する
ことを非常に明瞭に示す。これが明らかに示すように、表面上の残基の2つのパ
ッチは2つのドメイン間の相互作用のための結合部位の部分であるか、あるいは
その付近に存在する。
【０２０１】 これらの試料を構造の決定に使用した、（a）H2O中の非標識化NCAMドメイン−
2、約1mM、（b）D2O中の非標識化NCAMドメイン−2、約1mM、および（c）H2O中の 15 N標識化NCAMドメイン−2、約1mM。すべての場合において、緩衝液は50mMのNaC
l、20mMのリン酸カリウムpH6.0であった。下記のスペクトルはNCAMドメイン−2
を記録し、帰属に使用した：TCSCY、それぞれ、H2OおよびD2Oの両方の中におい
て、70分の混合時間を使用した；DQFCOSY、それぞれ、H2OおよびD2Oの両方の中
において；NOESY、それぞれ、H2OおよびD2Oの両方の中において、100分または20
0分の混合時間を使用した；15N HSQC；15N TCSCY−HSQC、70分の混合時間を使
用した；および15N NOESY−HSQC、100分の混合時間を使用した。
【０２０２】 NMR実験をBruker AMX−600 MHzスペクトロメーターおよびVarian Unity I
nova 750 MHzスペクトロメーターにより実施した。すべてのスペクトルは298K
において記録した。これらのスペクトルからの1Hおよび15N共鳴線の帰属を捕捉
プログラムPRONTOにより実施した。構造の計算のために、X−PLORからの距離幾
何学／シミュレートしたアニーリングプロトコルを使用した。100の構造を計算
し、そして70の構造をX−PLORにより受け入れられ、任意の構造をNOE−違反＞0.
5Åおよび／または角度−違反＞5実施で区別した。
【０２０３】 これらの70の構造のうちで、最低のエネルギーを有する20の構造を選択してNC
AMドメイン−2の構造を表した。構造の計算において、2D−NOESYおよび15N NOE
SY−HSQCスペクトルから誘導された107 intra−、300 sequential−、145 sh
ort−range−および466 long range−NOEsを使用し、上限は2.7、3.3、4.3お
よび5Åであった。NOE拘束がメチル基を含んだとき、これらは0.5Åだけ増加し
た。DQFCOSYおよびNOESYスペクトルから誘導された3JHNHαカップリング定数が
、それぞれ、＞8 Hzまたは＜5 Hzであるとき、41φ二平面角度の拘束に、それ
ぞれ、限界−120±40°およびー57±40°を適用した。
【０２０４】 それぞれ、DQFCOSYおよびNOESYスペクトルから誘導された3JHαHβカップリン
グ定数およびNOE強度の推定値により、34のχ1を帰属させた。最終構造の計算に
おいて、78の水素結合の拘束を選択し、HN−O距離について2.1ÅおよびN−O距離
について3Åの上限を使用して計算の中にNOE拘束として適用した。プログラムPR
OCHECK＿NMRを使用して、NCAMドメイン−2の構造を検査した。MOLMOLおよびPROC
HECK＿NMRを使用して、二次構造の因子を同定した。
【０２０５】 ドメイン−1およびドメイン−2の結合の研究のために、下記の例の6つの15N
HSQCスペクトルを記録した：a) 15N標識化ドメイン−1の15N−HSQC（1mMおよび0
.5mM）；b) 15N標識化ドメイン−2の15N−HSQC（1mMおよび0.5mM）；c) 非標識
化ドメイン−2添加15N標識化ドメイン−1の15N−HSQC（比1mM：0.5mM）；d) 非
標識化ドメイン−1添加15N標識化ドメイン−2の15N−HSQC（比1mM：0.5mM）。15 N−HSQCスペクトルの化学シフトの変化に従い、ドメイン−1／ドメイン−2の滴
定を実施した。すべての試料をpH6.0および298K、50mMのNaClおよび20mMのリン
酸カリウムにおいて測定した。
【０２０６】 NMR実験をVarian Unity Inova 750 MHzスペクトロメーターにより実施し
た。スPRONTOを使用して、ペクトルの解析を実施した。ドメイン−1とドメイン
−2との間のアフィニティーを滴定実験において測定し、ここで15N標識化ドメイ
ン−2を非標識化ドメイン−1で滴定した。非標識化ドメイン−1を使用する14点
の滴定において、化学シフトの変化を10残基について測定した。これらの10残基
の各々についての結合曲線のフィッティングは、（2.5±2）×10-3Mの同一解離
定数を生じた。
【０２０７】 2つのNCAMドメインの表面上で混乱した残基のパッチの合着ならびにドメイン
−1における混乱した部位について測定した同一結合定数のすべては、結合が非
常に特異的であるが、NMR測定条件下において弱いことを示唆する。非標識化ド
メイン−1（2mM）および15N標識化ドメイン−1（1mM）の2：1混合物のアリコー
トを15N標識化ドメイン−2の1mMの溶液に添加して、滴定を実施した。このよう
にして、15N標識化ドメイン−2の濃度を1.0mMに維持し、そしてドメイン−1の濃
度を徐々に増加させた。アミノ酸分析により、タンパク質濃度を測定した。
【０２０８】 2成分の相互作用の結合曲線に対する滴定点のフィッティングをプログラムCAN
OOにより実施した。NCAMの最初の2つのドメイン（Ig1−Ig2）の二量体のモデル
を構築するために、距離幾何学／シミュレートしたアニーリング−および拘束力
学的−X−PLORからのプロトコルを使用した。拘束として、NOEから得られた拘束
およびドメイン−1および−2のカップリング定数の測定値を使用した。提案され
