CN109354605B

CN109354605B - 一种Nogo-A受体结合肽及其衍生物与应用

Info

Publication number: CN109354605B
Application number: CN201811100009.4A
Authority: CN
Inventors: 肖飞; 孙中轻; 代小勇; 林熙; 武征; 苏志坚; 黄亚东; 罗焕敏
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2015-07-17
Filing date: 2015-07-17
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2035-07-17
Also published as: CN105061560B; CN109354605A; CN105061560A

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种Nogo‑A受体结合肽及其衍生物与应用。所述的Nogo‑A受体结合肽其氨基酸残基序列为：HIYTALV或GFATITG；该结合肽的衍生物为Nogo‑A受体结合肽氨基酸侧链基团上、Nogo‑A受体结合肽片段的氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物，或者为Nogo‑A受体结合肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物；该结合肽及其衍生物在体外能结合NgR，通过阻断NgR与Nogo‑A的结合而促进神经再生，治疗中枢神经损伤疾病所导致的神经再生障碍，促进中枢神经功能的恢复，能够在医学与生物学领域得到广泛的应用。

Description

一种Nogo-A受体结合肽及其衍生物与应用

本发明专利申请是申请号为“CN201510424727.7”的分案申请，原申请的申请日为“2015年07月17日”，申请号为“CN201510424727.7”，发明名称为“一种Nogo-A受体结合肽及其衍生物与应用”。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种Nogo-A受体结合肽及其衍生物与应用。

背景技术

随着人类寿命的延长，人口老龄化问题日益突出，一些中枢神经系统(centralneverous system,CNS)的疾病发病率越来越高，而有效治疗手段缺乏。主要原因是中枢神经系统是处理信息的人体司令部，其功能依赖于大量的基本结构单位神经元所形成的神经网络。由于神经元本身不能分裂，一旦神经元受损只能通过神经突起的再生长而达到神经网络的重新连接，进而达到功能的恢复，而受损神经元本身再生的能力很弱，这就导致了主要的中枢神经损伤疾病没有很好的疗效。中枢神经损伤疾病包括有神经外伤、脑中风、神经退行性疾病等。目前这类疾病还没有有效的药物能让病人的神经功能得以恢复。哺乳动物外周神经(peripheral neverous system,PNS)损伤后有很强的再生能力，而中枢神经系统(CNS)再生能力很差，损伤后的突起及神经元几乎不能再生。由于这个原因，CNS外伤、中风等疾病都不能完全恢复其感觉、运动和认知功能。早在1913年，Cajal就认识到神经再生的能力受到外在因素限制。他观察到如果损伤视束，视束本身没有再生能力。如果将外周神经移植物缝合到损伤处，一些突起能够生长进去。他认为，中枢通路不能再生是由于神经元所处的神经胶质环境造成的。许多年过去，Cajal的观察被人们遗忘。一直到1970年，许多临床和神经学家都相信中枢神经再生是不可能的。

1988年，Schwab和Caroni在培养背根神经节细胞(dorsal root ganglia,DRG)和诱导分化神经母细胞瘤中加入来源于PNS的鞘磷酯或CNS的鞘磷酯或少突胶质细胞，发现CNS的鞘磷酯或少突胶质细胞能引起生长锥的崩溃，突起生长受抑制，而来源于PNS的鞘磷酯对其生长没有影响。这表明CNS的再生障碍与CNS的鞘磷酯有关。他们用SDS-PAGE方法从成体中枢髓磷脂中分离出大小为35kD和250kD两个蛋白质，取名为NI-35/250，有特别地抑制DRG和神经母细胞瘤突起生长的作用。而且用此制备的抗体能在一定程度上提高脊髓损伤后皮质脊髓通路的再生。

2000年，3个研究小组独立的确定了NI-250的编码序列，并命名为Nogo-A。Nogo基因通过不同的剪接能产生3种变异体：Nogo-A(1162个氨基酸)，Nogo-B(373个氨基酸)和Nogo-C(199个氨基酸)。他们的C-末端含有相同的188个氨基酸，这188个氨基酸与reticulon(RTN)基因家族成员具有同源性。Reticulon是由内质网相联系的蛋白质组成的一个家族，大部分蛋白质功能还不清楚，为了和已发现的其它3种相区别，Nogo蛋白又被称为RTN4。3个Nogo异构体含有两个疏水区，使蛋白质两次跨膜。两个跨膜区之间的细胞表面中间环区域，有一段长度为66个氨基酸的肽段，称为Nogo-66，它具有抑制轴突生长的活性。Nogo-A另一个具有抑制突起生长活性的区域为Nogo-A_544-725。它处在蛋白质的N末端，所以也称之为氨基-Nogo-A(amino-Nogo-A)。不久便找到了与Nogo-66结合的Nogo-66的受体(nogo-66receptor,NgR)。后来又发现了另外两个同源的NgR，因此与Nogo-66结合的受体后来又被称为NgR1。Nogo-A主要在少突胶质细胞中表达，但在许多神经元中也能表达。

