JP2005510463A6 - 細胞の分化、増殖、再生、可塑性及び生存に影響を及ぼすことができる化合物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、神経細胞接着分子(NCAM)の第3免疫グロブリン(Ig3)モジュール、及び/又は第4免疫グロブリン(Ig4)モジュール、及び/又は第1フィブロネクチンIII (Fn3,1)モジュール、及び/又は第2フィブロネクチンIII (Fn3,2)モジュール、もしくは、その断片、もしくはその変異体を含んで成り、繊維芽細胞増殖因子(FGF)レセプター及び/もしくはアデノシン三リン酸(ATP)及び/もしくはL1と相互作用することができ、従って、細胞の分化を誘導し、増殖を調節し、再生、ニューロンの可塑性及び/又は生存を刺激することができる化合物に関連する。更に、本発明は前記化合物を含んで成る医薬組成物、医薬組成物を生産する方法及び前記化合物の使用に関連する。
Description
本発明は、繊維芽細胞増殖因子(FGF)レセプター及び/又はアデノシン三リン酸(ATP)及び/又はL1と相互作用することができる、神経細胞接着分子(NCAM)の第3免疫グロブリン(Ig3)モジュール、及び/又は第4免疫グロブリン(Ig4)モジュール、及び/又は第5免疫グロブリン(Ig5)モジュール、及び/又は第1フィブロネクチンIII (Fn3,1)モジュール、及び/又は第2フィブロネクチンIII (Fn3,2)モジュール、もしくはその断片、もしくは変異体を含んで成る化合物であって、従って、当該化合物は細胞の分化を誘導し、増殖を調節し、再生、ニューロンの可塑性及び/もしくは生存を刺激することができる化合物に関連する。更に、本発明は前記化合物を含んで成る医薬組成物、医薬組成物を生産する方法及び前記化合物の使用に関連する。
発明の背景
細胞接着分子(CAM)は、細胞間の接着に介在するタンパク質の群を構成する。CAMの主要な群は、免疫グロブリンドメインの存在を特徴とする免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーに属する。神経細胞接着分子(NCAM)は、例えば神経系において特に豊富であるIgスーパーファミリーの細胞接着分子である。NCAMは神経細胞の外膜上で発現している。ある細胞上のNCAM分子が他の細胞上のNCAM分子に対して結合する場合(同種親和性結合)、3つの細胞間での結合がより強められる。NCAMは、NCAMに対してのみ結合するのではなく、神経細胞上もしくは細胞外マトリクスにおいて発見されるタンパク質及び/もしくは複合糖質に対しても結合する(異好性結合)。NCAMはATPにも結合する。NCAM相互作用は細胞の移動、神経突起の伸長、神経突起の繊維束収縮、細胞増殖、細胞生存、及びシナプスの形成に影響を与える。
細胞接着分子(CAM)は、細胞間の接着に介在するタンパク質の群を構成する。CAMの主要な群は、免疫グロブリンドメインの存在を特徴とする免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーに属する。神経細胞接着分子(NCAM)は、例えば神経系において特に豊富であるIgスーパーファミリーの細胞接着分子である。NCAMは神経細胞の外膜上で発現している。ある細胞上のNCAM分子が他の細胞上のNCAM分子に対して結合する場合(同種親和性結合)、3つの細胞間での結合がより強められる。NCAMは、NCAMに対してのみ結合するのではなく、神経細胞上もしくは細胞外マトリクスにおいて発見されるタンパク質及び/もしくは複合糖質に対しても結合する(異好性結合)。NCAMはATPにも結合する。NCAM相互作用は細胞の移動、神経突起の伸長、神経突起の繊維束収縮、細胞増殖、細胞生存、及びシナプスの形成に影響を与える。
NCAMは、25個以上のエキソンを含む単一の遺伝子によってコードされている。前駆体mRNAの選択的スプライシングにより、様々な成熟mRNA種及びそれによるNCAMのタンパク質イソ型が生産されて良い。3つの主要なNCAMイソ型は、NCAMが原形質膜に対して結合する方法及び細胞内NCAMドメインのサイズをそれぞれ決定するエキソン15と18の選択適スプライシングによって生み出されている。神経系において、グリコシルスルファチジルイノシトール(GPI)が係留した120kDaのイソ型は、グリア細胞の表層で発現しており、膜貫通型の140kDaのイソ型はニューロンとグリア細胞の両方で発現しており、その一方で膜貫通型の180kDaのイソ型は主にニューロンの表層上で発見されている。NCAMの細胞外部分は、5つのIg様相同モジュール(Ig1、Ig2、Ig3、Ig4とIg5)及び2つのIII 型フィブロネクチンモジュール(F3,1とF3,2)を含んで成る(Berezinら、2000)。
NCAMの異好性リガンドは、様々なヘパラン硫酸プロテオグリカン(アグリンなど)及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ニューロカンなど)を含んで成る。NCAMのIg1とIg2は、おそらくNCAMとヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用の構造決定因子であり、その理由は、これら2つのモジュールがヘパリンを結合することが示されている(Kiselvoyら1997)からである。コアタンパク質又は炭水化物の部分が、NCAMに対するプロテオグリカンの結合を担うことが矛盾しているかどうか、そしてNCAMが介在する細胞機能に対するこの相互作用の寄与は現在も理解されていないことに関する報告(Retzlerら、1996)がある。NCAMとL1との相互作用は、L1によって担持されるN結合オリゴマンノシジルグリカン並びにNCAMの4つのIgモジュール中に局在するレクチン様結合部位が介在していることが示されている。この結合を通じて、NCAMは、2つの神経CAM同士の協力作用の注目の例を提示するいわゆる補助的L1−L1相同相互作用に参加することが示唆されている(Horstkortsら1993)。
3つの異なるモデルの同種親和性結合が示唆されており、それは:1)2つの対立する分子の第3Ig様モジュール(Raoら、1992)同士の結合;2)逆平行相互作用におけるIg様モジュール全5つの関与(Ranheimら、1996);並びに3)第1Ig様モジュールと第2Ig様モジュールの相互結合(Kiselvyovら、1997)である。後者のモデルは最近、核磁気共鳴(NMR)解析(Jensenら、1999)及びX線結晶解析によって確認された(Kasperら、2000)。
NCAMは、神経系及び器官の例えば、腎臓、腸、心臓、性腺、すい臓、及び筋肉が生長する間の重要な役割をする。成熟神経系において、NCAMは、再生、学習及び記憶に関連する神経連絡の可塑性のために重要である。末梢神経系において、NCAMは、神経線維の伸長及び外傷など傷害後の再生にける神経−筋連絡の形成に関わる。
シグナル伝達において、NCAMは、例えば、FGFレセプターなどのチロシンリン酸化、及び細胞外カルシウム濃度増加につながる細胞外シグナルを変換する。
DohertyとWalsh(1999)は、NCAM、Nカドヘリン及びL1がニューロン中の繊維芽細胞増殖因子(FGFR)を活性化することによって軸索の生長を刺激することを記載している。
NCAMを提示する細胞からの分化及び/又は神経突起生長を刺激することができるNCAM結合化合物はWO00/18801に記載されており、ここで当該化合物は、NCAM提示細胞の再生のための治療において用いられている。
かかる1つの化合物C3の同定は、Ronnら(1999)によって記載されている。C3は、同種親和性NCAM結合によって活性化されるシグナル伝達経路と同一の経路を活性化することによって、伸長を刺激するが、FGFレセプターに対して直接結合することはない。
様々な因子により神経細胞死が生じうる。神経細胞死を生じる危険因子にさらされている個体において神経細胞死を予防することは、細胞の生存を維持する/刺激するもしくは促すことと呼ばれて良く、又は神経防護作用と呼ばれうる。
神経細胞が、例えば、還元酸素の供給などによって傷害された場合、細胞死の過程がスタートし、そして細胞の機能障害、細胞同士の細胞間連絡(ネットワーク)の「崩壊」、細胞が後退する過程及び最終的には細胞死につながる。神経細胞死を予防すること、即ち、生存を刺激/促進することとは、細胞が細胞死の過程の開始から保護されることを意味する。
神経細胞の生存は、いくつかの参考文献中で議論されてきた。例えば、Hullyら(1998)は、L1神経細胞接着分子は、毒素MPP+の存在下で培養された胎児中脳ドーパミン作用性神経細胞の生存及び分化を刺激できることを開示している。
米国特許第6,037,320号は、神経栄養因子、NT−4の同定を記載しており、そして米国特許第5,767,240号中では、脊髄神経細胞、大脳皮質細胞及び海馬神経細胞の生存を高めることができる活性依存性神経栄養因子が明らかになっている。
更に、米国特許第5,567,682号は、短鎖ペプチドを鼻腔内投与することによってアルツハイマー病の症状を治療する方法に関連する。前記ペプチドは、進行性の神経細胞変性を減らすかあるいは中断せしめることによって神経生存を促す。
NCAMは、外アデノシン三リン酸アーゼ(ATPase)活性を有することが最近証明された(Dzhandzhugazyan及びBock、1993及び1997)。ATPにおけるこの活性の役割は、神経系中で最も豊富な神経伝達物質の1つである。最近の研究で、ATPはNCAMが誘導した神経突起生長を調節することが示されており、このことは、ATPが推定NCAM−FGFレセプターシグナル伝達経路の調節因子でありうることを示唆している(Skladchikovaら、1999)。
しかし、本発明者は、神経細胞接着分子(NCAM)第3免疫グロブリン(Ig3)モジュール、及び/もしくは第4免疫グロブリン(Ig4)モジュール、及び/もしくは第5免疫グロブリン(Ig5)モジュール、並びに/又は第1フィブロネクチンIII (Fn3,1)モジュール、及び/もしくは第2フィブロネクチンIII (Fn3,2)モジュール、もしくは、その断片、もしくは変異体を含んで成る化合物は、繊維芽細胞増殖因子(FGF)レセプター及び/もしくはアデノシン三リン酸(ATP)及び/もしくはL1との相互作用を通じて、細胞の分化の誘導、増殖の調節、再生、ニューロンの可塑性及び/もしくは生存を刺激することができるという、驚くべきことを発見している。
発明の概要
本発明は、神経細胞接着分子(NCAM)の第3免疫グロブリン(Ig3)モジュール、及び/もしくは第4免疫グロブリン(Ig4)モジュール、及び/もしくは第5免疫グロブリン(Ig5)モジュール、及び/もしくは第1フィブロネクチンIII (Fn3,1)モジュール、及び/もしくは第2フィブロネクチンIII (Fn3,2)モジュール、もしくは、その断片、もしくは変異体を含んで成り、繊維芽細胞増殖因子(FGF)レセプター及び/もしくはアデノシン三リン酸(ATP)及び/もしくはL1と相互作用できる化合物に関する。本発明の背景において、第1フィブロネクチンIII モジュール及び第2フィブロネクチンIII モジュールは、「Fn3,1及びFn3,2」もしくは「FnIII ,1及びFnIII ,2」もしくは「Fn3,1及びFn3,2」に等しい。
本発明は、神経細胞接着分子(NCAM)の第3免疫グロブリン(Ig3)モジュール、及び/もしくは第4免疫グロブリン(Ig4)モジュール、及び/もしくは第5免疫グロブリン(Ig5)モジュール、及び/もしくは第1フィブロネクチンIII (Fn3,1)モジュール、及び/もしくは第2フィブロネクチンIII (Fn3,2)モジュール、もしくは、その断片、もしくは変異体を含んで成り、繊維芽細胞増殖因子(FGF)レセプター及び/もしくはアデノシン三リン酸(ATP)及び/もしくはL1と相互作用できる化合物に関する。本発明の背景において、第1フィブロネクチンIII モジュール及び第2フィブロネクチンIII モジュールは、「Fn3,1及びFn3,2」もしくは「FnIII ,1及びFnIII ,2」もしくは「Fn3,1及びFn3,2」に等しい。
更なる観点において、本発明は、神経細胞接着分子(NCAM)の第4免疫グロブリン(Ig4)モジュール、及び/もしくは第5免疫グロブリン(Ig5)モジュール、及び/もしくは第1フィブロネクチンIII (Fn3,1)モジュール、及び/もしくは第2フィブロネクチンIII (Fn3,2)モジュール、もしくは、その断片、もしくは変異体を含んで成り、FGFレセプター及び/もしくはアデノシン三リン酸(ATP)及び/もしくはL1と相互作用することができる化合物に関する。
本発明の化合物は、FGFレセプターを提示する細胞及び/又はNCAMリガンド提示細胞の分化を誘導すること、増殖を調節すること、再生、ニューロンの可塑性及び生存を刺激することができる。
更に、本発明は、本発明の化合物を1つ以上含んで成る医薬組成物、及びかかる医薬組成物を生産する方法を開示する。そしてまた、本発明の化合物の使用並びに当該化合物により疾患及び症状を治療することは本発明の範囲内である。
発明の詳細な説明
本発明の化合物は、細胞の分化の誘導、増殖の調節、再生、ニューロンの可塑性及び/もしくは生存の刺激に関連する。
本発明の化合物は、細胞の分化の誘導、増殖の調節、再生、ニューロンの可塑性及び/もしくは生存の刺激に関連する。
用語、FGLペプチドとは、NCAMのFGループペプチドを意味し、それは配列番号1に対応するNCAMのFGFレセプター結合部位である。
用語「調節」とは、変化、例えば、阻害又は刺激のいずれかを意味する。
本発明の背景において、用語「相互作用」とは、本発明の化合物とFGFレセプター間での直接的又は間接的な接触、好適には直接的な相互作用を意味する。用語「直接相互作用」とは、当該化合物がレセプターに対して直接結合することを意味する。
用語「FGFレセプターを提示する細胞」とは、FGFレセプターを細胞の外膜上で発現する細胞を意味し、これらの細胞としては、例えば、ニューロン、グリア細胞、全種類の筋細胞、神経分泌細胞、性腺細胞及び腎細胞、内皮細胞及び繊維芽細胞が挙げられる。
用語「NCAMリガンドを提示する細胞」とは、NCAM及び/もしくはNCAMの一部が結合しうるレセプターもしくはリガンド(即ち、いわゆるカウンターレセプター)を発現する細胞を意味する。NCAMリガンドの例は、FGF(繊維芽細胞増殖因子)レセプター、L1もしくは複合糖質もしくはグルコースアミノグリカン、例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカン及びATPである。
