CN103333227B - 转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽抑制剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽、其衍生物或其盐，还提供了该转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽、其衍生物或其盐的制备方法以及在制备抗肿瘤药物中的应用。转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽分子量低、稳定性高、毒性很小，并能够通过细胞膜进入细胞，通过抑制Mtss1蛋白二聚化作用，在胞内抑制肿瘤细胞内摄、干扰细胞膜形态变化以及干扰肿瘤相关信号传导，削弱了由表皮生长因子EGF、血小板衍生因子PDGF或刺猬因子shh等肿瘤刺激因素引发的细胞增殖和生长，其中抑制剂-蛋白的体外抑制活性在纳摩尔级，不需转染或脂质体包裹直接加入细胞培养液中即能显著抑制肿瘤细胞内吞作用。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域，特别涉及转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽抑制剂，还涉及该转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽化合物的制备方法及应用。
背景技术
蛋白是决定生物体生存、衰老、疾病和死亡的关键功能构件。但是，蛋白在医药、科研和工业过程中的应用受到其复杂性、高成本、化学稳定性差和低生物利用度的限制。这就需要新的化学技术，以得到更简单、更小、更廉价、更稳定和具有生物相容性的分子，能够选择性、特异性和准确性的完成蛋白所具有的功能。在合成过程中如果能够将分子构象精确地模拟为蛋白质的最小构成单元（例如螺旋、回转、链和组合），则能够在医药、诊断、疫苗和纳米材料领域带来广泛的应用[Chakravorty,D.,et al.(2013)MedChem Res22,(4),2038-2049.]。许多蛋白通过自身简单的α螺旋片段（通常为包含4-15个氨基酸的1-4个α螺旋）与核酸或其他蛋白发生作用[Pal,L.,et al.(2003)J Mol Biol326,(1),273-291.]。然而，这种长度的短链合成多肽在水溶液中通常不是热动力稳定性的螺旋结构，容易形成随机的构象[Scholtz,J.M.;Baldwin,R.L.(1992)Annu Rev Bioph Biom21,95-118.]。一些技术能够实现建立或模仿短肽α螺旋，但是由于在水溶液中难以形成螺旋结构，或过分依赖特定序列以及其他苛刻条件，或生物活性低，或特异的靶向性弱，都给应用带来限制[Chapman,R.N.,et al.(2004)J Am Chem Soc126,(39),12252-12253.]。
BAR（Bin-Amphiphysin-Rvs）家族蛋白在结构上包含有一个高度保守的N端结构域，往往会形成具有典型特征的二聚体结构，参与细胞膜的运动过程[McMahon,H.T.;Gallop,J.L.(2005)Nature438,(7068),590-6.]。BAR超家族蛋白中，包括称作inverse BAR(I-BAR)的亚族，其N段结构域的二聚体外形类似扭曲的椭球，并通过其凸面结合细胞膜。其他的I-BAR蛋白还包括胰岛素受体酪氨酸激酶底物p53(IRSp53)、含BAIAP2同源区的actin结合蛋白(ABBA)、胰岛素受体酪氨酸激酶底物(IRTKS),平面化的肠道和肾脏专有BAR(PINKBAR)。Mtss1(Metastasis suppressor1，Missing in metastasis，MIM orBEG4)是I-BAR中的典型，是家族命名蛋白之一，同时也是重要的Hedgehog通路响应基因[Callahan,C.A.,et al.(2004)Gene Dev18,(22),2724-2729.]，该基因在基底细胞癌细胞中发生富集，在Shh信号刺激下激活，并且可能促进Gli的转录，同时对纤毛轴的形成和维持有重要作用，调控cilium的发生，除此之外，最初还被认为是首个转移肿瘤抑制基因[Lee,Y.G.,et al.(2002)Neoplasia4,(4),291-294.]。研究发现Mtss1蛋白参与包括细胞迁移，细胞极化，丝状伪足形成，细胞内吞，刺激相应和细胞间相互作用等细胞过程[Yu,D.,et al.(2012)Oncogene31,(30),3561-3568.]，因此Mtss1蛋白的生物化学研究是近年来分子生物学研究的热点。
