NO342041B1

NO342041B1 - Templatfikserte β-hårnålspeptidomimetika, sammensetning innholdende disse, anvendelse derav samt fremgangsmåter for fremstilling derav.

Info

Publication number: NO342041B1
Application number: NO20074674A
Authority: NO
Inventors: Frank Gombert; Steven J Demarco; Kerstin Moehle; Heiko Henze; Daniel Obrecht; Odile Sellier; Françoise Jung; Christian Ludin
Original assignee: Polyphor Ltd; Univ Zuerich
Priority date: 2005-02-17
Filing date: 2007-09-13
Publication date: 2018-03-12
Also published as: NO20074674L; US10562933B2; AU2005327825B2; EA200701727A1; US10100084B2; US20190002498A1; MX2007009873A; CA2915175C; PT1856140E; EP1856140B1; ES2453540T3; US20140213531A1; US20090054345A1; KR20070106775A; CA2915175A1; JP2008531485A; KR101443171B1; EP1856140A1; CA2598360A1; HK1213914A1

Abstract

Templatfikserte ?-hårnålspeptidomimetika av generell formel (I), hvori Z er en kjede av 11??-aminosyrerester som, avhengig av deres stilling i kjeden, (telling starter fra den N-terminale aminosyren) er Gly eller Pro eller Pro(4NHCOPhe), eller er av visse typer som, som de gjenværende symbolene i formelen over, er definert i beskrivelsen og kravene, og salter av disse, som har den egenskapen å hemme proteaser, særlig serinproteaser, særlig katepsin G, elastase eller tryptase. Disse hårnålspeptidomimetika kan bli fremstilt ved fremgangsmåter som er basert på en blanding av fast- og løsningsfase syntesestrategi.

Description

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer templatfikserte phåmålspeptidomimetika som inkorporerer en templatfiksert kjede av 11 ami no syr er ester som, avhengig av deres stilling i kjeden, er som definert i det etterfølgende. Disse templatfikserte ^-håmålspeptidomimetika kan brukes somhemmere av proteaseenzymer. De er spesielt verdifulle som hemmere av forskjellige serinproteaser så som humant katepsin G, elastase eller tryptase. I tillegg tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en effektiv fremgangsmåte ved hjelp av hvilken disse forbindelsene, hvis ønskelig kan fremstilles i bibliotekformat.

Ø-hårnålspeptidomimetikaene ifølge den foreliggende oppfinnelsen har bedreteffekt, oral biotilgjengelighet, bedret halvliv og viktigere, et høyt selektivitetsforhold mellom forskjellige serinproteaser som er avhengige av et passende valg av visse typer av aminosyrerester og deres stilling i nevnte kjede. I tillegg har disse p-håmålspeptidomimetikaene en lav hemolyse av røde blodcellerog lav cytotoksisitet.

WO 2004/096839 Al gjør kjent templatfikserte p~hårnålspeptidomimetika som inkorporerer templat-fikserte kjeder av 12 eller 14 a-aminosyrerester. Dissetemplatfikserte p-hårnålspeptidomimetika har CXCR4 antagonistisk aktivitet ogviser forbedret virkeevne, biotilgjengelighet, halveringstid og signifikant forsterket forhold mellom CXCR4 antagonistisk aktivitet på den ene siden og hemolyse av røde blodceller og cytotoksisitet på den andre siden. Det er også beskrevet en prosess der peptidomimetika kan bli laget i parallell bibliotek-format.

WO 2004/096838 Al gjør kjent templatfikserte P-hårnålspeptidomimetika sominkorporerer templatfikserte kjeder av 4 og 6 eller 5 og 7 a-aminosyrerester. Dissetemplatfikserte P-hårnålspeptidomimetika har CXCR4 antagonistisk aktivitet ogviser forbedret virkeevne, biotilgjengelighet, halveringstid og signifikant forsterket forhold mellom CXCR4 antagonistisk aktivitet på den ene siden og hemolyse av røde blodceller og cytotoksisitet på den andre siden. Det er også beskrevet en prosess der peptidomimetika kan bli laget i parallell bibliotek-format.

WO 03/054000 Al gjør kjent templatfikserte P-hårnålspeptidomimetika sominkorporerer templatfikserte kjeder av 7 eller 11 a-aminosyrerester. Dissetemplatfikserte p-håmålspeptidomimetika er angitt å være anvendelige søminhibitorer av proteaseenzymer, spesielt som inhibitorer av serin proteaser, slik som trypsin, humant katepsin G og trombin. Det er også beskrevet en prosess der peptidomimetika kan bli laget i parallell bibliotek-format.

Hemmere av protease har etter hvert vist seg å ha lovende terapeutisk anvendelse ved behandlingen av forskjellige sykdommer så som kreft (R.P. Beckett, A.

Davidson, A.H. Drummond, M. Whittaker, Drug Disc. Today 1996, 1, 16-26; L.L.Johnson, R. Dyer, D.J. Hupe, Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 466-71; D. Leung,

G. Abbenante og D.P. Fairlie, J. Med. Chem. 2000, 43, 305-341; T. Rockway,Expert Opin. Ther. Patents 2003, 13, 773-7S6), parasitt-, sopp- og virusinfeksjoner[for eksempel schistosomiase (M.M. Decker, S.A. Harrop, J.P. Dalton, B.H. Kalinna, D.P. McManus, D.P. Brindley, J. Biol. Chem. 1995, 270, 24496-501); C.albicans (C. Abad-Zapetero, R. Goldman, S.W. Muchmore, C. Hutchins, K.Stewart, J. Navaza, C.D. Payne, T.L. Ray, Protein Sei. 1996, 5, 640-52), HIV (A.Wlodawer, J.W. Erickson, Annu. Rev. Biochem. 1993, 62, 543-85; P.L. Darke, J.R.Huff, Adv. Pharmacol. 1994, 5, 399-454), hepatitt (J.L. Kim, K.A. Morgenstem, C.Lin, T. Fox, M.D. Dwyer, J.A. Landro, S.P. Chambers, W. Markland, C.A. Lepre, E.T. O'Malley, S.L. Harbeson, C.M. Rice, M.A. Murcko, P.R. Caron, J.A. Thomson, Cell, 1996, 87, 343-55; R.A. Love, H.E. Parge, J.A. Wickersham, Z. Hostomsky, N.Halbuka, E.W. Moomaw, T. Adachi, Z. Hostomska, Cell, 1996, 87, 331-342),herpes (W. Gibson, M.R. Hall, Drug. Des. Discov. 1997, 15, 39-47)] oginflammatoriske, immunologiske, respiratoriske (P.R. Bernstein, P.D. Edwards, J.C. Williams, Prog. Med. Chem. 1994, 31, 59-120; T.E. Hugli, Trends Biotechnol.1996, 14, 409-12), kardiovaskulære (M.T. Stubbs, W.A. Bode, Thromb. Res. 1993,69, 1-58; H. Fukami et al., Current Pharmaceutical Design 1998, 4, 439-453) ognevrodegenerative defekter inklusive Alzheimers sykdom (R. Vassar, B.D. Bennett, S. Babu-Kahn, S. Kahn, E.A. Mendiaz, Science, 1999, 286, 735-41), angiogenese(M. Kaatinen et ah, Atherosklerosis 1996, 123 1-2, 123-131) og multippel sklerose(M.Z. Ibrahim et al., J. Neuroimmunol 1996, 70, 131-138).

Ettersom de fleste proteaser binder sine substrater i en utstrakt eller i en Ptrådkonformasjon, så må gode hemmere således være i stand til å etterligne en slik konformasjon. p-håmålsmimetika er således ideelt egnet til å låse peptidsekvenser ien utstrakt konformasjon.

Blant proteaser så er serinproteaser viktige terapeutiske mål. Serinproteaser er klassifisert etter sin substratspesifisitet, da spesielt den type rest som forekommer ved Pl, enten som trypsinlignende (positivt ladde rester Lys/Arg, foretrukket ved Pl), elastaselignende (små hydrofobe rester Ala/Val ved Pl) eller kymotrypsinlignende (store hydrofobe rester Phe/Tyr/Leu ved Pl). Serinproteaser for hvilke proteasehemmer røntgenkrystallinske data er tilgjengelige på PDBdatabasen (PDB: www.resb.org/pdb) inkluderer trypsin, a-kymotrypsin, ykymotrypsin, human neutrofil elastase, trombin, subtilisin, humant cytomegalovirus, proteinase A, akromobakter, humant katepsin G, glutaminsyrespesifikk protease, karbopeptidase D, blodkoaguleringsfaktor VHa, svinefaktor 1XA, mesenteriosampeptidase, HCV-protease og termitase. Andre serinproteaser avterapeutisk interesse inkluderer tryptase, komplement konvertase og hepatitt CNS3-protease. Hemmere av trombin (for eksempel J.L. Metha, L.Y. Chen, W.W.Nichols, C. Mattsson, D. Gustaffson, T.G.P. Saldeen, ./. Cardiovasc. Pharmacol.

1998, 31, 345-51; C. Lila, P. Gloanec, L. Cadet, Y. Herve, J. Fournier, F. Leborgne,

T.J. Verbeuren, G. DeNanteuil, Synth. Comm. 1998, 28, 4419-29) og faktor Xa (foreksempel J.P. Vacca, Annu. Rep. Med. Chem. 1998, 33, 81-90) er under kliniskbedømmelse som antitrombotiske midler, hemmere av elastase (J.R. Williams, R.C. Falcone, C. Knee, R.L. Stein, A.M. Strimpler, B. Reaves, R.E. Giles, R.D. Krell, Am. Rev. Respir. Dis. 1991, 144, 875-83) brukes i kliniske forsøk på behandling avemfysem og andre lungesykdommer, mens tryptasehemmere er for tiden i fase II kliniske forsøk for behandling av astma (C. Seife, Science 1997, 277, 1602-3),urokinasehemmere for brystkreft og kymasehemmere for hjerterelaterte sykdommer, endelig er katepsin G og elastase intimt involvert i moduleringen av aktivitetene til cytokiner og deres reseptorer. Spesielt på steder med inflammasjon blir det frigjort høye konsentrasjoner av katepsin G, elastase og proteinase 3 fra infiltrerende polymorfonukleære celler i nær tidsmessig korrelasjon til forhøyede nivåer av inflarnrnatoriske cytokiner, noe som sterkt indikerer at disse proteasene er involvert i kontrollen av cytokinbioaktivitet og tilgjengelighet (U. Bank, S. Ansorge, J. Leukoc. Biol. 2001, 69, 177-90). Hemmere av elastase og katepsin G utgjør såledesverdifulle mål for nye medikamentkandidater, da spesielt for KOLS (kronisk obstruktiv lungesykdom) (H. Ohbayashi, Epert Opin. Investig. Drugs 2002, 11, 965980).

Av de mange forekommende proteinholdige serinproteasehemmerne, så er en et 14 aminosyrer langt syklisk peptid fra solsikkefrø, betegnet solsikketrypsinhemmer (SFT-1) (S. Luckett, R. Santiago Garcia, J.J. Barker, A.V. Konarev, P.R. Shewry,A.R. Clarke, R.L. Brady, J. Mol. Biol. 1999, 290, 525-533; Y.-Q. Long, S.-L. Lee,C.-Y. Lin, I.J. Enyedy, S. Wang, P. Li, R.B. Dickson, P.P. Roller, Biorg. & Med.Chem. Lett. 2001, 11, 2515-2519) som både har sekvens- og konformell likhet medden trypsinreaktive sløyfen i Bowman-Birkfamilien av serinproteasehemmere.Hemmeren inntar en P-hårnålskonformasjon når den er bundet til det aktive setet istorfe Ø-trypsin. SFTI-1 hemmet ø-trypsin (Kå < 0,1 nM), katepsin G (Ki -—0,15nM), elastase (K; — 105 pM), kymotrypsin (Ki -7,4 pM) og trombin (K; ~136 mM).

De foreliggende søkere beskriver her en fremgangsmåte for utforming av hemmere som innbefatter å transplantere p-håmålssløyfen fra det naturlige forekommendepeptidet til en hårnålsinduserende templat. Basert på den godt definerte tredimensjonale strukturen til Ø-hårnålsmimetika, kan det utformes bibliotek avforbindelser som til slutt kan føre til nye hemmere med forskjellige spesifisitetsprofiler i forhold til flere klasser av proteaser.

Templatbundne håmålsmimetiske peptider er blitt beskrevet i litteraturen (D. Obrecht, M. Altorfer, J.A. Robinson, Adv. Med. Chem. 1999, 4, 1-68; A. RobinsonSyn. Lett. 2000, 4, 429-441) og serinproteasehemmende templatfiksertepeptidomimetika og fremgangsmåter for deres syntese, er blitt beskrevet i internasjonal patentsøknad W02003/054000 Al og i A. Descours, K. Moehle, A.

Renard, J. Robinson ChemBioChem 2002, 3, 318-323, men de tidligere beskrevne

molekyler har ikke høy selektivitet og spesielt stor styrke. Evnen til å utvikle phårnålspeptidomimetika ved å bruke kombinatoriske og parallelle syntesemetoder, er imidlertid nå blitt etablert (L. Jiang, K, Moehle, B, Dhanapal, D. Obrecht, J.A. Robinson, Heiv. Chim. Acta. 2000, 83, 3097-3112).

Disse fremgangsmåtene gjør det nå mulig å syntetisere og screene store hårnålsmimetiske bibliotek, som igjen i betydelig grad letter strukturaktivitetsundersøkelser og følgelig oppdagelsen av nye molekyler med høy styrke og selektiv serinproteasehemmende aktivitet, oral biotilgjengelighet, lav hemolytisk aktivitet i forhold til humane røde blodceller og lav cytotoksisitet.

p-hårnålspeptidomimetikaene ifølge den foreliggende oppfinnelsen som kan væretilstede i fri form eller i farmasøytisk akseptabel saltform, er definert i det etterfølgende, for eksempel i kav 1, og kan fremstilles i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen ved en fremgangsmåte definert i det etterfølgende, for eksempel i krav 40 eller krav 41.

Peptidomimetikaene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan også være tilstede i enantiomer form, som kan bli fremstilt ved en fremgangsmåte definert i det etterfølgende, for eksempel i krav 42.

Dipeptidresten som er nevnt i krav 1 (heri etter angitt som «templat») har en Nterminus og en C-terminus orientert i rommet på en slik måte at avstanden mellomde to kan ligge mellom 4,0 og 5,5 Å. Ellevepeptidkjeden Z nevnt i krav 1 er forbundet med C-terminusen og N-terminusen i templaten via de tilsvarende N- ogC-termini slik at templaten og kjeden Z danner en syklisk struktur av den type somer vist i formel I angitt i krav 1. I et tilfelle som her hvor avstanden mellom N- ogC-termini i templaten ligger mellom 4,0 og 5,5 Å, vil templaten indusere det Hbindingsnettverket som er nødvendig for dannelsen av en p-håmålskonformasjon ikjeden Z. Templaten og kjeden Z vil således danne et p-hårnålsmimetika.

p-hårnålskonformasjonen er sterkt relevant for den serinproteasehemmendeaktiviteten til p-hårnålsmimetikaene ifølge den foreliggende oppfinnelsen. De phårnålsstabiliserende konformelle egenskapene til templaten spiller en nøkkelrolle, ikke bare for den selektive hemmende aktiviteten, men også for den synteseprosessen som er beskrevet ovenfor, ettersom inkorporeringen av templaten ved begynnelsen eller nær midten av de lineært beskyttede peptidforløperne gir signifikant bedrede sykliseringsutbytter.

Sidekjeder av (L)-aminosyrer i motstående posisjoner av p-trådområdet kan danneen intertrådbinding. Den mest kjente bindingen er disulfidbroen som dannes av cysteiner plassert i motstående posisjoner på p-tråden. Det er kjent forskjelligefremgangsmåter for å danne disulfidbindinger inklusive de som er beskrevet av: J.

P. Tam et al. Synlhesis 1979, 955-957; Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis,

2. utgave., Pierce Chemical Company, III., 1984; Ahmed et al. J. Biol. Chem. 1975, 250, 8477-8482; og Pemiington et al., Pepiides, sidene 164-166, Giralt and Andreu,red., ESCOM Leiden, Nederland, 1990. Mest fordelaktig innenfor den foreliggende oppfinnelsen er at disulfidbindingene fremstilles ved å bruke acetamidometyl (Acm)

5 -beskyttende grupper for cystein. En videre velkjent og etablert intertrådbindingbestår i å forbinde en lysinrest med en glutaminsyrerest som er plassert i motstående P-trådposisjon ved hjelp av en amidbindingsdannelse. En foretrukketbeskyttende gruppe for sidekjedeaminogruppen i lysin er allyloksykarbonylgruppen (Alloc), og sidekjedekarboksygruppen av glutaminsyre er fortrinnsvis beskyttet som

10 allylester.

Posisjoner for en intertrådbinding er P2 og P10 tatt sammen. Slike intertrådbindinger er kjent for å stabilisere P-håmålskonformasjoner og såledesutgjøre et viktig strukturelt element for utformingen av p-hårnålsmimetika.

I det etterfølgende er de aminosyrene listet, hvis rester, utgjør kjeden Z og hvor 15 forkortelsene tilsvarer de som generelt er tilpasset vanlig praksis.

