CN103582490A - 作为治疗剂的肝细胞生长因子模拟物 - Google Patents

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Abstract

生成了能够起到模拟物和拮抗剂作用的小分子肽类肝细胞生长因子模拟物。这些分子已经表明或预测对众多疾病具有治疗潜力，包括痴呆、神经变性疾病、糖尿病和代谢综合征、癌症和伤口愈合不良。

Description

作为治疗剂的肝细胞生长因子模拟物
联邦资助研发声明
本发明部分地是在美国国立卫生研究院（NIH）授予的编号为MH086032的政府资助下完成的。政府对于本发明拥有一定的权利。
序列表
本发明包括附后的TXT文档“序列.txt”中的序列表全部内容，创建于2012年4月2日，包含1022字节，均以引用的方式包含在本文中。
说明书
总结
技术领域
本发明一般涉及肝细胞生长因子（HGF）模拟物的研发，它可以起到模拟物（兴奋剂）或拮抗剂的作用。模拟物的作用：加强认知功能；作为基本的神经保护/神经再生因子；有利于创伤修复；提高胰岛素敏感性和葡萄糖运输；并减少组织或器官纤维化以防止或逆转痴呆症状，保护机体免于或逆转神经退化性疾病，有利于修复神经系统的损伤，增加组织和器官的血管化，改善受损创伤的愈合，减少或逆转器官中的纤维化改变，例如心脏、肺、肾脏和肝脏。拮抗剂的作用，例如，作为抗血管生成因子和抗癌因子，治疗不同的恶性肿瘤和疾病，例如黄斑变性和糖尿病视网膜病变，它们都和血管过度形成有关。
背景技术
模拟物：
痴呆：仅美国，就已经有大约一千万人诊断为痴呆，并且这一数字随着人口老化每年都在持续增加。治疗和照顾这些病人的成本年均超过700亿美元，并且处于快速增长中。不幸的是，当前对于痴呆的治疗选项是非常有限的并基本无效的。对这种有着重大需求并且增长迅速的健康问题的治疗手段的缺乏，导致新型和创新性的治疗手段必须尽快开发。
痴呆病的核心源于神经元中减退的突触连接和内嗅皮层、海马和新（大脑）皮质中的神经元死亡的综合。因此，有效的治疗方法期望能够增加突触连接，保护神经元免于潜在的死亡诱导物，并且刺激从预先存在的神经干细胞库中丢失的神经元的替换。这些临床终端提倡神经营养因子的治疗应用，它可以介导神经发育、神经形成、神经保护和突触发生。不出所料，神经营养因子曾被认为可以作为对多种神经退化性疾病的治疗选项，包括阿尔茨海默病（见文献-Nagahara and Tuszynski,2011;Calissano et al.,2010）。一个特别吸引人、但常常被忽视的神经营养因子是HGF，它被证明可以同时刺激神经形成（Shang et al.,2011,Wang et al,2011）和突触发生（见下面的初步研究）。HGF的用途可能代表了一种针对痴呆可行的治疗方法，这一认识并不让人惊讶。HGF是一种在多个脑部区域有效的神经营养因子（Kato et al.,2009;Ebens et al.,1996），同时它可以影响多种类型的神经元细胞。
神经保护/神经再生：HGF和c-Met能够在处于发育阶段和已成年脑部及神经中活跃表达。Met系统对于中枢和周围神经系统的正常起作用是必需的。大量研究表明，HGF和c-Met在脑部多个区域表达，包括额叶皮层、室管膜下层、丘脑、小脑皮质、深灰质和用于认知的重要区域-海马。
上述生物学活性还表征了Met在脑部所起的功能，其中HGF/c-Met信号传导是神经营养性的（Honda et al.,1995）和保护性的（Zhang et al.,2000;Takeo et al.,2007；Tyndall and Walikonis,2007;Takeuchi et al.,2008）。与它在其他组织的活性相似，脑部的Met涉及发育，能够在分化、有丝分裂和神经突生成期间起到导向因子的作用（Ebens et al.,1996;Sun et al.,2002;Tyndall and Walikonis,2007）。HGF/c-Met信号传导同样也表明能够促进神经元损伤愈合（Trappal et al.,2008），特别是在局部缺血性脑损伤之后（Takeo et al.，2007）。HGF在神经退化性疾病动物模型中也显示具备神经保护作用，所述疾病包括肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）。HGF的各种功能，加上它高度有效的神经营养活性，促使HGF可以作为治疗神经系统各种疾病的潜在治疗剂。
肌萎缩性脊髓侧索硬化症：ALS是一种致命的突发性的神经退化性疾病，其特征在于脊髓中的运动神经元和运动皮质及脑干中的传出神经元出现退化。这种退化的影响导致逐步丧失肌肉功能，并最终导致全身瘫痪。大约90%的ALS病例被认为是随机发生的而没有已知致病源，剩余的10%似乎是家族性的，部分源自过氧化物歧化酶1（SOD1）中铜/锌的不足，导致夸张的氧化压力和开放性蛋白质反应。各种ALS疾病形式的共同之处是目前均没有有效的治疗方法。
尽管缺乏有效的治疗选择手段，若干研究已经强调了使用肝细胞生长因子（HGF）作为治疗剂的潜在益处。这些调查表明，在患有家族性ALS疾病的鼠科动物或大鼠模型中应用肝细胞生长因子（HGF）能够显著减慢运动神经元的退化（Aoki et al.,2009）；减少助于退化过程的神经胶质增生（Kadoyama et al.,2007）；延迟瘫痪的发生（Kadayamaet al.,2009）；和增加寿命（Sun et al.,2002）。
HGF的应用可能代表了一种针对ALS可行的治疗方法，然而这一认识是不能预料到的。很早就认识HGF和它的类型I酪氨酸激酶受体c-Met在管状结构发育中的作用（Santos et al.,1993）和它们对于肝细胞和上皮来源的细胞的基本增殖、抗-细胞凋亡、有丝分裂（motogenic）和形态发生中的作用。然而，最相关的是最近认识到HGF在多个脑部区域都是有效的神经营养因子（Maina and Klein,1993;Kato et al.,2009）和它作为运动神经元的促存活/再生因子是特别有效的（Ebens et al.,1996;Yamamotoet al.,1997;Hayashi et al.,2006;Elsen et al.,2009）。
帕金森氏病：长久用于治疗很多神经退化性疾病的治疗选择方法是采用生长因子，以期防止疾病恶化，恢复丧失的功能，或者两者兼具，所述神经退化性疾病包括帕金森氏病（PD）（综述，Rangasamy et al.,2010）。然而，这一想法在临床医学水平上大部分尚未实现，因为有和脑部递药有关的限制以及成本问题。生长因子一般是代谢不稳定的大蛋白质分子，并且因为太大而不能通过血脑屏障（BBB）。因此，大部分递送方法是利用基因治疗方法，以期望生长因子能够在正确的位置高浓度长时间表达以提供临床缓解。虽然，在动物模型中已采用了大量创造性的和成功的手段，以期递送生长因子例如GDNF（Wang et al.,2011）到脑部，但这些方法在技术上是复杂的和令人生畏的，难于在大量病人身上实施。
虽然很多生长因子系统经检测为PD的潜在治疗靶标，但人们主要地、并且我们错误地认为忽视了肝细胞生长因子（HGF）/c-Met（它的类型I酪氨酸激酶-受体）系统。不过，HGF作为PD的治疗方法的潜在应用在Koike et al.,（2006）的一项研究中显示：HGF质粒直接插入到黑质（SN）将导致局部过表达HGF，并能够显著防止神经元细胞死亡和保护6-羟基多巴胺（6-OHDA）帕金森氏病大鼠模型中正常的运动功能。观察到的HGF对多巴胺能（DA）神经元的神经保护效应和它增加多巴胺能神经祖细胞的增殖和迁移作用是相吻合的（Lan et al.,2008）。
然而，对于HGF对黑质纹状体路径的神经保护作用不应该感到惊讶，考虑到它对干细胞的调控作用和管状结构的发育（Santos et al.,1993）和它对于很多细胞类型都有基本增殖、抗-细胞凋亡、有丝分裂和形态发生作用，所述细胞类型包括肝细胞和上皮来源细胞等（Gherardi et al.，1993）。特别相关的是，Maina et al.表明HGF对于多种神经元细胞类型都是有效的神经营养因子（Kato et al,2009），包括运动神经元（Elsen etal.,2009;Hayashi et al.,2006）、海马神经元（Lim et al.,2008）、小脑颗粒细胞（Ieraci et al.，2002）和交感神经元（1999）。而且，HGF对于神经干细胞的扩增和分化好像是一个关键调控因子（Nicoleau et al.,2009），这表明神经细胞和其他多种外周干细胞都处于HGF/c-Met系统的控制之下。
创伤性脑损伤/脊髓损伤：创伤性脑损伤TBI经常会对认知功能产生负面影响，并引起轻微的情感能力减弱效应或严重的延长的和衰弱的认知功能障碍（Kane et al.，2011）。认知困难和其他神经功能缺损包括焦虑、行为过激、和抑郁会导致生活品质显著下降（Masel和DeWitt，2010）。总结伊拉克和阿富汗持续进行的军事行为，创伤性脑损伤已经成为主要战争伤害，占全部战争伤亡的28%（Okie,2005；美国医学，2006年5月，卷42）。在2001年和2010年之间的全部军事服务成员遭受创伤性脑损伤的人数估计为180,000人至320,000人之间（美国国防和老兵脑损伤中心）。
从根本上讲，TBI是一种脑部损伤，导致神经元突触连接降低，神经元损失和死亡，大脑血管损伤，导致缺血性/含氧量低诱导的损害，以及次级神经胶质损伤。神经元的丧失和突触连接性的减少在海马特别明显（Gao et al.,2011;Zhang et al.,2011a;Zhanget al.,2011b），这导致长期强化（potentiation）的缺陷（Schwarzbach et al.,2006）和认知缺陷（例如Dikmen et al.,2009;Patel et al.,2010）。导致神经元损失和突触连接降低的TBI相关损伤疾病的高发，表明对支持神经修复和/或替代的治疗的需求。这些临床终端提倡利用神经营养因子治疗TBI，它可以介导神经发育，神经形成，神经保护和突触发生。不出所料的是，神经营养因子曾被认为是TBI的治疗选项（Kaplan et al.,2010;Richardson et al.,2010;Qi et al.,2011）。一个特别吸引人的但常常被忽视的神经营养因子是HGF，它被证明可以同时刺激神经形成（Shang et al.,2011;Wanget al,2011）和突触发生（见下面的初步研究）。事实上，HGF的应用可能代表了一种切实可行的治疗TBI的选择方法，这源自于最近认识到HGF在脑部多个区域都是有效的神经营养因子（Kato et al.,2009;Ebens et al.,1997），并同时影响多种神经元细胞类型（Yamamoto et al.,1997;Hayashi et al.,2006;Elsent et al.,2009）。
HGF和伤口愈合：过度创伤的典型特征是由于细胞外基质（ECM）成分的合成和降解之间的不平衡，导致不必要的细胞外基质成分在伤口聚集。病理性创伤的治疗可能直接抑制ECM的合成并促进ECM的降解。在皮肤中的HGF通过以下几种方式有效促进伤口愈合：激发真皮层血管内皮细胞的增殖和流动性；刺激表皮角化细胞的流动性；加强局部血液供应；并加速创伤的再上皮化（Nakanishi et al.,2002）。再上皮化抑制了伤疤形成。研究已经表明，导入HGF基因能够通过刺激血管生成和再上皮化而加速真皮伤口愈合（Nakanishi et al.,2002）。增加HGF/SF的治疗手段可以期望用于促进伤口愈合和阻止伤疤形成。
HGF作为代谢综合征和糖尿病的治疗方法选项：最近多个研究暗示了HGF/c-Met系统在葡萄糖处理、胰岛素分泌和组织胰岛素敏感性的调控中起到关键作用。这些调查共同凸显了通过增加HGF/c-Met系统对于治疗2型糖尿病和代谢综合征的治疗潜力（Fafalioset al.,2011;Flaquer et al.,2012）。这些研究者已经表明：1）c-Met，作为具有胰岛素受体的HGF受体复合物；2）c-Met关键与肝部葡萄糖稳态有关；3）HGF能够恢复患鼠科糖尿病的大鼠模型的胰岛素响应；4）HGF基因治疗能够防止通常伴随糖尿病的肾损伤；和5）HGF能够改善糖尿病引起的血管并发症（Peng et al.,2011）。
HGF/c-Met信号通路加强血管生成：血管生成的定义是指在已有血管床中形成新的血管，它在生理过程例如伤口愈合和月经周期中都是基本要求，换句话说，它对于多种病理状况，例如癌症、黄斑变性、粥样硬化、糖尿病视网膜病、新生血管性青光眼、牛皮癣和类风湿性关节炎都是一个必要步骤。因此，不管是通过增强治疗性的血管生成还是通过阻止病理性的血管生成，调控血管生成对于近代医学具有令人振奋的前景。生理性的和病理性之间血管生成的平衡是通过众多内源性血管生成调制剂和抗-血管生成调制剂之间的交流介导的。
众多研究已经表明HGF是一个强大的形成新生血管的诱导子。而且，HGF/c-Met抑制剂是临床上相关的抗-血管生成剂（Gherardi et al.,2012）。这可能是通过多种途径获得的，通过直接或间接作用于内皮细胞。
HGF作为抗纤维化因子：纤维化疾病的形式是多种多样的，而且它是导致心脏、肾脏和肝脏衰竭的主要原因，而且也是导致多种病理状态包括心肌梗塞、糖尿病和酒精中毒的次要原因。肝细胞生长因子（HGF）在多种动物模型中显示出具备强大的抗纤维化效应，它在减轻一系列动物模型的组织纤维化情况中具备显著的效应，HGF展示了显著强大的抗纤维化效应，使得可以减轻多种动物模型和组织的组织纤维化情况（Liu and Yang,2006）。已经有证据记录了外源性HGF在慢性异源移植肾病的大鼠中的治疗效应，该模型是一种慢性炎症并逐步形成组织疤痕。肌内给药人类HGF基因能够降低死亡率，限制炎症和渗透，并减少肾的纤维化（Liu and Yang,2006）。
在西方世界，冠状动脉病（CAD）、局部缺血症和心肌梗塞是导致心力衰竭的主要原因。严重型冠状动脉堵塞和粥样硬化的唯一选择是心脏搭桥手术。在CAD中观察到两种病理事件在CAD的心肌功能丧失中起到主要作用：1）心脏冠状动脉的堵塞会导致灌流到心脏的血液减少；和2）心脏受损后形成的组织纤维化会导致心室重构和顺应性下降。急性心肌梗死之后血液循环中HGF的水平增高已有报道过（Jin et al.,2003）。血液循环中HGF水平的增加可以用来作为心脏受损的生物标记物，并且关于它的保护作用可以提供一定的提示（Ueda et al.,2001）。能够增强HGF/Met信号传导的药物可以潜在地用于治疗心肌梗塞，保护机体免于氧化压力和由于细胞凋亡导致的细胞死亡，以及减少组织纤维化形成（Ahmet et al.,2002;Kondo et al.,2004;Pietronave et al.,2010）。而且，HGF对于心肌梗塞的另一个有益效果在于它能够诱导新血管形成，这可以支撑形成新的心脏血管并改善心肌的再灌注。
虽然已知HGF可以保护肝脏免于外界损伤，但是HGF的形成同样也和若干肝脏和肝外疾病有关。实验和临床证据显示，HGF在肝脏再生中起到关键的作用。肝硬化是纤维化瘢疤形成和肝细胞再生的不可逆的最终结果，是世界范围内导致患病率和死亡率的主要原因，并且没有有效的治疗方法。虽然这种疾病没有特定的致病源，硬化已经定义为肝脏的一种慢性疾病，会扩散肝实质细胞损害和再生，其中结缔组织的分散会导致支气管和血管结构不足（Fujimoto and Kaneda,1999;Kaibori et al.,2002）。理想的是，治疗肝硬化的手段应该包含减弱纤维发生、增强肝细胞有丝分裂和改善组织结构。
研究表明，外源性给药重组HGF可以增加肝切除术后肝脏再生的可能性，特别是在肝硬化的情况中（Boros and Miller,1995;Kaibori et al.,2002;Borowiak et al.,2004）。相反，研究已经表明安妥明相关化合物能够增加HGF/SF的含量，会诱导肝肿大、肝过氧化物酶体增殖和肝癌（Xu and Wu,1999）。HGF/SF和肝脏疾病之间积极和消极的联系均表明，HGF相关的治疗已成为药剂研发的一个热点。
直接使用HGF的限制：直接使用HGF或其他任何蛋白神经营养因子作为治疗剂有两种严重的限制：1）大尺寸和亲水的特性阻止了它的血脑屏障透过率（BBB）；和2）通过重组方法生产的成本太高，以至于限制了它们的广泛使用。
发明内容
这些障碍可以通过使用本文描述的小分子HGF模拟物的扩展库中的一种或多种而被克服；其中一些是口服有效的，体现了意义深远的促认知/抗痴呆/神经保护活性，而且合成成本低。
拮抗剂：c-Met受体不适当的活化可以通过遗传性的活化突变、上调转录或通过配体依赖性的自分泌或旁分泌机理而被增强。
c-Met在癌症中的活化：癌症是一组异质的疾病，其源自基因突变的累积。这些突变会引起原癌基因的功能改变，导致DNA修复、扩增和细胞凋亡信号调节异常（Tannock,2005）。一组细胞中的信号调控失常会导致难以控制的生长和入侵，入侵包括直接侵入和损坏相邻的组织或通过淋巴系统或血流转移并分布到身体的其他位置。
Met和HGF系统的功能紊乱可能是众多人类恶性肿瘤的关键特征。在小鼠和人类细胞系中异位过表达的HGF和/或c-Met会导致在没有胸腺的裸鼠中形成肿瘤发生表型和转移性表现型（Rong et al.,1994）。大量研究表明，HGF/c-Met通路是人类恶性肿瘤中失调最严重的通路之一，所述恶性肿瘤包括但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌（http://www.vai.org/met/）。最后，在人类乳头状肾癌中已经发现了一种随机的、遗传形式的c-Met的激活突变（Danilkovitch-Miagkova andZbar,2002）。在其他类型的实体瘤和转移性病灶中同样发现了这些激酶区域序列改变的突变。在这一点上，值得一提的是HGF过表达或漏表达（miss-expression）经常和不良预后有关，c-Met或HGF在人类肿瘤细胞的表达下调可以降低它们的致肿瘤性（Abounader et al.,2002）。
在癌症中Met的激活最经常通过配体自分泌或旁分泌的激活而发生。骨肉瘤和多形性成胶质细胞瘤能够同时表达c-Met和HGF是自分泌控制功能障碍的例子。在其他例子中，旁分泌控制是最重要的，c-Met的过表达在人类原发肿瘤中已经报道过，其中HGF是由基质细胞而不是由肿瘤细胞本身提供的（Houldsworth et al.,1990;Kuniyasu et al.,1992;Hara et al.,1998;Tong et al.,2004;Miller et al,2006;Bean et al.,2007）。
已经检测的c-Met在其中过表达的瘤的列表正在稳定增加。以恶性肿瘤为例，事实上已在每个恶性肿瘤中发现c-Met的高水平表达（Danilkovitch-Miagkova and Zbar,2002）。受体的过表达会导致局部受体的寡聚化并且在低于配体浓度阈值时产生细胞反应。HGF本身能够引发c-Met的转录（Boccaccio et al.,1994），因此HGF能够通过基质细胞在整个机体普遍表达，这一般会导致肿瘤过表达c-Met（Aguirre Ghiso et al.，1999；Parret al.，2004）。HGF的独特性使得它能在支撑癌细胞生长和新陈代谢的旁分泌正反馈途径中发挥关键作用。有趣的是，这种见解与观察到的c-Met的激活突变需要HGF以加强它们的催化效应是一致的（Michieli et al.,1999）。HGF同样也能以自分泌的方式异常刺激c-Met，正如在恶性胶质瘤（Weidner et al.,1990）、乳腺癌（Potempaand Ridley,1998）、横纹肌肉瘤（Hartmannetal.,1994）和骨肉瘤（Ridleyetal.,1995）中所述。虽然激活的机制是多种多样的，但清楚的是，Met和HGF是大多数人类癌症恶化的主要原因。此外，c-Met和HGF在增殖、入侵、血管生成和抗-细胞凋亡中已证明的活性（Weidner et al.,1990;Rong et al.,1994;Kitamura et al.,2000;Xiaoet al.,2001;Wang et al.,2002;Derksen et al.,2003），能够区分这些分子参与了肿瘤发生中的不同阶段。虽然，c-Met用作癌症的一般标记物，它同样也是生物学意义上关于恶性肿瘤和病人预后的指示，它和不良预后的相关性非常高。因此预料能够抑制c-Met和HGF的分子可以干扰多种引起癌症的分子起因，并能够显著帮助减弱。来自Harding实验室的最近研究已经证实，HGF拮抗剂能够潜在地用作有效的抗癌症因子/抗血管生成因子（Yamamoto et al.,2010;Kawas et al.,2011;Kawas et al.,2012）。
黄斑变性/糖尿病视网膜病：与年龄有关的黄斑变性（ARMD）是在美国60岁以上人群中导致不可逆失明的最常见的原因。预计将有1千万美国人会在退休时期患有一定程度的这种与年龄相关的视力损伤。在正常的健康的眼中，视网膜色素上皮（RPE）细胞会形成一种极化的邻接感光器的单层细胞，并且这些RPE细胞会涉及保证视网膜稳定和视觉功能必须的各种活动。以黄斑变性为例，不幸的是，RPE细胞之间的粘连和交流功能由于炎症而丧失。当炎症发生的时候，RPE细胞能够分泌多种生长因子包括HGF/SF，其能够刺激RPE的分裂和迁移，并能从现存血管中形成新的血管（血管生成）。HGF同样能够刺激产生其他生长因子（例如VEGF），它能够进一步促进形成新的血管，所述血管能够入侵相邻胞间质（Jun et al.,2007）。因此，HGF阻断剂的使用可以用于预防、或者减慢疾病发展和随后导致的视力丧失的治疗方法。
增殖性糖尿病性视网膜病变（PDR），使得视网膜中形成明显的新血管，其特征在于血管入侵到玻璃体腔，并伴随围绕增生性管道的出血和瘢疤形成（Katsura et al.,1998）。大量证据表明，一般情况下，特别是PDR情况下，多种生长因子参与新血管形成的开始阶段和发展阶段。这些生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子（IGF-I），血管内皮生长因子（VEGF）和HGF。这些生长因子之中，HGF对内皮生长和促有丝分裂的活性具有最明显的效应（Boulton,1999）。研究已发现，HGF在PDR病人玻璃体腔液体中的水平一般认为是高于非糖尿病患者的水平，同时HGF的水平在PDR病人的活动期是尤其高的（Katsura et al.,1998）。这表明HGF能够刺激或保持PDR中的新血管形成。因此，有理由相信HGF拮抗剂对于预防性治疗或者对于改善PDR的进展会是一种有希望的选择。
附图说明