本発明の背景において、用語「生存の刺激/促進」とは、用語「細胞死を予防すること」もしくは「神経防護」と同義語で使用されている。生存を刺激/促進することによって、疾患を予防すること又は変性性の疾患を患う個体の神経系の更なる変性を予防することが可能である。
「生存」とは、細胞が外害を受けており、そしてもし本発明の化合物が当該細胞の変性を予防するために用いられなければ、通常の条件下で死ぬ可能性が非常に高く、従って、前記傷害を受けた細胞の生存を促進するかあるいは刺激する方法を意味する。
「ニューロンの可塑性」とは神経連絡の再構築をする機能を意味する。
末梢神経細胞は、様々な障害を受けた後それらの標的との機能的連絡を再生及び再構築する可能性がある程度はある。しかし、機能の回復は殆ど全く稀であり、そして末梢神経細胞の傷害は多くの問題を残す。中枢神経系においては、再生の可能性は更に限定されている。従って、末梢神経系及び中枢神経系の神経細胞死を予防する能力を有する物質を同定することは有意であり且つ商業的価値がある。
従って、本発明は神経細胞接着分子(NCAM)の第3免疫グロブリン(Ig3)モジュール、及び/又は第4免疫グロブリン(Ig4)モジュール、及び/又は第5免疫グロブリン(Ig5)モジュール、及び/又は第1フィブロネクチンIII (Fn3,1)モジュールを、及び/又は第2フィブロネクチンIII (Fn3,2)モジュール、もしくはその断片、もしくは変異体を含んで成る化合物は、繊維芽細胞増殖因子(FGF)レセプター及びもしくはアデノシン三リン酸(ATP)及び/もしくはL1と相互作用できるという発見に関連する。
本発明の背景において、NCAM分子とはデータベースSWISSPROT、アクセスNo.:P13591に示されている配列を有するNCAMを意味する。
この配列中、本明細書中に記載の前記ドメインの位置は以下の通りに記載されている。
Ig3:203〜308
Ig4:309〜404
Ig5:405〜500
F3,1:501〜601
F3,2:602〜695
Ig3:203〜308
Ig4:309〜404
Ig5:405〜500
F3,1:501〜601
F3,2:602〜695
本発明は更に、神経細胞接着分子(NCAM)の第4免疫グロブリン(Ig4)モジュール、及び/又は第5免疫グロブリン(Ig5)モジュール、及び/又は第1フィブロネクチンIII (Fn3,1)モジュール、及び/又は第2フィブロネクチンIII (Fn3,2)モジュール、もしくはその断片、もしくは変異体を含んで成る化合物はFGFレセプター及び/もしくはアデノシン三リン酸(ATP)及び/もしくはL1と相互作用することができること、例えば、神経細胞接着分子(NCAM)の第4免疫グロブリン(Ig4)モジュール、及び/又は第1フィブロネクチンIII (Fn3,1)モジュール、及び/又は第2フィブロネクチンIII (Fn3,2)モジュール、もしくはその断片、もしくはその変異体を含んで成る化合物がFGFレセプター及び/もしくはアデノシン三リン酸(ATP)及び/もしくはL1と相互作用することができること、又は例えば、神経細胞接着分子(NCAM)の第5免疫グロブリン(Ig5)モジュール、及び/又は第1フィブロネクチンIII (Fn3,1)モジュール、及び/又は第2フィブロネクチンIII (Fn3,2)モジュール、もしくはその断片、もしくは変異体を含んで成る化合物がFGFレセプター及び/又はアデノシン三リン酸(ATP)及び/もしくはL1と相互作用することができること、例えば、神経細胞接着分子(NCAM)の第1フィブロネクチンIII (Fn3,1)モジュール、及び/又は第2フィブロネクチンIII (Fn3,2)モジュール、もしくはその断片、もしくは変異体を含んで成る化合物がFGFレセプター及び/もしくはアデノシン三リン酸(ATP)及び/もしくはL1と相互作用することができるという発見に関連する。
本発明の背景において、「その断片」とは、FGF−レセプター及び/もしくはATP及び/もしくはL1と相互作用することができるNCAM分子の任意の部分であるものと解され、そして前記結合を通じて、細胞の増殖を調節し、そして/又は分化を誘導し、そして/もしくは再生、ニューロンの可塑性及び/もしくは生存を刺激する。「その変異体」とは、FGFレセプター及び/もしくはATP及び/もしくはL1と相互作用することができる任意のペプチド配列であるとして解され、そして前記結合により、細胞の分化を誘導し、増殖を調節し、そして/又は分化を誘導し、再生、ニューロンの可塑性及び/もしくは生存を刺激する。従って、断片又は変異体は以下のように規定されて良い。
i)抗体により認識されることができ、そして所定のNCAMアミノ酸配列をも認識することができるアミノ酸配列を含んで成る断片/変異体、及び/又は、
ii)レセプター部分に対して結合することができ、そして所定のNCAMアミノ酸配列をも結合することができるアミノ酸配列を含んで成る断片/変異体、及び/又は
iii )前記所定のアミノ酸配列のように、FGFレセプター及び/もしくはATP及び/もしくはL1の少なくとも1つに対して少なくとも実質的に類似する結合親和性を有する断片/変異体
である。
i)抗体により認識されることができ、そして所定のNCAMアミノ酸配列をも認識することができるアミノ酸配列を含んで成る断片/変異体、及び/又は、
ii)レセプター部分に対して結合することができ、そして所定のNCAMアミノ酸配列をも結合することができるアミノ酸配列を含んで成る断片/変異体、及び/又は
iii )前記所定のアミノ酸配列のように、FGFレセプター及び/もしくはATP及び/もしくはL1の少なくとも1つに対して少なくとも実質的に類似する結合親和性を有する断片/変異体
である。
本発明の背景において、用語「機能的同等物」とは、先に規定した変異体を意味する。
本発明の化合物の結合親和性は、NCAM及び/又はNCAMがリガンドに対して、好適に、10-3〜10-10Mの範囲、例えば、好適に、10-4〜10-8Mの範囲の結合親和性(Kd値)を有する。本発明によれば、前記結合親和性は、以下の、表層プラズモン共鳴解析又は核磁気共鳴スペクトロスコピーのアッセイのうちの1つによって決定されている。
本発明の背景において、上記のNCAMドメインの変異体とは、FGFレセプターもしくはNCAMリガンド、及び/もしくはL1を提示する全ての細胞と相互作用する全ての化合物であるものとして解されており、そして前記相互作用を通じてFGFレセプター提示細胞の増殖を調節し、そして/もしくは分化を誘導し、再生、ニューロンの可塑性及び/もしくは生存を刺激する、即ち、機能的変異体であるものと解されている。変異体は、ペプチド、ペプチド誘導体、抗体及び非ペプチド化合物、例えば、小有機化合物の、糖及び脂質、並びに模倣ペプチドでありうる。好適な実施態様において、前記変異体は先に論じたようなペプチドである。
ある実施態様において、変異体とは、好適な所定の配列とは、挿入、欠失及び置換の数と範囲が次第に異なっていき、保存的置換などが増えるアミノ酸配列を示すものと解されて良い。この差は、所定の配列と変異体との相同性の低下として測定されている。
ペプチドは、例えば、1又は数個のアミノ酸残基の置換によって修飾されて良い。L−アミノ酸とD−アミノ酸の両方が使用されて良い。他の修飾は、例えば、エステル、糖などの誘導体を含んで成る。例としては、メチルエステル及びアセチルエステルがある。重合化、例えば、反復配列又は様々な担体に対する結合は当業界で周知あり、例えば、リジン骨格の、4ペプチド、8ペプチド、16ペプチド、又は32ペプチドを担持するリジンデンドリマーが挙げられる。他の担体は、タンパク質部分、例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)、もしくは脂肪親和性デンドリマー、もしくは、脂肪親和性誘導体によって形成されたミセル様担体、もしくは星状(星様)共役炭素鎖ポリマーでありうる。
本発明の断片の変異体は、同変異体内もしくはその断片内又は異なる複数の変異体内もしくはその断片内に、1つ以上の置換、例えば、独立してかあるいは互いに導入された複数の置換を含んで成りうる。従って、複合体の変異体又はその断片は、互いに独立して保存的置換を含んで成って良く、ここで、前記変異体、又はその断片の1つ以上のグリシン(Gly)が、Ala、Val、Leu及びIleからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸により置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の1つ以上のアラニン(Ala)は、Gly、Val、Leu及びIleからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の1つ以上のバリン(Val)は、Gly、Ala、Leu及びIleからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の1つ以上のロイシン(Leu)は、Gly、Ala、Val、及びIleからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の1つ以上のイソロイシン(Ile)は、Gly、Ala、Val及びIleからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の1つ以上のアスパラギン酸(Asp)は、Glu、Asn、及びGlnからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の1つ以上のアスパラギン(Asn)は、Asp、Glu、及びGlnからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の1つ以上のグルタミン(Gln)は、Asp、Gul、Leu及びAsnからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の1つ以上のフェニルアラニン(Phe)は、Tyr、Trp、His、Proからなるアミノ酸の群、そして好適にはTyr及びTrpからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の1つ以上のチロシン(Tyr)は、Phe、Trp、His、Proからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸、好適にはPhe及びTrpからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の1つ以上のアルギニン(Arg)は、Lys及びHisからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の1つ以上のリジン(Lys)は、Arg及びHisからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、並びに独立して、変異体、又はその断片並びに、独立して、変異体もしくはその断片の1つ以上のプロリン(Pro)は、Phe、Tyr、Trp及びHisからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、その変異体もしくはその断片の1つ以上のシステイン(Cys)は、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr及びTyrからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されている。
上記の概要から、前記同等物又はその断片は、本明細書中先に規定した複数の保存的アミノ酸の群に由来する複数の保存的アミノ酸置換を含んで成りうることは明らかである。
保存的置換は、本発明の好適な所定のペプチド又はその断片の任意の位置に導入されて良い。しかし、非保存的置換、特に、1又は複数の位置において非保存的置換を導入することが望ましいが、それらには限定されない。
本発明のペプチドの機能的に等しい断片を形成することにつながる非保存的置換は、極性などにおいて実質上違うであるだろう。それは例えば、非極性側鎖を有する残基(Ala、Leu、Pro、Trp、Val、Ile、Leu、Phe又はMet)が極性側鎖を有する残基、例えば、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、もしくはGln又は荷電したアミノ酸の、例えばAsp、Glu、ArgもしくはLysなどへの置換、又は荷電したもしくは極性残基を非極性のものに置換すること;及び/又はii)そのペプチド骨格方向に対するその効果の実質上の違い、例えば、ProもしくはGlyのもしくはそれらへの他の残基による置換;及び/又はiii )実質上の電荷における違い、例えば、負に荷電した残基、例えばGluもしくはASPの正に荷電した残基、例えばLys、HisもしくはArgへの置換(及びその逆)であり;及び/又はiv)立体的なかさ(steric bulk)における実質上の違い、例えば、かさばる残基、例えば、His、Trp、PheもしくはTyrの、小さな側鎖を有するもの、例えばAla、GlyもしくはSerへの置換(及びその逆)である。
1つの実施態様において、アミノ酸の置換は、それらの疎水性及び親水性の等級及びアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば電荷、サイズなどに基づいて行われて良い。例えば、様々な先の特性を考慮したアミノ酸置換が当業者に周知であり、そして例えば:アルギニンとリジン;グルタミン酸塩とアスパラギン酸塩;セリンとトレオニン;グルタミンとアスパラギン;バリン、ロイシンとイソロイシンである。
アミノ酸の付加もしくは欠失は、2〜好適に10個のアミノ酸、例えば、2〜8個のアミノ酸、例えば2〜6個のアミノ酸、例えば2〜4個のアミノ酸の付加もしくは欠失であって良い。しかし、10を超えるアミノ酸、例えば2〜10個のアミノ酸の付加も本発明内に含まれて成る。多量体形態において、付加/欠失は、多量体のそれぞれの単量体において個々に行われて良い。
