CN112574281B - 一种成对免疫球蛋白样受体b结合肽及其衍生物与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种PirB结合肽及其衍生物与应用。本发明的PirB结合肽的氨基酸残基序列为：Pro‑Phe‑Arg‑Leu‑Gln‑Leu‑Ser(PFRLQLS)，其衍生物为PirB结合肽氨基酸侧链基团上、PirB结合肽片段的氨基端或羧基端常规修饰得到的产物，或者为PirB结合肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物。本发明的PirB结合肽及其衍生物能够与PirB结合，阻断髓磷脂抑制因子Nogo与PirB的结合，解除对神经再生的抑制作用，治疗神经再生障碍的疾病，也可降低Aβ‑PirB介导的神经毒性，抵抗Aβ对神经突起的损伤，治疗神经退行性疾病，从而促进中枢神经功能的恢复。

Description

一种成对免疫球蛋白样受体B结合肽及其衍生物与应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及一种成对免疫球蛋白样受体B结合肽及其衍生物与应用。
背景技术
成对免疫球蛋白样受体B(paired immunoglobulin-like receptor B，PirB)最早由Kubagawa H等在1997年首先从小鼠脾脏的cDNA文库里发现。PirB由单一的PirB基因编码，分子量大约是120kD，是Ⅰ型跨膜糖蛋白家族的成员，无亚单位偶联，胞外为6个Ig样的结构域(从N段到C段为D1到D6区)，跨膜区是疏水片段，胞内段含有3个免疫受体酪氨酸抑制基序区(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motifs，ITIM)以及1个ITIM样序列，能够招募SHP-1或SHP-2蛋白促进抑制。早期的研究认为，PirB是免疫系统的一个重要受体，主要分布在造血细胞系(包括B细胞、肥大细胞、巨噬细胞、粒细胞及树突细胞，但是不表达在T细胞和NK细胞上)，发挥着免疫抑制的作用。近来的研究表明，除了表达于免疫细胞，PirB还在中枢神经系统中广泛表达，如海马、大脑皮质神经元、小脑颗粒细胞和嗅鞘等，其在正常脑组织中的生理功能为防止轴突芽生的异常以及调节正常的突触活性，防止神经元异常放电，维持正常的学习记忆能力，其表达水平在神经细胞受到损后才有明显上调。髓磷脂抑制因子(Nogo,MAG和OMgp)也是PirB的高亲和配体，在神经损伤后再生障碍过程中发挥重要作用。研究如何促进神经元的再生能力，恢复神经网络成为治疗中枢神经损伤疾病(如神经外伤，中风等)的关键。阻断髓磷脂抑制因子与其受体(PirB)结合将有助于中枢神经系统损伤后的恢复。因此，PirB也就成为了治疗中枢神经系统外伤、中风等疾病的一个潜在靶标。
继髓磷脂抑制因子之后，β-淀粉样蛋白(Aβ)也被发现是PirB的高亲和配体，Aβ寡聚体的神经毒性可诱发突触可塑性损伤，介导与神经退行性疾病相关的突触丢失，神经元凋亡。2014年，Kim等发表在science上的研究提出PirB也是Aβ的受体，PirB和Aβ在纳摩尔级别便具有亲和力，敲除小鼠PirB可免除Aβ寡聚体介导的海马长时程增强效应损害。在转基因模型中，PirB不仅介导成年小鼠的学习记忆障碍，还介导年轻小鼠视觉皮质神经突触可塑性的缺失。神经退行性疾病是老年人常见的一种疾病，随年龄增长其发病率显著增加,包括有阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，其共同特征是中枢神经元退行性变性，最终死亡。目前有多种发病学说，其中β淀粉样蛋白学说得到较为广泛认可，该学说认为Aβ聚集形成的寡聚体引起神经元毒性损伤，抑制神经突触的功能，破坏神经网络，最终导致神经退行性变性。因此，抑制Aβ的神经毒性，恢复神经网络成为治疗神经退行性疾病的重要策略，而PirB是Aβ介导神经毒性的高亲和配体，因此，PirB成为了治疗神经退行性疾病的一个潜在靶标。
