EA013814B1

EA013814B1 - Связанные с матрицей бета-шпилечные пептидомиметики с ингибирующей активностью в отношении протеаз

Info

Publication number: EA013814B1
Application number: EA200701727A
Authority: EA
Inventors: Стивен Дж. Демарко; Керстин Меле; Хайко Хенце; Одиль Селлье; Франсуаза Юнг; Франк Гомберт; Даниель Обрехт; Кристиан Лудин
Original assignee: Полифор Лтд.; Универзитет Цюрих
Priority date: 2005-02-17
Filing date: 2005-02-17
Publication date: 2010-08-30
Also published as: NO20074674L; US10562933B2; AU2005327825B2; EA200701727A1; US10100084B2; US20190002498A1; MX2007009873A; CA2915175C; PT1856140E; EP1856140B1; ES2453540T3; US20140213531A1; US20090054345A1; KR20070106775A; CA2915175A1; JP2008531485A; KR101443171B1; EP1856140A1; CA2598360A1; HK1213914A1

Abstract

В изобретении связанные с матрицей β-шпилечные пептидомиметики общей формулыгде Z означает цепь из 11 α-аминокислотных остатков, которые в зависимости от их положений в цепи (при отсчете начиная с N-концевой аминокислоты) представляют собой Gly, или Pro, или Pro(4NHCOPhe), или остатки определенных типов, которые, как и другие обозначения в приведенной выше формуле, определены в описании и формуле изобретения, и их соли, обладают способностью ингибировать протеазы, в частности сериновые протеазы, в особенности катепсин G, или эластазу, или триптазу. Эти β-шпилечные пептидомиметики можно приготовить способами, которые основаны на смешанной стратегии твердофазного и жидкофазного синтеза.

Description

Матрица (I) где Ζ означает цепь из 11 α-аминокислотных остатков, которые в зависимости от их положений в цепи (при отсчете начиная с Ν-концевой аминокислоты) представляют собой О1у, или Рго, или Рго(4ЫНСОРЬе), или остатки определенных типов, которые, как и другие обозначения в приведенной выше формуле, определены в описании и формуле изобретения, и их соли, обладают способностью ингибировать протеазы, в частности сериновые протеазы, в особенности катепсин О, или эластазу, или триптазу. Эти β-шпилечные пептидомиметики можно приготовить способами, которые основаны на смешанной стратегии твердофазного и жидкофазного синтеза.

Настоящее изобретение относится к связанным с матрицей β-шпилечным пептидомиметикам, включающим связанную с матрицей цепь из 11 α-аминокислотных остатков, которые в зависимости от их положения в цепи представляют собой С1у. или Рго, или ΡΐΌ(4ΝΗί.'ΘΡ1ιο). или являются остатками определенных типов, определенных ниже в настоящем изобретении. Эти связанные с матрицей βшпилечные пептидомиметики применимы в качестве ингибиторов протеазных ферментов. Они являются особенно полезными в качестве ингибиторов различных сериновых протеаз, таких как катепсин О, эластаза или триптаза человека. Кроме того, настоящее изобретение относится к эффективному способу, с помощью которого эти соединения при желании можно получить в виде библиотеки.

β-Шпилечные пептидомиметики, соответствующие настоящему изобретению, обнаруживают улучшенную эффективность, биологическую доступность при пероральном введении, увеличенный период полувыведения и, что наиболее важно, большое отношение селективности по отношению к различным сериновым протеазам, которое зависит от надлежащего выбора некоторых типов α-аминокислотных остатков и их положения в указанной цепи. Кроме того, эти β-шпилечные пептидомиметики характеризуются небольшим гемолизом на эритроцитах и низкой цитотоксичностью.

Установлено, что ингибиторы протеаз перспективны для применения в медицине с целью лечения таких заболеваний, как раковые заболевания (В.Р. ВсексИ Α. Όανίάδοη, А.Н. Эгиттоиб, М. ^Ыйакег, Эгид Экс. Тобау 1996, 1, 16-26; Б.Б. 1обикои, В. Эует, Ό.Ι. Нире, Сигг. Ορίη. СЬет. Вю1., 1998, 2, 466-71; Ό. Беиид, О. Аббеиаи!е, апб Ό.Ρ. РалИе, 1. Меб. СЬет., 2000, 43, 305-341, Т. Воскмау, Ехрег! Ορίη. ТЬег. Ра1еп1к 2003, 13, 773-786), переносимые паразитами, грибковые и вирусные инфекции [например, шистосомоз (М.М. Вескег, 8.А. Наггор, ЕР. ЭаНоп, В.Н. КаЪииа, Ό.Ρ. МсМапик, Ό.Ρ. Вйиб1еу, 1. Вю1. СЬет., 1995, 270, 24496-501); С. а1б1саик (С. Абаб-2аре1ето, В. 6о1бтащ 8.ν. МисЬтоге, С. Ни!сбтк, К. 8!емай, 1. Nаνаζа, С.Э. Раупе, Т.Б. Вау, Рто!еш 8сб, 1996, 5, 640-52), ВИЧ (Α. IV. Ейской, Аипи. Веν.

ВюсЬет., 1993, 62, 543-85; Р.Б. Эатке, ЕВ. Ний, Αбν. РЬагтасо1., 1994, 5, 399-454), гепатит (ЕЬ. К1т, К.А. Могдеик!еги, С. Бт, Т. Рох, Μ.Ό. Эмуег, ЕА. Баибго, 8.Р. СЬатбегк, V. Магк1аиб, С.А. Берте, Е.Т. О'Ма11еу, 8.Б. Нагбекои, С.М. В1се, М. А. Мигско, Р.В. Сагои, ЕА. ТЬоткои, Се11, 1996, 87, 343-55; В. А. Бо^'е, Н. Е. Рагде, ЕА. V^ске^κЬат, Ζ. Нок!откку, Ν. Набика, Ε.ν. Моотам, Т. АбасЫ, Ζ. Нок!откка, Се11., 1996, 87, 331-342), герпес (V. О1бкои, М.В. На11, Эгид. Эек. Όί^ν., 1997, 15, 39-47)], и воспалительные, иммунологические, респираторные (Р.В. Ветик!е1и, Р.Э. Ебмагбк, ЕС. Ргод. Меб.

СЬет., 1994, 31, 59-120; Т.Е. Нидй, Тгеибк Вю!есбио1., 1996, 14, 409-12,), сердечно-сосудистые (М.Т. 8!иббк, ν.λ Вобе, ТЬготб. Век., 1993, 69, 1-58; Н. Рикат1 е! а1., Сиггеи! РЬаттасеийса1 Эе^ди, 1998, 4, 439-453) и нейродегенеративные нарушения, включая болезнь Альцгеймера (В. Уаккаг, В.Э. Веиией, 8. Ваби-КаЬи, 8. КаЬи, Е.А. Меиб1а/, 8с1еисе, 1999, 286, 735-41), ангиогенез (Каайиеи М. е! а1., А!Ьегокк1его815, 1996, 123 1-2, 123-131) и рассеянный склероз (1бтаЫт М^. е! а1., 1. №иго1ттиио1, 1996, 70, 131-138).

Поскольку большинство протеаз связываются со своими субстратами в растянутой конформации или конформациях β-цепи, эффективные ингибиторы должны быть способны имитировать такую конформацию. Поэтому β-шпилечные миметики идеально подходят для фиксации последовательностей пептидов в растянутой конформации.

Из числа протеаз сериновые протеазы являются важными объектами терапевтического воздействия. Сериновые протеазы классифицируют по их специфичности по отношению к субстрату, в особенности по типам остатков, находящихся у Р1, как трипсиноподобные (положительно заряженные остатки Бук/Атд являются предпочтительными у Р1), эластазоподобные (небольшие гидрофобные остатки А1а/Уа1 у Р1) или химотрипсиноподобные (большие гидрофобные остатки РЬе/Тут/Беи у Р1). Сериновые протеазы, для которых в базе данных РЭВ (РЭВ: \\'\т\у.гскб.огд/рбб) имеются рентгеноструктурные данные для кристаллов ингибиторов протеазы, включают трипсин, α-химотрипсин, γ-химотрипсин, эластазу нейтрофилов человека, тромбин, субтилизин, цитомегаловирус человека, протеиназу А, ахромобактер, катепсин О человека, специфичную по отношению к глутаминовой кислоте протеазу, карбопептидазу Ό, фактор свертывания крови УНа, фактор свиней 1ХА, мезентерикопептидазу, НСУ протеазу и термитазу. Другие сериновые протеазы, которые представляют терапевтический интерес, включают триптазу, комплементарную конвертазу, протеазу гепатита ΟΝ83. Ингибиторы тромбина (например, ББ. Ме!Ьа, Б.У. СЬеи, ν.ν. №сЬо1к, С. Майккои, Ό. Оийай'кои, Т.О.Р. 8а1бееи, 1. Сагбю\^гакс. РЬагтасо1., 1998, 31, 345-51; С. БПа, Р. О1оаиес, Б. Сабе!, Υ. Негее, 1. Роитшет, Р. Беботдие, Т.1. Уетбеитеи, О. Пе№и!еш1, 8уи!Ь. Сотт., 1998, 28, 4419-29) и фактор Ха (например, ЕР. Уасса, Аиии. Вер. Меб. СЬет., 1998, 33, 81-90) включены в клинические исследования в качестве антитромботических средств, ингибиторы эластазы (ЕВ. νίΒίοΐ!!^ В.С. Ра1соие, С. Киее, В.Б. 8!ет, А.М. 8!йтр1ег, В. Веауек, В.Е. Ойек, В.Э. Кге11, Ат. Веν. Векрп. би., 1991, 144, 875-83) включены в клинические исследования по лечению эмфиземы и других заболеваний легких, а ингибиторы триптазы находятся в фазе II клинических исследований по лечению астмы (С. 8ейе, 8с1еисе, 1997, 277, 1602-3), ингибиторы урокиназы - по лечению рака молочной железы и ингибиторы химазы - по лечению заболеваний, связанных с сердцем. Наконец, катепсин О и эластаза непосредственно участвуют в модуляции активности цитокинов и их рецепторов. В частности, на участках воспаления большие концентрации катепсина О, эластазы и протеиназы 3, высвобождающиеся из инфильтрованных полиморфноядерных клеток, находятся в хорошей временной корреляции с повышен

- 1 013814 ными содержаниями воспалительных цитокинов, что убедительно указывает на то, что эти протеазы участвуют в регулировании биологической активности и доступности цитокинов (и. Вапк, 8. Апзогде, I. Беикос. Вю1., 2001, 69, 177-90). Таким образом, ингибиторы эластазы и катепсина О являются важными объектами воздействия новых предлагаемых лекарственных средств, в частности, для лечения хронического обструктивного заболевания легких (Оккауазк1 Н., Ерег! Θρΐη. 1пуез1щ. Бгидз., 2002, 11, 965-980).

Из числа многих появившихся белковых ингибиторов сериновой протеазы один представляет собой содержащий 14 аминокислот циклический пептид, выделенный из семян подсолнечника, названный подсолнечниковым ингибитором трипсина (8ΡΤΙ-1) (8. Бискей, К. 8апйадо Оагс1а, Ы. Вагкег, А.У. Копагеу, Р.К. 8кемту, А.К. С1агке, К.Ь. Вгабу, I. Мо1. Вю1., 1999, 290, 525-533; Υ.-б. Бопд, 8.-Ь. Ьее, С.-Υ. Бш, Ι.Ι. Епуебу, 8. Жищ, Р. Ы, К.В. ккскзоп, Р.Р. Ко11ег, Вюгд. & Меб. Скет. Бей., 2001, 11, 2515-2519), который обладает последовательностью и конформацией, сходными с характеристиками трипсиновой реакционноспособной петли ингибиторов семейства Баумана-Бирк (Вомгаап-Впк) сериновых протеаз. Ингибитор принимает β-шпилечную конформацию при связывании с активным участком бычьего β-трипсина. 8ΕΤΙ-1 ингибирует β-трипсин (К_;<0,1 нМ), катепсин О (К_;~0,15нМ), эластазу (К ,-105 мкМ), химотрипсин (К ,-7,4 мкМ) и тромбин (К,-136 мМ).

В настоящем изобретении иллюстрируется подход к разработке ингибитора, который включает трансплантацию β-шпилечной петли из природного пептида в индуцированную шпилькой матрицу. На основании хорошо известной трехмерной структуры β-шпилечных миметиков можно получить библиотеки соединений, которые в конечном счете могут привести к новым ингибиторам, обладающим разными профилями специфичности по отношению к нескольким классам протеаз.

Связанные с матрицей шпилечные миметические пептиды описаны в литературе (Ό. Окгеск!, М. А11ог1ег, 1.А. КоЫпзоп, Αάν. Меб. Скет., 1999, 4, 1-68; 1.А. КоЫпзоп, 8уп. Бей., 2000, 4, 429-441) и ингибирующие сериновую протеиназу связанные с матрицей пептидомиметики и методики их синтеза описаны в международной патентной заявке Ж) 2003/054000 А1 и в публикации Безсоигз А., Моек1е К., Кепагб А., КоЫпзоп I. СкетВюСкет., 2002, 3, 318-323, но описанные ранее молекулы не обладают высокой селективностью и, в особенности, высокой активностью. Однако недавно установлена возможность получения β-шпилечных пептидомиметиков с помощью комбинаторного метода и метода параллельного синтеза (Б. Лапд, К. Моек1е, В. Бкапара1, Ό. Окгеск!, 1.А. КоЫпзоп, Нек. СЫт. Ас1а., 2000, 83, 3097-3112).

Эти методы позволяют синтезировать и выполнить скрининг больших библиотек шпилечных миметиков, что, в свою очередь, облегчает проведение исследований зависимостей структура-активность и, следовательно, обнаружение новых молекул, обладающих очень эффективной и селективной ингибирующей активностью по отношению к сериновой протеазе, пероральной биологической доступностью, низкой гемолитической активностью по отношению к эритроцитам человека и низкой цитотоксичностью.

β-Шпилечные пептидомиметики, соответствующие настоящему изобретению, являются соединениями общей формулы

где

Матрица означает группу одной из формул где

(а!) (а2)

означает А1а; Агд; Азп; Суз; О1п; О1у; Н1з; 11е; Беи; Буз; Ме1; Рке; Рго; Рго(5КРке), 8ег; Ткг; Тгр; Туг; Уа1; Сй; Огп; 1ВиА; 8аг; 1-ВиО; 4АтРке; 3АтРке; 2АтРке; Рке(тС(ИН2)=ИН); Рке(рС(ИН2)=ИН);

- 2 013814

Р11е(т\НС(\Н₂) \Н); Р11е(р\НС(\Н₂)=ΝΗ); Ркд; Ска; Сда1; С₅а1; Ν1ε; 2-Να1; 1-Να1; 4С1-Рке; 3С1-Рке;

2С1-Рке; 3,4С1₂Рке; 4Р-Рке; 3Р-Рке; 2Р-Рке; Т1с; ТЫ; Τζα; Мзо; АсЬуз; Эрг; А₂Ви; Эки; Аки; Ака; А1к; Υ(Βζ1); Βΐρ; 8(Βζ1); Τ(Βζ1); кСка; кСуз; к8ег, кАгд; кРке; Вра; Р1р; ОсЮ; МеРке; МеМе; МеА1а; Ме11е; МеУа1 или МеЬеи означает группу формулы

А5

Ζ означает цепь из 11а-аминокислотных остатков, положения указанных аминокислотных остатков в боковой цепи отсчитывается от Ν-концевой аминокислоты, причем указанные аминокислотные остатки в положениях 1-11 цепи Ζ представляют собой

ΡΙ: Νΐε, Пе, Аос, кЬеи, Скд, ОсЮ, кРке, 4АтРке, Ска, Рке, Туг,

2С1-Рке, Тгр, 1 -Ь4а1, Ьеи, Ска или Агд;

Р2: Суз, О1и, Νΐε, Ткг, или 61п ;

РЗ: Ткг, А1а или АЬи;

Р4: Ьуз, Νΐε, А1а, АЬи, или Ткг;

Р5: 8ег, АПоТкг или Орг;

Р6: Пе, С5а1, Ьеи, Νίβ, Аос, ОсЮ, Ска, кЬеи, кРке, Скд, ΐ-ВиА, (Ни, или Азр;

Р7: Рго;

Р8: Рго, А1а, или Рго(4ЫНСОРке);

Р9: Туг, Рке, Пе, Νΐε, Ска, С1п, Агд, Ьуз, Н1з, Ткг, или А1а;

РЮ: Суз, Агд, Νΐε, 61п, Ьуз, Ме1, Ткг, или 8ег;

Р11: Туг, О1п, Агд, 8ег, Νΐε, 2-Ма1, 2С1-Рке, Ска, Ркд, Рке, Азр Азп, или Ткг; и при дополнительном условии, что, если матрица представляет собой °Рго^ЕРго, то аминокислотные остатки в положениях Р1-Р6 и Р8-Р11 не означают

- Р1: Агд

- Р2: Суз, связанный с Суз в положении РЮ дисульфидным мостиком

- РЗ: Ткг

- Р4 Ьуз

- Р5 8ег

- Р6 Пе

- Р7 Рго

- Р8 Рго

- Р9 Пе

- РЮ Суз, связанный с Суз в положении Р2 дисульфидным мостиком; и

- Р11 Рке;

и их фармацевтически приемлемые соли.

В соответствии с настоящим изобретением эти β-шпилечные пептидомиметики можно получить способом, который предусматривает:

(а) проведение реакции сочетания соответствующим образом функционализированной твердой

- 3 013814 подложки с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты, которая в искомом конечном продукте находится в положении 5, 6 или 7, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(b) удаление Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта;

(c) проведение реакции сочетания полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты, которая в искомом конечном продукте находится на одно положение ближе к Ν-концевому аминокислотному остатку, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(ά) удаление Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта;

(е) повторение стадий (с) и (ά), пока не будет введен Ν-концевой аминокислотный остаток;

(ί) проведение реакции сочетания полученного таким образом продукта с соединением общей формулы где

является такой, как определено выше, и X означает Ν-защитную группу, или, альтернативно, если

0= —--Ν—

Матрица означает указанную выше группу (а1) или (а2), (£а) проведение реакции сочетания продукта, полученного на стадии (е), с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты общей формулы

НООС-В-Н III или

НООС-А-Н IV в которой В и А являются такими, как определено выше, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(1Ь) удаление Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта и (£с) проведение реакции сочетания полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты указанной выше общей формулы IV и, соответственно, III, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(д) удаление Ν-защитной группы из продукта, полученного на стадии (ί) или (£с);

(11) проведение реакции сочетания полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты, которая в искомом конечном продукте находится в положении 11, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(ί) удаление Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта;

(Ϊ) проведение реакции сочетания полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты, которая в искомом конечном продукте находится на одно положение дальше от положения 11, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(k) удаление Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта;

(l) повторение стадий (ΐ) и (к), пока не будут введены все аминокислотные остатки;

(т) при желании селективное снятие защиты у одной или нескольких защищенных функциональ

- 4 013814 ных групп, содержащихся в молекуле, и соответствующее замещение реакционноспособной группы (групп), высвободившихся при этом;

(п) при желании образование внутри цепи связи между боковыми цепями соответсвующих аминокислотных остатков в положениях 2 и 10;

(о) отделение полученного таким образом продукта от твердой подложки;

(р) циклизацию продукта, отделенного от твердой подложки;

(ς) удаление любых защитных групп, находящихся на функциональных группах любых элементов цепи аминокислотных остатков, и при желании любой защитной группы (групп), которые дополнительно могут находиться в молекуле; и (г) при желании превращение полученного таким образом продукта в фармацевтически приемлемую соль или превращение полученной таким образом фармацевтически приемлемой или неприемлемой соли в соответствующее свободное соединение формулы (I) или в другую фармацевтически приемлемую соль.

Альтернативно, пептидомиметики, соответствующие настоящему изобретению, можно получить с помощью:

(а') проведения реакции сочетания соответствующим образом функционализированной твердой подложки с соединением общей формулы

означает указанную выше группу (а1) или (а2), (а'а) проведения реакции сочетания указанной соответствующим образом функционализированной твердой подложки с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты общей формулы

НООС-В-Н III или

(а'Ь) удаления Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта и (а'с) проведения реакции сочетания полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты указанной выше общей формулы IV и, соответственно, III, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(Ь') удаления Ν-защитной группы из продукта, полученного на стадии (а') или (а'с);

(с') проведения реакции сочетания полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты, которая в искомом конечном продукте находится в положении 11, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(д') удаления Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта;

(е') проведения реакции сочетания полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты, которая в искомом конечном продукте находится на одно положение дальше от положения 11, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

- 5 013814 (Г) удаления Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта;

(д') повторения стадий (е') и (Г), пока не будут введены все аминокислотные остатки;

(IV) при желании селективного снятия защиты у одной или нескольких защищенных функциональных групп, содержащихся в молекуле, и соответствующего замещения реакционноспособной группы (групп), высвободившихся при этом;

(ί') при желании образования внутри цепи связи между боковыми цепями соответствующих аминокислотных остатков в положениях 2 и 10;

О') отделения полученного таким образом продукта от твердой подложки;

(к') циклизации продукта, отделенного от твердой подложки;

(1') удаления любых защитных групп, находящихся на функциональных группах любых элементов цепи аминокислотных остатков, и при желании любой защитной группы (групп), которые дополнительно могут находиться в молекуле; и (т') при желании превращения полученного таким образом продукта в фармацевтически приемлемую соль или превращение полученной таким образом фармацевтически приемлемой или неприемлемой соли в соответствующее свободное соединение формулы (I) или в другую фармацевтически приемлемую соль.

