CN106008672A

CN106008672A - 一种基于nk3受体的合成肽nk3r-a2及其应用

Info

Publication number: CN106008672A
Application number: CN201610442178.0A
Authority: CN
Inventors: 陈鲤翔; 陈思伟; 石梁; 王婷; 王成功; 祁元明; 安秀丽; 高艳锋; 李国栋
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2016-06-20
Filing date: 2016-06-20
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2036-06-20
Also published as: CN106008672B

Abstract

本发明属于肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤血管生成作用的基于NK3受体的合成肽NK3R‑A2。该合成肽分子量为：1536.70Da，具体序列为：CNGRCGGDFF(MeF)GLM‑NH₂；该合成肽采用Fmoc固相多肽合成法制备而成；可用于制备抗肿瘤制剂。通过体外细胞活性实验、细胞划痕实验以及细胞迁移实验验证了它的抗血管生成作用，同时通过对其进一步的鸡胚尿囊膜载体实验以及具有丰富血管的小鼠S180移植瘤模型实验验证，发现其对肿瘤的抑制效果明显，具有抗肿瘤血管生成作用，且无明显的毒副作用，具有较好的医疗应用前景，同时也为肿瘤治疗提供了十分具有潜力的靶向序列。

Description

一种基于NK3受体的合成肽NK3R-A2及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤血管生成作用的基于NK3受体的合成肽NK3R-A2。

背景技术

近年来，随着全球经济的飞速发展，临床诊断、手术治疗、化疗和放疗等水平也不断提高，但是传统的肿瘤治疗手段依旧不能缓解随着环境日益严重而给人类带来的健康威胁，尤其是近几十年来癌症患者的数目直线增长，人们急需新的、有效的肿瘤治疗策略和手段。自70年代，Folkman发现肿瘤血管形成因子（TAF）以来，人们对于血管生成有了新的认识，尤其是近10年来，人们就血管生成与肿瘤的发生发展之间的关系进行了大量的研究，发现肿瘤是血管依赖型的恶性细胞，其生长、转移、复发和预防均与肿瘤血管生成密切相关，而抗肿瘤血管生成策略也成为了肿瘤治疗中的研究热点。与传统的治疗方法相比，抗肿瘤血管生成的治疗方法更注重全方面的治疗肿瘤，它通过改变肿瘤微环境，来防止肿瘤的复发和转移。既降低了放/化疗药物的大规模细胞毒性作用，减少损伤正常细胞，又提高了药物的靶向治疗效果，目前普遍认为，抗肿瘤血管生成治疗具有高效、迅速、副作用少、一般不会产生抗药性等优点。

血管生成过程依赖于各个生长因子和信号通路的分泌与调控，因此，针对促血管生成因子的拮抗物质，无论是从多肽药物还是单抗药物都成为了抗肿瘤血管生成的重要研究方向，例如针对血管内皮生长因子（VEGF）的单克隆抗体，其抗肿瘤活性作用已经得到了美国食品药品监督管理局（FDA）的认证。而近几年来的研究发现，神经激肽B（NKB）能够可逆的抑制血管内皮细胞血管网络的形成，它通过与其速激肽家族主要结合受体NK3的结合可以介导消除Ca²⁺振荡，并且增加3’-5’环化腺苷酸（cAMP）的含量从而来减少细胞的增殖、迁移以及血管内皮细胞生长因子受体的表达，并诱导抗血管生成蛋白钙网蛋白的产生。

目前对于NKB及其受体NK3的生物调节机理尽管已有了较多的基础研究，但是仍然处于初步探索阶段，而对于其在抗肿瘤血管生成方面的应用研究尚需进一步地进行深入的探讨研究。

发明内容

本发明基于NK3受体及现有NKB结构研究基础上，提出设计了一种新的合成肽NK3R-A2，该合成肽由甘氨酸柔性连接子将改造后与NK3受体有更高亲和性且具有抗血管生成作用的多肽片段和具有靶向肿瘤血管的氨基肽酶N配体基序连接起来构成。

