KR101730680B1 - 치료용 펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 +2의 알짜 양전하(net positive charge)를 가지며, 이치환된 β 아미노산(disubstituted β amino acid)을 포함하고; 같거나 서로 다를 수 있는 상기 β 아미노산에서의 각 치환기는 적어도 7개의 비수소 원자(non-hydrogen atoms)를 포함하고, 친유성이며, 적어도 하나의 시클릭기를 가지고; 치환기 내 하나 또는 그 이상의 시클릭기는 다른 치환기 내 하나 또는 그 이상의 시클릭기에 연결되거나 융합될 수 있고; 시클릭기가 이러한 식으로 융합되는 경우, 두 개의 치환기에 결합된 비수소 원자의 총 수는 적어도 12인 것을 특징으로 하는, 세포용해성 치료제(cytolytic therapeutic agent)로서 사용하기 위한 펩티드(peptide), 펩티도 모방체(peptidomimetic) 또는 아미노산 유도체(amino acid derivative) 뿐만 아니라, 이 분자들 및 이 정의 내에 있는 어떤 정의된 신규한 화합물의 비치료적 용도를 제공한다.

Description

치료용 펩티드{THERAPEUTIC PEPTIDES}
본 발명은 변경된 아미노산(amino acid), 펩티드(peptide) 및 펩티드 모방체(peptidomimetics) 및 그것들의 세포 용해제(cytolytic agent)로서의 용도에 관한 것이며, 이 세포 용해제는 특히 항균제(antimicrobial agents) 및 항종양제(antitumoural agents)로서 유용하다고 여겨진다.
다중 저항성(multi-resistant) 세균에 의해 야기되는 감염은 지난 20-25년간에 걸쳐 사회의 주요 관심사가 되었다. 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin resistant Staphylococcus aureus; MRSA), 반코마이신 내성 황색포도상구균(vancomycin resistant Staphylococcus aureus; VRSA) 및 메티실린 내성 표피포도상구균(methicillin resistant Staphylococcus epidermidis; MRSE)에 의해 야기되는 감염이 면역이 저하된 환자들에게 심각한 손상, 긴 입원 및 죽음을 초래하는 경우, 이는 특히 병원에서 문제가 된다. 반코마이신은 한때 최후의 약제(drug of last resort)였으나, 세계 각지의 병원들로부터의 보고서는 반코마이신의 드문 사용이 더 이상 사실이 아님을 보여준다.
상기 그람-양성 종들뿐만 아니라, 임상의들은 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)를 포함하는 다중 저항성 그람-양성 종들 또한 문제가 있다고 보고하고 있다. 그람 양성 및 그람 음성 종들 모두를 포함하는 광범위한 세균에 대하여 활성을 나타내는 단일 항생 분자(single antibiotic molecule)가 있다면 매우 바람직할 것이다.
실질적으로 막대한 개발 비용 및 만성 질환의 치료에 비해서 상대적으로 한정된 환자의 치료기간 때문에, 새로운 종류의 항균성 화합물을 개발하기 위한 가장 큰 제약회사 중 하나가 외풍을 맞았다. 그러나, 신규한 항균제에 대한 요구가 시급하며, 미국에서 병원감염(hospital acquired infections)에 의해 야기되는 사망은 현재 HIV-관련 사망률을 대체하고 있다.
촉망받고 있는 항균제의 종류는 생체 방어 펩티드(host defence peptides)로도 알려져 있는 양이온 항균 펩티드(cationic antimicrobial peptides; AMP's)이다. 양이온 항균 펩티드는 비수용체 특이적 방법으로 세균의 내막(inner membrane) 및/또는 외막(outer membrane)을 표적화하는 독특한 작용 방식을 가진다. 양이온 항균 펩티드에 의한 막 파괴의 상세한 메커니즘은 여전히 잘 알려져 있지 않으며, 관찰된 효과를 설명하기 위하여 다양한 모델들이 제안되어 있다.
원핵생물의 지질 세포막 성분과 진핵생물의 암세포 사이의 상대적인 유사성 때문에, 이 항균 펩티드에 대한 암세포에 대한 선택적 막 불안정화 및 그에 의한 용해 활성 또한 관찰되었다. 두 가지 표적 세포 타입 모두에 대하여 알짜 양전하(net positive charge)와 친유성기(들)을 가지는 효과적인 종류의 양친매성 펩티드(amphipathic peptide) 및 펩티드-유사 분자(peptide-like molecules)들이 확인되었다. 이 분자들의 1세대에 대하여, 구멍형성(pore-forming) 작용 방식이 추정되었으며, 그것들은 전형적으로는 통합된 10개 또는 그 이상의 아미노산이지만, 더 최근에는 더욱 작은 분자들이 치료학적으로 적절한 수준의 활성과 선택성을 유지할 수 있다는 것을 발견하였다(Strom M.B. et al., J. Med. Chem. 2003, 46, 1567-1570).
그럼에도 불구하고, 때때로 치료학적 활성, 선택성, 독성, 생체 내 및 시험관 내 안정성, 생산 비용 및 운반 수단의 용이성의 목적에 대한 갈등이 있으며, 여전히 이 일반적인 종류의 분자들 내에서 새로운 약물 후보물질을 개발할 필요성이 있다.
본 발명자들은 이치환된 β 아미노산을 사용함으로써 넓은 스펙트럼의 항균 활성, 예를 들어 그람양성 및 그람음성 종들 모두에 대한 활성을 포함하는, 매우 전도유망한 활성 및 다른 바람직한 특성을 가지는 새로운 종류의 세포 용해성 분자를 제조할 수 있음을 발견하였다. 바람직하게는, 상기 분자는 경구 운반에 적합하다.
따라서, 일 양상에서, 본 발명은 적어도 +2의 알짜 양전하(net positive charge)를 가지며 이치환된 β 아미노산을 포함하고, 같거나 서로 다를 수 있는 상기 β 아미노산에서의 각 치환기는 적어도 7개의 비수소 원자(non-hydrogen atoms)를 포함하고, 친유성이며, 적어도 하나의 시클릭기를 가지고; 치환기 내 하나 또는 그 이상의 시클릭기는 다른 치환기 내 하나 또는 그 이상의 시클릭기에 연결되거나 융합될 수 있고; 시클릭기가 이러한 식으로 융합되는 경우, 두 개의 치환기에 결합된 비수소 원자의 총 수는 적어도 12인 것을 특징으로 하는, 세포용해성 치료제(cytolytic therapeutic agent)로서 사용하기 위한 펩티드(peptide), 펩티도 모방체(peptidomimetic) 또는 (변경된) 아미노산을 제공한다. 상기 β 아미노산 상의 2개의 치환기는 바람직하게는 같다.
본 발명은 본 발명에 따른 펩티드, 펩티드 모방체 또는 변경된 아미노산을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 미생물 감염, 바람직하게는 세균 감염을 치료하거나 예방하는 방법 또는 종양 세포를 치료하거나 종양의 성장(growth), 기관 확산(establishment spread) 또는 전이(metastasis)를 예방하거나 감소시키는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 1의 화합물 4a-n을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에 기재된 것과 같은 화합물 4a-n의 합성의 도식적 개요를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 4의 화합물 4a-d, 5a-d, 6a-d 및 7a-d를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 4의 화합물의 합성의 도식적 개요를 나타낸 것이다.
a) NaOMe(1eq.), R-Br(1eq.), 두 번 수행함, 78℃ s: MeOH.
b) Ra/Ni, H2(g), 45℃, 5일, s: 2% 아세트산을 포함하는 MeOH.
c) TEA, pH 8, BoC2O(1.2eq.), r.t, 18h, s: H2O:디옥산(1:5).
d) LiOH(6eq.), 18h, 100℃, s: H2O:디옥산(1:3).
e) DIPEA(3eq), TFFH(1.5eq.), r.t, 2h, 그 후 7일까지 원하는 아민(2eq.)을 첨가함, s: DMF
f) TEA:TIS:H2O(95:2.5:2.5), r.t, 2h, s: DCM.
모든 β2,2-아미노산 유도체들은 그것들의 디-트리플루오로아세테이트염으로 분리되었다.
이론에 얽매이지 않고, 이치환된 β 아미노산의 봉입(inclusion)은 분자의 안정성을 증가시키는 것으로 보이며, 강제적 구조 전하(forced conformational charges)는 분자의 양친매성(amphipathicity)을 향상시킬 뿐만 아니라 이치환된 잔기에서의 두 개의 친유성 부분(moieties)의 반발 상호작용 때문에 막 상에 강력한 붕괴 효과를 초래한다고 여겨진다. 이것은 세포독성을 일으킬 수 있는 세포용해 효과를 제공한다.
이 세포용해 활성은 항균성, 바람직하게는 항균 활성 및/또는 항종양 활성일 수 있으며, 이와 같은 의학 용도는 본 발명의 바람직한 구현을 구성한다. 따라서, 본 발명은 항균제 또는 항종양제로서 사용하기 위한 상기에 정의된(및 하기에 더욱 상세히 기재되는) 것과 같은 펩티드, 펩티드 모방체 및 변경된 아미노산을 제공한다. 대안적 관점에서, 본 발명은 세균(특히, 박테리아) 감염을 치료하거나 암 세포(특히, 고형암)을 치료하는데 사용하기 위한 상기에 정의된(및 하기에 더욱 상세히 기재되는) 것과 같은 펩티드, 펩티드 모방체 및 변경된 아미노산을 제공한다.
표적이 되거나 치료될 미생물은 세균(그람양성 및 그람음성), 곰팡이, 고세균(archaea) 및 원생생물(protists)을 포함한다. 세균은 건강과 생명을 위협하는 방식으로 인간 및 다른 동물들을 감염시키는 능력 때문에 특히 관심을 가지는 것들 중 하나이다.
바람직한 세균 표적은 그람양성 세균, 특히 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin resistant Staphylococcus aureus; MRSA), 및 메티실린 내성 표피포도상구균(methicillin resistant Staphylococcus epidermidis; MRSE)을 포함한다. 슈도모나스 애루기노사 및 에스케리키아 콜리와 같은 그람음성 세균 종류 또한 치료될 수 있다. 만성 창상(chronic wounds)은 종종 그람양성 및 그람음성 종 양쪽 모두에 의해 감염되며, (예를 들어, 만성 창상 부위에서의) 다중 병원성 감염(multipathogen infection)이 있거나, 다중 병원성 감염이 의심되거나, 다중 병원성 감염의 발병이 의심되는 환자의 치료는 본 발명에 따른 바람직한 용도이다.
항균 활성은 또한 예를 들어, 소독제(disinfectant)와 같은 비치료적 용도를 제공하며, 본 발명의 다른 양상에서 세포 용해제로서 본원에 정의되고 설명된 것과 같은 펩티트, 펩티드 모방체 또는 변경된 아미노산의 체외(ex vivo) 용도를 제공한다.
친유성(lipophilicity)은 예를 들어, 1-옥탄올/물과 같은 액체-액체의 2상 계(biphasic system)에서의 분자의 분포에 의해 측정될 수 있다. 히드록시(hydroxy), 카르복시(carboxy), 카르보닐(carbonyl), 아미노(amino) 및 에테르(ethers)와 같은 극성 치환기는 친유성을 감소시키기 때문에, 1-옥탄올/물과 같은 2상 계에서의 분배 계수(partition coefficient)를 감소시키며; 따라서 친유성 치환기는 바람직하게는 2 이하, 더욱 바람직하게는 하나 또는 어떠한 극성기도 포함하지 않을 것이다.