Mtss1蛋白N端的I-BAR结构域由250个氨基酸构成，对蛋白功能的发挥起到关键作用。研究表明，Mtss1I-BAR能够结合富含PI(4,5)P2磷脂的人工膜，并通过结合在膜的内侧而引起膜突起的管道状结构[Mattila,P.K.,et al.(2007)J Cell Biol176,(7),953-64.]。此外，Mtss1I-BAR能与小GTP酶Rac相互作用[Bompard,G.,et al.(2005)J CellSci118,(22),5393-5403.]，结合细胞膜[Lee,S.H.,et al.(2007)Structure15,(2),145-155.]并交联actin蛋白微丝[Yamagishi,A.,et al.(2004)J Biol Chem279,(15),14929-14936.]。在结构上，Mtss1I-BAR区折叠形成3个扭曲超螺旋，通过细胞间相互作用，以超螺旋中的特定位点紧密结合，形成同源二聚体，而结合位点主要由α螺旋组成。Mtss1I-BAR二聚体接触面作用区域，其结构上的α螺旋有可能具有特异性结合Mtss1蛋白相关区域，阻断二聚体形成的能力。但是短肽很难得到理想的抑制效果，因为短的氨基酸序列在水溶液中很难形成具有活性的理想构象[Scholtz,J.M.;Baldwin,R.L.(1992)Annu RevBioph Biom21,95-118.]。若将接触面处的氨基酸残基整体作为多肽来进行竞争性结合，则该多肽的分子量相对于药物设计来说将有些偏大，用于体内实验将遇到很多局限，例如难以保证在细胞生长环境下的稳定性，以及难以穿过细胞膜以被细胞吸收等。近期Harrison等[Harrison,R.S.,et al.(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107,(26),11686-11691.]发现了一种将肽链简短的方法，实现了比较好的模拟短肽螺旋，在水中能够保持很好的稳定性。这种方法主要通过赖氨酸和天冬氨酸内酰胺键桥接的方法，来保持短肽的α螺旋结构，即使用K---D的结构以内酰胺桥相连接，将氨基酸的构象束缚住，制备了一系列转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽和对应的直链对照肽。利用圆二色性分析和核磁共振检测转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽在水溶液中的构象，结合NMR衍生的溶液结构和生物活性研究，发现不论是水溶液中的构象还是生物活性，经构象约束的转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽均远远好于其对应的直链对照肽。其他一些固定多肽结构的方法也有报道。一种典型的方法与内酰胺桥法类似，称为“装订”法，即使用共价键将一个化学桥接连在临近的螺旋回转部位，可以通过降低相互作用熵损失而提高多肽的亲和力，增加结构稳定性以提高体内半衰期，最重要的是能够利于细胞的吸收[Walensky,L.D.,et al.(2004)Science305,(5689),1466-1470.]。例如近期Brown等[Brown,C.J.,et al.(2012)ACS Chem Biol.]利用多肽“装订”技术，制备了模仿p53蛋白N端反式激活结构域的一系列多肽衍生物sMTide，以抑制Mdm2/Mdm4，得到了一系列MTide-02/02A多肽，能够透过细胞膜进入细胞，具有很好的效果。这些研究给小分子Mtss1抑制剂的设计带来了启发。本发明的目的，是结合上述原理并根据Mtss1蛋白二聚体自身的结构性质，按照尽可能模拟二聚体接触面处关键α螺旋的设计原则，得到一系列小分子转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽Mtss1抑制剂。
