CN110452289A - 一类新型mdm2环肽抑制剂的设计及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一类新型MDM2环肽抑制剂的设计及其制备方法，其主要有以下过程：(1)通过计算机辅助技术，分析p53‑MDM2复合物的空间晶体结构，针对与MDM2结合的p53的结合部位的结构，设计MDM2抑制剂，阻断p53与MDM2的结合。选取能够与MDM2蛋白特异性结合的氨基酸序列色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸为模拟对象，同时，考虑到这三种氨基酸的疏水性较强，引入亲水性较强的丝氨酸、甘氨酸和谷氨酸等氨基酸，形成所需合成的多肽序列。(2)采用固相合成技术合成直链肽后，在高度稀释的溶液中进行溶液法合成环肽，随后脱除氨基酸侧链的保护基后得到目标产物。本发明针对MDM2设计并制备了一类新型环肽抑制剂，设计思路新颖，合成方法高效经济、简便易行。

Description

一类新型MDM2环肽抑制剂的设计及其制备方法
技术领域
本发明涉及一类新型MDM2环肽抑制剂的设计及其制备方法，可经济高效地合成多种靶向MDM2的新型环肽抑制剂，合成方法简便易行，可为MDM2 多肽抑制剂的发展提供参考。
背景技术
生物体内蛋白质之间的相互作用在生命过程中起着至关重要的作用。据此设计和制备抑制剂的策略,目前已在多种疾病的干预性治疗中得到验证。抑瘤蛋白p53及其负性调节蛋白MDM2之间的相互作用与众多肿瘤发生、发展密切相关。在多种人类肿瘤中p53活性受到抑制，其中一个机制是与癌蛋白 MDM2结合，形成一个负反馈环。在这个负反馈环中，当细胞处于应激状态时，p53水平升高，激活MDM2的转录，细胞中MDM2蛋白水平增加，增加的MDM2又与p53结合，抑制p53的活性。另外，MDM2能促进p53的水解。理论上，在含野生型p53的肿瘤细胞(这时p53有功能，但活性受到抑制)中加入MDM2阻断剂，阻断MDM2与p53的结合，就能降低p53的水解，并消除MDM2对p53活性的抑制，p53的抑癌功能得到恢复。因此，p53-MDM2 复合物是发明新的抗癌药物的靶点。
p53-MDM2复合物的空间晶体结构已经清楚，p53的17-27位氨基酸形成和MDM2的17-125位氨基酸形成的疏水裂隙以范德华力和静电力(主要是氢键作用)相结合，p53功能被抑制。因此，可以针对与MDM2结合的p53的结合部位的结构，设计MDM2阻断剂，阻断MDM2与p53的结合，解脱MDM2 对p53活性的抑制，恢复p53的功能。
附图说明：
图1为环肽的合成方法流程示意图；
图2为p53片段与设计环肽与MDM2的结合模式示意图；
图3为p53片段与设计环肽与MDM2的结合模式示意图；
图4为产物Cyclo-(Phe-D-Trp-D-Leu-Ser-Glu-Gly)的高分辨质谱；
图5为产物Cyclo-(Phe-D-Trp-D-Leu-Ser-Glu-Gly)的核磁共振氢谱图；
图6为TAMRA-NHS与MDM2/MDMX的结合曲线图。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的具体实施方式不限于以下实施例。
实施例一：环肽的设计
本发明公开了一类新型MDM2环肽抑制剂的设计及其制备方法，如图2 和图3所示通过计算机辅助，通过分析p53-MDM2复合物的空间晶体结构，针对与MDM2结合的p53的结合部位的结构，设计MDM2抑制剂，阻断p53 与MDM2的结合。选取能够与MDM2蛋白特异性结合的氨基酸序列色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸为模拟对象,同时，考虑到这三种氨基酸的疏水性较强，引入亲水性较强的丝氨酸、甘氨酸和谷氨酸等氨基酸，形成所需合成的多肽序列。环肽CP-1,CP-2,CP-3的序列分别为：Cyclo-(Phe-D-Trp-D-Leu-Ser-Glu-Gly), Cyclo-(Phe-D-Trp-D-Leu-Ser-Gln-Gly),Cyclo-(Phe-D-Trp-D-Leu-Met-Glu-Gly)。
实施例二：环肽的合成
本发明中环肽类化合物采用固相与液相连用的方法进行合成：将带有 Fmoc保护的氨基酸在DIPEA催化下接入树脂，在哌啶-DMF(1:4)溶液作用下脱去Fmoc保护；通过活化脂反应将不同的氨基酸依次接上树脂，并在哌啶 -DMF(1:4)溶液作用下脱去Fmoc保护，合成直链肽；将合成得到的直链肽用乙酸/三氟乙醇/二氯甲烷(1:2:16)混合液从树脂上切下；将切下的直链肽溶于DMF溶液中，并在PyBOP，HOBt和DIPEA的作用下环合形成环肽；将环合后的环肽用凝胶柱分离，得到纯度更高的环肽化合物。最后，将该环肽化合物用TFA和DCM脱保护，得到目标化合物。具体的合成路线见图1。
实施例三：Cyclo-(Phe-D-Trp-D-Leu-Ser-Glu-Gly)的合成