β 아미노산은 β 탄소 원자에 결합된 아미노기를 가지며, 유전적으로 코딩된(genetically coded) 아미노산은 아미노기가 α 탄소 원자에 결합되어 있는 α 아미노산이다. 이 배열은 β 아미노산 당 하나의 원자를 늘이고, 펩티드의 골격(backbone)은 하나 또는 그 이상의 β 아미노산을 포함한다. 이 배열에서, 상기 α 및/또는 β 탄소 원자는 치환될 수 있다. 상기 α 또는 β 탄소 원자는 이치환(disubstituted)될 수 있고; 상기 α 탄소 원자가 이치환될 경우 β2,2 아미노산이 생성되고, β 탄소 원자가 이치환될 경우 β3,3 아미노산이 생성된다. 각각의 α 또는 β 탄소 원자에서 하나의 치환기는 β2,3 아미노산을 생성한다. β2,2 및 β3,3 이치환된 아미노산은 본 발명에 따른 용도에 바람직하며, β2,2 이치환된 아미노산이 특히 바람직하다.
β 아미노산은 적어도 7개의 비수소 원자를 포함하는 두 개의 기로 치환된다. 바람직하게는 하나, 더욱 바람직하게는 치환기 둘 다 적어도 8개, 더욱 바람직하게는 적어도 10개의 비수소 원자를 포함한다. 이 기들은 자연 상태에서 친유성이면서, 동시에 서로 다르거나 바람직하게는 동일할 수 있다. 각각은 적어도 하나의 시클릭기, 지방족(aliphatic) 또는 방향족(aromatic), 바람직하게는 방향족일 수 있고, 치환될 수 있는 6원자 고리(6 membered ring)를 포함하며, 치환기는 산소(oxygen), 질소(nitrogen), 황(sulphur) 또는 할로겐(halogen), 특히 불소(fluorine) 또는 염소(chlorine)와 같은 헤테로 원자를 포함할 수 있다. 바람직한 치환기는 C1-C4 알킬(특히 t-부틸), 메톡시(methoxy), 플루오로(fluoro) 및 플로오로메틸(fluoromethyl) 기를 포함한다. 상기 시클릭기는 호모시클릭(homocyclic) 또는 헤테로시클릭(heterocyclic)일 수 있고, 바람직하게는 그것들은 탄소 원자의 호모시클릭 고리(homocyclic ring)이다. 바람직한 친유성 치환기는 연결되거나 융합, 바람직하게는 융합될 수 있는 두 개 또는 세 개의 시클릭기, 바람직하게는 두 개의 시클릭기를 포함한다. 특히 바람직한 치환기는 나프탈렌기(naphthalene group)를 포함한다.
친유성 치환기의 또 다른 바람직한 기는 단일 치환되거나 이치환된 시클릭기, 바람직하게는 페닐(phenyl)기 또는 시클로헥실(cyclohexyl)기를 가진다.
상기 시클릭기(들)은 전형적으로 1 내지 4개의 사슬, 바람직하게는 1 내지 3개의 원자에 의해 펩티드 골격으로부터(즉, β 아미노산의 α 또는 β 탄소 원자로부터) 이격되어 있고; 이 연결 원자는 질소 및/또는 산소를 포함할 수 있으나 전형적으로 탄소 원자일 수 있고, 바람직하게는 상기 연결 원자는 이치환된다. 이 스페이서(spacers)들은 물론 본원에 정의된 것과 같은 치환기의 일부분이다.
상기 이치환된 β 아미노산의 각 치환 부분은 전형적으로 7 내지 20개의 비수소 원자, 바람직하게는 7 내지 13개, 더욱 바람직하게는 8 내지 12개, 가장 바람직하게는 9 내지 11개의 비수소 원자를 포함할 것이다.
본 발명에 사용하기 위한 분자들은 바람직하게는 1 또는 2 내지 12개의 아미노산 길이의 펩티드 또는 펩티드 모방체 또는 동등한 길이의 서브유닛일 것이다. 별다른 언급이 없는 한, 본원에서 '아미노산(amino acid)'으로 칭하는 것은 펩티드 모방체와 동등한 서브유닛을 포함한다. 항균을 목적으로 하는 바람직한 분자들은 1 내지 3 또는 4개의 아미노산 길이를 가지며, 항암을 목적으로 하는 분자들은 예를 들어, 3 내지 12개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 5 내지 12개의 아미노산 길이로 더욱 길다. 실시예에 설명된 바와 같이, 본 발명에 따라 사용하기 위한 분자는 단지 단일 아미노산만을 포함할 수 있으나, 이것은 전하에 대한 요구를 충족시키기 위하여 '변경된(modified)' 아미노산일 것이다.
단일 아미노산뿐만 아니라 펩티드 및 펩티드 모방체는 바람직하게는 변경된 C 말단을 포함할 것이며, 상기 C 말단 변경기(C terminal modifying group)는 전형적으로 전하역전(charge reversal)을 초래, 즉 카르복시기의 음전하를 제거하고 예를 들어, 아미노기의 존재를 통하여 양전하를 첨가한다. N 말단은 변경되지 않는 것으로 추정되는 이러한 변경은 분자에 +2의 전체 알짜 전하(net charge)를 제공할 것이다. C 말단이 전하역전을 제공하도록 변경되거나 단순히 카르복시기의 음전하를 제거하도록 변경되는 것의 여부와는 관계없이, 상기 분자는 또한 하나 또는 그 이상의 양이온성 아미노산을 포함한다. 따라서, 상기 분자의 총 전하는 더욱 큰 분자에 대하여 +3, +4 또는 그보다 높을 수 있다.
바람직하게는 자연계에서 양이온성인 적절한 C 말단 기는 전형적으로 최대 크기의 15개의 비수소 원자를 가질 것이다. 상기 C-말단은 바람직하게는 아미드화(amidated)되며, 아미드 기는 N-알킬 또는 N,N-디알킬 아미드를 형성하도록 더 치환될 수 있다. 1차 및 2차 아미드기가 바람직하다. 아미드기를 치환하는데 적절한 기는 아미노알킬(aminoalkyl), 예를 들어 아미노 에틸(amino ethyl) 또는 디메틸아미노에틸(dimethylaminoethyl)을 포함하며, 아미드기의 질소 원자는 시클릭기, 예를 들어 피라졸리딘(pyrazolidine), 피페리딘(piperidine), 이미다졸리딘(imidazolidine) 및 피페라진(piperazine)의 일부를 형성할 수 있고, 여기에서 피페라진이 바람직하며, 이 시클릭기는 예를 들어, 알킬 또는 아미노알킬기로 치환될 수 있다.
본 발명에 따른 용도를 위한 펩티드는 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 양이온성 아미노산을 포함하며, 라이신(lysine), 아르기닌(arginine), 오르니틴(ornithine) 및 히스티딘(histidine)이 바람직하나, pH 7.0에서 양전하를 운반하는 임의의 비유전적으로 코딩(non-genetically coded)되거나 변경된(modified) 아미노산이 포함될 수 있다.
적절한 비유전적으로 코딩된 양이온성 아미노산 및 변경된 양이온성 아미노산은 호모라이신(homolysine), 오르니틴(ornithine), 디아미노부티르산(diaminobutyric acid), 디아미노피메르산(diaminopimelic acid), 디아미노프로피온산(diaminopropionic acid) 및 호모아르기닌(homoarginine)과 같은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘의 유사체뿐만 아니라, 트리메틸라이신(trimethyllysine) 및 트리메틸오르니틴(trimethylornithine), 4-아미노피페리딘-3-카르복시산(4-aminopiperidine-4-carboxylic acid), 4-아미노-1-카르바미미도일피페리딘-4-카르복시산(4-amino-1-carbamimidoylpiperidine-4-carboxylic acid) 및 4-구아니디노페닐알라닌(4-guanidinophenylalanine)도 포함한다.
디펩티드(dipeptide)는 전형적으로 하나의 양이온성 아미노산을 포함할 것이고, 더욱 긴 펩티드는 주로 추가적인 양이온성 아미노산을 포함할 것이므로, 4 또는 5개의 아미노산의 펩티드는 2 또는 3개의 양이온성 아미노산을 가질 것이며, 6 내지 9개의 아미노산의 펩티드는 3 내지 6개의 양이온성 아미노산을 가질 것이다.
분자의 바람직한 기는 C 말단 L-아르기닌 아미드 잔기에 결합된 β2,2 이치환된 아미노산을 포함하며, 이 배열을 가지는 디펩티드가 특히 바람직하다.
세 개 또는 그 이상의 아미노산을 가지는 펩티드는 전형적으로 하나 또는 그 이상의 추가적인 친유성 아미노산, 즉 친유성 R기를 가지는 아미노산을 가질 것이다. 전형적으로, 상기 친유성 R기는 적어도 하나, 바람직하게는 융합되거나 연결될 수 있는 두 개의 시클릭기를 가진다. 상기 친유성 R기는 O, N 또는 S와 같은 헤테로 원자를 포함할 수 있으나, 전형적으로는 단지 하나의 헤테로 원자, 바람직하게는 질소뿐이다. 이 R기는 바람직하게는 단지 2개의 극성기를 가지며, 더욱 바람직하게는 하나도 가지지 않거나 하나를 가지며, 가장 바람직하게는 하나도 가지지 않는다.
트립토판(tryptophan)은 바람직한 친유성 아미노산이며, 펩티드는 바람직하게는 1 내지 3개의 트립토판 잔기를 포함한다. 포함될 수 있는 더 유전적으로 코딩된 친유성 아미노산은 페닐알라닌(phenylalanine) 및 티로신(tyrosine)이다.
비유전적으로 코딩될 수 있는 친유성 아미노산은 변경된 R 기를 가지는 유전적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.
펩티드 모방체는 전형적으로 그것의 펩티드 동등체(peptide equivalent)의 극성(polarity), 3차원적 크기(three dimensional size) 및 기능성(functionality)(생물활성)을 유지하지만, 여기에서 펩티드 결합은 종종 더욱 안정한 결합으로 치환되었다. '안정한(stable)'은 가수분해 효소에 의한 효소적 분해에 더욱 잘 견디는 것을 의미한다. 일반적으로, 아미드 결합(아미드 결합 대체물)을 대신하는 결합은 많은 아미드 결합의 특성, 예를 들어, 구조(conformation), 입체 부피(steric bulk), 정전기적 특성(electrostatic character), 수소결합(hydrogen bonding) 가능성 등을 보존한다. "약물 설계 및 개발"의 챕터 14는 펩티드 모방체의 설계 및 합성을 위한 기술의 일반논평을 제공한다(Krogsgaard, Larsen, Liljefors and Madsen (Eds) 1996, Horwood Acad. Pub, "Drug Design and Development"). 주어진 상황에서, 분자가 효소의 특정 활성 부위보다는 막과 반응하는 경우, 기재된 정확하게 모방하는 친화성(affinity) 및 능률(efficacy) 또는 기질 작용(substrate function)의 몇몇의 문제들은 관련이 없으며, 펩티드 모방체는 주어진 펩티드 구조 또는 요구되는 작용기의 모티프에 기초하여 쉽게 제조될 수 있다. 적절한 아미드 결합 대체물은 하기의 기를 포함한다: N-알킬화(N-alkylation)(Schmidt, R. et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1995, 46, 47), 레트로-인버소 아미드(retro-inverso amide)(Chorev, M and Goodman, M., Acc. Chem. Soc., 1990, 112, 433), 티오아미드(thioamide)(Sherman D.B. and Spatola, A.F. J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 433), 티오에스테르(thioester), 포스포네이트(phosphonate), 케토메틸렌(ketomethylene)(Hoffman, R.V. and Kim, H.O. J. Org. Chem., 1995, 60, 5107), 하이드록시메틸렌(hydroxymethylene), 플루오로비닐(fluorovinyl)(Allmendinger, T. et al., Tetrahydron Lett., 1990, 31, 7297), 비닐(vinyl), 메틸렌아미노(methyleneamino)(Sasaki, Y and Abe, J. Chem. Pharm. Bull. 1997 45, 13), 메틸렌티오(methylenethio)(Spatola, A.F., Methods Neurosci, 1993, 13, 19), 알칸(alkane)(Lavielle, S. et. al., Int. J. Peptide Protein Res., 1993, 34, 2391).