在生物化学研究和体内药物治疗领域，小分子的Mtss1抑制剂都将会有相对更广泛的应用空间。小分子化合物可以解决稳定性和细胞吸收能力的问题。在随机的细胞培养和处理以及动物实验等方面，小分子的抑制剂将更有优势。因此，分子量更小、稳定性好、活性较高，而且能够被细胞直接吸收的Mtss1蛋白二聚化抑制剂，具有很高的应用价值和开发意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供分子量小、稳定性好、能被细胞吸收并有效抑制Mtss1蛋白二聚化作用的转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽化合物、其衍生物或其盐，以及上述转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽的制备方法。
技术方案：本发明提供的转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽抑制剂，式（I）的转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽：
R1-cyclo(AA1-AA2-AA3-AA4-AA5)-AA6-AA7-R2（I）
其中
AA1和AA5分别为Lys和Asp，或分别为Asp和Lys；
AA2、AA3、AA4和AA6分别独立地为天然或非天然氨基酸；
AA7不存在，或者为Ala或Phe；
R1不存在，或为乙酰基，或为异硫氰酸荧光素，或为胺己酸间隔结构(NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)连接的异硫氰酸荧光素；
R2不存在或为氨基。
优选地，式（I）的转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽，其中，AA2为Ala、Phe、Gln、Val、Lys、Met、Ile、Gly、Ser、Leu、Trp、Glu、Asn、Arg或His。
优选地，式（I）的转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽，其中，AA3为Ala、Phe、Gln、Val、Lys、Met、Ile、Gly、Ser、Leu、Trp、Glu、Asn、Arg或His。
优选地，式（I）的转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽，其中，AA4为Ala、Phe、Gln、Val、Lys、Met、Ile、Gly、Ser、Leu、Trp、Glu、Asn、Arg或His。
优选地，式（I）的转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽，其中，AA6为Ala、Phe、Gln、Val、Lys、Met、Ile、Gly、Ser、Leu、Trp、Glu、Asn、Arg或His。
式（I）的转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽，所述转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽分子内由AA1Lys的epsilon氨基与AA5Asp的侧链羧基之间的内酰胺键连接成环，或由AA5Lys的epsilon氨基与AA1Asp的侧链羧基之间的内酰胺键连接成环。
优选地，式（I）的转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽，其选自下列4个序列的化合物：
H2N-cyclo(Asp-Ala-Phe-Gln-Lys)-Val-OH 序列1；
H2N-cyclo(Lys-Lys-Val-Ala-Asp)-Met-Ala-OH 序列2；
H2N-cyclo(Lys-Ile-Gly-Ser-Asp)-Leu-OH 序列3；
H2N-cyclo(Lys-Arg-His-Arg-Asp)-Ile-OH 序列4；
其结构式分别为如式（II）、（III）、（IV）和（V）所示：
式（I）的转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽的衍生物，包括
Ac-cyclo(Asp-Ala-Phe-Gln-Lys)-Val-NH2；
Ac-cyclo(Lys-Lys-Val-Ala-Asp)-Met-Ala-NH2；
Ac-cyclo(Lys-Ile-Gly-Ser-Asp)-Leu-NH2；
Ac-cyclo(Lys-Arg-His-Arg-Asp)-Ile-NH2；
FITC-cyclo(Asp-Ala-Phe-Gln-Lys)-Val-NH2；