本発明は、本明細書中で開示された化合物の非ペプチド変異体にも関連する。詳細には、かかる変異体は、繊維芽細胞増殖因子(FGF)レセプター及び/もしくはアデノシン三リン酸(ATP)及び/もしくはL1と結合するかあるいは相互作用し、そしてFGFレセプターを提示する細胞の、FGFレセプターシグナル伝達を刺激するそして/もしくは増殖を調節するそして/もしくは分化を誘導するそして/もしくは再生、ニューロンの可塑性及び/又は生存を刺激する化合物であると解されるべきである。
従って、本発明は、1以上のレセプターを結合することができる1以上の断片、又はその変異体、例えば、1以上の断片の任意の変異体及び機能的同等物を含んで成る化合物に関連すると解されるべきである。
置換によって獲得された機能的同等物は、もし機能的に類似するアミノ酸側鎖を含む残基が置換されているならば、相同性は低いが、おそらく、ある形態かあるいは程度の天然NCAM活性を示す。本発明に関連して、機能的な類似とは、側鎖の有力な特性を意味する。その特性とは、疎水性、塩基性、中性、もしくは酸性、又は立体的かさの存在もしくは不在である。従って、本発明の実施態様において、i)効果を起こすことができる所定の機能的同等物とii)好適な所定の断片との間での同一性の程度は、本発明の好適な所定のペプチド断片の変異体又は機能的同等物としての重要な尺度ではない。
いくつか以上の相同性を、好適には3アミノ酸以上、一層好適には5アミノ酸以上の所定の断片と共有する断片は、それらが好適な所定のNCAMペプチド又はその断片と相同性が約25%以上、例えば、相同性が約30%以上、例えば相同性が約40%以上、例えば相同性が約50%以上、例えば相同性が約55%以上、例えば約60%以上、例えば相同性が約65%以上、例えば相同性が約70%以上、例えば相同性が約80%以上、例えば相同性が約85%以上である場合、本発明の範囲内にあるものとして考えられている。
配列の同一性は、配列解析ソフトウェア(例えば、the Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、1710 University Avenue、Madison、WI 53705)を、それに指定されている初期パラメーターで使用することで測定されて良い。
詳細な説明及び請求項の全体に渡り、3文字コードかあるいは1文字コードのいずれかが天然アミノ酸に関して使用されている。LあるいはD形態かが明示されていない場合、そのアミノ酸は天然のL形態(Pure & Appl.Chem.Vol.56(5)pp.595〜624(1984)を参照のこと)又はD形態を有しているもとのと解され、従って形成されるペプチドはL形態、D形態、又はL形態とD形態が混合された配列からなりうる。
本発明のポリペプチドのC末端アミノ酸は、何も明示されていない場合、遊離カルボン酸として存在しているものと解され、このことは「−OH」としても明示されうる。しかし、本発明の化合物のC末端アミノ酸は、「−NH2」として示されているアミド化された誘導体でありうる。記載が他にない場合、ポリペプチドのN末端アミノ酸は遊離アミノ基を含んで成り、これも「H−」として明示されて良い。アミノ酸は、明示されていない場合、天然に生じるかあるいはそうでないに関わらず、例えば、αアミノ酸、βアミノ酸、及び/又はγアミノ酸など、任意のアミノ酸から選択されて良い。従って、群は、限定されないが:Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Aib、Nal、Sar、Orn、リジン類似物のDAP及びDAPA、4Hypを含んで成る。
本発明の1つの観点において、前記化合物はNCAMの第1フィブロネクチンIII (F3,1)モジュール、もしくはその断片、もしくは変異体を含んで成る。
更に詳細には、本発明は、FGFレセプターと相互作用することができる、神経細胞接着分子(NCAM)の第1フィブロネクチンIII (F3,1)モジュール、もしくはその断片、もしくは変異体を含んで成る化合物に関連する。
従って、本発明の1つの好適な実施態様において、前記化合物は、
式L1−A−L2−B−L3−C−L4
(式中、
A、B、Cのうち1つが塩基性アミノ酸から選択されており、
A、B、Cのうち1つが疎水性アミノ酸から選択されており、
A、B、Cのうち1つがグリシンであり、そして
L1、L2、L3、L4は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは0〜5の整数である)
のアミノ酸配列を含んで成る。
式L1−A−L2−B−L3−C−L4
(式中、
A、B、Cのうち1つが塩基性アミノ酸から選択されており、
A、B、Cのうち1つが疎水性アミノ酸から選択されており、
A、B、Cのうち1つがグリシンであり、そして
L1、L2、L3、L4は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは0〜5の整数である)
のアミノ酸配列を含んで成る。
更なる実施態様において、Bはグリシンであり、Aは塩基性アミノ酸残基、及びCは疎水性アミノ酸残基である。
更に、他の実施態様において、Aはリジン(K)又はアルギニン(R)、及びCはロイシン(L)又はアラニン(A)である。
他の好適な実施態様において、本発明の化合物は、配列NGKGL(アスパラギン、グリシン、リジン、グリシン、ロイシン)、NGKGA、NGRGL及び/又はNGRGAを含んで成る。配列NGRGLは、例えばL1中で発見されておりそして配列NGKGLは、例えばNCAMのF3,1中で発見されている。
本発明は更に、F3,2がFGFレセプターのリガンドであり且つFGFレセプターを提示する細胞と相互作用することができることを開示する。従って、本発明の他の観点において、前記化合物は、NCAM分子の第2FnIII モジュールのFGループ、もしくはその断片、もしくはその変異体に対して相同的なペプチドを含んで成る。
NCAMのF3,2モジュールのFGループを含んで成る断片が特に好適である。しかし、本発明は、FGループを含んで成るF3,2モジュールの断片に限定されてはいない。FGループよりも少ない欠失を含んで成る機能的同等物を生じる断片も本発明内に含まれて成る。本発明の機能的に同等なペプチド及びその断片は、FGFレセプター及び/又はNCAMリガンド提示する細胞に対して結合することができるF3,2モジュールのFGループよりも少ないかあるいは多いアミノ酸残基を含んで成りうる。
F3,2ペプチドの全ての機能的同等物は、相同性の程度に関わらず本発明の範囲内であり、それらはF3,2ペプチド又はFGループの所定の配列を示す。この理由とは、その結合領域のいくつかの部分が、生じる断片の結合活性に対する任意の有意な効果を伴わずに、最も突然変異しやすいかあるいはペプチドを欠失しやすいからである。
かかるペプチド、断片又は変異体は、
式L1−A−L2−B−L3−C−L4−D−L5
(式中、
A、B、C、Dのうち1つが塩基性アミノ酸残基から選択されており、
A、B、C、Dのうち1つが疎水性アミノ酸残基から選択されており、
A、B、C、Dのうち1つが酸性アミノ酸残基から選択されており、
A、B、C、Dのうち1つがグリシンであり、そして
L1、L2、L3、L4及びL5は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは0〜5の整数である)
のアミノ酸配列を含んで成る化合物であって良い。
式L1−A−L2−B−L3−C−L4−D−L5
(式中、
A、B、C、Dのうち1つが塩基性アミノ酸残基から選択されており、
A、B、C、Dのうち1つが疎水性アミノ酸残基から選択されており、
A、B、C、Dのうち1つが酸性アミノ酸残基から選択されており、
A、B、C、Dのうち1つがグリシンであり、そして
L1、L2、L3、L4及びL5は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは0〜5の整数である)
のアミノ酸配列を含んで成る化合物であって良い。
詳細には、ペプチド、断片又は変異体は、
式A- B-L3-L4-C-L4
(式中、
Aは疎水性アミノ酸残基であり、
Bは酸性アミノ酸残基であり、
L3は1又は数個の親水性アミノ酸残基であり、
L4は上記L4について規定したようなアミノ酸配列であり、そして
Cはグリシンである)
のアミノ酸配列を含んで成る化合物であって良い。
式A- B-L3-L4-C-L4
(式中、
Aは疎水性アミノ酸残基であり、
Bは酸性アミノ酸残基であり、
L3は1又は数個の親水性アミノ酸残基であり、
L4は上記L4について規定したようなアミノ酸配列であり、そして
Cはグリシンである)
のアミノ酸配列を含んで成る化合物であって良い。
好適な実施態様において、前記化合物は、式AENQ-L4-G
(式中、A、E、N、Q、及びGはアミノ酸残基の1文字表記であり、そしてL4は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは0〜5の整数である)
のアミノ酸配列を含んで成る。
(式中、A、E、N、Q、及びGはアミノ酸残基の1文字表記であり、そしてL4は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは0〜5の整数である)
のアミノ酸配列を含んで成る。
他の好適な実施態様において、本発明のペプチド、断片又は変異体は、NCAM分子のF3,2モジュールのFGループ、もしくはその断片、もしくはその変異体に対して相同的なペプチドを含んで成りうる。本発明の好適な実施態様において、前記のペプチドは、アミノ酸残基モチーフA−E−N−Q−X−X−K(式中、Xは任意のアミノ酸残基であって良い)を有する配列を含んで成る。Xは例えば、グルタミン(Q)、アラニン(A)、グリシン(G)及び/又はアスパラギン(N)から個々に選択されて良い。
詳細には、ペプチド、断片又は変異体は、
式A- L2-B-L3-L4-C-L4
(式中、
Aは疎水性アミノ酸残基であり、
L2は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは0〜5の整数であり、
Bは塩基性アミノ酸残基であり、
L3は1又は数個の親水性アミノ酸残基であり、
L4は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは0〜5の整数であり、そして
Cはグリシンである)
のアミノ酸配列を含んで成る化合物であって良い。
式A- L2-B-L3-L4-C-L4
(式中、
Aは疎水性アミノ酸残基であり、
L2は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは0〜5の整数であり、
Bは塩基性アミノ酸残基であり、
L3は1又は数個の親水性アミノ酸残基であり、
L4は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは0〜5の整数であり、そして
Cはグリシンである)
のアミノ酸配列を含んで成る化合物であって良い。
好適な実施態様において、前記化合物は、
式AM-B-L3-L4-G
(式中、A、M及びGはアミノ酸残基の1文字表記であり、L3は1又は数個の疎水性アミノ酸残基であり、そしてL4は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは0〜5の整数である)
のアミノ酸配列を含んで成る。
式AM-B-L3-L4-G
(式中、A、M及びGはアミノ酸残基の1文字表記であり、L3は1又は数個の疎水性アミノ酸残基であり、そしてL4は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは0〜5の整数である)
のアミノ酸配列を含んで成る。
例は配列:AMKEDGR(配列番号:7)であって良い。
本発明の更なる観点において、前記化合物は、アデノシン三リン酸(ATP)を結合することができる。理論に縛られることなく、シナプスからのATPの放出は、NCAMとFGFレセプターとの結合に影響を及ぼし、従って新たに形成されたシナプスが接触する領域での軸索生長を調節する、即ち、ATPが、シナプスの接触する領域での可塑性に間接的に影響を与えるものと考えられる。
1つのかかる実施態様において、前記化合物は、
式L1−A−L2−B−L3−C−L4−D−L5−E−L6
(式中、
L1、L2、L3、又はL4のうち少なくとも1つはアミノ酸残基Yを含んで成り、そして他の1つはアミノ酸残基Kを含んで成り、そしてL5及び/又はL6は個々にKであり、そしてA、B、C、D、E、は任意のアミノ酸であり、但しYとKとの間の距離は5アミノ酸以上、例えば7アミノ酸残基以上、例えば9アミノ酸残基以上、例えば11アミノ酸残基以上である)
のアミノ酸配列を含んで成る。
式L1−A−L2−B−L3−C−L4−D−L5−E−L6
(式中、
L1、L2、L3、又はL4のうち少なくとも1つはアミノ酸残基Yを含んで成り、そして他の1つはアミノ酸残基Kを含んで成り、そしてL5及び/又はL6は個々にKであり、そしてA、B、C、D、E、は任意のアミノ酸であり、但しYとKとの間の距離は5アミノ酸以上、例えば7アミノ酸残基以上、例えば9アミノ酸残基以上、例えば11アミノ酸残基以上である)
のアミノ酸配列を含んで成る。
アミノ酸Yは、アミノ酸KよりもN末端に対して非常に近接していることが好適である。
本発明の更なる実施態様において、前記化合物は、
式A-Xaa-B-C-C
(式中、
Aはチロシン(Y)、
Bはグリシン(G)、
Cはリジン (K)であり、そして
Xaaは任意のアミノ酸である)
の配列を含んで成る。
式A-Xaa-B-C-C
(式中、
Aはチロシン(Y)、
Bはグリシン(G)、
Cはリジン (K)であり、そして
Xaaは任意のアミノ酸である)
の配列を含んで成る。
上に列挙した配列は、天然に生じるタンパク質、例えば、繊維芽細胞増殖因子2(FGF2)中で見出されるAMKEDGR(配列番号7)の配列を有するペプチドの一部であって良い。
本発明の1つの実施態様において、配列86〜206は、F3,I及びF3,IIドメイン中のFGLペプチド(FGループペプチド)に対して相同的な配列である。
用語「相同物」とは、本発明のFGLペプチドと構造的及び/又は機能的に同一な配列であることを意味している。配列の同一性は、配列解析ソフトウェア(例えば、Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、1710 University Avenue 、Madison WI 53705のSequence Analysis Software )をそれに指定された初期パラメーターを用いることで測定できる。