Пептидомиметики, соответствующие настоящему изобретению, также могут представлять собой энантиомеры соединений формулы (I). Эти энантиомеры можно получить путем модификации указанных выше способов, в которых используются энантиомеры всех хиральных исходных веществ.

Структурный элемент -А-СО- означает аминокислотные структурные фрагменты, которые в комбинации со структурным элементом -В-СО- образуют матрицы (а1) и (а2). Матрицы (а1) и (а2) образуют структурные фрагменты, которые содержат Ν-конец и С-конец, ориентированные в пространстве таким образом, что расстояние между этими двумя группами может составлять 4,0-5,5 А. Пептидная цепь Ζ связана с С-концом и Ν-концом матриц (а1) и (а2) через соответствующие Ν- и С-концы, так что матрица и цепь образуют циклическую структуру, такую как представлена в формуле (I). В таком случае, как описанный в настоящем изобретении, когда расстояние между Ν- и С-концами матрицы составляет 4,0-5,5 А, матрица вызовет образование сетки Н-связей, необходимой для образования β-шпилечной конформации пептидной цепи Ζ. Эта матрица и пептидная цепь образуют β-шпилечный миметик.

β-Шпилечная конформация тесно связана со способностью β-шпилечных миметиков, соответствующих настоящему изобретению, ингибировать активность сериновой протеазы. Свойства матриц (а1) и (а2) стабилизировать конформацию β-шпильки играют ключевую роль не только для селективной ингибирующей способности, но и для описанного выше синтеза, поскольку включение матриц в начале или вблизи от середины, содержащих защитные группы линейных предшественников пептидов, значительно повышает выход реакции циклизации.

Так, например, ^сРго-^ъРго образует прототип матриц (а1) и ^ъРго-^сРго образует прототип матрицы (а2).

Следует понимать, что структурный фрагмент -А-СО-, в котором А имеет (Э)-конфигурацию, несет водород (Н) в α-положении к Ν-концу. Специалисты в данной области техники должны понимать, что А приведена в (Э)-конфигурации, которая соответствует (Реконфигурации.

- 6 013814

Структурный фрагмент -В-СО- в матрицах (а1) и (а2) означает Ь-аминокислотный остаток. Наиболее предпочтительными являются

А1а

Агд

Азп

Суз

О1п

О1у

Н18

Не

Ьеи

Ьуз

Ме!

Рйе

Рго

Рго(5КРйе)

8ег

ТЬг

Тгр

Туг

Уа1

Сй

От тВиА аг ΐ-ВиСг

4АтРЬе

Ь-аланин

Ь-аргинин

Ь-аспарагин

Ь-цистеин

Ь-глутамин глицин

Ь-гистидин

Ь-изолейцин

Ь-лейцин

Ь-лизин

Ь-метионин

Ь-фенил аланин

Ь-пролин (28,5К)-5-фенилпирролидин-2'Карбоциклическая кислота

Ь-серин

Ь-треонин

Ь-триптофан

Ь-тирозин

Ь-валин

Ь-цитрулин

Ь-орнитин

Ь-трет-бутил аланин саркозин

Ь-трет-бутилглицин

Ь-пара-аминофенилаланин

- 7 013814

ЗАтРЬе	Ь-мета-аминофенилаланнн
2АтРйе	Ь-орто-аминофенил аланин
Рйе(тС(№у=РШ)	Ь-мета-амидинофенилаланин
Ρ1ιε(ρ€(ΝΗ₂)=ΝΗ) Рйе(тЫНС (ΝΗ₂)=ΝΗ)	Ь-пара-амидинофенил аланин Ь-мета-гуанидинофенилаланин
РЬеСрИНС (ΝΗ₂)=ΝΗ)	Ь-пара-гуанидинофенилаланин
РЬё	Ь-фенилглицин
СЬа	Ь-циклогексилаланин
С₄а1	Ь-3-циклобутилаланин
С₅а1	Ь-3-циклопентилаланин
Νΐε	Ь-норлейцин
2-Να1	Ь-2-нафтил аланин
1-Να1	Ь-1 -нафтилаланин
4С1-Рйе	Ь-4-хлорфенилаланин
ЗС1-РЬе	Ь-3 -хлорфенил аланин
2С1-Р1ге	Ь-2-хлорфенил аланин
3,4С1₂-Рйе	Ь-3,4-дихлорфенил аланин
4Р-РЬе	Ь-4-фторфенилаланин
ЗР-Рйе	Ь-З-фторфенилаланин
2Р-Рйе	Ь-2-фторфенил аланин
Тю	Ь-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-З -карбоновая кислота
ТЫ	Ь-3-2-тиенилаланин
Тга	Ь-2-тиазолилаланин
Мао	Ь-метионинсульфоксид
АсЬуз	Ь-ЬЬацетиллизин
Орг	Ь-2,3-диаминопропионовая кислота
А₂Ви	Ь-2,4-диаминомасляная кислота
ОЬи	(8)-2,3-диаминомасляная кислота
АЬи	γ-аминомасляная кислота (ГАМК)
Айа	ε-аминогексановая кислота
А1Ь	α-аминоизомасляная кислота
Υ(ΒζΙ)	Ь-О-бензилтирозин
Βίρ	Ь-бифенил аланин
8(Βζ1)	Ь-О-бензилсерин
Τ(ΒζΙ)	Ь-О-бензилтреонин

- 8 013814

ЬСйа	Ь-гомоциклогексил аланин
ЪСуз	Ь-гомоцистеин
Ь8ег	Ь-гомосгрин
ЬАгд	Ь-гомоаргинин
НРйе	Ь-гомо ф енил аланин
Вра	Ь-4-бгнзоилфенилаланин
Ρΐρ	Ь-пипеколиновая кислота
ОсЮ	Ь-октилглицин
МеРЬе	Ь-И-метилфенил аланин
ΜεΝΙε	Ь-Ν-мгтилнорлейцин
ΜεΑΗ	Ε-Ν-метил аланин
ΜεΙΙε	Ь-И-метилизолейцин
МгУа1	Ь-И-мотилвалин
МеЬеи	Ε-Ν-метиллейцин

Боковые цепи, состоящие преимущественно из (Б)-аминокислот в противолежащих положениях региона β-цепи, могут образовывать межцепочечную связь. Наиболее известной связью является дисульфидный мостик, образованный цистеинами и гомоцистеинами, расположенными в противолежащих положениях β-цепи. Известны различные методики образования дисульфидных связей, включая описанные в публикациях: 1.Р. Таги е! а1. 8уп1Иез18, 1979, 955-957; 81е^аг1 е1 а1. 8о11й РИазе Рерййе 8уп1Иез18, 2й Ей., Р1егее СИет1са1 Сотрапу, III., 1984; АИтей е! а1. I. ΒίοΙ. СИет., 1975, 250, 8477-8482 и Репптдфоп е! а1. Рерййез, р. 164-166, О1га11 апй Апйгеи, Ейз., Е8СОМ Бе1йеп, ТИе Не1Иег1апйз, 1990. Для объема настоящего изобретения дисульфидные связи предпочтительнее всего можно получить с использованием ацетамидометильных (Аст)-защитных групп для цистеина.

Положениями для межцепочечной связи являются положения Р2 и Р10, взятые совместно. Известно, что такие межцепочечные связи стабилизируют β-шпилечные конформации и тем самым образуют структурный элемент, важный для образования β-шпилечных миметиков.

Наиболее предпочтительным аминокислотными остатками в цепи Ζ являются образованные из природных α-аминокислот. Ниже приведен перечень аминокислот, которые или остатки которых пригодны для задач настоящего изобретения, и использованы общепринятые аббревиатуры:

- 9 013814

трехбуквенный код	однобуквенный код
А1а	Ь-аланин	А
Агд	Ь-аргинин	К.
Азп	Ь-аспарагин	N
Αδρ	Ь-аспарагиновая кислота	О
Суз	Ь-цистеин	С
О1и	Ь-глутаминовая кислота	Е
О1п	Ь-глутамин	Ω
О1у	глицин	6
Н13	Ь-гистидин	н
Не	Ь-изолейцин	I
Ьеи	Ь-лейцин	ь
Ьуз	Ь-лизин	к
Ме!	Ь-метионин	м
РЬе	Ь-фенилаланин	Р
Рго	Ь-пролин	Р
°Рго	О-пролин	Ор
Зег	Ь-серин	8
ТЬг	Ь-треонин	Т
Тгр	Ь-триптофан	А
Туг	Ь-тирозин	Υ

Другие α-аминокислоты, которые или остатки которых пригодны для задач настоящего изобретения, включают:

1ВиА

4АшРЬе

РЬ§

СЬа

С₅а1

Νίβ

2-№1

1-Па1

2С1-РЬе

Орг

ЬРЬе

Рго(4ЫНСОРЬе)

Аос

Ь-трет-бутил аланин

Ь-пара-аминофенил аланин

Ь-фенилглицин

Ь-циклогексил аланин

Ь-3-циклопентил аланин

Ь-норлейцин

Ь-2-нафтил аланин

Ь-1 -нафтилаланин

Ь-2-хлорфенил аланин

2,3-диаминопропионовая кислота

Ь-гомофенил аланин (2 8)-4-бензамидинопирролидин-2-карбоновая кислота

2-(8)-аминооктановая кислота

Обычно пептидная цепь Ζ в β-шпилечных миметиках, соответствующих настоящему изобретению, включает 11 аминокислотных остатков. Положения Р1-Р11 каждого аминокислотного остатка в цепи Ζ однозначно определяются следующим образом: Р1 означает первую аминокислоту в цепи Ζ, которая своим Ν-концом связана с С-концом группы -В-СО- в матрице (а1), или группы -А-СО- в матрице (а2); и Р11 означает последнюю аминокислоту в цепи Ζ, которая своим С-концом связана с Ν-концом группы -А-СО- в матрице (а1), или группы -В-СО- в матрице (а2).

α-Аминокислотные остатки в положениях 1-11 в цепи Ζ особенно предпочтительно представляют собой

- 10 013814

- Ρ1: Νΐε, Не, Аос, кЬеи, Скд, ОсЮ, кРке, 4АтпРке, Ска, Рке, Туг, 2С1-

Рке, Тгр, 1-Ыа1, Ьеи, Ска или Агд;

- Р2: Суз, С1и, Νΐε, Ткг, или О1п ;

- РЗ; Ткг, А1а или Аки;

- Р4: Ьуз, Νΐε, А1а, Аки, или Ткг;

- Р5: Зег, АПоТкг или Орг;

- Рб: Не, С₅а1, Ьеи, Νΐε, Аос, ОсЮ, Ска, кЬеи, кРке, Скд, ЬВиА, О1и, или Азр;

- Р7: Рго;

- Р8: Рго, А1а, или Рго(4кИСОРке);

- Р9: Туг, Рке, Пе, кПе, Ска, О1п, Агд, Ьуз, ΗΪ8, Ткг, или А1а;

- РЮ: Суз, Агд, Νΐε, СИп, Ьуз, Ме1, Ткг, или 8ег;

- Р11: Туг, О1п, Агд, 8ег, Νΐε, 2-кУа1,2С1-Рке, Ска, Ркд, Рке, Азр Азп, или

Ткг; и

- Суз, если имеется в положении Р2 и РЮ,может образовывать дисульфидный мостик;

при дополнительном условии, что, если матрица представляет собой °Рго^ЕРго, то аминокислотные остатки в положениях Р1-Р6 и Р8-Р11 не означают

Р1: Агд

Р2: Суз, связанный с Суз в положении РЮ дисульфидным мостиком

РЗ: Ткг

Р4 Ьуз

Р5 8ег

Рб Пе

Р7 Рго

Р8 Рго

Р9 Пе

РЮ Суз, связанный с Суз в положении Р2 дисульфидным мостиком;

и

- Р11 РЬе;

Для ингибиторов катепсина О α-аминокислотные остатки в положениях 1-11 наиболее предпочтительно представляют собой

- Р1: Рке, кРке, 4АтРке, Νΐε, Скд, Пе, Туг, Агд, Тгр, 2С1-Рке, Агд, 1-Να1 или

Ска;

- Р2: Суз, 61и или Νΐε;

- РЗ: Ткг;

- Р4: Ьуз или Νΐε;

- Р5: 8ег, АПоТЬг или Орг;

- Рб: Азр или О1и;

- Р7: Рго;

- Р8: Рго;

- Р9: Пе, кПе, Ска, О1п, Туг или А1а;

- РЮ: Суз, Агд или кПе;

- Р11: Ткг, Азр, Зег, Туг, Рке, Азп или Агд; и

- Суз, если содержится в Р2 и РЮ, может образовывать дисульфидный мостик.

- 11 013814

Для ингибиторов эластазы α-аминокислотные остатки в положениях 1-11 наиболее предпочтительно представляют собой

- Р1: Пе, ЬПе, Аос, ЬЬеи, СЬ§, ОсГО или ЬРЬе;

- Р2: Суз, С1и, ТЬг или СИп;

- РЗ: ТЬг, А1а или АЬи;

- Р4: А1а, ТЬг или АЬи;

- Р5: 8ег;

- Р6: ОсЮ, Пе, СЬа, Ьеи, с5а1, Νΐε, Аос, СЬд, 1ВиА или ЬЬеи;

- Р7: Рго;

- Р8: Рго, или Рго(4ЫНСОРЬе);

- Р9: О1п, Туг, 1Ье или РЬе;

- РЮ: Суз, Ьуз, О1п, ТЬг, Ме1 или Аг§;

- Р11: Туг, 8ег, Агд, О1п, Ы1е, 2-Иа1, 2С1-РЬе, РЬе, СЬа или РЬд; и

- Суз, если содержится в Р2 и Р10, может образовывать дисульфидный мостик.

Для ингибиторов триптазы α-аминокислотные остатки в положениях 1-11 в цепи Ζ наиболее предпочтительно представляют собой:

- Р1: СЬа, Туг или Тгр

- Р2: Суз

- РЗ: ТЬг

- Р4: Ьуз

- Р5: Зег

- Р6: Ьеи

- Р7: Рго

- Р8: Рго

- Р9: Ьуз

- РЮ: Суз

- Р11: Аг§;и остатки Суз, содержащиеся в Р2 и Р10, могут образовывать дисульфидный мостик.

Особенно предпочтительные β-пептидомиметики, соответствующие настоящему изобретению, включают описанные в примерах 5, 19, 20, 22, 23, 38, 39, 40 и 75 в качестве ингибиторов катепсина О; в примерах 91, 121, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 177 и 178 в качестве ингибиторов эластазы и в примерах 193, 194 и 195 в качестве ингибиторов триптазы.

Способы, соответствующие настоящему изобретению, с успехом могут быть осуществлены как параллельный матричный синтез (рага11е1 аггау зуп1йез1з) с получением библиотек связанных с матрицей β-шпилечных пептидомиметиков указанной выше общей формулы (I). Такой параллельный синтез позволяет получить группы, содержащие множество (обычно от 24 до 192, в типичном случае 96) соединений общей формулы (I) с высокими выходами и определенной чистотой со сведением к минимуму образования димерных и полимерных побочных продуктов. Поэтому ключевую роль играет надлежащий выбор функционализированной твердой подложки (т.е. твердой подложки с молекулой-линкером), матрицы и положения циклизации.

Функционализированную твердую подложку обычно получают из полистирола, предпочтительно сшитого с 1-5% дивинилбензола; полистирола с покрытием из полиэтиленгликолевых спейсеров (Теп1аде1^Е); и поликариламидных смол (см. также ОЬгесЫ Ώ.; У111а1догбо Ь-М. 8о11б-8иррог1еб СотЫпа1ог1а1 апб Рага11е1 8уп1йез1з оР 8та11-Мо1еси1аг-Ше1ц1п Сотроипб ЫЬгапез, Те1гайебгоп Огдатс Сйет1з1гу 8ег1ез, уо1. 17, Регдатоп, Е1зеу1ег 8с1епсе, 1998).

Твердую подложку обычно функционализируют с помощью линкера, т.е. бифункциональной спейсерной молекулы, которая на одном конце содержит якорную группу для присоединения к твердой подложке, а на другом конце содержит селективно отщепляемую функциональную группу, использующуюся для проведения последующих химических превращений и отщепления. Для задач настоящего изобретения используют два типа линкеров.

Линкеры типа 1 предназначены для высвобождения амидной группы в кислой среде (Ктпк Н., Те1гайебгоп ЬеП., 1987, 28, 3783-3790). Линкеры этого типа образуют амиды карбоксигрупп аминокислот; примеры смол, функционализированных такими линкерными структурами, включают смолу 4-[(((2,4диметоксифенил)Ртос-аминометил)феноксиацетамидо)аминометил] ПС (полистирол), смолу 4-[(((2,4диметоксифенил)Ртос-аминометил)феноксиацетамидо)аминометил]-4-метилбензгидриламин ПС (амидная смола Ктпк МВ НА ПС) и смолу 4-[(((2,4-диметоксифенил)Ртос-аминометил)феноксиацетами

- 12 013814 до)аминометил]бензгидриламин ПС (амидная смола К1пк ВНА ПС). Предпочтительно, если подложка образована из полистирола, предпочтительно сшитого с 1-5% дивинилбензола, и функционализирована с помощью 4-(((2,4-диметоксифенил)Етое-аминометил)феноксиацетамидного) линкера.

Линкеры типа 2 предназначены для высвобождения в конечном счете карбоксильной группы в кислой среде. Линкеры этого типа образуют лабильные в кислой среде эфиры с карбоксигруппами аминокислот, обычно лабильные в кислой среде бензиловые, бензгидриловые и тритиловые эфиры; примеры таких линкерных структур включают 2-метокси-4-гидроксиметилфеноксигруппу (линкер 8а§г1п^к), 4-(2,4диметоксифенилгидроксиметил)феноксигруппу (линкер К1пк), 4-(4-гидроксиметил-3-метоксифеноксигруппу)масляную кислоту (линкер НМРВ), тритил и 2-хлортритин. Предпочтительно, если подложка получена из полистирола, наиболее предпочтительно сшитого с 1-5% дивинилбензола и функционализированного с помощью 2-хлортритильного линкера.

При проведении параллельного матричного синтеза способы, соответствующие настоящему изобретению, можно с успехом применять так, как описано ниже в настоящем изобретении, но для специалистов в данной области техники должно быть совершенно очевидно, как эти методики следует модифицировать в случае, когда необходимо синтезировать одно конкретное соединение приведенной выше формулы (I).

В количество реакционных сосудов (обычно от 24 до 192, в типичном случае 96), равное общему количеству соединений, синтезируемых по параллельной методике, помещают от 25 до 1000 мг, предпочтительно 100 мг соответствующим образом функционализированной подложки, которая предпочтительно получена из полистирола, сшитого с 1-3% дивинилбензола, или из смолы Теп1а§е1.

Использующиеся растворители должны обеспечивать набухание смолы и они включают, но не ограничиваются только ими, дихлорметан (ДХМ), диметилформамид (ДМФ), Ν-метилпирролидон (ΝΜΡ), диоксан, толуол, тетрагидрофуран (ТГФ), этанол (ЕЮН), трифторэтанол (ТФЭ), изопропиловый спирт и т. п. Смеси растворителей, содержащие в качестве по меньшей мере одного компонента полярный растворитель (например, 20% ТФЭ/ДХМ, 35% ТГФ/ΝΜΡ), прекрасно подходят для обеспечения высокой реакционной способности и сольватации связанных со смолой пептидных цепей (Е1е1й§, О.В., Е1е1й§, С.С., 1. Ат. Сйет. 8ос., 1991, 113, 4202-4207).

После разработки различных линкеров, которые высвобождают С-концевую карбоксигруппу в слабокислой среде, без воздействия на лабильные в кислой среде защитные группы функциональных групп в боковой цепи (цепях), достигнут значительный прогресс в синтезе защищенных пептидных фрагментов. Полученный из 2-метокси-4-гидроксибензилового спирта линкер (линкер 8а§г1п^к, Мегд1ег е1 а1., Те1гайейгоп 1,е11., 1988, 29 4005-4008) отщепляется с помощью разбавленной трифторуксусной кислоты (0,5-1% ТФК в ДХМ) и стабилен при условиях, использующихся для удаления защитной группы Етое при синтезе пептидов, и дополнительные защитные группы на основе ВоеДВи совместимы с этой схемой защиты. Другие линкеры, которые являются подходящими для способов, соответствующих настоящему изобретению, включают лабильный в суперкислоте 4-(2,4-диметоксифенилгидроксиметил)феноксильный линкер (линкер Ктк, Ктк, Н. Тейайейгоп Ьей., 1987, 28, 3787-3790), когда для удаления пептида требуется 10% уксусная кислота в ДХМ или 0,2% трифторуксусная кислота в ДХМ; полученный из 4-(4-гидроксиметил-3-метоксифенокси)масляной кислоты линкер (линкер НМРВ, Е1ог§йе1тег & К1ткег, Рерййез, 1991, 1990, 131) который также отщепляется с помощью 1% ТФК/ДХМ с получением пептидного фрагмента, содержащего все лабильные в кислой среде защитные группы боковой цепи; и, в дополнение, 2-хлортритилхлоридный линкер (Ваг1о§ е1 а1., Тейайейгоп 1,е11., 1989, 30, 3943-3946), который позволяет отщепить пептид с использованием смеси ледяная уксусная кислота/трифторэтанол/ДХМ (1:2:7) в течение 30 мин.