本发明所采取的技术方案如下所述。

一种基于NK3受体合成肽NK3R-A2，该合成肽由两个功能结构域通过甘氨酸柔性连接子连接构建而成，具体为由甘氨酸柔性连接子将与NK3受体结合的多肽片段和具有靶向肿瘤血管的氨基肽酶N配体基序连接起来构成；：

该合成肽分子量为：1536.70 Da，序列如SEQ ID NO.1所示，具体序列为： Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-Gly-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-NH₂；即：CNGRCGGDFF(MeF)GLM-NH₂或CNGRC-GG-DFF(MeF)GLM-NH₂。

所述基于NK3受体合成肽NK3R-A2，采用Fmoc固相多肽合成法制备而成；具体过程为：

（1）选用Rink树脂与待合成肽C端的第一个Fmoc-氨基酸羧基以共价键形式连接，再以该氨基酸的N端作为该条多肽合成的起点，并让其与下一个氨基酸的羧基端发生脱水缩合反应，形成肽键；

（2）然后，将N端的Fmoc-氨基酸的保护基进行脱保护，再让第二个氨基酸的N端与后面的氨基酸的羧基反应，如此不断重复这一过程直至多肽合成完毕；

（3）最后再将合成的多肽从树脂上切割下来，经过乙醚沉淀与洗涤，得到此粗肽；

（4）经过脱盐处理，RP-HPLC分析纯化，得到本发明所述的基于NK3受体的具有抗血管生成作用的合成肽NK3R-A2，所得合成肽NK3R-A2亦可进一步置于-20℃冻存备用。

所述基于NK3受体的合成肽NK3R-A2，用于抗肿瘤血管生成。

本发明基于现有NK3受体即NKB研究基础上，对现有的NKB多肽序列（Asp-Phe-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH₂）重新进行了设计，通过将其缬氨酸（Val）替换为甲基苯丙氨酸（MePhe），设计了一种新的改造肽，提高了其与NK3受体的亲和性。为进一步加强NKB的抗血管生成作用，降低其细胞毒性作用，发明人又整合进氨基肽酶N配体的可耦联药物并起定位肿瘤血管作用的一段多肽序列（Cys-Asn-Gly-Arg-Cys），通过甘氨酸柔性连接子将两段序列连接后，可较好的保证新的合成肽序列具有一定的自由度，防止发生潜在的空间位阻问题而影响其与相应受体结合而发挥作用。通过对合成肽NK3R-A2进行体外细胞活性实验、细胞划痕实验以及细胞迁移实验验证了它的抗血管生成作用，同时通过对其进一步的鸡胚尿囊膜载体实验以及具有丰富血管的小鼠S180移植瘤模型实验验证，发现其对肿瘤的抑制效果明显，具有抗肿瘤血管生成作用，且无明显的毒副作用，具有较好的医疗应用前景，同时也为肿瘤治疗提供了十分具有潜力的靶向序列。本发明所提供的、新的合成肽序列（NK3R-A2），具有较好的抗肿瘤血管生成作用，表现出了较好的潜在应用价值。

附图说明

图1为NK3R-A2的ESI-MS质谱分析鉴定结果；

图2为NK3R-A2在25μM时，对于HUVECs增殖的影响；

图3为NK3R-A2在25μM时，在细胞划痕实验中对于HUVECs迁移的影响；

图4为NK3受体选择性拮抗剂[Gly⁶]NKB[3-10]在细胞划痕实验中拮抗NK3R-A2抑制作用的情况；

图5为NK3R-A2在细胞迁移实验中对于HUVECs迁移的影响；

图6为NK3受体选择性拮抗剂[Gly6]NKB[3-10]在细胞迁移实验中拮抗NK3R-A2抑制作用的情况；

图7为NK3R-A2在鸡胚尿囊膜实验中的相关结果，其中（a）相对血管密度情况，（b）为相对血管面积情况；

图8为鸡胚尿囊膜（CAM）载体实验情况，其中（a）为受体选择性拮抗剂[Gly⁶]NKB[3-10] 拮抗NK3R-A2时血管密度对比情况，（b）为受体选择性拮抗剂[Gly⁶]NKB[3-10] 拮抗NK3R-A2时血管面积对比情况；