固相合成直链肽：将1g 2-氯三苯甲基氯树脂，Fmoc-Gly-OH(450mg) 置于洗干净的三通管中，加入DCM(15ml)和DIPEA(0.2ml)，室温振荡1h。抽滤，用甲醇和DCM分别润洗三通管三次，真空干燥。向装有干燥好的树脂的三通管内加入约20ml配制好的哌啶-DMF(1:4)溶液，室温振摇3h,抽滤。用DCM润洗三通管内的树脂三次，真空干燥。再将称量好的HOBt(304mg， 2.25mmol)、Fmoc-Glu(tBu)-OH(640mg，1.5mmol)、DCC(464mg，2.25mmol) 依次置于100ml茄形瓶内，加10ml NMP溶解，再加入10ml DCM，室温振荡 30min，过滤，滤液倒入第一步干燥好的装有树脂的三通管内，室温振荡3h。抽滤，用甲醇和DCM分别洗三遍。真空干燥。脱Fmoc保护同上面所述方法，再以与接Fmoc-Glu-OH相同的方法依次接入Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Trp-OH、Fmoc-Phe-OH后，合成保护了的直链肽。在脱Fmoc保护后，向固相管内加入HOAc/TFE/DCM(1:2:16，19ml)，室温振荡1h将肽与树脂分离，抽滤，滤液加入甲苯后真空浓缩。
环合：利用常见的PyBOP条件下进行。在1L圆底烧瓶内将PyBOP(1.5g， 3mmol)HOBt(405mg，3mmol)，DIPEA(0.6ml，3.6mmol)溶于300ml DMF。将直链完全保护的直链肽500mg溶于300ml DCM后，以每秒一滴缓慢滴入圆底烧瓶。室温磁力搅拌过夜，用MS检测反应完全后，真空浓缩后凝胶层析得产物为白色粉末。
脱保护：将200mg上一步骤化合物溶于50ml TFA/DCM(v/v,1:4),室温搅拌4-5h，停止反应，脱去氨基酸上的保护，反应用MS监测，加入甲苯真空浓缩，浓缩液用液氮冷却，置于冻干机冻干过夜。得产物 Cyclo-(Phe-D-Trp-D-Leu-Ser-Glu-Gly)，高分辨质谱如图4所示，核磁共振氢谱图如图5所示。其他目标化合物的此步反应同此法。
实施例四：荧光偏振结合试验测定环肽对MDM2/MDMX的抑制活性
首先我们将TAMRA-NHS通过共价键链接到PMI的N端氨基上，得到了一个以TAMRA为荧光基团的荧光标记肽PMI-TAMRA，随后我们确定了PMI-TAMRA与MDM2和MDMX的结合常数分别为0.62nM和0.72nM(图 7)。为了验证该方法的特异性，我们测定了未用荧光标记的PMI对PMI-TAMRA和MDM2或MDMX的复合体系的竞争性结合常数Ki。此外，我们还测定了Nutlin-3对MDM2或MDMX的竞争结合常数Ki，分别为5.1nM 和1.54μM，这与文献报道的Ki数值基本一致。具体来说，我们将溶解于DMSO 中的不同浓度的化合物(25μL)加入到盛有50μL的MDM2或MDMX(50 nM)的96孔板中，随后加入50μLPMI-TAMRA(10nM)。检测终体积为125 μL，测量缓冲液为PBS(pH＝7.4)，96孔板为Corning-3993平底黑孔板。孵育半个小时后在Tecan M-1000多孔板酶标仪中测定偏振值(FP)读数，激发波长为530nM，发射波长为580nM。使用GraphPadPrism软件进行曲线拟合并计算Ki值，结果如表1所示。
表1.CP-1,CP-2,CP-3对MDM2和MDMX的竞争抑制常数
MDM2(nM) MDMX(nM)
CP-1 3.7 10.2
CP-2 4.3 11.5
CP-3 2.9 9.3
实施例五：MTT细胞抗增殖活性实验测定环肽对肿瘤细胞的抑制活性
人胶质母细胞瘤癌细胞系U87和人结肠癌细胞HCT116使用含有10％ FBS，100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养，培养条件为37℃， 5％CO2和充足的湿度。将细胞(1×104cells/well)接种在96孔板后，加入浓度为0,0.39,0.78,1.5,3.12,6.25,12.50,25.00,50.00μM的肽或Nutlin-3孵育24 小时。加入MTT(5mg/mL的PBS溶液)孵育4小时后，将培养板孔中的沉淀溶解于100μL DMSO中，随后测量体系570nm处的吸光度，根据样品孔与空白孔中吸光度的比率计算细胞活力，结果如表2所示
表2.CP-1,CP-2,CP-3对HCT116和U87细胞系的IC50
HCT116(μM) U87(μM)
CP-1 5.4 3.2
CP-2 4.9 6.7
CP-3 7.2 4.1

Claims (5)

1.新型MDM2环肽抑制剂CP-1,CP-2,CP-3，其序列如下所示：
CP-1:Cyclo-(Phe-D-Trp-D-Leu-Ser-Glu-Gly)
CP-2:Cyclo-(Phe-D-Trp-D-Leu-Ser-Gln-Gly)
CP-3:Cyclo-(Phe-D-Trp-D-Leu-Met-Glu-Gly)
其中Phe，D-Trp和D-Leu为关键作用残基，为保守序列，环六肽后面三个氨基酸包括Ser,Glu,Gly,Gln和Met，也可替换为其他亲水氨基酸，如Asp,Arg,Lys等。
2.如权利要求1所述的环肽的合成方法:如图1所示。
3.使用荧光偏振结合试验测定如权利要求1所述的环肽对MDM2和MDMX蛋白的抑制活性。
4.如权利要求1所述的环肽作为MDM2/MDMX抑制剂在体外抑制肿瘤细胞生长上的应用，肿瘤细胞系包括：HCT116，U87等，使用MTT细胞抗增殖活性实验测定环肽对肿瘤细胞的IC50。
5.如权利要求1所述的环肽作为MDM2/MDMX抑制剂在抑制动物体内肿瘤生长上的应用。
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