FITC-cyclo(Lys-Lys-Val-Ala-Asp)-Met-Ala-NH2；
FITC-cyclo(Lys-Ile-Gly-Ser-Asp)-Leu-NH2；
FITC-cyclo(Lys-Arg-His-Arg-Asp)-Ile-NH2；
FITC-NH-(CH2)5-CO-cyclo(Asp-Ala-Phe-Gln-Lys)-Val-NH2；
FITC-NH-(CH2)5-CO-cyclo(Lys-Lys-Val-Ala-Asp)-Met-Ala-NH2；
FITC-NH-(CH2)5-CO-cyclo(Lys-Ile-Gly-Ser-Asp)-Leu-NH2；
FITC-NH-(CH2)5-CO-cyclo(Lys-Arg-His-Arg-Asp)-Ile-NH2；
H2N-cyclo(Lys-Ile-Ile-Ser-Asp)-Met-OH；
H2N-cyclo(Lys-Val-Trp-Glu-Asp)-Phe-OH；
H2N-cyclo(Asp-Phe-Ile-Asn-Lys)-Ala-OH；
H2N-cyclo(Lys-Ala-Phe-Leu-Asp)-Ala-Phe-OH。
本发明还提供了式（I）的转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽的制备方法，包括固相合成方法和组合化学有机合成方法，其中固相合成方法包括以下步骤：
（1）Fmoc-AAx-OBzl-树脂与Pip的DMF溶液混合搅拌，脱除Fmoc保护基，得H2N-AAx-OBzl-树脂，其中，x为6或7；
（2）H2N-AAx-OBzl-树脂与Fmoc-AAx-1-OBzl-OH混合，加入DCC的DMF溶液和HOBt的DMF溶液，发生偶联反应，得Fmoc-AAx-1-AAx-OBzl--树脂；
（3）Fmoc-AAx-1-AAx-OBzl--树脂与Pip的DMF溶液混合搅拌，脱除Fmoc保护基，得H2N-AAx-1-AAx-OBzl--树脂；
（4）重复步骤（2）和（3）的操作，依次使用Fmoc-AAx-2-OBzl-树脂至Fmoc-AA1-OBzl-树脂循环进行偶链反应，直至得到Fmoc-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5)-AA6-OBzl-树脂或Fmoc-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5)-AA6-AA7-OBzl-树脂；
（5）步骤（4）的产物中加入HBr的HOAc溶液搅拌脱除侧链Boc保护基，产物加入DCC的DMF溶液和HOBt的DMF溶液，发生环化反应；
（6）步骤（5）的产物与Pip的DMF溶液混合搅拌，脱除Fmoc保护基；
（7）步骤（6）的产物加入TFA的二氯甲烷溶液反应，即得。
其中，步骤（1）中，Pip的DMF溶液的体积百分比浓度为10%～30%，优选25%；搅拌温度为室温，搅拌时间为10-30min，优选20min。
步骤（2）中，偶联反应温度为室温，反应时间为10-20min，优选15min；DCC的DMF溶液浓度为0.2～0.4mol/L，优选0.3mol/L；HOBt的DMF溶液浓度为0.35～0.45mol/L，优选0.4mol/L；H2N-AAx-OBzl-树脂、Fmoc-AAx-1-OBzl-OH、DCC、HOBt的摩尔比1:(2-3):(1.5-2.5):(2-3)，优选1:2.5:2:2.5。
步骤（3）中，Pip的DMF溶液的体积百分比浓度为10%～30%，优选25%；搅拌温度为室温，搅拌时间为10-30min，优选20min；所述Fmoc-AAx-1-AAx-OBzl--树脂与Pip的DMF溶液的用量比为1mmol:(1-3)ml，优选1mmol:2ml。
步骤（5）中，HBr的HOAc溶液中HBr浓度为0.08N～0.12N，优选0.1N；搅拌温度为室温，搅拌时间为0.5-2h，优选1h；环化反应温度为室温，环化反应时间为0.5-2h，优选1h，DCC的DMF溶液浓度为0.1～0.2mol/L，优选0.15mol/L；HOBt的DMF溶液浓度为0.15～0.25mol/L，优选0.2mol/L；步骤（4）的产物、DCC、HOBt的摩尔比1:(1.5-2.5):(2-3)，优选1:2:2.5。
步骤（6）中，Pip的DMF溶液的体积百分比浓度为10%～30%，优选25%；搅拌温度为室温，搅拌时间为10-30min，优选20min；步骤（5）的产物与Pip的DMF溶液的用量比为1mmol:(1-3)ml，优选1mmol:2ml。