除Nogo-A以外，另两个髓磷脂来源的生长抑制分子，髓磷脂相关糖蛋白(oligodendrocyte-myelin glycoprotein,OMG)和少突细胞髓磷脂糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)也能结合NgR，产生抑制效应。NgR是一种糖基磷脂酰肌醇锚定(glycosylphosphatidyl-anchored,GPI-anchored)的蛋白质，由473个氨基酸组成。该蛋白N端富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat,LRR)的结构域，其C末端富含半胱氨酸结构。NgR借助于C末端的GPI结构附着于细胞膜表面。NgR并不是跨膜蛋白，而是GPI锚定的蛋白质，向细胞内传递信号需要其它蛋白质参与，共同形成受体复合物来传导信号。NgR受体复合物中的p75NTR和LINGO-1能够转导生长抑制信号。进一步研究发现，在许多成体神经元表达的肿瘤坏死因子受体家族成员——TAJ/TROY，能够代替p75NTR，作为NgR1的共受体。

封闭Nogo-66受体可使神经元对Nogo-66不敏感而免遭轴突再生障碍。因而，推测阻断Nogo-66与其受体结合将有助于人类中枢神经系统损伤的恢复。Nogo-66受体也就成为了治疗中枢神经系统外伤、中风等疾病的一个潜在靶标。使用Nogo-66受体拮抗剂NEP1-40，能减弱Nogo-A对突起生长的抑制。当大鼠脊髓损伤后，给予NEP1-40治疗可促进皮质脊髓束和中缝脊髓束纤维再生，动物运动功能明显改善。小鼠局部脑梗塞后，使用NEP1-40能提高轴突的再生，运动功能恢复。在Nogo-66受体基因敲除小鼠身上也观察到，脊髓损伤后红核脊髓束和中缝脊髓束纤维再生增强。

Nogo-A在中枢神经系统疾病中的作用也已得到证实，在脊髓损伤和中风中抑制Nogo-A的表达有利于轴突生长和恢复。IN-1单克隆抗体具有抗Nogo-A的作用，同时具有较强的中和轴突生长抑制作用。已有研究表明在脊髓损伤后注射IN-1，神经纤维再生距离增长并且功能得到了恢复，IN-1也能够引起中风后神经元的生长。更有针对Nogo-A蛋白特殊区域例如N末端和C末端靶向抗体，能够有利于中风后功能的改善并有利于皮质脊髓束再生。卡蒂和马库斯等研究发现，在中风的老鼠中，Nogo-A或Nogo-66受体(NgR)基因缺陷实验组以及服用NgR抗体和Nogo-A拮抗剂组的老鼠具有更强的神经代偿性发芽和结构可塑性。

Nogo-A通过特异性结合受体NgR通过多位点的相互作用激活，启动神经细胞内的信号转导通路抑制轴突再生和结构的重塑性，从而在缺血缺氧脑损伤疾病发生发展中发挥作用。有研究表明大鼠脑缺血缺氧后及受体表达均增高，强烈抑制神经纤维的再生作用，参与脑缺血一系列的病理生理过程。郎嘉等研究发现，全脑缺血引起、及在皮层的表达显著增强，高压氧治疗可显著减轻神经损伤，降低、及在皮层的表达。赵红等研究表明，在脑梗死早期，表达增强，应用抗体可明显促进受损的中枢神经系统轴突生长和功能恢复。这些研究表明，调控Nogo-A/NgR可影响脑缺血的发展和结果。