随着我国社会老龄化的加快，神经外伤、脑中风和神经退行性病变的发生率及患病率逐年升高，这些疾病给社会带来巨大的经济损失，给病患个人及家庭带来了不可估量的负担。因此，研究治疗神经损伤类疾病(如神经外伤、脑中风等)和神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症等)的特效药具有重要的社会现实意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种成对免疫球蛋白样受体B结合肽。
本发明的另一目的在于提供上述成对免疫球蛋白样受体B结合肽的衍生物。
本发明的再一目的在于提供上述成对免疫球蛋白样受体B结合肽及其衍生物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种成对免疫球蛋白样受体B(PirB)结合肽，其氨基酸残基序列为：Pro-Phe-Arg-Leu-Gln-Leu-Ser(PFRLQLS)。
上述PirB结合肽的衍生物，为PirB结合肽的氨基酸侧链基团上、PirB结合肽片段的氨基端或羧基端进行公认的常规修饰得到的产物，或者为PirB结合肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的公认的常规标签所得到的产物。
所述的常规修饰优选为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰等。
所述的常规标签优选为His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc或Profinity eXact等。
所述的PirB结合肽及其衍生物的获得，采用现有技术中的公知方法进行，可以用多肽自动合成仪进行化学合成，通过将短肽序列推导出核苷酸序列，然后克隆到载体中进行生物合成。
上述PirB结合肽或其衍生物在制备预防和/或治疗中枢神经损伤疾病和神经退行性疾病方面的药物中的应用。
所述的中枢神经损伤疾病优选为脑外伤(brain trauma)、脑损伤(brain injury，BI)、脑缺血(cerebral ischemia，CI)、脑中风(stroke)和脊髓损伤等。
所述的神经退行性疾病优选为阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)和亨廷顿舞蹈症等。
所述的药物可以含有一种或者是多种药学上可以接受的载体。
所述的载体优选为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等。
所述的药物可以进一步制成片剂、粒剂、胶囊、口服液或注射剂等多种形式，各种剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备。
一种预防和/或治疗中枢神经损伤疾病和神经退行性疾病的药物，包含上述PirB结合肽和PirB结合肽衍生物中的至少一种。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明的PirB结合肽及其衍生物能够与PirB专一结合，通过阻断髓磷脂抑制因子Nogo与PirB的结合解除对神经再生的抑制作用，治疗神经再生障碍的疾病，促进中枢神经功能的恢复。PirB同时也是Aβ的高亲和性受体，Aβ寡聚体损害神经元通过PirB介导，本发明的PirB结合肽及其衍生物通过竞争性与PirB结合，降低Aβ-PirB介导的神经毒性，抵抗Aβ对神经突起可塑性的损伤，治疗神经退行性疾病，促进中枢神经功能的恢复。
2.本发明的PirB结合肽及其衍生物可用于制备预防和/或治疗中枢神经损伤疾病和神经退行性疾病的药物，能够在医学与生物学领域得到广泛的应用，并产生良好的社会与经济效益。
附图说明
图1为实施例2中ELISA检测分析单克隆噬菌体与PirB结合能力结果图。
图2为实施例2中平均疏水性轮廓分析图。
图3为实施例3中16号候选多肽的高效液相色谱法和质谱法分析结果图；其中，A为高效液相色谱图；B为质谱图。