Foretrukne aminosyrerester i kjeden Z er de som er avledet fra de følgende naturlige «.-aminosyrene:

Trebokstavskode

Navn

Enbokstavskode

Ala

L-alanin

A

Arg

L-arginin

R

Asn

L-asparagin

N

Asp

L-asparginsyre

D

Cys

L-cystein

C

Glu

L-glutaminsyre

E

Gin

L-glutamin

Q

His

L-histidin

H

Ile

L-isoleukin

I

Leu

L-leukin

L

Lys

L-lysin

K

Met

L-metionin

M

Phe

L-fenylalanin

F

Pro

L-prolin

P

Ser

L-serin

S

Thr

L-treonin

T

Trp

L-tryptofan

W

5 Tyr

L-tyrosin

Y

Andre aminosyrerester i kjeden Z er de som er avledet fra de følgende aminosyrene:

Forkortelse

Navn

Abu

y-aminosmørsyre (GABA)

AlloThr

Allo-treonin

4AmPhe

L-para-aminofenylalanin

Aoc

(2S)-ammooktansyre

Cha

L-sykloheksylalanin

C5al

L-3-syklopentylalanin

2C1-Phe

L-2-klorfenylalanin

Dpr

2,3 -diaminopropionsyre

hPhe

L- hom o - fen yl al an i n

l-X al

L-l-naftylalanin

2-Nal

L-2-naftylalanin

Nle

L-norleucin

OctG

L-oktylglysin

Phg

L-fenylglycin

Pro(4NHCOPhe)

(2S)-4-benzamidinopyrrolidin-2-karboksylsyre

t-BuA

L-t-butvlalanin

25 Posisjonene Pl til Pli for hver av de 11 aminosyrerestene i kjeden Z er utvetydig definert som følger: Pl representerer den første aminosyreresten i kjeden Z som er koblet med sin N-terminus til C-terminus i templaten, og P11 representerer den siste

aminosyreresten i kjeden Z som er koblet i sin C-temiinus til N-terminus itemplaten. For hemmere av katepsin G, er aminosyrerestene i kjeden Z fortrinnsvis de som er definert i ethvert av kravene 2 og 5 til 10.

For hemmere av elastase, er aminosyrerestene i kjeden Z fortrinnsvis de som er definert i ethvert av kravene 3 og 11 til 22.

For hemmere av tryptase, er aminosyrerestene i kjeden Z fortrinnsvis de som er definert i ethvert av kravene 4 og 23 til 25Aminosyrebyggesteinene som utgjør templaten er de som er avledet fra de følgende aminosyrene, hvor forkortelsene tilsvarer de som generelt er tilpasset vanlig praksis (arnino syren LPro er identisk med aminosyren Pro):

Forkortelse Navn

DPro D-prolin

LPro L-prolin

Spesielt foretrukne P-håmålspeptidomimetika ifølge den foreliggendeoppfinnelsen inkluderer de som er beskrevet i eksemplene 5, 19, 20, 22, 23, 38, 39 og 40 som hemmere av katepsin G; i eksemplene 91, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 og 161 som hemmere av elastase; og i eksemplene 193, 194 og 195 som hemmere av tryptase.

Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan med fordel utføres som parallellmatrisesynteser for derved å få fremstilt bibliotek av templatfikserte phårnålspeptidomimetika ifølge oppfinnelsen. Slike parallellsynteser gjør det mulig å oppnå matriser av tallrike (normalt 24 til 192, typisk 96) forbindelser ifølge oppfinnelsen med høye utbytter og definerte renheter og med en minimal dannelse av dimere og polymere biprodukter. Et passende valg av det funksjonaliserte faste underlaget (det vil si fast underlag pluss linkermolekyl), templater og sete for syklisering spiller derved nøkkelroller.

Det funksjonaliserte faste underlaget er hensiktsmessig avledet fra polystyren tverrbundet med, fortrinnsvis 1-5% divinylbenzen; polystyren belagt medpolyetylenglykolavstandsdannende grupper (TentagelR); og polyakrylamidharpikser (se også Obrecht, D.; Villalgordo, J.-M, "Solid- Supported Combinatorial andParallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries", TetrahedronOrganic Chemistry Series, Vol. 17, Pergamon, Elsevier Science, 1998).

Det faste underlaget er funksjonalisert ved hjelp av en linker, det vil si et bifunksjonelt avstandsdannende molekyl som i den ene enden inneholder en forankringsgruppe for tilfesting til det faste underlaget, mens den andre enden har en selektiv spaltbar funksjonell gruppe som brukes for de etterfølgende kjemiske

transformasjoner og spaltningsprosedyrer. For det foreliggende formålet brukes to typer av linkere:

Type 1-linkere er utformet for å frigjøre amidgruppen under sure betingelser (H.Rink, Tetrahedron Lett. 1987, 28, 3783-3790). Linkere av denne typen danneramider av karboksylgruppen i aminosyrene; og eksempler på harpikser som er funksjonalisert ved hjelp av slike Hnkerstrukturer inkluderer 4-[(((2,4dimetoksyfenyl)Fmoc-aminometyl)fenoksyacetamido)aminometyI]-PS-harpiks, 4[(((2,4-dimetoksyfenyl)Fmoc-aminometyl)fenoksyacetamido)aminometyl]-4metylbenzhydrylamin-PS-harpiks (Rink-amid MBHA PS-harpiks) og 4-[(((2,4dimetoksyfenyl)Fmoc-aminometyr)fenoksyacetamido)aminometyl]benzhydrylaminPS-harpiks (Rink-amid BHA PS-harpiks). Underlaget er fortrinnsvis avledet frapolystyren tverrbundet med, mest foretrukket, 1-5% divinylbenzen ogfunksjonalisert ved hjelp av 4-(((2,4-dimetoksyfenyl)Fmocaminometyljfenoksyacetamidoj-linkeren.

Type 2-linkere er utformet for eventuelt å frigjøre karboksylgruppen under surebetingelser. Linkere av denne typen danner syrelabile estere med karboksylgruppen i aminosyrene, vanligvis syrelabile benzyl-, benzhydryl- og tritylestere; ogeksempler på slike Hnkerstrukturer inkluderer 3 -metoksy-4-hydroksymetylfenoksy(SasrinR-linker), 4-(2,4-dimetoksyfenylhydroksymetyl)fenoksy (Rink-linker), 4-(4hydroksymetyl-3-metoksyfenoksy)smørsyre (HMPB-linker), trityl og 2-klortrityl.Underlaget er fortrinnsvis avledet fra polystyren tverrbundet med, mest foretrukket 1-5% divinylbenzen og funksjonalisert ved hjelp av 2-klortrityllinkeren.

Når fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjennomføres som parallelle matrisesynteser, så kan disse med fordel utføres slik det er beskrevet i det etterfølgende, men det er helt innlysende for personer med faglig innsikt at disse fremgangsmåtene vil kunne modifiseres i tilfelle det er ønskelig bare å syntetisere en enkelt forbindelse ifølge oppfinnelsen.

En rekke reaksjonskar (normalt 24 til 192, typisk 96) som tilsvarer det antall forbindelser som skal syntetiseres ved parallellmetoden, påsettes fra 25 til 1000 mg, fortrinnsvis 100 mg, av det passende funksjonaliserte faste underlaget som fortrinnsvis er avledet fra polystyren som er tverrbundet med 1 til 3% divinylbenzen eller fra Tentagel® harpiks.

Det løsemiddel som brukes må være i stand til å svelle harpiksen og inkluderer, men er ikke begrenset til, diklomietan (DCM), dimetylformamid (DMF), Nmetylpyrrolidon (NMP), dioksan, toluen, tetrahydrofuran (THF), etanol (EtOH), trifluoretanol (TFE), isopropylalkohol og lignende. Løsemiddelblandinger som inneholder minst én komponent av et polart løsemiddel (for eksempel 20% TFE/DCM, 35% THF/NMP) er fordelaktige for å sikre høy reaktivitet og

solvatering av de harpiksbundne peptidkjedene (G. B. Fields, , C. G. Fields, , J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 4202-4207).

Med utviklingen av forskjellige linkere som frigjør den C-terminalekarboksylsyregruppen under milde sure betingelser og som ikke påvirker syrelabile grupper som beskytter funksjonelle grupper i sidekjedene, har vært en betydelig utvikling med hensyn til syntesen av beskyttede peptidfragmenter. Den 2-metoksy4-hydroksybenzylalkoholavledede linkeren (Sasrin®-linker, Mergler et al.,Tetrahedron Lett. 1988, 29 4005-4008) er spaltbar med fortynnet trifluoreddiksyre(0,5-1% TFA i DCM) og er stabil under de Fmoc-avbeskyttelsesbetingelser sombrukes under peptidsyntesen og Boc/tBu-baserte ytterligere beskyttende grupper erforenlige med dette beskyttelsesregimet. Andre linkere som er egnet i fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen inkluderer den supersyrelabile 4-(2,4-dimetoksyfenylhydroksymetyl)fenoksylinker en (Rink-linker,H. Rink, Tetrahedron Lett. 1987, 28, 3787-3790) hvor fjerningen av peptidet krever10% eddiksyre i DCM eller 0,2% trifluoreddiksyre i DCM; den 4-(4hydroksymetyl-3-metoksyfenoksy)smørsyreavledede linkeren (HMPB-linker,Florsheimer & Riniker, Peptides 1991,1990 131) som også spaltes med 1%TFA/DCM for å få fremstilt et peptidfragment som inneholder alle de syrelabile sidekjedebeskyttende gruppene, og 2-klortritylkloridlinkeren (Barlos et al.,Tetrahedron Lett. 1989, 30, 3943-3946) som gjør det mulig å løsne peptidet ved åbruke en blanding av iseddik/trifluoretanol/DCM (1:2:7) i 30 minutter.

Egnede beskyttende grupper for aminosyrer og henholdsvis for deres rester, er for eksempel:

For aminogruppen (som er tilstede, for eksempel også i sidekjeden til lysin)

Cbz

benzyloksykarbonyl

Boc

tert-butyloksykarbonyl

Fmoc

9-fluorenylmetoksykarbonyl

Alloc

allyloksykarbonyl

Teoc

trimetylsilyletoksykarbonyl

Toe

Nps

trikloretoksykarbonyl

o-nitrofenylsulfonyl;

Trt

tridenymetyl eller trityl

- For karboksylgruppen (som er tilstede, for eksempel også i sidekjedene tilasparginsyre og glutaminsyre) ved omdannelse til estere med alkoholkomponentene

tBu

tert-butyl

Bn

benzyl

Me

metyl

Ph

fenyl

Pac

fenacyl

allyl

Tse

trimetylsilyletyl

Tce

trikloretyk

For guanidinogruppen (som er tilstede, for eksempel i sidekj eden til arginin)

Pmc

Ts

2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl

tosyl (det vil si p-toluensulfonyl)

Cbz

benzyloksykarbonyl

Pbf

p en tametyld ihy drobenzo furan-5-sulfonyl

- For hy dr oksy gruppen (som er tilstede, for eksempel i sidekjeden til treonin og

serin)

tBu

tert-butyl

Bn

benzyl

Trt

trityl

For merkaptogruppen (som er tilstede, for eksempel i sidekjeden til cystein)

Acm

acetamidometyl

tBu

tert-butyl

Bn

benzyl

tntyl

Trt

4-metoksytrityl.

Mtr

De (Fmoc)-beskyttede aminosyrederivatene ble fortrinnsvis brukt sombyggeblokkene for konstruksjonen av de templatfikserte Phårnålssløyfemimetikaene ifølge oppfinnelsen. For avbeskyttelsen, for eksempel avspaltingen av Fmoc-gruppen, kan man bruke 20% piperidin i DM eller 2%DBU/2% piperidin i DMF.

Mengden av reaktanten, det vil si av aminosyrederivatet, er vanligvis fra 1 til 20 ekvivalenter basert på milliekvivalentene pr gram (meq/g) av tilsetningen av det funksjonaliserte faste underlaget (typisk fra 0,1 til 2,85 meq/g for polystyren harpikser) som opprinnelig ble veid inn i reaksjonsrøret. Ytterligere ekvivalenter av reaktanter kan brukes, hvis dette er nødvendig, for å drive reaksjonen til et sluttpunkt innenfor et rimelig tidsrom. Reaksjonsrørene i kombinasjon med holdeblokken og manifolden, settes inn på nytt i reservoarblokken og apparatet settes sammen. Gasstrømmen gjennom manifolden startes for å gi et kontrollert miljø, for eksempel nitrogen, argon, luft og lignende. Gasstrømmen kan også oppvarmes eller avkjøles før den tilføres gjennom manifolden. Oppvarming og avkjøling av reaksjonsbrønnene oppnås ved å oppvarme reaksjonsblokken eller avkjøle den eksternt med isopropanol/tørris og lignende for å få til de forønskede syntesereaksjonene. Røring oppnås ved risting eller magnetisk røring (inne i reaksjonsrøret). De foretrukne arbeidsstasjonene (uten at man er begrenset til disse) er Labsource's Combi-kjemstasjon og MultiSyn Tech's-Syro-synteseapparat.

Amidbindingsdannelse krever aktivering av a-karboksylgruppen foracyleringstrinnet. Når denne aktiveringen utføres ved hjelp av vanlig brukte karbodiimider så som disykloheksylkarbidiimid (DCC, Sheehan & Hess, J. Am. Chem. Soc. 1955, 77, 1067-1068) eller diisopropylkarbodiimid (DIC, Sarantakis etal Biochem. Biophys. Res. Comm.un.1916, 73, 336-342), så vil det resulterendedisykloheksylurea og diisopropylurea være henholdsvis uløselig og løselig i de løsemidler som vanligvis brukes. I en variasjon av karbodiimidmetoden blir 1hydroksybenzotriazol (HOBt, Konig & Geiger, Chem. Ber 1970, 103, 788-798)inkludert som et additiv til koblingsblandingen. HOBt hindrer dehydrering, undertrykker rasemisering av de aktiverte aminosyrene og virker som en katalysator for å bedre de ellers noe sene koblingsreaksjonene. Visse fosfoniumreagenser er blitt brukt som direkte koblingsreagenser så som benzotriazol-l-yloksy-tris(dimetylamino)fosfoniumheksafluorfosfat (BOP, Castro et al., Tetrahedron Lett. 1975, 14, 1219-1222; Synthesis, 1976, 751-752) eller benzotriazol-1 -yloksy-trispyrrolidinofosfoniumheksaflurfosfat (Py-BOP, Coste et al., Tetrahedron Lett. 1990,31, 205-208) eller 2-(lH-benzotriazol-l-yl-) 1,1,3,3-tetrametyluroniumterafluorborat(TBTU) eller heksafluorfosfat (HBTU, Knorr et al., Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927-1930); Disse fosfoniumreagensene er også egnet for in situ dannelse av HOBtestere med de beskyttede aminosyrederivatene. I den senere tid er også (DPPA) eller O-(7-azabenzotriazol-1 -yl)-N,N,N',N'-tetrametyluroniumtetrafluorborat

(TATU) eller O-(7-azabenzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'-tetrametyluromumheksafluorfosfat (HATU)/7-aza-l-hydroksybenzotriazol (HOAt, Carpino et al.,Tetrahedron Lett. 1994, 35, 2279-2281) også blitt brukt som koblingsreagenser.

På grunn av det faktum at nesten-kvantitative koblingsreaksjoner er essensielle, erdet ønskelig å ha eksperimentbevis på at reaksjonene er fullstendige.

Ninhydrintesten (Kaiser et al., Anal. Biochemistry 1970, 34, 595) hvor en positiv kolorirnetrisk respons på en porsjon av det harpiksbundne peptidet indikerer et kvalitativt nærvær av det primære aminet, kan lett og raskt gjennomføres etter hvert koblingstrinn. Fmoc-kjemi gjør det dessuten mulig med en spektrofotometriskpåvisning av Fmoc-kromoforen når denne blir frigjort med basen (Meienhofer et al.,Int. J. Peptide Protein Res. 1979, 13, 35-42).

Det harpiksbundne mellomproduktet i hvert reaksjonsrør blir vasket fritt for overskudd av reagenser, av løsemidler og av biprodukter ved gjentatt eksponering for rene løsemidler ved hjelp av en av de to følgende metoder:

1) Reaksjonsbrønnene fylles med løsemiddel (fortrinnsvis 5 ml), hvoretter reaksjonsrørene i kombinasjon med holdeblokken og manifolden nedsenkes og røres i fra 5 til 300 minutter, fortrinnsvis 15 minutter, dreneres ved vanlig avrenning fulgt av et gasstrykk som påsettes gjennom innløpet på manifolden (mens utløpet lukkes) for å drive ut løsemiddelet;

2) manifolden fjernes fra holdeblokken, porsjoner av løsemiddel (fortrinnsvis 5 ml) tilsettes på toppen av reaksjonsrørene og avhelles på vanlig måte gjennom et filter og over i et mottakerkar så som et testrør eller en ampulle.

Begge de ovennevnte vaskeprosedyrene gjentas opptil 50 ganger (fortrinnsvis omtrent 10 ganger), mens kontrollen med hensyn til effekten av reagenser, løsemiddel og biproduktfjeming gjøres ved hjelp av metoder så som TLC, GC eller undersøkelse av vaskeløsningene.

Den ovenfor beskrevne fremgangsmåten for å reagere den harpiksbundne forbindelsen med reagenser i reaksjonsbrønnene følges av en fjerning av overskudd av reagenser, biprodukter og løsemidler, gjentas for hver vellykkede transformasjon inntil man har oppnådd det endelig harpiksbundne helbeskyttede lineære peptidet.

Før dette helbeskyttede lineære peptidet fjernes eller løsnes fra det faste underlaget, så er det mulig, hvis dette er ønskelig, selektivt å avbeskytte en eller flere av de beskyttede funksjonelle gruppene som er tilstede i molekylet og passende substituere de reaktive grupper som derved er blitt frigjort. For å oppnå dette, må de angjeldende funksjonelle grupper først beskyttes ved hjelp av en beskyttende gruppe som selektivt kan fjernes uten å påvirke de gjenværende beskyttende gruppene.