图9 为NK3R-A2对荷S180的BABL/c小鼠体重变化的影响结果图；

图10 为NK3R-A2对荷S180的BABL/c小鼠移植瘤体积变化的影响结果图；

图11为NK3R-A2对荷S180的BABL/c小鼠的移植瘤瘤重的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细介绍，但在介绍具体实施例前，首先对本发明中所用到部分实验试剂及实验设备等情况简要介绍如下。

生物材料：

S180细胞（鼠肉瘤细胞）、HUVECs（人脐静脉内皮细胞），购买于ATCC（American Type Culture Collection）；

白兰鸡鸡胚，购买于郑州市某市场；

SPF级5~8周龄BALB/c雌鼠（50只），购买于河南省实验动物中心；

实验试剂：

Fmoc多肽固相合成的Rink树脂、Fmoc保护的L型氨基酸，为吉尔生化（上海）有限公司产品；

Fmoc多肽固相合成中的洗涤试剂、1-羟基苯并三唑（HOBt）、N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇（MeOH）、二氯甲烷（DCM）、茚三酮、六氢吡啶、哌啶、醋酸酐、三氟乙酸（TFA）、乙腈等，自天津市风船化学试剂科技有限公司；

RPMI-1640培养基，为北京Solarbio公司产品；

磷酸盐缓冲液（PBS）配置相关试剂，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；

FBS（胎牛血清），购自杭州四季青生物有限公司；

MTT（噻唑蓝），为美国Amresco公司产品；

实验设备：

多肽合成仪，江苏通州市南兴申海玻仪厂；

旋转蒸发器RE-52，上海亚荣生化仪器厂；

RP-HPLC分析仪，日本岛津公司；

酶联免疫检测仪，MD公司；

倒置显微镜AE2000，Olympus公司；

NIS ELEMENT 2.20生物图像处理系统，Nikon。

实施例 1

本发明所提供的合成肽NK3R-A2，分子量为：1536.70Da；具体序列为 Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-Gly-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-NH₂；或者简写为： CNGRC-GG-DFF(MeF)GLM-NH₂。该合成肽通过Fmoc固相多肽合成法制备而成；以某次合成0.2495克的合成肽NK3R-A2为例，具体制备步骤详细介绍如下。

（1）称取0.3gRink树脂放入DMF润洗过的多肽合成仪中，然后加入4mLDMF，静置30min，使树脂充分溶胀，然后用真空泵抽去DMF；脱保护两次：

所述脱保护是指在合成仪中加入4mL脱保护液（哌啶与DMF的体积比为1:3），25℃~28℃下搅拌反应20min，真空泵抽干；

（2）将步骤（1）中脱保护后的树脂按以下顺序及次数进行洗涤，DMF两次→MeOH三次→DCM三次→DMF两次，摇床中震荡洗涤，每次洗涤两分钟，洗涤结束时用真空泵将液体抽干；

（3）第一个氨基酸的添加：按公式1称取甲硫氨酸、HoBt及DIC对应的量，分别为278.625mg、101.3475mg、94.65μL，先用4 mL DMF溶解甲硫氨酸和HoBt加入合成仪中，然后直接在合成仪中加入DIC，25℃~28℃下搅拌反应 2.5h；

所述公式1为：氨基酸的质量=该氨基酸的相对分子质量×2.5（当量）×树脂的质量；

然后洗涤，洗涤方法同步骤（2）中的洗涤要求，洗涤结束时用真空泵将液体抽干；

用分光光度计测定波长为290nm处树脂和第一个氨基酸的吸光度OD，根据公式计算取代值，加封头液封头两次，每次20min，在摇床中震荡，然后洗涤，洗涤方法同步骤（2）中的洗涤要求；

取代值计算公示为：取代值=OD/（1.65×m_树酯），m_树酯为树脂的质量；

（4）第二个氨基酸即亮氨酸的添加：合成时是从C端到N端方向进行，对步骤（3）中第一个氨基酸添加后树脂脱保护两次，方法及步骤同步骤（1）中的脱保护；

然后洗涤，洗涤方法及步骤同步骤（2）中洗涤；

然后挑取树脂茚检呈蓝色时，按公式2称取第二个氨基酸亮氨酸、HoBt、DIC对应的量，分别为196.137mg、74.99715mg、70.041μL，先用4 mL DMF溶解亮氨酸和HoBt加入合成仪中，然后直接在合成仪中加入DIC，25℃~28℃下搅拌反应 2.5h；