图4为实施例4中Aβ42介导的原代皮质神经元突起生长抑制结果图；其中，A为原代皮质神经元加入不同浓度的Aβ42(a～f分别对应0μmol/L、0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L)培养下突起的生长情况图，标尺为20μm；B为MTT检测分析Aβ42对皮质神经元的神经毒性结果图；C为定量分析Aβ42介导的原代皮质神经元突起损伤结果图；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白对照组(0μmol/L)进行比较，数据来自3个重复样品，代表平均OD值(±标准差)。
图5为实施例5中免疫荧光筛选阳性结合多肽结果图；其中，A的a～h分别为P5-1～P5-8号候选肽的荧光结合照片图；B为Image-Pro Plus软件半定量分析候选肽与皮质神经元的结合的荧光强度结果图。
图6中，A为筛选具有神经保护作用的多肽结果图；其中，a为空白对照组；b为1μmol/L的Aβ42；c为2μmol/L的Aβ42；d为P5-8+1μmol/L Aβ42；e为P5-8+2μmol/L Aβ42；f为P5-2+1μmol/L Aβ42；g为P5-4+1μmol/L Aβ42；h为P5-5+1μmol/L Aβ42；i为P5-7+1μmol/L Aβ42；B为定量分析候选肽对神经元突起的影响结果图；其中，培养基缓冲液为空白对照组，1μmol/L和2μmol/L Aβ42为模型组；Aβ42造模组与对照组比较，#P<0.05,##P<0.01，有统计学意义；多肽处理组和Aβ42模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，有统计学意义。
图7为免疫荧光实验分析P5-8和PirB结合情况结果图；其中，A为FITC-P5-8与原代皮质神经元共培养，标尺为10μm；B为阴性对照组FITC-AP7，标尺为50μm；C为P5-8和PirB共定位，标尺为10μm；D为用Image-Pro Plus软件免疫荧光半定量分析P5-8与皮质神经元的结合程度，采用单因素方差分析，***P<0.001；E为定量分析FITC-P5-8和不相关肽FITC-AP7与皮质神经元的共定位情况，数据来自3次独立实验，以平均值±标准差的形式表示，采用Student’st test(T检验)进行分析，***P<0.001；FITC：异硫氰酸荧光素标记，与蛋白质结合，黄绿色荧光；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚，细胞核染色，蓝色荧光。
图8为P5-8拮抗Aβ42诱导的大脑皮质神经元突起损伤作用结果图；其中，A为P5-8拮抗Aβ42诱导的大脑皮质神经元突起损伤的作用照片图，基础培养基作为空白对照组(a)，1μmol/L Aβ42作为损伤模型组(b)，1μmol/L Aβ42+0.5μmol/L P5-8(c)，1μmol/L Aβ42+1μmol/LP5-8(d)，1μmol/L Aβ42+2μmol/L P5-8(e)，1μmol/L Aβ42+4μmol/L P5-8(f)，标尺为20μm；B为不同浓度的P5-8对原代皮质神经元的细胞毒性MTT检查分析结果图；C为定量分析P5-8对Aβ42诱导的原代皮质神经元突起损伤的作用结果图，与对照组或阴性组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，结果以OD(±SD)的形状呈现，每个结果均重复3次。
图9为P5-8拮抗Nogo-66诱导皮质神经突起损伤的保护作用结果图；其中，A为P5-8在皮质神经元中对Nogo-66引起的神经突起损伤的保护作用照片图(a：PBS，b：0.3μmol/LNogo-66，c：0.3μmol/L Nogo-66和1μmol/L P5-8，d：0.3μmol/L Nogo-66和2μmol/L P5-8，e：0.3μmol/L Nogo-66和4μmol/L P5-8；B为P5-8拮抗Nogo-66引起的神经突起缩短的保护作用柱状图。
具体实施例
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1噬菌体随机展示7肽库的生物淘选