Защитными группами, подходящими для аминокислот и, соответственно, для их остатков, являются, например, для аминогруппы (содержащейся, например, также в боковой цепи лизина)

СЬг	бензилоксикарбонил
Вос	трет-бутилоксикарбонил
Гтос	9-флуоренилметоксикарбонил
АПос	аллилоксикарбонил
Теос	триметилсилилэто ксикарб онил
Тсс	трихлорэтоксикарбонил
Νρδ	о-нитрофенилсульфонил;
Ττί	трифенилметил или тритил

для карбоксигруппы (содержащейся, например, также в боковой цепи аспарагиновой или глутаминовой кислоты) путем превращения в эфиры со спиртами

- 13 013814 ΐΒιι трет-бутил

Βη бензил

Ме метил

Рй фенил

Рас фенацил аллил

Тзе триметилсилилэтил

Тсе трихлорэтил;

для гуанидиновой группы (содержащейся, например, в боковой цепи аргинина)

Рте 2,2,5,7,8-пеитаметилхроман-б-сульфонил

Тз тозил (т.е, п-толуолсульфонил)

СЬг бензилоксикарбонил

РЬГ пентаметилдигидробензофуран-5 -сульфонил для гидроксигруппы (содержащейся, например, в боковой цепи треонина и серина)

!Ви	трет-бутил
Вп	бензил
тп	тритил

и для меркаптогруппы (содержащейся, например, в боковой цепи цистеина)

Аст ацетамидометил сВи трет-бутил

Вп бензил

Тй тритил

М1г 4-метокситритил.

Защищенные с помощью 9-флуоренилметоксикарбонила (Етос) производные аминокислот предпочтительно используют в качестве структурных фрагментов для получения связанных с матрицей β-шпилечных петлевых миметиков формулы (I). Для удаления защитной группы, т.е. отщепления группы Етос, можно использовать 20% пиперидина в ДМФ или 2% ИВи/2% пиперидина в ДМФ.

Количество реагента, т.е. производного аминокислоты, обычно составляет 1-20 экв. в расчете на количество миллиэквивалентов на 1 г (мэкв./г) функционализированной твердой подложки (обычно 0,1-2,85 мэкв./г для полистирольных смол), в исходном состоянии отвешенных в пробирку для проведения реакций. При необходимости для доведения реакции до конца за разумное время можно использовать дополнительное количество эквивалентов реагентов. Пробирки для проведения реакций совместно с блоком держателя и коллектором повторно вставляют в блок резервуара и аппаратуру скрепляют друг с другом. Через коллектор подают поток газа для образования регулируемой среды, например азота, аргона, воздуха и т.п. До подачи в коллектор поток газа также можно нагреть или охладить. Нагрев или охлаждение ячеек для проведения реакций с целью проведения необходимых реакций синтеза проводят путем нагревания или охлаждения реакторного блока снаружи смесью изопропанол/твердый диоксид углерода и т.п. Перемешивание проводят путем встряхивания или с помощью магнитной мешалки (в пробирке для проведения реакций). Предпочтительными установками (без наложения ограничений) являются установка ЕаЬзоигсе'з СотЬьсйет и синтезатор Ми1!18уп Тесй'8-8уго.

Для образования амидной связи необходима активация α-карбоксигруппы с целью проведения стадии ацилирования. Если активацию проводят с помощью обычно применяющихся карбодиимидов, таких как дициклогексилкарбодиимид (ДЦК, 8йеейап & Не88, 1. Ат. СНет. 8ос., 1955, 77, 1067-1068) или диизопропилкарбодиимид (ДИК, 8агап!ак18 е! а1. Вюсйет. Вюрйуз. Ке8. Соттип., 1976, 73, 336-342), полученная дициклогексилмочевина и диизопропилмочевина нерастворима и, соответственно, растворима в обычно применяющихся растворителях. В варианте методики с использованием карбодиимида в качестве добавки к смеси для сочетания включают 1-гидроксибензотриазол (НОВ!, Кош§ & Ое1§ег, СНет. Вег., 1970, 103, 788-798). НОВ! предотвращает дегидратацию, подавляет рацемизацию активированных аминокислот и выступает в качестве катализатора для улучшения протекания медленных реакций сочетания. В качестве реагентов для прямого сочетания используют некоторые фосфониевые реагенты, такие как бензотриазол-1-илокси-трис-(диметиламино)фосфонийгексафторфосфат (ВОР, Саз!го е! а1., Те!гайебгоп Бе!!., 1975, 14, 1219-1222; 8уп!йе818, 1976, 751-752) или бензотриазол-1-илокси-триспирролидинофосфонийгексафторфосфат (Ру-ВОР, Соз!е е! а1., Те!гайебгоп Бе!!. 1990, 31, 205-208), или 2(1Н-бензотриазол-1-ил-)1,1,3,3-тетраметилуронийтетрафторборат (ТВТи) или -гексафторфосфат (НВТи, Кпогг е! а1., Те!гайебгоп Бе!!., 1989, 30, 1927-1930); эти фосфониевые реагенты также пригодны для образования 1п 8Йи эфиров НОВ! с защищенными производными аминокислоты. С недавних пор в качестве реагентов для реакции сочетания используют дифеноксифосфорилазид (ДФФА) или О-(7-азабензотриа

- 14 013814 зол-1-ил)-Л,Х,Х',Х'-тетраметилуронийтетрафторборат (ТАТИ) или О-(7-азабензотриазол-1-ил)-Х,Х,Х',Х'тетраметилуронийгексафторфосфат (НАТи)/7-аза-1-гидроксибензотриазол (ΗΟΑΐ, Сагрто е1 а1., Те1гайейгоп Ьей., 1994, 35, 2279-2281).

Поскольку важно протекание реакций сочетания с выходом, близким к количественному, желательно получать экспериментальные доказательства завершения реакций. После каждой стадии сочетания можно легко и быстро провести нингидриновую реакцию (Ка1кег е1 а1., Апа1. ВюсйешМгу. 1970, 34, 595), при которой положительная колориметрическая реакция аликвоты связанного со смолой пептида является качественным подтверждением наличия первичного амина. Использование группы Ртос позволяет спектрофотометрически определить хромофор Ртос, если он высвобождается с основанием (Ме1епйоРег е1 а1., Σηΐ. 1. Рерййе Рго1ет Век., 1979, 13, 35-42).

В каждой пробирке для проведения реакций связанный со смолой промежуточный продукт промывают для удаления избытка сохранившихся реагентов, растворителей и побочных продуктов путем многократной обработки чистым растворителем (растворителями) по одной из двух описанных ниже методик:

1) ячейки проведения реакций заполняют растворителем (предпочтительно 5 мл), пробирки для проведения реакций совместно с блоком держателя и коллектором погружают и перемешивают в течение от 5 до 300 мин, предпочтительно 15 мин, и сливают под действием силы тяжести, а затем через входное отверстие коллектора подают газ под давлением (закрыв выходное отверстие) для удаления растворителя;

2) коллектор удаляют из блока держателя, аликвоты растворителя (предпочтительно 5 мл) подают через верхнюю часть пробирок для проведения реакций и через фильтр сливают под действием силы тяжести в приемный сосуд, такой как пробирка или флакон.

Обе указанные выше процедуры промывки повторяют до около 50 раз (предпочтительно примерно 10 раз), контролируя удаление реагента, растворителя и побочного продукта по таким методикам, как ТСХ (тонкослойная хроматография), ГХ (газовая хроматография), или путем исследования промывочных растворов.

Описанную выше методику реакции связанного со смолой соединения с реагентом в ячейках для проведения реакций с последующим удалением избытка реагентов, побочных продуктов и растворителей повторяют для каждого последовательного превращения, пока не будет получен конечный связанный со смолой полностью защищенный линейный пептид.

До отделения этого связанного со смолой полностью защищенного линейного пептида от твердой подложки при необходимости можно селективно удалить защитные группы от одной или нескольких функциональных групп, содержащихся в молекуле, и соответствующим образом заместить высвобожденную таким образом реакционноспособную группу (группы). Для этого рассматриваемую функциональную группу (группы) необходимо сначала защитить защитной группой, которую можно селективно удалить без воздействия на остальные защитные группы. А11ос (аллилоксикарбонил) является примером такой защитной группы аминогруппы, которую можно селективно удалить, например, с помощью Ρά⁰ и фенилсилана в СН₂С1₂ без воздействия на остальные защитные группы, такие как Ртос, содержащиеся в молекуле. Высвободившуюся таким образом реакционноспособную группу затем можно обработать реагентом, пригодным для введения необходимого заместителя. Так, например, аминогруппу можно ацилировать с помощью ацилирующего реагента, соответствующего вводимому ацильному заместителю.

До отделения этого связанного со смолой полностью защищенного линейного пептида от твердой подложки при необходимости также можно образовывать межцепочечные связи между боковыми цепями подходящих аминокислотных остатков в положениях 2 и 10.

Межцепочечные связи и их образование обсуждены выше в связи с пояснениями выше, которые, например, могут представлять собой дисульфидные мостики, образованные цистеиновым и гомоцистеиновыми остатками в противолежащих положениях β-цепи; или лактамные мостики, образованные остатками глутаминовой и аспарагиновой кислот, связывающими орнитиновые и, соответственно, лизиновые остатки, или остатками глутаминовой кислоты, связывающими остатки 2,4-диаминомасляной кислоты, расположенными в противолежащих положениях β-цепи, путем образования амидной связи. Образование таких межцепочечных связей можно провести по методикам, хорошо известным в данной области техники.

Для образования дисульфидных мостиков предпочтительно используют раствор 10 экв. раствора йода в ДМФ или в смеси СН₂С1₂/МеОН в течение 1,5 ч и после отфильтровывания раствора йода обработку повторяют в течение еще 3 ч с использованием свежего раствора йода, или в смеси ДМСО (диметилсульфоксид) и уксусной кислоты, значение рН которого доведено до 5-6 с помощью 5% ЫаНСО₃, в течение 4 ч, или в воде, значение рН которой доведено до 8 раствором гидроксида аммония, при перемешивании в течение 24 ч, или в аммонийацетатном буфере, значение рН которого доведено до 8, в присутствии воздуха, или в растворе ΝΜΡ и три-н-бутилфосфина (предпочтительно 50 экв.).

Отделение связанного со смолой полностью защищенного линейного пептида от твердой подложки проводят путем погружения пробирок для проведения реакций совместно с блоком держателя и коллек

- 15 013814 тором в ячейки для проведения реакций, содержащие раствор отщепляющего реагента (предпочтительно от 3 до 5 мл). Поток газа, регулирование температуры, перемешивание и мониторинг протекания реакции проводят так, как это описано выше и необходимо для проведения реакции отделения. Пробирки для проведения реакций совместно с блоком держателя и коллектором отделяют от блока резервуара и поднимают выше уровня раствора, но ниже верхнего края ячеек для проведения реакций и через входное отверстие коллектора подают газ под давлением (закрыв выходное отверстие) для полного слива раствора конечного продукта в ячейки резервуара. Затем смолу, оставшуюся в пробирках для проведения реакций, от 2 до 5 раз промывают так, как выше, с помощью от 3 до 5 мл подходящего растворителя для экстракции (вымывания) как можно большего количества отделенного продукта. Полученные таким образом растворы продукта объединяют, соблюдая осторожность, чтобы не допустить перекрестного смешивания. Затем отдельные растворы/экстракты обрабатывают так, как это необходимо для выделения конечных соединений. Типичная обработка включает, но не ограничивается только ими, выпаривание, концентрирование, жидкостно/жидкостную экстракцию, подкисление, подщелачивание, нейтрализацию или дополнительные реакции в растворе.

Растворы, содержащие производные полностью защищенного линейного пептида, которые отделены от твердой подложки и нейтрализованы основанием, выпаривают. Затем циклизацию проводят в растворах с использованием таких растворителей, как ДХМ, ДМФ, диоксан, ТГФ и т.п. Для циклизации можно использовать различные реагенты реакции сочетания, которые указаны выше. Длительность циклизации составляет примерно 6-48 ч, предпочтительно примерно 16 ч. За протеканием реакции следят, например, с помощью ОФ-ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой). Затем растворитель удаляют выпариванием, производное полностью защищенного линейного пептида растворяют в растворителе, который не смешивается с водой, таком как ДХМ, и для удаления избытка реагента сочетания раствор экстрагируют водой или смесью смешивающихся с водой растворителей.

В заключение производное полностью защищенного линейного пептида обрабатывают с помощью 95% ТФК, 2,5% Н₂О, 2,5% ТИС или другой комбинации поглотителей для проведения отщепления защитных групп. Длительность реакции отщепления обычно составляет от 30 мин до 12 ч, предпочтительно примерно 2,5 ч. Летучие вещества выпаривают досуха и неочищенный пептид и неочищенный пептид растворяют в 20% АсОН в воде и экстрагируют водой и изопропиловым эфиром или другими подходящими для этого растворителями. Водный слой собирают и выпаривают досуха и в качестве конечного продукта получают производное циклического пептида с полностью удаленными защитными группами формулы (I).

Альтернативно, отделение, циклизацию и полное отделение полностью защищенного пептида от твердой подложки можно провести вручную в стеклянных сосудах.

В зависимости от его чистоты это производное пептида можно использовать непосредственно для биологических исследований или его необходимо дополнительно очистить, например, с помощью препаративной ВЭЖХ.

Как отмечено выше, при необходимости после этого можно превратить полученный таким образом продукт с полностью удаленными защитными группами формулы (I) в фармацевтически приемлемую соль или превратить полученную таким образом фармацевтически приемлемую или неприемлемую соль в соответствующее свободное соединение формулы (I) или в другую фармацевтически приемлемую соль. Любую из этих операций можно провести по методикам, хорошо известным в данной области техники.

Исходные вещества матриц формулы II, использующиеся в способах, соответствующих настоящему изобретению, вещества для получения исходных веществ и получение исходных веществ и веществ для получения исходных веществ описаны в заявке на международный патент РСТ/ЕР 02/01711 тех же заявителей, опубликованной, как \УО 02/070547 А1.

β-Шпилечные пептидомиметики, соответствующие настоящему изобретению, можно использовать в самых различных случаях, когда воспалительные заболевания или заболевания легких, или инфекционные или иммунологические заболевания, или сердечно-сосудистые заболевания, или нейродегенеративные заболевания опосредуются активностью сериновой протеазы или обусловлены ее активностью, или когда рак опосредуется активностью сериновой протеазы или обусловлен ее активностью. Для лечения или предупреждения данного нарушения или заболевания, которое поддается лечению ингибиторами протеазы, β-шпилечные пептидомиметики можно вводить по отдельности или можно применять в виде подходящего состава совместно с носителями, разбавителями или инертными наполнителями, хорошо известными в данной области техники.

При использовании для лечения или предупреждения таких заболеваний, как эмфизема легких, ревматоидный артрит, остеоартрит, атеросклероз, псориаз, кистозный фиброз, рассеянный склероз, респираторный дистресс-синдром взрослых, панкреатит, астма, аллергический ринит, воспалительные дерматозы, рестеноз после ангиопластики, гипертрофия сердца, сердечная недостаточность или рак, такой как, но не ограничиваясь только ими, рак молочной железы или рак, связанный с ангиогенезом или метастазированием, β-шпилечные пептидомиметики можно вводить по отдельности, в виде смесей нескольких β-шпилечных пептидомиметиков, в комбинации с другими противовоспалительными средствами

- 16 013814 или противомикробными средствами, или противораковыми средствами и/или комбинации с другими фармацевтически активными средствами. β-Шпилечные пептидомиметики можно вводить по отдельности или в виде фармацевтических композиций.

Фармацевтические композиции, содержащие β-шпилечные пептидомиметики, соответствующие настоящему изобретению, можно приготовить с помощью обычных технологий смешивания, растворения, гранулирования, изготовления таблеток с покрытием, растирания в порошок, эмульгирования, капсулирования, включения или лиофилизации. Фармацевтические композиции можно приготовить обычным образом с использованием одного или большего количества физиологически приемлемых носителей, разбавителей, инертных наполнителей или вспомогательных веществ, которые облегчают переработку активных β-шпилечных пептидомиметиков в препараты, которые можно использовать фармацевтически. То, какой препарат является подходящим, зависит от выбранного пути введения.

Для местного введения β-шпилечные пептидомиметики, соответствующие настоящему изобретению, можно приготовить в виде растворов, гелей, мазей, кремов, суспензий и т.п., хорошо известных в данной области техники.

Системные препараты включают предназначенные для введения путем инъекции, например подкожной, внутривенной, внутримышечной, внутриоболочечной или внутрибрюшинной инъекции, а также предназначенные для чрескожного, проводимого через слизистую оболочку, перорального или легочного введения.

Для инъекции β-шпилечные пептидомиметики, соответствующие настоящему изобретению, можно приготовить в виде надлежащих растворов предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенка (Ηίπίχ'κ §о1и1юп), раствор Рингера или физиологический солевой раствор. Растворы могут содержать использующиеся для приготовления вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие вещества. Альтернативно, β-шпилечные пептидомиметики, соответствующие настоящему изобретению, могут находиться в виде порошка, предназначенного для проводимого перед использованием комбинирования с подходящим разбавителем, например стерильной апирогенной водой.

Для введения через слизистые оболочки в препаратах, известных в данной области техники, используют обеспечивающие проницаемость вещества, соответствующие барьеру, проникновение через который необходимо обеспечить.

Для перорального введения β-шпилечные пептидомиметики, соответствующие настоящему изобретению, можно легко приготовить путем их объединения с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области техники. Такие носители позволяют приготовить β-шпилечные пептидомиметики, соответствующие настоящему изобретению, в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п., предназначенных для проглатывания подвергающимися лечению пациентами. Подходящие для пероральных препаратов, таких как, например, порошки, капсулы и таблетки, инертные наполнители включают наполнители, такие как сахара, например лактоза, сахароза, маннит и сорбит; препараты целлюлозы, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовую камедь, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы и/или поливинилпирролидон (ПВП); гранулирующие средства и связывающие вещества. При необходимости можно прибавить вещества, обеспечивающие распадаемость, такие как сшитые поливинилпирролидоны, агар или альгиновую кислоту или ее соль, такую как альгинат натрия. При необходимости с помощью стандартных технологий на твердые дозированные формы можно нанести покрытие из сахара или энтеросолюбильное покрытие.

Для приготовления пероральных жидких препаратов, таких как, например, суспензии, эликсиры и растворы, подходящие носители, разбавители или инертные наполнители включат воду, гликоли, масла, спирты и т.п. Кроме того, можно прибавить ароматизаторы, консерванты, красители и т.п.

Для трансбуккального введения композиция может находится в форме таблеток, пастилок и т.п., приготовленных обычным образом.

Для введения путем ингаляции β-шпилечные пептидомиметики, соответствующие настоящему изобретению, обычно готовят в виде аэрозолей, распыляемых из находящихся под давлением упаковок или распылителя с использованием подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под давлением разовую дозу можно подавать с помощью клапана, подающего отмеренное количество. Можно изготовить капсулы и катриджи, например, изготовленные из желатина, предназначенные для использования в ингаляторе или аппарате для вдувания порошка, содержащие порошкообразную смесь β-шпилечных пептидомиметиков, соответствующих настоящему изобретению, и подходящей порошкообразной основы, такой как лактоза или крахмал.

Соединения также можно приготовить в виде композиций для ректального или вагинального введения, таких как суппозитории, совместно с подходящей основой для суппозиториев, такой как масло какао или другие глицериды.

В дополнение к описанным выше композициям β-шпилечные пептидомиметики, соответствующие

- 17 013814 настоящему изобретению, также можно приготовить в виде препаратов-депо (бсро1 ргерагайопк). Такие препараты длительного действия можно вводить путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. Для приготовления таких препаратов-депо β-шпилечные пептидомиметики, соответствующие настоящему изобретению, можно приготовить вместе с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в подходящем масле) или ионообменными смолами, или в виде умеренно растворимых солей.

Кроме того, можно использовать другие фармацевтические системы доставки, такие как липосомы и эмульсии, хорошо известные в данной области техники. Также можно использовать некоторые органические растворители, такие как диметилсульфоксид. Кроме того, β-шпилечные пептидомиметики, соответствующие настоящему изобретению, можно вводить с использованием систем пролонгированного действия, таких как полупроницаемые матрицы из твердых полимеров, содержащие лекарственное средство. Имеются различные материалы пролонгированного действия, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. В зависимости от своей химической природы капсулы пролонгированного действия выделяют соединения в течение от нескольких недель до более 100 дней. В зависимости от химической природы и биологической стабильности лекарственного средства можно использовать дополнительные стратегии или стабилизацию белка.

Поскольку β-шпилечные пептидомиметики, соответствующие настоящему изобретению, могут содержать заряженные остатки, их можно включать в любые описанные выше препараты сами по себе или в виде фармацевтически приемлемых солей. Фармацевтически приемлемые соли обычно лучше растворимы в водных и других протонных растворителях, чем соответствующие свободные формы.

β-Шпилечные пептидомиметики, соответствующие настоящему изобретению, или их композиции обычно используют в количествах, эффективных для достижения поставленной цели. Следует понимать, что использующееся количество зависит от конкретного случая применения.