反应结束后按步骤（2）的方法洗涤树脂，洗涤结束后挑取树脂茚检呈无色；

所述公式2为：氨基酸的量=该氨基酸的相对分子质量（此处为亮氨酸）×2.5×树脂的质量（此处为0.3）×取代值（此处为步骤（3）中取代值计算结果）；

（5）后续氨基酸的添加：后续氨基酸的添加方法同第二个氨基酸的添加过程，直至加完所有氨基酸；其中茚检样品时，显色要求有所调整，茚检时，若前一个氨基酸是脯氨酸、丝氨酸和组氨酸时则茚检呈红棕色；

（6）切割多肽：从树酯上切割多肽，首先按步骤（1）中的脱保护方法进行两次；洗涤（同步骤（2））；然后进行切割；

所述切割为，将切割试剂加入合成仪中，搅拌柱搅拌三小时，然后将合成仪中的液体抽入球形烧瓶中，并用DCM冲洗3遍；

把球形烧瓶装在旋转蒸发仪上蒸发1小时；

在旋转蒸发后加2mL TFA冰切30min；

在球形烧瓶中加入乙醚再蒸发4~6次，最后加入冰乙醚在冰上静置30min，白色沉淀即为析出的粗肽；

将含粗肽的乙醚溶液2000rpm离心2min，得粗肽沉淀，把粗肽在37℃烘箱中烘干（烘干约需3h）；

需要强调的是，所述切割试剂需现配现用，其具体组成配比为：三蒸水0.3mL、苯甲硫醚0.3mL、1,2-二硫醇0.15mL、苯酚0.3mL、三氟乙酸TFA 4.95mL；

（7）粗肽纯化：利用RP-HPLC纯化粗肽，纯化体系为：乙腈，1‰；TFA=25%~50%；流速5min/mL，检测波长是228nm；

纯化后所得精肽即为本发明所述靶向基于NK3受体的合成肽NK3R-A2，纯度检测表明，纯化后后其纯度大于95%，可于-20℃保存备用。

对纯化后的基于NK3受体的合成肽NK3R-A2进行ESI-MS质谱鉴定，结果如图1。从图1中可以看出，所制备的合成肽NK3R-A2的分子量符合预期。

实施例 2

对于实施例1所制备的合成肽NK3R-A2，发明人对其抗肿瘤血管生成作用进行了具体的实验验证，相关实验简要介绍如下。

一、 体外抗血管生成作用验证

1 、细胞增殖检测实验

利用MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐）细胞增殖实验，对合成肽NK3R-A2对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的增殖影响进行评价，相关实验过程如下所述。

（1）将HUVECs以2×10⁴个/mL的细胞密度，以200μL/孔的体积接种到96孔板中；

（2）24小时后，待细胞贴壁良好，用无血清RPMI 1640培养基对其进行饥饿处理，使细胞周期处于G0/G1期；

（3）饥饿处理后，合成肽NK3R-A2分别以100μM、25μM、5μM的浓度梯度分组，每组5个复孔，共6组实验组，同时，以无血清RPMI 1640培养基为阴性对照组，环磷酰胺（7.5mg/mL）为阳性对照组对HUVECs药物处理4小时；

（4）4小时后，每孔补加20μL血清，再分别培养24小时、48小时和72小时，到相应时间点后取样，用酶标仪（酶联免疫检测仪）在490nm处测其OD值；

实验期间，HUVECs在37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养，每日观察细胞生长状况，每次检测后，绘制相应OD值柱状图。

需要注意的是，NK3R-A2使用时，先溶于无血清RPMI 1640培养基中制成多肽药物，过滤除菌后直接使用，或者过滤除菌后-20℃分装保存，备用；环磷酰胺用无血清RPMI 1640培养基溶解到所用剂量后直接使用。