(1)选用宿主菌大肠杆菌E.coli ER2738，用NaHCO3包被缓冲液(pH 9.6)稀释PirB蛋白(美国R&D公司)至200μg/mL，第一次取100μL上述PirB蛋白稀释液加入到96孔板的小孔里，加入50μL NaHCO3包被缓冲液稀释补足容积，另加入150μL的NaHCO3包被缓冲液(不含PirB)包被到另一小孔，以之作为空白对照。封口膜封口，轻微摇动至溶液充分浸湿孔底，放置在湿盒里，4℃温和震荡，孵育过夜。
(2)第二天，从湿盒中取出96孔板，将板中的包被缓冲液在干净的滤纸上甩扣干，尽量去除残余溶液，然后加入封阻缓冲液(封阻缓冲液：将BSA 0.25g和NaN3 0.01g溶解在50mL配制好的包被缓冲液，0.22μm的滤膜用来过滤除菌，4℃密封保存)300uL/孔，于4℃封闭2h，再次倾倒封阻缓冲液，在干净滤纸上拍甩，用1×TBST洗涤板6次，1min/次。
(3)吸取10μL噬菌体随机展示7肽库(New England Biolabs，Beverly，MA)，用1×TBST稀释至2×1011pfu/mL，稀释好的噬菌体菌液分别加入有靶蛋白和包被缓冲液的小孔中(包被缓冲液：NaHCO3 0.84g，加入超纯水95mL，用NaOH调pH至8.6，定容至100mL，0.22μm的滤膜过滤除菌后，4℃密封保存)，室温孵育，温和振荡3h，再次在洁净的滤纸上拍甩去除未结合的噬菌体菌液，用0.05％(v/v)的TBST轻柔洗板10次，0.5min/次。向小孔中加入Glycin-HCl缓冲液(pH 2.2)，100uL/孔，室温温和摇动10min，洗脱与靶蛋白分子结合的噬菌体，转移洗脱液到EP管，加入1mol/L Tris-HCl(pH 9.1)，15μL/孔，快速中和上述洗脱液(4℃短期保存)。
(4)将步骤(3)中和后的洗脱液取1μL用于噬菌体的滴度测定，剩余的投入到LB液体培养基中扩增、纯化，继续新的一轮扩增物的滴度测定，用于新的一轮淘选，扩增物4℃短期储存，-20℃长期储存。
在确保每轮淘选过程中投入的噬菌体随机展示7肽库滴度不低于1×1010pfu/mL的前提下，逐渐增加每轮的筛选条件的严苛性。每轮减少PirB包被量(20μg、10μg、5μg、2.5μg、1.25μg)及PirB与噬菌体菌液的结合时间(3h、2h、1.5h、1h、0.5h)，提高洗涤所用的TBST缓冲液中吐温20的浓度(0.05％、0.1％、0.3％、0.6％、0.9％)及TBST洗涤板的时间(1min/次、2min/次、3min/次、4min/次、5min/次)。按照上述条件，严格重复进行5轮生物淘选。
实施例2PirB阳性噬菌体克隆的序列分析
经过实施例1的五轮筛选，从最后一轮筛选的平板上随机挑选16个单克隆噬菌体篮斑，通过ELISA检测PirB与单克隆噬菌体之间的亲和力，酶标仪450nm检测OD值，具体步骤如下：
(1)用包被缓冲液NaHCO3(pH 9.6)溶解稀释靶蛋白PirB，加入靶蛋白PirB稀释液至96孔酶标板中进行包被，150μL/孔，加入同体积的包被缓冲液(不含PirB)作为阴性对照，湿盒4℃孵育过夜。
(2)第二天，从4℃拿出湿盒复温后甩去包被液后，96孔酶标板在洁净的滤纸上扣干，加入封闭缓冲液，4℃封闭2h。然后弃掉封闭缓冲液，在洁净的滤纸上扣干，1×TBST洗涤板6次，2min/次。用1×TBST稀释阳性噬菌后加入到96孔酶标板中至1010pfu/孔，在摇床上轻微摇晃，室温结合2h。
(3)1×TBST洗6次，加入HRP-anti-M13单抗(稀释至1:4000，美国Amersham Pharma公司)，200μL/孔，置于摇床上轻轻的摇动，室温1h。1×TBST洗6次，2min/次，加入TMB 150μL/孔，室温显色15～20min，避光。用酶标仪于450nm波长处检测OD值。
结果如图1所示，标号为1、3、7、8、9、12、14、16的阳性噬菌体克隆具有显著性差异，故选为能与PirB特异性结合的候选多肽。结合等位点(PI值)及总平均疏水性(GRAVY)预测候选多肽的生物学功能，表明候选多肽能够在静电作用以及疏水作用方面高度模拟Aβ42与PirB的结合。图2为采用BioEdit软件Kyte&Doolittle模拟平均疏水性轮廓分析的结果，可见16号候选多肽的疏水轮廓与Aβ42高度相似。