た分子間塩架橋を水素結合の拘束としてモデルの中に構築し、HN−O距離につい
て2.1ÅおよびN−O距離について3Åの上限を使用して計算の中にNOE拘束として
適用した。20の構造を計算し、最低のエネルギーを有するこれらの構造のうちで
10をNCAMの（Ig1−Ig2）のモデルの構築を評価するために選択した。
【０２０９】
【表１】
【表２】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 第1図は、神経細胞接着分子の異なる形態を示す。A）NCAMの主要な形態のすべ
ては、5つの免疫グロブリンドメイン（Igドメイン）および2つのフィブロネクチ
ンIII型ドメイン（FnIIIドメイン）から成る、同様な細胞外部分を有する。3つ
のトランスメンブランまたは膜結合型（NCAM−120、−140および−180）は、オ
ールタネイティブスプライシングにより発生される。さらに、種々の可溶性形態
が存在する。B）個々のNCAMドメインはN−末端（NH2）から番号を付され、大部
分のN−末端ドメインはNCAM Ig2と呼ばれる。重要なオールタネイティブスプラ
イシングされたエクソンは、NCAMのIg4ドメインをコードする領域の中に挿入す
ることができるVASEエクソンである。Ig5ドメインはポリシアル酸（PSA）でグリ
コシル化することができる。
【図２】 第2図は、ビーズ結合ペプチド結合性NCAMドメインの同定を示す。A）ビーズ結
合デカペプチドのライブラリーを組換えNCAM Ig1ドメインとインキュベートす
る。NCAM Ig1に結合するビーズを染色反応により可視化する。染色されたビー
ズを単離し、ミクロ配列決定する（実施例3および4）。B）結合性配列を評価し
た後、これらの配列に対応するペプチドをモノマー、デンドリマー（4マー）ま
たはBSA結合20マーとして合成する（実施例5）。C）ペプチドデンドリマーの構
造。4つのペプチドモノマー（「ペプチド」）を3つのリシンから成るバックボー
ンにカップリングさせる。
【図３】 第3図は、C3d（5.4×10-7M）の非存在（A）または存在（B）下に維持された単
一の海馬細胞を示す（実施例7（2））。
【図４】 第4図は、組合わせのペプチドライブラリーから同定されたペプチド配列を示
す。A）NCAM Ig1で組合わせライブラリーをスクリーニングして同定された22配
列。B）ボールドフェースで強調されたモチーフK／R−K／R−P−K／R−N／Sの部
分を含んでなるA）からのペプチド。C3ペプチドには下線が引かれている。C）ボ
ールドフェースで強調されたモチーフK／R−K／R−E−K／R−X−K／R−X−K／R
−K／Rの部分を含んでなペプチド。D）ボールドフェースで強調されたモチーフG
−X−K／R−P−K／Rの部分を含有するペプチド。D4ペプチドには下線が引かれて
いる。
【図５】 第5図は、1.07μMおよび2.15μMの濃度のC3デンドリマーの存在下に24時間培
養した後、形成した一次海馬ニューロンの凝集物の数を示す（実施例7）。形成
した凝集物の数の観測された増加は、凝集プロセスの阻害を反映する。
【図６】 第6図は、1.07μMおよび2.15μMの濃度のC3デンドリマーの存在下に24時間培
養した後、形成した一次海馬ニューロンからのニューロンプロセスの数を示す（
実施例7）。
【図７】 第7図は、NCAM Ig1結合性ペプチドを要約し、そして一次海馬ニューロンの同
時培養における神経突起のアウトグロースおよび凝集に対するそれらの作用を示
す。神経突起のアウトグロースに対する作用は、実施例7に記載するように解離
したニューロンの培養において測定した。「neur」について、0は作用なしを示
し、＋は刺激作用を示し、＋＋は神経突起のアウトグロースに対する強い刺激作
用を示す。「agg」について、0は作用なしを示し、−は阻害作用を示し、−−は
神経突起のアウトグロースに対する強い阻害作用を示し、阻害作用は形成した凝
集物の数の増加として反映される。ペプチドの名称および／または数は図面中に
示した配列のペプチドに対応する。ペプチドはすべてデンドリマーとして試験し
た。
【図８】 第8図は、ニューロンおよび繊維芽細胞の同時培養における神経突起のアウト
グロースに対するC3デンドリマーの作用を示す（実施例7）。NCAM−140発現を含
む（LBN）またはを含まない（LVN）繊維芽細胞の単層上で、一次海馬ニューロン
を成長させた。LVN繊維芽細胞単層に比較して、神経突起のアウトグロースはLBN
繊維芽細胞−単層上で増加した。この増加は0.54または5.4μMのC3dにより阻害
された。LVN単層上で、C3dは神経突起のアウトグロースを刺激した。
【図９】 第9図は、示した投与量（μM）の一次海馬ニューロンからの神経突起のアウト
グロースに対するD3およびD4デンドリマーの作用を示す。
【図１０】 第10図は、示した投与量（μM）の一次海馬ニューロンからの神経突起のアウ
トグロースに対するC3ペプチドデンドリマーの作用を示す。最長の神経突起の平
均長さ（「軸索長さ」）として、神経突起のアウトグロースを測定する。E18ラ
ットからの一次海馬ニューロンをフィブロネクチン上で21時間維持した。
【図１１】 第11図は、0.54μMの濃度の神経突起のアウトグロースに対する、C3dおよび対
照ペプチドの作用（第7図参照）。
【図１２】 第12図は、C3dにより刺激されたフィブロネクチン上で維持した一次海馬ニュ
ーロンからの神経突起のアウトグロースに対する、シグナルトランスダクション
の種々のインヒビターの作用を示す（0.54μM、実施例7 2参照）。Ver：ベラパ