图1A、B和C.Dihexa对水迷宫空间学习能力的影响。A：测试开始之前30分钟，直接向大鼠侧脑室（ICV）注射东莨菪碱，10分钟后向ICV注射Dihexa10皮摩尔（低剂量）或100皮摩尔（高剂量）。在第一次训练试验之前每天重复该动作。8天内每天有5组试验。找到平台的潜伏期（latency）被认为是学习和记忆能力的衡量标准。接受高剂量Dihexa注射的大鼠能够完全克服东莨菪碱的缺陷，并与对照组没有差异。B：测试开始之前30分钟，直接向大鼠侧脑室（ICV）注射东莨菪碱，10分钟后口服给药Dihexa1.25毫克/千克/天（低剂量）或2毫克/千克/天（高剂量）。在第一次训练试验之前每天重复该动作。8天内每天有5组试验。找到平台的潜伏期被认为是学习和记忆能力的衡量标准。接受高剂量Dihexa的大鼠能够完全克服东莨菪碱的缺陷，并与对照组没有差异。C：把性别和年龄（22-26个月）混合的老年大鼠随机分配到对照组/非处理组或Dihexa处理组中（2毫克/千克/天）。大鼠没有经过预筛。注意到一般会有大约50%的老年大鼠表现出缺陷，因而出现大组错误（Large group error）。Dihexa处理组表现的要显著好于非处理的对照组。
图2A和B.Dihexa和Nle1-AnglV剂量依赖性地刺激树突棘生成（spinogenesis）。A）Dihexa和B）Nle1-AnglV对mRFP-β-肌动蛋白转染的海马神经元以剂量依赖性方式增加树突棘密度。经过5天很宽浓度值范围内的Dihexa或Nle1-AnglV处理，神经元被刺激。培养基固定之后12天；从单独培养基中获得数据。典型的50μm树突部分中树突棘的个数采用手动统计。**=p<0.05和***=p<0.001；n=50；平均值±平均数标准误差；ζ=与对照组有显著差异。
图3A-E.Nle1-AngIV和Dihexa处理过的神经元对于树突棘生成的时间依赖效应。被m-RFP-β-肌动蛋白转染的海马神经元用10-12M的Dihexa或Nle1-AngIV在培养基内处理5天，或在体外第12天（DIV12）固定前处理30分钟，以促进树突棘生成。A）采用媒介物（vehicle）处理5天后的海马神经元的树突树（dendritic arbor）的代表图象。B）采用10-12M的Dihexa刺激5天后的神经元的树突树的代表图象。C）采用10-12M的Nle1-AngIV刺激5天后的神经元的树突树的代表图象。D）代表每种处理情况体外处理5天后每50μm树突长度的树突棘的个数的柱形图。***P<0.001；n=200。E）代表每种处理情况急性处理30分钟后每50μm树突长度的树突棘的个数的柱形图。***P<0.001；n=60。*培养基固定之后12天；从单独培养基中获得数据。通过单因素方差分析和图基（tukey）事后检验法计算平均值±平均数标准误差。
图4.Nle1-AngIV和Dihexa增加树突棘的头部宽度。测量树突棘头部宽度作为突触强度的一个指示。树突棘的头部有更大的表面积能够接受更多的神经递质受体，也更容易形成功能性突触。AngIV类似物处理引起的树突棘头部宽度的增长表明神经传递得到促进。***=p<0.001；平均值±平均数标准误差；n=100。
图5A-G.Nle1-AngIV和Dihexa刺激的神经元的神经递质模式。Dihexa和Nle1-AngIV处理的神经元采用通用的突触前标记物突触蛋白和谷氨酸能突触前标记物VGLUT1进行免疫染色。测量突触后树突棘（红色）和突触前斑点（绿色）之间的百分比关系作为功能性突触的指示。A）代表采用媒介物、Nle1-AngIV和Dihexa处理之后增加的树突棘个数的柱形图。这能确保神经元中活跃的表型（***=P<0.001；平均值±平均数标准误差；n=25）。B）代表处理诱导的突触后树突棘占谷氨酸能突触前标记物VGLUT1的百分比关系的柱形图，突触前标记物和突触后树突棘之间的高比例相关性表明了已形成功能性连接（P>0.05；平均值±平均数标准误差；n=25）。C）代表采用媒介物、Nle1-AngIV或Dihexa处理之后树突棘个数增加的柱形图，这能确保神经元的健康。D）代表处理诱导的突触后树突棘占一般性突触前标记物突触蛋白的百分比关系的柱形图。在刺激后的神经元和媒介对照处理过的神经元之间没有观察到显著差异（P>0.05；平均值+平均数标准误差；n=25），这表明突触前的多数传入都是谷氨酸能神经元。E）代表采用媒介物、Nle1-AngIV或Dihexa处理之后树突棘个数增加的柱形图，确保活跃的表型（***=P<0.001；平均值±平均数标准误差；n=25）。F）代表处理诱导的突触后树突棘占突触前标记物PSD-95的百分比关系的柱形图。G）突触后标记物PSD-95与突触后树突棘之间显示没有显著差异（P>0.05；平均值±平均数标准误差；n=25），表明新形成的树突棘具备功能性的突触后成分。
图6A和B.分离的海马神经元中的微小-兴奋性突触后电流（mEPSCs）。Nle1-AngIV和Dihexa处理增加了微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）的频率。在记录前5天采用媒介物、10-12M Nle1-AngIV或Dihexa处理的分离的海马神经元上完成记录。记录到的电流是在没有动作电位，同时存在番木鳖碱、木防己苦毒素和河豚毒素的条件下，由AMPA介导的突触传递自发产生的电流。A）用Nle1-AngIV或Dihexa处理的海马神经元中记录到的mEPSC代表剂量。B）代表用Nle1-AngIV或Dihexa处理的海马神经元中由AMPA介导的频率增加的柱形图。增加的频率表明Nle1-AngIV或Dihexa诱导的树突棘支持功能性的突触。***=p<0.001；±平均数标准误差；n=25。
图7A和B.对源于大鼠的器官型海马脑切片培养物的CA1海马神经元中Nle1-AngIV和Dihexa依赖性的树突棘生成的评估。发现Nle1-AngIV和Dihexa能够支持CA1海马神经元中的树突棘生成。器官型海马脑切片培养物（厚度400μm）代表的更加完整环境，以生物弹道法（biolistically）转染可溶性的红色荧光蛋白Tomato。选择CA1海马神经元用于评估，是由于已知它们在学习过程中具备可塑性反应。切片来自出生后5天的大鼠。A）来自经Tomato转染的海马脑切片的CA1神经元树突的代表图象。图片表示采用10-12MNle1-AngIV或Dihexa处理2天的图象。B）在海马神经元CA1区锥体细胞观察到处理诱导的树突棘生成。对照切片中经测量为每50μm树突长度有7个树突棘，而经Nle1-AngIV和Dihexa处理过的神经元每50μm树突长度有11个树突棘；平均值±平均数标准误差，n=17；**=P<0.01。通过单因素方差分析和图基（tukey）事后检验法计算统计学意义；试验至少重复三次。
图8.HGF剂量依赖性增加树突棘生成。HGF对于分离的海马神经元的树突棘生成的影响。选自1日龄或2日龄大鼠分离的海马神经元经mRFP-β-肌动蛋白转染并采用HGF刺激5天。采用2.5纳克/毫升HGF处理不会影响基础树突棘的数量，2.5纳克/毫升是亚阈值（sub-threshold）的。和采用媒介物处理的神经元相比，5、10和20纳克/毫升的剂量能够显著增加每50μm树突长度树突棘的个数。***P<0.001；平均值±平均数标准误差；每个处理组n=50。
图9A和B.Dihexa和HGF对器官型海马脑切片培养物的的树突棘生成的影响。海马脑切片培养物在体外培养第三天（DIV3）采用红色可溶性蛋白Tomato以生物弹道法转染并在体外培养第五天（DIV5）采用Dihexa或HGF刺激。器官型海马脑切片培养物保持更加完整的穿质通路能够代表更完整的环境。A）展示学习相关的突触可塑性的海马区域的神经元类型CA1神经元的代表图象。海马脑切片采用媒介物、10-12M Dihexa或10纳克/毫升的HGF刺激2天。B）代表每个处理组每50μm树突长度的树突棘个数的柱形图。和对照处理组的神经元相比，Dihexa和HGF能够显著增加海马神经元CA1的树突棘个数。***=P<0.001；平均值±平均数标准误差；对照组神经元n=20、Dihexa刺激的神经元n=26、HGF刺激的神经元n=38。
图10A-D.HGF处理对于分离的海马神经元的树突棘生成的影响。HGF的处理支持功能性突触的形成，正如突触后树突棘（红色）和突触前活跃区域的标志物（绿色）之间的高度相关性所示。A）海马神经元在体外培养第6天（DIV6）采用mRFP-β-肌动蛋白转染并在体外培养第6天采用10纳克/毫升的HGF处理后的代表图像。神经元采用普通的突触前标记物突触蛋白和谷氨酸能突触前标记物VGLUT1染色。B）代表活跃表型的柱形图，正如采用HGF（10纳克/毫升）刺激后每50μm树突长度的树突棘的个数的显著增加所示。平均树突棘个数=33而对照组=23；***=P<0.001，采用单因素方差分析和图基（tukey）事后检验法；平均值±平均数标准误差；n=25）。C）富含肌动蛋白的突触后树突棘（红色）与一般性突触前标记物突触蛋白（绿色）相比的相关百分比。高相关百分比表明已形成了功能性突触。D）富含肌动蛋白的树突棘（红色）和谷氨酸能突触前标记物VGLUT1（绿色）并列相比的相关百分比。高于95%的关系表明这些传入大部分都是谷氨酸能神经元。
图11.Dihexa和HGF处理对于分离的海马神经元的mEPSCs频率的影响。转染了mRFP-β-肌动蛋白的分离的海马神经元在开始记录mEPSCs之前5天采用10-12MDihexa或10纳克/毫升的Dihexa进行刺激。神经元采用河豚毒、木防已苦毒素和马钱子碱处理以抑制动作电位、GABA依赖性抑制和甘氨酸依赖性抑制。和媒介物处理的神经元相比，采用两种兴奋剂处理能够显著增强AMPA介导的电流（**P<0.002；通过Newman-Keuls事后检验法和单因素方差分析计算±平均数标准误差；n分别为9、9和11）。
图12A和B.最高剂量和亚阈值剂量的血管紧张素IV类似物和HGF对于树突棘生成的影响。A）亚阈值剂量的HGF、Dihexa或Nle1-AngIV不会影响基础树突棘的数量。联合给药亚阈值水平的Dihexa（10-13M）和HGF（2.5纳克/毫升）的表型与单独给药生物学有效剂量的Dihexa产生的效应类似；#=10-13M，$=2.5纳克/毫升。B）亚阈值剂量的母体化合物Nle1-AngIV（10-13M）不会影响基础树突棘水平。联合给药亚阈值水平的Dihexa（10-13M）和HGF（2.5纳克/毫升）的表型与单独给药生物学有效剂量的Nle1-AngIV产生的效应类似；#=10-13M，$=2.5纳克/毫升。亚阈值剂量的联合兴奋剂产生最大反应表明了受体通路的共性。***P<0.001；平均值±平均数标准误差；n=50。
图13A-D.新型HGF拮抗剂Hinge对血管紧张素IV型配体和HGF介导的树突棘生成的影响。A）评估了HGF拮抗剂Hinge（10-12M）对树突棘生成的影响。在很宽剂量范围内，Hinge不会影响神经元的树突棘生成；包含Dihexa以确保神经元能够响应处理；B）Hinge抑制HGF诱导的树突棘生成；C）Hinge抑制Nle1-AngIV诱导的树突棘生成；D）Hinge抑制Dihexa诱导的树突棘生成。#=10-12M，$=10纳克/毫升。上述数据进一步表明Nle1-AngIV和Dihexa是由HGF/c-Met系统介导的。***P<0.001；平均值±平均数标准误差；n=50。
图14A-D.HGF拮抗剂Hinge对HGF和Dihexa介导的分离的海马神经元的mEPSCs增强的影响。在没有动作电位时，记录mEPSCs之后，对分离的海马神经元采用Hinge（10-12M）、HGF、Dihexa（10-12M）或HGF（10纳克/毫升）处理5天。A）Hinge处理的神经元的代表痕量（trace）。B）媒介物处理的神经元的代表痕量。C）和对照处理组的神经元相比，HGF显著增加AMPA介导的频率。这一效应被Hinge减弱，而Hinge单独使用没有任何影响。D）自发的AMPA介导的频率会在Dihexa处理后显著增加，而在采用Hinge前处理后会显著降低，Hinge单独使用对基线频率没有任何影响。*P<0.001；平均值±平均数标准误差，单因素方差分析和Newman-Keuls事后检验法。
图15A-B.c-Met蛋白在成年大鼠脑中的分布。总的脑部区域取自Sprague-Dawley大鼠，并迅速采用液氮冰冻。样品被均质化，并采用电泳和免疫印迹分离c-Met蛋白和肌动蛋白。A）代表对于认知非常重要的特定脑部区域的c-Met总量（未指明单位）的柱形图。比较脑部样品和HGF的产生地-肾脏。B）以肌动蛋白为内参照（loadingcontrol），样品使用能够结合c-Met蛋白（条带在145kDa）的探针的代表性蛋白印迹图象。基于BCA蛋白决定簇，每条泳道中使用等量的蛋白。
图16.在大鼠海马脑切片中使用HGF和Dihexa激活c-Met磷酸化。为了检测Dihexa是否能够激活成年大鼠脑中的c-Met受体，海马脑切片采用HGF、Dihexa或媒介物（aCSF）急性刺激30分钟。通过蛋白印迹中c-Met受体的磷酸化测量受体活化程度。和媒介物处理的切片相比，饱和剂量的HGF（100纳克/毫升）和Dihexa（10-10M）能够有效增加经急性刺激的成年海马脑切片中c-Met的磷酸化。和对照相比，亚阈值剂量的HGF（50纳克/毫升）和Dihexa（10-12M）不能显著增加c-Met受体的磷酸化。然而，联合给药亚阈值剂量的HGF和Dihexa的表型与给药饱和剂量的HGF和Dihexa表型类似。
图17.HGF模拟物、Dihexa对c-Met活化的影响。HEK293细胞采用各种剂量的HGF+/-Dihexa处理后，在37℃保温30分钟，然后通过免疫印迹分析磷酸化的（活化的）c-Met。结果清楚地表明，HGF和Dihexa能够协同激活c-Met。
图18.HGF模拟物、Dihexa、HGF依赖性细胞分散的影响。在MDCK细胞（犬肾上皮连续细胞系）中评定细胞分散性。细胞在盖玻片上生长聚集，然后转移到一个干净的平板。处理4天后，测定从盖玻片分散下来的细胞的数量。HEX=Dihexa10-10M。
图19.确认敲除c-Met受体。通过采用用于证实蛋白存在的6Myc标记的cMet基因产品mRFP-β-肌动蛋白（未转染）、shRNA（c-Met）序列（仅shl用于敲除实验）和两种合并的shRNA转染HEK细胞，来确认敲除受体。转染的细胞继续培养24小时，然后在细胞裂解液（RIPA）中溶解，准备用于凝胶电泳。样品通过蛋白印迹采用探针检测Myc。未被感染的细胞可以用作显示没有信号的阴性对照，带有6-Myc标记的cMet基因产品是阳性对照并有强烈的信号。shMet1和shMet2序列能够大大减弱信号，并且二者的结合没有信号表明能够有效敲除受体。
图20.使用shRNA敲除c-Met对树突棘生成的影响。该图显示了蛋白印记探测的Myc。经mRFP-β-肌动蛋白或shMet转染以便敲除c-Met受体的海马神经元采用HGF（10纳克/毫升）、Dihexa（10-12M）或Nle1-AngIV（10-12M）刺激48小时。经mRFP-β-肌动蛋白转染并经HGF、Dihexa或Nle1-AngIV刺激的神经元显著增加树突棘生成（*P<0.05；平均值±平均数标准误差；n=100）。那些转染了mRFP-β-肌动蛋白和shMet的神经元对HGF、Dihexa或Nle1-AngIV的刺激没有反应，证实HGF和c-Met是靶标（P>0.05；平均值±平均数标准误差；n=100）。
图21.HGF和c-Met对于空间学习和记忆有作用。在Morris水迷宫空间学习和记忆测试中，测量大鼠找到水下平台的潜伏期用于确定HGF/c-Met对学习和记忆的影响。大鼠接受侧脑室注射失忆药或HGF/c-Met受体兴奋剂。经东莨菪碱处理的大鼠→通过测量逃避潜伏期表明东莨菪碱不能使其学习该任务。经aCSF处理的一组大鼠的潜伏期→aCSF相比东莨菪碱处理的大鼠组第一天的培训明显更短。东莨菪碱→Dihexa处理过的大鼠和Hinge处理过的大鼠→Hinge虽然和东莨菪碱处理的小组没有明显不同，在培训第一天表现出快速适应任务。接受东莨菪碱+Hinge的小组→Dihexa和东莨菪碱处理的小鼠没有明显区别，并且逃避潜伏期较长。在Morris水迷宫空间学习和记忆测试中大鼠找到水下平台的小组潜伏期。Hinge单独对学习没有任何影响；然而，除了东莨菪碱，Hinge也能够阻止对任务的适应。
图22.和D-Nle-Tyr-IIe-NH-（CH2）5-CONH2相比，大鼠血液中Norleual的稳定性。
Figure BDA0000428053160000161
Norleual和D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2在肝素化的大鼠血液中37℃下保温；该图显示了百分回收率（平均值±标准偏差）随着时间的变化。基于单相指数式衰减计算得到的Norleual的稳定性t1/2是4.6分钟，而D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2的稳定性t1/2是79.97分钟。
图23.D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-CONH2类似物和HGF的结合。代表性曲线显示了D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-CONH2类似物相对于3H-Hinge的与HGF竞争性结合。D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-CONH2类似物和3H-Hinge（13.3x10-12M）和1.25纳克HGF一起在0.25毫升缓冲剂中在37℃下保温40分钟。HGF结合的Hinge在添加不同浓度的D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-CONH2类似物（10-13-10-7M）之后从生物胶（Bio-Gel）P6柱中洗脱。洗脱后溶液的放射性使用闪烁计数定量。这些数据表明D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-CONH2类似物展示了对HGF的广泛亲和性。Met、Trp、Cys和Tyr类似物的Kis分别测定为：1.375x10-07M、3.372x10-09M、1.330x10-10M，和2.426x10-10M；N=9。
Figure BDA0000428053160000163
D-Nle-Cys-Ile-NH-（CH2）5-CONH2、
Figure BDA0000428053160000164
D-Nle-Met-Ile-NH-（CH2）5-CONH2、
Figure BDA0000428053160000165
D-Nle-Trp-Ile-NH-（CH2）5-CONH2、
Figure BDA0000428053160000166
D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2。
图24.通过D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-CONH2类似物抑制HGF二聚物形成。在PBS中保存时，当肝素存在时，HGF自发形成二聚物。HGF单独保温（对照组）或HGF与浓度为10-10M的各种候选药物一起温育。这些候选药物包括D-Nle-X-Ile-（6）氨基己酰胺，一种基于AngIV的类似物家族，其中X=Tyr、Cys、Tip和Met。经过30分钟的温育，样本和BS3交联，通过凝胶电泳分离，并进行银染。定量条带密度并用于确定每组HGF的二聚化水平。处理组（Tyr、Cys、Tip）在统计学上不同于HGF处理的小组（P<0.05；n=8）。（A）代表性凝胶图片。（B）汇集的和量化的数据。
图25.通过D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-CONH2类似物抑制Met磷酸化。采用HGF+/-Nle-X-Ile-（6）氨基己酰胺类似物以所示浓度处理HEK293细胞10分钟。HEK293细胞溶解产物采用抗-磷酸-Met和抗-Met抗体进行免疫印迹。和HGF处理组相比，所示处理组中Met磷酸化的平均值的差异（Nle-X-Ile-（6）氨基己酰胺类似物）意外地高于预期（P<0.05；N=6）。Met组和HGF组没有区别（P>0.05；N=6）。
图26.D-NIe-X-IIe-NH-（CH2）5-CONH2类似物对MDCK细胞增殖的影响。MDCK细胞采用10-10M的PBS媒介物（阴性对照）、HGF、HGF联合Nle-X-Ile-（6）-氨基己酰胺类似物（X=L-氨基酸）处理。代表HGF二聚化区域的Hinge多肽（KDYIR）包含在阳性对照中。细胞生长4天。通过检测MTT试验中590nm下的吸收值，评估第四天细胞数量。HGF依赖性扩增的百分比：从所有数值中都减去对照值以测定HGF诱导的细胞增殖的增长。N=6。***p<0.001。**p<0.001，*p<0.05，ns：没有显著性。
图27.D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-CONH2类似物对依赖HGF的MDCK细胞分散的影响。细胞分散，其中细胞丧失细胞之间的联系并能够快速迁移，是对HGF的经典响应。MDCK细胞是用于研究HGF/Met系统的黄金标准细胞模型，先在盖玻片上培养至100%汇合率，然后置于干净的平板。通过单独添加20纳克/毫升的HGF或联合Nle-X-Ile-（6）氨基己酰胺类似物（X=L-氨基酸）到基质中以刺激细胞从盖玻片上分散开。经过48小时的分散，细胞用甲醇固定并用Diff-Quik染色。去除盖玻片以显示从盖玻片分散到平板的细胞的环。（A）HGF对于细胞分散的影响通过对分散细胞的数字图像采用光密度分析法进行定量。单因素方法分析ANOVA表明Tyr+HGF处理组、Cys+HGF处理组和Tip+HGF处理组不同于HGF单独处理组，但和对照组相同。HGF组和HGF+Met组相同。N=8，p<0.05（B）MDCK细胞从盖玻片分散下来的代表图象。
图28.抑制MDCK细胞分散与对干扰HGF的二聚化以及HGF结合亲和性之间的相关性。检测D-Nle-X-Ile-（6）氨基己酰胺的三种衍生物（其中X为Cys、Trp、或Met），以确定每种化合物抑制HGF二聚化和HGF结合亲合性的百分比是否和体外细胞活性即MDCK细胞分散性相关。图片表示抑制HGF二聚化（◆；R2=0.9809）和HGF结合亲和性（●；Ki值；R2=0.9903）的百分比与抑制HGF依赖性细胞分散的百分比之间有很强的相关性。
图29.通过D-Nle-Cys-Ile-NH-（CH2）5-CONH2抑制B16-F10黑素瘤在肺部定殖。将400,000B16-F10小鼠的黑素瘤细胞注射到C57BL/6小鼠的尾巴静脉中。小鼠每天腹腔注射（IP）D-Nle-Cys-Ile-（6）氨基己酰胺（10微克/千克/天或100微克/千克/天）或PBS媒介物。（A）14天后，与未处理的对照组相比，源自D-Nle-Cys-Ile-（6）-氨基己酰胺处理的小鼠的肺部显示黑素瘤集落已经明显降低。（B）摘除后，使肺部均质化，用分光光度计测定黑色素全部含量，并用于为媒介物处理的小鼠和D-Nle-Cys-Ile-（6）-氨基己酰胺处理的小鼠中全部肺部黑素瘤集落定量。未定殖（ungrafted）的年龄相仿的对照组的肺部显示背景吸收值在410nm。N=15，平均值+平均数标准误差；*P<0.05，***P<0.001。
具体实施方式