近年研究表明，Nogo-A和NgR在神经退行疾病中(AD和PD)发病中有一定的作用。2006年Gil和Zhu等报道，在AD海马组织中，Nogo-A是过表达的，并与老年斑相联系，Nogo-66受体是也过表达的，与神经原纤维缠结相联系。同年Park等相继在《The Journal ofNeuroscience》上报道，在AD患者脑内，Nogo-A和Nogo-66受体的分布均发生异常。同时发现NgR与APP相互作用可降低淀粉样蛋白(amyloid beta protein，Aβ)沉淀所形成的老年斑。表现为阻止NgR表达则增加AD转基因模型小鼠脑内APP的水平及增加Aβ沉积形成的老年斑，使得突起营养发生障碍，而给这些小鼠灌注可溶性NgR片断则降低Aβ水平及Aβ沉淀所形成的老年斑，突起营养不良的状况得到明显改善。在转APP基因的SH-SY5Y细胞系，NgR过度表达也同样能降低Aβ产生。以上研究提示Nogo-66受体可作为APP处理过程中的阻断剂。Nogo-66受体提供了一个能干预AD病理过程的新靶标，使人们关注突起功能障碍在该病中所起的作用。

研究如何促进神经元的再生能力，恢复神经网络成为治疗神经损伤是治疗神经损伤的关键。阻断Nogo-66与其受体结合将有助于中枢神经系统损伤后的恢复。因此，Nogo-66受体也就成为了治疗中枢神经系统外伤、中风等疾病的一个潜在靶标。

随着我国社会老龄化的加快，神经外伤、脑中风和神经退行性病变的发生率及患病率逐年升高。这些疾病给社会带来巨大的经济损失，给病患个人及家庭带来了不可估量的负担，因此研究治疗神经损伤类病病，如神经外伤、脑中风和神经退行性疾病的特效药具有重要的社会现实意义。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种Nogo-A受体结合肽，该结合肽与Nogo-A受体(NgR)具有特异性高亲和力，且特异性竞争Nogo-A与Nogo-A受体的结合位点，能够抑制Nogo-A结合NgR。

本发明的另一目的在于提供上述Nogo-A受体结合肽的衍生物，该衍生物也能够与Nogo-A受体具有特异性高亲和力，且特异性竞争Nogo-A与Nogo-A受体的结合位点，能够抑制Nogo-A结合NgR。

本发明的再一目的在于提供上述Nogo-A受体结合肽及其衍生物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种Nogo-A受体结合肽，其氨基酸残基序列为：

His-Ile-Tyr-Thr-Ala-Leu-Val(HIYTALV)或Gly-Phe-Ala-Thr-Ile-Thr-Gly(GFATITG)；

所述的Nogo-A受体结合肽的衍生物为Nogo-A受体结合肽氨基酸侧链基团上、Nogo-A受体结合肽片段的氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物，或者为Nogo-A受体结合肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物；

所述的常规修饰优选为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰等；

所述的标签优选为His₆、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc或ProfinityeXact等；

所述的Nogo-A受体结合肽的衍生物优选为：

上述Nogo-A受体结合肽第二个氨基酸残基为D构型异亮氨酸，末端进行酰胺化修饰，即为His-(d)Ile-Tyr-Thr-Ala-Leu-Val-NH₂；

或上述Nogo-A受体结合肽第二个氨基酸残基为D构型苯丙氨酸，末端进行酰胺化修饰，即为Gly-(d)Phe-Ala-Thr-Ile-Thr-Gly-NH₂；

所述的Nogo-A受体结合肽及其衍生物的获得，采用现有技术中的公知方法进行，既可以用多肽自动合成仪进行化学合成，通过将短肽序列推导出核苷酸序列，然后克隆到载体中进行生物合成；

所述的Nogo-A受体结合肽及其衍生物可以应用于制备预防和/或治疗中枢神经损伤疾病方面的药物；

优选的，所述的Nogo-A受体结合肽及其衍生物可以应用于制备预防和/或治疗神经外伤、脑中风和神经退行性疾病三种疾病中至少一种的药物；

所述的神经退行性疾病优选为阿尔茨海默病或帕金森病等；

所述的药物可以含有一种或者是多种药学上可以接受的载体；

所述的载体优选为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等；

所述的药物可以进一步制成片剂、粒剂、胶囊、口服液或注射剂等多种形式，各种剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备；

一种预防和/或治疗中枢神经损伤疾病方面的药物，包含上述Nogo-A受体结合肽和Nogo-A受体结合肽的衍生物中的至少一种；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:

(1)本发明提供了一种Nogo-A受体结合肽及其衍生物，所述的Nogo-A受体结合肽及其衍生物能够专一性与NgR专一结合，并特异性竞争Nogo-A与NgR结合位点，能够抑制Nogo-A结合NgR。