Для местного введения с целью лечения или предупреждения заболеваний, которые поддаются лечению β-шпилечными пептидомиметиками, терапевтически эффективную дозу можно определить с использованием, например, исследований ίη νίίΓΟ, описанных в примерах. Лечение можно проводить, когда заболевание проявляется или даже когда оно не проявляется. Специалист с общей подготовкой в данной области техники будет способен без проведения чрезмерно большого количества экспериментов определить терапевтически эффективные количества, необходимые для лечения местных заболеваний.

Для системного введения терапевтически эффективную дозу можно определить заранее по данным исследований ίη νίίΓΟ. Например, дозу можно приготовить для подопытных животных для определения диапазона концентраций циркулирующего в кровотоке β-шпилечного пептидомиметика с использованием значения 1С₅₀, определенного для клеточной культуры. Такую информацию можно использовать для более точного определения доз, подходящих для людей.

Начальные дозы также можно определить по данным исследований ίη νίνο, например, на подопытных животных, по методикам, которые хорошо известны в данной области техники. Специалист с общей подготовкой в данной области техники может легко оптимизировать введение людям на основании данных, полученных для животных.

Дозы для использования в качестве агентов, ингибирующих сериновую протеазу, можно подобрать индивидуально с обеспечением в плазме содержания β-шпилечных пептидомиметиков, соответствующих настоящему изобретению, которое достаточно для поддержания терапевтического эффекта. Терапевтически эффективные содержания в сыворотке можно обеспечить путем введения нескольких доз ежедневно.

В случае местного введения или селективного потребления эффективная локальная концентрация β-шпилечных пептидомиметиков, соответствующих настоящему изобретению, может не быть связана с концентрацией в плазме. Специалист с общей подготовкой в данной области техники должен быть способен без проведения чрезмерно большого количества экспериментов оптимизировать терапевтически эффективные локальные дозы.

Количество вводимых β-шпилечных пептидомиметиков, разумеется, зависит от подвергающегося лечению субъекта, массы субъекта, тяжести заболевания, пути введения и решения лечащего врача.

Обычно терапевтически эффективная доза β-шпилечных пептидомиметиков, описанных в настоящем изобретении, обеспечит благоприятное терапевтическое воздействие и не приведет к существенной токсичности.

Токсичность β-шпилечных пептидомиметиков, соответствующих настоящему изобретению, можно определить с помощью стандартных фармацевтических процедур на клеточных культурах или подопытных животных, например, путем определения ЬИ₅₀ (дозы, летальной для 50% популяции) или ЬИ₁₀₀(дозы, летальной для 100% популяции). Отношение доз, приводящих к токсическому и терапевтическому воздействию, называется терапевтическим индексом. Предпочтительными являются соединения, обладающие большим терапевтическим индексом. Данные, полученные с помощью клеточных культур или подопытных животных, можно использовать для определения диапазона доз, которые не являются токсичными при введении людям. Дозы β-шпилечных пептидомиметиков, соответствующих

- 18 013814 настоящему изобретению, предпочтительно находятся в диапазоне находящихся в кровотоке концентраций, которые включают эффективную дозу при слабой токсичности или при отсутствии токсичности. Дозы могут меняться в определенном диапазоне, зависящем от использующихся дозированной формы и пути введения. Точный состав препарата, путь введения и дозу может подобрать каждый врач с учетом состояния пациента (см., например, Ρίπβί е! а1., 1975, Ιη: Тйе Рйагтасо1о§1са1 Ва818 о£ ТРегареийсз, СЬ.1, р. 1).

Приведенные ниже примеры более подробно иллюстрируют настоящее изобретение, но никоим образом не ограничивают его объем. В примерах использованы следующие аббревиатуры:

НВТи: 1-бензотриазол-1-илтетраметилуронийгексафторфосфат (Кпогг е! а1. Те1гаЬес1гоп Ье!!., 1989, 30, 1927-1930);

НОВ!: 1-гидроксибензотриазол;

ДИЭА: диизопропилэтиламин;

НОАТ: 7-аза-1 -гидроксибензотриазол;

НАТИ: О-(7-азабензотриазол-1-ил)-№^,№,№-тетраметилуронийгексафторфосфат (Сагрто е! а1. Те!гаЬебгоп Ье!!., 1994, 35, 2279-2281).

Примеры

1. Синтез пептидов.

Примеры 1-45, 48, 51-63, 65-67, 70, 71, 74-114, 122-125, 129, 131-162, 164, 166, 167, 169, 170, 172, 173, 175, 177-182, 184-189 и 191-196 иллюстрируют изобретение и примеры 46, 47, 49, 50, 64, 68, 69, 72, 73, 115-121, 126-128, 130, 163, 165, 168, 171, 174, 183 и 190 представлены ради полноты описания.

Связывание первого защищенного аминокислотного остатка со смолой.

0,5 г 2-хлортритилхлоридной смолы (Ваг1оз е! а1. ТеН’аЬебгоп Ье!!., 1989, 30, 3943-3946) (0,83 ммоль/г, 0,415 ммоль) помещают в высушенную колбу. Смолу суспендируют в СН₂С1₂ (2,5 мл) и ей дают набухать при комнатной температуре при непрерывном перемешивании в течение 30 мин. Смолу обрабатывают с помощью 0,415 ммоль (1 экв.) первого соответствующим образом защищенного аминокислотного остатка (см. ниже) и 284 мкмоль (4 экв.) диизопропилэтиламина (ДИЭА) в СН₂С1₂ (2,5 мл), смесь встряхивают при 25°С в течение 4 ч. Цвет смолы переходит в пурпурный и раствор остается желтоватым. Смолу встряхивают (СН₂С1₂ /МеОН/ДИЭА:17/2/1), 30 мл в течение 30 мин; затем промывают в следующем порядке с помощью СН₂С1₂ (1х), ДМФ (1х), СН₂С1₂ (1х), МеОН (1х), СН₂С1₂ (1х), МеОН (1х), СН₂С1₂ (2х), Е!₂О (2х) и сушат в вакууме в течение 6 ч. Содержание аминокислоты обычно составляет 0,6-0,7 ммоль/г.

Получают следующие смолы, содержащие аминокислоты: Ртос-Рго-2-хлортритиловая смола, Ртос-Азр (О!Ви)-2-хлортритиловая смола, Ртос-Рго(5КРйе)-2-хлортритиловая смола, Ртос-Ьеи-2хлортритиловая смола, Ртос-О1и(О!Ви)-2-хлортритиловая смола, Ртос-Азр(О!Ви)-2-хлортритиловая смола, Ртос-Рйе-2-хлортритиловая смола, Ртос-О1п(Тг!)-2-хлортритиловая смола, Ртос-8ег(О!Ви)-2хлортритиловая смола, Ртос-Уа1-2-хлортритиловая смола, Ртос-Тйг(О!Ви)-2-хлортритиловая смола и Ртос-11е-2-хлортритиловая смола.

Синтез полностью защищенного пептидного фрагмента.

Синтез проводят с помощью синтезатора 8уго-рер!10е (Ми1!18уп!есй) с использованием от 24 до 96 сосудов для проведения реакций. В каждый сосуд помещают 60 мг (масса смолы до введения аминокислоты) указанной выше смолы. Программируют и выполняют следующие циклы реакций:

Стадия Реагент

СН₂С1₂, промывка и набухание (вручную)

ДМФ, промывка и набухание

40 % пиперидин/ДМФ

ДМФ, промывка

5 экв. Ршос аминокислоты/ДМФ + 5 экв. нвти + 5 экв. НОВ!

+ 5 экв. ДИЭА

ДМФ, промывка

СН₂С1₂, промывка (в конце синтеза)

Время х 1 мин. 1 х 5 мин 1 х 5 мин. 5x2 мин.

х 120 мин.

4x2 мин.

3x2 мин.

Для добавления каждой аминокислоты повторяют стадии 3-6.

После завершения синтеза полностью защищенного пептидного фрагмента выполняют процедуру А или процедуру В, описанные ниже, в зависимости от того, необходимо ли формировать межцепочечные связи (т.е. дисульфидные связи в β-цепи).

- 19 013814

Процедура А. Циклизация и обработка основной цепи циклизованных пептидов.

Отщепление полностью защищенного пептидного фрагмента.

После завершения синтеза смолу суспендируют в 1 мл (0,39 ммоль) 1% ТФК в СН₂С1₂ (об./об.) в течение 3 мин, фильтруют и фильтрат нейтрализуют с помощью 1 мл (1,17 ммоль, 3 экв.) 20% ДИЭА в СН₂С1₂ (об./об.). Эту процедуру повторяют дважды, чтобы обеспечить завершение отщепления. Из аликвоты (200 мкл) фильтрата полностью удаляют защитные группы с помощью 0,5 мл смеси для отщепления, содержащей 95% трифторуксусной кислоты (ТФК), 2,5% воды и 2,5% триизопропилсилана (ТИС) и анализируют с помощью ЖХ-МС с обращенной фазой (жидкостная хроматография-масс-спектроскопия) для мониторинга эффективности синтеза линейного пептида.

Циклизация линейного пептида.

Полностью защищенный линейный пептид растворяют в ДМФ (8 мл, концентрация 10 мг/мл). Прибавляют 2 экв. НАТИ (0,72 ммоль) в 1 мл ДМФ и 4 экв. ДИЭА (1,44 ммоль) в 1 мл ДМФ и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 ч. Летучие вещества выпаривают досуха. Неочищенный циклизованный пептид растворяют в 7 мл СН₂С1₂ и трижды экстрагируют с помощью 10% ацетонитрила в воде (4,5 мл). Содержащий СН2С12 слой выпаривают досуха.

Удаление защитных групп и очистка циклического пептида.

Полученный циклический пептид растворяют в 3 мл смеси для отщепления, содержащей 95% трифторуксусной кислоты (ТФК), 2,5% воды и 2,5% триизопропилсилана (ТИС). Смесь выдерживают при 20°С в течение 2,5 ч и затем концентрируют в вакууме. Неочищенный пептид растворяют в 20% АсОН в воде (7 мл) и трижды экстрагируют диизопропиловым эфиром (4 мл). Водный слой собирают, выпаривают досуха и остаток очищают с помощью препаративной ЖХ-МС с обращенной фазой.

После лиофилизации получают продукты в виде белых порошков и их анализируют с помощью ЖХ-МС. Данные анализа, включающие чистоту после препаративной ВЭЖХ и ИЭР-МС (масс-спектроскопия с ионизацией электрораспылением), приведены в табл. 1.

Методика анализа.

Времена удерживания по данным анализа с помощью ВЭЖХ (ВУ, в мин) определяют с помощью 1ирйег Рго!ео 90А, 150 х 2,0 мм, (сой. 00Ρ4396-Β0 - РИепотепех) с использованием следующих растворителей А (Н₂О + 0,1% ТФК), В (СН₃СЫ + 0,1% ТФК) и градиентного режима: 0 мин: 95% А, 5% В; 20 мин: 40% А, 60% В; 21-23 мин: 0% А, 100% В; 23,1-30 мин: 95% А, 5% В.

Процедура В. Циклизация и обработка основной цепи циклизованных пептидов, содержащих дисульфидные связи в β-цепи.

Образование дисульфидной связи в β-цепи.

После завершения синтеза смоле дают набухать в 3 мл сухого ДМФ в течение 1 ч. Затем в реактор прибавляют 10 экв. раствора йода в ДМФ (6 мл), затем перемешивают в течение 1,5 ч. Смолу отфильтровывают и прибавляют свежий раствор йода (10 экв.) в ДМФ (6 мл), затем перемешивают в течение еще 3 ч. Смолу отфильтровывают и промывают с помощью ДМФ (3х) и СН₂С1₂ (3х).

Циклизация основной цепи, отщепление и очистка пептида.

После образования дисульфидной связи в β-цепи смолу суспендируют в 1 мл (0,39 ммоль) 1% ТФК в СН₂С1₂ (об./об.) в течение 3 мин и фильтруют и фильтрат нейтрализуют с помощью 1 мл (1,17 ммоль, 3 экв.) 20% ДИЭА в СН₂С1₂ (об./об.). Эту процедуру повторяют дважды, чтобы обеспечить завершение отщепления. Смолу промывают с помощью 2 мл СН2С12. Содержащий СН2С12 слой выпаривают досуха.

Полностью защищенный линейный пептид солюбилизируют в 8 мл сухого ДМФ. Затем к пептиду прибавляют 2 экв. НАТИ в сухом ДМФ (1 мл) и 4 экв. ДИПЭА в сухом ДМФ (1 мл), затем перемешивают в течение 16 ч. Летучие вещества выпаривают досуха. Неочищенный циклизованный пептид растворяют в 7 мл СН₂С1₂ и трижды экстрагируют с помощью 10% ацетонитрила в воде (4,5 мл). Содержащий СН₂С1₂ слой выпаривают досуха. Для полного удаления защитных групп из пептида прибавляют 3 мл смеси для отщепления ТФК:ТИС:Н₂О (95:2,5:2,5) и смесь выдерживают в течение 2,5 ч. Летучие вещества выпаривают досуха и неочищенный пептид растворяют в 20% АсОН в воде (7 мл) и трижды экстрагируют диизопропиловым эфиром (4 мл). Водный слой собирают и выпаривают досуха и остаток очищают с помощью препаративной ЖХ-МС с обращенной фазой.

После лиофилизации получают продукты в виде белых порошков и их анализируют с помощью аналитической методики ИЭР-МС, описанной выше. Данные анализа, включающие чистоту после препаративной ВЭЖХ и ИЭР-МС, приведены в табл. 1.

Соединения примеров 1-45, 52-63, 65-67, 70-71, 75-114, 129, 131-162 и 179-196 приведены в табл. 1. Пептиды синтезируют с использованием в качестве исходной аминокислоты Рго, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Ртос-Рго-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейные пептиды синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Рго-^сРго-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Соединения примеров 1-6, 9-45, 52-63, 65-67, 70-71, 75-103, 112-114, 129, 131, 133, 136-138, 140-141, 143-146, 148-153, 155, 157-162 и 179-196 отщепляют от смолы, вводят в реакцию образования дисульфидных мостиков, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В. Соединения примеров 82,

- 20 013814

123, 149, 159, 161 и 178 отщепляют от смолы так, как указано в процедуре В. Дисульфидные мостики образуют по следующей процедуре:

Неочищенный продукт солюбилизируют в аммонийацетатном буфере 0,1 М (рН доводят до 8) (концентрация: 1 мг неочищенного продукта в 1 мл). Смесь перемешивают при комнатной температуре в присутствии воздуха. За протеканием реакции следят с помощью ЖХ-МС с обращенной фазой. После завершения реакции раствор выпаривают досуха и остаток очищают с помощью препаративной ЖХ-МС с обращенной фазой.

Циклизацию основной цепи проводят так, как указано в процедуре А. Удаление защитных групп проводят по следующей методике:

Для полного удаления защитных групп из пептида прибавляют 5 мл смеси для отщепления ТФК:Н₂О:фенол:тиоанизол:этандитиол (82,5:5:5:5:2,5) и смесь выдерживают в течение 5 ч при комнатной температуре. Петид осаждают путем прибавления холодного диэтилового эфира (10 мл). После центрифугирования надосадочную фазу удаляют. Осадок трижды промывают с помощью 5 мл диэтилового эфира и очищают с помощью препаративной ЖХ-МС с обращенной фазой.

После лиофилизации получают продукты в виде белых порошков и их анализируют с помощью аналитической методики ИЭР-МС, описанной выше.

Соединения примеров 7, 8, 104-111, 132, 134, 135, 139, 142, 147, 154 и 156 отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре А.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике (далее аббревиатура прим. означает соединение примера) прим. 1 (15,37), прим. 2 (11,54), прим. 3 (7,82), прим. 4 (8,62), прим. 5 (16,51), прим. 6 (13,67), прим. 7 (3,61), прим. 8 (4,11), прим. 9 (5,82), прим. 10 (7,98), прим. 11 (8,38), прим. 12 (6,80), прим. 13 (7,41), прим. 14 (6,20), прим. 15 (8,68), прим. 16 (9,82), прим. 17 (5,59), прим. 20 (7,32), прим. 21 (8,66), прим. 22 (8,68), прим. 23 (12,66), прим. 24 (8,67), прим. 25 (7,53), прим. 26 (9,02), прим. 27 (8,06), прим. 28 (9,62), прим. 29 (8,78), прим. 30 (10,49), прим. 31 (5,50), прим. 32 (7,45), прим. 33 (8,39), прим. 34 (10,16), прим. 35 (9,04), прим. 36 (10,98), прим. 37 (7,56), прим. 38 (9,29), прим. 39 (8,32), прим. 40 (10,11), прим. 41 (7,23), прим. 42 (8,83), прим. 43 (7,92), прим. 44 (9,87), прим. 45 (8,26), прим. 52 (6,20), прим. 53 (8,68), прим. 54 (9,82), прим. 55 (5,59), прим. 56 (6,06), прим. 57 (6,47), прим. 58 (7,32), прим. 59 (8,68), прим. 60 (10,66), прим. 61 (8,54), прим. 62 (9,83), прим. 63 (16,54), прим. 65 (15,71), прим. 66 (17,50), прим. 67 (15.87) , прим. 70 (12,87), прим. 71 (13,48), прим. 75 (14,22), прим. 76 (4,47), прим. 77 (5,15), прим. 78 (10,93), прим. 79 (10,70), прим. 80 (12,09), прим. 81 (11,63), прим. 82 (5,71), прим. 83 (5,45), прим. 84 (11,14), прим. 85 (10,90), прим. 86 (13,78), прим. 87 (13,98), прим. 88 (14,35), прим. 89 (15,21), прим. 90 (14,72), прим. 91 (11,97), прим. 92 (11,77), прим. 93 (15,25), прим. 94 (14,61), прим. 95 (20,46), прим. 96 (15,08), прим. 97 (20,78), прим. 98 (18,28), прим. 99 (14,62), прим. 100 (13,90), прим. 101 (13,76), прим. 102 (20,53), прим. 103 (14,14), прим. 104 (11,60), прим. 105(11,90), прим. 106 (11,63), прим. 107 (11,78), прим. 108 (13,03), прим. 109 (15,22), прим. 110 (12,40), прим. 111 (12,10), прим. 112 (5,49), прим. 113 (5,67), прим. 114 (5,55), прим. 129 (17,22), прим. 131 (11,97), прим. 132 (13,56), прим. 133 (14,57), прим. 134 (14,72), прим. 135 (17,53), прим. 136 (18,28), прим. 137 (14,72), прим. 138 (14,35), прим. 139 (15,40), прим. 140 (11,14), прим. 141 (5,71), прим. 142 (13,97), прим. 143 (13,94), прим. 144 (15,08), прим. 145 (20.87) , прим. 146 (17,91), прим. 147 (17,11), прим. 148 (7,83), прим. 149 (16,22), прим. 150 (20,09), прим. 151 (20,72), прим. 152 (21,38), прим. 153 (17,97), прим. 154 (16,58), прим. 155 (19,46), прим. 156 (15,66), прим. 157 (22,04), прим. 158 (15,65), прим. 159 (17,89), прим. 160 (18,72), прим. 161 (19,91), прим. 162 (17,79), прим. 179 (4,25), прим. 180 (11,43), прим. 181 (12,30), прим. 182 (12,83), прим. 183 (10,51), прим. 184 (12,12), прим. 185 (10,14), прим. 186 (10,09), прим. 187 (10,14), прим. 188 (10,65), прим. 189 (10,73), прим. 190 (10,10), прим. 191 (10,17), прим. 192 (10,19), прим. 193 (11,02), прим. 194 (9,92), прим. 195 (10,74), прим. 196 (9,94).

Соединение примера 46 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Рго, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Ртос-Рго-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Рго-^сАкр(О1Ви)-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 46 (8,94).

Соединение примера 47 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Акр, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Ртос-Акр(О1Ви)-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Акр(О1Ви)-^сРго-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 47 (7,29).

- 21 013814

Соединение примера 48 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Рго(5КРке), которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-Рго(5КРке)-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Рго(5КРке)-^сРго-Р11-Р10-Р9-Р8Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 48 (10,07).

Соединение примера 49 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Рго, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-Рго-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Р^о-^{^}Λ1а-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 49 (8,09).

Соединение примера 50 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Рго, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-Рго-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Рго-^с11е-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 50 (9,78).

Соединение примера 51 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Ьеи, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-Ьеи-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Ьеи-^сРго-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 51 (8,94).

Соединение примера 64 приведено в табл. 7. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты С1и, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-С1и(О1Ви1)-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-С1и(О1Ви)-^сРго-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 64 (13,17).

Соединение примера 68 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Акр, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-А^ОШи^-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Л8ρ(ОΐΒи)-^{^}Л1а-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 68 (12,44).

Соединение примера 69 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Рго, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Егиос-Рго-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола Рго-^сА8и(Тг1)-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 69 (12,97).

Соединение примера 72 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Рго, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-Рго-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Рго-^сТйг(О1Ви)-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

- 22 013814

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 72 (13,34).

Соединение примера 73 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Рго, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-Рго-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Рго-^сПе-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 73 (9,78).

Соединение примера 74 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Ьеи, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-Ьеи-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Ьеи-^сРго-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 74 (8,94).

Соединение примера 115 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Рго, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-Рго-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Рго-^сАзр(О1Ви)-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 115 (4,82).

Соединение примера 116 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Рго, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-Рго-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Рго-^сРке-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 116 (5,98).

Соединение примера 117 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Рго, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-Рго-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Рго-^сАгд(Тг1)-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 117 (4,48).

Соединение примера 118 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Рго, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-Рго-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Рго-^с8ег(О1Ви)-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 118 (4,73).