ミル（10μM）、Cono：オメガ−コノトキシンGVIA（0.27μM）、ploop1：実施例
1に記載するようにピキア・パストリス（Pichia pastoris）中で製造されたNCA
M Ig1、0.54μM。
【図１３】 第13図は、C3dにより刺激されたフィブロネクチン上で維持した一次海馬ニュ
ーロンからの神経突起のアウトグロースに対する、シグナルトランスダクション
の種々のインヒビターの作用を示す（0.54μM、実施例7 2参照）。Erb：エルブ
スタチンアナローグ（0.2μM）、Pertus：百日咳トキシン（Pertussis toxin）
（1μg／ml）、CHD：PGF−R中のCAM相同ドメインに対応するペプチド（175また
は350μM）。
【図１４】 第14図は、フィブロネクチン上で維持した一次海馬ニューロンからの神経突起
のアウトグロースに対する、実施例2に記載するようにピキア・パストリス（Pic
hia pastoris）中の製造した、NCAM Ig2の作用を示す。NCAM Ig2を示した濃
度（μg／ml）で添加した（1μg／mlは0.1μMに相当する）。最長の神経突起の
平均長さ（「軸索長さ」）として、神経突起のアウトグロースを測定する。
【図１５】 第15図は、フィブロネクチン上で維持した一次海馬ニューロンからの神経突起
のアウトグロースに対する、組合わせで添加したC3dおよびNCAM Ig2の作用を示
す。
【図１６】 第16図は、実施例８に記載された、BrdUの取込みとして測定された一次海馬ニ
ューロンの増殖に対する示された濃度（μM）でのC3dの効果を示す。
【図１７】 第17図は、ヒトNCAM、140kDのイソ型前駆体の予測されたアミノ酸配列を示す
（SWISS−PROT：遺伝子座NCA1−HUMAN、受け入れ番号P13591）。
【図１８】 第18図は、NCAMの最初の2つのドメインの二量体（Ig1−Ig2）。A）二量体のリ
ボン表示。淡い灰色はIg1およびIg2中の結合部位の残基をマークする。B）NCAM
の2つの最初のドメインの空間充填モデル、NNCAMの2つの最初のドメインの二量
体、（Ig1−Ig2）。2つのドメイン中の結合部位の残基は淡い灰色である。Ig1と
Ig2との間の結合において主要な残基は、NCAM配列中のそれらの位置に対応する
番号でマークされている。C）二量体のリボン表示は、二量体構造のモデル化に
おいて使用した主要な静電的および疎水的相互作用を示す。
【図１９】 第19図は、ラット胚（E18）の解離した海馬細胞の一次培養物における凝集に
対する、ドメイン2、モノマーのIg2−ペプチドおよびその誘導体の作用。培養物
を24成長させた。化合物で処理した培養物中の凝集物の数は、対照培養物中の凝
集物の数の百分率として表されている（100±10）。4回の個々の実験を実行した
。結果を平均±SEMとして記載する。（a） Igドメイン2（Ig2）およびIg2−ペ
プチド（Ig2−p）の作用の比較、投与量−応答の研究。（b） Ig2−ペプチド（
Ig2−p）およびIg2ペプチドの作用の比較、ここでArg−2、Arg−6およびIle−9
（P2−3S）またはArg−2、Arg−6、Glu−8およびIle−9（P2−3S）をSerと置換
した。ペプチドを180μMの濃度で使用した。
【図２０】 第20図は、24時間成長させた海馬ニューロンからの神経突起のアウトグロース
に対するIgドメイン2（Ig2）およびIg2−ペプチド（Ig2−p）の作用。処理した
培養物中の神経突起の長さを、対照培養物中の神経突起の長さの百分率として表
す。4回の個々の実験を実行した。結果を平均±SEMとして記載する。
【図２１】 第21図は、24時間成長させた海馬ニューロンからの神経突起のアウトグロース
に対するIg2−ペプチド（Ig2−p）およびその誘導体（P2−3SおよびP2−4S）の
作用。処理した培養物中の神経突起の長さを、対照培養物中の神経突起の長さの
百分率として表す。4回の個々の実験を実行した。結果を平均±SEMとして記載す
る。
【図２２】 第22図は、Igドメイン2の残基191〜202を包含する3.6μMのIg2−ペプチド（デ
ンドリマー）の非存在（a）または存在（b）下に成長させた海馬から解離した細
胞の24時間の低密度培養物の位相差顕微鏡写真。
【図２３】 第23図は、海馬ニューロンからの神経突起のアウトグロースに対する、NCAMの
Igドメイン1（Ig1、25μM）、FGFR抗体（α−FGFR、1：2000に希釈した）、CAM
相同ドメインペプチド（CHD、200μM）およびU−73122、ホスホリパーゼCγのイ
ンヒビター（5μM）の作用。3.6μMのIg2−ペプチド（デンドリマー、Ig−pd）
の非存在または存在下に、培養物を成長させた。処理した培養物中の神経突起の
長さを、対照培養物中の神経突起の長さの百分率として表す。4回の個々の実験
を実行した。結果を平均±SEMとして記載する。
【図２４】 第24図は、24時間成長させた海馬ニューロンからの凝集（左、250μg／ml）お
よび神経突起のアウトグロース（右、5μg／ml）に対するIg1−ペプチド（Ig1−
p）の作用。凝集物の数および神経突起の長さを対照培養物に関して正規化して
表す。3回の個々の実験を実行した。結果を平均±SEMとして記載する。
【図２５】 第25図は、海馬ニューロンからの神経突起のアウトグロースに対するNCAMの二
重Igドメイン（Ig1−2）中の突然変異の作用。下記の突然変異をNCAM（20〜208
）の中につくった：R192A、R196AおよびE198A。対照培養物中の神経突起の長さ