Alloc (allyloksykarbonyl) er et eksempel på en slik aminobeskyttende gruppe som

selektivt kan fjernes, for eksempel ved hjelp av Pd° og fenylsilan i CH2CI2 uten at dette påvirker de gjenværende beskyttende gruppene så som Fmoc, som måtte være tilstede i molekylet. Den reaktive således frigjorte gruppen kan så behandles med et middel som er egnet for å innføre den forønskede substitusjonen. For eksempel kan en aminogruppe acyleres ved hjelp av et acyleringsmiddel som tilsvarer den acylsubstituenten som skal innføres. Før dette helbeskyttede lineære peptidet løsnes eller fjernes fra det faste underlaget, så er det også mulig, hvis dette er ønskelig, å danne intertrådbindinger mellom sidekjedene til passende aminosyrerester i posisjonene 2 og 10.

Intertrådbindinger som tidligere nevnt kan være disulfidbroer dannet mellom cysteinrester i motstående posisjoner på p-tiåden; eller laktambroer dannet mellomglutaminsyrerester og lysinrester, som er plassert i motstående P-trådposisjoner.Dannelsen av slike intertrådbindinger kan utføres ved fremgangsmåter som i seg selv er kjente innenfor fagområdet.

For dannelsen av disulfidbroer, blir fortrinnsvis en løsning av 10 ekvivalenter av jod i DMF eller en blanding av CEhCh/MeOH anvendt i 1,5 timer og deretter i ytterligere 3 timer med en frisk jodløsning etter frafiltrering av den foregående jodløsningen, eller i en blanding av DMSO og en eddiksyreløsning bufret med 5% NaHCOa til pH 5-6 i 4 timer eller i vann justert til pH 8 medammoniumhydroksidløsning og røring i 24 timer eller ammoniumacetatbuffer justert til pH 8 i nærvær av luft eller i en løsning av NMP og tri-n-butylfosfin(fortrinnsvis 50 ekvivalenter).

Løsgjøringen av det helbeskyttede lineære peptidet fra det faste underlaget oppnås ved å senke reaksjonsrørene i kombinasjon med holdeblokken og manifolden i reaksjonsbrønner som inneholder en løsning av spaltningsreagensen (fortrinnsvis 3 til 5 ml). Gasstrøm, temperaturkontroll, røring og reaksjonskontroll gjennomføres som beskrevet ovenfor etter behov for å få gjennomført denne løsgjørende reaksjonen. Reaksjonsrørene i kombinasjon med holdeblokken og manifolden fjernes fra reservoarblokken og heves til omtrent løsningsnivået, men under den øvre toppen av reaksjonsbrønnene og gasstrykk påsettes gjennom manifoldinnløpet (rnens utløpet er lukket) for effektivt å drive den endelige produktløsningen over i reservoarbrønnene. Harpiksen som er tilbake i reaksjonsrørene blir så vasket 2 til 5 ganger som beskrevet ovenfor, med fra 3 til 5 ml av et passende løsemiddel for å ekstrahere (vaske ut) så mye som mulig av det tilfestede produktet.

Produktløsningene blir så forsiktig kombinert for å unngå tverrblanding. De individuelle løsningene/ekstraktene blir så manipulert etter behov for å isolere sluttforbindelsene. Typiske manipuleringer inkluderer, men er ikke begrenset til, fordampning, konsentrasjon, væske/væskeekstraksjon, surgjøring, basegjøring, nøytralisering og ytterligere reaksjoner i løsning.

Løsningene som inneholder de helbeskyttede lineære peptidderivatene som er blitt spaltet av fra det faste underlaget og nøytralisert med en base, blir så fordampet. Sykliseringen blir så utført i løsning ved å bruke løsemidler så som DCM, DMF, dioksan, THF og lignende. De forskjellige koblingsreagenser som er nevnt tidligere, kan brukes for sykliseringen. Varigheten på sykliseringsreaksjonen er 6-48 timer,fortrinnsvis omtrent 16 timer. Utviklingen på reaksjonen følges for eksempel ved hjelp av RP-HPLC (revers fase høytrykks væskekromatografi). Deretter bleløsemiddelet tjernet ved fordampning og det helbeskyttede sykliske peptidet ble løst i et løsemiddel som ikke er blandbart med vann så som DCM, hvoretter løsningen ekstraheres med vann eller en blanding av vannblandbare løsemidler for å fjerne et eventuelt overskudd av koblingsreagensen.

Endelig blir det helbeskyttede peptidderivatet behandlet med 95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% TIS eller en annen kombinasjon av forbindelser (scavengere) for å få gjennomført avspaltningen av de beskyttende gruppene. Spaltningsreaksjonstiden er vanligvis fra 30 minutter til 12 timer, fortrinnsvis omtrent 2,5 timer. Flyktige forbindelser fordampes til tørrhet og det urene peptidet blir løst i 20% AcOH i vann, som er ekstrahert med isopropyleter eller andre løsemidler som er egnet for dette. Det vandige laget blir oppsamlet og fordampet til tørrhet og det helavbeskyttede sykliske peptidderivatet med formel I blir således oppnådd som sluttproduktet.

Alternativt kan løsgjøringen fra det faste underlaget, sykliseringen og den fullstendige avbeskyttelse av det helbeskyttede peptidet gjøres manuelt i glasskar.

Avhengig av dets renhet, kan peptidderivatet brukes direkte i biologiske prøver eller kan ytterligere renses, for eksempel ved preparativ HPLC.

Det er mulig, hvis dette er ønskelig, å omdanne et helt avbeskyttet produkt med formel I i fri form fremstilt som beskrevet ovenfor, til et farmasøytisk akseptabelt salt eller omdanne et farmasøytisk akseptabelt eller uakseptabelt således fremstilt salt til den tilsvarende forbindelsen med formel I i fri form eller til et annet farmasøytisk akseptabelt salt. Enhver av disse operasjonene kan gjennomføres ved fremgangsmåter som i seg selv er velkjente.

Startmaterialene med formel II som vist i krav 40 og 41, prestartmaterialer for disse og fremstillingen av disse start- og prestartmaterialene er beskrevet i WO02/070547 Al.

De nevnte p-håmålspeptidomimetika ifølge oppfinnelse kan brukes for en rekkeformål hvor kreft, inflammatoriske sykdommer, lungesykdommer, infeksjoner, immunologiske sykdommer, hjerte/karsykdommer eller nevrodegenerative sykdommer er kontrollert av eller er et resultat av serinproteaseaktivitet. For kontroll eller forebygging av en gitt sykdom eller en sykdom som lar seg behandle med proteasehemmere, så kan de her angitte P-hårnålspeptidomimetikaene

administreres som sådan eller anvendes som en passende formulering sammen med bærere, fortynningsmidler eller eksipienter av velkjent type.

Når de brukes for å behandle eller forebygge sykdommer så som lungeemfysem, reumatoid artritt, osteoartritt, aterosklerose, psoriasis, cystisk fibrose, multippel sklerose, voksent akutt lungesviktsyndrom (adult respiratory distress syndrome), pankreatitt, astma, allergisk rhinitt, inflammatoriske dermatoser, postangioplastikkrestenose, hjertehypertrofi, hjertesvikt eller kreft slik som, men ikke begrenset til, brystkreft eller kreft som er relatert til angiogenese eller metastase, så kan de nevnte p-hårnålspeptidomimetika administreres enkeltvis ellersom en blanding av flere P-hårnålspeptidomimetika i kombinasjon med andreinflammatoriske midler eller antimikrobielle midler eller antikreftmidler og/eller i kombinasjon med andre farmasøytisk aktive midler, p-hårnålspeptidomimetikaenekan administreres som sådan eller i fonn av farmasøytiske sammensetninger.

Farmasøytiske sammensetninger som omfatter p-hårnålspeptidomimetikaene ifølgeoppfinnelsen kan fremstilles på vanlig måte ved blanding, oppløsning, granulering, fremstilling av belagte tabletter, fmmaling, emulgering, innkapsling, innfanging eller ffysetørkingsprosesser. Farmasøytiske sammensetninger kan formuleres på vanlig måte ved å bruke en eller flere fysiologisk aktive bærere, fortynningsmidler, eksipienter eller hjelpestoffer som letter bearbeidingen av de aktive phårnålspeptidomimetika til preparater som kan brukes farmasøytisk. Passende formulering er avhengig av den valgte administrasjonsmetoden.

For topisk administrering kan p-hårnålspeptidomirnetikaene ifølge oppfinnelsenformuleres som løsninger, geler, salver, kremer, suspensjoner, osv., slik det er velkjent innenfor den farmasøytiske industrien.

Systemiske formuleringer inkluderer de som er utformet for administrering ved injeksjon, for eksempel subkutan, intravenøs, intramuskulær, intratrakal eller intraperitoneal injeksjon så vel som de som er utformet for transdermal, slimhinne, oral eller lungeadministrering.

For injeksjoner så kan P-hårnålspeptidomimetikaene ifølge oppfinnelsen formuleresi passende løsninger, fortrinnsvis i fysiologisk forenlige buffere så som Hinks løsning, Ringers løsning eller en fysiologisk saltbuffer. Løsningene kan inneholde formuleringsmidler så som suspenderingsmidler, stabilisatorer og/eller dispergeringsmidler. Alternativt kan p-hårnålspeptidomimetikaene ifølgeoppfinnelsen være i pulverform for senere kombinasjon med en egnet væske, for eksempel sterilt pyrogenfritt vann.

For slimhinneadministrering kan inntrengningsmidler som er passende for den barriere som skal gjennomtrenges brukes i formuleringen på velkjent måte.

For oral administrering kan Ø-håmålspeptidomimetikaene ifølge oppfinnelsen lettformuleres ved at kombineres med farmasøytisk akseptable bærere på velkjent måte. Slike bærere gjør det mulig for P-hårnålspeptidomimetikaene ifølge denforeliggende oppfinnelsen å bli formulert som tabletter, piller, overtrukne piller, kapsler væsker, geler, siruper, slurryer, suspensjoner, osv., for oralt inntak av den pasienten som skal behandles. For orale formuleringer slik som pulvere, kapsler og tabletter, så inkluderer egnede eksipienter fyllstoffer så som sukkere, for eksempel laktose, sukrose, mannitol eller sorbitol; cellulosepreparater så som maisstivelse, hvetestivelse, risstivelse, potetstivelse, gelatin, gummi tragant, metylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose, natriumkarboksymetylcellulose og/eller polyvinylpyrrolidon (PVP); granuleringsmidler; og bindemidler. Hvis det er ønskelig, kan nedbrytningsmidler tilsettes så som tverrbundet polyvinylpyrrolidon, agar eller algininsyre eller salter av denne så som natriumalginat. Hvis det er ønskelig, kan faste doseformer sukkerbelegges eller enterisk belegges ved hjelp av standardteknikker.

For oralt flytende preparater så som suspensjoner, safter eller løsninger, så vil egnede bærerstoffer, eksipienter eller fortynningsmidler inkludere vann, glykoler, oljer, alkoholer, osv. I tillegg kan smaksstoffer, konserveringsmidler, fargestoffer og lignende tilsettes.

For bukal administrering kan sammensetningene være i form av tabletter, drops, osv., formulert på vanlig måte.

For administrering ved inhalering kan p-håmålspeptidomimetikaene ifølgeoppfinnelsen hensiktsmessig leveres i form av en aerosolspray fra beholdere under trykk eller ved hjelp av et forstøvningsapparat ved hjelp av et egnet drivmiddel, for eksempel diklordifluormetan, triklorfluormetan, karbondioksid eller enhver annen egnet gass. I forbindelse med en aerosol under trykk, så må doseenheten kunne bestemmes ved å tilveiebringe en ventil som leverer en utmålt mengde. Kapsler og patroner, for eksempel av gelatin for bruk i et inhaleringsapparat eller i en såkalt insufflator kan formuleres slik at de inneholder en pulverblanding av phårnålspeptidomimetikaene ifølge oppfinnelsen og en egnet pulverbase så som laktose eller stivelse.

Forbindelsene kan også formuleres i rektale eller vaginale sammensetninger, for eksempel i form av stikkpiller, sammen med passende stikkpillebaser så som kakaosmør eller andre glyserider.

I tillegg til de formuleringene som er beskrevet ovenfor, så kan også phårnålspeptidomimetikaene ifølge oppfinnelsen formuleres som depotpreparater. Slike lengevirkende formuleringer kan administreres ved implantering (for eksempel subkutant eller intramuskulært) eller ved intramuskulær injeksjon. For

fremstillingen av slike depotpreparater, kan P-håmålspeptidomimetikaene ifølgeoppfinnelsen formuleres med egnede polymere eller hydrofobe materialer (for eksempel som en emulsjon i en akseptabel olje) eller ioneutbyttingsharpikser eller ved hjelp av svakt løselige salter.

I tillegg kan andre farmasøytiske leveringssystemer brukes så som liposomer og emulsjoner av velkjent type. Visse organiske løsemidler så som dimetylsulfoksid kan også anvendes. Videre kan p-hårnålspeptidomimetikaene ifølge oppfinnelsenleveres ved hjelp av et system for vedvarende frigjøring, for eksempel ved hjelp av semipermeable matriser av faste polymerer som inneholder det terapeutiske middelet. Forskjellige materialer og stoffer for formuleringer med vedvarende frigjøring er vel etablerte og velkjente for personer med faglig innsikt. Kapsler med vedvarende frigjøring vil avhengig av sin kjemiske natur frigjøre forbindelsene i løpet av fra et par uker og opptil over 100 dager. Avhengig av kjemisk natur og biologisk stabilitet på det terapeutiske middelet, kan man anvende ytterligere strategier for proteinstabilisering.

Ettersom p-håmålspeptidomimetikaene ifølge oppfinnelsen inneholder ladde rester,kan de inkluderes i enhver av de ovenfor beskrevne formuleringer som sådan eller som farmasøytisk akseptable salter. Farmasøytisk akseptable salter har en tendens til å være mer løselige i vandige og andre protiske løsemidler enn de tilsvarende frie formene.

P-håmålspeptidomimetikaene ifølge oppfinnelsen eller sammensetninger av disse,vil generelt brukes i en mengde som effektivt vil oppnå det tiltenkte formål. Det er underforstått at den anvendte mengden vil være avhengig av den påtenkte anvendelsen.

For topisk administrering for å behandle eller å forebygge sykdommer som lar seg behandlet med p-hårnålspeptidomimetika, kan en terapeutisk effektiv dose foreksempel bestemmes ved hjelp av in vitro prøver av den type som er beskrevet i de etterfølgende eksemplene. Behandlingen kan utføres mens sykdommen er synlig, eller endog når den ikke er synlig. En person med faglig innsikt vil lett kunne bestemme terapeutisk effektive mengder for behandling av topiske sykdommer uten for omfattende eksperimentering.

For systemisk administrering vil en terapeutisk effektiv dose først bestemmes ut fra in vitro prøver. For eksempel kan det formuleres en dose i dyremodeller for å oppnå et sirkulerende konsentrasjonsområde for nevnte p-håmålspeptidomimetika sominkluderer ICso-verdien slik denne kan bestemmes i cellekulturer. Slik informasjonkan så brukes for mer nøyaktig å bestemme brukbare doser for mennesker.

Start dosene kan også bestemmes ut fra in vivo data, for eksempel ved hjelp av dyremodeller, ved å bruke teknikker som i seg selv er velkjente. Personer med

vanlig faglig innsikt vil lett kunne optimalisere administreringen til mennesker basert på dyredata.

Dosemengder for anvendelse som serinproteasehemmende midler kan justeres individuelt for å tilveiebringe plasmanivåer av P-håmålspeptidomimetikaene ifølgeoppfinnelsen som er tilstrekkelige til å opprettholde den terapeutiske effekten. Terapeutisk effektive serum nivåer kan oppnås ved å administrere multiple doser hver dag.

I forbindelse med lokal administrering eller selektivt opptak, så vil den effektive lokale konsentrasjonen av p-håmålspeptidomimetikaene ifølge oppfinnelsen ikkenødvendigvis være relatert til plasmakonsentrasjonen. Personer med faglig innsikt vil lett kunne optimalisere terapeutisk effektive lokale doser uten for omfattende eksperimentering.

Den mengden av P-hårnålspeptidomimetika som administreres vil selvsagt væreavhengig av pasienten som behandles, dennes vekt, graden av lidelsen og sykdommen, administrasjonsmåten og en vanlig bedømmelse av den behandlende legen.

Normalt vil en terapeutisk effektiv dose av de P-hårnålspeptidomimetika som erbeskrevet her gi en terapeutisk effekt uten å forårsake vesentlig toksisitet.

Toksisiteten til p-hårnålspeptidomimetikaene ifølge oppfinnelsen kan bestemmesved hjelp av standard farmasøytiske prosedyrer i cellekulturer eller eksperimentdyr, for eksempel ved å bestemme LDso-verdien (den dosen som er letal for 50% avpopulasjonen) eller LDioo-verdien (det vil si den dosen som er letal for 100% avpopulasjonen). Døseforholdet mellom toksisk og terapeutisk effekt er den såkalte terapeutiske indeksen. Det er foretrukket å anvende forbindelser som har høye terapeutiske indekser. Data som oppnås fra disse cellekulturprøvene og dyreundersøkelser kan brukes for å formulere et doseområde som ikke er toksisk når det anvendes for mennesker. Dosen av P-hårnålspeptidomimetika ifølgeoppfinnelsen ligger fortrinnsvis innenfor et område med hensyn til sirkulerende konsentrasjoner som inkluderer den effektive dosen med liten eller ingen toksisitet. Dosen vil kunne variere innenfor et slikt område avhengig av den doseformen som brukes og den anvendte administrasjonsmåten. Nøyaktig formulering, administrasjonsvei og dose vil kunne velges og fastsettes av den individuelle behandlende legen på bakgrunn av pasientens tilstand (se for eksempel Fingl et al. 1975,: The Pharmacological Basis of Therapeutics, kapittel I, side 1).