본 발명의 분자들은 이치환된 β 아미노산을 포함하며, 단지 하나의 아미노산을 더 포함하는, 즉 아미드 결합에 의해 결합된 두 개의 아미노산을 가지는 다양한 분자들이 실시예에 기재되어 있다.
이와 같은 분자들은 아미드 결합 때문에 디펩티드로 간주될 수 있으나; 이 분자들에서 아미드 결합은 사실 β 아미노산의 이치환 때문에 끊어지지 않으며(non-scissile), 그와 같은 이러한 분자들은 펩티드 모방체로 간주될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 이러한 분자들(및 아미노산을 더 가지는 큰 분자들)은 아미드 결합의 존재에 의해 (펩티드 모방체라기 보다는) 펩티드로 간주된다. 이것은 주어진 아미드 결합이 어느 정도까지 끊어지는지의 여부를 테스트할 필요없이 명명을 명료하게 해준다. 즉, 만약 분자 내의 모든 아미노산이 아미드 결합으로 연결되어 있다면, 그 분자는 하나 또는 그 이상의 아미드 결합이 쉽게 끊어지지 않는다 할지라도 펩티드로 간주된다.
본 발명의 펩티드 모방체 화합물은 전형적으로 아미노산에 대하여 대략적으로 동등한 크기와 기능을 가지는 식별가능한 서브유닛(identifiable sub-units)을 가질 것이다. 펩티드 모방체는 일반적으로 아미노산의 R기에 상응하는 기를 가질 것이며, 본원에서 논의된 적절한 R기 및 그것의 N 및 C 말단을 변경하는 기를 필요한 변경을 가하여 펩티드 모방체 화합물에 적용한다.
상기에 언급된 교과서에 논의된 바와 같은 것뿐만 아니라, 아미드 결합의 대체물의 예로써, 펩티드 모방체는 디펩티드 모방체 또는 트리펩티드 모방체 구조를 가지는 더욱 큰 구조적 부분의 대체물을 포함하며, 이 경우에 아졸-유래 모방체(azole-derived mimetics)와 같은 펩티드 결합을 포함하는 모방체 부분이 디펩티드 대체물로서 사용될 수 있다. 그러나, 펩티드 모방체 및 상기에 논의된 바와 같이 단지 아미드 결합만이 치환된 펩티드 모방체 골격이 바람직하다.
적절한 펩티드 모방체는 아미드 결합이 환원제(reducing agent), 예를 들어 보란(borane) 또는 리튬 알루미늄-하이브리드(lithium aluminium-hybride)와 같은 하이브리드 시약으로 처리함으로써 메틸렌 아민(methylene amine)으로 환원되는 환원된 펩티드(reduced peptides)를 포함한다. 이와 같은 환원은 분자의 전체 양이온성(cationicity)을 증가시키는 부가적인 이점을 가진다.
다른 펩티드 모방체는 예를 들어, 아미드-기능화된 폴리글리신(amide-functionalized polyglycines)의 단계적 합성에 의해 형성되는 펩토이드(peptoids)를 포함한다. 몇몇의 펩티드 모방체 골격은 과메틸화된(permethylated) 펩티드와 같은 그것들의 펩티드 전구체(peptide precursors)로부터 쉽게 공급될 것이며, 적절한 방법은 오스트레쉬 등에 의해 설명되어 있다(Ostresh, J.M. et al. In Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1994) 91, 11138-11142). 강한 염기성 조건은 O-메틸화에 비하여 N-메틸화에 알맞을 것이며, 그 결과 펩티드 결합에서의 몇몇 또는 모든 질소 원자 및 N-말단 질소가 메틸화된다.
바람직한 펩티드 결합 대체물은 에스테르, 폴리아민 및 그것의 유도체뿐만 아니라 치환된 알칸 및 알켄, 특히 아미노메틸 및 케토메틸렌을 포함한다. 펩티드 모방체는 바람직하게는 본원에 언급된 바와 같이 변경될 수 있는 N 말단 및 C 말단을 가질 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 상기에 정의된 것과 같은 펩티드, 펩티드 모방체 또는 변경된 아미노산을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 미생물 감염, 바람직하게는 세균 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 상기에 정의된 것과 같은 펩티드, 펩티드 모방체 또는 변경된 아미노산을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포를 치료하거나 종양의 성장(growth), 기관 확산(establishment spread) 또는 전이(metastasis)를 예방하거나 감소시키는 방법을 제공한다.
본원에서 사용된 것과 같이, 미생물/세균 감염의 치료는 바람직하게는 생존가능한 미생물/세균 세포의 수의 감소를 의미할 뿐만 아니라, 억제하지 못하여 감염이 진행되는 것보다 피험자에게 덜 해로운 수로 세포 수가 억제되는 정균성 활성(bacteriostatic type activity)을 포함할 수 있다. "예방(prevention)"은 측정가능하고/하거나 해로운 집단이 치료된 피험자에게서 확정되지 않도록 하는 미생물/세균 세포 성장의 억제를 포함한다.
치료된 종양 세포는 순환(circulating)할 수 있으나, 전형적으로 고형 종양의 일부분일 것이며; 미생물 세포에서는 흔한 일이지만, 치료는 바람직하게는 세포 용해를 통한 세포사를 포함할 것이다. 세포 용해는 종양 세포 항원을 제시할 수 있으며, 2차 종양의 발병을 예방 또는 억제할 수 있는 후천성 면역(aquired immunity)을 생성할 수 있게 한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 상기에 정의된 것과 같은 펩티드, 펩티드 모방체 또는 변경된 아미노산, 및 (b) 미생물 감염의 치료 또는 예방에 별개로, 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 조합 제제로서 항균제를 더 포함하는 제품을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 상기에 정의된 것과 같은 펩티드, 펩티드 모방체 또는 변경된 아미노산, 및 (b) 종양 세포의 치료에 별개로, 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 조합 제제로서 항종양제를 더 포함하는 제품을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 미생물 감염, 바람직하게는 세균 감염을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, 상기에 정의된 것과 같은 펩티드, 펩티드 모방체 또는 변경된 아미노산의 용도를 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 종양 세포를 치료 또는 종양의 성장, 기관 확산 또는 전이를 예방 또는 감소시키기 위한 약제의 제조에 있어서, 상기에 정의된 것과 같은 펩티드, 펩티드 모방체 또는 변경된 아미노산의 용도를 제공한다.
상기 설명된 분자의 종류들 중에 신규한 매우 효과적인 분자 그룹이 존재한다. 이 분자들은 본원에 기재된 다양한 용도 및 방법에 적합하다. 따라서, 다른 양상에서, 본 발명은 일반식 I의 군:
Figure 112012044013751-pct00001
을 포함하지만, 화합물 N-메틸-L-페닐알라닐-L-리실-L-프롤릴-2,2-비스(페닐메틸)-β-알라닐-D-아르기닌(N-methyl-L-phenylalanyl-L-lysyl-L-prolyl-2,2-bis(phenylmethyl)-β-alanyl-D-Arginine) 및 N-메틸-L-페닐알라닐-L-리실-프롤릴-D-시클로헥실알라닐-2,2-비스(페닐메틸)-β-알라닐-D-아르기닌(N-methyl-L-phenylalanyl-L-lysyl-L-prolyl-D-cyclohexylalanyl-2,2-bis(phenylmethyl)-β-alanyl-D-Arginine)을 제외하고,
여기에서, R1, R2, R3 및 R4 중 임의의 2개는 수소 원자이고, 2개는 적어도 7개의 비수소 원자를 포함하며, 친유성이며 시클릭기를 포함하는, 같거나 서로 다를 수 있는 치환기이고, 상기 시클릭기는 α 또는 β 탄소 원자 각각에 직접적으로 결합되지는 않으나 다른 치환기에서 시클릭기에 선택적으로 연결 또는 융합되고, 시클릭기가 융합될 경우 두 개의 치환기에 대하여 결합된 비수소 원자의 총수는 적어도 12개이며, 여기에서 X는 O, C, N 또는 S를 나타내는, 적어도 +2의 알짜 양전하를 가지는 펩티드, 펩티드 모방체 또는 (변경된) 아미노산을 제공한다.
IUPAC 시스템 대신에 화학 초록 형태 명명법을 사용하면, 상기 두 개의 분자는 D-아르기닌, N2-[N-[1-[N2-(N-메틸-L-페닐알라닐)-L-리실]-L-프롤릴]-2,2-비스(페닐메틸)-β-알라닐](D-Arginine, N2-[N-[1-[N2-methyl-L-phenylalanyl)-L-lysyl]-L-prolyl]-2,2-bis(phenylmethyl)-β-alanyl]) 및 D-아르기닌, N2-[N-[3-시클로헥실-N-[1-[N2-(N-메틸-L-페닐알라닐)-L-리실]-L-프롤릴]-D-알라닐]-2,2-비스(페닐메틸)-β-알라닐](D-Arginine, N2-[N-[3-cyclohexyl-N-[1-[N2-(N-methyl-L-phenylalanyl)-L-lysyl]-L-prolyl]-D-alanyl]-2,2-bis(phenylmethyl)-β-alanyl])로 칭할 수 있으며, 그것들이 CAS 번호는 각각 145149-42-4 및 145149-43-5이다.
상기 제외된 화합물은 WO 92/12168에 염증성 질병 상태의 치료에 유용한 아나필라톡신 수용체 리간드(anaphylatoxin receptor ligands)로서 기재되어 있으며, 그러한 것으로서 이 문헌은 본 발명에 의해 해결되는 문제를 다루고 있지 않다.
R1 -4의 두 개의 기에서 결합된 비수소 원자의 총수인 최소 숫자 12는 각 부분(moiety)의 시클릭기가 융합되는 경우, 비융합된 기(7+7=14)의 최소 숫자를 더하고 각 기에서 고리 형성에 효과적으로 참여하는 두 개의 비수소 원자 때문에 2를 뺌으로써 얻어진다는 것을 확인할 수 있을 것이다. 바람직하게는, R1 -4의 두 개의 기에서 결합된 비수소 원자의 총수는 각 부분의 시클릭기가 융합되는 경우 14이다. Cα 또는 Cβ에 결합된 두 개의 기가 한 쌍 이상의 융합된 시클릭기를 포함할 수 있는 경우, 치환기들 사이에 추가적인 연결 결합(linking bond)에 상관없이 복잡하게 융합 및 연결된 기들을 예상할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 두 개의 치환기는 바람직하게는 분자로서 융합되거나 연결되지 않으므로, 가장 큰 움직임의 유연성을 가지는 이 기들이 바람직하다.
일반식 (I)에서의 질소 원자는 물론 간접적으로 Cβ 또는 Cα 를 통하는 것을 제외하고, 바람직하게는 R1 -4 기의 어떠한 원자와도 결합하지 않는다. 바람직하게는, 상기 골격(N-Cβ-Cα-C-X)에서 5개의 원자는 고리형이 아니라 단지 선형의 형식으로 서로 연결된다. 일반식 (I)에서 X 및 N은 그것들의 정상적인 원자가를 가지므로, 전형적으로 그것들은 화합물의 다른 부분, 예를 들어 다른 아미노산 또는 N-말단 혹은 C-말단 캡핑기(capping groups)에 결합하기 때문에 더 치환될 수 있을 것이다.