の百分率として表す。5回の個々の実験を実行した。結果を平均±SEMとして記載
する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/00 Ａ６１Ｐ 1/18 1/16 3/10 1/18 9/00 3/10 9/10 9/00 13/12 9/10 15/08 13/12 21/00 15/08 25/00 21/00 25/02 25/00 25/16 25/02 25/18 25/16 25/28 25/18 43/00 １０１ 25/28 １０５ 43/00 １０１ Ｃ０７Ｋ 7/08 ＺＮＡ １０５ 14/78 Ｃ０７Ｋ 7/08 ＺＮＡ 16/42 14/78 16/46 16/42 Ｃ１２Ｐ 21/08 16/46 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 オルセン，マリアンネ デンマーク国，デーコー−4000 ロスキル デ，モセバイ ５ (71)出願人 エステルガールド，セーレン デンマーク国，デーコー−2700 ブレンシ ェイ，ボレビイバイ 21 (71)出願人 イエンセン，ペーテル ホー． デンマーク国，デーコー−1359 ケーベン ハウン，１．テーホー．，アウレフェルツ ガーデ 18アー (71)出願人 ポウルセン，フレミン エム． デンマーク国，デーコー−2000 フレデリ クスベルウ，１．テーベー．，セー．エ フ．リフスバイ 99アー (71)出願人 ソロカ，ウラジスラフ デンマーク国，デーコー−2900 ヘレル プ，１．テーベー．，トゥボルウバイ 58 (71)出願人 ラレッツ，イゴール デンマーク国，デーコー−2200 ケーベン ハウン エン，111，ネーレ アレ ８ (71)出願人 ベレジン，ウラジミール デンマーク国，デーコー−2200 ケーベン ハウン エン，１．テーホー．，ネーレブ ロガーデ 223 (72)発明者 レーン，ラルス クリスチャン ベー． デンマーク国，デーコー−2450 ケーベン ハウン エスベー，３．テーホー，レクト ルパルケン 14 (72)発明者 ボック，エリザベト デンマーク国，デーコー−2920 カルロッ テンルンド，トニスバイ 20 (72)発明者 ホルム，アルネ デンマーク国，デーコー−2942 スコドス ボルウ，２．テーベー．，スコドスボルウ パルケン 20 (72)発明者 オルセン，マリアンネ デンマーク国，デーコー−4000 ロスキル デ，モセバイ ５ (72)発明者 エステルガールド，セーレン デンマーク国，デーコー−2700 ブレンシ ェイ，ボレビイバイ 21 (72)発明者 イエンセン，ペーテル ホー． デンマーク国，デーコー−1359 ケーベン ハウン，１．テーホー．，アウレフェルツ ガーデ 18アー (72)発明者 ポウルセン，フレミン エム． デンマーク国，デーコー−2000 フレデリ クスベルウ，１．テーベー．，セー．エ フ．リフスバイ 99アー (72)発明者 ソロカ，ウラジスラフ デンマーク国，デーコー−2900 ヘレル プ，１．テーベー．，トゥボルウバイ 58 (72)発明者 ラレッツ，イゴール デンマーク国，デーコー−2200 ケーベン ハウン エン，111，ネーレ アレ ８ (72)発明者 ベレジン，ウラジミール デンマーク国，デーコー−2200 ケーベン ハウン エン，１．テーホー．，ネーレブ ロガーデ 223 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA41 CA04 DA12 EA04 GA11 4B064 AG27 CA06 CC24 DA01 4C084 AA02 AA07 AA17 BA44 CA53 CA59 DA01 NA14 ZA02 ZA15 ZA16 ZA18 ZA20 ZA36 ZA66 ZA75 ZA81 ZA94 ZB21 4C085 AA13 AA14 BB17 CC21 CC32 EE01 EE03 4H045 AA11 BA10 BA41 CA40 DA75 DA76 EA21 FA34 FA73 FA74

Claims (86)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 NCAM Ig1−Ig2ドメインに結合しかつNCAM提示細胞からの神
    経突起のアウトグロース（outgrowth）および／またはNCAM提示細胞の増殖を刺
    激または促進することができる化合物。
  2. 【請求項２】 NCAM Ig1ドメインに結合する、請求項1に記載の化合物。
  3. 【請求項３】 NCAM Ig2ドメインに結合する、請求項1に記載の化合物。
  4. 【請求項４】 Ig1ドメインにより構築されたIg1−Ig2ドメインの同種親和
    性結合部位に結合する、請求項1または2に記載の化合物。
  5. 【請求項５】 Ig2ドメインにより構築されたIg1−Ig2ドメインの同種親和
    性結合部位に結合する、請求項1または3に記載の化合物。
  6. 【請求項６】 化合物がNCAM Ig2ポリペプチドまたはそのフラグメントま
    たは模擬物である、請求項1、2または3に記載の化合物。
  7. 【請求項７】 化合物がNCAM Ig2ポリペプチドである、請求項6に記載の化
    合物。
  8. 【請求項８】 化合物がNCAM Ig2ポリペプチドのそのフラグメントまたは
    模擬物である、請求項6に記載の化合物。
  9. 【請求項９】 化合物がNCAM Ig1ポリペプチドまたはそのフラグメントま
    たは模擬物である、請求項1、2または3に記載の化合物。