实施例3多肽的合成及鉴定
由强耀公司(上海)使用多肽合成仪合成实施例2中的16号候选多肽5mg、FITC标记肽2mg、生物素标记肽2mg，1mg每管分装。利用高效液相色谱法(high performance liquidchromatography，HPLC)以及质谱法(mass spectrum，MS)对合成物进行成分及分子量鉴定，所合成多肽的纯度均达98％以上，符合实验要求。图3是第16号多肽的HPLC检测图谱和MS检测图谱。
实施例4原代皮质神经元突起损伤模型的确立
(1)原代皮质神经元培养
1)实验前一天，用0.0125％(v/v)多聚赖氨酸(PLL)包被细胞培养板，放在37℃细胞培养箱孵育过夜。吸弃多聚赖氨酸，用超纯水洗板三遍，晾干待用。
2)取出生后1～3天的Sprague-Dawley(SD)乳鼠(广东省医学实验动物中心，许可证号SCXK(粤)2013-0002)，在75％(v/v)乙醇中浸泡消毒约30s。在无菌操作台里用灭菌眼科剪“T字”剪开乳鼠的皮肤，暴露脑壳，剪开人字缝，用镊子小心取出完整大脑，浸泡在盛有预冷的D-hanks缓冲液(1×，pH 7.4)的培养皿中，体视镜或肉眼下用眼科精细分离镊分离出大脑皮质，剥离除去脑膜及血丝，小心的将其转移至无菌EP管中(含2mL D-hanks缓冲液(1×，pH 7.4))，用灭菌的眼科剪快速将大脑皮质组织剪成1mm3的小组织块，加入0.125％(v/v)胰蛋白酶，轻轻吹打使其充分接触，置于37℃恒温培养箱中消化20min，每隔10min拿出来轻柔吹打消化组织，促进充分消化，加入含10％(v/v)FBS的DMEM/F12培养基，终止消化，转移消化液至50mL离心管重悬细胞。用200目的细胞滤网对细胞悬液过滤处理，收集得到滤液后，1000rpm离心5min，小心弃除上清液，用含有10％(v/v)FBS的DMEM/F12培养基重悬沉淀，枪头轻柔吹打40次左右，避免气泡对细胞造成的损伤，制作成原代皮质神经元单细胞悬液。
3)取100μL原代皮质神经元单细胞悬液和0.4％的台盼蓝按1：1等体积进行混匀，用血细胞计数板计数，根据培养所需要的细胞密度调整稀释好细胞悬液，接种到步骤1)中提前包被过多聚赖氨酸的细胞培养板上。接种4h后，待原代皮质神经元细胞贴壁后，小心弃去旧的培养基，更换新的不含血清培养基(含2％B27和1％青霉素-链霉素的Neurobasal培养基，美国Invitrogen公司)。观察原代皮质神经元的生长情况。
(2)用Aβ42制作原代皮质神经元突起损伤模型。首先采用MTT法检测Aβ42对神经元的细胞的毒性：步骤(1)得到的原代皮质神经元细胞按5.0×105细胞/孔的密度接种于96孔板中，生长到70～80％的密度时，加入一系列不同浓度(0μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L和4μmol/L的Aβ42，每组作6个复孔，37℃培养箱孵育48h，弃掉旧的培养基，每孔加入100μL MTT质量比为10％的DMEM培养基，将板放入细胞培养箱中继续培养4h，4小时后小心吸弃上清液，加入DMSO，150μL/孔，室温温和振荡10min，避光，置于酶标仪上检测吸光度(570nm)。MTT结果显示(图4B)，0.5μmol/L以上的Aβ42对神经元的活性有损伤，呈剂量依赖。
(3)Aβ42对神经元突起损伤的影响：共聚焦板接种步骤(1)得到的元代皮质神经元，每个皿500000个细胞，37℃培养箱培养4小时后换液，继续培养48h。在元代皮质神经元中分别加入连续梯度稀释的Aβ42：0μmol/L(缓冲液对照组PBS(pH＝7.4、0.1mol/L)、0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L，继续培养48h，然后用质量比为4％的多聚甲醛固定10～12min，用0.3％(v/v)的TritonX-100通透处理30分钟后，1％(v/v)BSA和5％(v/v)山羊血清室温封闭1h，加入抗微管蛋白β-III抗体(1:800，Sigma-Aldrich)，4℃孵育过夜，IgG二抗(美国CST公司)室温孵育1h后，DAPI复染核，激光共聚焦下观察拍照(图4A)，突起长度用Image-Pro Plus软件计算(图4C)。结果表明，Aβ42对神经元损伤呈现剂量依赖性，1μM Aβ42有50％的抑制作用，选取该浓度为造模浓度。