De følgende eksemplene illustrerer oppfinnelsen mer detaljert, men er ikke tenkt å begrense dens omfang på noen som helst måte.

Eksempler

De følgende forkortelser er brukt i disse eksemplene:

HBTU: l-benzotriazol-l-yl-tetrametylurouniumheksafluorfosfat (Knorr et al.

Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927-1930);

HOBt: 1-hydroksybenzotriazol;

DIE A: diisopropyletylamin;

HOAT: 7-aza-l -hydroksybenzotriazol;

HATU: O-(7-azabenzotriazol-1 -yl)-N,N,N',N'-tetrametyluronoium

heksafluorfosfat (Carpino et al. Tetrahedron Lett. 1994, 35, 2279-2281).

1. Peptidsyntese

Kobling av den første beskyttede aminosyre/est ert til harpiksen

0,5 g 2-klortritylkloridharpiks (Barlos et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 3943-3946)(0,83 mmol/g, 0,415 mmol) ble fylt i en tørr kolbe. Harpiksen ble suspendert i 2,5 ml CH2CI2 og hensatt for sslurry ved romtemperatur under konstant røring i 30 minutter. Den ble så behandlet med 0,415 mmol (1 ekvivalent) av den første egnede aminosyreresten (se nedenfor) og 284 pl (4 ekvivalenter) diisopropyletylamin (DIEA) i 2,5 ml CH2CI2 og blandingen ble ristet ved 25°C i 4 timer. Harpiksfargen forandret seg til purpur mens løsningen forble gul. Harpiksen ble ristet (ClfeCh/MeOH/DIEA: 17/2/1), 30 ml i 30 min; og så vasket i den følgende rekkefølgen med CH2CI2 (lx), DMF (lx), CH2CI2 (lx), MeOH (lx), CH2C12(lx), MeOH (lx), CH2CI2 (2x), Et2O (2x) og så tørket under vakuum i 6 timer.

Påsettingen var typisk 0,6-0,7 mmol/g.

De følgende på forhånd påsatte harpikser ble fremstilt: Fmoc-Pro-2klortritylharpiks, Fmoc-Asp (OtBu)-2-klortritylharpiks, Frnoc-Pro(5RPhe)-2klortritylharpiks, Fmoc-Leu-2-klortritylharpiks, Fmoc-Glu(OtBu)~2klortritylharpiks, Fmoc-Asp(OtBu)-2-klortritylharpiks, Fmoc-Phe-2klortritylharpiks, Fmoc-Gln(Trt)-2-klortritylharpiks, Fmoc-Ser (OtBu)-2klortritylharpiks, Fmoc-Val-2-klortritylharpiks, Fmoc-Thr(OtBu)-2-klortritylharpiksog Fmoc-Ile-2-klortritylharpiks.

Syntese av det helbeskyttede peptidfragmentet

Syntesen ble utført ved hjelp av et Syro-peptidsynteseapparat (Multisyntech) ved åbruke fra 24 til 96 reaksjonskar. Hvert kar ble tilsatt 60 mg (vekten av harpiksen før

påsetting) av den ovennevnte harpiksen. De følgende reaksjonssykluser ble programmert og utført:

Trinn Reagens

Tid

1 CH2CI2, vasking og sslurry (manuell)

3x1 min.

2 DMF, vasking og sslurry

1x5 min

3 40% piperidin/DMF

1x5 min.

4 DMF, vasking

5 x 2 min.

5 5 ekvivalenter Fmoc-aminosyre/DMF

+ 5 ekvivalenter HBTU

+ 5 ekvivalenter HOBt

4- 5 ekvivalenter DIEA

1 x 120 min.

6 DMF, vasking

4x2 min.

7 CH2CI2, vasking (ved slutten av syntesen)

3 x 2 min.

Trinnene 3 til 6 blir gjentatt for å tilføye hver aminosyre.

Etter at syntesen av det helbeskyttede peptidfragmentet var avsluttet, så ble deretter enten prosedyre A eller prosedyre B som beskrevet i det etterfølgende utført, avhengig av hvorvidt det ikke skulle dannes noen intertrådbindinger (for eksempel disulfid Ø-trådbindinger).

Prosedyre A: Syklisering og opparbeiding av kjedede sykliserte peptider

Spalting av det helbeskyttede peptidfragmentet

Etter at syntesen var ferdig, ble harpiksen suspendert i 1 ml (0,39 mmol) av 1% TFA i 1% TFA i CH2CI2 (volum/volum) i 3 minutter, filtrert, hvoretter filtratet ble nøytralisert med 1 ml (1,17 mmol, 3 ekvivalenter) av 20% DIEA i CH2CI2 (volum/volum). Denne fremgangsmåten blir gjentatt to ganger for å sikre at spaltingen var fullstendig. En porsjon på 200 pl av filtratet ble helt avbeskyttet med 0,5 ml av spaltningsblandingen som inneholdt 95% trifluoreddiksyre (TFA), 2,5% vann og 2,5% triisopropylsilan (TIS) og analysert ved revers fase LC-MS for åkontrollere effekten av den lineære peptidsyntesen.

Syklisering av det lineære peptidet

Det helbeskyttede lineære peptidet ble løst i DMF (8 ml, konsentrasjon 10 mg/ml). To ekvivalenter HATU (0,72 mmol) i 1 ml DMF og 4 ekvivalenter DIEA (1,44

mmol) i 1 ml DMF ble tilsatt og blandingen ble rørt ved romtemperatur i 16 timer. Flyktige forbindelser ble så fordampet. Det urene sykliserte peptidet ble løst i 7 ml CH2CI2 og ekstrahert med 10% acetonitril i 4,5 ml vann tre ganger. CFhCh-lagetble så fordampet til tørrhet.

Avheskyttelse og rensing av det sykliske peptidet

Det fremstilte sykliske peptidet ble løst i 3 ml av spaltningsblandingen som inneholdt 95% trifluoreddiksyre (TFA), 2,5% vann og 2,5% triisopropylsilan (TIS). Blandingen ble hensatt i 2,5 timer ved 20°C og så konsentrert i vakuum. Det urene peptidet ble løst i 20% AcOH i 7 ml vann og så ekstrahert tre ganger med 4 ml diisopropyleter. Det vandige laget ble utskilt og fordampet til tørrhet og harpiksen ble renset ved preparativ revers fase LC-MS.

Etter frysetørking ble produktene oppnådd som hvite pulvere og disse ble analysert ved LC-MS. De analytiske data som omfatter renhet etter preparativ HPLC og ESIMS er vist i tabell 1.

Analysemetode:

Analytisk HPLC-retensjonstid (RT i minutter) ble bestemt ved å bruke et JupiterProteo 90A, 150 x 2,0 mm, (kode 00F4396-B0 - Phenomenex) med følgendeløsemidler: A (H2O + 0,1% TFA) og B (CH3CN + 0,1% TFA) og gradienten: 0 min: 95%A, 5%B; 20 min: 40%A 60%B; 21-23 min: 0%A, 10()%B; 23,1-30 min: 95% A,5% B.

Prosedyre B: Syklisering og opparbeiding av de kjedede sykliserte peptidene med disulfid Ø-trådbindinger

Dannelse av disulfid p-trådbindinger

Etter at syntesen var ferdig, ble harpiksen svellet i 3 ml tørr DMF i 1 time. Deretter ble 10 ekvivalenter jodløsning i 6 ml DMF tilsatt reaktoren fulgt av røring i 1,5 timer. Harpiksen ble frafiltrert og en frisk løsning av jod (10 ekvivalenter) i 6 ml DMF ble tilsatt, hvoretter reaksjonsblandingen ble rørt i ytterligere 3 timer. Harpiksen ble frafiltrert og vasket 3 ganger med DMF og 3 ganger med CH2CI2.

Kjedesyklisering, spalting og rensing av peptidet

Etter dannelsen av disulfid P-trådbindingen ble harpiksen suspendert i 1 ml (0,39mmol) av 1% TFA i CH2CI2 (volum/volum) i 3 minutter og filtrert, hvoretter filtratet ble nøytralisert med 1 ml (1,17 mmol, 3 ekvivalenter) av 20% DIEA i CH2CI2 (volum/volum). Denne fremgangsmåten ble gjentatt to ganger for å sikre at spaltingen var fullstendig. Harpiksen ble vasket med 2 ml CH2CI2, hvoretter CføCh-laget ble fordampet til tørrhet.

Det helbeskyttede lineære peptidet ble løst i 8 ml tørr DMF. Deretter ble 2 ekvivalenter HATU i 1 ml tørr DMF og 4 ekvivalenter DIPEA i 1 ml tørr DMF tilsatt peptidet fulgt av røring i 16 timer. Flyktige forbindelser ble fjernet i vakuum. Det urene sykliserte peptidet ble løst i 7 ml CH2CI2 og så ekstrahert tre ganger med 4,5 ml av en 10% acetonitrilløsning i vann. CEkCh-laget ble fordampet til tørrhet.Det helavbeskyttede peptidet ble tilsatt 3 ml av en spaltningsblanding TFA:TIS:H2O (95:2,5:2,5) og blandingen ble hensatt i 2,5 timer. Flyktige forbindelser ble fordampet til tørrhet og det urene peptidet ble løst i 7 ml 20% AcOH i vann og ekstrahert tre ganger med 4 ml diisopropyleter. Det vandige laget ble oppsamlet og fordampet til tørrhet og resten ble renset ved preparativ revers fase LC-MS.

Etter frysetørking ble produktene oppnådd som hvite pulvere og analysert ved den ESI-MS-analytiske metoden som er beskrevet tidligere. De analytiske dataene somomfatter renhet etter preparativ HPLC og ESI-MS er vist i tabell 1.

Eksemplene 1-45, 52-63, 65-67, 70-71, 75-114, 129, 131-162 og 179-196 er vist itabell 1. Peptidene ble syntetisert ved å starte med aminosyren Pro som ble podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Pro-2-klortritypharpiks som var fremstilt sombeskrevet ovenfor. De lineære peptidene ble syntetisert på et fast underlag ifølge den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor i den følgende rekkefølgen: ResinPro-DPro-Pll-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-Pl. Eksemplene 1-6, 9-45, 52-63,65-67, 70-71, 75-103 112-114, 129, 131, 133, 136-138, 140-141, 143-146, 148-153,155, 157-162 og 179-196 ble spaltet fra harpiksen, underkastet disulfidbrodannelse,syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B. Eksemplene 82, 123, 149, 159, 161 og 178 ble avspaltet fra harpiksen som angitt i fremgangsmåte B.

Disulfidbroene ble dannet ved å bruke den følgende fremgangsmåten:

Råproduktet ble løst i en ammoniumacetatbuffer 0,1 M (pH justert til 8) (konsentrasjon: 1 mg urent produkt pr ml). Blandingen ble rørt ved romtemperatur i nærvær av luft. Reaksjonen ble kontrollert ved revers fase LC-MS. Etter atreaksjonen var fullstendig ble løsningen fordampet til tørrhet og resten ble renset ved preparativ revers fase LC-MS.

Sykliseringen av hovedkjeden ble utført som angitt i prosedyre A. Avbeskyttelsen ble utført ved å bruke den følgende fremgangsmåten:

For fullstendig å avbeskytte peptidet, ble det tilsatt en spaltningsblanding av TFA:H2O:fenol:tioanisol:etanditiol (82,5:5:5:5:2,5), hvoretter blandingen ble holdt på romtemperatur i 5 timer. Peptidet ble utfelt ved å tilsette 10 ml kald dietyleter. Etter sentrifugering ble supernatantfasen tjernet. Bunnfallet ble vasket tre ganger med 5 ml dietyleter og renset ved preparativ revers fase LC-MS.

Etter frysetørking ble produktene oppnådd som hvite pulvere og ble analysert ved den ESI-MS-analytiske metoden som er beskrevet ovenfor.

Eksemplene 7, 8, 104-111, 132, 134, 135, 139, 142, 147, 154 og 156 ble avspaltetfra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre A.

HPLC-retensjonstidene (i minutter) ble bestemt ved å bruke den analysemetodensom er beskrevet ovenfor:

Eksempel 1 (15,37), eksempel 2 (11,54), eksempel 3 (7,82), eksempel 4 (8,62), eksempel 5 (16,51), eksempel 6 (13,67), eksempel 7 (3,61), eksempel 8 (4,11), eksempel 9 (5,82), eksempel 10 (7,98), eksempel 11 (8,38), eksempel 12 (6,80), eksempel 13 (7,41), eksempel 14 (6,20), eksempel 15 (8,68), eksempel 16 (9,82); eksempel 17 (5,59), eksempel 20 (7,32), eksempel 21 (8,66), eksempel 22 (8,68), eksempel 23 (12,66), eksempel 24 (8,67), eksempel 25 (7,53), eksempel 26 (9,02), eksempel 27 (8,06), eksempel 28 (9,62), eksempel 29 (8,78), eksempel 30 (10,49), eksempel 31 (5,50), eksempel 32 (7,45), eksempel 33 (8,39), eksempel 34 (10,16), eksempel 35 (9,04), eksempel 36 (10,98), eksempel 37 (7,56), eksempel 38 (9,29), eksempel 39 (8,32), eksempel 40 (10,11), eksempel 41 (7,23), eksempel 42 (8,83), eksempel 43 (7,92), eksempel 44 (9,87), eksempel 45 (8,26), eksempel 52 (6,20), eksempel 53 (8,68), eksempel (9,82), eksempel 55 (5,59), eksempel 56 (6,06), eksempel 57 (6,47), eksempel 58 (7,32), eksempel 59 (8,68), eksempel 60 (10,66), eksempel 61 (8,54), eksempel 62 (9,83), eksempel 63 (16,54), eksempel 65 (15,71), eksempel 66 (17,50), eksempel 67 (15,87), eksempel 70 (12,87), eksempel 71 (13,48), eksempel 75 (14,22), eksempel 76 (4,47), eksempel 77 (5,15), eksempel 78 (10,93), eksempel 79 (10,70), eksempel 80 (12,09), eksempel 81 (11,63), eksempel 82 (5,71), eksempel 83 (5,45), eksempel 84 (11,14), eksempel 85 (10,90), eksempel 86 (13,78), eksempel 87 (13,98), eksempel 88 (14,35), eksempel 89 (15,21), eksempel 90 (14,72), eksempel 91 (11,97), eksempel 92 (11,77), eksempel 93 (15,25), eksempel 94 (14,61), eksempel 95 (20,46), eksempel 96 (15,08), eksempel 97 (20,78), eksempel 98 (18,28), eksempel 99 (14,62), eksempel 100 (13,90), eksempel 101 (13,76), eksempel 102 (20,53), eksempel 103 (14,14), eksempel 104 (11,60), eksempel 105 (11,90), eksempel 106 (11,63), eksempel 107 (11,78), eksempel 108 (13,03), eksempel 109 (15,22), eksempel 110 (12,40), eksempel 111 (12,10), eksempel 112 (5,49), eksempel 113 (5,67), eksempel 114 (5,55), eksempel 129 (17,22), eksempel 131 (11,97), eksempel 132 (13,56), eksempel 133 (14,57), eksempel 134 (14,72), eksempel 135 (17,53), eksempel 136 (18,28), eksempel 137 (14,72), eksempel 138 (14,35), eksempel 139 (15,40), eksempel 140 (11,14), eksempel 141 (5,71), eksempel 142 (13,97), eksempel 143 (13,94), eksempel 144 (15,08), eksempel 145 (20,87), eksempel 146 (17,91), eksempel 147 (17,11), eksempel 148 (7,83), eksempel 149 (16,22), eksempel 150 (20,09), eksempel 151 (20,72), eksempel 152 (21,38), eksempel 153 (17,97), eksempel 154 (16,58), eksempel 155 (19,46), eksempel 156 (15,66), eksempel 157 (22,04), eksempel 158 (15,65), eksempel 159 (17,89), eksempel 160 (18,72), eksempel 161 (19,91), eksempel 162 (17,79),

eksempel 179 (4,25), eksempel 180 (11,43), eksempel 181 (12,30), eksempel 182 (12,83), eksempel 183 (10,51), eksempel 184 (12,12), eksempel 185 (10,14), eksempel 186 (10,09), eksempel 187 (10,14), eksempel 188 (10,65), eksempel 189 (10,73), eksempel 190 (10,10), eksempel 191 (10,17), eksempel 192 (10,19), eksempel 193 (11,02), eksempel 194 (9,92), eksempel 195 (10,74), eksempel 196 (9,94).

Eksempel 46 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Pro som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Pro-2-klortritylharpikssom ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Pro-DAsp(OtBu)-P1 l-P10-P9~P8-P7-P6-P5-P4-P3~P2-P1. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fra harpiksen,syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

HPLC-retensjonstid (minutter) ble bestemt ved å bruke den analysemetoden som erbeskrevet ovenfor:

Eksempel 46 (8,94).

Eksempel 47 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Asp som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Asp(OtBu)-2klortritypharpiks, som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Asp(OtBu)-DPro-Pl l~P10~P9-P8-P7P6-P5-P4-P3-P2-P1. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fraharpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 47 (7,29).