Соединение примера 119 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Рго, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-Рго-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Рго-^сУа1-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 119 (5,47).

Соединение примера 120 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Рго, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-Рго-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Рго-^сР1р-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1.

- 23 013814

Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше градиентной методике 1: прим. 120 (5,48).

Соединение примера 121 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Акр, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-Акр(О1Ви)-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Акр(О1Ви)-^сРго-Р11-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 121 (4,56).

Соединения примеров 122 и 167 приведены в табл. 1. Пептиды синтезируют, начиная с аминокислоты Р11С. которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-РЬе-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейные пептиды синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Рйе-^сРго-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 122 (5,75); 167 (5,75).

Соединения примеров 123, 164, 169, 170, 172, 173, 175, 177 и 178 приведены в табл. 1. Пептиды синтезируют, начиная с аминокислоты С1и, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-С1п(Тг1)-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейные пептиды синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-С1п(Тг1)-^сРго-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 123 (4,35), 164 (13,20), 169 (16,81), 170 (14,57), 172 (16,78), 173 (13,57), 175 (15,94), 177 (16,78), 178 (17,45).

Соединение примера 124 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты 8ег, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-8ег(О1Ви)-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-8ег(О1Ви)-^сРго-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 124 (4,46).

Соединение примера 125 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Уа1, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-Уа1-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Уа1-^сРго-Р11-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 125 (18,42).

Соединение примера 126 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты ТЬг, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-ТЬг(О1Ви)-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Тйг(О1Ви)-^сТйг(О1Ви)-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 126 (4,35).

Соединения примеров 127, 163, 165 и 174 приведены в табл. 1. Пептиды синтезируют, начиная с аминокислоты С1и, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Етос-С1и(О1Ви)-2хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейные пептиды синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-С1и(О1Ви)^сЬук(Вос)-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 127 (4,11), 163 (14,93), 165 (14,40), 174 (12,73).

Соединение примера 128 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты ТЬг,

- 24 013814 которую прививают к смоле. Исходной смолой является Ртос-Тйг(О£Ви)-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Тйг(О1Ви)-°Рйе-Р11-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше градиентной методике 1: прим. 128 (5,26).

Соединение примера 130 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Рго, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Ртос-Рго-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Рго-°А1а-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 130 (14,79).

Соединение примера 166 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Не, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Ртос-Ие-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-Ие-°Рйе-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 166 (16,80).

Соединение примера 168 приведено в табл. 1. Пептид синтезируют, начиная с аминокислоты Акр, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Ртос-А§р(О1Ви)-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейный пептид синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-А§р(О£Ви)-°Рго-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 168 (4,56).

Соединения примеров 171 и 176 приведены в табл. 1. Пептиды синтезируют, начиная с аминокислоты Θίη, которую прививают к смоле. Исходной смолой является Ртос-О1п(Тг1)-2-хлортритильная смола, которую получают так, как описано выше. Линейные пептиды синтезируют на твердой подложке по описанной выше методике в следующей последовательности: Смола-О1п(Тг£)-°О1п(Тг£)-Р11-Р10-Р9-Р8Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Затем образуют дисульфидный мостик и пептид отщепляют от смолы, циклизуют, удаляют защитные группы и очищают так, как указано в процедуре В.

Время удерживания для ВЭЖХ (мин) определяют по описанной выше аналитической методике: прим. 171 (15,40), 176 (13,67).

Пример

Зеци.ГО

Ρ1

Примеры

Р11

Матрица

Таблица 1 Чистота%^а) [М+ Н]

Р2

РЗ

Р4

Р5

Р6

Р7

Р8

Р9

РЮ

1

8ЕЦ ГО ΝΟ: 1

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

8ег

О1и

Рго

Не

Суз

ТЬг

°Рго^ЕРго

95

1385,7

2

ЗЕЦ ГО ΝΟ: 2

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Азр

°Рго^ЕРго

93

1399,5

3

ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 3

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Азп

°Рго^ЕРго

95

1398,5

4

8Е<3 ГО ΝΟ: 4

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

8ег

Азр

Рго

Не

Суз

Зег

°Рго^ЕРго

95

1371,1

5

ЗЕО ГО ΝΟ: 5

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1447,5

6

8Εζ) ГО ΝΟ: 6

Туг

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

ТЬг

°Рго^ЕРго

95

1401,7

7

8Еф ГО ΝΟ: 7

Агд

О1и

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Агд

РЬе

°Рго^ЕРго

95

1521,2

8

ЗЕО ГО ΝΟ: 8

Агд

Νΐε

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Νίβ

РЬе

°Рго^ЕРго

95

1462,4

9

ЗЕО ГО ΝΟ: 9

4АшРЬеСуз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Зег

°Рго^ЕРго

92

1386,9

10

ЗЕр ΙΌΝΟ: 10

Νίβ

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Зег

°Рго^ЕРго

93

1337,8

11

8ЕЦ ГО ΝΟ: 11

СЬд

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Зег

°Рго^ЕРго

95

1363,8

12

ЗЕр ГО ΝΟ: 12

СЬд

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

95

1432,7

13

ЗЕО ГОЖ): 13

2С1-РЬе Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

95

1474,5

14

ЗЕр 10 N0: 14

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

А1а

Не

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

93

1380,5

15

ЗЕр ΙϋΝΟ: 15

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Νίβ

Суз

Зег

°Рго^ЕРго

95

1371,8

16

8Ε0ΙΏΝΟ: 16

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

СЬа

Суз

Зег

°Рго^ЕРго

95

1411,6

17

ЗЕрГОМО: 17

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

О1п

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

95

1421,6

18

ЗЕО ГОЖ): 18

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Туг

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

89

1456,6

19

δΕΟΙΌΝΟ: 19

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

ΝΊβ

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

95

1476,6

20

8ΕΡ ΙΌ ΝΟ: 20

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

СЬа

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

95

1446,5

21

8Ε0 ГО N0:21

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

О1и

Рго

Не

Суз

Зег

°Рго^ЕРго

95

1385,8

22

8Εζ) Ю ΝΟ: 22

Не

Суз

ТЬг

Νίβ

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

95

1391,6

23

8ЕЦ ГО ΝΟ: 23

РЬе

Суз

ТЬг

Νίβ

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1432,7

24

8Ε0 ΙΌ ΝΟ: 24

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

АПоТЬг Азр

Рго

Не

Суз

Зег

°Рго^ЕРго

95

1385,7

25

8Εζ) Ю ΝΟ: 25

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Орг

Азр

Рго

Не

Суз

Зег

°Рго^ЕРго

95

1370,9

26

8Εζ) ΙΌ ΝΟ: 26

Туг

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1463,8

27

ЗЕр ГО ΝΟ: 27

ЬРЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Азп

°Рго^ЕРго

95

1412,6

28

8Ε<2 ГО ΝΟ: 28

ЬРЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

ТЬг

°Рго^ЕРго

95

1399,7

- 25 013814

Пример

Зеци.Ю

Р1

Ρ2

РЗ

Р4

Р5

Р6

Р7

Р8

Р9

РЮ

Ρ11

Матрица

Чистота%^а) [М+ Н]

29

8ЕЦ ГО N0: 29

ЬРЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

8гг

Азр

Рго

Не

Суз

Азр

°Рго^ЕРго

95

1413,6

30

8ЕЦ ГО N0: 30

ЬРЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1461,7

31

8Е<2 ГО N0: 31

4АшРЬе Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Азп

“Рго'Рго

91

1413,8

32

8Εζ) ГО N0: 32

4АтРЬе Суз

ТЬг

Ьуз

8ег

Азр

Рго

Не

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

93

1462,7

33

8ЕЦ ГО N0: 33

СЬа

Суз

ТЬг

Ьуз

8ег

Азр

Рго

Не

Суз

Азп

°Рго^ЕРго

94

1404,8

34

8ЕЦ ГО ΝΟ: 34

СЬа

Суз

ТЬг

Ьуз

8ег

Азр

Рго

Не

Суз

ТЬг

°Рго^ЕРго

95

1391,7

35

ЗЕЦ ГО N0: 35

СЬа

Суз

ТЬг

Ьуз

8ег

Азр

Рго

Не

Суз

Азр

°Рго^ЕРго

95

1405,8

36

8Εζ) ГО N0: 36

СЬа

Суз

ТЬг

Ьуз

8ег

Азр

Рго

Не

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1453,8

37

8ЕЦ ГО N0: 37

сь_ё

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Азп

°Рго^ЕРго

95

1390,7

38

8ЕЦ ГО N0: 38

сь_ё

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

ТЬг

°Рго^ЕРго

95

1377,6

39

8Εζ) ГО N0: 39

сь§

Суз

ТЬг

Ьуз

8ετ

Азр

Рго

Не

Суз

Азр

°Рго^ЕРго

95

1391,6

40

8ЕЦ ГО N0: 40

сь§

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1439,6

41

8Εζ) ГО N0:41

Νίβ

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Азп

°Рго^ЕРго

95

1364,7

42

8ЕЦ ГО N0: 42

Νίβ

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

ТЬг

°Рго^ЕРго

93

1351,7

43

8Εζ) ГО N0: 43

Νίβ

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Азр

°Рго^ЕРго

95

1365,7

44

8Εζ) ГО N0: 44

ΝΙβ

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1413,6

45

8ЕЦ ГО ΝΟ: 45

2С1-РЬе Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Азп

°Рго^ЕРго

95

1432,6

46

8Εζ) ГО ΝΟ: 46

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Зег

°Азр^ЕРго

95

1389,6

47

8ЕЦ ГО N0: 47

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Пе

Суз

Зег

°Рго^ЕАзр

95

1389,6

48

8Εζ) ГО N0: 48

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Не

Суз

Зег

°Рго^ЕРго(5КРЬе) 95

1447,5

49

8Е0 ГО N0: 49

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Пе

Суз

Зег

°А1а^ЕРго

95

1345,6

50

8ЕЦ ГО N0: 50

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Пе

Суз

Зег

°11е^ЕРго

94

1387,9

51

8ΕςΐΟΝΟ:51

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Пе

Суз

Зег

°Рго^ЕЬеи

94

1395,7

52

8ЕЦ ГО ΝΟ: 52

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

А1а

Пе

Суз

Аг§

°Рго^ЕРго

93

1380,7

53

8Εζ) ГО N0: 53

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Νίβ

Суз

Зег

°Рго^ЕРго

95

1371,8

54

8ЕЦ ГО N0: 54

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

СЬа Суз

Зег

°Рго^ЕРго

95

1411,6

55

8Εζ) ГО N0: 55

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

01л

ί Суз

Аг_ё

°Рго^ЕРго

95

1421,6

56

8Εζ) ГО N0: 56

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Туг

Суз

Аг_ё

°Рго^ЕРго

89

1456,5

57

8Εζ) ГО N0: 57

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Νΐε

Суз

Аг_ё

°Рго^ЕРго

94

1406,6

58

8ЕЦ ΙΟ ΝΟ: 58

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

СЬа Суз

Аг_ё

°Рго^ЕРго

95

1446,5

59

8Εζ) 10 N0: 59

Не

Суз

ТЬг

Νίβ

Зег

Азр

Рго

Пе

Суз

Аг_ё

°Рго^ЕРго

95

1391,6

60

8Εζ) ГО N0: 60

РЬе

Суз

ТЬг

Νίβ

Зег

Азр

Рго

Пе

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1432,7

61

8Εζ) ГО N0: 61

Тгр

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Пе

Суз

Зег

°Рго^ЕРго

95

1410,9

Пример

8еяи.ГО

Р1

Р2

РЗ

Р4

Р5

Р6

Р7

Р8

Р9 1

РЮ

РН

Матрица

Чистота%^а) [М+ И:

62

8ЕЦ ГО N0: 62

1-ΝαΙ

Суз

ТЬг

Ьуз

8ег

Азр

Рго

Пе

Суз

Зег

°Рго^ЕРго

95

1421,9

63

8Εζ) ГО ΝΟ: 63

СЬ§

Суз

ТЬг

Ьу5

8ег

Азр

Рго

Νΐε

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1439,

64

8Е0 ГО ΝΟ: 64

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

8ег

Азр

Рго

Не

Суз

8ег

°Рго^ЕС1и

95

1403,8

65

8Е(/) ГО N0: 65

СЬ§

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Туг

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1489,5

66

8Е<2 ГО ΝΟ: 66

сь§

Суз

ТЬг

Ьуз

8ег

Азр

Рго

СЬа

Суз

Туг

^όΡγο^εΡγο

95

1479,6

67

8Е(,) ГО N0: 67

СЬ§

Суз

ТЬг

Ьуз

АПоТЬг Азр

Рго

Туг

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1503,6

68

8Εζ) ГО N0: 68

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

8ег

Азр

Рго

Пе

Суз

Зег

°А1а^ЕАзр

95

1363,6

69

ЗЕО ГО ΝΟ: 69

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Пе

Суз

Зег

°Азп^ЕРго

90

1388,8

70

8Ер ГО ΝΟ: 70

4АтРЬеСуз

ТЬг

Ьуз

8ег

Азр

Рго

СЬа

Суз

Азп

°Рго^ЕРго

92

1454,5

71

8ЕЦ ГО ΝΟ: 71

сь§

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

СЬа

Суз

Аг§

°Рго^ЕРго

95

1472,6

72

8ЕЦ ГО N0: 72

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

8ег

Азр

Рго

Не

Суз

Зег

°ТЬг^ЕРго

95

1375,6

73

8Εζ) ГО ΝΟ: 73

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Пе

Суз

Зег

°11е^ЕРго

94

1387,9

74

8ЕЦ ГО N0: 74

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

8ег

Азр

Рго

Пе

Суз

Зег

°Рго^ЕЬеи

94

1387,9

75

ЗЕО ГО ΝΟ: 75

Аг_ё

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Пе

Суз

РЬе

’Тго'Рго

95

1440,5

76

8ЕЦ ГО N0: 76

Не

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Ьеи

Рго

01п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1369,3

77

8Εζ) ГО N0: 77

Νίβ

Суз

ТЬг

Зег

Не

Рго

Туг

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1434,3

78

8Ер ГО ΝΟ: 78

Νίβ

Суз

ТЬг

АЬи

Зег

Не

Рго

01п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1383,6

79

8ЕЦ ГО ΝΟ: 79

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Νίβ

Рго

О1п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1369,8

80

8Е0 ГО ΝΟ: 80

Νΐε

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Аос

Рго

С1п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1397,6

81

8ЕЦ ГО ΝΟ: 81

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

ОсЮ Рго

Рго

О1п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1425,6

82

8ЕЦ ГО N0: 82

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

8ег

СЬа

Рго

01п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1409,5

83

8ЕЦ ГО ΝΟ: 83

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

ЬЬеи Рго

Рго

01п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1383,6

84

8ЕЦ ГО N0: 84

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

сь_ё

Рго

О1п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1395,7

85

8ЕЦ ГО ΝΟ: 85

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

ЬВиА Рго

Рго

С1п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1383,6

86

ЗЕЦГОЯО: 86

Νίβ

Суз

А1а

Зег

Не

Рго

01п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1340,1

87

8Е0 ГО N0: 87

Νίβ

Суз

АЬи

А1а

Зег

Не

Рго

01п

Суз

Туг

^вРго^ЕРго

95

1354,0

88

8ЕЦ ГО ΝΟ: 88

Νΐε

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго РгоЦХНСОРЬе) О1п Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1488,6

89

8ЕЦ ГО N0: 89

Νΐε

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

РЬе

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

88

1388,7

90

8ЕЦ ГО N0: 90

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

О1п

Суз

РЬе

°Рго^ЕРго

95

1353,6

91

8Е0 ГО ΝΟ: 91

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

01п

Суз

01п

°Рго^ЕРго

95

1334,5

92

8Ер ГО N0: 92

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

01η

Суз

Аге

, °Рго^ЕРго

56

1362,6

93

8ЕЦ ГО N0: 93

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

01η

Суз

Зег

°Рго^ЕРго

95

1293,7

- 26 013814

Пример

Зеци.ГО

Ρ1

Р2

РЗ

Р4

Р5

Р6

Р7

Р8

Р9

РЮ

РН

Матрица

Чистота%^а) [М+ Н]

94

ЗЕО ГО ΝΟ: 94

ΝΙε

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

61п

Суз

Νίβ

°Рго^ЕРго

95

1319,5

95

ЗЕО ГО ΝΟ: 95

Νΐε

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

О1п

Суз

2-Ча1

°Рго^ЕРго

94

1404,0

96

ЗЕО ГО ΝΟ: 96

Νΐε

Суз

ТЬг

А1а

8ег

Не

Рго

О1п

Суз

2С1-РЬе°Рго^ЕРго

94

1387,8

97

ЗЕО ГО ΝΟ: 97

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

61п

Суз

СЬа

°Рго^ЕРго

95

1359,8

98

8ЕЦ ГО ΝΟ: 98

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

8ег

Не

Рго

О1п

Суз

РЬд

°Рго^ЕРго

95

1359,9

99

ЗЕО ГО ΝΟ: 99

Аос

Суз

ТЬг

А1а

8ег

Не

Рго

О1п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

93

1397,4

100

8Εζ)ΙΟΝΟ: 100

ЬЬеи

Суз

ТЬг

А1а

8ег

Не

Рго

С1п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1383,4

101

ЗЕО ΙϋΝΟ: 101

сь§

Суз

ТЬг

А1а

8ег

Не

Рго

61п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

87

1395,6

102

8ЕЦ ΙΟΝΟ: 102

ОсЮ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

О1п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1425,5

103

ЗЕО ΙΟΝΟ: 103

ЫРЬе

Суз

ТЬг

А1а

8ег

Не

Рго

С1п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1417,5

104

8Εζ) ΙϋΝΟ: 104

Νίβ

С1и

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

О1п

Ьуз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1422,8

105

ЗЕЦГОЪЮ: 105

Νίβ

О1и

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

<31п

Агд

Туг

°Рго^ЕРго

95

1450,9

106

δΕςίΌΝΟ: 106

И1е

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

С1п

Ьуз

Туг

¹⁾Рго^ЕРго

95

1394,7

107

8Εζ) ГО ΝΟ: 107

Νίβ

О1п

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

С1п

Агд

Туг

°Рго^ЕРго

90

1449,8

108

8Ε0ΙΏΝΟ: 108

Νίβ

ТЬг

А1а

8ег

Не

Рго

С1п

Ме1

Туг

°Рго^ЕРго

96

1397,7

109

8ЕЦ ГО ΝΟ: 109

Νΐε

О1п

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

С1п

ТЬг

Туг

°Рго^ЕРго

95

1394,7

110

8Ε0ΙΌΝΟ: 110

Νίβ

ТЬг

А1а

8ег

Не

Рго

С1п

Туг

°Рго^ЕРго

81

1394,6

111

8ЕЦ ГО ΝΟ: 111

Νίβ

С1п

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

О1п

Зег

Туг

°Рго^ЕРго

95

1380,7

112

ЗЕЦГОИО: 112

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

8ег

С5а1

Рго

61п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

85

1413,8

113

ЗЕО ΙϋΝΟ: 113

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Ьеи

Рго

Туг

Суз

Туг

“Рго'Рго

95

1404,7

114

ЗЕО ГО ΝΟ: 114

Не

Суз

ТЬг

А1а

8ег

Теи

Рго

Туг

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1404,7

115

8ЕЦ ΙΌΝΟ: 115

ΝΙε

Суз

ТЬг

А1а

8ег

Не

Рго

61п

Суз

Туг

°Азр^ЕРго

95

1387,8

116

δΕςίϋΝΟ: 116

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

8ег

Не

Рго

61п

Суз

Туг

°РЬе^ЕРго

95

1419,9

117

8ЕЦ ΙΟΝΟ: 117

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

61п

Суз

Туг

°Агд^ЕРго

95

1428,6

118

8Ε0ΙΟΝΟ: 118

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

С1п

Суз

Туг

°Зег^ЕРго

95

1359,9

119

ЗЕО ГО ΝΟ: 119

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

С1п

Суз

туг

°Уа1^ЕРго

95

1371,8

120

8Ε0ΙΌΝΟ: 120

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

61п

Суз

Туг

°Р1р^ЕРго

95

1383,7

121

8Εζ) ΙΟΝΟ: 121

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

С1п

Суз

Туг

°Рго^ЕАзр

95

1387,9

122

ЗЕЦГОИО: 122

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

О1п

Суз

Туг

°Рго^ЕРЬе

95

1419,9

Пример

Зеци-ГО

Ρ1

Р2

РЗ

Р4

Р5

Р6

Р7

Р8

Р9

РЮ

Р11

Матрица Чистота%^а

’ [М+ Н]