(2)本发明筛选得到的Nogo-A受体结合肽及其衍生物在体外能结合NgR，通过阻断NgR与Nogo-A的结合而促进神经再生，治疗神经再生障碍的疾病，促进中枢神经功能的恢复，可以作为神经细胞上NgR与Nogo-A结合位点的生物类多肽药物，可用于制备预防和/或治疗中枢神经损伤疾病方面的药物，例如：神经外伤、脑中风和神经退行性疾病。能够在医学与生物学领域得到广泛的应用，并产生巨大的社会与经济效益。

附图说明

图1是His-Ile-Tyr-Thr-Ala-Leu-Val的HPLC检测图谱图。

图2是His-Ile-Tyr-Thr-Ala-Leu-Val的MS检测图谱图。

图3是Gly-Phe-Ala-Thr-Ile-Thr-Gly的HPLC检测图谱图。

图4是Gly-Phe-Ala-Thr-Ile-Thr-Gly的MS检测图谱图。

图5是ELISA方法检测噬菌体展示多肽与NgR特异性结合的结果分析图。

图6是Nogo-A受体结合肽在不同细胞中与NgR特异性结合的结果分析图；其中，A：2号多肽(NAP2)与不同细胞结合的结果分析；B：2号多肽(NAP2)与PC-12细胞表面NgR共定位的结果分析；C：2号多肽(NAP2)与不同细胞结合能力的荧光半定量分析；D：2号多肽(NAP2)与PC-12细胞共定位结合能力的荧光强度分析。

图7是Nogo-A受体结合肽与Nogo-66竞争结合NgR的共聚焦检测结果分析图；其中，A～D：不同浓度的2号多肽(NAP2)和固定浓度的Nogo-66与PC12细胞结合能力(A：PBS；B：1μM2号多肽；C：4μM 2号多肽；D：16μM 2号多肽)；E：2号多肽(NAP2)和Nogo-66的荧光强度的半定量荧光分析。

图8是Nogo-A受体结合肽在PC-12细胞中拮抗Nogo-66对神经突起损伤的保护作用的结果分析图；其中，A：2号多肽(NAP2)在PC-12细胞中对Nogo-66引起的神经突起损伤的保护作用(a：PBS；b:0.3μM Nogo-66；c：0.3μM Nogo-66和1μM 2号多肽；d：0.3μM Nogo-66和4μM 2号多肽；e：0.3μM Nogo-66和16μM 2号多肽；f：0.3μM Nogo-66和1μM NEP1-40)；B：2号多肽(NAP2)的细胞活力；C：不同浓度的Nogo-66引起的突起缩短；D：2号多肽(NAP2)拮抗由Nogo-66引起的分支的缺失，促进突起分支的增加；E：2号多肽(NAP2)拮抗Nogo-66引起突起的缩短，促进神经细胞突起的增长，促进了神经细胞的再生。

图9是Nogo-A受体结合肽在CGCs细胞中拮抗Nogo-66对神经突起损伤的保护作用的结果分析图；其中，A：2号多肽(NAP2)在CGC细胞中对Nogo-66引起的神经突起损伤的保护作用(a：PBS；b:0.3μM Nogo-66；c：0.3μM Nogo-66和1μM 2号多肽；d：0.3μM Nogo-66和4μM2号多肽；e：0.3μM Nogo-66和16μM 2号多肽；f：0.3μM Nogo-66和1μM NEP1-40)；B：不同浓度的Nogo-66引起的突起缩短，C：2号多肽(NAP2)拮抗由Nogo-66引起的分支的缺失，促进突起分支的增加；D：2号多肽(NAP2)拮抗Nogo-66引起突起的缩短，促进神经细胞突起的增长，促进了神经细胞的再生。

图10是Nogo-A受体结合肽对Nogo-66激活的ROCK2细胞信号通路影响的结果分析图；其中，A、B：在PC-12和CGCs细胞中加入不同浓度的2号多肽(NAP2)和Nogo-66以及NEP1-40和Nogo-66后ROCK2的表达情况；C、D：在PC-12和CGC细胞中加入不同浓度的2号多肽(NAP2)和Nogo-66以及NEP1-40和Nogo-66后ROCK2的灰度值分析。