实验结果如图2所示。从图2可以看出，25μM 浓度的合成肽NK3R-A2并没有明显抑制HUVECs的增殖。

在进行MTT细胞增殖检测实验后，发明人认为合成肽NK3R-A2并没有明显抑制HUVECs的增殖，而阳性对照环磷酰胺组相较于阴性对照组有极其显著的差异（***p<0.001），所以发明人为进一步检测上述多肽的抗血管生成作用，进行了细胞划痕实验和细胞迁移实验，来检测NK3R-A2对于HUVECs迁移情况的影响。

2 、细胞划痕实验和竞争性实验

由于合成肽NK3R-A2并没有明显抑制HUVECs的增殖，为此我们进一步进行了细胞划痕实验，以检测NK3R-A2对于HUVECs迁移情况的影响，过程简要介绍如下。

（1）将HUVECs以1×10⁵个/mL的细胞密度接种于24孔板中，待细胞铺板率达到90%以上后，用200μL枪头轻轻地沿着标记进行划痕；

（2）随后，用PBS将划去的细胞清洗干净，和MTT细胞增殖检测实验一样，将NK3R-A2分别以3个不同浓度（100μM、25μM、5μM）加入每个复孔中，每个浓度为一个实验组，每组3个复孔，同时，以无血清RPMI 1640培养基为阴性对照组；

实验期间，HUVECs在37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养。

对HUVECs进行药物处理24小时，期间每隔6小时在倒置显微镜下以40×的放大倍数进行观察拍照记录，并按照下述公式计算各个时间段的划痕愈合程度并绘制柱状图；

计算公式：[1-（6小时－24小时的相对区域/0小时的相对区域）]×100%。

实验结果如图3所示。从图中可以看出，合成肽NK3R-A2有抑制HUVECs迁移的作用，处理24小时后，阴性对照组的“伤口”愈合程度是合成肽NK3R-A2的25μM组“伤口”愈合程度的的3.7倍，有差异（*p<0.05），说明实验组HUVECs的迁移速度慢于阴性对照组，NK3R-A2对于HUVECs的迁移有很好的抑制效果。

在上述实验基础上，发明人做了进一步的竞争性实验：以NK3受体的选择性拮抗剂[Gly⁶]NKB[3-10]（50μM）来拮抗NK3R-A2，从而进一步验证合成肽NK3R-A2对于HUVECs的抑制迁移的作用，过程简要介绍如下。

（1）将HUVECs以1×10⁵个/mL的细胞密度接种于24孔板中；

（2）待细胞铺板率达到90%以上后，用200μL枪头轻轻地沿着标记进行划痕，随后，用PBS将划去的细胞清洗干净；

（3）由于在上述细胞划痕实验中，25μM实验组和其他浓度实验组相比体现出了最好的抑制效果，所以在竞争性实验中，发明人选择了此浓度作为最佳抑制浓度进行实验，并且，为了保证NK3受体选择性拮抗剂[Gly⁶]NKB[3-10]的拮抗作用，先用拮抗剂处理细胞1小时；

（4）1小时后，吸出旧培养基，PBS冲洗一遍，再用25μM的NK3R-A2处理细胞24小时，每隔6小时在倒置显微镜下以40×的放大倍数进行观察拍照记录，并按照下述公式计算各个时间段的划痕愈合程度并绘制柱状图；

实验期间，HUVECs在37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养。

实验结果如图4所示。从图4中可以看出，处理24小时后，NK3受体选择性拮抗剂[Gly⁶]NKB[3-10]处理组的“伤口”愈合程度，与单独用25μM的NK3R-A2处理组的“伤口”愈合程度相比，有着极其显著的差异（***p<0.001），而与阴性对照组的“伤口”愈合程度几乎保持一致，说明NK3受体选择性拮抗剂[Gly⁶]NKB[3-10]可以拮抗NK3R-A2的抑制HUVECs迁移的作用。这一结果初步印证了这条多肽的作用机理。

3 、细胞迁移实验和竞争性实验

为进一步验证NK3R-A2抑制HUVECs迁移的作用，发明人以8.0μm 的Transwell小室进行了实验（BD公司），实验过程简介如下。

（1）HUVECs依次先后经过无血清RPMI 1640培养基饥饿处理12小时，不同药物浓度（100μM、25μM、5μM）的NK3R-A2处理12小时，无血清培养基处理后，收集细胞并用无血清培养基进行重悬；