步骤（7）中，TFA/二氯甲烷/水混合溶液中TFA、二氯甲烷和水的体积比为（95-82）:（2.5-5）:（2.5-5），优选为95:2.5:2.5，反应温度为室温，反应时间0.5-3h，优选为2h。
其反应路线如下：
本发明还提供了式（I）的转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽、其衍生物或其盐在制备抗肿瘤药物中的应用，具体为，所述转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽、其衍生物或其盐具有肿瘤转移缺失蛋白Mtss1的拮抗活性，更具体地，所述转移肿瘤缺失蛋白抑制剂转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽生物稳定性好，能被活细胞吸收，在细胞内通过与Mtss1蛋白I-BAR区结合，抑制Mtss1蛋白二聚化作用，从而达到干扰肿瘤细胞内摄，抑制肿瘤信号传导的作用。其中，抑制剂-蛋白的体外抑制活性在纳摩尔级。
在本发明中使用的缩写具有下面的含义：
固相合成树脂
Ac 乙酰基
Ala 丙氨酸
Arg 精氨酸
Asp 天冬氨酸
Bzl 苄基
CH2 亚甲基
CO 酮羰基
COOH 羧基
DCC N,N-二环己基碳二亚胺
DMF N,N-二甲基甲酰胺
FITC 异硫氰酸荧光素
Fmoc 9-芴甲氧羰基
Gln 谷氨酰胺
Gly 甘氨酸
His 组氨酸
HOBt 1-羟基苯并三唑
Ile 异亮氨酸
Leu 亮氨酸
Lys 赖氨酸
Met 蛋氨酸
NH 仲氨基
NH2 伯氨基
OH 羧基
Phe 苯丙氨酸
Pip 哌啶
Ser 丝氨酸
TFA 三氟乙酸
Val 缬氨酸
本发明中，所有氨基酸构型均为L-型。
转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽其衍生物为其相应的直链肽、或其片段、或化学结构类似物。
转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽其衍生物为其与有机酸如醋酸、草酸、苯磺酸、谷氨酸等，或无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸等，或有机碱如三乙胺、吡啶、乙醇胺、精氨酸等，或无机碱如钠、钾、钙、镁、铁等所形成的盐。
有益效果：本发明提供的转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽分子量低、稳定性高、毒性很小，并能够通过细胞膜进入细胞，通过抑制Mtss1蛋白二聚化作用，在胞内抑制肿瘤细胞内摄、干扰细胞膜形态变化以及干扰肿瘤相关信号传导，削弱了由表皮生长因子EGF、血小板衍生因子PDGF或刺猬因子shh等肿瘤刺激因素引发的细胞增殖和生长，其中抑制剂-蛋白的体外抑制活性在纳摩尔级，不需转染或脂质体包裹直接加入细胞培养液中即能显著抑制肿瘤细胞内吞作用。
附图说明
图1为式（III）所示的小分子转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽化合物对Mtss1高表达细胞生长的直接抑制作用，数据显示在500nM浓度下该化合物对实验细胞生长抑制作用明显。
图2为式（III）所示的小分子转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽化合物的Mtss1蛋白体外抑制活性，计算得到的化合物IC50值为93nM。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例中的试剂、材料和仪器包括，Fmoc-Val-OBzl-、Fmoc-Ala-OBzl-、Fmoc-Leu-OBzl-和Fmoc-Ile-OBzl-树脂（aappTec公司产品），Fmoc保护的Ala、Phe、Gln、Val、Lys、Met、Ile、Gly、Ser、Leu、Arg和His氨基酸以及1-羟基苯并三唑(HOBt)、N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)（上海吉尔生化产品），多肽合成管（北京纽比特公司产品），高效液相色谱仪HPLC（Alliance Waters公司产品），垂直电泳仪和转膜仪（BIO-RAD公司产品），96孔培养板（corning公司产品），PBS磷酸盐缓冲液（GIBCO公司产品），DMEM培养液（Lonza公司产品），胎牛血清（四季青公司产品），新型细胞毒试剂盒（凯基公司产品），Ni-NTA亲和树脂（QIAGEN公司产品），GST标记Mtss1-I-BAR重组蛋白和His标记Mtss1重组蛋白（东南大学制药工程研究所制备），Mtss1-I-BAR-GFP/293A细胞系（生物材料与器件江苏省重点实验室构建）。