实施例5候选肽体外筛选
将8条合成候选多肽(1、3、7、8、9、12、14、16)重新编号为多肽P5-1～P5-8，采用实施例3中合成的FITC标记的多肽通过免疫荧光结合实验筛选出能与表达PirB的原代皮质神经元特异性结合的候选多肽。
免疫荧光结合实验具体步骤：在共聚焦板接种皮质神经细胞。每个皿接种约100000个细胞，37℃培养箱培养4h后换液，继续培养48h，倒掉培养基，用1×PBS温和洗涤三次，4％多聚甲醛溶液固定细胞15min，去除多聚甲醛，用1×PBS洗板3次，2min/次。用1％(v/v)的BSA和5％(v/v)的山羊血清进行封闭，室温1h。FITC标记的合成多肽用1×PBS稀释后分别加入共聚焦皿内，室温孵育2h，避光，10×PBST温和洗涤三次，DAPI复核染。共聚焦显微镜下观察、拍照(图5A)。Image-Pro Plus软件半定量分析候选肽与皮质神经元的结合的荧光强度(图5B)。初步筛选结果表明，多肽P5-2、P5-4、P5-5、P5-7、P5-8与皮质神经元结合强。
将结合强度高的5条候选多肽继续进行下一轮筛选，采用皮质神经元损伤模型筛选出具有促进神经突起生长的候选多肽。将实施例4步骤(1)制备得到的原代皮质神经元细胞提前2h分别用P5-2、P5-4、P5-5、P5-7、P5-8候选多肽进行预保护后，加入Aβ42，分析候选肽对突起的影响(培养基缓冲液为空白对照组，1μmol/L和2μmol/L Aβ42为模型组)，多肽处理组和Aβ42模型组比较。结果显示，多肽P5-8能够拮抗Aβ42对皮质神经元所造成的神经损伤作用，促进神经再生(图6)。利用原代皮质神经元体外损伤模型，最终筛选出具有生物活性的多肽P5-8用于后续进一步实验。
实施例6P5-8的生物活性分析
(1)FITC标记P5-8候选短肽，采用表达PirB的原代皮质神经元作为细胞模型，利用免疫荧光和共聚焦鉴定P5-8与原代皮质神经元的结合情况。具体步骤如下：在共聚焦板接种实施例4步骤(1)得到的原代皮质神经元细胞。每个皿接种约100000个细胞，37℃培养箱培养4h后换液，继续培养48h，倒掉培养基，1×PBS温和洗涤三遍，4％多聚甲醛溶液固定细胞15min，去除多聚甲醛，1×PBS洗3次，2min/次。用1％(v/v)的BSA和5％(v/v)的山羊血清进行封闭，室温作用1.5h，加入1:250PirB抗体(圣克鲁斯(上海)生物技术公司)，于湿盒内4℃孵育过夜。第二天，拿出湿盒，常温下放置30min，复温，去除PirB抗体，1×PBST温和的洗涤3次，3min/次。加入IgG H&L Dylight 594二抗(兔IgG)(美国Abcam公司)，避光，室温孵育2h，PBST洗3次，2min/次；再加入FITC标记的P5-8多肽，室温作用2h，避光，1×PBST温和洗涤3次，2min/次，DAPI复核染(蓝色)。1×PBS缓冲液及不相关肽AP7作为阴性对照，于共聚焦显微镜下观察、拍照。FITC标记的PAP11多肽的在皮质神经细胞膜表面表达，荧光强度很高，而阴性对照组不相关肽AP7荧光强度很弱(图7A和B)。图7C为验证P5-8是否与神经元膜表面的PirB受体特异性结合，采用免疫荧光双染，结果显示，PAP11与抗体PirB共定位结合在元代皮质神经细胞膜表面。用Image-Pro Plus软件免疫荧光半定量分析FITC-P5-8、FITC-AP7与皮质神经元的结合程度(图7D)。采用倒置荧光显微镜Olympus IX-71定量分析FITC-P5-8、不相关肽FITC-AP7分别与皮质神经元的共定位情况(图7E)。结果显示，P5-8与原代皮质神经元结合能力与对照组相比有显著性差异。