本発明の1つの好適な実施態様において、前記化合物は、繊維芽細胞増殖因子(FGF)レセプターと相互作用することができる。様々なFGFレセプターが存在する。FGFレセプターは、FGFレセプターI、FGFレセプターII、FGFレセプターIII 、FGFレセプターIVからなる群から選択されうることが好適である。更に好適な実施態様において、FGFレセプターIシグナル伝達が刺激されている。
本発明の好適な実施態様において、本発明の化合物とFGFレセプターとの相互作用は、FGFレセプターシグナル伝達の刺激をもたらしている。本発明の化合物がFGFレセプターと相互作用する場合、化学的事象のカスケード及び生理学的な変化が生じる。本発明の化合物とFGFレセプターとの反応により、推定上、レセプターの構造変化及びクラスター化が生じ、それによって相互作用する部分から細胞内部への化学的シグナルが生じそして増える。このシグナルは、細胞外部から細胞内部へと導入されるといわれており、後者は、細胞の生理的応答をもたらす。
本発明によれば、FGFレセプターシグナル伝達は、所定の濃度の化合物がFGFレセプターを提示している細胞に対して適用されている場合、FGFレセプターのリン酸化として測定されている。リン酸化の程度は、コントロールの値の少なくとも20%超、例えば少なくとも20%〜200%、例えば少なくとも50〜200%である。
本発明の化合物を試験する場合、例えばシグナル伝達の測定をすることに関して、前記化合物の濃度は、0.1〜1000μM、1〜1000μM、例えば、1〜200μM、例えば、10〜200μM、例えば、20〜180μM、例えば、30〜160μM、例えば、40〜140μM、例えば、50〜130μM、例えば、60〜120μM、例えば、70〜110μM、例えば、80〜100μMであって良い。
本発明の化合物のアミノ酸配列は、任意の適切な長さであって良く、その理由は、アミノ酸配列の長さは、ペプチドの機能及び化合物を医薬組成物へと処方することにより規定されるからである。従って、化合物は通常、3〜100アミノ酸残基範囲のアミノ酸残基、例えば、10〜90アミノ酸残基、例えば、15〜85アミノ酸残基、例えば、20〜80アミノ酸残基、例えば、25〜75アミノ酸残基、例えば、30〜70アミノ酸残基、例えば、35〜65アミノ酸残基、例えば40〜60アミノ酸残基、例えば、45〜55アミノ酸残基を含んで成る。
他の観点において、本発明の化合物は、3〜20アミノ酸残基の範囲のアミノ酸残基、例えば、3〜19アミノ酸残基、例えば、3〜18アミノ酸残基、例えば、3〜17アミノ酸残基、例えば、3〜16アミノ酸残基、例えば、3〜15アミノ酸残基、例えば、3〜14アミノ酸残基、例えば、3〜13アミノ酸残基を含んで成る。
本発明のペプチドは、FGFレセプター及び/又はATPに対して結合することが期待されるペプチドリガンド中のモチーフを同定するための道具として働きうる。かかるペプチドリガンドは、ペプチド及び/もしくは非ペプチドライブラリーにより発見されて良い。FGFレセプター及び/もしくはATP及び/もしくはL1を結合することができる前記ペプチドを含んで成る任意のペプチド配列は、本発明の一部である。
記載のこれら化合物及び組成物は、FGFレセプター又はNCAMリガンドを発現する末梢及び/もしくは中枢神経系及び/もしくは筋及び他の組織に影響を及ぼす症状並びにFGFレセプター機能又は他のNCAMリガンドの機能を刺激することが有効である他の症状を治療するために使用することができる。
推定上の人工リガンドが、ペプチド又は非ペプチドライブラリーから選択及び同定されうる。任意のペプチド又は非ペプチドライブラリーも使用されて良い。合成ペプチド及び非ペプチドライブラリー並びに断片化した天然に生じるタンパク質を含むライブラリーが、有用なペプチドをサーチするために用いられて良い。非ペプチド化合物を含んで成る任意の種類の化合物が類似して使用されて良い。
アミノ酸の所定の配列を特徴とするペプチドは、タンパク質の所定の領域の変異体であって良い。天然に生じるアミノ酸は、L−アミノ酸からなる。しかし、人工ペプチドも、D−アミノ酸残基からなるかあるいは含んで成って良い。コンビナトリアルケミストリーによって、等しい長さのペプチドを担持するビーズの混合物が構築されて良く、ここで、各ビーズはユニーク配列のペプチドを担持する(Lamら、1991)。かかるビーズ上のペプチドの混合物は、ペプチドライブラリーとよばれている。
本発明において、ペプチド、断片又は変異体は、精製された組換えNCAMもしくは組換えFGFレセプターもしくは組換えL1もしくは他のNCAMリガンドを伴う樹脂結合ペプチドを含んで成る合成ランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって同定されて良い。前記樹脂結合1ビーズ1ペプチドライブラリーの合成は、部分的に、任意に当業者によって改変されたFurka、A、Sebestyyen、F、Asgedom、M及びDido、G(1991)、Int.J.Prep.Prot.Res.Vol37.pp.489〜493の混合手段を用いて行われて良い。注目のペプチドを同定及び選択するための選定の方法は推定のモチーフの同定をするために重要ではないと解される。
有機小化合物のライブラリーは、繊維芽細胞増殖因子(FGF)レセプター及び/もしくはアデノシン三リン酸(ATP)及び/もしくはL1と相互作用することができる、FGFレセプターリガンドもしくはL1リガンドもしくは他のNCAMカウンターレセプターリガンドを同定するためにスクリーニングされて良い。かかるライブラリー又は他の構築体は、一般に公知であり、そして有用なリガンドのスクリーニングは、本明細書中で開示されているスクリーニングのための方法かあるいは当業者に明らかな方法に従いうる。
本発明の化合物は、好適に、単量体のオリゴマー(多量体)の形態にあり、ここで各単量体は上記の化合物のために規定されている。詳細には、デンドリマーなどの多量体ペプチドは、多重軟ペプチド単量体(multiple flexible peptide monomer)が存在することにより構造決定因子又はクラスターを形成しうる。1つの実施態様において、前記化合物は二量体である。好適な実施態様において、前記化合物はデンドリマー、例えば、リジン骨格に対して、又はBSAなどのタンパク質担体などポリマー担体に対して結合した4つのペプチドである。繰り返し配列又は様々な担体に対する接着などのポリマー化は当業界で周知であり、例えば、リジン骨格、例えば、4ペプチド、8ペプチド、16ペプチド、又は32ペプチドを担持するリジンデンドリマーが挙げられる。他の担体は脂肪親和性デンドリマー、もしくは、脂肪親和性誘導体によって形成されるミセル様担体、もしくは星型(星状)共役炭素鎖ポリマーであって良い。
前記化合物は、好適には、独立して、FGFレセプター及び/又はNCAMリガンド/カウンターレセプター及び/又はL1を提示する細胞のFGFレセプターシグナル伝達及び/もしくは増殖及び/もしくは分化、再生、生存及び/もしくはニューロンの可塑性の調節をすることができる単量体を含んで成る。
個々の単量体は、相同的、即ち、互いに同一であって良い、又は個々の単量体は、異種、即ち、互いに異なっていて良い。後者の種類の単量体は2種類以上の異なる単量体を含んで成りうる。一般に、二量体及び多量体は2以上の同一の単量体又は2以上の互いに異なる単量体を含んで成る。
医薬組成物
本発明は、神経細胞接着モジュール(NCAM)の第3免疫グロブリン(Ig3)モジュール、及び/もしくは第4免疫グロブリン(Ig4)モジュール、及び/もしくは第5免疫グロブリン(Ig5)モジュール、及び/もしくは第1フィブロネクチンIII (Fn3,1)モジュール、及び/もしくは第2フィブロネクチンIII (Fn3,2)モジュール、もしくはその断片、もしくはその変異体を含んで成る先に規定された1又は複数の化合物を含んで成る医薬組成物にも関連し、ここで当該化合物は繊維芽細胞増殖因子(FGF)レセプター及び/もしくはアデノシン三リン酸(ATP)及び/もしくはL1と相互作用することができる。
本発明は、神経細胞接着モジュール(NCAM)の第3免疫グロブリン(Ig3)モジュール、及び/もしくは第4免疫グロブリン(Ig4)モジュール、及び/もしくは第5免疫グロブリン(Ig5)モジュール、及び/もしくは第1フィブロネクチンIII (Fn3,1)モジュール、及び/もしくは第2フィブロネクチンIII (Fn3,2)モジュール、もしくはその断片、もしくはその変異体を含んで成る先に規定された1又は複数の化合物を含んで成る医薬組成物にも関連し、ここで当該化合物は繊維芽細胞増殖因子(FGF)レセプター及び/もしくはアデノシン三リン酸(ATP)及び/もしくはL1と相互作用することができる。
本発明の背景において、用語「医薬組成物」とは「医薬」と同義語で使用されている。
1つの実施態様において、医薬組成物は、NCAM F3,2モジュール、もしくはその断片、もしくはその変異体を含んで成る。他の実施態様において、前記組成物はNCAM F3,1モジュール、もしくはその断片、もしくはその変異体を含んで成る。
組成物は、好適に先に論じたような多量体又は二量体として処方されている。
本発明は更に、FGFレセプターを提示する細胞のFGFレセプターシグナル伝達を刺激すること及び/もしくは増殖を調節すること及び/もしくは分化を誘導すること及び/もしくは再生、ニューロンの可塑性及び/もしくは生存の誘導することができる医薬組成物に関連する。
1つの観点において、前記医薬組成物はin vitro又はin vivoで細胞の死を予防しうる。ここで前記組成物は、対象者に対して、1もしくは複数の先に記載した化合物又は下に記載の組成物を有効な量でin vitroもしくはin vivoにおいて、本明細書で論じられている数個の組織及び器官中のFGFレセプター提示細胞及び/又はL1提示細胞の死を防ぐように投与されている。
本発明の医薬は、有効な量の1もしくは複数の先に規定された化合物、又は先に規定された組成物を医薬的に許容できる添加剤との組み合わせにおいて含んで成る。かかる医薬は、経口、経皮、筋内、静脈内、頭蓋内、鞘内、脳室内、鼻腔内又は肺内投与のために適切であって良い。
本発明の化合物に基づく医薬及び組成物の製剤開発における戦略は、一般に、任意の他のタンパク質ベースの薬物生産のための処方戦略に対応する。潜在的な問題及びこれらの問題を解消するのに必要な指標は、「Therapeutic Peptide and Protein Formation. Processing and Delivery Systems」 A.K.Banga著、Technomic Publishing AG、Basel 1995などのいくつかの文献中で取り扱われている。
注射用物質は、通常、液体溶液又は懸濁、注射する前に溶液中で懸濁せしめる又は溶かすのに適した固体形態のいずれかとして調製されて良い。製剤は乳化されていても良い。活性成分は、往々にして、医薬的に許容でき且つ当該活性成分と適合する賦形剤と混合されている。適切な賦形剤としては、例えば、水、塩類溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、並びにそれらの組み合わせである。加えて、製剤は、所望されれば、少量の補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤、又は当該製剤の効率もしくは輸送を増強する物質を含んで良い。
本発明の化合物の製剤は、当業者公知の技術によって調製できる。前記製剤は、医薬的に許容できる担体及び賦形剤の、例えば微小球、リポソーム、ミクロカプセル、ナノ粒子などを含みうる。
製剤は、任意に、活性成分がその効果を発揮する部位に、注射によって適切に投与されて良い。他の投与方法のために適切である更なる剤形としては、座薬、鼻腔、肺及びある場合には経口製剤が挙げられる。座薬について、伝統的な結合剤及び担体としては、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが挙げられる。かかる座薬は、1又は複数の活性成分を、0.5%〜10%、好適には、1〜2%の範囲で含有する混合物から生産されうる。経口製剤としては、通常用いられる賦形剤の、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム(sodium saccharine)、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含む。これらの組成物は、溶液、懸濁、錠剤、ピル、カプセル、持続放出製剤又は粉末の形態をとり、そして一般に、1又は複数の活性成分を10〜95%、公的には25〜70%含む。
他の製剤は、鼻腔及び肺内投与に適切な吸入器及びエアロゾルなどである。
活性化合物は、中性又は塩形態として処方されて良い。医薬的に許容できる塩としては、酸付加塩(ペプチド化合物の遊離アミノ基を伴い形成されている)が挙げられ、そしてそれは無機酸の例えば、ヒアルロン酸もしくはリン酸など、又は有機酸の例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などで形成されている。遊離カルボキシル基を伴い形成される塩は、無機塩基の例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第2鉄など、及び有機塩基のイソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどにも由来しうる。
製剤は、製剤用量(dosage formulation)と適合する方法、そして治療上有効であるだろう量で投与されている。投与される量は治療される対象者に依存し、例えば、対象者の体重及び年齢、治療される疾患及び疾患のステージに応じて投与される。適切な用量範囲は、kg体重あたり、通常は、数百μg活性成分/投与のオーダーであり、そして好適に、約0.1μg〜5000μg/kg体重の範囲である。単量体形態の化合物を使用する場合、往々にして適切な用量は0.1μg〜5000μg/kg体重の範囲、例えば、約0.1μg〜3000μg/kg体重の範囲、そして特に約0.1μg〜1000μg/kg体重の範囲である。多量体形態の化合物を用いる場合、適切な用量は、往々にして0.1μg〜1000μg/kg体重の範囲、例えば、約0.1μg〜750μg/kg体重の範囲、そして特に約0.1μg〜500μg/kg体重の範囲、例えば約0.1μg〜250μg/kg体重の範囲である。特に、鼻腔内に投与する場合、他の経路で使用される場合よりもより少ない用量が使用されている。用量は、投与経路にも基づいており、そして治療される患者の年齢及び体重により様々であるだろう。多量体形態の好適な用量は、1mg〜70mg/70kg体重の間隔であるだろう。