实施例1H2N-cyclo(Asp-Ala-Phe-Gln-Lys)-Val-OH的制备
将0.8g的Fmoc-Val-OBzl-树脂浸泡于10ml无水DMF中，室温搅拌30min。之后，使用25%Pip的DMF溶液与树脂混合20min，以脱除Fmoc保护基。
使用DMF洗涤树脂，之后加入3ml3.8g的Fmoc-Lys(Boc)-OH的DMF溶液、3ml0.3mol/L DCC的DMF溶液和3ml0.4mol/L HOBt的DMF溶液，室温搅拌15min，进行偶联反应。
反应结束后，使用DMF洗涤树脂，并使用25%Pip的DMF溶液与树脂混合20min，以脱除Fmoc保护基，随后再用DMF洗涤，得到Fmoc-Lys(Boc)-Val-OBzl-准备下一个偶联反应。
依次使用Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Asp(OtBu)-OH循环进行偶链反应，直至得到Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Phe-Gln-Lys(Boc)-Val-OBzl-
使用0.1N的HBr/HOAc处理1h以脱去侧链保护基，之后洗涤并加入5ml0.15mol/LDCC的DMF溶液和5ml0.2mol/L HOBt的DMF溶液，室温反应1h进行环化。
使用DMF洗涤后，加入25%Pip的DMF溶液与树脂混合以脱除末端Fmoc保护基得到柱结合转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽化合物H2N-cyclo(Asp-Ala-Phe-Gln-Lys)-Val-OBzl-之后加入10ml的TFA/二氯甲烷/水混合溶液95:2.5:2.5（v:v:v）2h进行脱柱，得到H2N-cyclo(Asp-Ala-Phe-Gln-Lys)-Val-OH，经HPLC纯化后得到最终产品7.3mg。
实施例2H2N-cyclo(Lys-Lys-Val-Ala-Asp)-Met-Ala-OH的制备。
将1mmol的Fmoc-Ala-OBzl-树脂浸泡于10ml无水DMF中，室温搅拌30min。之后，使用10%Pip的DMF溶液与树脂混合30min，以脱除Fmoc保护基。
使用DMF洗涤树脂，之后加入含2mmol Fmoc-Met(Boc)-OH的DMF溶液、5ml0.3mol/L DCC的DMF溶液和5ml0.4mol/L HOBt的DMF溶液，室温搅拌10min，进行偶联反应。
反应结束后，使用DMF洗涤树脂，并使用3ml的10%Pip的DMF溶液与树脂混合30min，以脱除Fmoc保护基，随后再用DMF洗涤，得到Fmoc-Met(Boc)-Ala-OBzl-，准备下一个偶联反应。
依次使用Fmoc-Asp-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys-OH和Fmoc-Lys(OtBu)-OH循环进行偶链反应，直至得到Fmoc-Lys(OtBu)-Lys-Val-Ala-Asp-Met-Ala--
使用0.08N的HBr/HOAc处理2h以脱去侧链保护基，之后洗涤并加入5ml0.3mol/LDCC的DMF溶液和5ml0.4mol/L HOBt的DMF溶液，室温反应2h进行环化。
使用DMF洗涤后，加入3ml10%Pip的DMF溶液与树脂混合30min以脱除末端Fmoc保护基得到柱结合转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽化合物H2N-cyclo(Lys-Lys-Val-Ala-Asp)-Met-Ala-OBzl-之后加入10ml的TFA/二氯甲烷/水混合溶液82:5:5（v:v:v）2h进行脱柱，得到H2N-cyclo(Lys-Lys-Val-Ala-Asp)-Met-Ala-OH，经HPLC纯化后得到最终产品7.1mg。
实施例3H2N-cyclo(Lys-Ile-Gly-Ser-Asp)-Leu-OH的制备。