有多种治疗效应的多肽类似物或HGF模拟物（也称为“生长因子模拟物”或“类似物”）具有以下结构通式：
其中
R1为N-酰基例如，己酰基、庚酰基、戊酰基、丁酰基、丙酰基、乙酰基（acetanoyl）、苯甲酰基，
取代或未被取代的苯基，
D或L-正亮氨酸，
氨基酸（D或L）例如：赖氨酸、精氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、或S-苄基半胱
氨酸氨基酸残基；
R2为氨基酸（D或L），例如：酪氨酸、半胱氨酸、苯基丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、色氨酸、赖氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、苯基丁氨酸；
R3为D或L异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸氨基酸残基；并且
n的范围是3-6；
并且其中共价键1、2和3是肽键（比如-CO-NH-）或还原型肽键（CH2-NH2）。
典型的肽键和还原型肽键如下所示：
Figure BDA0000428053160000182
通式中的化合物已经根据以下步骤进行合成和分析。
标准合成方法：
全部化合物都通过固相方法，使用AAPPTEC Endeavor90型号多肽合成仪和Fmoc基团保护的氨基酸进行合成。全部肽酰胺都在Rink树脂上合成。树脂先在二甲基甲酰胺（DMF）中预溶胀，然后用20%的哌啶/DMF去保护30分钟。哌啶/DMF然后通过过滤去除。去保护之后，N-αFmoc基团保护的氨基酸作为干粉添加到反应容器中（3等份）。然后向容器中加入DMF和干燥的二异丙基乙胺（DIPEA；3.5-4等份）至2/3满。然后添加N-[（1H-苯并三唑-1-yl）]（二甲氨基）亚甲基]-N-甲基-甲胺六氟磷酸盐（methanaminium hexafluorophosphate）N-氧化物（HBTU；2.9等份），并搅拌悬浮液30分钟。溶液然后通过过滤去除。树脂然后用DMF洗涤两次，用甲醇洗涤两次，用二氯甲烷洗涤两次，最后用DMF洗涤两次以上。每次洗涤后的溶液通过过滤而被去除。采用Kaiser实验检测游离胺的耦合效应。如果检测呈阳性，则再次将氨基酸耦合到树脂上或生成肽链。如果检测显示连接很好，则用DMF再次洗涤树脂，并用上述20%哌啶/DMF去保护30分钟，然后用DMF再次洗涤。然后采用上述步骤进行耦合。
肽N端的酰基化
最终去保护之后，肽树脂和20%适当的酰基酸酐在DMF和DIPEA（1.5等份）中室温下温育30分钟。树脂用DMF洗涤两次，用甲醇洗涤两次，用二氯甲烷洗涤两次，最后用DMF洗涤两次以上。溶液通过过滤去除，用Kaiser实验以确认封端（capping）的完成。如果检测到游离胺，则重复封端步骤。
N端还原的肽键插入：
在去保护之后，己醛（3等份）DMF添加到树脂中并混合5分钟。然后，添加3等份的氰基硼氢化钠，悬浮液再混合2个小时。在标准洗涤步骤之后（如上所述），再次用Kaiser实验以确认反应的完成。如果认为耦合是不完全的，则重复进行上述步骤。
从Rink树脂上分离肽：
在最后一个氨基酸去保护之后，洗涤过的树脂转移到一个烧结玻璃漏斗（4孔）中，DMF在真空下去除。半干燥的树脂悬浮在具有2.5%作为清除剂的三异丙酯-硅烷的20%三氟乙酸（TFA）中，在室温下保温15分钟，然后过滤。树脂用额外的DMF洗涤并过滤三次。添加10倍体积冰冷的二乙醚到合并的滤液中，将混合液置于4℃过夜。沉淀下来的多肽通过过滤回收，并用冰冷的乙醚洗涤三次。对于非常疏水的多肽，合并的乙醚洗液用DMF再次萃取以沉淀出肽，并过滤以回收多余的肽。
肽纯化和分析：
肽粗产物先用反相HPLC C18柱采用梯度洗脱进行首次纯化。典型的梯度是在30分钟内，以1毫升/分钟的流速在37℃下以10%-40%成分B洗脱，成分A是80mM的三乙胺磷酸，其pH为3.0，成分B是乙腈（ACN）。在所有例子中，在215nm下仅检测并收集单一吸收峰。收集到的化合物冻干，再溶解于20%甲醇中，然后注射到第二个C18柱子中。使用的HPLC MS系统来自Shimadzu（日本，京东），包括CBM-20A通讯总线模块、LC-20AD泵、SIL-20AC自动进样器，SPD-M20A二极管矩阵检测器和LCMS-2010EV质谱仪。使用Shimadzu LCMS solution软件完成数据收集和整合。分析柱用的是来自Grace Davison Discovery Science的Econosphere C18（100mmX2.1mm）柱（Deerfield，伊利诺伊州，美国）。移动相包括HPLC梯度甲醇和含有0.1%三氟乙酸的水。
采用非等度洗脱方法（甲醇30分钟内由20%改变为50%）在37℃进行分离，流速为0.3毫升/分钟。对于质谱分析（MS），使用正离子模式（扫描），并在预期的m/z值处分析峰值。典型的峰值纯度分析显示峰值纯度指数为>0.95。二极管矩阵检测器检测波长比率进一步确定峰值纯度。
下面表1列出了家族1中的化合物（作为模拟物）、家族2-5（作为拮抗剂），所有化合物根据上述步骤进行合成和分析。
表1
家族1（模拟物）和家族2-5（拮抗剂）的通式结构
Figure BDA0000428053160000201
箭头1-3表示pb=肽键；ψ=还原型肽键（CH2-NH2）
n=5
Figure BDA0000428053160000211
Figure BDA0000428053160000231
关于表1，虽然许多化合物，包括R2和R3上为酪氨酸和异亮氨酸的化合物，已经分别被合成，许多氨基酸和其他残基可能在本发明实施方式的实践中用于模拟物或兴奋剂（分别为家族1和家族2-5），这些位点包括但不限于：半胱氨酸、蛋氨酸、苯丙胺酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、色氨酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、和高苯丙胺酸。而且，虽然本发明的各种实施方式中的模拟物包括特定的如表1所述的N-酰基（家族1），但其他N-酰基或替代的或非替代的苯基基团也可能用于R基团。此外，虽然表1（家族2-5）中所述的许多兴奋剂在R1位置为正亮氨酸，或一种氨基酸残基，但在本发明的各种实施方式中许多氨基酸残基（D或L）可能用在残基R1位置，包括但不限于酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、S-苄基半胱氨酸氨基酸残基。最终，表1中的包括5个甲基重复单元的全部化合物都已被合成和测试，在本发明的一些实施方式中甲基重复单元数（n）可以为3-6。
表1中的化合物采用如下方法评估：
HGF模拟物活性评估：
HGF模拟物活性一般通过以下一种或两种方法评估：增加HEK293细胞中HGF依赖性的c-Met磷酸化，或2）增加MDCK细胞中HGF依赖性的细胞分散。家族1中的全部化合物都使用c-Met磷酸化试验进行测定。通过进一步评估发现，N-己酰-酪氨酸-异亮氨酸（6）氨基己酰胺（aminohexamide）能够大大增加HGF依赖性的MDCK细胞的分散性。表2是对这些结果的总结。
表2
Figure BDA0000428053160000241
细胞培养。在包含10%牛胎儿血清（FBS）的DMEM（细胞培养基）中培养人类胚胎肾细胞293（HEK 293）、犬肾上皮连续细胞（MDCK）和B16F10小鼠黑素瘤细胞。使用前，细胞被培养至90-100%汇合率。在大多数而非全部研究中，HEK和MDCK细胞在开始药物处理之前，会先采取血清饥饿24小时。
蛋白印迹。HEK293细胞接种在6孔组织培养板中，并在包含FBS的DMEM培养基中培养至95%汇合率。细胞在处理前去除血清24小时，以降低磷酸化-Met的基本水平。在血清饥饿之后，制备包含溶剂并包含/不含HGF（2.5纳克/毫升）的混合物，并在室温下预温育30分钟。然后添加混合物到细胞中10分钟，以刺激Met受体和下游蛋白质。细胞采用添加了磷酸酯酶抑制剂1和2的混合物（Sigma-Aldrich；圣路易斯，密苏里州）的RIPA裂解缓冲液（Upstate）进行收集。裂解产物通过以15,000gx15分钟离心进行澄清，使用BCA蛋白定量法测定蛋白质浓度，然后用2倍的还原性Laemmli缓冲液稀释适量体积的裂解产物，并在95℃加热10分钟。包含相似含量的蛋白质样品使用SDS-PAGE溶解（标准，BioRad实验室），转移到硝化纤维膜，在Tirs盐缓冲液中室温下封闭1个小时。添加磷酸化-Met抗体到封闭缓冲液中，其终浓度为1：1000，在4℃下过夜保温并轻微搅拌。使用水和TBS（PBS，0.05%吐温-20）洗涤上述膜数次，添加1：5000的辣根-过氧化物酶共价结合的山羊抗兔抗血清，在室温下进一步温育所述膜。使用超灵敏West Pico化学发光底物系统（Pierce，芬顿，密苏里州）使得蛋白质可视化，根据蛋白梯（protein ladders）确定蛋白质分子量大小（BenchMark,Invitrogen；和Kaleidoscope,BioRad）。使用凝胶成像系统（UVP）磷光影像分析仪数字化和分析图象。
分散实验。MDCK细胞在6孔平板的盖玻片上培养到100%汇合率，并用PBS洗涤两次。汇合的盖玻片在无菌条件下转移到新的包含900微升无血清DMEM培养基的6孔平板中。添加Norleual、Hinge多肽、和/或HGF（2.5纳克/毫升）到适当的孔中。对照孔添加PBS媒介物。平板在含5%CO2，37℃下培养48小时。去除培养基，细胞采用甲醇固定。细胞使用Diff-Quik、Wright-Giemsa（Dade-Behring,Newark，DE）染色并获得数字图象。使用镊子去除盖玻片，同时获得更多数字图象。使用Prism5软件的图象J方法和InStat3.05版的统计学方法对图象的像素量化。
对于上述的基本结构式和再次出现的下述结构式以便于参考，多种化合物可以根据上述步骤进行合成并用于下述治疗中。表3给出了许多包含多个相应家族中列出的化合物的代表性家族（通过在通式结构式内部分取代来确定）。
表3
通式结构
Figure BDA0000428053160000251
Figure BDA0000428053160000252
Figure BDA0000428053160000271
Figure BDA0000428053160000281
Figure BDA0000428053160000291
Figure BDA0000428053160000301
13-16与家族1-4结构相同，并且R2=S
17-20与家族1-4结构相同，并且R2=T
21-24与家族1-4结构相同，并且R2=D
25-28与家族1-4结构相同，并且R2=E
29-32与家族1-4结构相同，并且R2=Y，R3=V
33-36与家族1-4结构相同，并且R2=F，R3=V
37-40与家族1-4结构相同，并且R2=C，R3=V
41-44与家族1-4结构相同，并且R2=S，R3=V
45-48与家族1-4结构相同，并且R2=T，R3=V
49-52与家族1-4结构相同，并且R2=D，R3=V
53-56与家族1-4结构相同，并且R2=E，R3=V
57-85与家族29-56结构相同，并且R3=L
86-170与家族1-85结构相同，并且n=3
171-256与家族1-85结构相同，并且n=4
257-341与家族1-85结构相同，并且n=6
Figure BDA0000428053160000302
Figure BDA0000428053160000311
346-349与家族342-345结构相同，并且R3=V
350-353与家族342-345结构相同，并且R3=L
354-365与家族342-353结构相同，并且R1=D-正缬氨酸
366-377与家族342-345结构相同，并且R3=D-赖氨酸
378-389与家族342-345结构相同，并且R3=D-精氨酸
390-401与家族342-345结构相同，并且R3=D S-甲基半胱氨酸
402-457与家族342-401结构相同，并且n=3
458-513与家族342-401结构相同，并且n=4
514-569与家族342-401结构相同，并且n=6
可选地，本发明所述的类似物或生长因子模拟物可以用下述结构式表示，所述结构式包含由共价肽键或还原肽键连接的四个部分：
I-II-III-IV
其中
I=一种酸，例如庚酸、己酸、戊酸、丁酸、丙酸、醋酸、安息香酸、或安息香酸取代物、和它们的异构体；或D/L正亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、或S-苄基半胱氨酸；
II=一种D或L半胱氨赖氨酸、苯基丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、或苯基丁氨酸氨基酸残基；
III=为一种D或L异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸氨基酸残基；并且
IV=氨基-己酸、氨基-戊酸或氨基丁酸；其中成分I、II、III和IV通过肽键或还原型肽键连接。
在一个实施方式中，类似物是：己酸-酪氨酸-异亮氨酸-（6）-氨基己酰胺。把公式I作为一种基本结构，对于该特定的类似物，R1=己酰；R2=酪氨酸；R3=异亮氨酸；并且n=5。可选地，使用I-II-III-IV命名法，在该实施方式中，I=己酸；II=酪氨酸；III=异亮氨酸；并且IV=己酰胺。
本发明的实施方式涉及为有需要的受试者提供一种或多种HGF类似物。可能从接受这种治疗例如给药一种或多种此处描述的HGF模拟物中获益的典型的受试者或病人一般为哺乳动物，通常为人类，但并不是所有的案例都如此，因为已经计划使用和本技术有关的兽医和研究应用。一般而言，用于治疗的所需的合适受试者或病人通过例如，健康护理专业人员或专业人员使用已知的测试、测量方法和标准进行筛选。例如，在治疗痴呆时，已经有了痴呆的症状，或有可能形成痴呆的症状的受试者将会被筛选出来。其他疾病和/或失调（例如肿瘤治疗、其他认知障碍治疗等）的筛选也会采取类似的筛选过程。基于病人、疾病和/或失调本身及所处的发展阶段、HGF模拟物和它的剂量、释药形式和其他相关因素研制出合适的治疗方法。受试者然后接受HGF模拟物治疗。本发明的实施方式也包含与监控给药效应或结果的一个或多个步骤以用于评估治疗方法和/或根据需要调整或使用一种有可能提供更多益处的方法，例如增加或降低药物剂量，或通过改变用于给药的模拟物的特定类型，或通过改变给药频率或给药途径等。特别参照提供认知增加的实施方式，例如在一些案例中认知能力的提高（或防止认知丧失）可能完成，例如病人的各项功能恢复或正常（与合适的对照受试者相比或根据从中所获的标准值来评估），并不需要所有的案例都如此。本领域技术人员知道，即使认知中较低程度的提高也可能对病人是非常有益的，相对于完全治愈，可能延缓病情发展。
本发明的方法为有需要的病人给药此处公开的包含HGF模拟物的组合物。本发明因此同样提供一种组合物，其包含此处公开的HGF类似物/模拟物，通常结合药学上可接受的载体或稀释剂。在一些实施方式中，组合物中包含一种已纯化的HGF模拟物；在其他实施方式中包含一种以上的HGF模拟物，每种HGF模拟物在组合物混合之前都会基本纯化。制备药学上合适的组合物用作药物的方法对于本领域技术人员是已知的。一般地，这种组合物要么以溶液形式、要么以悬浮液的形式制备，然而，同样构思了固体形式例如药片、药丸、粉末和类似物。适合溶液或悬浮液的固体药物形式，要在给药之前准备好溶液。制剂可能被乳化。活性成分可能和药学上可接受的并能和活性成分兼容的赋形剂相混合。适合的赋形剂为，例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，或它们的组合物。此外，组合物可能包含少量的辅助物质例如润湿剂、pH缓冲剂和类似物。如果该组合物以口服形式给药，那么各种增稠剂、调味品、稀释剂、乳化剂、分散剂或粘合剂和类似物都可能添加进去。本发明中的组合物可能包含任何其他的成分，以使得组合物以合适的形式给药。HGF模拟物在配方中的最终含量可能会改变。然而，一般而言，其在配方的含量为大约1%至大约99%。
本发明中的HGF模拟组合物（制剂）可能以本领域技术人员已知的任何合适的途径给药，包括但不限于：注射、吸入、口服、阴道给药、鼻腔、通过食物或包含模拟物的产品摄取、局部用作滴眼液、通过喷雾等。在优选的实施方式中，给药方式是口服或注射。此外，组合物可能连同其他治疗方式给药，例如用于治疗如痴呆或导致病人痴呆情况的其他制剂，其例子包括但不限于给药抗抑郁药和精神药物、给药多巴胺和类似的试剂。类似地，在癌症治疗的方式中，HGF模拟物可能联合镇痛药和其他合适的药物共同给药。因此，在本发明的实施方式中，一种或多种HGF模拟物可能联合一种或多种不同的生物活性药物使用。
HGF抑制剂的给药含量范围在大约0.1至大约1,000毫克/千克，优选1至大约100毫克/千克，但本领域技术人员知道，精确含量可能因为药物赋形剂的一种或多种因素而改变，这包括但不限于：重量、整体健康、性别、年龄、民族、基因历史、其他治疗的情况等，更大或更小的剂量也包含在本发明的实践之中。剂量也可能在一段时期发生周期性改变，剂量也可能随着时间改变（增加或减少）。
本发明的HGF模拟物可能用于治疗一系列认知功能失调（认知障碍）以及其他和HGF活性或缺乏有关的失调。此处用到的术语“认知功能”或“认知”是指一系列高水平的脑部功能，包括但不限于：学习和记住信息的能力；组织、计划和解决问题的能力；根据需要专注、保持和转移注意力的能力；理解和使用语言的能力；精确感受环境的能力；执行计算的能力。这些功能包括但不限于：记忆（例如获得、保留和检索新信息）；注意力和专注（特别是分散注意力）；信息处理（例如处理五官收集的信息）；执行功能（例如计划和优先排序）；视觉空间功能（例如视觉感知和构建能力）；言语流畅和演讲（例如语言处理）；基本智力（例如“智商”）；长期（久远）记忆；对话技巧；阅读理解等。相反地，“认知障碍”是指丧失了这些能力。可以以本领域技术人员已知的多种方式中的一种测量、检测和/或诊断丧失。这些方法包括但不限于：使用专业人员提供的标准测试（字谜、文字游戏或问题等）；通过自我评定和/或遭受疾病折磨的人的护理人、朋友和家庭成员评定；通过专业人士或他人观察个体的活动、生活技能、习惯和应对机制；通过遭受疾病折磨的个体的问卷结果等。
这些失调可能是由于，例如，因某些因素导致的突触连接性和/或神经元密度的降低而导致的。在一些实施方式中，丧失是由脑损伤而导致的，例如创伤性脑损伤。由于战争或体育活动导致的创纪录的创伤性脑损伤，其特征在于神经元连接性的降低。因此，HGF的使用代表了一种切实可行的治疗方法。这种脑损伤可能是外部创伤影响脑部的结果，例如由严重意外（例如车祸、坠落等）、枪击事件、体育伤害（例如因撞击头部引起的如拳击手和足球运动员经历）；比赛中的受伤等。或者，这种伤害可能是由于内部脑创伤，例如中风、动脉瘤、外科手术、肿瘤等或其他导致脑部或脑部部分区域缺氧的情况；由于吸入有毒气体导致的伤害；由于脑部老化；对神经系统和/或脑部产生毒害影响的疾病或失调，如多发性脑脊髓硬化症、帕金森氏病、杭廷顿氏舞蹈病、脑紊乱如精神分裂症等。
本发明实施方式预期的一种特定的治疗例子为，HGF模拟物可能用于治疗痴呆。对于术语“痴呆”，我们是指先前未受损的人的认知能力的严重受损，其超出了一般正常老化带来的影响。它可能是静态的、特定整体脑损伤的结果、或进行性的，由于身体损伤或疾病而导致长期退化。虽然痴呆在老年群体中更加常见，但它也可能在成年的任何阶段发生。为本发明实施方式的目的，“痴呆”可能包含和/或由于例如阿尔茨海默病、血管性痴呆、路易体痴呆等或这些的组合而引起的。在本发明其他实施方式中，阿尔茨海默病可能不包含在该定义中。可能采用此处所述方法治疗的痴呆的其他致病原因包括但不限于甲状腺机能减退和正常压力性脑积水。可能采用此处所述方法治疗的导致痴呆或和痴呆有关的遗传形式包括但不限于：额颞叶变性、杭廷顿氏舞蹈病、溢血性痴呆、拳击员痴呆等。在较年轻的人群中，认知障碍的发展可能是由精神病、乙醇或其他药物滥用或代谢失调引起的。特定遗传缺陷可能在较年轻的人群中导致神经变性的痴呆（例如45岁或低于45岁）。这些遗传缺陷包括家族性阿尔茨海默病、SCA17（显性遗传）；肾上腺脑白质营养不良（X-连接）；高歇病类型3、异染性脑白质营养不良、尼曼-皮克症（Niemann-Pick）类型C、泛酸激酶-相关的神经退化，家族黑蒙性白痴（Tay-Sachs）病和Wilson's疾病。维生素缺乏和慢性感染也可能偶尔类似于型变性痴呆。这些维生素缺乏和慢性感染包括缺乏维生素B12、叶酸或烟酸，和感染原因包括隐球菌性脑膜炎、HIV、莱姆病、进行性多灶性白质脑病、亚急性硬化性全脑炎、梅毒和惠普耳氏病。对于发展快速的痴呆，由朊病毒引起的克雅氏病（Creutzfeldt-Jakob病）而导致的痴呆一般会在数周至数月后加剧。引起缓慢发展的痴呆的原因有时也会带来快速发展，例如阿尔茨海默病、路易体痴呆、和额颞叶变性（包括皮层基底节变性和进行性核上性麻痹）。
此外，脑病或精神错乱可能发展相对缓慢，然后导致痴呆。可能的原因包括脑部感染（病毒性脑炎、亚急性硬化性全脑炎、Whipple病（惠普尔病））或炎症（边缘性脑炎、Hashimoto脑病、脑血管炎）；肿瘤例如淋巴瘤或胶质瘤；药物毒性（例如抗惊厥药）；代谢原因例如肝功能衰竭或肾衰竭；和硬脑膜下血肿。采用本发明所述的方法治疗的痴呆可能是其他情况或疾病导致的结果。例如，在很多种医学或神经学情况中，痴呆只发生在疾病的后期或作为微小特征。例如，一部分帕金森氏病病人导致的痴呆，认知损伤同样也发生在进行性核上性麻痹和皮层基底节变性的帕金森叠加综合征（和可能导致额颞叶变性临床综合征相同的基础病理）。脑部的慢性炎症条件可能影响长期认知能力，包括贝堤特氏病、多发性脑脊髓硬化症、结节病、Sjogren综合征和系统性红斑狼疮。此外，遗传情况可能也会引起痴呆及其他特征包括：亚历山大病、卡纳万病（Canavan）、脑腱黄瘤病、脆弱X相关的震颤/释义视合网膜色素变性、戊二酸血症I型、克腊伯氏病、槭糖尿症、尼曼匹克症（Niemann Pick）C型、库夫斯病（Kufs'disease）、神经棘红细胞增多症、有机酸血症、佩梅病、尿素循环障碍、沙费利波综合征类型B、和脊髓小脑性共济失调类型2。
除了治疗痴呆外，本发明的HGF模拟物可能用于神经保护和/或治疗神经退化病，一些病也涉及上述的痴呆。对于神经保护，HGF模拟物可能用于预防给药，即在受试者患有潜在的神经危害之前给药。例如，模拟物可能在受试者接触某种已知的可能会导致神经损害的药物、化学品或治疗程序之前给药。对于治疗神经退化病，HGF基本的促存活抗凋亡活性支持利用HGF治疗神经退化病，包括但不限于帕金森氏病、杭廷顿氏舞蹈病、和肌萎缩侧索硬化（ALS）等。
此外，模拟物可能被用于治疗“抑郁症”，对于该术语，我们是指重度抑郁症（MDD）（又名复发性抑郁障碍、临床抑郁、严重抑郁、单相抑郁、或单相障碍），或带有躁郁症的抑郁等。抑郁在根本上是一种海马区域神经元和突触连接丧失的疾病。HGF诱导海马区新的突触连接和刺激神经发生的能力表明HGF模拟物可以用于治疗抑郁症。