  10. 【請求項１０】 化合物がNCAM Ig1ポリペプチドである、請求項9に記載の
    化合物。
  11. 【請求項１１】 化合物がNCAM Ig1ポリペプチドのそのフラグメントまた
    は模擬物である、請求項9に記載の化合物。
  12. 【請求項１２】 化合物が少なくとも2つの塩基性アミノ酸残基を含んでな
    る結合モチーフを通してNCAM Ig1ドメインに結合するポリペプチドである、請
    求項6〜8のいずれか一項に記載の化合物。
  13. 【請求項１３】 10アミノ酸残基の配列内の少なくとも2つの塩基性アミノ
    酸残基を含んでなる、請求項12に記載のペプチド。
  14. 【請求項１４】 3アミノ酸残基の配列内の少なくとも2つの塩基性アミノ酸
    残基を含んでなる、請求項13に記載のペプチド。
  15. 【請求項１５】 ペプチドが下記の配列を含んでなることを特徴とする、請
    求項6〜8または12〜14のいずれか一項に記載のペプチド： （Xaa+）m−（Xaa）p−（Xaa+）−（Xaa1）r−（Xaa+）−（Xaa）q−（Xaa+）n
    ここで Xaa+は塩基性アミノ酸残基であり、 Xaa1は任意のアミノ酸残基であり、 Xaaは任意のアミノ酸残基であり、そして m、n、p、qおよびrは独立して0または1である。
  16. 【請求項１６】 塩基性アミノ酸残基がリシン（K）またはアルギニン（R）
    である、請求項12〜15のいずれか一項に記載のペプチド。
  17. 【請求項１７】 rが1である、請求項12〜16のいずれか一項に記載のペプチ
    ド。
  18. 【請求項１８】 Xaa1がプロリン（P）またはグルタミン酸（E）である、請
    求項17に記載のペプチド。
  19. 【請求項１９】 mおよびnの少なくとも1つが1である、請求項12〜18のいず
    れか一項に記載のペプチド。
  20. 【請求項２０】 ペプチドが配列（K／R）0-1−K／R−X−K／R）を含んでな
    り、ここでXは意味Xaa1、適当にはK／R−K／R−X−K／RまたはK／R−X−K／R、
    より適当には配列K／R−P−K／R、K／R−K／R−P−K／R、K／R−K／R−E−K／R
    またはK／R−K／R−E−K／R、なおより適当には配列K−P−K、K−K−P−K、K−K
    −E−KまたはK−K−E−R、最も適当には配列A−S−K−K−P−K−R−N−I−K−A
    （配列番号1）、A−K−K−E−R−Q−R−K−D−T−Q（配列番号2）、またはA−R
    −A−L−N−W−G−A−K−P−K（配列番号3）を有する、請求項12〜19のいずれか
    一項に記載のペプチド。
  21. 【請求項２１】 ペプチドが配列A−S−K−K−P−K−R−N−I−K−A（配列
    番号1）、A−K−K−E−R−Q−R−K−D−T−Q（配列番号2）、またはA−R−A−L
    −N−W−G−A−K−P−K（配列番号3）を有する、請求項20に記載のペプチド。
  22. 【請求項２２】 アミノ酸残基の1またはそれ以上が修飾されており、例え
    ば、アセチル化されている、請求項12〜21のいずれか一項に記載のペプチド。
  23. 【請求項２３】 ペプチドがNCAM Ig2ドメインの一部分と同一である、請
    求項12〜22のいずれか一項に記載のペプチド。
  24. 【請求項２４】 ペプチドがNCAM Ig2ドメインの模擬物またはNCAM Ig2ド
    メインのフラグメントの模擬物である、請求項12〜22のいずれか一項に記載のペ
    プチド。
  25. 【請求項２５】 ペプチドがNCAM Ig1ドメイン上のNCAM Ig2結合部位に結
    合する、請求項12〜24のいずれか一項に記載のペプチド。
  26. 【請求項２６】 ペプチドがNCAM Ig1ドメイン上の結合部位に結合し、前
    記結合部位がNCAM Ig2結合部位と異なる、請求項12〜24のいずれか一項に記載
    のペプチド。
  27. 【請求項２７】 化合物がNCAM Ig2ドメインのIg1ドメインまたはそのフラ
    グメントまたはペプチド模擬物への結合を模擬する非ペプチド分子である。請求
    項6〜8のいずれか一項に記載の化合物。
  28. 【請求項２８】 化合物が抗NCAM Ig1抗体である、請求項6〜8のいずれか
    一項に記載の化合物。
  29. 【請求項２９】 抗体がモノクローナルである、請求項28に記載の抗体。
  30. 【請求項３０】 抗体がキメラであるか、あるいはヒト化されている、請求
    項28〜29のいずれか一項に記載の抗体。
  31. 【請求項３１】 化合物がペプチドであり、ここで結合モチーフが少なくと
    も2つの塩基性アミノ酸残基および少なくとも1つの無極性アミノ酸を含んでなる
    、請求項2および4のいずれか一項に記載の化合物。
  32. 【請求項３２】 結合モチーフの配列中のアミノ酸残基の数が12アミノ酸残
    基の範囲内である、請求項31に記載のペプチド。
  33. 【請求項３３】 結合モチーフの配列中のアミノ酸残基の数が8アミノ酸残
    基の範囲内である、請求項31および32のいずれか一項に記載のペプチド。
  34. 【請求項３４】 ペプチドが下記の配列を含んでなることを特徴とする、請
    求項2、4、31、32および33のいずれか一項に記載のペプチド： （Xaa+）−（Xaa）−（Xaa）−（Xaa）m−（Xaa+）−（Xaa）−（Xaa-）n− （Xaah）−（Xaa）o−（Xaah）p ここで Xaa+は塩基性アミノ酸残基であり、 Xaa-は酸性アミノ酸残基であり、 Xaahは無極性アミノ酸残基であり、 Xaaは任意のアミノ酸残基であり、そして m、n、oおよびpは独立して0または1である。