将1mmol的Fmoc-Leu-OBzl-树脂浸泡于10ml无水DMF中，室温搅拌30min。之后，使用30%Pip的DMF溶液与树脂混合10min，以脱除Fmoc保护基。
使用DMF洗涤树脂，之后加入含3mmol Fmoc-Asp(Boc)-OH的DMF溶液、5ml0.5mol/L DCC的DMF溶液和5ml0.6mol/L HOBt的DMF溶液，室温搅拌20min，进行偶联反应。
反应结束后，使用DMF洗涤树脂，并使用1ml的30%Pip的DMF溶液与树脂混合10min，以脱除Fmoc保护基，随后再用DMF洗涤，得到Fmoc-Met(Boc)-Ala-OBzl-准备下一个偶联反应。
依次使用Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys-OH循环进行偶链反应，直至得到Fmoc-Lys(OtBu)-Ile-Gly-Ser-Asp-
使用0.12N的HBr/HOAc处理0.5h以脱去侧链保护基，之后洗涤并加入5ml0.50mol/L DCC的DMF溶液和5ml0.6mol/L HOBt的DMF溶液，室温反应0.5h进行环化。
使用DMF洗涤后，加入1ml30%Pip的DMF溶液与树脂混合10min以脱除末端Fmoc保护基得到柱结合转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽化合物H2N-cyclo(Lys-Ile-Gly-Ser-Asp)-Leu-OBzl-之后加入10ml的TFA/二氯甲烷/水混合溶液90:3:3（v:v:v）2h进行脱柱，得到H2N-cyclo(Lys-Ile-Gly-Ser-Asp)-Leu-OH，经HPLC纯化后得到最终产品7.4mg。
实施例4
利用实施例1的方法按照实施例1的方法同样的方法制备得到以下化合物：
实施例5小分子转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽抑制剂对Mtss1高表达细胞生长的直接抑制作用。
按每孔3×103的密度将Mtss1-I-BAR-GFP/293A细胞接种于96孔培养板中，使用100μlDMEM+10%胎牛血清培养液，在37℃含5%CO2浓度的培养箱中过夜培养。
在96孔板培养液中加入不同浓度的化合物2，37℃下培养24h，之后使用新型细胞毒试剂盒检验细胞活性，并计算该化合物的细胞生长抑制作用，发现在500nM浓度下该化合物对Mtss1高表达细胞生长抑制作用明显（如图1）。
在96孔板培养液中分别加入500nM浓度的化合物1-20，37℃下培养24h，之后使用新型细胞毒试剂盒检验细胞活性，并计算化合物1-20的细胞生长抑制作用，发现在500nM浓度下化合物1-20对Mtss1高表达细胞生长均有明显的抑制作用，结果见表1。
表1化合物1-20的细胞生长抑制作用
| 化合物 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 细胞存活率% | 53 | 55 | 57 | 56 | 62 | 64 | 59 | 55 | 59 | 57 |
| 化合物 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 |
| 细胞存活率% | 62 | 65 | 58 | 57 | 61 | 54 | 59 | 60 | 58 | 53 |
实施例6Mtss1蛋白体外抑制活性的检测。
以化合物2的小分子转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽化合物为例，在500μl PH=7.4的PBS磷酸盐缓冲液中，加入不同浓度的该化合物以及25nM浓度的GST标记Mtss1-I-BAR重组蛋白和25nM浓度的His标记Mtss1重组蛋白，在37℃下培养2h，之后移至4℃培养箱旋转孵育12h。孵育结束后加入40μl的50%(v/v)Ni-NTA亲和树脂，4℃旋转摇床孵育30分钟，以沉淀His标签蛋白和相关的相互作用蛋白。离心收集沉淀，用于10%(v/v)SDS-PAGE凝胶电泳分析和GST抗体的Western blot检测。使用ImageJ软件分析条带将上清液中的His-MIM蛋白含量进行量化，随后使用Prism5软件左图，可计算出抑制剂的抑制活性数值（如图2）。化合物2的小分子转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽化合物IC50值为93nM。