(2)鉴定P5-8拮抗Aβ42诱导的大脑皮质神经元突起损伤作用。具体步骤如下：对原代皮质神经元提前2h用不同浓度的P5-8进行预保护后，加入1μmol/L Aβ42，共培养48h，免疫荧光染色，激光共聚焦拍照(免疫荧光和共聚焦鉴定与上述过程相同)，分析神经元突起长度，结果如图8的A和C所示(a：基础培养基作为对照组，b：单独加入1μmol/L Aβ42作为损伤模型组，c～f：分别为采用0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L P5-8预保护2小时后加入Aβ42)，结果证明P5-8多肽浓度的增加可以提高对Aβ42引起的神经元突起缩短的拮抗作用。将皮质神经元加入不同浓度(0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L)的P5-8培养后MTT检查分析P5-8的细胞毒性(图8B)，结果表明P5-8在0.5μM至8μmol/L的浓度范围内对原代皮质神经元不具有细胞毒性。
实施例7P5-8的生物活性分析
24孔板接种大鼠原代皮质神经元细胞(神经元培养同实施例4)，每个孔10万个细胞，培养24h。在细胞中分别加入梯度稀释的P5-8多肽(1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L)和0.3μmol/L Nogo-66，空白对照为PBS，继续培养48h，然后用质量比为4％的多聚甲醛固定，加入抗微管蛋白β-III抗体(1:800，Sigma-Aldrich)，于共聚焦显微镜下观察、拍照，突起长度用Image-Pro Plus软件计算。
图9是P5-8拮抗Nogo-66对神经突起损伤的保护作用的结果分析图。当皮质神经元同时加入不同浓度的P5-8和0.3μmol/L的Nogo-66，结果显示，P5-8可以拮抗Nogo-66引起的突起缩短，增加皮质神经元突起长度(见图9A中的c-e)。以上结果可以看出P5-8可以拮抗Nogo-66引起的皮质神经元中突起缩短，促进神经细胞的突起长度，促进神经细胞的再生，并且具有明显的剂量依赖性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>暨南大学
<120>一种成对免疫球蛋白样受体B结合肽及其衍生物与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>成对免疫球蛋白样受体B结合肽
<400> 1
Pro Phe Arg Leu Gln Leu Ser
1 5

Claims (6)

1.一种PirB结合肽，其特征在于：所述的PirB结合肽的氨基酸残基序列为：Pro-Phe-Arg-Leu-Gln-Leu-Ser。
2.权利要求1所述的PirB结合肽在制备预防和/或治疗与皮质神经元损伤相关的中枢神经损伤疾病和神经退行性疾病方面的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的PirB结合肽在制备预防和/或治疗与皮质神经元损伤相关的中枢神经损伤疾病和神经退行性疾病方面的药物中的应用，其特征在于：
所述的中枢神经损伤疾病为脑外伤、脑损伤、脑缺血、脑中风和脊髓损伤；
所述的神经退行性疾病为阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症和亨廷顿舞蹈症。
4.根据权利要求2所述的PirB结合肽在制备预防和/或治疗与皮质神经元损伤相关的中枢神经损伤疾病和神经退行性疾病方面的药物中的应用，其特征在于：
所述的药物含有一种或者是多种药学上可以接受的载体；
所述的药物进一步制成片剂、粒剂、胶囊、口服液或注射液。
5.根据权利要求4所述的PirB结合肽在制备预防和/或治疗与皮质神经元损伤相关的中枢神经损伤疾病和神经退行性疾病方面的药物中的应用，其特征在于：所述的载体为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。
6.一种预防和/或治疗与皮质神经元损伤相关的中枢神经损伤疾病和神经退行性疾病的药物，其特征在于：包含权利要求1所述的PirB结合肽。
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