  35. 【請求項３５】 塩基性アミノ酸残基が好ましくはリシン（K）またはアル
    ギニン（R）である、請求項31〜34のいずれか一項に記載のペプチド。
  36. 【請求項３６】 酸性アミノ酸が好ましくはグルタミン酸（E）またはアス
    パラギン酸（D）であり、無極性アミノ酸が好ましくはロイシン（L）、イソロイ
    シン（I）、バリン（V）またはフェニルアラニン（F）であり、そしてrが好まし
    くは1である、請求項31〜34のいずれか一項に記載のペプチド。
  37. 【請求項３７】 ペプチドが配列（K／R）−X−X−X−（K／R）−X−（E／D
    ）−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）を含んでなり、ここでXは任意のアミノ
    酸残基、適当には配列（K／R）−X−（E／D）−（L／I／V／F）−X−（L／I／V
    ／F）、（K／R）−X−X−X−（K／R）−X−（E／D）、（K／R）−X−X−（K／R
    ）−X−（E／D）または（K／R）−X−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）、よ
    り適当には配列（K／R）−X−X−X−（K／R）−X−（E／D）−（L／I／V／F）、
    （K／R）−X−X−（K／R）−X−（E／D）−（L／I／V／F）または（K／R）−X−
    X−X−（K／R）−X−（L／I／V／F）、なおより適当には配列（K／R）−X−X−
    （K／R）−X−（E／D）−（L／I／V／F）、（K／R）−X−X−X−（K／R）−X−
    （L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）または（K／R）−X−X−X−（K／R）−X−
    （E／D）−（L／I／V／F）−（L／I／V／F）、最も適当には配列GRILARGEINFK（
    配列番号23）である、請求項31〜36のいずれか一項に記載のペプチド。
  38. 【請求項３８】 ペプチドがGRILARGEINFK（配列番号23）である、請求項37
    に記載のペプチド。
  39. 【請求項３９】 アミノ酸残基の1またはそれ以上が修飾されており、例え
    ば、アセチル化されている、請求項31〜38のいずれか一項に記載のペプチド。
  40. 【請求項４０】 ペプチドがIg2ドメインにより構築されたNCAM Ig1−Ig2
    ドメインの同種親和性結合部位の部分の模擬物またはフラグメントであるか、あ
    るいは前記部分と同一である、請求項31〜39のいずれか一項に記載のペプチド。
  41. 【請求項４１】 請求項2および4のいずれか一項に記載の非ペプチド。
  42. 【請求項４２】 化合物がIg1ドメインに対する抗体である、請求項4に記載
    の化合物。
  43. 【請求項４３】 抗体がモノクローナルである、請求項42に記載の抗体。
  44. 【請求項４４】 抗体がキメラであるか、あるいはヒト化されている、請求
    項42〜43のいずれか一項に記載の抗体。
  45. 【請求項４５】 化合物がペプチドであり、ここで結合モチーフが少なくと
    も2つの酸性アミノ酸残基および少なくとも1つの無極性アミノ酸を含んでなる、
    請求項3および5のいずれか一項に記載の化合物。
  46. 【請求項４６】 結合モチーフの配列中のアミノ酸残基の数が12アミノ酸残
    基の範囲内である、請求項45に記載のペプチド。
  47. 【請求項４７】 結合モチーフの配列中のアミノ酸残基の数が9アミノ酸残
    基の範囲内である、請求項46に記載のペプチド。
  48. 【請求項４８】 ペプチドが下記の配列を含んでなることを特徴とする、請
    求項3、5、45、46および47のいずれか一項に記載のペプチド： （Xaa-）−（Xaa）−（Xaa）−（Xaa）m−（Xaa+）n−（Xaa-）−（Xaa-）− （Xaah）−（Xaah）p ここで Xaa+は塩基性アミノ酸残基であり、 Xaa-は酸性アミノ酸残基であり、 Xaahは無極性アミノ酸残基であり、 Xaaは任意のアミノ酸残基であり、そして m、n、oおよびpは独立して0または1である。
  49. 【請求項４９】 塩基性アミノ酸残基が好ましくはリシン（K）またはアル
    ギニン（R）である、請求項45〜48のいずれか一項に記載のペプチド。
  50. 【請求項５０】 酸性アミノ酸が好ましくはグルタミン酸（E）またはアス
    パラギン酸（D）であり、無極性アミノ酸が好ましくはロイシン（L）、イソロイ
    シン（I）、バリン（V）またはフェニルアラニン（F）であり、そしてrが好まし
    くは1である、請求項31〜34のいずれか一項に記載のペプチド。
  51. 【請求項５１】 ペプチドが配列（E／D）−X−X−X−（E／D）−X−（K／R
    ）−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）を含んでなり、ここでXは任意のアミノ
    酸残基、適当には配列（E／D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）−X−（L／I／V