此外，患有一定程度认知障碍遗传倾向的人的认知能力可能会获得增高，例如患有基因紊乱如唐氏综合征（Down's syndrome），缺乏恰当的脑部发育，例如出生时缺氧、各种影响脑部发育的先天失常等。
如下述实施例中所示，HGF模拟物能够抑制HGF/Met系统，并因此可以用作抗癌因子。HGF模拟物可以用于减弱恶性和转移性的转化。
HGF模拟物应用于纤维化病的治疗中。在老龄化人群中，肝脏、肾脏、贲门和肺的纤维化是一个日益严重的问题。不幸的是，伴随纤维化变化的功能退化难以治疗。HGF抑制或转换组织纤维化的强大能力表明口服有效的HGF模拟物是一个治疗选项手段。
HGF模拟物可应用于周围性血管疾病、下肢动脉疾患的治疗中。导致不良心肌灌注的血管疾病是糖尿病、肥胖症和粥样硬化的常见后发病。一种治疗方法是在受影响的器官和组织中诱导新的副血管。HGF和HGF模拟物有效的血管生成活性可以为血管机能不全的治疗提供临床应用。
HGF模拟物可能用于伤口愈合。伤口愈合缺陷是糖尿病患者和烧伤病人的特点。HGF促进伤口愈合的能力归因于它的血管生成和促有丝分裂活性支持HGF模拟物的使用可以增强伤口愈合过程。数据表明，多种HGF模拟物在正常和糖尿病个体中都是有效的伤口愈合增强剂。
无需结合理论，相信该显著的促认知活动的潜在的可能机制是提高的突触连接性。这可能归因于由增加的树突棘密度和改变的突触后树突棘的形态显型所带来的小型突触活动。
前述例子是为了说明本发明中的各种实施方式，不能因此用来以任何方式解释限制本发明。
实施例
实施例1Dihexa和Nle1-AnglV调控突触发生。
之前已经发现AngIV的Nle1-AngIV类似物的四肽（Nle1-YIH）和三肽（Nle1-YI）片段是在空间学习任务中能够克服东莨菪碱诱导的认知障碍的最小活性片段。使用三肽作为一种新的模版，合成具备改善的代谢能力、血脑屏障渗透性和口服效用的其他活性类似物。在本实施例中，我们展示了这种新颖的、口服有效的、血管紧张素IV型类似物Dihexa。材料与方法
动物和手术。重390-450g的雄性Sprague-Dawley大鼠（源于Taconic）除了在手术前夜移除食物外，之前都能够自由摄取食物和水（Harland Tekland F6鼠饲料，麦迪逊，威斯康星州）。采用盐酸开他敏和甲苯噻嗪麻醉每个动物（肌内注射，分别为100和2毫克/千克；凤凰科学；圣若瑟，密苏里州，和Moby;肖尼，堪萨斯州）。使用flatskull校准功能，将侧脑室（icv）引导管（PE-60,Clay Adams;Parsippany,纽约）立体定位（Model900,David Kopf Instruments;Tujunga,加利福尼亚州）在右半球前囟后1.0毫米和前囟一侧1.5毫米（见Wright et al.1985）。引导管总长为2.5厘米并在斜尖前2.5毫米处设置热隆起，用作控制插入深度的障碍物。一旦到达合适位置，用不锈钢螺钉和牙粘固粉将引导管安全固定在颅骨中。术后的动物单独饲养在美国实验动物饲养管理认可委员会批准的动物房中，并保持在22±1℃，从每天早上6：00开始明暗各12小时。所有的动物在手术后5-6天内每天都用手轻抚5分钟。在完成整个行为测验之后，通过向引导管注射5微升固绿染料，经组织学诊断确认引导管的位置。本实验中用到的所有大鼠中的引导管安放证明为正确。
行为测试。水迷宫由黑色的圆形水槽（直径：1.6米；高度：0.6米），充满深约26厘米的26-28℃的水。一个黑色的圆形站台（直径：12厘米；高度24厘米）置于距池壁30厘米水面2厘米以下的位置。迷宫设为四个象限，分别命名为NW、NE、SW和SE。对于每只大鼠，将站台随机分配到一个象限中，并在整个训练期间保持固定。入水点在每个象限的角落处（即N、S、E和W）并假装随机分配使得每个实验的入水点均和上次实验不同。四个测试池壁中的三个覆盖了一层由不同的形状（圆形、方形、三角形）和颜色组成的其他迷宫空间提示。动物的游泳轨迹通过电脑图象跟踪系统进行记录（Chromotrack；圣地亚哥仪器公司，加利福尼亚州）。计算机显示整个游泳潜伏期和游泳距离。根据这些数据确定游泳速度。
东莨菪碱处理组的每个成员都是在测试开始之前30分钟从侧脑室注射东莨菪碱氢溴酸盐（70纳摩尔溶于2微升aCSF，历时20秒），随后在测试开始之前10分钟注射Dihexa。对照组在测试开始之前20分钟接受东莨菪碱或aCSF，随后在测试开始之前10分钟接受aCSF。行为测试的操作方法已经详细描述过（Wright et al.1999）。用于年老大鼠研究中的大鼠接受Dihexa和aCSF（对照组）。简而言之，采集实验每天进行5次试验，连续8天。在测试的第一天，动物在开始第一次试验之前30秒钟被放置到站台上。将大鼠面向水迷宫的池壁分别从指定的入水点放入水中开始实验。大鼠寻找站台的最长允许时间为120秒。一旦动物找到站台，则让其在站台休息30秒钟。如果大鼠没有找到站台，则实验者将动物放置站台休息30秒钟。在休息期之后立刻开始下次训练。
在8天获得训练之后，进行另一个实验，其中站台将被移除（空间探索实验）。动物将游泳120秒钟以确定所学反应的残留量。记录停留在之前获得训练中设置站台的目标象限的时间和经过所述象限的次数。每次训练结束之后要将动物用毛巾擦干，并放置在100瓦的灯泡前10-15分钟，然后放回笼内。
制备海马细胞培养物。在涂覆购自西格玛（Sigma）的聚-L-赖氨酸（圣路易市，密苏里州；分子重量300,000）的平板上培养来自P1Sprague Dawley大鼠的海马神经元（每平方厘米有2x105个细胞）。海马神经元保持在购自Invitrogen的Neurobasal A培养基中（Carlsbad,加利福尼亚州），该培养基中添加有购自Invitrogen的B27、并在体外第二天添加的购自Sigma的0.5mM L-谷氨酰胺、5mM胞嘧啶-D-阿糖胶呋喃糖苷。海马神经元然后继续培养3-7天，然后它们如（Wayman,Davare et al.2008）所述被转染或者用不同的药剂学试剂处理。
转染。在体外培养第6天（DIV6），通过LipofectAMINETM2000（Invitrogen）根据生产商操作方法用mRFP-β-肌动蛋白转染神经元。该操作方法能够获得3-5%的转染效率，因此可以看到单个神经元。更高的效率会使单个神经元的树突树模糊。荧光标记的肌动蛋白的表达使得树突棘清晰可见，因为在肌动蛋白中富含树突棘。在体外培养第7天（DIV7），把对照（水）或肽（如文中所述）添加到培养基中处理细胞。在体外培养第12天，用（4%促甲醛、3%蔗糖、60mM PIPES、25mM HEPES、5mM双乙烷四乙酸、1mM MgCl2、pH7.4）在室温下固定神经元20分钟并封片。载玻片在4℃干燥至少20小时，采用Slidebook4.2数码显微镜软件驱动的奥林巴斯IX81倒共焦显微镜的60倍油镜、NA1.4和分辨率0.280μm获得荧光图像。测定距离胞体至少150μm的主树突和次级树突上的树突棘的密度。针对每个报道的数据点，分析五个至少来自10个神经元中50μm长度的树突片段。每个实验使用独立的培养物制品重复至少三次。使用国家卫生研究院的J1.410图象程序（NIH,Bethesda,马里兰州）和神经突跟踪程序Neuron J（（Meijering,Jacob et al.2004）测定树突长度。手动计算树突棘的数量。
器官型海马脑切片培养物的制备和转染。根据之前所述的方法（Wayman,Impey etal.,2006），培养来自P4Sprague Dawley大鼠的海马细胞。简而言之，根据制造商的操作程序，使用Helios基因枪（BioRad,Hercules,加利福尼亚州）以生物弹道法转染番茄荧光蛋白质（TFP）到400μm长度的切片后，培养3天，以使树突树可视化。24小时恢复期后的切片采用对照（水）、1皮摩尔Nle1-AngIV或Dihexa刺激2天。切片固定并封片。通过上述方法对海马CA1区神经元过程进行成像和测量。
免疫细胞化学。对转染后的神经元进行处理、固定和染色。简而言之，细胞浸渍在0.1%Triton-X-100去垢剂（Bio-Rad;Hercules,加利福尼亚州）中10分钟。用含8%牛血清白蛋白（Intergen Company;Burlington,麻萨储塞州）的PBS溶液在室温下处理一小时，以防止非特异性结合；一抗孵育以1:2500比例稀释（如下文）在含1%BSA的PBS并在4℃过夜。二抗，1:3000的羊抗小鼠Alexafluor488（Invitrogen:Carlabad,加利福尼亚州）在室温下处理（applied）两个小时。盖玻片使用ProLong Gold抗褪色试剂（Invitrogen;Carlsbad,加利福尼亚州）封片，全部冲洗步骤均采用PBS。图像采集和分析采用上述方法。对于突触前兴奋传输，使用VGLUT1（Synaptic Systems,Goettingen,德国）作为标志物（Balschun,Moechars et al.）；对于普通突触前传输（Synaptic Systems,Goettingen,德国），使用突触蛋白1（Ferreira and Rapoport2002）。使用突触后密度蛋白95（PSD-95）确定突触后功能（Milipore,Bilerica,麻萨储塞州）（El-Husseini,Schnell et al.2000）。在每个例子中，对处理组、对照组、Nle1-AngIV组合Dihexa组树突棘的总量进行计数，以确保活跃表型。对相邻VGLUT1或突触蛋白的富含肌动蛋白的树突棘的总量进行计数并转化为百分比，因为经处理诱导的树突棘相对于突触前标志物的百分比相关性系数是传输兴奋信号能力强有力的标志。在我们的研究中，相关性数量是由红色荧光标记的肌动蛋白树突棘相对于绿色PSD-95免疫阳性色斑组成，而当二者融合到一起时，会形成橙色的树突棘。
全细胞记录。使用膜片钳实验检测培养的mRFP-β-肌动蛋白转染的海马神经元（媒介物）和用1皮摩尔Nle1-AngIV或Dihexa预处理5天的转染后的海马神经元。只针对锥样神经元（细胞胞体约20μm并且非对称树突分布）进行记录。转染之后的时间是6天。培养基用细胞外溶液更换，该溶液包括（以mM计）140mM NaCl、2.5mM KCL、1mM MgCl2、3mM CaCl2、25mM葡萄糖和5mM HEPES；pH用KOH调至7.3；摩尔渗透压浓度调至310mOsm。在开始记录之前，用培养基平衡安装在倒置显微镜（IX-71；奥林巴斯光学，东京）中的记录槽30分钟。通过荧光观察转染后的细胞（奥林巴斯光学）。记录管是（P-97flaming/brown拉针仪；Sutter仪器，诺瓦托，加利福尼亚）从标准壁厚的不含丝的硼硅玻璃（OD=1.5毫米；Sutter仪器）拉出来的。移液管-电解槽的斑状电极的直流电阻在4.0至5.2兆欧姆之间，并且内部充满以下组合物（以mM为单位）：25mM CsCl、100mM CsCH3O3S、10mM磷酸肌酸、0.4mMEGTA、10mM HEPES、2mM MgCl2、0.4mM Mg-ATP和0.04mM Na-GTP；pH用CsOH调整到7.2；摩尔渗透压浓度调至296-300mOsm。通过木防己苦毒素（100μM；西格玛）阻断GABA受体氯离子通道、通过士的宁（1μM；西格玛）阻断甘氨酸受体，通过河豚毒素（TTX，50nM，Tocris）阻断动作电位的产生而实现药剂学筛选微型EPSCs（mEPSCs）。
通过膜片钳放大系统700B（分子仪器，Sunnyvale,加利福尼亚州）获得记录。模拟信号用贝塞尔（Bessel）低通滤波器在2千赫兹过滤掉，并通过Digidata1440A界面（分子仪器）将其数字化，并使用Clampex10.2软件（分子仪器）储存在电脑中。从培养器中去除0.5-2个小时后，膜电位在室温下（25℃）检测为-70毫伏。液体接界电势没有被校正。采用Clampfit10.2软件（分子仪器）、迷你-分析6.0软件（SynaptosoftInc.;Fort Lee,新泽西州）进行数据分析。成功记录的标准包括记录管的外表面和铁壁细胞之间的密封的电阻要>2吉欧姆，神经元的输入电阻要>240兆欧姆。MEPSCs有5分钟的记录时间。
结果
已知Nle1-AngIV是一种有效的认知增强因子（Wrigth and Harding,2008），但是因其代谢不稳定性（在大鼠血清中t1/2=1.40分钟）而在临床应用上有限制。为了探究AngIV样分子的促认知性，有必要研究出代谢更加稳定的模拟物。作为研发过程的一部分，Dihexa（N-己酸-酪氨酸-异亮氨酸-（6）-氨基己酸氨基化合物）被合成并被表征（在大鼠血清中t1/2=330分钟）。为了测定稳定的模拟物-Dihexa是否仍然具备促认知性/抗-痴呆活性，在两种痴呆模型中进行测验，一种是东莨菪碱大鼠模型，另一组是年老大鼠。这些研究表明Dihexa能够逆转在两种模型中的认知缺陷。Dihexa通过侧脑室给药或强饲口服给药可改善了在水迷宫的表现至接近年轻健康大鼠中观察到的表现。在图1A中，给药100皮摩尔（n=8,p<0.1）但不是10皮摩尔的Dihexa能够治疗东莨菪碱-依赖性学习缺陷，其证据是逃离潜伏期与非东莨菪碱处理的对照组相当。类似的结果也可以在当Dihexa分别通过口服给药量（图1B）较低剂量（1.25毫克/千克/天）和较高剂量（2毫克/千克/天）中可以看到。高剂量组的表现和对照组（n=8，p<0.01）没有差异。随机分配的年老大鼠（20-24周龄）不分性别，在8天测试期（n=8）后同样口服给药Dihexa，并和未处理对照组（图1C）相比较。结果表明处理后的大鼠在水迷宫中的表现要显著高于未处理对照组（p<0.05）。
用于解释Nle1-AngIV和Dihexa的促认知效应的一个假设是，它们可以起到与肝脏生长因子模拟物一样的效应，并且因此也可以用于支持通过诱导树突棘的生长和形成许多新突触而实现神经元接触的扩张。为了测定在高密度mRFP-β-肌动蛋白中Dihexa对树突棘生成和突触发生的影响，检测已转染的海马神经元的培养物。肌动蛋白富集的树突棘以剂量依赖的形式相应于Dihexa和Nle1-AngIV的处理而增加（图2A和B）。施用10-12M的Dihexa（平均值±平均数标准误差；每50μm树突长度有30个树突棘，而对照组为19个；***=P<0.001；n分别=50和100）观察到一种明显的上限效应（ceilingeffect），与此同时，10-13M剂量的结果和对照组神经元（平均值±平均数标准误差；每50μm树突长度有21个树突棘，而对照组为19个；*=P<0.05；n分别=95和100）没有明显区别。然而，它们在统计学上不同于10-12M剂量的Dihexa。接受10-10M剂量Dihexa的神经元比用媒介物处理的神经元中的树突棘还要少（平均值±平均数标准误差；每50μm树突长度有11个树突棘，而对照组为19个；#=P<0.01；n分别=50和100）。同样地，Nle1-AngIV诱导的剂量依赖的树突棘密度的增长与促进树突棘增长的10-10M有明显不同（平均值±平均数标准误差；每50μm树突长度有22个树突棘，而对照组为17个；**=P<0.01；n=50）。从在用10-12M剂量处理之后再次观察到树突棘密度的最大增长（平均值±平均数标准误差；每50μm树突长度分别有25和26个树突棘，而对照组为17个；**=P<0.01；n=50）。10-13M剂量的Nle1-AngIV对于基础树突棘个数也没有影响（平均值±平均数标准误差；每50μm树突长度有17个树突棘，而对照组为17个；**=P<0.01；n=50）。
使长期施用（5天）AT4兴奋剂Dihexa和Nle1-AngIV和急性施用（30分钟）生物学有效剂量10-12M的兴奋剂（图3A-E）进行对比。结果显示，在处理5天后，经Dihexa刺激产生的树突棘个数增加了3倍，大于Nle1-AngIV刺激产生的树突棘个数的2倍增加（图3D）。两个处理组和媒介物对照组有显著区别，媒介物对照组每50μm树突长度平均树突棘的个数为15个。Dihexa和Nle1-AngIV处理组的每50μm树突长度平均树突棘的个数分别是41个和32个（平均值±平均数标准误差，n=200；***=P<0.001，单因素方差分析和图基事后检验法）。行为数据（数据没有显示）可以表明在获得空间记忆任务中发生了快速的作用机理。因此，通过在培养最后一天急性施用Dihexa和Nle1-AngIV30分钟测量了Dihexa和Nle1-AngIV促进树突棘生成的能力（图3E）。在体外培养第12天（DIV12）急性施用Dihexa和Nle1-AngIV30分钟，和用媒介物处理的神经元相比，显示树突棘个数显著增长（Dihexa每50μm树突长度的平均树突棘长度=23.9±平均数标准误差；Nle1-AngIV平均树突棘个数=2.6±平均数标准误差；媒介对照组处理的神经元的平均树突棘个数=17.4±平均数标准误差；n=60；***=p<0.0001，单因素方差分析和图基事后检验法）。
树突棘大小、树突棘的持续率、AMPA-受体的数量和突触有效性之间有强烈的相关性。已经显示树突棘体积和长期记忆之间存在相关性（Kasai,Fukuda et al.,2001;Yasumatsu,Matsuzaki et al.2008）。基于这些考虑，测量树突棘头部大小。结果显示10-12M剂量的Dihexa和Nle1-AngIV增加了树突棘头部的宽度（图4）。和对照组头部大小（0.67μm）相比，Nle1-AngIV组平均树突棘头部宽度=0.87μm（***=P<0.001；平均值±平均数标准误差），Dihexa组=0.80μm（**=P<0.01；平均值±平均数标准误差）。
Dihexa和Nle1-AngIV介导树突棘生成
为了对突触传递进行定量，对mRFP-β-肌动蛋白转染的神经元用突触标志物进行免疫染色。海马神经元在体外用10-12M的Dihexa或Nle1-AngIV刺激5天（图5A-F）。通过对谷氨酸能突触前标志物囊泡膜谷氨酸转运体1（VGLUT1）染色来探索Nle1-AngIV和Dihexa的神经传递模式的兴奋性突触传递（Balschun,Moechars et al.2010）。使用一般突触前标志物突触蛋白测量新形成的并存的具有突触前小结（presynapticboutons）的树突棘（Ferreira and Rapoport2002）。PSD-95作为突触后密度的标志物（El Husseini,Schnell et al.2000）。
Dihexa和Nle1-AngIV处理的神经元显著增加了树突棘形成；Nle1-AngIV处理组中每50μm树突长度的平均树突棘个数=39.4；Dihexa处理组中每50μm树突长度的平均树突棘个数=44.2；媒介物处理的神经元中每50μm树突长度的平均树突棘个数=23.1（平均值±平均数标准误差，***=P<0.001）（图3B、D和F及表4）。计算新形成的树突棘个数占突触标志物的相关性百分比，作为功能性突触形成的一种测量方法。Dihexa和Nle1-AngIV处理诱导的树突棘和对照处理的神经元在VGLUT1、突触蛋白或PSD-95的相关性百分比上没有区别（P>0.05）（图5A、C和E及表4）。
表4突触成分标志物和由Dihexa和Nle1-AngIV处理诱导的树突棘个数之间相关性百分比的总结
处理 对照 Nle1-AngIV Dihexa
树突棘个数/50μm 22 39 44
相关性%VGLUT1 95.2 95.1 94.4
树突棘个数/50μm 19 31 37
相关性%突触蛋白 93.4 94.2 96.3
树突棘个数/50μm 18 36 43
相关性%PSD-95 98.03 97.38 98.71
每个处理组中树突棘总量显示为每50μm树突长度的树突棘个数。突触前标志物突触蛋白、谷氨酸能突触前标志物VGLUT1或突触后成分PSD-95的相关性百分比如下所述。每个处理组n=25。
上述结果表明，由Dihexa和Nle1-AngIV处理新形成的树突棘形成了功能性突触。为了进一步支持这一结论，记录被mRFP-β-肌动蛋白转染的海马神经元的迷你兴奋性突触后电流（mEPSCs）和功能性突触数量相应的频率。用10-12M Nle1-AngIV和Dihexa处理之后的AMPA介导的电流增加了两倍（图6A和B）。媒介物处理的神经元记录的AMPA介导的mEPSCs平均频率为3.06±0.23赫兹（来自33个细胞）。Nle1-AngIV诱导出相对于对照组频率增加了1.7倍（25个细胞中5.27±0.43赫兹；平均值±平均数标准误差；***=P<0.001，相比之下，对照组和Dihexa组增加了1.6倍（29个细胞；4.82±0.34赫兹；***=P<0.001，相比之下，对照组证实功能性突触的放大。观察不到振幅、提高或衰退有差异（数据未显示），这表明突触的个体特性没有改变。
为了进一步评估树突棘诱导的生理学意义，在分离的初生海马神经元中评估Dihexa和Nle1-AngIV对器官型海马脑切片培养物的树突棘形成的影响。这些制剂，当仍处于新生原始状态时，相比于分离的神经元，代表了完整的和三维的环境。海马CA1神经元的功能与海马可塑性和学习/记忆相关，可以根据形态发生很容易被识别并挑选出来用于分析。和媒介物处理的神经元相比，Dihexa和Nle1-AngIV能够显著增加器官型海马脑切片培养物中的树突棘生成。Dihexa和Nle1-AngIV处理组的树突棘个数之间没有差异（图7A和B）。每50μm树突长度的对照组的树突棘个数是7个，相比之下，Nle1-AngIV和Dihexa处理的神经元每50μm树突长度的树突棘个数是11个；平均数±平均数标准误差，n=13-20；**=P<0.01。
讨论
在本研究中，Dihexa和Nle1-AngIV类似，当以侧脑室注射或口服方式给药时，都是有效的认知增强剂。据预测，Dihexa和Nle1-AngIV都能促进培养的大鼠的海马神经元的树突棘生成并增强突触发生。预期作为血管紧张肽IV类似物，通过Dihexa和Nle1-AngIV刺激后最早在30分钟内生成了一些树突棘，展现了Dihexa可以亚纳摩尔浓度对树突棘产生诱导效应（Harding,Cook et al.1992;Krebs,Hanesworth etal.2000）（图3D）。然而，获得最大效应则需要显著更长的处理时间（图3C）。
测量树突棘头部大小测量值被用作突触强化的指示。有较大表面积的较大的树突棘倾向于有较大的突触、蓄积支架蛋白的较大的PSD、以及较大数量的谷氨酸接收性神经递质受体（Kennedy1997）。虽然和彼此没有不同（P>0.05），Dihexa和Nle1-AngIV处理组都展示了树突棘头部大小的扩张。树突棘形态和数量的变化被认为是将短期突触变化改变为高度稳定和持久的改变的机理（Hering和Sheng2001）。
为了评估Nle1-AngIV和Dihexa刺激的海马神经元中这些突触改变的功能性意义，对谷氨酸能突触前标志物VGLUT1（Balschun,Moechars et al.2010）、基本的突触前标志物突触蛋白（Ferreira和Rapoport2002）和突触后标志物PSD-95（Kennedy1997；Han和Kim2008）进行免疫染色，以分析神经递质表型。VGLUT1、突触蛋白和PSD-95在处理过的树突和对照树突中高而且稳定的相关性，表明新出现的树突棘支持功能性突触（图5和表4）（Han和Kim2008;Yasumatsu,Matsuzaki et al.2008）。而且，mRFP-β-肌动蛋白标记的树突棘和一般的突触前标志物突触蛋白和VLGUT1染色之间的高度相关性能够识别兴奋性谷氨酸能突触，表明多数AngIV依赖的对海马树突棘的最大效用限制于兴奋性突触。这些发现和（De Bundel et al.）的发现相应，观察到天然血管紧张肽IV对抑制神经递质GABA没有任何影响（De Bundel,Demaegdt et al.2010）。