Eksempel 48 er vist i tabell I. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Pro(5RPhe) som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Pro(5RPhe)-2klortritypharpiks, som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Pro(5RPhe)-DPro-Pl 1-P10-P9-P8-P7P6-P5-P4-P3-P2-P1. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fraharpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 48 (10,07).

Eksempel 49 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Pro som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Pro-2-klortritypharpiks,som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Pro-DAla-P 11 -P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1.Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 49 (8,09).

Eksempel 50 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Pro som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Pro-2-klortritypharpiks,som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Pro-DIle-Pl 1-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1.Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 50 (9,78).

Eksempel 51 er vist i tabell /. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Leu som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Leu-2-klortritypharpiks,som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Leu-DPro-Pl 1 -Pl0-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1.Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 51 (8,94).

Eksempel 64 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Glu som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Glu(OtBut)-2klortritypharpiks, som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Glu(OtBu)-DPro-Pl 1-P10-P9-P8-P7P6-P5-P4-P3-P2-P1. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fraharpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 64 (13,17).

Eksempel 68 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Asp som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Asp(OtBu)-2klortritypharpiks, som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Asp(OtBu)-DAla-Pl 1-P10-P9-P8-P7P6-P5-P4-P3-P2-P1. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fraharpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 68 (12,44).

Eksempel 69 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Pro som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Pro-2-klortritypharpiks,som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Pro-DAsn(Trt)-Pl 1-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2Pl. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 69 (12,97).

Eksempel 72 er vist i tabell /. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Pro som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Pro-2-klortritypharpiks,som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Pro-DThr(OtBu)-Pl 1 -Pl 0-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3P2-P1. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fra harpiksen,syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 72 (13,34).

Eksempel 73 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Pro som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Pro-2-klortritypharpiks,som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den

følgende rekkefølgen: Harpiks-Pro~DIle-Pl l~P10-P9-P8-P7-P6~P5~P4-P3-P2-P 1.Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 73 (9,78).

Eksempel 74 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Leu som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Leu-2-klortritypharpiks,som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Leu-DPro-Pl 1-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1.Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 74 (8,94).

Eksempel 115 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Pro som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Pro-2-klortritypharpiks,som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Pro-DAsp(OtBu)-P11-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3P2-P1. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fra harpiksen,syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 115 (4,82).

Eksempel 116 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Pro som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Pro-2-klortritypharpiks,som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Pro-DPhe-Pl 1-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1.Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 116 (5,98).

Eksempel 117 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Pro som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Pro-2-klortritypharpiks,som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Pro-DArg(Trt)-Pl 1-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2Pl. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble av spaltet fra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 117 (4,48).

Eksempel 118 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Pro som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Pro-2-klortritypharpiks,som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert. på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Pro-DSer(OtBu)"Pl 1-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3P2-P1. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fra harpiksen,syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 118 (4,73).

Eksempel 119 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Pro som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Pro-2-klortritypharpiks,som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Pro-DVal-Pl 1-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1.Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 119 (5,47).

Eksempel 120 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Pro som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Pro-2-klortritypharpiks,som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Pro-DPic-Pl 1-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1.Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 120 (5,48).

Eksempel 121 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Asp som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Asp(OtBu)-2klortritypharpiks, som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Asp(OtBu)~DPro-Pl 1-P11-P10-P9-P8P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltetfra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 121 (4,56).

Eksemplene 122 og 167 er vist i tabell 1. Peptidene ble syntetisert ved å starte med aminosyren Phe som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Phe-2klortritypharpiks, som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. De lineære peptidene ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Phe-DPro-Pl l-P10-P9-P8P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltetfra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 122 (5,75); 167 (5,75).

Eksemplene 123, 164, 169, 170, 172, 173, 175, 177 og 178 er vist i tabell 1.

Peptidene ble syntetisert. ved å starte med aminosyren Gin som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Gln(Trt)-2-klortritypharpiks, som ble fremstiltsom beskrevet ovenfor. De lineære peptidene ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks~Gln(Trt)-DPro-Pll-P10~P9-P8-P7-P6-P5-P4~P3-P2-Pl. Deretter bledisulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 123 (4,35), 164 (13,20), 169 (16,81), 170 (14,57), 172 (16,78), 173 (13,57), 175 (15,94), 177 (16,78), 178 (17,45).

Eksempel 124 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Ser som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Ser(OtBu)-2

klortritypharpiks, som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Ser(OtBu)-DPro-Pl 1-P10-P9-P8-P7P6-P5-P4-P3-P2-P1. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fraharpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 124 (4,46).

Eksempel 125 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Val som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Val-2-klortritypharpiks,som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Val-DPro-Pl 1-P11-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2Pl. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 125 (18,42).

Eksempel 126 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Thr som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Thr(OtBu)-2klortritypharpiks, som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Thr(OtBu)-DThr(OtBu)-Pl 1-P10-P9P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet bleavspaltet fra harpi ksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 126 (4,35).

Eksemplene 127, 163, 165 og 174 er vist i tabell 1. Peptidene ble syntetisert ved å starte med aminosyren Glu som var podet på harpi ksen. Startharpiksen var FmocGlu(OtBu)-2-klortritypharpiks, som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. De lineærepeptidene ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Glu(OtBu)-°Lys(Boc)P11-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1. Deretter ble disulfidbroen dannet ogpeptidet ble avspaltet fra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 127 (4,11), 163 (14,93), 165 (14,40), 174 (12,73).

Eksempel 128 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Thr som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Thr(OtBu)-2klortritypharpiks, som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks~Thr(OtBu)-DPhe-Pl 1-P1 l~P10-P9-P8P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltetfra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 128 (5,26).

Eksempel 130 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Pro som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Pro-2-klortritypharpiks,som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Pro-DAla-Pl 1-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1.Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 130 (14,79).

Eksempel 166 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Ile som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Ile-2-klortritypharpiks,som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Ile-DPhe-P11-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1.Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

Eksempel 166 (16,80).

Eksempel 168 er vist i tabell 1. Peptidet ble syntetisert ved å starte med aminosyren Asp som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Asp(OtBu)-2klortritypharpiks, som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det lineære peptidet ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet

ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks~Asp(OtBu)-DPro~Pl l~P10~P9~P8-P7P6-P5-P4-P3-P2-P1. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidet ble avspaltet fraharpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

HPLC-retensjonstid (minutter) ble bestemt ved å bruke den analysemetoden som er5 beskrevet ovenfor:

Eksempel 168 (4,56).

Eksemplene 171 og 176 er vist i tabell 1. Peptidene ble syntetisert ved å starte med aminosyren Gin som var podet på harpiksen. Startharpiksen var Fmoc-Gln(Trt)-2klortritypharpiks, som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. De lineære peptidene 10 ble syntetisert på et fast underlag ved hjelp av den fremgangsmåten som er

beskrevet ovenfor, i den følgende rekkefølgen: Harpiks-Gln(Trt)-DGln(Trt)-Pll

P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1. Deretter ble disulfidbroen dannet og peptidetble avspaltet fra harpiksen, syklisert, avbeskyttet og renset som angitt i prosedyre B.

HPLC-retensjonstid (minutter) ble bestemt ved å bruke den analysemetoden som er15 beskrevet ovenfor:

Eksempel 171 (15,40), 176 (13,67).

Eksempel SEKV.ID. Pl P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Pli Templat Renhet%a) [M+H]

t'' ir> ri in

oo r-T r--'

OC Cs t~' '3

m cn c<"j m id

r-i ri" cl

O

id- v") id"

c-- 3c oc r- «ri ir> oo

<D t'' CO r-l TT O ri r-1

oo en ‘-o m r'- oo r-i

c**j ’’xt* *’>?*

'•O

'■O

in

</"; in ri c<"> ir>

'Od. Od <O> Cd o

in «n ro 'Zd >n in Od in in Od Cd Od Od. OdOdOOOdOd

•n cd <n «d t> vd

Ch O. Od Ch Ch o>

o o i" U-lSL- Cl»

O O t,,,.

ft-iQ ' Q

c o

&

~l '

o o

5-1f\. fi-'

a o

L" 5—1

&

-I '

o o

5-1f\. fi-'

ooooooooooo

L-i 5—: L-i «-* i" 5—i «— i— 5—1

fe CL fe ~q

" - O O

5-i 5-i

fe fe 2 Q

fe fe fe fe fe fe

2 2 2 2 2 2

Q O O Q O O

5—1 21 5—1 5—1 2» 5—1

P-? fe p-? fe

0 Q ' Q Q Q ' Q

o S-jo .

O S-jo .

Q

,

& d

"2

<C <C izi

0£) O0 2 2

< <

OjO

>>

E

GO

U5 !*•*> >**•» J u u

o

fe

a o 2» 5—i fe fe

a o 2» 5—i

Ål Ål

O O

S-. S-!

Pi Pi

opoopoopooooooopoopo

22222222222222222222

fe fe| fe fe fe. fe fe fe fe fe fe fe fe fe fe. fe| fe fe fe]

c~

d

ad

<

2 2 2 2 2

O O O O Q

CZD C/j CZ) GC GO

*—i 5—i 2 5— 5—i 5—i

O O Q O O Q

GO QQ CZ) æ GO CZi

2^

H

fe

cÆ dZ! cÆ

£>» r5***

u u u u

rz; rz> dj >

O O O

E

O S- Ofi OD S42 >. Si 5-. <tfe fe -fe

CZJ V* c/2

fei fed. fe o o o

fe rz CÆ u fe ?Q U

4=1

Pl

«j

Jo t> O <D t>

CL PS ■,:::: S PÅ

dO i''. 00 Od o

-I r-H r-r r-l (SJ

Cl)

fe

fe Q?

r-i

fe GC

§

Q

<Z)

ai Z

Z Z

Q Q — 1-2

z z

LLj fej GQ GT

z z

Q Q

2-1 1-2

z z

us LL

<Z) M

PS z

Q

!Z' K GO

ai ess ps ai cd

Z Z Z Z Z

Q Q O Q Q

«—~ >—* m—« h2

Z. Z !Z lZ Z

fe r-l fe fe fe

GO GO GC GQ GC

Q

z

Q

Z

r-rl

z

GO

O d

co 'stm cd b~ co a> o

x... v... ..... x... ,... ..... x...

CM

CO -St

10 CD N. CO

CT>

Cdi

Tabell 1 fortsetter, eksempler

Eksempel SEKV.ID. Pl P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Pli Templat Renhet%a) [M+H]

QC O

oo m

cT) en

oy o r* cn

QC xO

r

r-T

3x

cn

SEK.ID.NR. 40 Chg Cys Thr Lys Ser Asp Pro Pro Ile Cys Tyr DProLPro 95 1439,6

SEK.ID.NR. 41 Nle Cys Thr Lys Ser Asp Pro Pro Ile Cys Asn DProLPro 95 1364,7

en

oo

X

'xT

00^ n

oo

en

un un un un un un

Cx Cx Cx Cx CX Cx Cx

ir» m

OX Cx Cx Cx

'-ri on

O. O' O O, O' O O. Cx

©OOOOOOQOOOOOOOOOOO

<—I k-1 <"i k-1 «-* i" k-< «-* i" U-l «-* i" <"i U-l

CL CL o o fX-. p-.-iQ Q

CL CL

o o

L-i L4

Cl. CL

° P

CL CL

-i Q '

Cl. CL CL

QQOQQOQOOO !L* Li Ld !L* Ld Ld >Ld L* Ld Ld

n. p-? ft-j n. p-? fx,. n.-i r1--; ft-i P-j

cq'qqq'qqcqq

£

<Zi

p

<

Ld o

>x >>

CZ;

>>

O O O Q

M—« h—I I—d m—«

o o o

Ld L-l S-d

£. e. s.

o

L

1-^

o

L

1-^

o o Us Ld CL &

O

L

>L

O Q

L-i Ld

CL CL

O Q

Ld Ld

CL CL

cz>

<C

H ,o

F

J3 o

<

Ld Ld Ld Ld Ld Ld Ld Ld !Ld Ld Ld

<D O O Q O O O O O Q C

Gcæonczioooncz)æoncziQn

<U Q

CO co

■Z)

<D

Q

>vL

Ud

H

cz CZ2 rZ

?n.

o o o

& cz CÆ

«>•> >>■« £n £>•* o O O O

r/l

o

CJ o u

Q

Æ

D .

33 ‘OD OD OD , p _ r? . p , p o u o o r~- a© om en m m

o

O un CT}

o

CL

!"*d

I (N en

CSj O’ CN

CX

en

Pi

Z

Q

ai %

at at

Z

Q Q

^ud |~~t

L L

Ul CL

00 00

Pi

Z

Q

L

M

cz

Pi z

A

L

cz

Pi

z

Q

L

cz

Z

Q

L

K

cz

Z

Q

Z

Q

z

Q

L

r-rl

L

K

cz

~ t\ « -t

CX! <N CN CX!

ir> co r-- co øj o t- cxj

cxj cxj cx! cxi cxj co cn co

cOdtmcoN.ææovco oo co co co co oo xt

Tabell 1 fortsetter, eksempler

Eksempel SEKV.ID. Pl P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Pli Templat Renhet%a) [M+H]

r- 'X Æ if;

irT o' -4 —r r-l \D 'E'

o\ Qo r - (M in a ■^r

rn cn CO 'xF 'xF 'sF "O"

SEK.ID .NR, 61 Trp Cys Thr Lys Ser .Asp Pro Pro Ile Cys Ser DProLPro 95 1410,9 SEK.ID.NR. 62 1-Nal Cys Thr Lys Ser Asp Pro Pro Ile Cys Ser DProLPro 95 1421,9

CO

C!

rei

"F co m

Ch o> o->

i/o ir> o ■'d- vs uo wo

Ch O> S£> OS O, C-, O\

p c£ -j

o

o o

!-< !-<

Q-i fXj

Q Q

O

£ p- <

j ■

o

o o

l- S_|

fi..

o o

5-< !-<

p k 2

p„ p„

oooooooooo

$«’’/ 5~~i 5«’d $«’’/ 5~~i J<~! »>’’’< 5—1

P-,. ft-j p-? fi-. ft-.-j f\, ft-, p-.|

p q'q q q'q q q q q

O <0 o

5—1

CU £L|

o s

&

3 Q

o £ < 5 Q

M 5—< 5— 5—i

Q O O O

< a) æ go

o

I~S=I

O Q

?—< 5—i

CU £L(

Q 5fi-, fi-_;

O Q 5—i 5—i fi-. fi-.-i

F

c~

’Z1

<c

5—; 5—1 Uh

O O Q

CZ) G0 C/j

5-i U- Uh 5-i

O O Q O O

CZ) G0 c/j CZ) G0

Un*—15—15—i*—15—15—;U-<U-5—il—<

<D O O Q O O O O O Q O

æGOGOGCiGOGOGDæc/jGCiGC

Uh

H

is

H

c/2 CZ} y*

>■>

o o o

«j

CP

■— '..> o

O _c| r i C_ 2

O O Q

S z z

r-i m ■’xT

p p P -gt~' oo cs o uo co «r> so

1/0 SQ I> QO O> O T-i CS] CO

of tF ■'d* ■'T xF <co '/0 </0 '-/O

ps ai

z z z

Q Q Q

M—« h—I 1

Z lZ z

K M M CO M iZl

PS z

Q

ai %

ps Z Q

Z M æ

Pi

z

Q

<Z)

Pi z

S

<Z)

Z

Q

h—I

z

csfcO'srmcor>~roa>Os--cs!cO'^-ir)co

■oF OF OF -oF oF OF xF ot m LO m m i.D m UO

F*. CO

m co

05 O o- CM

LO CO «P CD

o

<rj

'e

Tabell 1 fortsetter, eksempler

Eksempel SEKV.ID. Pl P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Pli Templat Renhet%a) [M+H]

QC '-O

C»’) O. C7 ooortf; V 'Ti’ O,

Ck «-j r-n oc kD

r- o Gk xt Ok r- *-Tj

(N*j ■'xj' /"'f'} C**J "^sj*

SEK.ID.NR. 82 Nle Cys Thr Ala Ser Cha Pro Pro Gin Cys Tyr DProLPro 95 1409,5

SEK.ID.NR. 83 Nle Cys Thr Ala Ser hLeu Pro Pro Gin Cys Tyr DProLPro 95 1383,6

o >r> o tN

P o o. o.

CL)

^T) o.

in ‘o

o o>

Vi

O.

■q- in ‘r, ir> vs in m

O\ O. O. O> Ch Ch O\ c-,

p

o s-.

j2 O

£

c o o

5—1

O« ÉL| &

Q

o

L. S-i

Cl j j o o 5-< !-<

CL

P £ Q

CL

4>

O O O O O O Q 5~~i J<~! »>’’’< $~n 5—1

gk. p-? fy. er, ft-, p-.|

3 Q ' Q Q Q Q Q

«j

Q

P

IX

o

o k1-^

o

S-i .

CL &d

3^

O

o

O

P

CL

P

CL

O

P

CL

O

P

Cl

s~<

i

s~<

S—i

S

CL

O

o

CL CL CL

g M CC rZl

< < < ~

lS

r/S O

Uh 5—i v—<

>-> O Q O

J o: 'Z 7] <

CL

<Zi

z

<

Q

o

Uh 5—i

<D O O

Z K z

Un 5—i Un

<D O O Q

z z z z

*«•< 5—i < Uh 5— Uh 5—i

O O O O O Q O

GG CZ) GO æ O) GO

CS

H

-£h

cZi

-<? u

o

X

'XI CX CX <X :X ’X

'l? '•>‘i ?*%

rj Q U U U U U

U

OJQ

<

o o

43 43

X X

(N cTi ■^r

o

Z o. r

Q

z

X

OO Ok o ko •o r

o

QO

Z

pi pi

z z

Q Q

^-1 I—

iZ z

i.L LL

CO M

cc

Z

Q

ci

Z

A

co

Pi

z

Q

co

z

Q

M co

Z

M co

L^i

<n M- m o b». co

CD CD CO CD CD CO

æ O T- 'M CO '<t

«3 K- K- |s».