    ／F）、（E／D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）−（L／I／V／F）、（E／D）−
    X−X−X−X−（E／D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）、（E／D）−X−X−X−（
    E／D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）または（E／D）−X−X−（E／D）−X−（
    K／R）−（L／I／V／F）、より適当には配列（E／D）−X−X−（E／D）−X−（K
    ／R）−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）または（E／D）−X−X−（E／D）−
    X−（K／R）−（L／I／V／F）−（L／I／V／F）、なおより適当には配列（E／D
    ）−X−X−X−X−（E／D）−X−（L／I／V／F）−（L／I／V／F）、（E／D）−X
    −X−X−（E／D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）−X−（L／I／V／F）、または
    （E／D）−X−X−X−（E／D）−X−（K／R）−（L／I／V／F）−（L／I／V／F）
    、最も適当には配列GEJSVGESKFFL（配列番号26）である、請求項45〜50のいずれ
    か一項に記載のペプチド。
  52. 【請求項５２】 ペプチドがGEJSVGESKFFL（配列番号26）である、請求項51
    に記載のペプチド。
  53. 【請求項５３】 アミノ酸残基の1またはそれ以上が修飾されており、例え
    ば、アセチル化されている、請求項45〜52のいずれか一項に記載のペプチド。
  54. 【請求項５４】 ペプチドがIg1ドメインにより構築されたNCAM Ig1−Ig2
    ドメインの同種親和性結合部位の部分の模擬物またはフラグメントであるか、あ
    るいは前記部分と同一である、請求項45〜53のいずれか一項に記載のペプチド。
  55. 【請求項５５】 請求項3および5のいずれか一項に記載の非ペプチド。
  56. 【請求項５６】 化合物がIg2ドメインに対する抗体である、請求項3および
    5のいずれか一項に記載の化合物。
  57. 【請求項５７】 抗体がモノクローナルである、請求項56に記載の抗体。
  58. 【請求項５８】 抗体がキメラであるか、あるいはヒト化されている、請求
    項56〜57のいずれか一項に記載の抗体。
  59. 【請求項５９】 正常の、変性したまたは損傷したNCAM提示細胞の処置にお
    いて使用するための請求項1〜58のいずれか一項に記載の化合物またはそのフラ
    グメントまたはその模擬物。
  60. 【請求項６０】 NCAM提示細胞からのアウトグロースおよび／またはNCAM提
    示細胞の増殖を刺激することから成る、処置において使用するための、請求項1
    〜58のいずれか一項に記載の化合物。
  61. 【請求項６１】 処置が中枢神経系または末梢神経系、筋肉または種々の器
    官の疾患または症状の処置である、請求項59〜60のいずれか一項に記載の処置に
    おいて使用するための請求項1〜60のいずれか一項に記載の化合物。
  62. 【請求項６２】 処置が中枢神経系または末梢神経系の疾患または症状、例
    えば、術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成の障害、虚血後の損
    傷、例えば、卒中から生ずる損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、痴呆、
    例えば、多梗塞性痴呆、硬化症、真性糖尿病に関連する神経変性、概日時計また
    は神経−筋肉伝達に影響を与える疾患、および精神分裂病の処置である、請求項
    61に記載の処置において使用するための請求項1〜61のいずれか一項に記載の化
    合物。
  63. 【請求項６３】 処置が神経−筋肉接続の機能障害を伴う症状を包含する筋
    肉の疾患、例えば、遺伝的または外傷的萎縮性筋肉障害の処置である、請求項61
    に記載の処置において使用するための請求項1〜62のいずれか一項に記載の化合
    物。
  64. 【請求項６４】 処置が種々の器官の疾患、例えば、生殖腺、膵臓の変性的
    症状、例えば、I型またはII型の真性糖尿病、腎臓の変性的症状、例えば、ネフ
    ローゼおよび心臓、肝臓および腸の変性的症状の処置である、請求項61に記載の
    処置において使用するための請求項1〜62のいずれか一項に記載の化合物。
  65. 【請求項６５】 処置が学習および／または記憶する能力の刺激である、請
    求項59〜60のいずれか一項に記載の処置において使用するための請求項1〜62の
    いずれか一項に記載の化合物。
  66. 【請求項６６】 正常の、変性されたまたは損傷したNCAM提示細胞を処置す
    る薬剤の製造における、請求項1〜58のいずれか一項に記載の化合物の使用。
  67. 【請求項６７】 処置がNCAM提示細胞からの神経突起のアウトグロースおよ
    び／またはNCAM提示細胞の増殖を刺激することである、請求項66に記載の使用。
  68. 【請求項６８】 薬剤が中枢神経系または末梢神経系の疾患または症状、例
    えば、術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成の障害、虚血後の損