R1 -4의 치환기는 일반적으로 사실상 친유성이고, 바람직하게는 어떤 전하도 지니지 않으며, 바람직하게는 두 개 이하, 더욱 바람직하게는 하나 이하의 극성기(polar group)를 가진다. R1 -4의 치환기 중 하나 또는 둘 다는 바람직하게는 적어도 8개, 더욱 바람직하게는 적어도 9 또는 10개의 비수소 원자, 예를 들어 7-13, 7-12, 8-12 또는 9-11의 비수소 원자를 포함한다. 이들 두 개의 치환기는 합성이 용이하기만 하면 동일한 것이 바람직하다. 바람직하게는, 두 개의 치환기는 R1 및 R2 또는 R3 및 R4이며, R3 및 R4가 가장 바람직하다.
상기에 언급한 바와 같이, R1 -4의 시클릭기는 그것들이 1 내지 4개의 사슬, 바람직하게는 1 내지 3 원자에 의해 α 또는 β 탄소 원자 양쪽 모두로부터 이격되어 있기 때문에, α 또는 β 탄소 원자 양쪽 모두에 직접적으로 결합하지 않으며; 이들 연결 원자는 질소 및/또는 산소를 포함할 수 있으나 전형적으로 탄소 원자일 것이며, 바람직하게는 상기 연결 원자는 비치환된 것이다. 바람직한 간격 부분(spacing moieties)은 실시예에 나타내었으며, 본원에 정의된 것과 같은 R1 -4의 치환기의 일부분을 형성한다.
X는 치환되거나 비치환될 수 있고, 바람직하게는 N 원자이고 바람직하게는 치환된 것이다. X가 N일 때, 그것은 실시예 1의 분자들에 나타낸 것과 같이 다른 아미노산을 가지는 아미노 결합의 일부분을 형성할 수 있다. 대안적으로, N 원자는 예를 들어 아미노알킬(aminoalkyl) 기 또는 아미노에틸(aminoethyl) 또는 아미노프로필(aminopropyl) 또는 디메틸아미노에틸(dimethylaminoethyl)에 의해 치환될 수 있으며, 이러한 분자들은 실시예 2에 나타내었다. 다른 대안에 있어서, N 원자는 알킬기 또는 아미노알킬기에 의해 그 자신이 치환될 수 있는, 피페라진(piperazine)과 같은 시클릭기의 일부분을 형성할 수 있으며, 이 또한 실시예 2에 나타내었다.
일반식 I의 군을 포함하는 펩티드 또는 펩티드 모방체는 바람직하게는 아미드화되고, 세포용해성 치료제로서 사용하기 위한 분자에 관하여 상기에 기재되어 있는 변경된 C 말단을 가질 것이다.
β 아미노산의 바람직한 치환기를 정의하고 있는 이전의 구절들은 R1 -4의 두 개의 치환기에 대하여 필요한 부분만 약간 수정하여 사용한다. 일반식 I의 군을 포함하는 펩티드 및 펩티드 모방체는 세포용해성 치료제로서 사용하기 위한 것으로서 이 명세서에서 앞서 설명된 분자들의 바람직한 서브셋(subset)이므로, 분자들의 바람직한 특성, 예를 들어 그것들의 길이 및 그것들이 포함하는 다른 아미노산들을 정의하고 있는 이전의 구절들 또한 일반식 I의 군의 그것들의 통합으로 정의된 이 분자들에 적용되며, 반대의 경우도 마찬가지이다. 특히 바람직한 분자는 1 내지 7 또는 8개(예를 들어, 1 내지 5개), 더욱 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개 아미노산 길이이다. 펩티드 모방체 분자는 동일한 숫자의 서브유닛을 포함할 것이나, 이 서브유닛은 전형적으로 아미드 결합의 모방작용에 의해 연결될 것이며, 바람직한 연결은 상기에 언급되어 있고, 에스테르 및 아미노메틸 및 케토메틸렌을 포함한다.
본원의 실시예는 디-펩티드(실시예 1) 및 단일 변경된 아미노산 및 헵타-펩티드(실시예 2 및 4)의 형태로 본 발명의 구조적 모티프를 나타낸다. 상기 실시예의 분자들은 본 발명의 바람직한 분자 및 본 발명에 사용하기에 바람직한 분자를 나타낸다.
본 발명의 펩티드, 펩티드 모방체 및 아미노산은 염의 형태, 시클릭 또는 에스테르화된 것뿐만 아니라 바람직하게는 상기에 언급된 아미드화된 유도체일 수 있다.
본 발명의 분자 및 본 발명에 사용하기 위한 분자의 바람직한 종류는 β, 바람직하게는 상기에 정의된 것과 같은 두 개의 친유성 측쇄(lipophilic side chains)를 포함하는 단일 β2,2-아미노산을 가지는 β2,2-아미노산 유도체, 두 개의 양이온성 기로 측면이 둘러싸인 이치환된 β-아미노산이다. 앞서 설명한 바와 같이, 두 개의 치환기는 바람직하게는 동일하며, 6원자 시클릭기와 적어도 8개, 바람직하게는 적어도 10개의 비수소 원자를 포함한다. 이 분자들은 특히 항균제에 적합하며, 경구 투여에 적합하다.
본원에 기재된 분자들은 임의의 기존의 방법으로 합성될 수 있다. 일반적으로, 존재하는 반응기(reactive groups)(예를 들어, 아미노, 티올 및/또는 카르복실)는 전체 합성과정 동안 보호될 것이다. 따라서, 합성 과정에서의 마지막 단계는 본 발명의 보호된 유도체의 탈보호(deprotection)일 것이다. 화합물 합성의 방법은 본 발명의 다른 양상을 구성한다. 예를 들어, 일 구현에서 본 발명은 본원에 정의된 것과 같은 일반식 I의 군을 포함하는 적어도 +2의 알짜 양전하를 가지는 펩티드, 펩티드 모방체 또는 변경된 아미노산을 합성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 펩티드, 펩티드 모방체 또는 변경된 아미노산으로부터 보호기(protecting group)의 제거를 포함한다.
펩티드를 만드는데 있어서, 비록 C-말단에서 시작하는 방법이 바람직할지라도, 원칙적으로 C-말단 또는 N-말단 중 어느 하나에서 시작할 수 있다.
펩티드 합성 방법은 당업계에 잘 알려져 있으나, 본 발명에서는 특히 고체상 지지체(solid phase support) 상에서 합성을 수행하는 것이 편리할 수 있으며, 이와 같은 지지체는 당업계에 잘 알려져 있다.
아미노산에 대한 폭넓은 선택의 보호기들이 공지되어 있으며, 적절한 아민 보호기는 카르보벤질옥시(carbobenzyloxy)(Z로도 나타냄), t-부톡시카르보닐(t-butoxycarbonyl)(Boc로도 나타냄), 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠 술포닐(4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzene sulphonyl)(Mtr) 및 9-플루오레닐메톡시-카르보닐(9-fluorenylmethoxy-carbonyl)(Fmoc로도 나타냄)을 포함할 수 있다. 펩티드가 C-말단 끝(C-terminal end)에서부터 만들어질 때, 아민-보호기는 추가되는 각각의 새로운 잔기의 α-아미노기 상에 존재할 것이며, 다음의 결합 단계(coupling step) 이전에 선택적으로 제거될 필요가 있다는 것을 확인할 수 있을 것이다.
예를 들어 사용될 수 있는 카르복실 보호기는 쉽게 분리되는 벤질(benzyl; Bzl), p-니트로벤질(p-nitrobenzyl; ONb) 또는 t-부틸(t-butyl; OtBu) 기와 같은 에스테르기뿐만 아니라 고체 지지체 상의 결합기(coupling group), 예를 들어 폴리스티렌에 연결되어 있는 링크 아미드(Rink amide)를 포함한다.
티올 보호기는 p-메톡시벤질(p-methoxybenzyl; Mob), 트리틸(trityl; Trt) 및 아세트아미도메틸(acetamidomethyl; Acm)을 포함한다.
본 발명의 바람직한 펩티드는 Lys, Orn, Dab 및 Dap의 아민 측쇄뿐만 아니라 트립토판 잔기의 인돌 질소의 보호를 위한 t-부틸옥시카르보닐(t-butyloxycarbonyl; Boc) 보호기를 사용하여 편리하게 제조될 수 있다. Fmoc는 알파-아미노기의 보호를 위하여 사용될 수 있다. Arg, 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤토퓨란-5-술포닐(2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl)를 포함하는 펩티드는 구아니딘 측쇄의 보호를 위하여 사용될 수 있다.
아민- 및 카르복실-보호기를 제거하기 위한 다양한 방법들이 존재한다. 그러나, 이것들은 사용되는 합성 단계와 일치하여야만 한다. 측쇄 보호기는 다음의 결합 단계 이전에 임시의 α-아미노 보호기를 제거하는데 사용되는 조건에 안정해야만 한다.
Boc와 같은 아민 보호기 및 tBu와 같은 카르복실 보호기는 산 처리, 예를 들어 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)에 의해 동시에 제거될 수 있다. Trt와 같은 티올 보호기는 요오드(iodine)와 같은 산화제(oxidation agent)를 사용하여 선택적으로 제거될 수 있다.
펩티드 모방체 화합물을 합성하기 위한 참고문헌 및 기술은 상기에 제공되어 있으며, 당업자들에게 공지되어 있다.
적절한 희석제(diluent), 담체(carrier) 또는 첨가제(excipient)와 혼합된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함하는 제형은 본 발명의 다른 양상을 구성한다. 이와 같은 제형은 그 중에서도 (수의학을 포함하는) 약제학적 목적을 위한 것일 수 있으므로, 적절한 희석제, 담체 또는 첨가제는 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 것일 것이다. 적절한 희석제, 첨가제 및 담체는 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 기재된 분자들은 사실상 세포용해성(cytolytic)이고, 특히 항미생물, 예를 들어, 항균제 또는 항진균제로서 유용하며, 항균 용도가 바람직하다. 상기 분자들의 특이성은 또한 그것들이 항종양제로서 적합하도록 만들어 준다. 따라서, 또 다른 양상에서, 본 발명은 일반식 I의 군:
Figure 112012044013751-pct00002
을 포함하지만, 화합물 N-메틸-L-페닐알라닐-L-리실-L-프롤릴-2,2-비스(페닐메틸)-β-알라닐-D-아르기닌(N-methyl-L-phenylalanyl-L-lysyl-L-prolyl-2,2-bis(phenylmethyl)-β-alanyl-D-Arginine) 및 N-메틸-L-페닐알라닐-L-리실-L-프롤릴-D-시클로헥실알라닐-2,2-비스(페닐메틸)-β-알라닐-D-아르기닌(N-methyl-L-phenylalanyl-L-lysyl-L-prolyl-D-cyclohexylalanyl-2,2-bis(phenylmethyl)-β-alanyl-D-Arginine)을 제외하고,
여기에서, R1, R2, R3 및 R4 중 임의의 2개는 수소 원자이고, 2개는 적어도 7개의 비수소 원자를 포함하며, 친유성이며 시클릭 기를 포함하는, 같거나 서로 다를 수 있는 치환기이고, 상기 시클릭기는 α 또는 β 탄소 원자 각각에 직접적으로 결합되지는 않으나 다른 치환기에서 시클릭기에 선택적으로 연결 또는 융합되고, 시클릭기가 융합될 경우 두 개의 치환기에 대하여 결합된 비수소 원자의 총수는 적어도 12개이며, 여기에서 X는 O, C, N 또는 S를 나타내는, 치료에 사용하기 위한 적어도 +2의 알짜 양전하를 가지는 펩티드, 펩티드 모방체 또는 (변경된) 아미노산을 제공한다.