（2）以1.5×10⁵个/mL的细胞密度接种于Transwell上室中，每孔200μL，下室加入750μL含10%FBS的RPMI 1640培养基，放入37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养12小时；

（3）培养结束后，将旧的培养基吸出，用PBS清洗2遍；

（4）用3.8%的多聚甲醛固定细胞20min；到时间后，用PBS清洗2遍；

（5）用0.2%的结晶紫染色15min；到时间后，用PBS清洗5遍；

（6）清洗干净后，向每孔加入适量的超纯水，放到倒置显微镜下以40×的放大倍数进行观察拍照计数并绘制柱状图。

实验结果如图5所示。从图5中可以看出，NK3R-A2有抑制HUVECs迁移的作用，合成肽NK3R-A2在5μM时迁移的HUVECs的细胞数是阴性对照组的九分之一，具有极其显著的差异（***p<0.001），再一次说明了它有抑制HUVECs迁移的能力。

和细胞划痕实验一样，我们也做了细胞迁移实验的竞争性实验，依旧运用NK3受体拮抗剂[Gly⁶]NKB[3-10]（10μM）拮抗NK3R-A2的抑制作用，证明它的作用机理。过程简要介绍如下。

（1）HUVECs依次先后经过无血清RPMI 1640培养基饥饿处理12小时，为保证NK3受体选择性拮抗剂[Gly⁶]NKB[3-10]的拮抗作用，先用拮抗剂处理细胞1个小时；

（2）1小时后，用上述细胞迁移实验中的最佳抑制浓度5μM的NK3R-A2再处理细胞12小时，无血清培养基处理后，收集细胞并用无血清培养基进行重悬；

（3）以1.5×10⁵个/mL的细胞密度接种于Transwell上室中，每孔200μL，下室加入750μL含10%FBS的RPMI 1640培养基，放入37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养12小时；

（4）培养结束后，将旧的培养基吸出，用PBS清洗2遍；

（5）用3.8%的多聚甲醛固定细胞20min；到时间后，用PBS清洗2遍；

（6）用0.2%的结晶紫染色15min；到时间后，用PBS清洗5遍；

（7）清洗干净后，向每孔加入适量的超纯水，放到倒置显微镜下以40×的放大倍数进行观察拍照计数并绘制柱状图。

实验结果如图6所示。从图6中可以看出，在用NK3受体选择性拮抗剂[Gly⁶]NKB[3-10]处理细胞1小时后，即使用5μM的NK3R-A2进行了处理，但和单独的用5μM的NK3R-A2的处理组相比，仍有极其显著的差异（***p<0.001），其发生迁移的细胞数量有大幅度的增加，说明NK3受体选择性拮抗剂[Gly⁶]NKB[3-10]可以拮抗NK3R-A2的抑制HUVECs迁移的作用。

综合上述体外实验结果，可以看出，NK3R-A2作为一种基于NK3受体的合成肽，可以通过与NK3受体的高亲和作用结合，从而发挥抗血管生成作用，MTT细胞增殖实验表明，其对于HUVECs的增殖并没有明显的抑制作用，而细胞划痕实验和细胞迁移实验的结果显示，合成肽NK3R-A2对于HUVECs的迁移有着明显的抑制作用。HUVECs是体外血管内皮细胞实验模型中通常选用的经典细胞系，基于NK3受体的合成肽NK3R-A2对其的迁移抑制作用，可以在体外证明NK3R-A2的抗血管生成作用。

二、载体实验对合成肽 NK3R-A2 的抗血管生成作用的验证

发明人采用鸡胚尿囊膜（CAM）载体实验对合成肽NK3R-A2的抗血管生成作用进行了更加直观的验证，相关实验过程简要介绍如下。

（1）鸡胚使用速黄鸡胚，保持37℃的孵化温度和55%的相对湿度，每小时翻转鸡蛋一次，到孵化的第7天在鸡胚的头部附近小心的开一1~2cm的小窗，然后用消过毒的玻璃片封闭窗口；