156

ЗЕО ГО ΝΟ: 156

ОсЮ

О1и

ТЬг

А1а

8ег

Не

Рго

С1п

Ьуз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1478,7

157

ЗЕЦГОЧО: 157

ОсЮ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

СЬа

Рго

О1п

Суз

РЬе

°Рго^ЕРго

95

1449,8

158

ЗЕО ГО ΝΟ: 158

ЬРНе

Суз

ТЬг

А1а

Зег

СЬа

Рго

61п

Суз

С1п

°Рго^ЕРго

94

1422,7

159

ЗЕО ГО ΝΟ: 159

ОсЮ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

СЬа

Рго

О1п

Суз

С1п

°Рго^ЕРго

93

1430,0

160

8Εζ> ΙΟΝΟ: 160

ОсЮ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

СЬа

РГО Рго(4Г1НСОРЬе) О1п Суз

С1п

’Юго'Рго

95

1549,6

161

8Εζ)ΙϋΝΟ: 161

ЬРЬе

Суз

ТЬг

А1а

Зег

ОсЮ

Рго

61п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1473,4

162

8Ε<2 ΙΟΝΟ: 162

ЬРИе

Суз

ТЬг

А1а

Зег

СЬа

Рго

О1л

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1457,3

163

8ЕЦ ГО ΝΟ: 163

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

ОсЮ

Рго

О1л

Суз

Туг

°Ьуз^ЕС1и

95

1374,4

164

δΕΟΙΏΝΟ: 164

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

СЬа

Рго

О1л

Суз

σΐη

°Рго^ЕС1п

95

1405,5

165

ЗЕО ΙϋΝΟ: 165

ОсЮ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

С1п

Суз

Туг

°Ьуз^ЕС1и

95

1488,0

166

ЗЕЦГОИО: 166

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

С1п

Суз

Туг

°Рго^Е11е

95

1385,6

167

8Εζ) ΓΟΝΟ: 167

Νΐε

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

61п

Суз

Туг

°Рго^ЕРЬе

95

1419,9

168

3Ε0 ΙΟΝΟ: 168

Νΐε

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

С1п

Суз

Туг

°Рго^ЕАзр

95

1387,9

169

8ЕЦ ГО ΝΟ: 169

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

ОсЮ

Рго

С1п

Суз

Туг

°Рго^ЕС1п

95

1456,5

170

8ЕЦ ΙΟΝΟ: 170

Νΐε

Суз

ТЬг

А1а

Зег

СЬа

Рго

О1п

Суз

Туг

°Рго^ЕС1п

95

1440,5

171

8Εζ) ΙΏΝΟ: 171

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

СЬа

Рго

О1л

Суз

СЬа

°01п^Е61п

95

1461,0

172

8Εζ) ΙΟΝΟ: 172

Νΐε

Суз

ТЬг

А1а

Зег

СЬа

Рго

61п

Суз

СЬа

°Рго^ЕС1п

95

1430,6

173

8Εζ) ΙΟΝΟ: 173

ИРИе

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

61л

Суз

Туг

°Рго^ЕС1п

95

1448,6

174

δΕΟΙΟΝΟ: 174

ЬРЬе

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

О1п

Суз

Туг

°Ьуз^ЕС1и

95

1480,0

175

δΕΟΙΟΝΟ: 175

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

СЬа

Рго

О1п

Суз

2С1-РЬе¹⁾Рго^ьСг1п

95

1458,5

176

8ЕЦ ΙΟΝΟ: 176

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

СЬа

Рго Рго(4ЫНСОРЬе) О1п Су8

С1п

°σΐη^Εσΐη

95

1555,5

177

δΕΟΙΟΝΟ: 177

ОсЮ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Не

Рго

О1п

Суз

Туг

°Рго^Е61п

95

1430,6

178

8Ε0ΙΟΝΟ: 178

ОсЮ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

ОсЮ

Рго

О1л

Суз

С1п

°Рго^Е61п

95

1477,6

179

ЗЕО ΙΟΝΟ: 179

Νίβ

Суз

ТЬг

А1а

Зег

11е

Рго

О1п

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

90

1369,7

180

ЗЕО ΙϋΝΟ: 180

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Ьеи

Рго

Не

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

94

1404,8

181

ЗЕО ГО ΝΟ: 181

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

ЬРЬе

Рго

Не

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

92

1452,6

182

8ЕЦ ΙϋΝΟ: 182

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

СЬа

Рго

Не

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

95

1444,6

183

δΕΟΙϋΝΟ: 183

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Туг

Рго

Не

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

91

1454,5

184

δΕΟΙϋΝΟ: 184

РЬе

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Ьеи

Рго

Не

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

95

1438,6

Пример

Зеди.Ю

Р1

Р2

РЗ

Р4

Р5

Р6

Р7

Р8

Р9

РЮ Р11 Матрица Чистота%^а) [М+ Н]

185

8Ες ГО N0

185

Не

Су5

ТЬг

Ьуз

Зег

Ьеи

Рго

Агд

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

95

1447,5

186

8ЕС) ГО N0

186

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Ьеи

Рго

Ьуз

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

95

1419,9

187

3Ες ГО ΝΟ

187

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Ьеи

Рго

ΗΪ3

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

95

1428,6

188

8Е<2 ГО ΝΟ

188

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Ьеи

Рго

О1п

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

95

1419,8

189

8Е(2 ГО ΝΟ

189

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Ьеи

Рго

ТЬг

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

95

1392,4

190

3Ες ГО ΝΟ

190

Не

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Ьеи

Рго

Агд

Суз

Ьуз

°Рго^ЕРго

95

1420,1

191

3Εζ) ГО ΝΟ

191

Ьеи

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Ьеи

Рго

Ьуз

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

95

1420,0

192

8Е(2 ГО ΝΟ

192

Νίβ

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Ьеи

Рго

Ьуз

Суз

Агд

^пРго^ЕРго

95

1420,0

193

8Ες ГО ΝΟ

193

СЬа

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Ьеи

Рго

Ьуз

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

95

1459,7

194

ЗЕО Ю N0

194

Туг

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Ьеи

Рго

Ьуз

Суз

Агд

°Рго^ЕРго

95

1469,6

195

ЗЕО ГО N0

195

Тгр

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Ьеи

Рго

Ьуз

Суз

Агд

^сРго^ЕРго

92

1492,6

196

ЗЕО Ю N0

196

Агд

Суз

ТЬг

Ьуз

Зег

Ьеи

Рго

Ьуз

Суз

Туг

°Рго^ЕРго

95

1469,6

а) Чистота %-чистота соединения после препаративной ВЭЖХ Суз в положениях 2 и 10 в соединениях примеров 1-6, 9-103, 112-131, 133, 136-138, 140-141, 143-146, 148-153, 155, 157-196 образует дисульфидный мостик.

2. Биологические методика.

2.1. Приготовление образцов пептидов.

Лиофилизированные пептиды отвешивают на микровесах (МеШег МТ5) и растворяют в стерильной воде до конечной концентрации, равной 1 мМ, если не указано иное. Исходные растворы держат при +4°С в защищенном от воздействия света месте.

2.2. Исследования ферментов.

Характеристики ферментов и субстратов приведены в табл. 2.

Кинетические исследования проводят при полном объеме реакционной смеси, равном 100 мкл, в

- 27 013814 плоскодонных 96-луночных планшетах (Сгешег) на устройстве считывания планшетов Сешо8 (Тесап). Фермент объединяют с пептидами (ингибиторами) в буфере, содержащем 100 мМ НЕРЕ8 (Ν-2гидроксиэтилпиперазин-Ы-2-этансульфоновая кислота) (рН 7,5), 50 мМ СаС1₂, 0,025% Т\уееп-20. 5% ДМСО и 1 мМ субстрата. Скорость гидролиза субстрата измеряют путем мониторинга изменения поглощения при 405 нм в течение 30 мин для проверки линейности кривой реакции. Для всех расчетов используют среднюю скорость в промежутке от минуты 1 до минуты 10. Начальные значения вычитаемого фона, средней скорости, двойного усреднения и выраженного в % ингибирования проводят с использованием программного обеспечения Маде11ап Цегаюп 5), выпускающегося компанией Тесап. Расчеты ГС50% проводят с использованием программного обеспечения СгаГй (уегаюп 5.0.10), выпускающегося компанией Егййасик 8оГ1етаге, путем аппроксимации данных для 6 разных концентраций ингибитора с помощью 4-параметрического уравнения:

100%

В этом уравнении 8 означает коэффициент наклона, х означает концентрации ингибитора и у означает выраженное в % ингибирование при данной концентрации ингибитора.

Определение К_т/К₁.

Значения К_т для субстрата сериновой протеазы определяют по зависимости Ьтетеауег-Вигке (СгаГй ν5). Значения К₁ для ингибиторов рассчитывают по формуле 1<_|=[С₅%₁/(1+(|субстрат|/1<_т)).

При реакции с ферментом используют увеличивающиеся концентрации субстрата и строят зависимость скорости каждой реакции (АВ8/т8ес) от концентрации субстрата. Для получения К_т и ν^ (вставка) (см. ниже ссылку 1) также строят обратную зависимость (^^ηе^еаνе^-Βи^ке).

- 28 013814

Таблица 2

Фермент/ поставщик	Концентрация фермента при исследовании	Подложка/ поставщик	Концентрация подложки при исследовании (мМ)
Эластаза из нейтрофилов человека/ Зегуа	0,6 мЕд/реакция	И-МеТАк-Рго-У а1-пнитроанилид /81§та	1
Катепсин 6 из нейтрофилов человека САЗ пг. 107200-92-0 Са1Ыосйет	1 мЕд/реакция	Ν-сукцинил-Ак-Рго- РЬе-п-нитроанилид 31§та	1
Трипсин, йодированная марка, из поджелудочной железы человека, САЗ пг. 9002-07-7 Са1Ыосйет	1 мЕд/реакция	Ν-бензоил-Агд-п- нитроанилид 31§та	0,32
Химаза из кожи человека Са1Ыосйет	9 мЕд/реакция	Ν-сукцинил-Ак-Рго- РЬе-п-нитроанилид 81§та	1,5
Тромбин из плазмы человека, высокоактивный, САЗ пг. 9002-04-4 СаПпосйет	100 мЕд/реакция	бензоил-РЬе-У а1-Аг§- п-нитроанилид Са1Ыосйет	0,5
Химотрипсин из поджелудочной железы человека САЗ пг 9004-07-3 Са1Ыосйет	1,6 мкМ/ реак- ция	Ν-сукцинил-Ак-Рго- Рйе-п-нитроанилид 81§та	1
Фактор свертывания крови Ха из плазмы человека, САЗ пг. 9002-05-5 Са1ЫосЬет	0,4 мЕд/реакция	метоксикарбонил-Ок[1е-61у-Аг£-пнитроанилид Воске	2

- 29 013814

Триптаза из легких человека Са1ЬюсЬет	12,5 мЕд/реакция	Ν-бензоил-Агд-п- нитроанилид 81§та	1,28
Урокиназа из мочи человека / 31§та АШпсЬ САЗ пг. 9039-53-6	250 мЕд/реакция	Ругод1и-О1у-Аг§-п- нитроанилид х НС1 Епдо1е11	0,5

Фермент/ поставщик	Концентрация фермента при исследовании	Подложка/ поставщик	Концентрация подложки при исследовании (мМ)
Калликреин из плазмы человека, САЗ Ντ 900Ι- Ο 1-8 Са1ЬюсЬет	0,34 мкг/реакция	Ν-бензоил-Рго-Рйе- Агд-п-нитроанилид 81§та	1
Плазмин из плазмы человека, САЗ пг. 900190-5 31§та-АМг1сЬ	2 мЕд/реакция	ϋ-У аЕЬеи-Ьуз-п- нитро анилид 31§та	5

2.3. Исследование цитотоксичности.

Цитотоксичность пептидов по отношению к клеткам НЕЕ А (Асс57) и клеткам СО8-7 (СКЬ-1651) определяют с помощью анализа с восстановлением МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид) [см. ниже ссылки 2 и 3]. Вкратце, методика заключается в следующем: клетки ПЕЕА и клетки СО8-7 высевают по 7,0 х 10³ и, соответственно, 4,5 х 10³ клеток/лунка и выращивают в 96луночных планшетах для микротирования в течение 24 ч при 37°С при 5% СО₂. В этот момент время ноль (Т/) определяют путем восстановления МТТ (см. ниже). Надосадочную жидкость из остальных лунок удаляют и в лунки пипеткой вводят свежую среду и пептиды в серийных разведениях 12,5, 25 и 50 мкМ. Для каждой концентрации пептидов проводят по 3 исследования. Инкубацию клеток проводят в течение 48 ч при 37°С при 5% СО₂. Затем лунки один раз промывают физиологическим раствором с фосфатным буфером (РВ8) и затем в лунки прибавляют 100 мкл реагента МТТ (0,5 мг/мл в среде ΚΡΜΙ 1640 и, соответственно, ΌΜΕΜ (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла)). Инкубацию проводят при 37°С в течение 2 ч и затем среду отсасывают и в каждую лунку прибавляют 100 мкл изопропанола. Измеряют поглощение солюбилизированного продукта при 595 нм (ОЭ₅₉₅пептид). По данным трехкратных измерений для каждой концентрации рассчитывают средние значения. Выраженный в процентах рост рассчитывают следующим образом: (ОП₅₉₅пептид-ОВ₅₉₅Т7-ОП₅₉₅пустая лунка )'(ОО₅₉₅Т/ОЭ₅₉₅пустая лунка) х 100% (ОП - оптическая плотность) и строят зависимость от концентрации каждого пептида.

Значения ЕС 50 (летальная концентрация, определяемая, как концентрация, приводящая к гибели 50% клеток) определяют для каждого пептида с использованием функции линии трендов программы ЕХСЕЕ (Μ^с^о8ΟЙ ОШее 2000) для концентраций (50, 25, 12,5 и 0 мкМ), а также определяют соответствующий рост, выраженный в процентах, и значение -50, (=ТКЕN^(С₅₀:С₀,%₅₀:%₀,-50)).

Концентрации ΟΙ 50 (ингибирования роста) рассчитывают для каждого пептида с использованием функции линии трендов программы для концентраций (50, 25, 12,5 и 0 мкг/мл), а также определяют соответствующие значения, выраженные в процентах, и значение 50, (=ТКЕ№ (С_5О:С_о,%₅о:%о,50).

2.4. Гемолиз.

Исследуют гемолитическую активность пептидов по отношению к эритроцитам человека (йКВС). Свежие йКВС трижды промывают физиологическим раствором с фосфатным буфером (РВ8) с использованием центрифугирования в течение 10 мин при 2000 х д. Пептиды при концентрации, равной 100 мкМ, инкубируют с 20% об./об. йКВС в течение 1 ч при 37°С. Конечная концентрация эритроцитов составляет примерно 0,9 х 10⁹ клеток/мл. Составляющие 0% и, соответственно, 100% степени лизиса клеток исследуют путем инкубации йКВС в присутствии только РВ8 и, соответственно, 0,1% Тгйоп Х-100 в Н₂О. Образцы центрифугируют, надосадочную жидкость в 20 раз разводят буфером РВ8 и измеряют оптическую плотность (ОЭ) образца при 540 нМ. Равная 100% степень лизиса (ОЭ₅₄₀Н₂О) приводит к ОЭ₅₄₀, равной примерно 1,3-1,8. Выраженную в процентах степень гемолиза рассчитывают следующим образом: (ОЭ₅₄₀пептид,/ОЭ₅₄₀Н₂О) х 100%.

2.5 Стабильность плазмы.

405 мкл раствора плазма/альбумин помещают в изготовленную из полипропилена (ПП) (ПП) и прибавляют 45 мкл соединения из 100 мМ раствора В, полученного из 135 мкл РВ8 и 15 мкл 1 мМ пептида в

- 30 013814

РВ8, рН 7,4. Аликвоты по 150 мкл переносят в отдельные лунки фильтрующего планшета 10 кДа (мембрана М1Шроге МАРРВ 1010 Вютах). Для 0 мин контролей: 270 мкл РВ8 помещают в пробирку ПП и прибавляют 30 мкл исходного раствора В и взбалтывают. 150 мкл контрольного раствора помещают в одну лунку фильтрующего планшета и он выступает в качестве фильтрованного контроля.

Еще 150 мкл контрольного раствора помещают непосредственно в приемную лунку (зарезервированную для фильтрата) и он выступает в качестве нефильтрованного контроля. Весь планшет вместе с крышкой для исключения испарения инкубируют в течение 60 мин при 37°С. Образцы плазмы (плазма крысы: Наг1ап 8ега 1аЬ ИК, плазма человека: В1н15репбехеп1гит Ζϋποίι) центрифугируют в течение не менее 2 ч при 4300 об/мин (3500 д) и 15°С и получают 100 мкл фильтрата. Для образцов сывороточного альбумина (свежеприготовленный альбумин человека: 81дта А-4327, альбумин крысы: 81дта А-6272, все при концентрации 40 мг/мл в РВ8) достаточно примерно 1 ч центрифугирования. Фильтраты из приемного ПП планшета анализируют с помощью ЖХ/МС при следующих условиях: колонка: 1ирйег С18 (Рйепотепех), подвижные фазы: (А) 0,1% муравьиной кислоты в воде и (В) ацетонитрил, градиентный режим: 5-100% (В) в 2 мин, ионизация электрораспылением, детектирование с помощью МКМ (тройной квадрупольный). Определяют площади пиков и полученные трижды значения усредняют. Связывание выражают в процентах от (момент времени 0 мин для фильтрованных и нефильтрованных) контролен 1 и 2 с помощью соотношения: 100-(100 х Т₆₀/Т₀). Рассчитывают средние значения этих величин.

2.6. Фармакокинетическое исследование (ФК).

Фармакокинетическое исследование после одного перорального (через желудочный зонд) и внутривенного введения крысам.

Фармакокинетическое исследование после одного внутривенного (ВВ) и перорального (ПО, через желудочный зонд) введения проводят для соединения примера 75 (прим. 75). В исследовании используют имеющих массу 332 г (± 10 г) самцов мышей ХУМаг полученных от КСС Ыб., ЬаЬогаФгу ашта1 8егу1ее5, СН-4414 ЕиШпкбог!, 8\\'Цхег1апб. Разбавитель, физиологический раствор, прибавляют до получения конечной концентрации соединения, равной 2,5 мг/мл. 2 мл/кг ВВ и 10 мл/кг ПО и пептид из примера 75 вводят при конечной внутривенной дозе, равной 5 мг/кг, и пероральной дозе, равной 50 мг/кг. Пробы крови (примерно 0,24 мл) с помощью автоматического прибора для отбора проб крови П1ЬаЬ Асси8атр1ег отбирают по указанной ниже схеме в разные моменты времени и помещают в гепаринизированные пробирки. В случае затруднений при автоматическом отборе проб пробы отбирают путем ретроорбитальных кровопусканий при слабой анестезии посредством изофлурана. Пробы отбирают в следующие моменты времени:

0, 5 мин (только ВВ), 15, 30 мин и 1, 2, 4, 8, 16, 24 и 36 ч (только ПО) и помещают в гепаринизированные пробирки. Плазму отделяют от таблетированных клеток после центрифугирования и замораживают при -80°С до проведения анализа с помощью ВЭЖХ-МС.

Приготовление калибровочных образцов плазмы.

Используют чистую плазму крыс, которым не вводили соединения. К аликвотам плазмы по 0,1 мл прибавляют 50 нг пропранолола (1п1егпа1 81апбагб, 18), (образцы готовят путем твердофазной экстракции с использованием катриджей ОА818® НЬВ (^а!ег§)) и известные количества соединения примера 75 и получают 9 калибровочных образцов плазмы в диапазоне концентраций 5-2000 нг/мл. Катриджи ОА818® НЬВ кондиционируют с помощью 1 мл метанола и затем с помощью 1 мл 1% ΝΗ₃ в воде. Затем образцы разбавляют с помощью 400 мкл 1% Ν4₃ в воде и загружают. Планшет промывают с помощью 1 мл смеси метанол/1% Ν4₃ в воде 5/95. Элюирование проводят с помощью 1 мл 0,1% ТФК в метаноле. Планшет, содержащий элюаты, помещают в устройство для концентрирования и выпаривают досуха. Остатки растворяют в 100 мкл смеси муравьиная кислота 0,1%/ацетонитрил, 95/5 (об./об.) и анализируют с помощью ВЭЖХ/МС на аналитической колонке с обращенной фазой (1ирйег С18, 50 х 2,0 мм, 5 мкм Рйепотепех) с элюированием в градиентном режиме (подвижные фазы А: 0,1% муравьиной кислоты в воде, В: ацетонитрил; от 5% В до 100% В в течение 2 мин).

Приготовление образцов плазмы.

Для экстракции из каждого образца берут по 100 мкл плазмы. Если объем меньше 100 мкл, то прибавляют соответствующее количество чистой плазмы мышей, так чтобы матрикс совпадал с использованным для построения калибровочного графика. Затем в образцы прибавляют внутренний стандарт и их обрабатывают, как это описано для построения калибровочного графика.

Фармакокинетическое исследование.

ФК анализ проводят для объединенных данных (обычно п=2 или 3) с использованием программного обеспечения РК юйПющ 2.0™ (8иттй Кекеагсй 8егуюе, МопКоке, СО 81401 И8А). Площадь под кривой (ППК) рассчитывают по линейной формуле трапеций. ППК(_1-М) оценивают как С.'1/Ь (Ь: константа скорости элиминации). ППК(_1-М) представляет собой сумму ППК(_0-1) и ППК(_(|-/, Время полуэлиминации рассчитывают с помощью линейной регрессии по меньшей мере по трем значениям данных для фазы элиминации. Интервалы времени, выбираемые для определения расчета времен полуэлиминации, оценивают с помощью коэффициента корреляции (г²), который должен по меньшей мере превышать 0,85 и наиболее оптимально - по меньшей мере превышать 0,96. В случае ВВ введения начальную концентрацию

- 31 013814 при !_2его определяют путем экстраполяции кривой, проходящей через два первых момента времени. Наконец, биологическую доступность после внутрибрюшинного (ВБ) введения рассчитывают по нормированному отношению ППК(_0-да) для ВБ и ВВ введения.

3.0. Результаты.