图11是Nogo-A受体结合肽对Nogo-66激活的磷酸化的CRMP2和磷酸化的MLC细胞信号通路影响的结果分析图；其中，E、F：在PC-12和CGCs细胞中加入不同浓度的2号多肽(NAP2)和Nogo-66以及NEP1-40和Nogo-66后磷酸化的CRMP2和磷酸化的MLC的表达情况；G～J：在PC12和CGCs细胞中加入不同浓度的2号多肽(NAP2)和Nogo-66以及NEP1-40和Nogo-66后磷酸化的CRMP2和磷酸化的MLC的灰度值分析。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1 Nogo-A受体结合肽的有机合成及检测

有机合成2号多肽(His-Ile-Tyr-Thr-Ala-Leu-Val)和5号多肽(Gly-Phe-Ala-Thr-Ile-Thr-Gly)(由上海强耀生物公司合成)，称取KP树脂1g置于反应器中，加入DMF溶涨30min，滤除DMF，将Fmoc氨基酸，HBTU，HOBT各0.4mmol和NMM 0.6mmol溶于适量DMF中，将其加入反应器中，于40℃震荡2h，滤除反应液，以甲醇、DMF交替洗涤树脂各2次，用无水乙醚洗一次；用体积分数20％哌啶/DMF溶液洗脱Fmoc基；反应10min，滤除反应液甲醇，DMF交替洗涤树脂各2次；进行下一个氨基酸残基的偶联，如此依次由C端第一个氨基酸向N端延伸，直到短肽完成。合成的短肽经G10柱脱盐和HPLC纯化，冷冻干燥保存。

2号多肽和5号多肽的纯度均达到98％以上；其中图1～4分别为2号多肽和5号多肽HPLC检测图谱和MS检测图谱。

实施例2 ELISA检测噬菌体展示:NgR特异性、专一性结合阳性单克隆

用由PBS稀释浓度为2.5μg/mL的sNgR蛋白(美国R&D公司)包被96孔酶标板(Corning，公司)，每孔150μL，同时用未包被sNgR的孔作为对照。4℃缓慢摇床过夜，倾去包被液，加进PBS稀释的质量分数为1％BSA封闭液，封闭1h；加入第四轮反筛的单克隆1×10¹⁰pfu/mL的噬菌体(New England Biolabs，Beverly,MA)100μL，室温缓慢摇床结合1h；然后用质量分数为0.1％PBST洗涤6次，加入HRP-抗M13抗体(NEB公司)100μL(1：5000稀释)，37℃孵育40min，PBST洗涤6次后加入显示底物TMB(碧云天公司)50μL显色10min，1M H₂SO₄终止显色，酶标仪450nm检测OD值。根据ELISA的结果，对特异性较强的单克隆序列进行ssDNA提取和测序，然后采用Bioedit软件和ProtParam程序进行序列分析和特性分析，最后得到展示序列为His-Ile-Tyr-Thr-Ala-Leu-Val噬菌体(12)和Gly-Phe-Ala-Thr-Ile-Thr-Gly噬菌体(21)OD值分别为1.3512和1.2538，表明其与NgR具有较高的特异性、专一性结合能力，结果见图5。

实施例3共聚焦Nogo-A受体结合肽与NgR高表达细胞PC-12、CGCs细胞膜表面NgR的结合，以及Nogo-A受体结合肽与PC-12细胞表面NgR共定位

共聚焦板接种PC-12、CGCs细胞，其中PC12细胞购自中科院细胞库(ATCCCRL-1721)，CGCs细胞取自出生后6～8天Sprague-Dawley(SD)乳鼠(SPF级，广东省实验中心(SCXK粤2013-0002))；每个皿10000个细胞，培养24h，PBS洗三次，多聚甲醛固定15min，PBS洗3次，BSA封闭1.5h，然后用1μM的FITC标记的2号多肽或5号多肽(其中2号多肽或5号多肽的FITC标记均由上海强耀生物公司制备)室温孵育2h(共定位实验需要加入(1:250)NgR抗体)，PBST洗三次，DAPI核染。MDA-MB-231细胞(购自中科院细胞库，ATCC HTB-26)和PBS作为阴性对照，结果如图6。