（2）在第8天，把一个直径为6mm，厚度为1mm的无菌硅胶环放置在鸡头下方无血管区域；

（3）合成肽NK3R-A2分别以100nM、10nM、1nM的浓度梯度分组，将30μL相应浓度药物加入到步骤2中先前放入的硅胶环中心，并在第10天对其拍照；以PBS处理作为阴性对照组。

解剖并拍照记录，并使用生物图像处理软件进行图像处理（NIS-Elements Basic Research，尼康，日本），并按下述公式统计鸡胚尿囊膜加药区域的微血管数和微血管面积（只计算100μm以下的血管），公式如下：

[加药鸡胚血管数/空白对照鸡胚血管数]×100%=%相对血管密度；

[加药鸡胚血管面积/空白鸡胚血管面积] ×100%=%相对血管面积。

实验结果如图7所示。从图中可以看出，NK3R-A2具有抗血管生成作用。与阴性对照组相比，100nM NK3R-A2实验组具有显著差异（**p<0.01），NK3R-A2最高可减少微血管密度到59.9%，血管面积到58.1%。这些结果均说明了上述多肽有很好的抗血管生成效果。

和体外实验一样，发明人也做了载体实验的竞争性实验，依旧运用NK3受体拮抗剂[Gly⁶]NKB[3-10]（1μM）拮抗NK3R-A2的抗血管生成作用，验证它的作用机理。简要步骤如下。

（3）为保证NK3受体选择性拮抗剂[Gly⁶]NKB[3-10]的拮抗作用，先用30μL 1μM的拮抗剂处理细胞1个小时，随后，用上述载体实验中的最佳抑制浓度30μL 100nM的NK3R-A2再加入到步骤2中先前放入的硅胶环中心，并在第10天对其拍照；以PBS处理作为阴性对照组。

解剖并拍照记录，参考上述计算方式统计统计鸡胚尿囊膜加药区域的微血管数和微血管面积。

实验结果如图8所示。从图中可以看出，合成肽NK3R-A2的抗血管生成作用能够被NK3受体选择性拮抗剂[Gly⁶]NKB[3-10]所抑制。100nM的NK3R-A2实验组和拮抗组相比具有显著差异（**p<0.01）。和阴性对照组相比，联合使用拮抗剂和NK3R-A2实验组的相对血管密度和血管面积分别增加到了113.5%和109.5%。再一次在载体实验中证明了NK3R-A2的作用机理。

CAM载体实验结果表明，NK3R-A2作为一种基于NK3受体的合成肽，可以通过和NK3受体的相互作用而发挥抗血管生成作用。CAM是研究抗血管生成最广泛使用的载体实验模型，它的二维空间血管结构使其无需特别的准备便能观察微血管结构变化，因而成为一个测试促血管或抗血管生成药物公认的试验器官，基于NK3受体的合成肽NK3R-A2对其的迁移抑制作用，可以在载体上证明NK3R-A2的抗血管生成作用。

三、合成肽 NK3R-A2 的抗肿瘤活性的体内实验验证

为进一步检验合成肽NK3R-A2的抗肿瘤活性，发明人以实施例1制备的合成肽NK3R-A2进一步做了抗肿瘤相关实验，具体实验情况如下。

抑瘤率实验

实验过程如下：

（1）于每只小鼠的右前肢腋下荷1×10⁷个瘤细胞，待小鼠的瘤体积达到50~100mm³时按瘤体积随机分组，分为4组，分别为NK3R-A2高剂量组、NK3R-A2低剂量组、环磷酰胺组（阳性对照组）和生理盐水组（阴性对照组），每组5只。

所述高剂量是指将合成肽NK3R-A2直接溶于生理盐水配成0.1mg/mL的溶液，按1mL/Kg注射用量注射；

所述低剂量是指将NK3R-A2直接溶于生理盐水配成0.02mg/mL的溶液，按1mL/Kg（即1000µg/Kg）注射用量注射；

环磷酰胺直接溶于生理盐水配成2.5mg/mL的溶液，按0.2mL/Kg（即200µg/Kg）注射用量注射；

需要注意的是，将合成肽NK3R-A2（或环磷酰胺）溶于生理盐水后，需过滤除菌，为使用方便期间，可过滤除菌后分装后-20℃保存备用；

（2）尾静脉给药的方式注射，共给药14天；各组每天上午给药；实验期间小鼠自由进食和饮水；

（3）实验期间每日测量小鼠体重并记录，绘制曲线，以评价合成肽NK3R-A2的毒副作用；同时每日测量肿瘤的长（a）短（b）径，并按公式（计算公示为：V=1/2×(a×b²)）计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线；给药结束的第二天将小鼠脱颈处死取出肿瘤并称重。