多くの徴候のために、局所化されたかあるいは実質上局所化された適用が好適である。
本発明のいくつかの化合物は、活性が十分であるが、他のいくつかについては、製剤が更に医薬的に許容できる添加剤及び/又は担体を含んで成るのならば、効果が増強されるだろう。かかる添加剤及び担体は当業者に公知であるだろう。いくつかの場合、活性物質のその標的へのデリバリーを促す化合物を含むことは有利であるだろう。
多くの場合、製剤を複数回投与することが必要であるだろう。投与は連続注入、例えばより多くの用量での脳室内注入又は投与、例えば、毎日、1日につきより多くの回数、毎週、1週につきより多くの回数などであって良い。医薬の投与は、個体が、細胞が死につながりうる1又は複数の因子に委ねられる直前又は直後に開始されることが好ましい。好適に、医薬は、因子攻撃の8時間以内、例えば、因子攻撃から5時間以内に投与されている。多くの化合物が長期間効果を示し、そのため化合物の投与は長い間隔、例えば1週又は2週で行われて良い。
神経ガイド(nerve guide)中での使用に関連して、投与は、1又は複数の活性化合物の調節放出に基づき連続的かあるいは少量ずつであって良い。更に、前駆体も、放出速度及/又は放出の部位を調節するために用いられて良い。他の種類の移植物並びに経口投与も類似して前駆体の持続放出及び/又は使用に基づきうる。
先に論じたように、本発明は、in vitoもしくは in vivoでFGFレセプター提示細胞もしくはL1提示細胞もしくは他のNCAMリガンド提示細胞の分化を誘導し、増殖を調節し、再生、ニューロンの可塑性及び生存を刺激するための個体の治療に関連し、この治療は先に規定した有効な量の1又は複数の化合物を投与することを伴う。
投与するための他の戦略は、前記化合物を発現及び分泌することができる細胞の移植もしくは注射をすることである。従って、前記化合物はそれが作用するであるだろう部位で生産されて良い。
治療
更なる観点において、本発明は、FGFレセプターを提示する細胞の増殖の調節及び/もしくは分化の誘導及び/もしくは再生、ニューロンの可塑性及び/もしくは生存の刺激において使用するための前記ペプチド、断片、又はその変異体に関連する。前記使用は、中枢神経及び末梢神経系、並びに筋肉又は様々な器官の疾患及び症状を予防する治療のためである。
更なる観点において、本発明は、FGFレセプターを提示する細胞の増殖の調節及び/もしくは分化の誘導及び/もしくは再生、ニューロンの可塑性及び/もしくは生存の刺激において使用するための前記ペプチド、断片、又はその変異体に関連する。前記使用は、中枢神経及び末梢神経系、並びに筋肉又は様々な器官の疾患及び症状を予防する治療のためである。
本発明の化合物/組成物の使用による治療は、移植(implant)又は移植(transplant)された細胞の、分化を誘導すること、増殖を調節すること、再生、ニューロンの可塑性及び生存を刺激するための有用な1つの実施態様である。これは特に、長期効果を有する化合物を使用する場合に有用である。
更なる実施態様において、治療は、様々な因子により死の危険にある細胞の生存を刺激するためでありうる。その因子とは、例えば外傷及び傷害、急性疾患、慢性疾患及び/又は障害、詳細には、通常、細胞の死につながる変性疾患、他の外的因子、例えば、フリーラジカルの形成を生じうる医薬及び/もしくは外科治療及び/もしくは診断方法又は本来細胞傷害性の効果を有する、X線及び化学療法である。化学療法に関連して、本発明のNCAM結合化合物は、NCAMリガンドを提示する全てのガン細胞のガンの治療において有用である。
従って、前記治療は、疾患又は中枢及び末梢神経系の疾患又は症状に関連する細胞死の治療、及び/又は予防を含んで成り、その疾患又は症状とは、例えば、手術後の神経傷害、外傷性神経傷害、原因は例えば脊髄傷害、神経繊維の髄鞘形成傷害、虚血後傷害、原因は例えば動悸、多発脳梗塞性痴呆、多発性硬化症、糖尿病による神経変性、神経−筋変性、統合性失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、又はハンチントン病である。
そしてまた、筋−神経連絡の機能傷害を含む症状など筋肉の疾患又は症状、例えば、遺伝的又は外傷性萎筋縮障害に関連して;又は性腺、すい臓の変性症状、例えばI型及びII型の糖尿病、腎臓の変性症状、例えばネフローゼ、など様々な器官の疾患及び症状を治療するために、本発明の化合物は、分化を誘導すること、増殖を調節すること、再生、ニューロンの可塑性及び生存を刺激する、即ち、生存を刺激することのために使用されて良い。
更に、前記化合物及び/又は医薬組成物は、血管形成を誘導するために、心筋細胞の細胞死、例えば急性心筋梗塞後の心筋細胞の細胞死を予防するためであって良い。更に、1つの実施態様において、前記化合物及び/又は医薬組成物は、例えば、急性心筋梗塞後の心筋細胞の生存を刺激するためである。他の観点において、化合物及び/又は医薬組成物は、例えば傷害後の血管再開通術のためである。
創傷治癒を促進するための化合物及び/又は医薬組成物を使用することも本発明の範囲内である。本発明の化合物は血管形成を刺激することができ、従って、創傷治癒プロセスを促進する。
本発明は更に、ガンの治療における化合物及び/又は医薬組成物の使用を開示する。NCAMはガン細胞の運動性を調節し且つ広がるのを抑制する。
更なる実施態様において、前記化合物及び/又は医薬組成物の使用は、学習する能力並びに/又は短期及び/もしくは長期記憶を刺激するためである。
詳細には、本発明の化合物及び/又は医薬組成物は臨床症状の治療において使用されて良い。その症状とは、例えば、新生物、例えば悪性新生物、良性新生物、in situガン腫及び挙動が不確かな新生物、内分泌腺の疾患、例えば、糖尿病、精神病、例えば、老人性及び初老性の基質性精神病、アルコール精神病、薬物精神病、一過性臓器質症状、アルツハイマー病、脳類脂質沈着症、癲癇、進行麻痺[梅毒]、肝レンズ核変性症、ハンチントン舞踏病、クロイツフェルトヤコブ病、多発性硬化症、脳のピック病、梅毒、統合性失調症、感情精神病、神経性疾患、人格障害、例えば、性格神経症、器質脳症候群に関連する非精神病性障害、妄想性人格障害、狂信的人格、偏執性人格(障害)、偏執性の特徴、性的逸脱及び障害、知的障害、神経系及び感覚器の障害、認知異常、中枢神経系の炎症性疾患、例えば髄膜炎、脳炎、脳変性、例えば、アルツハイマー病、ピック病、脳の老年性変性、交通性水痘症、閉塞性水痘症、パーキンソン病、例えば他の錐体外路疾患及び運動異常障害、脊髄小脳疾患、小脳性運動失調症、Marie’s、Sanger−Brown、ミオクローヌス性小脳性共同運動障害、原発性小脳変性、例えば、脊髄筋萎縮症、家族性萎縮症、若年性萎縮症、成人脊髄筋萎縮症、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、運動ニューロン疾患、進行性球麻痺、進行性偽球麻痺、原発性側索硬化症、他の全角細胞疾患、全角細胞疾患、詳細不明な、他の脊髄の疾患、脊髄空洞症及び延髄空洞症、血管ミエロパシー、脊髄の急性梗塞(幹栓症)(非幹栓症)、脊髄の動脈血管症、脊髄の浮腫、亜急性壊死ミエロパシー、他の何処かに分類される脊髄の亜急性合併変性、ミエロパシー、薬物が誘導した脊髄炎、放射線が誘導した脊髄炎、自律神経系の障害、末梢自律、交感、副交感又は栄養系の障害、家族性自律神経失調症[Riley−Days症候群]、突発性末梢自律ニューロパシー、頸動脈洞性失神又は症候群、頸部交感神経ジストロフィー又は麻痺である。例えば、新生児の場合の、他のいずれかに分類される障害における末梢自律ニューロパシー、アミロイドーシス、末梢神経系の疾患、鰓器官業障害、頸肋症候群、肋骨鎖骨症候群、前斜角筋症候群、胸郭出口症候群、鰓器管神経炎又は神経根炎である。炎症性及び毒性ニューロパシー、例えば、急性感染性多発性神経炎、Guillain-Barre症候群、感染後多発性神経炎、膠原血管病における多発ニューロパシー、目の多重構造に影響を及ぼす障害、化膿性内眼球炎、耳及び乳様突起の疾患、慢性リュウマチ性心臓疾患、虚血性心臓病、不整脈、肺系における疾患、新生児の器官及び軟組織の異常、例えば、神経系における異常、麻酔及び他の鎮痛剤の投与の働き及びデリバリーにおける合併症、皮膚における疾患、例えば、感染症、不十分な循環の問題、傷害、例えば、外科手術後、衝撃傷害、火傷である。神経及び脊髄に対する傷害、例えば、神経の分裂、連続的な傷害(開放創有無の)、外傷性神経腫(開放創有無の)、外傷性一過性麻痺(開放創有無の)、医療手順中の偶発的穿刺又は裂傷、視神経及び経路に対する傷害、視神経傷害、第二脳神経傷害、視交差に対する傷害、視覚経路に対する傷害、視覚野に対する障害、原因不明の失明、1又は複数の脳神経に対する他の傷害、他の及び詳細が分からない神経に対する傷害。医薬物及び医学的及び生物学的な物質又による中毒、遺伝的又は外傷性筋萎縮障害;又は様々な器官の疾患又は症状、例えば、性腺、すい臓の変性症状、例えばI型及びII型糖尿病、腎臓の変性症状、例えば、ネフローゼを治療するためである。
本発明の更なる観点は、有効な量の本発明の1又は複数の本発明の化合物、又は本発明の医薬組成物を1又は複数の医薬的に許容できる添加剤もしくは担体と混合することを含んで成る医薬組成物を生産する方法、並びに有効な量の前記化合物、又は医薬組成物を象者に対して投与する方法である。
先に論じた方法の1つの実施態様において、前記化合物は、補綴装置との組み合わせにおいて使用されている。ここで、前記装置は補綴神経ガイド(prosthetic nerve guide)である。従って、更なる観点において、本発明は、先に規定した1もしくは複数の化合物もしくは医薬組成物を含んで成ることを特徴とする補綴神経ガイドに関連する。神経ガイドは当業者に公知である。
本発明の化合物は先に規定した化合物の使用に関連する。詳細には、本発明の化合物の使用は、医薬組成物を生産するためである。医薬組成物は、先に規定した全疾患及び症状を治療又は予防するために好適である。
更なる観点において、本発明は、本明細書中で規定した化合物を投与することによって先に論じた疾患又は症状を治療する方法に関連する。
実施例
以下は本発明を説明する例であり限定するものではない。
以下は本発明を説明する例であり限定するものではない。
材料と方法
材料
ラットNCAMの612〜705番目のアミノ酸に対応する15Nで標識したタンパク質と標識していないタンパク質(swissport p13596)を酵母P.パストリス(P.pastoris)中で生産した。この発現産物はベクターに由来する2つのN−末端残基、A及びGを含み且つ順番に1〜96の番号付けがされている。2mMの非標識タンパク質と1mMの15N標識したタンパク質(30mMのNaCl、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.27中)を用いた。1Hと15N共鳴をDQF−COSY、TOCSY、15N TOCSY−HSQC NMR実験のスペクトルから与えた。全データを298Kで得た。NOE制限は、80/200msNOESY及び125ms15N NOESY−HSQCスペクトル、上限が2.7、3.3及び6.0Å(もし制限がメチル基を含めば0.5Åずつ上昇する)に由来した。境界−120±40°及び−57±40°(3JHNHαカップリング制限に由来する)の40φ角度制限及び4χ1角度(バリンについて)を適用した。96種類の構造をX−PLORプログラムを使用して距離幾何学法/シュミレーションアニーリングプロトコルにより生じさせた。水素結合エネルギーを調査した後、80個の水素結合制限に、NH−O及びN−O距離についてそれぞれ2Å及び3Åの上限を適用した。全構造が0.3Å未満のNOE妨害、及び結合長及び角度についてそれぞれ0.01Å及び2°の理想化幾何学からのRms偏差を有した。
材料
ラットNCAMの612〜705番目のアミノ酸に対応する15Nで標識したタンパク質と標識していないタンパク質(swissport p13596)を酵母P.パストリス(P.pastoris)中で生産した。この発現産物はベクターに由来する2つのN−末端残基、A及びGを含み且つ順番に1〜96の番号付けがされている。2mMの非標識タンパク質と1mMの15N標識したタンパク質(30mMのNaCl、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.27中)を用いた。1Hと15N共鳴をDQF−COSY、TOCSY、15N TOCSY−HSQC NMR実験のスペクトルから与えた。全データを298Kで得た。NOE制限は、80/200msNOESY及び125ms15N NOESY−HSQCスペクトル、上限が2.7、3.3及び6.0Å(もし制限がメチル基を含めば0.5Åずつ上昇する)に由来した。境界−120±40°及び−57±40°(3JHNHαカップリング制限に由来する)の40φ角度制限及び4χ1角度(バリンについて)を適用した。96種類の構造をX−PLORプログラムを使用して距離幾何学法/シュミレーションアニーリングプロトコルにより生じさせた。水素結合エネルギーを調査した後、80個の水素結合制限に、NH−O及びN−O距離についてそれぞれ2Å及び3Åの上限を適用した。全構造が0.3Å未満のNOE妨害、及び結合長及び角度についてそれぞれ0.01Å及び2°の理想化幾何学からのRms偏差を有した。
HEK293細胞培養及びトランスフェクション
細胞をDMEM1965(10%FCS、10U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び58.4g/l Glutamaxを伴う)中で増殖せしめた。約0.8×106個の細胞を60mmプレート中に塗布して、製造説明書に従いLipofect AMIN PLUS(登録商標)試薬キット(Gibco BRL)を用いて、his標識した(C末端ヘキサヒスチジン)バージョンFGFR−1をコードするPcDNA3.1(+)プラスミド0.2μgをトランスフェクションする前に24時間に渡り培養した。細胞を更に24時間に渡り完全培地中で増殖せしめ、そして飢餓培地(0.5%FCSを伴うDMEM1965)へと一晩移した。