观察到由Dihexa和Nle1-AngIV处理的制剂的mEPSC频率增加，进一步支持了新的树突棘形成功能性突触（Malgaroli和Tsien1992；Hering和Sheng2001；Tyler和Pozzo-Miller2003）。持续加强的Dihexa和Nle1-AngIV激起的神经递质传递不能归因于内在的神经递质释放波动或代谢和机械影响（Yasumatsu,Matsuzaki et al.2008）。此处所述数据表明，Nle1-AngIV和Dihexa能够通过增加树突棘密度和改变体外突触后树突棘表型而增加微型突触活动，可能代表了AngIV类似物中观察到的促学习能力的根本机理（Wright,Stubley et al.1999;Lee,Albiston et al.2004）。
为了使成人行为数据和体外机械论相联系，采用可维持完整海马环境代表性的器官型海马脑切片培养物来评估治疗诱导的突触发生。对以生物弹道转染的海马脑切片施用10-12M Nle1-AngIV和Dihexa能够显著增加树突棘密度（图7），这暗示这种改变事实上能在完整的海马区发生。
因此，Dihexa符合有效抗痴呆药的必要标准：1）它口服有效，它能通过肠部，并进入脑部；2）它增加了神经元连接性，当面临神经元连接性丧失时，这是一个必要的特性；和3）它的合成不贵，使得它容易为病人得到。
实施例2.AngIV类似物的靶标是肝脏生长因子
该实施例表明，新型血管紧张肽IV配体Dihexa和它的母体分子Nle1-AngIV通过HGF/c-Met受体系统起作用。
材料与方法
动物和手术
重390-450g的雄性Sprague-Dawley大鼠（源于Taconic）除了在手术前夜移除食物之外，之前都能够自由摄取食物和水（Harland Tekland F6鼠饲料，麦迪逊，威斯康星州）。采用盐酸开他敏和甲苯噻嗪麻醉每个动物（肌内注射，分别为100和2毫克/千克；凤凰科学；圣若瑟，密苏里州，和Moby;Shawnee,堪萨斯州）。使用flat skull校准功能，将侧脑室（icv）引导管（PE-60,Clay Adams;Parsippany,NY）立体定位（Model900,David Kopf Instruments;Tujunga,加利福尼亚州）在右半球前囟后1.0毫米和前囟一侧1.5毫米（见Wright et al.1985）。引导管总长为2.5厘米并在斜尖前2.5毫米处设置热隆起，用作控制插入深度的障碍物。一旦到达合适位置，用不锈钢螺钉和牙粘固粉将引导管安全固定在颅骨中。术后的动物单独饲养在美国实验动物饲养管理认可委员会批准的动物房中，并保持在22±1℃，从每天早上6:00开始明暗各12小时。所有的动物在手术后的恢复期间每天都用手轻抚5分钟。
行为测试水迷宫由黑色的圆形水槽（直径：1.6米；高度：0.6米），充满深约26厘米的26-28℃的水。一个黑色的圆形站台（直径：12厘米；高度24厘米）置于距墙壁30厘米水面2厘米以下的位置。迷宫设为四个象限，分别命名为NW、NE、SW和SE。对于每只大鼠，将站台随机分配到一个象限中，并在整个训练期间保持固定。入水点在每个象限的角落处（即N、S、E和W）并假装随机分配使得每个实验的入水点均和上次实验不同。四个测试房间墙壁中的三个覆盖了一层由不同的形状（圆形、方形、三角形）和颜色组成的其他迷宫空间提示。动物的游泳轨迹通过电脑图象跟踪系统进行记录（Chromotrack；圣地亚哥仪器公司，加利福尼亚州）。计算机显示整个游泳潜伏期和游泳距离。根据这些数据确定游泳速度。
处理组的每个成员都是在测试开始之前20分钟从侧脑室注射东莨菪碱氢溴酸盐（70纳摩尔溶于2微升aCSF，历时20秒），随后在测试开始之前5分钟注射Dihexa（300皮摩尔溶于2微升aCSF）、Hinge（300皮摩尔溶于2微升aCSF），或Hinge+Dihexa（300皮摩尔溶于4微升aCSF）。该东莨菪碱制剂对于空间记忆障碍伴随痴呆动物模型是普遍可以接受的（Fisher et al.,2003）。对照组在测试开始之前20分钟接受东莨菪碱或aCSF，随后在测试开始之前5分钟接受aCSF。行为测试的操作程序已经详细描述过（Wright et al.1999）。简而言之，获得实验连续进行8天，每天5次实验。在测试的第一天，动物在开始第一次试验之前30秒钟被放置到基座上。将大鼠面向水迷宫的池壁分别从指定的入水点放入水中开始实验。大鼠寻找站台的最长允许时间为120秒。一旦动物找到站台，则允许其在站台休息30秒钟。
如果大鼠没有找到站台，则实验者将动物放置站台休息30秒钟。在休息期之后立刻开始下次试验。每次训练结束之后要将动物用毛巾擦干并放置在100瓦的灯泡前10-15分钟，然后放回笼内。
统计分析
采用单因素方差分析比较树突棘结果，采用图基事后检验法检验差异显著性。Morris水迷宫数据组是指：每个动物的每天获得训练中在每天五次的试验期间找到平台的潜伏期。单因素方差分析用于对比训练期第1、4和8天的小组之间的潜伏期。采用Newman-Keuls事后检验法分析显著性效果，显著性水平设为P<0.05。
分散实验MDCK细胞在6孔平板的盖玻片上培养到100%汇合率并用PBS洗涤两次。汇合的盖玻片在无菌条件下转移到新的包含90微升无血清DMEM培养基的6孔平板中。
添加Norleual、Hinge多肽、和/或HGF（20纳克/毫升）到适当的孔中。对照孔添加PBS媒介物。平板在含5%CO2，37℃下培养48小时。去除培养基，细胞采用甲醇固定。细胞使用Diff-Quik、Wright-Giemsa（Dade-Behring,Newark，DE）染色并获得数字图象。使用镊子去除盖玻片，同时获得更多数字图象。使用Prism5软件的图象J方法和InStat3.05版的统计学方法对图象的像素量化。
制备分散的海马神经元细胞培养物
在涂覆购自西格玛（Sigma）的聚-L-赖氨酸（圣路易市，密苏里州；分子重量300,000）的平板上培养来自PI-2Sprague Dawley大鼠的海马神经元（每平方厘米有2x105个细胞）。海马神经元被保持在添加有Invitrogen B27购自Invitrogen的Neurobasal A培养基（Invitrogen）中（Carlsbad,加利福尼亚州），该培养基中添加有购自Invitrogen的B27、并在体外第二天添加的购自Sigma的0.5mM L-谷氨酰胺、5mM胞嘧啶-D-阿糖胶呋喃糖苷。海马神经元然后继续培养3-7天，然后它们如上文或图例所述被转染或者用不同的药剂学试剂处理。
转染分散的海马神经元细胞培养
在体外培养第6天（DIV6），通过LipofectAMINETM2000（Invitrogen）根据生产商操作步骤用mRFP-β-肌动蛋白转染神经元。该操作步骤能够获得3-5%的转染效率，因此可以看到单个神经元。更高的效率会使单个神经元的树突树模糊。荧光标记的肌动蛋白的表达使得树突棘清晰可见，因为在肌动蛋白中富含树突棘。在体外培养第7天（DIV7），把对照（水）或肽（如文中所述）添加到培养基中处理细胞。在体外培养第12天，用（4%促甲醛、3%蔗糖、60mM PIPES、25mM HEPES、5mM双乙烷四乙酸、1mMMgCl2、pH7.4）在室温下固定神经元20分钟并封片。载玻片在4℃干燥至少20小时，采用Slidebook4.2数码显微镜软件驱动的奥林巴斯IX81倒共焦显微镜的60倍油镜、NA1.4和分辨率0.280μm获得荧光图像。测定距离胞体至少150μm的主树突和次级树突上的树突棘的密度。针对每个报道的数据点，分析五个至少来自10个神经元中50μm长度的树突片段。每个实验使用独立的培养物制品重复至少三次。使用国家卫生研究院的J1.410图象程序（NIH,Bethesda,MD）和神经突跟踪程序Neuron J（（Meijering,Jacob et al.2004）测定树突长度。手动计算棘的数量。
器官型海马脑切片培养物的制备和转染
根据之前所述的方法（Wayman,Impey et al.,2006），培养来自P4SpragueDawley大鼠的海马细胞。简而言之，根据制造商的操作程序，使用Helios基因枪（BioRad,Hercules,加利福尼亚州）以生物弹道法转染番茄荧光蛋白质（TFP）到400μm长度的切片后，培养3天，以使树突树可视化。24小时恢复期后的切片采用1皮摩尔Nle1-AngIV或Dihexa刺激2天。切片固定并封片。通过上述方法对海马CA1区神经元过程进行成像和测量。
急性海马脑切片
来自Harlan实验室（加利福尼亚州，美国）的成年Sprague-Dawley大鼠（250克+）使用异氟烷麻醉（Vet OneTM,MWI,Meridian,美国爱达荷州）并断头。迅速取出脑部并放置在冰冻的人工脑脊液（aCSF）中大约30秒。两个半球在正中矢状切开分离后，取出两部分海马结构。使用Mcllwain组织切片机（Brnkmann,Gomshall，英国）沿横向和长度方向（400μm）切出切片以确保药物的渗透率，并且转移到充气的（95%氧气/5%二氧化碳）并包含aCSF的培养箱中，在室温下培养90分钟。切片转移到新鲜的试管，通过仔细抽吸去除aCSF，然后替换为包含媒介物（aCSF+aCSF）的aCSF，含100纳克/毫升无载体的成年重组干细胞生长因子（HGF）（R和D系统，美国明尼苏达州）的aCSF、10-10M Hinge（Harding实验室）、50纳克/毫升aCSF，10-10MDihexa（Harding实验室）的aCSF、10-12M Dihexa的aCSF或包含50纳克/毫升HGF+10-12M Dihexa的aCSF，在37℃下轻摇30分钟。去除aCSF，使用RIPA缓冲液（upstate/密理博，Billerica,马萨诸塞州和抑制子混合物I和II（西格玛，圣路易斯，密苏里州）裂解脑切片，在冰上进行超声波处理，并在4℃以13,000rpm转速离心30分钟进行分离。从试管中分离上清液，然后将其储存在-80℃或立即处理用于凝胶电泳。
shRNA
使用RNAi设计程序设计c-Met的目标序列（见网站：cancan.cshl.edu/）。目标序列GTGTCAGGAGGTGTTTGGAAAG（SEQ ID NO:2）插入到pSUPER载体（Oligoengine,西雅图，华盛顿州）中，其可在H1启动子下内源性生成shRNA。使用上述脂质体方法把shRNA转染到细胞中。使用通路克隆系统（Gateway cloningsystem，Invitrogen）通过产生c-Met-6-Myc标签基因产物，确认受体被敲除。使用来自Integrated DNA科技公司的引物，从大鼠大脑全部cDNA中克隆出Met蛋白编码序列。扩增产物用凝胶纯化，切离出对应于190千道尔顿的条带，并克隆到PCAGGS-6-Myc目的载体（Gateway）。
凝胶电泳和Western印迹
使用BCA方法（Pierce,Rockford,IL）根据生产商手册对样品的蛋白质浓度进行定量。在加载到4-12%的Bis-Tris预制凝胶（Invitrogen,Carlsbad,CA）上用于电泳之前，将样品添加到SDS-PAGE缓冲液中并煮沸10分钟。蛋白质转移到PVDF膜上（BioRad，Hercules，CA），并用AquaBlockTM（New England Biolabs,Ipswich,MA）室温下封闭1小时（RT）。第一抗体和兔抗Met及抗兔磷酸化-Met（Tyrl234/1235）（1:1000,Cell Signaling Technology,Danvers,MA）在AquaBlockTM中4℃温育过夜。用PBS和PBST交替冲洗。第二抗体（IRDye）（Rockland，Gilbertsville，PA）在AquaBlockTM中室温下温育一小时。使用IL-COR Odyssey红外荧光扫描成像系统（LI-COR Biosciences,Lincoln,NE）对印迹成像。
免疫细胞化学
如之前在第二章所述，对转染后的神经元处理、固定和染色。简而言之，细胞浸渍在0.1%Triton-X-100去垢剂（Bio-Rad;Hercules,CA）中10分钟。用含8%牛血清白蛋白（Intergen Company;Burlington,MA）的PBS溶液在室温下处理一小时，以防止非特异性结合；一抗孵育以1:2500比例稀释（如下文）在含1%BSA的PBS并在4℃过夜。二抗，1:3000的羊抗小鼠Alexafluor488（Invitrogen:Carlabad,CA）在室温下处理（applied）两个小时。盖玻片使用ProLong Gold抗褪色试剂（Invitrogen;Carlsbad,CA）封片，全部冲洗步骤均采用PBS。图像采集和分析采用上述方法。对于突触前兴奋传输，使用VGLUT1（Synaptic Systems,Goettingen,Germany作为标志物（Balschun,Moechars et al.）；对于普通突触前传输（Synaptic Systems，Goettingen,Germany），使用突触蛋白1（Ferreira and Rapoport2002）。使用突触后密度蛋白95（PSD-95）确定突触后功能（Milipore,Bilerica,MA）（El-Husseini,Schnell et al.2000）。在每个例子中，对处理组、对照组、Nle1-AngIV组合Dihexa组棘的总量进行计数，以确保活跃表型。
对相邻VGLUT1或突触蛋白的富含肌动蛋白的树突棘（红色）的总量进行计数并转化为百分比，因为经处理诱导的树突棘相对于突触前标志物的相关性百分比是传输兴奋信号能力强有力的标志。在我们的研究中，相关性数量是由红色荧光标记的肌动蛋白树突棘相对于绿色PSD-95免疫阳性色斑组成，而当二者融合到一起时，会形成橙色的树突棘。
全细胞记录
使用膜片钳实验检测培养的mRFP-β-肌动蛋白转染的海马神经元（媒介物）和用1皮摩尔Hinge或Dihexa，或10纳克/毫升HGF（R&D体系）预处理5天的转染后的海马神经元。针对锥样神经元（细胞胞体约20μm并且非对称树突分布）进行记录。转染之后的时间是6天。培养基用细胞外溶液更换，该溶液包括（以mM计）140mM NaCl、2.5mM KCL、1mM MgCl2、3mM CaCl2、25mM葡萄糖和5mM HEPES；pH用KOH调至7.3；摩尔渗透压浓度调至310mOsm。在开始记录之前，用培养基平衡安装在倒置显微镜（IX-71；奥林巴斯光学，东京）中的记录槽30分钟。通过荧光观察转染后的细胞（奥林巴斯光学）。记录管是（P-97flaming/brown拉针仪；Sutter仪器，诺瓦托，加利福尼亚）从标准壁厚的不含丝的硼硅玻璃（OD=1.5毫米；Sutter仪器）拉出来的。移液管-电解槽的斑状电极的直流电阻在4.0至5.2兆欧姆之间，并且内部充满以下组合物（以mM为单位）：25mM CsCl、100mM CsCH3O3S、10mM磷酸肌酸、0.4mM EGTA、10mM HEPES、2mM MgCl2、0.4mM Mg-ATP和0.04mMNa-GTP；pH用CsOH调整到7.2；摩尔渗透压浓度调至296-300mOsm。通过木防己苦毒素（100μM；西格玛）阻断GABA受体氯离子通道、通过士的宁（1μM；西格玛）阻断甘氨酸受体，通过河豚毒素（TTX，500nM，Tocris）阻断动作电位的产生而实现药剂学筛选微型EPSCs（mEPSCs）。
通过膜片钳放大系统700B（分子仪器，Sunnyvale,CA）记录。模拟信号用贝塞尔（Bessel）低通滤波器在2千赫兹过滤掉，并通过Digidata1440A界面（分子仪器）将其数字化，并使用Clampex10.2软件（分子仪器）储存在电脑中。从培养器中去除0.5-2个小时后，膜电位在室温下（25℃）检测为-70毫伏。采用Clampfit10.2软件（分子仪器）、迷你-分析6.0软件（Synaptosoft Inc.;Fort Lee,NJ）进行数据分析。成功记录的标准包括记录管的外表面和铁壁细胞之间的密封的电阻要>2吉欧姆，神经元的输入电阻要>240兆欧姆。MEPSCs有5分钟的记录时间。
结果
肝细胞生长因子增加树突结构和支持突触发生
之前已经表明了Dihexa和Ne1-AngIV可在mRFP转染的海马神经元中诱导树突棘生成（见实施例1）；然而该行为背后的机理尚不清楚。由于Norleual的功能，另一个AngIV类似物阻碍HGF对c-Met起作用（Yamamoto et al.,2010，）我们假定为通过Dihexa和Nle1-AngIV增加树突棘的密度是由HGF/c-Met体系介导的。同样地，在分离的海马培养基中评估HGF对树突棘发生的影响。海马神经元在体外培养第6天（DIV6）用mRFP-β-肌动蛋白转染，并用HGF刺激5天。
对于HGF刺激剂量依赖性的树突棘数量增加，观察到最低有效剂量为5纳克/毫升（平均树突棘数量=24.7；**=p<0.01vs.对照；ns vs HGF10和20纳克/毫升）。10和20纳克/毫升剂量产生的影响最显著（平均树突棘数量分别=27.5和27.0；每个处理组n=50；***=p<0.001；df=4/245；F=13.5）。然而，2.5纳克/毫升剂量的HGF对于基础树突棘数量没有影响（平均树突棘数量=18.6vs.对照=18.0）（图8），因此认为是亚阈值的。
为了评估HGF在与生理环境更加相关的环境下增加树突棘生成的功能，使用器官型海马脑切片。使用可溶性红色荧光蛋白Tomato经生物弹道法转染的海马脑切片，用10纳克/毫升的HGF、10-12M Dihexa或媒介物刺激48小时。已知CA1海马神经元会响应学习而经历可塑性变化，根据形态可以很容易的挑出用于分析。Dihexa和HGF能够显著增加CA1海马神经元中每50μm树突长度中树突棘个数（平均棘个数分别=15.0和18.5，相比于对照组平均树突棘个数=6.1；两个处理组：***=P<0.001和**=P<0.01；df=2/81；F=41.5）（图9A和B）。
之前的研究中，用Dihexa和Nle1-AngIV处理的神经元表明大部分树突棘被诱导和突触前和突触后标志物共定位，这表明这些新的树突棘支持功能性突触。此外，大部分突触输入好像是谷氨酸能的（glutamatergic）。因为Dihexa、Nle1-AnglV和HGF被认为是通过相同机理起作用，评估HGF-诱导的树突棘的功能特性。对mRFP-β-肌动蛋白转染的海马神经元进行免疫染色，用于突触前活跃区域的普通标志物、突触蛋白（Ferreiraand Rapoport;2002）以及对谷氨酸能突触特异的标志物、囊泡膜谷氨酸转运体（VGLUT1）（Balschun,Moechars et al.2010）。HGF刺激显著增加了突触后棘数量（HGF处理组每50μm树突长度平均树突棘个数=33，相比之下，对照组为23个；***=P<0.001；±S.E.M，单因素方差分析），因此确保了通过HGF处理后的活性表型（图10A和B）。和VGLUT1相邻的突触后树突棘的个数或突触蛋白-阳性斑点被计数，并转换为占被记数的总树突棘数的百分比。对于用突触蛋白1a免疫染色的HGF处理的神经元（10纳克/毫升），观察到突触前标志物和突触后富含肌动蛋白的树突棘之间存在98%相关性（图9C）。VGLUT1和突触后树突棘之间的相关性为95%表明，由HGF诱导的树突棘几乎都是谷氨酸能的（图10D）。媒介物处理的神经元在绿色标志和红色树突棘之间的相关性对于突触蛋白和VGLUT1同样为94%（图10C和D）。
上述数据表明，响应于HGF处理诱导产生的棘形成了功能性突触。进一步地，VGLUT1的高相关性表明很多这些输入在本质上是兴奋性的。为了进一步评估该结论，我们测量了在HGF处理后自发产生的AMPA介导的迷你兴奋性突触后电流（mEPSCs）的频率，并和之前已确定为增加mEPSC频率的Dihexa处理组的数据对比。在mRFP-β-肌动蛋白转染的或用10-12M Dihexa、10纳克/毫升HGF或等体积媒介物处理5天的分离的海马神经元上完成记录。
HGF处理组（平均频率=7.09±0.53；n=11）和Dihexa处理组（平均频率=6.75±0.99；n=9）的兴奋性突触传递相比于对照处理的神经元增加了接近两倍（平均频率=3.55±0.60；n=9；**=P<0.002；平均值±S.E.M.通过单因素方差分析和Newman-Keuls事后检验法）（图11），证实HGF处理支持增加突触发生这一假设。
为了确定血管紧张素IV配体是由HGF/c-Met介导的，进行了一个协同实验。之前已经表明，亚阈值剂量的HGF添加亚阈值剂量的Dihexa或Nle1-AngIV能够促进树突棘生成，并表明了共同的作用机理。mRFP-β-肌动蛋白感染的分离的海马神经元用亚阈值浓度的HGF和Dihexa（分别为10纳克/毫升）、生物有效剂量的HGF（10纳克/毫升）、Dihexa或Nle1-AngIV（10-12M）或亚阈值剂量的2.5纳克/毫升HGF+10-12MDihexa或2.5纳克/毫升HGF+10-12M Nle1-AngIV的组合刺激5天。结果已呈现在图12A和图12B中。亚阈值浓度的HGF（2.5纳克/毫升）、Dihexa和Nle1-AngIV（10-13M）对基础的树突棘生成没有影响，并和对照处理的神经元没有区别（平均值±S.E.M.，每50μm树突长度中平均树突棘个数：对照组=17.4，HGF组=16.5，Dihexa=17.1，Nle1-AngIV=16.5；p>0.05）。生物有效剂量的HGF（10纳克/毫升）、Dihexa和Nle1-AngIV（10-12M）相比于对照处理的棘产生了显著效应（平均值±S.E.M.，每50μm树突长度中平均树突棘个数：HGF组=29.3，Dihexa组=26.4，Nle1-AngIV组=29.8）。亚阈值剂量的2.5纳克/毫升+10-13M Dihexa和2.5纳克/毫升+10-13MNle1-AngIV的组合可以模拟每种拮抗剂单独生物有效剂量的效果（平均值±S.E.M.，每50μm树突长度中平均树突棘个数：HGF+Dihexa组为28.8，HGF+Nle1-AngIV组为26.2，相比之下，对照处理的神经元为17.4；***=P<0.001；平均值±S.E.M.；单因素方差分析和图基事后检验法）。
为了进一步证实血管紧张素IV配体和HGF/c-Met介导的相互作用，使用新型HGF拮抗剂Hinge（DYIRNC,SEQ ID NO:3）（Kawas et al.,20113）。由于Hinge能够抑制分散狗肾传代细胞（MDCK）细胞，Hinge被证实为HGF/c-Met受体拮抗剂，MDCK是评估c-Met介导的活性的黄金标准。细胞分散涉及细胞粘附性、细胞迁移和分化、HGF和c-Met作用的特征的丧失（Yamamoto,Elias et al.,2010;Birchmeier,Sonnenberg et al.1993）。检测Hinge对分散的海马神经元的影响，发现在很宽范围内的剂量对树突棘生成都没有影响，因此表明Hinge和HGF/c-Met体系在培养的神经元中基础树突棘生成中没有明显作用（图13A）。然而，Hinge的确有效抑制了用10纳克/毫升HGF（图13B）、10-12M Nle1-AnglV（图13C）或10-12M Dihexa（图12D）刺激的神经元中棘的形成，这进一步支持了这些作用是由HGF/c-Met体系介导的。