结果如图6A所示，加入相同浓度2号多肽(NAP2)到不同细胞(PC12细胞、CGCs细胞、MDA-MB-231细胞)中，高表达NgR的PC12细胞和CGCs细胞的荧光强度很高，而低表达NgR的MDA-MB-231细胞荧光强度很弱，作为对照的多肽AP7(筛选自其它不相关的七肽库，序列为VPPLWPA)和PBS在高表达NgR的PC12细胞荧光强度也很低。从图6B中可以看出，2号多肽(NAP2)与细胞膜表面NgR特异性结合。图6C是2号多肽(NAP2)与不同细胞结合能力的荧光半定量分析(对图6A的荧光的半定量分析)，图6D是2号多肽(NAP2)与PC-12细胞共定位结合能力的荧光强度分析，AP7作为阴性对照。以上结果表明，2号多肽可以与NgR特异性结合。

同样实验方法证明：5号多肽的结果与2号多肽相似，可以与NgR特异性结合。

实施例4Nogo-A受体结合肽与Nogo-66竞争结合NgR

共聚焦板接种PC-12细胞，每个皿10000个细胞，培养24h，PBS洗三次，多聚甲醛固定15min，PBS洗3次，BSA封闭1.5h，然后用不同浓度的的FITC标记的2号多肽或5号多肽(PBS、1μM、4μM、16μM)室温孵育1h，加入1μM Rho-123标记的Nogo-66(Recombinant Nogo-66via soluble expression with SUMO fusion in Escherichia coli inhibits neuriteoutgrowth in vitro.Appl Microbiol Biotechnol.2015Jul；99(14):5997-6007，然后经上海强耀生物公司标记制备)30min，PBST洗三次，DAPI核染，结果见图7。

从图7A～D中可以看出，随着FITC标记的2号多肽的浓度增加，绿色荧光逐渐变强，而Rho-123标记的Nogo-66的红色荧光逐渐变弱。图7E为半定量分析图7A～D的荧光强度。以上结果表明，2号多肽可以与Nogo-66竞争结合NgR。

同样实验方法证明：5号多肽的结果与2号多肽相似，可以与Nogo-66竞争结合NgR。

实施例5 Nogo-A受体结合肽对神经突起再生障碍模型的影响

共聚焦板接种PC-12、CGCs细胞，每个皿10000个细胞，培养24h。然后PC-12细胞加入100ng/mL的NGF(human recombinant NGF,Sigma)。

在PC-12、CGCs细胞中加入连续梯度稀释的2号多肽(NAP2)或5号多肽(PBS、1μM、4μM、16μM)和0.3μM的Nogo-66，其中，加入1μM NEP1-40(Calbiochem(EMD Millipore))和0.3μM的Nogo-66的细胞作为阳性对照；继续培养24h，然后用质量分数为4％的多聚甲醛固定，加入抗微管蛋白β-III抗体(1:800；Sigma-Aldrich)，突起长度用Image-Pro Plus软件计算，同时用MTT测试短肽对PC-12细胞存活率的影响。结果见图8，图9。

先用MTT法检测2号多肽(NAP2)在PC12细胞中的毒性，发现在实验要求浓度内没有毒性(见图8B)。然后在PC12细胞中加入不同浓度Nogo-66，结果显示0.3μM Nogo-66有50％的抑制作用，这个浓度就是造模浓度(见图8C)。当PC12细胞同时加入不同浓度的2号多肽(NAP2)和固定浓度(0.3μM)的Nogo-66，结果显示随2号多肽(NAP2)浓度的增加可以不同程度拮抗Nogo-66引起的突起缩短，增加PC12细胞突起长度和PC12细胞分支数。2号多肽(NAP2)具有与阳性药物NEP1-40相似的功能(见图8A、图8D和图8E)。

图9是2号多肽(NAP2)在CGCs细胞中拮抗Nogo-66对神经突起损伤的保护作用的结果分析图。在CGCs细胞中加入不同浓度Nogo-66，结果显示0.3μM的Nogo-66有很好的抑制作用，这个浓度就是造模浓度(见图9B)。当PC12细胞同时加入不同浓度的2号多肽(NAP2)和固定浓度的Nogo-66，结果显示2号多肽可以拮抗Nogo-66引起的突起缩短，增加CGCs细胞突起长度和CGCs细胞分支数，其中可以明显看到2号多肽(NAP2)具有与阳性药物NEP1-40相似的功能。(见图9A、图9C和图9D)。

以上结果可以看出2号多肽(NAP2)可以在PC12和CGC细胞中可以拮抗Nogo-66引起的突起缩短，促进神经细胞的突起长度和分支数的增加，促进了神经细胞的再生，并且具有明显的剂量依赖性。同样，实验结果表明，5号多肽可以在PC12和CGCs细胞中可以拮抗Nogo-66引起的突起缩短，促进神经细胞的突起长度和分支数的增加，促进了神经细胞的再生，并且具有明显的剂量依赖性。