同样的方法检测化合物1-20的IC50值，结果见表2。
表2化合物1-20转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽化合物的抑制活性数值
| 化合物 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| IC50nM | 90 | 93 | 97 | 95 | 101 | 104 | 98 | 96 | 96 | 97 |
| 化合物 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 |
| IC50nM | 101 | 105 | 99 | 95 | 102 | 93 | 98 | 100 | 96 | 93 |
Claims (3)
1.转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽，其选自下列4个序列的化合物：
H2N-cyclo(Asp-Ala-Phe-Gln-Lys)-Val-OH 序列1；
H2N-cyclo(Lys-Lys-Val-Ala-Asp)-Met-Ala-OH 序列2；
H2N-cyclo(Lys-Ile-Gly-Ser-Asp)-Leu-OH 序列3；
H2N-cyclo(Lys-Arg-His-Arg-Asp)-Ile-OH 序列4；
其结构式分别为如式(II)、(III)、(IV)和(V)所示：
2.转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽，其选自下列序列的化合物：
Ac-cyclo(Asp-Ala-Phe-Gln-Lys)-Val-NH2；
Ac-cyclo(Lys-Lys-Val-Ala-Asp)-Met-Ala-NH2；
Ac-cyclo(Lys-Ile-Gly-Ser-Asp)-Leu-NH2；
Ac-cyclo(Lys-Arg-His-Arg-Asp)-Ile-NH2；
FITC-cyclo(Asp-Ala-Phe-Gln-Lys)-Val-NH2；
FITC-cyclo(Lys-Lys-Val-Ala-Asp)-Met-Ala-NH2；
FITC-cyclo(Lys-Ile-Gly-Ser-Asp)-Leu-NH2；
FITC-cyclo(Lys-Arg-His-Arg-Asp)-Ile-NH2；
FITC-NH-(CH2)5-CO-cyclo(Asp-Ala-Phe-Gln-Lys)-Val-NH2；
FITC-NH-(CH2)5-CO-cyclo(Lys-Lys-Val-Ala-Asp)-Met-Ala-NH2；
FITC-NH-(CH2)5-CO-cyclo(Lys-Ile-Gly-Ser-Asp)-Leu-NH2；
FITC-NH-(CH2)5-CO-cyclo(Lys-Arg-His-Arg-Asp)-Ile-NH2；
H2N-cyclo(Lys-Ile-Ile-Ser-Asp)-Met-OH；
H2N-cyclo(Lys-Val-Trp-Glu-Asp)-Phe-OH；
H2N-cyclo(Asp-Phe-Ile-Asn-Lys)-Ala-OH；
H2N-cyclo(Lys-Ala-Phe-Leu-Asp)-Ala-Phe-OH。
3.权利要求1的转移肿瘤缺失蛋白小分子环肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)树脂与Pip的DMF溶液混合搅拌，脱除Fmoc保护基，得树脂，其中，x为6或7；
(2)树脂与Fmoc-AAx-1-OBzl-OH混合，加入DCC的DMF溶液和HOBt的DMF溶液，发生偶联反应，得树脂；
(3)树脂与Pip的DMF溶液混合搅拌，脱除Fmoc保护基，得树脂；
(4)重复步骤(2)和(3)的操作，依次使用树脂至树脂循环进行偶联反应，直至得到Fmoc树脂或Fmoc树脂；
(5)步骤(4)的产物中加入HBr的HOAc溶液搅拌脱除侧链Boc保护基，产物加入DCC的DMF溶液和HOBt的DMF溶液，发生环化反应；
(6)步骤(5)的产物与Pip的DMF溶液混合搅拌，脱除Fmoc保护基；步骤(6)的产物加入TFA的二氯甲烷溶液反应，即得。
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