为了评估Hinge对兴奋性突触传导mEPSCs的影响，记录用Hinge（10-12M）、HGF（10纳克/毫升）、Dihexa（10-12M）、Hinge+HGF（分别为10-12M+10纳克/毫升）或Hinge+Dihexa（各10-12M）处理5天的mRFP-β-肌动蛋白转染的海马神经元的mEPSCs。和媒介物处理的神经元相比（平均频率=5.31±0.35；图14A和B），Hinge单独处理不会影响突触传导（平均频率=4.51±0.47）。与Hinge和媒介物处理的神经元相比，HGF和Dihexa处理组的频率显著增加（平均频率：HGF组=9.66±0.20，Dihexa组=8.25±0.56）。然而，这些影响由于Hinge的存在而被显著减弱（平均频率：HGF+Hinge=5.25±0.27，Dihexa+Hinge=5.57±0.65；图14A和B）。这些结果表明，新形成的树突棘形成了功能性突触，与此同时Hinge对突触传导没有影响，它对树突棘生成的抑制使得AMPA介导的频率下降。
推荐的血管紧张素IV受体HGF是酪胺酸激活酶受体c-Met的配体。虽然c-Met和HGF mRNA在脑部的定位已经被详细记载过（Jung,Castren et al.1994;Honda,Kagoshima et al.1995;Thewke and Seeds1996;Achim,Katyal et al.1997），但c-Met蛋白的存在和分布还没有被检测过。因此，我们探测了数个脑部区域以检测c-Met的存在，但是由于缺乏有效的抗体，该方法不能同样地用于HGF。可以在大部分脑部区域观察到高水平的c-Met。特别地，在海马中观察到c-Met蛋白信号最高，并且显然比在作为HGF主要产生位点的肝脏中还要高。同样也在前额皮质和中脑处观察到很强的信号，这些都是认知的重要区域，与此同时，新皮质的信号有点减弱，小脑产生的信号最低（图15A和B）。
Dihexa的作用对于HGF/c-Met体系的明显依赖性预示着低于HGF阈值剂量的Dihexa能够刺激c-Met磷酸化和激活。因此，急性成年大鼠海马脑切片用HGF、饱和浓度和不饱和浓度的Dihexa单独或共同用于检测磷酸化-Met刺激。c-Met受体的磷酸化程度表明了受体的活化程度。图16显示了在用媒介物和各种浓度的HGF或Dihexa处理30分钟后的c-Met受体磷酸化情况。相比于对照（aCSF）处理的切片，饱和剂量的HGF（100纳克/毫升）和Dihexa（10-10M）都能增加c-Met的磷酸化，（p<0.007）。非饱和剂量的HGF（50纳克/毫升）和Dihexa（10-12M）和对照组处理的切片没有统计学差异（p>0.05），因此认为是亚阈值的。然而，亚阈值剂量的HGF和Dihexa的组合，明显能够产生类似于饱和剂量的HGF和Dihexa的效果（p<0.007）。因此，剂量依赖性表明Dihexa在成年大鼠脑部能够单独或联合HGF激活HGF/c-Met体系。和这些发现相一致的是，Dihexa能够在HEK293细胞中通过磷酸化显著增加HGF激活c-Met的能力（图17）并激活MDCK细胞分散（图18）。
为了无可辩驳地确认AngIV类似物是通过HGF/c-Met体系起作用，使用一种c-Met的shRNA来敲除受体。分散的海马神经元用mRFP-β-肌动蛋白和shMet RNA转染，受体的敲除在用0.5μg（每孔）HGF（10纳克/毫升）、Dihexa或Nle1-AnglV（均为10-12M）刺激之前48小时进行。更长时间的暴露似乎对神经元是有害的或有毒的。有效的c-Met受体的敲除通过用（0.1μg）6-Myc-标签c-Met、（0.1g）shMet或mRFP-β-肌动蛋白转染人类中肾细胞（HEK）来进行确认。成功的敲除通过使用抗-Myc抗体标记带有Myc标签的c-Met免疫印迹来证实（图19）。
用mRFP-β-肌动蛋白单独转染的神经元用作对照，并用10纳克/毫升的HGF、10-12M Dihexa或Nle1-AnglV处理。和对照组相比，可以观察到树突棘的数量有显著增加（每50μm树突长度平均棘个数=13.2，相比之下，HGF组=20.6；Dihexa组=21.8，Nle1-AnglV组=20.0；p<0.05，单因素方差分析和图基事后检验法）。用mRFP-β-肌动蛋白转染的神经元和用10纳克/毫升HGF、10-12M Dihexa或Nle1-AngIV刺激的shMet，和对照组相比树突棘数量没有区别（每50μm树突长度平均棘个数=13.5，相比之下，HGF组=12.4；Dihexa组=12.0，Nle1-AnglV=12.1；p>0.05，单因素方差分析和图基事后检验法），如图20所示。Scrambled RNA序列用作阴性对照，其对基础的或刺激的树突棘生成没有影响（数据没有显示）。上述数据证明，AngIV类似物的作用是由HGF/c-Met系统介导的。
Morris水迷宫是一种海马区依赖型空间学习任务，要求大鼠能够通过迷宫外暗示自我导向找到隐藏在水面以下的平台，以此用来评估HGF拮抗剂Hinge对Dihexa促认知效应的影响。被检测的组包括aCSF伴随（followed by）aCSF、东莨菪碱（70nM）伴随aCSF、东莨菪碱伴随Dihexa（300pM）、aCSF伴随Hinge（300pM）和东莨菪碱+Hinge伴随Dihexa。图21代表了在1-8天水迷宫训练中找到隐藏平台的平均潜伏期。这些组在培训第一天找到平台的潜伏期没有显著区别。媒介物对照组的平均潜伏期（aCSF→aCSF）=89.3s；东莨菪碱处理组=114.7s；东莨菪碱+Hinge→Dihexa处理组=107.9s；Hinge组平均潜伏期=111.1s；东莨菪碱→Dihexa组=115.2s。训练第四天被认为是非常关键的一天，因为训练中大部分提高和神经可塑性都在这一天发生（Meighan et al.，2006），东莨菪碱组（找到平台的平均潜伏期=102.4s）和东莨菪碱+Hinge→Dihexa组（平均潜伏期=105.2s）表明与媒介物对照组（平均潜伏期=43.0）、Hinge组（平均潜伏期=78.3s）和东莨菪碱→Dihexa（平均潜伏期=63.0s）相比没有提高的信号。在训练最后一天出现最高学习水平（Meighan,Meighan et al.2006），东莨菪碱组的平均潜伏期（找到平台的平均潜伏期=84.8s）和东莨菪碱+Hinge→Dihexa组（平均潜伏期=93.6s）表明与媒介对照组（平均潜伏期=43.0s）、Hinge组（平均潜伏期=46.1s）和东莨菪碱→Dihexa组（平均潜伏期=62.3s）相比略有提高。这些结果表明，HGF和c-Met在海马依赖的认知过程中起到重要作用。
讨论
血管紧张素IV类似物的促认知作用表明抗痴呆药物基于该体系可以被研发出来（Braszko,Kupryszewski et al.1988;Stubley-Weatherly,Harding et al.1996;Pederson,Harding et al.1998;Wright,Stubley et al.1999）。然而，由于血管紧张素IV和很多AngIV类似物的稳定性很差，早期类似物不能穿透血脑屏障，不能被AT4受体识别，目前还没有制药公司推动他们这方面的发展。Dihexa，一种新型血管紧张素IV型类似物，是由我们实验室合成的，它很稳定并具有口服活性，因此克服了阻止开发的主要药代动力学障碍。Dihexa已经证明了在血液中5个小时以内是稳定的（未显示），并可通过肠部渗透到血脑屏障中，克服了急性和慢性痴呆模型中的认知缺陷（未显示）。借助于水迷宫任务可以确定基本机制，这涉及呈新形成的突触后树突棘和伴随的突触发生形式的树突树的扩张。对于研发，最后遗留的障碍是缺乏分子机制。
在此，我们证明AngIV类似物的作用依赖于HGF/c-Met体系。这两种体系似乎介导产生类似的生理作用。血管紧张素IV/AT4体系有抗损伤保护脑的作用（Wright,Clemens et al.1996;Date,Takagi et al.2004），增加了长期增强作用（Kramar,Armstrong et al.2001;Wayner,Armstrong et al.2001;Akimoto,Baba et al.2004;Davis,Kramar et al.2006），已经确认具备促认知效应（Wright and Harding2008），被认为可以用来调控神经细胞发育。HGF/c-Met体系同样具备促认知效应（Akimoto,Baba et al.2004;Tyndall and Walikonis2006;Tyndall andWalikonis2007）并被认为参与肝细胞调控（Urbanek,Rota et al.2005;Nicoleau,Benzakour et al.2009）。除了功能相似性，在血管紧张素IV和HGF的“Hinge”链接区域之间存在同源序列（Wright,Yamamoto et al.2008）。该概念通过观察进一步稳固，已知AT4拮抗剂Norleual能够阻断多种HGF/c-Met调控的功能例如MDCK细胞分散（Yamamoto,Elias et al.2010）。
水迷宫任务的简易化受Dihexa和母血管紧张素IV配体Nle1-AngIV的影响，通过树突树的扩大（elaboration）来增加神经传导发生。假设在AngIV类似物和HGF/c-Met体系之间存在联系，可以预测Dihexa和Nle1-AngIV HGF能够刺激分离的海马神经元中的树突棘的生长。
正如预测的那样，HGF促进了分离的海马神经元中树突棘生成的剂量依赖性增加（图7）。最有效浓度（10纳克/毫升）的HGF随后发现可以刺激器官型海马脑切片培养物中的海马神经元，该培养物与Dihexa类似是更加完整的制品（图8A和B），这进一步证明Dihexa和HGF/c-Met之间存在机械连接。为了评估这些新形成的树突棘之间的生理相关性，确定驻留突触的神经递质标签，对用mRFP-β-肌动蛋白标记的HGF处理诱导形成的树突棘中的、位于突触前活跃区域的普遍存在的突触前标志物突触蛋白（Ferreiraand Rapoport2002）和在谷氨酸能突触前突触中发现的兴奋性突触前标志物VGLUT1（Balschun,Moechars et al.）进行免疫染色。与突触蛋白并列的用突触后mRFP-β-肌动蛋白标记的树突棘或或VGLUT1树突棘的比例，和对照处理的神经元没有什么区别，这表明处理诱导的棘形成了功能性突触（图9A-D）。通过记录mEPSCs，HGF和Dihexa处理的神经元中自发性的不依赖动作电位的突触前爆发（burst），进一步确认突触发生。AMPA介导的传导响应在HGF和Dihexa处理组放大，这可以从增加的频率中看出（图10）。
亚阈值浓度的Dihexa和HGF、或Nle1-AngIV和HGF用于体外刺激海马神经元，以确定血管紧张素IV配体Dihexa和Nle1-AngIV、以及HGF是否会影响相同信号的级联放大或对一种受体（c-Met）的作用。为了测定Dihexa和Nle1-AngIV是否参与同样的信号级联放大，亚阈值浓度的AnglV配体和亚阈值剂量的HGF组合在一起。当亚阈值浓度的每种配体单独使用时不会改变基本的树突棘生成，亚阈值浓度的10-13M Dihexa和2.5纳克/毫升的HGF或10-13M Nle1-AngIV和2.5纳克/毫升HGF的组合会产生近乎最高效应，与每种配体单独使用的生物反应剂量相似（图11A和B）。树突对AnglV类似物和HGF反应的相似性和作用机理是相一致的。
为了进一步证实这种机理共性的认识，使用新型HGF类似物Hinge来评估它对被AnglV类似物和HGF刺激的海马神经元的影响。Hinge，正如血管紧张素IV的拮抗剂Norleual，因其能够阻断依赖HGF的c-Met磷酸化和防止HGF依赖性的MDCK表皮细胞系的分散而被确认是一种c-Met类似物。细胞分散，是HGF/c-Met相互作用的特征，导致细胞粘附特性的丧失，使得细胞能够迁移（Yamamoto,Elias et al.;Birchmeier,Sonnenberg et al.1993）。发现Hinge对培养的海马神经元没有不良影响，并且不会促进或妨碍树突棘生成（图12A）。然而，皮摩尔（pico molar）浓度的Hinge防止了HGF、Nle1-AngIV和Dihexa诱导树突棘生成（图12B-D），这进一步表明观察到的血管紧张素IV配体的作用是由HGF/c-Met介导的。Hinge对突触发生的影响是通过记录培养的海马神经元的mEPSC频率评估的。虽然Hinge单独使用不能改变突触传导基线，但它可以减弱HGF和Dihexa对AMPA-频率的增加（图13A和B）。该效应可能归因于HGF和Dihexa处理促进的树突棘生成的减弱，在没有Hinge的对抗效应的情况下，每种兴奋剂都会增加微小-AMPA频率（图13A-B和图10），因此形成功能性突触连接。总的来说，这些数据表明，抑制HGF不能改变媒介物处理的神经元中功能性突触的数量，但是会通过降低突触前棘的数量而减弱HGF和Dihexa对突触发生的影响。
为了进一步支持兴奋剂Dihexa和Nle1-AngIV通过HGF和它的受体c-Met起作用这一观点，海马神经元被shRNA转染以敲除c-Met受体。受体的敲除通过用Myc标签的c-Met基因产物进行免疫染色来确认（图16）。正如预料的那样，转染了mRFP-β-肌动蛋白的海马神经元被HGF、Dihexa和Nle1-AngIV刺激后可以显著加强树突树，同时被she-Met RNA转染的神经元则和对照处理的神经元没有区别（图17）。这些数据进一步支持我们的下述观点：血管紧张素IV配体Dihexa和Nle1-AngIV通过HGF/c-Met体系起作用。
已经显示新开发的血管紧张素IV兴奋剂配体Dihexa有助于东莨菪碱处理的大鼠获得空间学习和记忆任务（未显示数据）。由于在水迷宫实验中检测HGF的成本过高，我们通过用HGF拮抗剂Hinge阻断Dihexa来评估它对于认知的参与。用毒蕈碱胆碱能受体拮抗剂东莨菪碱处理，使得大鼠急性失忆，因此不能学习该任务。在东莨菪碱预处理后给予Dihexa可以观察到一种援救效应。这些大鼠展现了快速的任务顺利性，并和媒介物处理大鼠的表现没有区别。用东莨菪碱和Hinge预处理的大鼠组没有展现出在东莨菪碱制剂处理后Dihexa引起的援救效应（图14A和B）。这些数据表明HGF和c-Met体系在学习和记忆的作用，并且表明能够模拟HGF作用的试剂可以被用于加强有需要的受试者的学习和记忆能力。
实施例3：作为肝细胞生长因子/Met改性剂的血管紧张素IV类似物的研发
血管紧张素IV类似物的6-AH家族[D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-CONH2；其中X=各种氨基酸]可直接和肝细胞生长因子（HGF）结合并抑制HGF形成功能性二聚体的能力。代谢稳定的6-AH家族成员D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2在血液中t1/2时间为80分钟，相比之下，母化合物Norleual（Nle-Tyr-Leu-ψ-（CH2-NH2）3-4-His-Pro-Phe，SEQ ID NO:1）在血液中t1/2的时间＜5分钟。发现6-AH家族成员可以作为HGF的二聚化区域的模拟物（Hinge区域），阻止HGF分子和3H-hinge区域肽的相互作用，导致HGF活化它的受体Met的能力减弱。这种干扰转化为抑制了HGF依赖性的信号传导、增殖和将多种细胞类型的浓度分散到低皮摩尔范围内。我们也注意到在6-AH家族成员阻断HGF二聚化和抑制细胞活性之间存在显著相关性。进一步地，6-AH家族中第2号位置为半胱氨酸的成员，是HGF依赖性的细胞活性特别有效的拮抗剂。该化合物抑制了B16-F10鼠的黑素瘤细胞在肺部的定殖，其特征在于异常活跃的HGF/Met体系。总起来，这些数据表明，AngIV类似物的6-AH家族通过修饰HGF/Met体系的活性展现了它们的生物活性，并可能作为HGF/Met体系依赖性的或具有HGF/Met体系过度激活的失调的治疗剂。
引言
多功能的生长因子肝细胞生长因子（HGF）和它的受体Met在很多细胞类型中都是重要的促有丝分裂、有丝分裂和形态发生的中介因子（Birchmeier et al.,2003），所述细胞类型包括上皮细胞（Kakazu et al.,2004）、内皮细胞（Kanda et al.,2006）、和造血细胞（Ratajczak et al.,1997）、神经细胞（Thompson et al.,2004）、黑素细胞（Halaban et al.,1992）、和肝细胞（Borowiak et al.,2004）。进一步地，HGF/Met体系的失调经常导致肿瘤改变和癌（在人和动物中），其中它导致肿瘤形成、肿瘤转移和肿瘤血管生成（Christensen et al.,2005;Liu et al.,2008）。该信号体系的过度激活常规情况下和病人不良预后有关（Liu et al.,2010）。因此，可以预料抑制HGF/Met体系的分子能够展示抗癌活性并且减弱恶性的和转移性的转化。
HGF是一种脊椎动物杂聚肽多肽生长因子，并带有和血纤维蛋白溶酶原家族蛋白酶极其接近的结构域（Donate et al.,1994）。HGF由七个结构域组成：一个氨基末端结构域、一个二聚化连接结构域、四个三环结构域（K1-K4）、和一个丝氨酸蛋白酶同源（SPH）的结构域（Lokker et al.,1992;Chirgadze et al.,1999）。单链聚多肽可由转化酶蛋白水解生成一个成熟的α链（重链55千道尔顿）和β链（轻链34千道尔顿）的异质二聚体，它们通过二硫键相连接（Stella and Comoglio,1999;Birchmeier et al.,2003;Gherardi et al.,2006）。除了蛋白水解处理，HGF还需要二聚化才能被完全活化（Lokker et al.,1992;Chirgadze et al.,1999;Youles et al.,2008）。若干报告显示HGF形成了二聚体和/或多聚体，在和Met相互作用之前按头尾相接方向排列（Gherardi et al.,2006）。包含内部区域连接氨基酸（K122、D123、Y124、I125、R126和N127）的二聚体界面被称为hinge区域（Gherardi et al.,2006;Youles et al.,2008）。虽然pre-pro-HGF和活跃的二硫键连接的杂二聚体和Met的结合都有高的亲和性，但只有杂二聚体能够激活Met（Lokker et al.,1992;Sheth et al.,2008）。
来自我们实验室（Yamamoto et al.,2010）最近的研究表明，皮摩尔浓度的AngIV类似物、Norleual（Nle-Tyr-Leu-ψ-（CH2-NH2）3-4-His-Pro-Phe）能够有效地抑制HGF/Met体系，并直接结合到HGF的hinge区域以阻断它的二聚化（Kawas et al.,2011）。而且，代表急性hinge区域的六肽具有和Norleual相似的生物化学和药理特性（Kawas et al.,2011）。这些研究的主要含义是靶向HGF二聚化区域的分子能够代表新型的和可行的抗癌治疗。此外，这些数据能够支持以Norleual和/或Hinge肽为模板合成的这些分子的研发。
尽管具有抗癌特征，Norleual的高度不稳定性使得它在临床应用中存在问题。因此，我们实验室已经研发了代谢稳定的AngIV相关的类似物家族，它们此处被称为6-AH家族，是由于在C端位置6-氨基己酰胺被取代。该取代连同N端的D-正亮氨酸加强了该家族成员的代谢抗性。
在实施例3中，表明6-AH家族成员（即HGF模拟物）和Norleual相比具有优异的代谢稳定性，和HGF结合具有高亲和性，并作为hinge区域模拟物起作用；因此防止了HGF的二聚化和活化。这种干扰以皮摩尔浓度水平抑制了多种细胞类型中依赖HGF的信号传导、增殖和分散。证明在阻断二聚化的能力和抑制HGF活化的细胞结果之间存在正相关。最终，D-Nle-Cys-Ile-NH-（CH2）5-CONH2作为6-AH家族成员抑制了B16-F10鼠的黑素瘤细胞在肺部的定殖，其特征在于异常活跃的HGF/Met体系。该实施例强调了AngIV样分子和HGF结合、以及阻断HGF二聚化和抑制HGF/Met体系的能力。而且，这些HGF模拟物作为AngIV相关的药品，能够在抑制HGF/Met体系的失调中作为治疗剂在临床上是有非常有用的。
材料与方法
动物。来自Taconic农场的C57BL/6小鼠用于肺部定殖研究。来自Harlan实验室的雄性Sprague-Dawley大鼠（250+克）用于药代动力学研究（加利福尼亚州，美国）。动物根据NIH指南如“实验室动物照料和使用指南”中所述进行饲养和照料。
化合物。D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-COOH；其中X=各种氨基酸和Norleual（Nle-Tyr-Leu-ψ-（CH2-NH2）3-4-His-Pro-Phe，SEQ ID NO:1）使用基于Fmoc的固相方法在Harding实验室合成并通过反相HPLC纯化。纯度和结构通过LC-MS确认。肝细胞生长因子（HGF）购自R&D体系（明尼苏达州明尼阿波利市）。
抗体。抗-Met抗体购自细胞信号科技公司（Beverly,麻萨诸塞州），磷酸化-Met抗体购自AbCam公司（剑桥市，麻萨诸塞州）。
细胞培养。在DMEM（细胞培养基）、10%牛胎儿血清（FBS）中培养人类胚胎肾细胞293（HEK293）、犬肾上皮连续细胞（MDCK）。使用前，细胞培养至100%汇合率。HEK和MDCK细胞在开始药物处理之前会先采取血清饥饿2-24小时。
血液稳定性试验。为了对比Norleual和D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2（6-AH家族的一个代表性成员）的血液稳定性，20微升包含化合物的媒介物（水[Norleual]或30%的乙醇[D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2]）被添加到180微升的肝素化血液中，并在37℃培养不同时间。对于Norleual处理组，37℃培养至0、20、40和60分钟时停止；对于D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2处理组，培养至0、1、3和5小时的时候停止。