본 발명은 일반식 I의 군:
Figure 112012044013751-pct00003
을 포함하고,
여기에서, R1, R2, R3 및 R4 중 임의의 2개는 수소 원자이고, 2개는 적어도 7개의 비수소 원자를 포함하며, 친유성이며 시클릭 기를 포함하는, 같거나 서로 다를 수 있는 치환기이고, 상기 시클릭기는 α 또는 β 탄소 원자 각각에 직접적으로 결합되지는 않으나 다른 치환기에서 시클릭기에 선택적으로 연결 또는 융합되고, 시클릭기가 융합될 경우 두 개의 치환기에 대하여 결합된 비수소 원자의 총수는 적어도 12개이며, 여기에서 X는 O, C, N 또는 S를 나타내는, 세포용해성 치료제로서 사용하기 위한 적어도 +2의 알짜 양전하를 가지는 펩티드, 펩티드 모방체 또는 (변경된) 아미노산을 제공한다. 바람직하게는 상기 용도는 항미생물, 특히 항균제 또는 항종양제로서의 용도이다.
다른 양상에서, 본 발명은 상기에 정의된 것과 같은 펩티드, 펩티드 모방체 또는 변경된 아미노산을 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 미생물 감염, 바람직하게는 세균 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 상기에 정의된 것과 같은 펩티드, 펩티드 모방체 또는 변경된 아미노산을 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포를 치료하거나 종양의 성장, 기관 확산 또는 전이를 예방 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 미생물 감염, 바람직하게는 세균 감염을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 상기에 정의된 것과 같은 펩티드, 펩티드 모방체 또는 변경된 아미노산의 용도를 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 종양 세포를 치료하거나 종양의 성장, 기관 확산 또는 전이를 예방 또는 감소시키기 위한 약제의 제조에서의 상기 정의된 것과 같은 펩티드, 펩티드 모방체 또는 변경된 아미노산의 용도를 제공한다.
미생물 감염은 다중 병원성 감염일 수 있거나 다중 병원성 감염으로 의심될 수 있으며, (예를 들어, 만성 창상의 부위에서의) 이러한 감염, 예를 들어 그람 양성 및 그람 음성 세균 종을 모두 포함하는 감염의 치료는 본 발명에 따른 용도를 위한 바람직한 표적 및 방법을 대표한다.
투여되는 양은 환자에게서 표적 세포의 전부 또는 일부를 죽이거나, 그것들의 증식을 방지 또는 증식 속도를 감소시키거나, 전이를 억제하거나 그렇지 않으면 종양의 유해한 효과를 줄이는데 효과적이어야만 한다. 임상의 또는 환자는 하나 또는 그 이상의 종양에 관련된 매개변수 또는 증상에서의 개선을 관찰하여야만 한다. 투여는 또한 예방을 위한 것일 수 있다. 환자는 전형적으로 인간 환자일 것이나, 애완동물 또는 가축과 같은 비인간 동물 또한 치료될 수 있다.
단백질 표적을 가지는 대다수의 약제와는 달리, 본 발명의 분자는 다양한 암을 표적으로 할 수 있다. 바람직한 암 표적은 림프종(lymphomas), 백혈병(leukemias), (예를 들어, 뇌에서의) 신경모세포종(neuroblastoma)과 교아세포종(glioblastomas), (특히, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 전립선 및 피부에서의) 암종(carcinomas)과 선암종(adenocarcinomas) 및 흑색종을 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 예를 들어, 경구(oral), 국부(topical), 비강(nasal), 비경구(parenteral), 정맥내(intravenal), 종양내(intratumoral), 직장(rectal) 또는 국소(regional)(예를 들어, 사지 격리 관류법(isolated limb perfusion)) 투여에 적합한 형태로 존재할 수 있다. 투여는 전형적으로 비경구적 방법, 바람직하게는 피하(subcutaneously), 근육내(intramuscularly), 피막내(intracapsularly), 척수내(intraspinaly), 종양내(intratumouraly) 또는 정맥내(intravenously) 주사에 의한다.
본원에 정의된 활성 화합물은 정제(tablet), 코팅정(coated tablets), 비강 스프레이(nasal sprays), 용액(solutions), 에멀전(emulsions), 리포좀(liposomes), 파우더(powders), 캡슐(capsules)과 같은 투여의 전통적인 약제학적 형태 또는 방출지연 형태(sustained release forms)로 존재할 수 있다. 전통적인 약제학적 첨가제뿐만 아니라 제조의 통상적 방법이 이러한 형태의 제조를 위하여 사용될 수 있다.
기관 특이적 담체 시스템(organ specific carrier systems) 또한 사용될 수 있다.
주사 용액은 예를 들어, p-하이드록시벤조에이트(p-hydroxybenzoates)와 같은 방부제 또는 EDTA와 같은 안정화제의 첨가에 의한 것과 같은 기존의 방법으로 제조될 수 있다. 상기 용액은 그 후 주사 바이알 또는 앰플 안에 채워진다.
바람직한 제형은 펩티드가 식염수에 용해된 것이다. 이러한 제형은 예를 들어, 주사에 의하여 또는 바람직하게는 (부분 격리를 포함하는) 사지, 몸통 또는 기관 격리 관류/투입에 의한 바람직한 투여 방법, 특히 국부 투여, 즉 종양 내 투여에 사용하는데 적합하다.
활성 분자를 포함하는 투약 단위는 바람직하게는 0.1-10mg, 예를 들어 1-5mg의 항종양제를 포함한다. 약제학적 조성물은 추가적으로 활성 성분을 더 포함할 수 있으며, 다른 항종양 펩티드와 같은 다른 세포용해제를 포함할 수 있다. 다른 활성 성분은 서로 다른 타입의 사이토카인(cytokines), 예를 들어, INF-γ, TNF, CSF 및 성장인자, 면역조절제(immunomodulator), 화학치료제, 예를 들어, 시스플라틴(cisplatin) 또는 항체(antibodies) 또는 암 백신(cancer vaccines)을 포함할 수 있다.
이러한 조성물을 전신에 사용함에 있어서, 활성 분자는 적어도 약 5μg/ml의 생활성 분자의 혈청 농도를 달성하기 위한 양으로 존재한다. 일반적으로, 혈청 농도는 500μg/ml을 넘을 필요는 없다. 바람직한 혈청 농도는 약 100μg/ml이다. 이와 같은 혈청 농도는 1 내지 약 10mg/kg의 복용량으로 전신에 투여되는 조성물에 활성 분자를 포함함으로써 달성될 수 있다. 일반적으로, 분자들은 100mg/kg을 초과하는 양으로 투여될 필요는 없다.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) 적어도 +2의 알짜 양전하를 가지며 본원에 정의된 것과 같은 일반식 (I)의 군을 포함하는 펩티드, 펩티드 모방체 또는 변경된 아미노산, 및 (b) 미생물 감염의 치료 또는 예방에 별개로, 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 조합 제제로서 항균제를 더 포함하는 제품을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 적어도 +2의 알짜 양전하를 가지며 본원에 정의된 것과 같은 일반식 (I)의 군을 포함하는 펩티드, 펩티드 모방체 또는 변경된 아미노산, 및 (b) 종양 세포의 치료에 별개로, 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 조합 제제로서 항종양제를 더 포함하는 제품을 제공한다.
펩티드 및 유사한 분자들의 염의 형태 및 적절한 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 본 발명의 화합물 및 본 발명의 방법 및 용도에 적합한 화합물은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명을 도면을 참조하여 본 발명의 범위를 벗어나는 몇몇의 참조 분자들을 포함하는 하기 실시예에 더 설명하였다.
실시예
실시예 1
C-말단 L-아르기닌 아미드 잔기에 결합된 아키랄 친유성 3-아미노-2,2-이치환된 프로피온산(β2,2-아미노산)의 스캐폴드에 기초한 일련의 분자들을 제조하고, 그것들의 항균 활성을 테스트하였다. 이 디-펩티드들은 β2,2-아미노산 유도체 때문에 트리-펩티드의 측쇄 기능을 가진다. β2,2-아미노산 유도체의 다양한 친유성 치환기들을 도 1에 나타낸 것과 같이 분석하였다. 화합물 4a-n의 합성의 개요를 도 2에 나타내었다.
시약 및 분석 방법
400 또는 600 MHz 배리언 분광계(Varin spectrometers)로 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 기록하였다. 마이크로매스 쿼트로 LC(Micromass Quattro LC)(Micromass, Manhester, UK)로 질량 스펙트럼을 얻었다. 워터스 마이크로매스 LCT 프리미어(Waters Micromass LCT Premier)(Micromass, Manchester, UK)로 고해상도 질량 스펙트럼을 얻었다. 상업적으로 입수가능한 화합물 및 용매들을 시그마-알드리치로부터 구입하여 추가 정제 없이 사용하였다. RP BondaPak C18(125Å, 10㎛, 25×100mm) 컬럼이 장착된 워터스 시스템 상에서 예비적 RP-HPLC를 수행하고, 각각 0.1% TFA를 포함하는 아세토니트릴 및 물을 사용하여 용출하였다. RP-HPLC Delta Pak C18(100Å, 5㎛, 3.9×150mm) 워터스 컬럼이 장착된 워터스 2695 HPLC 상에서 분석적 HPLC를 수행하고, 210 내지 310nm의 파장으로부터 PDA 검출기 스패닝(PDA detector spanning)을 사용하여 214nm 파장에서 분석하였다. 모든 화합물들은 래들리®(Radleys®)로부터 병렬 반응 캐러셀(parallel reaction carousels)을 사용하여 제조하였다.
메틸 시아노아세테이트의 디알킬화를 위한 일반적인 방법( GP1 ) 1a-n
메탄올(0.2M)에 소디움 메톡시드(sodium methoxide)(20mmol)을 용해하고, 메틸 시아노아세테이트(methyl cyanoacetate)(20mmol)를 첨가하였다. 5분 후 상온에서 교반하였다. 바람직한 벤질 브로마이드(benzyl bromide)(20mmol)를 첨가하고, 상기 용액을 환류하기 위하여 가열하였다. 15분 후, 상기 용액을 상온에서 냉각하였다. 제2의 소디움 메톡시드(20mmol)를 첨가하고, 5분 후 상온에서 교반하였다. 제2의 원하는 벤질 브로마이드(20mmol)를 첨가하고, 다시 한번 15분간 환류시켰다. 반응 혼합물의 부피를 진공하에서 약 1/3로 감소시키고, 물/에틸 아세테이트로 추출하였다. 건조를 위해 유기상(organic phase)을 NgSO4로 건조시키고 증발시켰다. 생성물을 어떠한 추가 정제도 하지 않고 하기의 합성에 사용하였다.
Ra / Ni 를 사용한 아민의 니트릴의 감소 및 그 후의 Boc -보호를 위한 일반적인 방법( GP2 ) 2a-n
메탄올(0.1M)에 용해시킨 바람직한 니트릴(3.5mmol)을 아세트산(대략 1ml/g 니트릴)과 함께 첨가하기 전, 아르곤 하에서 Ra/Ni(대략 2ml/g 니트릴)을 메탄올로 3번 세척하였다. 반응 혼합물을 1 바(bar)의 H2 압력하에서 5일간 45℃에서 수소화하였다. 그 뒤에 건조를 위하여 증발시키기 전에 Ra/Ni를 제거하기 위하여 상기 반응 혼합물을 셀라이트(Celite)를 통하여 여과하였다. 조(crude) β2,2-아미노산 메틸 에스테르(0.35mmol)을 1,4-디옥산과 물의 혼합물(5:1, ~0.35M)에 용해시키고, TEA를 사용하여 pH를 8로 조정하고, 가능한 최대한 적은 1,4-디옥산에 용해시킨 BoC2O를 첨가하였다. 10% 시트르산을 사용하여 pH 2-3으로 산성화시키기 전, 약 18시간 동안 상온에서 용액을 교반하고, 에틸 아세테이트로 3번 추출하였다. 건조를 위하여 유기상을 MgSO4로 건조시키고, 증발시켰다. 생성물을 임의의 추가 정제 없이 하기 합성에 사용하였다.