細胞をDMEM1965(10%FCS、10U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び58.4g/l Glutamaxを伴う)中で増殖せしめた。約0.8×106個の細胞を60mmプレート中に塗布して、製造説明書に従いLipofect AMIN PLUS(登録商標)試薬キット(Gibco BRL)を用いて、his標識した(C末端ヘキサヒスチジン)バージョンFGFR−1をコードするPcDNA3.1(+)プラスミド0.2μgをトランスフェクションする前に24時間に渡り培養した。細胞を更に24時間に渡り完全培地中で増殖せしめ、そして飢餓培地(0.5%FCSを伴うDMEM1965)へと一晩移した。
刺激、精製及びウェスタンブロット解析
組換えfIII .2又はFG−ループに由来する50μg/mlのNCAMと共に20分に渡りインキュベートしたかあるいは刺激しなかったFGFR−1トランスフェクト細胞を1mMのオルトバナジン酸塩を伴うPBS中、8Mの尿素中で溶解せしめた。FGFR−1を総溶解物からHis−標識部分を介してIMACカラム上で精製した。当量の溶解物をNi2+/NTAセファロース(Qiagen)上に置き、10mMのイミダゾールを伴う溶解緩衝液中で洗浄し、そしてhis標識したFGFR−1を250mMのイミダゾールを伴う溶解緩衝液中で溶出せしめた。試料にSDS−PAGE試料緩衝液を加え、そして抗−pentahis ab(#34660 Quiagen)又は抗−phosphotyrosine ab(PY20)(#11120 Transduction Laboratories)を用いて解析した。バンドを化学発光によって視覚化して密度を16bitのカメラを伴うSynGeneのGeneGnomeを使用して測定した。
組換えfIII .2又はFG−ループに由来する50μg/mlのNCAMと共に20分に渡りインキュベートしたかあるいは刺激しなかったFGFR−1トランスフェクト細胞を1mMのオルトバナジン酸塩を伴うPBS中、8Mの尿素中で溶解せしめた。FGFR−1を総溶解物からHis−標識部分を介してIMACカラム上で精製した。当量の溶解物をNi2+/NTAセファロース(Qiagen)上に置き、10mMのイミダゾールを伴う溶解緩衝液中で洗浄し、そしてhis標識したFGFR−1を250mMのイミダゾールを伴う溶解緩衝液中で溶出せしめた。試料にSDS−PAGE試料緩衝液を加え、そして抗−pentahis ab(#34660 Quiagen)又は抗−phosphotyrosine ab(PY20)(#11120 Transduction Laboratories)を用いて解析した。バンドを化学発光によって視覚化して密度を16bitのカメラを伴うSynGeneのGeneGnomeを使用して測定した。
ニューロンを24時間に渡りPermanox plastic(Nunc、Denmark)上で、20mMのHepes、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、0.4%のBSAを含有し、B27を補足したNeurobasal培地(Gibco BRL、USA)中、37℃、5%CO2にて密度6250細胞/cm2で増殖せしめた。24時間後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定化し、Coomassie Brilliant Blue R250で染色して解析した。
NCAMの第2F3モジュールの構造及び機能的特性並びにFGFレセプターとの可能な相互作用を調べるために、NCAMの第2F3モジュールの組換えタンパク質及びFGFレセプターの第2及び第3IgモジュールをP.パストリスの酵母発現系において生産した。P.パストリスは高等真核生物に類似してタンパク質の折りたたみ及びプロセッシングをすることができ、そして培地中へと分泌されたタンパク質を容易に精製できるので、この発現系を選択した。
実施例1
NCAMの第2F3モジュールの構造
モジュールの三次構造は1434の実験的に決定した制限(15の制限/残基)、即ち、1322の構造的に有意な核オーバーハウザー 増強(NOE)距離制限(プログラムDIANAによって決定した)、44の二面角制限(40φ及び4χ1)、及び68の水素結合制限に由来した。骨格原子に関する重ね書きした30の構造のオーバーレイを図1aに示している。重ね書きした30の構造の平均からの大域平方根(grobal root)平均二乗(rms)偏差(rmsd)は、骨格原子について0.25Åでありそして重原子について0.68Åである。この構造の7つのβストランドを示すリボン表示を図1bに示している。NOE統計値、エネルギー用語及び理想的な幾何学からの偏差を表1に示している。
NCAMの第2F3モジュールの構造
モジュールの三次構造は1434の実験的に決定した制限(15の制限/残基)、即ち、1322の構造的に有意な核オーバーハウザー 増強(NOE)距離制限(プログラムDIANAによって決定した)、44の二面角制限(40φ及び4χ1)、及び68の水素結合制限に由来した。骨格原子に関する重ね書きした30の構造のオーバーレイを図1aに示している。重ね書きした30の構造の平均からの大域平方根(grobal root)平均二乗(rms)偏差(rmsd)は、骨格原子について0.25Åでありそして重原子について0.68Åである。この構造の7つのβストランドを示すリボン表示を図1bに示している。NOE統計値、エネルギー用語及び理想的な幾何学からの偏差を表1に示している。
この構造は2つのβシートのサンドイッチにて配置された7つの逆平行βストランドからなり、あるのもは3つのストランドを含み(ABE)そして他のものは4つのストランドを含む(GFCD)。両方のβシートは右回りにねじれている。三重ストランドβシートは残基Lys7〜Gly13(A)、Ser18〜Ile24(B)、His59〜Lys63(E)からなり、そして4つのストランド状βシートは残基Ile33〜Ala42(C)、Ile51、Arg52(D)、Glu70〜Asn79(F)及びGly82〜Arg92(G)からなる。二次構造の成分の同定をプログラムPROCHECK及びMOLMOLを使用して行った。残基Lys85、Ala86及びVal76(G及びF βストランド)、並びに残基Ala77及びHis35、Tyr36(F及びC βストランド)を伴う2つの大きい種類のβ隆起(Chanら1993)がある。2つのβ−隆起が、4つのストランド状βシートの右回りねじれ構造に寄与している。A及びBストランドによって形成されたβヘアピン、並びにG及びFβストランドによって形成されたβヘアピンは良く規定されている。AストランドとBストランド間のβヘアピンは4:6型のIターン、平均ψ、Ψ値がGlu14(i+1残基)に関して−64±1°、12±2°、及びASP15(i+2残基)に関して−80±1°、24±2°に対応し、一方で、GストランドとFストランド間のβヘアピンはタイトな2:2型のIターン、平均ψ、Ψ値がGln80(i+1残基)について−38±3°、−42±4°、そしてGln81(i+2残基)について−107±13°、28±30°に対応する(Sibabdaら、1989;Wimot及びThornton、1990)。D−EとE−Fストランド間のループは見掛け上、歪んだII型ターン、平均ψ、Ψ値がi+1残基について−70±8°、93±17°(Ser55、D−Eループ)、−73±20°、154±3°(Trp67、E−Fループ)、並びに平均ψ、Ψ値がi+2残基について109±9°、57±8°(Gly56、D−Eループ)、46±3°、48±2°(Asn68、E−Fループ)のようである。2つのβ−シートで囲まれている疎水性中心は、残基Leu8、Met12、Ile19、Val21、Leu23、Ile33、Tyr36、Val38、Tyr40、Ala42、Ile51、Leu53、Val60、Leu62、Leu65、Tyr71、Val73、Val75、Ala77、Ala87、Phe89、Phe91及びThr93からなる。注目すべきことに、2つのトリプトファン、Trp47とTrp67は、C−Dループ及びE−Fループ中にそれぞれ局在している。そしてTyr74(Fストランド)は、モジュールの表層上に露出しており、そしてそれらは疎水性中心の一部ではない。
全30の構造は、通常適用される許容基準に一致する。即ち、NOE制限について0.5Åを超えそして二面角制限について5°を超える妨害はなく、結合長及び結合角度についての理想的幾何学からの平方根平均二乗偏差は、それぞれ0.01Å及び2°に満たなかった。各構造の質をプログラムWHAT IFを使用して評価した。30の構造一式に関する平均Zスコアは:第2全体詰め込み特性(generation packing quality)について−1.42±0.17、ラマチャンドランプロットに関して−1.94±0.27、χ1/χ2プロットについて−1.53±0.34、及び骨格構造に関して−2.10±0.20であった。30の構造の質を更にプログラムPROCHECKを使用して解析した。解析した全ての主鎖及び側鎖パラメーターは、2.0Åの解像度のX線構造と比較した場合、通常の範囲内であることが発見された。ラマチャンドランプロットの最も好ましい領域における残基の数は、75.3%であった。NOE妨害をプログラムAQUAを使用して分析した。最大NOE妨害は0.25Åであり、そしてrmsNOE妨害は、0.0189±0.00067Åであった。
実施例2
NCAMの第2F3モジュールはFGFレセプター及びATPに対して結合する
モジュールの指定のNMRスペクトルの配置及びその既知の三次構造を考えると、モジュールの表層上で結合部位を形成する残基を配置することが可能である。15N標識したタンパク質の15N−HSQCスペクトルにおいて、ペプチド窒素及びプロトンの両方伴う各アミノ酸に関するシグナルが確認できる。このシグナルの化学シフトの変化は、他の分子が結合することによって摂動するタンパク質中の残基を同定する方法を供する。NCAMの第2F3モジュールの15N標識した0.05mMの試料に対して、FGFレセプターの1mMの非標識第2もしくは第3Igモジュール、又は5mMのAMP−PCP(ATPの非加水分解型類似物)を添加した。化学シフトの有意な変化は、FGFレセプターの第2Igモジュールの存在下では確認されなかった(データを示していない)。FGFレセプターの第3lgモジュール又はATPの存在下で確認された化学シフトの変化を図2a〜dに示している。FGFレセプターの第3Igモジュールの存在下での1H及び15N化学シフトを、モジュールの構造上で、摂動1H及び15N化学シフトに関するカットオフ値0.006p.p.m及び0.03をそれぞれ使用してマッピングした。
NCAMの第2F3モジュールはFGFレセプター及びATPに対して結合する
モジュールの指定のNMRスペクトルの配置及びその既知の三次構造を考えると、モジュールの表層上で結合部位を形成する残基を配置することが可能である。15N標識したタンパク質の15N−HSQCスペクトルにおいて、ペプチド窒素及びプロトンの両方伴う各アミノ酸に関するシグナルが確認できる。このシグナルの化学シフトの変化は、他の分子が結合することによって摂動するタンパク質中の残基を同定する方法を供する。NCAMの第2F3モジュールの15N標識した0.05mMの試料に対して、FGFレセプターの1mMの非標識第2もしくは第3Igモジュール、又は5mMのAMP−PCP(ATPの非加水分解型類似物)を添加した。化学シフトの有意な変化は、FGFレセプターの第2Igモジュールの存在下では確認されなかった(データを示していない)。FGFレセプターの第3lgモジュール又はATPの存在下で確認された化学シフトの変化を図2a〜dに示している。FGFレセプターの第3Igモジュールの存在下での1H及び15N化学シフトを、モジュールの構造上で、摂動1H及び15N化学シフトに関するカットオフ値0.006p.p.m及び0.03をそれぞれ使用してマッピングした。
FGFレセプターの第3Igモジュールにより有意な摂動を経験したF3モジュールの残基は、Tyr36、Leu37、Val38、Tyr40、Leu53、Tyr71、Tyr74、Val75、Val76、Ala77、Asn79、Gln81、Gly82、Lys83、Ser84、Lys85、Ala87、His88、Phe89、Val90(図2a、b)であった。これらの残基の化学シフトの変化は、NCAMの第2F3モジュールに接近するFGFレセプターの第3Igモジュールの存在が、F3モジュールの摂動残基における化学環境を変化せしめることを示す。摂動した残基は、モジュール表層上の十分に規定され且つ密着した区域に局在しており、このことは、摂動残基が、NCAMの第2F3分子とFGFレセプターの第3lgモジュールとの間での相互作用のための結合部位の一部かあるいは近傍にあるかのいずれかを示す(図2E)。摂動残基の表層領域は、約2600Å2であり、これは、一般に生物特異的反応のために必要であると考えられる1000Å2の最小領域よりも有意に大きい。しかし、結合部位の表層領域はより小いようである。何故なら、おそらくいくつかの摂動残基が前記部位に極めて近接して位置するからである。
AMP−PCPによって摂動せしめられるF3モジュールの残基は、Tyr74及びVal75である(Fig2c〜d)。Tyr74の側鎖はモジュールの表層上に露出しており且つモジュールのATP結合コンセンサス配列:Ala77−Glu−Asn−Gln−Gln−Gly−Lys−Ser84及びLys85の極めて近傍に位置している(図2f)。Lys83及びLys85は両方ともモジュールの表層に露出しており、そして正に荷電したLys83とLys85の側鎖は、負に荷電したATPの三リン酸塩部分と相互作用することが可能である。その一方で、Tyr74の側鎖は、ATPのアデノシン部分との疎水性相互作用に関わる。ATPと第2F3モジュールの複合体の可能な配置を図2gに描いている。ATPによって摂動せしめられた残基(Try74とVal75)はFGFレセプターの第3Igモジュールによっても摂動せしめられ、これはATP結合部位とFGFレセプター結合部位が重複していることを示す。
実施例3
FGFレセプターは、NCAMの第2F3モジュールによって、そしてFGLペプチドによって活性化される