每次培养最后，添加20微升Nle1-AnglV（100微克/毫升）到每个样品中作为内标物。D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2样品在4℃下以2300x g的转速离心5分钟以便使红细胞成团，然后将血浆转移到干净的试管中。Norleual和D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2样品通过添加3倍体积的冰冷的乙腈（ACN）沉淀，然后样品被剧烈涡旋混合。所有样品在4℃下以2300x g的转速离心旋转5分钟，上清液被转移到干净的试管中。样品然后在Savant 
Figure BDA0000428053160000621
浓缩器中（赛默飞世尔科技，Waltham,麻萨诸塞州）蒸发干燥，残留物用225微升35%的甲醇重配，简短涡旋，然后转移到HPLC自动进样瓶中，向HPLC系统注射100微升溶液。
样品通过HPLC用来自Grace Davison Discovery Science公司（Deerfield，伊利诺伊州）的Econosphere C18（100mm X2.1mm）柱分离。通过质谱法使用LCMS-2010EV质谱仪（Shimadzu,京东，日本）检测和分析各峰。流动相包括含有0.1%三氟乙酸或0.1%七氟丁酸（西格玛，圣路易市，密苏里州）和不同浓度的ACN或甲醇的HPLC水（西格玛，圣路易市，密苏里州）。在室温下以0.3毫升/分钟的流速使用梯度方法执行分离（参见下文了解更多）。
通过假定正常单相指数式衰减，使用Prism5图示/统计学程序（GraphPad,圣地亚哥市，加利福尼亚州）测定稳定性半衰期。
IV药代动力学。
手术步骤。雄性Sprague-Dawley大鼠（250+g）在我们AAALAC认证的动物试验场中可以自由摄食（Harlan Teklad鼠饲料）和饮水。大鼠饲养在有温控的房间内，并12小时交替明/暗。大鼠在施以氯胺酮（Fort Dodge Animal Health,Fort Dodge,爱荷华州，美国）和异氟烷（Vet OneTM,MWI,Meridian,爱德华州，美国）麻醉后，在其右颈静脉插入无菌聚氨酯HydrocoaTM导液管（Access Technologies,Skokie,伊利诺伊州，美国）。导液管通过背部皮肤外置。导液管在收集血液样品之前充满了肝素化的盐水，而当长于8小时时间不用的时候充满肝素-甘油混合溶液（6毫升甘油、3毫升盐水、0.5毫升庆大霉素（100毫克/毫升）、0.5毫升肝素（10,000u/毫升））。动物在用于任何实验之前允许从手术后恢复若干天，并在药代动力学实验之前禁食过夜。
药代动力学研究。插入导管的大鼠在开始研究之前被安置在代谢笼中，并收集开始0时间时的血液样品。动物然后通过颈静脉导管静脉注射溶于30%乙醇的D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2（24mg/kg）。给药之后，按如下方式收集血液样品（时间和血液体积按收集时间顺序排序）：
Figure BDA0000428053160000631
在收集完每个血液样品之后，导液管用盐水冲洗，并注射和所取血液体积等量的盐水（以保证整体血液体积）。
制备血液样品。血液样品在收集至不含肝素的聚丙烯微管之后，直接在4℃以2300xg转速离心5分钟，以去除细胞和凝块，将血清转移到干净的微型离心管中。添加0.1倍样品血清体积的内标物（Nle1-AnglV,100g/mL）。然后添加四倍样品血清体积的冰冷乙腈并剧烈涡旋混合30秒。将上清液转移到干净的试管中，然后放置在冰上直到实验结束，然后在4℃下储存，直到进一步处理。
由使用的储存液制备D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2在30%乙醇中的连续稀释液，给予动物，用于标准曲线。将20微升每个系列稀释液添加到180微升在冰上的血液中，至终浓度为0.01微克/毫升、0.1微克/毫升、1微克/毫升和10微克/毫升。所有样品在4℃下以2300xg的转速离心5分钟，然后血清被转移到聚丙烯微型离心管中。添加0.1倍样品血清体积的内标物（Nle1-AnglV,100微克/毫升）。然后添加四倍样品血清体积的冰冷乙腈并剧烈涡旋混合30秒。上清液转移到干净的试管中，样品在4℃下储存，并和药代动力学研究样品一起处理。所有样品在Savant 
Figure BDA0000428053160000641
浓缩器中蒸发干燥。残留物用225微升的35%甲醇重配，并简短涡旋。样品然后转移到HPLC自动进样瓶中，每个样品向HPLC系统注射共两次100微升（2HPLC/MS分析）。
色谱系统和条件。使用的HPLC MS系统购自Shimadzu（日本，京东），包括CBM-20A通讯总线模块、LC-20AD泵、SIL-20AC自动进样器，SPD-M20A二极管矩阵检测器和LCMS-2010EV质谱仪。使用Shimadzu LCMS solution软件完成数据收集和整合。分析柱用的是来自Grace Davison Discovery Science公司（Deerfield，伊利诺伊州，美国）的Econosphere C18（100mm X2.1mm）柱。移动相包括HPLC梯度甲醇和含有0.1%三氟乙酸的水。采用非等度洗脱方法（甲醇10分钟内由40%改变为50%）在室温下分离，流速为0.3毫升/分钟。对于MS分析，正离子模型（扫描）用于监控D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2在542处的m/z，以及Nle1-AnglV（用作内标）在395处的m/z。成功完成D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2和内标的分离。没有和分析物或内标共同洗脱出的干扰峰值。峰值纯度分析表明了D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2峰值纯度指数为0.95，内标的为0.94。D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2在5.06分钟时洗脱出来，内标则在4.31分钟时洗脱出来。数据基于内标的回收率而规范化。
药代动力学分析。药代动力学分析采用来自单个大鼠的数据进行。计算该组的平均值和标准差（SD）。根据血清药物浓度-时间变化图，使用
Figure BDA0000428053160000651
软件（Pharsight,Mountain View,加利福尼亚州，美国）计算未分区的药代动力学参数。可能的情况下测定下述相关参数：从0到最后时刻浓度时间曲线下的面积（AUC0-最后）或推测至无穷（AUC0-∞），血浆中的Cmax浓度推测为0（C0），终端消除半衰期（t1/2）、体积分布（Vd）、清除率（CL）。
微粒体代谢。雄性大鼠肝脏微粒体来自Celsis（Baltimore,马里兰州，美国）。对Celsis的用于评估微粒体-依赖性药物代谢的操作手册有小的调整。一种NADPH再生系统（NRS）的制备方法如下：将1.7毫克/毫升NADP、7.8毫克/毫升葡萄糖-6-磷酸盐和6单位/毫升葡萄糖-6-磷酸脱氢酶添加到10毫升2%的碳酸氢钠并立即使用。500μM Norleual、D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2、吡罗昔康、维拉帕米和7-乙氧基香豆素（分别为低、中和高代谢对照）在乙腈中制备。微粒体悬浮在0.1M的Tris缓冲液中（pH7.38）浓度为0.5毫克/毫升，将100微升微粒体悬浮液添加到放置在冰上预冷的微型离心机试管中。每个样品中添加640微升0.1M的Tris缓冲液，10微升500μM的待测化合物和250微升NRS。样品在旋转杂交箱中37℃下温育适当的时间（10、20、30、40或60分钟）。每个样品取500微升转移到含有500微升冰冷乙腈的试管中，每个温育样品都含有内标。取500微升温育缓冲液添加到500微升含有内标的冰冷乙腈中用于制备标准曲线的样品。所有样品然后通过高效液相层析法/质谱分析。测定药品浓度，相比不含微粒体的阴性对照样品计算母液的损失。通过对ke和t1/2的非线性回归分析和公式Clint=keVd测定清除率。对于体外-体内相关性，使用下述测量方法计算Sprague-Dawley大鼠的每千克体重的Clint值：每克肝脏44.8毫克蛋白质、每千克体重40克肝脏。
HGF结合。6-AH类似物和HGF的竞争性结合使用可溶性结合实验进行评估。含人类HGF（1.25纳克）的250微升PBS与HGF的主要二聚化区域3H-Hinge在10-13M至10-7M（对半稀释）不同浓度的6-AH类似物存在下在37℃共同温育40分钟。温育试剂然后用Bio-Gel P6离心柱（400微升填充体积）旋转1分钟，以分离游离的3H-Hinge和被结合的3H-Hinge，收集洗脱液。向洗脱液中添加5毫升闪烁液，洗脱液中包含HGF结合的3H-Hinge，然后使用闪烁记数器计数。基于机器计数效率计算每分钟被结合的3H-Hinge的总衰减。使用Prism5测定与肽结合的Ki值。绘制竞争结合曲线一式三份。初步动力学研究表明37℃温育40分钟达到平衡结合。最近表明3H-Hinge与HGF结合固有高亲和性（Kawas et al.,2011）。
HGF二聚化。使用PAGE通过银染色后评估HGF二聚化（Kawas et al.,2011）。将0.08纳克/微升浓度的人类HGF（包含或不含6-AH类似物）与终浓度为5微克/毫升的肝素共同温育。向每个样品中添加上样缓冲液，使用梯度标准XT预制凝胶（4-12%Bis-Tris；Biorad实验室，Hercules,加利福尼亚州），通过非变性PAGE分离混合物。然后凝胶用银染色，以检测HGF单体和二聚体。使用凝胶成像系统（UVP）磷光影像分析仪（Upland，加利福尼亚州）对条带进行定量。
蛋白印迹。HEK293细胞接种在6孔组织培养板中，并在包含10%FBS的DMEM培养基中培养至95%汇合率。细胞在处理前去除血清24小时以降低磷酸化-Met的基本水平。在血清饥饿之后，制备包含媒介物并包含/不含6-AH类似物的HGF的混合物，并在室温下预温育30分钟。然后混合物添加到细胞中10分钟，以刺激Met受体和下游蛋白质。细胞采用添加了磷酸酯酶抑制剂的混合物1和2（Sigma-Aldrich；圣路易斯，密苏里州）的RIPA裂解缓冲液（Millipore;Billerica,麻萨诸塞州）收集。裂解物以15,000nx g的转速离心15分钟澄清，蛋白质浓度使用BCA蛋白总量测试法（Pierce）测定，然后适当体积的裂解物用2x laemmli缓冲液稀释并在95℃下加热10分钟。包含相同蛋白质含量的样品使用SDS-PAGE（Criterion,BioRad Laboratories）分离后，转移到硝酸纤维素膜上，然后在包含5%牛奶的Tris缓冲盐水（TBS）中室温下封闭1小时。向封闭缓冲液添加磷酸化-Met抗体，其终浓度为1：1000，在4℃下保温并轻微搅拌过夜。使用水和TBS（PBS，0.05%吐温-20）洗涤上述膜数次，添加1：5000的辣根-过氧化物酶共价结合的山羊抗兔抗血清，在室温下进一步温育所述膜1小时。使用超灵敏West Pico化学发光底物系统（Pierce，芬顿，密苏里州）使得蛋白质可视化，根据对比蛋白阶梯（protein ladder）来确定蛋白质分子量大小（BenchMark,Invitrogen,andKaleidoscope,BioRad）。使用UVP磷光影像分析仪对薄膜图像进行数字化并分析。
细胞增殖。5000MDCK细胞接种到包含10%胎牛血清的培养基（10%FBS DMEM）的96孔板上的孔中。为了诱导细胞静止，在开始处理之前24小时去除血清培养。血清饥饿之后，10纳克/毫升的HGF单独添加或连同不同浓度的6-AH类似物或PBS试剂一起添加到介质中。细胞在该环境下培养4天，每天添加6-AH类似物。在第四天，在PBS中制备1毫克/毫升的1-（4，5-二甲基噻唑-2-yl）3,5-二苯基甲簪试剂（MTT,Sigma-Aldrich），并将其添加到细胞中然后温育4小时。添加用0.01M的甘氨酸缓冲液稀释的二甲亚砜以溶解细胞膜，缓冲液中减少的四甲基偶氮唑盐的吸收值使用酶标仪（Biotek Synergy2,Winooski,佛蒙特州）在590纳米下定量。通过从包含HGF的组的总增殖率中减去基本增殖率（不含HGF时），从而测定HGF依赖性的增殖。
分散实验。MDCK细胞在6孔平板的盖玻片上培养到100%汇合率，并用PBS洗涤两次。汇合的盖玻片在无菌条件下转移到新的包含900微升无血清DMEM培养基的6孔平板中。添加Norleual、Hinge多肽、和/或HGF（20纳克/毫升）到合适的孔中。对照孔添加PBS媒介物。平板在含5%CO2，37℃下培养48小时。去除培养基，细胞采用甲醇固定。细胞使用Diff-Quik、Wright-Giemsa（Dade-Behring,纽瓦克，特拉华州）染色并获得数字图象。使用镊子去除盖玻片，同时获得更多数字图像。使用图像J方法对图像的像素进行量化，使用Prism5软件和InStat3.05版（GraphPad;圣地亚哥，加利福尼亚州）进行统计。
肺部集落形成。6到8个月龄的C57BL/6小鼠通过尾部静脉注射在200微升PBS中的400,000个B16-F10细胞，随后每天腹膜内注射D-Nle-X-Cys-NH-（CH2）5-CONH2（10μg/kg和100μg/kg）或PBS媒介物。两周之后，小鼠麻醉，肺部灌注PBS后，切取肺部。拍照，肺部用1%的Triton x-100，20mM Tris、0.15M NaCl、2mM EDTA和0.02%叠氮化钠溶解。样品用超声（Mixonix,Farmingdale,纽约）和旋转方法破碎。上清液转移到96孔板上，使用酶标仪在410nm吸收峰下测量黑色素。
统计。独立单因素方差分析（ANOVA）（InStat v.3.05and Prism5）用于测定各组之间的差异。必要时采用Tukey-Kramar或Bonferroni多重比较事后检验法。使用双侧学生t-检验（InStat v.3.05和Prism5）测定两组的统计比较。
结果
AngIV类似物D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2比Norleual（Nle-Tyr-Leu-ψ-（CH2-NH2）3-4-His-Pro-Phe（SEQ ID NO:1）代谢更稳定：之前已经表明，AnglV相关的肽模拟物（peptidomimetic）Norleual具备抗-HGF/Met、抗-血管生成和抗癌活性（Yamamoto et al.,2010）。N端和C端连接处存在的未被保护的肽键预示Norleual的代谢稳定性低、并且在血液循环中可以快速被清除的特性，这些特性可能限制它的临床应用。为了克服这些限制，设计并合成化合物家族6-AH家族以抵抗外肽酶。图22表明，正如所预料的那样，Norleual在肝素化血液中是不稳定的，相比之下D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2的稳定性得到改善。
AngIV类似物D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2比Norleual（Nle-Tyr-Leu-ψ-（CH2-NH2）3-4-His-Pro-Phe（SEQ ID NO:1）的血液循环半衰期更长：正如根据血液稳定性数据预测的那样，D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2通过静脉注射到大鼠后体内，消除半衰期延长到1012分钟。静脉注射单次剂量后，D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2其他相关的药代动力学参数的总结见表5。血清数据使用
Figure BDA0000428053160000681
软件建模，进行未分区分析（non-compartmental analysis）。D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2广泛分布在中央血液区以外，并且/或者在组织内被结合，这可由它大量的分布体积（Vd）证实。根据定量结构-活性关系（QSAR）模型（讨论如下）和血清总的回收率高于35%，估计D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2和血浆蛋白不会高度结合。这些结果表明D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2在一定程度上是疏水性的，这和由ADMET 
Figure BDA0000428053160000682
产生的QSRA模型估计结果是一致的，该估计结果计算了D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2的辛醇：水分配系数为28.18（表6）。
由于具有稳定性、疏水性和较小体积，D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2预计是口服有活性的，这一点也不让人惊讶。预测的Peff值（1.53）在两种口服有效的药物：依那普利Peff预测值（1.25）和吡罗昔康（2.14）之间是居中的。D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2在血液循环中未和血浆结合的比例预计为42.68%，因此它能够分布到组织中。
同样由于D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2缺乏阶段I的代谢，导致它从血液中消失缓慢。D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2在使用大鼠肝脏微粒体的体外代谢测试中，90分钟后检测不到代谢（数据未显示）。总之，这些数据表明，D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2相比Norleual代谢更稳定，在血液循环中具备更长的半衰期并能有效渗透到组织中。总而言之，这些有利的药代动力学特性证明D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2和相关分子的机理和疗效评价。
D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-CONH2类似物与HGF结合，并和3H-Hinge肽竞争性结合HGF：
分析6-AH家族的一些成员D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-CONH2与3H-Hinge对HGF进行竞争结合的能力。从下面可以显而易见地看出，6-AH家族成员表现出了不同的阻断HGF生物作用的能力。同样地，评估生物活性不同的类似物的HGF结合特性，以测定在HGF抑制性和亲和性之间是否存在一定关系。有人提出了这样的假设：类似物直接和HGF结合并影响呈失活形式的HGF的隔离（sequestration）。为了开始评估这一观念，我们采用3H-Hinge多肽作为探针直接评估多肽的HGF结合性。采用3H-Hinge检测相互作用是基于3H-Hinge能够特异性结合HGF并和HGF具有高亲和性（Kawas et al.,2011）。对D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-CONH2家族若干衍生物进行竞争性研究。该研究表明，不同的类似物和HGF结合的能力不同，并且表明对HGF有拮抗作用的类似物可以起到Hinge模拟物的作用。发现D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-CONH2衍生物和Hinge竞争性地结合HGF，并表现出对于HGF的广泛亲和性，Kis变化范围为1.37x10-7-1.33x10-10M（图23）。正如预料的那样，化合物和HGF的结合能力与它阻断HGF二聚化和抑制HGF依赖性活动之间是相关的（见图25、26、27）。
D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-CONH2类似物阻断HGF二聚化：若干报告已经显示，在HGF激活Met之前，HGF需要形成同型二聚体和/或多体（Chirgadze et al.,1999;Gherardi et al.,2006）。该二聚体头尾朝向排列；二聚体界面包括一个中央区域、和对于合适的二聚体形成及定向非常重要的Hinge区域。对于所有可能的不依赖于和非来源于血管紧张素原的转录本，筛选同源序列保守性，以寻找和所识别的AnglV和hinge区域部分同源（Yamamoto et al.,2010）的蛋白质胞浆素原家族，其中包括胞浆素原本身、它的抗-血管生成降解物、血管抑素和蛋白质激素、肝细胞生长因子（HGF）和巨噬细胞刺激蛋白（MSP）。而且，AngIV类似物Norleual是HGF/Met体系的有效抑制剂，表明其能够和HGF结合并阻断HGF的二聚化（Kawas et al.,2011）。该知识结合6-AH家族一些成员与HGF的hinge区域的结合有高亲和性的证明，导致期望其他活跃的AngIV类似物，例如6-AH家族成员，能够期望具有抑制HGF二聚化，并且单个类似物结合HGF并抑制HGF依赖性过程应被反映它减弱二聚化的能力。图24的数据表明，可高亲和性地与HGF结合（图23）、并能有效减弱HGF依赖过程（图25、26、27）的D-Nle-Cys-Ile-NH-（CH2）5-CONH2和D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2可以完全阻断HGF形成二聚体，证实了这一期望。相反的，和HGF亲和性低（图23）并展示了很小的抗-HGF/Met活性的D-Nle-Met-Ile-NH-（CH2）5-CONH2在测试浓度下不能阻断二聚化。D-Nle-Trp-Ile-NH-（CH2）5-CONH2类似物表现出可以适度抑制二聚化，可以预测其对HGF的亲和性适中、抑制HGF依赖性过程的能力适中（图25、26、27）。这些数据共同证实了有活性的6-AH类似物可以阻断二聚化，并进一步证明一种类似物抑制二聚化的潜力至少在定性方面是和它阻断HGF依赖性过程是一致的。
D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-CONH2类似物减弱了HGF依赖性Met信号传导：
在确立了6-AH家族成员结合HGF和抑制HGF二聚化的轮廓之后，我们接下来确定这些特性是否和化合物抑制Met信号传导的能力相一致。酪氨酸激酶相关的生长因子受体例如Met的特征是酪氨酸残基自磷酸化步骤是必须的，这对于最终汇集各种SH2区域信号蛋白是必须的。因此，我们评估了若干种6-AH类似物诱导Met酪氨酸磷酸化的能力。正如所预料的那样，图25中的数据表明，D-Nle-Cys-Ile-NH-（CH2）5-CONH2和D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2都能高亲和性地结合HGF（图23）并能有效阻断它的二聚化（图24），能够阻断Met自磷酸化。D-Nle-Trp-Ile-NH-（CH2）5-CONH2类似物具有适度的抑制活性，D-Nle-Met-Ile-NH-（CH2）5-CONH2类似物显示出不能对Met活化起作用。总的来说，这些数据表明，6-AH类似物抑制HGF依赖性Met活化和它们与HGF结合的亲和性及它们阻断HGF二聚化的能力是相符合的。