    傷、例えば、卒中から生ずる損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、痴呆、
    例えば、多梗塞性痴呆、硬化症、真性糖尿病に関連する神経変性、概日時計また
    は神経−筋肉伝達に影響を与える疾患、および精神分裂病の処置のため；神経−
    筋肉接続の機能障害を伴う症状を包含する筋肉の疾患または症状、例えば、遺伝
    的または外傷的萎縮性筋肉障害の処置のため；種々の器官の疾患または症状、例
    えば、生殖腺、膵臓の変性的症状、例えば、I型またはII型の真性糖尿病、腎臓
    の変性的症状、例えば、ネフローゼおよび心臓、肝臓および腸の変性的症状の処
    置ための薬剤である、請求項66〜67のいずれか一項に記載の使用。
  69. 【請求項６９】 薬剤が学習および／または記憶する能力を刺激する薬剤で
    ある、請求項66〜67のいずれか一項に記載の使用。
  70. 【請求項７０】 請求項1〜58のいずれか一項に記載の1またはそれ以上の化
    合物を含んでなる医薬組成物。
  71. 【請求項７１】 化合物がNCAM Ig1ペプチドまたはそのフラグメントまた
    は模擬物である、請求項70に記載の組成物。
  72. 【請求項７２】 化合物がNCAM Ig2ペプチドまたはそのフラグメントまた
    は模擬物である、請求項70に記載の組成物。
  73. 【請求項７３】 ペプチドがマルティマーとして処方されている、請求項70
    〜72のいずれか一項に記載の組成物。
  74. 【請求項７４】 ペプチドがデンドリマー、例えば、リシンに連鎖したまた
    はタンパク質担体、例えば、BSAにカップリングした4つのペプチドとして処方さ
    れていることを特徴とする、請求項70〜73のいずれか一項に記載の組成物。
  75. 【請求項７５】 有効量の請求項1〜58のいずれか一項に記載の1またはそれ
    以上のペプチドまたは請求項70〜74のいずれか一項に記載の医薬組成物をin vi
    troまたはin vivoで投与することを特徴とする、正常の、変性されたまたは損
    傷したNCAM提示細胞をin vitroまたはin vivoで処置する方法。
  76. 【請求項７６】 処置がNCAM提示細胞からの神経突起のアウトグロースおよ
    び／またはNCAM提示細胞の増殖を刺激することである、請求項75に記載の方法。
  77. 【請求項７７】 処置が中枢神経系または末梢神経系の疾患または症状、例
    えば、術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成の障害、虚血後の損
    傷、例えば、卒中から生ずる損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、痴呆、
    例えば、多梗塞性痴呆、硬化症、真性糖尿病に関連する神経変性、概日時計また
    は神経−筋肉伝達に影響を与える疾患、および精神分裂病；神経−筋肉接続の機
    能障害を伴う症状を包含する筋肉の疾患または症状、例えば、遺伝的または外傷
    的萎縮性筋肉障害；器官の疾患または症状、例えば、生殖腺、膵臓の変性的症状
    、例えば、I型またはII型の真性糖尿病、腎臓の変性的症状、例えば、ネフロー
    ゼおよび心臓、肝臓および腸の変性的症状；のin vivo処置である、請求項75〜
    76のいずれか一項に記載の方法。
  78. 【請求項７８】 処置が神経の再生に導く、請求項75〜76のいずれか一項に
    記載の方法。
  79. 【請求項７９】 化合物を人工装置と組合わせて使用する、請求項78に記載
    の方法。
  80. 【請求項８０】 装置が人工神経ガイドである、請求項79に記載の方法。
  81. 【請求項８１】 請求項1〜58のいずれか一項に記載の1またはそれ以上の化
    合物または請求項71〜74のいずれか一項に記載の組成物を含んでなることを特徴
    とする、人工神経ガイド。
  82. 【請求項８２】 有効量の請求項1〜58のいずれか一項に記載の1またはそれ
    以上の化合物または請求項71〜74のいずれか一項に記載の組成物を被検体に投与
    することを特徴とする、被検体における学習および／または記憶の能力を刺激す
    る方法。
  83. 【請求項８３】 有効量の請求項1〜58のいずれか一項に記載の1またはそれ
    以上の化合物または請求項70〜74のいずれか一項に記載の組成物と、1またはそ
    れ以上の薬学上許容される添加剤または担体とを含んでなる、中枢神経系または
    末梢神経系、筋肉または種々の器官の疾患および症状を処置するための薬剤。
  84. 【請求項８４】 経口的、経皮的、筋肉内、頭蓋内、心室内、鼻内または肺
    内に投与するように処方された、請求項83に記載の薬剤。
  85. 【請求項８５】 有効量の請求項1〜58のいずれか一項に記載の1またはそれ
    以上の化合物または請求項70〜74のいずれか一項に記載の組成物と、1またはそ
    れ以上の薬学上許容される添加剤または担体とを含んでなる、被検体における学
    習および／または記憶の刺激において使用するための医薬組成物。
  86. 【請求項８６】 経口的、経皮的、筋肉内、頭蓋内、心室内、鼻内または肺
    内に投与するように処方された、請求項85に記載の薬剤。
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