上記NMR実験によりNCAMの第2F3モジュールがFGFレセプターに対して結合することが裏付けられたので、この結合が生細胞中でFGFレセプター活性化を誘導できるかどうかを試験することに注目した。従って、HEK293細胞を24時間に渡りプラスチックプレート上で増殖せしめ、そして続いてFGFレセプター1のHis標識したバージョンでトランスフェクションして更に24時間に渡り培養した。細胞を以下に記載の化合物と20分に渡りインキュベーションした後、細胞を8Mの尿素中でリンスしてFGFレセプターをhis標識した部分を介して総溶解物から精製した。次いで、精製したFGFレセプター1を、his標識かあるいはホスホチロシンのいずれかに対する抗体を使用する免疫ブロットによって解析した。FGFレセプターの活性化をFGFレセプターリン酸化の量によって見積もった。
FGFレセプターは、NCAMの第2F3モジュールによって、そしてFGLペプチドによって活性化される
上記NMR実験によりNCAMの第2F3モジュールがFGFレセプターに対して結合することが裏付けられたので、この結合が生細胞中でFGFレセプター活性化を誘導できるかどうかを試験することに注目した。従って、HEK293細胞を24時間に渡りプラスチックプレート上で増殖せしめ、そして続いてFGFレセプター1のHis標識したバージョンでトランスフェクションして更に24時間に渡り培養した。細胞を以下に記載の化合物と20分に渡りインキュベーションした後、細胞を8Mの尿素中でリンスしてFGFレセプターをhis標識した部分を介して総溶解物から精製した。次いで、精製したFGFレセプター1を、his標識かあるいはホスホチロシンのいずれかに対する抗体を使用する免疫ブロットによって解析した。FGFレセプターの活性化をFGFレセプターリン酸化の量によって見積もった。
図3から、5μMのNCAMの第2F3モジュールの添加によりFGFレセプターのリン酸化が見掛け上コントロールの細胞に比較して約150%上昇した。FGFレセプターの第3Igモジュールによって摂動せしめられた、NCAMの第2F3モジュールの残基の大部分は、NCAMモジュールのF、Gβストランド及びFGターン領域中に位置している。従って、我々は、これらの残基に橋がけ(spanning)をする合成ペプチドが、第2F3モジュールと異なりうるかどうかを、そのFGFレセプターを活性する能力において試験した。確かに、残基Glu72〜Ala86(FGループペプチドと命名されている)に対応するペプチドの、濃度25μMでの添加も、リン酸化を約100%に増やし、FGFレセプターを活性化した。従って、第2F3モジュールのこれらの残基がFGFレセプターに対する結合に関連しているという考えが支持される(図3)。従って、本発明のデータは、NCAMの第2F3モジュールのFGFレセプターに対する結合は後者の活性化をもたらすことを示す。
実施例4
NCAMの第2F3モジュールによるFGFレセプターの活性化が神経突起生長を刺激する
NCAMの第2F3モジュール及びそのFGFレセプター結合部分(FGループペプチド)がFGFレセプターを活性化するので、F3モジュール及びFGループペプチドでNCAM刺激の特徴的機能、即ち、神経突起生成に反映されるようなニューロンの分化、を真似ることができると予測されうる。この予測を試験するために、胎児ラット海馬から分離させたニューロンをプラスチック上に播いて以下に記載の化合物の存在下で24時間に渡り増殖せしめた。この後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定化し、Coomasie Brilliant Blue R250で染色して、神経突起の長さを立体学的方法(Ronnら、2000)で測定した。
NCAMの第2F3モジュールによるFGFレセプターの活性化が神経突起生長を刺激する
NCAMの第2F3モジュール及びそのFGFレセプター結合部分(FGループペプチド)がFGFレセプターを活性化するので、F3モジュール及びFGループペプチドでNCAM刺激の特徴的機能、即ち、神経突起生成に反映されるようなニューロンの分化、を真似ることができると予測されうる。この予測を試験するために、胎児ラット海馬から分離させたニューロンをプラスチック上に播いて以下に記載の化合物の存在下で24時間に渡り増殖せしめた。この後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定化し、Coomasie Brilliant Blue R250で染色して、神経突起の長さを立体学的方法(Ronnら、2000)で測定した。
位相差顕微鏡写真(図4a、b)から分かるように、5μMの濃度でのNCAMの第2F3モジュールの添加により、細胞あたりの神経突起の長さがコントロールの、刺激していない神経突起に比較して上昇した。この効果を用量反応試験(図4c)で定量化し、F3モジュール、FGループペプチド及び当該ペプチドのトランケーショントランケーションバージョン(Ala77〜Lys83)は全て神経突起生長を誘導し、そして神経突起生成を誘導した増殖因子に典型的なベル型用量反応曲線(Hattenら、1988)を示す。ペプチドの潜在能力は、最大効果のためには10倍高い濃度が必要であることに反映されるように、モジュールのそれよりも低く、そしてトランケーション形態は拡張形態よりも効果が低かった。第2F3モジュール及びFGループペプチドの刺激効果は、NCAM刺激した神経突起の生長の阻害物質、及びFGFレセプターに対する抗体によって消されうる。コントロール条件下での抗体の前記効果及び第2F3モジュール又はFGループによって誘導された神経突起の生長に対する効果を図4dに示している。後者の場合に、完全阻害が達成され、更に、モジュール及びFGループペプチドがFGFレセプターと相互作用するという考えが支持される。
FGループペプチドの機能的に重要なアミノ酸を特定するために、ペプチドを、トランケーション及び様々なアミノ酸の置換することによって解析した。FGループペプチドのトランケーション(N及びC末端から)したバージョンを2つ、即ち、9量体Val76〜Ser84及び7量体Ala77〜Lys83を生産した。トランケーションしたペプチドは、FGループベプチドよりも実質上に短いが、それらは両方とも全体FGループペプチドに比べて約50%の刺激効果を維持しており(図5a)、これは、Fβストランド及びGβストランド間のターン領域(Gln80、Gln81)並びに当該ターンの両側に近接する僅かなアミノ酸が、FGFレセプターとNCAMの第2F3レセプターとの間での相互作用のために重要であることを示している。続いて7量体ペプチドをいわゆるAlaスキャンによって解析した。ここで各連続するアミノ酸をアラニンで置換した1組のペプチドを試験した。図5aから分かるように、ペプチド中の任意のアミノ酸の置換は神経突起生成の潜在力を低下させることにつながり、そして機能の完全なロスは、もしGlu78、Asn79、Gln80、Gly82、Lys83をAlaで置換した場合に達成され、これはこれらの残基がFGFレセプターとの相互作用のためには重要であることを示している。FGループペプチド全体において、FGループのターン領域(Gln80、Gln81)に由来する2つのアミノ酸のアラニンへの2重置換も、ペプチドの完全不活性化をもたらした(図5a)。これらの発見は、第2F3モジュール中のAsn79、Gln81、Gly82及びLys83が、FGFレセプターの第3モジュールに対して結合することによって摂動せしめられることによって裏付けられる。しかし、見掛け上ATPとの相互作用のために重要である残基(Tyr74、Lys83及びLys85)をFGループペプチド中、アラニンに置換した場合、このペプチドは非突然変異ペプチドに比較して約60%の刺激効果を維持していた(図5a)。F3モジュールにおける7量体ペプチドの構造をFGFレセプター天然リガンド、塩基性FGF(PDBコード:4FGF、Erikssonら、1993)の公知の3次構造と比較して、当該ペプチドは、塩基性FGF中のループ領域、Ala42〜Arg48に類似する構造と配列を有していたことを発見した。両方のペプチドの配列及び構造配置を図6a中に示している。塩基性FGFに由来する7量体ペプチド及びAla置換を伴う一連のペプチドを、それらの神経突起生長を誘導する能力について試験し、そして図5bから分かるように、塩基性FGFに由来するペプチドはNCAMの第2F3モジュールに由来する7つのアミノ酸に類似して、神経突起生長をある程度誘導した。任意のアミノ酸のアラニンへの置換は、機能の完全なロスをもたらした。
ATPは、NCAMの第2F3モジュールによるFGFレセプターの活性化を阻害した(図3)ので、ATPも当該モジュールの神経突起生成活性を阻害することができると予測した。この予測を試験するために、ニューロンを、ATPかあるいはATPの加水分解不可能型類似物、AMP−PCPの存在下(0、0.4又は1mMの濃度で添加した)、以下に記載の化合物で刺激した。図7から分かるように、ATPとAMP−PCPはどちらも、第2F3モジュール及びFGループによって誘導される神経突起生成効果を実質的に減少させたが、これらの化合物を単独で添加した場合、それらは任意の効果をもたなかった。AMP−PCPの場合、F3モジュールとFGループペプチド両方の効果の完全阻害を達成し、そしてATPの場合、完全阻害はFGループの効果のみで達成した。このことは、ATPはその加水分解不可能型類似物AMP−PCPよりも有力な阻害物質ではないことを示している。最も有意には、ATPを結合するために重要であることが予測されるFGループのアミノ酸残基(Tyr74、Lys83及びLys85)をアラニンで置換した場合、ペプチドはその神経突起生成潜在力を維持していた。しかし、ペプチドの刺激効果はATPによっては阻害されることはなく(図7)、これは、ATPの結合が、F3モジュールとFGFレセプターとの相互作用を調節するという考えを支持している。
ニューロン中でのNCAMの第2F3モジュールによるFGFレセプターの活性化は、神経突起生成を誘導しそしてこの効果はATPによって阻害できうることをこれらの結果が示す。
本発明の化合物を試験するための生存アッセイ
7日齢ラットに由来する小脳顆粒ニューロン(GCN)を高濃度(40mM)のカリウムの存在下で7〜8日に渡り増殖せしめた。細胞を、低濃度(5mM)のカリウムを含有する血清を伴わない培養培地(基本Eagle培地BME)で2度洗浄して、FGLペプチドを補足した血清を伴わない培地中で2日に渡り増殖せしめた。培養物を、MTSの減少率を測定することによって、細胞生存率(D‘Melloら、1997;Villalbaら、1997;Skaperら、1998)についてアッセイした。MTSは新規のテトラゾリウム化合物(Promega、USA)であり、それは細胞により、組織培養培地中に可溶性であるフォルマザンへと生物還元される。フォルマザンの490nmでの吸光度を、96ウェルアッセイプレートから直接、更なる方法を伴わずに測定する。MTSの水溶性フォルマザンへの転換は、代謝活性のある細胞中で発見されるデヒドロゲナーゼ酵素によって達成される。フォルマザン生産物の量は、490nmの量での吸光度によって測定した場合、培養物中で生存する細胞の数に直接比例する(Yao及びCooperら、1995)。
7日齢ラットに由来する小脳顆粒ニューロン(GCN)を高濃度(40mM)のカリウムの存在下で7〜8日に渡り増殖せしめた。細胞を、低濃度(5mM)のカリウムを含有する血清を伴わない培養培地(基本Eagle培地BME)で2度洗浄して、FGLペプチドを補足した血清を伴わない培地中で2日に渡り増殖せしめた。培養物を、MTSの減少率を測定することによって、細胞生存率(D‘Melloら、1997;Villalbaら、1997;Skaperら、1998)についてアッセイした。MTSは新規のテトラゾリウム化合物(Promega、USA)であり、それは細胞により、組織培養培地中に可溶性であるフォルマザンへと生物還元される。フォルマザンの490nmでの吸光度を、96ウェルアッセイプレートから直接、更なる方法を伴わずに測定する。MTSの水溶性フォルマザンへの転換は、代謝活性のある細胞中で発見されるデヒドロゲナーゼ酵素によって達成される。フォルマザン生産物の量は、490nmの量での吸光度によって測定した場合、培養物中で生存する細胞の数に直接比例する(Yao及びCooperら、1995)。
細胞の数を決定して、高濃度のカリウムの存在下で生存する細胞の量を100%で設定した。図8により大まかに分かるように、脳に由来する神経栄養性因子又は塩基性繊維芽細胞増殖因子の存在下では、60%のみが生存した。FGLを2〜250μg/mlのソード(sode)範囲で添加した場合、統計的に有意な生存率が、用量250μg/mlでのFGLペプチド単量体形態のポジティブコントロールの最大90%で確認された。
実施例6
FGループ断片及び変異体
天然細胞接着分子L1及びNCAMのFGループに由来するペプチド(L1の第3F3モジュール及びNCAMの第1F3モジュール)を様々な長さで調製した(図9aを参照のこと)。そしてそれらの一次海馬ニューロンから神経突起が生長することに対する効果を、25μMの濃度で様々なペプチドを添加することで試験した(図9b)。NCAMペプチドをFN3,1に言及し且つL1ペプチドをL1に言及した。図9aで示した変異を各ペプチド中のアミノ酸の数で示している。図から分かるように、ペプチドは神経突起生長に対する刺激効果を有しており、NCAMの第1フィブロネクチンIII 型モジュールのFgループの9個のアミノ酸の変異のために、そしてL1の第3フィブロネクチンIII 型モジュールのFgループの9個のアミノ酸の変異のために統計的有意に到する。
FGループ断片及び変異体
天然細胞接着分子L1及びNCAMのFGループに由来するペプチド(L1の第3F3モジュール及びNCAMの第1F3モジュール)を様々な長さで調製した(図9aを参照のこと)。そしてそれらの一次海馬ニューロンから神経突起が生長することに対する効果を、25μMの濃度で様々なペプチドを添加することで試験した(図9b)。NCAMペプチドをFN3,1に言及し且つL1ペプチドをL1に言及した。図9aで示した変異を各ペプチド中のアミノ酸の数で示している。図から分かるように、ペプチドは神経突起生長に対する刺激効果を有しており、NCAMの第1フィブロネクチンIII 型モジュールのFgループの9個のアミノ酸の変異のために、そしてL1の第3フィブロネクチンIII 型モジュールのFgループの9個のアミノ酸の変異のために統計的有意に到する。