D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-CONH2类似物影响HGF/Met刺激的MDCK细胞增殖:
Met活化可启动多种细胞应答，包括增加的增殖和流动性、提高的存活率和分化（Zhang and Vande Woude,2003）。在6-AH家族成员改变HGF-依赖性细胞活性能力的初步测试中，我们评估了该家族若干成员影响马丁达比狗肾（MDCK）细胞增殖活性的能力，MDCK细胞是研究HGF/Me体系的标准细胞模型（Stella and Comoglio,1999）。如图26所示，对HGF依赖性细胞增殖的抑制是非常广泛的。和结合性实验及二聚化实验的结果相类似，Cys2和Tyr2类似物展现出明显的抑制活性。早期的研究没有评估Asp2类似物，它也展示出显著的抑制活性。Trp2、Phe2和Ser2也展现出抑制活性，尽管低于大部分有效的类似物。一些化合物对HGF-依赖性的MDCK增殖的降低低于对照水平也是不必惊讶的，因为实验在2%的血清中进行，其中很可能包含一定含量的HGF。代表HGF二聚化区域的Hinge肽（KDYIRN）包含在阳性对照中。最近的研究表明，Hinge与HGF的结合具有高亲和性，这阻断了它的二聚化并可作为包括MDCK增殖在内的HGF依赖性细胞活性的有效抑制子（Kawas et al.,2011）。
D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-CONH2类似物改变HGF/Met介导的MDCK细胞的细胞分散：
细胞分散是HGF/Met信号传导的特有效应；该过程特征在于降低细胞黏附性、增加流动性和增加增殖能力。用HGF处理MDCK细胞启动了在两个阶段发生的分散响应。首先，细胞丧失细胞之间的黏附性并开始两极化。其次，它们完全分离，并相互游离出来。可以预计如果6-AH家族成员能够抑制HGF/Met体系，那么它们就能够改变HGF依赖性MDCK细胞分散。
图27A&B表明，那些之前发现的可以阻断HGF二聚化的类似物也是HGF/Met介导分散MDCK细胞的有效抑制子，与此同时那些和HGF亲和性很低的类似物是没有作用的。图28表明了在HGF二聚化和HGF结合亲和性的阻断与防止MDCK细胞分散的能力之间的相关性。
D-Nle-Cys-Ile-NH-（CH2）5-CONH2抑制B16-F10小鼠黑素瘤细胞迁移和肺部集落形成：
为了评估6-AH家族成员潜在的治疗预期效应，我们检测了[D-Nle-Cys-Ile-NH-（CH2）5-CONH2]的能力，该类似物展现出强烈的抑制HGF依赖性Met活化和抑制B16-F10鼠科黑素瘤细胞迁移及肺部集落形成的能力。B16黑素瘤细胞过表达Met（Ferraro et al.,2006），被选中用于这些研究是因为Met信号对于它们的迁移、入侵和转移（metastasis）是非常关键的。在6-AH家族阻断Met依赖性细胞结果的生理性意义的最终测试中，我们评估了D-Nle-Cys-Ile-NH-（CH2）5-CONH2由小鼠尾部静脉注射后抑制B16-F10细胞形成肺部群落的能力。图29a显示了小鼠每天腹膜内注射两次剂量（10ug/kg/天和100μg/kg/天）的[D-Nle-Cys-Ile-NH-（CH2）5-CONH2]所产生的抑制反应。图29b提供了测量在肺部定殖的黑色素含量的定量评估方法，反映了黑色素定殖的含量。这些数据共同表明了用D-Nle-Cys-Ile-NH-（CH2）5-CONH2处理的黑素瘤细胞彻底阻止了肺部定殖，并突出了6-AH类似物作为抗癌因子的效用。
讨论：
研发靶向HGF/Met体系的治疗的兴趣最近在逐渐增长。目前，该兴趣主要是因为意识到HGF/c-Met体系的过度激活是很多病人癌症的普遍特征（Comoglio et al.,2008;Eder et al.,2009）。抗-HGF/Met药物的潜在应用除了它们用作抗癌药以外还有很多。例如，已经识别的HGF/c-Met体系在血管生成调控中的参与（见文献）-支持HGF/Met拮抗剂在控制组织血管生成失调疾病的潜在应用在临床上是非常有益的。这些疾病可能包括眼部的恶性血管疾病，例如糖尿病视网膜病和湿型黄斑变性。在两种情况下，抗血管生成治疗都是目前流行的做法（见文献-Jeganathan,2011）。同样对抗-血管生成药物治疗其他不同的疾病进行了评估，包括肥胖症，其中脂肪组织血管生成为靶标（Daquinag etal.,2011），慢性肝脏疾病（Coulon et al.,2011），和牛皮藓，其中抗血管生成药物在局部涂敷（Canavese et al.,2010）。
目前，制药工厂使用两种基本方法来阻断Met依赖性的细胞活动（Eder et al.,2009;Liu X et al2010）。第一种涉及HGF（Burgess et al.,2006;Stabile et al.,2008）或Met（Martens et al.,2006）的单臂（single-arm）人类抗体的研发。第二种方法利用“激酶抑制剂”，阻断Met活化的胞内结果。这些“激酶”是小的疏水性分子，并在胞内完成ATP与Met激酶区域的结合，因此抑制受体的自磷酸化（.,2002;Christensenet al.,2003;Sattler et al.,2003）。目前在临床试验中，尽管有生物学和激酶抑制剂应用前景，但它们都有不同的缺陷，包括毒性或特异性考虑和/或成本问题（Hansel et al.,2010;Maya,2010）。
第三种方法，我们实验室已经探索用于活化HGF-Met体系活化过程的一步；即在它激活Met之前用于HGF预二聚。因此，我们已经研发了可以模拟二聚化区域，即hinge区域的分子以靶向二聚化过程，因为它们可以起到显性负抑制取代作用。最近的研究已经证实该基本方法表明，根据血管紧张素IV（Yamamoto et al,2010）或hinge序列本身（Kawas et al.,2011）设计的分子可以结合HGF，阻断它的二聚化并减弱HGF依赖性细胞作用。此处所述研究代表了生产有用的靶向HGF二聚化的治疗剂的第一步。本研究的主要目标是提高母体化合物Norleual的药代动力学特征（Yamamoto et al.,2010）同时保持生物学活性。因此，我们已成功合成并评估了一个新分子家族，6-AH家族[D-Nle-X-Ile-NH-（CH2）5-COOH]。这些分子本身不仅具有提高的代谢稳定性和血液循环t1/2值，而且在体内体外都具备极强的活性。
除了对HGF/Met拮抗剂新家族进行表征之外，实施例也表明了在化合物结合HGF和阻断HGF二聚化的能力与体外观察到的活性之间的定性关系。而且，这些研究提供了原始的结构活性数据，并且为更广泛的评估做好了准备。在AngIV分子的N端和C端进行化学修饰，所产生的代谢稳定性的提高突出了外肽酶在AngIV衍生分子代谢中的关键作用。保护末端对于药代动力学特征的重要性表明，众多额外的合成路径可能是可用的，包括在第一和第二个氨基酸之间插入非肽类连接（见Sardinia et al.,1994）、用非氨基酸替换N端氨基酸、和N端酰基化。
总之，这些研究进一步证实了靶向HGF二聚化区域是一种抑制HGF/Met体系的有效途径。进一步地，它们表明可以生产带有良好的药代动力学特征的分子，因此突出体现了它们的临床实用性。
表5.在通过静脉给药成年雄性Sprague-Dawley大鼠后用
Figure BDA0000428053160000733
估计D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2的药代动力学参数。平均值±SEM；n=5.AUC0-∞曲线下方面积。Vd=体积分布。Cp0=血清中原始药物浓度。t1/2=生物半衰期。KE=消除率。CL=清除率。
Figure BDA0000428053160000731
表6.预测的D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2的物理化学特性。
D-Nle-Tyr-Ile-NH-（CH2）5-CONH2的物理化学特性用ADMET 软件建模来估计。LogP是辛醇：水的分配系数。Peff值是估计的人类肠有效渗透系数。Pavg是沿整个人肠道的近似的平均肠道渗透性。PrU1bnd是未与血浆蛋白结合的百分比。
Figure BDA0000428053160000732
Figure BDA0000428053160000741
虽然本发明已经描述了优选的实施方式，但是本领域技术人员可以认识到本发明也可以在本发明精神和所附权利要求范围之内进行修改而实施。相应地，本发明不应该限于上述实施方式，进一步地，本发明还包括此处所述本发明精神范围之内的所有修改和等同替换。
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Figure IDA0000428053250000011
Figure IDA0000428053250000021

Claims (24)

1.一种具有以下通式的肝细胞生长因子（HGF）模拟物：
Figure FDA0000428053150000011
其中
R1为N-酰基、正亮氨酸基和氨基酸中之一，所述氨基酸选自于由酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸和S-苄基半胱氨酸所组成的组；
R2为氨基酸，所述氨基酸选自于由酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸和缬氨酸所组成的组；
R3为异亮氨酸；并且
n的范围是3-6；
并且其中共价键1、2和3选自于由肽键或还原型肽键组成的组。
2.如权利要求1所述的HGF模拟物，其特征在于R1为N-酰基，选自于由己酰基、庚酰基、戊酰基、丁酰基、丙酰基、乙酰基和苯甲酰基所组成的组。
3.如权利要求1所述的HGF模拟物，其特征在于R1为正亮氨酸基和D-正亮氨酸。
4.如权利要求1所述的HGF模拟物，其特征在于R1为氨基酸，所述氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸和S-苄基半胱氨酸。
5.如权利要求1所述的HGF模拟物，其特征在于R2为酪氨酸。
6.如权利要求1所述的HGF模拟物，其特征在于所述HGF模拟物为己酸-酪氨酸-异亮氨酸-（6）-氨基己酰胺。
7.一种治疗组合物，包含：
至少一种具有以下通式的肝细胞生长因子（HGF）模拟物：
其中
R1为N-酰基、正亮氨酸基和氨基酸中之一，所述氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸和S-苄基半胱氨酸；
R2为氨基酸，所述氨基酸选自于由酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸和缬氨酸所组成的组；
R3为异亮氨酸；并且
n的范围是3-6；
并且其中共价键1、2和3选自于由肽键或还原型肽键组成的组；以及
载体，所述HGF模拟物溶解于或分布于所述载体中。
8.如权利要求7所述的治疗组合物，其特征在于进一步包含至少一种与所述至少一种HGF模拟物不同的其他生物活性试剂。
9.如权利要求8所述的治疗组合物，其特征在于所述至少一种其他生物活性试剂选自于由抗抑郁药、精神药物和镇痛药组成的组。
10.一种在有需要的受试者中强化认知功能、或者治疗或防止认知障碍的方法，包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物：
Figure FDA0000428053150000031
其中
R1为N-酰基、取代或非取代苯基、正亮氨酸基和氨基酸中之一，所述氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸和S-苄基半胱氨酸；
R2为氨基酸，所述氨基酸选自于由酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸和缬氨酸所组成的组；
R3为选自异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的氨基酸；并且
n的范围是3-6；
并且其中共价键1、2和3选自于由肽键或还原型肽键组成的组。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于所述给药步骤为在一时间段内实施多次。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于进一步包括下述步骤：在所述时间段内检测所述受试者的认知，并且基于检测结果调整所述HGF模拟物的给药量。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于所述HGF模拟物为己酸-酪氨酸-异亮氨酸-（6）-氨基己酰胺。
14.一种在有需要的受试者中扩展突触连接性和/或引起神经更替的方法，包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物：
Figure FDA0000428053150000032
其中
R1为N-酰基、取代或非取代苯基、正亮氨酸基和氨基酸中之一，所述氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸和S-苄基半胱氨酸；
R2为氨基酸，所述氨基酸选自于由酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸和缬氨酸所组成的组；
R3为选自异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的氨基酸；并且
n的范围是3-6；
并且其中共价键1、2和3选自于由肽键或还原型肽键组成的组。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于在所述受试者患有脊髓损伤之后实施所述给药步骤。
16.一种在有需要的受试者中治疗痴呆的方法，包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物：
Figure FDA0000428053150000041
其中
R1为N-酰基、取代或非取代苯基、正亮氨酸基和氨基酸中之一，所述氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸和S-苄基半胱氨酸；
R2为氨基酸，所述氨基酸选自于由酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸和缬氨酸所组成的组；
R3为选自异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的氨基酸；并且
n的范围是3-6；
并且其中共价键1、2和3选自于由肽键或还原型肽键组成的组。
17.一种在有需要的受试者中提供神经保护或诱导神经再生的方法，包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物：
Figure FDA0000428053150000051
其中
R1为N-酰基、取代或非取代苯基、正亮氨酸基和氨基酸中之一，所述氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸和S-苄基半胱氨酸；
R2为氨基酸，所述氨基酸选自于由酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸和缬氨酸所组成的组；
R3为选自异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的氨基酸；并且
n的范围是3-6；
并且其中共价键1、2和3选自于由肽键或还原型肽键组成的组。
18.一种在具有正常认知能力的个体中提高认知功能的方法，包括向所述受试者给药促进剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物：
Figure FDA0000428053150000052
其中
R1为N-酰基、取代或非取代苯基、正亮氨酸基和氨基酸中之一，所述氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸和S-苄基半胱氨酸；
R2为氨基酸，所述氨基酸选自于由酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸和缬氨酸所组成的组；
R3为选自异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的氨基酸；并且
n的范围是3-6；
并且其中共价键1、2和3选自于由肽键或还原型肽键组成的组。
19.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物：
其中
R1为N-酰基、取代或非取代苯基、正亮氨酸基和氨基酸中之一，所述氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸和S-苄基半胱氨酸；
R2为氨基酸，所述氨基酸选自于由酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸和缬氨酸所组成的组；
R3为选自异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的氨基酸；并且
n的范围是3-6；
并且其中共价键1、2和3选自于由肽键或还原型肽键组成的组。
20.一种在有需要的受试者中治疗糖尿病的方法，包含向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物：
Figure FDA0000428053150000062
其中
R1为N-酰基、取代或非取代苯基、正亮氨酸基和氨基酸中之一，所述氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸和S-苄基半胱氨酸；
R2为氨基酸，所述氨基酸选自于由酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸和缬氨酸所组成的组；
R3为选自异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的氨基酸；并且
n的范围是3-6；
并且其中共价键1、2和3选自于由肽键或还原型肽键组成的组。
21.一种在有需要的受试者中治疗纤维化疾病的方法，所述纤维化疾病包括心肌纤维化、肺纤维化、肾纤维化和肝纤维化，所述方法包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物：
Figure FDA0000428053150000071
其中
R1为N-酰基、取代或非取代苯基、正亮氨酸基和氨基酸中之一，所述氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸和S-苄基半胱氨酸；
R2为氨基酸，所述氨基酸选自于由酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸和缬氨酸所组成的组；
R3为选自异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的氨基酸；并且
n的范围是3-6；
并且其中共价键1、2和3选自于由肽键或还原型肽键组成的组。
22.一种在有需要的受试者中治疗血管功能不全的方法，所述血管功能不全包括深静脉血栓形成和冠状动脉闭塞，所述方法包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物：
Figure FDA0000428053150000081
其中
R1为N-酰基、取代或非取代苯基、正亮氨酸基和氨基酸中之一，所述氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸和S-苄基半胱氨酸；
R2为氨基酸，所述氨基酸选自于由酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸和缬氨酸所组成的组；
R3为选自异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的氨基酸；并且
n的范围是3-6；
并且其中共价键1、2和3选自于由肽键或还原型肽键组成的组。
23.一种在有需要的受试者中促进伤口愈合的方法，包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物：
Figure FDA0000428053150000082
其中
R1为N-酰基、取代或非取代苯基、正亮氨酸基和氨基酸中之一，所述氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸和S-苄基半胱氨酸；
R2为氨基酸，所述氨基酸选自于由酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸和缬氨酸所组成的组；
R3为选自异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的氨基酸；并且
n的范围是3-6；
并且其中共价键1、2和3选自于由肽键或还原型肽键组成的组。
24.一种在有需要的受试者中延缓或逆转疾病中眼部血管过度形成的方法，所述疾病包括糖尿病视网膜病和黄斑变性，所述方法包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物：
Figure FDA0000428053150000091
其中
R1为N-酰基、取代或非取代苯基、正亮氨酸基和氨基酸中之一，所述氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸和S-苄基半胱氨酸；
R2为氨基酸，所述氨基酸选自于由酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸和缬氨酸所组成的组；
R3为选自异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的氨基酸；并且
n的范围是3-6；
并且其中共价键1、2和3选自于由肽键或还原型肽键组成的组。
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