LOcDb~æa)Ov--cMr)K \ s &o æ æ co

xo

co mo

00 OX (N

ro or

103 SEK.ID.NR. 103 hPhe Cys Thr Ala Ser He Pro Pro Gin Cys Tyr DProLPro 95 1417,5

104 SEK.ID.NR. 104 Nle Glu Thr Ala Ser Ile Pro Pro Gin Lys Tyr DProLPro 95 1422,8

Tabell 1 fortsetter, eksempler

Eksempel SEKV.ID. Pl P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Pli Templat Renhet%a) [M+H]

r- o

kn C»’) O xf

o, qc m

cTi rn cTi tn

_ _ _ _ Q.,

r

00 oo C7

r' c< o?

oe in ox

rn cO) co co

xo tn

QC CC 'xt'

■30 '-Ticn c<*)

C<

cn

o

O ^"■| !_, Q fi„ j o !-<

C

Q-i Cl cl

3 Q Q

o

Ui .

j ' J

o o

!-< !-<

Q-i fXj

Q Q

O

o

o o i" U-l£Li 0-.

-q '

p

i- Us

&

O O 5-i .

P-. fi-, O

O Q ' Q £

C^

P

Cl Cl

5 Q

>>■«

Q „C

O O 0 O fe o o K

o

o S-i

o k

1-^

o k

1-^

o

S-i

Qj CL)

p £

o S-j

O

.

P-< 53

O 5_ 0^ CL,

O s-,Q-i Q-i

£

CL CL CL 0^ CL CL £L

Q

u u< c5

O O "" 00 00 <

?~i 5-l Um

O O Q

00 O) QO

Um 5

O O Q O O

00 00 co æ oo

S~n 5—1 »""l

<D O O Q

CO GO 00 00

o

^2

rzi

o o u

o

c/j 'Z 7; Æ ’Z rZ Æ Z

rO pO £>>

O O O O X^

-C|Jo

o

g

QC

Q

z

Q O O

Z Z Z

Q O O z S z !X C<3 's!' o o> o,

Q <U Q <U Z Z Z Z ir> ld r- QoO O> C-. J>

o

z

QC

00

z

r

oo

<X

Ox

oo

CL

CL.

o

oo

Z

Q

<Z)

CL

Z

Q

ai %

cL ai

Q Q

^«1

Uj ttj

00 00

CL

Z

Q

M co

Pi

Z

Q

<Z)

z

Q

M æ

O v- CMw co ■' t iTj sfi s æ ® o o o ææææææææx-v-T

'^-iricob-coæoT

ærococQooæææ

O, t'* '30

o" 'xT Ch?

<z^

'd"

r-*-;

"sf’

C7

oT QC O'?

C\! 92

'xt' en

00 r-" O*. 'xOr\ r.

t-h en 02 O

C'' X X o

m en en 'xT

124 SEK.ID.NR. 124 Nle Cys Thr Ala Ser Ile Pro Pro Gin Cys Tyr DProLSer 95 1359,5

125 SEK.ID.NR. 125 Nle Cys Thr Ala Ser Ile Pro Pro Gin Cys Tyr DProLVal 95 1371,8

QC

en

o

'd"

Tabell 1 fortsetter, eksempler

Eksempel SEKV.ID. Pl P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Pli Templat Renhet%a) [M+H]

tn Mn o 20 m in *r> wn *r> Mn

O, 02 O O, 02 QC 02 00 O 02 02 C\

vn «/n Mn ^2

02 02 02 02 02 02 02

"b

o o o o o

5"»«i

fv. ft.j n,. f2-.

k—] k—3 t—2 »—! >—l

fe

CX

CÆ

>>»

^Z!

>>■«

«J Z :Z)

«>•> >>■«

u u u

j3 Cj Q o

o

H H O O

U* Uh

fV. ft-j fi-j

p

c~

o

P

o

P

Cl

O

Q

P

Cl

o

p

CL

O

5-,

s

Lj

S-

5_

CL)

CL

O L<

o

L<

o

L<

H-l

Q

U-i Uh

OOO

æ cx) ai

U» U-i Uh

OOO

iZ CÆ (Z)

Uh o c/j

Un Uh Un Uh Uh Uh Uh

<D O O Q O Q Q

gæ c/j 00 cæ 00 on æ

c/j

<0

(Z)

Q

CS

s3

=3

Un

Uh

H

Uh

H

Uh

H

•x X CÆ -X :Z)

u u u u u

^2 LO c/2 CÆ 90 cz; UO

£>•»

O O u»/1 o o o o

jS

ø

3C

H

4>

js z z

ir> t~

o>

o

cx

<-<•> -sd- >z> '■©

O - <■ : rrcd rx ex cx

QO

o

OOO

Pi

Z

pi Pi z z Q Q

)™) 1—~)

iZ z fe fe 00 00

eZ

z

Q

Z

r-rX

z Q

Z

<Z)

Pi

Z

Q

Pi

z

S

<Z)

Z

Q

!Z K æ

Z

Q

h—I

!Z fe 00

Z

M co

h4

in©x®roor-N

O O O O O V- V~ T

co^mcø^-ææov-cxco

oo

'OC'

’xj"

rr-j f-r)

'Tf- !<) 92 92

r\ c*.

Oc^-^OOøs, F'- xT

m cn xf

(> 02

cf o" 02

irj ro

'd" xt cn

145 SEK.ID.NR, 145 OctG Cys Thr Ala Ser Ile Pro Pro Gin Cys Phe DProLPro 95 1409,4

146 SEK.ID.NR. 146 hPhe Cys Thr Ala Ser Ile Pro Pro Gin Cys Phe DProLPro 95 1401,5

QC

5/2 M*-) QC

02 sO cn r-'O O OO QC

O O 22

‘-r-j

Tabell 1 fortsetter, eksempler

Eksempel SEKV.ID. Pl P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Pli Templat Renhet%a) [M+H]

Ch

£ O< C' C'O C'O

iry oo io

02 -OC' 02 02

tn m ‘rj kn iry in *r>

O, 02 02 o, 02 øs, o>

O 5-kP-i

2 Q p o o o

P-. fi.,

uj O —i tO

o & ~ ~ ~

£ <

Q O

o u

,

O O Q

u u u

er. C-: P-i

o

o o

r . ’_I

Q-i P~

J >-J

o g g £ O« G-. A

O O Q

o

I~S=I

H S-ifi..

— a q

o o o o

U U OD O

r**» >'**> ,-O >£3

1""^ "" flj fij

L L F""i 1""^

U5 gei tz>

0^1 p>>

o u u

CZ)

0^1 p>>

o u u

U2

>>

vS

O O O 5

u u u

Cu, C-: P-.-i '

Q u O<

o

I~S=I

o u

l~s=l

o u &

o o

U Ui

Ø-i fi-i

o o

>-i S-iø-H ø-l

o

u

o

U> U; U« U< U Ul

O O O Q O Q Q

cz) co c/2 æ co æ æ

U Ui u

O Q O

w m ta

U Ui U U Ui

O Q O O O

W M W W «

GC

!Zi

Oj iZ)

<

=3

CCS

«3

<

ccS

C3

CCS

CC

CCS

<

u

H

u

H

U

H

cz cZJ rzj

>■> pO.

0 0x4

cZJ v* ^3

u o o o

<Z! CZ) CÆ u

£*> 40

O O U E—1

o o o ji xl ™ a. c~

O Q O

4 z z

<o t" oo

’ t 'C r—z a o — f i ^, - r

20 CO CC CO CC "xf* 'xj"

n c ■ <x

Pi z

Q

Pi z

Q

Pi Pi Z Z

Q Q E—I I—I iZ z ui tP <Z) M

Z z Q

Z M co

Pi

z

Q

<Z)

Z z

Q

Z

<Z)

Z

Q

h—I

!Z

GO

!Z K æ

CD X CO

CM CX3 CM

O> O v- CM COcm co « n m

-st to co x- co æoo co co co co co

O r- CM CO 's!

Sf

s© so m o. in r

r. e-. r.

v) 1; b- x o x

c

qc r- o

c< ef o £

xj- <n m

'xt'

Ch

'O -sf

O 's© o ir> 'st 'sj- 'T en

166 SEK.ID.NR. 166 Nle Cys Thr Ala Ser Ile Pro Pro Gin Cys Tyr DProLIle 95 1385,6

167 SEK.ID.NR. 167 Nle Cys Thr Ala Ser Ile Pro Pro Gin Cys Tyr DProLPhe 95 1419,9

o od" QC

r-'

O

'xt'

Tabell 1 fortsetter, eksempler

Eksempel SEKV.ID. Pl P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Pli Templat Renhet%a) [M+H]

tn o <n in cn o ir> «z> •^r

o, i; o o*. o. o o*. o. c\

tn

O, O-. o

m tn «r-j kn

O*. £ O, Ok Ch Ch O

s d 3

o p 6

'~O '~Q

0«^

3 0 0

P c£ s-J

Q

,

O O Q o o Q $~n J<~! S~n J<~! r~M

er. er, p-.|

-2

p

£

, "b o £2 Us Ut

.

C a ' £ '

O

l~s=l

o

I~S=I

O Q i" U-l0-1 0-1q a

Q jS

I-S-I

o

z zC ;. . ._ -.

’~—I r-Z-. p>> S*, r™) p>> H^*"»

OQQQøQohO

tZz uo

?*> u u

*7 *"* *7 k *"* , *"*

55oogo6oo o z

53 JS P-s G 0 Oo

VQ

Q Um 04

O Q O

U-i i-d04 04 04

o

o ø^

O k

o

S-i .

CL)

£

ø^ £0 ø-i

o o o S»4 «--!

0-) £X)

o

^4 U-l «4O Q O æ CZ! GC

i-« U-l «4 i" 5—1

O O O CD O

CO M GC cz; <Z)

«4 i" $"! t4

CD CD O Q

GO GO <Z) M

<—i i-« ^4 «—( ^4 U-l

CD O O CD CD Q Q

CZ) c/j QQ QQ 00 CZ) GQ

c5

<

C5

<

CS

cs

1-4

H

J-4

H

Z p Z P

£*> >4*^ £*> «4^»

0 0 s-/ Cxj o

U4

H

o

CD

o

oo o

,-4.

m so r- qcin «r', tn tn

Ok o m

DO M0 \O kO lsO kO kO

cd

z

Q

ai %

Pi

Z

ai %

Pi Pi

z z

Q Q

>™i i—~)

iZ z

Uj 0-1

00 00

Z z Q

Z Z æ

Pi z

Q

<Z)

z z

Q

Z

<Z)

z

Q

Z

r-rl

Z

Q

h—I

K æ

G0

Z

w

GC

r-oocz>o-r~c\ico-<f

-sj' co to i.o !n m

loosoooor-wnftio

1.0 if) LO W (£> G2 'X> O æ (O

s© <q oo <q

—< O f'- o? ol

m 'sO o ir>

!<) 'xj- CO xj"

Ch T-< T-<

QC

'd"

Cx'

187 SEK.ID.NR. 187 Ile Cys Thr Lys Ser Leu Pro Pro His Cys Arg DProLPro 95 1428,6

188 SEK.ID.NR. 188 Ile Cys Thr Lys Ser Leu Pro Pro Gin Cys Arg DProLPro 95 1419,8

o

'00

Tf*

O

Tabell 1 fortsetter, eksempler

Eksempel SEKV.ID. Pl P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Pli Templat Renhet%a) [M+H]

oo

'd"

tn in

O, Ox OX o. Ox OX os,

& 23 13 J3

< □ o o 6 c

»-J K~j 1-2 1 K~j 1-2

0 0 0 ^00

<—I k-1 k-l

0- cx, O & £««

Q C - ’ ~

o i

Q r te

a \ l !

o

I~S=I

c o

V Vv o &

Q Q

Q O i" U-l0-1 0-1q a

c o o

U-1 i-M

Su- £L| £L|

3 Q Q

i- Us0^ 0_i q a

U5 cZi tZ> U5 r- -

>**•» O*'! £*> >**•» O*'! £*>

o o u o o u o

o

æ

z

0^000

*—i »—I

fi-; Q fi-.

£

O Q O

gL-i p-.-i ft.j

o

O k

o k

Q O

U-l —

O O O CD O

<Z) CZ! iZl oa <Zj

Ste i—»

CD O Q

CZ) c/j 00

i-« U-1 «-*

O Q O

Z M Z

<—i t-M

CD CD O Q

&0 00 <Z) iZ)

aS

<

ccS

J2

<

ccS

C3

<

5-i

H

5-i

H

5-i

H

^2

C/2 CZJ V*

D*-* t>s

o o o

Æ Z Z Æ z

D*-* t>s «>•> >>■«u o o u o

Z U2 Z Z £*> £>»

U U U v

o

U

CD

O Q CD z z z

O

Q

JD

„c

QC CX O

CN

‘-Ti

r- r-

xc

r-

Cx r

xo

QC

en

oo

xn

oc

xD XQ f-.

z

Q

Z

<Z)

Z

Q

aC Z

z z z z

Q Q h—i I-—Iz z

Uj ØLj c/j æ

iZ

z

Q

<Z)

z

Q

!Z

M co

Z

Q

z

Q

Z

r-rl

Q

!Z

Z

M co

1^4

CO 03 O V"

<X> CO b~ b~

CN CO

|x. X- x»

O - (\ fiv u3 <£■ro co co æ co co co

is

o'

«N

Tabell 1 fortsetter, eksempler

Eksempel SEKV.ID. Pl P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Pli Templat Renhet%a) [M+H]

C'!

i*"; ir-> in (n in in ci ki

Q O Q fS-|

o o o o o

Ld Ld L*

fV. ft.j ft-.-j f\,

k-J h-j i-2 k-2

Us Ld

Cl &

o

I~S=I

o

I~S=I

01) uc OO OD OD OO -OD u-s

5—i L« S—i Ld L« «-*

UUUUCJUUU

5-1 01) !Z M iZ) Z W rZ

Æ >-> >-> £>t >-> £>■,

H <C j «J

p

IX

p

X

o

p

X

Ld

ft-l

X

G k

G

O Q o 5 p

►^1 >X ^X >""< M""«

Q

X

Cl

cf)

L« U-i Ld

Q Q G

Z M Z

L« U-i Ld L« S—i

O Q G O ©

<Z) CZ! (Z) !Zi <Zj

t/b. tjfi r-^i <X)

O*-* X >■» X £>>xxxxxxxx

s

c/2 CZ} r/i c/2

>■> X X

o o o x

■OD

©

J©

Ul

X

<

u

o r--s c’0 tT <n

oo o\ ©•••, o> ©x ©x ax cx

X

Z

Q

Pi z

Q

ai

s

co

>

iS

GO

M co

d

\O

c3

æov-cNco^tøco

æææoææææ

2. Biologiske metoder

2.1 Fremstilling av peptidprøver

Frysetørkede peptider ble veid på en mikrovekt (Mettler MT5) og oppløst i sterilt vann til en sluttkonsentrasjon på 1 mM hvis intet annet er angitt. Lagerløsningene ble holdt på +4°C og beskyttet mot lys.

2.2 Enzymatiske prøver

Enzym- og substratbetingelser er som angitt i tabell 2.

Kinetikkmålingene ble utført, i et totalt reaksjonsvolum på 100 pl i 96-brønnersflatbunnede plater (Greiner) på en Genios plateleser (Tecan). Enzymet ble blandet med peptidene (hemmere I i en buffer som inneholdt 100 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM CaCh, 0,025% Tween-20, 5% DMSO og 1 mM av substratet. Hastigheten påsubstrathydrolysen ble målt ved å følge absorpsjonsforandringen ved 400 nm over 30 minutter for å verifisere reaksjonskurvens linearitet. Middelhastigheten fra minutt 1 til og med minutt 10 ble brukt i alle beregningene. De første beregningene med hensyn til bakgrunnssubtraksjon, middelhastighet, parallellmiddelverdier og % hemming ble utført ved å bruke Magellanprogrammet (versjon 5) fra Tecan. IC50%beregningene ble utført ved å bruke Grafit (versjon 5.0.10) fra Erithacus Software ved å tilpasse hemmingsdata fra 6 forskjellige hemmerkonsentrasjoner til en 4parameters likning:

100%

I denne likningen er s helningsfaktoren, x er hemmerkonsentrasjonen og y er % hemming ved en gitt konsentrasjon av hemmeren.

Kin/Ki-bestemmelse

Km-verdien for serinproteasesubstratet ble bestemt ved hjelp av et LineweaverBruke-diagram (Grafit v5). Kj-verdiene for hemmere ble beregnet ved å brukeformelen K. ::= IC50%/(l+([substrat]/Km)).

Økende konsentrasjoner av substrat ble reagert med enzymet og hastigheten for den enkelte reaksjon (ABS/msek) ble avsatt vs substratkonsentrasjon. Det resiprokale diagrammet (Lineweaver-Bruke) ble også plotet for å Km og Vmax (innsatt) (se ref. 1nedenfor).