NCAMは、25個以上のエキソンを含む単一の遺伝子によってコードされている。前駆体mRNAの選択的スプライシングにより、様々な成熟mRNA種及びそれによるNCAMのタンパク質イソ型が生産されて良い。3つの主要なNCAMイソ型は、NCAMが原形質膜に対して結合する方法及び細胞内NCAMドメインのサイズをそれぞれ決定するエキソン15と18の選択適スプライシングによって生み出されている。神経系において、グリコシルスルファチジルイノシトール(GPI)が係留した120kDaのイソ型は、グリア細胞の表層で発現しており、膜貫通型の140kDaのイソ型はニューロンとグリア細胞の両方で発現しており、その一方で膜貫通型の180kDaのイソ型は主にニューロンの表層上で発見されている。NCAMの細胞外部分は、5つのIg様相同モジュール(Ig1、Ig2、Ig3、Ig4とIg5)及び2つのIII 型フィブロネクチンモジュール(F3,1とF3,2)を含んで成る(Berezinら、2000)。NCAMの個々の細胞外モジュールは、タンパク質の機能における独特な役割を果たすことが示されており、詳細には、F3,1及びF3,2はNCAMが介在した細胞接着及び栄養増殖に関わることが示されている(Freiら、1992;Kasperら、1996、Stahlhutら、1997)。
シグナル伝達において、NCAMは、例えば、FGFレセプターなどのチロシンリン酸化、及び細胞外カルシウム濃度増加につながる細胞外シグナルを変換する。DohertyとWalsh(1999)は、NCAM、Nカドヘリン及びL1がニューロン中の繊維芽細胞増殖因子(FGFR)を活性化することによって軸索の生長を刺激することを記載している。
神経細胞の生存は、いくつかの参考文献中で議論されてきた。例えば、Hullyら(1998)及び米国特許第5,792,743号は、L1神経細胞接着分子は、毒素MPP+の存在下で培養された胎児中脳ドーパミン作用性神経細胞の生存及び分化を刺激できることを開示している。
本発明の背景において、NCAM分子とはデータベースSWISSPROT、アクセスNo.:P13596に示されている配列を有するNCAMを意味する。
実施例6
FGループ断片及び変異体
天然細胞接着分子L1及びNCAMのFGループに由来するペプチド(L1の第3F3モジュール及びNCAMの第1F3モジュール)を様々な長さで調製した(図9aを参照のこと)。そしてそれらの一次海馬ニューロンから神経突起が生長することに対する効果を、25μMの濃度で様々なペプチドを添加することで試験した(図9b)。NCAMペプチドをFN3,1に言及し且つL1ペプチドをL1に言及した。図9aで示した変異を各ペプチド中のアミノ酸の数で示している。図から分かるように、ペプチドは神経突起生長に対する刺激効果を有しており、NCAMの第1フィブロネクチンIII 型モジュールのFgループの9個のアミノ酸の変異のために、そしてL1の第3フィブロネクチンIII 型モジュールのFgループの9個のアミノ酸の変異のために統計的有意に到する。
FGループ断片及び変異体
天然細胞接着分子L1及びNCAMのFGループに由来するペプチド(L1の第3F3モジュール及びNCAMの第1F3モジュール)を様々な長さで調製した(図9aを参照のこと)。そしてそれらの一次海馬ニューロンから神経突起が生長することに対する効果を、25μMの濃度で様々なペプチドを添加することで試験した(図9b)。NCAMペプチドをFN3,1に言及し且つL1ペプチドをL1に言及した。図9aで示した変異を各ペプチド中のアミノ酸の数で示している。図から分かるように、ペプチドは神経突起生長に対する刺激効果を有しており、NCAMの第1フィブロネクチンIII 型モジュールのFgループの9個のアミノ酸の変異のために、そしてL1の第3フィブロネクチンIII 型モジュールのFgループの9個のアミノ酸の変異のために統計的有意に到する。
Claims (51)
- 繊維芽細胞増殖因子(FGF)レセプターと相互作用することができる化合物であって:
(i)神経細胞接着分子(NCAM)の第2フィブロネクチンIII (Fn3,2)モジュール、もしくはその断片、もしくは変異体、及び/又は
(ii)NCAMの第1フィブロネクチンIII (Fn3,1)モジュールの断片、もしくは変異体、
を含んで成り、
前記断片、もしくは前記変異体はNCAMのFn3,2モジュールのFG−ループに対して相同的である化合物。 - 前記FGFレセプターが、FGFレセプターI、FGFレセプターII、FGFレセプターIII 、又はFGFレセプターIVから選択されている、請求項1に記載の化合物。
- FGFレセプターシグナル伝達を刺激することができる、請求項1又は2に記載の化合物。
- 前記FGFレセプターIシグナル伝達が刺激されている、請求項3に記載の化合物。
- 前記NCAMの第2Fn3,2モジュール、もしくはその断片、もしくは変異体を含んで成る、請求項1に記載の化合物。
- (ii)が式L1−A−L2−B−L3−C−L4
(式中、
A、B、Cのうち1つが塩基性アミノ酸から選択されており、
A、B、Cのうち1つが疎水性アミノ酸から選択されており、
A、B、Cのうち1つがグリシンであり、そして
L1、L2、L3、L4は、化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは0〜5の整数である)
のアミノ酸配列を含んで成る、請求項1に記載の化合物。 - Bがグリシンであり、Aが塩基性アミノ酸残基であり、そしてCが疎水性アミノ酸残基である、請求項6に記載の化合物。
- Aがリジン(K)であり、そしてCがロイシン(L)又はアラニン(A)である、請求項7に記載の化合物。
- 配列NGKGL又はNGRGLを含んで成る、請求項6〜8のいずれか1項に記載の化合物。
- (i)が式L1−A−L2−B−L3−C−L4−D−L5
(式中、
A、B、C、Dのうち1つが塩基性アミノ酸残基から選択されており、
A、B、C、Dのうち1つが疎水性アミノ酸残基から選択されており、
A、B、C、Dのうち1つが酸性アミノ酸残基から選択されており、
A、B、C、Dのうち1つがグリシンであり、そして
L1、L2、L3、L4及びL5は、化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは0〜5の整数である)
のアミノ酸配列を含んで成る、請求項1に記載の化合物。 - 前記化合物が、NCAM分子のFn3,2モジュールのFGループ、もしくはその断片、もしくは変異体に対して相同的なペプチドを含んで成る、請求項1〜10のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記化合物が、モチーフA−E−N−Q−X−X−K(式中、Xは任意のアミノ酸残基でありうる)を有するペプチド配列を含んで成る、請求項11に記載の化合物。
- 前記Xが、グルタミン(Q)、アラニン(A)及び/又はアスパラギン(N)及び/又はグリシン(G)から選択されている、請求項12に記載の化合物。
- 前記アミノ酸配列が、式AENQ−L4−G(式中、L4は請求項10に規定された通りである)を有する、請求項10に記載の化合物。
- (i)が、式A−B−L3−L4−C−L4
(式中、
Aは疎水性アミノ酸残基であり、
Bは酸性アミノ酸残基であり、
L3は1又は数個の親水性アミノ酸残基であり、
L4は請求項10においてL4について規定したようなアミノ酸配列であり、そして
Cがグリシンである)
のアミノ酸配列を含んで成る、請求項1に記載の化合物。 - 式L1−A−L2−B−L3−C−L4−D−L5−E−L6
(式中、
L1、L2、L3又はL4のうち少なくとも1つがアミノ酸残基Yを含んで成り且つ他の1つがアミノ酸残基Kを含んで成り、
L5及び/又はL6は個別にKであり、そしてA、B、C、D、Eは任意のアミノ酸であるが、但しY〜K間の距離は5アミノ酸以上、例えば、7アミノ酸残基以上、例えば9アミノ酸残基以上、例えば11アミノ酸残基以上である)
の配列を含んで成る、請求項1〜16のいずれか1項に記載の化合物。 - アデノシン三リン酸(ATP)を結合することができる、請求項17に記載の化合物。
- 前記化合物が二量体である、請求項1〜18のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記化合物が多量体、例えばデンドリマーである、請求項1〜18のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記化合物が、独立してFGFレセプターを提示する細胞のFGFレセプターシグナル伝達を刺激すること及び/又は増殖を調節すること及び/又は分化を誘導すること及び/又は再生、ニューロンの可塑性及び/又は生存を刺激することができる単量体を含んで成る、請求項1〜20のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記単量体が相同物である、請求項19又は20に記載の化合物。
- 前記単量体が異種である、請求項19又は20に記載の化合物。
- 前記FGFレセプターシグナル伝達は、FGFレセプターを発現する細胞に対して所定の濃度の前記化合物が適用された場合のFGFレセプターのリン酸化として測定されている、請求項1〜23のいずれか1項に記載の化合物。
- リン酸化の程度がコントロール値の20%超である、請求項24に記載の化合物。
- 前記化合物の所定濃度が、0.1〜200μM、例えば、1〜200μM、例えば10〜200μM、例えば20〜180μM、例えば30〜160μM、例えば40〜140μM、例えば50〜130μM、例えば60〜120μM、例えば70〜110μM、例えば80〜100μMである、請求項24又は25に記載の化合物。
- 3〜100アミノ酸残基の範囲のアミノ酸残基、例えば10〜90アミノ酸残基、例えば15〜85アミノ酸残基、例えば20〜80アミノ酸残基、例えば25〜75アミノ酸残基、例えば30〜70アミノ酸残基、例えば35〜65アミノ酸残基、例えば40〜60アミノ酸残基、例えば45〜55アミノ酸残基を含んで成る、請求項1に記載の化合物。
- 3〜20アミノ酸残基の範囲のアミノ酸残基、例えば3〜19アミノ酸残基、例えば3〜18アミノ酸残基、例えば3〜17アミノ酸残基、例えば3〜16アミノ酸残基、例えば3〜15アミノ酸残基、例えば3〜14アミノ酸残基、例えば3〜13アミノ酸残基を含んで成る、請求項1に記載の化合物。
- 細胞の増殖の及び/又は分化及び/又は再生及び/又はニューロンの可塑性及び/又は生存を調節することができる、請求項1に記載の化合物。
- 請求項1〜29のいずれか1項に記載の化合物を1種類以上含んで成る医薬組成物。
- 前記化合物が、NCAM Fn3,2モジュール、もしくはその断片、もしくはその変異体である、請求項30に記載の医薬組成物。
- 前記化合物が二量体として処方されている、請求項30〜31のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記化合物が多量体として処方されている、請求項30〜31のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 経口、経皮、筋内、静脈内、頭蓋内、鞘内、脳室内、鼻腔内又は肺内投与のために処方されている、請求項30〜33のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記投与が連続である、請求項34に記載の医薬組成物。
- 有効な量の1又は複数の請求項1〜29のいずれか1項に記載の化合物、又は請求項30〜35のいずれか1項に記載の医薬組成物と1又は複数の医薬的に許容できる添加剤もしくは担体とを混合することを含んで成る、医薬組成物を生産する方法。
- 請求項1〜29のいずれか1項に記載の化合物が補綴装置との組み合わせにおいて使用されている、請求項36に記載の方法。
- 前記装置が補綴神経ガイド(nerve prosthetic guide)である、請求項37に記載の方法。
- 前記補綴神経ガイドが、1種類以上の請求項1〜29のいずれか1項に記載の化合物、又は請求項30〜35のいずれか1項に記載の医薬組成物を含んで成ることを特徴とする、請求項38に記載の方法。
- 有効な量の1種類以上の請求項1〜30のいずれか1項に記載の化合物、又は請求項31〜36のいずれか1項に記載の医薬組成物が対象者に対して投与されている、請求項36〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜29のいずれか1項に記載の化合物の使用。
- 前記化合物が医薬の製造のためである、請求項41に記載の使用。
- 前記化合物及び/又は医薬組成物が、中枢及び末梢神経系の疾患もしくは症状、例えば、手術後の神経傷害、外傷性神経傷害、原因は例えば脊髄傷害、神経繊維の髄鞘形成傷害、虚血後傷害、原因は例えば動悸、多発脳梗塞性痴呆、多発性硬化症、糖尿病による神経変性、神経−筋変性、統合性失調症、気分障害、例えば躁うつ病、アルツハイマー病、パーキンソン病、又はハンチントン病の治療ためである、請求項41〜42のいずれか1項に記載の使用。
- 前記化合物及び/又は医薬組成物が、例えば、神経−筋連絡の機能損傷による症状を含む筋肉の疾患もしくは症状、例えば、遺伝的もしくは外傷性筋萎縮性障害の治療のため;又は、様々な器官の疾患もしくは症状、例えば、性腺、すい臓の変性症状、例えばI型及びII型の糖尿病、腎臓の変性症状、例えばネフローゼの治療のためである、請求項41〜42のいずれか1項に記載の使用。
- 前記化合物及び/又は医薬組成物が、例えば、急性心筋梗塞後の心筋細胞の細胞死を予防するためである、請求項44に記載の使用。
- 前記化合物及び/又は医薬組成物が血管再開通術のためである、請求項45に記載の使用。
- 前記化合物及び/又は医薬組成物が創傷治癒を促進するためである、請求項42に記載の使用。
- 前記化合物及び/又は医薬組成物が血管形成を阻害することができる、請求項42に記載の使用。
- 前記化合物及び/又は医薬組成物がガンを治療するためである、請求項42又は48に記載の使用。
- 前記化合物が、学習する能力及び/又は短期及び/もしくは長期記憶の刺激のためである請求項42又は43に記載の使用。
- 細胞の増殖及び/又は分化及び/又は再生及び/又はニューロンの可塑性及び/又は生存を調節することができる、請求項42に記載の使用。
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