Результаты экспериментов, описанных выше в разделах 2.2 - 2.5, приведены ниже в табл. 3.

Таблица 3

При мер	Катепсин О 1С50 (нмоль)	Эластаза 1С50 (нмоль)	Трипсин при 100 мкМ %	Химотрипсин при 100 мкМ %	Химаза при 100 мкМ %	Тромбин при 100 мкМ %	РХа при 100 мкМ %	Урокиназа при 100 мкМ %	Триптаза при 100 мкМ %	Цитотоксичность ЬСХ Сг1}0 клетки Не1а	Гемолиз при 100 мкМ %
1	86	>100000	92,6	7,8	0	1,1	5,7	5,7	0	НО	0
2	84	>100000	92	2,9	0	9,2	5,3	0,9	39,6	но	НО
3	51	>100000	92	0	1	0	4	4	68	100	0
4	91	>100000	96	1,8	0	0	2,4	5,4	0	100	0
5	56	>100000	92	3	0	0,5	0,2	5,7	74	но	0
6	?	но	НО	но	но	НО	НО	НО	НО	но	но
7	91	1,5 при 100 мкМ %	41	12	13,4	0	11,7	1,1	1,5	100	0,2
8	126	0,8 при 100 мкМ %	74,2	5,6	71,7	НО	НО	но	НО	но	НО
9	105	4,1 при 100 мкМ %	88,1	НО	НО	НО	но	но	но	но	но
10	75	0,3 при 100 мкМ %	89,9	НО	9,4	НО	но	но	но	но	но
11	95	19 при 100 мкМ %	6,5	73,6	12,1	НО	но	но	но	но	но
12	90	37038	97	28	12	и	5	12	59,3	59,3	но
13	100	8,2 при 100 мкМ %	95,0	НО	19,9	НО	но	но	НО	но	но

14	52	>100000	88	0	42,3	8,7	6	5,4	84,2	100	0
15	56,0	>100000	95,0	54,2	12,7	но	НО	но	НО	100	0
16	66	>100000	90,0	17,9	12,9	НО	но	3,2	НО	94	0,1

При мер	Катепсин О 1С50 (нмоль )	Эластаза 1С50 (нмоль)	Трипсин при 100 мкМ %	Химотрипсин при 100 мкМ %	Химаза при 100 мкМ %	Тромбин при 100 мкМ %	РХа при 100 мкМ %	Урокиназа при 100 мкМ %	Триптаза при 100 мкМ %	Цитотоксичность ЬСХ О1$о клетки Не1а	Гемолиз при 100 мкМ %
17	55	>100000	90,0	16	27,6	0	но	НО	90,4	94	о,1
18	47	>100000	84	25	32,5	0	но	но	88,3	100	0
19	41	>100000	94,0	0	26,9	и	32	4	85,2	100	0
20	48	>100000	97,0	0	44,1	28	25	6,7	НО	100	0
21	97	16,4	95,6	2,6	5	НО	НО	НО	НО	НО	но
22	55	>100000	84,	0	98,8	НО	но	5,7	3,8	8	0
23	38	>100000	90	4	60	0	11	9	29	51	0
24	71	>100000	97	1,0	1,2	3,5	30	5,1	0	99	но
25	102	3,2 при 100мкМ%	89,3	НО	10,0	НО	но	НО	НО	НО	но
26	49	>100000	84	2,2	0	3	6	3,1	66,4	НО	но
27	48	НО	НО	НО	но	но	но	но	НО	НО	но
28	39	>100000	95	32	0	12	6	1	0	НО	но
29	42	НО	НО	НО	но	но	но	но	НО	НО	но
30	39	49900	98	49	0	2	3	9	НО	НО	но
31	34	>100000	98	15	12	10	8	15	76	НО	но
32	52	НО	НО	НО	НО	но	но	НО	НО	НО	но
33	45	но	НО	но	но	но	но	НО	НО	НО	но
34	56	но	НО	но	но	но	но	но	НО	НО	но
35	54	но	НО	но	но	но	но	но	НО	НО	но

- 32 013814

Пр им ер	Катепсин 0 1С5О (нмол Ь)	Эластаза 1С50 (нмоль)	Трипсин при 100 мкМ %	Химотрипсин при 100 мкМ %	Химаза при 100 мкМ %	Тромбин при 100 мкМ %	РХа при 100 мкМ %	Урокиназа при 100 мкМ %	Триптаза при 100 мкМ %	Цитотоксичность ьСзо/ а50 клетки Не1а	Гемолиз при 100 мкМ %
36	41	НО	но	но	но	но	но	0	73,3	83	0
37	35	НО	но	но	но	но	но	5	56	92	0,1
38	31	>100000	96	4	1	0	0	1	11	100	0
39	38	>100000	94	7	0	2	0	2	34	98	0
40	25	>44862	94	19	8	1	3	10	33	97	0,1
41	49	НО	но	но	но	но	но	но	но	НО	но
42	46	НО	но	но	но	но	но	7	0	87	0
43	77	НО	но	но	но	но	но	но	но	НО	но
44	31	>10000	100	24	3	9	9	14	50	67	0,1
45	47	но	но	НО	но	но	но	но	но	НО	но
46	87,5	>100000	95	0	10,2	6,9	12,2	5,8	44,1	НО	но
47	64	>10000	87	1	8,2	0	9,3	6,3	0	100	0
48	83	>100000	93	3	но	но	но	но	но	НО	но
49	82	>10000	96	0	0	7,9	но	6,2	30,5	НО	но
50	89	>100000	94	0	но	НО	но	НО	но	но	но
51	91	>100000	НО	но	но	НО	но	но	но	но	но
52	52	>100000	86	0	42,3	8,7	6	5,4	84,2	100	0
53	56	>100000	95	54	12,7	НО	но	НО	но	63	0
54	66	>100000	90	18	12,9	НО	но	3,2	но	но	но
55	55	>100000	90	16	27,6	но	но	НО	90,4	94	0,1
56	47	>100000	84	25	32,5	0	но	НО	88,3	100	0
Пр	Катеп-	Эластаза	Трипсин	Химот-	Химаза	Тромбин	РХа	Урокина-	Триптаза	Цитоток- Г емолиз
им	син О	1С50	при	рипсин	при	при	при	за	при	сичность при 100
ер	1С50 (нмол ь)	(нмоль)	100 мкМ %	при 100 мкМ %	100 мкМ %	100 мкМ %	100 мкМ %	при 100 мкМ %	100 мкМ %	ЬСуо/ Сг150 мкМ % клетки Не1а
57	41	>100000	94	0	26,9	И	32	4	82,2	0 0
58	47,5	>100000	97	0	44,1	28	25	6,7	но	100 ι	0
59	55	>100000	84	0	98,8	но	но	5,7	3,8	8 '	0
60	38	>100000	90	4	60	0	11	9	29,4	51 ι	0
61	72	но	НО	НО	НО	НО	но	НО	НО	НО	но
62	69	но	НО	но	НО	но	по	НО	но	но	но
63	41	>100000	96	11	7	1	0	0	50	87	0
64	45	>100000	87	0	0	2,3	0	3	0	59	0
65	47	но	НО	но	НО	но	но	1	57	84	0
66	48	но	НО	но	но	но	но	НО	НО	но	но
67	48	но	НО	но	но	но	но	но	НО	НО	но
68	59	>100000	84,2	4,3	0	5,4	8,6	4,6	21,3	НО	но
69	68	но	НО	но	но	но	но	но	НО	НО	но
70	69	но	НО	но	но	но	но	но	но	но	но
71	70	но	НО	но	но	но	но	но	но	но	но
72	87	но	но	но	но	но	но	но	но	но	но
73	89	>100000	94	0	но	но	но	но	но	но	но
74	91	>100000	86	>100000	но	но	но	но	но	но	но
75	86	69,1 при 100 мкМ %	92,6	7,8 при 100 мкМ % НО	0	1,1	5,7	5,7	0	но	но
76	НО	71	но	но	но	но	но	но	но	но

Пр им ер	Катепсин О 1С50 (нмоль)	Эластаза 1С50 (нмоль)	Трипсин при 100 мкМ %	Химотрипсин при 1С50 (нмоль)	Химаза при 100 мкМ %	Тромбин при 100 мкМ %	РХа при 100 мкМ %	Урокиназа при 100 мкМ %	Триптаза при 100 мкМ %	Цитотоксичность ЬС)(/ ΟΙ50 клетки Не1а	Гемолиз при 100 мкМ %
77	НО	68	НО	НО	НО	но	НО	НО	НО	НО	НО
78	НО	29	НО	<4000	НО	но	НО	НО	НО	61	НО
79	НО	66	но	НО	НО	но	но	но	НО	но	НО
80	НО	35	но	>20000	НО	но	но	но	но	12	НО
81	61,3 при 100 мкМ %	28	100000	100000	но	13,1	8,7	но	но	58	НО
82	НО	18	но	72,9	но	но	15,3	но	44,5	НО	НО
83	НО	43	но	100000	но	но	НО	но	НО	12	НО
84	20195	18	10,8	17103	0	20,6	13,3	10,4	4,2	9	НО
85	НО	28	0	>20000	но	12,6	25,6	но	НО	НО	НО
86	47 при 100 мкМ %	26	0	>100000	0	10,7	24,8	но	0	НО	НО
87	НО	37	но	106977	но	но	НО	но	но	65	НО
88	>100000	18	6,4	4309	0	0,2	3	96	0,6	73	но
89	НО	43	но	НО	но	но	НО	но	но	51	но
90	66975	21	5,2	33074	0	0	5,5	3,5	5	96	но
91	45 при 100 мкМ %	28	0	48108	4,7	13,5	19,4	НО	НО	79	но
92	НО	43	но	НО	но	но	НО	но	но	93	но
93	НО	41	но	НО	но	но	НО	но	5,6	100	но
94	но	50	но	НО	но	но	НО	но	НО	НО	но
95	38677	24	8,9	33729	0	0	11,3	10,3	0	89	но

- 33 013814

При мер	Катепсин О1С50 (нмоль)	Эластаза 1С50 (нмоль)	Трипсин при 100 мкМ %	Химотрипсин при 1С50 (нмоль)	Химаза при 100 мкМ %	Тромбин при 100 мкМ %	РХа при 100 мкМ %	Урокиназа при 100 мкМ %	Триптаза при 100 мкМ %	Цитотоксичность ЬС₅₀/ (31 50 клетки Не1а	Гемолиз при 100 мкМ %
96	21175	15	7,5	15433	0	3,6	0	6,2	0	52	но
97	>100000	24	9,5	77431	0	11,6	4,8	11,9	0	100	но
98	>100000	21	0	38820	0	5,2	0	0	0	78	но
99	85196	16	30,5	8558	0	0	0	17,4	0	58	но
100	НО	35	НО	НО	но	НО	НО	НО	но	83	но
101	НО	49	но	НО	но	но	но	но	но	НО	но
102	>100000	13	0	4975	0	1,7	0	0,5	0	55	но
103	>100000	18	6,4	4309	0	10,2	3	9,6	0,6	47	но
104	53,5 при 100 мкМ %	34	0	3,1 при 100 мкМ %	0	7,7	6,2	0	0	но	но
105	НО	34	НО	НО	но	но	НО	НО	но	но	но
106	но	49	НО	но	но	но	НО	НО	но	но	но
107	но	51	но	но	но	но	НО	НО	но	но	но
108	но	31	но	но	но	но	но	НО	но	но	но
109	54,1 при 100 мкМ %	33	0	13,8	0,1	0	5,6	НО	но	но	но
110	но	38	но	НО	но	но	НО	НО	но	но	но
111	но	46	но	но	но	но	но	НО	но	но	но
112	но	39	но	но	но	но	но	но	но	33	но
ИЗ	но	35	но	но	но	но	но	но	но	но	но
114	но	47	но	но	но	но	но	но	но	34	но
115	но	38	но	27751	но	но	но	но	но	51	но
116	но	46	0	39710	но	но	но	но	но	но	но

117	но	33	НО	но	но	но	но	но	но	29	но
118	но	43	но	но	но	но	но	но	но	но	но
119	но	45	но	но	но	но	но	но	но	но	но

При мер	Катепсин О1С50 (нмоль)	Эластаза 1С50 (нмоль)	Трипсин при 100 мкМ %	Химотрипсин при 100 мкМ %	Химаза при 100 мкМ %	Тромбин при 100 мкМ %	РХа при 100 мкМ %	Урокина- за при 100 мкМ %	Триптаза при 100 мкМ %	Цитотоксичность ЬС₅₀/<31₅₀клетки Не1а	Гемо- лиз при 100 мкМ %
120	НО	29	НО	НО	НО	НО	но	НО	НО	38	НО
121	11155	18	12,8	27526,1С50 (нмоль)	1,2	0	5,6	5,7	4,6	49	но
122	35134	18	19	58000,1С50 (нмоль)	6,4	0	19,6	11,1	0,2	29	но
123	35203	14	7,9	14995,1050 (нмоль)	0	2,7	0	7,6	НО	НО	но
124	НО	40	НО	НО	НО	НО	но	НО	НО	40	но
125	18269	15	28,3	>20000,1С50 (нмоль)	4,8	0	0	НО	НО	37	но
126	НО	36	НО	НО	НО	НО	но	НО	НО	НО	но
127	64 при 100 мкМ %	29	0	47,2	1,9	3,7	13,3	НО	0	но	но
128	НО	40	НО	НО	НО	НО	но	но	НО	но	но
129	но	30	но	НО	НО	но	но	но	но	но	но
130	но	29	но	НО	<4000	но	но	но	но	но	но
131	45	28	0	но	46108	но	но	но	но	но	но
132	НО	26	но	но	НО	но	но	но	но	но	но
133	но	26	но	но	НО	но	но	но	но	но	но
134	но	23	но	но	НО	но	но	но	но	но	но

135	НО	23	НО	НО	но	но	но	НО	но	НО	но
136	>100000	21	0	67,9	0	5,2	0	0	0	НО	но
137	66975	21	5,2	68,7	0	0	5,5	3,5	5	НО	но
138	43856	19	12,2	77,1	4,6	17,1	12,6	14,4	0	но	но
139	НО	18	НО	НО	НО	НО	НО	НО	НО	но	но

154	27 при 100 мкМ %	8,3	0	4	0	7	0	1	15	но	но
155	52 при 100 мкМ %	8,2	18	83	3	19	9	12	30	но	но
156	46 при 100 мкМ %	7,5	0	5	0	17	0	7	15	но	но
157	НО	7	НО	НО	НО	НО	НО	но	но	но	но
158	55 при 100 мкМ %	7,1	8	93	0	2	1	10	13	но	но
159	НО	7	НО	НО	но	НО	НО	но	но	но	но
160	55 при 100 мкМ %	6	3	94	2	23	1	14	30	но	но
161	НО	6	НО	НО	НО	НО	НО	но	но	но	но
162	НО	12,5	НО	НО	НО	НО	НО	но	но	но	но
163	НО	24	НО	НО	НО	НО	но	но	но	но	но

- 34 013814

Пример	Катепсин О1С50 (нмоль)	Эластаза 1С50 (нмоль)	Трипсин при 100 мкМ %	Химотрипсин при 100 мкМ %	Химаза при 100 мкМ %	Тромбин при 100 мкМ %	РХа при 100 мкМ %	Урокиназа при 100 мкМ %	Триптаза при 100 мкМ %	Цитотоксичность ЬС;,(/ С1зо клетки Не1а	Г емолиз при 100 мкМ %
164	НО	24	НО	НО	НО	но	но	но	НО	но	НО
165	НО	22	НО	НО	но	но	но	но	но	НО	но
166	НО	18	НО	НО	НО	но	но	но	но	НО	но
167	35134	18	19	60,2	6,4	0	19,6	11,1	0,2	но	но
168	11155	18	12,8	72,9	1,2	0	5,6	5,7	4,6	но	но
169	20295	18	10,8	79,6	0	20,6	13,3	10,4	4,2	но	но
170	НО	16	НО	НО	НО	НО	НО	НО	НО	но	но

171	НО	13	НО	НО	НО	НО	но	но	НО	но	но
172	но	13	НО	НО	НО	но	но	но	но	но	но
173	но	12	НО	НО	но	НО	НО	но	но	но	но
174	56 при 100 мкМ %	12	7	85	0	11	3	1	10	но	но
175	НО	12	НО	НО	но	но	но	но	но	но	но
176	69 при 100 мкМ %	10,3	7	55	2	15	1	8	17	но	но
177	54 при 100 мкМ %	7	5	86	3	17	7	12	15	но	но
178	НО	6	НО	НО	НО	НО	но	но	но	но	но
179	НО	50	>100000 , 1С50 (нмоль)	76,0	но	но	но	но	0	но	но

При мер	Катепсин 61С50 (нмоль)	Эластаза 1С50 (нмоль)	Трипсин 1С50 (нмоль)	Химотрипсин при 100 мкМ %	Химаза при 100 мкМ %	Тромбин при 100 мкМ %	РХа при 100 мкМ %	Урокиназа при 100 мкМ %	Триптаза 1С50 (нмоль)	Цитотоксичность ЬС₅₀/С1₅₀клетки Не1а	Г емолиз при 100 мкМ %
180	120	НО	60	НО	НО	но	но	НО	<100	но	НО
181	127	НО	113	НО	но	но	но	но	40	но	но
182	111	НО	59	НО	но	но	но	но	39	но	но
183	243	НО	146	НО	но	но	но	но	25	но	но
184	221	НО	48	но	но	но	но	но	27	но	но
185	514	НО	126	но	но	но	но	но	14	но	но

186	337	НО	99	НО	НО	НО	но	но	15	но	но
187	158	но	39	но	но	НО	но	но	<100	но	но
188	105	но	34	но	НО	НО	но	но	<100	но	но
189	164	но	39	но	НО	НО	но	но	<100	но	но
190	1500	но	172	но	НО	НО	но	но	<100	но	но
191	400	но	66	НО	но	но	но	но	21	но	но
192	650	но	72	НО	но	но	но	но	16	но	но
193	431	но	35	НО	но	но	но	но	6	но	но
194	1570	но	431	НО	но	но	но	но	9	но	но
195	4000	но	108	НО	но	но	но	но	12	но	но
196	2165	но	70	НО	но	но	но	но	52	но	но

НО: не определено.

Результаты эксперимента, описанного выше в разделе 2.5, приведены ниже в табл. 4. Таблица 4

Пример	Стабильность плазмы человека 1_]/2(мин)	Стабильность плазмы крысы 1_1/2(мин)
22	300	300
23	300	300
75	300	300
121	300	300
158	300	300

Результаты эксперимента, описанного выше в разделе 2.6 (ФК), приведены ниже в табл. 5.

- 35 013814

Таблица 5

Путь введения	Внутривенный	Пероральный
Доза (мг/кг)	5	50
Доза _погт (мг/кг)	5	5
ПИК о-ι (нг-ч/мл)	6044	782
ППК о-» (нг-ч/мл)	6047	813
ППК О-оо погт (нг-ч/мл)	6047	81
^тах оБкеггес! ('О	10752	464
Т_тах погт (ч)	10752	46
Сщах погт (нг/мл)	0,08	0,25
β(Η-’)
Г раничное Бд (ч)	0,5	0,87
У<1 (мл/кг)	547	1008
Всасывание, % (Г) (выраженное в процентах отношение нормированной ΠΠΚο-оо ПО к нормированной ППКо-оо ВВ)	100%	1,3%

Большое различие концентрации в плазме соединения примера 75 у разных индивидуумов является наиболее существенным после одного перорального введения (для ВВ: % С.У. = 6-68%, за исключением одного значения при наименьшей измеримой концентрации, равного 173%; для ПО %С.У.: 113-173%).

Внутривенное введение.

После внутривенного введения соединения примера 75 при дозе, равной 5 мг/(кг массы тела), данные для соединения примера 75 описываются кинетикой, соответствующей внутривенному введению. При анализе ФК для соединения примера 75 получают экстраполированное значение С;_пц;_а1, равное 14069 нг/мл, и наблюдающееся значение С_тах равно 10762 нг/мл через 5 мин (0,083 ч). Содержания в плазме быстро снижаются до 5774 и 3455 нг/мл через 15 мин и 30 мин соответственно. В период от 1 до 2 ч содержания в плазме снижаются при конечном 1д/₂, равном 0,46 ч, до 18 нг/мл через 4 ч. ППК_0-1 и ППК₍,_-/равны 6044 и 6047 нг х ч/мл соответственно; начальный объем распределения равен 355 мл/кг. Кажущийся объем распределения равен 547 мл/кг.

Пероральное введение.

После перорального введения соединения примера 75 при дозе, равной 50 мг/(кг массы тела), данные для соединения примера 75 описываются кинетикой, соответствующей пероральному введению. При анализе ФК для соединения примера 75 получают наблюдающееся значение С_тах, равное 464 нг/мл через 0,25 ч (15 мин). Через 0,25 ч содержания в плазме снижаются при конечном ίι/₂, равном 0,87 ч, до 24 нг/мл через 4 ч. ППК_0-1 и ППК₍,_-/ равны 782 и 813 нг х ч/мл соответственно. С учетом всасывания, равного 1,3%, кажущийся объем распределения равен 1008 мл/кг.

Сопоставление перорального и внутривенного введения.

Вследствие того, что дозы при пероральном и ВВ введении различаются, значения сопоставлены после нормировки доз.