Tabell 2

Enzym/Ieverandør

Enzymkonsentrasjon i prøve

Substrat/leverandø

r

Substratkonsentrasjon i prøve (mM)

Elastase fra humane nøytro filer/S erva

0,6 mU/reaksjon

N-Met-Ala-Pro-Valp-nitroanilid/Sigma

Katepsin G, fra hum an e nøytrofi I er CAS nr. 107200-92-0Calbiochem

1 mU/reaksjon

N-succinyl-Ala-Pro

Phe-p-nitroanilid

Sigrna

Trypsin, jodineringskvalitet, fra human pankreas, CAS nr. 9002-07-7Calbiochem

1 mU/reaksjon

N-benzoyl-Arg-pnitroanilid

Sigma

0,32

Kymase, fra menneskehud Calbiochem

9 mU/reaksjon

N-succinyl-Ala-Pro

Phe-p-nitroanilid

Sigma

1,5

Trombin, fra humant plasma, høy aktivitet, CAS nr. 9002-04-4Calbiochem

100 mU/reaksjon

Benzoyl-Phe-Val

Arg-p-nitroanilid

Calbiochem

0,5

Kyrnotrypsin, fra human pankreas CAS nr 9004-07-3Calbiochem

1,6 pM/reaksjon

N - su c ciny 1 - A la-Pro

Phe-p-nitroanilid

Sigma

Koaguleringsfaktor

Xa, fra humant plasma,

CAS nr. 9002-05-5

Calbiochem

0,4 mU/reaksjon

Metoksykarbonyl

D-Nle-Gly-Arg-p

nitroanilid

Roche

Tryptase, fra menneskelunge Calbiochem

12,5 mU/reaksj on

N-benzoyl-Arg-pnitroanilid Sigma

1,28

Urokinase fra menneskeurin/S igma Aldrich

( AS nr. 9039-53-6

250 mU/reaksjon

Pyroglu-Gly-Arg-p

nitroanilid x HC1

Endotell

0,5

Kallikrein, fra humant plasma,

CAS Nr 9001-01-8

Calbiochem

0,34 pg/reaksjon

N-benzoyl-Pro-Phe

Arg-p-nitroanilid

Sigma

Plasmin fra humant, CAS nr. 9001-90-5

Sigma-Aldrich

2 mU/reaksjon

D - Val-Leu-Ly s-p nitroanilid Sigma

2.3. Cytotoksitetsprøve

Cytotoksiteten til peptidene i forhold til HELA-celler (Acc57) og COS-7-celler(CRL-1651) ble bestemt ved å bruke MTT-reduksjonsprøven [se ref. 2 og 3nedenfor]. Kort beskrevet er fremgangsmåten som følger: HELA-celler og COS-7celler ble utsådd i en konsentrasjon på henholdsvis 7,0 x 10J og 4,5 x 1()3 pr brønn og dyrket i 96-brønners mikrotiterplater i 24 timer ved 37°C ved 5% CO?.. På dettepunktet ble så tid null (Tz) bestemt ved MTT-reduksjon (se nedenfor).

Supematanten i de gjenværende brønnene ble kastet og nytt medium og peptidene i seriefortynninger på 12,5, 25 og 50 pM ble så pipettert inn i brønnene. Hver peptidkonsentrsjon ble undersøkt i tre paralleller. Innkuberingen av cellene ble fortsatt i 48 timer ved 37°C ved 5% CO?. Cellene ble så vasket en gang med fosfatbuffet saltløsning (PBS) og deretter med 100 pl MTT-reagens (0,5 mg/mlhenholdsvis i medium RPMI1640 og DMEM) ble så tilsatt brønnene. Disse ble innkubert ved 37°C i 2 timer, hvoretter mediet ble sugd opp og 100 pl isopropanol ble tilsatt hver brønn. Absorpsjonen ved 595 nm for det løseliggjorte produktet ble så målt (ODsospeptid). For hver konsentrasjon ble middelverdien beregnet ut fra tre paralleller. Prosent vekst ble beregnet som følger: (ODspspeptid-ODspsTz-ODspstombrønn)/(OD595Tz-OD595tom brønn) x 100% og dette ble avsatt for hverpeptidkonsentrasjon.

LC50-verdiene (letal konsentrasjon, definert som den konsentrasjonen som dreper50% av cellene) ble bestemt for hvert peptid ved å bruke trendlinjefunksjonen i EXCEL (Microsoft Office 2000) for konsentrasjonene (50, 25, 12,5 og 0 pM), den tilsvarende vekstprosenten og verdien -50, (::=TREND(C50:C0,%50:%0,-50)).

GI50 (veksthemming) -konsentrasjonene ble beregnet for hvert peptid ved å brukeen trendlinjefunksjon for konsentrasjonene (50, 25, 12,5 og 0 jig/ml), de tilsvarende prosentene og verdien 50 (==:TREND (C5o:Co,%5o:%o,5O).

2.4. Hemolyse

Peptidene ble testet for sin hemolyttiske aktivitet mot humane røde blodceller (hRBC). Friske hRBC ble vasket tre ganger med fosfatbufret saltløsning (PBS) ved sentrifugering i 10 minutter ved 2000 x g. Peptider ved en konsentrasjon på 100 pM ble innkubert med 20% v/v hRBC i I time ved 37°C. Den endelige erytrocyttkonsentrasjonen var tilnærmet 0,9 x 109 celler pr ml. En verdi på henholdsvis 0% og 100% celleoppløsning ble bestemt ved å innkubere nevnte hRBC i nærvær av PBS alene og henholdsvis 0,1% Triton-X i H2O. Prøvene blesentrifugert, supematanten ble 20 ganger fortynnet i PBS-buffer, hvoretter denoptiske tettheten (OD) på prøven ved 540 nm ble målt. 100% oppløsningsverdien (OD540H2O) ga en OD540 på tilnærmet 1,3-1,8. Prosent hemolyse ble beregnet somfølger: (OD54opeptid/OD54oH20) x 100%.

2.5. Plasmastabilitet

405 pl plasma/albuminløsning ble plassert i et polypropylen (PP) -rør og aktivertmed 45 pl av forbindelse fra en 100 mM løsning B, fremstilt fra 135 pl PBS og 15 ul av 1 mM peptid i PBS, pH 7,4. 150 pl porsjoner ble overført til individuelle brønner på en 10 kDa filterplate (Millipore MAPPB 1010 Biomax-membran). For "0minutter-kontrollene" ble 270 pl PBS plassert i et PP-rør og tilsatt 30 pl avlagerløsning B og deretter virvlet. 150 pl kon tro I løsning ble så plassert i en brønn på filterplate og tjente som "filtrert kontroll".

Ytterligere 150 ul av kontrolløsningen ble direkte plassert i en mottakerbrønn (reservert for filtrat) og tjente som "ikke-filtrert kontroll". Hele platen inklusivefordampningslokket ble innkubert i 60 minutter ved 37°C. Plasmaprøver (rotteplasma: Harlan Sera lab UK, humant plasma: Blutspendezentrum Zurich) ble sentrifugert i minst 2 timer ved 4300 rpm (3500 g) ved 15°C for å gi 100 pl filtrat. For "serum albumin"-prøver (nylig fremstilt humant albumin: Sigma A-4327,rottealbumin: Sigma A-6272, alle i en konsentrasjon på 40 mg/ml i PBS), vartilnærmet 1 times sentrifugering tilstrekkelig. Filtratene på mottaker PP-platen bleanalysert ved LC/MS som følger: Kolonne: Jupiter Cl 8 (Phenomenex), mobile faser: (A) 0,1% maursyre i vann (B) acetonitril, gradient: 5%-100% (B) i løpet av 2minutter, elektrosprayionisering, MRM-påvisning (trippel kvadrupol). Topparealeneble bestemt og triplikatverdiene ble utregnet til middelverdier. Bindingen ble uttrykt i prosent av (filtrert og ikke-filtrert på tidspunkt 0 minutter) kontroll 1 og 2 ved:100-(l00 x Téo/To). Middelverdien for disse verdiene ble så beregnet.

2.6. Farmakokinetisk undersøkelse (PK)

Farmakokinetisk undersøkelse etter enkel oral (mageslange) og intravenøs administrering i rotter

Farmakokinetisk undersøkelse etter en enkelt intravenøs (i.v.) og oral (p.o., mageslange) administrering ble utført for forbindelsen fra eksempel 75. 332 g (± 10 g) Wistar hannmus levert fra RCC Ltd. Laboratory animal Services, CH-4414Fullinsdorf, Sveits, ble brukt i undersøkelsen. Bærervæsken, fysiologisk saltløsning, ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 2,5 mg/ml av forbindelsen. Volumet var 2 ml/kg i.v. og 10 ml/kg p.o. og peptidet eksempel 75 ble injisert til en sluttintravenøs dose på 5 mg/kg og en oral dose på 50 mg/kg. Blodprøver (tilnærmet 0,24 ml) ble tatt ved å anvende det regime som er beskrevet nedenfor på forskjellige tidspunkter i hepariniserte rør ved automatisk blodprøvetaking ved å bruke Di Lab AccuSampleren. Hvis det oppstår et problem under den automatiserte blodprøvetakingen, ble blod oppsamlet ved retroorbital blødning under svak isofluranbedøvelse. Prøver ble tatt på de følgende tidspunkter: 0, 5 minutter (bare i.v.), 15, 30 minutter og 1,2, 4, 8, 16, 24 og 36 (bare p.o.) timer og tilsatt hepariniserte rør. Plasma ble fjernet fra de pelleterte cellene ved sentrifugering og så frosset ved -80°C før HPLC-MS-analyse.

Fremstilling av plasmakalibreringsprøver

"Rent" rotteplasma fra ubehandlede dyr ble brukt. Prøver av plasma på 0,1 ml hver ble aktivert med 50 ng propranolol (indre standard, IS), (prøvepreparering ved fastfaseekstraksjon på OASIS® HLB-patroner (Waters)) med kjente mengder aveksempel 75 for å få fremstilt 9 plasmakalibreringsprøver i området 5-2000 ng/ml.OASIS® HLB-patronene ble kondisjonert med 1 ml metanol og deretter 1 ml 1%NH3. Prøvene ble så fortynnet med 400 ul 1% NH3 i vann og så tilsatt platen. Denne ble vasket med 1 ml metanol/1 % NH3 i vann 5/95. Eluering ble utført ved å bruke 1 ml 0,1% TFA i metanol.

Platen som inneholdt eluatene ble ført inn i konsentratorsystemet og fordampet til tørrhet. Restene ble løst i 10 pl maurstyre, 0,1% acetonitril 95/5 (v/v) og analysert i HPLC/MS på en revers fase analytisk kolonne (Jupiter C18, 50 x 2,0 mm, 5 pm, Phenomenex) ved å bruke gradienteluering (mobile faser A: 0,1% maursyre i vann, B: Acetonitril; fra 5% B til 100% B i løpet av 2 minutter).

Fremstilling av plasmaprøver

Fra hver prøve ble det tatt 100 pl plasma for ekstraksjon. Hvis volumet var mindre enn 100 pl, så ble en passende mengde av det "rene" museplasmaet tilsatt for å holde matrisen identisk med den til kalibreringskurven. Prøvene ble så tilsatt IS og bearbeidet som beskrevet for kalibreringskurven.

Farmakokinetisk bedømmelse

PK-analyse ble utført på de samlede data (generelt n = 2 eller 3 ) ved å bruke dataPK-løsninger 2.0™ (Summit Research Service, Montrose, CO 81401 USA). Arealetunder kurven AUC ble beregnet ved hjelp av den lineære trapezoidale regelen

5 AUC(t-æ) ble estimert som Ct/b (b: konstant elimineringshastighet). AUC(t-æ) ersummen av AUC(o-t) og AUC(t.®). Elimineringshalvlivet ble beregnet ved lineærregresjon på minst tre datapunkter under elimineringsfasen. De tidsintervaller som ble valgt for halvlivbestemmelsene ble bedømt ved hjelp av korrelasjonskoeffisienten (r2) som bør være minst over 0,85 og mest optimalt over

10 0,96. I forbindelse med i.v.-administrering, ble de opprinnelige konsentrasjonen ved

tnuii bestemt ved ekstrapolering av kurt'en gjennom de første to tidspunktene.

Endelig ble biotilgjengeligheten etter i.p.-administrering beregnet ut fra detnormaliserte AUC(o-<x>)-forholdet etter i.p. versus i.v.administrering.

3.0. Resultater

15 Resultatene av de eksperimenter som er beskrevet under avsnittene 2.2-2.5 ovenfor,er angitt i den etterfølgende tabell 3.

Hemo -lysisved 100 gM %

o

nd

a

o

nd

rl d

nd

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

nd

Tryptas e ved 100 pM %

o

39.6

nd

IT)

nd

Urokina se ved 100 pM %

r-

0.9

5.4

pu

ri

pu

FXa ved 100 pM %

5.7

in

r-i

C>j o

nd

Trombi n ved 100 tiM

%

ri

«N

o

nd

o

nd

Kymase ved 100 pM %

o

pu

13.4

71.7 _!

Kymotrypsin ved 100

pM

%

7.8

2.9

o

1.8

cn

nd

5.6

Trypsin ved 100

pM

%

92.6

pu

74.2

Elastase

IC50 (nmol)

o o o o o

A

>100000

nd

1.5 ved

100 pM

%

0.8 ved

100 pM

%

& o O

Ei

'•O

QC

IS

Eks

■^T

GO

Hemo -lysisved 100 gM %

nd

pu

nd

pu

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

nd

Ch

nd

Tryptas e ved 100 pM %

nd

Urokina se ved 100 pM %

nd

Cl

nd

FXa ved 100 pM %

nd

sn

nd

Trombi n ved 100 tiM

%

nd

_i

nd

Kymase ved 100 pM %

nd

9.4

12.1

Cl

19.9

Kymotrypsin ved 100

pM

%

nd

73.6

GC

nd

Trypsin ved 100 pM %

88.1

89.9

6.5

o

Os

Elastase

IC50 (nmol)

4.1 ved

100 pM

%

0.3 ved

100 pM

%

19 ved

100 pM

%

37038

8.2 ved

100 pM

%

& o O

Ei

Eks

«-A

u.

Hemo -lysisved 100 gM %

o

a

ro

a

nd

o

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

nd

Tryptas e ved 100 pM %

84.2

nd

90.4

88.3

85.2

nd

3.8

Urokina se ved 100 pM %

nd

C1

nd

6.7

pu

in

FXa ved 100 pM %

nd

<N

nd

Trombi n ved 100 tiM

%

8.7

pu

o

«-A

nd

Kymase ved 100 pM %

42.3

ON

C-'<N

26.9

44.1

in

98.8

Kymotrypsin ved 100

pM

%

o

54.2

c>

2.6

o

Trypsin ved 100 pM %

95.0

0’06

94.0

97.0

95.6

84.

Elastase

IC50 (nmol)

o o o o o

A

>100000

16.4

o o o o o

A

& o O

Ei

56.0

r-'

Eks

t"

r-s

Hemo -lysisved 100 gM %

o

nd

pu

nd

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

o

"O

£

"O

£

"O

"Q

Tryptas e ved 100 pM %

«N

o

-o

'O

'T?

o

^0

x*

£

Urokina se ved 100 pM %

O.

iri

'"O a

cn

'T?

Ch

FXa ved 100 pM %

o

"C3 a

'O

'sC

"O

ec

GO

Trombi n ved 100 tiM

%

o

cn

"C3

£

"O

(N

o

Kymase ved 100 pM %

o

C1

o

(N

Kymotrypsin ved 100

pM

%

'sj

o

'75

CNI

CN

"O

(N ec

"O

o.

Trypsin ved 100 pM %

o o.

r-'

o<

ae

■75 52

Os

75 $2

oc Os

Os

Elastase

IC50 (nmol)

o o o o o

A

o o o o o

7?

3.2 at 100pM %

o o o o o

/\

"O

o o o o o

Ax

"O

£

a

c£

o. •71

o o o o o

& o O

>2 ej

QO

Cl o

o>

GO

én

C-l

OS.

rc

Eks

C»’)

<n

'O r-s

(NI

oo

C-l

OA.