에스테르가수분해( esterhydrolysis )의 일반적인 방법( GP3 ) 3a-n
Boc-보호된 B2,2-아미노산 메틸 에스테르(0.35mmol)를 1,4-디옥산과 물(3:1, 1.17mmol)의 혼합물에 용해시키고, 가능한 적은 물에 용해시킨 리튬 하이드록시드(lithium hydroxide)(2.1mmol)를 첨가하였다. 부피를 감압하에서 대략 1/5로 감소시키기 전, 반응 혼합물을 18시간 동안 N2 하의 환류에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물에 물(10ml)을 첨가하고, 0.1M HCl을 한 방울씩 사용하여 pH를 1-2로 조정하였다. 이 수용액을 동량의 에틸 아세테이트를 사용하여 3번 추출하였다. 유기상을 MgSO4로 건조시키고, 건조를 위하여 증발시켰다. 생성물을 임의의 추가 정제 없이 하기 합성에 사용하였다.
Boc -보호된 B 2,2 -아미노산의 L-아르기닌 결합을 위한 일반적인 방법( GP4 ) 4a-n
Boc-보호된 B2,2-아미노산(0.2mmol)을 DNF(0.02M)에 용해하고, DIPEA(0.6mmol)를 TFFH(0.2mmol)과 함께 첨가하였다. H-Arg-NH2×2HCl(0.3mmol)를 첨가하기 전, 상기 아미노산을 2시간 동안 미리 활성화시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 소금물로 세척하기 전, 7일간 상온에서 교반하였다. 유기상을 MgSO4로 건조시키고, 건조를 위하여 증발시켰다. 조 Boc-보호된 생성물을 DCM(~0.4M)에 용해시킴으로써 탈보호화시키고, 동량의 TFA:TIS:물(95:2.5:2.5)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 건조를 위하여 증발시키기 전 2시간 동안 상온에서 교반하였다. 조 생성물을 예비 RP-HPLC로 정제하였다. 상기 용액을 건조를 위하여 증발시키기 전, 펩티드의 순도를 분석 RP-HPLC로 체크하였고, 잔류물을 물에 재용해하여 감압하에 동결건조하였다. 모든 화합물은 약 95%의 순도를 가졌다.
세포 테스트
토스랩 에이/에스(TosLab A/S)(Tromso, Norway)로 항균 테스트를 수행하였다. 각 화합물을 물에 1mg/ml로 희석하여, 용해도 문제 때문에 50, 35, 15, 10, 5, 2.5, 1, 0.5㎍/ml에서 테스트한 4n을 제외하고는 200, 100, 50, 35, 15, 10, 5, 2.5, 1, 0.5㎍/ml에서 두 번 테스트하였다. 테스트된 화합물 모두 di TFA 염이었다.
세균 균주를 지수적 성장(exponential growth)이 달성될 때까지 2% 박토 펩톤 워터(bacto peptone water)에 배양하였다. 37℃에서 1% 박토 펩톤 워터에 밤새 배양하여 MIC를 측정하였다. 2×106cfu/ml의 세균 농도를 사용하였다. 모든 세균 균주에 대하여 음성 대조군(펩티드 없음)과 양성 대조군(겐타마이신)을 모두 사용하였다. 웰의 탁도(turbidity)에 의해 성장 또는 성장하지 않음을 판단하였다. MIC 값 그리고 MIC 값 이상에서 모든 농도로 아가 플레이트에 도말하고, 밤새 37℃에서 배양하고, 성장 또는 비성장을 측정함으로써 MBC를 측정하였다.
50㎍/ml보다 적은 MIC 값을 나타내는 모든 화합물들을 동일한 방법을 사용하여 다시 테스트하였다.
MIC 및 MBC 값을 표 1A 및 B에 나타내었다.
리틱스 바이오파르마 에이/에스(Lytix Biopharma A/S)(Tromso, Norway)로 인간 적혈구에 대한 용혈성 테스트를 수행하였다. 용해도 문제 때문에 단지 0.5mg/ml 이하에서만 테스트한 4k 및 4n을 제외하고는, 각각의 화합물을 1mg/ml 및 그 이하의 농도로 테스트하였다. 건강한 남성 도너로부터 8mL의 피를 수집하였다. 상기 혈액을 동일하게 나누고, 상용 EDTA를 포함하는 시험관(BD vacutainer, 7.2mg K2 EDTA)과 40μL의 헤파린 용액(0.9% 염화나트륨에 용해시킨 1000U/mL)을 포함하는 10mL의 반응 바이알에 분배하였다. 30분 후, EDTA가 처리된 혈액의 적혈구 용적율(hematocrit)을 측정하였다. 헤파린 처리된 혈액을 1500rpm에서 10분간 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 그 후, RBCs를 미리 예열한 PBS로 세 번 세척하고, 10% 적혈구 용적율로 희석하였다. 화합물을 PBS(1μg/mL 내지 1000μg/mL의 농도)에 용해하고, 적혈구를 1시간 동안 37℃에서 교반하에 배양하였다. 최종 농도 0.1% 트리톤 X-100을 포함하는 양성 대조군 및 순수한 PBS 버퍼를 포함하는 음성 대조군을 포함하였다. 샘플을 5분간 원심분리하고(4000rpm), 상층액의 흡광도를 405nm에서 측정하였다. 50%의 용혈작용에 해당하는 값을 표 1A에 나타내었다.
α- 키모트립신에 대한 안정성
물에 1mg/ml로 원하는 화합물을 용해시킴으로써 α-키모트립신에 대한 안정성 테스트를 수행하였다. α-키모트립신을 2mM CaCl2를 포함하는 1mM HCl에 0.1mg/ml로 용해하였다. 10mM CaCl2를 포함하는 100mM TRIS HCl에서 효소적 분해를 수행하였다. 최종 효소 농도는 2μg/ml이었으며, 최종 펩티드 농도는 100μg/ml이었다. 총 부피는 0.5ml이었다.
15μl의 샘플을 0, 15, 30, 60, 120 및 240분에 수집하고, 그리고 추가로 24시간 및 48시간의 샘플을 수집하였다. 샘플에 외부 표준(external standard)(아테놀올 하이드로클로라이드(atenolol hydrochloride))을 첨가하고, 물을 사용하여 1ml로 희석하기 전 분해를 중지시키기 위하여 100μl 10% 아세트산을 첨가하였다.
모든 테스트에 대하여, 분해가 다른 인자 때문이 아니라 효소 활성 때문이라는 것을 확실히 하기 위하여 효소를 사용하지 않은 음성 대조를 하였다. 숙시닐-알라닌-알라닌-프롤린-페닐-파라 니트로아닐린(Succinyl-ala-ala-pro-phe-para nitroaniline)을 양성 대조군으로 사용하였다. 모든 테스트를 세 번 수행하였다.
결과
S. 아우레우스(S. aureus), MRSA, MRSE 및 에스케리키아 콜리(E.coli)에 대한 최소 저해 농도(Minimum inhibitory concentration; MIC) 및 본 연구에서 제조된 항균 펩티드에 대한 인간 RBC의 EC50 값
[표 1a]
Figure 112012044013751-pct00004
a 테스트된 가장 최고 농도는 200μg/ml이었다.
b 테스트된 가장 최고 농도는 1000μg/ml이었다.
c 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus; ATCC 25923)
d 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin resistant Staphylococcus aureus; ATCC 33591)
e 메티실린 내성 표피포도상구균(methicillin resistant Staphylococcus epidermidis; ATCC 27626)
f 에스케리키아 콜리(Escherichia coli; ATCC 25922)
g 인간 적혈구 세포(human red blood cells)
기호 "-"는 테스트된 농도 범위 내에서 활성(MIC 또는 EC50)이 검출되지 않음을 나타낸다. n.t: 테스트하지 않음
[표 1b]
S. 아우레우스(S. aureus), MRSA, MRSE 및 에스케리키아 콜리(E.coli)에 대한 최소 살균 농도(Minimum bacteriocidal concentration; MBC). 균주는 상기 표 1a에 나타낸 것들과 동일하다.
Figure 112012044013751-pct00005

선택된 여섯 개의 화합물(4c, 4g, 4h, 4i, 4k 및 4m)을 α-키모트립신에 대한 단백질 가수분해성 안전성을 조사하기 위하여 조사하였다. 그 결과는 48시간 동안 어떠한 화합물에 대한 분해도 검출되지 않았음을 나타내었다. 또한, 모든 테스트 화합물들이 적어도 48시간 동안 pH 7.4의 수용액에서 화학적으로 안정함을 발견하였다.
상기 결과는 항균 효능과 제조된 화합물 전체의 친유성 사이의 강력한 연관성을 나타낸다. 이는 S.아우레우스에 대한 화합물의 효능 및 컬럼의 소수성 고정상(hydrophobic stationary phase)에 대한 화합물의 친화력을 보여주는 분석적 RP-HPLC 상에서의 그것들의 체류 시간(retention time; Rt) 사이의 비교에 의하여 설명될 수 있다(결과는 도시하지 않음).
제조된 화합물의 용혈 활성은 독성의 측정으로서 사용되며, 화합물 4g, 4j 및 4h를 제외하고는, 상기 화합물들은 테스트된 농도 범위(<1000㎍/ml) 내에서 비용혈성이었다. 화합물 4n이 가장 높은 용혈 활성을 보였으나, 그럼에도 불구하고 EC50 농도는 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 모두에 대한 MIC 값보다 10배 내지 거의 50배 더 높았다. 유사한 항균 효능을 나타내는 화합물 4j 및 4k는 용혈 활성에 대하여 꽤 달랐다. 이는 용혈 활성과 항균 효능이 정확히 동일한 구조적 특성에 의해 측정되지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 2
본 발명의 또 다른 분자를 만들고, 항균 및 항암 활성 모두를 테스트하였다.
물질 및 방법
세균 균주
스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(ATCC 25923)
메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin resistant Staphylococcus aureus)(ATCC 33591)
메티실린 내성 표피포도상구균(Methicollin resistant Staphylococcus epidermidis)(ATCC 27626)
에스케리키아 콜리(Escherichia coli)(ATCC 25922)
암세포주
A20 또는 MethA
독성 연구에 사용하기 위한 세포
MRC-5 및 인간 RBC
다양한 검정법에 사용된 최고 농도
항균 검정법 : 200㎍/ml
항암 검정법 : 500㎍/ml
MRC-5 검정법 : 500㎍/ml
RBC 검정법 : 1000㎍/ml
물리화학적 특성 Log P, tPSA 및 CLogP를 계산하기 위하여, 캠드루 울트라 버전 11.0( ChemDraw Ultra version 11.0)을 사용하였다.
분자의 합성
레진의 팽창: 링크 아미드 MBHA 레진(Rink amide MBHA resin)(0.64mmol/g 로딩)을 1시간 동안 7mL DMF에서 팽창시킨 후, 7ml의 DMF로 5번 세척하였다.
Fmoc-제거: DMF에 용해시킨 7ml의 20% 피페리딘을 반응 시험관에 첨가하고, 현탁액을 10분간 교반한 후 용액을 제거하였다. 1분간의 교반을 두 번 반복한 후, 레진을 7ml DMF로 5번 세척하였다.