По сравнению с нормированным значением ППК₍,_-/ после ВВ введения соединения примера 75 (100%: 6047 нг х ч/мл) выраженная в процентах доля всосавшегося (Б) соединения примера 75 после перорального введения составляет 1,3% (81 нг х ч/мл) при примерно в 234 раз меньшем значении нормированной С_тах после перорального введения (46 и 10762 нг/мл; табл. 3). Кажущийся объем распределения после перорального введения примерно в 1,8 раз больше, чем после ВВ введения (1008 и 547 мл/кг).

Литература

1. ВаггН АЧ. Ме1Еобз ίη Епгуто1оду, 1981, 80, 561-565; Ееа1ЕегЬагго^ КЧ. 1992, ОгаЕЕ, ЕгЙЕасиз 8ой^аге 1 Чс1., 81атез, и. К.

2. Моззтап Т. I. 1ттипо1. Ме1Е., 1983, 65:55-63.

3. Ветбде М.У., Тап А.8. АгсЕ. ВюсЕет. ВюрЕуз., 1993, 303:474-482.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение общей формулы

Матрица (1)

- 36 013814 где

Матрица означает группу одной из формул (а!) (а2) где в— представляет собой А1а; Агд; Азп; Суз; О1п; О1у; Н1з; 11е; Ьеи; Ьуз; Ме!; Рке; Рго; Рго(5КРке), Зег; Ткг; Тгр; Туг; Уа1; Сй; От; ®иА; Заг; ΐ-ВиО; 4АтРке; 3АтРке; 2АтРке; Рке(тС^Н2^Н); Рке(рС^Н2^Н); РЬе(тЫНС^₂)=МН); Рке^НС^Н2^Н); Ркд; Ска; Сда1; Сза1; Ме; 2-Νβ1; 1-Νβ1; 4С1-Рке; 3С1-Рке; 2С1-Рке; 3,4С1₂Рке; 4Р-Рке; 3Р-Рке; 2Р-Рке; Т1с; ТЫ; Τζа; Мзо; АсЬуз; Орг; А₂Ви; Оки; Аки; Ака; А1к; Υ^ζ1); В1р; 8(Ва); Т(ВЯ); кСка; кСуз; кЗег, кАгд; кРке; Вра; Ир; ОсЮ; МеРке; МеМе; МеА1а; Ме11е; МеУа1 или МеЬеи

I означает группу формулы

Ζ означает цепь из 11 α-аминокислотных остатков, положения указанных аминокислотных остатков в боковой цепи отсчитываются от Ν-концевой аминокислоты, причем указанные аминокислотные остатки в положениях 1-11 цепи Ζ представляют собой

- Р1: Ме, Пе, Аос, кЬеи, Скд, ОсЮ, кРке, 4АшРке, Ска, Рке, Тут,

2С1-Рке, Тгр, 1 -Ма1, Ьеи, Ска или Агд;

- Р2: Суз, 61и, Νΐε, Ткг, или 61п ;

- РЗ: Ткг, А1а или Аки;

- Р4: Ьуз, Ме, А1а, АЪи, или Ткг;

- Р5: Зег, АПоТкг или Орг;

- Р6: Пе, С5а1, Ьеи, Ме, Аос, ОсЮ, Ска, кЬеи, кРке, Скд, ΐ-ВиА,

Сг1и, или Азр;

- Р7: Рго;

- Р8: Рго, А1а, или Рго(4МТСОРке);

- Р9: Туг, Рке, Пе, Ме, Ска, С1п, Агд, Ьуз, ΗΪ8, Ткг, или А1а;

- РЮ: Суз, Агд, Ме, СИп, Ьуз, Мер Ткг, или Зег;

- Р11: Туг, (Ни, Агд, Зег, Ме, 2-Ыа1, 2С1-Рйе, Ска, Ркд, Рке, Азр Азп, или Ткг; и

- Суз, если имеется в положении Р2 и Р10, может образовывать дисульфидный мостик;

- 37 013814 при дополнительном условии, что, если матрица представляет собой °Рго^ЕРго, то аминокислотные остатки в положениях Р1-Р6 и Р8-Р11 не означают

- Р1: Ατβ - Р2: Суз, связанный с Суз в положении РЮ дисульфидным мостиком - РЗ: ТЬг - Р4 Ьуз - Р5 8ег - Р6 Не - Р7 Рго - Р8 Рго - Р9 Не - РЮ Суз, связанный с Суз в положении Р2 дисульфидным

мостиком; и

- Р11 РЬе;

и их фармацевтически приемлемые соли.

2. Соединение по п.1, в котором α-аминокислотные остатки в положениях 1-11 представляют собой

- Р1: РЬе, ЬРЬе, 4АтРЬе, Νΐε, СЬ§, Не, Туг, Агд, Тгр, 2С1-РЬе, 1-Иа1, или

СЬа;

Р2: Суз, О1и, или Νΐε;

РЗ: ТЬг;

Р4: Ьуз или Ы1е;

Р5: 8ег, АПоТЬг, или Орг;

Р6: Азр, или С1и;

Р7: Рго;

Р8: Рго;

Р9: Не, Т41е, СЬа, О1п, Туг, или А1а;

РЮ: Суз, Аг§ или Νΐε;

Р11: ТЬг, Азр, Зег, Туг, РЬе, Азп или Агд; и

- Суз, если имеется в положении Р2 и Р10,может образовывать дисульфидный мостик;

3. Соединение по п.1, в котором α-аминокислотные остатки в положениях 1-11 представляют собой

- Р1: Не, Νίβ, Аос, ЬЬеи, СЬ§, ОсЮ или ЬРЬе; - Р2: Суз, О1и, ТЬг или <31п; - РЗ: ТЬг, А1а или АЬи; - Р4: А1а, ТЬг или АЬи; - Р5: 8ег; - Р6: ОсЮ, Не, СЬа, Ьеи, С₅а1, Ы1е, Аос, СЬ§, ТВиА или ЬЬеи; - Р7: Рго; - Р8: Рго или Рго(4?1НСОРЬе); - Р9: О1п, Туг, Не или РЬе; - РЮ: Суз, Ьуз, СИп, ТЬг, Ме! или Агд; - Р11: Туг, Зег, Аг§, СИп, Νίβ, 2-№1, 2С1-РЬе, РЬе, СЬа или РЬд; и

Суз, если имеется в положении Р2 и РЮ, может образовывать дисульфидный мостик;

- 38 013814

4. Соединение по п.1, в котором α-аминокислотные остатки в положениях 1-11 цепи Ζ представляют собой

Р1: СЬа, Туг или Тгр

Р2: Су 5

РЗ: ТЬг

Р4: Ьуз

Р5: бег

Р6: Ьеи

Р7: Рго

Р8: Рго

Р9: Ьуз

РЮ: Суз

Р11: Агд; и

Суз, если имеется в положении Р2 и РЮ,может образовывать дисульфидный мостик;
5. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой ^пРго-^ьРго и аминокислотные остатки в положениях 1-11 представляют собой

- Р1: РЬе;

- Р2: Суз;

- РЗ: ТЬг;

- Р4: Ьуз;

- Р5: Зег;

- Р6: Азр;

- Р7: Рго;

- Р8: Рго;

- Р9: Не;

- РЮ: Суз;

- Р11: Туг;

Суз в Р2 и РЮ образуют дисульфидный мостик.
6. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой ^пРго-^ьРго и аминокислотные остатки в положениях 1-11 представляют собой

- Р1: Не;

- Р2: Суз;

- РЗ: ТЬг;

- Р4: Ьуз;

- Р5: Зег;

- Р6: Азр;

- Р7: Рго;

- Р8: Рго;

- Р9: Νίβ;

- РЮ: Суз;

- Р11: Агд;

Суз в Р2 и РЮ образуют дисульфидный мостик.

- 39 013814
7. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой °Рго-^ЕРго татки в положениях 1-11 представляют собой аминокислотные ос-

Р4:

Ьуз;
8ег;

Р5:

Р6:

Р7:

Р8:

Р
9:

Азр;

Рго;

Рго;

СЬа;

РЮ:

Р11:

аминокислотные осСуз;

Аг§;

Суз в Р2 и РЮ образуют дисульфидный мостик.

8. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой °Рго-^ЕРго татки в положениях 1-11 представляют собой аминокислотные ос9. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой ^иРго-^ЕРго татки в положениях 1-11 представляют собой

- 40 013814
10. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой °Рго-^ЕРго и аминокислотные остатки в положениях 1-11 представляют собой

- Р1: СЬд;

- Р2: Суз;

- РЗ: ТЬг;

- Р4: Ьуз;

- Р5: 8ег;

- Рб: Азр;

- Р7: Рго;

- Р8: Рго;

- Р9: Не;

- РЮ: Суз;

- Р11: Туг;

Суз в Р2 и РЮ образуют дисульфидный мостик.

11. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой °Рго-^ЕРго и аминокислотные остатки в положениях 1-11 представляют собой

- Р1: Агд; - Р2: Суз; - РЗ: ТЬг; - Р4: Ьуз; - Р5: 8ег; - Рб: Азр; - Р7: Рго; - Р8: Рго; - Р9: Пе; - РЮ: Суз; - Р11: РЬе;

Суз в Р2 и РЮ образуют дисульфидный мостик.

12. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой °Рго-^ЕРго и аминокислотные остатки в положениях 1-11 представляют собой

- Р1: Ме;

- Р2: Суз;

- РЗ: ТЬг;

- Р4: А1а;

- Р5: 8ег;

- Рб: Пе;

- Р7: Рго;

- Р8: Рго;

- Р9: С1п;

- РЮ: Суз;

- Р11: О1п;

Суз в Р2 и Р10 образуют дисульфидный мостик.

- 41 013814
13. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой ^пРго-^ьРго и аминокислотные остатки в положениях 1-11 представляют собой

- Р1: йРйе;

- Р2: Суз;

- РЗ: Тйг;

- Р4: А1а;

- Р5: 8ег;

- Р6: ОсЮ;

- Р7: Рго;

- Р8: Рго;

- Р9: С1п;

- РЮ: Суз;

- Р11: С1п

Суз в Р2 и РЮ образуют дисульфидный мостик.
14. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой °Рго-^ьРго и аминокислотные остатки в положениях 1-11 представляют собой

- Р1: ОсЮ;

- Р2: О1п;

- РЗ: ТЬг;

- Р4: А1а;

- Р5: Зег;

- Р6: Не;

- Р7: Рго;

- Р8: Рго;

- Р9: О1п;

- РЮ: Тйг;

- Р11: Туг.
15. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой °Рго-^ьРго и аминокислотные остатки в положениях 1-11 представляют собой

- Р1: йРйе;

- Р2: Суз;

- РЗ: Тйг;

- Р4: А1а;

- Р5: 8ег;

- Р6: Сйа;

- Р7: Рго;

- Р8: Рго;

- Р9: О1п;

- РЮ: Суз;

- Р11: Рйе;

Суз в Р2 и РЮ образуют дисульфидный мостик.

- 42 013814

16. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой °Рго-^ЕРго и аминокислотные остатки в положениях 1-11 представляют собой

- Р1: ОсЮ; - Р2: О1и; - РЗ: ТЬг; - Р4: А1а; - Р5: 8ег; - Р6: Не; Р7: Рго; Р8: Рго; Р9: С1п; РЮ: Ьуз; Р11: Туг.

17. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой ^пРго-^ЕРго и аминокислотные остатки в положениях 1-11 представляют собой

- Р1: ОсЮ;

- Р2: Суз;

- РЗ: ТЬг;

- Р4: А1а;

- Р5: 8ег;

- Р6: СЬа;

- Р7: Рго;

- Р8: Рго;

- Р9: С1п;

- РЮ: Суз;

- Р11: РЬе;

Суз в Р2 и РЮ образуют дисульфидный мостик.
18. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой °Рго-^ЕРго и аминокислотные остатки в положениях 1-11 представляют собой

- Р1: ЬРЬе;

- Р2: Суз;

- РЗ: ТЬг;

- Р4: А1а;

- Р5: 8ег;

- Р6: СЬа;

- Р7: Рго;

- Р8: Рго;

- Р9: С1п;

- РЮ: Суз;

- Р11: С1п;

Суз в Р2 и РЮ образуют дисульфидный мостик.

- 43 013814
19. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой °Рго-^ЕРго остатки в положениях 1-11 представляют собой:

ОсЮ;

Суз;

ТЫ;

А1а;

8ег;

СЬа;

Рго;

Рго(4№1СОР11е);

О1п;

Суз;

С1п;

Р1:

Р2:

РЗ:

Р4:

Р5:

Р6:

Р7:

Р8:

Р9:

РЮ:

- Р11:

Суз в Р2 и РЮ образуют дисульфидный мостик.
20. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой °Рго-^ЕРго остатки в положениях 1-11 представляют собой йРйе;

Суз;

ТЫ;

А1а;

8ег;

ОсЮ;

Рго;

Рго;

О1п; ·

Суз;

Туг;

Р1:

Р2:

РЗ:

Р4:

Р5:

Рб:

Р7:

Р8:

- Р9:

- РЮ:

- Р11:

Суз в Р2 и РЮ образуют дисульфидный мостик.
21. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой °Рго-^ЕРго остатки в положениях 1-11 представляют собой аминокислотные аминокислотные аминокислотные

- 44 013814
22. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой ^пРго-^ьРго и аминокислотные остатки в положениях 1-11 представляют собой

- Р1: СЬ§;

- Р2: Суз;

- РЗ: ТЬг;

- Р4: Ьуз;

- Р5: 8ег;

- Р6: Азр;

- Р7: Рго;

- Р8: Рго;

- Р9: Пе;

- РЮ: Суз;

- РН: Азр;

Суз в Р2 и РЮ образуют дисульфидный мостик.
23. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой °Рго-^ьРго и аминокислотные остатки в положениях 1-11 представляют собой

- Р1: ОсЮ;

- Р2: Суз;

- РЗ: ТЬг;

- Р4: А1а;

- Р5: 8ег;

- Р6: СЬа;

- Р7: Рго;

- Р8: Рго;

- Р9: О1п;

- РЮ: Суз;

- Р11: О1п;

Суз в Р2 и РЮ образуют дисульфидный мостик.
24. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой °Рго-^ьРго и аминокислотные остатки в положениях 1-11 представляют собой

- Р1: ОсЮ;

- Р2: Суз;

- РЗ: ТЬг;

- Р4: А1а;

- Р5: 8ег;

- Р6: ОсЮ;

- Р7: Рго;

- Р8: Рго;

- Р9: О1п;

- РЮ: Суз;

- РН: С1п;

Суз в Р2 и РЮ образуют дисульфидный мостик.

- 45 013814 аминокислотные
25. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой °Рго-^ЕРго остатки в положениях 1-11 представляют собой
26. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой ^иРго-^ЕРго остатки в положениях 1-11 представляют собой аминокислотные аминокислотные
27. Соединение формулы (I) по п.1, где матрица представляет собой ^иРго-^ЕРго остатки в положениях 1-11 представляют собой
28. Энантиомеры соединения формулы (I) по п.1.
29. Соединения по любому из пп.1-28 для применения в качестве терапевтически активных веществ.
30. Соединения по п.29, обладающие селективной ингибирующей активностью по отношению к протеазе, в частности против катепсина О, или эластазы, или триптазы, и/или противораковой активностью, и/или противовоспалительной активностью, и/или противоинфекционной активностью, и/или лечебной активностью при сердечно-сосудистых заболеваниях, и/или антииммунологической активностью,

- 46 013814 и/или антинейродегенеративной активностью.
31. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-28 и фармацевтически инертный носитель.
32. Композиции по п.31 в форме, пригодной для перорального, местного, чрескожного, трансбуккального, проводимого через слизистую оболочку, или легочного введения, или введения с помощью инъекции или ингаляции.
33. Композиции по п.31 или 32 в форме таблеток, драже, капсул, растворов, жидкостей, гелей, пластыря, кремов, мазей, сиропа, взвесей, суспензий, спрея, распыляемого средства или суппозиториев.
34. Применение соединений по любому из пп.1-28 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для применения в качестве ингибитора протеазных ферментов.
35. Применение по п.34, в котором указанное ингибирующее протеазу лекарственное средство предназначено для применения с целью предупреждения инфекций у здоровых индивидуумов или для замедления инфекций у инфицированных пациентов; или когда рак опосредуется активностью протеазы или обусловлен ее активностью; или когда иммунологические заболевания опосредуются активностью протеазы или обусловлены ее активностью, или когда воспаление опосредуется активностью протеазы или обусловлено ее активностью; или когда иммунологическая реакция опосредуется активностью протеазы или обусловлена ее активностью.
36. Применение соединений по любому из пп.2 и 5-11 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для применения в качестве ингибитора катепсина С.
37. Применение соединений по любому из пп.3 и 12-22 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для применения в качестве ингибитора эластазы.
38. Применение соединений по любому из пп.4 и 23-24 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для применения в качестве ингибитора триптазы.
39. Способ получения соединений по любому из пп.1-27, который предусматривает:

(a) проведение реакции сочетания соответствующим образом функционализированной твердой подложки с подходящим Ν-защищенным производным аминокислоты, которая в искомом конечном продукте находится в положении 5, 6 или 7, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(b) удаление Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта;

(c) проведение реакции сочетания полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты, которая в искомом конечном продукте находится на одно положение ближе к Ν-концевому аминокислотному остатку, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(д) удаление Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта;

(е) повторение стадий (с) и (д), пока не будет введен Ν-концевой аминокислотный остаток;

(Г) проведение реакции сочетания полученного таким образом продукта с соединением общей формулы является группой (а1) или (а2), как определено в п.1,

- 47 013814 (£а) проведение реакции сочетания продукта, полученного на стадии (е), с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты общей формулы

НООС-В-Н III или

НООС-А-Н IV в которой В и А являются такими, как определено в п.1, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(£Ь) удаление Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта и (£е) проведение реакции сочетания полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты указанной выше общей формулы IV и, соответственно, III, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(д) удаление Ν-защитной группы из продукта, полученного на стадии (ί) или (£е);

(11) проведение реакции сочетания полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты, которая в искомом конечном продукте находится в положении 11, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Νзащищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(ΐ) удаление Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта;

(Ϊ) проведение реакции сочетания полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты, которая в искомом конечном продукте находится на одно положение дальше от положения 11, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(k) удаление Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта;

(l) повторение стадий (ΐ) и (к), пока не будут введены все аминокислотные остатки;

(т) при желании селективное снятие защиты у одной или нескольких защищенных функциональных групп, содержащихся в молекуле, и соответствующее замещение реакционноспособной группы (групп), высвободившихся при этом;

(п) при желании образование внутри цепи связи между боковыми цепями соответсвующих аминокислотных остатков в положениях 2 и 10;

(о) отделение полученного таким образом продукта от твердой подложки;

(р) циклизацию продукта, отделенного от твердой подложки;

(ς) удаление любых защитных групп, находящихся на функциональных группах любых элементов цепи аминокислотных остатков, и при желании любой защитной группы (групп), которые дополнительно могут находиться в молекуле; и (г) при желании превращение полученного таким образом продукта в фармацевтически приемлемую соль или превращение полученной таким образом фармацевтически приемлемой или неприемлемой соли в соответствующее свободное соединение формулы (I) или в другую фармацевтически приемлемую соль.
40. Способ получения соединений по любому из пп.1-27, который предусматривает:

(а') проведение реакции сочетания соответствующим образом функционализированной твердой подложки с соединением общей формулы в которой

- 48 013814 является такой, как определено в п.1, и X означает Ν-защитную группу, или, альтернативно, если о= —-Матрица является группой (а1) или (а2), как определено в п.1, (а'а) проведение реакции сочетания указанной соответствующим образом функционализированной твердой подложки с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты общей формулы

НООС-В-Н III или

НООС-А-Н IV в которой В и А являются такими, как определено в п.1, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(а'Ь) удаление Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта и (а'с) проведение реакции сочетания полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты указанной выше общей формулы ГУ и, соответственно, III, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(Ь') удаление Ν-защитной группы из продукта, полученного на стадии (а') или (а'с);

(с') проведение реакции сочетания полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты, которая в искомом конечном продукте находится в положении 11, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(б') удаление Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта;

(е') проведение реакции сочетания полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным аминокислоты, которая в искомом конечном продукте находится на одно положение дальше от положения 11, причем любая функциональная группа, которая может содержаться в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;

(Г) удаление Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта;

(д') повторение стадий (е') и (ί¹), пока не будут введены все аминокислотные остатки;

(Е') при желании селективное снятие защиты у одной или нескольких защищенных функциональных групп, содержащихся в молекуле, и соответствующее замещение реакционноспособной группы (групп), высвободившихся при этом;

(ΐ') при желании образование внутри цепи связи между боковыми цепями соответствующих аминокислотных остатков в положениях 2 и 10;

0') отделение полученного таким образом продукта от твердой подложки;

(к') циклизацию продукта, отделенного от твердой подложки;

(1') удаление любых защитных групп, находящихся на функциональных группах любых элементов цепи аминокислотных остатков, и при желании любой защитной группы (групп), которые дополнительно могут находиться в молекуле; и (т') при желании превращение полученного таким образом продукта в фармацевтически приемлемую соль или превращение полученной таким образом фармацевтически приемлемой или неприемлемой соли в соответствующее свободное соединение формулы (I) или в другую фармацевтически приемлемую соль.
41. Модификация способов по п.39 или 40 для получения соединений по п.28, в которой используются энантиомеры всех хиральных исходных веществ.

Евразийская патентная организация, ЕАПВ

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2