Cl

fC

CC

Hemo -lysisved 100 gM %

nd

o

ro

o

ro

pu

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

nd

C'

nd

Tryptas e ved 100 pM %

nd

73.3

i

en

nd

Urokina se ved 100 pM %

nd

o

in

o

nd

FXa ved 100 pM %

nd

o

a

en

nd

Trombi n ved 100 tiM

%

nd

pu

nd

o

T_;

nd

Kymase ved 100 pM %

nd

pu

o

QC

nd

Kymotrypsin ved 100

pM

%

nd

t"

nd

Trypsin ved 100 pM %

nd

Nd

pu

nd

Elastase

IC50 (nmol)

nd

o o o o o

A

o o o o o

Ax

CN

■nT

Ax

nd

& o O

Ei

ri

Eks

en

Hemo -lysisved 100 gM %

o

nd

ro

nd

o

nd

pu

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

nd

pu

nd

Tryptas e ved 100 pM %

o

nd

a

nd

44.1

o

nd

in o en

nd

Urokina se ved 100 pM %

r-

nd

'd"

nd

5.8

6.3

pu

6.2

nd

FXa ved 100 pM %

nd

o*

nd

cp cd

9.3

nd

Trombi n ved 100 tiM

%

nd

pu

O-.

nd

6.9

o

nd

ON

nd

Kymase ved 100 pM %

nd

10.2

8.2

pu

o

nd

Kymotrypsin ved 100

pM

%

nd

o

nd

Trypsin ved 100 pM %

nd

Elastase

IC50 (nmol)

nd

00001<

nd

>100000

o o o o

A

o o o o o

A

o

o o

Ax

o

o o

>100000

& o O

Ei

'O

'sj

l£

87.5

5^

Eks

Hemo -lysisved 100 gM %

o

a

nd

ro

o

a

pu

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

nd

o

,—i

nd

Tryptas e ved 100 pM %

84.2

nd

90.4

88.3

s

nd

3.8

ei

nd

Urokina se ved 100 pM %

nd

c3

nd

L'9

Ch

nd

FXa ved 100 pM %

nd

Trombi n ved 100 tiM

%

8.7

pu

nd

o

■'_1

nd

Kymase ved 100 pM %

42.3

ON

t'' r 1

'•r.

en

26.9

44.1

98.8

nd

Kymotrypsin ved 100

pM

%

o

■st

nd

Trypsin ved 100 pM %

'•O

QC

nd

Elastase

IC50 (nmol)

o o o o o

A

>100000

o o o o o

A

o o o o o

A

o o o o o

Ax

o

o o

nd

& o O

Ei

47.5

Eks

en

Hemo -lysisved 100 gM %

nd

a

nd

pu

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

nd

pu

nd

Tryptas e ved 100 pM %

nd

o

nd

en

CN

nd

Urokina se ved 100 pM %

nd

o

nd

pu

4.6

nd

FXa ved 100 pM %

nd

o

nd

'•O ae

nd

Trombi n ved 100 tiM

%

nd

_,

en ci

nd

5.4

nd

Kymase ved 100 pM %

nd

r

o

nd

pu

o

nd

Kymotrypsin ved 100

pM

%

nd

o

nd

4.3

nd

Trypsin ved 100 pM %

nd

pu

84.2

nd

Elastase

IC50 (nmol)

nd

>100000

nd

o o o o o

A

pu

nd

& o O

Ei

GO

a r

Eks

en

'sO

Hemo

-lysisved 100 gM

%

nd

Nd

nd

Cytotoksitet LCso/ CjIso Hela-cells

nd

eN

Tryptas e ved 100 pM %

nd

-o

nd

Urokina se ved 100 pM %

nd

in

nd

pu

FXa ved 100 pM %

nd

Trombi n ved 100 tiM %

nd

pu

nd

Kymase ved 100 pM %

nd

o

nd

pu

Kymotrypsin ved 100 pM %

nd

o

o o o a o

7.8 at 100 pM %

nd

<4000

nd

>20000

Trypsin ved 100 pM %

nd

92.6

-oc

nd

pu

Elastase

IC50

(nmol)

nd

>100000

% wtf 001

1'69

en

& o O

Ei

r

QC

-o

nd

Eks

C! f"

en

9£

r-

Hemo

-lysisved 100 gM

%

nd

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

nd

Tryptas e ved 100 pM %

nd

44.5

nd

4.2

nd

Urokina se ved 100 pM %

nd

10.4

nd

FXa ved 100 pM %

8.7

15.3

nd

13.3

24.8

nd

Trombi n ved 100 tiM %

13.1

nd

20.6

o

pu

Kymase ved 100 pM %

nd

o

nd

o

nd _!

Kymotrypsin ved 100 pM %

o o o o o

72.9

o o o o o

17103

>20000

>100000

106977

Trypsin ved 100 pM %

o o o o o

nd

10.8

o

nd

Elastase

IC50

(nmol)

& o O

Ei

61.3 at

100 pM

%

nd

20195

nd

47 at

100 pM

%

nd

Eks

t'oe

Herno -lysisved 100 fiM %

nd

pu

nd

Cytotoksitet

LCso/ GIso Hela-cells

,—i

£6

nd

Tryptas e ved 100 iiM %

O

nd

-o

5.6

nd

o

Urokina se ved

100 pM

%

nd

cq o

6.2

FXa ved 100 pM %

ec

nd

5.5

19.4

nd

c*-)

o

Trombi n ved 100 pM %

o

nd

cn

pu

nd

o

3.6

Kymase ved 100

pM

%

o

nd

r

nd

o

Kymotrypsin ved 100 jLlM %

o o

"xt

nd

33074

48108

nd

33729

15433

Trypsin ved 100

jiM

%

17'9

nd

5.2

o

"O

c

nd

8.9

IT)

Elastase

IC50

(nmol)

ir*"'

z-*-.

9 ° 2

o a o o o

A

nd

66975

45 at 100 pM %

-o

nd

38677

21175

Eks

Os

Gl

Hemo

-lysisved 100 gM

%

nd

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

QO r-'

nd

r-

pu

nd

Tryptas e ved 100 pM %

o

nd

o

0.6

o

nd

Urokina se ved 100 pM %

11.9

o

'd"

nd

in o

9.6

o

pu

FXa ved 100 pM %

4.8

o

nd

o

cn

6.2

nd

Trombi n ved 100 tiM %

11.6

Cl

K}

o

nd

1.7

<N O

nd

Kymase ved 100 pM %

o

nd

o

O

o

pu

Kymotrypsin ved 100 pM %

77431

38820

8558

nd

4975

4309

3.1 at 100 pM %

nd

Trypsin ved 100 pM %

9.5

o

O

nd

o

6.4

o

pu

Elastase

IC50 (nmol)

Cl

’-r»

Katepsin

G IC50

(nmol)

o o o o o

A

o o o a o

96198

nd

>100000

53.5 at

100 pM

%

nd

Eks

t"

Hemo -lysisved 100 gM %

nd

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

nd

Tryptas e ved 100 pM %

nd

Urokina se ved 100 pM %

nd

pu

FXa ved 100 pM %

nd

Trombi n ved 100 tiM

%

nd

pu

o

pu

nd

Kymase ved 100 pM %

nd

o

nd

pu

Kymotrypsin ved 100

pM

%

nd

13.8

nd

Trypsin ved 100 pM %

nd

o

nd

pu

Elastase IC50 (nmol)

8£

Katepsin

G IC50 (nmol)

nd

54.1 at

100 pM

%

nd

Eks

00 o

o

Hemo -lysisved 100 gM %

nd

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

nd

Tryptas e ved 100 pM %

nd

4.6

Urokina se ved 100 pM %

nd

pu

in

FXa ved 100 pM %

nd

'•O

in

Trombi n ved 100 tiM %

nd

pu

nd

o

Kymase ved 100 pM %

nd

pu

1.2

Kymotrypsin ved 100 pM %

27751

39710

nd

27526, IC50 (nmol)

Trypsin ved 100

pM

%

nd

o

nd

pu

12.8

Elastase

IC50 (nmol)

Katepsin

G IC50 (nmol)

nd

11155

Eks

r

«N

Herno -lysisved 100 fiM %

nd

pu

Cytotoksitet

LCso/ GIso Hela-cells

6g

nd

o

•xl

Tryptas e ved 100 iiM %

o

-o

nd

Urokina se ved 100 pM %

r ii

nd

FXa ved 100 pM %

9'61

o

nd

Trombi n ved 100 pM %

o

ci

nd

Kymase ved 100

pM

%

o

nd

4.8 _!

Kymotrypsin ved 100 jLlM %

58000, IC50 (nmol)

in O

ch o 2

o> ir> g

3 O

nd

>20000, IC50 (nmol)

Trypsin ved 100

jiM

%

r-’

nd

28.3

Elastase IC50 (nmol)

'd"

z-*-.

9 ° 2

35134

35203

nd

18269

Eks

Cl n

cQ

Herno -lysisved 100 fiM %

nd

pu

nd

Cytotoksitet

LCso/ GIso Hela-cells

pu

nd

Tryptas e ved 100 iiM %

nd

Urokina se ved 100 pM %

nd

pu

FXa ved 100 pM %

nd

13.3

nd

Trombi n ved 100 pM %

nd

pu

nd

Kymase ved 100

pM

%

nd

6’1

nd

o o o "xt V

46108

nd

pu

Kymotrypsin ved 100 jLlM %

nd

2 Lb

nd

Trypsin ved 100

jiM

%

nd

o

nd

pu

Elastase IC50 (nmol)

Cl

C'4

kø

C'4

z-*-.

9 ° 2

nd

% wtf 001 w w

nd

Eks

Hemo -lysisved 100 gM %

nd

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

nd

Tryptas e ved 100 pM %

nd

o

nd

4.2

44.5

nd

Urokina se ved 100 pM %

nd

o

in

14.4

nd

d

pu

FXa ved 100 pM %

nd

o

5.5

12.6

nd

13.3

CC

IT)

nd

Trombi n ved 100 tiM

%

nd

Cl

K}

o

17.1

nd

d

o

nd

Kymase ved 100 pM %

nd

o

4.6

nd

o

pu

Kymotrypsin ved 100

pM

%

nd

67.9

VLL

nd

79.6

72.9

nd

Trypsin ved 100 pM %

nd

o

12.2

nd

O

o

pu

Elastase IC50 (nmol)

Cl

0©

Katepsin

G IC50 (nmol)

nd

o o o a o

66975

43856

nd

20195

63.4 at

100 pM

%

nd

Eks

4£1

Herno -lysisved 100 fiM %

nd

pu

Cytotoksitet

LCso/ GIso Hela-cells

pu

nd

pu

nd

Tryptas e ved 100 iiM %

■>0

o

nd

Urokina se ved 100 pM %

QC

r'i.

nd

o

nd

FXa ved 100 pM %

a

o

nd

_1

nd

QO

nd

Trombi n ved 100 pM %

ei

3.6

nd

Kymase ved 100

pM

%

o

nd

o

nd

Kymotrypsin ved 100 jLlM %

o

9'08

nd

Trypsin ved 100

jiM

%

Cl

t""

nd

Elastase IC50 (nmol)

K}

Cl

z-*-.

9 ° 2

28 at 100 pM %

21175

nd

% IA[ri 001 W l

nd

% 001 zs

nd

Eks

EF l

Hemo -lysisved 100 gM %

nd

pu

nd

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

nd

Tryptas e ved 100 pM %

nd

o.

nd

Urokina se ved 100 pM %

nd

r-

nd

FXa ved 100 pM %

nd

o

nd

Trombi n ved 100 tiM

%

nd

pu

_,

K^

nd

Kymase ved 100 pM %

nd

o

nd

Kymotrypsin ved 100

pM

%

nd

kn

nd

Trypsin ved 100 pM %

nd

GC

o

nd

Elastase IC50 (nmol)

O"

in

cn

oe

8.2

kn

Katepsin

G IC50 (nmol)

nd

56 at 100 pM %

27 at 100 pM %

52 at 100 pM %

46 at 100 pM %

nd

Eks

kn

in

Hemo -lysisved 100 gM %

nd

pu

nd

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

nd

pu

nd

Tryptas e ved 100 pM %

cn

nd

Urokina se ved 100 pM %

nd

FXa ved 100 pM %

w—j

nd

Trombi n ved 100 tiM

%

CN

nd

(N

nd

Kymase ved 100 pM %

o

nd

C'!

nd

Kymotrypsin ved 100

pM

%

nd

Trypsin ved 100 pM %

nd

cn

nd

Elastase IC50 (nmol)

7.1

'sC

12.5

r-s

Katepsin

G IC50 (nmol)

55 at 100 pM %

nd

55 at 100 pM %

nd

Eks

Hemo

-lysisved 100 gM

%

nd

Cytotoksitet LCso/ CjIso Hela-cells

nd

pu

nd

Tryptas e ved 100 pM %

«N

o

4.6

nd

Urokina se ved 100 pM %

III

r

KOI

nd

pu

nd

FXa ved 100 pM %

19.6

5.6

rq

nd

ec

nd

Trombi n ved 100 tiM %

o

o Cl

nd

_i

nd

Kymase ved 100 pM %

6.4

c3

o

nd

pu

o

nd

Kymotrypsin ved 100

pM

%

O 'O

72.9

9’64

nd

Trypsin ved 100 pM %

12.8

8’01

nd

pu

nd

Elastase

IC50 (nmol)

Katepsin

G IC50 (nmol)

35134

11155

20295

nd

56 at 100 pM %

nd

Eks

Hemo -lysisved 100 gM %

nd

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

nd

pu

nd

Tryptas e ved 100 pM %

r

nd

o

<100

Urokina se ved 100 pM %

QC

pu

nd

FXa ved 100 pM %

w—j

nd

Trombi n ved 100 tiM

%

nd

pu

nd

Kymase ved 100 pM %

eN

pu

nd

nd _!

Kymotrypsin ved 100

pM

%

nd

o

nd

Trypsin ved 100 pM %

r-

in

pu

0S3I ‘0

00001<

Elastase IC50 (nmol)

o

'O

nd

pu

Katepsin

G IC50 (nmol)

% wri

001 Vt 69

54 at 100 pM %

nd

Hl

Eks

LL\

GC

£81

Hemo

-lysisved 100 gM

%

nd

pu

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

nd

pu

nd

Tryptas e ved 100 pM %

r«N

V

<100

Urokina se ved 100 pM %

nd

pu

nd

FXa ved 100 pM %

nd

Trombi n ved 100 tiM %

nd

pu

nd

Kymase ved 100 pM %

nd

pu

nd

Kymotrypsin ved 100 pM %

nd

Trypsin ved 100 pM %

Elastase

IC50 (nmol)

nd

pu

nd

Katepsin

G IC50 (nmol)

cn

1500

Eks

ei

Hemo -lysisved 100 gM %

nd

Cytotoksitet

LCso/ CjIso Hela-cells

nd

Tryptas e ved 100 pM %

Urokina se ved 100 pM %

nd

FXa ved 100 pM %

nd

Trombi n ved 100 tiM

%

nd

pu

Kymase ved 100 pM %

nd

nd _!

Kymotrypsin ved 100

pM

%

nd

Trypsin ved 100 pM %

cn

o r-

Elastase IC50 (nmol)

nd

Katepsin

G IC50 (nmol)

1570

4000

2165

Eks

Resultatene av eksperimentet som er beskrevet i avsnitt 2.5 ovenfor er angitt i den etterfølgende tabell 4.

Tabell 4

Eksempel

Stabilitet humant plasma ti/2 (minutt)

Stabilitet ved rotteplasma ti/2 (minutter)

5 Resultatene av eksperimentet som er beskrevet i avsnitt 2.6 (PK) ovenfor er angitt i den etterfølgende tabell 5.

Tabell 5

Administrasj onsmåte

Intravenøst

Oralt

Dose (mg/kg)

Dosenorm (mg/kg)

AUCo-t (ng-h/ml)

6044

AUCo-oo (ng-h/ml)

6047

AU Co-oo iionii (ng‘h/nil)

6047

I mai observert (timer}

10752

I max norm (timer)

10752

Cmai norm (ng/Hll)

0,08

0,25

P (timer-1)

Terminalt tl/2 (timer)

0,5

0,87

Vd (ml/kg)

1008

% absorbert(F)

(prosent av normalisert AUC0-a> po. iforhold til normalisert AUCO-oo i.v.)

100%

1,3%

Den store interindividuelle variasjonen i plasmakonsentrasjonen med hensyn til eksempel 75 er mest utpreget etter en enkel oral administrering (lor i.v.: %C.V = 668%, bortsett fra en verdi ved den lavest målbare konsentrasjonen 173%; for p.o. %C.V.: 113-173%).

Intravenøs administrering

Etter intravenøs administrering av eksempel 75 i et dosenivå på 5 mg/kg kroppsvekt, så fulgte eksempel 75 de intravenøse kinetikkarakteristika. Etter PKanalyse viste eksempel 75 en ekstrapolert Copprinneiig verdi på 14069 ng/ml og en Cmax observert på 10762 ng/ml etter 5 minutter (0,083 timer). Plasmanivåene sank raskt til 5774 og 3455 ng/ml etter henholdsvis 15 minutter og 30 minutter. Fra 1 til 2 timer sank plasmanivåene med en terminal ti/2 på 0,46 timer til 18 ng/ml etter 4 timer. AUCo.t og AUCo-uendeiig steg til 6044 og 6047 ng x timer/ml henholdsvis; ogdet opprinnelige fordelingsvolumet var 355 ml/kg. Det tilsynelatende fordelingsvolumet var 547 ml/kg.

Oral administrering

Etter oral administrering av eksempel 75 ved et dosenivå på 50 mg/kg kroppsvekt, så utviklet plasmanivåene av eksempel 75 orale kinetikkegenskaper. Etter PKanalyse viste eksempel 75 en observert Cmax på 464 ng/ml etter 15 minutter. Fra 0,25 timer sank plasmanivåene i en terminal ti/2 etter 0,87 timer til 24 ng/ml etter 4 timer. AUCo-t og AUCo-infinite steg til 782 g 813 ng x timer/ml henholdsvis. Underhensyntagen til absorpsjonen på 1,3%, var det tilsynelatende fordelingsvolumet 1008 ml/kg.

Oral versus intravenøs administrering

På grunn av forskjellige dosenivåer mellom den orale gruppen versus den intravenøse gruppen, så ble verdiene sammenlignet etter dosenormalisering.

Sammenlignet med den normaliserte AUCo-iniinite-etter intravenøs administrering aveksempel 75 (100%: 6047 ng-timer/ml), så utgjorde prosenten av eksempel 75absorbert (F) etter oral administrering seg til 1,3% (81 ng x timer/ml) ved en omtrent 234 ganger lavere normalisert Cmax-verdi etter normal administrering (46versus 10762 ng/ml; tabell 3). Det tilsynelatende fordelingsvolumet etter oral administrering var omtrent 1,8 ganger høyere enn etter en intravenøs administrering (1008 versus 547 ml/kg).

Referanser

1. Barrtt, A.J. Methods in Enzymology 1981, 80, 561-565; Leatherbarrow, R. J.

1992, GraFit, Erithacus Software Ltd., Staines, U.K.

2. Mossman T. J.Immunol.Meth. 1983, <55: 55-63

5 3. Berridge MV, Tan AS. Arch.Biochem.Biophys. 1993, 303: 474-482