小鼠体重变化曲线如图9所示，小鼠肿瘤体积变化曲线如图10所示，小鼠瘤重情况如图11所示。

从图9中可以看出，合成肽NK3R-A2给药组的体重变化在正常范围内，表明该合成肽没有明显的毒副作用，对比阳性对照环磷酰胺组，小鼠的体重并没有随时间的增长而增加，说明其具有一定的毒副作用。从图10、图11我们可知，合成肽NK3R-A2给药组的瘤体积和瘤重比阴性对照即生理盐水组都要小，具有显著差异（**p<0.01），且浓度越高，效果越好，因此可以认为合成肽NK3R-A2具有较好地抗肿瘤效果。

现有技术中，环磷酰胺作为一种广谱性的细胞周期非特异性抗癌药物，可用于多种类型肿瘤的治疗，但由于其不具备靶向特定肿瘤细胞的功能，因而长期使用时存在较大毒副作用的潜在危险。本发明所提供的合成肽NK3R-A2，由于包含有氨基肽酶N配体序列，而该序列具有特定靶向肿瘤细胞的功能（Arap W. et.al.，Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model，Science，1998，279：377–380），因而使得合成肽NK3R-A2能够明显降低非特异性（非靶向性）抗癌药物所带来的毒副作用风险，因而使得合成肽NK3R-A2的具有较好地推广应用前景。

现有研究表明，神经激肽B（NKB）可以和其速激肽家族受体结合发挥抗血管生成作用，并且这种作用首先是NKB通过与速激肽受体家族成员NK3受体的结合而发挥出来的（Pennefather JN，et.al.，Tachykinins and tachykinin receptors：a growing family，Life Sci.，2004，74(12)：1445-1463）。通过将NKB第7号氨基酸缬氨酸（Val）替换为甲基苯丙氨酸（MePhe），得到了与NK3受体高亲和的改造肽，研究发现，其也具有十分良好的抗血管生成作用。但是，由于NKB作为一种神经递质，在生物体内广泛表达，直接用于肿瘤治疗，会产生比较大的毒副作用。

在避免可能存在的空间位阻的设计原则基础上，本发明通过甘氨酸柔性连接子将基于NKB的改造肽与氨基肽酶N配体基序列（Cys-Asn-Gly-Arg-Cys）连接，构建了新的合成肽NK3R-A2，而新的合成肽NK3R-A2可较为充分利用氨基肽酶N配体基序靶向肿瘤血管的功能，将NKB的改造序列定位在肿瘤血管附近，从而减少NKB潜在的毒副作用并提高其作用效果。而一系列的体外细胞实验和体内载瘤实验，均证明了新的合成肽NK3R-A2具有较好的抗肿瘤血管生成作用和抑制肿瘤作用，加上多肽类试剂的无毒副作用及较为成熟的制备方法，使得本发明在肿瘤预防与治疗应用中具有较好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学

<120> 一种基于NK3受体的合成肽NK3R-A2及其应用

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 基于NK3受体合成肽

<400> 1

Cys Asn Gly Arg Cys Gly Gly Asp Phe Phe Phe Gly Leu Met

1 5 10

Claims

1.一种基于NK3受体合成肽NK3R-A2，其特征在于，该合成肽分子量为：1536.70 Da，序列如SEQ ID NO.1所示，其中第11位氨基酸为甲基化修饰的苯丙氨酸；该合成肽的具体氨基酸序列为：Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-Gly-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-NH₂；即：CNGRCGGDFF(MeF)GLM-NH₂。

2.权利要求1所述基于NK3受体合成肽NK3R-A2的制备方法，其特征在于，采用Fmoc固相多肽合成法制备而成。

3.权利要求1所述基于NK3受体的合成肽NK3R-A2在制备抗肿瘤制剂中的应用。