비보호된 레진에 대한 아미노산의 결합: Fmoc-Lys(Boc)-OH 또는 Fmoc-Trp(Boc)-OH(4 eq.), HOBt 수화물(4 eq.) 및 HBTU(3.92 eq.)를 5ml의 DMF에 용해시키고, DIPEA(8 eq.)를 첨가하고, 혼합물을 15분간 미리 활성화시킨 후 레진에 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후, 결합 혼합물을 제거하고, 레진을 7ml DMF로 5번 세척하였다.
비보호된 레진에 대한 β-아미노산의 결합: Fmoc-β-aa-OH(2 eq.) 및 TFFH(1.96 eq.)을 5ml DMF에 용해시키고, DIPEA(8 eq.)을 첨가하고, 혼합물을 15분간 미리 활성화시킨 후 레진에 첨가하였다. 48시간 동안 교반한 후, 결합 혼합물을 제거하고, 레진을 7ml DMF로 5번 세척하였다.
비보호된 레진에 대한 β-아미노산 후의 아미노산의 결합: Fmoc-Trp(Boc)-OH(4 eq.) 및 TFFH(3.92 eq.)을 5ml DMF에 용해시키고, DIPEA(8 eq.)을 첨가하고, 혼합물을 15분간 미리 활성화시킨 후 레진에 첨가하였다. 24시간 동안 교반한 후, 결합 혼합물을 제거하고, 레진을 7ml DMF로 5번 세척하였다.
최종 결합 후, 레진을 DCM으로 5번 세척한 후 밤새 자연건조시켰다.
레진으로부터의 분리 및 Boc-제거: 10ml TFA-TIS:물(95:2.5:2.5)을 반응 시험관에 첨가하고, 현탁액을 2시간 동안 교반한 후, 펩티드 용액을 회수하였다. 10분간의 교반을 두 번 반복하였다. 회수된 펩티드 용액을 건조를 위해 감압하에서 증발시키고, 에틸 에테르로 침전시키고 디에틸 에테르로 세척하였다. 펩티드를 HPLC로 정제하고 동결건조하였다.
세포 테스트
적합한 방법은 실시예 1에 기재하였다.
결과
β2,2-아미노산 1,2-디아미노 에탄 유도체의 생물학적 효능(모든 값은 ㎍/ml이다)
[표 2]
Figure 112012044013751-pct00006
Figure 112012044013751-pct00007
Figure 112012044013751-pct00008
Figure 112012044013751-pct00009
Figure 112012044013751-pct00010
* 테스트 배양액에서의 낮은 용해도
2* 감소된 수용해도 때문에 가장 높은 농도로 테스트함
n.t = 테스트하지 않았음
[표 3]
헵타-β-펩티드의 생물학적 효능(모든 값은 ㎍/ml로)
Figure 112012044013751-pct00011
Figure 112012044013751-pct00012
Figure 112012044013751-pct00013
n.t = 테스트하지 않았음
* 두 세트의 결과는 두 개의 개별적인 스크리닝(및 각 스크리닝에서의 세 번의 병렬 시험의 평균) 때문이다
[표 4]
β2,2-아미노산 디메틸아미노-에틸 유도체의 생물학적 효능(모든 값은 ㎍/ml이다)
Figure 112012044013751-pct00014
Figure 112012044013751-pct00015
n.t = 테스트하지 않았음
[표 5]
β2,2-아미노산 N-메틸 피페라진 유도체의 생물학적 효능(모든 값은 ㎍/ml이다)
Figure 112012044013751-pct00016
Figure 112012044013751-pct00017
n.t = 테스트하지 않았음
[표 6]
β2,2-아미노산 N,N-디메틸아미노-에틸-피페라진 유도체의 생물학적 효능(모든 값은 ㎍/ml이다)
Figure 112012044013751-pct00018
n.t = 테스트하지 않았음
[표 7]
Figure 112012044013751-pct00019
n.t = 테스트하지 않았음
실시예 3
실시예 2에 기재된 화합물 7을 두 개의 일반 세포주 및 9개의 암 세포주에 대하여 스크리닝하였다.
모든 세포주는 인간 기원의 것들이었다. 화합물 7의 스톡 용액을 10% DMSO를 포함하는 검정 매질(assay media)에 용해시켰다. 세 개의 병렬 시험을 각 세포주에 대하여 수행하였다.
A20 암 세포에 대한 화합물 7의 이전 결과는 IC50 0.7㎍/ml이었고, RBC에 대하여 292㎍/ml이었다(표 2). MRC-5 세포에 대한 화합물 7의 이전 테스트는 IC50 13.5 및 14㎍/ml이었으나, 패널 스크리닝은 IC50 8.21㎍/ml이었다.
[표 8]
두 개의 일반 세포주(MRC-5 및 HUV-EC-C) 및 9개의 암 세포주에 대한 화합물 7의 패널 스크리닝으로부터의 결과
Figure 112012044013751-pct00020

실시예 4
본 발명의 β2,2-아미노산 유도체를 만들어 항균 활성을 테스트하고, 경구 투여에 대한 그것의 안정성을 연구하였다.
합성 β2,2-아미노산 유도체(도 3)를 도 4에 나타낸 단계에 따라 합성하였다. β-아미노를 제조하기 위한 다양한 방법을 포함하는 리뷰에 대하여 아벨레, 에스 등을 참고하라(Abele, S. et al. Eur. J. Org. Chem. [2000] 2000, 1-15). Boc-보호된 β2,2-아미노산 3a-d를 4개의 서로 다른 C-말단 양이온기에 결합시켰다(도 4). 수율을 향상시키기 위하여, 1.5 eq.의 결합제 TFFH를 최종 결합 단계에서 사용하였고, 상기 β2,2-아미노산 또한 표준 10분 대신 TFFH와 함께 2시간 동안 미리 활성화시켰다. 결합 반응에 뒤이어 질량분석(mass spectrometric analysis)을 하고, Na2CO3 수용액을 첨가하여 반응을 종결하였다. 그러나, 입체적 장애(sterical hindrance) 때문에 C-말단 양이온기의 부착을 위한 결합 시간이 7일까지 연장되었다.
1a-d 의 합성을 위한 일반적인 방법
크로닌 등에 의하여 이전에 보고된 합성에 기초하여 합성하였다(Cronin et al. Anal. Biochem. [1982] 124, 139-149). 간단히 말해서, 대략 0.2M의 농도를 만들기 위하여 메탄올에 소디움 메톡시드(sodium methoxide)(20mmol)를 용해시킨 후, 메틸 시아노아세테이트(methyl cyanoacetate)(20mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 상온에서 5분간 교반하였다. 원하는 벤질 브로마이드(benzyl bromide)(20mmol)을 첨가하고, 용액을 15분간 환류하기 위하여 가열한 후, 용액을 상온으로 냉각시키고, 두번째 소디움 메톡시드(20mmol)를 첨가하였다. 5분간 상온에서 교반한 후, 다른 원하는 벤질 브로마이드(10mmol)를 첨가한 뒤, 다시 15분간 환류하였다. 대략 2/3의 메탄올을 진공하에서 제거한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 물로 세척하였다. 건조를 위하여 유기상을 MgSO4로 건조하고 여과시킨 후 증발시켰다. 생성물 1a-d를 임의의 다른 추가 정제 없이 하기의 합성에 사용하였다.
2a-d 의 합성을 위한 일반적인 방법
상기 크로닌 및 보단스키 등(Bodanszky et al. "The practice of peptide synthesis" Springe-Verlag 1994)에 의하여 이전에 보고된 합성에 기초하여 합성하였다. 간단히 말해서, 물을 제거하기 위하여 Ra/Ni(전형적으로, 2mL)를 메탄올로 세척한 후, 최종농도 대략 0.1M의 메틸 시아노아세테이트(methyl cyanoacetate) 유도체(1a-d)를 얻기 위하여 원하는 1a-d(3.5mmol)를 아세트산(전형적으로, 1ml) 및 메탄올과 함께 첨가하였다. 반응 혼합물을 1 바(bar)의 H2 하에서 5일간 고정시킨 환류 냉각기(reflux condenser)를 사용하여 45℃에서 수소화시킨 후, Ra/Ni를 여과시키고 반응 혼합물을 건조를 위해 증발시켰다. 조 β2,2-아미노산 메틸 에스테르를 1,4-디옥산(1,4-dioxane)과 물 5:1의 혼합물(0.35M)에 용해시키고, pH를 TEA를 사용하여 8로 조정한 후, 1,4-디옥산에 가능한 적게 용해시킨 Boc2O(1.5 eq.)를 첨가하고, 용액을 18시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 0.1M HCl을 사용하여 4-5로 산성화시켜 에틸 아세테이트로 3번 추출한 후, 건조를 위해 유기상을 MgSO4로 건조하여 여과시키고 증발시켰다. 조 생성물 2a-d를 임의의 추가 정제 없이 하기 합성에 사용하였다.
3a-d 의 합성을 위한 일반적인 방법
씨배치 등의 간행물에 기초하여 합성하였다(Seebach et al. Helv. Chim. acta [1998] 81, 2218-2243). 간단히 말해서, 최종 농도를 대략 1.2mM로 하기 위하여 1,4-디옥산과 물 3:1의 혼합물에 조 Boc-보호된 β2,2-아미노산 메틸 에스테르 2a-d(0.35mmol)을 용해한 후, 가능한 적은 양의 물에 용해시킨 리튬 하이드록시드(lithium hydroxide)(2.1mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류를 위해 가열하고 18시간 동안 정치한 후, 진공하에서 부피를 대략 1/5로 감소시키고, 0.1M HCl을 천천히 첨가함으로써 pH를 1-2로 조정하였다. 수용액을 에틸 아세테이트로 3번 추출한 후, 건조를 위하여 유기상을 MgSO4로 건조하여 여과시키고 증발시켰다. 조 생성물 3a-d를 임의의 추가 정제 없이 하기의 합성에 사용하였다.
4a-d, 5a-d, 6a-d 및 7a- d 의 합성을 위한 일반적인 방법
챤 및 화이트 등의 교과서에 기초하여 합성하였다(Chan and White, "Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach", Oxford University Press 2000; p346). 간단히 말해서, Boc-보호된 β2,2-아미노산(3a-d)(전형적으로, 0.2mmol)을 DMF(0.02M)에 용해한 후, DIPEA(3 eq.)를 TFFH(1 eq.)과 함께 첨가하였다. 상기 β2,2-아미노산을 2시간 동안 활성화시킨 후, 원하는 아민(2 eq.)을 첨가하였다. 반응에 뒤이어 MS를 하고, 7일까지 반응시킨 후 에틸 아세테이트로 희석하고 염수로 세척하였다. 건조를 위하여 유기상을 MgSO4로 건조하여 여과시키고 증발시켰다. Boc-보호된 β2,2-아미노산 유도체를 DCM에 용해하여 탈보호시키고, 동량의 TFA:TIS:물(95:2.5:2.5)을 첨가하여 2시간 동안 상온에서 교반한 후, 건조를 위하여 증발시켰다. 조 생성물을 예비적 RPHPLC로 정제하고 동결건조시켰다. 상기 화합물의 순도를 210nm 내지 310nm로 스패닝하는 PDA 검출기(PDA detector)와 함께 분석적 HPLC로 확인하였다. 모든 화합물들은 95% 이상의 순도를 가졌다.
항균 활성
각 화합물을 200, 100, 50, 35, 15, 10, 5, 2.5, 1, 0.5㎍/ml로 두 번 테스트하였다. 모든 테스트된 화합물들은 디-플루오로아세트산염(di-trifluoroacetic acid salts)이었다.