实施例6 Nogo-A受体结合肽对细胞信号通路影响的结果

在6孔板接种PC-12和CGCs细胞，每个板接种3.5×10⁶个细胞，培养24h。加入连续梯度稀释的2号多肽(NAP2)或5号多肽(PBS、1μM、4μM、16μM)和0.3μM的Nogo-66作用15min，其中，加入1μM NEP1-40和0.3μM的Nogo-66的细胞作为阳性对照。吸出培养基，然后加入预冷的PBS洗涤三次，再加入细胞裂解液(RIPA:PMSF＝100:1)，4℃孵育40min，然后收集蛋白置于4℃冷冻离心机离心5min(12000g/min)，加入5×Buffer，制成蛋白样品。在将蛋白样品进行电泳，转膜，得到含有蛋白的PVDF膜用含质量分数为5％的脱脂奶粉的TBST室温封闭1h，然后用含质量分数为5％BSA的TBST稀释抗ROCK2抗体、抗磷酸化CRMP2抗体和抗磷酸化MLC抗体(均购自Cell Signaling Technology,Inc.(Shanghai,China))，加入上述一抗后，4℃孵育过夜。次日，加入羊抗兔的二抗(1:2000)后，用ECL试剂盒显色，用Quantity-One软件分析实验结果，结果如图10和11所示。

2号多肽(NAP2)或5号多肽可以显著降低ROCK2的表达，其中，图10A～B是PC-12和CGCs细胞中同时加入Nogo-66和不同浓度的2号多肽(NAP2)后ROCK2的表达情况，图10C～D是PC-12和CGC细胞上ROCK2的灰度值分析。2号多肽(NAP2)或5号多肽可以降低磷酸化的CRMP2和磷酸化的MLC的表达水平，并且有明显的剂量依赖性。其中，图11E～F为在PC-12和CGCs细胞中加入不同浓度的2号多肽(NAP2)和Nogo-66以及NEP1-40和Nogo-66后，磷酸化的CRMP2和磷酸化的MLC的表达情况。图11G～J为在PC12和CGC细胞中磷酸化的CRMP2和磷酸化的MLC的灰度值分析。以上结果表明2号多肽(NAP2)或5号多肽能拮抗Nogo-66激活的细胞信号通路，进一步说明其具有拮抗Nogo-66的抑制突起再生作用，促进了神经细胞的再生。

以上实施例证明，2号多肽(NAP2)或5号多肽可以拮抗Nogo-66引起的突起缩短，促进了神经细胞的再生，其机制是多肽抑制了Nogo-66所激活的下游信号分子。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>暨南大学

<120>一种Nogo-A受体结合肽及其衍生物与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Nogo-A受体结合肽（2号多肽）

<400> 1

His Ile Tyr Thr Ala Leu Val

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Nogo-A受体结合肽（2号多肽）的衍生物

<220>

<222> (2)..(2)

<223> D构型

<220>

<222> (7)..(7)

<223>酰胺化修饰

<400> 2

His Ile Tyr Thr Ala Leu Val

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Nogo-A受体结合肽（5号多肽）

<400> 3

Gly Phe Ala Thr Ile Thr Gly

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Nogo-A受体结合肽（5号多肽）的衍生物

<220>

<222> (2)..(2)

<223> D构型

<220>

<222> (7)..(7)

<223>酰胺化修饰

<400> 4

Gly Phe Ala Thr Ile Thr Gly

1 5

Claims

1.一种 Nogo-A 受体结合肽，其特征在于，所述的 Nogo-A 受体结合肽的氨基酸残基序列为：

Gly-Phe-Ala-Thr-Ile-Thr-Gly。

2.权利要求 1 所述的 Nogo-A 受体结合肽在制备预防和/或治疗中枢神经损伤疾病方面的药物中的应用。

3.根据权利要求 2 所述的 Nogo-A 受体结合肽在制备预防和/或治疗中枢神经损伤疾病方面的药物中的应用，其特征在于：

所述的药物含有一种或者是多种药学上可以接受的载体。

4.根据权利要求 2 所述的 Nogo-A 受体结合肽在制备预防和/或治疗中枢神经损伤疾病方面的药物中的应用，其特征在于：

所述的药物进一步制成片剂、粒剂、胶囊、口服液或注射剂。