용혈 활성
헤파린 처리된 인간 혈액의 혈장 분획을 먼저 원심분리로 제거하고, 37℃로 미리 데워진 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 3번 추가로 세척하였다. 그 후, 인간 적혈구를 10% 헤마토크릿으로 희석하고, 1-1000㎍/ml의 농도 범위를 가지도록 β2,2-아미노산 유도체를 PBS에 용해하였다. 1% v/v의 최종 적혈구 농도가 되도록 희석된 적혈구를 화합물 용액에 첨가하였다. 최종 농도 0.1% v/v에 음성 및 양성 대조군으로서 PBS 및 트리톤 X-100을 포함시켰다. 37℃에서 1시간 동안의 진탕 배양 후, 샘플을 5분간 4000rpm으로 원심분리하였다. 405nm에서 상층액의 흡광도를 측정함으로써 헤모글로빈의 방출을 측정하였다. 하기식에 따라 β2,2-아미노산 유도체를 사용하여 처리된 샘플과 텐시드(tenside) 처리된 샘플의 비율로서 용혈 활성을 계산하였다:
Figure 112012044013751-pct00021

[표 9]
MRSA, MRSE, S. 아우레우스, 대장균 및 P.애루기노사에 대한 최소억제농도(MIC는 μM으로) 및 일련의 작은 β2,2-아미노산 유도체의 인간 RBC에 대한 용혈 활성(EC50은 μM으로). 치료학적 인덱스(therapeutic index)는 EC50 RBC 값을 각 세균 균주에 대한 MIC 값으로 나눔으로써 계산하였다.
Figure 112012044013751-pct00022
테스트된 가장 높은 농도는 a200㎍/ml 및 b1000㎍/ml이다. 모든 β2,2-아미노산 유도체는 그것들의 디-플루오로아세테이트염으로 분리되었고, 몰농도는 상기와 같이 계산되었다. c메티실린 내성 황색포도상구균(ATCC 33591), d메티실린 내성 표피포도상구균(ATCC 27626), e스태필로코커스 아우레우스(ATCC 25923), f에스케리키아 콜리(ATCC 25922), g슈도모나스 애루기노사(ATCC 27853) 및 h인간 적혈구 세포. 표시 "-"는 테스트된 농도 범위 내에서 활성(MIC 또는 EC50)이 검출되지 않았음을 나타낸다.
약물 가능성( drug - likeness ) 및 경구 흡수( oral absorption )
슈뢰딩거의 마에스트로 소프트웨어(Schrodinger's Maestro software) v9.1에 포함된 슈뢰딩거의 QikProp 응용 프로그램을 사용하여, 리핀스키의 5대 법칙(lipinski's rule of five)에 대한 β2,2-아미노산 유도체의 약물 가능성의 평가를 인간에서의 경구 흡수 백분율 평가와 함께 평가하였다. 상기 법칙은 경구 활성 약물은 하기 4개의 기준 중 하나 이상을 위반해서는 안된다고 언급하고 있다: 1) 옥탄올-물 분배계수 로그 P(octanol-water partition coefficient log P)는 5 미만이어야만 함, 2) 분자량(molecular mass; Mw)은 500 달톤을 초과해서는 안됨, 3) 최대 5개의 수소 결합 공여(hydrogen bond donor; HBD) 기가 허용되어야 함, 및 4) 10개 이하의 수소결합 수용(hydrogen bond acceptor; HBA) 기가 있어야만 함. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
[표 10]
리핀스키의 5대 법칙에 대하여 제조된 β2,2-아미노산 유도체의 약물 가능성의 평가 및 인간에서의 경구 흡수 가능성의 계산
Figure 112012044013751-pct00023
a분자량은 비이온화된 β2,2-아미노산 유도체에 대하여 계산하였다. b계산된 수소결합 공여(HBD) 기의 수. c계산된 수소결합 수용(HBA) 기의 수. 상기 값들은 구성의 수에 대한 평균이므로 비정수값(non-integer values)이다. d계산된 옥탄올-물 분배계수 로그 P. e계산된 인간에서의 경구 흡수 백분율. 모든 관측은 슈뢰딩거의 마에스트로 소프트웨어 v9.1에 포함되어 있는 슈뢰딩거 QikProp 응용 프로그램을 사용하여 계산하였다.
계산으로부터 얻어진 결과는 어떠한 화합물도 4개의 법칙 중 하나 이상을 위반하지 않았으므로 모든 β2,2-아미노산 유도체들이 리핀스키의 5대 규칙을 충족함을 나타낸다. 단일 법칙(single rule)은 16개의 제조된 β2,2-아미노산 유도체 중 5개에 의해 깨졌으며, 이 위반들 중 세 개는 500 이상의 분자량 때문이고(4b, 4c 및 4d), 다른 두 개는 허용치 5 이상의 로그 P값 때문이었다(5d 및 6d).
소프트웨어에 의한 인간에서의 경피 흡수 백분율의 계산은 모든 β2,2-아미노산 유도체들이 62% 내지 89%의 범위의 계산된 경구 흡수를 가지는 것에 의하여 상당히 잘 흡수될 것으로 결론을 내렸다. 가장 높은 경구 흡수 백분율은 β2,2-아미노산 유도체 5a, 5b, 5c, 6b 및 6c에서 계산되었고, 모두 86%-89%의 경구 흡수 범위 내에 있었다.
투과성( permeability )
이론적 계산에 힘입어, 최근에 확립된 포스포리피드 베시클에 기초한 장벽 모델(phospholipid vesicle based barrier model)을 사용하여 β2,2-아미노산 유도체의 투과성을 더 조사하였다(Flaten et al. Eur J. Pharm. Sci. [2006] 27, 80-90). MRSA 및 E.coli에 대하여 유사한 효능을 나타내는 4개의 β2,2-아미노산 유도체(4c, 5c, 6c 및 7c)를 조사하였다. 모델의 흡수 유형에 근거하여, 4개의 화합물은 모두 인간에서 중간 정도로 흡수(moderately absorbed)되는 것과 동일한 투과성을 나타내었다. 실험적 투과값(permeability value)에 대하여, 화합물 5c는 가장 높은 투과성을 나타내었고, 그 다음으로는 화합물 6c, 4c 및 7c였다.

Claims (19)

  1. 하기의 일반식 I의 군을 포함하는 적어도 +2의 알짜 양전하(net positive charge)를 가지는 펩티드(peptide), 펩티드 모방체(peptidomimetic) 또는 아미노산 유도체(amino acid derivative)로 이루어지는 세균 감염 또는 종양의 치료에 사용하기 위한 약제로서,
    Figure 112016112346064-pct00030
    (I)

    여기에서, R1, R2, R3 및 R4 중 임의의 2개는 수소 원자이고, 2개는 같거나 서로 다를 수 있는 치환기로서 적어도 8개의 비수소 원자를 포함하고 친유성이며 시클릭기를 포함하되, 상기 시클릭기는 α 또는 β 탄소 원자 각각에 직접적으로 결합되지 않으나 다른 치환기 내 시클릭기에 연결 또는 융합되고, 시클릭기가 융합될 경우 두 개의 치환기에 대하여 결합된 비수소 원자의 총 수는 적어도 12개이며, 여기에서 X는 O, C, N 또는 S를 나타내고, 여기에서 상기 펩티드, 펩티드 모방체 또는 아미노산 유도체는 1 내지 4개의 아미노산 또는 동등한 길이의 서브유닛인 것을 특징으로 하는, 약제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 두 개의 치환기는 같은 것을 특징으로 하는, 약제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 펩티드, 펩티드 모방체 또는 아미노산 유도체는 β2,2 또는 β3,3 이치환된 아미노산인 것을 특징으로 하는, 약제.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    각각의 친유성 치환기는 페닐(phenyl)기 또는 시클로헥실(cyclohexyl)기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 페닐기 또는 시클로헥실기는 치환된 것을 특징으로 하는, 약제.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 페닐기 또는 시클로헥실기는 1 내지 4개의 연결 원자(linking atoms)에 의해 β 아미노산의 α 또는 β 탄소 원자로부터 이격되어 있는 것을 특징으로 하는, 약제.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 페닐기 또는 시클로헥실기는 1 내지 4개의 연결 원자(linking atoms)에 의해 β 아미노산의 α 또는 β 탄소 원자로부터 이격되어 있는 것을 특징으로 하는, 약제.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    각각의 친유성 치환기는 12개 이하의 비수소 원자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서
    상기 펩티드, 펩티드 모방체 또는 아미노산 유도체의 C 말단은 아미드화된 것을 특징으로 하는, 약제.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 펩티드, 펩티드 모방체 또는 아미노산 유도체의 C 말단은 치환된 것을 특징으로 하는, 약제.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 펩티드 또는 펩티드 모방체는 양이온성 아미노산(cationic amino acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 양이온성 아미노산은 아르기닌(arginine) 또는 라이신(lysine)인 것을 특징으로 하는, 약제.
  13. 하기의 일반식 I의 군을 포함하는 적어도 +2의 알짜 양전하(net positive charge)를 가지는 펩티드(peptide), 펩티드 모방체(peptidomimetic) 또는 아미노산 유도체(amino acid derivative)로 이루어지는 체외(ex vivo) 용도를 위한 항균제로서의 조성물로,
    l
    Figure 112016112346064-pct00031
    (I)

    여기에서, R1, R2, R3 및 R4 중 임의의 2개는 수소 원자이고, 2개는 같거나 서로 다를 수 있는 치환기로서 적어도 8개의 비수소 원자를 포함하고 친유성이며 시클릭기를 포함하되, 상기 시클릭기는 α 또는 β 탄소 원자 각각에 직접적으로 결합되지 않으나 다른 치환기 내 시클릭기에 연결 또는 융합되고, 시클릭기가 융합될 경우 두 개의 치환기에 대하여 결합된 비수소 원자의 총 수는 적어도 12개이며, 여기에서 X는 O, C, N 또는 S를 나타내고, 여기에서 상기 펩티드, 펩티드 모방체 또는 아미노산 유도체는 1 내지 4개의 아미노산 또는 동등한 길이의 서브유닛인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  14. 하기의 일반식 I의 군을 포함하는 적어도 +2의 알짜 양전하(net positive charge)를 가지는 펩티드(peptide), 펩티드 모방체(peptidomimetic) 또는 아미노산 유도체(amino acid derivative)로 이루어지는 화합물로,
    Figure 112016112346064-pct00032
    (I)

    여기에서, R1, R2, R3 및 R4 중 임의의 2개는 수소 원자이고, 2개는 같거나 서로 다를 수 있는 치환기로서 적어도 8개의 비수소 원자를 포함하고 친유성이며 시클릭기를 포함하되, 상기 시클릭기는 α 또는 β 탄소 원자 각각에 직접적으로 결합되지 않으나 다른 치환기 내 시클릭기에 연결 또는 융합되고, 시클릭기가 융합될 경우 두 개의 치환기에 대하여 결합된 비수소 원자의 총 수는 적어도 12개이며, 여기에서 X는 O, C, N 또는 S를 나타내고, 여기에서 상기 펩티드, 펩티드 모방체 또는 아미노산 유도체는 1 내지 4개의 아미노산 또는 동등한 길이의 서브유닛인 것을 특징으로 하는, 화합물.
  15. 제14항의 화합물 및 희석제, 담체 또는 첨가제를 포함하는 제형.
  16. 치료에 사용하기 위한, 제14항의 펩티드, 펩티드 모방체 또는 아미노산 유도체로 이루어진 화합물.
  17. (a) 제14항의 화합물로 이루어진 약제 및
    (b) 세균 감염의 치료에 별개로, 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 조합 제제(combined preparation)로서 항균 제를 더 포함하는 제품.
  18. (a) 제14항의 화합물로 이루어진 약제 및
    (b) 종양 세포의 치료에 별개로, 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 조합 제제로서 항종양제를 더 포함하는 제품.
  19. 삭제
KR1020127014266A 2009-11-02 2010-11-02 치료용 펩티드 KR101730680B1 (ko)

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